OCHOBI
’	’ ’’И ‘
основы
БИОХИМИИ
Под редакцией проф. А. А. АНИСИМОВА
Допущено
Министерством высшего и среднего
специального образования СССР
в качестве учебника
для студентов университетов,
обучающихся по специальности
«Биология»
МОСКВА .ВЫСШАЯ ШКОЛА
ББК 28.072
0-75
УДК 577.1
А А. Анисимов, А. Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова, М. С. Каманина,
Л. М. Бронштейн
Рецензенты:	i
кафедра биохимии (зав. кафедрой проф. С. Н. Лызлова) и кафедра фи-
зиологии и биохимии растений (зав. кафедрой проф. В. В. Полевой)
Ленинградского государственного университета им. А. А. Жданова;
чл.-кор. АН Грузинской ССР, д-р биол. наук, проф. Н. Н. Нуцубидэе
(Институт биохимии растений АН Грузинской ССР)
Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец, ун-тов/
0-75 А. А. Анисимов, А. Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова и др.;
Под ред. А. А. Анисимова.— М.: Высш, шк., 1986.—551 с.: ил.
С учетом новейших достижений науки рассмотрены вопросы статической и ди-
намической биохимии белков, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, минераль-
ных веществ, витаминов. Особое внимание уделено проблемам биосинтеза белка,
дыхания и энергетики, ферментативного катализа, регуляции метаболизма, перспек-
тивам дальнейшего развития физико-химической биологии, освещены экологические
аспекты ряда биохимических проблем. Отличительная особенность книги — сравни-
тельно-эволюционный принцип изложения материала.
О
2007020000—353
001(01)— 86
ББК 28.072
57.04
104—86
© Издательство «Высшая школа», 1986
ПРЕДИСЛОВИЕ
Биохимия — одна из наиболее быстро развивающихся об-
ластей биологии. Раскрывая биохимические основы различ-
ных проявлений жизнедеятельности, она оказывает огромное
влияние на развитие всех разделов биологии и имеет большое
значение для формирования диалектико-материалистического
мировоззрения. Достижения биохимии призваны обеспечить
качественно новый этап в управлении явлениями жизни. Био-
химия широко применяется в различных областях народного
хозяйства и в медицине. Поэтому для подготовки специалис-
тов-биологов в университетах страны крайне нужны учебники
и учебные пособия, излагающие основы современной биохи-
мии, обобщающие и анализирующие ее новейшие достижения
и пути развития.
Предлагаемый учебник подготовлен в соответствии с про-
граммой курса «Биохимия» для студентов биологических спе-
циальностей университетов. Необходимость такого издания
диктуется тем, что для университетов учебники общей биохи-
мии отечественных авторов не публиковались в СССР после
1966 г.; студенты использовали переводные книги. Появивши-
еся в 1981—1982 гг. трехтомные издания по биохимии Д. Мец-
лера, А. Уайта и других благодаря своему большому объему
имеют характер кратких энциклопедий и более пригодны ас-
пирантам и студентам, специализирующимся по биохимии на
старших курсах. В известной мере это относится и к образцо-
вому во многих отношениях 3-томному изданию А. Лениндже-
ра (1985).
При написании данного учебника был использован много-
летний опыт чтения лекционного курса общей биохи-
мии студентам Горьковского государственного университета
им. Н. И. Лобачевского. Излагаемый материал отражает ос-
новные достижения в области биохимии, опубликованные в
монографиях и периодической литературе последних лет как
отечественных, так и зарубежных авторов. Большое внимание
уделено проблемам молекулярной биологии, поскольку это
направление в последние годы особенно активно и успешно
развивалось. Рассмотрены перспективы дальнейшего разви-
тия физико-химического направления в биологии.
а
Особенностью учебника является сравнительно-эволюцион-
ный принцип изложения, обсуждаются отличия и общие чер-
ты основных биохимических процессов у бактерий, растений
и животных, что необходимо для студентов-биологов широкого
профиля. Излагаются также экологические аспекты биохими-
ческих проблем, крайне актуальные в наше время. По воз-
можности указывается практическое использование отдельных
веществ и биохимических процессов в народном хозяйстве.
Учебник представляет собой совместный труд коллектива
авторов. Распределение материала между авторами следую-
щее: А. А. Анисимов — введение, гл. 1, 12 и ряд разделов дру-
гих глав; А. Н. Леонтьева — гл. 4, 6, 7 и разд. «Синтез белка»;
И. Ф. Александрова — гл. 2, 3, 9 и разд. «Регуляция биосин-
теза белка»; М. С. Каманина — гл. 6, 8 и разд. «Аминокисло-
ты» и «Фиксация молекулярного азота воздуха»; Л. М. Брон-
штейн — гл. 10, 11 и разд. «Гормоны человека и животных»,
«Структура антител, механизм их образования», «Диссимиля-
ция белков», «Превращение углеводов в процессе пищеваре-
ния» и некоторые другие.
Авторы искренне признательны за просмотр рукописи и
сделанные полезные замечания акад. С. Е. Северину, проф.
В. В. Полевому и чл.-кор. АН Груз. ССР проф. Н. Н. Нуцубид-
зе. Особенно благодарны авторы за большой труд по тщатель-
ному ознакомлению с рукописью, ценные советы и большую
помощь при окончательной доработке рукописи проф. С. Н.
Лызловой, проф. В. П. Гончаровой, доц. А. А. Мюльбергу, доц.
Ю. П. Глушанкову, доц. А. И. Камковой. По отдельным гла-
вам учебника полезные замечания были сделаны проф.
Н. А. Добротиной, ст. науч. сотр. Л. Н. Олюниной, которым
авторы также выражают свою признательность.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия (биохимия) — наука о химическом сос-
таве и свойствах веществ живых организмов, о превращениях ве-
ществ в процессе жизнедеятельности. Совокупность этих превра-
щений, отражающих постоянную взаимосвязь организма с внеш-
ней средой, принято называть обменом веществ.
Понятия «химический состав», «превращения веществ» и само
название науки — «биологическая химия» наталкивают на вопрос:
разделом биологии или химии является биохимия? Ф. Энгельс
разработал и изложил в «Диалектике природы» научно и методи-
чески обоснованную классификацию наук по формам движения
материи, которые эти науки изучают. Жизнь — качественно свое-
образная, высшая форма движения материи в природе. Обмен ве-
ществ представляет собой основу, сущность этой особой формы
движения материи. «Жизнь есть способ существования белковых
тел, существенным моментом которого является постоянный обмен
веществ с окружающей их внешней природой» Ч Поэтому наука,
изучающая сущность биологической формы движения материи—
обмен веществ, должна быть отнесена к группе биологических
наук.
Определение биохимии как науки одновременно характеризу-
ет и ее положение, значение среди других биологических наук.
Изучая сущность жизни, самое главное в жизненных процессах—
обмен веществ, биохимия, несомненно, должна быть отнесена к
важнейшим биологическим наукам. Недаром даже в одном из ос-
новополагающих документов нашей страны — Основных направ-
лениях экономического и социального развития СССР на 1986—
1990 годы и на период до 2000 года — отмечается необходимость в
области естественных наук «развивать физико-химическую биоло-
гию, научные основы получения физиологически активных веществ
для медицины и сельскохозяйственного производства...»1 2
Значение биохимии как науки для человеческого общества оп-
ределяется тем, что она является одной из теоретических основ ме-
дицины, сельского хозяйства, биотехнологии, генетической инжене-
рии и ряда отраслей промышленности, лесного дела. В основе
многих патологических состояний человека лежат нарушения от-
1 Маркс К., Энгельс Ф. Соч. 2-е изд., т. 20, с. 616.
2 Рыжков Н. И. Об основных направлениях экономического и социального
развития СССР на 1986—1990 годы и на период до 2000 года. М., 1986.
5
дельных биохимических процессов. Известно, например, более ста
заболеваний, обусловленных нарушением деятельности фермента-
тивных систем, отсутствием отдельных ферментов вследствие на-
следственных дефектов. Для некоторых заболеваний характерны
изменения в химической структуре ряда высокомолекулярных сое-
динений. Такого рода «молекулярные дефекты» описаны, в частно-
сти, для гемоглобина и полисахаридов. Без глубоких знаний моле-
кулярных основ патологии невозможны ни диагностика и лечение,
ни профилактика болезней. Успехи биохимии определяют и стра-
тегию создания новых лекарственных препаратов. Большой инте-
рес в этом отношении представляет широкое использование фер-
ментов при лечении некоторых заболеваний.
Биохимические процессы и показатели лежат в основе любой
технологии пищевой промышленности: хлебопечения, сыроварения,
виноделия, пивоварения, производства чая, жиров и масел, перера-
ботки молока, мяса и рыбы, плодов и овощей, производства крах-
мала и патоки. Биохимические знания необходимы для успешной
организации кожевенного производства, при изготовлении меховых
изделий, обработке натурального шелка. Ферментативные препа-
раты широко используют при изготовлении хлопчатобумажных
тканей. Все более расширяются такие биохимические производст-
ва, как изготовление витаминов, антибиотиков и других биологиче-
ски активных соединений, органических кислот, кормового белка.
Только на основе глубокого изучения закономерностей обмена
веществ сельскохозяйственных растений и животных возможно
получение больших урожаев с высоким качеством в растениевод-
стве и повышение продуктивности в животноводстве. Исключи-
тельно эффективно в этом отношении применение в сельском хо-
зяйстве разнообразных химических препаратов: гербицидов, фун-
гицидов, кормовых витаминов, белков и антибиотиков, дефолиан-
тов и десикантов (вызывают опадение листьев и предуборочное
высушивание растений), инсектицидов (уничтожают насекомых-
вредителей), репеллентов (отпугивают вредителей) и т. д.
Все перечисленное свидетельствует о большом значении био-
химии для человеческого общества, объясняет громадный и все
возрастающий интерес к этой науке во всех странах мира.
Биохимию принято делить на статическую и динамическую. За-
дача статической биохимии — изучение химического состава и
свойств веществ живых организмов. Динамическая биохимия изу-
чает превращения веществ в процессе жизнедеятельности. Это де-
ление, в значительной мере условное, полезно при изложении тео-
рии биохимии в учебных, методических целях. При проведении же
реальных биохимических исследований невозможно глубоко изу-
чить и понять превращения какого-либо вещества в организме, не
зная строения, свойств этого вещества, и, наоборот, любая харак-
теристика свойств биохимических соединений будет неполной без
описания их превращений в организме. В зависимости от объектов
исследования различают биохимию человека и животных, биохи-
0
мию растений, биохимию микроорганизмов. Выделяют определен-
ные разделы биохимии и по направленности исследований.
Техническая биохимия разрабатывает биохимические основы
тех отраслей промышленности, где перерабатываются сырье и ма-
териалы биологического происхождения (хлебопечение, сыроваре-
ние, виноделие и т. д.).
Медицинская биохимия изучает биохимические процессы в ор-
ганизме человека в норме и при патологии.
Эволюционная биохимия сопоставляет состав и пути превраще-
ния веществ и энергии различных систематических групп живых
организмов в эволюционном плане.
Квантовая биохимия исследует свойства, функции и пути прев-
ращения различных веществ живых организмов в связи с электрон-
ными характеристиками этих веществ, полученными с помощью
квантово-механических расчетов.
Энзимология изучает структуру, свойства и механизм действия
энзимов (ферментов) — биологических катализаторов.
Из всех других наук биохимия наиболее тесно связана с физио-
логией. Эта связь обусловлена самой природой, сущностью биоло-
гических процессов. В основе любого нарушения какой-либо физио-
логической функции лежит система изменений биохимических ре-
акций. Нельзя глубоко, до конца правильно понять природу любо-
го физиологического процесса, не зная его биохимизма, так же как
нельзя изучать биохимические реакции в отрыве от их физиологи-
ческого значения. Неудивительно поэтому, что до второй половины
XIX столетия биохимия была не самостоятельной наукой, а разде-
лом физиологии. На течение биохимических процессов решающее
значение оказывает состояние физиологических функций организ-
ма и прежде всего состояние нервной системы.
Тесная связь биохимии и физиологии отразилась и в творчест-
ве многих крупных исследователей. Великий русский физиолог
акад. И. П. Павлов является одновременно одним из основополож-
ников ряда важных разделов биохимии, в частности разделов энзи-
мологии: о превращении зимогенов (проферментов) в активные
ферменты, об обратимости действия ферментов, о строении и свой-
ствах пищеварительных ферментов.
Постепенно, в связи с накоплением биологических знаний,
биохимия стала одним из ведущих разделов физиологии, а затем
обособилась в самостоятельную науку. В наши годы, в связи с
мощным развитием отдельных разделов биохимии, появляется тен-
денция выделения некоторых из них в самостоятельные научные
дисциплины (например, энзимологии).
Биохимия взаимосвязана и с органической химией. При прове-
дении исследований биохимики выделяют отдельные вещества из
живых организмов, очищают от примесей, устанавливают однород-
ность, определяют состав и структуру, изучают свойства, после че-
го, при необходимости, синтезируют эти вещества. Таковы же эта-
пы исследования и химика-органика. Но если у химика на этом
работа исчерпывается, у биохимика начинается самое важное и
7
интересное — изучение превращений данных соединений в общей
системе обмена веществ живого организма, выяснение их роли в
его жизнедеятельности. Связь биохимии и органической химии так-
же отразилась в научном творчестве ряда ученых. Так крупнейший
советский химик-органик акад. Н. Д. Зелинский известен своими
работами по биохимии белков.
С каждым годом расширяются связи биохимии с физической
химией. Большое значение для протекания жизненных процессов
имеют скорости биохимических реакций, их зависимость от темпе-
ратуры, активной реакции среды и связи с осмотическими явлени-
ями. Все эти вопросы являются одновременно компетенцией и
биохимии и физической химии. В последнее время особенно актив-
но внедряются в биохимические исследования физико-химические
и физические методы: хроматография, электрофорез, рентгено-
структурный анализ, спектроскопия, электронный парамагнитный
резонанс (ЭПР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), метод ме-
ченых атомов и т. д. В итоге сформировалась новая область науч-
ных знаний — физико-химическая биология, успешно развивающа-
яся в нашей стране.
Еще лет тридцать назад вряд ли можно было говорить о серь-
езном взаимодействии биохимии с математикой. Теперь же это
стало очевидным фактом. И не только потому, что результатам био-
химических исследований лишь тогда можно доверять, когда они
статистически обработаны, известна степень их достоверности.
Значительно более важен вклад математики в биохимию в связи с
широким внедрением метода математических моделей, рассмотре-
нием ряда биохимических процессов с точки зрения прямых и об-
ратных связей, механизмов регуляции и управления этими процес-
сами, их саморегуляции (т. е. сопряжения биохимии с кибернети-
кой), что привело к широкому использованию ЭВМ в современных
биохимических исследованиях.
Как самостоятельная наука биохимия сформировалась около
ста лет назад, однако биохимическими процессами люди пользова-
лись и во времена глубокой древности, не зная, естественно, их те-
оретической сущности. Нам представляется возможным в истории
развития биохимических знаний и биохимии как науки выделить
четыре периода.
/ период — с древних времен до эпохи Возрождения (XV в.).
Это период практического использования биохимических процессов
без знания их теоретических основ и первых, порой очень прими-
тивных, биохимических исследований.
В самые отдаленные времена люди уже знали технологию та-
ких производств, основанных на биохимических процессах, как
хлебопечение, сыроварение, виноделие, дубление кож. Необходи-
мость лечения болезней заставляла задумываться о превращениях
веществ в организме, о причинах целебных свойств лекарственных
растений. Использование растений в пищевых целях, для изготов-
ления красок, тканей, дубителей также наталкивало на попытки
понять свойства отдельных веществ растительного происхождения.
8
Талантливый ученый X столетия Авиценна (Ибн-Сина) в своей
знаменитой книге, многократно переиздававшейся вплоть до на-
ших дней,— «Канон врачебной науки» — подробно описал многие
лекарственные вещества, отведя им целый раздел книги.
Берестяные грамоты XI в., найденные при раскопках Новгоро-
да, свидетельствуют, что в то время на Руси была хорошо развита
технология пивоварения, виноделия, хлебопечения. Наши предки
уже тогда знали много достаточно сложных рецептов красок и чер-
нил из растений. До сих пор поражает богатством и свежестью
красок знаменитый памятник славянской культуры — рукописное
Остромирово Евангелие (XI в.).
И период в развитии биохимии, существующей еще как раздел
физиологии, характеризуется усилением накопления биохимичес-
ких знаний. Этот период ведет отсчет от начала эпохи Возрожде-
ния и заканчивается во второй половине XIX в., когда биохимия
становится самостоятельной наукой.
Эпоха Возрождения характеризуется некоторым ослаблением
церковного гнета в науке, освобождением естествознания от пут
средневекового религиозного мракобесия. Гений того времени, ав-
тор многих шедевров искусства, архитектор, инженер, анатом Лео-
нардо да Винчи, интересовавшийся также процессами, в основе
которых лежат биохимические реакции, провел интересные опыты и
на основании их результатов сделал важный для тех лет вывод,
что живой организм способен существовать только в такой атмос-
фере, в которой может гореть пламя.
Для XVI—XVII вв. характерно возникновение и развитие
иатролимии (от греч. иатрос — врач). Сторонники этого направле-
ния утверждали, что жизнедеятельность человека, причины его
заболеваний можно понять только с точки зрения химии, и лечение
многих болезней следует осуществлять путем применения прежде
всего химических средств. Один из основоположников иатрохи-
мии, немецкий врач и физиолог Парацельс (1492—1541) писал,
что задача алхимии не в изготовлении золота, а в создании того,
что является силой медицины.
Восемнадцатый век, ознаменованный гениальными трудами
М. В. Ломоносова, характеризуется мощным и всесторонним раз-
витием наук в России. Открытие М. В. Ломоносовым закона сох-
ранения массы веществ нанесло сокрушительный удар по идеализ-
му в естествознании. Это великое открытие заложило основы мате-
риалистического понимания природы и ее явлений, послужило на-
чалом новой эры в химии, биологии и других науках — эры точных
количественных измерений. Известно, что М. В. Ломоносов — осно-
воположник химической науки в России. Ее становление отрази-
лось и на развитии химии растений. Замечательную мысль выска-
зал М. В. Ломоносов во «Введении в истинную физическую хи-
мию» (1752): «...хотя органы животных и растений весьма тонки,
однако они состоят из более мелких частичек, и именно из неорга-
нических.., ^потому что при химических операциях разрушается их
организованное строение». Эта блестящая материалистическая
9
трактовка строения живых организмов уже в те годы не оставляла
места для особой «жизненной силы», для витализма. В работе
«Слово о явлениях воздушных» (1753) М.В. Ломоносов впервые в
науке высказал важные мысли о «воздушном питании» растений,
т. е. о фотосинтезе. В его трудах неоднократно говорится о значе-
нии химии для медицины; им дано описание ряда биохимических
соединений — жиров, эфирных масел, смол.
На основе открытого М. В. Ломоносовым закона сохранения
массы веществ и накопившихся к концу XVIII в. эксперименталь-
ных исследований французский ученый А. Лавуазье количественно
исследовал и объяснил сущность дыхания, указав на роль кислоро-
да в этом процессе. Немецкий химик Ю. Либих в 30—40 годы
XIX в. успешно развил методы количественного химического ана-
лиза и применил их к исследованию биологических систем.
Мощным толчком к развитию органической химии и биохимии
явилась созданная великим русским химиком А. М. Бутлеровым
теория строения органических соединений (1861). В те годы неко-
торые ученые (например, известный химик-органик Ш. Вюрц) счи-
тали, что познать строение органических веществ принципиально
невозможно и что существующие их формулы являются лишь ус-
ловными символами строения. Неверие в возможности науки, че-
ловеческого разума, признание их ограниченности — агности-
цизм — является, как известно, откровенным идеализмом.
А. М. Бутлеров в своей теории утверждал, что атомы и моле-
кулы существуют в определенных реальных взаимоотношениях,
количественных и пространственных, которые и выражаются фор-
мулами. Он указывал также, что химические свойства веществ
обусловлены их строением. Материалистическая теория А. М. Бут-
лерова — революционная для своего времени, надолго определила
пути развития органической химии и биохимии.
А. М. Бутлеров сделал и другой ценный вклад в биохимию: он
впервые синтезировал лабораторным путем сахар. Виталисты ут-
верждали, что органические соединения могут образовываться толь-
ко в живом организме под влиянием непознаваемых жизненных
сил. Синтез сахара А. М. Бутлеровым и мочевины немецким хи-
миком Ф. Вёлером опроверг лженаучные утверждения виталистов.
В 50-х годах прошлого столетия известный французский физи-
олог К. Бернар выделил из печени гликоген и показал, что он пре-
вращается в глюкозу, поступающую в кровоток. В 1868 г. Ф. Ми-
шер в лаборатории немецкого физиолога и биохимика Ф. Гоппе-
Зейлера открыл ДНК. Однако по достоинству это открытие и,
главное, само вещество были оценены лишь почти 100 лет спустя.
Ill период в истории биохимии, начинающийся со второй поло-
вины XIX в., ознаменован выделением биохимии как самостоятель-
ной науки из физиологии. Эго связано с резким увеличением интен-
сивности и глубины биохимических исследований, объема получае-
мой информации, возросшим прикладным значением — использо-
ванием биохимии в промышленности, медицине, сельском хозяйст-
ве. к этому времени относятся работы одного из основоположни-
10
ков отечественной биохимии А. Я* Данилевского (1838—1923). Ис-
следуя строение белков, он сформулировал ряд положений, кото-
рые в дальнейшем легли в основу полипептидной теории структу-
ры белков, А. Я. Данилевским впервые высказана идея об обрати-
мости действия ферментов и на основании этого осуществлен фер-
ментативный синтез белковоподобных веществ (пластеины). Он
разработал оригинальную методику разделения и очистки фермен-
тов путем адсорбции и элюции (десорбция), которую широко ис-
пользуют и в наши дни. А. Я. Данилевский возглавил в Казанском
университете первую в России кафедру биохимии и создал первую
русскую школу биохимиков.
Большие заслуги в развитии отечественной биохимии принад-
лежат М. В. Ненцко-му (1847—1901). В 1891 г. он создал первую
в России биохимическую лабораторию при Институте эксперимен-
тальной медицины в Петербурге. Им был выполнен ряд выдаю-
щихся исследований: совместно с сотрудниками Л. П. Мархлев-
ским и С. В. Салазкиным впервые были установлены основные
этапы биосинтеза мочевины, также впервые подробно исследова-
но строение гемоглобина и сделано сопоставление в эволюционном
плане со структурой хлорофилла. Поражает широта диапазона
научных интересов М. В. Ненцкого, к уже перечисленному можно
добавить — синтез салола, изучение обмена белков, исследование
некоторых аспектов этиологии туберкулеза.
К концу прошлого столетия относится открытие Н. И. Луниным
витаминов (1880), Д. И. Ивановским — вирусов (1892).
На рубеже XIX и XX вв. работал крупнейший немецкий химик-
органик и биохимик Э. Фишер (1852—1919). Его исследования со-
ставили целую эпоху в развитии биохимии. Им были сформулиро-
ваны основные положения полипептидной теории белков, начало
которой дали исследования А. Я. Данилевского. Э. Фишер устано-
вил структуру, предложил формулы и исследовал свойства почти
всех аминокислот, входящих в состав белков. Им было проведено
подробное и обширное изучение строения и ферментативных пре-
вращений углеводов, особенно моносахаридов.
К этому же времени относятся исследования великого русско-
го физиолога растений К. А. Тимирязева (1843—1920), в трудах
которого затрагиваются многие биохимические вопросы фотосинте-
за и минерального питания растений. Еще в 1868 г. на I съезде
русских естествоиспытателей 25-летний К. А. Тимирязев сделал
сообщение о превращении неорганических веществ зелеными лис-
тьями растений в органические под влиянием солнечной энергии.
Это было лишь начало его фундаментальных работ по фотосинте-
зу, завоевавших затем мировое признание.
В конце прошлого столетия начал свои исследования и другой
великий русский ученый — А. Н. Бах, ставший впоследствии ос-
нователем советской биохимической школы. С самого начала своей
научной деятельности А. Н. Бах направил внимание на одну из уз-
ловых проблем биохимии — дыхание. Его не удовлетворяла идея
о полной аналогии между дыханием и горением, высказанная
Ц
к. Лавуазье. Созданная (А. Н. Бахрм на основании глубоких йодле-,
дований перекисная теория объяснила механизм участия кислоро-
да воздуха в реакциях дыхания. Она не потеряла своего значения
и в наше время, выяснение роли оксигеназ, пероксидаз и каталазы
в процессе биологического окисления все больше привлекает вни-
мание биохимиков.
Многое сделано А. Н. Бахом в области энзимологии, им зало-
жены основы учения о физиологической роли ферментов. Исследо-
вания Баха способствовали развитию технической биохимии в на-
шей стране. А. Н. Бах являет собой прекрасный пример ученого-
гражданина, всегда сочетавшего большую научную работу с актив-
ной общественной (а до 1917 г. и с революционной) деятельностью.
Уже в гимназии он читал К. Маркса, в студенческие годы был
сослан на 5 лет за участие в «беспорядках», впоследствии он —
активный член «Народной воли». После Октябрьской революции
А. Н. Бах организует ряд крупных биохимических институтов:
Биохимический институт Наркомздрава, Институт биохимии АН
СССР и др. Образованная акад. А. Н. Бахом, его учениками и
сотрудниками советская школа биохимиков получила всеобщее
признание и поныне занимает достойное место в мировой науке.
Среди непосредственных сотрудников А. Н. Баха особого внимания
заслуживает А. И. Опарин — создатель широко известной и при-
знанной теории происхождения жизни.
Ряд замечательных русских ученых, начавших научную деятель-
ность до Октябрьской революции, проявили свой талант уже в го-
ды Советской власти:
В. И. Палладии показал, что дыхание представляет собой систе-
му ферментативных процессов, установил роль кислорода воды и
реакций дегидрогенизации — отщепления водорода — при ды-
хании;
С. П. Костычев исследовал химизм спиртового брожения и
анаэробной фазы дыхания, нашел общность между ними;
Д. Н. Прянишников заложил основы учения об азотном обмене
растений, раскрыл роль аммиака и аспарагина в этом процессе,
создал основы советской агрохимии.
В первой трети XX в. акад. В. С. Гулевичем (МГУ) были от-
крыты и исследованы карнозин и ансерин — азотистые экстрактив-
ные вещества мышц. В. С. Гулевич — один из основателей сравни-
тельно-эволюционной биохимии в нашей стране, им создана в Со-
ветском Союзе крупная биохимическая школа.
Начало XX столетия характеризуется рядом фундаментальных
исследований в области химии и за рубежом. В 1905 г. А. Гарден и
В. Ионг выделили первый кофермент спиртового брожения — «ко-
зимазу», называемый в наше время НАД (никотинамидаденинди-
нуклеотид). В этом же году Ф. Кнооп открыл и исследовал 0-окис-
ление жирных кислот. К 20—30 годам относятся блестящие работы
немецкого биохимика О. Варбурга по выделению и изучению дыха-
тельных ферментов (цитохромоксидаза, флавиновые дегидрогена-
зы и др.), выделению пиридиновых нуклеотидов, изучению их
12
структуры и функции. В это же время Д. Самнер и Д. Нортроп
(США) впервые выделили ферменты в виде белковых кристаллов,
совершив тем самым революцию в энзимологии. В 1933 г. Г. Кребс
подробно изучил орнитиновый цикл образования мочевины, а
1937 г. датируется открытие им же цикла трикарбоновых кислот,
который является биохимической основой аэробного расщепления
углеводов.
В 1933 г. Д. Кейлин (Англия) выделил цитохром с и воспроиз-
вел процесс переноса электронов по дыхательной цепи в препара-
тах из сердечной мышцы.
В Советском Союзе в 30—40 годах были сделаны два замеча-
тельных открытия, сказавшихся на последующем развитии всей
биохимии. В 1931 г. В. А. Энгельгардт показал, что фосфорилиро-
вание сопряжено в процессе дыхания с окислительными процесса-
ми, а в 1942 г. он же совместно с М. Н. Любимовой открыл АТФ-
авную активность миозина и других сократительных белков.
В 1938 г. А. Е. Браунштейн и М. Г. Крицман впервые описали
реакции трансаминирования, являющиеся одним из узловых пунк-
тов азотного обмена всех живых организмов.
40-е и особенно 50-е годы характеризуются усиленным исполь-
зованием в биохимических исследованиях физических, физико-хи-
мических и математических методов, активным и успешным изу-
чением основных жизненных процессов (биосинтез белков, в пер-
вую очередь) на молекулярном и надмолекулярном уровнях. Это
был несомненно качественный скачок в развитии биохимии, поэто-
му представляется возможным, 50-е годы, в которые была опуб-
ликована статья Д. Уотсона и Ф. Крика о строении двойной спи-
рали ДНК, положившая начало новому научному направлению —
молекулярной биологии, считать одновременно и началом каче-
ственно нового периода в истории биохимии — IV периода.
Вот краткая хронология основных открытий в биохимии этого
периода.
1953 — Д. Уотсон и Ф. Крик предложили модель двойной спи-
рали строения ДНК.
1953 — Ф. Сэнгер впервые расшифровал аминокислотную по-
следовательность белка инсулина, состоящего из 51 аминокислот-
ного остатка.
1955—1960 — А. Н. Белозерский и его сотрудники, исследовав
нуклеотидный состав ДНК огромного числа представителей живот-
ных, растений и бактерий, охарактеризовали таксономическое и
эволюционное значение количественного соотношения отдельных
азотистых оснований в ДНК.
1959, 1960 — А. С. Спирин и П. Доти установили вторичную и
третичную структуру рибосомальной РНК.
1961 — М. Ниренберг расшифровал первую «букву» кода белко-
вого синтеза — триплет ДНК, соответствующий фенилаланину.
Позднее С. Очоа и Г. Корана расшифровали все буквы этого кода.
1965—1967 — Р. Холли и независимо от него А. А. Баев опре-
делили нуклеотидную последовательность транспортных РНК.
в
1966 — П. Митчелл сформулировал хемиосмотическую теорию
сопряжения окисления и фосфорилирования,
1969 — Р. Мерифильд химическим путем синтезировал фермент
рибонуклеазу.
1970 — Г. Корана синтезировал ген (транспортной РНК), а в
1976 г. присоединил его к ДНК мутантного штамма бактериофага
X, дефектного по данному гену, после чего этот бактериофаг стал
нормально размножаться.
1971 — в совместной работе двух лабораторий, руководимых
Ю. А. Овчинниковым и А. Е. Браунштейном, установлена первич-
ная структура аспартатаминотрансферазы — белка из 412 амино-
кислот.
1977 — Ф. Сэнгер и сотрудники впервые полностью расшифро-
вали первичную структуру молекулы ДНК (фаг фХ174).
В нашей стране в настоящее время продолжают активно раз-
виваться различные направления биохимических исследований.
В МГУ многие годы под руководством академика С. Е. Северина
плодотворно проводятся работы по биохимии дыхания. С. Е. Севе-
рин длительное время является Президентом Всесоюзного биохими-
ческого общества, его исследования и организаторская работа мно-
гое сделали для укрепления и развития советской биохимической
школы. Крупные работы приоритетного характера по биоэнергети-
ке выполняются в МГУ В. П. Скулачевым. Большие успехи достиг-
нуты коллективом Института биохимии АН СССР, особенно в об-
ласти энзимологии (И. В. Березин), биологической фиксации азо-
та воздуха и азотного обмена растений, технической биохимии
(В. Л. Кретович), биохимии и биофизики фотосинтеза (А. А. Крас-
новский). Ряд интереснейших открытий в области биосинтеза бел-
ков и их структуры сделаны в Институте белка АН СССР
(А. С. Спирин), по исследованию структуры и функций нуклеино-
вых кислот, некоторым энзимологическим проблемам — в Инсти-
туте молекулярной биологии АН СССР (В. А. Энгельгардт,
А. Е. Браунштейн, А. А. Баев, Г. П. Георгиев). Широкое признание
в нашей стране и за рубежом получили исследования структуры и
свойств мембран Ю. А. Овчинниковым (Институт биоорганической
химии АН СССР). Научным центром функциональной биохимии
растений является в Советском Союзе Институт физиологии расте-
ний АН СССР, руководимый А. Л. Курсановым. Кроме перечис-
ленных институтов интенсивные и успешные работы в области
биохимии проводятся в Институте медицинской и биологической
химии АМН СССР, Институте биохимии и физиологии микроор-
ганизмов, Институте фотосинтеза, Институте биофизики АН
СССР, а также в ряде институтов ВАСХНИЛ. Институты биохи-
мии существуют и в академиях наук большинства союзных респуб-
лик. ЦК КПСС и правительство нашей страны оказывают большое
внимание и помощь развитию биохимических исследований, о чем
свидетельствуют специальные постановления последних лет о
мерах по ускорению развития молекулярной биологии (1974), фи-
зико-химической биологии и биотехнологии (1981), о дальнейшем
14
развитии биологии и биотехнологии (1985). Эти постановления
способствовали коренным изменениям в советской биологической
науке, в первую очередь развитию таких ее разделов, как молеку-
лярная! биология, биоорганическая химия, молекулярная генетика,
иммунология.
По £яду вопросов физико-химического направления в биологии
советские ученые заняли передовые позиции в мировой науке. На
основе достижений физико-химического направления биологии в
СССР формируется перспективная научно-техническая отрасль —
биотехнология. Одним из существенных показателей активного раз-
вития биохимических исследований в нашей стране является рез-
кое увеличение числа публикуемых работ. До Октябрьской социа-
листической революции в России не было периодических изданий
по биохимии. В настоящее время у нас издаются журналы: «Био-
химия», «Успехи биологической химии» (ежегодник), рефератив-
ный журнал «Биологическая химия», «Украинский биохимический
журнал», «Прикладная биохимия и микробиология», «Эволюцион-
ная биохимия и физиология», «Биоорганическая химия», «Моле-
кулярная биология», «Вопросы медицинской химии», «Физиология
и биохимия культурных растений» (Киев). Кроме перечисленных
специализированных изданий большое число биохимических работ
публикуется в «Докладах АН СССР», журнале «Физиология рас-
тений» и многих других периодических изданиях.
Советские биохимики являются постоянными и активными
участниками всех международных биохимических конгрессов, кон-
ференций Федерации Европейских биохимических обществ
(ФЕБО), членами международных биохимических организаций
(очередная, 16-я конференция ФЕБО проходила в 1984 г, в
Москве).
Проблемы, решение которых предстоит в настоящее время био-
химической науке, чрезвычайно важны для человечества, инте-
ресны и увлекательны. Одна из них: исследование обмена веществ
человека с целью оздоровления, разработки кардинальных методов
борьбы с «болезнями века» — раком, сердечно-сосудистыми заболе-
ваниями, нахождение путей увеличения продолжительности жизни.
Биохимические исследования — основа решения этой проблемы,
ибо возникновение раковых опухолей есть результат изменения
строения ядерной ДНК, нарушения биохимических механизмов
регуляции клеточного деления. Причина многих сердечно-сосуди-
стых заболеваний заключается в искажении нормального течения
липидного обмена. Любая болезнь связана с нарушениями обмена
веществ, и лечение очень часто представляет собой нормализацию об-
мена с помощью лекарственных препаратов. Невозможно предста-
вить себе в настоящее время диагностирование (распознавание) бо-
лезней без предварительных биохимических анализов. Иммунитет,
способность организма противостоять заболеванию, основан на
сложной системе биохимических процессов. Иммунохимия — одна
из актуальных областей знания в наше время, стоящая на стыке
биохимии и медицины.
15
Крайне интересно также изучение биохимических основ дея-
тельности центральной нервной системы, головного мозга. Еще
акад. И. П. Павлов указывал (1949), что настоящую теорию всех
нервных явлений может дать нам только изучение физико-химиче-
ского процесса, происходящего в нервной ткани.
Уже сейчас найдены вещества, образующиеся в головном моз-
гу (чаще всего это пептиды), от которых зависят состояния воз-
буждения, торможения, характер поведения человека. Решение
многих проблем психики человека, его поведения, эмоций, памяти
возможно только на основе биохимических исследований.
Быстрый рост народонаселения на нашей планете делает очень
актуальной проблему питания. Биохимикам теперь уже хорошо изве-
стны реакции, в результате которых в зеленых листьях растений из
СО2 воздуха и Н2О образуются сахара, крахмал. Совершенно реаль-
ным стало в наши годы решение задачи о воспроизведении этих про-
цессов в реакторах, которые заменят тысячи гектаров посевных
площадей с сельскохозяйственными растениями, не будут зависеть от
метеоусловий и потребуют значительно меньше рабочих рук. Осо-
бое место в проблеме питания занимает вопрос о достаточности со-
держания белков в рационе. Некоторые бактерии способны интен-
сивно усваивать азот воздуха, превращая его в аминокислоты, а
затем в белки. Воспроизвести биохимические реакции, протекаю-
щие при этом у бактерий, в промышленных условиях — крайне за-
манчивая идея, реализация которой вполне возможна.
Актуальные направления развития биохимии в нашей стране
указаны в постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР
1981 г. «О дальнейшем развитии физико-химической биологии и
биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сель-
ском хозяйстве и промышленности».
Центральный Комитет КПСС и Совет Министров СССР счита-
ют одной из важнейших задач советской науки на современном
этапе дальнейшее расширение и углубление фундаментальных ис-
следований в области познания физико-химических основ жизнен-
ных явлений и обеспечение на этой базе профилактики и эффек-
тивного лечения заболеваний человека, производства лекарствен-
ных препаратов, пищевых и кормовых веществ с использованием
биотехнологических методов, а также разработки новых эффектив-
ных методов селекции.
Все перечисленные задачи биохимии будут решаться на основе
опережающего развития фундаментальных, теоретических исследо-
ваний структуры и функции биохимических соединений, разработ-
ки методов их анализа, выяснения путей их биосинтеза и метабо-
лизма.
Большие задачи ставит перед биохимиками Советского Союза
Продовольственная программа, принятая майским (1982 г.) Пле-
нумом ЦК КПСС. Исследование путей управления обменом ве-
ществ сельскохозяйственных растений и животных с целью повы-
шения их продуктивности может привести к открытию и использо-
ванию огромных резервов.
ГЛАВА 1
ОБЩАЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
‘ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ
1.1. Химический состав живых организмов
В составе живых организмов нет ни одного химического эле-
мента, который бы составлял исключительную принадлежность
именно живых организмов, не встречался в неживой природе. Это
обстоятельство является одним из многочисленных доказательств
ложности виталистических представлений о строении живых орга-
низмов. Кроме обычных химических элементов в живом организме
нельзя обнаружить и следов какой-то особой «жизненной силы».
Из 107 известных в настоящее время химических элементов в
живых организмах найдено более 70, из них около 20 встречается
во всех типах организмов; как и в верхних слоях земной коры, в
них количественно преобладают элементы с малыми атомными мас-
сами. Длительное время существовало неправильное представление
о химическом элементарном составе биомассы нашей планеты.
Считали, что число «обязательных» элементов для живой при-
роды очень невелико; существовали даже теории, пытавшиеся
объяснить и обосновать причины такой ограниченности. Авторы
этих теорий допускали типичные метафизические ошибки, рассмат-
ривая состав живых организмов как нечто постоянное, неизменяю-
щееся, вне его взаимосвязи с окружающей средой, с веществами
литосферы (земной коры).
Еще К. А. Тимирязев указывал, что одного экспериментального
метода недостаточно для решения биологических проблем, он дол-
жен сочетаться с историческим методом. Именно с этих диалекти-
ческих позиций рассматривал химию биосферы выдающийся рус-
ский ученый, один из основателей науки о химии земли — геохи-
мии, В. И. Вернадский (1863—1945). В своей широко известной
книге «Биосфера» (1926) он писал, что жизнь представляет собой
не случайное явление на земной поверхности, она теснейшим обра-
зом связана со строением земной коры. Геохимические процессы,
непрерывно идущие в земной коре, и эволюция химического эле-
ментарного состава живого вещества, по Вернадскому, — два со-
пряженных процесса. По мере развития жизни на Земле все боль-
шее число химических элементов вовлекалось в круг жизненных
процессов. Включаясь в метаболизм на протяжении огромного чис-
ла поколений, многие элементы стали обязательными компонента-
ми живых организмов, необходимость в них закрепилась наследст-
&
венно. Сказанное не отрицает, конечно, возможности случайного,
одномоментного попадания некоторых элементов в живой организм
вместе с пищей, водой. Более того, известны элементы, которые
присутствуют достаточно часто у многих видов животных и расте-
ний (хотя и в микроколичествах), но необходимость в них у боль-
шинства видов отсутствует (Al, As, Rb и др.).
Следует заметить, что вопрос о необходимости или незаменимо-
сти того или иного химического элемента для конкретных видов
живых организмов не всегда решается однозначно и просто. Так,
если критерием необходимости считать неспособность данного ор-
ганизма нормально развиваться при отсутствии определенного эле-
мента, то возникает затруднение с взаимозаменяемыми элементами
(например, у растений хлор, по крайней мере частично, может
быть заменен бромом). Необходимость в том или ином элементе
зависит также от конкретных условий. Так, при нитратных формах
азотного питания водоросли Scenedesmus не растут в отсутствие
молибдена, а на средах с аммиачной формой азота молибден им не
нужен.
Живые организмы в свою очередь оказывали и оказывают су-
щественное влияние на химический состав земной коры, между
ними всегда есть тесное взаимовлияние, взаимосвязь. Однако эта
взаимосвязь основана не на прямо пропорциональных количест-
венных соотношениях. Так, в неорганической природе широко рас-
пространены элементы, дающие в большинстве случаев нераство-
римые соединения (Si, Fe, Al), а в живых организмах эти элементы
присутствуют в очень малых количествах. В то же время основную
массу биосферы составляют элементы, легко образующие раство-
римые и газообразные соединения (С, N, Р, S), но в земной коре их
содержание относительно невелико. Хорошая растворимость этих
элементов, обес1}£чшвает, видимо, и легкость их попадания в орга-
низм, а также актийюе участие в обменных процессах. В. И. Вер-
надский предложил группировать химические элементы биосферы
«декадами» в зависимости от содержания в живых организмах
(табл. 1.1).
Таблица 1.1. Средний элементарный состав растений и животных
Номера декад	Примерное содержание в биосфере. % на сырую массу	Элементы
Макроэлементы		
I	10	о, н
II	I	с
III	0,1	N, Р, К, Са, Si
IV	0,01	Mg, S, Fe, Na, Ci, Al
Микроэлеме нты		
V—VII	0,001—10“5	Мп, B, Cu, Zn, Ba, Li, Ni, Rb, F и др.
Ультрамикроэле менты		
VIII—XIV	10’6—10-12	Mo, I, As, Ag, Hg, Au, Pb, Ra и др.
18
Потребность в некоторых химических элементах не одинакова
у отдельных таксономических групп. Например, положительное
действие мышьяка нароет убедительно установлено только для ря-
да водорослей ти плесневых грибов. Более того, В. И. Вернадским
и его учеником А. П. Виноградовым было высказано положение об
элементном химическом составе растений как о систематическом
признаке. Так, хорошая корреляция между содержанием иода и
таксономией установлена для водорослей. У одного из наиболее
распространенных семейств бурых водорослей Laminariaceae из-
вестны роды и виды, исключительно богатые иодом. В то же время
обитающие в тех же морях виды другого распространенного семей-
ства бурых водорослей Fucaceae всегда значительно беднее иодом.
Существует определенная зависимость между распространени-
ем элементов в биосфере, их биологической ролью и положением
в периодической системе Менделеева. Вещества живых организмов
более чем на 99% состоят из элементов первых трех периодов этой
системы, т. е. из легких элементов. Как правило, при переходе от
легких к тяжелым элементам в пределах одной и той же подгруппы
(например, Zn—>-Cd—^Hg) возрастает токсичность элементов и
одновременно уменьшается содержание их в биомассе. Высокой
биологической активностью обладают многие соединения так на-
зываемых переходных металлов, к которым относятся элементы
4-го периода (с 21 по 30): Мп, Fe, Со, Ni, Си, Zn и др. Это связано
с хорошо выраженной у этих элементов способностью к образова-
нию комплексов, в которых они играют роль центральных атомов.
Комплексные соединения нередко обладают каталитической актив-
ностью, входят в состав ферментативных молекул (например, же-
лезосодержащие геминовые ферменты). Элементы некоторых под-
групп периодической системы могут в той или иной степени заме-
нять друг друга в биологических процессах (например, Са и Ва,
С1 и Вг).
Около 98% массы биосферы составляют четыре элемента: водо-
род, кислород, углерод и азот. Они легко спаривают электроны и
образуют прочные ковалентные связи. Малые размеры атомов этих
элементов также способствуют образованию коротких, прочных хи-
мических связей. Молекулы с такими связями более устойчивы к
действию химических и других факторов. Большое значение имеет
также способность перечисленных элементов образовывать кратные
связи (двойные, тройные), благодаря чему они превосходят многие
элементы по числу и разнообразию соединений с уникальными
свойствами.
Интересно сравнение углерода и кремния. Запасов Si на Земле
в 135 раз больше, чем С. Можно было бы предполагать, что и роль
кремния в биосфере более значительна по сравнению с углеродом.
Однако это не так. Кремний в присутствии кислорода дает одно-
типные, нерастворимые и неактивные полимеры из SiO2. Меньший
размер атомов углерода по сравнению с кремнием обусловливает
возможность образования ими более прочных связей, в том числе
ковалентных углерод-углеродных, не только одинарных, но и двой-
19
ных, тройных. Спаренные электроны создают вокруг каждого атома
углерода тетраэдрическую конфигурацию. В результате может воз-
никнуть бесчисленное множество разнообразных каркасов органи-
ческих молекул с различной пространственной структурой. Ника-
кой другой химический элемент, кроме углерода, не образует
прочные молекулы с таким большим разнообразием конфигураций,
размеров, функциональных групп, химической и биологической ак-
тивности.
Основными типами соединений, входящих в состав живых орга-
низмов, являются: белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды
(жиры и жироподобные вещества), вода, минеральные соли. Кро-
ме них в составе организмов присутствуют некоторые другие орга-
нические вещества: карбоновые кислоты, углеводороды, амины,
спирты, альдегиды. Есть вещества, характерные только для расти-
тельных тканей: эфирные масла, алкалоиды, дубильные вещества.
И, наконец, в отдельные группы должны быть выделены вещества,
присутствующие в тканях живых организмов, как правило, в не-
больших количествах, но играющие первостепенную роль в регуля-
ции всего обмена веществ: гормоны, ферменты, витамины, анти-
биотики, фитонциды и т. п. Их иногда объединяют в группу биоло-
гически активных соединений.
Серьезной ошибкой ряда биохимиков и цитологов было пред-
ставление о протоплазме живых клеток как о смеси (хотя и очень
сложной) перечисленных соединений. При этом все процессы, про-
текающие в живой клетке, сводились только к химическим и физико-
химическим явлениям. Это — типичное механистическое толкова-
ние биологических процессов, сводящее различия между живой и
неживой материей только к количественным характеристикам, от-
рицающее качественные различия. Протоплазма живых клеток —
не смесь множества веществ, а система с присущими только ей
закономерностями, качественными особенностями живой материи.
1.2. Основные особенности метаболических
процессов	fl
Обмен веществ (метаболизм) живой клетки складывается в ос-
новном из двух потоков реакций — катаболических и анаболиче-
ских.
Катаболические пути (катаболизм) — это процессы деграда-
ции, диссимиляции. Сюда относятся различные реакции расщепле-
ния (гидролиз, фосфоролиз) и окисления. Крупные органические
молекулы расщепляются до простых веществ с одновременным вы-
делением содержащейся в них свободной химической энергии.
Энергия запасается организмом в форме АТФ и в ряде других
соединений, а затем используется на процессы жизнедеятельности
(см. рис. 7.8).
Анаболические пути (анаболизм) — процессы синтеза, ассими-
ляции. При этом из относительно простых молекул строятся слож-
ные органические соединения. Эти пути часто включают в себя
20
восстановительные реакции и осуществляются с затратой энергии.
Благодаря разной локализации ферментов катаболизма и ана-
болизма эти противоположные метаболические процессы протека-
ют в клетке одновременно. Их связывают центральные, или ам-
фиболические, процессы (рис. 1.1). Примером служит цикл три-
карбоновых кислот (см. разд. 6.9.5).
Рис. 1.1. Связь катаболических и анаболических путей:
Фн — ортофосфорная кислота, ФФН — пирофосфорная кислота
Тесная связь между анаболизмом и катаболизмом проявляется
на трех уровнях.
1.	На уровне источников углерода: продукты катаболизма могут
быть исходными субстратами анаболических реакций.
2.	На энергетическом уровне: в процессе катаболизма образу-
ются АТФ и другие высокоэнергетические соединения; анаболиче-
ские процессы протекают с их потреблением.
3.	На уровне восстановительных эквивалентов: реакции катабо-
лизма являются в основном окислительными; процессы анаболиз-
ма, наоборот, потребляют восстановительные эквиваленты.
Во взаимосвязи процессов анаболизма и катаболизма проявля-
ется один из важнейших законов диалектического материализма —
единства и борьбы противоположностей как внутренний источник
развития (в данном случае — живой материи).
Основные биохимические реакции, их последовательность уди-
вительно сходны у всех живых форм. По-видимому, они возникли
на ранних этапах эволюции, и к тому моменту, когда началось ви-
дообразование, достигли совершенства. В особенности сходны
центральные метаболические пути.
21
В процессе метаболизма осуществляются четыре специфические
функции. 1. Извлечение энергии из окружающей среды (либо в
форме энергии органических веществ, либо в форме энергии сол-
нечного света). 2. Превращение экзогенных веществ в «строитель-
ные блоки», т. е. в предшественники биополимеров. 3. Сборка бел-
ков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов и других кле-
точных компонентов из этих строительных блоков. 4. Разрушение
«устаревших» биомолекул, уже выполнивших в клетке свои
функции.
С чисто химической точки зрения, метаболизм представляет со-
бой совокупность огромного числа разнообразных реакций: окисле-
ния, восстановления, расщепления, объединения молекул, межмо-
лекулярного переноса групп и т. д. Специфичным для обмена ве-
ществ живого организма является скоординированность отдельных
реакций во времени и пространстве. Протоплазма клетки обладает
сложной внутренней организацией, структурой. Отдельные биохи-
мические процессы локализованы в определенных участках клетки,
органеллах, мембранных образованиях. Так, синтез белка проис-
ходит в рибосомах, получение энергии в легко используемой фор-
ме — в митохондриях, анаэробная фаза дыхания, гликолиз —
в цитоплазме, фотосинтез растений — в хлоропластах и т. д. Мно-
гочисленные мембраны как бы делят клетку на отделы, отсеки,
компартменты (от англ, compartment), поэтому разнообразные био-
химические реакции, зачастую противоположного характера, идут
в клетке одновременно, не мешая друг другу, вследствие простран-
ственного разделения — компартментализации. В этом и выража-
ется пространственная скоординированность биохимических ре-
акций.
Не менее важна их координация во времени. Игра любого ор-
кестра только тогда дает гармоническое сочетание звуков, приятное
для слуха, когда инструмент каждого оркестранта издает звуки в
точно определенное время, предусмотренное партитурой. Точно
так же и в клетке отдельные биохимические реакции протекают в
строго определенной временной последовательности, часто образуя
длинные цепи взаимосвязанных реакций. Например, гликолиз уг-
леводов протекает в 11 реакций, строго следующих одна за другой,
при этом каждая предыдущая создает условия для осуществления
следующей. Очень важно, что эта пространственная и временная
скоординированность, гармоничность биохимических реакций на-
правлены на достижение одной цели: самовозобновление, самосо-
хранение данной живой системы — организма, клетки. Это харак-
терно для любого живого организма, даже микроскопического.
На первый взгляд, возникает вопрос: не противоречит ли ска-
занное выше второму закону термодинамики, согласно которому
для самопроизвольно протекающих процессов характерно стремле-
ние к увеличению энтропии, т. е. неупорядоченности, хаотичности.
Нет, живые организмы также подчиняются этому закону. Они по-
требляют из окружающей среды энергию в форме питательных ве-
ществ, частично используют свободную энергию последних и воз-
22
вращают в окружающую среду энергию в форме тепла и других
бесполезных или малополезных для жизни форм энергии. В ре-
зультате этого энтропия среды увеличивается, а живые организмы
создают и поддерживают характерную для них упорядоченность.
Поглощая питательные вещества из внешней среды, живые ор-
ганизмы получают не только энергию, но и строительный материал;
конечные продукты обмена веществ выводятся в среду. Такие сис-
темы, в которых непрерывно происходит поступление и удаление
веществ, а также обмен со средой энергией, называются открытыми
системами. Их характерная особенность заключается в отсутствии
равновесия с внешней средой.
При термодинамическом равновесии системы все параметры по-
стоянны во времени, нет никаких стационарных потоков за счет
действия внешних источников. Энтропия термодинамического рав-
новесия максимальна, свободная энергия равна нулю. В отличие от
термодинамического равновесия в биосистемах существует стацио-
нарное состояние, при котором скорость переноса вещества и
энергии из среды в систему точно соответствует скорости переноса
вещества и энергии из системы. Один из ведущих современных спе-
циалистов в области биоэнергетики А. Ленинджер называет живую
клетку «неравновесной открытой системой, машиной для извлече-
ния из внешней среды свободной энергии; в результате чего про-
исходит возрастание энтропии среды». В понимании живой клетки
как открытой системы в стационарном состоянии отражается важ-
нейшее свойство всего живого — постоянный обмен веществ с ок-
ружающей средой.
Рассмотрение живого организма как открытой стационарной
системы хорошо объясняет явление гомеостаза — постоянства со-
става внутренней среды организма, устойчивость и стабильность
биохимических параметров. Например, содержание глюкозы в кро-
ви у здорового человека колеблется в достаточно узком интервале
(около 5 мМ), pH крови всегда равен 7,40 ±0,05 и т. д.
Живая клетка не только потребляет вещества, но и экскретиру-
ет продукты распада, является открытой системой. Между поступ-
лением питательных веществ в организм и выделением отработан-
ных продуктов существует сложная, часто разветвленная система
промежуточных реакций. Если скорости образования и распада
промежуточных продуктов равны, устанавливается стационарное
состояние. Но в окружающей среде содержание некоторых пита-
тельных веществ может резко увеличиться или уменьшиться, вслед-
ствие этого изменится скорость их поступления в клетку. Под влия-
нием различных факторов может увеличиваться или уменьшаться
скорость той или иной промежуточной реакции, скорость выведе-
ния веществ из клетки. В результате значительно изменяются ста-
ционарные концентрации компонентов системы.
Однако в живой клетке, организме есть многочисленные чувст-
вительные механизмы, которые «выявляют» сдвиги концентраций и
компенсируют их, возвращают к норме. При изменении условий
стационарного состояния в открытой системе развиваются процес-
23
сы, направленные на сохранение свойств системы, — динамическая
стабилизация стационарного состояния. В большинстве случаев эти
механизмы функционируют по принципу обратной связи. Так, при
снижении содержания глюкозы в крови (например, вследствие го-
лодания) происходит возбуждение определенного центра в голов-
ном мозгу, в результате чего начинает действовать сложный гормо-
нально-ферментативный механизм расщепления запасного углево-
да гликогена в печени до глюкозы, которая поступает в кровь. Как
только ее содержание в крови поднимается до нормы, соответствую-
щий центр головного мозга перестает возбуждаться, механизм рас-
щепления гликогена выключается. Это один из многочисленных
примеров функционирования живого организма как саморегули-
рующейся системы.
Таким образом, относительное постоянство биохимических пара-
метров живого организма не статическое, пассивное (подобно
устойчивости гранитной скалы или железобетонного моста), а
активное, динамическое. В организм непрерывно поступают веще-
ства из среды, они ассимилируются, из них образуются вещества
самого организма, вместе с тем постепенно «стареют» молекулы
ранее имевшихся в организме соединений, идут реакции катаболиз-
ма, диссимиляции, продукты расщепления удаляются. Все эти ре-
акции находятся под контролем генетического аппарата организма,
поэтому вновь образующиеся в нем вещества соответствуют приз-
накам наследственности.
За небольшие промежутки времени внешние признаки организ-
ма могут не измениться, в то время как его вещества существенно
обновятся. Методом меченых атомов установлено, например, что
половина всех белков обновляется за 80 дней, а полное обновле-
ние воды происходит за 30 дней. Виднейший английский исследова-
тель и прогрессивный общественный деятель Дж. Бернал1 писал:
«Молекулы в нашем теле и во всяком организме находятся в со-
стоянии непрерывного восстановления, и атомы протекают через
него почти непрерывным потоком. Весьма вероятно, что никто из
нас не сохранил больше чем несколько атомов, с которыми мы на-
чали свою жизнь и что, даже будучи взрослыми, мы, вероятно, ме-
няем большую часть материала нашего тела всего за несколько
месяцев». Коротко эту мысль так выразил великий диалектик
древней Греции Гераклит: «Наши тела текут как ручьи, вещество
в них возобновляется как вода в потоке». В постоянном обновлении
веществ живого организма проявляется диалектический закон
отрицания: новое отрицает старое, затем оно само становится ста-
рым и тоже отрицается новым.
Важнейшей особенностью всех биохимических реакций являет-
ся их большая скорость, обусловленная присутствием ферментов —
биологических катализаторов. Те же реакции вне организма при
участии химических катализаторов обладают скоростью на не-
1 Бернал Дж. Наука в истории общества. М., 1956, с. 483.
24
сколько порядков меньше; Ферменты как катализаторы значитель-
но более совершенны, чем химические катализаторы.
Для метаболических процессов характерны также ступенчатость
и сопряженность. Многие реакции в клетке идут обычно через ряд
промежуточных этапов, ступеней. Например, окисление углеводов
(клетчатка, крахмал и т. д.) в процессе сгорания вне организма
протекает одноэтапно — присоединяется О2 и сразу образуются ко-
нечные продукты окисления СО2 и Н2О.
В живом организме окисление углеводов в процессе дыхания до
СО2 и Н2О происходит ступенчато, более чем через 20 промежуточ-
ных реакций. Достаточно часто имеет место сопряженность отдель-
ных реакций, взаимозависимость друг от друга. Так, многие реак-
ции биосинтеза, будучи энергопотребляющими, сопряжены обычно
с экзэргоническими, в процессе которых свободная энергия выделя-
ется в легко используемой форме. Сопряженность хорошо выражена
и в многоэтапных цепных процессах, где продукты каждой преды-
дущей реакции являются исходными соединениями для последую-
щей.
В последние годы в литературе все больше появляется сведений
о жидкокристаллическом состоянии в водных средах многих важ-
нейших биополимеров (в том числе белков, нуклеиновых кислот,
липидов, полисахаридов), о жидкокристаллических свойствах
структур клетки (например, биомембран). Этот новый аспект био-
химических исследований позволяет более глубоко и полно понять
многие метаболические процессы, объяснить поведение тех или
иных веществ в процессе жизнедеятельности.
В жидкокристаллическом состоянии веществу одновременно
присущи свойства и жидкости (способность течь, образовывать
капли), и твердого тела (строгая упорядоченность кристалличе-
ской структуры). Вместе с тем у жидких кристаллов есть собст-
венные свойства, характерные только для них (способность обра-
зовывать монокристаллы во внешнем электромагнитном поле, край-
не большая оптическая активность и Др.)* Для понимания биохи-
мических явлений очень важна чрезвычайная чувствительность
жидких кристаллов ко многим внешним воздействиям. Жидкие
кристаллы, для которых характерна одно-или двумерная упорядо-
ченность, обладают способностью к самоорганизации, спонтанному
образованию упорядоченной структуры и ее воспроизведению. Это
представляет большой интерес при исследовании и объяснении
структурообразования в живых клетках.
Ни одна из перечисленных особенностей метаболических процес-
сов не может претендовать на то, что она является единственным
фактором, придающим системе свойство живого. Жизнь как ка-
чественно своеобразная, самая сложная форма движения материи
может быть понята и объяснена только с позиций совокупного рас-
смотрения всех особенностей этой формы существования белковых
тел с ее постоянным обменом веществ с окружающей средой.
38
1.3. Источники энергии для живых организмов,
высокоэнергетические соединения
1.3.1. Источники энергии и углерода для живых организмов.
Все живые организмы можно разделить на две большие группы в
зависимости от того, в какой химической форме они получают угле-
род из окружающей среды. Автотрофы (от греч. авто — само, тро-
фе — пища) — самостоятельно питающиеся — могут использовать
в качестве единственного источника углерода оксид углерода (IV)
СО2, из которого они способны образовывать все свои углеродсо-
держащие соединения. К автотрофам относятся растения, фотосин-
тезирующие и хемосинтезирующие бактерии. Процесс хемосинтеза,
т. е. ассимиляции СО2 за счет энергии, выделяемой при окислении
неорганических соединений, впервые открыт в конце прошлого сто-
летия С. Н. Виноградским.
Гетеротрофы (от греч. гетерос — другой, трофе — пища) долж-
ны получать углерод в виде готовых достаточно сложных органиче-
ских соединений (например, углеводов). Сюда относятся животные
и большинство микроорганизмов. Все гетеротрофные организмы
способны ассимилировать небольшие количества СО2. Однако при
этом он связывается путем карбоксилирования уже присутствую-
щих в клетке карбоновых кетокислот, т. е. гетеротрофный организм
нуждается в готовых органических соединениях.
Живые организмы можно также классифицировать по источни-
кам получения энергии. Для большой группы фототрофов непосред-
ственным энергетическим ресурсом является свет. Они используют
энергию солнечного света для образования высокоэнергетических
соединений, которые служат своеобразными аккумуляторами энер-
гии. Сюда относятся высшие растения, водоросли, фотосинтезирую-
щие бактерии.
Хемотрофы в качестве источника энергии используют окисли-
тельно-восстановительные реакции. Хемотрофами являются жи-
вотные, большая часть микроорганизмов. Этот способ получения
энергии свойствен и нефотосинтезирующим клеткам растений.
Как фототрофы, так и хемотрофы можно, в свою очередь, разделить
на группы в зависимости от того, какие вещества являются доно-
рами электронов в окислительно-восстановительных процессах.
У литотрофов таковыми служат неорганические соединения, у
органотрофов — органические. Таким образом, в зависимости от
используемых источников энергии и доноров электронов можно вы-
делить четыре основных типа организмов (табл. 1.2).
Хемотрофные организмы группируют и по виду акцепторов
электронов. В тех случаях, когда для окисления используется кис-
лород, имеет место аэробный, или дыхательный, тип энергетики.
При анаэробном типе энергетического обмена в роли окислителя
выступает не кислород, а ряд других веществ, т. е. другие акцепто-
ры электронов.
Многие организмы могут существовать как в аэробных, так и в
анаэробных условиях, В аэробных условиях они используют в ка-
26
Таблица 1.2. Классификация организмов в зависимости от используемых
источников энергии и доноров электронов
Типы организмов	Источник энергии	Доноры электроноь	Конечные акцепторы электронов	Примеры организмов
Фото ли то- трофы	Свет	Неорганические соединения (Н2О, H2S, S)	—	Зеленые клетки высших растений, синезеленые водоросли, цианобакте- рии , большинство пур- пурных и зеленых серо- бактерий
Фотооргано - трофы	Свет	Органические соединения	—	Несерные пурпурные бактерии, галобактерии
Хемолито-	Окислитель-	Неорганические	О2, со2,	Тионовые, сульфатвос-
трофы	но-восстано- вительные реакции	соединения (H?S. Н2, S, Fe2+, NH3)	SO’-	станавливакицие, водо- родные, железные, ме- танобразующие и денит- рифицирующие бактерии
Хемоорга-	Окислитель-	Органические	О2 и орга-	Все высшие животные,
нотрофы	но-восстано-	соединения	нические	большая часть бактерий,
	вительные реакции	(например, глюкоза)	соединения	грибы, нефотосинтези- рующие клетки растений
честве акцептора электронов кислород, т. е. осуществляют процесс
дыхания. В анаэробных условиях акцепторами электронов у них
служат органические вещества, происходит брожение. Такие орга-
низмы называют факультативными анаэробами. К ним относится
большинство органотрофных клеток (дрожжи, клетки высших орга-
низмов). При наличии в среде кислорода они предпочитают исполь-
зовать его. Анаэробы, не способные использовать кислород, назы-
ваются облигатными анаэробами, кислород для них ядовит. По-
скольку весь свободный кислород, содержащийся в атмосфере
Земли, образовался в результате процесса фотосинтеза, очевидно,
что анаэробный тип энергетики является более древним, чем аэроб-
ный. Таким образом, брожение — процесс более древний, чем ды-
хание.
1.3.2. Высокоэнергетические соединения. Высокоэнергетически-
ми соединениями являются АТФ и вещества, способные образовы-
вать АТФ в ферментативных реакциях переноса групп без участия
окислительных процессов. Такие соединения содержат в своей мо-
лекуле связи, при гидролизе которых высвобождается большое ко-
личество свободной энергии. Реакции протекают при различных ус-
ловиях, оказывающих влияние на величину изменения свободной
энергии. Поэтому в биохимии используют термин изменение стан-
дартной свободной энергии — AG°. Под ним понимают изменение
свободной энергии при стандартных условиях: давление 1 атм* 1,
исходные концентрации субстратов — 1 М, температура 25°С.
AG° при pH 7,0 обозначают AG0'. Величину AG0 применяют для
1 По международной системе единиц СИ давление измеряется в паскалях:
1 атм = 101,3 кПА. В биологии общепринято измерение давления в атмосферах.
27
количественной характеристики как метаболических цепей, так и
отдельных химических реакций; как и в термодинамике, знаком
«минус» обозначается отдача энергии, а знаком «плюс» — ее при-
нятие. Если величина Л6° данной реакции имеет отрицательное
значение, то реакция может происходить самопроизвольно с выде-
лением свободной энергии — экзергоническая реакция. Если
Дб° — положительная величина, то реакция протекает с поглоще-
нием энергии (эндергоническая реакция). Среди реакций обмена
веществ известны полностью эндергонические. Они зависят от
притока свободной энергии извне (например, световой) или от дру-
гих экзергонических реакций обмена веществ (например, окисле-
ния). В качестве посредника между процессами, связанными с ге-
нерированием и использованием энергии, функционирует система
высокоэнергетических соединений. Величина стандартной свобод-
ной энергии гидролиза высокоэнергетических связей превышает
—21 кДж-моль-1 (табл. 1.3), такие связи обозначают знаком
Таблица 1.3. Стандартная свободная энергия гидролиза некоторых
соединений (в кДж моль-1)
Соединение	Продукты	Д(7° (pH 7.0)
Фосфоенолпируват3-	Пируват- + НРС>4~	—61,9
1,3-Дифосфоглицерат4"	З-Фосфоглицерат3- + НРО^ + Н+	-54,5
Креатинфосфат“	Креатин* -J-HPO^-	-43,1
Ацетил фосфат2"	Ацетат- + НРО^- + Н+	—47,7
Фосфоаргинин“	Аргинин++ НРО^-	—38,1
АТФ4"	АДФ3- + НРО|“ + Н+	—34,5
Глюкозо-1 -фосфат2"	Глюкоза + НРО|~"	—20,9
a-D-Г люкозо-6-фосфат2-	а-D-Глюкоза + НРО^“	—13,8
Гл ицерофосфат2-	Глицерин + НРО^“	—9,2
Высокоэнергетические соединения имеют, как правило, в своем
составе высокоэнергетическую фосфатную группу и могут переда-
вать ее другим веществам. Многочисленные эксперименты показа-
те-
ли, что переносится не фосфатная группа	-О—Р==О , а фосфо-
Го-
во-
рильная	—Р=о . Хотя выражение «перенос фосфатных групп»
Го-
общепринято, правильнее говорить о переносе фосфорильных
групп. Высокоэнергетические фосфорильные группы обозначают
~Ф или ~Р.
23
Различают пять основных типов высокоэнергетических соедине-
ний: рибонуклеозид-5'-дифосфаты и трифосфаты (АТФ, ГТФ,
УТФ, ЦТФ, АДФ и др.), карбоксилфосфаты (например, ацетил-
фосфат), ацилтиоловые эфиры (например, ацетилкоэнзим А), фос-
форамидные соединения (креатинфосфат), енолфосфаты (фосфо-
енолпировиноградная кислота).
В центре энергетического обмена клетки стоит аденилатная
система: АТФ и продукты ее гидролиза — АДФ, АМФ, Фш
ФФн. Она подобна аккумулятору, который заряжается энергией от
разных генераторов и снабжает ею множество машин и аппаратов
(в живом организме им соответствуют органы, ткани, биохимиче-
ские реакции). В этом плане «зарядка аккумулятора» состоит в
синтезе АТФ:
АДФ + Фн АТФ + Н2О
а «разрядка аккумулятора» сопровождается гидролизом АТФ:
АТФ + Н2О АДФ + Фн
где и £2 — ферменты, катализирующие соответствующие реак-
ции.
/ОН
В ходе гидролиза АТФ фосфорильная группа —Р=о	перено-
^он
сится на гидроксид-ион, при этом стандартная свободная энергия
гидролиза при pH 7,0 составляет —34,5 кДж-моль"1. Для гидроли-
за концевой фосфорильной группы АДФ характерна близкая вели-
чина. Отщепление фосфорильной группы от АМФ характеризуется
более низкой величиной —9,6 кДж-моль-1. Следовательно, высоко-
энергетическими в молекуле АТФ являются лишь две последние
фосфоангидридные связи. Однако следует учитывать, что в кон-
29
кретных реакциях величина выделившейся энергии зависит от тем-
пературы, pH, концентраций субстратов и ионов магния.
Основная часть адениловых нуклеотидов присутствует в клетке
в виде комплексов с магнием МдАТФ2” и М§АДФ”. Именно в этой
форме они участвуют в большинстве ферментативных реакций, где
играют роль доноров фосфорильных групп и энергии. Некоторое
количество АТФ и АДФ присутствует в клетке в виде свободных
анионов. При этом АТФ содержит четыре ОН-группы, способные
к ионизации, т. е. имеет максимальный заряд АТФ4”, а АДФ —
три ОН-группы, заряд — АДФ3”.
В молекуле АТФ заряды располагаются близко друг к другу,
между ними возникает сильное отталкивание. Оно уменьшается
при отщеплении концевой фосфорильной группы. Продукты реак-
ции — НРО42“ и АДФ3- не могут вновь воссоединиться, так как их
сближению препятствует отталкивание одноименных зарядов. Это
и обусловливает большую отрицательную величину стандартной
свободной энергии гидролиза АТФ.
Следует также иметь в виду, что в концевой фосфоангидридной
связи молекулы АТФ атомы фосфора и кислорода окружает боль-
шое число электронов. Они конкурируют друг с другом за энергети-
чески наиболее выгодные орбитали. Конкуренция не позволяет
всем электронам занять низкие энергетические уровни. В продуктах
гидролиза АТФ—АДФ3” и НРО42- электроны занимают низкие
энергетические уровни, что стабилизирует продукты, придает всей
реакции необратимость. Этот фактор также обусловливает боль-
шую отрицательную величину AG° гидролиза АТФ.
АТФ по величине свободной энергии гидролиза занимает проме-
жуточное положение между высокоэнергетическими и низкоэнерге-
тическими фосфатсодержащими соединениями. В этом состоит
уникальность АТФ, она служит посредником-переносчиком фосфо-
рильных групп и энергии от высокоэнергетических соединений
(в табл. 1.3 расположены выше АТФ) к низкоэнергетическим при
синтезе последних (в табл. 1.3 расположены ниже АТФ).
В клетке никогда не происходит прямого переноса фосфориль-
ных групп от высокоэнергетических соединений к низкоэнергетиче-
ским, практически все реакции переноса фосфорильных групп в
клетке происходят с участием системы АТФ—АДФ в качестве по-
средника-переносчика. Другие нуклеозид-5'-трифосфаты (УТФ,
ГТФ, ЦТФ) тоже являются высокоэнергетическими соединениями,
но не играют в клетке такой универсальной роли, как АТФ, выпол-
няют как доноры энергии узкоспециализированные функции: УТФ
служит поставщиком фосфорила и энергии при синтезе полисаха-
ридов, ЦТФ — при синтезе липидов, ГТФ избирательно ускоряет
образование пептидной связи при биосинтезе белков.
Перенос фосфорильных групп и энергии с АТФ на другие соеди-
нения осуществляют ферменты, имеющие тривиальное, краткое
рабочее название — киназы (например, гексокиназа, пируваткина-
за; от греч. кинео — двигаю, перемещаю). Следовательно, кина-
за означает активатор, так как образование фосфорного эфира лю-
30
бого соединения приводит к активации этого соединения, увеличе-
нию его реакционной способности.
Все живые организмы улавливают энергию внешних энергетиче-
ских ресурсов с помощью систем аккумуляции энергии и преобра-
зуют ее в энергию высокоэнергетических соединений. Системы ак-
кумуляции энергии делятся на два типа, отличающиеся принципа-
ми энергетического сопряжения. Первый тип — реакции фосфори-
лирования, не требующие нерастворимых мембранных структур,—
субстратное (или немембранное) фосфорилирование. Образование
АТФ при этом происходит путем переноса активного фосфорила с
продукта окисления субстрата на АДФ. Например, образование
АТФ при гликолизе, брожении. Второй тип — реакции фосфорили-
рования, протекающие в сопрягающих мембранах, — мембранное
фосфорилирование. Образование АТФ происходит путем фосфори-
лирования АДФ неорганическим фосфатом за счет энергии элект-
рохимического потенциала ионов водорода на мембране. Напри-
мер, образование АТФ при фотосинтезе, или в аэробной фазе ды-
хания. Мембранное фосфорилирование протекает во внутренней
мембране митохондрий, в мембранах тилакоидов хлоропластов,
в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий, в цитоплазматиче-
ской мембране бактерий. Эти мембраны, несущие ферменты пере-
носа электронов и сопряженного с ним фосфорилирования, называ-
ются сопрягающими мембранами.
ГЛАВА 2
БЕЛКИ
2.1.	Общая характеристика
Одно из принципиальных отличий определения жизни, данно-
го Ф. Энгельсом, от ранее существовавших, идеалистических, за-
ключается в том, что в нем подчеркивается материальность жизни,
указывается материальный носитель — белок. Энгельс называет
белок «...исключительным самостоятельным носителем жизни»1.
На первостепенное значение белков в жизнедеятельности организ-
мов указывали и выдающиеся русские биологи-материалисты:
И. М. Сеченов, А. Я. Данилевский, К. А. Тимирязев, И. П. Павлов
и др.
В настоящее время установлено, что в живой природе не суще-
ствует небелковых организмов. При этом термин «белки» следует
понимать в широком смысле, включая сюда и сложные белки, в
частности нуклеопротеины — комплексы белков с нуклеиновыми
кислотами. Тогда становятся совершенно беспочвенными, схола-
стичными дискуссии на тему — что важнее для жизни, белки или
нуклеиновые кислоты.
Белки — это высокомолекулярные полимерные соединения, об-
разующие при гидролизе аминокислоты. Иногда их называют про-
т винами (от греч. протос — первый, важнейший). Для живых орга-
низмов они действительно являются первенствующими и по содер-
жанию, и, особенно, по значению. В организме животных белков
содержится до 40—50% и более на сухую массу, меньше у расте-
ний — до 20—35%. Разнообразны и очень важны функции белков.
Строительная, структурная функция. Белки образуют основу
протоплазмы любой живой клетки, в комплексе с липидами они
являются основным структурным материалом всех клеточных мем-
бран, всех органелл.
Каталитическая функция. Все ферменты являются белками,
простыми или сложными. Таким образом, практически все биохими-
ческие реакции катализируются белками-ферментами.
Двигательная функция. Любые формы движения в живой при-
роде (работа мышц, движение ресничек и жгутиков у простейших,
движение протоплазмы в клетке и т. д.) осуществляются белко-
выми структурами клеток.
1 Маркс К., Энгельс Ф. Соч. 2-е изд., т. 20, с. 514.
32
Транспортная функция. Белок крови гемоглобин транспортиру-
ет кислород от легких к тканям и органам. Перенос жирных кислот
по организму происходит с участием другого белка крови — аль-
бумина. Есть белки крови, транспортирующие липиды, железо, сте-
роидные гормоны. Перенос многих веществ через клеточные мем-
браны осуществляют особые белки-переносчики.
Защитная функция. Важнейшие факторы иммунитета — анти-
тела и система комплемента — являются белками. Процесс свер-
тывания крови, защищающий организм от ее чрезмерной потери,
основан на превращениях белка крови — фибриногена. Эти пре-
вращения осуществляются с участием белка тромбина и большого
числа других факторов свертывания, тоже являющихся белками.
Внутренние стенки пищевода, желудка выстланы защитным слоем
слизистых белков — муцинов. Токсины многих видов организмов,
защищающих их в борьбе за существование, также являются бел-
ками (змеиные яды, бактериальные токсины). Основу кожи, пре-
дохраняющей тело животных от многих внешних воздействий, со-
ставляет белок коллаген. Кератин — белок волосяного защитного
покрова.
Гормональная функция. Ряд гормонов по своему строению от-
носится к белкам (инсулин) или пептидам (адренокортикотропный
гормон, окситоцин, вазопрессин и др.).
Запасная функция. Способны образовывать запасные отложе-
ния овальбумин яиц, казеин молока, многие белки семян растений.
^Опорная функция. Сухожилия, суставные сочленения, кости ске-
летаТадйыта образованы в значительной мере белками.
рецепторная функция. Многие белки (особенно гликопротеины,
л'Йтйны) осуществляют важнейшую функцию избирательного уз-
навания и присоединения отдельных веществ.
Перечисленные функции белков не исчерпывают все их многооб-
разие. Так, регуляторное действие белков не ограничивается только
каталитическим и гормональным. Известна очень важная группа
белков-регуляторов активности генома. Некоторые полипептиды
играют роль ингибиторов ферментов и таким путем регулируют их
действие. Большой интерес представляют исследования так назы-
ваемых мозгоспецифических белков (МСБ), выполненные в послед-
ние годы. Тонкие иммунохимические методы их анализа в спинно-
мозговой жидкости и крови позволили установить наличие корре-
ляции между содержанием отдельных групп МСБ и поведением,
некоторыми сторонами психики.
Белки имеют и большое народнохозяйственное значение. Оно
определяется прежде всего хтем, что белки представляют собой
важнейшие компоненты пищи человека и сельскохозяйственных
животных. Массовые эпидемии, небольшая средняя продолжитель-
ность жизни населения некоторых бывших колониальных стран
связаны нередко с хроническим белковым голоданием (особенно
недостатком животных белков). От содержания белков в корме
существенно зависит продуктивность сельскохозяйственных живот-
ных. Технология многих производств основана на переработке бел-
2—937
33
ков, изменении их свойств: в кожевенной промышленности, при
выделке мехов, натурального шелка. В хлебопекарном производ-
стве важнейшую роль играют свойства белков муки.
Первостепенная роль белков в жизнедеятельности всех организ-
мов, их большое народнохозяйственное значение объясняют тот
громадный интерес, который проявляется к ним в биохимии, опре-
деляют центральное место белков в биохимических исследованиях.
Рассмотрение строения и свойств белков удобнее начинать с
характеристики их структурных элементов — аминокислот.
2.2.	Аминокислоты
2.2.1.	Определение и классификация. Аминокислоты можно
рассматривать как производные кар^рновых кислот, в которых
один из водородов углеродной цепи^зШйгещен на группу NH2.
У большинства природных аминокислот аминогруппа находится
в a-положении по отношению к карбоксилу:
NH2
R—С—СООН
I
н
Значительно реже в живых организмах встречаются аминокислоты
с р- или у-положением аминогрупп ((3-аминопропионовая,
у-аминомасляная).
В зависимости от характера боковых цепей (R-группы) амино-
кислоты делят на ^ациклические (алифатические) и циклические
(гомо- и гетероциклические).
По числу аминных и карбоксильных групп аминокислоты разде-
ляются на: 1) моноаминомонокарбоновые (глицин, аланин, валин,
лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, метионин, триптофан,
тирозин, фенилаланин); 2) диаминомонокарбоновые (лизин, арги-
нин, цитруллин); 3) моноаминодикарбоновые (аспарагиновая и
глутаминовая кислоты); 4) диаминодикарбоновые (цистин). По ха-
рактеру заряженности боковых радикалов, их полярности амино-
кислоты классифицируют на: 1) неполярные, гидрофобные (гли-
цин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, три-
птофан, метионин); 2) полярные, но незаряженные (серин, треонин,
аспарагин, глутамин); 3) полярные с отрицательным (аспарагино-
вая и глутаминовая кислоты, цистеин, тирозин) или положительным
(лизин, аягинин. гистидин) зарядами.
2.2.2.	Изомерия, общие понятиям Изомеры — соединения, имею-
щие одинаковую молекулярную формулу, но отличающиеся распо-
ложением атомов в пространстве, природой и последовательностью
связей между ними.
1 Материал этого раздела излагается в соответствии с номенклатурой орга-
нической химии, предложенной Международной организацией чистой и при-
кладной химии «IUPAC. Nomenclature of Organic Chemistry». Oxford—New-
York—Toronto—Sydney—Paris—Frankfurt., 1979.
34
Существует два вида изомеров: структурные изомеры и стерео-
изомеры.
Структурные изомеры (новые правила международной номен-
клатуры рекомендуют их называть конститутивными) имеют раз-
личную последовательность связывания атомов. Например, лейцин
и изолейцин. Молекулярная формула их одинакова — C6Hi3O2, а
структурные формулы отличаются:
CHS СН3	СН3
\н	\н2	СН3
СНа	\н
I	I
hcnh2	hcnh»
I	I
COOH	COOH
Лейцин „	,	Изолейцин
Стереоизомеры — изомеры с одинаковой последовательностью
соединения атомов, но с различным их расположением в простран-
стве. Например, стереоизомеры аланина:
СН3	СН3
Н—С—NHa	H2N—С—Н
соон	соон
В прошлом стереоизомерия включала оптическую изомерию и
геометрическую изомерию. В настоящее время употребление этих
терминов не рекомендуется: известно, например, что оптическая
активность в зависимости от растворителя может меняться не
только по величине, но и по знаку.
Если два стереоизомера относятся друг к другу как предмет и
его зеркальное изображение, они называются энантиомерами. Сте-
реоизомеры, не относящиеся друг к другу как предмет и его зер-
кальное изображение, называют диастереомерами. Диастереомера-
ми являются, в частности, и цис-транс-изомеры, если они отлича-
ются только расположением атомов относительно плоскости, про-
ходящей через молекулу:	f Ф
Н3С\ /СН3.
Транс-форк^а
Цис-форма
Цис-транс-изомерия возможна только в структурах, которым при-
дает жесткость двойная связь или цикл,
В целом изомеры можно классифицировать следующим обра-
зом:
35
Изомеры
I	I
Структурные	Стереоизомеры
(конститутивные)	"1
I }
Диастереомеры	Энантиомеры
Цис-,транс-	Обычные
Симметричность любой молекулы может быть охарактеризована
по присутствию или отсутствию основных элементов симметрии,
которыми являются: плоскость симметрии, центр симметрии и ось
симметрии. Если молекула не имеет ни центра симметрии, ни плос-
кости симметрии, она хиральна, существует в виде пары энантио-
меров.
Хиральность, следовательно, — это свойство соединении суще-
ствовать в виде пары не совместимых между собой зеркальных
изображений (от англ, chirality — принадлежность руке).
Хиральные соединения иначе называются дисимметричными. Те
хиральные молекулы, у которых нет оси симметрии, называют
асимметричными. Таким образом, асимметричная молекула всегда
хиральна, но не всякая хиральная молекула асимметрична. Моле-
кулы, не имеющие энантиомеров, называют ахиральными. Хираль-
ные молекулы содержат атом, вокруг которого размещены четыре
разных атома или функциональные группы. Он называется хираль-
ным атомом или хиральным центром. Кроме углерода хиральными
могут быть атомы Р, N, Si и др. Если в соединении содержится п
хиральных атомов, оно может существовать в количестве 2П сте-
реоизомеров.
Ранее употреблявшийся термин асимметричный углерод в на-
стоящее время не рекомендуется, так как хиральность и асиммет-
ричность не являются синонимами.
Хиральные соединения обладают оптической активностью^ они
способны вращать плоскость поляризованного света. Величину и
направление вращения плоскости поляризации измеряют прибором
поляриметром. Энантиомеры проявляют одинаковые химические и
физические свойства, за исключением одного — направления вра-
щения плоскости поляризованного света. Энантиомер, вращающий
плоскость поляризации по часовой стрелке, называется правовра-
щающим (его обозначают знаком « + »), против часовой стрелки —
левовращающим (обозначают «—»).
Эквимолярная смесь (т. е. смесь равного количества молекул)
правого и левого энантиомеров называется рацемической (раце-
мат). Она не обладает оптической активностью, так как действия
36
правовращающих и левовращающих молекул взаимно компен-
сируются. Для характеристики оптически активных соединений ус-
тановлена константа — удельное оптическое вращение* под кото-
рым понимают величину вращения в угловых градусах при кон-
центрации вещества 1 г/мл . и толщине слоя измерения 1 дм,
Удельное вращение обозначают знаком [a]L где t — температура,
при которой проводили измерение, a D — длина волны света (как
правило, используют D — линию натрия, равную 546 нм).
Существуют две системы, характеризующие расположение ато-
мов и группировок вокруг хиральных атомов. Одна из них, доста-
точно давно принятая и более широко распространенная (особенно
для характеристики аминокислот и сахаров), имеет в основе срав-
нение конфигурации описываемого хирального соединения с глице-
ральдегидом (для моносахаридов и аминокислот) или с серином
(для аминокислот). Этот относительный принцип обозначения форм
сахаров и аминокислот был введен Э. Фишером (1898). Использо-
вать при этом глицеральдегид в качестве «ключа» предложил
М. А. Розанов в 1906 г. Та форма глицеральдегида, у которой на
проекционном изображении ОН-группа расположена справа от оси
углеродных атомов, была обозначена D-формой, а при нахожде-
нии ОН — слева от углеродной оси — L-формой:
сн2он	СН2ОН
. D-Глицеральдегид	L -Г лицераль дегид
Чтобы определить, к D- или L-форме относится данный энантиомер
аминокислоты, сравнивают конфигурацию его хирального центра
с энантиомерами глицеральдегида. Если аминогруппа расположена
справа от оси СООН—R, это D-аминокислота, при нахождении
аминогруппы слева от оси СООН—R — L-форма.
Для обозначения энантиомеров моносахаридов сравнивают с
глицеральдегидом расположение ОН-группы у последнего хираль-
ного атома, т. е. наиболее удаленного от альдегидной или кето-
группы. Иногда к буквам D и L добавляют индексы s или g, кото-
рые указывают, серин (s) или глицерин (g) использованы в каче-
стве «ключа».
В 1951 г. был найден способ определения абсолютной конфигу-
рации, и в связи с этим предложена новая система описания хи-
ральных центров без сравнения с каким-либо «ключевым» соедине-
нием — RS-система. Она нами не рассматривается, поскольку при
определении конфигурации аминокислот и сахаров обычно исполь-
зуют D, L-систему.
37
Одним из частных случаев стереоизомерии является конформа-
ция. В правилах международной химической номенклатуры (1978)
указывается, что пока нет общепринятого определения термина
конформация. Наиболее часто употребляют следующее. Конфор-
мациями молекулы называют различные расположения ее атомов
в пространстве, возникающие в результате вращения вокруг оди-
нарных (о) связей.
В последние годы некоторые авторы распространяют это опре-
деление на двойные и другие связи. При наличии цикла под кон-
формациями понимают формы молекулы, возникшие в результате
изгибов плоскости цикла, изменения взаимного положения частей
цикла. Молекулы, отличающиеся конформацией, называются кон-
формационными изомерами или конформерами. В приложении к
молекулам белков термин конформация характеризует простран-
ственную структуру молекулы в целом.
2.2.3.	Стереохимия аминокислот. Все аминокислоты, за исклю-
чением глицина, оптически активны и могут существовать в виде
пары энантиомеров — D и L, поскольку углеродный атом, у кото-
рого водород замещен на группу NH2, Является хиральным. На-
правление вращения плоскости поляризации обозначают знаком
« + » или «—». Например, D(—)-аланин и L( + ) -аланин. Необходи-
мо указывать условия, при которых проводили измерение: природа
растворителя, реакция среды, наличие в растворе солей. Так,
L-гистидин в водном растворе обнаруживает удельное вращение,
равное —39,3°, а в солянокислом растворе [а]о = +11,1°. Знак и
величина оптического вращения зависят также от природы боковой
цепи аминокислоты (R-rpynna).
Живые организмы различают L- и D-формы аминокислот. Пока-
зано, что дрожжи и плесневый гриб Penicillium glaucum использу-
ют L-глутаминовую кислоту и L-лейцин, но не усваивают D-формы
этих аминокислот. Большинство D-изомеров обладают сладким
вкусом, а L-формы аминокислот безвкусные или горькие.
В составе белков обнаруживаются только L-аминокислоты. Ес-
ли гидролиз белков проводят в мягких условиях, то аминокислоты
сохраняют свою оптическую активность. В процессе химического
синтеза аминокислот или при их кипячении в присутствии сильных
оснований происходит рацемация и образуется О,Ь-смесь амино-
кислот, не обладающая оптической активностью.
D-Формы аминокислот в природе встречаются редко. Они вхо-
дят, например, в состав клеточных стенок некоторых микроорганиз-
мов (см. разд. 6.4.4), являются компонентом пептидных антибиоти-
ков (грамицидин, актиномицин D); очень редко обнаруживаются
у растений.
2.2.4.	Диссоциация аминокислот. Все а-аминокислоты существу-
ют в водных растворах преимущественно в виде биполярных ионов
или цвиттерионов с диссоциированной карбоксильной группой и
протонированной аминогруппой;
38
nh2 +nh3
I	I
R—С—COOH	R—C—COO’
I	I
H	H
Биполярность структур молекул аминокислот обусловливает це-
лый ряд их свойств, в частности хорошую растворимость большин-
ства аминокислот в воде и сравнительно низкую в органических
растворителях, большие дипольные моменты их молекул, высокие
значения диэлектрических постоянных и температуры плавления.
В зависимости от pH среды аминокислоты могут быть в форме
'анионов, катионов, электронейтральных биполярных ионов или в
виде смеси этих форм с доминированием одной из них. В сильно-
кислых растворах аминокислоты присутствуют в виде положитель-
ных ионов, а в щелочных — в виде отрицательных ионов, т. е. ами-
нокислоты представляют собой амфотерные электролиты:
+NH3
R—С—СОО-
I
н
NHo
+он- |
---->• R—С—COO’ + Н2О
н
+NH3
I	+Н+
R—С—COO’ ----->
I
н
+NH3
I
R—С—СООН .
Н
В соответствии со своей амфотерной природой аминокислоты в
зависимости от состава раствора могут образовывать различные со-
ли, реагируя как с кислотами, так и с основаниями:
+NH3C1-	NH2
I	I
R—C—COOH	R—C—COONa
I	I
H	H
Солянокислая соль	Натриевая соль
Диссоциация аминокислот может быть хорошо понята с пози-
ций теории кислот и оснований Бренстеда, согласно которой кис-
лотой называют все те вещества, которые способны отдать протон,
а основанием — все те, что способны его связать. С этой точки
зрения группы СООН и H3N+ следует считать кислотами, а груп-
пы СОО- и NH2 — основаниями.
Константы диссоциации карбоксильной (Кт)" И“ямниной~ групп
(Кг) или их отрицательные логарифмы	р Кг) ^численно рай-
оны концентрации "водородных ионов_(значения рНХ-jipnjiofqpoH
о7но1нё11йё^диссбЩ1ированных форм к нёдиссоциированным равно
едипице, т: е. 5G%‘ аминокислоты находится в виде диполей, а
50%—в виде катионов и анионов.
Величины pKi и рКг можно определить с помощью электромет-
рического титрования. Кривая титрования аланина соляной кисло-
той и гидроксидом натрия представлена на рис. 2.1. Как видно из
рисунка, титрование аланина (и других моноаминомонокарбоно-
вых кислот) носит двухстадийный характер, вследствие чего кри-
вая титрования состоит из двух четко различающихся ветвей. Точ-
ки перегиба этих
2,0.
0,5	1,0	1,5
Эквиваленты ОН~
Рис. 2.1. Кривая титрования аланина (в рам-
ках указаны виды ионов, преобладающих в
точках перегиба кривой)
ветвей соответствуют значениям pKi и
рКэ и равны соответствен-
ной,34 и 9,69. При значе*
ПШй pH ниже pKi все
нейтральные аминокисло-
ты несут положительный
заряд, а при pH выше.
рКг — отрицательный. В
точке перехода между
ветвями молекула ами-
нокислоты не несет заря-
да, так как число отрица-
тельных и положительных
ионов одинаково.
Значение pH, при кото-
ром суммарный заряд
аминокислоты ^рЖен'"ну-
лю, 'тг-е. -молекула элект-
рбнеитральна, _называет.-
ся	—хшь—
кой ИЭТ__Хд1). При этом
рТГнеПпроисходит переме-
щения аминокислоты в
электрическом поле. pH
раствора чистой амино-
кислоты в воде называет-
сяизоионной точкой. Изоэлектрические ^ГизсшШп^^
кислоты в разбавленных растворах приблизительно совпадают.
Изоэлектрическую точку для моноаминомонокарбоновых кислот
можно найти путем деления суммы рК и рК? на 2, В нашем случае:
Д2^34+9,б9)/2 — £.02. В изоэлектрической точке аминокислоты не
проявляют буферных свойств, их буферная емкость максимальна
при pH, равных значениям рК кислотных групп. Если известны
величины pKi и рКг, то можно рассчитать соотношение различных
видов ионов для любого значения pH.
Кривые титрования аминокислот с ионизирующимися R-rpyn-
пами (например, гистидин, лизин, глутаминовая кислота) имеют
более сложный характер, поскольку кривые, описывающие диссо-
циацию R-групп, накладываются на кривые диссоциации «-карбок-
сильных и а-аминогрупп. Диссоциация боковых R-групп идет сле-
дующим образом:
40
Имидазольная
HN^ .NH
Гуанидиновая H2N—С—NH—R + Н+
NH
H2N—С—NH—R
II j
nh2
R—S" + Н+ ~	R—SH
Г идроксил
тирозина
С ульф гидрильная
Величины рК диссоциирующих группировок некоторых амино-
кислот приведены в табл. 2.1.
Таблица 2.1. Значения рК диссоциирующих групп некоторых аминокислот
(при +25 С)
Аминокислота	РК»	РК4	Название R-группы и рК3
Алзнин	2,34	9,69	-
Лейцин	2,19	9,60	—
Аспарагиновая	1,88	9,60	₽-Карбоксильная 3,65
Глутаминовая	2,19	9,67	7-Карбоксильная 3,22
Гистидин	1,82	9,17	Имидазольная 6,00
Лизин	2,18	8,95	е-Аминогруппа 10,53
Аргинин	2,17	9,04	Гуанидиновая 12,48
Тирозин	2,20	9,11.	ФЬнольный гидроксил 10,07
Цистеин	1,96	10,28	Сульфгидрильная 8,18
Сравнение величин рК диссоциирующих групп разных аминокислот
позволяет заключить, что у большинства аминокислот достаточно
близки значения как рК а-СООН групп (2,1—2,3), так и рК
а-МНз- групп (9,1—9,6). Карбоксильные группы моноаминомоно-
карбоновых кислот имеют более сильную кислотность, чем карбок-
силы соответствующих алифатических кислот (положительно заря-
женные «-аминогруппы способствуют отталкиванию Н+ карбокси-
ла). Например, у аланина pKi=2,34, а у соответствующей ему про-
пионовой кислоты pKi = 4,85. Аминогруппа лизина и гуанидиновая
группа аргинина характеризуются сильно выраженными основны-
ми свойствами, при pH 7 их суммарный заряд положителен. Гидрок-
сильная группа тирозина и сульфгидрильная группа цистеина име-
ют слабо выраженные кислотные свойства.
2.2.5.	Спектры поглощения аминокислот. Ни одна из двадцати
аминокислот, входящих в состав белков, не поглощает свет в види-
мой части спектра, а только в дальней ультрафиолетовой области
(<220 нм). Тирозину, фенилаланину и особенно триптофану свойст-
венно заметное поглощение в ультрафиолетовой области спектра
(260—280 нм). Цистин обладает слабым поглощением при 240 нм
вследствие наличия в нем дисульфидной группы.
2.2.6.	Растворимость. За некоторым исключением, аминокислоты
хорошо растворимы в воде. С увеличением углеводородного боко-
вого радикала растворимость в воде падает, а в спирте возрастает
(рис. 2.2).
2.2.7	Химические свойства аминокислот. Одной из наиболее ха-
рактерных реакций а-аминогруппы является ее взаимодействие с
Аминокислоты	Глицин
В	Н—
Аланин
СН3—
Валин
СН3\
СП3Х
сн—
Лейцин
СН3^
/СН—СН2—
СН<
Растворимость
в воде
растворимость
в спирте
Рис. 2.2. Растворимость аминокислот
ином. Эта реакция может быть использована для количе-
ственного определения аминокислот, содержащихся в растворе в
очень небольших концентрациях. При pH выше 5 реакция протекает
в две стадии. В 1-й стадии образуется восстановленный нингидрин
за счет окислительного дезаминирования аминокислоты. Одновре-
менно происходит и ее декарбоксилирование.
нингидрин
нингидрин
На 2-й стадии реакции образовавшийся аммиак реагирует с экви-
молярными количествами окисленного и восстановленного нингид-
рина, образуя сине-фиолетовый продукт (пурпур Руэманна) с мак-
симумом поглощения при 580 нм, интенсивность окраски которого
пропорциональна количеству аминокислоты.
Пурпур Руэманна
Пролин и оксипролин, содержащие замещенные а-аминогруппы,
образуют с нингидрином производные, окрашенные в желтый цвет
(максимум поглощения при 440 нм), и не образуют аммиака.
Реакция с нингидрином не является специфической, ее дают
многие другие соединения, содержащие аминогруппы, в том числе
белки, аммиак, с тем лишь отличием, что при этом не выделяется
СО2. Образование СО2 специфично для а-аминокарбоновых кислот.
Эту реакцию используют в хроматографии для выявления амино-
кислот\Их количественное определение в автоматических анализа-
торах производят путем измерения окраски, возникающей при взаи-
модействии последовательно выделяющихся с колонки аминокис-
лот с нингидрином.
Благодаря наличию аминогруппы аминокислоты реагируют так-
же с азотистой кислотой (1) и с формальдегидом (2).
nh2	он
I	I
R—сн—соон + HNO2	R-СН-СООН + N21 + Н2О (1)
NH2	N—(СН2ОН)2
R—СН—СООН + 2H—С—О -+ R— СН—СОО“ + Н+	(2)
I
Н
Данные реакции применяются для количественного определения
аминокислот (метод Ван-Слайка — по измерению объема выделив-
шегося газообразного азота, и формольный — путем титрования
щелочью освободившегося после добавления формальдегида про-
тона) .
Очень важными реакциями на а-аминогруппы являются реакция
Сенгера с 1-фтор-2,4-динитробензолом и реакция Эдмана с фенил-
изотиоцианатом. Они представляют исключительную ценность для
идентификации N-концевых аминокислот полипептидных цепей
(см. разд. 2.4.2).
Интересной и важной является реакция образования амидов ас-
парагиновой и глутаминовой кислот. В природе эти реакции идут
обычно с использованием энергии АТФ:
NH2
|	Аспарагинсин-
НООС—СН2—СН—СООН + NH3 + АТФ -------------->
тетаза
NH2
-> H2N—СО—СН2—СН-СООН + Н2О + АДФ + Н3РО4
nh2
|	Глутамин-
НООС—СН2—СН2—СН—СООН + NH3 + АТФ---------------
синтетаза
NH2
->h2n—со—сна-сн2-сн-соон + НаО 4- АДФ + Н3РО4
43
При декарбоксилировании аминокислот образуются амины:
nh2
|	Декарбоксилазы
R—СН—СООН-----------------> СО2 + R—СН2—NH2
аминокислот
Амины обычно существуют в виде жидкости с резким запахом и
щелочной реакцией. Многие из них обладают хорошо выраженной
физиологической активностью. Так, продукт декарбоксилирования
гистидина — гистамин имеет широкий спектр биологического дейст-
вия. Он обладает сосудорасширяющими свойствами, чем отличает-
ся от других биогенных аминов, оказывающих сосудосуживаю-
щий эффект. В большом количестве гистамин образуется в местах
воспалительного процесса. Вызывая расширение сосудов в очаге
воспаления, он ускоряет тем самым приток лейкоцитов. Содержа-
ние гистамина резко возрастает при радиоактивном облучении,
травматическом шоке. Он способствует также выделению желудоч-
ного сока с повышенным содержанием соляной кислоты, играет
существенную роль в явлении аллергии и в болевом синдроме. Гис-
тамин содержится в яде пчел и ряда животных, в большом коли-
честве присутствует в спорынье.
Большой интерес представляют диамины путресцин и када-
верин, возникающие в результате декарбоксилирования орнитина
и лизина.
TST--п—сн,—сн,—nh2
сг
I
н
Гистамин
NH3
I	СО2
H2N—(СН2)з—СН—СООН------> H2N(CH2)4—nh2
Орнитин	Путресцин (тетра метилен диамин)
nh2
I — со2
H2N—(СН2)4—СН—СООН -----► H2N(CH2)5—nh2
Лизин	Кадаверин (пентаметилендиамин)
Кадаверин и путресцин образуются при расщеплении белков гнию-
щих трупов (от лат. cadaver — труп, putresko — тлеть, гнить) и
могут быть причиной отравления, вызванного испорченным мясом.
Их образование возможно в кишечнике человека при некоторых
кишечных инфекционных заболеваниях. В норме небольшие коли-
чества этих диаминов быстро нейтрализуются уже в клетках сли-
зистой оболочки кишечника путем связывания аминогрупп, напри-
мер, их ацетилированием, а также путем расщепления в процессе
окислительного дезаминирования. Продукты деградации этих ве-
ществ выводятся через почки с мочой. В малых концентрациях
44
путресцин стимулирует синтез РНК, ускоряет рост *йлеток живот-
ных и бактерий.
Очень важными производными аминов являются адреналин и
норадреналин — гормоны мозгового слоя надпочечников, образую-
щиеся из тирозина (см. разд. 12.6.6.).
Радикалы аминокислот исключительно разнообразны, что дает
возможность для обнаружения большинства аминокислот исполь-
зовать цветные реакции. Многие из них весьма чувствительны и
специфичны, позволяют определять ничтожные количества той или
иной индивидуальной аминокислоты в составе сложных смесей,
биологических жидкостях, белках. Некоторые цветные реакции на-
ходят применение при количественном определении аминокислот
и белков.
Аминокислоты могут вступать в реакцию с соединениями, имею-
щими карбонильную группу, например с восстанавливающими са-
харами, в результате чего из аминокислоты образуется соответст-
вующий альдегид, а из углевода — фурфурол или оксиметилфур-
фурол. Альдегиды, образующиеся из аминокислот, обладают
приятным запахом. Сочетание запахов разных альдегидов и опре-
деляет, в основном, аромат пищевых продуктов. Фурфурол и окси-
метилфурфурол в свою очередь способны взаимодействовать с ами-
нокислотами, давая темноокрашенные продукты, называемые мела-
ноидинами. Синтез меланоидинов является причиной потемнения
многих пищевых продуктов при их приготовлении, сушке и хране-
нии. Особенно интенсивно реакция меланоидинообразования проте-
кает при повышенных температурах, например при сушке плодов,
овощей, солода, при топлении молока, выпечке хлеба (придает цвет
корке), при обработке вина теплом и т. п.
2.2.8.	Характеристика отдельных аминокислот, входящих в бел-
ки. Моноаминомонокарбоновые аминокислоты.
Глицин (гликокол, а-аминоуксусная кислота)
nh2
I
Н—С—СООН
I
н
Единственная оптически неактивная аминокислота. Имеет сладкий
привкус и является одной из самых распространенных. Особенно
много ее в желатине. Является предшественником при биосинтезе
пуринов, порфириновой части гемоглобина, хлорофилла, геминовых
ферментов. Участвует в образовании клеточных стенок бактерий.
Функционирует как тормозной медиатор в спинном мозге и в боль-
шинстве структур ствола мозга, где находится в высоких концент-
рациях.
L-Аланин (а-аминопропионовая кислота)
NH2
Н3С—С—СООН
н
45
Содержится практически во всех белках. Играет большую роль в
обмене азотистых соединений. Может быть исходным продуктом
для синтеза каротиноидов, каучука, жиров и углеводов.
L-В алии (а-аминоизовалериановая кислота )
СН3 NH2
Н,С—СН—С—СООН
I
н
Обладает способностью к гидрофобным взаимодействиям, что
важно при создании и стабилизации структуры белковой молеку-
лы. Содержится во многих белках, но обычно в небольших количе-
ствах. Участвует в синтезе алкалоидов, некоторых циклопептидов,
пантотеновой кислоты, пенициллина.
L-Лейцин (а-аминоизокапроновая кислота)
СН3 NH2
Н3С—СН—СН2—С—СООН
н
L-Изолейцин (а-амино-$-этил-$-метилпропионовая кислота)
nh2
Н3С—СН2—ОН—С—СООН
I I
сн3 н
Обе аминокислоты плохо растворимы в воде. В белках содержатся
в незначительных количествах, способны к гидрофобным взаимо-
действиям. Являются источником сивушных масел при брожении.
L-Серин (а-амино-р-оксипропионовая кислота)
iNH3
НО—СН2—С—СООН
ll
Играет большую роль в обмене веществ любого организма. Входит
в состав фосфолипидов (фосфатидилсерины), полипептидов бради-
кинина и каллидина, участвует в построении активного центра
некоторых протеолитических ферментов, синтезе аминоспирта
сфингозина (компонент сфинголипидов). В некоторых белках, та-
ких, как казеин молока или вителлин яичного желтка, содержится
в виде сложного эфира—так называемой серинфосфорной кислоты,
которая играет важную роль в метаболизме молодого растущего
животного организма. У растений образуется в ходе фотодыхания
из глицина.
L-Треонин (а-амино-^-оксимасляная кислота)
NHa
Н3С—СН—С—СООН
I I
он н
46
Участвует в синтезе витамина Bi2, антибиотика актиномицина D.
L-Цистеин (а-амино-$-меркаптопропионовая кислота)
NH3
HS—СН2—(!—соон
н
Играет большую роль в обмене веществ растений и животных как
источник серы, а также в связи с наличием сульфгидрильной
SH-группы, являющейся восстанавливающим агентом. Входит в
состав трипептида глютатиона, в виде амина в кофермент А, при-
сутствует в активном центре многих ферментов. В молекулах бел-
ков и пептидов (инсулин, АКТГ и др.) принимает участие в обра-
зовании дисульфидных связей между полипептидными цепями или
внутри одной цепи, отсюда его важная роль в образовании третич-
ной структуры белковой молекулы. Является тем соединением, в
виде которого некоторые микроорганизмы и растения метаболизи-
руют сероводород. Из двух молекул цистеина при их окислении
получается цистин. Столь же легко происходит и обратный пере-
ход. Таким путем образуется одна из важнейших окислительно-
восстановительных систем живых организмов:
NH2
NH2 _____2Н+	।
I	S—CH2—CH—COOH
2hs—сн2—с—соон Z— ।
|	+ 2H+ S—CH2—CH—COOH
H	I
nh2
В белках цистин преобладает над цистеином. В больших количест-
вах он содержится в белках волос, рогов, копыт.
L-Метионин (а-амино-у-метилтиомасляная кислота)
nh2
Н3с—S—сн2—сн2—с—соон
н
Является одним из основных доноров метильных групп при синтезе
углеводов клеточной стенки растений, холина, адреналина, креати-
на, стеринов и источником серы при образовании тиамина. Из него
могут образовываться и другие серосодержащие аминокислоты.
Много метионина в белке молока — казеине. Как липотропный
фактор является лечебным препаратом при атеросклерозе.
Диаминомонокарбоновые аминокислоты. L-Ли-
зин (а, в-диаминокапроновая кислота)
NH2
HaN—сн2—сн2—сн2—сн2—С—соон
н
47
Содержится почти во всех белках, особенно много его в белках мо-
лок рыб, относящихся к протаминам и гистонам. Является исход-
ным продуктом при синтезе алкалоидов (анабазин, никотин, лупа-
нин, кониин). Участвует своей 8-аминогруппой в образовании комп-
лекса между белковой частью фермента и коферментом, например
в биотин-зависимых ферментах.
Содержится в незначительных количествах в белках семян зла-
ковых, особенно кукурузы, что существенно обесценивает кормо-
вые свойства последней. Советские селекционеры, лауреаты Госу-
дарственной премии М. И. Хаджинов и Г. С. Галеев вывели ряд
сортов кукурузы с повышенным содержанием лизина.
L-Аргинин ((1-амино-б-гуанидил-п-валериановая кислота)
NH2
h2n—С—NH—СН2—СН2—СН2—С—СООН
II	I
NH	Н
Содержится во всех белках. Входит в большом количестве в состав
основных белков-гистонов и протаминов, в связи с чем его много
в белках рыбьих молок. Играет большую роль в белковом обмене,
участвуя в синтезе мочевины, креатина. В виде фосфоаргинина в
мышцах беспозвоночных выполняет функцию, аналогичную функ-
ции фосфокреатина у высших животных.
Моноаминодикарбоновые аминокислоты. L-Acna-
рагиновая кислота, аспартат (а-аминоянтарная кислота)
nh2
ноос—сн2—с-соон
н
Очень плохо растворима в воде, ее раствор имеет кислую реакцию.
Содержится в больших количествах во всех растительных белках и
играет важную роль в обмене веществ у растений и животных, в
частности, принимая участие в реакциях переаминирования, обра-
зовании мочевины, креатина, циклопептидов. При ее декарбокси-
лировании образуется а- или ft-аланин, необходимый для синтеза
карнозина, ансерина и коэнзима А (КоА). Амид аспарагиновой
кислоты — аспарагин накапливается в очень больших количествах
при прорастании семян бобовых растений, особенно в темноте, из-
за отсутствия углеводов или при избытке аммиака. Аспарагин об-
наружен в плазме крови и в составе некоторых животных белков
(инсулин, гемоглобин, миоглобин и др.).-У человека и животных
аспарагин, как и аспарагиновая кислота, активно участвует в ре-
акциях переаминирования, служит предшественником при синтезе
пуриновых и пиримидиновых оснований, никотиновой кислоты, у
растений является запасной и транспортной формой азота.
48
L-Глутаминовая кислота (глутамат,а-аминоглутаровая кислота)
NH2
I
НООС—СН2—СН2—С—СООН
I
н
В водных растворах дает кислую реакцию. Содержится в больших
количествах во всех белках. Входит в состав витамина фолиевой
кислоты, глутатиона. Наряду с аспарагиновой кислотой играет
первостепенную роль в аминокислотном обмене, активно участвуя
в реакциях переаминирования, дезаминирования, прямого амини-
рования. При декарбоксилировании глутаминовой кислоты образу-
ется у-аминомасляная кислота, имеющая большое значение в мета-
болизме мозга, усиливающая, в частности, процессы торможения,
и b-аминолевулиновая кислота, участвующая в синтезе порфиринов.
Амид глутаминовой кислоты — глутамин, является транспортной
формой азота у животных и растений, исходным соединением при
синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований, никотиновой кис-
лоты. Мононатриевая соль глутаминовой кислоты служит вкусовой
приправой, обладая вкусом и запахом куриного бульона.
Ц и к л и чес к ие а м и н о к м г л пт кт Г-Фриилалднин
(а-амино-^-фенил-пропионовая кислота)
Содержится во всех белках. Участвует в биосинтезе флавоноидов,
алкалоидов. Обладает способностью к гидрофобным взаимодейст-
виям. Обусловливает ксантопротеиновую реакцию на белки. В сос-
тав молекулы грамицидина и антибиотика тироцидина входит
D-фенилаланин, который в свободном виде в природе не обнару-
жен.
н
L-Тирозин (а-амино-^-гидроксифенилпропионовая кислота)
Одна из наиболее распространенных в природе аминокислот; содер-
жится во всех белках (за исключением некоторых протаминов).
Является исходным субстратом для синтеза гормонов (тироксин,
норадреналин, адреналин), алкалоидов (морфин, кодеин, папаве-
рин). Окисление тирозина под влиянием тирозиназы приводит к
образованию меланинов (пигмент кожи, волос, перьев).
49
L-Триптофан (а-амино-^-индолилпропионовая кислота)
СН2—СН—СООН
Находится почти во всех белках. Бедны триптофаном семена зла-
ков. При кислотном гидролизе белков распадается. Триптофан слу-
жит исходным продуктом для синтеза никотиновой кислоты (вита-
мин РР), гетероауксина.
L-Гистидин (а-амино-$-имидазолпропионовая кислота)
НС----Г-ГН;—с Н—СООН
iL -NH NH2
А
Принадлежит к группе основных аминокислот — в водных раство-
рах дает щелочную реакцию. Значительное количество гистидина
содержится в глобине — белковом компоненте гемоглобина крови.
Входит в активные центры некоторых протеолитических фер-
ментов.
L-Пролин (пирролидин-а~карбоновая кислота)
.сн—СООН
'N^
Я
Является иминокислотой. Хорошо растворим в спирте. Особенно
велико содержание пролина в белках семян злаков (проламины),
в коллагене, эластине и белке эмали зубов. Входит в состав ряда
антибиотиков циклопептидов — грамицидина, лихениформина, ак-
тиномицина D.
L-Оксипролин
НО—НС----сн2
h2<L ,СН—СООН
н
Является производным L-пролина. Значительные его количества
обнаружены в белках клеточных оболочек, желатине, колла-
гене.
2.2.9.	Аминокислоты, редко встречающиеся в белках, и небелко-
вые аминокислоты. Кроме обычных 20 аминокислот из белков уда-
50
лось выделить в небольших количествах другие редко встречаю-
щиеся аминокислоты:
NH.
I
H2N—СН2—СН(ОН)—сн2—сн2—с-соон
н
Оксилизин (много в коллагене)
н	nh2
ноос—с—сн2—сн,—сн2—с—соон
I	I
nh2	н
£-а,е-Диаминопимелиновая кислота (только у бактерий)
nh2
НООС—СН2—СН2—СН2—(!—соон
н
L-a-Аминоадипиновая кислота (в белке зерна кукурузы)
Свыше 150 аминокислот, обнаруженных в живых организмах,
не входят в состав белков. Некоторые из них играют важную роль
в обмене веществ.
fi-Аланин ($-аминопропионовая кислота)
h2n—сн2—сн2—соон
Является составной частью кофермента А (см. разд. 3.4.1), витами-
на В3 (пантотеновая кислота), карнозина, ансерина. Встречается
также в свободном виде. Оказывает тормозящий эффект на цент*
ральную нервную систему.
L-Орнитин (а, Ъ-диаминовалериановая кислота)
NH2
h2n— сн2—сн2-сн2—соон
н
Легко образуется из аргинина под действием фермента аргиназы.
Принимает участие в образовании мочевины, а также в синтезе
алкалоидов и антибиотика грамицидина.
L-Цитруллин (а-амино-Ь’Карбамидовалериановая кислота)
nh2
h2n—с—NH—СН2—СН2—сн2—с—соон
О .	J
Является промежуточным продуктом при синтезе мочевины. Встре-
чается в свободном виде в соке плодов арбуза (Citrullus), отку-
да и получил свое название.
у-Аминомасляная кислота (ГАМК)
H2N—СН2—СН2—СН2—СООН
Содержится во многих растениях, в тканях мозга млекопитающих,
некоторых земноводных, птиц. Образуется в мозге при участии глу-
таматдекарбоксилазы:
NH2
I
НООС—СН2—СН2—С—СООН	со2 + ноос—сн,—сн2—сн2—nh2
"	" I	*	1	if	&	&	в
н
У животных функционирует в качестве химического агента при пе-
редаче нервного импульса, т. е. является нейромедиатором. Пола-
гают, что в количественном отношении ГАМК является главным
тормозным медиатором в нервной системе. Наличие ГАМК в цент-
ральной нервной системе необходимо также для нормального те-
чения обмена веществ: под ее влиянием усиливаются энергети-
ческие процессы, повышается дыхательная активность тканей
головного мозга, улучшается утилизация мозгом глюкозы, активи-
руются многие ферменты дыхания, улучшается кровоснабжение
мозга, стимулируется удаление из мозга токсических продуктов.
ГАМК используют как лечебный препарат под названием «Амина-
лон» или «Гаммалон».
2.3.	Физико-химические свойства белков
2.3.1.	Выделение и очистка белков. Первым этапом выделения и
очистки белков является извлечение их из клеток. Для этого клетки
разрушают, т. е. превращают в гомогенат (разрушают клеточные
оболочки, наружные мембраны, цитоплазматические структуры).
Существуют различные методы гомогенизации клеток и тканей, и
выбор того или иного метода определяется свойствами, составом,
прочностью исходного объекта. Большинство животных клеток раз-
рушается сравнительно легко, однако при работе с растительными
и бактериальными клетками встречаются значительные трудности,
обусловленные наличием клеточных оболочек.
Довольно простым и доступным методом разрушения является
гомогенизация путем растирания клеток и тканей с твердым мате-
риалом— абразивом (например, кварцевый песок) в ступкЛр пес-
тиком в присутствии среды суспендирования. Недостаток метода
заключается в том, что при этом может нарушаться структура наи-
более крупных органелл, например хлоропластов.
Для разрушения животных клеток часто используют гомогени-
заторы с вращающимися лопастями или пестиком, обычно выпол-
ненным из инертного материала — тефлона. С целью дезинтеграции
микробных клеток применяют механичЙ&ое встряхивание суспен-
зии клеток с мелкими стеклянными бусинками диаметром от 50 до
500 мкм. Встряхивание с частотой 300—3000 колебаний/мин разру-
52
ъ
шает клетки, однако возникающая сильная вибрация может иногда
вызывать и разрушение клеточных органелл. Гомогенизация мик-
робных клеток может быть достигнута с помощью высокого дав-
ления при применении специальных прессов. При этом суспензию
клеток помещают в камеру, создают избыточное давление (до
Ь108 Па), затем его снижают. Резкий перепад давления приводит
к тому, что клетки разрушаются. Клетки можно гомогенизировать
также путем продавливания их через мелкие отверстия.
Широко используют для разрушения клеток специальные при-
боры — ультразвуковые дезинтеграторы. Однако, поскольку
ультразвук — денатурирующий белки агент, следует очень тща-
тельно подбирать режим работы прибора, чтобы избежать инакти-
вации белков. Существуют также методы разрушения клеток с по-
мощью осмотического шока, попеременного замораживания и
оттаивания, обработки органическими растворителями (охлажден-
ный ацетон, толуол), автолиза. Для удаления оболочек раститель-
ных и бактериальных клеток могут быть применены ферментатив-
ные препараты — лизоцим, комплекс целлюлолитических фермен-
тов, хитиназа.
На всех этапах выделения и очистки белков следует учитывать
их большую неустойчивость, лабильность, склонность к потере при-
родных, нативных свойств, т. е. к денатурации. Белки очень чувст-
вительны к действию многих химических реагентов (в том числе
кислот, щелочей, органических растворителей), денатурируют при
нагревании. Они адсорбируются многими веществами (например,
фарфором ступок), что приводит к потере белка. Возможен автолиз
белков (самопереваривание), разрушение их микроорганизмами,
попавшими в раствор из воздуха или воды.
В большинстве случаев процесс разрушения клеток сопровожда-
ется выделением тепла, поэтому все процедуры по дезинтеграции
клеток и выделению клеточных органелл с целью предотвращения
тепловой денатурации следует проводить при пониженных темпера-
турах (около +4°С) в термостатированных холодных комнатах.
Важно также поддержание постоянства активной реакции среды в
определенном интервале, с этой целью среду суспендирования го-
товят на буферных растворах. Чтобы устранить воздействие ионов
тяжелых металлов, которые могут попасть с водой и реактивами
при гомогенизации, используют комплексообразователи — ЭДТА
(этилендиаминтетраацетат), его натриевую соль — трилон Б и др.
НООС—Н,Ск	/СН2—СООН
СН2—СН2—
НООС—H2CZ	ХСН2—СООН
ЭДТА (версен)
Для предотвращения окисления сульфгидрильных групп в
белках в среду выделения добавляют восстановители, например
цистеин, p-меркаптоэтанол, дитиотреитол и некоторые другие.
HS—СН2—СН2—ОН
Меркаптоэтанол
63
CH2—CH----СН—сн2
SH ОН OH SH
Д*1тиотреитол
Белки могут терять биологическую активность вследствие по-
верхностной денатурации, что происходит при сильном вспенива-
нии реагирующей массы. Образования пены избегают добавлением
нейтральных поверхностно-активных веществ (ПАВ).
Известно, что многие белки локализованы в клеточных органел-
лах. Для их выделения гомогенат, полученный после разрушения
клеток, подвергают центрифугированию. В зависимости от величи-
ны центробежного ускорения в осадке получают те или иные орга-
неллы, с которыми затем проводят работу по выделению белка.
Методом центрифугирования можно также отделить твердые час-
тицы-обломки клеточных структур. Надосадочная жидкость
(экстракт) представляет собой водный раствор различных орга-
нических и неорганических соединений — компонентов клетки и сре-
ды солюбилизации (растворения).
Многие белки в клетке находятся в ассоциированном состоянии
с другими веществами или клеточными структурами, для их луч-
шей солюбилизации применяют слабые растворы детергентов (ве-
щества с поверхностной активностью) или неполярных растворите-
лей (эфир, бутанол и др.).
Неионные детергенты, такие, как дезоксихолат натрия, тритон
Х-100, широко применяющиеся для солюбилизации мембранных
белков, ослабляют гидрофобные белково-липидные и белок-белко-
вые взаимодействия, в результате чего белки высвобождаются из
мембран. Анионные и катионные детергенты дестабилизируют так-
же и ионные связи между заряженными группами компонентов
мембран. Примером анионного детергента, использующегося для
выделения белков мембран, является додецилсульфат натрия
(ДСН, SDSV
СН3(СН2)10СН2О SO3Na
к______v J
Лауриновый спирт
Додецилсульфат натрия
51
После гомогенизации материала производится экстрагирование
из него белков. В качестве растворителей в зависимости от свойств
выделяемого белка и целей исследований применяют воду, солевые
растворы, разнообразные буферные смеси, органические реагенты,
водно-спиртовые растворы, слабые кислоты или щелочи. Очень час-
то экстракцию белков осуществляют в процессе гомогенизации ма-
териала.
В результате экстракции получают смесь белков и других ве-
ществ. Для выделения индивидуальных белков применяют различ-
ные методы очистки. Набор и последовательность использования
этих методов подбирают экспериментально в каждом конкретном
случае в зависимости прежде всего от физико-химических свойств
выделяемого белка. Разделение на фракции может быть достигну-
то за счет использования различий в растворимости белков при
разных концентрациях нейтральных солей (высаливание), органи-
ческих растворителей (этанол, серный эфир, ацетон, диоксан и не-
которые другие), разных значениях pH, t° (см. разд. 2.3.4).
Высоленные белки содержат большое количество солей, для ос-
вобождения от них полученный при центрифугировании белковый
осадок подвергают диализу против буферного раствора или гель-
фильтрации на колонках с молекулярными ситами. Обессоливание
о помощью молекулярных сит протекает во много раз быстрее.
Эффективным способом очистки белков является их фракциони-
рование с применением хроматографических методов. Хроматогра-
фическим методом называют физико-химический метод разделения
веществ, оснбванный на распределении компонентов смеси между
двумя фазами, одна из которых неподвижная, а другая — поток,
фильтрующийся через слой неподвижной фазы. Подвижной фазой
чаще всего бывает жидкость (жидкостная хроматография) или
газ (газовая хроматография). В зависимости от свойств, которыми
обладает неподвижная фаза, различают несколько видов хромато-
графии. Ниже приведена характеристика хроматографических ме-
тодов.
Принципы разделения
Вид хроматографии
Физическая сорбция веществ.....................
Разделение веществ между двумя жидкими несме-
шивающимися фазами ............................
Ионные взаимодействия между растворенными ве-
ществами и носителем ..... ....................
Неодинаковая доступность внутреннего раствори-
теля пористой структуры молекулам разделяемых
веществ........................................
Избирательное взаимодействие со специфическими
лигандами, закрепленными на носителе ..........
Адсорбционная
Распределительная
Ионообменная
Молекулярно-ситовая (гель-
проникающая)
Аффинная (по сродству),
биоспецифическая адсорбци-
онная хроматография (БАХ)
В белковой химии широкое применение нашли три последних
вида хроматографии. При ионообменной хроматографии (ИОХ)
55
разделение .белков происходит вследствие их взаимодействия с про-
тивоположно заряженными частицами ионообменных смол (аонм-
ты)— твердых нерастворимых веществ, которыми после соответст-
вующей обработки заполняется колонка.
Иониты содержат активные (ионогенные) группы с подвижны-
ми ионами, способными при определенных условиях обмениваться
на ионы анализируемой смеси. Иониты, содержащие активные кис-
лотные группы и способные к обмену подвижные катионы, назы-
ваются катионитами. Анионитами называются иониты, содержащие
активные группы основного характера и подвижные анионы.
R—SO^"H+ + H3N+—R'	R—SOJ-H3N+—R' + Н+
Катионообменная смола
R—СН2—N+OH- 4- -000—R'	R—СН2—N+~OOC—R' + ОН~
,IL >	,L >
(СНз)з	(СНз)з
Анионообменная смола
где R'—+NH3 hR'—COO" —белок, —БОГи —CH2~N+= (СН3)3 —
функциональные (сульфо- и триметиламинометил-) группы, Н+ и
ОН" — подвижные ионы, R — основа (матрица).
Применение гель-проникающей хроматографии (гель-фильтра-
ция) позволяет разделять белки в соответствии с размерами их
молекул. С этой целью используют различные пористые- нераство-
римые материалы — синтетические смолы, пористое стекло (био-
глас), пористый кварц (порасил), производные полисахаридов на
основе декстрана (сефадекс, молселект), агарозы (сефароза), син-
тетического полимера полиакриламида (биогель Р) и др.
Пористые материалы выпускают в виде гранул определенного
размера, при суспендировании их в растворителе образуется две
его фазы: одна внутри гранул, другая — вне. Суспендированными
гранулами наполняют колонку, наносят смесь белков и пропускают
растворитель. В зависимости от размера и формы белковых моле-
кул они по-разному распределяются между обеими фазами: более
крупные и асимметричные молекулы реже проникают или совсем
не проникают (в зависимости от размера пор носителя) во внутрен-
нюю фазу растворителя. Молекулы, для которых недоступен внут-
ренний растворитель, остаются во внешней фазе и продвигаются по
колонке с гораздо большей скоростью, чем мелкие молекулы. Бел-
ки с относительно небольшим размером молекул (менее диаметра
пор) или низкомолекулярные соединения — соли, сахара, амино-
кислоты и др. — обязательно попадают в поры гранул и медленнее
выходят с колонки, так как находятся в состоянии диффузионного
равновесия с внутренним растворителем (рис. 2.3). Пористые ма-
териалы работают как молекулярное сито, точнее, как антисито,
так как крупные молекулы проходят через них быстрее.
В качестве молекулярного сита наиболее часто используют се-
фадекс— производное синтетического полисахарида декстрана.
В результате химической обработки в декстране образуются попе-
56
О 2
Рис. 2.3. Схема обессоливания белкового раствора с по-
мощью сефадекса:
Л II, III— стадии фильтрования; / — гранулы сефадекса, 2 — мо-
лекулы белка, 3 — неорганические соли
речные сшивки, и он становится нерастворимым в воде, но легко в
ней набухает, образуя гель. Существует несколько марок сефадек-
сов, различающихся по диаметру пор внутри гранул (табл. 2.2).
Таблица 2.2. Типы сефадексов
Тип	Область разделения по моле- кулярной массе (М), дальтон	Поглощение воды, г/г сефадекса
0-25	1 000—5 000	2,5
0-50	1 500—30000	5,0
G-75	3 000—80000	7,5
0- 100	4 000—150 000	10,0
0 - 150	5000—300000	15,0
G- 200	5 000—600 000	20,0
Аффинная хроматография основана на биоспецифическом взаи-
модействии выделяемого биополимера или группы биополимеров с
определенным веществом. Этот вид хроматографии применим к
ферментам, иммуноглобулинам, лектинам, рецепторным белкам,
которые способны избирательно связываться с субстратами, инги-
биторами, кофакторами, антигенами, рецепторами. Принцип этого
метода хроматографии заключается в том, что на нерастворимом
носителе закрепляют вещество, способное специфически связывать-
57
ся с выделяемым белком. Это вещество называют лигандом. Обра-
ботанный таким образом носитель (адсорбент) помещают в колон-
ку и через нее пропускают смесь белков. С адсорбентом связывает-
ся только тот белок, который имеет сродство к специфическому
лиганду (рис. 2.4). Затем белок снимают с колонки раствором,
Рис. 2.4. Схема метода аф-
финной хроматографии:
1 — носитель (матрица). 2 —
<ножка>, J —лиганд, 4 — белок
вызывающим диссоциацию образовавше-
гося комплекса между белком и лиган-
дом.
Для разделения белков широко ис-
пользуют электрофоретические методы,
основанные на движении заряженных
молекул белков в электрическом поле со
скоростью, зависящей от величины их
зарядов при данном pH и ионной силе
раствора. На скорость перемещения ока-
зывают влияние также форма и масса
белковых молекул, но в меньшей степе-
ни, чем их суммарный заряд.
Электрофоретическое разделение
можно проводить в растворе или на твер-
дых влажных носителях — в геле из крахмала, полиакриламида,
силикагеле, на хроматографической бумаге. Высокой разрешаю-
щей способностью и чувствительностью характеризуется электро-
форез в полиакриламидном геле (ПААГ), имеющем стандартный
размер пор, определяемый концентрацией исходных мономеров,
взятых для полимеризации геля. Поэтому в данном методе разде-
ление веществ происходит и по величине заряда, и по размеру мо-
лекул.
К электрофоретическим методам относятся также изотахофо-
рез и изоэлектрофокусирование (ИЭФ). При изотахофорезе (от
греч. изос — равный, одинаковый, тахос — скорость) заряженные
ионы сначала разделяются в соответствии с величинами их заряда
и подвижности, а затем перемещаются в электрическом поле с
одинаковыми и постоянными в данном опыте скоростями.
Метод изоэлектрофокусирования позволяет разделять белки од-
новременно как в градиенте напряжения, так и pH. Градиент pH
поддерживают, добавляя в колонку смесь амфолитов-носителей
(фирменные названия амфолины и сервалиты)—синтетических ве-
ществ, обладающих амфотерными свойствами и отличающихся друг
от друга по величине ПЭТ. Амфолины, в частности, являются по-
лиаминополикарбоновыми кислотами с молекулярной массой от 300
до 1000, их синтезируют на основе полиэтиленполиаминов. Под
действием электрического поля амфолиты-носители распределяют-
ся по высоте колонки в строго определенной последовательности и
создают линейный градиент pH. Диапазон градиента зависит от
состава смеси амфолинов или сервалитов, величин их ИЭТ. Крутой
градиент pH создается смесью амфолитов с широким интервалом
ИЭТ, пологий — смесью с более узким спектром изоточек амфоли-
тов (рис. 2.5). В последнем случае достигается более высокая
68
разрешающая способ-
ность метода — разделе-
нию могут подвергнуться
белки, отличающиеся по
величине ИЭТ на 0,01
значения pH и меньше.
Исследуемые белки,
внесенные в колонку, пе-
ремещаются в ней под
действием приложенного
электрического поля
(рис. 2.6). Молекулы бел-
ка в той области, где pH
выше его ИЭТ, заряжены
отрицательно и переме-
щаются сверху вниз (к
аноду). Напротив, моле-
кулы белка в области с
pH ниже его ИЭТ мигри-
руют снизу вверх. В ито-
ге каждый вид белка ока-
зывается сконцентриро-
ванным в зоне с pH, рав-
ным его ИЭТ. Здесь бе-
лок фокусируется, так
как на молекулы, поте-
рявшие заряд, электриче-
ское поле перестает дей-
Рис. 2.5. Границы pH смесей амфолитов-носи-
телей
ствовать.
Применение перечисленных методов извлечения и очистки бел-
ков позволяет выделять индивидуальные белки, имеющие высокую
степень чистоты. Хорошо очищенные белки в отдельных случаях
удается получить в кристаллическом виде. Белки выкристаллизо-
вывают из растворов солей, органических растворителей. Пере-
кристаллизация белков повышает степень их чистоты.
Выделенные препараты белка должны быть проверены на гомо-
генность. Прямых методов оценки чистоты белков не существует,
гомогенность образца оценивают по отсутствию примесей. Вещест-
во считают чистым, если ни один из методов определения гомо-
генности не выявит наличие примесей. С этой целью применяют
обязательно несколько методов, основанных на разных принципах.
Гомогенность образца по молекулярной массе устанавливают уль-
трацентрифугированием, по величине заряда — электрофорезом в
ПААГ, ИЭФ. Чистое вещество дает только один симметричный
пик при ультрацентрифугировании. Асимметричность пика, а так-
же наличие плеча в лике или нескольких пиков свидетельствует о
гетерогенности исследуемого белкового раствора. При электрофо-
ретических методах оценки гомогенности после разделения также
должна получаться только одна белковая зона. Кроме того, ис-
59
® А И
/nCnnuIC MvJlCnUJiD'
A П Молекулы, не несущие
О ZX LJ суммарного заряда
• Д I Положительно заря-
женные молекулы
Рис. 2.6. Процесс миграции молекул белков при изоэлектрическом фокусирова-
нии. А — начало процесса; Б — окончание
пользуют критерий функциональной гомогенности — определение
специфической активности белков. Существует и биологический
метод установления чистоты белковых препаратов, основанный на
том, что большинство белков обладает свойствами антигенов, т. е.
способностью вызывать у животного после введения появление спе-
цифических антител. Инъекция гомогенного вещества вызывает об-
разование антител одного вида, а гетерогенного — нескольких
видов.
Выделенный и очищенный белок должен храниться при пони-
женной температуре. Если белок кристаллизуется из раствора
сульфата аммония, его можно хранить в этом растворе в виде
суспензии. Чаще всего белки хранят в высушенном состоянии;
сушку производят под высоким вакуумом из замороженного сос-
тояния (лиофилизация).
2.3.2.	Молекулярная масса белков и методы ее определения.
Молекулярная масса белков может быть определена различными
физическими методами, из которых наиболее часто используют
гравитационный, гельфильтрационный и электрофоретический. Сов-
ременные методы позволяют определять молекулярные массы с
погрешностью, не превышающей 5%, что составляет несколько ты-
60
сяч, а иногда и сотен дальтон.. Выяснение первичной структуры
многих индивидуальных белков дало возможность рассчитать их
молекулярную массу с высокой точностью.
При гравитационном методе для определения молекулярной
массы используют аналитические ультрацентрифуги, которые поз-
воляют наблюдать процесс седиментации (оседание) частиц. В сов-
ременных ультрацентрифугах развивается центробежное ускорение,
превышающее ускорение силы тяжести до 500 000 раз. Определе-
ние молекулярной массы белка методом ультрацентрифугирования
ведут по скорости седиментации белковых молекул и по седимента-
ционному равновесию.
При определении молекулярной массы по скорости седимента-
ции исследуемые белковые растворы центрифугируют при больших
скоростях. Это приводит к тому, что равномерно распределенные
по всему объему частицы белка в начале центрифугирования посте-
пенно перемещаются ко дну ячейки. Между областями растворите-
ля, свободной от белковых молекул и содержащей их, образуется
граница раздела. Регистрируя перемещение этой группы в процес-
се центрифугирования, определяют скорость седиментации моле-
кул, на основании чего рассчитывают молекулярную массу белка
по уравнению Сведберга.
В методе седиментационного равновесия центрифугирование
проводят при относительно небольших скоростях вращения ~7—
8 тыс. об/мин, что соответствует центробежному ускорению 40—
50 тыс. g. При таком ускорении даже частицы с большой молеку-
лярной массой не оседают на дно. Центрифугирование продолжают
до тех пор, пока не будет достигнуто равновесное распределение
изучаемого белка по всей длине ячейки, при котором движение
белка ко дну ячейки под действием центробежной силы уравнове-
шивается движением вверх, обусловленным диффузией. По обра-
зовавшемуся градиенту концентрации белка в центрифужной ячей-
ке рассчитывают молекулярную массу белка по специальной фор-
муле.
Установление молекулярной массы белков гель-фильтрацией
проводят при заполнении пористым гелем (сефадекс, сефароза
и др.) колонки или нанесении его тонким слоем на твердую под-
ложку (тонкослойная хроматография). При колоночном варианте
фиксируют объем элюирования (14) исследуемого белка и белков
с известной молекулярной массой, затем строят калибровочный
график зависимости IgM от Ve/Vo и по нему определяют молеку-
лярную массу изучаемого белка. Vo (внешний объем)—объем
растворителя между гранулами, определяется как объем, необхо-
димый для элюирования соединения, которое не проникает в поры
гранул. Значения молекулярных масс большинства белков уклады-
ваются на калибровочную прямую, исключение составляют лишь
белки с ярко выраженной асимметричной формой молекул. Этим
методом устанавливают и молекулярные массы субъединиц белков,
имеющих четвертичную структуру (см. разд. 2.4.7). В этом случае
используют 6/М гуанидингидрохлорид, вызывающий диссоциацию
61
белка на субъединицы и потерю нативной конформации, что поз-
воляет избежать влияния формы молекулы.
znh2
H2N-C<f Cl-
XNH2
Г уанидингидро хлорид
При тонкослойной хроматографии на пористых гелях опреде-
ляют путь, пройденный белком за определенное время, и рассчи-
тывают молекулярную массу, используя калибровочный график,
построенный в координатах IgAf от х (пройденное белком расстоя-
ние) с использованием стандартных белков.
При электрофоретическом методе определения молекулярной
массы белка в ПААГ также сравнивают подвижность исследуемого
белка с подвижностью белков-маркеров. Графическая зависимость
подвижности белка от логарифма его молекулярной массы выра-
жается прямой линией. Чтобы избежать влияния формы молекул
и их заряда на электрофоретическое разделение белков, а также
установить молекулярную массу отдельных субъединиц в молекуле
с четвертичной структурой, предварительно проводят денатура-
цию белков с помощью додецилсульфата натрия (ДСН). С 1 г
белка связывается примерно 1.4 г ДСН, при этом гидрофобные
группы ДСН располагаются внутри образующегося комплекса, а
сульфокислотные — на поверхности. Последние обеспечивают сум-
марный отрицательный заряд комплекса, зависящий только от
массы белка, и при электроферезе в гелях с однородной пористо-
стью комплексы мигрируют со скоростью, обратно пропорциональ-
ной молекулярной массе белка. Электрофорез в присутствии ДСН
широко применяют при изучении сложных смесей мембранных бел-
ков, определении их молекулярной массы, поскольку многие мем-
бранные белки плохо растворимы в отсутствие ДСН.
Каждый из указанных выше методов определения молекуляр-
ной массы имеет свои недостатки, поэтому точный результат мо-
жет быть получен при сочетании различных методов.
Использование перечисленных методов позволило установить,
что молекулярные массы различных белков колеблются в широ-
ких пределах: от 6 тыс. до нескольких миллионов дальтон. Ниже
приведены молекулярные массы некоторых белков.
к	Молекулярная
Инсулин........................................ 5	700
Рибонуклеаза	. .............................. 14	000
Пепсин........................................ 35	500
Сывороточный	альбумин........................ 66	500
Каталаза..................................... 250	000
Уреаза....................................... 480	000
Гемоцианин................................. 2	800 000
2.3.3.	Амфотерные свойства белков. Белки являются амфотер-
ными электролитами, так как в их молекуле присутствуют как кис-
62
лотные, так и основные группировки. Кислотно-основные свойства
белков определяются главным образом боковыми радикалами ами-
нокислот, способными к ионизации. Вклад концевых NH2- и
COOH-групп крайне незначителен. Величины рК боковых ради-
калов аминокислот в составе белков несколько отличаются от та-
ковых в свободных аминокислотах, поскольку степень ионизации
групп в белках зависит от природы соседних боковых радикалов,,
т. е. от электростатического окружения.
Присутствие диссоциирующих группировок в белках обуслов-
ливает определенный суммарный заряд молекулы, зависящий от
pH среды. Большинство природных белков относится к кислым
белкам благодаря значительному содержанию дикарбоновых кис-
лот и поэтому при pH, близких к нейтральным, имеет, как и цито-
плазма, в целом, отрицательный заряд.
Аминокислоты с диссоциирующими боковыми радикалами вхо-
дят в состав всех белков, где они преимущественно располагаются
на поверхности глобулы и тем самым определяют гидрофильность
молекулы в целом, а также ряд других физико-химических свойств
белковых молекул. Распределение заряда на поверхности молеку-
лы неравномерно, различные участки ее могут иметь противопо-
ложные заряды, стабилизированные диполями воды. Сдвиг pH
среды приводит к изменению характера диссоциации радикалов^
перераспределению зарядов на поверхности молекулы, следствием
чего является изменение пространственной структуры белков и
степени их биологической активности.
Наличие большого числа точек диссоциации определяет и спо-
собность белковых молекул взаимодействовать с малыми ионами,,
в частности ионами металлов, другими заряженными макромолеку-
лами, что очень важно для функционирования белка. Способность
белков взаимодействовать как с катионами, так и с анионами име-
ет большое биологическое значение. Например, важную роль во
многих физиологических процессах играет способность белков свя-
зывать катион кальция, что имеет непосредственное отношение к
регуляции метаболических процессов.
дая каждого белка существует такое значение активной ре-
акции среды, при котором положительные и отрицательные заряды
в молекуле скомпенсированы. Значение pH, при котором белок не
несет суммарного заряда и не движется в электрическом поле, на-
зывают изоэлектрической точкой (ИЭТ) и обозначают как pl. Ве-
личина ИЭТ может быть определена по кривым, полученным при
кислотно-основном титровании белкового раствора, а также при
изоэлектрофокусировании белка (см. разд. 2.3.1). Ниже приведены
изоэлектрические точки некоторых белков.
Белок.	р/
Пепсин.........................................
Уреаза.........................................
Каталаза ......................................
Рибонуклеаза ..................................
Лизоцим ..............*....................  •
1,0
5,1
5,6
7,8
11,0
63
Значение pH, отвечающее ИЭТ белка, определяется числом его
ионогенных групп и величинами их констант диссоциации (рК).
ИЭТ выше 7, если белок содержит большое число остатков основ-
ных аминокислот, и менее 7 при преимущественном содержании
кислых аминокислот. Для большинства глобулярных белков ИЭТ
лежат в кислой области (4,5—6,5). Однако есть и исключения. Так,
например, фермент пепсин, функционирующий в сильно кислой
среде желудка, имеет ИЭТ около 1, а протамины — около 12.
Суммарный заряд белковой молекулы положителен при рН<р! и
отрицателен, если рН>р1. Поскольку в ИЭТ молекула белка не
несет суммарного заряда и между соседними молекулами отсутст-
вует электростатическое отталкивание, белки легко осаждаются из
растворов при pH, равном их ИЭТ.
Изоэлектрическую точку белка следует отличать от изоионной
точки, так как эти величины не всегда совпадают. Изоионной точ-
кой белка называется то значение pH, при котором число прото-
нов, связанных с основными группами, равно числу протонов, от-
данных диссоциированными кислотными группами в белковой мо-
лекуле. Таким образом, изоионной точке соответствует значение
pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю
в условиях полного отсутствия электролитов в растворе. Следова-
тельно, изоэлектрическая и изоионная точки совпадают только в
том случае, когда раствор белка не содержит никаких других ио-
нов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой моле-
кулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Прямое изме-
рение изоионной точки затруднено, поэтому ее определяют, изме-
ряя ИЭТ при различных концентрациях солей и экстраполируя к
нулевой концентрации. В отсутствие солей и при значении изоион-
ной точки вблизи pH 7 она будет почти совпадать с изоэлектричес-
кой. Однако в присутствии солей различие между этими точками
может быть весьма значительным.
Белки, являясь амфотерными электролитами, проявляют бу-
ферные свойства.
2.3.4.	Растворимость белков. Подавляющее большинство бел-
ков— гидрофильные вещества, хорошо растворяющиеся в вод-
ных растворах. Растворимость их, как и других высокомолекуляр-
ных веществ, определяется природой тех групп, которые оказыва-
ются на поверхности молекулы при ее пространственной укладке в
нативную конформацию. Большая часть поверхности белковой мо-
лекулы образована группами, способными гидратироваться.
Под гидратацией понимается связывание диполей воды с ион-
ными и полярными группами. Ионными, несущими заряд, группа-
ми в белках являются радикалы, способные к диссоциации. В дис-
социированном состоянии они притягивают молекулы воды за счет
ион-дипольных взаимодействий. Неионные полярные боковые ра-
дикалы аминокислот (аспарагин, глутамин, серин, треонин) обра-
зуют с водой водородные связи. К образованию водородных связей
с водой способны кислород и водород, входящие в состав пептид-
ных групп, поскольку эти атомы несут избыточный отрицательный
64
(О) и положительный (Н) заряды. Однако доступ воды к пептид-
ным группам затруднен из-за стерического препятствия, создавае-
мого боковыми радикалами аминокислот, поэтому значительного
вклада в гидрофильность белков они не вносят.
Растворимость белков в воде возрастает при добавлении не-
больших концентраций нейтральных солей [(NH4)2SO4, Na2SO4>
AlgSO4 и др.], этот эффект называют солевым растворением. Раст-
ворению белков, как и других веществ, способствуют те факторы,
которые уменьшают взаимодействие между молекулами растворя-
емого вещества. Нейтральные соли в малых концентрациях увели-
чивают степень диссоциации ионизированных групп белка, экра-
нируют заряженные группы белковых молекул и тем самым умень-
шают белок-белковое взаимодействие. Известно, что степень диссо-
циации электролитов (в том числе белков) прямо пропорциональна
диэлектрической постоянной растворителя, которая, в свою очередь,
пропорциональна степени поляризации молекул растворителя, их
дипольному моменту. У сильно поляризованных молекул воды, на-
пример, диэлектрическая постоянная при комнатной температуре
равна 80, а у ацетона, этанола — 20—30. Нейтральные соли в ма-
лых концентрациях еш(е больше увеличивают диэлектрическую пос-
тоянную воды. В результате вода усиливает диссоциацию раство-
ренного вещества, в частности белка. Входя между заряженными
группами и ориентируясь вокруг них, диполи воды препятствуют
их взаимодействию.
Высокие концентрации нейтральных солей, напротив, осаждают
(высаливают) белки из водных растворов, наиболее активно это
происходит в ИЭТ белка. Относительная эффективность высали-
вающего действия различных ионов зависит от их размера, вели-
чины заряда, способности к гидратации. При больших концентра-
циях ионов в растворе они оттягивают к себе от заряженных групп
белка поляризованные молекулы воды и частично лишают тем
самым белок гидратной оболочки, которая предотвращает его
осаждение из раствора. При высоких концентрациях солей этот
фактор играет решающую роль. По способности к высаливанию
белков из водного раствора анионы и катионы могут быть распо-
ложены в особые ряды — ряды Гофмейстера, лиотропные ряды.
Для анионов в более щелочной среде по сравнению с ИЭТ белка
это будет такой ряд: SO4~ >17~>[нитрат]2~>[тартрат]2~>[аце-
TaT]->CI->NO3“>Br->I“>CNS“ Лиотропный ряд для катионов
в этих же условиях выглядит следующим образом: Ba2+>Sr2+>
>Ca2+>Mg2+>Cs+>Rb+>K+>Na-b>Li+.
Растворимость белков зависит также от pH растворителя, его
состава, температуры. Минимальной растворимостью, как указыва-
лось выше, обладают белки в ИЭТ, что объясняется отсутствием
электростатического отталкивания между молекулами белка.
Добавление к белковому раствору смешивающихся с водой ор-
ганических растворителей (этанол, ацетон) уменьшает раствори-
мость белков, а при больших концентрациях растворителей наблю-
дается выпадение белков в осадок. Данное явление объясняется
3—937
65
снижением диэлектрической постоянной среды и, кроме того,
уменьшением степени гидратации белков, приводящими к увеличе-
нию притяжения между противоположно заряженными группами в
белковой молекуле и к агрегации белков. Белки, обладающие раз-
ными по растворимости свойствами, осаждаются при различных
интервалах концентрации солей или органических растворителей,
при неодинаковых значениях активной реакции среды. Это свойство
белков используют при их выделении и очистке фракционировани-
ем (см. разд. 2.3.1).
В растворах белки проявляют коллоидные свойства: они мед-
ленно диффундируют, не проходят через полупроницаемую мем-
брану, рассеивают свет, характеризуются высокой вязкостью. Од-
нако следует иметь в виду, что белковые растворы не являются
типичными коллоидными растворами, так как белки диспергирова-
ны до единичных молекул и образуют гомогенный раствор. В отли-
чие от них типичные коллоидные растворы гетерогенны, двухфазны
(растворенное вещество и растворитель), коллоидные частицы (ми-
целлы) растворенного вещества состоят из нескольких молекул.
Сходство белковых и истинных коллоидных растворов основано на
том, что молекулы белков имеют размеры, приближающиеся к раз-
меру мицелл коллоидного раствора (10~4—10-7 см).
Образование коллоидных растворов белками и другими биологи-
ческими макромолекулами обусловливает многие физико-химичес-
кие явления, наблюдающиеся в биологических жидкостях и орга-
низмах в целом. Растворы белков, как и все коллоидные растворы,
могут при определенных условиях терять свою текучесть и образо-
вывать гели, или студни. Гели возникают в результате объединения
молекул в виде сетки, внутреннее пространство которой заполнено
большим количеством растворителя, при этом разделения на жид-
кую и твердую фазы, как в случае коагуляции, не происходит. По-
лагают, что в ряде растительных и животных тканей белки нахо-
дятся не только в виде растворов, но и гелей (в протоплазме кле-
тоц^хрусталике глаза, соединительной ткани и др.). В состояние
гелябёлковые растворы, например молоко, могут переходить под
воздействием ферментов микроорганизмов, результатом чего явля-
ется образование простокваши, кефира. При подготовке растений
к зимнему периоду жизни, в процессе так называемого осеннего
«закаливания» происходит переход части белков из растворенного
состояния в гелеобразное.
Гели со временем стареют, отслаивают воду и делятся на две
фазы: уплотненный гель и разведенный золь. Этот процесс получил
название синерезиса, он протекает, например, при стоянии кефира.
Одним из свойств гелей является их способность к набуханию —
увеличению объема за счет связывания большого количества воды.
Такой процесс происходит, например, при прорастании семян. Бел-
ки соединительных тканей животных, поглощая воду, осуществля-
ют тем самым ее запасание организмом. Набухание играет большую
роль в технологии кожевенной промышленности, хлебопе-
чении.
66
В растворах белков и других высокомолекулярных соединений
может наблюдаться явление коацервации — слияния водных оболо-
чек нескольких частиц без объединения самих частиц. Коацерваты
возникают при ограниченной растворимости компонентов раствора,
это служит причиной появления коацерватных капель. Коацерваты
образуются, например, из белков с противоположными зарядами.
Им придают большое значение в теории происхождения жизни,
однако в отличие от биологических неравновесных структур коа-
церваты термодинамически равновесны.
Благодаря гидрофильным и гидрофобным группировкам белки
могут влиять на растворимость других веществ, выступая в роли
эмульгаторов — веществ, стабилизирующих эмульсию, которую об-
разуют взаимно нерастворимые жидкости (вода—масло). В орга-
низме человека в эмульгированном состоянии находятся жиры в
крови и лимфе. Белок образует на поверхности капелек жира тон-
кую пленку, которая притягивает воду и препятствует слипанию
жировых частичек. Одной из причин образования мочевых и желч-
ных камней может быть недостаток в организме муцинов — слизис-
тых гликопротеинов, обволакивающих гидрофобные микрочастицы
и способствующих тем самым их выведению из организма. Как
эмульсию можно рассматривать и молоко, представляющее собой
эмульгированные жззеушогеном капельки жира в воде.
2.3.5.	Денатур^Ояпбелков. Под денатурацией белка понимают
нарушение” нативной пространственной структуры белковой мо-
лекулы, приводящее к уменьшению или полной потере ее раствори-
мости, изменению других физико-химических свойств белка, утрате
специфической биологической активности. Денатурация ще сопро-
вождается разрывом ковалентных связей в остове полипептидной
цепи. Происходит расщепление дисульфидных мостиков, гидрофоб-
ных, ионных, водородных связей. В результате нарушается натив-
ная третичная структура и в значительной мере вторичная. Денату-
рацию белковых молекул вызывают как некоторые химические
соединения, так и физические факторы/Механизм денатурирующе-
го воздействия химических агентов определяется их строением.
Например, мочевина, гуанидинхлорид, формамид благодаря нали-
чию амидной группировки конкурируют с пептидными группиров-
ками белка за водородные связи, переключая их на себя. Эти реа-
генты нарушают также гидрофобные взаимодействия. Максималь-
ное денатурирующее влияние мочевина и другие амиды проявляют
в больших концентрациях (6М—ЮМ).
Денатурирующее действие умеренно полярных органических
растворителей (низшие спирты, этиленгликоль, диоксан, диметил-
сульфоксид и др.) связано с резким уменьшением диэлектрической
константы водных растворов белков, вследствие чего увеличивают-
ся электростатические силы взаимодействия между заряженными-
группами. Образование прочных внутри- и межмолекулярных ион-
ных связей и приводит к денатурации белков. Органические раст-
ворители нарушают гидрофобные взаимодействия в молекулах
белков. Неполярные алифатические и ароматические углеводороды
3*
67
разрушают внутримолекулярные гидрофобные связи белков вслед-
ствие прямого взаимодействия с их гидрофобными группами.
Ионные детергенты, например додецилсульфат натрия, соединя-
ются с противоположно заряженными группами белка. Электроста-
тическое отталкивание оставшихся в пептидной цепи одноименно
заряженных групп приводит к разрыву водородных связей и других
слабых взаимодействий, стабилизирующих нативную конформацию
белка.
Денатурирующими агентами являются также катионы тяжелых
металлов и анионы иода, тиоцианата. Эти вещества, по-видимому,
образуют достаточно прочные соединения с полярными группами
белков, искажая систему ионных и водородных связей.
Для трихлоруксусной кислоты и таннина характерен сложный
механизм денатурации, включающий как непосредственное воздей-
ствие на водородные связи, так и блокирование полярных группи-
ровок.
Многие белки денатурируют при сильном подкислении (рН<
<2—3) или подщелачивании (рН>10—11). В этих условиях прак-
тически все диссоциирующие группы белка имеют одноименный
заряд (преимущественно Н3Ы+-группы при низких значениях pH и
СОО- — при высоких). Взаимное отталкивание одноименных за-
рядов вызывает разрыв части слабых связей, в результате чего
нарушается нативная структура. Однако необходимо учитывать,
что некоторые белки достаточно устойчивы при крайних значениях
pH. Например, при pH 2 довольно стабильны гистоны, протамины,
лизоцим, а у пепсина при pH 1,5—2,2 активность даже максималь-
на. Лизоцим, гистоны и протамины устойчивы и при pH 10, а- у
щелочных фосфатаз и аргиназы оптимум pH каталитической ак-
тивности лежит в интервале 9,5—9,7.
Из физических факторов денатурации наиболее общим является
нагревание. Усиление теплового движения полипептидных цепей
приводит к разрыву водородных связей и нарушению гидрофоб-
ных взаимодействий. Скорость тепловой денатурации существен-
но зависит от активной реакции среды, присутствия солей, их кон-
центрации. Тепловая денатурация сопровождается агрегацией бел-
ков, выпадением их в осадок, что представляет собой уже вторичное
явление.
Существуют многочисленные данные о том, что у термофильных
микроорганизмов большинство белков обладает повышенной тер-
мостабильностью. При нагревании до 60°С они не денатурируют,
претерпевают лишь небольшие конформационные изменения, в то
время как у белков мезофиллов (организмы, обитающие при обыч-
ных, средних температурах) при +60°С наблюдается существенная
денатурация. У мезофиллов лишь редкие белки обладают повы-
шенной термостабильностыо.
Белки денатурируют и при многих механических воздействиях;
высоком давлении (5000—10 000 атм), растирании сухих препа-
ратов, энергичном встряхивании растворов, облучении звуковыми
волнами высокой частоты. Все это следует иметь в виду при биохи-
68
мических исследованиях белков. При лиофилизации большинство
белков не денатурирует, что позволяет использовать этот способ
сушки для получения белковых препаратов длительного хранения.
Физическими факторами денатурации белков являются также
ультрафиолетовый свет (особенно в границах 260—310 нм), иони-
^ируййцёе”излучение. Денатурация белка происходит также при
распределении его на границе раздела двух фаз, такая поверхно-
стная денатурация наблюдается при вспенивании белковых раст-
воров в процессе выделения белков и при образовании пены на
поверхности водоемов.
При денатурации белков изменяются многие физико-химичес-
кие свойства белка: растворимость, константа седиментации, вяв-
кость, оптические свойства и др. В процессе денатурации белков с
четвертичной структурой может происходить их диссоциация на
субъединицы. В белке существенно уменьшается количество участ-
ков с регулярными типами вторичной структуры, снижается коли-
чество внутримолекулярных водородных связей и возрастает чис-
ло этих связей между белком и водой. Поскольку при денатурации
происходит нарушение гидрофобных взаимодействий в процессе
развертывания белковой молекулы и гидрофобные группы оказы-
ваются на поверхности молекулы, это вызывает потерю раствори-
мости и набухаемости белков в водных растворах.
> При денатурации белка выявляются реактивные группы, кото-
рые в нативном белке не полностью доступны для обнаружения
обычными методами (сульфгидрильные, фенольные, имидазольные
и др.). Изменение числа реактивных групп при денатурации прояв-
ляется и в изменении ИЭТ белков. Как правило, изоэлектрическая
точка смещается в сторону щелочных значений pH. Денатурация
белков сопровождается возрастанием отрицательной оптической
активности.
Превращение компактной молекулы в беспорядочный клубок,
происходящее при денатурации,-приводит к тому, что большинство
пептидных связей становится доступным действию протеолитичес-
ких ферментов. В связи с этим протеолиз денатурированных бел-
ков протекает с большей скоростью, чем нативных.
Потеря белками биологической активности выражается в инак-
тивации ферментов, гормонов, вирусов. Это является важным кри-
терием денатурации, хотя здесь и существуют некоторые исключе-
ния. Такие ферменты, как папаин, пепсин, сохраняют свою актив-
ность при денатурации мочевиной, а рибонуклеаза и лизоцим сох-
раняют активность при нагревании в разбавленной кислоте. При
денатурации ряда белков происходит понижение антигенности, но
сохраняется иммунологическая специфичность.
Медленная денатурация белков происходит при длительном
хранении семян, в результате чего у них уменьшается набухае-
мость и, как следствие, снижается интенсивность прорастания.
Полная денатурация белка в большинстве случаев необратима,
однако при подборе соответствующих условий иногда удается ре-
натурировать белки. Способность к ренатурации после нагревания
69
показана, например, для фермента трипсина. Необходимым усло-
вием его ренатурации является очень медленное охлаждение белка
до комнатной температуры («отжиг»), при этом восстанавливается
нативная конформация и специфическая биологическая функция
трипсина.
2.3.6	Оптические свойства. Все белки, как правило, поглощают
ультрафиолетовый (УФ) свет в трех областях. Поглощение при
длинах волн (X) более 250 нм с максимумом около 280 нм обуслов-
лено присутствием исключительно ароматических аминокислот —
триптофана, тирозина и фенилаланина. Основной вклад дают ами-
нокислоты триптофан (%iax=278 нм, е1 2 = 5600) и тирозин
(Хтах=275 нм, 8=1300), входящий в больших количествах в состав
почти всех белков. Поглощение при 210—250 нм имеет сложную при-
роду и определяется наличием-ароматических и ряда других ами-
нокислот, а также присутствием в белках водородных связей,
«-спиральных участков и т. д. Полоса поглощения, максимум ко-
торой расположен вблизи 190 нм, обусловлена главным образом
наличием в белке пептидных связей. Интенсивность поглощения в
этой области меняется в основном в зависимости от количества
а-спиральных структур в белке.
На свойстве белков поглощать свет в УФ-области спектра осно-
ван спектрофотометрический метод количественного определения
белка (по интенсивности поглощения при 280 нм). Он не очень то-
чен, поскольку количество триптофана и тирозина в различных
белках варьирует в довольно широких пределах. При работе с
белками условно принимают, что 1 единица оптической плотности
раствора при 280 нм соответствует концентрации, равной приблизи-
тельно 1 мг/мл (при толщине кюветы 1 см). Несмотря на недос-
таточную точность, этот метод широко применяют в современной
биохимии, так как он прост и быстр в исполнении, дает возмож-
ность дальнейшего использования раствора белка после определе-
ния оптической плотности. Метод особенно часто используют при
контроле за изменением концентрации белков при их разделении
на колонках.
Спектрофотометрия позволяет также устанавливать зависи-
мость оптической плотности растворов от длины волны поглощае-
мого света, т. е. получать спектры поглощения, и, кроме того, ис-
пользуется для определения пространственного расположения аро-
матических аминокислот в белковой глобуле (внутри или снаружи).
Последний способ применения основан на том, что спектры погло-
щения ароматических аминокислот (их Хтах и е) претерпевают за-
метные изменения в зависимости от окружения, в частности от
полярности растворителя, pH среды. Триптофан, тирозин и фенила-
ланин в менее полярном окружении (например, внутри белковой
глобулы) имеют более высокие Хтах и 8. Если спектр белка чувст-
вителен к изменению полярности растворителя, это дает основание
1 %тах — длина^ волны, при которой наблюдается максимальное поглощение.
2 е — молярный коэффициент поглощения.
70
заключить, что аминокислоты, для которых наблюдаются измене-
ния Хтах и е, располагаются в основном на поверхности белковой
глобулы.
Подобного типа анализы обычно проводят путем снятия диффе-
ренциальных спектров, т. е. непосредственной регистрацией разно-
сти поглощения УФ-света белком в различных растворителях. Ме-
тод дифференциальной спектрофотометрии позволяет установить
и степень полярности окружения ароматической аминокислоты,
находящейся внутри глобулы. Так, если в спектре аминокислоты в
составе белка, находящегося в полярном растворителе, наблюда-
ются большие Хтах и 8, чем эти же величины для свободной амино-
кислоты в том же растворителе, то эта аминокислота находится во
внутренней области белка и окружена неполярными аминокисло-
тами.
В видимом диапазоне спектра (380—760 нм) способностью пог-
лощать свет обладают только окрашенные белки, так называемые
хромопротеины — гемоглобины, цитохромы, флавопротеины, «голу-
бой белок» из Pseudomonas, интенсивно поглощающий свет с дли-
ной волны около 600 нм, и некоторые другие.
В инфракрасной (ИК) области спектра (760—10 000 нм) погло-
щают свет все белки. ИК-спектроскопию широко используют для
определения относительного содержания а-спиралей, p-структур и
аморфных участков в белковой молекуле. Это можно оценить по
интенсивности некоторых полос спектра, в частности полосы амид I
(~ 1680 см-1). При изображении ПК-спектров используют не дли-
ны волн, а частоты (v) или волновые числа (1/Z), поэтому положе-
ние полос определяют в обратных сантиметрах.
Использование поляризованного ИК-света позволяет опреде-
лять ориентацию водородных связей относительно полипептидной
цепи: в а-спирали они параллельны, в p-структуре перпендикуляр-
ны цепи. Методом инфракрасного дихроизма регистрируют спект-
ры поглощения белка для двух взаимно перпендикулярных направ-
лений поляризации падающего света. В одном случае вектор
напряженности электрического поля параллелен пептидным цепям,
в другом — перпендикулярен им. В указанном методе получают
так называемые растянутые пленки белков, в которых все белко-
вые молекулы ориентированы в одном и том же направлении, и из-
меряют дихроичное отношение, т. е. отношение площадей полос,
полученных, когда электрический вектор световой волны паралле-
лен и перпендикулярен оси молекулы. Группы —С —О (1660 см-1)
и _N—н (3300 см-1) поглощают наиболее сильно тогда, когда они
параллельны вектору. По величине дихроичного отношения судят
о вероятности а-спиральной структуры в белке.
Белки являются оптически активными веществами: они вращают
проходящий через них плоскополяризованный свет и неодинаково
поглощают левый и правый циркулярно поляризованный свет.
Плоско поляризованный свет — это свет, у которого вектор напря-
женности электрического поля для всех фотонов светового пучка
лежит в одной плоскости; циркулярно поляризованным светом на-
71
зывается свет, у которого вектор напряженности описывает спи-
раль. Указанное свойство белков объясняется наличием в их моле-
куле хиральных атомов углерода. Взаимодействие с белками по-
ляризованного света изучают методами дисперсии оптического вра-
щения (ДОВ), кругового дихроизма (КД). С помощью этих мето-
дов в зависимости от длины волны измеряют способность оптиче-
ски активного вещества вращать плоско поляризованный свет
(ДОВ) и по-разному поглощать поляризованный по кругу вправо
и влево свет (КД). Методы ДОВ и КД применяют для общего опи-
сания содержания спиральных структур в белках и исследования
конформационных изменений.
Для белков и многих белковых структур характерно свойство
оптической анизотропии, т. е. различие оптических свойств по раз-
ным направлениям. В одних случаях оптическая анизотропия обус-
ловлена внутренним строением белков, в других — их формой или
искусственно вызванной ориентацией.
Белковые растворы обладают также способностью флуорес-
цировать — испускать квант света при переходе из электронно-
возбужденного состояния в основное. На этом свойстве белков ос-
нована флуоресцентная спектроскопия — измерение интенсивности
испускаемого света при возбуждении образца (поглощение им
кванта света при облучении УФ-светом). Спектр флуоресценции
всегда бывает смещен относительно спектра поглощения в длин-
новолновую область, так как при переходе из возбужденного со-
стояния в основное молекула теряет энергию.
Флуоресцирующими аминокислотными остатками в белках яв-
ляются триптофан, тирозин и фенилаланин. Флуоресценцию каждо-
го из них можно отличить по длине волны, при которой она наблю-
дается. Кроме того, сложные белки могут содержать и другие флу-
оресцирующие компоненты. Измерение флуоресценции дает сведе-
ния о конформационных перестройках белков, местах связывания
лигандов, взаимодействиях с растворителем, степени гибкости мо-
лекулы, межмолекулярных расстояниях и др.
2.4.	Строение белковой молекулы
2.4.1.	Полипептидное строение белков. Первые белковые вещест-
ва выделили более 250 лет назад, а во второй половине XVIII —
начале XIX вв. уже неоднократно описывали белковые вещества
растений и животных.
В настоящее время хорошо известен химический элементарный
состав белков. Они обычно содержат 50—55% С, 21—23% О2,
15—17% N2, около 7% Н2, от 0 до 3% S. В сложные белки, кроме
того, могут входить Р и некоторые металлы.
Значительно более сложным является вопрос структуры белко-
вых молекул. Глубокие и очень интересные для своего времени
исследования структуры белков были проведены выдающимся рус-
ским биохимиком, одним из основоположников отечественной био-
72
химии А. Я. Данилевским (1838—1923) в 80-х годах прошлого сто-
летия. Исследуя продукты расщепления белков под влиянием сла-
бых щелочей, особенности биуретовой реакции, типичной для бел-
ков и некоторых продуктов их распада, он высказал ряд интерес-
ных идей по поводу строения белковой молекулы. Молекула белка»
по А. Я. Данилевскому, состоит из достаточно похожих по строению
цепей, в которых чередуются атомы С и N («углеазотные цепи»,
«элементарные ряды»), с которыми соединены аминокислоты.
А. Я. Данилевский впервые в науке указал на полимерный ха-
рактер строения белков. Большой интерес представляло его ут-
верждение, что расщепление белка имеет гидратационный харак-
тер, т. е. идет путем гидролиза. Эти идеи А. Я. Данилевского не-
сомненно были еще очень далеки от современной теории строения
белков, но они уже представляли собой ее начало.
Решающий шаг в создании полипептидной теории строения
белковой молекулы сделал крупнейший немецкий химик-органик и
биохимик Э. Фишер (1852—1919). Гидролизуя белки соляной кис-
лотой и ферментами, а затем исследуя продукты расщепления, он
пришел к заключению, что белковая молекула образована боль-
шим числом аминокислотных остатков. Чтобы определить, каким
образом они соединены между собой, Э. Фишер пошел по пути ис-
кусственного синтеза белковоподобных молекул из аминокислот.
Так как свободные аминокислоты при сливании их растворов не
взаимодействуют, он использовал их галогенацилпроизводные в
качестве исходного материала для синтеза. Условия синтеза были
таковы, что аминогруппа одной аминокислоты реагировала с кар-
боксилом другой, образуя пептидную связь —СО—NH— (на при-
сутствие в белковой молекуле такого типа связей указывал еще
А. Я. Данилевский, называя их биуретовыми). Таким путем ему
удалось объединить в одну молекулу до 19 аминокислотных остат-
ков. Сравнение свойств этих искусственно синтезированных соеди-
нений с пептидами — продуктами неполного расщепления природ-
ных белков — показало большое сходство. Это доказывало, что и
в природных белках аминокислоты соединены друг с другом пеп-
тидными связями.
По современным данным, наиболее часто в составе различных
белков обнаруживают 20 видов аминокислот. Именно для 20 ами-
нокислот существует генетический код в виде триплетов (тройки
нуклеотидов в ДНК). Иногда в белках присутствуют и другие ами-
нокислоты, они образуются в результате модификации белков
уже после их биосинтеза, являются некодируемыми (цистин, гид-
роксипролин, гидроксилизин и некоторые другие). В составе белков
обнаружены только а-аминокислоты, в подавляющем большинстве
в L-конфигурации.
Аминокислоты соединяются друг с другом ковалентной пептид-
ной или амидной связью. Образование ее происходит за счет ами-
ногруппы (—МНЙ) одной аминокислоты и карбоксильной группы
(—СООН) другой с выделением молекулы воды.
73
о
Т2
HaN— СН— с—ОН + H~—N—СН—COOH^-H2N—СП-
1.	Н	1,
о
Т2
сн—СООН + н2о
:—n-
н
Транспептидная связь
Наиболее распространена в природе транс-пептидная связь, ре-
же встречается менее устойчивая цис-пептидная связь. Пептидная
связь является частично двойной, частично одинарной, между эти-
ми структурами есть взаимный переход. Время жизни одинарной
связи несколько больше, чем двойной (6:4), можно сказать, что
пептидная связь на 60% одинарна и на 40% двойная.
В результате явления резонанса образуется флуктуирующая,
динамическая связь, которую невозможно описать на основе одной
валентной структуры. Так как вращение вокруг двойной связи за-
торможено, все атомы пептидной связи оказываются расположен-
ными примерно в одной плоскости, т. е. она планарна, только во-
круг атома азота связи отчасти сохраняют пирамидальный харак-
тер. К настоящему времени установлены все валентные углы и
длины связей в пептидных группировках (рис. 2.7).
Образованные аминокислотами полимеры называют пептидами
или белками в зависимости от числа входящих в них структурных
единиц. Условно принято, что пептиды, содержащие до 20 амино-
кислотных остатков, относятся к олигопептидам, среди них разли-
чают ди-, три-, тетрапептиды и т. д. Полипептиды имеют в молеку-
ле от 20 до 50 аминокислотных остатков. Пептидные цепи, объеди-
Рис. 2.7. Межатомные расстояния
(нм) и углы в пептидной связи.
Все атомы внутри рамки находятся
примерно в одной плоскости
няющие более 50 аминокислот и
имеющие молекулярную массу свы-
ше 6 тыс., относятся к белкам.
Самый низкомолекулярный бе-
лок — гормон инсулин, состоящий
из 51 аминокислотного остатка. Чис-
ло аминокислотных звеньев в бел-
ке может доходить до нескольких
сотен и даже тысяч. Количество ви-
дов белков в природе огромно, их
разнообразие связано с различным
набором аминокислот, входящих в
белок, и порядком их чередования в
молекуле. Так, уже из трех амино-
кислот можно получить 6 различ-
ных трипептидов, из четырех — 24
74
тетрапептида, пяти — 120 пента пептидов, из 11—40 млн. изомеров,
а из 20 разных аминокислот, каждая из которых встречается только
один раз, теоретически может образовываться астрономическое
число (2-Ю18) изомеров. Однако в живой природе реализуется
только малая доля возможных изомеров.
Для описания строения белковых молекул были введены поня-
тия о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах.
В последние годы добавлены еще два уровня: сверхвторичная
структура и домены, которые занимают место между вторичной и
третичной структурами.
/ 2.4.2. Первичная структура. Под первичной структурой белко-
вой молекулы понимают порядок чередования аминокислот в поли-
пептидной цепи (или цепях) и местоположение. ^дисульфидных свя-
~зей. ТТолипептидная цепь содержит на одном конце св'бббХную амйг
’ногруппу (N-конец), на другом — карбоксильную группу (С-ко-
нец). За начало цепи принимается ее N-конец, именно отсюда на-
чинается отсчет аминокислот. 1Это совпадает с направлением син-
теза полипептидной цепи на ''рибосоме, которое в свою очередь
отвечает направлению 5'—>3' мРНК (см. разд. 4.4.3).
Аминогруппа на N-конце полипептидной цепи может быть
иногда ацетилированной, присоединившей остаток уксусной кис-
лоты (СН3—СО—NH—...), как например, в цитохроме овальбу-
мине, лактатдегидрогеназе, актине, миозине. Блокированные за
счет ацетилирования N-концы характерны также для белков обо-
лочки многих растительных вирусов, некоторых вирусов животных
и бактерий. Формилирование а-аминогруппы обнаружено в пче-
лином яде мелиттине, гемоглобине миноги, метилирование — в ри-
босомных белках Е. coll. В ряде белков (гормоны, легкая и тяже-
лая цепи иммуноглобулинов) N-концевым является остаток пирро-
лидонкарбоновой кислоты (пироглутаминовой кислоты), не содер-
жащей свободной аминогруппы.
На С-конце встречается либо свободная карбоксильная группа
(у большинства белков), либо амидированная (некоторые гормо-
ны, пчелиный яд). Модификации С-конца более редки по сравне-
нию с N-концевыми модификациями.
Названия отдельных пептидов образуются в соответствии с сос-
тавляющими их аминокислотными остатками, начиная с N-конца.
При этом в названиях всех аминокислот, за исключением послед-
ней, меняется окончание на «ил». Например, Е-аланил-Ь-цистеиЛ-
L-метионин. Полная аминокислотная последовательность белков
указывается в виде сокращенных названий аминокислот. Принято
трехбуквенное и однобуквенное обозначение аминокислот
(табл. 2.3).
75
Таблица 2.3. Обозначения аминокислотных остатков, входящих в состав
пептидов и белков
Полное название аминокислоты	Сокращенное название	
	трехбуквенное	однобуквенное
Глицин	Тли, Gly	G
Аланин	Ала, Ala	A
Валин	Вал, Vai	V
Лейцин	Лей, Leu	L
Изолейцин	Иле, Не	I
Пролин	Про, Pro	P
Фенилаланин	Фен, Phe	F
Тирозин	Тир, Туг	Y
Триптофан	Три, Тгр	W
Серин	Сер, Ser	S
Треонин	Тре, Thr	T
Аспарагиновая кислота	Асп, Asp	D
Глутаминовая кислота	Глу, Glu	E
Аспарагин1	Асн, Asn	N
Глутамин1	Глн, Gin	Q
Цистеин	Цис, Cys	c
Метионин	Mem, Met	M
Гистидин	Гис, His	H
Лизин	Лиз, Lys	к
Аргинин	Ape, Arg	R
1 Если неизвестно, аминокислота или ее амид имеется в цепи белка, используют следующие
обозначения: Асх (Asx) или В и Глх (Glx) или Z.
Рис. 2.8. Торсионные углы у а-уг-
леродного атома в пептидной
цепи
/^Основная связь первичной.струк-
туры *^ел ков -£(^ёптрщная _ „связ^
Эта связь достаточно жесткая и по-
этому конформационная подвиж-
ность ее ограничена. Однако в каж-
дом аминокислотном звене есть а-
углеродный атом, который обуслов-
ливает присутствие в этом звене
двух одинарных связей; вокруг этих
связей возможно вращение. Углы
вращения одинарных связей назы-
ваются торсионными и обозначают-
ся через ф (N -- Са) и ф (С — Сп )
(рис. £3). Число возможных комби-
наций торсионных углов велико, и
многие из них реализуются в бел-
ках. Исключение составляют такие
пары углов, которые стерически не-
возможны вследствие близкого про-
странственного расположения ато-
76
мов соседних пептидных групп и боковых радикалов аминокислот-
ных остатков.
В настоящее время с помощью вычислительных машин и моле-
кулярных моделей просматривают всю область возможных значе-
ний ф и ф, результаты такого анализа представляют в виде графи-
ков зависимости ф от ф, которые получили название конформаци-
онных карт или графиков Рамачандрана.
На сегодня задача установления аминокислотной последова-
тельности решена примерно для 2000 белков: цитохромов, ферре-
доксинов, иммуноглобулинов, белков рибосом, гемоглобинов, боль-
шого числа ферментов. Первым был расшифрован инсулин быка
(Ф. Сэнгер, 1951 —1953), за эти работы была присуждена Нобе-
левская премия. Одним из крупных белков, для которого установ-
лена первичная структура, является фермент аспартатаминотранс-
фераза (М 93 000). Одна полипептидная цепь этого фермента — J
димера состоит из 412 аминокислотных остатков. Его структура
расшифрована в совместной работе двух лабораторий, руководимых
Ю. А. Овчинниковым и А. Е. Браунштейном, в 1971 г.
Последовательность изучения первичной структуры белков та-
кова. 1. Расщепление полипептидной цепи белка на более короткие
фрагменты по определенным положениям в его последовательности.
2. Установление порядка чередования аминокислот в полученных
фрагментах-пептидах. 3. Определение расположения пептидов с
известной аминокислотной последовательностью в белковой мо-
лекуле.
Расщеплению полипептидной цепи на фрагменты должен пред-
шествовать разрыв дисульфидных мостиков и модификация остат-
ков цистеина. Для расщепления белков на фрагменты применяют
селективный гидролиз с помощью протеолитических ферментов
(трипсин, химотрипсин и др.), разрывающих пептидные связи,
которые образованы определенными аминокислотами, или химиче-
ских агентов, также обладающих избирательностью действия.
Трипсин расщепляет пептидные связи, карбонильная группа кото-
рых принадлежит лиз или гар, а химотрипсин гидролизует пептид-
ные связи, в образовании которых принимает участие карбоксиль-
ная группа ароматических аминокислот — тир, фен и три.
Протеолитические ферменты, применяющиеся для селективного
гидролиза, обычно предварительно иммобилизуют, т. е. связывают
с нерастворимой матрицей, чтобы облегчить последующее отделе-
ние ферментов от продуктов гидролиза.
Среди химических реагентов, применяющихся для избиратель-
ного гидролиза, наиболее удачными являются бромциан, расщепля-
ющий пептидные связи, карбонильная группа которых принадле-
жит остаткам мет, а также N-бромсукцинимид, разрывающий свя-
зи после три.
В результате селективного гидролиза получается набор пепти-
дов, из которого затем каждый пептид должен быть получен в
индивидуальном виде. Для фракционирования пептидов использу-
ют преимущественно высоковольтный (до 10 000 В) электрофорез
77
и хроматографию (в основном, ионообменную, распределительную,
молекулярно-ситовую) или сочетание указанных методов, напри-
мер метод пептидных карт, или «отпечатков пальцев». Последний
метод заключается в том, что смесь пептидов наносят на лист хро-
матографической бумаги и проводят в одном направлении распре-
делительную хроматографию, а в другом, перпендикулярном пер-
вому, — электрофорез.
Для установления порядка чередования аминокислот в пепти-
дах разработан ряд методов, позволяющих исследовать аминокис-
лотную последовательность как с N-, так и с С-конца молекулы.
Одним из самых распространенных реагентов, используемых для
N-концевого анализа пептидов, является фенилизотиоцианат
(ФИТЦ), впервые примененный П. Эдманом^В результате реакции
ФИТЦ с МН2-группой пептидов образуется продукт — фенилтио-
карбамильное производное аминокислоты, или ФТК-производное.
В кислой среде продукт циклизуется, что приводит к разрыву пеп-
тидной связи и отделению от остального пептида фенилтиогиданто-
инового производного N-концевой аминокислоты (ФТГ-производ-
ное). Полученные ФТГ-производные идентифицируют с использо-
ванием различных вариантов метода хроматографии, и таким об-
разом устанавливают первую аминокислоту в пептиде. Повторяя
обработку ФИТЦ укороченного пептида, определяют следующий
аминокислотный остаток и т. д. Реакции, лежащие в основе метода
Эдмана, таковы:___	**	'	.... ~...—..
ФТК-производное	ФТГ-производное
Принцип метода Эдмана используют в приборах — секвенато-
рах, позволяющих автоматически определять последовательность-/'
аминокислот в пептиде, включающем несколько десятков остатков.
Специфическим реагентом на свободные NH2-rpynnbi в белках яв-
ляется и динитрофторбензол (ДНФБ), использованный впервые
Ф. Сэнгером и примененный им для установления N-концевых ами-
нокйс'лот^ттен^идах. Реакция протекает следующим образом:
ДНФБ
Пептид
„ ,ДНФ-аминокислота
Д НФ-пептид
78
Кислотный гидролиз динитрофенилированного пептида приво-
дит к разрыву всех пептидных связей в молекуле и высвобождению
динитрофенилированной N-концевой аминокислоты, которую
идентифицируют хроматографическими методами с применением
метчиков: ДНФ-аминокислот.
Для расшифровки аминокислотной последовательности пепти-
дов с N-конца могут быть применены ферменты аминопептидазы,
последовательно отщепляющие аминокислоты со свободной амино-
группой. Используя хроматографические методы, идентифицируют
аминокислоты и определяют скорость их накопления в гидролизате,
на основании чего получают представление о чередовании амино-
кислот на N-конце пептида.
Аналогичный подход используют при расшифровке С-концевой
последовательности аминокислот с применением ферментов карбок-
сипептидаз, отщепляющих аминокислоты со свободной карбоксиль-
ной группой. Информацию о С-концевой аминокислоте можно по-
лучить, расщепляя пептидные связи в белках путем гидразинолиза.
Этот метод, предложенный С. Акабори, основан на реакции поли-
пептида с гидразином в безводной среде при 100°С.
H2N—CHRj—CO-NH—CHR2—СО—NH—CHR3—СООН + 2HaN—nh2 ->
Трипептид	Гидразин
-> H2N—CHRj—CONHNH2 + H2N—CHRjCONHNHj + H2N—CHR3COOH
Гидразиды аминокислот
В гидразиды аминокислот превращаются все аминокислотные
остатки, за исключением несущего свободную карбоксильную груп-
пу. Он получается в виде свободной аминокислоты, выделяется и
идентифицируется хроматографически.
Для анализа последовательности аминокислот как с N-, так и
С-конца в предварительно модифицированных олигопептидах при-
меняют метод масс-спектрометрии.
Для установления полной аминокислотной последовательности
в белках необходимо знать порядок чередования пептидов в моле-
куле. Это решается логическим методом, получившим название ме-
тода «перекрывающихся пептидов». Он может быть применен в том
случае, если известна первичная структура пептидов, полученных
после гидролиза белка, по меньшей мере, с использованием двух
различных видов селективного гидролиза. По «перекрывающимся»
фрагментам определяют порядок следования пептидов.
а	б	в
G-W-V-R A-O-V-K C-E-C-D
I--------1 |-------1 ।-------1
Триптические
пептиды
Химотриптические
пептиды
Например, пептид а триптического гидролизата содержит пол-
ную последовательность пептида г и часть пептида д химотрипти-
79
ческого гидролизата. Следовательно, в белковой молекуле пептид
д следует непосредственно за пептидом г. Аналогично устанавли-
вается относительное расположение остальных пептидов (G, W.
и т. д. — сокращенные названия аминокислот).
Первичная структура белка может быть установлена косвенно,
по строению кодирующего его гена: по чередованию в нем нуклео-
тидов. С помощью этого приема в сочетании с указанными выше
методами установления порядка чередования аминокислот в бел-
ках группа советских ученых во главе с Ю. А. Овчинниковым рас-
шифровала первичную структуру РНК-полимеразы — крупного
белка, состоящего приблизительно из 4000 аминокислот.
Расшифровка первичной структуры белков включает также оп-
ределение аминокислотного состава и установление мест локализа-
ции дисульфидных связей. Качественный и количественный амино-
кислотный состав белков устанавливают после их гидролиза до мо-
номеров и применения специальных приборов — автоматических
анализаторов аминокислот. В этих приборах на колонках с ионо-
обменными смолами аминокислоты разделяются, последовательно
вымываются и количественно анализируются с помощью нингидри-
на или более чувствительного реагента — флуорескамина, обра-
зующего с аминокислотами флуоресцирующие продукты.
Установление мест локализации дисульфидных мостиков в бел-
ке проводят в процессе выяснения полной аминокислотной после-
довательности. Для этого перед проведением селективного гидро-
лиза в белке модифицируют все свободные SH-группы. Пептиды,
содержащие S—S-связи, выделяют и обрабатывают реагентами,
вызывающими разрыв дисульфидных мостиков. Образовавшиеся
пептиды разделяют и определяют аминокислотную последователь-
ность каждого с помощью указанных выше методов.
Заканчивая рассмотрение основных этапов и методов, приме-
няющихся при изучении первичной структуры белков, необходимо
подчеркнуть, что самой начальной процедурой является определе-
ние числа полипептидных нитей в белковой молекуле — протоме-
ров, Заключение об этом обычно делают на основании числа NH2-
концевых остатков, приходящихся на молекулу белка. Если в бел-
ке более одной полипептидной цепи, то их отделяют друг от друга,
например, с помощью детергентов, а затем разделяют и очищают
путем электрофореза или хроматографии.
Результаты расшифровки первичной структуры, полученные в
настоящее время для большого числа белков, уже позволяют сде-
лать некоторые обобщения. Несмотря на большое разнообразие
свойств отдельных белков и различия в первичной структуре, есть
некоторое сходство в количественном составе аминокислот. Для
преобладающего числа белков характерно присутствие всех 20 ви-
дов аминокислот, из которых особенно много обычно глицина,
аланина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, мало — триптофа-
на, гистидина, метионина, аргинина. Аминокислоты с углеводород-
ными боковыми группами составляют обычно 30—40% от общего
числа аминокислот. Исключением из этой обобщенной характера-
S0
стики количественного состава аминокислот разных белков явля-
ются лишь некоторые группы белков: гистоны, протамины и про-
теиноиды. У них могут отсутствовать некоторые виды аминокислот,
количественно преобладать определенные аминокислоты (арги-
нин— у гистонов и протаминов, гидроксипролин — у протеиноидов).
Анализ большого числа белков с изученной первичной структу-
рой показал, что в глобулярных белках отсутствуют какие-либо об-
щие закономерности чередования аминокислот (нельзя, например,
сказать, что за аминокислотой X во всех белках следует аминокис-
лота Z, у каждого белка свой характер чередования). Вместе с
тем природа, видимо, не пошла по пути реализации существования
всего того колоссального разнообразия белков, которое теоретиче-
ски может быть образовано двадцатью видами аминокислот. Как
указывает Ф. Шорм (Чехословакия), даже у далеких по биологи-
ческой активности белков — гормона инсулина и фермента рибо-
нуклеазы — имеются одинаковые небольшие фрагменты молекул:
три тождественных трипептида, один тождественный тетрапептид,
пять аналогичных трипептидов, отличающихся только одной амино-
кислотой, при этом отличающиеся аминокислоты близки по строе-
нию (например, вместо ала — вал, вместо асп — глу).
Расположение аминокислот в белках, так же как и образующая-
ся на его основе пространственная структура, закреплены генети-
чески и приспособлены к выполнению определенной биологической
функции. Аминокислотная последовательность белков, ответствен-
ных за одну и ту же биологическую функцию, часто близка для
разных видов? Такие белки, одинаковые или сходные по строению
и выполняющие у разных организмов одинаковые функции, назы-
ваются гомологичными. Так, все инсулины позвоночных состоят из
двух цепей (А и В), включающих 51 аминокислотный остаток.
В A-цепи инсулинов разных животных единичные различия в ами-
нокислотной последовательности имеют место, в основном, в поло-
жениях 4, 8, 9, 10, 13, 14, 15 и 18. Эти аминокислоты называются
вариабельными, другие аминокислоты, как правило, не подверга-
ются заменам. В цитохромах с 35 остатков из 104 одинаковы у
всех видов, причем число аминокислотных замен находится в пря-
мой зависимости от их филогенетического родства. В то время как
цитохромы с позвоночных животных и дрожжей различаются меж-
ду собой по 43—48 аминокислотам, цитохромы с человека и обезья-
ны имеют только одну замену, а молекулы этого белка у курицы и
индейки идентичны.
Изучение первичной структуры гомологичных белков, выделен-
ных из различных видов живых организмов, является одним из ме-
тодов современной таксономии.
Различия в структуре гомологичных белков также дают ценную
информацию о роли отдельных аминокислотных остатков в функ-
ционировании молекулы. Остатки, находящиеся в активных участ-
ках или определяющие конформацию полипептидной цепи, не мо-
гут быть изменены генетически или путем химической модифика-
ции без влияния на функцию. Так, известные в настоящее время
31
вариации первичной структуры в цитохроме с разных видов живых
организмов не связаны со значительными изменениями функцио-
нальных свойств белка, поскольку наименее изменяемыми явля-
ются участки вблизи связывания гема, а также участки, ответст-
венные за пространственную укладку цеди.
Большинство аминокислотных замен, делений или вставок
обычно происходит на поверхности белковой глобулы, поскольку
наружные остатки менее существенны для стабильности белка.
Однако эти изменения обычно наблюдаются на участках, менее
существенных для проявления функциональных свойств. По вари-
абельности аминокислотного остатка в гомологичных белках мож-
но судить о местонахождении данного остатка — на поверхности
или внутри белка.
На ряде ферментов показано, что по отношению к некоторым
заменам, делениям и вставкам аминокислот функции белков устой-
чивы. В белках есть фрагменты полипептидной цепи, которые
можно удалить, и при этом функция не нарушится. Малосущест-
венными заменами в большинстве случаев являются замены одних
аминокислотных остатков на другие с близкими свойствами, на-
пример, взаимозамена алифатических гидрофобных остатков (иле
на вал или лей, мет и т. д.), полярных (арг на лиз, глу на асп, глн
на асн). Замещение на остаток с другим типом боковой цепи очень
существенно, если происходит в области молекулы, ответственной
за проявление функции и конформацию.
Возможность замен в первичной структуре гомологичных бел-
ков не является общим правилом для всех белков. Существуют и
консервативные белки, к ним, например, относится гистон Н4, от-
личающийся у растений и животных лишь двумя аминокислотными
остатками из 102. Очевидно, каждый остаток в гистоне Н4 крити-
чен для его функции, а эволюция этого «древнего» белка закончи-
лась на раннем этапе существования организмов.
Наряду с явлением дивергенции (по первичной структуре) бел-
ков, выполняющих одинаковые функции у различных организмов,
в биохимии известно и явление конвергенции, когда белки с анало-
гичными функциями не гомологичны по структуре. Например, гид-
ролиз пептидной связи осуществляют ферменты разных типов, от-
личающиеся по структуре активного центра и механизму катализа.
Панкреатические протеиназы (трипсин, химотрипсин и др.) и суб-
тилизин (протеиназа из Вас. subtilis) имеют различные первичные
структуры и конформации, но близкий механизм реакции.
Установление чередования аминокислот в белках показало
также, что в процессе эволюции происходило удвоение и слияние
генов. С дупликации соответствующих генов обычно начинается
дифференциация белков. Продукты этих генов постепенно могут
выполнять различные функции. Аналогичные последовательности
и пространственную структуру имеют, например, а-лактальбумин
и лизоцим, являющиеся ярким примером дифференциации белков.
Таким образом, изучение первичной структуры белков дает нам
ценную информацию о ходе эволюции, помогает в установлении
В2
филогенетических взаимоотношений между отдельными видами
живых организмов, а также доказывает непрерывность эволюци-
онного процесса. Последний вывод может быть сделан на осно-
вании того, что аминокислотные последовательности определенного
белка не всегда полностью идентичны у каждой особи данного ви-
да. Такой полиморфизм является результатом непрерывно проис-
ходящих мутаций в геноме данного вида. Полезные для вида му-
тации закрепляются в потомстве. Мутации, вызывающие наруше-
ние функций белка, приводят к появлению наследственных бо-
лезней.
2.4.3.	Роль слабых взаимодействий в образовании пространст-
венной структуры биополимеров. Пространственная организация
макромолекул и клеточных структур осуществляется в основном
при помощи химических связей, значительно более слабых, чем
ковалентные. Атомы, связанные ковалентно, способны к дополни-
тельным слабым взаимодействиям с другими атомами как в преде-
лах одной молекулы, так и с атомами близлежащих молекул. Сла-
бые взаимодействия участвуют в образовании формы молекул
сложных биополимеров (белков, нуклеиновых кислот), их про-
странственной структуры, а также определяют степень прочности
последней.
К слабым взаимодействиям, иногда их называют вторичными
связями, относят: водородные и ионные связи, ван-дер-ваальсовы
силы, гидрофобные взаимодействия. Прочность химической связи
может быть охарактеризована изменением свободной энергии, ДО
(см. разд. 1.3.2), которое происходит при ее образовании. Для сла-
бых взаимодействий она находится в пределах 4—30 кДж/моль, в
то время как ковалентные связи очень прочные, свободная энергия
их образования составляет 200—450 кДж/моль. Прочность связи
коррелирует с расстоянием между атомами: чем прочнее связь,
тем меньше это расстояние. Ковалентные связи самые короткие —
0,10—0,18 нм, при слабых взаимодействиях межатомное расстояние
составляет 0,20—0,45 нм.
Важную роль в образовании структуры биологических макромо-
лекул играют водородные связи. Они возникают между двумя
электроотрицательными атомами, когда протон водорода, кова-
лентно связанный с одним из этих атомов, располагается между
ними. Электроотрицательными (т. е. обладающими повышенной
способностью притягивать электроны) являются атомы О, N, F,
реже в образовании водородных связей участвуют С1 и S. Атом
водорода содержит единственный электрон, и когда последний ухо-
дит на образование ковалентной связи, ядро остается без электрон-
ных слоев. Такой водород, т. е. протон, не отталкивается, естест-
венно, электронными облаками соседних атомов, а наоборот, при-
тягивается ими, образуя водородную связь.
Обязательное условие образования водородной связи — нали-
чие у электроотрицательного атома хотя бы одной свободной пары
электронов, к которым будет притягиваться атом водорода. Элект-
роотрицательные атомы обладают повышенным сродством к
83
электронам, поэтому они заполняют электронами весь внешний
слой (8 электронов), как бы перегружаясь отрицательными заря-
дами. При этом если возникает пара свободных электронов, она
взаимодействует с протоном. Ниже приведен пример водородной
связи, где б* — избыток положительного или отрицательного за-
ряда, а пунктиром обозначены водородные связи:
— н6+— о5 —
=N6—Нб+——
Водородные связи характеризуются низкой энергией образова-
ния (около 20 кДж/моль), они длиннее ковалентных (0,26—
0,31 нм). Атом водорода, образующий водородную связь, находится
не на равном расстоянии от электроотрицательных атомов, а ближе
к тому атому, с которым образована ковалентная связь.
Водородные связи имеют направленный характер. В наиболее
прочных водородных связях атом водорода расположен по прямой,
соединяющей донорные и акцепторные атомы. Если же водородная
связь располагается под углом к ковалентной, то ее энергия выра-
жается меньшей величиной. Белковая молекула имеет два вида
водородных связей: между группами пептидных связей и между
боковыми радикалами аминокислот.
Водородные связи могут быть внутримолекулярными и межмо-
лекулярными. Целый ряд жидкостей (вода, органические кислоты,
спирты и др.) являются ассоциированными благодаря образованию
межмолекулярных водородных связей. Углерод не способен к об-
разованию водородных связей, потому что его электроотрицатель-
ность значительно меньше, чем у О или N, она довольно близка
к Н. Поэтому углеводородные цепи гидрофобны, они с трудом про-
никают в воду, так как не могут разорвать ее водородные связи.
,0
У соединений с группами —ОН, —NH2, —СООН, —хоро-
ши
шо выражена способность к образованию водородных связей, они
гидрофильны. Молекулы воды, находящейся в состоянии льда, свя-
заны друг с другом водородными связями. При этом каждые шесть
молекул образуют кольцеобразную шестичленную структуру.
В жидкой воде также, видимо, имеются льдоподобные кластеры
(группировки, ассоциации), которые непрерывно распадаются и
вновь возникают. Молекулы воды образуют водородные связи не
только между собой, но и с полярными группами растворенных
соединений. Полярность молекулы воды, способность образовы-
вать водородные связи очень важны в ее роли биологического рас-
творителя — основной среды живых клеток.
Единичные водородные связи, образованные в водном раство-
ре, очень слабы, что объясняется конкуренцией молекул воды с
молекулами растворенного вещества за образование водородных
связей. Однако если в макромолекуле существует большое число
водородных связей, возникает очень большая их суммарная проч-
84
ность. Это явление называют кооперативностью водородных свя-
зей.
Не менее важны в стабилизации структуры биополимеров и их
функционировании гидрофобные взаимодействия. Молекулы воды,
стремясь образовывать между собой водородные связи, выталкива-
ют гидрофобные группы и молекулы, находящиеся в воде, застав-
ляя их скучиваться, образовывать ассоциаты. Этот процесс идет
самопроизвольно, свободная энергия системы при этом уменьшает-
ся, так как слой воды у поверхности гидрофобных групп по срав-
нению с остальной массой воды имеют большую степень структури-
рованности, меньшую энтропию (мера неупорядоченности), а при
объединении гидрофобных групп их общая поверхность уменьшает-
ся. При этом никаких особенных связей между гидрофобными груп-
пами или молекулами не образуется (возможно только возникно-
вение ван-дер-ваальсовых сил притяжения), вследствие чего чаще
говорят о гидрофобных взаимодействиях, а не связях.
Наиболее слабые связи между молекулами обусловлены дис-
персионными силами ван-дер-ваальсова притяжения (иногда их
называют ван-дер-ваальсовыми связями). Они возникают только
на достаточно малом расстоянии между молекулами и имеют в
основе кулоновские силы электростатического притяжения. Ядра
внутри электронных оболочек атомов находятся в постоянном коле-
бательном движении, поэтому возможно временное смещение
электронных орбит относительно ядра, что ведет к образованию
диполя. Последние существуют короткое время, но оно достаточно
для возникновения согласованной ориентации между молекулами.
Следует иметь в виду, что в направлении, противоположном
дисперсионным силам притяжения, действует взаимное отталки-
вание электронных оболочек валентно-несвязанных атомов. С дру-
гой стороны, поскольку ковалентные связи между разными типа-
ми атомов приводят к асимметричному распределению валентных
электронов, большинство атомов молекулы несет парциальные
заряды. Так как суммарный заряд нейтральной молекулы равен
нулю, она может приближенно рассматриваться как набор дипо-
лей или мультиполей, между которыми возникают электростати-
ческие взаимодействия.
Для удобства вычислений обычно объединяют три перечислен-
ные невалентные силы (ван-дер-ваальсово притяжение, отталки-
вание электронных оболочек и электростатические взаимодейст-
вия) в одно силовое поле — потенциал Ван-дер-Ваальса. Такого
рода потенциалы позволяют определить возможные контактные
расстояния пар атомов — ван-дер-ваальсовы радиусы. Принято
считать, что силы ван-дер-ваальсовых взаимодействий обратно
пропорциональны шестой степени расстояния между взаимодей-
ствующими группами. Энергия этих взаимодействий находится в
пределах 4—8 кДж/моль, возможная длина таких связей — 0,33—
0,45 нм (самая большая из всех типов слабых взаимодействий).
Ван-дер-ваальсовы силы имеют большое биологическое значение,
так как они играют определенную роль в процессах самосборки
85
биологических макромолекул и структур, при взаимодействии
между белками и другими биополимерами, в стабилизации тре-
тичной и четвертичной структур биополимеров.
В результате взаимодействия резко отличающихся по свойствам
атомов (например, металлов и металлоидов) образуются ионные
связи. При этом один атом (катион) отдает электрон другому ато-
му, так что образовавшаяся пара электронов принадлежит только
ему (аниону). Наиболее легко отдают электроны атомы щелочных
металлов, максимальное сродство к электронам проявляют атомы
галогенов. В основе ионной связи лежит электростатическое вза-
имодействие. Средняя энергия ионной связи в водных растворах
составляет около 21 кДж/моль, длина колеблется в пределах
0,20—0,33 нм.
Ионные силы очень важны при взаимодействиях между молеку-
лами. Например, притяжение между группами —СОО~ и —NHa"
имеет большое значение в процессе взаимодействия между моле-
кулами белка. Катион Са2+, обладающий двойным зарядом, мо-
жет играть роль «мостика», соединяющего две карбоксильные
группы.
Существенным аспектом всех ионных взаимодействий в водных
растворах является гидратация ионов. Каждый ион в воде окружен
диполями воды, строго ориентированными по отношению к нему.
Гидратация ионов оказывает большое влияние на их взаимодей-
ствие в растворе, определяет наряду с другими факторами силу
кислот и оснований, прочность связи катионов металлов с отрица-
тельно заряженными группами и др.
Известно, что во многих случаях заряд ионизированной органи-
ческой молекулы нейтрализуется или неорганическими катионами
(Na+, К+, Mg2+ и др.), или неорганическими анионами (С1~, SO^
и др.). В водных растворах такие нейтрализующие ионы не могут
занимать фиксированное положение вследствие своей гидратиро-
ванности. Поэтому в водных растворах ионные взаимодействия с
гидратированными неорганическими ионами обычно не играют су-
щественной роли при определении конфигурации органических мо-
лекул.
Важнейшая особенность и вместе с тем достоинство перечис-
ленных слабых взаимодействий состоит в том, что их энергия (4—
30 кДж/моль) не превышает значительно кинетическую энергию
теплового движения (2,5 кДж/моль). Этого небольшого превыше-
ния вполне достаточно, чтобы при физиологических температурах
возникали относительно прочные вторичные связи между молеку-
лами. Однако поскольку разница между энергией слабых взаимо-
действий и кинетической энергией теплового движения невелика,
их разрушение и образование происходят без участия ферментов.
Так как в распределении кинетической энергии молекул наблю-
дается большой разброс, при физиологических температурах всег-
да существуют молекулы, кинетическая энергия которых достаточ-
на для разрушения слабых связей. Это придает межмолекулярным
86
взаимодействиям определенную лабильность. В противном случае
клетка имела бы жесткую структуру типа кристаллической, ско-
рость диффузии была бы очень низкой, а это несовместимо с су-
ществованием живой клетки. В частности, удивительно высокая
активность ферментативного катализа, в известной мере, связана
с тем, что фермент-субстратные комплексы образуются с участием
слабых взаимодействий, поэтому эти комплексы возникают и рас-
падаются быстро даже под влиянием беспорядочного теплового
движения.
2.4.4.	Вторичная структура. Вторичная структура — это упоря-
доченное пространственное расположение отдельных участ-
ков полипептидной цепи без учета типа и конформации боковых
радикалов аминокислот. Она образуется за счет замыкания водо-
родных связей между пептидными группами. Вторичная структура
представлена в основном такими регулярными структурами как
а-спираль, складчатые слои (^-структура), p-изгиб. Часть полипеп-
тидной цепи не имеет упорядоченного строения, такие участки на-
зывают аморфными или бесструктурными областями.
В а-спиральных участках и участках с р-складчатой структурой
все последовательно расположенные пептидные звенья полипептид-
ной цепи имеют идентичные взаимные ориентации, поскольку все
торсионные углы ф и все углы ф у Са одинаковы. В таком случае
участок полипептидной цепи имеет линейную структуру, которая
формируется из линейных групп.
Линейная группа представляет собой виток спирали, парамет-
ры которой (смещение вдоль оси, приходящееся на повторяющийся
элемент, число элементов на виток, радиус и др.) зависят от ве-
личины углов ф и ф. Спираль с числом элементов в витке менее
двух невозможна. В белках обнаружено несколько типов линейных
групп, не имеющих стерических затруднений; они стабилизированы
водородными связями либо в пределах одного участка полипептид-
ной цепи (спираль), либо между соседними участками (p-складча-
тая структура). Когда торсионные углы близки к —60, —45°,
вторичная структура представлена правыми а-спиралями. Этот тип
спирали, описанный Л. Полингом, обладает наименьшей свободной
энергией, наиболее «выгоден» с учетом ограничений, налагаемых
геометрией пептидной связи и допустимыми изменениями углов
Ф и ф.
В а-спирали все водородные связи примерно параллельны оси
спирали и коллинеарны друг другу, что отвечает минимуму свобод-
ной энергии; каждая карбонильная группа образует водородную
связь с четвертой по ходу цепи NH-группой.
О...............н
—С—(NH—CHR—СО)3—N—
При образовании а-спиралей замыкается максимально возмож-
ное число водородных связей, что придает прочность этой структу-
ре. а-Спираль характеризуется следующими параметрами: число
S7
.аминокислотных остатков на виток спирали — 3,6; число атомов в
витке, замыкаемом водородной связью, — 13; формула спирали
3,61з]; диаметр спирали —0,5 им; шаг спирали
ция одного аминокислотного остатка
остатка на оси) ~0,15 нм (рис. 2.9).
0,54 нм; трансля-
вдоль осн спирали (проекция
Рис. 2.9. Участок а-спиральной структуры
белка
В природных белках
обнаружены только пра-
вые а-спирали. Боковые
радикалы аминокислот в
а-спирали обращены на-
ружу и расположены по
разные стороны от ее оси.
Неполярные боковые ра-
дикалы аминокислот
обычно группируются на
одной стороне а-спирали,
образуя неполярные ду-
ги; это создает условия
для сближения разных
спиральных участков.
Кроме а-спирали опи-
саны и другие типы спи-
ральных структур, неко-
торые их параметры при-
ведены в табл. 2.4.
Из табл. 2.4 видно, что
кроме а-спирали в белках
обнаружены и другие
типы спиралей, например
Зю и л-спираль, которые
встречаются редко, в ос-
новном на коротких уча-
Таблица 2.4. Спиральные конфигурации белков
Название	Формула	Радиус, нм	Проекция остатка на ось, нм	Примечание
Зю	Зю	0,19	0,20	Напряженная структура, встре- чается редко в виде 1—2 вит- ков на концах а-спирали
а-Спираль	З,613	0,23	0,15	Универсальная конфигурация
и-Спираль	4,4i6	0,28	0,11	Встречается редко в виде 1—2 витков на концах а-спи- рали
1 Б последние годы вводится новая система обозначений. В соответствии
с ней запись Nm расшифровывается следующим образом: М — минимальное чис-
ло витков, на которых укладывается целое число N остатков; при такой форме
записи а-спираль обозначается как 18s.
88
стках, образуя на концах а-
спирали 1—2 витка.
Складчатые структуры по-
липептидной цепи образуются
в том случае, когда торсион-
ные углы ср и гр близки к —120,
+ 135°. Следует оговориться,
что хотя при описании вторич-
ной структуры белков складча-
тые структуры отличают от
спиральных, и те и другие фак-
тически являются спиральны-
ми; только в случае складча-
тых структур эта спираль
сильно вытянута. В складча-
тых цепях число остатков на
«виток» равно 2 (в плоском
складчатом слое) или 2,3 (в
слегка скрученном слое), про-
екция остатка на ось —
0,33 нм, радиус «спирали» —
0,1 нм. Складчатые участки
полипептидной цепи проявля-
ют кооперативные свойства,
т. е. стремятся расположиться
рядом в белковой молекуле, и
Рис. 2.10. Параллельная 0-структура
белка
формируют параллельные и антипараллельные складчатые слои,
или листы, которые укрепляются благодаря водородным связям
между складчатыми участками цепи (рис. 2.10, 2.11).
Рис. 2.11. Антипараллельная 0-структура белка
89
Антипараллельная ^-струк-
тура образуется, в том случае,
если складчатая цепь делает
поворот назад и идет вдоль са-
мой себя, т. е. в обратном на-
правлении; в месте поворота
образуется 3-изгиб (рис. 2.12).
В 3-изгиб входят четыре пос-
ледовательно расположенных
аминокислотных остатка. Па-
раллельная ^-структура скла-
дывается участками из поли-
пептидной цепи, направления
которых совпадают. Антипа-
раллельность цепей создает
наиболее благоприятные усло-
вия для возникновения водо-
родных связей между ними
при участии пептидных групп.
В случае параллельного рас-
положения цепей в структуре
складчатого 3-слоя водородные
связи между цепями менее
прочны. Боковые радикалы
аминокислотных остатков
(точнее связи Са — Ср) при-
близительно перпендикулярны
плоскости р-складчатых слоев,
причем боковые цепи аминокислот ориентированы поочередно то
по одну, то по другую сторону этол плоскости.
Складчатые слои могут образовываться не только одной поли-
пептидной цепью (при этом водородные связи будут внутри данной
цепи), но и группой близко расположенных полипептидных цепей
в молекуле (водородные связи будут замыкаться между цепями).
3-Структура второго типа характерна для таких фибриллярных
белков, как фиброин шелка, кератин волос, состоящих из несколь-
ких полипептидных цепей. У глобулярных белков в формировании
3-складчатой структуры принимает участие обычно около 15%
аминокислотных остатков полипептидной цепи. Большинство
складчатых слоев содержит менее шести цепей. Как правило,
складчатые слои не являются плоскими, для них характерна не-
большая левая закрученность.
На некоторых участках белковой цепи встречается нерегулярная
укладка аминокислотных остатков в пространстве, которая также
удерживается благодаря водородным связям и гидрофобным
взаимодействиям. Такие области в белковой молекуле называются
неупорядоченными, бесструктурными или аморфными.
Короткие а-спирали и 3-структуры формируются в различных
90
Рис. 2.13. Общий вид ле-
вой двухцепочечной су-
перспирали
по длине полипептидной цепи участках, между этими упорядочен-
ными типами структур находятся бесструктурные области.
2.4.5.	Сверхвторичная структура и домены. а-Спиральные и
p-структурные участки в белках могут взаимодействовать друг с
другом и между собой, образуя ансамбли. Пространственное строе-
ние таких ансамблей вторичной структуры
называют сверхвторичной структурой бел-
ковой молекулы. Встречающиеся в натив-
ных белках сверхвторичные структуры —
энергетически наиболее предпочтительны.
Пример сверхвторичной структуры —
суперспирализованная а-спираль, в кото-
рой две а-спирали скручены друг относи-
тельно друга, образуя левую суперспираль
(рис. 2.13). Короткие участки этой сверх-
вторичной структуры встречаются в глобу-
лярных белках (бактериородопсин, гемэ-
ритрин), а чаще и в наиболее упорядочен-
ной форме — в фибриллярных белках. Су-
перспирализация выгодна энергетически,
так как между боковыми радикалами ами-
нокислот, принадлежащих разным а-спира-
лям, образуются дополнительные некова-
лентные контакты (ван-дер-ваальсовые).
Сверхспираль могут образовывать а-спира-
ли, расположенные как параллельно, так и
антипараллельно.
Другим возможным элементом сверхвторичной структуры яв-
ляется р%р-звено (рис. 2.14), состоящее из двух параллельных
р-слоев с сочленением между
ка (рср), а-спирали (Рсф),
p-структуры (РРР). Два по-
следовательно соединенных
участка рар называются
укладкой цепи по Россману
(Рарар-звено). Этот тип
сверхвторичной структуры
найден в НАД+-связываю-
щем домене дегидрогеназ.
Сверхвторичная структу-
ра в виде антипараллельной
трехцепочечной p-структуры
(РРР) называется ^-зигза-
гом, Она довольно широко
распространена в белках,
например в стафилококко-
вой нуклеазе, лактатдегид-
рогеназе, Г4-лизоциме и ря-
де других белков.
ними в виде неупорядоченного клуб-
Рис. 2.14. Сверхвторичные структуры бел-
ков. А — 0ср-звено; Б — укладка цепи по
Россману (два последовательно соединен-
ных участка (Зсф); В — 0-зигзаг:
стрелками обозначены (3-складчатые слон, ци-
линдрами — а-спирали, аморфные области зачер-
нены
91
Следующим уровнем организации, присущим крупным глобу-
лярным белкам, являются домены, Они представляют собой струк-
турно и функционально обособленные области (субобласти) моле-
кулы, соединенные друг с другом короткими участками полипептид-
ной цепи, которые называются шарнирными участками, Функцио-
Рис. 2.15. Домены глицеральдегидфосфатдегидрогеназы
из мышц омара, А — НАД+-связываюший домен; Б —
каталитический домен.
цифрами обозначены аминокислотные остатки, остальные обо
значения те же, что в рис. 2.14
92
нальные домены могут состоять из одного или нескольких струк-
турных доменов. Вероятнее всего, функциональные домены, у кото-
рых молекулярная масса выше 20 000, содержат несколько струк-
турных доменов.
Большинство крупных глобулярных белков можно разделить
на несколько структурных доменов, содержащих 100—150 амино-
кислотных остатков и имеющих диаметр около 2,5 нм. Структурные
домены обнаружены, например, у фермента глутатионредуктазьц
катализирующего переход окисленного глутатиона в восстановлен-
ный (трипептид глу-цис-гли). Этот фермент является димером, т. е.
его молекула построена из двух полипептидных цепей — субъеди-
ниц. Каждая из субъединиц, в свою очередь, состоит из трех струк-
турных доменов, выполняющих свою определенную функцию при
действии фермента.
Для ряда ферментов показано, что в углублении между доме-
нами располагается активный центр. Так, в глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназе выделяют два функциональных домена: НАД+-свя-
зывающий и каталитический, формирующие активный центр
(рис. 2.15).
Рубредоксин
(jt-белок)
Миоглобин
('а - делок)
Триозоуроссратизомерази
[и/#-белок)
Миогемэритрин
(к-белок)
Рлаводоксин
(&/р- белок)
Рис. 2.16. Классификация глобулярных белков в соответствии с представитель-
ством и расположением в их молекулах^а- и P-структур (по Ю. Б. Филипповичу,
А — расположение а- и p-структур (обозначены кружками и прямоугольниками соответст-
венно) в а-. Р-, (а+Р)- и а/Р-белках; стрелками указан ход полипептидной цепи от N-конца
к С-концу молекулы:
JS — строение трех представителей а-. Р- и а/Р-белков; где а-структура представлена в виде
спирали, Р-структура — в виде стрелок. У миогемэритрина заштрихованными кружками по-
казаны два атома железа, у эрабутоксина пунктиром — четыре дисульфидных мостика;
у флаводоксина группировка, ответственная за передачу атомов водорода, изображена
вверху в виде трех конденсированных шестичленных колец
93
В некоторых глобулярных белках (сериновые протеиназы, им-
муноглобулины) структурные домены в молекуле очень сходны, что
наводит на мысль о дупликации генов. Сходные структурные до-
мены могут встречаться и в разных белках, например, НАД+-свя-
зывающий домен в дегидрогеназах.
Во всех глобулярных белках, состоящих из доменов, существу-
ет высокая степень сродства между близко расположенными по це-
Рис. 2.17. Укладка полипеп-
тидной цепи флаводоксина в
пространстве.
Стрелками показан ход цепи от
N-конца к С-концу в области
«твист» -структуры

пи аминокислотными остатками. На
основании этого предполагают, что
домены формируются независимо
друг от друга, что упрощает процесс
укладки макромолекул.
Структурные домены и белки по ор-
ганизации вторичной структуры поли-
пептидной цепи, т. е. по количеству а-
спиралей и p-структур, характеру их
расположения в доменах предложено
разделять на пять классов или групп
(рис. 2.16).
Первая группа (а-белки) включает
те белки, в которых преобладают а-
спирали. Сюда, в частности, относятся
гемоглобин, миоглобин, кальцийсвязы-
вающие белки.
Вторая группа (р-белки) содержит
белки, построенные в основном из ан-
типараллельных p-слоев, например
конканавалин А — лектин из канава-
лии мечевидной, рубредоксин — простейший железосерный белок,
переносчик электронов, химотрипсин.
К третьей группе принадлежат а- +р-белки, у них имеются
участки, целиком построенные из а-спиралей, и участки, целиком
состоящие из p-слоев, в основном антипараллельных. Примерами
такого типа белков являются; папаин — протеолитический фер-
мент из плодов дынного дерева, термолизин, инсулин, цитохром 65,
рибонуклеаза, лизоцим.
Четвертая группа — это а/p белки, в них а-спирали и р-струк-
туры чередуются по ходу цепи. Большинство p-структур, преиму-
щественно параллельных, оказывается локализованным в цент-
ральной части молекулы, где эти структуры изгибаются в виде
пропеллера («твист»-структуры), .образуя жесткую «основу», с
которой связаны остальные участки молекулы (рис. 2.17). К бел-
кам четвертой группы принадлежат карбоксипептидаза, гексокина-
за, фосфоглицераткиназа, триозофосфатизомераза, субтилизин,
лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа.
В пятую группу входят домены без выраженной вторичной
структуры. Пространственная структура белка значительно более
консервативна, чем его аминокислотный состав. Тип свертывания
полипептидной цепи иногда позволяет устанавливать такие род-
94
ственные связи между белками, которые не улавливаются при ами-
нокислотном анализе.
2.4.6.	Третичная структура. Третичная структура характеризует
пространственное расположение упорядоченных и аморфных участ-
ков в полипептидной цепи в целом, которое достигается за счет
взаимодействия боковых радикалов и зависит от их типа и конфор-
мации. Таким образом, третичная структура описывает простран-
ственную укладку всей молекулы белка, если она образована одной
полипептидной цепью. Третичная структура имеет прямое отноше-
ние к форме молекул белка, которая может быть различной: от
шарообразной до нитевидной. Форма белковой молекулы характе-
ризуется таким показателем, как степень асимметрии (отношение
длинной оси молекулы к короткой). К нитевидным, или фибрил-
лярным, белкам относят белки, имеющие степень асимметрии 80
и выше, это фиброин шелка, кератин волос, рогов, копыт, колла-
ген соединительной ткани и некоторые другие белки. При степени
асимметрии менее 80 белки относят к глобулярным-, большинство
из них имеет степень асимметрии 3—5. Таким образом, у глобу-
лярных белков третичная структура ' характеризуется достаточно
плотной упаковкой полипептидной цепи в виде клубкообразной мо-
лекулы, приближающейся по форме к шару.
В поддержании третичной структуры глобулярных белков, ее
закреплении принимают участие различные типы связей (рис. 2.18):
Рис. 2.18. Связи, стабилизирующие третичную структуру белковой моле-
кулы:
1— ионная связь, // — водородная связь, /// — гидрофобные взаимодействия, IV —
ковалентная связь
95
ковалентные, ионные, или солевые, водородные и гидрофобные
взаимодействия (указаны в порядке убывания энергии связи).
Преимущественную роль в формировании третичной структуры
отводят гидрофобным взаимодействиям, возникающим между не-
полярными боковыми радикалами аминокислот.
Ковалентные связи, участвующие в поддержании третичной
структуры белка, представлены дисульфидными и пептидными
связями, последние образованы за счет амино- и карбоксильных
групп боковых радикалов аминокислот. Дисульфидные связи воз-
никают между двумя близко расположенными SH-группами боко-
вых цепей цистеина. К замыканию ковалентных дисульфидных
связей (—S—S—) приводит окисление сульфгидрильных (тиоль-
ных) групп в присутствии кислорода или некоторых других реа-
гентов. In vivo эти связи образуются самопроизвольно, если тиоль-
ные группы в результате пространственной укладки полипептидной
цепи оказываются расположенными рядом, т. е. дисульфидные
связи стабилизируют конформацию молекулы, но не определяют
характер свертывания полипептидной цепи. В рибонуклеазе и ли-
зоциме, содержащих четыре дисульфидные связи, теоретически
возможно образование 44 = 256 вариантов S—S-связей, однако
реализуется в нативной конформации только четыре.
Дисульфидные связи наиболее часто встречаются в секретируе-
мых белках (змеиные яды, пептидные гормоны, пищеварительные
ферменты, белки молока и др.). Наличием большого числа дисуль-
фидных мостиков в фибриллярных белках (например, кератине),
способных к взаимному превращению с сульфгидрильными груп-
пами, т. е. к временному разрыву и образованию заново, отчасти
объясняются свойства вязкости и эластичности этих белков.
Дисульфидные мостики никогда не образуются между соседними
остатками цистеина.
Солевые, или ионные, связи возникают между группами бел-
ков, имеющими противоположные заряды, т. е. между боковыми
радикалами аминокислот, диссоциированными по кислотному и
основному типам. В качестве основных групп могут выступать
з-аминогруппа лиз, гуанидиновая группа арг, имидазольная группа
гис (один из его атомов азота обладает основными свойствами,
другой — кислотными). Помимо гистидина кислотными группами
в белках могут быть p-карбоксильная группа асп и у-карбоксиль-
ная — злу.
Группы, способные к ионизации, и полярные группы аминокис-
лот (см. разд. 2.3.3) обычно находятся на поверхности белковой
глобулы и реже встречаются внутри. Так, на поверхности химо-
трипсина расположены 4 остатка аре и 14 лиз, которые обусловли-
вают суммарный заряд 18 ( + ), а также? остатковасп и 5 глу, оп-
ределяющие суммарный заряд 12 (—). Заряженные группы на по-
верхности белковой глобулы обычно сольватированы и окружены
противоионами, что увеличивает растворимость белков в водной сре-
де. Полярные боковые радикалы аминокислот, находящиеся внутри
96
белковой молекулы, обычно образует водородные связи между
собой или с полипептидным остовом.
Нахождение заряженных групп внутри глобулы энергетически
невыгодно, поэтому они там встречаются редко. Если все-таки за-
ряженные группы локализуются внутри глобулы, то они образуют
солевые мостики.
Гидрофобные боковые радикалы, не имеющие сродства к воде,
оказываются компактно упакованными, в основном, внутри гло-
булы, образуя гидрофобные области, стабилизирующие третичную
структуру молекулы. В связи с этим диэлектрическая проницае-
мость (е ) внутри белковой глобулы значительно меньше, чем у
воды. Гидрофобные области (ядра) в центре белковой глобулы
имеют высокую плотность упаковки, характерную для многих
кристаллов. Более низкая плотность упаковки получена для по-
верхностных участков молекулы, например, активных центров фер-
ментов, что согласуется с предположением о подвижности центров.
В среднем плотность упаковки белковой молекулы тоже достаточ-
но высока, что свидетельствует об эффективном использовании не-
ковалентных сил при организации пространственной структуры
белковой молекулы. Небольшая часть неполярных радикалов мо-
жет находиться на поверхности молекулы, и, скапливаясь, образо-
вывать гидрофобные кластеры. Таким образом, в целом поверхность
белковой глобулы мозаична: в основном гидрофильна, но содержит
и небольшие неполярные участки.
Только после приобретения белком нативной третичной струк-
туры он проявляет свою специфическую функциональную актив-
ность. Пространственной структурой белка и взаимным располо-
жением отдельных групп определяются биологические функции
белковой молекулы в организме. Активные центры ферментов,
центры, связывающие лиганды, ответственные за встраивание дан-
ного белка в мультиферментный комплекс и самосборку надмоле-
кулярных структур, а также антигенные детерминанты белка об-
разуются из пространственно сближенных групп при формирова-
нии третичной структуры. Например, сходная биологическая функ-
ция гемоглобина и миоглобина, обусловленная их способностью
обратимо связывать кислород, объясняется сходством третичной
структуры их полипептидных цепей. Активные центры у мономер-
ных ферментов формируются в процессе свертывания полипептид-
ной цепи, причем у мультидоменных ферментов активные центры
включают участки всех структурных доменов данного глобулярно-
го белка, в результате чего активный центр оказывается распо-
ложенным между ними.
Фибриллярные белки выполняют в организме, в основном,
структурную функцию. Это плохо растворимые или нерастворимые
белки, отличающиеся высоким содержанием неполярных амино-
кислот. К ним принадлежат, например, белки соединительных и
сократительных тканей, волос, кожи, некоторые белки клеточных
оболочек растений, водорослей и ряд других белков. Молекулы фиб-
риллярных белков построены чаще всего из нескольких полипеп-
4—937
97
тидных нитей, имеющих структуру а-спирали (а-кератины, мио-
зин), р-складчатых слоев (p-кератины, фиброин) или скрученных
в особый вид спирали (коллагены).
Образование полипептидными нитями длинных, вытянутых по
форме молекул и будет в целом характеризовать третичную
структуру фибриллярных белков. Коллаген входит в состав соеди-
нительной ткани животных и человека, где образует так называе-
мые нити или коллагеновые волокна. Они построены из фибрилл,
структурной единицей которых, в свою очередь, является тропо-
коллаген.
Молекула тропоколлагена (М 300 000) состоит из трех поли-
пептидных нитей, каждая из которых скручена в плотную левую
спираль с тремя аминокислотными остатками в витке. Три цепи
вместе слегка закручены в правую спираль и образуют молекулу
тропоколлагена диаметром 1,5 нм и длиной 300 нм. Взаимораспо-
ложение пептидных цепей в молекуле стабилизируется водородны-
ми связями между пептидными группами соседних цепей и кова-
лентными связями между лизином, гидроксилизином, аллизином
и гидроксиаллизином (последние две аминокислоты образуются в
результате окисления 8-NH2-rpynn до альдегидных). При взаимо-
действии указанных аминокислотных остатков получаются шиффо-
вы основания и альдоли.
Для тропоколлагена характерно высокое содержание глицина
(7з аминокислотных остатков) и иминокислот (пролин, гидрокси-
пролин — 21%); в большом количестве встречается аланин (11%).
В составе коллагенов в небольшом количестве обнаружен 5-гидр-
оксилизин, редко встречающийся в других белках. Описано не-
сколько типов коллагенов, отличающихся друг от друга набором
полипептидных цепей, аминокислотным составом. Например, трой-
ная спираль коллагена большинства позвоночных состоит из двух
агцепей и гомологичной аз-цепи, щ- и а2-Цепи имеют небольшие
отличия в аминокислотном составе. Фибриллы коллагена образуют-
ся из молекул тропоколлагена при их соединении «конец к концу»
и «бок о бок». В кипящей воде коллаген частично растворяется,
образуя раствор желатины, который при охлаждении переходит в
гель.	. '
Белки волос, рогов, кожи, перьев (а-кератины) состоят из 3—7
полипептидных цепей, включающих приблизительно 100 аминокис-
лотных остатков и имеющих a-спиральную конфигурацию. Поли-
пептидные цепи, связанные дисульфидными мостиками, скручива-
ясь вместе, образуют левую суперспираль; из суперспиральных
структур формируются микрофибриллы диаметром около 2 нм.
При обработке a-кератинов горячим паром нарушается система
внутрицепочечных водородных связей в каждой полипептидной
нити, и при их растягивании они переходят в состояние р-склад-
чатых слоев (fi-кератин). В p-кератине водородные связи образу-
ются между отдельными полипептидными нитями. Повторяющей-
ся единицей кератинов является последовательность: — цис —
цис — глу — про — сер —.
98
Сходную с p-кератином пространственную структуру имеет
фиброин шелка. Этот белок богат глицином, серином и аланином.
В фиброине соседние цепи антипараллельны: С- и N-концы у них
не совпадают; S—S-связи между цепями отсутствуют. Фиброин
шелка состоит, в основном, из следующей периодически повторяю^
щейся последовательности:—гли—сер—ели—ала—гли—ала—. При
образовании складчатой структуры все боковые группы ала и сер
оказываются по одну сторону цепи, а гли — по другую. Структура,
сходная с а-кератином, лежит в основе мышечных белков миозина
и тропомиозина.
Волокнистый фибриллярный белок обнаружен в опорных струк-
турах у диатомовых водорослей, он наряду с SiO2 принимает
участие в образовании скелета диатомей. Этот белок помимо гидр-
оксипролина содержит дигидроксипролин, а также e-N-триметил-
гидроксилизин и некоторые другие редкие аминокислоты. В опор-
ных белках кораллов, губок, медуз обнаружены бромтирозин, иод-
тирозин. В состав первичной клеточной стенки высших растений
входит фибриллярный белок экстенсии, очень богатый гидрокси-’
пролином (до 33%). Экстенсии существует в виде жестко закручен^
ной левой спирали. Этот белок связан с гемицеллюлозой клеточ-
ных стенок за счет гликозидной связи между арабинозой или га-
лактозой и гидроксипролином.
В наружном скелете насекомых обнаружен белок ресилин, бо-
гатый гли и ала. Он не содержит гидроксипролина и серосодержа-
щих аминокислот, чем напоминает фиброин шелка.
Наиболее информативным методом изучения пространственной
структуры белковых молекул (вторичной, сверхвторичной, третич-
ной) является метод рентгеноструктурного анализа (РСА). С его
помощью устанавливают распределение электронной плотности в
кристалле и тем самым пространственное строение молекул, обра-
зующих кристалл. Результаты исследования белков методом РСА
позволяют построить пространственную модель молекулы: опреде-
лить расположение полипептидной цепи в пространстве, найти
участки, образующие регулярные структуры, изгибы цепи и др.,
выявить пространственное расположение аминокислотных остат-
ков и контакт их с другими остатками, места присоединения не-
белковых частей (в случае сложных белков, двухкомпонентных
ферментов). Сведения о наличии упорядоченных структур в белке,
их типе и общей доле в цепи, конформационных изменениях бел-
ков в растворах дают оптические методы — ДОВ, КД, ИК-спектро-
скопии и др., а также метод ядерного магнитного резонанса
(ЯМР).
В настоящее время применяют расчетные, теоретические мето-
ды для определения характера укладки полипептидной цепи на
основе данных о первичной структуре. Это направление работ ши-
роко представлено в Институте белка АН СССР.
2.4.7	Четвертичная структура. Четвертичную структуру имеют
те белки, молекула которых состоит из двух и более полипептид-
ных цепей, связанных нековалентно. Четвертичная структура ха-
4*	99
рактерна, как правило, для белков, относительная молекулярная
масса которых больше 50 000—100 000. Белки, имеющие четвертич-
ную структуру, называются олигомерными.
Под четвертичной структурой понимают способ взаимного рас-
положения в пространстве отдельных полипептидных цепей в мо-
лекуле, характер связей между ними. Каждая отдельная полипеп-
тидная цепь в составе молекулы белка с четвертичной структурой
называется протомером или субъединицей. Термин субъединица
некоторые авторы используют только по отношению к части моле-
кулы, обладающей функциональной активностью. Она может быть
представлена как одним протомером, так и несколькими. К белкам
с четвертичной структурой относят иногда и сложные надмолеку-
лярные белковые структуры, в которых объединяются до не-
скольких сотен субъединиц, например, жгутики бактерий, головки
вирусов и т. д. Такие белки предлагают также называть мульти-
мерными. Объединение протомеров в любом неопределенном коли-
честве, не ведущее к появлению новых биологических свойств
белка, называют в отличие от четвертичной структуры агрегиро-
ванным состоянием.
Большинство внутриклеточных белков является олигомерными,
внеклеточные белки — мономеры с небольшой молекулярной мас-
сой, белки плазмы крови — крупные мономеры. Такая взаимо-
связь в строении и локализации белков, очевидно, не случайна.
Мономерность внеклеточных белков, например ферментов пище-
варительного тракта, лизоцима слюны, связывается с неопределен-
ностью судьбы молекул и, как следствие, целесообразностью су-
ществования большого числа независимых единиц. Большая мо-
лекулярная масса белков — мономеров плазмы крови (>60 000) —
препятствует их фильтрации и выделению почками, легкому про-
никновению во внешнее пространство. Примером такого белка
служит сывороточный альбумин, содержащий несколько функцио-
нальных доменов.
Присутствие большого числа различных олигомерных белков
внутри клетки снижает осмотическое давление в ней, вязкость,
кроме того, олигомерные белки хорошо регулируются эффектора-
ми (см. разд. 12.5). Биологический смысл олигомерности белков
связан также с тем, что для их кодирования требуется меньше ге-
нетического материала в том случае, если все или некоторые
субъединицы белковой молекулы идентичны. У таких олигомеров
существует меньшая вероятность возникновения дефектных моле-
кул, чем у крупных мономеров с той же молекулярной массой.
Дефектные субъединицы в процессе диссоциации и реассоциации
устраняются. Наиболее часто в олигомерной белковой молекуле
насчитывается две или четыре субъединицы, реже 6, 8 и больше
или нечетное число. Взаимное расположение отдельных субъеди-
ниц в молекулах белков с четвертичной структурой, а также в
надмолекулярных белковых структурах может быть различным,
оно зависит от формы субъединиц, их числа и отвечает минимуму
свободной энергии. Различают изологические и гетерологические
100
случаях обра-
одних
в
Б
субъ-
Рис.
А
2.19. Гетерологическое связывание
единиц. А — кольцо; Б — спираль
при-
взаимодействия между субъединицами в макромолекуле. В случае
гетерологического взаимодействия каждая из субъединиц одного
типа имеет взаимно комплементарные участки а и & (рис. 2.19).
При соединении двух таких субъединиц у одной остается свобод-
ный участок а, а у другой — Ь. К этим участкам могут присоеди-
няться аналогичные субъединицы, причем в
зуются длинные цепи, в
других — кольцо или спи-
раль. Кольца, образован-
ные только за счет гете-
рологических взаимодей-
ствий обладают цикличе-
ской симметрией: при по-
вороте вокруг оси сим-
метрии на определенный
угол каждая субъедини-
ца может быть совмеще-
на со следующей. В за-
висимости от геометрии
субъединиц их число в
кольце может быть различным.
Если углы, возникающие между двумя субъединицами, не
водят к замыканию кольца, образуется спираль. В этом случае
кроме гетерологических контактов типа ab могут возникать допол-
нительные взаимодействия при наличии других комплементарных
участков. Спиральные структуры разных типов из белковых субъ-
единиц представляют собой нити актина мышечного волокна, ви-
рионы некоторых вирусов, жгутики бактерий и др.
Если две одинаковые субъединицы белка образуют пару идеи- У
тичных связей типа ab, такое взаимодействие называется изологи-
ческим (рис. 2.20). Подобная структура обладает осью симметрии
второго порядка, т. е. каждая точка одной субъединицы может
быть совмещена с такой же точкой другой субъединицы при пово-
роте вокруг оси симметрии на 360°/2=180°. При наложении двух
изологических димеров друг на друга между ними могут возникать
дополнительные изологические связи, при этом образуются тетра-
мерные структуры с диэдрической симметрией. Примерами таких
структур могут быть фермент лактатдегидрогеназа и растительный
агглютинин конканавалин А.
В крупных белковых структурах существуют два типа контак-
тов — гетерологические и изологические. При этом обычно возни-
кают олигомеры разных форм с кубической симметрией (много-
гранники типа тетраэдра куба, икосаэдра). Структуры с кубиче-
ской симметрией обладают более чем одной осью симметрии, по-
рядок которой выше двух. Кубическая симметрия характерна
для капсид некоторых вирионов — бактериофаг фХ174, вирус
SV40, папилломы человека, аденовирусы, вирус гриппа и т. д.
Четвертичная структура многих белков и надмолекулярных
белковых структур формируется из протомеров двух или болыпе-
101
Рис. 2.20.
Изологическое связывание
субъединиц (объяснение см. в тексте)
го числа типов. Так, гемоглобин — тетрамер, построенный из двух
похожих, но неидентичных субъединиц аир (агРг), фермент acnap-
тат-карбомоилтрансфераза из 12 субъединиц (два тримера — ка-
талитические субъединицы и три димера — регуляторные субъеди-
ницы). Чехлы некоторых вирусов также построены из протомеров
двух и большего числа типов. Для структур, сформированных из
неидентичных субъединиц, тоже характерно симметричное их рас-
положение.
Между субъединицами, составляющими молекулу белка с чет-
вертичной структурой, могут возникать связи различных типов:
гидрофобные взаимодействия, ионные и водородные связи. Кон-
тактные поверхности субъединиц, формирующих четвертичную
структуру, комплементарны, что вносит свой вклад в упрочение мо-
лекул белка. Специфичность ассоциации достигается комплемен-
тарностью профилей контактных поверхностей, а также оптималь-
ным взаиморасположением доноров и акцепторов водородных свя-
зей и заряженных остатков. Однако основными связями, закреп-
ляющими четвертичную структуру, являются гидрофобные. Име-
ются гидрофобные участки («липкие» пятна) на контактирующих
поверхностях протомеров, которые мешают воде образовывать
межмолекулярные связи, иммобилизуют ее. В соответствии со
вторым законом термодинамики стремление системы, содержащей
молекулы воды, к максимальной энтропии, когда между молеку-
лами есть водородные связи, заставляет протомеры так сблизить-
ся, чтобы между ними не было воды. Гидрофобные участки «сли-
паются», комплементарная электрозаряженность отдельных точек
102
усиливает скрепление протомеров, субъединиц. Поскольку отдель-
ные протомеры в молекуле связаны нековалентно, вполне законо-
мерен вопрос — одна ли это молекула. Так как все протомеры
четвертичной структуры прочно связаны друг с другом (пусть не-
ковалентно) и только будучи объединенными выполняют возни-
кающую при этом биологическую функцию, всю систему следует
считать одной молекулой.
Одним из методов анализа четвертичной структуры является
электронная микроскопия} этот метод может дать полезную ин-
формацию, если белок достаточно велик, имеет молекулярную мас-
су более 200 000.
Заключение о наличии четвертичной структуры можно-сделать
и на основе определения молекулярных масс в различных услови-
ях: близких к нативным и в присутствии денатурирующих хими-
ческих агентов, диссоциирующих молекулу на отдельные протоме-
ры (гуанидингидрохлорид, додецилсульфат натрия, мочевина^
нейтральные соли в высоких концентрациях). Если в обоих случа-
ях получают одно и то же значение молекулярной массы, то белок
не имеет четвертичной структуры и построен из одной полипептид-
ной цепи.
В том случае, когда белок является олигомером, построенным
из одинаковых по величине субъединиц, получающаяся в присут-
ствии химических агентов молекулярная масса должна быть крат-
на таковой нативной молекулы белка. Например, если белок со-
держит два протомера, то молекулярная масса после денатурации
равняется половине нативной и т. д. Присутствие в белке субъеди-
ниц различных размеров устанавливается с помощью электрофоре-
за в полиакриламидном геле или гель-фильтрацией на колонке с
молекулярными ситами, например сефадексами. В таком случае
обработка олигомерных белков додецилсульфатом натрия при-
водит к диссоциации молекул на субъединицы и появлению двух
и более фракций, отличающихся от исходной по величине молеку-
лярной массы.
Четвертичной структуре принадлежит большая роль в регуля-
ции биологической активности белков, ибо она очень чувствитель-
на к внешним условиям: небольшие их отклонения могут вызывать
изменение взаиморасположения субъединиц и в связи с этим из-
менение биологической активности белка. Это явление представля-
ет собой один из основных механизмов регуляции метаболизма, по-
скольку многие ферменты и некоторые другие метаболически ак-
тивные белки имеют четвертичную структуру.
2.4.8.	Взаимосвязь отдельных уровней структуры, упорядочен-
ность и относительная динамичность белковой молекулы. Подроб-
ное изучение строения глобулярных и фибриллярных белков пока-
зало, что для каждого индивидуального белка характерна своя про-
странственная структура — конформация: В ее формировании ве-
дущая роль принадлежит первичной структуре, т. е. генетически
детерминируемой аминокислотной, последовательности. Об этом
свидетельствует, в частности, способность полипептидных цепей к
103
самопроизвольной укладке в пространстве с образованием той
конформации, которая соответствует первичной структуре данного
полипептида.
Предложена классификация аминокислотных остатков по их
способности к образованию тех или иных регулярных структур.
Образованию а-спирали способствуют такие аминокислоты, как
глу, ала, лей, в то время как мет, вал, иле чаще встречаются в
составе (3-структуры, а гли, про, асн — в местах изгиба цепи (они
дестабилизируют а-спираль). В том случае, если на каком-то
участке оказываются рядом по ходу цепи несколько остатков, спо-
собствующих образованию спирали, имеет место формирование
этой структуры. Считается, что шесть сгруппированных остатков,
четыре из которых способствуют образованию спирали, можно рас-
сматривать как центр спирализации. От этого центра идет рост
спиралей в обоих направлениях до участка — тетрапептида, со-
стоящего из остатков, которые препятствуют образованию этих
спиралей. При формировании p-слоя роль затравок выполняют три
аминокислотных остатка из пяти, способствующие образованию
р-структуры.
Подтверждением положения о ведущей роли первичной струк-
туры при образовании нативной конформации являются также
опыты по ренатурации белков. Устранение денатурирующих воз-
действий приводит в ряде случаев к самопроизвольной ренатура-
ции, результатом чего является восстановление нативной конфор-
мации и специфической биологической функции. Так. К. Б. Анфин-
сену (1975) удалось подобрать условия ренатурации РНКазы, при
которых она может после денатурации возвращаться к исходному
нативному состоянию.
Первичная структура субъединиц белков определяет и их чет-
вертичную структуру, что доказывается данными рентгенострук-
турного анализа и фактами реконструкции биологически активных
белков из диссоциированных субъединиц. Так в ацетоне при кислом
pH происходит денатурация глобиновой части гемоглобина, отде-
ление гема и диссоциация на субъединицы. Нейтрализация pH
приводит к объединению гема с глобином и ассоциации субъединиц
с образованием нативного гемоглобина.
Предполагают, что первичная структура белков определяет не
только их конформацию, но и пути, порядок ее достижения. В мо-
лекуле белка, видимо, есть достаточно автономные «узлы», «бло-
ки», которые осуществляют укладку своей конформации незави-
симо друг от друга. Такими «блоками» могут быть те а-спирали и
p-структуры, которым свойственна высокая степень сродства к
близким с ними по цепи остаткам аминокислот. Это облегчает
процесс укладки белковой цепи в пространстве и увеличивает его
скорость. В процессе формирования пространственной структуры
белка наблюдаются и промежуточные состояния, не входящие в
нативную конформацию. Укладка белков, имеющих дисульфидные
связи, происходит значительно медленнее по сравнению с белками,
лишенными S—S-связей. Структурные блоки затем укладываются
104
в 2—3 больших домена, а последние объединяются, «досворачи-
ваются» до целой молекулы. В заключение следует, однако, от-
метить, что последовательность чередования аминокислот явля-
ется основным, решающим фактором в образовании конформации
белковой молекулы, но не единственным; некоторое влияние ока-
зывают и другие факторы ограничения, корректировки. Так, обра-
зование вторичной структуры в каком-либо участке полипептидной
цепи зависит не только от его аминокислотной последовательности,
но и от влияния других участков, удаленных от данного.
Специфическая конформация полипептидной цепи начинает
формироваться еще во время синтеза белка на рибосоме. Это до-
казано опытами с рибосомами, которые выделяли с синтезируемы-
ми на них молекулами фермента. Хотя рибосомы выделяли до
завершения синтеза фермента, молекулы которого были еще
связаны с рибосомой, каталитическая активность фермента уже
обнаруживалась, что возможно лишь при почти окончательном
сформировании третичной структуры. Полностью организация на-
тивной структуры завершается по окончании синтеза полипептид-
ной цепи и посттрансляционной модификации последней при учас-
тии различных ферментов, а в случае олигомерных белков — ор-
ганизации четвертичной структуры. Складывающаяся уникальная
структура белковой молекулы очень специфично приспособлена к
выполнению белком определенной биологической функции в клет-
ке: каталитической, гормональной, транспортной и т. д.
Нативные конформации белков отобраны в процессе эволюции
и представляют собой наиболее энергетически выгодные состояния,
обладающие наименьшей свободной энергией. Такие относительно
стабильные пространственные структуры молекул обусловливают
специфические биологические функции белка. Нативные белковые
молекулы с определенной трехмерной структурой имеют большую
степень упорядоченности по сравнению с развернутой полипептид-
ной нитью и, следовательно, должны характеризоваться более
низкой энтропией, чем неупорядоченные белковые структуры. Ис-
ходя из этого можно было бы ожидать, что термодинамически
более выгодным должен являться процесс образования неупорядо-
ченной белковой структуры из упорядоченной. Однако поскольку
белки всегда находятся в клетке в водном окружении, то должна
рассматриваться не изолированная белковая система, а система
белок + вода. В том случае, когда белок имеет упорядоченную
трехмерную структуру, для воды характерна максимальная энтро-
пия, и в целом энтропия системы (белок + вода) при формирова-
нии третичной структуры белка либо остается постоянной, либо
возрастает. Именно поэтому возможно самопроизвольное образо-
вание упорядоченных структур со специфической биологической
функцией. При образовании четвертичной структуры белков в
результате ассоциации субъединиц действуют те же законы, что и
при свертывании индивидуальной полипептидной цепи в процессе
формирования ее нативной конформации.
Однако упорядоченность пространственной структуры белков
105
является не статичной, а динамичной. Значительной свободой дви-
жения обладают, например, боковые радикалы аминокислот, рас-
положенные на поверхности молекулы. В белковых макромолеку-
лах спонтанно и обратимо происходят различные конформацион-
ные переходы, в результате чего каждому макросостоянию белка
соответствует много микросостояний. Последние обусловлены как
мелкомасштабными тепловыми движениями групп около положения
равновесия, так и локальными трансконформациями, движениями
доменов. В физиологических условиях доминируют мелкомасштаб-
ные тепловые движения и среднемасштабные локальные транскон-
формации. Их вероятность зависит от различных функциональных
воздействий на белок, хотя его статистическая макроконформация
может при этом меняться крайне мало.
В процессе функционирования белковые молекулы претерпе-
вают небольшие конформационные изменения (флуктуации). Та-
кие флуктуации наблюдаются, например, при соединении белковой
части ферментативной молекулы с коферментом при образовании
фермент-субстратного комплекса. Б. Ф. Поглазовым (1967) об-
наружено, что сокращение хвостового чехла бактериофага Т4 со-
провождается сильным (до 50% от общего содержания) уменьше-
нием числа а-спиралей белков чехла и эквивалентным нарастанием
(3-структур.
На конформацию белков существенное влияние оказывают ус-
ловия среды (pH, ионный состав, температура и др.). Изменение
параметров среды приводит к перезарядке отдельных точек белко-
вой молекулы, перестройке системы ионных, водородных связей и
гидрофобных взаимодействий между боковыми радикалами ами-
нокислот, т. е. к изменению конформации белка и его биологи-
ческой активности.
2.4.9.	Самоорганизация надмолекулярных белковых структур.
Та информация, которая содержится в аминокислотной после-
довательности, реализуется и при так называемой самоорганиза-
ции (или самосборке) надмолекулярных структур, протекающих
без участия матрицы и генетического контроля. Под самосборкой
понимают наряду с самоорганизацией третичной структуры, спо-
собность белковых молекул к спонтанной и упорядоченной ассо-
циации между собой и с другими биополимерами, приводящей к
образованию биологически активных структур.
Одной из первых in vitro была осуществлена самосборка-рекон-
струкция вируса табачной мозаики (ВТМ) в 1955 г. У этого виру-
са, имеющего цилиндрическую форму, спираль РНК образует как
бы ось, вокруг которой располагаются более 2000 субъединиц бел-
ка. Защелачивание среды или обработка детергентами приводит к
диссоциации такой белковой оболочки до отдельных субъединиц —
полипептидов. При закислении раствора происходит самосборка
вирусных частиц, реассоциация белковых субъединиц вокруг
РНК. Такие частицы сохраняют инфекционность, что свидетельст-
вует об их сходстве с исходным нативным вирусом. Это подтвер-
дило и сравнение физических свойств.
106
В дальнейшем аналогичная искусственная сборка биологиче-
ских структур из субъединиц была осуществлена с отростком
бактериофага Т4, мембранными структурами, микротрубочками и
другими объектами. Сборка отростка фага Т4 начинается с обра-
зования из специальных белков «втулки», являющейся центром
базальной пластинки. Затем вокруг «втулки» собираются другйе
белки, формируя шестиугольную базальную пластинку (рис. 2.21).
Активирование базальной пластинки в результате присоединения
Рис. 2.21. Последовательные стадии процесса сборки отростка бактерио-
фага Т4\
а —базальная пластинка с шипами,. б — стержень, в — субъединицы чехла
специфических белков приводит к началу сборки из структурных
единиц стержня, а затем и чехла отростка. На следующем этапе
к отростку подходят белки головки фага, происходит ее формиро-
вание, и далее прикрепляются к базальной пластинке готовые нити
отростка. Микротрубочки — элементы цитоплазмы, участвующие
в ее движении, внутриклеточном транспорте, формируются из мо-
лекул глобулярного гликопротеина (тубулин), укладывающихся з
спираль. Процесс самосборки микротрубочек инициируется акти-
вацией белка за счет энергии ГТФ. Сборка и разборка этих струк-
тур, постоянно происходящие в клетке, регулируются внутрикле-
точной концентрацией ионов кальция.
Формирование мембран происходит также в результате само-
сборки ее компонентов: белков, липидов, углеводов и др. Для об-
разования мембраны, различных органелл клетки не нужен гене-
тический код, органеллы возникают в результате взаимодействия
молекул определенной химической структуры. Эта концепция до-
казывается многочисленными опытами. Например, добавление з
суспензию мембранных фосфоглицеридов интегрального белка
приводит к образованию пузырьков, в которых все молекулы белка
погружены в липид и определенным образом ориентированы.
Большие и интересные исследования по самосборке жгутиков
бактерий проведены Б. Ф. Поглазовым (1967). В опытах А. С. Спи-
рина (1968) была осуществлена «разборка» рибосом (с помощью
высоких концентраций CsCl и других хлоридов одновалентных
катионов), а затем их самосборка (при. высокой концентрации
Mg2+ и нагревании до 37°С).
10?
Образование комплексов фермент-субстрат, антиген-антитело
также можно рассматривать как проявление самосборки, самоор-
ганизации.
При самосборке надмолекулярных структур аналогично обра-
зованию нативной конформации белков система стремится к со-
стоянию с минимальной свободной энергией и максимальной энтро-
пией. Окружающая вода повышает свою энтропию на величину,
достаточную для компенсации снижения энтропии, обусловленной
ассоциацией молекул при самосборке.
В процессе агрегации биомолекул большая роль отводится ион-
ным взаимодействиям как наиболее дальнодействующим (до
0,7 нм) и включающимся в первую очередь. Затем между молеку-
лами возникают более короткодействующие (на расстоянии до
0,2 нм) связи: водородные, гидрофобные, ван-дер-ваальсовы. Для
того чтобы эти силы могли возникать и действовать, необходимо
прежде всего стерическое, пространственное соответствие (компле-
ментарность) взаимодействующих поверхностей. Иначе говоря,
должна существовать возможность сближения этих поверхностей
на короткое расстояние, при котором возможно образование пере-
численных связей. Необходима также комплементарность по рас-
пределению зарядов противоположного знака (для возникновения
электростатических сил), гидрофобных областей и групп, способ-
ных к образованию водородных связей. Таким образом, в процессе
самосборки важнейшую роль играет явление «узнавания», нали-
чие стерической и химической комплементарности.
Самосборку можно рассматривать как простейший этап биоло-
гического морфогенеза на молекулярном уровне. При формирова-
нии элементарных биологических структур самосборка является,
по существу, единственной основой процесса (при содействии ряда
второстепенных моментов). Более сложные биологические обра-
зования требуют уже дополнительного участия ряда регулирующих
и корректирующих факторов. Можно предполагать, что особенно
большое значение самосборка биологических структур имела на
заре возникновения жизни, при переходе от неживой материи к
живой.
2.5 Классификация, характеристика,
представители
Все белки принято делить на две группы: простые, или протеи-
ны (состоят только из аминокислот), и сложные1 (в их молекуле
помимо белковой части содержится и небелковая, простетическая
часть). Внутри каждой из этих групп существует деление на под-
группы. Простые белки подразделяют в соответствии с их раствори-
1 Длительное время все сложные белки называли протеидами (хромопро-
теиды, липопротеиды, нуклеопротеиды и т. д.). В последние годы все более
общепринятыми становятся названия сложных белков с окончанием — ины (хро-
мопротеины, липопротеины, нуклеопротеины и т. д.). Объясняется это в основ-
ном тем, что термин протеиды означает белковоподобные вещества.
108
мостью в различных веществах, а сложные белки классифицируют
по химизму небелковой части молекулы. Следует сразу заметить, что
классификация простых белков весьма условна и несовершенна, так
как основана на сравнении относительно несущественных признаков.
Многие белки, ранее отнесенные в группу простых белков (на-
пример, глобулины крови), по результатам исследований строения
их молекул оказались двухкомпонентными. В природе в свободном
виде существуют также пептиды, молекулы которых содержат,
как указывалось ранее, не более 50 аминокислотных остатков.
2.5.1.	Природные пептиды. В живых организмах обнаружено
несколько сотен свободных пептидов. К ним принадлежат некото-
рые гормоны, токсины, антибиотики, нейропептиды, а также ряд
других биологически активных веществ.
Глутатион (у-глутаминилцистеинилглицин, глу-цис-гли, G-SH).
НООС—СН—СН2—СН2—СО—NH—СН—CO-NH—СНа—СООН
nh2	сн2
I
SH
Обнаружен в клетках животных и человека (особенно его много в
мозге, хрусталике глаза), бактериях, дрожжах, грибах, зеленых
растениях. Принимает активное участие в окислительно-восстано-
вительных процессах:
— 2Н
2G-SH	G—S—S—а
+2Н
Основная функция глутатиона в клетках заключается в защите
сульфгидрильных групп белков от окисления. Он служит также
коферментом в ряде ферментативных реакций (см. разд. 3.4.3).
У животных и человека глутатион принимает участие в разложе-
нии Н2О2, образующегося в эритроцитах в результате обменных
процессов или аутоокисления лекарственных препаратов. Он
участвует в детоксикации ряда чужеродных для живой клетки
соединений (галогенсодержащие алифатические или ароматические
углеводороды), переводя их в водорастворимую, способную к вы-
делению почками, форму.
Грамицидин S — антибиотик, активно синтезируется бактерия-
ми Вас. brevis, по своему химизму является циклическим декапеп-
тидом, в составе которого, кроме белковых аминокислот, есть орни-
тин (орн):
109
Пептидные антибиотики типа грамицидинов являются ионофора-
ми, они действуют на биологические мембраны, образуя комплек-
сы с ионами металлов, чем нарушают регуляцию ионной прони-
цаемости в мембранах бактерий.
Аманитины— токсичные октапептиды ядовитых грибов рода
Amanita. Типичным представителем аманитинов является а-ама-
нитин. Он блокирует синтез белка в клетке эукариот на стадии
транскрипции. Замена в молекуле а-аманитина диоксиизолейцина
на лейцин приводит к образованию нетоксичного соединения.
В этих же грибах содержится ряд токсичных гептапептидов —
фаллоидинов, имеющих сходное с аманитинами строение (бицик-
лическое). Фаллоидины необратимо поражают печень млекопитаю-
щих. Роль противоядия фаллоидинам выполняет циклический де-
капептид — антаманид, содержащийся в тех же грибах, что и ток-
син. Он уплотняет мембраны клеток печени и понижает их прони-
цаемость по отношению к токсинам. Антаманид является ионофо-
ром, связывающим Na+ или Са2+, сорбированные на поверхности
мембраны, и тем самым покрывает определенные участки мембра-
ны, уплотняя ее и меняя ее свойства, в частности, проницаемость.
В Amanita muscaria обнаружен другой токсичный для человека
пептид — мускарин.
Известно большое число гормонов пептидной природы. Они
рассматриваются в гл. 12.
К свободным пептидам принадлежат каллидин и брадикинин
плазмы крови, относящийся к кининам. Они повышают проницае-
мость капилляров, обладают мощным сосудорасширяющим дей-
ствием, являются сильнейшими возбудителями болевых ощущений.
Оба эти пептида образуются из общего предшественника кинино-
гена в результате протеолитического расщепления. Брадикинин —
линейный нонапептид: арг— про — про — гли — фен — сер —
— про — фен — арг; каллидин отличается от него наличием еще од-
ного аминокислотного остатка (лиз) на N-конце. Инактивируются
пептиды в результате отщепления С-концевого аргинина при учас-
тии карбоксипептидазы В.
Опиоидные пептиды (эндопиоиды) — группа нейропептидов,
оказывающих модулирующее влияние на передачу нервных им-
пульсов в ряде отделов центральной нервной системы (ЦНС). Эти
пептиды взаимодействуют с теми же рецепторами, что и опиатные
соединения (например, морфин), и близки к ним по своему дей-
ствию.
Наибольшее количество рецепторов связывания эндопиоидов
обнаружено в таламусе, гипоталамусе, нейрогипофизе и ряде дру-
гих отделов ЦНС. Рецепторы опиоидных пептидов находятся и в
периферической нервной системе. Эндопиоиды принимают участие
в регуляции процессов, связанных с восприятием боли, влиянием
гормонов на обмен веществ, воздействуют на сердечно-сосудистую
деятельность, стрессорные реакции и ряд других физиологических
функций. Например, при обезболивании путем иглоукалывания
(акупунктурная анальгезия) в спинно-мозговой жидкости повыша-
ло
ется содержание эндопиоидов, что говорит об активации этой сис-
темы в результате иглоукалывания. Некоторое влияние опиоидные
пептиды оказывают на характер эмоций, поведение.
В настоящее время известно несколько десятков опиоидных пеп-
тидов. Конкретными их представителями являются, в частности,
а-, р- и у-эндорфины, а- и p-неоэндорфины, динорфин, пентапепти-
ды метионин-энкефалин (тир — гли — гли — фен — мет) и лей-
цин-энкефалин (тир — гли — гли — фен — лей).
Особый интерес представляет процесс синтеза опиоидных пеп-
тидов. Его основным принципом является посттрансляционное рас-
щепление протеазами высокомолекулярных белковых предшествен-
ников. Одним из предшественников эндопиоидов является так на-
зываемый проопиомеланокортин, представляющий собой прегормо-
нальный белок с молекулярной массой около 31000. Его молекула
содержит аминокислотные последовательности меланоцитстимули-
рующих гормонов (МСГ), адренокортикотропного гормона
(АКТГ), p-липотропного гормона. В свою очередь, в р-липотропи-
не, являющемся гормоном, стимулирующим высвобождение жир-
ных кислот из жировой ткани и состоящим у человека из 91 ами-
нокислотного остатка, обнаружены последовательности, аналогич-
ные р-МСГ (41—58), АКТГ4-ю (47—53), а также эндопиоидов:
а-эндорфина (61—76), р-эндорфина (61—91), у-эндорфина
(61—77) и метионин-энкефалина (61—65). Ниже дана аминокис-
лотная последовательность p-липотропина человека, содержащая
последовательности р-МСГ, p-эндорфина и метионин-энкефалина.
I-----Р-МСГ..
40 I	45
... Глу—лиз—лиз—асп—глу—гли—про—тир—арг—мет—*
.... р~мсг-1
50	55	I*
—глу—гис—фен—арг—три—гли—-сер—про—про*—лиз,—асп—
I-------0-Эндорфин...
60 J	65
<—лиз—арг-г-тир—гли—гли—фен—мет—три—сер...
’----— Э нкефалин-----
80	85
• • • лей—фен—лиз—асн—ала—иле—иле—лиз—асн—
,.,р- Эндорфин —----п
90
—ала—тир—лиз—лиз—гли—глу
Однако, поскольку p-липотропин и энкефалины имеют различ-
ную тканевую локализацию, полагают, что основным предшествен-
ником энкефалинов является не проопиомеланокортин, а другие
полипептиды, включающие в себя несколько копий метионин-энке-
фалина и лейцин-энкефалина.
Кейлоны — тканеспецифичные гормоны местного действия —
представлены белками или пептидами различной молекулярной
111
массы. Кейлоны подавляют митотическую активность других кле-
ток той же ткани. Вероятно, эти гормоны, участвуя в регуляции
деления клеток, предотвращают их злокачественный рост.
Фолиевая кислота, являющаяся по своей биологической функ-
ции витамином (см. разд. 10.3), также может быть отнесена к пеп-
тидам. В ее составе содержится до 7 остатков глу в виде у-глута-
минилпептида (т. е. соединение глутаминовых остатков происхо-
дит за счет у-карбоксильных, а не а-групп).
Помимо перечисленных пептиды выполняют ряд других, очень
интересных и важных функций. Открыты гормоны, ответственные
за индукцию сна. Некоторые специфические пептиды, возможно,
являются веществами, участвующими в явлениях памяти, выра-
ботке условных рефлексов. Не исключено, что долговременная па-
мять связана с синтезом в определенных нейронах этих пептидов.
Так, при тренировке крыс на избегание темноты у них в мозге на-
капливается 15-членный пептид (скотофобин), введение которого
нетренированным животным вызывает у последних такое же по-
ведение. Прослеживается связь между отклонениями в психической
деятельности человека от нормы и содержанием определенных
пептидов в мозге.
Таким образом, биологическая активность пептидов связана с
их регуляторной ролью, причем точки приложения их действия и
эффективность в организме очень разнообразны.. Природные пеп-
тиды привлекают в настоящее время большое внимание исследо-
вателей, активно ведутся работы по их выделению, установлению
структуры, функции, химическому синтезу с целью применения в
практической медицине как лекарственных средств.
2.5.2.	Протеины (простые белки). Ниже представлены группы
простых белков, классификация которых основана на растворимо-
сти этих соединений.
Альбумины. Это водорастворимые белки, осаждающиеся
при насыщении растворов нейтральными солями, например
(NH4)2SO4. Добавление одной соли обычно не приводит к осаж-
дению белков (за исключением (NH4)2SO4), требуется смесь со-
лей, преимущественно одно- и двухвалентных катионов (NaCl и
MgSO4 или Na2SO4 и MgCl2). Сульфат аммония начинает осаждать
альбумины при 65% насыщения, а полное осаждение наступает
при 100% насыщения.
Альбумины широко распространены в природе. Они составляют
около 50% всех белков плазмы крови человека. Высоко содержа-
ние альбумина в белке яиц (до 50%). Белок, обладающий сходной
растворимостью и получивший название лактальбумин, выделен
из молока; богаты альбуминами и растения.
Глобулины. Растворимы в слабых растворах нейтральных
солей, однако высокие концентрации последних осаждают глобу-
лины. (NH4)2SO4 высаливает глобулины уже при 50% насыщения,
хотя надо иметь в виду, что полного разделения альбуминов и
глобулинов как при этой концентрации сульфата аммония, так и
при других не происходит. В воде глобулины нерастворимы, по-
этому выпадают в осадок при отделении солей диализом. Глобу-
лины составляют большую часть белков семян многих растений»
особенно бобовых и масличных, например легумин в семенах го-
роха, фазеолин — фасоли, эдестин — конопли.
Проламины. Хорошо растворимы в 60—80%-ном этиловом
спирте, в их составе много аминокислоты пролина, а также глута-
миновой кислоты. В очень незначительном количестве в эти белки
входят лиз, арг, гли. Проламины характерны исключительно для се-
мян злаков, где выполняют роль запасных белков: в семенах пше-
ницы и ржи — белок глиадин, в семенах ячменя — гордеин, куку-
рузы — зеин. Все указанные проламины представляют собой ком-
плексы белков, различающихся по составу и молекулярной массе.
Глютелины. Хорошо растворимы в щелочных растворах
(0,2—2% NaOH). Это белки растений, содержатся в семенах зла-
ков и других культур, а также в зеленых частях растений. Комплекс
щелочерастворимых белков семян пшеницы получил название глю-
тенин, риса — оризенин. Глиадин семян пшеницы в соединении е
глютенином образует клейковину, свойства которой в значительной
мере определяют технологические качества муки и теста.
Гистоны. Представляют собой щелочные белки с молекуляр-
ной массой 12 000—30 000, на долю основных кислот в них прихо-
дится 20—30%. Гистоны растворимы в слабых кислотах (0,2 н.
НС1), осаждаются аммиаком, спиртом. Они не содержат триптофа-
на и, в большинстве случаев, цистеина, цистина. Гистоны присутст-
вуют главным образом в ядрах клеток животных, растений и игра-
ют важную роль в структуре хроматина, так как количественно
преобладают среди белков хромосом.
Гистоны — сравнительно консервативные в эволюционном пла-
не белки. Показано, что гистоны животных и растений характери-
зуются близкими величинами отношения арг к лиз и содержат до-
вольно сходный набор фракций.
Согласно данным рентгеноструктурного анализа и электронной
микроскопии гистоны не найдены в хромосомах тех организмов, ко-
торые не имеют оформленного клеточного ядра (бактерии, сине-
зеленые водоросли). Вместе с тем следует отметить, что фракции
белков, богатые лиз-и арг, выделены из клеток ряда бактерий и не-
которых синезеленых водорослей. Противоречивы данные о содер-
жании гистонов в грибах.
Протамины. Это сильно основные белки с низкой молекуляр-
ной массой (до 12 000), благодаря чему некоторые из них проходят
через целлофан при диализе. Протамины растворимы в слабых кис-
лотах, не осаждаются при кипячении; в их молекуле содержание
щелочных аминокислот составляет около 80%, особенно много арг.
В протаминах нет цис, три и асп, очень часто отсутствуют тир, фен,
поэтому они не дают многих цветных реакций на белок. Благодаря
высокой концентрации в молекуле протаминов основных аминокис-
лот, она представляет собой поливалентный органический катион и
легко реагирует с молекулами, имеющими избыток отрицательно
заряженных групп, в частности нуклеиновыми кислотами.
113
Протамины широко распространены в природе. Они содержатся
в половых клетках животных и человека и составляют основную
массу белков хроматина этого типа. Протамины придают ДНК био-
химическую инертность, что является необходимым условием сох-
ранения наследственных свойств организма. Показано, что синтез
протаминов происходит в процессе сперматогенеза в цитоплазме
половой клетки, после этого протамины фосфорилируются, прони-
кают в клеточное ядро и по мере созревания спермы вытесняют гис-
тоны из нуклеопротеина, образуя прочный комплекс с ДНК. В ре-
зультате такого взаимодействия наследственные свойства организ-
ма оказываются защищенными от неблагоприятных воздействий.
Протамины в большом количестве встречаются в сперме рыб; наи-
более хорошо из них изучены сальмин из лососевых рыб, клупеин
из сельди. Протамины обнаружены и у представителей раститель-
ного царства — они выделены из спор плауна.
Протеиноиды. Трудно растворимые белки, для них харак-
терно высокое содержание серы. К протеиноидам относятся фибрил-
лярные белки: фиброин — белок шелка, кератины — белки волос,
рогов, копыт, коллагены — белки соединительной ткани, спонгин —
белок морских губок и др.
2.5.3.	Сложные белки/ Липопротеины. Простетической груп-
пой в этих сложных белках являются различные жироподобные ве-
щества — липиды. Связь между компонентами липопротеинов мо-
жет быть различной степени прочности. Полагают, что основной
вклад в стабилизацию комплексов дают силы слабого взаимодей-
ствия (гидрофобные, ионные, водородные), роль ковалентных свя-
зей незначительна.
В составе липопротеинов обнаружены как полярные, так и ней-
тральные липиды, а также холестерин и его эфиры. Липопротеины
широко распространены в природе, встречаются у всех представи-
телей живых организмов. Они являются обязательными компонен-
тами всех клеточных мембран, где их небелковая часть представ-
лена, в основном, полярными липидами — фосфолипидами, глико-
липидами. Липопротеины всегда присутствуют в крови (см. разд.
2.5.4). Инозитолдифосфатсодержащий липопротеин выделен из бе-
лого вещества мозга, в состав липопротеинов серого вещества мозга
входят сфинголипиды. У растений значительная часть фосфолипи-
дов в протоплазме находится также в форме липопротеинов.
Известны комплексы липидов и белков, белковая часть которых
содержит много гидрофобных аминокислот, липидный компонент
часто преобладает над белковым. В результате такие сложные бел-
ки растворимы в органических растворителях, например в смеси
хлороформа и метанола. Подобного рода комплексы называются
протеолипидами. Они в большом количестве содержатся в миели-
новых оболочках нервных клеток, а также в синаптических мембра-
нах и внутренних мембранах митохондрий.
Фосфопротеины. Характерной особенностью фосфопротеи-
нов является присутствие в значительных количествах ортофосфор-
ной кислоты, которая связана обычно с оксигруппой сер, реже тре
114
сложноэфирной связью. Другие оксиаминокислоты (тирозин, гид-
роксипролин) не образуют фосфорные эфиры.
К фосфопротеинам относятся многие белки, играющие важную
роль в питании молодых организмов. Это основной белок молока
казеин, осаждающийся при створаживании, яичного желтка — ви-
теллин и фосвитин, икры рыб — ихтулин. Они содержат 1—10%
фосфора. Фосфопротеины обнаружены в мозге.
Казеин кроме фосфорной кислоты имеет углеводный компонент
молекулы, поэтому является фосфогликопротеином. Относительно
кратковременное фосфорилирование самых разнообразных белков
(ферментативных, мембранных, рибосомальных и др.) происходит
при участии особой группы ферментов — протеинкиназ. Такого ро-
да фосфорилирование имеет регуляторный, временный характер, и
эти белки, видимо, следует отличать от структурно-постоянных
фосфопротеинов.
Металлопротеины. Комплексы ионов металлов с белками,
в которых ионы металлов присоединены к белку непосредственно,
являясь составной частью структуры белковых молекул, называют-
ся металлопротеинами. Некоторые авторы относят к металлопро;
теинам и те белки, которые помимо металла имеют металлсвязыва-
ющие простетические группы, например порфириновая группа в ге-
моглобине, хлорофилле. Однако эта точка зрения не является обще-
принятой.
В составе металлопротеинов часто встречаются такие металлы,
как Си, Fe, Zn, Мо и др. Типичными металлопротеинами являются
некоторые ферменты, содержащие перечисленные металлы, а также
Мп, Ni, Se, Са и др. (см. разд. 3.4.2).
К медьсодержащим белкам относятся, например, цитохромо-
ксидаза, пластоцианин (переносчики электронов), белок крови це-
рулоплазмин; к железосодержащим — лактоферрин (белок моло-
ка), трансферрин (белок крови), ферритин и др. В сыворотке крови
найден специфический никельсодержащий белок класса макрогло-
булинов, названный никеле плазмином.
Обнаружены белки — селенопротеины, в которых селен, вероят-
нее всего, ковалентно присоединен к ароматической или гетероцик-
лической (гем) группе. Один из селенопротеинов содержится в мы-
шцах животных.
У некоторых морских животных обнаружен белок, содержащий
ванадий,— ванадохром, являющийся, вероятнее всего, переносчи-
ком кислорода.
- Гликопротеины. Это сложные белки, в составе которых
имеется углеводный компонент. Белок в данных соединениях яв-
ляется своеобразной основой, к нему прикрепляются углеводные
группировки. Общепризнанная и устоявшаяся классификация этих
белков отсутствует. В соответствии с особенностями химического
строения гликопротеины могут быть подразделены на истинные
гликопротеины и протеогликаны (гликозаминопротеогликаны).
Основное различие между ними заключается в том, что угле-
водные группировки истинных гликопротеинов содержат обычно
115
до 15—20 моносахаридных компонентов, не образующих повторя-
ющихся олигосахаридных фрагментов, в то время как у протеогли-
канов они построены из очень большого числа повторяющихся еди-
ниц, в основном имеющих своеобразный дисахаридный характер.
Истинные гликопротеины. Молекулярная масса истинных гли-
копротеинов варьирует в широких пределах, достигая иногда
1 млн. и более. Особенно велика молекулярная масса у гликопро-
теинов слюны. На долю углеводного компонента в гликопротеинах
приходится от 1—3% (овальбумин) до 80—90% (групповые ве-
щества крови) массы всей молекулы. В значительных пределах
колеблется и число углеводных цепей, приходящихся на одну мо-
лекулу. Так, в трансферрине, рибонуклеазе их количество не пре-
вышает 1—4, а у групповых веществ крови, муцинов слюны дос-
тигает 300—800. Углеводные цепочки, разветвленные или линейные,
всегда ковалентно связаны с пептидной частью молекулы.
В составе углеводных компонентов обнаружено более 10 раз-
личных моносахаридов: D-галактоза, D-манноза, D-глюкоза,
N-ацетилглюкозамин и N-ацетилгалактозамин, дезоксисахара
(L-фукоза, L-рамноза), D-ксилоза, L-арабиноза. Типичным компо-
нентом гликопротеинов является также нейраминовая кислота
(см. разд. 6.2.3), которая благодаря наличию карбоксильной груп-
пы (при физиологических значениях pH) придает молекуле угле-
водсодержащих соединений отрицательный заряд. Нейраминовая
кислота чаще встречается в форме сиаловых кислот, которые на-
ряду с фукозой обычно занимают терминальное положение в угле-
водных цепях гликопротеинов.
Ковалентную связь между углеводной и белковой частями гли-
копротеинов могут образовывать различные группировки. Очень
распространен гликозиламидный тип связи между N-ацетилглю-
козамином и р-амидным азотом аспарагина.
N-Ацетилглюкозамин	Аспарагин
Другим типом углеводпептидной связи в гликопротеинах явля-
ется О-гликозидный. В образовании этой связи чаще всего участ-
вуют сер или тре и N-ацетилгалактозамин или галактоза.
В коллагене встречается галактозил-гидроксилизиновая О-гли-
козидная связь, а в углеводсодержащих белках высших расте-
ний — арабинозил-гидроксипролиновая. В гликопротеинах мочи
человека обнаружена также S-гликозидная связь галактозы с цис-
теином и О-гликозидная связь фукозы с треонином. В молекулах
116
одних и тех же гликопротеинов может встречаться более чем один
тип углеводпептидной связи.
Протеогликаны. Молекулярная масса протеогликанов велика
и достигает иногда нескольких миллионов за счет большого числа
чередующихся дисахаридных звеньев. Растворы этих углеводсо-
держащих белков обладают высокой вязкостью. Протеогликаны
состоят из небольшой белковой части, к которой ковалентно при-
соединяется значительное число (несколько десятков) гетерополи-
сахаридных цепей, содержащих в своих молекулах остатки амино-
сахаридов и уроновых кислот.
Углеводные компоненты протеогликанов, называемые гликоза-
миногликанами, представлены в основном следующими полисаха-
ридами: гиалуроновой кислотой, хондроитинсульфатами, гепари-
ном, гепарансульфатом и кератансульфатами. Все эти полисаха-
риды содержат чередующиеся парные звенья, состоящие из остат-
ков аминосахаридов, гексуроновых кислот и реже моносахаридов
(см. разд. 6.4). В протеогликанах, содержащих гиалуроновую кис-
лоту, на долю белковой части приходится 0,4—2% от всей массы
молекулы, в случае хондроитинсульфатов — 17—22%.
Углеводпептидная связь может осуществляться через О-глико-
зидную связь D-ксилозы с сериновым остатком пептидной цепи (у
хондроитинсульфатов, гепарина) или N-ацетилглюкозамина с тре-
онином, а также гликозиламидную связь N-ацетилглюкозамина с
аспарагином (у кератансульфатов).
Ксилоза	. Серин
Ксилоза не входит в состав гликозаминогликанов, а выполня-
ет роль вставочного, связующего компонента между полисахари-
дом и белком. Протеогликаны обладают полианионными свойства-
ми, так как в них присутствуют карбоксильные группы уроновых
кислот и сульфатные группы аминосахаридов.
Биологическая роль гликопротеинов. Углеводсодержащие бел-
ки широко распространены в живых организмах, они встречаются
у животных, растений и микроорганизмов, где выполняют самые
разнообразные функции.
/. Функция избирательного взаимодействия, высокоспецифиче-
ского узнавания. В состав поверхностных мембран наряду с дру-
гими компонентами входят гликопротеины, участвующие в очень
тонких процессах биологического узнавания и межклеточного вза-
имодействия, выполняющие роль рецепторных систем для опреде-
ленных соединений и клеток. Так, эпителиальные клетки слизис-
той оболочки кишечника снабжены рецепторами, специфически
117
связывающими клетки инфицирующих организм бактерий и ви-
русов.
Определенные гликопротеины эритроцитарных мембран ответ-
ственны за избирательное присоединение вируса гриппа. Специ-
фическое связывание гормонов с поверхностью клеток-мишеней
обеспечивается во многих случаях углеводсодержащими соедине-
ниями этих клеток. Такого типа рецептор для инсулина существу-
ет на поверхности клеток печени, жировой ткани и лимфоцитов.
Гормоны с предварительно отщепленными концевыми сиаловыми
кислотами при введении в кровоток не достигают клеток-мишеней.
Несомненна также важнейшая роль углеводного компонента глико-
протеинов в определении специфичности многих антигенов. Это от-
носится прежде всего к групповым веществам крови и раствори-
мым групповым веществам биологических жидкостей (слюна, мо-
локо, семенная жидкость).
Антигенные комплексы бактерий имеют очень сложную хими-
ческую структуру, состоят из белкового, полисахаридного и липид-
ного компонентов. Комплексные антигены многих бактерий, токсич-
ные для человека и животных, называются эндотоксинами. Детер-
минирующие участки полисахаридных компонентов макромолекул
эндотоксинов определяют их антигенную специфичность. Пептиды
также являются иммунодетерминантами и увеличивают иммуноген-
ность макромолекул. В липидном компоненте локализованы все или
большинство активных токсичных участков, он определяет также
пирогенное действие.
Акцептирование бактериальных токсинов клетками организма-
хозяина» также происходит с участием гликопротеинов.
Углеводный компонент гликопротеинов является своего рода
указателем, в котором при помощи последовательности сахаров в
углеводной цепи записано, куда должна следовать молекула — вы-
ходить из клетки, поступать в клеточные мембраны различных ор-
ганов или субклеточные мембраны.
Гликопротеины являются распространенными компонентами се-
мян растений. Так, в семенах фасоли содержится вицилин — белок,
в состав которого входит манноза и N-ацетилглюкозамин, в семе-
нах клещевины — белок рицин, обладающий способностью избира-
тельно осаждать группоспецифические вещества крови и агглюти-
нировать эритроциты. Соединения, обладающие таким свойством и
выделенные из растений, называются фитогемагглютининами и от-
носятся к группе лектинов. Под лектинами понимают белки неиммун-
ного происхождения, в том числе и гликопротеины, способные спе-
цифически связывать полисахариды и углеводсодержащие биопо-
лимеры, не вызывая их химического превращения. В частности, вза-
имодействие лектинов -с углеводсодержащими соединениями прояв-
ляется в виде реакции агглютинации частиц и клеток, например,
эритроцитов, или преципитации полисахаридов и гликопротеинов.
К настоящему времени лектины обнаружены у организмов, нахо-
дящихся на разных ступенях эволюционной лестницы: у бактерий,
водорослей, грибов, моллюсков, рыб, млекопитающих и других жи-
118
вотных. В связи с этим предлагают применять термины «фитолекти-
ны», «зоолектины», «миколектины» и т. д.
У млекопитающих некоторые лектины, вероятно, принимают уча-
стие в формировании органов в процессе эмбриогенеза, поскольку в
больших количествах встречаются в тканях зародыша и плода.
Кроме того, у животных лектины, очевидно, участвуют в компарт-
ментализации специфических гликопротеинов в клетке. Разнообраз-
ные функции лектинов в той или иной мере связаны со способно-
стью узнавания клеток и клеточных компонентов, организации их
избирательного взаимодействия.
Лектины широко распространены в растениях, предполагают,
что они могут участвовать в регулировании клеточного деления и
прорастания семян. Лектины играют важную роль в процессах уз-
навания при образовании симбиотических сообществ, в частности,
между бобовыми растениями и азотфиксирующими клубеньковыми
бактериями. Такую же роль выполняют лектины грибов при обра-
зовании лишайников. Лектины принимают участие и в формирова-
нии паразитических межвидовых сообществ: высшее растение —
бактерии, высшее растение — грибы. Важна роль лектинов в кле-
точном узнавании при формировании колониальных микроорганиз-
мов. Межклеточная адгезия за счет лектинуглеводного узнавания
хорошо показана при образовании клеточных слизевиков из одно-
клеточных миксамеб. Высказывают предположения об участии лек-
тинов и в транспорте ассимилятов по флоэме растений, что также
объясняется их участием в избирательном акцептировании.
Поскольку связывающие участки лектинов специфичны к опре-
деленным углеводным остаткам, с их помощью в настоящее время
выявляют архитектонику клеточных поверхностей.
Таким образом, во многих случаях, когда в живых организмах
имеет место тонкая биохимическая специфичность и происходит
высокоизбирательное узнавание, принимают участие углеводы. Осо-
бенно важны в этом отношении углеводные компоненты гликопро-
теинов, содержащие большое разнообразие моносахаридных остат-
ков в различных сочетаниях, что в комплексе с белками создает воз-
можность большой биохимической специфичности.
2.	Т ранспортная функция. Ряд гликопротеинов, циркулирующих
в кровяном русле человека и животных, являются транспортными
белками, например функцию переносчика железа выполняет транс-
феррин, меди — церулоплазмин, стероидных гормонов — транскор-
тин. Главный интегральный белок эритроцитарной мембраны уча-
ствует в транспорте анионов и, возможно, глюкозы.
3.	Каталитическая функция. Углеводный компонент обнаружен
в составе некоторых ферментов, в частности энтерокиназы, така-
амилазы, пероксидазы, глюкозооксидазы, сывороточной холинэсте-
разы, расщепляющей ацетилхолин и участвующей в передаче нерв-
ного возбуждения, РНКазы В и др.
4.	Структурно-механическая функция. Эту функцию выполняют
у различных видов живых организмов в основном протеогликаны.
У позвоночных животных они входят в состав межклеточного ве-
119
щества соединительной ткани. Протеогликаны содержатся в коже,
костях, хрящах, синовиальной жидкости суставных сумок, сухожи-
лиях, клапанах сердца, стекловидном теле, роговице глаза и других
тканях. Они придают им эластичность и устойчивость по отношению
к сжатию. Протеогликаны, содержащие гиалуроновую кислоту, об-
разуют очень вязкие растворы, что повышает стойкость ткани к
проникновению инфекции. У многих бактерий защитная капсула
ткани в основном построена из сложных белков, включающих гиа-
луроновую кислоту. Кроме того, данный протеогликан наряду с
хондроитинсульфатом А выполняет роль смазки в суставах. Функ-
цию защитной смазки выполняют гликопротеины — основные сос-
тавные вещества муцинов слюны, желудочного и кишечного муци-
нов. Гликопротеины являются широко распространенными структур-
ными компонентами различных клеточных мембран.
Помимо перечисленных гликопротеины выполняют в организме
и ряд других функций. К гликопротеинам относятся фибриноген,
протромбин и некоторые другие факторы свертывания крови. В пе-
чени синтезируется гликозаминогликан — гепарин — важнейшее
противосвертывающее вещество. Гликопротеинами являются и им-
муноглобулины (см. разд. 5.5), некоторые гормоны — гонадотроп-
ные, фолликулостимулирующий, тиреоглобулин, ингибитор размно-
жения вирусов животных — интерферон. С наличием гликопротеи-
нов в оболочке ряда вирусов связывают гемагглютинирующую ак-
тивность последних.
Углеводный компонент повышает стабильность молекул глико-
протеинов, предохраняя их от действия протеолитических фермен-
тов. Небелковая часть ряда сывороточных гликопротеинов опреде-
ляет период их полураспада. В сыворотке крови и мышцах антарк-
тических рыб обнаружены гликопротеины — антифризы, защища-
ющие клетки от замораживания. Некоторые соединительно-тканные
протеогликаны (хондроитинсульфаты) способны набухать' с погло-
щением большого количества воды, в связи с чем иногда играют
роль депо воды.
К гликопротеинам относится белок яиц — авидин. Он взаимо-
действует с витамином Н (биотин), препятствует его всасыванию
из кишечника, что приводит к острой биотиновой недостаточности.
Авидин применяется в опытах in vitro в качестве ингибитора био-
тинсодержащих ферментов.
' Хромопротеины. К хромопротеинам относятся сложные бел-
ки, у которых небелковой частью являются окрашенные соединения,
принадлежащие к различным классам органических веществ: пор-
фириновые структуры, флавинадениндинуклеотид (ФАД), флавина-
денинмононуклеотид (ФМН) и др. Порфириновое кольцо с коорди-
национно связанным с ним ионом железа входит как простетичес-
кая часть в состав ряда окислительно-восстановительных фермен-
тов (каталаза, пероксидаза) и группы переносчиков электронов—
цитохромов. Хромопротеинами являются и флавиновые дегидроге-
назы или «желтые дыхательные ферменты»—флавопротеины (ФП).
Белковая часть их молекулы связана с ФАД или ФМН. Более под*
120
робно ФП освещены в гл. 3. Типичными хромопротеинами являются
родопсин (см. разд. 10.2), гемоглобин крови.
Важнейшая группа сложных белков — нуклеопротеины рас-
сматривается в гл. 4.
Гемоглобин и другие дыхательные пигменты.
Ге мог лоб ин (сокращенное обозначение — НЬ) составляет молеку-
лярную основу дыхательной функции крови, т. е. способности транс-
портировать О2 и СО2.
Первые подробные исследования строения гемоглобина были вы-
полнены в 1896—1901 гг. профессором Петербургского института
экспериментальной медицины М. В. Ненцким. Он же впервые пред-
ложил структурную формулу небелкового компонента гемоглоби-
на, в основе которой лежали 4 пиррольных цикла, расположенные
вокруг атома железа, что правильно отражает основные структур-
ные особенности небелковой части молекулы. К настоящему време-
ни установлено, что гемоглобины различных видов состоят из белка
глобина и гема (ферропротопорфирина), нековалентно связанных
между собой. Отличия в свойствах гемоглобинов у разных видов
животных обусловлены, в основном, глобиновым компонентом.
Гем. Гем представляет собой достаточно плоскую молекулу, по
форме приближающуюся к квадратной, в которой ион Fe2+ нахо-
дится в центре ядра протопорфирина IX, причем его четыре лиганд-
ных места заняты атомами азота пиррола. Протопорфирины могут
существовать в пятнадцати изомерных формах, поскольку содержат
три различных вида заместителей. В их состав входят четыре ме-
тильные группы, две винильные и два остатка пропионовой кисло-
ты. Протопорфирин IX — самый распространенный из пятнадцати
возможных изомеров. Кроме гемоглобина он содержится в миогло-
бине и большинстве цитохромов. Хелатный комплекс протопорфи-
рина с Fe2+ называется протогемом или гемом.
121
Молекулярным кислородом и другими окислителями в присут-
ствии соляной кислоты или щелочей гем окисляется до гемина, в
котором трехвалентное железо связано с анионом хлора, или до
гематина, в котором третья валентность занята гидроксилом. Пор-
фириновое кольцо из четырех пиррольных ядер является основой
не только гема, но и хлорофилла растений, на что указал еще в
1896 г. М. В. Ненцкий в работе «О биологической связи пигмента
крови и листьев». В ней автор сделал широкое обобщение о един-
стве растительного и животного мира, связывая это с теорией Дар-
вина.
Глобин. Белок гемоглобина — глобин — у взрослого человека
состоит из двух а- и двух 0-цепей. Субъединицы упакованы в тетра-
мере таким образом, что образуют макромолекулу сферической фо-
рмы длиной 6,4 нм и шириной 5,5 нм. Каждая субъединица в одной
из своих «складок» (так называемый «гемовый карман») содержит
плоское кольцо гема. «Гемовый карман» как бы выстлан большим
числом неполярных групп аминокислот, осуществляющих гидрофоб-
ное взаимодействие с пиррольными кольцами гема. Последний име-
ет также координационную связь с глобином, которая возникает
между атомом железа гема и атомом азота в гистидине глобина.
Четыре гема из четырех субъединиц ориентированы по отношению
к молекуле в целом так, что одним краем каждый гем обращен к
внутренней области молекулы, а другим — наружу, в сторону вод-
носолевой среды.
Внутри глобинового тетрамера существует свободная полость,
пронизывающая всю молекулу по ее высоте на 5 нм. В полость об-
ращены в основном неполярные группы аминокислотных остатков
и лишь единичные полярные. Между неполярными группами в вод-
ной среде возникают гидрофобные взаимодействия, которые, по-ви-
димому, в известной мере защищают молекулу изнутри от контак-
та с водой и стабилизируют структуру в целом. Опытами с мечены-
ми атомами установлено, что гемоглобин каждого эритроцита пос-
ле своего образования не подвергается обновлению и остается прак-
тически в неизменном виде до разрушения эритроцита. Средняя
«продолжительность жизни» эритроцитов около 4 месяцев. После
их разрушения основная часть Fe (90%) не выделяется из организ-
ма, а идет на образование особого белка — ферритина, содержаще-
го до 30% железа. Этот белок является, таким образом, запасным
депо железа. Из ферритина железо поступает на образование новых
эритроцитов в костном мозге.
Гетерогенность гемоглобинов. В организме могут одновременно
присутствовать две и более фракций гемоглобина, отличающихся в
основном первичной структурой протомеров глобина (т. е. последо-
вательностью их аминокислотных остатков), а иногда и четвертич-
ной структурой. Это явление получило название гетерогенности ге-
моглобинов. Различают три ее типа в популяции людей: 1. Гетеро-
генность обусловленная наличием минорных компонентов; если ос-
новные формы (НЬА) состоят из двух а- и двух 0-цепей, то минор-
ные НЬ содержат вместо p-цепей две 6-цепи, которые отличаются
122
от p-цепей десятью аминокислотными остатками. 2. Гетерогенность
генетическая: у взрослого человека выявлено до 300 вариантов ге-
нетически детерминированных гемоглобинов. Многие из них функ-
ционально нормальны, некоторые служат причиной заболеваний.
3. Гетерогенность эмбриональная: представлена двумя фракциями
так называемого «примитивного» гемоглобина, основная из них
HbF (фетальный гемоглобин). В норме при рождении его содержа-
ние составляет 60—70% от всего НЬ. С возрастом количество HbF
резко снижается, у взрослых он отсутствует.
Свойства гемоглобина, Кооперативное взаимодействие субъеди-
ниц. В макромолекуле НЬ существует подвижность субъединиц в
процессе функционирования, при связывании и отдаче лигандов. В
своем движении субъединицы взаимодействуют, создавая коопера-
тивный эффект, сущность которого заключается в том, что сродст-
во каждой из субъединиц к лиганду не остается постоянным, а ме-
няется под влиянием соседних субъединиц. Благодаря кооператив-
ному эффекту, отношение НЬ к О2 меняется под влиянием самого О2
в ходе оксигенации: начальное присоединение О2, вызывая измене-
ние конформации НЬ, облегчает связывание последующих молекул
кислорода. В результате зависимость степени оксигенации НЬ от
парциального давления О2 выражается кривой сигмоидной формы.
Кооперативный характер связывания О2 гемоглобином имеет
большое физиологическое значение. В капиллярах легких при пар-
циальном давлении О2 около 100 мм рт. ст. кооперативность приво-
дит к почти полному насыщению гемоглобина кислородом. Когда
же эритроциты проходят через капилляры кислородпотребляющих
тканей, его парциальное давление падает примерно до 5 мм рт. ст.,
и кооперативность в этом случае способствует более полной разгруз-
ке гемоглобина от кислорода, чем в том случае, если бы четыре ге-
могруппы действовали независимо.
Влияние pH. Концентрация Н+ существенно изменяет свойства
НЬ, прежде всего его способность связывать О2. Это явление полу-
чило название эффекта Бора. В общей форме эффект Бора рассмат-
ривается как влияние pH среды на взаимодействие атома Fe в мо-
лекулах дыхательных пигментов с различными лигандами — О2,
СО, NO. Сюда же относится зависимость от pH окисления Fe2+
до Fe3+.
В капиллярах, где парциальное давление О2 невелико и может
накапливаться СО2 и молочная кислота, понижение pH приводит к
тому, что оксигемоглобин отдает свой кислород более активно.
В эффекте Бора протоны играют роль аллостерических регулято-
ров, присоединяющихся к амино- и имидазольным группам глоби-
на. Аллостерическим регулятором конформационных равновесий в
гемоглобине является также 2,3-дифосфорный эфир глицерина (ди-
фосфоглицерат), содержание которого в эритроцитах человека при-
близительно эквимолярно по отношению к гемоглобину. Дифосфо-
глицерат присоединяется между двумя 0-цепями дезоксигемоглоби-
на, в результате этого сродство последнего к кислороду снижается,
эритроциты могут отдавать тканям большую долю переносимого
123
ими О2. Содержание дифосфоглицерата в эритроцитах варьирует в
зависимости от физиологических условий: у людей, живущих в вы-
сокогорных районах, его концентрация выше. Присутствие дифос-
фоглицерата в эритроцитах характерно не для всех видов живот-
ных; у птиц и черепах его заменяет, по-видимому, инозитолпента-
фосфат.
Формы гемоглобина. Оксигемоглобин (НЬОг). Атомы Fe каж-
дой из гем-групп молекулы НЬ могут обратимо связывать молекулу
О2. Полностью оксигенированный НЬ называется оксигемоглоби-
ном, содержит четыре молекулы О2 на молекулу гемоглобина.
Валентность железа гема при образовании оксигемоглобина не
меняется. Гемоглобин обладает уникальной способностью обратимо
связывать О2, образуя стабильный комплекс без окисления Fe2+ до
Fe3+. В геме четыре лигандные группы порфирина образуют ком-
плекс с железом, имеющий плоскостное строение. Оставшиеся пя-
тая и шестая координационные связи железа располагаются пер-
пендикулярно плоскости порфиринового кольца. Пятая связь при
этом занята имидазольным остатком гис, а шестая или остается не-
замещенной (дезоксигемоглобин), или замещается кислородом (ок-
сигемоглобин). Окисление Fe2+ до Fe3+ в реакции О2 с гемом воз-
можно только в растворах с высокой диэлектрической проницаемо-
стью, а в гидрофобном гемовом кармане, из которого вытесняется
вода, создается среда с низкой диэлектрической постоянной.
Карбаминогемоглобин. СО2 может связываться с НЬ с образо-
ванием карбаминогемоглобина:
О
II
Hb—NH2 + СО2	Hb—NH—С—О" + Н+
СО2 связывает только N-концевые а-аминогруппы. Реакция легко
обратима. Образование карбаминогемоглобина определяется пар-
циальным давлением СО2, имеет прямое отношение к транспорту
СО2 кровью.
Карбоксигемоглобин (НЬСО). НЬ может соединяться с четырь-
мя молекулами СО (угарный газ) с образованием СО-гемоглобина
или карбоксигемоглобина, который является фоточувствительным и
диссоциирует на свету с выделением СО. Fe гема при этом остается
двухвалентным. Сродство НЬ человека к СО более чем в 200 раз
превышает сродство к О2, т. е. для образования НЬСО требуется в
200 раз более низкое парциальное давление СО, чем, соответствен-
но, для НЬО2—О2. В результате этого при вдыхании воздуха, со-
держащего угарный газ, большая часть гемоглобина крови перехо-
дит в карбоксигемоглобин, оксигемоглобин не образуется, наруша-
ется перенос О2 от легких к тканям, в чем и заключается механизм
отравления угарным газом. Смерть наступает вследствие недоста-
точного снабжения тканей (в первую очередь мозга) кислородом
уже при связывании 70% НЬ угарным газом. Своевременное увели-
чение парциального давления О2 (вдыхание чистого кислорода) мо-
жет вызвать достаточное превращение НЬСО в НЬО2.
124
Метгемоглобин (Met-Hb). Пероксиды, ферицианид, оксиды азо-
та и хиноны могут окислять Fe2+ в гемоглобине до Fe3+ с образова-
нием метгемоглобина, который не присоединяет ни О2, ни СО. Он
имеет коричневый цвет, образуется in vivo в норме, но в небольших
количествах и ферментативным путем восстанавливается до НЬ.
Так как Met-Hb не может служить переносчиком О2, при образова-
нии в организме значительных его количеств (например, при от-
равлениях анилином, нитробензолом, оксидами азота) наступает
кислородное голодание, а в тяжелых случаях и смерть. Однако прё-
вращение небольшой части гемоглобина в метгемоглобин менее
опасно, чем образование НЬСО, поскольку Met-Hb постепенно вос-
станавливается в организме в гемоглобин.
Функции гемоглобинов. Основные функции гемоглобинов:
1) транспорт О2, 2) транспорт СО2, 3) поддержание постоянной бу-
ферной емкости крови.
В легких, благодаря имеющемуся градиенту О2, последний диф-
фундирует через стенки капилляров и плазму и попадает в эритро-
циты. НЬ артериальной крови насыщается О2 на 96%. В тканях О2
диффундирует из эритроцитов через плазму в интерстициальную
жидкость (межтканевая), а затем в клетки ткани, в то же время
СО2 диффундирует в обратном направлении.
Транспорт СО2 от тканей до альвеолярного воздуха осуществля-
ется небольшой частью в виде карбаминогемоглобина. Основная
часть СО2 под действием карбоангидразы гидратируется до Н2СО3,
которая затем диссоциирует. Около 60% СО2 транспортируется в
виде НСО” венозной плазмой и около 32% в виде карбамино-СО2
и НСО“ эритроцитами. Однако и транспорт 60% НСО" венозной
плазмы косвенно обеспечивается НЬ, так как он служит акцепто-
ром водорода при диссоциации Н2СО3.
Гемоглобин — функционально более слабая кислота, чем НЬО2.
Эти два белка образуют буферную систему, которая способствует
поддержанию pH крови на постоянном уровне-.
Обмен гемоглобина. Срок жизни эритроцитов 120 суток. В 1 сут-
ки из разрушившихся эритроцитов освобождается 8—9 г НЬ. Раз-
рушение эритроцитов и распад гемоглобина происходят главным
образом в печени, селезенке и костном мозге. Распад НЬ начинает-
ся с разрыва одной а-метиновой связи (между 1-м и 2-м порфирино-
выми кольцами) под действием НАДФ-содержащей оксидазы. Об-
разуется зеленый пигмент вердоглобин, в котором еще содержатся
железо и глобин. Дальнейший распад протекает, видимо, спонтан-
но. Отщепляются железо, глобин и образуется один из желчных
пигментов — биливердин. Биливердин восстанавливается НАДФН-
зависимой дегидрогеназой до билирубина, который из печени вмес-
те с желчью изливается в желчный пузырь.
В крови взрослого человека содержание билирубина относитель-
но постоянно—от 2,5 до 12 мг/л. Возрастание концентрации били-
рубина в крови до 20 мг/л приводит к возникновению желтухи,
дальнейшее увеличение его содержания в крови вызывает явления
125
тяжелого отравления. Поступая с током крови в печень, билирубин
обезвреживается путем связывания с глюкуроновой кислотой. Окон-
чательный распад билирубина происходит в кишечнике под дейст-
вием бактерий: отщепляется глюкуроновая кислота, а билирубин
восстанавливается в стеркобилиноген, который выводится с калом.
Миоглобин. Миоглобин — небольшой глобулярный белок
(М 17 000); молекула его состоит из одной полипептидной цепи
(153 аминокислотных остатка) и одного гема. Таким образом мио-
глобин представляет собой как бы 1/4 молекулы НЬ. Известна пол-
ная аминокислотная последовательность полипептидной цепи мио-
глобина. Она несколько отличается у человека и различных видов
животных, но характер укладки цепи во вторичную спираль и тре-
тичную конфигурацию в основных чертах одинаков. Молекула об-
разует восемь сегментов из правых а-спиралей. В складке между
сегментами расположен гем. Подобно гемоглобину он образует ок-
симиоглобин, карбокси- и метмиоглобин.
Типы переноса кислорода к тканям у разных по эволюционному
положению животных. По данным П. А. Коржуева (1964), пример-
но у 86% видов животных транспорт Ог осуществляется без учас-
тия дыхательных пигментов типа НЬ. Из них у 78% видов (насеко-
мые, многоножки, большинство паукообразных) Ог доставляется
всем тканям и органам системой трахей, а у остальных 8% «беспиг-
ментных» видов (простейшие, губки, кишечнополостные, моллюски,
иглокожие) — путем диффузии через поверхность тела. Дыхатель-
ные пигменты есть в крови или полостной жидкости только у 14%
видов, но это наиболее высокоорганизованные животные, в том чис-
ле все позвоночные.
У наиболее примитивных животных переносчик О2 включен в
клетки, суспендированные в целомической жидкости. С развитием
циркуляции появились переносчики Ог, растворимые в циркулиру-
ющей плазме. Важнейшим этапом в ходе эволюции был период
появления специализированных клеток — эритроцитов, в которых
сосредоточены высокие концентрации переносчиков, благодаря че-
му не происходит резкого увеличения вязкости и коллоидного осмо-
тического давления циркулирующей крови.
Наиболее распространенным дыхательным пигментом является
гемоглобин, который содержится почти у всех групп животных, на-
чиная от простейших и кончая позвоночными. Близок по структуре
гемоглобину хлорокруорин. Он находится в крови некоторых коль-
чатых червей. В его состав входит железо, однако порфирин хлоро-
круорина отличается от протопорфирина гема тем, что винильная
группа у 2-го пиррольного кольца заменена на формильную.
В крови морских червей находится гемэритрин. Он встречается у
небольшого числа многощетинковых червей и у одной формы бра-
хиопод. Субъединицы этого белка обычно образуют октамеры, в
каждом мономере имеется активный центр, содержащий два атома
негемового Fe2+. В плазме крови многих моллюсков и членистоно-
гих находятся гемоцианины — синие медьсодержащие пигменты, не
имеющие гема.
126
2.5.4. Белки плазмы крови. Представители и функции.
Если кровь предохранить от свертывания и с помощью центрифуги-
рования осадить форменные элементы, то прозрачная светло-жел-
тая надосадочная жидкость будет представлять собой плазму кро-
ви. В процессе свертывания крови из плазменного белка фибрино-
гена образуются нити фибрина, которые вместе с форменными
элементами крови дают сгусток. Жидкая часть свернувшейся крови
называется сывороткой. Следовательно, плазма отличается от сы-
воротки наличием в ней белка фибриногена. На долю белков, ра-
створенных в плазме, приходится около 7% ее массы. С помощью
метода электрофореза в сыворотке было обнаружено пять главных
фракций белков: альбумин, на долю которого приходится 54—58%,
«1-глобулины — 6—7, «2-глобулины — 8—9, ргглобулины — 13—
14, у-глобулины— 11 —12%.
Методом электрофореза в крахмальном геле дополнительно об-
наруживаются фракции преальбумина, ^-липопротеина и трансфер-
рина. При иммуноэлектрофорезе выделяются также Pi-липопротеин,
«г и аз-липопротеины, гаптоглобин, церулоплазмин, LgG-глобулин.
Преальбумин. Содержание в плазме невысокое — 10—40 мг/
/100 мл. Его функция заключается в связывании и транспорте ти-
роксина и ретинолсвязывающего белка.
Сывороточный альбумин содержится в плазме в значительном
количестве — 3500—4500 мг/100 мл. Один из немногих белков плаз-
мы, которые не являются гликопротеинами.
Основные функции альбуминов — осмотическая регуляция и
транспорт. Осмотический эффект плазмы на 75—80% связан с аль-
бумином, так как из основных белков плазмы, где он составляет
более половины по массе, альбумин обладает наименьшей молеку-
лярной массой. Транспортная функция альбуминов проявляется в
переносе свободных жирных кислот из печени, билирубина в печень,
где он экскретируется с желчью, стероидных гормонов. Ряд лекар-
ственных препаратов, поступая в кровь, образуют прочные ком-
плексы с альбумином. Альбумин может принимать участие в уда-
лении ядовитых веществ, например тяжелых металлов. Альбуми-
нам отводится большая роль в азотистом обмене тканей, содержа-
ние их может служить показателем восполнения белковых запасов
организма.
а-Глобулины. Их обозначают как щ и аг-глобулины в зависи-
мости от электрофоретической подвижности. К си-глобулинам отно-
сятся: со-гликопротеин кислый (ретинолсвязывающий белок), си-ан-
титрипсин, транскортин (связывает ^транспортирует кортизол и
кортикостерон), тироксинсвязывающий белок. К аз-глобулинам от-
носятся: церулоплазмин, гаптоглобины, аз-макроглобулин и интер-
-а-трипсиновый ингибитор.
Церулоплазмин — основной медьсодержащий белок крови, отно-
сится к гликопротеинам, им^еет голубой цвет, на его долю прихо-
дится 3% меди, содержащейся в организме. Церулоплазмин участ-
вует в транспорте Си, в поддержании ее уровня в тканях, особенно
в печени. Церулоплазмин обладает ферментативными свойствами,
127
полиаминоксидазной и ферроксидазной активностью. Последняя
проявляется в катализе окисления Fe2+ в Fe3+. Важность этой реак-
ции состоит в том, что лишь Fe3+ может присоединяться к транс-
портирующему железо белку трансферрину.
Г аптоглобины (Нр). Это аг-глобулины гликопротеинового строе-
ний, способные связываться с гемоглобином, в результате повыша-
ется устойчивость последнего и увеличивается время его жизни —
в этом основная функция гаптоглобинов. Нр выполняют также не-
специфическую защитную функцию, комплексируясь с различными
белковыми и небелковыми веществами, появляющимися при рас-
паде клеток, защищают ткани от протеолиза, участвуют в процес-
сах детоксикации.
^-Глобулины. Это целый ряд белков, в том числе и липопротеи-
ны. Трансферрин (Tf), или сидерофелин, является главным компо-
нентом этой фракции. Он легко образует с Fe комплексное соедине-
ние, которое при определенных условиях также легко распадается.
Благодаря этому свойству трансферрин выполняет важную физио-
логическую функцию по переводу железа плазмы в депонирован-
ную форму и доставке его в костный мозг (где железо использует-
ся при кроветворении) и другие ткани, особенно ретикулоэндотели-
альной системы.
Гемопексин. Связывает гем, предотвращая выведение его с мо-
чой.
Липопротеины. Содержатся в плазме крови в количестве 700—
1100 мг/100 мл. В крови человека присутствуют несколько фракций
липопротеинов, отличающихся по плотности, что связано с различ-
ным соотношением липидного и белкового компонентов в молекуле.
Самая низкая плотность (менее 0,95 г-см“3) характерна для хило-
микронов, на долю липидов в них приходится около 98%. Хиломик-
роны — это капельки липидов, стабилизированные небольшим по-
верхностным слоем белков. Липиды здесь представлены в основном
триацилглицеринами (80%). Более высокую плотность имеют р-ли-
попротеины, их средняя молекулярная масса составляет 10 млн.
Эти липопротеины плазмы разделяют (в свою очередь) на пре-ли-
попротеины, или липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП),
и p-липоротеины, или липопротеины низкой плотности (ЛПНП).
Липопротеины плазмы с плотностью 1,06—1,20 г-см~3 называют
аглипопротеинами или липопротеинами высокой плотности
(ЛПВП), содержание липидов в них составляет примерно 65%.
Наименьшее количество липидов характерно для аа-липопротеинов,
липопротеинбв очень высокой плотности (ЛПОВП, плотность более
1,2 г-см”3). На долю липидов в них приходится 43%. а-Липопроте-
ины имеют молекулярную массу около 300 000, в них преобладают
фосфолипиды. Классификация липопротеинов плазмы условна, по-
скольку их состав и плотность изменяются в процессе транспорта
липидов к тканям.
Липопротеины крови представляют собой сферические частицы,
диаметр которых уменьшается с увеличением плотности. Ядро этих
частиц содержит неполярные липиды (триацилглицерины, эстери-
128
фицированный холестерин). Ядро окружено оболочкой, в состав
которой входят фосфолипиды, белок и свободный холестерин.
В настоящее время доказана роль некоторых фракций липопро-
теинов в патогенезе атеросклероза, они получили название атеро-
генных липопротеинов.
Атеросклероз возникает при значительном повышении в крови
фракции ЛПНП, а во многих случаях и ЛПОНП. Атеросклероз —
это липидное перерождение стенок артерий, образование бляшек,
сужение просвета. Хиломикроны не могут проникать в стенку со-
судов из-за своих больших размеров. ЛПВП имеют самый малень-
кий размер, легко проникают в стенку, но и легко удаляются из нее
в лимфу. Кроме того, в ЛПВП самый высокий процент белков и
фосфолипидов, в связи с чем они быстро метаболизируются в стен-
ке, не оседая в ней. Поэтому атерогенностью обладают ЛПНП и
ЛПОНП, они достаточно хорошо проникают в стенку и очень бога-
ты холестерином и триацилглицеринами (жирами), вызывающими
атеросклероз. Есть указания, что в регуляции содержания ЛПНП и
ЛПОНП в крови важнейшую роль играют белки — рецепторы
ЛПНП. Они располагаются на поверхности клеток организма и из-
влекают частицы ЛПНП из крови. Затем ЛПНП переходят внутрь
клеток, где холестерин освобождается и метаболизируется. Количе-
ство рецепторов может определяться как генетически, так и зави-
сеть от ряда других факторов.
Механизм свертывания крови. Биологические и биохи-
мические процессы, которые обеспечивают в организме предупреж-
дение и остановку кровотечений, называются гемостазом. Он осу-
ществляется следующими компонентами: 1) тромбоцитами, 2) со-
судистой стенкой, 3) плазменной ферментативной системой сверты-
вания. Последняя включает ряд веществ (факторы свертывания
крови), которые в соответствии с рекомендациями Международно-
го комитета по номенклатуре обозначают римскими цифрами (бук-
ва а рядом с номером фактора означает его активную форму). Ни-
же дана характеристика некоторых факторов свертывания.
Фактор I (фибриноген) присутствует в плазме крови теплокров-
ных в концентрации от 0,17 до 0,4 г/100 мл. Гликопротеин, у кото-
рого три пары неидентичных полипептидных цепей соединены ди*
сульфидными мостиками. Синтезируется в печени.
Фактор II (протромбин) — гликопротеин, играющий централь-
ную роль в свертывании крови. Представляет собой профермент
тромбина (факторПа).
Фактор На (тромбин) относится к сериновым протеиназам.
Осуществляет путем расщепления пептидных связей преобразова-
ние фибриногена в фибрин и превращение фактора XIII в фактор
ХШа.
Фактор XII является ключевым ферментом внутренней активи-
рующей системы протромбина, имеет гликопротеиновое строение.
Активация фактора XII, осуществляемая путем его адсорбции на
поверхностях иных, нежели нормальная эндотелиальная выстилка
кровеносных сосудов, служит пусковым механизмом для цепной ре-
5-937
129
акции последовательной активации ряда специфических протеиназ
гемокоагуляционной системы.
Фактор XIII является проферментом трансглутаминазы. Пос-
ле перехода в активную форму (ХШа) катализирует синтез кова-
лентных связей, соединяющих между собой мономерные единицы
в фибрине. При этом растворимый фибрин S переходит в нераство-
римый фибрин I.
Калликреин-кининовая система участвует в активации началь-
ных этапов свертывания крови и в формировании «калликреиново-
го моста» между факторами ХПа и VII (рис. 2.22).
Важнейшими кининами плазмы являются пептиды брадикинин,
каллидин и метиониллизил-брадикинин (см. разд. 2.5.1). Субстра-
ты, из которых высвобождаются кинины, называются кининогена-
Внутренний механизм	Внешний механизм
Фибрин-мономер —Фибрин Фибрин Г
Рис. 2.22. Каскадно-комплексная схема свертывания крови:
фибрин S и фибрин I — растворимый и нерастворимый фибрин, а —
активированные факторы, пф — пластиночный фактор
130
ми. Они представляют собой белки, связанные в плазме крови с
а2-глобулиновой фракцией. Образование кининов из кининогенов
происходит при участии специфических ферментов — калликреи-
нов, являющихся протеиназами типа трипсина.
Участие тромбоцитов в гемостазе определяется основными
функциями этих клеток: а) ангиотрофической, т. е. способностью
поддерживать нормальную структуру и функцию микрососудов
(диаметр до 100 мкм); б) способностью образовывать в повреж-
денных сосудах первичную тромбоцитарную пробку (адгезивно-
агрегационная функция); в) способностью поддерживать спазм
поврежденных сосудов; г) участием в свертывании крови и инги-
бирующим влиянием на фибринолиз. Если повреждение сосуда не-
большое, тромбоцитарная пробка может остановить кровотечение.
Тромбоциты периодически смыкаются с эндотелиальными
клетками и «изливают» в них свое содержимое, являются естест-
венными «кормильцами» эндотелия. Последний не в состоянии из-
влекать ряд необходимых ему веществ прямо из плазмы.
Формирование тромбоцитарной пробки начинается с приклеива-
ния (адгезии) тромбоцитов к субэндотелиальным структурам сосу-
дистой стенки. Коллаген сосудистой стенки — главный стимулятор
этого процесса. Тромбоциты, интенсивно склеиваясь друг с дру-
гом, образуют агрегаты. Одним из агрегирующих агентов является
тромбин. Он вызывает агрегацию тромбоцитов, будучи в дозах, в
несколько раз меньших, чем те, что необходимы для свертывания
крови. Поэтому формирование тромбоцитарной пробки опережа-
ет свертывание крови.
В настоящее время свертывание крови рассматривают как
многоэтапный каскадный ферментативный процесс, в котором по-
следовательно активируются проферменты и действуют механизмы
аутокатализа, функционирующие как сверху вниз, так и в направ-
лении «обратной связи». В последние годы выяснилось, что на раз-
ных этапах процесса свертывания образуются белково-липидные
комплексы, в составе которых активируются ферментные факторы.
Неферментные компоненты этих комплексов ускоряют процесс и
обеспечивают специфичность действия коагулирующих ферментов
путем создания дополнительных мест связывания в комплексах
фермент-субстрат. Каскадно-комплексная схема свертывания кро-
ви включает четыре типа комплексов.
Комплекс 1: факторы ХПа + XI + фосфолипид = активатор
фактора II.
Комплекс 1а: фактор 111 +фактор VII + Са2+=активатор факто-
ра X (внешний механизм).
Комплекс 2: факторы IXa + VIII + Са2++ фосфолипид = акти-
ватор фактора X (внутренний механизм).
Комплекс 3: факторы Ха + V + Са2+ + фосфолипид = активатор
протромбина (протромбиназа).
Свертывание осуществляется с помощью двух механизмов, тес-
но связанных между собой, — внешнего и внутреннего (рис. 2.22).
Внешний механизм свертывания запускается тканевым тромбо-
5*
131
пластическим фактором (фактор III), который взаимодействует с
фактором VII и при участии Са2+ образует комплекс 1а (активатор
фактора X). Последний, будучи составной частью комплекса 3,
трансформирует фактор II в фактор Па.
Внутренний механизм свертывания запускается без добавления
извне тканевого тромбопластина, т. е. за счет внутренних ресурсов
крови или плазмы. Запуск внутреннего механизма начинается с
активации фактора XII. Активация этого фактора может осущест-
вляться коллагеном поврежденной сосудистой стенки, измененны-
ми клеточными мембранами, некоторыми протеазами, адренали-
ном. Вне организма активация фактора XII наступает от контакта
с чужеродными поверхностями — стеклом, иглами и т. д. Вслед за
фактором XII последовательно активируются факторы XI (в со-
ставе комплекса 7), IX и VIII. Последние входят в состав комплек-
са 2, который активирует фактор X, т. е. опять-таки приводит к
формированию протромбиназной активности, необходимой для
превращения протромбина в тромбин. Тромбин (Па) и фактор
XIII необходимы для превращения фибриногена в фибрин, образо-
вания сгустка крови.
Этот процесс состоит из трех стадий. Молекула фибриногена
содержит три пары неидентичных полипептидных цепей, соединен-
ных дисульфидными мостиками (2аА, 2рВ, 2у). В первую, протео-
литическую, стадию тромбин отщепляет фибринопептиды А от
а (А)-цепей и фибринопептиды В от р (В)-цепей, оставляя соответ-
ственно а- и p-цепи, входящие в состав образующегося фибрин-
мономера. Таким образом, полипептидная формула фибрин-моно-
мера (а, р, у)2. В следующую, полимеризационную, стадию моно-
мерные молекулы соединяются друг с другом «бок о бок» и «ко-
нец в конец», формируя сеть фибрина с полипептидной формулой
(а, р, у)п- В последнюю, стабилизационную, стадию фибриновая
сеть стабилизируется ковалентными связями под действием фер-
мента, образующегося из фактора XIII.
Ферментная система, обеспечивающая лизис фибрина в кровя-
ном русле, получила название фибринолитической или плазмино-
вой системы. Этот лизис осуществляется фибринолизином, или плаз-
мином, который находится в плазме крови в виде профермента
плазминогена в концентрации около 20 мг%. Активаторами плаз-
миногена служат протеиназы, в том числе змеиного яда, стрепто-
киназа из гемолитического стрептококка. Физиологическим акти-
ватором является урокиназа. Плазмин гидролизует в фибрине пеп-
тидные связи, образованные арг и лиз.
Антикоагулянты — вещества, предупреждающие процесс свер-
тывания крови. Их можно разделить на две основные группы: фи-
зиологические и нефизиологические. К первым относятся гепарин,
антитромбины, антитромбопластины и др. К нефизиологическим
антикоагулянтам относят вещества, осаждающие Са2+ из плазмы
(оксалаты, цитраты), антивитамины К (производные кумаринов),
биологические яды (змей, пиявок), воздействие физико-химиче-
ских условий (/°, ультразвук и т. д.).
ГЛАВА 3
ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Ферменты, пли энзимы, — это катализаторы белковой приро-
ды, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах
(фермент от лат. fermentum — закваска; энзим от греч. эн — в,
внутри, зиме — закваска). Происхождение терминов связано с
тем, что первоначально ферментативные процессы были открыты
и изучены в бродильном производстве.
В настоящее время большое внимание уделяют исследованию
строения, механизма функционирования ферментов, путей регуля-
ции ферментативной активности. Такой интерес к биологическим
катализаторам не случаен. Ферменты являются важнейшими ком-
понентами клетки, они теснейшим образом связаны с разнообраз-
ными процессами жизнедеятельности. Совокупность биохимических
реакций, катализируемых ферментами, составляет сущность обме-
на веществ, являющегося отличительной чертой всех живых орга-
низмов. Через ферментативный аппарат, регуляцию его активности
происходит и регуляция скорости метаболических реакций, их
направленности.
Изучение ферментов важно для медицины, промышленности,
сельского хозяйства. Установлено, что многие заболевания челове-
ка связаны с нарушением деятельности ферментов, при некоторых
заболеваниях ферментативные препараты применяются как лекар-
ственные средства. Технология ряда отраслей промышленности
(пищевая, текстильная и др.) также предусматривает использова-
ние ферментов. Ферменты — необходимые реагенты в научных ис-
следованиях.
3.1.	Общие и специфические свойства
ферментов
Являясь катализаторами — веществами, ускоряющими реак-
ции, ферменты имеют ряд общих свойств с химическими, небиоло-
гическими катализаторами.
1.	Ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции и
выходят из реакции в первоначальном виде. Они не расходуются
в процессе катализа.
2.	Ферменты не могут возбудить реакций, противоречащих за-
конам термодинамики, они ускоряют только те реакции, которые
могут протекать и без них.
133
3.	Ферменты, как правило, не смещают положения равновесия
реакции, а лишь ускоряют его достижение.
Для ферментов характерны и специфические свойства, отли-
чающие их от химических катализаторов, выражающих их биоло-
гическую природу.
1.	По химическому строению молекулы все ферменты являются
белками.
2.	Эффективность ферментов выше, чем небиологических ката-
лизаторов (скорость протекания реакции при участии фермента на
несколько порядков выше, чем при участии химических катализа-
торов) .
3.	Ферменты обладают узкой специфичностью, избирательно-
стью действия на субстраты, г. е. на вещества, превращение которых
они катализируют.
4.	Одним из важнейших свойств ферментов как биокатализато-
ров является их регулируемость. Через регуляцию ферментативно-
го аппарата осуществляется скоординированность всех метаболи-
ческих процессов во времени и пространстве, направленная на вос-
произведение живой материи, поддержание постоянства внутри-
клеточной среды, на приспособление к меняющимся внешним ус-
ловиям (см. разд. 12.5).
5.	При ферментативных реакциях в отличие от неферментатив-
ных наблюдаются лишь незначительные, побочные процессы, для
ферментативных реакций характерен почти 100% выход про-
дуктов.
3.2.	Общие принципы строения ферментов
До начала XX столетия сведений относительно химической при-
роды ферментов было очень мало, но уже тогда высказывались
предположения о белковой природе ферментов. Такой точки зре-
ния придерживался профессор Московского университета
Н. Е. Лясковский, позднее аналогичное мнение высказывали ака-
демик И. П. Павлов, немецкий химик Э. Фишер и др., однако экс-
периментального подтверждения эти предположения не имели.
Иной взгляд был у известного немецкого химика Р. Вильштеттера,
добившегося больших успехов в выделении и очистке ферментов.
Изучая свойства выделенных ферментов, Р. Вилыптеттер пришел
к выводу, что они относятся к особому классу веществ и состоят
из двух компонентов: низкомолекулярной активной части (агон) и
высокомолекулярного носителя (ферон).
В 20—30-х годах XX столетия стало появляться все больше
данных, свидетельствующих о том, что ферменты — это белки.
В 1926 г. Д. Самнером (США) из семян канавалии был выделен
фермент уреаза в виде кристаллического белка. Несколько позже
в 1931 г. Д. Нортроп (США) получил кристаллический пепсин.
Этими работами была окончательно доказана белковая природа
ферментов. Признанием больших заслуг Д. Самнера и Д. Нортро-
134
па в области энзимологии было присуждение им в 1946 г. Нобелев-
ской премии.
Относительная молекулярная масса белков, обладающих фер-
ментативными свойствами, колеблется от 15 тысяч до нескольких
миллионов. Для ферментативных белков характерны те же физи-
ко-химические свойства, что и для белков, не наделенных этими
функциями. Ферменты являются глобулярными белками, их моле-
кулы могут быть представлены как простыми, так и сложными
белками. В первом случае ферменты называют однокомпонентны-
ми, во втором — двухкомпонентными.
Белковая часть двухкомпонентных ферментов называется апо-
ферментом, а молекула в целом — холоферментом. Небелковые
компоненты, легко диссоциирующие из комплекса с ферментатив-
ным белком, принято называть коферментами. Они действуют как
акцепторы (или доноры) атомов или функциональных групп, уда-
ляющихся от субстрата (или присоединяющихся к нему). В связи
с этим считают, что более правильно рассматривать коферменты
как косубстраты. Это хорошо видно из следующих реакций (Е —
фермент, К — кофермент, АН2, В — субстраты):
Е-К + АН2^А + ЕКН2
Е'.КН3 +В^Е'-К + ВН2
Прежде чем сможет окислиться новая молекула АН2, кофермент
КН2 должен возвратиться в исходное состояние К. Это осуществля-
ется при участии другого фермента Е', на который переходит вос-
становленный кофермент.
Если небелковая часть фермента прочно связана с белком и в
цикле биохимических реакций не отсоединяется от него, ее при-
нято называть простетической группой. Однако резкой границы
между коферментами и простетическими группами не существует,
степень прочности связи ферментативных белков с небелковыми
компонентами широко варьирует.
Небелковые компоненты ферментативной молекулы принято
называть также кофакторами. Соединение белковой части фермен-
та и небелковой может осуществляться за счет ионных, водородных
связей, гидрофобных взаимодействий, реже — с помощью кова-
лентных связей.
Функциями коферментов и простетических групп являются:
1) участие в акте катализа, 2) осуществление контакта между фер-
ментативным белком и субстратом, 3) стабилизация апофермента.
Апофермент, в свою очередь, усиливает каталитическую активность
небелковой части и, кроме того, определяет специфичность дейст-
вия ферментов, поскольку одна и та же по химизму небелковая
часть может функционировать в составе различных ферментов.
Например, НАД+ является коферментом многих дегидрогеназ —
лактатдегидрогеназы (ЛДГ), ^малатдегидрогеназы (МДГ) и др.;
они отличаются апоферментной, белковой частью молекулы.
135
3.3.	Активный центр
Рис. 3.1. Активный центр фер-
мента:
а—группировки каталитической зо-
ны, б — группировки зоны связыва-
ния
В ходе ферментативных реакций осуществляется контакт меж-
ду ферментом и субстратом, образуются промежуточные фермент-
субстратные комплексы (ES). Та область ферментативной молеку-
лы, в которой происходит связывание и превращение субстрата,
называется активным центром (на его долю обычно приходится
лишь небольшая часть молекулы). Ак-
тивный центр образуется определен-
ными боковыми радикалами аминокис-
лотных остатков полипептидной цепи,
а в двухкомпонентных ферментах в
него входят и некоторые группировки
небелковой части. У ферментов, имею-
щих четвертичную структуру, число ак-
тивных центров, как правило, совпада-
ет с числом субъединиц.
Активный центр функционально не-
однороден, в нем условно выделяют
несколько зон. Тс группировки актив-
ного центра, которые контактируют с
подвергающимися превращению фраг-
ментами молекул субстрата, т. е. при-
нимают непосредственное участие в
синтезе или расщеплении связи суб-
страта, входят в каталитическую вону. Группировки, контактирую-
щие с непревращаемыми фрагментами субстрата, и укрепляющие
его в активном центре, относятся к зоне гвчвыванпя (рис. 3.1).
Связывание субстрата, как правило, многоточечное, оно осуще-
ствляется при участии нескольких группировок ферментативной
молекулы и субстрата. В молекуле фермента существуют также
остатки аминокислот, которые не имеют прямых контактов с суб-
стратом, но способствуют катализу, фиксируя группировки ката-
литической зоны в активном состоянии.
Наиболее часто в состав активных центров входят такие амино-
кислоты, как сер, гис, тре, цис, глу, асп, арг. Аминокислоты, обра-
зующие активный центр, по длине полипептидной цепи находятся
далеко друг от друга и оказываются сближенными при формирова-
нии пространственной структуры. Например, в активный центр хи-
мотрипсина входят гис — 57, асп — 102, сер— 195, всего фермент
состоит из 246 аминокислотных остатков. Химотрипсин, как и не-
которые другие, в основном секретируемые ферменты, образуется
сначала в неактивной форме, в форме профермента (зимоген) —
химотрипсиногена.. Химотрипсиноген не имеет окончательно сфор-
мированного активного центра и не способен активно катализиро-
вать свойственные ферменту реакции. При активации химотрипси-
ногена под действием трипсина и химотрипсина гидролизуются че-
тыре пептидные связи, в результате чего выщепляются дипептиды
14—15 и 147—148 (рис. 3.2), происходит окончательное формиро-
136
Tup -146
Химотрипсин —
Zpe-147	<'S-S)4
А сн -148
Химотрипсин-----
лла-149	8
Иле 16
---------Трипсин
Лрг-15
I
Сер-14
f-*----Химотрипсин
Лей-13
соон nh2
Химотрипсиноген
Тир СООН
Тре-147-Лсн-148
Илет2
Арг-15-Сер~14
(S~S)4
ЛлаЫН2 S
----А сн	L \ис —
соон nh2
а-Химотрипсин
Лей СООН
Рис. 3.2. Активация химотрипсиногена (одна полипептидная
цепь).
Образующийся d-химотрипсин состоит из трех цепей, соединенных ди-
сульфидными связями
ванне активного центра, сближение 57-й, 102-и и 195-й аминокис*
лот, участвующих непосредственно в акте катализа (см. рис. 3.7).
Для многих ферментов сейчас известны аминокислоты, образую-
щие активный центр, а также выполняемая ими функция в ката-
лизе Заключение о нахождении тех или иных аминокислотных
остатков ферментативной молекулы в активном центре можно сде-
лать изучая кинетику ферментативных реакций и применяя специ-
фические реагенты на определенные группировки. Специфические
реагенты подобраны для таких аминокислот, как три (N-бромсук-
цинимид) цис (органические производные ртути, например р-хлор-
меркурибензоат — ПХМБ, монойодуксусная кислота), сер (диизо-
пропилфторфосфат - ДИФФ) и ряда других.
Сведения о функциональных группах активного центра позво-
ляет получить и применение протеолитических ферментов, расщеп-
137
ляющих избирательно пептидные связи в ферментативной молеку-
ле. Ценную информацию дает сравнение пространственных струк-
тур фермента в отсутствие и присутствии ингибиторов в совокуп-
ности с информацией о первичной структуре.
Активные центры ферментов расположены в углублениях на
поверхности ферментативной молекулы (рис. 3.3). Например, у
Рис. 3.3. Модель молекулы фермента. А — третичная структура
молекулы; Б — силуэт молекулы с активным центром (в рамке)
многих дегидрогеназ активные центры находятся во впадине меж-
ду двумя доменами. Микросреда активного центра отличается от
остального окружения фермента более низкой диэлектрической
проницаемостью, приближающейся к таковой для некоторых орга-
нических растворителей. Среда с пониженной диэлектрической про-
ницаемостью является более благоприятной по сравнению с водой
для протекания реакций с переносом заряда, которые характерны
для работы большого числа ферментов. Кроме указанной особен-
ности, микросреда активного центра характеризуется повышенной
микровязкостью, что ограничивает свободу вращательного движе-
ния группировок активного центра. Если фермент двухкомпонен-
тен, то его активный центр достраивается после взаимодействия
апофермента с небелковой частью. Показано, например, что пиру-
ват — субстрат фермента лактатдегидрогеназы не связывается
ферментом до тех пор, пока не образуется комплекс между апо-
ферментом и НАДН. Следовательно, пируватсвязывающий центр
на поверхности фермента возникает после присоединения НАДН
вследствие изменения конформации, а возможно, и заряда в этом
участке белковой молекулы.
Индивидуальные особенности строения активных центров раз-
личных ферментов обусловливают специфичность их действия.
Специфичность ферментов может быть абсолютной и относитель-
ной. В случае абсолютной специфичности ферменты катализируют
превращение только одного вещества, в случае относительной —
138
небольшой группы близких по свойствам веществ. Примерами
ферментов с абсолютной специфичностью являются уреаза, сукци-
натдегидрогеназа (СДГ):
О
Н	Уреаза
H2N—С—NH2 + Н2О------> 2NH3 + СО2
Мочевина
К ферментам с относительной специфичностью относятся эсте-
разы, расщепляющие обширный ряд эфиров карбоновых кислот;
некоторые фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кисло-
ты; пептидазы и протеиназы, гидролизующие пептиды и белки.
Относительная специфичность протеиназ выражается также и
в том, что они расщепляют большое число различных белков.
У ряда ферментов это сочетается со способностью гидролизовать
только определенные пептидные связи в субстрате, что объясняет-
ся особенностями строения их активных центров. Так, различие в
селективности действия трипсина, химотрипсина и эластазы обус-
ловлено небольшими изменениями в строении того участка актив-
ного центра, куда попадает боковая цепь аминокислоты расщеп-
ляемого субстрата.
В химотрипсине этот участок («карман») приспособлен к свя-
зыванию больших гидрофобных радикалов (фен, тир, три), в трип-
сине — положительно заряженных группировок, так как на дне
«кармана» активного центра фермента находится отрицательно за-
ряженная СООН-группа асп — 189. В эластазе (гидролизует бел-
ки по ала) у входа в «карман» вместо двух гли, как в химотрип-
сине, находятся вал и тре, предотвращающие попадание туда боль-
ших боковых радикалов субстрата.
Подобным же образом объясняются различия в специфичности
действия карбоксипептидаз А и В. Оба фермента гидролизуют
белки с С-конца, первый отщепляет с наибольшей скоростью С-
концевые ароматические аминокислоты (тир, три, фен), второй —
преимущественно лиз и арг. Основное различие этих ферментов
заключается в том, что связывающий остаток в «кармане» карбок-
сипептидазы А — иле — 255, а в В — асп — 255, что и определяет
сродство к различным С-концевым аминокислотным остаткам.
Кроме химической специфичности некоторые ферменты обнару-
живают и стерическую специфичность. Такие ферменты различают
стереоизомеры и катализируют превращение только одного из
них: D- или L-, а- или £»-, цис- или транс-. Например, существуют
а- и р-гликозидазы, гидролизующие только один из видов глико-
зидов. Фумарат-гидратаза действует лишь на фумарат (транс-
изомер) и не превращает малеинат (цис-изомер). При дегидрата-
ции малата (эта реакция протекает в цикле трикарбоновых кис-
лот) образуется только фумарат:
НООС—СН	фумарат- СН(ОН) СООН
И	+ Н2О	t I
СН—СООН	гидратаза СН2СООН
Фумарат	Малат
139
3.4.	Строение и функции отдельных коферментов
и простетических групп
В качестве небелковых частей ферментов может функциониро-
вать большое число органических и неорганических (ионы метал-
лов) веществ. Все их разнообразие принято условно делить на
группы. Существует несколько различных принципов классифика-
ции небелковых частей. По химизму они могут быть условно под-
разделены на 4 группы: 1) нуклеотидного типа строения, 2) вита-
мины и их производные, 3) металлы и металлсодержащие небел-
ковые части, 4) другие небелковые части. Небелковые компоненты
ферментов имеют сравнительно небольшую молекулярную массу
и в отличие от апофермента являются гермостабильными.
3.4.1.	Небелковые части нуклеотидного типа строения.
Никотинамидные коферменты. К никотинамидным
коферментам относятся НАД+ (никотинамидадениндинуклеотид)
и НАДФ+ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Молекулы
НАД+ и НАДФ+ состоят из двух гетероциклов — пиридинового и
пуринового, соединенных цепочкой из двух остатков моносахари-
да рибозы и остатка пирофосфорной кислоты.
В составе этих коферментов содержится витамин РР, поэтому
они могут быть отнесены и к группе коферментов — производных
витаминов. НАДФ+ отличается от НАД+ тем, что содержит еще
один остаток ортофосфата, связанный с С—2 рибозы аденозиновой
части. НАД+ и НАДФ+ — типичные коферменты, так как непрочно
140
Tup -85
Рис. 3.4. Связывание НАД+ и L-лактата (окружены волнистой линией) в актив-
ном центре лактатдегидрогеназы
связаны с белком и в цикле биохимических реакций переходят от
одного фермента к другому.
Никотинамидные коферменты функционируют в составе боль-
шого числа дегидрогеназ. Кофермент связан с белком за счет
электростатических связей и гидрофобных взаимодействий
(рис. 3.4). НАД+- и НАДФ+-содержащие дегидрогеназы катализи-
руют перенос гидрид-иона (Н~) от субстрата к никотинамидной
части молекулы кофермента, при этом в среду переходит протон:
Восстановленные НАД и НАДФ не имеют заряда на азоте пи-
ридинового кольца и содержат присоединенный от субстрата водо-
род в пиридиновом кольце в положении 4. Образовавшиеся в ре-
зультате переноса гидрид-иона НАДН и НАДФН теряют сродство
к апоферменту и отделяются от дегидрогеназы. Восстановленные
коферменты затем окисляются путем переноса электронов и про-
тонов к акцептору, связанному со вторым ферментом. Таким обра-
141
зом, НАД* и НАДН, так же как НАДФ+ и НАДФН, функциони-
руют циклически и принимают участие в дисмутациях, т. е. в вос-
ставлении одного метаболита другим.
В живых организмах большая часть НАД находится в окислен-
ной форме, а НАДФ — в восстановленной, что связано с различ-
ной ролью этих коферментов в метаболизме. Окислительно-вос-
становительные ферменты, участвующие в снабжении клетки
энергией, являются НАД+-зависимыми, а ферменты, катализирую-
щие реакции восстановительных синтезов, используют НАДФН.
НАДФН требуется для восстановительного биосинтеза большинст-
ва клеточных компонентов; в растениях он участвует и в синтезе
глюкозы из СО2 за счет световой энергии. Меньшую роль в про-
цессах биосинтеза играет НАДН.
Переход НАД+ и НАДФ+ в восстановленное состояние сопро-
вождается изменением спектра поглощения в УФ-области. Если
окисленные формы коферментов имеют одну узкую полосу погло-
щения с максимумом при 260 нм, то у восстановленных появляется
еще один пик с максимумом при 340 нм. На этом свойстве нико-
тинамидных коферментов основан широко распространенный метод
спектрофотометрического определения активности НАД+- и
НАДФ+-зависимых дегидрогеназ.
НАД+- и НАДФ+-зависимые дегидрогеназы встречаются у всех
живых организмов, такая универсальность их распространения
свидетельствует о единстве основных путей метаболизма в живой
природе. НАД+- и НАДФ+-зависимые дегидрогеназы катализиру-
ют обратимые реакции дегидрирования спиртов, гидроксикислот,
аминокислот. Хорошо изученными к настоящему времени дегид-
рогеназами являются ЛДГ (лактатдегидрогеназа), МДГ (малат-
дегидрогеназа), АДГ (алкогольдегидрогеназа), глицеральдегид-
фосфатдегидрогеназа.
Все указанные выше дегидрогеназы имеют сходный белковый
фрагмент, состоящий из шести параллельных 0-цепей и нескольких
а-спиральных участков. Именно этот фрагмент связывает кофер-
мент и называется НА Довязывающим доменом. Для дегидроге-
наз характерно наличие четвертичной структуры; димерами, в
частности, являются МДГ, АДГ, тетрамером — ЛДГ.
В настоящее время показано, что НАД+ как кофермент участ-
вует и в таких реакциях, где не используются его окислительно-
восстановительные свойства, например, он необходим при работе
ДНК-лигазы из Е. coll, катализирующей образование фосфоди-
эфирной связи.
Флавиновые простетические группы. К этой груп-
пе принадлежат ФМН (флавинмононуклеотид) и ФАД (флавин-
адениндинуклеотид). Оба эти соединения можно одновременно
рассматривать и как производные витамина В2 (рибофла-
вин).
Флавинмононуклеотид (ФМН)—зН
АМФ
ФМН не является типичным нуклеотидом, так как содержит не
рибозу, а спирт рибит, не образующий гликозидной связи. Азотис-
тым основанием служит демитилизоаллоксазин, не относящийся к
производным пурина или пиримидина. Оба флавиновых нуклеотида
прочно связаны с белковыми частями ферментов, иногда даже ко-
валентно, поэтому их называют простетическими группами.
ФМН и ФАД функционируют в составе ряда окислительно-вос-
становительных ферментов (флавопротеинов). В настоящее время
известно около 80 флавиновых ферментов, большинство из них в
качестве небелковой части содержит ФАД. Рабочей частью флави-
нов является изоаллоксазиновое кольцо, способное в окисленной
форме принимать на себя два атома водорода.
Окисленные флавопротеины имеют три максимума поглощения:
при 280, 350—380 и 450 нм. При восстановлении почти полностью
исчезает полоса поглощения в видимой области спектра (450 нм),
обусловливающая желтую окраску флавопротеинов, кроме того,
происходит частичное уменьшение поглощения при 280 и 350—
380 нм.
Флавопротеины катализируют разнообразные окислительно-вос-
становительные реакции: окисление полуацеталей в лактоны, спир-
тов в альдегиды, аминов в имины, насыщенных карбонильных
соединений в а,^-ненасыщенные, НАДН и НАДФН в НАД+ и
НАДФ+ (ФАД и ФМН — более сильные окислители, чем нико-
тинамидные коферменты). Примером этих реакций является
окисление глюкозы при участии глюкозооксидазы в глюконовую
кислоту.
143
соон
D-Глюкоза
(полуацеталь)
Й—с—он
I
но—с—н
н—с—он
н—с—он
сн2он
Лактон глюконовой	D-Глюконовая
кислоты
кислота
Глюкозооксидаза, как и некоторые другие флавопротеины, ауто-
оксидабельна, т. е. способна передавать отщепляемый от субстрата
водород непосредственно на молекулярный кислород, минуя цепь
переноса электронов с образованием пероксида воророда, такие
ферменты относятся к оксидазам,..,
ФАД(ФМН)Н, ФАД (ФМН)
о2
н2о2
Образующийся Н2О2 или используется в качестве окислителя не-
сколькими пероксидазами или расщепляется каталазой.
Другие флавиновые ферменты представлены дегидрогеназами,
которые передают электроны и протоны от окисляемых веществ
промежуточным переносчикам (см. разд. 7.3.1). а,£-Дегидрирова-
ние при участии флавиновых ферментов протекает, например, при
окислении янтарной кислоты в фумаровую в цикле трикарбоновых
кислот (ЦТК) и катализируется сукцинатдегидрогеназой'ДСДГ).
СДГ отщепляет водород непосредственно ст окисляемого веще-
ства, она является первичной дегидрогеназой. Среди флавопротеи-
нов имеются и вторичные дегидрогеназы, они принимают водород
от НАДН и НАДФН, образовавшихся в результате действия пер-
вичных НАД+ и НАДФ+-зависимых дегидрогеназ. В составе фла-
вопротеинов может содержаться металл (металлофлавопротеины),
гем, железосероцентры. В таких сложных флавопротеинах на одном
белке находится целая миниатюрная электронпереносящая систе-
ма. К металлофлавопротеинам относятся, в частности, альдегидок-
сидаза, ксантиноксидаза. Последняя катализирует окисление не
только гипоксантина, но и альдегидов.
'Г	Альдегид-	и л
R-<H + Н1° + °2	~ \он 2 2
Гипоксантин
144
Ксантиноксидаза является димером (М~ 275 000), содержит две
молекулы ФАД, два атома Мо и восемь атомов Fe. Ксантинокси-
даза относится к железосерным белкам. Альдегидоксидаза катали-
зирует только реакцию окисления альдегидов и имеет очень сход-
ное с ксантиноксидазой строение. В железосерных белках атомы
Fe связаны с SH-группами цис. К флавинсодержащим железосер-
ным белкам принадлежат и сукцинатдегидрогеназа, нитратредук-
таза, нитритредуктаза.
Нуклеозидтрифосфаты и НДФС. АТФ и другие ну-
клеозидтрифосфаты (ГТФ, УТФ, ЦТФ) являются коферментами
фосфотрансфераз, катализирующих перенос фосфатного остатка
от нуклеозидтрифосфатов на другие соединения с активацией по-
следних (см. разд. 3.10). В некоторых случаях активация осуще-
ствляется путем переноса пирофосфатной, аденозиновой или аде-
нозинмонофосфатной части молекулы АТФ. Например, перенос
пирофосфата — двух фосфатных остатков от АТФ — имеет место
при образовании тиаминдифосфата (ТДФ) — фосфорилированной
формы витамина Bi (см. разд. 10.3), перенос аденозинмонофосфа-
та (АМФ) — в процессе активации аминокислот при биосинтезе
белка (см. разд,’5.3.2), перенос аденозильного остатка (аденин —
рибоза) осуществляется на соединения типа R — S — СН3, в
частности, на аминокислоту метионин. Последняя реакция приво-
дит к синтезу активной формы метионина: S-аденозилметионина,
у которого метильная группа обладает повышенной реакционной
способностью.
НООС—CHNH2—(CH2)2—-S—СН3 + АТФ + Н2О
Метионин
НООС—CHNH2—(СН2)2—S+—СН3 + Н3РО4 + Н4Р2О7
аденозин
S-Аденозилметионин
Нуклеозиддифосфатсахара (НДФС) участвуют как коферменты
гликозилтрансфераз в реакциях переноса моносахаридных остат-
ков при биосинтезе олиго- и полисахаридов (см. разд. 6.6.3).
Кофермент ацетилирования — коэнзим А(КоА).
Строение КоА
145
Нуклеотидная часть в КоА служит «ручкой», с помощью кото-
рой кофермент присоединяется к белку, другая часть молекулы,
имеющая длину 1,9 нм, оканчивается важной для функционирова-
ния SH-группой.
Для КоА наиболее характерно участие в реакциях активации и
переноса ацетильных групп, однако он может осуществлять пере-
нос и других кислотных групп, поэтому его еще называют кофер-
ментом ацилирования. Ацильные группы присоединяются к сере в
составе КоА, богатой энергией тиоэфирной связью. Кислотный ос-
таток при этом активируется. Синтез ацетилкоэнзима А (ацетил-
КоА) из ацетата и КоА происходит у млекопитающих в печени и
нервной ткани за счет энергии АТФ, при участии фермента ацетат-
тиокиназы.
КоА входит в состав пируватдегидрогеназной и а-кетоглутарат-
дегидрогеназной систем, катализирующих процесс окислительного
декарбоксилирования соответствующих кетокислот. Как кофер-
мент КоА действует и в составе тиокиназы жирных кислот, осуще-
ствляющей реакцию их активации перед p-расщеплением (см. разд.
В.8.2). Ацетил-КоА в свою очередь является коферментом ацетил-
трансфераз, катализирующих реакции биологического ацетилиро-
вания, присоединения ацетильных групп (СН3СО—) к другим мо-
лекулам. Ацетил-КоА участвует в таких биохимических процессах,
как синтез жирных кислот и стероидов из углеводов, осуществляет
ацетилирование при синтезе ацетилхолина и ацетиламиносахаров,
3.4.2.	Металлы и металлсодержащие небелковые части. Фер-
менты, функционирующие в форме комплексов разной степени
прочности с металлом, называются металлоферментами. По проч-
ности связи металлов с белками их условно разделяют на истин-
ные металлофермеиты и ферменты, активируемые металлами. Ис-
тинные металлофермеиты содержат прочно связанный металл, не
отделяющийся от апофермента при очистке, и характеризуются
довольно четкой специфичностью по отношению к металлу. В фер-
ментах, активируемых металлами, металл непрочно связан с бел-
ком, легко отделяется от него частично или полностью в процессе
очистки; специфичность к металлу, как правило, плохо выражена.
В настоящее время известно около ста ферментов, которые
должны быть отнесены к истинным металлоферментам. Наиболее
часто в состав ферментов, так же как и других металлопротеинов,
входят Zn, Си, Fe, Мо. Ионы металлов, находящиеся в активных
центрах ферментативных молекул, могут участвовать в акте ката-
лиза, служить связующим мостиком между ферментом и субстра-
том, участвовать в образовании комплекса фермент-кофермент.
Если ион металла находится вне активного центра фермента, то он
поддерживает третичную и четвертичную структуры фермента.
Ионы металлов в истинных металлоферментах связаны с опре-
деленными группами белка (лигандами) координационными свя-
зями, образуя комплексы. Прочные комплексы с азотсодержащими
лигандами дают ионы Cu2+, Со2+, Ni2*, Fe2+. Помимо атомов азота
ионы переходных металлов хорошо связываются и с серой (Zn2+,
146
Cu2+, Fe2+ и др.). Ионы Са и Mg связываются в белках преимуще-
ственно с такими лигандами, как фосфатные и карбоксилатные ио-
ны. Предполагают наличие в белковых молекулах специфических
участков и для присоединения щелочных металлов К+ и Na+, хотя
в клетке они в основном присутствуют в свободном виде.
Ниже даны примеры истинных металлоферментов, некоторые
сведения об их строении и выполняемой металлом функции. Ши-
роко распространены в растениях аскорбатоксидаза и полифено-
локсидаза (тирозиназа). Первая из них катализирует окисление ас-
корбиновой кислоты за счет О2 воздуха в дегидроаскорбиновую
кислоту (см. разд. 10.3), вторая — фенолов до хинонов. Эти фер-
менты имеют относительную молекулярную массу около 120 000»
являются медьсодержащими; их молекулы построены из несколь-
ких субъединиц.
Иногда наряду с Си2+ в состав ферментов входят и другие ионы.
Так, цитоплазматическая супероксид-дисмутаза	эукариот
(см. разд. 7.5) представляет собой димер, каждая из субъединиц
которого содержит прочно связанные Си2+ и Zn2+.
У окислительно-восстановительных ферментов металлы обычно
принимают непосредственное участие в акте катализа.
Железосодержащими ферментами являются в основном так на-
зываемые железопорфирины, т. е. белки, у которых железо нахо-
дится в составе гема (гемовое железо). К таким ферментам отно-
сятся каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза и др.
К цинксодержащим ферментам относятся карбоангидраза, ал-
когольдегидрогеназа, карбоксипептидаза А и др. Карбоангидраза
катализирует обратимое расщепление угольной кислоты Н2СО3^
=г^Н2О-ьСО2. Фермент широко распространен у растений и живот-
ных. В капиллярах тканей животных реакция смещена в сторону
образования угольной кислоты, что способствует ее удалению с то-
ком крови, а в капиллярах легких реакция более активно протека-
ет в противоположном направлении, в результате ускоряется уда-
ление СО2 через легкие.
Реакция окисления спиртов идет при участии алкогольдегидро-
геназы:
R-CH2OH + НАД+	R—С	+ НАДН + Н+
Этот 2п2+-зависимый фермент активен в печени человека, он окис-
ляет этиловый спирт до токсичного для человека продукта — ук-
сусного альдегида. Сложным белком, содержащим один ион Zn2+>
является панкреатическая карбоксипептидаза А. Ионы Zn2+ содер-
жит ДНК-полимераза 1 из Е. colt. Ионы цинка в гп2+-зависимых
ферментах часто могут быть заменены на Мп2+, Со2+ без сущест-
венного снижения каталитической активности.
Известно несколько селенсодержащих ферментов, участвую-
щих в окислительно-восстановительных реакциях. Видимо, это од-
147
на из причин того, что крайне токсичный в определенных концент-
рациях элемент Se в то же время является необходимым компонен-
том пищи, отсутствие которого может привести к гибели клеток,
как было показано в опытах с лабораторными животными.
3.4.3.	Другие небелковые части ферментов. Липоевая кис-
лота. Как кофермент липоевая кислота участвует в окислитель-
ном декарбоксилировании а-кетокислот. Липоевая кислота кова-
лентно связана амидной связью с е-ЫН2-группой лиз в составе
апофермента.
Окислительное декарбоксилирование а-кетокислот протекает по
• следующей схеме:
о
II
R—С—СООН
ТДФ
л
HSKoA
ЛК, ФАД
НАД+ НАДН
R—C~SKoA
Глутатион. Данный трипептид служит коферментом для
ряда изомераз непредельных соединений и выполняет эту роль при
внутримолекулярном переносе водорода (дисмутация). Глутатион
участвует, например, в реакции изомеризации производных малеино-
вой кислоты в производные фумаровой кислоты, т. е. осуществляет
процесс цис-транс-изомеризации. Глутатион является также кофер-
ментом при окислений формальдегида в формиат. Этот трипептид
входит в состав ДДТ-дехлоргидразы, отщепляющей НС1 от инсек-
тицида и участвующей в его детоксикации. Высокая активность
данного фермента характерна для насекомых, устойчивых
к ДДТ.
Роль витаминов как небелковых частей ферментов рассмотрена
в гл. 10.
3.5.	Механизм ферментативного катализа
Для протекания любой реакции необходимо, чтобы реагирую-
щие молекулы пришли в контакт друг с другом. Однако не каждое
столкновение молекул сопровождается их взаимодействием, реак-
ция протекает только в том случае, если молекулы обладают дос-
таточным запасом кинетической энергии. Совокупность молекул
любого вещества представляет собой статистический набор моле-
148
кул с различной кинетической энергией (рис. 3.5). Энергию, необ-
ходимую для достижения активированного (переходного) состоя-
ния, или тот избыток энергии по сравнению со средней энергией
молекул при данной температуре, которым они должны обла-
дать, чтобы вступить в реакцию, называют энергией актива-
ции (Еа).
В случае ферментативных реакций энергетический барьер сни-
жается благодаря образованию фермент-субстратного комплекса,
а чем меньше энергия активации, тем быстрее протекают реакции,
Рис. 3.5. Распределение кинетиче-
ской энергии в популяции моле-
кул:
А — молекулы, вступающие в реакцию
(активированные молекулы), Еа — ми-
нимальная энергия активации
Рис. 3.6. Профили энергии реакции:
Еа и Е'а — энергия активации нефермен-'
тативной и ферментативной реакций, АВ —
исходное вещество, А4-В — продукты реак-
ции, А* В* — активированные молекулы,
ES — активированный комплекс
так как вступить во взаимодействие могут молекулы с меньшим
запасом энергии (рис. 3.6). Как видно из рисл З.6, при фермента-
тивной и неферментативной реакциях для достижения переходного
состояния молекулы исходных веществ активируются, приобретают
более высокий запас энергии, только после этого они могут претер-
певать превращение в продукты реакции, но Еа в случае фермента-
тивной реакции ниже.
Таким образом, большие скорости ферментативных реакций яв-
ляются в конечном счете результатом снижения энергии активации
катализируемых реакций. Именно благодаря тому, что биологичес-
кие катализаторы снижают энергию активации, ферментативные
реакции протекают с высокой скоростью при относительно низкой
температуре.
Снижение энергии активации при ферментативном катализе
имеет некоторую связь с многостадийностью этих реакций. Они
протекают не в один этап, а ступенчато, через несколько промежу-
точных реакций. Активационный барьер реакции при этом разбива-
ется на несколько более низких барьеров каждой промежуточной
реакции, преодолеть которые реагирующим молекулам легче, чем
один большой барьер.
149
Ферментативный катализ имеет признаки как гомогенного, таки
гетерогенного катализа, протекающего на границе раздела двух
фаз. В каталитическом действии ферментов можно выделить 3 ста-
дии: 1) присоединение молекулы субстрата (S) к ферменту (£),
2) превращение субстрата, 3) отделение конечных продуктов реак-
ции (Р) от фермента. Простейшая схема ферментативной реакции
записывается следующим образом:
£ + S^£S^£ + P
Наиболее быстрой обычно является первая стадия реакции,
медленной — вторая. На 1-й стадии реакции происходит образова-
ние фермент-субстратного комплекса (£5, ФСК), в результате чего
структура и свойства молекулы субстрата меняются, образуются
его переходные формы. Это является главной предпосылкой уско-
рения процесса его превращения в катализируемой реакции.
Образование ФСК становится возможны’м благодаря опреде-
ленному сродству ферментов к своим субстратам. Наиболее четко
мысль о таком соответствии была высказана Э. Фишером (1890)
при объяснении специфичности действия ферментов. Он сравнивал
фермент и субстрат с ключом и замком и полагал, что фермент
подходит к своему субстрату как ключ к замку. В настоящее вре-
мя не вызывает сомнения, что между пространственными структу-
рами субстрата и активного центра фермента существует стеричес-
кое соответствие, однако это соответствие, как будет показано
дальше, не абсолютное. В образовании фермент-субстратного
комплекса принимают участие ионные, водородные ^вязи и гидро-
фобные взаимодействия. Возникновение временных ковалентных
связей между ферментом и субстратом возможно в ряде фермента-
тивных реакций только на 2-й стадии — при превращении субстра-
та и образовании промежуточных и переходных состояний. ФСК
очень лабильны: существуют лишь доли секунды, тем не менее к
настоящему времени удалось получить ряд ФСК*
Образование ФСК создает предпосылки высокой каталитичес-
кой активности. Установлено, что при образовании ФСК молекулы
фермента и субстрата не только сближаются, но и определенным
образом ориентируются друг относительно друга. Между структу-
рой субстрата и активного центра фермента кроме стерического
соответствия существует и топохимическое, при котором обеспечи-
вается взаимодействие узнающих групп фермента (связывающая
зона) и узнаваемых групп субстрата. Связывание фермента и суб-
страта обычно многоточечное, причем чем выше специфичность
фермента, тем больше точек узнавания.
Немаловажным фактором, вносящим определенный вклад в
возрастание скорости ферментативных реакций, является увеличе-
ние на несколько порядков времени контакта реагирующих моле-
кул в результате многоточечного связывания субстрата (ов) фер-
ментом. Время, в течение которого длится контакт молекул при
столкновении в случае чисто химической реакции, равно приблизи-
ло
тельно периоду тепловых колебаний молекул (10~13—10~12 с). За
это время не всегда успевает произойти химическая реакция.
Определенный вклад в увеличение скорости ферментативных ре-
акций вносит индуцированное соответствие фермента субстрату.
Согласно теории индуцированного соответствия, высказанной впер-
вые Д. Кошландом, у многих ферментов в отсутствие субстратов
функциональные группы активных центров ориентированы таким
образом, что оптимального взаимодействия их с комплементарны-
ми группами субстрата не происходит. Вхождение субстрата в ак-
тивный центр фермента вызывает конформационное изменение в
ферменте, при котором функциональные группы фермента занима-
ют положение, оптимальное для протекания каталитического про-
цесса. Доказательством конформационных изменений фермента
при связывании субстрата является отличие рентгенограмм сво-
бодного фермента и в присутствии специфического ингибитора.
Наличие конформационных изменений при связывании субстратов
и их аналогов хорошо показано для карбоксипептидазы А, лизоци-
ма, гидролизующего полисахариды клеточных стенок бактерий.
Например, у карбоксипептидазы А в присутствии аналога субст-
рата наблюдается смещение ряда аминокислот в активном центре
(тар-248 смещается приблизительно на 1,2 нм, арг-145 и глу-270 —
на 0,2 нм).
При оптимальном связывании субстрата (ов) с ферментом обра-
зуется продуктивный фермент-субстратный комплекс, т. е. такой
комплекс, который через ряд промежуточных стадий дает про-
дукт (ы) реакции. Эти процессы протекают на 2-й стадии фермен-
тативной реакции. Быстрому протеканию ферментативной реакции
способствует то, что при взаимодействии субстрата с ферментом
индуцируется напряжение разрываемых связей в субстрате (дефор-
мация или дестабилизация их), т. е. разрываемые связи становятся
менее стабильными, чем в свободном субстрате.
Увеличение скорости реакции под влиянием ферментов происхо-
дит и благодаря большей гидрофобности среды активного центра
по сравнению с окружающим раствором, в такой среде наблюдает-
ся десольватация заряженного субстрата, приводящая к дестаби-
лизации разрываемой связи.
Важной особенностью ферментативных реакций является и то,
что превращение субстрата протекает как полифункциональный ка-
тализ. Полифункциональность обеспечивается разнообразием ами-
нокислотных остатков белковой части фермента и групп кофакто-
ров в активном центре; на превращающуюся химическую связь
субстрата одновременно или в результате серии последовательных
атак воздействует несколько групп фермента., В результате этого
происходит поляризация превращающейся связи и затем ее раз-
рыв.
Многие группы в активных центрах ферментов функционируют
как обобщенные кислоты или основания, воздействуют на суб-
страт, активируют его и тем самым увеличивают скорость катали-
за. Обобщенные кислоты, согласно Бренстеду, — это любые доноры
151
протонов, а основания — акцепторы протонов. Особенно эффекти-
вен обобщенный кислотно-основной катализ. Он дает увеличение
скорости в 10—100 раз. В качестве обобщенных кислотно-основных
катализаторов функционируют в активном центре боковые ради-
калы таких аминокислот, как, например, глу, асп, гис, лиз, тир и
др. В протонированной форме они являются кислотными катализа-
торами, в непротонированной — основными.
Для ферментативных реакций большое значение имеет и элек-
трофильно-нуклеофильный катализ. В активных центрах некото-
рых ферментов есть электрофильные и нуклеофильные группы,
принимающие участие в акте катализа. Электрофильная группа —
это акцептор электронной пары (кислота Льюиса), нуклеофиль-
ная— донор электронной пары (основание Льюиса).
Нуклеофильные группы ферментов вступают в реакции нуклео-
фильного замещения, что приводит к образованию ковалентных
промежуточных соединений, — ковалентный катализ. Нуклеофиль-
ная группа становится на место замещаемой группы, образуется
ковалентный интермедиат; он неустойчив и легко распадается на
продукты реакции. Сильным нуклеофилом является имидазольная
группа гис, поэтому химическая модификация гис в составе актив-
ного центра приводит к инактивации ферментов. К нуклеофильным
группам относятся также ОН-группа сер, SH-группа цис. Примера-
ми электрофильных групп являются ионы металлов — Zn2+, Fe3+
и др.
Известно значительное количество ферментов, образующих с
субстратами или промежуточными продуктами их превращения ко-
валентные интермедиаты, при этом определенные группы активно-
го центра подвергаются ковалентной модификации за счет суб-
стратов. Например, модификация сер в химотрипсине, субтилизине
и плазмине происходит с образованием эфира карбоновой кислоты
О
II
НО—СН2—СН—...——С—О—СН2—СН—...; в щелочной фосфа-
тазе образуется эфир фосфорной кислоты НО—СН2—СН—...—*
I
О
II
—>-’0—Р—О—СН2—СН—... В папаине и глицеральдегидфос-
I	I
О-
фатдегидрогеназе цис модифицируется в тиоэфир карбоновой кис-
лоты HS—СН2—СН—...—>-R— С—S—СН2—СН—..., втрансальдо-
I	II	।
О
лазе и пиридоксальзависимых ферментах лиз дает ковалентный
интермедиат с субстратами — шиффово основание H2N—(СН2)4—
—СН—...—*R—С = N— (СН2) 4—СН—...
152
Образование ковалентных интермедиатов избирательно увели-
чивает вероятность протекания определенной реакции, поскольку
ковалентно связанный интермедиат обладает ограниченной под-
вижностью и может поэтому занимать более благоприятное поло-
жение для завершения реакции по отношению к соответствующим
группам фермента. Ускорение ферментативной реакции в резуль-
тате образования ковалентного интермедиата возрастает в 102—
103 и более раз.
Специфический кис л от но-основной катализ, т. е. активация суб-
стратов под влиянием повышенных концентраций ионов Н3О^(Н+‘)
и ОН", в биохимических реакциях встречается редко, этот тип
реакций широко распространен в органической химии. Таким обра-
зом, большие скорости ферментативных реакций возможны благо-
даря наличию целого ряда эффектов: эффект сближения и ориента-
ционный эффект, имеющие место благодаря стеричсскому и топо-
химическому соответствию фермента и субстрата, индуцированное
соответствие структуры активного центра переходному состоянию
субстрата и возникновение «напряжения» в субстрате, полифунк-
циональность и многостадийность катализа, особые физико-хими-
ческие условия среды активного центра и как результат всего —
снижение энергии активации катализируемой реакции. Все эти
эффекты обусловлены сложным строением молекул ферментов.
Уникальное строение активного центра фермента обеспечивает и
его высокую специфичность.
Структура активного центра, механизм связывания субстрата,
каталитические свойства и первичная структура хорошо изучены
у таких гидролитических ферментов, как химотрипсин, РНКаза, ли-
зоцим, карбоксипептидаза А. Описан также механизм действия
каждого из этих ферментов. Ниже в качестве примеров кратко рас-
смотрены представления о механизме некоторых ферментативных
реакций. В активном центре химотрипсина важная роль в акте
катализа принадлежит сгр-195 и гис~Ы. Расстояние между ОН-
группой сер и третьим атомом имидазола гис равно 0,3 нм, между
ними возникает водородная связь, что увеличивает реакционную
способность гидроксильной группы сер. Первый атом азота гцс-57
образует водородную связь с COOH-группой асп-102, также входя-
щей в активный центр химотрипсина, в результате чего образуется
система с переносом заряда, состоящая из асп-102, гис~Ы и сер-195
(рис. 3.7, стадия I).
Анион ОН-группы сер осуществляет нуклеофильную атаку угле-
рода расщепляемой пептидной связи субстрата, образуется ацил-
фермент, и вслед за этим освобождается первый продукт реак-
ции— аминный продукт (стадия II). Далее происходит гидролиз
ацилфермента, образование 2-го продукта реакции, а фермент воз-
вращается в исходное состояние (стадии III, IV).
При связывании лизоцима с субстратом — полисахаридом кле-
точных стенок бактерий, состоящим из большого числа дисахарид-
ных единиц (N-ацетилглюкозамин— N-ацетилмурамовая кислота),
происходит вынужденный контакт. Он сводится к небольшому пе*
153
Рис. 3.7. Последовательность стадий катализа химотрипсином (пояснение см.
в тексте)
ремещению (~0,07 нм) некоторых боковых аминокислотных групп
внутри активного центра. При связывании субстрата одно из колец
гексоз, располагающееся против каталитических групп активного
центра, переходит в напряженное состояние (из конформации крес-
ла в конформацию полукресла), что способствует ускорению гидро-
лиза гликозидной связи, в которой участвует гексоза в напряжен-
ной конформации (рис. 3.8).
Рис. 3.8. Предполагаемый механизм действия лизоцима:
I, III— стадии реакции, D, Е— остатки гексоз субстрата (S)
154
Каталитическими остатками активного центра являются 2Л1/-35
и асп-52, причем глг/-35 находится в гидрофобном окружении в
протонированном состоянии, а асп-52 — в гидрофильном окруже-
нии и ионизирован (рис. 3.8, стадия /). Глу-35 выступает донором
протона для кислорода разрываемой гликозидной связи. Вместе с
разрывом связи образуется
карбониевый ион (С+) гек-
созы, стабилизируемый от-
рицательным зарядом на
асп-52 (стадия II). Далее
происходит гидролиз: ОН-
группа воды присоединяется
к карбониевому остатку,
протон воды — к глг/-35, и
реакция завершается (ста-
дия III). В увеличение ско-
рости реакции, катализи-
руемой лизоцимом, дают
вклад следующие эффекты:
напряженная конформация
субстрата, вынужденный
контакт, обобщенный кис-
лотно-основной катализ при
участии глг/-35, стабилиза-
ция карбониевого иона
асп-52.
Рис. 3.9. Связывание С-концевого фраг-
мента субстрата (показан более толсты-
ми линиями) в активном центре кар-
боксипептидазы А:
Zn2+ — электрофильный агент, воздействую-
щий на расщепляемую пептидную связь
Одна из функций, кото-
рую выполняют металлы в ферментах, заключается в том, что они
выступают в роли электрофильных агентов. Так, в активном центре
карбоксипептидазы А, содержащем ион Zn2+, последний представ-
ляет собой электрофильный агент, оттягивающий электроны от
пептидной связи субстрата, облегчая ее гидролиз (рис. 3.9).
3.6.	* Типы ферментативных реакций
Ферментативные реакции по числу участников делятся на одно-
субстратные и двухсубстратные. С большим числом субстратов ре-
акции встречаются достаточно редко. Самым распространенным
типом ферментативной реакции является двухсубстратная реакция
с образованием двух продуктов: A-rB^C-\-D. К этому типу отно-
сится примерно 60% всех известных реакций и прежде всего реак-
ции переноса групп.
Редко встречаются односубстратные — однопродуктные реак-
ции, примерами их являются реакции изомеризации, в частности
глюкозо-1 -фосфат^глюкозо-6-фосфат. Однако многие реакции по
своим свойствам близки к односубстратным. Это наблюдается в тех
случаях, когда из двух субстратов варьирует концентрация только
одного. Например, гидролитические реакции можно рассматривать
155
как односубстратные, так как концентрацию 2-го субстрата — во-
ды — можно считать постоянной, в процессе реакции она уменьша-
ется несущественно.
Реакции с одним субстратом по существу являются мономоле-
кулярными химическими реакциями (А—Ф). Большинство из них
относится к реакциям 1-го порядка, поскольку скорость реакции
пропорциональна концентрации только одного реагирующего ве-
щества (K~£i[S]). Порядок реакции определяется характером ее
зависимости от концентрации субстрата. Скорость мономолекуляр-
ной реакции может не зависеть от концентрации субстрата (при
его избытке), тогда порядок реакции будет нулевым (V=ko, где
feo — константа скорости реакции нулевого порядка).
К реакциям 1-го порядка будут относиться и бимолекулярные
(двухсубстратные) реакции. Это происходит в том случае, если
концентрация одного из субстратов очень высока по сравнению с
концентрацией другого, как, например, в случае реакций гидроли-
за. Большинство бимолекулярных реакций является реакциями
2-го порядка, поскольку их скорость пропорциональна концентра-
ции двух реагирующих веществ или реже квадрату концентрации
субстрата: ( V=£2[Si][S2] или V=&2[S]2, где k2— константы
скорости реакции соответствующего порядка).
Следует иметь в виду, что реальные скорости реакций не обяза-
тельно в точности соответствуют определенному порядку, часто на-
блюдаются и реакции смешанного типа. Порядок реакции может
также изменяться со временем и, как будет показано ниже, зави-
сеть от концентрации субстрата. Поэтому порядок реакции опре-
деляют по отношению к «текущей» концентрации субстрата. Кроме
того, ферментативные реакции идут в несколько последовательных
моно- и бимолекулярных стадий, и потому молекулярность полной
реакции не обязательно совпадает с порядком.
В зависимости от последовательности присоединения субстра-
тов в двухсубстратных реакциях (A + B+±C+D) различают два
основных механизма этих реакций.
1. Механизм двойного замещения, он хорошо иллюстрируется
следующей формой записи:
Сначала к ферменту присоединяется один субстрат (А), обра-
зуется комплекс ЕА, в результате 1-го этапа реакции он превраща-
ется в продукт С и интермедиат F (несколько измененная фор-
ма Е). Этот интермедиат присоединяет 2-й субстрат (В) с обра-
зованием комплекса FB, распадающегося на свободный фермент
(£) и 2-й продукт (£)). Механизм двойного замещения называют
«пинг-понг»-механизмом. По такому механизму протекают, напри-
мер, реакции переаминирования.
156
Так, в реакции переаминирования (глутамат + оксалоацетат—>
—>а-кетоглутарат + аспартат), катализируемой аспартатамино-
трансферазой (£), 1-м субстратом (Л), который присоединится к
ферменту, содержащему пиридоксальфосфат в качестве небелковой
части, будет глутамат. При этом образуется комплекс ЕА, содер-
жащий альдимин, он превращается в комплекс FC, где небелковая
часть фермента и связанный с ней субстрат образуют кетимин.
Гидролиз кетимина приводит к высвобождению 1-го продукта ре-
акции (С) — а-кетоглутарата (2-оксоглутарат) и интермедиата F,
представляющего собой измененную форму фермента £, в которой
в качестве небелковой части вместо пиридоксальфосфата имеется
пиридоксаминфосфат. Интермедиат F присоединяет 2-й субстрат
(В) — оксалоацетат с образованием комплекса FB, содержащего
кетимин. Кетимин затем превращается в альдимин, после чего про-
исходит образование 2-го продукта (В)—аспартата и освобожде-
ние свободного фермента (£).
I	I — н2и
н—с—NH2 + О—С—н
I	+н20
соон
а-Аминокисло-	Пиридоксаль-
та I	фосфатфермент
Глутамат
А	Е
Rx Е
Н—С—N=i-н
соон
Альдимин
АЕ
I	I	+Н2° I	I
C=N—С—Н ^=2 С=О + H2N—С—Н
I	I	-н20 I	I
соон н соон н
Кетимин	а-Кетокис- Пиридоксамин
лота I	-фосфатфер-
а-Кето-	мент
глутарат
FC	С	F
R2	Е
I	I
с-о + h2n—с-н
соон	н
“Н20 f2 |
C=N—C—H
+ Н2о I |
соонн
а-Кето- Пиридоксамин-
кислота II фосфатфермент
Сксалоа-
Кетимин
FB
цетат
В	F
R2	Е	.	н n	F2	Е
I	I	+На°	I	I
Н—С—N=C—Н -«---Н—С—NH2 + О=с—Н
I	Н2о	|
соон	СООН
Альдимин	а-Аминокислота И	Пиродоксаль-
Аспартат фосфатфермеэт
FD	£>	Е
157
2. Последовательный механизм, при котором оба субстрата
должны соединиться с ферментом и сформировать тройной комп-
лекс, прежде чем образуется один из продуктов. Последовательный
механизм представлен двумя видами: упорядоченным и неупорядо-
ченным. Упорядоченный имеет следующую форму записи:
4	У	C	D
♦________1__________________I_______i
В+А BA + В (EAB^g^ ECD)ED ^E
В случае неупорядоченного последовательного механизма фер-
мент содержит в активном центре два независимых участка связы-
вания субстратов, и их присоединение к ферменту может происхо-
дить в любой последовательности. Нет также определенного
порядка выхода продуктов реакции из активного центра. Запись
такого типа реакций имеет следующий вид:
По упорядоченному механизму функционируют, например,
НАД (Ф) + == зависимые дегидрогеназы. Так, последовательность
реакций, протекающих при участии ЛДГ, запишется следующим
образом:
С	D
А	В
НАДН	Пируват	Лактат
i____________f____________________________________J
Е-* Е-НАДН-* Е-НАДН-пируват	Е-НАД+ -лактат	Е-НАД
НАД*
ЕА	EAB	ECD	ED
По упорядоченному механизму работают некоторые гликозил-
трансферазы и креатинкиназа.
Реакции с тремя и четырьмя субстратами протекают либо по
одному из двух вышеуказанных механизмов, либо по смешанному.
3.7. Кинетика ферментативных реакций
3.7.1.	Единицы ферментативной активности. Кинетика — это
учение о скоростях реакций, их зависимости от различных факто-
ров. Скорость ферментативной реакции, как и любой химической
реакции, определяется количеством веществ, прореагировавших за
единицу времени при заданных условиях. Скорость ферментатив-
ной реакции зависит от активности фермента, которая может быть
выражена в различных единицах. До недавнего времени наиболее
158
принятой единицей активности была так называемая стандартная
единица (£). Под ней понимают то количество фермента, которое
катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин при оптималь-
ных условиях для данного фермента (f\ pH, [S]). Согласно послед-
нему международному соглашению 1 единица любого фермента
есть такое количество фермента, которое в определенных условиях
катализирует превращение субстрата со скоростью 1 моль/с. Эта
единица называется катал (сокращенно кат; 1 кат=6-107 стан-
дартных единиц). Для выражения активности фермента обычно
используют нано- и пикокаталы.
Существует также понятие удельной активности, которая выра-
жается числом единиц активности фермента, приходящихся на
1 мг белка в ферментативном препарате (Е/мг). Удельную актив-
ность в настоящее время рекомендуют выражать в кат/кг. Если
известна молекулярная масса фермента, то можно рассчитать мо-
лекулярную активность (число оборотов), она характеризуется
числом молей субстрата, которое подвергается превращению 1 мо-
лем фермента за 1 мин. В том случае, когда у фермента несколько
активных центров, то определяют число молей субстрата, подвер-
гающихся превращению одним молем каталитических центров
(молярная концентрация фермента, умноженная на число актив-
ных центров в молекуле фермента)—активность каталитического
центра.
При определении активности ферментов измеряют начальные
скорости реакции (V) в стационарной фазе (рис. 3.10). Участок
реакции, предшествующий установлению стационарного состояния,,
называют переходным. Пос-
ле стационарной фазы ско-
рость реакций снижается.
Это может быть связано с
уменьшением концентрации
исходного субстрата, накоп-
лением продуктов реакции и
ингибированием ими фер-
мента, инактивацией фер-
мента в процессе инкубации
и рядом других причин.
3.7.2.	Влияние концент-
рации фермента и субстра-
та на начальную скорость
реакции. Зависимость скоро-
сти реакции от концентра-
ции фермента является ли-
нейной (рис. 3.11). Нелиней-
ная зависимость при высо-
ких концентрациях фермен-
та наблюдается вследствие
нехватки субстрата или ак-
тиватора, агрегации моле-
V
Время 7 с
Рис. 3.10. Зависимость скорости фермента-
тивной реакции от времени:
Z — переходный участок. II — участок начальной
скорости, ill — участок основного протекания ре-
159
кул ферментативного белка, приводящей к маскировке активных
центров. Отсутствие прямо пропорциональной зависимости при не-
больших концентрациях фермента может быть результатом при-
сутствия в инкубационной среде токсических примесей, связываю-
щихся с ферментом и инактивирующих его.
Рис. 3.11. График зависимости
начальной скорости реакции
(V) от концентрации фермен-
та [£]:
1 — норма, 2 — в системе присутст-
вует небольшое количество токси-
ческих для фермента примесей
Рис. 3.12. Зависимость скорости ре-
акции (Г) от концентрации субстра-
та [S]
Почти во всех случаях график зависимости начальной скорости
реакции от концентрации субстрата представляет собой гиперболу
(рис. 3.12).
По мере возрастания концентрации субстрата кривая выходит
на плато, скорость достигает своей максимальной величины
(Утах)- Это говорит о том, что все молекулы фермента (их актив-
ные центры) полностью насыщены субстратом.
Гиперболический график зависимости V от [S] показывает, что
порядок реакции при ферментативном катализе изменяется. При
небольших концентрациях субстрата протекает реакция 1-го по-
рядка (V пропорционально [S]). При насыщающей концентрации
субстрата скорость не зависит от нее, такая реакция является ре-
акцией нулевого порядка. При промежуточных концентрациях суб-
страта протекает реакция сметанного порядка.
Для описания зависимости начальной скорости реакции от кон-
центрации субстрата Л. Михаэлисом и М. Ментен выведено урав-
нение для односубстратной реакции:
г/ _ ^тах 1^1
“ Ks + [S] •
Это уравнение получило название уравнения Михаэлиса—Ментен
(/<s — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса,
равная Утах — максимальная скорость реакции). При выво-
де уравнения Л. Михаэлис и М. Ментен исходили из следующего
обобщающего механизма односубстратной реакции. Фермент взаи-
160
модействует с субстратом, образуя фермент-субстратный комп-
лекс (£3), который затем распадается на свободный фермент и
продукт реакции:
kr k2
k—2
где k]f k-\, k2, k-^ — константы скоростей соответствующих стадий
реакции.
Стадию обратной реакции — образование £3 из £ и Р — обыч-
но не учитывают, так как рассматривают начальные скорости реак-
ций, при которых только очень небольшая доля 3 превращена в Р.
В этом случае из Р практически не образуется £S.
Позже Дж. Бриггсом и Дж. Холдейном было предложено урав-
нение Михаэлиса-Ментен записывать в следующем виде:
у _ fr'max [3]
“ Km + [S] ’
где Кт— константа Михаэлиса. Кт = (k-y+kz) /ky — Ks+kdkx.
Такое преобразование уравнения связано с тем, что Михаэлис и
Ментен исходили из допущения, согласно которому 1-я стадия ре-
акции (£ + S = £S) является равновесной, ъ е. равновесие в ней до-
стигается гораздо быстрее, чем успевает распасться комплекс £3
с образованием продукта реакции. Однако это далеко не всегда
справедливо, и хотя указанная стадия протекает достаточно быст-
ро и обратимо; она не является равновесной. Поскольку ферментам
свойственна высокая каталитическая активность, в реальных усло-
виях система находится в стационарном состоянии, при котором
концентрация промежуточного соединения (£3) постоянна, т. е.
скорости его образования и распада, в том числе и до конечного
продукта, равны. Это и учитывается введением Кт вместо Ks-
Кт~Кз ТОЛЬКО при
Константа Михаэлиса (Кт)—важная характеристика фермен-
та, по ней судят о степени сродства фермента к субстрату и способ-
ности фермента образовывать продукты реакции. Однако об истин-
ном сродстве фермента к субстрату можно судить только по вели-
чине /G, определить которую экспериментально значительно слож-
нее, чем Кт- Кт измеряется в моль/л. Если Кт велика, то комп-
лекс ES легко распадается на исходные вещества и реакция идет
медленно. При низких Кт (велика й+Q реакция идет быстро. Для
большинства ферментативных реакций с участием одного субстра-
та Кт равняется от 1 • 10-2 до 1 • 10~5 моль/л. Кт и Итах для данного
фермента и субстрата при определенных параметрах внешней сре-
ды (pH, t° и др.) —величины постоянные. У ферментов с относи-
тельной специфичностью каждый субстрат характеризуется своим
значением Кт-
Кт определяют графически по результатам измерения V при
различных концентрациях субстрата. В частном случае, когда
6—937
161
г? __ 1 /О ту Ушах ___________ Утах 1^1
“ гаах’ 2 Кт + [$] ’
отсюда Лт = [5], т. е. константа Михаэлиса равна концентрации
субстрата при скорости реакции, равной половине от максимальной
скорости (см. рис. 3.12). По гиперболической зависимости V от
[S] точное определение Кт затруднено, поскольку Vmax является
величиной асимптотиче-
ской и определяется недо-
статочно точно. В связи с
этим предложено несколько
преобразований уравнения
Михаэлиса—Ментен, сводя-
Рис. 3.13. График Лайнуивера— Бэрка
щихся к получению прямо
пропорциональной зависи-
мости V от [S]. Приравни-
вая обратные выражения
правой и левой частей урав-
нения Михаэлиса — Мен-
тен, Г. Лайнуивер и Д. Бэрк
получили следующую зави-
симость:
1	Кт	1 + 1
У	^гпах [^1 ^тах
где Кт, Vmax — величины постоянные при заданных условиях опре-
деления, а V и [S] — переменные. Это уравнение прямой линии
(y^kx+Ь). График зависимости 1/Т от 1/fS] представляет собой
прямую с наклоном Km/Vmax, отсекающую на оси ординат отрезок
1/Vmax, а на оси абсцисс— \!Кт (рис. 3.13). Измеряя отрезок на
оси абсцисс, определяют величину
При умножении обеих частей уравнения Лайнуивера—Бэрка на
[S], получают новое линейное уравнение, которое также используют
для графического определения Кт (рис. 3.14):
Рис. 3.15. Зависимость V от V/[S]
(график Эди-Хофсти)
Рис. 3.14. График зависимости [SJ/V от [S],
используемый для определения Кт и, Ушах
162
[S]	= Km	.	[S]
V Kmax Knax
Умножение обеих частей уравнения Лайнуивера — Бэрка на
Утах дает еще один вид уравнения, график которого представля-
ет собой прямую линию (рис. 3.15):
v
V « Угаах - Кт
М. Ментен исходили
из упро-
и
V*
V
Чпах
^/77
Рис. 3.16. Прямая линейная зави-
симость Утах от Кт (график Кор-
ниш-Боудена)
5^	£>2 бу О-
Э.	Корниш-Боуденом предложен следующий линейный график
ДЛЯ определения Кт И Уюах:	Утах = у	Для построения
PJ
этого графика не требуется расчетов, каждая прямая на нем соот-
ветствует одному наблюдению (рис. 3,16).
При выводе уравнения зависимости скорости реакции от кон-
центрации субстрата Л. Михаэлис
щенной схемы ферментативной
реакции. Однако большинство
ферментативных реакций не яв-
ляются односубстратными и, кро-
ме того, в них образуется не
один, а несколько фермент-суб-
стратных комплексов: Е +
^ЕЗ^ЕЗР'^ЕР^Е + Р. Появ-
ление дополнительных комплек-
сов не изменяет общего вида
уравнения Михаэлиса — Ментен,
но Кт и Утах будут более слож-
ными константами, включающими
в себя большее число констант
скоростей, чем в случае односта-
дийной реакции.
Уравнение скорости для двух-
субстратных реакций также близ-
ко к уравнению Михаэлиса — Ментен: протекание реакций сопро-
вождается образованием фермент-субстратных комплексов, причем
каждый субстрат характеризуется своей Кт. Константа Михаэлиса
определяется, как и в случае односубстратных реакций, графически
по зависимости У от концентрации одного из субстратов при по-
стоянной, насыщающей концентрации другого; Кт можно опреде-
лить и по отношению к активатору фермента, при этом концентра-
ция субстрата должна быть фиксированной.
Построение кинетических кривых зависимости V от [S] оказыва-
ется полезным не только при определении величины Кт, но и при
установлении механизма протекания двухсубстратных реакций, ти-
па ингибирования (см. разд. 3.7.5).
3.7.3.	Влияние температуры на скорость ферментативной реак- У
ции. Скорость ферментативной реакции существенно зависит от тем-
пературы. Зависимость константы скорости реакции (k) от темпе-
6*
163
ратуры (7) выражается уравнением Аррениуса: 2,3 \gk = B—EaIRT\
где Еа — энергия активации (Дж/моль), В — характеризует часто-
ту столкновения молекул и их взаимную ориентацию, Т — абсолют-
ная температура, R — газовая постоянная. В уравнении Еа, В, R —
величины постоянные при заданных условиях. Следовательно, гра-
фик зависимости IgA от 1/7 должен быть прямолинейным
(рис. 3.17).
Наклон прямой равен Ea/2,3R, поэтому по графику зависимости
скорости реакции от температуры можно определить энергию акти-
Рис. 3.17. Влияние температуры
на константу скорости (k) фер-
ментативной реакции (зависи-
мость k от обратной величины
абсолютной температуры)
Рис. 3.18. Энергетическая схема фер-
ментативной реакции:
ES* — переходное состояние (активирован-
ный комплекс — короткоживущее соедине-
ние Е и S, возникающее при их сближе-
нии и переходящее затем в обычный ком-
плекс ES — промежуточное состояние);
Еа — энергия активации, Р — продукт ре-
акции; I, II — стадии реакции (ста-
дия II — лимитирующая)
вации реакции. Точнее говоря, из графика определяется только Еа
лимитирующей стадии реакции, самой медленной стадии, т. е. ста-
дии с самой высокой энергией активации (рис. 3.18).
График зависимости IgA от 1/7 прямолинеен только в опреде-
ленных пределах. Это связано с тем, что при повышении темпера-
туры скорость ферментативных реакций увеличивается до опреде-
ленного максимального значения, при дальнейшем повышении тем-
пературы происходит снижение скорости реакции вследствие начи-
нающейся тепловой денатурации фермента (рис. 3.19). При нагре-
вании выше 80°С преобладающее большинство ферментов полно-
стью денатурирует.
Температурный оптимум для большинства ферментов лежит в
пределах 40—60°С. Высокой термостабильностью обладают фермен-
ты термофильных микроорганизмов; некоторые из них способны
даже выдерживать кратковременное кипячение без существенного
снижения активности. Термостабильность ферментов повышается
в присутствии субстрата (ов). В кристаллическом виде ферменты
более термоустойчивы. Большинство ферментов хорошо сохраняет
164
свою активность при пониженных и отрицательных температурах.
Только некоторые холодлабильные ферменты инактивируются при
понижении температуры от 30 до 0°С.,	У
3.7.4.	Влияние pH на скорость ферментативной реакции. Графи-
ческая зависимость скорости большинства ферментативных реак-
ций от pH имеет колоколообразную форму (рис. 3.20). То значение
pH, при котором скорость реакции максимальна, называется опти-
мумом pH; при отклонении pH в любую сторону от этого значения
Рис. 3.19. Зависимость скоро-
сти ферментативной реакции от
температуры
Рис. 3.20. Влияние активной
реакции среды на скорость фер-
ментативной реакции
скорость реакции снижается. Ферментативные реакции чувстви-
тельны к изменению pH, потому что ферменты содержат большое
число ионогенных групп. Состояние ионизации наиболее важных
для функционирования фермента групп, зависящее от pH, влияет
на каталитическую активность фермента, поскольку максимальную
активность фермент может проявлять только при определенном со-
стоянии этих групп: ионизированном или неионизированном. Во
многих случаях к ионизации способны и определенные группы суб-
страта, что также сказывается на оптимуме pH для действия фер-
мента, так как для реакции важно присутствие субстрата в опреде-
ленной форме.
Кроме того, pH может оказывать косвенное влияние на актив-
ность ферментов, дестабилизируя их структуру, нарушать прочность
связи апофермента с небелковым компонентом. Изменение pH мо-
жет также влиять на состояние активаторов и*ингибиторов фермен-
тов. Значение pH, соответствующее оптимальному/ не всегда сов-
падает со значением pH, характерным для внутриклеточной среды.
Поэтому pH может быть одним из факторов, ответственных за регу-
лирование ферментативной активности внутри клетки.
3.7.5.	Ингибиторы ферментов. Скорость ферментативной реак-
ции может быть снижена, а в ряде случаев и полностью приоста-
новлена при действии ингибиторов — веществ, которые по той или
иной причине частично или полностью препятствуют образованию
продуктивного фермент-субстратного комплекса. В частности, ток-
сичность многих ядов для живых организмов, лечебный эффект ря-
да лекарственных препаратов обусловлены их ингибирующим дей-
ствием на ферменты. Среди ингибиторов есть как синтетические
165
вещества, так и природные метаболиты. Для ингибиторов характер-
на специфичность действия. Необратимую (и неспецифичную) де-
натурацию ферментов под влиянием тепла, сильных кислот или ка-
ких-либо других факторов обычно не рассматривают как ингибиро-
вание. К ингибиторам неприродного происхождения относят, на-
пример, фторид натрия — ингибитор фосфатаз, фенантролин — ме-
таллсодержащих ферментов, р-хлормеркурибензоат — SH-фермен-
тов, диизопропилфторфосфат (ДИФФ) — сериновых протеиназ и
эстераз. Действие таких ингибиторов обычно необратимо.
Примерами обратимых ингибиторов являются клеточные мета-
болиты и их структурные аналоги, снижающие активность фермен-
тов. Различают три типа обратимого ингибирования ферментов:
конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. К конкурентным
ингибиторам относят вещества, способные связываться с активным
центром фермента и, следовательно, конкурировать с субстратом.
Взаимодействие фермента с конкурентным ингибитором записыва-
ют в виде уравнения: £+/^£7, где I— ингибитор; Е1 — фермент-
ингибиторный комплекс, не превращающийся в продукт; Ki —
константа ингибирования, представляющая собой константу диссо-
циации EI, /С ==[£][/]/[£/]. Ki показывает сродство ингибитора к
ферменту; чем меньше Ки тем сильнее ингибитор.
При Ki—И) ингибирование необратимо. Скорость реакции в при-
сутствии конкурентного ингибитора зависит от соотношения [S] и
[Д Примером конкурентного ингибирования является действие ма-
лоновой кислоты и ряда других дикарбоновых кислот на сукцинат-
дегидрогеназу (СДГ). В качестве конкурентных ингибиторов выс-
тупают вещества, структурно сходные с субстратом. В случае СДГ
это вещества следующего строения:
СООН
I
сн2
СООН
Малоновая
кислота
СООН
I
со
сн2
СООН
Шавелево-
уксусная
кислота
СООН
СН2
СН.
I
СН,
I
СООН
Глутаровая
кислота
Наиболее сильным ингибитором СДГ из них является малоновая
кислота, замедляющая на 50% скорость ферментативной реакции
при [/]/[£] = 50. Увеличение концентрации субстрата* приводит к
снижению степени ингибирования, поскольку субстрат вытесняет
ингибитор из активного центра.
Неконкурентный ингибитор связывается с ферментом вне актив-
ного центра, поэтому конкурентных отношений между субстратом
и ингибитором нет, и степень ингибирования зависит только от
концентрации последнего. Связываясь с ферментом, неконкурент-
ные ингибиторы вызывают существенные изменения конформации
166
фермента, пространственной структуры активного центра, что и на-
рушает нормальное связывание субстрата.
Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, ког-
да ингибитор обратимо взаимодействует с ферментом, только после
образования £S : ES + I^ESI. Бесконкурентное ингибирование наи-
более характерно для ферментов, каталитическое действие которых
осуществляется по механиз-
му «пинг-понга».
Помимо указанных ти-
пов обратимого ингибирова-
ния выделяют смешанный
тип ингибирования.
Тип ингибирования мо-
жет быть выявлен с помо-
щью кинетического анализа,
при изучении зависимости V'
от [S] при различных кон-
центрациях ингибитора
(рис. 3.21). Влияние конку-
рентного ингибитора на ско-
рость реакции заключается
в том, что он увеличивает
Кт и оставляет без измене-
ния Утах- Для бесконку-
рентного ингибирования ха-
рактерно уменьшение в оди-
наковой степени Утах и Кт
и вследствие этого постоян-
ство отношения Vmax/Km.
Неконкурентные ингибито-
ры действуют на активность
фермента, снижая значение
Ушах и не оказывая влияния
на Кт.
В случае построения за-
висимости Ушах от Кт ТИП
Рис. 3.21. Графики Эди-Хофсти (слева)
и Лайнуивера-Бэрка (справа) для раз-
личных типов ингибирования:
а — конкурентное, б — бесконкурентное, в —
неконкурентное
ингибирования характеризуется смещением точки пересечения. Для
конкурентного — вправо, бесконкурентного — пр направлению к
началу координат, для смешанного характерен промежуточный ха-
рактер смещения.
Многие фармакологически активные соединения изменяют тече-
ние метаболических процессов в результате действия на ферменты.
Некоторые из них выступают в роли конкурентных ингибиторов
благодаря сходству структуры с метаболитами. Такие соединения
называются антиметаболитами. Например, синтетические антибак-
териальные вещества сульфаниламиды являются конкурентами
р-аминобензойной кислоты (ПАБК). ПАБК используется бактери-
ями для синтеза фолиевой кислоты — фактора их роста. Сульфа-
ниламидные препараты тормозят ферментативную стадию на пути
167
синтеза фолиевой кислоты благодаря конкуренции ПАБК и синте-
тического аналога. Торможение синтеза фолиевой кислоты в присут-
ствии сульфаниламидов обусловливает бактериостатический эффект
последних. Поскольку человек не синтезирует фолиевую кислоту из
ПАБК и других метаболитов (см. разд. 10.3), сульфаниламидные
препараты в лечебных дозах существенно не влияют на его орга-
низм (однако подавляют жизнедеятельность полезной микрофло-
ры кишечника, которая, в частности, является источником ряда ви-
таминов для человека; поэтому лечение сульфаниламидными пре-
паратами — сульфадимезином» этазолом, сульфамонометоксином и
т. д. сопровождается приемом поливитаминов).
ПАБК	-Сульфаниламид
v 3.8. Множественные молекулярные формы ферментов
и изоферменты
Под множественными молекулярными формами ферментов
(ММФФ) понимают Группу ферментов, выполняющих идентичную
каталитическую функцию у одного биологического вида, но отлича-
ющихся по структуре и ряду физико-химических свойств. Для раз-
деления ММФФ наиболее часто используют различные варианты
метода электрофореза с последующим специфическим выявлением
зон, обладающих одинаковой ферментативной активностью. На
электрофореграммах зоны активности ММФФ обозначают араб-
скими цифрами в порядке уменьшения анодной подвижности.
Наличие ММФФ имеет определенное биологическое значение.
Показано, например, что при изменении условий существования
спектр ММФФ в клетке может меняться, в результате чего организм
лучше приспосабливается к внешним условиям. Различные молеку-
лярные формы ферментов играют важную роль в процессе диффе-
ренцировки, развития. Таким образом, сдвиги в соотношении
ММФФ (их число, активность каждой из форм, стабильность) яв-
ляются одним из механизмов регуляции обменных процессов.
Первые исследования по выявлению ММФФ выполнены на лак-
татдегидрогеназе (ЛДГ), катализирующей окислительно-восстано-
вительные превращения лактата в пируват и обратно. При электро-
форетическом исследовании этого фермента обнаруживается в
большинстве случаев пять фракций (/—5), обладающих ^ЛДГ-ак-
тивностью (рис. 3.22). Все пять молекулярных форм обладают поч-
ти одинаковой молекулярной массой (М 134 000) и состоят из че-
тырех полипептидных цепей, каждая с относительной молекуляр-
ной массой 33 500.
168
Б
м4
М3н1 М2н2

5	4	3	2	1
— И- тип
Q — Н- тип
Рис. 3.22. Множественные молекулярные формы лактатдегидрогена-
зы (4) и их разделение при электрофорезе (Б)
Полипептидные цепи, несмотря на близкие молекулярные мас-
сы, неидентичны и могут быть двух типов: М и Н (от англ, muscle—
мышца, и англ, heart — сердце). Оба типа цепей содержат кофер-
мент НАД(Н+)» но отличаются по ряду аминокислот, что и опреде-
ляет их неодинаковую электрофоретическую подвижность.
М~ и //-типы полипептидных цепей кодируются различными ге-
нами. Единичные цепи лишены ферментативной активности, обра-
зование тетрамера в результате различной комбинации цепей двух
типов дает активный фермент. В мышечной ткани преобладает тет-
рамер Af4, характеризующийся наименьшей анодной подвижно-
стью, в сердечной — обладающий наибольшей подвижностью,
по направлению к аноду. Остальные три ММФ ЛДГ обозначают
как МзНъ М2Н2 и MYH3. Формы М4 и M3Hi содержатся преимуще-
ственно в тканях, где источником энергии является гликолиз ( ске-
летные мышцы, эмбриональные ткани), а МН3 и Н4—в тканях, для
которых характерен аэробный метаболизм (сердечная мышца).
В настоящее время известно большое число ферментов, пред-
ставленных в организме несколькими молекулярными формами.
Причины, приводящие к появлению ММФФ, могут быть различны-
ми, в соответствии с чем Международной комиссией по биохимиче-
ской номенклатуре разработана классификация молекулярных
форм ферментов. Среди ММФФ есть как генетически детерминиро-
ванные, их принято называть изоферментами^ллл изоэнзимами (от-
личаются друг от друга по первичной . структуре), так и формы,
возникшие в результате эпигенетических изменений (на посттранс-
ляционйом уровне).
Все ММФФ делят на шесть классов.
/. Генетически независимые белки. Это ферменты» синтезирую-
щиеся на разных генах. У многоклеточных организмов они часто
169
характеризуются различной внутриклеточной, тканевой локализа-
цией: например, пируваткиназа, енолаза, фруктозодифосфат-альдо-
лаза в тканях мышц и печени, малатдегидрогеназа и ряд амино-
трансфераз — в митохондриях и цитозоле.
2.	Гетерополимеры (гибриды) двух и более полипептидных це-
пей, связанных нековалентно. Примерами молекулярных форм фер-
ментов этого класса являются ЛДГ, алкогольдегидрогеназа, креа-
тинкиназа.	-------*
3.	Генетические варианты (аллелозимы). Аллелозимы встреча-
ются у организмов, гетерозиготных по генам, кодирующим данный
фермент. В этот класс входят мутантные формы ферментов. Это
очень многочисленный класс молекулярных форм ферменюв, сюда
относятся, например, глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа человека,
аденозиндезаминаза и многие другие.
4.	Сопряженные или производные белки. К этому классу ММФФ
принадлежат формы ферментов, образующиеся в результате кова-
лентного присоединения или отщепления специфических групп к
(от) белку. Такие модификации, как правило» сопровождаются из-
менениями ферментативной активности и некоторых физико-хими-
ческих свойств фермента. Модификация может заключаться в фос-
форилировании — дефосфорилировании (гликоген-фосфорилаза,
гликоген-синтаза, фруктозо-дифосфатаза), аденилировании — де-
аденилировании (глутамин-синтетаза из Е. coli), окислении сульф-
гидрильных групп (ксантиноксидаза, липоилдегидрогеназа), глико-
зилировании (варьирование числа углеводных остатков показано
для p-глюкуронидазы из печени быка, глюкозооксидазы из Penicil-
lium vitale, ДНКазы и РНКазы из поджелудочной железы быка),
амидировании остатков асп и глу (неодинаковая степень амидиро-
вания обнаружена у щелочной протеазы из Streptomyces rectus),
расщеплении пептидных связей протеазами (альдолаза).
5.	Олигомеры единственной субъединицы. При наличии у фер-
мента четвертичной структуры различные молекулярные формы мо-
гут возникать за счет объединения в четвертичную структуру раз-
ного числа одинаковых полипептидных цепей. Так, р-глюкозидаза
активна в виде моно-, ди-, тетра- и октамера. Различная степень
олигомерности как причина появления ММФФ была установлена
для глутаматдегидрогеназы, холинэстеразы и ряда других фермен-
тов.
6.	Конформационно различающиеся формы (конформеры). Кон-
формерами называют белки, отличающиеся по конформации при
одной и той же аминокислотной последовательности. Различия в
пространственной структуре белка, связанные с числом заряжен-
ных групп на поверхности молекулы, приводят к неодинаковой элек-
трофоретической подвижности. К 6-му классу будут относиться и
все аллостерически модифицируемые ферменты.
Итак, термин ММФФ может быть использован как наиболее об-
щий для группы ферментов, встречающихся у одного биологическо-
го вида и обладающих одинаковой специфичностью действия. Его
следует использовать независимо от причины их появления. Термин
170
изофермент, или изоэнзим, применим только к тем ММФФ, появле-
ние которых связано с генетически детерминированными различия-
ми в первичной структуре (классы 1—3), а не с теми, которые обус-
ловлены другими причинами при однаковой первичной структуре
(классы 4—6).
3.9. Локализация ферментов и их сравнительная
активность в отдельных органах и тканях
Все организмы, отдельные органы и ткани многоклеточных орга-
низмов отличаются друг от друга не только по морфологическим и
анатомическим признакам, химическому составу, но и характеру
метаболических процессов, который определяется «набором» фер-
ментов и их активностью. Например, ферменты метаболизма зеле-
ных пигментов характерны только для фотосинтезирующих орга-
низмов, а ферменты тромбин и плазмин — для человека и живот-
ных.
Внутри клетки индивидуальные ферменты, как правило, содер-
жатся и действуют в строго определенных ее органеллах, компарт-
ментах. Внутриклеточная локализация ферментов непосредственно
связана с той функцией, которую выполняет данный участок клетки.
В настоящее время хорошо установлено, что почти все ферменты
гликолиза обнаруживаются в цитоплазме, ферменты ЦТК, p-окисле-
ния жирных кислот — в матриксе митохондрий, ферменты окисли-
тельного фосфорилирования — во внутренней мембране митохонд-
рий. Ферменты орнитинового цикла присутствуют в митохондриях
и цитоплазме, причем одни из них (орнитин-карбамоилтрансфера-
за, большая часть карбаматкиназы) локализованы в митохондри-
ях, а другие (аргининосукцинат-синтетаза, аргининосукцинат-ли-
аза) — в цитоплазме.
В ядрах сосредоточено небольшое число ферментов, в основном
это ферменты синтеза нуклеиновых кислот, типичными представите-
лями их являются а- и (3-ДНК-полимеразы, РНК-полимераза.
Очень богаты по набору ферментов лизосомы, в них широко пред-
ставлены гидролитические ферменты. Лизосомы участвуют в «пере-
варивании» содержимого фагоцитарных пузырьков, которые при
этом сливаются с лизосомами. Такие объединенные образования
остаются отделенными мембраной от остальных внутриклеточных
компонентов, что и защищает последние от гидролиза. Вместе с тем
при автолизе и некрозе тканей ферменты лизосом участвуют непо-
средственно в расщеплении компонентов самой клетки. У животных
и человека лизосомы присутствуют в различных клетках, особенно
много их содержится в лейкоцитах.
В пероксисомах сосредоточены ферменты метаболизма гликоле-
вой кислоты и утилизации пероксида водорода.1 Мембранные струк-
туры микросом богаты цитохромом Р-450, катализирующим ряд
реакций биологического гидроксилирования и других окислитель-
ных процессов. В строме хлоропластов содержится рибулозобисфос-
фат-карбоксилаза и другие ферменты, участвующие в синтезе угле-
171
водов из СОг. В мембраны хлоропластов встроены АТФазы и пере-
носчики электронов» функционирующие в процессе фотосинтеза.
Четкая пространственная локализация ферментов в клетке обеспе-
чивает их согласованную деятельность.
Многие биологические катализаторы благодаря их строгому рас-
положению в клетке используют как маркеры тех или иных внутри-
клеточных структур. Например, при исследовании печени крыс по-
казано, что кислая фосфатаза локализована в лизосомах, каталаза,
оксидаза D-аминокислот — в пероксисомах, аденилатциклаза — в
плазматической мембране, глюкозо-6-фосфатаза, НАДФН-цитохром
с — редуктаза — в ЭПР,1лактатдегидрогеназа — в цитоплазму га-
лактозилтрансферазы — вПаппарате Гольджи. Однако распределе-
ние ряда ферментов внутри клетки может быть неоднотипным у раз-
личных представителей живой природы. Так, фосфоенолпируват-
карбоксилаза в печени крыс обнаружена в цитоплазме, кролика —
в митохондриях, а морской свинки — ив митохондриях, и в цито-
плазме.
Отдельные ткани и органы животных и растений отличаются не
только по набору ферментов» но и по их активности. Так, почти во
всех тканях млекопитающих содержатся ферменты гликолиза, ЦТК,
но активности их существенно отличаются в разных по специфич-
ности клетках. Наибольшая активность ферментов гликолиза, а
также креатинкиназы характерна для скелетных мышц, ферментов
орнитинового цикла — для печени, РНКазы — для поджелудочной
железы, глутаминазы — для мозга, р-глюкуронидазы — для селе-
зенки. Такую особенность тканей используют в клинике при диаг-
ностике некоторых заболеваний. В частности, возрастание актив-
ности креатинкиназы в сыворотке крови является одним из показа-
телей повреждения мышечной ткани.
Существуют также возрастные изменения в активности и наборе
ферментов в тканях, которые наиболее четко заметны в период
эмбрионального развития при дифференцировке тканей. Так, у не-
оплодотворенного куриного яйца обнаруживаются лишь следы лак-
татдегидрогеназной активности; она существенно возрастает с нача-
лом развития эмбриона.
3.10. Классификация и номенклатура ферментов
Согласно классификации, разработанной Международной ко-
миссией по ферментам и принятой в 1961 г., все ферменты разделя-
ют на шесть классов в соответствии с характером катализируемых
ими реакций. Классы делятся на подклассы1, а последние — на под-
подклассы или группы» внутри которых ферментам присвоен поряд-
ковый номер. Каждый фермент имеет свой индивидуальный четы-
рехзначный шифр. Например, шифр фермента глюкозооксидазы
КФ. 1.1.3.4, т. е. она относится к первому классу, первому подклассу
1 В этом разделе рассматриваются подклассы наиболее часто встречающих-
ся ферментов.
172
внутри этого класса и к третьему подподклассу, где имеет поряд-
ковый номер 4. Деление на классы осуществляется следующим об-
разом.
1.	Оксидоредуктазы, Катализируют окислительно-восстанови-
тельные реакции.
2.	Трансферазы. Катализируют реакции переноса группировок
с одного соединения на другое: XR4-Z=e*X4-RZ.
3.	Гидролазы. Ускоряют гидролитическое расщепление веществ:
ХУ+Н2О = ХОН + УН.
4.	Лиазы. Катализируют реакции негидролитического расщеп-
ления с образованием двойных связей или реакции присоединения
по двойным связям1.
5.	Изомеразы. Катализируют реакции изомеризации соединений.
6.	Лигазы (синтетазы). Ускоряют реакции синтеза с использо-
ванием энергии макроэргических соединений.
Рациональные ,или систематические, названия ферментов, пред-
ложенные Международной комиссией, включают названия субстра-
тов и характер катализируемых реакций. Рациональные названия
довольно громоздки, поэтому за ферментами сохраняются и рабо-
чие (тривиальные) названия. Например, фермент, катализирующий
реакцию: АТФ + гексоза == гексозо-6-фосфат 4-АДФ, имеет рабочее
название гексокиназа, а рациональное АТФ: D-гексоза 6-фосфо-
трансфераза (названия субстратов в двухсубстратных реакциях
указывают через двоеточие). Если фермент катализирует реакцию,
при которой одновременно идут два превращения, то в наименова-
нии фермента, второе превращение дается в скобках. Реакцию
О-аспартат4- Н2О 4- О2 = оксалоацетат 4- NH3 4- Н2О катализирует
D-аспартат: кислород оксидоредуктаза (дезаминирующая)2.
1-й класс. Оксидоредуктазы. Систематическое название фермен-
тов этого класса составляют по схеме: донор водорода : акцептор
оксидоредуктаза. Оксидоредуктазы, катализирующие перенос водо-
рода, имеют тривиальное название дегидрогеназы: R'H24-R/,==
==R/zH2+R/. В тех случаях, когда донор водорода точно не установ-
лен, используют термин редуктаза.* Если акцептором водорода слу-
жит О2, то ферменты, катализирующие эти реакции, имеют триви-
альное название оксидазы. Реакции прямого присоединения кисло-
рода к субстрату катализируются оксигеназами. Термин пероксида-
за относится к тем ферментам, которые используют Н2О2 в качестве
акцептора водорода. Оксидоредуктазы подразделяют на 17 подклас-
сов главным образом в зависимости от того, какие группировки
1 Там, где значительно более важной (или единственно обнаруженной) яв-
ляется обратная реакция, в названии может применяться термин синтаза (но не
синтетаза). Термин синтетаза рекомендуется только для ферментов шестого класса.
2 В метаболических процессах органические кислоты и аминокислоты обыч-
но участвуют в форме солей или в диссоциированном состоянии, в виде анионов,
поэтому при описании реакции нередко указывают названия анионов, а не самих
кислот. Например: уксусная кислота — ацетат, пировиноградная кислота — пи-
руват, янтарная кислота — сукцинат, аспарагиновая кислота — аспартат. В не-
которых случаях названия анионов производятся от латинских или греческих
названий кислот (ацетат, сукцинат).
173
подвергаются окислению, т. е. в зависимости от природы доноров
водорода. В основу деления на подклассы, или группы, положен хи-
мизм акцептора водорода.
Подкласс 1.1 включает ферменты, действующие на СН—ОН-
группу доноров. Примером фермента, входящего в этот подкласс,
является алкогольдегидрогеназа. Сюда же относятся ЛДГ, МДГ,
фосфоглюконатдегидрогеназа (декарбоксилирующая) и другие.
Подкласс 1.2. содержит ферменты, окисляющие альдегидную
или кетонную группу доноров.
Подкласс 1.4 — ферменты действуют на СН—ПН2~группу доно-
ров. В этот подкласс входят ферменты, катализирующие окисли-
тельное дезаминирование аминокислот.
Подкласс 1.6 — ферменты окисляют восстановленные НАД и
НАДФ, в основном представлены флавопротеинами.
Подкласс 1.10 содержит ферменты, действующие на дифенолы
и родственные им соединения в качестве доноров. К этому подклас-
су принадлежит, в частности, аскорбатоксидаза.
Подкласс 1.11 включает ферменты, действующие на пероксид во-
дорода в качестве акцептора (каталаза, пероксидаза).
Подкласс 1.13 содержит ферменты, действующие на отдельные
доноры с присоединением к ним кислорода (оксигеназы).
2-й) класс. Трансферазы. Систематическое название ферментов
этого класса образуется следующим образом: донор : акцептор —
транспортируемая группа — трансфераза. Часто используют и циф-
ровую приставку для указания положения, к которому присоединя-
ется переносимая группа. Деление на подклассы идет по химизму
переносимых групп, всего выделено восемь подклассов.
2.1.	Переносят одноуглеродные остатки: метильные, оксиметил fa-
ные, формильные, карбоксильные и др. Пример: метилтрансфера-
зы, катализирующие перенос метильных групп.
2.2.	Переносят альдегидные и кетонные остатки. Сюда относятся
ферменты: транскетолаза (переносит 2-углеродный фрагмент) и
трансальдолаза (переносит 3-углеродный фрагмент). Эти фермен-
ты участвуют в пентозном цикле дыхания, в фотосинтетическом
цикле Кальвина.
2.3.	Ацилтрансферазы — переносчики кислотных радикалов.
В этот подкласс входит большое число ферментов — переносчиков
ацетильных остатков от ацетил-КоА, такие ферменты имеют триви-
альное название ацетилтрансферазы, они участвуют, например, в
синтезе ацетилглюкозамина, ацетилхолина.
2.4.	Гликозилтрансферазы — переносчики гликозильных остат-
ков, например, ферменты, участвующие в синтезе полисахаридов и
имеющие в качестве небелковой части нуклеозиддифосфатсахар
(НДФС). Фосфоролитическое расщепление нуклеозидов также идет
при участии этих ферментов.
2.6.	Переносят группы, содержащие азот. К этому подклассу от-
носятся важнейшие ферменты азотного обмена — аминотрансфе-
разы.
174
2.7.	Переносят группы, содержащие фосфор (фосфотрансфера*
зы). Эти ферменты переносят фосфатный остаток от АТФ на раз-
личные акцепторы, пирофосфатный остаток (пирофосфотрансфера-
зы), а также более сложные группировки, содержащие фосфатный
остаток (нуклеотидилтрансферазы и др.).
2.8.	Переносят группы, содержащие серу. В этот подкласс вхо-
дят, в частности, КоА-трансферазы.
3-й [класс. Гидролазы. Систематическое название ферментов
класса гидролаз составляется из названия субстрата и через тире
слова гидролаза. Отщепляемые группы могут быть указаны после
названия субстрата, например аденозин — аминогидролаза. Класс
гидролаз делится на одиннадцать подклассов.
3.1. Гидролизуют сложноэфирныё связи. Примеры: эстеразы,
фосфатазы, нуклеазы.
3.2. Гидролизуют гликозильные связи. Представителями этого
подкласса являются амилазы, хитиназа, полигалактуроназа, нейра-
минидаза, а-глюкозидаза, 0-глюкозидаза, р-фруктофуранозидаза
(инвертаза).
3.4.	Гидролизуют пептидные связи (пептид-гидролазы). Систе-
матической номенклатуры для ферментов данного подкласса нет,
так как специфичность этих ферментов перекрывается. В этом под-
классе различают ряд подподклассов ферментов, в частности от-
щепляющие N-концевые аминокислоты (аминопептидазы), С-конце-
вые аминокислоты (карбоксипептидазы), гидролизующие дипепти-
ды (дипептидазы), несколько подподклассов пептид-гидролаз, рас-
щепляющих белки (пептидил-пептидгидролазы, протеиназы).
Протеиназы являются эндопептидазами и гидролизуют белки до
пептидов разной величины. В зависимости от строения активного
центра выделяют следующие подклассы протеиназ.
3.4.21.	Сериновые протеиназы — содержат в активном центре
серин, необходимый для катализа. Сюда относятся химотрипсин,
трипсин — протеиназы желудочно-кишечного тракта, тромбин,
плазмин — протеиназы крови, субтилизин—протеолитический фер-
мент из Вас. subtilis.
3.4.22.	Тиоловые протеиназы — содержат в активном центре
цистеин. Это, в основном, растительные протеиназы, например па-
паин из млечного сока дынного дерева. Некоторые тканевые протеи-
назы (катепсин В и др.) относятся к этому же типу строения.
3.4.23.	Кислые протеиназы — содержат в активном центре две
карбоксильные группы, оптимум pH их действия от 1 до 5. К этому
типу принадлежат пепсин, реннин (химозин), катепсин D, пеницил-
лопепсин.
3.4.24.	Металлопротеиназы.
3.4.99.	Протеиназы с неизвестным механизмом катализа.
3.5.	Гидролизуют С—N-связи, отличные от пептидных. В част-
ности, сюда относятся ферменты, расщепляющие амидные связи:
аспарагиназа, глутаминаза, уреаза.
3.6.	Гидролизуют кислотно-ангидридные связи. В этот подкласс
входят неорганическая пирофосфатаза и АТФазы.
175
3.7.	Гидролизуют С—С-связи. Например, оксалоацетаза, уско-
ряющая гидролитическое расщепление оксалоацетата до оксалата
и ацетата.
(4-iu класс. Лиазы, Систематические названия ферментов этого
класса образуют из названия субстрата, затем указывают отщеп-
ляемую группу и через дефис добавляют слово лиаза. Класс делят
на семь подкласов.
4.1.	С—C-Лиазы. К этому подклассу принадлежит фруктозо-
дифосфат-альдолаза» оксалоацетатдекарбоксилаза, аспартат —
4-декарбоксилаза.
4.2.	С—О-Лиазы. Сюда относятся карбоангидраза, фумарат-
гидратаза.
4.3.	С—N-Лиазы. Например, аспартат — аммиак-лиаза, катали-
зирующая расщепление аспартата до фумарата и аммиака.
С5Ц класс. Изомеразы. Систематическое название ферментов это-
го класса образуют по схеме: субстрат-тип реакции изомеризации-
изомераза. При внутримолекулярном переносе групп ферменты
имеют тривальные названия мутазы, а в реакциях инверсии групп
у хиральных центров—рацемазы и эпимеразы.
В 5-м классе выделено шесть подклассов.
5.1.	Рацемазы и эпимеразы.
5.2.	Цис-транс-изомеразы.
5.3.	Внутримолекулярные оксидоредуктазы. Эти ферменты ка-
тализируют взаимопревращение альдоз и кетоз, кетонных и еноль-
ных групп, перемещают С = С-связи. Например, в реакции D-глице-
ральдегид-З-фосфат^дигидроксиацетонфосфат, которая ускоря-
ется D-глицеральдегид-З-фосфат кетол-изомеразой у первого угле-
родного атома глицеральдегидфосфата (ГАФ) идет восстановление,
у второго — окисление.
5.4.	Внутримолекулярные трансферазы. Примером фермента
этого подкласса является D-фосфоглицерат 2,3-фосфомутаза, ката-
лизирующая превращение 2-фосфо-В-глицерата в З-фосфо-Р-гли-
церат.
класс. Лигазы (синтетазы). Систематическое название об-
разуется по схеме: А : В лигаза (образующая АДФ), где А и В —
соединяющиеся молекулы, в скобках указывается продукт расщеп-
ления нуклеозидтрифосфата, который использовался в данной ре-
акции как источник энергии. Весь класс делится на пять подклас-
сов в зависимости от того, между какими атомами образуются
связи.
6.1.	Образуют С—О-связи. Такой тип связи возникает при
действии аминоацил-тРНК-синтетаз, активирующих аминокислоты
и передающих их на тРНК.
6.2.	Образуют С—S-связи. Ферменты этого подкласса катализи-
руют присоединение различных кислотных остатков к КрА.
6.3.	Образуют C—N-связи. Эти ферменты участвуют, например,
в синтезе различных амидов.
6.4.	Образуют С~С-связи. Сюда относятся карбоксилазы —
биотинсодержащие ферменты.
176
3.11. Ферменты в промышленности, медицине,
сельском хозяйстве
Ферментативные препараты находят в настоящее время широ-
кое применение в различных отраслях промышленности. В хлебо-
пекарном производстве для ускорения гидролиза крахмала и улуч-
шения качества теста используют амилазы. При приготовлении дет-
ской пищи с целью облегчения переваривания углеводов и белков
исходные продукты обрабатываются амилазой и протеиназами.
Протеиназы значительно ускоряют процесс мягчения мяса, улучша-
ют его консистенцию при производстве консервов, «созревании»
сельди при засолке. Протеиназы и пектиновые ферменты оказыва-
ются полезными реагентами в виноделии и приготовлении соков.
Добавление их к мезге вызывает гидролиз белков, пектиновых ве-
ществ, это ускоряет сокоотдачу, способствует просветлению сока.
В сыроварении используют реннин, или химозин, образующийся в
сычуге телят и ягнят молочного периода.
В текстильном производстве для расшлихтовки хлопчатобумаж-
ного волокна (удаление примесей крахмала) перед отбеливанием
и крашением также используют амилазы. Специфические протеи-.-
назы находят применение в кожевенной промышленности с целью
мягкого удаления волос с кожи, в технике — при регенерации ки-
нопленки. Щелочные протеиназы наряду с липазами используют
при производстве синтетических моющих средств.
Некоторые ферменты используют как лекарственные средства:
например пепсин, трипсин, химотрипсин, лидаза, протелин, стреп-
токиназа, урокиназа, плазмин и др.
Комплекс целлюлолитических ферментов может быть полезным
в сельском хозяйстве при силосовании соломы. Многие ферменты —
необходимые реагенты при проведении научно-исследовательских
работ. Трудно переоценить в этом плане роль рестриктаз в молеку-
лярной биологии, генетической инженерии.
Такое широкое применение ферментов в различных отраслях на-
родного хозяйства и для других целей привело к их промышленно-
му получению в больших количествах. Сырьем для их выделения
чаще всего служат микроорганизмы, обладающие при выращивании
на селективных средах высокой активностью многих ферментов.
Кроме того, микроорганизмы быстро наращивают свою биомассу,
для их культивирования могут быть использованы дешевые пита-
тельные среды.
Полученные ферментативные препараты, как правило, быстро
теряют свою активность. Чтобы повысить долговечность ферментов
и облегчить их отделение от продуктов химической реакции с целью
повторного использования, их иммобилизуют — встраивают в не-
растворимый носитель, при иммобилизации используются те же
принципы, что и при аффинной хроматографии белков (см.
разд. 2.3.1). Химическое «пришивание» фермента к носителю зак-
репляет конформацию фермента, что и является причиной повыше-
ния устойчивости, снижения лабильности.
ГЛАВА 4
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
4.1.	Открытие нуклеиновых кислот
и их биологическая роль
В 1868 г. швейцарский исследователь Ф. Мишер впервые выде-
лил из ядер лейкоцитов человека соединения нового типа, ранее не-
известные, которые он назвал нуклеинами (от лат. nucleus — яд-
ро). Вскоре сотрудники лаборатории Ф. Гоппе-Зейлера, в которой
работал Ф. Мишер, в том числе и наш соотечественник Н. Любавин,
выделили нуклеины из эритроцитов птиц, рептилий, из дрожжевых
клеток и ряда других объектов. Позднее Ф. Мишер установил, что
нуклеин — это сложное соединение, состоящее из кислого компо-
нента с высоким содержанием фосфора (в 1889 г. этот компонент
назвали нуклеиновой кислотой) и белкового компонента. Так были
открыты нуклеиновые кислоты и новая группа сложных белков, со-
держащая их, — нуклеопротеины. Долгое время считали, что белко-
вые компоненты нуклеопротеинов представлены только белками
основного характера — гистонами и протаминами. В 1936 г. одним
из основателей молекулярной биологии в нашей стране акад.
А. Н. Белозерским и его сотрудниками в растительных нуклеопро-
теинах были обнаружены кислые белки типа альбуминов и глобу-
линов.
К середине 80-х годов XIX в. нуклеин был найден в составе хро-
мосом, в связи с чем сформировались первые представления о его
важной роли в передаче наследственных свойств. Однако позднее
эти представления не получили развития, передачу наследствен-
ных свойств стали связывать с молекулами белка. Только в 40—
50-х годах XX в. были получены экспериментальные доказательства
важнейшей роли дезоксирибонуклеиновой кислоты — ДНК в явле-
ниях наследственности у микроорганизмов. Первое доказательство
принадлежит О. Эвери, К. Мак-Леоду и М. Мак-Карти, определив-
шим в 1944 г. химическую природу трансформирующего агента.
Явление генетической трансформации было открыто Ф. Гриф-
фитсом в 1928 г. Он сумел перенести свойство патогенности от од-
ного штамма пневмококка Diplococcus pneumoniae другому штам-
му, заражая мышей смесью живых клеток непатогенного штамма и
убитых клеток патогенного штамма. О. Эвери и его сотрудники по-
казали, что свойство патогенности можно передать, используя ДНК»
выделенную из убитых клеток. В настоящее время явление транс-
формации широко используют для генетического анализа у бакте-
178
рий. Установлено, что можно осуществить также трансформацию
клеток высших организмов.
Вторым важным доказательством генетической роли ДНК было
выяснение механизма размножения бактериофага Т2 в клетках
£. colL В 1952 г. А. Херши и М. Чейз показали, что ДНК бактерио-
фага проникает внутрь бактериальной клетки и вводит туда «про-
грамму» для синтеза новых фаговых частиц. Подавляющая часть
белка бактериофага остается на поверхности бактериальной клет-
ки. Таким образом, именно ДНК, а не белок отвечает за передачу
наследственной информации у бактерий и бактериофагов.
Свидетельства генетической роли ДНК Для клеток высших ор-
ганизмов привели в 1949 г. Г. Рис и А. Мирский. Они установили,
что количество ДНК в клетке данного организма всегда постоянно
в расчете на гаплоидный хромосомный набор и изменяется строго
пропорционально изменениям плоидности.
Таким образом было доказано, что нуклеиновые кислоты — это
важнейший компонент всех живых организмов, всех живых клеток.
С участием нуклеиновых кислот происходит образование белков,
являющихся материальной основой всех жизненных процессов.
Каждый живой организм содержит свои специфические белки, ко->
торыми он отличается от других организмов. Информация, опреде-
ляющая особенности структуры белков, «записана» в ДНК и пере-
дается в ряду поколений молекулами ДНК.
Нуклеиновые кислоты другого типа—рибонуклеиновые кисло-
ты (РНК) — являются обязательными и первостепенными участ-
никами самого механизма биосинтеза белков. В связи с этим орга-
низм содержит РНК особенно много в тех тканях, в которых ин-
тенсивно образуются белки. Активное участие РНК в биосинтезе
белков определяет их важное значение в процессе морфогенеза, по-
скольку без интенсивного синтеза белков немыслимо появление лю-
бого органа. В процессе эмбрионального развития до стадии гаст-
руляции прирост содержания РНК у эмбриона идет медленно. На-
чало морфогенеза совпадает с резким повышением количества РНК>
особенно в тех участках, где образуются органы. Самым высоким
содержанием РНК характеризуется дорсальная губа бластопора —
«организатор» морфогенеза. Первостепенная роль РНК в биосин-
тезе белков объясняет и ее большое значение в процессе регенера-
ции тканей и органов, для которого прежде всего необходимо но-
вообразование белков.
Важность изучения нуклеиновых кислот и нуклеопротеинов оп-
ределяется также тем, что вирусы являются почти чистыми нуклео-
протеинами. Борьба с многочисленными вирусными заболеваниями
невозможна без глубокого знания строения и свойств нуклеиновых
кислот. Особый интерес представляет выяснение причин заболева-
ния раком и методов лечения этой болезни, в основе которой лежит
нарушение нормального функционирования нуклеиновых кислот и
белков клетки, что очень часто связано с воздействием вирусов.
Следует, наконец, иметь в виду, что мономерные звенья нукле-
иновых кислот — нуклеотиды — играют самостоятельную важную
179
роль в метаболизме: некоторые из них — коферменты, другие —
аккумуляторы энергии в клетке, третьи — циклические нуклеотиды-
регуляторы обмена веществ.
4.2.	Общая характеристика строения
нуклеиновых кислот
4.2.1.	Компоненты нуклеиновых кислот. При полном гидролизе
нуклеиновых кислот образуются пуриновые и пиримидиновые азо-
тистые основания, моносахарид пентоза (рибоза или дезоксирибо-
за) и фосфорная кислота. В выделении и доказательстве присутст-
вия рибозы в нуклеиновых кислотах большую роль сыграли работы
советского физиолога и биохимика Е. С. Лондона (1929).
Все нуклеиновые кислоты делятся на два типа в зависимости от
того, какой моносахарид входит в их состав. Нуклеиновая кислота
называется рибонуклеиновой (РНК), если в ее состав входит рибо-
за, или дезоксирибонуклеиновой (ДНК), если в ее состав входит
дезоксирибоза.
Пентозы в нуклеиновых кислотах присутствуют всегда в (S-D-фу-
ранозной форме:
Р~ D -Рибофураноза
(рибоза)
Д-2'-Дезокси-0-рибофураноза
(дезоксирибоза)
Углеродные атомы пентозы нумеруются цифрами со знаком
«штрих» для того, чтобы можно было отличить их от атомов азотис-
того основания (например, 5-й углеродный атом обозначают С-5'
или 5'). Небольшое отличие — присутствие Н— вместо ОН— у
С-2' рибозы является одной из основных причин существенных раз-
личий в свойствах ДНК и РНК. Предполагают, что замена ОН—
на Н— упрочняет связь между 2-м и 3-м углеродом рибозы. Эго в
целом увеличивает прочность молекулы ДНК, ее консервативность
как хранителя наследственности. Отсутствие кислорода у С-2' де-
зоксирибозы способствует компактности укладки молекулы ДНК,
что важно для вмещения ее гигантских молекул в малом объеме
клеток и ядер.
Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, входящие в
состав нуклеиновых кислот, являются производными ароматических
гетероциклических соединений — пурина и пиримидина. Молекула
пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина и
имидазола. Среди пуриновых азотистых оснований главную роль
играют аденин (А) и гуанин (Г), а среди пиримидиновых основа-
ний— цитозин (Ц), урацил (У), тимин (Т; 5-метилурацил):
180
Пурин
Аденин
(6-амино пурин)
Г уанин
(2-ам ино-6-оксипури н)
Н
нЛ. ‘Ин
нсЧ^хсн
Пиримидин
NH2
Н
Цитозин
(2-окси-4-амино-
пиримидин/
Урацил
(2,4-диокси^
пиримидин)
Тимин
(5-метил-2,4-диокси-
пиримидин)
В состав ДНК входят аденин, гуанин, цитозин, тимин; в РНК
вместо тимина присутствует урацил. Ниже приведены одинаковые
и отличающиеся компоненты ДНК и РНК.	ч
Одинаковые компоненты
Аденин
Гуанин
Цитозин
Отличающиеся компоненты
ДНК	РНК
Дезоксирибоза Рибоза
Тимин	Урацил
Кроме главных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах
присутствуют в небольших количествах необычные — минорные
основания. Так, в состав ДНК высших организмов входит б-метил-
цитозин, содержание которого у высших растений намного превы^1
шает его содержание у животных. В ДНК ряда бактерий встреча-
ются небольшие количества 6-метиладенина и 5-метилцитозина. Эти
метилированные основания защищают «свои» ДНК от расщепления
ферментами — ДНКазами. В ДНК Т-четных фагов Е. coli цитозин
заменен на 5-гидроксиметилцитозин. В некоторых случаях его гид-
роксиметильная группа соединена с глюкозой. Особенно много ми-
норных компонентов содержится в транспортных РНК: тиоурацил,
дигидроурацил, псевдоуридин1, ксантин (2,6-диоксипурин), гипо-
ксантин (6-оксипурин), ацетилцитозин, оротовая кислота и другие,
всего около 60.
1 Псевдоуридин — это минорный нуклеозид, в котором рибоза присоеди-
няется не к 1-му, а к 5-му атому урацила.
181
5,6-Дигидроурацил
Оротовая кислота
Трехмерная структура различных пуриновых и пиримидиновых
оснований была исследована методом рентгеноструктурного анали-
за. Молекулы пиримидинов имеют плоское строение, а молекулы
пуринов — почти плоское. Все они, кроме аденина, существуют в
таутомерных формах. Так, урацил может находиться в форме или
лактима, или лактама:
Лактим (енол-форма) Лактам (кето-форма)
В составе нуклеиновых кислот все оксопроизводные азотистые
основания присутствуют в форме лактамов. Азотистые основания
поглощают свет в ультрафиолетовой области спектра с длинами
волн 200—300 нм и максимумом около 260 нм. Это свойство исполь-
зуют при количественном определении нуклеиновых кислот.
В процессе обмена веществ растений и животных пуриновые ос-
нования образуют ряд продуктов: мочевую кислоту, кофеин, тео-
бромин. В последние годы некоторые синтетические пиримидины
широко используют в качестве биологически активных соединений.
4.2.2.	Нуклеозиды и нуклеотиды. В нуклеиновых кислотах пури-
новые азотистые основания через 9-й атом, а пиримидиновые —
через 1-й образуют N-гликозидную связь с пентозой рибозой или
2'-дезоксирибозой.
Такие соединения, в которых азотистые основания связаны с ри-
бозой или дезоксирибозой, называются нуклеозидами, а их фосфор-
ные эфиры — нуклеотидами. Если аденин присоединяется к рибозе,
то получается нуклеозид аденозин. Если к аденозину присоединяет-
ся остаток фосфорной кислоты в 5'-положении, то образуется 5'-аде-
ниловая кислота, или аденозин-5'-монофосфат, если в З'-положе-
нии — то З'-адениловая кислота, или аденозин-З'-монофосфат. Но-
менклатура нуклеозидов и нуклеотидов приведена в табл. 4.1. Фос-
фат может этерифицировать сахар также в 2'- или З'-положении.
Все нуклеотиды — сильные кислоты, так как остаток фосфорной
кислоты легко диссоциирует. К нуклеозидмонофосфату могут при-
соединиться посредством фосфоангидридной связи еще один или
два остатка фосфорной кислоты. При этом образуются нуклеозид-
182
ди- и нуклеозидтрифосфаты. Если в состав нуклеозида входит де-
зоксирибоза, то перед названием соответствующего нуклеотида ста-
вится приставка дезокси, например, д-АТФ-дезоксиаденозин-5'-три-
фосфат.
4.2.3.	Строение полинуклеотидной цепи L Нуклеотиды — это
повторяющиеся мономерные единицы олигонуклеотидов и полинук-
леотидов. Олигонуклеотиды построены из нескольких мономеров,
полинуклеотиды — из многих. Нуклеиновые кислоты представляют
собой полинуклеотиды, построенные из мономеров — нуклеотидов,
число которых колеблется от 7 десятков до сотен миллионов.
Молекулы нуклеиновых кислот всех типов живых организмов —
линейные полимеры, не имеющие разветвлений, что доказано с по-
мощью ряда методов (химических, ферментативных, электронной
микроскопии). Наличие так называемых палиндромных шпилек
(см. разд. 4.3.1), образующих своеобразные боковые отростки от
линейной цепи ДНК, не следует считать нарушением ее линейности,
Таблица 4.1. Номенклатура нуклеозидов и нуклеотидов
Азотистые основания	Нуклеозиды	Нуклеотиды	
		полное название	сокращенное название
Аденин	Аденозин	Адениловая кислота, аденозинмоно- фосфат	АМФ
Гуанин	Гуанозин	Гуаниловая кислота, гуанозинмоно- фосфат Цитидиловая кислота, цитидинмоно- фосфат Уридиловая кислота, уридинмоно- фосфат Тимидиловая кислота, тимидинмоно- фосфат	ГМФ
Цитозин	Цитидин		ЦМФ
Урацил	Уридин		УМФ
Тимин	Тимидин		ТМФ
так как в пределах каждой шпильки линейность структуры сохраня-
ется. При суперспирализации ДНК также могут возникать своеоб-
разные структуры, однако это тоже будут различные изгибы непре-
рывно продолжающейся линейной цепи. Роль мостика между нук-
леотидами выполняет 3', 5'-фосфодиэфирная связь, соединяющая
С-3' D-рибозы (или З'-дезоксирибозы) одного нуклеотида и С-5'
другого (рис. 4.1).
В связи с этим полинуклеотидная цепь имеет определенное нап-
равление. На одном ее конце остается свободной 5'-ОН-группа (на-
чало цепи), на другом — З'-ОН-группа (конец цепи). Концевые гид-
роксильные группы могут быть этерифицированы фосфатом. Пол'
ное написание полинуклеотидных цепей сложно и громоздко, поэто-
му применяют схематическое изображение. Вертикальными прямы-
ми линиями обозначают углеродные цепи сахаров с основаниями,
1 Иногда употребляется также и термин нить.
183
Рис. 4.1. Строение полинуклеотидной це-
пи РНК:
А, Г, Ц — азотистые основания; / — полная, II —
сокращенная форма записи
присоединенными к С-Г,
диагоналями с буквой Р в
середине — фосфодиэфир-
ные связи между атомом
С-3' (вблизи середины
прямой линии) и С-5' (ко-
нец следующей линии).
Используют также бук-
венную систему: буквами
А, Г, Ц, Т, У обозначают
азотистые основания, бук-
вой ф — фосфатную груп-
пу. Если буква ф находит-
ся слева, этерифицирова-
на группа при С-5', спра-
ва — этерифицирована
группа при С-3' (рис. 4.1).
Например, фА — адепо-
зин-5'-фосфат, Аф — аде-
нозин-З'-фосфат.
Полинуклеотидная цепь
несет множество фосфат-
ных групп, которые легко
диссоциируют, вследствие
чего она приобретает от-
рицательный заряд. В
связи с этим нуклеиновые
кислоты в клетке во мно-
гих случаях связываются
с основными белками, об-
разуя нуклеопротеины.
РНК входят в состав
рибонуклеопр о т е и н о в
(РНП), ДНК — дезоксирибонуклеопротеинов (ДНП).
Нуклеопротеины экстрагируют обычно из клеток 1 М раствором
нейтральных солей. Существенным моментом выделения нуклеи-
новых кислот является отщепление от нуклеопротеинов белков и
их удаление. Этого можно достичь использованием в качестве
растворителя белков фенола или смеси хлороформа с изоамило-
вым спиртом. С этой целью применяют также детергенты (доде-
цилсульфат натрия) или расщепление белков протеиназами. Из
последних особенно эффективна проназа (протеиназа Streptomyces
griseus). После отделения белка нуклеиновую кислоту можно оса-
дить, медленно прибавляя этанол. При препаративном выделении
нуклеиновых кислот их получают в виде бариевых, натриевых или
литиевых солей, в которых отрицательные заряды фосфатных
групп экранированы катионами.
В препаратах ДНК обнаруживаются в малых количествах Si,
Mg, Са, Sr и ряд других микроэлементов, которые, по-видимому,
184
участвуют в стабилизации структуры. Есть предположение, что
кремний в форме кремниевой кислоты может в некоторых случаях
заменять фосфатные остатки в молекуле ДНК.
4.3.	Дезоксирибонуклеиновые .кислоты
4.3.1.	Первичная структура ДНК. Структура нуклеиновых кис-
лот лучше изучена у простейших живых существ — прокариот,
К ним относятся бактерии, синезеленые водоросли, риккетсии и
микоплазмы. В клетках прокариот содержится единственная хро-
мосома, состоящая из одной молекулы ДНК, которая не отделена
от цитоплазмы мембраной. Наиболее подробно исследована струк-
тура нуклеиновых кислот, выделенных из различных штаммов и
мутантов Е. coli и ее бактериофагов. Позднее начали изучать гене-
тический материал эукариотических клеток. К ним относятся клет-
ки животных, растений, грибов, простейших, большей части видов
водорослей. Эукариотические клетки содержат ядро, окруженное
мембраной. Ядерный материал распределяется между несколькими
хромосомами, основу которых составляют ДНК и белки (главным
образом, гистоны).
ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третич-
ную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в
полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичную структуру.
Определение первичной структуры ДНК оказалось крайне сложной
и трудной задачей, так как размеры молекулы огромны, а нуклео-
тиды бывают всего четырех видов. Больших успехов в изучении
структуры ДНК достигли Э. Чаргафф и сотрудники его лаборато-
рии, которые, используя метод хроматографии, впервые (1950)
определили нуклеотидный состав ДНК, выделенной из разных объ-
ектов. Они установили, что соотношение в ДНК азотистых основа-
ний подчиняется универсальным закономерностям, которые полу-
чили название правила Чаргаффа.
1.	Сумма пуриновых нуклеотидов (Пур) равна сумме пиримиди-
новых нуклеотидов (Пир) (Пур = Пир, или Пур/Пир=1).
2.	Молярное содержание аденина равно молярному содер-
жанию тимина (А = Т, или А/Т = 1).
3.	Молярное содержание гуанина равно молярному содержанию
цитозина (Г==Ц, или Г/Ц=1).
4.	Количество аденина и цитозина равно количеству гуанина
и тимина (А + Ц^Г + Т, или А + Ц/Г + Т=1).
5.	В ДНК из различных источников неодинаково соотношение
нуклеотидов: у одних преобладает содержание аденина над гуа-
нином, тимина над цитозином (А + Т>Г+Ц) — это так называе-
мый АТ-тип ДНК\ у других преобладают гуанин и цитозин над
аденином и тимином (Г + Ц>А + Т), это — ГЦ-тип ДНК, Таким
образом, ДНК из различных источников отличается по нуклеотид-
ному составу, что выражается различной величиной отношения
Г-ЬЦ/А + Т. В связи с этим Э. Чаргафф выдвинул положение о
видовой специфичности ДНК по нуклеотидному составу. Этот воп-
185
рос был глубоко и всесторонне исследован в лаборатории А. Н. Бе-
лозерского, где были проведены обширные исследования нуклео-
тидного состава обоих типов нуклеиновых кислот сначала у пред-
ставителей различных групп бактерий, а затем и у других орга-
низмов: водорослей, грибов, высших растений и животных. Школой
А. Н. Белозерского была составлена уникальная, наиболее полная
в мировой научной литературе сводка нуклеотидного состава
ДНК почти всех таксономических групп организмов и установле-
но, что нуклеотидный состав ДНК может служить одной из ха-
рактеристик в эволюционной систематике организмов. Советская
наука заняла лидирующее положение в области геносистема-
1ИКИ.
Эти исследования на огромном экспериментальном материале
показали, что внутри ряда систематических групп нуклеотидный
состав ДНК специфичен для каждого вида. Установлено, что у
большинства животных преобладает АТ-тип строения ДНК.
У бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильно
выраженного ГЦ-типа до АТ-типа. Нуклеотидный состав ДНК
бактерий используют в настоящее время как один из систематиче-
ских признаков в исследованиях по таксономии. Этот признак по-
зволяет уточнять родство отдельных бактериальных видов, решать
спорные вопросы классификации. Однако даже при одинаковом
количественном соотношении А, Т, Г, Ц строение ДНК может быть
различным, поскольку оно обусловлено также последовательно-
стью расположения нуклеотидов. Разработка методов определения
последовательности нуклеотидов, т. е. первичной структуры, была
следующим этапом в изучении ДНК.
В течение ряда лет о первичной структуре ДНК, точнее ее от-
дельных фрагментов, судили по косвенным данным: по сблоченно-
сти пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, по распределению
минорных азотистых оснований, по особенностям физических
свойств. Перелом в этой области наметился в 70-х годах в связи
с усовершенствованием метода электрофореза в полиакриламид-
ном геле (ПААГ) и с открытием ферментов рестриктаз (см.
разд. 4.6.8).
Рестриктазы были применены для разделения молекул ДНК на
фрагменты, поскольку рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в
строго определенных точках, там, где расположены специфические
последовательности нуклеотидов. Разные рестриктазы «узнают»
разные последовательности. Используя эти ферменты, можно «раз-
резать» молекулу ДНК на множество фрагментов, концевые по-
следовательности которых известны, поскольку они зависят от ви-
да использованной рестриктазы. Полученные фрагменты разделя-
ют методом электрофореза в ПААГ. Молекула ДНК несет отри-
цательный заряд, обусловленный диссоциацией фосфатных групп,
пропорциональной по величине длине цепочки, поэтому передвига-
ется в электрическом поле. Разделение фрагментов молекулы про-
исходит вследствие различий в величине их заряда и размерах.
Благодаря этому разрешающая способность метода оказалась на-
186
столько высока, что позволяет отделять друг от друга фрагменты
ДНК, отличающиеся по длине на одно мономерное звено. Напри-
мер, можно разделить фрагменты длиной в 98, 99 и 100 нуклеоти-
дов. Гель разрезают так, чтобы каждый кусочек содержал одну
полоску, одно скопление фрагментов ДНК.
Последовательности нуклеотидов в коротких фрагментах ДНК
определяют с помощью ряда методов. Идея одного из них была
предложена советским ученым Е. Д. Свердловым (1972—1973).
Окончательно она была реализована американскими учеными
А. Максимом и В. Гилбертом (1977). Исходным материалом явля-
ется образец, состоящий из тождественных друг другу одноните-
вых фрагментов ДНК. К 5'-концу, т. е. началу фрагмента, при-
соединяют с помощью специального фермента фосфатную группу,
несущую радиоактивный фосфор 32Р. Далее образец делят на че-
тыре части.
В каждой из порций осуществляют специфические реакции раз-
рыва нити ДНК по месту одного из четырех оснований. С этой
целью обычно используют диметилсульфат, гидразин и пиперидин.
Проводя несколько таких реакций с разной специфичностью (в от-
ношении оснований, расположенных рядом с данным), получают
набор более коротких фрагментов ДНК. Затем все четыре образца
разделяют параллельно в аппарате для гель-электрофореза. Гели
накладывают на рентгеновскую пленку; на ней отпечатываются те
полоски, которые несут 32Р. Непосредственно по радиоавтографам
электрофореграмм можно «прочесть» последовательность. За один
опыт можно исследовать фрагменты длиной до 300—500 нуклеоти-
дов. Это очень высокая производительность, не достижимая ни
одним из других существующих методов.
Однако необходимо знать, в каком порядке располагаются фраг-
менты в целой молекуле. С этой целью ДНК «разрезают» с помо-
щью другого набора рестриктаз, получают другой набор фрагмен-
тов, а затем вновь определяют в них последовательности нуклеоти-
дов. По перекрыванию последовательностей, полученных при раз-
личных способах разрезания, определяют с помощью ЭВМ порядок
расположения фрагментов. Этот метод секвенирования, т. е. опре-
деления последовательности нуклеотидов в ДНК, назван методом
Свердлова — Максима — Гилберта.
Несколько раньше В. Гилбертом (1975— 1976) был предложен
метод получения РНК-овых копий с участков ДНК и их последую-
щей расшифровки. При этом используют фермент РНК-полимеразу
(см. разд. 4.6.2), которая синтезирует РНК-копии на одиночных
цепях ДНК, начиная и кончая синтез в строго определенных мес-
тах. Расшифровка получаемых РНК-овых копий облегчается тем,
что можно предварительно ввести радиоактивную метку в любое
азотистое основание.
Иной путь для такого рода работ предложил Ф. Сэнгер (Анг-
лия, 1976—1978): получение ДНК-копий с помощью ДНК-полиме-
разы и использование минус- и плюс-систем. Метод основан на том,
что ДНК-полимераза обладает способностью удлинять затравку
187
(начальный отрезок цепи — праймер), связанную с одноцепочеч-
ной матрицей, в результате чего образуются одноцепочечные фраг-
менты (ДНК-копии). В минус-системе ДНК-копии получаются в
четырех вариантах, каждый из которых не содержит какой-либо
один вид нуклеотида. При этом синтез цепи обрывается в том мес-
те, где должен следовать отсутствующий нуклеотид.
В плюс-системе в каждом из четырех вариантов добавляется
только один вид нуклеотида из четырех. Восемь полученных проб
радиоактивно меченных фрагментов разделяют методом гель-элект-
рофореза. Полученные радиоавтографы дают возможность судить о
первичной структуре исследуемой ДНК.
Известен и другой вариант метода секвенирования путем получе-
ния ДНК-копий. В этом случае удлинение затравки осуществляют
в присутствии четырех обычных нуклеотидов и одного химического
аналога нуклеотида, включение которого в растущую цепь прекра-
щает синтез, так как у аналога нет свободной З'-ОН-группы, к ко-
торой должен присоединяться следующий нуклеотид. Имея четыре
вида аналогов и используя их в определенном отношении с обыч-
ными нуклеотидами, можно получать наборы продуктов копирова-
ния ДНК-матрицы, имеющие общее начало — праймер — и кончаю-
щиеся на нуклеотидах того или иного типа. Разделение этих фраг-
ментов в ПААГ в зависимости от размеров позволяет «прочитать»
их последовательность на радиоавтографе.
Для изучения повторяющихся последовательностей в ДНК эука-
риот широко применяют метод реассоциации (см. разд. 4.3.3). Ис-
пользуя методы расщепления рестриктазами, химическими агента-
ми, получения РНК-овых копий, минус- и плюс-систем, реассоциа-
ции, гель-электрофореза, радиоавтографии, удалось расшифровать
первичную структуру ДНК вируса SV40, бактериофагов срХ174,
fd, а также отдельных участков ДНК эукариот: гена гормона сома-
тостатина, гена тирозиновой тРНК, р-глобинового гена человека и
кролика и ряда других. При этом было выяснено, что в молекулах
ДНК, выделенных из бактериофагов, почти все последовательности
нуклеотидов уникальны, т. е. встречаются один раз. Они несут ин-
формацию о последовательности чередования аминокислотных ос-
татков в белках.
В гораздо более крупных по размерам молекулах ДНК бакте-
рий большинство генов также уникальны. Наряду с этим повторя-
ются по несколько раз гены, кодирующие транспортные РНК и ри-
босомные РНК. Например, в геноме £. coli содержится примерно
6 участков, кодирующих рибосомные РНК. Среди коротких повто-
ряющихся единиц в хромосомах бактерий и некоторых бактериофа-
гов встречаются /S-элементы (мигрирующие элементы ДНК, см.
разд. 4.3.8).
В геноме высших эукариот ДНК содержится на 3—4 порядка
больше, чем у бактерий, в то время как количество разных белков
увеличивается не более чем на порядок. Это объясняют как слож-
ной организацией генов, так и наличием повторяющихся участков
ДНК.
188
Так, в геноме человека около 64% составляют участки ДНК»
представленные один или несколько раз (уникальные последова-
тельности). Это — структурные гены, несущие информацию о струк-
туре специфических белков. Остальную ДНК составляют повторяю-
щиеся последовательности. От 1/ю до 1Д генома животных представ-
лены умеренно повторяющимися последовательностями (от 10 до
104 копий на гаплоидный геном). Сюда относятся структурные ге-
ны, которые кодируют продукты, необходимые клетке в больших
количествах. Так, гены рибосомных РНК имеются у животных в
количестве от 100 до 1000, у человека — от 300 до 600. Многократ-
но повторяются гены, кодирующие транспортные РНК, и гены, ко-
дирующие белки-гистоны, отдельные цепи иммуноглобулинов. Ча-
ще всего они располагаются в ДНК в виде тандемных повторов (от
англ, tandem — расположение гуськом, цугом), один ген отделяет-
ся от другого спейсером (от англ, spacer — промежуток). По-види-
мому, на ранних стадиях эмбриогенеза, когда необходима продук-
ция огромных количеств рибосомных РНК и гистонов, один ген не
может обеспечить требуемую скорость синтеза. Многочисленные
копии генов делают это возможным.
В группу умеренно повторяющихся последовательностей входят
участки ДНК, выполняющие регуляторные функции. К этой же
группе относятся гены, которые представлены в виде нескольких
копий и могут изредка менять свою локализацию в геноме. Они
открыты в дрожжах, у мышей, дрозофил и получили название мо-
бильные диспергированные гены (МДГ, см. разд. 4.3.8).
В ДНК эукариот существуют также часто повторяющиеся по-
следовательности (повторены сотни тысяч и миллионы раз). В ос-
новном это сателлитная ДНК. Ее можно отделить от остальной
ДНК и разделить на несколько фракций. С этой целью ДНК рас-
щепляют на двухцепочечные фрагменты длиной в 10 000—60 000
пар нуклеотидов, а затем подвергают ультрацентрифугированию в
градиенте CsCl. В этих условиях ДНК распределяется в основной
полосе и в наборе меньших полос, называемых сателлитами (от
лат. satellitis — спутник, сопровождающий).
Сателлитные ДНК обычно имеют очень простую многократно
повторяющуюся последовательность. Например, сателлитная ДНК
мыши содержит такие часто повторяющиеся последовательности:
5'ГАААААТГА-З' и 3'-ТТТТТАЦТ-5'. Повторяясь 150—300 раз, >
они образуют кластеры (скопления), из которых состоит сателлит-
ная ДНК. Одна из общих черт сателлитов — это присутствие в
каждой цеп и “ДНК только трех из четырех возможных оснований.
Фунвдйи" сателлитной ДНК пока неизвестны. Сателлиты обнару-
живаются обычно в центромерном гетерохроматине и могут, види-
мо, участвовать в спаривании и расхождении хромосом.
У человека обнаружены четыре сателлитные ДНК, которые со-
ставляют 6% хромосомной ДНК. Из них изучены три —Л II, IIL
Все они сосредоточены в центромерном хроматине. В каждой хро-
мосоме преобладает какой-либо один сателлит. Единственная хро-
мосома, в которой наряду с центромерным содержится сателлит в
189
дистальной части—У-хромосома. Участки У-хромосомы, содержа-
щие высокие концентрации сателлитов, различны у разных индиви-
дуумов, что указывает на наследственный полиморфизм.
ДНК содержит обращенные повторы, или палиндромы (от
греч. палиндроме — перевертыш), — последовательности, повторя-
ющиеся в обратном порядке. Последовательность оснований в од-
ной из цепей палиндрома совпадает с последовательностью осно-
ваний другой цепи, если прочитывать ее в противополож-
ном направлении. В эукариотических ДНК обнаружены как корот-
кие, так и очень длинные палиндромы. Находясь в линейной ДНК,
«перевертыши» не оказывают влияния на ее вторичную структуру.
Если же ДНК приобретает сверхспирализованную конформацию,
то длинные палиндромы (10—20 и более пар оснований), склады-
ваясь, образуют крестообразные структуры. Предполагают, что по-
следние могут служить сигналами для узнавания определенных
участков ДНК ферментами (рестриктазами, метилазами) и бел-
ками, регулирующими действие генов.
А—т
г Г
И • г
T • А
Т • А
5'-ЦТТЦГАТГГААГ-3' 	5— Ц • Г—3'
, 3'—ГААГЦТАЦЦТТЦ—5'	3'“Г‘Ц—-5'
А • T
А • T
Г . ц
—ч	Ц ц
4.3.2.	Вторичная структура ДНК. Выяснение вторичной структу-
ры ДНК — это одно из крупнейших открытий в биологии, поскольку
при этом одновременно был раскрыт механизм передачи наследст-
венной информации в ряду поколений. В 1953 г. Д. Уотсон и
Ф. Крик установили, что ДНК представляет собой двойную спи-
раль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных це-
пей. Это заключение явилось результатом большого числа экспери-
ментальных данных и первичных обобщений. К ним относятся ра-
боты. Э. Чаргаффа и его сотрудников, которые показали, что нук-
леотидный состав ДНК жестко сбалансирован (см. выше). Важ-
ное значение имели результаты рентгеноструктурного анализа
ДНК, полученные Р. Франклин, М. Вилкинсом с сотрудниками
(1953). Они свидетельствуют о том, что полинуклеотидная цепь
ДНК расположена в форме спирали с периодом идентичности (ша-
гом) 3,4 нм и расстоянием между плоскостями оснований 0,34 нм.
Физико-химическими исследованиями было установлено, что в мо-
лекуле ДНК между амино- и кетогруппами азотистых оснований
образуются водородные связи.
В модели двойной спирали Уотсона — Крика две полинуклеотид-
ные цепи обвивают друг друга, образуя правую спираль (хеликс),
углаводно-фосфатные группы располагаются снаружи, а пурино-
190
вне и пиримидиновые основания — внутри. Азотистые основания,
принадлежащие двум цепочкам, избирательно соединяются водо-
родными связями, образуя специфические пары: А — Т, Г — Ц (это
отражается в одном из правил Чаргаффа). А и Т соединяются дву-
мя водородными связями в положениях 1 : 3 и 6 : 4, Г и Ц — тремя
водородными связями в положениях 1:3, 2:2 и 6:4 (рис. 4.2).
Эти азотистые основания называются комплементарными.
Специфичность спаривания азотистых оснований обусловлива-
ет комплементарностъ, т. е. дополнительность цепей ДНК друг дру-
гу. Так, если в одной цепи находится сочетание нуклеотидов АТГЦ,
то во второй цепи ему соответствует сочетание ТАЦГ. Таким обра-
зом, последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически
определяет последовательность нуклеотидов в другой, комплемен-
тарной цепи.	V
191
Расстояния между гликозидными связями одинаковы для каж-
дой пары нуклеотидов— 1,085 нм. Цепи ДНК направлены проти-
воположно друг другу, т. е. антипараллелъны. Стабильность двой-
ной спирали определяется в основном взаимодействием располо-
женных друг над другом, как стопка монет, азотистых оснований.
Расстояние между плоскостями оснований (0,34 нм) примерно эк-
вивалентно сумме ван-дер-ваальсовых радиусов ароматических
колец. При этом создаются условия для возникновения особого ро-
да ван-дер-ваальсовых сил — стэкинг-взаимодействий.
В зависимости от
условий выделения
ДНК получают в ви-
де разнообразных
упорядоченных во-
локнисто - кристал-
лических структур.
Основные черты мо-
дели, предложенной
Д. Уотсоном и Ф.
Криком, сохраняют-
ся в структуре, кото-
рой молекулы ДНК
обладают в растворе
и in vivo, получив-
шей название фор-
мы В. Влажность
ДНК в форме В вы-
ше 75%. На один ви-
ток спирали прихо-
дится 10 пар оснований, шаг спирали 3,4 нм, диаметр 2,0 нм. Счита-
ют, чтоВ-форма ДНК благоприятна для процесса репликации. В-
форма превращается в A-форму, когда влажность препарата ДНК
становится менее 75%. В A-форме пары оснований наклонены к
оси спирали под углом около 20°, в результате чего шаг спирали
уменьшается с 3,4 до 2,8 нм. В A-форме насчитывается 11 пар ос-
нований на виток, что приводит к укорачиванию цепи приблизи-
тельно на 25% (рис. 4.3). Предполагают, что в A-форме ДНК функ-
ционирует в процессе транскрипции. С-форма очень сходна с В-
формой, имеет 9,3 пар оснований на виток, основания наклонены
под углом 5°. Полагают, что форму, близкую к С, имеет ДНК в
составе надмолекулярных структур хроматина и у ряда вирусов.
В участкахТсодёржащих чередующуюся последовательность Г и
Ц, ДНК приобретает Z-форму. Это левая спираль, на один виток
которой приходится 12 пар оснований. Сахарофосфатный остов име-
ет не форму спирали, а зигзагообразный вид (Z) (рис. 4.4). Суще-
ствуют данные, что в Z-форме ДНК участвует в кроссинговере.
Известна также SBS-форма ДНК (от англ, side by side — бок о бок),
в которой нет взаимозакрученности цепей в двойную спираль. Та-
192
кая форма, видимо, обеспечивает легкость разделения цепей, что
очень существенно при биосинтезе ДНК.
Очень редко в частицах бактериофагов особой морфологической
группы роль носителя генетической информации выполняет одно-
цепочечная ДНК. Пример — коль-
цевая одноцепочечная ДНК мелко-
го сферического бактериофага Of Х17
<рХ174, поражающего кишечную па- {V. v \f)/
лочку.	J V У//
4.3.3.	Физико-химические свойст-	A V	/	zxlX
ва ДНК. Хромосомы животных, бак-	[Ч	I /	//
терий, вирусов содержат по одной	> у гН	И	И У J
непрерывной ДНК-спирали огром-
ной длины по сравнению с размера- jyxA S	/1
ми ядра (табл. 4.2). Молекулярная (	j\
масса ДНК определена с помощью'. \ д / S л /ау
ряда методов. Классический метод*
ультрацентрифугирования позволяй Z-торма 8-шорна
ет определять размеры ДНК в пре-
делах М==2Х105—1 • 109. Более, Рис. 4.4. Строение Z- и В-форм
длинные молекулы разрываются ДНК. Жирными линиями показан
при ультрацентрифугировании, по- ход сахаРоФ°сФатной «епи
этому их молекулярную массу опре-
деляют по вязкости.
Для определения плотности молекул ДНК широко используют
метод равновесного центрифугирования в градиенте CsCl. Если
растворы солей цезия (хлористого или сернокислого) центрифуги-
Таблица 4.2. Размер различных молекул ДНК (по В. А. Ратнеру, 1983)
Объект	Длина хе- ликса, мкм	Размер, кб*	Форма
Онкогенный вирус SV40 Фаг срХ174 Фаг X Хромосома Е. coli Хромосомы дрожжей X-Хромосома дрозофилы Средняя хромосома мыши	1,7 1,8 17,0 1500 50—750 104 2 3,4Х1О4	5,2 53 48,0 (2—3) XI О3 1.5Х102— 2,2x10s 3X10* 11,3X10*	Двухцепочечная кольцевая Одноцепочечная	» Двухцепочечная	» >	» »	линейная »	» »	»
1 Число мономеров в килобазах (1 кб — 1000 нуклеотидов или их пар).
8 104 мкм = 1 см.
ровать при достаточно высоких скоростях, то в поведении молекул
возникают две взаимно противоположные тенденции: к седимента-
ции под действием большого ускорения и к хаотической диффузии.
При определенных условиях центрифугирования достигается рав-
новесие между этими двумя процессами, в пробирке возникает
7—937	193
устойчивый градиент концентрации и, следовательно, плотности.
Если в раствор внести молекулы нуклеиновой кислоты, то они бу-
дут оседать в градиенте, пока не достигнут области, где плотность
солевого раствора будет такой же, как их собственная. Такую
плотность называют плавучей. Пользуясь этим методом, можно
разделить смесь очень близких по свойствам полимеров на отдель-
ные компоненты. Еиавуггая.плотность ДНК находитсящ_.цределах
ДД9^1,73. Она зависит от физического состояния и химического
состава ДНК. Нативная ДНК имеет меньшую плавучую плотность,
чем денатурированная, и это свойство используют для разделения
одно- и двухцепочечных молекул. Установлена зависимость плаву-
чей плотности ДНК от нуклеотидного состава: для нативной ДНК
! в нейтральном растворе CsCl плавучая плотность пропорциональна
1 содержанию Г + Ц в пределах от 20 до 80%. При использовании
в качестве стандарта ДНК Е. colt с плотностью 1,71 г-см-3 была
выведена эмпирическая формула: плавучая плотность = 1,660 +
+ 0,098 (Г + Ц в молярных долях). По ней можно рассчитать Г + Ц
в процентах, т. е. определить нуклеотидный состав ДНК. Исполь-
зуя метод центрифугирования в градиенте CsCl, можно также от-
делить многократно повторяющиеся последовательности нуклеоти-
дов от остальной ДНК.
Все внешние факторы, которые нарушают водородные связи
или ослабляют стэкинг-взаимодействия, вызывают денатурацию
ДНК. К ним относятся реагенты, подобные формамиду и мочеви-
не, резкое изменение pH и ионной силы раствора^ повышение тем-
пературы'выше 80°С. Денатурация ДНК — это любые изменения
пространственного расположения цепей ДНК без разрыва кова-
лентных связей. Обычно при денатурации происходит нарушение
водородных связей, или стэкинг-взаимодействий, или тех и других.
Двойная спираль ДНК при этом полностью или частично разделя-
ется на составляющие ее цепи.
Для оценки перехода ДНК от нативного состояния к денатури-
рованному используют ряд методов. Чаще всего измеряют погло-
щение в УФ-области. Интенсивность поглощения света пуриновыми
и пиримидиновыми основаниями в расчете на одно основание зави-
сит от того, присутствует ли оно в свободном состоянии или входит
в состав полинуклеотидов. При образовании двухспиральной струк-
туры ДНК поглощение света каждым основанием уменьшается
(явление гипохромизма). Разрушение двухцепочечной структуры
при денатурации уменьшает «экранированность» оснований, ин-
тенсивность поглощения УФ-света возрастает. Если относитель-
ное поглощение при 260 нм отложить по оси ординат, а темпера-
туру— по оси абсцисс, то получается S-образная кривая (профиль
плавления, рис. 4.5).
Она показывает, что при нагревании ДНК ведет себя подобно
кристаллам: двухцепочечная молекула «расплетается» на состав-
ляющие ее цепи в пределах небольшого температурного интервала.
Поэтому денатурацию ДНК нередко называют плавлением, а тем-
пературу^ при которой ДНК денатурирована на 50%, — темпера-
194
турой плавления — Тпл. S-Образные профили плавления показы-
вают, что денатурация ДНК — кооперативный процесс, т. е. каж-
дое предшествующее изменение повышает вероятность последую-
щего. Например, в результате внешнего воздействия разрывается
несколько водородных связей между азотистыми основаниями, это
Рис. 4.5. Кривые плавления образцов ДНК, выделенных из
разных объектов и отличающихся по нуклеотидному составу:
1 — пневмококк. 2 — тимус, 3 — сперма лосося, 4 — £. coli, 5 — S. mar-
’	cesens, 6 — М. phlei
приводит к нарушению стэкинг-взаимодействий, что облегчает раз-
рыв следующих водородных связей, и т. д.; этот процесс можно
сравнить с расстегиванием молнии.
Температуры плавления, и профили плавления разных ДНК
отличаются. Например, ДНК человека имеет Тпд — 81—82°С, а
ДНК Е. coll 90,5°С. Температура плавления ДНК зависит от соот-
ношения азотистых оснований (Гч-Ц) и (Ач-Т). ГЦ-пары более
прочные (содержат три водородные связи), поэтому чем больше
содержание (ГЧ-Ц), тем выше температура плавления. При стан-^
дартных условиях (определенные pH и ионная сила) Тпл возраста-=
ет на 1% «ри увеличении молярной доли ГЦ-пар на 2,5%. Таким
образом, измеряя температуру плавления, можно точно определить
соотношение в ДНК (ГЧ-Ц) и (АЧ-Т) нуклеотидов. Выведена
эмпирическая зависимость между ГЦ-содержанием и ТПл в стан-
дартном солевом растворе (0,015 М NaCl 4-0,015 М цитрата нат-
рия), это соотношение выглядит так: ГЧ-Ц== (Тпл—69,3) Х2,44.
Полная денатурация ДНК — это расхождение" комплементар-
ных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной
ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако если охлаж-
дение проводить медленно, поддерживая в течение некоторого вре-
мени температуру немного ниже ТПл (этот прием называют отжи-
гом), может восстановиться нативная структура. Восстановление
•
7*
195
первоначальной структуры нуклеиновой кислоты с более или ме-
нее полным восстановлением физических показателей и биологи-
ческих свойств получило название ренатурации. Это процесс, про-
тивоположный денатурации.
Степень сплавляемости молекул ДНК разных видов характе-
ризует и степень их гомологии. Это используют для решения проб-
лем таксономии бактерий: проводят молекулярную гибридизацию,
т. е. процесс ренатурации, но с цепями ДНК, принадлежащими
разным, хотя и родственным, бактериям. Гомологию испытуемых
молекул можно охарактеризовать количественно.
Р. Бриттен и Э. Дэвидсон применили метод реассоциации к
изучению организации генома эукариот. С этой целью ДНК разде-
ляют на фрагменты и плавят, т. е. получают одноцепочечные фраг-
менты. Затем изучают кинетику реассоциации: скорость поиска
комплементарных партнёров. Изучение скорости восстановления
двухспиральных фрагментов показало, что ДНК высших организ-
мов очень гетерогенна: от очень медленно реассоциирующихся
фрагментов, которые должны соответствовать уникальным участ-
кам генома, до очень быстро реассоциирующихся фрагментов.
; Быстрая реассоциация показывает, что данная последовательность
повторяется в геноме многократно. Этим методом была количе-
; ственно охарактеризована степень повторяемости нуклеотидных
последовательностей в геноме эукариот.
Искусственным путем можно получить гибрид ДНК-РНК: мо-
лекулы матричной РНК (мРНК) гибридизуются с одной из двух
разделившихся цепей ДНК, несущей участки, комплементарные
мРНК. Измеряя в процентах количество связавшейся мРНК бел-
ка, кодируемого исследуемой ДНК, можно определить частоту
I повторов данного гена. Р а створ ы на тив но й ДНК имеют высокую
: вязкость, которая резко "понижается при денатурации. Поэтому
измерение ’ вязкости также можно использовать для определения
состояния молекул ДНК.
Резкое подкисление или подщелачивание разрушает двухспи-
ральную структуру ДНК, так как изменяется ионизация амино- и
кетогрупп азотистых оснований, вследствие чего разрываются во-
дородные связи. Растворы нативной ДНК оптически активны, об-
ладают сильным правым вращением поляризованного света, ко-
торое уменьшается при денатурации.
Денатурация и ренатурация ДНК непрерывно протекают в
клетке в процессе репликации ДНК, в процессе транскрипции. Про-
ведение их в лаборатории позволяет изучать многие свойства мо-
лекул ДНК.
4.3.4.	Третичная структура ДНК бактерий и вирусов. В частицах
вирусов, клетках бактерий, как и в ядрах высших организмов,
ДНК плотно «упакована», образует сложные структуры. Напри-
мер, в хромосоме Е, coll содержится ДНК длиной более 1 мм, хотя
длина клетки не превышает 5 мкм. Одна из самых мелких молекул
ДНК — вирусная, однако если ее вытянуть, то она будет во много
раз длиннее, чем сам вирус.
195
Выделенные из вирусных частиц молекулы ДНК имеют либо
линейную, либо кольцевую форму, двух- или одноцепочечную. Час-
то встречаются обычные линейные формы, имеющие начало и ко-
нец. Большой интерес представляют линейные двухцепочечные
формы с так называемыми «липкими» концами. На обоих концах
такой двухспиральной молекулы располагаются одноцепочечные
участки, которые полностью комплементарны друг другу. Напри-
мер, ДНК умеренного фага 1 А Е. coli представляет собой линей-
ную молекулу, на обоих концах которой полинуклеотидная цепь
с б'-концевым фосфатом на 12 нуклеотидов длиннее цепи с З'-ОН-
концом. Последовательности оснований на двух одноцепочечных
концах комплементарны друг другу. Эти «липкие» концы одной
молекулы соединяются друг с другом за счет комплементарного
спаривания оснований. В результате линейная молекула ДНК пре-
вращается в кольцевую, удерживаемую водородными связями.
Эта структура ДНК характерна и для других умеренных бак-
териофагов. Образовавшееся кольцо имеет по одному разрыву в
обеих цепях. После «зашивания» разрывов ферментом ДНК-лига-
зой образуется ковалентно замкнутое кольцо, которое служит
репликативной формой. Молекулы ДНК, содержащие «липкие»
концы, широко используют в генетической инженерии для объеди-
нения двух молекул ДНК в единую структуру.
Линейные молекулы ДНК ш vivo свертываются в плотный клу-
бок. В таком состоянии они устойчивы к деградации.
Одноцепочечные ДНК сущесхвуюъл. в кольцевой. форме. Коль-
цевую форму имеет, например, ДНК фага фХ174. Кольцевую ко-
валентно-замкнутую форму имеют двухцепочечные ДНК бактерий,
ряда вирусов, бактериофагов, плазмид, митохондрий и пластид
эукариот. Двухцепочечные кольцевые ДНК легко переходят в
суперспирализованное состояние, образуя левую (—) спираль.
Это состояние — не исключение, а правило. Однако если в коль-
цевой ДНК имеется хотя бы один разрыв, то суперспирализация
невозможна. Суперспирализация прежде всего необходима для
«упаковки» громадной молекулы ДНК в малом объеме ядра или
клетки. Предполагают также, что суперспирализация служит для
«проверки» ДНК на целостность сахарофосфатной цепи: перед
началом редупликации ДНК закручивается в суперспираль, это
возможно лишь в той ДНК, где обе цепи сохраняют целостность
на всем протяжении. Затем следует редупликация. В сверхспи-
ральной ДНК легче, чем в кольцевой, разводятся комплементарные
цепи, что необходимо для начала репликации и транскрипции.
Суперспирализация способствует также образованию в ДНК
крестообразных структур в участках, где расположены длинные
палиндромы.
1 В отличие от вирулентных умеренные фаги, инфицируя клетку, не размно-
жаются, а переходят в состояние профагов. При этом ДНК умеренного фага
репрессируется и интегрируется в бактериальный геном, в результате чего она
реплицируется как часть генома бактерии.
197
Интактную молекулу ДНК, выделенную из Е. coll, удалось
расправить на специальной подложке и рассмотреть с помощью
электронного микроскопа. Оказалось, что молекула содержит су-
перспиральные участки. Она образует 12—80 петель и прикреплена
к цитоплазматической мембране. С ДНК связаны многочисленные
молекулы РНК, образовавшиеся при транскрипции. Эти молекулы
РНК вместе с белками обусловливают укладку молекул ДНК с
образованием определенного числа петель в компактную струк-
туру.-
4.3.5.	Третичная структура ДНК и организация хроматина в эу-
кариотических клетках. Третичная структура ДНК эукариотических
клеток также выражена в многократной суперспирализации моле-
кулы, однако в отличие от прокариот она осуществляется в форме
комплексов ДНК с белками. ДНК эукариот почти вся находится
в хромосомах ядер, лишь небольшое количество ее содержится в
митохондриях, а у растений и в пластидах. Суммарный материал
хромосом — хроматин — содержит ДНК, гистоны, негистоновые
белки, небольшое количество РНК.
До 50% хроматина составляют простые белки гистоны. Разде-
ление гистонов было проведено методами гель-фильтрации, ионо-
обменной хроматографии, электрофореза. Во всех изученных клет-
ках животных и растений обнаружено пять основных классов
гистонов: Hl, Н2А, Н2В, НЗ, Н4. Классификация гистонов основа-
на на содержании в них лиз и арг. Так, гистон Н1 очень богат лиз,
гистоны Н2А и Н2В содержат умеренное количество лиз, гистон
НЗ содержит цис и умеренно богат арг, гистон Н4 богат арг и гли.
У птиц и амфибий гистон Н1 может быть частично заменен гисто-
ном Н5, тоже богатым лиз.
Молекула гистона состоит из одной полипептидной цепи, кото-
i рая в своей средней части спирализована и скручена в глобулу ди-
аметром около 2,5 нм; от глобулы отходят два неспирализованных
конца молекулы. Первичная структура гистонов имеет ряд особен-
ностей. Так, в гистонах Н2А, Н2В, НЗ, Н4 в N-концевой области
большинство аминокислотных остатков положительно заряжено, а
С-концевая лишена заряда. Первичная структура этих белков эво-
люционно консервативна, у разных животных и растений они мало
отличаются. Например, аминокислотные последовательности
гистона Н4 из проростков гороха и тимуса быка отличаются только
двумя из 102 аминокислот. Исключение в этом плане представля-
ет гистон Н1.
Гистоны взаимодействуют с ДНК в основном через ионные свя-
зи (солевые мостики), образующиеся между отрицательно заря-’
женными фосфатными группами ДНК и положительно заряженны-
ми лизиновыми и аргининовыми остатками гистонов.
Все гистоны подвергаются модификациям: ацетилированию,
метилированию, фосфорилированию и поли-АДФ-рибозилирова-
нию. При этом в их молекулах изменяется распределение элект-
ронной плотности, что приводит к изменению их способности вза-
198
имодействовать с ДНК. В этом, видимо, заключается один из ме-
ханизмов регуляции действия генов (см. разд. 5.4).
В организации хромосом различают три уровня, которые отра-
жают и уровни третичной структуры ДНК. Первый уровень —
нуклеосомный. Диспергированный хроматин выглядит в электрон-
ном микроскопе как цепочка бусин — нуклеосом. Нуклеосома со-
держит ДНК длиной 160—240 пар нуклеотидов, одну молекулу
гистона Н1 и гистоновый октамер. Последний состоит из 8 моле-
кул — по две молекулы из гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4.
Из нуклеосом можно выделить нуклеосомное ядро, или нуклео-
сомный кор. Эта дискретная частица содержит гистоновый октамер
и участок ДНК длиной 145— 150 нуклеотидных пар\ Нуклеосомный
кор выглядит как диск диамет-
ром 11 нм и толщиной 5,7 нм,
в котором ДНК образует на
поверхности примерно 4,75 вит:
ка левой спирали. Гистоновый
октамер располагается внутри
коровой частицы в виде клино-
образной структуры. Коровая
частица содержит много поло-
стей, заполненных водой
Рис. 4.6. Строение нуклеосомного кора
клеток. В результате этого варь-
(рис. 4.6). Между коровыми
частицами расположены участ-
ки ДНК — линкеры, их длина
варьирует в зависимости от типа
ирует и длина фрагмента ДНК, входящего в состав нуклеосом (от
160 до 240 нуклеотидных пар). Межкоровые (линкерные) участки
ДНК или свободны, или связаны с гистоном Н1 и негистоновыми
белками. Гистон Н1 способствует компактной упаковке хроматина/
При этом он может препятствовать транскрипции ряда генов и та-
ким образом регулировать их активность.
Упаковке ДНК в нуклеосомы in vitro способствуют белок нук-
леоплазмин и фермент топоизомераза I. Упаковочный коэффициент
для ДНК, т. е. степень уменьшения размеров, составляет на нуклео-'
сомном уровне около семи.
Второй уровень организации хромосом — это образование из
нуклеосомной нити более толстых фдбрилл (20—35 нм). Предпо-
лагают, что фибриллы представляют собой по форме соленоиды,
образующиеся в результате скручивания нуклеосомной нити. Шаг
соленоида равен 11 нм, на один виток приходится около 6—10 нук-
леосом. Соленоидная упаковка считается наиболее вероятной, од-
нако существуют и другие модели организации хроматина, напри-
мер супербидная. Согласно последней фибрилла хроматина диа-
метром 20—30 нм представляет собой цепь гранул, или супербидов,
каждая из которых состоит из восьми нуклеосом. Упаковочный ко-
эффициент 2-го уровня составляет около шести. В сумме 1-й и 2-й
уровни обеспечивают уменьшение линейных размеров ДНК в 40—
50 раз.
199
! Третий уровень организации хромосом изучен недостаточно.
: Фибрилла толщиной 25—30 нм образует петли, дополнительно
упаковывается, в результате чего происходит уменьшение линей-
ных размеров ДНК,примерно в 200 раз. Петлеобразные структуры
типа «ламповых щеток» в ооцитах земноводных можно видеть на
цитологических препаратах. Эти петли, видимо, суперспирализова-
ны и представляют собой домены ДНК, соответствующие, веро-
ятно, единицам транскрипции и репликации хроматина. Специфи-
ческие белки фиксируют основания петель и, возможно, некоторые
их внутренние участки. Петлеобразная доменная организация спо-
собствует укладке хроматина в метафазных хромосомах в спираль-
ные структуры более высоких порядков. В результате последова-
тельной упаковки хроматина линейные размеры ДНК уменьшают-
ся в 104 раз.
Существуют данные, что при активировании участка хромати-
на, т. е. при транскрипции, с него обратимо удаляются сначала
гистон Н1, а затем и октет гистонов. Это вызывает деконденсацию
хроматина, последовательный переход 30-нанометровой фибриллы
хроматина в 10-нанометровую нить и ее дальнейшее разворачива-
ние в участки свободной ДНК, г. е. утрату нуклеосомной струк-
туры.
4.3.6.	Цитоплазматическая ДНК. В цитоплазме эукариот содер-
жится небольшое количество ДНК (менее 1% всей ДНК клетки).
Она получила название цитоплазматической и отличается от ядер-
ной ДНК по нуклеотидному составу и молекулярной массе. Заклю-
ченная в ней генетическая информация обусловливает цитоплазма-
тическую наследственность. Цитоплазматические гены находятся
в митохондриях и хлоропластах.
Наиболее полно изучена митохондриальная ДНК (мтДНК).
В клетках животных она представлена двухцепочечными, обычно
кольцевыми молекулами, длиной по окружности от 5 до 30 мкм.
Молекулярная масса мтДНК у дрожжей, грибов, простейших
(3—4) XI О7, у высших животных до 107. В одной митохондрии мо-
жет содержаться от 2 до 10 молекул ДНК, обычно они находятся
в матриксе.
Все гены в мтДНК млекопитающих расположены исключитель-
но компактно, почти без промежуточных нуклеотидных последова-
тельностей, в то же время в дрожжевой мтДНК между генами
находятся повторяющиеся некодирующие участки. МтДНК коди-
рует две рРНК митохондриальных рибосом, полный набор тРНК»
необходимых для синтеза белка, и ограниченное число полипепти-
дов, синтезируемых на полисомах в митохондриях. Полипептиды
представляют собой субъединицы ферментативных комплексов
внутренней мембраны митохондрий. Например, митохондриальную
природу имеют в зависимости от объекта одна, две, а у дрожжей —
три субъединицы АТФ-синтетазного комплекса, три субъединицы
цитохромоксидазы и апофермент цитохрома Ь. Остальные субъеди-
ницы этих комплексов кодируются ядерными генами и синтезиру-
ются в цитоплазме.
200
ДНК хлоропластов имеет молекулярную массу около 1Х108,
т. е. она приблизительно в 10 раз больше, чем мтДНК животных.
ДНК хлоропластов детерминирует синтез рРНК хлоропластов,
рибосомных белков большой субчастицы рибосом хлоропластов,
фермента рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы и других белков.
4.3.7.	Бактериальные плазмиды. В цитоплазме многих бактерий
кроме хромосомной ДНК содержатся добавочные маленькие коль-
цевые молекулы ДНК, присутствие которых необязательно для
жизни клетки. Они получили название плазмид. Плазмиды способ-
ны автономно размножаться, стабильно наследуются, т. е. сохра-
няются без специальной селекции во внехромосомном состоянии.
Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому бактерии, они
называются эписомами.
Плазмиды обнаруживаются в клетке в виде кольцевых двухце-
почечных молекул ДНК с 2И=от 2Х104 до 3,2Х108. Таким обра-
зом, плазмидная ДНК составляет 1—15% от массы хромосомной
ДНК бактерии. Мелкие плазмиды содержат генетическую инфор-
мацию в среднем для двух белков, крупные могут кодировать до
200 белков. Мелких плазмид может находиться в бактериальной
клетке несколько десятков, крупных — одна-две. Чаще в одной
клетке находятся плазмиды одного типа, но могут присутствовать
плазмиды разных типов.
Плазмиды обладают как общими, так и специальными функ-
циями. Всем плазмидам свойственна, например, способность к ав-
тономной репликации, а также свойство несовместимости (две
близкородственные плазмиды не могут существовать в одной
клетке).
Существует классификация плазмид по группам несовместимо-
сти. Большим плазмидам присуща также функция переноса, т. е.
способность вызывать конъюгацию бактериальных клеток и пере-
ходить при этом в реципиентные клетки. Некоторые из таких плаз-
мид способны переносить хромосомные гены бактерии. Например,
фактор F (половой фактор £. colt) может включаться в бактери-
альную хромосому и осуществлять перенос ее части или, очень
редко, всей хромосомы в подходящий реципиентный штамм. Из
клетки донора в клетку реципиента переносится только одна цепь
ДНК, на ней сразу же синтезируется комплементарная цепь. Вклю-
чение плазмиды в хромосому бактерии происходит с участием
/S-элементов и транспозонов (см. разд. 4.3.8). Распространение
плазмид, не обладающих способностью к переносу, происходит с
помощью бактериофагов, других плазмид или путем трансфор-
мации. Типы плазмид отличаются друг от друга по специ-
альным функциям. Широко изучают в настоящее время плазмиды,
обусловливающие устойчивость бактерий к антибиотикам, — /?-
факторы. Это крупные плазмиды, которые вызывают конъюгацию
бактерий и таким образом распространяются в бактериальной по-
пуляции. Передаваясь от одной клетки к другой, они придают
бактериям устойчивость к действию одного или нескольких ле-
карств: тетрациклина, пенициллина, стрептомицина и др.
201
У многих видов бактерий встречаются бактериоциногенные
плазмиды, продукты которых представляют собой бактериоцины —
белки, обладающие антибиотическими свойствами. Бактериоцины
убивают бактерии того же или близкого вида и даже рода, не со-
держащих плазмид. К наиболее хорошо изученным бактериоцинам
относятся колицины, продуцируемые Е. coll. Новые исследования
показали, что у многих продуцентов антибиотиков существуют
плазмиды, прямо или косвенно участвующие в самом процессе
образования антибиотиков, например хлорамфеникола, метилено-
мицина. Известны также плазмиды, придающие бактериям способ-
ность расщеплять необычные источники углерода (алифатические
и ароматические углеводороды, камфора, салициловая кислота),—
плазмиды биодеградации. Интересные и важные результаты по
исследованию этой группы плазмид получены в Советском Союзе
под руководством Г. К. Скрябина, А. М. Боронина. Обнаружены
плазмиды, влияющие на патогенность бактерий: они кодируют
биосинтез энтеротоксинов, гемолизинов и антигенов, расположен-
ных на поверхности бактериальных клеток.
Биологическая роль плазмид велика: они обеспечивают бакте-
риям селективные преимущества в меняющихся условиях внешней
среды. Благодаря способности к переносу и автономной реплика-
ции плазмиды широко используются в генетической инженерии.
Кроме бактерий плазмиды иногда содержат синезеленые водо-
росли, а из эукариотических организмов — дрожжи.
4.3.8.	Мигрирующие элементы ДНК. В последнее десятилетие
накопились данные о существовании «прыгающих генов», т. е.
таких участков ДНК, которые могут перемещаться из одних час-
тей генома в другие. Эти мигрирующие элементы ДНК участвуют
в регуляции действия генов и индуцировании хромосомных пере-
строек. Они способствуют осуществлению необычных рекомбинаци-
онных событий. Мигрирующие элементы прокариот делят на два
типа: /S-элементы и транспозоны.
/S-Элементы, инсерционные сегменты или вставочные последо-
вательности (от англ, insertion sequences) содержат только Tg гены,
которые необходимы для внедрения в ДНК. Размер /S-элементов
составляет в большинстве случаев от 800 до 1400 нуклеотидных
пар. На концах они содержат повторяющиеся нуклеотидные после-
довательности, прямые или инвертированные. /S-Элементы обнару-
жены в бактериальных плазмидах, хромосомах бактерий и бакте-
риофагов в виде повторяющихся нуклеотидных последовательно-
стей. В хромосоме Е. coli К12 они содержатся во многих копиях
как природные компоненты.
Встраивание /S-элемента в тот или иной ген — инсерция —
представляет собой мутацию особого типа. Она или препятствует
транскрипции генов, отделенных от регуляторной части /S-элемен-
том (см. разд. 5.4), или, наоборот, обеспечивает проявление гена.
Таким образом, /S-элементы оказывают как положительное, так и
отрицательное влияние на экспрессию соседних генов, т. е. на их
функционирование.
502
Транспозоны — это более сложные мигрирующие элементы,
состоящие из 3000—25 000 нуклеотидных пар. Они ведут себя как
/S-элементы, часто включают их в свой состав, но содержат кроме
генов, ответственных за способность перемещаться, также допол-
нительные гены. Так, некоторые транспозоны несут в виде допол-
нительных гены устойчивости к лекарственным препаратам: неко-
торым антибиотикам и сульфаниламидам. Гены устойчивости при-
крыты с обеих сторон повторами, инвертированными по отноше-
нию друг к другу, или же содержат на концах прямые повторы
/S-элементов. Таким образом, концевые повторяющиеся нуклеотид-
ные последовательности — это типичный признак мигрирующих
элементов, структура, необходимая для транспозиции (перемеще-
ние). Вплотную к обоим концам транспозона примыкают неболь-
шие (5, 9, 11 нуклеотидных пар) повторы ДНК. Они представляют
собой прямые повторы прилегающих к транспозону участков ре-
ципиентной хромосомы.
Находясь в составе четко очерченных структур — транспозонов,
из генома в геном мигрируют гены лекарственной устойчивости.
Например, из плазмиды —в геном фага —> в геном бакте-
рий —> в плазмиду и т. д. Иногда происходит эксцизия встроенно-
го фрагмента ДНК, т. е. его освобождение из хромосомы. При этом
он либо теряется, либо встраивается в другое место той же или
иной хромосомы. Вследствие этого вызванные транспозициями му-
тации оказываются нестойкими. Встраивание и выщепление «пры-
гающих генов» контролируют специальные белки. Каждый транс-
позон содержит одну или несколько специфических точек встраи-
вания в данный геном. Выщепление транспозона происходит, как
правило, неточно, что индуцирует перестройки хромосом (делеции,
инверсии, слияния). /S-Элементы нередко внедряются в регулятор-
ные участки ДНК, изменяя регуляцию активности генов. 75-Эле-
менты и транспозоны, входящие в состав плазмид или бактерио-
фагов, обусловливают встраивание этих структур в бактериальную
хромосому. Таким образом, они определяют способность больших
блоков ДНК мигрировать между генами, содержащимися в одной
клетке. Это приводит к нестабильности геномов, что играет важ-
ную роль в эволюции бактериальных плазмид и бактериофа-
гов.
Элементы, подобные транспозонам и /5-элементам, найдены в
грибах, кукурузе и других растениях, у дрозофилы, млекопитающих
и др. По общему плану строения, способу транслокации и генети-
ческому эффекту они аналогичны подвижным элементам прока-
риот. Такого рода мобильные диспергированные гены (МДГ)
эукариотических организмов насчитывают 5000—10000 нуклеотид-
ных пар. Они могут составлять до 5% ДНК генома. На своих кон-
цах МДГ содержат прямые повторы по 200—500 пар нуклеотидов,
которые ограничены палиндромами. МДГ транскрибируются с
обеих цепей, но кодируемые ими продукты пока неизвестны. Как
минимум они должны кодировать ферменты транспозиции, как
/5-элементы и транспозоны прокариот. Большие заслуги в изуче-
203
нии подвижных генетических элементов эукариот принадлежат
Г. П. Георгиеву (1984).
Существуют данные, что МДГ оказывают влияние на структуру
и экспрессию других генов. В последнее время установлено боль-
шое сходство в строении транспозонов прокариот, МДГ эукариот
и онкогенных провирусов. По гипотезе Г. Темина (1972) последние,
вступая в рекомбинантные отношения с некоторыми клеточными
генами, приводят к раковой трансформации клетки. Существует
мнение, что транспозоны прокариот прошли через всю эволюцию,
породив у теплокровных ретровирусы.
Таким образом, изменения в геноме эукариот не ограничивают-
ся только редкими мутациями и генетическими рекомбинациями.
Наличие транспозирующих элементов может служить источником
изменений, выступающих как факторы регуляции дифференциров-
ки клеток и генной активности, могут давать необычные мутации.
Особенно важно, что в основе такой высокочастотной изменчиво-
сти лежат иные механизмы, чем те, которые ответственны за му-
тации, возникшие под влиянием экзогенных факторов. Однако в
обычных условиях нестабильные генетические элементы в основной
массе заблокированы, поэтому, хотя представления о стабильно-
сти генома эукариот и претерпели некоторые изменения, в основе
они остаются незыблемыми.
4.4.	Рибонуклеиновые кислоты
4.4.1.	Гетерогенность молекул РНК. Содержащиеся в клетке
РНК различаются размером, составом, функциями и локализаци-
ей. В цитоплазме содержится стабильная РНК нескольких видов:
транспортная РНК (тРНК), матричная, или' информационная
(мРНК, или иРНК), рибосомная (рРНК). В ядре локализована
ядерная РНК (яРНК), количестве которой составляет от 4 до 10%
от суммарной клеточной РНК. В состав яРНК входит большое
число молекул, различающихся по размерам и нуклеотидным по-
следовательностям, существенно превышающее число различных
молекул цитоплазматических мРНК.
В ядре эукариот синтезируются высокомолекулярные предше-
ственники (пре-РНК) рибосомных 28S1 и 18SPHK, 5SPHK, тРНК,
мРНК. Значительную часть яРНК составляют стабильные виды
РНК рибосомной и нерибосомной природы. Предшественники вы-
сокомолекулярных рРНК локализуются в ядрышке. С ними связа-
на гетерогенная популяция низкомолекулярных РНК (нмРНК),
содержащая всего около 30 разнообразных молекулярных видов.
Особую фракцию образует гетерогенная ядерная РНК (гяРНК),
составляющая 2—10% тотальной яРНК. Она характеризуется вы-
сокой скоростью обмена и ДНК-подобным нуклеотидным составом.
1 S — коэффициент седиментации, выраженный в единицах Сведберга, свед-
бергах. 1 S = 1X10 13 с, определяется по скорости седиментации молекул в
центробежном поле, зависит от размеров и формы молекул.
204
Это полидисперсные по размерам гигантские по длине молекулы
(в среднем 20—35 S). Они являются в основном предшественника-
ми цитоплазматических мРНК. Здесь же, в ядре, обнаруживаются
короткоживущие затравочные формы РНК, необходимые для син-
теза ДНК.
Наряду с основными видами РНК из зараженных вирусами
клеток можно выделить геномные РНК вирусов растений, некото-
рых вирусов бактерий (например, бактериофаг Q|3 кишечной па-
лочки) и некоторых вирусов животных (вирус полиомиелита). Ге-
номные РНК хранят и передают следующему поколению соответ-
ствующую генетическую информацию. Они относятся к самым
крупным: их молекулярная масса достигает нескольких миллионов,
а число нуклеотидов — десятков тысяч.
Молекула РНК в отличие от ДНК состоит (за редким исключе-
нием) из одной полинуклеотидной цепи. Полинуклеотидная цепь
РНК, закручиваясь на себя, образует в палиндромных участках
короткие двухспиральные «шпильки», в которых азотистые осно-
вания образуют комплементарные пары: Г с Ц, А с У. Это довольно
прочные структуры, которые видны под электронным микроскопом.
К настоящему времени удалось определить первичную структу-
ру почти всех тРНК, рРНК Е. coll, ряда вирусных РНК, в состав
которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Отдельные
виды РНК отличаются как первичной, так и вторичной и третичной
структурами.
4.4.2.	Транспортная РНК. Транспортные РНК — самые мелкие
молекулы РНК. Они включают в себя от 75 до 90 нуклеотидных
единиц, М = 23 000—30 000. тРНК составляют 10—20% суммарной
РНК клетки. Их функция состоит в том, чтобы транспортировать
аминокислоты в рибосомы и ставить их в определенные участки по-
липептидной цепи при ее биосинтезе. Таким образом, тРНК участ-
вует в процессе трансляции, причем играет роль адаптера, т. е.
своеобразного переводчика: переводит последовательность нуклео-
тидов в последовательность аминокислотных остатков белковой
молекулы. Каждой из 20 аминокислот соответствует своя тРНК.
Для некоторых аминокислот известно несколько тРНК. Например,
существует пять различных тРНК, переносящих лей, и пять раз-
личных тРНК, переносящих сер. В то же время каждый вид
тРНК переносит в рибосому только один вид аминокислоты, «свою»
аминокислоту. В клетке присутствует до 60 разных видов тРНК.
Впервые первичная структура была расшифрована в 1965—
1967 гг. Р. Холли (США) у аланиновой тРНК и А. А. Баевым
(СССР) у валиновой тРНК. В настоящее время первичная струк-
тура расшифрована более чем у 250, тРНК, выделенных из клеток
разных организмов: Е. coli, дрожжей, зародышей пшеницы, печени
крысы и кролика и т. д. Эти исследования показали, что кроме че-
тырех обычных рибонуклеотидов (А, Г, Ц и У) в тРНК содержится
много (8—19%) минорных нуклеотидов. Список минорных компо-
нентов тРНК включает до 60 названий: различные метилирован-
ные аденины и гуанины, метилированные пиримидины (тимин,
205
5-метилцитозин) и др. Не все они встречаются в какой-либо одной
молекуле тРНК, но универсальными и наиболее распространенны-
ми являются псевдоуридин и дигидроуридин.
Молекула тРНК представляет собой одиночную полинуклео-
тидную цепь, закрученную сна себя». Она образует сложную про-
странственную структуру. Все тРНК построены по одному плану,
все они укладываются в модель «клеверный лист». Главный прин-
цип, положенный в ее основу, — образование максимального чис-
ла водородных связей между азотистыми основаниями.
«Клеверный лист» содержит пять спирализованных стеблей, че-
тыре из которых заканчиваются петлями из неспаренных нуклео-
тидов. Таким образом, вторичная структура тРНК характеризу-
ется частичной спирализацией молекулы. В центре молекулы
находится неспирализованная область. 3'- и 5'-Концы полинук-
леотидной цепи спарены, образуют акцептирующий стебель. Это
самый длинный спирализованный участок (7 пар). Он завершает-
ся на З'-конце в большинстве случаев неспаренной последователь-
ностью ЦЦА. К 3'- или 2'-ОН-группе концевого аденозинового
остатка присоединяется соответствующая аминокислота через
свою СООН-группу, образуется аминоацил-тРНК.
•Акцептирующий конец
транспортной РНК
Аминокислота соединяется со своей тРНК с помощью специ-
фического фермента. Противостоит акцептирующему стеблю ан*
тикодоновый стебель. Он насчитывает в длину 5 пар нуклеотидов и
несет антикодоновую петлю, состоящую из 7 нуклеотидов. Антико-
доновая петля содержит в своей средней части антикодон, состоя-
щий из 3 нуклеотидов, комплементарный кодону данной амино-
кислоты в мРНК. Например, кодону в мРНК 5'-ГЦЦ-3' соответ-
ствует антикодон З'ЦГГ-5'. Последний обеспечивает специфич-
ность взаимодействия тРНК с мРНК. Каждая тРНК имеет свой
специфический антикодон.
Тг|)Ц-Петля (или петля псевдоуридина), которую несет Т-сте-
бель, содержит минорный компонент псевдоуридин. Она состоит
206
из 7 нуклеотидных остатков, среди которых всегда существует
последовательность б'-ТфЦГ-З'. Предполагают, что именно этой
петлей тРНК взаимодействует с рибосомой. D-Стебель несет
петлю из 8—12 нуклеотидов. Это петля дигидроуридина, в ней
всегда содержится несколько остатков минорного компонента ди-
гидроуридина. Считают, что она участвует во взаимодействии со
специфическим активирующим ферментом. Во всех тРНК находит-
Рис. 4.7. Структура транспортных РНК:
/ — общая схема строения, II — третичная структура
ся пятый, дополнительный стебель разной длины, функции его ма-
ло исследованы, вероятнее всего, с его помощью уравнивается
длина разных молекул тРНК. На рис. 4.7 представлена обобщен-
ная структура тРНК.
Метилированные и другие модифицированные нуклеотиды рас-
полагаются в тРНК в участках, не вовлеченных в образование во-
дородных связей. Возможно, они играют некоторую роль в обра-
зовании третичной структуры тРНК.
Третичная структура изучена у тРНКфен и у тРНКосп, получен-
ных из дрожжей. Она очень компактна, одинакова и в кристалле, и
в растворе тРНК. Третичная структура тРНКфе* образуется путем
сближения отдельных частей «клеверного листа». Дополнительные
водородные связи изгибают «клеверный лист» в L-образную струк-
туру. При этом антикодон расположен на одном конце, а группа
ЦЦА, акцептирующая аминокислоту, — на другом. Акцептирую-
щий стебель и Т-стебель образуют одну двойную спираль, а анти-
кодоновый и D-стебель — другую. Эти два спирализованных участ-
ка располагаются друг к другу под углом 92°. Петли D и ТфП
взаимодействуют друг с другом, образуя угол буквы L (рис. 4.7).
207
Структура стабилизируется водородными связями, стэкинг-взаимо-
действиями, катионами Mg.
Сходную третичную структуру имеет тРНКасп. Вероятно, тре-
тичные структуры всех тРНК похожи, так как смесь различных
тРНК образует кристаллы. Общность пространственного строения
разных тРНК дает возможность им взаимодействовать с рибосо-
мой. Незначительные отличия в пространственной структуре раз-
ных тРНК позволяют им взаимодействовать со специфическими
ферментами: аминоацил-тРНК-синтетазами (см. разд. 5.3.2).
Сравнение первичной структуры тРНК, выделенных из орга-
низмов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, сви-
детельствует о ее большой консервативности. Структура инициатор-
ных тРНК, которые приносят в рибосому первые аминокислоты
синтезируемого белка, одинакова у всех позвоночных животных.
Следовательно, эти тРНК оставались неизменными на протяжении
500 млн. лет, т. е. со времени дивергенции позвоночных животных.
4.4.3.	Матричная (информационная) РНК. Матричная РНК об-
разуется в процессе транскрипции. Она несет точную копию гене-
тической информации, закодированной в определенном участке
ДНК, а именно информации о последовательности аминокислот в
белках. У прокариот матричные РНК (мРНК) образуются сразу
в процессе транскрипции. В эукариотических клетках в процессе
транскрипции вначале образуются про-мРНК. Затем протекает
процессинг (см. разд. 4.8.2), в ходе которого первичные транскрип-
ты превращаются в мРНК. Свое название матричная РНК полу-
чила в связи с той функцией, которую она выполняет в клетке: она
служит матрицей, на которой синтезируется полипептидная цепь
в рибосоме. Каждой аминокислоте соответствует в мРНК опреде-
ленная тройка (триплет) нуклеотидов, называемая кодоном этой
аминокислоты. Последовательность кодонов в цепи мРНК опреде-
ляет последовательность аминокислот в белке. Поскольку мРНК
несет наследственную информацию о первичной структуре белка,
нередко ее называют информационной РНК (иРНЮ1.
Впервые на существование мРНК было указано А. Н. Белозер-
ским и А. С. Спириным в 1960 г. за 4 года до ее прямого выделе-
ния и идентификации. Изучая нуклеотидный состав нуклеиновых
кислот, эти исследователи обнаружили положительную корреляцию
в составе ДНК и РНК- Так, при переходе от видов резко выражен-
ного АТ-типа ДНК к видам с резко выраженным ГЦ-типом соотно-
шение нуклеотидов в РНК также несколько сдвигалось в сторону
ГЦ. На основании этого ученые выдвинули предположение о том,
что в передаче наследственной информации от ДНК к белкам уча-
ствует часть общей РНК клетки, коррелирующая с ДНК по нуклео-
тидному составу.
Количество мРНК в клетке невелико: 2—6% от общего коли-
чества РНК. Однако мРНК представлена разнообразными видами
молекул, которые значительно отличаются по молекулярной массе
1 В современной литературе общепринят термин матричная РНК.
208
и нуклеотидной последовательности. Каждый отдельный белок, син-
тезируемый в клетке, кодируется определенной «своей» мРНК или
ее участком.
При выделении мРНК используют преимущественно метод аф-
финной хроматографии. В высокоочищенном состоянии получены
мРНК субъединиц гемоглобина, яичного альбумина, легких и тяже-
лых цепей иммуноглобулинов, гистонов, кристаллинов (белки хрус-
талика глаза), миозина, фиброина шелка, а-казеина и др.
мРНК состоит из
участков — цистронов,
определяющих после-
довательность амино-
кислот в кодируемых
ими белках. На концах
молекулы располага-
ются нетранслируемые
области. Так, в начале
молекулы на 5'-конце
т7Г5'ффф^Хгаф.1=1 АУГ 1=
КЭП I
ААУААА
2	3 4
Рис. 4.8. Строение мРНК эукариот:
/ — прецистронные нетранслируемые участки, 2 — транс-
лируемая (кодирующая) зона, 3 — постцистронные не-
транслируемые участки, 4 — полиаденилат (поли-А);
остальные пояснения см. в тексте
расположены прецист-
ронные участки, затем
следует кодирующая зона, за ней — на З'-конце— постцистронные
участки (рис. 4.8) .Если мРНК кодирует один белок, то она на-
зывается моноцистронной (моногенная), если несколько белков —
полицистронной (полигенная). В последнем случае в ней нахо-
дятся межцистронные участки — спейсеры, не кодирующие белков.
На 5'-конце всех эукариотических мРНК расположен так назы-
ваемый кэп (от англ, cap — шапка) — группировка, в составе ко-
торой обязательно присутствует 7-метилгуанозин, с которого начи-
нается кэп- Далее располагается несколько метилированных рибо-
нуклеозидов. В разных молекулах мРНК отличаются как сами ри-
бонуклеозиды, число метилированных рибонуклеозидов (от одного
до трех), так и расположение метильных групп- Присоединение
7-метилгуанозина к 5'-концу растущей цепи мРНК происходит фер-
ментативным путем в ядре, когда РНК-полимераза не успела транс-
крибировать еще и 20 нуклеотидов. Предполагают,-что кэпы необ-
ходимы для стабилизации мРНК, предохранения ее от расщепления
5'-экзонуклеазами. Сам процесс присоединения кэпа называется
кэпингом.
Вблизи 5'-конца мРНК за 3—15 нуклеотидов до первого кодона
располагается последовательность нуклеотидов, необходимая для
взаимодействия мРНК с рибосомой, она богата АГ. Ей соответству-
ет участок рРНК, богатый ЦУ, он является комплементарным к
последовательности мРНК и образует с ней стабильный комплекс.
После этого участка в мРНК находится инициирующий кодон
АУГ — сигнал начала синтеза белка, а вслед за ним располагаются
кодоны, соответствующие аминокислотам, начиная со стоящих на
N-конце полипептидной цепи. Сигналом окончания синтеза белка
служит любой из кодонов УАА, УАГ или УГА. Заканчивается мРНК
обычно последовательностью поли(А), расположенной на З'-конце.
209
В мРНК млекопитающих и мРНК вирусов участки поли (А)
состоят из 150—200 нуклеотидов, однако в митохондриальных
мРНК они короче. С другой стороны, мРНК бактерий, бактериофа-
гов и некоторых вирусов, а также мРНК, кодирующие гистоны, не
содержат поли (А). Участки поли (А) образуются не в результате
транскрипции, а присоединяются специальным ферментом. Они не
нужны для трансляции. Предполагают, что эти участки стабилизи-
руют мРНК, предохраняют их от разрушающего воздействия
РНКаз клетки. Время жизни в цитоплазме мРНК, лишенной по-
ли (А), всего несколько минут, в то время как мРНК, имеющие по-
лиса), стабильны в течение многих часов и даже дней. Поли(А) -
участки укорачиваются с возрастом мРНК, поэтому, возможно, они
определяют время ее существования. Согласно одному из предпо-
ложений от З'-конца мРНК отщепляются один или несколько нук-
леотидов, когда она после окончания трансляции покидает рибосо-
му. В этом случае отдельные звенья поли (А) — это как бы «биле^
ты», каждый из которых дает право мРНК на одну «поездку» через
рибосомы. Когда все остатки А будут израсходованы, мРНК раз-
рушается.
На расстоянии 12—25 нуклеотидов от поли (А) в эукариотичес-
ких мРНК располагается последовательность из 6 нуклеотидов
(ААУААА), общая для многих видов мРНК. Предполагают, что она
участвует в окончании синтеза белка.
мРНК обладает сложной вторичной структурой, которая необ-
ходима для считывания знаков начала (инициация) и окончания
(терминация) синтеза белка. Существуют данные, что мРНК обра-
зует несколько двухспиральных «шпилек», на концах которых рас-
полагаются знаки инициации и терминации.
4.4.4.	Структура рибосом и рибосомной РНК. Рибосомная РНК
(ррнк) — это та основа, на которой располагаются белки, обра-
зуя рибосому. На электронных микрофотографиях рибосомы видны
как плотные округлые гранулы приблизительно сферической формы.
Число рибосом в клетке очень велико: у бактерий в среднем 104,
в эукариотических клетках— 106. Рибосомы локализуются главным
образом в цитоплазме, кроме того,— в ядре (особенно в ядрышке),
митохондриях и хлоропластах. В исследования структуры и функ-
ции рибосом большой вклад внесли А. С. Спирин, а также Г. Витт-
ман.
По размерам и молекулярной массе все изученные до сих пор
рибосомы делят на три группы. Первую группу образуют относи-
тельно мелкие (30x30x20 нм) бактериальные рибосомы. Они име-
ют константу седиментации 70S и М^ЗхЮ6. 70S Рибосомы состо-
ят из малой 30S- и большой 505-субчастиц. У Е. coli 305-субчастица
содержит молекулу 16S РНК и 21 молекулу различных белков.
503-субчастица содержит две молекулы нуклеиновой кислоты —
23S РНК и 5S РНК и 34 белка.
Вторую группу образуют крупные (40X40X20 нм) рибосомы
эукариотических клеток. Они имеют константу седиментации 80S
и М—4,5Х Ю6. Как и рибосомы первой группы, они состоят из двух
210
субчастиц. Малая 405-субчастица содержит 18S РНК и 30 белков.
Большая бОБ-субчастица содержит 28S РНК, 5S РНК и 5,8S РНК,
а также 41 белок (табл. 4.3).
Третью группу составляют рибосомы митохондрий и хлороплас-
тов эукариотических клеток. Рибосомы митохондрий в общем отно-
сятся к классу 70S. Однако они различаются по коэффициентам се-
диментации у разных групп эукариот. Так, у грибов и эвгленовых
Рис. 4.9. Большая (4) и малая {Б) субчастицы рибосомы (В)
коэффициент седиментации митохондриальных рибосом составляет
70—74S, у высших животных — 55—60S, у высших растений —
около 80S. Рибосомы хлоропластов, напротив, более однородны по
этому признаку, коэффициент их седиментации равен 67—70S.
Ранее считали, что обе субчастицы рибосом имеют округлую
форму. Применение тонких электронно-микроскопических методов
показало, что конфигурация частиц весьма сложна. Малая субчас-
тица изогнута в виде телефонной трубки, а большая напоминает
ковш (рис. 4.9). Возможно, что в ходе синтеза белка рибосома изме-
няет свою конформацию.
Размеры молекул рибосомных РНК несколько различны у жи-
вотных и растений. Рибосомы животных содержат 28S и 18S рРНК.
28S рРНК животных варьирует по величине у разных видов в за-
висимости от их положения в эволюционном ряду, ее молекулярная
Таблица 4.3, Размеры рибосомных РНК
Объект исследования	Константа седиментации. S	Молекулярная масса	Чнвлв нуклеотидов
Е. colt	23	1,1x10е	3200
	16	0,56х 10е	1600
	5	4.1Х104	120
Печень крысы	28	1,7x10е	5000
	18	0,65 X 10е	1900
	5,8	5X10*	155
	5	4x10*	121
211
масса колеблется от 1,4 млн. у морских ежей до 1,75 млн. у млеко-
питающих. Рибосомы растений содержат 25S, 18S, иногда 16S РНК.
5S рРНК прокариот гомологичны 5,8S рРНК эукариотических кле-
ток.
Нуклеотидный состав сходен у рРНК из различных источников,
например из печени крысы и Е. coli. Гуаниловые нуклеотиды преоб-
ладают; уридиловые и цитидиловые — находятся в малых и приб-
лизительно равных количествах; псевдоуридин и метилированные
основания присутствуют в небольших или даже следовых количест-
вах.
Рибосомные РНК имеют V-образную или У-образную форму.
Они образуют каркас, к которому прикрепляются белки, создавая
плотно упакованный рибонуклеопротеин. Вторичная структура
рРНК создается за счет коротких двухспиральных участков моле-
кулы — шпилек. Около 2/з рРНК организована в шпильки, осталь-
ная часть молекулы представлена однотяжевыми «аморфными» уча-
стками, где сосредоточены пуриновые основания. С «аморфными»
участками по преимуществу связаны белки рибосом.
Локализация белков в рибонуклеопротеинах определяется после-
довательностью расположения нуклеотидов. Белки связываются с
рРНК кооперативно: при попытке удалить их из тяжа рибонуклео-
протеина они уходят не по одному, а целыми группами. Белковый
состав рибосом гетерогенен. Молекулярные массы рибосомных бел-
ков варьируют от 5000—7000 до 50 000— 70 000. У Е. coli белки
обозначают для малой субъединицы как SI, S2...S21 (от англ.
small—маленький), а для большой субъединицы—какЫ, L2... L34
(от англ, large — большой). Набор белков в субъединицах разли-
чен. Каждый белок рибосомы уникален, т. е. представлен одной
молекулой. Исключение составляют L7 и L12, которые отличаются
по N-концевому остатку, и S20 и L26, которые имеют идентичную
первичную структуру.
Белки рибосом, подобно гистонам, обладают основным харак-
тером. Митохондриальные рибосомы, выделенные из разных источ-
ников, отличаются и по количественному, и по качественному сос-
таву рибосомных белков. Митохондриальные рРНК не гомологич-
ны ни цитоплазматическим рРНК, ни рРНК прокариот. Они отли-
чаются по первичной и по вторичной структурам. Их структура бо-
лее рыхлая, менее стабильная, меньше содержит спиральных участ-
ков. Крупные рРНК митохондрий и хлоропластов близки к таковым
прокариот. 5,8S РНК не обнаружена в рибосомах ни у митохонд-
рий, ни у хлоропластов. В большинстве рибосом митохондрий не об-
наружена 5S РНК, но она присутствует в хлоропластах.
При синтезе белка определенное число рибосом (от 3 до 80—
100) прикрепляется к длинным нитевидным молекулам мРНК, об-
разуя полисомы. Каждая рибосома в полисоме способна синтезиро-
вать полную полипептидную цепь. Образование групп рибосом по-
вышает эффективность использования мРНК, поскольку на ней мо-
жет одновременно синтезироваться несколько идентичных полипеп-
тидных цепей. Полисомы находятся или в свободном состоянии, или
.212
в тесной связи с мембранами эндоплазматической сети. мРНК, ко-
дирующие внутриклеточные белки, содержатся преимущественно в
свободных полисомах, а мРНК, кодирующие секреторные белки,—
в мембраносвязанных.
4.5.	Биосинтез нуклеотидов
4.5.1.	Пути синтеза мононуклеотидов. Пуриновые и пиримиди-
новые нуклеотиды могут синтезироваться de novo, т. е. из простых
предшественников, а также непосредственно из готовых пуриновых
Аспарагиновая
кислота
Муравьиная
кислота
Рис. 4.10. Происхождение
атомов пуринового кольца
и пиримидиновых оснований. Относительное значение этих двух пу-
тей существенно отличается для разных клеток. Так, в тканях мле-
копитающих нуклеотиды преимущественно синтезируются de novo,
хотя в быстро растущих тканях образуются обоими путями. Напро-
тив, для нормального роста и развития многих видов бактерий не-
обходимо наличие в питательной среде готовых молекул пуринов
или пиримидинов.
4.5.2.	Биосинтез пуриновых нуклеотидов. Биосинтез пуринового
кольца de novo протекает одинаково у разных видов живых су-
ществ: у бактерий, дрожжей, птиц, человека. Это один из многих
примеров единства ряда основных биохимических процессов всего
живого. Эксперименты с использованием изотопов позволили уста-
новить, из какого предшественника поступает каждый атом пури-
нового кольца (рис. 4.10) •
Цепочку из двух атомов углерода и одного атома азота (С-4,
С-5, N-7) дает аминокислота гли, один атом азота (N-1) поступает
из асп, оставшиеся два атома азота (N-3 и N-9) дает глн, два атома
углерода (С-2 и С-8) — муравьиная кислота. В первых этапах син-
теза участвует Б-рибозо-5-фосфат, и уже. над ним надстраивается
каркас молекулы гипоксантина. Таким образом, синтезируется не
свободное азотистое основание, а его нуклеотид — инозиновая кис-
лота (рис. 4.11).
Инозиновая кислота служит предшественником всех остальных
пуриновых нуклеотидов. Так, адениловая кислота (АМФ) образу-
ется в результате аминирования ИМФ, аминогруппа поставляется
213
_ ЛТлутамин
ФРП Ф----------Ф РА
Глицин
N5, М10-формил-
^nh2 ТГф
ГАР
ТГФК
ЫН
С НО
Формил-Г АР
+Mg3\
Глутамин, АТФ
ЫН
сж ^СНО
ЙЙ ^ЫН-Риб^'-ф
Формил-Г AM
Рис. 4.11. Схема биосинтеза
пуриновых нуклеотидов:
АПК АР — 5-аминоимидазол-4-кар-
бокс амидрибонуклеотид, АИР — 5-
аминоимидазол рибонуклеотид, ГАР
— глицинамидрибонуклеотид, И МФ
— инозин-5' монофосфат, Риб-5-ф —
рибозо-5-фосфат, №,Ы10-ТГФ — N-
форм илтетрагидрофолиевая кисло-
та, ТГФК — тетрагидрофолиевая
кислота, формил-ГAM — формилгли-
цинамидинрибонуклеотид, ФРА—5-
фосфорибозиламин, ФРПФ — 5-фос-
форибозил -1-пирофосфат
Сукцино-АИК АР
НООС^
+АТФ, аспартат, Mg2 +	'СН +со2
НзЫ-^^^^-т^Риб-З'-ф
Карбокси-АИР	АИР
H2N
Фумаровая кислота
В %н
„
Формил-ТГФ ТГФК
Формил-АИКАР	ИМФ
АИКАР
аспарагиновой кислотой. Образование гуаниловой кислоты (ГМФ)
из ИМФ является двухстадийной реакцией. Первая стадия состоит
в окислении ИМФ до ксантозин-5'-фосфата (КМФ). Затем происхо-
дит его аминирование, и образуется ГМФ. Донор аминогруппы, по-
видимому, различен у ряда организмов: у птиц и млекопитающих
донором служит глн, в бакте-
риальных системах — NH3.
4.5.3. Биосинтез пиримиди-
новых нуклеотидов. Примене-
ние метода изотопов позволи-
ло выяснить происхождение от-
дельных звеньев пиримидино-
вого ядра (рис. 4.12).
Первым этапом в синтезе
пиримидиновых нуклеотидов
NH3
со"
сн
.сн
Аспарагиновая
кислота
Рис. 4.12. Происхождение атомов пири-
мидинового кольца
является образование карба-
люилфосфата из NH3 и СО2. Карбамоилфосфат вступает в реак-
цию с асп и под действием аспартат-карбамоилтрансферазы прев-
ращается в карбамоиласпартат. Последний подвергается циклиза-
ции и окислению, в результате чего образуется оротовая кислота
(см. разд. 10.4.1), т. е. завершается формирование пиримидинового
кольца.
Таким образом, в процессе синтеза пиримидиновых нуклеоти-
дов в отличие от рассмотренного выше синтеза пуриновых нуклео-
тидов сначала образуется свободное азотистое основание. Только
после этого протекает пирофосфорилазная реакция, в ходе которой
к оротовой кислоте присоединяется рибозо-5'-фосфат от фосфори-
бозилпирофосфата (ФРПФ), образуется нуклеотид оротидин-5'-мо-
нофосфат (ОМФ). Декарбоксилирование ОМФ приводит к образо-
ванию уридин-5'-монофосфата (УМФ) — предшественника других
пиримидиновых нуклеотидов (рис. 4.13)-
Превращение урацила в цитозин происходит на уровне нуклео-
зидтрифосфатов. Оно осуществляется под действием фермента
соон
^сн,
I ---------
сн—соон
nh2
Аспарагиновая
соон
н2у ^сн2
ос. ^сн—соон
NH
Карбамоиласпартат
JCO НАД+ НАДН+Н*
HN' '
СН2
соон
NH
Оротовая кислота
ФРПФ
.сн—соон
кислота
Дигидрооротовая
кислота
Карбамоилфосфаг
ФФН
СО
СО
HN^ ^СН
I II
ОСХ ^сн
И-Риб-5'-ф	>6Риб-5'-Ф
УМФ	Оротидин-5'-фосфат
Рис. 4.13. Схема биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов (пояснение см.
в тексте)
215
ЦТФ-синтетазы: УТФ 4-NH3 4-АТФ->ЦТФ 4-АДФ 4- Фн. Тиминовые
нуклеотиды образуются в результате метилирования дезоксиури-
динмонофосфата. Реакция катализируется ферментной системой,
которую часто называют тимидилат-синтазой. Процесс весьма сло-
жен и протекает в несколько стадий. Источником одноуглеродного
фрагмента при С-5 служит кофермент М5,М10-метилентетрагидрофо-
лиевая кислота.
4.5.4.	Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Превращение рибозы
в дезоксирибозу происходит на нуклеотидном уровне. Механизм
этого процесса был выяснен при изучении восстановления рибонук-
леотидов в экстрактах Е. coli. Фермент рибонуклеозид-дифосфат-
редуктаза катализирует восстановление всех четырех рибонуклео-
зиддифосфатов — АДФ, ГДФ, ЦДФ, УДФ в их дезоксипроизводные
дАДФ, дГДФ, дЦДФ, дУДФ. Источник восстанавливающей спо-
собности фермента in vivo неизвестен.
In vitro активны два донора водорода. Один из них — низкомо-
лекулярный серосодержащий белок тиоредоскин, две SH-группы ко-
торого окисляются с образованием дисульфидного мостика. Вторым
донором водорода может служить восстановленный глутатион.
Редуктазные системы, выделенные из различных животных клеток,
сходны с описанной системой Е. coli.
4.6.	Ферменты синтеза и превращений
нуклеиновых кислот
4.6.1.	ДНК-полимеразы. В бактериальных клетках содержится
несколько ДНК-полимераз. ДНК-полимераза 1 была открыта пер-
вой в экстрактах Е. coli группой А. Корнберга (1956). Этот фермент
катализирует полимеризацию нуклеотидов на одноцепочечной мат-
рице. Для синтеза необходима ДНК-затравка (праймер). Полиме-
ризация протекает путем присоединения мононуклеотидов к З'-ОН-
группе ДНК-затравки. Матрица определяет выбор ферментом нук-
леотида соответственно правилам комплементарности: А спарива-
ется с Т, Г — с Ц. Рост цепи происходит в направлении 5'->3'.
ДНК-полимераза специфически нуждается в б'-трифосфатах дезок-
сирибонуклеозидов, б'-дифосфаты и б'-монофосфаты неактивны.
Неактивны также б'-трифосфаты рибонуклеозидов. Для реакции
требуются ионы Mg2+.
В процессе репликации ДНК синтетическая активность ДНК-по-
лимеразы I играет вспомогательную роль — этот фермент «застра-
ивает» бреши, образующиеся между фрагментами ДНК после уда-
ления РНК-затравок (см. разд. 4.7-2). ДНК-полимераза I выполня-
ет также функцию коррекции, т. е. отщепляет неправильно вклю-
ченные в ДНК нуклеотиды. В этом случае фермент проявляет
З'-^б'-экзонуклеазную активность.
ДНК-полимераза I играет важную роль в репарации, т. е. в уст-
ранении повреждений участков ДНК. В отличие от других ДНК-
полимераз ДНК-полимераза I может вести синтез ДНК на матри-
це, имеющей несколько разрывов. Это связано с присущей ей б'-З'-
216
экзонуклеазной активностью: ДНК-полимераза I проводит отщеп-
ление ряда нуклеотидов, увеличивает размер бреши до величины,
при которой она может служить «стартовой площадкой» для син-
теза.
Важная роль принадлежит ДНК-полимеразе I в вырезании ти-
миновых димеров, образующихся в результате ультрафиолетового
облучения клеток, и в застройке образовавшихся пробелов. Ката-
лизируя одновременно включение нуклеотида по З'-концу и удале-
ние нуклеотида с 5'-конца, ДНК-полимераза 1 вызывает продвиже-
ние однонитевого разрыва вдоль молекулы ДНК. Такое перемеще-
ние разрыва или «трансляция ника» (от англ, nick — насечка), по-
видимому, происходит и при репарации повреждений, возникающих
в результате ультрафиолетового облучения клеток- Таким образом,
роль в клетке ДНК-полимеразы I очень велика.
В клетках Е. coli содержится также ДНК-полимераза II. Роль
ее сводится к восстановлению повреждений в участках молекулы
ДНК. Если в ДНК существует пробел в 2—100 нуклеотидов, то
ДНК-полимераза II заполняет его путем встраивания нуклеотидов
с З'-ОН-конца пробела. Если пробел больших размеров, то ДНК-
полимераза II не может проводить репарацию, или проводит ее
частично. Если в клетке отсутствует ДНК-полимераза /, то ДНК-по-
лимераза II достраивает фрагменты ДНК, образующиеся при ре-
пликации ДНК.
В 1972 г. Т. Корнберг и сотрудники выделили из клеток Е. coli
ДНК-полимеразу III. Она играет главную роль в репликации ДНК.
Как и другие полимеразы, фермент проводит полимеризацию толь-
ко в 5'-3'-направлении. Матрицей in vitro служит двухцепочечная
молекула ДНК, имеющая большое число коротких пробелов и в
связи с этим свободных З'-ОН-концов. Однако активный комплекс
ДНК-полимеразы III с двумя специфическими белками в присутст-
вии кополимеразы III работает только на длинной матрице. Актив-
ность ДНК-полимеразы III в 15 раз выше, чем ДНК-полимеразы I,
и в 300 раз выше, чем ДНК-полимеразы II.
Эукариотические клетки, так же как и клетки Е. coli и других
прокариот, содержат несколько ДНК-полимераз. В отличие от про-
кариотических, эукариотические ДНК-полимеразы не обладают эк-
зонуклеазной активностью, поэтому они не могут выполнять функ-
цию коррекции. Преобладающий фермент называется а-ДНК-поли-
мераза. Особенно часто она встречается в быстро растущих клет-
ках, осуществляет репликацию ядерной ДНК. Второй фермент —
р-ДНК-полимераза — участвует в репарации ядерной ДНК, не
встречается у низших эукариот (дрожжи, низшие растения). Тре-
тья — у-ДНК-полимераза обнаружена в митохондриях. Она отли-
чается от а- и p-ферментов по свойст