Автор: Анисимов А.А.
Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика общая биохимия химия биология
Год: 1986
Текст
OCHOBI
’ ’ ’’И ‘
основы
БИОХИМИИ
Под редакцией проф. А. А. АНИСИМОВА
Допущено
Министерством высшего и среднего
специального образования СССР
в качестве учебника
для студентов университетов,
обучающихся по специальности
«Биология»
МОСКВА .ВЫСШАЯ ШКОЛА
ББК 28.072
0-75
УДК 577.1
А А. Анисимов, А. Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова, М. С. Каманина,
Л. М. Бронштейн
Рецензенты: i
кафедра биохимии (зав. кафедрой проф. С. Н. Лызлова) и кафедра фи-
зиологии и биохимии растений (зав. кафедрой проф. В. В. Полевой)
Ленинградского государственного университета им. А. А. Жданова;
чл.-кор. АН Грузинской ССР, д-р биол. наук, проф. Н. Н. Нуцубидэе
(Институт биохимии растений АН Грузинской ССР)
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец, ун-тов/
0-75 А. А. Анисимов, А. Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова и др.;
Под ред. А. А. Анисимова.— М.: Высш, шк., 1986.—551 с.: ил.
С учетом новейших достижений науки рассмотрены вопросы статической и ди-
намической биохимии белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, минераль-
ных веществ, витаминов. Особое внимание уделено проблемам биосинтеза белка,
дыхания и энергетики, ферментативного катализа, регуляции метаболизма, перспек-
тивам дальнейшего развития физико-химической биологии, освещены экологические
аспекты ряда биохимических проблем. Отличительная особенность книги — сравни-
тельно-эволюционный принцип изложения материала.
О
2007020000—353
001(01)— 86
ББК 28.072
57.04
104—86
© Издательство «Высшая школа», 1986
ПРЕДИСЛОВИЕ
Биохимия — одна из наиболее быстро развивающихся об-
ластей биологии. Раскрывая биохимические основы различ-
ных проявлений жизнедеятельности, она оказывает огромное
влияние на развитие всех разделов биологии и имеет большое
значение для формирования диалектико-материалистического
мировоззрения. Достижения биохимии призваны обеспечить
качественно новый этап в управлении явлениями жизни. Био-
химия широко применяется в различных областях народного
хозяйства и в медицине. Поэтому для подготовки специалис-
тов-биологов в университетах страны крайне нужны учебники
и учебные пособия, излагающие основы современной биохи-
мии, обобщающие и анализирующие ее новейшие достижения
и пути развития.
Предлагаемый учебник подготовлен в соответствии с про-
граммой курса «Биохимия» для студентов биологических спе-
циальностей университетов. Необходимость такого издания
диктуется тем, что для университетов учебники общей биохи-
мии отечественных авторов не публиковались в СССР после
1966 г.; студенты использовали переводные книги. Появивши-
еся в 1981—1982 гг. трехтомные издания по биохимии Д. Мец-
лера, А. Уайта и других благодаря своему большому объему
имеют характер кратких энциклопедий и более пригодны ас-
пирантам и студентам, специализирующимся по биохимии на
старших курсах. В известной мере это относится и к образцо-
вому во многих отношениях 3-томному изданию А. Лениндже-
ра (1985).
При написании данного учебника был использован много-
летний опыт чтения лекционного курса общей биохи-
мии студентам Горьковского государственного университета
им. Н. И. Лобачевского. Излагаемый материал отражает ос-
новные достижения в области биохимии, опубликованные в
монографиях и периодической литературе последних лет как
отечественных, так и зарубежных авторов. Большое внимание
уделено проблемам молекулярной биологии, поскольку это
направление в последние годы особенно активно и успешно
развивалось. Рассмотрены перспективы дальнейшего разви-
тия физико-химического направления в биологии.
а
Особенностью учебника является сравнительно-эволюцион-
ный принцип изложения, обсуждаются отличия и общие чер-
ты основных биохимических процессов у бактерий, растений
и животных, что необходимо для студентов-биологов широкого
профиля. Излагаются также экологические аспекты биохими-
ческих проблем, крайне актуальные в наше время. По воз-
можности указывается практическое использование отдельных
веществ и биохимических процессов в народном хозяйстве.
Учебник представляет собой совместный труд коллектива
авторов. Распределение материала между авторами следую-
щее: А. А. Анисимов — введение, гл. 1, 12 и ряд разделов дру-
гих глав; А. Н. Леонтьева — гл. 4, 6, 7 и разд. «Синтез белка»;
И. Ф. Александрова — гл. 2, 3, 9 и разд. «Регуляция биосин-
теза белка»; М. С. Каманина — гл. 6, 8 и разд. «Аминокисло-
ты» и «Фиксация молекулярного азота воздуха»; Л. М. Брон-
штейн — гл. 10, 11 и разд. «Гормоны человека и животных»,
«Структура антител, механизм их образования», «Диссимиля-
ция белков», «Превращение углеводов в процессе пищеваре-
ния» и некоторые другие.
Авторы искренне признательны за просмотр рукописи и
сделанные полезные замечания акад. С. Е. Северину, проф.
В. В. Полевому и чл.-кор. АН Груз. ССР проф. Н. Н. Нуцубид-
зе. Особенно благодарны авторы за большой труд по тщатель-
ному ознакомлению с рукописью, ценные советы и большую
помощь при окончательной доработке рукописи проф. С. Н.
Лызловой, проф. В. П. Гончаровой, доц. А. А. Мюльбергу, доц.
Ю. П. Глушанкову, доц. А. И. Камковой. По отдельным гла-
вам учебника полезные замечания были сделаны проф.
Н. А. Добротиной, ст. науч. сотр. Л. Н. Олюниной, которым
авторы также выражают свою признательность.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия (биохимия) — наука о химическом сос-
таве и свойствах веществ живых организмов, о превращениях ве-
ществ в процессе жизнедеятельности. Совокупность этих превра-
щений, отражающих постоянную взаимосвязь организма с внеш-
ней средой, принято называть обменом веществ.
Понятия «химический состав», «превращения веществ» и само
название науки — «биологическая химия» наталкивают на вопрос:
разделом биологии или химии является биохимия? Ф. Энгельс
разработал и изложил в «Диалектике природы» научно и методи-
чески обоснованную классификацию наук по формам движения
материи, которые эти науки изучают. Жизнь — качественно свое-
образная, высшая форма движения материи в природе. Обмен ве-
ществ представляет собой основу, сущность этой особой формы
движения материи. «Жизнь есть способ существования белковых
тел, существенным моментом которого является постоянный обмен
веществ с окружающей их внешней природой» Ч Поэтому наука,
изучающая сущность биологической формы движения материи—
обмен веществ, должна быть отнесена к группе биологических
наук.
Определение биохимии как науки одновременно характеризу-
ет и ее положение, значение среди других биологических наук.
Изучая сущность жизни, самое главное в жизненных процессах—
обмен веществ, биохимия, несомненно, должна быть отнесена к
важнейшим биологическим наукам. Недаром даже в одном из ос-
новополагающих документов нашей страны — Основных направ-
лениях экономического и социального развития СССР на 1986—
1990 годы и на период до 2000 года — отмечается необходимость в
области естественных наук «развивать физико-химическую биоло-
гию, научные основы получения физиологически активных веществ
для медицины и сельскохозяйственного производства...»1 2
Значение биохимии как науки для человеческого общества оп-
ределяется тем, что она является одной из теоретических основ ме-
дицины, сельского хозяйства, биотехнологии, генетической инжене-
рии и ряда отраслей промышленности, лесного дела. В основе
многих патологических состояний человека лежат нарушения от-
1 Маркс К., Энгельс Ф. Соч. 2-е изд., т. 20, с. 616.
2 Рыжков Н. И. Об основных направлениях экономического и социального
развития СССР на 1986—1990 годы и на период до 2000 года. М., 1986.
5
дельных биохимических процессов. Известно, например, более ста
заболеваний, обусловленных нарушением деятельности фермента-
тивных систем, отсутствием отдельных ферментов вследствие на-
следственных дефектов. Для некоторых заболеваний характерны
изменения в химической структуре ряда высокомолекулярных сое-
динений. Такого рода «молекулярные дефекты» описаны, в частно-
сти, для гемоглобина и полисахаридов. Без глубоких знаний моле-
кулярных основ патологии невозможны ни диагностика и лечение,
ни профилактика болезней. Успехи биохимии определяют и стра-
тегию создания новых лекарственных препаратов. Большой инте-
рес в этом отношении представляет широкое использование фер-
ментов при лечении некоторых заболеваний.
Биохимические процессы и показатели лежат в основе любой
технологии пищевой промышленности: хлебопечения, сыроварения,
виноделия, пивоварения, производства чая, жиров и масел, перера-
ботки молока, мяса и рыбы, плодов и овощей, производства крах-
мала и патоки. Биохимические знания необходимы для успешной
организации кожевенного производства, при изготовлении меховых
изделий, обработке натурального шелка. Ферментативные препа-
раты широко используют при изготовлении хлопчатобумажных
тканей. Все более расширяются такие биохимические производст-
ва, как изготовление витаминов, антибиотиков и других биологиче-
ски активных соединений, органических кислот, кормового белка.
Только на основе глубокого изучения закономерностей обмена
веществ сельскохозяйственных растений и животных возможно
получение больших урожаев с высоким качеством в растениевод-
стве и повышение продуктивности в животноводстве. Исключи-
тельно эффективно в этом отношении применение в сельском хо-
зяйстве разнообразных химических препаратов: гербицидов, фун-
гицидов, кормовых витаминов, белков и антибиотиков, дефолиан-
тов и десикантов (вызывают опадение листьев и предуборочное
высушивание растений), инсектицидов (уничтожают насекомых-
вредителей), репеллентов (отпугивают вредителей) и т. д.
Все перечисленное свидетельствует о большом значении био-
химии для человеческого общества, объясняет громадный и все
возрастающий интерес к этой науке во всех странах мира.
Биохимию принято делить на статическую и динамическую. За-
дача статической биохимии — изучение химического состава и
свойств веществ живых организмов. Динамическая биохимия изу-
чает превращения веществ в процессе жизнедеятельности. Это де-
ление, в значительной мере условное, полезно при изложении тео-
рии биохимии в учебных, методических целях. При проведении же
реальных биохимических исследований невозможно глубоко изу-
чить и понять превращения какого-либо вещества в организме, не
зная строения, свойств этого вещества, и, наоборот, любая харак-
теристика свойств биохимических соединений будет неполной без
описания их превращений в организме. В зависимости от объектов
исследования различают биохимию человека и животных, биохи-
0
мию растений, биохимию микроорганизмов. Выделяют определен-
ные разделы биохимии и по направленности исследований.
Техническая биохимия разрабатывает биохимические основы
тех отраслей промышленности, где перерабатываются сырье и ма-
териалы биологического происхождения (хлебопечение, сыроваре-
ние, виноделие и т. д.).
Медицинская биохимия изучает биохимические процессы в ор-
ганизме человека в норме и при патологии.
Эволюционная биохимия сопоставляет состав и пути превраще-
ния веществ и энергии различных систематических групп живых
организмов в эволюционном плане.
Квантовая биохимия исследует свойства, функции и пути прев-
ращения различных веществ живых организмов в связи с электрон-
ными характеристиками этих веществ, полученными с помощью
квантово-механических расчетов.
Энзимология изучает структуру, свойства и механизм действия
энзимов (ферментов) — биологических катализаторов.
Из всех других наук биохимия наиболее тесно связана с физио-
логией. Эта связь обусловлена самой природой, сущностью биоло-
гических процессов. В основе любого нарушения какой-либо физио-
логической функции лежит система изменений биохимических ре-
акций. Нельзя глубоко, до конца правильно понять природу любо-
го физиологического процесса, не зная его биохимизма, так же как
нельзя изучать биохимические реакции в отрыве от их физиологи-
ческого значения. Неудивительно поэтому, что до второй половины
XIX столетия биохимия была не самостоятельной наукой, а разде-
лом физиологии. На течение биохимических процессов решающее
значение оказывает состояние физиологических функций организ-
ма и прежде всего состояние нервной системы.
Тесная связь биохимии и физиологии отразилась и в творчест-
ве многих крупных исследователей. Великий русский физиолог
акад. И. П. Павлов является одновременно одним из основополож-
ников ряда важных разделов биохимии, в частности разделов энзи-
мологии: о превращении зимогенов (проферментов) в активные
ферменты, об обратимости действия ферментов, о строении и свой-
ствах пищеварительных ферментов.
Постепенно, в связи с накоплением биологических знаний,
биохимия стала одним из ведущих разделов физиологии, а затем
обособилась в самостоятельную науку. В наши годы, в связи с
мощным развитием отдельных разделов биохимии, появляется тен-
денция выделения некоторых из них в самостоятельные научные
дисциплины (например, энзимологии).
Биохимия взаимосвязана и с органической химией. При прове-
дении исследований биохимики выделяют отдельные вещества из
живых организмов, очищают от примесей, устанавливают однород-
ность, определяют состав и структуру, изучают свойства, после че-
го, при необходимости, синтезируют эти вещества. Таковы же эта-
пы исследования и химика-органика. Но если у химика на этом
работа исчерпывается, у биохимика начинается самое важное и
7
интересное — изучение превращений данных соединений в общей
системе обмена веществ живого организма, выяснение их роли в
его жизнедеятельности. Связь биохимии и органической химии так-
же отразилась в научном творчестве ряда ученых. Так крупнейший
советский химик-органик акад. Н. Д. Зелинский известен своими
работами по биохимии белков.
С каждым годом расширяются связи биохимии с физической
химией. Большое значение для протекания жизненных процессов
имеют скорости биохимических реакций, их зависимость от темпе-
ратуры, активной реакции среды и связи с осмотическими явлени-
ями. Все эти вопросы являются одновременно компетенцией и
биохимии и физической химии. В последнее время особенно актив-
но внедряются в биохимические исследования физико-химические
и физические методы: хроматография, электрофорез, рентгено-
структурный анализ, спектроскопия, электронный парамагнитный
резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), метод ме-
ченых атомов и т. д. В итоге сформировалась новая область науч-
ных знаний — физико-химическая биология, успешно развивающа-
яся в нашей стране.
Еще лет тридцать назад вряд ли можно было говорить о серь-
езном взаимодействии биохимии с математикой. Теперь же это
стало очевидным фактом. И не только потому, что результатам био-
химических исследований лишь тогда можно доверять, когда они
статистически обработаны, известна степень их достоверности.
Значительно более важен вклад математики в биохимию в связи с
широким внедрением метода математических моделей, рассмотре-
нием ряда биохимических процессов с точки зрения прямых и об-
ратных связей, механизмов регуляции и управления этими процес-
сами, их саморегуляции (т. е. сопряжения биохимии с кибернети-
кой), что привело к широкому использованию ЭВМ в современных
биохимических исследованиях.
Как самостоятельная наука биохимия сформировалась около
ста лет назад, однако биохимическими процессами люди пользова-
лись и во времена глубокой древности, не зная, естественно, их те-
оретической сущности. Нам представляется возможным в истории
развития биохимических знаний и биохимии как науки выделить
четыре периода.
/ период — с древних времен до эпохи Возрождения (XV в.).
Это период практического использования биохимических процессов
без знания их теоретических основ и первых, порой очень прими-
тивных, биохимических исследований.
В самые отдаленные времена люди уже знали технологию та-
ких производств, основанных на биохимических процессах, как
хлебопечение, сыроварение, виноделие, дубление кож. Необходи-
мость лечения болезней заставляла задумываться о превращениях
веществ в организме, о причинах целебных свойств лекарственных
растений. Использование растений в пищевых целях, для изготов-
ления красок, тканей, дубителей также наталкивало на попытки
понять свойства отдельных веществ растительного происхождения.
8
Талантливый ученый X столетия Авиценна (Ибн-Сина) в своей
знаменитой книге, многократно переиздававшейся вплоть до на-
ших дней,— «Канон врачебной науки» — подробно описал многие
лекарственные вещества, отведя им целый раздел книги.
Берестяные грамоты XI в., найденные при раскопках Новгоро-
да, свидетельствуют, что в то время на Руси была хорошо развита
технология пивоварения, виноделия, хлебопечения. Наши предки
уже тогда знали много достаточно сложных рецептов красок и чер-
нил из растений. До сих пор поражает богатством и свежестью
красок знаменитый памятник славянской культуры — рукописное
Остромирово Евангелие (XI в.).
И период в развитии биохимии, существующей еще как раздел
физиологии, характеризуется усилением накопления биохимичес-
ких знаний. Этот период ведет отсчет от начала эпохи Возрожде-
ния и заканчивается во второй половине XIX в., когда биохимия
становится самостоятельной наукой.
Эпоха Возрождения характеризуется некоторым ослаблением
церковного гнета в науке, освобождением естествознания от пут
средневекового религиозного мракобесия. Гений того времени, ав-
тор многих шедевров искусства, архитектор, инженер, анатом Лео-
нардо да Винчи, интересовавшийся также процессами, в основе
которых лежат биохимические реакции, провел интересные опыты и
на основании их результатов сделал важный для тех лет вывод,
что живой организм способен существовать только в такой атмос-
фере, в которой может гореть пламя.
Для XVI—XVII вв. характерно возникновение и развитие
иатролимии (от греч. иатрос — врач). Сторонники этого направле-
ния утверждали, что жизнедеятельность человека, причины его
заболеваний можно понять только с точки зрения химии, и лечение
многих болезней следует осуществлять путем применения прежде
всего химических средств. Один из основоположников иатрохи-
мии, немецкий врач и физиолог Парацельс (1492—1541) писал,
что задача алхимии не в изготовлении золота, а в создании того,
что является силой медицины.
Восемнадцатый век, ознаменованный гениальными трудами
М. В. Ломоносова, характеризуется мощным и всесторонним раз-
витием наук в России. Открытие М. В. Ломоносовым закона сох-
ранения массы веществ нанесло сокрушительный удар по идеализ-
му в естествознании. Это великое открытие заложило основы мате-
риалистического понимания природы и ее явлений, послужило на-
чалом новой эры в химии, биологии и других науках — эры точных
количественных измерений. Известно, что М. В. Ломоносов — осно-
воположник химической науки в России. Ее становление отрази-
лось и на развитии химии растений. Замечательную мысль выска-
зал М. В. Ломоносов во «Введении в истинную физическую хи-
мию» (1752): «...хотя органы животных и растений весьма тонки,
однако они состоят из более мелких частичек, и именно из неорга-
нических.., ^потому что при химических операциях разрушается их
организованное строение». Эта блестящая материалистическая
9
трактовка строения живых организмов уже в те годы не оставляла
места для особой «жизненной силы», для витализма. В работе
«Слово о явлениях воздушных» (1753) М.В. Ломоносов впервые в
науке высказал важные мысли о «воздушном питании» растений,
т. е. о фотосинтезе. В его трудах неоднократно говорится о значе-
нии химии для медицины; им дано описание ряда биохимических
соединений — жиров, эфирных масел, смол.
На основе открытого М. В. Ломоносовым закона сохранения
массы веществ и накопившихся к концу XVIII в. эксперименталь-
ных исследований французский ученый А. Лавуазье количественно
исследовал и объяснил сущность дыхания, указав на роль кислоро-
да в этом процессе. Немецкий химик Ю. Либих в 30—40 годы
XIX в. успешно развил методы количественного химического ана-
лиза и применил их к исследованию биологических систем.
Мощным толчком к развитию органической химии и биохимии
явилась созданная великим русским химиком А. М. Бутлеровым
теория строения органических соединений (1861). В те годы неко-
торые ученые (например, известный химик-органик Ш. Вюрц) счи-
тали, что познать строение органических веществ принципиально
невозможно и что существующие их формулы являются лишь ус-
ловными символами строения. Неверие в возможности науки, че-
ловеческого разума, признание их ограниченности — агности-
цизм — является, как известно, откровенным идеализмом.
А. М. Бутлеров в своей теории утверждал, что атомы и моле-
кулы существуют в определенных реальных взаимоотношениях,
количественных и пространственных, которые и выражаются фор-
мулами. Он указывал также, что химические свойства веществ
обусловлены их строением. Материалистическая теория А. М. Бут-
лерова — революционная для своего времени, надолго определила
пути развития органической химии и биохимии.
А. М. Бутлеров сделал и другой ценный вклад в биохимию: он
впервые синтезировал лабораторным путем сахар. Виталисты ут-
верждали, что органические соединения могут образовываться толь-
ко в живом организме под влиянием непознаваемых жизненных
сил. Синтез сахара А. М. Бутлеровым и мочевины немецким хи-
миком Ф. Вёлером опроверг лженаучные утверждения виталистов.
В 50-х годах прошлого столетия известный французский физи-
олог К. Бернар выделил из печени гликоген и показал, что он пре-
вращается в глюкозу, поступающую в кровоток. В 1868 г. Ф. Ми-
шер в лаборатории немецкого физиолога и биохимика Ф. Гоппе-
Зейлера открыл ДНК. Однако по достоинству это открытие и,
главное, само вещество были оценены лишь почти 100 лет спустя.
Ill период в истории биохимии, начинающийся со второй поло-
вины XIX в., ознаменован выделением биохимии как самостоятель-
ной науки из физиологии. Эго связано с резким увеличением интен-
сивности и глубины биохимических исследований, объема получае-
мой информации, возросшим прикладным значением — использо-
ванием биохимии в промышленности, медицине, сельском хозяйст-
ве. к этому времени относятся работы одного из основоположни-
10
ков отечественной биохимии А. Я* Данилевского (1838—1923). Ис-
следуя строение белков, он сформулировал ряд положений, кото-
рые в дальнейшем легли в основу полипептидной теории структу-
ры белков, А. Я. Данилевским впервые высказана идея об обрати-
мости действия ферментов и на основании этого осуществлен фер-
ментативный синтез белковоподобных веществ (пластеины). Он
разработал оригинальную методику разделения и очистки фермен-
тов путем адсорбции и элюции (десорбция), которую широко ис-
пользуют и в наши дни. А. Я. Данилевский возглавил в Казанском
университете первую в России кафедру биохимии и создал первую
русскую школу биохимиков.
Большие заслуги в развитии отечественной биохимии принад-
лежат М. В. Ненцко-му (1847—1901). В 1891 г. он создал первую
в России биохимическую лабораторию при Институте эксперимен-
тальной медицины в Петербурге. Им был выполнен ряд выдаю-
щихся исследований: совместно с сотрудниками Л. П. Мархлев-
ским и С. В. Салазкиным впервые были установлены основные
этапы биосинтеза мочевины, также впервые подробно исследова-
но строение гемоглобина и сделано сопоставление в эволюционном
плане со структурой хлорофилла. Поражает широта диапазона
научных интересов М. В. Ненцкого, к уже перечисленному можно
добавить — синтез салола, изучение обмена белков, исследование
некоторых аспектов этиологии туберкулеза.
К концу прошлого столетия относится открытие Н. И. Луниным
витаминов (1880), Д. И. Ивановским — вирусов (1892).
На рубеже XIX и XX вв. работал крупнейший немецкий химик-
органик и биохимик Э. Фишер (1852—1919). Его исследования со-
ставили целую эпоху в развитии биохимии. Им были сформулиро-
ваны основные положения полипептидной теории белков, начало
которой дали исследования А. Я. Данилевского. Э. Фишер устано-
вил структуру, предложил формулы и исследовал свойства почти
всех аминокислот, входящих в состав белков. Им было проведено
подробное и обширное изучение строения и ферментативных пре-
вращений углеводов, особенно моносахаридов.
К этому же времени относятся исследования великого русско-
го физиолога растений К. А. Тимирязева (1843—1920), в трудах
которого затрагиваются многие биохимические вопросы фотосинте-
за и минерального питания растений. Еще в 1868 г. на I съезде
русских естествоиспытателей 25-летний К. А. Тимирязев сделал
сообщение о превращении неорганических веществ зелеными лис-
тьями растений в органические под влиянием солнечной энергии.
Это было лишь начало его фундаментальных работ по фотосинте-
зу, завоевавших затем мировое признание.
В конце прошлого столетия начал свои исследования и другой
великий русский ученый — А. Н. Бах, ставший впоследствии ос-
нователем советской биохимической школы. С самого начала своей
научной деятельности А. Н. Бах направил внимание на одну из уз-
ловых проблем биохимии — дыхание. Его не удовлетворяла идея
о полной аналогии между дыханием и горением, высказанная
Ц
к. Лавуазье. Созданная (А. Н. Бахрм на основании глубоких йодле-,
дований перекисная теория объяснила механизм участия кислоро-
да воздуха в реакциях дыхания. Она не потеряла своего значения
и в наше время, выяснение роли оксигеназ, пероксидаз и каталазы
в процессе биологического окисления все больше привлекает вни-
мание биохимиков.
Многое сделано А. Н. Бахом в области энзимологии, им зало-
жены основы учения о физиологической роли ферментов. Исследо-
вания Баха способствовали развитию технической биохимии в на-
шей стране. А. Н. Бах являет собой прекрасный пример ученого-
гражданина, всегда сочетавшего большую научную работу с актив-
ной общественной (а до 1917 г. и с революционной) деятельностью.
Уже в гимназии он читал К. Маркса, в студенческие годы был
сослан на 5 лет за участие в «беспорядках», впоследствии он —
активный член «Народной воли». После Октябрьской революции
А. Н. Бах организует ряд крупных биохимических институтов:
Биохимический институт Наркомздрава, Институт биохимии АН
СССР и др. Образованная акад. А. Н. Бахом, его учениками и
сотрудниками советская школа биохимиков получила всеобщее
признание и поныне занимает достойное место в мировой науке.
Среди непосредственных сотрудников А. Н. Баха особого внимания
заслуживает А. И. Опарин — создатель широко известной и при-
знанной теории происхождения жизни.
Ряд замечательных русских ученых, начавших научную деятель-
ность до Октябрьской революции, проявили свой талант уже в го-
ды Советской власти:
В. И. Палладии показал, что дыхание представляет собой систе-
му ферментативных процессов, установил роль кислорода воды и
реакций дегидрогенизации — отщепления водорода — при ды-
хании;
С. П. Костычев исследовал химизм спиртового брожения и
анаэробной фазы дыхания, нашел общность между ними;
Д. Н. Прянишников заложил основы учения об азотном обмене
растений, раскрыл роль аммиака и аспарагина в этом процессе,
создал основы советской агрохимии.
В первой трети XX в. акад. В. С. Гулевичем (МГУ) были от-
крыты и исследованы карнозин и ансерин — азотистые экстрактив-
ные вещества мышц. В. С. Гулевич — один из основателей сравни-
тельно-эволюционной биохимии в нашей стране, им создана в Со-
ветском Союзе крупная биохимическая школа.
Начало XX столетия характеризуется рядом фундаментальных
исследований в области химии и за рубежом. В 1905 г. А. Гарден и
В. Ионг выделили первый кофермент спиртового брожения — «ко-
зимазу», называемый в наше время НАД (никотинамидаденинди-
нуклеотид). В этом же году Ф. Кнооп открыл и исследовал 0-окис-
ление жирных кислот. К 20—30 годам относятся блестящие работы
немецкого биохимика О. Варбурга по выделению и изучению дыха-
тельных ферментов (цитохромоксидаза, флавиновые дегидрогена-
зы и др.), выделению пиридиновых нуклеотидов, изучению их
12
структуры и функции. В это же время Д. Самнер и Д. Нортроп
(США) впервые выделили ферменты в виде белковых кристаллов,
совершив тем самым революцию в энзимологии. В 1933 г. Г. Кребс
подробно изучил орнитиновый цикл образования мочевины, а
1937 г. датируется открытие им же цикла трикарбоновых кислот,
который является биохимической основой аэробного расщепления
углеводов.
В 1933 г. Д. Кейлин (Англия) выделил цитохром с и воспроиз-
вел процесс переноса электронов по дыхательной цепи в препара-
тах из сердечной мышцы.
В Советском Союзе в 30—40 годах были сделаны два замеча-
тельных открытия, сказавшихся на последующем развитии всей
биохимии. В 1931 г. В. А. Энгельгардт показал, что фосфорилиро-
вание сопряжено в процессе дыхания с окислительными процесса-
ми, а в 1942 г. он же совместно с М. Н. Любимовой открыл АТФ-
авную активность миозина и других сократительных белков.
В 1938 г. А. Е. Браунштейн и М. Г. Крицман впервые описали
реакции трансаминирования, являющиеся одним из узловых пунк-
тов азотного обмена всех живых организмов.
40-е и особенно 50-е годы характеризуются усиленным исполь-
зованием в биохимических исследованиях физических, физико-хи-
мических и математических методов, активным и успешным изу-
чением основных жизненных процессов (биосинтез белков, в пер-
вую очередь) на молекулярном и надмолекулярном уровнях. Это
был несомненно качественный скачок в развитии биохимии, поэто-
му представляется возможным, 50-е годы, в которые была опуб-
ликована статья Д. Уотсона и Ф. Крика о строении двойной спи-
рали ДНК, положившая начало новому научному направлению —
молекулярной биологии, считать одновременно и началом каче-
ственно нового периода в истории биохимии — IV периода.
Вот краткая хронология основных открытий в биохимии этого
периода.
1953 — Д. Уотсон и Ф. Крик предложили модель двойной спи-
рали строения ДНК.
1953 — Ф. Сэнгер впервые расшифровал аминокислотную по-
следовательность белка инсулина, состоящего из 51 аминокислот-
ного остатка.
1955—1960 — А. Н. Белозерский и его сотрудники, исследовав
нуклеотидный состав ДНК огромного числа представителей живот-
ных, растений и бактерий, охарактеризовали таксономическое и
эволюционное значение количественного соотношения отдельных
азотистых оснований в ДНК.
1959, 1960 — А. С. Спирин и П. Доти установили вторичную и
третичную структуру рибосомальной РНК.
1961 — М. Ниренберг расшифровал первую «букву» кода белко-
вого синтеза — триплет ДНК, соответствующий фенилаланину.
Позднее С. Очоа и Г. Корана расшифровали все буквы этого кода.
1965—1967 — Р. Холли и независимо от него А. А. Баев опре-
делили нуклеотидную последовательность транспортных РНК.
в
1966 — П. Митчелл сформулировал хемиосмотическую теорию
сопряжения окисления и фосфорилирования,
1969 — Р. Мерифильд химическим путем синтезировал фермент
рибонуклеазу.
1970 — Г. Корана синтезировал ген (транспортной РНК), а в
1976 г. присоединил его к ДНК мутантного штамма бактериофага
X, дефектного по данному гену, после чего этот бактериофаг стал
нормально размножаться.
1971 — в совместной работе двух лабораторий, руководимых
Ю. А. Овчинниковым и А. Е. Браунштейном, установлена первич-
ная структура аспартатаминотрансферазы — белка из 412 амино-
кислот.
1977 — Ф. Сэнгер и сотрудники впервые полностью расшифро-
вали первичную структуру молекулы ДНК (фаг фХ174).
В нашей стране в настоящее время продолжают активно раз-
виваться различные направления биохимических исследований.
В МГУ многие годы под руководством академика С. Е. Северина
плодотворно проводятся работы по биохимии дыхания. С. Е. Севе-
рин длительное время является Президентом Всесоюзного биохими-
ческого общества, его исследования и организаторская работа мно-
гое сделали для укрепления и развития советской биохимической
школы. Крупные работы приоритетного характера по биоэнергети-
ке выполняются в МГУ В. П. Скулачевым. Большие успехи достиг-
нуты коллективом Института биохимии АН СССР, особенно в об-
ласти энзимологии (И. В. Березин), биологической фиксации азо-
та воздуха и азотного обмена растений, технической биохимии
(В. Л. Кретович), биохимии и биофизики фотосинтеза (А. А. Крас-
новский). Ряд интереснейших открытий в области биосинтеза бел-
ков и их структуры сделаны в Институте белка АН СССР
(А. С. Спирин), по исследованию структуры и функций нуклеино-
вых кислот, некоторым энзимологическим проблемам — в Инсти-
туте молекулярной биологии АН СССР (В. А. Энгельгардт,
А. Е. Браунштейн, А. А. Баев, Г. П. Георгиев). Широкое признание
в нашей стране и за рубежом получили исследования структуры и
свойств мембран Ю. А. Овчинниковым (Институт биоорганической
химии АН СССР). Научным центром функциональной биохимии
растений является в Советском Союзе Институт физиологии расте-
ний АН СССР, руководимый А. Л. Курсановым. Кроме перечис-
ленных институтов интенсивные и успешные работы в области
биохимии проводятся в Институте медицинской и биологической
химии АМН СССР, Институте биохимии и физиологии микроор-
ганизмов, Институте фотосинтеза, Институте биофизики АН
СССР, а также в ряде институтов ВАСХНИЛ. Институты биохи-
мии существуют и в академиях наук большинства союзных респуб-
лик. ЦК КПСС и правительство нашей страны оказывают большое
внимание и помощь развитию биохимических исследований, о чем
свидетельствуют специальные постановления последних лет о
мерах по ускорению развития молекулярной биологии (1974), фи-
зико-химической биологии и биотехнологии (1981), о дальнейшем
14
развитии биологии и биотехнологии (1985). Эти постановления
способствовали коренным изменениям в советской биологической
науке, в первую очередь развитию таких ее разделов, как молеку-
лярная! биология, биоорганическая химия, молекулярная генетика,
иммунология.
По £яду вопросов физико-химического направления в биологии
советские ученые заняли передовые позиции в мировой науке. На
основе достижений физико-химического направления биологии в
СССР формируется перспективная научно-техническая отрасль —
биотехнология. Одним из существенных показателей активного раз-
вития биохимических исследований в нашей стране является рез-
кое увеличение числа публикуемых работ. До Октябрьской социа-
листической революции в России не было периодических изданий
по биохимии. В настоящее время у нас издаются журналы: «Био-
химия», «Успехи биологической химии» (ежегодник), рефератив-
ный журнал «Биологическая химия», «Украинский биохимический
журнал», «Прикладная биохимия и микробиология», «Эволюцион-
ная биохимия и физиология», «Биоорганическая химия», «Моле-
кулярная биология», «Вопросы медицинской химии», «Физиология
и биохимия культурных растений» (Киев). Кроме перечисленных
специализированных изданий большое число биохимических работ
публикуется в «Докладах АН СССР», журнале «Физиология рас-
тений» и многих других периодических изданиях.
Советские биохимики являются постоянными и активными
участниками всех международных биохимических конгрессов, кон-
ференций Федерации Европейских биохимических обществ
(ФЕБО), членами международных биохимических организаций
(очередная, 16-я конференция ФЕБО проходила в 1984 г, в
Москве).
Проблемы, решение которых предстоит в настоящее время био-
химической науке, чрезвычайно важны для человечества, инте-
ресны и увлекательны. Одна из них: исследование обмена веществ
человека с целью оздоровления, разработки кардинальных методов
борьбы с «болезнями века» — раком, сердечно-сосудистыми заболе-
ваниями, нахождение путей увеличения продолжительности жизни.
Биохимические исследования — основа решения этой проблемы,
ибо возникновение раковых опухолей есть результат изменения
строения ядерной ДНК, нарушения биохимических механизмов
регуляции клеточного деления. Причина многих сердечно-сосуди-
стых заболеваний заключается в искажении нормального течения
липидного обмена. Любая болезнь связана с нарушениями обмена
веществ, и лечение очень часто представляет собой нормализацию об-
мена с помощью лекарственных препаратов. Невозможно предста-
вить себе в настоящее время диагностирование (распознавание) бо-
лезней без предварительных биохимических анализов. Иммунитет,
способность организма противостоять заболеванию, основан на
сложной системе биохимических процессов. Иммунохимия — одна
из актуальных областей знания в наше время, стоящая на стыке
биохимии и медицины.
15
Крайне интересно также изучение биохимических основ дея-
тельности центральной нервной системы, головного мозга. Еще
акад. И. П. Павлов указывал (1949), что настоящую теорию всех
нервных явлений может дать нам только изучение физико-химиче-
ского процесса, происходящего в нервной ткани.
Уже сейчас найдены вещества, образующиеся в головном моз-
гу (чаще всего это пептиды), от которых зависят состояния воз-
буждения, торможения, характер поведения человека. Решение
многих проблем психики человека, его поведения, эмоций, памяти
возможно только на основе биохимических исследований.
Быстрый рост народонаселения на нашей планете делает очень
актуальной проблему питания. Биохимикам теперь уже хорошо изве-
стны реакции, в результате которых в зеленых листьях растений из
СО2 воздуха и Н2О образуются сахара, крахмал. Совершенно реаль-
ным стало в наши годы решение задачи о воспроизведении этих про-
цессов в реакторах, которые заменят тысячи гектаров посевных
площадей с сельскохозяйственными растениями, не будут зависеть от
метеоусловий и потребуют значительно меньше рабочих рук. Осо-
бое место в проблеме питания занимает вопрос о достаточности со-
держания белков в рационе. Некоторые бактерии способны интен-
сивно усваивать азот воздуха, превращая его в аминокислоты, а
затем в белки. Воспроизвести биохимические реакции, протекаю-
щие при этом у бактерий, в промышленных условиях — крайне за-
манчивая идея, реализация которой вполне возможна.
Актуальные направления развития биохимии в нашей стране
указаны в постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР
1981 г. «О дальнейшем развитии физико-химической биологии и
биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сель-
ском хозяйстве и промышленности».
Центральный Комитет КПСС и Совет Министров СССР счита-
ют одной из важнейших задач советской науки на современном
этапе дальнейшее расширение и углубление фундаментальных ис-
следований в области познания физико-химических основ жизнен-
ных явлений и обеспечение на этой базе профилактики и эффек-
тивного лечения заболеваний человека, производства лекарствен-
ных препаратов, пищевых и кормовых веществ с использованием
биотехнологических методов, а также разработки новых эффектив-
ных методов селекции.
Все перечисленные задачи биохимии будут решаться на основе
опережающего развития фундаментальных, теоретических исследо-
ваний структуры и функции биохимических соединений, разработ-
ки методов их анализа, выяснения путей их биосинтеза и метабо-
лизма.
Большие задачи ставит перед биохимиками Советского Союза
Продовольственная программа, принятая майским (1982 г.) Пле-
нумом ЦК КПСС. Исследование путей управления обменом ве-
ществ сельскохозяйственных растений и животных с целью повы-
шения их продуктивности может привести к открытию и использо-
ванию огромных резервов.
ГЛАВА 1
ОБЩАЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
‘ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
1.1. Химический состав живых организмов
В составе живых организмов нет ни одного химического эле-
мента, который бы составлял исключительную принадлежность
именно живых организмов, не встречался в неживой природе. Это
обстоятельство является одним из многочисленных доказательств
ложности виталистических представлений о строении живых орга-
низмов. Кроме обычных химических элементов в живом организме
нельзя обнаружить и следов какой-то особой «жизненной силы».
Из 107 известных в настоящее время химических элементов в
живых организмах найдено более 70, из них около 20 встречается
во всех типах организмов; как и в верхних слоях земной коры, в
них количественно преобладают элементы с малыми атомными мас-
сами. Длительное время существовало неправильное представление
о химическом элементарном составе биомассы нашей планеты.
Считали, что число «обязательных» элементов для живой при-
роды очень невелико; существовали даже теории, пытавшиеся
объяснить и обосновать причины такой ограниченности. Авторы
этих теорий допускали типичные метафизические ошибки, рассмат-
ривая состав живых организмов как нечто постоянное, неизменяю-
щееся, вне его взаимосвязи с окружающей средой, с веществами
литосферы (земной коры).
Еще К. А. Тимирязев указывал, что одного экспериментального
метода недостаточно для решения биологических проблем, он дол-
жен сочетаться с историческим методом. Именно с этих диалекти-
ческих позиций рассматривал химию биосферы выдающийся рус-
ский ученый, один из основателей науки о химии земли — геохи-
мии, В. И. Вернадский (1863—1945). В своей широко известной
книге «Биосфера» (1926) он писал, что жизнь представляет собой
не случайное явление на земной поверхности, она теснейшим обра-
зом связана со строением земной коры. Геохимические процессы,
непрерывно идущие в земной коре, и эволюция химического эле-
ментарного состава живого вещества, по Вернадскому, — два со-
пряженных процесса. По мере развития жизни на Земле все боль-
шее число химических элементов вовлекалось в круг жизненных
процессов. Включаясь в метаболизм на протяжении огромного чис-
ла поколений, многие элементы стали обязательными компонента-
ми живых организмов, необходимость в них закрепилась наследст-
&
венно. Сказанное не отрицает, конечно, возможности случайного,
одномоментного попадания некоторых элементов в живой организм
вместе с пищей, водой. Более того, известны элементы, которые
присутствуют достаточно часто у многих видов животных и расте-
ний (хотя и в микроколичествах), но необходимость в них у боль-
шинства видов отсутствует (Al, As, Rb и др.).
Следует заметить, что вопрос о необходимости или незаменимо-
сти того или иного химического элемента для конкретных видов
живых организмов не всегда решается однозначно и просто. Так,
если критерием необходимости считать неспособность данного ор-
ганизма нормально развиваться при отсутствии определенного эле-
мента, то возникает затруднение с взаимозаменяемыми элементами
(например, у растений хлор, по крайней мере частично, может
быть заменен бромом). Необходимость в том или ином элементе
зависит также от конкретных условий. Так, при нитратных формах
азотного питания водоросли Scenedesmus не растут в отсутствие
молибдена, а на средах с аммиачной формой азота молибден им не
нужен.
Живые организмы в свою очередь оказывали и оказывают су-
щественное влияние на химический состав земной коры, между
ними всегда есть тесное взаимовлияние, взаимосвязь. Однако эта
взаимосвязь основана не на прямо пропорциональных количест-
венных соотношениях. Так, в неорганической природе широко рас-
пространены элементы, дающие в большинстве случаев нераство-
римые соединения (Si, Fe, Al), а в живых организмах эти элементы
присутствуют в очень малых количествах. В то же время основную
массу биосферы составляют элементы, легко образующие раство-
римые и газообразные соединения (С, N, Р, S), но в земной коре их
содержание относительно невелико. Хорошая растворимость этих
элементов, обес1}£чшвает, видимо, и легкость их попадания в орга-
низм, а также актийюе участие в обменных процессах. В. И. Вер-
надский предложил группировать химические элементы биосферы
«декадами» в зависимости от содержания в живых организмах
(табл. 1.1).
Таблица 1.1. Средний элементарный состав растений и животных
Номера декад Примерное содержание в биосфере. % на сырую массу Элементы
Макроэлементы
I 10 о, н
II I с
III 0,1 N, Р, К, Са, Si
IV 0,01 Mg, S, Fe, Na, Ci, Al
Микроэлеме нты
V—VII 0,001—10“5 Мп, B, Cu, Zn, Ba, Li, Ni, Rb, F и др.
Ультрамикроэле менты
VIII—XIV 10’6—10-12 Mo, I, As, Ag, Hg, Au, Pb, Ra и др.
18
Потребность в некоторых химических элементах не одинакова
у отдельных таксономических групп. Например, положительное
действие мышьяка нароет убедительно установлено только для ря-
да водорослей ти плесневых грибов. Более того, В. И. Вернадским
и его учеником А. П. Виноградовым было высказано положение об
элементном химическом составе растений как о систематическом
признаке. Так, хорошая корреляция между содержанием иода и
таксономией установлена для водорослей. У одного из наиболее
распространенных семейств бурых водорослей Laminariaceae из-
вестны роды и виды, исключительно богатые иодом. В то же время
обитающие в тех же морях виды другого распространенного семей-
ства бурых водорослей Fucaceae всегда значительно беднее иодом.
Существует определенная зависимость между распространени-
ем элементов в биосфере, их биологической ролью и положением
в периодической системе Менделеева. Вещества живых организмов
более чем на 99% состоят из элементов первых трех периодов этой
системы, т. е. из легких элементов. Как правило, при переходе от
легких к тяжелым элементам в пределах одной и той же подгруппы
(например, Zn—>-Cd—^Hg) возрастает токсичность элементов и
одновременно уменьшается содержание их в биомассе. Высокой
биологической активностью обладают многие соединения так на-
зываемых переходных металлов, к которым относятся элементы
4-го периода (с 21 по 30): Мп, Fe, Со, Ni, Си, Zn и др. Это связано
с хорошо выраженной у этих элементов способностью к образова-
нию комплексов, в которых они играют роль центральных атомов.
Комплексные соединения нередко обладают каталитической актив-
ностью, входят в состав ферментативных молекул (например, же-
лезосодержащие геминовые ферменты). Элементы некоторых под-
групп периодической системы могут в той или иной степени заме-
нять друг друга в биологических процессах (например, Са и Ва,
С1 и Вг).
Около 98% массы биосферы составляют четыре элемента: водо-
род, кислород, углерод и азот. Они легко спаривают электроны и
образуют прочные ковалентные связи. Малые размеры атомов этих
элементов также способствуют образованию коротких, прочных хи-
мических связей. Молекулы с такими связями более устойчивы к
действию химических и других факторов. Большое значение имеет
также способность перечисленных элементов образовывать кратные
связи (двойные, тройные), благодаря чему они превосходят многие
элементы по числу и разнообразию соединений с уникальными
свойствами.
Интересно сравнение углерода и кремния. Запасов Si на Земле
в 135 раз больше, чем С. Можно было бы предполагать, что и роль
кремния в биосфере более значительна по сравнению с углеродом.
Однако это не так. Кремний в присутствии кислорода дает одно-
типные, нерастворимые и неактивные полимеры из SiO2. Меньший
размер атомов углерода по сравнению с кремнием обусловливает
возможность образования ими более прочных связей, в том числе
ковалентных углерод-углеродных, не только одинарных, но и двой-
19
ных, тройных. Спаренные электроны создают вокруг каждого атома
углерода тетраэдрическую конфигурацию. В результате может воз-
никнуть бесчисленное множество разнообразных каркасов органи-
ческих молекул с различной пространственной структурой. Ника-
кой другой химический элемент, кроме углерода, не образует
прочные молекулы с таким большим разнообразием конфигураций,
размеров, функциональных групп, химической и биологической ак-
тивности.
Основными типами соединений, входящих в состав живых орга-
низмов, являются: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды
(жиры и жироподобные вещества), вода, минеральные соли. Кро-
ме них в составе организмов присутствуют некоторые другие орга-
нические вещества: карбоновые кислоты, углеводороды, амины,
спирты, альдегиды. Есть вещества, характерные только для расти-
тельных тканей: эфирные масла, алкалоиды, дубильные вещества.
И, наконец, в отдельные группы должны быть выделены вещества,
присутствующие в тканях живых организмов, как правило, в не-
больших количествах, но играющие первостепенную роль в регуля-
ции всего обмена веществ: гормоны, ферменты, витамины, анти-
биотики, фитонциды и т. п. Их иногда объединяют в группу биоло-
гически активных соединений.
Серьезной ошибкой ряда биохимиков и цитологов было пред-
ставление о протоплазме живых клеток как о смеси (хотя и очень
сложной) перечисленных соединений. При этом все процессы, про-
текающие в живой клетке, сводились только к химическим и физико-
химическим явлениям. Это — типичное механистическое толкова-
ние биологических процессов, сводящее различия между живой и
неживой материей только к количественным характеристикам, от-
рицающее качественные различия. Протоплазма живых клеток —
не смесь множества веществ, а система с присущими только ей
закономерностями, качественными особенностями живой материи.
1.2. Основные особенности метаболических
процессов fl
Обмен веществ (метаболизм) живой клетки складывается в ос-
новном из двух потоков реакций — катаболических и анаболиче-
ских.
Катаболические пути (катаболизм) — это процессы деграда-
ции, диссимиляции. Сюда относятся различные реакции расщепле-
ния (гидролиз, фосфоролиз) и окисления. Крупные органические
молекулы расщепляются до простых веществ с одновременным вы-
делением содержащейся в них свободной химической энергии.
Энергия запасается организмом в форме АТФ и в ряде других
соединений, а затем используется на процессы жизнедеятельности
(см. рис. 7.8).
Анаболические пути (анаболизм) — процессы синтеза, ассими-
ляции. При этом из относительно простых молекул строятся слож-
ные органические соединения. Эти пути часто включают в себя
20
восстановительные реакции и осуществляются с затратой энергии.
Благодаря разной локализации ферментов катаболизма и ана-
болизма эти противоположные метаболические процессы протека-
ют в клетке одновременно. Их связывают центральные, или ам-
фиболические, процессы (рис. 1.1). Примером служит цикл три-
карбоновых кислот (см. разд. 6.9.5).
Рис. 1.1. Связь катаболических и анаболических путей:
Фн — ортофосфорная кислота, ФФН — пирофосфорная кислота
Тесная связь между анаболизмом и катаболизмом проявляется
на трех уровнях.
1. На уровне источников углерода: продукты катаболизма могут
быть исходными субстратами анаболических реакций.
2. На энергетическом уровне: в процессе катаболизма образу-
ются АТФ и другие высокоэнергетические соединения; анаболиче-
ские процессы протекают с их потреблением.
3. На уровне восстановительных эквивалентов: реакции катабо-
лизма являются в основном окислительными; процессы анаболиз-
ма, наоборот, потребляют восстановительные эквиваленты.
Во взаимосвязи процессов анаболизма и катаболизма проявля-
ется один из важнейших законов диалектического материализма —
единства и борьбы противоположностей как внутренний источник
развития (в данном случае — живой материи).
Основные биохимические реакции, их последовательность уди-
вительно сходны у всех живых форм. По-видимому, они возникли
на ранних этапах эволюции, и к тому моменту, когда началось ви-
дообразование, достигли совершенства. В особенности сходны
центральные метаболические пути.
21
В процессе метаболизма осуществляются четыре специфические
функции. 1. Извлечение энергии из окружающей среды (либо в
форме энергии органических веществ, либо в форме энергии сол-
нечного света). 2. Превращение экзогенных веществ в «строитель-
ные блоки», т. е. в предшественники биополимеров. 3. Сборка бел-
ков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и других кле-
точных компонентов из этих строительных блоков. 4. Разрушение
«устаревших» биомолекул, уже выполнивших в клетке свои
функции.
С чисто химической точки зрения, метаболизм представляет со-
бой совокупность огромного числа разнообразных реакций: окисле-
ния, восстановления, расщепления, объединения молекул, межмо-
лекулярного переноса групп и т. д. Специфичным для обмена ве-
ществ живого организма является скоординированность отдельных
реакций во времени и пространстве. Протоплазма клетки обладает
сложной внутренней организацией, структурой. Отдельные биохи-
мические процессы локализованы в определенных участках клетки,
органеллах, мембранных образованиях. Так, синтез белка проис-
ходит в рибосомах, получение энергии в легко используемой фор-
ме — в митохондриях, анаэробная фаза дыхания, гликолиз —
в цитоплазме, фотосинтез растений — в хлоропластах и т. д. Мно-
гочисленные мембраны как бы делят клетку на отделы, отсеки,
компартменты (от англ, compartment), поэтому разнообразные био-
химические реакции, зачастую противоположного характера, идут
в клетке одновременно, не мешая друг другу, вследствие простран-
ственного разделения — компартментализации. В этом и выража-
ется пространственная скоординированность биохимических ре-
акций.
Не менее важна их координация во времени. Игра любого ор-
кестра только тогда дает гармоническое сочетание звуков, приятное
для слуха, когда инструмент каждого оркестранта издает звуки в
точно определенное время, предусмотренное партитурой. Точно
так же и в клетке отдельные биохимические реакции протекают в
строго определенной временной последовательности, часто образуя
длинные цепи взаимосвязанных реакций. Например, гликолиз уг-
леводов протекает в 11 реакций, строго следующих одна за другой,
при этом каждая предыдущая создает условия для осуществления
следующей. Очень важно, что эта пространственная и временная
скоординированность, гармоничность биохимических реакций на-
правлены на достижение одной цели: самовозобновление, самосо-
хранение данной живой системы — организма, клетки. Это харак-
терно для любого живого организма, даже микроскопического.
На первый взгляд, возникает вопрос: не противоречит ли ска-
занное выше второму закону термодинамики, согласно которому
для самопроизвольно протекающих процессов характерно стремле-
ние к увеличению энтропии, т. е. неупорядоченности, хаотичности.
Нет, живые организмы также подчиняются этому закону. Они по-
требляют из окружающей среды энергию в форме питательных ве-
ществ, частично используют свободную энергию последних и воз-
22
вращают в окружающую среду энергию в форме тепла и других
бесполезных или малополезных для жизни форм энергии. В ре-
зультате этого энтропия среды увеличивается, а живые организмы
создают и поддерживают характерную для них упорядоченность.
Поглощая питательные вещества из внешней среды, живые ор-
ганизмы получают не только энергию, но и строительный материал;
конечные продукты обмена веществ выводятся в среду. Такие сис-
темы, в которых непрерывно происходит поступление и удаление
веществ, а также обмен со средой энергией, называются открытыми
системами. Их характерная особенность заключается в отсутствии
равновесия с внешней средой.
При термодинамическом равновесии системы все параметры по-
стоянны во времени, нет никаких стационарных потоков за счет
действия внешних источников. Энтропия термодинамического рав-
новесия максимальна, свободная энергия равна нулю. В отличие от
термодинамического равновесия в биосистемах существует стацио-
нарное состояние, при котором скорость переноса вещества и
энергии из среды в систему точно соответствует скорости переноса
вещества и энергии из системы. Один из ведущих современных спе-
циалистов в области биоэнергетики А. Ленинджер называет живую
клетку «неравновесной открытой системой, машиной для извлече-
ния из внешней среды свободной энергии; в результате чего про-
исходит возрастание энтропии среды». В понимании живой клетки
как открытой системы в стационарном состоянии отражается важ-
нейшее свойство всего живого — постоянный обмен веществ с ок-
ружающей средой.
Рассмотрение живого организма как открытой стационарной
системы хорошо объясняет явление гомеостаза — постоянства со-
става внутренней среды организма, устойчивость и стабильность
биохимических параметров. Например, содержание глюкозы в кро-
ви у здорового человека колеблется в достаточно узком интервале
(около 5 мМ), pH крови всегда равен 7,40 ±0,05 и т. д.
Живая клетка не только потребляет вещества, но и экскретиру-
ет продукты распада, является открытой системой. Между поступ-
лением питательных веществ в организм и выделением отработан-
ных продуктов существует сложная, часто разветвленная система
промежуточных реакций. Если скорости образования и распада
промежуточных продуктов равны, устанавливается стационарное
состояние. Но в окружающей среде содержание некоторых пита-
тельных веществ может резко увеличиться или уменьшиться, вслед-
ствие этого изменится скорость их поступления в клетку. Под влия-
нием различных факторов может увеличиваться или уменьшаться
скорость той или иной промежуточной реакции, скорость выведе-
ния веществ из клетки. В результате значительно изменяются ста-
ционарные концентрации компонентов системы.
Однако в живой клетке, организме есть многочисленные чувст-
вительные механизмы, которые «выявляют» сдвиги концентраций и
компенсируют их, возвращают к норме. При изменении условий
стационарного состояния в открытой системе развиваются процес-
23
сы, направленные на сохранение свойств системы, — динамическая
стабилизация стационарного состояния. В большинстве случаев эти
механизмы функционируют по принципу обратной связи. Так, при
снижении содержания глюкозы в крови (например, вследствие го-
лодания) происходит возбуждение определенного центра в голов-
ном мозгу, в результате чего начинает действовать сложный гормо-
нально-ферментативный механизм расщепления запасного углево-
да гликогена в печени до глюкозы, которая поступает в кровь. Как
только ее содержание в крови поднимается до нормы, соответствую-
щий центр головного мозга перестает возбуждаться, механизм рас-
щепления гликогена выключается. Это один из многочисленных
примеров функционирования живого организма как саморегули-
рующейся системы.
Таким образом, относительное постоянство биохимических пара-
метров живого организма не статическое, пассивное (подобно
устойчивости гранитной скалы или железобетонного моста), а
активное, динамическое. В организм непрерывно поступают веще-
ства из среды, они ассимилируются, из них образуются вещества
самого организма, вместе с тем постепенно «стареют» молекулы
ранее имевшихся в организме соединений, идут реакции катаболиз-
ма, диссимиляции, продукты расщепления удаляются. Все эти ре-
акции находятся под контролем генетического аппарата организма,
поэтому вновь образующиеся в нем вещества соответствуют приз-
накам наследственности.
За небольшие промежутки времени внешние признаки организ-
ма могут не измениться, в то время как его вещества существенно
обновятся. Методом меченых атомов установлено, например, что
половина всех белков обновляется за 80 дней, а полное обновле-
ние воды происходит за 30 дней. Виднейший английский исследова-
тель и прогрессивный общественный деятель Дж. Бернал1 писал:
«Молекулы в нашем теле и во всяком организме находятся в со-
стоянии непрерывного восстановления, и атомы протекают через
него почти непрерывным потоком. Весьма вероятно, что никто из
нас не сохранил больше чем несколько атомов, с которыми мы на-
чали свою жизнь и что, даже будучи взрослыми, мы, вероятно, ме-
няем большую часть материала нашего тела всего за несколько
месяцев». Коротко эту мысль так выразил великий диалектик
древней Греции Гераклит: «Наши тела текут как ручьи, вещество
в них возобновляется как вода в потоке». В постоянном обновлении
веществ живого организма проявляется диалектический закон
отрицания: новое отрицает старое, затем оно само становится ста-
рым и тоже отрицается новым.
Важнейшей особенностью всех биохимических реакций являет-
ся их большая скорость, обусловленная присутствием ферментов —
биологических катализаторов. Те же реакции вне организма при
участии химических катализаторов обладают скоростью на не-
1 Бернал Дж. Наука в истории общества. М., 1956, с. 483.
24
сколько порядков меньше; Ферменты как катализаторы значитель-
но более совершенны, чем химические катализаторы.
Для метаболических процессов характерны также ступенчатость
и сопряженность. Многие реакции в клетке идут обычно через ряд
промежуточных этапов, ступеней. Например, окисление углеводов
(клетчатка, крахмал и т. д.) в процессе сгорания вне организма
протекает одноэтапно — присоединяется О2 и сразу образуются ко-
нечные продукты окисления СО2 и Н2О.
В живом организме окисление углеводов в процессе дыхания до
СО2 и Н2О происходит ступенчато, более чем через 20 промежуточ-
ных реакций. Достаточно часто имеет место сопряженность отдель-
ных реакций, взаимозависимость друг от друга. Так, многие реак-
ции биосинтеза, будучи энергопотребляющими, сопряжены обычно
с экзэргоническими, в процессе которых свободная энергия выделя-
ется в легко используемой форме. Сопряженность хорошо выражена
и в многоэтапных цепных процессах, где продукты каждой преды-
дущей реакции являются исходными соединениями для последую-
щей.
В последние годы в литературе все больше появляется сведений
о жидкокристаллическом состоянии в водных средах многих важ-
нейших биополимеров (в том числе белков, нуклеиновых кислот,
липидов, полисахаридов), о жидкокристаллических свойствах
структур клетки (например, биомембран). Этот новый аспект био-
химических исследований позволяет более глубоко и полно понять
многие метаболические процессы, объяснить поведение тех или
иных веществ в процессе жизнедеятельности.
В жидкокристаллическом состоянии веществу одновременно
присущи свойства и жидкости (способность течь, образовывать
капли), и твердого тела (строгая упорядоченность кристалличе-
ской структуры). Вместе с тем у жидких кристаллов есть собст-
венные свойства, характерные только для них (способность обра-
зовывать монокристаллы во внешнем электромагнитном поле, край-
не большая оптическая активность и Др.)* Для понимания биохи-
мических явлений очень важна чрезвычайная чувствительность
жидких кристаллов ко многим внешним воздействиям. Жидкие
кристаллы, для которых характерна одно-или двумерная упорядо-
ченность, обладают способностью к самоорганизации, спонтанному
образованию упорядоченной структуры и ее воспроизведению. Это
представляет большой интерес при исследовании и объяснении
структурообразования в живых клетках.
Ни одна из перечисленных особенностей метаболических процес-
сов не может претендовать на то, что она является единственным
фактором, придающим системе свойство живого. Жизнь как ка-
чественно своеобразная, самая сложная форма движения материи
может быть понята и объяснена только с позиций совокупного рас-
смотрения всех особенностей этой формы существования белковых
тел с ее постоянным обменом веществ с окружающей средой.
38
1.3. Источники энергии для живых организмов,
высокоэнергетические соединения
1.3.1. Источники энергии и углерода для живых организмов.
Все живые организмы можно разделить на две большие группы в
зависимости от того, в какой химической форме они получают угле-
род из окружающей среды. Автотрофы (от греч. авто — само, тро-
фе — пища) — самостоятельно питающиеся — могут использовать
в качестве единственного источника углерода оксид углерода (IV)
СО2, из которого они способны образовывать все свои углеродсо-
держащие соединения. К автотрофам относятся растения, фотосин-
тезирующие и хемосинтезирующие бактерии. Процесс хемосинтеза,
т. е. ассимиляции СО2 за счет энергии, выделяемой при окислении
неорганических соединений, впервые открыт в конце прошлого сто-
летия С. Н. Виноградским.
Гетеротрофы (от греч. гетерос — другой, трофе — пища) долж-
ны получать углерод в виде готовых достаточно сложных органиче-
ских соединений (например, углеводов). Сюда относятся животные
и большинство микроорганизмов. Все гетеротрофные организмы
способны ассимилировать небольшие количества СО2. Однако при
этом он связывается путем карбоксилирования уже присутствую-
щих в клетке карбоновых кетокислот, т. е. гетеротрофный организм
нуждается в готовых органических соединениях.
Живые организмы можно также классифицировать по источни-
кам получения энергии. Для большой группы фототрофов непосред-
ственным энергетическим ресурсом является свет. Они используют
энергию солнечного света для образования высокоэнергетических
соединений, которые служат своеобразными аккумуляторами энер-
гии. Сюда относятся высшие растения, водоросли, фотосинтезирую-
щие бактерии.
Хемотрофы в качестве источника энергии используют окисли-
тельно-восстановительные реакции. Хемотрофами являются жи-
вотные, большая часть микроорганизмов. Этот способ получения
энергии свойствен и нефотосинтезирующим клеткам растений.
Как фототрофы, так и хемотрофы можно, в свою очередь, разделить
на группы в зависимости от того, какие вещества являются доно-
рами электронов в окислительно-восстановительных процессах.
У литотрофов таковыми служат неорганические соединения, у
органотрофов — органические. Таким образом, в зависимости от
используемых источников энергии и доноров электронов можно вы-
делить четыре основных типа организмов (табл. 1.2).
Хемотрофные организмы группируют и по виду акцепторов
электронов. В тех случаях, когда для окисления используется кис-
лород, имеет место аэробный, или дыхательный, тип энергетики.
При анаэробном типе энергетического обмена в роли окислителя
выступает не кислород, а ряд других веществ, т. е. другие акцепто-
ры электронов.
Многие организмы могут существовать как в аэробных, так и в
анаэробных условиях, В аэробных условиях они используют в ка-
26
Таблица 1.2. Классификация организмов в зависимости от используемых
источников энергии и доноров электронов
Типы организмов Источник энергии Доноры электроноь Конечные акцепторы электронов Примеры организмов
Фото ли то- трофы Свет Неорганические соединения (Н2О, H2S, S) — Зеленые клетки высших растений, синезеленые водоросли, цианобакте- рии , большинство пур- пурных и зеленых серо- бактерий
Фотооргано - трофы Свет Органические соединения — Несерные пурпурные бактерии, галобактерии
Хемолито- Окислитель- Неорганические О2, со2, Тионовые, сульфатвос-
трофы но-восстано- вительные реакции соединения (H?S. Н2, S, Fe2+, NH3) SO’- станавливакицие, водо- родные, железные, ме- танобразующие и денит- рифицирующие бактерии
Хемоорга- Окислитель- Органические О2 и орга- Все высшие животные,
нотрофы но-восстано- соединения нические большая часть бактерий,
вительные реакции (например, глюкоза) соединения грибы, нефотосинтези- рующие клетки растений
честве акцептора электронов кислород, т. е. осуществляют процесс
дыхания. В анаэробных условиях акцепторами электронов у них
служат органические вещества, происходит брожение. Такие орга-
низмы называют факультативными анаэробами. К ним относится
большинство органотрофных клеток (дрожжи, клетки высших орга-
низмов). При наличии в среде кислорода они предпочитают исполь-
зовать его. Анаэробы, не способные использовать кислород, назы-
ваются облигатными анаэробами, кислород для них ядовит. По-
скольку весь свободный кислород, содержащийся в атмосфере
Земли, образовался в результате процесса фотосинтеза, очевидно,
что анаэробный тип энергетики является более древним, чем аэроб-
ный. Таким образом, брожение — процесс более древний, чем ды-
хание.
1.3.2. Высокоэнергетические соединения. Высокоэнергетически-
ми соединениями являются АТФ и вещества, способные образовы-
вать АТФ в ферментативных реакциях переноса групп без участия
окислительных процессов. Такие соединения содержат в своей мо-
лекуле связи, при гидролизе которых высвобождается большое ко-
личество свободной энергии. Реакции протекают при различных ус-
ловиях, оказывающих влияние на величину изменения свободной
энергии. Поэтому в биохимии используют термин изменение стан-
дартной свободной энергии — AG°. Под ним понимают изменение
свободной энергии при стандартных условиях: давление 1 атм* 1,
исходные концентрации субстратов — 1 М, температура 25°С.
AG° при pH 7,0 обозначают AG0'. Величину AG0 применяют для
1 По международной системе единиц СИ давление измеряется в паскалях:
1 атм = 101,3 кПА. В биологии общепринято измерение давления в атмосферах.
27
количественной характеристики как метаболических цепей, так и
отдельных химических реакций; как и в термодинамике, знаком
«минус» обозначается отдача энергии, а знаком «плюс» — ее при-
нятие. Если величина Л6° данной реакции имеет отрицательное
значение, то реакция может происходить самопроизвольно с выде-
лением свободной энергии — экзергоническая реакция. Если
Дб° — положительная величина, то реакция протекает с поглоще-
нием энергии (эндергоническая реакция). Среди реакций обмена
веществ известны полностью эндергонические. Они зависят от
притока свободной энергии извне (например, световой) или от дру-
гих экзергонических реакций обмена веществ (например, окисле-
ния). В качестве посредника между процессами, связанными с ге-
нерированием и использованием энергии, функционирует система
высокоэнергетических соединений. Величина стандартной свобод-
ной энергии гидролиза высокоэнергетических связей превышает
—21 кДж-моль-1 (табл. 1.3), такие связи обозначают знаком
Таблица 1.3. Стандартная свободная энергия гидролиза некоторых
соединений (в кДж моль-1)
Соединение Продукты Д(7° (pH 7.0)
Фосфоенолпируват3- Пируват- + НРС>4~ —61,9
1,3-Дифосфоглицерат4" З-Фосфоглицерат3- + НРО^ + Н+ -54,5
Креатинфосфат“ Креатин* -J-HPO^- -43,1
Ацетил фосфат2" Ацетат- + НРО^- + Н+ —47,7
Фосфоаргинин“ Аргинин++ НРО^- —38,1
АТФ4" АДФ3- + НРО|“ + Н+ —34,5
Глюкозо-1 -фосфат2" Глюкоза + НРО|~" —20,9
a-D-Г люкозо-6-фосфат2- а-D-Глюкоза + НРО^“ —13,8
Гл ицерофосфат2- Глицерин + НРО^“ —9,2
Высокоэнергетические соединения имеют, как правило, в своем
составе высокоэнергетическую фосфатную группу и могут переда-
вать ее другим веществам. Многочисленные эксперименты показа-
те-
ли, что переносится не фосфатная группа -О—Р==О , а фосфо-
Го-
во-
рильная —Р=о . Хотя выражение «перенос фосфатных групп»
Го-
общепринято, правильнее говорить о переносе фосфорильных
групп. Высокоэнергетические фосфорильные группы обозначают
~Ф или ~Р.
23
Различают пять основных типов высокоэнергетических соедине-
ний: рибонуклеозид-5'-дифосфаты и трифосфаты (АТФ, ГТФ,
УТФ, ЦТФ, АДФ и др.), карбоксилфосфаты (например, ацетил-
фосфат), ацилтиоловые эфиры (например, ацетилкоэнзим А), фос-
форамидные соединения (креатинфосфат), енолфосфаты (фосфо-
енолпировиноградная кислота).
В центре энергетического обмена клетки стоит аденилатная
система: АТФ и продукты ее гидролиза — АДФ, АМФ, Фш
ФФн. Она подобна аккумулятору, который заряжается энергией от
разных генераторов и снабжает ею множество машин и аппаратов
(в живом организме им соответствуют органы, ткани, биохимиче-
ские реакции). В этом плане «зарядка аккумулятора» состоит в
синтезе АТФ:
АДФ + Фн АТФ + Н2О
а «разрядка аккумулятора» сопровождается гидролизом АТФ:
АТФ + Н2О АДФ + Фн
где и £2 — ферменты, катализирующие соответствующие реак-
ции.
/ОН
В ходе гидролиза АТФ фосфорильная группа —Р=о перено-
^он
сится на гидроксид-ион, при этом стандартная свободная энергия
гидролиза при pH 7,0 составляет —34,5 кДж-моль"1. Для гидроли-
за концевой фосфорильной группы АДФ характерна близкая вели-
чина. Отщепление фосфорильной группы от АМФ характеризуется
более низкой величиной —9,6 кДж-моль-1. Следовательно, высоко-
энергетическими в молекуле АТФ являются лишь две последние
фосфоангидридные связи. Однако следует учитывать, что в кон-
29
кретных реакциях величина выделившейся энергии зависит от тем-
пературы, pH, концентраций субстратов и ионов магния.
Основная часть адениловых нуклеотидов присутствует в клетке
в виде комплексов с магнием МдАТФ2” и М§АДФ”. Именно в этой
форме они участвуют в большинстве ферментативных реакций, где
играют роль доноров фосфорильных групп и энергии. Некоторое
количество АТФ и АДФ присутствует в клетке в виде свободных
анионов. При этом АТФ содержит четыре ОН-группы, способные
к ионизации, т. е. имеет максимальный заряд АТФ4”, а АДФ —
три ОН-группы, заряд — АДФ3”.
В молекуле АТФ заряды располагаются близко друг к другу,
между ними возникает сильное отталкивание. Оно уменьшается
при отщеплении концевой фосфорильной группы. Продукты реак-
ции — НРО42“ и АДФ3- не могут вновь воссоединиться, так как их
сближению препятствует отталкивание одноименных зарядов. Это
и обусловливает большую отрицательную величину стандартной
свободной энергии гидролиза АТФ.
Следует также иметь в виду, что в концевой фосфоангидридной
связи молекулы АТФ атомы фосфора и кислорода окружает боль-
шое число электронов. Они конкурируют друг с другом за энергети-
чески наиболее выгодные орбитали. Конкуренция не позволяет
всем электронам занять низкие энергетические уровни. В продуктах
гидролиза АТФ—АДФ3” и НРО42- электроны занимают низкие
энергетические уровни, что стабилизирует продукты, придает всей
реакции необратимость. Этот фактор также обусловливает боль-
шую отрицательную величину AG° гидролиза АТФ.
АТФ по величине свободной энергии гидролиза занимает проме-
жуточное положение между высокоэнергетическими и низкоэнерге-
тическими фосфатсодержащими соединениями. В этом состоит
уникальность АТФ, она служит посредником-переносчиком фосфо-
рильных групп и энергии от высокоэнергетических соединений
(в табл. 1.3 расположены выше АТФ) к низкоэнергетическим при
синтезе последних (в табл. 1.3 расположены ниже АТФ).
В клетке никогда не происходит прямого переноса фосфориль-
ных групп от высокоэнергетических соединений к низкоэнергетиче-
ским, практически все реакции переноса фосфорильных групп в
клетке происходят с участием системы АТФ—АДФ в качестве по-
средника-переносчика. Другие нуклеозид-5'-трифосфаты (УТФ,
ГТФ, ЦТФ) тоже являются высокоэнергетическими соединениями,
но не играют в клетке такой универсальной роли, как АТФ, выпол-
няют как доноры энергии узкоспециализированные функции: УТФ
служит поставщиком фосфорила и энергии при синтезе полисаха-
ридов, ЦТФ — при синтезе липидов, ГТФ избирательно ускоряет
образование пептидной связи при биосинтезе белков.
Перенос фосфорильных групп и энергии с АТФ на другие соеди-
нения осуществляют ферменты, имеющие тривиальное, краткое
рабочее название — киназы (например, гексокиназа, пируваткина-
за; от греч. кинео — двигаю, перемещаю). Следовательно, кина-
за означает активатор, так как образование фосфорного эфира лю-
30
бого соединения приводит к активации этого соединения, увеличе-
нию его реакционной способности.
Все живые организмы улавливают энергию внешних энергетиче-
ских ресурсов с помощью систем аккумуляции энергии и преобра-
зуют ее в энергию высокоэнергетических соединений. Системы ак-
кумуляции энергии делятся на два типа, отличающиеся принципа-
ми энергетического сопряжения. Первый тип — реакции фосфори-
лирования, не требующие нерастворимых мембранных структур,—
субстратное (или немембранное) фосфорилирование. Образование
АТФ при этом происходит путем переноса активного фосфорила с
продукта окисления субстрата на АДФ. Например, образование
АТФ при гликолизе, брожении. Второй тип — реакции фосфорили-
рования, протекающие в сопрягающих мембранах, — мембранное
фосфорилирование. Образование АТФ происходит путем фосфори-
лирования АДФ неорганическим фосфатом за счет энергии элект-
рохимического потенциала ионов водорода на мембране. Напри-
мер, образование АТФ при фотосинтезе, или в аэробной фазе ды-
хания. Мембранное фосфорилирование протекает во внутренней
мембране митохондрий, в мембранах тилакоидов хлоропластов,
в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, в цитоплазматиче-
ской мембране бактерий. Эти мембраны, несущие ферменты пере-
носа электронов и сопряженного с ним фосфорилирования, называ-
ются сопрягающими мембранами.
ГЛАВА 2
БЕЛКИ
2.1. Общая характеристика
Одно из принципиальных отличий определения жизни, данно-
го Ф. Энгельсом, от ранее существовавших, идеалистических, за-
ключается в том, что в нем подчеркивается материальность жизни,
указывается материальный носитель — белок. Энгельс называет
белок «...исключительным самостоятельным носителем жизни»1.
На первостепенное значение белков в жизнедеятельности организ-
мов указывали и выдающиеся русские биологи-материалисты:
И. М. Сеченов, А. Я. Данилевский, К. А. Тимирязев, И. П. Павлов
и др.
В настоящее время установлено, что в живой природе не суще-
ствует небелковых организмов. При этом термин «белки» следует
понимать в широком смысле, включая сюда и сложные белки, в
частности нуклеопротеины — комплексы белков с нуклеиновыми
кислотами. Тогда становятся совершенно беспочвенными, схола-
стичными дискуссии на тему — что важнее для жизни, белки или
нуклеиновые кислоты.
Белки — это высокомолекулярные полимерные соединения, об-
разующие при гидролизе аминокислоты. Иногда их называют про-
т винами (от греч. протос — первый, важнейший). Для живых орга-
низмов они действительно являются первенствующими и по содер-
жанию, и, особенно, по значению. В организме животных белков
содержится до 40—50% и более на сухую массу, меньше у расте-
ний — до 20—35%. Разнообразны и очень важны функции белков.
Строительная, структурная функция. Белки образуют основу
протоплазмы любой живой клетки, в комплексе с липидами они
являются основным структурным материалом всех клеточных мем-
бран, всех органелл.
Каталитическая функция. Все ферменты являются белками,
простыми или сложными. Таким образом, практически все биохими-
ческие реакции катализируются белками-ферментами.
Двигательная функция. Любые формы движения в живой при-
роде (работа мышц, движение ресничек и жгутиков у простейших,
движение протоплазмы в клетке и т. д.) осуществляются белко-
выми структурами клеток.
1 Маркс К., Энгельс Ф. Соч. 2-е изд., т. 20, с. 514.
32
Транспортная функция. Белок крови гемоглобин транспортиру-
ет кислород от легких к тканям и органам. Перенос жирных кислот
по организму происходит с участием другого белка крови — аль-
бумина. Есть белки крови, транспортирующие липиды, железо, сте-
роидные гормоны. Перенос многих веществ через клеточные мем-
браны осуществляют особые белки-переносчики.
Защитная функция. Важнейшие факторы иммунитета — анти-
тела и система комплемента — являются белками. Процесс свер-
тывания крови, защищающий организм от ее чрезмерной потери,
основан на превращениях белка крови — фибриногена. Эти пре-
вращения осуществляются с участием белка тромбина и большого
числа других факторов свертывания, тоже являющихся белками.
Внутренние стенки пищевода, желудка выстланы защитным слоем
слизистых белков — муцинов. Токсины многих видов организмов,
защищающих их в борьбе за существование, также являются бел-
ками (змеиные яды, бактериальные токсины). Основу кожи, пре-
дохраняющей тело животных от многих внешних воздействий, со-
ставляет белок коллаген. Кератин — белок волосяного защитного
покрова.
Гормональная функция. Ряд гормонов по своему строению от-
носится к белкам (инсулин) или пептидам (адренокортикотропный
гормон, окситоцин, вазопрессин и др.).
Запасная функция. Способны образовывать запасные отложе-
ния овальбумин яиц, казеин молока, многие белки семян растений.
^Опорная функция. Сухожилия, суставные сочленения, кости ске-
летаТадйыта образованы в значительной мере белками.
рецепторная функция. Многие белки (особенно гликопротеины,
л'Йтйны) осуществляют важнейшую функцию избирательного уз-
навания и присоединения отдельных веществ.
Перечисленные функции белков не исчерпывают все их многооб-
разие. Так, регуляторное действие белков не ограничивается только
каталитическим и гормональным. Известна очень важная группа
белков-регуляторов активности генома. Некоторые полипептиды
играют роль ингибиторов ферментов и таким путем регулируют их
действие. Большой интерес представляют исследования так назы-
ваемых мозгоспецифических белков (МСБ), выполненные в послед-
ние годы. Тонкие иммунохимические методы их анализа в спинно-
мозговой жидкости и крови позволили установить наличие корре-
ляции между содержанием отдельных групп МСБ и поведением,
некоторыми сторонами психики.
Белки имеют и большое народнохозяйственное значение. Оно
определяется прежде всего хтем, что белки представляют собой
важнейшие компоненты пищи человека и сельскохозяйственных
животных. Массовые эпидемии, небольшая средняя продолжитель-
ность жизни населения некоторых бывших колониальных стран
связаны нередко с хроническим белковым голоданием (особенно
недостатком животных белков). От содержания белков в корме
существенно зависит продуктивность сельскохозяйственных живот-
ных. Технология многих производств основана на переработке бел-
2—937
33
ков, изменении их свойств: в кожевенной промышленности, при
выделке мехов, натурального шелка. В хлебопекарном производ-
стве важнейшую роль играют свойства белков муки.
Первостепенная роль белков в жизнедеятельности всех организ-
мов, их большое народнохозяйственное значение объясняют тот
громадный интерес, который проявляется к ним в биохимии, опре-
деляют центральное место белков в биохимических исследованиях.
Рассмотрение строения и свойств белков удобнее начинать с
характеристики их структурных элементов — аминокислот.
2.2. Аминокислоты
2.2.1. Определение и классификация. Аминокислоты можно
рассматривать как производные кар^рновых кислот, в которых
один из водородов углеродной цепи^зШйгещен на группу NH2.
У большинства природных аминокислот аминогруппа находится
в a-положении по отношению к карбоксилу:
NH2
R—С—СООН
I
н
Значительно реже в живых организмах встречаются аминокислоты
с р- или у-положением аминогрупп ((3-аминопропионовая,
у-аминомасляная).
В зависимости от характера боковых цепей (R-группы) амино-
кислоты делят на ^ациклические (алифатические) и циклические
(гомо- и гетероциклические).
По числу аминных и карбоксильных групп аминокислоты разде-
ляются на: 1) моноаминомонокарбоновые (глицин, аланин, валин,
лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, метионин, триптофан,
тирозин, фенилаланин); 2) диаминомонокарбоновые (лизин, арги-
нин, цитруллин); 3) моноаминодикарбоновые (аспарагиновая и
глутаминовая кислоты); 4) диаминодикарбоновые (цистин). По ха-
рактеру заряженности боковых радикалов, их полярности амино-
кислоты классифицируют на: 1) неполярные, гидрофобные (гли-
цин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, три-
птофан, метионин); 2) полярные, но незаряженные (серин, треонин,
аспарагин, глутамин); 3) полярные с отрицательным (аспарагино-
вая и глутаминовая кислоты, цистеин, тирозин) или положительным
(лизин, аягинин. гистидин) зарядами.
2.2.2. Изомерия, общие понятиям Изомеры — соединения, имею-
щие одинаковую молекулярную формулу, но отличающиеся распо-
ложением атомов в пространстве, природой и последовательностью
связей между ними.
1 Материал этого раздела излагается в соответствии с номенклатурой орга-
нической химии, предложенной Международной организацией чистой и при-
кладной химии «IUPAC. Nomenclature of Organic Chemistry». Oxford—New-
York—Toronto—Sydney—Paris—Frankfurt., 1979.
34
Существует два вида изомеров: структурные изомеры и стерео-
изомеры.
Структурные изомеры (новые правила международной номен-
клатуры рекомендуют их называть конститутивными) имеют раз-
личную последовательность связывания атомов. Например, лейцин
и изолейцин. Молекулярная формула их одинакова — C6Hi3O2, а
структурные формулы отличаются:
CHS СН3 СН3
\н \н2 СН3
СНа \н
I I
hcnh2 hcnh»
I I
COOH COOH
Лейцин „ , Изолейцин
Стереоизомеры — изомеры с одинаковой последовательностью
соединения атомов, но с различным их расположением в простран-
стве. Например, стереоизомеры аланина:
СН3 СН3
Н—С—NHa H2N—С—Н
соон соон
В прошлом стереоизомерия включала оптическую изомерию и
геометрическую изомерию. В настоящее время употребление этих
терминов не рекомендуется: известно, например, что оптическая
активность в зависимости от растворителя может меняться не
только по величине, но и по знаку.
Если два стереоизомера относятся друг к другу как предмет и
его зеркальное изображение, они называются энантиомерами. Сте-
реоизомеры, не относящиеся друг к другу как предмет и его зер-
кальное изображение, называют диастереомерами. Диастереомера-
ми являются, в частности, и цис-транс-изомеры, если они отлича-
ются только расположением атомов относительно плоскости, про-
ходящей через молекулу: f Ф
Н3С\ /СН3.
Транс-форк^а
Цис-форма
Цис-транс-изомерия возможна только в структурах, которым при-
дает жесткость двойная связь или цикл,
В целом изомеры можно классифицировать следующим обра-
зом:
35
Изомеры
I I
Структурные Стереоизомеры
(конститутивные) "1
I }
Диастереомеры Энантиомеры
Цис-,транс- Обычные
Симметричность любой молекулы может быть охарактеризована
по присутствию или отсутствию основных элементов симметрии,
которыми являются: плоскость симметрии, центр симметрии и ось
симметрии. Если молекула не имеет ни центра симметрии, ни плос-
кости симметрии, она хиральна, существует в виде пары энантио-
меров.
Хиральность, следовательно, — это свойство соединении суще-
ствовать в виде пары не совместимых между собой зеркальных
изображений (от англ, chirality — принадлежность руке).
Хиральные соединения иначе называются дисимметричными. Те
хиральные молекулы, у которых нет оси симметрии, называют
асимметричными. Таким образом, асимметричная молекула всегда
хиральна, но не всякая хиральная молекула асимметрична. Моле-
кулы, не имеющие энантиомеров, называют ахиральными. Хираль-
ные молекулы содержат атом, вокруг которого размещены четыре
разных атома или функциональные группы. Он называется хираль-
ным атомом или хиральным центром. Кроме углерода хиральными
могут быть атомы Р, N, Si и др. Если в соединении содержится п
хиральных атомов, оно может существовать в количестве 2П сте-
реоизомеров.
Ранее употреблявшийся термин асимметричный углерод в на-
стоящее время не рекомендуется, так как хиральность и асиммет-
ричность не являются синонимами.
Хиральные соединения обладают оптической активностью^ они
способны вращать плоскость поляризованного света. Величину и
направление вращения плоскости поляризации измеряют прибором
поляриметром. Энантиомеры проявляют одинаковые химические и
физические свойства, за исключением одного — направления вра-
щения плоскости поляризованного света. Энантиомер, вращающий
плоскость поляризации по часовой стрелке, называется правовра-
щающим (его обозначают знаком « + »), против часовой стрелки —
левовращающим (обозначают «—»).
Эквимолярная смесь (т. е. смесь равного количества молекул)
правого и левого энантиомеров называется рацемической (раце-
мат). Она не обладает оптической активностью, так как действия
36
правовращающих и левовращающих молекул взаимно компен-
сируются. Для характеристики оптически активных соединений ус-
тановлена константа — удельное оптическое вращение* под кото-
рым понимают величину вращения в угловых градусах при кон-
центрации вещества 1 г/мл . и толщине слоя измерения 1 дм,
Удельное вращение обозначают знаком [a]L где t — температура,
при которой проводили измерение, a D — длина волны света (как
правило, используют D — линию натрия, равную 546 нм).
Существуют две системы, характеризующие расположение ато-
мов и группировок вокруг хиральных атомов. Одна из них, доста-
точно давно принятая и более широко распространенная (особенно
для характеристики аминокислот и сахаров), имеет в основе срав-
нение конфигурации описываемого хирального соединения с глице-
ральдегидом (для моносахаридов и аминокислот) или с серином
(для аминокислот). Этот относительный принцип обозначения форм
сахаров и аминокислот был введен Э. Фишером (1898). Использо-
вать при этом глицеральдегид в качестве «ключа» предложил
М. А. Розанов в 1906 г. Та форма глицеральдегида, у которой на
проекционном изображении ОН-группа расположена справа от оси
углеродных атомов, была обозначена D-формой, а при нахожде-
нии ОН — слева от углеродной оси — L-формой:
сн2он СН2ОН
. D-Глицеральдегид L -Г лицераль дегид
Чтобы определить, к D- или L-форме относится данный энантиомер
аминокислоты, сравнивают конфигурацию его хирального центра
с энантиомерами глицеральдегида. Если аминогруппа расположена
справа от оси СООН—R, это D-аминокислота, при нахождении
аминогруппы слева от оси СООН—R — L-форма.
Для обозначения энантиомеров моносахаридов сравнивают с
глицеральдегидом расположение ОН-группы у последнего хираль-
ного атома, т. е. наиболее удаленного от альдегидной или кето-
группы. Иногда к буквам D и L добавляют индексы s или g, кото-
рые указывают, серин (s) или глицерин (g) использованы в каче-
стве «ключа».
В 1951 г. был найден способ определения абсолютной конфигу-
рации, и в связи с этим предложена новая система описания хи-
ральных центров без сравнения с каким-либо «ключевым» соедине-
нием — RS-система. Она нами не рассматривается, поскольку при
определении конфигурации аминокислот и сахаров обычно исполь-
зуют D, L-систему.
37
Одним из частных случаев стереоизомерии является конформа-
ция. В правилах международной химической номенклатуры (1978)
указывается, что пока нет общепринятого определения термина
конформация. Наиболее часто употребляют следующее. Конфор-
мациями молекулы называют различные расположения ее атомов
в пространстве, возникающие в результате вращения вокруг оди-
нарных (о) связей.
В последние годы некоторые авторы распространяют это опре-
деление на двойные и другие связи. При наличии цикла под кон-
формациями понимают формы молекулы, возникшие в результате
изгибов плоскости цикла, изменения взаимного положения частей
цикла. Молекулы, отличающиеся конформацией, называются кон-
формационными изомерами или конформерами. В приложении к
молекулам белков термин конформация характеризует простран-
ственную структуру молекулы в целом.
2.2.3. Стереохимия аминокислот. Все аминокислоты, за исклю-
чением глицина, оптически активны и могут существовать в виде
пары энантиомеров — D и L, поскольку углеродный атом, у кото-
рого водород замещен на группу NH2, Является хиральным. На-
правление вращения плоскости поляризации обозначают знаком
« + » или «—». Например, D(—)-аланин и L( + ) -аланин. Необходи-
мо указывать условия, при которых проводили измерение: природа
растворителя, реакция среды, наличие в растворе солей. Так,
L-гистидин в водном растворе обнаруживает удельное вращение,
равное —39,3°, а в солянокислом растворе [а]о = +11,1°. Знак и
величина оптического вращения зависят также от природы боковой
цепи аминокислоты (R-rpynna).
Живые организмы различают L- и D-формы аминокислот. Пока-
зано, что дрожжи и плесневый гриб Penicillium glaucum использу-
ют L-глутаминовую кислоту и L-лейцин, но не усваивают D-формы
этих аминокислот. Большинство D-изомеров обладают сладким
вкусом, а L-формы аминокислот безвкусные или горькие.
В составе белков обнаруживаются только L-аминокислоты. Ес-
ли гидролиз белков проводят в мягких условиях, то аминокислоты
сохраняют свою оптическую активность. В процессе химического
синтеза аминокислот или при их кипячении в присутствии сильных
оснований происходит рацемация и образуется О,Ь-смесь амино-
кислот, не обладающая оптической активностью.
D-Формы аминокислот в природе встречаются редко. Они вхо-
дят, например, в состав клеточных стенок некоторых микроорганиз-
мов (см. разд. 6.4.4), являются компонентом пептидных антибиоти-
ков (грамицидин, актиномицин D); очень редко обнаруживаются
у растений.
2.2.4. Диссоциация аминокислот. Все а-аминокислоты существу-
ют в водных растворах преимущественно в виде биполярных ионов
или цвиттерионов с диссоциированной карбоксильной группой и
протонированной аминогруппой;
38
nh2 +nh3
I I
R—С—COOH R—C—COO’
I I
H H
Биполярность структур молекул аминокислот обусловливает це-
лый ряд их свойств, в частности хорошую растворимость большин-
ства аминокислот в воде и сравнительно низкую в органических
растворителях, большие дипольные моменты их молекул, высокие
значения диэлектрических постоянных и температуры плавления.
В зависимости от pH среды аминокислоты могут быть в форме
'анионов, катионов, электронейтральных биполярных ионов или в
виде смеси этих форм с доминированием одной из них. В сильно-
кислых растворах аминокислоты присутствуют в виде положитель-
ных ионов, а в щелочных — в виде отрицательных ионов, т. е. ами-
нокислоты представляют собой амфотерные электролиты:
+NH3
R—С—СОО-
I
н
NHo
+он- |
---->• R—С—COO’ + Н2О
н
+NH3
I +Н+
R—С—COO’ ----->
I
н
+NH3
I
R—С—СООН .
Н
В соответствии со своей амфотерной природой аминокислоты в
зависимости от состава раствора могут образовывать различные со-
ли, реагируя как с кислотами, так и с основаниями:
+NH3C1- NH2
I I
R—C—COOH R—C—COONa
I I
H H
Солянокислая соль Натриевая соль
Диссоциация аминокислот может быть хорошо понята с пози-
ций теории кислот и оснований Бренстеда, согласно которой кис-
лотой называют все те вещества, которые способны отдать протон,
а основанием — все те, что способны его связать. С этой точки
зрения группы СООН и H3N+ следует считать кислотами, а груп-
пы СОО- и NH2 — основаниями.
Константы диссоциации карбоксильной (Кт)" И“ямниной~ групп
(Кг) или их отрицательные логарифмы р Кг) ^численно рай-
оны концентрации "водородных ионов_(значения рНХ-jipnjiofqpoH
о7но1нё11йё^диссбЩ1ированных форм к нёдиссоциированным равно
едипице, т: е. 5G%‘ аминокислоты находится в виде диполей, а
50%—в виде катионов и анионов.
Величины pKi и рКг можно определить с помощью электромет-
рического титрования. Кривая титрования аланина соляной кисло-
той и гидроксидом натрия представлена на рис. 2.1. Как видно из
рисунка, титрование аланина (и других моноаминомонокарбоно-
вых кислот) носит двухстадийный характер, вследствие чего кри-
вая титрования состоит из двух четко различающихся ветвей. Точ-
ки перегиба этих
2,0.
0,5 1,0 1,5
Эквиваленты ОН~
Рис. 2.1. Кривая титрования аланина (в рам-
ках указаны виды ионов, преобладающих в
точках перегиба кривой)
ветвей соответствуют значениям pKi и
рКэ и равны соответствен-
ной,34 и 9,69. При значе*
ПШй pH ниже pKi все
нейтральные аминокисло-
ты несут положительный
заряд, а при pH выше.
рКг — отрицательный. В
точке перехода между
ветвями молекула ами-
нокислоты не несет заря-
да, так как число отрица-
тельных и положительных
ионов одинаково.
Значение pH, при кото-
ром суммарный заряд
аминокислоты ^рЖен'"ну-
лю, 'тг-е. -молекула элект-
рбнеитральна, _называет.-
ся —хшь—
кой ИЭТ__Хд1). При этом
рТГнеПпроисходит переме-
щения аминокислоты в
электрическом поле. pH
раствора чистой амино-
кислоты в воде называет-
сяизоионной точкой. Изоэлектрические ^ГизсшШп^^
кислоты в разбавленных растворах приблизительно совпадают.
Изоэлектрическую точку для моноаминомонокарбоновых кислот
можно найти путем деления суммы рК и рК? на 2, В нашем случае:
Д2^34+9,б9)/2 — £.02. В изоэлектрической точке аминокислоты не
проявляют буферных свойств, их буферная емкость максимальна
при pH, равных значениям рК кислотных групп. Если известны
величины pKi и рКг, то можно рассчитать соотношение различных
видов ионов для любого значения pH.
Кривые титрования аминокислот с ионизирующимися R-rpyn-
пами (например, гистидин, лизин, глутаминовая кислота) имеют
более сложный характер, поскольку кривые, описывающие диссо-
циацию R-групп, накладываются на кривые диссоциации «-карбок-
сильных и а-аминогрупп. Диссоциация боковых R-групп идет сле-
дующим образом:
40
Имидазольная
HN^ .NH
Гуанидиновая H2N—С—NH—R + Н+
NH
H2N—С—NH—R
II j
nh2
R—S" + Н+ ~ R—SH
Г идроксил
тирозина
С ульф гидрильная
Величины рК диссоциирующих группировок некоторых амино-
кислот приведены в табл. 2.1.
Таблица 2.1. Значения рК диссоциирующих групп некоторых аминокислот
(при +25 С)
Аминокислота РК» РК4 Название R-группы и рК3
Алзнин 2,34 9,69 -
Лейцин 2,19 9,60 —
Аспарагиновая 1,88 9,60 ₽-Карбоксильная 3,65
Глутаминовая 2,19 9,67 7-Карбоксильная 3,22
Гистидин 1,82 9,17 Имидазольная 6,00
Лизин 2,18 8,95 е-Аминогруппа 10,53
Аргинин 2,17 9,04 Гуанидиновая 12,48
Тирозин 2,20 9,11. ФЬнольный гидроксил 10,07
Цистеин 1,96 10,28 Сульфгидрильная 8,18
Сравнение величин рК диссоциирующих групп разных аминокислот
позволяет заключить, что у большинства аминокислот достаточно
близки значения как рК а-СООН групп (2,1—2,3), так и рК
а-МНз- групп (9,1—9,6). Карбоксильные группы моноаминомоно-
карбоновых кислот имеют более сильную кислотность, чем карбок-
силы соответствующих алифатических кислот (положительно заря-
женные «-аминогруппы способствуют отталкиванию Н+ карбокси-
ла). Например, у аланина pKi=2,34, а у соответствующей ему про-
пионовой кислоты pKi = 4,85. Аминогруппа лизина и гуанидиновая
группа аргинина характеризуются сильно выраженными основны-
ми свойствами, при pH 7 их суммарный заряд положителен. Гидрок-
сильная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина име-
ют слабо выраженные кислотные свойства.
2.2.5. Спектры поглощения аминокислот. Ни одна из двадцати
аминокислот, входящих в состав белков, не поглощает свет в види-
мой части спектра, а только в дальней ультрафиолетовой области
(<220 нм). Тирозину, фенилаланину и особенно триптофану свойст-
венно заметное поглощение в ультрафиолетовой области спектра
(260—280 нм). Цистин обладает слабым поглощением при 240 нм
вследствие наличия в нем дисульфидной группы.
2.2.6. Растворимость. За некоторым исключением, аминокислоты
хорошо растворимы в воде. С увеличением углеводородного боко-
вого радикала растворимость в воде падает, а в спирте возрастает
(рис. 2.2).
2.2.7 Химические свойства аминокислот. Одной из наиболее ха-
рактерных реакций а-аминогруппы является ее взаимодействие с
Аминокислоты Глицин
В Н—
Аланин
СН3—
Валин
СН3\
СП3Х
сн—
Лейцин
СН3^
/СН—СН2—
СН<
Растворимость
в воде
растворимость
в спирте
Рис. 2.2. Растворимость аминокислот
ином. Эта реакция может быть использована для количе-
ственного определения аминокислот, содержащихся в растворе в
очень небольших концентрациях. При pH выше 5 реакция протекает
в две стадии. В 1-й стадии образуется восстановленный нингидрин
за счет окислительного дезаминирования аминокислоты. Одновре-
менно происходит и ее декарбоксилирование.
нингидрин
нингидрин
На 2-й стадии реакции образовавшийся аммиак реагирует с экви-
молярными количествами окисленного и восстановленного нингид-
рина, образуя сине-фиолетовый продукт (пурпур Руэманна) с мак-
симумом поглощения при 580 нм, интенсивность окраски которого
пропорциональна количеству аминокислоты.
Пурпур Руэманна
Пролин и оксипролин, содержащие замещенные а-аминогруппы,
образуют с нингидрином производные, окрашенные в желтый цвет
(максимум поглощения при 440 нм), и не образуют аммиака.
Реакция с нингидрином не является специфической, ее дают
многие другие соединения, содержащие аминогруппы, в том числе
белки, аммиак, с тем лишь отличием, что при этом не выделяется
СО2. Образование СО2 специфично для а-аминокарбоновых кислот.
Эту реакцию используют в хроматографии для выявления амино-
кислот\Их количественное определение в автоматических анализа-
торах производят путем измерения окраски, возникающей при взаи-
модействии последовательно выделяющихся с колонки аминокис-
лот с нингидрином.
Благодаря наличию аминогруппы аминокислоты реагируют так-
же с азотистой кислотой (1) и с формальдегидом (2).
nh2 он
I I
R—сн—соон + HNO2 R-СН-СООН + N21 + Н2О (1)
NH2 N—(СН2ОН)2
R—СН—СООН + 2H—С—О -+ R— СН—СОО“ + Н+ (2)
I
Н
Данные реакции применяются для количественного определения
аминокислот (метод Ван-Слайка — по измерению объема выделив-
шегося газообразного азота, и формольный — путем титрования
щелочью освободившегося после добавления формальдегида про-
тона) .
Очень важными реакциями на а-аминогруппы являются реакция
Сенгера с 1-фтор-2,4-динитробензолом и реакция Эдмана с фенил-
изотиоцианатом. Они представляют исключительную ценность для
идентификации N-концевых аминокислот полипептидных цепей
(см. разд. 2.4.2).
Интересной и важной является реакция образования амидов ас-
парагиновой и глутаминовой кислот. В природе эти реакции идут
обычно с использованием энергии АТФ:
NH2
| Аспарагинсин-
НООС—СН2—СН—СООН + NH3 + АТФ -------------->
тетаза
NH2
-> H2N—СО—СН2—СН-СООН + Н2О + АДФ + Н3РО4
nh2
| Глутамин-
НООС—СН2—СН2—СН—СООН + NH3 + АТФ---------------
синтетаза
NH2
->h2n—со—сна-сн2-сн-соон + НаО 4- АДФ + Н3РО4
43
При декарбоксилировании аминокислот образуются амины:
nh2
| Декарбоксилазы
R—СН—СООН-----------------> СО2 + R—СН2—NH2
аминокислот
Амины обычно существуют в виде жидкости с резким запахом и
щелочной реакцией. Многие из них обладают хорошо выраженной
физиологической активностью. Так, продукт декарбоксилирования
гистидина — гистамин имеет широкий спектр биологического дейст-
вия. Он обладает сосудорасширяющими свойствами, чем отличает-
ся от других биогенных аминов, оказывающих сосудосуживаю-
щий эффект. В большом количестве гистамин образуется в местах
воспалительного процесса. Вызывая расширение сосудов в очаге
воспаления, он ускоряет тем самым приток лейкоцитов. Содержа-
ние гистамина резко возрастает при радиоактивном облучении,
травматическом шоке. Он способствует также выделению желудоч-
ного сока с повышенным содержанием соляной кислоты, играет
существенную роль в явлении аллергии и в болевом синдроме. Гис-
тамин содержится в яде пчел и ряда животных, в большом коли-
честве присутствует в спорынье.
Большой интерес представляют диамины путресцин и када-
верин, возникающие в результате декарбоксилирования орнитина
и лизина.
TST--п—сн,—сн,—nh2
сг
I
н
Гистамин
NH3
I СО2
H2N—(СН2)з—СН—СООН------> H2N(CH2)4—nh2
Орнитин Путресцин (тетра метилен диамин)
nh2
I — со2
H2N—(СН2)4—СН—СООН -----► H2N(CH2)5—nh2
Лизин Кадаверин (пентаметилендиамин)
Кадаверин и путресцин образуются при расщеплении белков гнию-
щих трупов (от лат. cadaver — труп, putresko — тлеть, гнить) и
могут быть причиной отравления, вызванного испорченным мясом.
Их образование возможно в кишечнике человека при некоторых
кишечных инфекционных заболеваниях. В норме небольшие коли-
чества этих диаминов быстро нейтрализуются уже в клетках сли-
зистой оболочки кишечника путем связывания аминогрупп, напри-
мер, их ацетилированием, а также путем расщепления в процессе
окислительного дезаминирования. Продукты деградации этих ве-
ществ выводятся через почки с мочой. В малых концентрациях
44
путресцин стимулирует синтез РНК, ускоряет рост *йлеток живот-
ных и бактерий.
Очень важными производными аминов являются адреналин и
норадреналин — гормоны мозгового слоя надпочечников, образую-
щиеся из тирозина (см. разд. 12.6.6.).
Радикалы аминокислот исключительно разнообразны, что дает
возможность для обнаружения большинства аминокислот исполь-
зовать цветные реакции. Многие из них весьма чувствительны и
специфичны, позволяют определять ничтожные количества той или
иной индивидуальной аминокислоты в составе сложных смесей,
биологических жидкостях, белках. Некоторые цветные реакции на-
ходят применение при количественном определении аминокислот
и белков.
Аминокислоты могут вступать в реакцию с соединениями, имею-
щими карбонильную группу, например с восстанавливающими са-
харами, в результате чего из аминокислоты образуется соответст-
вующий альдегид, а из углевода — фурфурол или оксиметилфур-
фурол. Альдегиды, образующиеся из аминокислот, обладают
приятным запахом. Сочетание запахов разных альдегидов и опре-
деляет, в основном, аромат пищевых продуктов. Фурфурол и окси-
метилфурфурол в свою очередь способны взаимодействовать с ами-
нокислотами, давая темноокрашенные продукты, называемые мела-
ноидинами. Синтез меланоидинов является причиной потемнения
многих пищевых продуктов при их приготовлении, сушке и хране-
нии. Особенно интенсивно реакция меланоидинообразования проте-
кает при повышенных температурах, например при сушке плодов,
овощей, солода, при топлении молока, выпечке хлеба (придает цвет
корке), при обработке вина теплом и т. п.
2.2.8. Характеристика отдельных аминокислот, входящих в бел-
ки. Моноаминомонокарбоновые аминокислоты.
Глицин (гликокол, а-аминоуксусная кислота)
nh2
I
Н—С—СООН
I
н
Единственная оптически неактивная аминокислота. Имеет сладкий
привкус и является одной из самых распространенных. Особенно
много ее в желатине. Является предшественником при биосинтезе
пуринов, порфириновой части гемоглобина, хлорофилла, геминовых
ферментов. Участвует в образовании клеточных стенок бактерий.
Функционирует как тормозной медиатор в спинном мозге и в боль-
шинстве структур ствола мозга, где находится в высоких концент-
рациях.
L-Аланин (а-аминопропионовая кислота)
NH2
Н3С—С—СООН
н
45
Содержится практически во всех белках. Играет большую роль в
обмене азотистых соединений. Может быть исходным продуктом
для синтеза каротиноидов, каучука, жиров и углеводов.
L-В алии (а-аминоизовалериановая кислота )
СН3 NH2
Н,С—СН—С—СООН
I
н
Обладает способностью к гидрофобным взаимодействиям, что
важно при создании и стабилизации структуры белковой молеку-
лы. Содержится во многих белках, но обычно в небольших количе-
ствах. Участвует в синтезе алкалоидов, некоторых циклопептидов,
пантотеновой кислоты, пенициллина.
L-Лейцин (а-аминоизокапроновая кислота)
СН3 NH2
Н3С—СН—СН2—С—СООН
н
L-Изолейцин (а-амино-$-этил-$-метилпропионовая кислота)
nh2
Н3С—СН2—ОН—С—СООН
I I
сн3 н
Обе аминокислоты плохо растворимы в воде. В белках содержатся
в незначительных количествах, способны к гидрофобным взаимо-
действиям. Являются источником сивушных масел при брожении.
L-Серин (а-амино-р-оксипропионовая кислота)
iNH3
НО—СН2—С—СООН
ll
Играет большую роль в обмене веществ любого организма. Входит
в состав фосфолипидов (фосфатидилсерины), полипептидов бради-
кинина и каллидина, участвует в построении активного центра
некоторых протеолитических ферментов, синтезе аминоспирта
сфингозина (компонент сфинголипидов). В некоторых белках, та-
ких, как казеин молока или вителлин яичного желтка, содержится
в виде сложного эфира—так называемой серинфосфорной кислоты,
которая играет важную роль в метаболизме молодого растущего
животного организма. У растений образуется в ходе фотодыхания
из глицина.
L-Треонин (а-амино-^-оксимасляная кислота)
NHa
Н3С—СН—С—СООН
I I
он н
46
Участвует в синтезе витамина Bi2, антибиотика актиномицина D.
L-Цистеин (а-амино-$-меркаптопропионовая кислота)
NH3
HS—СН2—(!—соон
н
Играет большую роль в обмене веществ растений и животных как
источник серы, а также в связи с наличием сульфгидрильной
SH-группы, являющейся восстанавливающим агентом. Входит в
состав трипептида глютатиона, в виде амина в кофермент А, при-
сутствует в активном центре многих ферментов. В молекулах бел-
ков и пептидов (инсулин, АКТГ и др.) принимает участие в обра-
зовании дисульфидных связей между полипептидными цепями или
внутри одной цепи, отсюда его важная роль в образовании третич-
ной структуры белковой молекулы. Является тем соединением, в
виде которого некоторые микроорганизмы и растения метаболизи-
руют сероводород. Из двух молекул цистеина при их окислении
получается цистин. Столь же легко происходит и обратный пере-
ход. Таким путем образуется одна из важнейших окислительно-
восстановительных систем живых организмов:
NH2
NH2 _____2Н+ ।
I S—CH2—CH—COOH
2hs—сн2—с—соон Z— ।
| + 2H+ S—CH2—CH—COOH
H I
nh2
В белках цистин преобладает над цистеином. В больших количест-
вах он содержится в белках волос, рогов, копыт.
L-Метионин (а-амино-у-метилтиомасляная кислота)
nh2
Н3с—S—сн2—сн2—с—соон
н
Является одним из основных доноров метильных групп при синтезе
углеводов клеточной стенки растений, холина, адреналина, креати-
на, стеринов и источником серы при образовании тиамина. Из него
могут образовываться и другие серосодержащие аминокислоты.
Много метионина в белке молока — казеине. Как липотропный
фактор является лечебным препаратом при атеросклерозе.
Диаминомонокарбоновые аминокислоты. L-Ли-
зин (а, в-диаминокапроновая кислота)
NH2
HaN—сн2—сн2—сн2—сн2—С—соон
н
47
Содержится почти во всех белках, особенно много его в белках мо-
лок рыб, относящихся к протаминам и гистонам. Является исход-
ным продуктом при синтезе алкалоидов (анабазин, никотин, лупа-
нин, кониин). Участвует своей 8-аминогруппой в образовании комп-
лекса между белковой частью фермента и коферментом, например
в биотин-зависимых ферментах.
Содержится в незначительных количествах в белках семян зла-
ковых, особенно кукурузы, что существенно обесценивает кормо-
вые свойства последней. Советские селекционеры, лауреаты Госу-
дарственной премии М. И. Хаджинов и Г. С. Галеев вывели ряд
сортов кукурузы с повышенным содержанием лизина.
L-Аргинин ((1-амино-б-гуанидил-п-валериановая кислота)
NH2
h2n—С—NH—СН2—СН2—СН2—С—СООН
II I
NH Н
Содержится во всех белках. Входит в большом количестве в состав
основных белков-гистонов и протаминов, в связи с чем его много
в белках рыбьих молок. Играет большую роль в белковом обмене,
участвуя в синтезе мочевины, креатина. В виде фосфоаргинина в
мышцах беспозвоночных выполняет функцию, аналогичную функ-
ции фосфокреатина у высших животных.
Моноаминодикарбоновые аминокислоты. L-Acna-
рагиновая кислота, аспартат (а-аминоянтарная кислота)
nh2
ноос—сн2—с-соон
н
Очень плохо растворима в воде, ее раствор имеет кислую реакцию.
Содержится в больших количествах во всех растительных белках и
играет важную роль в обмене веществ у растений и животных, в
частности, принимая участие в реакциях переаминирования, обра-
зовании мочевины, креатина, циклопептидов. При ее декарбокси-
лировании образуется а- или ft-аланин, необходимый для синтеза
карнозина, ансерина и коэнзима А (КоА). Амид аспарагиновой
кислоты — аспарагин накапливается в очень больших количествах
при прорастании семян бобовых растений, особенно в темноте, из-
за отсутствия углеводов или при избытке аммиака. Аспарагин об-
наружен в плазме крови и в составе некоторых животных белков
(инсулин, гемоглобин, миоглобин и др.).-У человека и животных
аспарагин, как и аспарагиновая кислота, активно участвует в ре-
акциях переаминирования, служит предшественником при синтезе
пуриновых и пиримидиновых оснований, никотиновой кислоты, у
растений является запасной и транспортной формой азота.
48
L-Глутаминовая кислота (глутамат,а-аминоглутаровая кислота)
NH2
I
НООС—СН2—СН2—С—СООН
I
н
В водных растворах дает кислую реакцию. Содержится в больших
количествах во всех белках. Входит в состав витамина фолиевой
кислоты, глутатиона. Наряду с аспарагиновой кислотой играет
первостепенную роль в аминокислотном обмене, активно участвуя
в реакциях переаминирования, дезаминирования, прямого амини-
рования. При декарбоксилировании глутаминовой кислоты образу-
ется у-аминомасляная кислота, имеющая большое значение в мета-
болизме мозга, усиливающая, в частности, процессы торможения,
и b-аминолевулиновая кислота, участвующая в синтезе порфиринов.
Амид глутаминовой кислоты — глутамин, является транспортной
формой азота у животных и растений, исходным соединением при
синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, никотиновой кис-
лоты. Мононатриевая соль глутаминовой кислоты служит вкусовой
приправой, обладая вкусом и запахом куриного бульона.
Ц и к л и чес к ие а м и н о к м г л пт кт Г-Фриилалднин
(а-амино-^-фенил-пропионовая кислота)
Содержится во всех белках. Участвует в биосинтезе флавоноидов,
алкалоидов. Обладает способностью к гидрофобным взаимодейст-
виям. Обусловливает ксантопротеиновую реакцию на белки. В сос-
тав молекулы грамицидина и антибиотика тироцидина входит
D-фенилаланин, который в свободном виде в природе не обнару-
жен.
н
L-Тирозин (а-амино-^-гидроксифенилпропионовая кислота)
Одна из наиболее распространенных в природе аминокислот; содер-
жится во всех белках (за исключением некоторых протаминов).
Является исходным субстратом для синтеза гормонов (тироксин,
норадреналин, адреналин), алкалоидов (морфин, кодеин, папаве-
рин). Окисление тирозина под влиянием тирозиназы приводит к
образованию меланинов (пигмент кожи, волос, перьев).
49
L-Триптофан (а-амино-^-индолилпропионовая кислота)
СН2—СН—СООН
Находится почти во всех белках. Бедны триптофаном семена зла-
ков. При кислотном гидролизе белков распадается. Триптофан слу-
жит исходным продуктом для синтеза никотиновой кислоты (вита-
мин РР), гетероауксина.
L-Гистидин (а-амино-$-имидазолпропионовая кислота)
НС----Г-ГН;—с Н—СООН
iL -NH NH2
А
Принадлежит к группе основных аминокислот — в водных раство-
рах дает щелочную реакцию. Значительное количество гистидина
содержится в глобине — белковом компоненте гемоглобина крови.
Входит в активные центры некоторых протеолитических фер-
ментов.
L-Пролин (пирролидин-а~карбоновая кислота)
.сн—СООН
'N^
Я
Является иминокислотой. Хорошо растворим в спирте. Особенно
велико содержание пролина в белках семян злаков (проламины),
в коллагене, эластине и белке эмали зубов. Входит в состав ряда
антибиотиков циклопептидов — грамицидина, лихениформина, ак-
тиномицина D.
L-Оксипролин
НО—НС----сн2
h2<L ,СН—СООН
н
Является производным L-пролина. Значительные его количества
обнаружены в белках клеточных оболочек, желатине, колла-
гене.
2.2.9. Аминокислоты, редко встречающиеся в белках, и небелко-
вые аминокислоты. Кроме обычных 20 аминокислот из белков уда-
50
лось выделить в небольших количествах другие редко встречаю-
щиеся аминокислоты:
NH.
I
H2N—СН2—СН(ОН)—сн2—сн2—с-соон
н
Оксилизин (много в коллагене)
н nh2
ноос—с—сн2—сн,—сн2—с—соон
I I
nh2 н
£-а,е-Диаминопимелиновая кислота (только у бактерий)
nh2
НООС—СН2—СН2—СН2—(!—соон
н
L-a-Аминоадипиновая кислота (в белке зерна кукурузы)
Свыше 150 аминокислот, обнаруженных в живых организмах,
не входят в состав белков. Некоторые из них играют важную роль
в обмене веществ.
fi-Аланин ($-аминопропионовая кислота)
h2n—сн2—сн2—соон
Является составной частью кофермента А (см. разд. 3.4.1), витами-
на В3 (пантотеновая кислота), карнозина, ансерина. Встречается
также в свободном виде. Оказывает тормозящий эффект на цент*
ральную нервную систему.
L-Орнитин (а, Ъ-диаминовалериановая кислота)
NH2
h2n— сн2—сн2-сн2—соон
н
Легко образуется из аргинина под действием фермента аргиназы.
Принимает участие в образовании мочевины, а также в синтезе
алкалоидов и антибиотика грамицидина.
L-Цитруллин (а-амино-Ь’Карбамидовалериановая кислота)
nh2
h2n—с—NH—СН2—СН2—сн2—с—соон
О . J
Является промежуточным продуктом при синтезе мочевины. Встре-
чается в свободном виде в соке плодов арбуза (Citrullus), отку-
да и получил свое название.
у-Аминомасляная кислота (ГАМК)
H2N—СН2—СН2—СН2—СООН
Содержится во многих растениях, в тканях мозга млекопитающих,
некоторых земноводных, птиц. Образуется в мозге при участии глу-
таматдекарбоксилазы:
NH2
I
НООС—СН2—СН2—С—СООН со2 + ноос—сн,—сн2—сн2—nh2
" " I * 1 if & & в
н
У животных функционирует в качестве химического агента при пе-
редаче нервного импульса, т. е. является нейромедиатором. Пола-
гают, что в количественном отношении ГАМК является главным
тормозным медиатором в нервной системе. Наличие ГАМК в цент-
ральной нервной системе необходимо также для нормального те-
чения обмена веществ: под ее влиянием усиливаются энергети-
ческие процессы, повышается дыхательная активность тканей
головного мозга, улучшается утилизация мозгом глюкозы, активи-
руются многие ферменты дыхания, улучшается кровоснабжение
мозга, стимулируется удаление из мозга токсических продуктов.
ГАМК используют как лечебный препарат под названием «Амина-
лон» или «Гаммалон».
2.3. Физико-химические свойства белков
2.3.1. Выделение и очистка белков. Первым этапом выделения и
очистки белков является извлечение их из клеток. Для этого клетки
разрушают, т. е. превращают в гомогенат (разрушают клеточные
оболочки, наружные мембраны, цитоплазматические структуры).
Существуют различные методы гомогенизации клеток и тканей, и
выбор того или иного метода определяется свойствами, составом,
прочностью исходного объекта. Большинство животных клеток раз-
рушается сравнительно легко, однако при работе с растительными
и бактериальными клетками встречаются значительные трудности,
обусловленные наличием клеточных оболочек.
Довольно простым и доступным методом разрушения является
гомогенизация путем растирания клеток и тканей с твердым мате-
риалом— абразивом (например, кварцевый песок) в ступкЛр пес-
тиком в присутствии среды суспендирования. Недостаток метода
заключается в том, что при этом может нарушаться структура наи-
более крупных органелл, например хлоропластов.
Для разрушения животных клеток часто используют гомогени-
заторы с вращающимися лопастями или пестиком, обычно выпол-
ненным из инертного материала — тефлона. С целью дезинтеграции
микробных клеток применяют механичЙ&ое встряхивание суспен-
зии клеток с мелкими стеклянными бусинками диаметром от 50 до
500 мкм. Встряхивание с частотой 300—3000 колебаний/мин разру-
52
ъ
шает клетки, однако возникающая сильная вибрация может иногда
вызывать и разрушение клеточных органелл. Гомогенизация мик-
робных клеток может быть достигнута с помощью высокого дав-
ления при применении специальных прессов. При этом суспензию
клеток помещают в камеру, создают избыточное давление (до
Ь108 Па), затем его снижают. Резкий перепад давления приводит
к тому, что клетки разрушаются. Клетки можно гомогенизировать
также путем продавливания их через мелкие отверстия.
Широко используют для разрушения клеток специальные при-
боры — ультразвуковые дезинтеграторы. Однако, поскольку
ультразвук — денатурирующий белки агент, следует очень тща-
тельно подбирать режим работы прибора, чтобы избежать инакти-
вации белков. Существуют также методы разрушения клеток с по-
мощью осмотического шока, попеременного замораживания и
оттаивания, обработки органическими растворителями (охлажден-
ный ацетон, толуол), автолиза. Для удаления оболочек раститель-
ных и бактериальных клеток могут быть применены ферментатив-
ные препараты — лизоцим, комплекс целлюлолитических фермен-
тов, хитиназа.
На всех этапах выделения и очистки белков следует учитывать
их большую неустойчивость, лабильность, склонность к потере при-
родных, нативных свойств, т. е. к денатурации. Белки очень чувст-
вительны к действию многих химических реагентов (в том числе
кислот, щелочей, органических растворителей), денатурируют при
нагревании. Они адсорбируются многими веществами (например,
фарфором ступок), что приводит к потере белка. Возможен автолиз
белков (самопереваривание), разрушение их микроорганизмами,
попавшими в раствор из воздуха или воды.
В большинстве случаев процесс разрушения клеток сопровожда-
ется выделением тепла, поэтому все процедуры по дезинтеграции
клеток и выделению клеточных органелл с целью предотвращения
тепловой денатурации следует проводить при пониженных темпера-
турах (около +4°С) в термостатированных холодных комнатах.
Важно также поддержание постоянства активной реакции среды в
определенном интервале, с этой целью среду суспендирования го-
товят на буферных растворах. Чтобы устранить воздействие ионов
тяжелых металлов, которые могут попасть с водой и реактивами
при гомогенизации, используют комплексообразователи — ЭДТА
(этилендиаминтетраацетат), его натриевую соль — трилон Б и др.
НООС—Н,Ск /СН2—СООН
СН2—СН2—
НООС—H2CZ ХСН2—СООН
ЭДТА (версен)
Для предотвращения окисления сульфгидрильных групп в
белках в среду выделения добавляют восстановители, например
цистеин, p-меркаптоэтанол, дитиотреитол и некоторые другие.
HS—СН2—СН2—ОН
Меркаптоэтанол
63
CH2—CH----СН—сн2
SH ОН OH SH
Д*1тиотреитол
Белки могут терять биологическую активность вследствие по-
верхностной денатурации, что происходит при сильном вспенива-
нии реагирующей массы. Образования пены избегают добавлением
нейтральных поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Известно, что многие белки локализованы в клеточных органел-
лах. Для их выделения гомогенат, полученный после разрушения
клеток, подвергают центрифугированию. В зависимости от величи-
ны центробежного ускорения в осадке получают те или иные орга-
неллы, с которыми затем проводят работу по выделению белка.
Методом центрифугирования можно также отделить твердые час-
тицы-обломки клеточных структур. Надосадочная жидкость
(экстракт) представляет собой водный раствор различных орга-
нических и неорганических соединений — компонентов клетки и сре-
ды солюбилизации (растворения).
Многие белки в клетке находятся в ассоциированном состоянии
с другими веществами или клеточными структурами, для их луч-
шей солюбилизации применяют слабые растворы детергентов (ве-
щества с поверхностной активностью) или неполярных растворите-
лей (эфир, бутанол и др.).
Неионные детергенты, такие, как дезоксихолат натрия, тритон
Х-100, широко применяющиеся для солюбилизации мембранных
белков, ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок-белко-
вые взаимодействия, в результате чего белки высвобождаются из
мембран. Анионные и катионные детергенты дестабилизируют так-
же и ионные связи между заряженными группами компонентов
мембран. Примером анионного детергента, использующегося для
выделения белков мембран, является додецилсульфат натрия
(ДСН, SDSV
СН3(СН2)10СН2О SO3Na
к______v J
Лауриновый спирт
Додецилсульфат натрия
51
После гомогенизации материала производится экстрагирование
из него белков. В качестве растворителей в зависимости от свойств
выделяемого белка и целей исследований применяют воду, солевые
растворы, разнообразные буферные смеси, органические реагенты,
водно-спиртовые растворы, слабые кислоты или щелочи. Очень час-
то экстракцию белков осуществляют в процессе гомогенизации ма-
териала.
В результате экстракции получают смесь белков и других ве-
ществ. Для выделения индивидуальных белков применяют различ-
ные методы очистки. Набор и последовательность использования
этих методов подбирают экспериментально в каждом конкретном
случае в зависимости прежде всего от физико-химических свойств
выделяемого белка. Разделение на фракции может быть достигну-
то за счет использования различий в растворимости белков при
разных концентрациях нейтральных солей (высаливание), органи-
ческих растворителей (этанол, серный эфир, ацетон, диоксан и не-
которые другие), разных значениях pH, t° (см. разд. 2.3.4).
Высоленные белки содержат большое количество солей, для ос-
вобождения от них полученный при центрифугировании белковый
осадок подвергают диализу против буферного раствора или гель-
фильтрации на колонках с молекулярными ситами. Обессоливание
о помощью молекулярных сит протекает во много раз быстрее.
Эффективным способом очистки белков является их фракциони-
рование с применением хроматографических методов. Хроматогра-
фическим методом называют физико-химический метод разделения
веществ, оснбванный на распределении компонентов смеси между
двумя фазами, одна из которых неподвижная, а другая — поток,
фильтрующийся через слой неподвижной фазы. Подвижной фазой
чаще всего бывает жидкость (жидкостная хроматография) или
газ (газовая хроматография). В зависимости от свойств, которыми
обладает неподвижная фаза, различают несколько видов хромато-
графии. Ниже приведена характеристика хроматографических ме-
тодов.
Принципы разделения
Вид хроматографии
Физическая сорбция веществ.....................
Разделение веществ между двумя жидкими несме-
шивающимися фазами ............................
Ионные взаимодействия между растворенными ве-
ществами и носителем ..... ....................
Неодинаковая доступность внутреннего раствори-
теля пористой структуры молекулам разделяемых
веществ........................................
Избирательное взаимодействие со специфическими
лигандами, закрепленными на носителе ..........
Адсорбционная
Распределительная
Ионообменная
Молекулярно-ситовая (гель-
проникающая)
Аффинная (по сродству),
биоспецифическая адсорбци-
онная хроматография (БАХ)
В белковой химии широкое применение нашли три последних
вида хроматографии. При ионообменной хроматографии (ИОХ)
55
разделение .белков происходит вследствие их взаимодействия с про-
тивоположно заряженными частицами ионообменных смол (аонм-
ты)— твердых нерастворимых веществ, которыми после соответст-
вующей обработки заполняется колонка.
Иониты содержат активные (ионогенные) группы с подвижны-
ми ионами, способными при определенных условиях обмениваться
на ионы анализируемой смеси. Иониты, содержащие активные кис-
лотные группы и способные к обмену подвижные катионы, назы-
ваются катионитами. Анионитами называются иониты, содержащие
активные группы основного характера и подвижные анионы.
R—SO^"H+ + H3N+—R' R—SOJ-H3N+—R' + Н+
Катионообменная смола
R—СН2—N+OH- 4- -000—R' R—СН2—N+~OOC—R' + ОН~
,IL > ,L >
(СНз)з (СНз)з
Анионообменная смола
где R'—+NH3 hR'—COO" —белок, —БОГи —CH2~N+= (СН3)3 —
функциональные (сульфо- и триметиламинометил-) группы, Н+ и
ОН" — подвижные ионы, R — основа (матрица).
Применение гель-проникающей хроматографии (гель-фильтра-
ция) позволяет разделять белки в соответствии с размерами их
молекул. С этой целью используют различные пористые- нераство-
римые материалы — синтетические смолы, пористое стекло (био-
глас), пористый кварц (порасил), производные полисахаридов на
основе декстрана (сефадекс, молселект), агарозы (сефароза), син-
тетического полимера полиакриламида (биогель Р) и др.
Пористые материалы выпускают в виде гранул определенного
размера, при суспендировании их в растворителе образуется две
его фазы: одна внутри гранул, другая — вне. Суспендированными
гранулами наполняют колонку, наносят смесь белков и пропускают
растворитель. В зависимости от размера и формы белковых моле-
кул они по-разному распределяются между обеими фазами: более
крупные и асимметричные молекулы реже проникают или совсем
не проникают (в зависимости от размера пор носителя) во внутрен-
нюю фазу растворителя. Молекулы, для которых недоступен внут-
ренний растворитель, остаются во внешней фазе и продвигаются по
колонке с гораздо большей скоростью, чем мелкие молекулы. Бел-
ки с относительно небольшим размером молекул (менее диаметра
пор) или низкомолекулярные соединения — соли, сахара, амино-
кислоты и др. — обязательно попадают в поры гранул и медленнее
выходят с колонки, так как находятся в состоянии диффузионного
равновесия с внутренним растворителем (рис. 2.3). Пористые ма-
териалы работают как молекулярное сито, точнее, как антисито,
так как крупные молекулы проходят через них быстрее.
В качестве молекулярного сита наиболее часто используют се-
фадекс— производное синтетического полисахарида декстрана.
В результате химической обработки в декстране образуются попе-
56
О 2
Рис. 2.3. Схема обессоливания белкового раствора с по-
мощью сефадекса:
Л II, III— стадии фильтрования; / — гранулы сефадекса, 2 — мо-
лекулы белка, 3 — неорганические соли
речные сшивки, и он становится нерастворимым в воде, но легко в
ней набухает, образуя гель. Существует несколько марок сефадек-
сов, различающихся по диаметру пор внутри гранул (табл. 2.2).
Таблица 2.2. Типы сефадексов
Тип Область разделения по моле- кулярной массе (М), дальтон Поглощение воды, г/г сефадекса
0-25 1 000—5 000 2,5
0-50 1 500—30000 5,0
G-75 3 000—80000 7,5
0- 100 4 000—150 000 10,0
0 - 150 5000—300000 15,0
G- 200 5 000—600 000 20,0
Аффинная хроматография основана на биоспецифическом взаи-
модействии выделяемого биополимера или группы биополимеров с
определенным веществом. Этот вид хроматографии применим к
ферментам, иммуноглобулинам, лектинам, рецепторным белкам,
которые способны избирательно связываться с субстратами, инги-
биторами, кофакторами, антигенами, рецепторами. Принцип этого
метода хроматографии заключается в том, что на нерастворимом
носителе закрепляют вещество, способное специфически связывать-
57
ся с выделяемым белком. Это вещество называют лигандом. Обра-
ботанный таким образом носитель (адсорбент) помещают в колон-
ку и через нее пропускают смесь белков. С адсорбентом связывает-
ся только тот белок, который имеет сродство к специфическому
лиганду (рис. 2.4). Затем белок снимают с колонки раствором,
Рис. 2.4. Схема метода аф-
финной хроматографии:
1 — носитель (матрица). 2 —
<ножка>, J —лиганд, 4 — белок
вызывающим диссоциацию образовавше-
гося комплекса между белком и лиган-
дом.
Для разделения белков широко ис-
пользуют электрофоретические методы,
основанные на движении заряженных
молекул белков в электрическом поле со
скоростью, зависящей от величины их
зарядов при данном pH и ионной силе
раствора. На скорость перемещения ока-
зывают влияние также форма и масса
белковых молекул, но в меньшей степе-
ни, чем их суммарный заряд.
Электрофоретическое разделение
можно проводить в растворе или на твер-
дых влажных носителях — в геле из крахмала, полиакриламида,
силикагеле, на хроматографической бумаге. Высокой разрешаю-
щей способностью и чувствительностью характеризуется электро-
форез в полиакриламидном геле (ПААГ), имеющем стандартный
размер пор, определяемый концентрацией исходных мономеров,
взятых для полимеризации геля. Поэтому в данном методе разде-
ление веществ происходит и по величине заряда, и по размеру мо-
лекул.
К электрофоретическим методам относятся также изотахофо-
рез и изоэлектрофокусирование (ИЭФ). При изотахофорезе (от
греч. изос — равный, одинаковый, тахос — скорость) заряженные
ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда
и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с
одинаковыми и постоянными в данном опыте скоростями.
Метод изоэлектрофокусирования позволяет разделять белки од-
новременно как в градиенте напряжения, так и pH. Градиент pH
поддерживают, добавляя в колонку смесь амфолитов-носителей
(фирменные названия амфолины и сервалиты)—синтетических ве-
ществ, обладающих амфотерными свойствами и отличающихся друг
от друга по величине ПЭТ. Амфолины, в частности, являются по-
лиаминополикарбоновыми кислотами с молекулярной массой от 300
до 1000, их синтезируют на основе полиэтиленполиаминов. Под
действием электрического поля амфолиты-носители распределяют-
ся по высоте колонки в строго определенной последовательности и
создают линейный градиент pH. Диапазон градиента зависит от
состава смеси амфолинов или сервалитов, величин их ИЭТ. Крутой
градиент pH создается смесью амфолитов с широким интервалом
ИЭТ, пологий — смесью с более узким спектром изоточек амфоли-
тов (рис. 2.5). В последнем случае достигается более высокая
68
разрешающая способ-
ность метода — разделе-
нию могут подвергнуться
белки, отличающиеся по
величине ИЭТ на 0,01
значения pH и меньше.
Исследуемые белки,
внесенные в колонку, пе-
ремещаются в ней под
действием приложенного
электрического поля
(рис. 2.6). Молекулы бел-
ка в той области, где pH
выше его ИЭТ, заряжены
отрицательно и переме-
щаются сверху вниз (к
аноду). Напротив, моле-
кулы белка в области с
pH ниже его ИЭТ мигри-
руют снизу вверх. В ито-
ге каждый вид белка ока-
зывается сконцентриро-
ванным в зоне с pH, рав-
ным его ИЭТ. Здесь бе-
лок фокусируется, так
как на молекулы, поте-
рявшие заряд, электриче-
ское поле перестает дей-
Рис. 2.5. Границы pH смесей амфолитов-носи-
телей
ствовать.
Применение перечисленных методов извлечения и очистки бел-
ков позволяет выделять индивидуальные белки, имеющие высокую
степень чистоты. Хорошо очищенные белки в отдельных случаях
удается получить в кристаллическом виде. Белки выкристаллизо-
вывают из растворов солей, органических растворителей. Пере-
кристаллизация белков повышает степень их чистоты.
Выделенные препараты белка должны быть проверены на гомо-
генность. Прямых методов оценки чистоты белков не существует,
гомогенность образца оценивают по отсутствию примесей. Вещест-
во считают чистым, если ни один из методов определения гомо-
генности не выявит наличие примесей. С этой целью применяют
обязательно несколько методов, основанных на разных принципах.
Гомогенность образца по молекулярной массе устанавливают уль-
трацентрифугированием, по величине заряда — электрофорезом в
ПААГ, ИЭФ. Чистое вещество дает только один симметричный
пик при ультрацентрифугировании. Асимметричность пика, а так-
же наличие плеча в лике или нескольких пиков свидетельствует о
гетерогенности исследуемого белкового раствора. При электрофо-
ретических методах оценки гомогенности после разделения также
должна получаться только одна белковая зона. Кроме того, ис-
59
® А И
/nCnnuIC MvJlCnUJiD'
A П Молекулы, не несущие
О ZX LJ суммарного заряда
• Д I Положительно заря-
женные молекулы
Рис. 2.6. Процесс миграции молекул белков при изоэлектрическом фокусирова-
нии. А — начало процесса; Б — окончание
пользуют критерий функциональной гомогенности — определение
специфической активности белков. Существует и биологический
метод установления чистоты белковых препаратов, основанный на
том, что большинство белков обладает свойствами антигенов, т. е.
способностью вызывать у животного после введения появление спе-
цифических антител. Инъекция гомогенного вещества вызывает об-
разование антител одного вида, а гетерогенного — нескольких
видов.
Выделенный и очищенный белок должен храниться при пони-
женной температуре. Если белок кристаллизуется из раствора
сульфата аммония, его можно хранить в этом растворе в виде
суспензии. Чаще всего белки хранят в высушенном состоянии;
сушку производят под высоким вакуумом из замороженного сос-
тояния (лиофилизация).
2.3.2. Молекулярная масса белков и методы ее определения.
Молекулярная масса белков может быть определена различными
физическими методами, из которых наиболее часто используют
гравитационный, гельфильтрационный и электрофоретический. Сов-
ременные методы позволяют определять молекулярные массы с
погрешностью, не превышающей 5%, что составляет несколько ты-
60
сяч, а иногда и сотен дальтон.. Выяснение первичной структуры
многих индивидуальных белков дало возможность рассчитать их
молекулярную массу с высокой точностью.
При гравитационном методе для определения молекулярной
массы используют аналитические ультрацентрифуги, которые поз-
воляют наблюдать процесс седиментации (оседание) частиц. В сов-
ременных ультрацентрифугах развивается центробежное ускорение,
превышающее ускорение силы тяжести до 500 000 раз. Определе-
ние молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования
ведут по скорости седиментации белковых молекул и по седимента-
ционному равновесию.
При определении молекулярной массы по скорости седимента-
ции исследуемые белковые растворы центрифугируют при больших
скоростях. Это приводит к тому, что равномерно распределенные
по всему объему частицы белка в начале центрифугирования посте-
пенно перемещаются ко дну ячейки. Между областями растворите-
ля, свободной от белковых молекул и содержащей их, образуется
граница раздела. Регистрируя перемещение этой группы в процес-
се центрифугирования, определяют скорость седиментации моле-
кул, на основании чего рассчитывают молекулярную массу белка
по уравнению Сведберга.
В методе седиментационного равновесия центрифугирование
проводят при относительно небольших скоростях вращения ~7—
8 тыс. об/мин, что соответствует центробежному ускорению 40—
50 тыс. g. При таком ускорении даже частицы с большой молеку-
лярной массой не оседают на дно. Центрифугирование продолжают
до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное распределение
изучаемого белка по всей длине ячейки, при котором движение
белка ко дну ячейки под действием центробежной силы уравнове-
шивается движением вверх, обусловленным диффузией. По обра-
зовавшемуся градиенту концентрации белка в центрифужной ячей-
ке рассчитывают молекулярную массу белка по специальной фор-
муле.
Установление молекулярной массы белков гель-фильтрацией
проводят при заполнении пористым гелем (сефадекс, сефароза
и др.) колонки или нанесении его тонким слоем на твердую под-
ложку (тонкослойная хроматография). При колоночном варианте
фиксируют объем элюирования (14) исследуемого белка и белков
с известной молекулярной массой, затем строят калибровочный
график зависимости IgM от Ve/Vo и по нему определяют молеку-
лярную массу изучаемого белка. Vo (внешний объем)—объем
растворителя между гранулами, определяется как объем, необхо-
димый для элюирования соединения, которое не проникает в поры
гранул. Значения молекулярных масс большинства белков уклады-
ваются на калибровочную прямую, исключение составляют лишь
белки с ярко выраженной асимметричной формой молекул. Этим
методом устанавливают и молекулярные массы субъединиц белков,
имеющих четвертичную структуру (см. разд. 2.4.7). В этом случае
используют 6/М гуанидингидрохлорид, вызывающий диссоциацию
61
белка на субъединицы и потерю нативной конформации, что поз-
воляет избежать влияния формы молекулы.
znh2
H2N-C<f Cl-
XNH2
Г уанидингидро хлорид
При тонкослойной хроматографии на пористых гелях опреде-
ляют путь, пройденный белком за определенное время, и рассчи-
тывают молекулярную массу, используя калибровочный график,
построенный в координатах IgAf от х (пройденное белком расстоя-
ние) с использованием стандартных белков.
При электрофоретическом методе определения молекулярной
массы белка в ПААГ также сравнивают подвижность исследуемого
белка с подвижностью белков-маркеров. Графическая зависимость
подвижности белка от логарифма его молекулярной массы выра-
жается прямой линией. Чтобы избежать влияния формы молекул
и их заряда на электрофоретическое разделение белков, а также
установить молекулярную массу отдельных субъединиц в молекуле
с четвертичной структурой, предварительно проводят денатура-
цию белков с помощью додецилсульфата натрия (ДСН). С 1 г
белка связывается примерно 1.4 г ДСН, при этом гидрофобные
группы ДСН располагаются внутри образующегося комплекса, а
сульфокислотные — на поверхности. Последние обеспечивают сум-
марный отрицательный заряд комплекса, зависящий только от
массы белка, и при электроферезе в гелях с однородной пористо-
стью комплексы мигрируют со скоростью, обратно пропорциональ-
ной молекулярной массе белка. Электрофорез в присутствии ДСН
широко применяют при изучении сложных смесей мембранных бел-
ков, определении их молекулярной массы, поскольку многие мем-
бранные белки плохо растворимы в отсутствие ДСН.
Каждый из указанных выше методов определения молекуляр-
ной массы имеет свои недостатки, поэтому точный результат мо-
жет быть получен при сочетании различных методов.
Использование перечисленных методов позволило установить,
что молекулярные массы различных белков колеблются в широ-
ких пределах: от 6 тыс. до нескольких миллионов дальтон. Ниже
приведены молекулярные массы некоторых белков.
к Молекулярная
Инсулин........................................ 5 700
Рибонуклеаза . .............................. 14 000
Пепсин........................................ 35 500
Сывороточный альбумин........................ 66 500
Каталаза..................................... 250 000
Уреаза....................................... 480 000
Гемоцианин................................. 2 800 000
2.3.3. Амфотерные свойства белков. Белки являются амфотер-
ными электролитами, так как в их молекуле присутствуют как кис-
62
лотные, так и основные группировки. Кислотно-основные свойства
белков определяются главным образом боковыми радикалами ами-
нокислот, способными к ионизации. Вклад концевых NH2- и
COOH-групп крайне незначителен. Величины рК боковых ради-
калов аминокислот в составе белков несколько отличаются от та-
ковых в свободных аминокислотах, поскольку степень ионизации
групп в белках зависит от природы соседних боковых радикалов,,
т. е. от электростатического окружения.
Присутствие диссоциирующих группировок в белках обуслов-
ливает определенный суммарный заряд молекулы, зависящий от
pH среды. Большинство природных белков относится к кислым
белкам благодаря значительному содержанию дикарбоновых кис-
лот и поэтому при pH, близких к нейтральным, имеет, как и цито-
плазма, в целом, отрицательный заряд.
Аминокислоты с диссоциирующими боковыми радикалами вхо-
дят в состав всех белков, где они преимущественно располагаются
на поверхности глобулы и тем самым определяют гидрофильность
молекулы в целом, а также ряд других физико-химических свойств
белковых молекул. Распределение заряда на поверхности молеку-
лы неравномерно, различные участки ее могут иметь противопо-
ложные заряды, стабилизированные диполями воды. Сдвиг pH
среды приводит к изменению характера диссоциации радикалов^
перераспределению зарядов на поверхности молекулы, следствием
чего является изменение пространственной структуры белков и
степени их биологической активности.
Наличие большого числа точек диссоциации определяет и спо-
собность белковых молекул взаимодействовать с малыми ионами,,
в частности ионами металлов, другими заряженными макромолеку-
лами, что очень важно для функционирования белка. Способность
белков взаимодействовать как с катионами, так и с анионами име-
ет большое биологическое значение. Например, важную роль во
многих физиологических процессах играет способность белков свя-
зывать катион кальция, что имеет непосредственное отношение к
регуляции метаболических процессов.
дая каждого белка существует такое значение активной ре-
акции среды, при котором положительные и отрицательные заряды
в молекуле скомпенсированы. Значение pH, при котором белок не
несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле, на-
зывают изоэлектрической точкой (ИЭТ) и обозначают как pl. Ве-
личина ИЭТ может быть определена по кривым, полученным при
кислотно-основном титровании белкового раствора, а также при
изоэлектрофокусировании белка (см. разд. 2.3.1). Ниже приведены
изоэлектрические точки некоторых белков.
Белок. р/
Пепсин.........................................
Уреаза.........................................
Каталаза ......................................
Рибонуклеаза ..................................
Лизоцим ..............*.................... •
1,0
5,1
5,6
7,8
11,0
63
Значение pH, отвечающее ИЭТ белка, определяется числом его
ионогенных групп и величинами их констант диссоциации (рК).
ИЭТ выше 7, если белок содержит большое число остатков основ-
ных аминокислот, и менее 7 при преимущественном содержании
кислых аминокислот. Для большинства глобулярных белков ИЭТ
лежат в кислой области (4,5—6,5). Однако есть и исключения. Так,
например, фермент пепсин, функционирующий в сильно кислой
среде желудка, имеет ИЭТ около 1, а протамины — около 12.
Суммарный заряд белковой молекулы положителен при рН<р! и
отрицателен, если рН>р1. Поскольку в ИЭТ молекула белка не
несет суммарного заряда и между соседними молекулами отсутст-
вует электростатическое отталкивание, белки легко осаждаются из
растворов при pH, равном их ИЭТ.
Изоэлектрическую точку белка следует отличать от изоионной
точки, так как эти величины не всегда совпадают. Изоионной точ-
кой белка называется то значение pH, при котором число прото-
нов, связанных с основными группами, равно числу протонов, от-
данных диссоциированными кислотными группами в белковой мо-
лекуле. Таким образом, изоионной точке соответствует значение
pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю
в условиях полного отсутствия электролитов в растворе. Следова-
тельно, изоэлектрическая и изоионная точки совпадают только в
том случае, когда раствор белка не содержит никаких других ио-
нов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой моле-
кулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Прямое изме-
рение изоионной точки затруднено, поэтому ее определяют, изме-
ряя ИЭТ при различных концентрациях солей и экстраполируя к
нулевой концентрации. В отсутствие солей и при значении изоион-
ной точки вблизи pH 7 она будет почти совпадать с изоэлектричес-
кой. Однако в присутствии солей различие между этими точками
может быть весьма значительным.
Белки, являясь амфотерными электролитами, проявляют бу-
ферные свойства.
2.3.4. Растворимость белков. Подавляющее большинство бел-
ков— гидрофильные вещества, хорошо растворяющиеся в вод-
ных растворах. Растворимость их, как и других высокомолекуляр-
ных веществ, определяется природой тех групп, которые оказыва-
ются на поверхности молекулы при ее пространственной укладке в
нативную конформацию. Большая часть поверхности белковой мо-
лекулы образована группами, способными гидратироваться.
Под гидратацией понимается связывание диполей воды с ион-
ными и полярными группами. Ионными, несущими заряд, группа-
ми в белках являются радикалы, способные к диссоциации. В дис-
социированном состоянии они притягивают молекулы воды за счет
ион-дипольных взаимодействий. Неионные полярные боковые ра-
дикалы аминокислот (аспарагин, глутамин, серин, треонин) обра-
зуют с водой водородные связи. К образованию водородных связей
с водой способны кислород и водород, входящие в состав пептид-
ных групп, поскольку эти атомы несут избыточный отрицательный
64
(О) и положительный (Н) заряды. Однако доступ воды к пептид-
ным группам затруднен из-за стерического препятствия, создавае-
мого боковыми радикалами аминокислот, поэтому значительного
вклада в гидрофильность белков они не вносят.
Растворимость белков в воде возрастает при добавлении не-
больших концентраций нейтральных солей [(NH4)2SO4, Na2SO4>
AlgSO4 и др.], этот эффект называют солевым растворением. Раст-
ворению белков, как и других веществ, способствуют те факторы,
которые уменьшают взаимодействие между молекулами растворя-
емого вещества. Нейтральные соли в малых концентрациях увели-
чивают степень диссоциации ионизированных групп белка, экра-
нируют заряженные группы белковых молекул и тем самым умень-
шают белок-белковое взаимодействие. Известно, что степень диссо-
циации электролитов (в том числе белков) прямо пропорциональна
диэлектрической постоянной растворителя, которая, в свою очередь,
пропорциональна степени поляризации молекул растворителя, их
дипольному моменту. У сильно поляризованных молекул воды, на-
пример, диэлектрическая постоянная при комнатной температуре
равна 80, а у ацетона, этанола — 20—30. Нейтральные соли в ма-
лых концентрациях еш(е больше увеличивают диэлектрическую пос-
тоянную воды. В результате вода усиливает диссоциацию раство-
ренного вещества, в частности белка. Входя между заряженными
группами и ориентируясь вокруг них, диполи воды препятствуют
их взаимодействию.
Высокие концентрации нейтральных солей, напротив, осаждают
(высаливают) белки из водных растворов, наиболее активно это
происходит в ИЭТ белка. Относительная эффективность высали-
вающего действия различных ионов зависит от их размера, вели-
чины заряда, способности к гидратации. При больших концентра-
циях ионов в растворе они оттягивают к себе от заряженных групп
белка поляризованные молекулы воды и частично лишают тем
самым белок гидратной оболочки, которая предотвращает его
осаждение из раствора. При высоких концентрациях солей этот
фактор играет решающую роль. По способности к высаливанию
белков из водного раствора анионы и катионы могут быть распо-
ложены в особые ряды — ряды Гофмейстера, лиотропные ряды.
Для анионов в более щелочной среде по сравнению с ИЭТ белка
это будет такой ряд: SO4~ >17~>[нитрат]2~>[тартрат]2~>[аце-
TaT]->CI->NO3“>Br->I“>CNS“ Лиотропный ряд для катионов
в этих же условиях выглядит следующим образом: Ba2+>Sr2+>
>Ca2+>Mg2+>Cs+>Rb+>K+>Na-b>Li+.
Растворимость белков зависит также от pH растворителя, его
состава, температуры. Минимальной растворимостью, как указыва-
лось выше, обладают белки в ИЭТ, что объясняется отсутствием
электростатического отталкивания между молекулами белка.
Добавление к белковому раствору смешивающихся с водой ор-
ганических растворителей (этанол, ацетон) уменьшает раствори-
мость белков, а при больших концентрациях растворителей наблю-
дается выпадение белков в осадок. Данное явление объясняется
3—937
65
снижением диэлектрической постоянной среды и, кроме того,
уменьшением степени гидратации белков, приводящими к увеличе-
нию притяжения между противоположно заряженными группами в
белковой молекуле и к агрегации белков. Белки, обладающие раз-
ными по растворимости свойствами, осаждаются при различных
интервалах концентрации солей или органических растворителей,
при неодинаковых значениях активной реакции среды. Это свойство
белков используют при их выделении и очистке фракционировани-
ем (см. разд. 2.3.1).
В растворах белки проявляют коллоидные свойства: они мед-
ленно диффундируют, не проходят через полупроницаемую мем-
брану, рассеивают свет, характеризуются высокой вязкостью. Од-
нако следует иметь в виду, что белковые растворы не являются
типичными коллоидными растворами, так как белки диспергирова-
ны до единичных молекул и образуют гомогенный раствор. В отли-
чие от них типичные коллоидные растворы гетерогенны, двухфазны
(растворенное вещество и растворитель), коллоидные частицы (ми-
целлы) растворенного вещества состоят из нескольких молекул.
Сходство белковых и истинных коллоидных растворов основано на
том, что молекулы белков имеют размеры, приближающиеся к раз-
меру мицелл коллоидного раствора (10~4—10-7 см).
Образование коллоидных растворов белками и другими биологи-
ческими макромолекулами обусловливает многие физико-химичес-
кие явления, наблюдающиеся в биологических жидкостях и орга-
низмах в целом. Растворы белков, как и все коллоидные растворы,
могут при определенных условиях терять свою текучесть и образо-
вывать гели, или студни. Гели возникают в результате объединения
молекул в виде сетки, внутреннее пространство которой заполнено
большим количеством растворителя, при этом разделения на жид-
кую и твердую фазы, как в случае коагуляции, не происходит. По-
лагают, что в ряде растительных и животных тканей белки нахо-
дятся не только в виде растворов, но и гелей (в протоплазме кле-
тоц^хрусталике глаза, соединительной ткани и др.). В состояние
гелябёлковые растворы, например молоко, могут переходить под
воздействием ферментов микроорганизмов, результатом чего явля-
ется образование простокваши, кефира. При подготовке растений
к зимнему периоду жизни, в процессе так называемого осеннего
«закаливания» происходит переход части белков из растворенного
состояния в гелеобразное.
Гели со временем стареют, отслаивают воду и делятся на две
фазы: уплотненный гель и разведенный золь. Этот процесс получил
название синерезиса, он протекает, например, при стоянии кефира.
Одним из свойств гелей является их способность к набуханию —
увеличению объема за счет связывания большого количества воды.
Такой процесс происходит, например, при прорастании семян. Бел-
ки соединительных тканей животных, поглощая воду, осуществля-
ют тем самым ее запасание организмом. Набухание играет большую
роль в технологии кожевенной промышленности, хлебопе-
чении.
66
В растворах белков и других высокомолекулярных соединений
может наблюдаться явление коацервации — слияния водных оболо-
чек нескольких частиц без объединения самих частиц. Коацерваты
возникают при ограниченной растворимости компонентов раствора,
это служит причиной появления коацерватных капель. Коацерваты
образуются, например, из белков с противоположными зарядами.
Им придают большое значение в теории происхождения жизни,
однако в отличие от биологических неравновесных структур коа-
церваты термодинамически равновесны.
Благодаря гидрофильным и гидрофобным группировкам белки
могут влиять на растворимость других веществ, выступая в роли
эмульгаторов — веществ, стабилизирующих эмульсию, которую об-
разуют взаимно нерастворимые жидкости (вода—масло). В орга-
низме человека в эмульгированном состоянии находятся жиры в
крови и лимфе. Белок образует на поверхности капелек жира тон-
кую пленку, которая притягивает воду и препятствует слипанию
жировых частичек. Одной из причин образования мочевых и желч-
ных камней может быть недостаток в организме муцинов — слизис-
тых гликопротеинов, обволакивающих гидрофобные микрочастицы
и способствующих тем самым их выведению из организма. Как
эмульсию можно рассматривать и молоко, представляющее собой
эмульгированные жззеушогеном капельки жира в воде.
2.3.5. Денатур^Ояпбелков. Под денатурацией белка понимают
нарушение” нативной пространственной структуры белковой мо-
лекулы, приводящее к уменьшению или полной потере ее раствори-
мости, изменению других физико-химических свойств белка, утрате
специфической биологической активности. Денатурация ще сопро-
вождается разрывом ковалентных связей в остове полипептидной
цепи. Происходит расщепление дисульфидных мостиков, гидрофоб-
ных, ионных, водородных связей. В результате нарушается натив-
ная третичная структура и в значительной мере вторичная. Денату-
рацию белковых молекул вызывают как некоторые химические
соединения, так и физические факторы/Механизм денатурирующе-
го воздействия химических агентов определяется их строением.
Например, мочевина, гуанидинхлорид, формамид благодаря нали-
чию амидной группировки конкурируют с пептидными группиров-
ками белка за водородные связи, переключая их на себя. Эти реа-
генты нарушают также гидрофобные взаимодействия. Максималь-
ное денатурирующее влияние мочевина и другие амиды проявляют
в больших концентрациях (6М—ЮМ).
Денатурирующее действие умеренно полярных органических
растворителей (низшие спирты, этиленгликоль, диоксан, диметил-
сульфоксид и др.) связано с резким уменьшением диэлектрической
константы водных растворов белков, вследствие чего увеличивают-
ся электростатические силы взаимодействия между заряженными-
группами. Образование прочных внутри- и межмолекулярных ион-
ных связей и приводит к денатурации белков. Органические раст-
ворители нарушают гидрофобные взаимодействия в молекулах
белков. Неполярные алифатические и ароматические углеводороды
3*
67
разрушают внутримолекулярные гидрофобные связи белков вслед-
ствие прямого взаимодействия с их гидрофобными группами.
Ионные детергенты, например додецилсульфат натрия, соединя-
ются с противоположно заряженными группами белка. Электроста-
тическое отталкивание оставшихся в пептидной цепи одноименно
заряженных групп приводит к разрыву водородных связей и других
слабых взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию
белка.
Денатурирующими агентами являются также катионы тяжелых
металлов и анионы иода, тиоцианата. Эти вещества, по-видимому,
образуют достаточно прочные соединения с полярными группами
белков, искажая систему ионных и водородных связей.
Для трихлоруксусной кислоты и таннина характерен сложный
механизм денатурации, включающий как непосредственное воздей-
ствие на водородные связи, так и блокирование полярных группи-
ровок.
Многие белки денатурируют при сильном подкислении (рН<
<2—3) или подщелачивании (рН>10—11). В этих условиях прак-
тически все диссоциирующие группы белка имеют одноименный
заряд (преимущественно Н3Ы+-группы при низких значениях pH и
СОО- — при высоких). Взаимное отталкивание одноименных за-
рядов вызывает разрыв части слабых связей, в результате чего
нарушается нативная структура. Однако необходимо учитывать,
что некоторые белки достаточно устойчивы при крайних значениях
pH. Например, при pH 2 довольно стабильны гистоны, протамины,
лизоцим, а у пепсина при pH 1,5—2,2 активность даже максималь-
на. Лизоцим, гистоны и протамины устойчивы и при pH 10, а- у
щелочных фосфатаз и аргиназы оптимум pH каталитической ак-
тивности лежит в интервале 9,5—9,7.
Из физических факторов денатурации наиболее общим является
нагревание. Усиление теплового движения полипептидных цепей
приводит к разрыву водородных связей и нарушению гидрофоб-
ных взаимодействий. Скорость тепловой денатурации существен-
но зависит от активной реакции среды, присутствия солей, их кон-
центрации. Тепловая денатурация сопровождается агрегацией бел-
ков, выпадением их в осадок, что представляет собой уже вторичное
явление.
Существуют многочисленные данные о том, что у термофильных
микроорганизмов большинство белков обладает повышенной тер-
мостабильностью. При нагревании до 60°С они не денатурируют,
претерпевают лишь небольшие конформационные изменения, в то
время как у белков мезофиллов (организмы, обитающие при обыч-
ных, средних температурах) при +60°С наблюдается существенная
денатурация. У мезофиллов лишь редкие белки обладают повы-
шенной термостабильностыо.
Белки денатурируют и при многих механических воздействиях;
высоком давлении (5000—10 000 атм), растирании сухих препа-
ратов, энергичном встряхивании растворов, облучении звуковыми
волнами высокой частоты. Все это следует иметь в виду при биохи-
68
мических исследованиях белков. При лиофилизации большинство
белков не денатурирует, что позволяет использовать этот способ
сушки для получения белковых препаратов длительного хранения.
Физическими факторами денатурации белков являются также
ультрафиолетовый свет (особенно в границах 260—310 нм), иони-
^ируййцёе”излучение. Денатурация белка происходит также при
распределении его на границе раздела двух фаз, такая поверхно-
стная денатурация наблюдается при вспенивании белковых раст-
воров в процессе выделения белков и при образовании пены на
поверхности водоемов.
При денатурации белков изменяются многие физико-химичес-
кие свойства белка: растворимость, константа седиментации, вяв-
кость, оптические свойства и др. В процессе денатурации белков с
четвертичной структурой может происходить их диссоциация на
субъединицы. В белке существенно уменьшается количество участ-
ков с регулярными типами вторичной структуры, снижается коли-
чество внутримолекулярных водородных связей и возрастает чис-
ло этих связей между белком и водой. Поскольку при денатурации
происходит нарушение гидрофобных взаимодействий в процессе
развертывания белковой молекулы и гидрофобные группы оказы-
ваются на поверхности молекулы, это вызывает потерю раствори-
мости и набухаемости белков в водных растворах.
> При денатурации белка выявляются реактивные группы, кото-
рые в нативном белке не полностью доступны для обнаружения
обычными методами (сульфгидрильные, фенольные, имидазольные
и др.). Изменение числа реактивных групп при денатурации прояв-
ляется и в изменении ИЭТ белков. Как правило, изоэлектрическая
точка смещается в сторону щелочных значений pH. Денатурация
белков сопровождается возрастанием отрицательной оптической
активности.
Превращение компактной молекулы в беспорядочный клубок,
происходящее при денатурации,-приводит к тому, что большинство
пептидных связей становится доступным действию протеолитичес-
ких ферментов. В связи с этим протеолиз денатурированных бел-
ков протекает с большей скоростью, чем нативных.
Потеря белками биологической активности выражается в инак-
тивации ферментов, гормонов, вирусов. Это является важным кри-
терием денатурации, хотя здесь и существуют некоторые исключе-
ния. Такие ферменты, как папаин, пепсин, сохраняют свою актив-
ность при денатурации мочевиной, а рибонуклеаза и лизоцим сох-
раняют активность при нагревании в разбавленной кислоте. При
денатурации ряда белков происходит понижение антигенности, но
сохраняется иммунологическая специфичность.
Медленная денатурация белков происходит при длительном
хранении семян, в результате чего у них уменьшается набухае-
мость и, как следствие, снижается интенсивность прорастания.
Полная денатурация белка в большинстве случаев необратима,
однако при подборе соответствующих условий иногда удается ре-
натурировать белки. Способность к ренатурации после нагревания
69
показана, например, для фермента трипсина. Необходимым усло-
вием его ренатурации является очень медленное охлаждение белка
до комнатной температуры («отжиг»), при этом восстанавливается
нативная конформация и специфическая биологическая функция
трипсина.
2.3.6 Оптические свойства. Все белки, как правило, поглощают
ультрафиолетовый (УФ) свет в трех областях. Поглощение при
длинах волн (X) более 250 нм с максимумом около 280 нм обуслов-
лено присутствием исключительно ароматических аминокислот —
триптофана, тирозина и фенилаланина. Основной вклад дают ами-
нокислоты триптофан (%iax=278 нм, е1 2 = 5600) и тирозин
(Хтах=275 нм, 8=1300), входящий в больших количествах в состав
почти всех белков. Поглощение при 210—250 нм имеет сложную при-
роду и определяется наличием-ароматических и ряда других ами-
нокислот, а также присутствием в белках водородных связей,
«-спиральных участков и т. д. Полоса поглощения, максимум ко-
торой расположен вблизи 190 нм, обусловлена главным образом
наличием в белке пептидных связей. Интенсивность поглощения в
этой области меняется в основном в зависимости от количества
а-спиральных структур в белке.
На свойстве белков поглощать свет в УФ-области спектра осно-
ван спектрофотометрический метод количественного определения
белка (по интенсивности поглощения при 280 нм). Он не очень то-
чен, поскольку количество триптофана и тирозина в различных
белках варьирует в довольно широких пределах. При работе с
белками условно принимают, что 1 единица оптической плотности
раствора при 280 нм соответствует концентрации, равной приблизи-
тельно 1 мг/мл (при толщине кюветы 1 см). Несмотря на недос-
таточную точность, этот метод широко применяют в современной
биохимии, так как он прост и быстр в исполнении, дает возмож-
ность дальнейшего использования раствора белка после определе-
ния оптической плотности. Метод особенно часто используют при
контроле за изменением концентрации белков при их разделении
на колонках.
Спектрофотометрия позволяет также устанавливать зависи-
мость оптической плотности растворов от длины волны поглощае-
мого света, т. е. получать спектры поглощения, и, кроме того, ис-
пользуется для определения пространственного расположения аро-
матических аминокислот в белковой глобуле (внутри или снаружи).
Последний способ применения основан на том, что спектры погло-
щения ароматических аминокислот (их Хтах и е) претерпевают за-
метные изменения в зависимости от окружения, в частности от
полярности растворителя, pH среды. Триптофан, тирозин и фенила-
ланин в менее полярном окружении (например, внутри белковой
глобулы) имеют более высокие Хтах и 8. Если спектр белка чувст-
вителен к изменению полярности растворителя, это дает основание
1 %тах — длина^ волны, при которой наблюдается максимальное поглощение.
2 е — молярный коэффициент поглощения.
70
заключить, что аминокислоты, для которых наблюдаются измене-
ния Хтах и е, располагаются в основном на поверхности белковой
глобулы.
Подобного типа анализы обычно проводят путем снятия диффе-
ренциальных спектров, т. е. непосредственной регистрацией разно-
сти поглощения УФ-света белком в различных растворителях. Ме-
тод дифференциальной спектрофотометрии позволяет установить
и степень полярности окружения ароматической аминокислоты,
находящейся внутри глобулы. Так, если в спектре аминокислоты в
составе белка, находящегося в полярном растворителе, наблюда-
ются большие Хтах и 8, чем эти же величины для свободной амино-
кислоты в том же растворителе, то эта аминокислота находится во
внутренней области белка и окружена неполярными аминокисло-
тами.
В видимом диапазоне спектра (380—760 нм) способностью пог-
лощать свет обладают только окрашенные белки, так называемые
хромопротеины — гемоглобины, цитохромы, флавопротеины, «голу-
бой белок» из Pseudomonas, интенсивно поглощающий свет с дли-
ной волны около 600 нм, и некоторые другие.
В инфракрасной (ИК) области спектра (760—10 000 нм) погло-
щают свет все белки. ИК-спектроскопию широко используют для
определения относительного содержания а-спиралей, p-структур и
аморфных участков в белковой молекуле. Это можно оценить по
интенсивности некоторых полос спектра, в частности полосы амид I
(~ 1680 см-1). При изображении ПК-спектров используют не дли-
ны волн, а частоты (v) или волновые числа (1/Z), поэтому положе-
ние полос определяют в обратных сантиметрах.
Использование поляризованного ИК-света позволяет опреде-
лять ориентацию водородных связей относительно полипептидной
цепи: в а-спирали они параллельны, в p-структуре перпендикуляр-
ны цепи. Методом инфракрасного дихроизма регистрируют спект-
ры поглощения белка для двух взаимно перпендикулярных направ-
лений поляризации падающего света. В одном случае вектор
напряженности электрического поля параллелен пептидным цепям,
в другом — перпендикулярен им. В указанном методе получают
так называемые растянутые пленки белков, в которых все белко-
вые молекулы ориентированы в одном и том же направлении, и из-
меряют дихроичное отношение, т. е. отношение площадей полос,
полученных, когда электрический вектор световой волны паралле-
лен и перпендикулярен оси молекулы. Группы —С —О (1660 см-1)
и _N—н (3300 см-1) поглощают наиболее сильно тогда, когда они
параллельны вектору. По величине дихроичного отношения судят
о вероятности а-спиральной структуры в белке.
Белки являются оптически активными веществами: они вращают
проходящий через них плоскополяризованный свет и неодинаково
поглощают левый и правый циркулярно поляризованный свет.
Плоско поляризованный свет — это свет, у которого вектор напря-
женности электрического поля для всех фотонов светового пучка
лежит в одной плоскости; циркулярно поляризованным светом на-
71
зывается свет, у которого вектор напряженности описывает спи-
раль. Указанное свойство белков объясняется наличием в их моле-
куле хиральных атомов углерода. Взаимодействие с белками по-
ляризованного света изучают методами дисперсии оптического вра-
щения (ДОВ), кругового дихроизма (КД). С помощью этих мето-
дов в зависимости от длины волны измеряют способность оптиче-
ски активного вещества вращать плоско поляризованный свет
(ДОВ) и по-разному поглощать поляризованный по кругу вправо
и влево свет (КД). Методы ДОВ и КД применяют для общего опи-
сания содержания спиральных структур в белках и исследования
конформационных изменений.
Для белков и многих белковых структур характерно свойство
оптической анизотропии, т. е. различие оптических свойств по раз-
ным направлениям. В одних случаях оптическая анизотропия обус-
ловлена внутренним строением белков, в других — их формой или
искусственно вызванной ориентацией.
Белковые растворы обладают также способностью флуорес-
цировать — испускать квант света при переходе из электронно-
возбужденного состояния в основное. На этом свойстве белков ос-
нована флуоресцентная спектроскопия — измерение интенсивности
испускаемого света при возбуждении образца (поглощение им
кванта света при облучении УФ-светом). Спектр флуоресценции
всегда бывает смещен относительно спектра поглощения в длин-
новолновую область, так как при переходе из возбужденного со-
стояния в основное молекула теряет энергию.
Флуоресцирующими аминокислотными остатками в белках яв-
ляются триптофан, тирозин и фенилаланин. Флуоресценцию каждо-
го из них можно отличить по длине волны, при которой она наблю-
дается. Кроме того, сложные белки могут содержать и другие флу-
оресцирующие компоненты. Измерение флуоресценции дает сведе-
ния о конформационных перестройках белков, местах связывания
лигандов, взаимодействиях с растворителем, степени гибкости мо-
лекулы, межмолекулярных расстояниях и др.
2.4. Строение белковой молекулы
2.4.1. Полипептидное строение белков. Первые белковые вещест-
ва выделили более 250 лет назад, а во второй половине XVIII —
начале XIX вв. уже неоднократно описывали белковые вещества
растений и животных.
В настоящее время хорошо известен химический элементарный
состав белков. Они обычно содержат 50—55% С, 21—23% О2,
15—17% N2, около 7% Н2, от 0 до 3% S. В сложные белки, кроме
того, могут входить Р и некоторые металлы.
Значительно более сложным является вопрос структуры белко-
вых молекул. Глубокие и очень интересные для своего времени
исследования структуры белков были проведены выдающимся рус-
ским биохимиком, одним из основоположников отечественной био-
72
химии А. Я. Данилевским (1838—1923) в 80-х годах прошлого сто-
летия. Исследуя продукты расщепления белков под влиянием сла-
бых щелочей, особенности биуретовой реакции, типичной для бел-
ков и некоторых продуктов их распада, он высказал ряд интерес-
ных идей по поводу строения белковой молекулы. Молекула белка»
по А. Я. Данилевскому, состоит из достаточно похожих по строению
цепей, в которых чередуются атомы С и N («углеазотные цепи»,
«элементарные ряды»), с которыми соединены аминокислоты.
А. Я. Данилевский впервые в науке указал на полимерный ха-
рактер строения белков. Большой интерес представляло его ут-
верждение, что расщепление белка имеет гидратационный харак-
тер, т. е. идет путем гидролиза. Эти идеи А. Я. Данилевского не-
сомненно были еще очень далеки от современной теории строения
белков, но они уже представляли собой ее начало.
Решающий шаг в создании полипептидной теории строения
белковой молекулы сделал крупнейший немецкий химик-органик и
биохимик Э. Фишер (1852—1919). Гидролизуя белки соляной кис-
лотой и ферментами, а затем исследуя продукты расщепления, он
пришел к заключению, что белковая молекула образована боль-
шим числом аминокислотных остатков. Чтобы определить, каким
образом они соединены между собой, Э. Фишер пошел по пути ис-
кусственного синтеза белковоподобных молекул из аминокислот.
Так как свободные аминокислоты при сливании их растворов не
взаимодействуют, он использовал их галогенацилпроизводные в
качестве исходного материала для синтеза. Условия синтеза были
таковы, что аминогруппа одной аминокислоты реагировала с кар-
боксилом другой, образуя пептидную связь —СО—NH— (на при-
сутствие в белковой молекуле такого типа связей указывал еще
А. Я. Данилевский, называя их биуретовыми). Таким путем ему
удалось объединить в одну молекулу до 19 аминокислотных остат-
ков. Сравнение свойств этих искусственно синтезированных соеди-
нений с пептидами — продуктами неполного расщепления природ-
ных белков — показало большое сходство. Это доказывало, что и
в природных белках аминокислоты соединены друг с другом пеп-
тидными связями.
По современным данным, наиболее часто в составе различных
белков обнаруживают 20 видов аминокислот. Именно для 20 ами-
нокислот существует генетический код в виде триплетов (тройки
нуклеотидов в ДНК). Иногда в белках присутствуют и другие ами-
нокислоты, они образуются в результате модификации белков
уже после их биосинтеза, являются некодируемыми (цистин, гид-
роксипролин, гидроксилизин и некоторые другие). В составе белков
обнаружены только а-аминокислоты, в подавляющем большинстве
в L-конфигурации.
Аминокислоты соединяются друг с другом ковалентной пептид-
ной или амидной связью. Образование ее происходит за счет ами-
ногруппы (—МНЙ) одной аминокислоты и карбоксильной группы
(—СООН) другой с выделением молекулы воды.
73
о
Т2
HaN— СН— с—ОН + H~—N—СН—COOH^-H2N—СП-
1. Н 1,
о
Т2
сн—СООН + н2о
:—n-
н
Транспептидная связь
Наиболее распространена в природе транс-пептидная связь, ре-
же встречается менее устойчивая цис-пептидная связь. Пептидная
связь является частично двойной, частично одинарной, между эти-
ми структурами есть взаимный переход. Время жизни одинарной
связи несколько больше, чем двойной (6:4), можно сказать, что
пептидная связь на 60% одинарна и на 40% двойная.
В результате явления резонанса образуется флуктуирующая,
динамическая связь, которую невозможно описать на основе одной
валентной структуры. Так как вращение вокруг двойной связи за-
торможено, все атомы пептидной связи оказываются расположен-
ными примерно в одной плоскости, т. е. она планарна, только во-
круг атома азота связи отчасти сохраняют пирамидальный харак-
тер. К настоящему времени установлены все валентные углы и
длины связей в пептидных группировках (рис. 2.7).
Образованные аминокислотами полимеры называют пептидами
или белками в зависимости от числа входящих в них структурных
единиц. Условно принято, что пептиды, содержащие до 20 амино-
кислотных остатков, относятся к олигопептидам, среди них разли-
чают ди-, три-, тетрапептиды и т. д. Полипептиды имеют в молеку-
ле от 20 до 50 аминокислотных остатков. Пептидные цепи, объеди-
Рис. 2.7. Межатомные расстояния
(нм) и углы в пептидной связи.
Все атомы внутри рамки находятся
примерно в одной плоскости
няющие более 50 аминокислот и
имеющие молекулярную массу свы-
ше 6 тыс., относятся к белкам.
Самый низкомолекулярный бе-
лок — гормон инсулин, состоящий
из 51 аминокислотного остатка. Чис-
ло аминокислотных звеньев в бел-
ке может доходить до нескольких
сотен и даже тысяч. Количество ви-
дов белков в природе огромно, их
разнообразие связано с различным
набором аминокислот, входящих в
белок, и порядком их чередования в
молекуле. Так, уже из трех амино-
кислот можно получить 6 различ-
ных трипептидов, из четырех — 24
74
тетрапептида, пяти — 120 пента пептидов, из 11—40 млн. изомеров,
а из 20 разных аминокислот, каждая из которых встречается только
один раз, теоретически может образовываться астрономическое
число (2-Ю18) изомеров. Однако в живой природе реализуется
только малая доля возможных изомеров.
Для описания строения белковых молекул были введены поня-
тия о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах.
В последние годы добавлены еще два уровня: сверхвторичная
структура и домены, которые занимают место между вторичной и
третичной структурами.
/ 2.4.2. Первичная структура. Под первичной структурой белко-
вой молекулы понимают порядок чередования аминокислот в поли-
пептидной цепи (или цепях) и местоположение. ^дисульфидных свя-
~зей. ТТолипептидная цепь содержит на одном конце св'бббХную амйг
’ногруппу (N-конец), на другом — карбоксильную группу (С-ко-
нец). За начало цепи принимается ее N-конец, именно отсюда на-
чинается отсчет аминокислот. 1Это совпадает с направлением син-
теза полипептидной цепи на ''рибосоме, которое в свою очередь
отвечает направлению 5'—>3' мРНК (см. разд. 4.4.3).
Аминогруппа на N-конце полипептидной цепи может быть
иногда ацетилированной, присоединившей остаток уксусной кис-
лоты (СН3—СО—NH—...), как например, в цитохроме овальбу-
мине, лактатдегидрогеназе, актине, миозине. Блокированные за
счет ацетилирования N-концы характерны также для белков обо-
лочки многих растительных вирусов, некоторых вирусов животных
и бактерий. Формилирование а-аминогруппы обнаружено в пче-
лином яде мелиттине, гемоглобине миноги, метилирование — в ри-
босомных белках Е. coll. В ряде белков (гормоны, легкая и тяже-
лая цепи иммуноглобулинов) N-концевым является остаток пирро-
лидонкарбоновой кислоты (пироглутаминовой кислоты), не содер-
жащей свободной аминогруппы.
На С-конце встречается либо свободная карбоксильная группа
(у большинства белков), либо амидированная (некоторые гормо-
ны, пчелиный яд). Модификации С-конца более редки по сравне-
нию с N-концевыми модификациями.
Названия отдельных пептидов образуются в соответствии с сос-
тавляющими их аминокислотными остатками, начиная с N-конца.
При этом в названиях всех аминокислот, за исключением послед-
ней, меняется окончание на «ил». Например, Е-аланил-Ь-цистеиЛ-
L-метионин. Полная аминокислотная последовательность белков
указывается в виде сокращенных названий аминокислот. Принято
трехбуквенное и однобуквенное обозначение аминокислот
(табл. 2.3).
75
Таблица 2.3. Обозначения аминокислотных остатков, входящих в состав
пептидов и белков
Полное название аминокислоты Сокращенное название
трехбуквенное однобуквенное
Глицин Тли, Gly G
Аланин Ала, Ala A
Валин Вал, Vai V
Лейцин Лей, Leu L
Изолейцин Иле, Не I
Пролин Про, Pro P
Фенилаланин Фен, Phe F
Тирозин Тир, Туг Y
Триптофан Три, Тгр W
Серин Сер, Ser S
Треонин Тре, Thr T
Аспарагиновая кислота Асп, Asp D
Глутаминовая кислота Глу, Glu E
Аспарагин1 Асн, Asn N
Глутамин1 Глн, Gin Q
Цистеин Цис, Cys c
Метионин Mem, Met M
Гистидин Гис, His H
Лизин Лиз, Lys к
Аргинин Ape, Arg R
1 Если неизвестно, аминокислота или ее амид имеется в цепи белка, используют следующие
обозначения: Асх (Asx) или В и Глх (Glx) или Z.
Рис. 2.8. Торсионные углы у а-уг-
леродного атома в пептидной
цепи
/^Основная связь первичной.струк-
туры *^ел ков -£(^ёптрщная _ „связ^
Эта связь достаточно жесткая и по-
этому конформационная подвиж-
ность ее ограничена. Однако в каж-
дом аминокислотном звене есть а-
углеродный атом, который обуслов-
ливает присутствие в этом звене
двух одинарных связей; вокруг этих
связей возможно вращение. Углы
вращения одинарных связей назы-
ваются торсионными и обозначают-
ся через ф (N -- Са) и ф (С — Сп )
(рис. £3). Число возможных комби-
наций торсионных углов велико, и
многие из них реализуются в бел-
ках. Исключение составляют такие
пары углов, которые стерически не-
возможны вследствие близкого про-
странственного расположения ато-
76
мов соседних пептидных групп и боковых радикалов аминокислот-
ных остатков.
В настоящее время с помощью вычислительных машин и моле-
кулярных моделей просматривают всю область возможных значе-
ний ф и ф, результаты такого анализа представляют в виде графи-
ков зависимости ф от ф, которые получили название конформаци-
онных карт или графиков Рамачандрана.
На сегодня задача установления аминокислотной последова-
тельности решена примерно для 2000 белков: цитохромов, ферре-
доксинов, иммуноглобулинов, белков рибосом, гемоглобинов, боль-
шого числа ферментов. Первым был расшифрован инсулин быка
(Ф. Сэнгер, 1951 —1953), за эти работы была присуждена Нобе-
левская премия. Одним из крупных белков, для которого установ-
лена первичная структура, является фермент аспартатаминотранс-
фераза (М 93 000). Одна полипептидная цепь этого фермента — J
димера состоит из 412 аминокислотных остатков. Его структура
расшифрована в совместной работе двух лабораторий, руководимых
Ю. А. Овчинниковым и А. Е. Браунштейном, в 1971 г.
Последовательность изучения первичной структуры белков та-
кова. 1. Расщепление полипептидной цепи белка на более короткие
фрагменты по определенным положениям в его последовательности.
2. Установление порядка чередования аминокислот в полученных
фрагментах-пептидах. 3. Определение расположения пептидов с
известной аминокислотной последовательностью в белковой мо-
лекуле.
Расщеплению полипептидной цепи на фрагменты должен пред-
шествовать разрыв дисульфидных мостиков и модификация остат-
ков цистеина. Для расщепления белков на фрагменты применяют
селективный гидролиз с помощью протеолитических ферментов
(трипсин, химотрипсин и др.), разрывающих пептидные связи,
которые образованы определенными аминокислотами, или химиче-
ских агентов, также обладающих избирательностью действия.
Трипсин расщепляет пептидные связи, карбонильная группа кото-
рых принадлежит лиз или гар, а химотрипсин гидролизует пептид-
ные связи, в образовании которых принимает участие карбоксиль-
ная группа ароматических аминокислот — тир, фен и три.
Протеолитические ферменты, применяющиеся для селективного
гидролиза, обычно предварительно иммобилизуют, т. е. связывают
с нерастворимой матрицей, чтобы облегчить последующее отделе-
ние ферментов от продуктов гидролиза.
Среди химических реагентов, применяющихся для избиратель-
ного гидролиза, наиболее удачными являются бромциан, расщепля-
ющий пептидные связи, карбонильная группа которых принадле-
жит остаткам мет, а также N-бромсукцинимид, разрывающий свя-
зи после три.
В результате селективного гидролиза получается набор пепти-
дов, из которого затем каждый пептид должен быть получен в
индивидуальном виде. Для фракционирования пептидов использу-
ют преимущественно высоковольтный (до 10 000 В) электрофорез
77
и хроматографию (в основном, ионообменную, распределительную,
молекулярно-ситовую) или сочетание указанных методов, напри-
мер метод пептидных карт, или «отпечатков пальцев». Последний
метод заключается в том, что смесь пептидов наносят на лист хро-
матографической бумаги и проводят в одном направлении распре-
делительную хроматографию, а в другом, перпендикулярном пер-
вому, — электрофорез.
Для установления порядка чередования аминокислот в пепти-
дах разработан ряд методов, позволяющих исследовать аминокис-
лотную последовательность как с N-, так и с С-конца молекулы.
Одним из самых распространенных реагентов, используемых для
N-концевого анализа пептидов, является фенилизотиоцианат
(ФИТЦ), впервые примененный П. Эдманом^В результате реакции
ФИТЦ с МН2-группой пептидов образуется продукт — фенилтио-
карбамильное производное аминокислоты, или ФТК-производное.
В кислой среде продукт циклизуется, что приводит к разрыву пеп-
тидной связи и отделению от остального пептида фенилтиогиданто-
инового производного N-концевой аминокислоты (ФТГ-производ-
ное). Полученные ФТГ-производные идентифицируют с использо-
ванием различных вариантов метода хроматографии, и таким об-
разом устанавливают первую аминокислоту в пептиде. Повторяя
обработку ФИТЦ укороченного пептида, определяют следующий
аминокислотный остаток и т. д. Реакции, лежащие в основе метода
Эдмана, таковы:___ ** ' .... ~...—..
ФТК-производное ФТГ-производное
Принцип метода Эдмана используют в приборах — секвенато-
рах, позволяющих автоматически определять последовательность-/'
аминокислот в пептиде, включающем несколько десятков остатков.
Специфическим реагентом на свободные NH2-rpynnbi в белках яв-
ляется и динитрофторбензол (ДНФБ), использованный впервые
Ф. Сэнгером и примененный им для установления N-концевых ами-
нокйс'лот^ттен^идах. Реакция протекает следующим образом:
ДНФБ
Пептид
„ ,ДНФ-аминокислота
Д НФ-пептид
78
Кислотный гидролиз динитрофенилированного пептида приво-
дит к разрыву всех пептидных связей в молекуле и высвобождению
динитрофенилированной N-концевой аминокислоты, которую
идентифицируют хроматографическими методами с применением
метчиков: ДНФ-аминокислот.
Для расшифровки аминокислотной последовательности пепти-
дов с N-конца могут быть применены ферменты аминопептидазы,
последовательно отщепляющие аминокислоты со свободной амино-
группой. Используя хроматографические методы, идентифицируют
аминокислоты и определяют скорость их накопления в гидролизате,
на основании чего получают представление о чередовании амино-
кислот на N-конце пептида.
Аналогичный подход используют при расшифровке С-концевой
последовательности аминокислот с применением ферментов карбок-
сипептидаз, отщепляющих аминокислоты со свободной карбоксиль-
ной группой. Информацию о С-концевой аминокислоте можно по-
лучить, расщепляя пептидные связи в белках путем гидразинолиза.
Этот метод, предложенный С. Акабори, основан на реакции поли-
пептида с гидразином в безводной среде при 100°С.
H2N—CHRj—CO-NH—CHR2—СО—NH—CHR3—СООН + 2HaN—nh2 ->
Трипептид Гидразин
-> H2N—CHRj—CONHNH2 + H2N—CHRjCONHNHj + H2N—CHR3COOH
Гидразиды аминокислот
В гидразиды аминокислот превращаются все аминокислотные
остатки, за исключением несущего свободную карбоксильную груп-
пу. Он получается в виде свободной аминокислоты, выделяется и
идентифицируется хроматографически.
Для анализа последовательности аминокислот как с N-, так и
С-конца в предварительно модифицированных олигопептидах при-
меняют метод масс-спектрометрии.
Для установления полной аминокислотной последовательности
в белках необходимо знать порядок чередования пептидов в моле-
куле. Это решается логическим методом, получившим название ме-
тода «перекрывающихся пептидов». Он может быть применен в том
случае, если известна первичная структура пептидов, полученных
после гидролиза белка, по меньшей мере, с использованием двух
различных видов селективного гидролиза. По «перекрывающимся»
фрагментам определяют порядок следования пептидов.
а б в
G-W-V-R A-O-V-K C-E-C-D
I--------1 |-------1 ।-------1
Триптические
пептиды
Химотриптические
пептиды
Например, пептид а триптического гидролизата содержит пол-
ную последовательность пептида г и часть пептида д химотрипти-
79
ческого гидролизата. Следовательно, в белковой молекуле пептид
д следует непосредственно за пептидом г. Аналогично устанавли-
вается относительное расположение остальных пептидов (G, W.
и т. д. — сокращенные названия аминокислот).
Первичная структура белка может быть установлена косвенно,
по строению кодирующего его гена: по чередованию в нем нуклео-
тидов. С помощью этого приема в сочетании с указанными выше
методами установления порядка чередования аминокислот в бел-
ках группа советских ученых во главе с Ю. А. Овчинниковым рас-
шифровала первичную структуру РНК-полимеразы — крупного
белка, состоящего приблизительно из 4000 аминокислот.
Расшифровка первичной структуры белков включает также оп-
ределение аминокислотного состава и установление мест локализа-
ции дисульфидных связей. Качественный и количественный амино-
кислотный состав белков устанавливают после их гидролиза до мо-
номеров и применения специальных приборов — автоматических
анализаторов аминокислот. В этих приборах на колонках с ионо-
обменными смолами аминокислоты разделяются, последовательно
вымываются и количественно анализируются с помощью нингидри-
на или более чувствительного реагента — флуорескамина, обра-
зующего с аминокислотами флуоресцирующие продукты.
Установление мест локализации дисульфидных мостиков в бел-
ке проводят в процессе выяснения полной аминокислотной после-
довательности. Для этого перед проведением селективного гидро-
лиза в белке модифицируют все свободные SH-группы. Пептиды,
содержащие S—S-связи, выделяют и обрабатывают реагентами,
вызывающими разрыв дисульфидных мостиков. Образовавшиеся
пептиды разделяют и определяют аминокислотную последователь-
ность каждого с помощью указанных выше методов.
Заканчивая рассмотрение основных этапов и методов, приме-
няющихся при изучении первичной структуры белков, необходимо
подчеркнуть, что самой начальной процедурой является определе-
ние числа полипептидных нитей в белковой молекуле — протоме-
ров, Заключение об этом обычно делают на основании числа NH2-
концевых остатков, приходящихся на молекулу белка. Если в бел-
ке более одной полипептидной цепи, то их отделяют друг от друга,
например, с помощью детергентов, а затем разделяют и очищают
путем электрофореза или хроматографии.
Результаты расшифровки первичной структуры, полученные в
настоящее время для большого числа белков, уже позволяют сде-
лать некоторые обобщения. Несмотря на большое разнообразие
свойств отдельных белков и различия в первичной структуре, есть
некоторое сходство в количественном составе аминокислот. Для
преобладающего числа белков характерно присутствие всех 20 ви-
дов аминокислот, из которых особенно много обычно глицина,
аланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, мало — триптофа-
на, гистидина, метионина, аргинина. Аминокислоты с углеводород-
ными боковыми группами составляют обычно 30—40% от общего
числа аминокислот. Исключением из этой обобщенной характера-
S0
стики количественного состава аминокислот разных белков явля-
ются лишь некоторые группы белков: гистоны, протамины и про-
теиноиды. У них могут отсутствовать некоторые виды аминокислот,
количественно преобладать определенные аминокислоты (арги-
нин— у гистонов и протаминов, гидроксипролин — у протеиноидов).
Анализ большого числа белков с изученной первичной структу-
рой показал, что в глобулярных белках отсутствуют какие-либо об-
щие закономерности чередования аминокислот (нельзя, например,
сказать, что за аминокислотой X во всех белках следует аминокис-
лота Z, у каждого белка свой характер чередования). Вместе с
тем природа, видимо, не пошла по пути реализации существования
всего того колоссального разнообразия белков, которое теоретиче-
ски может быть образовано двадцатью видами аминокислот. Как
указывает Ф. Шорм (Чехословакия), даже у далеких по биологи-
ческой активности белков — гормона инсулина и фермента рибо-
нуклеазы — имеются одинаковые небольшие фрагменты молекул:
три тождественных трипептида, один тождественный тетрапептид,
пять аналогичных трипептидов, отличающихся только одной амино-
кислотой, при этом отличающиеся аминокислоты близки по строе-
нию (например, вместо ала — вал, вместо асп — глу).
Расположение аминокислот в белках, так же как и образующая-
ся на его основе пространственная структура, закреплены генети-
чески и приспособлены к выполнению определенной биологической
функции. Аминокислотная последовательность белков, ответствен-
ных за одну и ту же биологическую функцию, часто близка для
разных видов? Такие белки, одинаковые или сходные по строению
и выполняющие у разных организмов одинаковые функции, назы-
ваются гомологичными. Так, все инсулины позвоночных состоят из
двух цепей (А и В), включающих 51 аминокислотный остаток.
В A-цепи инсулинов разных животных единичные различия в ами-
нокислотной последовательности имеют место, в основном, в поло-
жениях 4, 8, 9, 10, 13, 14, 15 и 18. Эти аминокислоты называются
вариабельными, другие аминокислоты, как правило, не подверга-
ются заменам. В цитохромах с 35 остатков из 104 одинаковы у
всех видов, причем число аминокислотных замен находится в пря-
мой зависимости от их филогенетического родства. В то время как
цитохромы с позвоночных животных и дрожжей различаются меж-
ду собой по 43—48 аминокислотам, цитохромы с человека и обезья-
ны имеют только одну замену, а молекулы этого белка у курицы и
индейки идентичны.
Изучение первичной структуры гомологичных белков, выделен-
ных из различных видов живых организмов, является одним из ме-
тодов современной таксономии.
Различия в структуре гомологичных белков также дают ценную
информацию о роли отдельных аминокислотных остатков в функ-
ционировании молекулы. Остатки, находящиеся в активных участ-
ках или определяющие конформацию полипептидной цепи, не мо-
гут быть изменены генетически или путем химической модифика-
ции без влияния на функцию. Так, известные в настоящее время
31
вариации первичной структуры в цитохроме с разных видов живых
организмов не связаны со значительными изменениями функцио-
нальных свойств белка, поскольку наименее изменяемыми явля-
ются участки вблизи связывания гема, а также участки, ответст-
венные за пространственную укладку цеди.
Большинство аминокислотных замен, делений или вставок
обычно происходит на поверхности белковой глобулы, поскольку
наружные остатки менее существенны для стабильности белка.
Однако эти изменения обычно наблюдаются на участках, менее
существенных для проявления функциональных свойств. По вари-
абельности аминокислотного остатка в гомологичных белках мож-
но судить о местонахождении данного остатка — на поверхности
или внутри белка.
На ряде ферментов показано, что по отношению к некоторым
заменам, делениям и вставкам аминокислот функции белков устой-
чивы. В белках есть фрагменты полипептидной цепи, которые
можно удалить, и при этом функция не нарушится. Малосущест-
венными заменами в большинстве случаев являются замены одних
аминокислотных остатков на другие с близкими свойствами, на-
пример, взаимозамена алифатических гидрофобных остатков (иле
на вал или лей, мет и т. д.), полярных (арг на лиз, глу на асп, глн
на асн). Замещение на остаток с другим типом боковой цепи очень
существенно, если происходит в области молекулы, ответственной
за проявление функции и конформацию.
Возможность замен в первичной структуре гомологичных бел-
ков не является общим правилом для всех белков. Существуют и
консервативные белки, к ним, например, относится гистон Н4, от-
личающийся у растений и животных лишь двумя аминокислотными
остатками из 102. Очевидно, каждый остаток в гистоне Н4 крити-
чен для его функции, а эволюция этого «древнего» белка закончи-
лась на раннем этапе существования организмов.
Наряду с явлением дивергенции (по первичной структуре) бел-
ков, выполняющих одинаковые функции у различных организмов,
в биохимии известно и явление конвергенции, когда белки с анало-
гичными функциями не гомологичны по структуре. Например, гид-
ролиз пептидной связи осуществляют ферменты разных типов, от-
личающиеся по структуре активного центра и механизму катализа.
Панкреатические протеиназы (трипсин, химотрипсин и др.) и суб-
тилизин (протеиназа из Вас. subtilis) имеют различные первичные
структуры и конформации, но близкий механизм реакции.
Установление чередования аминокислот в белках показало
также, что в процессе эволюции происходило удвоение и слияние
генов. С дупликации соответствующих генов обычно начинается
дифференциация белков. Продукты этих генов постепенно могут
выполнять различные функции. Аналогичные последовательности
и пространственную структуру имеют, например, а-лактальбумин
и лизоцим, являющиеся ярким примером дифференциации белков.
Таким образом, изучение первичной структуры белков дает нам
ценную информацию о ходе эволюции, помогает в установлении
В2
филогенетических взаимоотношений между отдельными видами
живых организмов, а также доказывает непрерывность эволюци-
онного процесса. Последний вывод может быть сделан на осно-
вании того, что аминокислотные последовательности определенного
белка не всегда полностью идентичны у каждой особи данного ви-
да. Такой полиморфизм является результатом непрерывно проис-
ходящих мутаций в геноме данного вида. Полезные для вида му-
тации закрепляются в потомстве. Мутации, вызывающие наруше-
ние функций белка, приводят к появлению наследственных бо-
лезней.
2.4.3. Роль слабых взаимодействий в образовании пространст-
венной структуры биополимеров. Пространственная организация
макромолекул и клеточных структур осуществляется в основном
при помощи химических связей, значительно более слабых, чем
ковалентные. Атомы, связанные ковалентно, способны к дополни-
тельным слабым взаимодействиям с другими атомами как в преде-
лах одной молекулы, так и с атомами близлежащих молекул. Сла-
бые взаимодействия участвуют в образовании формы молекул
сложных биополимеров (белков, нуклеиновых кислот), их про-
странственной структуры, а также определяют степень прочности
последней.
К слабым взаимодействиям, иногда их называют вторичными
связями, относят: водородные и ионные связи, ван-дер-ваальсовы
силы, гидрофобные взаимодействия. Прочность химической связи
может быть охарактеризована изменением свободной энергии, ДО
(см. разд. 1.3.2), которое происходит при ее образовании. Для сла-
бых взаимодействий она находится в пределах 4—30 кДж/моль, в
то время как ковалентные связи очень прочные, свободная энергия
их образования составляет 200—450 кДж/моль. Прочность связи
коррелирует с расстоянием между атомами: чем прочнее связь,
тем меньше это расстояние. Ковалентные связи самые короткие —
0,10—0,18 нм, при слабых взаимодействиях межатомное расстояние
составляет 0,20—0,45 нм.
Важную роль в образовании структуры биологических макромо-
лекул играют водородные связи. Они возникают между двумя
электроотрицательными атомами, когда протон водорода, кова-
лентно связанный с одним из этих атомов, располагается между
ними. Электроотрицательными (т. е. обладающими повышенной
способностью притягивать электроны) являются атомы О, N, F,
реже в образовании водородных связей участвуют С1 и S. Атом
водорода содержит единственный электрон, и когда последний ухо-
дит на образование ковалентной связи, ядро остается без электрон-
ных слоев. Такой водород, т. е. протон, не отталкивается, естест-
венно, электронными облаками соседних атомов, а наоборот, при-
тягивается ими, образуя водородную связь.
Обязательное условие образования водородной связи — нали-
чие у электроотрицательного атома хотя бы одной свободной пары
электронов, к которым будет притягиваться атом водорода. Элект-
роотрицательные атомы обладают повышенным сродством к
83
электронам, поэтому они заполняют электронами весь внешний
слой (8 электронов), как бы перегружаясь отрицательными заря-
дами. При этом если возникает пара свободных электронов, она
взаимодействует с протоном. Ниже приведен пример водородной
связи, где б* — избыток положительного или отрицательного за-
ряда, а пунктиром обозначены водородные связи:
— н6+— о5 —
=N6—Нб+——
Водородные связи характеризуются низкой энергией образова-
ния (около 20 кДж/моль), они длиннее ковалентных (0,26—
0,31 нм). Атом водорода, образующий водородную связь, находится
не на равном расстоянии от электроотрицательных атомов, а ближе
к тому атому, с которым образована ковалентная связь.
Водородные связи имеют направленный характер. В наиболее
прочных водородных связях атом водорода расположен по прямой,
соединяющей донорные и акцепторные атомы. Если же водородная
связь располагается под углом к ковалентной, то ее энергия выра-
жается меньшей величиной. Белковая молекула имеет два вида
водородных связей: между группами пептидных связей и между
боковыми радикалами аминокислот.
Водородные связи могут быть внутримолекулярными и межмо-
лекулярными. Целый ряд жидкостей (вода, органические кислоты,
спирты и др.) являются ассоциированными благодаря образованию
межмолекулярных водородных связей. Углерод не способен к об-
разованию водородных связей, потому что его электроотрицатель-
ность значительно меньше, чем у О или N, она довольно близка
к Н. Поэтому углеводородные цепи гидрофобны, они с трудом про-
никают в воду, так как не могут разорвать ее водородные связи.
,0
У соединений с группами —ОН, —NH2, —СООН, —хоро-
ши
шо выражена способность к образованию водородных связей, они
гидрофильны. Молекулы воды, находящейся в состоянии льда, свя-
заны друг с другом водородными связями. При этом каждые шесть
молекул образуют кольцеобразную шестичленную структуру.
В жидкой воде также, видимо, имеются льдоподобные кластеры
(группировки, ассоциации), которые непрерывно распадаются и
вновь возникают. Молекулы воды образуют водородные связи не
только между собой, но и с полярными группами растворенных
соединений. Полярность молекулы воды, способность образовы-
вать водородные связи очень важны в ее роли биологического рас-
творителя — основной среды живых клеток.
Единичные водородные связи, образованные в водном раство-
ре, очень слабы, что объясняется конкуренцией молекул воды с
молекулами растворенного вещества за образование водородных
связей. Однако если в макромолекуле существует большое число
водородных связей, возникает очень большая их суммарная проч-
84
ность. Это явление называют кооперативностью водородных свя-
зей.
Не менее важны в стабилизации структуры биополимеров и их
функционировании гидрофобные взаимодействия. Молекулы воды,
стремясь образовывать между собой водородные связи, выталкива-
ют гидрофобные группы и молекулы, находящиеся в воде, застав-
ляя их скучиваться, образовывать ассоциаты. Этот процесс идет
самопроизвольно, свободная энергия системы при этом уменьшает-
ся, так как слой воды у поверхности гидрофобных групп по срав-
нению с остальной массой воды имеют большую степень структури-
рованности, меньшую энтропию (мера неупорядоченности), а при
объединении гидрофобных групп их общая поверхность уменьшает-
ся. При этом никаких особенных связей между гидрофобными груп-
пами или молекулами не образуется (возможно только возникно-
вение ван-дер-ваальсовых сил притяжения), вследствие чего чаще
говорят о гидрофобных взаимодействиях, а не связях.
Наиболее слабые связи между молекулами обусловлены дис-
персионными силами ван-дер-ваальсова притяжения (иногда их
называют ван-дер-ваальсовыми связями). Они возникают только
на достаточно малом расстоянии между молекулами и имеют в
основе кулоновские силы электростатического притяжения. Ядра
внутри электронных оболочек атомов находятся в постоянном коле-
бательном движении, поэтому возможно временное смещение
электронных орбит относительно ядра, что ведет к образованию
диполя. Последние существуют короткое время, но оно достаточно
для возникновения согласованной ориентации между молекулами.
Следует иметь в виду, что в направлении, противоположном
дисперсионным силам притяжения, действует взаимное отталки-
вание электронных оболочек валентно-несвязанных атомов. С дру-
гой стороны, поскольку ковалентные связи между разными типа-
ми атомов приводят к асимметричному распределению валентных
электронов, большинство атомов молекулы несет парциальные
заряды. Так как суммарный заряд нейтральной молекулы равен
нулю, она может приближенно рассматриваться как набор дипо-
лей или мультиполей, между которыми возникают электростати-
ческие взаимодействия.
Для удобства вычислений обычно объединяют три перечислен-
ные невалентные силы (ван-дер-ваальсово притяжение, отталки-
вание электронных оболочек и электростатические взаимодейст-
вия) в одно силовое поле — потенциал Ван-дер-Ваальса. Такого
рода потенциалы позволяют определить возможные контактные
расстояния пар атомов — ван-дер-ваальсовы радиусы. Принято
считать, что силы ван-дер-ваальсовых взаимодействий обратно
пропорциональны шестой степени расстояния между взаимодей-
ствующими группами. Энергия этих взаимодействий находится в
пределах 4—8 кДж/моль, возможная длина таких связей — 0,33—
0,45 нм (самая большая из всех типов слабых взаимодействий).
Ван-дер-ваальсовы силы имеют большое биологическое значение,
так как они играют определенную роль в процессах самосборки
85
биологических макромолекул и структур, при взаимодействии
между белками и другими биополимерами, в стабилизации тре-
тичной и четвертичной структур биополимеров.
В результате взаимодействия резко отличающихся по свойствам
атомов (например, металлов и металлоидов) образуются ионные
связи. При этом один атом (катион) отдает электрон другому ато-
му, так что образовавшаяся пара электронов принадлежит только
ему (аниону). Наиболее легко отдают электроны атомы щелочных
металлов, максимальное сродство к электронам проявляют атомы
галогенов. В основе ионной связи лежит электростатическое вза-
имодействие. Средняя энергия ионной связи в водных растворах
составляет около 21 кДж/моль, длина колеблется в пределах
0,20—0,33 нм.
Ионные силы очень важны при взаимодействиях между молеку-
лами. Например, притяжение между группами —СОО~ и —NHa"
имеет большое значение в процессе взаимодействия между моле-
кулами белка. Катион Са2+, обладающий двойным зарядом, мо-
жет играть роль «мостика», соединяющего две карбоксильные
группы.
Существенным аспектом всех ионных взаимодействий в водных
растворах является гидратация ионов. Каждый ион в воде окружен
диполями воды, строго ориентированными по отношению к нему.
Гидратация ионов оказывает большое влияние на их взаимодей-
ствие в растворе, определяет наряду с другими факторами силу
кислот и оснований, прочность связи катионов металлов с отрица-
тельно заряженными группами и др.
Известно, что во многих случаях заряд ионизированной органи-
ческой молекулы нейтрализуется или неорганическими катионами
(Na+, К+, Mg2+ и др.), или неорганическими анионами (С1~, SO^
и др.). В водных растворах такие нейтрализующие ионы не могут
занимать фиксированное положение вследствие своей гидратиро-
ванности. Поэтому в водных растворах ионные взаимодействия с
гидратированными неорганическими ионами обычно не играют су-
щественной роли при определении конфигурации органических мо-
лекул.
Важнейшая особенность и вместе с тем достоинство перечис-
ленных слабых взаимодействий состоит в том, что их энергия (4—
30 кДж/моль) не превышает значительно кинетическую энергию
теплового движения (2,5 кДж/моль). Этого небольшого превыше-
ния вполне достаточно, чтобы при физиологических температурах
возникали относительно прочные вторичные связи между молеку-
лами. Однако поскольку разница между энергией слабых взаимо-
действий и кинетической энергией теплового движения невелика,
их разрушение и образование происходят без участия ферментов.
Так как в распределении кинетической энергии молекул наблю-
дается большой разброс, при физиологических температурах всег-
да существуют молекулы, кинетическая энергия которых достаточ-
на для разрушения слабых связей. Это придает межмолекулярным
86
взаимодействиям определенную лабильность. В противном случае
клетка имела бы жесткую структуру типа кристаллической, ско-
рость диффузии была бы очень низкой, а это несовместимо с су-
ществованием живой клетки. В частности, удивительно высокая
активность ферментативного катализа, в известной мере, связана
с тем, что фермент-субстратные комплексы образуются с участием
слабых взаимодействий, поэтому эти комплексы возникают и рас-
падаются быстро даже под влиянием беспорядочного теплового
движения.
2.4.4. Вторичная структура. Вторичная структура — это упоря-
доченное пространственное расположение отдельных участ-
ков полипептидной цепи без учета типа и конформации боковых
радикалов аминокислот. Она образуется за счет замыкания водо-
родных связей между пептидными группами. Вторичная структура
представлена в основном такими регулярными структурами как
а-спираль, складчатые слои (^-структура), p-изгиб. Часть полипеп-
тидной цепи не имеет упорядоченного строения, такие участки на-
зывают аморфными или бесструктурными областями.
В а-спиральных участках и участках с р-складчатой структурой
все последовательно расположенные пептидные звенья полипептид-
ной цепи имеют идентичные взаимные ориентации, поскольку все
торсионные углы ф и все углы ф у Са одинаковы. В таком случае
участок полипептидной цепи имеет линейную структуру, которая
формируется из линейных групп.
Линейная группа представляет собой виток спирали, парамет-
ры которой (смещение вдоль оси, приходящееся на повторяющийся
элемент, число элементов на виток, радиус и др.) зависят от ве-
личины углов ф и ф. Спираль с числом элементов в витке менее
двух невозможна. В белках обнаружено несколько типов линейных
групп, не имеющих стерических затруднений; они стабилизированы
водородными связями либо в пределах одного участка полипептид-
ной цепи (спираль), либо между соседними участками (p-складча-
тая структура). Когда торсионные углы близки к —60, —45°,
вторичная структура представлена правыми а-спиралями. Этот тип
спирали, описанный Л. Полингом, обладает наименьшей свободной
энергией, наиболее «выгоден» с учетом ограничений, налагаемых
геометрией пептидной связи и допустимыми изменениями углов
Ф и ф.
В а-спирали все водородные связи примерно параллельны оси
спирали и коллинеарны друг другу, что отвечает минимуму свобод-
ной энергии; каждая карбонильная группа образует водородную
связь с четвертой по ходу цепи NH-группой.
О...............н
—С—(NH—CHR—СО)3—N—
При образовании а-спиралей замыкается максимально возмож-
ное число водородных связей, что придает прочность этой структу-
ре. а-Спираль характеризуется следующими параметрами: число
S7
.аминокислотных остатков на виток спирали — 3,6; число атомов в
витке, замыкаемом водородной связью, — 13; формула спирали
3,61з]; диаметр спирали —0,5 им; шаг спирали
ция одного аминокислотного остатка
остатка на оси) ~0,15 нм (рис. 2.9).
0,54 нм; трансля-
вдоль осн спирали (проекция
Рис. 2.9. Участок а-спиральной структуры
белка
В природных белках
обнаружены только пра-
вые а-спирали. Боковые
радикалы аминокислот в
а-спирали обращены на-
ружу и расположены по
разные стороны от ее оси.
Неполярные боковые ра-
дикалы аминокислот
обычно группируются на
одной стороне а-спирали,
образуя неполярные ду-
ги; это создает условия
для сближения разных
спиральных участков.
Кроме а-спирали опи-
саны и другие типы спи-
ральных структур, неко-
торые их параметры при-
ведены в табл. 2.4.
Из табл. 2.4 видно, что
кроме а-спирали в белках
обнаружены и другие
типы спиралей, например
Зю и л-спираль, которые
встречаются редко, в ос-
новном на коротких уча-
Таблица 2.4. Спиральные конфигурации белков
Название Формула Радиус, нм Проекция остатка на ось, нм Примечание
Зю Зю 0,19 0,20 Напряженная структура, встре- чается редко в виде 1—2 вит- ков на концах а-спирали
а-Спираль З,613 0,23 0,15 Универсальная конфигурация
и-Спираль 4,4i6 0,28 0,11 Встречается редко в виде 1—2 витков на концах а-спи- рали
1 Б последние годы вводится новая система обозначений. В соответствии
с ней запись Nm расшифровывается следующим образом: М — минимальное чис-
ло витков, на которых укладывается целое число N остатков; при такой форме
записи а-спираль обозначается как 18s.
88
стках, образуя на концах а-
спирали 1—2 витка.
Складчатые структуры по-
липептидной цепи образуются
в том случае, когда торсион-
ные углы ср и гр близки к —120,
+ 135°. Следует оговориться,
что хотя при описании вторич-
ной структуры белков складча-
тые структуры отличают от
спиральных, и те и другие фак-
тически являются спиральны-
ми; только в случае складча-
тых структур эта спираль
сильно вытянута. В складча-
тых цепях число остатков на
«виток» равно 2 (в плоском
складчатом слое) или 2,3 (в
слегка скрученном слое), про-
екция остатка на ось —
0,33 нм, радиус «спирали» —
0,1 нм. Складчатые участки
полипептидной цепи проявля-
ют кооперативные свойства,
т. е. стремятся расположиться
рядом в белковой молекуле, и
Рис. 2.10. Параллельная 0-структура
белка
формируют параллельные и антипараллельные складчатые слои,
или листы, которые укрепляются благодаря водородным связям
между складчатыми участками цепи (рис. 2.10, 2.11).
Рис. 2.11. Антипараллельная 0-структура белка
89
Антипараллельная ^-струк-
тура образуется, в том случае,
если складчатая цепь делает
поворот назад и идет вдоль са-
мой себя, т. е. в обратном на-
правлении; в месте поворота
образуется 3-изгиб (рис. 2.12).
В 3-изгиб входят четыре пос-
ледовательно расположенных
аминокислотных остатка. Па-
раллельная ^-структура скла-
дывается участками из поли-
пептидной цепи, направления
которых совпадают. Антипа-
раллельность цепей создает
наиболее благоприятные усло-
вия для возникновения водо-
родных связей между ними
при участии пептидных групп.
В случае параллельного рас-
положения цепей в структуре
складчатого 3-слоя водородные
связи между цепями менее
прочны. Боковые радикалы
аминокислотных остатков
(точнее связи Са — Ср) при-
близительно перпендикулярны
плоскости р-складчатых слоев,
причем боковые цепи аминокислот ориентированы поочередно то
по одну, то по другую сторону этол плоскости.
Складчатые слои могут образовываться не только одной поли-
пептидной цепью (при этом водородные связи будут внутри данной
цепи), но и группой близко расположенных полипептидных цепей
в молекуле (водородные связи будут замыкаться между цепями).
3-Структура второго типа характерна для таких фибриллярных
белков, как фиброин шелка, кератин волос, состоящих из несколь-
ких полипептидных цепей. У глобулярных белков в формировании
3-складчатой структуры принимает участие обычно около 15%
аминокислотных остатков полипептидной цепи. Большинство
складчатых слоев содержит менее шести цепей. Как правило,
складчатые слои не являются плоскими, для них характерна не-
большая левая закрученность.
На некоторых участках белковой цепи встречается нерегулярная
укладка аминокислотных остатков в пространстве, которая также
удерживается благодаря водородным связям и гидрофобным
взаимодействиям. Такие области в белковой молекуле называются
неупорядоченными, бесструктурными или аморфными.
Короткие а-спирали и 3-структуры формируются в различных
90
Рис. 2.13. Общий вид ле-
вой двухцепочечной су-
перспирали
по длине полипептидной цепи участках, между этими упорядочен-
ными типами структур находятся бесструктурные области.
2.4.5. Сверхвторичная структура и домены. а-Спиральные и
p-структурные участки в белках могут взаимодействовать друг с
другом и между собой, образуя ансамбли. Пространственное строе-
ние таких ансамблей вторичной структуры
называют сверхвторичной структурой бел-
ковой молекулы. Встречающиеся в натив-
ных белках сверхвторичные структуры —
энергетически наиболее предпочтительны.
Пример сверхвторичной структуры —
суперспирализованная а-спираль, в кото-
рой две а-спирали скручены друг относи-
тельно друга, образуя левую суперспираль
(рис. 2.13). Короткие участки этой сверх-
вторичной структуры встречаются в глобу-
лярных белках (бактериородопсин, гемэ-
ритрин), а чаще и в наиболее упорядочен-
ной форме — в фибриллярных белках. Су-
перспирализация выгодна энергетически,
так как между боковыми радикалами ами-
нокислот, принадлежащих разным а-спира-
лям, образуются дополнительные некова-
лентные контакты (ван-дер-ваальсовые).
Сверхспираль могут образовывать а-спира-
ли, расположенные как параллельно, так и
антипараллельно.
Другим возможным элементом сверхвторичной структуры яв-
ляется р%р-звено (рис. 2.14), состоящее из двух параллельных
р-слоев с сочленением между
ка (рср), а-спирали (Рсф),
p-структуры (РРР). Два по-
следовательно соединенных
участка рар называются
укладкой цепи по Россману
(Рарар-звено). Этот тип
сверхвторичной структуры
найден в НАД+-связываю-
щем домене дегидрогеназ.
Сверхвторичная структу-
ра в виде антипараллельной
трехцепочечной p-структуры
(РРР) называется ^-зигза-
гом, Она довольно широко
распространена в белках,
например в стафилококко-
вой нуклеазе, лактатдегид-
рогеназе, Г4-лизоциме и ря-
де других белков.
ними в виде неупорядоченного клуб-
Рис. 2.14. Сверхвторичные структуры бел-
ков. А — 0ср-звено; Б — укладка цепи по
Россману (два последовательно соединен-
ных участка (Зсф); В — 0-зигзаг:
стрелками обозначены (3-складчатые слон, ци-
линдрами — а-спирали, аморфные области зачер-
нены
91
Следующим уровнем организации, присущим крупным глобу-
лярным белкам, являются домены, Они представляют собой струк-
турно и функционально обособленные области (субобласти) моле-
кулы, соединенные друг с другом короткими участками полипептид-
ной цепи, которые называются шарнирными участками, Функцио-
Рис. 2.15. Домены глицеральдегидфосфатдегидрогеназы
из мышц омара, А — НАД+-связываюший домен; Б —
каталитический домен.
цифрами обозначены аминокислотные остатки, остальные обо
значения те же, что в рис. 2.14
92
нальные домены могут состоять из одного или нескольких струк-
турных доменов. Вероятнее всего, функциональные домены, у кото-
рых молекулярная масса выше 20 000, содержат несколько струк-
турных доменов.
Большинство крупных глобулярных белков можно разделить
на несколько структурных доменов, содержащих 100—150 амино-
кислотных остатков и имеющих диаметр около 2,5 нм. Структурные
домены обнаружены, например, у фермента глутатионредуктазьц
катализирующего переход окисленного глутатиона в восстановлен-
ный (трипептид глу-цис-гли). Этот фермент является димером, т. е.
его молекула построена из двух полипептидных цепей — субъеди-
ниц. Каждая из субъединиц, в свою очередь, состоит из трех струк-
турных доменов, выполняющих свою определенную функцию при
действии фермента.
Для ряда ферментов показано, что в углублении между доме-
нами располагается активный центр. Так, в глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназе выделяют два функциональных домена: НАД+-свя-
зывающий и каталитический, формирующие активный центр
(рис. 2.15).
Рубредоксин
(jt-белок)
Миоглобин
('а - делок)
Триозоуроссратизомерази
[и/#-белок)
Миогемэритрин
(к-белок)
Рлаводоксин
(&/р- белок)
Рис. 2.16. Классификация глобулярных белков в соответствии с представитель-
ством и расположением в их молекулах^а- и P-структур (по Ю. Б. Филипповичу,
А — расположение а- и p-структур (обозначены кружками и прямоугольниками соответст-
венно) в а-. Р-, (а+Р)- и а/Р-белках; стрелками указан ход полипептидной цепи от N-конца
к С-концу молекулы:
JS — строение трех представителей а-. Р- и а/Р-белков; где а-структура представлена в виде
спирали, Р-структура — в виде стрелок. У миогемэритрина заштрихованными кружками по-
казаны два атома железа, у эрабутоксина пунктиром — четыре дисульфидных мостика;
у флаводоксина группировка, ответственная за передачу атомов водорода, изображена
вверху в виде трех конденсированных шестичленных колец
93
В некоторых глобулярных белках (сериновые протеиназы, им-
муноглобулины) структурные домены в молекуле очень сходны, что
наводит на мысль о дупликации генов. Сходные структурные до-
мены могут встречаться и в разных белках, например, НАД+-свя-
зывающий домен в дегидрогеназах.
Во всех глобулярных белках, состоящих из доменов, существу-
ет высокая степень сродства между близко расположенными по це-
Рис. 2.17. Укладка полипеп-
тидной цепи флаводоксина в
пространстве.
Стрелками показан ход цепи от
N-конца к С-концу в области
«твист» -структуры
пи аминокислотными остатками. На
основании этого предполагают, что
домены формируются независимо
друг от друга, что упрощает процесс
укладки макромолекул.
Структурные домены и белки по ор-
ганизации вторичной структуры поли-
пептидной цепи, т. е. по количеству а-
спиралей и p-структур, характеру их
расположения в доменах предложено
разделять на пять классов или групп
(рис. 2.16).
Первая группа (а-белки) включает
те белки, в которых преобладают а-
спирали. Сюда, в частности, относятся
гемоглобин, миоглобин, кальцийсвязы-
вающие белки.
Вторая группа (р-белки) содержит
белки, построенные в основном из ан-
типараллельных p-слоев, например
конканавалин А — лектин из канава-
лии мечевидной, рубредоксин — простейший железосерный белок,
переносчик электронов, химотрипсин.
К третьей группе принадлежат а- +р-белки, у них имеются
участки, целиком построенные из а-спиралей, и участки, целиком
состоящие из p-слоев, в основном антипараллельных. Примерами
такого типа белков являются; папаин — протеолитический фер-
мент из плодов дынного дерева, термолизин, инсулин, цитохром 65,
рибонуклеаза, лизоцим.
Четвертая группа — это а/p белки, в них а-спирали и р-струк-
туры чередуются по ходу цепи. Большинство p-структур, преиму-
щественно параллельных, оказывается локализованным в цент-
ральной части молекулы, где эти структуры изгибаются в виде
пропеллера («твист»-структуры), .образуя жесткую «основу», с
которой связаны остальные участки молекулы (рис. 2.17). К бел-
кам четвертой группы принадлежат карбоксипептидаза, гексокина-
за, фосфоглицераткиназа, триозофосфатизомераза, субтилизин,
лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа.
В пятую группу входят домены без выраженной вторичной
структуры. Пространственная структура белка значительно более
консервативна, чем его аминокислотный состав. Тип свертывания
полипептидной цепи иногда позволяет устанавливать такие род-
94
ственные связи между белками, которые не улавливаются при ами-
нокислотном анализе.
2.4.6. Третичная структура. Третичная структура характеризует
пространственное расположение упорядоченных и аморфных участ-
ков в полипептидной цепи в целом, которое достигается за счет
взаимодействия боковых радикалов и зависит от их типа и конфор-
мации. Таким образом, третичная структура описывает простран-
ственную укладку всей молекулы белка, если она образована одной
полипептидной цепью. Третичная структура имеет прямое отноше-
ние к форме молекул белка, которая может быть различной: от
шарообразной до нитевидной. Форма белковой молекулы характе-
ризуется таким показателем, как степень асимметрии (отношение
длинной оси молекулы к короткой). К нитевидным, или фибрил-
лярным, белкам относят белки, имеющие степень асимметрии 80
и выше, это фиброин шелка, кератин волос, рогов, копыт, колла-
ген соединительной ткани и некоторые другие белки. При степени
асимметрии менее 80 белки относят к глобулярным-, большинство
из них имеет степень асимметрии 3—5. Таким образом, у глобу-
лярных белков третичная структура ' характеризуется достаточно
плотной упаковкой полипептидной цепи в виде клубкообразной мо-
лекулы, приближающейся по форме к шару.
В поддержании третичной структуры глобулярных белков, ее
закреплении принимают участие различные типы связей (рис. 2.18):
Рис. 2.18. Связи, стабилизирующие третичную структуру белковой моле-
кулы:
1— ионная связь, // — водородная связь, /// — гидрофобные взаимодействия, IV —
ковалентная связь
95
ковалентные, ионные, или солевые, водородные и гидрофобные
взаимодействия (указаны в порядке убывания энергии связи).
Преимущественную роль в формировании третичной структуры
отводят гидрофобным взаимодействиям, возникающим между не-
полярными боковыми радикалами аминокислот.
Ковалентные связи, участвующие в поддержании третичной
структуры белка, представлены дисульфидными и пептидными
связями, последние образованы за счет амино- и карбоксильных
групп боковых радикалов аминокислот. Дисульфидные связи воз-
никают между двумя близко расположенными SH-группами боко-
вых цепей цистеина. К замыканию ковалентных дисульфидных
связей (—S—S—) приводит окисление сульфгидрильных (тиоль-
ных) групп в присутствии кислорода или некоторых других реа-
гентов. In vivo эти связи образуются самопроизвольно, если тиоль-
ные группы в результате пространственной укладки полипептидной
цепи оказываются расположенными рядом, т. е. дисульфидные
связи стабилизируют конформацию молекулы, но не определяют
характер свертывания полипептидной цепи. В рибонуклеазе и ли-
зоциме, содержащих четыре дисульфидные связи, теоретически
возможно образование 44 = 256 вариантов S—S-связей, однако
реализуется в нативной конформации только четыре.
Дисульфидные связи наиболее часто встречаются в секретируе-
мых белках (змеиные яды, пептидные гормоны, пищеварительные
ферменты, белки молока и др.). Наличием большого числа дисуль-
фидных мостиков в фибриллярных белках (например, кератине),
способных к взаимному превращению с сульфгидрильными груп-
пами, т. е. к временному разрыву и образованию заново, отчасти
объясняются свойства вязкости и эластичности этих белков.
Дисульфидные мостики никогда не образуются между соседними
остатками цистеина.
Солевые, или ионные, связи возникают между группами бел-
ков, имеющими противоположные заряды, т. е. между боковыми
радикалами аминокислот, диссоциированными по кислотному и
основному типам. В качестве основных групп могут выступать
з-аминогруппа лиз, гуанидиновая группа арг, имидазольная группа
гис (один из его атомов азота обладает основными свойствами,
другой — кислотными). Помимо гистидина кислотными группами
в белках могут быть p-карбоксильная группа асп и у-карбоксиль-
ная — злу.
Группы, способные к ионизации, и полярные группы аминокис-
лот (см. разд. 2.3.3) обычно находятся на поверхности белковой
глобулы и реже встречаются внутри. Так, на поверхности химо-
трипсина расположены 4 остатка аре и 14 лиз, которые обусловли-
вают суммарный заряд 18 ( + ), а также? остатковасп и 5 глу, оп-
ределяющие суммарный заряд 12 (—). Заряженные группы на по-
верхности белковой глобулы обычно сольватированы и окружены
противоионами, что увеличивает растворимость белков в водной сре-
де. Полярные боковые радикалы аминокислот, находящиеся внутри
96
белковой молекулы, обычно образует водородные связи между
собой или с полипептидным остовом.
Нахождение заряженных групп внутри глобулы энергетически
невыгодно, поэтому они там встречаются редко. Если все-таки за-
ряженные группы локализуются внутри глобулы, то они образуют
солевые мостики.
Гидрофобные боковые радикалы, не имеющие сродства к воде,
оказываются компактно упакованными, в основном, внутри гло-
булы, образуя гидрофобные области, стабилизирующие третичную
структуру молекулы. В связи с этим диэлектрическая проницае-
мость (е ) внутри белковой глобулы значительно меньше, чем у
воды. Гидрофобные области (ядра) в центре белковой глобулы
имеют высокую плотность упаковки, характерную для многих
кристаллов. Более низкая плотность упаковки получена для по-
верхностных участков молекулы, например, активных центров фер-
ментов, что согласуется с предположением о подвижности центров.
В среднем плотность упаковки белковой молекулы тоже достаточ-
но высока, что свидетельствует об эффективном использовании не-
ковалентных сил при организации пространственной структуры
белковой молекулы. Небольшая часть неполярных радикалов мо-
жет находиться на поверхности молекулы, и, скапливаясь, образо-
вывать гидрофобные кластеры. Таким образом, в целом поверхность
белковой глобулы мозаична: в основном гидрофильна, но содержит
и небольшие неполярные участки.
Только после приобретения белком нативной третичной струк-
туры он проявляет свою специфическую функциональную актив-
ность. Пространственной структурой белка и взаимным располо-
жением отдельных групп определяются биологические функции
белковой молекулы в организме. Активные центры ферментов,
центры, связывающие лиганды, ответственные за встраивание дан-
ного белка в мультиферментный комплекс и самосборку надмоле-
кулярных структур, а также антигенные детерминанты белка об-
разуются из пространственно сближенных групп при формирова-
нии третичной структуры. Например, сходная биологическая функ-
ция гемоглобина и миоглобина, обусловленная их способностью
обратимо связывать кислород, объясняется сходством третичной
структуры их полипептидных цепей. Активные центры у мономер-
ных ферментов формируются в процессе свертывания полипептид-
ной цепи, причем у мультидоменных ферментов активные центры
включают участки всех структурных доменов данного глобулярно-
го белка, в результате чего активный центр оказывается распо-
ложенным между ними.
Фибриллярные белки выполняют в организме, в основном,
структурную функцию. Это плохо растворимые или нерастворимые
белки, отличающиеся высоким содержанием неполярных амино-
кислот. К ним принадлежат, например, белки соединительных и
сократительных тканей, волос, кожи, некоторые белки клеточных
оболочек растений, водорослей и ряд других белков. Молекулы фиб-
риллярных белков построены чаще всего из нескольких полипеп-
4—937
97
тидных нитей, имеющих структуру а-спирали (а-кератины, мио-
зин), р-складчатых слоев (p-кератины, фиброин) или скрученных
в особый вид спирали (коллагены).
Образование полипептидными нитями длинных, вытянутых по
форме молекул и будет в целом характеризовать третичную
структуру фибриллярных белков. Коллаген входит в состав соеди-
нительной ткани животных и человека, где образует так называе-
мые нити или коллагеновые волокна. Они построены из фибрилл,
структурной единицей которых, в свою очередь, является тропо-
коллаген.
Молекула тропоколлагена (М 300 000) состоит из трех поли-
пептидных нитей, каждая из которых скручена в плотную левую
спираль с тремя аминокислотными остатками в витке. Три цепи
вместе слегка закручены в правую спираль и образуют молекулу
тропоколлагена диаметром 1,5 нм и длиной 300 нм. Взаимораспо-
ложение пептидных цепей в молекуле стабилизируется водородны-
ми связями между пептидными группами соседних цепей и кова-
лентными связями между лизином, гидроксилизином, аллизином
и гидроксиаллизином (последние две аминокислоты образуются в
результате окисления 8-NH2-rpynn до альдегидных). При взаимо-
действии указанных аминокислотных остатков получаются шиффо-
вы основания и альдоли.
Для тропоколлагена характерно высокое содержание глицина
(7з аминокислотных остатков) и иминокислот (пролин, гидрокси-
пролин — 21%); в большом количестве встречается аланин (11%).
В составе коллагенов в небольшом количестве обнаружен 5-гидр-
оксилизин, редко встречающийся в других белках. Описано не-
сколько типов коллагенов, отличающихся друг от друга набором
полипептидных цепей, аминокислотным составом. Например, трой-
ная спираль коллагена большинства позвоночных состоит из двух
агцепей и гомологичной аз-цепи, щ- и а2-Цепи имеют небольшие
отличия в аминокислотном составе. Фибриллы коллагена образуют-
ся из молекул тропоколлагена при их соединении «конец к концу»
и «бок о бок». В кипящей воде коллаген частично растворяется,
образуя раствор желатины, который при охлаждении переходит в
гель. . '
Белки волос, рогов, кожи, перьев (а-кератины) состоят из 3—7
полипептидных цепей, включающих приблизительно 100 аминокис-
лотных остатков и имеющих a-спиральную конфигурацию. Поли-
пептидные цепи, связанные дисульфидными мостиками, скручива-
ясь вместе, образуют левую суперспираль; из суперспиральных
структур формируются микрофибриллы диаметром около 2 нм.
При обработке a-кератинов горячим паром нарушается система
внутрицепочечных водородных связей в каждой полипептидной
нити, и при их растягивании они переходят в состояние р-склад-
чатых слоев (fi-кератин). В p-кератине водородные связи образу-
ются между отдельными полипептидными нитями. Повторяющей-
ся единицей кератинов является последовательность: — цис —
цис — глу — про — сер —.
98
Сходную с p-кератином пространственную структуру имеет
фиброин шелка. Этот белок богат глицином, серином и аланином.
В фиброине соседние цепи антипараллельны: С- и N-концы у них
не совпадают; S—S-связи между цепями отсутствуют. Фиброин
шелка состоит, в основном, из следующей периодически повторяю^
щейся последовательности:—гли—сер—ели—ала—гли—ала—. При
образовании складчатой структуры все боковые группы ала и сер
оказываются по одну сторону цепи, а гли — по другую. Структура,
сходная с а-кератином, лежит в основе мышечных белков миозина
и тропомиозина.
Волокнистый фибриллярный белок обнаружен в опорных струк-
турах у диатомовых водорослей, он наряду с SiO2 принимает
участие в образовании скелета диатомей. Этот белок помимо гидр-
оксипролина содержит дигидроксипролин, а также e-N-триметил-
гидроксилизин и некоторые другие редкие аминокислоты. В опор-
ных белках кораллов, губок, медуз обнаружены бромтирозин, иод-
тирозин. В состав первичной клеточной стенки высших растений
входит фибриллярный белок экстенсии, очень богатый гидрокси-’
пролином (до 33%). Экстенсии существует в виде жестко закручен^
ной левой спирали. Этот белок связан с гемицеллюлозой клеточ-
ных стенок за счет гликозидной связи между арабинозой или га-
лактозой и гидроксипролином.
В наружном скелете насекомых обнаружен белок ресилин, бо-
гатый гли и ала. Он не содержит гидроксипролина и серосодержа-
щих аминокислот, чем напоминает фиброин шелка.
Наиболее информативным методом изучения пространственной
структуры белковых молекул (вторичной, сверхвторичной, третич-
ной) является метод рентгеноструктурного анализа (РСА). С его
помощью устанавливают распределение электронной плотности в
кристалле и тем самым пространственное строение молекул, обра-
зующих кристалл. Результаты исследования белков методом РСА
позволяют построить пространственную модель молекулы: опреде-
лить расположение полипептидной цепи в пространстве, найти
участки, образующие регулярные структуры, изгибы цепи и др.,
выявить пространственное расположение аминокислотных остат-
ков и контакт их с другими остатками, места присоединения не-
белковых частей (в случае сложных белков, двухкомпонентных
ферментов). Сведения о наличии упорядоченных структур в белке,
их типе и общей доле в цепи, конформационных изменениях бел-
ков в растворах дают оптические методы — ДОВ, КД, ИК-спектро-
скопии и др., а также метод ядерного магнитного резонанса
(ЯМР).
В настоящее время применяют расчетные, теоретические мето-
ды для определения характера укладки полипептидной цепи на
основе данных о первичной структуре. Это направление работ ши-
роко представлено в Институте белка АН СССР.
2.4.7 Четвертичная структура. Четвертичную структуру имеют
те белки, молекула которых состоит из двух и более полипептид-
ных цепей, связанных нековалентно. Четвертичная структура ха-
4* 99
рактерна, как правило, для белков, относительная молекулярная
масса которых больше 50 000—100 000. Белки, имеющие четвертич-
ную структуру, называются олигомерными.
Под четвертичной структурой понимают способ взаимного рас-
положения в пространстве отдельных полипептидных цепей в мо-
лекуле, характер связей между ними. Каждая отдельная полипеп-
тидная цепь в составе молекулы белка с четвертичной структурой
называется протомером или субъединицей. Термин субъединица
некоторые авторы используют только по отношению к части моле-
кулы, обладающей функциональной активностью. Она может быть
представлена как одним протомером, так и несколькими. К белкам
с четвертичной структурой относят иногда и сложные надмолеку-
лярные белковые структуры, в которых объединяются до не-
скольких сотен субъединиц, например, жгутики бактерий, головки
вирусов и т. д. Такие белки предлагают также называть мульти-
мерными. Объединение протомеров в любом неопределенном коли-
честве, не ведущее к появлению новых биологических свойств
белка, называют в отличие от четвертичной структуры агрегиро-
ванным состоянием.
Большинство внутриклеточных белков является олигомерными,
внеклеточные белки — мономеры с небольшой молекулярной мас-
сой, белки плазмы крови — крупные мономеры. Такая взаимо-
связь в строении и локализации белков, очевидно, не случайна.
Мономерность внеклеточных белков, например ферментов пище-
варительного тракта, лизоцима слюны, связывается с неопределен-
ностью судьбы молекул и, как следствие, целесообразностью су-
ществования большого числа независимых единиц. Большая мо-
лекулярная масса белков — мономеров плазмы крови (>60 000) —
препятствует их фильтрации и выделению почками, легкому про-
никновению во внешнее пространство. Примером такого белка
служит сывороточный альбумин, содержащий несколько функцио-
нальных доменов.
Присутствие большого числа различных олигомерных белков
внутри клетки снижает осмотическое давление в ней, вязкость,
кроме того, олигомерные белки хорошо регулируются эффектора-
ми (см. разд. 12.5). Биологический смысл олигомерности белков
связан также с тем, что для их кодирования требуется меньше ге-
нетического материала в том случае, если все или некоторые
субъединицы белковой молекулы идентичны. У таких олигомеров
существует меньшая вероятность возникновения дефектных моле-
кул, чем у крупных мономеров с той же молекулярной массой.
Дефектные субъединицы в процессе диссоциации и реассоциации
устраняются. Наиболее часто в олигомерной белковой молекуле
насчитывается две или четыре субъединицы, реже 6, 8 и больше
или нечетное число. Взаимное расположение отдельных субъеди-
ниц в молекулах белков с четвертичной структурой, а также в
надмолекулярных белковых структурах может быть различным,
оно зависит от формы субъединиц, их числа и отвечает минимуму
свободной энергии. Различают изологические и гетерологические
100
случаях обра-
одних
в
Б
субъ-
Рис.
А
2.19. Гетерологическое связывание
единиц. А — кольцо; Б — спираль
при-
взаимодействия между субъединицами в макромолекуле. В случае
гетерологического взаимодействия каждая из субъединиц одного
типа имеет взаимно комплементарные участки а и & (рис. 2.19).
При соединении двух таких субъединиц у одной остается свобод-
ный участок а, а у другой — Ь. К этим участкам могут присоеди-
няться аналогичные субъединицы, причем в
зуются длинные цепи, в
других — кольцо или спи-
раль. Кольца, образован-
ные только за счет гете-
рологических взаимодей-
ствий обладают цикличе-
ской симметрией: при по-
вороте вокруг оси сим-
метрии на определенный
угол каждая субъедини-
ца может быть совмеще-
на со следующей. В за-
висимости от геометрии
субъединиц их число в
кольце может быть различным.
Если углы, возникающие между двумя субъединицами, не
водят к замыканию кольца, образуется спираль. В этом случае
кроме гетерологических контактов типа ab могут возникать допол-
нительные взаимодействия при наличии других комплементарных
участков. Спиральные структуры разных типов из белковых субъ-
единиц представляют собой нити актина мышечного волокна, ви-
рионы некоторых вирусов, жгутики бактерий и др.
Если две одинаковые субъединицы белка образуют пару идеи- У
тичных связей типа ab, такое взаимодействие называется изологи-
ческим (рис. 2.20). Подобная структура обладает осью симметрии
второго порядка, т. е. каждая точка одной субъединицы может
быть совмещена с такой же точкой другой субъединицы при пово-
роте вокруг оси симметрии на 360°/2=180°. При наложении двух
изологических димеров друг на друга между ними могут возникать
дополнительные изологические связи, при этом образуются тетра-
мерные структуры с диэдрической симметрией. Примерами таких
структур могут быть фермент лактатдегидрогеназа и растительный
агглютинин конканавалин А.
В крупных белковых структурах существуют два типа контак-
тов — гетерологические и изологические. При этом обычно возни-
кают олигомеры разных форм с кубической симметрией (много-
гранники типа тетраэдра куба, икосаэдра). Структуры с кубиче-
ской симметрией обладают более чем одной осью симметрии, по-
рядок которой выше двух. Кубическая симметрия характерна
для капсид некоторых вирионов — бактериофаг фХ174, вирус
SV40, папилломы человека, аденовирусы, вирус гриппа и т. д.
Четвертичная структура многих белков и надмолекулярных
белковых структур формируется из протомеров двух или болыпе-
101
Рис. 2.20.
Изологическое связывание
субъединиц (объяснение см. в тексте)
го числа типов. Так, гемоглобин — тетрамер, построенный из двух
похожих, но неидентичных субъединиц аир (агРг), фермент acnap-
тат-карбомоилтрансфераза из 12 субъединиц (два тримера — ка-
талитические субъединицы и три димера — регуляторные субъеди-
ницы). Чехлы некоторых вирусов также построены из протомеров
двух и большего числа типов. Для структур, сформированных из
неидентичных субъединиц, тоже характерно симметричное их рас-
положение.
Между субъединицами, составляющими молекулу белка с чет-
вертичной структурой, могут возникать связи различных типов:
гидрофобные взаимодействия, ионные и водородные связи. Кон-
тактные поверхности субъединиц, формирующих четвертичную
структуру, комплементарны, что вносит свой вклад в упрочение мо-
лекул белка. Специфичность ассоциации достигается комплемен-
тарностью профилей контактных поверхностей, а также оптималь-
ным взаиморасположением доноров и акцепторов водородных свя-
зей и заряженных остатков. Однако основными связями, закреп-
ляющими четвертичную структуру, являются гидрофобные. Име-
ются гидрофобные участки («липкие» пятна) на контактирующих
поверхностях протомеров, которые мешают воде образовывать
межмолекулярные связи, иммобилизуют ее. В соответствии со
вторым законом термодинамики стремление системы, содержащей
молекулы воды, к максимальной энтропии, когда между молеку-
лами есть водородные связи, заставляет протомеры так сблизить-
ся, чтобы между ними не было воды. Гидрофобные участки «сли-
паются», комплементарная электрозаряженность отдельных точек
102
усиливает скрепление протомеров, субъединиц. Поскольку отдель-
ные протомеры в молекуле связаны нековалентно, вполне законо-
мерен вопрос — одна ли это молекула. Так как все протомеры
четвертичной структуры прочно связаны друг с другом (пусть не-
ковалентно) и только будучи объединенными выполняют возни-
кающую при этом биологическую функцию, всю систему следует
считать одной молекулой.
Одним из методов анализа четвертичной структуры является
электронная микроскопия} этот метод может дать полезную ин-
формацию, если белок достаточно велик, имеет молекулярную мас-
су более 200 000.
Заключение о наличии четвертичной структуры можно-сделать
и на основе определения молекулярных масс в различных услови-
ях: близких к нативным и в присутствии денатурирующих хими-
ческих агентов, диссоциирующих молекулу на отдельные протоме-
ры (гуанидингидрохлорид, додецилсульфат натрия, мочевина^
нейтральные соли в высоких концентрациях). Если в обоих случа-
ях получают одно и то же значение молекулярной массы, то белок
не имеет четвертичной структуры и построен из одной полипептид-
ной цепи.
В том случае, когда белок является олигомером, построенным
из одинаковых по величине субъединиц, получающаяся в присут-
ствии химических агентов молекулярная масса должна быть крат-
на таковой нативной молекулы белка. Например, если белок со-
держит два протомера, то молекулярная масса после денатурации
равняется половине нативной и т. д. Присутствие в белке субъеди-
ниц различных размеров устанавливается с помощью электрофоре-
за в полиакриламидном геле или гель-фильтрацией на колонке с
молекулярными ситами, например сефадексами. В таком случае
обработка олигомерных белков додецилсульфатом натрия при-
водит к диссоциации молекул на субъединицы и появлению двух
и более фракций, отличающихся от исходной по величине молеку-
лярной массы.
Четвертичной структуре принадлежит большая роль в регуля-
ции биологической активности белков, ибо она очень чувствитель-
на к внешним условиям: небольшие их отклонения могут вызывать
изменение взаиморасположения субъединиц и в связи с этим из-
менение биологической активности белка. Это явление представля-
ет собой один из основных механизмов регуляции метаболизма, по-
скольку многие ферменты и некоторые другие метаболически ак-
тивные белки имеют четвертичную структуру.
2.4.8. Взаимосвязь отдельных уровней структуры, упорядочен-
ность и относительная динамичность белковой молекулы. Подроб-
ное изучение строения глобулярных и фибриллярных белков пока-
зало, что для каждого индивидуального белка характерна своя про-
странственная структура — конформация: В ее формировании ве-
дущая роль принадлежит первичной структуре, т. е. генетически
детерминируемой аминокислотной, последовательности. Об этом
свидетельствует, в частности, способность полипептидных цепей к
103
самопроизвольной укладке в пространстве с образованием той
конформации, которая соответствует первичной структуре данного
полипептида.
Предложена классификация аминокислотных остатков по их
способности к образованию тех или иных регулярных структур.
Образованию а-спирали способствуют такие аминокислоты, как
глу, ала, лей, в то время как мет, вал, иле чаще встречаются в
составе (3-структуры, а гли, про, асн — в местах изгиба цепи (они
дестабилизируют а-спираль). В том случае, если на каком-то
участке оказываются рядом по ходу цепи несколько остатков, спо-
собствующих образованию спирали, имеет место формирование
этой структуры. Считается, что шесть сгруппированных остатков,
четыре из которых способствуют образованию спирали, можно рас-
сматривать как центр спирализации. От этого центра идет рост
спиралей в обоих направлениях до участка — тетрапептида, со-
стоящего из остатков, которые препятствуют образованию этих
спиралей. При формировании p-слоя роль затравок выполняют три
аминокислотных остатка из пяти, способствующие образованию
р-структуры.
Подтверждением положения о ведущей роли первичной струк-
туры при образовании нативной конформации являются также
опыты по ренатурации белков. Устранение денатурирующих воз-
действий приводит в ряде случаев к самопроизвольной ренатура-
ции, результатом чего является восстановление нативной конфор-
мации и специфической биологической функции. Так. К. Б. Анфин-
сену (1975) удалось подобрать условия ренатурации РНКазы, при
которых она может после денатурации возвращаться к исходному
нативному состоянию.
Первичная структура субъединиц белков определяет и их чет-
вертичную структуру, что доказывается данными рентгенострук-
турного анализа и фактами реконструкции биологически активных
белков из диссоциированных субъединиц. Так в ацетоне при кислом
pH происходит денатурация глобиновой части гемоглобина, отде-
ление гема и диссоциация на субъединицы. Нейтрализация pH
приводит к объединению гема с глобином и ассоциации субъединиц
с образованием нативного гемоглобина.
Предполагают, что первичная структура белков определяет не
только их конформацию, но и пути, порядок ее достижения. В мо-
лекуле белка, видимо, есть достаточно автономные «узлы», «бло-
ки», которые осуществляют укладку своей конформации незави-
симо друг от друга. Такими «блоками» могут быть те а-спирали и
p-структуры, которым свойственна высокая степень сродства к
близким с ними по цепи остаткам аминокислот. Это облегчает
процесс укладки белковой цепи в пространстве и увеличивает его
скорость. В процессе формирования пространственной структуры
белка наблюдаются и промежуточные состояния, не входящие в
нативную конформацию. Укладка белков, имеющих дисульфидные
связи, происходит значительно медленнее по сравнению с белками,
лишенными S—S-связей. Структурные блоки затем укладываются
104
в 2—3 больших домена, а последние объединяются, «досворачи-
ваются» до целой молекулы. В заключение следует, однако, от-
метить, что последовательность чередования аминокислот явля-
ется основным, решающим фактором в образовании конформации
белковой молекулы, но не единственным; некоторое влияние ока-
зывают и другие факторы ограничения, корректировки. Так, обра-
зование вторичной структуры в каком-либо участке полипептидной
цепи зависит не только от его аминокислотной последовательности,
но и от влияния других участков, удаленных от данного.
Специфическая конформация полипептидной цепи начинает
формироваться еще во время синтеза белка на рибосоме. Это до-
казано опытами с рибосомами, которые выделяли с синтезируемы-
ми на них молекулами фермента. Хотя рибосомы выделяли до
завершения синтеза фермента, молекулы которого были еще
связаны с рибосомой, каталитическая активность фермента уже
обнаруживалась, что возможно лишь при почти окончательном
сформировании третичной структуры. Полностью организация на-
тивной структуры завершается по окончании синтеза полипептид-
ной цепи и посттрансляционной модификации последней при учас-
тии различных ферментов, а в случае олигомерных белков — ор-
ганизации четвертичной структуры. Складывающаяся уникальная
структура белковой молекулы очень специфично приспособлена к
выполнению белком определенной биологической функции в клет-
ке: каталитической, гормональной, транспортной и т. д.
Нативные конформации белков отобраны в процессе эволюции
и представляют собой наиболее энергетически выгодные состояния,
обладающие наименьшей свободной энергией. Такие относительно
стабильные пространственные структуры молекул обусловливают
специфические биологические функции белка. Нативные белковые
молекулы с определенной трехмерной структурой имеют большую
степень упорядоченности по сравнению с развернутой полипептид-
ной нитью и, следовательно, должны характеризоваться более
низкой энтропией, чем неупорядоченные белковые структуры. Ис-
ходя из этого можно было бы ожидать, что термодинамически
более выгодным должен являться процесс образования неупорядо-
ченной белковой структуры из упорядоченной. Однако поскольку
белки всегда находятся в клетке в водном окружении, то должна
рассматриваться не изолированная белковая система, а система
белок + вода. В том случае, когда белок имеет упорядоченную
трехмерную структуру, для воды характерна максимальная энтро-
пия, и в целом энтропия системы (белок + вода) при формирова-
нии третичной структуры белка либо остается постоянной, либо
возрастает. Именно поэтому возможно самопроизвольное образо-
вание упорядоченных структур со специфической биологической
функцией. При образовании четвертичной структуры белков в
результате ассоциации субъединиц действуют те же законы, что и
при свертывании индивидуальной полипептидной цепи в процессе
формирования ее нативной конформации.
Однако упорядоченность пространственной структуры белков
105
является не статичной, а динамичной. Значительной свободой дви-
жения обладают, например, боковые радикалы аминокислот, рас-
положенные на поверхности молекулы. В белковых макромолеку-
лах спонтанно и обратимо происходят различные конформацион-
ные переходы, в результате чего каждому макросостоянию белка
соответствует много микросостояний. Последние обусловлены как
мелкомасштабными тепловыми движениями групп около положения
равновесия, так и локальными трансконформациями, движениями
доменов. В физиологических условиях доминируют мелкомасштаб-
ные тепловые движения и среднемасштабные локальные транскон-
формации. Их вероятность зависит от различных функциональных
воздействий на белок, хотя его статистическая макроконформация
может при этом меняться крайне мало.
В процессе функционирования белковые молекулы претерпе-
вают небольшие конформационные изменения (флуктуации). Та-
кие флуктуации наблюдаются, например, при соединении белковой
части ферментативной молекулы с коферментом при образовании
фермент-субстратного комплекса. Б. Ф. Поглазовым (1967) об-
наружено, что сокращение хвостового чехла бактериофага Т4 со-
провождается сильным (до 50% от общего содержания) уменьше-
нием числа а-спиралей белков чехла и эквивалентным нарастанием
(3-структур.
На конформацию белков существенное влияние оказывают ус-
ловия среды (pH, ионный состав, температура и др.). Изменение
параметров среды приводит к перезарядке отдельных точек белко-
вой молекулы, перестройке системы ионных, водородных связей и
гидрофобных взаимодействий между боковыми радикалами ами-
нокислот, т. е. к изменению конформации белка и его биологи-
ческой активности.
2.4.9. Самоорганизация надмолекулярных белковых структур.
Та информация, которая содержится в аминокислотной после-
довательности, реализуется и при так называемой самоорганиза-
ции (или самосборке) надмолекулярных структур, протекающих
без участия матрицы и генетического контроля. Под самосборкой
понимают наряду с самоорганизацией третичной структуры, спо-
собность белковых молекул к спонтанной и упорядоченной ассо-
циации между собой и с другими биополимерами, приводящей к
образованию биологически активных структур.
Одной из первых in vitro была осуществлена самосборка-рекон-
струкция вируса табачной мозаики (ВТМ) в 1955 г. У этого виру-
са, имеющего цилиндрическую форму, спираль РНК образует как
бы ось, вокруг которой располагаются более 2000 субъединиц бел-
ка. Защелачивание среды или обработка детергентами приводит к
диссоциации такой белковой оболочки до отдельных субъединиц —
полипептидов. При закислении раствора происходит самосборка
вирусных частиц, реассоциация белковых субъединиц вокруг
РНК. Такие частицы сохраняют инфекционность, что свидетельст-
вует об их сходстве с исходным нативным вирусом. Это подтвер-
дило и сравнение физических свойств.
106
В дальнейшем аналогичная искусственная сборка биологиче-
ских структур из субъединиц была осуществлена с отростком
бактериофага Т4, мембранными структурами, микротрубочками и
другими объектами. Сборка отростка фага Т4 начинается с обра-
зования из специальных белков «втулки», являющейся центром
базальной пластинки. Затем вокруг «втулки» собираются другйе
белки, формируя шестиугольную базальную пластинку (рис. 2.21).
Активирование базальной пластинки в результате присоединения
Рис. 2.21. Последовательные стадии процесса сборки отростка бактерио-
фага Т4\
а —базальная пластинка с шипами,. б — стержень, в — субъединицы чехла
специфических белков приводит к началу сборки из структурных
единиц стержня, а затем и чехла отростка. На следующем этапе
к отростку подходят белки головки фага, происходит ее формиро-
вание, и далее прикрепляются к базальной пластинке готовые нити
отростка. Микротрубочки — элементы цитоплазмы, участвующие
в ее движении, внутриклеточном транспорте, формируются из мо-
лекул глобулярного гликопротеина (тубулин), укладывающихся з
спираль. Процесс самосборки микротрубочек инициируется акти-
вацией белка за счет энергии ГТФ. Сборка и разборка этих струк-
тур, постоянно происходящие в клетке, регулируются внутрикле-
точной концентрацией ионов кальция.
Формирование мембран происходит также в результате само-
сборки ее компонентов: белков, липидов, углеводов и др. Для об-
разования мембраны, различных органелл клетки не нужен гене-
тический код, органеллы возникают в результате взаимодействия
молекул определенной химической структуры. Эта концепция до-
казывается многочисленными опытами. Например, добавление з
суспензию мембранных фосфоглицеридов интегрального белка
приводит к образованию пузырьков, в которых все молекулы белка
погружены в липид и определенным образом ориентированы.
Большие и интересные исследования по самосборке жгутиков
бактерий проведены Б. Ф. Поглазовым (1967). В опытах А. С. Спи-
рина (1968) была осуществлена «разборка» рибосом (с помощью
высоких концентраций CsCl и других хлоридов одновалентных
катионов), а затем их самосборка (при. высокой концентрации
Mg2+ и нагревании до 37°С).
10?
Образование комплексов фермент-субстрат, антиген-антитело
также можно рассматривать как проявление самосборки, самоор-
ганизации.
При самосборке надмолекулярных структур аналогично обра-
зованию нативной конформации белков система стремится к со-
стоянию с минимальной свободной энергией и максимальной энтро-
пией. Окружающая вода повышает свою энтропию на величину,
достаточную для компенсации снижения энтропии, обусловленной
ассоциацией молекул при самосборке.
В процессе агрегации биомолекул большая роль отводится ион-
ным взаимодействиям как наиболее дальнодействующим (до
0,7 нм) и включающимся в первую очередь. Затем между молеку-
лами возникают более короткодействующие (на расстоянии до
0,2 нм) связи: водородные, гидрофобные, ван-дер-ваальсовы. Для
того чтобы эти силы могли возникать и действовать, необходимо
прежде всего стерическое, пространственное соответствие (компле-
ментарность) взаимодействующих поверхностей. Иначе говоря,
должна существовать возможность сближения этих поверхностей
на короткое расстояние, при котором возможно образование пере-
численных связей. Необходима также комплементарность по рас-
пределению зарядов противоположного знака (для возникновения
электростатических сил), гидрофобных областей и групп, способ-
ных к образованию водородных связей. Таким образом, в процессе
самосборки важнейшую роль играет явление «узнавания», нали-
чие стерической и химической комплементарности.
Самосборку можно рассматривать как простейший этап биоло-
гического морфогенеза на молекулярном уровне. При формирова-
нии элементарных биологических структур самосборка является,
по существу, единственной основой процесса (при содействии ряда
второстепенных моментов). Более сложные биологические обра-
зования требуют уже дополнительного участия ряда регулирующих
и корректирующих факторов. Можно предполагать, что особенно
большое значение самосборка биологических структур имела на
заре возникновения жизни, при переходе от неживой материи к
живой.
2.5 Классификация, характеристика,
представители
Все белки принято делить на две группы: простые, или протеи-
ны (состоят только из аминокислот), и сложные1 (в их молекуле
помимо белковой части содержится и небелковая, простетическая
часть). Внутри каждой из этих групп существует деление на под-
группы. Простые белки подразделяют в соответствии с их раствори-
1 Длительное время все сложные белки называли протеидами (хромопро-
теиды, липопротеиды, нуклеопротеиды и т. д.). В последние годы все более
общепринятыми становятся названия сложных белков с окончанием — ины (хро-
мопротеины, липопротеины, нуклеопротеины и т. д.). Объясняется это в основ-
ном тем, что термин протеиды означает белковоподобные вещества.
108
мостью в различных веществах, а сложные белки классифицируют
по химизму небелковой части молекулы. Следует сразу заметить, что
классификация простых белков весьма условна и несовершенна, так
как основана на сравнении относительно несущественных признаков.
Многие белки, ранее отнесенные в группу простых белков (на-
пример, глобулины крови), по результатам исследований строения
их молекул оказались двухкомпонентными. В природе в свободном
виде существуют также пептиды, молекулы которых содержат,
как указывалось ранее, не более 50 аминокислотных остатков.
2.5.1. Природные пептиды. В живых организмах обнаружено
несколько сотен свободных пептидов. К ним принадлежат некото-
рые гормоны, токсины, антибиотики, нейропептиды, а также ряд
других биологически активных веществ.
Глутатион (у-глутаминилцистеинилглицин, глу-цис-гли, G-SH).
НООС—СН—СН2—СН2—СО—NH—СН—CO-NH—СНа—СООН
nh2 сн2
I
SH
Обнаружен в клетках животных и человека (особенно его много в
мозге, хрусталике глаза), бактериях, дрожжах, грибах, зеленых
растениях. Принимает активное участие в окислительно-восстано-
вительных процессах:
— 2Н
2G-SH G—S—S—а
+2Н
Основная функция глутатиона в клетках заключается в защите
сульфгидрильных групп белков от окисления. Он служит также
коферментом в ряде ферментативных реакций (см. разд. 3.4.3).
У животных и человека глутатион принимает участие в разложе-
нии Н2О2, образующегося в эритроцитах в результате обменных
процессов или аутоокисления лекарственных препаратов. Он
участвует в детоксикации ряда чужеродных для живой клетки
соединений (галогенсодержащие алифатические или ароматические
углеводороды), переводя их в водорастворимую, способную к вы-
делению почками, форму.
Грамицидин S — антибиотик, активно синтезируется бактерия-
ми Вас. brevis, по своему химизму является циклическим декапеп-
тидом, в составе которого, кроме белковых аминокислот, есть орни-
тин (орн):
109
Пептидные антибиотики типа грамицидинов являются ионофора-
ми, они действуют на биологические мембраны, образуя комплек-
сы с ионами металлов, чем нарушают регуляцию ионной прони-
цаемости в мембранах бактерий.
Аманитины— токсичные октапептиды ядовитых грибов рода
Amanita. Типичным представителем аманитинов является а-ама-
нитин. Он блокирует синтез белка в клетке эукариот на стадии
транскрипции. Замена в молекуле а-аманитина диоксиизолейцина
на лейцин приводит к образованию нетоксичного соединения.
В этих же грибах содержится ряд токсичных гептапептидов —
фаллоидинов, имеющих сходное с аманитинами строение (бицик-
лическое). Фаллоидины необратимо поражают печень млекопитаю-
щих. Роль противоядия фаллоидинам выполняет циклический де-
капептид — антаманид, содержащийся в тех же грибах, что и ток-
син. Он уплотняет мембраны клеток печени и понижает их прони-
цаемость по отношению к токсинам. Антаманид является ионофо-
ром, связывающим Na+ или Са2+, сорбированные на поверхности
мембраны, и тем самым покрывает определенные участки мембра-
ны, уплотняя ее и меняя ее свойства, в частности, проницаемость.
В Amanita muscaria обнаружен другой токсичный для человека
пептид — мускарин.
Известно большое число гормонов пептидной природы. Они
рассматриваются в гл. 12.
К свободным пептидам принадлежат каллидин и брадикинин
плазмы крови, относящийся к кининам. Они повышают проницае-
мость капилляров, обладают мощным сосудорасширяющим дей-
ствием, являются сильнейшими возбудителями болевых ощущений.
Оба эти пептида образуются из общего предшественника кинино-
гена в результате протеолитического расщепления. Брадикинин —
линейный нонапептид: арг— про — про — гли — фен — сер —
— про — фен — арг; каллидин отличается от него наличием еще од-
ного аминокислотного остатка (лиз) на N-конце. Инактивируются
пептиды в результате отщепления С-концевого аргинина при учас-
тии карбоксипептидазы В.
Опиоидные пептиды (эндопиоиды) — группа нейропептидов,
оказывающих модулирующее влияние на передачу нервных им-
пульсов в ряде отделов центральной нервной системы (ЦНС). Эти
пептиды взаимодействуют с теми же рецепторами, что и опиатные
соединения (например, морфин), и близки к ним по своему дей-
ствию.
Наибольшее количество рецепторов связывания эндопиоидов
обнаружено в таламусе, гипоталамусе, нейрогипофизе и ряде дру-
гих отделов ЦНС. Рецепторы опиоидных пептидов находятся и в
периферической нервной системе. Эндопиоиды принимают участие
в регуляции процессов, связанных с восприятием боли, влиянием
гормонов на обмен веществ, воздействуют на сердечно-сосудистую
деятельность, стрессорные реакции и ряд других физиологических
функций. Например, при обезболивании путем иглоукалывания
(акупунктурная анальгезия) в спинно-мозговой жидкости повыша-
ло
ется содержание эндопиоидов, что говорит об активации этой сис-
темы в результате иглоукалывания. Некоторое влияние опиоидные
пептиды оказывают на характер эмоций, поведение.
В настоящее время известно несколько десятков опиоидных пеп-
тидов. Конкретными их представителями являются, в частности,
а-, р- и у-эндорфины, а- и p-неоэндорфины, динорфин, пентапепти-
ды метионин-энкефалин (тир — гли — гли — фен — мет) и лей-
цин-энкефалин (тир — гли — гли — фен — лей).
Особый интерес представляет процесс синтеза опиоидных пеп-
тидов. Его основным принципом является посттрансляционное рас-
щепление протеазами высокомолекулярных белковых предшествен-
ников. Одним из предшественников эндопиоидов является так на-
зываемый проопиомеланокортин, представляющий собой прегормо-
нальный белок с молекулярной массой около 31000. Его молекула
содержит аминокислотные последовательности меланоцитстимули-
рующих гормонов (МСГ), адренокортикотропного гормона
(АКТГ), p-липотропного гормона. В свою очередь, в р-липотропи-
не, являющемся гормоном, стимулирующим высвобождение жир-
ных кислот из жировой ткани и состоящим у человека из 91 ами-
нокислотного остатка, обнаружены последовательности, аналогич-
ные р-МСГ (41—58), АКТГ4-ю (47—53), а также эндопиоидов:
а-эндорфина (61—76), р-эндорфина (61—91), у-эндорфина
(61—77) и метионин-энкефалина (61—65). Ниже дана аминокис-
лотная последовательность p-липотропина человека, содержащая
последовательности р-МСГ, p-эндорфина и метионин-энкефалина.
I-----Р-МСГ..
40 I 45
... Глу—лиз—лиз—асп—глу—гли—про—тир—арг—мет—*
.... р~мсг-1
50 55 I*
—глу—гис—фен—арг—три—гли—-сер—про—про*—лиз,—асп—
I-------0-Эндорфин...
60 J 65
<—лиз—арг-г-тир—гли—гли—фен—мет—три—сер...
’----— Э нкефалин-----
80 85
• • • лей—фен—лиз—асн—ала—иле—иле—лиз—асн—
,.,р- Эндорфин —----п
90
—ала—тир—лиз—лиз—гли—глу
Однако, поскольку p-липотропин и энкефалины имеют различ-
ную тканевую локализацию, полагают, что основным предшествен-
ником энкефалинов является не проопиомеланокортин, а другие
полипептиды, включающие в себя несколько копий метионин-энке-
фалина и лейцин-энкефалина.
Кейлоны — тканеспецифичные гормоны местного действия —
представлены белками или пептидами различной молекулярной
111
массы. Кейлоны подавляют митотическую активность других кле-
ток той же ткани. Вероятно, эти гормоны, участвуя в регуляции
деления клеток, предотвращают их злокачественный рост.
Фолиевая кислота, являющаяся по своей биологической функ-
ции витамином (см. разд. 10.3), также может быть отнесена к пеп-
тидам. В ее составе содержится до 7 остатков глу в виде у-глута-
минилпептида (т. е. соединение глутаминовых остатков происхо-
дит за счет у-карбоксильных, а не а-групп).
Помимо перечисленных пептиды выполняют ряд других, очень
интересных и важных функций. Открыты гормоны, ответственные
за индукцию сна. Некоторые специфические пептиды, возможно,
являются веществами, участвующими в явлениях памяти, выра-
ботке условных рефлексов. Не исключено, что долговременная па-
мять связана с синтезом в определенных нейронах этих пептидов.
Так, при тренировке крыс на избегание темноты у них в мозге на-
капливается 15-членный пептид (скотофобин), введение которого
нетренированным животным вызывает у последних такое же по-
ведение. Прослеживается связь между отклонениями в психической
деятельности человека от нормы и содержанием определенных
пептидов в мозге.
Таким образом, биологическая активность пептидов связана с
их регуляторной ролью, причем точки приложения их действия и
эффективность в организме очень разнообразны.. Природные пеп-
тиды привлекают в настоящее время большое внимание исследо-
вателей, активно ведутся работы по их выделению, установлению
структуры, функции, химическому синтезу с целью применения в
практической медицине как лекарственных средств.
2.5.2. Протеины (простые белки). Ниже представлены группы
простых белков, классификация которых основана на растворимо-
сти этих соединений.
Альбумины. Это водорастворимые белки, осаждающиеся
при насыщении растворов нейтральными солями, например
(NH4)2SO4. Добавление одной соли обычно не приводит к осаж-
дению белков (за исключением (NH4)2SO4), требуется смесь со-
лей, преимущественно одно- и двухвалентных катионов (NaCl и
MgSO4 или Na2SO4 и MgCl2). Сульфат аммония начинает осаждать
альбумины при 65% насыщения, а полное осаждение наступает
при 100% насыщения.
Альбумины широко распространены в природе. Они составляют
около 50% всех белков плазмы крови человека. Высоко содержа-
ние альбумина в белке яиц (до 50%). Белок, обладающий сходной
растворимостью и получивший название лактальбумин, выделен
из молока; богаты альбуминами и растения.
Глобулины. Растворимы в слабых растворах нейтральных
солей, однако высокие концентрации последних осаждают глобу-
лины. (NH4)2SO4 высаливает глобулины уже при 50% насыщения,
хотя надо иметь в виду, что полного разделения альбуминов и
глобулинов как при этой концентрации сульфата аммония, так и
при других не происходит. В воде глобулины нерастворимы, по-
этому выпадают в осадок при отделении солей диализом. Глобу-
лины составляют большую часть белков семян многих растений»
особенно бобовых и масличных, например легумин в семенах го-
роха, фазеолин — фасоли, эдестин — конопли.
Проламины. Хорошо растворимы в 60—80%-ном этиловом
спирте, в их составе много аминокислоты пролина, а также глута-
миновой кислоты. В очень незначительном количестве в эти белки
входят лиз, арг, гли. Проламины характерны исключительно для се-
мян злаков, где выполняют роль запасных белков: в семенах пше-
ницы и ржи — белок глиадин, в семенах ячменя — гордеин, куку-
рузы — зеин. Все указанные проламины представляют собой ком-
плексы белков, различающихся по составу и молекулярной массе.
Глютелины. Хорошо растворимы в щелочных растворах
(0,2—2% NaOH). Это белки растений, содержатся в семенах зла-
ков и других культур, а также в зеленых частях растений. Комплекс
щелочерастворимых белков семян пшеницы получил название глю-
тенин, риса — оризенин. Глиадин семян пшеницы в соединении е
глютенином образует клейковину, свойства которой в значительной
мере определяют технологические качества муки и теста.
Гистоны. Представляют собой щелочные белки с молекуляр-
ной массой 12 000—30 000, на долю основных кислот в них прихо-
дится 20—30%. Гистоны растворимы в слабых кислотах (0,2 н.
НС1), осаждаются аммиаком, спиртом. Они не содержат триптофа-
на и, в большинстве случаев, цистеина, цистина. Гистоны присутст-
вуют главным образом в ядрах клеток животных, растений и игра-
ют важную роль в структуре хроматина, так как количественно
преобладают среди белков хромосом.
Гистоны — сравнительно консервативные в эволюционном пла-
не белки. Показано, что гистоны животных и растений характери-
зуются близкими величинами отношения арг к лиз и содержат до-
вольно сходный набор фракций.
Согласно данным рентгеноструктурного анализа и электронной
микроскопии гистоны не найдены в хромосомах тех организмов, ко-
торые не имеют оформленного клеточного ядра (бактерии, сине-
зеленые водоросли). Вместе с тем следует отметить, что фракции
белков, богатые лиз-и арг, выделены из клеток ряда бактерий и не-
которых синезеленых водорослей. Противоречивы данные о содер-
жании гистонов в грибах.
Протамины. Это сильно основные белки с низкой молекуляр-
ной массой (до 12 000), благодаря чему некоторые из них проходят
через целлофан при диализе. Протамины растворимы в слабых кис-
лотах, не осаждаются при кипячении; в их молекуле содержание
щелочных аминокислот составляет около 80%, особенно много арг.
В протаминах нет цис, три и асп, очень часто отсутствуют тир, фен,
поэтому они не дают многих цветных реакций на белок. Благодаря
высокой концентрации в молекуле протаминов основных аминокис-
лот, она представляет собой поливалентный органический катион и
легко реагирует с молекулами, имеющими избыток отрицательно
заряженных групп, в частности нуклеиновыми кислотами.
113
Протамины широко распространены в природе. Они содержатся
в половых клетках животных и человека и составляют основную
массу белков хроматина этого типа. Протамины придают ДНК био-
химическую инертность, что является необходимым условием сох-
ранения наследственных свойств организма. Показано, что синтез
протаминов происходит в процессе сперматогенеза в цитоплазме
половой клетки, после этого протамины фосфорилируются, прони-
кают в клеточное ядро и по мере созревания спермы вытесняют гис-
тоны из нуклеопротеина, образуя прочный комплекс с ДНК. В ре-
зультате такого взаимодействия наследственные свойства организ-
ма оказываются защищенными от неблагоприятных воздействий.
Протамины в большом количестве встречаются в сперме рыб; наи-
более хорошо из них изучены сальмин из лососевых рыб, клупеин
из сельди. Протамины обнаружены и у представителей раститель-
ного царства — они выделены из спор плауна.
Протеиноиды. Трудно растворимые белки, для них харак-
терно высокое содержание серы. К протеиноидам относятся фибрил-
лярные белки: фиброин — белок шелка, кератины — белки волос,
рогов, копыт, коллагены — белки соединительной ткани, спонгин —
белок морских губок и др.
2.5.3. Сложные белки/ Липопротеины. Простетической груп-
пой в этих сложных белках являются различные жироподобные ве-
щества — липиды. Связь между компонентами липопротеинов мо-
жет быть различной степени прочности. Полагают, что основной
вклад в стабилизацию комплексов дают силы слабого взаимодей-
ствия (гидрофобные, ионные, водородные), роль ковалентных свя-
зей незначительна.
В составе липопротеинов обнаружены как полярные, так и ней-
тральные липиды, а также холестерин и его эфиры. Липопротеины
широко распространены в природе, встречаются у всех представи-
телей живых организмов. Они являются обязательными компонен-
тами всех клеточных мембран, где их небелковая часть представ-
лена, в основном, полярными липидами — фосфолипидами, глико-
липидами. Липопротеины всегда присутствуют в крови (см. разд.
2.5.4). Инозитолдифосфатсодержащий липопротеин выделен из бе-
лого вещества мозга, в состав липопротеинов серого вещества мозга
входят сфинголипиды. У растений значительная часть фосфолипи-
дов в протоплазме находится также в форме липопротеинов.
Известны комплексы липидов и белков, белковая часть которых
содержит много гидрофобных аминокислот, липидный компонент
часто преобладает над белковым. В результате такие сложные бел-
ки растворимы в органических растворителях, например в смеси
хлороформа и метанола. Подобного рода комплексы называются
протеолипидами. Они в большом количестве содержатся в миели-
новых оболочках нервных клеток, а также в синаптических мембра-
нах и внутренних мембранах митохондрий.
Фосфопротеины. Характерной особенностью фосфопротеи-
нов является присутствие в значительных количествах ортофосфор-
ной кислоты, которая связана обычно с оксигруппой сер, реже тре
114
сложноэфирной связью. Другие оксиаминокислоты (тирозин, гид-
роксипролин) не образуют фосфорные эфиры.
К фосфопротеинам относятся многие белки, играющие важную
роль в питании молодых организмов. Это основной белок молока
казеин, осаждающийся при створаживании, яичного желтка — ви-
теллин и фосвитин, икры рыб — ихтулин. Они содержат 1—10%
фосфора. Фосфопротеины обнаружены в мозге.
Казеин кроме фосфорной кислоты имеет углеводный компонент
молекулы, поэтому является фосфогликопротеином. Относительно
кратковременное фосфорилирование самых разнообразных белков
(ферментативных, мембранных, рибосомальных и др.) происходит
при участии особой группы ферментов — протеинкиназ. Такого ро-
да фосфорилирование имеет регуляторный, временный характер, и
эти белки, видимо, следует отличать от структурно-постоянных
фосфопротеинов.
Металлопротеины. Комплексы ионов металлов с белками,
в которых ионы металлов присоединены к белку непосредственно,
являясь составной частью структуры белковых молекул, называют-
ся металлопротеинами. Некоторые авторы относят к металлопро;
теинам и те белки, которые помимо металла имеют металлсвязыва-
ющие простетические группы, например порфириновая группа в ге-
моглобине, хлорофилле. Однако эта точка зрения не является обще-
принятой.
В составе металлопротеинов часто встречаются такие металлы,
как Си, Fe, Zn, Мо и др. Типичными металлопротеинами являются
некоторые ферменты, содержащие перечисленные металлы, а также
Мп, Ni, Se, Са и др. (см. разд. 3.4.2).
К медьсодержащим белкам относятся, например, цитохромо-
ксидаза, пластоцианин (переносчики электронов), белок крови це-
рулоплазмин; к железосодержащим — лактоферрин (белок моло-
ка), трансферрин (белок крови), ферритин и др. В сыворотке крови
найден специфический никельсодержащий белок класса макрогло-
булинов, названный никеле плазмином.
Обнаружены белки — селенопротеины, в которых селен, вероят-
нее всего, ковалентно присоединен к ароматической или гетероцик-
лической (гем) группе. Один из селенопротеинов содержится в мы-
шцах животных.
У некоторых морских животных обнаружен белок, содержащий
ванадий,— ванадохром, являющийся, вероятнее всего, переносчи-
ком кислорода.
- Гликопротеины. Это сложные белки, в составе которых
имеется углеводный компонент. Белок в данных соединениях яв-
ляется своеобразной основой, к нему прикрепляются углеводные
группировки. Общепризнанная и устоявшаяся классификация этих
белков отсутствует. В соответствии с особенностями химического
строения гликопротеины могут быть подразделены на истинные
гликопротеины и протеогликаны (гликозаминопротеогликаны).
Основное различие между ними заключается в том, что угле-
водные группировки истинных гликопротеинов содержат обычно
115
до 15—20 моносахаридных компонентов, не образующих повторя-
ющихся олигосахаридных фрагментов, в то время как у протеогли-
канов они построены из очень большого числа повторяющихся еди-
ниц, в основном имеющих своеобразный дисахаридный характер.
Истинные гликопротеины. Молекулярная масса истинных гли-
копротеинов варьирует в широких пределах, достигая иногда
1 млн. и более. Особенно велика молекулярная масса у гликопро-
теинов слюны. На долю углеводного компонента в гликопротеинах
приходится от 1—3% (овальбумин) до 80—90% (групповые ве-
щества крови) массы всей молекулы. В значительных пределах
колеблется и число углеводных цепей, приходящихся на одну мо-
лекулу. Так, в трансферрине, рибонуклеазе их количество не пре-
вышает 1—4, а у групповых веществ крови, муцинов слюны дос-
тигает 300—800. Углеводные цепочки, разветвленные или линейные,
всегда ковалентно связаны с пептидной частью молекулы.
В составе углеводных компонентов обнаружено более 10 раз-
личных моносахаридов: D-галактоза, D-манноза, D-глюкоза,
N-ацетилглюкозамин и N-ацетилгалактозамин, дезоксисахара
(L-фукоза, L-рамноза), D-ксилоза, L-арабиноза. Типичным компо-
нентом гликопротеинов является также нейраминовая кислота
(см. разд. 6.2.3), которая благодаря наличию карбоксильной груп-
пы (при физиологических значениях pH) придает молекуле угле-
водсодержащих соединений отрицательный заряд. Нейраминовая
кислота чаще встречается в форме сиаловых кислот, которые на-
ряду с фукозой обычно занимают терминальное положение в угле-
водных цепях гликопротеинов.
Ковалентную связь между углеводной и белковой частями гли-
копротеинов могут образовывать различные группировки. Очень
распространен гликозиламидный тип связи между N-ацетилглю-
козамином и р-амидным азотом аспарагина.
N-Ацетилглюкозамин Аспарагин
Другим типом углеводпептидной связи в гликопротеинах явля-
ется О-гликозидный. В образовании этой связи чаще всего участ-
вуют сер или тре и N-ацетилгалактозамин или галактоза.
В коллагене встречается галактозил-гидроксилизиновая О-гли-
козидная связь, а в углеводсодержащих белках высших расте-
ний — арабинозил-гидроксипролиновая. В гликопротеинах мочи
человека обнаружена также S-гликозидная связь галактозы с цис-
теином и О-гликозидная связь фукозы с треонином. В молекулах
116
одних и тех же гликопротеинов может встречаться более чем один
тип углеводпептидной связи.
Протеогликаны. Молекулярная масса протеогликанов велика
и достигает иногда нескольких миллионов за счет большого числа
чередующихся дисахаридных звеньев. Растворы этих углеводсо-
держащих белков обладают высокой вязкостью. Протеогликаны
состоят из небольшой белковой части, к которой ковалентно при-
соединяется значительное число (несколько десятков) гетерополи-
сахаридных цепей, содержащих в своих молекулах остатки амино-
сахаридов и уроновых кислот.
Углеводные компоненты протеогликанов, называемые гликоза-
миногликанами, представлены в основном следующими полисаха-
ридами: гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатами, гепари-
ном, гепарансульфатом и кератансульфатами. Все эти полисаха-
риды содержат чередующиеся парные звенья, состоящие из остат-
ков аминосахаридов, гексуроновых кислот и реже моносахаридов
(см. разд. 6.4). В протеогликанах, содержащих гиалуроновую кис-
лоту, на долю белковой части приходится 0,4—2% от всей массы
молекулы, в случае хондроитинсульфатов — 17—22%.
Углеводпептидная связь может осуществляться через О-глико-
зидную связь D-ксилозы с сериновым остатком пептидной цепи (у
хондроитинсульфатов, гепарина) или N-ацетилглюкозамина с тре-
онином, а также гликозиламидную связь N-ацетилглюкозамина с
аспарагином (у кератансульфатов).
Ксилоза . Серин
Ксилоза не входит в состав гликозаминогликанов, а выполня-
ет роль вставочного, связующего компонента между полисахари-
дом и белком. Протеогликаны обладают полианионными свойства-
ми, так как в них присутствуют карбоксильные группы уроновых
кислот и сульфатные группы аминосахаридов.
Биологическая роль гликопротеинов. Углеводсодержащие бел-
ки широко распространены в живых организмах, они встречаются
у животных, растений и микроорганизмов, где выполняют самые
разнообразные функции.
/. Функция избирательного взаимодействия, высокоспецифиче-
ского узнавания. В состав поверхностных мембран наряду с дру-
гими компонентами входят гликопротеины, участвующие в очень
тонких процессах биологического узнавания и межклеточного вза-
имодействия, выполняющие роль рецепторных систем для опреде-
ленных соединений и клеток. Так, эпителиальные клетки слизис-
той оболочки кишечника снабжены рецепторами, специфически
117
связывающими клетки инфицирующих организм бактерий и ви-
русов.
Определенные гликопротеины эритроцитарных мембран ответ-
ственны за избирательное присоединение вируса гриппа. Специ-
фическое связывание гормонов с поверхностью клеток-мишеней
обеспечивается во многих случаях углеводсодержащими соедине-
ниями этих клеток. Такого типа рецептор для инсулина существу-
ет на поверхности клеток печени, жировой ткани и лимфоцитов.
Гормоны с предварительно отщепленными концевыми сиаловыми
кислотами при введении в кровоток не достигают клеток-мишеней.
Несомненна также важнейшая роль углеводного компонента глико-
протеинов в определении специфичности многих антигенов. Это от-
носится прежде всего к групповым веществам крови и раствори-
мым групповым веществам биологических жидкостей (слюна, мо-
локо, семенная жидкость).
Антигенные комплексы бактерий имеют очень сложную хими-
ческую структуру, состоят из белкового, полисахаридного и липид-
ного компонентов. Комплексные антигены многих бактерий, токсич-
ные для человека и животных, называются эндотоксинами. Детер-
минирующие участки полисахаридных компонентов макромолекул
эндотоксинов определяют их антигенную специфичность. Пептиды
также являются иммунодетерминантами и увеличивают иммуноген-
ность макромолекул. В липидном компоненте локализованы все или
большинство активных токсичных участков, он определяет также
пирогенное действие.
Акцептирование бактериальных токсинов клетками организма-
хозяина» также происходит с участием гликопротеинов.
Углеводный компонент гликопротеинов является своего рода
указателем, в котором при помощи последовательности сахаров в
углеводной цепи записано, куда должна следовать молекула — вы-
ходить из клетки, поступать в клеточные мембраны различных ор-
ганов или субклеточные мембраны.
Гликопротеины являются распространенными компонентами се-
мян растений. Так, в семенах фасоли содержится вицилин — белок,
в состав которого входит манноза и N-ацетилглюкозамин, в семе-
нах клещевины — белок рицин, обладающий способностью избира-
тельно осаждать группоспецифические вещества крови и агглюти-
нировать эритроциты. Соединения, обладающие таким свойством и
выделенные из растений, называются фитогемагглютининами и от-
носятся к группе лектинов. Под лектинами понимают белки неиммун-
ного происхождения, в том числе и гликопротеины, способные спе-
цифически связывать полисахариды и углеводсодержащие биопо-
лимеры, не вызывая их химического превращения. В частности, вза-
имодействие лектинов -с углеводсодержащими соединениями прояв-
ляется в виде реакции агглютинации частиц и клеток, например,
эритроцитов, или преципитации полисахаридов и гликопротеинов.
К настоящему времени лектины обнаружены у организмов, нахо-
дящихся на разных ступенях эволюционной лестницы: у бактерий,
водорослей, грибов, моллюсков, рыб, млекопитающих и других жи-
118
вотных. В связи с этим предлагают применять термины «фитолекти-
ны», «зоолектины», «миколектины» и т. д.
У млекопитающих некоторые лектины, вероятно, принимают уча-
стие в формировании органов в процессе эмбриогенеза, поскольку в
больших количествах встречаются в тканях зародыша и плода.
Кроме того, у животных лектины, очевидно, участвуют в компарт-
ментализации специфических гликопротеинов в клетке. Разнообраз-
ные функции лектинов в той или иной мере связаны со способно-
стью узнавания клеток и клеточных компонентов, организации их
избирательного взаимодействия.
Лектины широко распространены в растениях, предполагают,
что они могут участвовать в регулировании клеточного деления и
прорастания семян. Лектины играют важную роль в процессах уз-
навания при образовании симбиотических сообществ, в частности,
между бобовыми растениями и азотфиксирующими клубеньковыми
бактериями. Такую же роль выполняют лектины грибов при обра-
зовании лишайников. Лектины принимают участие и в формирова-
нии паразитических межвидовых сообществ: высшее растение —
бактерии, высшее растение — грибы. Важна роль лектинов в кле-
точном узнавании при формировании колониальных микроорганиз-
мов. Межклеточная адгезия за счет лектинуглеводного узнавания
хорошо показана при образовании клеточных слизевиков из одно-
клеточных миксамеб. Высказывают предположения об участии лек-
тинов и в транспорте ассимилятов по флоэме растений, что также
объясняется их участием в избирательном акцептировании.
Поскольку связывающие участки лектинов специфичны к опре-
деленным углеводным остаткам, с их помощью в настоящее время
выявляют архитектонику клеточных поверхностей.
Таким образом, во многих случаях, когда в живых организмах
имеет место тонкая биохимическая специфичность и происходит
высокоизбирательное узнавание, принимают участие углеводы. Осо-
бенно важны в этом отношении углеводные компоненты гликопро-
теинов, содержащие большое разнообразие моносахаридных остат-
ков в различных сочетаниях, что в комплексе с белками создает воз-
можность большой биохимической специфичности.
2. Т ранспортная функция. Ряд гликопротеинов, циркулирующих
в кровяном русле человека и животных, являются транспортными
белками, например функцию переносчика железа выполняет транс-
феррин, меди — церулоплазмин, стероидных гормонов — транскор-
тин. Главный интегральный белок эритроцитарной мембраны уча-
ствует в транспорте анионов и, возможно, глюкозы.
3. Каталитическая функция. Углеводный компонент обнаружен
в составе некоторых ферментов, в частности энтерокиназы, така-
амилазы, пероксидазы, глюкозооксидазы, сывороточной холинэсте-
разы, расщепляющей ацетилхолин и участвующей в передаче нерв-
ного возбуждения, РНКазы В и др.
4. Структурно-механическая функция. Эту функцию выполняют
у различных видов живых организмов в основном протеогликаны.
У позвоночных животных они входят в состав межклеточного ве-
119
щества соединительной ткани. Протеогликаны содержатся в коже,
костях, хрящах, синовиальной жидкости суставных сумок, сухожи-
лиях, клапанах сердца, стекловидном теле, роговице глаза и других
тканях. Они придают им эластичность и устойчивость по отношению
к сжатию. Протеогликаны, содержащие гиалуроновую кислоту, об-
разуют очень вязкие растворы, что повышает стойкость ткани к
проникновению инфекции. У многих бактерий защитная капсула
ткани в основном построена из сложных белков, включающих гиа-
луроновую кислоту. Кроме того, данный протеогликан наряду с
хондроитинсульфатом А выполняет роль смазки в суставах. Функ-
цию защитной смазки выполняют гликопротеины — основные сос-
тавные вещества муцинов слюны, желудочного и кишечного муци-
нов. Гликопротеины являются широко распространенными структур-
ными компонентами различных клеточных мембран.
Помимо перечисленных гликопротеины выполняют в организме
и ряд других функций. К гликопротеинам относятся фибриноген,
протромбин и некоторые другие факторы свертывания крови. В пе-
чени синтезируется гликозаминогликан — гепарин — важнейшее
противосвертывающее вещество. Гликопротеинами являются и им-
муноглобулины (см. разд. 5.5), некоторые гормоны — гонадотроп-
ные, фолликулостимулирующий, тиреоглобулин, ингибитор размно-
жения вирусов животных — интерферон. С наличием гликопротеи-
нов в оболочке ряда вирусов связывают гемагглютинирующую ак-
тивность последних.
Углеводный компонент повышает стабильность молекул глико-
протеинов, предохраняя их от действия протеолитических фермен-
тов. Небелковая часть ряда сывороточных гликопротеинов опреде-
ляет период их полураспада. В сыворотке крови и мышцах антарк-
тических рыб обнаружены гликопротеины — антифризы, защища-
ющие клетки от замораживания. Некоторые соединительно-тканные
протеогликаны (хондроитинсульфаты) способны набухать' с погло-
щением большого количества воды, в связи с чем иногда играют
роль депо воды.
К гликопротеинам относится белок яиц — авидин. Он взаимо-
действует с витамином Н (биотин), препятствует его всасыванию
из кишечника, что приводит к острой биотиновой недостаточности.
Авидин применяется в опытах in vitro в качестве ингибитора био-
тинсодержащих ферментов.
' Хромопротеины. К хромопротеинам относятся сложные бел-
ки, у которых небелковой частью являются окрашенные соединения,
принадлежащие к различным классам органических веществ: пор-
фириновые структуры, флавинадениндинуклеотид (ФАД), флавина-
денинмононуклеотид (ФМН) и др. Порфириновое кольцо с коорди-
национно связанным с ним ионом железа входит как простетичес-
кая часть в состав ряда окислительно-восстановительных фермен-
тов (каталаза, пероксидаза) и группы переносчиков электронов—
цитохромов. Хромопротеинами являются и флавиновые дегидроге-
назы или «желтые дыхательные ферменты»—флавопротеины (ФП).
Белковая часть их молекулы связана с ФАД или ФМН. Более под*
120
робно ФП освещены в гл. 3. Типичными хромопротеинами являются
родопсин (см. разд. 10.2), гемоглобин крови.
Важнейшая группа сложных белков — нуклеопротеины рас-
сматривается в гл. 4.
Гемоглобин и другие дыхательные пигменты.
Ге мог лоб ин (сокращенное обозначение — НЬ) составляет молеку-
лярную основу дыхательной функции крови, т. е. способности транс-
портировать О2 и СО2.
Первые подробные исследования строения гемоглобина были вы-
полнены в 1896—1901 гг. профессором Петербургского института
экспериментальной медицины М. В. Ненцким. Он же впервые пред-
ложил структурную формулу небелкового компонента гемоглоби-
на, в основе которой лежали 4 пиррольных цикла, расположенные
вокруг атома железа, что правильно отражает основные структур-
ные особенности небелковой части молекулы. К настоящему време-
ни установлено, что гемоглобины различных видов состоят из белка
глобина и гема (ферропротопорфирина), нековалентно связанных
между собой. Отличия в свойствах гемоглобинов у разных видов
животных обусловлены, в основном, глобиновым компонентом.
Гем. Гем представляет собой достаточно плоскую молекулу, по
форме приближающуюся к квадратной, в которой ион Fe2+ нахо-
дится в центре ядра протопорфирина IX, причем его четыре лиганд-
ных места заняты атомами азота пиррола. Протопорфирины могут
существовать в пятнадцати изомерных формах, поскольку содержат
три различных вида заместителей. В их состав входят четыре ме-
тильные группы, две винильные и два остатка пропионовой кисло-
ты. Протопорфирин IX — самый распространенный из пятнадцати
возможных изомеров. Кроме гемоглобина он содержится в миогло-
бине и большинстве цитохромов. Хелатный комплекс протопорфи-
рина с Fe2+ называется протогемом или гемом.
121
Молекулярным кислородом и другими окислителями в присут-
ствии соляной кислоты или щелочей гем окисляется до гемина, в
котором трехвалентное железо связано с анионом хлора, или до
гематина, в котором третья валентность занята гидроксилом. Пор-
фириновое кольцо из четырех пиррольных ядер является основой
не только гема, но и хлорофилла растений, на что указал еще в
1896 г. М. В. Ненцкий в работе «О биологической связи пигмента
крови и листьев». В ней автор сделал широкое обобщение о един-
стве растительного и животного мира, связывая это с теорией Дар-
вина.
Глобин. Белок гемоглобина — глобин — у взрослого человека
состоит из двух а- и двух 0-цепей. Субъединицы упакованы в тетра-
мере таким образом, что образуют макромолекулу сферической фо-
рмы длиной 6,4 нм и шириной 5,5 нм. Каждая субъединица в одной
из своих «складок» (так называемый «гемовый карман») содержит
плоское кольцо гема. «Гемовый карман» как бы выстлан большим
числом неполярных групп аминокислот, осуществляющих гидрофоб-
ное взаимодействие с пиррольными кольцами гема. Последний име-
ет также координационную связь с глобином, которая возникает
между атомом железа гема и атомом азота в гистидине глобина.
Четыре гема из четырех субъединиц ориентированы по отношению
к молекуле в целом так, что одним краем каждый гем обращен к
внутренней области молекулы, а другим — наружу, в сторону вод-
носолевой среды.
Внутри глобинового тетрамера существует свободная полость,
пронизывающая всю молекулу по ее высоте на 5 нм. В полость об-
ращены в основном неполярные группы аминокислотных остатков
и лишь единичные полярные. Между неполярными группами в вод-
ной среде возникают гидрофобные взаимодействия, которые, по-ви-
димому, в известной мере защищают молекулу изнутри от контак-
та с водой и стабилизируют структуру в целом. Опытами с мечены-
ми атомами установлено, что гемоглобин каждого эритроцита пос-
ле своего образования не подвергается обновлению и остается прак-
тически в неизменном виде до разрушения эритроцита. Средняя
«продолжительность жизни» эритроцитов около 4 месяцев. После
их разрушения основная часть Fe (90%) не выделяется из организ-
ма, а идет на образование особого белка — ферритина, содержаще-
го до 30% железа. Этот белок является, таким образом, запасным
депо железа. Из ферритина железо поступает на образование новых
эритроцитов в костном мозге.
Гетерогенность гемоглобинов. В организме могут одновременно
присутствовать две и более фракций гемоглобина, отличающихся в
основном первичной структурой протомеров глобина (т. е. последо-
вательностью их аминокислотных остатков), а иногда и четвертич-
ной структурой. Это явление получило название гетерогенности ге-
моглобинов. Различают три ее типа в популяции людей: 1. Гетеро-
генность обусловленная наличием минорных компонентов; если ос-
новные формы (НЬА) состоят из двух а- и двух 0-цепей, то минор-
ные НЬ содержат вместо p-цепей две 6-цепи, которые отличаются
122
от p-цепей десятью аминокислотными остатками. 2. Гетерогенность
генетическая: у взрослого человека выявлено до 300 вариантов ге-
нетически детерминированных гемоглобинов. Многие из них функ-
ционально нормальны, некоторые служат причиной заболеваний.
3. Гетерогенность эмбриональная: представлена двумя фракциями
так называемого «примитивного» гемоглобина, основная из них
HbF (фетальный гемоглобин). В норме при рождении его содержа-
ние составляет 60—70% от всего НЬ. С возрастом количество HbF
резко снижается, у взрослых он отсутствует.
Свойства гемоглобина, Кооперативное взаимодействие субъеди-
ниц. В макромолекуле НЬ существует подвижность субъединиц в
процессе функционирования, при связывании и отдаче лигандов. В
своем движении субъединицы взаимодействуют, создавая коопера-
тивный эффект, сущность которого заключается в том, что сродст-
во каждой из субъединиц к лиганду не остается постоянным, а ме-
няется под влиянием соседних субъединиц. Благодаря кооператив-
ному эффекту, отношение НЬ к О2 меняется под влиянием самого О2
в ходе оксигенации: начальное присоединение О2, вызывая измене-
ние конформации НЬ, облегчает связывание последующих молекул
кислорода. В результате зависимость степени оксигенации НЬ от
парциального давления О2 выражается кривой сигмоидной формы.
Кооперативный характер связывания О2 гемоглобином имеет
большое физиологическое значение. В капиллярах легких при пар-
циальном давлении О2 около 100 мм рт. ст. кооперативность приво-
дит к почти полному насыщению гемоглобина кислородом. Когда
же эритроциты проходят через капилляры кислородпотребляющих
тканей, его парциальное давление падает примерно до 5 мм рт. ст.,
и кооперативность в этом случае способствует более полной разгруз-
ке гемоглобина от кислорода, чем в том случае, если бы четыре ге-
могруппы действовали независимо.
Влияние pH. Концентрация Н+ существенно изменяет свойства
НЬ, прежде всего его способность связывать О2. Это явление полу-
чило название эффекта Бора. В общей форме эффект Бора рассмат-
ривается как влияние pH среды на взаимодействие атома Fe в мо-
лекулах дыхательных пигментов с различными лигандами — О2,
СО, NO. Сюда же относится зависимость от pH окисления Fe2+
до Fe3+.
В капиллярах, где парциальное давление О2 невелико и может
накапливаться СО2 и молочная кислота, понижение pH приводит к
тому, что оксигемоглобин отдает свой кислород более активно.
В эффекте Бора протоны играют роль аллостерических регулято-
ров, присоединяющихся к амино- и имидазольным группам глоби-
на. Аллостерическим регулятором конформационных равновесий в
гемоглобине является также 2,3-дифосфорный эфир глицерина (ди-
фосфоглицерат), содержание которого в эритроцитах человека при-
близительно эквимолярно по отношению к гемоглобину. Дифосфо-
глицерат присоединяется между двумя 0-цепями дезоксигемоглоби-
на, в результате этого сродство последнего к кислороду снижается,
эритроциты могут отдавать тканям большую долю переносимого
123
ими О2. Содержание дифосфоглицерата в эритроцитах варьирует в
зависимости от физиологических условий: у людей, живущих в вы-
сокогорных районах, его концентрация выше. Присутствие дифос-
фоглицерата в эритроцитах характерно не для всех видов живот-
ных; у птиц и черепах его заменяет, по-видимому, инозитолпента-
фосфат.
Формы гемоглобина. Оксигемоглобин (НЬОг). Атомы Fe каж-
дой из гем-групп молекулы НЬ могут обратимо связывать молекулу
О2. Полностью оксигенированный НЬ называется оксигемоглоби-
ном, содержит четыре молекулы О2 на молекулу гемоглобина.
Валентность железа гема при образовании оксигемоглобина не
меняется. Гемоглобин обладает уникальной способностью обратимо
связывать О2, образуя стабильный комплекс без окисления Fe2+ до
Fe3+. В геме четыре лигандные группы порфирина образуют ком-
плекс с железом, имеющий плоскостное строение. Оставшиеся пя-
тая и шестая координационные связи железа располагаются пер-
пендикулярно плоскости порфиринового кольца. Пятая связь при
этом занята имидазольным остатком гис, а шестая или остается не-
замещенной (дезоксигемоглобин), или замещается кислородом (ок-
сигемоглобин). Окисление Fe2+ до Fe3+ в реакции О2 с гемом воз-
можно только в растворах с высокой диэлектрической проницаемо-
стью, а в гидрофобном гемовом кармане, из которого вытесняется
вода, создается среда с низкой диэлектрической постоянной.
Карбаминогемоглобин. СО2 может связываться с НЬ с образо-
ванием карбаминогемоглобина:
О
II
Hb—NH2 + СО2 Hb—NH—С—О" + Н+
СО2 связывает только N-концевые а-аминогруппы. Реакция легко
обратима. Образование карбаминогемоглобина определяется пар-
циальным давлением СО2, имеет прямое отношение к транспорту
СО2 кровью.
Карбоксигемоглобин (НЬСО). НЬ может соединяться с четырь-
мя молекулами СО (угарный газ) с образованием СО-гемоглобина
или карбоксигемоглобина, который является фоточувствительным и
диссоциирует на свету с выделением СО. Fe гема при этом остается
двухвалентным. Сродство НЬ человека к СО более чем в 200 раз
превышает сродство к О2, т. е. для образования НЬСО требуется в
200 раз более низкое парциальное давление СО, чем, соответствен-
но, для НЬО2—О2. В результате этого при вдыхании воздуха, со-
держащего угарный газ, большая часть гемоглобина крови перехо-
дит в карбоксигемоглобин, оксигемоглобин не образуется, наруша-
ется перенос О2 от легких к тканям, в чем и заключается механизм
отравления угарным газом. Смерть наступает вследствие недоста-
точного снабжения тканей (в первую очередь мозга) кислородом
уже при связывании 70% НЬ угарным газом. Своевременное увели-
чение парциального давления О2 (вдыхание чистого кислорода) мо-
жет вызвать достаточное превращение НЬСО в НЬО2.
124
Метгемоглобин (Met-Hb). Пероксиды, ферицианид, оксиды азо-
та и хиноны могут окислять Fe2+ в гемоглобине до Fe3+ с образова-
нием метгемоглобина, который не присоединяет ни О2, ни СО. Он
имеет коричневый цвет, образуется in vivo в норме, но в небольших
количествах и ферментативным путем восстанавливается до НЬ.
Так как Met-Hb не может служить переносчиком О2, при образова-
нии в организме значительных его количеств (например, при от-
равлениях анилином, нитробензолом, оксидами азота) наступает
кислородное голодание, а в тяжелых случаях и смерть. Однако прё-
вращение небольшой части гемоглобина в метгемоглобин менее
опасно, чем образование НЬСО, поскольку Met-Hb постепенно вос-
станавливается в организме в гемоглобин.
Функции гемоглобинов. Основные функции гемоглобинов:
1) транспорт О2, 2) транспорт СО2, 3) поддержание постоянной бу-
ферной емкости крови.
В легких, благодаря имеющемуся градиенту О2, последний диф-
фундирует через стенки капилляров и плазму и попадает в эритро-
циты. НЬ артериальной крови насыщается О2 на 96%. В тканях О2
диффундирует из эритроцитов через плазму в интерстициальную
жидкость (межтканевая), а затем в клетки ткани, в то же время
СО2 диффундирует в обратном направлении.
Транспорт СО2 от тканей до альвеолярного воздуха осуществля-
ется небольшой частью в виде карбаминогемоглобина. Основная
часть СО2 под действием карбоангидразы гидратируется до Н2СО3,
которая затем диссоциирует. Около 60% СО2 транспортируется в
виде НСО” венозной плазмой и около 32% в виде карбамино-СО2
и НСО“ эритроцитами. Однако и транспорт 60% НСО" венозной
плазмы косвенно обеспечивается НЬ, так как он служит акцепто-
ром водорода при диссоциации Н2СО3.
Гемоглобин — функционально более слабая кислота, чем НЬО2.
Эти два белка образуют буферную систему, которая способствует
поддержанию pH крови на постоянном уровне-.
Обмен гемоглобина. Срок жизни эритроцитов 120 суток. В 1 сут-
ки из разрушившихся эритроцитов освобождается 8—9 г НЬ. Раз-
рушение эритроцитов и распад гемоглобина происходят главным
образом в печени, селезенке и костном мозге. Распад НЬ начинает-
ся с разрыва одной а-метиновой связи (между 1-м и 2-м порфирино-
выми кольцами) под действием НАДФ-содержащей оксидазы. Об-
разуется зеленый пигмент вердоглобин, в котором еще содержатся
железо и глобин. Дальнейший распад протекает, видимо, спонтан-
но. Отщепляются железо, глобин и образуется один из желчных
пигментов — биливердин. Биливердин восстанавливается НАДФН-
зависимой дегидрогеназой до билирубина, который из печени вмес-
те с желчью изливается в желчный пузырь.
В крови взрослого человека содержание билирубина относитель-
но постоянно—от 2,5 до 12 мг/л. Возрастание концентрации били-
рубина в крови до 20 мг/л приводит к возникновению желтухи,
дальнейшее увеличение его содержания в крови вызывает явления
125
тяжелого отравления. Поступая с током крови в печень, билирубин
обезвреживается путем связывания с глюкуроновой кислотой. Окон-
чательный распад билирубина происходит в кишечнике под дейст-
вием бактерий: отщепляется глюкуроновая кислота, а билирубин
восстанавливается в стеркобилиноген, который выводится с калом.
Миоглобин. Миоглобин — небольшой глобулярный белок
(М 17 000); молекула его состоит из одной полипептидной цепи
(153 аминокислотных остатка) и одного гема. Таким образом мио-
глобин представляет собой как бы 1/4 молекулы НЬ. Известна пол-
ная аминокислотная последовательность полипептидной цепи мио-
глобина. Она несколько отличается у человека и различных видов
животных, но характер укладки цепи во вторичную спираль и тре-
тичную конфигурацию в основных чертах одинаков. Молекула об-
разует восемь сегментов из правых а-спиралей. В складке между
сегментами расположен гем. Подобно гемоглобину он образует ок-
симиоглобин, карбокси- и метмиоглобин.
Типы переноса кислорода к тканям у разных по эволюционному
положению животных. По данным П. А. Коржуева (1964), пример-
но у 86% видов животных транспорт Ог осуществляется без учас-
тия дыхательных пигментов типа НЬ. Из них у 78% видов (насеко-
мые, многоножки, большинство паукообразных) Ог доставляется
всем тканям и органам системой трахей, а у остальных 8% «беспиг-
ментных» видов (простейшие, губки, кишечнополостные, моллюски,
иглокожие) — путем диффузии через поверхность тела. Дыхатель-
ные пигменты есть в крови или полостной жидкости только у 14%
видов, но это наиболее высокоорганизованные животные, в том чис-
ле все позвоночные.
У наиболее примитивных животных переносчик О2 включен в
клетки, суспендированные в целомической жидкости. С развитием
циркуляции появились переносчики Ог, растворимые в циркулиру-
ющей плазме. Важнейшим этапом в ходе эволюции был период
появления специализированных клеток — эритроцитов, в которых
сосредоточены высокие концентрации переносчиков, благодаря че-
му не происходит резкого увеличения вязкости и коллоидного осмо-
тического давления циркулирующей крови.
Наиболее распространенным дыхательным пигментом является
гемоглобин, который содержится почти у всех групп животных, на-
чиная от простейших и кончая позвоночными. Близок по структуре
гемоглобину хлорокруорин. Он находится в крови некоторых коль-
чатых червей. В его состав входит железо, однако порфирин хлоро-
круорина отличается от протопорфирина гема тем, что винильная
группа у 2-го пиррольного кольца заменена на формильную.
В крови морских червей находится гемэритрин. Он встречается у
небольшого числа многощетинковых червей и у одной формы бра-
хиопод. Субъединицы этого белка обычно образуют октамеры, в
каждом мономере имеется активный центр, содержащий два атома
негемового Fe2+. В плазме крови многих моллюсков и членистоно-
гих находятся гемоцианины — синие медьсодержащие пигменты, не
имеющие гема.
126
2.5.4. Белки плазмы крови. Представители и функции.
Если кровь предохранить от свертывания и с помощью центрифуги-
рования осадить форменные элементы, то прозрачная светло-жел-
тая надосадочная жидкость будет представлять собой плазму кро-
ви. В процессе свертывания крови из плазменного белка фибрино-
гена образуются нити фибрина, которые вместе с форменными
элементами крови дают сгусток. Жидкая часть свернувшейся крови
называется сывороткой. Следовательно, плазма отличается от сы-
воротки наличием в ней белка фибриногена. На долю белков, ра-
створенных в плазме, приходится около 7% ее массы. С помощью
метода электрофореза в сыворотке было обнаружено пять главных
фракций белков: альбумин, на долю которого приходится 54—58%,
«1-глобулины — 6—7, «2-глобулины — 8—9, ргглобулины — 13—
14, у-глобулины— 11 —12%.
Методом электрофореза в крахмальном геле дополнительно об-
наруживаются фракции преальбумина, ^-липопротеина и трансфер-
рина. При иммуноэлектрофорезе выделяются также Pi-липопротеин,
«г и аз-липопротеины, гаптоглобин, церулоплазмин, LgG-глобулин.
Преальбумин. Содержание в плазме невысокое — 10—40 мг/
/100 мл. Его функция заключается в связывании и транспорте ти-
роксина и ретинолсвязывающего белка.
Сывороточный альбумин содержится в плазме в значительном
количестве — 3500—4500 мг/100 мл. Один из немногих белков плаз-
мы, которые не являются гликопротеинами.
Основные функции альбуминов — осмотическая регуляция и
транспорт. Осмотический эффект плазмы на 75—80% связан с аль-
бумином, так как из основных белков плазмы, где он составляет
более половины по массе, альбумин обладает наименьшей молеку-
лярной массой. Транспортная функция альбуминов проявляется в
переносе свободных жирных кислот из печени, билирубина в печень,
где он экскретируется с желчью, стероидных гормонов. Ряд лекар-
ственных препаратов, поступая в кровь, образуют прочные ком-
плексы с альбумином. Альбумин может принимать участие в уда-
лении ядовитых веществ, например тяжелых металлов. Альбуми-
нам отводится большая роль в азотистом обмене тканей, содержа-
ние их может служить показателем восполнения белковых запасов
организма.
а-Глобулины. Их обозначают как щ и аг-глобулины в зависи-
мости от электрофоретической подвижности. К си-глобулинам отно-
сятся: со-гликопротеин кислый (ретинолсвязывающий белок), си-ан-
титрипсин, транскортин (связывает ^транспортирует кортизол и
кортикостерон), тироксинсвязывающий белок. К аз-глобулинам от-
носятся: церулоплазмин, гаптоглобины, аз-макроглобулин и интер-
-а-трипсиновый ингибитор.
Церулоплазмин — основной медьсодержащий белок крови, отно-
сится к гликопротеинам, им^еет голубой цвет, на его долю прихо-
дится 3% меди, содержащейся в организме. Церулоплазмин участ-
вует в транспорте Си, в поддержании ее уровня в тканях, особенно
в печени. Церулоплазмин обладает ферментативными свойствами,
127
полиаминоксидазной и ферроксидазной активностью. Последняя
проявляется в катализе окисления Fe2+ в Fe3+. Важность этой реак-
ции состоит в том, что лишь Fe3+ может присоединяться к транс-
портирующему железо белку трансферрину.
Г аптоглобины (Нр). Это аг-глобулины гликопротеинового строе-
ний, способные связываться с гемоглобином, в результате повыша-
ется устойчивость последнего и увеличивается время его жизни —
в этом основная функция гаптоглобинов. Нр выполняют также не-
специфическую защитную функцию, комплексируясь с различными
белковыми и небелковыми веществами, появляющимися при рас-
паде клеток, защищают ткани от протеолиза, участвуют в процес-
сах детоксикации.
^-Глобулины. Это целый ряд белков, в том числе и липопротеи-
ны. Трансферрин (Tf), или сидерофелин, является главным компо-
нентом этой фракции. Он легко образует с Fe комплексное соедине-
ние, которое при определенных условиях также легко распадается.
Благодаря этому свойству трансферрин выполняет важную физио-
логическую функцию по переводу железа плазмы в депонирован-
ную форму и доставке его в костный мозг (где железо использует-
ся при кроветворении) и другие ткани, особенно ретикулоэндотели-
альной системы.
Гемопексин. Связывает гем, предотвращая выведение его с мо-
чой.
Липопротеины. Содержатся в плазме крови в количестве 700—
1100 мг/100 мл. В крови человека присутствуют несколько фракций
липопротеинов, отличающихся по плотности, что связано с различ-
ным соотношением липидного и белкового компонентов в молекуле.
Самая низкая плотность (менее 0,95 г-см“3) характерна для хило-
микронов, на долю липидов в них приходится около 98%. Хиломик-
роны — это капельки липидов, стабилизированные небольшим по-
верхностным слоем белков. Липиды здесь представлены в основном
триацилглицеринами (80%). Более высокую плотность имеют р-ли-
попротеины, их средняя молекулярная масса составляет 10 млн.
Эти липопротеины плазмы разделяют (в свою очередь) на пре-ли-
попротеины, или липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП),
и p-липоротеины, или липопротеины низкой плотности (ЛПНП).
Липопротеины плазмы с плотностью 1,06—1,20 г-см~3 называют
аглипопротеинами или липопротеинами высокой плотности
(ЛПВП), содержание липидов в них составляет примерно 65%.
Наименьшее количество липидов характерно для аа-липопротеинов,
липопротеинбв очень высокой плотности (ЛПОВП, плотность более
1,2 г-см”3). На долю липидов в них приходится 43%. а-Липопроте-
ины имеют молекулярную массу около 300 000, в них преобладают
фосфолипиды. Классификация липопротеинов плазмы условна, по-
скольку их состав и плотность изменяются в процессе транспорта
липидов к тканям.
Липопротеины крови представляют собой сферические частицы,
диаметр которых уменьшается с увеличением плотности. Ядро этих
частиц содержит неполярные липиды (триацилглицерины, эстери-
128
фицированный холестерин). Ядро окружено оболочкой, в состав
которой входят фосфолипиды, белок и свободный холестерин.
В настоящее время доказана роль некоторых фракций липопро-
теинов в патогенезе атеросклероза, они получили название атеро-
генных липопротеинов.
Атеросклероз возникает при значительном повышении в крови
фракции ЛПНП, а во многих случаях и ЛПОНП. Атеросклероз —
это липидное перерождение стенок артерий, образование бляшек,
сужение просвета. Хиломикроны не могут проникать в стенку со-
судов из-за своих больших размеров. ЛПВП имеют самый малень-
кий размер, легко проникают в стенку, но и легко удаляются из нее
в лимфу. Кроме того, в ЛПВП самый высокий процент белков и
фосфолипидов, в связи с чем они быстро метаболизируются в стен-
ке, не оседая в ней. Поэтому атерогенностью обладают ЛПНП и
ЛПОНП, они достаточно хорошо проникают в стенку и очень бога-
ты холестерином и триацилглицеринами (жирами), вызывающими
атеросклероз. Есть указания, что в регуляции содержания ЛПНП и
ЛПОНП в крови важнейшую роль играют белки — рецепторы
ЛПНП. Они располагаются на поверхности клеток организма и из-
влекают частицы ЛПНП из крови. Затем ЛПНП переходят внутрь
клеток, где холестерин освобождается и метаболизируется. Количе-
ство рецепторов может определяться как генетически, так и зави-
сеть от ряда других факторов.
Механизм свертывания крови. Биологические и биохи-
мические процессы, которые обеспечивают в организме предупреж-
дение и остановку кровотечений, называются гемостазом. Он осу-
ществляется следующими компонентами: 1) тромбоцитами, 2) со-
судистой стенкой, 3) плазменной ферментативной системой сверты-
вания. Последняя включает ряд веществ (факторы свертывания
крови), которые в соответствии с рекомендациями Международно-
го комитета по номенклатуре обозначают римскими цифрами (бук-
ва а рядом с номером фактора означает его активную форму). Ни-
же дана характеристика некоторых факторов свертывания.
Фактор I (фибриноген) присутствует в плазме крови теплокров-
ных в концентрации от 0,17 до 0,4 г/100 мл. Гликопротеин, у кото-
рого три пары неидентичных полипептидных цепей соединены ди*
сульфидными мостиками. Синтезируется в печени.
Фактор II (протромбин) — гликопротеин, играющий централь-
ную роль в свертывании крови. Представляет собой профермент
тромбина (факторПа).
Фактор На (тромбин) относится к сериновым протеиназам.
Осуществляет путем расщепления пептидных связей преобразова-
ние фибриногена в фибрин и превращение фактора XIII в фактор
ХШа.
Фактор XII является ключевым ферментом внутренней активи-
рующей системы протромбина, имеет гликопротеиновое строение.
Активация фактора XII, осуществляемая путем его адсорбции на
поверхностях иных, нежели нормальная эндотелиальная выстилка
кровеносных сосудов, служит пусковым механизмом для цепной ре-
5-937
129
акции последовательной активации ряда специфических протеиназ
гемокоагуляционной системы.
Фактор XIII является проферментом трансглутаминазы. Пос-
ле перехода в активную форму (ХШа) катализирует синтез кова-
лентных связей, соединяющих между собой мономерные единицы
в фибрине. При этом растворимый фибрин S переходит в нераство-
римый фибрин I.
Калликреин-кининовая система участвует в активации началь-
ных этапов свертывания крови и в формировании «калликреиново-
го моста» между факторами ХПа и VII (рис. 2.22).
Важнейшими кининами плазмы являются пептиды брадикинин,
каллидин и метиониллизил-брадикинин (см. разд. 2.5.1). Субстра-
ты, из которых высвобождаются кинины, называются кининогена-
Внутренний механизм Внешний механизм
Фибрин-мономер —Фибрин Фибрин Г
Рис. 2.22. Каскадно-комплексная схема свертывания крови:
фибрин S и фибрин I — растворимый и нерастворимый фибрин, а —
активированные факторы, пф — пластиночный фактор
130
ми. Они представляют собой белки, связанные в плазме крови с
а2-глобулиновой фракцией. Образование кининов из кининогенов
происходит при участии специфических ферментов — калликреи-
нов, являющихся протеиназами типа трипсина.
Участие тромбоцитов в гемостазе определяется основными
функциями этих клеток: а) ангиотрофической, т. е. способностью
поддерживать нормальную структуру и функцию микрососудов
(диаметр до 100 мкм); б) способностью образовывать в повреж-
денных сосудах первичную тромбоцитарную пробку (адгезивно-
агрегационная функция); в) способностью поддерживать спазм
поврежденных сосудов; г) участием в свертывании крови и инги-
бирующим влиянием на фибринолиз. Если повреждение сосуда не-
большое, тромбоцитарная пробка может остановить кровотечение.
Тромбоциты периодически смыкаются с эндотелиальными
клетками и «изливают» в них свое содержимое, являются естест-
венными «кормильцами» эндотелия. Последний не в состоянии из-
влекать ряд необходимых ему веществ прямо из плазмы.
Формирование тромбоцитарной пробки начинается с приклеива-
ния (адгезии) тромбоцитов к субэндотелиальным структурам сосу-
дистой стенки. Коллаген сосудистой стенки — главный стимулятор
этого процесса. Тромбоциты, интенсивно склеиваясь друг с дру-
гом, образуют агрегаты. Одним из агрегирующих агентов является
тромбин. Он вызывает агрегацию тромбоцитов, будучи в дозах, в
несколько раз меньших, чем те, что необходимы для свертывания
крови. Поэтому формирование тромбоцитарной пробки опережа-
ет свертывание крови.
В настоящее время свертывание крови рассматривают как
многоэтапный каскадный ферментативный процесс, в котором по-
следовательно активируются проферменты и действуют механизмы
аутокатализа, функционирующие как сверху вниз, так и в направ-
лении «обратной связи». В последние годы выяснилось, что на раз-
ных этапах процесса свертывания образуются белково-липидные
комплексы, в составе которых активируются ферментные факторы.
Неферментные компоненты этих комплексов ускоряют процесс и
обеспечивают специфичность действия коагулирующих ферментов
путем создания дополнительных мест связывания в комплексах
фермент-субстрат. Каскадно-комплексная схема свертывания кро-
ви включает четыре типа комплексов.
Комплекс 1: факторы ХПа + XI + фосфолипид = активатор
фактора II.
Комплекс 1а: фактор 111 +фактор VII + Са2+=активатор факто-
ра X (внешний механизм).
Комплекс 2: факторы IXa + VIII + Са2++ фосфолипид = акти-
ватор фактора X (внутренний механизм).
Комплекс 3: факторы Ха + V + Са2+ + фосфолипид = активатор
протромбина (протромбиназа).
Свертывание осуществляется с помощью двух механизмов, тес-
но связанных между собой, — внешнего и внутреннего (рис. 2.22).
Внешний механизм свертывания запускается тканевым тромбо-
5*
131
пластическим фактором (фактор III), который взаимодействует с
фактором VII и при участии Са2+ образует комплекс 1а (активатор
фактора X). Последний, будучи составной частью комплекса 3,
трансформирует фактор II в фактор Па.
Внутренний механизм свертывания запускается без добавления
извне тканевого тромбопластина, т. е. за счет внутренних ресурсов
крови или плазмы. Запуск внутреннего механизма начинается с
активации фактора XII. Активация этого фактора может осущест-
вляться коллагеном поврежденной сосудистой стенки, измененны-
ми клеточными мембранами, некоторыми протеазами, адренали-
ном. Вне организма активация фактора XII наступает от контакта
с чужеродными поверхностями — стеклом, иглами и т. д. Вслед за
фактором XII последовательно активируются факторы XI (в со-
ставе комплекса 7), IX и VIII. Последние входят в состав комплек-
са 2, который активирует фактор X, т. е. опять-таки приводит к
формированию протромбиназной активности, необходимой для
превращения протромбина в тромбин. Тромбин (Па) и фактор
XIII необходимы для превращения фибриногена в фибрин, образо-
вания сгустка крови.
Этот процесс состоит из трех стадий. Молекула фибриногена
содержит три пары неидентичных полипептидных цепей, соединен-
ных дисульфидными мостиками (2аА, 2рВ, 2у). В первую, протео-
литическую, стадию тромбин отщепляет фибринопептиды А от
а (А)-цепей и фибринопептиды В от р (В)-цепей, оставляя соответ-
ственно а- и p-цепи, входящие в состав образующегося фибрин-
мономера. Таким образом, полипептидная формула фибрин-моно-
мера (а, р, у)2. В следующую, полимеризационную, стадию моно-
мерные молекулы соединяются друг с другом «бок о бок» и «ко-
нец в конец», формируя сеть фибрина с полипептидной формулой
(а, р, у)п- В последнюю, стабилизационную, стадию фибриновая
сеть стабилизируется ковалентными связями под действием фер-
мента, образующегося из фактора XIII.
Ферментная система, обеспечивающая лизис фибрина в кровя-
ном русле, получила название фибринолитической или плазмино-
вой системы. Этот лизис осуществляется фибринолизином, или плаз-
мином, который находится в плазме крови в виде профермента
плазминогена в концентрации около 20 мг%. Активаторами плаз-
миногена служат протеиназы, в том числе змеиного яда, стрепто-
киназа из гемолитического стрептококка. Физиологическим акти-
ватором является урокиназа. Плазмин гидролизует в фибрине пеп-
тидные связи, образованные арг и лиз.
Антикоагулянты — вещества, предупреждающие процесс свер-
тывания крови. Их можно разделить на две основные группы: фи-
зиологические и нефизиологические. К первым относятся гепарин,
антитромбины, антитромбопластины и др. К нефизиологическим
антикоагулянтам относят вещества, осаждающие Са2+ из плазмы
(оксалаты, цитраты), антивитамины К (производные кумаринов),
биологические яды (змей, пиявок), воздействие физико-химиче-
ских условий (/°, ультразвук и т. д.).
ГЛАВА 3
ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Ферменты, пли энзимы, — это катализаторы белковой приро-
ды, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах
(фермент от лат. fermentum — закваска; энзим от греч. эн — в,
внутри, зиме — закваска). Происхождение терминов связано с
тем, что первоначально ферментативные процессы были открыты
и изучены в бродильном производстве.
В настоящее время большое внимание уделяют исследованию
строения, механизма функционирования ферментов, путей регуля-
ции ферментативной активности. Такой интерес к биологическим
катализаторам не случаен. Ферменты являются важнейшими ком-
понентами клетки, они теснейшим образом связаны с разнообраз-
ными процессами жизнедеятельности. Совокупность биохимических
реакций, катализируемых ферментами, составляет сущность обме-
на веществ, являющегося отличительной чертой всех живых орга-
низмов. Через ферментативный аппарат, регуляцию его активности
происходит и регуляция скорости метаболических реакций, их
направленности.
Изучение ферментов важно для медицины, промышленности,
сельского хозяйства. Установлено, что многие заболевания челове-
ка связаны с нарушением деятельности ферментов, при некоторых
заболеваниях ферментативные препараты применяются как лекар-
ственные средства. Технология ряда отраслей промышленности
(пищевая, текстильная и др.) также предусматривает использова-
ние ферментов. Ферменты — необходимые реагенты в научных ис-
следованиях.
3.1. Общие и специфические свойства
ферментов
Являясь катализаторами — веществами, ускоряющими реак-
ции, ферменты имеют ряд общих свойств с химическими, небиоло-
гическими катализаторами.
1. Ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции и
выходят из реакции в первоначальном виде. Они не расходуются
в процессе катализа.
2. Ферменты не могут возбудить реакций, противоречащих за-
конам термодинамики, они ускоряют только те реакции, которые
могут протекать и без них.
133
3. Ферменты, как правило, не смещают положения равновесия
реакции, а лишь ускоряют его достижение.
Для ферментов характерны и специфические свойства, отли-
чающие их от химических катализаторов, выражающих их биоло-
гическую природу.
1. По химическому строению молекулы все ферменты являются
белками.
2. Эффективность ферментов выше, чем небиологических ката-
лизаторов (скорость протекания реакции при участии фермента на
несколько порядков выше, чем при участии химических катализа-
торов) .
3. Ферменты обладают узкой специфичностью, избирательно-
стью действия на субстраты, г. е. на вещества, превращение которых
они катализируют.
4. Одним из важнейших свойств ферментов как биокатализато-
ров является их регулируемость. Через регуляцию ферментативно-
го аппарата осуществляется скоординированность всех метаболи-
ческих процессов во времени и пространстве, направленная на вос-
произведение живой материи, поддержание постоянства внутри-
клеточной среды, на приспособление к меняющимся внешним ус-
ловиям (см. разд. 12.5).
5. При ферментативных реакциях в отличие от неферментатив-
ных наблюдаются лишь незначительные, побочные процессы, для
ферментативных реакций характерен почти 100% выход про-
дуктов.
3.2. Общие принципы строения ферментов
До начала XX столетия сведений относительно химической при-
роды ферментов было очень мало, но уже тогда высказывались
предположения о белковой природе ферментов. Такой точки зре-
ния придерживался профессор Московского университета
Н. Е. Лясковский, позднее аналогичное мнение высказывали ака-
демик И. П. Павлов, немецкий химик Э. Фишер и др., однако экс-
периментального подтверждения эти предположения не имели.
Иной взгляд был у известного немецкого химика Р. Вильштеттера,
добившегося больших успехов в выделении и очистке ферментов.
Изучая свойства выделенных ферментов, Р. Вилыптеттер пришел
к выводу, что они относятся к особому классу веществ и состоят
из двух компонентов: низкомолекулярной активной части (агон) и
высокомолекулярного носителя (ферон).
В 20—30-х годах XX столетия стало появляться все больше
данных, свидетельствующих о том, что ферменты — это белки.
В 1926 г. Д. Самнером (США) из семян канавалии был выделен
фермент уреаза в виде кристаллического белка. Несколько позже
в 1931 г. Д. Нортроп (США) получил кристаллический пепсин.
Этими работами была окончательно доказана белковая природа
ферментов. Признанием больших заслуг Д. Самнера и Д. Нортро-
134
па в области энзимологии было присуждение им в 1946 г. Нобелев-
ской премии.
Относительная молекулярная масса белков, обладающих фер-
ментативными свойствами, колеблется от 15 тысяч до нескольких
миллионов. Для ферментативных белков характерны те же физи-
ко-химические свойства, что и для белков, не наделенных этими
функциями. Ферменты являются глобулярными белками, их моле-
кулы могут быть представлены как простыми, так и сложными
белками. В первом случае ферменты называют однокомпонентны-
ми, во втором — двухкомпонентными.
Белковая часть двухкомпонентных ферментов называется апо-
ферментом, а молекула в целом — холоферментом. Небелковые
компоненты, легко диссоциирующие из комплекса с ферментатив-
ным белком, принято называть коферментами. Они действуют как
акцепторы (или доноры) атомов или функциональных групп, уда-
ляющихся от субстрата (или присоединяющихся к нему). В связи
с этим считают, что более правильно рассматривать коферменты
как косубстраты. Это хорошо видно из следующих реакций (Е —
фермент, К — кофермент, АН2, В — субстраты):
Е-К + АН2^А + ЕКН2
Е'.КН3 +В^Е'-К + ВН2
Прежде чем сможет окислиться новая молекула АН2, кофермент
КН2 должен возвратиться в исходное состояние К. Это осуществля-
ется при участии другого фермента Е', на который переходит вос-
становленный кофермент.
Если небелковая часть фермента прочно связана с белком и в
цикле биохимических реакций не отсоединяется от него, ее при-
нято называть простетической группой. Однако резкой границы
между коферментами и простетическими группами не существует,
степень прочности связи ферментативных белков с небелковыми
компонентами широко варьирует.
Небелковые компоненты ферментативной молекулы принято
называть также кофакторами. Соединение белковой части фермен-
та и небелковой может осуществляться за счет ионных, водородных
связей, гидрофобных взаимодействий, реже — с помощью кова-
лентных связей.
Функциями коферментов и простетических групп являются:
1) участие в акте катализа, 2) осуществление контакта между фер-
ментативным белком и субстратом, 3) стабилизация апофермента.
Апофермент, в свою очередь, усиливает каталитическую активность
небелковой части и, кроме того, определяет специфичность дейст-
вия ферментов, поскольку одна и та же по химизму небелковая
часть может функционировать в составе различных ферментов.
Например, НАД+ является коферментом многих дегидрогеназ —
лактатдегидрогеназы (ЛДГ), ^малатдегидрогеназы (МДГ) и др.;
они отличаются апоферментной, белковой частью молекулы.
135
3.3. Активный центр
Рис. 3.1. Активный центр фер-
мента:
а—группировки каталитической зо-
ны, б — группировки зоны связыва-
ния
В ходе ферментативных реакций осуществляется контакт меж-
ду ферментом и субстратом, образуются промежуточные фермент-
субстратные комплексы (ES). Та область ферментативной молеку-
лы, в которой происходит связывание и превращение субстрата,
называется активным центром (на его долю обычно приходится
лишь небольшая часть молекулы). Ак-
тивный центр образуется определен-
ными боковыми радикалами аминокис-
лотных остатков полипептидной цепи,
а в двухкомпонентных ферментах в
него входят и некоторые группировки
небелковой части. У ферментов, имею-
щих четвертичную структуру, число ак-
тивных центров, как правило, совпада-
ет с числом субъединиц.
Активный центр функционально не-
однороден, в нем условно выделяют
несколько зон. Тс группировки актив-
ного центра, которые контактируют с
подвергающимися превращению фраг-
ментами молекул субстрата, т. е. при-
нимают непосредственное участие в
синтезе или расщеплении связи суб-
страта, входят в каталитическую вону. Группировки, контактирую-
щие с непревращаемыми фрагментами субстрата, и укрепляющие
его в активном центре, относятся к зоне гвчвыванпя (рис. 3.1).
Связывание субстрата, как правило, многоточечное, оно осуще-
ствляется при участии нескольких группировок ферментативной
молекулы и субстрата. В молекуле фермента существуют также
остатки аминокислот, которые не имеют прямых контактов с суб-
стратом, но способствуют катализу, фиксируя группировки ката-
литической зоны в активном состоянии.
Наиболее часто в состав активных центров входят такие амино-
кислоты, как сер, гис, тре, цис, глу, асп, арг. Аминокислоты, обра-
зующие активный центр, по длине полипептидной цепи находятся
далеко друг от друга и оказываются сближенными при формирова-
нии пространственной структуры. Например, в активный центр хи-
мотрипсина входят гис — 57, асп — 102, сер— 195, всего фермент
состоит из 246 аминокислотных остатков. Химотрипсин, как и не-
которые другие, в основном секретируемые ферменты, образуется
сначала в неактивной форме, в форме профермента (зимоген) —
химотрипсиногена.. Химотрипсиноген не имеет окончательно сфор-
мированного активного центра и не способен активно катализиро-
вать свойственные ферменту реакции. При активации химотрипси-
ногена под действием трипсина и химотрипсина гидролизуются че-
тыре пептидные связи, в результате чего выщепляются дипептиды
14—15 и 147—148 (рис. 3.2), происходит окончательное формиро-
136
Tup -146
Химотрипсин —
Zpe-147 <'S-S)4
А сн -148
Химотрипсин-----
лла-149 8
Иле 16
---------Трипсин
Лрг-15
I
Сер-14
f-*----Химотрипсин
Лей-13
соон nh2
Химотрипсиноген
Тир СООН
Тре-147-Лсн-148
Илет2
Арг-15-Сер~14
(S~S)4
ЛлаЫН2 S
----А сн L \ис —
соон nh2
а-Химотрипсин
Лей СООН
Рис. 3.2. Активация химотрипсиногена (одна полипептидная
цепь).
Образующийся d-химотрипсин состоит из трех цепей, соединенных ди-
сульфидными связями
ванне активного центра, сближение 57-й, 102-и и 195-й аминокис*
лот, участвующих непосредственно в акте катализа (см. рис. 3.7).
Для многих ферментов сейчас известны аминокислоты, образую-
щие активный центр, а также выполняемая ими функция в ката-
лизе Заключение о нахождении тех или иных аминокислотных
остатков ферментативной молекулы в активном центре можно сде-
лать изучая кинетику ферментативных реакций и применяя специ-
фические реагенты на определенные группировки. Специфические
реагенты подобраны для таких аминокислот, как три (N-бромсук-
цинимид) цис (органические производные ртути, например р-хлор-
меркурибензоат — ПХМБ, монойодуксусная кислота), сер (диизо-
пропилфторфосфат - ДИФФ) и ряда других.
Сведения о функциональных группах активного центра позво-
ляет получить и применение протеолитических ферментов, расщеп-
137
ляющих избирательно пептидные связи в ферментативной молеку-
ле. Ценную информацию дает сравнение пространственных струк-
тур фермента в отсутствие и присутствии ингибиторов в совокуп-
ности с информацией о первичной структуре.
Активные центры ферментов расположены в углублениях на
поверхности ферментативной молекулы (рис. 3.3). Например, у
Рис. 3.3. Модель молекулы фермента. А — третичная структура
молекулы; Б — силуэт молекулы с активным центром (в рамке)
многих дегидрогеназ активные центры находятся во впадине меж-
ду двумя доменами. Микросреда активного центра отличается от
остального окружения фермента более низкой диэлектрической
проницаемостью, приближающейся к таковой для некоторых орга-
нических растворителей. Среда с пониженной диэлектрической про-
ницаемостью является более благоприятной по сравнению с водой
для протекания реакций с переносом заряда, которые характерны
для работы большого числа ферментов. Кроме указанной особен-
ности, микросреда активного центра характеризуется повышенной
микровязкостью, что ограничивает свободу вращательного движе-
ния группировок активного центра. Если фермент двухкомпонен-
тен, то его активный центр достраивается после взаимодействия
апофермента с небелковой частью. Показано, например, что пиру-
ват — субстрат фермента лактатдегидрогеназы не связывается
ферментом до тех пор, пока не образуется комплекс между апо-
ферментом и НАДН. Следовательно, пируватсвязывающий центр
на поверхности фермента возникает после присоединения НАДН
вследствие изменения конформации, а возможно, и заряда в этом
участке белковой молекулы.
Индивидуальные особенности строения активных центров раз-
личных ферментов обусловливают специфичность их действия.
Специфичность ферментов может быть абсолютной и относитель-
ной. В случае абсолютной специфичности ферменты катализируют
превращение только одного вещества, в случае относительной —
138
небольшой группы близких по свойствам веществ. Примерами
ферментов с абсолютной специфичностью являются уреаза, сукци-
натдегидрогеназа (СДГ):
О
Н Уреаза
H2N—С—NH2 + Н2О------> 2NH3 + СО2
Мочевина
К ферментам с относительной специфичностью относятся эсте-
разы, расщепляющие обширный ряд эфиров карбоновых кислот;
некоторые фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кисло-
ты; пептидазы и протеиназы, гидролизующие пептиды и белки.
Относительная специфичность протеиназ выражается также и
в том, что они расщепляют большое число различных белков.
У ряда ферментов это сочетается со способностью гидролизовать
только определенные пептидные связи в субстрате, что объясняет-
ся особенностями строения их активных центров. Так, различие в
селективности действия трипсина, химотрипсина и эластазы обус-
ловлено небольшими изменениями в строении того участка актив-
ного центра, куда попадает боковая цепь аминокислоты расщеп-
ляемого субстрата.
В химотрипсине этот участок («карман») приспособлен к свя-
зыванию больших гидрофобных радикалов (фен, тир, три), в трип-
сине — положительно заряженных группировок, так как на дне
«кармана» активного центра фермента находится отрицательно за-
ряженная СООН-группа асп — 189. В эластазе (гидролизует бел-
ки по ала) у входа в «карман» вместо двух гли, как в химотрип-
сине, находятся вал и тре, предотвращающие попадание туда боль-
ших боковых радикалов субстрата.
Подобным же образом объясняются различия в специфичности
действия карбоксипептидаз А и В. Оба фермента гидролизуют
белки с С-конца, первый отщепляет с наибольшей скоростью С-
концевые ароматические аминокислоты (тир, три, фен), второй —
преимущественно лиз и арг. Основное различие этих ферментов
заключается в том, что связывающий остаток в «кармане» карбок-
сипептидазы А — иле — 255, а в В — асп — 255, что и определяет
сродство к различным С-концевым аминокислотным остаткам.
Кроме химической специфичности некоторые ферменты обнару-
живают и стерическую специфичность. Такие ферменты различают
стереоизомеры и катализируют превращение только одного из
них: D- или L-, а- или £»-, цис- или транс-. Например, существуют
а- и р-гликозидазы, гидролизующие только один из видов глико-
зидов. Фумарат-гидратаза действует лишь на фумарат (транс-
изомер) и не превращает малеинат (цис-изомер). При дегидрата-
ции малата (эта реакция протекает в цикле трикарбоновых кис-
лот) образуется только фумарат:
НООС—СН фумарат- СН(ОН) СООН
И + Н2О t I
СН—СООН гидратаза СН2СООН
Фумарат Малат
139
3.4. Строение и функции отдельных коферментов
и простетических групп
В качестве небелковых частей ферментов может функциониро-
вать большое число органических и неорганических (ионы метал-
лов) веществ. Все их разнообразие принято условно делить на
группы. Существует несколько различных принципов классифика-
ции небелковых частей. По химизму они могут быть условно под-
разделены на 4 группы: 1) нуклеотидного типа строения, 2) вита-
мины и их производные, 3) металлы и металлсодержащие небел-
ковые части, 4) другие небелковые части. Небелковые компоненты
ферментов имеют сравнительно небольшую молекулярную массу
и в отличие от апофермента являются гермостабильными.
3.4.1. Небелковые части нуклеотидного типа строения.
Никотинамидные коферменты. К никотинамидным
коферментам относятся НАД+ (никотинамидадениндинуклеотид)
и НАДФ+ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Молекулы
НАД+ и НАДФ+ состоят из двух гетероциклов — пиридинового и
пуринового, соединенных цепочкой из двух остатков моносахари-
да рибозы и остатка пирофосфорной кислоты.
В составе этих коферментов содержится витамин РР, поэтому
они могут быть отнесены и к группе коферментов — производных
витаминов. НАДФ+ отличается от НАД+ тем, что содержит еще
один остаток ортофосфата, связанный с С—2 рибозы аденозиновой
части. НАД+ и НАДФ+ — типичные коферменты, так как непрочно
140
Tup -85
Рис. 3.4. Связывание НАД+ и L-лактата (окружены волнистой линией) в актив-
ном центре лактатдегидрогеназы
связаны с белком и в цикле биохимических реакций переходят от
одного фермента к другому.
Никотинамидные коферменты функционируют в составе боль-
шого числа дегидрогеназ. Кофермент связан с белком за счет
электростатических связей и гидрофобных взаимодействий
(рис. 3.4). НАД+- и НАДФ+-содержащие дегидрогеназы катализи-
руют перенос гидрид-иона (Н~) от субстрата к никотинамидной
части молекулы кофермента, при этом в среду переходит протон:
Восстановленные НАД и НАДФ не имеют заряда на азоте пи-
ридинового кольца и содержат присоединенный от субстрата водо-
род в пиридиновом кольце в положении 4. Образовавшиеся в ре-
зультате переноса гидрид-иона НАДН и НАДФН теряют сродство
к апоферменту и отделяются от дегидрогеназы. Восстановленные
коферменты затем окисляются путем переноса электронов и про-
тонов к акцептору, связанному со вторым ферментом. Таким обра-
141
зом, НАД* и НАДН, так же как НАДФ+ и НАДФН, функциони-
руют циклически и принимают участие в дисмутациях, т. е. в вос-
ставлении одного метаболита другим.
В живых организмах большая часть НАД находится в окислен-
ной форме, а НАДФ — в восстановленной, что связано с различ-
ной ролью этих коферментов в метаболизме. Окислительно-вос-
становительные ферменты, участвующие в снабжении клетки
энергией, являются НАД+-зависимыми, а ферменты, катализирую-
щие реакции восстановительных синтезов, используют НАДФН.
НАДФН требуется для восстановительного биосинтеза большинст-
ва клеточных компонентов; в растениях он участвует и в синтезе
глюкозы из СО2 за счет световой энергии. Меньшую роль в про-
цессах биосинтеза играет НАДН.
Переход НАД+ и НАДФ+ в восстановленное состояние сопро-
вождается изменением спектра поглощения в УФ-области. Если
окисленные формы коферментов имеют одну узкую полосу погло-
щения с максимумом при 260 нм, то у восстановленных появляется
еще один пик с максимумом при 340 нм. На этом свойстве нико-
тинамидных коферментов основан широко распространенный метод
спектрофотометрического определения активности НАД+- и
НАДФ+-зависимых дегидрогеназ.
НАД+- и НАДФ+-зависимые дегидрогеназы встречаются у всех
живых организмов, такая универсальность их распространения
свидетельствует о единстве основных путей метаболизма в живой
природе. НАД+- и НАДФ+-зависимые дегидрогеназы катализиру-
ют обратимые реакции дегидрирования спиртов, гидроксикислот,
аминокислот. Хорошо изученными к настоящему времени дегид-
рогеназами являются ЛДГ (лактатдегидрогеназа), МДГ (малат-
дегидрогеназа), АДГ (алкогольдегидрогеназа), глицеральдегид-
фосфатдегидрогеназа.
Все указанные выше дегидрогеназы имеют сходный белковый
фрагмент, состоящий из шести параллельных 0-цепей и нескольких
а-спиральных участков. Именно этот фрагмент связывает кофер-
мент и называется НА Довязывающим доменом. Для дегидроге-
наз характерно наличие четвертичной структуры; димерами, в
частности, являются МДГ, АДГ, тетрамером — ЛДГ.
В настоящее время показано, что НАД+ как кофермент участ-
вует и в таких реакциях, где не используются его окислительно-
восстановительные свойства, например, он необходим при работе
ДНК-лигазы из Е. coll, катализирующей образование фосфоди-
эфирной связи.
Флавиновые простетические группы. К этой груп-
пе принадлежат ФМН (флавинмононуклеотид) и ФАД (флавин-
адениндинуклеотид). Оба эти соединения можно одновременно
рассматривать и как производные витамина В2 (рибофла-
вин).
Флавинмононуклеотид (ФМН)—зН
АМФ
ФМН не является типичным нуклеотидом, так как содержит не
рибозу, а спирт рибит, не образующий гликозидной связи. Азотис-
тым основанием служит демитилизоаллоксазин, не относящийся к
производным пурина или пиримидина. Оба флавиновых нуклеотида
прочно связаны с белковыми частями ферментов, иногда даже ко-
валентно, поэтому их называют простетическими группами.
ФМН и ФАД функционируют в составе ряда окислительно-вос-
становительных ферментов (флавопротеинов). В настоящее время
известно около 80 флавиновых ферментов, большинство из них в
качестве небелковой части содержит ФАД. Рабочей частью флави-
нов является изоаллоксазиновое кольцо, способное в окисленной
форме принимать на себя два атома водорода.
Окисленные флавопротеины имеют три максимума поглощения:
при 280, 350—380 и 450 нм. При восстановлении почти полностью
исчезает полоса поглощения в видимой области спектра (450 нм),
обусловливающая желтую окраску флавопротеинов, кроме того,
происходит частичное уменьшение поглощения при 280 и 350—
380 нм.
Флавопротеины катализируют разнообразные окислительно-вос-
становительные реакции: окисление полуацеталей в лактоны, спир-
тов в альдегиды, аминов в имины, насыщенных карбонильных
соединений в а,^-ненасыщенные, НАДН и НАДФН в НАД+ и
НАДФ+ (ФАД и ФМН — более сильные окислители, чем нико-
тинамидные коферменты). Примером этих реакций является
окисление глюкозы при участии глюкозооксидазы в глюконовую
кислоту.
143
соон
D-Глюкоза
(полуацеталь)
Й—с—он
I
но—с—н
н—с—он
н—с—он
сн2он
Лактон глюконовой D-Глюконовая
кислоты
кислота
Глюкозооксидаза, как и некоторые другие флавопротеины, ауто-
оксидабельна, т. е. способна передавать отщепляемый от субстрата
водород непосредственно на молекулярный кислород, минуя цепь
переноса электронов с образованием пероксида воророда, такие
ферменты относятся к оксидазам,..,
ФАД(ФМН)Н, ФАД (ФМН)
о2
н2о2
Образующийся Н2О2 или используется в качестве окислителя не-
сколькими пероксидазами или расщепляется каталазой.
Другие флавиновые ферменты представлены дегидрогеназами,
которые передают электроны и протоны от окисляемых веществ
промежуточным переносчикам (см. разд. 7.3.1). а,£-Дегидрирова-
ние при участии флавиновых ферментов протекает, например, при
окислении янтарной кислоты в фумаровую в цикле трикарбоновых
кислот (ЦТК) и катализируется сукцинатдегидрогеназой'ДСДГ).
СДГ отщепляет водород непосредственно ст окисляемого веще-
ства, она является первичной дегидрогеназой. Среди флавопротеи-
нов имеются и вторичные дегидрогеназы, они принимают водород
от НАДН и НАДФН, образовавшихся в результате действия пер-
вичных НАД+ и НАДФ+-зависимых дегидрогеназ. В составе фла-
вопротеинов может содержаться металл (металлофлавопротеины),
гем, железосероцентры. В таких сложных флавопротеинах на одном
белке находится целая миниатюрная электронпереносящая систе-
ма. К металлофлавопротеинам относятся, в частности, альдегидок-
сидаза, ксантиноксидаза. Последняя катализирует окисление не
только гипоксантина, но и альдегидов.
'Г Альдегид- и л
R-<H + Н1° + °2 ~ \он 2 2
Гипоксантин
144
Ксантиноксидаза является димером (М~ 275 000), содержит две
молекулы ФАД, два атома Мо и восемь атомов Fe. Ксантинокси-
даза относится к железосерным белкам. Альдегидоксидаза катали-
зирует только реакцию окисления альдегидов и имеет очень сход-
ное с ксантиноксидазой строение. В железосерных белках атомы
Fe связаны с SH-группами цис. К флавинсодержащим железосер-
ным белкам принадлежат и сукцинатдегидрогеназа, нитратредук-
таза, нитритредуктаза.
Нуклеозидтрифосфаты и НДФС. АТФ и другие ну-
клеозидтрифосфаты (ГТФ, УТФ, ЦТФ) являются коферментами
фосфотрансфераз, катализирующих перенос фосфатного остатка
от нуклеозидтрифосфатов на другие соединения с активацией по-
следних (см. разд. 3.10). В некоторых случаях активация осуще-
ствляется путем переноса пирофосфатной, аденозиновой или аде-
нозинмонофосфатной части молекулы АТФ. Например, перенос
пирофосфата — двух фосфатных остатков от АТФ — имеет место
при образовании тиаминдифосфата (ТДФ) — фосфорилированной
формы витамина Bi (см. разд. 10.3), перенос аденозинмонофосфа-
та (АМФ) — в процессе активации аминокислот при биосинтезе
белка (см. разд,’5.3.2), перенос аденозильного остатка (аденин —
рибоза) осуществляется на соединения типа R — S — СН3, в
частности, на аминокислоту метионин. Последняя реакция приво-
дит к синтезу активной формы метионина: S-аденозилметионина,
у которого метильная группа обладает повышенной реакционной
способностью.
НООС—CHNH2—(CH2)2—-S—СН3 + АТФ + Н2О
Метионин
НООС—CHNH2—(СН2)2—S+—СН3 + Н3РО4 + Н4Р2О7
аденозин
S-Аденозилметионин
Нуклеозиддифосфатсахара (НДФС) участвуют как коферменты
гликозилтрансфераз в реакциях переноса моносахаридных остат-
ков при биосинтезе олиго- и полисахаридов (см. разд. 6.6.3).
Кофермент ацетилирования — коэнзим А(КоА).
Строение КоА
145
Нуклеотидная часть в КоА служит «ручкой», с помощью кото-
рой кофермент присоединяется к белку, другая часть молекулы,
имеющая длину 1,9 нм, оканчивается важной для функционирова-
ния SH-группой.
Для КоА наиболее характерно участие в реакциях активации и
переноса ацетильных групп, однако он может осуществлять пере-
нос и других кислотных групп, поэтому его еще называют кофер-
ментом ацилирования. Ацильные группы присоединяются к сере в
составе КоА, богатой энергией тиоэфирной связью. Кислотный ос-
таток при этом активируется. Синтез ацетилкоэнзима А (ацетил-
КоА) из ацетата и КоА происходит у млекопитающих в печени и
нервной ткани за счет энергии АТФ, при участии фермента ацетат-
тиокиназы.
КоА входит в состав пируватдегидрогеназной и а-кетоглутарат-
дегидрогеназной систем, катализирующих процесс окислительного
декарбоксилирования соответствующих кетокислот. Как кофер-
мент КоА действует и в составе тиокиназы жирных кислот, осуще-
ствляющей реакцию их активации перед p-расщеплением (см. разд.
В.8.2). Ацетил-КоА в свою очередь является коферментом ацетил-
трансфераз, катализирующих реакции биологического ацетилиро-
вания, присоединения ацетильных групп (СН3СО—) к другим мо-
лекулам. Ацетил-КоА участвует в таких биохимических процессах,
как синтез жирных кислот и стероидов из углеводов, осуществляет
ацетилирование при синтезе ацетилхолина и ацетиламиносахаров,
3.4.2. Металлы и металлсодержащие небелковые части. Фер-
менты, функционирующие в форме комплексов разной степени
прочности с металлом, называются металлоферментами. По проч-
ности связи металлов с белками их условно разделяют на истин-
ные металлофермеиты и ферменты, активируемые металлами. Ис-
тинные металлофермеиты содержат прочно связанный металл, не
отделяющийся от апофермента при очистке, и характеризуются
довольно четкой специфичностью по отношению к металлу. В фер-
ментах, активируемых металлами, металл непрочно связан с бел-
ком, легко отделяется от него частично или полностью в процессе
очистки; специфичность к металлу, как правило, плохо выражена.
В настоящее время известно около ста ферментов, которые
должны быть отнесены к истинным металлоферментам. Наиболее
часто в состав ферментов, так же как и других металлопротеинов,
входят Zn, Си, Fe, Мо. Ионы металлов, находящиеся в активных
центрах ферментативных молекул, могут участвовать в акте ката-
лиза, служить связующим мостиком между ферментом и субстра-
том, участвовать в образовании комплекса фермент-кофермент.
Если ион металла находится вне активного центра фермента, то он
поддерживает третичную и четвертичную структуры фермента.
Ионы металлов в истинных металлоферментах связаны с опре-
деленными группами белка (лигандами) координационными свя-
зями, образуя комплексы. Прочные комплексы с азотсодержащими
лигандами дают ионы Cu2+, Со2+, Ni2*, Fe2+. Помимо атомов азота
ионы переходных металлов хорошо связываются и с серой (Zn2+,
146
Cu2+, Fe2+ и др.). Ионы Са и Mg связываются в белках преимуще-
ственно с такими лигандами, как фосфатные и карбоксилатные ио-
ны. Предполагают наличие в белковых молекулах специфических
участков и для присоединения щелочных металлов К+ и Na+, хотя
в клетке они в основном присутствуют в свободном виде.
Ниже даны примеры истинных металлоферментов, некоторые
сведения об их строении и выполняемой металлом функции. Ши-
роко распространены в растениях аскорбатоксидаза и полифено-
локсидаза (тирозиназа). Первая из них катализирует окисление ас-
корбиновой кислоты за счет О2 воздуха в дегидроаскорбиновую
кислоту (см. разд. 10.3), вторая — фенолов до хинонов. Эти фер-
менты имеют относительную молекулярную массу около 120 000»
являются медьсодержащими; их молекулы построены из несколь-
ких субъединиц.
Иногда наряду с Си2+ в состав ферментов входят и другие ионы.
Так, цитоплазматическая супероксид-дисмутаза эукариот
(см. разд. 7.5) представляет собой димер, каждая из субъединиц
которого содержит прочно связанные Си2+ и Zn2+.
У окислительно-восстановительных ферментов металлы обычно
принимают непосредственное участие в акте катализа.
Железосодержащими ферментами являются в основном так на-
зываемые железопорфирины, т. е. белки, у которых железо нахо-
дится в составе гема (гемовое железо). К таким ферментам отно-
сятся каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза и др.
К цинксодержащим ферментам относятся карбоангидраза, ал-
когольдегидрогеназа, карбоксипептидаза А и др. Карбоангидраза
катализирует обратимое расщепление угольной кислоты Н2СО3^
=г^Н2О-ьСО2. Фермент широко распространен у растений и живот-
ных. В капиллярах тканей животных реакция смещена в сторону
образования угольной кислоты, что способствует ее удалению с то-
ком крови, а в капиллярах легких реакция более активно протека-
ет в противоположном направлении, в результате ускоряется уда-
ление СО2 через легкие.
Реакция окисления спиртов идет при участии алкогольдегидро-
геназы:
R-CH2OH + НАД+ R—С + НАДН + Н+
Этот 2п2+-зависимый фермент активен в печени человека, он окис-
ляет этиловый спирт до токсичного для человека продукта — ук-
сусного альдегида. Сложным белком, содержащим один ион Zn2+>
является панкреатическая карбоксипептидаза А. Ионы Zn2+ содер-
жит ДНК-полимераза 1 из Е. colt. Ионы цинка в гп2+-зависимых
ферментах часто могут быть заменены на Мп2+, Со2+ без сущест-
венного снижения каталитической активности.
Известно несколько селенсодержащих ферментов, участвую-
щих в окислительно-восстановительных реакциях. Видимо, это од-
147
на из причин того, что крайне токсичный в определенных концент-
рациях элемент Se в то же время является необходимым компонен-
том пищи, отсутствие которого может привести к гибели клеток,
как было показано в опытах с лабораторными животными.
3.4.3. Другие небелковые части ферментов. Липоевая кис-
лота. Как кофермент липоевая кислота участвует в окислитель-
ном декарбоксилировании а-кетокислот. Липоевая кислота кова-
лентно связана амидной связью с е-ЫН2-группой лиз в составе
апофермента.
Окислительное декарбоксилирование а-кетокислот протекает по
• следующей схеме:
о
II
R—С—СООН
ТДФ
л
HSKoA
ЛК, ФАД
НАД+ НАДН
R—C~SKoA
Глутатион. Данный трипептид служит коферментом для
ряда изомераз непредельных соединений и выполняет эту роль при
внутримолекулярном переносе водорода (дисмутация). Глутатион
участвует, например, в реакции изомеризации производных малеино-
вой кислоты в производные фумаровой кислоты, т. е. осуществляет
процесс цис-транс-изомеризации. Глутатион является также кофер-
ментом при окислений формальдегида в формиат. Этот трипептид
входит в состав ДДТ-дехлоргидразы, отщепляющей НС1 от инсек-
тицида и участвующей в его детоксикации. Высокая активность
данного фермента характерна для насекомых, устойчивых
к ДДТ.
Роль витаминов как небелковых частей ферментов рассмотрена
в гл. 10.
3.5. Механизм ферментативного катализа
Для протекания любой реакции необходимо, чтобы реагирую-
щие молекулы пришли в контакт друг с другом. Однако не каждое
столкновение молекул сопровождается их взаимодействием, реак-
ция протекает только в том случае, если молекулы обладают дос-
таточным запасом кинетической энергии. Совокупность молекул
любого вещества представляет собой статистический набор моле-
148
кул с различной кинетической энергией (рис. 3.5). Энергию, необ-
ходимую для достижения активированного (переходного) состоя-
ния, или тот избыток энергии по сравнению со средней энергией
молекул при данной температуре, которым они должны обла-
дать, чтобы вступить в реакцию, называют энергией актива-
ции (Еа).
В случае ферментативных реакций энергетический барьер сни-
жается благодаря образованию фермент-субстратного комплекса,
а чем меньше энергия активации, тем быстрее протекают реакции,
Рис. 3.5. Распределение кинетиче-
ской энергии в популяции моле-
кул:
А — молекулы, вступающие в реакцию
(активированные молекулы), Еа — ми-
нимальная энергия активации
Рис. 3.6. Профили энергии реакции:
Еа и Е'а — энергия активации нефермен-'
тативной и ферментативной реакций, АВ —
исходное вещество, А4-В — продукты реак-
ции, А* В* — активированные молекулы,
ES — активированный комплекс
так как вступить во взаимодействие могут молекулы с меньшим
запасом энергии (рис. 3.6). Как видно из рисл З.6, при фермента-
тивной и неферментативной реакциях для достижения переходного
состояния молекулы исходных веществ активируются, приобретают
более высокий запас энергии, только после этого они могут претер-
певать превращение в продукты реакции, но Еа в случае фермента-
тивной реакции ниже.
Таким образом, большие скорости ферментативных реакций яв-
ляются в конечном счете результатом снижения энергии активации
катализируемых реакций. Именно благодаря тому, что биологичес-
кие катализаторы снижают энергию активации, ферментативные
реакции протекают с высокой скоростью при относительно низкой
температуре.
Снижение энергии активации при ферментативном катализе
имеет некоторую связь с многостадийностью этих реакций. Они
протекают не в один этап, а ступенчато, через несколько промежу-
точных реакций. Активационный барьер реакции при этом разбива-
ется на несколько более низких барьеров каждой промежуточной
реакции, преодолеть которые реагирующим молекулам легче, чем
один большой барьер.
149
Ферментативный катализ имеет признаки как гомогенного, таки
гетерогенного катализа, протекающего на границе раздела двух
фаз. В каталитическом действии ферментов можно выделить 3 ста-
дии: 1) присоединение молекулы субстрата (S) к ферменту (£),
2) превращение субстрата, 3) отделение конечных продуктов реак-
ции (Р) от фермента. Простейшая схема ферментативной реакции
записывается следующим образом:
£ + S^£S^£ + P
Наиболее быстрой обычно является первая стадия реакции,
медленной — вторая. На 1-й стадии реакции происходит образова-
ние фермент-субстратного комплекса (£5, ФСК), в результате чего
структура и свойства молекулы субстрата меняются, образуются
его переходные формы. Это является главной предпосылкой уско-
рения процесса его превращения в катализируемой реакции.
Образование ФСК становится возможны’м благодаря опреде-
ленному сродству ферментов к своим субстратам. Наиболее четко
мысль о таком соответствии была высказана Э. Фишером (1890)
при объяснении специфичности действия ферментов. Он сравнивал
фермент и субстрат с ключом и замком и полагал, что фермент
подходит к своему субстрату как ключ к замку. В настоящее вре-
мя не вызывает сомнения, что между пространственными структу-
рами субстрата и активного центра фермента существует стеричес-
кое соответствие, однако это соответствие, как будет показано
дальше, не абсолютное. В образовании фермент-субстратного
комплекса принимают участие ионные, водородные ^вязи и гидро-
фобные взаимодействия. Возникновение временных ковалентных
связей между ферментом и субстратом возможно в ряде фермента-
тивных реакций только на 2-й стадии — при превращении субстра-
та и образовании промежуточных и переходных состояний. ФСК
очень лабильны: существуют лишь доли секунды, тем не менее к
настоящему времени удалось получить ряд ФСК*
Образование ФСК создает предпосылки высокой каталитичес-
кой активности. Установлено, что при образовании ФСК молекулы
фермента и субстрата не только сближаются, но и определенным
образом ориентируются друг относительно друга. Между структу-
рой субстрата и активного центра фермента кроме стерического
соответствия существует и топохимическое, при котором обеспечи-
вается взаимодействие узнающих групп фермента (связывающая
зона) и узнаваемых групп субстрата. Связывание фермента и суб-
страта обычно многоточечное, причем чем выше специфичность
фермента, тем больше точек узнавания.
Немаловажным фактором, вносящим определенный вклад в
возрастание скорости ферментативных реакций, является увеличе-
ние на несколько порядков времени контакта реагирующих моле-
кул в результате многоточечного связывания субстрата (ов) фер-
ментом. Время, в течение которого длится контакт молекул при
столкновении в случае чисто химической реакции, равно приблизи-
ло
тельно периоду тепловых колебаний молекул (10~13—10~12 с). За
это время не всегда успевает произойти химическая реакция.
Определенный вклад в увеличение скорости ферментативных ре-
акций вносит индуцированное соответствие фермента субстрату.
Согласно теории индуцированного соответствия, высказанной впер-
вые Д. Кошландом, у многих ферментов в отсутствие субстратов
функциональные группы активных центров ориентированы таким
образом, что оптимального взаимодействия их с комплементарны-
ми группами субстрата не происходит. Вхождение субстрата в ак-
тивный центр фермента вызывает конформационное изменение в
ферменте, при котором функциональные группы фермента занима-
ют положение, оптимальное для протекания каталитического про-
цесса. Доказательством конформационных изменений фермента
при связывании субстрата является отличие рентгенограмм сво-
бодного фермента и в присутствии специфического ингибитора.
Наличие конформационных изменений при связывании субстратов
и их аналогов хорошо показано для карбоксипептидазы А, лизоци-
ма, гидролизующего полисахариды клеточных стенок бактерий.
Например, у карбоксипептидазы А в присутствии аналога субст-
рата наблюдается смещение ряда аминокислот в активном центре
(тар-248 смещается приблизительно на 1,2 нм, арг-145 и глу-270 —
на 0,2 нм).
При оптимальном связывании субстрата (ов) с ферментом обра-
зуется продуктивный фермент-субстратный комплекс, т. е. такой
комплекс, который через ряд промежуточных стадий дает про-
дукт (ы) реакции. Эти процессы протекают на 2-й стадии фермен-
тативной реакции. Быстрому протеканию ферментативной реакции
способствует то, что при взаимодействии субстрата с ферментом
индуцируется напряжение разрываемых связей в субстрате (дефор-
мация или дестабилизация их), т. е. разрываемые связи становятся
менее стабильными, чем в свободном субстрате.
Увеличение скорости реакции под влиянием ферментов происхо-
дит и благодаря большей гидрофобности среды активного центра
по сравнению с окружающим раствором, в такой среде наблюдает-
ся десольватация заряженного субстрата, приводящая к дестаби-
лизации разрываемой связи.
Важной особенностью ферментативных реакций является и то,
что превращение субстрата протекает как полифункциональный ка-
тализ. Полифункциональность обеспечивается разнообразием ами-
нокислотных остатков белковой части фермента и групп кофакто-
ров в активном центре; на превращающуюся химическую связь
субстрата одновременно или в результате серии последовательных
атак воздействует несколько групп фермента., В результате этого
происходит поляризация превращающейся связи и затем ее раз-
рыв.
Многие группы в активных центрах ферментов функционируют
как обобщенные кислоты или основания, воздействуют на суб-
страт, активируют его и тем самым увеличивают скорость катали-
за. Обобщенные кислоты, согласно Бренстеду, — это любые доноры
151
протонов, а основания — акцепторы протонов. Особенно эффекти-
вен обобщенный кислотно-основной катализ. Он дает увеличение
скорости в 10—100 раз. В качестве обобщенных кислотно-основных
катализаторов функционируют в активном центре боковые ради-
калы таких аминокислот, как, например, глу, асп, гис, лиз, тир и
др. В протонированной форме они являются кислотными катализа-
торами, в непротонированной — основными.
Для ферментативных реакций большое значение имеет и элек-
трофильно-нуклеофильный катализ. В активных центрах некото-
рых ферментов есть электрофильные и нуклеофильные группы,
принимающие участие в акте катализа. Электрофильная группа —
это акцептор электронной пары (кислота Льюиса), нуклеофиль-
ная— донор электронной пары (основание Льюиса).
Нуклеофильные группы ферментов вступают в реакции нуклео-
фильного замещения, что приводит к образованию ковалентных
промежуточных соединений, — ковалентный катализ. Нуклеофиль-
ная группа становится на место замещаемой группы, образуется
ковалентный интермедиат; он неустойчив и легко распадается на
продукты реакции. Сильным нуклеофилом является имидазольная
группа гис, поэтому химическая модификация гис в составе актив-
ного центра приводит к инактивации ферментов. К нуклеофильным
группам относятся также ОН-группа сер, SH-группа цис. Примера-
ми электрофильных групп являются ионы металлов — Zn2+, Fe3+
и др.
Известно значительное количество ферментов, образующих с
субстратами или промежуточными продуктами их превращения ко-
валентные интермедиаты, при этом определенные группы активно-
го центра подвергаются ковалентной модификации за счет суб-
стратов. Например, модификация сер в химотрипсине, субтилизине
и плазмине происходит с образованием эфира карбоновой кислоты
О
II
НО—СН2—СН—...——С—О—СН2—СН—...; в щелочной фосфа-
тазе образуется эфир фосфорной кислоты НО—СН2—СН—...—*
I
О
II
—>-’0—Р—О—СН2—СН—... В папаине и глицеральдегидфос-
I I
О-
фатдегидрогеназе цис модифицируется в тиоэфир карбоновой кис-
лоты HS—СН2—СН—...—>-R— С—S—СН2—СН—..., втрансальдо-
I II ।
О
лазе и пиридоксальзависимых ферментах лиз дает ковалентный
интермедиат с субстратами — шиффово основание H2N—(СН2)4—
—СН—...—*R—С = N— (СН2) 4—СН—...
152
Образование ковалентных интермедиатов избирательно увели-
чивает вероятность протекания определенной реакции, поскольку
ковалентно связанный интермедиат обладает ограниченной под-
вижностью и может поэтому занимать более благоприятное поло-
жение для завершения реакции по отношению к соответствующим
группам фермента. Ускорение ферментативной реакции в резуль-
тате образования ковалентного интермедиата возрастает в 102—
103 и более раз.
Специфический кис л от но-основной катализ, т. е. активация суб-
стратов под влиянием повышенных концентраций ионов Н3О^(Н+‘)
и ОН", в биохимических реакциях встречается редко, этот тип
реакций широко распространен в органической химии. Таким обра-
зом, большие скорости ферментативных реакций возможны благо-
даря наличию целого ряда эффектов: эффект сближения и ориента-
ционный эффект, имеющие место благодаря стеричсскому и топо-
химическому соответствию фермента и субстрата, индуцированное
соответствие структуры активного центра переходному состоянию
субстрата и возникновение «напряжения» в субстрате, полифунк-
циональность и многостадийность катализа, особые физико-хими-
ческие условия среды активного центра и как результат всего —
снижение энергии активации катализируемой реакции. Все эти
эффекты обусловлены сложным строением молекул ферментов.
Уникальное строение активного центра фермента обеспечивает и
его высокую специфичность.
Структура активного центра, механизм связывания субстрата,
каталитические свойства и первичная структура хорошо изучены
у таких гидролитических ферментов, как химотрипсин, РНКаза, ли-
зоцим, карбоксипептидаза А. Описан также механизм действия
каждого из этих ферментов. Ниже в качестве примеров кратко рас-
смотрены представления о механизме некоторых ферментативных
реакций. В активном центре химотрипсина важная роль в акте
катализа принадлежит сгр-195 и гис~Ы. Расстояние между ОН-
группой сер и третьим атомом имидазола гис равно 0,3 нм, между
ними возникает водородная связь, что увеличивает реакционную
способность гидроксильной группы сер. Первый атом азота гцс-57
образует водородную связь с COOH-группой асп-102, также входя-
щей в активный центр химотрипсина, в результате чего образуется
система с переносом заряда, состоящая из асп-102, гис~Ы и сер-195
(рис. 3.7, стадия I).
Анион ОН-группы сер осуществляет нуклеофильную атаку угле-
рода расщепляемой пептидной связи субстрата, образуется ацил-
фермент, и вслед за этим освобождается первый продукт реак-
ции— аминный продукт (стадия II). Далее происходит гидролиз
ацилфермента, образование 2-го продукта реакции, а фермент воз-
вращается в исходное состояние (стадии III, IV).
При связывании лизоцима с субстратом — полисахаридом кле-
точных стенок бактерий, состоящим из большого числа дисахарид-
ных единиц (N-ацетилглюкозамин— N-ацетилмурамовая кислота),
происходит вынужденный контакт. Он сводится к небольшому пе*
153
Рис. 3.7. Последовательность стадий катализа химотрипсином (пояснение см.
в тексте)
ремещению (~0,07 нм) некоторых боковых аминокислотных групп
внутри активного центра. При связывании субстрата одно из колец
гексоз, располагающееся против каталитических групп активного
центра, переходит в напряженное состояние (из конформации крес-
ла в конформацию полукресла), что способствует ускорению гидро-
лиза гликозидной связи, в которой участвует гексоза в напряжен-
ной конформации (рис. 3.8).
Рис. 3.8. Предполагаемый механизм действия лизоцима:
I, III— стадии реакции, D, Е— остатки гексоз субстрата (S)
154
Каталитическими остатками активного центра являются 2Л1/-35
и асп-52, причем глг/-35 находится в гидрофобном окружении в
протонированном состоянии, а асп-52 — в гидрофильном окруже-
нии и ионизирован (рис. 3.8, стадия /). Глу-35 выступает донором
протона для кислорода разрываемой гликозидной связи. Вместе с
разрывом связи образуется
карбониевый ион (С+) гек-
созы, стабилизируемый от-
рицательным зарядом на
асп-52 (стадия II). Далее
происходит гидролиз: ОН-
группа воды присоединяется
к карбониевому остатку,
протон воды — к глг/-35, и
реакция завершается (ста-
дия III). В увеличение ско-
рости реакции, катализи-
руемой лизоцимом, дают
вклад следующие эффекты:
напряженная конформация
субстрата, вынужденный
контакт, обобщенный кис-
лотно-основной катализ при
участии глг/-35, стабилиза-
ция карбониевого иона
асп-52.
Рис. 3.9. Связывание С-концевого фраг-
мента субстрата (показан более толсты-
ми линиями) в активном центре кар-
боксипептидазы А:
Zn2+ — электрофильный агент, воздействую-
щий на расщепляемую пептидную связь
Одна из функций, кото-
рую выполняют металлы в ферментах, заключается в том, что они
выступают в роли электрофильных агентов. Так, в активном центре
карбоксипептидазы А, содержащем ион Zn2+, последний представ-
ляет собой электрофильный агент, оттягивающий электроны от
пептидной связи субстрата, облегчая ее гидролиз (рис. 3.9).
3.6. * Типы ферментативных реакций
Ферментативные реакции по числу участников делятся на одно-
субстратные и двухсубстратные. С большим числом субстратов ре-
акции встречаются достаточно редко. Самым распространенным
типом ферментативной реакции является двухсубстратная реакция
с образованием двух продуктов: A-rB^C-\-D. К этому типу отно-
сится примерно 60% всех известных реакций и прежде всего реак-
ции переноса групп.
Редко встречаются односубстратные — однопродуктные реак-
ции, примерами их являются реакции изомеризации, в частности
глюкозо-1 -фосфат^глюкозо-6-фосфат. Однако многие реакции по
своим свойствам близки к односубстратным. Это наблюдается в тех
случаях, когда из двух субстратов варьирует концентрация только
одного. Например, гидролитические реакции можно рассматривать
155
как односубстратные, так как концентрацию 2-го субстрата — во-
ды — можно считать постоянной, в процессе реакции она уменьша-
ется несущественно.
Реакции с одним субстратом по существу являются мономоле-
кулярными химическими реакциями (А—Ф). Большинство из них
относится к реакциям 1-го порядка, поскольку скорость реакции
пропорциональна концентрации только одного реагирующего ве-
щества (K~£i[S]). Порядок реакции определяется характером ее
зависимости от концентрации субстрата. Скорость мономолекуляр-
ной реакции может не зависеть от концентрации субстрата (при
его избытке), тогда порядок реакции будет нулевым (V=ko, где
feo — константа скорости реакции нулевого порядка).
К реакциям 1-го порядка будут относиться и бимолекулярные
(двухсубстратные) реакции. Это происходит в том случае, если
концентрация одного из субстратов очень высока по сравнению с
концентрацией другого, как, например, в случае реакций гидроли-
за. Большинство бимолекулярных реакций является реакциями
2-го порядка, поскольку их скорость пропорциональна концентра-
ции двух реагирующих веществ или реже квадрату концентрации
субстрата: ( V=£2[Si][S2] или V=&2[S]2, где k2— константы
скорости реакции соответствующего порядка).
Следует иметь в виду, что реальные скорости реакций не обяза-
тельно в точности соответствуют определенному порядку, часто на-
блюдаются и реакции смешанного типа. Порядок реакции может
также изменяться со временем и, как будет показано ниже, зави-
сеть от концентрации субстрата. Поэтому порядок реакции опре-
деляют по отношению к «текущей» концентрации субстрата. Кроме
того, ферментативные реакции идут в несколько последовательных
моно- и бимолекулярных стадий, и потому молекулярность полной
реакции не обязательно совпадает с порядком.
В зависимости от последовательности присоединения субстра-
тов в двухсубстратных реакциях (A + B+±C+D) различают два
основных механизма этих реакций.
1. Механизм двойного замещения, он хорошо иллюстрируется
следующей формой записи:
Сначала к ферменту присоединяется один субстрат (А), обра-
зуется комплекс ЕА, в результате 1-го этапа реакции он превраща-
ется в продукт С и интермедиат F (несколько измененная фор-
ма Е). Этот интермедиат присоединяет 2-й субстрат (В) с обра-
зованием комплекса FB, распадающегося на свободный фермент
(£) и 2-й продукт (£)). Механизм двойного замещения называют
«пинг-понг»-механизмом. По такому механизму протекают, напри-
мер, реакции переаминирования.
156
Так, в реакции переаминирования (глутамат + оксалоацетат—>
—>а-кетоглутарат + аспартат), катализируемой аспартатамино-
трансферазой (£), 1-м субстратом (Л), который присоединится к
ферменту, содержащему пиридоксальфосфат в качестве небелковой
части, будет глутамат. При этом образуется комплекс ЕА, содер-
жащий альдимин, он превращается в комплекс FC, где небелковая
часть фермента и связанный с ней субстрат образуют кетимин.
Гидролиз кетимина приводит к высвобождению 1-го продукта ре-
акции (С) — а-кетоглутарата (2-оксоглутарат) и интермедиата F,
представляющего собой измененную форму фермента £, в которой
в качестве небелковой части вместо пиридоксальфосфата имеется
пиридоксаминфосфат. Интермедиат F присоединяет 2-й субстрат
(В) — оксалоацетат с образованием комплекса FB, содержащего
кетимин. Кетимин затем превращается в альдимин, после чего про-
исходит образование 2-го продукта (В)—аспартата и освобожде-
ние свободного фермента (£).
I I — н2и
н—с—NH2 + О—С—н
I +н20
соон
а-Аминокисло- Пиридоксаль-
та I фосфатфермент
Глутамат
А Е
Rx Е
Н—С—N=i-н
соон
Альдимин
АЕ
I I +Н2° I I
C=N—С—Н ^=2 С=О + H2N—С—Н
I I -н20 I I
соон н соон н
Кетимин а-Кетокис- Пиридоксамин
лота I -фосфатфер-
а-Кето- мент
глутарат
FC С F
R2 Е
I I
с-о + h2n—с-н
соон н
“Н20 f2 |
C=N—C—H
+ Н2о I |
соонн
а-Кето- Пиридоксамин-
кислота II фосфатфермент
Сксалоа-
Кетимин
FB
цетат
В F
R2 Е . н n F2 Е
I I +На° I I
Н—С—N=C—Н -«---Н—С—NH2 + О=с—Н
I Н2о |
соон СООН
Альдимин а-Аминокислота И Пиродоксаль-
Аспартат фосфатфермеэт
FD £> Е
157
2. Последовательный механизм, при котором оба субстрата
должны соединиться с ферментом и сформировать тройной комп-
лекс, прежде чем образуется один из продуктов. Последовательный
механизм представлен двумя видами: упорядоченным и неупорядо-
ченным. Упорядоченный имеет следующую форму записи:
4 У C D
♦________1__________________I_______i
В+А BA + В (EAB^g^ ECD)ED ^E
В случае неупорядоченного последовательного механизма фер-
мент содержит в активном центре два независимых участка связы-
вания субстратов, и их присоединение к ферменту может происхо-
дить в любой последовательности. Нет также определенного
порядка выхода продуктов реакции из активного центра. Запись
такого типа реакций имеет следующий вид:
По упорядоченному механизму функционируют, например,
НАД (Ф) + == зависимые дегидрогеназы. Так, последовательность
реакций, протекающих при участии ЛДГ, запишется следующим
образом:
С D
А В
НАДН Пируват Лактат
i____________f____________________________________J
Е-* Е-НАДН-* Е-НАДН-пируват Е-НАД+ -лактат Е-НАД
НАД*
ЕА EAB ECD ED
По упорядоченному механизму работают некоторые гликозил-
трансферазы и креатинкиназа.
Реакции с тремя и четырьмя субстратами протекают либо по
одному из двух вышеуказанных механизмов, либо по смешанному.
3.7. Кинетика ферментативных реакций
3.7.1. Единицы ферментативной активности. Кинетика — это
учение о скоростях реакций, их зависимости от различных факто-
ров. Скорость ферментативной реакции, как и любой химической
реакции, определяется количеством веществ, прореагировавших за
единицу времени при заданных условиях. Скорость ферментатив-
ной реакции зависит от активности фермента, которая может быть
выражена в различных единицах. До недавнего времени наиболее
158
принятой единицей активности была так называемая стандартная
единица (£). Под ней понимают то количество фермента, которое
катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин при оптималь-
ных условиях для данного фермента (f\ pH, [S]). Согласно послед-
нему международному соглашению 1 единица любого фермента
есть такое количество фермента, которое в определенных условиях
катализирует превращение субстрата со скоростью 1 моль/с. Эта
единица называется катал (сокращенно кат; 1 кат=6-107 стан-
дартных единиц). Для выражения активности фермента обычно
используют нано- и пикокаталы.
Существует также понятие удельной активности, которая выра-
жается числом единиц активности фермента, приходящихся на
1 мг белка в ферментативном препарате (Е/мг). Удельную актив-
ность в настоящее время рекомендуют выражать в кат/кг. Если
известна молекулярная масса фермента, то можно рассчитать мо-
лекулярную активность (число оборотов), она характеризуется
числом молей субстрата, которое подвергается превращению 1 мо-
лем фермента за 1 мин. В том случае, когда у фермента несколько
активных центров, то определяют число молей субстрата, подвер-
гающихся превращению одним молем каталитических центров
(молярная концентрация фермента, умноженная на число актив-
ных центров в молекуле фермента)—активность каталитического
центра.
При определении активности ферментов измеряют начальные
скорости реакции (V) в стационарной фазе (рис. 3.10). Участок
реакции, предшествующий установлению стационарного состояния,,
называют переходным. Пос-
ле стационарной фазы ско-
рость реакций снижается.
Это может быть связано с
уменьшением концентрации
исходного субстрата, накоп-
лением продуктов реакции и
ингибированием ими фер-
мента, инактивацией фер-
мента в процессе инкубации
и рядом других причин.
3.7.2. Влияние концент-
рации фермента и субстра-
та на начальную скорость
реакции. Зависимость скоро-
сти реакции от концентра-
ции фермента является ли-
нейной (рис. 3.11). Нелиней-
ная зависимость при высо-
ких концентрациях фермен-
та наблюдается вследствие
нехватки субстрата или ак-
тиватора, агрегации моле-
V
Время 7 с
Рис. 3.10. Зависимость скорости фермента-
тивной реакции от времени:
Z — переходный участок. II — участок начальной
скорости, ill — участок основного протекания ре-
159
кул ферментативного белка, приводящей к маскировке активных
центров. Отсутствие прямо пропорциональной зависимости при не-
больших концентрациях фермента может быть результатом при-
сутствия в инкубационной среде токсических примесей, связываю-
щихся с ферментом и инактивирующих его.
Рис. 3.11. График зависимости
начальной скорости реакции
(V) от концентрации фермен-
та [£]:
1 — норма, 2 — в системе присутст-
вует небольшое количество токси-
ческих для фермента примесей
Рис. 3.12. Зависимость скорости ре-
акции (Г) от концентрации субстра-
та [S]
Почти во всех случаях график зависимости начальной скорости
реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу
(рис. 3.12).
По мере возрастания концентрации субстрата кривая выходит
на плато, скорость достигает своей максимальной величины
(Утах)- Это говорит о том, что все молекулы фермента (их актив-
ные центры) полностью насыщены субстратом.
Гиперболический график зависимости V от [S] показывает, что
порядок реакции при ферментативном катализе изменяется. При
небольших концентрациях субстрата протекает реакция 1-го по-
рядка (V пропорционально [S]). При насыщающей концентрации
субстрата скорость не зависит от нее, такая реакция является ре-
акцией нулевого порядка. При промежуточных концентрациях суб-
страта протекает реакция сметанного порядка.
Для описания зависимости начальной скорости реакции от кон-
центрации субстрата Л. Михаэлисом и М. Ментен выведено урав-
нение для односубстратной реакции:
г/ _ ^тах 1^1
“ Ks + [S] •
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса—Ментен
(/<s — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса,
равная Утах — максимальная скорость реакции). При выво-
де уравнения Л. Михаэлис и М. Ментен исходили из следующего
обобщающего механизма односубстратной реакции. Фермент взаи-
160
модействует с субстратом, образуя фермент-субстратный комп-
лекс (£3), который затем распадается на свободный фермент и
продукт реакции:
kr k2
k—2
где k]f k-\, k2, k-^ — константы скоростей соответствующих стадий
реакции.
Стадию обратной реакции — образование £3 из £ и Р — обыч-
но не учитывают, так как рассматривают начальные скорости реак-
ций, при которых только очень небольшая доля 3 превращена в Р.
В этом случае из Р практически не образуется £S.
Позже Дж. Бриггсом и Дж. Холдейном было предложено урав-
нение Михаэлиса-Ментен записывать в следующем виде:
у _ fr'max [3]
“ Km + [S] ’
где Кт— константа Михаэлиса. Кт = (k-y+kz) /ky — Ks+kdkx.
Такое преобразование уравнения связано с тем, что Михаэлис и
Ментен исходили из допущения, согласно которому 1-я стадия ре-
акции (£ + S = £S) является равновесной, ъ е. равновесие в ней до-
стигается гораздо быстрее, чем успевает распасться комплекс £3
с образованием продукта реакции. Однако это далеко не всегда
справедливо, и хотя указанная стадия протекает достаточно быст-
ро и обратимо; она не является равновесной. Поскольку ферментам
свойственна высокая каталитическая активность, в реальных усло-
виях система находится в стационарном состоянии, при котором
концентрация промежуточного соединения (£3) постоянна, т. е.
скорости его образования и распада, в том числе и до конечного
продукта, равны. Это и учитывается введением Кт вместо Ks-
Кт~Кз ТОЛЬКО при
Константа Михаэлиса (Кт)—важная характеристика фермен-
та, по ней судят о степени сродства фермента к субстрату и способ-
ности фермента образовывать продукты реакции. Однако об истин-
ном сродстве фермента к субстрату можно судить только по вели-
чине /G, определить которую экспериментально значительно слож-
нее, чем Кт- Кт измеряется в моль/л. Если Кт велика, то комп-
лекс ES легко распадается на исходные вещества и реакция идет
медленно. При низких Кт (велика й+Q реакция идет быстро. Для
большинства ферментативных реакций с участием одного субстра-
та Кт равняется от 1 • 10-2 до 1 • 10~5 моль/л. Кт и Итах для данного
фермента и субстрата при определенных параметрах внешней сре-
ды (pH, t° и др.) —величины постоянные. У ферментов с относи-
тельной специфичностью каждый субстрат характеризуется своим
значением Кт-
Кт определяют графически по результатам измерения V при
различных концентрациях субстрата. В частном случае, когда
6—937
161
г? __ 1 /О ту Ушах ___________ Утах 1^1
“ гаах’ 2 Кт + [$] ’
отсюда Лт = [5], т. е. константа Михаэлиса равна концентрации
субстрата при скорости реакции, равной половине от максимальной
скорости (см. рис. 3.12). По гиперболической зависимости V от
[S] точное определение Кт затруднено, поскольку Vmax является
величиной асимптотиче-
ской и определяется недо-
статочно точно. В связи с
этим предложено несколько
преобразований уравнения
Михаэлиса—Ментен, сводя-
Рис. 3.13. График Лайнуивера— Бэрка
щихся к получению прямо
пропорциональной зависи-
мости V от [S]. Приравни-
вая обратные выражения
правой и левой частей урав-
нения Михаэлиса — Мен-
тен, Г. Лайнуивер и Д. Бэрк
получили следующую зави-
симость:
1 Кт 1 + 1
У ^гпах [^1 ^тах
где Кт, Vmax — величины постоянные при заданных условиях опре-
деления, а V и [S] — переменные. Это уравнение прямой линии
(y^kx+Ь). График зависимости 1/Т от 1/fS] представляет собой
прямую с наклоном Km/Vmax, отсекающую на оси ординат отрезок
1/Vmax, а на оси абсцисс— \!Кт (рис. 3.13). Измеряя отрезок на
оси абсцисс, определяют величину
При умножении обеих частей уравнения Лайнуивера—Бэрка на
[S], получают новое линейное уравнение, которое также используют
для графического определения Кт (рис. 3.14):
Рис. 3.15. Зависимость V от V/[S]
(график Эди-Хофсти)
Рис. 3.14. График зависимости [SJ/V от [S],
используемый для определения Кт и, Ушах
162
[S] = Km . [S]
V Kmax Knax
Умножение обеих частей уравнения Лайнуивера — Бэрка на
Утах дает еще один вид уравнения, график которого представля-
ет собой прямую линию (рис. 3.15):
v
V « Угаах - Кт
М. Ментен исходили
из упро-
и
V*
V
Чпах
^/77
Рис. 3.16. Прямая линейная зави-
симость Утах от Кт (график Кор-
ниш-Боудена)
5^ £>2 бу О-
Э. Корниш-Боуденом предложен следующий линейный график
ДЛЯ определения Кт И Уюах: Утах = у Для построения
PJ
этого графика не требуется расчетов, каждая прямая на нем соот-
ветствует одному наблюдению (рис. 3,16).
При выводе уравнения зависимости скорости реакции от кон-
центрации субстрата Л. Михаэлис
щенной схемы ферментативной
реакции. Однако большинство
ферментативных реакций не яв-
ляются односубстратными и, кро-
ме того, в них образуется не
один, а несколько фермент-суб-
стратных комплексов: Е +
^ЕЗ^ЕЗР'^ЕР^Е + Р. Появ-
ление дополнительных комплек-
сов не изменяет общего вида
уравнения Михаэлиса — Ментен,
но Кт и Утах будут более слож-
ными константами, включающими
в себя большее число констант
скоростей, чем в случае односта-
дийной реакции.
Уравнение скорости для двух-
субстратных реакций также близ-
ко к уравнению Михаэлиса — Ментен: протекание реакций сопро-
вождается образованием фермент-субстратных комплексов, причем
каждый субстрат характеризуется своей Кт. Константа Михаэлиса
определяется, как и в случае односубстратных реакций, графически
по зависимости У от концентрации одного из субстратов при по-
стоянной, насыщающей концентрации другого; Кт можно опреде-
лить и по отношению к активатору фермента, при этом концентра-
ция субстрата должна быть фиксированной.
Построение кинетических кривых зависимости V от [S] оказыва-
ется полезным не только при определении величины Кт, но и при
установлении механизма протекания двухсубстратных реакций, ти-
па ингибирования (см. разд. 3.7.5).
3.7.3. Влияние температуры на скорость ферментативной реак- У
ции. Скорость ферментативной реакции существенно зависит от тем-
пературы. Зависимость константы скорости реакции (k) от темпе-
6*
163
ратуры (7) выражается уравнением Аррениуса: 2,3 \gk = B—EaIRT\
где Еа — энергия активации (Дж/моль), В — характеризует часто-
ту столкновения молекул и их взаимную ориентацию, Т — абсолют-
ная температура, R — газовая постоянная. В уравнении Еа, В, R —
величины постоянные при заданных условиях. Следовательно, гра-
фик зависимости IgA от 1/7 должен быть прямолинейным
(рис. 3.17).
Наклон прямой равен Ea/2,3R, поэтому по графику зависимости
скорости реакции от температуры можно определить энергию акти-
Рис. 3.17. Влияние температуры
на константу скорости (k) фер-
ментативной реакции (зависи-
мость k от обратной величины
абсолютной температуры)
Рис. 3.18. Энергетическая схема фер-
ментативной реакции:
ES* — переходное состояние (активирован-
ный комплекс — короткоживущее соедине-
ние Е и S, возникающее при их сближе-
нии и переходящее затем в обычный ком-
плекс ES — промежуточное состояние);
Еа — энергия активации, Р — продукт ре-
акции; I, II — стадии реакции (ста-
дия II — лимитирующая)
вации реакции. Точнее говоря, из графика определяется только Еа
лимитирующей стадии реакции, самой медленной стадии, т. е. ста-
дии с самой высокой энергией активации (рис. 3.18).
График зависимости IgA от 1/7 прямолинеен только в опреде-
ленных пределах. Это связано с тем, что при повышении темпера-
туры скорость ферментативных реакций увеличивается до опреде-
ленного максимального значения, при дальнейшем повышении тем-
пературы происходит снижение скорости реакции вследствие начи-
нающейся тепловой денатурации фермента (рис. 3.19). При нагре-
вании выше 80°С преобладающее большинство ферментов полно-
стью денатурирует.
Температурный оптимум для большинства ферментов лежит в
пределах 40—60°С. Высокой термостабильностью обладают фермен-
ты термофильных микроорганизмов; некоторые из них способны
даже выдерживать кратковременное кипячение без существенного
снижения активности. Термостабильность ферментов повышается
в присутствии субстрата (ов). В кристаллическом виде ферменты
более термоустойчивы. Большинство ферментов хорошо сохраняет
164
свою активность при пониженных и отрицательных температурах.
Только некоторые холодлабильные ферменты инактивируются при
понижении температуры от 30 до 0°С., У
3.7.4. Влияние pH на скорость ферментативной реакции. Графи-
ческая зависимость скорости большинства ферментативных реак-
ций от pH имеет колоколообразную форму (рис. 3.20). То значение
pH, при котором скорость реакции максимальна, называется опти-
мумом pH; при отклонении pH в любую сторону от этого значения
Рис. 3.19. Зависимость скоро-
сти ферментативной реакции от
температуры
Рис. 3.20. Влияние активной
реакции среды на скорость фер-
ментативной реакции
скорость реакции снижается. Ферментативные реакции чувстви-
тельны к изменению pH, потому что ферменты содержат большое
число ионогенных групп. Состояние ионизации наиболее важных
для функционирования фермента групп, зависящее от pH, влияет
на каталитическую активность фермента, поскольку максимальную
активность фермент может проявлять только при определенном со-
стоянии этих групп: ионизированном или неионизированном. Во
многих случаях к ионизации способны и определенные группы суб-
страта, что также сказывается на оптимуме pH для действия фер-
мента, так как для реакции важно присутствие субстрата в опреде-
ленной форме.
Кроме того, pH может оказывать косвенное влияние на актив-
ность ферментов, дестабилизируя их структуру, нарушать прочность
связи апофермента с небелковым компонентом. Изменение pH мо-
жет также влиять на состояние активаторов и*ингибиторов фермен-
тов. Значение pH, соответствующее оптимальному/ не всегда сов-
падает со значением pH, характерным для внутриклеточной среды.
Поэтому pH может быть одним из факторов, ответственных за регу-
лирование ферментативной активности внутри клетки.
3.7.5. Ингибиторы ферментов. Скорость ферментативной реак-
ции может быть снижена, а в ряде случаев и полностью приоста-
новлена при действии ингибиторов — веществ, которые по той или
иной причине частично или полностью препятствуют образованию
продуктивного фермент-субстратного комплекса. В частности, ток-
сичность многих ядов для живых организмов, лечебный эффект ря-
да лекарственных препаратов обусловлены их ингибирующим дей-
ствием на ферменты. Среди ингибиторов есть как синтетические
165
вещества, так и природные метаболиты. Для ингибиторов характер-
на специфичность действия. Необратимую (и неспецифичную) де-
натурацию ферментов под влиянием тепла, сильных кислот или ка-
ких-либо других факторов обычно не рассматривают как ингибиро-
вание. К ингибиторам неприродного происхождения относят, на-
пример, фторид натрия — ингибитор фосфатаз, фенантролин — ме-
таллсодержащих ферментов, р-хлормеркурибензоат — SH-фермен-
тов, диизопропилфторфосфат (ДИФФ) — сериновых протеиназ и
эстераз. Действие таких ингибиторов обычно необратимо.
Примерами обратимых ингибиторов являются клеточные мета-
болиты и их структурные аналоги, снижающие активность фермен-
тов. Различают три типа обратимого ингибирования ферментов:
конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. К конкурентным
ингибиторам относят вещества, способные связываться с активным
центром фермента и, следовательно, конкурировать с субстратом.
Взаимодействие фермента с конкурентным ингибитором записыва-
ют в виде уравнения: £+/^£7, где I— ингибитор; Е1 — фермент-
ингибиторный комплекс, не превращающийся в продукт; Ki —
константа ингибирования, представляющая собой константу диссо-
циации EI, /С ==[£][/]/[£/]. Ki показывает сродство ингибитора к
ферменту; чем меньше Ки тем сильнее ингибитор.
При Ki—И) ингибирование необратимо. Скорость реакции в при-
сутствии конкурентного ингибитора зависит от соотношения [S] и
[Д Примером конкурентного ингибирования является действие ма-
лоновой кислоты и ряда других дикарбоновых кислот на сукцинат-
дегидрогеназу (СДГ). В качестве конкурентных ингибиторов выс-
тупают вещества, структурно сходные с субстратом. В случае СДГ
это вещества следующего строения:
СООН
I
сн2
СООН
Малоновая
кислота
СООН
I
со
сн2
СООН
Шавелево-
уксусная
кислота
СООН
СН2
СН.
I
СН,
I
СООН
Глутаровая
кислота
Наиболее сильным ингибитором СДГ из них является малоновая
кислота, замедляющая на 50% скорость ферментативной реакции
при [/]/[£] = 50. Увеличение концентрации субстрата* приводит к
снижению степени ингибирования, поскольку субстрат вытесняет
ингибитор из активного центра.
Неконкурентный ингибитор связывается с ферментом вне актив-
ного центра, поэтому конкурентных отношений между субстратом
и ингибитором нет, и степень ингибирования зависит только от
концентрации последнего. Связываясь с ферментом, неконкурент-
ные ингибиторы вызывают существенные изменения конформации
166
фермента, пространственной структуры активного центра, что и на-
рушает нормальное связывание субстрата.
Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, ког-
да ингибитор обратимо взаимодействует с ферментом, только после
образования £S : ES + I^ESI. Бесконкурентное ингибирование наи-
более характерно для ферментов, каталитическое действие которых
осуществляется по механиз-
му «пинг-понга».
Помимо указанных ти-
пов обратимого ингибирова-
ния выделяют смешанный
тип ингибирования.
Тип ингибирования мо-
жет быть выявлен с помо-
щью кинетического анализа,
при изучении зависимости V'
от [S] при различных кон-
центрациях ингибитора
(рис. 3.21). Влияние конку-
рентного ингибитора на ско-
рость реакции заключается
в том, что он увеличивает
Кт и оставляет без измене-
ния Утах- Для бесконку-
рентного ингибирования ха-
рактерно уменьшение в оди-
наковой степени Утах и Кт
и вследствие этого постоян-
ство отношения Vmax/Km.
Неконкурентные ингибито-
ры действуют на активность
фермента, снижая значение
Ушах и не оказывая влияния
на Кт.
В случае построения за-
висимости Ушах от Кт ТИП
Рис. 3.21. Графики Эди-Хофсти (слева)
и Лайнуивера-Бэрка (справа) для раз-
личных типов ингибирования:
а — конкурентное, б — бесконкурентное, в —
неконкурентное
ингибирования характеризуется смещением точки пересечения. Для
конкурентного — вправо, бесконкурентного — пр направлению к
началу координат, для смешанного характерен промежуточный ха-
рактер смещения.
Многие фармакологически активные соединения изменяют тече-
ние метаболических процессов в результате действия на ферменты.
Некоторые из них выступают в роли конкурентных ингибиторов
благодаря сходству структуры с метаболитами. Такие соединения
называются антиметаболитами. Например, синтетические антибак-
териальные вещества сульфаниламиды являются конкурентами
р-аминобензойной кислоты (ПАБК). ПАБК используется бактери-
ями для синтеза фолиевой кислоты — фактора их роста. Сульфа-
ниламидные препараты тормозят ферментативную стадию на пути
167
синтеза фолиевой кислоты благодаря конкуренции ПАБК и синте-
тического аналога. Торможение синтеза фолиевой кислоты в присут-
ствии сульфаниламидов обусловливает бактериостатический эффект
последних. Поскольку человек не синтезирует фолиевую кислоту из
ПАБК и других метаболитов (см. разд. 10.3), сульфаниламидные
препараты в лечебных дозах существенно не влияют на его орга-
низм (однако подавляют жизнедеятельность полезной микрофло-
ры кишечника, которая, в частности, является источником ряда ви-
таминов для человека; поэтому лечение сульфаниламидными пре-
паратами — сульфадимезином» этазолом, сульфамонометоксином и
т. д. сопровождается приемом поливитаминов).
ПАБК -Сульфаниламид
v 3.8. Множественные молекулярные формы ферментов
и изоферменты
Под множественными молекулярными формами ферментов
(ММФФ) понимают Группу ферментов, выполняющих идентичную
каталитическую функцию у одного биологического вида, но отлича-
ющихся по структуре и ряду физико-химических свойств. Для раз-
деления ММФФ наиболее часто используют различные варианты
метода электрофореза с последующим специфическим выявлением
зон, обладающих одинаковой ферментативной активностью. На
электрофореграммах зоны активности ММФФ обозначают араб-
скими цифрами в порядке уменьшения анодной подвижности.
Наличие ММФФ имеет определенное биологическое значение.
Показано, например, что при изменении условий существования
спектр ММФФ в клетке может меняться, в результате чего организм
лучше приспосабливается к внешним условиям. Различные молеку-
лярные формы ферментов играют важную роль в процессе диффе-
ренцировки, развития. Таким образом, сдвиги в соотношении
ММФФ (их число, активность каждой из форм, стабильность) яв-
ляются одним из механизмов регуляции обменных процессов.
Первые исследования по выявлению ММФФ выполнены на лак-
татдегидрогеназе (ЛДГ), катализирующей окислительно-восстано-
вительные превращения лактата в пируват и обратно. При электро-
форетическом исследовании этого фермента обнаруживается в
большинстве случаев пять фракций (/—5), обладающих ^ЛДГ-ак-
тивностью (рис. 3.22). Все пять молекулярных форм обладают поч-
ти одинаковой молекулярной массой (М 134 000) и состоят из че-
тырех полипептидных цепей, каждая с относительной молекуляр-
ной массой 33 500.
168
Б
м4
М3н1 М2н2
5 4 3 2 1
— И- тип
Q — Н- тип
Рис. 3.22. Множественные молекулярные формы лактатдегидрогена-
зы (4) и их разделение при электрофорезе (Б)
Полипептидные цепи, несмотря на близкие молекулярные мас-
сы, неидентичны и могут быть двух типов: М и Н (от англ, muscle—
мышца, и англ, heart — сердце). Оба типа цепей содержат кофер-
мент НАД(Н+)» но отличаются по ряду аминокислот, что и опреде-
ляет их неодинаковую электрофоретическую подвижность.
М~ и //-типы полипептидных цепей кодируются различными ге-
нами. Единичные цепи лишены ферментативной активности, обра-
зование тетрамера в результате различной комбинации цепей двух
типов дает активный фермент. В мышечной ткани преобладает тет-
рамер Af4, характеризующийся наименьшей анодной подвижно-
стью, в сердечной — обладающий наибольшей подвижностью,
по направлению к аноду. Остальные три ММФ ЛДГ обозначают
как МзНъ М2Н2 и MYH3. Формы М4 и M3Hi содержатся преимуще-
ственно в тканях, где источником энергии является гликолиз ( ске-
летные мышцы, эмбриональные ткани), а МН3 и Н4—в тканях, для
которых характерен аэробный метаболизм (сердечная мышца).
В настоящее время известно большое число ферментов, пред-
ставленных в организме несколькими молекулярными формами.
Причины, приводящие к появлению ММФФ, могут быть различны-
ми, в соответствии с чем Международной комиссией по биохимиче-
ской номенклатуре разработана классификация молекулярных
форм ферментов. Среди ММФФ есть как генетически детерминиро-
ванные, их принято называть изоферментами^ллл изоэнзимами (от-
личаются друг от друга по первичной . структуре), так и формы,
возникшие в результате эпигенетических изменений (на посттранс-
ляционйом уровне).
Все ММФФ делят на шесть классов.
/. Генетически независимые белки. Это ферменты» синтезирую-
щиеся на разных генах. У многоклеточных организмов они часто
169
характеризуются различной внутриклеточной, тканевой локализа-
цией: например, пируваткиназа, енолаза, фруктозодифосфат-альдо-
лаза в тканях мышц и печени, малатдегидрогеназа и ряд амино-
трансфераз — в митохондриях и цитозоле.
2. Гетерополимеры (гибриды) двух и более полипептидных це-
пей, связанных нековалентно. Примерами молекулярных форм фер-
ментов этого класса являются ЛДГ, алкогольдегидрогеназа, креа-
тинкиназа. -------*
3. Генетические варианты (аллелозимы). Аллелозимы встреча-
ются у организмов, гетерозиготных по генам, кодирующим данный
фермент. В этот класс входят мутантные формы ферментов. Это
очень многочисленный класс молекулярных форм ферменюв, сюда
относятся, например, глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа человека,
аденозиндезаминаза и многие другие.
4. Сопряженные или производные белки. К этому классу ММФФ
принадлежат формы ферментов, образующиеся в результате кова-
лентного присоединения или отщепления специфических групп к
(от) белку. Такие модификации, как правило» сопровождаются из-
менениями ферментативной активности и некоторых физико-хими-
ческих свойств фермента. Модификация может заключаться в фос-
форилировании — дефосфорилировании (гликоген-фосфорилаза,
гликоген-синтаза, фруктозо-дифосфатаза), аденилировании — де-
аденилировании (глутамин-синтетаза из Е. coli), окислении сульф-
гидрильных групп (ксантиноксидаза, липоилдегидрогеназа), глико-
зилировании (варьирование числа углеводных остатков показано
для p-глюкуронидазы из печени быка, глюкозооксидазы из Penicil-
lium vitale, ДНКазы и РНКазы из поджелудочной железы быка),
амидировании остатков асп и глу (неодинаковая степень амидиро-
вания обнаружена у щелочной протеазы из Streptomyces rectus),
расщеплении пептидных связей протеазами (альдолаза).
5. Олигомеры единственной субъединицы. При наличии у фер-
мента четвертичной структуры различные молекулярные формы мо-
гут возникать за счет объединения в четвертичную структуру раз-
ного числа одинаковых полипептидных цепей. Так, р-глюкозидаза
активна в виде моно-, ди-, тетра- и октамера. Различная степень
олигомерности как причина появления ММФФ была установлена
для глутаматдегидрогеназы, холинэстеразы и ряда других фермен-
тов.
6. Конформационно различающиеся формы (конформеры). Кон-
формерами называют белки, отличающиеся по конформации при
одной и той же аминокислотной последовательности. Различия в
пространственной структуре белка, связанные с числом заряжен-
ных групп на поверхности молекулы, приводят к неодинаковой элек-
трофоретической подвижности. К 6-му классу будут относиться и
все аллостерически модифицируемые ферменты.
Итак, термин ММФФ может быть использован как наиболее об-
щий для группы ферментов, встречающихся у одного биологическо-
го вида и обладающих одинаковой специфичностью действия. Его
следует использовать независимо от причины их появления. Термин
170
изофермент, или изоэнзим, применим только к тем ММФФ, появле-
ние которых связано с генетически детерминированными различия-
ми в первичной структуре (классы 1—3), а не с теми, которые обус-
ловлены другими причинами при однаковой первичной структуре
(классы 4—6).
3.9. Локализация ферментов и их сравнительная
активность в отдельных органах и тканях
Все организмы, отдельные органы и ткани многоклеточных орга-
низмов отличаются друг от друга не только по морфологическим и
анатомическим признакам, химическому составу, но и характеру
метаболических процессов, который определяется «набором» фер-
ментов и их активностью. Например, ферменты метаболизма зеле-
ных пигментов характерны только для фотосинтезирующих орга-
низмов, а ферменты тромбин и плазмин — для человека и живот-
ных.
Внутри клетки индивидуальные ферменты, как правило, содер-
жатся и действуют в строго определенных ее органеллах, компарт-
ментах. Внутриклеточная локализация ферментов непосредственно
связана с той функцией, которую выполняет данный участок клетки.
В настоящее время хорошо установлено, что почти все ферменты
гликолиза обнаруживаются в цитоплазме, ферменты ЦТК, p-окисле-
ния жирных кислот — в матриксе митохондрий, ферменты окисли-
тельного фосфорилирования — во внутренней мембране митохонд-
рий. Ферменты орнитинового цикла присутствуют в митохондриях
и цитоплазме, причем одни из них (орнитин-карбамоилтрансфера-
за, большая часть карбаматкиназы) локализованы в митохондри-
ях, а другие (аргининосукцинат-синтетаза, аргининосукцинат-ли-
аза) — в цитоплазме.
В ядрах сосредоточено небольшое число ферментов, в основном
это ферменты синтеза нуклеиновых кислот, типичными представите-
лями их являются а- и (3-ДНК-полимеразы, РНК-полимераза.
Очень богаты по набору ферментов лизосомы, в них широко пред-
ставлены гидролитические ферменты. Лизосомы участвуют в «пере-
варивании» содержимого фагоцитарных пузырьков, которые при
этом сливаются с лизосомами. Такие объединенные образования
остаются отделенными мембраной от остальных внутриклеточных
компонентов, что и защищает последние от гидролиза. Вместе с тем
при автолизе и некрозе тканей ферменты лизосом участвуют непо-
средственно в расщеплении компонентов самой клетки. У животных
и человека лизосомы присутствуют в различных клетках, особенно
много их содержится в лейкоцитах.
В пероксисомах сосредоточены ферменты метаболизма гликоле-
вой кислоты и утилизации пероксида водорода.1 Мембранные струк-
туры микросом богаты цитохромом Р-450, катализирующим ряд
реакций биологического гидроксилирования и других окислитель-
ных процессов. В строме хлоропластов содержится рибулозобисфос-
фат-карбоксилаза и другие ферменты, участвующие в синтезе угле-
171
водов из СОг. В мембраны хлоропластов встроены АТФазы и пере-
носчики электронов» функционирующие в процессе фотосинтеза.
Четкая пространственная локализация ферментов в клетке обеспе-
чивает их согласованную деятельность.
Многие биологические катализаторы благодаря их строгому рас-
положению в клетке используют как маркеры тех или иных внутри-
клеточных структур. Например, при исследовании печени крыс по-
казано, что кислая фосфатаза локализована в лизосомах, каталаза,
оксидаза D-аминокислот — в пероксисомах, аденилатциклаза — в
плазматической мембране, глюкозо-6-фосфатаза, НАДФН-цитохром
с — редуктаза — в ЭПР,1лактатдегидрогеназа — в цитоплазму га-
лактозилтрансферазы — вПаппарате Гольджи. Однако распределе-
ние ряда ферментов внутри клетки может быть неоднотипным у раз-
личных представителей живой природы. Так, фосфоенолпируват-
карбоксилаза в печени крыс обнаружена в цитоплазме, кролика —
в митохондриях, а морской свинки — ив митохондриях, и в цито-
плазме.
Отдельные ткани и органы животных и растений отличаются не
только по набору ферментов» но и по их активности. Так, почти во
всех тканях млекопитающих содержатся ферменты гликолиза, ЦТК,
но активности их существенно отличаются в разных по специфич-
ности клетках. Наибольшая активность ферментов гликолиза, а
также креатинкиназы характерна для скелетных мышц, ферментов
орнитинового цикла — для печени, РНКазы — для поджелудочной
железы, глутаминазы — для мозга, р-глюкуронидазы — для селе-
зенки. Такую особенность тканей используют в клинике при диаг-
ностике некоторых заболеваний. В частности, возрастание актив-
ности креатинкиназы в сыворотке крови является одним из показа-
телей повреждения мышечной ткани.
Существуют также возрастные изменения в активности и наборе
ферментов в тканях, которые наиболее четко заметны в период
эмбрионального развития при дифференцировке тканей. Так, у не-
оплодотворенного куриного яйца обнаруживаются лишь следы лак-
татдегидрогеназной активности; она существенно возрастает с нача-
лом развития эмбриона.
3.10. Классификация и номенклатура ферментов
Согласно классификации, разработанной Международной ко-
миссией по ферментам и принятой в 1961 г., все ферменты разделя-
ют на шесть классов в соответствии с характером катализируемых
ими реакций. Классы делятся на подклассы1, а последние — на под-
подклассы или группы» внутри которых ферментам присвоен поряд-
ковый номер. Каждый фермент имеет свой индивидуальный четы-
рехзначный шифр. Например, шифр фермента глюкозооксидазы
КФ. 1.1.3.4, т. е. она относится к первому классу, первому подклассу
1 В этом разделе рассматриваются подклассы наиболее часто встречающих-
ся ферментов.
172
внутри этого класса и к третьему подподклассу, где имеет поряд-
ковый номер 4. Деление на классы осуществляется следующим об-
разом.
1. Оксидоредуктазы, Катализируют окислительно-восстанови-
тельные реакции.
2. Трансферазы. Катализируют реакции переноса группировок
с одного соединения на другое: XR4-Z=e*X4-RZ.
3. Гидролазы. Ускоряют гидролитическое расщепление веществ:
ХУ+Н2О = ХОН + УН.
4. Лиазы. Катализируют реакции негидролитического расщеп-
ления с образованием двойных связей или реакции присоединения
по двойным связям1.
5. Изомеразы. Катализируют реакции изомеризации соединений.
6. Лигазы (синтетазы). Ускоряют реакции синтеза с использо-
ванием энергии макроэргических соединений.
Рациональные ,или систематические, названия ферментов, пред-
ложенные Международной комиссией, включают названия субстра-
тов и характер катализируемых реакций. Рациональные названия
довольно громоздки, поэтому за ферментами сохраняются и рабо-
чие (тривиальные) названия. Например, фермент, катализирующий
реакцию: АТФ + гексоза == гексозо-6-фосфат 4-АДФ, имеет рабочее
название гексокиназа, а рациональное АТФ: D-гексоза 6-фосфо-
трансфераза (названия субстратов в двухсубстратных реакциях
указывают через двоеточие). Если фермент катализирует реакцию,
при которой одновременно идут два превращения, то в наименова-
нии фермента, второе превращение дается в скобках. Реакцию
О-аспартат4- Н2О 4- О2 = оксалоацетат 4- NH3 4- Н2О катализирует
D-аспартат: кислород оксидоредуктаза (дезаминирующая)2.
1-й класс. Оксидоредуктазы. Систематическое название фермен-
тов этого класса составляют по схеме: донор водорода : акцептор
оксидоредуктаза. Оксидоредуктазы, катализирующие перенос водо-
рода, имеют тривиальное название дегидрогеназы: R'H24-R/,==
==R/zH2+R/. В тех случаях, когда донор водорода точно не установ-
лен, используют термин редуктаза.* Если акцептором водорода слу-
жит О2, то ферменты, катализирующие эти реакции, имеют триви-
альное название оксидазы. Реакции прямого присоединения кисло-
рода к субстрату катализируются оксигеназами. Термин пероксида-
за относится к тем ферментам, которые используют Н2О2 в качестве
акцептора водорода. Оксидоредуктазы подразделяют на 17 подклас-
сов главным образом в зависимости от того, какие группировки
1 Там, где значительно более важной (или единственно обнаруженной) яв-
ляется обратная реакция, в названии может применяться термин синтаза (но не
синтетаза). Термин синтетаза рекомендуется только для ферментов шестого класса.
2 В метаболических процессах органические кислоты и аминокислоты обыч-
но участвуют в форме солей или в диссоциированном состоянии, в виде анионов,
поэтому при описании реакции нередко указывают названия анионов, а не самих
кислот. Например: уксусная кислота — ацетат, пировиноградная кислота — пи-
руват, янтарная кислота — сукцинат, аспарагиновая кислота — аспартат. В не-
которых случаях названия анионов производятся от латинских или греческих
названий кислот (ацетат, сукцинат).
173
подвергаются окислению, т. е. в зависимости от природы доноров
водорода. В основу деления на подклассы, или группы, положен хи-
мизм акцептора водорода.
Подкласс 1.1 включает ферменты, действующие на СН—ОН-
группу доноров. Примером фермента, входящего в этот подкласс,
является алкогольдегидрогеназа. Сюда же относятся ЛДГ, МДГ,
фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая) и другие.
Подкласс 1.2. содержит ферменты, окисляющие альдегидную
или кетонную группу доноров.
Подкласс 1.4 — ферменты действуют на СН—ПН2~группу доно-
ров. В этот подкласс входят ферменты, катализирующие окисли-
тельное дезаминирование аминокислот.
Подкласс 1.6 — ферменты окисляют восстановленные НАД и
НАДФ, в основном представлены флавопротеинами.
Подкласс 1.10 содержит ферменты, действующие на дифенолы
и родственные им соединения в качестве доноров. К этому подклас-
су принадлежит, в частности, аскорбатоксидаза.
Подкласс 1.11 включает ферменты, действующие на пероксид во-
дорода в качестве акцептора (каталаза, пероксидаза).
Подкласс 1.13 содержит ферменты, действующие на отдельные
доноры с присоединением к ним кислорода (оксигеназы).
2-й) класс. Трансферазы. Систематическое название ферментов
этого класса образуется следующим образом: донор : акцептор —
транспортируемая группа — трансфераза. Часто используют и циф-
ровую приставку для указания положения, к которому присоединя-
ется переносимая группа. Деление на подклассы идет по химизму
переносимых групп, всего выделено восемь подклассов.
2.1. Переносят одноуглеродные остатки: метильные, оксиметил fa-
ные, формильные, карбоксильные и др. Пример: метилтрансфера-
зы, катализирующие перенос метильных групп.
2.2. Переносят альдегидные и кетонные остатки. Сюда относятся
ферменты: транскетолаза (переносит 2-углеродный фрагмент) и
трансальдолаза (переносит 3-углеродный фрагмент). Эти фермен-
ты участвуют в пентозном цикле дыхания, в фотосинтетическом
цикле Кальвина.
2.3. Ацилтрансферазы — переносчики кислотных радикалов.
В этот подкласс входит большое число ферментов — переносчиков
ацетильных остатков от ацетил-КоА, такие ферменты имеют триви-
альное название ацетилтрансферазы, они участвуют, например, в
синтезе ацетилглюкозамина, ацетилхолина.
2.4. Гликозилтрансферазы — переносчики гликозильных остат-
ков, например, ферменты, участвующие в синтезе полисахаридов и
имеющие в качестве небелковой части нуклеозиддифосфатсахар
(НДФС). Фосфоролитическое расщепление нуклеозидов также идет
при участии этих ферментов.
2.6. Переносят группы, содержащие азот. К этому подклассу от-
носятся важнейшие ферменты азотного обмена — аминотрансфе-
разы.
174
2.7. Переносят группы, содержащие фосфор (фосфотрансфера*
зы). Эти ферменты переносят фосфатный остаток от АТФ на раз-
личные акцепторы, пирофосфатный остаток (пирофосфотрансфера-
зы), а также более сложные группировки, содержащие фосфатный
остаток (нуклеотидилтрансферазы и др.).
2.8. Переносят группы, содержащие серу. В этот подкласс вхо-
дят, в частности, КоА-трансферазы.
3-й [класс. Гидролазы. Систематическое название ферментов
класса гидролаз составляется из названия субстрата и через тире
слова гидролаза. Отщепляемые группы могут быть указаны после
названия субстрата, например аденозин — аминогидролаза. Класс
гидролаз делится на одиннадцать подклассов.
3.1. Гидролизуют сложноэфирныё связи. Примеры: эстеразы,
фосфатазы, нуклеазы.
3.2. Гидролизуют гликозильные связи. Представителями этого
подкласса являются амилазы, хитиназа, полигалактуроназа, нейра-
минидаза, а-глюкозидаза, 0-глюкозидаза, р-фруктофуранозидаза
(инвертаза).
3.4. Гидролизуют пептидные связи (пептид-гидролазы). Систе-
матической номенклатуры для ферментов данного подкласса нет,
так как специфичность этих ферментов перекрывается. В этом под-
классе различают ряд подподклассов ферментов, в частности от-
щепляющие N-концевые аминокислоты (аминопептидазы), С-конце-
вые аминокислоты (карбоксипептидазы), гидролизующие дипепти-
ды (дипептидазы), несколько подподклассов пептид-гидролаз, рас-
щепляющих белки (пептидил-пептидгидролазы, протеиназы).
Протеиназы являются эндопептидазами и гидролизуют белки до
пептидов разной величины. В зависимости от строения активного
центра выделяют следующие подклассы протеиназ.
3.4.21. Сериновые протеиназы — содержат в активном центре
серин, необходимый для катализа. Сюда относятся химотрипсин,
трипсин — протеиназы желудочно-кишечного тракта, тромбин,
плазмин — протеиназы крови, субтилизин—протеолитический фер-
мент из Вас. subtilis.
3.4.22. Тиоловые протеиназы — содержат в активном центре
цистеин. Это, в основном, растительные протеиназы, например па-
паин из млечного сока дынного дерева. Некоторые тканевые протеи-
назы (катепсин В и др.) относятся к этому же типу строения.
3.4.23. Кислые протеиназы — содержат в активном центре две
карбоксильные группы, оптимум pH их действия от 1 до 5. К этому
типу принадлежат пепсин, реннин (химозин), катепсин D, пеницил-
лопепсин.
3.4.24. Металлопротеиназы.
3.4.99. Протеиназы с неизвестным механизмом катализа.
3.5. Гидролизуют С—N-связи, отличные от пептидных. В част-
ности, сюда относятся ферменты, расщепляющие амидные связи:
аспарагиназа, глутаминаза, уреаза.
3.6. Гидролизуют кислотно-ангидридные связи. В этот подкласс
входят неорганическая пирофосфатаза и АТФазы.
175
3.7. Гидролизуют С—С-связи. Например, оксалоацетаза, уско-
ряющая гидролитическое расщепление оксалоацетата до оксалата
и ацетата.
(4-iu класс. Лиазы, Систематические названия ферментов этого
класса образуют из названия субстрата, затем указывают отщеп-
ляемую группу и через дефис добавляют слово лиаза. Класс делят
на семь подкласов.
4.1. С—C-Лиазы. К этому подклассу принадлежит фруктозо-
дифосфат-альдолаза» оксалоацетатдекарбоксилаза, аспартат —
4-декарбоксилаза.
4.2. С—О-Лиазы. Сюда относятся карбоангидраза, фумарат-
гидратаза.
4.3. С—N-Лиазы. Например, аспартат — аммиак-лиаза, катали-
зирующая расщепление аспартата до фумарата и аммиака.
С5Ц класс. Изомеразы. Систематическое название ферментов это-
го класса образуют по схеме: субстрат-тип реакции изомеризации-
изомераза. При внутримолекулярном переносе групп ферменты
имеют тривальные названия мутазы, а в реакциях инверсии групп
у хиральных центров—рацемазы и эпимеразы.
В 5-м классе выделено шесть подклассов.
5.1. Рацемазы и эпимеразы.
5.2. Цис-транс-изомеразы.
5.3. Внутримолекулярные оксидоредуктазы. Эти ферменты ка-
тализируют взаимопревращение альдоз и кетоз, кетонных и еноль-
ных групп, перемещают С = С-связи. Например, в реакции D-глице-
ральдегид-З-фосфат^дигидроксиацетонфосфат, которая ускоря-
ется D-глицеральдегид-З-фосфат кетол-изомеразой у первого угле-
родного атома глицеральдегидфосфата (ГАФ) идет восстановление,
у второго — окисление.
5.4. Внутримолекулярные трансферазы. Примером фермента
этого подкласса является D-фосфоглицерат 2,3-фосфомутаза, ката-
лизирующая превращение 2-фосфо-В-глицерата в З-фосфо-Р-гли-
церат.
класс. Лигазы (синтетазы). Систематическое название об-
разуется по схеме: А : В лигаза (образующая АДФ), где А и В —
соединяющиеся молекулы, в скобках указывается продукт расщеп-
ления нуклеозидтрифосфата, который использовался в данной ре-
акции как источник энергии. Весь класс делится на пять подклас-
сов в зависимости от того, между какими атомами образуются
связи.
6.1. Образуют С—О-связи. Такой тип связи возникает при
действии аминоацил-тРНК-синтетаз, активирующих аминокислоты
и передающих их на тРНК.
6.2. Образуют С—S-связи. Ферменты этого подкласса катализи-
руют присоединение различных кислотных остатков к КрА.
6.3. Образуют C—N-связи. Эти ферменты участвуют, например,
в синтезе различных амидов.
6.4. Образуют С~С-связи. Сюда относятся карбоксилазы —
биотинсодержащие ферменты.
176
3.11. Ферменты в промышленности, медицине,
сельском хозяйстве
Ферментативные препараты находят в настоящее время широ-
кое применение в различных отраслях промышленности. В хлебо-
пекарном производстве для ускорения гидролиза крахмала и улуч-
шения качества теста используют амилазы. При приготовлении дет-
ской пищи с целью облегчения переваривания углеводов и белков
исходные продукты обрабатываются амилазой и протеиназами.
Протеиназы значительно ускоряют процесс мягчения мяса, улучша-
ют его консистенцию при производстве консервов, «созревании»
сельди при засолке. Протеиназы и пектиновые ферменты оказыва-
ются полезными реагентами в виноделии и приготовлении соков.
Добавление их к мезге вызывает гидролиз белков, пектиновых ве-
ществ, это ускоряет сокоотдачу, способствует просветлению сока.
В сыроварении используют реннин, или химозин, образующийся в
сычуге телят и ягнят молочного периода.
В текстильном производстве для расшлихтовки хлопчатобумаж-
ного волокна (удаление примесей крахмала) перед отбеливанием
и крашением также используют амилазы. Специфические протеи-.-
назы находят применение в кожевенной промышленности с целью
мягкого удаления волос с кожи, в технике — при регенерации ки-
нопленки. Щелочные протеиназы наряду с липазами используют
при производстве синтетических моющих средств.
Некоторые ферменты используют как лекарственные средства:
например пепсин, трипсин, химотрипсин, лидаза, протелин, стреп-
токиназа, урокиназа, плазмин и др.
Комплекс целлюлолитических ферментов может быть полезным
в сельском хозяйстве при силосовании соломы. Многие ферменты —
необходимые реагенты при проведении научно-исследовательских
работ. Трудно переоценить в этом плане роль рестриктаз в молеку-
лярной биологии, генетической инженерии.
Такое широкое применение ферментов в различных отраслях на-
родного хозяйства и для других целей привело к их промышленно-
му получению в больших количествах. Сырьем для их выделения
чаще всего служат микроорганизмы, обладающие при выращивании
на селективных средах высокой активностью многих ферментов.
Кроме того, микроорганизмы быстро наращивают свою биомассу,
для их культивирования могут быть использованы дешевые пита-
тельные среды.
Полученные ферментативные препараты, как правило, быстро
теряют свою активность. Чтобы повысить долговечность ферментов
и облегчить их отделение от продуктов химической реакции с целью
повторного использования, их иммобилизуют — встраивают в не-
растворимый носитель, при иммобилизации используются те же
принципы, что и при аффинной хроматографии белков (см.
разд. 2.3.1). Химическое «пришивание» фермента к носителю зак-
репляет конформацию фермента, что и является причиной повыше-
ния устойчивости, снижения лабильности.
ГЛАВА 4
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
4.1. Открытие нуклеиновых кислот
и их биологическая роль
В 1868 г. швейцарский исследователь Ф. Мишер впервые выде-
лил из ядер лейкоцитов человека соединения нового типа, ранее не-
известные, которые он назвал нуклеинами (от лат. nucleus — яд-
ро). Вскоре сотрудники лаборатории Ф. Гоппе-Зейлера, в которой
работал Ф. Мишер, в том числе и наш соотечественник Н. Любавин,
выделили нуклеины из эритроцитов птиц, рептилий, из дрожжевых
клеток и ряда других объектов. Позднее Ф. Мишер установил, что
нуклеин — это сложное соединение, состоящее из кислого компо-
нента с высоким содержанием фосфора (в 1889 г. этот компонент
назвали нуклеиновой кислотой) и белкового компонента. Так были
открыты нуклеиновые кислоты и новая группа сложных белков, со-
держащая их, — нуклеопротеины. Долгое время считали, что белко-
вые компоненты нуклеопротеинов представлены только белками
основного характера — гистонами и протаминами. В 1936 г. одним
из основателей молекулярной биологии в нашей стране акад.
А. Н. Белозерским и его сотрудниками в растительных нуклеопро-
теинах были обнаружены кислые белки типа альбуминов и глобу-
линов.
К середине 80-х годов XIX в. нуклеин был найден в составе хро-
мосом, в связи с чем сформировались первые представления о его
важной роли в передаче наследственных свойств. Однако позднее
эти представления не получили развития, передачу наследствен-
ных свойств стали связывать с молекулами белка. Только в 40—
50-х годах XX в. были получены экспериментальные доказательства
важнейшей роли дезоксирибонуклеиновой кислоты — ДНК в явле-
ниях наследственности у микроорганизмов. Первое доказательство
принадлежит О. Эвери, К. Мак-Леоду и М. Мак-Карти, определив-
шим в 1944 г. химическую природу трансформирующего агента.
Явление генетической трансформации было открыто Ф. Гриф-
фитсом в 1928 г. Он сумел перенести свойство патогенности от од-
ного штамма пневмококка Diplococcus pneumoniae другому штам-
му, заражая мышей смесью живых клеток непатогенного штамма и
убитых клеток патогенного штамма. О. Эвери и его сотрудники по-
казали, что свойство патогенности можно передать, используя ДНК»
выделенную из убитых клеток. В настоящее время явление транс-
формации широко используют для генетического анализа у бакте-
178
рий. Установлено, что можно осуществить также трансформацию
клеток высших организмов.
Вторым важным доказательством генетической роли ДНК было
выяснение механизма размножения бактериофага Т2 в клетках
£. colL В 1952 г. А. Херши и М. Чейз показали, что ДНК бактерио-
фага проникает внутрь бактериальной клетки и вводит туда «про-
грамму» для синтеза новых фаговых частиц. Подавляющая часть
белка бактериофага остается на поверхности бактериальной клет-
ки. Таким образом, именно ДНК, а не белок отвечает за передачу
наследственной информации у бактерий и бактериофагов.
Свидетельства генетической роли ДНК Для клеток высших ор-
ганизмов привели в 1949 г. Г. Рис и А. Мирский. Они установили,
что количество ДНК в клетке данного организма всегда постоянно
в расчете на гаплоидный хромосомный набор и изменяется строго
пропорционально изменениям плоидности.
Таким образом было доказано, что нуклеиновые кислоты — это
важнейший компонент всех живых организмов, всех живых клеток.
С участием нуклеиновых кислот происходит образование белков,
являющихся материальной основой всех жизненных процессов.
Каждый живой организм содержит свои специфические белки, ко->
торыми он отличается от других организмов. Информация, опреде-
ляющая особенности структуры белков, «записана» в ДНК и пере-
дается в ряду поколений молекулами ДНК.
Нуклеиновые кислоты другого типа—рибонуклеиновые кисло-
ты (РНК) — являются обязательными и первостепенными участ-
никами самого механизма биосинтеза белков. В связи с этим орга-
низм содержит РНК особенно много в тех тканях, в которых ин-
тенсивно образуются белки. Активное участие РНК в биосинтезе
белков определяет их важное значение в процессе морфогенеза, по-
скольку без интенсивного синтеза белков немыслимо появление лю-
бого органа. В процессе эмбрионального развития до стадии гаст-
руляции прирост содержания РНК у эмбриона идет медленно. На-
чало морфогенеза совпадает с резким повышением количества РНК>
особенно в тех участках, где образуются органы. Самым высоким
содержанием РНК характеризуется дорсальная губа бластопора —
«организатор» морфогенеза. Первостепенная роль РНК в биосин-
тезе белков объясняет и ее большое значение в процессе регенера-
ции тканей и органов, для которого прежде всего необходимо но-
вообразование белков.
Важность изучения нуклеиновых кислот и нуклеопротеинов оп-
ределяется также тем, что вирусы являются почти чистыми нуклео-
протеинами. Борьба с многочисленными вирусными заболеваниями
невозможна без глубокого знания строения и свойств нуклеиновых
кислот. Особый интерес представляет выяснение причин заболева-
ния раком и методов лечения этой болезни, в основе которой лежит
нарушение нормального функционирования нуклеиновых кислот и
белков клетки, что очень часто связано с воздействием вирусов.
Следует, наконец, иметь в виду, что мономерные звенья нукле-
иновых кислот — нуклеотиды — играют самостоятельную важную
179
роль в метаболизме: некоторые из них — коферменты, другие —
аккумуляторы энергии в клетке, третьи — циклические нуклеотиды-
регуляторы обмена веществ.
4.2. Общая характеристика строения
нуклеиновых кислот
4.2.1. Компоненты нуклеиновых кислот. При полном гидролизе
нуклеиновых кислот образуются пуриновые и пиримидиновые азо-
тистые основания, моносахарид пентоза (рибоза или дезоксирибо-
за) и фосфорная кислота. В выделении и доказательстве присутст-
вия рибозы в нуклеиновых кислотах большую роль сыграли работы
советского физиолога и биохимика Е. С. Лондона (1929).
Все нуклеиновые кислоты делятся на два типа в зависимости от
того, какой моносахарид входит в их состав. Нуклеиновая кислота
называется рибонуклеиновой (РНК), если в ее состав входит рибо-
за, или дезоксирибонуклеиновой (ДНК), если в ее состав входит
дезоксирибоза.
Пентозы в нуклеиновых кислотах присутствуют всегда в (S-D-фу-
ранозной форме:
Р~ D -Рибофураноза
(рибоза)
Д-2'-Дезокси-0-рибофураноза
(дезоксирибоза)
Углеродные атомы пентозы нумеруются цифрами со знаком
«штрих» для того, чтобы можно было отличить их от атомов азотис-
того основания (например, 5-й углеродный атом обозначают С-5'
или 5'). Небольшое отличие — присутствие Н— вместо ОН— у
С-2' рибозы является одной из основных причин существенных раз-
личий в свойствах ДНК и РНК. Предполагают, что замена ОН—
на Н— упрочняет связь между 2-м и 3-м углеродом рибозы. Эго в
целом увеличивает прочность молекулы ДНК, ее консервативность
как хранителя наследственности. Отсутствие кислорода у С-2' де-
зоксирибозы способствует компактности укладки молекулы ДНК,
что важно для вмещения ее гигантских молекул в малом объеме
клеток и ядер.
Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, входящие в
состав нуклеиновых кислот, являются производными ароматических
гетероциклических соединений — пурина и пиримидина. Молекула
пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина и
имидазола. Среди пуриновых азотистых оснований главную роль
играют аденин (А) и гуанин (Г), а среди пиримидиновых основа-
ний— цитозин (Ц), урацил (У), тимин (Т; 5-метилурацил):
180
Пурин
Аденин
(6-амино пурин)
Г уанин
(2-ам ино-6-оксипури н)
Н
нЛ. ‘Ин
нсЧ^хсн
Пиримидин
NH2
Н
Цитозин
(2-окси-4-амино-
пиримидин/
Урацил
(2,4-диокси^
пиримидин)
Тимин
(5-метил-2,4-диокси-
пиримидин)
В состав ДНК входят аденин, гуанин, цитозин, тимин; в РНК
вместо тимина присутствует урацил. Ниже приведены одинаковые
и отличающиеся компоненты ДНК и РНК. ч
Одинаковые компоненты
Аденин
Гуанин
Цитозин
Отличающиеся компоненты
ДНК РНК
Дезоксирибоза Рибоза
Тимин Урацил
Кроме главных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах
присутствуют в небольших количествах необычные — минорные
основания. Так, в состав ДНК высших организмов входит б-метил-
цитозин, содержание которого у высших растений намного превы^1
шает его содержание у животных. В ДНК ряда бактерий встреча-
ются небольшие количества 6-метиладенина и 5-метилцитозина. Эти
метилированные основания защищают «свои» ДНК от расщепления
ферментами — ДНКазами. В ДНК Т-четных фагов Е. coli цитозин
заменен на 5-гидроксиметилцитозин. В некоторых случаях его гид-
роксиметильная группа соединена с глюкозой. Особенно много ми-
норных компонентов содержится в транспортных РНК: тиоурацил,
дигидроурацил, псевдоуридин1, ксантин (2,6-диоксипурин), гипо-
ксантин (6-оксипурин), ацетилцитозин, оротовая кислота и другие,
всего около 60.
1 Псевдоуридин — это минорный нуклеозид, в котором рибоза присоеди-
няется не к 1-му, а к 5-му атому урацила.
181
5,6-Дигидроурацил
Оротовая кислота
Трехмерная структура различных пуриновых и пиримидиновых
оснований была исследована методом рентгеноструктурного анали-
за. Молекулы пиримидинов имеют плоское строение, а молекулы
пуринов — почти плоское. Все они, кроме аденина, существуют в
таутомерных формах. Так, урацил может находиться в форме или
лактима, или лактама:
Лактим (енол-форма) Лактам (кето-форма)
В составе нуклеиновых кислот все оксопроизводные азотистые
основания присутствуют в форме лактамов. Азотистые основания
поглощают свет в ультрафиолетовой области спектра с длинами
волн 200—300 нм и максимумом около 260 нм. Это свойство исполь-
зуют при количественном определении нуклеиновых кислот.
В процессе обмена веществ растений и животных пуриновые ос-
нования образуют ряд продуктов: мочевую кислоту, кофеин, тео-
бромин. В последние годы некоторые синтетические пиримидины
широко используют в качестве биологически активных соединений.
4.2.2. Нуклеозиды и нуклеотиды. В нуклеиновых кислотах пури-
новые азотистые основания через 9-й атом, а пиримидиновые —
через 1-й образуют N-гликозидную связь с пентозой рибозой или
2'-дезоксирибозой.
Такие соединения, в которых азотистые основания связаны с ри-
бозой или дезоксирибозой, называются нуклеозидами, а их фосфор-
ные эфиры — нуклеотидами. Если аденин присоединяется к рибозе,
то получается нуклеозид аденозин. Если к аденозину присоединяет-
ся остаток фосфорной кислоты в 5'-положении, то образуется 5'-аде-
ниловая кислота, или аденозин-5'-монофосфат, если в З'-положе-
нии — то З'-адениловая кислота, или аденозин-З'-монофосфат. Но-
менклатура нуклеозидов и нуклеотидов приведена в табл. 4.1. Фос-
фат может этерифицировать сахар также в 2'- или З'-положении.
Все нуклеотиды — сильные кислоты, так как остаток фосфорной
кислоты легко диссоциирует. К нуклеозидмонофосфату могут при-
соединиться посредством фосфоангидридной связи еще один или
два остатка фосфорной кислоты. При этом образуются нуклеозид-
182
ди- и нуклеозидтрифосфаты. Если в состав нуклеозида входит де-
зоксирибоза, то перед названием соответствующего нуклеотида ста-
вится приставка дезокси, например, д-АТФ-дезоксиаденозин-5'-три-
фосфат.
4.2.3. Строение полинуклеотидной цепи L Нуклеотиды — это
повторяющиеся мономерные единицы олигонуклеотидов и полинук-
леотидов. Олигонуклеотиды построены из нескольких мономеров,
полинуклеотиды — из многих. Нуклеиновые кислоты представляют
собой полинуклеотиды, построенные из мономеров — нуклеотидов,
число которых колеблется от 7 десятков до сотен миллионов.
Молекулы нуклеиновых кислот всех типов живых организмов —
линейные полимеры, не имеющие разветвлений, что доказано с по-
мощью ряда методов (химических, ферментативных, электронной
микроскопии). Наличие так называемых палиндромных шпилек
(см. разд. 4.3.1), образующих своеобразные боковые отростки от
линейной цепи ДНК, не следует считать нарушением ее линейности,
Таблица 4.1. Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов
Азотистые основания Нуклеозиды Нуклеотиды
полное название сокращенное название
Аденин Аденозин Адениловая кислота, аденозинмоно- фосфат АМФ
Гуанин Гуанозин Гуаниловая кислота, гуанозинмоно- фосфат Цитидиловая кислота, цитидинмоно- фосфат Уридиловая кислота, уридинмоно- фосфат Тимидиловая кислота, тимидинмоно- фосфат ГМФ
Цитозин Цитидин ЦМФ
Урацил Уридин УМФ
Тимин Тимидин ТМФ
так как в пределах каждой шпильки линейность структуры сохраня-
ется. При суперспирализации ДНК также могут возникать своеоб-
разные структуры, однако это тоже будут различные изгибы непре-
рывно продолжающейся линейной цепи. Роль мостика между нук-
леотидами выполняет 3', 5'-фосфодиэфирная связь, соединяющая
С-3' D-рибозы (или З'-дезоксирибозы) одного нуклеотида и С-5'
другого (рис. 4.1).
В связи с этим полинуклеотидная цепь имеет определенное нап-
равление. На одном ее конце остается свободной 5'-ОН-группа (на-
чало цепи), на другом — З'-ОН-группа (конец цепи). Концевые гид-
роксильные группы могут быть этерифицированы фосфатом. Пол'
ное написание полинуклеотидных цепей сложно и громоздко, поэто-
му применяют схематическое изображение. Вертикальными прямы-
ми линиями обозначают углеродные цепи сахаров с основаниями,
1 Иногда употребляется также и термин нить.
183
Рис. 4.1. Строение полинуклеотидной це-
пи РНК:
А, Г, Ц — азотистые основания; / — полная, II —
сокращенная форма записи
присоединенными к С-Г,
диагоналями с буквой Р в
середине — фосфодиэфир-
ные связи между атомом
С-3' (вблизи середины
прямой линии) и С-5' (ко-
нец следующей линии).
Используют также бук-
венную систему: буквами
А, Г, Ц, Т, У обозначают
азотистые основания, бук-
вой ф — фосфатную груп-
пу. Если буква ф находит-
ся слева, этерифицирова-
на группа при С-5', спра-
ва — этерифицирована
группа при С-3' (рис. 4.1).
Например, фА — адепо-
зин-5'-фосфат, Аф — аде-
нозин-З'-фосфат.
Полинуклеотидная цепь
несет множество фосфат-
ных групп, которые легко
диссоциируют, вследствие
чего она приобретает от-
рицательный заряд. В
связи с этим нуклеиновые
кислоты в клетке во мно-
гих случаях связываются
с основными белками, об-
разуя нуклеопротеины.
РНК входят в состав
рибонуклеопр о т е и н о в
(РНП), ДНК — дезоксирибонуклеопротеинов (ДНП).
Нуклеопротеины экстрагируют обычно из клеток 1 М раствором
нейтральных солей. Существенным моментом выделения нуклеи-
новых кислот является отщепление от нуклеопротеинов белков и
их удаление. Этого можно достичь использованием в качестве
растворителя белков фенола или смеси хлороформа с изоамило-
вым спиртом. С этой целью применяют также детергенты (доде-
цилсульфат натрия) или расщепление белков протеиназами. Из
последних особенно эффективна проназа (протеиназа Streptomyces
griseus). После отделения белка нуклеиновую кислоту можно оса-
дить, медленно прибавляя этанол. При препаративном выделении
нуклеиновых кислот их получают в виде бариевых, натриевых или
литиевых солей, в которых отрицательные заряды фосфатных
групп экранированы катионами.
В препаратах ДНК обнаруживаются в малых количествах Si,
Mg, Са, Sr и ряд других микроэлементов, которые, по-видимому,
184
участвуют в стабилизации структуры. Есть предположение, что
кремний в форме кремниевой кислоты может в некоторых случаях
заменять фосфатные остатки в молекуле ДНК.
4.3. Дезоксирибонуклеиновые .кислоты
4.3.1. Первичная структура ДНК. Структура нуклеиновых кис-
лот лучше изучена у простейших живых существ — прокариот,
К ним относятся бактерии, синезеленые водоросли, риккетсии и
микоплазмы. В клетках прокариот содержится единственная хро-
мосома, состоящая из одной молекулы ДНК, которая не отделена
от цитоплазмы мембраной. Наиболее подробно исследована струк-
тура нуклеиновых кислот, выделенных из различных штаммов и
мутантов Е. coli и ее бактериофагов. Позднее начали изучать гене-
тический материал эукариотических клеток. К ним относятся клет-
ки животных, растений, грибов, простейших, большей части видов
водорослей. Эукариотические клетки содержат ядро, окруженное
мембраной. Ядерный материал распределяется между несколькими
хромосомами, основу которых составляют ДНК и белки (главным
образом, гистоны).
ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третич-
ную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в
полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичную структуру.
Определение первичной структуры ДНК оказалось крайне сложной
и трудной задачей, так как размеры молекулы огромны, а нуклео-
тиды бывают всего четырех видов. Больших успехов в изучении
структуры ДНК достигли Э. Чаргафф и сотрудники его лаборато-
рии, которые, используя метод хроматографии, впервые (1950)
определили нуклеотидный состав ДНК, выделенной из разных объ-
ектов. Они установили, что соотношение в ДНК азотистых основа-
ний подчиняется универсальным закономерностям, которые полу-
чили название правила Чаргаффа.
1. Сумма пуриновых нуклеотидов (Пур) равна сумме пиримиди-
новых нуклеотидов (Пир) (Пур = Пир, или Пур/Пир=1).
2. Молярное содержание аденина равно молярному содер-
жанию тимина (А = Т, или А/Т = 1).
3. Молярное содержание гуанина равно молярному содержанию
цитозина (Г==Ц, или Г/Ц=1).
4. Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина
и тимина (А + Ц^Г + Т, или А + Ц/Г + Т=1).
5. В ДНК из различных источников неодинаково соотношение
нуклеотидов: у одних преобладает содержание аденина над гуа-
нином, тимина над цитозином (А + Т>Г+Ц) — это так называе-
мый АТ-тип ДНК\ у других преобладают гуанин и цитозин над
аденином и тимином (Г + Ц>А + Т), это — ГЦ-тип ДНК, Таким
образом, ДНК из различных источников отличается по нуклеотид-
ному составу, что выражается различной величиной отношения
Г-ЬЦ/А + Т. В связи с этим Э. Чаргафф выдвинул положение о
видовой специфичности ДНК по нуклеотидному составу. Этот воп-
185
рос был глубоко и всесторонне исследован в лаборатории А. Н. Бе-
лозерского, где были проведены обширные исследования нуклео-
тидного состава обоих типов нуклеиновых кислот сначала у пред-
ставителей различных групп бактерий, а затем и у других орга-
низмов: водорослей, грибов, высших растений и животных. Школой
А. Н. Белозерского была составлена уникальная, наиболее полная
в мировой научной литературе сводка нуклеотидного состава
ДНК почти всех таксономических групп организмов и установле-
но, что нуклеотидный состав ДНК может служить одной из ха-
рактеристик в эволюционной систематике организмов. Советская
наука заняла лидирующее положение в области геносистема-
1ИКИ.
Эти исследования на огромном экспериментальном материале
показали, что внутри ряда систематических групп нуклеотидный
состав ДНК специфичен для каждого вида. Установлено, что у
большинства животных преобладает АТ-тип строения ДНК.
У бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильно
выраженного ГЦ-типа до АТ-типа. Нуклеотидный состав ДНК
бактерий используют в настоящее время как один из систематиче-
ских признаков в исследованиях по таксономии. Этот признак по-
зволяет уточнять родство отдельных бактериальных видов, решать
спорные вопросы классификации. Однако даже при одинаковом
количественном соотношении А, Т, Г, Ц строение ДНК может быть
различным, поскольку оно обусловлено также последовательно-
стью расположения нуклеотидов. Разработка методов определения
последовательности нуклеотидов, т. е. первичной структуры, была
следующим этапом в изучении ДНК.
В течение ряда лет о первичной структуре ДНК, точнее ее от-
дельных фрагментов, судили по косвенным данным: по сблоченно-
сти пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, по распределению
минорных азотистых оснований, по особенностям физических
свойств. Перелом в этой области наметился в 70-х годах в связи
с усовершенствованием метода электрофореза в полиакриламид-
ном геле (ПААГ) и с открытием ферментов рестриктаз (см.
разд. 4.6.8).
Рестриктазы были применены для разделения молекул ДНК на
фрагменты, поскольку рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в
строго определенных точках, там, где расположены специфические
последовательности нуклеотидов. Разные рестриктазы «узнают»
разные последовательности. Используя эти ферменты, можно «раз-
резать» молекулу ДНК на множество фрагментов, концевые по-
следовательности которых известны, поскольку они зависят от ви-
да использованной рестриктазы. Полученные фрагменты разделя-
ют методом электрофореза в ПААГ. Молекула ДНК несет отри-
цательный заряд, обусловленный диссоциацией фосфатных групп,
пропорциональной по величине длине цепочки, поэтому передвига-
ется в электрическом поле. Разделение фрагментов молекулы про-
исходит вследствие различий в величине их заряда и размерах.
Благодаря этому разрешающая способность метода оказалась на-
186
столько высока, что позволяет отделять друг от друга фрагменты
ДНК, отличающиеся по длине на одно мономерное звено. Напри-
мер, можно разделить фрагменты длиной в 98, 99 и 100 нуклеоти-
дов. Гель разрезают так, чтобы каждый кусочек содержал одну
полоску, одно скопление фрагментов ДНК.
Последовательности нуклеотидов в коротких фрагментах ДНК
определяют с помощью ряда методов. Идея одного из них была
предложена советским ученым Е. Д. Свердловым (1972—1973).
Окончательно она была реализована американскими учеными
А. Максимом и В. Гилбертом (1977). Исходным материалом явля-
ется образец, состоящий из тождественных друг другу одноните-
вых фрагментов ДНК. К 5'-концу, т. е. началу фрагмента, при-
соединяют с помощью специального фермента фосфатную группу,
несущую радиоактивный фосфор 32Р. Далее образец делят на че-
тыре части.
В каждой из порций осуществляют специфические реакции раз-
рыва нити ДНК по месту одного из четырех оснований. С этой
целью обычно используют диметилсульфат, гидразин и пиперидин.
Проводя несколько таких реакций с разной специфичностью (в от-
ношении оснований, расположенных рядом с данным), получают
набор более коротких фрагментов ДНК. Затем все четыре образца
разделяют параллельно в аппарате для гель-электрофореза. Гели
накладывают на рентгеновскую пленку; на ней отпечатываются те
полоски, которые несут 32Р. Непосредственно по радиоавтографам
электрофореграмм можно «прочесть» последовательность. За один
опыт можно исследовать фрагменты длиной до 300—500 нуклеоти-
дов. Это очень высокая производительность, не достижимая ни
одним из других существующих методов.
Однако необходимо знать, в каком порядке располагаются фраг-
менты в целой молекуле. С этой целью ДНК «разрезают» с помо-
щью другого набора рестриктаз, получают другой набор фрагмен-
тов, а затем вновь определяют в них последовательности нуклеоти-
дов. По перекрыванию последовательностей, полученных при раз-
личных способах разрезания, определяют с помощью ЭВМ порядок
расположения фрагментов. Этот метод секвенирования, т. е. опре-
деления последовательности нуклеотидов в ДНК, назван методом
Свердлова — Максима — Гилберта.
Несколько раньше В. Гилбертом (1975— 1976) был предложен
метод получения РНК-овых копий с участков ДНК и их последую-
щей расшифровки. При этом используют фермент РНК-полимеразу
(см. разд. 4.6.2), которая синтезирует РНК-копии на одиночных
цепях ДНК, начиная и кончая синтез в строго определенных мес-
тах. Расшифровка получаемых РНК-овых копий облегчается тем,
что можно предварительно ввести радиоактивную метку в любое
азотистое основание.
Иной путь для такого рода работ предложил Ф. Сэнгер (Анг-
лия, 1976—1978): получение ДНК-копий с помощью ДНК-полиме-
разы и использование минус- и плюс-систем. Метод основан на том,
что ДНК-полимераза обладает способностью удлинять затравку
187
(начальный отрезок цепи — праймер), связанную с одноцепочеч-
ной матрицей, в результате чего образуются одноцепочечные фраг-
менты (ДНК-копии). В минус-системе ДНК-копии получаются в
четырех вариантах, каждый из которых не содержит какой-либо
один вид нуклеотида. При этом синтез цепи обрывается в том мес-
те, где должен следовать отсутствующий нуклеотид.
В плюс-системе в каждом из четырех вариантов добавляется
только один вид нуклеотида из четырех. Восемь полученных проб
радиоактивно меченных фрагментов разделяют методом гель-элект-
рофореза. Полученные радиоавтографы дают возможность судить о
первичной структуре исследуемой ДНК.
Известен и другой вариант метода секвенирования путем получе-
ния ДНК-копий. В этом случае удлинение затравки осуществляют
в присутствии четырех обычных нуклеотидов и одного химического
аналога нуклеотида, включение которого в растущую цепь прекра-
щает синтез, так как у аналога нет свободной З'-ОН-группы, к ко-
торой должен присоединяться следующий нуклеотид. Имея четыре
вида аналогов и используя их в определенном отношении с обыч-
ными нуклеотидами, можно получать наборы продуктов копирова-
ния ДНК-матрицы, имеющие общее начало — праймер — и кончаю-
щиеся на нуклеотидах того или иного типа. Разделение этих фраг-
ментов в ПААГ в зависимости от размеров позволяет «прочитать»
их последовательность на радиоавтографе.
Для изучения повторяющихся последовательностей в ДНК эука-
риот широко применяют метод реассоциации (см. разд. 4.3.3). Ис-
пользуя методы расщепления рестриктазами, химическими агента-
ми, получения РНК-овых копий, минус- и плюс-систем, реассоциа-
ции, гель-электрофореза, радиоавтографии, удалось расшифровать
первичную структуру ДНК вируса SV40, бактериофагов срХ174,
fd, а также отдельных участков ДНК эукариот: гена гормона сома-
тостатина, гена тирозиновой тРНК, р-глобинового гена человека и
кролика и ряда других. При этом было выяснено, что в молекулах
ДНК, выделенных из бактериофагов, почти все последовательности
нуклеотидов уникальны, т. е. встречаются один раз. Они несут ин-
формацию о последовательности чередования аминокислотных ос-
татков в белках.
В гораздо более крупных по размерам молекулах ДНК бакте-
рий большинство генов также уникальны. Наряду с этим повторя-
ются по несколько раз гены, кодирующие транспортные РНК и ри-
босомные РНК. Например, в геноме £. coli содержится примерно
6 участков, кодирующих рибосомные РНК. Среди коротких повто-
ряющихся единиц в хромосомах бактерий и некоторых бактериофа-
гов встречаются /S-элементы (мигрирующие элементы ДНК, см.
разд. 4.3.8).
В геноме высших эукариот ДНК содержится на 3—4 порядка
больше, чем у бактерий, в то время как количество разных белков
увеличивается не более чем на порядок. Это объясняют как слож-
ной организацией генов, так и наличием повторяющихся участков
ДНК.
188
Так, в геноме человека около 64% составляют участки ДНК»
представленные один или несколько раз (уникальные последова-
тельности). Это — структурные гены, несущие информацию о струк-
туре специфических белков. Остальную ДНК составляют повторяю-
щиеся последовательности. От 1/ю до 1Д генома животных представ-
лены умеренно повторяющимися последовательностями (от 10 до
104 копий на гаплоидный геном). Сюда относятся структурные ге-
ны, которые кодируют продукты, необходимые клетке в больших
количествах. Так, гены рибосомных РНК имеются у животных в
количестве от 100 до 1000, у человека — от 300 до 600. Многократ-
но повторяются гены, кодирующие транспортные РНК, и гены, ко-
дирующие белки-гистоны, отдельные цепи иммуноглобулинов. Ча-
ще всего они располагаются в ДНК в виде тандемных повторов (от
англ, tandem — расположение гуськом, цугом), один ген отделяет-
ся от другого спейсером (от англ, spacer — промежуток). По-види-
мому, на ранних стадиях эмбриогенеза, когда необходима продук-
ция огромных количеств рибосомных РНК и гистонов, один ген не
может обеспечить требуемую скорость синтеза. Многочисленные
копии генов делают это возможным.
В группу умеренно повторяющихся последовательностей входят
участки ДНК, выполняющие регуляторные функции. К этой же
группе относятся гены, которые представлены в виде нескольких
копий и могут изредка менять свою локализацию в геноме. Они
открыты в дрожжах, у мышей, дрозофил и получили название мо-
бильные диспергированные гены (МДГ, см. разд. 4.3.8).
В ДНК эукариот существуют также часто повторяющиеся по-
следовательности (повторены сотни тысяч и миллионы раз). В ос-
новном это сателлитная ДНК. Ее можно отделить от остальной
ДНК и разделить на несколько фракций. С этой целью ДНК рас-
щепляют на двухцепочечные фрагменты длиной в 10 000—60 000
пар нуклеотидов, а затем подвергают ультрацентрифугированию в
градиенте CsCl. В этих условиях ДНК распределяется в основной
полосе и в наборе меньших полос, называемых сателлитами (от
лат. satellitis — спутник, сопровождающий).
Сателлитные ДНК обычно имеют очень простую многократно
повторяющуюся последовательность. Например, сателлитная ДНК
мыши содержит такие часто повторяющиеся последовательности:
5'ГАААААТГА-З' и 3'-ТТТТТАЦТ-5'. Повторяясь 150—300 раз, >
они образуют кластеры (скопления), из которых состоит сателлит-
ная ДНК. Одна из общих черт сателлитов — это присутствие в
каждой цеп и “ДНК только трех из четырех возможных оснований.
Фунвдйи" сателлитной ДНК пока неизвестны. Сателлиты обнару-
живаются обычно в центромерном гетерохроматине и могут, види-
мо, участвовать в спаривании и расхождении хромосом.
У человека обнаружены четыре сателлитные ДНК, которые со-
ставляют 6% хромосомной ДНК. Из них изучены три —Л II, IIL
Все они сосредоточены в центромерном хроматине. В каждой хро-
мосоме преобладает какой-либо один сателлит. Единственная хро-
мосома, в которой наряду с центромерным содержится сателлит в
189
дистальной части—У-хромосома. Участки У-хромосомы, содержа-
щие высокие концентрации сателлитов, различны у разных индиви-
дуумов, что указывает на наследственный полиморфизм.
ДНК содержит обращенные повторы, или палиндромы (от
греч. палиндроме — перевертыш), — последовательности, повторя-
ющиеся в обратном порядке. Последовательность оснований в од-
ной из цепей палиндрома совпадает с последовательностью осно-
ваний другой цепи, если прочитывать ее в противополож-
ном направлении. В эукариотических ДНК обнаружены как корот-
кие, так и очень длинные палиндромы. Находясь в линейной ДНК,
«перевертыши» не оказывают влияния на ее вторичную структуру.
Если же ДНК приобретает сверхспирализованную конформацию,
то длинные палиндромы (10—20 и более пар оснований), склады-
ваясь, образуют крестообразные структуры. Предполагают, что по-
следние могут служить сигналами для узнавания определенных
участков ДНК ферментами (рестриктазами, метилазами) и бел-
ками, регулирующими действие генов.
А—т
г Г
И • г
T • А
Т • А
5'-ЦТТЦГАТГГААГ-3' 5— Ц • Г—3'
, 3'—ГААГЦТАЦЦТТЦ—5' 3'“Г‘Ц—-5'
А • T
А • T
Г . ц
—ч Ц ц
4.3.2. Вторичная структура ДНК. Выяснение вторичной структу-
ры ДНК — это одно из крупнейших открытий в биологии, поскольку
при этом одновременно был раскрыт механизм передачи наследст-
венной информации в ряду поколений. В 1953 г. Д. Уотсон и
Ф. Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спи-
раль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных це-
пей. Это заключение явилось результатом большого числа экспери-
ментальных данных и первичных обобщений. К ним относятся ра-
боты. Э. Чаргаффа и его сотрудников, которые показали, что нук-
леотидный состав ДНК жестко сбалансирован (см. выше). Важ-
ное значение имели результаты рентгеноструктурного анализа
ДНК, полученные Р. Франклин, М. Вилкинсом с сотрудниками
(1953). Они свидетельствуют о том, что полинуклеотидная цепь
ДНК расположена в форме спирали с периодом идентичности (ша-
гом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм.
Физико-химическими исследованиями было установлено, что в мо-
лекуле ДНК между амино- и кетогруппами азотистых оснований
образуются водородные связи.
В модели двойной спирали Уотсона — Крика две полинуклеотид-
ные цепи обвивают друг друга, образуя правую спираль (хеликс),
углаводно-фосфатные группы располагаются снаружи, а пурино-
190
вне и пиримидиновые основания — внутри. Азотистые основания,
принадлежащие двум цепочкам, избирательно соединяются водо-
родными связями, образуя специфические пары: А — Т, Г — Ц (это
отражается в одном из правил Чаргаффа). А и Т соединяются дву-
мя водородными связями в положениях 1 : 3 и 6 : 4, Г и Ц — тремя
водородными связями в положениях 1:3, 2:2 и 6:4 (рис. 4.2).
Эти азотистые основания называются комплементарными.
Специфичность спаривания азотистых оснований обусловлива-
ет комплементарностъ, т. е. дополнительность цепей ДНК друг дру-
гу. Так, если в одной цепи находится сочетание нуклеотидов АТГЦ,
то во второй цепи ему соответствует сочетание ТАЦГ. Таким обра-
зом, последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически
определяет последовательность нуклеотидов в другой, комплемен-
тарной цепи. V
191
Расстояния между гликозидными связями одинаковы для каж-
дой пары нуклеотидов— 1,085 нм. Цепи ДНК направлены проти-
воположно друг другу, т. е. антипараллелъны. Стабильность двой-
ной спирали определяется в основном взаимодействием располо-
женных друг над другом, как стопка монет, азотистых оснований.
Расстояние между плоскостями оснований (0,34 нм) примерно эк-
вивалентно сумме ван-дер-ваальсовых радиусов ароматических
колец. При этом создаются условия для возникновения особого ро-
да ван-дер-ваальсовых сил — стэкинг-взаимодействий.
В зависимости от
условий выделения
ДНК получают в ви-
де разнообразных
упорядоченных во-
локнисто - кристал-
лических структур.
Основные черты мо-
дели, предложенной
Д. Уотсоном и Ф.
Криком, сохраняют-
ся в структуре, кото-
рой молекулы ДНК
обладают в растворе
и in vivo, получив-
шей название фор-
мы В. Влажность
ДНК в форме В вы-
ше 75%. На один ви-
ток спирали прихо-
дится 10 пар оснований, шаг спирали 3,4 нм, диаметр 2,0 нм. Счита-
ют, чтоВ-форма ДНК благоприятна для процесса репликации. В-
форма превращается в A-форму, когда влажность препарата ДНК
становится менее 75%. В A-форме пары оснований наклонены к
оси спирали под углом около 20°, в результате чего шаг спирали
уменьшается с 3,4 до 2,8 нм. В A-форме насчитывается 11 пар ос-
нований на виток, что приводит к укорачиванию цепи приблизи-
тельно на 25% (рис. 4.3). Предполагают, что в A-форме ДНК функ-
ционирует в процессе транскрипции. С-форма очень сходна с В-
формой, имеет 9,3 пар оснований на виток, основания наклонены
под углом 5°. Полагают, что форму, близкую к С, имеет ДНК в
составе надмолекулярных структур хроматина и у ряда вирусов.
В участкахТсодёржащих чередующуюся последовательность Г и
Ц, ДНК приобретает Z-форму. Это левая спираль, на один виток
которой приходится 12 пар оснований. Сахарофосфатный остов име-
ет не форму спирали, а зигзагообразный вид (Z) (рис. 4.4). Суще-
ствуют данные, что в Z-форме ДНК участвует в кроссинговере.
Известна также SBS-форма ДНК (от англ, side by side — бок о бок),
в которой нет взаимозакрученности цепей в двойную спираль. Та-
192
кая форма, видимо, обеспечивает легкость разделения цепей, что
очень существенно при биосинтезе ДНК.
Очень редко в частицах бактериофагов особой морфологической
группы роль носителя генетической информации выполняет одно-
цепочечная ДНК. Пример — коль-
цевая одноцепочечная ДНК мелко-
го сферического бактериофага Of Х17
<рХ174, поражающего кишечную па- {V. v \f)/
лочку. J V У//
4.3.3. Физико-химические свойст- A V / zxlX
ва ДНК. Хромосомы животных, бак- [Ч I / //
терий, вирусов содержат по одной > у гН И И У J
непрерывной ДНК-спирали огром-
ной длины по сравнению с размера- jyxA S /1
ми ядра (табл. 4.2). Молекулярная ( j\
масса ДНК определена с помощью'. \ д / S л /ау
ряда методов. Классический метод*
ультрацентрифугирования позволяй Z-торма 8-шорна
ет определять размеры ДНК в пре-
делах М==2Х105—1 • 109. Более, Рис. 4.4. Строение Z- и В-форм
длинные молекулы разрываются ДНК. Жирными линиями показан
при ультрацентрифугировании, по- ход сахаРоФ°сФатной «епи
этому их молекулярную массу опре-
деляют по вязкости.
Для определения плотности молекул ДНК широко используют
метод равновесного центрифугирования в градиенте CsCl. Если
растворы солей цезия (хлористого или сернокислого) центрифуги-
Таблица 4.2. Размер различных молекул ДНК (по В. А. Ратнеру, 1983)
Объект Длина хе- ликса, мкм Размер, кб* Форма
Онкогенный вирус SV40 Фаг срХ174 Фаг X Хромосома Е. coli Хромосомы дрожжей X-Хромосома дрозофилы Средняя хромосома мыши 1,7 1,8 17,0 1500 50—750 104 2 3,4Х1О4 5,2 53 48,0 (2—3) XI О3 1.5Х102— 2,2x10s 3X10* 11,3X10* Двухцепочечная кольцевая Одноцепочечная » Двухцепочечная » > » » линейная » » » »
1 Число мономеров в килобазах (1 кб — 1000 нуклеотидов или их пар).
8 104 мкм = 1 см.
ровать при достаточно высоких скоростях, то в поведении молекул
возникают две взаимно противоположные тенденции: к седимента-
ции под действием большого ускорения и к хаотической диффузии.
При определенных условиях центрифугирования достигается рав-
новесие между этими двумя процессами, в пробирке возникает
7—937 193
устойчивый градиент концентрации и, следовательно, плотности.
Если в раствор внести молекулы нуклеиновой кислоты, то они бу-
дут оседать в градиенте, пока не достигнут области, где плотность
солевого раствора будет такой же, как их собственная. Такую
плотность называют плавучей. Пользуясь этим методом, можно
разделить смесь очень близких по свойствам полимеров на отдель-
ные компоненты. Еиавуггая.плотность ДНК находитсящ_.цределах
ДД9^1,73. Она зависит от физического состояния и химического
состава ДНК. Нативная ДНК имеет меньшую плавучую плотность,
чем денатурированная, и это свойство используют для разделения
одно- и двухцепочечных молекул. Установлена зависимость плаву-
чей плотности ДНК от нуклеотидного состава: для нативной ДНК
! в нейтральном растворе CsCl плавучая плотность пропорциональна
1 содержанию Г + Ц в пределах от 20 до 80%. При использовании
в качестве стандарта ДНК Е. colt с плотностью 1,71 г-см-3 была
выведена эмпирическая формула: плавучая плотность = 1,660 +
+ 0,098 (Г + Ц в молярных долях). По ней можно рассчитать Г + Ц
в процентах, т. е. определить нуклеотидный состав ДНК. Исполь-
зуя метод центрифугирования в градиенте CsCl, можно также от-
делить многократно повторяющиеся последовательности нуклеоти-
дов от остальной ДНК.
Все внешние факторы, которые нарушают водородные связи
или ослабляют стэкинг-взаимодействия, вызывают денатурацию
ДНК. К ним относятся реагенты, подобные формамиду и мочеви-
не, резкое изменение pH и ионной силы раствора^ повышение тем-
пературы'выше 80°С. Денатурация ДНК — это любые изменения
пространственного расположения цепей ДНК без разрыва кова-
лентных связей. Обычно при денатурации происходит нарушение
водородных связей, или стэкинг-взаимодействий, или тех и других.
Двойная спираль ДНК при этом полностью или частично разделя-
ется на составляющие ее цепи.
Для оценки перехода ДНК от нативного состояния к денатури-
рованному используют ряд методов. Чаще всего измеряют погло-
щение в УФ-области. Интенсивность поглощения света пуриновыми
и пиримидиновыми основаниями в расчете на одно основание зави-
сит от того, присутствует ли оно в свободном состоянии или входит
в состав полинуклеотидов. При образовании двухспиральной струк-
туры ДНК поглощение света каждым основанием уменьшается
(явление гипохромизма). Разрушение двухцепочечной структуры
при денатурации уменьшает «экранированность» оснований, ин-
тенсивность поглощения УФ-света возрастает. Если относитель-
ное поглощение при 260 нм отложить по оси ординат, а темпера-
туру— по оси абсцисс, то получается S-образная кривая (профиль
плавления, рис. 4.5).
Она показывает, что при нагревании ДНК ведет себя подобно
кристаллам: двухцепочечная молекула «расплетается» на состав-
ляющие ее цепи в пределах небольшого температурного интервала.
Поэтому денатурацию ДНК нередко называют плавлением, а тем-
пературу^ при которой ДНК денатурирована на 50%, — темпера-
194
турой плавления — Тпл. S-Образные профили плавления показы-
вают, что денатурация ДНК — кооперативный процесс, т. е. каж-
дое предшествующее изменение повышает вероятность последую-
щего. Например, в результате внешнего воздействия разрывается
несколько водородных связей между азотистыми основаниями, это
Рис. 4.5. Кривые плавления образцов ДНК, выделенных из
разных объектов и отличающихся по нуклеотидному составу:
1 — пневмококк. 2 — тимус, 3 — сперма лосося, 4 — £. coli, 5 — S. mar-
’ cesens, 6 — М. phlei
приводит к нарушению стэкинг-взаимодействий, что облегчает раз-
рыв следующих водородных связей, и т. д.; этот процесс можно
сравнить с расстегиванием молнии.
Температуры плавления, и профили плавления разных ДНК
отличаются. Например, ДНК человека имеет Тпд — 81—82°С, а
ДНК Е. coll 90,5°С. Температура плавления ДНК зависит от соот-
ношения азотистых оснований (Гч-Ц) и (Ач-Т). ГЦ-пары более
прочные (содержат три водородные связи), поэтому чем больше
содержание (ГЧ-Ц), тем выше температура плавления. При стан-^
дартных условиях (определенные pH и ионная сила) Тпл возраста-=
ет на 1% «ри увеличении молярной доли ГЦ-пар на 2,5%. Таким
образом, измеряя температуру плавления, можно точно определить
соотношение в ДНК (ГЧ-Ц) и (АЧ-Т) нуклеотидов. Выведена
эмпирическая зависимость между ГЦ-содержанием и ТПл в стан-
дартном солевом растворе (0,015 М NaCl 4-0,015 М цитрата нат-
рия), это соотношение выглядит так: ГЧ-Ц== (Тпл—69,3) Х2,44.
Полная денатурация ДНК — это расхождение" комплементар-
ных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной
ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако если охлаж-
дение проводить медленно, поддерживая в течение некоторого вре-
мени температуру немного ниже ТПл (этот прием называют отжи-
гом), может восстановиться нативная структура. Восстановление
•
7*
195
первоначальной структуры нуклеиновой кислоты с более или ме-
нее полным восстановлением физических показателей и биологи-
ческих свойств получило название ренатурации. Это процесс, про-
тивоположный денатурации.
Степень сплавляемости молекул ДНК разных видов характе-
ризует и степень их гомологии. Это используют для решения проб-
лем таксономии бактерий: проводят молекулярную гибридизацию,
т. е. процесс ренатурации, но с цепями ДНК, принадлежащими
разным, хотя и родственным, бактериям. Гомологию испытуемых
молекул можно охарактеризовать количественно.
Р. Бриттен и Э. Дэвидсон применили метод реассоциации к
изучению организации генома эукариот. С этой целью ДНК разде-
ляют на фрагменты и плавят, т. е. получают одноцепочечные фраг-
менты. Затем изучают кинетику реассоциации: скорость поиска
комплементарных партнёров. Изучение скорости восстановления
двухспиральных фрагментов показало, что ДНК высших организ-
мов очень гетерогенна: от очень медленно реассоциирующихся
фрагментов, которые должны соответствовать уникальным участ-
кам генома, до очень быстро реассоциирующихся фрагментов.
; Быстрая реассоциация показывает, что данная последовательность
повторяется в геноме многократно. Этим методом была количе-
; ственно охарактеризована степень повторяемости нуклеотидных
последовательностей в геноме эукариот.
Искусственным путем можно получить гибрид ДНК-РНК: мо-
лекулы матричной РНК (мРНК) гибридизуются с одной из двух
разделившихся цепей ДНК, несущей участки, комплементарные
мРНК. Измеряя в процентах количество связавшейся мРНК бел-
ка, кодируемого исследуемой ДНК, можно определить частоту
I повторов данного гена. Р а створ ы на тив но й ДНК имеют высокую
: вязкость, которая резко "понижается при денатурации. Поэтому
измерение ’ вязкости также можно использовать для определения
состояния молекул ДНК.
Резкое подкисление или подщелачивание разрушает двухспи-
ральную структуру ДНК, так как изменяется ионизация амино- и
кетогрупп азотистых оснований, вследствие чего разрываются во-
дородные связи. Растворы нативной ДНК оптически активны, об-
ладают сильным правым вращением поляризованного света, ко-
торое уменьшается при денатурации.
Денатурация и ренатурация ДНК непрерывно протекают в
клетке в процессе репликации ДНК, в процессе транскрипции. Про-
ведение их в лаборатории позволяет изучать многие свойства мо-
лекул ДНК.
4.3.4. Третичная структура ДНК бактерий и вирусов. В частицах
вирусов, клетках бактерий, как и в ядрах высших организмов,
ДНК плотно «упакована», образует сложные структуры. Напри-
мер, в хромосоме Е, coll содержится ДНК длиной более 1 мм, хотя
длина клетки не превышает 5 мкм. Одна из самых мелких молекул
ДНК — вирусная, однако если ее вытянуть, то она будет во много
раз длиннее, чем сам вирус.
195
Выделенные из вирусных частиц молекулы ДНК имеют либо
линейную, либо кольцевую форму, двух- или одноцепочечную. Час-
то встречаются обычные линейные формы, имеющие начало и ко-
нец. Большой интерес представляют линейные двухцепочечные
формы с так называемыми «липкими» концами. На обоих концах
такой двухспиральной молекулы располагаются одноцепочечные
участки, которые полностью комплементарны друг другу. Напри-
мер, ДНК умеренного фага 1 А Е. coli представляет собой линей-
ную молекулу, на обоих концах которой полинуклеотидная цепь
с б'-концевым фосфатом на 12 нуклеотидов длиннее цепи с З'-ОН-
концом. Последовательности оснований на двух одноцепочечных
концах комплементарны друг другу. Эти «липкие» концы одной
молекулы соединяются друг с другом за счет комплементарного
спаривания оснований. В результате линейная молекула ДНК пре-
вращается в кольцевую, удерживаемую водородными связями.
Эта структура ДНК характерна и для других умеренных бак-
териофагов. Образовавшееся кольцо имеет по одному разрыву в
обеих цепях. После «зашивания» разрывов ферментом ДНК-лига-
зой образуется ковалентно замкнутое кольцо, которое служит
репликативной формой. Молекулы ДНК, содержащие «липкие»
концы, широко используют в генетической инженерии для объеди-
нения двух молекул ДНК в единую структуру.
Линейные молекулы ДНК ш vivo свертываются в плотный клу-
бок. В таком состоянии они устойчивы к деградации.
Одноцепочечные ДНК сущесхвуюъл. в кольцевой. форме. Коль-
цевую форму имеет, например, ДНК фага фХ174. Кольцевую ко-
валентно-замкнутую форму имеют двухцепочечные ДНК бактерий,
ряда вирусов, бактериофагов, плазмид, митохондрий и пластид
эукариот. Двухцепочечные кольцевые ДНК легко переходят в
суперспирализованное состояние, образуя левую (—) спираль.
Это состояние — не исключение, а правило. Однако если в коль-
цевой ДНК имеется хотя бы один разрыв, то суперспирализация
невозможна. Суперспирализация прежде всего необходима для
«упаковки» громадной молекулы ДНК в малом объеме ядра или
клетки. Предполагают также, что суперспирализация служит для
«проверки» ДНК на целостность сахарофосфатной цепи: перед
началом редупликации ДНК закручивается в суперспираль, это
возможно лишь в той ДНК, где обе цепи сохраняют целостность
на всем протяжении. Затем следует редупликация. В сверхспи-
ральной ДНК легче, чем в кольцевой, разводятся комплементарные
цепи, что необходимо для начала репликации и транскрипции.
Суперспирализация способствует также образованию в ДНК
крестообразных структур в участках, где расположены длинные
палиндромы.
1 В отличие от вирулентных умеренные фаги, инфицируя клетку, не размно-
жаются, а переходят в состояние профагов. При этом ДНК умеренного фага
репрессируется и интегрируется в бактериальный геном, в результате чего она
реплицируется как часть генома бактерии.
197
Интактную молекулу ДНК, выделенную из Е. coll, удалось
расправить на специальной подложке и рассмотреть с помощью
электронного микроскопа. Оказалось, что молекула содержит су-
перспиральные участки. Она образует 12—80 петель и прикреплена
к цитоплазматической мембране. С ДНК связаны многочисленные
молекулы РНК, образовавшиеся при транскрипции. Эти молекулы
РНК вместе с белками обусловливают укладку молекул ДНК с
образованием определенного числа петель в компактную струк-
туру.-
4.3.5. Третичная структура ДНК и организация хроматина в эу-
кариотических клетках. Третичная структура ДНК эукариотических
клеток также выражена в многократной суперспирализации моле-
кулы, однако в отличие от прокариот она осуществляется в форме
комплексов ДНК с белками. ДНК эукариот почти вся находится
в хромосомах ядер, лишь небольшое количество ее содержится в
митохондриях, а у растений и в пластидах. Суммарный материал
хромосом — хроматин — содержит ДНК, гистоны, негистоновые
белки, небольшое количество РНК.
До 50% хроматина составляют простые белки гистоны. Разде-
ление гистонов было проведено методами гель-фильтрации, ионо-
обменной хроматографии, электрофореза. Во всех изученных клет-
ках животных и растений обнаружено пять основных классов
гистонов: Hl, Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Классификация гистонов основа-
на на содержании в них лиз и арг. Так, гистон Н1 очень богат лиз,
гистоны Н2А и Н2В содержат умеренное количество лиз, гистон
НЗ содержит цис и умеренно богат арг, гистон Н4 богат арг и гли.
У птиц и амфибий гистон Н1 может быть частично заменен гисто-
ном Н5, тоже богатым лиз.
Молекула гистона состоит из одной полипептидной цепи, кото-
i рая в своей средней части спирализована и скручена в глобулу ди-
аметром около 2,5 нм; от глобулы отходят два неспирализованных
конца молекулы. Первичная структура гистонов имеет ряд особен-
ностей. Так, в гистонах Н2А, Н2В, НЗ, Н4 в N-концевой области
большинство аминокислотных остатков положительно заряжено, а
С-концевая лишена заряда. Первичная структура этих белков эво-
люционно консервативна, у разных животных и растений они мало
отличаются. Например, аминокислотные последовательности
гистона Н4 из проростков гороха и тимуса быка отличаются только
двумя из 102 аминокислот. Исключение в этом плане представля-
ет гистон Н1.
Гистоны взаимодействуют с ДНК в основном через ионные свя-
зи (солевые мостики), образующиеся между отрицательно заря-’
женными фосфатными группами ДНК и положительно заряженны-
ми лизиновыми и аргининовыми остатками гистонов.
Все гистоны подвергаются модификациям: ацетилированию,
метилированию, фосфорилированию и поли-АДФ-рибозилирова-
нию. При этом в их молекулах изменяется распределение элект-
ронной плотности, что приводит к изменению их способности вза-
198
имодействовать с ДНК. В этом, видимо, заключается один из ме-
ханизмов регуляции действия генов (см. разд. 5.4).
В организации хромосом различают три уровня, которые отра-
жают и уровни третичной структуры ДНК. Первый уровень —
нуклеосомный. Диспергированный хроматин выглядит в электрон-
ном микроскопе как цепочка бусин — нуклеосом. Нуклеосома со-
держит ДНК длиной 160—240 пар нуклеотидов, одну молекулу
гистона Н1 и гистоновый октамер. Последний состоит из 8 моле-
кул — по две молекулы из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4.
Из нуклеосом можно выделить нуклеосомное ядро, или нуклео-
сомный кор. Эта дискретная частица содержит гистоновый октамер
и участок ДНК длиной 145— 150 нуклеотидных пар\ Нуклеосомный
кор выглядит как диск диамет-
ром 11 нм и толщиной 5,7 нм,
в котором ДНК образует на
поверхности примерно 4,75 вит:
ка левой спирали. Гистоновый
октамер располагается внутри
коровой частицы в виде клино-
образной структуры. Коровая
частица содержит много поло-
стей, заполненных водой
Рис. 4.6. Строение нуклеосомного кора
клеток. В результате этого варь-
(рис. 4.6). Между коровыми
частицами расположены участ-
ки ДНК — линкеры, их длина
варьирует в зависимости от типа
ирует и длина фрагмента ДНК, входящего в состав нуклеосом (от
160 до 240 нуклеотидных пар). Межкоровые (линкерные) участки
ДНК или свободны, или связаны с гистоном Н1 и негистоновыми
белками. Гистон Н1 способствует компактной упаковке хроматина/
При этом он может препятствовать транскрипции ряда генов и та-
ким образом регулировать их активность.
Упаковке ДНК в нуклеосомы in vitro способствуют белок нук-
леоплазмин и фермент топоизомераза I. Упаковочный коэффициент
для ДНК, т. е. степень уменьшения размеров, составляет на нуклео-'
сомном уровне около семи.
Второй уровень организации хромосом — это образование из
нуклеосомной нити более толстых фдбрилл (20—35 нм). Предпо-
лагают, что фибриллы представляют собой по форме соленоиды,
образующиеся в результате скручивания нуклеосомной нити. Шаг
соленоида равен 11 нм, на один виток приходится около 6—10 нук-
леосом. Соленоидная упаковка считается наиболее вероятной, од-
нако существуют и другие модели организации хроматина, напри-
мер супербидная. Согласно последней фибрилла хроматина диа-
метром 20—30 нм представляет собой цепь гранул, или супербидов,
каждая из которых состоит из восьми нуклеосом. Упаковочный ко-
эффициент 2-го уровня составляет около шести. В сумме 1-й и 2-й
уровни обеспечивают уменьшение линейных размеров ДНК в 40—
50 раз.
199
! Третий уровень организации хромосом изучен недостаточно.
: Фибрилла толщиной 25—30 нм образует петли, дополнительно
упаковывается, в результате чего происходит уменьшение линей-
ных размеров ДНК,примерно в 200 раз. Петлеобразные структуры
типа «ламповых щеток» в ооцитах земноводных можно видеть на
цитологических препаратах. Эти петли, видимо, суперспирализова-
ны и представляют собой домены ДНК, соответствующие, веро-
ятно, единицам транскрипции и репликации хроматина. Специфи-
ческие белки фиксируют основания петель и, возможно, некоторые
их внутренние участки. Петлеобразная доменная организация спо-
собствует укладке хроматина в метафазных хромосомах в спираль-
ные структуры более высоких порядков. В результате последова-
тельной упаковки хроматина линейные размеры ДНК уменьшают-
ся в 104 раз.
Существуют данные, что при активировании участка хромати-
на, т. е. при транскрипции, с него обратимо удаляются сначала
гистон Н1, а затем и октет гистонов. Это вызывает деконденсацию
хроматина, последовательный переход 30-нанометровой фибриллы
хроматина в 10-нанометровую нить и ее дальнейшее разворачива-
ние в участки свободной ДНК, г. е. утрату нуклеосомной струк-
туры.
4.3.6. Цитоплазматическая ДНК. В цитоплазме эукариот содер-
жится небольшое количество ДНК (менее 1% всей ДНК клетки).
Она получила название цитоплазматической и отличается от ядер-
ной ДНК по нуклеотидному составу и молекулярной массе. Заклю-
ченная в ней генетическая информация обусловливает цитоплазма-
тическую наследственность. Цитоплазматические гены находятся
в митохондриях и хлоропластах.
Наиболее полно изучена митохондриальная ДНК (мтДНК).
В клетках животных она представлена двухцепочечными, обычно
кольцевыми молекулами, длиной по окружности от 5 до 30 мкм.
Молекулярная масса мтДНК у дрожжей, грибов, простейших
(3—4) XI О7, у высших животных до 107. В одной митохондрии мо-
жет содержаться от 2 до 10 молекул ДНК, обычно они находятся
в матриксе.
Все гены в мтДНК млекопитающих расположены исключитель-
но компактно, почти без промежуточных нуклеотидных последова-
тельностей, в то же время в дрожжевой мтДНК между генами
находятся повторяющиеся некодирующие участки. МтДНК коди-
рует две рРНК митохондриальных рибосом, полный набор тРНК»
необходимых для синтеза белка, и ограниченное число полипепти-
дов, синтезируемых на полисомах в митохондриях. Полипептиды
представляют собой субъединицы ферментативных комплексов
внутренней мембраны митохондрий. Например, митохондриальную
природу имеют в зависимости от объекта одна, две, а у дрожжей —
три субъединицы АТФ-синтетазного комплекса, три субъединицы
цитохромоксидазы и апофермент цитохрома Ь. Остальные субъеди-
ницы этих комплексов кодируются ядерными генами и синтезиру-
ются в цитоплазме.
200
ДНК хлоропластов имеет молекулярную массу около 1Х108,
т. е. она приблизительно в 10 раз больше, чем мтДНК животных.
ДНК хлоропластов детерминирует синтез рРНК хлоропластов,
рибосомных белков большой субчастицы рибосом хлоропластов,
фермента рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы и других белков.
4.3.7. Бактериальные плазмиды. В цитоплазме многих бактерий
кроме хромосомной ДНК содержатся добавочные маленькие коль-
цевые молекулы ДНК, присутствие которых необязательно для
жизни клетки. Они получили название плазмид. Плазмиды способ-
ны автономно размножаться, стабильно наследуются, т. е. сохра-
няются без специальной селекции во внехромосомном состоянии.
Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому бактерии, они
называются эписомами.
Плазмиды обнаруживаются в клетке в виде кольцевых двухце-
почечных молекул ДНК с 2И=от 2Х104 до 3,2Х108. Таким обра-
зом, плазмидная ДНК составляет 1—15% от массы хромосомной
ДНК бактерии. Мелкие плазмиды содержат генетическую инфор-
мацию в среднем для двух белков, крупные могут кодировать до
200 белков. Мелких плазмид может находиться в бактериальной
клетке несколько десятков, крупных — одна-две. Чаще в одной
клетке находятся плазмиды одного типа, но могут присутствовать
плазмиды разных типов.
Плазмиды обладают как общими, так и специальными функ-
циями. Всем плазмидам свойственна, например, способность к ав-
тономной репликации, а также свойство несовместимости (две
близкородственные плазмиды не могут существовать в одной
клетке).
Существует классификация плазмид по группам несовместимо-
сти. Большим плазмидам присуща также функция переноса, т. е.
способность вызывать конъюгацию бактериальных клеток и пере-
ходить при этом в реципиентные клетки. Некоторые из таких плаз-
мид способны переносить хромосомные гены бактерии. Например,
фактор F (половой фактор £. colt) может включаться в бактери-
альную хромосому и осуществлять перенос ее части или, очень
редко, всей хромосомы в подходящий реципиентный штамм. Из
клетки донора в клетку реципиента переносится только одна цепь
ДНК, на ней сразу же синтезируется комплементарная цепь. Вклю-
чение плазмиды в хромосому бактерии происходит с участием
/S-элементов и транспозонов (см. разд. 4.3.8). Распространение
плазмид, не обладающих способностью к переносу, происходит с
помощью бактериофагов, других плазмид или путем трансфор-
мации. Типы плазмид отличаются друг от друга по специ-
альным функциям. Широко изучают в настоящее время плазмиды,
обусловливающие устойчивость бактерий к антибиотикам, — /?-
факторы. Это крупные плазмиды, которые вызывают конъюгацию
бактерий и таким образом распространяются в бактериальной по-
пуляции. Передаваясь от одной клетки к другой, они придают
бактериям устойчивость к действию одного или нескольких ле-
карств: тетрациклина, пенициллина, стрептомицина и др.
201
У многих видов бактерий встречаются бактериоциногенные
плазмиды, продукты которых представляют собой бактериоцины —
белки, обладающие антибиотическими свойствами. Бактериоцины
убивают бактерии того же или близкого вида и даже рода, не со-
держащих плазмид. К наиболее хорошо изученным бактериоцинам
относятся колицины, продуцируемые Е. coll. Новые исследования
показали, что у многих продуцентов антибиотиков существуют
плазмиды, прямо или косвенно участвующие в самом процессе
образования антибиотиков, например хлорамфеникола, метилено-
мицина. Известны также плазмиды, придающие бактериям способ-
ность расщеплять необычные источники углерода (алифатические
и ароматические углеводороды, камфора, салициловая кислота),—
плазмиды биодеградации. Интересные и важные результаты по
исследованию этой группы плазмид получены в Советском Союзе
под руководством Г. К. Скрябина, А. М. Боронина. Обнаружены
плазмиды, влияющие на патогенность бактерий: они кодируют
биосинтез энтеротоксинов, гемолизинов и антигенов, расположен-
ных на поверхности бактериальных клеток.
Биологическая роль плазмид велика: они обеспечивают бакте-
риям селективные преимущества в меняющихся условиях внешней
среды. Благодаря способности к переносу и автономной реплика-
ции плазмиды широко используются в генетической инженерии.
Кроме бактерий плазмиды иногда содержат синезеленые водо-
росли, а из эукариотических организмов — дрожжи.
4.3.8. Мигрирующие элементы ДНК. В последнее десятилетие
накопились данные о существовании «прыгающих генов», т. е.
таких участков ДНК, которые могут перемещаться из одних час-
тей генома в другие. Эти мигрирующие элементы ДНК участвуют
в регуляции действия генов и индуцировании хромосомных пере-
строек. Они способствуют осуществлению необычных рекомбинаци-
онных событий. Мигрирующие элементы прокариот делят на два
типа: /S-элементы и транспозоны.
/S-Элементы, инсерционные сегменты или вставочные последо-
вательности (от англ, insertion sequences) содержат только Tg гены,
которые необходимы для внедрения в ДНК. Размер /S-элементов
составляет в большинстве случаев от 800 до 1400 нуклеотидных
пар. На концах они содержат повторяющиеся нуклеотидные после-
довательности, прямые или инвертированные. /S-Элементы обнару-
жены в бактериальных плазмидах, хромосомах бактерий и бакте-
риофагов в виде повторяющихся нуклеотидных последовательно-
стей. В хромосоме Е. coli К12 они содержатся во многих копиях
как природные компоненты.
Встраивание /S-элемента в тот или иной ген — инсерция —
представляет собой мутацию особого типа. Она или препятствует
транскрипции генов, отделенных от регуляторной части /S-элемен-
том (см. разд. 5.4), или, наоборот, обеспечивает проявление гена.
Таким образом, /S-элементы оказывают как положительное, так и
отрицательное влияние на экспрессию соседних генов, т. е. на их
функционирование.
502
Транспозоны — это более сложные мигрирующие элементы,
состоящие из 3000—25 000 нуклеотидных пар. Они ведут себя как
/S-элементы, часто включают их в свой состав, но содержат кроме
генов, ответственных за способность перемещаться, также допол-
нительные гены. Так, некоторые транспозоны несут в виде допол-
нительных гены устойчивости к лекарственным препаратам: неко-
торым антибиотикам и сульфаниламидам. Гены устойчивости при-
крыты с обеих сторон повторами, инвертированными по отноше-
нию друг к другу, или же содержат на концах прямые повторы
/S-элементов. Таким образом, концевые повторяющиеся нуклеотид-
ные последовательности — это типичный признак мигрирующих
элементов, структура, необходимая для транспозиции (перемеще-
ние). Вплотную к обоим концам транспозона примыкают неболь-
шие (5, 9, 11 нуклеотидных пар) повторы ДНК. Они представляют
собой прямые повторы прилегающих к транспозону участков ре-
ципиентной хромосомы.
Находясь в составе четко очерченных структур — транспозонов,
из генома в геном мигрируют гены лекарственной устойчивости.
Например, из плазмиды —в геном фага —> в геном бакте-
рий —> в плазмиду и т. д. Иногда происходит эксцизия встроенно-
го фрагмента ДНК, т. е. его освобождение из хромосомы. При этом
он либо теряется, либо встраивается в другое место той же или
иной хромосомы. Вследствие этого вызванные транспозициями му-
тации оказываются нестойкими. Встраивание и выщепление «пры-
гающих генов» контролируют специальные белки. Каждый транс-
позон содержит одну или несколько специфических точек встраи-
вания в данный геном. Выщепление транспозона происходит, как
правило, неточно, что индуцирует перестройки хромосом (делеции,
инверсии, слияния). /S-Элементы нередко внедряются в регулятор-
ные участки ДНК, изменяя регуляцию активности генов. 75-Эле-
менты и транспозоны, входящие в состав плазмид или бактерио-
фагов, обусловливают встраивание этих структур в бактериальную
хромосому. Таким образом, они определяют способность больших
блоков ДНК мигрировать между генами, содержащимися в одной
клетке. Это приводит к нестабильности геномов, что играет важ-
ную роль в эволюции бактериальных плазмид и бактериофа-
гов.
Элементы, подобные транспозонам и /5-элементам, найдены в
грибах, кукурузе и других растениях, у дрозофилы, млекопитающих
и др. По общему плану строения, способу транслокации и генети-
ческому эффекту они аналогичны подвижным элементам прока-
риот. Такого рода мобильные диспергированные гены (МДГ)
эукариотических организмов насчитывают 5000—10000 нуклеотид-
ных пар. Они могут составлять до 5% ДНК генома. На своих кон-
цах МДГ содержат прямые повторы по 200—500 пар нуклеотидов,
которые ограничены палиндромами. МДГ транскрибируются с
обеих цепей, но кодируемые ими продукты пока неизвестны. Как
минимум они должны кодировать ферменты транспозиции, как
/5-элементы и транспозоны прокариот. Большие заслуги в изуче-
203
нии подвижных генетических элементов эукариот принадлежат
Г. П. Георгиеву (1984).
Существуют данные, что МДГ оказывают влияние на структуру
и экспрессию других генов. В последнее время установлено боль-
шое сходство в строении транспозонов прокариот, МДГ эукариот
и онкогенных провирусов. По гипотезе Г. Темина (1972) последние,
вступая в рекомбинантные отношения с некоторыми клеточными
генами, приводят к раковой трансформации клетки. Существует
мнение, что транспозоны прокариот прошли через всю эволюцию,
породив у теплокровных ретровирусы.
Таким образом, изменения в геноме эукариот не ограничивают-
ся только редкими мутациями и генетическими рекомбинациями.
Наличие транспозирующих элементов может служить источником
изменений, выступающих как факторы регуляции дифференциров-
ки клеток и генной активности, могут давать необычные мутации.
Особенно важно, что в основе такой высокочастотной изменчиво-
сти лежат иные механизмы, чем те, которые ответственны за му-
тации, возникшие под влиянием экзогенных факторов. Однако в
обычных условиях нестабильные генетические элементы в основной
массе заблокированы, поэтому, хотя представления о стабильно-
сти генома эукариот и претерпели некоторые изменения, в основе
они остаются незыблемыми.
4.4. Рибонуклеиновые кислоты
4.4.1. Гетерогенность молекул РНК. Содержащиеся в клетке
РНК различаются размером, составом, функциями и локализаци-
ей. В цитоплазме содержится стабильная РНК нескольких видов:
транспортная РНК (тРНК), матричная, или' информационная
(мРНК, или иРНК), рибосомная (рРНК). В ядре локализована
ядерная РНК (яРНК), количестве которой составляет от 4 до 10%
от суммарной клеточной РНК. В состав яРНК входит большое
число молекул, различающихся по размерам и нуклеотидным по-
следовательностям, существенно превышающее число различных
молекул цитоплазматических мРНК.
В ядре эукариот синтезируются высокомолекулярные предше-
ственники (пре-РНК) рибосомных 28S1 и 18SPHK, 5SPHK, тРНК,
мРНК. Значительную часть яРНК составляют стабильные виды
РНК рибосомной и нерибосомной природы. Предшественники вы-
сокомолекулярных рРНК локализуются в ядрышке. С ними связа-
на гетерогенная популяция низкомолекулярных РНК (нмРНК),
содержащая всего около 30 разнообразных молекулярных видов.
Особую фракцию образует гетерогенная ядерная РНК (гяРНК),
составляющая 2—10% тотальной яРНК. Она характеризуется вы-
сокой скоростью обмена и ДНК-подобным нуклеотидным составом.
1 S — коэффициент седиментации, выраженный в единицах Сведберга, свед-
бергах. 1 S = 1X10 13 с, определяется по скорости седиментации молекул в
центробежном поле, зависит от размеров и формы молекул.
204
Это полидисперсные по размерам гигантские по длине молекулы
(в среднем 20—35 S). Они являются в основном предшественника-
ми цитоплазматических мРНК. Здесь же, в ядре, обнаруживаются
короткоживущие затравочные формы РНК, необходимые для син-
теза ДНК.
Наряду с основными видами РНК из зараженных вирусами
клеток можно выделить геномные РНК вирусов растений, некото-
рых вирусов бактерий (например, бактериофаг Q|3 кишечной па-
лочки) и некоторых вирусов животных (вирус полиомиелита). Ге-
номные РНК хранят и передают следующему поколению соответ-
ствующую генетическую информацию. Они относятся к самым
крупным: их молекулярная масса достигает нескольких миллионов,
а число нуклеотидов — десятков тысяч.
Молекула РНК в отличие от ДНК состоит (за редким исключе-
нием) из одной полинуклеотидной цепи. Полинуклеотидная цепь
РНК, закручиваясь на себя, образует в палиндромных участках
короткие двухспиральные «шпильки», в которых азотистые осно-
вания образуют комплементарные пары: Г с Ц, А с У. Это довольно
прочные структуры, которые видны под электронным микроскопом.
К настоящему времени удалось определить первичную структу-
ру почти всех тРНК, рРНК Е. coll, ряда вирусных РНК, в состав
которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Отдельные
виды РНК отличаются как первичной, так и вторичной и третичной
структурами.
4.4.2. Транспортная РНК. Транспортные РНК — самые мелкие
молекулы РНК. Они включают в себя от 75 до 90 нуклеотидных
единиц, М = 23 000—30 000. тРНК составляют 10—20% суммарной
РНК клетки. Их функция состоит в том, чтобы транспортировать
аминокислоты в рибосомы и ставить их в определенные участки по-
липептидной цепи при ее биосинтезе. Таким образом, тРНК участ-
вует в процессе трансляции, причем играет роль адаптера, т. е.
своеобразного переводчика: переводит последовательность нуклео-
тидов в последовательность аминокислотных остатков белковой
молекулы. Каждой из 20 аминокислот соответствует своя тРНК.
Для некоторых аминокислот известно несколько тРНК. Например,
существует пять различных тРНК, переносящих лей, и пять раз-
личных тРНК, переносящих сер. В то же время каждый вид
тРНК переносит в рибосому только один вид аминокислоты, «свою»
аминокислоту. В клетке присутствует до 60 разных видов тРНК.
Впервые первичная структура была расшифрована в 1965—
1967 гг. Р. Холли (США) у аланиновой тРНК и А. А. Баевым
(СССР) у валиновой тРНК. В настоящее время первичная струк-
тура расшифрована более чем у 250, тРНК, выделенных из клеток
разных организмов: Е. coli, дрожжей, зародышей пшеницы, печени
крысы и кролика и т. д. Эти исследования показали, что кроме че-
тырех обычных рибонуклеотидов (А, Г, Ц и У) в тРНК содержится
много (8—19%) минорных нуклеотидов. Список минорных компо-
нентов тРНК включает до 60 названий: различные метилирован-
ные аденины и гуанины, метилированные пиримидины (тимин,
205
5-метилцитозин) и др. Не все они встречаются в какой-либо одной
молекуле тРНК, но универсальными и наиболее распространенны-
ми являются псевдоуридин и дигидроуридин.
Молекула тРНК представляет собой одиночную полинуклео-
тидную цепь, закрученную сна себя». Она образует сложную про-
странственную структуру. Все тРНК построены по одному плану,
все они укладываются в модель «клеверный лист». Главный прин-
цип, положенный в ее основу, — образование максимального чис-
ла водородных связей между азотистыми основаниями.
«Клеверный лист» содержит пять спирализованных стеблей, че-
тыре из которых заканчиваются петлями из неспаренных нуклео-
тидов. Таким образом, вторичная структура тРНК характеризу-
ется частичной спирализацией молекулы. В центре молекулы
находится неспирализованная область. 3'- и 5'-Концы полинук-
леотидной цепи спарены, образуют акцептирующий стебель. Это
самый длинный спирализованный участок (7 пар). Он завершает-
ся на З'-конце в большинстве случаев неспаренной последователь-
ностью ЦЦА. К 3'- или 2'-ОН-группе концевого аденозинового
остатка присоединяется соответствующая аминокислота через
свою СООН-группу, образуется аминоацил-тРНК.
•Акцептирующий конец
транспортной РНК
Аминокислота соединяется со своей тРНК с помощью специ-
фического фермента. Противостоит акцептирующему стеблю ан*
тикодоновый стебель. Он насчитывает в длину 5 пар нуклеотидов и
несет антикодоновую петлю, состоящую из 7 нуклеотидов. Антико-
доновая петля содержит в своей средней части антикодон, состоя-
щий из 3 нуклеотидов, комплементарный кодону данной амино-
кислоты в мРНК. Например, кодону в мРНК 5'-ГЦЦ-3' соответ-
ствует антикодон З'ЦГГ-5'. Последний обеспечивает специфич-
ность взаимодействия тРНК с мРНК. Каждая тРНК имеет свой
специфический антикодон.
Тг|)Ц-Петля (или петля псевдоуридина), которую несет Т-сте-
бель, содержит минорный компонент псевдоуридин. Она состоит
206
из 7 нуклеотидных остатков, среди которых всегда существует
последовательность б'-ТфЦГ-З'. Предполагают, что именно этой
петлей тРНК взаимодействует с рибосомой. D-Стебель несет
петлю из 8—12 нуклеотидов. Это петля дигидроуридина, в ней
всегда содержится несколько остатков минорного компонента ди-
гидроуридина. Считают, что она участвует во взаимодействии со
специфическим активирующим ферментом. Во всех тРНК находит-
Рис. 4.7. Структура транспортных РНК:
/ — общая схема строения, II — третичная структура
ся пятый, дополнительный стебель разной длины, функции его ма-
ло исследованы, вероятнее всего, с его помощью уравнивается
длина разных молекул тРНК. На рис. 4.7 представлена обобщен-
ная структура тРНК.
Метилированные и другие модифицированные нуклеотиды рас-
полагаются в тРНК в участках, не вовлеченных в образование во-
дородных связей. Возможно, они играют некоторую роль в обра-
зовании третичной структуры тРНК.
Третичная структура изучена у тРНКфен и у тРНКосп, получен-
ных из дрожжей. Она очень компактна, одинакова и в кристалле, и
в растворе тРНК. Третичная структура тРНКфе* образуется путем
сближения отдельных частей «клеверного листа». Дополнительные
водородные связи изгибают «клеверный лист» в L-образную струк-
туру. При этом антикодон расположен на одном конце, а группа
ЦЦА, акцептирующая аминокислоту, — на другом. Акцептирую-
щий стебель и Т-стебель образуют одну двойную спираль, а анти-
кодоновый и D-стебель — другую. Эти два спирализованных участ-
ка располагаются друг к другу под углом 92°. Петли D и ТфП
взаимодействуют друг с другом, образуя угол буквы L (рис. 4.7).
207
Структура стабилизируется водородными связями, стэкинг-взаимо-
действиями, катионами Mg.
Сходную третичную структуру имеет тРНКасп. Вероятно, тре-
тичные структуры всех тРНК похожи, так как смесь различных
тРНК образует кристаллы. Общность пространственного строения
разных тРНК дает возможность им взаимодействовать с рибосо-
мой. Незначительные отличия в пространственной структуре раз-
ных тРНК позволяют им взаимодействовать со специфическими
ферментами: аминоацил-тРНК-синтетазами (см. разд. 5.3.2).
Сравнение первичной структуры тРНК, выделенных из орга-
низмов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, сви-
детельствует о ее большой консервативности. Структура инициатор-
ных тРНК, которые приносят в рибосому первые аминокислоты
синтезируемого белка, одинакова у всех позвоночных животных.
Следовательно, эти тРНК оставались неизменными на протяжении
500 млн. лет, т. е. со времени дивергенции позвоночных животных.
4.4.3. Матричная (информационная) РНК. Матричная РНК об-
разуется в процессе транскрипции. Она несет точную копию гене-
тической информации, закодированной в определенном участке
ДНК, а именно информации о последовательности аминокислот в
белках. У прокариот матричные РНК (мРНК) образуются сразу
в процессе транскрипции. В эукариотических клетках в процессе
транскрипции вначале образуются про-мРНК. Затем протекает
процессинг (см. разд. 4.8.2), в ходе которого первичные транскрип-
ты превращаются в мРНК. Свое название матричная РНК полу-
чила в связи с той функцией, которую она выполняет в клетке: она
служит матрицей, на которой синтезируется полипептидная цепь
в рибосоме. Каждой аминокислоте соответствует в мРНК опреде-
ленная тройка (триплет) нуклеотидов, называемая кодоном этой
аминокислоты. Последовательность кодонов в цепи мРНК опреде-
ляет последовательность аминокислот в белке. Поскольку мРНК
несет наследственную информацию о первичной структуре белка,
нередко ее называют информационной РНК (иРНЮ1.
Впервые на существование мРНК было указано А. Н. Белозер-
ским и А. С. Спириным в 1960 г. за 4 года до ее прямого выделе-
ния и идентификации. Изучая нуклеотидный состав нуклеиновых
кислот, эти исследователи обнаружили положительную корреляцию
в составе ДНК и РНК- Так, при переходе от видов резко выражен-
ного АТ-типа ДНК к видам с резко выраженным ГЦ-типом соотно-
шение нуклеотидов в РНК также несколько сдвигалось в сторону
ГЦ. На основании этого ученые выдвинули предположение о том,
что в передаче наследственной информации от ДНК к белкам уча-
ствует часть общей РНК клетки, коррелирующая с ДНК по нуклео-
тидному составу.
Количество мРНК в клетке невелико: 2—6% от общего коли-
чества РНК. Однако мРНК представлена разнообразными видами
молекул, которые значительно отличаются по молекулярной массе
1 В современной литературе общепринят термин матричная РНК.
208
и нуклеотидной последовательности. Каждый отдельный белок, син-
тезируемый в клетке, кодируется определенной «своей» мРНК или
ее участком.
При выделении мРНК используют преимущественно метод аф-
финной хроматографии. В высокоочищенном состоянии получены
мРНК субъединиц гемоглобина, яичного альбумина, легких и тяже-
лых цепей иммуноглобулинов, гистонов, кристаллинов (белки хрус-
талика глаза), миозина, фиброина шелка, а-казеина и др.
мРНК состоит из
участков — цистронов,
определяющих после-
довательность амино-
кислот в кодируемых
ими белках. На концах
молекулы располага-
ются нетранслируемые
области. Так, в начале
молекулы на 5'-конце
т7Г5'ффф^Хгаф.1=1 АУГ 1=
КЭП I
ААУААА
2 3 4
Рис. 4.8. Строение мРНК эукариот:
/ — прецистронные нетранслируемые участки, 2 — транс-
лируемая (кодирующая) зона, 3 — постцистронные не-
транслируемые участки, 4 — полиаденилат (поли-А);
остальные пояснения см. в тексте
расположены прецист-
ронные участки, затем
следует кодирующая зона, за ней — на З'-конце— постцистронные
участки (рис. 4.8) .Если мРНК кодирует один белок, то она на-
зывается моноцистронной (моногенная), если несколько белков —
полицистронной (полигенная). В последнем случае в ней нахо-
дятся межцистронные участки — спейсеры, не кодирующие белков.
На 5'-конце всех эукариотических мРНК расположен так назы-
ваемый кэп (от англ, cap — шапка) — группировка, в составе ко-
торой обязательно присутствует 7-метилгуанозин, с которого начи-
нается кэп- Далее располагается несколько метилированных рибо-
нуклеозидов. В разных молекулах мРНК отличаются как сами ри-
бонуклеозиды, число метилированных рибонуклеозидов (от одного
до трех), так и расположение метильных групп- Присоединение
7-метилгуанозина к 5'-концу растущей цепи мРНК происходит фер-
ментативным путем в ядре, когда РНК-полимераза не успела транс-
крибировать еще и 20 нуклеотидов. Предполагают,-что кэпы необ-
ходимы для стабилизации мРНК, предохранения ее от расщепления
5'-экзонуклеазами. Сам процесс присоединения кэпа называется
кэпингом.
Вблизи 5'-конца мРНК за 3—15 нуклеотидов до первого кодона
располагается последовательность нуклеотидов, необходимая для
взаимодействия мРНК с рибосомой, она богата АГ. Ей соответству-
ет участок рРНК, богатый ЦУ, он является комплементарным к
последовательности мРНК и образует с ней стабильный комплекс.
После этого участка в мРНК находится инициирующий кодон
АУГ — сигнал начала синтеза белка, а вслед за ним располагаются
кодоны, соответствующие аминокислотам, начиная со стоящих на
N-конце полипептидной цепи. Сигналом окончания синтеза белка
служит любой из кодонов УАА, УАГ или УГА. Заканчивается мРНК
обычно последовательностью поли(А), расположенной на З'-конце.
209
В мРНК млекопитающих и мРНК вирусов участки поли (А)
состоят из 150—200 нуклеотидов, однако в митохондриальных
мРНК они короче. С другой стороны, мРНК бактерий, бактериофа-
гов и некоторых вирусов, а также мРНК, кодирующие гистоны, не
содержат поли (А). Участки поли (А) образуются не в результате
транскрипции, а присоединяются специальным ферментом. Они не
нужны для трансляции. Предполагают, что эти участки стабилизи-
руют мРНК, предохраняют их от разрушающего воздействия
РНКаз клетки. Время жизни в цитоплазме мРНК, лишенной по-
ли (А), всего несколько минут, в то время как мРНК, имеющие по-
лиса), стабильны в течение многих часов и даже дней. Поли(А) -
участки укорачиваются с возрастом мРНК, поэтому, возможно, они
определяют время ее существования. Согласно одному из предпо-
ложений от З'-конца мРНК отщепляются один или несколько нук-
леотидов, когда она после окончания трансляции покидает рибосо-
му. В этом случае отдельные звенья поли (А) — это как бы «биле^
ты», каждый из которых дает право мРНК на одну «поездку» через
рибосомы. Когда все остатки А будут израсходованы, мРНК раз-
рушается.
На расстоянии 12—25 нуклеотидов от поли (А) в эукариотичес-
ких мРНК располагается последовательность из 6 нуклеотидов
(ААУААА), общая для многих видов мРНК. Предполагают, что она
участвует в окончании синтеза белка.
мРНК обладает сложной вторичной структурой, которая необ-
ходима для считывания знаков начала (инициация) и окончания
(терминация) синтеза белка. Существуют данные, что мРНК обра-
зует несколько двухспиральных «шпилек», на концах которых рас-
полагаются знаки инициации и терминации.
4.4.4. Структура рибосом и рибосомной РНК. Рибосомная РНК
(ррнк) — это та основа, на которой располагаются белки, обра-
зуя рибосому. На электронных микрофотографиях рибосомы видны
как плотные округлые гранулы приблизительно сферической формы.
Число рибосом в клетке очень велико: у бактерий в среднем 104,
в эукариотических клетках— 106. Рибосомы локализуются главным
образом в цитоплазме, кроме того,— в ядре (особенно в ядрышке),
митохондриях и хлоропластах. В исследования структуры и функ-
ции рибосом большой вклад внесли А. С. Спирин, а также Г. Витт-
ман.
По размерам и молекулярной массе все изученные до сих пор
рибосомы делят на три группы. Первую группу образуют относи-
тельно мелкие (30x30x20 нм) бактериальные рибосомы. Они име-
ют константу седиментации 70S и М^ЗхЮ6. 70S Рибосомы состо-
ят из малой 30S- и большой 505-субчастиц. У Е. coli 305-субчастица
содержит молекулу 16S РНК и 21 молекулу различных белков.
503-субчастица содержит две молекулы нуклеиновой кислоты —
23S РНК и 5S РНК и 34 белка.
Вторую группу образуют крупные (40X40X20 нм) рибосомы
эукариотических клеток. Они имеют константу седиментации 80S
и М—4,5Х Ю6. Как и рибосомы первой группы, они состоят из двух
210
субчастиц. Малая 405-субчастица содержит 18S РНК и 30 белков.
Большая бОБ-субчастица содержит 28S РНК, 5S РНК и 5,8S РНК,
а также 41 белок (табл. 4.3).
Третью группу составляют рибосомы митохондрий и хлороплас-
тов эукариотических клеток. Рибосомы митохондрий в общем отно-
сятся к классу 70S. Однако они различаются по коэффициентам се-
диментации у разных групп эукариот. Так, у грибов и эвгленовых
Рис. 4.9. Большая (4) и малая {Б) субчастицы рибосомы (В)
коэффициент седиментации митохондриальных рибосом составляет
70—74S, у высших животных — 55—60S, у высших растений —
около 80S. Рибосомы хлоропластов, напротив, более однородны по
этому признаку, коэффициент их седиментации равен 67—70S.
Ранее считали, что обе субчастицы рибосом имеют округлую
форму. Применение тонких электронно-микроскопических методов
показало, что конфигурация частиц весьма сложна. Малая субчас-
тица изогнута в виде телефонной трубки, а большая напоминает
ковш (рис. 4.9). Возможно, что в ходе синтеза белка рибосома изме-
няет свою конформацию.
Размеры молекул рибосомных РНК несколько различны у жи-
вотных и растений. Рибосомы животных содержат 28S и 18S рРНК.
28S рРНК животных варьирует по величине у разных видов в за-
висимости от их положения в эволюционном ряду, ее молекулярная
Таблица 4.3, Размеры рибосомных РНК
Объект исследования Константа седиментации. S Молекулярная масса Чнвлв нуклеотидов
Е. colt 23 1,1x10е 3200
16 0,56х 10е 1600
5 4.1Х104 120
Печень крысы 28 1,7x10е 5000
18 0,65 X 10е 1900
5,8 5X10* 155
5 4x10* 121
211
масса колеблется от 1,4 млн. у морских ежей до 1,75 млн. у млеко-
питающих. Рибосомы растений содержат 25S, 18S, иногда 16S РНК.
5S рРНК прокариот гомологичны 5,8S рРНК эукариотических кле-
ток.
Нуклеотидный состав сходен у рРНК из различных источников,
например из печени крысы и Е. coli. Гуаниловые нуклеотиды преоб-
ладают; уридиловые и цитидиловые — находятся в малых и приб-
лизительно равных количествах; псевдоуридин и метилированные
основания присутствуют в небольших или даже следовых количест-
вах.
Рибосомные РНК имеют V-образную или У-образную форму.
Они образуют каркас, к которому прикрепляются белки, создавая
плотно упакованный рибонуклеопротеин. Вторичная структура
рРНК создается за счет коротких двухспиральных участков моле-
кулы — шпилек. Около 2/з рРНК организована в шпильки, осталь-
ная часть молекулы представлена однотяжевыми «аморфными» уча-
стками, где сосредоточены пуриновые основания. С «аморфными»
участками по преимуществу связаны белки рибосом.
Локализация белков в рибонуклеопротеинах определяется после-
довательностью расположения нуклеотидов. Белки связываются с
рРНК кооперативно: при попытке удалить их из тяжа рибонуклео-
протеина они уходят не по одному, а целыми группами. Белковый
состав рибосом гетерогенен. Молекулярные массы рибосомных бел-
ков варьируют от 5000—7000 до 50 000— 70 000. У Е. coli белки
обозначают для малой субъединицы как SI, S2...S21 (от англ.
small—маленький), а для большой субъединицы—какЫ, L2... L34
(от англ, large — большой). Набор белков в субъединицах разли-
чен. Каждый белок рибосомы уникален, т. е. представлен одной
молекулой. Исключение составляют L7 и L12, которые отличаются
по N-концевому остатку, и S20 и L26, которые имеют идентичную
первичную структуру.
Белки рибосом, подобно гистонам, обладают основным харак-
тером. Митохондриальные рибосомы, выделенные из разных источ-
ников, отличаются и по количественному, и по качественному сос-
таву рибосомных белков. Митохондриальные рРНК не гомологич-
ны ни цитоплазматическим рРНК, ни рРНК прокариот. Они отли-
чаются по первичной и по вторичной структурам. Их структура бо-
лее рыхлая, менее стабильная, меньше содержит спиральных участ-
ков. Крупные рРНК митохондрий и хлоропластов близки к таковым
прокариот. 5,8S РНК не обнаружена в рибосомах ни у митохонд-
рий, ни у хлоропластов. В большинстве рибосом митохондрий не об-
наружена 5S РНК, но она присутствует в хлоропластах.
При синтезе белка определенное число рибосом (от 3 до 80—
100) прикрепляется к длинным нитевидным молекулам мРНК, об-
разуя полисомы. Каждая рибосома в полисоме способна синтезиро-
вать полную полипептидную цепь. Образование групп рибосом по-
вышает эффективность использования мРНК, поскольку на ней мо-
жет одновременно синтезироваться несколько идентичных полипеп-
тидных цепей. Полисомы находятся или в свободном состоянии, или
.212
в тесной связи с мембранами эндоплазматической сети. мРНК, ко-
дирующие внутриклеточные белки, содержатся преимущественно в
свободных полисомах, а мРНК, кодирующие секреторные белки,—
в мембраносвязанных.
4.5. Биосинтез нуклеотидов
4.5.1. Пути синтеза мононуклеотидов. Пуриновые и пиримиди-
новые нуклеотиды могут синтезироваться de novo, т. е. из простых
предшественников, а также непосредственно из готовых пуриновых
Аспарагиновая
кислота
Муравьиная
кислота
Рис. 4.10. Происхождение
атомов пуринового кольца
и пиримидиновых оснований. Относительное значение этих двух пу-
тей существенно отличается для разных клеток. Так, в тканях мле-
копитающих нуклеотиды преимущественно синтезируются de novo,
хотя в быстро растущих тканях образуются обоими путями. Напро-
тив, для нормального роста и развития многих видов бактерий не-
обходимо наличие в питательной среде готовых молекул пуринов
или пиримидинов.
4.5.2. Биосинтез пуриновых нуклеотидов. Биосинтез пуринового
кольца de novo протекает одинаково у разных видов живых су-
ществ: у бактерий, дрожжей, птиц, человека. Это один из многих
примеров единства ряда основных биохимических процессов всего
живого. Эксперименты с использованием изотопов позволили уста-
новить, из какого предшественника поступает каждый атом пури-
нового кольца (рис. 4.10) •
Цепочку из двух атомов углерода и одного атома азота (С-4,
С-5, N-7) дает аминокислота гли, один атом азота (N-1) поступает
из асп, оставшиеся два атома азота (N-3 и N-9) дает глн, два атома
углерода (С-2 и С-8) — муравьиная кислота. В первых этапах син-
теза участвует Б-рибозо-5-фосфат, и уже. над ним надстраивается
каркас молекулы гипоксантина. Таким образом, синтезируется не
свободное азотистое основание, а его нуклеотид — инозиновая кис-
лота (рис. 4.11).
Инозиновая кислота служит предшественником всех остальных
пуриновых нуклеотидов. Так, адениловая кислота (АМФ) образу-
ется в результате аминирования ИМФ, аминогруппа поставляется
213
_ ЛТлутамин
ФРП Ф----------Ф РА
Глицин
N5, М10-формил-
^nh2 ТГф
ГАР
ТГФК
ЫН
С НО
Формил-Г АР
+Mg3\
Глутамин, АТФ
ЫН
сж ^СНО
ЙЙ ^ЫН-Риб^'-ф
Формил-Г AM
Рис. 4.11. Схема биосинтеза
пуриновых нуклеотидов:
АПК АР — 5-аминоимидазол-4-кар-
бокс амидрибонуклеотид, АИР — 5-
аминоимидазол рибонуклеотид, ГАР
— глицинамидрибонуклеотид, И МФ
— инозин-5' монофосфат, Риб-5-ф —
рибозо-5-фосфат, №,Ы10-ТГФ — N-
форм илтетрагидрофолиевая кисло-
та, ТГФК — тетрагидрофолиевая
кислота, формил-ГAM — формилгли-
цинамидинрибонуклеотид, ФРА—5-
фосфорибозиламин, ФРПФ — 5-фос-
форибозил -1-пирофосфат
Сукцино-АИК АР
НООС^
+АТФ, аспартат, Mg2 + 'СН +со2
НзЫ-^^^^-т^Риб-З'-ф
Карбокси-АИР АИР
H2N
Фумаровая кислота
В %н
„
Формил-ТГФ ТГФК
Формил-АИКАР ИМФ
АИКАР
аспарагиновой кислотой. Образование гуаниловой кислоты (ГМФ)
из ИМФ является двухстадийной реакцией. Первая стадия состоит
в окислении ИМФ до ксантозин-5'-фосфата (КМФ). Затем происхо-
дит его аминирование, и образуется ГМФ. Донор аминогруппы, по-
видимому, различен у ряда организмов: у птиц и млекопитающих
донором служит глн, в бакте-
риальных системах — NH3.
4.5.3. Биосинтез пиримиди-
новых нуклеотидов. Примене-
ние метода изотопов позволи-
ло выяснить происхождение от-
дельных звеньев пиримидино-
вого ядра (рис. 4.12).
Первым этапом в синтезе
пиримидиновых нуклеотидов
NH3
со"
сн
.сн
Аспарагиновая
кислота
Рис. 4.12. Происхождение атомов пири-
мидинового кольца
является образование карба-
люилфосфата из NH3 и СО2. Карбамоилфосфат вступает в реак-
цию с асп и под действием аспартат-карбамоилтрансферазы прев-
ращается в карбамоиласпартат. Последний подвергается циклиза-
ции и окислению, в результате чего образуется оротовая кислота
(см. разд. 10.4.1), т. е. завершается формирование пиримидинового
кольца.
Таким образом, в процессе синтеза пиримидиновых нуклеоти-
дов в отличие от рассмотренного выше синтеза пуриновых нуклео-
тидов сначала образуется свободное азотистое основание. Только
после этого протекает пирофосфорилазная реакция, в ходе которой
к оротовой кислоте присоединяется рибозо-5'-фосфат от фосфори-
бозилпирофосфата (ФРПФ), образуется нуклеотид оротидин-5'-мо-
нофосфат (ОМФ). Декарбоксилирование ОМФ приводит к образо-
ванию уридин-5'-монофосфата (УМФ) — предшественника других
пиримидиновых нуклеотидов (рис. 4.13)-
Превращение урацила в цитозин происходит на уровне нуклео-
зидтрифосфатов. Оно осуществляется под действием фермента
соон
^сн,
I ---------
сн—соон
nh2
Аспарагиновая
соон
н2у ^сн2
ос. ^сн—соон
NH
Карбамоиласпартат
JCO НАД+ НАДН+Н*
HN' '
СН2
соон
NH
Оротовая кислота
ФРПФ
.сн—соон
кислота
Дигидрооротовая
кислота
Карбамоилфосфаг
ФФН
СО
СО
HN^ ^СН
I II
ОСХ ^сн
И-Риб-5'-ф >6Риб-5'-Ф
УМФ Оротидин-5'-фосфат
Рис. 4.13. Схема биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов (пояснение см.
в тексте)
215
ЦТФ-синтетазы: УТФ 4-NH3 4-АТФ->ЦТФ 4-АДФ 4- Фн. Тиминовые
нуклеотиды образуются в результате метилирования дезоксиури-
динмонофосфата. Реакция катализируется ферментной системой,
которую часто называют тимидилат-синтазой. Процесс весьма сло-
жен и протекает в несколько стадий. Источником одноуглеродного
фрагмента при С-5 служит кофермент М5,М10-метилентетрагидрофо-
лиевая кислота.
4.5.4. Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Превращение рибозы
в дезоксирибозу происходит на нуклеотидном уровне. Механизм
этого процесса был выяснен при изучении восстановления рибонук-
леотидов в экстрактах Е. coli. Фермент рибонуклеозид-дифосфат-
редуктаза катализирует восстановление всех четырех рибонуклео-
зиддифосфатов — АДФ, ГДФ, ЦДФ, УДФ в их дезоксипроизводные
дАДФ, дГДФ, дЦДФ, дУДФ. Источник восстанавливающей спо-
собности фермента in vivo неизвестен.
In vitro активны два донора водорода. Один из них — низкомо-
лекулярный серосодержащий белок тиоредоскин, две SH-группы ко-
торого окисляются с образованием дисульфидного мостика. Вторым
донором водорода может служить восстановленный глутатион.
Редуктазные системы, выделенные из различных животных клеток,
сходны с описанной системой Е. coli.
4.6. Ферменты синтеза и превращений
нуклеиновых кислот
4.6.1. ДНК-полимеразы. В бактериальных клетках содержится
несколько ДНК-полимераз. ДНК-полимераза 1 была открыта пер-
вой в экстрактах Е. coli группой А. Корнберга (1956). Этот фермент
катализирует полимеризацию нуклеотидов на одноцепочечной мат-
рице. Для синтеза необходима ДНК-затравка (праймер). Полиме-
ризация протекает путем присоединения мононуклеотидов к З'-ОН-
группе ДНК-затравки. Матрица определяет выбор ферментом нук-
леотида соответственно правилам комплементарности: А спарива-
ется с Т, Г — с Ц. Рост цепи происходит в направлении 5'->3'.
ДНК-полимераза специфически нуждается в б'-трифосфатах дезок-
сирибонуклеозидов, б'-дифосфаты и б'-монофосфаты неактивны.
Неактивны также б'-трифосфаты рибонуклеозидов. Для реакции
требуются ионы Mg2+.
В процессе репликации ДНК синтетическая активность ДНК-по-
лимеразы I играет вспомогательную роль — этот фермент «застра-
ивает» бреши, образующиеся между фрагментами ДНК после уда-
ления РНК-затравок (см. разд. 4.7-2). ДНК-полимераза I выполня-
ет также функцию коррекции, т. е. отщепляет неправильно вклю-
ченные в ДНК нуклеотиды. В этом случае фермент проявляет
З'-^б'-экзонуклеазную активность.
ДНК-полимераза I играет важную роль в репарации, т. е. в уст-
ранении повреждений участков ДНК. В отличие от других ДНК-
полимераз ДНК-полимераза I может вести синтез ДНК на матри-
це, имеющей несколько разрывов. Это связано с присущей ей б'-З'-
216
экзонуклеазной активностью: ДНК-полимераза I проводит отщеп-
ление ряда нуклеотидов, увеличивает размер бреши до величины,
при которой она может служить «стартовой площадкой» для син-
теза.
Важная роль принадлежит ДНК-полимеразе I в вырезании ти-
миновых димеров, образующихся в результате ультрафиолетового
облучения клеток, и в застройке образовавшихся пробелов. Ката-
лизируя одновременно включение нуклеотида по З'-концу и удале-
ние нуклеотида с 5'-конца, ДНК-полимераза 1 вызывает продвиже-
ние однонитевого разрыва вдоль молекулы ДНК. Такое перемеще-
ние разрыва или «трансляция ника» (от англ, nick — насечка), по-
видимому, происходит и при репарации повреждений, возникающих
в результате ультрафиолетового облучения клеток- Таким образом,
роль в клетке ДНК-полимеразы I очень велика.
В клетках Е. coli содержится также ДНК-полимераза II. Роль
ее сводится к восстановлению повреждений в участках молекулы
ДНК. Если в ДНК существует пробел в 2—100 нуклеотидов, то
ДНК-полимераза II заполняет его путем встраивания нуклеотидов
с З'-ОН-конца пробела. Если пробел больших размеров, то ДНК-
полимераза II не может проводить репарацию, или проводит ее
частично. Если в клетке отсутствует ДНК-полимераза /, то ДНК-по-
лимераза II достраивает фрагменты ДНК, образующиеся при ре-
пликации ДНК.
В 1972 г. Т. Корнберг и сотрудники выделили из клеток Е. coli
ДНК-полимеразу III. Она играет главную роль в репликации ДНК.
Как и другие полимеразы, фермент проводит полимеризацию толь-
ко в 5'-3'-направлении. Матрицей in vitro служит двухцепочечная
молекула ДНК, имеющая большое число коротких пробелов и в
связи с этим свободных З'-ОН-концов. Однако активный комплекс
ДНК-полимеразы III с двумя специфическими белками в присутст-
вии кополимеразы III работает только на длинной матрице. Актив-
ность ДНК-полимеразы III в 15 раз выше, чем ДНК-полимеразы I,
и в 300 раз выше, чем ДНК-полимеразы II.
Эукариотические клетки, так же как и клетки Е. coli и других
прокариот, содержат несколько ДНК-полимераз. В отличие от про-
кариотических, эукариотические ДНК-полимеразы не обладают эк-
зонуклеазной активностью, поэтому они не могут выполнять функ-
цию коррекции. Преобладающий фермент называется а-ДНК-поли-
мераза. Особенно часто она встречается в быстро растущих клет-
ках, осуществляет репликацию ядерной ДНК. Второй фермент —
р-ДНК-полимераза — участвует в репарации ядерной ДНК, не
встречается у низших эукариот (дрожжи, низшие растения). Тре-
тья — у-ДНК-полимераза обнаружена в митохондриях. Она отли-
чается от а- и p-ферментов по свойствам и, видимо, катализирует
репликацию митохондриальной ДНК.
4.6.2. ДНК-зависимая РНК-полимераза. Все типы РНК в клет-
ке — матричная, рибосомная, транспортная — синтезируются на
матрице ДНК- Они образуются благодаря действию ДНК-зависи-
мой РНК-полимеразы. Последовательность дезоксирибонуклеоти-
217
дов цепи ДНК при этом транскрибируется, как бы переписывается
буквами другого языка (поэтому сам процесс называется транс-
крипцией, см. разд. 4.8.1) в последовательность рибонуклеотидов в
РНК. В упрощенном виде РНК-полимеразную реакцию можно за-
писать следующим образом:
тАТФ АМФт
П УТФ ДНК-матрица, Mg2+ УМФП
+ (т+п+о+р) ФФн
О ГТФ РНК-полимераза ГМФ0
рЦТФ ЦМФр
Мононуклеотиды присоединяются по принципу комплементар-
ности один за другим к З'-гидроксильному концу цепи РНК, цепь
растет в направлении 5'->3', нуклеотиды связываются 3'—5'-фосфо-
диэфирными связями. Для реакции нужны все четыре вида рибо-
нуклеозидтрифосфатов и ионы Mg или Мп. Хотя обычно матрицей
служит двухцепочечная ДНК, транскрибируется одна ее цепочка,
несущая антикодоновые последовательности, так что образующая-
ся мРНК содержит кодоны. Обычно копируется только определен-
ный участок ДНК, кодирующий один определенный фермент или
группу ферментов.
РНК-полимеразы найдены в животных, растительных и бакте-
риальных клетках. Наиболее хорошо изучена РНК-полимераза у
Е. coli и некоторых бактериофагов. У Е. coli РНК-полимераза обла-
дает сложным строением, большой молекулярной массой (М=
= 480 000). В ее состав входят следующие субъединицы: две
а—(39 000), р—(155 000), (165 000), о—(95 000). Комплекс,
содержащий только аз-, Р'-субъединицы, называется сог-фермен-
том (т. е. сердцевина фермента). Он катализирует синтез РНК, но
без о-субъединицы делает это беспорядочно, о-частицы стабилизи-
руют комплекс фермента с определенными участками ДНК. После
присоединения о к кор-ферменту образуется холофермент.
Кроме транскрипционной РНК-полимеразы у Е. coli существует
еще одна РНК-полимераза. Ее функция — синтез коротких РНК-
затравок, необходимых для инициации репликации и синтеза фраг-
ментов ДНК (см. разд. 4.7.2). В клетках прокариот обнаружены
также мелкие РНК-полимеразы фагов. Они синтезируют мРНК, ко-
дирующие фаговые белки, на матрицах ДНК фагов.
У всех эукариот, от дрожжей до млекопитающих, обнаружена
система множественных РНК-полимераз. РНК-полимеразы эукари-
отических клеток выделены из тимуса теленка, культуры клеток че-
ловека, печени крысы и дрожжей. В каждом объекте обнаружено
три различных фермента: высокомолекулярные белковые комплек-
сы, содержащие сложный набор субъединиц. Все они являются
ядерными ферментами.
РНК-полимераза I обнаружена в ядрышке и катализирует син-
тез рибосомных РНК. Этот фермент существует в двух формах,
218
одна из которых состоит из 5—6 субъединиц, другая содержит на
одну субъединицу меньше. РНК-полимераза II присутствует в нук-
леоплазме, транскрибирует все гены эукариот, кодирующие белки,
а также основные гены вирусов животных. Состоит из пяти субъ-
единиц. РНК-полимераза III также локализована в нуклеоплазме,
считается, что она отвечает за синтез 5S РНК и тРНК; состоит из
10 и более субъединиц. Молекулярная масса субъединиц перечис-
ленных РНК-полимераз колеблется в широких границах.
Митохондрии эукариот имеют самостоятельный аппарат для
матричного синтеза. Из них выделена самая простая из известных
РНК-полимераз — мономер с М — 64 000.
4.6.3. Обратная транскриптаза. Необычное внимание привлека-
ла к себе обратная транскриптаза, или ревертаза, или РНК-зависи-
мая ДНК-полимераза. Она была обнаружена в составе РНК-содер-
жащих онкогенных вирусов саркомы Рауса, птичьего миелобласто-
за, лейкемии Раушера, в ряде опухолей человека. До ее открытия
полагали, что генетическая информация передается только с ДНК
на РНК (транскрипция). Этот фермент синтезирует ДНК на РНК,
переносит генетическую информацию с РНК на ДНК, в связи с чем
получил название обратной транскриптазы или ревертазы. Ревер-
таза обладает тремя ферментативными активностями.
Первая из них — РНК-зависимая ДНК-полимеразная. Она обес-
печивает синтез одноцепочечной комплементарной ДНК (кДНК) по
матрице РНК; требует затравки, которой может служить гомо- или
гетерополимер длиной от 4 до 200 нуклеотидов, построенный либо
из рибо-, либо из дезоксирибонуклеотидов, т. е. обязательно содер-
жащий З'-ОН-группу.
Вторая активность — ДНК-зависимая ДНК-полимеразная, обес-
печивающая синтез второй цепи ДНК (анти- кДНК) и отвечающая
за превращение одноцепочечной ДНК в двухцепочечную форму на
матрице ДНК. Третья — активность РНКазы Н, гидролизирующей
РНК в составе РНК-ДНК-гибрида. Сначала обратная транскрип-
таза синтезирует на матрице РНК комплементарную цепь ДНК, в
результате чего образуется двухцепочечная гибридная молекула
РНК-ДНК. Исходная молекула РНК разрушается. На оставшейся
цепи ДНК обратная транскриптаза достраивает вторую цепь ДНК,
получается двухцепочечная молекула.
Образовавшаяся таким образом двухцепочечная вирусная ДНК
может встраиваться в геном (хромосому) клетки-хозяина. В даль-
нейшем это приводит либо к размножению онкорнавируса (РНК-
овый онкогенный вирус), либо к образованию опухоли. Ген, коди-
рующий синтез обратной транскриптазы, содержится в геноме он-
корнавируса.
Изучение свойств обратной транскриптазы показало, что она не
обладает избирательностью в отношении матрицы и затравки. Это
позволило использовать фермент в генетической инженерии для
синтеза генов, для изучения разных участков вирусных геномов, а
также числа генов в эукариотических клетках, их первичной струк-
туры, процессинга РНК.
219
4.6.4. ДНК-лигазы. Единичные разрывы в цепи ДНК устраня-
ются ферментами ДНК-лиаазалш. Они катализируют образование
фосфодиэфирной связи между З'-ОН и 5'-фосфорилом, между фраг-
ментами ДНК, сближенными на расстояние одного нуклеотидного
звена. Синтез происходит сопряженно с расщеплением пирофосфат-
ной связи в НАД+ (£. coli и другие прокариоты) или Атф (эука-
риоты). Так образуются ковалентно замкнутые нити ДНК.
При этом от НАД+ отщепляется НМН (никотинамидмононукле-
отид), а от АТФ — Н4Р2О7. Образующийся в обоих случаях АМФ
присоединяется сначала к ферменту, а затем к сшиваемому 5'-концу
ДНК, активируя его и выделяясь после завершения лигазной реак-
ции. Лигазы играют важную роль в метаболизме нуклеиновых кис-
лот, участвуют в процессах репликации, репарации и рекомбинации.
В генетической инженерии лигазы используют для «сшивания» мо-
лекул ДНК.
4.6.5. Репликаза. Репликацию РНК РНК-содержащих вирусов
проводит РНК-зависимая РНК-полимераза (РНК-репликаза). Об-
разование этого фермента в зараженной вирусом клетке индуциру-
ет вирусная РНК. Репликаза использует нуклеозидтрифосфаты для
синтеза одноцепочечной вирусной РНК. На первой стадии синтеза
фермент образует на матрице РНК вируса комплементарную РНК
с противоположной полярностью (репликативная форма). На
второй стадии эта цепь служит матрицей для синтеза множества
новых вирусных цепей РНК. Обе стадии синтеза катализируются
одним и тем же ферментом, но в каждой из них участвуют различ-
ные белковые факторы.
4.6.6. Полинуклеотидфосфорилаза. Полинуклеотидфосфорилаза
катализирует синтез РНК из рибонуклеозиддифосфатов: РНКп +
+ НДФ^РНКп+1 + Фн. Для синтеза требуется затравочная цепь
РНК со свободной З'-ОН-группой, к которой присоединяются моно-
нуклеотиды. Состав продукта полностью определяется соотношени-
ем рибонуклеозиддифосфатов в исходной смеси, что позволяет по-
лучить in vitro полимеры с заданным нуклеотидным составом. В
связи с этим полинуклеотидфосфорилаза была использована для
построения матриц с целью расшифровки генетического кода (см.
220
разд. 5.3.5). Поскольку реакция, катализируемая полинуклеотид-
фосфорилазой, обратима, считают, что в клетке с ее помощью про-
исходит разрушение короткоживущих мРНК.
4.6.7. ДН К-(цитозин-5)-метилтрансферазы (ДН К-метилазы).
Известно, что в ДНК наряду с основными азотистыми основаниями
содержатся минорные компоненты — метилированные, глюкозили-
рованные и иным образом модифицированные основания. Они на-
ряду с особенностями первичной структуры обеспечивают видовую
специфичность ДНК. Модификация обычных азотистых оснований
протекает после того, как цепи ДНК уже построены. Например, ме-
тилируются 6-аминогруппа аденина и С-5 цитозина. Метильная
группа с S-аденозилметионина переносится на адениновый или ци-
тозиновый остаток в цепи ДНК. Процесс катализирует фермент
ДНК-метилаза* Метилирование происходит в строго определенных
точках молекулы ДНК, где находятся специфические последова-
тельности нуклеотидов. Метилирование защищает ДНК от расщеп-
ляющего действия ДНК-рестрикционных ферментов.
4.6.8. Нуклеазы. Ферменты, расщепляющие фосфодиэфирные
связи в молекулах нуклеиновых кислот, называются нуклеазами.
Расщепление фосфодиэфирной связи может осуществляться двумя
способами: в одном случае образуются продукты, фосфорилирован-
ные на 5'-конце, в другом — на З'-конце. Различают эндонуклеазы и
экзонуклеазы. Эндонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные связи
внутри молекулы одновременно во многих точках с образованием
обломков различной величины. Экзонуклеазы отделяют один нукле-
отид за другим от одного из концов полинуклеотидной цепи. В зави-
симости от специфичности к субстрату нуклеазы делят на две
группы: рибонуклеазы (РНКазы) и дезоксирибонуклеазы (ДНК-
азы).
Функции РНКаз в клетке разнообразны. Например, РНКаза 1
расщепляет РНК разных типов до мононуклеотидов, которые ис-
пользуются впоследствии для синтеза новых РНК. РНКазы II, ПЦ
IV, Р участвуют в процессинге мРНК, рРНК, тРНК, которые обра-
зуются сначала в виде молекул-предшественников. РНКаза спе-
цифически расщепляет РНК в ДНК-РНК гибридных комплексах.
Она может участвовать в расщеплении РНК-затравок при синтезе
ДНК, а также в расщеплении РНК при работе обратной транс-
криптазы.
Группа ДНКаз также представлена разнообразными фермента-
ми. К эндо-ДНКазам относятся ДНКазы I и II. ДНКаза I выде-
лена из поджелудочной железы, она расщепляет внутренние фосфо-
диэфирные связи в одной из цепей ДНК с образованием олиго-
нуклеотидов, имеющих фосфорильную группу на б'-конце. ДНК-
аза II содержится в селезенке и тимусе. Она катализирует разрывы
обеих цепей ДНК, в результате ее действия на ДНК образуются
З'-фосфо-олигонуклеотиды. Несколько ДНКаз выделено из бакте-
рий.
Большое внимание исследователей привлекли ДНКазы, рас-
щепляющие ДНК в строго определенных участках, где распо-
221
ложены специфические последовательности нуклеотидов, обычно
палиндромные, длиной 4—6 нуклеотидов. Эти ферменты называют
рестриктазами (ДЯК-рестрикционные ферменты). Рестриктаза и
метилаза «узнают» в ДНК одну и ту же последовательность из не-
скольких нуклеотидов. Рестриктаза расщепляет двухцепочечную
ДНК в том случае, если ни в одной из цепей основанияузнаваемой
последовательности не метилированы.
С помощью рестриктаз бактерии могут разрушать чужеродные
ДНК, попавшие в клетку в результате конъюгации или вирусной
инфекции. Таким образом, рестриктазы защищают бактериальную
клетку от внедрившейся в нее чужеродной ДНК. Чтобы остаться в
клетке нерасщепленной, чужеродная ДНК должна быть определен-
ным образом метилированной. Рестриктазы обладают специфично-
стью к: 1) узнаваемой последовательности, 2) месту рестрикции
(расщепление), 3) метилированию оснований узнаваемой последо-
вательности.
Название рестриктаз трехбуквенное, его образуют первая буква
названия рода микроорганизма-продуцента и первые две буквы
названия вида. Если рестриктаза кодируется геном плазмиды или
фага, то указывают символ этого нехромосомного элемента, напри-
мер EcoR. Если штамм содержит несколько рестриктаз, то они
обозначаются римскими цифрами: Hind I, Hind II, Hind III. Если
несколько штаммов бактерий одного вида содержат разные рест-
риктазы, то к трем буквам названия добавляют цифровое или бук-
венное обозначение штамма: Есо В, Есо К.
Рестриктазы делят на три типа. Ферменты I и III типов обна-
руживают две активности; рестрикционную и метилирующую. Оба
типа ферментов узнают специфическую неметилированную последо-
вательность нуклеотидов в ДНК. Рестриктазы I типа (например,
Есо К, Есо В) характеризуются относительно малой специфично-
стью к точкам рестрикции. Ферменты III типа (Есо PI, Hind III}
«разрезают» ДНК в специфических точках, но не доводят расщеп-
ление до конца, так как одновременно с расщеплением катализиру-
ют метилирование, препятствующее первому. Ферменты обоих ти-
пов обладают большой молекулярной массой (200 000—400000).
Рестриктазы II типа состоят из двух отдельных белков — собст-
венно рестриктазы и метилазы. Эти ферменты «узнают» опреде-
ленную последовательность в ДНК, которая обычно представляет
собой палиндром из 4 или 6 пар нуклеотидов. Рестриктаза, имею-
щая небольшую молекулярную массу (около 60 000), «разрезает»
либо эту последовательность, либо последовательность, располо-
женную рядом. Например, EcoR 7-эндонуклеаза узнает гексанукле-
отидную последовательность и разрезает ее в точках, указанных
стрелками (звездочками указаны места метилирования) :
I
5'—Г—А*— А—Т—Т—Ц—3'
3'—Ц— т—Т—А—А*—Г—5'
t
222
Участки расщепления представляют собой палиндромы. EcoR
7-эндонуклеаза расщепляет две цепи ДНК в разных точках; поэто-
му продукты расщепления имеют «липкие» концы.
Эндонуклеаза Hind II (рестриктаза бактерии Hemophilus influ-
enzae) расщепляет ДНК, образуя «тупые» концы, в следующих уча-
стках:
I
5'—Г—Т—Пир—Пур—А—Ц—3'
3'—Ц—А—Пур—Пир—Т—Г—5'
t
Метилазы модифицируют основания ДНК в этих же специфических
участках.
Наиболее отчетливая разница между ферментами I и III типов,
с одной стороны, и II типа, с другой, проявляется в природе про-
дуктов расщепления. В результате действия на ДНК рестриктаз
типа I образуются гетерогенные продукты, а типа III — продукты
неполного расщепления субстрата. Только рестриктазы II типа спе-
цифично и полно расщепляют ДНК на фрагменты, соответствующие
по длине расстояниям между узнаваемыми последовательностя-
ми. Поэтому именно рестриктазы II типа широко используют в ге-
нетической инженерии. Поскольку рестриктазы расщепляют цепи
ДНК в участках, имеющих строго специфичную последователь-
ность нуклеотидов, их используют в экспериментах по определению
первичной структуры ДНК.
4.6.9. Топоизомеразы. ДНК-топоизомеразы, — это ферменты, из-
меняющие число супервитков в кольцевой замкнутой ДНК. Извест-
ны топоизомеразы, воздействующие на одноцепочечные и на двух-
цепочечные молекулы ДНК. Среди них обнаружены ферменты, ко-
торые объединяют две или более молекул ДНК в катенаны (зацеп-
ленные кольца). Топоизомераза I разрывает одну из цепей кольце-
вой суперспирализованной ДНК, тогда цепи раскручиваются,
уменьшается число супервитков, затем этот же фермент устраняет
разрыв.
К этому же классу ферментов относится фермент гираза (топо-
изомераза II), Гираза превращает расслабленную несверхспирали-
зованную замкнутую кольцевую ДНК в суперспираль, т. е. прояв-
ляет действие, противоположное топоизомеразе 7. На эту реакцию
затрачивается большое количество АТФ. Если вывести из строя
гиразу, то в клетке нарушаются самые важные процессы, в част-
ности репликация ДНК.
4.7. Синтез ДНК
4.7.1. Полуконсервативная репликация ДНК. Д. Уотсон и Ф.
Крик не только разработали модель структуры ДНК, соответствую-
щую всем экспериментальным данным, но и предложили гипотезу
механизма синтеза ДНК путем удвоения (репликации). Согласно
223
этому механизму двухцепочечная молекула ДНК сначала разделя-
ется вдоль, две ее цепи расходятся- На каждой старой цепи обра-
зуется новая цепь. При этом нуклеотиды новых цепей спариваются
комплементарно с нуклеотидами старых цепей, так что старые це-
пи служат матрицами. Так образуются две дочерние двухцепочеч-
ные молекулы ТШК; совершенно одинаковые, идентичные роди-
тельской молекуле. В каждой дочерней молекуле одна цепь полу-
Рис. 4.14. Возможные способы воспроизведения ДНК:
/ — консервативный, U — полуконсервативный. Ill — дисперсный
чена от родительской ДНК, а вторая синтезирована заново. Этот
путь синтеза получил название полуконсервативной репликации.
Однако теоретически возможны еще два механизма разделения
ДНК между дочерними клетками поровну, получившие название
консервативной и дисперсной репликации. При консервативной реп-
ликации на двух цепях родительской молекулы ДНК, без их разде-
ления, синтезируется новая молекула ДНК. Дисперсный механизм
предполагает дробление молекул ДНК, в результате которого каж-
дая отдельная цепь новых дочерних молекул содержит в себе уча-
стки как старой, так и новой цепи ДНК (рис. 4.14).
М. Месельсон и Ф. Сталь (1958) в опытах с Е. coli доказали, что
в клетке репликация ДНК происходит полуконсервативным спосо-
бом. Они выращивали Е. coli на синтетической среде, содержащей
глюкозу и соли. Источник азота NH4C1 вместо обычного легкого
азота 14N содержал тяжелый i5N, так что все азотсодержащие ве-
щества бактерий, в том числе и ДНК, становились «тяжелыми». За-
тем бактериальные клетки отмывали и переносили на «легкую» пи-
тательную среду, содержащую изотоп азота 14N, где происходил их
дальнейший рост. Через различные промежутки времени из бакте-
рий выделяли ДНК и центрифугировали ее в градиенте плотности
CsCl. Для нулевого-поколения была получена единственная полоса,
224
соответствующая 15Ь1-ДНК. После кратковременного роста, в тече-
ние которого число клеток удваивалось, в градиенте появилась дру-
гая, более легкая полоса. Плотность ее соответствовала гибридной
молекуле ДНК, которая содержит равное количество I5N и 14N.
По-видимому, цепи с 14N были вновь синтезированными. Это именно
тот результат, которого следовало ожидать, исходя из полуконсер-
вативного механизма. После репликации ДНК, завершения двух
циклов деления бактерий, в градиенте плотности обнаруживали две
полосы ДНК разной плотности. Одна из этих полос соответствова-
ла гибридной ДНК, содержащей 15N и 14N, вторая — ДНК, содержа-
щей обе цепи с 14N. Эти данные убедительно доказывают, что син-
тез ДНК происходит полуконсервативным способом.
4.7.2. Репликация ДНК как многоступенчатый процесс. Для
того чтобы ДНК могла реплицироваться полуконсервативным спо-
собом, она должна разделиться на составляющие ее цепи. Установ-
лено, что цепи ДНК раскручиваются не по всей длине, а на ко-
ротком участке. Здесь образуется вилка репликации — место удвое-
ния ДНК. Перемещение репликационной вилки возможно только при
раскручивании двухспиральной ДНК (хеликса) и закручивании
двух дочерних молекул. Конформацию хеликса изменяет ряд фер-
ментов; их делят на три группы*
Первую группу составляют хеликазы — белки, расплетающие
двойную спираль и удерживающие одиночные цепи от воссоедине-
ния. К ним у coli относятся связывающий белок и гер-белок.
Вторая группа—свивелазы (топоизомеразы /, или релаксирую-
щие белки). С их помощью устраняется суперспирализация ДНК
(т. е. они выполняют функцию шарнира). Свивелазы вносят в одну
из цепей ДНК разрыв, благодаря чему делается возможным рас-
кручивание этой цепи с последующим замыканием разрыва. К ним
у Е. coli относится со-белок.
Третью группу составляют жиразы (гиразы)—топоизомеразы
II. Они вызывают негативную суперспирализацию в кольцевой
ДНК путем разрыва одной связи, вращения цепи и замыкания
связи. Фактически тоже выполняют функцию шарнира.
В репликационной вилке Е. coli гер-белок дестабилизирует
двойную спираль ДНК, а связывающий белок присоединяется к од-
ноцепочечным участкам, обеспечивая им роль матриц. Жиразы, ви-
димо, способствуют формированию левозакрученных, т. е. (—)
сверхспиралей, что создает (—) сверхспиральное давление на вил-
ку и облегчает работу хеликаз-
Геномы фагов и бактерий реплицируются как единое целое. Они
представляют собой организованные единицы репликации, так на-
зываемые репликоны. Репликон имеет начало — ori (от англ, ori-
gin— начало), ориентированное направление и иногда терминаль-
ный участок— ter.
Репликация начинается в участке ori. Здесь цепи ДНК расхо-
дятся, образуются две репликационные вилки, в которых синтези-
руются новые цепи ДНК. Если ДНК имеет кольцевую форму, то
репликационные вилки передвигаются навстречу друг другу до тех
8—937
225
пор, пока ДНК че будет скопирована полностью (или до точки
ter), У некоторых плазмид обнаружена однонаправленная репли-
кация, при которой одна репликационная вилка движется в опре-
деленном направлении.
Процесс репликации ДНК делится на три основных этапа:
1) инициация, 2) элонгация, или рост цепи, 3) терминация. Со-
гласно электронно-микроскопическим, радиоавтографическим и ге-
нетическим данным, в репликационной вилке с большой скоростью
осуществляется синтез двух противоположно ориентированных
цепей ДНК. Направление одной цепи 5'—>3' совпадает с направле-
нием движения вилки, эту цепь называют лидирующей. Вторая цепь
называется запаздывающей. В 1968 г. Р. Оказаки и сотрудники по-
казали, что синтез ДНК происходит на обеих цепях матричной
ДНК в направлении 5'—>3' и идет прерывисто, отдельными фраг-
ментами размером в 1—2 тыс. нуклеотидов. В дальнейшем эти
фрагменты получили название фрагментов Оказаки, В лидирующей
цепи ДНК образуются более крупные фрагменты, направление их
роста 5'—>3' совпадает с направлением движения вилки реплика-
ции. С течением времени фрагменты Оказаки укрупняются и, на-
конец, образуют непрерывные дочерние цепи ДНК. Допускают да-
же, что у Е. coli лидирующая цепь растет непрерывно. В запазды-
вающей цепи ДНК образуются короткие фрагменты, в связи с чем
многократно осуществляется инициация синтеза.
Синтез ДНК проводят ДНК-полимеразы, праймерами для ко-
торых in vivo служат фрагменты РНК.
Важную роль в инициации репликации в точке ori играет белок
В. После расплетания двойной спирали В-белок связывается в
участке ori с матрицей лидирующей цепи; инициирует ее праймер,
затем перемещается в противоположном направлении и обеспечи-
вает инициацию праймеров запаздывающей цепи. Таким образом,
В-белок выполняет у £. coli функции «мобильного промотора», т. е.
участка инициации транскрипции.
Синтез праймеров осуществляют ферменты примазы (специаль-
ные РНК-полимеразы). З'-Конец РНК-праймера используется
примазой для инициации фрагмента ДНК, дальнейшая его элон-
гация проводится холоэнзимом ДНК-полимеразы 111, Поэтому
каждый фрагмент Оказаки начинается фрагментом РНК в 50—
200 нуклеотидов, который затем удаляется. Удаление праймеров из
фрагментов Оказаки у Е, coli проводит ДНК-полимераза Z, она же
застраивает образовавшиеся бреши. Укрупнение фрагментов* Ока-
заки путем их сшивания происходит с участием ДНК-лигазы
(рис. 4.15).
Механизмы терминации репликации исследованы недостаточно.
В ДНК Е. coli для терминации существует специальный участок —
терминатор. В геноме ряда бактериофагов терминаторы отсутству-
ют, двусторонняя репликация завершается, видимо, после встречи
двух вилок и реплицирующих комплексов.
Детали репликации хромосом эукариот изучены недостаточно,
однако общие черты процесса можно представить следующим обра-
226
5'
3'
— Белок Л
Синтез праймера примазой
Элонгация
Элонгация
3'
Направление движения
репликационной вилки
Лигазная
реакция
Удаление праймера,
заполнение бреши
ДНК-полимеразой I
ДНК-раскручивающий
гер -белок
5'
3'
Законченные
фрагменты Оказаки
Рис. 4.15. Репликационная вилка ДНК Я. coli (показаны стадии репликации и
участвующие в ней белки)
ДНК-связывающие /§
белки
ДНК-полимераза Ш
зом. Хромосома эукариот — это полирепликонная структура, т. е. в
ней есть множество независимых репликонов, каждый из которых
содержит начало и терминатор. Смежные репликоны ориентирова-
ны противоположно, после завершения репликации их реплики, т. е.
синтезированные комплементарные нити, сливаются. Размеры реп-
ликонов составляют от 10 до 100 мкм, что отвечает ЗХ104—ЗХ105
нуклеотидных пар. Высокая скорость репликации обеспечивается
образованием большого числа репликационных вилок.
Полуконсервативная репликация инициируется в участке ori
путем надрезания одной из цепей сверхспиральной молекулы и,
как следствие, разделения цепей ДНК- Здесь формируется репли-
кационная вилка. В вилке по лидирующей цепи ДНК идет непре-
рывный синтез, по запаздывающей — дискретный. Фрагменты Ока-
заки имеют размер от 40 до 290 нуклеотидов (в среднем 135),
праймеры — около 9 нуклеотидов. Механизм репликации, по-види-
мому, сходен с таковым у прокариот. Синтез ДНК проводит ДНК-
полимераза а. Выделены и другие ферменты клетки, выполняющие
функции, сходные с функциями ферментов репликации прокариот.
Особенности репликации ДНК в хромосомах связаны с нукле-
осомной организацией последних. Когда вилка репликации прохо-
дит через нуклеосомный участок ДНК, этот участок «развивается»
с помощью хеликсдестабилизирующих ферментов. После прохож-
8*
227
дения вилки формируются две новые двойные спирали, восстанав-
ливается нуклеосомная структура.
Репликация геномов вирусов и фагов часто осуществляется пу-
тем использования ферментов клетки хозяина. Однако она может
быть организована иначе, чем у бактерий.
В инфицированных плазмидами бактериях нередко обнаружи-
ваются олигомерные геномы плазмид. Несколько одинаковых реп-
ликонов одной плазмиды ока-
Рис. 4.16. Репликация ДНК по меха-
низму «катящегося кольца» (по Г. Мей-
неллу, 1976):
1 — исходная двухспиральная молекула, 2 —
вновь синтезированные спирали, 3 — З'-конец,
4 — 5'-конец
зываются объединенными в од-
ной молекуле ДНК. Образова-
ние таких форм объясняет мо-
дель репликации ДНК, полу-
чившая название «катящегося
кольца» (рис. 4.16). Согласно
этой модели, одна цепь двух-
спиральной кольцевой молеку-
лы ДНК разрывается, и ее S'-
конец прикрепляется к мембра-
не клеточной стенки. Затем
происходит полуконсерватив-
ная репликация, в ходе которой
вторая цепь сохраняет кольце-
вую форму: она как бы «ка-
тится», представляя собой бес-
конечную матрицу. Если реп-
ликация завершится в той же
точке, откуда она началась, то
будет синтезирован геном-мономер, если же кольцо «покатится»
дальше, то появятся олигомеры, содержащие несколько геномов.
Такие продукты репликации могут мономеризоваться и приобре-
тать кольцевую форму за счет рекомбинации. Предполагают, что
репликация по механизму «катящегося кольца» осуществляется у
ряда бактериофагов Е. coli, например Р2, Р22, Т4, %, у бактерий
при конъюгации. В клетках эукариот с помощью этого механизма
протекает амплификация, т. е. избирательная многократная реп-
ликация генов. Примером служит амплификация генов, кодирую-
щих рРНК в ооцитах Xenopus.
А. Корнберг (1977) предполагает, что ферменты, участвующие
в синтезе ДНК, объединены в комплекс. Они образуют частицы диа-
метром 8—12 нм, связанные с мембраной клетки посредством гид-
рофобных взаимодействий. Комплекс называется реплисома-
После того как цепи ДНК построены, ДНК-метилазы метили-
руют их, придавая ДНК видовую специфичность. ДНК-гираза ка-
тализирует образование супервитков.
4.7.3. Репарация повреждений ДНК. Химические и физические
факторы внешней среды могут вызвать повреждение ДНК. Так,
например, ультрафиолетовое облучение в больших дозах оказыва-
ет летальное, в малых — антимитотическое и мутагенное действие.
При этом в молекуле ДНК возникает ряд изменений: происходит
228
дезаминирование цитозина, он превращается в урацил, что может
привести к возникновению мутации; тиминовые основания образу-
ют димеры—двойные тиминовые кольца; появляются участки ло-
кальной денатурации ДНК, которые препятствуют репликации
ДНК.
В процессе эволюции в клетках живых организмов выработа-
лись механизмы репарации повреждений ДНК. Один из процессов
репарации протекает с участием света, это фотореактивация. Из-
вестен фермент, соединенный с хромофором, который поглощает
видимый свет, доставляя необходимую для осуществления реакции
энергию. Фермент специфически связывается с тиминовым димером,
расщепляет его, а затем отделяется от ДНК. Функции ДНК вос-
станавливаются примерно на 90%.
Другой изученный процесс — темновая (эксцизионная) репара-
ция ДНК, т. е. репарация, связанная с удалением поврежденного
участка. Специфическая эндонуклеаза распознает повреждение и
надрезает нить ДНК вблизи тиминового димера. Другой фермент —
УФ-эндонуклеаза — вырезает олигонуклеотид, содержащий тими-
новый димер. ДНК-полимераза / (или в других случаях ДНК-по-
лимераза II) заполняет образовавшуюся брешь путем включения
нуклеотидов. Фермент ДНК-лигаза замыкает фосфодиэфирную
связь между вновь синтезированным фрагментом и остальной
ДНК. Посредством темновой репарации может происходить исправ-
ление множества потенциально летальных нарушений генома. Так,
у бактерий она может устранять разрывы полинуклеотидных цепей
ДНК, вызванные действием рентгеновских лучей. При темновой
репарации могут удаляться сшивки пуриновых оснований в ДНК,
вызванные действием иприта. Таким образом, системы репарации
повышают стабильность носителя наследственной информации —
ДНК.
Некоторые редкие наследственные заболевания человека связа-
ны с дефектами в репарации повреждений ДНК. К ним относится
пигментная ксеродерма. Больные ксеродермой повышенно чувстви-
тельны к солнечному свету, у них часто возникает рак кожи. Если
культуры клеток кожи таких больных подвергнуть ультрафиолето-
вому облучению, то скорость выщепления димеров тимина у этих
клеток будет меньше, чем у клеток кожи нормальных людей.
У одной группы больных, страдающих ксеродермой, отсутствует
активность УФ-эндонуклеазы. У другой группы больных клетки
не способны репарировать ДНК, имеющую однонитевые разрывы,
что связано, по-видимому, с отсутствием ДНК-полимеразы 1.
4.8. Синтез РНК
4.8.1. Транскрипция. Транскрипция у прокариот.
Транскрипция — процесс, посредством которого заключенная в
ДНК генетическая информация «переписывается» в одиночные це-
пи РНК. Впоследствии РНК переносится к рибосомам.
229
Единицы процесса транскрипции несут информацию о структу-
ре одного или нескольких белков- Участок ДНК, в котором заклю-
чена информация о структуре одного белка, называется цистроном
или структурным геном. Регуляция транскрипции осуществляется
благодаря наличию в ДНК специальных регуляторных участков.
Регуляторная зона включает в себя промотор, оператор, а нередко
и другие участки управления (рис. 4.17).
Промотор содержит участок первоначального прочного связы-
вания ДНК-зависимой РНК-полимеразы с ДНК. Оператор — регу-
ляторный участок, кото-
рый связывается с реп-
рессорами — белками,
контролирующими синтез
мРНК в соответствии с
потребностями клетки.
Оператор и промотор
Рис. 4.17. Строение оперона прокариот:
Р — промотор, О — оператор. А, В, С — цистроны, t —
терминатор, R — ген-регулятор
иногда частично пере-
крываются. В некоторых
единицах транскрипции
(опероны) между оператором и структурными генами располага-
ется так называемая лидерная зона. Она транскрибируется, но,
как правило, не транслируется. В ее границах располагаются учас-
ток связывания рибосомы на мРНК и аттенюатор. Последний регу-
лирует транскрипцию, оказывая влияние на связь РНК-полимеразы
с матрицей ДНК. После структурных генов находится терминатор.
Последовательность нуклеотидов ДНК, ограниченная промото-
ром и терминатором, кодирующая одну молекулу мРНК и контро-
лируемая оператором, называется опероном. У прокариот известны
опероны, в состав которых входит несколько цистронов (генов), ко-
дирующих структуру ферментов одной метаболической цепи. Бла-
годаря наличию регуляторной зоны все цистроны включаются и
выключаются одновременно- Представления об опероне были сфор-
мулированы в 1959 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно и являются основой
понимания механизмов управления работой генов у прокариот.
В геноме находятся также единицы транскрипции, не контролируе-
мые каким-либо оператором, функционирующие конститутивно.
ДНК-зависимый синтез РНК можно разбить на несколько ста-
дий, которые в целом составляют цикл транскрипции. Они подроб-
но изучены на прокариотических объектах. Первая стадия тран-
скрипции — инициация — включает взаимодействие РНК-полиме-
разы с матричной ДНК. РНК-полимераза может связываться с
любым участком ДНК, при этом образуется неспецифический сла-
бый комплекс с коротким периодом полураспада. Через серию ак-
тов ассоциации — диссоциации на случайных последовательностях
ДНК РНК-полимераза находит промотор. В области промотора
образуется сначала закрытый стабильный комплекс ДНК и РНК-
полимеразы. Затем происходит локальная денатурация ДНК. РНК-
полимераза^получает прямой доступ к основаниям ДНК, образует-
ся открытый комплекс.
£50
Взаимно комплементарные цепи молекулы ДНК антипараллель-
ны, комплементарная вырожденность кода отсутствует, поэтому
обе цепи ДНК не могут кодировать один белок. Считают, что
транскрибируется или только одна из двух цепей, или обе, но лишь
одна из образовавшихся молекул РНК является матричной, вторая
же выполняет иные функции. Цепь ДНК, комплементарную мРНК,
обычно называют кодирующей, вторую цепь — замыкающей* Так
как транскрипция несимметрична (идет на одной цепи из двух),
можно предполагать, что и промотор фиксирован лишь в одной из
двух цепей ДНК, имеет тоже несимметричную структуру и опреде-
ляет направление движения РНК-полимеразы, т. е. выбор ею ко-
дирующей цепи.
Если имеются соответствующие рибонуклеозидтрифосфаты, то
начинается синтез РНК. Первыми нуклеотидами при инициации
транскрипции почти всегда бывают А или Г. Образуется трехком-
понентный комплекс ДНК-РНК-полимераза-растущая цепь РНК.
Промотор не транскрибируется. Оператор в некоторых случаях
частично транскрибируется.
Элонгация (рост цепи) РНК происходит в направлении
Рибонуклеотиды присоединяются к З'-ОН-концу последовательно,
один за другим, соответственно матрице ДНК. Скорость процесса
элонгации в клетках £. coli in vivo составляет 45—50 нуклеотидов
при 37°С в 1 с.
Терминацию синтеза РНК вызывает последовательность нук-
леотидов в ДНК — терминатор или стоп-сигнал. Структура терми-
наторов полностью не выяснена. Известно, что в их состав входят
длинные блоки дд^;; . У Е. coli обнаружены стоп-сигналы друго-
го типа, которые действуют
только в присутствии белка,
называемого p-фактором. Этот
белок с М = 50 000. обычно не
связанный с РНК-полимеразой.
При его участии цепь РНК ос-
вобождается от матрицы ДНК,
но фермент еще остается свя-
занным с ДНК. Для высвобож-
дения фермента нужны неко-
торые дополнительные факто-
ры. Выделен еще один белок,
участвующий в терминации,—
каппа-частица.
В клетках бактерий к гото-
вому, начинающему отделять-
ся от матрицы участку мРНК
присоединяются рибосомы. Они
способствуют отделению мРНК
от матрицы и начинают синтез
белка. Так образуется единый
транскрипционно - трансляци-
Рис. 4.18. Транскрипция и трансляция
в клетках Е. coli (согласно данным
электронной микроскопии).
На двухцепочечной ДНК растут цепи
мРНК- Сверху, где транскрипция только
началась, цепи мРНК короче, а ниже, где
транскрипция продолжалась в течение
определенного времени, — длиннее. К Це'
пям мРНК присоединяются рибосомы, на-
чинается синтез полипептидных цепей
231
онный комплекс, который удалось обнаружить методом электрон-
ной микроскопии (рис. 4.18).
Особенности транскрипции у э у к а р и о т. Если у
прокариот транскрипция и трансляция сопряжены, то у эукариот
эти процессы разобщены во времени и пространстве. Важная роль
в этом принадлежит ядру клетки, разграничивающему аппараты
транскрипции и трансляции. При описании транскрипции у эукари-
от термин «оперон» может быть использован весьма условно, так
как гены, детерминирующие структуру белков одной метаболиче-
ской цепи, не обязательно расположены рядом, а могут быть лока-
лизованы даже в разных хромосомах. В связи с этим мутации, пре-
рывающие один и тот же метаболический путь, у эукариот также
бывают «разбросаны» по всему геному. Для структурных генов
эукариот выявлены не одиночные регуляторные участки, а их боль-
шие серии. Также отличаются ферментные системы, считывающие
информацию с генома про- и эукариот, и этапы превращений
первичных продуктов транскрипции в зрелые молекулы
мРНК.
Большинство цитоплазматических молекул РНК синтезируется
первоначально в ядре в виде высокомолекулярных предшественни-
ков— пре-мРНК и пре-рРНК. Они гораздо длиннее, чем цитоплаз-
матические РНК, подвергаются процессингу (созревание). Транс-
крипция у эукариотических организмов осуществляется примерно
по тем же стадиям, что и у прокариот, но ее проводят три разных
РНК-полимеразы. Транскрипция РНК-полимеразами / и III мало
изучена. Однако установлено, что инициация транскрипции в раз-
ных генах определяется их внутренними участками, имеющими
сходное строение, но расположенными на различном расстоянии от
места начала транскрипции.
РНК-полимераза II эукариотических клеток катализирует син-
тез всех пре-мРНК. Механизм функционирования РНК-полимеразы
II в значительной степени напоминает прокариотические системы.
Изучение продуктов транскрипции позволило выявить характер-
ные особенности строения как структурных, так и регуляторных
зон генома. Наиболее детально изучены гистоновые гены и в не-
сколько меньшей мере — глобиновые, овальбуминовый и кональбу-
миновый.
У большинства генов этой группы обнаружена сходная последо-
вательность (ТАТААА или более короткая — ТАТА или АТА), на-
званная последовательностью Гольдберга-Хогнесса. Она располо-
жена «вверх по течению» от точки начала транскрипции на 21—
28 нуклеотидных пар. С обеих сторон от АТ-богатой последова-
тельности располагаются ГЦ-богатые участки. Предполагают, что
ТАТА-участок важен для инициации транскрипции, т. е. выполняет
роль промотора. ТАТА-блок определяет выбор точки начала транс-
крипции, но не влияет на ее эффективность, поэтому иногда его
называют селектором. На определенном расстоянии от ТАТА-по-
следовательности располагается инициаторная область, с которой
непосредственно начинается транскрипция мРНК, она заканчива-
232
ется до кодона АТГ. На расстоянии примерно 100—300 пар нуклео-
тидов от точки начала транскрипции за селектором располагается
другой функционально важный участок — модулятор (модуляторов
может быть несколько). Он определяет скорость синтеза неизмен-
ных по структуре молекул мРНК только в присутствии селектора и
инициатора (рис. 4.19).
На инициацию транскрипции могут влиять и более отдаленные
области генома. По-видимому, истинный промотор генов, транскри-
бируемых РНК-полимеразой //, формируется из нескольких участ-
лтг тк
Поли£\)
Е АВС Экзон 1 Интрон 1 Интрон 2
') Экзон 2 Экзон 3
Нетранслируемая область
Рис. 4.19. Строение единицы транскрипции эукариот:
А и Е — модуляторы, В — селектор. С — инициатор, t — терминатор транскрипции,
поли (А)-участок, являющийся» видимо, затравкой при полиаденилировании в про-
цессинге; 5'— первый транскрибируемый кодон; АП —кодон, инициирующий транс-
ляцию на рибосоме; ТК — кодон, терминирующий трансляцию; темными участками
обозначены экзоны, светлыми — интроны
ков генома за счет определенной конформации хроматина. За точ-
ность и эффективность транскрипции отвечают также многочислен-
ные белковые факторы клетки, которые еще плохо изучены.
Структурные зоны генов эукариот также имеют некоторые осо-
бенности, отличающие их от структурных генов бактерий. Внутри
участков, кодирующих структуру белков, существуют разрывы —
интроны. Они чередуются с экзонами — участками гена, которые
кодируют последовательности зрелых мРНК (рис. 4.19). Первый
экзон, если он не кодирует полипептид, а является матрицей для
5'-нетранслируемого участка мРНК, называется лидерной после-
довательностью. Число экзонов сильно варьирует у разных генов.
Существует предположение, что экзоны в ряде случаев соответст-
вуют определенным доменам в кодируемых белках. Например, это
показано в исследованиях иммуноглобулиновых генов. Возможно,
перестановка крупных блоков (экзонов) в генах является одним из
путей эволюции последних.
Терминация транскрипции в эукариотических клетках изучена
недостаточно. Существуют, например, сведения, полученные при
анализе гистоновых генов. В области, примыкающей к З'-конпу
структурной зоны гена, на расстоянии 23—47 пар нуклеотидов от
ее последнего кодона, обнаружен консервативный участок, состоя-
щий из двух коротких палиндромов, которые разделены последо-
233
вательностью ТТТТ. Предполагают, что РНК образует в этом уча-
стке «шпильку», которая участвует в терминации.
Работы американского цитолога О. Миллера (1969) позволили
увидеть единицы процесса транскрипции на электронных микрофо-
тографиях. Из яйцеклеток амфибий ученым были выделены дей-
ствующие гены, кодирующие рибосомную РНК. На схеме, состав-
НапраЬпение синтеза —1—»
Рис. 4.20. Образование молекул . РНК на матрице ДНК,
соответствующей одному гену
ленной по микрофотографии, изображены нити ДНК с прикреплен-
ными к ним молекулами РНК-полимеразы и свисающими с молекул
полимеразы нитями РНК (рис. 4.20). Схема показывает, что тран-
скрипцию проводят сразу 80—100 молекул РНК-полимеразы, кото-
рые последовательно связываются с промотором.
4.8.2. Процессинг мРНК. В эукариотических клетках первичные
транскрипты превращаются в мРНК в ходе процессинга. Пре-
мРНК составляют основную фракцию гетерогенной ядерной РНК
(гяРНК), которую выделили впервые в 1961 г. Г. П. Георгиев и
сотрудники. Пре-мРНК содержит от 5 000 до 50 000 нуклеотидов, в
то время как мРНК относительно коротки, их средний размер со-
ставляет около 2000 нуклеотидов. Одна мРНК кодирует одну поли-
пептидную цепь, т. е. является моноцистронной. Каждая молекула
пре-мРНК обычно дает начало только одной молекуле мРНК, при
этом большая часть цепи пре-мРНК (иногда до 90% и более), со-
ответствующая некодирующей зоне ДНК, подвергается фермента-
тивному расщеплению до свободных нуклеотидов и в цитоплазму
не поступает. Эти изменения представляют собой часть процес-
синга.
Процессинг (посттранскрипционная модификация) включает в
себя: 1) отрезание «лишних» концевых последовательностей,
2) расщепление длинных первичных транскриптов, «вырезание» из
них участков,^транскрибированных с интронов, 3) добавление нук-
леотидов к З'-концу транскрипта, 4) добавление нуклеотидов к
5'-концуж транскрипта^ 5) модификацию оснований в транскрипте.
Процессинг протекает в ядре. К Зг-концу пре-мРНК присоеди-
няется (с участием специального фермента) последовательность
234
пре-мнги\— комплекс
51 пре^ мРНК
Рис. 4.21. Предполагаемая
структура, образующаяся при
сплайсинге.
Пунктиром обозначены водород-
ные связи, образовавшиеся между
комплементарными азотистыми ос-
нованиями. Темными участками
представлены последовательности
пре-мРНК, транскрибированные с
экзонов, светлыми — с интронов
из 150—200 адениловых нуклеотидов — поли (А)-фрагмент, к 5'-
концу присоединяется кэп (см. разд. 4.4.3). Вырезание интронов из
первичного транскрипта сопровождается сплайсингом1. Механизм
сплайсинга точно не выяснен. Предполагают, что в нем участвуют
особая L7-PHK и некоторый фермент. [//-РНК узнает места соеди-
нения интронов и экзонов, она взаимодействует с ними по принципу
комплементарности, образуя гибрид
РНК-фермент. Это приводит к сближе-
нию двух участков пре-мРНК, транск-
рибированных с соседних экзонов.
Участок, транскрибированный с интро-
на, образует петлю (рис. 4.21). Обра-
зовавшиеся гибриды могут быть мес-
тами атак РНКаз, специфичных для
двухнитевых участков РНК. После вы-
резания «лишнего» участка, т. е. транс-
крибированного с интрона, специаль-
ные лигазы сшивают два конца разре-
занной молекулы пре-мРНК.
В результате процессинга из пре-
мРНК получается молекула мРНК,
имеющая 5'-кэп-, универсальный З^по-
ли(А)блок и одну кодирующую после-
довательность. Для прокариотических
клеток процессинг не характерен.
Сплайсинг протекает в эукариотиче-
ских клетках при биосинтезе как
мРНК, так и тРНК, рРНК. Например
некоторые тРНК дрожжей, хотя их интроны очень малы по раз-
мерам. У дрозофилы гены рРНК также содержат интрон.
4.8.3. Рибонуклеопротеиновые комплексы (PHП-комплекеы).
Молекулы РНК сразу же после транскрипции соединяются с бел-
ками, образуя компактные структуры. РНП-комплексы, содержа-
щие гяРНК, называются ядерными информосомами (гяРНП). От-
ношение белок : РНК составляет в них 4:1.
Кроме гяРНК в составе гяРНП обнаружены низкомолекуляр-
ные стабильные РНК, имеющие коэффициенты седиментации от
4,5 S до 6,5 S. Они тесно связаны как с самими молекулами
гяРНК, так и с белками РНП-частиц.
Общую схему строения гяРНП можно представить следующим
образом. Вдоль цепи гяРНК формируются многочисленные моно-
частицы, расположенные нестрого регулярно. Эти 30—40S части-
цы состоят из белковой глобулы (информофера), на поверхности
которой некоторым образом «накручен» небольшой (600 нуклеоти-
дов) участок цепи гяРНК. Моночастицы чередуются с гетероген-
ными (30—200S) РНП-комплексами. Такие структуры обнаружи-
сплайсингу подвергаются
1 Слово сплайсинг (splicing) взято из английской морской терминологии,
где так называют сращивание канатов без узла.
236
ваются при электронной микроскопии в виде отходящих от хрома-
тина фибрилл со множеством повторяющихся РНП-частиц.
Предполагают, что определенные третичная и четвертичная
структуры гяРНК, обусловленные взаимодействием с белками,
способствуют точному протеканию процессинга и сплайсинга. Ус-
тановлено, что процессинг гяРНК протекает в составе РНП-час-
тиц. В цитоплазме мРНП появляются после процессинга гяРНП.
Здесь обнаруживаются свободные мРНП-частицы (цитоплазмати-
ческие информосомы), или мРНП, связанные с полисомами (поли-
сомные информосомы). В них отношение белка и РНК по массе
составляет 3: 1—4: 1. В состав мРНП-частиц входят молекулы
мРНК разных размеров. Связанные с полисомами мРНК активно
транслируются. В полисомных и свободных цитоплазматических
информосомах содержится не более 15—20 различных белков.
В полисомных информосомах обнаруживаются два основных
белка. В свободных информосомах содержится больше белков,
среди них — ингибирующие трансляцию белки. Белки мРНП су-
щественно отличаются от белков гяРНП. Переход из ядра в цито-
плазму сопровождается сменой белкового компонента РНП-час-
тиц. Белки, связывающиеся с информосомами, маскируют мРНК и
обеспечивают ее хранение в цитоплазме в нетранслируемом со-
стоянии. Переход мРНП из информосом в полисомы также должен
сопровождаться изменением в составе белков: отщеплением или
модификацией репрессорных и связыванием активаторных белков
(факторы инициации и др.).
А. С. Спирин (1966) высказал предположение, что информосомы
представляют собой форму хранения мРНК в цитоплазме до вхож-
дения мРНК в полисомы и трансляции. В таком виде, например,
хранится в неактивном состоянии мРНК яйцеклетки до оплодотво-
рения, в семенах до прорастания.
Таким образом, в эукариотических клетках мРНК всегда нахо-
дится в комплексе с белками. РНП-комплекс — это единственная
форма существования мРНК в животной и растительной клетке,
от момента синтеза пре-мРНК в ядре до распада мРНК в ци-
топлазме.
4.8.4. Синтез рибосомных и транспортных РНК. Все рибосомные
и транспортные РНК синтезируются на матрице ДНК. У £. coli
рибосомные РНК образуются в виде большого предшественника
30 S. Он дает начало всем рРНК—16 S,23 S, 5 S. При созревании
рРНК интенсивно метилируются. Транспортные РНК у прокариот
также транскрибируются в виде предшественников, содержащих
одну или более тРНК. Например, гены фага Т4 кодируют предше-
ственник сразу двух тРНК — пролиновой и сериновой. Он «наре-
зается» на мономеры, от которых отщепляются «лишние» участки-
Если у продуктов расщепления отсутствует ЦЦА-последователь-
ность, то она достраивается специальным ферментом.
В эукариотических клетках рРНК кодируются областью хро-
мосомы, которая образует ядрышко — ядрышковый организатор.
Здесь несколько сотен раз повторяется участок, который кодирует
236
28 S, 18 S, 5,8 S рРНК. На транскрибируемой области РНК-поли-
мераза 1 образует крупный предшественник. От него чрезвычайно
быстро удаляется несколько сотен нуклеотидов, находящихся на
5'-конце. Оставшийся предшественник подвергается процессингу.
В клетках млекопитающих обнаружено 8 различных по размеру
пре-рРНК (от 45 S до 12 S), поэтому предполагают, что существуют
по крайней мере три пути процессинга. Места разрывов предшест-
венника (45 S РНК) одинаковы во всех случаях, мест разрывов
всего пять, но порядок расщепления может отличаться. Обычно
45 S расщепляется на две части эндонуклеазой. Затем другие фер-
менты удаляют спейсеры (разделяющие последовательности). Из
одной половины образуется 18 S рРНК, из другой — 28 S и 5,8 S
рРНК, связанные водородными связями.
Синтез 5 S рРНК и тРНК катализирует РНК-полимераза III.
Пре-5 S рРНК содержит небольшое число «лишних» нуклеотидов
на З'-конце молекулы, они удаляются при процессинге. В предшест-
венниках тРНК имеются избыточные последовательности, которые
могут быть расположены как на обоих концах молекулы, так и
внутри ее. При процессинге пре-тРНК эти избыточные последова-
тельности отщепляются, идет модификация оснований, «вырезает-
ся» (если существует) вставочная последовательность, происходит
сплайсинг. К З'-концу пре-тРНК присоединяется последователь-
ность ЦЦА. Все эти процессы осуществляются в ядре.
4.9. Генетическая инженерия
Давней мечтой генетиков и биохимиков было получение живых
организмов с заранее известными наследственными свойствами, с
определенным обменом веществ. Эту задачу ставит перед собой
новое направление в науке — генетическая инженерия. Ее основная
цель — получение рекомбинантных молекул ДНК in vitro, их раз-
множение и введение в организм с целью получения новых наслед-
ственных свойств. В основе генетической инженерии лежит универ-
сальность свойств генетического материала, что позволяет созда-
вать рекомбинантные молекулы ДНК из молекул ДНК разных
организмов, например из клеток бактерий и клеток эукариот, и
вводить такие рекомбинантные молекулы в живые клетки. Пока
генетическая инженерия делает первые шаги, тем не менее успехи
ее поразительны. Она открывает путь для создания в короткие
сроки высоко продуктивных промышленных штаммов бактерий,
повышения урожайности растений и лечения генетических заболе-
ваний человека. На ее основе разработан ряд проектов, имеющих
практическое значение, например включение в клетки сельскохо-
зяйственных растений генов, ответственных за фиксацию атмо-
сферного азота. В этом направлении достигнуты определенные ус-
пехи: гены азотфиксирующего оперона бактерий Klebsiella перене-
сены в клетки Е. coli. Другой проект — введение нормальных генов
в клетки людей, страдающих наследственными заболевани-
ями.
237
В настоящее время методы генетической инженерии успешно
применяют для создания бактериальных штаммов — продуцентов
биологически активных соединений, в том числе гормонов (инсу-
лина, соматостатина), противовирусного препарата интерферона.
С развитием генетической инженерии стало возможным изучение
особенностей структуры и функции генетического материала эука-
риот.
Для проведения работ по генетической инженерии требуется
прежде всего получение определенных фрагментов ДНК, т. е. генов.
С этой целью используют ряд методов. Первые гены были синте-
зированы химическим путем. В 1969 г. группа X. Кораны синтези-
ровала ген аланиновой тРНК дрожжей, в котором была к тому
времени полностью расшифрована последовательность из 77 нук-
леотидов. Химическим путем синтезировали мелкие фрагменты
ДНК (от 4 до 13 пар нуклеотидов), а затем соединяли их в нуж-
ном порядке с помощью лигазы. Полученный ген не имел регуля-
торных участков и был функционально неактивным.
В 1976 г. в той же лаборатории был синтезирован отрезок ДНК
кишечной палочки, кодирующий тирозиновую супрессорную тРНК.
Ген тРНК состоит из 126 пар нуклеотидов, к нему примыкает на
одном конце промоторный участок из 52 пар нуклеотидов, а на
другом—терминаторный участок из 21 пары нуклеотидов, к кон-
цам отрезка были присоединены тетрануклеотиды ААТТ и ТТАА.
Синтетический ген оказался полностью активным. После введения
такого гена в мутантный штамм бактериофага Т4, у которого этот
ген отсутствовал, бактериофаг хорошо размножался в клетках
Е. coli, т. е. становился полноценным.
Группа Г. Бойера синтезировала химическим путем ген гормо-
на соматостатина. Синтез проводили, учитывая последовательность
аминокислот в полипептиде. Соответствующие аминокислотам три-
плеты синтезировали и соединяли химическим путем. Полученную
двухспиральную ДНК — ген вводили в геном Е, coli рядом с геном
р-галактозидазы. В результате бактерия стала вырабатывать бе-
лок, в котором одна часть была 3-галактозидазой, другая — сомато-
статином. Эти блестящие результаты показали возможность созда-
ния химическим путем генов, не отличимых от природных.
Позднее для синтеза генов стали применять менее трудоемкий
и более быстрый метод — синтез при помощи обратной транскрип-
тазы. Изучение этого фермента показало, что матрицей для обра-
зования ДНК может служить любая РНК, даже синтетический по-
лирибонуклеотид. Это открыло путь для синтеза разнообразных
генов по матричным РНК. Работу начинают с очистки мРНК оп-
ределенного гена. На мРНК обратная транскриптаза синтезирует
ДНК-копию (кДНК).
Этим способом в лабораториях разных стран, в том числе и
СССР, синтезированы гены, кодирующие глобины человека, кро-
лика, мыши, белок хрусталика быка, гены вируса осповакцины, не-
которых бактериофагов. Однако следует учитывать, что при ис-
пользовании мРНК в качестве матрицы для синтеза ДНК получа-
238
ется не сам ген, а только его структурная информационная часть,
в то же время регуляторные участки, необходимые для работы мно-
гих генов, отсутствуют. К тому же гены эукариот устроены сложно,
иногда состоят из ряда отдельных участков, расположенных в раз-
ных местах генома. Это обусловливает ограниченность использова-
ния указанного метода. Поэтому широко используют выделение
природных генов из генома. С этой целью ДНК расщепляют, инте-
ресующий фрагмент ДНК включают в состав вектора, с помощью
которого нужный фрагмент ДНК может быть размножен во мно-
гих экземплярах и введен в клетки-реципиенты.
Вектор — это молекула ДНК, способная переносить в клетку
чужеродную ДНК любого происхождения и обеспечивать там ее
умножение. Широко применяются векторы, способные к автоном-
ной репликации. Ими служат умеренные бактериофаги или чаще
всего плазмиды. Такие векторы позволяют получать многочислен-
ные копии чужеродного гена. Их используют с целью клонирова-
ния, т. е. получения гомогенной популяции молекул ДНК. Гомо-
генность обусловлена тем, что все молекулы являются прямыми
потомками единственной молекулы ДНК.
Включение чужеродного фрагмента ДНК в плазмиду проводят
in vitro. Сначала оба объекта переводят в линейную форму. ДНК
высшего организма фрагментируют чаще всего с помощью фермен-
тов — рестриктаз. Некоторые рестриктазы образуют фрагменты
ДНК с «липкими» концами. Комплементарность оснований в «лип-
ких» концах позволяет соединять друг с другом любые фрагменты
ДНК, полученные при помощи одной рестриктазы. Это дает воз-
можность включить фрагмент ДНК в вектор. Если фрагмент ДНК
имеет «тупые» концы, то с помощью фермента полинуклеотидтранс-
феразы к ним можно пристроить последовательности адениловых
и тимидиловых нуклеотидов. Длина этих «липких» поли (А) и по-
ли (Т) равна 50—100 нуклеотидов, что достаточно для образования
гибридных структур двумя разными ДНК.
Вектор «вскрывают» обычно той же рестриктазой, с помощью
которой получали фрагмент ДНК. Специально подбирают условия
для того, чтобы «вскрыть» вектор только в одном определенном
месте. Объединение фрагмента ДНК и вектора производят обычно
по «липким» концам, фосфодиэфирную связь между соседними ну-
клеотидами замыкают при помощи ДНК-лигазы.
Иногда проводят объединение ДНК по «тупым» концам с по-
мощью специального фермента. В ряде случаев с целью соедине-
ния молекул ДНК применяют так называемые линкеры и адапте-
ры— короткие фрагменты ДНК, с одной стороны имеющие конец,
полученный при помощи одной рестриктазы, а с другой стороны —
другой рестриктазы. Это позволяет соединять фрагменты ДНК; так
получается рекомбинантная молекула ДНК. Она содержит полный
набор плазмидных генов, необходимых для автономной реплика-
ции, и чужеродную ДНК.
В зависимости от задач и целей экспериментов в генетической
инженерии используют разные плазмиды, но в большинстве случа*
239
ев их конструируют in vitro из фрагментов плазмид различного
происхождения. Были отобраны такие плазмиды, которые рас-
щепляются определенной рестриктазой только в одном участке и
быстро размножаются, давая 1000—3000 копий на клетку. В ре-
Рис. 4.22. Схема опыта по генетической инженерии (по
С. Г. Инге-Вечтомову, 1983):
1 — плазмида, обработанная рестриктазой, 2 — фрагменты ДНК,
обработанные той же рестриктазой, 3 — химерная плазмида, 4 —
трансформированная бактерия, 5 — трансформированные дочерние
клетки
зультате клонирования с помощью этих плазмид получаются специ-
фические фрагменты ДНК высокой чистоты и в больших (милли-
граммовых) количествах (рис. 4.22). Полученную рекомбинант-
ную молекулу ДНК вводят в специально обработанные бактерии.
Чтобы отобрать бактерии, получившие вектор, последний метят,
вводя в него ген антибиотикорезистентности.
Поскольку выделение и очистка отдельных генов — очень слож-
ная и трудоемкая работа, широкое распространение получил метод
240
«дробового ружья», в котором этот начальный трудоемкий этап
отсутствует. Работа начинается с того, что ДНК, содержащую ген,
нужный для введения в вектор, механически или рестриктазами
дробят на многочисленные фрагменты, их соединяют с молекулами
ДНК вектора (например, плазмидами), обработанными рестрикта-
зой для превращения в линейные и для придания им «липких»
концов. Образовавшиеся гибридные молекулы вводят в кишечную
палочку, и затем отыскивают те бактерии, в которые попал нужный
ген. При использовании огромного числа бактериальных клонов,
несущих случайные фрагменты ДНК, искомый ген обязательно на-
ходится в каком-то клоне. Сначала отбирают те клоны бактерий, в
которые попали плазмиды. Если плазмида несет ген устойчивости
к какому-либо антибиотику, то бактерии высевают на среду с анти-
биотиком, и выживают только те, которые получили плазмиду. За-
тем необходимо идентифицировать интересующий ген.
Легко обнаруживаются гены, кодирующие ферменты, которые
участвуют в метаболизме низкомолекулярных веществ. Если ген,
введенный в плазмиду, будет работать в клетке хозяина, то на се-
лективной среде выделяются клоны бактерий, получившие плаз-
миду с данным геном. Однако природные гены высших и низших
эукариот очень редко проявляются в Е. coli. Чтобы их обнаружить,
нередко используют векторы, устойчивые к двум антибиотикам,
например к стрептомицину и ампициллину, и встраивают клони-
руемый ген в один из генов устойчивости. По потере устойчивости
отыскивают клон бактерий, содержащий рекомбинантную плазмиду.
Можно отыскать клон, несущий ДНК изучаемого гена, по спо-
собности нуклеиновых кислот к гибридизации. С этой целью неред-
ко используют мРНК, синтезируемую на данном гене. Другой
путь — проведение гибридизации с ДНК-пробой, т- е. одноцепочеч-
ным фрагментом ДНК, последовательность нуклеотидов в котором
мало отличается от последовательности в одной из нитей ДНК кло-
нируемого гена. Поскольку ДНК-проба комплементарна второй це-
пи, она специфически гибридизируется с искомой ДНК. Если
ДНК-пробу пометить радиоактивным изотопом, то клон бактерий,
содержащий нужный фрагмент ДНК, можно обнаружить с по-
мощью метода радиоавтографии.
Последний этап в работах по генетической инженерии — адап-
тация введенного гена в новом для него генетическом и физиологи-
ческом окружении и его экспрессия, т. е. синтез специфического
белка. При введении ДНК^эукариот в геном бактериальной клетки
возникает ряд затруднений. Чтобы обеспечить функционирование
встроенного гена, в плазмиду включают впереди него «сильный»,
высокоэффективный промотор. Другой метод, использованный еще
X. Кораной, — слияние генов. На границах между генами «выреза-
ют» знаки начала и конца генов. При этом сливаются любые гены,
объединяются их продукты. Образованные полипептиды укладыва-
ются в третичную структуру, ^как правило, самостоятельно, и пеп-
тидный мостик, объединяющий продукты разных генов, можно рас-
щепить каким-либо способом.
241
Например, ген, кодирующий гормон пептидной природы — со-
матостатин, был синтезирован искусственным путем и не содержал
регуляторных участков. Чтобы обеспечить его работу в кишечной
палочке, его встроили в вектор вместе с хорошо изученным геном
Е. coli, кодирующим р-галактозидазу. Последовательность нуклео-
тидов синтетического гена транскрибировалась, а затем трансли-
ровалась как С-концевой фрагмент р-галактозидазы. Синтезирован-
ный активный соматостатин отделяли от р-галактозидазы путем
расщепления полипептидной цепи специфическим реагентом. Таким
образом, регуляторные сигналы гена р-галактозидазы использо-
вались для работы синтетического гена.
В последние годы предпринимаются попытки использования в
генетической инженерии новых векторов. Так, нашли применение
рекомбинантные векторы, обеспечивающие интеграцию чужерод-
ного фрагмента ДНК непосредственно в хромосому хозяина. К ним
относятся некоторые фрагменты хромосомной ДНК Вас, subtilis, а
также фрагмент умеренного фага X, кодирующий синтез интегра-
ционного фермента. При использовании этих векторов сразу появ-
ляются трансформированные клетки, что чрезвычайно важно; од-
нако количество этих клеток невелико.
Предпринимают попытки использования эукариотических век-
торов, построенных на основе онкогенных вирусов. В клетках
низших эукариот — дрожжей — обнаружены плазмиды, которые
можно использовать как векторы. Использование новых векторов
открывает перспективы работы с эукариотическими клетками.
Интересные и большие работы по генетической инженерии
проводятся в Советском Союзе под руководством академиков
А. А. Баева и Ю. А. Овчинникова. В Институте биоорганической
химии АН СССР созданы разновидности бактерий, вырабатываю-
щих ряд гормональных препаратов, завершаются работы по полу-
чению высокопродуктивных бактерий, синтезирующих такие важ-
ные для медицины вещества, как инсулин и интерферон человека.
Синтез интерферона человека типа a-F штаммами Е. coli, по-
лученными генно-инженерным путем, явился результатом огромной
работы, проведенной Ю. А. Овчинниковым и его сотрудниками.
Суммарная мРНК интерферона была выделена из лейкоцитов че-
ловеческой крови (из 10й клеток лейкоцитов получали 400 мкг
мРНК). Эту мРНК использовали в качестве матрицы для обратной
транскрипции, возникала однонитевая ДНК длиной 650—900 нук-
леотидов.
Вторую цепь ДНК синтезировали с помощью ДНК-полимеразы
1, получали двухцепочечную ДНК — ген человеческого лейкоцитар-
ного интерферона. К нему химическим путем присоединяли лин-
керы, которые позволили встроить его в плазмиду, расщепленную
рестриктазой. Плазмиды вводили в клетки Е, coli. Колонии, содер-
жащие плазмиды со встроенной ДНК, были отобраны путем гибри-
дизации с синтетическим олигонуклеотидом, меченным 32Р.
Из 30 000 колоний было отобрано 40. Их подвергали дальней-
шему анализу, так как необходимо было выбрать те клоны, в ко-
,242
торых находился полный ген. Затем, используя еще ряд методов
молекулярной биологии и генетической инженерии, выбрали один
клон бактерий, из него выделили рекомбинантную плазмиду, а из
нее получили фрагмент ДНК размером 575 нуклеотидов. Секвени-
рование показало, что структура фрагмента почти полностью сов-
падала со структурой гена человеческого лейкоцитарного интерфе-
рона F.
Чтобы обеспечить экспрессию гена интерферона в клетках
Е. coli, его необходимо было снабдить регуляторными элементами
транскрипции и трансляции. Регуляторные участки были получе-
ны также благодаря использованию ряда методов генетической
инженерии (расщепление рестриктазами, клонирование и др.), а
затем присоединены к гену интерферона. В результате этой рабо-
ты был получен ряд рекомбинантных клонов Е. coli, содержащих
ген IFN—F под контролем различных промоторов. Наиболее эф-
фективным оказался триптофановый промотор. Экстракты из бак-
терий обладали высокой противовирусной активностью.
Под руководством В. Г. Дебабова впервые в мире создан штамм
микроба, синтезирующий в больших количествах незаменимую ами-
нокислоту треонин. Методы генетической инженерии позволили
сделать это за три года, тогда как обычными методами новые штам-
мы получают за несколько десятилетий. Полученный штамм выра-
батывает 30 г/л треонина за 1 сутки.
У клубеньковых бактерий способность к азотфиксации опреде-
ляет геном плазмид (й только частичный контроль—хромосо-
мой), специфичность родства к растению-хозяину — тоже плазми-
дой. Методами генетической инженерии, для которой плазмиды яв-
ляются удобным объектом, в последние годы удалось существенно
увеличить способность к азотфиксации Rhizobium, вызывать обра-
зование клубеньков у сельскохозяйственных растений, которым
раньше это не было свойственно.
В 1972 г. ген азотфиксации удалось ввести в Е. coli, а в послед-
ние годы начаты работы по генетической инженерии сельскохозяй-
ственных растений с целью ввести им ген азотфиксации. У агро-
бактерий есть онкогенные Ti-плазмиды (Т-ДНК). Они встраивают-
ся в геном хозяина, вызывая раковую опухоль. Из таких опухолей
можно регенерировать методом культуры тканей полноценные
растения, в геноме которых есть Т-ДНК. Удалось встраивать в Т-
ДНК разные специфичные гены, и тогда они обнаруживаются у ре-
генерированных растений. Таким путем сейчас пытаются встроить
ген азотфиксации зерновым злакам.
Достигнутые в генетической инженерии успехи дают возмож-
ность ученым манипулировать геномами и преодолевать межвидо-
вые барьеры. Это открывает возможность для перемещения генов
между организмами, которые до этого практически никогда не
вступали в генетический контакт. Однако следует иметь в виду, что
манипулирование с некоторыми генами может привести к возник-
новению опасных организмов с непредсказуемой инфекционностью
и экологическими свойствами. Например, можно представить, что
243
штамм Е, coli, несущий плазмиду, в которую вставлен геном пато-
генного для человека вируса, заселит кишечник человека, что мо-
жет привести к распространению этого заболевания. В связи с этим
в 1975 г. была проведена Международная конференция с целью
обсуждения и предотвращения возможных вредных последствий
бесконтрольного использования генетической инженерии. Участ-
ники конференции пришли к соглашению о том, что опыты по соз-
данию рекомбинантных молекул ДНК должны продолжаться, но
необходимо обеспечить биологические и физические барьеры, пре-
пятствующие распространению вновь созданных организмов. В ча-
стности, в экспериментах определенной категории разрешается ис-
пользовать и создавать только такие бактерии и плазмиды, которые
не способны выживать за пределами лаборатории (погибают при
температуре выше + 35°С, т. е. в организме человека, и т. п.).
ГЛАВА 5
ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ
5.1. Фиксация молекулярного азота воздуха
Подсчитано, что на Земле содержится около 3,8X1O1S т азота
(в расчете на элементарный). Основную часть его составляет мо-
лекулярный азот атмосферы — N2. Однако человек, животные и
высшие растения не способны самостоятельно усваивать такой
азот. Тем не менее все живые организмы для нормального функ-
ционирования должны потреблять азот в большом количестве;
азотсодержащие соединения — белки и аминокислоты — являются
важнейшими компонентами пищевого рациона человека и живот-
ных, столь же важны и необходимы минеральные соли азота для
питания высших растений.
Обеспечение населения пищевым белком — одна из наиболее
острых проблем, стоящих в настоящее время перед человечеством,
особенно в развивающихся, бывших колониальных странах. Этой
проблеме в наши дни уделяется столь большое внимание, что при
Организации Объединенных Наций создан специальный комитет
по всестороннему изучению проблемы белковых ресурсов и разра-
ботке практических рекомендаций по предотвращению белкового
голода. Д. И. Менделеев, оценивая эту проблему, писал, что во-
прос о способах превращения азота воздуха в почвенные азотистые
соединения или в ассимилируемый азот, способный поглощаться
растениями и давать в них сложные (белковые) вещества, состав-
ляет один из таких вопросов, которые представляют великий теоре-
тический и практический интерес. По мнению акад. С. П. Косты-
чева, азотное голодание является тем фактором, который преиму-
щественно перед всеми остальными ограничивает развитие жизни
на Земле и задерживает размножение организмов.
При производстве азотных минеральных удобрений азот возду-
ха превращают промышленным путем в аммиак или азЪтную кис-
лоту. Однако этот азот составляет только 2—3% от азота, содер-
жащегося в урожае сельскохозяйственных растений всей Земли.
Практически почти весь азот, находящийся в живых организмах
нашей планеты, имеет своим источником азот атмосферы, фиксиро-
ванный микроорганизмами, ибо только они способны к самостоя-
тельному усвоению молекулярного азота.
Некоторые высшие растения фиксируют атмосферный азот,
вступая в симбиотические отношения с бактериями своих корневых
клубеньков, и таким путем вносят значительный вклад в общее
245
усвоение молекулярного азота. Считают, что из известных 13 000
видов бобовых растений большинство способны симбиотически
фиксировать азот, причем в значительных количествах, особенно
это относится к культурным бобовым растениям (горох, соя и др.).
Примерно 250 видов других семейств, небобовых, тоже способны к
симбиотической фиксации азота (например, ольха, лисохвост,
облепиха).
Бактерии клубеньковых бобовых растений принадлежат в ос-
новном к роду Rhizobium. Из свободноживущих бактерий фикси-
руют молекулярный азот почвенные бактерии рода Azotobacter
(аэроб), Clostridium (анаэроб) и некоторые факультативные ана-
эробы, а также все фотосинтезирующие бактерии. На долю сине-
зеленых водорослей приходится 10—15% всего количества фикси-
руемого N2 атмосферы.
При промышленном получении аммиака из N2 затрачивается
большое количество энергии, даже в присутствии катализаторов
требуется повышение температуры до +500°С и давления до 300—
350 атм. Поэтому не может не восхищать способность микроорга-
низмов осуществлять практически тот же процесс при обычном ат-
мосферном давлении и невысоких температурах. Основной «секрет»
этой способности — наличие у микроорганизмов особой фермента-
тивной системы фиксации азота. Поэтому не удивительно, что во
многих лабораториях мира в настоящее время очень активно ис-
следуют фиксацию N2, и крайне заманчивой, интересной и важной
является попытка решить вопрос об имитации в промышленных
условиях ферментативных процессов, протекающих у азотфиксиру-
ющих микроорганизмов. Большие и интересные работы по биохи-
мии усвоения молекулярного азота воздуха проведены в Советском
Союзе под руководством В. Л. Кретовича в Институте биохимии
АН СССР-
Все самые разнообразные азотфиксирующие микроорганизмы
содержат одинаковую ферментативную систему, катализирующую
превращение молекулярного азота в аммиак. Эта система получила
название нитрогеназы. Кроме того, для фиксации N2 необходимы
сильные восстановители (поток электронов), АТФ и Mg2+. Природа
доноров электронов различна у разных микроорганизмов. У аэроб-
ных бактерий (Azotobacter, Rhizobium) необходимые для фиксации
N2 восстановители и АТФ образуются в ходе углеводного обмена, в
реакциях с участием НАДФ. Фотосинтетические бактерии и сине-
зеленые водоросли способны к фотохимическому образованию силь-
ных восстановителей.
Нитрогеназа (КФ 1.18.2.1) состоит из двух белков—Mo-Fe-бел-
ка (молибдоферредоксин) и Fe-белка (азоферредоксин). Молеку-
лярная масса первого (в зависимости от вида микроорганизмов) со-
ставляет от 200 000 до 250 000; это тетрамер, содержащий два ато-
ма молибдена, негемовое железо и лабильный сульфид. Молекуляр-
ная масса Fe-белка составляет от 50 000 до 70 000; он является ди-
мером, тоже содержит негемовое железо и лабильный сульфид
(рис. 5.1).
246
В процессе фиксации АТФ взаимодействует с азоферредоксцном.
При этом выделяется АДФ, а азоферредоксин претерпевает конфор-
мационную перестройку, вследствие чего его окислительно-восста-
новительный потенциал понижается с —280 до —400 мВ. Азофер-
редоксин становится сильным восстановителем, передает электроны
Рис. 5.1. Схема биологической фиксации азота
на молибдоферредоксин, где и осуществляется восстановление Na
до NH3- Суммарно процесс фиксации азота можно выразить реак-
цией
N2 + 6е“ + 12АТФ + 12Н2О -> 2NH* + 12АДФ + 12Н3РО4 + 4Н+
Нитрогеназа обладает широкой субстратной специфичностью,
кроме N2 она может восстанавливать цианиды, закись азота, аце-
тилен и др. Нитрогеназа при участии АТФ катализирует также вос-
становление ионов водорода с образованием молекулярного водо-
рода. У некоторых азотфиксаторов этот процесс протекает одно-
временно с азотфиксацией. Предполагают, что данное свойство
азотфиксирующих микроорганизмов в будущем можно будет ис-
пользовать для получения дешевого топлива в виде молекулярного
водорода.
Для азотфиксации очень важен молибден, функции его в этом
процессе разнообразны. Он поддерживает определенную конфор-
мацию молекулы нитрогеназы, участвует в связывании азота и пе-
реносе электронов, индуцирует синтез нитрогеназы. Молекула газо-
образного азота очень прочна, для разрыва трех связей, соединяю-
щих ее атомы, требуется около 940 кДж/моль.
Существенным вопросом в процессе азотфиксации является по-
требление достаточно большого количества энергии, необходимой
для разрыва прочных внутримолекулярных связей N2 при его вос-
становлении до аммиака. Awtobacter, например, для связывания
247
15 мг азота расходует на дыхание 1 г сахара, a Clostridium pasteu-
rianum еще больше (5—6 г сахара). У клубеньковых бактерий
энергетическим материалом являются продукты фотосинтеза, по-
ступающие в корневую систему из листьев. Часть этих ассимилятов
может перерабатываться и откладываться в запас в бактероидах
в форме поли-р-гидроксимасляной кислоты (ПОМ).
Способность бактероидов к азотфиксации связана и с особен-
ностями их окислительно-восстановительных систем, в частности с
присутствием особого гемопротеина —легоглобина. Предполагают,
что он, подобно гемоглобину животных, выполняет роль перенос-
чика кислорода к бактероидам, находящимся в клубеньке в усло-
виях затрудненного доступа кислорода. Образовавшийся в резуль-
тате азотфиксации аммиак в дальнейшем ассимилируется в основ-
ном в растительной ткани клубенька. Первый этап этой ассимиля-
ции заключается в связывании аммиака кетокислотами с образова-
нием аминокислот-
5.2. Биосинтез аминокислот
5.2.1. Источники азота и углерода для биосинтеза аминокислот.
Биосинтез аминокислот из простых предшественников представля-
ет собой не менее важный процесс в биосфере, чем образование уг-
леводов при фотосинтезе, хотя и уступает последнему в количест-
венном отношении. Этот процесс абсолютно необходим для всех
форм жизни, поскольку аминокислоты служат строительными бло-
ками белков и предшественниками многих биомолекул, выполняю-
щих различные специализированные функции. Однако организмы
из разных систематических групп значительно различаются как по
способности синтезировать те или иные аминокислоты, так и по по-
требностям в определенных формах азота для этой цели.
Человек и животные способны синтезировать только 10 из 20
аминокислот, необходимых им для синтеза белка. Остальные, так
называемые незаменимые или обязательные аминокислоты они
должны получать с пищей (см. разд. 5.6.1). Для синтеза замени-
мых аминокислот человеку и животным необходимы только аммо-
нийные соединения азота, а не нитриты, нитраты или N2. Жвачные
животные могут использовать для этой цели нитриты и нитраты,
которые должны быть сначала восстановлены до аммиака бактерия-
ми, живущими у жвачных животных в рубце — одном из отделов
желудка.
Характерной особенностью высших растений, отличающей их
от животных, является способность синтезировать все аминокисло-
ты, используя в качестве источника азота аммиак, нитраты и нит-
риты. При этом источником углерода у зеленых растений служит
СО2. Таким образом, они синтезируют аминокислоты, а из них и
белки целиком из неорганических соединений. Этой же способно-
стью обладают бактерии — фотосинтетики и хемосинтетики. Все
другие лишенные хлорофилла микроорганизмы и гетеротрофные
ткани высших растений требуют для синтеза аминокислот кроме
248
источника азота готовые углеродсодержащие органические веще-
ства (углеводы, органические кислоты)- Высшие растения, способ-
ные к симбиозу с клубеньковыми бактериями, фиксируют также мо-
лекулярный азот атмосферы, превращая его в NH3 и затем исполь-
зуя на синтез аминокислот.
Среди бактерий одни могут синтезировать все необходимые им
аминокислоты (Е. coli), другие не растут, если в среде отсутству-
ют требующиеся для роста аминокислоты. Например, для золотис-
того стафилококка (вызывает образование гнойных ран) обяза-
тельно наличие в питательной среде двух аминокислот — три и цис;
для молочнокислой бактерии Lactobacillus casei необходимы 16
аминокислот, а для гемолитического стрептококка— 17.
Бактерии и грибы при питании органическими азотистыми со-
единениями, как правило, расщепляют их, превращая содержащий-
ся в них азот в аммиак и используя его затем для биосинтеза амино-
кислот. Большинство микроорганизмов используют азот в восста-
новленной, т. е. аммиачной форме, но есть бактерии и грибы, спо-
собные утилизировать нитриты и нитраты.
Свободный NH3 ядовит для живых организмов, поэтому при пи-
тании аммонийными солями растения и микроорганизмы не накап-
ливают его, а сразу используют для синтеза аминокислот и других
азотсодержащих органических веществ. Нитраты же могут накап-
ливаться в растительных тканях, иногда в достаточно больших ко-
личествах (гречиха, табак). При использовании нитратов в каче-
стве источника N для синтеза аминокислот у растений и микроорга-
низмов происходит их восстановление до NH3. Этот процесс двух-
стадийный: NO]—>NO] —^...—>NH].
Первая стадия катализируется нитратредуктазой, происходит
двухэлектронное восстановление нитратов до нитритов. У растений
и бактерий донором электронов при этом служит НАДН, а у гри-
бов НАДФН: НО3'+НАДН + Н+—>НАД+ + ЫО;4-Н2О. Нитратре-
дуктазы являются металлофлавопротеинами, содержащими Мо.
Синтез нитратредуктазы индуцируется нитратами и подавляется
NH+
4
На второй стадии с участием нитритредуктазы, происходит шес-
тиэлектронное восстановление нитритов до аммиака:ЫО] 4-8Н++
4-6е~—^NH4+ + 2H2O. Простетическими группами нитритредуктазы
являются ФМН, ФАД, Fe2S2 и сирогем (железотетрагидропорфи-
рин). Последний функционирует как непосредственный восстанови-
тель нитритов. У высших растений и водорослей восстановителем
при действии нитритредуктазы служит ферредоксин.
Помимо первичного синтеза аминокислот de novo растения мо-
гут усваивать и готовые аминокислоты. Особенно типично это для
насекомоядных растений и растений-паразитов. При выращивании
растений в условиях стерильных культур, когда исключена возмож-
ность развития микроорганизмов, установлено, что, в принципе, все
высшие растения через корневую систему могут усваивать амино-
кислоты и некоторые другие органические азотистые соединения.
249
Техника стерильных культур была в совершенстве разработана
Д. Н. Прянишниковым и его сотрудником Г. Г. Петровым. Несмотря
на эту способность усвоения органического азота высшие зеленые
растения нормально развиваются, только находясь на свету и обра-
зуя органическое вещество в процессе фотосинтеза.
5.2.2. Первичная ассимиляция аммиака. Первичное усвоение
NH3 у всех живых организмов происходит в результате трех глав-
ных реакций, приводящих к образованию: 1) глутаминовой кисло-
ты, 2) глутамина и 3) карбамоилфосфата. Однако если азот кар-
бамоилфосфата используется только для синтеза пиримидинов и
аргинина, то аминогруппа глутамата или амидная группа глута-
мина прямо или косвенно являются источником практически всех
атомов азота, входящих в состав аминокислот и других азотсодер-
жащих соединений (только в редких случаях вместо глутамина
используется аммиак)-
Включение NH3 в глутамат происходит в результате восстано-
вительного аминирования.
а-Кетоглутарат + ЫН^ + [НАДН или НАДФН] Глутамат+
+ [НАД+ или НАДФ+]ч-Н2О. Эту реакцию катализируют глутамат-
дегидрогеназы, которые в различных организмах существенно от-
личаются по числу входящих в молекулу фермента субъединиц и
по своей специфичности к НАД+ или НАДФ+. Данная реакция име-
ет огромное значение в биосинтезе всех аминокислот у всех орга-
низмов, так как трансаминирование а-кетокислот с использованием
глутаминовой кислоты в качестве донора аминогруппы является
основным путем введения а-аминогруппы при биосинтезе других
аминокислот.
У некоторых растений, бактерий и дрожжей аналогичным путем
происходит прямое восстановительное аминирование пирувата и
оксалоацетата с образованием соответственно аланина и аспартата.
Образовавшийся глутамат может использоваться для фиксации
второй молекулы NH3 по реакции
Глутамин-
Глутамат + NH3 + АТФ----------> Глутамин + АДФ + Фв
синтетаза
Фермент глутаминсинтетаза, катализирующий эту реакцию, явля-
ется регуляторным, имеющим четвертичную структуру.
В условиях, при которых количество NH3 ограничено, его ус-
воение может происходить при сопряжении предыдущей реакции
со следующей:
Глутамат-
ов - Кетоглутарат + Глутамин + НАДФН + Н+------>
синтаза
-> 2 Глутамат + НАДФ+
Подобная реакция синтеза глутамата имеет место у бактерий, а
также у высших растений.
250
Образование карбамоилфосфата, катализируемое карбамоил-
фосфатсинтазой, является третьим путем усвоения аммиака:
NH3 + СО2 + 2АТФ + Н2О H2N—СО—О—РО3Н2 + 2АДФ + Фв
Карбамоил фосфат
Для образования карбамоилфосфата может использоваться и
глутамин. Это происходит при биосинтезе пиримидинов:
Глутамин + СО2 + 2АТФ -> Глутамат + Карбамоилфосфат +
+ 2АДФ+ФН
Следует, наконец, упомянуть еще об одном пути ассимиляции
NH3: из некоторых бактерий выделен фермент аспартат — амми-
ак-лиаза, катализирующий синтез аспартата путем прямого при-
соединения NH3 к фумаровой кислоте:
НООС—СН—СН—СООН + NH3 НООС—СН2—СН—СООН
Фумарат NHt
Аспартат
5.2.3. Основные пути биосинтеза аминокислот. Как видно из
приведенных в предыдущем разделе реакций, в результате прямо-
го аминирования образуется сравнительно небольшое число ами-
нокислот и соединений, в составе которых фиксируется аммиак.
Все остальные аминокислоты синтезируются в ходе процессов раз-
личной сложности, описываемых как одиночными, так й многоста-
дийными реакциями. В целом можно говорить о трех основных пу-
тях биосинтеза аминокислот: 1) прямого аминирования а-кетокис-
лот или ненасыщенных органических кислот; 2) реакций транс-
аминирования (переаминирование) аминокислот и а-кетокислот;
3) ферментативных взаимопревращений отдельных аминокислот.
Первый путь рассмотрен в предыдущем разделе. Важнейшим
путем биосинтеза заменимых аминокислот являются реакции пе-
реаминирования — переноса аминогрупп (преимущественно глу-
тамата) на другие углеродные цепи, чаще всего соответствующие
кетоаналоги аминокислот. Ферменты, катализирующие этот про-
цесс, называются аминотрансферазами, а полные их наименования
включают названия участвующих в реакции аминокислот:
NH2
। Аспартатамино-
НООС—СН2—СН2—СН—СООН + НООС—СО—СН2—СООН
Глутамат Оксалоацетат трансфераза
Z2 НООС—СНо—СН2—СО—СООН + НООС—СН—СН2—СООН
I
NHa
а - Кетоглутарат Аспартат
Реакции переаминирования, играющие первостепенную роль в
азотном обмене любого живого организма, были открыты в 1937 г.
советскими биохимиками А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман.
251
Установлено, что донорами аминогрупп в реакции переаминирова-
ния могут служить также аспарагин и глутамин. Аминотрансфера-
зы, катализирующие эти реакции, найдены у микроорганизмов,
растений и животных.
Академик А. Е. Браунштейн установил, что путь прямого ами-
нирования кетокислот и переаминирование тесно связаны друг с
другом. Очень часто образование любой аминокислоты начинается
с прямого восстановительного аминирования ct-кетоглутарата, в
результате чего синтезируется глутаминовая кислота, которая,
вступая затем в реакции переаминирования с другими кетокисло-
тами, дает новые аминокислоты.
Дезаминирование аминокислот также часто идет через глута-
миновую кислоту. Сначала любая аминокислота при переаминиро-
вании с а-кетоглутаратом образует глутамат, который передает
аммиак в орнитиновый цикл образования мочевины путем пере-
аминирования с оксалоацетатом или дезаминируется.
Новые аминокислоты могут образовываться путем фермента-
тивных взаимопревращений: аргинин—^орнитин; глутамат—>про-
дин; серин—^глицин; фенилаланин—^тирозин.
В путях биосинтеза незаменимых и заменимых аминокислот
есть определенные отличия: биосинтез незаменимых аминокислот
включает большое число стадий — от 5 до 15, а заменимых —
меньше пяти; первые еще более сложны и в том отношении, что
промежуточные продукты их образования являются предшествен-
никами многих других типов биомолекул.
5.2.4, Биосинтез заменимых аминокислот. Синтез глутаминовой
кислоты — родоначальницы многих других аминокислот — рас-
смотрен в предыдущем разделе. Переаминирование ее с пирува-
том, оксалоацетатом дает аланин и аспартат. У растений и бакте-
рий последние могут синтезироваться также путем восстановитель-
ного аминирования кетокислот.
При последовательном восстановлении фосфорилированного
глутамата, замыкании его в цикл и повторного восстановления об-
разуется пролин. Восстановление глутамата тормозится по типу
обратной связи самим пролином.
Орнитин может легко синтезироваться из аргинина. В свою
очередь, орнитин может превращаться в пролин под действием ор-
нитинциклазы в ходе реакций, включающих в себя окислительное
дезаминирование, циклизацию и восстановление орнитина.
Тирозин образуется из незаменимой аминокислоты фенилала-
нина путем ее гидроксилирования под действием оксигеназы (фе-
нилаланин — 4-гидроксилаза) за счет прямого присоединения кис-
лорода:
он
1| ] *+ НАДФН + Н+ + о/—(I I + НАДФ+ + Н2о
NH2 NH2
СН2—СН—СООН СН2—сн—СООН
252
о=с—н
Эритрозо-4- Фосфоенол- 5-Д егидрохинная
фосфат пируват (ФЕП) кислота
Антраниловая
кислота
Хоризмовая кислота Шикимовая кислота
Префеновая кислота
|-со2
| -I IIАглутамат
Фенилаланин
И ндол-3-гл ицероф осфаз
+Серин
-Глицеральдегид-
3-фосфат
Триптофан
Тирозин
Рис. 5.2. Пути биосинтеза фенилаланина, триптофана и тирозина
Возможен также его синтез из префеновой кислоты (рис. 5.2) .
Цистеин у млекопитающих образуется из метионина (донора
серы) и серина (углеродная цепь и аминогруппа). В результате
ряда реакций происходит замена ОН-группы серина на сульфгид-
рильную группу гомоцистеина, образующегося из метионина. В ре-
акциях принимают участие АТФ и ряд ферментов, два из которых
являются пиридоксальфосфатзависимыми.
253
У микроорганизмов и растений цистеин образуется из серина с
использованием в качестве источника серы H2S.
Серин у животных главным образом синтезируется из проме-
жуточного продукта гликолиза — 3-фосфоглицериновой кислоты
(3-ФГК). У растений серин образуется в процессе фотосинтеза (см.
разд. 6.5.1):
соон соон 1 Переаминирование
НАД+
(2НОН с~ о
НАДН+Н+ с глутаматом
I 1
СН.2ОРО3Н2 СН2ОРО3Н2
3-ФГК СООН 1 3- Фосфопируват -н3Р04 СООН 1
2 CHNH2 CHNH,
СН2ОРО3Н2 1 СН2ОН
3-Фосфосерин Серин
Глицин синтезируется путем удаления p-углерода серина. В ре-
зультате этого процесса образуется не только глицин, но и актив-
ные одноуглеродные соединения (на уровнях окисления СН3ОН,
НСНО или НСООН). В реакции участвует кофермент — тетра-
гидрофолиевая кислота (ТГФК), производное фолиевой кислоты
(см. разд. 10.3), которая осуществляет перенос одноуглеродного
фрагмента, присоединяя его в форме метиленового остатка к N-5
и N-10 путем замещения водорода:
СООН СООН
| + ТГФК |
CHNH2 -------► CH2NH2 + N5, N10 - Метилентетрагидрофолат + H2O
I + 2Н
СН2ОН
Серин Глицин
5.2.5. Биосинтез незаменимых аминокислот. Неспособность жи-
вотных синтезировать некоторые аминокислоты (незаменимые)
объясняется тем, что в их организме не образуются кетокислоты,
аминирование которых приводит к образованию соответствующих
незаменимых аминокислот. Большинство бактерий и высших рас-
тений активно синтезируют эти аминокислоты, пути их биосинтеза
идентичны или близки.
Метионин и треонин синтезируются из аспарагиновой кислоты
с участием АТФ, НАДН+ и ряда ферментов, среди которых есть
пиридоксальфосфатзависимые, а также ферменты, содержащие в
качестве простетической группы восстановленное производное ко-
баламина (витамин Bi2). Метильную группу при биосинтезе ме-
тионина поставляет М5-метилтетрагидрофолат. Первые этапы био-
синтеза этих аминокислот до образования гомосерина протекают
одинаково, затем происходит разветвление путей:
254
COOH
СН2 АТФ АДФ
о
II „ НАДФН
С—ОРО3Н2 [ Hj
НАДФН
( НАДФ
СН2ОН
АТФ АДФ
о
сн2
СН2
сн2
Н—С-----NH2 Аспартил-
I ,иваи hcnh2
СООН
Аспартат
фн
Н—с—NH, Гомосе-
| ~ ринкиназа
СООН
Г омосерин
СООН
/?-Аспартил-
фосфат
н—с—nh2
сн3
Тетрагид-
рофолат
(сн2)2
nh2
СООН
Метионин .
+NHj
SH
сн2
сн2
Метилтетра-
гидрофолат
Метилтрансфераза
н—с—nh2
СООН
Гомоцистеин
СООН
О-Фосфо-
гомосерин
сн3
н—с—он
СООН
Треонин
и
‘3
Лизин у бактерий и высших растений синтезируется в результа-
те конденсации аспартата с пируватом через диаминопимелиновую
кислоту:
СООН
СИз СН2
С^=О I । , [Циклические промежу-1
। ~U HCNH2 [точные продукты J
СООН СООН
Пируват Аспартат
СООН
h2nch
сн2
I
-> сн2
сн2
I
hcnh2
СООН
—со2
Диаминопиме-
линовая кислота
ch2nh2
сн2
сн2
сн2
hcnh2
СООН
L-Лизин
У плесневых грибов лизин образуется из а-кетоглутарата и аце-
тил-КоА через а-аминоадипиновую кислоту.
Валин, лейцин, изолейцин имеют общую черту: разветвленную
алифатическую группировку. Синтез всех трех аминокислот начи-
нается с пирувата, из которого образуется активная ацетальдегид-
ная группа, которая конденсируется со 2-й молекулой а-кетокисло-
ты (пируватом, а-кетоизовалератом или а-кетобутиратом); в ре-
255
зультате длительных превращений образуется а-кетокислота —
аналог данной аминокислоты, на последнем этапе происходит пе-
реаминирование с глутаматом.
Изолейцин, кроме того, легко образуется из треонина.
Аргинин может синтезироваться млекопитающими из орнитина
в цикле образования мочевины (см. разд. 5.6.4), но в очень малых
количествах, так как, во-первых, он быстро гидролизуется фермен-
том аргиназой с образованием мочевины; во-вторых, орнитина со-
держится мало: только в каталитических количествах. У бактерий
и растений гуанидиновая группировка аргинина включает в себя
один атом азота из карбамоилфосфата и два, в конечном счете, от
глутамата (через аспартат и орнитин).
Гистидин образуется сложным путем, включающим девять ре-
акций. Исходными веществами служат АТФ, 5-фосфорибозил-1-пи-
рофосфат и глутамин. В ходе реакций происходит раскрытие пу-
ринового кольца АМФ. Атом азота на заключительном этапе пос-
тупает от глутамина (амидный азот). В последовательности реак-
ций существует несколько точек метаболического контроля. В ча-
стности, первая реакция, катализируемая АТФ: фосфорибозил-
трансферазой, специфически ингибируется гистидином.
Фенилаланин и триптофан являются продуктами превращения
циклических органических кислот. Пути биосинтеза фенилаланина
и триптофана установлены в опытах с мутантами Е. coli, ауксо-
трофными по этим аминокислотам (не способны их синтезировать).
Обнаружено, что шикимовая кислота, которая часто встречается
у растений, поддерживает рост таких мутантов. На основании это-
го сделан вывод, что эта кислота является предшественником фе-
нилаланина и триптофана. В свою очередь, поставщиками углерод-
ных атомов ароматического кольца и боковой цепи шикимата слу-
жат эритрозо-4-фосфат и фосфоенолпируват. Дальнейшее превра-
щение шикимовой кислоты приводит к образованию хоризмовой
кислоты, на стадии которой происходит разветвление путей синте-
за ароматических аминокислот. Образование антранилата ведет к
биосинтезу триптофана, а префенат является предшественником
фенилаланина и тирозина (см. рис. 5.2).
5.2.6. Регуляция биосинтеза аминокислот. Поскольку доступ-
ные для биологических систем формы азота довольно скудны в не-
живой природе, большинство живых организмов стремится к эко-
номному использованию восстановленных форм азота для нужд
метаболизма. Биосинтез аминокислот постоянно регулируется по
принципу обратной связи (ретроингибирование) благодаря функ-
ционированию регуляторных ферментов. При этом синтезируемая
аминокислота действует как ингибитор на одну из первых реакций
в длинной цепи процесса биосинтеза данной аминокислоты. Регу-
лируется и синтез ферментов, катализирующих образование ами-
нокислот, путем репрессии и дерепрессии соответствующих цист-
ронов ДНК (см. разд. 5.4).
Первый механизм обеспечивает «тонкую регулировку», так как
способен быстро изменить скорость биосинтеза любой аминокис-
256
лоты в зависимости от ее стационарной концентрации в данный
момент. Второй, регуляторный механизм имеет характер «грубой
регулировки» и используется в тех случаях, когда клетка обильно
снабжается аминокислотами из экзогенных источников. Обе эти
формы регуляции — выражение характерной экономичности син-
теза и использования аминокислот в биологических системах. Ни
одна из аминокислот не образуется в норме в избыточном количе-
стве. В процессе эволюции сформировался совершенный механизм,
благодаря которому в клетке находится сбалансированное количе-
ство каждой из двадцати аминокислот.
5^3. Синтез белка
5.3.1. Стадии синтеза белка. Биосинтез белка осуществляется
в два этапа. 1. Транскрипция — образование матричной РНК на
ДНК (см. разд. 4.8.1). 2. Трансляция — биосинтез белка на рибо-
сомах с участием тРНК и мРНК. . . ..
[Трансляция — это перевод информации, заложенной в последо-
вательности нуклеотидов мРНК, в последовательность аминокис-
лотных остатков полипептидных цепей. В ходе трансляции синте-
зируются все белки клетки. Сначала происходит активирование
аминокислот и присоединение их к соответствующим тРНК. За-
тем протекает сборка полипептидной цепи на рибосомах, что иног-
да называют собственно трансляцией.^При этом триплеты мРНК
определяют чередование аминокислотных остатков. Как и другие
матричные процессы, трансляция протекает в три этапа: инициа-
ция, элонгация, терминация.
Система для синтеза белка, т. е. полипептидной цепи с опреде-
ленной первичной структурой, включает в себя около 200 типов
макромолекул. Среди них около 100 молекул участвуют в активи-
ровании аминокислот и их переносе на рибосомы, более 60 входят
в состав рибосом, около 10 принимают участие в процессах, проис-
ходящих на рибосоме. Ниже приведены стадии синтеза полипеп-
тидной цепи и требующиеся для них компоненты.
Стадия Необходимые компоненты
Активирование аминокис- Аминокислоты
лот Транспортные РНК
Аминоацил-тРНК — синтетазы
АТФ, Mg2+
Инициация синтеза поли- У прокариот
пептидной цепи Инициирующий кодон АУГ или (редко) ГУГ
Формилметионил-тРНК
МРНК, ГТФ, Mg2+
Рибосомные 30S- и 508-субчастицы
Факторы инициации (/F-l, /F-2, /F-3)
У эукариот
Инициирующий кодон АУГ
Метионил-тРНК
мРНК, ГТФ, Mga+
9—937 257
Элонгация
Терминация
Рибосомные 40S- и 60S-cy6 частицы
Факторы инициации (e/F-2, e/F-3, e/F-5)
Различные аминоацил-тРНК
ГТФ, Mg2+
Факторы элонгации
У прокариот EF-T, EF - G
У эукариот EF - 1, EF - 2
Терминирующий кодон в мРНК (один из трипле-
тов УАА, УАГ, УГА)
Факторы терминации
У прокариот RF • 1, RF - 2, RF - 3 у эукари-
от eRF
Различают цитоплазматические, митохондриальные и пластид-
ные белоксинтезирующие системы. Все они имеют сходную струк-
турно-биохимическую организацию, хотя и содержат большое чис-
ло модификаций.
5.3.2. Активирование аминокислот. На этой стадии происходит
активирование аминокислот за счет энергии АТФ, «узнавание» (ре-
когниция) тРНК своих аминокислот с помощью специальных фер-
ментов, акцептирование этих аминокислот. Реакции протекают в
растворимой части цитоплазмы. Аминокислоты активируются осо-
быми ферментами — аминоацил-тРНК — синтетазами (иногда их
называют сокращенно АРСазами) и присоединяются к определен-
ным тРНК.
Каждый из этих ферментов обладает двойной специфичностью:
к определенной аминокислоте и к соответствующей ей тРНК. Ре-
акция активирования протекает в каталитическом центре фермен-
та в два этапа. Сначала в результате взаимодействия АТФ и ами-
нокислоты образуется связанный с ферментом промежуточный про-
дукт — аминоациладенилат. COOH-группа аминокислоты связыва-
ется ангидридной связью с б'-фосфатной группой АМФ с выделе-
нием пирофосфата, при этом аминоациладенилат приобретает от
АТФ часть энергии, необходимой для образования пептидной
связи.
R—с—СООН + АТФ + Е ---->
I
н
nh2 о о
I II II
R—С----С^О— Р—О—рибоза — аденин
I I
н ОН
Е + ФФИ
Аминоацила денилатфер мснтный комплекс
Затем во второй реакции происходит перенос аминоацильного
остатка на специфическую тРНК. COOH-группа аминокислоты
образует сложноэфирную связь с З'-ОН-группой концевого адено-
зи нового остатка тРНК:
258
NH2 о о
I II II
R—С----C~O—P—О—рибоза — аденин
I I
н ОН
Е + тРНК ч=а
Аминоацил аденилатферментный комплекс
nh2 о
I II
R—С----С-О—тРНК + АМФ + Е
Аминоацил-тРНК
Суммарный итог реакции заключается в этерификации каждой
аминокислоты соответствующей молекулой тРНК, т. е. в образо-
вании аминоацил-тРНК. В ходе этого процесса каждая аминокис-
лота активируется и связывается со специфичной для нее «своей»
тРНК.
Аминоацил-тРНК — синтетазы по структуре делят на три груп-
пы. Некоторые АРСазы состоят из одной полипептидной цепи, на-
пример валиновая, изолейциновая и лейциновая (М^ 100 000).
Вторую группу составляют ферменты, состоящие из одинаковых
субъединиц. Например, метиониновая синтетаза состоит из четы-
рех субъединиц с М — 45 000, сериновая — из двух субъединиц с
М^45 000. В третью группу входят АРСазы, содержащие неоди-
наковые субъединицы, например глициновая, триптофановая, кото-
рые состоят из двух разных субъединиц. АРСаза «узнает» только
тРНК, специфичные для данной аминокислоты. Этот процесс про-
текает с высокой точностью, определяя тем самым правильность
чередования аминокислот при синтезе полипептидной цепи, т. е.
точность всего процесса синтеза белка. В связи с этим В. А. Эн-
гельгардт назвал эти ферменты кодазами, что подчеркивает их
роль в реализации генетического кода.
У Е. coli для каждой из 20 аминокислот существует по одной
аминоацил-тРНК — синтетазе, но может быть несколько тРНК.
В то же время в цитоплазме эукариотических микроорганизмов
может присутствовать несколько АРСаз для одной аминокислоты.
Например, Neurospora crassa содержит три фенилаланил-тРНК —
синтетазы. В гиалоплазме прокариот АРСазы распределены диф-
фузно. У эукариот полный набор ферментов сосредоточен в одном
мультиэнзимнэм комплексе.
Нагруженные аминокислотами тРНК далее переносятся к рибо-
сомам, на которых и образуется полипептидная цепочка. Молеку-
лы тРНК при этом играют роль адаптеров, т. е. приспособлений,
при помощи которых аминокислоты включаются в определенном
порядке в растущую полипептидную цепь.
5.3.3. Инициация трансляции. Инициация — это одна из наибо-
лее сложных стадий трансляции. На этой стадии из отдельных
компонентов собирается аппарат для синтеза белка и протекают
подготовительные реакции.
9*
259
Организующими центрами процесса трансляции являются ри-
босомы. Если рибосома не связана с мРНК, она диссоциирует на
составляющие ее субъединицы (у прокариот — 30S и 50S, в эука-
риотических клетках — 40S и 60S). В ходе инициации происходит
сборка рибосом.
В процессе трансляции полипептидная цепь начинает строить-
ся с N-конца и завершается С-концом, т. е. имеет направление
NH2—>СООН.£Началом синтеза белка в мРНК является соче-
тание трех нуклеотидов: АУГ. Если эти нуклеотиды стоят внутри
цепи мРНК, то они кодируют аминокислоту метионин. Предпола-
гают, что в некоторых случаях инициирующим кодоном может
быть ГУГ (будучи внутренним, он кодирует аминокислоту валин).
В клетках прокариот существуют две метиониновые тРНК. Од-
на из них — тРНКж„т акцептирует остатки аминокислоты метио-
нина и включает их в полипептидные цепи. Вторая — тРНК^ф1
служит для инициации синтеза белков, т. е. является инициатор-
ной. Обе эти тРНК акцептируют аминокислоту метионин, образуя
метионил-тРНК. Если метионин соединился с инициаторной транс-
портной РНК — тРНК^фП, то он вступает в реакцию трансформи-
лирования. При этом формильная (формальдегидная) группа пе-
реносится от №°-формилтетрагидрофолиевой кислоты на метионил-
тРНКАфШ: Ы10-формилтетрагидрофолиевая кислота + метионил-
тРНК^ф1—^тетрагидрофолиевая кислота + формил метионил-
тРНК^ф1. Блокирование аминогруппы метионина формильным ос-
татком позволяет этой аминокислоте первой встать в рибосому, на*
чать рост полипептидной цепи. Формилметионил-тРНКф*771 имеет
следующую формулу:
/О
с/
NH О
| |1 мет
Н3С—S—СН2—СН2—С---С~О—тРНКф
I
н
В связи с тем, что формилметионин приходит в рибосому пер-
вым, все полипептиды у прокариот начинаются с формилметиони-
на. После окончания синтеза белка формильная группа отщепля-
ется от него ферментом деформилазой, а в ряде случаев отщепля-
ется и метиониновый остаток ферментом пептидазой. Иногда этот
фермент отщепляет от вновь образовавшегося полипептида не-
сколько десятков первых аминокислот.
Кроме инициаторной тРНК, мРНК, 30S- и 505-рибосомных
субчастиц для процесса инициации у прокариот необходимы еще
ГТФ и три белка. Они не входят обычно в состав рибосомы, на-
зываются факторами инициации и обозначаются как //Ч, 1F-2 и
IF-3.
260
Инициация протекает следующим образом. Инициирующий
фактор IF-3 соединяется с меньшей 308-субчастицей рибосомы.
Белковый фактор 1F-2 соединяется с ГТФ. К комплексу /Р-2-ГТФ
присоединяется формилметионил-тРНК^. На второй стадии с об-
разовавшимся комплексом реагирует 308-субчастица, содержащая
IF-3, получается комплекс: 308-/Е-3-ГТФ-/Е-2-формилметионил-
тРНК^ф1. К этому комплексу присоединяется мРНК своим 5'-кон-
цом при участии инициирующего фактора IF-\ (рис. 5.3). На зак-
лючительном этапе присоединяется 508-субчастица, при этом вы-
свобождаются все три фактора инициации, а также ГДФ и Фн.
В результате указанных процессов рибосома «собрана» и готова
для синтеза полипептидной цепи.
Важную роль в синтезе белка играют функциональные центры
рибосом. В рибосомах находятся полости, в которых специфически
связываются молекулы, участвующие в белковом синтезе. За вы-
бор из среды и специфичность связывания аминоацил-тРНК в при-
сутствии матрицы отвечает 308-субчастица. На ней находятся уча-
стки связывания матрицы, кодон-антикодоновых пар и ацилиро-
ванных тРНК.
Участок связывания ацилированной тРНК ограничивается по-
верхностями 30S- и 508-субчастиц рибосом, а также соответствую-
щим кодоном мРНК, вследствие чего участок обладает специфич-
ностью только для определенной молекулы тРНК. Аминоацил-
тРНК связывается в A-сайте (аминоацил-тРНК-связывающий
участок) 308-субчастицы. Аминоацил «свешивается» на 508-субчас-
тицу, замыкающую полость, при этом он поступает в А-(амино-
ацильный) участок пептидилтрансферазного центра рибосомы, на-
ходящегося на 508-субчастице. Рядом с A-участком на 308-субчас-
тице располагается Р- (пептидил-тРНК-связывающий) участок
(P-сайт), в котором помещается пептидил-тРНК. Пептидил также
«свешивается» на 508-субчастицу, помещается в Р-(пептидильный)
участке пептидилтрансферазного центра. На 508-субчастице обна-
ружен еще Е-участок (от англ, exit — выход), в котором неспеци-
фически связывается деацилированная тРНК в отсутствие мат-
рицы.
В результате инициаторных процессов формилметионил-тРНК^
встает сразу в P-участок. При этом ее антикодон 3'-УАЦ-5', види-
мо, связан с метиониновым кодоном мРНК 5'-АУГ-3'. А-Участок
свободен, в него встает следующий кодон мРНК, этот кодон счи-
тывается соответствующей аминоацил-тРНК.
У эукариот инициаторной (первой) также является метионил-
тРНК, однако в отличие от таковой прокариот она не формилиру-
ется, а реагирует с факторами инициации eIF-5, eIF-2, eIF-3, с 40S-
субчастицей рибосом и мРНК. Реакции идут по той же схеме, что
и у прокариот.
Синтез пептидов в митохондриях и хлоропластах идет так же,
как у прокариот: инициация осуществляется с помощью формил-
метионил-тРНКЖфт.
261
Рис. 5.3. Инициация белкового синтеза (пояснение см. в тексте):
фМет — формилметионин
Так на стадии инициации собирается весь аппарат для синтеза
полипептидной цепи. Факторы инициации повторно используютая
для инициации синтеза новых цепей.
5.3.4. Элонгация полипептидной цепи и терминация синтеза. По
окончании стадии инициации в P-участке рибосомы находится ини-
циаторная формилметиопил-тРНКЛфШ. A-Участок свободен, но в
нем уже находится следующий кодон мРНК. Вновь поступающая
комплементарная очередному кодону аминоацил-тРНК связывает-
ся с А-участком. Для этого процесса у бактерий требуются ГТФ
и специфический цитоплазматический белок — фактор элонга-
ции EF-T, состоящий из двух субъединиц EF-Tu и EF-Ts. Соответ-
ствующий фактор элонгации у эукариот обозначают EF-1. ГТФ
гидролизуется на ГДФ и Фн. Каждый раз специфическая тРНК
узнается благодаря взаимодействию кодон-антикодон. Предпола-
гают, что при образовании правильной кодон-антикодоновой пары
изменяется конформация тРНК. На поверхность ее выходит пос-
ледовательность Т^Ц, которая образует водородные связи с пос-
ледовательностью ЦГАА, находящейся в 16S рРНК. Таким обра-
зом, аминоацил-тРНК помещается в A-участке рибосомы.
Затем происходит образование пептидной связи. В пептидил-
трансферазном центре, располагающемся на SOS-субчастице ри-
босомы, происходит перенос формилметионинового остатка (или
пептидильного остатка в последующих стадиях трансляции) на
аминогруппу аминокислотного остатка, расположенного в А-участ-
ке (рис. 5.4). В результате взаимодействия аминогруппы вновь по-
ступившей в рибосому аминокислоты с карбоксилом предыдущей
аминокислоты образуется пептидная связь. Эта реакция, видимо,
протекает по механизму нуклеофильного замещения (вытесняется
тРНК предыдущей аминокислоты) и катализируется ферментом
пептидилтрансферазой, являющимся одним из белков 505-субчас-
тицы рибосомы.
Так образуется пептидная связь. Затем осуществляется транс-
локация (передвижение) в рибосоме мРНК на один кодон. Про-
цесс транслокации очень сложен, для него требуются ГТФ, второй
фактор элонгации — EF-G (или EF-2 у эукариот), а также энер-
гия гидролиза ГТФ. В результате транслокации мРНК перемеща-
ется на один триплет. При этом дипептидил-тРНК поступает в
P-участок, а вытесненная инициаторная тРНК^ф1 уходит с рибо-
сомы. В A-участке встает следующий кодон. Цикл повторяется при
поступлении следующей аминоацил-тРНК. мРНК передвигается,
ее кодоны «переводятся» на «язык» белков. Считывание инфор-
мации с мРНК идет в направлении 5'—>3'. Цикл элонгации пов-
торяется многократно — 100, 200 раз, т. е. столько, сколько амино-
кислотных остатков входит в состав полипептидной цепи.
Элонгация заканчивается тогда, когда в рибосому на мРНК
приходят сигналы окончания синтеза белка. Ими являются один
или несколько следующих триплетов УАА, УАГ, УГА. Они назы-
ваются терминирующими. Наличие их в любом участке мРНК при-
водит к окончанию белкового синтеза. В терминации участвуют
263
+ EF-T
+ ГДФ+ФН
3'
Рис. 5.4. Стадии роста полипептидной цепи
(пояснение см. в тексте)
+ |eF~g| 4- ГДФ+ФН
УАЦ
264
белковые факторы. У Е. coli это белок RFA, который узнает кодо-
ны УАА и УАГ, и белок 7? Г-2, который узнает УАА и УТА кодоны.
Белковые факторы терминации присоединяются к терминирующим
кодонам и блокируют дальнейшую элонгацию цепи. 7?Г-3-Фактор
освобождает полипептидную цепь от последней тРНК при взаимо-
действии с и RF-2. Считают, что терминирующие кодоны и
белковые факторы индуцируют пептидилэстеразную активность
белков 50Б-субчастицы рибосомы, при этом гидролизуется связь
между пептидом и тРНК, пептид и тРНК покидают рибосому.
В процессе терминации еще одна молекула ГТФ расщепляется на
ГДФ и Фн. Терминацию синтеза белка у эукариот обозначают те
же самые кодоны, в процессе участвует белковый фактор терми-
нации eRF. Рибосома диссоциирует на субчастицы.
Все освободившиеся компоненты белоксинтезирующей системы
(субчастицы рибосом, тРНК, белковые факторы трансляции) ис-
пользуются вновь в очередном цикле. Реакции белкового синтеза
протекают по типу конвейера, они синхронизированы, что обеспе-
чивает максимальную скорость и эффективность. Почти всегда на
одной молекуле мРНК трансляцию осуществляют несколько рибо-
сом, образуя полирибосомы или полисомы. У бактерий трансля-
ция 5'-конца мРНК нередко идет уже тогда, когда еще не закончен
синтез З'-конца самой мРНК. Скорость роста полипептидной цепи
очень велика. У бактерий она достигает 500 аминокислотных ос-
татков в 1 мин, в клетках животных — примерно в 10 раз меньше.
Достаточно большими являются и затраты энергии на образова-
ние пептидных связей. Одна молекула АТФ расходуется на акти-
вацию каждой аминокислоты и образование аминоацил-тРНК.
Вторая молекула макроэрга — ГТФ расходуется для связывания
аминоацил-тРНК с рибосомой. Третий эквивалент — также ГТФ—
затрачивается на транслокацию на стадии элонгации. Для инициа-
ции и терминации на всю синтезируемую молекулу белка требу-
ются дополнительные макроэрги. Таким образом, на синтез одной
пептидной связи расходуется несколько более трех эквивалентов
АТФ. Энергия пептидной связи составляет около 21 кДж, а на ее
образование расходуется энергии свыше 100 кДж. Большие затра-
ты энергии на синтез полипептидов связаны, видимо, с необходи-
мостью строгой упорядоченности, определенной последовательнос-
ти включения аминокислот.
5.3.5. Генетический код. Исследования показали, что последо-
вательность аминокислот в белке коллинеарна последовательности
кодонов в кодирующей ДНК, т. е. последовательность нуклеотидов
нуклеиновой кислоты однозначно определяет порядок расположе-
ния аминокислотных остатков в полипептидной цепи. В то же вре-
мя химическая природа мономеров (нуклеотиды и аминокислоты)
совершенно различна, так что они не могут непосредственно взаи-
модействовать друг с другом. К тому же в нуклеиновых кислотах
содержится всего 4 нуклеотида, а в белке — 20 аминокислот. Бе-
лок можно рассматривать как линейный текст, записанный при
помощи алфавита из 20 букв, роль которых играют аминокисло-
265
ты. Этот текст определяется (кодируется) другим текстом, запи-
санным при помощи алфавита из 4 «букв» молекулы ДНК. Сле-
довательно, для каждой аминокислоты существует свой кодон в
молекуле ДНК, т. е. последовательность нуклеотидов, кодирующая
аминокислоту.
Простые математические расчеты показывают, что каждая
аминокислота кодируется более чем одним нуклеотидом. Если ко-
дон для каждой аминокислоты содержит два нуклеотида, то воз-
можно 42=16 сочетаний, такого числа кодонов недостаточно для
кодирования 20 аминокислот. Если взять комбинации по три нук-
леотида, то получается 43 = 64 кодона. Таким образом, триплетный
код достаточен для кодирования всех 20 аминокислот, входящих
в состав природных белков.
Свойства генетического кода были исследованы эксперимен-
тально. Ф. Крик и его сотрудники изучили свойства кода на му-
тантах бактериофага Т4 Е. coli. При воздействии некоторых хими-
ческих мутагенов (акридины, фенантрен) единичные нуклеотиды
в ДНК бактериофага либо выпадают — делеция, либо встраива-
ются — инсерция, вставка. Это приводит к синтезу дефектного
белка оболочки вируса, так как сдвигается считывание кодонов.
Такие мутации получили название мутаций со сдвигом рамки. На-
пример, исходный бактериофаг содержит последовательность, в
которой нуклеотиды считываются по три: АВС.АВС.АВС... В ре-
зультате делеции одного нуклеотида С рамка считывания сдвига-
ется: АВА.ВСА.ВСА...
Если в одном и том же гене происходят две мутации со сдви-
гом рамки, причем одна из мутаций — вставка, а другая — деле-
ния, то правильное считывание восстанавливается. Если в одном
и том же гене произойдут три мутации одного знака (делеции или
вставки), то после третьей мутации правильное считывание вос-
станавливается. Эти эксперименты подтвердили, что код белково-
го синтеза триплетный и что существует точка начала считывания.
Считывание осуществляется непрерывно в одном направлении, т. е.
код не имеет «запятых».
После доказательства триплетности кода стала возможной рас-
шифровка кода, т. е. определение триплетов, характерных для
каждой аминокислоты. Важнейшее значение имели эксперименты
М. Ниренберга и И. Маттеи (1961). Эти исследователи разработа-
ли метод, позволяющий определять состав кодонов, и впервые оп-
ределили состав двух кодонов. В их экспериментах полиуридило-
вую кислоту (РНК-подобный полимер) инкубировали в серии про-
бирок, содержащих рибосомы Е. coli, 18 видов аминокислот и дру-
гие компоненты, необходимые для синтеза белка. В каждой про-
бирке «меченой» была только одна аминокислота из 18. В этой
системе в кислотонерастворимый материал (полипептид) включа-
лась только одна аминокислота — фенилаланин. Образовывался
полипептид, построенный из остатков аминокислоты фенилалани-
на,—• полифенилаланин. Следовательно, триплет УУУ кодирует
фенилаланин. Вскоре после этого М. Ниренберг и И. Маттеи обна-
266
ружили в аналогичных экспериментах, что ЦЦЦ кодирует про-
лин.
Впоследствии М. Ниренберг, С. Очоа и их сотрудники провели
детальные исследования кода, используя полирибонуклеотиды из-
вестного состава, синтезированные с помощью фермента полинук-
леотидфосфорилазы. К 70-м годам удалось выяснить генетический
«словарь» полностью (табл. 5.1).
Генетический код однозначен, т. е. каждый кодон кодирует толь-
ко одну аминокислоту. Исключение представляют инициаторные
кодоны АУГ и ГУГ. В начале трансляции они кодируют включение
Таблица 5.1. PH Кам инокислотный код
5'-ОН-кон- цевой нук- леотид Средний нуклеотид з'-он- концевой нуклеотид
У Ц А г
У УПУ1 УАУ) } Тир УАЦ) УАА) } Терм1 УАГ J У ц А Г
УУУ’ УУЩ Фен УГУ1 угц] Цис
УВД УЦА УЦГ Сер
УГА Терм1 УГГ Три
УУА 1 УУГ , Лей
1
и цуу ЦУЦ ЦУА ЦУГ] Лей 1 ЦЦУ ЦЦЦ ЦЦА ЦЦГ Про ЦАУ1 } Гис ЦАЦ) ЦАА) > Глн ЦАГ J ЦГУ ЦГЦ ЦГА цгг , Арг У ц А Г
А АУУ > АУЦ АУА > АУГ 1 + Ин] Иле лц2 АЦУ1 АЦЦ АЦА АЦГ J Тре 1 : ААУ | }Асн ААЦ) ААА ) У Лиз ААГ J АГУ^ АГЦ) АГА| АГГ) Сер Арг У ц А Г
Г ГУУ ] ГУЦ 1 ГУА ГУГ 1 1 Вал +Иница ГЦУ 1 гцц ГЦА ГЦГ . Ала ГАУ 1 у Асп ГАЦ J ГАА 1 } Глу ГАГ / ГГУ ГГЦ ГГА ггг Г ли У Ц А Г
1 Терм — терминирующий кодон.
* Иниц — инициирующий кодон.
267
формилметионина, а находясь внутри цепи, АУГ кодирует метио-
нин, а ГУГ — валин. Вместе с тем генетический код вырожден, т. е.
одной аминокислоте соответствует более чем один кодон. Напри-
мер, для серина существует шесть, для глицина и аланина — по
четыре, для многих других аминокислот — по два кодона. Исклю-
чение представляют триптофан и метионин, они имеют по одному
кодону.
Во многих случаях вырожденность кода затрагивает только
третий нуклеотид в кодоне, например, в кодонах треонина первые
два нуклеотида одинаковы, отличается только третий. Соответст-
венно нескольким триплетам в мРНК для одной аминокислоты су-
ществует несколько различных тРНК, отличающихся по антико-
донам. В других случаях одна тРНК может транслировать не один,
а несколько кодонов. Так, тРНКглиШ может транслировать ГГУ и
ГГЦ, но не может транслировать два других кодона глицина.
С другой стороны, тРНКгли// транслирует только кодоны ГГА и
ГГГ, а тРНКгли/ — один кодон ГГГ. В том случае, когда одна
тРНК может узнавать более чем один кодон, эти кодоны отлича-
ются одним нуклеотидом, стоящим на З'-конце. Это явление объ-
ясняется так называемой гипотезой качаний, согласно которой
третий нуклеотид кодона может давать необычные пары, кото-
рые лишь приблизительно соответствуют стандартным парам. На-
пример, У спаривается с А или Г, Г — с У или Ц. Таким образом,
третий нуклеотид менее существен.
Важным свойством генетического кода является его непере-
крываемость, независимость отдельных триплетов. Исключений из
этого правила пока известно очень мало. Если бы код был пере-
крывающимся, то должны существовать определенные сочетания
аминокислот, одинаковые во всех белках. Например, аргинину со-
ответствует триплет АГА. Значит, перед ним во всех белках долж-
на стоять аминокислота, кодируемая триплетом с окончанием АГ
(лизин или глутамин). Статистика первичной структуры белков
говорит о том, что таких универсальных для всех белков сочетаний
аминокислот нет.
1 2 ТТ
ч (—*—ч Неперекрывающиися код
АГГ ЦТТ
Перекрывающийся код
1 2 3
1,2,3-номера триплетов
В 1975 г. сотрудники лаборатории Ф. Сэнгера обнаружили ис-
ключение из правила неперекрываемости кода белкового синтеза.
Оказалось, что у бактериофага q?X 174 ген D полностью располо-
жен на участке гена Е и составляет 60% протяженности последне-
го. Разница между ними определяется сдвигом рамки считывания:
первая буква в кодоне гена D является последней в кодоне гена Е
и т. д. Область, гена А считывается трижды: один раз как полный
белок А, второй как укороченный белок А с сохранением после-
268
довательности, третий — как новый белок В в результате сдвига
рамки считывания.
Одно из существенных свойств кода — его универсальность.
Код в основном одинаков у организмов, стоящих на разных уров-
нях развития: у человека, растений, бактерий, вирусов. Вследствие
этого рибосомы и молекулы тРНК из Е. coli, например, могут осу-
ществлять трансляцию цепи мРНК» кодирующей синтез гемогло-
бина, и синтезировать при этом полноценный гемоглобин. Благо-
даря универсальности кода возможна генетическая инженерия.
Универсальность кода свидетельствует о древности его происхож-
дения и консервативности, в результате которой даже при дли-
тельной эволюции сохраняются неизменными важнейшие особен-
ности метаболизма. Сходство кода у разных организмов является
веским доказательством в пользу того, что все живые организмы
произошли от единого предка.
Следует заметить, что большинство аминокислот определяется
первыми двумя нуклеотидами в кодоне. Может быть, на самых
ранних этапах эволюции только два нуклеотида принимали учас-
тие в узнавании, но и тогда, по мнению Ф. -Крика, код был уже
триплетным, хотя третий нуклеотид был незначащим. Позднее, с
появлением новых аминокислот — метионина, тирозина и трипто-
фана, для их кодирования потребовались триплеты. Если это пред-
положение справедливо, то можно говорить о том, что эволюция
генетического кода имела место на самых ранних этапах развития
жизни на Земле.
Небольшим исключением из правила универсальности кода яв-
ляется код синтеза белков в митохондриях человека и в дрожже-
вых клетках. Код митохондрий человека похож на «универсаль-
ный», только четыре кодона имеют иной смысл: УГА—коди-
рует триптофан, АУА — метионин, а АГА и АГГ — терминиру-
ющие.
Дрожжевые клетки обладают своим генетическим кодом. К тем
изменениям, которые существуют в митохондриях человека, добав-
ляется еще одно: все четыре кодона лейцина, начинающиеся с ЦУ,
перешли к треонину, так что у лейцина стало два, а у треонина —
восемь кодонов. Кодон АУА «вернулся» к изолейцину, как в «уни-
версальном» коде. Особенности кода у некоторых объектов позво-
ляют высказывать предположения об' эволюции как разных живых
организмов, так и самого кода. Неоднократно высказывалось мне-
ние, что митохондрии — это потомки одноклеточного организма,
очень давно вступившего в симбиоз с эукариотической клеткой.
В пользу этого предположения говорит и существование у мито-
хондрий особого кода.
Механизмы репликации ДНК, синтеза РНК и белка в основном
одинаковы у всех организмов. Эволюция шла не путем изменения
основных биосинтетических процессов, а путем образования допол-
нительных генов для синтеза новых ферментов, новых белков, об-
ладающих иными структурами и функциями. Это и привело к бес-
конечному разнообразию живых организмов.
269
5.3.6. Ингибиторы биосинтеза белков. Ингибиторы биосинтеза
белков приобретают все большее значение и как инструмент в на-
учных исследованиях, и как средство решения ряда проблем ме-
дицины. Эти соединения широко используют в молекулярной био-
логии благодаря их способности избирательно воздействовать на
строго определенные звенья механизма синтеза белков. В то же
время многие антибиотики, с большим успехом применяемые в ме-
дицине, также относятся к ингибиторам биосинтеза белка. Более
того, перспективы развития ряда направлений биологии и медици-
ны, например экспериментальной онкологии, тесно связаны с по-
исками, изучением и использованием новых ингибиторов биосинте-
за белка.
Узкая избирательность действия позволяет классифицировать
ингибиторы биосинтеза белка по функциональным признакам
(И. П. Ашмарин, 1975): ингибиторы синтеза РНК-полимеразы,
транскрипции, трансляции, рекогниции и т. д.
Ингибиторы транскрипции. Наиболее изученным ин-
гибитором этой группы является актиномицин D. Он не только
представляет собой сильный бактерицид, но обладает также про-
тивоопухолевым действием, хотя не используется в медицине из-за
своей большой токсичности и находит применение в биохимичес-
ких исследованиях. Актиномицин D связывается с двухцепочечной
ДНК в участках, содержащих гуанин, внедряется между парами
Г : Ц, блокирует действие РНК-полимераз, вследствие чего прек-
ращается синтез всех типов РНК в клетке.
Способностью к интеркаляции — нековалентному встраиванию
плоских ароматических колец между парами оснований ДНК об-
ладают некоторые антибиотики и ряд лекарственных препаратов
(например, гикантон), бромистый этидий, акридины (хинакрин,
акридиноранил, профлавин), а также производные хинолина (на-
пример, хлорокин). Хинакрин и хлорокин широко известны как
антималярийные агенты и иммунодепрессанты.
Непосредственно взаимодействует с РНК-полимеразой, а не с
матричной ДНК гликопротеин гепарин. Он предотвращает присое-
динение фермента к матрице. Рифампицин — ингибитор бактери-
альной РНК-полимеразы. Он воздействует на ее р-субъединицу,
ингибирует инициацию транскрипции, но не влияет на связывание
РНК-полимеразы с ДНК.
Непосредственными ингибиторами РНК-полимеразы на стади-
ях инициации (а затем и элонгации) являются яды гриба поганки,
октапептиды — аманитины. К ингибиторам транскрипции относят-
ся также алкалоиды винкристин и винбластин. Механизм их дей-
ствия пока недостаточно изучен. Они обладают некоторым проти-
вораковым действием не только в эксперименте, но и в лечебной
практике.
Ингибиторы трансляции. В настоящее время извест-
ны ингибиторы любой реакции, любого этапа трансляции. Так, ре-
акцию присоединения мРНК к 30S- и 405-субчастицам рибосом
подавляет производное трифенилметана — ауринтрикарбоксило-
270
вая кислота. Следующую реакцию инициации — присоединение
формилметионил-тРНК и ГТФ тормозят алкалоид эдеин Ai и ан-
тибиотик косугомицин (последний только у прокариот).
Описано подавление присоединения мРНК к инициирующему
комплексу некоторыми алифатическими альдегидами — глицераль-
дегидом, метилглиоксалем. Последний (и его производные) изве-
стен некоторой противовирусной активностью. Заключительные
реакции инициации нарушает антибиотик пактамицин.
Целый ряд широко применяемых в исследовательской и лечеб-
ной практике веществ ингибирует связывание аминоацил-тРНК
при инициации и особенно при элонгации. Достаточно специфич-
но эта реакция подавляется солями — фторидами (0,02 М) и ка-
тионами Ni, Zn (0,0001 М).
Блокирование синтеза белка на рибосомах патогенных бакте-
рий лежит в основе действия многих наиболее эффективных анти-
биотиков. Высокий уровень их эффективности объясняется тем,
что эти антибиотики подавляют синтез белка на 70Б-рибосомах
бактерий — возбудителей болезней и не влияют на 80Б-рибосомы
организма человека.
К ингибиторам связывания аминоацил-тРНК относится ряд
антибиотиков — стрептомицин, неомицин, канамицин. Стрептоми-
цин и родственные ему антибиотики не только подавляют синтез
белка, но и вызывают ошибки в считывании генетического кода.
За чувствительность бактерий к стрептомицину отвечает один из
белков ЗОБ-рибосомной субчастицы. Устойчивость и даже зависи-
мость от стрептомицина возникают в результате мутационных из-
менений этого белка.
Стрептомицин-ЗОБ-комплекс менее эффективно образует ини-
циаторный комплекс, он легко диссоциирует, и процесс трансля-
ции прекращается. В присутствии стрептомицина нарушается свя-
зывание аминоацил-тРНК с кодоном в A-участке, что приводит к
ошибкам трансляции.
Антибиотик пуромицин — один из наиболее мощных ингибито-
ров белкового синтеза. Он воздействует на стадии пептидилтранс-
феразной реакции. Механизм ингибирования связан с тем, что
структура пуромицина имеет сходство со структурой концевого
остатка АМФ в аминоацил-тРНК. В процессе элонгации полипеп-
тидной цепи пуромицин конкурирует с аминоацил-тРНК, встает в
рибосому вместо очередной аминоацил-тРНК и принимает на себя
растущую полипептидную цепь. Образующийся при этом пепти-
дилпуромицин легко отделяется от рибосомы, поскольку молекула
пуромицина невелика и не содержит антикодона. Рост полипептид-
ной цепи прерывается, с рибосомы уходит неполная пептидная
цепь, содержащая на С-конце пуромициновый остаток.
Тетрациклин прекращает элонгацию полипептидных цепей. Он
блокирует вхождение аминоацил-тРНК в акцепторный участок
30Б-субчастицы рибосомы и нарушает контакт фактора EF-T
с 50Б-субчастицей.
271
Хлорамфеникол связывается с 505-субчастицами рибосом и ин-
гибирует синтез белка на 705-рибосомах клеток прокариот и мито-
хондрий эукариот. Он не влияет на синтез белка на 805-рибосо-
мах. Подавляет образование пептидной связи, ингибируя пепти-
дилтрансферазную активность рибосом.
ОН NH—С—СНС12
сн2
он
Хлорамфеникол
Циклогексимид (актидион) ингибирует образование пептидной
связи, ингибирует процесс транслокации. В отличие от хлорамфе-
никола он подавляет синтез белка на 805-рибосомах эукариотиче-
ских клеток.
Эритромицин и фусидовая кислота ингибируют транслокацию.
Эритромицин связывается с одним из белков 505-рибосомной суб-
частицы. Он блокирует стадию транслокации, задерживая пепти-
дил-тРНК в Л-участке. Фусидовая кислота — стероид, подавляет
реакцию расщепления ГТФ, необходимую для транслокации.
Дифтерийный токсин также специфически ингибирует синтез
белков у эукариот. Попадая в клетку, токсин подвергается протео-
литическому расщеплению, при этом отделяется фрагмент токси-
на, который блокирует активность белка EF-2. В результате транс-
локация не осуществляется, растущая полипептидная цепь оста-
ется в Д-участке рибосомы.
5.3.7. Биосинтез олигопептидов. Механизм биосинтеза коротких
цепей природных олигопептидов во многих случаях неизвестен.
Вряд ли существуют такие короткие мРНК, которые могли бы ко-
дировать синтез коротких пептидов. Более вероятно, что сущест-
вуют длинные матрицы, в которых сигналы инициации и термина-
ции расположены недалеко друг от друга, и на них синтезируются
пептиды. Однако пока не известно ни одного случая такого син-
теза.
Существуют сведения о трех других механизмах образования
олигопептидов. Первый из них — специфический разрыв пептидных
связей в белке, синтезированном при участии всей системы транс-
ляции. Сначала синтезируется длинная полипептидная цепь, затем
она разрезается на отдельные полипептиды. Таким способом син-
тезируются, например, пептидные гормоны гипофиза — вазопрес-
син и окситоцин, опиоидные пептиды.
Вторым путем пептиды синтезируются без мРНК и рибосом с
участием только тРНК. Сначала аминокислота активируется и ак-
цептируется своей тРНК, затем происходит ее перенос с тРНК на
свободную МНг-группу уже существующего белка. Например, фер-
мент из печени кролика катализирует перенос аргинина на ряд
272
белков, из которых лучшими акцепторами служат бычий сыворо-
точный альбумин и бычий тиреоглобулин. Этим же способом син-
тезируются пептидные мостики муреина в стенках бактериальных
клеток (см. разд. 6.4.4).
Третий способ — синтез полипептидов при действии специфиче-
ских ферментов. Порядок чередования аминокислот в полипепти-
дах определяется в этом случае специфичностью ферментов. Пеп-
тиды, которые синтезируются этим способом, обладают некоторы-
ми особенностями. В них, как правило, присутствуют необычные
аминокислоты. Например, в антибиотике грамицидине — L-орни-
тин, D-фенилаланин. В трипептиде глутатионе аминокислоты свя-
заны необычной пептидной связью: она образуется между NH2-
группой цистеина и у-СООН-группой глутаминовой кислоты.
Значительное число антибиотиков содержит остатки различных
аминокислот или их производных. В биосинтезе антибиотиков нук-
леиновые кислоты не участвуют, он также протекает под действием
специфических ферментов. Так, из бактерий Bacillus brevis, синте-
зирующих грамицидин S, выделена соответствующая мультиэнзим-
ная система. Для синтеза необходимы АТФ и Mg2+. Сначала ами-
нокислоты активируются, образуя с АТФ аминоациладенилаты, а
затем «нанизываются» одна на другую.
Таким образом, механизм синтеза антибиотиков пептидной при-
роды более прост, чем синтез белков в системе трансляции. Пред-
полагают, что именно таким способом могли образовываться по-
липептиды в пребиотический период.
5.4. Регуляция биосинтеза белка
В живых организмах происходит избирательный синтез белков,
различные белки образуются с неодинаковой скоростью. Например,
у Е. coli содержание одних белков не превышает 10 молекул на
клетку, у других достигает 500 тыс.; наиболее велико количество
рибосомных белков. Соматические клетки всех тканей и органов
многоклеточного организма имеют одинаковую генетическую ин-
формацию, но отличаются друг от друга по содержанию тех или
иных белков. Так, для клеток эритроцитов характерно высокое со-
держание гемоглобина, кожи — коллагена, клетки поджелудочной
железы вырабатывают много ферментативных белков. В отдель-
ных клетках, тканях и органах содержание разных белков меняет-
ся с возрастом, с фазой развития. Все это свидетельствует о том,
что в живых организмах существуют механизмы регуляции ско-
рости белкового синтеза. Они функционируют под действием внут-
ренних и внешних факторов на каждой из стадий сложного про-
цесса синтеза белка. Количество белка может изменяться в резуль-
тате специфического увеличения числа некоторых генов, регуляции
на стадии транскрипции, процессинга мРНК. Скорость белкового
синтеза определяется и временем жизни мРНК, регуляцией синте-
за на уровне трансляции, посттрансляционной модификации бел-
ков.
273
У прокариотических организмов механизмы регуляции белково-
го синтеза наиболее хорошо изучены на стадии транскрипции. На
этой стадии происходит, в частности, регуляция синтеза индуци-
бельных ферментов у бактерий, т. е. таких ферментов, количество
которых резко возрастает при добавлении в питательную среду суб-
страта этих- ферментов (индуктора). Например, у Е. coli усилен-
ный синтез ферментов метаболизма лактозы происходит только на
среде с лактозой, когда она является единственным источником уг-
лерода и энергии. В ее отсутствие содержание этих ферментов в
клетках очень мало. Индукция их синтеза у Е. coli подробно ис-
следована Ф. Жакобом и Ж. Моно. Синтез этих ферментов проис-
ходит на лактозном опероне (/ас-оперон).
Лактозный оперон Е. coli объединяет три структурных цистро-
на, кодирующих три фермента; галактозидпермеазу, р-галактози-
дазу и тиогалактозид-ацетилтрансферазу. Фермент галактозидпер-
меаза участвует в переносе лактозы через мембрану внутрь клет-
ки; р-галактозидаза непосредственно осуществляет расщепление
лактозы на глюкозу и галактозу; роль тиогалактозид-ацетилтранс-
феразы пока исследована недостаточно. В настоящее время изве-
стна полностью первичная структура /ас-оперона Е. coli, число и
порядок чередования нуклеотидных пар в каждом функциональном
его участке.
Один из видов контроля синтеза ферментов /ас-оперона на ге-
нетическом уровне осуществляется при участии регуляторного бел-
ка-репрессора, структура которого закодирована в гене-регуляторе
(рис. 5.5), не входящем в состав оперона. В отсутствие лактозы
/ас-оперон не транскрибируется, так как оператор блокирован за
Р П О А 8 С
Репрессор ।
(активный) | + Индуктор
4W
Рис. 5.5. Индукция синтеза ферментов
р — ген
строны
метаболизма лактозы:
|-регулятор, П — промотор, О ~~ оператор, А, В, С — структурные ци-
/ас-оперона, а, Ь, с — ферменты, кодируемые структурными цистронами
274
счет присоединения к нему репрессора, препятствующего специфи-
ческому присоединению РНК-полимеразы к промотору и продвиже-
нию РНК-полимеразы по ДНК. В связи с этим структурные цист-
роны /ас-оперона и других оперонов, находящиеся под контролем
одной и той же регуляторной зоны, включаются в трансляцию я
выключаются одновременно.
Репрессор /ас-оперона находится в связанном с ДНК состоя-
нии, пока не вступит во взаимодействие с индуктором — лактозой.
Рис. 5.6. Репрессия конечным продуктом триптофанового оперона:
А, В, С, D, Е — структурные цистроны триптофанового оперона; остальные
обозначения те же, что на рис. 5.5
Лактоза связывается с белком-репрессором, меняет его конформа-
цию, в результате чего он становится неспособным присоединять-
ся к оператору. При таком состоянии оператора происходят транс-
крипция, трансляция, синтез ферментов катаболизма лактозы. При
участии репрессора, образующегося изначально в активной, т. е.
способной связываться с оператором, форме, и индуктора, перево-
дящего репрессор в неактивную форму, происходит регуляция син-
теза индуцибельных ферментов.
Известны также репрессируемые ферменты, их образование по-
давляется продуктом катализируемой ими реакции. Действие этих
оперонов также контролируется с участием белков-репрессоров, но
они синтезируются изначально в неактивной форме. Присоединение
к ним накопившегося в значительном количестве продукта фермен-
тативной реакции — корепрессора (например, триптофана, в слу-
чае триптофанового оперона) переводит их в активную форму, что
сопровождается связыванием активированных репрессоров с опе-
ратором и прекращением синтеза белка (рис. 5.6). Таким образом,
275
индукция и репрессия синтеза ферментов по своему механизму
сходны. Отличие заключается в природе репрессора: у индуцибель-
ных ферментов свободный репрессор активен, а у репрессируе-
мых — неактивен и активируется в присутствии корепрессора.
В большинстве исследованных случаев индуцибельными явля-
ются опероны, ответственные за синтез ферментов, катализирую-
щих катаболические реакции (сбраживание сахаров, распад ами-
нокислот и др.). Индукторами таких оперонов, переводящими ак-
тивный репрессор в неактивную форму, являются субстраты этих
катаболических ферментов. Репрессируемые опероны, как прави-
ло,—системы синтеза анаболических ферментов, катализирующих
реакции синтеза аминокислот, азотистых оснований и т. д. В ка-
честве корепрессора, активирующего репрессор, выступают про-
дукты, синтезируемые ферментами данного оперона.
Если ген-регулятор располагается перед группой оперонов, коди-
рующих ферменты, ответственные за разные промежуточные ре-
акции синтеза одного и того же соединения, то он контролирует
работу всех оперонов с участием единственного репрессора.
Помимо индуцибельных и репрессируемых ферментов в клет-
ках существуют и конститутивные белки и в том числе конститу-
тивные ферменты. Это такие белки и ферменты, количество кото-
рых несущественно изменяется в процессе жизнедеятельности ор-
ганизма. Они постоянно синтезируются клеткой, на скорость их
синтеза существенно не влияет состав среды. Уровень конститу-
тивного синтеза зависит от скорости синтеза мРНК, скорости при-
крепления к ней рибосом, считывания матрицы и времени жизни
мРНК. К конститутивным белкам относятся, например, ферменты,
участвующие в расщеплении глюкозы у Е. coli. Оперон, отвечаю-
щий за синтез конститутивного белка, не содержит активно дейст-
вующего оператора. Потеря активности оператором может прои-
зойти в принципе у любого оперона вследствие мутации. В таком
случае действие репрессоров блокируется и идет неконтролируемый
синтез белков.
Регуляция синтеза ферментов /ас-оперона Е. coli на стадии
транскрипции может происходить и при участии механизма ката-
болитной репрессии, осуществляющейся под действием цАМФ (см.
разд. 12.3). Катаболитную репрессию индуцибельных ферментов
через цАМФ вызывают, как правило, субстраты конститутивных
ферментов. Так, Е. coli не утилизирует лактозу и не синтезирует
соответствующие ферменты в присутствии другого, более доступ-
ного энергетического субстрата — глюкозы, которая используется
организмами при участии конститутивных ферментов. Объясняет-
ся это тем, что один из продуктов расщепления глюкозы (катабо-
лит) снижает внутриклеточный уровень цАМФ. В отсутствие глю-
козы содержание цАМФ в клетке существенно повышается, она
связывается со специфическим белком клетки — БРЦ (белок-ре-
цептор цАМФ) или CRP (от сАМР receptor protein).
Комплекс цАМФ-ВРЦ способен взаимодействовать с промото-
ром /ас-оперона, изменять пространственную структуру данного
276
участка ДНК таким образом, что становится возможным присое-
динение к нему РНК-полимеразы. Это увеличивает скорость транс-
крипции оперона (рис. 5.7). Следовательно, транскрипция /ас-опе-
рона находится и под позитивным (с участием комплекса цАМФ-
БРЦ) и негативным (через репрессор) контролем. При негатив-
ном контроле /ас-оперон транскрибируется в отсутствие регуля-
торного белка-репрессора, в случае позитивного контроля для «за-
пуска» оперона необходим регуляторный белок — комплекс
Р П О А В С
5Т-----з'
1ШД БРЦ
Рис. 5.7. Регуляция работы /ас-оперона Е. coli с участием цАМФ
(катаболитная репрессия):
БРЦ — рецептор цАМФ; остальные обозначения те же, что на рис. 5.5
цАМФ-БРЦ. В настоящее время установлено, что роль цАМФ в
регуляции активности генома заключается не только в инициации
транскрипции, но и в противодействии терминации транскрипции.
В обеспечении селективности транскрипции, т. е. выборе транс-
крибируемого оперона, существенную роль играет сг-субъединица
РНК-полимеразы. Она сама не обладает сродством к ДНК, но
уменьшает неспецифическое присоединение РНК-полимеразы к
ДНК. Установлено, что р'-субъединица — единственный компонент
РНК-полимеразы, имеющей сродство к ДНК.
Широкое распространение получила гипотеза сменных о-субъ-
единиц, которые бы придавали РНК-полимеразе сродство к раз-
ным промоторам, направляя ее на транскрипцию разных участкЬв
генома. Однако «выбор» промоторов этот фермент может осуще-
ствлять и без о-субъединицы, при условии присоединения к нему
некоторых других дополнительных полипептидов.
В опытах с Е. coli обнаружено, что изменение транскрипцион-
ной специфичности РНК-полимеразы зависит также от АДФ-рибо-
зилирования а-субъединицы. Следовательно, функция последней
277
также связана со специфичностью транскрипции отдельных участ-
ков генома. Таким образом, механизмы изменения специфичности
РНК-полимеразы разнообразны и не сводятся к смене серии о-субъ-
единиц.
Скорость синтеза белков у прокариот зависит также от матрич-
ной активности ДНК, которая изменяется при химической модифи-
кации ДНК, в частности метилировании с участием ДНК-метилаз,
а также от особенностей сверхспирализации ДНК, определяемой
соотношением типов ДНК-топоизомераз (ДНК-гиразы и ДНК-ре-
лаксазы).
Для прокариот установлен еще один очень своеобразный меха-
низм контроля белкового синтеза. При недостатке аминокислот в
клетках накапливаются значительные количества необычного нук-
леотида — гуанозинтетрафосфата (ффГфф), который прерывает
инициацию синтеза рРНК и тРНК, присоединяясь, вероятнее все-
го, к РНК-полимеразе. ффГфф образуется при участии специфи-
ческого фермента в том случае, если ненагруженная аминокисло-
той молекула тРНК связывается с Д-участком на рибосоме. Это
инициирует реакцию отщепления пирофосфатной группы от АТФ
и перенос ее на фф5Г3ОН (ГДФ), что и приводит к синтезу не-
обычного нуклеотида. Ряд генов может находиться и под позитив-
ным контролем ффГфф. Таким путем контролируются системы, спо-
собные восстанавливать белковый синтез, подавленный в резуль-
тате недостатка аминокислот.
Приведенные выше механизмы контроля скорости белкового
синтеза на уровне транскрипции не исчерпывают все имеющиеся
к настоящему времени сведения в этой быстро пополняющейся но-
выми фактами области исследований. В частности, известны при-
меры ауторегуляции оперонов, когда регуляторный ген входит в
состав оперона, регулируемого его продуктом (оперон утилизации
гистидина). У арабинозного оперона индукция синтеза ферментов
происходит под действием активатора, связывающегося с инициа-
тором, расположенным ближе к структурным цистронам, чем опе-
ратор. Активатор образуется из репрессора при связывании его с
L-арабинозой, в то время как свободный репрессор узнает опера-
тор.
Для ряда оперонов биосинтеза аминокислот (например, трип-
тофана) показано существование механизма регуляции с участи-
ем специфического регуляторного участка ДНК — аттенюатора,
расположенного непосредственно перед структурными цистронами,
после оператора. Аттенюатор, включающий около 30 нуклеотидов,
может выполнять роль терминатора синтеза мРНК. При обычных
колебаниях содержания триптофана в среде большинство начав-
ших синтезироваться мРНК терминируется в области аттенюато-
ра, образуя небольшую по размерам лидерную РНК. Малая часть
инициированных мРНК (до 10%) транскрибируется до конца.
При голодании по триптофану доля терминации в аттенюаторе
снижается.
Существуют и механизмы контроля скорости белкового синтеза
278
на уровне трансляции. Фактором ограничения скорости или даже
прекращения трансляции может быть недостаточное количество
тРНК определенных видов или даже полное отсутствие их. Так,
после заражения Е. coll каким-либо фагом одни тРНК исчезают,
новые появляются. В результате некоторые белки совсем переста-
ют синтезироваться. Предполагают, что фаг путем модифицирова-
ния (метилирование, тиолирование) ингибирует одни тРНК, а дру-
гие активирует. Недостаток тРНК какого-либо типа может быть
результатом действия на них нуклеаз с расщеплением ЦЦА-конца.
Скорость трансляции может регулироваться также вследствие из-
менения активности аминоацил-тРНК-синтетаз (это, например,
могут вызывать фаги своими белками), а также числа и активно-
сти рибосом, в частности активности пептидилтрансферазы.
С. Очоа установил, что существуют протеинкиназы, ингибирую-
щие трансляцию путем фосфорилирования факторов инициации.
Контроль синтеза белка наблюдается даже у просто устроен-
ных фагов. Так, фаг MS2, содержащий всего лишь три гена (для
белка созревания, белка оболочки и репликазы), использует ме-
ханизм, регулирующий экспрессию (выражение) этих генов. Бел-
ки оболочки образуются в значительно больших количествах, чем
белки созревания. Вероятнее всего, связывание ЗОБ-субчастиц ри-
босом и факторов инициации происходит быстрее с инициаторным
нуклеотидом гена, кодирующего белки оболочки. При усиленном
образовании белка оболочки он подавляет трансляцию гена репли-
кации, связываясь с его инициаторным участком. Регуляция бел-
кового синтеза у вирусов имеет свои сложности, обусловленные
взаимодействием генетического аппарата инфицированной клетки
хозяина и вируса.
Механизмы регуляции белкового синтеза у эукариот исследо-
ваны пока недостаточно. Предполагают, что основные принципы
регуляции у них аналогичны таковым у прокариот, но в целом этот
процесс сложнее. Для эукариот не характерна прямая субстрат-
ная регуляция, распространенная у организмов без оформленного
клеточного ядра. В отличие от прокариот опероны эукариот обыч-
но моноцистронные, с очень обширными регуляторными зонами.
Наличие обширных регуляторных зон в опероне эукариот связано
с их способностью воспринимать большое число различных факто-
ров, изменяющих транскрипционную активность. У эукариот
структурные гены, ответственные за разные звенья той или иной
цепи биохимических реакций, как правило, разбросаны по геному,
а не сосредоточены в одном опероне, как это часто наблюдается
у прокариот.
В ядрах дифференцированных клеток эукариот большинство
генов находится в репрессированном состоянии: одновременно
транскрибируется в среднем только около 10% генов. Конкретное
же число активно работающих структурных генов различно в раз-
ных тканях и органах и на разных стадиях развития. Например, в
ретикулоцитах, где идет синтез глобинов, число копий глобиновых
мРНК превосходит 150 000 на клетку, а в других клетках того же
279
организма их либо крайне мало, либо совсем не удается обнару-
. жить.
Все структурные гены эукариот предлагают условно разделять
на три типа: 1) гены, функционирующие во всех клетках организма
(например, гены, кодирующие ферменты энергетического обмена);
2) гены, функционирующие только в тканях одного типа (в част-
ности, гены, определяющие синтез миозина в мышечной ткани);
3) гены, нужные для выполнения клетками узких функций (на-
пример, гены, кодирующие синтез белка хрусталика).
ДНК эукариот ассоциирована с гистонами и другими белками,
которые могут выполнять регуляторную функцию, влияя на РНК-
полимеразную реакцию. Сродство гистонов к ДНК зависит от сте-
пени их фосфорилирования, метилирования и ацетилирования. Уси-
ление этих процессов ведет к уменьшению способности гистонов
связываться с ДНК, что приводит к увеличению ее активности.
Предполагают, что такую модификацию гистонов катализируют
кислые белки, обладающие ферментативной активностью. С помо-
щью гистонов у эукариотических организмов осуществляется в
значительной мере групповая репрессия работы генов — одновре-
менное групповое подавление активности генов во всем ядре, в
целой хромосоме или в большом ее участке.
Групповая регуляция активности структурных генов у эукари-
от развита в гораздо большей степени, чем у прокариот и вирусов,
во многом отличаются и ее формы. Такой тип групповой регуля-
ции, очень характерный для прокариот, как управление работой
структурных генов общим для них оператором и другими регуля-
торными компонентами данного оперона, у эукариот очень редок,
так как оперон, как правило, содержит только один структурный
ген. У эукариот очень распространена согласованная регуляция
генов, принадлежащих к разным оперонам, пространственно раз-
общенных в хромосоме или даже находящихся в разных хромосо-
мах. Яркий пример групповой регуляции активности генов — пол-
ное прекращение транскрипции всех генов при сперматогенезе у
животных. Это происходит благодаря изменениям белковых ком-
понентов хромосом.
Групповая регуляция нескольких или многих генов, принадле-
жащих разным оперонам, может осуществляться общим для всех
этих генов регуляторным фактором, действующим на каждый ген
в отдельности. У эукариот широко распространена регуляция ак-
тивности групп генов особыми сигнальными веществами, выраба-
тываемыми другими клетками. Примерами таких сигнальных ве-
ществ являются гормоны, действующие на клетки-мишени. Неко-
торые из гормонов (стероидные) образуют в клетке комплексы с
белками-рецепторами, индуцирующие работу одного или несколь-
ких генов в хромосомах клеточного ядра. Большая часть гормо-
нов рецептируется на поверхности клеток и действует на синтез
белка через систему цАМФ-протеинкиназы (см. разд. 12.6.1).
Для скорости транскрипции у эукариот важен и уровень мети-
лирования ДНК, определяющий конформацию хроматина в облас-
280
ти соответствующих генов. В регуляции транскрипции у эукариот
определенная роль отводится изменениям в структуре (характер
упаковки) нуклеопротеинов. Некодирующие последовательности
нуклеотидов ДНК-интроны, возможно, являются внутригенными
регуляторными зонами, создающими необходимую структуру нук-
леопротеина. Аналогичную функцию, очевидно, могут выполнять и
спейсеры, расположенные между повторяющимися генами. От
структуры нуклеопротеиновых участков в геноме эукариот зависит
их способность к взаимодействию с белками-регуляторами, изме-
няющими транскрипционную активность генов. В управлении ра-
ботой генов у эукариот, так же как и у прокариот, могут играть
роль транспозиция и изменение положения регуляторных элемен-
тов в хромосоме (см. разд. 4.3.8).
Активация биосинтеза белка в хлоропластах у растений может
происходить под действием света как в результате того, что неко-
торые репрессирующие системы хлоропласта являются фоточув*
ствительными, так и в связи с увеличением активности РНК-поли-
меразы.
Пространственное разделение процессов транскрипции и транс*
ляции у эукариот дает возможность контролировать синтез белка
на этапе модификации РНК-транскрипта, проникновения мРНК из
ядра в цитоплазму. Регуляция на стадии модификации транскрип-
та, вероятно, может осуществляться путем изменения активности
ферментов кэпинга (например, метилаза гуанина) и скорости об-
разования полиаденилата, изменения режима сплайсинга или не-
однозначности сплайсинга (см. разд. 4.4.3). Скорость отделения
белков от информосом перед комплексированием мРНК с рибосо-
мой также определяет интенсивность биосинтеза белков. Если у
вирусов и прокариот после трансляции на рибосомах мРНК быст-
ро разрушаются, то; у эукариот многие мРНК, образуя комплексы
с белками, могут длительно сохраняться и использоваться для
трансляции спустя много времени после синтеза на ДНК- Напри-
мер, при эмбриогенезе стабильные мРНК, синтезированные еще во
время оогенеза и запасенные в цитоплазме яйца, определяют в
значительной мере течение ранних стадий развития зародыша. :
В регулировании процессов трансляции у эукариот известную
роль отводят изменениям в пространственной структуре тРНК,
определяемой содержанием минорных нуклеотидов. От конформа-
ции тРНК зависит скорость проникновения ее в рибосому, пра-
вильность ориентации. Помимо данного пути контроля синтеза че-
рез тРНК возможна регуляция и на уровне процессинга тРНК,
т. е. скорости превращения предшественника в активную тРНК.
Как и у прокариот, у эукариот большую роль играют изменения
числа и активности рибосом. Так, в неоплодотворенных яйцеклет-
ках синтез белка идет медленно, хотя рибосом достаточно много.
После оплодотворения синтез белка резко активируется без изме-
нения числа рибосом. Активность рибосомы определяется многими
факторами, в том числе активностью пептидилтрансферазы, инги-
бированием или активацией белковых факторов трансляции. Пост-
281
трансляционная модификация белков также может являться эта-
пом, на котором контролируется синтез белков.
У эукариот существует и такой механизм, обеспечивающий де-
терминированное направление развития групп клеток, как отбор
и избирательное размножение клеток, продуцирующих нужный
белок (например, клонирование клеток, синтезирующих анти-
тела) .
6.5. Структура антител, механизм
их образования
Появление белков-антител в сыворотке и тканях человека и по-
звоночных животных в ответ на введение генетически чужеродных
соединений (антигены) является основой гуморальной иммунной
реакции. Антигенами называются все те вещества, которые несут
признаки генетической чужеродности и при введении в организм вы-
зывают развитие специфических иммунологических реакций. Типич-
ными антигенами являются чужеродные белки, полисахариды мик-
роорганизмов.
Антигенные свойства могут проявлять нуклеиновые кислоты,
сложные липиды, некоторые низкомолекулярные вещества (ряд
гормонов, лекарств), химически синтезированные соединения, если
они связаны с носителем-белком, полисахаридом и др. Такие ве-
щества получили название гаптенов. Наименьшая молекулярная
масса веществ, против которых удалось получить антитела без их
присоединения к другим крупным молекулам, составляет около
1000 (например, олигопептиды, содержащие более 8 аминокислот-
ных остатков).
Антитела — вещества гликопротеиновой природы, образующиеся
в ответ на введение в организм антигена и обладающие способно-
стью к специфической реакции с антигеном. Кроме сыворотки кро-
ви антитела обнаружены в экскреторных жидкостях (молоко, выде-
ления слезных желез, слюна и др.), а также па поверхности некото-
рых типов клеток лимфатической системы. Встреча антигена с со-
ответствующим антителом приводит к образованию комплекса. При
выпадении этого комплекса в осадок происходит реакция преципи-
тации. Если антитела, взаимодействуя с антигенами, вызывают
склеивание клеток, их называют агглютининами. если же они вызы-
вают лизис, их называют лизинами.
Антитела обнаруживают высокую специфичность в отношении
чужеродных белков, вызвавших их образование. Различные белки
одного и того же организма вызывают образование различных ан-
тител. Так, если иммунизировать кролика гемоглобином лошади,
то образовавшиеся при этом антитела не способны реагировать с
другими белками лошади. Также неодинаковы в иммунологическом
отношении гомологичные белки разных организмов. Примером
вновь могут служить гемоглобины. Антитела, образовавшиеся в
организме кролика в ответ на введение гемоглобина лошади, реаги-
282
руют наиболее активно с гемоглобином лошади и значительно сла-
бее с гемоглобинами других млекопитающих.
Специфичность антител отражает филогенетические взаимоот-
ношения между видами. Гомологичные белки близкородственных
видов обнаруживают большее сходство по иммунологическим свой-
ствам, чем белки далеко отстоящих друг от друга видов. Узкую из-
бирательность взаимодействия антиген — антитело используют в
практике лабораторных биохимических исследований для иденти-
фикации индивидуальных белков. Благодаря своей высокой специ-
фичности иммунохимический метод (в сочетании с электрофорезом—
иммуноэлектрофоретический) очень точен и во многих случаях
незаменим.
Антитела представляют собой растворимые белки плазмы, от-
носящиеся к иммуноглобулинам (преимущественно к у-глобули-
нам). По седиментационным и электрофоретическим характеристи-
кам, а также по появлению в очень больших количествах при неко-
торых состояниях организма иммуноглобулины человека подразде-
ляют на пять классов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Первые три пред-
ставлены количественно более существенно, два последних называ-
ются минорными классами. Содержание IgG, IgM и IgA (относи-
тельно общего содержания иммуноглобулинов) в крови здорового
человека составляет 70—80, 5—10 и 10—20% соответственно.
Будучи гликопротеинами, иммуноглобулины всегда содержат
углеводы, количество которых по отношению к общей массе колеб-
лется от 2—3% в IgG до 10—12% в IgA и IgM. Ковалентно связан-
ные углеводы относятся главным образом к гексозо- и гексозами-
носодержащим олигосахаридам с небольшим содержанием сиало-
вой кислоты и фукозы. Углеводные простетические группы опреде-
ляют скорость деградации антител гепатоцитами. Молекулярная
масса иммуноглобулинов колеблется от 150 000 до 900 000; IgM
макроглобулийов — 900 000, IgA—170 000—500 000, IgG ~ 150 000,
IgD и IgE^ 180 000.
Молекулы большинства иммуноглобулинов представляют собой
димеры, состоящие из двух (L) легких (от англ, light) и двух тя-
желых цепей (Н, от англ, heavy). IgA и IgM содержат более четы-
рех цепей в своем составе. Н- и L-цепи существенно отличаются по
первичной структуре. В составе индивидуальной молекулы обе
L-цепи идентичны друг другу по структуре, обе /7-цепи также об-
ладают одинаковой последовательностью аминокислот. Их длина у
иммуноглобулинов разных классов различна. Молекулярная масса
легких цепей составляет 20 000—25 000, тяжелых — 50 000—55 000.
С помощью межцепочечных дисульфидных связей четыре цепи объ-
единяются в единую ковалентно связанную структуру. После вос-
становления межцепочечных дисульфидных связей требуются еще
дополнительные достаточно жесткие условия для разрушения проч-
ных нековалентных контактов между L- и //-цепями и разделения
цепей, например добавление мочевины или снижение pH.
В состав иммуноглобулинов человека могут входить L-цепи од-
ного из двух типов: х (каппа) либо А(ламбда).
283
Тяжелых цепей антител существует пять типов: а, у, б, е, ц.
Они определяют классы антител: в IgM входит ц-цепь, в IgG—у,
в IgD — б, в IgE — е, в IgA — а. Каждая тяжелая цепь может всту-
пать в ассоциацию с любой из легких цепей. В сыворотке крови
здорового человека содержится смесь множества различных им-
муноглобулинов. Их исключительно большая гетерогенность не
позволяет выделить из смеси и исследовать структуру какого-либо
одного индивидуального иммуноглобулина. Однако известно забо-
левание— множественная миелома (опухоль костного мозга), при
которой происходит злокачественная пролиферация (быстрое раз-
множение, разрастание и перерождение) одного определенного
типа антителообразующих клеток, синтезирующих один тип имму-
ноглобулинов в достаточно больших концентрациях. Было показа-
но, что миеломные белки по целому ряду структурных и функцио-
нальных признаков очень близки к нормальным иммуноглобули-
нам. Миеломные 1g можно выделить в относительно больших коли-
чествах, они легко поддаются очистке до гомогенного состояния. Из
мочи больных миеломой выделены белки Бенс-Джонса, которые
представляют собой L-цепи 1g.
В 70-х годах были проведены исследования, позволившие кар-
динально решить проблему получения высокоспецифических анти-
тел в больших количествах. Путем слияния В-лимфоцита (клетки
с коротким периодом продукции антител) и опухолевой клетки уда-
лось получить гибрид, в котором проявлялись важнейшие свойства
обеих родительских клеток: способность опухолевой клетки к не-
ограниченному размножению и способность лимфоцита к синтезу
антител. Так как в качестве опухолевой клетки исследователи взя-
ли клетку миеломы, то гибрид назвали гибридомой. Клонированные
(размноженные) гибридомные клетки синтезируют в большом ко-
личестве моноклональные антитела, гомогенные по структуре и
специфичности.
Определение аминокислотной последовательности иммуноглобу-
линов показало, что молекулу антитела можно разделить на уча-
стки, или домены. Одни из них характеризуются постоянной после-
довательностью аминокислот, они называются константными участ-
ками (С), у других — сильно различающиеся последовательности,
это — вариабельные участки (V).
С- и V-участки есть у всех легких и тяжелых цепей. Вариабель-
ные участки располагаются в N-концевых частях L- и //-цепей.
В L-цепях к V-участку относится около 100 аминокислотных ос-
татков, а в тяжелых — около 120. В пределах вариабельных участ-
ков цепей иммуноглобулинов содержатся гипервариабельные об-
ласти, Именно они формируют участки связывания антигенов и на-
зываются антигенов язывающими центрами молекул антител (актив-
ные центры). Аминокислотная последовательность в них варьиру-
ет в связи с различиями в специфичности антител. Эти структурные
особенности обеспечивают возможность взаимодействия с различ-
ными антигенами.
Константные участки антител функционируют при связывании
284
комплемента, обеспечивают перенос антител через плацентарный
барьер (у человека и некоторых млекопитающих иммунитет от ма-
тери к ребенку может передаваться в процессе внутриутробного
развития в результате переноса антител из крови матери через
плаценту).
При изучении структуры иммуноглобулинов установлено, что
их расщепление на фрагменты при частичном протеолизе происхо-
Рис. 5.8. Схема молекулы 1g человека
дит в области шарнирного участка Н-цепей. Этот участок располо-
жен на поверхности молекулы и обладает некоторой подвижно-
стью. Гидролиз IgG папаином приводит к образованию трех фраг-
ментов: двух Fab-фрагментов (от англ, antigen — binding) анти-
генсвязывающих и одного Fc-(ot англ, crystallizable) фрагмента с
постоянным аминокислотным составом. Молекулярная масса Fab-
фрагмента 50 000—52 000. Он сохраняет иммунологическую актив-
ность исходного IgG, но проявляет себя как моновалентное анти-
тело, т. е. имеющее один антигенсвязывающий участок. В состав
Fab-фрагмента входит целая L-цепь (либо х, либо Х-цепь) и N-
концевая половина //-цепи. Они соединены между собой дисуль-
фидной связью. Fc-фрагмент обладает М=48 000 и состоит из ос-
тавшихся половин //-цепей (рис. 5.8). Основной тип вторичной
структуры иммуноглобулинов — антипараллельная р-складчатая.
Она перемежается с a-спиралью и образует «клубки», возникаю-
щие при сшивании дисульфидными мостиками аминокислотных
остатков внутри каждой цепи. Эти «клубки» названы доменами.
Всего в молекуле IgG 12 доменов: по 4 на тяжелых и по 2 на
легких цепях. Молекулярная масса каждого домена примерно оди-
285
какова — около 12 500. Первые домены (Vl и Ун) составлены из
вариабельных участков легких и тяжелых цепей, остальные — из
константных участков легких или тяжелых цепей — Сь и Сн. Ак-
тивные центры антител формируются доменами вариабельных уча-
стков. В этом участвует от 4 до 8 аминокислотных остатков с ши-
рокой вариабельностью по видам аминокислот и их сочетаниям.
Эти участки называются гипервариабельными областями легких и
тяжелых цепей.
Специфичность антител при связывании антигенов обусловлена
как первичной, так и третичной структурой. Третичная структура
иммуноглобулинов комплементарна конформации антигена, обес-
печивает сближение, взаимную ориентацию специфических участ-
ков полипептидной цепи с образованием связывающего участка.
Однако узкая избирательность взаимодействия антител с антигена-
ми определяется в первую очередь различиями первичной структу-
ры вариабельных участков.
Реакция антиген — антитело протекает аналогично взаимодейст-
вию субстрата с активным центром фермента. Этот механизм был
исследован на связывании Таб-фрагмента с гаптенами. Взаимодей-
ствие антигена и faft-фрагмента осуществляется за счет водород-
ных связей, гидрофобных взаимодействий и электростатических
сил. Вклад отдельных остатков аминокислот или моносахаридов ан-
тигена во взаимодействие с антителом может широко варьировать.
Например, замена в брадикинине (нонапептид) хотя бы только
одной аминокислоты приводит к почти полному прекращению его
связывания антителами. Иная картина наблюдается при взаимодей-
ствии группового вещества А крови с антителами IgM. Последние
комплементарно связывают только N-ацетилглюкозамин, другие
моносахаридные остатки группового вещества А не влияют в дан-
ном случае на сродство антитела к антигену.
Синтез иммуноглобулинов осуществляется обычными механиз-
мами белкового синтеза, но L- и //-цепи образуются двумя раз-
личными типами полирибосом. В процессе синтеза антител наблю-
дается кооперативное взаимодействие клеток трех типов, которые
образуются в костном мозге: S-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и
макрофагов.
S-лимфоциты потенциально способны образовывать антитела.
Они попадают из костного мозга в периферические лимфоузлы, се-
лезенку. Другая группа клеток из костного мозга направляется
либо в тимус, либо в лимфатические узлы, либо в селезенку и там
под влиянием гормонов тимуса превращается в Т-лимфоциты. Мак-
рофаги играют роль в синтезе иммуноглобулинов за счет своей
способности к фагоцитарному поглощению и частичному расщепле-
нию корпускулярных чужеродных объектов (бактерии, белковые
структуры). Продукты деятельности макрофагов являются допол-
нительными антигенными стимулами для В- и Т-лимфоцитов.
В природе существует очень большое число самых разнообраз-
ных соединений, которые, попав в организм, будут выступать в ро-
ли антигенов. Возникают вопросы, наиболее интересные и в то же
286
время сложные, плохо исследованные в проблеме иммунохимии:
содержит ли ДНК в окончательно сформированном состоянии
столь же огромное число генов разных антител, сколь многообраз-
ны антигены? Поскольку простые расчеты и логика подсказывают
отрицательный ответ, каким же другим путем обеспечивается ко-
лоссальная вариабельность антител?
По современным представлениям, иммунная система способна
отличить друг от друга около 105—107 различных антигенов. Им-
Vhi ^Н2 Унп Л
—EH3-D—-0 0-0“ЧНЬ-^^—
Рис. 5.9. Соответствие участков полипептидов иммуноглобулина
и кодирующих их субгенов (по Р. Б. Хесину, 1984):
У7*!—п“ Участки* кодирующие вариабельные районы; С1—я — участки,
кодирующие константные районы поли пептидов; короткие участки,
соединяющие V- и С-районы; — «очень короткие участки»
муноглобулины кодируются большим числом мини-генов (субге-
ны), разделенных некодирующими последовательностями. Исходно
разобщенные мини-гены, кодирующие разные части цепей иммуно-
глобулинов, соединяются между собой на уровне ДНК и мРНК в
процессе развития В-лимфоцитов — продуцентов специфических
антител. В эмбриональных лимфоцитах содержится много сотен
субгенов, вариабельных частей легких цепей (VL) и тяжелых (Vh).
Кроме того, на расстоянии тысяч нуклеотидных пар перед началом
генов контактных участков иммуноглобулинов расположено не-
сколько коротких последовательностей — J (от англ, joining — со-
единяющие). В цепях, кроме того, имеются очень короткие последо-
вательности D (от англ, diversity — разнообразие), также прини-
мающих участие в создании разнообразия (рис. 5.9).
При образовании полных генов один из Vt-субгенов соединяет-
ся с одним из /^-участков, образуя единый ген. После его транс-
крипции и дальнейшего сплайсинга образуется единая мРНК, ко
дирующая единый V/C-полипептид^легкой цепи иммуноглобулина.
Еще сложнее происходит перестройка при образовании генов Н-
цепей: сливаются V^-участки с Jh> Dh и, возможно, Сн. Огромная
вариабельность клонов лимфоцитов объясняется, таким образом,
287
колоссальным количеством возможных комбинаций V-, J-; V4 D-,
/- и С-субгенов.
Выбор конкретных генетических элементов, которые «создают»
функционирующие гены иммуноглобулинов в данной лимфоидной
клетке, является, по-видимому, случайным. Поскольку в образова-
нии активного центра принимают участие и Н- и L-цепи, при рав-
ной вероятности соединения любых Я-цепей с любыми L-цепями
число возможных вариантов активных центров еще резко возрас-
тает.
В целом, многообразие специфичности антител в настоящее
время связывают с тем, что в процессе эволюции организмы стал-
кивались с огромным количеством чужеродных агентов и это спо-
собствовало накоплению большого числа генов антител. Соматиче-
ские мутации в генах и сборка самих генов из сегментов (субге-
нов, или мини-генов) многократно увеличивают разнообразие ан-
тител. Селективными агентами являются антигены, они узнают им-
муноглобулиновые рецепторы на поверхности клетки, связываются
с ними и стимулируют размножение данной клетки, способствуя
быстрому образованию ее многочисленного клона.
При взаимодействии антигенов с антителами происходит вклю-
чение системы комплемента. Она состоит из нескольких (около
10) сывороточных белков крови. Каскадный механизм их актива-
ции запускается в результате образования комплекса антиген —
антитело. В конечном счете действие комплемента приводит к ли-
зису чужеродных веществ и к активации лейкоцитов. Таким обра-
зом, комплемент вместе с антителами и специализированными
клетками участвует в защите организма хозяина от инфекций.
Явление отторжения пересаженных тканей, наблюдаемое у мле-
копитающих и птиц, обусловлено наличием антигенов гистосовмес-
тимости на поверхности практически всех клеток (за исключением
клеток эмбрионов и эритроцитов). Наиболее подробно они изучены
у человека и мышей. Это белки с большой гидрофобностью, кото-
рые кодируются рядом различных генных локусов (подобно изо-
ферментам). Часто эти гены находятся в хромосоме вблизи друг от
друга, образуя генные области. Для каждого генного локуса су-
ществует множество аллелей (альтернативные формы гена), что
обусловливает высокую степень полиморфизма.
Самые активные антигены гистосовместимости кодируются ге-
нами, расположенными в ограниченной области хромосомы,—
МНС (от англ, major histocompatibility complex). У человека эту
область обозначают HLA, у мышей — Н-2. Функции антигенов гис-
тосовместимости пока недостаточно изучены. Есть основание счи-
тать, что они участвуют в регуляции иммунной системы и системы
комплемента, а также во взаимодействиях между клетками.
Организм на протяжении своей жизни встречается со множест-
вом разных бактерий и антигенов, поэтому в норме плазма содер-
жит огромное число различных антител. В частности, иммунитет к
определенным бактериям или вирусам обусловлен присутствием со-
ответствующих «своих» специфических антител. Искусственный
238
активный иммунитет получают путем введения в организм убитых
бактерий, а также токсоидов — обработанных формальдегидом
(поэтому обезвреженных) токсинов дифтерийной или столбнячной
палочки. В результате прививок таким путем полученными вакци-
нами у человека вырабатываются специфические антитела, способ-
ные реагировать с определенным видом живых бактерий или есте-
ственным токсином, т. е. возникает иммунитет.
Наиболее активными в создании прочного искусственного имму-
нитета являются вакцины из живых ослабленных микробов. Их
получают путем выращивания патогенных микроорганизмов при
воздействии неблагоприятных факторов (прогревание при субоп-
тимальных температурах, добавление в питательную среду некото-
рых веществ и т. д.). Против ряда инфекций живые вакцины яв-
ляются практически единственным средством специфической про-
филактики (сибирская язва, туляремия, чума). Широко применяют
живые вакцины против оспы, бешенства, полиомиелита и многих
других заболеваний. В последнее время стали использовать также
химические вакцины, которые готовят путем экстрагирования ан-
тигенных фракций из культур соответствующих микроорганизмов.
Успешно проводят исследования по химическому синтезу антигенов,
значительно более простых по структуре, чем природные. Все более
реальным становится получение синтетических вакцин.
Временный пассивный иммунитет создается в результате введе-
ния антител, выработанных другим, иммунным организмом какого-
то животного. Для лечения дифтерии и столбняка, например, ис-
пользуют плазму иммунизированных лошадей, которая содержит
антитела к соответствующим токсинам.
Антитела образуются только у позвоночных животных, однако
это не означает, что беспозвоночные не обладают иммунитетом.
Иммунная система развилась из распознавания клеток друг другом
при помощи комплементарных поверхностных рецепторов, разли-
чения «своего» и «чужого». Так как иммунная система функциони-
рует во взаимодействии с комплексом гистосовместимости, их эво-
люция должна рассматриваться совместно.
У морских звезд и кольчецов происходит отторжение пересажен-
ной ткани, ее разрушение. У членистоногих имеются неиндуцируе-
мые механизмы агглютинации чужеродных веществ. Тимус и селе-
зенка, а с ними и антитела появляются только у позвоночных.
Строение цепей антител изменялось в процессе эволюции позвоч-
ночных животных. Бесчелюстные (или круглоротые, куда относятся
миноги и миксины) содержат иммуноглобулины с ц-подобными тя-
желыми цепями.
Даже самые примитивные иммуноглобулины состоят уже из не-
скольких, хотя и однотипных, полипептидных цепей. Однако субъ-
единицы у них еще не соединены дисульфидными мостиками.
IgM — один из древнейших классов иммуноглобулинов, он суще-
ствует у всех хрящевых и костистых рыб. У амфибий также найде-
ны антитела класса М, но, кроме того, у некоторых бесхвостых
амфибий обнаружены тяжелые цепи, напоминающие типы а или
239
10—937
6. Только у рептилий впервые появляются х- и Х-цепи. а-Цепи су-
ществуют у птиц и млекопитающих, а у — только у млекопитающих.
У них содержатся также разнообразные формы а-, у-, б- и е-цепей
и может наблюдаться экспрессия более чем одного класса в одной
клетке.
5.6. Диссимиляция белков
5.6.1. Расщепление белков в процессе пищеварения. Роль бел-
ков в питании. В организме человека и животных непрерывно
происходит разрушение клеток, расщепление и расходование бел-
ков: распад «устаревших» молекул белка всех тканей, шелушение
эпителия, рост ногтей, рогов, копыт, расход пищеварительных и
других ферментов, расход гормонов, образование антител и т. д.
Восполнение непрерывно расходующихся белков во всех этих про-
цессах возможно лишь при поступлении достаточного количества
их с пищей. Суточная потребность человека в белках составляет
80—100 г, а для людей физического труда — до 120—150 г, белков
животного происхождения из них должно быть не менее 50—70 г.
При недостатке белков быстро нарушается функционирование щи-
товидной железы, надпочечников, половых желез. Особенно чув-
ствительна к белковому голоданию центральная нервная система,
в первую очередь кора головного мозга. Даже при полном голода-
нии человека мозг и сердце долго не теряют в массе, обновляют
свои белки за счет их распада в мышцах, печени.
Различают белки пищи полноценные и неполноценные. Полно-
ценные белки содержат все 10 незаменимых аминокислот, которые
животные и человек в отличие от растений и микроорганизмов не
способны синтезировать. В процессе эволюции утратилась способ-
ность к их синтезу, так как эти аминокислоты поступали в организм
в достаточных количествах с растениями, микроорганизмами, дру-
гими животными.
К незаменимым аминокислотам относятся лизин, аргинин, гисти-
дин, валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин,
триптофан. Этот перечень требует некоторых примечаний. Аргинин
может синтезироваться в организме человека и других животных,
но происходит это в очень небольших количествах. Поскольку тиро-
зин образуется непосредственно из фенилаланина в одну стадию,
потребность в фенилаланине является фактически потребностью в
этих обеих аминокислотах, и тирозин можно отнести к незаменимым
аминокислотам. По этой же причине цистеин — заменимая амино-
кислота только в том случае, когда в пище есть метионин. Глицин,
являющийся заменимой аминокислотой для всех животных, неза-
меним для цыплят.
В неполноценных белках отсутствует одна или несколько неза-
менимых аминокислот. К полноценным белкам относят казеин мо-
лока, альбумин яйца, молочный альбумин, глутенин пшеницы, к
неполноценным — многие растительные белки (зеин кукурузы, ле-
гумин бобовых), они обычно бедны лизином, метионином, трипто-
290
фаном. Недостатком растительных белков является также то, что
в растительных продуктах содержание белков сравнительно неве-
лико, поэтому при вегетарианском питании (только растительными
продуктами) употребить их нужно очень много, чтобы покрыть су-
точную потребность организма в белках. Кроме того, некоторые
растительные белки плохо перевариваются.
Животные продукты содержат большие количества белков, и их
нужно сравнительно немного для обеспечения организма (особенно
важно, что животные белки являются обычно полноценными). Все
это объясняет, почему в суточном рационе более половины белков
должно быть животного происхождения.
Однако из сказанного не вытекает, что растительные белки сле-
дует игнорировать. В белках овощей достаточно много триптофана
и фенилаланина, белки картофеля обладают хорошим аминокислот-
ным составом, хотя содержание белков в клубнях невысокое —
около 2%. Кроме того, в белках разных растений отсутствуют раз-
личные незаменимые аминокислоты, поэтому смеси двух-трех рас-
тительных белков могут быть достаточно полноценными. Например,
смесь примерно из равного количества непросеянной муки куку-
рузы, сорго и семян хлопчатника с добавлением 3% дрожжей, а
также витамина А и СаСОз по питательности мало уступает ко-
ровьему молоку.
Наименьшее содержание белков в пище, при котором устанав-
ливается белковое равновесие (расходование белков организмом
компенсируется их поступлением с пищей), называется белковым
минимумом. Белковое равновесие сохраняется и при избытке бел-
ков в пище. Они не могут, подобно углеводам или жирам, откла-
дываться в запас, поэтому начинается усиленный распад белков,
выделение продуктов их диссимиляции с мочой и калом, пока не
установится равновесие. При этом в организме создается избыток
вредных кислых продуктов распада белка, происходит подкисление
тканей (ацидоз).
Одним из продуктов распада является мочевая кислота, которая
при избытке откладывается в суставах (заболевание подагрой).
Эти кислые вредные продукты нейтрализуются и выводятся из ор-
ганизма в соединении со щелочными минеральными веществами,
которых много в растительной пище — овощах, фруктах. Этим в
первую очередь и объясняется полезность сопровождения мясных
блюд растительными гарнирами, в чем люди на жизненном опыте
убедились с давних времен. Кроме того, избыточное односторон-
нее питание животными белками вызывает в кишечнике усилен-
ные гнилостные процессы с образованием токсических веществ.
Молочно-растительная пища благоприятно действует на кишечную
микрофлору, задерживает гнилостные процессы.
Переваривание белков. Организм использует не сами
поступающие с пищей белки, а продукты их расщепления — амино-
кислоты и простейшие пептиды. Белки пищи подвергаются гидро-
литическому перевариванию в «защищенных компартментах».
У простейших переваривание происходит в пищеварительных ва-
10*
291
куолях, у человека и животных—в просвете кишечника. Таким об-
разом, собственное содержимое животных клеток оказывается не
доступным гидролитическим пищеварительным ферментам. Послед-
ние синтезируются и секретируются в виде неактивных профермен-
тов — зимогенов.
После синтеза на рибосомах эндоплазматического ретикулума
особых секреторных клеток проферменты «упаковываются» в виде
зимогенных гранул, которые затем мигрируют к поверхности кле-
ток и секретируются в окружающую среду. Достигнув места своего
действия, зимогены превращаются в активные ферменты, иногда
под действием молекулы другого фермента, отсекающего от пред-
шественника фрагмент полипептидной цепи, так называемый пеп-
тид-ингибитор.
Переваривание белков начинается в желудке. У взрослого че-
ловека в желудок поступают секреты из протоков от 10 до 30 млн.
желудочных желез. Секреция осуществляется железами, образо-
ванными клетками трех типов: главными, мукозными и обкладоч-
ными. Главные клетки вырабатывают и секретируют пепсиноген,
мукозные — слизь, обкладочные клетки секретируют соляную кис-
лоту и у человека внутренний фактор — мукопротеин, необходимый
для нормального всасывания из кишечника поступающего с пищей
витамина В]2. Концентрация протонов в желудке в 106 раз больше,
чем в плазме крови. Точная природа механизма образования НС1
остается неизвестной. Простейшая гипотеза предполагает, что ме-
ханизм секреции сходен с механизмом транспорта протонов за
счет АТФ при функционировании внутренней мембраны митохонд-
рий. Большая роль в секреции НС1 отводится карбоангидразе.
Секрецию обкладочных клеток стимулируют гистамин и гормоны
гастрины. Последние вырабатываются в пилорической и привратни-
ковой частях желудка. Образование гастринов угнетается гормо-
ном слизистой двенадцатиперстной кишки — секретином и гормо-
ном гипоталамуса, присутствующим в поджелудочной железе,—
соматостатином.
Выдвинуто предположение о каскадном механизме регуляции
секреции кислоты в желудке. В основу этого предположения поло-
жена гипотеза о медиаторной роли гистамина для гастрина. Гаст-
рин индуцирует образование гистамина, который активирует аде-
нилатциклазу. Образовавшийся цАМФ активирует протеинкиназы,
одна из них фосфорилирует малоактивный изофермент карбоангид-
разы, что приводит к увеличению его активности, которая необходи-
ма для секреции НС1.
Основной протеолитический фермент желудочного сока — пеп-
син. Молекулярная масса его зимогенной формы — 40 000. Процесс
активации пепсиногена является аутокаталитическим и осуществ-
ляется под влиянием самого пепсина и резко кислой среды желу-
дочного содержимого. Молекулярная масса пепсина — 32 700, т. е.
меньше, чем у пепсиногена. При активации от N-концевой части
пепсиногена отщепляется 42 аминокислотных остатка в виде смеси
пептидов-ингибиторов. В желудке субстратами пепсина могут быть
292
как денатурированные белки после кулинарной обработки пищи,
так и нативные белки.
Пепсин гидролизует пептидные связи, образованные аминогруп-
пами циклических аминокислот: фен, три и тир. Пептидные связи,
образованные дикарбоновыми аминокислотами, гидролизуются
пепсином очень медленно. Оптимальным условием действия пепси-
на является pH 2—3. Если секреция НС1 не обеспечивает такой кис-
лотности, переваривание белков резко ухудшается. При желудоч-
ной ахилии оно вообще не происходит в желудке, так как в его
содержимом при этом нет ни пепсина, ни кислоты. В условиях in
vitro пепсин способен гидролизовать белки до отдельных амино-
кислот, но этот процесс требует большой затраты времени. Пиша
же в желудке находится ограниченное время, поэтому здесь про-
цесс переваривания белков останавливается на стадии образова-
ния смеси полипептидов.
Из слизистой желудка человека выделен протеолитический фер-
мент гастриксин. Он действует на белки примерно так же, как
пепсин, отличается меньшей молекулярной массой, менее кислым
оптимумом pH. У человека пепсин вызывает свертывание молока,
у жвачных животных эту функцию выполняет специфический фер-
мент, который находится в сычуге (четвертый отдел желудка) мо-
лочных телят и называется химозином или реннином. Исследования
структуры всех протеолитических ферментов желудка обнаружива-
ют значительную гомологию последовательностей, что указывает
на наличие у них общего предшественника.
Дальнейшему перевариванию белки подвергаются в слабоще-
лочной среде тонкого кишечника. Здесь их гидролиз катализируют
несколько ферментов: трипсин, химотрипсин, эластазы, пептидазы.
Трипсин и химотрипсин действуют эффективнее после пепсина,
однако они способны расщеплять белок и без его предварительно-'
го гидролиза пепсином. Благодаря этому больные после резекции
желудка сохраняют способность использовать пищевые белки.
Поджелудочная железа секретирует трипсиноген, химотрипси-
ноген (см. разд. 3.3), прокарбоксипептидазы А и В, проэластазу.
В кишечнике секретируется фермент энтерокиназа, которая осу-
ществляет специфично и быстро активацию трипсиногена в трип-
син. Энтерокиназа была впервые открыта и исследована Н. П. Ше-
повальниковым в лаборатории И. П. Павлова. Активация трипси-
ногена может происходить и аутокаталитическим путем самим три-
псином, однако этот процесс протекает медленнее в 2000 раз.
Роль энтерокиназы трудно переоценить, так как образующийся
трипсин служит активатором всех остальных протеолитических зи-
могенов в соответствующие активные формы. Трипсиноген образо-
ван одиночной полипептидной цепью. В процессе активации при
гидролизе в N-конце одной пептидной связи освобождается гекса-
пептид; происходит частичное изменение конформации молекулы,
появляется ферментативная активность и образуется трипсин.
Последовательность вал — (асп)$ — лиз отщепляемого гексапеп-
тида существует у трипсиногенов большинства позвоночных от рыб
293
до человека. Пепсин, трипсин и химотрипсин дополняют друг друга
по субстратной специфичности (см. разд. 3.3). Совместное их дей-
ствие приводит к глубокому гидролизу белков до небольших пеп-
тидов.
Карбоксипептидаза А — фермент, содержащий цинк, в основном
отщепляет С-концевые аминокислотные остатки с ароматическими
боковыми цепями. Она выделяется в виде прокарбоксипептидазы
А и активируется трипсином.
Карбоксипептидаза В также выделяется в неактивной форме.
Будучи активированной, она атакует С-концевые остатки, содер-
жащие только арг и лиз.
Проэластаза выделяется поджелудочной железой, превращает-
ся в эластазу под влиянием трипсина, действует на пептидные свя-
зи между остатками различных нейтральных аминокислот, особен-
но активна в отношении белка эластина.
Слизистая тонкого кишечника также содержит протеолитиче-
ские ферменты. Они могут секретироваться в кишечный сок, но
действуют преимущественно внутриклеточно. К этим ферментам
относится группа аминопептидаз, поочередно освобождающих N-
концевые аминокислоты. Лейцинаминопептидаза — экзопептидаза
со слабо выраженной специфичностью; это Zn-содержащий фер-
мент, который активируется также Мп2+. Слизистая кишечника со-
держит и дипептидазы, например глицилглицин-дипептидазу, акти-
вируемую Со2+ или Мп2+.
В результате комбинированного действия протеолитических
ферментов, выделяемых стенкой желудка, поджелудочной железой ,
и слизистой кишечника, белки, поступающие с пищей, подвергают-
ся в тонком кишечнике почти полному гидролизу до аминокислот.
Непрогидролизованные небольшие пептиды составляют очень
малую долю белков пищи. Они также могут всасываться из ки-
шечника, поэтому после переваривания белков содержание пеп-
тидного азота в крови несколько увеличивается. Проникновение
через слизистую кишечника в кровь нативных белков является
большим исключением. Оно может наблюдаться, например, при
скармливании животному белков сыворотки крови этого же вида.
После съедания большого количества яичного белка он появляется
в моче, при этом наблюдаются признаки интоксикации, отравле-
ния. У новорожденных большинства видов млекопитающих прони-
цаемость слизистой кишечника повышена, поэтому в кровь могут
поступать антитела молозивного молока. Эти примеры только под-
черкивают исключительность явления, крайне редко наблюдаемого
в природе всасывания белков из кишечника в кровь.
Всасывание аминокислот из кишечника. Вса-
сывание аминокислот происходит в основном в тонком кишечнике.
Это активный процесс, требующий энергии и зависящий от содер-
жания Na+ Существует более пяти специфических транспортных
систем, каждая из которых переносит наиболее близкие по строе-
нию аминокислоты. Аминокислоты конкурируют друг с другом за
294
участки связывания. Всосавшиеся в кишечнике аминокислоты по-
падают через портальную систему в печень.
Разложение белков при гнилостных процес-
сах в кишечнике. В ротовой полости и желудке в норме нет
условий для развития гнилостных бактерий. В кишечнике часть
аминокислот до всасывания используется микробами как источник
питания. При избыточном потреблении животных белков и ряде
патологий в кишечнике возможно развитие гнилостных и бродиль-
ных процессов. При декарбоксилировании аминокислот микробами
образуются амины, иногда ядовитые (путресцин, кадаверин). При
дезаминировании возникают различные продукты: насыщенные и
ненасыщенные кислоты, оксикислоты, кетокислоты.
Одним из основных условий декарбоксилирования аминокислот
бактериями является наличие кислой среды (pH 3,5—5,5). В ки-
шечнике же при нормальном функционировании среда слабоще-
лочная. Однако в результате инвазии некоторыми патогенными
бактериями возникают диспепсии (расстройства пищеварения, не
связанные с органическими изменениями желудочно-кишечного
тракта), при которых реакция среды в кишечнике подкисляется
(обычно локально) до pH 3—5. В подкисленных участках активно
развиваются процессы брожения.
При бактериальном разрушении цистина, цистеина и метионина
образуются сероводород (H2S), метилмеркаптан (CH3SH) и дру-
гие серосодержащие соединения. Из тирозина путем постепенного
укорочения его боковой цепи микроорганизмы могут образовывать
токсичные крезол и фенол. Эти вещества после всасывания через
систему воротной вены попадают в печень. Обезвреживание их
происходит при образовании парных соединений с серной или глю-
куроновой кислотами. Такие парные соединения нетоксичны, выде-
ляются с мочой.
Из аминокислоты триптофана при гниении белков образуются
индол и скатол. У скатола частично разрушена боковая цепь, ин-
дол полностью ее лишен. Кольцевая структура остается без изме-
нений.
Индол и скатол — ядовитые вещества, с которыми связан запах
кала, они также обезвреживаются в печени путем соединения с сер-
ной или глюкуроновой кислотами, предварительно окисляясь в со-
единения, содержащие гидроксильные группы (соответственно —
индоксил и скатоксил); в виде парных соединений они выводятся с
мочой.
5.6.2. Тканевые протеиназы животных. Протеолиз у растений и
микроорганизмов. Во всех животных тканях обнаружены активные
295
протеолитические ферменты как типа протеиназ (эндопептидазы,
пептидил-пептидгидролазы), так и пептидаз. Особенно большая их
активность отмечается обычно в интенсивно растущих или деля-
щихся клетках, а также в клетках желез и других органов, харак-
теризующихся высоким уровнем скорости белкового синтеза. Это
объясняется тем, что синтез тканевых белков в значительной мере
идет за счет аминокислот, образующихся при диссимиляции уста-
ревших белковых молекул. Наряду с доставкой пластического ма-
териала для биосинтетических реакций внутриклеточный протеолиз
может играть роль в специфических процессах: внутриклеточного
переваривания в ходе морфогенеза у насекомых и позвоночных, в
реакциях естественного иммунитета, образовании и распаде физио-
логически активных веществ (ферменты, гормоны). Последнее хо-
рошо иллюстрируется многочисленными примерами превращения
проферментов в активные ферменты, наличия во многих органах
и тканях протеиназ, расщепляющих избыточное количество от-
дельных гормонов.
Внутриклеточный протеолиз локализован в основном в лизосо-
мах, содержащих большой набор активных гидролаз, в том числе
и кислых протеиназ. Внутриклеточные протеиназы, гидролизующие
белки в слабокислой области pH, называются катепсинами, В на-
стоящее время различают пять достаточно хорошо охарактеризо-
ванных типов катепсинов, которые обозначают буквами А, В, Cf D,
Е. Они отличаются оптимумом pH, субстратной специфичностью и
рядом других свойств. На долю катепсина D у некоторых живот-
ных приходится около 2/3 общей протеолитической активности го-
могенатов селезенки, почек. В отличие от катепсинов В и С он не
относится к сульфгидрильным протеиназам, не ингибируется ре-
агентами на сульфгидрильные группы. Катепсин Е по субстратной
специфичности и другим свойствам близок к катепсину D.
Кроме катепсинов, являющихся кислыми тканевыми протеина-
зами, в различных органах и тканях обнаружены нейтральные и
щелочные протеиназы (в эритроцитах, легких, скелетных мышцах,
мозге). Их биологические функции и каталитические свойства ис-
следованы пока недостаточно. Особую группу внутриклеточных
протеиназ, имеющих оптимум в щелочной области pH, составляют
калликреины, широко распространенные в тканях и жидкостях
организма. Особенно активны они в крови, слюнных железах, под-
желудочной железе. Под действием калликреина плазмы образу-
ется брадикинин, а калликреинов поджелудочной и других желез —
каллидин (см. разд. 2.5.1), превращаемый в крови аминопептида-
зой в брадикинин.
Протеиназы высших, растений в большинстве случаев относятся
к сульфгидрильному типу, активируются цистеином, глутатионом
и другими восстановителями. Оптимальная зона их действия нахо-
дится в слабокислом, нейтральном и слабощелочном pH и во мно-
гом зависит от природы субстрата. Типичный представитель — па-
паин из сока плодов дынного дерева (Carica papaya). Значительно
реже встречаются растительные протеиназы, не активируемые вос-
296
становителями. Протеиназы насекомоядных растений (росянка, не-
пентес) имеют резко кислый оптимум pH 3—3,5.
Микроорганизмы образуют в основном секретируемые протеина-
зы (экзоцеллюлярныё), которые обеспечивают их низкомолекуляр-
ными продуктами распада белков окружающей среды. Внутрикле-
точными являются в основном пептидазы, которые расщепляют пеп-
тиды, проникшие в клетку из внешней среды. Значительно реже
обнаруживаются внутриклеточные протеиназы. Широкой субстрат-
ной специфичностью обладают протеазы актиномицетов, гидроли-
зирующие как глобулярные, так и фибриллярные белки.
Препараты протеазы из Str. griseus в связи с универсальностью
их действия и большой активностью используют в промышленнос-
ти, лабораторной биохимической практике и выпускаются под на-
званием проназа (Япония, США) или протелин (СССР).
Хорошо исследованы и широко используют в лабораторной
практике и промышленности щелочные протеиназы Вас. subtilis —
субтилизины, поскольку они гидролизуют белки глубже и с боль-
шей скоростью, чем многие другие протеиназы (в том числе пепсин
и трипсин). Это типичные сериновые протеиназы, по строению ак-
тивного центра очень близкие к химотрипсину.
5.6.3. Дезаминирование и дальнейший катаболизм аминокис-
лот у животных, растений и бактерий. Образовавшиеся в резуль-
тате протеолиза белков аминокислоты подвергаются дальнейшим
превращениям. Начальной стадией катаболизма большинства ами-
нокислот является удаление а-аминогруппы либо путем переамини-
рования с кетокислотой (чаще всего а-кетоглутаровой), либо пу-
тем различных типов дезаминирования: окислительного, восстано-
вительного, гидролитического, внутримолекулярного.
При переаминировании а-аминогруппа аминокислоты перено-
сится к а-углеродному атому а-кетоглутаровой кислоты, значитель-
но реже пировиноградной или щавелевоуксусной. В результате
реакции образуются а-кетоаналог исходной аминокислоты и новая
аминокислота (см. разд. 5.2.3). Общий итог переаминировании раз-
личных аминокислот (кроме лизина и треонина) состоит в том, что
все их аминогруппы «собираются» в виде глутаминовой кислоты,
а у некоторых организмов — аспартата или аланина. Однако в ко-
нечном итоге эти две аминокислоты тоже вступают в реакцию с а-
кетоглутаровой кислотой и образуют глутамат, который передает
аминогруппы в заключительную серию реакций, ведущих к образо-
ванию конечных продуктов азотистого обмена. В дальнейшем ами-
ногруппы, собранные из разных аминокислот в L-глутаминовой кис-
лоте, освобождаются в виде ионов NH^.
Реакцию окислительного дезаминирования осуществляет специ-
фическая и активная L-глутаматдегидрогеназа:
L - Глутамат + НАД* (НАДФ+) + НаО ZZ а-Кетоглутарат +
+ NHt + НДДН (НАДФН) + Н+
297
Таким образом, как в реакциях аминирования кетокислот, пере-
аминирования, так и при дезаминировании ведущую роль играет
система глутаминовая кислота+*а-кетоглутаровая.
L-Глутаматдегидрогеназа особенно активна в цитозоле печени,
а также в митохондриях; является аллостерическим ферментом.
Ее активность повышается в присутствии АДФ, ГДФ и некоторых
аминокислот, подавляется такими эффекторами, как АТФ, ГТФ и
НАДН. У многих организмов окислительное дезаминирование мо-
жет осуществляться за счет флавиновых дегидрогеназ: оксидазы
L-аминокислот и оксидазы D-аминокислот. Однако существенного
вклада в обмен аминогрупп они не вносят, локализованы в эндо-
плазматической сети и микротельцах клеток печени и почек.
У высших растений основным путем дезаминирования аминокислот
также является окислительное дезаминирование, происходящее по
той же схеме, что и в печени животных. Оно свойственно грибам,
дрожжам, бактериям.
В растениях дезаминирование аминокислот может, кроме того,
осуществляться при участии полифенолоксидазы и полифенолов по
следующей схеме:
Дегидрогеназа Полифенолоксидаза
П R—С—СООН + Н2О =E=fc R—С—СООН + NH3
NH О
У бактерий, иногда у растений, встречаются другие три типа
дезаминирования:
NHB ОН
I I
Гидролитическое R—СН—СООН + Н2О -> R—СН—СООН + NH3
NHg
Восстановительное R—(!н—СООН + 2Н+ -> R—СН2 — СООН 4- NH3
NH2
Внутримолекулярное R—СН2—СН—СООН R-CH=CH—СООН + NH3
В анаэробных условиях под действием микроорганизмов — ам-
монификаторов аминокислоты разлагаются таким образом, что
одна окисляется, а другая восстанавливается и при этом выделяет-
ся аммиак:
298
NH3 NH2
R1—CH—СООН + R2—сн—СООН + H2O Ri—CO—COOH +
+ R2—CH2—COOH + 2NH3
Кетокислота вновь взаимодействует с одной исходной аминокис-
лотой. Образующиеся в результате катаболизма аминокислот ке-
токислоты и другие органические соединения подвергаются даль-
нейшей деградации, что приводит к образованию веществ, кото-
Нуклеотиды
Пурины-гли, гли, асп
Пиримидины -глн, асп
Липиды
фен, тир, лей,
лиз, три
Рис. 5.10. Основные пути метаболизма аминокислот
рые или включаются в цикл трикарбоновых кислот и служат энер-
гетическим материалом, или используются в качестве предшествен-
ников для синтеза метаболитов, в том числе биологически важных
соединений. Насколько разнообразны по своей природе образую-
щиеся из аминокислот продукты можно видеть из рис. 5.10.
Путей включения аминокислот в цикл Кребса несколько, и они
зависят от природы бокового радикала аминокислоты. Иногда одна
часть углеродного скелета аминокислоты включается в цикл Креб-
са через одни «ворота», а другая часть — через другие. Например,
углеродные каркасы фенилаланина и тирозина поступают в цикл
в виде фумаровой и ацетоуксусной кислот.
Таким образом, процесс дезаминирования аминокислот являет-
ся основным способом превращения азотистых веществ в безазо-
тистые соединения, которые могут быть затем использованы для
дальнейшей переработки в углеводы, жиры и другие соединения.
5.6.4. Конечные продукты азотного обмена, эволюционные и
экологические аспекты. В результате диссимиляции аминокислот
29Э
у всех живых организмов образуется аммиак. Однако, будучи ток-
сичным даже в самых малых концентрациях, он не накапливается
в клетке, а быстро удаляется либо путем выведения во внешнюю
среду, либо путем превращения в нетоксичные соединения. У мно-
гих организмов первичное связывание аммиака в клетках происхо-
дит путем образования амидов — глутамина и аспарагина. Как по-
казал выдающийся советский агрохимик Н. Д. Прянишников, этот
путь особенно характерен для растительных тканей, у которых в
форме указанных амидов запасается постоянно дефицитный для
растений азот. Однако и у животных образование глутамина (в
несколько меньшей мере аспарагина) широко представлено, обна-
ружено в мышцах, мозге, печени, почках млекопитающих, жиро-
вом теле и гемолимфе насекомых.
У животных и человека образующийся в разных тканях и орга-
нах глутамин поступает в кровь, а затем в печень и почки, т. е. яв-
ляется своеобразной транспортной формой аммиака и временным
его хранилищем. В последние годы обнаружено, что аспарагиновая
и глутаминовая кислоты могут амидироваться, находясь в составе
белковой молекулы, т. е. возможно амидирование белков.
Освобождающийся в тканях NH3 может сразу же использовать-
ся и на синтез новых аминокислот, чаще всего путем восстанови-
тельного аминирования (см. разд. 5.2.3).
У человека, а также всех млекопитающих, амфибий и ряда дру-
гих животных основным конечным продуктом азотного обмена,
выводимым из организма, является мочевина.
Еще в конце прошлого столетия И. П. Павлов, М. В. Ненцкий,
И. Залесский, С. С. Салазкин установили, что синтез мочевины
осуществляется в печени. Первая теория синтеза мочевины была
разработана М. В. Ненцким, в ней правильно утверждалось, что
исходными соединениями для образования мочевины являются
NH3 и СО2. В 30-х годах Г. Кребс, подробно исследуя цепь реак-
ций образования мочевины, нашел, что эта цепь имеет циклический
характер и существенную роль в процессе играет орнитин. В связи
с последним весь процесс биосинтеза мочевины получил название
орнитинового цикла,
В первой реакции цикла взаимодействуют NH3, СО2, две моле-
кулы АТФ с образованием карбомоилфосфата (см. разд. 5.2.2).
Фермент карбамоилфосфат-синтаза локализован в митохондриях
печени, донором азота для этого фермента может служить только
NH3. Карбамоилфосфат отдает свою карбамоильную группу орни-
тину, в результате образуется цитруллин. Эта реакция катализиру-
ется орнитин-карбамоилтрансферазой:
ОН nh2
I । Орнитин-карбамоил-
h2n—С—О~Р—он + H2N—СН2—СН2—СН2—СН—СООН -----*•
(И трансфераза
Карбамоилфосфат Орнитин
300
: nh2
=₽± H2N—C—NH—сн2—сн2—CH2—CH—COOH + H3PO4
II .
о
Цитруллин
Вторая NHs-группа будущей молекулы мочевины включается в
цикл с помощью аспарагиновой кислоты, образующейся за счет пе-
реаминирования между глутаминовой кислотой и оксалоацетатом.
Превращение глутаминовой кислоты в аспарагиновую катализиру-
ется ферментом аспартатаминотрансферазой. Аминогруппа аспара-
гиновой кислоты конденсируется с карбамильной группой цитрул-
лина. Реакция протекает в присутствии АТФ, катализируется арги-
ниносукцинат-синтетазой. В результате образуется аргининосукци-
нат, который затем обратимо расщепляется до аргинина и фума-
рата.
Аргинин расщепляется аргиназой до мочевины и орнитина, ко-
торый снова входит в цикл (рис. 5.11). Следовательно, для синтеза
одной молекулы мочевины нужны две молекулы NH3, одна молеку-
ла СО2 и три молекулы АТФ. Количество выделяемой из организма
мочевины находится в зависимости от количества белков в пище и
у взрослого человека в норме составляет 25—35 г/сут.
Далеко не у всех систематических групп животных основным
конечным продуктом белкового обмена является мочевина. В про-
цессе эволюции у разных видов животных в зависимости от усло-
вий жизнеобитания сформировались разные биохимические пути
образования экскретируемых конечных продуктов азотного обмена
(табл. 5.2). Таким образом, конкретные формы конечных продук-
тов азотного обмена определяются и уровнем эволюционного раз-
вития, и условиями внешней среды (среди последних главную роль
играет обеспеченность водой).
Таблица 5.2. Основные конечные продукты азотного обмена у разных
групп животных
Животные Главный конечный про- дукт белкового обмена Животные Главный конечный продукт белкового обмена
Водные беспозво- ночные Аммиак Черепахи Мочевина и моче- вая кислота
Костистые рыбы Аммиак, некоторое количество мочевины Насекомые Мочевая кислота
Пластинчатожа- берные Мочевина Наземные брюхо- ногие моллюски » »
Крокодилы Аммиак, некоторое количество мочевой кислоты Ящерицы
Эмбрионы амфи- бий Аммиак Змеи » £
Взрослые амфибии Млекопитающие Мочевина Птицы »
301
co^
NH3
2АТФ
X)
Карбамоил ф осфат-
синтетаза
но-,_о-сЧгШг
ОН
Карбамоил-
фосфат
Орнитинкарба-
моилтрансфераза
nh2
NH
NH2
АТФ
!=O
Аргинин<кукцинат-
синтетаза
СООН
NH
(сн2)3
HCNH2
H2N—C=N—СН
Н2
СООН
СИ Аспарагиновая
| 2 кислота
НС—NH2
(сн2)3
hcnh2
СООН
Оксалоацетат
СООН
Цитруллин
СООН
СООН
(СН2)3
HCNH2
СООН
Орнитин
О
H2N—C“NH2
Мочевина
NH
A NH2
Аргиназа । z
C=NH
Фумарат
Аргининосукци-
натлиаза
(СН2)
I
hcnh2
Аргинино-
сукцинат
Малат
о
СООН
Аргинин
Рис. 5.11. Орнитиновый цикл
Способность к обезвреживанию аммиака путем синтеза органи-
ческих соединений появилась у животных на определенной ступени
их эволюционного развития. У многих беспозвоночных, особенно
обитателей водоемов, аммиак и аммонийные соли составляют до
80% азотистых веществ, выделяющихся с мочой. Эта группа живот-
ных получила название аммониотелических. В условиях больших
объемов воды выделяющийся аммиак разводится до столь малых
концентраций, что они становятся нетоксичными. Аммиак образу-
ется у этих животных непосредственно в почечных канальцах в ре-
зультате расщепления глутамина и сразу же поступает в мочу:
302
Глутамин + Н2О—^Глутаминовая кислота + NH3. Для беспозво-
ночных характерно также выделение с мочой некоторого количества
аминокислот (до 25% от белков пищи). Видимо, азотный обмен
беспозвоночных недостаточно совершенен, они не способны полно-
ценно использовать белки пищи.
В значительной мере аммониотелическими животными являют-
ся также пресноводные костистые рыбы, система химического свя-
зывания аммиака у них развита еще слабо. У костистых морских
рыб на долю аммонийных солей приходится 40—60% суммарного
азота мочи. Кроме того, у них довольно много выделяется триме-
тиламиноксида O = N =(СН3)з- Его образование связано, види-
мо, с окислительным расщеплением холина.
Небольшое количество аммонийных солей (3—6% общего азо-
та мочи) обнаруживается и в моче человека, позвоночных живот-
ных. Однако для них это нетипичный конечный продукт азотного
обмена. При некоторых заболеваниях (например, при диабете) в
организме накапливаются кислые продукты метаболизма, насту-
пает ацидоз. В таких случаях количество аммонийных солей в моче
резко возрастает, NH3 используется для нейтрализации кислот.
При этом организм экономит расходование других, полезных для
него катионов (К, Mg и др.), поддерживает нормальное солевое
равновесие.
Большинство наземных позвоночных животных — млекопитаю-
щие, амфибии (во взрослом состоянии), хрящевые рыбы—образуют
группу уреотелических животных, основным конечным продуктом
азотного обмена у них является хорошо растворимая в воде моче-
вина. Птицы и наземные пресмыкающиеся потребляют ограничен-
ное количество воды, у летающих птиц она создает перегрузку мас-
сы, наземные рептилии обитают часто в засушливых местах. У них
моча представляет собой полужидкую массу, содержащую кристал-
лы плохо растворимой в воде мочевой кислоты. Такие организмы
называют урикотелическими. Кроме птиц и наземных рептилий к
ним относятся насекомые.
Образование мочевой кислоты, происходящее в печени и отчас-
ти в слизистой кишечника, представляет собой сложный процесс,
поскольку ему предшествует образование пуриновых циклов. При
этом два атома азота пурина дают амидные группы глутамина,,
один атом азота — аспартат и один — глицин (см. разд. 4.5.2).
У человека и приматов мочевая кислота присутствует в моче, но
в очень небольших количествах как конечный продукт обмена пу-
ринов (у человека в норме за сутки с мочой выделяется 0,6—0,7 г
мочевой кислоты). При заболевании подагрой резко увеличивается
содержание мочевой кислоты в крови, ее малорастворимая натрие-
вая соль откладывается в хрящах, сухожилиях, суставных сумках.
Отложение мочевой кислоты и ее солей (ураты) в виде камней
происходит также в почках. Возникновению подагры способствует
избыток мясной пищи, содержащей много пуриновых оснований.
Интересный пример зависимости азотного обмена от условий
жизни представляют собой двоякодышащие рыбы из тропических
303
водоемов. Во время жаркого периода года они зарываются в ил,
моча содержит много мочевины; в сезон тропических дождей, когда
реки заполняются водой, двоякодышащие рыбы освобождаются от
избытка мочевины, накопившейся во время засухи, и начинают, по-
добно многим другим рыбам, выделять аммонийные соли. У водных
черепах, живущих в сырых местах, выделяется мочевина, а у чере-
пах засушливых районов — мочевая кислота. У лягушек, живущих в
воде, головастик выделяет с мочой в основном аммонийные соли,
т. е. может быть отнесен к аммониотелическим животным. Взрослые
лягушки, с выходом на сушу, выделяют мочевину и являются урео-
телическими.
На образование конечных продуктов азотного обмена у птиц и
рептилий большое влияние оказывают условия их эмбрионального
развития — замкнутое пространство яйца, окруженного оболочка-
ми, непроницаемыми для воды. Количество воды в яйце очень не-
большое, образование токсичных аммонийных солей быстро при-
вело бы к гибели эмбриона. Синтез мочевины имел бы последст-
вием резкое повышение осмотической концентрации, что тоже
отрицательно сказалось бы на развитии эмбриона. И только обра-
зование малорастворимой в воде мочевой кислоты не влияет на
развитие эмбриона, она образует осадок, выключается из обмена.
Интересно, что в самый первый период развития эмбрион птиц
выделяет в среду аммонийные соли, затем мочевину и, наконец,
далее — мочевую кислоту, что сохраняется в течение всего постэм-
брионального пути. Таким образом, здесь наблюдается своеобраз-
ное биохимическое выражение известного биогенетического закона
Мюллера — Геккеля повторения филогенеза в онтогенезе.
У человека и млекопитающих уреотелический тип азотного об-
мена устанавливается уже во время эмбриогенеза. Образующаяся
у них мочевина поступает через плаценту в кровь матери и затем
почками удаляется из организма.
У большинства млекопитающих мочевая кислота, образующая-
ся в небольших количествах как конечный продукт обмена пури-
новых оснований, в дальнейшем окисляется с участием фермента
печени уратоксидазы до аллонтоина:
Мочевая кислота Аллантоин
У собак, например, почти весь пуриновый азот выделяется с
мочой в форме аллантоина. У человека, приматов и птиц нет ура-
токсидазы, поэтому мочевая кислота у них сама является конеч-
ным продуктом пуринового обмена. Свиньи кроме аллантоина выде-
ляют с мочой гуанин, так как у них мала активность гуаниндезами-
304
назы. В связи с этим у свиней описаны случаи гуаниновой подагры,
при которой кристаллы гуанина откладываются в суставах. Гуа-
нин является конечным продуктом метаболизма у пауков.
У многих животных (кроме млекопитающих) аллантоин может
подвергаться дальнейшему расщеплению с образованием аллантои-
новой кислоты (у некоторых рыб), а из нее — мочевины и глиокси-
ловой кислоты (амфибии, большинство рыб, пресноводные плас-
тинчатожаберные моллюски), аммиака (ракообразные, некоторые
морские беспозвоночные). С эволюционной точки зрения интересно
отметить, что по мере усложнения форм животных у них исчезают
отдельные ферменты расщепления мочевой кислоты; у человека и
приматов эти ферменты вообще отсутствуют.
Постоянным азотсодержащим компонентом мочи человека и
многих позвоночных является креатинин — ангидрид креатина (ме-
тилгуанидинуксусная кислота). Человек выделяет его 1,5—2,5
г/сут. Креатина особенно много в мышцах, где его макроэргиче-
ский фосфорный эфир (креатинфосфат) является основной формой
запасания энергии. А. В. Палладии впервые предположил, что в
синтезе креатина принимает участие аргинин. В наше время опыты
с использованием меченых атомов подтвердили это: синтез креа-
тина (он происходит в почках и печени) начинается с переноса
гуанидинового фрагмента аргинина на глицин, образовавшаяся
гуанидинуксусная кислота затем метилируется. Креатинин образу-
ется или непосредственно из креатина при отщеплении воды (1),
или из креатинфосфата при отщеплении Н3РО4(2):
NH2 HN------
C=NH C=NH
I pH<7 I
N—CH3 - H2O----------->• N—CH3 (j)
CH2 CH2
(L)OH ----
Креатин О
Креатинин
Креатинфосфат — H3PO4 Креатинин (2)
Сам креатин в моче взрослого человека обычно отсутствует или
содержится в очень небольших количествах. Однако существует
прямая зависимость между содержанием креатина (и креатин-
фосфата) в мышцах и креатинина в моче. Особенно устойчиво кор-
релирует содержание креатинина в моче с мышечной массой дан-
ного человека.
Выделение самого креатина с мочой достаточно часто наблюда-
ется в детском возрасте. Появление его в моче взрослых (креатин-
урия) является следствием той или иной патологии: различные
формы мышечной дистрофии, миозит (воспаление скелетных
мышц), диабет, гипертиреоз, авитаминоз Е. У женщин креатинурия
бывает при беременности и в раннем послеродовом периоде.
305
У беспозвоночных животных вместо креатинина в моче присут-
ствует аргинин, креатинин же обнаруживается крайне редко. Ме-
таболическую и энергетическую роль креатинфосфата у беспозво-
ночных животных выполняют различные другие фосфорилирован-
ные гуанидинсодержащие вещества, наиболее часто — аргининфос-
фат.
В моче человека также всегда содержится некоторое количест-
во (0,1—2 г в суточном объеме) гиппуровой кислоты. Очень много
ее в моче травоядных животных, так как она образуется из бен-
зойной кислоты, продукта расщепления ароматических соединений
растительных тканей.
О—NH—СН2—СООН
Гиппуровая кислота
Сравнение путей и механизмов катаболизма белков у разных
представителей живого мира позволяет заключить, что основные
черты этого процесса имеют много общего и исходного. Следова-
тельно, эти биохимические процессы сформировались на достаточ-
но ранних этапах эволюции до разделения единого потока живой
материи по отдельным руслам. В дальнейшем ходе эволюции раз-
ные таксономические группы, занимая определенные экологические
ниши, формировали специфические особенности белкового метабо-
лизма, которые способствовали их выживанию в конкретных со-
четаниях условий жизнеобитания, помогали полнее использовать
эти условия.
Высшие растения с их неподвижным образом жизни достаточно
быстро используют соли азота в зоне корневой системы, поэтому
эволюция их азотного обмена шла в направлении экономного ис-
пользования азота в условиях строго ограниченного его поступле-
ния в организм. В связи с этим растения не экскретируют продукты
обезвреживания аммиака во внешнюю среду. Аспарагин и глута-
мин являются у них запасными формами азота. Кроме детоксика-
ции аммиака и запасания азота аспарагин и глутамин важны так
же, как резервные формы дикарбоновых аминокислот, необходимых
для многих метаболических процессов. Не удивительно поэтому,
что содержание амидов в белках растений достигает очень больших
величин: в белках семян кукурузы и пшеницы количество дикарбо-
новых кислот составляет 35—45%, причем большая часть — в фор-
ме амидов.
У растений, отличающихся высоким содержанием органических
кислот в тканях (щавель, ревень), обезвреживание аммиака про-
исходит путем образования аммиачных солей органических кислот.
В тканях некоторых высших растений обнаружена и мочевина,
синтезирующаяся в орнитиновом цикле. Большие количества моче-
вины накапливают некоторые грибы (шампиньоны — до 13%).
306
Исследованиями известного биохимика и физиолога растений из
ГДР К. Мотеса (1962) показано относительно широкое распрост-
ранение у растений аллантоина. В некоторых растениях (ольха, бе-
реза, орешник и др.) накапливаются значительные количества цит-
руллина, в форме которого обезвреживается, видимо, аммиак.
Однако образование мочевины, аллантоина, цитруллина для расте-
ний в целом нетипично (все они не выделяются во внешнюю среду).
Много своеобразного и пока еще плохо исследованного сущест-
вует в соотношениях процессов катаболизма и биосинтеза белков у
бактерий. Долгое время ставили под сомнение возможность приме-
нения для них термина «обновление белков», предполагали ста-
бильность некоторых белков (в границах жизни клетки). Только в
60-х годах было достоверно показано, что в живых, но не размно-
жающихся клетках Е. coli и дрожжей происходит обновление бел-
ков. Установлено, что в клетках Е. coli в логарифмической фазе
роста деградация белка происходит со скоростью около 3% в расче-
те на одну генерацию. При этом скорость деградации часто не
зависит от физиологического состояния клетки. Видимо, концентра-
ция белков в бактериальных клетках есть функция прежде всего
процессов их биосинтеза.
При дезаминировании аминокислот у бактерий наряду с общими
для всех живых организмов путями дезаминирования функциони-
руют специфичные для бактерий: восстановительный, гидролити-
ческий, внутримолекулярный. Характерно для ряда бактерий и при-
сутствие высокоактивных малоспецифичных оксидаз L- и D-ами-
нокислот. Многие микроорганизмы (прежде всего — анаэробные)
сбраживают аминокислоты, используют их не только как строи-
тельный материал, но и как источник энергии. Известны бактерии,
специализирующиеся на сбраживании пуриновых и пиримидино-
вых оснований, мочевой кислоты.
Принципиальное различие между бактериями и животными на-
блюдается в отношении регуляции метаболизма аминокислот.
У бактерий, когда они попадают в среду, богатую всеми аминокис-
лотами, происходит репрессия синтеза тех ферментов, которые уча-
ствуют в синтезе аминокислот. Когда же богатую аминокислотами
пищу получают животные, у них активируются процессы деграда-
ции аминокислот.
5.7. Алкалоиды
К алкалоидам принадлежат вещества растительного происхож-
дения, содержащие азот в составе цикла и являющиеся органиче-
скими основаниями. В растениях они образуют соли с органически-
ми кислотами, хорошо растворимые в воде.
Общим свойством для всех алкалоидов является способность
оказывать сильное физиологическое действие на организм человека
и животных. Большинство алкалоидов в малых дозах оказывают
возбуждающее действие на нервную систему, а в больших — угне-
тающее. Многие из них являются сильными ядами (кураре).
307
Исследования А. А. Шмука в СССР (1948) и К. Мотеса (1969)'
в ГДР показали, что в процессе жизнедеятельности растений алка-
лоиды подвергаются активным ферментативным превращениям и
не инертны в обмене веществ, как предполагали ранее. Они явля-
ются, видимо, определенной промежуточной формой в ходе превра-
щения азотистых соединений в растениях, в которой азотистые
продукты обмена веществ обезвреживаются и сохраняются. Уста-
новлена роль некоторых алкалоидов табака (например, никотина)
как исходного материала для синтеза пиридиновых дегидрогеназ.
Существуют экспериментальные данные, свидетельствующие о воз-
можном участии алкалоидов в окислительно-восстановительных
реакциях, происходящих в растениях. Предшественниками для
синтеза многих алкалоидов служат аминокислоты (тирозин, трип-
тофан и др.).
По своему строению алкалоиды весьма разнообразны, их делят
на группы в зависимости от химической природы азотистого гете-
роцикла.
Важнейшим представителем группы производных хинолина яв-
ляется хинин. Он содержится в коре хинного дерева и применяется
в медицине при лечении малярии.
Морфин и кодеин, представители группы изохинолиновых алка-
лоидов, содержатся в опии — млечном соке опийного мака. К груп-
пе алкалоидов — производных индола — относится стрихнин, содер-
жащийся в семенах чилибухи. Большие дозы стрихнина вызывают
появление сильных судорог и смерть от паралича дыхания.
Одним из представителей алкалоидов группы тропана является
атропин, содержащийся в растениях семейства пасленовых: красав-
ке, белене, различных видах дурмана. Широко применяется в меди-
цине. Под действием атропина происходит сильное расширение
зрачков, что используют при исследовании глазного дна. В тера-
певтических дозах он возбуждает дыхание, учащает сердечные со-
кращения.
В молекуле никотина соединены между собой пиридин и пирро-
лидин. Никотин — бесцветная, маслянистая жидкость, действует на
центральную и периферическую нервную систему. При отравлении
им наступает смерть от паралича дыхания.
В последнее время появились сведения об обнаружении алка-
лоидов и у животных, например в кожных выделениях некоторых
ядовитых лягушек.
ГЛАВА 6
УГЛЕВОДЫ
6.1. Строение, классификация, роль
в живой природе
Углеводами называют альдегиды и кетоны многоатомных
спиртов и полимеры этих соединении/ Появление термина «углево-
ды» связано с тем, что первые исследованные представители этого
класса оказались как бы соединением углерода с водой и имели
формулу Сл(Н2О)л. По мере открытия новых углеводов обнаружи-
ли, что не все они удовлетворяют этой формуле: в состав некото-
рых из них С, Н и О входят в иных соотношениях, а иногда присут-
ствуют N, S, Р. В то же время некоторые представители других
классов обладают такой же формулой, например уксусная кислота
С2Н4О2..
В 1927 г. Международная комиссия по реформе химической но-
менклатуры предложила заменить термин «углеводы», как не от-
ражающий ни химической природы, ни состава этого класса соеди-
нений, термином «глициды», однако он не получил широкого
распространения. В правилах биохимической номенклатуры Меж-
дународного химического союза (ШРАС), опубликованных в
1978 г., этот класс соединений по-прежнему именуется «углеводы».
? В биосфере углеводов больше, чем всех других органических
соединений, вместе взятых. В растительном мире на их долю при-
ходится 80—90% из расчета на сухое вещество. В животном орга-
низме углеводов содержится около 2% массы тела, но значение их
одинаково велико для всех живых организмов, о чем свидетельст-
вуют те важные функции, которые они выполняют. 3
^Углеводы являются теми продуктами, которые Образуются пер-
вично в зеленом растении из СО2 и Н2О за счет энергии солнечного
света и дают начало другим органическим веществам живых ор-
ганизмов. Функции углеводов разнообразны и важны. _]
Энергетическая. Окисляясь в процессе дыхания, углеводы выде-
ляют заключенную в них энергию и обеспечивают значительную
часть потребности организма в ней. При окислении 1 г углеводов
выделяется ~ 16,9 кДж энергии.
Пластическая. Углеводы используются на синтез многих важ-
ных для организма веществ: нуклеиновых кислот, органических
кислот, а из них — аминокислот и далее белков, липидов и т. д.
Защитная. Углеводы — основные компоненты оболочек расти-
тельных тканей, они участвуют в построении наружного скелета
309
насекомых и ракообразных, в образовании клеточных стенок
бактерий и клеточных мембран всех живых организмов (в виде
комплексов с белками).
Опорная. Целлюлоза и другие полисахариды оболочек расти-
тельных клеток не только защищают клетки от внешних воздейст-
вий, но и образуют прочный остов растения, его механические,
опорные ткани. В комплексе с белками углеводы входят в состав
хрящевых тканей (хондроитинсульфаты) и других соединительно-
тканных образований, выполняющих опорные функции у человека
и животных.
Регуляторная. Клетчатка, вызывая механическое раздражение
кишечника, способствует его перистальтике (движение) и тем са-
мым улучшает пищеварение. Взаимопревращения крахмала и са-
харов в замыкающих клетках устьиц растений регулируют движе-
ние последних, т. е. замыкание и раскрытие устьиц. Моносахариды
играют существенную роль в регуляции осмотических процессов.
Особенно интересны специфические функции углеводов. Как
уже указывалось в разделе о гликопротеинах, углеводсодержащие
соединения служат маркерами в процессах узнавания^молекулами
и клетками друг друга, определяют антигенную специфичность,
обусловливают различия групп крови. Некоторые углеводсодержа-
щие биополимеры являются рецепторами для связывания различ-
ных токсинов, бактериальных клеток, вирусов, гормонов. В пос-
ледние годы выясняются рецепторные функции углеводсодержа-
щих соединений в нервной ткани. В мембранах нервных окончаний
обнаружено сравнительно высокое содержание гликопротеинов,
которые участвуют в проведении нервного импульса и служат ре-
цепторами для некоторых фармакологически активных соединений.
Получены данные, подтверждающие участие углеводсодержа-
щих биополимеров в межклеточной адгезии, агрегации и морфо-
генезе. Углеводный компонент может определять и другие свой-
ства молекул живой клетки: повышать стабильность многих фер-
ментов— гликопротеинов, служить антифризом в крови и мыш-
цах антарктических рыб, выполнять роль антикоагулянта,
оказывать противоопухолевое действие (некоторые (3-1,3-гликаны,
гликопротеин «фактор TNF»).
Углеводы выполняют также функцию запасных питательных ве-
ществ. Они способны откладываться в организме в виде гликогена
(у человека и животных), крахмала и фруктозанов— (у растений),
которые расходуются по мере надобности. Так, в печени регулярно
питающегося животного может накапливаться гликоген до 10% от
массы ткани; содержание его при голодании снижается до 0,2%.
Углеводы обычно подразделяют на моносахариды, олигосаха-
риды и полисахариды (гликаны).
К моносахаридам относятся углеводы и их производные, кото-
рые не способны расщепляться без потери основных углеводных
свойств.
Олигосахариды (полисахариды I порядка) гидролизуются с об-
разованием небольшого числа моносахаридов (от 2 до 10).
310
Полисахариды II порядка (гликаны) представляют собой высо-
комолекулярные полимеры моносахаридов и их производных с
различным составом и строением. Число остатков моносахаридных
единиц в них от 10 до нескольких тысяч.
Большие заслуги в области изучения строения углеводов, осо-
бенно моносахаридов, принадлежат крупнейшему немецкому хими-
ку Э. Фишеру (1891). В Советском Союзе интересные и успешные
исследования углеводов долгое время возглавлял Б. Н. Степаненко.
6.2. Моносахариды
6.2.1. Классификация и номенклатура, строение молекулы. Су-
ществует несколько принципов классификации моносахаридов:
моносахариды делят на альдозы и кетозы в зависимости от нали-
чия в них альдегидной или кетонной группы; возможно деление по
числу углеродных атомов, входящих в состав молекулы (триозы,
тетрозы, пентозы, гексозы, гептозы, октозы и т. д.)-.
Сахара, содержащие более семи углеродных атомов, называют
высшими сахарами. По химической природе все моносахариды де-
лят на нейтральные (содержат только карбонильные и спиртовые
группы); кислые (содержат еще и карбоксильные группы) и амино-
сахароза, в которых кроме карбонильных и спиртовых групп есть
еще и аминогруппа, обусловливающая основные свойства этих
соединений. Известны также полифункциоцальные сахара, содер-
жащие в своем составе помимо карбонильных и гидроксильных
групп одновременно и карбоксильную и аминогруппы, как напри-
мер, нейраминовая кислота.
В основу наименований разнообразных представителей моно-
сахаридов в большинстве “случаев положены тривиальные назва-
ния нейтральных сахаров (ксилоза, рибоза, глюкоза, фруктоза). От
них производятся наименования аминосахаров (глюкозамин, га-
лактозамин) и карбоксилсодержащих сахаров (глюкуроновая кис-
лота, манноновая кислота, галактаровая кислота). Тривиальные
названия моносахаридов обычно складываются из двух частей:
корень, указывает на какое-либо свойство данного сахара или его
происхождение, а окончание -оза— на его принадлежность к угле-
водам. Например, название «фруктоза» указывает на содержание
этого моносахарида во фруктах.
Наименованиям кетоз придается окончание -у лоза, например,
кетоза С4 — тетрулоза, кетоза С5 — пентулоза. Часто в названиях
моносахаридов сочетаются два принципа — указывается как нали-
чие альдегидной или кетонной группировки, так и число атомов
углерода: альдопентоза, кетогексоза.
Для обозначения разнообразных производных моносахаридов
нумеруют атомы углерода, начиная от альдегидной группы или с
того конца, к которому ближе кетогруппа, и положение заместите-
лей указывают цифрой, а также тот атом, с которым связан замес-
титель, если он не связан непосредственно с углеродом. Например:
2-дезокси-2-амино-3,4-ди-0-метилглюкоза.
311
c^Q
(1)|\н
н—(2)C—nh2
H3C—О—(3)С—н
Н—(4)С—о—СНз
Н—(5)С—он
(6)СН2ОН
Всем моносахаридам, начиная с триоз, присуща стереоизомерия,
они существуют в двух энантиомерных формах: D и L. Принадлеж-
ность моносахарида к D- или L-ряду определяется по расположе-
нию ОН-группы у последнего (считая от альдегидной или кето-
группы) хирального атома углерода. Если она расположена
справа от углеродной цепи, то молекулу относят к D-ряду, если сле-
ва — к L-ряду. Обозначения D и L не служат указанием на направ-
ление вращения плоскости поляризации. Некоторые моносахари-
ды, отнесенные к D-ряду, являются левовращающими, а многие
представители L-ряда — правовращающими. Чтобы указать и при-
надлежность моносахарида к D- или L-ряду и направление вра-
щения плоскости поляризации, после символов D или L перед
названием сахара в скобках ставят знак ( + ) или (—), обозна-
чающий правое или левое вращение.
В живых организмах моносахариды присутствуют в преобла-
дающем большинстве случаев в D-конфигурации. Исключение сос-
тавляют L-арабиноза, относительно редко встречающиеся L-moho-
сахариды у бактерий, L-рамноза и L-сорбоза растений.
неон
I
носн
носн
I
неон
’ I
сн2он
D (+) -Галактоза
CZ
|\н
носн
I
неон
неон
I
носн
I
сн.2он
Ь (—)-Галактоза
СН2ОН
С-0
носн
неон
I
неон
сн.2он
D (—)-Фруктоза
сн2он
i=o
нсЬн
носн
носн
сн2он
L (+)-Фруктоза
Так как число стереоизомеров для альдогексоз с четырьмя хи-
ральными центрами равно 24, т. е. шестнадцати, то их можно сгруп-
пировать в восемь пар энантиомеров. D- и L-изомеры каждой из
8 пар энантиомеров альдогексоз имеют одинаковые химические и
физические свойства и отличаются только направлением враще-
ния плоскости поляризованного света.
312
Эквимолярная смесь энантиомеров (D- и L-форм) называется
рацемической смесью или рацематом и не обладает оптической ак-
тивностью. Если сравнивать стереоизомеры моносахаридов, не
являющихся энантиомерами, различия в структуре между ними дос-
таточны для того, чтобы у этих моносахаридов были разные хими-
ческие свойства, а также температура плавления и кипения, раст-
воримость и т. д. Такие пары стереоизомеров называют диастерео-
мерами, Например, D-манноза является энантиомером по отноше-
нию к L-маннозе и диастереомером по отношению к 14 другим
гексозам (D- и L-формы галактозы, глюкозы, гулозы, идо-
зы и т. д.).
Диастереомеры, отличающиеся по конфигурации только при
одном из нескольких хиральных центров, называются эпимерами.
В природе особенно часто встречаются такие эпимеры: глюкоза и
галактоза (различия по конфигурации только С-4), глюкоза и
манноза (различия по С-2). Часто к последней паре эпимеров до-
бавляют и фруктозу, хотя это неправильно — различия между
фруктозой и глюкозой имеют структурный характер. Превращение
одного эпимера в другой получило название эпимеризации.
Предложенные Э. Фишером формулы сахаров с прямой угле-
родной цепью удобны для изображения изомерных форм и демон-
страции общих свойств моносахаридов. Однако они не отражают
всех свойств этих соединений. Кроме того, они не объясняют яв-
ления мутаротации, которое заключается в изменении величи-
ны удельного вращения при растворении моносахаридов в
воде.
Московский профессор М. А. Колли (1870) для объяснения яв-
ления мутаротации впервые высказал предположение о существо-
вании циклического строения молекулы углеводов. Эта гипотеза
впоследствии была подтверждена исследованиями немецкого хи-
мика Б. Толленса.
В настоящее время твердо установлено, что в природе только
небольшая часть молекул пентоз и гексоз содержит открытую цепь,
большинство молекул находится в виде циклических структур.
Образование последних становится понятным, если вспомнить, что
четыре ковалентные связи углерода образуют тетраэдр, поэтому
углеродная цепь не представляет собой прямую, а существенно
изогнута, что способствует взаимодействию между карбонильной
и гидроксильной группами с образованием цикла. Такая реакция
характерна для всех моносахаридов с числом углеродных атомов
больше четырех. При замыкании молекулы моносахарида в цикл
происходит внутримолекулярная реакция образования полуацеталя
или полукеталя.
О Н
R—(f +но—СН2—R^R—С-ОН
' O-CH2-R1
Альдегид Спирт Полуацеталь
313
а-Глюкоза
Образование циклических структур
В зависимости от того, гидроксильная группа какого из угле-
родных атомов принимает участие в образовании полуацеталя или
полукеталя, могут получаться пятичленные циклы (из четырех ато-
мов С и одного атома О) или шестичленные (из пяти атомов С и
одного атома О). Эти структуры называются, соответственно, фу-
ранозными или пиранозными, по аналогии с известными органи-
ческими соединениями — фураном или пираном.
Для моносахаридов ряда пентоз обычно характерен фураноз-
ный цикл, в то время как большинство гексоз находится в пираноз-
ной форме. Образование семичленных колец у гексоз наблюдается
редко из-за значительного напряжения связей в таком цикле.
В процессе образования внутримолекулярного полуацеталя или
полукеталя в молекуле пентоз и гексоз появляется еще один хи-
ральный центр и новая пара изомеров (а- и p-формы), которые на-
зывают аномерами (от греч. ано — верхний, считая сверху, карбо-
нильные группировки в формулах моносахаридов располагаются
вверху).
Аномерные пары отличаются по расположению в пространстве
заместителей только у аномерного углеродного атома, поэтому их
можно рассматривать как частный случай эпимеров, а- и р-Аномер-
ные формы различают по расположению полуацетального (или
полукетального) гидроксила и гидроксила последнего хирального
углерода. Если они расположены по одну сторону от углеродной
цепи (цис-положение), это будет a-аномер; если эти гидроксилы
находятся по разные стороны от углеродной цепи (транс-положе-
ние) — p-аномер. Атом углерода, участвующий в образовании полу-
ацеталя (полукеталя), называется полуацетальным (полукеталь-
М4
/?-Пираноза
р -Фураноза
Рис. 6.1. Взаимопревращения различных форм глюкозы в водном
растворе
ным), или аномерным, а образующийся гидроксил — полуацеталь-
ным (полукетальным), или гликозидным.
Каждая гексоза образует четыре циклические формы (а- и р-фу-
ранозную и а- и p-пиранозную), находящиеся в растворе в дина-
мическом равновесии с ациклической формой. Так, в водном раст-
воре глюкозы присутствуют одновременно все его формы (четыре
циклические и одна нециклическая, альдегидная). При этом коли-
чество нециклической формы составляет менее 1%. Все эти формы
способны взаимно превращаться друг в друга через оксоформу
(т. е. нециклическую форму) глюкозы (рис. 6.1).
У кетогексоз в образовании полукеталя принимает участие кар-
бонильная группа и гидроксил у^Сл5._или С-6, в результате чего
также образуется фуранозная или пиранозная формы сахара. Пи-
ранозные формы гексоз и пентоз значительно более устойчивы, чем
фуранозные, поэтому в растворе всегда существенно преобладают
315
первые. Однако в составе олиго- и полисахаридов гексозы могут
присутствовать и в фуранозной форме (например, фруктофураноза
в молекуле сахарозы). Естественная тенденция гексоз и пентоз к
циклизации обеспечивает образование устойчивых полимеров из
чрезвычайно реакционноспособных неустойчивых мономеров.
Образование моносахаридами циклических форм объясняет
«аномалии» в их поведении как альдегидов или кетонов.
1. В циклической форме у сахаров нет свободной карбонильной
группы, поэтому они не дают некоторые цветные реакции на альде-
гиды.
2. Полуацетальный и полукетальный гидроксилы в отличие от
других гидроксилов в молекуле сахара образуют со спиртами легко
гидролизуемые простые эфиры.
3. D- и L-Формы каждого моносахарида существуют в виде
а- и p-изомеров, поэтому образуется не 2, а 4 ряда производных.
4. а- и p-Формы моносахаридов, обладающие разной величи-
ной оптического вращения, в процессе растворения в воде взаим-
но переходят друг в друга, поэтому удельное вращение ме-
няется до установления равновесия. В результате этого в первое
время после растворения обнаруживается много значений удельно-
го вращения, отсюда название явления—мутаротация или мульти-
ротация (от лат. multirotatia — много вращений). Так, при раство-
рении в воде a-D-глюкозы ([а]р = +112,2°) и p-D-глюкозы
([а] ^ = + 18,7°) удельное вращение меняется до установления
равновесия (36% а-формы, 64% p-формы и следы нециклической
формы), в момент которого оно достигает величины +52,7°.
Более совершенный способ изображения циклических форм мо-
носахаридов в виде проекционных формул был предложен В. Хе-
уорсом (1927). Примером проекционной формулы Хеуорса являет-
ся структура II, представленная ниже. При таком изображении
считают, что углеродный остов молекулы вместе с этерифициро-
ванным кислородом лежат в одной плоскости. Связи, расположен-
ные ближе к наблюдателю, обозначаются более жирными линиями.
Атомы углерода в кольце не пишутся, а иногда опускаются и ато-
мы водорода. Для обозначения конфигурации замещающих групп
их располагают выше или ниже плоскости кольца.
При переходе от формул Фишера (структура /) к проекцион-
ным формулам Хеуорса (структура II) используют следующие пра-
вила: 1) заместители, находящиеся справа от углеродного скелета
молекулы при ее линейном изображении, помещаются ниже плос-
кости кольца при изображении молекулы в циклической форме;
а заместители, находящиеся слева, занимают положение выше
плоскости кольца; 2) обратное правило применяется только для
углеродного атома, ОН-групиа которого участвует в образовании
циклического полуацеталя. Это исключение возникает потому, что
линейные формулы типа I не дают правильного представления о
структуре. Структурная идентичность линейной и циклических
формул будет понятнее, если изобразить линейную формулу, как
316
показано на структуре III. Ниже представлены различные способы
изображения молекул а- D-глюкопиранозы.
неон
HtffoH
носн
неон
нАо---
сн2он
a-D-Глюкопираноза
(П)
a-D-Глюкопираноза
(Ш)
a-D-Глюкопираноза
(I)
В такой формуле расположение заместителей при С-5 соответ-
ствует правилу для всех остальных углеродных атомов. Однако и
проекционные формулы Хеуорса являются лишь приближенными,
так как в действительности углы между валентностями атомов
углерода равны 120°. Эти формулы не отражают пространственно-
го расположения атомов в молекуле сахаров. В природе пирановое
кольцо не является плоским, вследствие изгибов его плоскости мо-
жет возникнуть большое число конформаций, однако стабильными
из них являются восемь: шесть в форме лодки (обозначают бук-
вой ^Вгот англ, boat — лодка) и две в форме кресла (С, от англ.
chair — кресло) (рис. 6.2.).
Различные заместители у атомов углерода могут располагаться
как в экваториальной, так и в аксиальной плоскостях, придавая
соединению неидентичные свойства. Экваториальные, т. е. зани-
мающие положение, близкое к плоскости молекулы, ОН-группы
пираноз этерифицируются гораздо легче, чем аксиальные, зани-
мающие положение, близкое перпендикулярному плоскости мо-
лекулы.
«Кресло» является более жесткой, устойчивой конформацией, а
форма «лодки» более под-
вижна, существует несколь-
ко ее вариантов. Хуже иссле-
дованы конформации фура-
ноз. Полагают, что фураноз-
ное кольцо может существо-
вать или в конформации
«конверт» (четыре атома в
одной плоскости, а один вы-
ступает из нее), или в «скру-
ченной» («твист») форме,
когда три атома лежат вод-
ной плоскости, а два высту-
пают из нее.
ца:
а — аксиальная связь, э — экваториальная связь
317
6.2.2. Физические и химические свойства. Моносахариды—твер-
дые, бесцветные, кристаллические вещества, хорошо растворимые
в воде и плохо растворимые (или даже совсем нерастворимые)
в органических растворителях (спирт, эфир). Всем им присущ
сладкий вкус, но сладость сахаров неодинакова. Если сладкий
вкус сахарозы принять за 100%, то у фруктозы он будет равен
173%, глюкозы — 74, ксилозы — 40, лактозы — 16%. Растворы
моносахаридов обладают нейтральной реакцией.
Действие кислот и оснований на моносахариды. Моносахариды
устойчивы в горячих разбавленных растворах неорганических кис-
лот, что позволяет количественно ввделять иХ в неизмененном ви-
де при гидролизе полисахаридов. Под действием концентрирован-
ных кислот моносахариды дегидратируются и дают циклические
альдегиды — фурфурали. При этом'из гексод образуется гидрокси-
метилфурфурол, а из пентоз — фурфурол.
^-D-Рибоза
Фурфурол
Р-D-Глюкоза
5-0 ксиметилфурфурол
Образующиеся фурфурали могут вступать с фенолами или их
производными в реакцию конденсации, давая окрашенные про-
дукты. Это свойство положено в основу некоторых цветных реак-
ций на сахара. Кетоаы образуют гидроксиметилфурфурол с боль-
шей скоростью, чем альдогексозы, на этом основано определение
кетогексоз по Селиванову.
Разбавленные водные растворы оснований при комнатной тем-
пературе вызывают перегруппировку относительно аномерного
атома углерода и соседнего с ним, не затрагивая замещающих
групп при других углеродных атомах, т. е. происходит эпимериза-
ция. Переход осуществляется через енольную форму, одинаковую
для всех трех сахаров. При проведении этой реакции обычно ис-
пользуют растворы Ва(ОН)2 или Са(ОН)2.
318
СН(ОН)
II
сон
I
HOCH
D-Глюкоза ч* НСОН ч* D-Манноза
I
НСОН
I
СН2ОН
Енольная форма
1!
D-Фруктоза
При нагревании с разбавленными щелочами или при высоких
их концентрациях свободные моносахариды подвергаются внутри-
молекулярным перегруппировкам, фрагментации и конденсации.
При конденсации сахаров образуются окрашенные продукты (от
желтых до темно-коричневых), причем интенсивность окраски за-
висит от концентрации углевода. Это свойство используют для ко-
личественного определения сахаров в моче по Альтгаузену.
Окисление сахаров. При окислении альдоз в кислой среде обра-
зуется три класса сахарных кислот: альдоновые, альдаровые и
альдуроновые.
!---------------D - Глюкоза-----------.
til zO
СООН СООН с<
I-' I 1ХН
НСОН > НСОН НСОН
I I I
НОСН НОСН НОСН
I I I
НСОН НСОН НСОН
I I I
НСОН НСОН НСОН
\| I I
<Н2ОН СООН СООН
Глюконовая Глюкаровая Глюкуроновая
кислота кислота кислота
В присутствии слабых окислителей (гипоиодит натрия, бромная
вода) или под действием специфических ферментов у альдоз окис-
ляется альдегидная группа и образуются альдоновые кислоты
(например, из глюкозы — глюконовая, из маннозы — манноновая).
Глюконовая кислота в виде кальциевых солей применяется в ме-
дицине. Ее фосфорилированная форма играет важную роль в ка-
честве промежуточного продукта углеводного обмена (см. разд.
6.9.3).
При более сильном окислении (действие азотной кислоты)
окисляются как альдегидная группа, так и первичная спиртовая
группа у последнего углеродного атома и образуются дикарбоно-
вые, или альдаровые кислоты. Продукт такого окисления D-глюко-
зы называется D-глюкаровой или сахарной кислотой, а D-галакто-
зы — D-галактаровой или слизевой. Большого биологического зна-
чения кислоты этого класса не имеют.
319
В отличие от них очень важен третий класс кислот — алъдуро-
новые кислоты. Они образуются при окислении только спиртовой
группы у С-6. Уроновые кислоты являются компонентами многих
полисахаридов.
При окислении альдоз в щелочной среде сначала образуются
альдоновые кислоты, а затем происходит расщепление углеродно-
го скелета. При этом появляемся ряд продуктов, обладающих силь-
ной восстанавливающей способностью, в результате ч.его моноса-
хариды легко восстанавливают такие слабые окислители, как ок-
сид серебра (I) и гидроксид меди (II), до металлического серебра
и оксида меди (I). Реакции простых сахаров с Ag2O, Cu(OH)2 и
фелинговой жидкостью [щелочной раствор оксида меди (II) и вин-
нокислого калия и натрия] широко применяют для открытия моно-
сахаридов и количественного их определения. Кетозы и в кислой,
и в щелочной среде окисляются с разрывом углеродной цепи.
Восстановление моносахаридов. Карбонильная группа моноса-
харида может быть восстановлена газообразным водородом или
амальгамой натрия в воде с образованием соответствующих мно-
гоатомных спиртов (иногда называются сахароспиртами). Из
D-глюкозы образуется спирт сорбит, а D-манноза дает маннит.
zO
с< СН2ОН
1ХН |
носн носн
I I
НОСН + н2 носн
I-------------> I
неон неон
неон неон
* сн2он сн2он
Манноза Маннит
6,2.3. Производные моносахаридов. Гликозиды образуются по
типу простых эфиров при взаимодействии полуацетального или
полукетального (гликозидного) гидроксила с гидроксильной груп-
пой другого соединения. Так, D-глюкоза дает с метанолом метил-а-
D-глюкозид и метил-р-О-глюкозид. «Несахарная» часть гликозида
называется агликоном.
своеобразными гликозидами являются также олигосахариды и
полисахариды, которые образуются при взаимодействии полуаце-
тальных или полукетальных гидроксилов одних моносахаридов с
гидроксилами других моносахаридов. Однако под термином «гли-
козиды» принято прежде йсего понимать соединения сахаров со
спиртами-агликонами.
В природе встречается большое разнообразие гликозидов. Мно-
гие из них обладают своеобразным (часто горьким) вкусом или
специфическим ароматом (синигрин горчицы, глюкованилин), по-
этому играют важную роль в пищевой промышленности. Другие
находят применение в медицине, например сердечные гликозиды,
содержащиеся в растениях родов Strophanthus и Digitalis.
320
н—с=о
НС/^СН
НС\ осн3
1 О—СбН12О5 [
Остаток
Д-глюкозы
Глюкованилин
О-Метильные производные. Если ОН-группа при аномерном
атоме легко реагирует в кислой среде с метанолом^ давая метил-
гликозиды, то метилирование остальных ОН-групп моносахаридов
требует более жестких условий. В этом случае вместо метилаце-
талей образуются метиловые эфиры, которые в отличие от метйл-
гликозидов не гидролизуются при кипячении с кислотой. Метили-
рование всех свободных гидроксильных групп углевода называют
исчерпывающим метилированием.
НСОСНз
неон
I О
носн
. неон
I
нс-------
СН2ОН
+CH3I
--------(
НСОСНз
НСОСНз
I с
Н3СОСН
НСОСНз
I
нс-------
СН2ОСН3
Метил - а - D - г люкоп иранозид
Им пользуются для установления положения заместителей, не
содержащих свободных ОН-групп (например, аминогрупп). Глико-
зиды метилированных сахаров, благодаря летучести в высоком
вакууме, используют для газожидкостной хроматографии и масс-
спектрометрии углеводов.
О-Ацильные производные. При замещении атомов водорода
гидроксильных групп углеводов остатками кислот получаются ве-
ществттипа сложных эфиров.
Огромное значение в метаболизме любой клетки и ткани имеют
многие моно- и дифосфорнокислые эфиры моносахаридов, которые
представляют собой промежуточные продукты дыхания, брожения,
биосинтеза и взаимопревращения углеводов. При образовании фос-
форных эфиров резко увеличивается реакционная способность мо-
носахаридов, их биохимическая активность.
Аминосахара. Замещение гидроксильной группы при С-2 на
аминогруппу приводит к образованию аминосахаров. Широко рас-
пространены в природе два аминосахара — D-глюкозамин и D-га-
лактозамин.
11—937
321
hcnh2
HOCH
НСОН
I
НСОН
I
CH2OH
D-Глюкоза мин
c/°
|\и
HCNHa
HOCH
I
HOCH
HCOH
CH2OH
D-Галактозамин
Аминосахара входят в состав многих гликопротеинов и гликолипи-
дов, чаще в форме N-ацетильных производных.
Мурамовая и нейраминовая кислоты. Эти производные сахаров
играют ведущую роль в качестве строительных блоков структур-
ных полисахаридов, входящих в состав клеточных стенок бактерий
(N-ацетилмурамовая кислота) и плазматических мембран клеток
животных (N-ацетилнейраминовая кислота). В молекуле N-ацетил-
мурамовой кислоты ацетилированный D-глюкозамин связан эфир-
ной связью с молочной кислотой. N-Ацетилнейраминовая кислота
содержит остатки ацетилированного D-маннозамина и пировино-
градной кислоты. Все О- и N-ацильные производные нейраминовой
кислоты имеют общее название — сиаловые кислоты.
Нейраминовая и сиаловая кислоты имеют большое значение
прежде всего как составные компоненты мембран нервной ткани.
Однако сиалсодержащие гликолипиды обнаружены и в других
тканях. Они выполняют механические, иммунохимические и другие
функции, могут восстанавливать электровозбудимость мозговой
ткани, специфически связывать или инактивировать некоторые
бактериальные токсины.
“СООН
Пируват
с=о
I
_сн2
* I
НСОН t
I
Н3С—С—NH—СН J
il I
О НОСН <
L НСОН
» I
i НСОН
' I
. СН2ОН
N-Ацетилней рамиповая
кислота
Лактат
^С=О
"СООН HC—NH—С—сн3
I I к II
СН—О—сн * о
I I
_сн3 * нсон
* НСОН
I
<СН2ОН
N-Ацетил мурамовая кислота
6.2.4. Отдельные представители моносахаридов. Триозы
(С3НбОз). Основными представителями являются глицеральдегид и
дигидроксиацетон, в свободном виде они обычно не встречаются.
322
Фосфорные эфиры триоз образуются в организме животных,
растений и бактерий как промежуточные продукты превращений
более сложных моносахаридов, а также в процессе фотосинтеза у
растений и хемосинтеза у бактерий.
Тетрозы (С4Н8О4). Из этой группы моносахаридов заслужива-
ет внимания D-эритроза, которая образуется в качестве промежу-
точного продукта при фотосинтезе и в пентозофосфатном цикле
окисления углеводов в виде 4-фосфорного эфира. Продукт восста-
новления эритрозы — спирт эритрит — обнаружен у водорослей,
лишайников.
Пентозы (С5Н10О5). Представители пентоз в свободном виде
встречаются очень редко (в моче, в листьях некоторых растений),
чаще они входят в состав более сложных углеводов и других орга-
нических соединений; образуются и в качестве промежуточных
продуктов в процессе метаболизма углеводов.
L-Арабиноза широко распространена в природе в составе геми-
целлюлоз, пектиновых веществ, слизей, гумми. Обнаруживается в
свободном виде в моче после употребления больших количеств
фруктов или их соков (алиментарная пентозурия). D-Арабиноза
входит в состав полисахаридов ряда бактерий, является компонен-
том некоторых растительных гликозидов.
D-Ксилоза — древесный сахар — обнаруживается у растений в
свободной форме, но в значительно большем количестве в составе
гемицеллюлоз, растительных слизей. Много ксилозы содержится в
соломе, отрубях, древесине, хлопковой шелухе и особенно много
(до 12%) в кукурузных кочерыжках, откуда ее и получают для
кондитерской промышленности. Образующийся из ксилозы спирт
ксилит используют вместо сахарозы в питании больных диабетом
и ожирением. У человека, животных и микроорганизмов ксилоза
входит в состав гликопротеинов.
D-Рибоза и D-2-дезоксирибоза содержатся в нуклеиновых кис-
лотах и свободных нуклеотидах. Продукт восстановления рибо-
зы — спирт рибитол — составная часть некоторых витаминов,
простетических групп ферментов.
В зеленых растениях, в микроорганизмах и тканях животных
найдены кетопентозы — D-рибулоза и L-ксилулоза. Фосфорные
эфиры этих сахаров играют важную роль в качестве промежуточ-
ных продуктов цикла Кальвина и пентозофосфатного пути окисле-
ния углеводов.
Гексозы (СбН12О6). Многие представители этой группы моноса-
харидов находятся в природе в свободном виде и играют важную
роль в жизни всех организмов.
D-Глюкоза (виноградный сахар, декстроза) присутствует в сво-
бодном виде в зеленых частях растений, в семенах, различных
фруктах и ягодах, меде, в крови человека и животных. У здорового
человека в крови содержится от 0,07 до 0,11% глюкозы. Кроме
того, она входит в состав большого числа полисахаридов, многих
гликозидов.
11*
323
D-Фруктоза (плодовый сахар, левулеза). Содержится в свобод-
ном виде в зеленых частях растений, в нектаре цветов, плодах,
меде.
D-Галактоза входит в состав дисахаридов лактозы и мелибио-
зы, трисахарида рафинозы, олигосахаридов стахиозы, вербаскозы
и целого ряда полисахаридов II порядка как растительного, так и
животного происхождения.
D-Манноза встречается в растениях в составе высокомолеку-
лярных полисахаридов — слизей, гемицеллюлоз. В организме жи-
вотных и человека манноза обнаружена в гликопротеинах, угле-
водных цепях протеогликанов. Найдена манноза и у микроорганиз-
мов, в частности в составе некоторых капсулярных полисахаридов
и О-антигенных детерминант у грамотрицательных бактерий.
Монодезоксигексозы и их производные известны как структур-
ные компоненты сердечных гликозидов. Ряд 6-дезоксисахаров об-
наружен в составе гликолипидов бактерий, а также некоторых ан-
тибиотиков. Наиболее широко распространены L-фукоза, L-рамно-
за и их метильные моно- и диэфиры. Так, L-фукоза является струк-
турным компонентом олигосахаридов молока, специфических по-
лисахаридов групповых веществ крови, бактериальных клеточных
стенок.
Дидезоксигексозы и их производные часто встречаются в сер-
дечных гликозидах (например, D-дигитоксоза). Источником 2,6- и
2,4-дидезоксисахаров оказались также некоторые антибиотики.
3,6-Дидезоксисахара были выделены из микробного материала
(абеквоза, колитоза и др.); они входят в состав специфических по-
лисахаридов грамотрицательных бактерий и составляют в среднем
10—15% от бактериальных полисахаридов. Значение их велико,
поскольку в полисахаридах эти сахара являются терминальными
группами, определяющими антигенную специфичность. Известна
также 2,3,6-тридезоксигексоза — амицетоза, выделенная из ан-
тибиотиков.
Гептозы (С7Н^О7) и другие высшие сахара обнаружены в при-
роде в различных видах. Так, из растений выделены D-седогепту-
лоза, D-манногептулоз а и др. Седогептулоза в виде фосфорного
эфира образуется] в процессе фотосинтеза в качестве промежуточ-
ного продукта, а./гакже в пентозофосфатном цикле. Из бактерий
изолированы Е)-глицеро-В-манногептоза, П-глицеро-О-глюкогепто-
за и другие высшие сахара.
6.3. Олигосахариды (полисахариды I порядка)
6.3.1. Номенклатура. Олигосахариды содержат от 2 до 10 ос-
татков моносахаридов, соединенных гликозидной связью. Они хо-
рошо растворимы в воде, обладают сладким вкусом. В зависимос-
ти от числа молекул простых сахаров, ^Ходящих в состав олигоса-
харида, различают: дисахариды, трисахариды, тетрасахариды и
т. д. По составу моносахаридных остатков их делят на гомоолиго-
сахариды (содержат одинаковые мономеры) и гетероолигосахари-
324
ды (содержат разные звенья моносахаридов). По строению моле-
кулы олигосахаридов могут быть разветвленными или линейными.
Существует несколько принципов построения номенклатуры
олигосахаридов. По одному из них для восстанавливающих олиго-
сахаридов за основу названия принимается моносахаридный оста-
ток со свободным полуацетальным гидроксилом, а все связанные с
ним звенья считаются заместителями. Места замещения и конфи-
гурация связанных моносахаридов указываются. У невосстанавли-
вающих сахаров все соединение рассматривается как гликозид.
Согласно другой номенклатуре названия звеньев записывают
подряд, а между ними ставят стрелку и цифры, указывающие, ка-
кие атомы соседних остатков соединены (иногда вместо стрелки
ставят запятую). И в том, и в другом случае окончание юза в на-
званиях моносахаридов меняется у моносахаридов-заместителей на
-ил, а у моносахаридов, принятых за основу названия,— на -ид,
если остаток не содержит свободного полуацетального гидрокси-
ла. Если же таковой имеется, то остается окончание юза.
Наконец, существует более краткая система обозначения стро-
ения олигосахаридов, подобная обозначению белков и пептидов.
Ее часто используют для обозначения высших олигосахаридов, с
большим числом звеньев. Каждый моносахаридный остаток обо-
значают двумя-тремя латинскими буквами. Конфигурацию (D или
L) и характер кольца также обозначают буквами (р — пираноза,
f — фураноза). Цифрами указывают атомы, через которые осу-
ществляется связь, а стрелкой — направление этой связи. Однако
в практике чаще употребляют рабочие, тривиальные названия оли-
госахаридов, многие из которых указывают или на происхождение
данного сахара, или на его свойство, как и в случае моносахари-
дов, с добавлением окончания юза.
Ниже приводятся тривиальные названия некоторых олигосаха-
ридов и их наименования по трем изложенным системам:
Лактоза 1) 4-О-(р-О-галактопиранозил)-В-глюкопираноза;
2) p-D-галактопиранозил- (1—*-4) -D-глюкопираноза;
3) p-D-Ga/p(l—>4)—Glp
Сахароза 1) 2-0-(а-0-глюкопиранозил)-р-В-фруктофуранозид;
2) a-D-глюкопиранозил- (1—>2) -p-D-фруктофуранозид;
3) a-D-G/p(1^2)p-D-Fruf.
6.3.2. Характеристика отдельных олигосахаридов. Из олигоса-
харидов наиболее широко распространены в природе дисахариды.
В молекулу дисахарида могут соединяться две гексозы,/две'пен-
тозы или гексоза и пентоза. Некоторые дисахариды содержат оди-
наковые моносахаридные остатки. Например, мальтоза, целлобио-
за и трегалоза при гидролизе дают только глюкозу, а различия в
свойствах этих трех дисахаридовГобусловлены тем, что в их состав
входят разные изомеры глюкозы (a-форма в мальтозе, p-форма в
целлобиозе), а также тем, что молекулы глюкозы соединены меж-
ду собой по-разному (мальтоза и трегалоза). В зависимости от
способа соединения двух остатков моносахаридов все дисахариды
делятся на два типа.
325
Дисахариды типа мальтозы. У этого типа дисахаридов
связь между двумя остатками моносахаридов осуществляется за
счет полуацетального гидроксила одной молекулы и гидроксилов,
находящихся в других положениях* (чаще всего в 4-м или 6-м)
другого моносахарида. Такие дисахариды содержат один свобод-
ный полуацетальный гидроксил, а потому способны восстанавли-
вать фелингову жидкость» В водных растворах обнаруживают му-
таротацию. Молекула дисахарида типа мальтозы существует в ра-
створе в виде смеси а- и 0-форм, в кристаллическом виде эти фор-
мы можно получить раздельно. Основными представителями этого
типа являются мальтоза, изомальтоза, целлобиоза, лактоза, мели-
биоза, гентиобиоза.
Мальтоза (a-D-глюкопиранозил- (1—>4) -D-глюкопираноза) об-
разуется при гидролизе крахмала под действием 0-амилазы. Со-
держится в большом количестве в солоде и солодовых экстрактах,
отсюда и получила свое название — солодовый сахар. Вопрос об
обнаружении у растений in vivo — дискуссионен. Преобладающей
является 0-форма.
а-Мальтоза
Целлобиоза (0-О-глюкопиранозил- (1—>4) -D-глюкопираноза)
представляет собой основную структурную единицу клетчатки (цел-
люлозы). В составе клетчатки находится в 0-форме.
Лактоза (0-О-галйктопиранозил- (1—>4) -D-глюкопираноза) со-
держится в больших количествах только в молоке (молочный са-
хар), из которого ее и получают. Так, в коровьем молоке на ее
долю приходится 4—5,5%, а в женском — 5,5—8,4%. У высших
растений лактоза встречается редко, хотя и найдена в пыльцевых
трубочках некоторых растений.
<цисахариды типа сахарозы. Для дисахаридов этого
типа характерно отсутствие восстанавливающей способности и спо-
собности к мутаротации. Это объясняется тем, что гликозидная
связь образуется за счет полуацетальных гидроксилов обоих мо-
326
носахаридных компонентов. Основными представителями дисаха-
ридов этого типа являются сахароза и трегалоза.
Сахароза (а-П-глюкопиранозил-(1—^2)-р-Б-фруктофуранозид)
чрезвычайно широко распространена в растениях. Встречается в
листьях, стеблях, корнях, фруктах, ягодах, клубнях. Является тран-
спортной формой углеводов большинства растительных организ-
мов и запасной формой у таких растений, как сахарная свекла и
сахарный тростник, которые и служат сырьем для ее получения.
Сахароза очень легко гидролизуется в кислой среде, что связано
с наличием в ее молекуле фуранозной формы фруктозы. Скорость
ее гидролиза примерно в 1000 раз больше, чем скорость гидроли-
за других дисахаридов при тех же условиях.
Сахароза
В процессе кислотного гидролиза или при действии фермента
инвертазы (p-D-фруктофуранозидаза) из сахарозы образуется
равное количество ct-D-глюкозы и p-D-фруктозы. При этом наблю-
дается смена правого вращения плоскости поляризации на левое.
Это явление называется инверсией, а образующийся продукт —
инвертным сахаром или инвертом. Инверсия объясняется тем, что
сама сахароза, имеющая удельное вращение [ct]^= +66,5°, распа-
дается на глюкозу ([а]2р =+52,5°) и фруктозу с удельным враще-
нием —92°, что и приводит к смене знака оптического вращения
на отрицательный. Мед является природным инвертным сахаром,
так как в основном состоит из равных количеств глюкозы и фрук-
тозы.
Трегалоза (a-D-глюкопиранозил- (1—И) -a-D-глюкопиранозид)
содержится в грибах, водорослях, рожках спорыньи. Этот дисаха-
рид является главным углеводом гемолимфы многих насекомых.
Три сахариды и другие олиго сахар а. Из трисахари-
дов в природе встречаются рафиноза, генцианоза и мелецитоза.
Они в основном выполняют функцию резервных углеводов расте-
ний, служат транспортной формой сахаров у некоторых растений
(рафиноза) или являются экскретами тлей и других сосущих на-
секомых на листьях растений (мелецитоза).
Рафиноза (a-D-гал актопиранозил- (1—И>) a-D-глюкопиранозил-
(1—>2)-р-В-фруктофуранозид) содержит моносахаридные остатки,
327
связанные за счет полуацетальных гидроксилов, поэтому не обла-
дает редуцирующими свойствами и мутаротацией.
Во многих растениях содержится тетрасахарид стахиоза. У ясе-
ня она является транспортной формой углеводов.
6.4. Полисахариды II порядка (гликаны)
Основная масса углеводов, встречающихся в природе, представ-
лена высокомолекулярными соединениями — полисахаридами II по-
рядка, или гликанами. При гидролизе они образуют большое чис-
ло остатков моносахаридов (до нескольких десятков тысяч).
6.4.1. Классификация и номенклатура. Различают гомополиса-
хариды (гомогликаны) и гетерополисахариды (гетерогликаны).
Первые состоят из моносахаридных единиц одного типа, вторые
содержат единицы двух и более типов. В зависимости от биологи-
ческой функции гликанов их делят на резервные и структурные.
По характеру полигликозидной цепи полисахариды II порядка мо-
гут быть линейными и разветвленными. По источнику выделения
различают зоогликаны, фитогликаны и полисахариды микробов.
Систематической номенклатуры полисахаридов не существует.
Однако часто применяют рациональный принцип: за основу берет-
ся название основного моносахарида (или моносахаридов) и окон-
чание -оза заменяется окончанием -ан. Например: D-глюкан (со-
стоит из остатков глюкозы), Ь-арабино-В-галактаны (состоят из
остатков L-арабинозы и D-галактозы). Наряду с этими названия-
ми используют и другие. Так, полимеры уроновых кислот называ-
ют полиуронидами, полисахариды, сопровождающие целлюлозу,—
гемицеллюлозами. Для многих представителей до сих пор приме-
няют давно возникшие названия: крахмал, гликоген, гепарин,
хондроитин и т. д.
В отличие от моносахаридов и олигосахаридов гликаны или не-
растворимы в воде, или дают очень вязкие коллоидные растворы;
не имеют сладкого вкуса, очень трудно поддаются выделению из
тканей и часто в процессе выделения претерпевают различные из-
менения (деполимеризация, окисление), что сильно затрудняет изу-
чение их строения.
6.4.2. Отдельные представители гомо- и гетерополисахаридов.
Крахмал. Не является химически индивидуальным веществом: на
96,1—97,6% состоит из полисахаридов (амилоза и амилопектин),
от 0,2 до 0,7% составляют минеральные вещества, в основном фос-
фаты. В крахмале найдены жирные кислоты: пальмитиновая, сте-
ариновая и другие, содержание которых достигает 0,6%. Они ад-
сорбированы на полисахаридной фракции крахмала и могут быть
удалены экстракцией нейтральными органическими растворите-
лями (например, метанолом).
В растениях крахмал является резервным питательным веще;
ством и находится в них в виде крахмальных зерен, различающих-
ся по форме, размерам, химическому составу и свойствам у раз-
личных видов и даже разных органов одного растения.
328
а-Амилоза представляет собой длинные, как правило, неразвет-
вленные цепи, в которых остатки D-глюкопиранозы соединены
<х(1—>4)-связями. Амилоза легко растворяется в теплой воде и
дает растворы со сравнительно невысокой вязкостью. Растворы
амилозы нестойкие, при стоянии могут образовывать осадки. Мо-
Рис. 6.3. Строение молекул амилозы (4), амилопектина (Б)
и гликогена (В)
лекулярная масса амилозы картофеля около 400 000, семян куку-
рузы и риса —100 000—200 000. Раствором иода амилоза окрашива-
ется в синий цвет, обусловленный образованием комплексного хи-
мического соединения. При этом молекулы иода располагаются
внутри спирально закрученных цепочек амилозы.
Амилопектин состоит из сильно разветвленных цепей, построен-
ных из a-D-глюкопиранозы. В ней кроме связей а(1—>4)-типа есть
в точках ветвления а(1—>-6)-связи, которые расположены пример-
но через 20 глюкозных остатков (рис. 63). Молекулярная масса
амилопектина может достигать 20-Ю6. Сине-фиолетовое окраши-
вание иодом, видимо, является результатом образования как комп-
лексных, так и адсорбционных соединений. Вследствие малой проч-
ности соединений углеводных компонентов крахмала с иодом они
легко распадаются при нагревании или добавлении щелочи, при
этом синяя окраска исчезает.
Соотношение количества амилозы и амилопектина в крахмале
различных видов растений различно (табл. 6.1).
Таблица 6.1. Соотношение амилозы и амилопектина в крахмале
Вид растения Амилоза, % Амилопектин, %
Картофель (клубни), пшеница и кукуруза обыч- 20—25 75—80
ная (семена) Кукуруза восковидная (семена) 0 100
Яблоки (плоды) 100 0
329
При гидролизе крахмала нагреванием в присутствии минераль-
ных кислот в качестве промежуточных продуктов образуются по-
лисахариды разной молекулярной массы — декстрины,
1. Амилодекстрины — дают с иодом фиолетово-синее окрашива-
ние, представляют собой белые порошки, растворимые в 25%-ном
этаноле, но осаждаемые 40%-ным этанолом.
2. Эритродекстрины — окрашиваются иодом в красно-бурый
цвет, растворяются в 55%-ном этаноле и осаждаются при 65%-ной
его концентрации в виде сферокристаллов.
3. Ахродекстрины — иодом не окрашиваются, растворяются в
70%-ном этаноле.
4. Мальтодекстрины — не дают окраски с иодом и не осажда-
ются этанолом.
Крахмал находит широкое практическое применение в медици-
не и многих отраслях промышленности: пищевой, текстильной, бу-
мажной, кожевенной, фармацевтической и т. д. В промышленных
масштабах крахмал получают в нашей стране из клубней картофе-
ля и зерна кукурузы. Клубни картофеля в среднем содержат 15—
25% крахмала на сырую массу, семена отдельных зерновых куль-
тур — 40—60%.
Гликоген, Представляет собой главный энергетический и угле-
водный резерв человека и животных. Особенно велико его содер-
жание в печени (до 10%) и мышцах (до 4%). Встречается также
в грибах, некоторых высших растениях (сахарная кукуруза) и
микроорганизмах. Гликоген — это разветвленный полимер, обра-
зованный остатками D-глюкопиранозы, которая в линейных участ-
ках молекулы соединена а-1,4-связями, а в точках ветвления —
а-1,6-связями. В отличие от амилопектина, где число остатков глю-
козы на одну точку ветвления в среднем равно 20, у гликогена од-
на связь а-1,6-тип а приходится на 8—12 остатков D-глюкопирано-
зы. Большая степень ветвления молекул гликогена по сравнению с
амилопектином придает им и большую компактность (см. рис. 6.3).
Молекулярная масса гликогена колеблется в пределах от 3-105 до
1-Ю8, форма молекулы приближается к сферической. При кислот-
ном гидролизе образуются в основном а-глюкоза, а-мальтоза и
а-изомальтоза.
Декстраны играют роль резервных полисахаридов у дрожжей и
бактерий. Представляют собой полисахариды с разветвленными,
как правило, цепями, состоящими из остатков a-D-глюкопиранозы,
связанных (1—>6) -связями. Различные декстраны отличаются друг
от друга характером связей в точках ветвления, которые могут
быть типа 1—>2, 1—>3 или 1—>4. Молекулярные массы декстра-
нов очень велики (М~до 5-Ю8). Декстраны и их производные об-
ладают антигенной специфичностью; они нашли широкое примене-
ние в качестве кровезаменителей, антикоагулянтов.
Продукты химической модификации декстранов — сефадексы
и сефароза — широко используют в биохимических лабораториях
при разделении смесей веществ.
330
Полифруктозаны. Являются резервными полисахаридами, осо-
бенно характерны для семейства сложноцветных, заменяя у них
крахмал. Наиболее хорошо из них изучен инулин. Он содержится
в клубнях земляной груши, георгина, артишока, где его количест-
во достигает 50%. Обнаружен также в корнях одуванчика, кок-
сасыза, цикория.
Целлюлоза (клетчатка). Наиболее широко распространенный
структурный полисахарид растительного мира. На ее долю прихо-
Рис.. 6.4. Схема водородных связей в сухой (Д) и ув-
лажненной (Б) клетчатке
дится более 50% всего органического углерода биосферы. Содер-
жится также в бактериях и некоторых низших животных.
Древесина примерно на 50% состоит из целлюлозы, хлопок —
почти на 100%. Целлюлоза представляет собой линейный полиса-
харид, состоящий из p-D-глюкопиранозных звеньев, соединенных
1—M-связями. Эти линейные молекулы обычно располагаются па-
раллельно друг другу, между ними возникают водородные связи,
образуются микрофибриллы (рис. 6.4).
При кислотном гидролизе образуется fi-D-глюкопираноза, а при
более мягких условиях — дисахарид целлобиоза. Молекуле цел-
люлозы свойственна изогнутая («германсовская») конформация,
являющаяся ее вторичной структурой. При этом между гидрокси-
лом у С-3 и кислородом кольца соседнего остатка возникает водо-
родная связь, делающая структуру еще более жесткой (рис. 6.5).
Целлюлоза не растворяется в воде, но растворима в аммиач-
ных растворах солей меди.
Молекулярная масса клетчатки точно не установлена, однако
можно принять, что она колеблется от 3-105 до 2-Ю6, а число глю-
козных остатков в молекуле может быть от 2-Ю3 до 1,1 -104. Мик-
рофибриллы целлюлозы вместе с сопровождающими веществами:
гемицеллюлозами, лигнином, пектиновыми веществами — образуют
331
клеточную стенку растений, имеющую очень сложное, многослойное
строение. В каждом из слоев микрофибриллы направлены различ-
но по отношению к оси клетки (взаимно перпендикулярно, под
острым углом, спиралеобразно). В результате прочность клеточной
стенки укрепляется во всех направлениях. Если учесть, что сами
Рис. 6.5. «Германсовская» конформация целлюлозы (во-
дородные связи между О и Н изображены пунктиром)
микрофибриллы имеют жесткую структуру, сложная архитектура
клеточной стенки в целом обладает исключительной прочностью,
которая передается и древесине, состоящей в основном из клеточ-
ных оболочек.
Рентгеноструктурные исследования показали, что в микрофиб-
риллах целлюлозы имеются участки, обладающие кристаллично-
стью, в которых линейные молекулы расположены строго упоря-
доченно, параллельно оси волокна, образуя мицеллы. В промежут-
ках между кристаллическими мицеллами молекулы целлюлозы ме-
нее упорядочены, образуют аморфные участки. Они обладают
меньшей прочностью, здесь быстрее проходят реакции гидролиза,
окисления.
Целлюлоза имеет очень большое практическое значение. Она
составляет основную массу хлопчатобумажных тканей, бумаги,
искусственного шелка, некоторых пластмасс и взрывчатых ве-
ществ, эмульгаторов, защитных коллоидов и т. д. В практике био-
химических лабораторий широко применяют карбоксиметилцел-
люлозу и ДЭАЭ-целлюлозу.
Хитин, Широко распространенный в природе структурный поли-
сахарид. Он входит в состав кутикулы или наружного скелета чле-
нистоногих и некоторых других беспозвоночных животных, а так-
же клеточных оболочек грибов. Хитин никогда не встречается в
свободном состоянии. Он обычно связан с белками, неорганически-
ми солями (СаСОз и др.), липидами, пигментами. По своей струк-
туре хитин представляет собой линейный полимер, состоящий из
остатков N-ацетилглюкозамина, соединенных 0 (1—И) -гликозид-
ными связями. Хитин выполняет механическую, опорную и защит-
ную функции в различных организмах.
Гемицеллюлозы. Это название объединяет большую группу по-
лисахаридов, не растворяющихся в воде, но растворимых в ще-
лочных растворах. Являются главными компонентами матрикса,
цементирующего целлюлозные волокна в оболочках растительных
клеток. Содержатся в значительном количестве в одревесневших
332
частях растений: древесине, соломе, орехах, семенах, отрубях, ку-
курузных початках.
Кислотами гидролизуются легче, чем целлюлоза. Образуют при
этом маннозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, иногда глюкозу. В
соответствии с продуктами гидролиза различают несколько групп
гемицеллюлоз: маннаны, галактаны, ксиланы и др.
Пектиновые вещества. В растениях присутствуют в виде нера-
створимого протопектина в межклеточном веществе и матриксе
клеточной стенки, а также в виде растворимого пектина в соке
плодов и овощей. Нерастворимый протопектин представляет собой
метиловый эфир полигалактуроновой кислоты, соединенный с га-
лактаном и арабаном клеточной стенки. Остатки L-арабинозы,
D-галактозы и L-рамнозы участвуют наряду с D-галактуроновой
кислотой в построении основной цепи. В образовании протопекти-
на вместе с пектиновыми веществами участвуют целлюлоза, ионы
Са, Mg и Н3РО4. Протопектин переходит в растворимый пектин
после действия на него разбавленными кислотами или ферментом
протопектиназой.
Расщепление протопектина происходит следующим образом;
Протопектин
Разбавленные кислоты-----►
Протопектиназа
Арайан, D-галактан,
рамйоза
Растворимый пектин
(метоксилированная
полигалактуроновая
кислота)
Эстераза----► ---NaOH
Полигалактуроновая кислота
-*---Полигалактуроназа
п a-D-Галактуроновая кислота
Превращение протопектина в растворимый пектин наблюдается
при созревании плодов, что приводит к уменьшению жесткости
плодов, улучшению их вкусовых качеств. Пектиновые вещества иг-
рают важную роль при обработке льна, процесс мочки которого
основан на гидролизе пектиновых веществ ферментами, выделяе-
мыми особыми микроорганизмами. В результате происходит маце-
рация стеблей льна и отделение волокон друг от друга. Характер-
ным и важным свойством растворимого пектина является его спо-
собность образовывать гели в присутствии сахара (65—70%-ный
раствор) и кислоты (pH 3,1—3,5). В образующемся геле содер-
жится 0,2—1,5% пектина. Это свойство широко используют в кон-
333
дитерской промышленности при производстве желе, мармелада,
джема, пастилы, фруктовых карамельных начинок.
Пектиновые вещества для человека весьма полезны. Они регу-
лируют работу кишечника, обладают детоксикационными свойства-
ми (например, при ртутных отравлениях).
Лихенин. Полисахарид лишайников. Особенно много его в ис-
ландском мхе (Cetraria islandica),у которого содержаниелихенина
достигает 45—50% на сухое вещество. Остатки a-D-глюкозы на
73% связаны 1—>4-гликозидными связями и на 27% 1—>3-связя-
ми. Организм человека не усваивает лихенин. Однако северные оле-
ни, для которых он является основным кормом, его усваивают
благодаря наличию в их пищеварительном тракте соответствую-
щих бактерий.
Агар-агар. Высокомолекулярный полисахарид, содержащийся в
некоторых морских водорослях. В СССР его добывают из багря-
ной водоросли анфельции, произрастающей в Белом, Баренцевом
и Балтийском морях, а также в водоемах Дальнего Востока.
Агар-агар растворяется в воде при нагревании. Водные раство-
ры его застывают в виде геля, поэтому он широко применяется в
бактериологии для приготовления твердых питательных сред, а в
кондитерской промышленности -для изготовления желе, пастилы,
мармелада. Представляет собой смесь агарозы и агаропектина.
Агароза состоит из чередующихся остатков D-галактозы и 3,6-ан-
гидро-Ь-галактозы, соединенных поочередно Й(1—>4)- и а(1—>3)-
связями. Агаропектин содержит цепочки, образуемые остатками
D-галактопиранозы, часть которых сульфатирована.
6.4.3. Гликозаминогликаны. Старое название — мукополисаха-
риды. Содержат чередующиеся парные звенья, состоящие из остат-
ков аминосахаров и гексуроновых кислот, реже моносахаридов, об-
ладают большой молекулярной массой. В организме всегда связа-
ны с белками. Образуют основное вещество внеклеточного матрик-
са соединительной ткани.
Гиалуроновая кислота. Содержится во многих видах соедини-
тельной ткани. Наибольшие ее количества найдены в пупочном ка-
натике, стекловидном теле глаза, синовиальной (суставной) жид-
кости и коже. В тканях и жидкостях гиалуроновая кислота суще-
ствует в свободном или ассоциированном с белками состоянии, об-
разуя очень вязкие растворы, чем и определяется стойкость ткани
к проникновению инфекции. Гиалуроновая кислота служит также
смазкой в суставах.
Многие бактерии, особенно грамположительные, вырабатывают
защитную капсулу из гиалуроновой кислоты, которая имеет пря-
мое отношение к вирулентности (удаление капсулы у стрептокок-
ков группы С уменьшает их вирулентность в 100 000 раз). Повто-
ряющейся единицей гиалуроновой кислоты служит дисахарид, со-
стоящий из остатков p-D-глюкуроновой кислоты и р-1Ч-ацетил-В-
глюкозамина, соединенных (1—>3) -связью. Дисахаридные едини-
цы соединены (1—^4)-связью линейно (см. представленный фраг-
мент молекулы гиалуроновой кислоты).
334
N-А цетил-Д -D- /f-D-Глюкуроновая
глюко за мин
кислота
Хондроитинсульфаты. Служат основными структурными ком-
понентами хрящевой ткани, сухожилий, роговицы глаз; содержат-
ся также в костной ткани, коже. Различают несколько типов:
хондроитин-4-сульфат (хондроитинсульфат А), хондроитин-6-суль-
фат (хондроитинсульфат С) и дерматансульфат (хондроитинсуль-
фат В). Полисахаридные цепи хондроитинсульфатов А и С состо-
ят из повторяющихся звеньев дисахарида [J-D-глюкуронозил-
(1—>3)-0-О-М-ацетилгалактозамина, соединенных 0(1—>4)-глико-
зидной связью. Хондроитинсульфат А содержит сульфогруппу в
С-4 положении N-ацетилгалактозамина, а хондроитинсульфат С
сульфатирован при С-6.
В дерматансульфате вместо остатков D-глюкуроновой кислоты
присутствуют остатки L-идуроновой кислоты, связанные а(1—>
—>-3)-гликозидной связью с сульфатированным N-ацетилгалакто-
замином. О биологической роли дерматансульфата сведений ма-
ло: обладает антикоагулянтным действием, стабилизирует волок-
на коллагена. •
Кератансульфаты. Их цепи состоят из чередующихся дисаха-
ридных фрагментов, состоящих из остатков D-галактозы и N-аце-
тилглюкозамин-6-сульфата, соединенных 0 (1—>4) -связью. Диса-
харидные единицы соединяются 0(1—*-3)-связью. Остатки галак-
тозы тоже могут быть сульфатированы. Иногда в молекуле есть
сиаловая кислота, фукоза и манноза. Кератансульфаты присутству-
ют в основном веществе хряща, роговице глаз.
Гепарин и гепарансульфат. Обладают очень сходной структу-
рой с другими типами гликозаминогликанов, однако отличаются от
них по локализации и функции в животных тканях. Гепарин обыч-
но присутствует на поверхности многих клеток, но является внут-
риклеточным веществом тучных клеток, в которых он синтезиру-
ется. Обнаружен впервые в печени, что и отражено в его названии.
Содержится также в коже, легких, слизистой оболочке желудка.
Гепарин — важнейший естественный антикоагулянт; он прини-
мает участие в обмене липидов, вызывая поступление в кровь ли-
пазы, влияет на холестериновый обмен. В медицинской практике
его используют при лечении тромбозов, ожоговой болезни, сердеч-
но-сосудистых заболеваний, а также в качестве стабилизатора
крови при переливании.
Углеводную структуру этого полисахарида можно представить
в виде повторяющегося тетрасахаридного фрагмента, состоящего
335
из двух связанных а (1—>4)-связью дисахаридов. Один из них
содержит L-идуроновую кислоту и N-ацетилглюкозамин, сульфати-
рованные в положении С-2, а второй — p-D-глюкуроновую ки-
слоту и N-ацетилглюкозамин, сульфатированный в положе-
нии С-6.
Гепарансульфат состоит, по-видимому, из таких же фрагментов
с большим количеством N-ацетильных, меньшим — N-сульфатных
групп и низкой степенью О-сульфатирования. Присутствует на
поверхности тромбоцитов и эндотелиальных клеток, что связано с
его функцией антикоагулянта.
6.4.4. Клеточные стенки бактерий, их полисахариды. В состав
клеточных стенок бактерий входят смешанные биополимеры, даю-
щие при гидролизе кроме моносахаридов еще и другие вещества.
Основным полимером такого рода является пептидогликан —
муреин. Он образует каркас клеточных стенок как грамположи-
тельных, так и грамотрицательных бактерий. Этот каркас состав-
ляет единое целое, поскольку образующий его муреин представ-
ляет собой одну гигантскую молекулу (Л4»5-1010).
Наиболее изучен муреин клеточной стенки Staphylococcus
aureus. Основной повторяющейся единицей ^его полисахаридных
цепей служит муропептид — дисахарид, в котором N-ацетил-О-глю-
козамин соединен (3(1—>-4)-связью с N-ацетилмурамовой кислотой.
К ОН-группе молочной кислоты присоединена тетрапептидная бо-
ковая цепь, состоящая из остатков D- и L-аланина, L-лизина, D-
изоглутамина. Концевой остаток D-аланина в боковой пептидной
цепи одного полисахарида ковалентно связан с L-лизином боковой
цепи другого полисахарида через пентаглициновый мостик. У Е. co-
li L-лизин заменен мезодиаминопимелиновой кислотой, а связь
между пептидами непосредственная.
Наличие сети параллельных полисахаридных цепей, связанных
многочисленными пептидными поперечными сшивками, создает
замкнутую сеть. У St. aureus и других грамположительных бакте-
рий она плотная и достаточно толстая (до 12 нм), у грамотрица-
тельных— рыхлая и тонкая (2 нм).
Стенки бактериальных клеток помимо муреина содержат и дру-
гие компоненты, которые у разных видов бактерий варьируют. Так,
для грамположительных бактерий характерны тейхоевые кислоты,
полисахариды и полипептиды (или белки), которые сложным обра-
зом вплетены в муреиновую сеть. Тейхоевые кислоты представляют
собой длинные цепи, состоящие из остатков глицерина или рибита,
связанных друг с другом фосфодиэфирной связью. Свободные ОН-
группы остова тейхоевых кислот могут быть заняты остатками D-
аланина, D-глюкозы, D-галактозы, L-рамнозы, N-ацетил-О-глюко-
замина и N-ацетилгалактозамина.
Сопутствующие муреину полисахариды представлены остатка-
ми рамнозы, глюкозы и галактозы (или их аминами), а также ос-
татками маннозы. Как тейхоевые кислоты, так и полисахариды
клеточных стенок грамположительных бактерий обладают антиген-
ной активностью.
336
NH, CH,
I I
CH3—CH—С—О—CH
о CH2
N-Ацетилглю козам ин
N - Ацетил мурам овая
кислота
Муреин из 5/. aureus
Участок молекулы
тейхоевой кислоты
одного из видов
Lactobacillus
Сопутствующих компонентов, вплетенных в муреиновую сеть
грамотрицательных бактерий больше, они представлены полипеп-
тидами, липопротеинами и сложными липополисахаридами. Все эти
компоненты наделяют клетки грамотрицательных бактерий слож-
ной антигенной специфичностью и акцепторной специфичностью по
отношению к вирусам и бактериоцинам. Если клеточная стенка
грамположительных бактерий — жесткий, хрупкий корпус клетки
(вроде наружного скелета ракообразных), то клеточные стенки
грамотрицательных бактерий обладают гладким мягким покрыти-
ем, богатым липидами и укрывающим лежащий под ними муреино-
вый скелет.
^7
6.4.5. Строение полисахаридов и вопросы филогении. Сравне-
ние строения различных полисахаридов у различных представите-
лей живой природы позволяет сделать ряд интересных выводов.
Почти все D-глюканы, которые были обнаружены либо в расти-
тельных, либо в животных клетках, были также выделены из того
или иного представителя одноклеточных. Низшие одноклеточные
(бактерии, микоплазма, сине-зеленые водоросли) характеризуются
большим разнообразием ct-D-глюканов, чем высшие одноклеточные
(миксомицеты, грибы, водоросли и простейшие), у которых преоб-
ладают p-D-глюканы. Множество p-D-глюканов с преобладанием
Р(1—>3) -связей обнаружено у различных грибов. Обычно (J-D-глю-
каны относят к структурным или внеклеточным полисахаридам, в
то время как ct-D-глюканы (гликоген, крахмал) представляют со-
бой внутриклеточные запасные соединения. Однако p-D-глюканы
грибов и р(1—>3)-ламинаран морских водорослей, будучи внекле-
точными полимерами, также могут служить источниками углерода
и энергии.
Наиболее распространенное в природе и количественно преоб-
ладающее у растений органическое вещество — целлюлоза— обна-
ружено у представителей всех основных форм жизни в качестве
структурного или внеклеточного полисахарида. Универсально рас-
пространены в живой природе гликоген и галактаны. Однако сте-
реоизомерная конфигурация последних варьирует у разных типов.
Так, у видов Penicillium — это полимер D-галактофуранозы со свя-
зями (1—>-5), а у высших растений (люпин) —полимер D-галакто-
пиранозы с Р(1—>5)-связями. Подобно этому другие гомогликаны
(маннаны, ксиланы, кетогликаны) и гетерогликаны разных
«царств» живой природы отличаются стереоизомерией мономеров
и характером связей между ними. Только целлюлоза и гликоген
универсальны в этом отношении у всех живых организмов. Некото-
рые полисахариды обнаружены лишь у высших одноклеточных
(галактозаминогликаны, полиглюкуроновая кислота), другие — у
низших одноклеточных (полиманнуроновая кислота, VT-антиген,
или поли-М-ацетилгалактозаминуроновая кислота, коламиновая,
или поли-М-ацетилнейраминовая кислота).
Поскольку хондроитинсульфат В и гиалуроновая кислота при-
сутствуют как у низших одноклеточных, так и у животных, некото-
рые авторы высказывают предположение, что данные полисахариды
животных произошли от аналогичных полимеров одноклеточных.
6.5. Образование углеводов в процессах фотосинтеза
и хемосинтеза1
6.5.1. Фотосинтез. Фотосинтез — это совокупность процессов, в
ходе которых запасается солнечная энергия в виде химических свя-
1 Этот раздел излагается очень сокращенно, так как в соответствии с прог-
раммой Министерства высшего и среднего специального образования РСФСР
фотосинтез должен подробно рассматриваться в лекционных курсах и учебни-
ках по физиологии растений.
338
зей органических соединений, синтезируемых из неорганических
веществ.
Фотосинтез состоит из двух фаз: световой (фотофизический и
фотохимический этапы) и темновой. В ходе световой фазы проис-
ходит поглощение солнечной энергии хлорофиллом и передача ее
в «реакционный центр», где в результате химических реакций,
Рис. 6.6. Строение хлорофилла а:
/—/V — пиррольные циклы; пунктиром показаны коор-
динационные связи
включающих транспорт электронов между различными переносчи-
ками и сопряженного с ним фосфорилирования, образуются восста-
новительные и энергетические эквиваленты (НАДФНиАТФ). Для
нормального функционирования реакций световой фазы кроме све-
та необходимы хлорофилл и вода (или другой источник водорода).
Различные хлорофиллы способны поглощать кванты света с опре-
деленной длиной волны и переходить при этом в возбужденное
состояние. Переход в исходное состояние приводит к высвобожде-
нию энергии, которая через ряд промежуточных стадий запасается
в форме АТФ и НАДФН.
Все известные в настоящее время фотосинтезирующие организ-
мы содержат хлорофиллы — зеленые магний-порфириновые пиг-
менты. Известно свыше десяти их видов, различающихся приро-
дой химических группу присоединенных к пиррольным структурам
порфиринового ядра, окраской, распространением среди живых ор-
ганизмов. Так, у всех зеленых растений содержатся хлорофиллы а
и b (рис. 6.6), в диатомовых водорослях — хлорофилл с, в красных
водорослях — хлорофилл d. В клетках пурпурных бактерий обнару-
339
жены бактериохлорофиллы а и Ь, а в зеленых бактериях — бакте-
риохлорофиллы с и d. Важным свойством молекул хлорофилла яв-
ляется их способность взаимодействовать с белками и друг с дру-
гом, образуя агрегированные формы с различными спектрами по-
глощения.
Наряду с зелеными пигментами в хлоропластах и хроматофорах
содержатся каротиноиды — желтые и оранжевые пигменты поли-
ен, СП, сн3 СН3 СН3 сн3 СЩ£Н3
CH=CHC—СНСН=СНС=СНСН=СНСН=ССН—СНСН=ССП=CH—1|]
Lch3 н3с—
Рис. 6.7. Структура р-каротина
изопреновой природы. Каротиноиды могут быть разделены на ряд
групп по своему строению: собственно каротиноиды, гидроксилсо-
держащие каротиноиды и каротиноиды, содержащие карбонильные
группы. Основными представителями у высших растений являются
Р-каротин и ксантофилл (рис. 6.7). Предполагают, что каротинои-
ды, используя лучи, не поглощаемые хлорофиллом, передают их
энергию на молекулы хлорофилла. Существуют данные, что кароти-
ноиды предохраняют молекулы хлорофилла от разрушения в процес-
се фотоокисления, а также играют определенную роль в половом
процессе при прорастании пыльцы и росте пыльцевых трубок, у
высших растений и при созревании половой клетки у водорослей и
грибов.
Третья группа пигментов — фикобилины. Это красные и синие
пигменты (фикоэритрины, фикоцианины), содержащиеся в хрома-
тофорах некоторых водорослей. В основе химического строения фи-
кобилинов лежит та же тетрапиррольная структура, но пиррольные
группы расположены линейно. Фикобилины поглощают энергию
света в зеленой и желтой областях спектра и передают ее на моле-
кулу хлорофилла, после чего она используется в процессе фотосин-
теза. Наличие фикобилинов у водорослей — пример приспособле-
ния в ходе эволюции к поглощению тех лучей солнечного света,
которые проникают через толщу морской воды. Оптические свойст-
ва хлорофилла, его роль как фотосенсибилизатора1 были впервые
исследованы великим русским физиологом К. А. Тимирязевым.
В дальнейшем крупный вклад в решение этой проблемы был сделан
А. Н. Терениным и А. А. Красновским.
Темновая фаза фотосинтеза — это фиксация и восстановление
СОг с образованием углеводов и других конечных продуктов фото-
синтеза. На этой стадии свет не нужен, а используются образован-
ные в световой фазе восстановительные и энергетические эквива-
ленты. Во время темновой фазы атомы водорода, поставляемые
’ Фотосенсибилизаторы — вещества, поглощающие энергию света и пере-
дающие ее на ту или иную бесцветную молекулу.
340
световыми реакциями, используются для восстановления СОз до
углеводов согласно общему уравнению фотосинтеза:
Свет
6СО2 + 12НаО-------------> СвН12Ов + 6О2 + 6Н2О
Хлорофилл
При этом на каждый моль синтезированного углевода запасается
~160 кДж энергии.
Процесс восстановления СО2 начинается с его присоединения к
пятиуглеродному акцептору рибулозо-1,5-бисфосфату (РуБФ).
Образующееся шестиуглеродное соединение очень нестойко. Опы-
тами М. Кальвина с меченым оксидом углерода (IV) установлено,
что при длительности фотосинтеза 2 с первым фиксируемым мече-
ным соединением является не Сб-соединение, а 3-фосфоглицерино-
вая кислота (ФГК), причем метка обнаруживается только в кар-
боксиле. Реакция карбоксилирования катализируется рибулозо-
бисфосфат-карбоксилазой (РБФ-карбоксилаза). Затем образую-
щаяся ФГК фосфорилируется при участии фермента фосфоглице-
раткиназы с использованием АТФ и превращается в 1,3-бисфосфо-
D-глицериновую кислоту, которая более реакционноспособна и лег-
че восстанавливается в глицеральдегид-3-фосфат (ГАФ).
В реакции восстановления принимают участие образовавшийся
в световой стадии НАДФН и фермент глицеральдегидфосфатде-
гидрогеназа. Часть образовавшихся молекул ГАФ под действием
фермента триозофосфатизомеразы превращается в дигидроксиаце-
тонфосфат (ДГАФ). Эти два триозофосфата конденсируются под
действием альдолазы. Сначала образуется фруктозо-1,6-дифосфат
(ФДФ), далее — монофосфаты фруктозы (Ф6Ф) и глюкозы
(Г6Ф) и, наконец, — сахароза и крахмал. Для того чтобы процесс
фотосинтеза продолжался, необходима постоянная регенерация
РуБФ, поэтому в одном обороте цикла участвуют 6 молекул РуБФ,
которые фиксируют 6 молекул СО2. Образующиеся 12 молекул
ФГК, а после ее восстановления 12 молекул ГАФ расходуются сле-
дующим образом:
5ГАФ -> 5ДГАФ
ЗГАФ + ЗДГАФ ЗФДФ ЗФ6Ф
2ГАФ + 2Ф6Ф 2 Ксилулоза-5Ф + 2Эритрозо-4Ф
2ГАФ + 2 Седогептулозо-7Ф -> 2 Ксилулозо-5Ф + 2 Рибозо-5Ф
Таким образом, две молекулы глицеральдегид-3-фосфата образуют
одну молекулу гексозы, которая выходит из цикла, а 10 идут на
регенерацию шести молекул рибулозо-1,5 бисфосфата, и цикл замы-
кается.
На рис. 6.8 представлены все реакции темновой фазы фотосин-
теза. Большая заслуга в разработке этой схемы принадлежит аме-
риканскому биохимику М. Кальвину и его сотрудникам (1957), по-
этому она носит название цикла Кальвина*
341
to
CH2o(p)
CH2O®
СО
6 I
НСОН
6СО2 6Н2О
НСОН
НСОН
I
СН2О®
РБФ
с;
НСОН
2НСОН
Рибозо-5-
фосфат
СН2ОН
с—о
6 НСОН
Л ।
— 2 НОСН
СООН.
ЗФГК
12НАДФН+Н+ 12НАДФ
НСОН
сн2о(р)
Рибулозо-
5-фосфат
СН2ОН
2 НОСН
НСОН
— 12
2
с:
12H3PO4
ГАФ
Гексоза
Сахароза
НСОН
Крахмал
СН2о(р)
Эритрозо-
4-фосфат
НСОН
СН2О0
Ксилулозо-
5-фосфат
12АТФ 12АДФ н
—
соо(р)
1,3 ФГК
СН2О®
СН2ОН
С=О
с—о
6
2 НОСН
2 НОСН
2*НСОН
2 НОСН
Н3РО4
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
Фруктозо-
6-фосфат
Седогептулозо-
7-фосфат
СН2ОН
НСОН
сн2о(р)
Фруктозо-
1,6-дифосфат
“---2 НОСН
Н2О
НСОН
СН2О®
Седогептулозо- -
1,7-дифосфат
СН2О
5
С=О
СН2ОН
ДГАФ
• НСОН
НСОН
I гл -
СН2О®
Кси л ул оз о- Рис. 6.8. Биохимические превращения углерода при фотосинтезе (цикл Кальвина):
5-фосфат цифрами указаны ферменты, катализирующие эти превращения; 1 — рибулозобисфосфат-карбокси-
лаза, 2 — фосфоглицераткиназа, 3 — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа, 4 — триозофосфатазомераза, 5 — альдолаза, 6 — фосфатаза, 7 — транс-
кетолаза, 3 — альдолаза, 9 — фосфатаза, 10 — транскетолаза, 11 — фосфокетопентозоэпимераза, 12 — рибозофосфат-изомераза, 13 — фосфори-
булокиназа; остальные обозначения см. в тексте.
На схеме видны три пути, ведущих к регенерации РуБФ, что
обеспечивает непрерывный приток этого соединения, поэтому за-
труднений с фиксацией СО2 не возникает. Суммарное уравнение
цикла Кальвина имеет следующий вид:
бРуБФ + 6СО2 + 12НАДФН + 18АТФ + I2H* -> бРуБФ +
+ 12НАДФ+ + 18АДФ + 18Н3РО4 + Гексоза
Долгое время считали, что единственный органический продукт
фотосинтеза — углеводы, а все другие метаболиты образуются в ра-
стениях из углеводов в результате реакций, не связанных с фото-
синтезом. Однако еще в начале XX в. известные русские физиологи
растений В. В. Сапожников и Ф. Н. Крашенинников указывали на
возможность образования в процессе фотосинтеза аминокислот и
белков, приводя в доказательство убедительные аргументы.
Экспериментальные доказательства образования аминокислот
при фотосинтезе (с использованием меченых атомов) были получе-
ны в СССР А. А. Ничипоровичем и сотрудниками. В настоящее
время не вызывает сомнений представление о том, что в хлороплас-
тах в качестве непосредственных продуктов фотосинтеза кроме уг-
леводов синтезируется целый ряд других соединений. Уже самый
первый продукт фотосинтеза — ФГК — путем аминирования может
превращаться в серин. ФГК легко преобразуется в фосфоенолпиро-
виноградную кислоту (ФЕП), затем в пируват, который может слу-
жить исходным продуктом для образования ряда органических кис-
лот; его аминирование дает аланин.
Карбоксилирование ФЕП приводит к синтезу оксалоацетата с
возможным восстановлением его до яблочной или аминированием
до аспарагиновой кислот. При взаимодействии ФЕП с другим про-
межуточным продуктом цикла Кальвина — эритрозофосфатом об-
разуется циклическая шикимовая кислота, являющаяся исходным
соединением для биосинтеза ароматических аминокислот, а также
ряда фенолов, дубильных веществ, гликозидов и др.
У некоторых растений в качестве первичных продуктов фото-
синтеза сначала образуются оксалоацетат и малат в результате
карбоксилирования ФЕП под действием ФЕП-карбоксилазы. По-
скольку первичные продукты в этом случае содержат четыре атома
углерода, его называют С4-путь фотосинтеза в отличие от цикла
Кальвина, где образующаяся ФГК содержит три атома углерода
(Сз-путь). С4-Путь фотосинтеза, в котором принимают участие
два типа клеток и два типа хлоропластов, называется кооператив-
ным. Он был открыт и исследован в 60-х годах XX в. Ю. С. Карпи-
ловым (СССР), М. Хэтчем и К. Слэком (Австралия).
6.5.2. Хемосинтез. Гетеротрофная фиксация СО2. Известный
русский микробиолог С. Н. Виноградский показал (1885—1895),
что органические вещества синтезируются в природе не только пу-
тем фотосинтеза в зеленых растениях, но и бактериями, не содер-
жащими хлорофилла. Энергию, необходимую для синтеза органи-
ческих соединений, эти бактерии получают при окислении различ-
343
ных неорганических соединений: Fe, N, S, Н, Sb, Мп. Этот процесс
называется хемосинтезом. Некоторые хемосинтетики используют в
качестве доноров водорода простейшие органические вещества —
метан, метанол и пр.
Исследование химизма ассимиляции меченого оксида углерода
(IV) (14СОа) различными хемосинтезирующими бактериями пока-
зало, что первым стойким продуктом хемосинтеза является фосфо-
глицериновая кислота, а присоединение СО2 к рибулозобисфосфату,
т. е. цикл Кальвина, — основным механизмом ассимиляции СО2.
У многих хемосинтезирующих бактерий цикл Кальвина — главный,
но не единственный путь образования органических веществ.
Таким образом, процессы фотосинтеза и хемосинтеза — источни-
ки органического вещества на Земле.
А. Ф. Лебедевым еще в 1914 г. была высказана мысль, что гете-
ротрофные организмы могут частично ассимилировать углерод не
только из готовых органических соединений, но и из СО2, связывая
последний с некоторыми кетокислотами. В последние годы это по-
лучило экспериментальное подтверждение в исследованиях А. Л.
Курсанова, Г. Вуда, С. Очоа и др.
Однако, как уже указывалось, между автотрофами и гетеро-
трофами существует коренное отличие: первые способны синтези-
ровать органическое вещество полностью за счет неорганических
веществ (СО2 и Н2О), вторые усваивают СО2, используя готовое
органическое соединение, например пируват.
6.6. Взаимопревращения углеводов, ферментативный синтез
и расщепление
6.6.1. Ферментативные взаимопревращения моносахаридов.
Первыми простейшими углеводами, образующимися в процессе
фотосинтеза, являются фосфотриозы — глицеральдегид-3-фосфат,
гидроксиацетонфосфат, которые дают начало всем моносахаридам
и другим углеводам. Вступая в реакцию конденсации, осуществляе-
мую альдолазой, они образуют фруктозо-1,6-бисфосфат. Последний,
теряя частично или полностью свои фосфатные остатки, способен
превращаться в другие гексозы (глюкоза, манноза, их фосфорные
эфиры) или участвовать в синтезе сахарозы и крахмала.
Взаимопревращения моносахаридов происходят в результате
действия соответствующих ферментов на уровне фосфорных эфи-
ров и нуклеозидфосфатов сахаров. Глюкоза под действием гексо-
киназы превращается в глюкозо-6-фосфат:
Гексокиназа
Глюкоза + АТФ-----------> Глюкозо-6-фосфат + АДФ
Аналогичные реакции известны и для других представителей угле-
водов. Само взаимопревращение моносахаридов осуществляется
ферментами изомеразами. Например, фермент глюкозофосфат-изо-
мераза катализирует обратимое превращение глюкозо-6-фосфата во
фруктозо-6-фосфат, а маннозофосфат-изомераза — маннозо-6-фос-
344
фата во фруктозо-6-фосфат. Действие обоих ферментов происходит
с образованием промежуточного ендиола; обе изомеразы стерео-
специфичны.
Образование свободных моносахаридов из их фосфорных эфи-
ров происходит под действием фосфатаз, которые чрезвычайно ши-
роко распространены в растениях, у микроорганизмов и животных.
В растениях содержатся изомеразы, катализирующие взаимные
превращения уроновых кислот: УДФ-глюкуроновая кислота
^УДФ-галактуроновая кислота; некоторых пентоз: УДФ-ксило-
за^УДФ-арабиноза.
Галактоза превращается в глюкозо-1-фосфат по следующей
схеме:
АТФ АДФ
1) Галактоза ► Галактозо-1-фосфат
Галактокиназа
2) Галактозо-1-фосфат + УДФ-глюкоза------------
Г ексозо-1-фосфат-
уридилилтрансфера за
УДФ-галактоза + глюкозо—1—фосфат
Реакции превращения галактозы в глюкозу привлекают к себе
большое внимание в связи с наследственным заболеванием — га-
лактоземией, причиной которой является генетическая утрата гек-
созо-1-фосфат — уридилилтрансферазной активности, в результате
чего организм1 ребенка лишается способности усваивать галактозу
из лактозы молока. Активность другого фермента, найденного в
печени взрослых людей, галактозо-1-фосфат — уридилилтрансфе-
разы, непосредственно образующего УДФ-галактозу из УТФ и га-
лактозо-1-фосфата, у детей обнаружена в следовых количествах,
не обеспечивающих усвоение галактозы.
Обратный процесс превращения глюкозы в галактозу представ-
ляет большой интерес с точки зрения образования лактозы в мо-
лочной железе, поскольку в последнюю с кровью поступает только
глюкоза. Он идет по схеме
Глюкозо-1-фосфат + УТФ----------------->• УДФ-Глюкоза + Н4Р2О7
Глюкозо-1-фосфат —
уридилилтрансфераза
УДФ-Глюкоза-----------------> УДФ-Галактоза
У ДФ-Глюкозо —
4-эпимераза
Образование пентоз в клетке может происходить различными
путями. Во многих случаях основным механизмом биосинтеза пен-
тоз является пентозофосфатный путь окисления углеводов (см.
разд. 6.9.3), а у растений, дополнительно к нему, фотосинтетиче-
ский цикл Кальвина.
Кроме того, пентозы могут образовываться из УДФ-уроновых
кислот при их декарбоксилировании. Так, ксилоза образуется из
345
глюкуроновой кислоты, а арабиноза из галактуроновой. Для рас-
тений- характерны превращения по схеме
-СО2
Гексозаны Полигексуроновые кислоты-----> Пентозаны
Известно, что у растений фермент альдолаза обладает широкой
специфичностью и может катализировать как биосинтез гексоз
(фруктоза), так и биосинтез пентоз, поскольку при ее участии ди-
гидроксиацетонфосфат может конденсироваться не только с гли-
церальдегидом, но также с целым рядом других альдегидов (ук-
сусный, гликолевый), в результате чего и образуются пентозы.
6.6.2. Биосинтез олиго- и полисахаридов. Роль нуклеозид-
дифосфатсахаров (НДФС) в биосинтезе поли-
сахаридов. Поскольку гидролиз одной гликозидной связи в
молекуле олиго- или полисахаридов сопровождается выделением
— 16,8 кДж энергии, а для сахарозы даже 29,3 кДж, то образова-
ние гликозидной связи возможно только при поступлении требуемо-
го количества энергии. Поэтому синтез олиго- и полисахаридов в
живых клетках не может быть объяснен обращением действия соот-
ветствующих гидролаз в противоположную сторону.
Экспериментальное подтверждение получили те пути синтеза
полисахаридов, в которых в реакцию вступают не свободные моно-
сахариды, а их производные с повышенным уровнем свободной
энергии, и реакции имеют характер замещения, переноса, а не при-
соединения молекул. При реакциях переноса, замещения одних
групп в молекуле другими обычно существенных изменений свобод-
ной энергии не происходит, эти реакции идут легко в обоих направ-
лениях. Именно этим объясняется обратимость в ряде случаев ре-
акций фосфоролиза олиго- и полисахаридов; продукты расщепляю-
щего действия гликозилтрансфераз—фосфорные эфиры сахаров
обладают достаточно высокой свободной энергией эфирной связи
~ 15—20 кДж/моль.
Работами аргентинского биохимика Л. Лелуара и его сотрудни-
ков в 60-х годах XX в. было установлено, что своеобразными доно-
рами гликозильных остатков для синтеза полисахаридов являются
НДФС: УДФ-глюкоза, АДФ-глюкоза, УДФ-глюкозамин, УДФ-
ксилоза и т. д.
Свободная энергия связи между гликозильными остатками и
нуклеозиддифосфатами (НДФ) относительно высокая, в УДФ-
глюкозе, например, она составляет более 30 кДж/моль, что вполне
достаточно для синтеза гликозидных связей в полисахаридах.
НДФС образуются из нуклеозид-5'-трифосфатов и сахар-1-фос-
фатов под действием ферментов, имеющих групповое название
нуклеотидилтрансферазы.
Нуклеозидтрифосфат (НТФ) + Сахар-1-фосфат НДФС + Н4Р2О7
Существенных изменений свободной энергии в процессе этой реак-
ции не происходит, однако вследствие гидролиза Н4Р2О7 неоргани-
346
ческими пирофосфатазами (которые практически всегда очень
активны в клетках) она становится необратимой.
Дальнейший синтез полисахаридов идет по схеме НДФС + ак-
цептор—ЖДФ + сахар-акцептор. Реакции этого типа катализиру-
ются ферментами подкласса гликозилтрансфераз, тривиальные на-
звания которых образуются по синтезируемому углеводу: сахаро-
зосинтаза, гликоген-синтаза и т. д. НДФС являются их кофермен-
тами. Если в качестве акцептора функционирует моносахарид, то
синтезируется дисахарид, но акцептором может быть любой другой
углевод, в результате взаимодействия с НДФС его молекула уве-
личивается на 1 гликозильный остаток. При многократном повторе-
нии реакции каждый раз молекула акцептора — «затравка» удли-
няется на 1 гликозил.
Повторяемость реакции обеспечивается регенерацией НДФ до
НДФС:
НДФ + АТФ -> НТФ + АДФ
НТФ + Сахар-1-фосфат НДФС + Н4Р2О7
В результате всей цепи реакций НДФС регенерируется, как компо-
нент катализатора (фермента) он не расходуется, не входит в со-
став конечных продуктов — эти свойства всех катализаторов ос-
таются ненарушенными.
В настоящее время считают, что рассмотренная система реак-
ций с участием НДФС является основным путем биосинтеза олиго-
и полисахаридов.
Биосинтез сахарозы. Биосинтез сахарозы осуществляется
двумя основными путями.
1. УДФ-глюкоза + Фруктозо-6-фосфат —> УДФ +Сахарозофос-
фат. Эта реакция катализируется сахарозофосфат-синтазой. Далее
образовавшийся сахарозофосфат под действием фосфатазы дает
сахарозу и Н3РО4.
2. УДФ-глюкоза +Фруктоза УДФ +Сахароза. В данной ре-
акции принимает участие другой фермент — сахарозосинтаза.
Установлено, что дезоксиуридиндифосфатглюкоза используется
также эффективно, как и УДФ-глюкоза, а АДФ-глюкоза — значи-
тельно менее эффективно.
СН2ОН
Н J----ЧХ И
HN-
ОН
он он
Уридиндифосфатглюкозй
347
Физиологическая роль двух вышеуказанных ферментов различ-
на: сахарозофосфат-синтаза свойственна хлорофиллоносным тка-
ням, а сахарозосинтаза — нехлорофиллоносным, где она в большей
степени проявляет активность, направленную на образование УДФ-
глюкозы, чем сахарозы. Синтез сахарозы с участием сахарозофос-
фат-синтазы требует больших затрат энергии, поэтому эта реакция
необратима. Энергия необходима для активации вступающих в ре-
акцию глюкозы и фруктозы согласно следующей серии реакций:
АТФ + Глюкоза Глюкозо-6-фосфат + АДФ
Глюкозо-6-фосфат Глюкозо-1-фосфат
УТФ + Глюкозо-1-фосфат -> УДФ-Глюкоза + ФФН
АТФ + Фруктоза Фруктозо-6-фосфат + АДФ
Таким образом, для образования одной гликозидной связи са-
харозы необходимы три макроэргические связи НТФ, С другой сто-
роны, благодаря сильно экзергоническому характеру этой реакции
возможно накопление в соке некоторых растений (сахарный трост-
ник, сахарная свекла) высоких концентраций сахарозы при очень
низком содержании ее предшественников. Установление факта
участия УДФ-глюкозы в синтезе сахарозы имеет большое значение,
так как именно она играет первостепенную роль и в процессе син-
теза в растениях гликозидов вообще.
Некоторые бактерии содержат фермент сахарозоглюкозилтранс-
феразу (сахарозофосфорилаза), катализирующую обратимую ре-
акцию:
Сахароза + Фн Глюкозо-1-фосфат + Фруктоза
Если из реакционной среды быстро удаляется неорганический фос-
фат, то эта реакция может приводить к синтезу сахарозы, однако в
условиях, существующих внутри клетки, обычно происходит рас-
пад сахарозы.
Биосинтез лактозы. Дисахарид лактоза образуется в мо-
лочной железе млекопитающих в результате следующей реакции:
УДФ-галактоза + D-Глюкоза—>УДФ + Лактоза. Фермент лактозо-
синтаза, катализирующий эту реакцию, сложный и состоит из двух
частей: белка А, обнаруженного кроме молочной железы в печени
и тонком кишечнике, и белка В, который не обладает фермента-
тивной активностью, но изменяет специфичность белка А таким
образом, что в качестве акцептора галактозы белок А может ис-
пользовать только D-глюкозу, а не М-ацетил-О-глюкозамин, как
при отсутствии белка В.
Биосинтез гликогена и крахмала. Избыток саха-
ров, синтезированных в организме или поступивших с пищей, обра-
зует запасные отложения в основном в форме крахмала у растений
и гликогена у животных.
Синтез крахмала в растениях катализируют несколько фермен-
тов. Крахмал-синтаза (УДФГ- или АДФГ-а-глюкан — глюкозил-
348
трансфераза) при участии АДФ-глюкозы (реже УДФ-глюкозы) и
акцептора — затравки, состоящей из четырех и более остатков
глюкозы (т. е. декстрина), синтезирует линейные цепи амилозы и
неразветвленные участки амилопектина.
п АДФГ + Декстрин -> п АДФ + (СвН10О6)4+п
(QH10o5)4
Л. Лелуар (1964) установил, что наиболее активным донором
глюкозильных остатков для синтеза крахмала в запасающих орга-
нах растений является АДФ-глюкоза. Известно, что крахмал, на-
капливающийся в листьях при фотосинтезе, может очень легко пре-
вращаться в сахарозу — основную транспортную форму углеводов
в растении. В таком виде образующиеся углеводы перетекают в се-
мена, клубни, луковицы, где и откладываются в запас опять в виде
крахмала или фруктозанов (инулин, левулезаны). В этом процессе
амилазы не принимают участия, основная роль принадлежит реак-
циям трансгликозилирования при участии НДФС. Сахароза может
превратиться в крахмал двумя путями:
1) Сахароза 11нпсртазаГлюкоза+Фруктоза-*-
Гексокиназа Фосфогексоизомераза
----------*- Глюкозо-б-фосфат 4- Фруктозе-6-фосф ат ——— ------*-
АТФ Фосфогексомутаза
, Пирофосфорилаза Крахмало-синтаза
---*- Г л ю ко зо-1 - ф о сф ат -----АДФГ или УД Ф Г--------------► К ра х м ал
АТФ или УТФ
Сахарозо-синтаза Крахмало-синтаза
Сахароза ---— ——*~АДФГ или УДФГ ----------------------Крахмал
АТФ или УТФ
Для синтеза крахмала по первому пути потребляется 4 моля
АТФ, а по второму — только 2, что является более экономичным и
более вероятным путем синтеза крахмала из сахарозы. Так же
легко происходит превращение сахарозы в левулезаны. У бактерий
аналогичным образом из сахарозы синтезируются различные дек-
страны (глюкозаны) и леваны (фруктозаны).
In vitro образование линейных цепей амилозы с а(1—>4)-связя-
ми при наличии затравочного декстрина может происходить и пу-
тем обращения фосфоролиза по реакции: Глюкозо-1-фосфат + Ак-
цептор ^а(1—И)-Глюкозил-акцептор-FОртофосфат. Однако воз-
можность такого синтеза in vivo с участием фермента фосфорила-
зы не доказана. Крахмал-фосфорилаза может катализировать у
растений лишь синтез коротких цепей затравочных декстринов, ко-
торые затем достраиваются до молекул амилозы при действии
АДФГ-а-глюкан — глюкозилтрансферазы (крахмал-синтаза).
Растительные фосфорилазы сильно отличаются от животных.
Так, в отличие от фермента из мышц у фосфорилазы из картофеля
отсутствует серинфосф ат, для него не требуется АМФ в качестве
кофактора. Ни крахмал-синтаза, ни фосфорилаза не способны ка-
тализировать образование а(1—>6)-связей в амилопектине, харак-
терных для точек ветвления. Эта реакция осуществляется под дей-
349
ствием энзима Q (фактор ветвления), который представляет собой
трансгликозилазу и переносит концевой олигосахарид амилозной
цепи на шестой гидроксил глюкозы той же или другой молекулы
амилозы, образуя ветвление (рис. 6.9).
В биосинтезе другого запасного полимера — гликогена — основ-
ная роль принадлежит также НДФС. У животных переносчиком
гликозильных групп служит обычно уридиндифосфат, тогда как в
клетках микроорганизмов эту
функцию осуществляет АДФ,
иногда ЦДФ и ГДФ. Реакция
идет в несколько стадий. На
первой стадии, катализируемой
глюкозо-1-фосфат — уридил ил-
Рис. 6.9. Действие амило(1,4—>-1,6)-
трансгликозилазы (фактор ветвления,
Q-фермент).
Темным кружком обозначена глюкозная моле-
кула, альдегидный углерод которой перенесен
с образованием а(1—6)-связи в точке ветвле-
ния, R — фрагмент молекулы гликогена
трансферазой образуется УДФ-
глюкоза по реакции: а-Глюко-
зо-1-фосфат + УТФ^УДФ-
Глюкоза + Пирофосфат.
На второй стадии глюко-
зильная группа УДФ-глюкозы
переносится на концевой оста-
ток амилозной цепи с нереду-
цирующего конца с образова-
нием а(1—>4)-связей. Эта ре-
акция катализируется глико-
ген-синтазой (УДФГ-а-глю-
кан — глюкозилтрансфераза):
УДФ-Глюкоза + (Глюко-
за) п—>УДФ + (Глюкоза) п+ь
В реакции равновесие сдвинуто в сторону преимущественного син-
теза гликогена.
В качестве акцептора для действия гликоген-синтазы необходи-
ма цепочка, состоящая не менее чем из четырех остатков глюкозы.
С удлинением цепочки активность фермента увеличивается. Вет-
вление цепей гликогена осуществляет, как и в случае амилопекти-
на, трансгликозилаза.
Биосинтез целлюлозы. Установлено, что в хлопчатнике—
главном продуценте целлюлозы — биосинтез этого полисахарида
осуществляется путем переноса глюкозных остатков из ГДФГ на
акцептор-затравку. Выделен фермент, катализирующий такую ре-
акцию. Аналогичные данные существуют и для синтеза клетчатки
у одного из видов фасоли. Вместе с тем есть сведения, что в коле-
оптилях овса и у некоторых бактерий биосинтез целлюлозы идет с
участием УДФГ. Не отрицается возможность функционирования
УДФГ как донора глюкозных остатков при образовании клетчатки
и у хлопчатника.
Биосинтез углеводных компонентов глико-
протеинов. Для углеводных компонентов гликопротеинов ха-
рактерно высокое содержание аминосахаров, ацетилглюкозамина и
сиаловых кислот. У человека и большинства животных аминосаха-
350
ра образуются путем переноса амидной группы глутамина на фрук-
тозо-6-фосфат с дальнейшим отщеплением Н3РО4 фосфатазой:
Фруктозо-6-фосфат + Глутамин -> Глюкозамин-6-фосфат 4-
+ Глутаминовая кислота
У бактерий и насекомых, образующих из глюкозамина хитино-
вые покровы, вместо глутамина для синтеза глюкозамин-6-фосфата
используется NH3. Ацетилглюкозамин образуется в результате пе-
реноса ацетил-группы с ацетил-КоА на глюкозамин-6-фосфат. Вза-
имодействие ацетилглюкозаминфосфата с УТФ дает УДФ-ацетил-
глюкозамин (при этом выделяется пирофосфат), а изомеризация
последнего — УДФ-ацетилманнозамин. В результате присоединения
к ацетилманнозамину путем альдольной конденсации фосфоенолпи-
рувата образуется фосфо-Ы-ацетилнейраминовая кислота, а из
нее — N-ацетилнейраминовая.
Образование полимерных углеводных цепей гликопротеинов осу-
ществляется, как и для всех полисахаридов, с участием НДФС.
Так, при биосинтезе гиалуроновой кислоты донорами моносахарид-
ных остатков являются УДФ-глюкуроновая кислота и УДФГ. В об-
разовании гепарина и хондроитинсульфата важную роль играет
УДФ-ксилоза, ибо связующим звеном комплекса этих углеводов с
белками является как раз ксилоза. Синтез указанных углеводов на-
чинается с перенесения ксилозы от УДФ-ксилозы на гидроксил се-
рина в молекуле белка. Присоединение сульфатных остатков к
компонентам гепарина и хондроитинсульфата катализирует особый
фермент — мукополисахаридсульфотрансфераза, а донором сульфо-
групп является З-фосфоаденозин-5-фосфосульфат.
При биосинтезе тейхоевых кислот бактерий основная цепь стро-
ится путем переноса рибитфосфатных остатков от ЦДФ-рибита и
ацетилглюкозаминных от УДФ-ацетилглюкозамина. Наращивание
углеводного компонента происходит путем последовательного дей-
ствия различных гликозилтрансфераз с их НДФС-коферментами:
галактозилтрансферазы, фукозилтрансферазы, сиалилтрансферазы
и т. д. Вопрос о механизме, определяющем порядок чередования
моносахаридных остатков при синтезе, пока недостаточно ясен.
Широкое участие НДФС в синтезе всех олиго- и полисахаридов
сочетается с избирательной «специализацией» нуклеотидов-доноров.
Так, донорами остатков галактозы, глюкозамина и мурамовой кис-
лоты у животных являются УДФ-нуклеотиды, донорами L-фукозы
и D-маннозы — ГДФ, глицерина и тивелозы — ЦДФ, N-ацетилней-
раминовой кислоты — ЦМФ.
Участие п о л и п р е н о л ф о с ф а т о в в биосинтезе
полисахаридов. В 60—70-х годах XX в. был обнаружен и ис-
следован новый тип переносчиков углеводных остатков при биосин-
тезе полисахаридов — полипренолфосфаты. Они имеют липидный
характер, играют первостепенную роль при биосинтезе гликопро-
теинов, содержатся у всех живых организмов. Их открытие явилось
крупнейшим событием в биохимии углеводов за последнее время.
351
Полипреноидные переносчики принимают углеводный остаток
(моно- или олигосахаридный) от НДФС и передают его акцептору
(например, бактериальному антигену). В ряде случаев синтез оли-
госахарида происходит на полипренолфосфате (ППФ).
В схеме процесс протекает следующим образом:
НДФС + ППФ ППФ-сахар + НДФ
ППФ-сахар + Акцептор ППФ + сахар-акцептор
По своему строению полипреноидные переносчики делятся на
две группы: полипренолфосфаты и полипренолпирофосфаты. Груп-
па полипренолпирофосфатов более многочисленна, они переносят в
отличие от первых не только моносахаридные остатки, но и ди-,
три-, тетрасахаридные. Обычная их функция — участие в биосинте-
зе олигосахаридных компонентов антигенов клеточной стенки бак-
терий.
Полипренолфосфаты имеют следующее схематическое строение:
Н(СН2—С=СН—СН2)П—О—РО3Н2
СНз
Изопреновое звено, несущее гидроксил, через который идет при-
соединение фосфата, обычно гидрировано, насыщенно. У бактерий
наиболее часто встречается ундекапренол (Css), имеющий 11 изо-
преновых остатков. Полипренолы высших растений содержат от 5
изопреновых остатков (древесина березы) до 16 (иглы хвойных).
Еще более высокомолекулярны ППФ животных (п=17—21). Наи-
более распространенными из них являются долихолы, к ним отно-
сятся те полипренолы, у которых а-изопреновый остаток, несущий
гидроксильную группу, насыщен:
сн3 и сн,
I .11 /СН3
но—сн2—сн2—сн-сн2—(сн2-с=с—снд, —сн2—сн=с;
СН3
Долихол
СН2ОН о СН, СНз
L а II I I ’ /СН3
И X. рО—Р—о—СН2—СН2— сн—СН2—(сн2—сн=с— сп2)^-сн2—сн=с^
<j>H оН СЪ
он А
Долихолмонофосфатсахар
С участием долихолфосфатов происходит образование «ядра»
(кор) олигосахарида и его встраивание в гликопротеины через N-
гликозидные связи. Для ядер характерно высокое содержание ман-
нозы и ацетилглюкозамина. Синтез олигосахарида завершается
гликозилтрансферазами уже без участия долихолфосфата. Глико-
зилирование белков протекает в аппарате Гольджи. Если же белок
синтезируется на свободных, а не на связанных с мембранами по-
лисомах, то он, как правило, не подвергается гликозилированию.
352
Есть сведения, что функции переносчиков углеводных остатков, по-
добно полипренолам, могут выполнять витамины А и К.
6,6.3. Расщепление олиго- и полисахаридов. Расщепление оли-
го- и полисахаридов происходит путем гидролиза и фосфоролиза.
Для ферментов гидролиза углеводов характерна стереоспецифич-
ность. Так, гидролиз сахарозы осуществляет фермент р-фруктофу-
ранозидаза, или сахараза (инвертаза), который разрывает связь,
находящуюся у р-глюкозидного С-атома остатка фруктозы. Инвер-
таза содержится в высших растениях, микроорганизмах, в пищева-
рительных соках животных, особенно она активна в дрожжах.
Расщепление сахарозы может происходить и под действием « глю-
козидазы, но в этом случае разрывается связь у а-глюкозидного
С-атома остатка глюкозы:
Расщепление сахарозы может также происходить под действи-
ем сахарозосинтазы в результате обращения реакции (см. с. 347).
Именно таким, путем сахароза вовлекается в метаболизм корне-
плода сахарной свеклы. Обратимость реакции обеспечивает эко-
номное расходование сахарозы, так как в случае недостаточно бы-
строго использования продуктов ее расщепления тот же фермент
переводит их избыток обратно в сахарозу, т. е. осуществляется
принцип саморегулирования.
И, наконец, у микроорганизмов расщепление сахарозы может
происходить путем фосфоролиза (реакция 3).
Гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу происходит при учас-
тии лактазы (р-галактозидаза). Она содержится в молочной железе
животных, в лактозных дрожжах, вызывающих брожение различ-
ных молочных продуктов, у бактерий, плесневых грибов.
Дисахарид мальтоза подвергается гидролизу под действием
фермента а-глюкозидазы, или мальтазы, которая содержится в
тканях растений, в плесневых грибах, дрожжах, бактериях, в пи-
щеварительном соке человека и животных. Особенно активна маль-
таза в солоде. У бактерий возможно расщепление мальтозы маль-
тозофосфорилазой.
Гидролиз целлобиозы осуществляет р-глюкозидаза.
Расщепление крахмала и гликогена также может быть гидро-
литическим и фосфоролитическим. Гидролиз происходит под дей-
ствием ферментов амилаз.
В настоящее время установлено наличие трех амилаз: а-амила-
зы, р-амилазы и глюкоамилазы, которые различаются по своим
12—937
353
свойствам, распространению в природе и способу действия на
крахмал (гликоген) (рис. 6.10).
и-Амилаза является эндоамилазой. Она беспорядочно разрыва-
ет а(1—И) -связи внутри цепей амилозы, амилопектина и гликоге-
на. В качестве продуктов реакции образуется большое количество
декстринов различной молекулярной массы. Среди конечных про-
Глюко-
амилаза
ВкАзЪЪЪЪЪЪ1
Рис. 6.10. Действие различных амилаз на линейные участки крахмала
дуктов реакции образуется также небольшое количество мальтозы,
мальтотриозы и глюкозы. а-Амилаза содержится в слюне, соке под-
желудочной железы, в проросших семенах злаков, в плесневых
грибах и бактериях. В непроросших семенах а-амилаза обнаружи-
вается крайне редко. Она чувствительна к подкислению, но термо-
стабильна.
^-Амилаза гидролизует амилозу, амилопектин и гликоген с не-
редуцирующего конца, отщепляя остатки мальтозы. Под действием
0-амилазы амилоза на 100% превращается в мальтозу. У амило-
пектина и гликогена она атакует только наружные цепи, в резуль-
тате чего образуются мальтоза и p-конечный декстрин. р-Амилаза
содержится в непроросших семенах пшеницы, ржи, ячменя.
Гидролиз крахмала под действием амилаз имеет большое зна-
чение в технологии хлебопечения, пивоварения, производства спир-
та, текстильной промышленности.
Глюкоамилаза гидролизует крахмал с образованием глюкозы и
небольшого количества декстринов. Препараты глюкоамилазы вы-
деляют из плесневых грибов и используют для получения из крах-
мала глюкозной патоки и кристаллической глюкозы.
Ни одна из перечисленных выше амилаз не способна разрывать
а(1—>6)-связи. Расщепление этих связей осуществляет изоамила-
за (Я-фермент).
Вторым путем расщепления крахмала и гликогена является
фосфоролиз.
354
(C6H10O5)n + HSPO4-------------> Глюкозо-1-фосфат + (C6H10O5)n_,
Крахмал -фосфорилаза
(гликоген-фосфорилаза)
В этой реакции от нередуцирующего конца отщепляется один ос-
таток глюкозы и соединяется с фосфорной кислотой, образуя глю-
козо-1-фосфат. Процесс повторяется многократно, пока вся молеку-
ла крахмала или гликогена не будет расщеплена до точек ветвле-
ния. Этот путь диссимиляции является энергетически более выгод-
ным, чем гидролиз, так как глюкоза оказывается уже в активиро-
ванной форме (глюкозо-1-фосфат) и легко вступает в различные
реакции. Действию а-глюканфосфорилазы подвергаются только
а(1—>4)-связи и реакция останавливается, как только фермент
дойдет до точки ветвления. Образуется остаточный декстрин. Для
того чтобы расщепление возобновилось, необходим другой фер-
мент— изоамилаза, разрывающий 1,6-связи и тем самым открыва-
ющий для действия крахмал (гликоген)-фосфорилазы новый учас-
ток полисахаридной цепи.
Гидролитическое расщепление клетчатки (целлюлозы) с образо-
ванием целлобиозы осуществляет фермент целлюлаза. Последний
представляет собой комплекс двух ферментов — эндоглюканазы и
экзоглюканазы. Они содержатся в проросшем зерне, в некоторых
бактериях и плесневых грибах, растущих на древесине.
В прорастающих семенах и плесневых грибах найдены гемицел-
люлазы — ферменты, гидролизующие различные гемицеллюлозы до
отдельных моносахаридов. Например, плесневый гриб Aspergillus
niger содержит ксиланазу, расщепляющую ксиланы до ксилозы.
Кроме перечисленных известен ряд других гликозидаз, катали-
зирующих расщепление О-, N- или S-гликозидных связей в различ-
ных гликозидах и углеводсодержащих соединениях (гликопро-
теины, гликолипиды, протеогликаны).
В тканях человека и животных гликозидазы содержатся в ос-
новном в лизосомах. При отсутствии или частичной недостаточнос-
ти какой-либо лизосомной гликозидазы или одной из ее молекуляр-
ных форм развиваются гликозидозы (лизосомные болезни накопле-
ния)— группа наследственных болезней, связанных с нарушением
распада углеводсодержащих соединений.
6.7. Превращение углеводов в процессе
пищеварения
Человек и животные не способны к первичному биосинтезу уг-
леводов из неорганических веществ, они могут лишь образовывать
их в процессе глюконеогенеза из других органических веществ
(органических кислот, жиров, аминокислот), но главным источни-
ком углеводов является пища. Некоторые насекомые получают
с пищей преимущественно одни углеводы (питающиеся древеси-
ной, цветочным нектаром). Они настолько приспособились к подоб-
ному питанию, что погибают без углеводов. У ряда беспозвоночных
12*
355
животных существует хорошо выраженная сезонная периодич-
ность содержания углеводов в организме. Так, у мидий и креветок
осенью резко увеличивается количество углеводов, происходит за-
пасание на зиму питательных веществ. Этому способствует и повы-
шенное содержание углеводов в планктоне — пище мидий и креве-
ток. Углеводы составляют существенную часть пищевого рациона
человека и многих животных. На их долю приходится 60—70%
общей суммы калорий пищи человека. Особенно много углеводов
содержат крупы, лапша и макароны (65—75%), хлеб (около 50%),
картофель (до 25%). Очень мало их в мясомолочных продуктах
(0,5-2%).
Углеводы всасываются через слизистую оболочку кишечника
только в виде моносахаридов. Даже хорошо растворимые дисаха-
риды сахароза и лактоза не могут в неизмененном виде всасы-
ваться в кишечнике1. Если их ввести в кровь, минуя желудочно-
кишечный тракт, дисахариды не будут утилизироваться клетками
различных тканей. Это еще в большей степени относится к нерас-
творимым в воде полисахаридам: крахмалу, гликогену. Таким об-
разом, в процессе переваривания углеводов пищи должно происхо-
дить их расщепление до моносахаридов — той единственной фор-
мы, которая может всасываться и утилизироваться в организме.
Переваривание углеводов начинается в ротовой полости. В со-
ставе слюны содержатся два фермента: а-амилаза и мальтаза.
Специфической особенностью а-амилазы слюны (старое назва-
ние — птиалин) является способность гидролитически расщеплять
крахмал только тех пищевых продуктов, которые подвергались
термической обработке при изготовлении пищи. «Сырой» крахмал
во рту почти не гидролизуется, только при очень медленном жева-
нии. а-Амилаза слюны млекопитающих в отличие от птиц высоко
активна. Интересно, что у некоторых приматов (бабуины, резусы)
этот фермент отсутствует, хотя у человека он очень активен.
Пища в ротовой полости находится недолго, после попадания ее
в желудок постепенно пищевой комок пропитывается кислым желу-
дочным соком. Низкие значения pH инактивируют а-амилазу слю-
ны. Таким образом, ее гидролитическое действие осуществляется
кратковременно, в ротовой полости расщепление крахмала и гли-
когена только начинается. В желудке амилолитические ферменты
отсутствуют.
Основным местом переваривания крахмала и гликогена являет-
ся тонкий кишечник, где на них действует а-амилаза поджелудочной
железы. Она может расщеплять крахмал, не подвергшийся терми-
ческой обработке при приготовлении пищи. Поэтому появление в
кале непереваренных гранул крахмала — признак либо нарушения
выделения, либо нарушения функции панкреатической а-амилазы.
Установлено, что активность а-амилазы в кишечнике отдельных
1 Только при значительном избытке дисахаридов в пише они могут в очень
небольшом количестве всасываться в кишечнике, однако быстро выводятся с
мочой в неизмененном виде.
*
356
видов рыб зависит от типа питания: у видов, питающихся фито-
планктоном, который богат крахмалом, она значительно выше, чем
у потребляющих зоопланктон.
В поджелудочном соке содержится также фермент мальтаза,
расщепляющий дисахарид мальтозу. Однако основная масса диса-
харидов, образовавшихся в результате действия а-амилазы и посту-
пивших с пищей, гидролизуется ферментами тонкого кишечника.
Этот процесс происходит не в просвете кишечника, а в клетках сли-
зистой оболочки. Там действуют мальтаза, изомальтаза и сахараза
(инвертаза). Последняя впервые была обнаружена в кишечном со-
ке В. В. Пашутиным (1870). Мальтаза и изомальтаза находятся
обычно в прочном комплексе с инвертазой. Эти ферменты функцио-
нируют в щеточной кайме эпителия слизистой оболочки кишечника
в количествах, обеспечивающих переваривание и усвоение пищи
взрослого человека. Помимо перечисленных ферментов кишечный
эпителий содержит р-галактозидазу с оптимумом pH 4,5, гетеро-
галактозидазу и лактазу.
Гетерогалактозидаза расщепляет олигосахариды смешанного
строения по р-галактозидазной связи. Лактаза обнаруживает не
очень высокую активность. У ряда млекопитающих активность лак-
тазы исчезает после прекращения вскармливания молоком. Лакто-
за в пище встречается только как компонент молока, в грудном мо-
локе ее содержание почти в два раза выше, чем в коровьем. Непе-
реносимость лактозы наблюдается у детей с генетическим дефек-
том лактазы.
В результате последовательного воздействия перечисленных
ферментов углеводы превращаются в моносахариды. Они хорошо
всасываются кишечной стенкой. Скорость их всасывания различна:
наибольшая для галактозы, близка для глюкозы, примерно полови-
ну последней составляет для фруктозы, у маннозы и ксилозы около
четверти от скорости всасывания глюкозы, самая малая у араби-
нозы. Пентозы и манноза проникают через эпителий путем облег-
ченной диффузии, их поступление против градиента концентрации
невозможно. Интенсивность всасывания пентоз и маннозы зависит
поэтому от скорости удаления этих сахаров путем диффузии нару-
жу, на серозную сторону клеток, откуда они быстро уносятся с то-
ком крови.
Глюкоза и галактоза могут всасываться в кишечнике даже про-
тив десятикратного градиента, что свидетельствует о функциони-
ровании при этом активного транспортного механизма. Предпола-
гают наличие переносчиков, обладающих избирательностью к от-
дельным моносахаридам. Эта транспортная система является Na+-
зависимой. Механизм активного транспорта сахаров работает при
низких концентрациях сахаров в просвете кишечника. При большом
содержании глюкозы или галактозы в кишечнике функционирует
вторая система переноса, основанная на механизме облегченного
транспорта. Она действует только до тех пор, пока концентрация
глюкозы и галактозы в кишечнике перед клеточной каймой значи-
тельно превышает их концентрацию в клетках. О механизме выхо-
357
да сахаров на серозную сторону сведений пока очень мало, пред-
полагают простую диффузию по градиенту концентрации.
У человека и млекопитающих животных отсутствует фермент
целлюлаза, вызывающий гидролиз клетчатки (целлюлозы). Не
атакуются ферментами желудочно-кишечного тракта млекопитаю-
щих и растительные пентозаны. Только некоторые из них частично
расщепляются бактериями в толстом кишечнике с образованием
органических кислот, СОг и других веществ. Поскольку многие
млекопитающие растительноядны, переваривание целлюлозы для
них крайне необходимо. В связи с этим они имеют специализиро-
ванный пищеварительный тракт, в высокой степени приспособлен-
ный для симбиотического переваривания целлюлозы. Так, у жвач-
ных желудок состоит из нескольких отделов, первый и самый боль-
шой из которых называется рубцом. Он содержит в больших коли-
чествах бактерии и простейших типа инфузорий, продуцирующих
фермент целлюлазу. Рубец можно сравнить с бродильным чаном,
в котором пища, смешанная со слюной, подвергается интенсивной
ферментации. Продукты брожения (главным образом масляная,
уксусная и пропионовая кислоты), всасываются и используются
организмом, СО2 и СН4 выводятся с отрыжкой. Очень важно, что
образовавшиеся из целлюлозы органические кислоты могут непос-
редственно использоваться на биосинтез жиров, они являются у
жвачных главным источником энергии (у крупного рогатого скота
доставляют до 70% всей необходимой организму энергии).
Микроорганизмы рубца полезны жвачным животным и в дру-
гом отношении — они могут синтезировать белок из неорганических
солей азота, например аммониевых. К пище жвачных можно до-
бавлять мочевину и таким путем увеличивать синтез белка. Это
значительно экономичнее, чем добавлять в корм дорогие продукты,
богатые белком. Особенно важен синтез белка микроорганизмами
в рубце в тех случаях, когда животное получает низкокачествен-
ный корм. Обнаружено, например, что верблюд, получающий пи-
щу, почти лишенную белка (плохое сено, финики) практически не
выделяет с мочой мочевину. Мочевина поступает в рубец отчасти
через его стенки, отчасти со слюной и используется на ресинтез
белков. Аналогичное повторное использование мочевины наблюда-
лось у овец. Если к рациону жвачных добавлять неорганический
сульфат, микробный синтез белка усиливается и, что крайне суще-
ственно, сера сульфата включается в очень важные аминокисло-
ты — метионин, цистеин.
Таким образом, микроорганизмы рубца улучшают и качество
белка. Они синтезируют все незаменимые аминокислоты, многие
важные витамины, все это после их отмирания остается в кишеч-
нике «хозяина» и усваивается. Большую роль в этом отношении
играет синтез витамина Bi2, который жвачные животные получают
только от микроорганизмов. Симбиотическое переваривание цел-
люлозы осуществляют и некоторые нежвачные травоядные живот-
ные, не имеющие хорошо выраженного рубца. Однако поскольку
целлюлозосодержащая пища бывает, как правило, большого объе-
358
ма, ее микробное брожение идет медленно и для нее требуется
отдел пищеварительного тракта больших размеров. У некоторых
нежвачных травоядных желудок большой, состоит из нескольких
отделений, у других целлюлоза расщепляется в слепой кишке.
Многокамерные желудки имеют также некоторые обезьяны, ле-
нивец, один из видов кенгуру.
Улучшение переваривания растительного материала с помощью
симбиотического микробного брожения встречается и у некоторых
птиц, например у белой куропатки, которая несколько зимних ме-
сяцев питается в основном почками и молодыми ветками. У боль-
шинства птиц семейства куриных имеются две слепые кишки для
сбраживания целлюлозы. Локализация этого процесса в заднем
отделе кишечника менее выгодна, чем в рубце, так как исключа-
ется возможность дальнейшего переваривания пищи при прохож-
дении кишечника. У многих грызунов, кроликов и зайцев это ком-
пенсируется капрофагией, поеданием кала.
Много дискуссионного пока остается в сведениях о переварива-
нии целлюлозы беспозвоночными. Убедительно такая способность
(без симбиоза с микроорганизмами!) доказана для чешуйницы
(Ctenolepisma lineata) в опытах с 14С-целлюлозой и стерильными
особями. Есть основания считать возможным самостоятельное
расщепление целлюлозы корабельным червем (Teredo), виноград-
ной улиткой, однако по этому поводу высказываются и возраже-
ния. Несомненна роль симбиотических бактерий и жгутиковых в
усвоении целлюлозы термитами.
У человека основная масса целлюлозы, поступающей с пищей,
в неизмененном виде переходит в кал. Лишь небольшая часть клет-
чатки расщепляется в толстом кишечнике человека с помощью
ферментов кишечной микрофлоры и может усваиваться. Доля та-
кой клетчатки зависит от количества и состава других компонентов
пищевого рациона. Однако присутствие целлюлозы в пище в лю- J
бом случае нельзя считать бесполезным, так как клетчатка повы-
шает секрецию пищеварительных соков, усиливает перистальтику,
способствуя тем самым пищеварению.
6.8. Регуляция постоянства содержания
глюкозы в крови
Всосавшиеся из кишечника моносахариды (преимущественно
глюкоза) через воротную вену доставляются прежде всего в пе-
чень, где часть глюкозы используется на образование запасных
отложений гликогена. Содержание последнего в печени человека
и животных зависит от режима питания; чем больше углеводов
в рационе, тем больше гликогена в печени. Синтез и распад глико-
гена катализируются различными ферментами и контролируются
независимо. Часть глюкозы используется самой печенью для по-
лучения энергии, необходимой для многочисленных реакций, про-
текающих в ней. Кроме того, определенное количество глюкозы в
печени превращается в жиры. Так, при нормальном смешанном
359
питании только 3—5% глюкозы превращается в гликоген (его
среднее содержание в печени колеблется от 5 до 7%), 30% глюко-
зы идет на образование жиров и 60—70% окисляется до СО2 и
Н2О. При обильном углеводном питании 10% глюкозы откладыва-
ется в печени в виде гликогена, 40%—превращается в жиры и
50% окисляется.
Сахар в крови, лимфе, спинно-мозговой жидкости представлен
глюкозой, уровень которой очень тонко регулируется. Содержание
глюкозы в артериальной и капиллярной крови здорового человека
составляет 54—96 мг/100 мл при определении глюкозооксидазным
методом и 80—120 мг/100 мл при определении по Хагедорну и
Йенсену (вторым методом кроме глюкозы определяются одновре-
менно некоторые другие редуцирующие вещества в крови). В ве-
нозной крови содержится меньше глюкозы, так как она потребля-
ется тканями из крови. Единственный орган, выделяющий глюкозу
в общую циркуляцию, — печень.
Сахара — компонент внутренней среды и у бесповозночных. Так,
в гемолимфе насекомых они представлены в основном трегалозой.
Из позвоночных наиболее постоянен уровень глюкозы натощак у
человека и высших позвоночных. У птиц содержание глю-
козы в крови выше, чем у млекопитающих. Для низших позвоноч-
ных характерны большие колебания сахара в крови в зависимо-
сти от внешней среды и биологического периода жизни. У холодно-
кровных животных (рыбы, амфибии, рептилии) глюкозы в крови
меньше, чем у теплокровных, — 30—50 мг/100 мл. Существует за-
висимость между содержанием глюкозы в крови и степенью под-
вижности животных; например, у донных, малоподвижных рыб
концентрация глюкозы в крови ниже, чем у подвижных рыб гор-
ных ручьев или быстротекущих рек. В крови жвачных глюкозы
менее 50 мг/100 мл, так как у них из кишечника кроме глюкозы в
кровь поступают продукты брожения клетчатки — органические
кислоты.
После приема пищи, содержащей углеводы, уровень глюкозы в
воротной вене печени человека может повыситься до 200—220
мг/100 мл. Однако при этом во всей остальной кровеносной системе
содержание глюкозы у здорового человека или не будет изменять-
ся (54—96 мг/100 мл), или несколько увеличится (пищевая ги-
пергликемия), но в результате выведения избытка глюкозы с мочой
через почки (пищевая глюкозурия) через 1,5—2 ч после принятия
пищи придет в норму. Выведение глюкозы с мочой начинается при
ее содержании в крови выше 120—150 мг/100 мл. Это может про-
исходить при одновременном приеме 160—180 г сахарозы или 120—
150 г фруктозы (рис. 6.11).
Углеводное голодание определенной продолжительности или
усиленное расходование глюкозы при активной физической нагруз-
ке у здорового человека также не приводит к существенным откло-
нениям содержания глюкозы в крови от нормы. Таким образом, в
организме непрерывно поддерживается постоянное количество глю-
козы в крови, происходит гомеостатическая регуляция.
360
живых орга-
рассматри-
и понятиях
науки о за-
управления и
лежит
такого
6.11. Динамика содержания глюкозы
Рис.
в крови человека после приема сахаров:
1 — норма, 2 — при диабете
При гомеостазе изменение концентрации какого-либо вещества
в организме само инициирует возникновение процессов, направлен-
ных на восстановление нормальной концентрации этого вещества,
осуществляется ауторегуляция. В основе этих механизмов
взаимодействие прямых и обратных связей, поэтому в целом
рода явления в
низмах можно
вать в рамках
кибернетики —
конах связи,
контроля.
Простейшей формой регу-
ляции уровня глюкозы в кро-
ви является осуществление
гомеостатической, регуля-
торной функции печени. Этот
физиологический механизм,
филогенетически наиболее
древний, недостаточен для
обеспечения организма вы-
сокоразвитых животных и
человека полноценным угле-
водным питанием. В процес-
. се эволюции выработались мощные нервные и эндокринные меха-
низмы, воздействующие как на гомеостатическую функцию пече-
ни, так и на способность различных клеток потреблять глюкозу.
При рассмотрении гормонального звена регуляции обращает
на себя внимание тот факт, что инсулин является единственным
гормоном, обладающим резким сахаропонижающим действием.
Остальные гормоны, влияющие на углеводный обмен в сторону
увеличения уровня глюкозы в крови, получили название диабето-
генных или контринсулярных. Инсулин выступаете роли репрессора
синтеза ключевых ферментов глюконеогенеза и индуктора синтеза
гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы и гликоген (крах-
мал)-синтазы. Глюкокортикоиды являются индукторами синтеза
ферментов глюконеогенеза.
Инсулин секретируется р-клетками островков Лангерганса под-
желудочной железы в форме проинсулина. Основным проявлением
недостаточности инсулина является повышение уровня глюкозы в
крови (гипергликемия), избыточное выведение глюкозы с мочой
(глюкозурия) и понижение содержания гликогена в печени. Недос-
таточность инсулина подавляет биосинтез жирных кислот из глю-
козы и ацетата, а также биосинтез белков; усиливает синтез фер-
ментов, участвующих в глюконеогенезе; нарушает соотношение
между гликолизом и глюконеогенезом.
Наиболее вероятной в настоящее время представляется мемб-
ранная локализация первичного действия инсулина. Получены до-
казательства наличия специфического акцептора инсулина на
внешней плазматической мембране жировых клеток, а также обра-
361
зование инсулин-рецепторного комплекса. Предполагают, что в
жировых клетках и частично клетках печени в передаче инсулино-
вого сигнала принимают участие аденилатциклаза ицАМФ. В мыш-
цах инсулин легко проникает внутрь клетки.
Мышцы и печень при недостатке инсулина не способны исполь-
зовать глюкозу даже при высоком ее содержании в крови. Это яв-
ление получило название «голод среди изобилия». Ткани мозга и
миокарда по мере нарастания гипергликемии усиливают утилиза-
цию глюкозы. В этом достаточно ограниченном аспекте гиперглике-
мию Можно рассматривать как полезное приспособление. Недоста-
точность выделения инсулина лежит в основе возникновения забо-
левания— диабета. Многие последствия диабета напоминают эф-
фект углеводного голодания, хотя содержание глюкозы в крови
при этом заболевании резко повышается.
Глюкагон — гормон, продуцируемый а-клетками поджелудоч-
ной железы, активирует расщепление гликогена в печени, в резуль-
тате чего освобождается глюкоза, поступающая в кровь.
Адреналин — гормон мозгового слоя надпочечников. Совместно
с глюкагоном активирует гликоген-фосфорилазу печени и мышц,
увеличивает содержание глюкозы в крови. Фермент встречается в
двух формах — активной (фосфорилаза а) и неактивной (фосфо-
рилаза Ь). Молекулярная масса фосфорилазы а составляет 380 000.
Фосфорилаза а состоит из четырех субъединиц, каждая из которых
содержит остаток фосфосерина и молекулу кофермента — пиридок-
сальфосфата, ковалентно связанную с остатком лизина. Фосфата-
за фосфорилазы вызывает гидролитическое расщепление связи
фосфатной группы с остатком серина и образование димеров.
Неактивная гликоген-фосфорилаза 6, состоящая из двух субъ-
единиц, фосфорилируется в активную гликоген-фосфорилазу а
киназой фосфорилазы. Последняя активируется циклическим
АМФ, образуемым аденилатциклазой. Адреналин стимулирует об-
разование цАМФ аденилатциклазой. Таким образом, адреналин
ускоряет расщепление гликогена. С другой стороны, стимулируя
аденилатциклазу, адреналин подавляет синтез гликогена из
УДФ-глюкозы за счет накопления формы гликоген (крахмал)-син-
тазы, нуждающейся в высоких концентрациях глюкозо-6-фосфата.
Механизмы действия адреналина и глюкагона на поддержание
уровня глюкозы в крови аналогичны.
Глюкокортикоиды (гормоны коркового слоя надпочечников)
усиливают глюконеогенез — новообразование сахара из неуглево-
дов. Это приводит к увеличению количества глюкозы в крови и
гликогена в печени. Соматотропный гормон гипофиза уменьшает
утилизацию глюкозы периферическими тканями, усиливает глюко-
неогенез, угнетает продукцию инсулина, в итоге повышает содер-
жание глюкозы в крови. Тироксин и трийодтиронин (гормоны щи-
товидной железы) в умеренных дозах усиливают всасывание моно-
сахаридов в кишечнике. Избыток этих гормонов тормозит окисли-
тельное фосфорилирование и способствует повышению концентра-
ции глюкозы в крови.
362
Содержание гормонов в крови находится под контролем цент-
ральной нервной системы, осуществляющей контроль за уровнем
глюкозы в крови через эндокринную систему. Однако помимо опос-
редованного влияния на уровень глюкозы в крови центральная
нервная система (ЦНС) осуществляет и прямое воздействие. Сни-
жение концентрации глюкозы в крови ниже 60—70 мг% приводит к
рефлекторному возбуждению соответствующих центров, располо-
женных в гипоталамусе. Возбуждение передается из ЦНС по нерв-
ным путям спинного мозга, переходит в симпатический ствол и по
симпатическому нерву достигает печени. В результате такого воз-
буждения нервной системы часть гликогена печени распадается с
образованием глюкозы. Этот процесс получил название мобилиза-
ции глюкозы. Когда концентрация глюкозы возвращается к исход-
ному уровню, импульсы, идущие из ЦНС, ослабевают и расщепле-
ние гликогена задерживается.
Таким образом, за счет контроля со стороны ЦНС и эндокрин-
ной системы в крови автоматически поддерживается постоянный
уровень глюкозы, происходит саморегуляция, которая может осу-
ществляться на различных уровнях. Так, например, кровь с избы-
точным содержанием глюкозы, достигая поджелудочной железы,
непосредственно стимулирует выделение инсулина. Последний уси-
ливает поглощение глюкозы тканями, использование ее на синтез
гликогена, в результате концентрация глюкозы снижается до
нормы. На содержание глюкозы в крови, как показали исследова-
ния К. М. Быкова, определенное влияние оказывает и кора голов-
ного мозга. Примером этого является эмоциональная гиперглике-
мия— повышенное содержание глюкозы в крови в возбужденном
состоянии (у спортсменов перед стартом, у студентов перед экза-
меном).
6.9. Превращения углеводов, связанные с дыханием
и брожением
6.9.1. Гликолиз. Стадии и реакции гликолиза. Гли-
колиз— это анаэробный процесс, приводящий к распаду одной мо-
лекулы глюкозы на две молекулы молочной кислоты. При этом ос-
вобождается энергия, которую организм аккумулирует в форме
АТФ. Реакции гликолиза протекают в цитозоле, без потребления
кислорода. В анаэробных условиях гликолиз—единственный про-
цесс в организме животных, растений и многих бактерий, постав-
ляющий энергию.
При аэробном расщеплении глюкозы один из конечных про-
дуктов гликолиза — пировиноградная кислота окисляется до СО2
и Н2О в цикле трикарбоновых кислот (см. разд. 6.9.5). Реакция это-
го цикла осуществляется в митохондриях (у бактерий-—в соответ-
ствующих мембранных образованиях) при участии кислорода.
Полная цепь реакций гликолиза была выявлена трудами
Л. А. Иванова, С. П. Костычева, А. Н. Лебедева, Г. Эмбдена,
Я. О. Парнаса и О. Мейергофа к середине 30-х годов нашего сто-
363
летия. Эти реакции катализируются группой из одиннадцати фер-
ментов, которые хорошо изучены, легко экстрагируются из клеток
и катализируют реакции in vitro. Гликолиз протекает в две стадии.
Первая стадия — подготовительная, или собирательная. На
этой стадии различные гексозы вовлекаются в гликолиз. Хотя в ре-
акциях гликолиза окисляется главным образом глюкоза, наряду с
ней могут вступить в этот процесс другие различные гексозы, на-
пример фруктоза, манноза. При этом инертные молекулы гексоз
активируются, фосфорилируются за счет АТФ, превращаются в
глюкозо-6-фосфат. Этот этап заканчивается образованием глице-
ральдегид-3-фосфата. Важнейшая роль фосфорной кислоты в про-
цессах анаэробного расщепления глюкозы была впервые установ-
лена в исследованиях русских биохимиков Л. А. Иванова (1901,
1906), А. Н. Лебедева (1905).
Вторая стадия — окислительная. Глицеральдегид-З-фосфат
окисляется до пировиноградной кислоты (пируват) или молочной
кислоты (лактат). Энергия окисления накапливается в АТФ, обра-
зуются восстановительные эквиваленты НАДН.
На схеме (рис. 6.12) представлена полная цепь реакций глико-
лиза. Она начинается с фосфорилирования D-глюкозы за счет
АТФ. Это первая пусковая реакция гликолиза, она является одной
из ключевых в этом процессе. Нейтральная молекула D-глюкозы
превращается в отрицательно заряженный глюкозо-6-фосфат:
Гексокиназа
АТФ + Глюкоза-------------> АДФ + Глюкозо-6-фосфат
Mg2+
Эту реакцию катализируют ферменты двух типов, различающи-
еся по своей специфичности в отношении сахаров, — гексокиназа и
глюкокиназа. Гексокиназа играет основную роль, именно она
функционирует в большинстве клеток. Гексокиназа способна ката-
лизировать фосфорилирование не только D-глюкозы, но также и
многих других гексоз, например D-фруктозы, D-маннозы и D-глю-
козамина.
Глюкокиназа фосфорилирует только D-глюкозу, к тому же об-
ладает к ней более низким сродством, чем гексокиназа. Глюкоки-
наза содержится в печени. Она вступает в действие только в том
случае, когда концентрация глюкозы в крови очень высока. Обе
киназы нуждаются в присутствии двухвалентных катионов (Mg2+
или Мп2+), которые связываются с АТФ, образуя истинные субст-
раты— МдАТФ2~ или МпАТФ2-. В ходе гексокиназной реакции
происходит значительное уменьшение свободной энергии, что обес-
печивает необратимость этой реакции внутри клетки. Скорость ре-
акции тормозится ее продуктом — глюкозо-6-фосфатом.
Вторая реакция — изомеризация глюкозо-6-фосфата во фрук-
тозо-6-фосфат:
Г ексозофосфат-
Глюкозо-6-фосфат <-------фруктозо-6-фосфат
изомераза
364
АТФ
Г люкоза _________________-
АДФ-*-' |-< Фн f ^^Глюкозо-1-ф осфат
АТФ
Г люкозо-6-фосфат
Ф руктоз о-6-ф осфат
-----------► Адф
Фруктозо-1,6-дифосфат
Глицеральдегид-З-фосфат (2)
Рис. 6.12. Реакции гликолиза,
В рамки помещены исходные субстраты и конечные продукты гли-
колиза; цифрами в скобках обозначено число молекул
Третья реакция — фосфорилирование фруктозо-6-фосфата с об-
разованием фруктозо-1,6-дифосфата. Это вторая пусковая реакция
гликолиза, в ней используется вторая молекула АТФ:
365
6-Фосфофрукто-
АТФ фруктозо-6-фосфат--------------> Фруктозо-1,6-дифосфат+АДФ
киназа, Mg2+
Реакция необратима, так как происходит значительное умень-
шение свободной энергии. Она протекает при участии фермента
фосфофруктокиназы в присутствии ионов Mg2+, необходимых, ви-
димо, для образования истинного субстрата, т. е. М§АТФ2". Это
наиболее медленная реакция гликолиза, она определяет скорость
процесса в целом, на ее уровне в основном осуществляется регуляция.
Фосфофруктокиназа относится к числу аллостерических, или регу-
ляторных, ферментов. Она ингибируется АТФ и лимонной кисло-
той, активируется АДФ и АМФ. В период покоя клетки при высо-
ком отношении АТФ/АДФ активность фосфофруктокиназы
понижается, гликолиз замедляется. При функциональной активно-
сти клетки количество АТФ уменьшается, и гликолиз ускоряется.
Четвертая реакция — расщепление фруктозо-1,6-дифосфата
представляет собой обращенную альдольную конденсацию (см.
разд. 6.5.1):
СН2О(Р) О
СН2О(Р)
С-0
С—Н
НОСН
Альдолаза J-JCOH
НСОН
СН2ОН
НСОН
СН2О(Р)
D-Глицераль-
дегид-3-фосфат
Дигидрокси-
ацетонфосфат
СН2О(Р)
Фруктозо-1 ,б-
ди фосфат
Пятая реакция — изомеризация триозофосфатов. Из образовав-
шихся триозофосфатов в последующие реакции гликолиза непос-
редственно включается только один — глицеральдегид-3-фосфат.
В него превращается дигидроксиацетонфосфат в обратимой реак-
ции:
СНоОН
। Триозофосфат-
С=О Z—~......
| изомераза
СН2О(Р)
НСОН
I
СН2О(Р)
Дигидрокси-
ацетонфосфат
D-Глицеральдегид-
3-фосфат
Образованием фосфотриоз завершается первая стадия гликоли-
за. Молекула глюкозы путем двух фосфорилирований и расщепле-
ния превратилась в две молекулы фосфотриоз.
Вторая стадия гликолиза включает окислительно-восстанови-
тельные реакции и реакции фосфорилирования, в процессе кото-
рых генерируется АТФ, На этой стадии окисляются обе молекулы
366
фосфотриоз, т. е. две половины молекулы глюкозы. Поэтому во
всех остальных реакциях впереди формулы субстрата следует пос-
тавить коэффициент 2.
Шестая реакция — центральный этап гликолиза — представляет
собой окислительно-восстановительный процесс. Альдегидная груп-
па глицеральдегид-3-фосфата окисляется в COOH-группу 1,3-ди-
фосфоглицериновой кислоты, НАД* восстанавливается в НАДН.
Освобождается энергия, за счет которой образуется высокоэнерге-
тическая связь 1,3-дифосфоглицериновой кислоты. Таким образом,
в этой реакции происходит субстратное фосфорилирование. Сум-
марное уравнение реакции следующее:
с<(° с<°
Глицеральдегид- I
ОН + Н3РО4 + НАД* . > ИСОН + НАДН + Н+
I фосфатдегидро- I
СН2О(Р) геназа СН2О(Р)
D-Глицеральдегид-З- 1,3-Дифосфоглице-
фосфат риновая кислота
Седьмая реакция — богатая энергией фосфорильная группа
1,3-дифосфоглицериновой кислоты (находящаяся в положении 1)
переносится на АДФ с образованием АТФ:
С-О~(Р)
H(Lh + АДФ
СН2О(Р)
1, 3-Дифосфоглице-
риновая кислота
Фосфоглице-
раткиназа
НСОН + АТФ
I
СН2О(Р)
3 • Фосфоглицерино-
вая кислота
Восьмая реакция — фосфатная группа фосфоглицериновой кис-
лоты переносится из положения 3 в положение 2:
НСОН
Фосфоглицеро-
I
СН2О(Р)
мутаза
I
СН2ОН
3- Фосфоглицери-
новая кислота
2 • Фосфог лицери-
новая кислота
Девятая реакция — внутримолекулярный окислительно-восста-
новительный процесс: степень окисления С-2 2-фосфоглицериновой
кислоты увеличивается, а С-1 — уменьшается. В результате обра-
зуется высокоэнергетическое соединение фосфоенолпировиноград-
ная кислота. Таким образом, здесь также происходит субстратное
фосфорилирование. Формально реакция представляет собой от-
щепление молекулы воды;
36?
с
Енолаза
НС—О—(Р)
СН2ОН
2-Фосфоглице-
риновая кислота
|\эн
С-О~(Р) + Н2О
II
сн2
Фосфоенолпиро*
виноградная
кислота
Десятая реакция — перенос фосфорильной группы вместе с вы-
сокоэнергетической связью от фосфоенолпировиноградной кислоты
на АДФ:
с^°
I 'ОН
I Пируватки-
С—О~(Р)+ АДФ------------»
|| наза
СН2
Фосфоенол пиро-
виноградная
кислота
с/°
|\он
С=О + АТФ
I
сн3
Пировиног-
радная
кислота
Эта реакция сильно экзергоническая, вследствие чего в клетке она
практически необратима.
В одиннадцатой реакции происходит восстановление пировино-
градной кислоты (ПВК) до молочной с участием НАДН:
с/°
1 ^он
I Лактатдеги-
С=О + НАДН + Н+ ...............:±
I дрогеназа
СН3
Пировиноград-
ная кислота
НСОН+ НАД+
СН3
Моточная
кислота
Равновесие сильно смещено в сторону образования молочной
кислоты. Кофермент НАД выполняет роль переносчика электро-
нов. Донором электронов для него в реакциях гликолиза служит
глицеральдегид-3-фосфат (реакция 6). Если бы НАДН, образо-
вавшийся при окислении глицеральдегид-3-фосфата, не окислялся,
то гликолиз остановился бы, так как весь НАД+ восстановился бы
в НАДН. Это предотвращается действием лактатдегидрогеназы.
Одиннадцатая реакция завершает процесс гликолиза. На ее
уровне осуществляется регуляция гликолиза с помощью изофер-
ментов лактатдегидрогеназы (см. разд. 3.8). Молочная кислота —
это своеобразный тупик в метаболизме. В аэробных условиях она
может превращаться только в ПВК путем обращения лактатде-
гидрогеназной реакции. В анаэробных условиях молочная кисло-
та — конечный продукт гликолиза, например в мышцах при боль-
ших физических нагрузках. Тогда из мышц в кровь поступает
большое количество молочной кислоты. В печени, а частично и в
363
самих мышцах примерно одна пятая количества молочной кислоты
окисляется до СО2 и Н2О в аэробной фазе дыхания. Оставшиеся
четыре пятых ресинтезируются в гликоген.
Образовавшийся при гликолизе в цитоплазме НАДН не может
проникать внутрь митохондрий. В аэробных условиях он передает
электроны и протон в дыхательную цепь митохондрий (см. разд.
7.2) посредством глицерофосфатного челночного механизма, В ци-
топлазме НАДН реагирует с дигидроксиацетонфосфатом, образуя
глицерол-3-фосфат, который легко проникает через мембрану ми-
тохондрий. Реакция катализируется цитоплазматической глицерол-
3-фосфат — дегидрогеназой (НАД+):
Дигидроксиацетонфосфат + НАДН + Н+ Глицерол-З-фосфат +
+ НАД+
Внутри митохондрии глицерол-3-фосфат снова окисляется до
дигидроксиацетонфосфата, но уже с помощью флавинового фер-
мента— митохондриальной глицерол-3-фосфат — дегидрогеназы:
Глицерол-З-фосфат + ФАД Дигидроксиацетонфосфат + ФАДН2
Кофермент ФАДН2 вводит электроны и протоны в дыхательную
цепь. При этом пара атомов Н дает только две молекулы АТФ, а
не три, как при обычном введении пары электронов в дыхательную
цепь через НАДН. Глицерофосфатный челночный механизм обес-
печивает перенос электронов только внутрь митохондрий, т. е. яв-
ляется односторонним. Он особенно характерен для клеток печени
и летательных'мышц насекомых. В г." же клетках печени, а также
в других тканях функционирует малатный челночный механизм,
который является обратимым: переносит водород в митохондрии
и из них. При этом цитоплазматический НАДН восстанавливает
щавелевоуксусную кислоту до яблочной, легко проникающей в ми-
тохондрии и там снова окисляющейся до щавелевоуксусной кисло-
ты с передачей водорода в дыхательную цепь.
Баланс энергии в реакциях гликолиза. В ходе
гликолиза каждая шестиуглеродная молекула D-глюкозы превра-
щается в две трехуглеродные молекулы молочной кислоты. При
этом в первую стадию гликолиза расходуются две молекулы АТФ
для активирования субстрата (в гексокиназной и фосфофруктоки-
назной реакциях). Во вторую стадию гликолиза АТФ образуется в
двух реакциях: при действии фосфоглицераткиназы и пируваткина-
зы. Поскольку каждая молекула глюкозы дает две молекулы гли-
цёральдегид-3-фосфата, всего получается четыре молекулы АТФ.
Но так как две из них расходуются в первой стадии, в результате
гликолиза образуются только две молекулы АТФ на одну молеку-
лу глюкозы. Нетрудно рассчитать КПД этого процесса. Выдели-
лась энергия:
Глюкоза -*• 2 Молочная кислота + 2Н+; AG0' (pH 7) =
= — 196 кДж • моль-1
369
При этом она аккумулировалась в двух молекулах АТФ:
АДФ + Н3РО4 -> АТФ + Н2О; AG0' (pH 7) ==
— + 34,5 кДж • моль-1; 34,5 кДж*моль"1х2 = 69 кДж*моль-1
Таким образом, энергетическая эффективность гликолиза, его
КПД составляет — 35%. Следовательно, лишь одна треть энергии,
выделяющейся при окислительном расщеплении глюкозы до молоч-
ной кислоты, запасается организмом в высокоэнергетических свя-
зях АТФ.
В извлечении из дыхательного материала (углеводов) свобод-
ной энергии и аккумуляции ее в легко используемой форме — моле-
кулах АТФ — прежде всего заключается роль гликолиза как ана-
эробной фазы дыхания. Кроме того, в ходе реакций гликолиза об-
разуется много высоко реакционноспособных соединений. Они ис-
пользуются в разнообразных метаболических реакциях. Значение
гликолиза особенно велико в тканях и органах, где ограничен дос-
туп кислорода или возможно внезапное и резкое возрастание ско-
рости потребления АТФ. Например, в сердечной мышце скорость
потребления АТФ может возрасти в 10 раз, а в работающей скелет-
ной мышце — более чем в 100 раз. В этих случаях потребность в
АТФ в какой-то мере удовлетворяется за счет аэробной фазы дыха-
ния, но она ограничена притоком кислорода. В таких обстоятельст-
вах скелетные мышцы (в меньшей мере — сердечные) получают
дополнительное количество АТФ за счет гликолиза.
У растений в некоторых тканях гликолиз протекает даже при
достаточном доступе кислорода. Особенно характерно такое одно-
фазовое, «анаэробное дыхание» (или «аэробное брожение») для
зародышевой ткани семян и внутренних тканей плодов растений
вследствие недостатка в них кислорода. Гликолиз является основ-
ным путем катаболизма глюкозы гомоферментативных молочно-
кислых бактерий, дрожжей.
Анаэробному расщеплению могут подвергаться глюкозные ос-
татки гликогена, этот процесс называется гликогенолизом. Вклю-
чение гликогена в процесс анаэробного распада осуществляется
тремя ферментами. Гликоген-фосфорилаза и амило-1,6-глюкозида-
за (изоамилаза) расщепляют гликоген до глюкозо-1-фосфата. Да-
лее фосфоглюкомутаза превращает последний в глюкозо-6-фосфат,
который включается в обычные реакции гликолиза. Поскольку при
гликогенолизе на образование глюкозо-6-фосфата АТФ не тратит-
ся, в процессе гликогенолиза накапливаются не две, а три молеку-
лы АТФ на молекулу глюкозы. Однако это не означает, что глико-
генолиз энергетически более выгоден, чем гликолиз, так как на
синтез гликогена из глюкозы АТФ расходуется.
6.9.2. Брожения. Многие микроорганизмы (дрожжевые грибы,
плесневые грибы, бактерии) получают энергию за счет брожения.
Это наиболее примитивный способ получения энергии. Разнообраз-
ные брожения совпадают с гликолизом во многих своих стадиях,
что было установлено акад. С. П. Костычевым (1907—1912). Один
370
из конечных продуктов гликолиза — ПВК —исходное соединение
для аэробного расщепления глюкозы и разнообразных брожений
(рис. 6.13). Реакции дальнейшего превращения ПВК различны у
ряда микроорганизмов и приводят к образованию характерных
продуктов брожения, таких, как спирты и кислоты.
Принципиальное отличие брожений и анаэробного расщепления
глюкозы от аэробного заключается в том, что при брожениях роль
Глюкоза
АДФ+ФН
Этанол
Лактат |"< -----Пируват--------Ацетальдегид
[2Н]
Ацетил~КоА
Рис. 6.13. Возможные пути превращения пировиноградной кислоты:
ЦТК — цикл трикгрбоновых кислот; в рамках указаны продукты возможных
превращений пирувата
конечного окислителя — акцептора электронов и водорода играет
не кислород, а какие-либо органические соединения. Брожение и
анаэробное расщепление углеводов — это внутренние окислительно-
восстановительные процессы, в результате которых происходит
запасание энергии, а также регенерируется окисленный НАД+, что
совершенно необходимо для продолжения гликолиза и брожения,
так как содержание НАД4 в клетках ограничено.
Для дрожжевых грибов, особенно штаммов Saccharomyces се-
revisiae, характерен процесс спиртового брожения, в ходе которого
сахара расщепляются с высоким выходом этилового спирта и окси-
да углерода (IV): СбН12Об==2СО2 + 2С2Н5ОН. Превращение ПВК в
конечные продукты спиртового брожения включает две реакции:
Пируватдекар-
Пировиноградная кислота-------------> Уксусный альдегид + СО2 (1)
боксилаза
Характерной особенностью этой реакции является ее полная не-
обратимость. Пируватдекарбоксилаза требует наличия Mg2+ и ко^
фермента тиаминдифосфата (ТДФ).
371
Алкоголь-
Уксусный альдегид + НАДН + Н+ «------------ Этиловый спирт +
дегидрогеназа
+ НАД+ (2)
Другой часто встречающийся тип брожения — молочнокислое.
В результате гомоферментативного молочнокислого брожения из
глюкозы образуется молочная кислота с почти 100%-ным выходом.
Реакции этого процесса идентичны реакциям гликолиза. При гете-
роферментативном (смешанное) молочнокислом брожении из глю-
козы кроме молочной кислоты образуются в значительном коли-
честве другие продукты — уксусная кислота, этиловый спирт и ок-
сид углерода (IV). Химизм этого процесса совершенно иной, в ос-
нове его лежит окисление глюкозы по пентозофосфатному пути
(см. разд. 6.9.3).
Молочнокислое брожение протекает при силосовании кормов
для сельскохозяйственных животных, квашении капусты. Образую-
щаяся молочная кислота предотвращает развитие гнилостных бак-
терий, плесневых грибов, т. е. служит консервантом.
Пропионовая кислота представляет собой продукт сбражива-
ния углеводов пропионовыми бактериями. Наряду с ней образуют-
ся уксусная кислота и оксид углерода (IV). На каждую молекулу
ПВК, окисленную до уксусной кислоты и СО2, приходится две моле-
кулы ПВК, которые превращаются в пропионовую кислоту.
Уксуснокислые бактерии (рода Acetobacter) окисляют этило-
вый спирт до уксусной кислоты. Эти бактерии способны окислять
и другие спирты, в том числе предельные многоатомные. Такое яв-
ление называется неполным окислением.
6.9.3. Пентозный путь, или пентозофосфатный цикл окисления
углеводов. В 30-е годы XX столетия работами В. А. Энгельгардта,
О. Варбурга, Ф. Липмана, Д. Диккенса было доказано, что кроме
гликолиза в клетках существует еще один путь расщепления угле-
водов — ступенчатый окислительный распад гексоз до пентоз и
других сахаров с более короткой цепью. Ключевую роль в реакциях
этого цикла играют пентозофосфаты, в связи с чем он называется
пентозным путем или пентозофосфатным циклом. Первая реакция
этого пути — окисление глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюконовой
кислоты (6-фосфоглюконат), в связи с чем пентозофосфатный путь
называется также фосфоглюконатным. Так как в реакциях пути
окисляется монофосфат глюкозы, его нередко называют гексозомо-
нофосфатным путем (ГМФ-путь).
Пентозный путь имеет две фазы, все реакции протекают в цито-
плазме, ядрах и митохондриях. Первая фаза окислительная: глю-
козо-6-фосфат окисляется до пентозофосфатов. Вторая фаза —
неокислительная, она представляет собой взаимопревращения
трех-, четырех-, пяти-, шести-, семи- и восьмиуглеродных сахаро-
фосфатов, в результате которых регенерируется глюкозо-6-фосфат.
Первая реакция окислительной фазы представляет собой деги-
дрирование глюкозо-6-фосфата, катализируемое глюкозо-6-фосфат-
372
дегидрогеназой, которая специфически использует в качестве ак-
цептора электронов НАДФ+:
D-Глюкозо-б-фосфат + НАДФ+ 6-Фосфоглюконо-5-лактон +
+ НАДФН 4- Н+
Равновесие реакции сильно смещено вправо: Лактон спонтанно
гидролизуется до свободной кислоты. Однако в клетках содержит-
ся специфический фермент — глюконолактоназа, катализирующий
гидролиз:
6-Ф осф оглю коно-^-лактон
Глюконо-
лактоназа
СООН
НСОН
носн
н<!:он
н^он
сн2о©
6-Фосфоглюконовая
кислота
В следующей окислительной реакции 6-фосфоглюконовая кисло-
та дегидрируется и декарбоксилируется. Реакция сопровождается
образованием еще одной молекулы НАДФН:
СООН СН2ОН
I I
НСОН Фосфоглюконат- С~О
| дегидрогеназа |
НОСН + НАДФ+ -----------------------> НСОН + СО2 + НАДФН + Н+
I (декарбоксили- I
НСОН рующая) НСОН
НСОН СН2О(Р)
СН2О(Р)
6-Фосфоглюконовая D- Рибулозо-5-фосфат
кислота
Под действием фермента рибулозофосфат—3-эпимеразы рибуло-
зо-5-фосфат может обратимо превращаться в своей 3-эпимер —
ксилулозо-5-фосфат. При участии особой рибозофосфат-изомеразы
рибулозо-5-фосфат способен также обратимо превращаться в свой
альдоизомер — рибозо-5-фосфат:
373
СН2ОН
неон
I
неон
СН2О(р)
Рибулозо-5-ф осф ат
L
неон
H<jOH
неон
I о
сн2о(р)
Рибозо-5-фосфат
носн
н<!:он
сн2о(р)
Ксилулозо-5-фосфат
При определенных условиях фосфоглюконатный путь на этом
завершается, и тогда суммарный итог описывается уравнением
Глюкозо-6-фосфат + 2НАДФ+ Пентозо-5-фосфат + СО2 +
+ 2НАДФН + 2Н+
В других условиях наступает неокислительная стадия пентозо-
фосфатного пути. Она протекает в анаэробных условиях. Основные
реакции этой стадии осуществляются с участием специфических
ферментов — транскетолазы и трансальдолазы. Транскетолаза
осуществляет перенос гликоальдегидной группы (СН2ОН—СО—)
от ксилулозо-5-фосфата к рибозо-5-фосфату, промежуточным пере-
носчиком гликоальдегидной группы является тиаминдифосфат
(ТДФ):
: СН2ОН :
i I i
= С-0 :
Т.....
НОСН +
неон
СН2О(Р)
Кси л улозо-5 - фосфат
с<°
,| Н Транскето-
НСОН лаза
I ...~
НСОН (ТДФ)
I
НСОН
СН2О(Р)
Рибозо-5-фосфат
ГснЖ] г^°
; I 1
! £=о i | ХН
..........! неон
носн + |
I сн2О(Р)
НСОН
। Глицеральде-
НСОН гид-3-фосфат
I
НСОН
СН2О(Р)
Седогептулозо-7-фосфат
374
Трансальдолаза действует на продукты транскетолазной реак-
ции. Происходит перенос группы дигидроксиацетона от седогепту-
лозо-7-фосфата на глицеральдегид-3-фосфат, в результате чего
образуется фруктозо-6-фосфат:
Трансальдолаза
Седогептулозо-7-фосфат + Глицеральдегид-З-фосфат
Фруктозо-6-фосфат + Эритрозо-4-фосфат
Второй продукт реакции представляет собой фосфорный эфир че-
тырехуглеродного сахара — эритрозо-4-фосфат. Он используется во
второй транскетолазной реакции:
Транске-
Ксилулозо-5-фосфат + Эритрозо-4-фосфат Фруктозо-6-фосфат 4-
т лаза
+ Глицеральдегид-З-фосфат
Посредством пентозофосфатного цикла может происходить пол-
ное окисление глюкозо-6-фосфата до СО2. При этом 6 молекул глю-
козо-6-фосфата дают 5 молекул глюкозо-6-фосфата и 6 молекул
СО2 (рис. 6.14). Суммарное уравнение реакций имеет следующий
вид:
6 Глюкозо-6-фосфат + 7Н2О + 12НАДФ* 5 Глюкозо-6-фосфат +
+ 6СО2 + 12НАДФН + 12Н+ + Фн
Глюкоза
5 | Глюкозо-6-фосфат
1
Ф рукгозо-1,6-дифосфат-
Н2О
АТФ---------
АДФ-*—
Глюкозо-6-фосфат
6НАДФ+---------
| [3] Фруктозо-6-фосфат
ГД Триозо-З-фосфат / \
|~6~] Глюконо-^-лактон-6-фосфат
6 Н3О~-------
R1 Фосфоглю коновая
кислота
6НАДФ+----
6 НАДФН+6Н+
__ ГД Триозо-З-фосфат
Ш Рибулозо-5-ф осфатКсилулозо-5-фосфат
2£С едогешулозо-7-ф осфат
Рибозо-5-фосфат
Рис. 6.14. Пентозофосфатный цикл окисления глюкозы:
цифрами в квадратах обозначено число молекул
375
После сокращения общих членов получается:
Глюкозо-6-фосфат + 7Н2О + 12НАДФ+ 6СО2 -Г 12НАДФН +
+ 12Н+ +Н3РО4
Такое полное окисление глюкозо-6-фосфата происходит не во
всех клетках. Чаще пентозный путь на одном из этапов переходит
в гликолитический. Существует всего три точки сопряжения пен-
тозного пути с гликолизом: на уровне глюкозо-6-фосфата, фрукто-
зо-6-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата. Здесь осуществляется
пересечение метаболических путей, обеспечивающее образование
широкого набора различных метаболитов.
Работами Д. Ф. Вильямса, М. Г. Кларка, С. Е. Северина пока-
зано, что превращения пентозофосфатов в неокислительной стадии
могут протекать еще более сложно. После первой транскетолазной
реакции происходит следующее:
Эпимераза
Рибозо-5-фосфат <_ .. .. Арабинозо-5-фосфат
Триозофосфат-
Глицеральдегид-З-фосфат ". " Дигидроксиацетонфосфат
изомераза
Альдолаза
Арабинозо-5-фосфат + Дигидроксиацетонфосфат ..
Октулозо-1,8-дифосфат
Фосфотранс-
Октулозо-1,8-дифосфат + Седогептулозо-7-фосфат Z-- ' " "t
фераза
Октулозо-8-фосфат + Седогептулозе-1,7-дифосфат
Альдолаза
Седогептулозе-1,7-дифосфат 4--'- Эритрозо-4-фосфат+
+ Дигидроксиацетонфосфат
Транске-
Эритрозо-4-фосфат + Октулозо-8-фосфат t
тол аза
Фруктозо-6-фосфат + Глюкозо-6-фосфат
Последняя транскетолазная реакция представляет собой еще
одно доказательство тесной взаимосвязи гликолитического и пен-
тозофосфатного путей обмена углеводов. Она показывает, что эрит-
розо-4-фосфат может образовываться посредством транскетолазной
реакции из начальных продуктов гликолиза — глюкозо-6-фосфата
и фруктозо-6-фосфата. Благодаря этому как считают многие иссле-
дователи, гликолиз и пентозный путь способны переключаться с
одного на другой. Роль регулятора этого процесса выполняет эрит-
376
розо-4-фосфат. Если пентозофосфатов много, то эритрозо-4-фосфат
участвует в транскетолазной реакции, приводящей к образованию
глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Если же много гексозо-
фосфатов, то эритрозо-4-фосфат вступает в альдолазную реакцию,
пополняющую пул седогептулозо-1,7-дифосфата.
Значение пентозного пути состоит главным образом в том, что
он генерирует в цитоплазме восстановитель в форме НАДФН, не-
обходимый в больших количествах для биосинтеза многих веществ,
в частности жирных кислот и стероидов. Поэтому активность пен-
тозного цикла высока в клетках печени, молочной железы, жиро-
вой ткани и коры надпочечников. Другая функция этого пути зак-
лючается в том, что он поставляет пентозофосфаты для синтеза
нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Кроме того, у ряда микроорга-
низмов этим путем пентозы могут окисляться, а также превра-
щаться в гексозы.
Пентозный путь может быть также источником и Cz-caxa-
ров, которые необходимы клетке для синтеза важных метаболи-
тов. Образовавшийся НАДФН, как правило, не участвует в окисли-
тельном фосфорилировании, протекающем в митохондриях, поэто-
му у большинства организмов в плане энергетики пентозофосфат-
ный путь существенной роли не играет. Согласно наиболее
распространенной точке зрения первоначально пентозофосфатный
путь возник, видимо, для обеспечения прокариотических организмов
пентозами. Появление в процессе эволюции только трех новых
ферментов (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глюконолактоназа и
фосфоглюконатдегидрогеназа) решило проблему синтеза пентоз.
Возникнув для выполнения узкой специфической задачи, пентозо-
фосфатный путь у некоторых микроорганизмов стал выполнять и
дополнительную функцию: снабжение энергией в анаэробных ус-
ловиях. Например, у некоторых облигатных гетероферментатив-
ных молочнокислых бактерий (Leuconosioc mesenteroides) он
является единственным путем сбраживания углеводов, эти бакте-
рии не имеют ключевых ферментов гликолиза. Способность исполь-
зовать энергию возникла с появлением в процессе эволюции двух
новых ферментов: эпимеразы фосфопентоз и транскетолазы. Сфор-
мировался новый биохимический механизм — пентозофосфатный
цикл, в котором происходит полное расщепление дыхательного ма-
териала до СО2.
6.9.4. Путь Энтнера — Дудорова. Небольшое число микроорга-
низмов, к которым относятся главным образом бактерии из рода
Pseudomonas, получают энергию с помощью специфического мета-
болического пути— Энтнера — Дудорова. Он связан с пентозофос-
фатным циклом через 6-фосфоглюконовую кислоту и с гликолизом
через глицеральдегид-3-фосфат. Первые две реакции этого пути
идентичны началу пентозофосфатного цикла. Специфичным для
пути Энтнера —Дудорова являются две следующие реакции: обра-
зование кетодезоксифосфоглюконовой кислоты и дальнейшее ее
альдолазное расщепление на две триозы (рис. 6.15). Если глице-
ральдегид-3-фосфат окисляется далее путем реакций гликолиза до
377
Глюкоза
I
Глюкозо-6-фосфат
6-Фосфоглюконовая Пентозофосфатный’
кислота-------------цикл
Дегидратаза
2-Кето-З-дезокси-6-ф осф о-
глю коновая кислота (КДФГ)
КДФГ-альдолаза
Глицеральдегид-З-фосфат
Пировиноградная
кислота
Реакции
гликолиза
Рис. 6.15. Реакции пути Энтнера—Дудорова
ПВК, то одна молекула глюкозы, расщепляясь по пути Энтнера —
Дудорова, образует одну молекулу АТФ, одну молекулу НАДН и
одну молекулу НАДФН.
Путь Энтнера — Дудорова возник в процессе эволюции, види-
мо, как ответвление пентозного пути, поскольку первые две реак-
ции у них одинаковы. Существует предположение, что он появился
в связи с высокой потребностью прокариот в ПВК как кратчай-
ший путь ее образования (всего четыре реакции, тогда как при
гликолизе ПВК образуется после девяти реакций).
6.9.5. Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Окисле-
ние ПВК до ацетил коэнзима А. В цикл трикарбоновых
кислот (ЦТК) вступают ацетильные группы, образовавшиеся из
углеводов, жиров и аминокислот. Именно в ЦТК происходит пол-
ное расщепление ПВК, образующейся в результате гликолиза, до
конечных продуктов: СО2 и воды. Этот цикл был открыт и иссле-
дован Г. Кребсом в 1937 г., в связи с чем он называется также
циклом Кребса. Все реакции цикла протекают в матриксе мито-
хондрий. Непосредственным реакциям цикла предшествует подго-
товительная фаза — окисление ПВК до ацетилкоэнзима А (ацетил-
КоА). Это сложный процесс, суммарное уравнение которого имеет
следующий вид:
ПВК + НАД+ + КоА Ацетил-КоА + НАДН + Н+ + СО2
Процесс сопровождается значительным уменьшением свободной
энергии, он практически необратим.
378
Окислительное декарбоксилирование ПВК катализируется пи-
руватдегидрогеназной системой1. Она состоит не менее чем из трех
ферментов, которые используют пять коферментов: тиаминдифос-
фат (ТДФ), амид липоевой кислоты | j, коэнзим A (KoA-SH),
ФАД, НАД+
Сначала протекает реакция между ПВК и связанным с пиру-
ватдегидрогеназой ТДФ, которая катализируется ферментом пиру-
ватдегидрогеназой. Происходит декарбоксилирование, образуются
а-гидроксиэтил-ТДФ и СО2. Гидроксиэтильная группа еще связана
на поверхности фермента, но уже реагирует с дисульфидной фор-
мой ЛК, присоединенного ко второму ферментативному белку
системы — липоат-ацетилтрансферазе. Протекает окислительно-
восстановительная реакция, дисульфидные связи липоевой кисло-
ты восстанавливаются до двух SH-групп, одна из них образует
эфир с ацетилом, возникшим в результате окисления гидроксиэтиль-
ной группы. Ацетильная группа переносится к SH-группе КоА с об-
разованием ацетил-КоА.
Ацетил-КоА отделяется от поверхности фермента, оставляя вос-
становленный ЛК(ЗН)2. Окисление восстановленного амида ли-
поевой кислоты протекает при участии третьего фермента систе-
мы — лшгоамид-дегидрогеназьц которая содержит кофермент ФАД,
способный к восстановлению. ФАДН2 окисляется присутствующим
в среде НАД4-. На этом весь процесс завершается, все коферменты
оказываются в своем исходном состоянии, пригодном для следую-
щего цикла.
Пируватдегидрогеназная система в животных клетках обладает
молекулярной массой около 9-106. В ее состав входит 30 молекул
пируватдегидрогеназы, 60 молекул липоат-ацетилтрансферазы и
10 молекул липоамид-дегидрогеназы.
Реакции и ферменты цикла трикарбоновых кис-
лот. Образовавшийся в результате окислительного декарбоксили-
рования ПВК ацетил-КоА вступает в цикл трикарбоновых кислот.
Он конденсируется с молекулой щавелевоуксусной кислоты
(ЩУК, или оксалоацетат), в результате чего образуется лимонная
кислота. Реакция катализируется ферментом цитрат-синтазой,
найденным у животных, микроорганизмов и у различных расте-
ний.
Лимонная кислота превращается в цис-аконитовую, а затем —
в изолимонную. Эти реакции катализируются одним и тем же фер-
ментом— аконитат-гидратазой (рис. 6.16). Далее изолимонная
кислота дегидрируется и декарбоксилируется под действием изо-
цитратдегидрогеназы с образованием СО2 и а-кетоглутаровой
кислоты. Коферментом митохондриальной изоцитратдегидрогена-
зы служит НАД+, фермент нуждается в ионах Mg2+ или Мп2+, ал-
1 Ранее употреблявшийся в данном случае термин «комплекс» новыми
правилами номенклатуры ферментов (1979) не рекомендуется.
379
соон
Н2
соон
с—соон
соон
сн2
со2
2H
сн3
с=о
н2о
KoA~SH
CH3C~SKoA
Ацетил-КоА
сн2
нос—соон
соон
с—о
соон
Лимонная
кислота
нс
н—с—соон
Щавелево-
уксусная
кислота
сн
соон
СООН
Пировиноградная
кислота
соон
НСОН
СН;
СООН
цис-А конитовая
кислота
носн
СООН
Изолимонная
кислота
соон
СН2
Фумаровая
кислота
сн2
а-Кетоглу-
таровая
кислота
СН2
СН2
соон
Янтарная
кислота
соон
сн
СООН \
н о
Яблочная 2 НС
кислота I
о
СООН
Рис. 6.16. Цикл трикарбоновых кислот (конечные продукты обведены рамкой)
лостерически активируется под действием АДФ. Активность фер-
мента сильно ингибируют АТФ и НАДН, последний за счет
конкуренции с НАД4-. Благодаря этому при любых метаболических
условиях, вызывающих повышение концентрации АДФ в клетке,
автоматически увеличивается скорость окисления изолимонной кис-
лоты. Вместе с тем увеличивается скорость всего ЦТК, так как
обычно именно эта реакция лимитирует процесс в целом. Наобо-
рот, увеличение концентрации АТФ и накопление НАДН приводит
к выключению изоцитратдегидрогеназы, замедлению реакций
цикла.
Следующая реакция — окислительное декарбоксилирование
а-кетоглутаровой кислоты до янтарной кислоты. Суммарное урав-
нение реакции таково:
СООН
I
СН2
I
СН2 ч- НАД+ + Н2О + ГДФ + Фн
I
с=о
I
соон
а-Кетоглутаратде-
гидрогеназная система
а-Кетоглутаровая
кислота
380
СООН
I
сн2
| + НАДН + Н+ + СО2 + П Ф
сн2
СООН
Янтарная
кислота
Это сложная многоступенчатая реакция, имеющая сходство с
реакцией окисления ПВК. Механизм обеих реакций практически
одинаков: и в той, и в другой участвуют в качестве кофакторов
тиаминдифосфат, ЛК, КоА, НАД+ и ФАД.
а-Кетоглутаратдегидрогеназная система напоминает по своей
структуре и свойствам пируватдегидрогеназную систему. Первая
стадия окислительного декарбоксилирования а-кетоглутаровой
кислоты включает в себя окисление и декарбоксилирование:
а-Кетоглутаровая кислота + НАД+ 4- КоА
Сукцинил ~ КоА + СО2 4- НАДН 4- Н+
Конечный продукт этой реакции — сукцинил-КоА— представля-
ет собой высокоэнергетический тиоэфир, у которого в образовании
сложноэфирной связи участвует одна из СООН-групп янтарной
кислоты (сукцината). На следующем этапе сукцинил-КоА утрачи-
вает свою КоА-группу, освобождающаяся энергия запасается в
фосфатной связи ГТФ:
Сукцинил ~ КоА 4- Фн 4- ГДФ Янтарная кислота + ГТФ 4- KoA-SH
Реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой и
относится к реакциям субстратного фосфорилирования: энергия
окисления, которая была накоплена в сукцинил-КоА, переносится
на ГТФ. ГТФ может отдавать свою концевую фосфорильную груп-
пу АДФ, в результате чего образуется АТФ: ГТФ + АДФ^ГДФ +
+АТФ. Эту реакцию катализирует нуклеозид-дифосфат— ки-
наза.
В дальнейшем происходит окисление янтарной кислоты до фу-
маровой. Оно катализируется ферментом сукцинатдегидрогена-
зой— флавопротеином, в молекуле которого с белком ковалентно
связан ФАД, действующий в этой реакции как акцептор водорода.
В отличие от других ферментов ЦТК, находящихся в матриксе ми-
тохондрий, сукцинатдегидрогеназа — белок внутренней мембраны
митохондрий. Через сукцинатдегидрогеназу электроны и протоны
от ФАДН2 непосредственно входят в дыхательную цепь.
В следующей реакции, протекающей в матриксе, осуществляет-
ся обратимая гидратация фумаровой кислоты с участием фермен-
та фумаратгидратазы, образуется L-яблочная кислота (L-малат).
В последней реакции ЦТК НАД-зависимая малатдегидрогеназа ка-
тализирует окисление L-яблочной кислоты в ЩУК, которая вступа-
ет в новый цикл реакций.
381
Баланс энергии в цикле трикарбоновых кис-
лот. За один оборот ЦТК молекула ПВК оказывается полностью
окисленной до СО2 и Н2О. Всего образуется 3 молекулы СО2 в
следующих реакциях: при окислительном декарбоксилировании
ПВК, при декарбоксилировании изолимонной кислоты, при окисли-
тельном декарбоксилировании а-кетоглутаровой кислоты. В цикл
вступает три молекулы воды: в реакции окислительного декарбок-
силирования ПВК и а-кетоглутаровой кислоты и в фумаратгидра-
тазную. Всего при окислении ПВК отнимается пять пар атомов
водорода, из них одна пара — от янтарной кислоты — поступает на
ФАД, четыре пары — на НАД+ с образованием НАДН: при окис-
лительном декарбоксилировании ПВК, а-кетоглутаровой и изоли-
монной кислот, при окислении яблочной кислоты. Нетрудно ви-
деть, что в ЦТК молекулярный кислород непосредственно не уча-
ствует, окисление осуществляется путем присоединения воды и
дегидрирования (см. разд. 6.16).
Суммарное балансовое уравнение окисления конечного продук-
та анаэробной фазы дыхания — ПВК — в реакция ЦТК следую-
щее:
• I I I ~ }
С3Н4О3 + ЗН2О + 2У2О2 --*- ЗСО2 + 5Н2О
i I I I
Из схемы видно, что весь углерод субстрата окисляется до ок-
сида углерода (IV), в состав которого входит кислород субстрата
и кислород воды. Кислород воздуха потребляется уже после непос-
редственных реакций цикла Кребса на окисление водорода ПВК
и водорода воды, присоединившейся к субстрату на определенных
стадиях цикла.
Восстановленный кофермент НАДН поступает в матрикс мито-
хондрии и диффундирует к ее внутренней мембране. Здесь он свя-
зывается с ферментом НАДН-дегидрогеназой, окисляется ею, отда-
вая электроны и протон в дыхательную (электронпереносящую)
цепь. Энергия окисления накапливается в форме электрохимичес-
кого потенциала ионов водорода на мембране ДрН4, за счет кото-
рого синтезируется АТФ из АДФ и Н3РО4, осуществляется окисли-
тельное фосфорилирование (см. разд. 7.3).
Можно рассчитать энергетический выход окисления глюкозы че-
рез ПВК в процессе дыхания. При окислении ПВК четыре пары
атомов водорода поступают на НАД+. Окисление одной молекулы
НАДН дает три молекулы АТФ. Одна пара атомов водорода окис-
ляется через ФАД, что дает две молекулы АТФ. Одна молекула
АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования. Всего
3-4 + 2-М ==15 молекул АТФ. Следовательно, за счет окисления
1 моля ПВК получается 15 молей АТФ. Следует учесть, что из од-
ной молекулы глюкозы образуется две молекулы ПВК, поэтому
необходимо ввести коэффициент 2:15 молекул АТФ X 2 —30 моле-
кул АТФ.
382
Кроме того, в анаэробной фазе (при гликолизе) образуются
еще две молекулы АТФ и две молекулы цитоплазматического
НАДН. В зависимости от механизма поступления восстановитель-
ных эквивалентов в матрикс митохондрий и далее в дыхательную
цепь (см. разд. 6.9.1) образуется еще 4 или 6 молекул АТФ. Та-
ким образом, при аэробном окислении 1 моля глюкозы клетка по-
лучает до 38 молей АТФ, т. е. значительно больше, чем при глико-
лизе. При этом в высокоэнергетических связях АТФ запасается
34,5X38=1311 кДж свободной энергии. Всего при полном окисле-
нии 1 моля глюкозы до СО2 и Н2О выделяется около 2872 кДж
энергии. Таким образом, при аэробном распаде глюкозы в высоко-
энергетических связях аккумулируется более 45% выделившейся
свободной энергии.
Цикл трикарбоновых кислот обнаружен у животных, растений,
микроорганизмов. Он может протекать не только в аэробных, но и
в анаэробных условиях, например у фотосинтезирующих бактерий,
однако при условии, что присутствует подходящий акцептор водо-
рода. Анаэробные варианты ЦТК известны также в животных клет-
ках. При нехватке кислорода в органах млекопитающих НАДН
может расходоваться на восстановление фумаровой кислоты до
янтарной. Филогенетически древние синезеленые водоросли не име-
ют полного цикла.
В цикле Кребса перерабатываются не только углеводы. Ацетил-
КоА, который получается при окислении жирных кислот, может
конденсироваться с ЩУК. Многие аминокислоты, подвергаясь ре-
акциям переаминирования, могут превращаться в какой-то мета-
болит цикла, и, таким образом, вступать в него. Промежуточные
продукты цикла, в свою очередь, могут удаляться из него и ис-
пользоваться как предшественники аминокислот и других биоло-
гически важных веществ. Таким образом, цикл трикарбоновых
кислот — это амфиболический путь метаболизма (см. разд. 1.2).
Функции его связаны не только с катаболическими, но и с анабо-
лическими процессами, для которых он поставляет вещества-пред-
шественники. Цикл трикарбоновых кислот — это не только аэроб-
ное расщепление глюкозы, но и тот фокус, в котором скрещивают-
ся многие метаболические пути.
6.9.6. Глиоксилатный цикл. Существуют специальные фермен-
тативные механизмы, пополняющие запас промежуточных продук-
тов ЦТК. Такую функцию, в частности, выполняет глиоксилатный
цикл. Он обнаружен в клетках высших растений, плесневых гри-
бов, некоторых бактерий (Pseudomonas, Е. coll). В животных
клетках пока не найдены ключевые ферменты этого цикла, поэто-
му считают, что у них он осуществляться не может. Цикл открыт
Г. Кребсом в 1957 г.
Глиоксилатный цикл — это видоизмененный цикл трикарбоно-
вых кислот. В нем ферменты изоцитратдегидрогеназа и а-кетоглу-
таратдегидрогеназа заменены ферментом изоцитрат-лиазой, кото-
рая расщепляет изолимонную кислоту до янтарной и глиоксиловой:
383
СООН СООН
1 НОСН 1 Изоцитрат-лиаза I сн2 1 ,О + с/
НС—СООН сн2 |\н
1 сн2 СООН СООН
СООН
Изолимонная
кислота
Янтарная Глиоксиловая
кислота
кислота
Другой ключевой фермент цикла — малат-синтаза. Она ката-
лизирует реакцию конденсации ацетил-КоА с глиоксиловой кисло-
той:
СН3 zO СООН
| Сс' Малат-синтаза |
С=О + Н2О + | ХН ----------------------> СН2 + KoA-SH
s-koa соои 4(L0H
I
СООН
Ацетил-КоА Глиоксиловая L-Яблочная
кислота кислота
Кроме этих двух специфических для глиоксилатного цикла фер-
ментов в нем участвует ряд ферментов ЦТК.
Пусковая реакция цикла обеспечивается работой цикла Кребса,
в котором образуется ЩУК. Под действием фермента цитрат-син-
тазы ацетил-КоА конденсируется с ЩУК, образуя лимонную кис-
лоту. Она под действием аконитат-гидратазы превращается в ако-
нитовую, а затем в изолимонную кислоту. Последняя расщепляет-
ся под действием изоцитрат-лиазы на янтарную и глиоксиловую
кислоты. С участием второго специфического для цикла фермен-
цис-А ионитовая
Рис. 6.17. Реакции глиоксилатного цикла
кислота
Изолимонная
кислота
кислота
384
та — малат-синтазы глиоксиловая кислота конденсируется со вто-
рой молекулой ацетил-КоА, образуется яблочная кислота, она
окисляется малатдегидрогеназой, в результате чего регенерируется
ЩУК (рис. 6.17).
Таким образом, при каждом обороте цикла в него включаются
две молекулы ацетил-КоА, образуется одна молекула янтарной
кислоты, которая может вступать в реакции глюконеогенеза, в
другие процессы биосинтеза или в ЦТК. В последний могут перехо-
дить и такие метаболиты глиоксилатного цикла, как яблочная и
изолимонная кислоты. В результате реакций глиоксилатного цик-
ла два атома водорода могут поступать в дыхательную цепь, при
этом образуются три молекулы АТФ. Это особенно важно для тех
организмов и в тех случаях, когда ацетильная группа и другие
двухуглеродные соединения служат единственным источником
энергии.
. Глиоксилатный цикл характерен, например, для микроорганиз-
мов, использующих в качестве энергетического и пластического ма-
териала двухуглеродные соединения. Уксусная кислота и этиловый
спирт непосредственно включаются в ЦТК в виде ацетил-КоА, но
в нем не могут использоваться более восстановленные соединения
типа глицина и гликолевой кислоты. Они окисляются до глиокси-
ловой кислоты в глиоксилатном цикле.
В тканях растений с помощью глиоксилатного цикла протекает
превращение жиров в углеводы и другие клеточные компоненты.
Особенно активно этот процесс осуществляется в прорастающих
семенах масличных растений. Запасные триацилглицерины рас-
щепляются, прй окислении входящих в их состав жирных кислот
образуется ацетил-КоА. Он вступает в реакции глиоксилатного
цикла, получается янтарная кислота. Последняя превращается в
углеводы в результате реакций ЦТК и глюконеогенеза. Ферменты
глиоксилатного цикла локализуются у растений в микротельцах,
называемых глиоксисомами.
6.10. Глюконеогенез
Анаэробная фаза расщепления глюкозы — гликолиз — заканчи-
вается образованием ПВК или молочной кислоты. Они при опреде-
ленных условиях могут вновь ресинтезироваться в глюкозу. Из
двух молекул молочной кислоты образуется одна молекула глюко-
зы, т. е. происходит как бы обращение гликолиза. Этот процесс на-
зывается глюконеогенезом. Если гликолиз — центральный путь
катаболизма углеводов, то глюконеогенез — анаболический про-
цесс, наиболее важный общий путь биосинтеза моносахаридов и
полисахаридов у человека, животных, многих бактерий. У фотосин-
тезирующих организмов он играет обычно второстепенную роль.
Большинство стадий глюконеогенеза представляет собой обра-
щение реакций гликолиза. Однако существуют три необратимые
стадии гликолиза, протекающие с выделением значительного коли-
чества энергии, поэтому глюконеогенез идет в обход этих стадий.
13—937
385
Первая необратимая стадия — превращение ПВК в фосфоенол-
пировиноградную. Фосфорилирование ПВК достигается за счет
последовательности реакций, катализируемых как ферментами
цитоплазмы, так и ферментами митохондрий. В митохондриях дей-
ствует фермент пируваткарбоксилаза. Этот регуляторный фермент
у животных активен только в присутствии ацетил- КоА. Он катали-
зирует следующую реакцию:
Пируват-
ПВК + СО2 + АТФ + Нао-----------------► ЩУК + АДФ + Фн
карбоксилаза
Образовавшаяся ЩУК восстанавливается в яблочную здесь же
в митохондриях с участием НАДН. Эта реакция протекает легко,
так как внутри митохондрий отношение НАДН/НАД+ высоко:
Малатдегидрогеназа
ЩУК + НАДН 4- Н+ ^.7.". Яблочная кислота + НАД*
(митохондриальная)
Яблочная кислота из митохондрий диффундирует в цитоплазму.
Она легко проходит через мембрану митохондрий, служит перенос-
чиком восстановительных эквивалентов между двумя компартмен-
тами клетки — митохондриями и цитоплазмой. В цитоплазме яб-
лочная кислота окисляется цитоплазматической НАД-зависимой
малатдегидрогеназой. Отношение НАДН/НАД+ в цитоплазме очень
мало, поэтому легко протекает реакция окисления:
Малатдегидрогеназа
L-Яблочная кислота + НАД* .........- ЩУК + НАДН + Н*
(цитоплазматическая)
Дальнейшие реакции протекают также в цитоплазме. Под дейст-
вием фосфоенолпируват-карбоксикиназы из ЩУК образуется фос-
фоенолпировиноградная кислота (ФЕП). Донором фосфата в этой
реакции служат ГТФ или ИТФ (инозинтрифосфат):
ФЕП-карбоксикиназа
ЩУК + ГТФ (ИТФ)----------------------> ФЕП + СО2 + ГДФ (ИДФ)
Таков обходной путь образования ФЕП. Суммарное уравнение его
следующее:
ПВК + АТФ + ГТФ ФЕП + АДФ + ГДФ + Фн
Образовавшаяся ФЕП далее легко превращается во фрукто-
зо-1, 6-дифосфат в результате ряда обратимых реакций гликолиза
(рис. 6.18). Затем фермент фруктозо-дифосфатаза катализирует
гидролитическое отщепление фосфатной группы, находящейся в
первом положении:
Фруктозо-
Фруктозо-1-6-дифосфат + Н2О-----------> Фруктозо-6-фосфат + Фн
дифосфатаза
386
1 Гликоген, крахмал и другие углеводы |
Глюкоза Глюкозо-6-фосфат
Фи ||
4 Фруктозо-6-фосфат
----------
дифосфат
Г лицеральдегид-3~фосфат (Дигидроксиацетонфосфат)
НАД+----s '<-»-НАД+
НАДН+Н+-«-Ч ------НАДН+Н*
1,3-Дифосфоглицериновая кислота
Адф--------'>-*~АДФ
АТФ*-^ 4------АТФ
3-Фосфоглицериновая кислота
2-Фосф о глицериновая кислота
Фосфоенолпировиноградная кислота
СО2
ГТФ
н
Щавелевоуксусная кислота
НАДН+Н+
НАД+
Яблочная кислота
Пировиноградная кислота
Рис. 6.18. Реакции глюконеогенеза
Так преодолевается вторая необратимая стадия гликолиза.
В следующей обратимой реакции фруктозо^б-фосфат превращается
в глюкозо-6-фосфат:
Гексозофосфат-
Фруктозо-6-фосфат <— Глюкозо-6-фосфат
изомераза
13*
387
В большинстве клеток глюкозо-6-фосфат используется как пред-
шественник моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов. Только
в некоторых органах и тканях, например в печени, почках, кишеч-
ном эпителии позвоночных животных и тканях некоторых растений,
он может превращаться в свободную глюкозу под действием фер-
мента глюкозо-6-фосфатазы:
Глюкозо- 6-фосфатаза
Глюкозо-6-фосфат + Н2О----------------> Глюкоза + Фн
Это третий, обходной путь, который используется для синтеза
глюкозы из ПВК. Суммарное уравнение реакций глюконеогенеза
следующее:
2СН3СОСООН + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДН + 2Н+ + 6Н2О
Глюкоза + 2НАД+ + 4АДФ + 2ГДФ + 6ФН
Таким образом, на синтез одной молекулы глюкозы расходуется
шесть высокоэнергетических фосфатных связей и две молекулы
НАДН в качестве восстановителя. Эта цепь реакций открывает
путь для образования глюкозы из молочной кислоты или ПВК, а
также из различных предшественников ПВК или фосфоенолпирови-
ноградной кислоты. В молекулу глюкозы могут входить в конеч-
ном счете промежуточные продукты ЦТК, поскольку они способны
превращаться в ЩУК. Те аминокислоты, которые могут превра-
щаться в ЩУК, могут образовывать глюкозу (гликогенные ами-
нокислоты). У растений и микроорганизмов ацетил-КоА, а также
все аминокислоты превращаются в углеводы через глиоксилатный
цикл и цикл Кребса с последующим вступлением в реакции глюко-
неогенеза.
ГЛАВА 7
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ И БИОЭНЕРГЕТИКА
7.1. Развитие учения о биологическом окислении
В разработке теории биологического окисления большую роль
сыграли работы русских ученых А. Н. Баха (1897) и В. И. Паллади-
на (1907). Дыхание с точки зрения химии — это медленное окис-
ление. Водород или электроны переходят от донора ДНг к акцеп-
тору А:
ДН24-А Д + АН2
Донор окисляется, акцептор восстанавливается. В последнем звене
окислительно-восстановительных реакций водород соединяется с
кислородом:
На 4- х/2 Оа Н2О
Эта реакция в обычных условиях протекает одномоментно и
сопровождается столь огромным выделением энергии, что проис-
ходит взрыв. В процессе дыхания транспорт водорода и электро-
нов от одного переносчика электронов к другому происходит сту-
пенчато, через несколько промежуточных реакций, в результате
чего энергия окисления выделяется отдельными малыми порциями
и накапливается в высокоэнергетических соединениях. При этом
может происходить активация как водорода субстрата, так и моле-
кулярного кислорода воздуха.
Известно, что молекулярный кислород обладает невысокой реак-
ционной способностью. А. Н. Бах в своей теории исходил из пред-
ставлений, что молекулярный кислород способен действовать как
окислитель органических веществ только после активации, раз-
рыва одной из связей в его молекуле. Активация происходит, в
частности, если в среде присутствуют легко окисляемые соедине-
ния, например имеющие двойные связи. Взаимодействуя с кисло-
родом, они дают пероксиды:
/О R—О
R + О2 -> R< | или 2R 4- О2 |
X) R—О
Пероксиды потом окисляют другие молекулы. Так происходит окис-
ление с образованием пероксидов как промежуточных продуктов:
389
A + 02 — A02
AO, + В = AO + BO
AO + В BO + A
A + O2 + 2B = A + 2BO
В этих реакциях окисление идет параллельно, взаимосвязанно с
восстановлением. А. Н. Бах впервые сформулировал идею о сопря-
женности окислительно-восстановительных процессов при дыхании.
Окисление за счет пероксидов в процессе дыхания, по А. Н. Баху,
происходит с участием фермента пероксидазы. В целом его идеи
получили название перекисной теории дыхания Баха.
Большую роль в развитии теории биологического окисления
сыграли также работы В. И. Палладина. Он развивал представле-
ние о дыхании как системе ферментативных процессов и особое
значение придавал окислению дыхательных субстратов путем от-
нятия водорода.
Окисление глюкозы, по Палладину, протекает в две фазы:
Анаэробная фаза: C6H12Oe + 6Н2О+ 12R 6СО2 4- 12RH2 (1)
Аэробная фаза: 12RH2 + 6О2 -> 12R 4- 12Н2О (2)
В этих уравнениях R — пигменты, или хромогены, т. е. проме-
жуточные переносчики водорода.
В дальнейшем были изучены связь дыхания с другими процес-
сами обмена веществ, свойства ферментов, катализирующих реак-
ции биологического окисления, локализация их в клетке, механиз-
мы аккумуляции и превращения энергии и др. Большой вклад в
изучение этих вопросов внесли в СССР В. А. Энгельгардт,
В. А. Белицер, С. Е. Северин, В. П. Скулачев и др., а за рубежом —
X. Виланд, О. Варбург, Д. Кейлин, Г. Кребс, А. Ленинджер,
П. Митчелл, Д. Грин, Б. Чанс, Э. Рэкер.
7.2. Митохондрии как внутриклеточные центры
аэробного дыхания
Митохондрии — это особые органеллы клетки, внутриклеточные
центры аэробного дыхания, «энергетические станции» клетки. Они
обнаружены во всех клетках животных и растений, как правило,
представляют собой овальные тельца размером примерно 0,5X
ХЗ мкм. Форма митохондрий в разных клетках различна — от ни-
тей до палочек, петель и сфер. Анализ серийных срезов одноклеточ-
ных организмов показывает, что митохондрии могут иметь гигант-
ские размеры, почти равные самой клетке, неправильную развет-
вленную форму. Такие митохондрии обнаружены в клетках жгути-
ковых, дрожжей, в клетках мышц диафрагмы крысы. Очень тонкий
срез такой гигантской митохондрии можно принять за несколько
более мелких органелл.
В клетке в зависимости от ее типа и функции может находиться
от нескольких десятков до нескольких тысяч митохондрий. Во мно-
390
гих клетках митохондрии распределены довольно равномерно, од-
нако наблюдается тенденция к локализации их в наиболее актив-
ных зонах клетки. В некоторых тканях митохондрии выстраивают-
ся таким образом, чтобы облегчить доставку АТФ к структурам,
использующим энергию. В эпителиальных клетках, например, ми-
тохондрии часто ориентированы так, что их длинные оси располо-
А Б
Рис. 7.1. Схема митохондрии. А — в разрезе; Б— внутренняя мембрана:
1 — внутренняя мембрана, 2 — наружная мембрана, 3 — кристы, 4 — межмембранное
пространство, 5 — матрикс
жены в направлении секреции веществ. У простейших, снабженных
ресничками, митохондрии располагаются непосредственно у осно-
вания этих специализированных органов движения.
Структура митохондрий изучена методом электронной микро-
скопии. В митохондриях различают две мембраны — наружную и
внутреннюю, внутреннее пространство и межмембранное простран-
ство. Внутреннее пространство заполнено так называемым матрик-
сом— гелеобразной полужидкой массой. Внутренняя мембрана об-
разует выпячивания, или кристы (рис. 7.1). Митохондриальные
мембраны представляют собой липопротеиновые структуры тол-
щиной 5—7 нм.
Наружная мембрана гладкая, хорошо проницаема для веществ,
имеющих молекулярную массу менее 10 000. Для нее характерно
высокое отношение количества фосфолипидов к белкам (примерно
1:1). В наружной мембране содержится ряд ферментов, участ-
вующих в удлинении молекул насыщенных жирных кислот, а так-
же белки, катализирующие окисление, не связанное с синтезом
АТФ. Набор ферментов наружной мембраны различается в мито-
хондриях разных организмов.
Внутренняя мембрана митохондрий покрыта со стороны матрик-
са грибовидными выростами1, или «элементарными тельцами», ко-
торые в основном являются АТФазой. При обработке внутренней
мембраны ультразвуком образуются «вывернутые частицы», у ко-
1 Некоторые исследователи придерживаются мнения, что грибовидные вы-
росты являются артефактом, обусловленным фиксацией и окраской материала
при электронной микроскопии.
391
торых грибовидные тельца находятся снаружи. Внутренняя мемб-
рана непроницаема для большинства веществ, а также для Н+ и
ОН~. Проникают только О2 и нейтральные молекулы с молекуляр-
ной массой меньше 150. Отношение фосфолипидов к белкам низ-
кое, примерно 1 :3. Внутренняя мембрана во всех клетках выпол-
няет одинаковую функцию: сопряжение окисления с синтезом
АТФ, т. е. является сопрягающей мембраной. Она содержит фер-
менты дыхательной цепи и синтеза АТФ.
В межмембранном пространстве митохондрий найдены фермен-
ты аденилаткиназа и нуклеозид-дифосфат-киназа. Матрикс мито-
хондрии содержит систему р-окисления жирных кислот и фермен-
ты цикла трикарбоновых кислот.
У бактерий митохондрий нет, аэробное окисление и фосфори-
лирование протекают в цитоплазматической мембране и в особых
мембранных образованиях — мезосомах. Мезосомы представлены
двумя основными формами — ламеллярной и везикулярной, раз-
личающимися между собой укладкой мембраны. Хорошо выраже-
ны мезосомы везикулярного типа у представителей сем. Bacilla-
сеае. Мезосомы ламеллярного типа чаще встречаются у кокков.
7.3. Окислительное фосфорилирование
7.3.1. Дыхательная цепь. В цикле трикарбоновых кислот от
субстратов отщепляются протоны и электроны. Они поступают на
коферменты НАД+ и ФАД+, которые передают их в дыхательную
цепь, образованную окислительно-восстановительными фермента-
ми, находящимися во внутренней мембране митохондрий. Передви-
гаясь от одного переносчика электронов к другому, электроны
опускаются на все более низкие энергетические уровни, отдавая
порциями двою энергию. В последнем звене цепи они восстанавли-
вают молекулярный кислород. Освобожденная при переносе элек-
тронов по дыхательной цепи энергия запасается в фосфатных свя-
зях АТФ.
Синтез АТФ из АДФ и фосфорной кислоты, который происходит
с использованием энергии,, освобождающейся при окислении ве-
ществ в живых клетках, и сопряжен с переносом электронов по
дыхательной цепи, называется окислительным фосфорилированием.
Оно было открыто в начале 30-х годов XX столетия В. А. Энгель-
гардтом.
Дыхательную цепь нередко называют редокс-цепью, что в пере-
воде означает окислительно-восстановительная цепь, поскольку в
ней многократно протекают процессы окисления — восстановления.
Ее называют также цепью переноса электронов, электронтран-
спортной или электронпереносящей цепью. Эти понятия более ши-
рокие, чем «дыхательная цепь», так как подобные системы функ-
ционируют в мембранах хлоропластов, ядер, микросом.
Компоненты дыхательной цепи, осуществляющие перенос элек-
тронов и окислительное фосфорилирование, слиты в единое целое
с внутренней мембраной митохондрий и функционируют в форме
392
полиферментативных комплексов или ансамблей. Одну полную
цепь переноса электронов составляет большое число молекул. Так,
в митохондриях, полученных из сердца быка, цепь переноса элек-
тронов состоит примерно из 80 белковых молекул. Только г/з из
них — непосредственные переносчики электронов, остальные 2/3 —
белки, выполняющие вспомогательные функции.
В состав дыхательной цепи входит небелковый перенос-
чик электронов — убихинон, который иногда называют кофермен-
том Q (сокращенно KoQ). Он представляет собой производное бен-
зохинона с изопреноидной боковой цепью, которая у разных видов
организмов содержит от 6 до 10 пятиуглеродных изопреновых ос-
татков. В большинстве тканей млекопитающих функционирует
убихинон Qio (10 — число изопреновых остатков в боковой цепи),
у дрожжевых грибов — Q6. Убихинон может участвовать в одно-
или двухэлектронном переносе. При частичном восстановлении (од-
ноэлектронный перенос) он образует относительно стойкий семихи-
нон, при полном (двухэлектронном) восстановлении — гидрохи-
нон (у бихинол).
Таким образом, убихинон и его гидрохинон образуют окисли-
тельно-восстановительную пару. Они переносят водородные атомы,
т. е. электроны и протоны, от одной группы переносчиков к дру-
гой. Убихинон может мигрировать в липидной фазе мембраны,
представляя собой мобильный субстрат для ферментов, встроен-
Электроны и протоны отщепляются от субстратов в реакциях
цикла Кребса преимущественно пиридинзависимыми дегидрогена-
зами с образованием НАДН. Последний окисляется флавинзави-
симым ферментом — НАДН-дегидрогеназой. Она отдает электроны
и протоны убихинону, который передает их системе цитохромов.
Флавинзависимых дегидрогеназ известно много. Они содержат
в качестве простетических групп флавинадениндинуклеотид
(ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН), которые прочно связаны
с белком, во многих случаях ковалентно. В окислительно-восстано-
вительных реакциях участвует изоаллоксазиновое кольцо рибофла-
вина: происходит перенос двух атомов водорода на ФАД или
ФНМ с образованием восстановленных форм ФАДН2 и
ФМН-Н2. Нередко флавиновые ферменты и образуемые ими комп-
лексы содержат в своем составе атомы металлов, чаще всего в
форме белков с железосерными центрами (FeS-белки). В этих бел-
ках железо находится не в форме гема, а присоединено координа-
ционными связями к атомам серы в цистеиновых остатках белка.
Некоторые белки содержат лабильно связанные атомы серы.
От некоторых субстратов (янтарная кислота, глицеролфосфат,
КоА-производные жирных кислот) флавиновые ферменты сами от-
Рис. 7.2. Расположение основных компонентов дыхательной цепи во внут-
ренней мембране митохондрий:
а, аз, Ь, с» Ci — компоненты цитохромной системы; остальные пояснения см. в тексте
нимают водород, минуя пиридинзависимые дегидрогеназы и
НАДН. Флавиновые дегидрогеназы передают электроны и прото-
ны в дыхательную цепь на убихинон. Примером могут служить
сукцинатдегидрогеназа, глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа. Они со-
держат в своем составе железосерные центры. При окислении
КоА-производных жирных кислот флавопротеин отщепляет атомы
водорода от алифатической цепи и передает их второму флавопро-
теину, от которого они поступают к третьему флавопротеину, со-
держащему железосерные центры и передающему атомы водорода
на убихинон (рис. 7.2).
Важнейшей флавинзависимой дегидрогеназой дыхательной цепи
является НАДН-дегидрогеназа, осуществляющая окисление НАДН.
Структура НАДН-дегидрогеназного комплекса еще не выяснена
полностью. В нем содержится не менее 10 отдельных полипептид-
ных цепей, ФМН и белки с железосерными центрами. В нативном
препарате на одну молекулу ФМН приходится 16 Fe и 16 S"2. Ис-
следования спектра ЭПР позволили выявить четыре железосерных
центра. Белки, содержащие железосерные центры, обнаружены в
составе второй важнейшей дегидрогеназы, входящей в состав ды-
хательной цепи, — сукцинатдегидрогеназы — ив ферментативном
комплексе, окисляющем восстановленный убихинон окисленным
цитохромом с.
Сукцинатдегидрогеназа — фермент внутренней мембраны мито-
хондрий; выделена из сердечной мышцы быка, М = 97 000 (состоит
из двух субъединиц с М = 70 000 и 27 000). Более крупный компо-
нент содержит субстратсвязывающий центр и ФАД. В обеих субъ-
единицах обнаружены железосерные центры. Электроны от сукци-
ната поступают на ФАД, затем на железосерные центры большой
субъединицы, а от нее — на железосерные центры малой субъеди-
ницы.
394
От восстановленного убихинона электроны поступают на цито-
хромную систему. Цитохромы — группа железосодержащих бел-
ков. Они присутствуют во всех аэробных клетках. В состав цито-
хромов входят железоиорфириновые простетические группы, по-
добные находящимся в гемоглобине и миоглобине. В ходе перено-
са электронов обратимо изменяется валентность содержащегося в
цитохромах железа:
— е~
Fe2+ Fe3+
+е
Роль цитохромов в дыхании клеток была впервые исследована
Д. Кейлиным (1925). В настоящее время из различных видов жи-
вых организмов выделено большое число цитохромов. Их делят на
группы, основываясь на различиях структуры гемовой простетичес-
кой части. Выделяют четыре типа гемов, их обозначают буквами
а, 6, с и d. Они отличаются боковыми цепями порфириновых
структур. При обозначении цитохромов с хорошо установленной
структурой при букве ставят числовой индекс, который указывает
на принадлежность цитохрома к определенной подгруппе. Напри-
мер, в митохондриях высших животных и растений идентифициро-
вано пять различных цитохромов: а, а3 b, с, cj.
Цитохромы отличаются друг от друга по своим белкам, по при-
роде боковых цепей порфиринов и по способу присоединения гема
к белкам. В спектре поглощения цитохромов в восстановленной
форме наблюдаются три основные полосы поглощения в видимой
области. В порядке уменьшения длин волн их обозначают как а-,
Р- и у-полосы; из них а-полоса обычно имеет вид острого пика.
В связи с этим при обозначении цитохромов с недостаточно иссле-
дованной структурой указывают длину волны (в нанометрах) а-
полосы поглощения в спектре восстановленной формы. Так, в ды-
хательную цепь входят два цитохрома 6-группы: 65б2 и 6566. В то
же время нередко используют названия цитохромов, данные им по
случайным признакам. Например, в эндоплазматической сети лока-
лизуется цитохром Р-450, названный так потому, что его комплекс
с СО имеет максимум поглощения при длине волны 450 нм.
С кислородом реагирует лишь последний цитохром дыхатель-
ной цепи — цитохром с-оксидаза (цитохром аа3), Это единствен-
ный цитохром, обладающий каталитическими, т. е. ферментатив-
ными, свойствами, другие цитохромы не являются ферментами. Мо-
лекула этой оксидазы содержит два атома Си и две группы гема
типа а: а и а3. Цитохром с-оксидаза, находящаяся во внутренней
мембране митохондрий сердечной мышцы быка, состоит из шести
разных белковых субъединиц. Цитохромоксидаза из дрожжей и
Neurospora содержит семь субъединиц. Цитохромоксидаза осуще-
ствляет быстрое окисление цитохрома молекулярным О2. Она яв-
ляется терминальной, т. е. конечной, оксидазой дыхательной цепи
митохондрий. Цитохромоксидаза локализована во внутренней
мембране митохондрий, с которой относительно прочно связана,
образуя асимметричный мостик между двумя сторонами мембраны.
395
Предполагают, что гем а? находится на внутренней стороне, а гем
а, который первым взаимодействует с цитохромом с, — на наруж-
ной стороне внутренней мембраны митохондрий. Кислород подхо-
дит к цитохромоксидазе, по-видимому, со стороны матрикса, про-
исходит четырехэлектронное восстановление молекулы О2 до воды.
Универсальным донором атомов Н для дыхательной цепи слу-
жит НАДН. Если при окислении субстрата возникает НАДФН, то
он обычно используется как восстановитель в процессах биосинте-
за. Однако может протекать трансгидрогеназная реакция, посред-
ством которой атомы водорода передаются от НАДФН на НАД+,
после чего поступают в дыхательную цепь:
Трансгидрогеназэ
НАДФН + НАД+ НАДН + НАДФ+
Решающее значение в установлении по-
следовательности переноса электронов меж-
ду компонентами дыхательной цепи имело
применение ряда специфических ингибито-
ров (рис. 7.3). Так, ротенон (инсектицид)
ингибирует НАДН-дегидрогеназу, и при его
воздействии все компоненты дыхательной
цепи переходят в окисленное состояние.
Амитал (барбитурат натрия) препятствует
восстановлению убихинона. Антибиотик
антимицин А блокирует окисление цитохро-
мов &, а цианиды, азид и H2S связываются
с цитохромоксидазой. На основании этих
определений, а также термодинамических
расчетов переносчики электронов можно
расположить так, как показано на рис. 7.3.
Каждый компонент дыхательной цепи во
внутренней мембране митохондрий встроен
между своим восстановителем и окислите-
лем. В результате этого создаются условия
для потока электронов от субстрата через
последовательно расположенные переносчи-
ки электронов к О2. Все белки погружены в
толщу мембраны, входят в ее состав, лишь
цитохром с лабильно присоединен к наруж-
ной поверхности мембраны. Активный центр
НАДН-дегидрогеназы располагается на
внутренней стороне мембраны, где и реаги-
рует с НАДН. Центр связывания О2 цито-
Рис. 7.3. Дыхательная цепь митохондрий.
Стрелками показаны места вхождения электронов от раз*
личных субстратов в электронпереносящую цепь и их даль-
нейший транспорт; пунктиром — точки приложения ингиби-
торов
396
хрома «з также находится на стороне мембраны, обращенной в
матрикс (см. рис. 7.2).
Когда электроны идут по дыхательной цепи, на определенных
участках они теряют свою энергию в сравнительно большом коли-
честве, вполне достаточном для образования АТФ. Это участки со-
пряжения окисления и фосфорилирования, на которых функциони-
руют белки, называемые сопрягающими факторами. Последние
образуют сопрягающее устройство или Н+-АТФазный комплекс,
синтезирующий АТФ из АДФ и Фн. Он пронизывает внутреннюю
мембрану митохондрий, которая поэтому и называется сопрягаю-
щей мембраной. Кроме белков, участвующих в переносе электро-
нов и преобразовании энергии, внутренняя мембрана митохондрий
содержит структурные белки и липиды.
7.3.2. Энергетика переноса электронов. Реакции, при которых
происходит перенос электронов от донора электронов (восстанови-
тель) к акцептору электронов (окислитель), называются окисли-
тельно-восстановительными. В некоторых из них перенос электро-
нов осуществляется путем передачи атомов водорода.
Восстановители и окислители образуют окислительно-восстано-
вительные пары:
Донор электронов е" + Акцептор электронов
Д А
Способность восстановителя отдавать электроны окислителю
обычно выражается величиной стандартного восстановительного
потенциала (Ё 'Q). Он измеряется при pH 7,0 и температуре 25°С.
Стандартный восстановительный потенциал численно равен элек-
тродвижущей силе (в вольтах), возникающей в полуэлементе, в
котором окислитель и восстановитель, присутствующие в концен-
трациях 1,0 моль при стандартных условиях, находятся в равно-
весии с электродом, способным обратимо принимать электроны от
восстановителя.
В качестве стандарта принят восстановительный потенциал ре-
акции: Н2^2Н+ + 2е~. При давлении газообразного Н2 в 1,0 атм,
концентрации ионов Н+, равной 1,0 моль (что соответствует pH 0),
и 25°С его условно считают равным 0. При pH 7,0 стандартный
восстановительный потенциал системы Н2^2Н+ равен —0,42 В.
Знание стандартных восстановительных потенциалов различных
биологических систем позволяет определять направление потока
электронов. Согласно законам термодинамики, если существуют
два компонента, способные к окислению — восстановлению, но об-
ладающие разным восстановительным потенциалом, вещество с
более высоким потенциалом будет служить в такой системе окисли-
телем, а вещество с более низким потенциалом — восстановите-
лем. В дыхательной цепи все реакции направлены по термодина-
мической лестнице от компонента с максимально отрицательный
потенциалом — НАДН (—0,32 В) к кислороду, имеющему боль-
шую положительную величину потенциала (+0,82 В). По этому
397
принципу можно расположить все переносчики электронов дыха-
тельной цепи в определенном порядке: НАД—>ФАД—>цитохром
Ъ—^-цитохром с—^цитохром а—>О2.
Если реагируют друг с другом две окислительно-восстанови-
тельных пары, то можно рассчитать стандартное изменение сво-
бодной энергии AG0' по формуле
AG°Z = —hfae;,
(I)
где AG°—стандартное изменение свободной энергии в килоджоу
лях, п — число переносимых электронов, F— число Фарадея
(96,5 кДж), ДЕ о —разность стандартных восстановительных по-
тенциалов акцептора и донора электронов. Например: пара элект-
ронных эквивалентов переносится от НАДН (Е'о =—0,32 В) к мо-
лекулярному кислороду (Е ' = +0,82 В), т. е. проходит всю дыха-
тельную цепь, изменение свободной энергии составляет: AG0' =
= —2.96,5-[0,82— (—0,32)]= —220 кДж.
Таким образом, перенос электронов через всю дыхательную
цепь от НАДН к молекулярному кислороду приводит к большому
изменению свободной энергии. В физиологических условиях для
образования АТФ из АДФ и неорганического фосфата требуется
—34,5 кДж. Используя уравнение (1), можно рассчитать, что для
синтеза АТФ достаточна разность потенциалов 0,2 В. Следователь-
но, при переносе одной пары электронов через всю дыхательную
цепь выделяется энергия, достаточная для синтеза нескольких мо-
лекул АТФ.
7.3.3. Участки сопряжения в дыхательной цепи. В дыхательной
цепи содержится три участка, в которых перенос электронов со-
Рис. 7.4. Уменьшение свободной
энергии, обусловленное перемеще-
нием пары электронов по дыха-
тельной цепи от НАДН до кисло-
рода
провождается большим изменени-
ем разности потенциалов (свобод-
ной энергии). Уменьшение сво-
бодной энергии в каждом из этих
участков достаточно велико для
того, чтобы обеспечить образова-
ние АТФ из АДФ и Фн. Именное
этих участках дыхательной цепи
осуществляется запасание энер-
гии в фосфатных связях АТФ
(рис. 7.4).
Более точно участки сопряже-
ния были определены путем изме-
рения коэффициента окислитель*
ного фосфорилирования — Р/О.
Он был предложен в 1939 г. со-
ветским ученым В. А. Белицером
как мера эффективности окисли-
тельного фосфорилирования. В
этих опытах, ставших классичес-
кими, было показано, что в элек-
398
тронпереносящей цепи осуществляется одно или несколько фосфо-
рилировании, сопряженных с окислением. Коэффициент Р/О — это
число молей АТФ, образующихся из АДФ и Фн на один грамм-атом
поглощенного кислорода.
К настоящему времени коэффициенты P/О определены для
окисления митохондриями ряда субстратов. Так, для НАДН и суб-
стратов, окисляющихся НАДН-дегидрогеназами (яблочная, пиро-
виноградная, изолимонная кислоты), Р/О = 3, а при окислении ян-
тарной кислоты в фумаровую Р/О = 2. Следовательно, электроны и
протоны, отщепляемые от НАДН, проходят через три, а от ян-
тарной кислоты только через два участка сопряжения (второй и
третий) дыхательной цепи (см. рис. 7.3).
Большое значение для выяснения локализации участков сопря-
жения в дыхательной цепи имели работы Б. Чанса. Им развито
представление о пяти состояниях дыхательной цепи. Состояние 1
наблюдается в отсутствие субстратов окисления и фосфорилирова-
ния, при этом скорость дыхания чрезвычайно низка. При состоя-
нии 2 дыхание ограничено, так как отсутствует субстрат окисления,
хотя субстрат фосфорилирования (АДФ) добавлен в достаточном
количестве. Состояние 3— это самое активное состояние, характе-
ризующееся высокой скоростью дыхания. В среду инкубации до-
бавлены в избытке и субстраты окисления, и субстрат фосфорили-
рования (АДФ). Скорость дыхания ограничивается только скоро-
стью проникновения субстратов в митохондрии и активностью
ферментов окислительного фосфорилирования.
После того как весь добавленный АДФ превратится в АТФ,
дыхание вновь затормозится. Это состояние 4, или состояние дыха-
тельного контроля. На сопрягающей мембране накапливается элек-
трохимический потенциал ионов Н+, мембрана не может разря-
жаться из-за отсутствия АДФ. Мембранный потенциал препятству-
ет движению электронов по дыхательной цепи, и тогда окисление
субстрата тоже прекращается. Остановка дыхания никогда не
бывает полной, так как рано или поздно наступает «утечка» мем-
бранного потенциала, что обеспечивает низкую скорость дыхания,
т. е. дыхательный контроль1. Митохондрии обладают очень высо-
ким сродством к АДФ. Новая добавка АДФ возвращает высокую
скорость дыхания (состояние 3), которое продолжается до исчер-
пания АДФ или кислорода. В последнем случае наступает анаэро-
биоз, или состояние 5.
Б. Чанс и сотрудники, используя спектрофотометрический ме-
тод, сравнили степень окисленности переносчиков электронов при
всех пяти состояниях дыхательной цепи и определили положение
участков сопряжения в ней. Если дыхательная цепь заторможена
1 В. П. Скулачевым введено понятие «протонный контроль», под которым
понимается торможение активности Н+-АТФазы, а также дыхательных и фото-
синтетических цепей переноса электронов посредством градиента электрохимиче-
ского потенциала протонов или одной из его составляющих. Это понятие не-
сколько шире, чем дыхательный контроль, так как относится не только к дыха-
тельным, но и к фотосинтетическим редокс-цепям.
399
из-за отсутствия АДФ (состояние 4), то она заторможена в участ-
ках сопряжения. Тогда переносчик, расположенный до точки соп-
ряжения, должен находиться в восстановленной форме, на нем
накоплены электроны, так как его окисление затруднено. Второй
переносчик, расположенный после точки сопряжения, находится
в наиболее окисленной форме, так как затруднено его восстановле-
ние. После этого к митохондриям добавляется АДФ, т. е. дыхатель-
ная цепь переходит в состояние 3 — наиболее активное. Интенсив-
ность дыхания увеличивается примерно в 50 раз. Перенос элект-
ронов в участках сопряжения при этом ускоряется. Первый
переносчик, расположенный до точки сопряжения, окисляется,
второй, расположенный после точки сопряжения, восстанавливается.
В результате Б. Чанс установил участки сопряжения в дыха-
тельной цепи: они соответствуют участкам, где перенос электронов
сопровождается большим изменением разности потенциалов: пер-
вый—между НАДН и ФП}, второй — между цитохромом b и цито-
хромом Ci, третий — на участке цитохромоксидазы. Таким образом,
дыхательная цепь разделяет энергию, выделяющуюся при переносе
электронов, на отдельные «порции». В трех случаях они превыша-
ют 34,5 кДж-моль-1, необходимые для генерирования АТФ из АДФ
и фосфата.
7.3.4. Механизм энергетического сопряжения в митохондриях.
Вопрос о механизме энергетического сопряжения — это выяснение
того, как энергия электронов дыхательной цепи трансформируется
в энергию фосфатных связей АТФ. Для объяснения этого явления
было предложено много схем, однако все они могут быть разделе-
ны на три группы.
Первая (хронологически)—химическая концепция, или про-
межуточных факторов сопряжения. Она рассматривает окисли-
тельное фосфорилирование по аналогии с фосфорилированием при
гликолизе. Предполагают, что на продукте окисления образуется
высокоэнергетическая связь, и эта энергия переносится на АТФ.
Таким образом, предусматривается прямое использование хими-
ческой энергии, освобождающейся при окислении переносчиков
электронов, в энергию предшественника АТФ. Сопряжение между
этими двумя реакциями — окисления и синтеза АТФ — осуществля-
ется через общие промежуточные продукты. Так как неорганичес-
кий фосфат не участвует непосредственно в цепи переноса электро-
нов, предполагают, что в переносе энергии функционируют проме-
жуточные факторы сопряжения, к которым присоединяется
фосфат. Ниже на представленной схеме символами А и В обозна-
чены переносчики электронов дыхательной цепи в окисленной или
восстановленной форме, X и Y — гипотетические промежуточные
факторы сопряжения, Фн — неорганический фосфат.
Восстановленный переносчик АН2 окисляется следующим пере-
носчиком В, образуется высокоэнергетическое соединение А~Х.
Затем А вытесняется другим фактором сопряжения — Y. В образо-
вавшемся комплексе X~Y один из промежуточных факторов заме-
щается на Фн, образуется соединение Х~Ф, которое служит непос-
400
редственным донором фосфорила для АДФ:
АН2 + X + В А - X + ВН2
А-Х+УА+Х-У
Х~у + ФН-^ Х-Ф + У
АДФ + X ~Ф-> АТФ + X
Гипотеза химического сопряжения не смогла объяснить двух
фактов. Во-первых, несмотря на длительные поиски, не удалось
доказать реальность существования высокоэнергетических проме-
жуточных соединений типа А~Х. Во-вторых, оставалось неясным,
почему для осуществления окислительного фосфорилирования не-
обходима неповрежденная мембрана митохондрий.
Эти противоречия легко разрешает хемиосмотическая (или про-
тондвижущая) концепция. Она была сформулирована английским
биохимиком П. Митчеллом (1961); многое для ее доказательства
сделано В. П. Скулачевым. Хемиосмотическая теория предусматри-
вает переход химической энергии, освобождающейся в процессе
переноса электронов, в электрическую энергию мембранного по-
тенциала, а затем преобразование последней в химическую энергию
связей АТФ. Согласно этой теории внутренняя мембрана митохонд-
рий (сопрягающая мембрана) обладает высоким электрическим
сопротивлением и очень низкой проницаемостью для заряженных
частиц, прежде всего для протонов и гидроксид-ионов. Окислитель-
но-восстановительные ферменты, составляющие дыхательную цепь,
располагаются поперек внутренней мембраны митохондрий.
Предполагают, что в ней содержится также система фермен-
тов — протонных насосов, приводимых в действие потоком элект-
ронов в дыхательной цепи. Используя энергию, выделяющуюся при
переносе электронов, «насосы» выкачивают протоны (без сопро-
вождающих их анионов) из матрикса в межмембранное простран-
ство. В результате происходит закисление последнего, наружная
сторона сопрягающей мембраны получает положительный заряд.
В матриксе митохондрии при этом образуется избыток ОН", внут-
ренняя сторона мембраны заряжается отрицательно. Таким обра-
зом, на сопрягающей мембране одновременно с градиентом кон-
центрации протонов (АрН) возникает градиент электрического по-
тенциала (Аф).
Химическая энергия окисления трансформируется в электриче-
скую и накапливается в форме мембранного потенциала. Внутрен-
няя мембрана митохондрий уподобляется конденсатору, ее поверх-
ность— обкладкам конденсатора, которые разделены слоем изоля-
тора — липидов. Образующийся электрохимический потенциал
ионов водорода (ДцН+) состоит, следовательно, из химической
компоненты (АрН) и электрической (Аф). Обратный поток прото-
нов по градиенту их концентрации к матриксной стороне мембраны
осуществляется через АТФ-синтетазный комплекс. Именно этот
поток протонов и служит движущей силой для синтеза АТФ. Сог-
ласно теории Митчелла на каждые два протона, прошедшие через
401
мембрану, синтезируется одна молекула АТФ. Следовательно, цепь
переноса электронов должна содержать три протонных насоса,
соответствующих трем участкам фосфорилирования.
Дыхательная цепь трижды «перешнуровывает» внутреннюю
мембрану митохондрий. Каждая пара электронов дыхательных
субстратов, транспортируемая от НАДН к кислороду, как бы из-
Рис, 7.5. Схема окислительного фосфорилирования, протекающего во
внутренней мембране митохондрии посредством протондвижущего ме-
ханизма
влекает три пары ионов Н+ из внутреннего матрикса, которые пере-
носятся затем наружу, в межмембранное пространство. В резуль-
тате при переносе двух электронов образуется три молекулы АТФ
(рис. 7.5).
Таким образом, АТФ-синтетаза — это протонный насос. Она ис-
пользует движение протонов вниз по градиенту для того, чтобы
синтезировать АТФ.
В настоящее время хемиосмотическая теория подтверждена
большим количеством экспериментов. Так, Э. Рэкер использовал с
этой целью бактериородопсин — хромопротеин, содержащий в сво-
ем составе ретиналь. Бактериородопсин, поглощая световую энер-
гию, образует на сопрягающей мембране электрохимический потен-
циал ионов водорода. Из митохондрий сердца быка была получена
Н+-АТФаза, из солелюбивых бактерий — бактериородопсин, после
чего оба белка соединили с растительным фосфолипидом. Это бы-
ла химерная протеслипосома — комплекс из веществ, принадле-
жащих существам из трех разных биологических царств — живот-
ных, растений и бактерий. Она оказалась способной к фотосинтезу:
поглощая свет, синтезировала АТФ из АДФ и фосфата. Бактерио-
родопсин генерировал протонный ток за счет энергии света, а Н+-
АТФаза использовала его при биосинтезе АТФ.
402
В последние годы Ю. А. Овчинникову, В. П. Скулачеву и сот-
рудникам удалось непосредственно измерить величину электродви-
жущей силы, возникающей при освещении бактериородопсина. Его
встраивали в фосфолипидную пленку, разделяющую два отсека кю-
веты, заполненных раствором электролита. В отсеки были погру-
жены электроды. При освещении бактериородопсина (вспышка
лазера 15 нс) на мембране возникала разность потенциалов около
0,25 В, т. е. достаточная для синтеза АТФ.
Третья концепция механизма сопряжения окисления и фосфо-
рилирования— конформационная. Она рассматривает работу ми-
тохондрий по аналогии с работой мышцы. Прямые эксперименты
показывают, что митохондрии могут сокращаться и расслабляться
(это обнаруживается по изменению их светорассеяния). Согласно
конформационной концепции химическая энергия окисления сна-
чала используется для совершения механической работы (измене-
ния конформации митохондрии) и лишь затем превращается в хи-
мическую энергию АТФ. Энергия, освобождающаяся при переносе
электронов в дыхательной цепи, используется непосредственно для
перевода внутренней мембраны митохондрий в новое, богатое
энергией конформационное состояние. Этот этап можно сравнить
со сжатием пружины. Затем происходит перенос энергии на АТФ.
Мембрана принимает исходную конформацию, «пружина» расслаб-
ляется. Эти положения конформационной схемы не получили экспе-
риментального подтверждения. В 1974 г. П. Бойер, модифицируя
конформационную гипотезу, предположил, что конформацию изме-
няет митохондриальная АТФаза (АТФ-синтетаза).
Большинство исследователей в настоящее время считают, что
проблема окислительного фосфорилирования может быть решена в
рамках хемиосмотической теории Митчелла. Она раскрывает ос-
новные принципы, дает общий подход к решению конкретных воп-
росов и механизмов энергетического сопряжения. Однако, видимо,
не следует сбрасывать со счетов химическую и конформационную
гипотезы, польза которых при расшифровке и конкретизации от-
дельных положений теории Митчелла несомненна.
Наиболее сложным в проблеме окислительного фосфорилиро-
вания является раскрытие механизма, с помощью которого элек-
трохимический потенциал ионов Н+ используется в реакции синте-
за АТФ. П. Митчелл, объясняя процесс утилизации энергии элек-
трохимического потенциала, постулировал прямое взаимодействие
протонного потока с активным участком АТФазной системы.
АТФазный комплекс митохондрий (Н+-АТФаза, или АТФ-син-
тетаза) состоит из растворимой АТФазы (фактор Л) и мембранных
компонентов (комплекс Fo). Фактор Л — белок с М = 360 000—
380000. Он обладает сложной четвертичной структурой: состоит из
пяти типов субъединиц: а (М = 54 000); 0(Л1 = 5ОООО); у (М =
= 33 000); б (М-17 000); е (М-11 000).
Наиболее вероятный субъединичный состав фактора соот-
ветствует формуле «зРзубв. Основные каталитические свойства фак-
тора Fj обеспечиваются а- и 0-субъединицами. Активный центр
403
Рис. 7.6. Гипотетическая схема моле-
кулярной организации АТФ-синтетазно-
го комплекса:
а, 3» V» б, е — субъединицы сопрягающего
фактора Fb Fo — мембранный компонент АТФ-
синтетазного комплекса, пунктиром показан
путь протонов
локализуется вблизи их контакта, находится на р-субъединице. На
а-субъединице фермента располагается нуклеотидсвязывающий
центр, обладающий высоким сродством к субстратам — АДФ и Фн
(рис. 7.6). Роль у- и 6-субъединиц состоит в осуществлении связи
между фактором Fi и остальными компонентами АТФазного комп-
лекса. Е-Субъединица играет роль природного ингибитора АТФаз-
ной активности.
В состав комплекса Fo входят четыре типа полипептидов: белок,
сообщающий АТФазному комплексу чувствительность к олигоми-
цину,— OSCP (М-19000), фа-
ктор F2 (А1 = 30 ООО), фактор
F$ (М=8000), ДЦКД^связы-
вающий протеолипид (М =
6500). Комплекс Fo обеспечива-
ет связывание фактора Fi с ме-
мбраной и участвует в образо-
вании протонпроводящего пути
в Н+-АТФазном комплексе.
Этот путь обладает высокой
специфичностью, так как про-
ницаем только для протонов.
Согласно хемиосмотической
теории энергетического сопря-
жения АТФазный комплекс
осуществляет сопряжение элек-
трохимического градиента про-
тонов, генерируемого дыхатель-
ной цепью, с реакциями синте-
за АТФ. Конкретная роль
АТФазы заключается в следу-
ющем. 1. Перенос протонов
через липидный бислой с внеш-
ней стороны митохондриальной мембраны к фактору Fx — трансло-
кационная ступень. 2. Образование АТФ из АДФ и Фн — каталити-
ческая ступень, 3. Обеспечение направленности тока протонов на
использование энергии электрохимического потенциала для полу-
чения высоких концентраций АТФ — сопрягающая ступень. Пер-
вые два процесса осуществляются соответственно факторами Fo и
Fi, третий требует согласованности в функционировании указанных
факторов.
Основную роль в переносе протона играет ДЦКД-связывающий
протеолипид фактора Fo. В нем обнаружены два гидрофобных
участка и один гидрофильный, расположенный в середине молеку-
лы. Предполагают, что протеолипид располагается поперек мемб-
раны, образуя шпильку, так что полярный участок оказывается на
внешней стороне мембраны и служит входом Н+-иона в канал.
1 ДЦКД — Н,№-Дициклогексилкарбодиимид — ингибитор протонной прово-
димости. Протеолипид — гидрофобный белок, содержащий ковалентно связанные
жирные кислоты.
404
В переносе протона, по-видимому, принимают участие остатки глу,
арг и тир, входящие в состав протеолипида. Наиболее вероятным
механизмом переноса протона представляется эстафетная переда-
ча по протрн-донорным и акцепторным группам указанных амино-
кислот. Передвижение протонов осуществляется электрофоретиче-
ски по градиенту их концентрации.
Каталитическая стадия, или синтез АТФ из АДФ и Н3РО4, фор-
мально может рассматриваться как реакция дегидратации: АДФ +
+ НзРО4^АТФ-ьН2О.
Согласно первоначальным предположениям П. Митчелла, соп-
ряжение окисления и фосфорилирования происходит в результате
использования энергии ДцН4' при нагнетании протонов в активный
центр АТФазы, который располагается вблизи от протонпроводя-
щего пути. Электрофоретическое движение протонов по этому пути
приводит к их концентрированию в активном центре. Два протона
воздействуют на кислород фосфата и, соединяясь с ним, обра-
зуют молекулу воды. Это делает фосфатную группу весьма реак-
тивной, способной связываться непосредственно с АДФ. Протони-
рование фосфата является энергозависимым. П. Митчелл предпо-
лагал, что именно на этом этапе используется энергия ДцН<
Однако исследования, проведенные в последние годы, позволили
П. Бойеру (США) сделать вывод, что быстрый и обратимый синтез
АТФ может происходить в активном центре АТФазы без затрат
энергии Д|лН+. Стадией, лимитирующей данную реакцию, является
высвобождение синтезированного АТФ из активного центра фер-
мента в матрикс, т. е. из гидрофобной фазы в водную. Именно этот
процесс многократно (в 1000 раз) ускоряется при энергизации
мембраны.
Энергозависимое протонирование определенных групп в АТФаз-
ном комплексе, происходящее за счет энергии ДцН\ может вызы-
вать конформационные изменения в факторе А. Эти изменения
приводят к быстрому высвобождению синтезированного АТФ из
активного центра. Следует признать, что многие конкретные вопро-
сы работы АТФ-синтетазы остаются пока нерешенными.
Согласно данным И. А. Козлова и В. П. Скулачева (1977, 1984),
в процессе выхода АТФ из активного центра АТФазы большую
роль играют изменения свойств тех центров фермента, где происхо-
дит связывание АТФ, АДФ и Н3РО4, а также характер взаимодей-
ствия этих центров. В целом АТФ-синтетазная реакция протекает
по тому же пути, что и АТФазная, путем обращения всех стадий
гидролиза.
По мнению А. Д. Виноградова (1984), сопрягающий фактор Fi
катализирует синтез или гидролиз АТФ, будучи в двух альтерна-
тивных, взаимопревращающихся состояниях, равновесие между
которыми контролируется соотношением количеств АТФ и АДФ
в митохондриях.
Протонные АТФазы, выделенные из митохондрий животных,
высших растений и грибов, а также из хлоропластов и бактериаль-
405
ных клеток, обладают общим типом строения и, по-видимому, од-
ним и тем же механизмом функционирования. Важным моментом
является обратимость реакции, катализируемой АТФазным комп-
лексом. При соответствующих условиях комплекс Fi—Fo может
расщеплять молекулу АТФ и использовать полученную при этом
энергию для выкачивания протонов, т. е. для образования на мем-
бране электрохимического потенциала ионов водорода.
7.4. Пути использования энергии в клетке
7.4.1. Энергетика биосинтетических реакций. Любое проявление
жизнедеятельности — движение, дыхание, воспроизведение, рост,
реакции на возбуждение — связаны с преобразованием энер-
гии. Прямым источником энергии для большинства эндергоничес-
ких процессов служит АТФ. Потенциальная химическая энергия
АТФ используется для синтеза белков, жирных кислот, нуклеино-
вых кислот, стероидов и ряда других соединений. Биосинтетические
реакции сопряжены с реакцией расщепления АТФ. Активирование
обычно происходит за счет энергии, высвобождаемой при отщепле-
нии фосфорильной группы от АТФ. Однако для того чтобы потен-
циал последней мог быть использован для протекания эндергони-
ческого метаболического процесса, должен существовать механизм
сопряжения, иначе гидролиз АТФ в клетке будет приводить просто
к выделению тепла.
Часть механизма сопряжения — это нуклеофильное замещение
у атома фосфора с последующим замещением у атома углерода.
Этот процесс начинается с переноса части молекулы АТФ на нук-
леофильное соединение. Нуклеофильная атака может протекать у
концевого атома фосфора (у) с замещением АДФ, при этом пере-
носится фосфоэфирная группа и АДФ освобождается; или у сред-
него атома фосфора (р), что приводит к переносу аденилатной
группы и высвобождению неорганического пирофосфата; в редких
случаях переносится пирофосфатная группа и высвобождается
АМФ. В очень редких случаях замещение происходит у внутрен-
него (а) атома фосфора, при этом образуется аденозин и триполи-
фосфат или продукты его гидролиза. Если в роли нуклеофила в
реакциях замещения выступает вода, то гидролиз доходит до пол-
ного завершения, и высвобождаются все группы АТФ (фосфатная,
аденилатная или пирофосфатная). Это сопровождается значитель-
ным уменьшением свободной энергии, что делает указанные ста-
дии практически необратимыми.
Разнообразные биосинтетические процессы в живом организме
начинаются, как правило, с взаимодействия АТФ и исходного для
биосинтеза соединения. Получив энергию одной из высокоэнергети-
ческих связей АТФ, это соединение активируется и становится спо-
собным вступать в биосинтез. Таким путем, например, активиру-
ются аминокислоты при биосинтезе белков, образуя предваритель-
но аминоациладенилаты. Биосинтез полисахаридов также
начинается с образования нуклеозиддифосфатсахаров при участии
406
АТФ или УТФ. Кроме УТФ в некоторых биосинтезах вместо АТФ
функционируют другие эквивалентные ей нуклеозидтрифосфаты —
ГТФ, ЦТФ.
7.4.2. Работа мышц и других сократительных структур. В жи-
вом организме непрерывно осуществляется движение органов, тка-
ней, отдельных клеток, их органелл, протоплазмы, жгутиков, рес-
ничек и т. п. Еще в 1939 г. В. А. Энгельгардт и М. Н. Любимова
обнаружили, что сократительный белок мышц — миозин — облада-
ет АТФазной активностью. При гидролизе АТФ за счет освобож-
дающейся энергии происходит его сокращение, изменение конфор-
мации— мышца совершает работу. Таким образом, сократитель-
ный белок мышц сам извлекает себе энергию для работы из
молекул АТФ. Позднее этими же авторами было показано, что по-
вышенная АТФазная активность обнаруживается и в ряде других
случаев, когда в живом организме осуществляется движение (на-
пример, при движении листьев стыдливой мимозы).
В настоящее время не вызывает сомнения, что разнообразные
движения в живых организмах (сокращение мышц, движение жгу-
тиков, ресничек у простейших, перемещение сперматозоидов, дви-
жение листьев у некоторых растений, цитоплазмы в клетке)
происходит за счет энергии АТФ, которая извлекается самими сок-
ратительными (контрактильными) белками, осуществляющими дви-
жение. Это явление хорошо иллюстрирует известное положение
диалектического материализма о жизни как форме движения мате-
рии качественно более высокой, чем физическая и химическая, но
включающей их в «снятом» виде.
Сокращение мышц — явление биологическое, но оно включает в
себя и химические процессы (гидролиз АТФ), и физические (ис-
пользование энергии для движения). Участвующие в процессах
движения молекулы обычно объединены в сократительные струк-
туры. В некоторых случаях кроме движения они обеспечивают
прочность и форму клеток, образуя так называемый цитоскелет.
В эукариотических клетках сократительные структуры подраз-
деляют на микротрубочки и микрофиламенты (от лат. philamen*
turn — нить). Первые состоят в основном из белка тубулина, вто-
рые— в большом количестве содержат белок актин. Характерной
особенностью мышечных клеток является наличие в них сократи-
тельных миофибрилл, представляющих собой пучки белковых мо-
лекул, организованные особым образом.
Под электронным микроскопом в миофибриллах обнаружива-
ются два вида нитей — толстые и тонкие. Основой тонких нитей
является белок актин, который может быть в двух формах — моно-
мерной, глобулярной (G-актин) и полимерной, в виде филаментов
(Г-актин). G-актин состоит из 375 аминокислотных остатков, его
полимеризация в F-актин обязательно сопровождается расходова-
нием АТФ с образованием двухнитчатой спирали. В цитоплазме
других клеток актин представлен равновесной смесью F- и G-форм.
В процессе эволюции актин претерпел незначительные изменения.
Второй основной белок мышц—миозин. Пучки его молекул обра-
407
зуют толстые нити миофибрилл. Миозин — очень крупный белок
(длиной до 160 нм), состоящий из двух тяжелых цепей в форме
а-спиралей (Л1 = 212 000) и 2—4 легких цепей (М = 20 000). К С-
концу молекула миозина приобретает форму фибриллярного
«хвоста», а на N-конце содержит «головку», где расположены ко-
роткие цепи.
С нитями актина связаны регуляторные белки мышцы — тропо-
миозин и тропонин. Тропомиозин имеет форму длинной а-спирали,
которая как бы обвивает нить актина. Тропонин, соединяясь с тро-
помиозином, образует комплекс, названный нативным тропомиози-
ном.
Многие стороны молекулярного механизма мышечного сокра-
щения пока еще недостаточно ясны, однако в общих чертах этот
процесс представляется следующим образом. Актин и миозин об-
разуют в мышце актомиозиновый комплекс — актомиозин, в ко-
тором нити актина связываются с головками миозина. АТФазная
активность миозина в таком комплексе существенно возрастает.
Сигналом для сокращения мышцы служит электрический импульс
двигательного нерва, вызывающий высвобождение катионов Са2+,
их выход из особых мембранных пузырьков — «цистерн» в сарко-
плазму — внутриклеточную жидкость мышц. Кальций активирует
гидролиз АТФ миозином. Свободная энергия гидролиза АТФ запа-
сается в виде конформационных изменений головок миозина, вы-
зывающих смещение нити актина примерно на 10 нм по отношению
к миозиновой нити. При этом сшивки между головками миозина и
актиновыми нитями расходятся, они стабильны только в отсутст-
вие АТФ. Тем временем другие поперечные мостики миозиновых
головок присоединяются к актиновым нитям, препятствуя их воз-
вращению в первоначальное положение. После рефосфорилирова-
ния АДФ в АТФ процесс повторяется. По мере образования и
разрушения поперечных сшивок происходит продолжение сколь-
жения нитей актина, они втягиваются межу нитями миозина и мо-
гут даже надвигаться одна на другую (рис. 7.7), что приводит в
итоге к укорочению мышцы, ее сокращению. Этот механизм, пока
еще в некоторых пунктах гипотетический, получил название «греб-
ной модели», поскольку повторяющееся кратковременное действие
поперечных сшивок в актомиозине напоминает гребки многовесель-
ной лодки, её движение. Расслабление мышцы происходит после
прекращения импульса от двигательного нерва. При этом ионы Са
вновь изолируются в цистернах, перемещаемые туда Са2+-зависи-
мой АТФазой (см. разд. 9.2.).
Хотя непосредственным источником энергии работающей мыш-
цы служит АТФ, ее содержание в мышце невелико. Запасными вы-
высокоэнергетическими соединениями в мышцах млекопитающих яв-
ляется креатинфосфат, а у беспозвоночных — аргининфосфат. За
счет высокоэнергетических связей этих соединений может образо-
вываться АТФ в мышцах из АДФ.
Кроме процесса сокращения мышц актин как главный компо-
нент микрофиламентов участвует в стабилизации и изменении фор-
403
Рис. 7.7. Модель сокращения мышцы:
I— состояние покоя, II— умеренное сокраще-
ние, III — максимальное сокращение; А —>
тонкие нити (актин), М—толстые нити (мио-
зин)
мы клеток, в митозе, движении клеток (в частности, амебоидном),
токах цитоплазмы, движении органелл, фагоцитозе, секреторной
активности, распределении белков в мембране и др. У растений
хлоропласты не обособлены друг от друга, а как бы нанизаны на
актиновые филаменты, которые осуществляют их движение.
Актомиозиновые структуры, обусловливающие пульсирующее
движение протоплазмы, обнаружены у миксомицетов. Актиноподоб-
ные филаменты обнаружены в ситовидных трубках растений; вы-
сказывают предположения об их участии в передвижении ассими-
лятов. Микрофиламенты эукариот представляют собой длинные
нитевидные структуры толщиной 5—7 нм. Они обычно образуют
пучки, группы или сетчатые структуры. Если в мышечных волок-
нах и ворсинках кишечника пучки актиновых филаментов образу-
ют стабильную структуру, то в большинстве других случаев их
форма и локализация в клетке меняются в зависимости от фазы
развития и других факторов. Актин содержится практически во
всех эукариотических клетках, но особенно много его (до 20—30%
от общего белка) в активно передвигающихся клетках (амебы, мак-
рофаги, тромбоциты), у которых он преобладает среди белков кле-
точного экстракта. У большинства немышечных клеток, как и в
мышечных волокнах, преобразователем энергии, обладающим
АТФазной активностью, является миозин, близкий по структуре к
мышечному.
Наряду с актинсодержащими микрофиламентами во всех эука-
риотических клетках найдены тубулинсодержащие микротрубочки.
409
Они участвуют в следующих процессах: 1) движение жгутиков и
ресничек; 2) движение хромосом во время митоза и мейоза; 3)
транспорт гранул и пузырьков в клетке; 4) движение гранул мела-
нина в меланоцитах; 5) транспорт веществ вдоль аксона и дендри-
тов нейрона; 6) сообщение между содержимым клетки и наружной
средой.
У растений микротрубочки обнаружены, например, у плесне-
вых грибов, в хлоропластах толстянковых. Из прокариотических ор-
ганизмов микротубулярные структуры есть у спирохет. Морфология
микротрубочек достаточно стандартна: они представляют собой
длинные полые цилиндры с наружным диаметром около 24 нм и
внутренним— 15 нм. Их основной белок—тубулин—очень похож по
первичной структуре и конформации у представителей самых отда-
ленных систематических групп, что говорит о его небольших изме-
нениях в процессе эволюции. Димерные глобулярные субъединицы
тубулина (М= 115 000), полимеризуясь, образуют длинные прото-
фибриллы, из которых построены микротрубочки. Если тубулин по
функции соответствует актину, то роль преобразователя энергии
АТФ (т. е. функцию миозина) в микротрубочках выполняет белок
динеин.
У бактерий в отличие от эукариот нет большого разнообразия
типов подвижности, они перемещаются с помощью однотипной
структуры—жгутика. Тело жгутика—филамент—представляет со-
бой полый цилиндр, образованный двумя рядами идентичных субъ-
единиц, состоящих из единственного белка — флагеллина. Источни-
ком энергии для движения бактериальных жгутиков является не
АТФ (редкое исключение), а электрохимический потенциал ионов
водорода — ДцН+.
7.4.3. Роль трансмембранного электрохимического потенциала в
биоэнергетике. Согласно концепции, развиваемой В. П. Скулаче-
вым, трансмембранный электрохимический потенциал ионов водо-
рода (АрН*) занимает важнейшее место в системе энергетических
превращений (рис. 7.8). Энергия внешних источников (света или
дыхательных субстратов) превращается в ДцН+, который может
Химическая
Рис. 7.8. Значение АТФ и электрохимического потенциала ионов водорода в
энергетике клетки
410
использоваться на разнообразные процессы, протекающие в_сопря-
гающих мембранах. Таким образом, по В. П. Скулачеву, АцН+—
это вторая (наряду с АТФ) конвертируемая форма энергии в клет-
ке. Она обеспечивает химическую работу, прежде всего синтез вы-
сокоэнергетических фосфатов — АТФ и неорганического пирофос-
фата.
Трансмембранный потенциал расходуется клеткой и на ряд дру-
гих эндергонических процессов. Как уже указывалось, бактериаль-
ные клетки в некоторых случаях непосредственно используют его
для совершения механической работы (движение жгутиков). Осмо-
тическая работа — накопление катионов и анионов в митохондриях
против градиента концентрации также совершается за счет электро-
химического потенциала. Электрохимический потенциал ионов во-
дорода, наряду с АТФ, расходуется на теплообразование.
7.5. Регуляторное теплообразование и свободное окисление.
Оксигеназы и оксидазы
В организме среднего взрослого человека, весящего около 70 кг,
каждые 24 ч генерируется и высвобождается 8000 кДж энергии.
За это время не изменяются существенно ни масса тела, ни его
структура и состав. Поэтому вся эта энергия, за исключением коли-
чества, которое потребовалось для выполнения физической работы,
выделяется в виде тепла. Она необратимо рассеивается в окружаю-
щей среде. Весь процесс обеспечивает организм теплом, необходи-
мым для поддержания температуры тела на уровне около 37°С.
При помещении теплокровных животных в холодные условия
усиливается теплообразование в мышцах. Это явление включает в
себя несколько механизмов. Первый механизм — сократительный
термогенез. Актомиозин гидролизует АТФ, скелетные мышцы сокра-
щаются, начинается мышечная дрожь. Таким образом, в опреде-
ленных условиях скелетные мышцы наряду с основной функцией —
сократительной — могут играть роль «отопительной системы» орга-
низма.
В других случаях термогенез осуществляется за счет рассеяния
энергии дыхания без участия АТФ, т. е. за счет свободного окисле-
ния. Оно будет играть в этом случае, как показано С. Е. Севери-
ным и В. П. Скулачевым (1960), роль биологического приспособ-
ления к низким температурам. При свободном окислении дыхание
протекает с максимальной скоростью, но АТФ не образуется, т. е.
имеет место разобщение переноса электронов и фосфорилирования.
Свободное окисление происходит на мембранах эндоплазматиче-
ской сети, в пероксисомах, а также и в самих митохондриях. Со-
гласно гипотезе В. П. Скулачева при свободном окислении в на-
ружной мембране митохондрий действует укороченная цепь перено-
са электронов, не содержащая участков сопряжения: НАДН—^ци-
тохром Ьь—^цитохром с.
Цитохром &5 всегда есть в наружной мембране митохондрий.
Цитохром с содержится только во внутренней мембране, но он мо-
411
жет частично десорбироваться в межмембранное пространство ми-
тохондрий. В этом случае поток электронов направляется прямо
на конечный пункт сопряженного фосфорилирования с образовани-
ем одной молекулы АТФ. В энергетическом плане этот процесс
менее эффективен, но при этом не прекращается образование АТФ.
Это происходит, например, при появлении и накоплении в клетках
ингибиторов двух первых участков сопряжения окисления и фосфо-
рилирования.
Свободное окисление может протекать также и во внутренней
мембране митохондрий, например, в случае воздействия особых ве-
ществ — разобщителей окисле-
ния и фосфорилирования. При
добавлении их в среду инкубации
митохондрий окисление (т. е. по-
глощение субстратов, кислорода,
выделение СО2) продолжается
с повышенной скоростью, а син-
тез АТФ прекращается. Следо-
вательно, энергия окисления рас-
сеивается.
~ .В биохимической практике
Рис. 7.9. Транспорт протонов разоб- л л г
жителем — 2,4-динитрофенолом давно используют одно из таких
веществ — 2,4-динитрофенол
(ДНФ). В настоящее время изве-
стно около 40 соединений — разобщителей, что позволило рас-
крыть механизм их действия на окислительное фосфорилирование.
Все эти вещества обладают гидрофобностью, т. е. хорошей раст-
воримостью в липидах мембраны, и содержат подвижные протоны.
Работами В. П. Скулачева и его сотрудников доказано, что разоб-
щители повышают проницаемость сопрягающей мембраны для
протонов, в результате чего снижается электрохимический потен-
циал ионов водорода, генерируемый дыхательной цепью. В связи
с этим разобщители называют протонофорами, т. е. переносчиками
протонов.
На рис. 7.9 представлена сопрягающая мембрана митохондрий,
на которой образуется в результате работы дыхательной цепи элек-
трохимический потенциал ионов водорода. ДНФ диссоциирует,
образуя протон и анион. Анион растворяется в липидах и движется
электрофоретически к наружной поверхности мембраны. Здесь он
захватывает протон из внешней среды и тогда направляется по
градиенту своей концентрации к внутренней стороне мембраны.
Так повышается протонная проводимость мембраны, рассеивается
в виде тепла энергия электрохимического потенциала ионов водо-
рода.
В живой клетке к числу эндогенных разобщителей окислитель-
ного фосфорилирования относятся тироксин, фенолы, ненасыщен-
ные жирные кислоты и их пероксиды, некоторые специфические
белки. Разобщение окисления и фосфорилирования наблюдается
при действии экстремальных температур, радиации, у растений —
412
при недостаточном снабжении водой, элементами минерального
питания.
Свободное окисление обнаружено также в микросомах. Под
ними подразумевают фракцию морфологически замкнутых везикул,
в которые превращается эндоплазматическая ееть при гомогени-
зации тканей. Часть микросомальных пузырьков может существо-
вать и в интактной клетке в виде отдельных цистерн и вакуолей.
Препаративно микросомы выделяют путем ультрацентрифугирова-
ния при £<50 000 (предварительно при £==24 000 удаляют мито-
хондрии). А. И. Арчаков (1983) предложил для обозначения окис-
лительных процессов в микросомах особый термин—микросомаль-
ное окисление. Оно особенно характерно для микросомных фрак-
ций таких органов, как печень и надпочечники.
В микросомах содержатся активные оксигеназы — ферменты,
непосредственно присоединяющие кислород к различным субстра-
там. Различают две группы этих ферментов. Диоксигеназы катали-
зируют присоединение обоих атомов молекулярного кислорода к
окисляемому субстрату. В качестве простетической группы содер-
жат гем или негемовое железо. Монооксигеназы (гидроксилазы)
присоединяют только один атом О с образованием ОН-группы суб-
страта, другой атом восстанавливается при этом до воды с участи-
ем НАДН или НАДФН.
Микросомальные окислительные цепи содержат флавопротеины
и цитохромы, отличающиеся от митохондриальных. Важную роль в
окислительных цепях играют цитохромы Р-450. Наиболее вероят-
ные пути переноса электронов в мембране микросом описываются
следующей схемой:
НАДФН
НАДН
На этой схеме ФП1 — флавопротеин цитохром Р-450-редуктаза,
специфичная к НАДФН, окисляет НАДФН и восстанавливает ци-
тохромы Р-450; ФП2 — НАДН-специфический флавопротеин;
ЦЧФ — цианидчувствительный фактор; RH — окисляемый субстрат.
В реакциях гидроксилирования цитохромы Р-450 выполняют не-
сколько функций. Одна из них—активация кислорода — характер-
на для всех цитохромов Р-450. Кислород активируется, один его
атом непосредственно внедряется в окисляемое вещество, образуя
ОН-группу, второй атом расходуется на образование воды. Вторая
функция — связывание субстратов — весьма специфична.
413
Разные цитохромы Р-450 связывают различные субстраты — со-
единения определенного класса. Благодаря этому микросомальная
фракция окисляет сотни веществ различной химической природы.
Среди них следует назвать эндогенные субстраты — насыщенные и
ненасыщенные жирные кислоты, стероидные гормоны, холестерин,
желчные кислоты, простагландины. Наряду с ними разрушается ог-
ромное количество чужеродных веществ, попадающих в организм
человека и животных из внешней среды, — ксенобиотиков (от греч.
ксенос — чуждый): ядохимикаты, лекарственные вещества, косме-
тические препараты. Атом кислорода, внедряясь в окисляемый суб-
страт, образует ОН-группу, и тогда гидрофобное соединение пре-
вращается в полярное. Полярные продукты менее токсичны, так как
легко удаляются из мембран в водную фазу клетки.
Таким образом, микросомальное окисление — основная деток-
сицирующая система в организме животных и человека. Цитохро-
мы Р-450, играющие главную роль в этой системе, обнаружены в
мембранах эндоплазматической сети клеток печени, в митохондри-
ях коры надпочечников, в плазматических мембранах различных
бактерий. В клетках печени они относятся к числу индуцируемых
ферментов: количество их может увеличиваться в 2—5 раз при
введении одного из чужеродных соединений, например фенобарби-
тала или ДДТ. В связи с этим можно облегчить лечение острой
интоксикации путем введения какого-либо безвредного индуктора
цитохрома Р-450.
Кроме детоксицирующей функции оксигеназы у человека и
животных играют определенную роль в некоторых реакциях био-
синтеза (стероидных гормонов, желчных кислот, простагланди-
нов) и других метаболических процессах (например, превращение
циклических аминокислот).
В бактериальных и дрожжевых клетках оксигеназы способству-
ют поступлению и усвоению пластического материала, окисляя
углеродсодержащие вещества и облегчая их поступление в клетки.
У растений окисление органических соединений в монооксигеназ-
ных реакциях используется главным образом для синтеза биорегу-
ляторов.
Биологическое окисление, осуществляемое без участия пиридин-
нуклеотидов и цитохромов, может катализироваться оксидазами,
т. е. теми оксидоредуктазами, которые переносят электроны или
водород непосредственно на кислород. К ним относятся оксидазы
L- и D-аминокислот, ксантиноксидаза, аскорбатоксидаза, феноло-
ксидазы, каталаза, пероксидазы, а также цитохромоксидаза, функ-
ционирующая в цепи переноса электронов. При действии оксидаз
энергия рассеивается, исключением служит только окисление, про-
водимое цитохромоксидазой.
Многие оксидазы представляют собой флавопротеины, состоя-
щие из белка и флавиннуклеотида. В процессе катализа флавино-
вый остаток принимает пару водородных атомов, восстановленная
форма спонтанно восстанавливает О2 до Н2Ог. Однако иногда суб-
страт (МН2) отдает флавину только один электрон, и тогда фла-
414
вин осциллирует между окисленной и восстановленной семихинон-
ной формами:
О2
МН2 + Е-ФАД Е-ФАДН --МН Е-ФАД + М + Н2О2
Реакции такого типа — главный источник пероксида водорода в
метаболических системах.
Молекулярный кислород парамагнитен и обладает двумя не-
спаренными электронами.. Они находятся на разных орбиталях, по-
скольку два электрона не могут занимать одну и ту же орбиталь
(если только их спины не противоположны — антипараллельны).
Восстановление Ог путем прямого введения пары электронов в его
частично заполненные орбитали невозможно без «обращения» спи-
на одного из них, следовательно, существует «спиновый запрет»
восстановления О2. Таким образом, взаимодействие Ог с вещества-
ми, все электроны которых спарены, затруднено. Спиновый запрет
восстановления О2 может быть преодолен последовательным до-
бавлением одиночных электронов. Поэтому О2 легко вступает в ре-
акции с веществами, содержащими одиночные неспаренные элек-
троны. В одноэлектронных реакциях восстановления кислорода
участвуют свободнорадикальные промежуточные продукты. Полное
восстановление О2 до Н2О требует четырех электронов. При одно-
электронном восстановлении в качестве промежуточных продуктов
возникают надпероксидный (супероксидный) анион Q" -, перок-
сид водорода Н2О2 и гидроксидный радикал ОН-. Эти продукты
очень реакционноспособны, ядовиты для живых организмов, обла-
дают мутагенным действием. Реакции протекают по следующей
схеме:
О2 4- е~ О2 • (1)
07 • + Н+ -> НО, - (2)
07. +но2. н2о2 + о2 (3)
Надпероксидный анион, возникший в результате одноэлектрон-
ного восстановления кислорода (1), может протонироваться в гид-
ропероксидный радикал в последующей реакции (2). Радикал
Н02- спонтанно вступает в реакцию, приводящую к образованию
пероксида водорода (3). Таким образом, любая система, продуци-
рующая надпероксидный анион, будет вскоре содержать Н2О2.
Железосодержащие соединения могут катализировать реакцию
между 02- и Н2О2, образуя ОН-:
07 + Fe3+ О2 + Fe2+
Н2О2 + Fe2+ Fe3+ + ОН’ + ОН •
Гидроксидный радикал ОН- представляет собой очень мощный
окислитель, который может атаковать все органические соедине-
ния. Он образуется в клетках при воздействии на них ионизирую-
щей радиации.
415т
При самопроизвольном окислении гемоглобина, ферредоксинов,
гидрохинонов появляются 07* и Н2О2. Эти соединения образуют-
ся также при других окислительных процессах в митохондриях и
хлоропластах и устраняются благодаря действию соответствую-
щих ферментов. Для защиты клетки от аниона О 2 • служит фер-
мент супероксид-дисмутаза, который преобразует надпероксидный
радикал в пероксид водорода:
07- +ОГ- + 2Н+н2о2 + о2
Супероксид-дисмутазы найдены во всех дышащих клетках, а
также в факультативно анаэробных бактериях. Это металлофер-
менты, у которых в каталитическом цикле происходит восстановле-
ние и окисление иона металла, например Си2+, Мп3+ или Fe3+.
Супероксид-дисмутаза клеток эукариот содержит Zn2+ и Си2+ в ак-
тивном центре вблизи друг от друга. Си2+ функционирует также в
каталитическом цикле. В бактериях и митохондриях эукариот
найдена супероксид-дисмутаза, содержащая Мп3+. В бактериях и
синезеленых водорослях найдены дисмутазы, содержащие Fe3+.
Пероксид водорода, образующийся из надпероксидного аниона,
а также выделяющийся при аэробном восстановлении флавопро-
теинов, обезвреживают ферменты каталазы и пероксидазы. Они
представляют собой гемопротеины. Каталаза действует согласно
реакции
Н2О2 “И Н2о2 —•> О2 + 2Н2О
Активность этого фермента высока почти во всех клетках и ор-
ганах животных. Она обнаруживается во всех растительных объек-
тах и в большинстве микроорганизмов (кроме облигатных анаэро-
бов).
Пероксидазы специфичны только в отношении акцептора водо-
рода, т. е. пероксида водорода. В качестве доноров водорода они
могут использовать различные соединения. Например, полифенолы
и некоторые ароматические соединения они окисляют по следую-
щей схеме с образованием соответствующего хинона и воды:
Фенол Хинон
Особенно активные пероксидазы содержатся в тканях высших
растений. В животных тканях (кровь, печень, почки) также обна-
ружены пероксидазы. Гемовое железо, присутствующее в молеку-
лах каталазы и пероксидазы, участвует в образовании промежу-
точных перекисных соединений. Ферменты, катализирующие мета-
болизм Н2О2, в большом количестве находятся в особых
органеллах растительных и животных клеток — пероксисомах.
Около 40% общего количества белка пероксисом из печени кры-
сы составляет каталаза.
416
Фенолоксидазы представляют собой медьпротеины, встречаю-
щиеся чаще всего в цитоплазме растительных клеток. Эти фермен-
ты окисляют монофенолы в дифенолы, а последние — до хинонов.
Действием фенолоксидаз объясняется самопроизвольное потем-
нение срезов растительных тканей (картофель, фрукты, грибы),
оно вызывается образованием хинонов с последующей спонтанной
реакцией между хинонами.
Широко распространена в растениях аскорбатоксидаза— медь-
протеин, также сосредоточенный главным образом в цитоплазме
клеток. В растениях содержатся дыхательные цепи, в которых
фенолоксидазы и аскорбатоксидаза функционируют как терми-
нальные оксидазы. Эти окислительные системы локализуются вне
митохондрий.
Автономными окислительными системами той или иной степени
сложности и эффективности наделены практически все структур-
ные компоненты клетки. Так, ядра обладают не только фермента-
ми гликолиза, но и рядом ферментов, связанных с окислительным
фосфорилированием. Достаточно полноценной системой окисли-
тельно-восстановительных ферментов обладают пластиды растений,
прежде всего хлоропласты.
7.6. Регуляция энергетического обмена
Ярким примером регуляции и саморегуляции энергетического
обмена в организме является ускорение генерирования АТФ в ра-
ботающей мышце. В покоящейся мышце, как и в других тканях,
АТФ расходуется на поддержание постоянства внутренней среды и
на непрерывно протекающие анаболические процессы. Однако при
выполнении механической работы потребность мышцы в энергии в
форме АТФ может почти мгновенно возрастать в 20—200 раз. В то
же время количество АТФ, содержащейся в мышечной ткани, неве-
лико, достаточно не более чем для 0,5 с интенсивной работы. Боль-
шой вклад в энергетику мышцы вносит креатинфосфат, его в 3—
8 раз больше, чем АТФ; но запасы креатинфосфата также невели-
ки, его расход должен возмещаться синтезом АТФ в процессах гли-
колиза и окислительного фосфорилирования. В период работы
мышцы окислительное фосфорилирование усиливается, однако пре-
дельно возможное поглощение кислорода гораздо меньше, чем это
требуется для получения достаточного количества энергии. Поэто-
му внезапное возрастание потребности в АТФ удовлетворяется в
основном за счет гликолиза, скорость которого увеличивается в
сотни раз. При этом используется запас мышечного гликогена, а
также глюкоза, поступающая из крови. Молочная кислота, обра-
зующаяся при сокращении мышцы, диффундирует в кровь и ресин-
тезируется в печени в глюкозу и гликоген (см. разд. 6.10). АДФ и
Фн, освобождающиеся при сокращении мышцы, используются в
окислительном фосфорилировании и в генерирующих энергию ре-
акциях гликолиза, повышая скорость этих процессов.
14—937
417
Другой пример регуляции энергетического обмена — эффект
Пастера. Известно, что в анаэробных условиях дрожжи извлекают
энергию из молекул глюкозы посредством брожения. Л. Пастер
открыл, что в присутствии кислорода воздуха клетки дрожжей по-
требляют меньше глюкозы на единицу массы, чем в анаэробных
условиях, при этом уменьшается накопление молочной кислоты.
Торможение гликолиза в присутствии кислорода аэробным дыхани-
ем получило название эффекта Пастера. Он характерен для фа-
культативно анаэробных клеток, включая клетки высших орга-
низмов.
Как уже указывалось, при полном аэробном окислении молеку-
лы глюкозы образуется 38 молекул АТФ, т. е. в 19 раз больше,
чем при гликолизе. Поэтому в присутствии кислорода клетка пере-
ключается на более экономный путь получения энергии, в связи с
чем потребляет меньшие количества глюкозы. В основе эффекта
Пастера лежат изостерические и аллостерические взаимодействия
ферментов и субстратов. Так, гликолиз и окислительное фосфорили-
рование конкурируют друг с другом за неорганический фосфат и
АДФ (изостерические взаимодействия). Митохондрии обладают
высоким сродством к АДФ, они продолжают фосфорилирование
АДФ до тех пор, пока не будет достигнута очень высокая величи-
на отношения АТФ/АДФ. Поэтому при включении окислительного
фосфорилирования гликолиз тормозится вследствие нехватки АДФ.
Общую скорость гликолиза лимитирует фосфофруктокиназная ре-
акция (см. разд. 6.9.1). 6-Фосфофруктокиназа — регуляторный ал-
лостерический фермент. Его активность стимулируется АДФ и Фн,
подавляется АТФ и лимонной кислотой. Поэтому при высоком зна-
чении отношения АТФ/АДФ активность фермента сильно снижа-
ется, а при низком — повышается.
Таким образом, в результате окислительного фосфорилирова-
ния происходит «выключение» 6-фосфофруктокиназы и соответст-
венно снижается скорость гликолиза. К тому же в аэробных усло-
виях в реакциях цикла трикарбоновых кислот образуется лимон-
ная кислота, которая выходит из митохондрий в цитоплазму и дей-
ствует как отрицательный модулятор 6-фосфофруктокиназы. Инак-
тивация 6-фосфофруктокиназы приводит к накоплению глюкозо-6-
фосфата, который подавляет активность гексокиназы—ключевого
фермента всего процесса гликолиза. Таким образом, эффект Пасте-
ра можно представить как результат последовательных и взаимо-
связанных ступенчатых процессов (рис. 7.10).
Известно, что при недостатке АДФ скорость аэробного дыхания
тормозится (дыхательный контроль). Таким способом регулирует-
ся скорость окислительного фосфорилирования. Д. Е. Аткинсон
(1968) предложил характеризовать энергетическое состояние клет-
ки количественно, вычисляя «заполнение» системы АТФ-АДФ-АМФ
высокоэнергетическими фосфатными связями. Если все содержа-
щиеся в клетке аденозинфосфаты находятся в форме АТФ, то сис-
тема энергетически заполнена до предела, т. е. ее энергетический
заряд равен 1,0. Если аденозинфосфаты находятся в форме АМФ,
418
Глюкоза
/ Глюкозо-6-фосфат
I (первичный, отрицательный)
\ Фн (вторичный, положительный)
Г люкозо-6-фосфат
Фруктозо-6-фосфат
АТФ (первичный, отрицательный)
С----------—ФН,АМФ (вторичный, положительный)
Цитрат (первичный, отрицательный)
Фруктозо-1,6-дифосфат
Глицеральдегид-3- фосфат
+АДФ+ФН
-*-АТФ+З-Фосф оглицерат
Фосфоенолпируват +АДФ
АТФ + Пируват
Лактат
Рис. 7.10. Механизм эффекта Пастера, аллостериче-
ские регуляторы фосфофруктокиназы и гексокиназы.
Эффекторы, стимулирующие активность фермента, — поло-
жительные, подавляющие — отрицательные; воздействующие
прямо на фермент, — первичные; эффекторы, влияющие на
стимуляцию или ингибирование первичным эффектором, —
вторичные
то система не содержит высокоэнергетических связей, она энерге-
тически «пуста», ее заряд равен 0. Энергетический заряд системы
АТФ-АДФ-АМФ вычисляется по уравнению
« 1 (АДФ] + 2 [АТФ]
Энергетическим заряд -- [ддф[ + 1АдгГТ,дтф|
От величины энергетического заряда зависят скорости реакций
цикла трикарбоновых кислот и скорости других реакций, связан-
ных с образованием или потреблением энергии. Например, у дрож-
жей уменьшение отношения АТФ/АМФ вызывает активацию цикла
трикарбоновых кислот за счет активирования цитрат-синтазы и
изоцитратдегидрогеназы. В тканях животных важную регулятор-
ную роль выполняет отношение АТФ/АДФ,
14*
ГЛАВА 8
ЛИПИДЫ
8.1. Общая характеристика и классификация
Липидами называются неоднородные в химическом отноше-
нии вещества, общим свойством которых является хорошая раство-
римость в неполярных органических растворителях: эфире, ацетоне,
хлороформе, четыреххлористом углероде, бензоле и т. п. По своему
химизму липиды, в большинстве случаев, представляют собой
сложные эфиры высших жирных кислот с глицерином или некото-
рыми другими спиртами специфического строения. В составе ряда
липидов кроме этих компонентов встречаются фосфорная кислота,
азотистые основания или углеводы. В экстракте, полученном при
обработке животных или растительных тканей органическими
растворителями, присутствуют обычно высшие и полициклические
спирты, жирорастворимые витамины, которые некоторые авторы
также относят к классу липидов.
Липиды могут быть классифицированы следующим образом:
1) нейтральные жиры и свободные жирные кислоты; 2) фосфолипи-
ды; 3) гликолипиды; 4) стероиды; 5) воска; 6) терпены. Функции
этого класса соединений важны и разнообразны.
Прежде всего, липиды в виде комплекса с белками являются
структурными элементами мембран клеток и клеточных органелл.
В связи с этим они определяют транспорт веществ в клетки и
участвуют в ряде других процессов, связанных с функционировани-
ем мембран.
Липиды служат также энергетическим материалом для орга-
низма. При окислении 1 г жира выделяется 39 кДж энергии, т. е.
в 2 раза больше, чем при расщеплении 1 г углеводов. Одновремен-
но липиды являются запасными веществами, в форме которых де-
понируется метаболическое топливо. Определенное исключение в
этом отношении составляют бактерии: у большинства из них на-
копление энергии осуществляется в нелипидной форме (гликоген)
и только (у некоторых видов — в форме поли-3-гидроксимасляной
кислоты (но не триацилглицеринов!).
В связи с хорошо выраженными термоизоляционными свойст-
вами липиды сохраняют тепло в организме, особенно у морских и
полярных животных, выполняя тем самым защитную функцию. В
виде жировой прокладки предохраняют тело и органы животных от
механического повреждения, служат жировой смазкой для кожи.
Восковой налет на листьях и плодах растений защищает от избы-
420
точного испарения и проникновения микроорганизмов. Липидные
компоненты бактерий в значительной мере определяют их чувстви-
тельность или резистентность к антибиотикам. Некоторые из липи-
дов имеют отношение к иммунитету (гликолипиды).
Регуляторной активностью обладают простагландины, полипре-
ноловые коферменты — переносчики. От свойств и структуры мем-
бранных липидов во многом зависит активность мембраносвязан-
ных ферментов, особенности протекания процессов окислительного
фосфорилирования.
Существует предположение, что одна из наиболее важных
функций липидов в мембранах как раз и заключается в их способ-
ности служить «кофактором твердого состояния», обеспечивая вы-
сокоупорядоченное, ориентированное, гидрофобное окружение для
определенных ферментативных реакций. Будучи важнейшими ком-
понентами нервных тканей, гликолипиды оказывают существенное
влияние на функционирование нервной системы.
Особое значение липиды имеют у бактерий, где они определяют
таксономическую индивидуальность, дифференциацию видов, тип
патогенеза и многие другие особенности.
8.2. Нейтральные жиры и жирные кислоты
В соответствии с рекомендацией Международной номенклатур-
ной комиссии нейтральные жиры принято называть триацилглице-
ринами (а не триглицеридами, как ранее). Это сложные эфиры
трехатомного спирта глицерина и высших жирных кислот. Их об-
щая формула
о
II
О СН3—O-C-R1
II I
R2__C—О—СН о
I II
СН2—О—С—R3
где R1, R2, R3 — остатки высших жирных кислот.
В молекуле глицерина могут быть этерифицированы как все три
гидроксильные группы, так и две, и даже одна. Триацилглицерины'
являются наиболее распространенной формой нейтральных жиров,
хотя моно- и диацилглицерины также встречаются в природе и
играют важную роль в метаболизме липидов. Номенклатура нейт-
ральных жиров основывается на названиях жирных кислот, входя-
щих в их состав (например, тристеарин, олеодипальмитин).
Как запасные вещества триацилглицерины обладают особыми
преимуществами перед другими соединениями: углеводами, белка-
ми. Они не растворяются в воде и клеточном соке, не смешиваются
с водой и поэтому не меняют существенно физико-химические свой-
ства цитоплазмы, до омыления ни в какие реакции в водной среде
не вступают.
421
Таблица 8.1. Природные жирные кислоты to
Название по Женевской
Тривиальное название номенклатуре
Насыщенные
Лауриновая «-Додекановая
Миристиновая «-Тетрадекановая
Пальмитиновая н-Гексадекановая
Стеариновая w-Октадекановая
Ненасыщенные
Пальмитоолеи новая 9-Гексадеценовая
Олеиновая Цис-§-октадеценовая
Линолевая Цис-цис-9,12-октадека-
диеновая
«-Линоленовая 9, 12, 15-Сктадекатрие-
новая
Арахидоновая 5, 8, 11,1 4-Эйкозантет-
раеновая
Структура
СН3 (СН2)10 СООН
СН3(СН2)12СООН
СН3 (СН2)МСООН
СН3(СН2)1вСООН
СН3 (СНа)6 СН=СН (СН2)7 СООН
СН3 (СН2)7-СН=СН (СН2)7 СООН
СН3 (СН2)4СН=СНСН2СН=СН (СН2), СООН
СНзСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)7СООН
СНз (СН2)4СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СНСН2СН=СН(СН2)з СООН
В составе природных триацилглицеринов найдено несколько де-
сятков различных жирных кислот. Все они отличаются друг от дру-
га длиной углеводородной цепи, степенью ненасыщенности, числом
и положением двойных связей, структурной конформацией, харак-
тером ветвления, наличием различных группировок (гидрокси-, ке-
то-, эпокси-, циклопропановых, циклопентановых и др.) В табл. 8.1
приведена структура наиболее важных природных жирных
кислот.
Жирные кислоты, входящие в состав липидов высших растений
и животных, обладают рядом общих свойств. Почти все они со-
держат четное число атомов углерода, но чаще всего встречаются
жирные кислоты с 16—18 атомами углерода, как насыщенные, так
и ненасыщенные. Содержание ненасыщенных жирных кислот вы-
ше, чем насыщенных. Особенно это преобладание заметно в нейт-
ральных жирах пойкилотермных организмов, живущих при низких
температурах. Это связано с тем, что ненасыщенные жирные кис-
лоты имеют более низкую температуру плавления и содержащие
их нейтральные жиры остаются жидкими даже при температуре
ниже 5°С. Ненасыщенные жирные кислоты преобладают и в рас-
тительных жирах (олеиновая, линолевая), называемых маслами.
В жирных кислотах растительного происхождения, содержащих
более одной двойной связи, обнаружены сопряженные (конъюгиро-
ванные) двойные связи: —СН = СН—СН = СН—, в то время как
двойные связи в ненасыщенных жирных кислотах животных липи-
дов обычно входят в дивинилметановую группировку —СН = СН—
СН2—СН^СН—. Структурные свойства цепей жирных кислот име-
ют большое биологическое значение, особенно в мембранах.
Присутствие в жирах большого количества ненасыщенных жир-
ных кислот придает им жидкую консистенцию (растительные мас-
ла), содержание преимущественно насыщенных жирных кислот
при комнатной температуре — твердую консистенцию (животные •*
жиры). Жидкие жиры могут быть превращены в твердые путем
гидрогенизации — присоединения водорода по месту двойных свя-
зей непредельных жирныХ^киСлот в' присутствии катализаторов.
^Гакие жиры широко используют в пищевой промышленности для
изготовления маргарина. Важнейшие регуляторы метаболизма —
простагландины (см. разд. 12.4) образуются в ходе метаболизма
в основном из арахидоновой кислоты. В связи с этим, очевидно,
большое значение полиненасыщенных жирных кислот среди компо-
нентов пищи.
Жирные кислоты, входящие в состав бактериальных липидов,
характеризуются большим разнообразием. Установлено, что у боль-
шинства микроорганизмов длина цепи жирных кислот может
достигать 26 углеродных атомов, но в основном это жирные кисло-
ты, состоящие из 18 или меньшего числа углеродных атомов. Мно-
гие из насыщенных жирных кислот, от капроновой до стеариновой,
в том числе и с нечетным числом атомов углерода, обнаруживаются
почти у всех бактерий. Ненасыщенные жирные кислоты бактерий
содержат чаще всего 16- или 18-углеродную молекулу с одной не-
423
насыщенной связью. Жирные кислоты с более чем одной двойной
связью обнаруживаются в бактериальных клетках крайне редко.
В зависимости от индивидуальности видов встречаются и даже
преобладают разветвленные насыщенные жирные кислоты и гид-
роксижирные кислоты, а также необычные жирные кислоты, содер-
жащие циклопрапановое кольцо:
СН2
R—СН^СН—[(СН)2]П—СООН
Эти циклические соединения имеют различную длину цепей, но
большей частью содержат 17 или 19 углеродных атомов. Спектр
жирных кислот разных видов приобрел значение таксономического
критерия для идентификации микроорганизмов.
Триацилглицерины могут быть простыми или смешанными. К
простым триацилглицеринам относятся те, в которых все три кис-
лотных радикала принадлежат одной кислоте, например трипаль-
митин, триолеин. В состав смешанных триацилглицеринов входят
остатки разных высших жирных кислот, например^ пальмитостеаро-
олеин, пальмитодистеарин. В природных жирах, представляющих
собой смесь разнообразных триацилглицеринов, доля простых три-
ацилглицеринов мала, в то время как процентное содержание сме-
шанных триацилглицеринов очень высоко. Например, жир коровь-
его молока является олеопальмитобутирином.
Свойства жиров определяются качественным составом жирных
кислот, их количественным соотношением, процентным содержани-
ем свободных жирных кислот. Для характеристики свойств жира
служат константы, или жировые числа, — кислотное число, иодное
число, эфирное число, число омыления и др.
Кислотное число — количество миллиграммов КОН, необходи-
мое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в
1 г жира. Это очень важный показатель качества природного жи-
ра, так как увеличение кислотного числа при хранении свидетель-
ствует о происходящем в жире или богатых жиром пищевых про-
дуктах гидролизе.
Иодное число — количество граммов иода, связываемое 100 г
данного жира. Присоединение иода происходит по месту двойных
связей ненасыщенных жирных кислот, следовательно, иодное чис-
ло дает представление о содержании в жире ненасыщенных жир-
ных кислот.
При гидролизе нейтральных жиров образуются жирные кисло-
ты и глицерин. В живых организмах эта реакция катализируется
ферментами — липазами. In vitro гидролиз жира происходит при
нагревании в воде до 100°С, но очень медленно; он значительно ус-
коряется в присутствии кислоты или щелочи.
Гидролиз нейтральных жиров щелочами называется омылени-
ем. В результате этой реакции образуются глицерин и соли жир-
ных кислот — мыла. При использовании КОН образуются жидкие
мыла, а при омылении NaOH “Твердые. Конечные продукты ще-
424
лочного гидролиза растворимы в воде и нерастворимы в неполяр-
ных растворителях, что часто используют в химии липидов для
разделения смеси различных липидов.
При хранении жиры под действием света, кислорода и влаг^
приобретают неприятный вкус и запах. Этот процесс, заключаю-
щийся в окислении и гидролизе жиров, называется прогорканием.
Легче всего окисляются) непредельные жирные кислоты,^входящие в
состав жира. При этом кислород присоединяется по месту двойных
связей и образуются перекиси:
НН НН
II 1:1
R—С = С—Ri + О2 ->R—С—С—Rx -> R—С—Н + Н—С—Ri
III II II
О—*—О о о
Далее происходит разрыв углеродной цепи по месту бывшей
двойной связи и образуются альдегиды и кислоты с короткими
цепями типа масляной кислоты, с неприятным запахом и вкусом.
В процессе прогоркания жиров участвуют также некоторые окис-
лительные ферменты, в частности липоксигеназа. Для предотвра-
щения окислительного прогоркания жиров или содержащих жиры
продуктов к ним прибавляют антиокислители, которые задержива-
ют окисление. Наиболее активным антиоксидантом является вита-
мин Е. Хранение жира в темноте, на холоду и в вакууме также
препятствует его окислению. Присутствие металлов, наоборот, спо-
собствует этому.
Жиры не только играют важную роль в метаболизме живых ор-
ганизмов, но широко используются в технике, медицине. Из них
получают мыло, олифу, масляные краски, основу для лекарствен-
ных мазей.
8.3. Фосфолипиды
Старое название этой группы липидов — фосфатиды — правила-
ми Международной номенклатуры не рекомендуется употреблять.
Молекула фосфолипидов образована остатками глицерина (или
заменяющего его спирта сфингозина), жирных кислот, фосфорной
кислоты, соединенной сложноэфирной связью с какой-либо поляр-
ной группировкой (чаще азотсодержащей).
Фосфолипиды широко распространены в растительных и жи-
вотных тканях, в микроорганизмах они являются преобладающей
формой липидов. В отличие от нейтральных жиров фосфолипиды
практически содержатся только в клеточных мембранах и очень
редко в небольших количествах обнаруживаются в составе запас-
ных отложений. Значительные количества фосфолипидов содержат-
ся в сердце и печени животных, в семенах растений (например, в
соевых бобах), в яйцах птиц. Особенно высоко содержание их в
нервной ткани человека и позвоночных животных.
425
Фосфолипиды растворимы в органических растворителях, но
избирательно: одни в этаноле, другие — в эфире, третьи — в бензо-
ле. Большинство из них нерастворимо в ацетоне, что используют
для отделения фосфолипидов от других липидов. Они нераствори-
мы в воде (но набухают); быстро окисляются на воздухе (так как
в молекуле есть ненасыщенные жирные кислоты), меняя при этом
окраску от светло-желтой до коричневой.
Фосфолипиды легко образуют комплексы с белками, чем и объ-
ясняется преимущественное участие их в формировании клеточных
оболочек и внутриклеточных мембран (составляют до 50% всех
липидов биологических мембран). Благодаря особенностям хими-
ческого строения (полярность молекулы) фосфолипиды обеспечи-
вают одностороннюю проницаемость мембран. В соответствии с
правилами Международной номенклатуры IUPAC класс фосфоли-
пидов может быть разделен на глицерофосфолипиды и сфингофос-
фо липиды.
8.3.1. Глицерофосфолипиды. Общая схема строения глицеро-
фосфолипидов имеет следующий вид:
о
II
О СН2—О—С—Rx
II I
R2—С—О—-СН он
I I
СН2—О—Р—О—X
II
о
где X — полярная группа; Ri и R2— радикалы жирных кислот.
В основе молекулы глицерофосфолипидов лежит фосфатидная
кислота, представляющая собой глицерин, у которого две спирто-
вые группы этерифицированы жирными кислотами, а одна, в 3-м
положении, фосфорной кислотой. У большинства природных глице-
рофосфолипидов насыщенные жирные кислоты (с 16—18 углерод-
ными атомами) находятся в положении С-1, а ненасыщенные (16—
20 углеродных атомов, от одной до четырех двойных связей) — как
правило, в положении С-2. В свободном виде фосфатидная кислота
в клетках содержится в очень малых количествах и преимущест-
венно в растительных тканях. В то же время фосфатидная кислота
является важным промежуточным соединением при биосинтезе,
фосфолипидов.
Находящийся в составе фосфатидной кислоты остаток фосфор-
ной кислоты может образовывать сложноэфирную связь с различ-
ными полярными группировками. Различные глицерофосфолипиды
отличаются друг от друга природой этих групп, а каждый тип в
свою очередь может быть представлен большим числом соедине-
ний, различающихся строением двух жирных кислот, входящих в
молекулу.
Наличие в молекуле глицерофосфолипидов остатков жирных
кислот (неполярные углеводородные «хвосты») и полярной иони-
426
зированной головы придает им свойства амфифилов. Этим объяс-
няются особые физико-химические свойства глицерофосфолипидов
и их участие в построении клеточных мембран. С одной стороны,
глицерофосфолипиды, как и нейтральные жиры, хорошо раствори-
мы в неполярных растворителях, с другой — могут давать с водой
стойкие эмульсии или даже образовывать коллоидные растворы.
По этой же причине глицерофосфолипиды обладают свойствами
детергентов.
В зависимости от строения полярной группы глицерофосфоли-
пиды делятся следующим образом: 1) фосфатидилхолины (старое
название лецитины не рекомендуется)^ 2) фосфатидилэтаноламины
(старое название — кефалины); 3) фосфатидилсерины; 4) фосфа-
тидилинозиты; |5) фосфатидилсахара; 6) фосфатидилглицерины;
7) фосфатидали, или плазмалогены.
В тканях животных и высших растений в больших коли-
чествах встречаются фосфатидилхолины и фосфатидилэтанола-
мины.
Фосфатидилхолины. Содержат в своем составе в качест-
ве полярной группы аминоспирт холин (гидроксид 3-гидрокси-
этилтриметиламмония), который является таким же сильным осно-
ванием, как КОН, и полностью диссоциирует в водной среде, с
сильными кислотами образует нейтральные соли:
ОН
(CH3)3=N—СН2—СН2~ОН Холин
Фосфатидилхолины в большом количестве содержатся в желт-
ках яиц птиц, откуда они были впервые получены К. Дьяконовым /j
(1867), отсюда их старое название лецитины (от греч. лецитос—
желток). Их много также в мозговой ткани человека и животных,
а у растений в соевых бобах, семенах подсолнечника, зародышах
пшеницы. Фосфатидилхолины крайне редко встречаются у бакте-
рий, чем бактериальные фосфолипиды отличаются от фосфолипи-
дов других представителей животного мира.
В настоящее время установлено наличие двух форм фосфати-
дилхолинов (а и Р) в зависимости от того, с каким углеродным
атомом глицерина связана фосфорная кислота (а — с углеро-
дом в крайнем положении, р — в срединном). Фосфатидилхолины *
хорошо растворимы в спиртах, эфирах, но нерастворимы в аце-
тоне.
Холин может присутствовать в тканях и в свободном виде. Он
обладает высокой биологической активностью: является донором
метильных групп при различных синтезах (например, метионина),
стимулирует перистальтику кишечника. При недостатке холина
наблюдается нарушение обмена веществ, в частности жировое пе-
рерождение печени.
427
о
II
СН2—О—С—Ri
О
R С_О₽—СН он он
I I 1
аСн2—О—Р—О—СН2—СН2 - к=(СНз)3
II
о
а - Фосфатидилхолин
Большое значение имеет производное холина — ацетилхолин
Н3С—С—О—СН2—СН2—N+=(CH3)3, являющийся медиатором
II
О
парасимпатической нервной системы. Действие его кратковремен-
но, так как он быстро разлагается ацетилхолинэстеразой. Накопле-
ние ацетилхолина приводит к сильнейшему отравлению.
Фосфатидилхолины широко используют в пищевой промышлен-
ности при изготовлении шоколада, маргарина и в качестве антиок-
сиданта; в текстильной и косметической промышленности; в меди-
цине при лечении заболеваний нервной системы, упадке сил, ане-
мии.
Фосфатидилэтаноламины. Вместо холина содержат
спирт этаноламин, наряду с фосфатидилхолином входят в состав
мембран.
НО—СН9—СН2—NH* Этаноламин
Фосфатидилсерины. Очень близки по сравнению и по
функциям к двум предыдущим фосфолипидам. Полярной группой у
них является серин.
о
II
О СН2—О—С—Rj
R2—С—О—СН ОН NH2 а-Фосфатид илсерин
СН2—О—Р—О—СН2—СН—СООН
II I
О
Фосфатидилинозиты. В этих глицерофосфолипидах по-
лярной группой служит шестиуглеродный циклический спирт ино-
зит. Фосфатидилинозиты обнаруживаются у животных, растений и
микробов. У животных они найдены в сердце, печени, легких, но
особенно высоко их содержание в миелиновых оболочках нервных
волокон спинного мозга.
Фосфатидилинозиты представляют интерес как возможные пред-
шественники простагландинов — важнейших регуляторов метабо-
лизма. Особенно важны фосфорилированные производные фосфа-
тидилинозитов: фосфатидилинозит-4-фосфат и фосфатидилинозит-
428
-3,4-дифосфат. Они присутствуют в тканях мозга и составляют
более половины всех фосфатидилинозитов.
1-Фосфатидилмиоинозит-3,4-дифосфат
Инозит — важнейший циклотол (т. е. циклоалкан), он широко
распространен в различных микроорганизмах, высших растениях
и животных. В растениях он обнаружен в виде его гексафосфата —
фитиновой кислоты или ее магниево-кальциевой соли — фитина.
Инозит и фитин представляют большой интерес в связи с их ролью
в питании, а также участии в липидном и углеводном обмене.
Фосфатидилглицерины. Фосфатидные кислоты могут
присоединять к себе еще один остаток глицерина, образуя фосфа-
тидилглицерины:
О
II
О СН2—О—С—Rj
11 I
R2—С—О—СН он
Н2С—О—Р—о—сн3—сн—сн.
II I г
о он он
В значительных количествах они содержатся в некоторых бакте-
риальных мембранах в форме аминокислотных производных. На-
пример, в форме L-лизилфосфатидилглицерина или L-аланилфос-
фатидилглицерина. Липиды этого типа называют липоаминокисло-
тами или О-аминоацилфосфатидилглицеринами. Растения, в осо-
бенно заметных количествах, содержат фосфатидилглицерины в
хлоропластах, где на их долю приходится около 50% от общего
содержания липидов в листьях.
Предполагают, что фосфатидилглицерины принимают участие в
обмене веществ хлоропластов, служат их структурным элементом,
а также могут играть роль запасного материала.
К фосфатидилглицеринам близок кардиолипин, представляю-
щий собой его производное, в котором 3-гидроксил второго остатка
глицерина этерифицирован фосфатной группой молекулы фосфа-
тидной кислоты, т. е. кардиолипин содержит три остатка глицери-
на. Эти остатки соединены друг с другом двумя фосфодиэфирными
мостиками через 1-е и 3-е положения, ОН-группы двух внешних
глицеринов этерифицированы жирными кислотами.
429
Кардиолипин выделен впервые из сердечной ткани. Это пока
единственный фосфолипид с известными иммунологическими свой-
ствами.
Н2С-О—С—R'
R __С—о—СН ОН ОН HC-O-C-R'
II I I I I II
О СН2—О—Р—О—СН2—СН(ОН)—СН2—О—Р—о- сн2 о
Кардиолипин — обязательный компонент бактериальных клеточ-
ных мембран; он входит в состав мембран митохондрий и хлоро-
пластов. Полагают, что кардиолипин играет большую роль в пере-
носе электронов и окислительном фосфорилировании в митохонд-
риях.
Фосфатидилсахара. Обнаружены в растениях и микро-
организмах. Роль полярной группы здесь играет молекула сахара.
Однако их не следует путать с гликолипидами, в молекуле которых
тоже есть углевод, но нет фосфорной кислоты.
Фосфатидали, или плазмалогены. Отличаются от
других глицерофосфолипидов только тем, что имеют в С-1 положении
L-глицеро-З-фосфата не остаток жирной кислоты, а а, р-ненасы-
щенный спирт, образующий простую эфирную связь. Ниже пред-
ставлена общая формула плазмалогенов: где R—радикал а, р-не-
насыщенного спирта, Ri — радикал жирной кислоты, X — полярная
группа.
Н Н
СН2—О—С—С—R
Ri—С—О—СН ОН
11 । 1
О СН2—О—Р—О—X
X-Группа в плазмалогенах чаще всего представлена холином,
этаноламином и серином. У а, p-ненасыщенных спиртов длина цепи
составляет от 12 до 18 углеродных атомов. Простые эфирные связи
их с глицерином устойчивы в разбавленных щелочах, но гидроли-
зуются в разбавленных кислотах с образованием альдегида соот-
ветствующего спирта, причем образующийся альдегид является
насыщенным (отсюда название этой группы фосфолипидов: плаз-
мал — высокомолекулярный альдегид).
Плазмалогены особенно широко распространены в мембранах
мышц и нервных клеток. Значительное количество их обнаружено
в эритроцитах, а в тканях некоторых беспозвоночных их содержание
достигает 25% общего количества глицерофосфолипидов. Из расти-
тельных тканей плазмалогены не удалось еще выделить и досто-
430
верно идентифицировать, хотя предварительные сообщения об
этом существуют. В составе мембран некоторых бактерий плазма-
логены обнаружены.
8.3.2. Сфингофосфолипиды. Липиды, относящиеся к этой груп-
пе, содержат те же компоненты, что и глицерофосфолипиды (жир-
ные кислоты, фосфат и Х-группу), лишь вместо глицерина они
включают ненасыщенный аминоспирт сфингозин или его насыщен-
ный аналог дигидросфингозин,
Н
Н3С-(СН2)12-С=С-СНОН н3С-(СН2)14—снон
н н—с—nh2 н—с—nh2
I I
СН2ОН СН2ОН
Сфингозин (D-4-сфингенин) Дигидросфингозин (D-сфинганин)
Двойная связь в молекуле сфингозина находится в транс-поло-
жении, а расположение заместителей у асимметричных атомов уг-
лерода соответствует D-конфигурации.
Наиболее распространены сфингозины с 18 углеродными атома-
ми в молекуле, но встречаются сфинголипиды, содержащие сфин-
гшиды с 16, 17, 19 и 20 атомами углерода.
Ацильные производные сфингозинов, в которых аминогруппа
ацилирована жирной кислотой, называют церамидами. Они широ-
ко распространены в тканях растений и животных, но содержатся
в незначительных количествах.
* Самыми распространенными сфингофосфолипидами являются
сфингомиелины, которые могут рассматриваться как фосфохоли-
новые производные церамидов. По своей конформации они очень
похожи на фосфатидилхолины, т. е. также содержат полярную го-
лову и два неполярных хвоста, один из которых является длинной
алифатической цепью сфингозина, а другой — этерифицированной
жирной кислотой.
Н О
I II
ОН N—С—R
Н3С—(СН2)12—СН=СН-СН—СН—СН2ОН
Церамид
н о
I II
он N—С—R О
I I , II
Н3С—(СН2)12—СН=СН-СН-€ЬфСН24-О—Р—О—СН2—СН2—N+=(CH3)3
он
Сфингомиелин (R-радикал жирной кислоты)
~ Сфингофосфолипиды обнаружены в мембранах растительных и
животных клеток. Особенно богата ими нервная ткань, в частно-
сти мозга, найдены и в составе липидов крови.
431
8.4. Гликолипиды
Гликолипиды содержат в составе молекулы углеводные остат-
ки (чаще D-галактозы), фосфорная кислота в них отсутствует. Они
находятся преимущественно в тканях мозга, есть также в клетках
крови и других тканях; играют важную роль в функционировании
биологических мембран. Представлены гликозилдиацилглицерина-
ми и гликосфинголипидами.
8.4.1. Гликозилдиацил глицерины. В их молекулу входит глице-
рин, этерифицированный двумя остатками жирных кислот, и одна
или две молекулы моносахарида, связанных с глицерином 0-глико-
зидной связью. В качестве углеводного компонента чаще всего
встречается D-галактоза, реже D-глюкоза. Они составляют поляр-
ную голову липида. В отличие от фосфатидилсахаров в молекуле
гликозилдиацилглицеринов нет фосфата. Представителями таких
гликолипидов являются моногалактозилдиацилглицерин и дига~
лактозилдиацилглицерин. Они были выделены из листьев растений,
где их концентрация приблизительно в 5 раз превышает концент-
рацию фосфолипидов из фотосинтезирующих бактерий.
Д игалактозилд иацилглицерин
(Rj и R2 -радикалы жирных кислот)
Галактолипиды, по-видимому, специфически связаны с хлоро-
пластами. Ни один из перечисленных выше гликолипидов в живот-
ных тканях не обнаружен.
8.4.2. Гликосфинголипиды. Близки по строению к сфингофосфо-
липидам, их можно рассматривать как производные церамида, но
они не содержат фосфора и азотистых оснований. В состав гликос-
финголипидов входит один или несколько остатков углеводов.
В зависимости от числа и состава моносахаридных остатков их
делят на цереброзиды, церамидолигосахариды и ганглиозиды.
Цереброзиды. Являются церамидмоносахаридами. Глико-
липиды этого типа в больших количествах содержатся в мембранах
нервных клеток (в миелиновых оболочках). При гидролизе 1 моля
цереброзида образуется по I молю сфингозина, жирной.жислоты и
гексозы (чаще галактозы, реже глюкозы). По этой причине пред-
ставителей этой группы липидов часто называют галактосфинголи-
432
пидами или глюкосфинголипидами. Остаток гексозы в молекулах
цереброзидов присоединен 0-гликозидной связью. Из жирных кис-
лот, обнаруженных в цереброзидах, чаще всего встречаются нер-
воновая, цереброновая и лигноцериновая, содержащие 24 атома
Галактоцереброзид френозин
При этерификации цереброзидов сульфатом по С-3 гексозы об-
разуются цереброзидсульфатиды. Как и цереброзиды, они нахо-
дятся в белом веществе мозга.
Церамидолигосахариды. В состав молекулы этой груп-
пы гликосфинголипидов входят гетероолигосахариды, связанные
гликозидной связью с церамидом. Могут быть церамидтрисахари-'
ды, церамидтетрасахариды и т. д.
Ганглиозиды. Аналогичны по строению церамидолигосаха-
ридам, однако в их состав обязательно входит хотя бы один оста-
ток сиаловой кислоты. Ганглиозиды очень сложные, богатые угле-
водами липиды. В отличие от цереброзидов находятся в сером ве-
ществе мозга, на внешней поверхности клеточных мембран. В ган-
глиозидах обнаружены D-глюкоза, D-галактоза, N-ацетилглюкоза-
мин, N-ацетилгалактозамин и N-ацетилнейраминовая кислота, ко-
торые образуют гидрофильную голову со сложным строением.
Благодаря наличию карбоксильной группы в остатке N-ацетил-
нейраминовой кислоты все ганглиозиды являются кислыми соеди-
нениями. В сером веществе мозга ганглиозиды составляют около
6% мембранных липидов.
Синтезируются ганглиозиды путем последовательных упорядо-
ченных реакций взаимодействия церамидов с нуклеозиддифосфат-
сахарами, в результате которых остатки моносахаридов и их про-
изводных присоединяются к церамиду. Структура образующегося
ганглиозида определяется специфичностью гликозилтрансфераз
данной клетки. В общей сложности в настоящее время описано бо-
лее 20 различных ганглиозидов.
Наряду с постоянным синтезом ганглиозидов непрерывно про-
исходит и их расщепление (в лизосомах) путем последовательного
удаления концевых углеводных остатков. Нарушения в способности
клетки к расщеплению ганглиозидов приводят к серьезным клини-
ческим последствиям.
438
Неполярные хвосты
Гликосфинголипиды, особенно ганглиозиды, вовлечены в про-
цесс приема сигналов, поступающих в клетки. Они активно участ-
вуют в контроле и регуляции межклеточных контактов, рецепции
пептидных гормонов, серотонина, некоторых вирусов и бактериаль-
ных токсинов. Структура ганглиозидов и их состав генетически
контролируются гликозилтрансферазами, поэтому ганглиозиды об-
ладают высокой тканевой специфичностью и выступают в роли ан-
тигенов клеточной поверхности.
8.5. Стероиды
Стероиды — производные
имеющего следующую структуру:
пергидровдклопентанфенантрена,
434
Характерными особенностями почти всех природных стероидов
является присутствие кислородсодержащего заместителя у С-3, на-
личие метильных групп, связанных с С-10 и С-13 и отсутствие
двойных связей в циклах.
К стероидам относятся стеролы (или стерины), стериды, желч-
ные кислоты, мужские и женские половые гормоны, гормоны над-
почечников, витамины группы D, сердечные гликозиды, сапогени-
ны, экдизоны, некоторые яды. В основе их классификации лежит
структура заместителя, присоединяемого к 17-му углеродному ато-
му ядра.
В клетках все стероиды присутствуют в следовых количествах,
за исключением стеринов, содержание которых достаточно вели-
ко (до 2%).
8.5.1. Стерины (или стеролы). К ним относятся стероиды, име-
ющие от 8 до 10 углеродных атомов в боковой цепи у С-17 и гидро-
ксильную группу в положении 3. Обнаружены в клетках животных
(зоостерины), растений (фитостерины) и грибах (микостерины).
В бактериях стерины встречаются только у некоторых видов.
Одним из важнейших представителей зоостеринов является хо-
лестерин — одноатомный вторичный циклический спирт, относя-
щийся к неомыляемым липидам. Он в значительном количестве
содержится в липидах нервной ткани, где связан со структурными
компонентами миелиновой оболочки, в липидах яиц и клеток спер-
мы, в печени, надпочечниках, кожном сале и в стенках эритроцитов.
В животных тканях холестерин находится как в свободном со-
стоянии, так и в виде сложного эфира с жирными кислотами —
холестерида. Чаще всего в составе холестеридов обнаруживаются
ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая), а из насыщенных —
пальмитиновая и стеариновая. В плазме крови только одна треть
холестерина существует в виде свободного спирта, а две трети его
этерифицировано жирными кислотами, переносчиком которых он
и является. Образование эфиров происходит в стенках кишечника.
сн3
Нз СН;
н—сн2—сн2—сн2—сн
сн3
R—с—О'
X о лестерид ( R -радикал жирной кислоты)
. Важнейшей биохимической функцией холестерина у позвоноч-
ных является его превращение в гормон прогестерон в плаценте,
семенниках, желтом теле и надпочечниках, в результате чего от-
крывается цепь биосинтеза стероидных половых гормонов и корти-
костероидов. Другое направление метаболизма холестерина —
435
образование желчных кислот и витамина D3. Кроме того, холесте-
рин участвует в регулировании проницаемости клеточных мембран
и предохраняет эритроциты крови от действия гемолитических
ядов. Есть данные об активации холестерином ферментов цикла
трикарбоновых кислот.
Холестерин преимущественно находится в животных тканях,
некоторых водорослях и в очень небольшом количестве в пыльце и
масле семян растений; из растительных продуктов выделен ряд
фитостеролов. Весьма распространенной группой стеролов в расте-
ниях являются ситостерол С29Н49ОН и стигмастерол С29Н47ОН.
Большой интерес представляет наличие в высших растениях
гормонов насекомых: ювенильного гормона и гормонов линьки —
экдизонов, которых к настоящему времени выделено около 40. Их
содержание в растениях достигает 2%, и все они обладают высо-
кой биологической активностью. Экдизоны представляют собой
полигидроксилированные стеролы.
Особенно велико содержание стеролов в дрожжах и плесневых
грибах. Основным стеролом в них является эргостерол С28Н43ОН.
8.5.2. Стериды. Стериды представляют собой эфиры стеринов
(стеролов) и высших жирных кислот. Из жирных кислот в составе
стеридов обнаружены в основном пальмитиновая, стеариновая и
олеиновая. Однако в стеридах ланолина (восковидное вещество ко-
жи и волос животных) обнаружены миристиновая, арахидоновая,
церотиновая кислоты, а также ланопальмитиновая и ланостеарино-
вая — специфические высшие жирные кислоты с разветвленной
цепью.
Все стериды, так же как и стеролы,— твердые бесцветные ве-
щества (от лат. steros — твердый). В природе, особенно у живот-
ных, они встречаются обычно в форме комплексов с белками.
8.6. Воска
Представляют собой сложные эфиры высших моноатомных
спиртов жирного (реже ароматического )ряда и высших жирных
кислот. Помимо таких эфиров воска содержат некоторое количест-
во свободных высших спиртов с четным числом атомов (от С22 до
С32), свободных высших жирных кислот с очень длинной цепью (от
См до С34), а также немного насыщенных углеводородов с нечет-
ным числом углеродных атомов (от C2i до С37), душистых и крася-
щих веществ. Общее количество этих примесей может достигать
50%. Обнаружены воска как у животных, так и у растений и даже
у некоторых микроорганизмов.
Воска выполняют в организме в основном защитную функцию.
Они образуют защитную смазку на коже, шерсти и перьях, покры-
вают листья, стебли, плоды, семена, а также кутикулу наружного
скелета у многих насекомых. Восковой налет предохраняет от
смачивания, высыхания и проникновения микробов. Опыты показа-
ли, что удаление воскового слоя с поверхности плодов приводит к
более быстрой их порче при хранении. Воска также являются
436
главным липидным компонентом многих видов морского планкто-
на — источника пищи для океанской фауны.
В состав восков входят как обычные жирные кислоты, содержа-
щиеся в жирах,— пальмитиновая, стеариновая, олеиновая и др.,
так и жирные кислоты, характерные только для восков,— карнау-
бовая С24Н48О2, церотиновая С27Н54О2 и др.
Среди высокомолекулярных спиртов, входящих в состав воска,
наиболее изучены цетиловый спирт СНз(СН2)14СН2ОН, мирицило-
вый спирт С31Н63ОН, n-гексакозанол СН3(СН2)24СН2ОН и др. Сре-
ди животных восков наибольшее значение имеют спермацет, лано-
лин и пчелиный воск.
Спермацет добывается из головы кашалота, где он находится
в большом фиброзном мешке в углублении костей черепа и слу-
жит кашалоту звукопроводом при эхолокации, является эфиром
цетилового спирта и пальмитиновой кислоты.
Спермацет используют в парфюмерии как основу при изготов-
лении кремов, мазей, так как он очень хорошо всасывается через
кожу, как и ланолин — смазочное вещество, покрывающее шерсть
овец. По своему строению ланолин является стеридом. Он состоит
из смеси эфиров двух стеринов — ланостерина и агностерина и
жирных кислот ланолиновой, пальмитиновой, стеариновой и др.
Пчелиный воск вырабатывается специальными железами рабо-
чих пчел. По своему химизму это преимущественно мирицилпаль-
митат, но в нем есть и другие сложные эфиры, а также свободные
жирные кислоты, свободные высшие спирты (цериловый спирт и
др.) и углеводороды. В его составе обнаруживаются вещества,
обусловливающие цвет и запах, а также минеральные соединения.
Пчелиный воск находит применение в различных отраслях про-
мышленности благодг я сочетанию пластичности с кислотоустойчи-
востью, водо- и электроизоляционными свойствами: литейной, ко-
жевенной, автомобильной, авиационной, текстильной, электричес-
кой, радио-телефонной, пищевой, фармацевтической, стекольной,
парфюмерной, гальванопластике и др.
С древних времен пчелиный воск используют и для медицинских
нужд: для приготовления пластырей, мазей, он входит в состав пи-
тательных, вяжущих, очищающих, отбеливающих кремов и масок
для лица. В отличие от нейтральных жиров воска более устойчивы
к действию света, окислителей, нагреванию, хуже гидролизуются.
8.7. Терпены
8.7.1. Общая характеристика терпенов. В основе терпеновых со-
единений лежат изопреновые остатки, чаще всего соединенные ме-
жду собой «голова к хвосту», но иногда возможно апериодическое
расположение изопреновых единиц — «хвост к хвосту».
СН3
I
(Голова) Н2С=С—СН—СНа (Хвост)
Изопрен
437
К терпенам относятся эфирные масла (лимонен, пинен, гера-
ниол, камфора, ментол), смоляные кислоты и каучук, различные
растительные пигменты (каротины, ликопин и др.), а также вита-
мин А и сквален из животных тканей. Химически родственны тер-
пенам витамин Е, витамин К, кофермент Q (см. разд. 7.3.1).
В зависимости от числа изопреновых группировок все терпены
делятся на монотерпены (2 группировки), сесквитерпены (3), ди-
терпены (4), тритерпены (6) и тетратерпены (8). Молекулы терпе-
нов могут обладать линейной или циклической структурой, у неко-
торых из них встречаются как те, так и другие компоненты. Воз-
можны взаимные переходы из одной структуры в другую внутри
каждой группы терпенов. Двойные связи в линейных сегментах
находятся у большинства терпенов в устойчивой транс-конфигура-
ции, но возможна и цис-конфигурация одной или нескольких двой-
ных связей. Например, в печени обнаружена цис-форма витамина
А, а в зрительном пигменте глаза — цис-форма каротиноида.
Физиологическая роль терпенов выяснена недостаточно. Одна-
ко из того, что известно, следует, что функции их разнообразны.
Так, эфирные масла, смоляные кислоты, гутта, каучук выполняют
защитную функцию; пигменты принимают участие в одном из важ-
нейших процессов растительного организма — фотосинтезе, а так-
же придают окраску цветам и плодам; некоторые из терпенов явля-
ются витаминами. Сквален — тритерпен — главный компонент се-
крета сальных желез, основной липидный компонент вируса диф-
терии птиц, жира акульей печени, а также промежуточный про-
дукт в биосинтезе холестерина.
Некоторые монотерпены у членистоногих являются феромона-
ми, которые представляют собой средство информации между на-
секомыми, в частности являются половыми аттрактантами. Основ-
ные компоненты феромонов — ненасыщенные углеводороды, а так-
же высокомолекулярные спирты и их эфиры. Феромоны имеют ог-
ромное значение не только в плане теоретического изучения пове-
дения насекомых, но и практического использования в сельском
хозяйстве, медицине, лесном хозяйстве для борьбы с вредными на-
секомыми.
8.7.2. Эфирные масла и смоляные кислоты. Среди эфирных ма-
сел большое распространение имеют монотерпены СюН1б. Они мо-
гут быть как алифатического ряда, так и циклического. В природе
больше распространены кислородные производные алифатических
терпенов — альдегиды и спирты. Эфирным маслам присущ резкий
и обычно приятный запах, летучесть (способность перегоняться с
водяным паром), высокий коэффициент оптического преломления
(1,4—1,6).
Среди кислородных производных терпенов можно назвать лина-
лоол — жидкость с запахом ландыша:
он
с=сн—сн,—сна—(!:—сн=сн2
I
СН3
438
Обнаружен в кожице цитрусовых, в цветах ландыша. Применяется
в парфюмерии сам и его эфиры.
Близки по строению к предыдущему гераниол и цитронеллол.
Последний обладает запахом розы, в большом количестве содер-
жится в розовом и гераниевом маслах. 80% всей мировой продук-
ции розового масла добывают из одного вида Rosa damascena.
Для получения 1 кг розового масла расходуется 35 млн. лепестков
роз.
Из циклических монотерпенов большой интерес представляет
ментол. На его долю приходится 70% в составе масла мяты. Мен-
тол обладает свойством раздражать нервные окончания; оказывает
легкое местное обезболивание и слабое антисептическое действие.
Его применяют в составе сердечных средств (валидол, капли Зеле-
нина), при насморке и других заболеваниях верхних дыхательных
путей, при мигрени (ментоловый карандаш).
Ментол
Среди бициклических монотерпенов важную роль играет пи-
нен — главный компонент скипидара, получаемого из сосновой
живицы. Широко применяется в качестве растворителя в лакокра-
сочной промышленности и в живописи. К этой же группе терпенов
относится камфора. Очень высока концентрация камфоры в древе-
сн3
*а-Пинен
Камфора
сине и листьях камфарного лавра, в некоторых видах полыни, от-
куда ее и получают. Для синтетического получения используют
скипидар. Применяют в медицине для возбуждения центральной
нервной системы, стимуляции дыхания и кровообращения. Кам-
фора оказывает раздражающее и антисептическое действие, в
связи с чем употребляется в виде мазей и втираний при воспали-
тельных процессах и ревматизме. Используется как сырье в ряде
отраслей химической промышленности.
Смоляные кислоты относятся к дитерпенам. Имеют формулу
С2оН3002 и составляют 4/з смолы хвойных растений — терпентина
439
(живица). При переработке живицы с водяным паром отгоняется
скипидар, и остается твердый остаток — канифоль, основную мас-
су которой составляют «смоляные кислоты», в частности абиети-
новая кислота
Абиетиновая кислота
Смоляные кислоты по некоторым свойствам аналогичны жир-
ным кислотам. Их Na- и К-соли обладают мылящими свойствами,
поэтому из канифоли иногда приготовляют мыла с высокой пено-
образующей способностью.
Канифоль служит сырьем для многих отраслей химической про-
мышленности (производство резин, пластмасс, искусственной ко-
жи, линолеума, сургуча, лаков, красок, лыжной мази). Из нее
получают электроизоляционные мастики и компаунды. Она служит
флюсом при лужении и пайке металлов. Музыканты, играющие на
смычковых инструментах, натирают ею смычок.
В состав выделяемых растениями смол кроме смоляных кислот
входят также смоляные спирты, фенолы, углеводороды.
К дитерпенам относятся также фитол, витамин А, гибберелли-
ны (см. разд. 10.2 и 12.7). Фитол в свободном виде в природе не
встречается, а входит в качестве терпеновой части в состав хло-
рофилла, витаминов К и Е:
СН3 СН3 СН3 СН3
Н3С—СН—(СН2)2—СН—(СН2)з—СН—(СН2)з-С=СН—СН2ОН
Фитол
Каучук и гутта—политерпены. Главным источником каучука слу-
жит тропическое каучуконосное дерево гевея, а основные отечест-
венные каучуконосы — кок-сагыз и тау-сагыз из семейства слож-
ноцветных. Гуттаперченосом являются некоторые виды бересклета
и эвкомия.
Каучук и гутта состоят из остатков изопрена, связанных «голо-
ва к хвосту». Полиизопреновая цепочка каучука имеет цис-конфи-
гурацию, а цепочка гуттаперчи (его изомер) — транс-конфигура-
цию. Различия в строении каучука и гуттаперчи обусловливают и
отличия в их физических свойствах. Так, каучук при обычной тем-
пературе эластичен и аморфен, а при охлаждении приобретает
кристаллическую структуру. При комнатной температуре гуттапер-
ча — твердый кожеподобный продукт, а при температуре 50—*
100°С становится пластичной-
440
Каучук и гуттаперча находят широкое применение в резиновой
промышленности, радио- и электропромышленности в качестве
изоляционного материала, а также при изготовлении кислотоупор-
ных и клеящих материалов.
Каучук (л -500-5000)
п
8.8. Обмен липидов
8.8.1. Превращения липидов в процессе пищеварения и всасыва-
ние. Липиды — важная составная часть пищи. Взрослому человеку
требуется от 70 до 145 г жира в сутки в зависимости от трудовой
деятельности, пола, климатических условий. Причем необходимы
как животные, так и растительные жиры. Липиды являются высо-
коэнергетическими веществами, поэтому за их счет удовлетворяет-
ся 25—30% потребности человеческого организма в энергетичес-
ком материале. Кроме того, в составе животных жиров в организм
поступают жирорастворимые витамины A, D, К и Е, растительные
жиры богаты непредельными жирными кислотами (витамин F),
являющимися предшественниками простагландинов, исходным ма-
териалом для синтеза организмом фосфолипидов и других веществ.
Переваривание жира начинается в желудке, где находится фер-
мент липаза. Но она расщепляет только эмульгированный жир,
каким является жир молока, и поэтому этот процесс имеет значе-
ние главным образом у детей грудного возраста.
Существуют данные, что у молодняка жвачных животных и
крыс липазная активность обнаруживается в слюне. Вполне воз-
можно, что в некоторых случаях липолитическая активность желуд-
ка может быть обусловлена липазой, секретируемой в ротовой по-
лости и попадающей в желудок вместе со слюной.
Основное расщепление липидов происходит в кишечнике, в пер-
вую очередь в двенадцатиперстной кишке. В этот отдел кишечника
поступает сок поджелудочной железы, содержащий очень актив-
ную липазу. Сюда же поступает из желчного пузыря желчь, со-
ставные компоненты которой (желчные кислоты) необходимы для
переваривания липидов. Это связано с тем, что желчные кислоты—
холевая (преобладает в желчи человека), дезоксихолевая, литохо-
левая, хенодезоксихолевая, таурохолевая и гликохолевая — пред-
ставляют собой поверхностно-активные вещества, способствующие
эмульгированию жиров, что является важнейшим условием их по-
следующего ферментативного расщепления (рис. 8.1).
441
442
Пройдя через барьер слизистой оболочки кишечника, желчные
кислоты в связанном состоянии с липидами отделяются от послед-
них и по венам кишечника через портальный кровоток возвраща-
ются в печень, а затем с желчью в двенадцатиперстную кишку.
Образование эмульсии жиров в кишечнике может происходить
и под влиянием мелких пузырьков CCh, выделяющегося при нейтра-
лизации соляной кислоты пищевой кашицы бикарбонатами подже-
лудочного и кишечного сока. Способствуют эмульгированию и соли
жирных кислот (мыла), возникающие при гидролизе липидов. Но
основная роль в эмульгировании жиров принадлежит желчным
кислотам.
В результате описанных процессов образуется очень тонкая жи-
ровая эмульсия, диаметр частиц которой не превышает 0,5 мкм.
Такие эмульгированные жиры способны самостоятельно проходить
через стенку кишечника и попадать в лимфатическую систему. Од-
нако большая часть эмульгированного жира всасывается после
гидролитического расщепления его панкреатическими липазами.
Последние образуются в поджелудочной железе в виде неактивных
проферментов, которые переходят в активную форму при участии
желчных кислот.
Основная масса липидов пищи представлена триацилглицерина-
ми, меньше фосфолипидами и стероидами. Гидролиз триацилглице-
ринов идет постепенно. Сначала расщепляются эфирные связи в
1-м и 3-м положениях, т. е. внешние сложноэфирные связи:
2CH2 О СО CpHjj, СН2—О СО Cj7H3$ CH2OH
2сн—о—со—с17н35 — - СН-о-со-с„н35 .. » |н-о-со-спнм
3СН2—О—СО—С15Н31 с15Н31СООН СН2ОН С17Н35СООН СН20Н
Пальмитодистеарин 1,2-Диацил глицерин 2-Моноацилглицерин
Эти реакции осуществляют липазы, специфичные в отношении
1,3-эфирных связей триацилглицерина. Связи во 2-м положении гид-
ролизуют другие липазы:
СН2ОН СН2ОН
| Липаза |
СН—О—СО—С17Н35 + Н2О---------> СН—ОН + С17Н3бСООН
СН2ОН £н2он
Связи 1 и 3 гидролизуются быстро, а потом идет медленный гидро-
лиз 2-моноглицерида. 2-Моноглицерид может всасываться стенкой
кишечника и использоваться на ресинтез триацилглицеринов, спе-
цифичных для данного вида организмов, уже в самой слизистой
тонкого кишечника. Таким образом, ресинтез жиров происходит в
процессе их всасывания через стенку кишечника.
Кроме липаз в соке поджелудочной железы присутствуют эсте-
разы, гидролизующие преимущественно эфиры жирных кислот с
короткой цепью (например, трибутирин) и эфиры холестерина. Эти
эстеразы тоже активны только в присутствии желчных кислот.
443
Пищеварительные липазы кроме человека и млекопитающих
животных обнаружены и исследованы у рыб, некоторых беспозво-
ночных. Однако, как правило, у большинства видов беспозвоночных
и костистых рыб липолитическая активность в пищеварительных
соках примерно в 1000 раз ниже, чем в панкреатическом соке мле-
копитающих. Не следует забывать, что жиры могут усваиваться
также путем фагоцитоза и сохраняться без предварительного гид-
ролиза до тех пор, пока не прогидролизуются внутриклеточными
липазами и, таким образом, примут участие в синтезе липидов в
процессах образования энергии.
Интересным является вопрос, на каком этапе эволюции внутри-
клеточное расщепление жиров перешло во внеклеточное и как раз-
личаются липазы этих процессов. У животных, для которых харак-
терно пищеварение смешанного типа, например у многих дву-
створчатых моллюсков, вне- и внутриклеточные липазы очень сход-
ны по свойствам. Можно предполагать, что липазы поджелудочной
железы произошли из внутриклеточных ферментов и специализи-
ровались в конкуренции за овладение просветом кишечника с по-
мощью более сильного сродства к поверхности раздела масло —
вода и более развитой полярной структуры молекулы фермента,
что обеспечивает необходимую ориентацию на поверхности разде-
ла. Необходимость в большей активности или более высокой кон-
центрации внеклеточных липаз высших животных вызвана, видимо,
тем, что у них должно усваиваться и расщепляться большее коли-
чество жиров в течение более короткого времени.
Расщепление фосфолипидов происходит при участии ряда фер-
ментов: фосфолипаз Ah Аг, С, D и лизофосфолипазы.
Фосфолипаза Л1 гидролизует связь в 1-м положении. Фосфоли-
паза Аг, образующаяся в поджелудочной железе в виде профермен-
та, который затем активируется трипсином, отщепляет жирную кис-
лоту во 2-м положении. В результате ее действия образуются лизо-
фосфолипиды (см. разд. 8.8.3), которые являются сильными поверх-
ностно-активными веществами и обладают мощным гемолитическим
действием (лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин).
Кроме панкреатического сока фосфолипаза А2 содержится в ядах
рептилий, беспозвоночных (особенно членистоногих — пчел, скор-
пионов, муравьев), а также у кишечнополостных. Известны также
внутриклеточные фосфолипазы Аг (в лизосомах, микросомах, мито-
хондриях) .
Лизофосфолипаза катализирует гидролиз одной сложноэфирной
связи в положении 1, превращая лизофосфолипиды в соответствую-
щие глицерофосфорильные производные. Фосфолипаза С вызывает
гидролиз связи между фосфорной кислотой и глицерином, а фос-
фолипаза D отщепляет полярную Х-группу. Фосфолипаза С пи-
щеварительного тракта животных недостаточно изучена, пока об-
наружена в небольшом числе объектов (в слизистой кишечника
морской свинки, в поджелудочной железе быка). Широко распро-
странены и хорошо исследованы экзогенные бактериальные фосфо-
липазы С.
444
Стериды, подвергаясь действию гидролитических ферментов ти-
па холестераз, расщепляются в кишечнике с образованием спирта
холестерола или эргостерола и соответствующей жирной кислоты.
Холестеразы продуцируются поджелудочной железой и активны
только в присутствии солей желчных кислот.
Таким образом, образующаяся в результате гидролиза липидов
смесь содержит анионы жирных кислот, моно-, ди- и триацилглице-
рины, хорошо эмульгированные солями жирных кислот и мылами,
глицерин, холин, этаноламин и другие полярные компоненты липи-
дов. Исследования с мечеными триацилглицеринами показали, что
около 40% жиров пищи гидролизуется полностью до глицерина и
жирных кислот, 3—10% всасываются без гидролиза в форме триа-
цилглицеринов, а остальные гидролизуются частично, главным об-
разом до 2-моноацилглицеринов. Глицерин водорастворим и вместе
с жирными кислотами, имеющими короткие углеродные цепи
(С< 10), уходит из кишечника через портальную систему кровооб-
ращения и поступает в печень. Такие жирные кислоты всасывают-
ся преимущественно в неэтерифицированной форме.
Для всасывания жирных кислот с длинной цепью (С> 10) не-
обходимы желчные кислоты. Способность последних транспорти-
ровать жирные кислоты через слизистую оболочку кишечника свя-
зана с их поверхностно-активными свойствами и способностью к
мицеллообразованию с моноацилглицеринами и мылами. Такие
мицеллы могут проходить через водный слой, имеющийся на по-
верхности слизистой оболочки кишечника. Особую роль при этом
играют такие желчные кислоты, как таурохолевая и гликохолевая.
Соединяясь с жирными кислотами, они образуют растворимые ком-
плексы— холеиновые кислоты, которые легко всасываются в эпи-
телий кишечника. Так как pH в тонком кишечнике слабощелочная,
желчные кислоты функционируют здесь в форме своих солей.
Лучше перевариваются и всасываются липиды, находящиеся в
жидком состоянии, при температуре тела. Липиды, у которых точ-
ка плавления существенно выше температуры тела, плохо перева-
риваются и всасываются.
Фосфорная кислота, образующаяся при гидролизе фосфолипи-
дов, всасывается в виде солей, а азотистые основания — холин, эта-
ноламин и серин — всасываются при участии нуклеотидов (ЦДФ).
Некоторая избирательность проявляется слизистой оболочкой
кишечника в отношении стероидов, особенно растительного проис-
хождения. Среди основных стероидов пищи только холестерин лег-
ко проникает через стенки кишечника. С такой же легкостью вса-
сываются витамин D и некоторые стероидные гормоны, введенные
перорально.
Преобладающими липидами лимфы являются триацилглицери-
ны, даже тогда, когда жирные кислоты находятся в составе слож-
ных эфиров других спиртов.
Ресинтезированные триацилглицерины, фосфолипиды, холесте-
рин и его эфиры в эпителиальных клетках кишечника соединяются
с небольшим количеством белка и образуют хиломикроны (ХМ).
445
Благодаря большим размерам (100—5000 нм) ХМ не способны
проникать в кровеносные капилляры и диффундируют в лимфати-
ческую систему кишечника, а из нее через грудной лимфатический
проток в кровяное русло, т. е. с их помощью осуществляется транс-
порт экзогенных триацилглицеринов, холестерина и частично фос-
фолипидов в печень и жировую ткань. Хиломикроны свободно диф-
фундируют из плазмы крови в межклеточные пространства печени.
Гидролиз триацилглицеринов может происходить как внутри кле-
ток печени, так и на их поверхности. В клетки жировой ткани ХМ
не способны проникать, в связи с чем триацилглицерины гидроли-
зуются на поверхности эндотелия капилляров жировой ткани при
участии фермента липопротеинлипазы. Часть образовавшихся жир-
ных кислот проходит внутрь клеток и запасается в виде соответст-
вующих липидов, другая часть связывается с альбуминами сыво-
ротки крови и разносится в другие органы и ткани. С током крови
может покидать жировую ткань и глицерин.
8.8.2. Окисление глицерина и жирных кислот в тканях. Реак-
ции окисления. Резервные липиды, состоящие более чем на
99% из триацилглицеринов, непрерывно мобилизуются, но одновре-
менно такое же количество вновь депонируется.
Метаболизм резервных липидов начинается с гидролиза под
действием липопротеинлипазы плазмы крови или активируемой
гормонами липопротеинлипазы жировой ткани. Образующиеся
жирные кислоты поступают в кровоток и транспортируются в свя-
занном с сывороточными альбуминами состоянии. Вход свободных
жирных кислот сопровождается появлением в плазме также и гли-
церина, но в значительно меньшем количестве, чем соответствую-
щих жирных кислот. Глицерин может участвовать в глюконеогенезе
или включаться в гликолитический путь расщепления с предвари-
тельным образованием глицерол-3-фосфата под действием глице-
ролкиназы и при участии АТФ:
Гликолиз
Г люконеогенез
АТФ _ л Дегид роге нала
Глицерин Гдицерол ** Глицерол-З-фосфат-Триозофосфаты
киназа У
НАД+ НАДН
Главное место деградации жирных кислот до ацетил-КоА —
печень. После того как жирные кислоты поступают в клетку, они
должны быть активированы путем образования коэнзим А-произ-
водных. Реакция активации может осуществляться двумя спосо-
бами.
В первом случае, характерном для животных тканей, ацил-
КоА — синтетаза катализирует образование КоА-производных жир-
ных кислот согласно реакции
Mg2+, К+
RCOOH + HSKoA + АТФ RCO—SKoA + АМФ + Н4Р2О7
Известно несколько таких ферментов. Они именуются в соответст-
вии с названием жирной кислоты, скорость превращения которой
данным ферментом максимальна. Например, ацетил-КоА — синте-
446
таза катализирует превращение С2 и Сз жирных кислот. Ацил-
КоА— синтетазы присутствуют в эндоплазматической сети и в на-
ружной митохондриальной мембране. В митохондриальном матрик-
се содержится ацил-КоА — синтетаза, активирующая жирные кис-
лоты с длинной цепью и использующая ГТФ вместо АТФ. Продук-
тами реакции в этом случае являются ацил-КоА, ГДФ и неоргани-
ческий фосфат.
В ряде растений была также обнаружена ацетил-КоА — синтета-
за, имеющая общие свойства с аналогичным ферментом из живот-
ных тканей. В то же время у некоторых микроорганизмов преоб-
ладает другой способ активации жирных кислот с короткой цепью:
КоА-трансфераза
Сукцинил-SKoA + RCOOH --------------------> Янтарная кисло-
та 4- RCO~SKoA. Здесь активация осуществляется с помощью
КоА-трансферазных реакций.
Существуют и некоторые другие пути образования ацил-произ-
водных КоА. Окисление этих производных происходит только в
митохондриях, однако проникать в митохондрии они самостоятель-
но не способны. Важную роль в транспорте КоА-производных жир-
ных кислот из цитоплазмы в матрикс митохондрий играет карни-
тин (витамин Вт, Ь-3-гидрокси-4-триметиламмонийбутират):
(СН3)3 = n+~ch2—сн—сн2—соо-
он
В этом процессе участвуют две ацилтрансферазы: карнитин-
ацетилтрансфераза (ацилирует карнитин жирными кислотами с
короткой цепью) и карнитин-пальмитоилтрансфераза (ацилирует
карнитин кислотами с длинной цепью). Оба фермента локализуют-
ся как в цитоплазме, так и на наружной и внутренней мембранах
митохондрий и осуществляют перенос остатков жирной кислоты от
ацил-КоА на карнитин. Ацилкарнитин легко проникает через мем-
брану и внутри митохондрии передает жирную кислоту на внутри-
митохондриальный КоА, при этом высвобождается карнитин. Ре-
акция катализируется внутримитохондриальной карнитин-ацил-
трансферазой. В результате достигается разделение цитоплазмати-
ческого и митохондриального пулов КоА.
HS КоА
В цитоплазме
В матриксе
HS КоА
Карнитин
Ацил-КоА
КоА-производные жирных кислот в матриксе подвергаются
окислению путем ряда последовательно повторяющихся реакций,
которые в каждом повторении приводят к укорачиванию цепи жир-
ной кислоты на два углеродных атома (3-окисление)1. Все проме-
1 По Международной номенклатуре положение замещающих групп в карбо-
новых кислотах отмечается не буквами греческого алфавита, как ранее, а циф-
рами. Однако старое название процесса окисления жирных кислот — p-окисле-
ние пока сохранилось.
447
жуточные продукты при р-окислении являются производнымиКоА.
Этот тип окисления жирных кислот — основной путь распада жир-
ных кислот как в животных, так и в растительных тканях.
Следующей реакцией на пути расщепления жирных кислот яв-
ляется дегидрирование, катализируемое различными ФАД-содер-
жащими ацил-КоА-дегидрогеназами с образованием транс-2,3-не-
насыщенных производных:
R—CH2—3CH22CH2CO~SKoA + ФАД------------------>
Ацил- Ко А-дег идрогеназа
Н
R—СН2—С=С—CO~SKoA + ФАДН2
I
н
Для нормальной работы ФАД-зависимых дегидрогеназ необходим
переход атомов водорода от их флавиновой части к электронпере-
носящему флавопротеину, который в свою очередь направляет
электроны в электронтранспортную цепь.
Далее происходит гидратация двойной связи по реакции
Н
| Еноил-КоА — гидратаза
R-CH2—С=С—CO~SKoA + Н2О х .. ................ >
Е
ОН
I
R—СН2—С—СН2—CO~SKoA
Н
L-3-Гидроксиацил-КоА
На следующем этапе цикла следует второе дегидрирование
КоА-эфира L-3-гидроксикислоты с образованием 3-кетопроизвод-
ных:
ОН
| L-3-Гидроксиацил-КоА-дегидроген аза
R—СН2—С—СН2—CO-SKoA + НАД+ ------
I
Н
R—СН2—СО—СН2—CO~SKoA + НАДН + Н+
3-Кётоацил-КоА
Фермент, катализирующий эту реакцию, абсолютно специфичен к
L-стереоизомеру КоА-эфиров 3-гидроксикислот, но не специфичен
в отношении числа атомов углерода в молекуле жирной кислоты.
И, наконец, в последней стадии каждого из повторяющихся
циклов окисления жирных кислот 3-кето-ацил-КоА вступает в ре-
акцию с другой молекулой КоА, в результате чего образуются мо-
лекулы ацетил-КоА и жирнокислотного производного КоА, укоро-
ченного на два углеродных атома:
448
3-Кето-тиолаза
R—CH2—СО—CH2CO~SKoA + HSKoA г— -“>
->R— CH2—CO-SKoA + H3C—CO-SKoA
Эта реакция носит название тиолиза и является сильно экзер-
гонической, поэтому равновесие в ней всегда смещено в правую
сторону. Некоторые из известных тиолаз проявляют специфичность
в отношении длины цепи.
Последовательное повторение этого ряда реакций приводит и
полному распаду жирных кислот с четным числом атомов углерода
до ацетил-КоА. Жирные кислоты с нечетным числом атомов угле-
рода распадаются до соответствующего числа молекул ацетил-
КоА и одной молекулы пропионил-КоА.
Окисление ненасыщенных жирных кислот происходит так же,
как и насыщенных, но после удаления нескольких единиц ацетил-
КоА образуется Д3’4-ацил-КоА, а не Д2>3-ацил-КоА и, чтобы окис-
ление прошло полностью, необходим еще один фермент — Д3*4-цпс-
&2>3-транс-еноил-КоА-изомераза, который катализирует перемеще-
ние двойной связи из положения 3—4 в положение 2—3 и измене-
ние конфигурации этой связи из цис- в транс-. В результате обра-
зуется нормальный субстрат, который может в дальнейшем окис-
ляться путем последовательного удаления ацетил-КоА. Так, на-
пример, окисляется олеиновая кислота.
Полиненасыщенные жирные кислоты требуют для своего пол-
ного окисления кроме Д3*4-цис-Д2’3-транс-еноил-КоА-изомеразы
еще один дополнительный фермент — 3-гидроксибутирил-КоА-эпи-
меразу, которая катализирует превращение D-стереоизомера 3-
гидроксиацил-КоА в L-стереоизомер, легко окисляемый Ь-специ-
фичной З-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназой. D-Форма 3-гидроксиа-
цил-КоА возникает при гидратации образующегося в ходе последо-
вательного отщепления ацетил-КоА от полиненасыщенной жирной
кислоты Д2>3-цис-ацил-КоА под действием фермента 3-гидрокси-
КоА-гидро-лиазы.
Таким образом, наличие изомеразы и эпимеразы обеспечивает
возможность полного окисления всех ненасыщенных жирных кис-
лот, содержащихся в природных липидах.
Баланс энергии. При окислении жирных кислот до конечных
продуктов выделяется большое количество энергии. Например,
пальмитиновая кислота: при окислительном расщеплении одной
молекулы пальмитоил-КоА до восьми молекул ацетил-КоА необ-
ходимо 7 следующих друг за другом циклов, в каждом из кото-
рых образуется одна молекула восстановленного ФАД, отдающего
в дыхательную цепь пару электронов на уровне KoQ или цитохро-
ма 6, в результате чего синтезируется две молекулы АТФ. Обра-
зующаяся в каждом цикле одна молекула НАДН + Н+ приводит к
синтезу еще трех молекул АТФ.
Суммарное уравнение имеет следующий вид:
Пальмитоил-КоА + 7КоА + 7ФАД + 7НАД+ + 7Н2О ->
8 Ацетил-КоА + 7ФАДН2 + 7НАДН 4- 7Н+
i/aI6—937 44 j
При сопряжении окисления с фосфорилированием это уравнение
будет выглядеть так:
Пальмитоил-КоА + 7КоА + 7О2 + 35ФН + 35АДФ ->
8 Ацетил-КоА + 35 АТФ + 42 Н2О
Однако образовавшиеся в результате окисления пальмитиновой
кислоты восемь молекул ацетил-КоА вступают в цикл трикарбоно-
вых кислот и баланс, включающий окисление ацетил-КоА и сопря-
женное с ним фосфорилирование, выражается следующим уравне-
нием:
8 Ацетил-КоА + 16 Оа + 96ФН + 96АДФ 8КоА +
+ 96АТФ + 104Н2О + 16СО2
В результате суммирования двух последних уравнений получается
уравнение
Пальмитоил-КоА + 23О2 + 131 Фн + 131 АДФ ->
~>КоА + 16СО2 + 146Н2О 4- 131 АТФ
Если учесть, что в самом начале на активацию пальмитиновой
кислоты тратится одна молекула АТФ (или ГТФ), то суммарный
выход на одну молекулу пальмитиновой кислоты составляет 130
молекул АТФ.
Если принять стандартное AG° для гидролиза АТФ равным при-
мерно 34,5 кДж, a AG° при полном окислении пальмитата до Н2О и
СОг равно 9797 кДж, то коэффициент полезного действия биологи-
ческого окисления пальмитата составит 34,5X 130 X 100 %/9797 =
=45%. Таким образом, эффективность накопления энергии как при
окислении пальмитиновой кислоты, так и глюкозы примерно оди-
накова, но при расчете на единицу массы при окислении пальмита-
та АТФ образуется в два раза больше (0,51 моль АТФ/г), чем при
окислении глюкозы (0,21 моль АТФ/г).
а- и (о-О кисление жирных кислот. Наряду с р-окисле-
нием высокомолекулярные жирные кислоты (от Cis до Cis) могут
подвергаться а-окислению. Этот тип окисления особенно характе-
рен для растительных тканей, но может происходить и у животных,
в частности в микросомах мозга и других нервных тканей, в состав
которых в большом количестве входят цереброзиды и ганглиозиды,
содержащие жирные 3-гидроксикислоты.
Суть а-окисления заключается в том, что происходит гидрокси-
лирование жирной кислоты во 2-м положении под действием мито-
хондриальной монооксигеназы (необходим О2, Mg2+, НАДФН и
кофактор). Гидроксикислота далее превращается в 2-кетокислоту,
которая подвергается окислительному декарбоксилированию уже в
эндоплазматической сети с образованием СО2 и жирной кислоты
с числом атомов углерода на один меньше, чем в исходной.
450
R—CH2—CH2—CH2—COOH -> R—СН2—СН2—СН(ОН)—соон ->
R—СН2—СН2—СО—СООН R—СН2—СН2—соон + СО2
Образующаяся кислота может затем включаться в аналогичную
реакцию, но полного окисления жирных кислот до СО2 и Н2О по
a-механизму не происходит из-за специфичности фермента, спо-
собного использовать в качестве субстрата только молекулы с дли-
ной цепи от 13 до 18 углеродных атомов. а-Окисление энергетически
не столь выгодно, как р-окисление.
Некоторые жирные кислоты менее длинноцепочечные или со
средней длиной цепи могут подвергаться окислению и по «-угле-
родному атому с образованием в качестве конечного продукта а,
со-дикарбоновых кислот. Этот путь называется ^-окислением. Об-
разующаяся дикарбоновая кислота может быть укорочена с любо-
го конца молекулы с помощью р-окисления, описанного выше.
У некоторых микроорганизмов образование а, со-дикарбоновых
кислот может происходить путем расщепления двойной связи.
Именно таким путем из олеиновой кислоты образуется азелаино-
вая кислота (Сэ), которая подвергается р-окислению, давая пиме-
линовую кислоту — предшественник биотина.
Метаболизм пропионовой кислоты. При окисле-
нии одной молекулы жирных кислот с нечетным числом атомов
углерода образуется кроме ацетил-КоА еще одна молекула пропио-
нил-КоА. Распад жирных кислот и аминокислот (валин, изолейцин)
с разветвленной цепью также ведет к образованию пропионовой
кислоты или пропионил-КоА.
Известно несколько путей метаболизации пропионата. Один из
них характерен для животных тканей и заключается в карбоксили-
ровании пропионил-КоА с образованием метилмалонил-КоА, кото-
рый с участием специфической мутазы превращается в сукцинил-
КоА. Дальнейшие превращения образующегося сукцинил-КоА свя-
заны с циклом трикарбоновых кислот.
Второй путь окисления пропионовой кислоты обнаружен как в
растениях, так и у животных и бактерий, он называется видоизме-
ненным ^-окислением. Его начальные стадии вплоть до образования
3-гидроксипропионил-КоА те же самые, что и при обычном (J-окис-
лении. В дальнейшем в результате реакций окисления и окисли-
тельного декарбоксилирования образуется ацетил-КоА.
Кетоновые тела. Обычно дегр адация жирных кислот
происходит без существенного накопления промежуточных продук-
тов и, в частности, ацетил-КоА. Однако некоторые условия (голо-
дание, сахарный диабет, резкие смены диеты и т. п.) приводят к
появлению в крови так называемых кетоновых тел. К ним относят-
ся ацетоуксусная кислота, 3-гидроксимасляная кислота и ацетон.
Образуются они в печени из ацетил-КоА и током крови доставляют-
ся к периферическим тканям, где окисляются в цикле трикарбоно-
вых кислот. Потеря организмом способности утилизировать эти ве-
щества (кетоз) приводит к их значительному накоплению в крови
454
(кетонемия) и в моче (кетонурия), что является диагностическим
признаком ряда заболеваний.
Ацетоуксусная кислота появляется в результате конденсации
двух молекул ацетил-КоА по принципу «голова к хвосту». Реакция
катализируется ферментом ацетил-КоА— ацетилтрансферазой.
Ацетил-S-KoA + Ацетил-S-KoA Анетоацетил-S-KoA + HS-KoA
Образующийся ацетоацетил-КоА может превращаться в свобод-
ную ацетоуксусную кислоту двумя путями. Он может взаимодейст-
вовать еще с одной молекулой ацетил-КоА при участии фермента
гидроксиметилглутарил-КоА — синтазы с образованием 3-гидрок-
си-З-метилглутарил-КоА, который под действием гидроксиметил-
глутарил-КоА — лиазы расщепляется на ацетоацетат и ацетил-
КоА. Кроме того, ацетоацетил-КоА способен превращаться в сво-
бодную ацетоуксусную кислоту, отщепляя HS-KoA путем деацили-
рования. Реакция катализируется ацетоацетил-КоА — гидролазой.
При восстановлении ацетоацетата образуется D-3-гидроксимас-
ляная кислота:
3-Г ид роксибутират-дегид роген аза
Н3С-СО-СН2—СООН + НАДН + н+ Ч-. . .........
Н3С-СН(ОН)СН2™-СООН + НАД+
D-3-Гидроксимасляная кислота
Ацетон образуется из ацетоацетата при декарбоксилировании,
катализируемом ацетоацетатдекарбоксилазой:
Н3С—С—СН2—-СООН -> Н3С—С—СН3 + СО2
II II
О о
Соотношение кетоновых тел в кровотоке колеблется: если в
печени много гликогена, то предпочтительно образуется 3-гидро-
ксимасляная кислота, когда его мало, преобладает ацетоацетат.
Метаболизация восков, их роль в пищевых
цепях. За небольшим исключением все животные, как позвоноч-
ные, так и беспозвоночные, не способны переваривать пчелиный
воск. Переваривание происходит с участием симбиотических бакте-
рий, например у гусеницы паразита пчелиных ульев — большой вос-
ковой огневки.
В целом, воска занимают очень важное место в пищевых цепях
морских животных. Первичными производителями их являются, ви-
димо, мелкие планктонные ракообразные, особенно веслоногие.
У некоторых из них воска составляют до 70% сухой массы тела,
хотя питаются они фитопланктоном, не содержащим воска. По-
скольку планктонные ракообразные являются главным связующим
звеном между микроскопическим фитопланктоном и крупными оби-
тателями моря, считают, что примерно половина всего органическо-
го вещества, образующегося на Земле в процессе фотосинтеза, на
какое-то время превращается в воска. Рыбы, питающиеся весло-
ногими (сельди, сардины), имеют в пищеварительном тракте липа-
452
зы для расщепления восков. Спирты последних окисляются до
жирных кислот, которые затем используются на биосинтез нейт-
ральных жиров.
8.8.3. Биосинтез липидов. У большинства организмов биосинтез
липидов — важное звено обмена веществ. В виде жирных кислот
и триацилглицеринов в организме животных запасается в больших
количествах энергетический материал, так как «запасающая ем-
кость» для углеводов в организме невелика. В семенах растений
также накапливается много триацилглицеринов, которые при про-
растании используются как энергетический, так и пластический
материал. Важным моментом в синтезе липидов является образо-
вание полярных липидов, входящих в состав мембран, поскольку
в большинстве клеток они постоянно обновляются.
Биосинтез жирных кислот. Синтез насыщенных и мо-
ноненасыщенных жирных кислот легко происходит в любом живом
организме. Основным местом их синтеза в отличие от окисления,
локализованного только в митохондриях, является цитоплазма.
В некотором количестве жирные кислоты синтезируются 'также с
участием ферментов, локализованных в мембранах эндоплазмати-
ческой сети путем удлинения КоА-производных полиненасшцен-
ных жирных кислот. Известен и еще один тип синтеза, при кото-
ром происходит удлинение молекул жирных кислот в митохонд-
риях. Особенно активно липогенез протекает в жировой ткани, мо-
лочной железе, печени. Сырьем для биосинтеза служит ацетил-
КоА, который образуется из избыточной глюкозы пищи, не ис-
пользованной на энергетические нужды, сохраняемых в резерве
полисахаридов и аминокислот, не требующихся для других функ-
ций. В качестве восстановителя в биосинтезе жирных кислот рас-
ходуется НАДФН, образующийся в пентозофосфатном цикле (см.
разд. 6.9.3). Другим источником НАДФН служит окисление ма-
лата до пирувата и СО2 малатдегидрогеназой. В листьях растений
поставщиком НАДФН, необходимого для синтеза жирных кис-
лот, является процесс фотовосстановления НАДФ+.
Основной путь биосинтеза жирных кислот, протекающий в ци-
топлазме, катализируется особой синтетазной системой, состоящей
из 7 ферментов. Конечный продукт этого пути — пальмитиновая
кислота, представляющая собой источник всех других насыщенных
и монопснасыщенных жирных кислот млекопитающих и всех жир-
ных кислот микроорганизмов.
Суммарная реакция биосинтеза жирных кислот в цитоплазме
имеет следующий вид:
Ацетил-КоА + 7 Малонил-КоА + 14 НАДФН + 14 Н+ ->
СН3(СН2)14СООН + 7 СО2 + 8 КоА + 14 НАДФ+ + 6Н2О
Пальмитат
Как видно из реакции, для синтеза требуется единственная
молекула ацетил-КоА, которая служит затравкой. Активную роль в
биосинтезе жирных кислот играет особый ацилпереносящий белок
15-937
453
(АПБ). У Е. coli он обладает небольшой молекулярной массой, от-
носится к сложным белкам, простетической группой у него явля-
ется 4-фосфопантотеновая кислота и тиоэтиламин с его сульфгид-
рильной группой. Пантотеновая часть молекулы АПБ действует как
«рука», переносящая растущую цепь жирной кислоты от одного
фермента к другому. Полагают, что у млекопитающих активность
АПБ присуща определенным участкам отдельных полипептидных
цепей, которые обладают также и другими активностями, требую-
щимися для биосинтеза жирных кислот.
Процесс начинается с переноса ацетильной группы ацетил-КоА
на 4-фосфопантотеин-АПБ (к его тиоловой группе). С карбоксиль-
ной группы этого первого ацетила начинается рост цепи жирной
кислоты путем последовательного добавления ацетильных остат-
ков. Другие семь ацетильных групп добавляются из малонил-КоА,
образующегося с помощью ацетил-КоА — карбоксилазы из ацетил-
КоА и бикарбоната:
Ацетил-КоА—карбоксилаза, биотин, Мп2+
Н3С—CO~SKoA + НСОГ + АТФ---------------------------------->
HOOC-CH2~CO-SKoA 4- АДФ + Фн
Малонил-КоА
Ацетил-КоА — карбоксилаза содержит в качестве простетиче-
ской группы витамин биотин. Реакция образования малонил-КоА
протекает в две стадии: сначала карбоксилируется биотиновая
часть карбоксилазы, а затем фермент транскарбоксилаза переносит
СО2 с биотина на ацетил-КоА, образуя малонил-КоА. У некоторых
микроорганизмов малонил-КоА может образовываться и другими
путями.
Реакция карбоксилирования ацетил-КоА является лимитирую-
щей для всего процесса синтеза жирных кислот и может ускоряться
аллостерическими положительными модуляторами: цитратом, изо-
цитратом и а-кетоглутаратом.
Цитоплазматический ацетил-КоА, необходимый для синтеза
малонил-КоА, ведет свое происхождение от внутримитохондриаль-
ного ацетил-КоА. Последний образуется в митохондриях при окис-
лительном декарбоксилировании пирувата и р-окислении жирных
кислот* Поскольку ацетил-КоА не способен проходить через мито-
хондриальную мембрану в цитоплазму, то его переносчиком слу-
жит цитрат, который легко транспортируется через мембрану ми-
тохондрий при помощи системы переноса. Цитрат образуется путем
переноса ацетил-КоА на оксалоацетат в митохондриях. После вы-
хода в цитоплазму он вновь расщепляется АТФ-зависимым фермен-
том на ацетил-КоА и оксалоацетат. Отсюда становится понятной
роль цитрата как положительного эффектора, стимулирующего об-
разование малонил-КоА. Ацильные группы могут переноситься и
карнитином, однако этот путь не является главным.
Далее аиетил-KoA и малонил-КоА вступают в реакцию с ацил-
переносящим белком (АПБ);
454
АПБ-ацетилтрансфераза
Н3С—СО~КоА + HS-АПБ
ч* Н3С—CO~S-AIIB + HS-KoA (1)
СООН соон
I АПБ-малонилтрансфераза I
СН2 + HS-АПБ — ............ -» СНа + HS-KoA
I I (2)
СО-S-КоА CO ~ S-АПБ
Присоединение ацильных остатков, как и в начале процесса,
происходит к SH-группе 4-фосфопантетеина ацилпереносящего
белка. Ацетил-Б-АПБ и малонил-Б-АПБ реагируют друг с другом с
образованием ацетоацетил-Б-АПБ, при этом из свободной СООН-
группы малонил-S-АПБ (углерод отмечен звездочкой) высвобож-
дается С О 2-*
Н3С—CO-S-АПБ + НООС*— СН2—СО~Б-АПБ
3- Кетоацил-АПБ -синтаза (3)
.... ...— ...—...-> Н3С—СО—СН2—CO-S-АПБ + HS-АПБ + *СОа
Ацетоацетил-S -АПБ
Таким образом, при биосинтезе жирных кислот происходит чере-
дование карбоксилирования и декарбоксилирования. СО2 в каж-
дом цикле реакций внедряется в ацетил с образованием малонила
и вновь выщепляется при присоединении малонила к синтезируе-
мой цепи жирной кислоты. Смысл этой реакции заключается в
том, что присоединение малонил-группировки с одновременным от-
щеплением СО2 идет с выделением энергии, поэтому протекает ак-
тивно, не требуя дополнительных условий. Присоединение ацетил-
группировок без предварительного их карбоксилирования потребо-
вало бы потребления энергии, сопряжения с реакцией, при которой
энергия выделяется. Следующие за 3-й реакцией восстановление,
дегидратация и второе восстановление приводят к образованию бу-
тирил-Б-АПБ, углеродная цепочка которого на два углеродных
атома длиннее исходной.
3-Кетоацил-АПБ-редуктаза
Ацетоацетил-Б-АПБ + НАДФН + Н+ "1 .......т.--1"
ОН
Н3С—СН—СН2—CO-S-АПБ + НАДФ+ (4)
О-З-Гидроксибутирил-Э-АПВ
3-Г идроксиацил-АПБ-дегидратаза
D-3-Г идрокс ибу тири л-S-АПБ -*
Н3С—СН=СН—CO-S-АПБ + Н2О (5)
Крогонил-8-АГ1Б
Е ноил -АПБ-редуктаза
Кротонил-Б-АПБ 4- НАДФН + Н+ , -*
Н8С—СН2—СНа—CO~S-AF1B + НАДФ" (6)
Бутирил -S -АПБ
15» 455
Затем реакции с 3-й по 6-ю повторяются и цепь удлиняется на
два углеродных атома в каждом обороте цикла. Таким образом,
для синтеза пальмитата требуется 7 циклов. Завершается синтез
пальмитата отщеплением HS-АПБ от ацил-АПБ в результате гид-
ролитического действия палъмитоил-АПБ — деацилазы. Пальмито-
ил-КоА ингибирует пальмитатсинтетазу, вызывая ее диссоциацию
на две субъединицы, не обладающие активностью. Напротив,
НАДФН активирует фермент, способствуя ассоциации субъединиц.
Образование пальмитата гарантируется и тем, что деацилаза (ко-
нечный фермент процесса) способна специфически отщеплять от
АПБ только пальмитат.
Ферментативные реакции синтеза пальмитиновой кислоты в из-
вестной мере представляют собой обращение процесса ее р-окисле-
ния (реакции 4,5,6). Эти два пути метаболизма отличаются лока-
лизацией, формой переносчика ацила, а также формой, в которой
добавляются или удаляются двухуглеродные единицы, специфич-
ностью пиридиннуклеотида, стереоконфигурацией 3-гидроксиациль-
ного промежуточного продукта, природой донора и акцептора элек-
тронов на кротонил-бутирильной стадии. Все это обеспечивает од-
новременное протекание в клетке противоположных процессов.
Человек и высшие животные содержат два основных источника
пополнения пула жирных кислот: биосинтез пальмитиновой кислоты
и поступление разнообразных жирных кислот с пищей. В печени
из смеси находящихся там жирных кислот образуется тот их на-
бор, который свойствен данному виду животного, хотя некоторое
влияние на окончательный состав оказывает и диета.
Пальмитиновая и стеариновая кислоты служат предшествен-
никами моноеновых (мононенасыщенных) жирных кислот (напри-
мер, олеиновой). Введение двойной связи может происходить
аэробным и анаэробным путями. У млекопитающих этот процесс
осуществляется в результате переноса отщепляемого водорода на
кислород с помощью ферментов десатураз (десатурация — полу-
чение ненасыщенного продукта), требующих для своего функцио-
нирования НАДН, Ог и участок микросомальной системы переноса
электронов.
Особый интерес представляет вопрос о биосинтезе полинена-
сыщенных жирных кислот. Полиеновые кислоты, у которых двой-
ная связь расположена между седьмым атомом углерода (отсчи-
тывая от метила) и карбоксилом, могут образовываться из олеино-
вой кислоты путем чередования реакций десатурации и удлинения
цепи. Животные и человек не способны к новообразованию тех
полиненасыщенных жирных кислот, у которых двойные связи (или
хотя бы одна из них) расположены между конечным метилом и
седьмым углеродом. Эти полиненасыщенные жирные кислоты яв-
ляются незаменимыми в пищевом рационе.
Разветвленные жирные кислоты синтезируются из продуктов
деградации аминокислот с разветвленной цепью (валин, изолей-
цин и лейцин) через ацильные производные с КоА путем удлине-
ния цепи и при участии АПБ.
456
Синтез триацилглицеринов. Свободные жирные кис-
лоты не встречаются в значительных количествах в животных ор-
ганизмах. Они присутствуют обычно в виде сложных эфиров гли-
церина. Синтез триацилглицеринов происходит главным образом
в печени и жировой ткани из КоА-производных жирных кислот че-
рез фосфатидную кислоту по реакции
О
II
2R—CO~SKoA + СН2ОН О СН2—О—С—R
I 11 I
НОСН R-С—О—СН + 2HSKOA
СН2ОРО3Н2 СН2ОРО3Н2
L-Глицерол-З-фосфат L-Фосфатидная кислота
Фосфорилирование глицерина осуществляется глицеролкиназой
за счет АТФ. Глицерол-З-фосфат может образовываться и при вос-
становлении диоксиацетонфосфата.
Гидролиз фосфатидной кислоты фосфатазой приводит к обра-
зованию 1,2-диацилглицерина, который, реагируя с другой молеку-
лой ацил-КоА, образует нейтральный триацилглицерин.
В слизистой оболочке кишечника триацилглицерины синтези-
руются из свободных жирных кислот, моно- и диацилглицеринов.
Эта реакция свойственна только слизистой оболочке кишечника.
Перенос остатка жирной кислоты происходит через ацильное про-
изводное КоА.
Образование глицерофосфолипидов. Предшест-
венником для синтеза важнейших глицерофосфолипидов, как и
триацилглицеринов, является фосфатидная кислота.
Фосфатидная кислота
+ЦТФ
Ц Д Ф -диацилглицерин
Фосфатидилглицерол-1-
фосфат
р
Фосфатидилглицерин
Фосфатид и лсерин Фосфатидилинозит
—С Оу
Фосфатидил этаноламин
+ЗСНЛ—
Фосфатидилхолин
+Фосфатидил-
глицерин
Глицерин
Кардиолипин
Биосинтез терпенов и стеринов. Хотя терпены име-
ют изопреновую природу, т. е. структурным звеном их молекулы
является изопрен, как таковой он не участвует в биосинтезе терпе-
нов. Исходным веществом для их синтеза служит мевалоновая кис-
457
лота (3,5-дигидрокси-3-метилвалериановая):
НОН2С—СН2—С(ОН)—СН2—СООН
СН3
Ацетоацетил-КоА, присоединяя еще одну молекулу ацетил-КоА
и восстанавливаясь, превращается в мевалоновую кислоту. Далее
в результате отщепления ССЪ и активации путем образования пи-
рофосфорного эфира при взаимодействии с АТФ мевалоновая кис-
лота образует активные пятиуглеродные изопреноподобные звенья,
конденсация которых через пирофосфорилазную реакцию приво-
дит к наращиванию углеродной цепи, образованию различных тер-
пенов. Конденсация шести таких пятиуглеродных звеньев дает
сквален — углеводород с открытой цепью, состоящий из шести изо-
преновых остатков. Молекула сквалена в результате нескольких
электронных сдвигов циклизуется, образуя ланостерин, а затем
холестерин, который в свою очередь является предшественником
многих стероидов.
Желчные кислоты
(в печени)
Холестерин
Стероиды растений
Г ормоны коры
надпочечников
Половые
гормоны
Витамины
группы D
Превращение холестерина
Копростанол,
холестанол,
(стерины кала)
ГЛАВА 9
БИОМЕМБРАНЫ
9Д. Строение мембран
Мембраны — неотъемлемый компонент всех клеток. Они ок-
ружают клетку, отделяют один клеточный компартмент от друго-
го, образуют структуры разнообразных клеточных органелл. Сеть
внутриклеточных мембранных систем особенно хорошо развита у
высокодифференцированных клеток. Мембраны представляют собой
сложные структуры толщиной 6—10 нм, состоящие в основном из
белков и липидов. Кроме того, в них присутствуют углеводы, неор-
ганические соли, вода и ряд других соединений; в некоторых мемб-
ранах, в частности, обнаружены следы РНК (до 0,1%).
В настоящее время общепринятой моделью строения мембран
является жидкостно-мозаичная, предложенная в 1972 г. С. Синд-
жером и Дж. Николсоном. Согласно данной модели мембрана —
это подвижная мозаика, образованная вязкой липидной фазой и
погруженными в нее белками (рис. 9.1). Часть белков глубоко рас-
Рис. 9.1. Мозаичная модель структуры мембраны:
I — интегральный белок, 2 — периферический белок, 3 — липидный бислой
459
положена в липидном слое или даже пронизывает его насквозь —
интегральные мембранные белки, другие лишь частично соприка-
саются с липидами, они рыхло соединены с мембраной — перифери-
ческие белки.
Среди мембранных белков лишь очень небольшая часть (в ос-
новном периферические белки) водорастворима и легко извлека-
ется из мембран. Интегральные белки отделяются от липидов
только при применении детергентов, органических растворителей.
На долю белков может приходиться от 20 до 80% от общей массы
белков и липидов. Их содержание зависит от происхождения,
строения и функции конкретных мембран. Главную часть липидной
фракции мембран составляют фосфолипиды (до 80—90% от обще-
го количества липидов). Помимо них в мембранах часто встреча-
ются и такие нейтральные липиды, как гликолипиды и холестерин.
В некоторых случаях до 16% липидов могут составлять моно-, ди-
и триацилглицерины.
В липидах мембран многих прокариот обнаружены специфиче-
ские для них жирные кислоты: с разветвленной цепью и циклопро-
пановой. Липидный состав мембран, особенно степень насыщеннос-
ти жирнокислотных остатков, изменяется в процессе адаптации ор-
ганизмов к новым температурным условиям среды. В этом заклю-
чается одна из функций липидов. Липидный слой (матрикс) мемб-
ран двойной, углеводородные длинные цепи (хвосты) жирных кис-
лот обращены друг к другу и образуют гидрофобную толщу мемб-
раны, а полярные группы (фосфатные и спиртовые — холин, эта-
ноламин и т. д.) направлены кнаружи. Интегральные мембранные
белки тоже содержат гидрофобные и гидрофильные части молекул,
первые вступают во взаимодействие с гидрофобными частями ли-
пидных молекул, вторые — располагаются в поверхностном слое
мембран, контактируют с полярными «головками» липидов.
Новейшие данные, полученные методом рентгеноструктурного
анализа, показали, что цепи мембранных белков сворачиваются,
по-видимому, так, что а-спиральные и 0-структурные участки ока-
зываются погруженными в гидрофобную область мембраны; нахо-
дящиеся вне мембраны части молекулы образованы преимущест-
венно неупорядоченными структурами.
У мембран различают наружную и внутреннюю стороны, кото-
рые в большинстве случаев имеют неодинаковый состав, т. е. мемб-
раны асимметричны. Липиды и белки, расположенные на наружной
стороне плазматической мембраны, обычно имеют ковалентно свя-
занные с ними углеводы. Внутренняя сторона мембраны и внутри-
клеточные мембраны, как правило, лишены углеводов. Углеводная
часть представлена полисахаридами, включающими обычно не бо-
лее 15 моносахаридных остатков, которые часто образуют разветв-
ленные структуры. В плазмалемме эукариотических клеток часто
обнаруживаются галактоза, манноза, фукоза, N-ацетилглюкозамин,
N-ацетилгалактозамин, арабиноза, ксилоза, нейраминовая кисло-
та. Гликолипиды представлены гликозилдиацилглицеринами (пре-
имущественно в бактериальных мембранах) и гликосфинголипида-
460
ми: цереброзиды, ганглиозиды и др. (в основном у эукариотиче-
ских клеток).
Мембрана представляет собой динамичную структуру. Наибо-
лее подвижным компонентом в ней являются липиды. Они довольно
свободно двигаются в плоскости липидного слоя (латеральное пе-
ремещение), меняя своих «соседей» в среднем 106 раз/с. Молекулы
белков также могут перемещаться латерально в плоскости мембра-
ны. Возможно также, что белковые молекулы вращаются вокруг
перпендикулярных и параллельных плоскости бислоя осей, что
может иметь большое значение при функционировании макромоле-
кул и мембран в целом.
Однако белки распределены в мембране не статистически, обра-
зуя участки с различными функциями. Иначе говоря, белковые мо-
лекулы не абсолютно свободно перемещаются в плоскости мембра-
ны, поскольку могут существовать взаимодействия между отдель-
ными белковыми молекулами и, кроме того, между белками мемб-
ран и цитоскелетом клетки: структурными белками, микрофиламен-
тами, микротрубочками, примыкающими к мембране изнутри.
В свою очередь расположение белковых молекул в мембране ока-
зывает влияние на распределение и ориентацию липидных молекул
в зависимости от сродства конкретных белков и липидов.
Подвижность мембранных молекул в значительной мере зави-
сит от состава жирных кислот. Более упорядоченной и стабильной
является структура мембран, содержащая большое число насыщен-
ных жирных кислот в фосфолипидах, менее упорядоченной — со-
держащая значительные количества ненасыщенных жирных кис-
лот. При оптимальных для жизнедеятельности живых организмов
температурах мембрана, как правило, имеет жидкокристалличе-
ское состояние (промежуточное между жидким и твердым). Это
состояние обусловлено прежде всего наличием в мембранах систе-
мы липид — белок—вода, формирующей различного типа упоря-
доченные структуры, обладающие в то же время определенной по-
движностью. Такое состояние мембран оказывает существенное
влияние на их функционирование и объясняет большую чувстви-
тельность к различным внешним факторам.
Соседние клетки одной ткани должны сообщаться друг с дру-
гом для того, чтобы координировать свою жизнедеятельность и
функционировать как целое в соответствии со спецификой ткани.
Такое сообщение достигается с помощью специальных коротких
«трубочек», которые собраны в дискообразные структуры в местах
так называемых щелевых контактов. Каждая трубочка состоит из
двух цилиндрических белковых молекул — коннексонов. Молекула
коннексона частично погружена в клеточную мембрану, а ее высту-
пающая часть способна связываться в межклеточном пространстве
с коннексоном соседней клетки, так что образуется непрерывный ка-
нал, соединяющий внутреннее пространство двух клеток.
Мембраны различных клеток и внутриклеточных органелл об-
ладают определенной специфичностью, обусловленной их строени-
ем, химическим составом и функциями. Выделяют следующие ос-
461
новные группы мембран у эукариотических организмов: плазмати-
ческая мембрана (наружная клеточная мембрана, плазмалемма),
ядерная мембрана, эндоплазматический ретикулум, мембраны аппа-
рата Гольджи, митохондрий, хлоропластов, миелиновых оболочек,
возбудимые мембраны. У прокариотических организмов помимо
плазматической мембраны существуют внутрицитоплазматические
Рис. 9.2. Расположение молекулы гли
кофорина в эритроцитарной мембране
мембранные образования, у ге-
теротрофных прокариот они
называются мезосомами. Пос-
ледние образуются инвагина-
цией (впячиванием) внутрь на-
ружной клеточной мембраны и
в некоторых случаях сохраня-
ют с ней связь.
Хороший объект для изу-
чения строения и свойств плаз-
малеммы представляют собой
мембраны эритроцитов, их
сравнительно легко получить в
чистом виде, поскольку эрит-
роциты не содержат внутри-
клеточных мембран. Эритроци-
тарная мембрана состоит из
белков (50%), липидов (40%)
и углеводов (10%). Основная
часть углеводов (93%) связа-
на с белками, остальная — с
липидами. Мембрана асиммет-
рична, так как углеводные компоненты расположены исключитель-
но на наружной стороне. Асимметрична мембрана и в отношении
ферментативной активности, липидного состава. Во внутреннем
слое эритроцитарной мембраны находятся в основном сфинго-
миелин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, в наружной —
фосфатидилхолин.
Хорошо исследованным интегральным белком эритроцитарных
мембран является гликофорин-амфипатический белок. Его N- и
С-концы гидрофильны и располагаются соответственно на наруж-
ной и внутренней стороне мембраны. Средняя часть гидрофобна,
она пронизывает мембрану (рис. 9.2). К N-концевой части присо-
единено 20—30 молекул полисахаридов, состоящих преимуществен-
но из N-ацетилгалактозамина, галактозы и сиаловой кислоты, рас-
положенной на конце полисахарида. Углеводные компоненты гли-
кофорина выполняют рецепторную функцию для вирусов гриппа,
фитогемагглютининов, ряда гормонов.
В эритроцитарной мембране обнаружен и другой интегральный
белок, содержащий мало углеводов и пронизывающий мембрану.
Его называют туннельным белком (компонент а), так как предпо-
лагают, что он образует канал для анионов. Периферическим бел-
ком, связанным с внутренней стороной эритроцитарной мембраны,
462
является спектрин — белок, выполняющий структурную роль. Он
прочно ассоциирован с актиноподобными белками эритроцитарной
мембраны, образуя сходную с актомиозином АТФ-зависимую сис-
тему.
Миелиновые мембраны, окружающие аксоны нейронов, много-
слойны, в них присутствует большое количество липидов (около
80%, половина из них —фосфолипиды). Белки этих мембран важ-
ны для фиксации лежащих друг над другом мембранных слоев.
Хлоропласты покрыты двухслойной мембраной. Наружная име-
ет некоторое сходство с таковой у митохондрий (см. разд. 7.2). По-
мимо этой поверхностной мембраны в хлоропластах имеется внут-
ренняя мембранная система — ламеллы. Ламеллы образуют или
уплощенные пузырьки — тилакоиды, которые, располагаясь друг
над другом, собираются в пачки (граны) или формируют мембран-
ную систему стромы (ламеллы стромы). Ламеллы гран и стромы
образованы глобулярными липопротеиновыми субъединицами. На
наружной стороне мембраны тилакоидов сосредоточены гидро-
фильные группировки белков, галакто- и сульфолипидов. Фитоль-
ная часть молекулы хлорофилла погружена в глобулу и находится
в контакте с гидрофобными группами белков и липидов. Порфири-
новые ядра хлорофилла в основном локализованы между соприка-
сающимися мембранами тилакоидов гран.
Внутренняя (цитоплазматическая) мембрана бактерий по
структуре сходна с внутренними мембранами хлоропластов и мито-
хондрий. В ней локализованы ферменты дыхательной цепи, окисли-
тельного фосфорилирования, активного транспорта; ферменты, уча-
ствующие в образовании компонентов мембраны, например глико-
зилтрансферазы, катализирующие синтез липополисахаридов на-
ружной мембраны. Преобладающим компонентом бактериальных
мембран являются белки: соотношение белок/липид (по массе) рав-
но 3 : 1. Состав белков мембраны регулируется в зависимости от по-
требностей клетки и внешней среды. Наружная мембрана грамот-
рицательных бактерий по сравнению с цитоплазматической содер-
жит меньшее количество различных фосфолипидов и белков. Обе
мембраны различаются по липидному составу. Во внешней мембра-
не находятся белки, образующие поры для проникновения многих
низкомолекулярных веществ. Характерным компонентом наруж-
ной мембраны является также специфический липополисахарид.
Ряд белков наружной мембраны служит рецепторами для фагов.
Среди вирусов мембранные структуры характерны для содер-
жащих нуклеокапсид, который состоит из белка и нуклеиновой
кислоты. Это «ядро» вирусов окружено мембраной (оболочка).
Она также состоит из двойного слоя липидов с включенными в не-
го гликопротеинами, расположенными в основном на поверхности
мембраны. У ряда вирусов (того-, микровирусы) в мембраны вхо-
дит 70—80% всех белков, остальные белки содержатся в нуклео-
капсиде.
Белки вирусных мембран — это специфические белки, напри-
мер гемагглютинин, нейраминидаза. Значительную часть массы
463
вирусной мембраны составляют углеводы. Специфичность^ олиго-
сахаридов на поверхности вируса определяется в некоторой степе-
ни клеткой-хозяином, так как в присоединении углеводов к белкам
оболочки участвуют трансферазы сахаров клеток-хозяев. Липиды
вирусных мембран также происходят от мембран инфицированных
клеток.
Мембраны митохондрий охарактеризованы в разд. 7.2.
9.2. Функции мембран
Мембраны выполняют большое число различных функций. Они
ограничивают клетку от наружной среды и тем самым служат
клетке защитой, обусловливают постоянство внутриклеточной сре-
ды. Через мембрану осуществляется контакт клетки с внешней сре-
дой, она передает в клетку информацию извне. Мембраны прямо
или косвенно участвуют в биохимических процессах, поскольку
большинство ферментов связано с ними.
Мембраны играют большую роль во взаимодействиях клеток
друг с другом, имеют прямое отношение к процессам их роста и
деления, определяют антигенные свойства. Строение и характер
распределения антигенов на поверхности всегда специфичны для
данной клетки, органа, стадии развития. На мембране расположены
клеточные рецепторы, распознающие и связывающие специфиче-
ские лиганды, проводящие внутрь клетки сигнал. К рецепторным
молекулам относятся антитела, рецепторы гормонов, нейромедиато-
ров, опиатов, токсинов, лектинов, вирусов. Большинство рецепто-
ров представляет собой гликопротеины или ганглиозиды (рецепто-
ры холерного, столбнячного, дифтерийного токсинов и токсина бо-
тулизма). Специфичность рецепторов по отношению к лигандам
обеспечивается углеводной частью молекул. Связывание лиганда
рецептором приводит в одних случаях к изменению активности аде-
нилатциклазы и количества цАМФ, в других — к усиленному по-
ступлению в клетку ионов (рецептор действует как ионофор), что
приводит к генерации электрических сигналов.
Способность клеток проводить сигналы наиболее ярко выражена
в нервных волокнах; обнаруживается она и у других клеток. Про-
ведение электрических сигналов по возбудимой мембране возмож-
но благодаря тому, что в клетках поддерживается разность кон-
центрации ионов по обе стороны мембраны. В состоянии покоя ионы
Na «выкачиваются» из клетки против градиента концентрации с
помощью К+, Ыа+-АТФазы, функционирующей как своеобразный
насос, для работы которого необходима энергия АТФ. Ионы К при
этом поступают внутрь клетки. Обмен К+ и Na+ происходит в не-
эквивалентных количествах (К+ поступает внутрь клетки меньше),
и это приводит к тому, что внутренняя сторона клеточной мембра-
ны заряжена электроотрицательно по отношению к наружной по-
верхности. Разность потенциалов между внешней и внутренней
сторонами мембраны называется потенциалом покоя. При возбуж-
дении избирательно увеличивается проницаемость клеток для
464
ионов Na, в результате чего они поступают внутрь клетки и кле-
точная мембрана при этом деполяризуется. Деполяризация сопро-
вождается распространением по поверхности мембраны затухаю-
щего электрического сигнала.
Такая локальная деполяризация мембраны происходит в ко-
ротких отростках нервных клеток — дендритах — и в мембранах
ряда других клеток. В длинных отростках нервных клеток — аксо-
нах— проведение импульса обусловлено развитием потенциала
действия, связанного с перезарядкой мембраны (внутренняя по-
верхность приобретает положительный заряд по отношению к на-
ружной). Длительность потенциала действия 1 мс, после чего про-
исходит его падение вследствие нарастания компенсирующего по-
тока ионов К наружу из клетки. После проведения импульса в
клетке восстанавливается состояние покоя. Химическая природа
процессов, изменяющих проницаемость мембран для ионов, пока
неясна. При передаче возбуждения определенную роль могут иг-
рать и другие ионы, например Са2+.
Важнейшей функцией мембран является регуляция транспорта
веществ в клетку и из нее. Небольшие нейтральные молекулы мо-
гут проникать через мембраны за счет диффузии. Скорость диффу-
зии вещества определяется его растворимостью в мембране, коэф-
фициентом диффузии и разностью концентрации вещества снаружи
и внутри клетки. При наличии разности (градиент) концентраций
вещества в двух точках случайное движение молекул переходит в
направленный перенос данного вещества из области повышенной
в область пониженной его концентрации.
Таким образом, поток веществ по градиенту концентрации —
пассивный транспорт — осуществляется путем диффузии и не тре-
бует для своего осуществления затрат энергии. Для веществ, рас-
творимых в липидах (основные компоненты биомембран), этот
процесс хорошо описывается обычными законами диффузии. Менее
исследован пассивный транспорт водорастворимых веществ. Пред-
полагают, что гидрофобные углеводородные цепи липидов постоян-
но извиваются в мембране, образуя в ней временные пустоты, че-
рез которые проникают вода и растворенные в ней незаряженные
молекулы. Однако теория временных дырок не может объяснить
проницаемости мембран для крупных гидрофильных молекул.
В этом случае очень плодотворны представления о наличии в плаз-
матических мембранах достаточно большого количества постоян-
ных пор. Из клеточной мембраны грамотрицательных бактерий
выделены особые белки, делающие мембраны проницаемыми для
сахаров и других водорастворимых метаболитов. Такие белки,
имеющие пока различные названия (порины, матричные белки,
колицины), пронизывают мембрану и образуют поры, каналы, про-
пускающие молекулы с массой до 600—900, но задерживающие
макромолекулы.
Если растворенное вещество заряжено, то в этом случае при пе-
реносе следует учитывать два градиента — градиент концентрации
и градиент электрического заряда. Их сумму называют электрохи-
465
мическим потенциалом. Пассивное движение ионов происходит по
градиенту электрохимического потенциала.
Когда диффузионный процесс сочетается с химической реакцией,
может существенно изменяться скорость переноса, которая при
этом обычно увеличивается. Это так называемая облеченная диф-
фузия. При ней перенос веществ совпадает с направлением свобод-
ной диффузии, т. е. осуществляется по градиенту концентрации, и
следовательно, как и при свободной диффузии для своего осуществ-
ления не требует затрат энергии.
При облегченной диффузии функционируют специальные веще-
ства— переносчики молекул и ионов. Соединяясь с транспорти-
руемыми молекулами, которые сами в мембране не растворяются,
они как бы «протаскивают» их через мембрану.
Облегченная диффузия обычно характерна для водораствори-
мых веществ. Большинство (если не все) мембранных переносчи-
ков являются белками. Конкретный механизм функционирования
переносчиков при облегченной диффузии исследован недостаточно.
Они могут, например, обеспечивать перенос путем вращательного
движения в мембране. В последнее время появились сведения, что
белки-переносчики при контакте с транспортируемым веществом
изменяют свою конформацию, в результате в мембране открывают-
ся своеобразные «ворота», или каналы. Эти изменения происходят
за счет энергии, высвобождающейся при связывании транспорти-
руемого вещества с белком. Возможен также перенос эстафетного
типа. В этом случае сам переносчик остается неподвижным, а ионы
мигрируют вдоль него от одной гидрофильной связи к другой.
Моделью переносчика такого типа может служить антибиотик
грамицидин. В липидном слое мембраны его длинная линейная
молекула принимает форму спирали и образует гидрофильный ка-
нал, по которому может мигрировать по градиенту ион К.
Получены экспериментальные доказательства существования
природных ионных каналов в биологических мембранах. Транс-
портные белки отличаются высокой специфичностью по отношению
к переносимому через мембраны веществу, по многим свойствам
напоминая ферменты. Они обнаруживают большую чувствитель-
ность к pH, конкурентно ингибируются соединениями, близкими по
структуре к переносимому веществу, и неконкурентно — агентами,
изменяющими специфически функциональные группы белков.
Облегченная диффузия отличается от обычной не только боль-
шей скоростью, но и способностью к насыщению. Увеличение ско-
рости переноса веществ происходит пропорционально росту гради-
ента концентрации только до определенных пределов. Последний
определяется «мощностью» переносчика.
Иногда транспорт какого-либо вещества с участием переносчика
сопровождается параллельной транслокацией другого соединения в
том же самом направлении. Это явление получило название сим-
порта. Если транспорт какого-либо вещества сопряжен с перено-
сом другого вещества в противоположном направлении, такое яв-
ление обозначают термином антипорт.
466
Биомембраны обладают не только пассивной проницаемостью
(транспорт по градиенту), но, действуя подобно насосу, могут пе-
рекачивать вещество в сторону большей его концентрации, т. е.
из более разбавленного раствора в менее разбавленный. Транспорт
веществ против градиента концентрации (незаряженные частицы)
или электрохимического градиента (для заряженных частиц), тре-
бующий затрат энергии, называется активным транспортом. Бес-
кислородная среда, ингибиторы дыхания, наркотики и другие воз-
действия, вызывающие нарушение снабжения клеток энергией,
приводят к приостановке активного транспорта.
В зависимости от способа использования энергии для транспор-
та (прямой или косвенный) различают первичный активный транс-
порт и вторичный. При первичном активном транспорте перенос
растворенного вещества через мембрану осуществляется непосред-
ственно в ходе реакции энергетического преобразования в АТФаз-
ных системах или окислительно-восстановительных цепях.
Движущей силой при вторичном активном транспорте служит
градиент ионов (Н+, К+, Na+ и др.), созданный на мембране за
счет функционирования систем первичного активного транспорта.
Этот градиент используется для переноса других веществ с помо-
щью белков-переносчиков. Например, транспорт сахарозы может
осуществляться за счет работы Н+-АТФазы (т. е. создаваемого
ею протонного градиента — ДцН+). Накопление ионов водорода
приводит к формированию на наружной стороне мембраны комп-
лекса: белок — сахароза — протон. Комплекс движется по гради-
енту ДцН+ внутрь клетки. Предполагают, что так же осуществля-
ется транспорт в клетку аминокислот, анионов.
Типичным примером первичного активного транспорта является
транспорт ионов К и Na против их электрохимического градиен-
та, осуществляемый Na+, К^-АТФазой, перенос Н+ с помощью про-
тонных насосов.
Общепринятое представление о работе Na+, К+-АТФазы, (Na\
К+-ионный насос) сводится к следующему. Ионы Na и АТФ при-
соединяются к молекуле АТФазы в присутствии Mg2+. Связывание
ионов Na запускает реакцию гидролиза АТФ, в результате которой
образуются АДФ и фосфорилированная форма фермента. Фосфо-
рилирование индуцирует переход ферментативного белка в новое
конформационное состояние и участок или участки, несущие Na+,
оказываются обращенными к внешней среде. Здесь Na+ обменива-
ется на К+, так как для фосфорилированной формы фермента ха-
рактерно высокое сродство к ионам К. Обратный переход фермен-
та в исходную конформацию инициируется гидролитическим отщеп-
лением фосфорильной группы в виде неорганического фосфата и
сопровождается освобождением К+ во внутреннее пространство
клетки. Дефосфорилированный активный центр фермента спосо-
бен присоединить новую молекулу АТФ, и цикл повторяется
(рис. 9.3).
Количества поступивших в клетку в результате работы насоса
ионов К и Na не равны между собой. На три выведенных иона Na
467
Рис. 9.3. Гипотетическая модель
Na+,K+-Hacoca (по Д. Мецлеру, 1980).
Открывание и закрывание канала на противо-
положных сторонах мембраны и чередующе-
еся изменение эффективности связывания Na+
и К.+ обеспечиваются энергией гидролиза
АТФ. / — конформация, при которой связы-
вается Na+; выступающие группы образуют
в центральной полости связывающие участки
размером 0,1 нм. // — связано три иона Na.
HI—группа Г фосфорилирована; возможно,
за счет отрицательного заряда ионы Na свя-
зываются более прочно. IV — происходит кон-
формационный переход; фосфорильная группа
переходит на другой акцептор — X. V — кон-
формация, при которой связывается К+; об-
разуются К+‘СВязывающие участки размером
0,13 нм; ионы Na диффундируют наружу.
VI — связаны два иона К. VII — за счет гид-
ролиза связи между X и фосфорилом проис-
ходит переход в исходную конформацию.
V/// —ионы К диффундируют внутрь клетки
приходится два введенных иона К при одновременном гидролизе
одной молекулы АТФ. Открывание и закрывание канала на про-
тивоположных сторонах мембраны и чередующееся изменение эф-
фективности связывания Na+ и К+ обеспечиваются энергией гид-
ролиза АТФ. Транспортируемые ионы — Na+ и К+ — кофакторы
данной ферментативной реакции. Теоретически можно представить
самые различные насосы, действующие по этому принципу, хотя в
настоящее время известны лишь немногие из них.
Ионы Са, подобно ионам Na, активно выводятся из клеток
Са2+-АТФазой. Особенно большое количество белка кальциево-
го насоса содержат мембраны эндоплазматического ретикулума.
Цепь химических реакций, ведущих к гидролизу АТФ и перебросу
Са2+, может быть записана в виде следующих уравнений:
Mg2+
2Сан + АТФ + Е, Са2—Е~Р + АДФ (1)
Mg2+
Са2-£~Р 2Савн + РО^ + Е2 (2)
£2 =*=* (3)
где Сан — Са2+, находящийся снаружи; СаВн — Са2+, находящийся
внутри; £] и Е2 — различные конформации фермента переносчика
Са2+); переход которых из одной в другую связан с использовани-
ем энергии АТФ.
468
Система активного вывода Н+ из цитоплазмы поддерживается
двумя типами реакций: деятельностью электрон-транспортной цепи
(редокс-цепи) и гидролизом АТФ. Оба — и редокс- и гидролитичес-
кий Н+-насосы — находятся в мембранах, способных превращать
световую или химическую энергию в энергию ДцН+ (т. е. плазмати-
ческих мембранах прокариот, сопрягающих мембранах хлороплас-
тов и митохондрий; см. разд. 7.4.3). В результате работы Н+
АТФазы и (или) редокс-цепи транслоцируются протоны, и на мем-
бране возникает протондвижущая сила (Дц,Н+). Электрохимический
градиент ионов водорода, как показывают исследования, может
быть использован для сопряженного транспорта (вторичный ак-
тивный транспорт) большого числа метаболитов — анионов, саха-
ров, аминокислот и т. д.
С активностью плазматической мембраны связаны процессы,
обеспечивающие, поглощение клеткой твердых и жидких веществ
с большой молекулярной массой, — фагоцитоз и пиноцитоз (от грец.
фагос — есть, пинос — пить, цитос— клетка). Клеточная мембрана
образует карманы, или впячивания, которые втягивают вещества
извне. Затем такие впячивания отшнуровываются и окружают
мембраной капельку внешней среды (пиноцитоз) или твердые час-
тицы (фагоцитоз). Пиноцитоз наблюдается в самых разнообраз-
ных клетках, особенно в тех органах, где происходят процессы вса-
сывания.
ГЛАВА 10
ВИТАМИНЫ
10.1. Общая характеристика
Витамины — низкомолекулярные органические соединения»
которые, присутствуя в пище в небольших количествах, являются
незаменимыми ее компонентами, обеспечивают нормальное проте-
кание биохимических и физиологических процессов путем участия
в регуляции метаболизма. Витамины не включаются в структуру
тканей человека и животных и не используются в качестве источ-
ника энергии.
Первые исследования, указавшие на необходимость присутствия
в пище, кроме главных компонентов — углеводов, белков, жиров,
минеральных веществ и воды, еще и каких-то других добавочных
веществ, необходимых для жизни, были проведены Н. И. Луни-
ным (1880). Значительно позднее эти вещества предложили назы-
вать витаминами (от лат. vita — жизнь), т. е. аминами жизни. Од-
нако, с точки зрения химии, название «витамины» в наше время
потеряло смысл, поскольку установлено, что они не все содержат
'аминогруппу или азот.
В организме человека некоторые витамины не синтезируются
вообще, другие — синтезируются кишечной микрофлорой и тканя-
ми в недостаточных количествах, поэтому витамины должны пос-
тупать с пищей. Некоторые микроорганизмы и низшие растения
также нуждаются в определенных витаминах, служащих для них
важнейшими факторами роста. Витамины и их производные — ак-
тивные участники биохимических и физиологических процессов
высших растений. Существует предположение, что отсутствие у че-
ловека и животных способности синтезировать витамины возникло
в процессе эволюции как результат своеобразной «специализации
и кооперирования» в биоценозах. Потеря этой способности была
заменена пищевыми связями с участием растений и бактерий. Сов-
ременные животные и человек унаследовали эту особенность обме-
на веществ своих далеких предков.
Многие витамины представляют собой исходный материал для
биосинтеза коферментов и простетических групп ферментов. В этом
состоит одна из основных причин необходимости витаминов для
нормального протекания обменных процессов. Структура каждого
коферментного витамина уникальна и, как правило, характеризу-
ется наличием сопряженных связей, четко выраженных электро-
ноакцепторных или электронодонорных свойств. Эти свойства обыч-
но усиливаются» когда витамин становится коферментом, соединя-
470
ется с металлом и апоферментом, входя в активный центр фермен-
та. Ряд витаминов обладает регуляторными функциями, в частно-
сти участвует в регуляции проницаемости мембран, прохождения
через них катионов.
С 1956 г. принята Международная химическая номенклатура,
согласно которой витамины делят на: 1) растворимые в воде,
2) растворимые в жирах^, 3) витаминоподобные соединения.
Несмотря на точное установление химического строения, вита-
мины сохранили названия в виде букв латинского алфавита, от-
ражающие хронологическую последовательность их открытия.
Для характеристики обеспеченности организма каким-либо
витамином принято различать три ее формы: авитаминоз, гипови-
таминоз, гипервитаминоз. Первый термин применяют в отношении
комплекса симптомов, развивающихся в результате достаточно
длительного, полного или почти полного отсутствия одного из ви-
таминов. Совместная недостаточность нескольких витаминов назы-
вается полиавитаминозом. Под гиповитаминозом понимают состоя-
ние, характеризующее частичную, но уже проявившуюся специфи-
ческим образом недостаточность витамина. Довольно распростра-
нено деление гиповитаминозов на две группы: пищевой гиповита-
миноз как следствие длительного субнормального обеспечения
организма витамином, и эндогенный гиповитаминоз, когда симпто-
мы витаминной недостаточности возникают на фоне нормального
поступления витамина, но ограниченно используемого вследствие
каких-либо внутриорганизменных причин. В ряде случаев обнару-
жены антагонистические взаимоотношения между отдельными ви-
таминами, когда один из них препятствует действию или всасы-
ванию и ассимиляции другого. Такие состояния одни авторы
склонны относить к разновидности гиповитаминозов, другие пред-
лагают ввести термин — дисвитаминоз.
Гипервитаминоз — комплекс патофизиологических и биохими-
ческих нарушений, возникающих вследствие длительного избыточ-
ного введения в организм любого из витаминов. Термин гипервита-
миноз не применим в отношении токсического действия однократно
введенной большой дозы витамина.
10.2. Жирорастворимые витамины
Витамин А (антиксерофталъмический, ретинол, аксерофтол).
Известны "три витамина этой группы: Аь А2 (у них все двойные
связи находятся в транс-конфигурации) и неовитамин А (цис-
форма витамина AJ. Витамин А2 отличается от Ат присутствием
дополнительной двойной связи в кольцевой части молекулы.
Витамин А, (ретинол)
47J
. Ранним симптомом авитаминоза А является ослабление темно-
вой адаптации, вплоть до полной утраты зрения в сумерках — ку-
риная слепота. Одно из основных проявлений авитаминоза А зак-
лючается в системном поражении эпителиальной, ткани. На этой
основе, в частности, происходит поражение роговой оболочки гла-
за. Нарушается строение выстилающего ее защитного эпителия, он
подвергается ороговению, высыхает, теряет прозрачность — разви-
вается ксерофтальмия (от греч. ксерос — сухой, офтальмос—-глаз),
за которой следует кератомаляция (размягчение роговицы) с пос-
ледующим некрозом и изъязвлением. После заживления этих пов-
реждений остается рубец — бельмо, преграждающий доступ света
к сетчатке. Повышенному ороговению подвергается и эпителий ко-
жи, что способствует возникновению кожных болезней. Особенно
опасны изменения эпителия, выстилающего слизистые оболочки
дыхательных путей (бронхиты), кишечника (колиты).
При А-витаминной недостаточности ослабевают механизмы им-
мунитета. Избыточное введение витамина А может вызвать гипер-
витаминоз, интоксикацию. Особенно тяжело она протекает у детей.
Основными источниками витамина А служат яйца, сливки, смета-
на, коровье молоко, сливочное масло, почки, печень крупного рога-
того скота и печень трески. Рекомендуемое суточное потребление
витамина А для взрослого человека — 1 мг. Витамин А в высших
растениях и микроорганизмах не синтезируется, но у ниЗс образу-
ются его предшественники — каротиноиды,. Их особенно много в
мор,ков1ут1омидорах, шпинате, перце. Биосинтез, каротинов., как и
всех терпенов, осуществляется из ацетил-КоА через мевалоновую
кислоту (см. разд. 8.8.3).
Структурные изомеры каротина (а-, у-каротины) способны
превращаться в организме человека и животных в витамин А.
В процессе превращения каротина в витамин А (ретинол) окисли-
тельное расщепление углеродной цепи провитамина происходит
двумя путями: по периферическим двойным связям и по централь-
ной двойной связи. В организме ретинол окисляется в ретиналь и
ретиноевую кислоту при участии соответствующих дегидрогеназ и
НАД. Ретиналь занимает ключевое положение в обмене витамина А
и легко подвергается энзиматическому обратимому восстановлению
в ретинол и необратимому окислению в ретиноевую кислоту.
Наиболее специфической функцией витамина А является его
участие в процессах фоторецепции. Фоточувствительный пигмент,
находящийся в наружном сегменте палочек сетчатки (ответственны
за сумеречное зрение) человека, наземных позвоночных и морских
рыб, — родопсин — является хромопротеином, состоящим из хро-
мофорной группы — витамина А — альдегида (ретиналь) и белка
опсина. Связь между ними осуществляется через альдегидную груп-
пу ретиналя и свободную NH2-rpynny белка с образованием шиф-
фова основания. Под действием света 11-цис-ретиналь отщеплляет-
ся от родопсина и одновременно переходит в транс-форму. Обес-
цвеченная в результате отщепления ретиналя, молекула родопсина
запускает сложную цепь ферментных реакций в зрительной клет-
472
ке — ферментативный каскад усиления слабого светового сигнала.
Обесцвечивание родопсина связано также с повышением проницае-
мости фоторецепторной мембраны. В результате всех этих процес-
сов происходит возбуждение зрительного нерва.
Есть сведения, что важную роль в зрительной рецепции играют
цАМФ и аденилатциклаза. Установлена активация светом адени-
латциклазы у некоторых животных. Дофамин, являющийся одним
из главных нейромедиаторов в сетчатке, активирует аденилатцик-
лазу, повышает уровень содержания цАМФ в интактной ткани.
цАМФ зависимое фосфорилирование родопсина, по мнению неко-
торых авторов, может быть причиной гиперполяризации мембраны
и возникновения первичного нервного импульса. Затем транс-ре-
тиналь через транс-ретинол вновь изомеризуется в цис-ретиналь и
соединяется с опсином.
Поглотившие квант света цис- или транс-изомеры переходят из
основного (невозбужденного) состояния в синглетное (электронно-
возбужденное состояние). В этом состоянии между атомами угле-
рода имеется простая (не двойная) связь, что крайне облегчает
изомеризацию — цис-транс-переходы. Часть ретиналя при этих
превращениях разрушается, для его образования требуются новые
молекулы витамина А. Вследствие недостатка последнего теряет-
ся способность видеть вечером и ночью.
В ходе биологической эволюции 11-цис-ретиналь сохранился в
качестве хромофорной группы зрительных пигментов всех позво-
ночных животных и беспозвоночных — моллюсков, ракообразных,
насекомых. Д^же у эволюционно древних галобактерий, находя-
щихся, видимо, на слепой ветви эволюции, в качестве светочувст-
вительной рецепторной молекулы функционирует ретин ал ьсодер-
жащий мембранный белок.
Важное проявление механизма действия витамина А заключа-
ется в его участии в регуляции проницаемости мембран, а также
в транспорте моносахаридов, необходимых для биосинтеза глико-
протеинов. Витамин А оказывает несомненное влияние на усвоение
белка пищи и его обмен в организме, а также на некоторые сторо-
ны обмена липидов, в том числе убихинона, сквалена, холестерина
и частично фосфолипидов.
Предполагают участие витамина А в окислительно-восстанови-
тельных реакциях: поскольку в молекуле витамина А имеются
двойные связи, он способен образовывать пероксиды, повышающие
скорость окисления других соединений.
huraMuji D (антирахитический. кальциферолы). Название каль-
щ^еролыобъединяет группу~родстветптЖТбёдинений, обладаю-
щих антирахитической активностью. Важнейшие среди них — хо-
лекальциферол (витамин D3), эргокальциферол (витамин D2), ди-
гидроэргокальциферол (витамин D4).
Основное отличие структуры кальциферолов от других стероид-
ных соединений состоит в размыкании одного кольца фенантрена,
появлении в молекуле трех сопряженных двойных связей и метиле-
новой группы вместо метильной.
473
Недостаток витамина D приводит к возникновению рахита. При
этом заболевании задерживается зарастание швов между костями
черепа, которые избыточно разрастаются; увеличиваются лобные
бугры. Деформируются и другие кости. Вследствие недостаточ-
ного окостенения реберных хрящей грудная клетка приобретает
неправильную форму. Кости ног под влиянием тяжести тела иск-
ривляются. Мышцы становятся дряблыми, их тонус понижается,
увеличивается живот. Рахит тормозит общее развитие ребенка. За-
держивается прорезывание зубов, а сами зубы легко разрушаются,
часты желудочно-кишечные расстройства, развивается малокровие,
ребенок становится легко подвержен другим заболеваниям.
Большие дозы витамина могут вызвать гипервитаминоз D, кото-
рый проявляется в резком похудании, остановке роста, подъеме
кровяного давления, повышении температуры, резких болях в сус-
тавах, судорогах, затруднении дыхания. Источниками витамина D
в пище являются рыбий жир, печень трески, икра, яичные желтки,
сливочное масло. Суточное потребление витамина D детьми до
6 лет должно составлять от 500 до 1000 ME, а в более старшем
возрасте во взрослом состоянии— 100 ME. Однако в поддержании
необходимого общего содержания витамина D в организме важ-
нейшую роль играет его эндогенное образование из 7-дегидрохоле-
стерина под влиянием ультрафиолетовой части света.
Провитамином холекальциферола является образующийся из
холестерина 7-дигидрохолестерин, провитамином эргокальциферо-
ла— эргостерин, присутствующий в растениях и микроорганизмах
(особенно много в дрожжах). Противорахитным действием облада-
ет и дигидротахистерин — каталитически восстановленный тахисте-
рин, образующийся при ультрафиолетовом облучении эргостерина.
В зеленых растениях витамин D не синтезируется, но они явля-
ются поставщиками 7-дегидрохолестерина, необходимого для об-
разования витамина D. Витамин D выполняет свои специфические
функции в обмене веществ не в виде холе- или эргокальциферола,
а в форме образующихся из них активных метаболитов^.важней-
шим из которых является 1,25-диоксихолекальциферол. Холекаль-
циферол в печени превращается под действием митохондриальных
ферментов при участии НАДН и О2 в 25-оксихолекальциферол.
Последний гидроксилируется в почках с образованием 1,25-диокси-
474
холекальциферола. Основные функции витамина D в организме
связаны с обеспечением транспорта Са и Р через биологические
мембраны. Участие витамина D в следующих процессах можно
считать хорошо установленным: 1. Перенос ионов Са и Р через
эпителиальные клетки слизистой тонкого кишечника в процессе их
всасывания. Витамин D вступает в комплекс с Са-связывающим
белком в кишечнике. Существует гипотеза, согласно которой один
из белков слизистой кишечника под влиянием 1,25-диоксихолекаль-
циферола приобретает способность активно связывать Са. По дру-
гому предположению, 1,25-диоксихолекальциферол влияет на
биосинтез мРНК для трансляции Са-связывающего белка. 2. Моби-
лизация кальция из скелета путем рассасывания предобразованной
костной ткани. 3. Реабсорбция фосфата и кальция в почечных ка-
нальцах. В итоге витамин D обусловливает оптимальное содержа-
ние Са и Р в плазме крови, необходимое для минерализации кост-
ной ткани.
Jiurajiun-Е (антистерильный, токоферолы), К группе витами-
на Е относятся метильные производные токола и токотриенола.
Индивидуальные токоферолы, обозначаемые греческими буквами
а, 0, у и б, отличаются друг от друга количеством и положением
дополнительных метильных заместителей в ароматическом кольце
6-оксихромана. а-, 0-, у- и 6-Токотриенолы — аналоги соответствую-
щих токоферолов и отличаются от них структурой боковой поли-
изопреноидной цепи. Последняя у всех жирорастворимых витами-
нов формируется из ацетил-КоА-через мевалонат и изопентенилпи-
Для недостаточности витамина Е характерно следующее: 1. Ре-
зорбция плодов при беременности. 2. Дегенерация семенников у
самцов: снижение подвижности сперматозоидов и прогрессирую-
щая дегенерация зародышевого эпителия с атрофией и уменьшени-
ем массы семенников. 3. Мышечная дистрофия с коагулирующим
или гиалиновым некрозом мышечных клеток, атаксией и парали-
чами. Это одно из основных проявлений недостаточности витами-
на Е у кроликов, морских свинок и многих видов домашних живот-
ных. 4. Макроцитарная (крупноклеточная) анемия у обезьян и
человека со снижением продолжительности жизни эритроцитов и
нарушением эритропоэза в костном мозгу. 5. Повышенная чувст-
вительность эритроцитов к перекисному гемолизу in vitro — одно
из наиболее универсальных проявлений недостаточности витами-
на Е, характерное, видимо, для всех видов животных.
475
Глубина и характер проявлений недостаточности витамина Е
существенно зависят от других компонентов рациона. Дефицит бел-
ка, Se, избыточное содержание жиров, особенно ненасыщенных,
добавки солей Fe, Ag и некоторых других металлов могут значи-
тельно ускорять и углублять развитие недостаточности витамина Е.
Такие признаки авитаминоза, как некроз печени у крыс, миопатии
у цыплят, возникают только в том случае, если дефицит витамина Е
сочетается с недостаточным содержанием в рационе Se. Токоферо-
лы широко распространены в природе, особенно в растениях и рас-
тительных продуктах. Наиболее богаты ими растительные масла
(из пшеничных зародышей, кукурузное, хлопкое, подсолнечное).
Суточная норма потребления здоровыми взрослыми людьми вита-
мина Е составляет 15 ME.
Конкретный механизм действия витамина Е на молекулярном
уровне окончательно не расшифрован. Одна из наиболее тщатель-
но разработанных гипотез, позволяющих на единой основе объяс-
нить многочисленные и разнообразные проявления недостаточно-
сти витамина Е, — антиоксидантная гипотеза. В соответствии с ней
токоферолы выполняют в живых тканях роль биологических анти-
оксидантов, инактивирующих свободные радикалы и тем самым
препятствующих развитию нерегулируемых, неферментативных,
цепных свободнорадикальных процессов перекисного окисления
ненасыщенных тканевых липидов молекулярным кислородом. По-
скольку ненасыщенные липиды являются компонентами липопро-
теинов мембран клеток и субклеточных органелл, то усиление их
перекисного окисления при снижении концентрации токоферола в
тканях приводит к повреждению структуры, нарушению проницае-
мости и функциональной активности клеточных и субклеточных
мембран. Этот дефект и лежит в основе многообразных биохимиче-
ских, морфологических и клинических проявлений недостаточности
витамина Е.
Витамин К^£пнтигеморрагический, филлохиноны, менахиноны).
Витамины группы К широко распространены в природе и пред-
ставлены двумя рядами хинонов — филлохинонами (витаминами
Ki-ряда) и менахинонами (витаминами Кг-ряда). Основой молеку-
лы тех и других является 1,4-нафтохинон.
Филлохиноны отличаются от менахинонов структурой боковой
цепи, у менахинонов она полиизопреноидная, число изопреновых
остатков указывается в названии (например, менахинон-4). Филло-
хиноны и их деметилированные производные обнаружены в расте-
ниях, менахиноны синтезируются различными бактериями или яв-
ляются продуктами трансформации нафтохинонов в организме.
В животных тканях нафтохиноны представлены филлохинонами и
менахинонами алиментарного происхождения (поступают с пи-
щей), а также менахинонами, которые образуются в организме из
филлохинона. Кроме того, менахинон-4 может образовываться в
организме при введении синтетических нафтохинонов, например
викасола, синкавита, менадиона и др.
476
Витамин К1 (2-метил-З-фитил “1,4-нафтбхинон)
При авитаминозе К появляются подкожные и внутримышечные
кровоизлияния (геморрагии), снижается скорость свертывания кро-
ви. Первичная недостаточность витамина К у взрослых людей на-
блюдается редко. Объясняется это тем, ч,то потребность в нем обыч-
но обеспечивается поступлением с пищевыми продуктами, где он
широко распространен, и за счет его синтеза кишечными бактерия-
ми. Дефицит витамина К нередко наблюдается у новорожденных
детей из-за низкого его содержания в молоке и отсутствия в кишеч-
нике синтезирующей его микрофлоры.
Вторичная недостаточность витамина К возникает вследствие
болезней печени, особенно обтурационной желтухи, хронических
заболеваний кишечника, при лечении сульфаниламидами и анти-
биотиками, угнетающими кишечную микрофлору, а также под
влиянием лечения препаратами, являющимися антагонистами ви-
тамина К. Богатые источник^ витамина К — зеленые растения, где
он содержится в хлоропластах в виде филлохинона. Синтез вита-
мина К в растениях связан с их фотосинтетической функцией. Осо-
бенно богаты' им шпинат, капуста, тыква. В микроорганизмах и
животных тканях присутствуют различные формы витамина Кг-
В отличие от микроорганизмов и растений, обладающих способно-
стью синтезировать витамин К, для человека и высших животных
он является экзогенным фактором. Остро нуждаются в нем птицы.
У человека потребность новорожденных в витаминах составляет
от 2 до 12 мкг/сут. Всасывание витаминов К происходит в тонком
кишечнике. Природным витаминам К1 = Кг-ряда, обладающим ли-
пофильными свойствами, требуется присутствие желчных кислот
и панкреатической липазы, тогда как водорастворимые формы
витамина К в этом не нуждаются. Биологически активной формой
витамина К в организме человека и животных является менахи-
нон-4, так как все другие формы витамина К трансформируются в
нее. Конкретный молекулярный механизм действия нафтохинонов
окончательно не выяснен. Наиболее вероятными считают следую-
щие гипотезы^
1. Участие витамина К в окислительном фосфорилировании. Из
митохондрий микробных и растительных клеток, а также из хлоро-
пластов были выделены филлохинонредуктаза, менадионредуктаза,
в которых витамин К выполняет коэнзимную функцию. Нафтохино-
ны наряду с бензохинонами присутствуют в составе фотосинтети-
ческой системы и участвуют в переносе световой энергии к хлоро-
филлу. Признано также участие витамина К в окислительном фос-
477
формировании у некоторых бактерий. Однако данных, доказываю-
щих специфическое участие витамина К в процессах окислительного
фосфорилирования в животном организме, пока нет.
2. Действие витамина К на генетическом уровне. На основании
опытов с использованием актиномицина D, блокирующего биосин-
тез белков на стадии образования мРНК, был сделан вывод, что
витамин К вовлекается в биосинтез факторов свертывания крови,
стимулируя ДНК-зависимый синтез соответствующей мРНК, и что
антагонизм между витамином К и дикумарином осуществлялется
на уровне гена-регулятора.
3. Участие витамина К в синтезе прокоагулянтов (факторов
свертывания крови II, VII, IX и X). Витамины К участвуют в пост-
трансляционном карбоксилировании остатков глутаминовой кис-
лоты в составе перечисленных белков (факторов свертывания), что
необходимо для их активного функционирования. Карбоксилирова-
ние остатков глутаминовой кислоты осуществляется микросомаль-
ной карбоксилазой. Солюбилизированная карбоксилаза нужда-
ется в НАДН, витамине К, НСО^ и О2. Витамин К обладает ко-
ферментной функцией, которая реализуется в форме 2,3-эпоксида.
Окисление в 2,3-эпоксид происходит под действием специфической
оксидоредуктазы, восстановление — под действием НАДФН-диафо-
разы. Ни одна из приведенных гипотез в настоящий момент не
может считаться всеобъемлющей и единственно верной.
10.3. Водорастворимые витамины
Витамин Bi (антиневритный, тиамин). Тиамин, или 4-метил-5-р-
-оксиэтил-Ы-тиазолий, синтезируется обычно в виде хлористо- или
бромистоводородной соли. Биосинтез тиамина осуществляется из
производных пиримидина и тиазола в результате их предвари-
тельного фосфорилирования, а затем объединения в одну молекулу
путем пирофосфорилазной реакции (т. е. выщепления Н4Р2О7).
Биосинтез самого тиазола пока исследован недостаточно. Кофер-
ментная форма, т, е. тиаминпирофосфат, или тиаминдифосфат
(ТДФ), образуется путем прямого переноса пирофосфатной груп-
пы от АТФ на тиамин.
Авитаминоз Bi (болезнь бери-бери, Bi-авитаминозный полинев-
рит) начинается с таких предвестников, как потеря аппетита, об-
щая вялость, затем слабость в ногах, онемение. Появляются тош-
нота, упорные запоры, при малейшем физическом напряжении —
одышка и сердцебиение. Постепенно нарастают признаки пораже-
ния нервной системы — понижается чувствительность кожи, разви-
ваются параличи и судороги конечностей, чаще нижних. Отмечает-
ся резкое похудение, истощение. Нередко появляются отеки. При
вскрытии людей и животных, погибших от бери-бери, обнаружива-
ются значительные изменения в строении центральной нервной сис-
темы и периферических нервов. Источником витамина Bi служат
как растительные продукты, так и мясные, рыбные и молочные.
478^
Особенно богаты им бобовые растения — фасоль, зеленый и сухой
горох, чечевица, соя. Потребность в витамине Bi — 0,6 мг на
4,19Х103 кДж (1000 ккал) суточного пищевого рациона.
Роль витамина Bi в обмене веществ определяется прежде всего
его коферментными функциями. Фосфорилированная форма этого
витамина — тиаминдифосфат является небелковой частью ряда
ферментов.
Тиаминдифосфат участвует в реакциях декарбоксилирования
о-кетокислот, а также расщепления и синтеза а-оксикетонов (на-
пример, кетосахаров), т. е. в реакциях синтеза и расщепления уг-
лерод-углеродных связей, находящихся в непосредственной близо-
сти к карбонильной группе.
он О о о
I II И II
R-C—С-Ri -> R-C-H + H-C-Ri
I
Н
Тиамин-зависимыми ферментами являются, например, пируват-
декарбоксилаз'а и транскетолаза (см. разд. 3.4). Ранее предполага-
ли, что авитаминоз Bi в основном связан с избыточным накоплени-
ем пирувата в крови и тканях вследствие торможения его декар-
боксилирования. Однако в настоящее время установлено, что этот
процесс протекает только в изолированных тканях при очень глу-
боком авитаминозе. Более вероятен другой механизм: блокирова-
ние транскетолазной реакции в пентозофосфатном цикле, приводя-
щее к резкому замедлению образования НАДФН и рибозо-5'-фос-
фата, что существенно сказывается на многих метаболических
процессах.
Наряду с этими данными за последние двадцать лет накоплены
сведения о высокой биологической активности некоферментных
производных витамина Вь Здесь отчетливо наметились два на-
правления: возможное участие различных фосфорных эфиров ви-
тамина Bi в активном переносе богатых энергией фосфатных групп
и возможной роли тиамина в окислительно-восстановительных про-
цессах.
* Витамин В2 (рибофлавин), Кроме самого рибофлавина (6,7-ди-
метил-9-В-рибитилизоаллоксазин) в природных источниках содер-
жатся его коферментные производные: флавинмононуклеотид
(ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД), Эти коферментные
формы витамина В? количественно преобладают в большинстве
животных и растительных тканей, а также в клетках микроорга-
479
низмов. Биогенез имеет очень сложный характер, исходным соеди-
нением является гуанозин. Синтез рибофлавина осуществляется зе-
леными растениями, большинством бактерий и грибов.
Авитаминоз В2 (арибофлавиноз) у человека характеризуется
воспалительными явлениями слизистой оболочки ротовой полости;
нарушением зрения: сначала отмечается быстрая утомляемость
глаз, светобоязнь, резь в глазах, воспаление их слизистой, век,
затем роговой оболочки глаз. Наряду с этим у больных отмечается
малокровие, поражение кожи лниЛг-уи1ей, груди. ВитаминПБг необ-"
ходим для нормального развития плода. Благодаря бактериально-
му биосинтезу рибофлавина в желудочно-кишечном тракте жвач-
ные животные не нуждаются в поступлении рибофлавина с пищей.
Наибольшее количество рибофлавина (65—70%) человек_лоду—
чает за счет молочных, мясных продуктов и хлеб а —35%—за
сцет^орощей и фруктов. Суточная потребность в витамине В2 2 мг
для взрослого ^ 1—2 мг для детей. Рибофлавин, всосавшийся в ки-
шечнике, подвергается фосфорилированию. При этом образуются
две коферментные формы — ФМН и ФАД. Все изученные флаво-
протеины — окислительно-восстановительные * ферменты, выпол-
няющие функцию транспорта водорода в процессе тканевого дыха-
ния (см. разд. 7.3.1).
Витамин В3 (пантотеновая кислота). В химическом отношении
природная пантотеновая кислота состоит из остатков D-a, у-диок-
си-р, р-диметилмасляной кислоты и р-аланина, связанных между
собой амидной связью.
СН3 ОН
НОН2С—С---СН—CO—NH—СН2—СН2—СООН
З-Аланин
Пантотеновая кислота синтезируется зелеными растениями и
микроорганизмами из a-кетоизовалериановой кислоты через кето-
пантоевую, затем пантоевую кислоту, к которой присоединяется
р-аланин. Последний образуется при декарбоксилировании аспара-
гиновой кислоты или путем переаминирования из малонового по-
луальдегида.
Известны производные пантотеновой кислоты: ее амид (панто-
тенамид) и пантотенол, образующийся при восстановлении СООН-
группы пантотеновой кислоты до спиртовой. Наиболее важными
производными пантотеновой кислоты является коэнзим А, в фор-
ме которого эта кислота и выполняет свою специфическую функ-
цию в обмене веществ, и ацилпереносящий белок (АПБ). Недоста-
точность пантотеновой кислоты у человека и животных проявляет-
ся в замедлении роста, потере массы тела, повреждении кожи,
шерсти, выпадении волос; в дегенеративных изменениях миелино-
вой оболочки спинного мозга, задних корешков и седалищного
нерва. С этим связаны дискоординация движений, появление «гу-
синого» шага, параличи; нарушения желудочно-кишечного тракта,
органов размножения, надпочечников.
480
Пантотеновая кислота исключительно широко распространена
в природе. Она синтезируется зелеными растениями и микроорга-
низмами: дрожжами, многими бактериями, в том числе кишечной
микрофлорой млекопитающих, грибками. Ткани животных не спо-
собны к синтезу пантотеновой кислоты, но синтезируют из нее КоА.
Пантотеновая кислота содержится практически во всех продуктах
животного или растительного происхождения. Особенно значитель-
но ее содержание в печени животных, почках, яичном желтке, икре,
мясе. Из овощей более богаты пантотеновой кислотой цветная ка-
пуста, картофель, помидоры. Очень высока концентрация пантоте-
новой кислоты в маточном молочке пчел и пивных дрожжах. Су-
точная потребность человека в пантотеновой кислоте составляет
10 мг. Пантотеновая кислота поступает в организм человека и жи-
вотных с пищей. Кроме того, в кишечнике млекопитающих и чело-
века происходит синтез пантотеновой кислоты кишечной микро-
флорой, особенно Е. coli.
* Витамин Вь (антипеллагрический, никотинамид, РР, никотино-
вая кислота, ниацин). В природе витамин РР встречается в двух
формах — в виде никотиновой кислоты и никотинамида. Никотино-
вая кислота является пиридин-3-карбоновой кислотой, а никотина-
мид — ее амидом. Превращение триптофана в мононуклеотид ни-
котиновой кислоты происходит у человека и животных. У зеленых
растений и микроорганизмов исходными соединениями в биогенезе
витамина РР является аспартат и производные триоз.
Недостаточность витамина РР вызывает заболевание пеллаг-
рой (от итал. pelle agra — шершавая кожа). Ведущий симптом бо-
лезни— дерматит. Кожа краснеет, становится шершавой, покры-
вается пузырями, трещинами, на местах лопающихся пузырей оста-
ются изъязвления. Эти изменения поражают открытые поверхности
тела, подверженные солнечному облучению. Другая группа
симптомов — тяжелые расстройства системы органов пищеваре-
ния. При пеллагре также возникают расстройства нервной системы
вплоть до психических заболеваний. <
Растения и большинство микроорганизмов синтезируют нико-
типовую кислоту и не нуждаются в экзогенном ее получении. Ею
наиболее богаты сухие пивные дрожжи, пекарские прессованные
дрожжи. Значительное количество никотиновой кислоты находится
в зерновых продуктах. Суточная потребность в витамине РР 6,5 мг
на 4,19Х103 кДж (1000 ккал). Никотиновая кислота и никотина-
мид входят в состав коферментов НАД и НАДФ и вместе с апофер-
ментами катализируют окислительно-восстановительные реакции
клеточного обмена, фотосинтеза (см. разд. 6.5.1).
/ Витамин Bq (антидерматитный, пиридоксин, пиридоксаль, пири-
доксамин).
Авитаминоз Вб проявляется в угнетении выработки эритроцитов,
дерматите, воспалительных процессах кожи, замедлении роста жи-
вотных, нарушении обмена триптофана. Витамин В6 синтезируется
многочисленными видами микроорганизмов и зелеными раетения-
ми из_вдодуктов гликолиза: глицеральдегид-3-фосфата, дигидрок-
481
сиацетонфосфата или пирувата. Конкретные пути синтеза исследо-
ваны недостаточно\Микроорганизмы кишечника жвачных живот-
ных активно синтезируют витамин В6} ^(икрофлора кишечника
человека тоже синтезирует витамин В^> но в недостаточных количе-
ствах. Наиболее богатыми источниками витамина В6 являются су-
хие пивные дрожжи, мясо, рыба, цельное зерно злаков и особенно
отруби злаков. У животных много его находится в ткани печени,
сердца, почек. Суточная потребность в витамине Вб — 2 мг для
взрослых людей при условии получения с пищей не менее 100 г
белка. Биологическая активность витаминов группы В6 связана с
их превращением в организме в коферментные формы — пиридок-
саль-5-фосфат и пиридоксамин-5-фосфат.
сн2он
ch2nh2
Пиридоксин
Пиридоксальфосфат
Пиридоксаминфосфат
Пиридоксаминфосфат как кофермент функционирует в реакци-
ях превращения карбонильных соединений, например в реакциях
образования 3,6-дидезоксигексоз, входящих в антигены, локализо-
ванные на поверхности бактериальных клеток. Биохимические
функции пиридоксальфосфата: 1) транспортная — участие в про-
цессе активного переноса некоторых аминокислот через клеточные
мембраны; 2) каталитическая — участие в качестве кофермента
широком круге ферментативных реакций (переаминирование, де-
карбоксилирование, рацемизация аминокислот и др.), катализи-
руемых пиридоксальфосфатсодержащими, или «пиридоксалевыми»,
ферментами; 3) функция регулятора скорости оборота пиридокса-
левых ферментов — удлинение времени полураспада в тканях не-
которых пиридоксальных апоферментов при их насыщении пири-
доксальфосфатом, повышающим устойчивость апоферментов к теп-
ловой денатурации и действию специфических протеиназ.
Витамин Вс (антианемический фактор, фолиевая кислота, фо-
лацин, птероилглутаминовая кислота). Фолиевая кислота — основ-
ной представитель обширной группы родственных соединений, объ-
единяемых общим названием фолацин. Все эти соединения содер-
жат гетероциклы птеридина, остаток р-аминобензойной кислоты с
присоединенными к ней по типу пептидной связи молекулами глу-
таминовой кислоты, число которых может колебаться от 1 до 7.
Исходным продуктом для биосинтеза птеридина является гуа-
нозинтрифосфат (ГТФ). Происходит раскрытие кольца с уходом
атома С-8 пурина в составе формиата. Далее осуществляется пе-
регруппировка. приводящая к включению части рибозы в кольце-
вую структуру. Присоединение р-аминобензойной кислоты приво-
дит к образованию дигидроптероевой кислоты, которая при учас-
482
тии АТФ и глутаминовой кислоты (источник аминогруппы)
превращается в дигидрофолиевую кислоту.
Фолиевая кислота метаболически неактивна, но представляет
собой предшественник коферментов, включающихся в обменные
процессы. Активной коферментной формой фолацина является
восстановленная фолиевая кислота с четырьмя атомами водорода,
присоединенными в 5, 6, 7 и 8-м положениях ее птеридинового
кольца — 5,6, 7,8-тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК), или тетра-
гидроптероилглутаминовая кислота. Она имеет следующую фор-
мулу:
Тетрагидроптерин . ррАкшнобензойная । Глутаминовая кислота
joiciioTa
Остатки глутаминовой кислоты соединяются амидной связью, об-
разовавшейся на а-карбоксилом, а у-карбоксилом. На активном
центре ТГФК (этилендиамицовая группировка) происходит фик-
сация одноуглеродных остатков, их активирование, превращение,
а затем перенос на субстрат.
ТГФК участвует в реакциях переноса одноуглеродных остат-
ков разной степени окисленности (за исключением СО2): —СН3
(метильная), —се (формильная), —СН2ОН (оксиметильная),
хн
'NH ? Z
—СН2 (метиленовая), — се (формйминогруппа), — се (ме-
тенильная). В связи с этим ТГФК играет важную роль в синтезе
пуринов и пиримидинов. Основным предшественником одноугле-
родных остатков служит серин, а также гистидин (—СН—NH-
-групп).
М5*10-Метилен-ТГФК, образующаяся за счет серина и восста-
навливающаяся до метил-ТГФК, является главным источником ме-
тильной группы при синтезе метионина, тимина и других соедине-
ний, синтез которых осуществляется путем метилирования специ-
фических групп. Использование формиата в качестве единственного
источника углеродного питания некоторыми бактериями также
происходит при участии птериновых коферментов.
Фолацин в организме человека связан с гемопоэзом (кроветво-
рением), это — противоанемический фактор. Сначала он был открыт
как фактор роста микробов молочнокислого брожения, содержа-
щийся в листьях шпината, отсюда и название фолиевая кислота (от
483
лат. folium — лист). Фолацин стимулирует не только эритропоэз,
но и лейкопоэз.
Фолаты (фолиевые кислоты) широко распространены в приро-
де. Большинство микроорганизмов, а также низшие и высшие рас-
тения способны синтезировать фолаты. В тканях млекопитающих
и птиц фолаты не образуются. В растительных и животных тканях
обнаружено незначительное количество птероилмоноглутаминовой
кислоты. Основная часть фолатов содержится в них в виде ди-,
три-, полиглутаматов. Преобладающей формой фолатов в бакте-
риях является птероилтриглутаминовая кислота, в дрожжах — геп-
таглутамат. Основные источники фолатов — салат, шпинат, капус-
та, морковь, помидоры, зеленый лук. Из продуктов животного про-
исхождения наиболее богаты фолатами печень, почки, яичный
желток, сыр. Суточная потребность взрослого человека в фолиевой
кислоте 100—200 мкг.
Витамин В12 (кобаламин). Кобаламины — групповое название
соединений, обладающих В12-витаминной активностью. Центральной
частью молекулы витамина Bi2 является циклическая корриновая
система, напоминающая по структуре порфирины (отличается от
них тем, что два пиррольных кольца плотно сконденсированы друг
с другом, а не соединены через метиленовый мостик). Все связи,
за исключением двух, имеют координационный характер. Одна из
них образована Со над плоскостью корринового кольца с 5,6-ди-
метилбензимидазолом, к которому глюкозидной связью присоеди-
нен рибозо-З'-фосфат. Под плоскостью корринового кольца нахо-
дится присоединенный к кобальту остаток 5'-дезоксиаденозина.
В присутствии анионов, особенно цианида, Со окисляется до 3-ва-
лентного и 5'-дезоксиаденозин замещается атакующим анионом.
Таким образом, цианкобаламин — это не нативный витамин, а его
модификация, получаемая обычно в процессе выделения витамина.
Витамин В12 синтезируют актиномицеты, они образуют корри-
новую часть молекулы из уропорфириногена III, Семь метильных
групп поступают от S-аденозилметионина. Рибофлавин является
обязательным интермедиатом в биосинтезе витамина В12. Завер-
шающие стадии синтеза включают этапы фосфорилирования 5'-де-
зоксиаденозилкабамида и конденсацию с ГТФ. Далее происходит
освобождение ГМФ, отщепляется фосфат и образуется кофер-
мент В12.
Гипо- и авитаминоз Bi2 у человека может развиваться вследст-
вие как экзогенной недостаточности содержания витамина (пища),
так и различных условий эндогенного порядка. Различают две фор-
мы эндогенного авитаминоза: гастрогенный и энтерогенный. При-
чиной гастрогенного авитаминоза является отсутствие или недос-
таточность «внутреннего фактора», что приводит к нарушению ис-
пользования пищевого витамина Bi2.
Внутренний фактор Касла вырабатывается в желудке, является
термолабильным, недиализируемым веществом гликопротеиновой
природы (транскоррин). Он специфически связывает витамин В12 с
образованием сложного комплекса. Только в этом связанном с
484
транскоррином виде витамин Bi2 всасывается в кишечнике. Гастро-
генный В12-авитаминоз лежит в основе болезни Аддисона-Бирмера
(синонимы: пернициозная, злокачественная анемия). Заболевание
характеризуется нарушениями со стороны кроветворной, нервной,
пищеварительной и сердечно-сосудистой систем.
'Структура 5;б-диметилб’ензимидазолкобамидного
кофермента
Энтерогенный авитаминоз Bi2 развивается вследствие наруше-
ния всасывания витамина Bi2 в кишечнике (наличие широкого лен-
теца, значительное разрушение витамина патологической кишеч-
ной микрофлорой).
Для обозначения коферментных форм кобаламинов используют
термины коэнзим-А^, кобамидные коферменты или кобаламиновые
коэнзимы. Ими являются метилкобаламин и 5'-дезоксиаденозилко-
боламин (последний преобладает).
Кобамидные коферменты участвуют в реакциях двух типов: в
переносе метильных групп (метилкобаламин) и изомеризации типа
485
X Н Н X
где X — переносимая группа (5'-дезоксиаденозилкобаламин).
В реакциях переноса метильных групп В12-зависимые ферменты
функционируют после ферментов, содержащих тетрагидрофолие-
вую кислоту: СН3-группа от метилтетрагидрофолиевой кислоты пе-
реносится сначала на кобаламин. В12-Зависимые ферменты участ-
вуют и в синтезе метана анаэробными бактериями, а также в пе-
реносе СНз-групп от метилкорриноидов на Hg, As, Se и Те, в
результате чего образуются соединения, обладающие токсическим
действием: метилртуть, диметилртуть и др. Круг реакций и набор
активных коферментных форм у микроорганизмов более богат, чем
у животных. Для микроорганизмов известно 14 зависимых от коба-
мидных коферментов реакций, причем роль нуклеотидной части ко-
ферментов в определенных реакциях у них менее существенна.
,-Вцтамин В12 2^единственный из витаминов, который синтезиру-
ется исключительно микроорганизмами. Главная роль принадле-
жит бактериям, актиномицетам и синезеленым водорослям. Пос-
ледние являются основным источником значительного накопления
витамина BJ2 в теле моллюсков, рыб и разных видов водных живот-
ных. Человек получает витамин Bi2 x пищей, в' которши. последний^
находится в связанном с белками состоянии. Нбдвлиянием пище-
варительйыХ ^уер^ентовнитамин высвобождается из этого комп-
лекса и всасыЬзется-в-^емТешЖ
Самыми богатыми природными источниками витамина Bj2 слу-
жат говяжья печень, почки. Суточная потребность в витамине Bi2
составляет 2—2,5 мкг.
\ Витамин H_J6uotuh). Молекула биотина состоит из им ид азол ь-
ногои тиофенового колец. Гетероцикл можно рассматривать как
тиофеновое кольцо, связанное с уреидной группировкой. В молеку-
ле содержится три асимметрических атома С, что обусловливает
существование восьми стереоизомеров. Биотин образуется из олеи-
новой кислоты, которая на первом этапе в результате обычных ре-
акций р-окисления дает пимелоил-КоА. Затем присоединяется ала-
нин и происходит замыкание цикла. Источник атома S в кольце
пока неизвестен.
В большом количестве .(^тиндихуж/шотея^^
myces cerevisae) при выращивании их на среде с мочевиной как ис-
точнике азота. Это объясняется тем, что перед расщеплением моче-
вина карбоксилируется при помощи биотинсодержащего фермента
карбоксилазы мочевины.
Биотиновый авитаминоз у животных характеризуется прекра-
щением роста, падением массы тела, покраснением и шелушением
кожи, выпадением шерсти или перьев, образованием красного
отечного ободка вокруг глаз в виде «очков», атактической поход-
кой, отеком лап и типичной позой животного с согнутой спиной.
Биотин широко распространен в природе. Он обнаружен у мик-
роорганизмов, растений, животных. Биосинтез биотина осущест-
486
вляют все зеленые растения, некоторые бактерии и грибы путем
постепенного усложнения молекулы пимелиновой кислоты. Содер-
жание его определено в различных систематических группах жи-
вотных. Наиболее высокий уровень биотина обнаружен в личин-
ках насекомых, наименьший — у пресмыкающихся. Человек пол-
ностью удовлетворяет свою потребность в биотине за счет синтеза
его микробной флорой кишечника. Особенно богаты витамином
свиная, говяжья печень, почки, сердце быка, яичный желток, из
продуктов растительного происхождения — бобы, рисовые отруби,
пшеничная мука, цветная капуста. Минимальная ежедневная доза
биотина для человека — около 150—200 мкг.
При биотиновой недостаточности нарушаются следующие функ-
ции печени животных: синтез цитруллина из орнитина, NH3 и СО2;
включение СО2 в пурины; карбоксилирование пропионовой кисло-
ты, приводящее к образованию янтарной кислоты; включение СО2
в ацетоуксусную кислоту.
Биотин в ферментах всегда прочно присоединен к белку путем
образования амидной связи с e-NH3-rpynnofi лизина.
Все известные в настоящее время биотиновые ферменты ката-
лизируют два типа реакций: 1) реакции p-карбоксилирования или
фиксации СО2, сопряженные с расщеплением АТФ, например кар-
боксилирование пирувата, ацетил КоА; в ходе реакции за счет
энергии АТФ образуется карбоксибиотин; 2) реакции транскарбок-
силирования, протекающие без распада АТФ, при которых карбок-
силирование одного субстрата осуществляется при одновременно
протекающем декарбоксилировании другого соединения.
Карбоксибиотин
. Витамин С (антискорбутный, аскорбиновая кислота). Аскорби-
новая кислота по своему строению может быть отнесена к произ-
водным углеводов. Она представляет собой лактон гексоновой
487
кислоты, содержащий диенольную группу. Благодаря наличию
двух асимметрических атомов углерода в положениях 4 и 5 аскор-
биновая кислота образует четыре оптических изомера и два раце-
мата. Аскорбиновая кислота — довольно сильная кислота; ее кис-
лый характер обусловлен наличием двух обратимо диссоциирую-
щих енольных гидроксилов:
О=С------
НО—С
II
но-с о
Н—С-----1
I
но—с—н
I
СН2ОН
— 2Н
*+2Н
L-Аскорбиновая кислота
о=с
но—с—н
I
СН2ОН
L-Дегидроаскорбиновая
кислота
Синтез аскорбиновой кислоты может осуществляться у всех
видов животных, кроме человека, обезьян и морских свинок. В про-
цессе синтеза D-глюкуроновая кислота превращается в L-гулоно-
вую, затем в L-гулонолактон с последующим превращением через
З-кето-Ь-гулонолактон в L-аскорбиновую кислоту.
Основные симптомы С-витаминной недостаточности: повышен-
ная ломкость кровеносных капилляров, общая слабость, апатия,
утомляемость, снижение аппетита, задержка роста, повышенная
восприимчивость к инфекциям, болезненность десен, их отечность,
разрыхленность, кровоточивость при чистке зубов. В далеко за-
шедших случаях цинги (скорбут) нарастают явления гингивита
(изъязвление десен, расшатывание зубов).
Аскорбиновая кислота — один из наиболее широко распростра-
ненных в природе витаминов. Она синтезируется растениями и по-
давляющим большинством животных. Семена высших растений
лишены витамина С, однако он появляется в них с первых дней про-
растания. Богаты витамином С листья, плоды, несколько беднее
корнеплоды. Потребность в витамине С для взрослых людей со-
ставляет 70—120 мг/сут.
Одно из основных свойств аскорбиновой кислоты — способность
к обратимым окислительно-восстановительным превращениям.
Окисление витамина катализируется аскорбиноксидазой, церуло-
плазмином и некоторыми другими оксидазами. Восстановление де-
гидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую катализируется де-
гидроаскорбинредуктазой, обнаруженной в животных и раститель-
ных тканях. Для действия фермента необходимо присутствие глу-
татиона и НАДФНа.
Таким образом, в растительных и животных тканях с помощью
ферментов поддерживается достаточно стабильное соотношение
форм аскорбиновой кислоты, которые в наиболее высоких концент-
рациях обнаруживаются в тканях с высокой метаболической актив-
488
ностью. Это позволяет предположить, что сами окислительно-вос-
становительные превращения витамина С играют важную роль в
биологических реакциях, протекающих с участием транспорта элек-
тронов. Аскорбиновая кислота известна как кофактор реакции гид-
роксилирования пролина при синтезе коллагена, гидроксилирова-
ния р-оксифенилпирувата в гомогентизиновую кислоту, превраще-
ний кортикостероидов и трансферрина.
Предполагают, что у растений фермент аскорбинатоксидаза,
окисляющий аскорбиновую кислоту, функционирует как одна из
терминальных оксидаз дыхания.,, .
Витамин Р (полифенолы, биофлавоноиды). По химической при-
роде биофлавоноиды не составляют общей группы соединений, но
все они имеют дифенилпропановый углеродный «скелет». К ним
относятся катехины, лейкоантоцианы, флаваноны, флаванолы (в
том числе рутин), антоцианы, флавоны.
Биофлавоноиды принадлежат к фенольным соединениям. Ис-
ходным продуктом для их синтеза служит шикимовая кислота. Ос-
новной точкой приложения действия биофлавоноидов являются ус-
тойчивость и проницаемость капилляров. Недостаточность витами-
на Р проявляется в ломкости стенок кровеносных сосудов, повы-
шенной проницаемости капилляров, мелкоточечных кровоизлияни-
ях. Суточная потребность во флавоноидах не установлена.
Полифенолы с Р-витаминной активностью широко распростра-
нены в растениях. Особенно много их содержится в черноплодной
рябине, черной смородине, щавеле, крыжовнике, темной черешне,
персиках, грушах, винограде, яблоках, грейпфрутах. Влияние био-
флавоноидов на сосудистую стенку осуществляется через эндокрин-
ные железы. Полифенолы предохраняют от окисления адреналин,
который стимулирует деятельность гипофиза, а последний, в свою
очередь,—секрецию кортикостероидов. Кроме того, биофлавонои-
ды влияют на сосудистую проницаемость, воздействуя на систему
гиалуроновая кислота — гиалуронидаза, ингибируя гиалуронидазу.
P-Витаминные вещества предохраняют аскорбиновую кислоту от
окисления. Механизм антиокислительного действия биофлавонои-
дов заключается в блокировании ими каталитического действия
тяжелых металлов, путем связывания их в стабильные комплексы.
Инозит. Инозит представляет собой циклический шестиатомный
спирт циклогексана.
г снон
нонс^ ^снон
НОНС^ ^снон
снон
Инозит
У человека недостаточность инозита практически не наблюдается;
у мышей проявляется в задержке роста, выпадении волос, сниже-
нии тонуса желудка, анемии, частичной жировой инфильтрации пе-
чени. Инозит широко распространен в растительных и животных
тканях; в растениях образуется в результате циклизации молекулы
17—937
439
глюкозы, содержится преимущественно в виде эфира с фосфорной
кислотой — фитина.
В животных тканях инозит присутствует главным образом как
компонент молекулы фосфатидилинозитов, которые содержатся во
многих тканях, особенно богаты ими клетки нервной системы. Ис-
точниками инозита являются мясные продукты, мозг, печень, серд-
це, яичные желтки, хлеб, кукуруза, картофель, зеленый горох, яб-
локи, дыни, грибы. Потребность человека в инозите 1—1,5 г/сут.
10.4. Витаминоподобные вещества, взаимодействие
витаминов, антивитамины
10.4.1. Витаминоподобные вещества. В эту группу веществ при-
нято объединять разнообразные химические вещества, обладающие
витаминными свойствами, однако частично синтезирующиеся в ор-
ганизме и иногда входящие в структуру тканей.
Витамцн (оротовая кислота). Это вещество отнесено к ви-
та минопоДббВьш, так как оно способно усиливать рост микроорга-
низмов и высших животных; является производным пиримидина
(см. разд. 4.2.1). Источниками витамина Bj3 могут быть печень,
молоко и дрожжи. У птиц и млекопитающих оротовая кислота син-
тезируется из аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата, участ-
вует в образовании нуклеиновых кислот. Оротовая кислота — един-
ственное циклическое соединение, включающееся в пиримидиновые
нуклеотиды после введения извне, благодаря чему она стимулирует
рост растений и животных, анаболитические процессы. Калиевую
соль витамина BJ3 (оротат калия) применяют при вскармливании
недоношенных детей, при болезнях печени и сердца, для стимуля-
ции продукции эритроцитов при некоторых формах анемий.
Витамин Bi5 (пангамовая кислота). Это эфир глюконовой кис-
лбтьГи дем'итилглицина. Пангамовая кислота выделена из дрож-
жей, печени, крови быка, проростков риса.
СООН
Н—С—ОН
НО—С—н
н—<!:—он
н-с-он -н
I
Н2с—О—С—СН2— NK
II хсн3
о
Пангамовая кислота
В ней присутствует две подвижные метильные группы, благодаря
которым витамин Bi5 является липотропным фактором, улучшает
липидный обмен, предотвращает жировую инфильтрацию печени.
Витамин Ви способствует синтезу креатинфосфата (см. разд. 7.4.2),
490
активирует окислительные процессы, что приводит к снижению
мышечного утомления. Кроме того, витамин оказывает детоксици-
рующее действие при остром и хроническом отравлении наркотика-
ми, алкоголем, хлорорганическими соединениями, антибиотиками
тетрациклинового ряда. Физиологическая потребность человека в
витамине Bt5 неизвестна, в лечебных целях пангамовую кислоту
используют в дозе 0,1—0,3 г.
Парааминобензойная кислота
h2n
ООН
. Это сое-
динение, входя в состав фолиевой кислоты, активирует синтез
пуринов и пиримидинов, участвуя таким путем в синтезе нуклеи-
новых кислот; влияет на функцию щитовидной железы, повы-
шает переносимость кислородного голодания, задерживает разви-
тие экспериментального атеросклероза, является фактором роста и
размножения микроорганизмов. Структурные аналоги параамино-
бензойной кислоты — сульфаниламиды — применяют при инфек-
ционных заболеваниях в качестве бактериостатических средств, так
как, будучи структурными аналогами парааминобензойной кислоты,
они являются ее антагонистами и могут конкурентно замещать ее
в ферментных системах патогенных микробов. Такие производные
парааминобензойной кислоты, как новокаин, анестезин, обладают
местным анестезирующим действием. Парааминобензойная кислота
широко распространена в пищевых продуктах: дрожжах, печени,
почках, сердце, грибах, в несколько меньших количествах встреча-
ется в молоке, яйцах, картофеле, моркови, шпинате, пшенице.
Витамин N (липоевая кислота). Липоевая кислота является
органической Тсислотой, содержащей дисульфидный мостик. Пяти-
членная структура части молекулы, включающая дисульфидную
связь, необходима для проявления биологической активности ви-
тамина N. Липоевая кислота широко распространена в растениях
и микроорганизмах. Наибольшее количество ее находится в мито-
хондриях и хлоропластах. Ориентировочная потребность человека
в липоевой кислоте составляет 1—2 мг/сут. Липоевая кислота вы-
полняет специфическую коферментную роль в реакции окислитель-
ного декарбоксилирования а-кетокислот, при переносе ацильных
остатков и сопряженных с этим процессом окислительно-восстано-
вительных превращениях (см. разд. 6.9.5). Благодаря этому липое-
вая кислота принимает участие в освобождении энергии и биосин-
тетических процессах. Ее применяют при атеросклерозе, некоторых
болезнях печени, сахарном диабете, различных интоксикациях.
Витамин U (метилметионин)
сн2----СН---СН—СООН
I 1 I
S—СН3 СН3 NHa
Содержится в соках сырых овощей, особенно в капустном. Являет-
ся активной формой аминокислоты метионина. Кристаллический
17*
491
препарат выделен из спаржи и свежих томатов, в 1000 раз актив-
нее капустного сока. Стимулирующее действие метилметионина при
восстановлении поврежденных слизистых оболочек желудочно-ки-
шечного тракта связывают с тем, что он является активным донором
метильных групп. Кроме того, участвует в синтезе холина и креа-
тина.
.Витамии^ЕЛэссенциалъные полиненасыщенные жирные кислоты
ЭжК)7 К ЭЖК относятся жирные кислоты, которые не могут быть
синтезированы в организме животных в количествах, необходимых
для роста, развития и нормального течения ряда процессов. При не-
достаточности витамина F прежде всего наступает остановка
роста. Происходит тяжелое поражение кожных покровов: образу-
ются язвы, очаговые некрозы, изменяется пигментация в связи с
нарушением обмена меланина. Наблюдается ломкость и выпадение
волос, крупность и расслоение ногтей. Считают, что роль ЭЖК в об-
менных процессах опосредуется простагландинами, являющимися
производными ЭЖК. Поскольку простагландины активно влияют на
обмен цАМФ и, следовательно, на широкий комплекс реакций, свя-
занных с обменом и функциями большинства гормонов, симптомы
недостаточности ЭЖК очень разнообразны (см. разд. 12.3 и 12.4).
10.4.2. Взаимодействие витаминов. Значительное количество
данных о витаминах показывает, что между ними существует опре-
деленное взаимодействие. Одни из них антагонизируют друг с дру-
гом (тиамин — никотиновая кислота), другие — обнаруживают
синергизм (аскорбиновая кислота—биофлавоноиды), третьи —
способны к взаимозаменяемости (витамины К и Е, К и А по неко-
торым аспектам своего действия). Факт взаимодействия витаминов
очень важен как для понимания механизма действия витаминов,
так и для правильного сочетанного применения их в лечебной прак-
тике.
10.4.3. Антивитамины. К этой группе относят вещества, различ-
ными способами нарушающие использование витаминов живой
клеткой и таким путем вызывающие состояние витаминной недос-
таточности. По механизму действия все антивитамины можно раз-
делить на две группы.
1. Вещества, вступающие с витамином в прямое взаимодейст-
вие, в результате которого последний утрачивает свою биологичес-
кую активность. Примером может служить авидин — белок яиц,
который связывается с биотином, образуя нерастворимый авидин-
биотиновый комплекс, не всасывающийся в кишечнике. При этом
развивается авитаминоз Н. К этой же группе относится аскорба-
токсидаза, окисляющая аскорбиновую кислоту, тиаминаза, разру-
шающая тиамин, и т. д.
2. Структурные аналоги витаминов, в которых та или иная
функциональная группа замещена, что приводит к потере молеку-
лой витаминной активности. Это частный случай типичных антиме-
таболитов. Примерами могут служить сульфаниламиды — конку-
ренты парааминобензойной кислоты, кумарин — конкурент вита-
мина К-
ГЛАВА 11
ВОДНО-СОЛЕВОИ ОБМЕН
11.1. Поддержание концентраций растворенных веществ —
важное условие жизни
В самом общем виде живой организм можно описать как вод-
ный раствор, заключенный в оболочку — поверхность тела. Объем
организма и концентрация растворенных веществ должны сохра-
няться постоянными в довольно узких пределах, так как для опти-
мального функционирования организма требуется совершенно
определенный и относительно неизменный состав жидкостей тела.
Значительные отклонения от нормального состава обычно несов-
местимы с жизнью. Перед живым организмом стоит задача под-
держать надлежащие концентрации растворенных веществ в жид-
костях тела, несмотря на то, что они почти всегда отличаются от
соответствующих концентраций во внешней среде. Разница кон-
центраций стремится выравняться, нарушая требуемое постоянство
внутренней среды. Живые организмы сводят к минимуму возни-
кающие трудности, уменьшая градиенты или проницаемость. Тем
не менее всегда происходит некоторая диффузионная утечка, и пос-
тоянство внутренней среды не может сохраняться, если организм
не создает противоток, в точности равный этой утечке.
Задачи поддержания постоянных концентраций воды и раство-
ренных в ней веществ меняются в зависимости от окружающей
среды, и они совершенно различны в морской воде, в пресной воде
и на суше. Водных животных, переносящих большие колебания
концентраций солей в воде, называют эвригалинными (от греч.
эурис — широкий, галос — соль), животных же, обладающих огра-
ниченной толерантностью (терпимостью) к изменениям концентра-
ции солей, — стеногалинными (от греч. стенос—узкий). Когда
животное гипертонично по отношению к окружающей среде, оно
сталкивается с двумя физиологическими «трудностями»: 1) вода
стремится проникнуть внутрь тела из-за более высокой концентра-
ции веществ жидкостей организма; 2) растворенные вещества
стремятся выходить наружу, так как их внутренняя концентрация
выше. Большую роль в преодолении этих трудностей играют про-
цессы активного транспорта веществ.
Самое большое преимущество жизни на суше состоит в доступ-
ности кислорода, наибольшей угрозой для наземной жизни являет-
493
ся опасность обезвоживания. Наиболее успешно переход к назем-
ной жизни осуществили членистоногие и позвоночные, они очень
хорошо приспособлены к жизни на суше, имеют ряд приспособле-
ний, предотвращающих потерю воды.
Растения тоже обладают рядом защитных приспособлений,
оберегающих организм от избыточных концентраций солей, а
также активными механизмами поглощения тех ионов, которых
мало в питательном субстрате. Корневая система — первый, очень
важный барьер на пути солей из почвы в надземную часть расте-
ний, здесь задерживается значительная часть избыточных ионов и
токсических солей (адсорбционно, хелатирующими метаболитами
и т. д.). Однако эти защитные возможности не безграничны: при
очень высоком содержании в почве отдельные ионы в избытке пос-
тупают и в листья.
По отношению к солям все растения делят на гликофиты (рас-
тения пресных мест обитания) и галофиты (растения засоленных
местообитаний). Способность растений выносить засоление может
быть обусловлена разными причинами: 1) устойчивостью прото-
плазмы к накоплению солей в больших концентрациях; 2) выделе-
нием избыточных солей через поры листьев и стеблей (лох, тама-
рикс); 3) малой проницаемостью клеток корня для солей.
Особенно острым моментом для растения в поддержании посто-
янства внутренней среды является водный баланс. Для активного
поглощения СОг воздуха при фотосинтезе у растений в процессе
эволюции выработалась обширная площадь листовой поверхности.
Но через большую поверхность идет непрерывное испарение воды
в громадном количестве. Одно растение кукурузы, например, за
вегетацию испаряет до 180 кг воды, а 1 га в Южной Америке ис-
паряет в среднем за сутки около 75 т воды. Тем не менее у расте-
ний есть механизмы, позволяющие восполнять эти потери и под-
держивать водный баланс.
Способность живого организма к поддержанию постоянства
«внутренней среды» — одно из самых существенных достижений
эволюции, оно резко уменьшило зависимость организма от мно-
гих изменений внешней среды.
11.2. Содержание и роль воды в организме,
водный обмен
Вода составляет около 75% биомассы Земли, однако ее содер-
жание в разных видах живых организмов, различных их тканях и
органах колеблется в широких границах. Так, биологические жид-
кости (кровь, лимфа, слюна, пасока деревьев) содержат 88—99%
воды, в то время как в костной ткани животных, древесине расте-
ний ее значительно меньше — 20—45%, в зерне злаковых (воздуш-
но-сухое состояние) — 12—14%. Своеобразными рекордсменами по
содержанию воды являются медузы — до 99,8%- У бактерий на во-
ду приходится 75—85% массы клетки, у спор — 40% и меньше. Чем
494
моложе организм или орган, тем выше в нем содержание воды.
Например, у 4-месячных эмбрионов человека воды содержится 94%,
у новорожденных — 74%, у взрослого человека — около 67%. В мо-
лодых листьях травянистых растений количество воды колеблется
в пределах 85—90%, а в старых — 70—80%.
Большую часть воды в организме (у человека до 2/3) составля-
ет внутриклеточная вода; меньшую часть (у человека около Уз) —
внеклеточная вода, которая разделена на субкомпартменты: интер-
стициальная (межклеточная), вода плазмы крови, лимфы, церебро-
спинальная, синовиальная и др. Распределение воды в теле челове-
ка неравномерно, наименьшее количество ее содержат кости (45%)
и жировая ткань, наибольшее — кровь (92%), моча (83%), слюна
(99%), пот (97%).
Вода в живом организме может быть в свободной и связанной
форме. Если в водном растворе содержатся ионы какого-либо элек-
тролита, то вокруг них ориентируются диполи воды, так как ионы
обладают зарядом. Вокруг катионов диполи воды располагаются
своими отрицательно заряженными концами, вокруг анионов —
положительно заряженными. Такое связывание воды называется
электростатической гидратацией.
Высокомолекулярные соединения тоже гидратируются, если со-
держат полярные, ионогенные группировки (карбоксильные, альде-
гидные, спиртовые, аминогруппы и др.). При этом гидратная обо-
лочка может быть не сплошной, а только вокруг полярных групп.
Степень гидратации различных ионов и молекул не одинакова,
зависит от размеров частиц и величины их заряда. Чем выше
удельная плотность заряда (больше заряд и меньше размеры), тем
сильнее гидратация. Молекулы воды располагаются при гидрата-
ции тремя слоями: 1) непосредственно около иона, строго упорядо-
чены и ориентированы сильным электрополем; 2) слой воды на не-
котором отдалении от иона, ориентированность молекул воды мень-
шая; 3) далеко отстоящие от иона молекулы воды с обычной
структурой.
Благодаря гидратации ионов и молекул часть воды в организме
находится в связанном состоянии. Водородные связи макромолекул
также удерживают часть молекул воды. Вокруг молекул белка,
например, слой строго структурированной воды достигает толщи-
ны 1—2 нм и составляет до 30% массы гидратированной белковой
молекулы. Следующий слой гидратационной воды — до 10 нм, и
вода еще сохраняет в нем некоторую ориентацию. Кроме того, во-
да входит в третичную структуру ряда макромолекул и надмоле-
кулярных структур. Помимо того, что вода связана непосредствен-
но на молекулярном уровне, она входит и в состав субклеточных
образований: рибосом, лизосом, мембран митохондрий, эндоплаз-
матического ретикулума, ядерной оболочки. Воду, связанную
субклеточными образованиями, называют иммобильной
водой.
495
Вода
Свободная
Связанная
Слабо связанная вода
диффузионных слоев
гидратационных оболочек,
структурированная вода
Прочно связанная
вода первого
гидратационного
слоя
Слабосвязанная вода может служить растворителем, замерзает
при температурах, близких к 0°С. Прочносвязанная вода почти не
способна быть растворителем, она замерзает при температурах
значительно ниже 0°С.
Велика и многообразна роль воды в жизни любого организма.
Прежде всего она заключается в том, что вода является основной
средой протекания жизненных процессов. В этом отношении очень
важны уникальные свойства воды как растворителя. Присутствие в
молекуле воды двух атомов водорода и двух необобщенных элек-
тронных пар обуславливает образование 4 водородных связей, ко-
торые придают воде исключительную растворяющую способность.
Это свойство позволило воде стать универсальной и доминирую-
щей дисперсионной средой в биологических системах. Другое важ-
ное свойство воды — полярность ее молекул, способность к диссо-
циации. Благодаря этому свойству она активирует диссоциацию
других веществ, особенно слабых электролитов, которые широко
представлены в биологических системах. В чистом виде слабые
электролиты находятся в недиссоциированном состоянии. При ра-
створении в воде они диссоциируют и становятся реакционно-ак-
тивными, что часто является условием их биологической активно-
сти.
Будучи основой внутренней среды в клетках и участвуя непос*
редственно в формировании клеточных структур, вода в значитель-
ной мере определяет их активность. Так, от степени набухания
митохондрий зависит интенсивность протекающих в них процессов
окислительного фосфорилирования, от насыщения водой рибо-
сом — активность биосинтеза белка. Обезвоживание листьев рас-
тений снижает интенсивность фотосинтеза вследствие неблагопри-
ятных конформационных изменений ферментов хлоропластов,
участвующих в темновой фазе фотосинтеза (другая причина —
закрывание устьиц). Только при определенной степени оводненно-
сти белки и нуклеиновые кислоты полностью проявляют свою
биологическую активность.
Вода непосредственно участвует в ряде биохимических реак-
ций, прежде всего — в гидролитических. Важную роль она играет
в процессах теплорегуляции, ее испарение через поверхность тела
животных и растений снижает температуру, предотвращает пере-
грев. Вода характеризуется очень высокой теплотой парообразова-
ния и теплоемкостью, это обеспечивает надежную стабилизацию
температуры организма. Вода определяет легкость протекания об-
496
менных процессов между организмом и средой: например, увлаж-
ненность стенок клеток корневых волосков способствует растворе-
нию и поглощению питательных солей корнями. Малая вязкость
воды обеспечивает высокую скорость движения по кровеносным и
лимфатическим сосудам, по флоэме и ксилеме растений. Большое
значение воды в процессах жизнедеятельности объясняет, почему
животные переносят отсутствие воды хуже, чем отсутствие пищи.
Например, голуби без пищи погибают через 2 недели, а без воды —
через 5 дней, мыши без воды погибают в 10 раз быстрее, чем без
пищи.
В обычных условиях взрослый человек теряет в сутки 1500 мл
воды, 600 мл удаляется через кожу в виде пота, 500 мл — с мочой,
400 мл — с выдыхаемым воздухом. Основная масса воды потребля-
ется с пищей. Так как при полном окислении белков, жиров и угле-
водов в количествах, обеспечивающих выделение энергии, равное
8400 кДж/сут, образуется 350 мл воды, то потребление воды долж-
но составлять 1150 мл. Вода, образующаяся при обмене белков, жи-
ров и углеводов, получила название эндогенной воды.
Очень энергично обмен воды осуществляется в растениях: в
жаркий день через лист проходит количество воды, в два раза пре-
вышающее его массу. Предел потери воды, при котором нет еще
видимых резких нарушений жизненных процессов, зависит от вида
организма. Так, мышечная ткань лягушки может терять воду с 80
до 20% без существенных отрицательных явлений. Тело же чело-
века может перенести снижение содержания воды не более чем
на 10%. Растения тоже очень чувствительны к потере воды; только
в семенах и спорах жизнь сохраняется при очень низком содержа-
нии воды (около 10%).
Проникновение воды в клетку и обратно осуществляется через
поры клеточных мембран. Механизм этого процесса исследован
недостаточно. Существует ряд точек зрения на этот процесс. По
мнению одних ученых, перенос воды осуществляется за счет сво-
бодной диффузии, другие — придают решающее значение осмоти-
ческим явлениям, третьи — считают этот процесс активным, что
обусловлено взаимодействием дипольных молекул с полярными
веществами мембран.
В регуляции обмена воды у человека и животных первостепен-
ное значение имеют импульсы, возникающие в коре головного
мозга. Поступление воды в организм регулируется чувством жаж-
ды, она возникает в результате рефлекторного возбуждения соот-
ветствующих участков коры головного мозга при первых признаках
изменения осмотического давления плазмы крови.
Исследованиями выдающихся советских физиологов Л. А. Ор-
бели и К. М. Быкова доказана регулирующая роль высших отделов
центральной нервной системы в процессах водного и минерального
обмена: при мнимом питье у животного с фистулой в пищеводе
вода не попадает в желудок, однако сам акт питья способствует
удалению воды из кровяного русла, что наблюдается при нормаль-
ном приеме воды. Сильные эмоциональные переживания нередко
497
сопровождаются усиленным выделением мочи, а иногда приводят,
наоборот, к анурии — задержке мочеотделения.
Гормоны гипофиза оказывают существенное влияние на баланс
воды. Диуретический гормон передней доли гипофиза обеспечивает
выведение воды, а его антагонист вазопрессин (гормон задней доли
гипофиза) удерживает воду, обеспечивая обратное всасывание ее
в почечных канальцах. Катионы Na удерживают воду в клетках и
тканях, К и Са способствуют ее выведению. Всасывание воды на-
чинается в желудке, однако основная масса ее всасывается в ки-
шечнике. Ряд тканей и органов при избыточном поступлении воды
могут служить ее депо. У человека и животных это кожа и печень,
у растений — межклеточное пространство. Уровень испарения во-
ды у растений регулируется в основном устьичным аппаратом.
11.3. Минеральные вещества
Образующаяся после сжигания живого организма зола состав-
ляет у позвоночных животных 3—5% от массы всего тела, у расте-
ний меньшее количество — 0,5—3%, еще меньше у микроорганиз-
мов— 0,4—2%. Отдельные ткани и органы существенно отличают-
ся по содержанию зольных элементов. Так, в костной ткани позво-
ночных животных их количество составляет около 17%, в сухой
обезжиренной ткани зубов — до 55, а в мышцах и плазме крови —
менее 1 % на сырую массу. У растений минеральных веществ много
в листьях—10—15% на сухую массу, существенно меньше в кор-
нях и семенах — 3—5%, особенно мало в древесине— 1 %. Для бак-
терий характерны очень большие колебания в содержании зольных
элементов в зависимости от условий выращивания. Так, у Vibrio
cholerae границы колебаний составляют от 6 до 26% на сухую мас-
су, в то время как при стандартной питательной среде и обычных
других условиях — 3—10%.
Минеральные элементы присутствуют в живом организме в раз-
личных формах: 1) в прочном соединении с органическими веще-
ствами (S в составе белков, Р — в нуклеиновых кислотах, Fe — в
гемоглобине, Zn и Си — в молекулах ряда ферментов); 2) в форме
нерастворимых отложений (Са и Р в костях); 3) в растворенном
состоянии в тканевых жидкостях, цитозоле (катионы К+, Na+,
Mg2+, Са2+, анионы Cl", SO2’, РО;3 ).
Велико и многосторонне значение неорганических солей в
жизни любого организма. Они создают определенное осмотическое
давление в отдельных тканях, органах, жидкостях, которое являет-
ся важным физиологическим фактором, влияющим на распределе-
ние воды и растворенных веществ по отдельным тканям. Особенно
чувствительны к изменениям осмотического давления высшие жи-
вотные, у них в процессе эволюции выработались приспособления,
обеспечивающие постоянство осмотического давления плазмы кро-
ви, лимфы, внеклеточной жидкости.
Так, осмотическое давление плазмы крови человека колеблется
в достаточно узких границах (7,7—8,1 атм.). Такое постоянство
498
поддерживается особой регуляторной системой, в которой основ-
ную роль играют почки и потовые железы. В противоположность
этому у морских беспозвоночных осмотическое давление в организ-
ме зависит от осмотического давления окружающей воды. Если
разводить морскую воду пресной, давление у них уменьшается.
У растений разность осмотического давления клеточного сока и
тургорного напряжения оболочки клетки определяет «сосущую си-
лу» клетки, интенсивность поступления воды и питательных
веществ. Для растений характерны большие колебания величины
осмотического давления в зависимости от условий выращивания.
Так, у пресноводных водорослей в клетках эпидермиса оно колеб-
лется в границах 1—3 атм. У полевых растений — 5—10 атм, у пус-
тынных и солончаковых растений 80—100 атм. Однако для каждо-
го вида растений существуют определенные физиологические
допустимые пределы изменений осмотического давления. Кроме
минеральных солей оно определяется также содержанием сахаров
и аминокислот.
Образуя буферные системы, некоторые минеральные соли спо-
собствуют поддержанию постоянства pH тканей и жидкостей орга-
низма. Так, у человека pH крови и тканей изменяется в очень
небольших пределах (pH 7,3—7,4), несмотря на непрерывное об-
разование самых разнообразных кислот. При подкислении крови
до pH 6,8 наступает смерть.
Жизнедеятельность теплокровных животных тоже может про-
текать только в узких рамках изменения реакции среды (pH 7,4—
7,0). У человека и животных функционируют три главные буфер-
ные системы: фосфатная, бикарбонатная и белковая. Фосфаты сос-
тавляют основной буфер мочи. В крови и тканях фосфатов относи-
тельно немного, поэтому в них емкость фосфатного буфера неве-
лика. Бикарбонатный буфер играет первостепенную роль в крови,
здесь емкость этого буфера велика (25—35% от общей буферной
емкости). Белковая буферная система носит универсальный харак-
тер и встречается во многих тканях.
Значение ряда минеральных элементов связано с их присутст-
вием в составе некоторых биологически важных соединений: Mg —
в молекуле хлорофилла, Fe — в гемоглобине, S — в белках, Р — в
нуклеиновых кислотах и ряде белков, I — в гормоне щитовидной
железы. Многие катионы металлов входят в состав отдельных фер-
ментов.
Способность минеральных элементов взаимодействовать с мо-
лекулами важнейших биополимеров — белков и нуклеиновых кис-
лот— определяет их влияние на формирование пространственной
структуры высокомолекулярных соединений. Большое значение в
этом отношении может иметь концентрация и состав ионного ок-
ружения, иногда независимо от образования химических связей
ионов с биополимерами. Влияя на конформацию и физико-химиче-
ские свойства биологически важных соединений, мембран и других
субклеточных структур, неорганические ионы воздействуют тем
самым на их функции — каталитическую, гормональную, тран-
499
спортную, формообразовательную и др. Хорошо известно в этом от-
ношении действие ионной силы на конформацию РНК, ДНК и
белков, влияние Mg2+ на функционирование рибосом, роль Са2+ в
регуляции аденилат-и гуанилатциклазной систем и т. д.
Особенно велико значение минеральных элементов в функцио-
нировании ферментативного аппарата любого живого организма.
Действие неорганических ионов на ферменты может быть прямым
и косвенным. При прямом ионы либо входят в состав ферментатив-
ной молекулы или фермент-субстратного комплекса, либо высту-
пают в роли аллостерических эффекторов и неспецифических аген-
тов, влияющих на физико-химические свойства ферментов, их
конформацию, не будучи их обязательными компонентами. Многие
ферментативные реакции протекают только в присутствии опреде-
ленных ионов.
Косвенное действие неорганических ионов на ферменты может
осуществляться через изменения: 1) физико-химических свойств
цитоплазмы, структуры воды в клетке; 2) структуры и свойств био-
мембран, поскольку многие ферменты являются мембраносвязан-
ными; 3) содержания субстратов отдельных ферментов; 4) актив-
ности биосинтеза ферментативных белков.
Роль зольных веществ в жизнедеятельности организмов связана
с рядом других явлений и процессов. Так, Са3(РО4)2 придает
прочность костной ткани; Na2CO3 участвует в транспорте СО2 от
дышащих тканей к легочным альвеолам. Особое значение среди
минеральных веществ имеют микроэлементы. Они входят в состав
живых организмов в очень малых количествах (10~6—10~12%), тем
не менее крайне необходимы, так как их отсутствие приводит к
серьезным нарушениям метаболизма. Объясняется это тем, что
микроэлементы активируют многие ферментативные процессы (бу-
дучи в составе или самих ферментов, или их активаторов), а также
необходимы для образования некоторых витаминов и гормонов.
К микроэлементам относятся: В, Мп, Zn, Си, Mo, Со, Ni, Li, Se,
I, Cl, Br, As и некоторые другие элементы. Компонентами молекул
ряда ферментов являются Си, Zn, Мо. Мп активирует ферменты
ЦТК, некоторые ферменты азотного обмена, а также ферменты
биосинтеза ауксина — важнейшего фитогормона, способствует об-
разованию витамина С у растений. I входит в состав гормонов щи-
товидной железы — тироксина и трииодтиронина, Со — в молекулу
витамина Bi2. Вг принимает участие в биосинтезе гормонов гипо-
физа.
В организме человека и позвоночных животных из катионов осо-
бенно много содержится Са (около 15 г/кг массы тела, преимуще-
ственно в костях), К (~ 3,5 г/кг), Nа+ (~ 1,5 г/кг), Mg (~ 0,5 г/кг),
Fe (~0,04 г/кг). Из металлоидов преобладают Р (~10 г), Se (~
2,2 г), С1 (~ 1,5 г). Потребность организма взрослого человека в
минеральных солях в сутки составляет 4—6 г Na, 2—4 г С1, 2—Зг
К, 0,7—0,8 г Са, 1,5—2 г Р и 0,015—0,020 г Fe. Потребность в Са и
Р при беременности и в детском возрасте до 8 лет возрастает. Пос-
тупление NaCl связано с привычными вкусовыми ощущениями и
500
резко превышает потребное количество. Всасывание растворимых
солей происходит на всем протяжении тонкого кишечника без ко-
личественных ограничений.' Изменение осмотического давления и
ионного состава крови и тканевых жидкостей при этом не наступа-
ет благодаря усилению выделения солей через почки и потребле-
нию организмом избытка воды (хорошо известно, что после при-
ема соленой пищи жажда резко возрастает).
Выделение не использованных организмом солей происходит с
мочой, калом, потом. При работе в горячих цехах, во время продол-
жительных маршей, при активных, занятиях спортом и т. д. проис-
ходит обильное потоотделение, которое может вызвать заметное
«обессоливание». В этих случаях рекомендуют питье с небольши-
ми добавками NaCl. При недостаточном поступлении в организм
минеральных элементов возникают тяжелые заболевания. Сниже-
ние содержания I в питьевой воде приводит к развитию эндемичес-
кого зоба. Недостаток Си и Со вызывает анемию (малокровие)
различного характера. Минеральный обмен тесно связан с обменом
гормонов. Так, в контроле обмена Са участвуют паращитовидные
железы, гормоны коры надпочечников регулируют содержание Na
и К. Солевой обмен тесно связан с водным обменом. При тяжелых
патологических процессах, связанных с обезвоживанием, наблю-
дается и обессоливание, в частности обесхлоривание.
Для растительных тканей особенно характерно высокое содер-
жание К (25—35% КгО от общей массы золы). Достаточно много
Р (7—10% Р2О5) и Са (3—30% СаО). Солома злаков очень бога-
та Si (свыше 40% массы всей золы), а зерно злаков — Р (до 50%,
в основном в форме фитина). Количество Са в золе с возрастом
обычно растет, в коре старого дуба на его долю приходится свыше
90% всей золы.
Опытами, в которых растения выращивались на водных раство-
рах минеральных солей, с исключением отдельных из них, уста-
новлено, что для жизнедеятельности высших растений необходимы
следующие семь макроэлементов: N, Р, К, S, Са, Mg, Fe. Необхо-
димы также микроэлементы, но в столь малых количествах, что
бывает достаточным их содержание в водопроводной воде и в ка-
честве примесей в солях макроэлементов. При выращивании рас-
тений в полевых условиях в почве достаточно быстро истощаются
запасы N, Р, К, поэтому основными минеральными удобрениями
являются азотные, фосфорные, калийные. Продовольствен-
ная программа СССР, принятая майским (1982 г.) Пленумом
ЦК КПСС, предусматривает существенный рост производства ми-
неральных удобрений в нашей стране.
У бактерий постоянными элементами золы являются: Р, К, Na,
Mg, Са, Fe, S, Cl. Соли этих элементов входят, как правило, в сос-
тав питательных сред для бактерий в ощутимых количествах —
0,1—1%. Особенно богаты микробные клетки фосфором (10—45%
Р2О5 от всей золы, а у Mycobacterium tuberculosis — 75%). Си, Si,
Zn, Со, Мп присутствуют в очень малых количествах и действуют
как микроэлементы.
ГЛАВА 12
ИНТЕГРАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА
12.1. Обмен веществ как единая система
процессов
В предыдущих разделах для удобства изложения и усвоения
материала раздельно были рассмотрены обмен белков, нуклеино-
вых кислот, углеводов, дипидов и других групп соединений. Однако
в живом организме все эти обмены протекают взаимосвязанно,
жизнь немыслима без тесного их взаимодействия. При этом обмен
веществ организма в целом не следует понимать как сумму обме-
нов белков, углеводов и т. д. В результате взаимодействия отдель-
ных обменов возникает единая система метаболических процессов,
общий обмен веществ, представляющий собой качественно новое
образование — жизнь. В этом находит отражение одно из сущест-
венных положений диалектического материализма о несводимости
целого к сумме частей в случае сложно организованных объектов.
Целое характеризуется новыми качествами и свойствами, не при-
сущими отдельным частям (элементам), но возникающим в ре-
зультате их взаимодействия в определенной системе связей. Взаи-
мосвязь обменов отдельных классов веществ особенно хорошо
выражена в процессах их взаимного превращения (хотя и не сво-
дится к этому).
12.1.1. Взаимосвязь белкового и углеводного обменов. Связую-
щим звеном многих обменов, в том числе белкового и углеводного,
является цикл трикарбоновых кислот. Продукты гликолиза и окис-
лительного расщепления углеводов в ЦТК — пировиноградная,
а-кетоглутаровая, щавелевоуксусная кислоты в результате амини-
рования и переаминирования образуют многие аминокислоты, ис-
пользуемые для синтеза белков. Взаимодействие фосфоенолпирува-
та (гликолиз) с эритрозофосфатом (пентозофосфатный путь рас-
щепления углеводов) ведет к синтезу шикимовой кислоты — пред-
шественницы фенилаланина, тирозина, триптофана. Гистидин обра-
зуется из другого участника пентозофосфатного цикла — рибозо-5-
фосфата. Таким образом, продукты расщепления углеводов при
аминировании дают аминокислоты, из которых синтезируются бел-
ки. Не удивительно поэтому, что растения при хорошем освещении,
когда в процессе фотосинтеза образуется много углеводов, в боль-
шем количестве усваивают азотные соли на синтез белков, чем при
недостаточном освещении. Этим же объясняются и результаты ис-
следований Д. Н. Прянишникова (1945), согласно которым содер-
502
жание углеводов в растительных тканях является важнейшим ус-
ловием ассимиляции аммиака.
Переход от белков к углеводам начинается с гидролиза белков
до аминокислот, которые затем дезаминируются, а выделившиеся
кетокислоты (пируват, а-кетоглутарат, оксалоацетат) вступают в
ЦТК и через пируват включаются в реакции глюконеогенеза с об-
разованием углеводов. Однако белки по сравнению с углеводами
являются для живого организма более ценными соединениями, об-
разующими основу всех клеточных структур, поэтому их превраще-
ние в углеводы происходит в природе в небольших масштабах.
В лабораторных же условиях при кормлении животных пищей, бо-
гатой белками, можно наблюдать отложение гликогена в печени
даже при ограничении или исключении из диеты углеводных про-
дуктов. Использование белков в процессе дыхания также наблю-
дается крайне редко, при длительном углеводном дефиците. Актив-
но образуются углеводы из белков и аминокислот у больных са-
харным диабетом. В опытах с экспериментальным диабетом у
собак показано, что из 100 г белков образуется от 50 до 80 г глю-
козы.
Важную роль в превращениях аминокислот в углеводы играют
глюкокортикоиды — гормоны коры надпочечников.
Известны и другие пути взаимодействия белков и углеводов.
Они выражаются прежде всего в образовании разнообразных и
очень важных в обмене веществ белок-углеводных комплексов —
гликопротеинов. Не следует также забывать, что на биосинтез бел-
ков расходуется в большом количестве энергия, которая высвобож-
дается при расщеплении углеводов в процессе дыхания. С другой
стороны, любая реакция углеводного обмена катализируется фер-
ментами, которые все являются белками.
12.1.2. Взаимосвязь обмена углеводов и липидов. Известно, что
избыточное употребление в пищу углеводов (мучные и крупяные
изделия) приводит к отложению жиров в организме. Откорм сви-
ней, которые способны образовывать жир в громадном количестве,
производят крахмалсодержащими продуктами — картофелем, зер-
ном кукурузы. В коре многих деревьев накопившийся за лето крах-
мал к концу осени превращается в масла. Тот же процесс протекает
при созревании орехов лещины: в июле — августе в них образуется
крахмальное «молочко», которое в сентябре заменяется плотным
ядром с высоким содержанием масел.
Обратный процесс превращения жиров в углеводы отчетливо
наблюдается у животных, находящихся в зимней спячке (медведи,
сурки, ежи). За зиму у них полностью исчезают жировые запасы,
однако уровень содержания гликогена в печени длительное время
остается достаточно высоким. В процессе превращения жиров в уг-
леводы усиливается потребление кислорода, поскольку в жирах
кислорода мало, а в углеводах его значительно больше. У растений
активное превращение масел в углеводы идет при прорастании
масличных семян. Связующим звеном в превращении углеводов в
липиды (а у бактерий, растений и в обратном направлении) явля-
503
ется ацетил-КоА. Он образуется из пировиноградной кислоты —
конечного продукта гликолиза углеводов — и представляет собой
исходное соединение для синтеза высших жирных кислот, стеролов,
полиизопреноидов. Глицерин, необходимый для образования мно-
гих липидов, получается в результате восстановления промежуточ-
ных продуктов гликолиза углеводов — глицеральдегидфосфата и
дигидроксиацетонфосфата с последующим отщеплением Н3РО4.
С другой стороны, один из основных продуктов расщепления ли-
пидов—глицерин—легко используется в синтезе углеводов через
образование глицеральдегидфосфата и его вступление в глюконео-
генез. У растений и микроорганизмов столь же легко используется
на синтез углеводов и другой важный продукт расщепления липи-
дов— ацетил-КоА (через гликоксилатный цикл, см. разд. 6.9.6).
Более сложна картина использования ацетил-КоА в животных
тканях. Если скармливать животным меченную по углероду уксус-
ную кислоту, метка будет включаться в гликоген печени. Однако
истинного синтеза глюкозы из ацетильной группы в тканях высших
животных не происходит: у них нет прямого метаболического пути
использования ацетил-КоА в глюконеогенезе (продукт конденса-
ции ацетил КоА с оксалацетатом — лимонная кислота в конечном
счете теряет три атома углерода на образование СО2). Видимо,
включение ацетил-КоА в биосинтез углеводов у животных носит
опосредованный характер.
12.1.3. Взаимосвязь белкового и липидного обменов. Только что
рассмотренные взаимосвязи «белки ^углеводы» и «углеводы^
^липиды» дают основание для объединения их в единую цепь
«белки^углеводы^липиды», в которой углеводы являются связую-
щим звеном между белками и липидами. Так в действительности и
может происходить в природе, однако существуют и более корот-
кие пути взаимосвязи белков и липидов. Один из основных продук-
тов расщепления липидов — ацетил-КоА, включаясь в ЦТК, обра-
зует кетокислоты, аминирование которых дает аминокислоты.
Другой важный продукт гидролиза липидов — глицерин — в ре-
зультате длинной цепи превращений через глицеральдегидфосф ат
в шикимовую кислоту участвует в биосинтезе циклических амино-
кислот. В известной мере возможен и обратный процесс синтеза
липидов за счет распадающихся белков. Продукты дезаминирова-
ния аминокислот через ЦТК и другие метаболические процессы об-
разуют пируват, при окислительном декарбоксилировании которого
возникает ацетил-КоА — исходное соединение для синтеза жирных
кислот и других компонентов липидов.
Взаимосвязь белков и липидов выражается, кроме того, непос-
редственно в образовании различных комплексов липопротеинов.
Биосинтез белков и их функционирование (например, в качестве
ферментов) всегда тесно связаны со структурой и свойствами кле-
точных мембран, в которых липиды играют важнейшую роль. С
другой стороны, в обмене липидов, как и любых других соединений,
первостепенное значение имеют белки.
504
12.1.4. Единство метаболических процессов и внешняя среда.
Рассмотрение взаимосвязей отдельных обменов хорошо демонст-
рирует центральную роль в них цикла трикарбоновых кислот как
основного амфиболического пути (см. рис. 1.1). Продукты катабо-
лизма, расщепления веществ разных классов, вступают в превра-
щения по этому циклу и дают исходные соединения для биосинтеза
многих веществ. Важнейшими звеньями при этом во многих случа-
ях являются ацетил-КоА и пируват. Двухуглеродные фрагменты
ацетил-КоА представляют собой как бы универсальные строитель-
ные элементы, на которые «разбираются» многие вещества жи-
вотного организма и из которых организм может вновь синтезиро-
вать другие соединения.
Крайне существенно подчеркнуть, что единство обменных про-
цессов находится под постоянным воздействием условий внешней
среды. Это воздействие выражается прежде всего в непрерывном
обмене веществами между организмом и средой, что является важ-
нейшим условием жизни как формы существования белковых тел.
Ферменты, катализирующие и тем самым регулирующие почти все
метаболические реакции, очень чувствительны ко многим факторам
внешней среды: температуре, pH, различным излучениям, солево-
му составу и т. д. В результате ферменты через внешние условия
оказывают мощное влияние на весь метаболизм. Перечисленные
факторы среды могут оказывать также непосредственное действие
на пространственную структуру и химические свойства веществ
живого организма (особенно — высокомолекулярных). Конкретные
иллюстрации влияния условий среды на метаболизм представлены
во всех предыдущих разделах.
12.2. Уровни и принципы регуляции метаболизма
Для любого живого организма характерно состояние высокой
степени упорядоченности, т. е. тонкое согласование всех биохими-
ческих процессов. Оно наблюдается в самых различных условиях
существования живой материи: активности и покоя, индукции и
репрессии, аэробиоза и анаэробиоза и т. д. Во всех этих случаях
действуют регулирующие механизмы, обеспечивающие высокую
степень приспособляемости живых организмов к соответствующей
ситуации, благоприятное и целесообразное течение всех жизненных
процессов.
В процессе эволюции в зависимости от условий жизни и уровня
организации отдельных таксономических групп выработалась це-
лая сеть регуляторных и контролирующих механизмов. Следует
различать разные уровни систем регуляции. Наиболее простая из
них — регуляция на уровне отдельных реакций. Можно предпола-
гать, что уже на самых ранних этапах возникновения жизни из не-
органической природы была «заимствована» элементарная система
регуляции реакций, описываемая законом действующих масс: ско-
рость реакции пропорциональна ’произвёденйю концентраций реа-
гирующих веществ. Для обратимых реакций это означает, что на-
505
копление продуктов реакции приводит к замедлению ее скорости.
Таким путем у протобионтов (предшественники живых клеток)
могли затормаживаться реакции, в результате которых произошло
достаточное накопление того или иного вещества.
В дальнейшем в систему регуляции включались, видимо, небио-
логические катализаторы: катионы металлов, амины (катализиру-
ют декарбоксилирование) и т. д. Их каталитическое действие на
следующих этапах эволюции усилилось в результате усложнения
молекул, образования комплексов с белками, возникли ферменты —
мощные катализаторы и регуляторы.
Следующий уровень регуляции — системы многих сопряженных
реакций, целая клетка. На этом уровне первостепенное значение в
регуляции имеет согласованно действующий ферментативный ап-
парат клетки с системой положительных и отрицательных обрат-
ных связей, включением в регуляцию генетического аппарата. Важ-
но подчеркнуть, что на уровне систем ферментативных реакций
уже достаточно хорошо функционирует саморегуляция, «биоавто-
матика»— в этом смысл обратных связей. В регуляторных процес-
сах на клеточном уровне велик удельный вес клеточных мембран,
процессов компартментализации.
Высокоразвитые организмы в отличие от низших форм облада-
ют дополнительными регуляторными механизмами. Природа их
многообразна. Они могут, например, выражаться в том, что от-
дельные клетки в тканях и органах теряют свою автономность;
их обмен веществ, скорость деления, секреция подчинены функциям
органа. Появились факторы, включающие многоклеточные струк-
туры в жизнь всего организма, согласовывающие и контролирую-
щие в нем метаболизм и функции отдельных органов и тканей —
нервная и эндокринная система.
В организме многоклеточных животных роль непосредственных,
первичных посредников (мессенджеров) действия факторов внеш-
ней и внутренней среды выполняют гормоны и нервные импульсы.
Передача нервных импульсов от одного нейрона к другому и
на иннервируемые ими клетки, ткани и органы осуществляется с
помощью особой группы веществ — нейромедиаторов, или нейро-
трансмиттеров. Они секретируются нервными окончаниями и при
передаче импульса выделяются в синаптическую щель; взаимодей-
ствуют со специфическими рецепторами на постсинаптической мем-
бране. В результате взаимодействия медиатора с рецепторами ми-
шени изменяется постсинаптическая мембрана и меняется ее ион-
ная проницаемость. Выход в синаптическую щель управляется по-
тенциалом пресинаптических мембран. Запускается ряд реакций,
заставляющих постсинаптическую нервную клетку или клетку
иннервируемой ткани, органа выполнять свои специфические функ-
ции. Длительность действия медиаторов регулируется определен-
ными механизмами.
Типичными нейромедиаторами являются ацетилхолин и норад-
реналин. К этой группе веществ относят также адреналин, дофамин,
серотонин, ГАМК, глицин и глутамат. Перечисленные соединения
506
5-АМФ
(вторичный мессенджер)
Фосфодиэстераза
Изменение функций клетки:
активация генов,
активация ферментов,
изменение проницаемости
Рис. 12.1. Система двух посредников (мессенджеров) регу-
ляции клеточных процессов:
/ и 2 — регуляторные субъединицы аденилатциклазы, тесно связан-
ные с гормональным рецептором или являющиеся его составной
частью, 3 — сопрягающая субъединица («сцепщик»), 4 — катали-
тическая субъединица
представляют различные классы химических веществ, поскольку
понятие нейромедиаторы функциональное, а не химическое. Медиа-
торы в отличие от гормонов являются агентами контактного, а не
дистантного действия, они проникают от места секреции к месту
действия посредством диффузии, тогда как гормон, чтобы достиг-
нуть клетки-мишени, должен попасть в подвижную жидкую среду
организма (кровь, лимфа).
Таким образом система кровотока, по которой гармоны достав-
ляются к тканям-мишеням, и нервная система служат в организме
основными путями передачи информации. Именно они, в основном,
обеспечивают в каждом органе или ткани и в целом организме
согласованную интеграцию большого числа разнообразных реак-
ций, процессов, создавая их гармоничный баланс в ответ на дейст-
вие внешних и внутренних факторов. Анатомической и биохимичес-
кой основой интеграции обоих путей потока информации является
гипоталамус.
507
У человека и животных нервная система играет важнейшую
роль в регуляции и интеграции обменных процессов. Расположен-
ные во всех тканях многочисленные рецепторы постоянно информи-
руют ЦНС о воздействии внешних факторов, состоянии обменных
процессов. Затем осуществляется обратная связь между ЦНС и ор-
ганами, тканями, протекает регуляция в них метаболизма. Денер-
вация мышц, печени и других органов всегда приводит к глубоким
нарушениям интенсивности и направленности метаболизма в денер-
вированных тканях. Клинические исследования И. П. Павлова убе-
дительно показали ведущую роль ЦНС в регуляции процессов пи-
щеварения. В ЦНС расположены специальные центры, регулирую-
щие отдельные виды обмена (например, «сахарный», см. разд. 6.8).
Хорошо известны случаи угнетения обменных процессов при силь-
ных нервных потрясениях (потеря аппетита, снижение основного
обмена, выброс сахара в кровь и мочу). Достоверно показано, что
чисто условно-рефлекторным путем можно изменять интенсивность
углеводного, белкового и водного обмена.
12.3. Циклические нуклеотиды
Внеклеточные сигналы в форме первичных посредников — гормо-
нов и нейромедиаторов, а также некоторых других биологически
активных веществ при достижении клеток-мишеней вызывают об-
разование вторичнык посредников внутри клетки—циклических,
нуклеотидов (цАМФ и цГМФ). Увеличение или уменьшение кон-
центрации последних в клетке приводит к различным изменениям
в метаболизме в зависимости от типа клетки и ее состояния в дан-
ный момент. цАМФ был впервые выделен и идентифицирован в
1958 г. Е. Сатерлендом, получившим впоследствии за исследования
свойств и функций этого соединения Нобелевскую премию. цАМФ
образуется из АТФ при участии фермента адекилатцкклазы:
Mg2+
АТф--------:-----> цАМФ + ФФН
Аденилатциклаза
Аденилатциклаза представляет собой компонент клеточной
мембраны; состоит из трех субъединиц. Регуляторная субъединица
находится на наружной стороне цитоплазматической мембраны и
является составной частью гормонального рецептора или тесно
связана с ним. На внутренней стороне мембраны расположена ка-
талитическая субъединица, ответственная за превращение АТФ вЗ',
5'-АМФ. В толще мембраны находится сопрягающая субъединица,
через которую передается сигнал от рецептора к каталитической
субъединице (см. рис. 12.1). Необходимыми компонентами сопря-
гающей субъединицы являются фосфолипиды; обработка фермента
фосфолипазами вызывает потерю чувствительности к гормонам.
Каталитическая субъединица активна только при взаимодей-
ствии гормонов с рецепторной субъединицей. Активация аденилат-
циклазы, увеличение содержания цАМФ происходит под действием
508
катехоламинов (адреналин, норадреналин), представляющих собой
одновременно и гормоны, и нейромедиаторы, многих других гормо-
нов (АКТГ, глюкагон, паратиреоидный гормон, вазопрессин и др.)
и ряда биологически активных веществ: простагландины Ei и Е2,
гистамин, холерный токсин и т. д. Кофакторами аденилатциклазы
являются Mg2+ и ГТФ.
Гуанилатциклаза в отличие от предыдущего фермента непроч-
но связана с цитоплазматической мембраной. Реакция образования
цГМФ активируется Mg2+, Са2+ усиливает эту активацию:
Mg2+
ГТФ---------------> цГМФ + ФФН
Г уанилатциклаза
Гуанилатциклаза отличается от аденилатциклазы, кроме того,
нечувствительностью к большинству гормонов. Исключение состав-
ляют некоторые стероидные гормоны, например эстрогены. Другие
стимуляторы аденилатциклазы тоже не действуют на гуанилатцик-
лазу. Этот фермент активируется ацетилхолином (в присутствии
Са2+), простагландинами F2« . Содержание цГМФ увеличивается
и под влиянием фитогемагглютинина (см. разд. 2.5.3). Действие
инсулина на ткани также сопровождается увеличением количества
внутриклеточного цГЛЪФ, через который, видимо, инсулин как-то
опосредует свое действие. Однако внутренние механизмы это-
го явления, причины указанных корреляций еще недостаточно
ясны.
Фосфодиэстераза 3', 57-АМФ и фосфодиэстераза 3', 5'-ГМФ ка-
тализируют гидролитическое расщепление циклических нуклеоти-
дов с образованием нециклических 5'-нуклеозидмонофосфатов:
Mg2+
цАМФ (или цГМФ)-----------------> 5'-АМФ (или 5'-ГМФ)
Фосфодиэстераза
Регуляторная функция циклических нуклеотидов осуществляет-
ся через активацию соответствующих протеинкиназ. Они состоят из
двух субъединиц: каталитической и рецепторной (или регулятор-
ной), содержащей аллостерический участок связывания цАМФ. В
отсутствие цАМФ обе субъединицы образуют малоактивный комп-
лекс, при связывании цАМФ происходит его диссоциация и
каталитическая субъединица приобретает максимальную ак-
тивность.
Белки, фосфорилируемые цАМФ-зависимыми протеинкиназами,
очень разнообразны, содержатся во всех компонентах клетки: бел-
ки хроматина (гистоновые, негистоновые), рибосомальные и мемб-
ранные белки, многие ферменты и др. Однако существуют меха-
низмы, определяющие специфичность фосфорилирования строго оп-
ределенных белков в каждой ситуации. Такая направленность
обеспечивается особенностями дифференцировки клетки, характе-
ром внешнего сигнала и функциональным состоянием клетки.
509
Доступность того или иного белка для протеинкиназы зависит
от его конформации, на которую оказывают влияние состав и кон-
центрация ионов, присутствие различных регуляторов и т. д.
цГМФ-зависимые протеинкиназы тоже состоят из каталитической
и регуляторной субъединицы. Наличие этих протеинкиназ в клетке
дает основание предполагать, что цГМФ является самостоятельным
внутриклеточным посредником, независимым от цАМФ. В связи с
этим для физиологических и биологических процессов большое зна-
чение имеет не концентрация какого-то одного из циклических ну-
клеотидов, а соотношение их концентраций. Фосфорилирование
белков протеинкиназами, как правило, активирует эти белки (на-
пример, ферментативные) или вызывает другой биохимический эф-
фект: активацию генов, изменение проницаемости мембран и др.
Фосфорилированные белки могут достаточно быстро дефосфорили-
роваться гидролитически, с участием фосфопротеинфосфатаз, кото-
рые таким путем снимают активирующее действие протеин-
киназ.
цАМФ и цГМФ рассматривают как самостоятельно функциони-
рующие регуляторы клеточного метаболизма, однако между ними
во многих случаях имеются антагонистические и реципрокные от-
ношения: 1) цГМФ (как и адреналин) стимулирует сердечные со-
кращения, цГМФ (как и ацетилхолин) —тормозит; 2) цАМФ (как
и адреналин) угнетает сокращение гладкой мускулатуры (кишеч-
ника, матки, сосудов), цГМФ (или ацетилхолин)—активирует;
3) цАМФ тормозит пролиферацию клеток, а цГМФ — стимулирует
ее; 4) цГМФ, подобно ацетилхолину, способствует деполяризации
постганглионарных нейронов, тогда как цАМФ вызывает их гипер-
поляризацию.
Наряду с этим известны и случаи однонаправленного действия
цАМФ и цГМФ: 1) секреция амилазы поджелудочной железой при-
мерно одинаково стимулируется цАМФ и цГМФ; 2) в границах оп-
ределенных концентраций оба нуклеотида стимулируют гликогено-
лиз.
Из биохимических и физиологических эффектов, вызываемых
цАМФ, кроме перечисленных заслуживают также внимания: 1) ак-
тивация липолиза, фосфоролиза гликогена; 2) стимуляция секреции
инсулина, простагландинов, кальцитонина, соляной кислоты в же-
лудке; 3) действие на белковый синтез (см. разд. 5.4); 4) инги-
бирование роста клеток; 5) ингибирование агрегации эритро-
цитов.
цАМФ легко диффундирует из клеток в различные жидкости
организма — кровь, церебральную жидкость, желудочный сок и при-
нимает участие в осуществлении разнообразных процессов жизне-
деятельности: увеличивает проницаемость мембран, участвует в
кортикостероидогенезе, в выработке приспособительных реакций,
в обмене всех классов веществ, в нервно-мышечной трансмиссии
возбуждения, в осуществлении функций ЦНС. Считают, что реали-
зация столь разнонаправленных эффектов аденилатциклазной сис-
темы возможна вследствие образования посредников (мессендже-
510
ров) 3-го порядка — разнообразных веществ с биологической ак-
тивностью.
В последние годы накапливается все больше сведений о важной
роли Са2+ в регуляции клеточного метаболизма в связи с дейст-
вием циклических нуклеотидов, гормонов и нейромедиаторов.
Высказывают предположения (М. А. Федоров, 1979), что Са2+
является основным и более древним внутриклеточным посредником
действия различных факторов на клетку, роль цАМФ часто заклю-
чается главным образом в стимуляции притока Са2+ извне и из
митохондрий. Концентрация Са2+ в клетке под влиянием внешних
стимулов может быстро и значительно меняться (от 10~ч 5 * * до
10~8М). Вполне вероятно, что систему внутриклеточной регуляции
(по крайней мере, для ряда случаев) можно представлять как
цепь из трех мессенджеров: гормоны—ациклические нуклеоти-
ды—>Са2+.
Циклические нуклеотиды найдены у многих видов животных, в
бактериях и ряде одноклеточных организмов. У прокариот цАМФ
играет существенную роль в регуляции биосинтеза белков (см.
разд. 5.4). У некоторых миксомицетов (слизевики) цАМФ служит
своеобразным гормоном, межклеточным химическим сигнализато-
ром. Он может образовываться в начальной фазе развития миксо-
мицетов, если истощаются запасы пищи. Отдельные миксомицеты
движутся в сторону исходного источника цАМФ, агрегируются,
формируют плодовые тела, образуют споры.
Наличие циклических нуклеотидов у высших растений достовер-
но не доказано. Однако обнаружение некоторыми авторами аде-
нилатциклазной активности и цАМФ-зависимых протеинкиназ у
высших растений заставляет воздерживаться от категоричности в
этом вопросе.
ч 12.4. Простагландины
Важнейшую роль в формировании клеточного ответа на вне-
клеточные нейрогумор альные воздействия через систему цикличе-
ских нуклеотидов играют простагландины. Они (относятся к «тка-
невым гормонам», см. разд. 12.6) содержат в молекуле 20 атомов
углерода, пять из которых образует циклопентановое кольцо. Про-
стагландины получили свое название в связи с тем, что были впер-
вые выделены из простаты (предстательная железа). В зависимос-
ти от структуры пятичленного кольца все простагландины делят
на 4 группы: ПГА (PGA), ПГБ (PGB), ПГЕ (PGE) и ПГФ (PGF),
из них основными являются ПГЕ и ПГФ. По числу двойных связей
в метильной и карбоксильной боковых цепях в каждой из групп
различают индивидуальные простагландины, обозначаемые кроме
букв еще цифрой, которая показывает число двойных связей в бо-
ковых цепях (например, ПГАЬ ПГА2). Буквы аир после цифро-
вых индексов указывают ориентацию гидроксильной группы при
С-9 по отношению к плоскости циклопентанового кольца.
511
о
В организме простагландины образуются из полиненасыщен-
ных 20-углеродных жирных кислот (среди которых очень важна
арахидоновая кислота) с участием ферментативной системы —
простагландин-синтетазы, находящейся в микросомальных мембра-
нах. Преобразование полиненасыщенных жирных кислот в проста-
гландины осуществляется в несколько стадий через образование
короткоживущих промежуточных соединений — эндопероксидов —
в результате включения двух молекул кислорода. Из эндоперокси-
дов при действии определенных ферментов могут синтезироваться
не простагландины, а другие биологически активные вещества,
например тромбоксаны, у которых исключительно выражена спо-
собность к адгезии, склеиванию тромбоцитов.
Простагландины и их основные предшественники — полинена-
сыщенные жирные кислоты—содержатся во многих тканях и орга-
нах млекопитающих, но в едва уловимых количествах. Наиболь-
шее содержание их —в семенной жидкости (у человека до 250
мкг/мл, у собаки, лошади — 0,5 мкг/мл). В небольших количествах
они найдены в семенниках рыб, яйцеклетках морского ежа. Неожи-
данно много простагландинов обнаружено в горгониевом коралле
Plexaure homomalla — до 2,6% на сухую массу. Сравнительно не-
давно их нашли и у^некоторых растений, причем в достаточно боль-
ших количествах.
Первые же исследования простагландинов показали, что они
оказывают мощное и многостороннее действие на организм челове-
ка и млекопитающих животных. В связи с этим простагландины
привлекли широкое внимание многих исследователей, их даже на-
зывали «чудодейственными», предрекали начало в биохимии «эпо-
хи простагландинов». Перечисление даже отдельных аспектов их
влияния на организм действительно выявляет необычайно широ-
кий спектр их действия. Вот некоторые примеры.
— ПГЕ1 и ПГЕ2 способствуют расширению сосудов, уменьша-
ют артериальное кровяное давление, увеличивают сердечный вы-
брос.
— Ряд простагландинов и их производных являются мощными
ингибиторами тромбообразования в сосудах.
512
— ПГФ2 прерывает беременность практически на любом сроке,
не вызывая отрицательных последствий в организме матери.
— Простагландины оказывают седативное и транквилизирую-
щее действие (успокаивающее).
— ПГЕ расслабляют мышцы бронхов и трахей, являются пре-
красными средствами при лечении астмы.
Из перечисленного очевидно явствует огромное значение про-
стагландинов в медицине при раскрытии причин и лечении сердеч-
но-сосудистых заболеваний, аллергических, воспалительных, гине-
кологических. Интересно отметить, что отдельные простагландины
в данных случаях могут действовать антагонистически. Так, мно-
гие простагландины участвуют в индукции воспалительного про-
цесса. Противовоспалительное действие аспирина (ацетилсалици-
ловая кислота) связано, видимо, с тем, что он тормозит синтез
простагландинов. В то же время ПГЕ2 угнетает процесс воспале-
ния. Если простагландины ПГФ индуцируют аллергическую реак-
цию, то вдыхание в небольших количествах ПГЕ уменьшает астма-
тические явления. В определенных условиях простагландины спо-
собствуют оплодотворению, но при других даже очень малые их ко-
личества вызывают абортирование плода.
Биохимические механизмы участия простагландинов в таком
широком спектре изменений состояния организма, его отдельных
тканей и органов связаны с взаимодействием простагландинов с
гормонами и циклическими нуклеотидами. Простагландины в за-
висимости от принадлежности к тому или иному классу (А, Б, Е,
Ф), а также от вида ткани и разновидности аденилатциклазы мо-
гут как стимулировать, так и ингибировать синтез цАМФ. Таким
образом, простагландины рассматривают как модуляторы адени-
латциклазной системы. Доказан также факт значительного повы-
шения в различных тканях цГМФ под влиянияем ПГФ2а.
Наряду с циклическими нуклеотидами многие гормоны нахо-
дятся в прямой связи с простагландинами. Так, ПГЕ оказывает
стимулирующее влияние на синтез гормона роста, вазопрессина,
АКТГ, тиреотропина. Простагландины ПГЕЬ ПГЕа и ПГФ стиму-
лируют биосинтез стероидов; ПГЕ2 и ПГФ2 способствуют высво-
бождению окситоцина гипофизарной системой и увеличивают в
крови концентрацию пролактина. Иными словами, простагланди-
ны оказывают влияние на важнейшие эндокринные железы: гипо-
физ, кору надпочечников, щитовидную железу, яичники.
С другой стороны, установлено стимулирующее влияние на син-
тез простагландинов АКТГ и ряда других гормонов. Так, тирео-
стимулин способствует биосинтезу простагландинов посредством
активирования фосфолипазы А2, высвобождающей арахидоновую
кислоту. Эстроген и экзогенный лютеинизирующий гормон акти-
вируют продукцию простагландинов тканью матки.
512
12.5. Регуляция метаболизма через ферментативный
аппарат
Поскольку практически все биохимические реакции протекают
при участии ферментов, важнейшим путем регуляции метаболиз-
ма является изменение функциональной активности ферментатив-
ного аппарата. Оно может достигаться благодаря изменению ко-
личества тех или иных ферментов в клетке, активности существую-
щих молекул ферментов, а также количественного соотношения
субстратов и ферментов при участии мембран. Увеличение и умень-
шение количества ферментов является результатом регуляции их
биосинтеза, подробно этот вопрос рассмотрен в разд. 5.3.
Регуляция активности ферментов по сравнению с регуляцией
их биосинтеза является более быстродействующей и более тонкой,
чувствительной к изменению концентрации отдельных метаболи-
тов в клетке. Вопросы влияния физико-химических условий среды
(в частности, pH, /°) на активность ферментов, типы специфиче-
ского обратимого ингибирования ферментов соединениями, конку-
рирующими за активный центр, освещены в гл. 3. В связи с этим
в данном разделе рассматриваются иные пути регуляции актив-
ности ферментов: аллостерическая и мембранная регуляция, ко-
валентная модификация ферментов и др.
Регуляция ферментативной активности по аллостерическому ти-
пу характерна для так называемых аллостерических или регулятор-
ных ферментов. Под аллостерическими эффектами понимают такие
эффекты, когда обратимое связывание ферментами некоторых ме-
таболитов (эффекторов) вызывает увеличение или уменьшение ак-
тивности фермента в результате изменения его сродства к субстра-
ту. Связывание эффекторов происходит в специфических участках
ферментов, отличных от активных центров, — аллостерических
центрах (от греч. аллос — другой).
Различают положительные эффекторы — метаболиты, вызываю-
щие аллостерическую активацию, и отрицательные, связывание
которых с ферментом снижает скорость реакции благодаря алло-
стерическому ингибированию. Ферменты могут быть моновалент-
ными, т. е. иметь один аллостерический эффектор, и поливалент-
ными.
Специфичность аллостерических центров к эффекторам может
быть абсолютной или относительной аналогично специфичности ак-
тивных центров к субстратам. Подавляющее большинство алло-
стерических ферментов имеет четвертичную структуру, в образова-
нии которой принимают участие идентичные или неидентичные
субъединицы. У одних регуляторных ферментов каждая субъеди-
ница содержит каталитический и аллостерический центры, у дру-
гих— эти центры локализованы на разных субъединицах. Однако
не все ферменты с четвертичной структурой способны к регулиро-
ванию по аллостерическому типу.
Механизм действия- аллостерических эффекторов заключается
в том, что они, соединяясь с аллостерическим центром, изменяют
514
конформацию фермента, что приводит к изменению сродства пос-
леднего к субстрату, т. е. снижению или повышению каталитиче-
ской активности. Субъединицы аллостерических ферментов отве-
чают на связывание эффекторов кооперативно: изменение конфор-
мации одной из субъединиц в результате связывания эффектора
влияет на конформацию не только этой, но и других субъединиц и
изменяет их сродство к субстрату. Кооперативное взаимодействие
субъединиц у ряда регуляторных ферментов наблюдается и под
действием субстрата, в этом случае
связывание первой молекулы субстра-
та с одной из субъединиц изменяет
сродство к субстрату остальных субъ-
единиц: при положительной коопера-
тивности сродство увеличивается, при
отрицательной — уменьшается. Харак-
тер и меру кооперативности отражает
коэффициент Хилла (Л). При й=1 ко-
оперативность отсутствует, при h<\—
отрицательная кооперативность, при
h>l — положительная. Чем выше й,
тем сильнее кооперативность, в преде-
ле коэффициент Хилла равен числу
Рис. 12.2. Зависимость скоро-
сти реакции (V), катализируе-
мой аллостерическим фермен-
том, от концентрации субстра-
та [S1
центров связывания.
Мысль об изменении конформации
у регуляторных ферментов под влияни-
ем эффекторов или субстратов и коопе-
ративном взаимодействии субъединиц
фермента возникла на основе сходства
кинетического поведения аллостерических ферментов и гемоглоби-
на при насыщении его кислородом (см. разд. 2.5.3). У аллостериче-
ских ферментов графики зависимости V от концентрации субстрата
или эффектора имеют вид сигмоидной, или S-образной, кривой, а
графики, построенные на основе обратных величин, нелинейны
(рис. 12.2).
Сигмоидный характер зависимости V от [S] у аллостерических
ферментов обнаруживается только в отсутствие насыщающих кон-
центраций эффекторов. В случае избытка аллостерических эффек-
торов все субъединицы ферментативных молекул находятся в ак-
тивной конформации и их каталитические центры функционируют
не по кооперативному принципу, независимо друг от друга. Такая
же автономность в работе активных центров субъединиц характер-
на и для неаллостерических ферментов с четвертичной структурой,
кинетика которых подчиняется уравнению Михаэлиса — Ментен.
Наличие сигмоидной кинетики у регуляторных ферментов дела-
ет их более чувствительными к изменению концентрации метаболи-
тов. Так, если зависимость скорости реакции от концентрации эф-
фектора или субстрата следует уравнению Михаэлиса — Ментен,
то для увеличения скорости в девять раз в ряде случаев необходи-
мо повысить концентрацию метаболита примерно в 80 раз, т. е. не-
515
обходимо существенное изменение состава окружающей среды.
Однако концентрация основных метаболитов в клетке не может
изменяться в столь широких пределах, а потребности в многократ-
ных изменениях скорости реакции возникают довольно часто.
В связи с этим регуляция метаболизма по обычным законам фер-
ментативной кинетики не обеспечивает необходимого контроля
ферментативной активности.
В случае сигмоидной кинетики, относительно небольшие изме-
нения концентрации метаболита приводят к существенным измене-
ниям в скоростях. Так, увеличение скорости реакции, как и в ире-
дыдущем случае, в девять раз достигается только четырехкратным
увеличением концентрации метаболита. Таким образом, коопера-
тивность связывания обеспечивает значительные изменения актив-
ности фермента в ответ на небольшие колебания в концентрации
метаболитов. Следует, однако, иметь в виду, что сигмоидный ха-
рактер зависимости скорости ферментативной реакции от концент-
рации субстрата не указывает однозначно на кооперативное взаи-
модействие нескольких центров в ферментативной молекуле. Сиг-
моидная зависимость V от [S] возможна и при наличии одного ак-
тивного центра (кажущаяся кооперативность), что может быть
связано, например, с существованием более чем одного пути при-
соединения субстрата к ферменту. В свою очередь, не все аллосте-
рические ферменты обнаруживают сигмоидную кинетическую
кривую.
Регуляция по аллостерическому типу наиболее характерна для
ферментов, катализирующих ключевые анаболические реакции.
Если в системе накопится много конечного продукта, то его обра-
зование будет заингибировано в результате того, что конечный
продукт выступит в роли отрицательного эффектора первого фер-
мента в метаболическом цикле, ведущем к синтезу этого продукта.
Такое ингибирование называется ингибированием по типу обрат-
ной связи или ретроингибированием. Подобного рода влияние, на-
пример, оказывает ФЕП (продукт одной из завершающих реакций
гликолиза) на фермент подготовительной стадии этого процесса —
фосфофруктокиназу. К регуляторным ферментам такого типа от-
носится и треониндезаминаза, катализирующая первую пусковую
реакцию синтеза изолейцина из треонина. Конечный продукт этой
цепи реакций — изолейцин избирательно ингибирует треониндеза-
миназу.
Аллостерическая регуляция ферментативной активности проис-
ходит и при активации предшественником, когда метаболит, дейст-
вующий как аллостерический эффектор, активирует фермент, ка-
тализирующий превращение либо этого же метаболита, либо про-
дукта, находящегося немного дальше в цепи превращений (фор-
активация). Так действует фруктозо-1,6-дифосфат, активирующий
фермент гликолиза фосфоенолпируваткиназу. Встречаются и дру-
гие пути контроля метаболизма по аллостерическому механизму.
Ферменты могут иметь один или несколько аллостерических
ингибиторов и активаторов. Например, фосфофруктокиназа у Е. со-
516
И ингибируется ФЕП, цитратом и активируется АДФ и ГДФ,
ФЕП — карбоксилаза ингибируется аспартатом и малатом, акти-
вируется ацетил-КоА, ГТФ, УТФ, фруктозо-1,6-дифосфатом, а МДГ
ингибируется только НАДН. К числу важных эффекторов отно-
сятся адениннуклеотиды (индикаторы энергетического состояния
клетки); их соотношение — регулятор активности ферментов цент-
ральных метаболических путей.
Различные изоферменты, а также один и тот ;же по специфич-
ности фермент, выделенный из разных организмов, благодаря не-
которому отличию в структуре могут иметь разную чувствитель-
ность к аллостерическим эффекторам, т. е. обладать разными ре-
гуляторными свойствами. Так, если клетка продуцирует несколько
множественных молекулярных форм фермента, то ингибированию
продуктом реакции по типу отрицательной обратной связи может
подвергаться только одна из форм.
Изменение активности ферментов часто усиливается с по-
мощью так называемого каскадного механизма, при этом первый
фермент увеличивает активность второго, второй — третьего и т. д.
Примером изменения активности фермента по каскадному меха-
низму является регуляция работы гликоген-фосфорилазы мышц.
Адреналин
I
Аденилатциклаза
АТФ—г-*-цАМФ + Н4Р2О7
Протеин киназа
\ТФ+киназа фосфорюшзьГ^—АДФ+киназа фосфорилазы
неактивная (протеин) активная (фосфопротеин)
Гликогенфосфорилаза b
(неактивная)
2ФЬ + 4АТФ
Гликоген--Глюкозо-1-фосфат
Гликогенфосфорилаза а
(активная)
1Фа 4- 4 АДФ
Биологический смысл каскадности заключается в том, что она
придает процессу активации ферментов взрывной характер, поз-
воляет в короткий срок осуществить активацию большого числа
молекул фермента. В приведенном ферментном каскаде одна мо-
лекула гормона «включает» в работу несколько молекул аденилат-
циклазы, каждая из которых катализирует образование большого
числа цАМФ. На этом этапе сигнал усиливается в 102—103 раз.
Сигнал возрастает еще примерно в 100 раз при активации протеин-
киназы АД1Ф, а затем увеличивается и до 106—107 раз за счет
517
включения киназы фосфорилазы и самой фосфорилазы. Одна из
причин усиления сигнала при активации гликоген-фосфорилазы —
более высокая концентрация фермента на каждом последующем
этапе по сравнению с предыдущим. Так, молярное соотношение
трех ферментов — протеинкиназы, киназы фосфорилазы и гликоген-
фосфорилазы в мышцах составляет примерно 1 :20 : 120.
Изменение активности ферментов происходит и в результате их
ковалентной модификации при участии специальных ферментов.
Для эукариотических организмов наиболее характерна модифика-
ция ферментов за счет фосфорилирования — дефосфорилирования.
Характерным примером в этом плане является активация глико-
ген-фосфорилазы. За счет фосфорилирования регулируется актив-
ность и гликоген-синтазы, перенос фосфатной группы от АТФ на ос-
таток серина переводит фермент в неактивную форму. Модификация
белков путем фосфорилирования осуществляется ферментами про-
теинкиназами, а дефосфорилирование— фосфатазами.
Роль ковалентной модификации как фактора регулирования
ферментативной активности показана и на примере ряда полифер-
ментных систем (пируват- и а-кетоглутаратдегидрогеназных сис-
тем), участвующих в окислительном декарбоксилировании а-кето-
кислот. В таких системах, отличающихся высокой организацией,
различные ферменты объединены в комплекс и функционируют
совместно. С дигидролипоилтрансацетилазой пируватдегидрогеназ-
ной системы (см. разд. 6.9.5) связано несколько молекул киназы
пируватдегидрогеназы, которая за счет АТФ катализирует фосфо-
рилирование серинового остатка в пируватдегидрогеназе. Фосфо-
рилированный фермент не способен декарбоксилировать пируват.
НАДН, ацетил-КоА, АТФ являются активаторами киназы пируват-
дегидрогеназы. Вместе с тем с трансацетилазой в пируватдегидро-
геназной системе связано несколько молекул Са2+-М§2+-зависи-
мой фосфатазы, действие которой восстанавливает активность пп-
руватдегидрогеназы за счет отщепления остатка ортофосфата.
Помимо модификации путем фосфорилирования известны так-
же и другие типы модификации: например, аденилирование — де-
аденилирование (у глутаминсинтетазы £. coli), ацетилирование —
деацетилирование (у цитрат-лиазы Rhodopseudomonas gelatinosa),
метилирование, гидроксилирование. Аденилирование тирозина (пе-
ренос АМФ от АТФ) в глутаминсинтетазе приводит к падению ее
активности, а ацетилирование цитрат-лиазы — к активации.
Уровень активности ряда ферментов зависит и от перехода их
из проферментной формы (зимоген) в активный фермент обычно в
результате частичного протеолиза, путем отщепления от зимогена
пептидов. В виде зимогенов синтезируются ферменты, функциони-
рующие вне клеток. Зимогенами, например, являются трипсиноген,
химотрипсиноген, которые после синтеза в поджелудочной железе
секретируются в тонкий кишечник и там активируются (см. разд.
5.6.1).
Регуляция активности ферментов может происходить и за счет
белок-белковых взаимодействий, они важны, например, при рабо-
518
те лактозосинтазы. Этот фермент представляет собой комплекс
специфической галактозилтрансферазы (неактивной в отношении
синтеза лактозы) и белка молока а-лактальбумина. Присоединение
последнего к галактозилтрансферазе придает ей лактозосинтазную
активность. Предполагают, что регуляция за счет белок-белковых
взаимодействий происходит в дыхательной цепи на уровне цитохро-
мов; предыдущий переносчик электронов активирует последующий
при их столкновении в фосфолипидном слое мембраны.
Довольно общим регулятором ферментативной активности явля-
ются мембраны. В настоящее время показано, что многие фермен-
ты в клетке связаны с мембранами и изменение состава, свойств
мембран может оказывать влияние на активность мембраносвязан-
ных ферментов. Обратимая адсорбция ферментов на субклеточных
структурах, контролируемая клеточными метаболитами, также мо-
жет быть фактором регуляции ферментативной активности. Идея
о существовании такого механизма регуляции ферментативной ак-
тивности была выдвинута и экспериментально разработана А. И.
Опариным (1935).
Регуляция метаболизма через ферментативный аппарат может
осуществляться и благодаря изменению проницаемости мембран
под влиянием различных факторов. От проницаемости зависит по-
ступление отдельных субстратов в компартменты, где локализова-
ны ферменты метаболизации этих субстратов.
В клетке находятся особые органеллы — лизосомы, представля-
ющие собой небольшие пузырьки, окруженные одиночной мембра-
ной. Они содержат большой набор ферментов (протеазы, нуклеазы,
гликозидазы и* др.), способных расщеплять практически любые
клеточные компоненты, и участвуют в процессе фагоцитоза, гене-
рации, удаления «отработанных» органелл. При функционировании
лизосом их ферменты начинают активно действовать только после
выхода из лизосом вследствие разрушения мембран последних.
12.6. Гормоны человека и животных
12.6.1. Общая характеристика, механизмы действия. К гормонам
(от греч. гормао—привожу в движение, побуждаю) относятся ор-
ганические соединения, вырабатываемые железами внутренней сек-
реции (эндокринные железы), транспортируемые кровью к клет-
кам-мишеням и активно влияющие на метаболические, морфогене-
тические и физиологические процессы. Однако некоторые гормоны
синтезируются не только эндокринными железами, но и в клетках
других органов и тканей. Так, гормоны поджелудочной железы
(инсулин и глюкагон) образуются также и в клетках кишечника,
катехоламины (гормоны надпочечников) синтезируются и в нерв-
ных окончаниях.
Существенной отличительной особенностью гормонов от других
биологически активных веществ является специализация клеток,
их синтезирующих. Железы внутренней секреции не содержат вы-
водных протоков, их клетки оплетены обильной сетью кровеносных
519
и лимфатических капилляров, выделение продуктов жизнедеятель-
ности происходит непосредственно в просвет этих сосудов. Этим
эндокринные железы отличаются от экзокринных, которые выде-
ляют свои секреты через выводные протоки.
Действие гормонов на органы и ткани характеризуется рядом
особенностей.
1. Высокой биологической активностью, проявляющейся в том,
что гормоны оказывают физиологическое действие в очень малых
концентрациях.
2. Специфичностью действия: гормоны вызывают строго специ-
фические ответные реакции органов и тканей.
3. Дистантностью действия: гормоны, как правило, переносятся
кровью далеко от места их образования и оказывают действие на
определенные чувствительные к ним органы-мишени или клетки-
мишени (только в последнее время обнаружены исключения из
этого правила — некоторые гормоны могут действовать в месте
своего образования).
4. Относительно небольшой период полужизни, обычно меньше
1 ч; в результате этого эффективное функционирование гормонов
возможно при непрерывном синтезе и секретировании их в течение
всего требуемого времени при данном состоянии организма.
Эндокринные железы появились у членистоногих и позвоночных
как один из основных компонентов нейроэндокринной регуляторной
системы для поддержания гомеостаза. Гормоны или вещества,
близкие к ним по действию, в последнее десятилетие были обнару-
жены у червей.
Гормоны млекопитающих по химическому строению можно раз*
делить на три большие группы: 1) белки и пептиды, 2) производные
аминокислот, 3) стероиды.
В особую группу обычно выделяют так называемые тканевые
гормоны или гуморальные факторы, которые образуются не в эн-
докринных железах, а во многих тканях организма (гистамин,
простагландины и др.).
Ряд полипептидных гормонов синтезируется эндокринными же-
лезами в виде более крупных молекул предшественников — прогор-
монов, в некоторых случаях продукты рибосомального синтеза
представляют собой еще более крупные белки — препрогормоны.
Последние кроме пептида-ингибитора (как все прогоморны) содер-
жат дополнительный пептид, определяющий транспорт гормона
через мембрану при его секреции железой.
Существуют представления о двух основных механизмах дейст-
вия гормонов (стероидных и нестероидных). Специфичность гор-
монов по отношению к клеткам-мишеням связана с наличием бел-
ковых рецепторов. Рецепторы большинства гормонов (полипептид-
ного строения и производных аминокислот, т. е. нестероидные) на-
ходятся в плазматической мембране клеток. Ответная реакция
возникает при связывании гормона рецептором. Так как рецепторы
являются гликопротеинами, их специфичность обусловлена угле-
водным компонентом. Определенную роль в этом играют и угле-
520
водные фрагменты ганглиозидов, находящихся в липидном бислое
плазматической мембраны.
Взаимодействие нестероидного гормона с рецептором активиру-
ет аденилатциклазу, что приводит к увеличению концентрации
внутриклеточной цАМФ, а следовательно, фосфорилированию про-
теинкиназами различных белков: ферментативных, мембранных,
рибосомальных, хроматиновых. В результате могут возникнуть
самые разнообразные изменения в метаболизме клетки. Фосфори-
лирование белков хроматина оказывает влияние на транскрибиро-
вание генов, контролируя тем самым скорость синтеза ферментов и
других белков. Исключение в группе гормонов-полипептидов и
производных аминокислот составляют инсулин и тиреоидные гор-
моны. Рецепторами последних являются внутриядерные белки,
входящие в состав хроматина. Рецепция приводит к усилению син-
теза РНК в клетках, активации РНК-полимеразы, увеличению ско-
рости синтеза белков. Видимо, тиреоидные гормоны стимулируют
последний на стадии транскрипции, что и лежит в основе их дейст-
вия на рост, развитие и дифференцировку клеток. Кроме того, ти-
реоидные гормоны содержат рецепторы в митохондриальной мемб-
ране, в результате чего оказывается влияние на энергетический
обмен.
Рецепторы инсулина локализованы на поверхности клеток-
мишеней,; гормон проявляет свое действие, не проникая в клетку.
Однако большинство эффектов инсулина (влияние на липолиз,
синтез гликогена и др.) противоположно действию цАМФ. Следо-
вательно, сходства инсулина в этом отношении с другими гор мо-
нами-полипепт’идами нет: он не стимулирует аденйлатциклазную
активность. Кроме того, специфические инсулинсвязывающие ре-
цепторы обнаружены в ядрах некоторых клеток, но роль их недос-
таточно выяснена. Связывание инсулина с клетками-мишенями
приводит к увеличению скорости синтеза и накопления белков, а
также гликогена и липидов (т. е. к запасанию энергии).
Стероидные гормоны проникают в цитоплазму клеток-мишеней
и связываются с определенными цитоплазматическими белками-ре-
цепторами. Образовавшиеся комплексы перемещаются в ядра
клеток и присоединяются к хроматину. Изменяя доступность для
транскрипции определенных участков ДНК, стероидные гормоны
влияют на синтез мРНК, т. е. действуют на уровне генома.
Таким образом, механизм действия гормонов направлен в ос-
новном на белки: на скорость их синтеза и активацию, модифика-
цию уже синтезированных белков. Стероидные и тиреоидные гор-
моны осуществляют регуляторную функцию первым путем, влияя
на синтез белка в стадии транскрипции. Гормоны-белки, пептиды и
производные аминокислот (кроме тиреоидных) воздействуют на
метаболизм прежде всего через активацию и модификацию белков
в результате их протеинкиназного фосфорилирования (второй
путь). В некоторых случаях вследствие фосфорилирования хрома-
тиновых и рибосомальных белков нестероидпые гормоны тоже мо-
гут (но уже опосредованно) влиять и па сам синтез белков.
18—937
521
Между железами внутренней секреции складываются сложные
взаимодействия. Это связано с тем, что: 1) на функцию каждого
органа оказывает влияние сразу несколько гормонов; 2) гормоны,
вырабатываемые одними железами, оказывают влияние на функ-
цию других эндокринных желез. Выделяют три основных типа
взаимодействия между эндокринными железами.
1. Взаимодействие по принципу положительной прямой или от-
рицательной обратной связи. Так, передняя доля гипофиза выра-
батывает тиреотропный гормон, стимулирующий образование гор-
монов щитовидной железы, — положительная прямая связь. С дру-
гой стороны, повышение уровня гормонов щитовидной железы вы-
ше нормы тормозит образование тиреотропного гормона гипофи-
за— отрицательная обратная связь.
2. Синергизм гормональных влияний. Например, как адрена-
лин — гормон мозгового слоя надпочечников, так и глюкогон а-
клеток островкового аппарата поджелудочной железы активируют
распад гликогена печени до глюкозы и вызывают увеличение со-
держания глюкозы в крови.
3. Антагонизм гормональных влияний. Примером могут слу-
жить женские половые гормоны — эстрогены и прогестерон. Пер-
вые усиливают сократительную функцию матки, второй — тормо-
зит ее.
Существует хорошо выраженная связь между эндокринной и
нервной системой. В секреторных клетках гипоталамуса (отдел
головного мозга) образуются гормоны — низкомолекулярные по-
липептиды, названные рилизинг-факторами или регуляторными
факторами. Их органом-мишенью является аденогипофиз (перед-
няя доля гипофиза). Рилизинг-факторы, вырабатываемые в гипо-
таламусе, по мнению одного из ведущих советских эндокриноло-
гов IL А. Юдаева (1976), можно рассматривать как универсаль-
ные химические сигналы, посредством которых осуществляется пе-
редача нервных импульсов на эндокринную систему.
Нервные стимулы, поступающие из таламуса и коры мозга,
влияют на скорость высвобождения гипоталамических регулятор-
ных гормонов, которые попадают в аденогипофиз по гипоталамо-
гипофизарной портальной системе циркуляции крови и вызывают
секрецию определенных гормонов аденогипофиза. Так, с участием
указанных нервных путей осуществляется быстрая регуляция аде-
ногипофизарной секреции в ответ на различные воздействия внеш-
ней среды (холод, гипоксия, травмы, яды) или на определенное
физиологическое состояние (страх, тревога).
Комиссия по биохимической номенклатуре IUPAC Международ-
ного биохимического общества предложила названия тех гипотала-
мических рилизинг-факторов, которые способствуют образованию
гормонов гипофиза, оканчивать словом либерин, а ингибирующих —
статин (например, кортиколиберин, пролактостатин).
: Гипоталамус непосредственно связан (анатомически, функцио-
нально) и с нейрогипофизом (задняя доля гипофиза). Секретируе-
мые нейрогипофизом гормоны (в ответ на определенные нервные
522
стимулы) синтезируются в гипоталамусе, мигрируют в составе гра-
нул по нервным волокнам и накапливаются у их окончаний в ней-
рогипофизе. Все изложенное свидетельствует о том, что «гипота-
ламо-гипофизарная ось» является анатомической и биохимической
основой интеграции действия нервной системы и эндокринной.
В свою очередь гормоны оказывают влияние на нервную систе-
му. При этом происходит изменение метаболизма нейронов мозго-
вой ткани — обмена электролитов и аминокислот, процессов образо-
вания и связывания аммиака. Влияние гормонов на функции ней-
ронов мозговых структур приводит к их участию в регулирующем
и коррегирующем воздействии ЦНС на различные органы. Гормо-
ны оказывают действие и на уровне рецепторного аппарата, осо-
бенно на хеморецепторы, расположенные в стенках кровеносных
сосудов.
12.6.2. Щитовидная железа. Секретирует тироксин и трииодтиро-
нин, а также кальцитонин (в особых парафолликулярных клетках).
Исходными продуктами синтеза первых двух гормонов являются
тирозин и неорганический иод.
н2—сн—соон
г
Трийодтиронин
Синтез тироксина и трииодтиронина катализируется тиреоид-
пероксидазой путем иодирования остатков тирозина в составе мо-
лекулы белка тиреоглобулина. Последний не обладает гормональ-
ными свойствами, они присущи только иодтиронинам, освобождаю-
щимся при его протеолизе, который осуществляется внутриклеточ-
ными протеиназами эпителиальных клеток. Синтез и протеолиз
тиреоглобулина происходит непрерывно.
Тироксин связывается в плазме крови с белковыми носителями:
тироксинсвязывающим глобулином, преальбумином и альбумином.
Гипофункция щитовидной железы (гипотиреоз) сопровождает-
ся снижением основного обмена, температуры тела, слизистыми
отеками. Это заболевание называется микседемой. Если гипотирео-
зом страдают дети, развивается кретинизм, сопровождающийся за-
держкой роста и умственного развития. Гиперфункция щитовидной
железы характеризуется резким усилением обмена, учащением
пульса, дрожанием рук, пучеглазием. Этот комплекс получил на-
звание базедовой болезни.
18*
523
Кальцитонин представляет собой линейный полипептид, постро-
енный из 32 остатков аминокислот. Все 32 остатка существенны
для проявления биологической активности. Первичная структура
кальцитонинов различных видов животных неидентична, но доволь-
но близка. Так, кальцитонин трески отличается от такового выс-
ших позвоночных только по девяти аминокислотным остаткам. Ос-
новная физиологическая роль кальцитонина состоит в том, что он
предупреждает возможное повышение концентрации Са2+ в кро-
ви путем торможения процесса выхода Са2+ из костей.
12.6.3. Паращитовидные железы. Секретируют паратгормон —
белок (М9500), находящийся в паращитовидных железах в виде
прогормона, на N-конце которого содержится дополнительный гек-
сапептид. Предполагают, что отщепление последнего приводит к
появлению биологической активности.
Главная функция паратгормона — регуляция концентрации
ионов Са в крови (путем ее увеличения после падения по какой-
либо причине). Основное место действия паратгормона — почки и
кости скелета.
12.6.4. Половые железы. Семенники секретируют тестостерон и
дигидротестостерон (андрогены) в количестве 5—7 мг/сут.
НАДН-5Я-
редуктаза
Д игидротестостерон
Биосинтез этих гормонов начинается с холестерина. Андрогены
обусловливают нормальный рост мужских половых органов, раз-
витие вторичных половых признаков у мужчин. При недостатке
тестостерона замедляется биосинтез белков, развивается ожире-
ние, утрачивается волосяной покров. Андрогены оказывают выра-
женное анаболическое действие на обмен азота и кальция.
Женские половые гормоны (эстрогены) синтезируются главным
образом в яичниках. Фолликулы яичников секретируют наиболее
активный эстроген — p-эстрадиол в количестве 1 мг/сут.
р-Эстрадиол
Он обеспечивает развитие половых органов и вторичных поло-
вых признаков. При недостаточности эстрадиола нарушаются цик-
Ь24
лы менструации, происходят самопроизвольные выкидыши, разви-
вается ожирение. Эстрогены оказывают выраженное влияние на
синтез белков, нуклеиновых кислот, обмен липидов.
12.6.5. Желтое тело. Продуцирует прогестерон и релаксин. Про-
гестерон образуется во второй половине менструального цикла.
Особенно много его образуется во время беременности. Так как
он воздействует на систему гиалуронидаза — гиалуроновая кисло-
та, прогестерон необходим при подготовке слизистой оболочки мат-
ки для закрепления в ней оплодотворенного яйца. Прогестерон
влияет на проницаемость клеточных и митохондриальных мембран
на процесс окислительного фосфорилирования, образование мРНК.
Прогестерон
Релаксин — полипептид (М6000), состоящий из двух неиден-
тичных цепей, соединенных дисульфидными мостиками (большое
сходство в строении молекулы с инсулином). Релаксин подготавли-
вает матку и тазовые сочленения к родам.
12.6.6. Надпочечники. Состоят из мозгового вещества и корко-
вого слоя. Гормонами мозгового вещества являются адреналин и
норадреналин. Эти гормоны и близкие к ним амины, содержащие в
своей структуре катехол, называются катехоламинами. Роль адре-
налина и продуктов его превращения в организме были глубоко
исследованы в работах А. М. Утевского (1950).
Адреналин
Норадреналин
Основной путь синтеза катехоламинов: тирозин—►диоксифени-
лаланин (ДОФА)—►диоксифенилэтиламин (ДОФАМИН) —►
—►норадреналин—►адреналин.
Адреналин и норадреналин, стимулируя аденилатциклазу в ор-
ганах-мишенях, активируют фосфоролиз гликогена в печени и ске-
летных мышцах, резко повышая уровень глюкозы в крови; увеличи-
вают силу сердечных сокращений, секрецию амилазы слюнных
желез. Катехоламины обладают выраженной липидмобилизуюшей
активностью.
525
Физиологическое действие адреналина и норадреналина сходно
с влиянием симпатических нервов (например, повышение кровяно-
го давления), возбуждение этих нервов приводит к секреции ука-
занных гормонов, поэтому последние называют симпатомиметиче-
скими аминами. В связи с тем, что они являются не только гормо-
нами, но и нейромедиаторами, эти амины могут синтезироваться в
нервной системе из тирозина по тому же пути, что и в надпочеч-
никах. В крови животных и человека в спокойном состоянии содер-
жится очень мало адреналина. Резкое эмоциональное возбуждение,
боль, физическое напряжение, охлаждение приводят к значитель-
ному повышению его концентрации в крови, так как он служит
инициатором «мобилизационной готовности организма».
В целом вся симпато-адреналовая система (мозговой слой над-
почечников и симпатический отдел нервной системы) обеспечивает
готовность организма к защитным реакциям, требующим активной
двигательной деятельности. Эта готовность выражается в усилении
функции сердечно-сосудистой системы, повышении энергетического
баланса, торможении деятельности желудочно-кишечного тракта,
усилении кровоснабжения скелетной мускулатуры. В связи с этим
адреналин называют «гормоном борьбы и бегства». У животных
значение симпато-адреналовой системы в борьбе за существование
первостепенно. У человека она также играет важную роль при
подготовке организма к выполнению повышенных нагрузок, напри-
мер при подготовке спортсменов к соревнованию.
В действии адреналина и норадреналина есть некоторые разли-
чия. Так, норадреналин в отличие от адреналина лишь в малой
степени увеличивает содержание глюкозы в крови и поглощение Ог.
Корковый слой надпочечников в нормальных условиях секрети-
рует адренокортикостероиды: кортизол (гидрокортизон), кортико-
стерон и альдостерон. Предшественником адренокортикостероидов
является холестерин.
У человека кортизол секретируется в количестве 10—30 мг/сут,
кортикостерон — 2—4 мг, альдостерон — 300—400 мкг. Кортизол и
кортикостерон транспортируются at-глобулином — транскортином,
а альдостерон — альбумином. Кортикостероиды оказывают влияние
на следующие метаболические и физиологические процессы: 1) спо-
собствуют гликогенезу, повышают содержание гликогена в печени
526
и глюкозы в крови; 2) сильно тормозят синтез белков в мышцах
и ряде других тканей, но активируют образование специфических
белков печени; 3) усиливают мобилизацию липидов из запасных
отложений; 4) регулируют водно-солевой обмен; 5) стимулируют
эритропоэз, но уменьшают количество лимфоцитов; 6) усиливают
секрецию HCI и пепсиногена; 7) предотвращают и замедляют раз-
витие воспалительных, аллергических явлений; 8) способствуют
поддержанию гомеостаза при действии повреждающих факторов
(травмы, инфекционные агенты, вредные химикаты и т. д.).
12.6.7. Поджелудочная железа. Синтезирует инсулин, глюкагон
(см. разд. 6.8), соматостатин, секретин, птичий панкреатический
полипептид (АРР, от лат. avis — птица).
Соматостатин ингибирует высвобождение соматотропина гипо-
физом, инсулина и глюкагона поджелудочной железой, гастрина
слизистой желудка. В связи с этим соматостатин регулирует секре-
цию гормона роста, оказывает антигипеогликемическое действие,
способствует высвобождению липидов из жировой ткани. Присутст-
вие соматостатина показано не только в гипоталамусе — основ-
ном месте его секреции, но и в поджелудочной железе, слизистой
желудка, кишечника. По строению соматостатин представляет со-
бой четырнадцатичленный пептид с одной дисульфидной связью.
Секретин — содержит 27 аминокислотных остатков, стимулирует
выделение панкреатического сока и в меньшей степени желчи, ки-
шечного сока, угнетает образование гастрина. У животных и чело-
века помимо гастрина и секретина вырабатываются и другие гор-
моны пептидной природы, регулирующие деятельность желудочно-
кишечного тракта — холецистокинин (стимулирует сокращение
желчного пузыря), сосудисто-активный кишечный пептид, желудоч-
ный ингибирующий пептид и др.
Панкреатический полипептид содержит 36 аминокислот. Увели-
чивает секрецию желудочных и панкреатических ферментов, рас-
слабляет желчный пузырь, уменьшает перистальтику кишечника.
12.6.8. Тимус. Осуществляет синтез и секрецию гормонов, кото-
рые влияют на скорость развития и созревания определенных попу-
ляций лимфоидных клеток. К таким гормонам относятся: тимозин,
тимопоэтины I и II, тимусный гуморальный фактор и гомеостатиче-
ский тимусный гормон. Поскольку лимфоидные клетки имеют пер-
востепенное значение и для иммунитета, роль гормонов тимуса в
этом плане тоже очень важна.
12.6.9. Гипофиз. Придаток мозга, состоящий из передней (аде-
ногипофиз), задней (нейрогипофиз) и промежуточной долей. Меж-
дународная комиссия по анатомической номенклатуре подразделя-
ет гипофиз на нейрогипофиз и аденогипофиз, включая в последний
переднюю долю и промежуточную (среднюю).
Нейрогипофиз млекопитающих секретирует: вазопрессин, окси-
тоцин, а- и 0-меланоцитстимулирующие гормоны, когерин.
Окситоцин и вазопрессин — циклические нонапептиды. Поскольку
два остатка цистеина, замыкая пептид в цикл, образуют одну мо-
лекулу цистеина, эти гормоны иногда называют октапептидами.
527
I-------s-----s-------!
Цис—тир—иле—глн—асн—цис—про—лей—гли NH2
С-Концевой
глицинам ид
Окситоцин человека
।-------S-----S
Цис—тир—фен—глн —асн—цис—про—арг — гли NH2
Вазопрессин человека
Вазопрессин и окситоцин человека отличаются лишь двумя ами-
нокислотными остатками. Изучение структуры вазопрессина у
ряда высших животных показало наличие видовой специфичности
в его строении. Так, вазопрессин свиньи отличается от вазопрессина
человека заменой остатка арг на лиз.
Окситоцин стимулирует сокращение мышц матки, активирует
лактацию. Вазопрессин усиливает сокращение гладких мышц кро-
веносных сосудов, что приводит к повышению давления. Кроме то-
го, вазопрессин участвует в регуляции осмотического давления
плазмы крови, водного обмена (обладает антидиуретическим свой-
ством, т. е. препятствует выделению мочи).
Когерин — пептид, синтезирующийся в нейрогипофизе и вызы-
вающий координированное сокращение кишечника.
Меланоцитстимулирующий гормон (меланотропин, МСГ) обла-
дает способностью увеличивать число меланоцитов — клеток, не-
сущих темный пигмент—меланин. У позвоночных животных этой
способностью обладают два пептида: а-МСГ и (3-МСГ. Их амино-
кислотный состав у отдельных видов позвоночных имеет некоторые
отличия.
Хорошо доказана способность МСГ вызывать потемнение кожи
земноводных за счет диспергирования меланина, концентрирован-
ного в центре меланоцитов. У человека и высших животных МСГ
повышает активность щитовидной железы, стимулирует секрецию
сальных желез, снижает адаптацию глаз к темноте, повышает чув-
ствительность к свету, участвуя в регуляции движения клеток чер-
ного пигментного слоя в глазу.
Нейрогоморны появились на очень ранних этапах филогенеза.
У всех позвоночных, кроме млекопитающих, секретируется вазото-
цин, отличающийся от вазопрессина только заменой остатка фен
на иле. Этот гормон вырабатывается даже у древних рыб и круг-
лоротых. Окситоцин также является продуктом длительной эволю-
ции. У древних рыб аналогом этого гормона является глумитоцин
(отличается от окситоцина двумя аминокислотными остатками в
4-м и 8-м положении), у костистых рыб изотоцин (тоже отличия по
двум аминокислотам), а у птиц, рептилий и амфибий — мезотоцин
(отличается от окситоцина только заменой остатка лей в 8-м поло-
жении на иле).
В процессе эволюции произошли и изменения в функциональ-
ном значении гормонов нейрогипофиза. Так вазотоцин, экстрагиро-
528
ванный из гипофиза рыб, оказывает сильное антидиуретическое
действие при введении его амфибиям и млекопитающим, но не вли-
яет таким путем на рыб. Видимо, у последних вазотоцин не регу-
лирует водный обмен, а выполняет какую-то иную роль.
Аденогипофиз секретирует тиреотропин, адренокортикотропин,
лютеинизирующий и фолликулостимулирующий гормоны, пролак-
тин, соматотропин, липотропины.
Тиреотропин — гликопротеин, состоящий из двух субъединиц
(М13 600 и 14 700); относится к числу белков, богатых серой. Влия-
ет на скорость поглощения иода из крови в щитовидной железе,
включение иода в состав тиреоидных гормонов и на секрецию пос-
ледних.
Адренокортикотропный гормон (адренокортикотропин, кортико-
тропин, АКТГ) представляет собой пептид, образованный 39 остат-
ками аминокислот. Первичная структура АКТГ установлена для
человека и нескольких представителей высших животных (овца,
свинья, бык и др.). Обнаружены видовые различия: наиболее ва-
риабельными являются аминокислоты в положениях 25—32. АКТГ
участвует в регуляции биосинтеза кортикостероидов надпочечника-
ми, стимулирует рост коры надпочечников, участвует в процессе
мобилизации липидов из жировой ткани.
Фолликулостимулирующий, лютеинизирующий гормоны и про-
лактин объединяют под названием гонадотропные гормоны. Это
гликопротеины, состоящие из а и р-субъединиц. Фолликулостиму-
лирующий гормон вызывает у самок развитие большого числа фол-
ликулов и увеличение массы яичников. Лютеинизирующий гор-
мон— окончательное созревание фолликулов яичника, разрыв
фолликула и превращение его в желтое тело. Пролактин необхо-
дим для появления молока у самок млекопитающих при родах.
Соматотропин — гормон, ускоряющий рост и увеличивающий
массу тела. Это белок с молекулярной массой 21 000.
Липотропины а и (З-полипептиды, стимулирующие высвобожде-
ние жирных кислот из жировой ткани, £-Липотропин состоит из 91
аминокислотного остатка. Является предшественником эндорфинов
(см. разд. 2.5.1). Кроме того, цепь аминокислотных остатков р-ли-
потропина содержит последовательности АКТГ и р-меланоцитсти-
мулирующего гормона.
12.6.10. Другие гормоны млекопитающих. Некоторые гормоны
синтезируются в клетках, не относящихся к эндокринной системе.
Так, слизистой желудка вырабатывается группа гормонов, полу-
чивших название гастрины. Основная их функция — стимуляция
секреции желудочного сока, соляной кислоты. Кроме того, они
усиливают тонус и сокращение мышц желудка и тонкого кишечни-
ка, стимулируют секрецию глюкагона и инсулина поджелудочной
железой. Показано наличие в слизистой желудка четырех гастри-
нов, один из них обладает молекулярной массой, равной 20 000, и от-
носится к белкам, а остальные три являются пептидами.
12.6.11. Гормоны насекомых. Беспозвоночные обладают нейро-
эндокринной системой, которая имеет ряд общих черт с нейроэн-
529
докринной системой млекопитающих. Насекомые синтезируют гор-
мон активации, который регулирует секреторную функцию парных
желез. Парные железы вырабатывают ювенильный гормон у ли-
чинок насекомых.
Проторокальная железа насекомых секретирует экдизон. Он от-
носится к стероидным гормонам. Этот гормон необходим для перио-
дической смены экзоскелета личинок, в связи с чем и получил
дополнительное название гормона линьки. Обнаружены различные
виды экдизонов, считают, что они могут оказывать влияние на раз-
ные стадии развития насекомых. Экдизон стимулирует синтез РНК
в тканях, по-видимому, подобно стероидным гормонам млекопитаю-
щих, непосредственно контролирует процесс транскрипции.
12.7. Фитогормоны, особенности регуляции метаболизма
у растении
Известны четыре основные группы фитогормонов (растительных
гормонов): ауксины, гиббереллины, цитокинины, ингибиторы роста.
Ауксины. Это вещества индольной природы, основное из них —
р-индолилуксусная кислота (р-ИУК)—образуется обычно в мери-
стематических тканях из шикимовой кислоты через триптофан.
СИг—СООН
р-Индолилуксусная кислота
При оптимальном содержании ауксины значительно ускоряют
рост клеток в фазе растяжения, в некоторых случаях стимулируют
деление клеток. Регулируют приток воды и питательных веществ.
В механизме действия ауксинов существенную роль играет актива-
ция биосинтеза РНК и белков под их влиянием, а также усиление
энергетических процессов (интенсивность дыхания, сопряженность
окисления и фосфорилирования). По данным В. В. Полевого (1967),
при взаимодействии ИУК с мембранами происходит увеличение
«выброса» протонов на их наружную поверхность, в результате
чего возникает гиперполяризация мембран, подкисление клеточной
оболочки. Последнее приводит к активации ферментов, ее разрых-
ляющих. Это способствует растяжению оболочки, росту клеток.
Гиперполяризация мембран митохондрий может быть также причи-
ной активации синтеза АТФ при окислительном фосфорилировании.
В последнее время все большее признание получают взгляды,
согласно которым в растительных клетках существуют определен-
ные рецепторы первичного действия ауксинов (некоторые фермен-
ты, отдельные участки ряда мембран). Предполагают, что дейст-
вие ауксинов на такие рецепторы приводит к существенным изме-
нениям в биохимических процессах, через которые, в свою очередь,
530
опосредуются все разнообразные физиологические эффекты этих
фитогормонов.
Содержание ауксинов в растительных тканях меняется под дей-
ствием условий освещения, водного режима, минерального питания
и других факторов.
Гиббереллины, К ним относят более 40 тетрациклических кар-
боновых кислот. Наиболее распространен гиббереллин А3, или гиб-
берелловая кислота (ГК).
Остальные отличаются в основном по структуре боковых груп-
пировок. Образуются из ацетил-КоА через мевалоновую кислоту
(см. разд. 8.8.3). Синтезируются главным образом в интенсивно
растущих органах (молодые листья, корни, формирующиеся семе-
на). Гиббереллины существенно усиливают рост стебля, его удлине-
ние как за счет активации деления клеток, так и за счет их растя-
жения. В основе механизма действия гиббереллинов лежит увели-
чение интенсивности биосинтеза ферментов, а также нециклическо-
го фотофосфорилирования.
Цитокинины, Основные регуляторы деления клеток у растений, в
связи с чем и получили свое название (ауксины и гиббереллины в
большей мере регулируют рост растяжением). Являются производ-
ными аденина, в котором 6-аминогруппа замещена различными
группировками. Образуются в корнях и передвигаются в надземные
органы по ксилеме. Вместе с ауксинами участвуют в процессе ор-
ганогенеза. Стимулируют синтез белка и хлорофилла, задерживают
старение листьев. Подобно ауксинам, усиливают передвижение ве-
ществ к обогащенным ими тканям. Повышают интенсивность
циклического (в отличие от гиббереллинов) фосфорилирования.
Увеличивают в тканях количество всех видов РНК, активируют
хроматин.
Ингибиторы роста. Наибольшее значение имеет абсцизовая
кислота (АБК).
Абсцизовая кислота
531
Она образуется, как и гиббереллины, из мевалоновой кислоты.
Содержится в различных органах растений в значительных количе-
ствах, когда растение находится в состоянии покоя. По своему фи-
зиологическому действию АБК во многих случаях является анта-
гонистом ИУК, гиббереллинов и цитокининов. Баланс между фито-
гормонами и АБК определяет способность данного органа к росту
и морфогенезу. Под влиянием АБК резко уменьшается проницае-
мость мембран, что, видимо, и лежит в основе механизма ее дейст-
вия. Это соединение рассматривают также как общий генный реп-
рессор, подготавливающий растение к состоянию покоя.
В покровах семян и мякоти плодов содержатся фенольные инги-
биторы роста — кумарин, кумаровая кислота и другие, которые
тормозят прорастание семян. Их содержат и другие ткани растений,
особенно находящиеся в состоянии покоя. Фенольные ингибиторы
роста уменьшают содержание фитогормонов, в частности подавля-
ют биосинтез ИУК; нарушают сопряжение окисления и фосфорили-
рования в митохондриях.
СН=СН—СООН
Кумарин
он
•Кумаровая кислота
В процессе онтогенеза происходит взаимодействие фитогормо-
нов, при этом большую роль играет их количественное соотношение.
Так, увеличение отношения ауксин/кинетин способствует дифферен-
циации корней, а его уменьшение — дифференциации побегов.
Существенную роль в регуляции метаболизма у растений играет
система круговорота веществ. Будучи в некоторой степени анало-
гом кровообращения у животных, она включает в себя процесс
транспорта ассимилятов из листа в стебель и далее в корень по
флоэме и обратный ток с пасокой по ксилеме продуктов взаимодей-
ствия ассимилятов с минеральными солями в корнях. Исследова-
ниями А. Л, Курсанова и сотрудников (1960) показано, что этот
круговорот координирует и объединяет превращения веществ в
отдельных органах в единый метаболизм целого растения. Так как
вместе с ассимилятами и продуктами их метаболизации транспор-
тируются в фитогормоны (ауксины, цитокинины), круговорот ве-
ществ имеет большое регуляторное значение.
Поскольку растения постоянно связаны с субстратами, содержа-
щими минеральные соли (почва или вода), и минеральное питание
является важнейшей частью их метаболизма, в растительных тка-
нях особенно велика роль минеральных ионов как регуляторов
обмена веществ. Эту функцию они осуществляют прежде всего че-
роз влияние на активность ферментов (входя в их состав, меняя их
532
конформацию, скорость биосинтеза), а также через изменение
структуры и свойств биомембран.
Работами А. А. Анисимова и сотрудников (1984) показано, что
фитогормоны, система транспорта веществ и минеральные ионы
образуют в растительном организме единую регуляторную систему
с постоянным взаимодействием составляющих ее элементов, обра-
зованием между ними прямых и обратных связей. Солевой состав
и ионные градиенты растительных тканей, воздействуя на актив-
ность ферментов и свойства клеточных мембран, оказывают силь-
нейшее влияние на биосинтез фитогормонов, их распределение по
растению. Обладая аттрагирующей способностью, т. е. свойством
как бы притягивать ассимиляты, фитогормоны действуют на ин-
тенсивность и направленность их транспорта. Изменения в количе-
стве и составе ассимилятов, поступающих в какой-либо орган, вы-
зывают, в свою очередь, изменения в его метаболизме. Так, недос-
таток солей азота или фосфора задерживает транспорт сахаров из
листьев пшеницы в корни, что приводит к падению интенсивности
дыхания последних. Искусственное торможение оттока ассимилятов
путем отделения листа от стебля замедляет гидролиз крахмала в
листе. Интенсивность круговорота веществ оказывает некоторое
влияние и на передвижение, распределение фитогормонов по расте-
нию, это уже будет обратная связь. В этом плане следует оценивать
и зависимость поглощения минеральных ионов корнями от притока
в последние ассимилятов.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная
Кантор Ч., Шим мел П. Биофизическая химия. М., 1984, т. 1—3.
Ленинджер А. Основы биохимии. М., 1985, т. 1—3.
Мецлер Д. Биохимия. М., 1980, т. 1—3.
Основы биохимии / Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл В., Леман И. М.»
1981, т. 1—3.
Страйер Л, Биохимия. М.,1984, т. 1—3.
Филиппович Ю. Б. Основы биохимии. М., 1985.
Дополнительная
Глава 2
Хьюз Р. Гликопротеины. М., 1985.
Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М„ 1982.
Я кубке X.t Ешкайте X. Аминокислоты, пептиды, белки. М., 1985.
Глава 3
Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.,, 1982, т. 1—3.
Фершт Э. Структура и мёханизм действия ферментов. М„ 1980.
Глава 4
Газарян К., Тарантул В, Геном эукариот. М., 1983.
Инге-Вечтомов С. Г. Введение в молекулярную генетику. М., 1983.
Ратнер В, А. Молекулярная генетика: принципы и механизмы. Новосибирск,
1983
Глава 5
Киселев Л. Л., Фаворова О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от амино-
кислот до аминоацил-тРНК, 1984.
Кретович В. Л. Молекулярные механизмы усвоения азота растениями М.,
1980.
Спирин А. С. Молекулярная биология. Структура рибосом и биосинтез бел-
ка. М., 1986.
Глава 6
Степаненко В. Н. Химия и биохимия углеводов (моносахариды). М., 1977.
Степаненко Б. Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М., 1978.
Глава 7
Кучеренко Н, Е., Войницкий В. И Биоэнергетика. Киев, 1982<
Николс Д. Введение в хемиосмотическую теорию. М., 1985.
534
Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. М., 1979.
Скулачев В. /7. Трансформация энергии в биомембранах. М., 1972.
Глава 8
Рубан Е. Л. Микробные липиды и липазы. М., 1977.
Северин С. Е. Липиды. Структура, биосинтез и функции. М., 1977.
Глава 9
Болдырев А. А, Биологические мембраны и транспорт ионов. М., 1985.
Мембраны: ионные каналы/Под ред. Ю. К. Чизмаджева. М., 1982.
Сим Э. Биохимия мембран. М., 1985.
Глава 10
Витамины / Под ред. М. И. Смирнова. М., 1974.
Экспериментальная витаминология / Под ред. Ю. М. Островского. Минск,
1979.
Глава 11
Ионы металлов в биологических системах/Под ред. X. Энгель. М., 1982.
Глава 12
Варфоломеев С. Д., Мевх А. Г. Простагландины — молекулярные биорегу-
ляторы, М., 1985-
Нь юс холм Э., Старт К. Регуляция метаболизма. М., 1977.
Ткачук В. А. Введение в молекулярную эндокринологию. М., 1983.
Циклические нуклеотиды / Под ред. С. Е. Северина. М.» 1979.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ1
Абиетиновая кислота 440*
Абсцизовая кислота 531*
Авидин 120
Авитаминоз 471
— гастрогенный 484
Автотрофы 26
Агар-агар 334
Агглютинины 282
Агликоны 320
Адаптеры 239, 259
Аденилатная система 29
Аденилатциклаза 292, 362, 473, 508
Аденин 180, 181*
Аденогипофиз 529
S-Аденозилметионин 145*
Аденозиндифосфат (АДФ) 29
Аденозинмонофосфат (АМФ) 29
.Аденозинтрифосфат (АТФ) 27, 29*,
30, 370, 382, 410*
Адреналин 45, 362, 525*
Адренокортикостероиды 526
Азотфиксация 245, 247*
Азоферредоксин 246
Аконитат-гидратаза 379
Активность оптическая 36
Актин 407, 409*
Актиномицин D 270
Актомиозин 408
Аланин 35*, 40*, 45*, 51*, 252
Алкалоиды 307
Алкогольдегидрогеназа 147, 174
Аллантоин 304*
Альбумины 112, 127
Альдаровые кислоты 319
Альдегид оксид аза 145
Альдимин 157*
Альдозы 311, 366*
Альдоновые кислоты 319
Альдостерон 526*
Альдуроновые кислоты 320
Аманитины НО, 270
Амилазы 353, 354*, 356
1 Звездочкой отмечены страницы, на
или формулы.
536
Амилодекстрины 330
Амилоза 329*
Амилопектин 329*
Аминирование восстановительное 250
Аминоадипиновая кислота 51*
Аминоациладенилат 258
Аминоацил-тРНК 206, 259*
Аминоацил-тРНК — синтетазы
(АРСазы) 258
р-Аминобензойная кислота (ПАБК)
167, 168*, 491*
Аминокислоты 11
— активирование 258
— амиды 43
— биосинтез 248
— — источники азота и углерода 248
---основные пути 251
— регуляция 256
— вариабельные 81
— всасывание из кишечника 294
— входящие в белки 45
— диаминомонокарбоновые 47
— диссоциация 38, 41*
— заменимые 252
— классификация 34
— метаболизм, основные пути 299*
— моноаминодикарбоновые 48
— моноаминомонокарбоновые 45
— Небелковые 51
— обмен 245
— обозначения 76*
— растворимость 42
— редко встречающиеся в белках 51
— спектры поглощения 41
— стереохимия 38
— химические свойства 42
— циклические 49
б-Аминолевулиновая кислота 49
у-Аминомасляная кислота (ГАМК)
49, 52*
Аминопептидазы 79, 294
Аминосахара 321
которых помещены рисунки, таблицы
Аминотрансферазы 175, 251
Амины 43
— симпатомиметические 526
Аммиак, первичная ассимиляция 250
Аммониотелические животные 302
Амплификация 228
Амфолины 58, 59*
Амфолиты 58
Амфотерные электролиты 63
Анаболизм 20, 21*
Анемия 501
Анизатропия оптическая 72
Аниониты 56
Аномеры 314
Ансерин 12
Антаманид 110
Антивитамины 492
Антигены 282
Антикодоны 206
Антиметаболиты 167
Антиоксиданты 476
Антипорт 166
Антитела 33, 282
Апофермент 135
Арабиноза 323
Арахидоновая кислота 512
Аргинин 48*, 256
Аскорбатоксидаза 417
Аскорбиновая кислота 487, 488 *
Аспарагин 48, 116*, 300
Аспарагиновая кислота (аспартат)
48*, 157*, 251*, 252, 255*
Аспартатаминотрансфераза 14, 77
Аспартат — аммиак-лиаза 251
Атропин 308
Аттенюатор 230
АТФазный комплекс 403, 404*
Н+-АТФаза 403
Na+, К+-АТФаза (Na, К-насос) 468
АТФ-синтетаза 402
Ауксины 530
Ахродекстрины 330
N-Ацетилглюкозамин 116*, 337*
Ацетилкоэнзим А 378, 386*, 504
N-Ацетилнейраминовая кислота 322*
N-Ацетилмурамовая кислота 322*,
337*
Ацетилхолин 428*, 506
Ацетилхолинэстераза 428
Ацетоуксусная кислота 452
Ацидоз 291, 303
Ацил-КоА-дегидрогеназа 448
Ацил-КоА — синтетаза 446
Ацилпереносящий белок (АПБ) 453,
480
Ацилтрансферазы 174, 447
Базедова болезнь 523
Бактериородопсин 402
Бактериохлорофиллы 340
Бактериоцины 202
Белки 32
— автолиз 53
— агрегация 66, 100, 108
— амфотерные свойства 63
— биосинтез 257
---ингибиторы 270
--------транскрипции 270
-------- трансляции 270
---инициация 260, 262*
---регуляция 273
---терминация 263
--- элонгация 263
— вторичная структура 87
— выделение и очистка 52
— высаливание 55
— гидратация 64
— глобулярные 95
— гомологичные 81
— денатурация 53, 67
— дивергенция 82
— диссимиляция 290
— дифференциация 82
— домены 91*
— (3-изгиб 90*
— интегральные мембранные 460
— классификация 108
— конвергенция 82
— конститутивные 276
— контрактильные 407
— молекулярная масса 60, 62*
— мультимерные 100
— народнохозяйственное значение 33
— обмен 245
— олигомерные 100
— оптические свойства 70
— первичная структура 75
— переваривание 291
— плазмы крови 127
— полноценные 290
— растворимость 64
— расщепление в процессе пищеваре-
ния 290
— разложение при гнилостных про-
цессах в кишечнике 295
— ренатурация 69
— роль в питании 290
— самосборка 106, 107*
— сверхвторичные структуры 91*
— складчатые структуры 89
— сложные 108, 114
— сократительные 407
— а-спираль 87, 88*, 93*
— строение молекулы 72
— p-структура 89*, 93*
— субъединицы 100
— третичная структура 95*, 138*
— фибриллярные (нитевидные) 95, 97
— физико-химические свойства 52
— функции 32—33
— четвертичная структура 99
Белковое равновесие 291
537
Белковый минимум 291
Белок-репрессор 230
Белок-рецептор цАМФ (БРЦ) 276
Белок туннельный
Биливердин 125
Билирубин 125
Биологическая химия 5
Биомембраны 459
— мозаичная модель 459*
Биотин 486
Биохимические реакции, скоордини-
рованность 22
Биохимия, история развития 8
— основные открытия 13
Болезнь Аддисона — Бирмера 485
Брадикинин НО, 130, 296
Брожение 370
— гетероферментативное 372
— гомофермеитативное (молочное)
372
— спиртовое 371
Буферные системы 499
Вазопрессин 498, 528*
Валин 46*, 255
Ванадохром 115
Вердоглобин 125
Взаимодействия гетерологические 101
— гидрофобные 83, 85, 95
— изологические 101, 102*
— изостерические 418
— ионные 108
— слабые 83
Витамины 470—492
Витаминоподобные вещества 490
Внутренний фактор Касла 484
Вода внеклеточная 495
— внутриклеточная 495
— иммобильная 495
— роль 496
— эндогенная 497
Водный баланс 494
Водородные связи белков 64, 83
---ДНК 191
--- клетчатки 331*
Воска 436
— метаболизация 452
Вращение оптическое удельное 37
Высокоэнергетические соединения 27
Галактаны 338
Галактоза 312*, 324, 357
Галактозамин 321, 322*
Галактоземия 345
Галактоцереброзид френозин 433*
Галофиты 494
Ганглиозиды 433
Гаптены 282
Гаптоглобины 128
Гастриксин 293
Гастрины 292, 529
Гексозы 314, 323
Гексокиназа 344*, 364*
Гем 121*
Гематин 122
Гемин 122
Гемицеллюлазы 355
Гемицеллюлозы 332
Гемоглобин 11, 33, 121
— гетерогенность 122
— обмен 125
— свойства 123
— формы 124
— функции 125
Гемопексин 128
Гемопоэз 483
Гемостаз 129
Гемоцианины 126
Гемэритрин 126
Ген-регулятор 230*
Генетическая инженерия 237, 240*
Генетический код 265, 267*
Гены* мобильные диспергированные
— «прыгающие» 202
— структурные 189, 230
Гепарансульфат 335
Гепарин 120, 270, 334
Гептозы 324
Гераниол 439
Гетерополисахариды 328
Гетеротрофы 26
Гиалуроновая кислота 334
Гиббериллины 440, 531*
Гидратация ионов 86
— электростатическая 495
Гидролазы 173, 175
Гидролиз селективный 77
Гидрохинон 393
Гипервитаминоз 471
Гипергликемия 361
— эмоциональная 363
Гиповитаминозы 471
Гипоксантин 144*
Гипотеза качаний 268
Гипотиреоз 523
Гипофиз 527
Гипохромизм 194
Гиппуровая кислота 306*
Гираза (жираза) 223, 225
Гистамин 44*, 292
Гистидин 256
Гистоны 113, 198
Гликаны 311, 328
Гликоген 10, 329*, 330, 338
— биосинтез 348, 350
Гликоген-синтаза 350
Гликогенфосфорилаза 362
Гликогенолиз 370
Гликозидазы 355
538
Гликозиды 320
Гликозаминогликаны 117, 334
Гликозаминопротеогликаны 115
Гликоз ил диацилглицерины 432
Гликозилтрансферазы 174
Гликолиз 363, 365*
— баланс энергии 369
Гликолипиды 432
Гликопротеины 33, 115
— биологическая роль 117
— биосинтез углеводных компонентов
350
— истинные 115, 116
Гликосфинголипиды 432
Гликофиты 494
Гликофорин 462*
Гликофорин-амфипатический белок
462
Глиоксисомы 385
Глицеральдегид 37*, 271, 322
Глицеральдегид-З-фосфат (ГАФ) 341,
366*
Глицеральдегидфосфатдегидрогена-
за 92*
Глицерин 504
— окисление 446
Глицерофосфатный челночный меха-
низм 369
Глицерофосфолипиды 426, 437
Глицерол-З-фосфатдегидрогеназа 394
Глициды 309
Глицин 45*, 254
Глобин 122 1 '
Глобулины 112, 127
Глутаматдегидрогеназа 250
Глутамат декарбоксилаза 52
Глутамин 49, 300
Глутаминовая кислота (глутамат)
49*, 157*, 252, 298
Глутаминсинтетаза 250
Глутатион 109*, 148, 216
Глутаровая кислота (глутарат) 166*
Глюкагон 362, 527
Глюкаровая кислота 319*
Глюкоамилазэ 354
Глюкоза 10, 144*, 314*, 315*, 323,
344*, 357
— мобилизация 363
— пентозофосфатный цикл окисле-
ния 375*
— регуляция постоянства содержа-
ния в крови 359, 361*
Глюкованилин 321*
Глюкозамин 321, 322*
Глюкозидазы 353*
Глюкозо-6-фосфат 344*, 364*, 373
Глюкозо-6-фосфатаза 388*
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа 372
Глюкозурия 361
Глюкокиназа 364
Глюкокортикоиды 362
Глюконеогенез 385, 387*
Глюкоиовая кислота 144*, 319*
Глюконолактоназа 373
Глюкопираноза 317*, 331
Глюкуроновая кислота 319*
Глютелины 113
Гомеостаз 23
Гомогенность 59
Гомополисахариды 328
Гомосерин 255*
Гомоцистеин 255*
Гормон адренокортикотропный
(АКТГ) 529
— диуретический 498
— лютеинизирующий 529
— меланоцитстимулирующий 528
— соматотропный 362
— фолликулостимулирующий 529
Гормоны гонадотропные 529
— насекомых 529
— нестероидные 521
— стероидные 521
Грамицидин 109*
Гуанидингидрохлорид 62*
Гуанилатциклаза 509*
Гуанин 180, 181*
Гуанозинтетрафосфат (ффГфф) 278
Гуттаперча 440
Давление осмотическое 498
Дегидрогеназы 144, 173
— НАД (Ф) Независимые 158
Дезаминирование аминокислот 297,
298
Дезоксирибоза 180*, 323
Дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) 181,
221
Дезоксирибонуклеиновая кислота
(ДНК) 178, 180, 185
------- вторичная структура 190
------- двойная спираль 13, 190
1------денатурация 194
-------мигрирующие элементы 220
—200 — митохонДриальная (мтДНК)
-------одноцепочечная 193
------- первичная структура 14,
185
-------размер молекул 193*
------- ренатурации 196
-------репарация 216, 228
-------репликация 192, 217, 223,
224*, 225, 226, 228*
------- сателлитная 189
------- синтез 223
-------строение 192*, 193*
— — третичная структура 196,
-------цитоплазматическая 200
Дезоксирибонуклеотиды, биосинтез
216
639
Декарбоксилирование 148*
Декстраны 330
Декстрины 349
Деления 266
Десатуразы 456
Десорбция 11
Детергенты 68
Диабет 362
Диаминопимелиновая кислота 51*
Диастереомеры 35, 313
Диацилглицерин 443*
Дигалактозилдиацилглицерин 432*
Дигидроксиацетон 322
Дигидроксиацетонфосфат 366*
Дигидросфингозин 431
Дигидроурацил 182*
Дигидроуридин 206
Дигидротестостерон 524*
Дидезоксигексозы 324
Динеин 410
Динитрофторбеизол (ДНФБ) 78*
Диоксигеназы 413
Дипептидазы 294
Дисахариды 324, 326
Дисвитаминоз 471
Диссоциация, константа 39, 40*, 41*
Дитиотреитол 54*
Дифтерийный токсин 272
Диффузия 465
Додецилсульфат натрия (ДСН, SDS)
54*, 62, 68
Долихолмонофосфатсахар 352*
Домены 91*, 285
Дофамин 473
Дыхание 11, 12
— анаэробное 26, 27, 370
— аэробное 26, 370
— участки сопряжения 398
Дыхательная цепь 392, 394*, 396*
Дыхательный контроль 399
Дыхательные пигменты 121
Железопорфирины 147
Желтое тело 525
Желчные кислоты 441, 442*
Жидкокристаллическое состояние био-
полимеров 25
Жирные кислоты 422*
---- биосинтез 453
---- окисление 446—451
-------баланс энергии 449
Жировые числа 424
Жиры нейтральные 421
Иатрохимия 9
Изоамилаза 354
Изолейцин 35*, 46*, 255
Изомальтаза 357
Изомеразы 173, 176, 344
Изомерия 34
Изомеры 34, 36*, 38
Изопрен 437*
Изотахофорез 58
Изоферменты 169
Изоцитрадегидрогеназа 379
Изоцитрат-лиаза 383, 384*
Изоэлектрофокусирование 58, 60*
Иммунитет 288
Иммуноглобулины 283, 285*, 287*
Инверсия сахарозы 327
Ингибирование 516
— роста 531
Индол 295*
Индолилуксусная кислота 530*
Инозиновая кислота 213
Инозит 429, 489
Инсерция 202, 266
Инсулин 13, 33, 74, 77, 361, 527
Интеркаляция 270
Интроны 233*
Информосомы 235, 236
Информоферы 235, 236
Иодное число 424
Кадаверин 44*, 295
Казеин 115
Каллидин 110, 130, 296
Калликреин-кининовая система 130
Калликреины. 296
Кальцитонин 524
Камфора 439*
Канамицин 271*
Канифоль 440
Карбаминогемоглобин 124
Карбамоилфосфат 215*, 251*, 300*
Карбамоилфосфатсинтаза 251, 300
Карбоангидраза 147, 292
Карбоксигемоглобин 124
Карбоксипептидазы 79, 139, 155*,
294
Кардиолипин 429, 430*
Карнитин 447
Карнозин 12
Каротиноиды 472
Каротины 340*
Катаболизм 20, 21*
Катал 159
Каталазы 416
Катализ кислотно-основной, обоб-
щенный 152
---специфический 153
— ковалентный 152
— полифуикциональный 151
— ферментативный 148
— электрофильно-нуклеофильный 152
Катализаторы 133
Катенаны 223
Катехоламины 509
Катиониты 56
540
Каучук 440, 441*
Кейлоны 111
Кэп, кэпинг 209
Кератансульфаты 335
Кератины 33, 98, 114
Кетимин 157*
а-Кетоглутаратдегидрогеназная сис-
тема 380*, 381
а-Кетоглутаровая кислота 157*, 250,
251*, 298, 380*
Кетозы 311
Кетонемия 452
Кетоновые тела 451
Кетонурия 452
Киназы 30
Кининогены 130
Кислород, перенос к тканям в ходе
эволюции 126
Кислота 39
— Льюиса 152
Кислотное число 424
Кластеры 84
— гидрофобные 97
Клетчатка 310, 331*
Клонирование 239
Коацервация 67
Кобаламин 484
Кодазы 259
Кодеин 308
Кодоны мРНК 208, 209
Козимаза 12
Колицины 202
Коллаген 33, 51,- 98, 114, 131
Компартментализация 22
Комплемент, система 33, 288
Комплементарность азотистых основа-
ний 191
Коннексоны 461
Константа Михаэлиса 161
Конформация 38, 103, 105, 317
— пиранозного кольца 317*
Конформационные карты 77
Конформеры 38, 170
Кор нуклеосомный 199*
Корепрессор 275
Кортизол 526*
Кортикостерон 526*
Кор-фермент 218
Кофакторы 135
Кофермент А (КоА) 145*
— Q 393
Коферменты 135, 140
— кобамидные 485
— никотинамидные 140*
Коэффициент окислительного фосфо-
рилирования 398
— Хилла 515
Крахмал 328, 354*
— биосинтез 348
Креатин 305*
Креатинин 305*
Креатинурия 305
Креатинфосфат 408
Крезол 295
Кроссинговер 192
Ксантин 144*
Ксантноксидаза 145
Ксенобиотики 414
Ксеродерма пигментная 229
Ксерофтальмия 472
Ксилоза 117, 323
Кумарин 532*
Кумаровая кислота 532*
Кураре 307
«Куриная слепота» 472
Лактаза 357
Лактам 182*
Лактатдегидрогеназа 138, 141*, 168,
169*, 170, 368*
Лактим 182*
Лактоза 275, 325, 326*
— биосинтез 348
— гидролиз 353
Лактоферрин 115
Ламеллы 463
Ланолин 437
Легоглобин 248
Лейцин 35*, 46*, 255
Лектины 33, 118
Лецитины 427
Лиазы 173, 176
Либерии 522
Лигазы 173, 176
Лиганды 58, 146
Лидерная последовательность 233
^Лизин 44*, 148*, 255*
лизины 282
Лизофосфолипазы 444
Лизоцим 154*
Линалоол 438*
Линкеры 199, 239
Лиофилизация 60
Липазы 424, 441
Липиды 420
— биосинтез 453
— классификация 420
— обмен 441
— превращения в процессе пищева*
рения и всасывания 441
«Липкие» концы 197, 239
Липоаминокислоты 429
Липоат-ацетилтрансфераза 379
Липоевая кислота 148*, 491
Липопротеины 114, 128
Липотропины 111*, 529
Литотрофы 26
Лихенин 334
Малатдегидрогеназа 381, 386
Малат-синтаза 384
541
Малонил-КоА 454
Малоновая кислота 166*
Мальтаза 353, 356, 357
Мальтодекстрины 330
Мальтоза 326*, 353
Маннит 320*
Манноза 320*, 324
Масла 423
— эфирные 438
Мевалоновая кислота 457
Мезосомы 462
Меланины 49
Меланоидины 45
Мембраны миелиновые 463
— сопрягающие 31
— функции 464
Ментол 439*
Меркаптоэтанол 53*
Метаболизм 20, 25
— регуляция 103, 505, 514
Металлопротеиназы 175
Металлопротеины 115
Металлоферменты 146
Метгемоглобин 125
Метилгликозиды 321
Метилентетрагидрофолиевая кислота
216, 254*
Метилирование исчерпывающее 321
Метилметионин 491
5-Метил урацил 180
5-Метилцитозин 181
Метионил-тРНК 260
Метионин 47*, 145*, 255*
Методы гравитационный 61
— дисперсии оптического вращения
(ДОВ) 72
— дифференциальной спектрофото»
метрии 71
— «дробового ружья» 240
— иммунохимический 283
— инфракрасного дихроизма 71
— кругового дихроизма (КД) 72
— масс-спектрофотометрии 79
— минус- и плюс-систем 187
— определения молекулярной массы
белков 60
— пептидных карт 78
— «перекрывающихся пептидов» 79
— равновесного центрифугирования в
градиенте CsCl 193
— радиоавтографии 241
— реассоциации 138, 196
— рентгеноструктурного анализа 99
— седиментационного равновесия 61
— секвенирования 187
~ слияния генов 241
— спектрофотометрии 70
— флуоресцентной спектроскопии 72
— хроматографии 55—58*
---аффинной 57, 209
--- газовой 55
---гель-проннкающей (гель-фильт-
рация) 56, 61
---жидкостной 55
--- ионообменной 55
---тонкослойной 61, 62
— Эдмаиа 78
— электрофоретические 58
---в полиакриламидном геле 186
Микросомы 413
Микротрубочки 407, 409
Микрофиламенты 407, 409
Микроэлементы 500
Мини-гены 287
Миоглобин 126
Миозин 407, 409*
— АТФазная активность 13
Митохондрии 369, 390, 391*, 394*»
396*
— сопрягающая мембрана 412
Модулятор 233
Молибдоферредоксин 246
Молочная кислота 368*
Моноацилглицерин 443*
Моногалактозилдиацилглицерин 432
Монодезоксигексозы 324
Мононуклеотиды 213
Монооксигеназы 413
Моносахариды 310, 311, 317
— О-ацильные производные 321
— восстановление 320
— действие кислот и оснований 318
— О-метильные производные 321
— производные 320
— ферментативные взаимопревраще-
ния 344
— физико-химические свойства 318
Морфин 308
Мостики солевые 97
Мочевая кислота 144*, 291, 304*
Мочевина 139*, 300
— биосинтез 1U^
— орнитиновыи цикл 13, 300
Мукополисахариды 334
Мурамовая кислота 322
Муреин 337*
Мускарин НО
Мутазы 176
Мутаротация 313, 316
Муцины 33
Мыла 424
Мышцы, работа 407
— , сокращение 409*
НАДН-дегидрогеназа 394
Надпочечники 525
Нейромедиаторы 52, 506
Нейраминовая кислота 116
Неомицин 271
Никелеплазмин 125
Никотин 308
542
Н и котина м ид а дени н динуклеотид
(НАД) 12, 140, 141*
Никотинамидадениндинуклеотид-
фосфат (НАДФ) 140
Никотиновая кислота 481
Нингидрин 42
Нитратредуктаза 249
Нитритредуктаза 249
Нитрогеназы 246
Норадреналин 45, 506, 525*
Нуклеазы 221
Нуклеиновые кислоты 178
--- строение 180
Нуклеины 178
Нуклеозиддифосфатсахара 145
Нуклеозидтрифосфаты 145
Нуклеозиды 182, 183*
Нуклеоплазмин 199
Нуклеопротеины 178
Нуклеосомы 199
Нуклеотидилтрансферазы 346
Нуклеотиды 179, 182, 183*
— биосинтез 213
— пиримидиновые 215*
— пуриновые 213, 214*
— циклические (цАМФ, цГМФ) 508
Обмен азотный 299, 301*
— белковый и углеводный 502
-------липидный 504
— водно-солевой- 493, 494
— веществ 5, 20, 502
---и внешняя среда 505
— углеводов и липидов 503
— энергетический 417
Окисление биологическое $89
— микросомальное 413
— неполное 372
— свободное 411
Оксигемоглобин 124
Оксигеназы 411
Оксидазы 173, 411
Оксидоредуктазы 173, 176
Оксилизин 51*
Оксиметилфурфурол 45
Оксипролин 50*
Окситоцин 528*
Олигонуклеотиды 183
Олигопептиды 74
— биосинтез 272
Олигосахариды 310, 324, 325
— биосинтез 346
— номенклатура 324
— расщепление 353
Оператор 230*
/as-Оперон 275, 276
Органотрофы 26
Орнитин 44*, 51*, 252, 300*
Оротовая кислота 182*, 490
Основание 39
— Льюиса 152
— шиффово 152
Основания минорные 181
Отжиг 195
Палиндромы 183, 190, 203, 205
Пальмитиновая кислота 456
Пальм итодистеарин 443*
Пангамовая кислота 490*
Пантотеновая кислота 480
Паратгормон 524
Паращитовидные железы 524
Пектин растворимый 333
Пектиновые вещества 333
Пеллагра 481
Пентозы 180, 314, 323
Пепсин 292
Пепсиноген 292
Пептидилтрансферазный центр рибо-
сомы 263
Пептиды 73
— опиоидные ПО, 111
— природные 109
Переаминирование 251
Пероксидазы 173, 416
Пероксисомы 416
«Пинг-понг»-механизм (механизм
двойного замещения) 156*, 167
Пинен 439*
Пиноцитоз 469
Пиран 314*
Пиридоксаль 481
Пиридоксальфосфат 157*, 482*
Пиридоксаминфосфат 157*, 482*
Пиридоксин 482*
Пиримидин 180, 181*, 215*
Пиримидиновые основания 180
Пировиноградная кислота (пируват)
368*
---окисление 378, 382
---пути превращения 371*
Пирролидонкарбоновая кислота 75*
Пируватдегидрогеназная система 379
Пируваткарбоксилаза 386
Плазмалогены 430
Плазмиды 201, 240*
Плазмин 132
Пластеины 11
Пластоцианин 115
Поджелудочная железа 527
Полиавитаминозы 471
Полинуклеотиды 183
Полинуклеотидфосфорилаза 220
Полипептиды 74
Полипренолфосфаты 351
Полисахариды 311, 328, 338
— бактерий 336
— биосинтез 346
— расщепление 353
Полисомы 212
Полифруктозаны 330
543
Половые железы 524
Полуацетали 313
Полукетали 313
Потенциал Ван-дер-Ваальса 85
— восстановительный стандартный
397
— покоя 464
— электрохимический 382, 410*, 465
Правила Чаргаффа 185
Праймер 138, 216
Преальбумин 127
Прелрогормоны 520
Примазы 226
Прогестерон 525*
Прогоркание 425
Прокоагулянты, синтез 478
Пролактин 529
Проламины 113
Пролин 50*, 252
Промотор 100, 230*
Проназа 297
Проопиомеланокортин 111
Пропионовая кислота 451
Простагландины 511, 512*
Простетическая группа 135, 140, 142
ПротаминьГ 113
Протеины 108, 112
Протеиназы 175, 295
Протеиноиды 114
Протелин 297
Протеогликаны 115, 117
Протеолипиды 114
Протеолипосома химерная 402
Прото гем 12
Протомеры 80
Протонный контроль 399
— насос 401
Протонофоры 412
Протопектин 333
Протопорфирин 121
Протромбин 129
Процессинг мРНК 208, 232, 234
Проэластаза 294
Псевдоуридин 181, 206
Птиалин 356
Пурин 180, 181*. 213* .
Пуриновые основания 180
Пуромицин 271
Путресцин 44*, 295
Путь Энтнера — Дудорова 377, 378*
Разобщители окисления и фосфори-
лирования 412
Растворение солевое 65
Рафиноза 327
Рацемазы 176
Рацематы 36, 312
Реакции двухсубстратные 155
— изомеризации 155
— мономолекулярные 156
544
— односубстратиые — одиопродукт-
ные 155
— окислительно - восстановительные
397
— переноса групп 155
— пиросфофорилазная 478
— преципитации 282
— траисгидрогеназная 396
— ферментативные 155
---- кинетика 158
----скорость 159, 160*, 163, 164*,
165
---- типы 155
---- энергия 164*
— эндергонические 28
— экзергонические 28
Ревертаза 219
Редокс-цепь 392
Редуктазы 173
Рекогниция 258
Релаксин 525
Ренатурация 69, 104, 196
Реннин 292
Репликаза 220
Репликация, вилка 225, 227*
Репликоны 225
Реплисома 228
Репрессия катаболитная 276, 277*
Рестриктазы 186, 222
Ретроингибирование 516
Рибоза 180*, 318*, 323
Рибонуклеазы (РНКазы) 14, 221
Рибонуклеиновые кислоты (РНК)
179, 180, 184*, 204
-------геномные 205
-------гетерогенность 204
-------информационная (иРНК) 208
-------матричная (мРНК) 208, 209*
-------рибосомная (рРНК) 13, 210,
236
-------синтез 229
-------транскрипция 229
-------транспортная (тРНК) 13,
205, 207*, 236
Рибонуклеопротеиновые комплексы
(РНП-комплексы) 235
Рибосомы 210, 211*
Рибофлавин 479
Рибулозо-1,5-бисфосфат (РуБФ) 341
Рилизинг-факторы 522
Рифампицин 270
РНКд^ависимая ДНК-полимераза
РНК-полимераза 80, 187
Родопсин 121, 472
Сахара, окисление 319
Сахараза (инвертаза) 327, 353 357
Сахароза 325, 327*
— биосинтез 347
Сахарозоглюкозилтрансфераза
харозофосфорилаза) 348
Сахарозосинтаза 348
Сахарозофосфат-синтаза 348
Свертывание крови 129, 131
Связи амидные 73
— биуретовые 73
— ван-дер-ваальсовы 83, 85
— водородные 83, 87, 95*
— вторичные 83
— гидрофобные 102
— дисульфидные 96
— ионные 83, 86, 95*, 96
— ковалентные 73, 95*, 96
— кооперативность 85
— пептидные 73, 74*, 76
— солевые (см. ионные)
— транс-пептидные 74*
Секвенаторы 78
Секретин 292, 527
Селектор 232
Селенопротеины 115
Семихинон 393
Сервалиты 58, 59*
Серин 46*, 117*, 254
Сефадексы 56, 57*, 330
Сефароза 330
Сиаловые кислоты 116, 322
Сигнальные вещества 280
Симметрия диэдрическая 101
— кубическая 101
— циклическая 102
— элементы 36 ’
Симпорт 466
Синерезис 66
Синтетазы 176
Сирогем 249
Ситостерол 436
Скатол 295*
Сквален 438, 458
Скорбут 488
Смоляные кислоты 438, 439
Солюбилизация 54
Соматостатин 292, 527
Состав организмов химический
18*
Спейсеры 189, 209
Спектрин 463
Спермацет 437
Сплайсинг 235*
Статин 522
Стеногалинные животные 493
Стереоизомерия 35, 312
Стериды 436
Стерины 435
— биосинтез 457
Стероиды 434
Стеролы 435
Стигмастерол 436
Стрептомицин 271
Стрихнин 308
Стэкинг-взаимодействия 191
(са- Субстраты 134, 155*
Субтилизины 297
Сукцинатдегидрогеназа 139, 381,
394
Сульфаниламидные препараты 167,
168*
Супероксид-дисмутаза 416
Сфингозин 431*
Сфинголипиды 114
Сфингомиелин 431*
Сфингофосфолипнды 431
Тейхоевые кислоты 336, 337*
Теория белков полипептидная 11, 72
— индуцированного соответствия 151
— дыхания перекисная Баха 390
— происхождения жизни 12
— синтеза мочевины 300
— сопряжения окисления и фосфори-
лирования хемиосмотическая 14,
401
Терминатор 230*
Терпентин 439
Терпены 437, 457
Тестостерон 524*
Тетрагидрофолиевая кислота
(ТГФК) 483
Тетрасахариды 324
Тетрозы 323
Тиамин 478
Тиаминдифосфат 479
Тимидилат-синтаза 216
Тимин 180, 181*
Тимозин 527
Тимопоэтины 527
Тимус 527
Тиолиз 449
Тиоредоксин 216
Тиоурацил 182*
Тиреотропин 529
Тирозин 49, 252, 253*
Тироксин 362, 523
Токоферолы 475
17, Топоизомеразы 199, 223
Торсионные углы в пептидной цепи
76*
Точка изо ионная 40, 64
— изоэлектрическая (ИЭТ) 40, 63
Трансальдолаза 174, 374
Трансаминирование 13
Транскетолаза 174, 374
Транскриптаза обратная 219
Транскрипция 192, 208, 218, 229,
232
— строение единицы 233, 234*
— цикл 230
Транслокация 263
Трансляция 257, 259
Транспозоны 203
Транспорт активный 467
~~ пассивный 465
545
Трансферазы 173, 174, 176
Трансферрин 115, 128
Трансформация генетическая 178
Трегалоза 327
Треонин 46*, 243,
Триацилглицерины 421, 443, 457
Трииодтиронин 362, 523*
Трилон Б 53
Триозофосфат-изомераза 366*
Триозы 322
Триплеты нуклеотидов 13, 73
— терминирующие 263
Трипсин 77, 293
Трипсиноген 293
Триптофан 50*, 253*, 256
Трисахариды 324, 327
Тритон Х-100 54*
Тромбин 33, 129, 131
Тромбоксаны 512
Тромбоциты 131
Тропомиозин 408
Тропоколлаген 98
Тропонин 408
Тубулин 407
Убихинон 393*
Углеводы 309
— взаимопревращения 344
— гидролиз 353
— классификация 309
— образование в процессах фото- и
хемосинтеза 338
— пентозный путь окисления 345
— превращение в процессе пищева-
рения 355
— расщепление 344
— ферментативный синтез 344
— функции 309
Углерод, источники для организмов
26
Уравнение Аррениуса 164
— Лайнуивера — Берка 162*, 167*
— Михаэлиса — Ментен 160
Уратоксидаза 304
Урацил 180, 181*
Уреаза 139*
Уреотелические животные 303
Уридинфосфат 350
Урндиндифосфатглюкоза 347
Уридинтрифосфат 350
Урикотелические организмы 303
УФ-эидонуклеаза 229
Фагоцитоз 469
Факторы свертывания крови 129, 130*
— сопрягающие 397
Фаллоидины НО
Фенилаланин 49*, 253*, 256
Фенилизотиоцианат (ФИТЦ) 78*
Фенол 295, 416*
Фенолоксидазы 417
Ферменты 133
— аллостерические 418, 514, 515*
— активность 517
---единицы 158
------- удельная 159
---каталитического центра 159
— активный центр 93, 136*, 138*, 153
— дыхательные 12
— железосбдержащие 147
— ингибирование 165, 166
— йндуцибельные 274
— классификация 172
— локализация 171
— медьсодержащие 147
— множественные молекулярные
формы (ММФФ) 168, 169*
— номенклатура 172
— принципы строения 134, 138*
— регуляторные 514
— свойства 133
— селеносодержащие' 147
— специфичность действия 138, 139,
153
— сравнительная активность в тка-
ням 171
— цянксодержащие 147
Феромоны 438
Ферритин 115, 122
Фибрин 130
Фибриноген 33, 127, 129
ФибринолМз 132
Фибринолизин 132
Фиброин 99, 114
Фикобилины 340
Филлохиноны 476
Фитин 490
Фитогемагглютинины 118
Фитогормоны 530
Фитол 440
Фитостеролы 436
Флавинадениндинуклеотид (ФАД)
120, 142, 393
Флавинмононуклеотид (ФМН) 120,
142, 143*, 393
Флавопротеины (ФП) 120, 174
Флагеллин 410
Фолиевая кислота 112, 167, 482
Фосфатидали 430
Фосфатидилглицерины 429
Фосфатидилинозиты 428, 429*
Фосфатидилсахара 430
Фосфатидилсерины 428
Фосфатидилхолины 427, 428*
Фосфатидилэтаноламиньт 428
Фосфатидная кислота 457
Фосфатиды 425
Фосфатные группы, перенос 28
Фосфоглицериновая кислота 254*, 344
Фосфоглюконовая кислота 373*
546
Фосфоенолпировиноградяая кисло-
та (фосфоенолпируват) 343, 367,
368*
Фосфоенолпируват - карбоксикиназа
386
Фосфолипазы 444
Фосфолипиды 114,425
Фосфопротеины 114
Фосфорилирование 13, 31
— окислительное 392, 402*, 477
— субстратное 381
Фосфоролиз 354
Фосфотрансферазы 175
Фосфотриозы 344
Фосфофруктокиназа 366*, 418
Фотолитотрофы 27*
Фотоорганотрофы 27*
Фотореактивация 229
Фоторецепция 472
Фотосинтез II, 338
Фототрофы 26
Фруктоза 312*, 324
Фруктозо-1,6-дифосфат 365, 366*,
386
Фруктозо-6-фосфат 364*, 386*
Фруктофуранозидаза 353*
Фумаратдегидрогеназа 381
Фумаровая кислота (фумарат) 251*
Фуран 314*
Фурфурали 318
Фурфурол 45, 318*
Фусидовая кислота 272
Хеликазы 225
Хемолитотрофы 27*
Хемоорганотрофы 27
Хемосинтез 26, 343
Хемотрофы 26
Хиломикроны 128, 445
Химозин 293
Химотрипсин 77, 136, 137*, 139, 153,
154*
Химотрипсиноген 136, 137*
Хинин 308
Хинон 416*
Хиральность 36
Хитин 332
Хлорамфеникол 272*
Хлорокруорин 126
Хлорофиллы 339*
Холестеразы 445
Холестерин 435*, 458*
Холин 427
Холофермент 135, 218
Хондроитинсульфаты 335
Хроматин 198
Хромопротеины 71, 120
Целлобиоза 326, 331, 353
Целлюлаза 355, 358
Целлюлоза 310, 331*, 338
— биосинтез 350
— «германсовская» конформация 332*
Церамиды 431
Церамидолигосахариды 433
Цереброзиды 432
Церулоплазмин 127
Цикл глиоксилатный 383, 384*
— Кальвина 341, 342*
— орнитиновый 13, 300, 302*
— пентозофосфатный 345, 372, 375*
— трикарбоновых кислот (Кребса)
13, 21, 378, 380*
------- баланс энергии 382
-------реакции и ферменты 379,
380*
Циклический аденозин монофосфат
(цАМФ) 473
Циклогексимид 272
Цинга 488
Цистеин 47*, 253, 255*
Цистин 47
Цис-транс-еноил-КоА-изомераза 449
Цис-транс-изомеразы 176
Цис-транс-изомеризация 148
Цис-транс-изомеры 35
Цистроны 209, 230*
Цитозин 180, 181*
Цитокинины 531
Цитохромная система 395
Цитохромоксидаза 115, 395
Цитохромы 395
Цитрат-синтаза 379
Цитронеллол 439
Цитруллин 51*, 301*
Шикимовая кислота 253, 256*
Щавелевоуксусная кислота (ЩУК,
оксалоацетат) 166*, 251*, 343,
386*
Щитовидная железа 523
Эвригалинные животные 493
Экдизоны 436, 530
Экзонуклеазы 221
Экзоны 233*
Эксцизия 203
Эластаза 294
Электронпереносящие цепи 392
Электроны, энергетика переноса 397
7S-Эле менты 202
Эмульгаторы 67
Энантиомеры 35, 312
Эндемический зоб 501
Эндонуклеазы 221
Эндопероксиды 512
Эндопиоиды 110
Эндорфины 111
Эндотоксины 118
Энергетика биосинтетических реак-
ций 406
547
Энергетический обмен, регуляция 417
Энергетическое сопряжение, меха-
низм 400
Энергия активации 149
— источники для организмов 26, 27*
— свободная стандартная 27, 28*
Энтерокиназа 293
Эпимеры 313
Эпимеразы 176
Эритродекстрины 330
Эритромицин 272
Эритроциты 126
Эргостерол 436
р-Эстрадиол 524*
Эстеразы 443
Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА)
53*
Эффект Бора 123
— Пастера 418, 419*
Яблочная кислота (малат) 343, 386*
Ядрышковый организатор 236
Янтарная кислота (сукцинат) 381*
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие ......................................................... 3
Введение .............................................................. 5
Глава 1. Общая биохимическая характеристика живых организмов ... 17
1.1. Химический состав живых организмов........................... 17
1.2. Основные особенности метаболических процессов................. 20
1.3. Источники энергии для живых организмов, высокоэнергетические
соединения 26
Глава 2. Белки........................................................ 32
2.1. Общая характеристика.......................................... 32
2.2. Аминокислоты . ............................................... 34
2.3. Физико-химические свойства белков............................ 52
2.4. Строение, белковой молекулы................................... 72
2.5. Классификация, характеристика, представители................. 108
Глава 3. Ферменты (энзимы)......................................... 133
3.1. Общие и специфические свойства ферментов.................. 133
3.2. Общие принципы строения ферментов......................... 134
3.3. Активный центр............................................ 136
3.4. Строение и функции отдельных коферментов и простетических
групп.......................................................... 140
3.5. Механизм ферментативного катализа........................ 148
3.6. Типы ферментативных реакций.............................. 155
3.7. Кинетика ферментативных реакций .......................... 158
3.8. Множественные молекулярные формы ферментов и изоферменты 168
3.9. Локализация ферментов и их сравнительная активность в от-
дельных органах и тканях ...................................... 171
3.10. Классификация и номенклатура ферментов.................. 172
3.11. Ферменты в промышленности, медицине, сельском хозяйстве • • 177
Глава 4. Нуклеиновые кислоты........................................ 178
4.1. Открытие нуклеиновых кислот и их биологическая роль .... 178
4.2. Общая характеристика строения нуклеиновых кислот...... 180
4.3. Дезоксирибонуклеиновые кислоты............................. 185
4.4. Рибонуклеиновые кислоты............................... 204
4.5. Биосинтез* нуклеотидов................................ 213
, 4.6. Ферменты синтеза и превращений нуклеиновых кислот ...» 216
4.7. Синтез ДНК............................................ 223
4.8. Синтез РНК................................................ 229
4.9. Генетическая инженерия ..................................... 237
549
Глава 5. Обмен белков и аминокислот ................................. 245
5.1. Фиксация молекулярного азота воздуха........................ 245
5.2. Биосинтез аминокислот.................................... 248
5.3. Синтез белка................................................ 257
5.4. Регуляция биосинтеза белка.................................. 273
5.5. Структура антител, механизм их образования ................. 282
5.6. Диссимиляция белков . ...................................... 290
5.7. Алкалоиды.......................................... . . 307
Глава 6. Углеводы.................................................... 309
6.1. Строение, классификация, роль в живой природе............... 309
6.2. Моносахариды . ............................................. 311
6.3. Олигосахариды (полисахариды I порядка) ........ 324
6.4. Полисахариды II порядка (гликаны).......................... 328
6.5. Образование углеводов в процессах фотосинтеза и хемосинтеза 338
6.6. Взаимопревращения углеводов, ферментативный синтез и рас-
щепление ...................................................... 344
6.7. Превращение углеводов в процессе пищеварения................ 355
6.8. Регуляция постоянства содержания глюкозы в крови.......... 359
6.9. Превращения углеводов, связанные с дыханием и брожением . . 363
6.10. Глюконеогенез.................................• . . . . 385
Глава 7. Биологическое окисление и биоэнергетика . . ................ 389
7.1. Развитие учения о биологическом окислении................ 389
7.2. Митохондрии как внутриклеточные центры аэробного дыхания 390
7.3. Окислительное фосфорилирование ............................. 392
7.4. Пути использования энергии в клетке .......... 406
7.5. Регуляторное теплообразование и свободное окисление. Оксиге-
назы и оксидазы........................................ . . . 411
7.6. Регуляция энергетического обмена............................ 417
Глава 8. Липиды ..................................................... 420
8.1. Общая характеристика и классификация........................ 420
8.2. Нейтральные жиры и жирные кислоты......................... 421
8.3. Фосфолипиды ......................................... . 4JJ5
8.4. Гликолипиды.............................................. 432
8.5. Стероиды ................................................... 434
8.6. Воска ...................................................... 436
8.7. Терпены..................................................... 437
8.8. Обмен липидов............................................ 441
Глава 9. Биомембраны................................................. 459
9.1. Строение мембран............................................ 459
9.2. Функции мембран............................................. 464
Глава 10. Витамины................................................... 470
10.1. Общая характеристика....................................... 470
10.2. Жирорастворимые витамины.................................. 471
10.3. Водорастворимые витамины..................................^478^
10.4. Витаминоподобные вещества, взаимодействие витаминов, анти-
витамины ....................................................... 490
Глава П. Водно-солевой обмен ........................................ 493
11.1. Поддержание концентраций растворенных веществ — важное
условие жизни.................................................. 493
11.2. Содержание и роль воды в организме, водный обмен .... 494
11.3. Минеральные вещества...................................... 498
550
Глава 12. Интеграция и регуляция метаболизма........................ 502
12.1. Обмен веществ как единая система процессов ........... 502
12.2. Уровни и принципы регуляции метаболизма............. 505
12.3. Циклические нуклеотиды.............................. 508
12.4, Простагландины".................................... 5JJL
12.5. Регуляция метаболизма через ферментативный аппарат ... 514
12.6. Гормоны человека и животных......................... 519
12.7. Фитогормоны, особенности регуляции метаболизма у растений 530
Рекомендуемая литература........................................... 534
Предметный указатель............................................ 536
Учебное издание
Анатолий Алексеевич Анисимов,
Ариадна Николаевна Леонтьева,
Ирина Филипповна Александрова,
Маргарита Сергеевна Каманина,
Людмила Михайловна Бронштейн
Основы биохимии
Заведующий редакцией Д. Г. Гаврилов
Редактор А. С. Орлова
Младшие редакторы С. М. Ерохина, Л. С-. Макаркина,
И: М. Павлова, Е. И. Попова, Е. Г. Самойло
Художник S. П, Бабикова
Художественный редактор Т. А. Коленкова
Технический редактор Т. Д. Гарина
Корректор С. К. Завьялова
ИБ № 5716
Изд. № Е-437. Сдано в набор 23.12.85. Подп. в печать. 12.06.86. Т—07553. Формат
60 x 90716. Бум. книжно-журн. Ns 2. Гарнитура литературная. Печать высокая.
Объем 34,5 усл. печ. л. 69,0 усл. кр.-отт. 38,85 уч.-изд. л. Тираж 31 000 экз.
Заказ. № 937. Цена 1 р. 80 к.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д 29/14,
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном
комитете СССР по делам издательств, полиграфии н книжной торговли.
150014, Ярославль, ул. Свободы, 97.