для высшихУЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙСельскохозяйственная
биотехнологияСельскохозяйственнаябиотехнология
Сельскохозяйственная
биотехнологияПод редакцией академика РАСХН
B.C. ШевелухиИздание третье; переработанное и дополненноеРекомендовано
Министерством образования и науки
Российской Федерации в качестве учебника
для студентов высших учебных заведений,
обучающихся по сельскохозяйственным,
естественнонаучным и педагогическим
специальностямМосква «Высшая школа» 2008
УДК 631.147
ББК 40.0
С 29Авторы:B.C. Шевелуха, Е.С. Воронин, Е.А. Калашникова, В.М. Ковалев, А.А. Ковалев,
Е.З. Кочиева, Н.Н. Новиков, М.И. Прокофьев, Н.Б. Пронина, Н.А. Проворов,
И.О. Свентицкий, И.В. Тихонов, И.А. ТихоновичРецензенты:д-р с.-х. наук, проф. Л.П. Степанова (Орловский государственный аграр¬
ный университет); академик РАСХН, д-р экон. наук, проф. И.Т. Трубилин (рек¬
тор Кубанского государственного аграрного университета)Сельскохозяйственная биотехнология: Учебник/B.C. Шевелуха,
С 29 Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др.; Под ред. B.C. Шевелу-
хи. — 3-е изд., перераб. идоп.— М.: Высш. шк., 2008.— 710с.: ил.ISBN 978-5-06-004264-1Третье издание сохраняет преемственность предыдущих выпусков и содер¬
жит в концентрированном виде идеи и достижения по биотехнологии и биоин¬
женерии как важнейших приоритетов фундаментальной науки и высоких техно¬
логий XXI века.Наибольшей переработке в третьем издании подверглись главы «Биотехно¬
логия и биобезопасность», «Биотехнология в животноводстве», «Применение
достижений биотехнологии и биоинженерии в агропромышленном производст¬
ве», что отражает ускоренное развитие научных исследований в областях био¬
технологии и биоинженерии и растущую обеспокоенность общественности рас¬
ширением масштабов производства и потребления трансгенных продуктов и
крайне слабую информированность людей о безопасности их использования.Учебник дополнен главой «Биотехнология в экологии». Существенные до¬
полнения внесены также и в остальные главы учебника.Для студентов вузов, обучающихся по сельскохозяйственным, естественнона¬
учным и педагогическим специальностям.УДК 631.147
ББК 40.0ISBN 978-5-06-004264-1	© ОАО «Издательство «Высшая школа», 2008Оригинал-макет данного издания является собственностью издательства «Выс¬
шая школа», и его репродуцирование (воспроизведение) любым способом без согласия
ОглавлениеВведение к третьему изданию		7Глава 1. Основы молекулярной биоинженерии		121.1.	Молекулярная биология и молекулярная генетика — фундаменталь¬
ная основа генетической инженерии		121.2.	Ферменты генетической инженерии		131.3.	Разделение фрагментов ДНК и построение рестрикционных карт
(физическое картирование)		171.4.	Конструирование рекомбинантных ДНК		241.5.	Идентификация и выделение последовательностей генов ....	33Глава 2. Генетическая инженерия растений		412.1.	Идентификация и клонирование гена		422.2.	Подбор генотипа растения-реципиента		422.3.	Введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента	422.4.	Факторы, влияющие на регенерационную способность трансфор¬
мированных клеток		432.5.	Введение чужеродных генов в растительную клетку при помощи аг-
робактериальных векторов		432.6.	Методы трансформации растительных клеток 			542.7.	Экспрессия (функционирование) чужеродных генов в геноме расте¬
ний 		592.8.	Повышение продуктивности растений и улучшение их качества ме¬
тодами генной инженерии		612.9.	Получение трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздей¬
ствиям . . . 			672.10.	Получение трансгенных растений, устойчивых к насекомым	682.11.	Получение трансгенных растений, устойчивых к грибной, бактери¬
альной и вирусной инфекции. ,		692.12.	Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам	712.13.	Трансгенные растения — продуценты лекарственных препаратов	732.14.	Трансформация пластомного генома растений		742.15.	Молекулярные методы анализа генома растений и применение
ДНК-технологий в генетике и селекции		812.16.	Нерешенные проблемы генной инженерии растений		97Контрольные вопросы к главам 1 и 2		98Г л а в а 3. Клеточная и тканевая биотехнология в селекции и растениеводстве . .	1003.1.	Биология культивируемой клетки		1003.2.	Культура клеток и тканей		1043.3.	Техника введения в культуру in vitro и культивирование изолированных
клеток и тканей растений			 .	1073.4.	Культура каллусных тканей		1123.5.	Гормононезависимые растительные ткани 			1183.6.	Культура клеточных суспензий		1223.7.	Культура одиночных клеток		1243.8.	Морфогенез в каллусных тканях		1263.9.	Культура каллусных клеток в получении веществ вторичного синтеза	136
3.11.	Культура изолированных клеток и тканей в селекции растений . .	1753.12.	Достижения клеточной биотехнологии в растениеводстве ...	208Контрольные вопросы к главе 3		215Глава 4. Биотехнология в животноводстве		2184.1.	Биотехнологический контроль воспроизводства сельскохозяйствен¬
ных животных		2184.2.	Клеточная биотехнология		2294.2.1.	Трансплантация эмбрионов			2294.2.2.	Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного. . .	2374.2.3.	Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных
животных		2444.2.4.	Клонирование животных		2464.3.	Генетическая инженерия		2624.3.1.	Получение трансгенных животных		262Контрольные вопросы к главе 4		283Глава 5. Биотехнология в ветеринарной медицине		2855.1.	Стерилизация оборудования и очистка воздуха		2885.2.	Приготовление питательных сред для культивирования микроорга¬
низмов 		2925.3.	Характеристика необходимых компонентов питательных сред, при¬
меняемых в биотехнологии		2955.4.	Выбор сырьевых источников для конструирования питательныхсред		2995.5.	Основы культивирования микроорганизмов		3025.6.	Классификация вакцин и технология их приготовления		3175.7.	Технология промышленного приготовления вакцин			3205.8.	Методы выделения, концентрирования и высушивания микроорга¬
низмов и продуктов микробного синтеза		3225.9.	Новые направления в создании вакцин		342Контрольные вопросы к главе 5		349Глава 6. Биотехнология кормовых препаратов		3516.1.	Получение кормовых белков		3516.2.	Производство незаменимых аминокислот		3716.3.	Производство кормовых витаминных препаратов		3816.4.	Кормовые липиды		3856.5.	Ферментные препараты		388Контрольные вопросы к главе 6		395Г л а в а 7. Генетические основы биотехнологии в симбиотической азотфиксации	3977.1.	Разнообразие и основные свойства азотфиксирующих систем	3977.2.	Бобово-ризобиальный симбиоз		4007.3.	Симбиозы растений с цианобактериями		4227.4.	Концепция генетических основ и эволюции азотфиксирующих сим¬
биотических биосистем		425Контрольные вопросы к главе 7		430Глава 8. Биоконверсия органических отходов		4318.1.	Технология производства биогаза		431
8.3.	Биоинженерные расчеты параметров биогазовых установок. . .	450Контрольные вопросы к главе 8		456Глава 9. Биоэнергетика в селекции, растениеводстве и биотехнологиях. .	4589.1.	Биотехнологии, информация и самоорганизация природы. . . .	4589.2.	Биоэнергетика на молекулярном уровне		4619.3.	Биотехнологии и энергетическая проблема		4659.4.	Необходимость учета биоэнергетических процессов в биотехноло¬
гиях 		4699.5.	Законы и основные понятия термодинамики		4709.6.	Способы анализа преобразований энергии		4719.7.	Энергосберегающая оптимизация производства продукции
растениеводства на основе эксергетического анализа		472Контрольные вопросы к главе 9		481Г л а в а 10. Биотехнология продукционного процесса, системы его регулированияи уровни функционирования у растений		48310.1.	Функциональные уровни		48310.2.	Мониторинг продукционного процесса		533Контрольные вопросы к главе 10		534Глава 11. Биохимические процессы в биотехнологии		53711.1.	Биохимическая характеристика генома прокариотических и эука¬
риотических клеток		53911.2.	Биохимические и биотехнологические процессы в азотном и бел¬
ковом обменах у растений		54011.3.	Биосинтез белка и его регуляция на генетическом уровне. . .	54611.4.	Биохимическая регуляция экспрессии генов		55511.5.	Биохимические доказательства генетической сущности ДНК и ге¬
нетического кода		56011.6.	Биохимическая характеристика процессов дифференцировки
(морфогенеза)		56111.7.	Биохимическая регуляция качества растениеводческой продукции	56711.8.	Инженерная энзимология		572Контрольные вопросы к главе 11		582Глава 12. Биотехнология в экологии		58512.1.	Понятие экологии и экологической безопасности		58512.2.	Экологическая доктрина Российской Федерации		58612.2.1.	Стратегическая цель, принципы и основные направления го¬
сударственной политики в области экологии		58712.2.2.	Научное обеспечение доктрины		58812.2.3.	Экологическое образование и просвещение		58912.2.4.	Биотехнология и биоинженерия — стратегические резервы
для увеличения производства продовольствия и экологиче¬
ски чистой продукции		58912.2.5.	Приостановка деградации почв, восстановление и повыше-
Новейшая сельскохозяйственная биотехнология и биоинжене¬
рия — это наука о генно-инженерных и клеточных методах и техно¬
логиях создания и использования генетически трансформированных
(модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в це¬
лях расширения их разнообразия, интенсификации производства и
получения новых видов продуктов различного назначения.В традиционном, классическом смысле биотехнологию можно
определить как науку о методах и технологиях производства, транс¬
портировки, хранения и переработки сельскохозяйственной и другой
продукции с использованием обычных, нетрансгенных (природных и
селекционных) растений, животных и микроорганизмов, в естест¬
венных и искусственных условиях.Высшим достижением новейшей биотехнологии является генети¬
ческая трансформация, перенос чужеродных (природных или искус¬
ственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений,
животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с
новыми или усиленными прежними свойствами и признаками. По
своим целям и возможностям это направление является стратегиче¬
ским. Оно позволяет решать принципиально новые задачи пд созда-
нию растений, животных и микроорганизмов с повышенной устой¬
чивостью к стрессовым факторам среды, высокой продуктивностью и
качеством продукции, по оздоровлению экологической обстанрвки в
природе и всех отраслях производства.Для достижения этих целей предстоит преодолеть определенные
трудности в повышении эффективности генетической трансформа¬
ции и, прежде всего, в идентификации и клонировании генов, созда¬
нии их банков, расшифровке механизмов полигенной детерминации
признаков и свойств биологических объектов, создании надежных
векторных систем и обеспечении высокой устойчивой экспрессии ге¬
нов. Уже сегодня во многих лабораториях мира с помощью методов
генетической инженерии созданы принципиально новые трансген¬
ные растения, животные и микроорганизмы, используемые в науч¬
ных и производственных, коммерческих целях.Клеточная биотехнология, основанная на уникальном свойстве
клеток — ихтотипотентности, способности к регенерации целого ор¬
ганизма, а также продуцированию ими важнейших соединений вто¬
ричного синтеза, обеспечила ускоренное получение новых ценных
форм и линий сельскохозяйственных растений, используемых в се¬
лекции на устойчивость, продуктивность и качество; размножение
ценных генотипов; оздоровление растений от вирусов и вироидов,
получение биологически активных препаратов пищевого, кормового
и медицинского назначения. В этой области также возникло много
трудностей, главными из которых являются недостаточная частота
регенерации клеток и нарушение нормального онтогенеза организ¬
мов, узкий спектр сомаклональных вариаций, слабая экспрессия ге¬
нов, контролирующих важнейшие хозяйственно-ценные признаки
организмов, и вторичный метаболизм веществ.Мощный всплеск исследований по биотехнологии в мировой
науке произошел в 80-е годы, когда новые методологические и мето¬
дические подходы обеспечили переход к эффективному их использо¬
ванию в науке и практике и возникла реальная возможность извлечь
из этого большой экономический эффект. Научно обоснованный
прогноз свидетельствует о том, что уже в первой четверти XXI века
биотехнологическая продукция составит не менее 20 % всего объема
товаров, поступающих на мировой рынок.В нашей стране значительное расширение научно-исследователь¬
ских биотехнологических и биоинженерных работ и внедрение их ре¬
зультатов в производство также было достигнуто в 80-е годы. В этот
период в стране была разработана и активно осуществлялась первая
государственная программа по биотехнологии, создано 15 биотехно¬
логических центров в АПК, подготовлены квалифицированные кад¬
ры специалистов-биотехнологов, организованы биотехнологические
институты, лаборатории и кафедры в селекционных центрах, отрас¬
левых и зональных научно-исследовательских учреждениях и вузах.Наибольших результатов в области сельскохозяйственной био¬
технологии в эти годы достигли научные учреждения и учебные заве¬
дения селекционного, ветеринарного и микробиологического про¬
филей, разработавшие методы и технологии получения новых линий
и форм растений, медицинских препаратов профилактического и те¬
рапевтического действия, а также штаммов микроорганизмов, вак¬
цин и других лечебных препаратов на генно-инженерной основе.
В эти же годы были организованы лаборатории по трансплантации
оплодотворенных зигот и эмбрионов в животноводстве, созданию
новых линий скота и птицы генно-инженерными методами.Однако в дальнейшем, в связи с распадом СССР, внимание к про¬
блемам биотехнологии, особенно к биоинженерии, в стране было ос¬
лаблено, а их финансирование резко сокращено. В результате разви¬
тие биотехнологических исследований и их практическое использо¬
вание в России замедлилось, что привело к их отставанию от мирово¬
го уровня, особенно в области генетической инженерии и
биотрансформации.В целях быстрейшего устранения этих крупных недостатков не¬
обходимо восстановить творческие контакты с учеными международ-
ных биотехнологических центров и других научных учреждений раз-
витых и развивающихся стран — США, Великобритании, Франции,
Германии, Японии, Италии, Индии, Китая, Нидерландов и других, а
также обеспечить постоянную и эффективную государственную под¬
держку этих исследований, что позволит в дальнейшем выйти в об¬
ласти биотехнологии и особенно биоинженерии на мировой уровень.
По клеточной биотехнологии результаты исследований ученых на¬
шей страны уже сегодня не уступают зарубежным, а по ряду важных
направлений и превосходят их.В этот же период под влиянием критического отношения к био¬
технологии в Западной Европе, Америке и России возникло заметное
протестное движение общественности, оказавшее отрицательное
влияние на темпы развития биотехнологии, особенно биоинжене¬
рии.В основе протестного движения общественности против ген¬
но-инженерных исследований лежат два важнейших фактора — не¬
знание обществом существа новейшей биотехнологии, а в связи с
этим интуитивное тревожное ожидание ее отрицательных последст¬
вий, основанных на исторических аналогах с использованием атом¬
ной энергии и на современных фактах возникновения очагов новых
заболеваний неустановленной природы. Для преодоления этого вре¬
менного препятствия в развитии биоинженерии ученые-биотехноло¬
ги должны постоянно поддерживать высокий уровень просвещения и
осведомленности граждан страны и мира в этой области, совершенст¬
вовать методы исследования и строго соблюдать законы, постановле¬
ния и другие государственные нормативно-правовые акты по обеспе¬
чению биобезопасности в генно-инженерной деятельности.Для этого во многих странах мира, в том числе в России, приняты
специальные законы о государственном регулировании генно-инже-
нерной деятельности, регламентирующие весь спектр взаимодейст¬
вий между наукой, государством и обществом.Строжайшее соблюдение этих законов, их постоянное совершен¬
ствование и развитие является первой и самой главной гарантией
биобезопасности в системе научных исследований по биотехнологии
и биоинженерии и использовании продуктовтрансгеноза в практиче¬
ских целях.Современные специалисты, работающие в сельском хозяйстве, в
сфере АПК и других отраслях народного хозяйства должны в совер¬
шенстве владеть методами биотехнологии и биоинженерии, уметь ис¬
пользовать их для увеличения производства сельскохозяйственной
продукции, улучшения ее качества, защиты природы от загрязнения
и повышения устойчивости всего агропромышленного производства.
В 1986 г. в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Ти¬10
мирязева нами была создана первая кафедра сельскохозяйственной
биотехнологии. Позднее такие кафедры были созданы во многих ву¬
зах аграрного профиля.Настоящий учебник подготовлен с учетом мирового состояния
биотехнологии и биоинженерии и их развития в России как науки,
так и отраслей производства с использованием новейших достиже¬
ний фундаментальных и прикладных наук, а также с учетом важней¬
ших документов по законодательно-правовому регулированию в об¬
ласти генно-инженерной деятельности в целях обеспечения биобезо¬
пасности. Авторы учебника ориентируют читателя на необходимость
привлечения современных и классических источников фундамен¬
тальной и приоритетной прикладной науки и производства для глу¬
бокого и всестороннего изучения биотехнологических и биоинже-
нерных проблем, которые в рамках вузовского учебника получили
лишь концептуальное рамочное освещение.Проф. В. Шевелуха
Глава 1ОСНОВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОИНЖЕНЕРИИ1.1.	МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ
ГЕНЕТИКА - ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ОСНОВА ГЕНЕТИЧЕСКОЙИНЖЕНЕРИИПо А.А. Баеву, генетическая инженерия — это конструирование in
vitro функционально активных генетических структур (рекомбинант¬
ных ДНК), или иначе — создание искусственных генетических про¬
грамм. Рекомбинантые ДНК придают организму новые генетические
и другие свойства.Возникновение генетической инженерии связано прежде всего с
развитием молекулярной биологии. Исследования, проведенные в
этой области за последние десятилетия, позволили перейти от описа¬
ния структуры и функции клеток на уровне органелл к установлению
молекулярных механизмов протекающих в них процессов.В конце 60-х годов многие исследователи считали, что молекуляр¬
ные механизмы фундаментальных генетических процессов — репли¬
кации, транскрипции, трансляции, а также система их регуляции в
основном изучены. Стройное, логичное здание молекулярной био¬
логии, казалось, было в основном построено. Схема, показываю¬
щая строго однонаправленный поток генетической информации,
ДНК—» РНК —»белок, была названа основной догмой молекуляр¬
ной биологии и свидетельствовала о незыблемости возведенного зда¬
ния. Правда, основные положения этой схемы были в основном по¬
казаны для кишечной палочки Escherichia coli, которая является про¬
кариотическим организмом, не имеющим истинного ядра. Однако
логичность и простота схемы давала возможность считать ее универ¬
сальной для всего живого, в том числе и для эукариотических орга¬
низмов, имеющих ядро, к которым относятся животные, растения и
человек.Однако, несмотря на несомненные успехи молекулярной биоло¬
гии прокариот, геном сложных организмов был практически недос-12
тупен для анализа. Изучение общих биохимических свойств клетки
не давало надежды на установление деталей генетической организа¬
ции: слишком велики были геномы эукариотических организмов и
слишком сложно было проводить с ними какие-либо эксперименты.
Для этого необходимо было, как минимум, научиться «разрезать»
ДНК не в случайных, а в строго определенных местах, с точностью до
одного нуклеотида. Возникла и другая проблема — невозможность
определения последовательности нуклеотидов в ДНК. Не было выде¬
лено ни одного гена, не была расшифрована структура гена. Одна из
причин такой ситуации заключается в том, что даже простейшие ор¬
ганизмы содержат очень длинные молекулы ДНК (геном кишеч¬
ной палочки составляет 4,2 • 106 н. п.), а геном высших эукариот, в
том числе растений и млекопитающих, содержит 109 — 1011 н. п. В ге¬
номе содержится несколько десятков тысяч генов.Сейчас генетическая инженерия позволяет вводить в ядерный ап¬
парат реципиента не только отдельные новые гены и регуляторные
последовательности, исходно не присущие данному организму, но и
получать новые формы организмов путем введения целых хромосом,
отдельных органелл или слияния двух клеток.1.2.	ФЕРМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИФерменты генетической инженерии — это ферменты, позволяю¬
щие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разре¬
зать в определенных местах, соединять различные по происхождению
фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе по¬
следовательности, и т. д. Рассмотрим основные ферменты генетиче¬
ской инженерии.ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в гене¬
тической инженерии ферментов является ДНК-полимераза I, выде¬
ленная из Е. coli или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способно¬
стью удлинять цепь ДНК в направлении 5'->3' путем присоединения
комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз ис¬
пользуется в генной инженерии для построения второй комплемен¬
тарной цепи: при добавлении фермента к одноцепочечной ДНК-мат-
рице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство
используется, например, при создании кДНК-библиотек. ДНК-по-
лимераза применяется также для заполнения «бреши» в цепи ДНК,
например, при застраивании фрагментов с выступающими 5'-конца-13
ми. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для
введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.Использование специфических термостабильных ДНК-полиме¬
раз — Tth- и Тац-полимераз — выделенных из бактерий, живущих в
гейзерах, позволило проводить амплификацию — множественную на¬
работку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной ре¬
акции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Гя^-полиме-
раза, не только упростил некоторые старые методики генной инжене¬
рии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как от¬
дельных генов, так и целых геномов.Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДН К-поли-
мераза — РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратной
транскриптазой, или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать
комплементарную цепь ДНК на РНК-Матрице. С помощью ревертаз
можно получать кДНК-ДНК-копии мРНК. кДНК позволяют изучать
строение генов и идентифицировать полноценные копии этих генов в
геноме.ДНК-лигаза осуществляет одну функцию — соединение фраг¬
ментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между
соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием.
Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют
ДНК-лигазу фага Т4. С помощью лигазы Т4 соединяют любые фраг¬
менты ДНКслюбыми концами: «липкими» или «тупыми» (см. ниже).
Это один из наиболее часто использующихся ферментов.Нуклеазы — это большая группа ферментов, катализирующих ре¬
акцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате дейст¬
вия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или
отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке — дегра¬
дация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (на¬
пример, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужерод¬
ных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бакте¬
риальными нуклеазами при заражении бактерии фагом).Нуклеазы по типу их действия можно поделить на группы. Нук¬
леазы могут действовать только на молекулы ДНК (ДНКазы) или
РНК (РНКазы), либо на молекулы и ДНК, и РНК одновременно
(нуклеаза золотистой фасоли). Нуклеазы избирательно могут дейст¬
вовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), или двуцепочечную (экзо-
нуклеаза III) молекулы ДНК, или на гибридную ДНК — РНК-моле-
кулу (рибонуклеаза Н).Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа: на экзонуклеа-
зы и эндонуклеазы. Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5'-
14
или З'-свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри
последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК.Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки
зрения ее применения в генной инженерии, представляют специфи¬
ческие эндонуклеазы — рестриктазы.В основе метода, позволившего непосредственно приступить к
манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных ре¬
стрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было
обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coli, введенная в
клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма
С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как бы¬
стро расщепляется на фрагменты ДНК специфическими фермента¬
ми — рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорга¬
низмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетиче¬
ской инженерии наиболее широко используются около двухсот.Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, ко¬
торые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим
последовательностям, называются сайтами рестрикции. Каждая из
рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри
последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной
близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестрик¬
тазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать
одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывает¬
ся из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которо¬
го был выделен фермент, и дополнительного обозначения, так как из
бактерий одного вида может быть выделено несколько различных ре¬
стриктаз: Escherichia coli — EcoR I, EcoR V, Haemophilus influenzae —
Hinf I, Sreptomyces albus — Sal I, Thermus aquaticus — Taq I.Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепле¬
ния нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают
сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произ¬
вольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч
пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно
использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III
типа похожи на рестриктазы I типа, они гидролизуют ДНК на рас¬
стоянии 20—35 н. п. от сайтов узнавания и также довольно редко ис¬
пользуются для практических целей.Ферменты, используемые для получения рекомбинантных моле¬
кул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рест¬
риктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции
совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную после¬15
довательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности
сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представле¬
ны симметричными при повороте на 180° последовательностя¬
ми — палиндромами:5' GAATTC У3' CTTAAG 5' сайт рестрикции рестриктазы EcoR I5' TAG А 3'3' АТСТ 5' сайт рестрикции рестриктазы Taq IРестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости
от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:1)	мелкощепящие — сайт рестрикции которых представлен че¬
тырьмя нуклеотидными парами;2)	среднещепящие — сайт рестрикции — 6—8 н. п.;3)	крупнощепящие — сайт рестрикции — 10—14 н. п.Рестриктазы II типа можно отнести к двум группам по тому, какони расщепляют последовательность ДНК. Одни вносят разрывы по
оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие — со сдви¬
гом, с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так на¬
зываемые «тупые» концы, а во втором — «липкие», т. е. фрагменты
имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные уча¬
стки.Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с
«липкими» концами:5' G i ААТТС 3'	5' С i CGG 3'EcoR I 3 СТТАА Т G 5 Нра II У GGC Т С 5'Образование при расщеплении рестриктазами фрагментов с «ту¬
пыми» концами:ТА I GA У	5' GTT i ААС 3'Taq I У АТ Т СТ 5' Hinc I У САА Т TTG 5'Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут
соединяться друге другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт ре¬
стрикции восстанавливается. Фрагменты, имеющие «тупые» концы,
могут быть соединены вне зависимости от того, какой рестриктазой
они были образованы. Фрагменты с «липкими» концами более удоб¬
ны для создания рекомбинантных ДНК, так как ДНК-лигаза обеспе¬
чивает беспрепятственное соединение фрагментов.16
Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах
активности. Это такое количество фермента, которое необходимо
для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага X при оптималь¬
ных условиях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рест¬
риктазы являются индивидуальными и зависят от pH, ионной силы,
присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции.
Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в ге¬
нетической инженерии.1.3.	РАЗДЕЛЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК И ПОСТРОЕНИЕРЕСТРИКЦИОННЫХ КАРТ (ФИЗИЧЕСКОЕ КАРТИРОВАНИЕ)Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом иссле¬
дования. Они позволяют превращать молекулы ДН К очень большого
размера (106— 1011 н. п.) в набор фрагментов длиной от нескольких со¬
тен до десятков тысяч пар оснований. С помощью метода электрофо¬
реза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру,
можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент от¬
дельно. Метод электрофореза основан на разделении (фрагментов)
молекул ДНК, движущихся с различной скоростью в электрическом
поле. В растворе ДНК существует в виде аниона, и при помещении
раствора ДНК в электрическое поле молекулы будут двигаться к по¬
ложительному полюсу (катоду).Разделение фрагментов ДНК осуществляют в носителе, которым
является раствор полимера агарозы. Отсюда и название метода. Ага¬
розный гель образует трехмерную полимерную ячеистую структуру.
Он электронейтрален и химически инертен по отношению к ДНК,
поэтому всегда легко можно выделить (элюировать) необходимый
фрагмент ДНК из геля с сохранением биологической активности.
Использование геля в качестве среды, где проводится электрофорез,
позволило решить проблему разделения фрагментов и затем выделе¬
ния конкретного фрагмента ДНК (рис. 1.1).Короткие фрагменты в агарозном геле мигрируют намного быст¬
рее, чем длинные, при этом подвижность фрагментов ДНК в геле об¬
ратно пропорциональна логарифму массы (заряда) этого фрагмента.
При окрашивании гелей красителями (например, бромистым этиди-
ем), связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из ко¬
торых отвечает рестрикционному фрагменту. Молекулярную массу
фрагмента можно определить, проводя калибровку с помощью фраг¬
ментов ДНК с известными молекулярными массами.17
Использование электрофореза для разделения рестрикционных
фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты — по¬
следовательности ДНК с нанесенными на них сайтами разрезания
для различных рестриктаз. Первая карта была получена для вируса
SV40, содержащего 5423 пары оснований (рис. 1.2). Использовали
рестриктазу Hind III, расщепляющую кольцевую ДНК вируса на 11
фрагментов. Порядок их расположения в ДНК был установлен путем
исследований наборов образованных фрагментов. Первый разрыв
превращал кольцевую молекулу в линейную, которая затем расщеп¬
лялась на все меньшие фрагменты. Вначале исследовали наборы пе¬
рекрывающихся фрагментов, а затем продукты полного расщепле¬
ния. Таким образом была получена рестрикционная карта кольцевой
вирусной ДНК, на которую были нанесены сайты расщепления рест-
риктазой Hind III. Повторив подобные эксперименты с другими рест-
риктами, можно получить более подробную карту, где отмечены сай¬
ты рестрикции для нескольких рестриктаз. Чем больше взято рест¬
риктаз для картирования, тем более подробна карта.Определение нуклеотидной последовательности — секвенирование.
Методы, позволившие идентифицировать генетически важные уча¬
стки ДНК, имели большое значение. Но они также способствовали
разработке исключительно эффективных новых методов секвениро-
вания ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование
позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную после¬
довательность сегмента длиной 350—1000 нуклеотидных пар и более,
образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонук¬
леазами. Существует два основных принципа секвенирования: хими¬
ческий и ферментативный сиквенс.Химический сиквенс основан на избирательной химической дегра¬
дации нуклеотидов. Он был предложен в 1977 г. А.М. Максамом и
В. Гилбертом и назван их именем. Для секвенирования этим методом
необходимо получить одноцепочечную молекулу ДНК, один из кон¬
цов которой метят с помощью изотопа фосфора 2Р; препарат мече¬
ной ДНКделят на четыре порции и каждую обрабатывают реагентом,
специфически разрушающим одно или два из четырех оснований.
Так, например, добавление 60 %-й муравьиной кислоты разрушает
пуриновые основания (А + Г), прибавление диметилсульфата —
только гуанидиновые основания; чистый гидразин разрушает пири¬
мидиновые основания (Т + Ц), а в присутствии 1,5 М NaCI избира¬
тельно разрушаются только цитозиновые основания. Очень важно
подобрать условия реакции таким образом, чтобы на каждую молеку¬
лу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. При обработке18
Рис. 1.1. Разделение фрагментов
ДНК, полученных в результате
действия рестриктаз с помощью
электрофореза в агарозном геле:о	— ДНК фага X Hind III; ДНК фага
Х/Нас III; ДНК плазмиды pBR322/Bst N1
(в знаменателе дроби — название рест¬
риктазы); б — схематичное изображение
фрагментов ДНК фага X, полученных
под действием различных рестриктаз
(на шкале указаны размеры фрагментов
в н. п.)а10000 -
5000 “
2500 -1000 -
500 -DraEcoR I EaeEcoRI	Eco 47 111	EcoR I	EspEcoR IDraEcoR III	EagTcoR I	Eco 0109	EcoR Vповрежденных молекул пиперидином вДН К образуется разрыв в том
месте, где находилось разрушенное основание.В результате получается набор меченых фрагментов, длины кото¬
рых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца
молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях,
подвергают электрофорезу на четырех соседних дорожках в акрила-
мидном геле в денатурирующих условиях; затем проводят радиоавто¬
графию, и фрагменты, содержащие радиоактивную метку, оставляют
«отпечатки» на рентгеновской пленке. По их положению можно оп¬
ределить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разру-
Nde I 4826,
BstX I 4759
Tag I 4739
PjM I 4558Nde 1 3808Pst I 3204Sph I 128
Nsp 7524 I 128 / Nsp 7524 I 200Bgl I 5235
Sfi I 5234Kpn I 294
Ban I 294
Hha I 343
Nae I 345
Cfr 10 I 345
Npa II 346EcoR V 768
Ban 11 776
Eco 47 III 832
Hae II 832
Hha 1 833Pf iM I 1007
Avr II 1078Acc I 1628
Afi II 1699
Esp I 1710
EcoR I 1782Pst I 1988
HgiE II 2174Bel I 2770BamHl 2533Ара I 2258
Ban II 2258Рис. 1.2. Генетическая и рестрикционная карта ДНК вируса SV40 (цифрами
указано положение сайтов рестрикции)шенное основание, а зная это основание — его положение. Так, по
набору полос на рентгеновской пленке определяют нуклеотидную
последовательность анализируемого фрагмента ДНК.С помощью этого метода за короткий срок удалось установить
полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомби¬
нантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей
ДНК. Однако секвенирование методом Максама—Гилберта имеет
ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудо¬
емкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с
помощью химической деградации разработаны усовершенствован¬
ные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательно¬го
сти, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с
использованием обращенно-фазовой хроматографии.Наиболее широко сейчас применяется метод ферментативного
секвенирования, или метод секвенирования путем терминации (оста¬
новки синтеза) цепи, предложенный Ф. Сэнгером в 1977 г. (рис. 1.3, а).
В основе метода Сэнгера лежит принцип репликации комплементар¬
ной цепи ДНК на одноцепочечной матрице при происходящем в раз¬
ных местах последовательности ДНК обрыве синтеза, т. е. термина¬
ции роста цепи. Основным моментом ферментативного секвениро¬
вания является терминация синтеза строящейся цепи. Терминирую¬
щими агентами, приводящими к остановке репликации, являются
2', З'-дидезокситрифосфаты (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ). Эти
модифицированные основания не могут образовать фосфодиэфир-
ную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост
(элонгация) данной цепи терминируется в том месте, где в ДНК
включился дидезоксирибонуклеотид.Так как в основе секвенирования по Сэнгеру лежит процесс реп¬
ликации ДНК, то основным ферментом является ДНК-полимераза
(используют ДНК-полимеразу I). В присутствии одноцепочечной
ДНК-матрицы, короткого полинуклеотидного праймера и нуклеоти¬
дов по принципу комплементарности будет происходить синтез вто¬
рой цепи ДНК. При этом удлинение цепи будет проходить до тех пор,
пока вместо дезоксинуклеотида не присоединится дидезоксинуклео¬
тид. Присоединение последнего приведет к остановке синтеза.В пробирках собирают четыре реакционные смеси, имеющие
одинаковый состав: денатурированный фрагмент ДНК-матрицы,
чью нуклеотидную последовательность определяют, четыре дезокси¬
нуклеотида, радиоактивно меченый короткий (16—24 н. п.) праймер,
комплементарный фрагменту ДНК-матрицы, с которого ДНК-поли¬
мераза I продолжит синтез, и сама ДНК-полимераза I. В каждую про¬
бирку затем добавляют только один из дидезокси нуклеотидов. В каж¬
дой пробирке синтезируемая цепь будет терминироваться в том мес¬
те, где ДНК-полимераза I присоединит дидезоксинуклеотид, кото¬
рый был добавлен в реакционную смесь, т. е. в одной пробирке синтез
оборвется при присоединении к комплементарной цепи ддАТФ, в
Другой — ддГТФ и т. д. Поскольку обрыв цепи происходит в случай¬
ных местах, то получается набор фрагментов всех возможных длин,
начиная с праймера до конца секвенируемого фрагмента.Полученные фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном
геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию21
5 '-GTTCCGCGATCGCTAGCCGAAGCTATT	3'3 -ATCAAGGCGCTAGCGATCGGCTTCGATAACTACTCCCGTCAATC-5'dATP dATP
I dCTP iff dCTP
| dGTP Bt dGTP
dTTP V dTTP
ddATP ч ddCTPdATP (dCTPdGTPdTTPddGTPdATPdCTPdGTPdTTPGCAT GCATCZDGCTddC
l=IGCTAGCCGddA
CD GCTAGCCGAddA
cm G CTAG CCGAAG CTddA♦CZIddG
C=lGCTAddG
C=IGCTAGCCddG
C=3GCTAGCCGAAddGCZDddG
CZDGCTAddC
CHJ GCTAGCCddC
ПЗ GCTAGCCGAAddC
	I	[=□ GCddT
□ G CTAG CCGAAG CddT
1=1 G CTAG CCGAAG CTAddT
E=D GCTAGCCGAAGCTATddT
	IG CTAG CCGAAG CTATTa•Ф -v *£it-'
•*.« •- ШS.v vjSSasfctРис. 1.3. Принцип определения нуклеотидной последовательности ДНК фермен¬
тативным методом Сэнгера с дидезокситерминантами (по Чемерис и др., 1999)
(а) и радиограмма, получаемая в результате эксперимента (б)и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавли¬
вают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 1.3, б).Располагая такой информацией, можно локализовать на ДНК
биологически важные участки. Так, например, показано, что реп¬
ликация вируса SV 40 всегда начинается в одном специфическом
Hind ///-фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Рестрик¬
ционные карты и рестрикционные фрагменты были также использо¬
ваны для картирования участков ДНК, на которых синтезируются
мРНК для вирусных белков.В настоящее время определение точной нуклеотидной последова¬
тельности любого фрагмента ДНК — вполне разрешимая задача. Уже
определена последовательность нескольких тысяч генов про- и эука¬
риот. В настоящее время расшифрованы последовательности боль¬
шинства прокариотических организмов. Из эукариот полностью сек-
венированы геномы дрожжей (S. cerevisiae), нематоды (С. elegans),22
арабидопсиса, дрозофилы и человека. На подходе расшифровка гено¬
мов риса и мыши. Понятно, что проведение работ такого масштаба
невозможно без автоматизации и модернизации методов секвениро¬
вания. Уже полностью налажено автоматическое секвенирование на
основе обоих методов, что значительно упрощает и удешевляет секве-
нирование. Особенно широко используется автоматизированный
ферментативный метод определения нуклеотидных последователь¬
ностей. Применение флуоресцентных красителей, связанных с тер¬
минирующими нуклеотидами, позволяет проводить все реакции в од¬
ной пробирке. Кроме того, разработаны принципиально новые под¬
ходы к секвенированию, например, секвенирование посредством
гибридизации с фиксированными олигонуклеотидными чипами, се¬
квенирование посредством использования экзонуклеаз и ряд других
методов. Все эти методы позволяют довольно быстро решать пробле¬
мы секвенирования как огромных участков ДНК, так и любых гено¬
мов. Полученные результаты заносятся в базы данных — банки ге¬
нов. Наиболее крупными являются банки генов NCBI (США),
EMBL (ОЕ), DDBJ (Япония), объединенных в единую сеть INSD.
Нуклеотидные последовательности, представленные в этих банках
данных, доступны по адресам в Интернете: www.ncbi.nlm.nih.gov,
www.ddbj.nig.ac.jp,www.ebi.ac.uk.Зная нуклеотидную последовательность гена и генетический код,
легко определить аминокислотную последовательность кодируемого
им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось де¬
лать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очи¬
щенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру
белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью пря¬
мого секвенирования белка. Существует огромное количество ком¬
пьютерных программ, позволяющих проводить компьютерный ана¬
лиз полученных секвенированных последовательностей, в том числе
сравнение с уже известными последовательностями, определение
степени гомологии, выявление специфических (например, регуля¬
торных) последовательностей, возможность моделировать вторич¬
ные структуры РНК.Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования по¬
явились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно
длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной после¬
довательностью. Теперь довольно легко можно синтезировать после¬
довательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры
еще более облегчает и ускоряет синтез.23
1.4.	КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНКПод рекомбинантными понимают ДНК, образованные объедине¬
нием in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различ¬
ных биологических источников. Определенные фрагменты ДНК, в
том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использовани¬
ем рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с «ту¬
пыми», так и с «липкими» концами. Соединение фрагментов ДНК в
единую молекулу производится несколькими методами, зависящими
от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.Соединение фрагментов по одноименным «липким» концам. Некото¬
рые рестриктазы, например EcoR I, вносят в цепи ДНК симметрич¬
ные, расположенные с образованием «ступеньки» разрывы на рав¬
ных расстояниях от центра сайта узнавания. Эти комплементарные
друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спарива¬
ния оснований и поэтому их называют комплементарными, или
«липкими» концами (рис. 1.4).Спаривание оснований происходит только между комплементар¬
ными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образующиеся
при действии рестриктазы EcoR /, не будут спариваться, например, с
AGCT-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (неза¬
висимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и
той же рестриктазы, могут «слипаться» за счет образования водородных
связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеоти¬
дов (см. рис. 1.4).Однако после такого спаривания целостность двойной спирали
не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфир-
ном остове. Для их восстановления, т. е. сшивания, или лигирования
нитей используют фермент ДНК-лигазу. Таким образом, лигаза за¬
вершает образование рекомбинантной молекулы ДНК. Впервые та¬
кие эксперименты были выполнены в 1972 г. (П. Берг, США) и было
показано, что использование рестриктазы, дающей «липкие» концы,
в сочетании с ДНК-лигазой может послужить основой для создания
общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК. В этой ла¬
боратории впервые были соединены рекомбинантное ДНК вируса
SV40 и бактериофага X.Соединение фрагментов по «тупым» концам. «Тупые» концы фраг¬
ментов ДНК, полученные после действия рестриктаз, производящих
прямой разрез внутри сайта рестрикции, также могут быть соединены
за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования
имеет свои особенности и ее эффективность на порядок ниже, чем24
Рис. 1.4. Сшивание фрагментов ДНК с одноименными «липкими» концамипри сшивке по «липким» концам. Однако преимущество соединения
фрагментов с «тупыми» концами по сравнению с «липкими» в том,
что не имеет значения, какие рестриктазы образовывали эти «тупые»
концы: фрагменты, образованные в результате действия разноимен¬
ных рестриктаз, легко соединимы (рис. 1.5).Соединение фрагментов с разноименными концами. «Липкие» кон¬
цы можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с
«тупыми» концами. Для этого «затупляют» «липкие» концы. Это дос¬
тигается либо отщеплением нуклеотидов «липких» концов с помо¬
щью фермента — нуклеазы S1, которая разрушает только одноцепо¬
чечную ДНК, либо «липкие» концы «застраивают», т. е. с помощью
ДНК-полимеразы I на однонитевых «липких» концах синтезируют
вторую нить.Таким образом, из фрагмента ДНК с «липкими» концами получа¬
ется фрагмент с «тупыми», и он соединяется с другим фрагментом
ДНК с «тупыми» концами ДНК-лигазой.После того как фрагменты ДНК соединены в пробирке, их надо
ввести в живые клетки. Для этого используют специальные молеку¬
лы — векторы.Векторные молекулы. Трансформация. Ключевой операцией в ге¬
нетической инженерии является введение в клетку и стабильное под¬
держание генетической информации, содержащейся в рекомбинант¬
ных молекулах ДНК. Это достигается при помощи так называемых25
3'I	Концеваятрансфераза] 5'5'3'АА(А„)АА—ОННО-ТТ(Т)„ТТС35'5'13'1АА(А)ЛАА СТТ(Т)„ТТ с] 5'Рис. 1.5. Сшивание фрагментов ДНК с одноименными «тупыми» концамивекторных молекул, или векторов. Дело в том, что при обычном вве¬
дении ДНК, например в бактериальную клетку, она, как правило,
подвергается атаке ферментов, которые гидролизуют ее на составные
компоненты — нуклеотиды. В некоторых случаях ДНК «выживает» в
клетке, однако в процессе деления клеток она не наследуется и теря¬
ется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью
генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее ге¬
ном (интегрироваться в хромосому) и реплицироваться за ее счет,
либо быть способной к автономной репликации.Векторами называются молекулы ДНК, способные акцептировать
чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию, экспрессию и/или
трансформацию (перенос в другие организмы). Таким образом, век¬
тор позволяет осуществить введение в клетку дополнительной гене¬
тической информации. В качестве векторов используют, как прави¬
ло, плазмиды, бактериофаги, мобильные элементы, вирусы живот¬
ных. В настоящее время создано большое число векторов, и по про¬
филю использования их можно разделить на несколько типов.1.Векторы	для клонирования используют для уве¬
личения количества (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в
такой вектор, посредством репликации. В этом качестве наиболее
часто используются бактериальные плазмиды и фаги. Для клониро¬
вания больших фрагментов генома используют векторы — искусст¬
венные бактериальные и дрожжевые хромосомы (ВАС и YAC).2.	Экспрессионные векторы используют для анализа
конкретных последовательностей генов и их белковых продуктов, а
также наработки конкретного белка. Существует огромное количест¬
во экспрессионных систем, особенно для прокариотических орга¬26
низмов. Есть также векторы для экспрессии генов в клетках дрожжей,
растений и млекопитающих. Экспрессионные векторы для эукарио¬
тических организмов всегда содержат так называемую экспрессион-
ную кассету, состоящую из промотора, способного работать в данном
организме, и сайта полиаденилирования.3.	Векторы для трансформации используют для
введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента. Обычно
такие векторы содержат специфические последовательности, спо¬
собствующие интеграции в геном.Современные векторные системы часто бывают полифункцио-
нальными, совмещая несколько функций в одном векторе. Первые
естественные векторные плазмиды были выделены из бактерий; в по¬
следующем большинство векторов было сконструировано при помо¬
щи методов генетической инженерии в соответствии с задачами экс¬
периментаторов (экспрессионные векторы, векторы для клонирова¬
ния, векторы для трансформации).Часто в составе векторной молекулы бывает маркерный ген, кото¬
рый после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип, сви¬
детельствующий о присутствии вектора. Иными словами, вектор дол¬
жен иметь селективный генетический признак. Часто в качестве се¬
лективных используют широко распространенные в природе гены ус¬
тойчивости к антибиотикам. Белковые продукты этих генов, обычно
ферменты, модифицирующие антибиотики и инактивирующие их
действие. Например, ген nplll, кодирует фермент неомицинфос-
фотрансферазу, инактивирующий антибиотик канамицин. В присут¬
ствии гена я/>///бактериальная клетка приобретает устойчивость к ка-
намицину и на среде с этим антибиотиком образует клон или коло¬
нию клеток. Обычные же клетки, не содержащие ген nptll, на данной
среде погибают. Таким образом, присутствие маркерного гена nptllъ
векторной конструкции позволяет обнаружить те клетки, в которых
присутствует вектор, и отобрать их.Трансформация клеток Е. coli векторными конструкциями. Полу¬
ченные векторные конструкции, содержащие чужеродный фрагмент
ДНК, используют для трансформации бактериальных клеток специ¬
альных штаммов Е. coli. Трансформация бактерий плазмидами векто¬
ров основана на способности клеток акцептировать внутрь себя мо¬
лекулы ДНК (компетентность клеток). Трансформацию клеток Е. coli
обычно проводят одним из двух методов: с помощью кальциевого
шока или электропорацией. В обоих случаях бактериальная мембра¬
на становится более проницаема для молекул ДНК, последние входят
в протоплазму бактериальной клетки.27
В целом к векторной молекуле предъявляются следующие основ¬
ные требования:1)	вектор должен содержать уникальные сайты рестрикции для
нескольких рестриктаз, что делает возможным встроить в него фраг¬
мент чужеродной ДНК;2)	вектор должен обладать определенной емкостью и не аборти¬
ровать встроенный фрагмент;3)	вектор должен реплицироваться в определенных клетках за
счет имеющейся последовательности точки начала репликации
(ориджина);4)	вектор должен содержать последовательность маркерного гена,
облегчающего селекцию клеток, несущих векторную конструкцию.Использование бактериальных плазмид в качестве векторов для
клонирования. Клетки бактерий содержат хромосомную ДНК. Одна¬
ко помимо хромосом бактерии содержат большое число небольших
(1—25 т. н. п.) кольцевых молекул ДНК. Такие кольцевые молекулы
называют плазмидами. Некоторые плазмиды имеют в своем составе
гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим чис¬
лом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез
большого количества ферментов, биохимически нейтрализующих
антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клет¬
ки к последним.Как было сказано выше, в присутствии ионов кальция плазмиды
легко поглощаются бактериями, которые их не содержали. Однако
бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плаз¬
миды только одного типа.Число копий плазмиды в клетке может существенно варьировать.
Это зависит от генетических особенностей как клетки, так и плазми¬
ды. Некоторые плазмиды могут размножаться до тех пор, пока их чис¬
ло не достигнет 10—200 копий на клетку. Другие типы плазмид реп¬
лицируются с той же скоростью, что и бактериальная хромосома. Та¬
кие плазмиды содержатся в клетке в количестве одной или несколь¬
ких копий. Естественно, для целей клонирования используют
векторы на основе плазмид первого типа.Впервые плазмида в качестве вектора была использована в 1973 г.
в лаборатории П. Берга. Эксперименты проводились с небольшой
(- 9 т. н. п.) плазмидой Е. colipSC 101, несущей ген устойчивости к ан¬
тибиотику тетрациклину. Она содержала только один сайт рестрик¬
ции для EcoR I. Под действием рестриктазы кольцевая плазмида пре¬
вращалась в линейную молекулу с «липкими» концами. Такую ДНК
плазмиды pSClOl смешивали с EcoR I-фрагментом чужеродной для28
Отбор клеток, содержащих рекомбинантные
молекулы ДН К, по способности расти
в присутствии антибиотикаI<OD (Q) <0>С2>Рис. 1.6. Схема эксперимента по клонированию фрагментов ДНК с помощьюплазмид:/ — встраиваемая гетерологичная ДНК; 2— маркер устойчивости к антибиотику; 3— рекомби¬
нантная молекула ДНК; 4—введение в бактериальные клеткикишечной палочки ДНК (ДНК золотистого стафилококка). С помо¬
щью ДНК-лигазы фрагмент чужеродной ДНК и плазмиды pSClOlсо¬
единяли в единую рекомбинантную молекулу. Затем такую рекомби¬
нантную плазмиду добавляли к компетентным клеткам Е. coli, плаз¬
мида входила внутрь бактериальной клетки. Клетки с рекомбинант¬
ной плазмидой отбирались на селективной среде с тетрациклином
(рис. 1.6). Этот исторический опыт положил начало генетической ин¬
женерии. Стало ясно, что можно будет проводить дальнейшие экспе¬
рименты с встраиванием различных фрагментов чужеродных про- и
эукариотических ДНК и получать клетки с новыми свойствами.В настоящее время на основе природных векторов сконструиро¬
ваны более удобные в использовании векторы. Наибольшее распро¬
странение приобрели векторы типа pUC и их производные29
(pBluescript, pGEM), которые используются как для клонирования,
так и для экспрессии. Векторы pUC небольшие (~ 2,7 т. н. п.), мульти-
копийные плазмиды, содержат последовательность точки начала ре¬
пликации (оп-сайт), что позволяет им независимо реплицироваться в
бактериальной клетке. Для облегчения клонирования в векторе pUC
имеется искусственно синтезированная последовательность полилин¬
кера, представляющая собой уникальные сайты рестрикции для наи¬
более часто использующихся рестриктаз (рис. 1.7). Полилинкер
встроен в ген lacZ, который является удобным маркером на присутст¬
вие в векторе чужеродной ДНК. Ген /«^кодирует белок р-галактози-
дазу, способный расщеплять субстрат X-gal (производное (3-галакто-
зида). При этом цвет бактериальных клеток меняется с белого на яр¬
ко-голубой. Небольшая последовательность полилинкра (100—
120 н. п.) не влияет на синтез белка р-галактозидазы. При клонирова¬
нии фрагмент чужеродной ДНК встраивается в полилинкер
pUC-вектора, что нарушает экспрессию гена lacZ, клетки, содержа¬
щие вектор со вставкой ДНК, не будут расщеплять субстрат X-gal, и
колонии таких бактериальных клеток останутся белыми, в отличие от
голубых колоний клеток, несущих пустую векторную плазмиду без
вставки. Наличие такой бело-голубой селекции pUC-векторов и их
производных значительно облегчает процесс клонирования, так как
встраивание чужеродной ДНК в векторную плазмиду довольно ред¬
кое событие — только одна из 10—30 полученных после лигирования
молекул будет рекомбинантной, т. е. нести в своем составе чужерод¬
ный фрагмент, и использование бело-голубой селекции позволяет
определить только те клоны бактерий, которые содержат рекомби¬
нантную ДНК.PUC-векторы несут специфические экспрессионные кассеты, со¬
стоящие из регуляторных последовательностей, обеспечивающих
транскрипцию клонируемых генов.Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YAC-векторы. Векторы на ос¬
нове бактериальных плазмид широко используются для клонирова¬
ния, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость.
В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более
7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо
длиннее (в среднем 10—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуля¬
торных последовательностей, находящихся за пределами кодирую¬
щей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные
области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов
плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содер¬
жащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), неста-зо
Ssp I 2850
Xmn I 2645,Seal 2526
Pvu 241Ssp 1 19Pvu I 500
„Pvu II 529
Крп I 657 T7 }^ Xho I
<T Sal I
Hind III
EcoR V
EcoR ISac I 759 T3 {Pvu II 977
Afl III 1153Pst I
ВашН I
Spe T
Xbal
Not IРис. 1.7. Схема вектора для клонирования pBluescript SK (MCS — последова¬
тельность полилинкера; Amp" — ген устойчивости к ампицилину (селективныймаркер)бильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в
результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК.На основе бактериофага X были сконструированы векторы, в со¬
ставе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весь¬
ма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на ос¬
нове фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть
молекулы ДНК фага (~ 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в
Е. coli. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага
так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые пра¬
вое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются не¬
изменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и ис¬
пользуют в качестве векторов для клонирования, содержащих на мес¬
те вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером
около 9—21 т. н. п. Размножаются в бактериях только те фаги, кото¬
рые содержат оба конца фаговой хромосомы и вставку чужеродной
ДНК (рис. 1.8), при этом длина полученной рекомбинантной ДНК
фага не должна быть меньше 30 т. н. п. и больше 52 т. н. п.Для выделения и исследования более длинных генов или группы
соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходи¬
мо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.).
Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специ¬
альные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие
собой гибридную молекулу, содержащую специальный cos-участок31
Рис. 1.8. Клонирование ДНК в векторе на основе бактериофага X:У —фрагмент ДНК фага, не нужный для репликации; 2—фрагменты ДНК фага, содержащие
гены, ответственные за репликацию в бактериальных клетках и дальнейшую упаковку фага;3 — бактериофаг, содержащий фрагмент чужеродной ДНКгенома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и
специальные последовательности, позволяющие им реплицировать¬
ся по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравне¬
нию с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в косми-
ду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45
т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК,
не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. coli.
Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамлен¬
ную cos-еайтами, размножается в Е. coli как плазмида, и каждая фа¬
говая частица вызывает образование колонии индивидуального бак¬
териального трансформанта.Клонирование фрагментов ДНК от 100 т. н. п. и более осуществ¬
ляют в специально сконструированных векторах ВАС и YAC.ВЛ С-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат
гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в
бактериальных клетках, и ряд дополнительных последовательностей
для облегчения клонирования. Емкость ВАС-векторов при собствен¬
ном небольшом размере (~ 7 т. н. п.) огромная — 100—300 т. н. п. Это
позволяет во много раз уменьшить число клонов при получении ге¬
номных библиотек (см. ниже).32
YAC-векторы, которые также используются для клонирования
больших фрагментов ДНК, представляют собой искусственную
дрожжевую минихромосому. YAC-вектор содержит центромеру, те-
ломеры и точку начала репликации. В такой вектор можно встроить
фрагменты чужеродной ДНК размером более 100 т. н. п., и такая ми¬
нихромосома, введенная в клетки дрожжей, будет реплицироваться и
вести себя аналогично другим дрожжевым хромосомам при митоти¬
ческом делении.Геномная библиотека (банк генов) представляет собой клониро¬
ванный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК
данного организма. Фрагментация целого генома на отдельные уча¬
стки значительно облегчает все генно-инженерные манипуляции и
позволяет анализировать отдельные последовательности, проводить
сравнительный анализ различных геномов по определенным участ¬
кам и, главное, выделять и работать с индивидуальными генами.Фрагменты геномной ДНК получают гидролизом высокополи¬
мерной хромосомной ДНК при помощи рестриктаз. Рестриктазы для
гидролиза ДНК подбирают таким образом, чтобы полученные фраг¬
менты перекрывались и их размер приблизительно соответствовал
емкости вектора. Полученные фрагменты лигируют с плечами фага и
упаковывают в уже готовые головки фаговых частиц. Таким образом,
получается геномная библиотека. Библиотеку хранят в виде фагового
банка под хлороформом при — 70 °С. Таким способом библиотека
может храниться десятки лет. Размножение полученных геномных
клонов (амплификацию библиотеки), а также поиск нужного клона
проводят, заражая фаговой библиотекой бактериальные клетки и за¬
тем высевая их на чашки Петри с агаризованной средой. Полный гап¬
лоидный набор хромосом клетки млекопитающих содержит около
3 • 109 пар оснований. При емкости вектора 15 т. н. п. библиотека мо¬
жет содержать около 1 млн фаговых частиц. Проверка миллиона фа¬
говых бляшек позволяет проверить весь геном на присутствие необ¬
ходимого гена. Так можно идентифицировать именно те фаговые
частицы, которые несут последовательность исследуемого гена, раз¬
множить ДНК только этой последовательности и проводить с ней
дальнейшие манипуляции.1.5.	ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВВыделение генов — один из главных этапов в генетической инже¬
нерии. Успех на этой стадии создания рекомбинантных ДНК зависит
прежде всего оттого, насколько изучен данный ген и его положение вЛ-426633
геноме донора; от разработки методов выделения м PH К данного гена
и методов обнаружения функциональной активности продукта дан¬
ного гена; от существования объектов, в которых данный ген нахо¬
дится в больших количествах (амплифицирован) или в которых он
особенно активен, что позволяет выделить достаточные количества
его мРНК, которые можно в дальнейшем использовать для получе¬
ния ДНК этого гена путем обратной транскрипции.В принципе существуют два основных пути получения гена: либо
ген искусственно синтезируют, либо из клонотеки отбирают ту ре¬
комбинантную ДНК, которая содержит нужный ген.Синтез комплементарной ДНК (кДНК). Осуществление первого
пути стало возможным вследствие открытия фермента — обратной
транскриптазы илиревертазы. Этот фермент был выделен из некото¬
рых РНК-содержащих онкогенных вирусов. Фермент представляет
собой специфическую ДНК-полимеразу и осуществляет РНК-на-
правляемый синтез ДНК, используя РНК как матрицу. В результате
синтезируется комплементарная цепь ДНК. Отсюда и название фер¬
мента — он катализирует реакцию, обратную первому этапу экспрес¬
сии гена — транскрипции.Предположим, что нам удалось выделить гомогенный препарат
мРНК определенного гена. В некоторых случаях, когда эта мРНК со¬
ставляет существенную часть тотальной мРНК, это удается. Практи¬
чески все эукариотические мРН К содержат на своем 3'-конце после¬
довательность, состоящую из остатков аденина, — поли(А)-последо-
вательность, которая присоединяется к мРНК в результате процес¬
синга.Для начала реакции синтеза ДНК ДНК-ревертазе, как и всем
ДНК-полимеразам, необходима затравка в виде небольшого двуце¬
почечного отрезка. Если добавить в реакцию короткие одноцепочеч¬
ные олигонуклеотиды, состоящие из 18—20 тиминовых остатков
(поли дТ), то они будут гибридизоваться (образовывать по принципу
комплементарности двуцепочечные ДНК—РНК-фрагменты) с
поли(А)-последовательностью мРНК — и такой дуплекс будет слу¬
жить затравкой для начала ферментативной реакции (рис. 1.9). В
результате образуется гибридная РНК—ДНК-молекула, причем на
конце у нее фермент будет синтезировать короткий отрезок двуцепо¬
чечной ДНК — шпильку. Шпилька может служить затравкой для
синтеза второй комплементарной цепи ДНК, который осуществляет
уже фермент ДНК-полимераза I (рис. 1.9). Цепь мРНК гидролизуют
РНКазой. С помощью эндонуклеазы S1, которая специфически гид-34
ро1у(А)«хвост»mphk ?'	.	.JaaaSaSВирусная обратная	■* 11 *■транскриптаза	Затравка1	oligo (dT)гПНК!		1	IААААААААШпилькаДН К-полимераза
Г'! 1Нуклеаза S1(специфически расщепляетодноцепочечныеполинуклеотиды) iДвуцепочечная кДНК
Рис. 1.9. Схема синтеза двуцепочечной кДНК на мРНКролизует одноцепочечные участки ДНК, последовательность шпиль¬
ки можно расщепить. В результате получится двуцепочечная молеку¬
ла ДНК, одна из нитей которой комплементарна мРНК. Такую ДНК
называют кДНК, и она соответствует структурному гену, с которого
транскрибировалась исходная молекула мРНК.К полученной кДНК присоединяют «липкие» концы и встраива¬
ют в плазмиду, например pUC19. Рекомбинантную ДНК вводят в
Е. coli, где кДНК-фрагмент размножается. Подобная схема была ис¬
пользована для получения генов, кодирующих инсулин, гормон рос¬
та, интерферон, альбумин, иммуноглобулины и ряд других белков,
производство которых уже налажено в промышленных масштабах.Для того чтобы убедиться, что получен именно тот ген, который
кодирует данный белок, существует несколько методов. Если извест¬
на последовательность аминокислот белка, кодируемого геном, то,
определив нуклеотидную последовательность клонированной ДНК
(см. рис. 1.3), можно убедиться, что она кодирует именно этот белок.Иногда применяют метод ДНК — РНК-гибридизации. Это воз¬
можно в том случае, если выделена индивидуальная мРН К (рис. 1.10).35
\ Рекомбинантная
| плазмидаДенатурацияЧистая МРНК сэавсэсэсэIРис. 1.10. Идентификация плазмид, содержащих в виде вставок специфические
кДНК, с помощью ДНК — РНК-гибридизации на фильтрахМолекулы кДНК подвергают денатурации (при этом нити ДНК рас¬
ходятся) и смешивают с избытком радиоактивно меченой мРНК.
В условиях ренатурации (процесс, при котором происходит восста¬
новление двойной спирали, причем последняя может образоваться как
из двух цепей ДНК, так и из цепи ДНК и комплементарной ей цепи
РНК) будет происходить образование гибридных ДНК — РНК-молекул.
Используя эндонуклеазу S1, можно убедиться в их полной комплемен¬
тарное™. Если кДНК не полностью комплементарна РНК, то в гиб¬
ридной молекуле будут одноцепочечные неспаренные участки, кото¬
рые могут быть гидролизованы эндонуклеазой S1.36
Если кДНК в составе векторной молекулы способна к экспрес¬
сии, происходит синтез мРНК, а затем с мРН К — синтез белка, то ген
можно идентифицировать по его продукту, например при помощи
специфического иммунохимического метода обнаружения белка. Та¬
ким образом, используя один из этих методов или их комбинацию,
можно доказать, что получен именно нужный ген.Создание библиотеки кДНК. Мы рассмотрели случай, когда уда¬
лось выделить индивидуальную м PH К. Это возможно, если ген изби¬
рательно активен в определенных клетках или тканях. В этом случае
реакцию обратной транскрипции проводят со смешанной популяци¬
ей мРНК и в результате получают кДНК, представляющую смесь об¬
ратных транскриптов со всех типов м PH К. Далее обычно прибегают к
методу создания банка кДНК. Для этого молекулы кДНК сшивают с
векторными молекулами и трансформируют ими бактериальные
клетки. Причем эксперимент проводят таким образом, что каждая
бактериальная клетка получает только одну рекомбинантную плаз¬
миду и, следовательно, будет содержать только один вид кДНК. Сово¬
купность векторных плазмид, каждая из которых несет в своем соста¬
ве кДНК, называют библиотекой кДНК. Таким образом, библиотеки
кД Н К, в отличие от геномных библиотек, представляют не все после¬
довательности генома и даже не все гены, а только ту их часть, которая
экспрессируется в этом организме в этот момент времени. При этом
необходимо помнить, что в кДНК представлена только структурная
часть гена без промоторных и интронных участков.Выделяя мРНК только из листьев или только из корней, можно
получить специфические кДНК листовой или корневой ткани, кото¬
рые будут соответствовать только тем генам, которые экспрессируют¬
ся в определенных тканях: листьях или корнях соответственно. Таким
образом, помимо библиотеки кДНК растений или животных можно
получить библиотеки кДНК отдельных органов и тканей (органо-
или тканеспецифичные библиотеки кДНК) или библиотеки кДНК,
характерные для различных стадий онтогенеза. Получение и анализ
таких библиотек позволяет идентифицировать тканеспецифичные
гены и изучать процессы дифференцировки клеток и тканей, ткане- и
органоспецифического метаболизма, определять гены, участвующие
в этих процессах.Идентификация нужного гена из клонотеки. В этом случае задача
исследователя сводится к поиску среди миллионов клонов тех, кото¬
рые содержат фрагмент ДН К с интересующим его геном. В настоящее
время для решения такой задачи применяются молекулярные зонды. 37
(пробы). Зонд представляет собой меченую молекулу нуклеиновой
кислоты, гомологичную последовательности гена.Индивидуальная радиоактивно меченая мРНК служит хорошим
зондом для выявления бактериальных колоний, несущих искомый
ген. Однако индивидуальную мPH К не всегда удается выделить. Ино¬
гда продукт (а значит, и мРНК) искомого гена присутствует в клетке в
очень малом количестве, или мРНК очень быстро деградирует, так
что получить индивидуальную РНК не удается. При наличии ста¬
бильного белка можно выделить его небольшое количество и опреде¬
лить аминокислотную последовательность некоторой его части
(обычно достаточно знания участка белковой молекулы длиной 5— 10
аминокислотных остатков). По известной аминокислотной последо¬
вательности можно установить возможные последовательности нук¬
леотидов (их будет несколько из-за вырожденности генетического
кода) в том участке мРНК, который кодирует данную аминокислот¬
ную последовательность. Затем из отдельных радиоактивно меченых
нуклеотидов химически синтезируют олигонуклеотиды длиной не
менее 30 нуклеотидных пар, один из которых полностью комплемен¬
тарен участку искомого гена. Такие нуклеотиды и являются проба¬
ми/зондами для поисков нужных клонов, соответствующих кДНК, а
затем и клонов в геномных библиотеках.Скрининг библиотек. После того как радиоактивный зонд получен,
просматривают геномную библиотеку или библиотеку кДНК для
идентификации бактериальных колоний, содержащих плазмиду с по¬
следовательностью, комплементарной зонду и, следовательно, соот¬
ветствующей анализируемому белку.На чашку Петри с бактериальными колониями накладывают лист
специального нейлонового фильтра; на него переходит часть клеток
бактерий каждой колонии, тогда как другая часть остается на чашке.
В результате получается реплика: на чашке и на фильтре колонии рас¬
пределены одинаково. ДНК прочно связывается (иммобилизуется) с
нейлоновым фильтром. Для лизиса бактерий и денатурации ДНК
клонов нейлоновый фильтр обрабатывают щелочью. Затем фильтр
помещают в раствор, содержащий меченый зонд (кДНК или мРНК,
или синтетический олигонуклеотид). При гибридизации зонд связы¬
вается с теми колониями, которые содержат последовательности,
комплементарные меченому зонду; фильтр отмывают от несвязав-
шихся молекул зонда и проводят радиоавтографию, которая выявляет
колонии, содержащие метку. Эти колонии идентифицируют на чаш¬
ке Петри, отбирают и размножают. Таким образом, из огромного38
числа геномных библиотек или клонов кДНК отбирается только тот,
который несёт последовательность анализируемого гена, и вдальней-
шем все манипуляции проводятся не со всем геномом, а только с од¬
ним геном (фрагментом ДНК).Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только
при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геном¬
ной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие
определенной последовательности ДНК в геноме (например, присут¬
ствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность
гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности
гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на
идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридиза¬
ции со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следую¬
щих этапов:1)	рестрикция ДНК;2)	перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый
фильтр и их иммобилизация;3)	гибридизация с меченым зондом.Высокомолекулярную хромосомную ДНК расщепляют одной
или несколькими рестриктазами. Образовавшиеся фрагменты разде¬
ляют методом электрофореза в агарозном геле, и на предварительно
денатурированный (0,4 М NaOH) гель помещают лист нейлонового
фильтра. Фильтр покрывают слоями фильтровальной бумаги; под
действием капиллярных сил ДНК-фрагменты перпендикулярно пе¬
реносятся на фильтр и связываются с ним (иммобилизуются). Такой
перенос называется блоттинг (от англ. blot — промокать). При этом
на фильтре получается как бы реплика с геля. Затем фильтр помеща¬
ют в раствор с радиоактивно меченым одноцепочечным зондом и
гибридизируют с закрепленными на фильтре фрагментами хромо¬
сомной ДНК. Зонд гибридизуется только с теми фрагментами, кото¬
рые содержат гомологичную ему последовательность ДНК. Фрагмен¬
ты, с которыми связывалась метка, выявляют радиоавтографией. На
рис. 1.11 представлена схема проведения блот-гибридизации по Сау-
зерну (Southern blotting).По полученным на радиоавтографе полосам судят о присутствии
анализируемого фрагмента в геноме, изменениях в этой последова¬
тельности (делеции, инсерции), а по интенсивности полос можно оп¬
ределить число копий гена в геноме. Таким образом, описанный ме¬
тод активно используется как для анализа отдельных генов, так и це¬
лых геномов.39
ВысокомолекулярнаяДнкГидролиз рестриктазами
Электрофорез в агарозном гелеРис. 1.11. Принцип блот-гибридизации по СаузернуАналогичным образом можно иммобилизовывать и анализиро¬
вать мРНК (Nothern blotting).Итак, методы в том или ином сочетании позволяют получить мно¬
гие гены, продукты которых — белки — известны и могут быть выде¬
лены хотя бы в малом количестве. Эти гены в дальнейшем могут стать
объектом генно-инженерных манипуляций, задача которых получить
их экспрессию в новом генетическом окружении.
Глава 2ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙТрадиционные методы селекции, основанные, главным образом,
на половой гибридизации и отборе, позволяют получать новые цен¬
ные генотипы растений. На их основе создано большинство совре¬
менных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, в том чис¬
ле шедевров отечественной и мировой селекции. Выдающиеся селек¬
ционеры нашей страны (П.П. Лукьяненко, B.C. Пустовойт, В.Н. Ре¬
месло, П.Ф. Гаркавый, Ф.Г. Кириченко и др.) внесли решающий
вклад в эти достижения. Классические методы селекции и в дальней¬
шем будут обеспечивать решение одной из главных задач сельскохо¬
зяйственной науки — повышение ее эффективности.Вместе с тем для повышения устойчивости сортов и гибридов к
биотическим и абиотическим стрессам необходимо использовать но¬
вые методы, основанные на получении принципиально новых форм
растений с помощью трансгенных технологий. Это, прежде всего, по¬
зволит значительно сократить сроки создания новых сортов и гибри¬
дов.Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены как
прокариотического, так и эукариотического происхождения, пере¬
носить их в хромосомы реципиентных растений и обеспечивать экс¬
прессию генов. Применение технологий генной инженерии делает
поиск более целенаправленным и значительно расширяет возможно¬
сти манипулирования генетическим аппаратом.Важным преимуществом растений по сравнению с животными
является возможность получения целого растения из одной клетки,
основанная на ее способности к тотипотентности — регенерации це¬
лого организма из одной клетки. Результаты генетической инжене¬
рии растений во многом зависят от разработки методов культуры тка¬
ней, особенно методик регенерации различных растений.Технология генетической инженерии состоит из следующих ос¬
новных этапов получения трансгенных растений:1)	поиск, идентификация, выбор гена и его клонирование;2)	подбор генотипа растения-реципиента;41
3)	введение гена в геном клеток растения-реципиента;4)	регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных
растений;5)	тестирование экспрессии гена в геноме трансгенного растения.2.1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНАВыбор гена определяется необходимостью передачи растению оп¬
ределенного хозяйственно-полезного признака. В настоящее время
для трансформации растений используются в основном гены, опре¬
деляющие моногенные признаки, такие, как устойчивость к гербици¬
дам и пестицидам, устойчивость к некоторым другим видам стрессов.
Большинство генов, определяющих эти признаки, выделены из бак¬
териальных геномов. В последнее время в качестве доноров генов, оп¬
ределяющих признаки устойчивости, выбирают геномы диких видов.
Такие гены не могут быть введены в геном растений-реципиентов пу¬
тем половой гибридизации из-за биологической несовместимости
растений, относящихся к разным видам, родам и даже семействам.
Еще более сложной является проблема получения признаков, отно¬
сящихся к группе количественных признаков: продуктивность, каче¬
ство зерна, устойчивость кзасухе, низким и высоким температурам.2.2. ПОДБОР ГЕНОТИПА РАСТЕНИЯ-РЕЦИПИЕНТАВ идеальном варианте в качестве реципиента подбираются расте¬
ния такого сорта или линии, которые отвечали бы требованиям про¬
изводства по урожайности, качеству плодов, устойчивости к биотиче¬
ским и абиотическим стрессам но имели бы лишь одно отрицатель¬
ное свойство, например неустойчивость к насекомым. Тогда введе¬
ние в геном растений этого сорта, например, бактериального гена Ы2
(сгу2А), экспрессирующего белок прототоксин, вызывающий гибель
насекомых, приводил бы к значительному улучшению выбранного
сорта. Выбор генотипа растения-реципиента определяется способно¬
стью его клеток к регенерации в целое фертильное растение, так как
показано, что это свойство значительно зависит от генотипа.2.3.	ВВЕДЕНИЕ ГЕНА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В ГЕНОМЕ
РАСТЕНИЯ-РЕЦИПИЕНТАПроблема переноса чужеродных генов в геном растений сущест¬
венно облегчается в связи с обнаружением Ti-плазмид почвенных аг¬
робактерий Agrobacterium tumefaciens, позволяющих вводить чужерод¬42
ные гены в геном двудольных и некоторых однодольных растений.
В последнее время довольно широко, особенно для трансформации
клеток однодольных растений, используется метод биобаллистиче-
ской трансформации. Важно обеспечить экспрессию чужеродного
гена в геноме растения-реципиента и стабильное наследование при¬
знака в поколениях. Экспрессия введенного гена зависит от ряда при-
чин, в том числе от места интеграции гена в геном растения, после¬
дующего метилирования промоторной области и введенного гена
и т. п.2.4.	ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ
СПОСОБНОСТЬ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТОКЭффективность получения трансгенных растений напрямую за¬
висит от регенерационной способности клеток растения-реципиен¬
та. В свою очередь регенерация взрослых растений из трансформиро¬
ванных клеток зависит от тотипотентности клеток определенных тка¬
ней и поэтому регенерационная способность отдельных тканей зна¬
чительно различается. Кроме того, виды и даже сорта растений могут
отличаться по способности к регенерации. Тотипотентность хорошо
выражена у клеток двудольных растений, таких как табак, картофель,
свекла, соя, рапс, люцерна, томаты, морковь, капуста, некоторых
плодовых, в то время как получить регенерацию трансгенных расте¬
ний из клеток большинства бобовых, перца, баклажана крайне тяже¬
ло. У однодольных, особенно злаков, свойство тотипотентности кле¬
ток выражено гораздо слабее, в связи с чем процесс регенерации кле¬
ток в целое растение затруднен. В настоящее время разработаны мето¬
дики регенерации трансформированных клеток некоторых основных
зерновых культур, таких как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. Однако
необходимо отметить, что с каждым годом методы регенерации раз¬
рабатываются для все большего числа растений.2.5.	ВВЕДЕНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В РАСТИТЕЛЬНУЮКЛЕТКУ ПРИ ПОМОЩИ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВОдной из основных проблем при получении трансгенных расте¬
ний был способ введения чужеродных генов в хромосомы растений,
т. е. трансформация растительных клеток. Значительный прорыв был
сделан при открытии возможности использования природной систе-43
Т-ДНК ХромосомаA.tumefaciens«лт-днкКорончатыйгаллу Agrobacterium Трансформированная
• ^ ' tumefasiens	растительная клеткаРис. 2.1. Интеграция Т-ДНК в хромосому растений и образование
опухоли (корончатого галла) (по Э.С. Пирузян)мы трансформации растений Ti-плазмидами почвенных агробакте¬
рий.Ранее было известно, что некоторые виды почвенных бактерий
(Agrobacteria) могут заражать двудольные растения и вызывать при
этом образование специфических опухолей — корончатых галлов.
Опухоли состоят из дедифференцированных клеток, интенсивно де¬
лящихся и растущих в месте заражения. При культивировании in vitro
клетки опухоли могут расти в отсутствие гормонов, необходимых для
роста нормальных растительных клеток. Было показано, что опухоле¬
вый рост связан с более высокими уровнями ауксинов и цитокини-
нов, детектируемых в клетках корончатых галлов. Кроме того, было
показано, что если после заражения все агробактерии инактивиро¬
вать добавлением антибиотика, то клетки корончатых галлов сохра¬
няют способность к неограниченному и неконтролируемому росту в
месте заражения. Если фрагмент опухолевой ткани, не содержащей
агробактерий, привить на незараженное растение, то в месте привив¬
ки также развивается опухоль, т. е. присутствие агробактерии необхо¬
димо только для индуцирования образования опухоли (рис. 2.1).Помимо повышенного синтеза фитогормонов, опухолевые клет¬
ки корончатых галлов начинают синтезировать необычные для расте¬
ния соединения — опины (производные аминокислоты аргинина),
которые используются агробактериями в качестве источника азота и
углерода. Агробактерии сами синтезировать опины не могут, так как
промежуточные продукты синтеза ингибируют рост бактериальной
клетки и используют растительные клетки как «фабрики» по произ¬
водству опинов. При заражении растения агробактерией происходит44
перестройка метаболизма трансформированных растительных кле¬
ток, и они начинают синтезировать соединения, необходимые только
для бактерий. Опины не могут утилизироваться растительной клет¬
кой и выделяются в межклетники, где и поглощаются агробактерией.
Также ряд бактерий могут содержать агропиновые Ti-плазмиды, ко¬
дирующие агропин, также относящийся к опинам.Молекулярно-генетические исследования показали, что все
Ti-плазмиды имеют сходное строение и содержат последовательно¬
сти, которые можно поделить на две группы: 1) необходимые для ме¬
таболизма самой агробактерии (гены катаболизма опинов, точка
начала репликации плазмиды и т. д.); 2) необходимые для транс¬
формации растительной клетки (см. ниже).Гены первой группы имеют прокариотический тип промотора,
т. е. могут функционировать только в бактериальной клетке, а второй
группы — могут экспрессироваться в эукариотической растительной
клетке. Ко второй группе относятся гены, ответственные за индук¬
цию опухоли и синтез опиновых аминокислот.Трансформация растения в результате агробактериального зара¬
жения происходит в несколько этапов. Было показано, что сама агро¬
бактерия не входит в растительную клетку, она располагается в меж¬
клетниках. Не входит в клетку растений и Ti-плазмида, но часть
Ti-плазмиды переносится в ядро растительной клетки и может
встраиваться в растительный геном. Этот фрагмент Ti-плазмиды был
назван Т-ДНК (от англ. Transforming DNA — трансформирующая
ДНК). Роль Т-ДНК при трансформации растений была показана в
1977 г. М. Чилтон с сотр.Было установлено, что длина Т-ДНК составляет -23 т. н. п. На
концах Т-ДНК находятся прямые высоко консервативные повторы
(25 н. п.), составляющие так называемые левый и правый погранич¬
ные районы, которые необходимы для вырезания ее из состава плаз¬
миды и интефации в геном растений (рис. 2.2). Непосредственно гра¬
ницы области Т-ДНК, а также последовательности, примыкающие к
этим районам, оказывают влияние на результативность трансформа¬
ции. При этом показано, что именно последовательность правой гра¬
ницы необходима для интеграции Т-ДНК в геном растения. Делеция
левой границы, как было показано опытным путем, не оказывала су¬
щественного эффекта на перенос Т-ДНК. Также рядом с правой гра¬
ницей внутри области Т-ДНК располагается специфическая область,
влияющая на вирулентность Ti-плазмиды. Делеция этой области
приводит к тому, что такие Ti-плазмиды не способны индуцировать
опухолеобразование. Кроме того, около правой границы Т-ДНК с
внешней стороны находится небольшая (24 п. н.) последователь-45
ТгаOriV IncРис. 2.2. Структура Ti-плазмидыность, называемая overdrive, которая узнается одним из v/У-белков,
что также влияет на эффективность трансформации.Область Т-ДНК несет семь генов: ген, кодирующий синтез одно¬
го из огтинов [гены nos (нопалинсинтетаза) или ocs (октопинсинтета-
за)], а также шесть генов, кодирующих признаки опухолеобразова-
ния, причем два из них (iaaM и iaaH) кодируют ферменты, вовлечен¬
ные в синтез ауксина (индолилуксусной кислоты), а один (/7/0 — син¬
тез цитокинина. В результате экспрессии этих генов в
трансформированных клетках меняется гормональный статус, что и
приводит к их дедифференцировке и опухолеобразованию.Наличие Т-ДНК необходимо, но недостаточно для трансформа¬
ции. За собственно вырезание Т-ДНКиз состава Ti-плазмиды и пере¬
нос ее в геном растения отвечает другая область Ti-плазмиды, лежа¬
щая вне Т-ДНК — v/r-область (область вирулентности). v/У-Область
состоит из семи локусов — virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF, состав¬
ляющих район ~ 35 т.н.п. Большинство этих локусов включают не¬
сколько генов и считается, что в у/>-области находится до 40 генов.По своим функциям v/r-гены можно поделить на два класса:1)	гены virA и virG — регуляторные, которые экспрессируются в
агробактериальных клетках постоянно (конститутивно), хотя и в не¬
больших количествах;2)	гены virB, virC, virD, virE, virF кодируют белки, непосредствен¬
но вовлеченные в перенос Т-ДНК в растения, и экспрессируются
только после непосредственной активации их промоторов.Для трансформации растений с помощью агробактерий необхо¬
димо выполнение трех условий:•	активация четырех генов (chvA, chvB, chvE, pscA) на хромосоме
агробактерий, осуществляющих синтез специальных полисахаридов46
на поверхности бактериальной клетки, необходимых для присоеди¬
нения бактерии к растительной клетке;•	активация v/r-области Ti-плазмиды, необходимой для инициа¬
ции переноса Т-ДНК в ядро растительной клетки;•	наличие Т-ДНК.Процесс трансформации растения начинается с экспрессии хро¬
мосомных генов (chvA, chvB, chvE, pscA) агробактерии, вовлеченных в
стадию ранней вирулентности и генов virA и у/гбТьплазмиды. Агро¬
бактерия прикрепляется к растительной клетке в области поранения
последней. При поранении растительная клетка выделяет во внеш¬
нюю среду небольшие молекулы фенольных производных и сахаров,
в том числе специфическое фенольное соединение — ацетосирингон.
Как было сказано выше ген virA экспрессируется в клетке агробакте¬
рии постоянно, и белок virA является мембранным рецептором аце-
тосирингона, образуя с белком ChvE комплекс, пронизывающий
мембрану. Ацетосирингон, выделяемый растениями, узнается бел¬
ком virA, связывается с ним, что приводит к активации белка virA пу¬
тем самофосфорилирования (транслокации фосфорного остатка с
одного участка virA белка на другой). Это в свою очередь активизиру¬
ет другой постоянно экспрессирующийся в агробактериальной клет¬
ке белок — virG. Белок virG — белок регуляторный и является актива¬
тором транскрипции всех остальных vir генов — vir С, D, В, Е, F. Ак¬
тивированный белок virG, связываясь с промоторными областями
этих генов, приводит к их экспрессии.Белковые продукты генов vir С, D, В, Е, /’связываются с Т-ДНК,
приводят к ее вырезанию из состава Ti-плазмиды и встраиванию в
растительный геном. Этот процесс начинается белками virDl,2, кото¬
рые, являясь эндонуклеазами, узнают последовательности правой и
левой границ и virDl делает одноцепочечный специфичный разрез в
одной из цепей между 3 и 4 нуклеотидом правого 25 н.п., а затем и ле¬
вого повтора пограничной области Т-ДНК, что стимулирует репли¬
кацию новой цепи Т-ДНК. Белок virC, связываясь с областью
overdrive вблизи правой границы Т-ДНК, совместно с virD\,2 ини¬
циируют вырезание одноцепочечного фрагмента Т-ДНК. В резуль¬
тате старая цепь Т-ДНК вытесняется. Полученная одноцепочечная
нить Т-ДНК, связанная на 5'- конце с virUl, защищается белком
virEl, который может соединяться с одноцепочечной ДНК. Молеку¬
лы virEl закрывают одноцепочечную Т-ДН К, тем самым защищая ее.
у/г/’белок также способствуют переносу и интеграции Т-ДНК в ядро
растительной клетки. Как минимум три (virB2, virBS и virB6) из 11 бел¬
ков virB образуют специфический трансклеточный мостик — Т-пи-
ли, по которому Т-ДНК переносится из агробактерии в растительную47
клетку. Белки virBl—10 вовлечены в образование контакта между
Т-пилей и мембраной растительной клетки. После проникновения
через образованный мостик в цитоплазму растительной клетки
Т-комплекса: Т-ДНК/белок v/гШ/белки virEl, узнаются специфиче¬
скими сигнальными рецепторами, что способствует проникновению
комплекса в ядро растительной клетки. Энергия, необходимая для
образования и переноса Т-комплекса в растительную клетку постав¬
ляется за счет АТФазного действия белков virB4 и virBX 1 совместно с
virD4.В ядре одноцепочечная нить Т-ДНК, по всей видимости, восста¬
навливает свою двуцепочечную структуру, может встраиваться в ге¬
ном растения по механизму гомологичной рекомбинации. Для
встраивания необходимы микрогомологии длиной 2—5 нуклеотидов
между пограничными районами Т-ДНК и участками генома расте¬
ний. Таким образом, теоретически встраивание Т-ДНК может проис¬
ходить в любые участки генома, хотя рядом авторов показан неслу¬
чайный характер встраивания и в отдельные районы генома растений
интеграция Т-ДНК происходит гораздо чаще, чем в другие. Установ¬
лено, что часто область хромосомы растений, граничащая с местом
встраивания Т-ДНК, богата А/Т-последовательностями. А/Т-бога-
тые последовательности часто встречаются в районах генных промо¬
торов, что может объяснять частое встраивание Т-ДНК в участки,
граничащие с генами.Приведенная схема генетической трансформации растительной
клетки лишь в общем виде описывает механизмы этого сложного и не
до конца исследованного процесса.Векторы для трансформации растений на основе И-плазмид. Уни¬
кальные биологические свойства Ti-плазмиды делают ее идеальным
природным вектором для переноса генов. Ti-Плазмида имеет широ¬
кий круг хозяев, встраивает Т-ДНК в хромосомы растений, где она
может реплицироваться, и ее гены транслируются с образованием
белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямы¬
ми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотид¬
ных пар, и любой фрагмент чужеродной ДНК, вставленный между
этими повторами, будет перенесен в растительную клетку. Однако
манипуляции с Ti-плазмидой затруднены из-за больших размеров,
вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется
возможным. Поэтому Ti-плазмида была модифицирована генно-ин¬
женерными путями, и на ее основе были получены векторы для
трансформации растений.Кроме того, надо отметить, что после трансформации растений
природной Ti-плазмидой трансформированные клетки не будут спо¬48
собны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка
за счет активности шести генов Т-ДНК области, кодирующих при¬
знаки опухолеобразования. Если же последовательности генов, бло¬
кирующих дифференцировку, вырезать из Т-ДНК, трансформиро¬
ванные клетки обретут способность к регенерации. Поэтому при ис¬
пользовании Ti-плазмид для получения векторных конструкций по¬
следовательности генов, ответственных за опухолеобразование и
синтез опинов, вырезают, оставляя только фрагменты Т-ДНК, необ¬
ходимые для ее переноса в растительный геном (прежде всего после¬
довательности левого и правого пограничного повторов). В область
Т-ДНК в дальнейшем и встраиваются чужеродные гены, которые же¬
лательно ввести в геном растения.Основные белки, отвечающие за перенос Т-ДНК, кодируются ге¬
нами v/У-области. В векторах для трансформации v/r-область может
находиться как в составе одной плазмиды с областью Т-ДНК, так и в
разных.Таким образом, вектора для трансформации растений на основе
Ti-плазмид агробактерий должны содержать следующие структурные
элементы:•	последовательности правой и левой границы Т-ДНК, а также по¬
следовательности, необходимые для переноса и встраивания области
Т-ДНК в геном растительной клетки;•	последовательность гена селективного маркера, что позволит
проводить селективный отбор трансгенных растений. В качестве се¬
лективного маркера могут использоваться гены устойчивости к анти¬
биотикам (nptll — устойчивость к канамицину, hptll — устойчивость
к антибиотику гигромицину), ген ^(устойчивость к гербициду фос-
финотрицину (BASTA) и ген ALS (устойчивость к гербициду хлор-
сульфорону), ген бета-глюкуронидазы (фермент расщепляющий суб¬
страт X-Gluc) и ряд других;•	последовательности, облегчающие встраивание целевого гена (по-
лилинкерные последовательности, промоторные и терминаторные
поел едовател ьности);•	сайты инициации для репликации в бактериальных клетках.Коинтегративный вектор. Один из способов, облег¬
чающий введение чужеродной ДНК в геном растения, заключается в
использовании коинтегративных векторов. Смысл подхода состоит в
следующем (рис. 2.3). Весь процесс введения чужеродного гена в ге¬
ном растений делится на два этапа: клонирование гена, который сле¬
дует встроить в растительный геном, и собственно трансформация
растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью раз¬
личных векторов.49
pBR322Рис. 2.3. Использование Ti-плазмиды в качестве вектора для переноса генов
в растительные клетки (по Э.С. Пирузян)В качестве вспомогательного (промежуточного) вектора, в кото¬
ром проводят клонирование нужного нам гена, используют векторы
на основе плазмиды Е. coli, в которые вставляют фрагмент Т-ДНК с
пограничными последовательностями Т-ДНК и ген селективного
маркера (обычно ген, кодирующий устойчивость к антибиотику (ка-
намицину, гигромицину или гербициду), что в будущем позволит
проводить селективный отбор трансгенных растений. Такой вектор
обладает небольшими размерами, и его используют для клонирова¬
ния в нем нужного гена, вставляя его последовательность в область
Т-ДНК.С помощью конъюгации такой промежуточный вектор переносят
в клетки специальных штаммов A. tumefaciens, содержащих другой50
вектор, несущий гены, необходимые для интеграции области Т-ДНК
в геном растения. Этот вектор имеет значительные размеры и пред¬
ставляет собой фрагмент Ti-плазмиды, несущей v/r-область, погра¬
ничные последовательности Т-ДНК и фрагменты плазмиды, анало¬
гичные промежуточному вектору. После конъюгации происходит ре¬
комбинация между гомологичными участками двух векторов, в
результате фрагмент промежуточного вектора, содержащий нужный
ген и селективный маркер, переносятся во второй вектор с v/r-обла-
стью и пограничными последовательностями Т-ДНК. Таким обра¬
зом, в результате рекомбинации между двумя плазмидами получается
коинтегративный вектор. Клетки агробактерий, содержащие такой
коинтегративный вектор, отбираются на селективных средах и ис¬
пользуются в дальнейшем для трансформации растений.Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому бо¬
лее часто применяемый метод введения чужеродной ДН К заключает¬
ся в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для
заражения и трансформации растительных клеток агробактериям не¬
обходима v/r-область, ответственная за перенос ДНК, и прямые по¬
вторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, v/r-область и по¬
граничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в од¬
ной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в аг-
робактериальной клетке, используемой для трасформации растений,
одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область по¬
граничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды
могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако,
поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При
этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагмен¬
ты плазмиды Е. coli (в том числе и точку начала репликации), что по¬
зволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках
Е. coli и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегратив-
ному вектору целевой ген и ген селективного маркера встраиваются в
область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в
клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с v/r-обла-
стью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомоло¬
гичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в
единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые v/r-генами од¬
ной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области
Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время
такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансфор¬
мации растительных клеток.Векторы для трансформации растений на основе Ri-плазмид. Поми¬
мо Ti-плазмид A. tumefaciens способностью трансформировать расти¬51
тельные клетки обладают также и Ri-плазмиды (от англ. Root
inducing — индуцирующая [избыточное] корнеобразование), выде¬
ленные из агробактерии A. rhizogenes. Ri-плазмиды вызывают усилен¬
ное образование корней и, также как Ti-плазмиды, приводят к синте¬
зу опинов. Однако Ri-плазмиды в большинстве случаев не онкоген-
ны, и после трансформации растительные клетки способны регене¬
рировать здоровые плодовитые растения. В настоящее время на
основе Ri-плазмид также получены вектора для генной инженерии
растений.Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений. Подавляю¬
щее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической ин¬
формации содержат РНК. Лишь 1—2 % от числа вирусов, инфици¬
рующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно они наи¬
более удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК
и рассматриваются главными кандидатами на роль векторов для пе¬
реноса генов в растения.Наиболее перспективным в этом отношении является вирус мо¬
заики цветной капусты CaMV {cauliflower mosaic virus), поражающий в
основном растения семейства Капустных. Частицы этого вируса име¬
ют диаметр около 50 нм и содержат кольцевую ДНК длиной 8000 н. п.
Небольшой размер генома CaMV дает возможность манипулировать
in vitro с вирусной ДНК, как с бактериальной плазмидой и затем вво¬
дить ее в растения путем втирания в листья. Инфицирование неболь¬
шого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как ви¬
рус быстро распространяется, передаваясь от клетки к клетке. Ис¬
пользованием 1—5 мкг ДНК для инфицирования одного растения
достигается почти 100%-я эффективность инфекции, что значитель¬
но выше, чем при агробактериальном заражении.Прямая интеграция ДНК CaMV в геном хозяина после инфекции
не показана. Разработан методический прием — агроинфекция, по¬
зволяющий осуществить прямое встраивание вирусной ДНК после
инокуляции. Для этого геном CaMV встраивается в Т-ДНК и в ее со¬
ставе интегрирует в ядерный геном различных растений, при этом из
состава CaMV вырезаются последовательности, обеспечивающие его
вирулентность.К преимуществам векторных систем на основе вирусов можно от¬
нести следующие: малый размер генома, что дает возможность легко
манипулировать вирусной Д НК; высокая копийность вирусной ДНК
в клетках зараженных растений (до 50 000 на клетку); наличие силь¬
ных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрес¬
сию чужеродных генов.52
Среди недостатков следует отметить небольшую емкость вектора
(800—1000 н.п.) и ограниченный круг хозяев — крестоцветные.В заключение следует отметить, что хотя векторы на основе виру¬
сов редко применяются для трансформации растений, вирусные про¬
моторы, и прежде всего промотор 35S-PHK CaMV, широко использу¬
ются для экспрессии чужеродных генов в других векторных системах.
Промотор 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты является силь¬
ным промотором, кроме того, он активен не только в клетках кресто¬
цветных, но и в клетках других семейств, не проявляет тканеспеци-
фичности и экспрессируется во всех клетках трансформированного
растения.Векторы на основе мобильных элементов (транспозонов). В 90-х го¬
дах стали использовать для трансформации растительных клеток век¬
торы на основе мобильных элементов — последовательностей ДНК,
имеющих специфическое строение и способных к транспозициям по гено¬
му. Какие преимущества дает применение таких векторов по сравне¬
нию с другими векторными конструкциями? Метод основывается на
том, что мобильные элементы могут после первичной интеграции в
хромосому растений перемещаться по геному путем встраивания и
последующего вырезания. Наиболее широко для растений использу¬
ется система Ac/Ds векторов.Ac (Activator) — это мобильный элемент растений, впервые иден¬
тифицированный генетическими методами в середине 1940-х годов
Барбарой МакКпинток по его способности вызывать хромосомные
разрывы в специфических участках генома кукурузы и вызывать яв¬
ление ксинильности. /4с-Элемент относится к группе мобильных эле¬
ментов, способных к активным транспозициям по геному. К этому же
семейству транспозонов относится и гетерогенная группа ^-элемен¬
тов, родственных по своей первичной структуре Ас-элементу, однако,
из-за делеций внутренних районов не способная к самостоятельным
перемещениям в геноме, при этом возможные транспозиции проис¬
ходят только в присутствии специфичного белка — транспозазы
Лс-элемента.Как было показано, Ас-элемент может быть активен помимо ку¬
курузы и в геномах других растений, таких, как арабидопсис, мор¬
ковь, картофель, томаты, рис и др. Недавние эксперименты по иссле¬
дованию закономерностей транспозиции Ас-элемента в геноме ара-
бидопсиса показали возможность использования конструкций на ос¬
нове Лс-мобильного элемента для получения систем маркированных
транспозиций, а также для создания так называемых линий ловушек ге¬
нов (enhances trap lines), позволяющих идентифицировать новые
гены, в том числе и группу генов, имеющих тканеспецифичную экс¬53
прессию, т. е. тех, которые транскрибируются и транслируются не во
всех, а только в определенных тканях. Таким образом можно иденти¬
фицировать (и в будущем найти практическое применение) тка¬
неспецифичные гены и белки, характерные только для конкретных
тканей, например корней, зародышевого мешка и т. д. Использова¬
ние в таких векторах репортерных генов (см. с. 61) позволит маркиро¬
вать новые сайты интеграции транспозонных конструкций и иденти¬
фицировать те места инсерций, которые произошли около или непо¬
средственно в последовательность функционального гена, для его
последующего клонирования и секвенирования, что и позволило на¬
зывать такие типы плазмид — вектора — ловушки генов.2.6.	МЕТОДЫ ТРАНСФОРМАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОКМетод кокультивации с агробактерией является одним из самых
распространенных методов получения трансгенных двудольных рас¬
тений (рис. 2.4, а). Он основан на трансформации растительных экс-
плантов агробактериями, несущими векторную конструкцию, содер¬
жащую чужеродный ген, встроенный в область Т-ДНК. Его популяр¬
ность связана с относительной простотой проведения трансформа¬
ции и довольно высоким выходом полученных трансгенных растений
(10—60% в зависимости от вида растения).В качестве исходного материала необходимо иметь штамм агро¬
бактерии с векторной конструкцией (бинарной, коинтегративной
или другой, приемлемой для этого типа трансформации). Вектор дол¬
жен содержать последовательность гена, который необходимо ввести
в геном растения. Происхождение гена (прокариотический или эука¬
риотический) не столь важно для трансформации, однако он должен
находиться под контролем промотора, способного экспрессировать¬
ся в растительной клетке. Кроме функционального гена вектор дол¬
жен содержать селективный маркер трансформации. В качестве тако¬
го маркера обычно используются гены устойчивости к антибиотикам
канамицину (ген npt), гигромицину (ген hpt) и/или гербицидам хлор-
сульфорону (ген ALS), фосфинотрицину (BASTA) (ген bar). Кроме
того, должны быть подобраны сорта растения-реципиента. В качест¬
ве эксплантов для трансформации обычно берут стерильные листо¬
вые диски. Однако можно брать и молодые корешки (арабидопсис),
гипокотили (томаты), семядоли (томаты, баклажаны), междоузлия
(картофель).Экспланты инокулируют жидкой средой, содержащей агробакте¬
рию с векторной конструкцией. Время инокуляции подбирается для
каждого вида растений индивидуально. При этом происходит зараже-54
ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙПлазмидаКлеткаагробактерииТ-ДНКХромосома
Заражение
растительной ткани
культурой
агробактерииБактериальнаясуспензия^Экспланты или
суспензия клетокМикрочастицы
напыленной
ДНКУскорение
микрочастиц
с напыленной
ДНКПушкаГелиевый потокМикрочастицы
с напыленной
ДНКЭкспланты или
суспензия клетокПеренос ДНК
в растительную
клеткуИнтеграция ДНК в
растительный геномРегенерация растений из
трансформированных клетокСелективная средаТестирование растений-трансформантовс помощью ПЦР методас помощью гибридизации
по СаузернуТрансгенные растенияРис. 2.4. Схема получения трансгенных растений:
а — кокультивацисй с агробактерией; б— методом биобаллистики
ние клеток раневой поверхности экспланта, и после 24—48 ч кокуль-
тивирования в некоторых клетках происходит встраивание в расти¬
тельный геном фрагмента Т-ДНК с чужеродным (выбранным) геном.
Далее экспланты переносят на среду с антибиотиком (карбеницил-
лин или цефотаксим), что приводит к избирательной гибели клеток
агробактерий. Кроме того, в среду добавляют соответствующие фито¬
гормоны (для прямой регенерации или каллусообразования) и анти¬
биотик/гербицид для проведения селективного отбора трансформи¬
рованных клеток. Такие трансгенные растения, экспрессирующие
ген устойчивости к антибиотику или к гербициду, будут расти на сре¬
де с добавлением селективного агента, в то время как нетрансгенные
растения погибнут. Через 2—5 недель на трансформированном экс-
планте развиваются побеги, которые в дальнейшем отсаживают или
переносят в почву для проведения дополнительного молекулярного
анализа.Сходным образом трансформируют протопласты, однако такого
рода трансформация значительно менее эффективна из-за низкой
способности к регенерации самих протопластов.Методом кокультивации с агробактериями к настоящему време¬
ни получены трансгенные растения практически всех сельскохозяй¬
ственных двудольных растений. Этот метод применим также и для
некоторых однодольных (пшеница, кукуруза, рис).Методы прямого переноса генов в растение. Для прямого переноса
генов в растительные клетки очень часто используется трансформа¬
ция растительных протопластов. При обработке клеточной стенки
растения ферментами (целлюлазой, пектиназой) клеточная оболочка
разрушается и остается один протопласт. Разработаны методы пря¬
мой трансформации протопластов с помощью ДНК. Наибольшей
эффективности трансформации (1(Г2) удалось достигнуть методом
электропорации и добавления полиэтиленгликоля. Хотя частота
трансформации значительно ниже, чем, например, при агробактери-
альной трансформации, метод прямого переноса обладает рядом пре¬
имуществ. Вектор может не содержать специальных биологических
сигналов и функций трансформации (пограничных областей Т-ДНК
и v/r-области). Для трансформации может быть использован практи¬
чески любой ДНК-вектор, несущий чужеродный ген. При этом гиб¬
ридный ген интегрирует в ядерную ДНК растения и экспрессируется
(при наличии соответствующих регуляторных областей), особенно в
случае прямой инъекции в ядро протопласта, используя механизмы
клеточной рекомбинации. Однако основным недостатком такого ме¬
тода является крайне низкая частота трансформации.56
В настоящее время более 140 видов растений были протрансфор-
мированы путем прямого переноса ДНК вектора в протопластные
клетки различными методами.Микроинъекции ДНК. В ряде экспериментов было показано, что
метод микроинъекций может успешно применяться для трансформа¬
ции растительных клеток аналогично микроинъекциям в животные
клетки. Это стало возможным после преодоления ряда технических
трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов
для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином. Пере¬
нос ДНК в цитоплазму или ядро растительной клетки осуществляют
микроинъекциями раствора, содержащего ДНК целевого гена. Мик¬
роинъекции очень трудоемкий процесс, требующий специального
оборудования. Для этого используют специальные микроманипуля¬
торы и микроиглы.Трансформация растительных протопластов происходит с эф¬
фективностью не более 10—15 %, независимо от типа вектора, и под¬
ходит как для двудольных, так и для однодольных растений.Электропорация. Этот метод основан на том, что импульсы высо¬
кого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомем¬
бран. Для растительных протопластов процедура электропорации
оказалась очень эффективной. Метод состоит в следующем: на расти¬
тельные протопласты, находящиеся в растворе большой концентра¬
ции, содержащем ДНК-векторы, действуют высоковольтным им¬
пульсом (напряжение 200—350 В, длительность импульса 54 мс).
В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в
клеточной мембране. После разведения раствора протопласты высе¬
ваются на соответствующую среду для регенерации. Эффективность
переноса определяется через 24—48 ч после электрошока.Упаковка влипосомы. Это один из методов, используемых для за¬
щиты экзогенного генетического материала, который вводится в
протопласты растений, от действия нуклеаз, которые разрушают нук¬
леиновые кислоты.Липосомы — это сферические образования, оболочки которых
состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого
встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфо¬
липидов. С помощьюлипосом в протопласты растений были введены
РНК вируса табачной мозаики, ДНК Ti-плазмиды A. tumefaciens, а
также целые метафазные хромосомы. К преимуществам систем пере¬
носа с помощью липосом можно отнести их низкую токсичность по
отношению к клеткам и возможность использования на множестве
растений, клетки которых способны утилизировать липосомы. В на¬
стоящее время этот способ трансформации применяется все реже57
из-за его технической сложности и низкой трансформирующей ак¬
тивности (0,5—1 %).Основные проблемы при описанных выше методах прямой транс¬
формации обычно связаны с низкой регенерационной способностью
протопластов и, следовательно, крайне низким выходом расте¬
ний -трансформантов.Вакуумная инфильтрация. Метод трансформации растений с по¬
мощью вакуумной инфильтрации был разработан относительно не¬
давно и используется как для трансформации побегов, так и семян.
Метод основан на том, что верхушечные части молодого растения
или предварительно обработанные семена (с частично разрушенным
перикарпом) помещаются в раствор агоробактериальных клеток, не¬
сущих вектор с целевым геном. Емкость с раствором и эксплантами
помещается в камеру, где создается отрицательное давление.
В результате этого агробактерия проникает в межклетники расти¬
тельного экспланта, что в дальнейшем приводит к трансформации.
Метод вакуумной инфильтрации довольно дешев и достаточно эф¬
фективен. Так как, в отличие от методов трансформации с помощью
липосом, микроинъекций или электропорации, при вакуумной
трансформации в качестве эксплантов используются не протопла¬
сты, он не требует дополнительных реактивов.Метод биобаллистической трансформации. Метод биобаллистики,
являясь одним из самых эффективных на сегодняшний день методов
трансформации однодольных, может также с успехом применяться
на двудольных (см. рис. 2.4, б). В качестве исходного материала для
трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань
или культивируемые незрелые зародыши однодольных.Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички
вольфрама, платины или золота диаметром 0,6—1,2 мкм напыляется
ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования
генную конструкцию. Вольфрамовые платиновые или золотые час¬
тички, несущие ДНК, на целлофановой подложке помещаются
внутрь биобаллистической пушки. Каллус или суспензия клеток вно¬
сится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под
биобалл истическую пушку на расстоянии 10—15см. В пушке вакуум¬
ным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасыва¬
ния давления вольфрамовые или золотые частички с огромной ско¬
ростью выбрасываются из пушки и, разрывая клеточные стенки, вхо¬
дят в цитоплазму и ядро клеток. Обычно клетки, располагающиеся
непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и
давления вольфрамовых или золотых частиц, в то время как в зоне
0,6—1 см от центра будут находиться трансформированные клетки.58
Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культи¬
вирования и регенерации.С помощью биобаллистической пушки были трансформированы
однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, и
получены стабильные трансгенные растения.Кроме успехов в получении трансгенных однодольных, биобал-
листическая трансформация применяется для прямого переноса
ДНК в эмбриогенную пыльцу и получения трансгенных дигаплоид-
ных растений, которые являются важным этапом в селекционной ра¬
боте. Этим методом была проведена трансформация растений табака
и после регенерации гаплоидных растений получены стабильные
трансформанты.Доказательства трансформации растений. В состав векторов для
трансформации растений помимо функционального гена входит ген
селективного маркера. Это обычно ген, кодирующий устойчивость к
антибиотикам канамицину (ген nptll) или гигромицину (ген hptll), и
поэтому первичную селекцию трансгенных растений проводят на
среде с соответствующим антибиотиком. На такой среде регенериру¬
ют растения, в геноме которых присутствует ген селективного марке¬
ра. Однако выживание на селективной среде не может быть абсолют¬
ным доказательством трансгенной природы растения. Для полного
доказательства присутствия в их геноме последовательности Т-ДНК
проводят анализ при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)
и молекулярного анализа, основанного на блот-гибридизации хромо¬
сомной ДНК трансгенного растения с использованием в качестве ра¬
диоактивного зонда фрагмента Т-ДНК. Проведение такого анализа
является более трудоемким и дорогим, но полученные результаты по¬
зволят убедиться в том, что произошла трансформация, а также в том,
сколько Т-ДНК-конструкций встроено в геном растения. Кроме
того, проводят дополнительный анализ экспрессии функционально¬
го гена методом выявления соответствующей мРНК или белка.2.7.	ЭКСПРЕССИЯ (ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ) ЧУЖЕРОДНЫХ
ГЕНОВ В ГЕНОМЕ РАСТЕНИЙПри экспрессии чужеродных генов в геноме растений возникает
ряд проблем.Первые гены, которые использовались для трансформации расте¬
ний, были выделены из бактерий, и их нельзя было напрямую ис¬
пользовать для трансформации растительных клеток. Для того чтобы
бактериальные гены транскрибировались в эукариотической клетке,
необходимо заменить их исходные бактериальные промоторные по¬59
следовательности либо на промоторы растительных генов, либо на
другие, которые могут инициировать транскрипцию в растительной
клетке. Кроме того, необходимо присоединить к З'-последовательно-
сти бактериального гена фрагмент, содержащий сигнал полиадени-
лирования. Такие модификации необходимы для того, чтобы эука¬
риотическая РНК-полимераза могла транскрибировать бактериаль¬
ную последовательность и затем мРНК транслировала бактериаль¬
ный белок в растительной клетке.В качестве промотора для экспрессии бактериальных генов наи¬
более часто используют промотор 35S-PHK вируса мозаики цветной
капусты (CaMV). Такой выбор решает сразу две проблемы: во-пер¬
вых, промоторы двудольных могут в ряде случаев не работать в геноме
однодольных, и наоборот, а промотор 35S CaMV обеспечивает транс¬
крипцию в любых геномах растений. Во-вторых, большинство эука¬
риотических промоторов являются довольно слабыми, a 35S-np0M0-
тор CaMV обеспечивает очень высокий уровень экспрессии гена, на¬
ходящегося под его контролем. В ряде случаев при трансформации
растительной клетки растительным геном все равно заменяют его
собственный промотор на промотор 35S CaMV как более сильный,
чтобы повысить выход белкового продукта.Промотор 35S CaMV является конститутивным, что обеспечивает
постоянную, сильную экспрессию гена, который находится под его
регуляцией, во всех тканях трансгенного растения. Именно поэтому
промотор 35S CaMV является самым используемым в векторных кон¬
струкциях для трансформации растений. В последнее время иногда
используют искусственно полученный МАС-промотор, который
представляет собой удвоенную последовательность 35S CaMV.В последнее время все большее значение приобретают тканеспе¬
цифичные промоторы растительных генов. Их преимущество перед
промотором 35S CaMV состоит в том, что гены под их контролем экс¬
прессируются только в определенных тканях. Так, любой ген, кон¬
тролируемый пататиновым промотором, будет экспрессироваться
только в клубнях, так как белок пататин — это запасной белок клуб¬
ней картофеля, и его гены экспрессируются только в клубнях. Тка¬
неспецифичные промоторы используют в случае, когда чужеродный
белок необходим в определенных органах растения. Например, в слу¬
чае защиты от каких-либо почвенных патогенов удобно использовать
корнеспецифичные промоторы, что приводило бы к синтезу защит¬
ного белка только в подземных частях растений в местах контакта с
патогенами. Использование таких промоторов для растения является
более приемлемым.60
Также используют так называемые индуцибельные промоторы.
В отличие от конститутивного промотора 35S CaMV гены под такими
промоторами экспрессируются не постоянно, а только в определен¬
ных условиях. Например, промоторы, которые индуцируются пора¬
нением, металл-индуцибельные — в присутствии ионов металлов
(меди, железа и т. п.). Таким образом, «включение — выключение»
гена под контролем таких промоторов легко регулируется. Индуци¬
бельные промоторы все чаще используются в генетической инжене¬
рии, и не только растений. Недостатком многих тканеспецифичных и
индуцибельных промоторов является их слабая активность.Помимо промотора на экспрессию трансгена влияет также место
интеграции в растительный геном. И хотя считается, что последова¬
тельность Т-ДНК может встраиваться в геном в любом месте, однако
в ряде работ показано, что это происходит не случайным образом.
Очень часто Т-ДНК встраивается в гетерохроматиновые участки, где
экспрессии гена не происходит, и трансген под любым даже сильным
промотором транскрибироваться не будет. Ситуацию можно преодо¬
леть только повторными трансформациями.Для выявления экспрессии чужеродных генов на ранних стадиях
получения трансгенных растений используют маркеры экспрес¬
сии — репортерные гены. Продукты генов-репортеров обычно легко
детектируются с помощью простых методов. Наиболее широко ис¬
пользуемый репортерный ген GUS кодирует фермент (З-глюкурони-
дазу и при добавлении субстрата расщепляет его с получением соеди¬
нения, окрашенного в ярко-голубой цвет. Другой репортерный ген
gfp при экспрессии образует флуоресцирующий белок, который так¬
же легко детектируется. Обычно экспрессия репортерного гена кор¬
релирует с уровнем экспрессии функционального гена в трансгенном
растении.2.8.	ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ РАСТЕНИЙ
И УЛУЧШЕНИЕ ИХ КАЧЕСТВА МЕТОДАМИ
ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИОдной из основных задач улучшения растений является повыше¬
ние качества синтезируемых продуктов: белков, жиров, полисахари¬
дов и других веществ, определяющих их питательную и техническую
ценность.У злаков наибольший интерес представляют запасные белки эн¬
досперма. Запасные белки в основном кодируются несколькими,
сходными по своей структуре и по нуклеотидному составу, генами,
объединяемыми в мультигенные семейства. Обычно экспрессия этих61
генов строго тканеспецифична и происходит на определенной стадии
развития семени. В большинстве случаев запасные белки растений
имеют несбалансированный для питания человека и животных ами¬
нокислотный состав. Так, запасные белки бобовых — легумины—
характеризуются низким уровнем аминокислоты метионина, а запас¬
ные белки злаков — проламины — бедны лизином, триптофаном и
треонином. Дефицит этих аминокислот снижает питательную и кор¬
мовую ценность семян.Улучшение аминокислотного состава белка методами традицион¬
ной селекции довольно затруднительно в связи с тем, что гены, опре¬
деляющие эти важные сельскохозяйственные признаки, часто быва¬
ют сцеплены и наследуются вместе с генами, вызывающими нежела¬
тельные признаки. Так, использование в селекции кукурузы и ячменя
мутантов типа опак-2, хайпроли, имеющих относительно высокое со¬
держание лизина в зерне, не привело к значительному улучшению ка¬
чества, так как у мутантных форм повышенное содержание лизина
коррелировало с уменьшением синтеза основных запасных белков
зеина и гордеина и, в конечном итоге, с уменьшением продуктивно¬
сти растений и урожайности посевов.В связи с этим наиболее перспективным является использование
генно-инженерных методов при создании новых сортов, что позволя¬
ет ввести в геном только полезный признак, без сцепления с отрица¬
тельными свойствами. Так, например, введение дополнительных ко¬
донов лизина в гены проламинов может привести к синтезу белков,
обогащенных лизином, и улучшению кормовой и питательной цен¬
ности белка.Технология генно-инженерного улучшения качества растений и
получаемой из них продукции включает ряд этапов:1)	клонирование генов запасных белков;2)	изучение механизмов тканеспецифичной и временной экс¬
прессии белков и определение последовательностей ДНК, опреде¬
ляющих и регулирующих такую специфическую экспрессию;3)	целенаправленное изменение последовательности генов запас¬
ных белков с целью улучшения аминокислотного состава;4)	создание векторов, содержащих измененный ген;5)	введение модифицированных генов в растения;6)	тестирование экспрессии генов и качества продукции.Получение трансгенных растений с улучшенными качествамизерна невозможно без подготовительного этапа, включающего де¬
тальное изучение как последовательности самого гена, так и его эле¬
ментов, участвующих в регуляции синтеза белка.62
Учеными уже охарактеризованы десятки генов запасных белков
злаков, бобовых и ряда других растений, изучены структура и регуля¬
ция экспрессии генов. Исследователи уже клонировали 10 генов гор-
деинов ячменя, гены а- и Р-глиадинов и глютенина пшеницы, зеинов
кукурузы, легуминов бобовых, пататина картофеля и др. Для некото¬
рых генов определена их нуклеотидная последовательность.Общий план изолирования генов запасных белков включает сле¬
дующие этапы: 1) получение и частичная очистка соответствующей
мРНК; 2) синтез и клонирование кДНК; 3) выделение из геномных
библиотек последовательности гена запасного белка.Синтез запасных белков имеетжесткую регуляцию: гены экспрес¬
сируются только в единственной ткани (проламины злаков только в
эндосперме зерна) и в течение короткого периода развития зерна. Ис¬
следование генов запасных белков показало общность их строения,
что представляется логичным, так как они выполняют одинаковую
функцию. Так, общим для подавляющего большинства генов запас¬
ных белков является отсутствие интронов. Кроме этого, у них на рас¬
стоянии 300 н. п. отточки начала транскрипции расположена специ¬
фическая последовательность в 25 н. п., названная эндосперм-бок-
сом. Была определена функция эндосперм-бокса и показано, что
именно от присутствия этой 25-нуклеотидной последовательности
зависит тканеспецифичная экспрессия генов запасных белков в эн¬
досперме зерна. Более того, продукт любого гена, перед которым на¬
ходится последовательность эндосперм-бокса, синтезируется только
в семенах или зернах, и представлялось логичным включение ее в со¬
став векторов, содержащих модифицированную последовательность
генов проламиновых белков с целью их последующего депонирова¬
ния в семенах или зернах.Следующий этап в получении трансгенных растений с улучшен¬
ным аминокислотным составом белка можно представить на приме¬
ре модифицированного а-зеина. Белок а-зеина кукурузы характери¬
зуется низким содержанием лизина, что значительно снижает его пи¬
тательную ценность. В последовательность гена а-зеина при помощи
олигонуклеотид-направленного мутагенеза вводили дополнитель¬
ные кодоны лизина. Полученный модифицированный ген а-зеина
экспрессировал белок, содержащий лизин. Впервые такая работа
была проведена по введению новых кодонов в последовательность
а-зеина. Теперь такое введение новых триплетов для изменения
(улучшения) аминокислотного состава белков является обычным.Модифицированный ген а-зеина был клонирован в область
Т-ДНК вектора для трансформации. В состав конструкции также63
LB Dr Э-Б I I / Pr		RBI PQQOOa Y/A I I PPd I	—Л J-. лТ-ДНК (3-фазолин а-зеин KmR	Т-ДНК тrv.iPMH	R\2
\4Анализ трансформантов методом:
блот-гибридизации на присутствие
в геноме вектора;синтеза модифицированного белкаРис. 2.5. Схема получения трансгенного растения табака с интегрированным ге¬
ном а-зеина, обогащенного лизиновыми кодонами:/ — трансформация агробактерии; 2 — трансформация растительных клеток; 3 — селекция на сре¬
де с антибиотиком канамицином; 4 — регенерациявходила последовательность эндосперм-бокса, что приводило к тка¬
неспецифичной экспрессии а-зеина в семенах. Были получены рас¬
тения кукурузы, трансформированные геном модифицированного
а-зеина, обогащенного лизином (рис. 2.5). Модифицированный бе¬
лок активно синтезировался в семенах трансгенных растений кукуру¬
зы. В результате получены линии кукурузы с улучшенным качеством
зерна. В дальнейшем такие трансгенные линии могут использоваться
для выведения новых гибридов и сортов методами классической се¬
лекции.Аналогично были получены трансгенные растения пшеницы.
Введение в геном растения модифицированного гена высокомолеку¬
лярной субъединицы белка глютенина с измененной последователь¬
ностью приводит к активному синтезу модифицированного белка и
влияет на состав и уровень соответствующих запасных белков, что
приводит к улучшению хлебопекарного качества пшеничной муки.64
Одним из новых подходов к улучшению состава белков является
конструирование химерных генов на основе известной последова¬
тельности генов запасных белков одно- и двудольных. В качестве ис¬
ходных были использованы гены гордеина В1 ячменя и легумина В4
бобов. Конструкцией, содержащей такой химерный ген, были транс¬
формированы растения табака и получены трансгенные линии расте¬
ний.Таким образом, реальной становится возможность манипулиро¬
вания белковым составом эндосперма зерновых методами генетиче¬
ской инженерии.Помимо получения растений с измененными запасными белками
было показано, что трансгенные растения могут быть использованы в
качестве производителей «съедобных» вакцин. Так, получены расте¬
ния табака и картофеля, синтезирующие иммуноглобулин A —G,
энтеротоксин, В-токсин холеры, белок поверхностного антигена ге¬
патита В. Белок, полученный из трансгенных растений, обладал та¬
кими же антигенными и физиологическими свойствами, как и белок,
полученный из животных клеток. В настоящее время проводятся ис¬
пытания по вакцинированию человека против гепатита В при по¬
мощи трансгенных растений. Из этого следует, что использование
трансгенных растений может привести в будущем к получению деше¬
вых и биологически высокоактивных вакцин.Помимо получения трансгенных растений с модифицированны¬
ми запасными белками зерновых и бобовых проводятся работы по
улучшению состава жирных кислот ряда масличных культур, и в пер¬
вую очередь рапса. Семена рапса характеризуются высоким содержа¬
нием масла, однако из-за большого количества в нем специфической
длинноцепочечной эруковой кислоты, а также глюкозинолатов вку¬
совые и питательные качества рапсового масла резко снижаются.
С помощью генетической инженерии и последующей селекции были
получены сорта рапса, содержащие гены, контролирующие длину
молекулы жирных кислот, что привело к снижению доли эруковой
кислоты и улучшению качества рапсового масла. Аналогичные рабо¬
ты ведутся по получению модифицированных жирных кислот с по¬
вышенным содержанием ненасыщенных связей, что позволит полу¬
чать растения, синтезирующие новые ценные жирные кислоты. Кро¬
ме того, в последнее время было показано, что изменение состава
жирных кислот может приводить к повышению устойчивости расте¬
ний к ряду насекомых, атакже к действию пониженных температур.К 2001 г. уже прошли полевые испытания сорта трансгенных рас¬
тений сои, рапса и кукурузы с модифицированным составом жирных
кислот.5-426665
Одним из приоритетных направлений в селекции является повы¬
шение урожайности новых сортов. Генно-инженерные разработки
активно ведутся в следующих направлениях: увеличение фотосинте-
тической активности и увеличение синтеза отдельных веществ.Работы по увеличению фотосинтетической активности проводят¬
ся в направлении введения генов С4 фотосинтеза в Сз-растения. Ген
фосфоенолпируваткарбоксилазы (PEPQ фотосинтетической систе¬
мы кукурузы С4, кодирующий основной фермент, участвующий в
фиксации атмосферного СОг в клетках мезофилла листа, был клони¬
рован и перенесен методом агробактериальной трансформации в
Сз-растения риса. Анализ полученных трансгенных растений пока¬
зал, что активность фермента в клетках риса в 2—3 раза выше, чем у
кукурузы, что привело к увеличению фотосинтетической активности
и урожайности.Кроме клонирования и использования генов, непосредственно
участвующих в процессах фотосинтеза, были идентифицированы
гены, контролирующие количество хлоропластов в клетке. Исполь¬
зование таких генов также приводит к изменению уровня фотосинте¬
за. Другой подход основан на увеличении содержания хлорофилла в
каждом хлоропласте. Были получены модифицированные белки,
специфически связывающие хлорофилл а/Ь, и было показано, что
повышенная экспрессия таких белков в трансгенных растениях при¬
водит к значительному увеличению биомассы.Другое направление проводимых работ касается возможностей
изменения метаболизма у трансгенных растений. Введение гена саха-
розофосфатсинтетазы кукурузы (SPS-гена), являющегося ключевым
ферментом в регуляции углеводного метаболизма, в геном других
растений приводило к изменению углеводного обмена и повышению
продуктивности растений. В настоящее время получены такие транс¬
генные растения томата, картофеля, рапса, хлопчатника.В 1999—2000 гг. в США, Канаде и ряде других стран, где разреше¬
но использование трансгенных растений, уже прошли полевые испы¬
тания и используются в сельскохозяйственном производстве семь
трансгенных сортов кукурузы и один сорт пшеницы, трансформиро¬
ванные различными генами, повышающими урожайность и качество
полученной продукции.Помимо трансформации генами, приводящими к улучшению ка¬
чества и повышенной продуктивности растений, в 1998—2001 гг.
были получены первые четыре коммерческих сорта трансгенных цве¬
тов: сорт гвоздики с геном АСС-синтетазы, вызывающим ускоренное
цветение, и три сорта (две — гвоздики и один — хризантемы) — с из¬
мененными генами биосинтеза антоциана, что привело к нетрадици¬66
онной окраске лепестков венчика. Также получены сорта петуньи и
львиного зева, трансформированные конструкциями, содержащими
мобильные элементы.2.9.	ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К СТРЕССОВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМЭкстремальное влияние окружающей среды, такое как засуха, из¬
быточное увлажнение, воздействие высоких или низких температур,
засоление и кислотность почв приводит к значительным потерям
сельскохозяйственной продукции. Поэтому использование сортов
растений, толерантных к стрессовым воздействиям, имеет большое
экономическое значение.Многие из адаптивных реакций растений на стресс обусловлива¬
ются синхронным взаимодействием множества генов. Поэтому более
доступными для генно-инженерных исследований оказываются био¬
химические процессы, непосредственно индуцировавшиеся фактором
стресса. Так, известно, что в растениях, подвергающихся длительному
водному стрессу, накапливается ряд органических низкомолекуляр¬
ных соединений, таких, как пролин, глицинбетаин, и ряд других, ко¬
торые служат осморегуляторами или осмопротекторами.Было показано сходство стрессового ответа у бактерий и высших
растений: в обоих случаях в клетках происходит синтез молекул осмо¬
протекторов, механизмом действия которых является установление
осмотического баланса между цитоплазмой и окружающей средой и,
кроме того, частичная стабилизация белков при стрессовых условиях.
Сходные биохимические пути синтеза молекул осмопротекторов по¬
зволили использовать гены бактериального происхождения для по¬
лучения трансгенных растений, устойчивых к стрессам.Из генома Е. coli были выделены два гена proBosm и pro А, кодирую¬
щие ферменты пути биосинтеза пролина, аккумулирование которого
в клетке происходит в ответ на осмотический стресс. Экспрессия этих
бактериальных генов в геноме растений приводила к повышенному
синтезу пролина. Полученные трансгенные растения табака осущест¬
вляли повышенный синтез и накопление пролина по сравнению с
контрольными растениями. Трансгенные побеги укоренялись и мог¬
ли расти при концентрации соли в среде 20 г/л (350 мМ).Был выделен ген бетаинальдегиддегидрогеназы (BADH), который
катализирует синтез глицинбетаина. Трансгенные растения табака,
экспрессирующие этот ген, обладали повышенной солеустойчиво-
стью.67
Было показано, что устойчивость к высоким температурам связа¬
на с геном Fad7, белок которого влияет на метаболизм жирных ки¬
слот. Инактивация такого гена в трансгенных растениях риса привела
к тому, что растения могли расти при повышенных температурах и
выдерживать до двух часов при + 47 °С.Полевые испытания сорта трансгенных газонных трав на засухо¬
устойчивость и устойчивость к засолению проходят с тем, чтобы в
дальнейшем их можно было использовать в больших городах с харак¬
терным абиотическим фоном.2.10.	ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К НАСЕКОМЫМИспользуя генно-инженерные методы, возможно конструирова¬
ние растений с повышенной резистентностью к атаке насекомыми.
Так, было показано, что бактерии Bacillus thuringiensis экспрессируют
инсектицидный белок-прототоксин, который, попадая в кишечник
насекомых, расщепляется поддействием протеаз до активного токси¬
на, приводящего к гибели вредителей.Препараты на основе этого токсина использовались для обработ¬
ки растений в поле. Полученные препараты были нестойкими и до¬
вольно быстро разлагались, что не позволяло развить у вредителей ус¬
тойчивость к инсектициду, в то время как продукция таких белков в
растительных клетках могла обеспечивать устойчивую резистент¬
ность растений к насекомым.Из генома В. thuringiensis был выделен ген токсина Ы2 и поставлен
под контроль промотора 35S CaMV. /tf-Ген был интегрирован в геном
растений табака методом агробактериальной трансформации. Экс¬
прессия бактериального ^/2-гена в растительных клетках была под¬
тверждена как на уровне транскрипции, по присутствию соответст¬
вующей мРНК, так и на уровне трансляции, по синтезу белка-токси-
на. Полученные трансгенные растения табака были устойчивы к вре¬
дителям. Эффективность защиты сельскохозяйственных культур от
вредителей была показана и на трансгенных растениях томата, транс¬
формированных генами эндотоксина, при этом бактериальный бе¬
лок, синтезированный в тканях растений, обеспечивал защитный эф¬
фект, сравнимый с использованием инсектицидных препаратов.Помимо табака и томата бактериальный Ы2-ген был введен в ге¬
ном многих сельскохозяйственных растений, в том числе в карто¬
фель, кукурузу, хлопчатник, рис, сою, брокколи и др. Для ряда куль¬
тур получены сорта трансгенных растений, экспрессирующих в своем
геноме Ы2-ген. Так, в 1994—1995 гг. были получены и прошли поле¬68
вые испытания сорта томата, картофеля и хлопчатника (фирма
«Monsanto»), кукурузы как кормовой, так и пищевой сахарной (фир¬
ма «Novartis»), а в 1998 г. был получен сорт картофеля с тройной ус¬
тойчивостью, который помимо 6/2-гена, содержал ген устойчивости к
вирусу скручивания листьев и ген устойчивости к гербициду глифо-
сату. В 2000 г. в странах с разрешенным использованием генетически
модифицированных продуктов сортами трансгенных растений, ус¬
тойчивых к насекомым, были засеяны около 380 тыс. га, из них:
230 тыс. га — трансгенным хлопчатником, 144 тыс. га — трансгенной
кукурузой, 5 тыс. га — трансгенным картофелем.Использование трансгенных растений привело к резкому сокра¬
щению применения инсектицидов и повышению урожайности.2.11.	ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБНОЙ, БАКТЕРИАЛЬНОЙ
И ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИПри действии фитопатогенов в растениях включается каскад ме¬
ханизмов защитных реакций. При этом активные ответные реакции в
растениях могут проходить по двум основным направлениям: во-пер¬
вых, в ответ на инфекцию начинается синтез соединений, являющих¬
ся токсичными и ограничивающих жизнедеятельность патогенов,
что в конечном итоге приводит к их гибели. Во-вторых, в качестве за¬
щитного ответа могут создаваться структурные барьеры, которые
предотвращают повреждение растений и распространение патоге¬
нов, что достигается лигнификацией клеточных стенок растений
либо укреплением клеточных стенок за счет гликопротеидов, богатых
гидроксипролином, и других соединений, так называемых экстенси-
нов, что приводит к защите тканей от повреждения фитопатогенами.В ответ на инфицирование вирусами, бактериями и грибами инду¬
цируются специфические PR-белки (pathogenesis related proteins), в том
числе и наиболее изученные хитиназы и Р-1,3-глюканазы. Эти фермен¬
ты ингибируют рост грибов, а также некоторых видов бактерий.Экспериментально был доказан фунгицидный эффект белков хи-
тиназ и глюканаз, а также их кодирование одиночными генами. По¬
этому гены хитиназы и глюканазы были использованы в генно-инже-
нерных работах по получению трансгенных растений, устойчивых к
фитопатогенам. Были получены трансгенные растения табака, хлоп¬
ка, кукурузы, рапса, томата, риса, картофеля, люцерны, турнепса и
других, экспрессирующих ген хитиназы под контролем промотора
35S CaMV. У этих растений наблюдалась устойчивость к грибной ин¬
фекции. В настоящее время получены трансгенные сорта табака, рап¬69
са, томатов, картофеля с повышенной устойчивостью к Rhizoctonia,
растения табака — к Cercospora nicotiana.Другую группу соединений, также обладающих фунгицидным
эффектом, представляют низкомолекулярные белки (40—50 кДа), к
которым относятся цистеиновые белки растений, ингибиторы галак-
туроназ, растительные дефензины, группа MF-белков. Все эти белки
обычно неспецифически повышают устойчивость растений к различ¬
ным грибным и бактериальным инфекциям. Трансгенные растения,
экспрессирующие этот белок, обладают устойчивостью как к гриб¬
ной, так и к вирусной инфекции.В процессе изучения взаимоотношений вирус — растение было
вовлечено большое число различных методов. Только их комбиниро¬
вание могло принести результаты по получению растений, устойчи¬
вых к вирусной инфекции. За последние годы в этом направлении
был сделан заметный рывок, что напрямую связано с более деталь¬
ным пониманием организации генома и функционирования вирус¬
ных генов. В настоящее время для получения растений, устойчивых к
вирусной инфекции, с помощью генно-инженерных технологий су¬
ществует ряд подходов, позволяющих получить трансгенные расте¬
ния, трансформированные геном белка оболочки вируса, что приво¬
дит к уменьшению инфицированное™ и ингибированию размноже¬
ния вируса. Таким методом были получены растения табака и карто¬
феля, трансформированные геном белка оболочки вируса табачной
мозаики, что привело к появлению стойкого антивирусного эффекта
у трансгенных растений.В настоящее время получены линии табака, которые, помимо ус¬
тойчивости к ВТМ, резистентны к вирусу тыквенной мозаики. Были
также получены растения картофеля и кукурузы, устойчивые к виру¬
сам скручивания листьев, и растения ячменя, резистентные к вирусу
карликовости. Также получен и выращивается сорт тыквы, обладаю¬
щий устойчивостью сразу к трем вирусам.Еще одним подходом к получению устойчивых к патогенам расте¬
ний является трансформация растительных клеток генами, кодирую¬
щими ферменты пути биосинтеза фитоалексинов, проявляющих
фунгицидное и антимикробное действие. Трансформация этими ге¬
нами растений томата и картофеля значительно повысила устойчи¬
вость к фитофторозу и фузариозу, а табака — к серой гнили.В настоящее время получены четыре трансгенных коммерческих
сорта картофеля, устойчивые к Y вирусу (PVY) и вирусам скручива¬
ния листьев (PLRV), сорт тыквы, устойчивый одновременно к трем
различным вирусам, сорт папайи, устойчивый к круговому вирусу па¬
пайи (PRV).70
2.12.	ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ,
УСТОЙЧИВЫХ К ГЕРБИЦИДАМОдним из основных направлений биотехнологии растений явля¬
ется получение культурных растений, устойчивых к воздействию гер¬
бицидов. Гербициды широкого спектра действия, уничтожая сорные
травы, оказывают угнетающее действие и на посевы. Получение ус¬
тойчивых к гербицидам растений ведется в двух направлениях:
во-первых, прямая селекция устойчивых к гербицидам форм расте¬
ний (в основном, путем скрещивания с дикими видами растений, ус¬
тойчивых к гербицидам), во-вторых, получение трансгенных расте¬
ний путем введения генов, экпрессия которых приводит к герби¬
цид-резистентности. Теоретической основой получения трансген¬
ных растений, устойчивых к гербицидам, являются данные о
молекулярных механизмах возникновения устойчивости к гербици¬
дам и выделения генов как бактериального, так и растительного про¬
исхождения, определяющих этот признак. Действие гербицидов про¬
является в подавлении метаболизма растительных клеток: ингибиро¬
вании биохимических процессов прежде всего фотосинтеза (атразин,
симазин, диурон) и синтеза аминокислот (глифосат, сульфонилмоче-
вина, биалафос). Устойчивость к гербициду возникает либо в резуль¬
тате изменения сродства гербицида с его ферментом-мишенью, либо
непосредственно ингибированием молекулы гербицида.Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной
инженерии прежде всего основывается на изучении молекулярных
механизмов толерантности и включает следующие этапы: выявление
мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор расте¬
ний/бактерий, устойчивых кданному гербициду (в качестве источни¬
ка генов резистентности), идентификация и клонирование этих ге¬
нов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных кон¬
струкциях.Действие гербицида атразина основано на его связывании с хло-
ропластным мембранным белком (Qb), который кодируется геном
pbcA. Ген pbcA был выделен из генома некоторых сорняков. Было по¬
казано, что устойчивость к гербициду связана с возникновением то¬
чечной мутации в гене pbcA, что приводит к замене в белке аминокис¬
лотного остатка серина на глицин. Такие замены в белке Qb приводят
к резкому уменьшению связывания гербицида с ферментом-мише¬
нью. В результате возникает устойчивость к гербициду. Мутантный
ген pbcA был встроен в векторные конструкции для трансформации
растений. Полученные трансгенные растения были устойчивы к ат-
разину.71
Аналогично было показано, что замена аланина на аргинин в бел¬
ке EPSP-синтетазы, который кодируется геном aroA Е. coli, приводит
к возникновению устойчивости к действию гербицида глифосата.
Это было использовано для трансформации клеток табака, томатов,
сахарной свеклы и картофеля мутантным геном агоА и получения
трансгенных растений, устойчивых к гербициду.Введение в геном растений бактериального гена bar приводит к
появлению устойчивости к гербициду BASTA. Было показано, что бе¬
лок, кодируемый bar-геном, — фосфинотрицинацетилтрансфера-
за — ацетилирует активный компонент гербицида фосфинотрицин,
что приводит к его инактивации. Получены сорта трансгенного риса
(1995), сорго (1995), пшеницы (1994) и ряда других растений. В по¬
следнее время ter-ген стал использоваться и в качестве селективного
маркера в генно-инженерных векторах.Введение в геном риса гена, кодирующего фермент протопорфи-
риногенсинтетазу (Protox), выделенного из бактерий В. subtilis, при¬
вело к повышению устойчивости трансгенных растений к гербици¬
дам дифенил-эфирового ряда. При этом был показан механизм анти-
гербицидного действия: повышенная экспрессия этого белка Protox
нейтрализует действие гербицида, чем и обусловлено повышение ус¬
тойчивости к нему. При этом была показана прямая зависимость ме¬
жду числом встроенных копий гена и уровнем устойчивости.В настоящее время в странах Северной Америки и Европе разре¬
шены к применению более 20 сортов трансгенных растений, устойчи¬
вых к гербицидам, таких важных сельскохозяйственных культур, как
кукуруза, хлопок, рис, соя, пшеница, картофель, томаты, лен. Прохо¬
дят полевые испытания трансгенные сорта клубники, сахарной свек¬
лы и некоторых цветочных культур. Всего в мире трансгенными сор¬
тами и гибридами, устойчивыми к гербицидам, засеяно около 34 млн
гектаров, или 80 % всех посевов трансгенных сортов.В целом можно говорить о том, что получение трансгенных расте¬
ний является одним из наиболее бурно развивающихся направлений
биотехнологии. К февралю 2001 г. в странах с разрешенным исполь¬
зованием генетически модифицированных растений были проведе¬
ны испытания и разрешены к коммерческому использованию 78 сор¬
тов трансгенных растений 18 возделываемых культур.Быстрые темпы развития генной инженерии растений приводят к
стремительному росту возделываемых площадей, занятых трансген¬
ными растениями, с 1,6 млн га в 1996 г., когда началось их возделыва¬
ние в коммерческих масштабах, до более 80 млн га в 2005 г., что соста¬
вило около 5 % всех пахотных площадей в мире. Интересно отметить,
что 99 % всех этих площадей занимают четыре основные трансгенные72
культуры: соя, кукуруза, рапс и хлопок. В 2004 г. трансгенными были
в США около 75 % хлопка и сои, в Китае — 53 % хлопка, в Аргенти¬
не — 99 % сои, в Канаде — 63 % рапса. В 2003 г. 75 % всех выращи¬
ваемых трансгенных растений содержали ген устойчивости к герби¬
цидам, 21 % — ген устойчивости к вредителям и почти 8 % — более
одного гена устойчивости.2.13.	ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ - ПРОДУЦЕНТЫ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВВ последние десятилетия началась разработка векторных конст¬
рукций для получения трансгенных растений, активно экспресси¬
рующих белки для медицинских целей, которые могли бы потреб¬
ляться непосредственно в пищу либо для выделения из них белкового
продукта с последующей его очисткой. Получение рекомбинантных
белков в растениях имеет ряд значительных преимуществ:•	экспрессия терапевтически важных белков в растениях гораздо
дешевле, чем в биореакторах с использованием культуры клеток мле¬
копитающих;•	большая безопасность рекомбинантных белков, синтезирован¬
ных в растениях, по сравнению с получением их в трансгенных жи¬
вотных, так как в растениях не развиваются патогенные для человека
вирусы и бактерии и возможность заражения конечных продуктов
минимальна;•	посттрансляционные изменения белков в растительных и жи¬
вотных клетках происходят одинаково, что приводит к образованию
правильной третичной структуры, в то время как именно правильная
упаковка эукариотической белковой молекулы является главной
проблемой при синтезе ее в прокариотических бактериях;•	наработка терапевтически важных рекомбинантных белков в
съедобных частях растения резко снижает конечную цену продукта
из-за отсутствия проблем с очисткой.Первые данные о возможности использования растений в качест¬
ве «фабрик» для производства лекарственных белков были получены
в 1989 г., когда были созданы трансгенные растения табака, экспрес¬
сирующие иммуноглобулины IgGl. В настоящее время получены
растения, синтезирующие различные белки для терапевтических це¬
лей, в том числе соматотропин (табак), который применяется в вете¬
ринарии, антитела против вируса герпеса (табак, кукуруза, соя), ин¬
терферон ы для лечения гепатита В и С (рис, турнепс), лактоферин
(картофель), обладающий антимикробным действием, гирудин73
(рапс) и протеин С (табак), использующиеся для лечения тромбозов,
и ряд других белков.Отдельный интерес представляет получение трансгенных расте¬
ний, продуцирующих иммунизирующие антигены с тем, чтобы полу¬
чить съедобные вакцины. Впервые данные о съедобной вакцине
были опубликованы в 1992 г., и это была вакцина против гепатита В,
полученная в растениях сначала табака, а затем и картофеля. У мы¬
шей, в пищу которых добавлялся такой картофель, наблюдали разви¬
тие иммунного ответа против вируса гепатита. В 1999 г. была получе¬
на вакцина против вируса гепатита в результате трансформации рас¬
тений люпина и салата-латука. В настоящее время уже созданы и
прошли клинические испытания ряд вакцин на основе трансгенных
растений, в том числе вакцина против гастроэнтерита (табак, карто¬
фель), вируса кори (латук), холерного вибриона (картофель), цитоме-
лаговируса (картофель, табак), вируса папилломы (картофель). В по¬
давляющем большинстве случаев при поедании съедобных трансген¬
ных растений, экспрессирующих эти белки, развивался специфиче¬
ский иммунный ответ. Получение новых съедобных растительных
вакцин является одним из наиболее перспективных направлений
генной инженерии.2.14.	ТРАНСФОРМАЦИЯ ПЛАСТОМНОГО ГЕНОМА РАСТЕНИЙПластиды представляют собой цитоплазматические органеллы и
присутствуют в каждой растительной клетке. Эволюционно пласти¬
ды произошли из цианобактерий в результате их захвата эукариоти¬
ческой клеткой и до настоящего времени сохранили многие характер¬
ные черты прокариотического организма, такие как прокариотиче¬
ский тип промотора, объединение генов в опероны, специфический
генетический код, прокариотический тип механизмов транскрипции
и трансляции. Функционально и морфологически пластиды могут
различаться. В целом можно выявить несколько основных типов пла¬
стид, присутствующих в различных органах и тканях растения: хлоро-
пласты (фотосинтезирующие пластиды листьев и других зеленых тка¬
ней растения), хромопласты (окрашенные пластиды цветков и зре¬
лых плодов) и амилопласты (пластиды запасающих органов расте¬
ния).Геном пластид представлен кольцевой молекулой ДНК длиной
120—180т. н. п. При этом геном всех пластид одного растения одина¬
ков и межвидовые отличия незначительны. Пластидные гены в моле¬
куле ДНК расположены очень компактно и функционально разделя¬
ются на два основных класса: гены, связанные с фотосинтетическим74
аппаратом, и гены генетических систем, включающие гены рибосом-
ных РНК и белков, тРНК, РНК полимеразы и т. д. Большинство пла-
стидных генов организованы в опероны и экспрессируются совмест¬
но с образованием гигантской полицистронной мРНК.Каждая клетка мезофилла листа содержит до 100 пластид. Каждая
пластида полиплоидна и содержит 10—100 копий кольцевой ДНК.
Таким образом, каждая клетка может содержать до 10 тыс. копий ка¬
ждого гена пластидного генома.В последнее время интерес к пластидам резко возрос в связи с
возможностью использования их для генной инженерии. Это прежде
всего связано с высоким уровнем белкового синтеза в пластоме, мате¬
ринским типом наследования и отсутствием эпигенетических про¬
цессов, таких как эффект положения и замолкание гена, значительно
осложняющих экспрессию трансгенов в ядерном геноме. Однако ак¬
тивное использование пластид в генной инженерии сдерживалось ря¬
дом факторов и, прежде всего, трудностью доставки чужеродной
ДНК через двойную мембрану пластид, а также полиплоидностью
пластидного генома, так как для получения генетически стабильных
трансформантов необходимо, чтобы трансген присутствовал в каж¬
дой копии пластидного генома.Впервые стабильная интеграция чужеродного гена в геном хлоро-
пластов растений была получена в лаборатории П. Малиги в 1990 г.
При помощи метода биобаллистики в геном хлоропластов табака
был введен ген aadA, определяющий устойчивость к антибиотику
стрептомицину, и получено первое транспластомное растение.В настоящее время хлоропластная трансформация начинает со¬
ставлять конкуренцию и является серьезной альтернативой транс¬
формации ядерного генома растений. Причиной этого является то,
что транспластомные растения имеют значительные преимущества
над трансгенными растениями с трансформированным ядерном ге¬
номом с позиций более высокой эффективности продуцирования
белков и большей биобезопасности для окружающей среды.В качестве основных преимуществ хлоропластной трансформа¬
ции можно указать следующие:•	10—50-кратное увеличение уровней экспрессии встроенного пла¬
стомного трансгена, при котором количество полученного чужеродного
белка может достигать 46 % от всего количество растворимых белков
клетки. Причиной такой величины экспрессии является высокая по-
липлоидность каждой из пластид и большое их количество в клетке,
и, таким образом, при введении трансгена в хлоропластный геном
число его копий в цитоплазме одной клетки может составлять75
5000—10000. В то время как ядро в клетке только одно при обычной
1—4 копийности встроенного в ядерный геном трансгена;•	экспрессия трансгена в хлоропластах более стабильная, чем в слу¬
чае ядерных трансформантов. Как указывалось выше, интеграция
трансгенов в ядерный геном происходит случайно и в непредсказуе¬
мые места на хромосомах. Это часто приводит к значительным разли¬
чиям в уровнях экспрессии, изменениям в уровне синтеза трансген¬
ного белка в течение времени до полного его прекращения. В случае
хлоропластной трансформации встраивание трансгена идет по кон¬
кретным и выбранным экспериментатором местам хлоропластного
генома. Это исключает возможность влияния на экспрессию трансге¬
на окружающих фрагментов хлоропластной ДНК и уменьшения син¬
теза трансгенного белка;•	все транспластомные растения, полученные при трансформации
одной векторной конструкцией, всегда будут генетически и фенотипи¬
чески идентичны. Это также связано с тем, что интеграция трансгена в
хлоропластную ДНК может проходить только по определенным по¬
следовательностям, присутствующим как в векторной конструкции,
так и хлоропластном геноме путем гомологичной рекомбинации ме¬
жду ними. В случае же трансформации ядерного генома трансген
встраивается в состав векторной конструкции в хромосомы ядра слу¬
чайным образом и получить две независимые трансформации в один
и тот же участок ядерной ДНК практически невозможно из-за огром¬
ного количества (сотни тысяч и более) потенциальных мест интегра¬
ции;•	возможности мультигенной экспрессии трансгенов в хлоропла¬
стах с одного полицистронного транскрипта мРНК. Это связано с осо¬
бенностями хлоропластных генов, которые сходны с оперонной
структурой бактериальных генов, когда несколько генов транскриби¬
руются совместно с одного промотора в виде одной мРНК. Возмож¬
ность создания вектора с таким искусственным мультигенным опе-
роном увеличивает количество генов, которые могут экспрессиро¬
ваться в растениях в результате одного акта трансформации. Кроме
того, значительно повышается биобезопасность таких трансгенных
растений, в связи с тем, что такие мультигенные векторные конструк¬
ции не могут работать в эукариотических геномах, в том числе и у на¬
секомых, которые могут потенциально быть вовлеченными в гори¬
зонтальный перенос;•	рекомбинантные белки, и прежде всего белки человека, могут
нормально процессироваться в хлоропластах, образуя вторичные струк¬
туры. В случае ядерных трансгенов чужеродные белки должны вовле¬
каться во вторичные метаболистические пути для правильного про¬76
цессинга. При этом рекомбинантные токсичные белки при экспрес¬
сии в больших количествах в цитозоле растительной клетки часто бы¬
вают нетоксичны при аккумуляции их в хлоропластах;•	риск распространения трансгенов в случае трансппастомных рас¬
тений минимален. Это связано с тем, что зрелая пыльца не содержит
пластид, которые могут передаваться только от яйца к эмбриону. Та¬
ким образом, значительно повышается биобезопасность таких расте¬
ний в связи с невозможностью переноса трансгена на другие растения
при переопылении.Векторы для хлоропластной трансформации. Векторные конструк¬
ции построены на основе плазмиды Е. coli (см. рис. 1.7) и содержат
гены селективного маркера, а также целевой ген(ы). Кроме того, так
как в основе трансформации пластома лежит тот факт, что и нтефа¬
ция в хлоропластный геном проходит по механизмам гомологичной
рекомбинации, участок векторной плазмиды, несущий ген(ы), кото¬
рый необходимо встроить в хлоропластный геном, фланкирован (ок¬
ружен) последовательностями, гомологичными двум фрагментам
хлоропластной ДНК. Длина таких фланкирующих последовательно¬
стей может достигать 400—2000 н. п. Такая протяженность гомологии
значительно увеличивает частоту рекомбинации между векторной
конструкцией и гомологичными участками хлоропластного генома и,
соответственно, увеличивается вероятность интеграции части век¬
тора в хлоропластный геном и получения транспластомных расте¬
ний. Для встраивания трансгенов выбираются межгенные районы
пластома.В качестве селективных маркеров в конструкциях для хлоропла¬
стной трансформации обычно использовался бактериальный ген
aadA, определяющий устойчивость растения к антибиотику стрепто¬
мицину, под контролем промотора рибосомного оперона пластид и
теминаторной последовательностью также пластидного гена psbA
(см. рис. 2.5). В присутствии стрептомицина в среде для регенерации
растения с трансформированными хлоропластами, несущими ген ус¬
тойчивости aadA, остаются зелеными, в то время как ^трансформи¬
рованные — белые. В последние годы в связи с возможным риском
переноса антибиотической устойчивости от трансгенов к почвенным
микроорганизмам в качестве селективного маркера эффективно ис¬
пользуется выделенный из шпината растительный ген бетаин альде-
гиддегидрогеназы (BADH), который переводит токсичный глициналь-
дегид (селективный агент) в нетоксичный для растений глицинбе-
таин.В качестве функциональных используются гены различного, как
бактериального (cry, aro, bar гены), так и животного, и растительного77
(гены GH1, gvgvp) происхождения, что определяется целями получе¬
ния транспластомных растений. В ряде случаев для получения актив¬
ного белкового продукта несколько генов объединяются в один опе-
рон под контроль сильных пластидных промоторов, как это было
сделано при введении кодирующего bt-токсин трехгенного оперона
сгу2Аа2 в геном хлоропластов табака.Методы трансформации пластидного генома. В настоящее время
для трансформации хлоропластов используются три метода: биобал¬
листики, трансформация с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГа) и с
помощью микроинъекций с использованием жидкого металла гали-
стана.Наиболее широко применяемым и наиболее эффективным мето¬
дом трансформации хлоропластов является метод биобаллистики.
Методика проведения биобаллистической трансформации пластид
аналогична проводимой при трансформации ядерного генома. Высо¬
кая эффективность, скорость регенерации трансформированных
тканей и возможность использования для различных типов эксплан-
тов и для разных видов растений, как однодольных, так и двудольных,
сделала этот метод приоритетным для получения транспластомных
растений. Выход трансформированных этим методом растений таба¬
ка может достигать до 5—8 на один обстрелянный эксплант. Единст¬
венным ограничением применения этого метода является наличие
дорогостоящей биобаллистической пушки.Для ПЭГ-опосредованной трансформации необходимо получить
протопласты. Протопласты в присутствии ПЭГа могут всасывать
векторную ДНК, и изменения в мембране протопласта позволяют
ДНК проникать внутрь цитоплазмы. Векторная ДНК транспортиру¬
ется из цитоплазмы в хлоропласт, где и встраивается в геном послед¬
него. Эффективность этого метода при трансформации хлоропла¬
стов не очень высока. Кроме того, не все растения могут регенериро¬
вать из протопластов, что довольно сильно сужает возможности при¬
менения этого метода.Трансформация с помощью микроинъекций с использованием жид¬
кого металла галистана является новейшей разработкой, однако пока
не очень распространенной. Этот метод основан на микроинъекциях
векторной ДНК непосредственно в хлоропласты с помощью стеклян¬
ной иглы диаметром 0,1 мм. Введение векторной конструкции проис¬
ходит в результате теплового расширения жидкого металла галистана
в шприце.Дальнейшие этапы отбора транспластомных растений аналогич¬
ны таковым у ядерных трансгенов и проводятся в присутствии высо¬
ких концентраций селективного агента. Существенным отличием яв-78
Рис. 2.6. Трансформация хлоропластовляется то, что при пластидной трансформации проводят несколько
дополнительных раундов (до 4) селекции и регенерации. Это связано
с плоидностью генома и мультикопийностью пластид в клетке. Так
как интеграция векторной конструкции происходит лишь в несколь¬
ко хлоропластов, проведение нескольких последовательных 3—4 эта¬
пов регенерации при очень жесткой селекции приводит к тому, что
размножаются лишь трансформированные хлоропласты и в резуль¬
тате все хлоропласты в клетке и растении будут нести фрагмент век¬
торной конструкции (рис. 2.6).В состав векторной конструкции для трансформации входят мар¬
керный ген (М) и функциональный ген (X), окруженные последова¬
тельностями L и R, гомологичными хлоропластной ДНК. Трансфор¬
мация хлоропластов основана на гомологичной рекомбинации между
последовательностями Lh R векторной конструкции и соответствую¬
щими последовательностями V и R' хлоропластной ДНК.В настоящее время хлоропласты все шире используются в качест¬
ве биореакторов и публикуется все больше работ, показывающих
перспективность использования пластид для наработки белковых
продуктов. Введение в пластидный геном гена crylAc и экспрессия
bt-токсина в несколько раз повысила устойчивость таких транспла¬
стомных растений табака и картофеля к насекомым по сравнению с
трансгенными, трансформированными аналогичным геном, но на¬
ходящимся вядерном геноме. Дальнейший анализ показал, чтовли-
стьях транспластомных растений bt-токсин может составлять до
5 % суммарного растворимого белка. Введение же в хлоропластную
ДНК трехгенного оперона сгу2Аа2, включающего также два бел¬
ка-помощника, достигало максимального количества 46 % от всех
белков листа.В настоящее время получены транспластомные растения табака,
картофеля, томатов устойчивые к различным биотическим и абиоти¬
ческим факторам (табл. 2.1).79
Таблица 2.1. Экспрессия чужеродных генов в хлоропластах растенийГенБелокАктивностьИсточникПолучение растений, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессамcry 1 Ассгу2Аа2агоАtpslmsi-99barBADHТоксин Bacillus
thuringiensisТоксин Bacillus
thuringiensisEPSPSTрехалозофосфат-
синтазаБелок MSI-99Фосфинотри цинаце-
тил трансферазаБетаинальдегид дегид¬
рогеназаУстойчивость к на¬
секомымТо жеУстойчивость к гер¬
бицидамЗасухоустойчивостьУстойчивость к гри¬
бам и бактериямУстойчивость к гер¬
бицидамЗасухоустойчивостьMcBride et al. (1995)
Kota et al. (1999)
Ye et al. (2001)Lee et al. (2004)
DeGrayet al. (2001)
Lutz et al. (2001)
Daniell etal. (2001)Получение вакцин и лекарственных препаратовctxBb-субъединица холер¬
ного токсина (СТВ)ВакцинаDaniell etal. (2001)раВакцина против си¬
бирской язвыВакцинаDaniell etal. (2005)gvgvp-120Биоэластичный бел¬
ковый полимерПрименение в меди¬
цинеGuda et al.(2000)GH1Соматотропин чело¬
века (гормон роста)Лекарственный пре¬
паратStaub et al.(2000)proinsulinПроинсулин, альфа-
и бетацепиТо жеINSa5Интенферон а5Отдельным направлением является использование транспла-
стомных растений для производства лекарственных препаратов и
съедобных вакцин. Так, введенный в хлоропластнй геном растения
табака ген GH1 приводит с синтезу белка соматотропина (гормон
роста), количество которого в листьях составляет до 7 % всех раство¬
римых белков. При этом была показана высокая биологическая ак¬
тивность полученного белка соматотропина. Другой пример — это
синтез бета-субъединицы холерного токсина в хлоропластах табака,
который может быть использован в качестве вакцины. Было показа¬
но, что полученный белок был антигенно идентичен природному80
СТВ токсину. При этом в листьях синтезированный белок мог со¬
ставлять более 4 % от всех белков, в то время как экспрессия анало¬
гичной конструкции у ядерных трансгенов в лучшем случае достигала0,1 %. Аналогично были получены транспластомные растения таба¬
ка, экспрессирующие вакцину против сибирской язвы.Рядом исследователей было показана возможность экспрессии
белка помимо листьев в хромопластах плодов томата и амилопластах
клубней картофеля, хотя нужно отметить, что количество ожидаемо¬
го продукта было значительно ниже. Однако возможность экспрес¬
сии целевых генов в съедобных частях транспластомных растений от¬
крывает перспективы новому направлению—получению съедобных
вакцин.2.15.	МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА РАСТЕНИЙ
И ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ТЕХНОЛОГИЙ В ГЕНЕТИКЕ И СЕЛЕКЦИИПолимеразная цепная реакция. Методы, основанные на полиме¬
разной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время являются одними
из наиболее часто использующихся ДНК-технологий анализа гено¬
ма, в том числе и генома растительного. Метод ПЦР или PCR (от
англ. Polymerase Chain Reaction) был разработан К. Маллис с сотруд¬
никами в 1985 г. Суть метода состоит в возможности увеличения ко¬
личества копий (амплификации) фрагмента ДНК. В основе ПЦР ле¬
жат механизмы репликации ДНК и используются аналогичные фер¬
менты репликации. При помощи этого метода можно в миллионы раз
увеличить копийность фрагмента ДНК. При этом метод ПЦР осно¬
ван на использовании специфической ДНК-полимеразы гейзерной
термофильной бактерии Themus aquaticus — 7а^-полимеразы. Ос¬
новное отличие 7о<7-полимеразы от других ДНК-полимераз состоит в
том, что она не инактивируется при нагревании до 95 °С. Температур¬
ный оптимум 7а<7-полимеразы, при котором она синтезирует ком¬
плиментарную цепь на ДНК-матрице, находится в районе 68—72 °С.
Так же как и другие ДНК-полимеразы, синтетическая активность
7о<7-полимеразы зависит от наличия одноцепочечной ДН К-матрицы
и праймера — небольшой (15—25 н. п.) одноцепочечной олигонук-
леотидной последовательности, комплементарной одному из концов
ДНК-фрагмента, который необходимо наработать. Поэтому для того,
чтобы провести ПЦР реакцию необходимо обязательно знать нук¬
леотидную последовательность концов амплифицируемого фрагмен¬
та. Праймеры могут находить гомологичные области на одноцепочеч¬
ной матричной ДНК и при определенной температуре реакционной
смеси, которая рассчитывается для каждой праймерной пары, гибри-81
дизоваться с ними, образовывая двуцепочечные участки. Фермента¬
тивная активность 7од-полимеразы, как и у других ДНК-полимераз,
активизируется наличием двуцепочечного участка на одноцепочеч¬
ной ДНК и начинается синтез комплиментарной цепи. Одним из
свойств используемой Год-полимеразы является то, что при ее помо¬
щи можно амплифицировать небольшие фрагменты, обычно не пре¬
вышающие 3000 н. п.П ЦР проводится следующим образом: в пробирку с реакционной
смесью, состоящей из буферного раствора с определенным составом
солей, добавляют ДНК-матрицу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, два
праймера, комплементарных концевым последовательностям фраг¬
мента, который необходимо наработать. ПЦР-реакцию проводят в
специальных приборах-термоциклерах. Термоциклеры по сути пред¬
ставляют собой своеобразные нагревательные установки, которые
могут быстро (со скоростью более 1 °С/мин) автоматически изменять
температуру: нагревать или охлаждать пробирки с реакционной сме¬
сью или инкубировать их в течение заданного времени при опреде¬
ленной температуре. При этом термоциклер можно запрограммиро¬
вать на определенные изменения температурных условий и времени
инкубации, а также цикличность повторений этого режима.Таким образом, каждый цикл состоит из трех основных темпера¬
турных этапов:•	денатурация ДНК матрицы при 92—96 °С; двуцепочечная
ДНК-матрица денатурирует на две одноцепочечные нити. Время эта¬
па денатурации обычно составляет 0,5—1 мин во всех циклах кроме
первого. В первом цикле для того, чтобы гарантированно прошла де¬
натурация ДНК-матрицы (обычно геномной ДНК), время этапа де¬
натурации увеличивают до 3—4 мин;•	отжиг праймеров', при так называемой температуре отжига
праймера (/отж) праймерные последовательности находят область го¬
мологий на одноцепочечной матрице ДНК и гибридизуются (отжига¬
ются) с ней, образуя двуцепочечный фрагмент, и являются затравкой
для Taq-полимеразы при синтезе комплементарной цепи. Темпера¬
тура отжига индивидуально рассчитывается для каждого праймера в
зависимости от нуклеотидного состава и длины. Так как праймеры
для конкретного эксперимента определяются непосредственно ис¬
следователем, то они обычно подбираются так, чтобы /отж праймера
была в интервале температур 30—60 °С. Время этого этапа составляет
обычно 15—60 с;•	синтез (наработка фрагмента); при 70—72 °С Год-полимераза,
инициируясь на праймерах, начинает репликацию фрагмента. Эта
температура является оптимальной для синтетазной активности82
Гя^-полимеразы. Время этого этапа обычно соотносится с длиной
фрагмента, который необходимо наработать и составляет от 0,5 до2	мин.При проведении ПЦР для наработки большого количества ДНК
фрагмента достаточно 25—30 циклов.На рис. 2.7 схематично представлены ПЦР-циклы. Разберем ги¬
потетическую задачу: растения табака были трансформированы кон¬
струкцией, содержащей маркерный ген nptll, и росли на селективной
среде с канамицином. Однако для доказательства трансгенной при¬
роды этих растений необходимо показать присутствие векторной
конструкции в геноме растений табака. Эта задача решаема с помо¬
щью метода полимеразной цепной реакции. Рассмотрим, как будет
проходить ПЦР, на примере наработки фрагмента маркерного гена
nptll. Для проведения ПЦР необходимо разработать праймеры для
проведения конкретной ПЦР и выделить геномную ДНК из анализи¬
руемых растений табака. Нуклеотидная последовательность гена
nptll известна. Основываясь на этом, были разработаны и искусст¬
венно синтезированы праймеры А и В длиной 21 н. п. и 23 н. п. соот¬
ветственно, комплементарные концам фрагмента, который необхо¬
димо наработать. Последовательности праймеров были выбраны та¬
ким образом, что /0тж их была одинакова и составляла 54 °С.В пробирке собирают все компоненты для проведения ПЦР,
включающую буферную смесь, дезоксирибонуклеотиды, 7а^-поли-
меразу, праймеры Аи В и геномнуюДНКтабака, которая и будет мат¬
рицей для ПЦР. Пробирку помещают в запрограммированный тер¬
моциклер.Первый цикл. Этап денатурации. При 92—96 °С двуцепо¬
чечная ДНК-матрица денатурирует на две одноцепочечные нити (см.
рис. 2.7). Как уже было упомянуто, ДНК-мартицей обычно является
геномная ДНК и в нашем случае это геномная ДНК табака. Для того
чтобы полностью денатурировать геномную ДНК, время денатура¬
ции на первом цикле увеличивают до 3—4 мин.Этап отжига. Температура в термоциклере изменилась и стала
54 °С (до /отж, рассчитанного для праймерной пары А и В). На этом
этапе одноцепочечные праймеры А и В находят область гомологий на
одноцепочечной матрице ДНК и гибридизуются (отжигаются) с ней,
образуя двуцепочечные фрагменты.Этап синтеза. При температуре в термоциклере 72 °С поли¬
мераза, инициируясь на праймерах, начинает репликацию. В резуль¬
тате на каждой из исходных цепей с каждого праймера синтезируется
фрагмент ДНК. При этом синтезированный фрагмент получается
значительно длиннее, чем необходимо.83
Количество ДНК амплифицируемого фрагмента 2 , где п — количество цикловФрагмент гена npt II ^температура отжига
праймер А	расчитывается дляпраймер Вкаждой пары
праймеровРис. 2.7. Схема полимеразной цепной реакции
Второй цикл. Изменение температуры до 92—96 °С снова
приводит к денатурации нагреванием как исходных, так и вновь син¬
тезированных цепей ДНК. Затем при температуре отжига 54 °С прай¬
меры А и В отжигаются также на всех цепях. При 72 °С 7Ь^-полиме-
раза вновь, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, реплицирует
фрагменты ДНК (см. рис. 2.7). При этом на исходных геномных мат¬
ричных цепях снова образуются длинные фрагменты. Однако когда в
качестве матрицы используются длинные фрагменты, синтезирован¬
ные в предыдущем цикле, то нарабатывается фрагмент необходимой
длины, ограниченный по концам праймерами А и В (см. рис. 2.7).Третий — 30-й цикл. При 92—96 °С денатурируют все мат¬
рицы. При температуре отжига праймеров праймеры А и В, отжига¬
ются на всех матрицах. При температуре синтеза Га^-полимераза ре¬
плицирует фрагмент. При этом с каждым циклом число фрагментов
nptll гена, ограниченных с двух сторон праймерами А и В, увеличива¬
ется в зависимости 2”, где п — число циклов ПЦР. В то время как об¬
разование длинных фрагментов будет увеличиваться по линейной за¬
висимости. Таким образом, в ПЦР будет избирательно нарабатывать¬
ся (амплифицироваться) только необходимый фрагмент ДНК, огра¬
ниченный выбранными праймерами. В результате количество
полученного фрагмента ДНК в 106 раз превышает исходное количест¬
во молекул ДНК-матрицы! После проведения ПЦР полученный
фрагмент ДНК детектируется напрямую методом электрофореза в
агарозном геле и дальнейшей окраской геля бромистым этидием.ПЦР — это крайне чувствительный метод анализа. Этим методом
можно амплифицировать фрагмент даже в присутствии нескольких
пикограмм (I0-12 г) ДНК и анализировать ДНК одной клетки. С его
помощью можно анализировать фрагменты ДНК, амплифицирован-
ные из мумифицированных образцов тканей возрастом более пяти
тысяч лет, гербарных образцов, найденных в древних пирамидах, и
организмов, замороженных во время Ледникового периода.В настоящее время полимеразная цепная реакция широко ис¬
пользуется в молекулярной биологии и генной инженерии прежде
всего для наработки фрагментов ДНК, в большинстве случаев заме¬
няя клонирование в плазмидных векторах. Также ПЦР используют
для внесения специфических точковых мутаций in vitro, детекции де-
леций и инсерций, а также для идентификации специфических или
мутантных аллельных вариантов генома, что широко используется
для ПЦР-диагностики болезней. ПЦР может быть использована для
выделения генов или фрагментов генов из геномных библиотек, для85
сборки небольших генов из искусственно синтезированных фрагмен¬
тов. Кроме того, ПЦР используется для секвенирования.Полемеразная цепная реакция позволяет амплифицировать не
только молекулы ДНК, но и РНК. Эта модификация П ЦР-метода на¬
зывается 0Г-ЯДР(обратно-транскриптазная ПЦР). ОТ-ПЦРсосто¬
ит из двух стадий. Первая — получение кДНК и вторая — собственно
ПЦР. В результате использование данного метода позволяет ампли¬
фицировать ДНК-копии мРНК. Этот метод может быть использован
для получения высоко представительных кДНК библиотек из мини¬
мального количества исходной мРНК, например кДНК библиотек из
клеток трихом или клеток каломеллы. Кроме того, ОТ-ПЦР широко
применяют для идентификации РНКовых вирусов или для детекции
зараженности организма такими вирусами.В настоящее время на основе ПЦР разработаны тест-системы для
быстрой идентификации огромного числа фитопатогенов растений.
В селекции метод ПЦР применяется для анализа гибридного мате¬
риала, для детекции у потомства определенных генов или определен¬
ных фрагментов ДНК, сцепленных с нужным признаком.Микрочипы. ПЦР-технологии лежит в основе продукции
микрочипов (микроматриц), в том числе и экспрессионных микрочи¬
пов, позволяющих одновременно изучать работу огромного количе¬
ства генов. Микрочип представляет собой твердый носитель, на кото¬
ром в строго определенном порядке иммобилизованы микроколичества
известных последовательностей ДНК. В качестве носителя для фикси¬
рования молекул ДНК может быть использован силикон, нейлоно¬
вые мембраны или даже специально обработанное стекло. Размеры
микрочипов — несколько квадратных сантиметров, на которых на¬
несены до нескольких тысяч индивидуальных проб ДНК. ДНК для
таких проб нарабатывается с помощью ПЦР. Для изготовления мик¬
рочипов используют специальные роботы-чипаторы. Образцы ДНК,
которые хотят проанализировать при помощи микрочипа, метят
ПЦР-методом флуоресцентным красителем и гибридизуют на мик¬
рочипе. После отмывки микрочип сканируют при помощи специаль¬
ного лазерного сканера, и данные о флуоресценции каждой точки на
микрочипе передаются на компьютер и обрабатываются, используя
специальное программное обеспечение. Первый экспрессионный
растительный микрочип был получен в 1995 г., когда при помощи
ПЦР были получены к ДНК фрагменты 48 генов арабидопсиса и в из¬
вестном порядке нанесены на микроматрицу. Затем, также при по¬
мощи ПЦР были получены два образца: кДНК копии мРНК из кор¬
ней и из листьев. Эти образцы метили различными флуорометками и
гибридизовали с микрочипом. Результаты анализа показали значи¬86
тельные различия в экспрессии анализируемых 48 генов в корнях и
листьях. Так были выявлены гены, которые экспрессировались толь¬
ко в корнях или только в листьях, кроме того, для части генов была
показана их экспрессия и в клетках корней, и в клетках листьев. Кро¬
ме того, были созданы микрочипы, которые можно использовать для
сортовой идентификации и паспортизации. Такие микрочипы были
созданы на основе SNP-маркеров (маркеров точкового нуклеотидно¬
го полиморфизма) для анализа и идентификации сортов картофеля и
томатов.На сегодняшний день создано большое количество всевозмож¬
ных микрочипов для растений. Так, получены микрочипы для раз¬
личных тканей растений, определенных семейств генов или генов,
вовлеченных в определенные метаболистические процессы. Исполь¬
зование микрочипов является мощнейшим инструментом для анали¬
за механизмов функционирования генома и является одним из пер¬
спективных направлений развития нанотехнологий в биологии.Применение ДНК маркеров в генетике и селекции. Исторически за¬
кономерности изменчивости и наследственности изучались при по¬
мощи анализа морфологических характеристик. Полиморфизм мор¬
фологических признаков и до настоящего времени остается главным
критерием в систематике, при изучении мутационного процесса, в
селекционных исследованиях филогенетических связей. Основные
достижения в селекции до недавнего времени были обусловлены ис¬
пользованием морфологических признаков, на основании которых
проводился биометрический анализ. Однако эти признаки имеют ог¬
раниченную информативность, далеко не всегда изменяются дис¬
кретно, и, как правило, на их проявление существенное влияние ока-
зываютусловия возделывания сельскохозяйственных культур. Поми¬
мо этого проявляются морфологические признаки чаще всего на
поздних стадиях онтогенеза. Кроме того, наблюдается недостаточ¬
ность морфологических данных при селекции на количественные
признаки, такие как продуктивность, качество урожая, устойчивость
к биотическим и абиотическим стрессам и др.Наряду с морфологическими признаками на протяжении многих
десятилетий в генетике и селекции широко и успешно используется
целый ряд биохимических показателей. Перспективы использования
биохимических белковых маркеров в селекции значительно расши¬
рились с обнаружением полиморфизма изоферментов и запасных
белков. Метод белковых маркеров позволяет решать ряд генетиче¬
ских и селекционных проблем таких, как, например, идентификация
сортов злаковых растений, маркирование инбредных линий и оценка
их на однородность, отбор ценных генотипов по белковому феноти¬87
пу, анализ гибридов, получение информации о подлинности и чисто¬
те партии семян и ряд других прикладных задач. Однако большая
часть принятых методов ориентирована лишь на зерновые (пшеница,
ячмень, овес, кукуруза) и кормовые культуры (бобовые, некоторые
кормовые злаки).Однако методы белкового маркирования растительных геноти¬
пов не лишены целого ряда серьезных недостатков. Прежде всего,
поскольку изозимы и белки являются генными продуктами, на сте¬
пень их экспрессии оказывают влияние факторы окружающей среды,
тканеспецифичность экспрессии и различные внутренние факторы,
к примеру, возраст растения. Как было показано, даже различия в ус¬
ловиях выращивания и хранения, а также зараженность вирусными
заболеваниями могут изменить качественно или количественно бел¬
ковые спектрограммы растений одного и того же генотипа.Развитие молекулярной биологии привело к появлению нового
класса маркеров — молекулярных маркеров, которые по сути являются
фрагментами ДНК. В результате точковых мутаций, вставок, делеций
или инверсий гомологичные последовательности ДНК у разных ин¬
дивидов могут различаться. Такие последовательности ДНК называ¬
ются полиморфными, а само явление вариабельности нуклеотидного
состава гомологичных последовательностей — полиморфизмом ДНК.В настоящее время полиморфные ДНК используются для марки¬
рования генов, отдельных участков хромосом и целых геномов. Мар¬
кирование геномов растений позволяет выявлять степень родства ме¬
жду индивидуальными организмами, что особенно важно при реше¬
нии прикладных задач, например установление генеалогии сорта или
линии для прогнозирования гетерозисного эффекта в программах
скрещивания. Еще большее значение молекулярное маркирование
геномов растительных организмов приобретает в фундаментальных
исследованиях по эволюции и таксономии при популяционном ана¬
лизе, что имеет прямое отношение к проблеме сохранения биологи¬
ческого разнообразия.Наибольшее распространение ДНК-маркеры получили также в
области молекулярно-генетического картирования геномов различ¬
ных растений, оценки уровня генетического полиморфизма, при ге-
нотипировании особей, линий, популяций, видов. Использование
ДНК-технологий во многом позволило преодолеть недостатки мето¬
да белковых маркеров в решении ряда таксономических вопросов и
отдельных задач селекции, в том числе сертификации сортов. Прежде
всего, это связано с тем, что ДНК-маркеры не подвержены влиянию
окружающей среды и могут быть идентифицированы на любой ста¬
дии развития.88
Применение молекулярных маркеров значительно расширило
возможности оценки генов устойчивости к болезням и вредителям
растений. За короткое время при помощи ДНК-маркеров удалось ус¬
тановить природу устойчивости, в частности, различать моногенную
и полигенную резистентность, исследовать взаимодействие соответ¬
ствующих локусов, определять расовую специфичность отдельных
генов, оценивать взаимодействие между генами устойчивости к пато¬
генам.На данный момент все известные молекулярные маркеры можно
условно разделить на три основные группы:•	ДНК-маркеры, основанные на гибридизации (маркеры
ПДРФ — полиморфизм длин рестрикционных фрагментов);•	ДНК-маркеры, основанные на использовании принципа поли¬
меразной цепной реакции (RAPD — амплификация полиморфной
ДНК с использованием случайных праймеров; маркеры AFLP — по¬
лиморфизм длин амплифицированных фрагментов; SSR — микроса-
теллитный анализ и др.);•	ДНК-маркеры, основанные на детекции полиморфизма точко-
вых замен в нуклеотидной последовательности (SNP — точковый
нуклеотидный полиморфизм).Метод ПДРФ-анализа генома. Одним из первых методов, позво¬
ливших оценить геномное разнообразие на уровне ДНК, стал метод
анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
В основе использования в качестве молекулярных маркеров ПДРФ
лежит тот факт, что различные аллели одного локуса могут отличать¬
ся по нуклеотидной последовательности. Это могут быть нуклеотид¬
ные замены, делеции, вставки или другие перестройки, в результате
которых может быть изменен сайт узнавания для какой-либо рест¬
рикционной эндонуклеазы или расстояние между этими сайтами. Та¬
ким образом, методом ПДРФ маркируется аллель, расположенный в
определенном локусе. Соответствующие аллельные варианты могут
быть использованы как маркеры отдельных сегментов хромосом и,
соответственно, лежащих в этих сегментах тесно сцепленных генов.
Суть метода заключается в гибридизации радиоактивно меченого
ДНК-зонда с рестрицированной, разделенной в агарозном геле и пе¬
ренесенной на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр геномной
ДНК. В результате этого можно детектировать полиморфизм исследуе¬
мых геномов, обусловленный как распределением сайтов рестрик¬
ции, так и присутствием или отсутствием локусов гомологичных по¬
следовательностей ДНК-зонда.Метод считается высоко воспроизводимым, а получаемые
ПДРФ-маркеры — кодоминантными. ПДРФ-маркеры успешно ис¬89
пользуются как при анализе отдельных участков генома, так и для ре¬
шения прикладных задач, в том числе для картирования генов и на¬
сыщения ДНК-маркерами генетических карт культурных растений,
исследования внутривидового разнообразия и выявления филогене¬
тических связей различных систематических групп у растений, а так¬
же для паспортизации сортов.На основе данных ПДРФ-анализа были составлены молекуляр-
но-генетические карты для таких растений, как арабидопсис, рис,
картофель, томат, кукуруза, гексаплоидная пшеница, ячмень, горох,
люцерна, соя, персик и др. Особенно важно наличие таких карт для
различных селекционных программ, так как позволяет определить
положение маркируемых агрономически важных генов и признаков и
значительно ускорить селекционный процесс. Так, например, у горо¬
ха выявлены ПДРФ-маркеры для локуса rb, контролирующего коли¬
чество липидов в зрелых семенах, и для локуса регуляции экспрессии
гена халконсинтетазы. С использованием ПДРФ-маркирования ри-
босомальной ДНК осуществлена генетическая паспортизация сортов
бобов.Благодаря применению большого набора ПДРФ-зондов появи¬
лась возможность сравнивать между собой геномы различных расте¬
ний, например злаков. Так, при помощи ПДРФ-маркеров показана
высокая гомология между локусом Hd-бриса и Vm-Al пшеницы. Ис¬
пользуя общие для пшеницы и ячменя маркеры Xpsr921 и Xmwg634,
удалось показать, что гены карликовости ячменя Dwf2 (4HS) и пше¬
ницы Rht-Blc и Rht-Dlc (4BS, 4DS) принадлежат к одной ортологиче-
ской группе. Подобные исследования позволяют проследить эволю¬
цию хромосом и отдельных генов у важнейших сельскохозяйствен¬
ных культур.Метод AFLP-анализа генома. Метод детекции полиморфизма
длин амплифицированных фрагментов — AFLP-метод (amplified
fragment length polymorphism) представляет собой комбинирование
ПЦР- и ПДРФ-методов. Несмотря на техническую сложность, этот
метод получил широкое распространение, так как позволяет опреде¬
лять генетические изменения, вызванные точечными мутациями в
сайтах рестрикции или делециями/инсерциями внутри рестрикциро-
ванного фрагмента. В отличие от метода ПДРФ, AFLP-метод отлича¬
ется высокой разрешающй способностью и позволяет анализировать
одновременно большое количество (до 150—300) локусов генома.В качестве ДНК-матрицы в AFLP используются рестрицирован-
ные двумя различными эндонуклеазами и лигированные с соответст¬
вующими адаптерами фрагменты геномной ДНК. После чего гидро¬
лизованные ДНК-продукты подвергаются двум последовательным90
раундам ПЦР амплификации с парой праймеров, гомологичных по¬
следовательностям адаптеров и сайтам рестрикций. AFLP-система
маркирования считается доминантной, хотя некоторые специалисты
отстаивают возможность идентификации и гетерозигот. На практике
AFLP-метод широко используется для анализа популяционного по¬
лиморфизма, филогенетических отношений, идентификации видов,
а также маркирования локусов, сцепленных с различными хозяйст-
венно-ценными признаками. Так, например, был картирован ген
Bs2, определяющий резистентность к Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria у перца, или же локус fadl, обеспечивающий синтез олеи¬
новой кислоты в семенах у озимого рапса.AFLP-метод также использовался для анализа генетического по¬
лиморфизма и эволюционных отношений между современными сор¬
тами табака (Nicotiana tabacum) и его дикими сородичами. Отобран¬
ные AFLP-праймеры применялись для исследования внутриспеци-
фических различий между местными и современными сортами Vicia
sativa L. AFLP-маркеры были использованы в анализе меж- и внутри-
специфичных различий 22 природных популяций 13 видов барбари¬
са, произрастающих в Патагонии (Аргентина), с возможностью вы¬
явления полиплоидных комплексов. Метод AFLP на сегодняшний
день является основным молекулярным методом получения насы¬
щенных молекулярно-генетических карт растений. Карты сцепления
на основе AFLP-маркеров были разработаны практически для всех
ценных агрономических культур, включая рис, пшеницу, кукурузу,
картофель, томат, огурцы, рапс, сахарную свеклу, бананы, лен, лю¬
церну и др.Кроме того, AFLP-метод также широко используется для марки¬
рования локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками.
Так были получены AFLP-маркеры, сцепленные с восстанавливаю¬
щим геном Rfo системы ЦМС у рапса, AFLP-маркеры, позволяющие
проводить селекцию на устойчивость к BaYMV у ячменя, дискрими¬
нировать нормальные и мутантные аллели Wx-Dl локуса у пшеницы.
В околоизогенных линиях перца при помощи AFLP-метода проводи¬
лось картирование гена Bs2, определяющего резистентность к бакте¬
риальному патогену Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Один из
AFLP-маркеров А2 оказался коинтегрирован в локусе Bs2, а два дру¬
гих, F1 и ВЗ, граничат с ним в пределах 0,6 сМ. Сцепленные с геном
Bs2 AFLP-маркеры позволили также выявить в локусе мутации, ин¬
дуцированные гамма-излучением. Локус Gpa2, обеспечивающий не-
матодоустойчивость картофеля, картирован на хромосоме 12 с ис¬
пользованием информации, основанной на позиционном картирова¬
нии в геноме картофеля 733 известных AFLP-маркеров. В сегрегаци¬9!
онном анализе F2 популяции, полученной от скрещивания двух
мутантных линий озимого рапса, при помощи трех AFLP-маркеров
удалось картировать локус fad2, обеспечивающий синтез олеиновой
кислоты в семенах.При размножении в культуре ткани ореха пекан (Сагуа
illinoinensis) AFLP-анализ использовался для оценки генетической
изменчивости сомаклонов, атакже меж- и внутрилинейных различий
соматических эмбрионов.Метод RAPD-анализа генома. RAPD (random amplified polimorphic
DNA) — метод амплификации полиморфной ДНКс использованием
случайных праймеров аналогично AFLP-методу позволяет исследо¬
вать, главным образом, селективно-нейтральные уникальные и уме¬
ренно повторяющиеся последовательности генома. Суть метода за¬
ключается в использовании для амплификации только одного, обыч¬
но 10-нуклеотидного праймера случайной природы, не прибегая к
необходимости иметь информацию о нуклеотидной последователь¬
ности конкретных участков генома, как в случае классической ПЦР.
Метод прост в исполнении, хотя и требует строгой стандартизации
условий амплификации. Однако амплифицированные фрагменты
«анонимны», их трудно связать с конкретными локусами генома.
Кроме того, доминантная природа RAPD-маркеров не позволяет вы¬
являть гетерозиготы.Благодаря простоте исполнения метод получил весьма широкое
распространение и используется для анализа генетического разнооб¬
разия различных растительных таксонов, в популяционных и эволю¬
ционных исследованиях, а также при построении филогений, реше¬
ния вопросов систематики растений. RAPD-маркеры широко ис¬
пользуются для целей генетического картирования и насыщения ге¬
нетических карт. Так, этот метод использовался для конструирования
карт сцепления в роде Fagopyrum. На основе 596 RAPD-праймеров
проведено построение генетической карты сцепления в сегрегацион¬
ной F2 популяции папайи (Carica papaya L.), в том числе впервые кар¬
тирован локус, определяющий пол растения, фланкированный
RAPD-маркерами.Успешное использование RAPD-анализа показано для решения
целого ряда спорных таксономических вопросов. Этот метод широко
применяется для изучения генетической дифференциации внутри се¬
мейства Роасеае и Solanaceae, родов Citrus, Allium, Oriza, Beta и ряда
других.Огромное количество RAPD-маркеров было получено для иден¬
тификации локусов, связанных с количественными признаками, так
называемыми QTL-локусами. Так были получены RAPD-маркеры,92
сцепленные с локусом, определяющим засухоустойчивость у ячменя
и пшеницы. Было выявлено четыре маркера, сцепленных с повышен¬
ной урожайностью в условиях температурного стресса у фасоли.
Были получены маркеры QTL-устойчивости к засолению у томата и
пшеницы. Было получено большое количество RAPD-маркеров, свя¬
занных с QTL устойчивостью к различным болезням растений.Весьма перспективным оказалось использование RAPD для иден¬
тификации сомаклональной изменчивости. Высокая разрешающая
способность этого метода позволяет обнаруживать изменения в гено¬
ме клеток на разных этапах их культивирования, даже если они не
проявляются фенотипически.Метод ISSR-анализа генома. Относительно недавно стал доступен
еще один метод, полученный при комбинировании RAPD-техноло¬
гии и анализа полиморфизма микросателлитной ДНК. Это так назы¬
ваемое ISSR-маркирование (inter simple sequence repeats —анализ
межмикросателлитных последовательностей). Как и RAPD, ISSR не
требует предварительного клонирования и секвенирования фрагмен¬
тов для подбора праймеров. Праймеры представляют собой фраг¬
мент микросателлитного повтора, обычно ди- или тринуклеотидно-
го. ISSR-метод использовался для картирования генома и изучения
генетических различий сортов ячменя, насыщения генетической
карты сцепления Citrusgrandis, составленной ранее с помощью RFLP,
RAPD и изозимных маркеров (Sankar, Moore, 2001).С целью отбора наиболее ценных генотипов томатов (Lycopersicon
esculentum) проводилось картирование гена, обусловливающего этот
признак. По результатам анализа сегрегирующих популяций расте¬
ний с помощью двух ISSR-маркеров на хромосоме 4 томата был кар¬
тирован локус Fgr , кодирующий высокое соотношение фруктозы к
глюкозе в плодах томата и ведущий свое происхождение из дикорас¬
тущего вида Lycopersicon hirsutum. Также была показана возможность
использования трех ISSR-фрагментов для маркирования признака,
сцепленных с мелкозерностью семян гексаплоидной пшеницы, атак-
же четырех ISSR-маркеров, выявляющих признак крупносемянно-
сти. Также были идентифицированы ISSR-маркеры, сцепленные с
признаком сезонного цветения у Fragaria vesca. Применение
ISSR-маркеров также расширило возможности идентификации ге¬
нов устойчивости к болезням. В качестве примера можно привести
картирование кластера генов устойчивости к фузариозному вилту у
горошка.Применение ISSR-анализа позволило определить, к какой из двух
субпопуляций риса относится генотип культурного риса, а также с
высокой точностью провести сортовую идентификацию внутри каж¬93
дой субпопуляции. При этом, как показал сравнительный анализ,
ISSR-метод характеризуется более высоким полиморфизмом по
сравнению с RAPD.В последнее время ISSR—PCR-анализ используется также для ге¬
нетической характеристики и поддержания мировых коллекций се¬
мян, например таких, как сорта люпина, какао и папайи.Микросателлиты или простые повторы SSR (от англ. simple
sequence repeats) представляет собой последовательности, состоящие
из тандемно повторяющихся 1—6 нуклеотидных единиц. Число по¬
второв в микросателлите и, следовательно, длина самих SSR-после-
довательностей очень сильно варьирует, что и позволяет их использо¬
вать в качестве маркеров. Например, в зависимости от видовой при¬
надлежности растений число микросателлитных повторов на геном
колеблется от 5 х 103доЗ х 105. Микросателлиты присутствуют прак¬
тически во всех геномах как про-, так и эукариот, и могут быть рас¬
сеяны как в гетеро-, так и эухроматиновых областях, включая экзо-
ны, интроны и межгенные участки. Микросателлиты также встреча¬
ются в геномах митохондрий и хлоропластов. Из-за своей высокой
мутабильности микросателлиты играют существенную роль в эволю¬
ции геномов и могут влиять на экспрессию генов.SSR-маркеры получают на основе ПЦР с использованием двух
олигонуклеотидных праймеров, комплементарных уникальным по¬
следовательностям, расположенным на концах SSR-локуса. В связи с
этим для конструирования праймеров к SSR-последовательностям
требуется предварительное получение геномных клонотек, гибриди¬
зация их с микросателлитным зондом, секвенирование отобранных
клонов и отбор полиморфных микросателлитных локусов.В последнее десятилетие благодаря высокому уровню вариабель¬
ности, кодоминантному типу наследования, простоте детекции с по¬
мощью ПЦР, а также необходимости небольшого количества ДНК
для анализа микросателлиты стали одними из самых популярных
маркеров в исследованиях внутривидового генетического разнообра¬
зия, а также генотипирования отдельных образцов. Кроме того, так
как микросателлитные последовательности достаточно плотно рас¬
сеяны по всему геному, они считаются идеальными генетическими
маркерами для построения молекулярно-генетических карт и насы¬
щения карт групп сцепления. К примеру, для риса, несущего в своем
геноме от 5 до 10 тыс. микросателлитных копий, удалось выявить 120
независимых микросателлитных SSR-маркеров, маркирующих все 12
хромосом его генома. Для мягкой пшеницы было выявлено 230 мик¬
росателлитных маркеров, локализованных на А, В и D геномах. Так¬
же проведено генетическое картирование 66 новых микросателлит-94
ных SSR-локусов твердой пшеницы. На основе SSR-маркеров была
построена генетическая карта сцепления плевела (Lolium perenne L.)
при помощи 309 специфичных для данного вида SSR-маркеров. При
этом большинство картированных SSR-локусов содержали динукле-
отидные (СА)„-повторы. Полученные SSR-маркеры покрывали 54 %
генетической карты плевела и преимущественно группировались во¬
круг предполагаемых центромерных регионов. Подробно охаракте¬
ризовано 172 SSR-маркера, использованных при построении молеку¬
лярно-генетической карты маниоки. В настоящее время на молеку¬
лярно-генетической карте кукурузы маркировано более 1000 микро-
сателлитных локусов. Также генетическая карта сои, включающая
689 RFLP, 79 RAPD, 11 AFLP, 10 изозимных и 26 локусов генетиче¬
ских признаков, была дополнена 606 SSR-маркерами.Одно из главных применений микросателлитных маркеров связа¬
но с возможностью их использования для маркирования и паспорти¬
зации сортов, а также разработки диагностических маркеров для важ¬
ных агрономических признаков. Так, одним из примеров SSR, сцеп¬
ленного с устойчивостью к болезни, является повтор (АТ)|5, локали¬
зованный внутри гена белка теплового шока у сои, который
располагается на расстоянии 0,5 сМ от гена ./^устойчивости к вирусу
мозаики у сои. Благодаря высокому уровню полиморфизма этот вид
маркеров используется для идентификации сортов, анализа внутри-
и межпопуляционной изменчивости. Например, с помощью SSR-ме-
тода анализировалась генетическая изменчивость различных сортов
сои, дыни, персика, черешни, яблони и др. Микросателлитные локу-
сы были использованы для идентификации близкородственных
форм сои {Glycine max и G. soja), характеризующихся низким уровнем
изменчивости. Также этот метод использовался для установления ге¬
нетических различий между видами колосняка — Elymus fibrrosus, Е.
alaskanus, Е. caninus и Е. mutabilis (Diaz, 1999), девятью видами рода
Licopersicon и некоторыми видами рода Brassica.Кроме того, микросателлиты имеют огромный потенциал для
внутри- и межпопуляционного анализа, предоставляя возможность
оценки размеров генетического дрейфа и уровня инбридинга в попу¬
ляциях. При этом, однако, высокая степень вариабельности микро¬
сателлитных локусов, позволяющая различить индивидуальные рас¬
тения, может ограничить их использование для оценки генетическо¬
го сходства между менее родственными генотипами. В настоящее
время разработаны микросателлитные маркеры более чем для сотни
растений, включая наиболее важные сельскохозяйственные виды.Высокая воспроизводимость SSR-маркеров и их большая дискри¬
минационная способность позволяет использовать их для паспорти¬95
зации сортов и линий сельскохозяйственных культур. В настоящее
время микросателлитные маркеры используются для идентификации
сортов картофеля, перца, томата, пшеницы, ржи, ячменя, яблок, роз,
олив и др.STS-метод анализа генома. SCAR-маркеры. В последнее время по¬
лучил развитие STS-метод, основанный на клонировании и секвени-
ровании фрагментов, полученных в результате RAPD-, RFLP- или
AFLP-анализа. Эти короткие последовательности, уникальные для
данного генома, используются как маркеры для картирования генов и
позиционного клонирования. С помощью STS-маркеров был карти¬
рован хлоропластный и митохондриальный геном растений кофе.
STS-маркеры, преобразованные из RFLP-фрагментов, были исполь¬
зованы для построения генетической карты ячменя и апельсина.
В сегрегационной F2 популяции ячменя на основе RFLP-маркеров
хромосомы 3 при помощи STS-метода картировали локусы таких
важнейших агрономических признаков, как величина и структура
урожая. При сравнении молекулярных карт растений, принадлежа¬
щих к различным систематическим группам, при помощи STS-мар-
керов выявлены гомологичные фрагменты у ячменя и плевела.STS-маркеры, созданные на основе данных о нуклеотидной по¬
следовательности полиморфных RAPD-маркеров, получили назва¬
ние SCAR (sequence characterized amplified region — охарактеризован¬
ный секвенированием амплифицированный участок). SCAR-марке-
ры являются кодоминантными. В этом смысле использование кодо-
минантных SCAR-маркеров является своеобразным дополнением
RAPD-метода и по сравнению с последним имеет несколько важных
преимуществ: характеризуется большей информативностью, высо¬
кой воспроизводимостью результатов и локусспецифичностью. Так¬
же они могут служить точками привязки между физическими и гене¬
тическими картами и использоваться для скрининга геномных биб¬
лиотек.Используя SCAR-маркеры, удалось осуществить идентификацию
и картирование генов устойчивости к вирусу мозаики бобов, пыль¬
ной головне у пшеницы и мучнистой росе у гороха. SCAR-анализ по¬
зволил маркировать в линиях томата ген устойчивости к вирусу мо¬
заики томата, полученный от дикорастущего вида Lycopersicon
peruvianum.На основе RAPD-маркеров, сцепленных с полом, у Actinidia
chinensis получены аллель-специфичные SCAR-праймеры, выявляю¬
щие нуклеотидные различия между растениями мужского и женского
пола, что крайне значимо при проведении селекционных работ. В по¬
пуляции пшеницы при использовании SCAR-маркера картирован96
ген устойчивости к листовой ржавчине Lr28, который ведет свое про¬
исхождение из Aegilops speltoides. SCAR-маркеры используются для
быстрой и эффективной идентификации пола в различных сортах
спаржи.Метод SNP-маркирования. Метод SNP (single nucleotide
polimorphism — точковый нуклеотидный полиморфизм) — позволя¬
ет исследовать такой наиболее общий тип ДНК-полиморфизма уни¬
кальных последовательностей геномов, какточковые мутации. К со¬
жалению анализ SNP в частной генетике растений пока еще не полу¬
чил такого широкого распространения, как при исследованиях гено¬
ма человека, хотя, по всей видимости, потенциал этого метода для
исследований как в области эволюционной и популяционной генети¬
ки, так и для прикладных целей селекции огромен. Относительно не¬
давние исследования SNP-полиморфизма у растений были предпри¬
няты пока только при генотипировании образцов кукурузы, картофе¬
ля, томата, сосны и сои.В целом, SNP-анализ может быть полезен для исследования мно¬
гих биологических феноменов, включая оценку частоты рекомбина¬
ции, происхождения популяций, генетического дрейфа. Создание
високо насыщенных генетических карт, видовая, сортовая иденти¬
фикация, а также характеристика коллекции генбанков представля-
кщ .еще одну обширную область применения этого метода.■M' SNP имеют относительно низкую мутационную скорость по
сфйвнению с микросателлитными локусами, и, как правило, биал-
Л)|Дьны. Однако комбинированные гаплотипы могут быть идентифи-
щфрваны посредством анализа тесно сцепленных SNP-аллелей. В
Настоящее время разработано множество методов детекции SNP,
включая аллель-специфичный PCR, TaqMan PCR, аллель-специ-
фнчную гибридизацию, пиросеквенирование, гибридизацию на
щ^срочипах и другие техники, применение которых определяется це-
З^ми и задачами конкретного исследования.ЩЩ' 2.16. НЕРЕШЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
t	РАСТЕНИЙПри значительном прогрессе в генной инженерии растений ос¬
тается большое количество нерешенных задач. Одна из проблем
связана с трудностью одновременного введения в геном растений
больших (более Ют. н. п.) генов или нескольких функциональных ге¬
нов. Это связано с емкостью векторов для трансформации. Сами
гены, особенно эукариотические, которые в последнее время все
чаще используются для трансформации растений, значительны по7-4266	07
размерам (5—15 т. н. п.). Но кроме выбранного гена векторные конст¬
рукции должны иметь в своем составе селективные гены. В некото¬
рых случаях для уменьшения длины используют кДНК-последова¬
тельность гена. Однако кДНК-копии не всегда приемлемы из-за спе¬
цифики сплайсинга in vivo или из-за присутствия, обычно в первом
интроне, специфических регуляторных последовательностей. Лими¬
тирующим фактором при использовании для трансформации расте¬
ний может быть и то, что необходимый признак кодируется несколь¬
кими генами и получение трансгенных растений, обладающих таким
признаком, в настоящее время технически несколько затруднено.Отдельно стоит проблема, возникающая при экспрессии чуже¬
родного гена: часто после двух-пяти поколений активно транскриби¬
рующийся трансген перестает экспрессироваться. Сточки зрения ло¬
гики это понятно: растительная клетка активно (например, из-за
сильного конститутивного промотора 35S CaMV) экспрессирует чуж¬
дый для ее метаболизма белок, обычно бактериального происхожде¬
ния. Чаще всего инактивация трансгена происходит из-за метилиро¬
вания регуляторных последовательностей либо возможна репресссия
в результате взаимодействия с промотором каких-то белков. Активи¬
зировать такой «выключенный» трансген не представляется возмож¬
ным. Спрогнозировать, будет ли со временем проходить такое «мол¬
чание» трансгена довольно трудно, так как оно зависит от ряда факто¬
ров, в том числе, по всей видимости, от последовательности самого
белка и конкретного места интеграции его в геном растения. Преодо¬
леть это, вероятно, в какой-то мере, возможно путем получения мно¬
гократной трансформации и получения различных линий, несущих
одинаковую векторную конструкцию с различными местами инте¬
грации в геном растений.Одной из главных причин, сдерживающих интенсивность и эф¬
фективность работ по трансгенозу, остается крайне слабое развитие
исследований по идентификации эффективных генов, созданию бан¬
ков генов и ограниченная научная база генетической инженерии, что
связано с крайне слабой финансовой поддержкой в нашей стране
биоинженерии как важнейшего приоритета XXI в.Контрольные вопросы к главам 1 и 21.	Каковы основные цели и задачи генной инженерии?2.	В чем основные отличия между селекцией растений и генной инженерией
растений при одинаковой конечной цели — получение новых сортов?3.	Почему рестриктазы I и III типов практически не используются в генной
инженерии?98
4.	Каким еще способом, кроме приведенного в тексте учебника, можно со¬
единить фрагменты с разноименными концами?5.	Что такое вектор и каковы основные типы векторов?6.	Что является определяющим при выборе вектора для клонирования?7.	В чем преимущества и недостатки клонирования в фагах?8.	В чем преимущества бинарного вектора по сравнению с коинтегратив-
ным?9.	Каковы основные отличия вектора для клонирования и вектора для
трансформации?10.	В чем преимущества прямого переноса генов в растительные клетки?11.	Какие существуют методы проверки истинности трансгенных растений?12.	На каких этапах получения трансгенных растений могут возникать труд¬
ности и почему?ЛИТЕРАТУРА К ГЛАВАМ 1 И 2Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск, Сибирское
университетское издательство, 2004.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и при¬
менение. — М.: Мир, 2002.Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. — СПб.: Изд-во
С-ПбГТУ, 1999.Патрушев Л.И. Экспрессия генов. — М., 2000.Сингер М, Берг П. Гены и геномы. Т. 1,2.— М.: Мир, 1998.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. — М.: Наука,
1986.Чемирис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. — М.:
Наука, 1999.Генная инженерия растений. Лабораторное руководство/Под ред.
Дж. Драйпера и др. — М.: Мир, 1991.Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. —
М.: Мир, 1986.
Глава 3КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
В СЕЛЕКЦИИ И РАСТЕНИЕВОДСТВЕ3.1. БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМОЙ КЛЕТКИОсновная форма существования жизни — клетка, в которой про¬
текают все физиологические процессы как у одноклеточных, так и у
многоклеточных организмов. Рост и размножение организмов связа¬
ны с образованием новых клеток. Совокупность биохимических про¬
цессов, обеспечивающих рост и развитие клетки, называется обменом
веществ, или метаболизмом. Каждая клетка на определенной стадии
делится и дает начало двум дочерним клеткам. Клетки разнообразны
по форме, величине, степени дифференциации и функциям.Клетка является элементарной единицей жизни: в ней имеется все
необходимое для поддержания обмена веществ и размножения. Со¬
матические и половые клетки многоклеточных животных и растений,
а также одноклеточные организмы сходны по строению. Среди жи¬
вых организмов встречаются два типа организации клеток. Наиболее
простое строение имеют клетки бактерий и сине-зеленых водорос¬
лей, которые объединяются в прокариотическую группу. У них нет
морфологически выраженного ядра. Клетки всех остальных предста¬
вителей живого мира относятся к эукариотической группе, потому что
у них обязательной структурой является клеточное ядро, отделенное
от цитоплазмы ядерной оболочкой. Кроме ядра и вакуолей, в цито¬
плазме существует целый набор специальных структур, или органелл,
выполняющих специфические функции.Ядро — центр, управляющий жизнедеятельностью всей клетки
и координирующий ее. Оно имеет сложное строение, изменяющееся
на разных этапах жизненного цикла клетки. Ядро окружено ядерной
оболочкой (мембраной), пронизанной порами, через которые осуще¬
ствляется обмен веществ между ядром и цитоплазмой. Внутри ядра
находятся хроматин, одно или несколько ядрышек и ядерный
сок — кариолимфа, или нуклеоплазма. Ядрышки — тельца, связан-100
ные с хромосомами, — содержат большое количество рибонуклеино¬
вой кислоты (РНК), в них происходит синтез рибосомной РНК.Энергия в клетке вырабатывается митохондриями — осо¬
быми сферическими или палочковидными образованиями разнооб¬
разной величины и сложной структуры. При исследовании цитоплаз¬
мы при помощи электронной микроскопии была открыта система
мембран и канальцев, служащих продолжением клеточной мембраны
и связанных с внешней мембраной ядерной оболочки. Эта система
получила название эндоплазматическойсети или р е -
тикулума. По эндоплазматической сети канальцев, образуемых
мембранами, передвигаются вещества внутри клетки. Здесь же от¬
крыты субмикроскопические частицы — рибосомы, состоящие из
белков и РНК.Важнейшими структурными элементами клетки являются пла¬
стиды— хлоропласты, лейкопласты, хромопласты и другие, ха¬
рактерные для цитоплазмы растительных клеток. Хлоропласты со¬
держат хлорофилл и участвуют в процессе фотосинтеза; бесцветные
пластиды синтезируют крахмал; хромопласты — пигменты; эупла-
сты — жиры и пластидные нуклеиновые кислоты.В цитоплазме клетки имеются специфические органиоды: ап¬
парат Гольджи — производное эндоплазматической сети —
обеспечивает выделительную и секреторную функцию клетки; л и -
з о с о м ы — тела, содержащие ряд ферментов и выполняющие
функцию пищеварения внутри клетки; центросомы — клеточ¬
ный центр которых состоит из недольших телец центриолей и цен¬
тросферы — особым образом дифференцированного участка цито¬
плазмы.Клеточная мембрана имеет сложное строение, приспо¬
собленное к выполнению определенных функций: защитной, изби¬
рательной проницаемости и активного втягивания частиц и молекул.
Активный транспорт молекул через клеточную мембрану осуществ¬
ляется при помощи ионных каналов.Передача наследственных признаков потомству как при вегета¬
тивном, так и при половом размножении осуществляется делением
клеток. Изучение процессов деления эукариотических клеток пока¬
зало, что из всех клеточных компонентов только хромосомы распре¬
деляются поровну между дочерними клетками (Дубинин, 1976, и др.).
Это указывает на участие хромосом в передаче наследственных при¬
знаков: в результате деления ядра каждая дочерняя клетка получает
точно такой же набор хромосом, как у исходной родительской клет¬
ки. В этом уравнительном распределении хромосом ядра заключается
генетическое значение митоза. Пластиды и митохондрии также раз¬101
множаются путем деления, но их распределение по дочерним клет¬
кам не подчиняется строгой закономерности.Деление клетки состоит из двух основных этапов: деление
ядра — митоз (кариокинез) и деление цитоплазмы (цитокинез). Ядро
клетки при делении проходит последовательные стадии: интерфазу,
профазу, метафазу, анафазу и телофазу. Между двумя последователь¬
ными делениями клетки ядро находится в стадии интерфазы. Хотя
интерфазу и называют стадией покоящегося ядра, но метаболические
процессы в ядре в этот период протекают наиболее активно.Продолжительность всего митотического цикла — от 30 мин до3	ч — зависит от вида и физиологического состояния организма, типа
ткани, внешних факторов — температуры, света и др. Скорость про¬
хождения отдельных фаз митоза также различна.Новый организм при половом размножении возникает из зиго¬
ты — оплодотворенной яйцеклетки, которая образуется при слиянии
гамет, т. е. мужской и женской половых клеток. Если бы каждая гаме¬
та вносила в зиготу полный набор хромосом родительского организ¬
ма, тогда бы их число увеличивалось вдвое за каждое поколение.
Мейоз, предшествующий образованию как женских, так и мужских
половых клеток, является регулирующим механизмом, позволяю¬
щим сохранять постоянное число хромосом.Мейоз — процесс деления клетки, при котором наблюдаются со¬
единение (конъюгация) гомологичных хромосом попарно и редукция
(уменьшение) их числа в клетках — продуктах деления. При мейозе
ядро делится дважды. В результате первого мейотического деления
образуются два ядра с половинным — гаплоидным числом хромосом.
Во втором делении каждое вновь образовавшееся ядро делится еще
раз, но уже митотическим путем — расходятся хромосомы, которые
образовались из сестринских хроматид. Таким образом, из каждой
клетки, вступившей в мейоз, после двух последовательных делений
образуются четыре клетки с половинным числом хромосом.При мейозе не только вдвое уменьшается число хромосом, но и
происходит распределение компонентов парных гомологичных хро¬
мосом по разным клеткам. При этом каждая пара ведет себя незави¬
симо. Редукции хромосом в мейозе предшествует слияние — конъю¬
гация гомологов, которое позволяет каждой паре гомологичных хро¬
мосом обмениваться участками. Это создает дополнительный резерв
наследственных комбинаций при половом размножении организмов.
Процесс обмена гомологичных хромосом своими частями получил
название кроссинговера.Таким образом, через комбинаторику гомологов из разных пар и
кроссинговер мейоз резко увеличивает наследственную изменчи¬102
вость нового поколения диплоидных организмов, возникающих по¬
сле слияния гамет.Возникшая после слияния отцовского и материнского ядер зигота
содержит программу развития будущего организма, записанную в
структурах молекул ДНК. Дочерние клетки развивающейся зиготы
получают информацию, которая позволяет им во взаимодействии с
условиями внешней среды формировать новый организм. Многочис¬
ленные факты и специально поставленные эксперименты показыва¬
ют, что в процессе индивидуального развития и специализации рас¬
тительных клеток генетическая информация в них не уменьшается,
все гены, как правило, сохраняются и при соответствующих благо¬
приятных условиях из каждой соматической клетки растения может
развиться целый организм. Это явление называется тотипотентно-
стью. В этом заключается отличие клеток растений от клеток высших
животных, для которых невозможна способность восстанавливать
целый организм.Все паренхимные клетки растения, в каких бы тканях они не на¬
ходились, содержат полный набор генов, такой же, какой имела зиго¬
та. Но в каждой ткани действует только часть генов, связанная с диф¬
ференциацией данного типа клеток. Одни гены функционируют во
всех клетках организма, например гены, контролирующие дыхание,
проницаемость мембран, синтез АТФ; другие — только в определен¬
ных. Каждая специализированная клетка характеризуется своим на¬
бором активных генов. Чем более специализированы клетки, тем
меньше в них активных генов. Разные гены работают не только в раз¬
личных клетках, но и в разное время, на разных стадиях развития осо¬
би. В однотипных клетках одной и той же ткани на разных стадиях
развития организма непрерывно меняется набор активных генов.
Одни гены включаются, синтезируя и-РНК определенных белков,
другие выключаются из этой работы.Образование в процессе развития из однородных клеток зароды¬
ша разнообразных по морфологическим признакам и функциям ти¬
пов клеток, тканей и органов называется дифференциацией. В основе
дифференциации тканей лежат различия в активности генов. Цен¬
тральная проблема онтогенетики — анализ действия гена при фор¬
мировании признака и установление промежуточных звеньев в цепи
ген — признак.В специализированных клетках работает ограниченная группа ге¬
нов, большая часть их репрессирована. Но ДНК и гены во всех расти¬
тельных клетках одинаковы, поэтому их активность должна опреде¬
ляться другими механизмами, включение которых не связано с дейст¬
вием генов. Такими механизмами активизации генов являются раз-юз
линия в структуре цитоплазмы, тканевая индукция и гормоны.
Яйцеклетка созревает под контролем генов, определяющих разнока-
чественность частей цитоплазмы, что приводит к неравноценности
продуктов первых делений и при дальнейшем размножении кле¬
ток — к тканевой дифференциации. Затем в процесс вступает эм¬
бриональная индукция — воздействие одних тканей зародыша на
другие. Это воздействие выражается в активации новых генов. Пред¬
полагают, что клетки ранее образующейся ткани выделяют вещества,
способные активизировать работу генов, необходимых для диффе¬
ренциации другой ткани, — тканевая индукция.Гормональная регуляция — наиболее хорошо изученный меха¬
низм активизации генов. Гормоны могут воздействовать на гены не¬
посредственно или вызывать появление в цитоплазме каких-то спе¬
цифических веществ, действующих затем на гены. Одни гормо¬
ны — очень сложные белки; другие — короткие цепочки полипепти¬
дов; третьи — простые производные аминокислот. Проникая в
клетку, гормоны воздействуют на комплекс гистоны-ДНК. и активи¬
руют отдельные локусы.Особую роль в дифференциации тканей играют гомеобоксовые
гены, группы которых содержат одинаковые элементы «гомеобоксы».
Они служат адресом для гормональных веществ-регуляторов, опреде¬
ляя одновременную активацию или репрессию целого семейства ге¬
нов. У растений гомеобоксовые гены были открыты в 1980-х годах.
Показано, что и у растений они контролируют порядок возникнове¬
ния и специализации метамеров (Э.Е. Хавкин, 1998).Таким образом, растительная клетка — весьма сложное образова¬
ние, включающее различные микроскопические и субмикроскопи-
ческие структуры, отличительной особенностью которых является
высокая динамичность, способность закономерно изменяться под
влиянием условий существования.3.2. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙКлеточная биотехнология базируется на способности клеток к су¬
ществованию и размножению in vitro, их тотипотентности и регене¬
рации. Метод культивирования изолированных тканей на искусст¬
венных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) применя¬
ют в растениеводстве для сохранения и размножения ценных геноти¬
пов, в эмбриогенезе, оздоровлении посадочного материала, для
получения продуктов вторичного метаболизма, в создании форм рас¬
тений, устойчивых к абиотическим и биотическм факторам окру¬
жающей среды, и т.д.104
Роль культуры изолированных клеток и тканей в биотехнологии
следует рассматривать в трех направлениях.Первое направление связано со способностью изоли¬
рованных растительных клеток продуцировать ценные для медици¬
ны, парфюмерии, косметики и других отраслей промышленности ве¬
щества вторичного синтеза: алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормо¬
ны, эфирные масла и др. Как правило, вторичные вещества получают
из каллусной ткани, выращенной на твердой (агаризованной) или
жидкой (суспензионная культура) питательной среде. На основе кле¬
точных технологий получают такие медицинские препараты, как ди-
осгенин из клеток диоскореи, аймолин из клеток раувольфии змеи¬
ной, тонизирующие вещества из клеток женьшеня, используемые в
медицине и парфюмерии. Продуктивность культивируемых клеток в
результате клеточной селекции может значительно превышать про¬
дуктивность целых растений. Преимуществом такого способа полу¬
чения веществ вторичного синтеза является также возможность ис¬
пользовать для этой цели растения, не произрастающие в наших при¬
родных условиях, и получать продукцию круглый год.Второе направление — это использование культуры
изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочно¬
го материала. Этот метод, названный клональным микроразмноже¬
нием растений, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч
растений в год.Третье направление — использование изолированных
клеток в селекции растений, дающее возможность получать быстро¬
растущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным фак¬
торам среды: засуха, засоление, низкие и высокие температуры, фи¬
топатогены, тяжелые металлы и др. Вместе с тем это направление
предусматривает создание новых растений путем слияния изолиро¬
ванных протопластов и получения неполовых (соматических) гибри¬
дов. Перенос в изолированные протопласты чужеродных генов мето¬
дами генной инженерии позволяет получать в дальнейшем растения с
новыми наследуемыми свойствами. Культивирование изолирован¬
ных пыльников и семяпочек на искусственных питательных средах
дает возможность получать гаплоиды, культивирование зародышей
позволяет получать растения из невсхожих (с плохо развитым эндос¬
пермом) гибридных семян. Оплодотворение в пробирке позволяет
преодолеть нескрещиваемость некоторых растений.Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь
зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечиваю¬
щих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенера¬
цию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регене¬105
рация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается
злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение
механизма морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе
процессов.Попытки культивировать изолированные от растений ткани дела¬
лись давно, и в истории развития этого метода можно выделить не¬
сколько этапов.I	этап (1892—1902 гг.) связан с именами таких немецких иссле¬
дователей, как Г. Хаберландт, X. Фёхтинг, С. Рехингер. Они пыта¬
лись культивировать в растворе сахарозы различные растительные
ткани. Для сегментов стеблей одуванчика и тополя был получен пер¬
вичный каллус и определен минимальный размер сегмента, способ¬
ного к каллусогенезу. Не достигнув положительных результатов, эти
исследователи высказали ряд идей и гипотез, которые подтвердились
значительно позже. Так, Г. Хаберландт выдвинул гипотезу о тотипо-
тентности любой живой растительной клетки, т. е. способности клеток
реализовывать свой потенциал развития и давать начало образованию
целого растения при определенных условиях культивирования.II	этап (1902—1922 гг.) ознаменовался созданием первых пита¬
тельных сред для культивирования тканей животных. Эти среды были
природного происхождения и содержали, как правило, плазму крови
и зародышевую жидкость. Попытки вырастить изолированные рас¬
тительные ткани на искусственных питательных средах, содержащих
растительные экстракты, оказались неудачными, так как в экспери¬
ментах использовались мало подходящие для проявления ростовой
активности клетки и ткани высших растений.III	э т а п (1922—1932 гг.). В этот период независимо друг от друга
американский ученый В. Робинс и немецкий ученый В. Котте пока¬
зали возможность культивирования на твердых питательных средах
меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Однако через опре¬
деленное время растительные ткани бурели и погибали. Подлинное
развитие метода культуры тканей растений началось с 1932 г.IV	этап (1932—1940 гг.) связан с именем французского уче¬
ного Р. Готре, который показал возможность долгого культивирова¬
ния в условиях in vitro растительных тканей за счет периодического
пересаживания их на свежую питательную среду. Это открытие дало
новый толчок в работе по культуре ткани, который ознаменовался на¬
растающим числом новых объектов, успешно введенных в культуру.V	э т а п (1940— 1960 гг.). С открытием в 1955 г. нового класса фи-
тогормонов-цитокининов, и в частности кинетина, была получена
возможность стимулировать деление клеток кусочка ткани сердце¬
винной паренхимы табака, лишенной проводящих пучков и камбия.106
В зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов роста
можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост
каллусной ткани, индуцировать морфогенез. В этот период было оце¬
нено положительное действие натуральных экстрактов типа эндос¬
перма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для
поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции
процессов морфогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных
суспензий.VI	этап (1960—1975 гг.). Наиболее важным событием этого
периода была разработка профессором Ноттингемского универси¬
тета Э.К. Коккингом метода получения ферментативным путем изо¬
лированных протопластов из корней и плодов томата и культивиро¬
вания их в контролируемых условиях. Позжев 1970г. в той же лабора¬
тории С. Пауэром и сотрудниками было осуществлено искусствен¬
ное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию
соматических гибридов. В этот же период разработан метод клональ¬
ного микроразмножения растений в условиях in vitro с использовани¬
ем меристемной культуры. Основоположником данного направле¬
ния был французский ученый Ж. Морель, который получил оздоров¬
ленный посадочный материал орхидей и картофеля.VII	этап (1975 г.—по настоящее время). Продолжается бы¬
строе развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых
объектов, разрабатываются методы электрослияния изолированных
протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы по¬
лучения гаплоидных растений, совершенствуется метод глубинного
культивирования клеток с использованием изолированных прото¬
пластов и векторов, созданных на основе Ti- и Ri-плазмид
Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes. При помощи методов генной
инженерии разработан эффективный метод переноса генов для дву¬
дольных растений. Таким образом, за последние десятилетия был
сделан большой шаг вперед в развитии технических приемов работы с
изолированными тканями и клетками растений. Однако объектом
исследования, как правило, служили одно- и двудольные травяни¬
стые растения и в редких случаях — древесные.3.3.	ТЕХНИКА ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO
И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙНеобходимым условием работы с культурой изолированных тка¬
ней является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная
среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроор¬107
ганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), ко¬
торые помещают на питательную среду, легко поражаются микроор¬
ганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и пита¬
тельную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введе¬
ние в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в
асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструмен¬
тами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изо¬
лированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажно¬
сти, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в про¬
бирку могут проникать микроорганизмы.Стерилизацию экспланта и семян проводят, выдерживая их 5—
20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной
промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зави¬
сит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора.
Семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части 5—10 мин.
Примеры стерилизующих растворов приведены в табл. 3.1.Таблица 3.1. Стерилизация исходного растительного материала
(Р. Г. Бутенко, 1990)ОбъектВремя стерилизациидиацид,
0,1 %-йсулема,
0,1 %-йгипохлориты
(Na, Са),
5-9 %-йпероксид во¬
дорода,
10-12 %-йСемена:сухие15-210-1515-2012-1набухшие6-106-810-156-8Ткани:мясистого корня,клубни20-315-2515-20—одревесневшие стебли20-420-2520-25—Листья1-31-33-63-5Апексы1-101-73-152-7Органы растений, из которых берут эксплант для введения в куль¬
туру, предварительно моют щеткой в мыльном растворе и споласки¬
вают дистиллированной водой, а затем погружают на несколько се¬
кунд в 70 %-й этанол. Семена погружают в спирт на 1—2 мин. Кроме
собственно стерилизующего действия спирта обработка тканей эта¬
нолом перед помещением в основной стерилизующий раствор повы¬
шает стерилизующий эффект последнего.После стерилизации растительные объекты должны быть тща¬
тельно промыты стерильной водой.Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от на¬
ружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю ин¬108
фекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Особенно
богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических
растений с крупными сосудами. Загрязнение культур грибами или
бактериями обычно выявляется через 1—14 дней после посадки. За¬
грязненные культуры необходимо тотчас же удалить, чтобы избежать
заражения воздуха в световой комнате.Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре
120 °С и давлении 0,75—1 атм в течение 20 мин. Если в состав пита¬
тельной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой темпе¬
ратуре, их подвергают холодной стерилизации, пропуская через бак¬
териальные фильтры с диаметром пор 0,22—0,45 мкм, после чего до¬
бавляют в проавтоклавированную охлажденную до 40 °С основную
среду.Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бу¬
магу, стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 °С в те¬
чение двух часов.Питательные среды для культивирования изолированных клеток и
тканей должны включать все необходимые растениям макроэлемен¬
ты (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэле¬
менты (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витами¬
ны, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некото¬
рые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты.
Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиамин-
тетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают
доступность железа для клеток.Для получения каллусной ткани в отдельных случаях к питатель¬
ной среде добавляют жидкий эндосперм кокосового ореха (кокосовое
молоко), каштана и др.Углеводы являются необходимым компонентом питательных
сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в
большинстве случаев последние не способны к автотрофному пита¬
нию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюко¬
зу в концентрации 2—3 %.Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для
индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных
тканей в состав питательных сред должны обязательно входить аукси¬
ны, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины,
индуцирующие деление клеток. В случае индукции стеблевого мор¬
фогенеза содержание ауксинов в среде может быть снижено или они
могут быть полностью исключены из питательной среды.109
На безгормональной среде растут опухолевые и «привыкшие»
ткани. Автономность по отношению к обоим гормонам или к одному
из них связана со способностью этих клеток синтезировать гормоны.В качестве источников ауксинов в питательных средах использу¬
ют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-3-уксус-
ную кислоту (ИУК), а-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получе¬
ния рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так
как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.В качестве источников цитокининов в искусственных питатель¬
ных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеа-
тин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддер¬
жании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по
сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин.В настоящее время известно большое число различных по составу
питательных сред, но наиболее часто применяемая при выращивании
изолированных растительных тканей в условиях in vitro среда Т. Му-
расига и Ф. Скуга, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит
хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается
от других, как правило, соотношением аммонийного и нитратного
азота (табл. 3.2).Таблица 3.2. Состав питательных сред для культивирования
изолированных тканей растенийКомпоненты питательной
средыКонце нтратрация, мг/лМурасига —
СкугаГамборгаШенка —
ХильдебрандтаГрессхофф —
Доуnh4no3165025002500—nh4h2po4——300—kno31900——1000СаС12 2Н20440150200150MgS04 7Н20370250400250(NH4)2S04—130—200КН2Р04170———Na23flTA37,337,320,037,3FeS04 • 7Н2027,9527,8515,027,8NaH2P04 • Н20—150—90Н3ВО36,23,05,03,0MnS04 • 4Н2022,310,010,010,0ZnS04 7Н208,62,01.03,0К10,830,751,00,75Na2Mo04 2Н200,250,250,10,25CuS04 • 5Н200,0250,0250,20,25110
Окончание табл. 3.2Компоненты питательной
средыКонцентратрация, мг/лМурасига —
С кугаГамборгаШенка —
ХильдебрандтаГрессхофф —
ДоуСоС12 • 6Н200,0250,0250,10,25Глицин2,0——2,0Мезоинозит100100100010Никотиновая кислота0,51,05,01,0Пиридоксин — НС10,51,00,50,1Тиамин — HCI110,05,00,12,4-Д—©то——Кинетин—0,10,1—Глутамин———2,0Сахароза30 00030 00030 00020 000Для приготовления твердых питательных сред используют
агар-агар, который представляет собой полисахарид, получаемый из
морских водорослей.С целью рационального использования времени растворы солей
макро- и микроэлементов, а также витаминов и фитогормонов гото¬
вят более концентрированными, что позволяет многократно их ис¬
пользовать. Концентрированные (маточные) растворы хранят в холо¬
дильнике.Условия культивирования. Для успешного культивирования изо¬
лированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать опре¬
деленные условия выращивания. Большинство каллусных тканей не
нуждается в свете, так как не имеют хлоропластов и питаются гетеро-
трофно. Исключение составляют некоторые зеленые каллусные тка¬
ни, такие, как каллусная ткань мандрагоры. В некоторых случаях кал¬
лусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выра¬
щивают на непрерывном освещении, что является необходимым ус¬
ловием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны.
Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рас¬
сеянном свете.Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и да¬
лее культивируют их при освещенности 1000—4000 лк.Культивирование изолированных меристем и их микроразмно¬
жение также происходит на свету. Освещенность факторостатной
(световой) комнаты должна составлять в зависимости от культуры
3000—10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требу¬
ется для данного культивируемого объекта. Влажность в световой
комнате должна составлять 60—70 %. Более сухой воздух способству-111
ет усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они за¬
крыты ватными пробками, изменению ее концентрации и наруше¬
нию условий культивирования. Для повышения влажности в комнате
можно использовать поддоны с водой.Оптимальная температура для большинства культивируемых тка¬
ней 25—26 °С, для культуры тканей тропических растений она может
достигать 29—30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру по¬
нижают до 18—20 °С.Наилучшие световой и температурный режимы, а также режим
оптимальной влажности можно создать при помощи климатических
камер.3.4.	КУЛЬТУРА КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙОбщие положения. Культура изолированных тканей обычно быва¬
ет представлена каллусными или реже опухолевыми тканями. Кал-
лусная культура — это неорганизованная пролиферирующая ткань,
состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они
специализируются как каллусные, т. е. становятся особым образом
дифференцированными. Каллус, что означает «мозоль», может обра¬
зовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) in
vitro, так и на растении при поранении.Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтовато¬
го, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интен¬
сивную зеленую окраску (у мандрагоры). Темно-коричневая окраска
возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накопле¬
нием в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавле¬
ния от них в питательные среды вносят антиоксиданты.Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической
структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращива¬
ния она может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из
сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мел¬
кие агрегаты; 2) средней плотности с хорошо выраженными меристе-
матическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются
элементы камбия и проводящей системы.Обязательным условием дедифференцировки растительной клет¬
ки и превращения ее в каллусную является присутствие в питатель¬
ной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и ци-
токининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки,
подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию
(деление) дедифференцированных клеток (рис. 3.1). Если в питатель¬
ную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без112
Рис. 3.1. Получение культуры каллусной ткани из различных эксплантов:
фрагментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинокверхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из
специализированных (дифференцированных) клеток, то деления
клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с
неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая
клетка проходиттри фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) диффе-
ренцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста явля¬
ется утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой
способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клет¬
ки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы про¬
изошла их дедифференцировка, т. е. клетки как бы возвратились в ме-
ристематическое состояние. Размножение дедифференцированных
клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в
результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превра¬
щение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией
клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе
дифференцировки.У	сердцевинной паренхимы табака (СПТ) отсутствие цитокини-
нов в питательной среде блокирует клеточный цикл в премитотиче-
ском периоде. Поэтому, если в питательной среде присутствует толь¬
ко ауксин, клетки не делятся и после четырехдневной латентной
фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины без аукси¬
нов приводят к такому же старению тканей СПТ, как и на среде без
гормонов. Приведенные данные, полученные для СПТ, не всегда мо¬
гут объяснить всех случаев, когда каллусная ткань получается на сре¬
де с одним гормоном, например каллусообразование на среде с 2,4-Д
без цитокининов у незрелых зародышей пшеницы или получение
каллуса на семядолях подсолнечника на среде с цитокининами, но113
без ауксинов. Установлено, что результаты во многом зависят от эн¬
догенных гормонов, содержащихся в клетках того или иного эксплан¬
та, т. е. связаны с особенностями их гормонального статуса.Имеются новые представления, согласно которым не ауксины и
цитокинины, а полисахариды и какие-то другие индукторы вызыва¬
ют деление клеток, приводящее к образованию каллуса.Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса
начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается
24—48 ч. В течение этого времени клетки увеличиваются в размерах и
ткань разрыхляется. После лаг-фазы клетки начинают быстро де¬
литься, образуя каллусную ткань. Таким образом, если дедифферен-
цировка специализированной клетки связана с индукцией деления
под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся ме-
ристематической клетки связана с остановкой делений, деспециали¬
зацией клетки и только после этого — с индукцией делений, приво¬
дящей к каллусообразованию.Эффект, вызываемый действием одних и тех же фитогормонов,
может быть различным в зависимости от физиологической характе¬
ристики ткани-мишени. Компетентность ее в рассмотренных приме¬
рах определяется степенью дифференцировки клеток.Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к де-
дифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен из¬
менением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активи¬
рование одних генов и репрессирование других приводит к измене¬
нию в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются спе¬
цифические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в
количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток лис¬
та. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов,
лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у од¬
нодольных.При переходе дедифференцированной клетки к неорганизован¬
ному анархическому размножению, приводящему к образованию
каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологи¬
ческие изменения. Дедифференцировка начинается с использования
запасных веществ и разрушения специализированных клеточных ор-
ганелл. Через 6— 12 ч после индукции дедифференцировки клеточная
стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных ри¬
босом, число элементов аппарата Гольджи, а также размеры и число
ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые
начинаются через 48—72 ч. Следует учитывать, что в клетках эксплан¬
та в начале культивирования могут наблюдаться изменения в метабо¬
лизме, вызванные какдедифференцировкой, так и травматическими114
синтезами. Для разделения этих процес¬
сов лучше проводить прединкубацию
экспланта на безгормональной среде
3—6 сут. Каллусная клетка имеет свой
цикл развития и повторяет развитие лю¬
бой клетки, включая деление, растяже¬
ние и дифференцировку, после чего на¬
ступает старение и гибель клетки. Кал-
лусную дифференцировку можно на¬
звать вторичной, но ее не следует путать
со вторичной дифференцировкой клет¬
ки, лежащей в основе морфогенеза.Для того чтобы не произошло старе¬
ния, утраты способности к делению и
гибели каллусных клеток, первичный
каллус, возникающий на эксплантах,
через 4—6 недель переносят на свежую
питательную среду. Эту операцию назы¬
вают пассированием. При регулярном
пассировании способность к делению
может поддерживаться в течение десят¬
ков лет.Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму (рис.
3.2). Такой характер роста легко обнаружить у суспензиозных культур
каллусных клеток. Кривая роста включает пять фаз. Во время 1-й ла¬
тентной или лаг-фазы увеличения числа или массы клеток не проис¬
ходит. Клетки в этот период подготавливаются к делениям. Следую¬
щая, 2-я фаза — логарифмическая, или экпоненциального рос¬
та — характеризуется наибольшей митотической активностью и уве¬
личением массы каллусной культуры, кроме того, рост происходит с
ускорением. 3-я фаза — линейная, в которой скорость роста клеток
постоянна. Далее наступает 4-я фаза — замедленного роста, когда
митотическая активность клеток резко снижается. В 5-й — стацио¬
нарной — фазе ростовая кривая выходит на плато. В этот период на¬
чинается деградация клеток, однако она еще уравновешивается воз¬
растанием числа клеток за счет их деления; в целом же скорость на¬
растания клеточной массы равна нулю. После стационарной фазы
наступает гибель (деградация) клеток, во время которой число и мас¬
са живых клеток уменьшается.Особенности каллусных клеток. Каллусные клетки in vitro сохра¬
няют многие физиолого-биохимические свойства, присущие нор¬
мальным клеткам, входящим в состав растительного организма. Кал-ВремяРис. 3.2. Модельная кривая
ростового цикла при периоди¬
ческом выращивании каллус¬
ных тканей. Фазы роста:1 — латентная; 2 — логарифмическая;
3 — линейная; 4—замедления; 5 —
стационарная115
лусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метабо¬
литов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи кал-
лусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим
свойством не обладают каллусные ткани, полученные от тропических
и субтропических культур. Таким образом, устойчивость к низким
температурам сохраняется при переходе клетки к каллусному росту.
Каллусным тканям свойственна и фотопериодическая реакция, что
связано с сохранением активности фитохрома.Общим у каллусных и нормальных клеток растения является и
еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких
температур, осмотически активных веществ, засолению.Вместе с тем каллусные клетки обладают отдельными свойства¬
ми, отличающими их от нормальных. В них появляются специфиче¬
ские белки и уменьшается количество белков, характерных для фото¬
синтезирующих клеток листа, или они совсем исчезают. Каллусные
клетки отличаются большой генетической гетерогенностью и физио¬
логической асинхронностью.В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных
клеток происходит неорганизованно, асинхронно и является неогра¬
ниченным. При пересадках на свежую питательную среду культура
каллусной ткани моркови, полученная Р. Готре более 60 лет назад, до
сих пор растет в коллекции.Клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у рас¬
тений, произрастающих в открытом грунте.Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по воз¬
расту. В каллусной ткани одновременно присутствуют клетки моло¬
дые в (7|-фазе, старые в ф- и 5-фазах цикла клеточных делений.Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене
каллусных клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению
с нормальными. Еще в 1938 г. Рамсгорн обнаружил такую же особен¬
ность у меристематических клеток, следовательно, это свойство ак¬
тивно делящихся клеток. Дыхательный коэффициент (Д. К) каллус¬
ных клеток более 1. Так, в каллусе гороха Д.К > 3,5 (А.В. Романова и
др., 1988). Это свидетельствует о сдвиге соотношения между дыхани¬
ем и брожением в сторону усиления брожения, т. е. о снижении эф¬
фекта Пастера. Под эффектом Пастера понимают подавление броже¬
ния дыханием в присутствии кислорода. Увеличение дыхательного
коэффициента при неизменном дыхательном субстрате говорит о
том, что дыхание перестает подавлять брожение и даже в присутствии
кислорода в каллусных клетках наряду с дыханием идет бескислород¬
ное расщепление углеводов — брожение. О бескислородном расщеп¬
лении углеводов при неорганизованном росте свидетельствует нако¬116
пление этилового спирта в делящихся клетках. Такие данные получе¬
ны при индукции неорганизованного роста на интактных проростках
гороха (Г.М. Артамонова, 1975, 1978).Митохондрии в каллусных клетках так же, как и в меристематиче-
ских, являются слабо развитыми, в них мало крист, что не может не
оказывать влияния на активность аэробного дыхания.Наиболее выражено нарушение эффекта Пастера в опухолевых
клетках животных. Это явление было обнаружено Варбургом, но до
настоящего времени не имеет четкой интерпретации. Возникающий
вследствие нарушения эффекта Пастера аэробный гликолиз, под ко¬
торым понимают бескислородное расщепление углеводов в присут¬
ствии кислорода, приводит к очень резкому (в 19 раз) усилению по¬
требления углеводов опухолевыми клетками.Наряду с изменением характера дыхания в каллусных клетках в
направлении усиления бескислородного расщепления углеводов
происходит также сдвиг в сторону пентозофосфатного пути, который
является источником пентоз, необходимых для делящихся клеток.Генетика каллусных клеток. Длительное время считали, что кал-
лусные клетки генетически строго однородны. Однако в 60-х годах
было выяснено, что клетки каллусной ткани обладают выраженной
генетической гетерогенностью. Генетическая неоднородность кал¬
лусных клеток выражается прежде всего в различной плоидности, т. е.
каллусные клетки отличаются по числу хромосом. Генетически ста¬
бильными in vitro являются меристематические ткани.В каллусных и суспензионных культурах встречаются клетки,
имеющие диплоидный набор хромосом, свойственный исходному
растению, а также полиплоидные клетки, содержащие 3, 4, 5 и более
хромосомных наборов. Наряду с полиплоидией в культуре каллусных
тканей можно нередко наблюдать анеуплоидию (возрастание или
уменьшение хромосомного набора на несколько хромосом). Чем
дольше культивировать каллусные клетки, тем больше они различа¬
ются по плоидности. В каллусных клетках табака через четыре года
культивирования совсем не остается диплоидных клеток: все клетки
становятся полиплоидными или анеуплоидными. Этот факт указыва¬
ет на то, что изменение плоидности происходит под влиянием усло¬
вий культивирования и прежде всего входящих в состав питательной
среды веществ. Однако можно интерпретировать его и иначе. Поли¬
плоидные клетки имеют меньшую лаг-фазу и поэтому быстрее пере¬
ходят к делениям, чем диплоидные. Вследствие этого они и получают
преимущество в дальнейших пассажах. Скорее всего влияние оказы¬
вают обе причины.117
Кроме изменения плоидности, культивирование клеток и тканей
растений in vitro вызывает появление в клетках хромосомных аббера-
ций. Последние сказываются на биологических особенностях куль¬
тивируемых тканей, изменяя их внешний вид, обмен веществ, ско¬
рость роста. Наряду с видимыми под микроскопом хромосомными
мутациями в культивируемых клетках могут возникать изменения, не
выявляемые микроскопически. Эти изменения могут затрагивать как
незначительные участки хромосом, так и структуру генов. Генные му¬
тации выявляются по изменению морфологии и физиолого-биохи-
мических свойств клеток.Каковы же причины генетической нестабильности культивируе¬
мых клеток? Таких причин несколько. Прежде всего — это генетиче¬
ская неоднородность исходного материала (гетерогенность эксплан-
та). У многих растений дифференцированные ткани характеризуются
наличием клеток разной плоидности и лишь активно пролиферирую¬
щие в течение онтогенеза ткани; такие, как верхушечные меристемы,
камбий и другие остаются всегда диплоидными. Другой причиной
может быть длительное пассирование тканевых и клеточных культур,
приводящее к накоплению в них генетических изменений, в том чис¬
ле к неравномерному изменению плоидности. Нарушение корреля¬
тивных связей при изолировании участков тканей растений и поме¬
щении их на питательную среду также приводит к генетической не¬
стабильности клеток. Подобные результаты могут быть связаны и с
влиянием на генетический аппарат клетки входящих в состав пита¬
тельных сред фитогормонов. В качестве гормонов в питательные сре¬
ды для каллусообразования обязательно входят ауксины и цитокини-
ны. О мутагенном действии этих веществ известно из целого ряда ра¬
бот. Наиболее активным мутагенным препаратом является 2,4-Д,
входящий в состав большинства питательных сред. Цитокинины, в
частности кинетин, способствуют полиплоидизации клеток.Генетическое разнообразие каллусных клеток позволяет исполь¬
зовать их для клеточной селекции на устойчивость к неблагоприят¬
ным факторам среды, фитопатогенам и на повышенную продуктив¬
ность.3.5.	ГОРМОНОНЕЗАВИСИМЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ТКАНИКаллусные клетки могут делиться только при наличии гормонов в
питательной среде. Однако при длительном культивировании они в
ряде случаев могут приобрести способность расти на среде без гормо¬
нов, т. е. становятся автономными по отношению к ауксинам и цито-
кининам. Такие клетки называются «привыкшими». Нередко ткани,118
образованные «привыкшими» клетками, называют химическими
опухолями. «Привыкшие» ткани, как и опухолевые, в большинстве
случаев не способны к нормальной регенерации и образуют лишь те¬
ратомы, хотя по некоторым данным из них в отдельных случаях полу¬
чаются нормальные регенеранты.Следует отметить, что у всех каллусных тканей в процессе куль¬
тивирования, у некоторых культур уже начиная с 4-го пассажа, за¬
метно снижается, а затем и полностью утрачивается способность к
регенерации. Из старых пересадочных культур получить расте-
ния-регенеранты не удается.Пока нет четкого ответа о причинах «привыкания». Возможно,
что оно связано с длительным действием на клетки гормонов, под¬
держивающих их в дедифференцированном или активно пролифери¬
рующем состоянии.Кроме «привыкших» тканей, представляющих собой химические
опухоли, существуют опухоли растительного происхождения, вы¬
званные бактериями, вирусами, а также генетические опухоли, воз¬
никающие на межвидовых гибридах различных растений. Наиболее
распространенными в природе и представляющими наибольший ин¬
терес для исследователей являются корончатые галлы-опухоли, ин¬
дуцированные удвудольных растений агробактериями (Agrobacterium
tumefaciens). Часто встречаются еще два вида истинных опухолей у
растений — бородатый корень (заболевание, вызываемое А.
rhizogenes) и стеблевой галл, вызываемый A. ruby, сходный с коронча¬
тым галлом.Общим свойством «привыкших» и опухолевых растительных тка¬
ней является их гормононезависимость, т. е. способность расти на
средах без гормонов. Это основное их отличие от каллусных тканей,
для которых присутствие гормонов в питательной среде является не¬
обходимым условием дедифференцировки и пролиферации клеток.В «привыкших» тканях так же, как и в опухолевых, идет интенсив¬
ный синтез собственных гормонов, поэтому они не нуждаются во
внесении их в питательные среды.Внешне гормононезависимые ткани не отличаются от каллусных,
и основным их отличием является приобретение способности к ин¬
тенсивному синтезу гормонов. Это свойство является общим как для
«привыкших», так и для опухолевых клеток. Однако пути для реше¬
ния этой задачи у них различны. У «привыкших» тканей гормононе¬
зависимость достигается в результате изменения активности генов,
отвечающих за синтез ферментных белков, участвующих в построе¬
нии молекул гормонов, следовательно, отвечающих за синтез гормо¬
нов. Таким образом, изменения в данном случае имеют эпигеномный119
характер, хотя нельзя исключить и возможность мутаций. Для того
чтобы ответить на вопрос, являются ли изменения в «привыкших»
клетках эпигеномными или генетическими, можно проверить, сохра¬
няется ли свойство гормононезависимости в ряду: клетка — расте¬
ние — клетка. С этой целью необходимо получить регенерацию в
«привыкшей» ткани, а затем эксплант от регенерировавшего расте¬
ния поместить на питательную среду без гормонов или без одного из
гормонов. Если в такой среде клетки будут делиться, т. е. окажутся ав¬
тономными по отношению к гормонам, то это означает, что свойство
гормононезависимости передается по наследству следующим поко¬
лениям, следовательно, оно имеет генетическое происхождение.
Если же на безгормонал ьной среде клетки делиться не будут и каллус¬
ной ткани не образуют, т. е. гормононезависимость не наследуется, то
это позволяет сделать вывод об эпигеномном характере изменений.
Проведенные эксперименты говорят в пользу эпигеномного характе¬
ра гормононезависимости в «привыкших» тканях. Однако таким пу¬
тем можно проверить только те «привыкшие» клетки, которые не ут¬
ратили способность к регенерации. В то же время подавляющее боль¬
шинство «привыкших» клеток теряет способность к регенерации, что
затрудняет использование предложенного метода для определения
характера природы гормононезависимости.В опухолевых тканях синтез гормонов связан с переносом в расти¬
тельную клетку бактериального гена, отвечающего за этот процесс.В 40-х годах XX в. Б. Браун, ученик Ф. Уайта, показал, что куль¬
тура ткани корончатогалловой опухоли даже в отсутствие агробакте¬
рий, например после гибели их под воздействием повышенной тем¬
пературы, сохраняет опухолевые свойства. На искусственной пита¬
тельной среде без гормонов ткань корончатого галла, лишенная бак¬
терий, продолжала интенсивно пролиферировать. Ткани корончатых
галлов содержат более высокие уровни ауксинов, чем нормальные, и
продуцируют несколько цитокининов. На основании своих опытов
Б. Браун пришел к выводу, что растительные клетки каким-то обра¬
зом трансформируются (превращаются) в опухолевые после воздей¬
ствия Agrobacterium tumefaciens. Было выдвинуто предположение, что
агробактерии вводят в клетки растения фактор Tip (Tumor inducing
principle), который за 36 ч превращает нормальные клетки в опухоле¬
вые. В дальнейшем оказалось, что Tip представляет собой ДНК и на¬
ходится в большой плазмиде агробактерии (Ti-плазмида). Онкоген-
ная активность может быть утрачена в результате удаления из бакте¬
риальной клетки всей Ti-плазмиды или ее определенной части.120
В 1977 г. Чилтон с сотр. доказали, что опухоли корончатого галла
возникают в результате включения определенного фрагмента
Ti-плазмиды агробактерии в растительную ядерную ДНК.Таким образом, сегмент Ti-плазмиды (Т-ДНК) интегрируется в
хромосому и становится частью наследственного аппарата трансфор¬
мированной (опухолевой) растительной клетки. Интеграция Т-ДНК
Ti-плазмиды агробактерии в хромосому растения приводит к появле¬
нию опухоли и гормононезависимому росту опухолевых клеток на
искусственных питательных средах. Оба эти явления тесно связаны
друг с другом, так как именно гормононезависимость, являющаяся
следствием экспрессии генов, контролирующих синтез ауксинов и
цитокининов, приводит к дедифференцировке и пролиферации кле¬
ток.Ti-плазмида является природным вектором (переносчиком) но¬
вых генов в растения. Путь синтеза ауксинов и цитокининов клетка¬
ми опухолей, индуцированных агробактериями, иной, чем у нор¬
мальных и «привыкших» клеток. Он более простой и короткий. С по¬
мощью мутагенов стало возможным идентифицировать участки
Т-ДНК, контролирующие изменения гормональной активности.
Было выяснено, что не один локус, а ряд генов ответственны за опу¬
холевый рост.Кроме ауксинов и цитокининов Т-ДНК детерминирует синтез
галлами нового класса аминокислот, не встречающихся в приро¬
де, — опинов. Эти вещества не являются причиной возникновения
опухолей: они синтезируются в уже образовавшейся опухолевой тка¬
ни. Опухоли начинают синтез опинов в возрасте нескольких дней,
например, на коланхоэ синтез опинов начинается на 7-й день с мо¬
мента индукции опухолей. Опины — производные аминокислот,
различных кетокислот и сахаров. Они являются биологически актив¬
ными соединениями нового типа, обнаруживаемыми только в тканях
корончатых галлов у растений, поэтому их можно рассматривать как
биохимические маркеры для клеток корончатых галлов. Опины слу¬
жат питательным веществом для агробактерии, однако опухоли про¬
должают продуцировать эти соединения и в стерильных культурах, не
содержащих агробактерии. Известно три типа опинов: нопалин, ок-
топин и агропин. Одни штаммы бактерий индуцируют октопинпро-
дуцирующие опухоли, другие — нопалинпродуцирующие.Итак, первое общее свойство «привыкших» и опухолевых тканей,
индуцированных агробактериями, заключается в гормононезависи-
мости, связанной с приобретением способности интенсивно синте¬
зировать гормоны. В галловых опухолях такая способность возникает
в результате переноса чужеродного гена из бактериальной клетки в121
растительную. В клетках химических опухолей («привыкших» тка¬
нях) это же свойство связано, как полагают, с депрессией генов, отве¬
чающих за синтез гормонов, однако оно может быть связано и с мута¬
циями.Второе общее свойство, которое вытекает из первого,— потеря
способности «привыкших» и опухолевых клеток, индуцированных
агробактериями, регенерировать фертильные растения. Галловые
опухоли в подавляющем большинстве случаев не способны к регене¬
рации нормального растения. Иногда они образуют тератомы (урод¬
ливые органоподобные структуры), которые не могут развиваться
нормально.«Привыкшие» ткани обычно также не регенерируют нормальных
растений, их клетки утрачивают способность ко вторичной диффе-
ренцировке и морфогенезу. Однако в некоторых случаях, варьируя
составы питательных сред, удается отодвинуть порог «привыкания».
Следовательно, имеется резерв, использование которого позволит
получать растения-регенеранты из все более длительно пассируемых
тканевых культур.3.6.	КУЛЬТУРА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙСуспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в
жидкую питательную среду с автоматическим перемешиванием. Ис¬
пользуя фермент, например пектиназу, получаем суспензионную
культуру непосредственно из ткани экспланта (лист, стебель, корень
и т. д.). Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная
ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в
результате чего получается клеточная суспензия. Для получения
100 мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной
ткани.Необходимым условием культивирования клеточных суспензий
является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если
клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление
суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.Деление суспензионных клеток поддерживается при наличии
ауксинов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы для
индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные
культуры представлены типичными каллусными клетками, обладаю¬
щими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на
средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция об¬
легчает суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавле¬122
ние в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция,
склеивающий отдельные клетки.Клеточные суспензии в биотехнологии используют для получе¬
ния вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными
лекарственными препаратами, для промышленного выращивания
клеточной биомассы и для клеточной селекции. Наряду с этим сус¬
пензии клеток можно применять в качестве исходного материала для
получения изолированных протопластов.При использовании суспензионных культур в качестве продуцен¬
тов вторичных веществ применяют закрытые или открытые системы
ферментеров в периодическом или проточном режимах выращива¬
ния клеток. В закрытой системе клеточная суспензия лишена прито¬
ка свежей питательной среды до конца выращивания, а в случае не¬
прерывного режима выращивания в открытой системе питательная
среда меняется на свежую. Как при периодическом, так и при проточ¬
ном режимах выращивания в открытой системе клетки остаются в
питательной среде и не удаляются даже при ее замене. Однако в от¬
крытых системах культивирования при замене питательной среды
(периодическом или непрерывном) вместе со средой отбирается и
часть суспензионных клеток.Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их ха¬
рактеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной
культуре, степень агрегированности, скорость роста.Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию кра¬
сителем (метиленовая синь или синь Эванса). Живые клетки не окра¬
шиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточ¬
ных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окра¬
шиваются в синий цвет.Одним из основных показателей, характеризующих состояние
клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции.
Число клеток определяют в счетной камере Фукса — Розенталя
(рис. 3.3.) под микроскопом после мацерации (разделения клеток).
В качестве мацерирующего вещества применяют хромовую кислоту4Рис. 3.3. Камера Фукса—Розенталя:1 — предметное стекло; 2 — желобок для
удаления лишнего раствора; 3 — область, в
которой подсчитывают клетки; 4 — покров¬
ное стекло123
(10—20 %-ю), которая гидролизует средние пластинки, соединяю¬
щие клетки.Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура,S-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет
14—16дней. При этом плотность возрастает от 5 • 104до5 • 106кл/мл.
Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциаль¬
ной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы — ос¬
новные критерии роста суспензионных культур.Качество суспензии зависит от степени агрегированное™ ее
клеток. Агрегаты не должны содержать более 10—12 клеток. Поэто¬
му, чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют
через марлевые, найлоновые или металлические фильтры. Одновре¬
менно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плот¬
ных кусков каллусной ткани.Суспензионные культуры могут быть источником ценных вто¬
ричных метаболитов, и в них могут быть новые необычные соедине¬
ния, например камптотецин, харрингтонин и другие антиканцероге¬
ны, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению
клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во
времени. Синтез вторичных метаболитов достигает максимума в ста¬
ционарной фазе роста.3.7.	КУЛЬТУРА ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОКДля генетических и физиологических исследований, а также для
практического использования в клеточной селекции очень ценным
является культивирование отдельных клеток. Получение клона—по¬
томства одиночной клетки помогает разобраться в причинах генети¬
ческой неоднородности каллусных клеток, так как наблюдения в дан¬
ном случае проводят на ткани, полученной не из гетерогенного экс¬
планта, а из одной клетки.Одиночная гибридная клетка, выделенная из культуры изолиро¬
ванных протопластов, при дальнейшем ее делении позволяет полу¬
чить клон, состоящий из гибридных клеток. Это намного облегчает
работу исследователя, так как устраняет необходимость отбора по¬
томства в культуре изолированных протопластов от негибридных, что
представляет значительные трудности. Кроме того, сам процесс со¬
матической гибридизации лучше наблюдать, если работа ведется с
одиночными протопластами.Выделяют одиночные клетки из клеточных суспензий, из тканей
растений, например из мезофилла листа после его мацерации фер¬124
ментами, из культуры изолированных протопластов после восстанов¬
ления клеточной стенки.Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры
иногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15—
30 мин. При этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надоса-
дочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агре¬
гаты. В том случае, когда при отстаивании не удается получить одно¬
клеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центри¬
фугирование в градиенте сахарозы или фильтрование через сита
(найлоновые или металлические).Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что
отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет
каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делить¬
ся, разработаны специальные методы. В 1960 г. Джонсон предложил
метод «няньки», при котором функцию «няньки», стимулирующей
деление одиночной клетки, выполняют кусочки каллусной ткани, от¬
деленные от нее фильтровальной бумагой. В присутствии «няньки»
одиночная клетка делится и дает индивидуальную колонию кле¬
ток — клон.Другой метод основан на использовании очень малых объемов бо¬
гатой питательной среды и представляет со¬
бой культивирование одиночных клеток в
микрокапле в чашке Купрака объемом
20 мкл. Метод предложен академиком
Ю.Ю. Глебой. В микрокаплях удобно на¬
блюдать за слиянием и делением клеток при
соматической гибридизации.Для индукции клеточных делений у оди¬
ночной клетки можно использовать также
«кормящий слой» (активно делящиеся клет¬
ки суспензионной культуры того же вида
растений, что и одиночная клетка) (рис. 3.4).Стимулирует клеточное деление и конди¬
ционирование среды, для чего в нее добавля¬
ют питательную среду от интенсивно деля¬
щейся культуры клеток. Кондиционирую¬
щий фактор получают при фильтровании
клеточной суспензии в экспоненциальной
фазе роста через бактериальный фильтр. По
сути дела все перечисленные методы основа¬
ны на использовании выделений из деля¬
щихся клеток — кондиционирующего фак¬
тора.Рис. 3.4. Использование в
качестве «няньки» куль¬
туры суспензионных кле¬
ток при выращивании
изолированных протопла¬
стов и одиночных клеток:7 — колонии клеток; 2 — фильт¬
ровальная бумага; 3 — алюми¬
ниевая сетка; 4 — пенополиуре¬
тан; 5—суспензия клеток (By
Дык Куанг, З.Б. Шамина, 1985)125
Несмотря на многочисленные попытки определить химическую
природу и раскрыть механизм действия кондиционирующего факто¬
ра на деление клеток, добиться этого пока не удалось. Однако уверен¬
но можно сказать, что этот фактор термостабилен, водорастворим,
включает низкомолекулярные вещества и не заменяется фитогормо¬
нами (А.И. Павлова, Р.Г. Бутенко, 1969). К сказанному можно доба¬
вить, что вещество стабильно при pH 4—11, молекулярная масса его
~ 700 Д и этот фактор является синергистом брассиностероида
(Bellmcampi, Morpurgo, 1987). Таким образом, исследования показа¬
ли, что это не чисто химическое вещество, а сумма веществ, которые
выделяются из клетки.3.8.	МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ ТКАНЯХСуществует несколько путей, по которым может идти развитие
клетки после ее дедифференцировки. Первый путь — это вторичная
регенерация целого растения, возможна дифференцировка на уровне
клеток, тканей, органов. Второй путь — это утрата клеткой способно¬
сти к вторичной дифференцировке и регенерации растения, стойкая
дедифференцировка, приобретение способности расти на среде без
гормонов, т. е. превращение в опухолевую. Такими свойствами часто
характеризуются клетки старых пересадочных культур. Третий
путь — это нормальный цикл развития каллусной клетки, заканчи¬
вающийся ее старением и гибелью. В этом случае клетка претерпевает
вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная
фаза роста). Однако такая дифференцировка не ведет к морфогенезу,
а закрепляет за ней свойства старой каллусной клетки.Для сельскохозяйственной биотехнологии наибольший интерес
представляет регенерация в культуре тканей из отдельной клетки це¬
лого растения. Иногда этот путь лежит через образование отдельных
органов.В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникно¬
вение организованных структур из неорганизованной массы клеток.
Существует два основных типа морфогенеза (рис. 3.5). В культуре
тканей он может проявляться в виде органогенеза (образования мо-
нополярной структуры, т. е. отдельных органов): корневого, стебле¬
вого, реже флорального (цветочного) или листового, а также в виде
соматического эмбриогенеза (образования биполярных зародыше¬
подобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза
сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них — целые
растения, исключение составляет корневой органогенез (рис. 3.6).В результате соматического эмбриогенеза в отличие от органоге¬
неза сразу образуется зародыш, имеющий как меристему корня, так и126
Рис. 3.5. Типы морфогенеза в культуре каллусной тканимеристему верхушечной почки, из которого в дальнейшем развивает¬
ся целое растение.Способность отдельной соматической клетки полностью реали¬
зовывать свою программу развития и давать начало целому расти¬
тельному организму называюттотипотентностью растительной клет¬
ки. Любая растительная клетка обладает одинаковыми потенциаль¬
ными возможностями, так как содержит весь набор генов и, следова¬
тельно, клетки сохраняют свойственную зиготе программу развития.
Поэтому если мы получаем каллус из клеток лепестка цветка, или из
клеток сердцевинной паренхемы стебля, или из клеток любой ткани,
то в принципе каждая такая клетка может регенерировать целое рас¬
тение. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так
как потенциальные возможности клеток разных типов проявляются
неодинаково. В некоторых из них гены в сильной степени репресси¬
рованы, в связи с чем проявление тотипотентности становится огра¬
ниченным.Идея о тотипотентности растительной клетки была выдвинута
Г. Хаберландтом еще в 1902 г., хотя и не получила тогда эксперимен¬
тального подтверждения. Согласно определению Г. Хаберландта, лю¬
бая клетка растения может дать начало новому организму, и если это¬
го не наблюдается, то только потому, что растительный организм по¬
давляет потенциал клетки к развитию. Изоляция клеток от растений
способствует проявлению этого потенциала.Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференциров-
ка. Регенерация растения начинается со вторичной дифференциров-
ки клеток. При этом дедифференцированные клетки вновь приобре¬
тают структуру и функции специализированных.Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда закан¬
чивается морфогенезом и регенерацией растения. Иногда она приво-127
Рис. 3.6. Морфогенетические ре¬
акции каллусной ткани:а — пролиферирующий каллус; б — об¬
разование адвентивных почек; в — об¬
разование корней (ризогенез)дит только к образованию тканей (гистодифференцировка). Таким
путем каллусная клетка может превращаться во флоэмные или кси-
лемные элементы. Другим примером вторичной дифференцировки
может служить превращение дедифференцированной активно про¬
лиферирующей клетки в старую неделящуюся каллусную клетку (ста¬
ционарная фаза роста).Из всех видов вторичной дифференцировки наибольший интерес
представляет морфогенез, так как он позволяет получать целое расте¬
ние из каллусной клетки.В основе дифференцировки и морфогенеза лежит последователь¬
ное включение различных генов, т. е. дифференцировка клеток опре¬
деляется дифференциальной активностью генов. Изменение актив¬128
ности структурных генов может быть связано с их дерепрессией, ре¬
прессией или амплификацией (умножение). Большую роль в этом
процессе играют фитогормоны.Таким образом, различия в балансе экзогенных гормонов аукси-
нового и цитокининового типов определяют, с одной стороны, воз¬
можность перехода клетки в культуре к дедифференцировке и неор¬
ганизованной пролиферации, а с другой — индукцию вторичной
дифференцировки того или иного типа морфогенеза, что было отме¬
чено Ф. Скугом и Е. Миллером (1957). Следовательно, ауксины и ци-
токинины, вызывающие в зависимости от соотношения либо дедиф-
ференцировку и переход к каллусному росту, либо дифференцировку
и морфогенез в культуре каллусных тканей, являются не только регу¬
ляторами роста, но и регуляторами дифференцировки.Если органогенез можно индуцировать с помощью ауксинов или
цитокининов, то соматический эмбриогенез фактически независим
от экзогенных фитогормонов. Обычно эмбриогенные зоны возника¬
ют в каллусной ткани на той же питательной среде, которая использо¬
валась для каллусообразования. Развитие соматических зародышей в
каллусной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифферен¬
цирующий фактор из питательной среды (2,4-Д или другие ауксины).
Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах, так
как сам обеспечивает себя ими.Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов являет¬
ся аргументом в пользу точки зрения, высказанной еще Г. Хаберланд-
том, а позднее Ф. Стэвардом, что сам процесс изолирования клетки
стимулирует реализацию ее тотипотентности, т. е. переход к морфо¬
генезу. Таким образом, основными стимулами морфогенеза являют¬
ся изменения соотношения гормонов в питательной среде, а также
сам процесс изоляции растительной клетки от организма. Дополни¬
тельными индукторами морфогенеза в культуре каллусных тканей
является присутствие в питательной среде нитрата серебра, нитрата
аммония, некоторых аминокислот (пролин, тирозин, иногда серин),
полиаминов (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют
процесс морфогенеза маннит и сорбит. Ионы NO-3 оказывают влия¬
ние на развитие возникших в каллусной ткани организованных
структур, а их индукцию стимулируют ионы NH+4. Гибберелловая ки¬
слота стимулирует рост зачатков стебля, а абсцизовая ускоряет диф¬
ференцировку органов соматических зародышей.Интересно отметить, что некоторые из перечисленных веществ,
например нитрат серебра, продлевают регенерационную способ¬
ность в старых пересадочных культурах.9-4266	|
Под влиянием того или иного индуцирующего фактора морфоге¬
неза каллусная клетка должна стать детерминированной, однако не
все клетки, а лишь одна из 400—1000 становится на путь регенерации.
Следовательно, для перехода к морфогенезу недостаточно индуктора
(стимула), а необходимо, чтобы клетка была готова к ответу на него.
Способность воспринимать стимулы морфогенеза называют компе¬
тентностью клетки. Исследователи пришли к выводу, что компетент¬
ность клеток — событие случайное и поэтому столь редкое. В связи с
этим напрашивается вопрос о судьбе тех каллусных клеток, которые в
силу некомпетентности не способны воспринять стимулы морфоге¬
неза и детерминироваться. В пересадочной культуре эти клетки про¬
должают делиться и скорее всего становятся на путь перехода к гор-
мононезависимости. Однако не все каллусные ткани со временем за¬
вершают развитие возникновением гормононезависимости. Многие
из них в силу генетических особенностей продолжают использовать
экзогенные гормоны, но полностью утрачивают способность к реге¬
нерации. Такие ткани занимают промежуточное положение между
«привыкшими» и свежими каллусными тканями.Морфогенез в каллусной ткани начинается с того, что под влия¬
нием соответствующих условий детерминированная клетка обособ¬
ляется от окружающих ее каллусных клеток, образуя утолщенную
клеточную стенку. Это явление было обнаружено в 1972 г. Н. Дани¬
линой при изучении соматического эмбриогенеза в культуре ткани
моркови.Клетка-инициаль при соматическом эмбриогенезе дает начало
зиготе, а при органогенезе — меристематическому очагу. От недетер¬
минированных каллусных клеток инициальная отличается более
крупным ядром и меньшими размерами вакуолей. Ядро обычно зани¬
мает центральное положение. В инициальных клетках содержатся
большие количества запасных веществ: крахмала, иногда — липидов.Некоторое время инициальные клетки находятся в лаг-фазе, что
необходимо для их перестройки и подготовки к последующим быст¬
рым делениям. Затем эти клетки делятся по типу дробления, образуя
сферическую массу мелких изодиаметрических клеток. В случае орга¬
ногенеза эту массу клеток называют меристематическим очагом, а в
случае соматического эмбриогенеза — глобулярным проэмбрио.
В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачат¬
ки стебля, корня, листа или цветочной почки и соответственно про¬
исходит стеблевой, корневой, листовой, или флоральный, органоге¬
нез. В глобулярном проэмбрио развивается биполярная эмбриоидная
структура. Можно выделить несколько последовательных стадий
формирования соматических эмбриоидов из каллусной клетки: гло-130
Рис. 3.7. Стадии соматического эмбриогенеза:
а — глобулярная; б— сердечко; в — торпедовидная; г — соматический зародышбулярную, сердечка, торпедовидную, соматического зародыша
(рис. 3.7). Меристематические очаги или проэмбрио могут возникать
на периферии каллусной ткани или быть погруженными в нее. Обыч¬
но не наблюдается определенной закономерности в их локализации
(рис. 3.8). Исключение составляет стеблевой органогенез в каллуснойРис. 3.8. Формирование соматических зародышей
(глобулярная стадия) пересадочной ткани ячменя
ткани, полученной из сердцевинной паренхимы табака сорта Вис¬
консин-38. Меристематические очаги здесь всегда локализуются
только в нижней части каллусной массы.При переходе каллусных клеток к морфогенезу происходит суще¬
ственное изменение их метаболизма. Морфогенезу предшествует по¬
явление в клетках белков-антигенов. Работами Р.Г. Бутенко,
Н.И. Володарского и Н.А. Моисеевой показано, что морфогенез в
культуре каллусных тканей табака характеризуется включением и вы¬
ключением синтеза определенных белков-маркеров. В меристемах
обнаружено два белка-антигена, которые являются маркерами этих
клеток. Одновременно показано, что индуцированная детерминация
клеток каллусной ткани сопряжена с появлением в ней антиге-
на-маркера клеток меристемы стебля.Белок (гликопротеид), выделенный из эмбриогенных культур,
можно рассматривать как кондиционирующий фактор. При частых
пересадках на свежую питательную среду, где гликопротеид накапли¬
ваться не может, эмбриогенез не идет. Если белок, появляющийся в
клетках при переходе к соматическому эмбриогенезу, выделить и вве¬
сти в длинные (неэмбриогенные) каллусные клетки, у которых гены
морфогенеза не работают или потеряны, то в них индуцируется пере¬
ход к морфогенезу.Работы по поиску новых маркеров морфогенеза продолжаются.
Клетки меристематических очагов и клетки, дающие начало эмбрио-
идным структурам, отличаются от каллусных интенсивным синтезом
РНК и ДНК, что связано с особенностями их белкового обмена. Из¬
менения в белковом обмене сходны с теми, которые происходят при
дедифференцировке клетки, но итоги у них различны. По мнению
Р.Г. Бутенко, специфика реакции определяется не общим усилением
синтеза макромолекул, что необходимо для усиленной пролифера¬
ции, а теми уникальными синтезами, которые идут на этом общем
фоне и обусловливают появление белков регуляторного типа. Пере¬
ход к морфогенезу в культуре каллусных тканей сопровождается зна¬
чительными изменениями дыхательного метаболизма. В целом дыха¬
ние (по С02) усиливается, но изменяется его характер в направлении
интенсификации пентозофосфатного пути. Возрастает активность
дыхательных ферментов. Вслед за биохимической наступает струк¬
турная реорганизация клетки. Биохимическая дифференцировка
клетки всегда предшествует структурной. В клетках, вступивших на
путь морфогенеза, возрастает число рибосом, митохондрий, меняет¬
ся их внутренняя структура.Процессы морфогенеза в каллусных клетках происходят асине-
хронно и продолжительно. Одновременно в каллусной ткани могут132
иметься как полностью сформированные структуры, так и клетки,
только что вступившие на этот путь.Повышенная синтетическая активность клеток меристематиче-
ского очага и глобулярного проэмбрио делает их аттрагирующим
центром, в который устремляются питательные вещества. Окружаю¬
щие каллусные клетки при этом часто разрушаются и образующиеся
эмбриоиды легко выпадают из массы каллусных клеток.Каллусные клетки не связаны между собой плазмодесмами или
последние сильно редуцированы. При появлении зародышеподоб-
ных структур или меристематических очагов между клетками снова
восстанавливается связь с помощью плазмодесм.Все изменения, происходящие при морфогенезе и заканчиваю¬
щиеся регерацией из каллусной клетки растения, управляются (кон¬
тролируются) специальными генами. В настоящее время одни уче¬
ные считают, что признак морфогенеза полигенен и контролируется
несколькими хромосомами, другие пришли к заключению, что этот
признак определяется двумя ядерными генами. Тот факт, что морфо¬
генетическая активность каллусных клеток имеет генетическую при¬
роду, объясняет, почему не удается в ряде случаев получить регенера¬
цию из каллусной ткани тех или иных генотипов. Регенерационную
способность может увеличить скрещивание генотипов, морфогене¬
тически активных in vitro.Факторы, влияющие на морфогенез каллусной ткани. Процесс мор¬
фогенеза in vitro зависит от ряда факторов, главные из которых сле¬
дующие: физиологические, минеральный состав питательной среды,
баланс экзогенных и нативных гормонов, физические, а также при¬
сутствие сигнальных белков и белков-акцепторов — условия, обяза¬
тельные для получения клеток, способных к морфогенезу.Способность каллусных клеток к формированию монополярных
и/или биполярных структур главным образом зависит от видовых и
сортовых особенностей исследуемых генотипов, для которых прин¬
ципиально важно учитывать принадлежность его к одно- или дву¬
дольным растениям, а также тип первичного экспланта. В табл. 3.3.
представлены различные семейства, растения которых способны к
морфогенезу в той или иной степени.Материнский эффект при наследовании способности к морфоге¬
незу отмечался рядом авторов (Ж.К. Джардемапиев и др., 1994;Н.И. Орлов и др., 1994). Однако никем не уточнялось, какие именно
органеллы (хлоропласты или митохондрии) несут гены, ответствен¬
ные за регенерационную способность растительных тканей. В рабо¬
тах Ю.И. Долгих (2005) показано, что все стерильные линии кукуру¬
зы обладали пониженной по сравнению с фертильной формой спо¬133
собностью индуцировать морфогенный каллус. На основании полу¬
ченных данных было сделано предположение о вероятном участии
митохондриальных генов в регуляции процесса морфогенеза.Таблица 3.3. Перечень семейств высших растений, расположенных по степени
снижения способности к морфогенезу (по Р.Г. Бутенко, 1999)Максимальная способностьПасленовыеКапустныеСельдерейныеАстровыеБобовые (травы)Бобовые (зерновые)Мятликовые (травы)Минимальная способность(зерновые)Физиологический возраст первичного экспланта, из которого
была получена каллусная ткань, имеет несомненное значение в про¬
явлении способности каллусных клеток к морфогенезу. Установлена
прямая корреляция между возрастом первичного экспланта и морфо¬
генезом: чем моложе эксплант, тем большей морфогенетической ак¬
тивностью обладают каллусные клетки. С увеличением возраста ис¬
ходного материала, как правило, снижается способность каллусной
ткани к морфогенезу.Существенное влияние на реализацию морфогенетического по¬
тенциала каллусной ткани оказывает число субкультивирований ее в
условиях in vitro. С увеличением числа пассажей значительно снижа¬
ется степень морфогенетической активности каллусных клеток. Осо¬
бо это проявляется на трудных объектах, таких как пшеница, ячмень,
рис, подсолнечник и других культурах.Применение экзогенных гормональных препаратов и изменение
их соотношения и концентраций является главным фактором,
влияющим на морфогенез каллусной ткани. Преобладание содержа¬
ния ауксина над цитокинином приводит к дифференциации мери-
стематических очагов корня, а преобладание цитокинина над аукси¬
ном — меристематических очагов апекса, дающих начало росту адве-
тивным побегам.Изучению регуляции морфогенеза экзогенными факторами по¬
священо много работ, однако молекулярные механизмы эндогенной
регуляции почти не исследованы. Учитывая большое значение балан¬
са эндогенных гормонов в определении тотипотентности (JT.A. Луто-
ва, 2003), можно предположить, что компетентность клеток к морфо¬
генезу в значительной степени обусловлена количеством и соотноше¬
нием эндогенных регуляторов роста. При сопоставлении уровней134
гормонов в морфогенных и неморфогенных тканях некоторых видов
растений были обнаружены заметные различия. Экспериментально
доказано, что в большинстве случаев для морфогенных тканей харак¬
терно преобладание цитокининов над ауксинами и невысокий уровень
АБК, а для неморфогенных — обратное соотношение (Ю.И. Долгих,
2005).Из трофических факторов особое внимание необходимо уделять
минеральным солям, содержащих азот в нитратной или аммонийной
форме. Присутствие в питательной среде NH| необходимо для нача¬
ла морфогенеза, тогда как для роста и развития дифференцирован¬
ных морфогенных структур предпочтение по концентрации отдается
N03_.Не только минеральные соли могут регулировать морфогенетиче¬
ские процессы в каллусной ткани, но и добавление в питательную
среду аминокислот (тирозин, аспарагин, глютамин), а также нитрата
серебра (для ингибирования синтеза этилена) значительно повышает
морфогенетическую активность каллусных клеток.Особое влияние на морфогенез каллусной ткани оказывают
стрессовые факторы — тяжелые металлы, хлорид или сульфат натрия,
низкие положительные температуры, низкие концентрации токси¬
нов или культурального фильтрата патогенов. Например, в конце
60-х годов XX в. в лаборатории академика РАСХН и чл.-корр. РАН
Р.Г. Бутенко Института физиологии растений РАН на культуре ткани
моркови показано стимулирующее действие 0,5 %-го NaCl на морфо¬
генез и регенерацию растений in vitro, что было в дальнейшем под¬
тверждено на каллусной культуре пшеницы. На культуре каллусных
клеток риса установлена положительная роль низких положительных
температур на морфогенетический потенциал дедифференцирован¬
ных клеток.Интенсивность освещения, спектральный состав света, темпера¬
турный режим, а также другие физические факторы воздействия ока¬
зывают особое влияние на морфогенез каллусной ткани. Доказано,
что дифференциация адвентивных почек в каллусной ткани происхо¬
дит при ее культивировании на свету с белым или синим спектраль¬
ным составом, в то время как при использовании света красного
спектрального состава в каллусной ткани дифференцируются мери¬
стемы корня. Для большинства растений температурный оптимум
составляет 23—25 °С. Однако среди исследуемых растений существу¬
ют исключения, например подсолнечник, для которого температур¬
ный режим, обеспечивающий морфогенез каллусной ткани, находит¬
ся в пределах 18—22 °С.135
Таким образом, для повышения морфогенетического потенциала
каллусной ткани необходимо подбирать индивидуальные условия
культивирования для каждого исследуемого генотипа, учитывая при
этом его генотипические особенности.3.9.	КУЛЬТУРА КАЛЛУСНЫХ КЛЕТОК
В ПОЛУЧЕНИИ ВЕЩЕСТВ ВТОРИЧНОГО СИНТЕЗАСуществующие методы субкультивирования изолированных кле¬
ток в условиях in vitro, позволяют использовать их как для фундамен¬
тальных исследований, так и для практического применения. Особый
интерес представляет способность изолированных клеток, тканей и
органов синтезировать вещества вторичного метаболизма, которые
широко используются в медицине, защите растений, ветеринарии,
кормопроизводстве, пищевой промышленности, парфюмерии и др.
Такой интерес исследователей к этому направлению работ неслучаен,
так как клеточная биотехнология для получения физиологически ак¬
тивных веществ имеет ряд преимуществ по сравнению с использова¬
нием традиционного растительного сырья: 1) получение биомассы
клеток не зависит от сезона, климатических и почвенных условий;
2) возможность оптимизировать условия культивирования суспен¬
зии клеток, позволяющих синтезировать в*необходимом количестве
нужные вещества; 3) автоматизация процесса.Установлено, что каллусные клетки, культивируемые in vitro, так
же, как и клетки интактного растения, могут синтезировать вторич¬
ные метаболиты. Причем по качественному и количественному со¬
ставу они могут быть схожи. Так, в Институте физиологии растений
РАН в отделе биологии клетки и биотехнологии собрана большая
коллекция клеточных культур растений из различных семейств, син¬
тезирующих вторичные метаболиты, широко используемые в про¬
мышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный — ис¬
точник диосгенина, диоскорея дельтовидная — стероидные гликози-
ды, равольфия змеиная — продуцент антиаритмического алкалоида
аймалина, стевия — стевиозид и т. д. В последние годы особый инте¬
рес представляют исследования по культивированию в биореакторах
изолированных клеток тиса ягодного. Установлено, что клетки дан¬
ного растения синтезируют вещество — таксон, которое является ан-
тираковым препаратом.Экспериментально доказано, что прирост клеточной биомассы в
условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. На¬
пример, за год прирост корня женьшеня в тайге составляет 1 г, на
плантации — 3 г. При выращивании клеток корневого происхожде-136
11	ия на агаре (in vitro) можно получать 0,4 г сухой массы на литр среды
в день. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в
50-литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за су¬
тки, что в 1000 раз больше, чем при выращивании на плантации. Учи¬
тывая высокую стоимость женьшеня (килограмм плантационного
корня стоит 100—150 дол. США; цена дикорастущего корня может
доходить до нескольких тысяч долларов США), биотехнологический
способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма при¬
влекателен.В табл. 3.4 приведены некоторые экономически важные продук¬
ты, синтез которых получен в культуре клеток высших растений.Таблица 3.4. Экономически важные продукты, полученные
в культуре клеток высших растений (по Р. Г. Бутенко, 1999)Традиционные растительныеНовые активные веществаПродукты биотрансформациипродуктыАлкалоидыИнгибиторы фитовиру¬Метилдигоксин, дигок-совсинСтероидытерпены и терпеноидыАнтиканцерогены, ком-
помицинМентолБетаниныгл и коз идынеоментолполифенолыингибиторы протеиназгераниолполисахаридынеролэфирные масланеобычные белкицитронеллолнатуральные красите¬ли (пигменты)убихинонвкусовые добавкиинсектицидылатексВещества вторичного синтеза, как правило, получают из суспен¬
зионной культуры, которую выращивают в биореакторах. По своей
конструкции биореакторы бывают барботажные, в которых переме¬
шивание осуществляется путем аэрирования воздухом за счет подни¬
мающихся пузырьков воздуха, и с применением механических пере¬
мешивающих устройств (рис. 3.9).Важной характеристикой клеток популяции является ее ста¬
бильность в отношении синтеза, транспорта и депонирования мета¬
болитов (Р.Г. Бутенко, 1999). Стабильность может сохраняться в те-137
Рис. 3.9. Принципиальные схемы биореакторов, наиболее часто применяемых
для выращивания суспензионных культур:а — биореактор с механическим перемешивающим устройством; б — барботажный биореактор;
в — аэролифтный биореактор; В — воздух (по Р.Г. Бутенко, 1999)чение всего времени существования популяции, медленно снижаться
за счет постепенного увеличения числа клеток со сниженным синте-
зом метаболитов и быть нестабильной в случае быстрой потери спо¬
собности клеток синтезировать вторичные метаболиты.Исследования показали, что, как правило, синтез вторичных ме¬
таболитов происходит во внутриклеточных органеллах: пластидах,
хлоропластах, митохондриях, ЭПР, лейкопластах; транспорт в сосед¬
ние клетки или питательную среду не происходит, а вакуоли и сво¬
бодное пространство клетки часто используются для накопления (де¬
понирования) метаболитов (И. Князьков, 1996).Количественный и качественный состав вторичных веществ воз¬
можно менять за счет изменения состава питательной среды при вы¬
ращивании клеток in vitro. Например, на культуре женьшеня было
показано, что соотношение различных форм азота в питательной сре¬
де влияло на продуктивность стероидных сапонинов. Так, соотноше¬
ние аммонийного и нитратного азота 1 : 3 приводило к увеличению
биомассы, а соотношение 2 : 3 не оказывало влияния на продуктив¬
ность, но приводило к снижению накопления диосгенина. Повы¬
шенные концентрации сахарозы (5 %) в среде более эффективны для
роста массы клеток, а пониженные концентрации (1,5 %) — на про¬
дуктивность диосгенина. Фитогормоны не оказывают существенного
влияния на продуктивность культур по биомассе.Технология выращивания культур клеток в биореакторах являет¬
ся масштабным процессом, т. е. разрабатываются условия культиви¬138
рования клеток в биореакторах большого объема. К настоящему вре¬
мени накопилось много факторов об успешном масштабировании
различных культур клеток в биореакторах объемом несколько кубо¬
метров. Например, специалисты немецкой фирмы DIVERSA
(ныне — FYTON) осуществили выращивание ряда культур в биореак¬
торах объемом до 75 000 л. В промышленном масштабе в России осу¬
ществлено получение биомассы женьшеня на Омутнинском биохи¬
мическом заводе в биореакторах объемом до 2,5 м3. В ТОО «Тэмбр»
(г. Ярославль) осуществлено проточное культивирование клеток
женьшеня в промышленных биореакторах объемом 7,5 м3 (по
Р.Г. Бутенко, 1999). В Институте физиологии растений А.М. Носов
с сотр. оптимизировал режимы культивирования целого ряда различ-
ных культур клеток высших растений в биореакторах объемом 630 л:
женьшеня настоящего, полисциаса и других аралиевых, диоскореи
дельтовидной, маральего корня и др.3.10.	КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙДля семенных растений характерно два способа размножения: се¬
менной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества,
так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует от¬
нести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого поса¬
дочного материала и длительность ювенильного периода. При вегета¬
тивном размножении сохраняется генотип материнского растения и
сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для
большинства видов (в первую очередь для древесных пород) пробле¬
ма вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это
обусловлено следующими причинами: 1) не все породы, даже на юве¬
нильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с тре¬
буемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
2) практически невозможно черенкованием размножать многие виды
древесных пород в возрасте старше 10— 15 лет; 3) не всегда удается по¬
лучать стандартный посадочный материал (возможность накопления
и передачи инфекции); 4) трудоемкостью и сложностью операций
при размножении взрослых (древесных) растений при помощи при¬
вивок; 5) неэффективностью разработанных технологий для получе¬
ния необходимого количества генетически однородного материала в
течение года.Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созда¬
нию принципиально нового метода вегетативного размножения —
клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в
пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных ис¬139
ходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способ¬
ность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотент-
ность, т. е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало це¬
лому растительному организму. Этот метод, несомненно, имеет ряд
преимуществ перед существующими традиционными способами раз¬
множения:—	получение генетически однородного посадочного материала;—	освобождение растений от вирусов за счет использования ме-
ристемной культуры;—	высокий коэффициент размножения (105—106 — для травяни¬
стых, цветочных растений, 10 —105 — для кустарниковых древесных,
104 — для хвойных);—	сокращение продолжительности селекционного процесса;—	ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктив¬
ной фазе развития;—	размножение растений, трудно размножаемых традиционны¬
ми способами;—	возможность проведения работ в течение года и экономия пло¬
щадей, необходимых для выращивания посадочного материала;—	возможность автоматизации процесса выращивания.Первые достижения в области клонального микроразмножениябыли получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым
Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-ре-
генеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способ¬
ствовала уже разработанная к тому времени техника культивирова¬
ния апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как прави¬
ло, исследователи в качестве первичного экспланта использовали
верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризанте¬
мы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали
влияние состава питательной среды на процессы регенерации и фор¬
мирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал
верхушку цимбидиума (сем. орхидные), состоящую из конуса нарас¬
тания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных
условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов.
Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культи¬
вировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной сре¬
де до образования листовых примордиев и корней. В результате им
было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно получать в
большом количестве высококачественный и генетически однород¬
ный, безвирусный посадочный материал.В нашей стране работы по клональному микроразмножению
были начаты в 60-х годах XX в. в лаборатории культуры тканей и мор¬140
фогенеза Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.
Под руководством проф. Р.Г. Бутенко были изучены условия микро¬
размножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фре-
зии и некоторых других растений и предложены промышленные тех¬
нологии.Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении
связаны с культивированием апикальных меристем травянистых рас¬
тений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в
конечном итоге получение растений-регенерантов.Однако область применения микроразмножения разнообразна и
имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь
относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особен¬
но хвойных, и использованию техники in vitro для сохранения редких
и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в
этом направлении наметился положительный сдвиг.Первые работы по культуре тканей древесных растений были
опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем
французского ученого Р. Готре. В них сообщалось о способности
камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in
vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способно¬
сти различных тканей вяза листового к образованию адвентивных по¬
чек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не
были получены. Лишь к середине 60-х годов Э. Матесу удалось полу¬
чить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены
до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных пород in
vitro долгое время не использовалось как объект исследования. Это
было связано со специфическими трудностями культивирования
ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с расте¬
ния. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются
медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количе¬
ство вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества),
которые в изолированных тканях окисляются различными фенолаза-
ми. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибиру¬
ют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта
или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенера¬
ции адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора посте¬
пенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, уче¬
ные все чаще используют в качестве объектов исследований различ¬
ные ткани и органы древесных растений. В настоящее время насчи¬
тывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств,
которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина,
гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом141
направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петер¬
бурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы,
Ялты и др.Этапы и методы клонального микроразмножения растений. Процесс
клонального микроразмножения можно разделить на четыре этапа:1)	выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хо¬
рошо растущей стерильной культуры; 2) собственно микроразмноже¬
ние, когда достигается получение максимального количества мери-
клонов; 3) укоренение размноженных побегов с последующей адап¬
тацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирова¬
ние растений-регенерантов при пониженной температуре (+2°,
+ 10 °С); 4) выращивание растений в условиях теплицы и подготовка
их к реализации или посадке в поле (рис. 3.10).Существует много методов клонального микроразмножения. Раз¬
личные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию
условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, на¬
блюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение
условий выращивания, что в свою очередь привело к созданию новых
классификаций методов клонального микроразмноженя. Исходя из
предложенных в литературе методов микроразмножения растений,
этот процесс возможно осуществлять следующими путями:—	активация развития уже существующих в растении меристем
(апекс'стебля, пазушные и спящие почки и интеркамерные зоны
стебля);—	индукция возникновения адвентивных почек непосредственно
тканями экспланта;—	индукция соматического эмбриогенеза;—	дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадоч¬
ной каллусной тканях.Основной метод, используемый при клональном микроразмно¬
жении растений,— это активация развития уже существующих в рас¬
тении меристем, основывающийся на снятии апикального домини¬
рования (рис. 3.11). Это может быть достигнуто двумя путями: а) уда¬
лением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочерен¬
кованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в
питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуци¬
рующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило,
в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентениладенин
(2ip) и зеатин. Полученные таким образом побеги отделяют от пер¬
вичного материнского экспланта и вновь культивирует на свежепри¬
готовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию па¬
зушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.142
Рис. 3.10. Схема клонального микроразмножения растений методом активации
развития существующих меристем (I путь), индукции возникновения адвентив¬
ных почек на экспланте (II путь):/ — выбор исходного эксплантна; 2— получение стерильной культуры; 3— образование адвен¬
тивных почек непосредственно на первичном экспланте; 4 — рост почек и формирование микро¬
побегов; 5 — размножение микропобегов (черенкование); 6 — укоренение микропобегов; 7 — де¬
понирование растений-регенерантов при пониженной температуре; 8— перевод растений в теп¬
личные условия; 9— высадка растений-регенерантов в полеВ настоящее время этот метод широко используется в производстве
безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур
как технических (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис),
так и овощных (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и
др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства
(гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических
растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягод¬
ных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, сморо-143
Рис. 3.11. Схема размножения растений методом активации развития сущест¬
вующих меристем:У —удаление верхушечной меристемы; 2 — добавление в питательную среду цитокининов
(Б/Г — безгормональная среда, Ц — цитокицины, А — ауксины)дина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, бе¬
реза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.) (рис. 3.12, а, б). Для
некоторых сельскохозяйственных культур, таких, как картофель, тех¬
нология клонального микроразмножения поставлена на промыш¬
ленную основу. Применение метода активации развития сущест¬
вующих в растении меристем позволяет получать из одной меристе¬
мы картофеля более 105 растений в год, причем технология преду¬
сматривает получение в пробирках микроклубней — ценного
безвирусного семенного материала (рис. 3.12, в).Второй метод — это индукция возникновения адвентивных по¬
чек непосредственно тканями экспланта (рис. 3.13, а, б). Он основан
на способности изолированных частей растения при благоприятных
условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и
таким образом регенерировать целые растения. Образования адвен¬
тивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей рас¬
тения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек
и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий), если их
удается получить свободными от инфекции. Этот процесс, как прави¬
ло, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин
или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10 : 1 или
100 : 1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют
Р-индолил-З-уксусную кислоту (ИУК) или а-нафтилуксусную ки-
144
а — роза; б — гранат; в — картофель	вслоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмно¬
жения высших растений, которым были размножены многие луко¬
вичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинт, гладиолусы,
тюльпаны) из луковичных чешуй, сегментов базальной части донца
луковиц, эксплантов листьев; представители рода Brassica (капуста145
Рис. 3.14. Клональное микроразмножение земляникицветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи — из сегмен¬
тов гипокотиля, семядолей, листьев; лук, чеснок — из верхушечной
меристемы, ткани донца луковиц; томаты — из апикальных или па¬
зушных меристем; салат цикорный — из сегментов листовых пласти¬
нок; петуния — из сегментов корней; глоксиния, фиалки — из сег¬
ментов листовых пластинок, а также некоторые представители дре¬
весных растений — из изолированных зрелых и незрелых зародышей
(рис. 3.13, в).Хорошо разработана технология клонального микроразмноже¬
ния земляники, основанная на культивировании апикальных мери¬
стем (рис. 3.14). Меристематические верхушки изолируют из моло¬
дых свободных от вирусных болезней растений и выращивают на мо¬
дифицированной питательной среде Т. Мурасига и Ф. Скуга, содер¬
жащей БАП в концентрации 0,1—0,5 мг/л. Через 3—4 недели
культивирования меристема развивается в проросток, в основании
которого формируются адвентивные почки, которые быстро растут и
дают начало новым почкам. В течение 6—8 недель образуется конгло¬
мерат почек, связанных между собой соединительной тканью и нахо¬
дящихся на разной стадии развития. Появляются листья на коротких
черешках, в нижней части которых формируются новые адвентивные
почки. Эти почки разделяют и пересаживают на свежую питательную
среду. На среде с цитокинином продолжается пролиферация прида¬
точных побегов, а на среде без регуляторов роста в течение 4—6 не¬
дель формируются нормальные растения с корнями и листьями.146
Морфогенетическая активность экспланта сохраняется в течение
3—4 лет. Таким образом, от одного материнского растения можно по¬
лучать несколько миллионов растений-регенерантов в год.Несомненный интерес у исследователей вызывает вопрос, свя¬
занный с происхождением адвентивных почек, и, в частности, какие
клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого
мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах
с тканями табака показала, что именно эпидермис является наиболее
активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни
в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цито¬
логические исследования, проведенные на сегментах базальной час¬
ти донца луковиц тюльпанов и нарциссов показали, что адвентив¬
ные побеги формируются из поверхностных слоев меристематиче-
ских клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии про¬
цесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в
субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок. Единого
мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работаю¬
щих с древесными растениями. Так, было показано, что образование
почек на изолированной хвое ели обыкновенной происходит в эпи¬
дермальном слое культивируемого экспланта, для псевдотсуги — в
субэпидермальных слоях, а при культивировании семядолей сосны
замечательной на среде, содержащей один цитокинин (БАП), этот
процесс происходит одновременно как в эпидермальном, так и в
субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было от¬
мечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпи¬
дермальном слоях семядолей зародыша (рис. 3.15), и этот процесс для
сосны не зависит от применяемых цитокининов.Третий метод, практикуемый при клональном микроразмноже¬
нии, основывается на дифференциации из соматических клеток за¬
родышеподобных структур, которые по своему внешнему виду напо¬
минают зиготические зародыши. Этот метод получил название — со¬
матический эмбриогенез. Основное отличие образования зародышей
in vitro от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что со¬
матические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого
мешка и по своему внешнему виду напоминают биополярные струк¬
туры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных
меристем стебля и корня. Согласно Ф. Стэварду, соматические заро¬
дыши проходят три стадии развития: глобулярную, сердцевидную,
торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию к развитию в
проросток. Это явление впервые было отмечено в культуре клеток
моркови еще в середине 50-х годов XX в., а в настоящее время исполь¬
зуется для размножения большинства растений из семейства147
Рис. 3.15. Образование адвентивных почек в эпидермальном
и субэпидермальном клеточных слоях эксплантаOrchidaceae и Rutaceae, некоторых представителей злаковых (пшени¬
ца, ячмень), люцерны, редиса, винограда, а также некоторых видов
древесных пород (осина, эвкалипт, дуб, ель обыкновенная).Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два
этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет
добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлор-
феноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональ¬
ные. Наследующей стадии необходимо заставить сформировавшиеся
клетки развиваться в эмбриоиды, что достигается уменьшением кон¬
центрации ауксина или полного его исключения из состава питатель¬
ной среды. Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непо¬
средственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной
культуре. Причем последний способ менее пригодный при клональ¬
ном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный
таким методом, будет генетически нестабилен по отношению к расте-
нию-донору. Как правило, соматический эмбриогенез происходит
при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде
(суспензия) и является наиболее трудоемкой операцией, так как не
всегда удается реализовывать свойственную клеткам тотипотент-
ность. Однако этот метод размножения имеет свои преимущества,
связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального
микроразмножения, не требующего подбора специальных условий
укоренения и адаптации пробирочных растений, так как соматиче¬
ские зародыши представляют собой полностью сформированные
растеньица. При использовании соответствующей техники их капсу-148
лирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные
семена.Четвертый метод клонального микроразмножения — дифферен¬
циация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной
тканях. Он мало используется для получения посадочного материала
in vitro. Это связано с тем, что при периодическом пересаживании
каллусной ткани на свежую питательную среду часто наблюдаются
явления, нежелательные при микроразмножении: изменение плоид¬
ности культивируемых клеток, структурные перестройки хромосом и
накопление генных мутаций, потеря морфогенетического потенциа¬
ла культивируемыми клетками. Наряду с генетическими изменения¬
ми растений наблюдаются и морфологические: низкорослость, не¬
правильное жилкование листьев и их расположение по стеблю, обра¬
зование укороченных, утолщенных междоузлий, уродливость, пони¬
женная устойчивость к болезням и вредителям. Причем длительное
культивирование каллусных клеток усугубляет эти изменения, по¬
этому период неорганизованного роста при микроразмножении дол¬
жен быть сведен к минимуму.Однако, несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет
положительные стороны и преимущества. Во-первых, он является
эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размно¬
жения из каждой индивидуальной каллусной клетки при благоприят¬
ных условиях культивирования может сформироваться адвентивная
почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев
он является единственно возможным способом размножения расте¬
ний в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для
селекционеров, так как растения, полученные данным методом, раз¬
личаются генетически и морфофизиологически. Это дает возмож¬
ность селекционерам проводить отбор растений по хозяйствен-
но-важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях.
Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для ко¬
торых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариа¬
бельность между растениями-регенерантами не превышает уровня
естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести ама¬
риллис, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие куль¬
туры. Через каллусную культуру были размножены сахарная свекла,
некоторые представители рода Brassica, кукуруза, рис, пшеница и
другие злаковые, подсолнечник, лен, разработаны условия, способ¬
ствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, тома¬
тов.Оздоровление посадочного материала от вирусов. Основное пре¬
имущество клонального микроразмножения — это получение гене¬149
тически однородного, безвирусного посадочного материала. Этого
возможно достичь, используя меристемные ткани апексов и пазуш¬
ных почек органов стеблевого происхождения. Как правило, мери¬
стема состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листо¬
вых зачатков (примордиев) и является свободной от инфекции.Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристема-
тических тканях больных растений впервые высказано Н. Чунгом
(1938) и П. Р. Уайтом (1943). Начиная с 50-х годов XX века были пред¬
приняты первые успешные опыты по получению свободных от виру¬
сов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Ж. Мо-
рель и С. Мартин полагали, что в больном растении вирус распро¬
страняется с отставанием от быстро растущих молодых органов, осо¬
бенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация
вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия. Теоретиче¬
ские концепции, положенные в основу этого метода, стали прояс¬
няться в последнее время.Структурной основой используемого на практике явления служит
специфика строения точки роста растений; дистальная ее часть,
представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет
средний диаметр до 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В более ниж¬
них слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют про¬
камбий, дающий начало пучкам проводящей системы. Известно, что
успех клонального микроразмножения зависит от размера меристе-
матического экспланта, чем больше листовых зачатков и тканей стеб¬
ля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получе¬
нием целого, нормального пробирочного растения. Вместе с тем
зона, свободная от вирусных частиц, очень различна для разных ви¬
русов. Это зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле зла¬
ков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды,
могут достигать до 250 мкм. Такая особенность строения апикальной
меристемы исключает проникновение в нее вируса путем быстрого
транспортирования по проводящей системе, но допускает возмож¬
ность медленного распространения через плазмодезмы, соединяю¬
щие меристематические клетки. При культивировании апикальной
меристемы картофеля величиной 200 мкм на питательной среде и
дальнейшее получение из нее растений-регенерантов показали, что
среди полученных растений только 10 % были свободны от Х-вируса,
но 70 % — от Y-вируса.Применение электронной микроскопии часто обнаруживает на¬
личие вирусов в меристеме пораженных ими растений, это, впрочем,
подтверждает общеизвестный факт, что число лишенных вируса рас¬150
тений после подобной операции чрезвычайно мало, и многие мери¬
стемы пораженных растений инфекционны.Таким образом, эффективность применения апикальной мери¬
стемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами расте¬
ний оказывается низкой. Это было доказано результатами, получен¬
ными рядом меристемных лабораторий Российской Федерации и
Крыма, показывающими, что из апикальных меристем растений
гвоздики, цимбидиума, пораженных вирусами CarMV и CarVMV, в
условиях in vitro получают инфицированные мериклоны.Практически возможно получение безвирусной апикальной ме¬
ристемы от больного растения, но при этом риск попадания вирусов в
здоровые ткани должен быть снижен до нуля. Это может быть достиг¬
нуто путем применения предварительной термотерапии исходных
растений или хемотерапии.Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in
vitro и предусматривает использование сухого горячего воздуха. Для
объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе
термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной из
них, высокие температуры воздействуют непосредственно на вирус¬
ные частицы через их рибонуклеиновую кислоту и белковую оболоч¬
ку, вызывая физическое разрушение и лишая вирусные частицы ин->
фекционности. Вторая гипотеза состоит в том, что высокая темпера¬
тура действует на вирусы через метаболизм растений. Под влиянием
высоких температур нарушается равновесие между синтезом и дегра¬
дацией вирусных частиц. Если преобладает синтез, то концентрация
вируса в зараженных тканях растет, и наоборот.Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в специаль¬
ные термокамеры, где в течение первой недели повышают температу¬
ру от 25 до 37 °С путем ежедневного увеличения температуры на 2 °С.
Не менее важно при термотерапии создавать и поддерживать на про¬
тяжении всего процесса оптимальные режимы: температуру 37 °С,
освещенность лампами дневного света 5 тыс. лк, фотопериод в зави¬
симости от культуры 14—16 ч в сутки при относительной влажности
воздуха в термокамере 90 %.Продолжительность термотерапии всецело зависит от состава ви-
русови их термостойкости. Если, например, для гвоздики достаточно
10—12-недельного воздействия теплом, то для освобождения хризан¬
темы от Б-вируса этот период длится 12 недель и более. Однако суще¬
ствуют растения, например луковичные культуры, цимбидиум, розы
и другие, рост которых угнетается в результате длительной термотера¬
пии in vivo. Для таких растений целесообразно проводить термотера¬
пию растений-регенерантов in vitro.151
Помимо положительного действия термотерапии на освобожде¬
ние растений от вирусов выявлен положительный эффект высоких
температур на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цве¬
точных культур (гвоздики, хризантемы, фрезии) в условиях in vitro.
Применение термотерапии позволяет увеличить коэффициент раз¬
множения на 50—60 %, повысить адаптацию пробирочных расте-
ний-регенерантов к почвенным условиям, а также получить более
высокий процент безвирусных маточных растений.Применение термотерапии в сочетании с меристемной культурой
позволяет оздоровить более 70 % растений-регенерантов хмеля от ви¬
русного хлороза, 90 % растений земляники, 25 % — черной и крас¬
ной смородины, 50 % — малины, более 80 % — картофеля. Проверку
растений на наличие вирусов, как правило, проводят при помощи
иммуноферментного анализа, электронной микроскопии и травяни¬
стых растений-индикаторов.Другой способ, применяемый для освобождения растений от ви¬
русов,— хемотерапия. Он заключается в добавлении в питательную
среду, на которой культивируют апикальные меристемы, аналога гуа-
нозина — 1р-Д-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоскимид (ком¬
мерческое название вирозол) в концентрации 20—50 мг/л. Это проти¬
вовирусный препарат широкого спектра действия. При использова¬
нии вирозола в культуральной среде процент безвирусных меристем-
ных растений для ряда обычных для этих растений вирусов
увеличивался до 80—100 % при 0—41 % в контроле. Положительные
результаты хемотерапии были получены для сливы, черешни, мали¬
ны, некоторых цветочных и других растений. Термо- и хемотерапев-
тические методы оздоровления посадочного материала от вирусов
экономически малоэффективны. Поэтому в настоящее время с помо¬
щью методов трансгеноза создаются формы растений с генетической
устойчивостью к вирусам.Техника культивирования растительных тканей на разных этапах
клонального микроразмножения. Для культивирования тканей на каж¬
дом из четырех этапов требуется применение определенного состава
питательной среды.1	э т а п. На этом этапе необходимо добиться получения хорошо
растущей стерильной культуры. Это осуществляется путем стерили¬
зации растительных тканей ртутьсодержащими растворами (сулема,
или диацид, 0,1—0,2%-я) или хлорсодержащими (хлорамин 10—
15 %-й, гипохлорит натрия или кальция 5—10 %-й) в течение 5—10	мин для нежных, легко повреждаемых тканей растений и 10—12	мин — для тканей, имеющих более плотную оболочку. После это¬
го растительные ткани необходимо тщательно промыть в стерильной152
дистиллированной воде, как правило, в трех порциях и перенести на
заранее приготовленную стерильную питательную среду. Если исход¬
ную стерильную культуру экспланта получить трудно, рекомендуется
вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бен¬
зил пенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую
очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается
тенденция к накоплению внутренней инфекции.На первом этапе, как правило, используют среду, содержащую
минеральные соли по рецепту Т. Мурасига и Ф. Скуга, а также раз¬
личные биологически активные вещества и стимуляторы роста (аук¬
сины, цитокинины) в различных сочетаниях в зависимости от объек¬
та. В случае, когда наблюдается ингибирование роста первичного
экспланта за счет выделения им в питательную среду токсичных ве¬
ществ (фенолов, терпенов и других вторичных соединений), усилить
его рост можно, используя антиоксиданты. Это возможно двумя спо¬
собами: омывкой экспланта слабым раствором антиоксиданта в тече¬
ние 4—24 ч; непосредственным добавлением антиоксиданта в пита¬
тельную среду. В качестве антиоксидантов используют: аскорбиновую
кислоту (1—60 мг/л), глютатион (4—5 мг/л), дитиотриэтол (1—3 мг/л),
диэтилдитиокарбамат (2—5 мг/л), поливинилпирролидон (5000—
10 000 мг/л). В некоторых случаях целесообразно добавлять в пита¬
тельную среду адсорбент — древесный активированный уголь в кон¬
центрации 0,5—1 %. Продолжительность первого этапа — от одного
до двух месяцев, в результате которого наблюдается рост меристема-
тических тканей и формирование первичных побегов.II	э т а п — собственно микроразмножение. На этом этапе необ¬
ходимо добиться получения максимального количества мериклонов,
учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличи¬
вается число растений-регенерантов с неправильной морфологией и
возможно образование растений-мутантов. Как и на первом этапе,
используют питательную среду по рецепту Т. Мурасига и Ф. Скуга,
содержащую различные биологически активные вещества, а также
регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий
культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация
внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цито¬
кининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до
10 мг/л, а из ауксинов — ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
При долгом культивировании растительных тканей на питательных
средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) про¬
исходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого
физиологического уровня, что приводит к появлению токсического
действия и формированию растений с измененной морфологией.153
Вместе с тем возможно наблюдать такие нежелательные для клональ¬
ного микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации
пазушных меристем, образование витрифицированных (оводнен-
ных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению.
Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по
данным Н.В. Катавой и Р.Г. Бутенко, используя питательные среды с
минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих ста¬
бильный коэффициент микроразмножения, или чередованием цик¬
лов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фито¬
гормонов.Ill—IV этапы — укоренение микропобегов, их последующая
адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наибо¬
лее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального
микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основ¬
ной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концен¬
трацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменя¬
ют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1 % и пол¬
ностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В каче¬
стве стимулятора корнеобразования используют (3-индолил-3-
масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК. Укоренение микропобе¬
гов проводят двумя способами:1)	выдерживание микропобегов в течение нескольких часов
(2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—
50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде
без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном суб¬
страте (импульсная обработка);2)	непосредственное культивирование микропобегов в течение
3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких
концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта).В последнее время предложен пока мало практикуемый метод
укоренения пробирочных растений — в условиях гидропоники. Этот
метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновре¬
менно получать растения, адаптированные к естественным условиям.
Для картофеля возможно использовать бессубстратную гидропонику
для получения миниклубней. Затенение нижней части культуральных
сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду
активированного угля способствует укоренению микропобегов.Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответст¬
венным этапом, завершающим процесс клонального микроразмно¬
жения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных
растений — весна или начало лета. Растения с двумя-тремя листьями
и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб154
или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным
крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвен¬
ный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90 °С в
течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов ис¬
пользуют торф, песок (3 : 1); торф, дерновую почву, перлит (1 : 1 : 1);
торф, песок, перлит (1 .1:1). Исключение составляют семейство ор¬
хидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха,
смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1: 1). Приго¬
товленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные
ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают расте-
ния-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с ре¬
гулируемым температурным режимом (20—22 °С), освещенностью не
более 5 тыс. лк и влажностью 65—90 %. Для лучшего роста растений
создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет воз¬
можности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают
стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые по¬
степенно открывают до полной адаптации растений.Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся расте¬
ния подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Му-
расига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений)
или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растения
рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее
выращивание акклиматизированных растений соответствует приня¬
той агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида
растений.Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным услови¬
ям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Не¬
редко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в
росте, опадение листьев и гибель растений. Это связано, в первую
очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность
устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого
количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro
не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою
очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из
почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах кло¬
нального микроразмножения применять искусственную микориза-
цию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль
в снабжении растений минеральными и органическими питательны¬
ми веществами, водой, биологически активными веществами, а так¬
же в защите растений от патогенов. Существует два способа зараже¬
ния растений микорйзообразующими грибами: 1) in vitro (в стериль¬
ных условиях); 2) in vivo (в естественных условиях). Первый способ155
более благоприятен, так как в этом случае исключается возможность
загрязнений почвы другими микроорганизмами. Кроме того, в усло¬
виях in vitro есть возможность контролировать условия культивиро¬
вания (свет, температура, влажность) и подбирать субстрат (pH, аэра¬
ция), обеспечивающий нормальное формирование микоризы. Расте¬
ния, размноженные in vitro, развиваются значительно лучше, если их
корневая система находилась в контакте с микоризообразующими
грибами. В этом случае улучшалось снабжение их азотом, увеличи¬
лась в 1,5—2 раза приживаемость растений при их пересадке в почву,
а также повышался прирост надземной биомассы. Такие работы были
проведены с березой, эвкалиптом, каштаном, сосной, лохом и разны¬
ми клонами ольхи.Индийскими учеными предложен простой метод предотвраще¬
ния быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro,
во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том,
что листья в течение всего акклиматизационного периода следует оп¬
рыскивать 50 %-м водным раствором глицерина или смесью парафи¬
на, или жира в диэтиловом эфире (1 : 1). Применение этого метода
помогает избежать длинных и затруднительных процессов закалива¬
ния пробирочных растений и обеспечивает 100 %-ю приживаемо¬
стью.В Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН раз¬
работан упрощенный способ адаптации пробирочных растений ви¬
нограда. Он состоит в том, что адаптацию растения безболезненно
проходят в пробирках — для этого достаточно снять пробки с тех про¬
бирок, в которых растения достигают пробки. В таком состоянии рас¬
тения оставляют на 1,5—2 недели. К концу этого периода верхушка
растения и два развитых листочка появляются над пробиркой и такое
растение готово к пересадке в почву. Растения пересаживают в сте¬
рильной почвенный субстрат вместе с агаром для предотвращения
механических повреждений корневой системы. Побег заглубляют в
почвенный субстрат так, чтобы над поверхностью оставался стебель с
одним-двумя развитыми листочками, не более. Применение этого
способа для адаптации растений винограда к почвенным условиям
позволяет упростить и удешевить технику акклиматизации растений.
Это достигается вследствие того, что в этом случае туманообразую¬
щая установка не используется (А.Б. Бургутин, 1988).Оптимизация условий клонального микроразмножения растений.
Важнейшее условие успешного культивирования изолированных
клеток и тканей — сбалансированность питательных сред по мине¬
ральным солям, углеводам, фитогормонам и т. д. При введении в
культуру нового вида растений исследователи нередко испытывают156
большое число сред. Этот процесс длителен и часто не приносит
должного результата. Для определения оптимального состава пита¬
тельной среды применяют методы математического планирования
эксперимента, позволяющие быстро при небольшом объеме экспе¬
риментов определить условия культивирования, обеспечивающие
высокую скорость размножения, изучить зависимость микроразмно¬
жения от совокупности факторов, действующих на процесс, а также
установить наличие и оценить эффективность межфакторных взаи¬
модействий. В зависимости от поставленной цели эксперименты
проводят по полному или дробному плану первого или второго по¬
рядка.Успех оптимизации зависит оттого, насколько правильно выбран
критерий оптимизации. На первом этапе микроразмножения крите¬
рием может служить количественная оценка любой морфогенетиче¬
ской реакции экспланта, ведущей в дальнейшем к формированию цело¬
го растительного организма. Например, высота побега, число диффе¬
ренцирующихся стеблевых апексов, побегов, эмбриоидов. На втором
этапе учитывается общее число развившихся побегов, эмбриоидов, ко¬
торое должно отражать эффективность размножения. Критерием оп¬
тимизации третьего этапа может служить процент укорененных расте¬
ний, длина корневой системы, число корней на один микропобег. При
этом также необходимо учитывать высоту и общее состояние растения
и приживаемость его при пересадке в почву.Математическое планирование необходимо начинать с выбора
факторов, действующих на изучаемый процесс (Х|, Х2, Х3,... и т. д.),
их предельных значений (верхний и нижний уровни) и схемы экспе¬
римента (матрицы). После чего отбирают экспланты, используемые в
эксперименте. При этом необходимо учитывать неоднородность ис¬
ходного растительного материала и гетерогенность культивируемых
тканей. Поэтому растительный материал необходимо равномерно
распределять между разными вариантами эксперимента. Оптималь¬
ные условия культивирования должны обеспечить удовлетворитель¬
ный рост всех эксплантов.Обработку результатов многофакторных экспериментов прово¬
дят статистически, и для получения уравнений регрессии рассчиты¬
вают следующие показатели: 1) коэффициент регресии свободного
члена; 2) коэффициенты регрессии изучаемых факторов; 3) коэффи¬
циенты регрессии межфакторных взаимодействий; 4) построчные
дисперсии; 5) значение критерия Кохрена; 6) адекватность результа¬
тов. Подробное и обстоятельное изложение принципов постановки,
проведения и обработки результатов многофакторных эксперимен¬
тов можно найти в руководстве по математическому планированию,157
изложенному в книге П.Н. Максимова «Многофакторный экспери¬
мент в биологии».Так, при оптимизации начальных условий культивирования ги-
покотилей шести генотипов томатов был поставлен опыт первого по¬
рядка по матрице полного факторного эксперимента 2 //16, где2	— число уровней, на которых испытывались факторы; 4 — число
изучаемых в эксперименте факторов (Xi — инозит, Х2 — сахароза,
Х3 — зеатин,Х4 — ЙУК); 16 — число опытов по схеме эксперимента.В результате статистической обработки были получены следую¬
щие уравнения регрессии:Y = 3,756 + 1,619Х2 - 0,419Х|Х2 - 0,244Х2Х3Х4 (по размеру кал¬
луса);Y, = 2,438 + 0,738Х 2 - 0,662Х3 - 0,438Х4 + 0,433Х2Х3 + 0,462Х,Х2Х3 +
+ 0,437Х|Х4 + 0,537Х|Х2Х4 - 0,312Х|Х2Х3Х4 (по числу почек на один
каллус).Из уравнений видно, что все факторы, за исключением Хь оказы¬
вают прямое положительное или отрицательное действие на изучае¬
мые процессы. Так, значение фактора Х2 в обоих уравнениях свиде¬
тельствует о том, что добавление его в питательную среду стимулиру¬
ет рост каллуса и образование адвентивных почек, а уменьшение кон¬
центрации зеатина и ИУК (Х3 и Х4 соответственно) увеличивает
выход адвентивных почек с одного каллуса. Таким образом, за один
эксперимент были определены факторы, влияющие на образование
каллуса и адвентивных почек, и определен оптимальный состав пита¬
тельной среды для начального этапа клонального микроразмножения
томатов через первичный каллус.В последние годы многофакторные эксперименты широко ис¬
пользуются для оптимизации условий культивирования каллусных
тканей сахарной свеклы, бобов, раувольфии, женьшеня; процессов
клонального микроразмножения герберы, фрезии, каперсов, полыни
лимонной, сосны обыкновенной и некоторых других растений. Ме¬
тоды математического планирования являются эффективным и эко¬
номически выгодным способом оптимизации культивирования рас¬
тительных тканей in vitro и микроразмножения растений.Влияние генетических, физиологических, гормональных и физиче¬
ских факторов на микроразмножение растений. При разработке мето¬
дов клонального микроразмножения растений необходимо учиты¬
вать влияние генетических, физиологических, гормональных и физи¬
ческих факторов. Это связано с тем, что разработанная методика для
определенного клона одного вида не всегда может быть применена
для размножения других представителей этого вида и тем более расте¬
ний другого вида. На микроразмножение влияют генотип, возраст158
исходного растения, сезонность изоляции, а также размер первично¬
го экспланта. Из гормональных — соотношение цитокининов и аук¬
синов, состав питательной среды по минеральным веществам, вита¬
минам, сахарозы, а из физических факторов влияние оказывают кон¬
систенция среды (жидкая или агаризованная), ее кислотность, усло¬
вия освещения, а также температурный режим и относительная
влажность воздуха.Генетические и физиологические факторы.
Из факторов, определяющих успех клонального микроразмножения,
наибольшее значение имеет генотип исходного растения. Экспери¬
ментально доказано, что двудольные травянистые растения обладают
большими морфогенетическими потенциями, т. е. имеют более выра¬
женную способность к индукции заложения адвентивных почек, рос¬
ту побегов, укоренению и, в конечном итоге, получению более высо¬
кого коэффициента размножения, чем ткани и органы однодольных
травянистых и, тем более, древесных растений. На примере сахарной
свеклы было показано, что наибольшее число регенерантов получено
от тетраплоидных форм, меньше всего от диплоидных, а триплоид-
ные гибриды занимают промежуточное положение. Аналогичные ре¬
зультаты были получены с 11 генотипами перуанского картофеля, ра¬
боты были проведены на кафедре сельскохозяйственной биотехноло¬
гии РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева.Существенное влияние на реализацию морфогенетического по¬
тенциала в процессе микроразмножения оказывают сортовая и родо¬
вая специфика исходного экспланта. Известно, что виды растений,
хорошо размножающихся вегетативно, обычно проявляют высокую
регенерационную способность в культуре in vitro. Среди видов, обла¬
дающих значительным морфогенетическим потенциалом, предста¬
вители семейств Solanaceae, Umbelliferae, Cruciferae, Compositae; труд¬
но регенерируют растения из семейства Gramineae. Генотип материн¬
ского растения значительно влияет на ход клонального микрораз¬
множения. В пределах вида некоторые генотипы размножаются
легче, чем другие.Для растений хмеля было показано, что изолированные апексы
различных сортов по-разному реагируют на присутствие в питатель¬
ной среде регуляторов роста: для сорта Смолистый оптимальной
была концентрация БАП 1 мг/л, для сорта Истринский-15 — 0,5—1,5 мг/л БАП и 0,05 мг/л ИУК. Апексы сорта Смолистый не реагиро¬
вали на добавление в питательную среду ИУК и 2,4-Д, а у сорта Ист-
ринский-15 увеличивался рост побегов на среде с 0,05 мг/л ИУК и
0,05 мг/л 2,4-Д. Для изолированных апексов крыжовника также были
отмечены сортовые различия в морфогенетических реакциях на усло¬159
вия культивирования. Так, апексы, культивируемые на питательной
среде, содержащей минеральные соли по Т. Мурасига и Ф. Скуга,
БАП 0,5 мг/л сорта Финик пролиферировали каллус, из которого за¬
тем формировались побеги, а апексы сортов Русский, Колобок, Розо¬
вый обладали способностью к прямой регенерации побегов.Зависимость морфогенетического потенциала от родовой специ¬
фики растений была обнаружена на злаковых травах, таких, как ежа
сборная, житняк гребенчатый, овсяница луговая и бороздчатая, ко-
лосняки гигантский, узколистный, мягкий, пырейник ситниковый,
пшеница Саратовская-29, Палестинка-6, неполные пшенично-ко-
лосняковые амфидиплоиды 98, 99, 101. В результате экспериментов
были отмечены различные потребности в макро- и микроэлементах,
органических компонентах (аминокислот, гидролизата казеина,
дрожжевого экстракта, биотина), регуляторах роста. Установлено,
что гибриды обладают более высокой морфогенетической активно¬
стью, чем исходные родительские формы.Среди древесных примером родовой специфики могут служить
хвойные. Так, например, культивирование изолированных зароды¬
шей сосны замечательной, сосны желтой, сосны приморской, ели
обыкновенной, ели колючей на модифицированной питательной
среде Т. Мурасига и Ф. Скуга, содержащей цитокинин (БАП), на¬
блюдается образование почек de novo. Причем в одних и тех же усло¬
виях выращивания процент образования адвентивных почек для пе¬
речисленных выше представителей рода Pinus колебался от 20 до
35 %, вто время какдля Picea это значение не превышало 10 %.Сортовая специфика может проявляться и при укоренении мик¬
ропобегов. Так, например, для микропобегов вишни было отмечено,
что сорт Шубинка после обработки ИМ К (50 мг/л) укоренился на
52 %, сорт Владимирская — на 18 %, а сорт Любская — на 13 %. Для
разных сортов черной смородины также наблюдается достоверное
различие в корнеобразовательной способности изолированных вер¬
хушек побегов.Физиологический возраст исходного экспланта имеет несомнен¬
ное значение в проявлении способности к морфогенезу. Зрелые заро¬
дыши, 20—30-дневные проростки или различные их части (ювениль¬
ный материал) обладают высокими морфогенетическими потенция¬
ми по сравнению с тканями взрослых растений и способны образо¬
вывать в большом количестве адвентивные почки, стимулировать
развитие пазушных меристем, которые в дальнейшем формируют хо¬
рошо растущие побеги, способные к укоренению. В этом случае, на¬
пример, из одного изолированного зародыша лиственных пород воз¬
можно получить до 10—100 тыс. растений в год, в то время как при160
культивировании пазушных или апикальных почек взрослых расте¬
ний коэффициент размножения уменьшается на 1—2 порядка.Возраст первичного экспланта оказывает существенное влияние
и на укоренение микропобегов,размноженных in vitro. С увеличени¬
ем возраста исходного материала, как правило, снижается способ¬
ность побегов и черенков к укоренению. Так, при работе с восемью
видами яблонь было получено 80—90 %-е укоренение микропобегов
из ювенильного материала, 50 % — из апикальных почек, изолиро¬
ванных с 2—3-летних растений, и 20—30 % — из растений более стар¬
шего возраста.Несомненно, с практической точки зрения целесообразно раз¬
множать растения, и в частности древесные, в возрасте старше 20 лет,
т. е. после проведения оценки по хозяйственно важным признакам.
Однако размножение их in vitro в таком возрасте представляет боль¬
шие трудности. Во-первых, все типы тканей и органов у взрослых
растений эндогенно заражены грибами и бактериями, что значитель¬
но затрудняет получение асептической культуры. Во-вторых, почки
или другие органы одного и того же взрослого дерева различаются ме¬
жду собой по поведению в условиях in vitro гораздо больше, чем имеет
место у травянистых растений. Это приводит к проведению специ¬
альных экспериментов, по подбору оптимальных условий культиви¬
рования, обеспечивающих нормальный рост и развитие вновь вве¬
денных эксплантов в культуру.В настоящее время преодоление возрастного барьера осуществля¬
ется путем реювенилизации — сочетание работ in vivo и in vitro. Рею-
венилизацию (омоложение) можно проводить несколькими способа¬
ми: 1) многократная обработка растущего дерева или отдельных
ветвей раствором цитокинина перед эксплантированием; 2) по¬
вторное черенкование; 3) частая подрезка деревьев для индукции
роста побегов непосредственно из ствола дерева или для стимуляции
корневых отпрысков; 4) проведение повторных прививок; 5) путем
серии субкультивирований (in vitro); 6) создание густых насажде¬
ний, обеспечивающих боковое затенение, которое будет стимулиро¬
вать развитие спящих почек. Або Эл Нил предложил технологию
реювенилизации, первый этап которой состоит в многократной обра¬
ботке цитокинином деревьев, находящихся в состоянии покоя. Одна¬
ко можно использовать и другие — кинетин, 2ip. Выбор цитокинина
зависит от реакции обрабатываемого вида, которую устанавливают
экспериментально.В сочетании с цитокинином можно использовать и другие регуля¬
торы роста. Например, у некоторых видов отмечается повышенная
реакция, когда с БАП применяют N-диметиламиноянтарную кисло-11-4266161
ту в небольшой концентрации. Обрабатывают in vivo все растущее де¬
рево или его отдельные ветви. Срезанные ветви погружают в раствор
цитокинина или его вводят непосредственно в сосудистую систему
дерева, например, через конец срезанной ветки путем инъекции. Об¬
работку проводят через 4—5 дней, так как более частые обработки
гормонами могут вызвать отравление растений. Такие обработки ин¬
дуцируют образование почек или побегов, которые приобретают
морфологию, сходную с морфологией молодых особей. Побеги или
короткие отрезки стебля, содержащие почки, затем помещают на пи¬
тательную среду (in vitro) для индукции роста почек и побегов. Впо¬
следствии сформировавшиеся побеги переносят либо на среду для
размножения, либо на среду для укоренения. Промежуточной стади¬
ей при этом является среда, способствующая раскрытию вновь обра¬
зовавшихся почек и развитию их в побеги.К физиологическим факторам также относится и время (сезон¬
ность) изоляции экспланта. Ткани и органы, изолированные в мо¬
мент вегетации растений, обладают более высокой чувствительно¬
стью к составу питательной среды и способны с высокой частотой об¬
разовывать адвентивные почки, формировать побеги и укореняться,
чем ткани, изолированные в период глубокого и вынужденного по¬
коя. Например, весенняя посадка апексов крыжовника сорта Финик
на питательную среду Т. Мурасига и Ф. Скуга, содержащей БАП
0,5 мг/л, способствовала пролиферации каллуса, из которого затем
индуцировались с высокой частотой побеги. В то время как летняя
изоляция апексов стимулировала более интенсивную пролиферацию
каллуса, но при этом уменьшался процент регенерации побегов.Размер экспланта является еще одним фактором, определяющим
успех микроразмножения. Чем меньше эксплант, тем меньшей реге¬
нерационной способностью он обладает, и наоборот. Экспланты
большего размера, состоящие из паренхимы, проводящей ткани и
камбия, могут независимо от соотношения фитогормонов в пита¬
тельной среде спонтанно образовывать почки. С другой стороны, в
крупном экспланте увеличивается возможность появления в его
клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению
размноженных в культуре тканей растений. Оптимальная величина
экспланта зависит от видовых особенностей растения-донора и
свойств органа, служащего источником первичного экспланта. Так,
для малины был установлен размер первичного экспланта 2 мм, при
котором 60 % апикальных верхушек растения регенерировали на
среде Мореля. Для хмеля этот показатель колеблется от 0,1 до
0,2 мм, а для лука и чеснока оптимальный размер меристемы состав¬
ляет 0,5—0,8 мм.162
У многих растений морфогенетическая способность изолирован¬
ных тканей, и в частности меристематических, зависит от расположе¬
ния почек на побегах. Так, исследования регенерационной способ¬
ности терминальных и латеральных почек побегов крыжовника сорта
Русский показали, что наибольшим морфогенетическим потенциа¬
лом обладают три верхние почки (45—65 %), а для растений спаржи
было установлено, что почки нижней части побега обладают большей
регенерационной способностью, чем почки средней и апикальной
частей.Гормональные факторы. Немаловажный фактор,
влияющий на успех клонального микроразмножения,— гормональ¬
ный баланс питательной среды. При высоком соотношении гормо¬
нов (цитокинин — ауксин) происходит развитие пазушных меристем
или образование адвентивных почек, при низком — индуцируется
корнеобразование, а при среднем — наблюдается образование и про¬
лиферация каллуса. Наиболее часто при клональном микроразмно¬
жении используют ИУК, реже НУК в качестве ауксиновых компо¬
нентов, кинетин и БАП представляют при этом цитокинины. Кроме
перечисленных цитокининов применяют и другие, у которых актив¬
ность в стимуляции образования побегов выше. Цитокинины, ис¬
пользуемые в микроразмножении растений, по своей активности
можно расположить в следующем порядке: кинетин < 6-бензилами-
нопурин (БАП) < 2-изопентениладенин (2ip) < зеатин.Кроме цитокининов и ауксинов в питательную среду иногда до¬
бавляют гибберелловую кислоту, которая стимулирует рост и вытяги¬
вание (элонгацию) сформировавшихся почек и способствует получе¬
нию растений с хорошо развитой надземной частью.Принципиально возможна индукция и стимуляция различных
морфогенетических реакций в культуре тканей низкими концентра¬
циями экзогенных фитогормонов и угнетение общей активности
вплоть до гибели растительных тканей при высокой гормональной
насыщенности питательной среды. Эту специфику реакций культи¬
вируемых тканей и органов растений на введение фитогормонов сле¬
дует учитывать при использовании регуляторов роста с целью раз¬
множения растений.На клональное микроразмножение наряду с гормонами влияют
минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении рас¬
тений in vitro часто используют среды Мурасига и Скуга, Линсмаера и
Скуга, Грессхоффа и Доу, Нича, Хеллера, Шенка и Хильдебрандта и
других, отличающиеся друг от друга соотношением аммонийного и
нитратного азота. В большинстве случаев исследователи отдают
предпочтение среде Мурасига и Скуга с более высоким содержанием163
неорганического азота. Использование сред, обогащенных азотом, не
только ведет к неорганизованному росту каллусной ткани, но и сти¬
мулирует процессы органогенеза и особенно соматического эмбрио¬
генеза. Например, NH4NO3 влияет на морфогенетический потенциал
зародышей разных видов Brassica. Процент выживания зародышей и
частота образования побегов увеличиваются при уменьшении кон¬
центрации NH4NO3 в среде, а максимальное число побегов на заро¬
дышах формируется в случае полного исключения NH4NO3 из среды.
Снижение содержания KN03 и NH4NO3 до 6,7 мМ улучшало морфо¬
генез крыжовника сортов Инвикта и Карлз. Для томатов эксперимен¬
тально было установлено, что среды с повышенным содержанием ми¬
нерального азота ингибируют пролиферацию каллуса и приводят к
гибели эксплантов. Для глоксинии была отмечена зависимость об¬
разования вегетативных или репродуктивных структур от концен¬
трации компонентов питательной среды. Так, при высокой концен¬
трации KN03 (20 мМ) и сахарозы (100 мМ) преимущественно разви¬
ваются вегетативные почки, а цветочные только у 28 % эксплантов.
При низком содержании K.NO3 (2 мМ) и сахарозы (15 мМ) на всех
эксплантах образуются только цветочные почки.Значительное влияние на процесс микроразмножения оказывают
биологически активные вещества негормональной природы, а также уг¬
леродное питание. Как правило, присутствие в составе питательной
среды витаминов, аминокислот, растительных экстрактов, гидроли¬
зата казеина необходимо для индукции пролиферации каллуса и ре¬
генерации из него побегов или эмбриоидов. Когда же развитие побе¬
гов происходит из существующих пазушных меристем или сформи¬
ровавшихся почек и эмбриоидов, то обычно влияние биологически
активных добавок становится несущественным, ибо побеги сами
способны к синтезу нужных для их жизнедеятельности веществ. За¬
мечено, что высокие концентрации биологически активных веществ
приводят к гипервитаминозу, что проявляется в угнетении роста, по-
бурении и высыхании листьев, в изменении морфологии растений.На всех этапах клонального микроразмножения в качестве источ¬
ника углеродного питания используют 3 %-ю сахарозу. Однако эта
концентрация не является оптимальной для всех вводимых в культуру
in vitro растений. Так, экспериментально доказано, что сахароза явля¬
ется фактором, способным направить развитие побегов каперса in
vitro, и что можно получать либо вегетирующие побеги, либо пурпур¬
ные почки возобновления. При культивировании апикальных и бо¬
ковых почек на среде, содержащей сахарозу в концентрации 3 % и бо¬
лее, наблюдается появление антоциановой окраски почек, что явля¬
ется первым признаком перехода почек в состояние зимнего покоя.164
При использовании же пониженных концентраций (менее 3 %)
происходит формирование зеленых почек, способных в дальнейшем
к размножению (С.А. Сафразбекян, В.В. Урманцева, Н.В. Катева,
1991).В работах с изолированными зародышами ели обыкновенной
было также выявлено отрицательное влияние высокой концентрации
сахарозы (2—3 %) на процесс образования адвентивных почек. Пока¬
зано, что уже на втором пассаже этот процесс практически не проис¬
ходит, а к четвертому пассажу наблюдается гибель всех эксплантов.
Пониженное содержание сахарозы в среде стимулировало не только
образование адвентивных почек, но и дальнейшее их развитие в побе¬
ги. При 0,5—1 %-й концентрации сахарозы побеги через 2—3 месяца
культивирования имели высоту 1—1,5 см и затем использовались для
дальнейшего размножения или укоренения.Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания воз¬
можно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. Известно, что
после сахарозы наиболее часто применяемым источником углерод¬
ного питания для культивирования in vitro тканей растений является
глюкоза. Из 38 исследованных культур (травянистых и древесных)
85 % имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой. На треть¬
ем месте по эффективности использования культурами тканей расте¬
ний находится фруктоза. По мнению Д. Миноха, /3 культур успешно
использовали для своего роста фруктозу. Галактоза заметно отлича¬
ется от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тка¬
ней растений. Более половины изученных культур слабо или почти не
используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие
положительную роль галактозы для культивирования тканей и орга¬
нов растений.Таким образом, проблема использования гормонов, биологиче¬
ски активных веществ и минеральных солей не должна сводиться к
простому включению этих соединений в состав питательной среды по
готовым стандартным рецептам, а должна решаться с учетом кон¬
кретных морфогенетических реакций, используемых для микрораз¬
множения того или иного вида растений.Физические факторы. Консистенция среды является
важным фактором, влияющим на процессы роста эксплантов и обра¬
зование адвентивных почек. Известно, что при культивировании экс¬
плантов верхушки побегов в жидких питательных средах на аппаратах
роллерного типа значительно стимулируется их рост, не наблюдается
ярко выраженного апикального доминирования побегов, сокращает¬
ся период выращивания и количество пересадок, что обусловливает¬
ся хорошим снабжением растений питательными веществами. С дру¬165
гой стороны, в этих условиях возрастает возможность образования
аномальных, витрифицированных побегов. Использование твердых
агаризованных сред способствует преодолению витрификации, но,
вместе с тем, этот способ выращивания ухудшает условия питания
эксплантов и препятствует удалению продуктов метаболизма.На клональное микроразмножение и рост растений также влияет
и кислотность среды, определяющая доступность для растений пита¬
тельных веществ. Известно, что сильно кислые или щелочные среды
лимитируют поступление некоторых элементов, например фосфора
и железа, делая их относительно нерастворимыми и этим ограничи¬
вая рост растений. В то же время при высокой кислотности большое
количество этих элементов переходит в растворенное состояние и
становится токсичным для эксплантов.Как правило, ткани и органы растений культивируют на пита¬
тельной среде с pH 5,6—5,8. Однако эти условия не всегда могут быть
оптимальными. Например, для культуры зародышей сосны обыкно¬
венной было показано, что изменение кислотности питательной сре¬
ды от 4,7 до 5,2 позволяет увеличить в 2,5—3 раза способность зароды¬
шей образовывать адвентивные почки, а для культуры ели обыкно¬
венной наиболее благоприятный pH среды находился в пределах
5,2—5,6. Эти данные полностью совпадают с кислотностью почвы, на
которых успешно произрастают данные породы в естественных усло¬
виях. Поэтому биотехнологи должны учитывать в экспериментах по
культуре ткани кислотность почв естественного произрастания ис¬
следуемых растений.Обычно изолированные ткани растений выращивают при осве¬
щении люминесцентными лампами с учетом требований материн¬
ского растения к интенсивности и фотопериоду. Т. Мурасига реко¬
мендует на первом и втором этапах клонального микроразмножения
растений культивировать ткани при 1—5 тыс. лк и 14—16-часовом
фотопериоде, такие условия освещения способствуют инициации
побегов и корней у большинства растений.Многие исследования свидетельствуют, что интенсивность осве¬
щения играет важную роль в индукции органогенеза. Увеличение ос¬
вещенности с 3 до 6 тыс. лк способствовало интенсивному побегооб¬
разованию в культуре бегонии. Максимальное образование побегов и
корней в культуре тканей аспарагуса отмечено при 1 тыс. лк (16-часо-
вой фотопериод), снижение или увеличение интенсивности освеще¬
ния угнетало органогенез тканей.Интенсивность и характер роста изолированных тканей зависят и
от спектрального состава света. Так, белый, красный и голубой свет
более интенсивно индуцируют образование почек у ткани Heloniopsis166
orienatalis, чем зеленый. Красный свет стимулирует образование цве¬
точных почек у ткани табака, а темнота — образование корней. Ад¬
вентивные почки в каллусе табака индуцируются ультрафиолетовым,
голубым и фиолетовым светом. У эксплантов салата красный свет вы¬
зывает образование побегов. Для пробирочных растений картофеля
было установлено, что присутствие в среде НУК или ИУК значитель¬
но сильнее стимулировало клубнеобразование при красном свете,
чем на синем, тогда как БАП или кинетин стимулировали клубнеоб¬
разование активнее на синем по сравнению с красным светом (Т.Н.
Констаниноваи др., 1988). Наиболее благоприятное действие на уко¬
ренение побегов березы, активацию существующих меристем оказы¬
вает красный свет, при котором практически 100 % микрочеренков
образуют корни. При белом свете этот процесс идет менее активно, а
при синем корни образуются только у половины черенков, и в темно¬
те — у еще меньшего числа. Сочетание красного света с введением в
среду ИУК значительно ускоряет процесс корнеобразования и повы¬
шает интенсивность роста побегов. Синий свет увеличивает содержа¬
ние цитокининов в тканях растений и тем самым стимулирует обра¬
зование побегов.Температура оказывает значительное влияние на рост и регенера¬
цию изолированных тканей растений, способствуя активации мета¬
болических процессов. Для большинства растительных тканей тем¬
пературный оптимум составляет 23—25 °С. Однако существуют раз¬
личия между растениями в отношении их требований к температуре.
Так, образование луковичек у Lilium auratum наиболее эффективно
при 20 °С. Охлаждение эксплантов, предшествующее культивирова¬
нию ткани гладиолуса, улучшает ее регенерационную способность.
Низкие температуры (15—18 °С) в течение двух недель необходимы
для индукции образования побегов в культуре черешков бегонии. Для
почек цветоносов фаленопсиса отмечается влияние температуры на
тип морфогенеза: при +28 °С из почек регенерируют вегетативные
побеги, а при +20 °С — генеративные.Температурный режим зависит, главным образом, от вида расте¬
ний. Например, для тропических растений оптимальная температура
выращивания приближается к 27 °С, для растений альпийских лу¬
гов — 18—20 °С, для большинства других — 25 °С. При клональном
микроразмножении пробирочные растения выращивают в климати¬
ческих камерах, где поддерживается 16-часовой фотопериод и 70 %-я
относительная влажность воздуха.Таким образом, для повышения коэффициента размножения рас¬
тений необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала167
произрастания подбирать индивидуальные условия культивирова¬
ния.Следовательно, клональное микроразмножение является новым
перспективным способом вегетативного размножения растений, по¬
зволяющим получать генетически однородный, оздоровленный по¬
садочный материал, иметь высокий коэффициент размножения, со¬
кращать селекционный процесс, проводить работы в течение кругло¬
го года, экономя при этом площади, необходимые для выращивания
растений. Во многих странах мира биоиндустрия микроклонального
размножения поставлена на поточную промышленную основу и
представлена десятками активно функционирующих предприятий.
Например, во Франции 94 % всей продукции цветочных культур по¬
лучают методом культуры изолированных тканей. В США около 100
коммерческих предприятий получают посадочный материал декора¬
тивных, овощных, полевых, плодовых и лесных культур методом кло¬
нального микроразмножения. Ведущим производителем оздоров¬
ленного посадочного материала цветочных растений является Гол¬
ландия, а подвоев яблони, сливы и персика — Италия (до 250—
500 тыс. ежегодно). В нашей стране также ведутся интенсивные рабо¬
ты по клональному микроразмножению растений, и в настоящее вре¬
мя многие научно-исследовательские институты и промышленные
лаборатории разрабатывают и усовершенствуют методы микрораз¬
множения и оздоровления различных декоративных плодовых, ягод¬
ных, овощных, кормовых и древесных культур. Например, методы ус¬
коренного размножения винограда, разработанные во Всесоюзном
научно-исследовательском институте виноделия и виноградарства
«Магарач», позволяют получать из одного одноглазкового черенка
8 тыс. растений в течение четырех месяцев. Оздоровление промыш¬
ленных посадок малины от комплекса вирусных заболеваний путем
сочетания термотерапии и культуры меристемы повышает продуктив¬
ность культуры в 6—8 раз. Размножение и получение безвирусного по¬
садочного материала гвоздики, хризантемы, антуриума Андре, розы,
бегонии Элатиор и других ведется в специализированных цветоводче¬
ских хозяйствах «Элита» Российской Федерации и в меристематиче-
ском комплексе Республиканского концерна «Крымзеленстрой».Клональное микроразмножение декоративных,
плодово-ягодных и хвойных растенийЦветочные, плодово-ягодные культуры. Необходимость использо¬
вания здорового посадочного материала в промышленном садоводст¬
ве, цветоводстве и лесном хозяйстве не вызывает сомнений. В настоя¬168
щее время существует несколько методов получения оздоровленных
растений: тестирование большого количества исходного раститель¬
ного материала; размножение в условиях in vitro с последующим их
тестированием; термотерапия или хемиотерапия, тестирование, раз¬
множение in vitro и снова тестирование.Выбор метода зависит от вида вирусной инфекции, а также от ге¬
нотипических особенностей исследуемых объектов. Трудоемкость
проведения таких работ обусловила разработку индивидуальных ме¬
тодов размножения растений в условиях in vitro для каждого конкрет¬
ного растения, относящегося к разным таксономическим группам.
Основным методом, применяемым для сохранения и размножения
ценных экземпляров, остается метод, основанный на снятии апи¬
кального доминирования. Из плодовых и ягодных культур подобным
образом в промышленных масштабах размножают землянику, ежеви¬
ку, малину, яблоню, сливу, вишню, подвои и скелетообразователи
груши, а также некоторые декоративные культуры, такие, как сирень,
жимолость, кизильник, роза, хризантема и др. Данный метод счита¬
ется универсальным и имеет хорошую воспроизводимость результа¬
тов в пределах вида и рода растений; минимальную степень риска в
отношении получения генетически неоднородного посадочного ма¬
териала (Н.Е. Павловская и др., 1998).Второй распространенный метод клонального микроразмноже¬
ния для практических целей цветочно-декоративных культур и неко¬
торых плодовых — развитие адвентивных почек/побегов. Как прави¬
ло, в качестве первичного экспланта используют чешуи или сегменты
базальной части донца луковиц, сегменты листовой пластинки и
междоузлий побегов. Таким методом размножают, главным образом,
луковичные цветочные культуры (гиацинты, лилии, гладиолусы,
тюльпаны, нарцисы и др.).В настоящее время в коммерческих целях метод клонального
микроразмножения применяется для растений семейства Орхидных,
для которых размножаемые растения являются сложными гибрида¬
ми. Некоторые из них сочетают геномы трех-четырех разных родов.
В обычных условиях осуществить вегетативное размножение этих
растений сложно, а в случае завязываемости семян и их прорастания,
растение достигает фазы цветения лишь через 3—5 лет.В последние годы резко возрос спрос на многие цветочные и деко¬
ративные культуры. Вместе с тем некоторые ценные виды находятся
на грани исчезновения и занесены в Красную книгу. Сокращение и
размножение редких, исчезающих и декоративных видов растений
возможно при помощи методов клеточной инженерии, и в частности
клонального микроразмножения. На кафедре сельскохозяйственной169
биотехнологии РГАУ—МСХА им. К.А. Тимирязева разработаны тех¬
нологии быстрого размножения цветочных и декоративных растений
в условиях in vitro. Создан банк редких, декоративных, цветочных и
исчезающих видов растений, разработаны лабораторные технологии
размножения декоративно-лиственных и красиво-цветущих бегоний
(16 сортов), хризантем (10 сортов), гиацинтов (8 сортов), фиалок (12
сортов), эписций (6 сортов), лилий (20 сортов), гладиолусов, фритил-
лярий и других растений.Как правило, первичным эксплантом служат сегменты чешуи (лу¬
ковичные культуры), листья (розеточные культуры) и пазушные поч¬
ки (для растений с вертикальным ростсТм). Разработанные техноло¬
гии позволяют в течение 1,5 — 2 месяцев получать на одном эксплан-
те от 8 шт. (гиацинты) до 70 шт. (бегонии) адвентивных почек, спо¬
собных впоследствии развиваться в нормальные растения. По
предварительным расчетам можно получить в течение 6 месяцев 1250
микролуковиц фритиллярии (рябчик императорский) из 15 сегмен¬
тов луковицы. В течение года из одной луковицы можно вырастить до
8 тысяч лилий. Эти технологии основываются на микрочеренкова¬
нии или на индукции образования дополнительных почек или луко¬
виц непосредственно на первичном экспланте.Коммерческое микроразмножение растений становится быстро¬
растущим промышленным производством (табл. 3.5). Однако созда¬
нию коммерческих фирм-лабораторий должно предшествовать про¬
гнозирование рентабельности и социальной необходимости произ¬
водства данного вида продукции. Перед принятием решения по орга¬
низации коммерческих лабораторий должны быть учтены такие
факторы, как стоимость продукции, рыночная цена, емкость рынка,
сезонность поставки, выбор сортов.Таблица 3.5. Промышленные культуры (млн шт.), выращенные in vitro
в США, странах Азии и Европы в 2000 годуКультураСШАЕвропаАзияЦимбидиум гибридный (орхидея)0,50,20,2Бегония2,510—Рододендрон—3,5—Гербера2,5-0,5Ирис гибридный5,02,82,5Папоротник1,51,5—Фикус1,74,5-170
Окончание табл. 3.5КультураСШАЕвропаАзияДиффенбахия6,0——Земляника4,0-2,0Картофель7,0-—Роза—5,7—Практический интерес представляют исследования, объектами
которых являются зародыши плодовых растений раннего срока со¬
зревания. Объясняется это тем, что селекционно-генетическая рабо¬
та с такими сортами затрудняется из-за формирования у них непол¬
ноценных семян с недоразвитыми зародышами, которые в обычных
условиях не образуют всходы. Поэтому среди значительного числа
сортов разных плодовых культур очень мало раннеспелых (Н.Е. Пав¬
ловская, Л.В. Голышкин, Л.В. Голышкина, 1998). Во многих науч¬
но-исследовательских институтах по плодовым культурам разраба¬
тываются методические приемы культивирования зародышей in vitro
(например, для преодоления покоя семян черешни и персика), в
результате чего из изолированных зародышей получают стерильные
проростки (груша, миндаль, хурма, персик, черешня и др.), а также их
межвидовые гибриды (например, миндаль и хурма), которые в даль¬
нейшем размножают in vitro. Размноженные формы и ультраранние и
ранние по срокам созревания сорта урожайные, с плодами хорошего
качества, включаются в государственное сортоиспытание и райони¬
руются (например, персик сорт Пламенный).Хвойные породы. Интерес к работе с хвойными породами вызван
главным образом необходимостью сохранения генофонда некоторых
пород, их декоративными свойствами и трудностью размножения че¬
ренками. Для можжевельника, например, применение клепального
микроразмножения является наиболее перспективным способом,
так как семена данной породы обладают низкой всхожестью, наблю¬
дается дегенерация зародышей, а при черенковании процент укоре¬
ненных черенков не превышает 5—8 %. Введение в культуру крипто¬
мерии и ее последующее размножение необходимо с целью получе¬
ния достаточного количества посадочного материала, который ис¬
пользуется главным образом для посадки в садах и парках, где она
ценится из-за декоративных свойств. Хвоя криптомерии очень гус¬
тая, обладает способностью изменять окраску в зимний период, что
делает эту породу еще более привлекательной. Что же касается ос¬
тальных пород, за исключением некоторых видов семейства сосно-171
вых, то размноженный посадочный материал в основном использует¬
ся при озеленении городов.В табл. 3.6 и 3.7 представлены некоторые древесные хвойные по¬
роды, для которых разработана техника культивирования изолиро¬
ванных тканей в условиях in vitro.Таблица 3.6. Применение культуры тканей для размножения хвойных породСемейство, видФаза развитияПроисхождение эксплантаМетодУкорене¬первичного экс¬размно¬ниеплантаженияСемейство СосновыеПихта бальзами¬ВзрослаяПобеги1ческаяЛиственницаевропейскаяЮвенильнаяНезрелые и зрелые за¬
родыши, гипокотиль1, 4ВзрослаяПочки3Сукачева»Апекальные почки1+даурская»Почки1, 2’+Псевдотсуга ти-ЮвенильнаяЗародыши, семядоли,1, 4+солистнаяапекс проростка, гипоко¬
тильВзрослаяПочки, стебли1, 2+Тсуга западнаяЮвенильнаяСемядоли1Семейство КипарисовыеБиота восточнаяЮвенильнаяАпекс проростка, гипо¬
котиль1Кипарис лузи-»Зародыши, семядоли,1+танскийапекс проросткаМожжевельникВзрослаяВерхушка побега, сте¬1, змногоплодныйбельТуягигантскаяЮвенильнаяАпекс проростка1, 2+ВзрослаяВерхушка побега1, 2западнаяЮвенильнаяЗародыш1+ВзрослаяВерхушка побега1Семейство АраукариевыеАраукариячилийскаяЮвенильнаяГ ипокотиль1, з+ВзрослаяСтебель1172
Окончание табл. 3.6Семейство, видФаза развития
первичного экс¬
плантаПроисхождение эксплантаМетодразмно¬женияУкорене¬ниеузколистнаяЮвенильнаяГипокотиль1кунихами»Гипокотиль1Семейство ТаксодиевыеСеквойя вечно¬ЮвенильнаяЗародыш, апекс проро¬1, з+зеленаясткаКриптомерия»Семядоли, гипокотиль1, з+японскаяВзрослаяПочки, стебли1,3Таблица 3.7. Применение культуры in vitro для клонирования растений
представителей рода сосна и ельРод, видФаза развития
первичного экс¬
плантаПроисхождение эксплан¬
таМетод раз¬
множения*Укоре¬нениеСоснаБанксаЮвенильнаяЗародыши3калабрийскаяТо жеЗародыши, семядоли1, зканарская»СемядолиКаллусскрученная»Зародыши1карибская»Зародыши1Культера»Зародыши1, зкороткохвой¬ная»Семядоли, гипоко¬
тиль3замечательная»Зародыши1яйцеплодная»Зародыши, семядоли1+приморская»Семядоли, гипоко¬
тиль, корень1КаллусВзрослаяПочки1, 2пицундскаяЮвенильнаяАпекс проростка1желтая»Зародыши1, зВзрослаяПучок хвои1, 2лучистаяЮвенильнаяЗародыши, семядоли1, з+красная»Зародыши, апекс
проростка3+173
Окончание табл. 3.7Род, видФаза развития
первичного экс¬
плантаПроисхождение эксплан¬
таМетод раз¬
множения*Укоре¬нениеобыкновеннаяЮвенильнаяЗародыши, семядо¬
ли, апекс проростка,
гипокотиль1, зВзрослаяПучок хвои1, 2веймутоваЮвенильнаяЗародыши, семядо¬
ли, апекс проростка,
гипокотиль1, з+ВзрослаяСтебельКаллусладаннаяЮвенильнаяСемядоли1+ВзрослаяСтебельЕльКаллусОбыкновеннаяЮвенильнаяНезрелые и зрелые
зародыши, гипокотиль1, 3, 4ВзрослаяПочки, хвоя, стебель1КаллусКанадскаяЮвенильнаяГипокотиль1БелаяЮвенильнаяНезрелые и зрелые
зародыши, гипокотиль1, 4ЧернаяЮвенильнаяЗародыши, гипоко¬
тиль1, 4+КолючаяВзрослаяПочки1♦Примечания к таблицам 3.6 и 3.7:1 — образование адвентивных по¬
чек; 2 — клонирование древесных пород с применением методов микроче¬
ренкования; 3 — дифференциация почек в каллусе; 4 — соматический эм¬
бриогенез в каллусе.Для основных лесообразующих пород России, и прежде всего со¬
сны обыкновенной и ели европейской, в перспективе возможно
включение способа культуры изолированных зародышей в систему
селекции. В данном случае сокращается примерно в 3,5—4 раза срок
получения посадочного материала (рис. 3.16.). Так, в Канаде (Онта¬
рио) ежегодно высаживают на лесокультурную площадь более 60 млн
саженцев ели черной, выращенных из изолированных зародышей в
стерильных условиях.174
Контролируемое
опыление плюсовых
деревьевЛесосеменная плантация
(1-е поколение)Культура ткани
ювенильного материалаУлучшенный клон
(10 — 12 лет)ЧеренкованиеIIIЧеренкованиеIIjРеювенилизацияОтбор2-е поколениеОтборВегетативная
плантация
(30 —.35 лет)Улучшенные деревья
(60 лет)Рис. 3.16. Практическое применение способа клонального микроразмножения
в селекции хвойных пород3.11.	КУЛЬТУРА ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ
В СЕЛЕКЦИИ РАСТЕНИЙОдно из направлений клеточных технологий — это использова¬
ние их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный се¬
лекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Су¬
ществующие методы культивирования изолированных клеток и тка¬
ней in vitro условно можно разделить на две группы.Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не
подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести:
оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости),
культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (пре¬175
одоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем
культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изоли¬
рованных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение
отдаленных гибридов.Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому
от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов
растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани,
соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов
и получение неполовых гибридов), применение методов генной ин¬
женерии.Вспомогательное использование методов in vitro в селекции расте¬
ний. В отдаленной гибридизации находят применение такие методы
культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эм¬
бриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусст¬
венных питательных средах), клональное микроразмножение цен¬
ных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохране¬
ние.Оплодотворение in vitro (преодоление п р о -
гамной несовместимости) проводится в том случае, ко¬
гда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными
парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причина¬
ми: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания
пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или
блокирование ее роста на разных этапах развития и т. д.). Оплодотво¬
рение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирова¬
ние на искусственной агаризованной питательной среде завязи с на¬
несенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается, и на пита¬
тельную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи
которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется го¬
товая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro
или нет, можно по быстроувеличивающимся в размерах семяпочкам.
Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние
покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Пла¬
центарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовмес¬
тимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дики¬
ми видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение
межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976),
И.К. Шинкаревой (1986).Преодоление постгамной несовместимо¬
сти. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации
возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуп¬
лые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во време¬176
ни развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндос¬
перма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию.
В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и
выращивают его в питательной среде.Выращивание зародышей в искусственной питательной среде на¬
зывается эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зароды¬
ша может быть простой, без добавок физиологически активных ве¬
ществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая мине¬
ральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нару¬
шения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах,
что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте.
В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрио¬
нального рост зародыша, во время которого продолжается его диффе-
ренцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа
требуется более сложная по составу среда с повышенным содержани¬
ем сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гор¬
монов.Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в послед¬
нее время большое значение для получения отдаленных гибридов
зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показа¬
на возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов пу¬
тем доращивания незрелых зародышей, а также использования эм¬
бриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при
гибридизации пшеницы с колосняком.Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в
межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны
приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных
семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от
частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолирован¬
ных зародышей используется в селекции томатов и других овощных
растений.Исследована гормональная регуляция роста и развития зароды¬
шей томата in vitro. Обсуждается возможность применения эмбрио¬
культуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изу¬
чаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей
подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод
при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоле¬
ния постгамной несовместимости, но также с целью микроразмноже¬
ния ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем
каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регене¬
рантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зароды¬177
шей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних ста¬
диях жизненного цикла. Еще одна возможность применения куль¬
туры зародышей — использование ее в клеточной селекции.Клональное ми кроразмножение отдален¬
ных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить
гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход
гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Ино¬
гда, например, при селекции гречихи, трудно воспроизвести в потом¬
стве уникальные генотипы из-за перекрестного опыления культуры.
Поэтому перед исследователями часто встает задача — размножить и
сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального
микроразмножения. Размножают гибриды путем активации развития
меристемы пазушных почек (черенкованием стерильных побегов),
адвентивными почками или регенерацией растений из каллусной
ткани, в частности полученной при культивировании зародышей.Получение гаплоидов in vitro и использова¬
ние их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции
очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную ком¬
бинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды использу¬
ются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза
также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном
уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.В диплоидных растениях мутации редко затрагивают оба аллель¬
ных гена в гомологичных хромосомах. Особь обычно гетерозиготна
(два гена различаются), при этом проявляется действие только доми¬
нантного (но не рецессивного) гена. Поскольку мутации чаще рецес¬
сивны, чем доминантны, их довольно сложно выявить. В гаплоидных
же растениях, которые содержат только одну из каждой пары гомоло¬
гичных хромосом, мутации проявляются немедленно. Селекция на
гаплоидном уровне позволяет вести прямой отбор не только доми¬
нантных, но и рецессивных признаков.Гаплоидные особи стерильны, но можно искусственно удвоить
набор их хромосом с помощью колхицина и получить диплоидные го¬
мозиготные растения.Гаплоиды могут возникать спонтанно, но частота их спонтанного
возникновения очень мала. Искусственным путем с использованием
методов in vitro удается получить большие количества гаплоидных
растений. Существует три способа получения гаплоидов с использо¬
ванием метода культуры изолированных тканей:—	андрогенез — получение гаплоидных растений на искусствен¬
ной питательной среде из изолированных пыльников и микроспор
(рис. 3.17);178
Рис. 3.17. Прямая регенерация соматических эмбриоидов из изолированных
пыльников пшеницы (С.С. Беккужина, 1993)—	гиногенез — получение гаплоидных растений на искусственной
питательной среде из изолированных семяпочек;—	партеногенез — получение гаплоидов из гибридного зародыша,
у которого из-за несовместимости хромосом родителей потеряны от¬
цовские хромосомы.Образовавшиеся в результате элиминации хромосом отцовского
генома гаплоидные эмбриоиды культивируют на искусственных пи¬
тательных средах и получают гаплоидные растения. Сорта ячменя
Исток и Одесская-15 были получены комбинацией партеногенетиче-
ского метода с культурой изолированных зародышей за четыре года
вместо обычных 10—12 лет. Методом культуры пыльников из сортов
и гибридов мягкой и твердой пшеницы в НПО «Элита Поволжья» за
четыре года получено более 2,5 тыс. дигаплоидных линий, которые
характеризуются гомогенностью и стабильностью.Продолжается разработка технологии получения гаплоидов по¬
средством культуры пыльников пшеницы, ячменя, кукурузы, озимой
ржи, картофеля. В культуре пыльников возможны два пути образова¬
ния гаплоидных растений. Первый — образование растений путем
эмбриогенеза в пыльцевых зернах. При этом внутри пыльников из от¬
дельных пыльцевых зерен возникают эмбриоиды. Они прорастают и
дают гаплоидные растения. Второй — образование каллуса из клеток
пыльника. В дальнейшем в результате морфогенеза из каллусных кле¬
ток регенерируют растения. В этом случае образовавшиеся растения
не всегда бывают гаплоидными и часто отличаются по плоидности.
До конца не выяснено, образуются ли они от полиплоидизированных
гаплоидных клеток или от слившихся клеток.179
Гаплоиды, полученные in vitro, могут применяться не только в
практической селекции, но и в работах по генетической инженерии, а
также по клеточной селекции. Пыльцевые зерна являются в некото¬
рых случаях более удобными, чем протопласты, объектами для
исследований по генетической трансформации.Криосохранение растений. Криосохранение сома¬
тических клеток растений в жидком азоте (температура —196 °С) —
новое направление в биотехнологии, которое широко стало разви¬
ваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии за¬
ключается в сохранении в культуре in vitro генофонда, а также в обес¬
печении селекционеров в любое время генотипом, имеющим иско¬
мые признаки: необходимая пыльца для проведения гибридизации;
уникальные и единичные семена, в том числе не выносящие обезво¬
живания; трансформированные, мутантные, гибридные клетки раз¬
ных видов растений, способных к морфогенезу in vitro; зиготические
и соматические зародыши и т. д. В настоящее время разработаны ус¬
ловия криосохранения для культивируемых клеток (более 30 видов),
каллусных культур (около 10 видов), изолированных протопластов
(8 видов), сохранения меристем (25 видов) и кончиков стебля (13 ви¬
дов). Приоритет в этом направлении принадлежит Институту физио¬
логии растений РАН и, в частности, отделу культуры тканей и морфо¬
генеза, возглавляемому в настоящее время проф. А.М. Носовым.При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде
всего, учитывать специфику растительных клеток; отбирать мелкие
клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды;
разрабатывать в каждом отдельном случае подходы замораживания и
последующего оттаивания растительных клеток. При криосохране¬
нии встречается ряд трудностей, одна из которых связана с защитой
замораживаемых клеток и тканей от осмотического стресса и механи¬
ческого разрушения структур в результате образования и роста кри¬
сталлов льда внутри клетки. Одновременно с этим необходимо пра¬
вильно подбирать условия, обеспечивающие высокую выживаемость
клеток при оттаивании и рекультивации.Несмотря на многообразие работ в этом направлении, в них все
же наметились общие приемы, лежащие в основе криосохранения:
обработка клеток перед замораживанием, применение криопротек¬
торов, соблюдение определенного режима замораживания в интерва¬
ле от 0 до —40 °С (в редких случаях до —70 °С), а также специальные
предосторожности при оттаивании объектов.Процесс криоконсервации, как правило, начинается с подготов¬
ки культуры клеток к замораживанию. Это может быть достигнуто
несколькими способами, предусматривающими культивирование180
клеток на питательных средах, содержащих различные осмотически
активные вещества: маннит или сорбит в концентрации 2—6 %, ами¬
нокислоты и среди них, в первую очередь, пролин, чье значение для
связывания воды в клетках растений широко известно, а также у-ами-
номасляная кислота.Подбор криопротекторов, веществ, уменьшающих повреждение
клеток от осмотического и механического стресса, проводят эмпири¬
чески по принципу наименьшей токсичности и оптимального эф¬
фекта. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие лег¬
ко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид
(ДМСО, 5—10 %), глицерин (10—20 %), атакже непроникающие вы¬
сокомолекулярные — поливинилпиролидон (ПВП), декстран, поли-
этиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.Большое значение при криосохранении имеет правильно подоб¬
ранный режим замораживания от 0 до -40 °С. Как правило, для всех
объектов устанавливается скорость замораживания 0,5—1 °С в мину¬
ту и всю эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспе¬
чивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает
специальное конструкторское технологическое бюро с опытным
производством при Институте проблем криобиологии и криомеди¬
цины (г. Харьков).Таким образом, медленное замораживание и использование кри¬
опротекторов позволяет освободить клетку от свободной воды, и при
-40°С клетки становятся полностью обезвоженными, что дает воз¬
можность проводить дальнейшее замораживание, а именно погру¬
жать ампулы с растительным материалом в жидкий азот.Хранение материала в жидком азоте практически не лимитирова¬
но. Например, в криобанке Института физиологии растений РАН
хранятся клетки моркови, которые находятся в жидком азоте около
20 лет, меристемы картофеля — более 10 лет и др.Оттаивание и проверка жизнеспособности клеток после хранения
в жидком азоте является последним этапом технологии криосохране¬
ния. Если замораживание осуществляют медленно, постепенно, то
оттаивание должно быть проведено как можно быстрее. Для этого ам¬
пулы помещают в водяную баню с температурой 40°, а иногда и 60 °С и
выдерживают до полного исчезновения последнего кристаллика
льда.Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания
применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворитель¬
ный способ — окраска витальным красителем (0,1 %-м феносафра-
нином или 0,25 %-м раствором сини Эванса), в результате которой
мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным крите¬181
рием, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления кле¬
ток при рекультивации на искусственных питательных средах после
оттаивания.Экспериментально было показано, что клетки после хранения в
жидком азоте не теряют способности к делению, регенерации расте¬
ний, не уменьшается продуктивность синтеза вторичных метаболи¬
тов (клетки продуценты) и т. д. Так, Институтом физиологии расте¬
ний РАН совместно с НПО по картофелеводству разработаны методы
криосохранения меристем четырех сортов картофеля и показана воз¬
можность из 20 % хранящихся меристем регенерировать целые расте¬
ния, которые при высадке в поле не отличались по всем признакам,
включая темпы роста и продуктивность, от обычных пробирочных
растений (С. Манжулин и др., 1982). Более подробно о технике крио¬
сохранения можно узнать из обзорных работ А.С. Попова.Таким образом, технология, связанная с криосохранением расти¬
тельных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несо¬
мненно, эта технология имеет свое будущее, так как уже сегодня
криобанки могут значительно облегчить работу селекционеров, пре¬
доставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в
том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов
растений.Клеточная селекция растений. Сомаклональная вариабельность.
Клеточная селекция растений in vitro — метод выделения генетиче¬
ски модифицированных мутантных клеток и сомаклональных вариа¬
ций при помощи селективных условий. Значительный интерес пред¬
ставляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с
получением сомаклонов. Одна из наиболее сильных сторон культуры
in vitro в создании технологий для сельского хозяйства — возмож¬
ность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных му¬
таций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характери¬
зующиеся искомыми признаками.Для проведения клеточной селекции используют следующие
приемы:—	прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь
определенный искомый мутантный тип клеток;—	непрямая (негативная) селекция, основанная на избиратель¬
ной гибели неустойчивыхделящихся клеток, но требующая дополни¬
тельной идентификации у них мутационных изменений;—	тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются
все клеточные клоны;—	визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная
линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток182
визуально или при использовании биохимических методов (тонкос¬
лойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ,
микроспектрофотометрия и др.).Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая се¬
лекция является наиболее распространенным методом и использует¬
ся главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчи¬
вых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым ме¬
таллам, солям и другим антиметаболитам.Для проведения работ по клеточной селекции растений в услови¬
ях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы
каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопла¬
сты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий
применительно к различным видам растений, а также от конечных
целей исследования.Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал,
который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как
правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной
ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяже¬
нии ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными
культурами многие исследователи отмечают существенные недостат¬
ки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех
клеток действие токсических веществ, которые применяются в каче¬
стве селективного фактора, а также потеря регенерационной способ¬
ности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно,
проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток
(суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов
растений не разработаны эффективные технологии и способы куль¬
тивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечислен¬
ные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ
селекции остается для некоторых видов растений пока единствен¬
ным.Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный.
Как правило, селекция начинается с получения достаточного количе¬
ства каллусной массы из изолированных растительных эксплантов,
использующейся в дальнейшем для определения концентрации се¬
лективного фактора (построение дозовой кривой), при которой на¬
блюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть
каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективно¬
го фактора признается оптимальной и используется в дальнейших
экспериментах. Так как первично полученные на средах с селектив¬
ными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие фи¬
зиологической адаптации или определенного состояния дифферен-183
цировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение по¬
следующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверя¬
ется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их
переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще
2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные
условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить
растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением
растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, вы¬
деленным из грибов — возбудителей болезней, показали, что устой¬
чивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору мо¬
жет совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчиво¬
стью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур,
устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и
другим факторам.Большое число работ по культивированию каллуса с целью полу¬
чения нового селекционного материала проведено на пшенице, яч¬
мене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне ,
редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные резуль- .
таты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых
к NaCI или Na2S04. Получены клетки, а из них растения моркови, ко¬
торые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз — триптофа¬
на, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсич¬
ных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, ус¬
тойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных, то для них ра¬
боты в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый ,
характер. Таким образом, использование каллусной культуры в се¬
лекционных целях открывает огромные возможности в создании но¬
вых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для че- ;
ловечества.Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензи¬
онная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного
материала для селекции могут быть использованы культуры соматиче¬
ских или андрогенных эмбриоидов: такие органогенные экспланты,
как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые
части растений, а также культура изолированных зародышей. Напри¬
мер, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян
получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с i
улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффек- i
тивный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводив- j
ший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и ан-
тибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой
пшеницы сорта Саратовская 29 и Московская 35 на питательных сре-184
дах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены со¬
матические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, про¬
явившие повышенную солеустойчивость (С.С. Беккужина, 1993).Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позво¬
ляет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравне¬
нию с традиционными способами селекции.Генетические, эпигенетические и морфофизиологические изменения
клеток при селекции in vitro. Метод культуры изолированных клеток,
тканей и органов растений in vitro, широко используемый для реше¬
ния многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физио¬
логии и генетики растений, в настоящее время находит все большее
применение и при создании новых биотехнологий. Начиная с первых
работ по культивированию растительных клеток, тканей и органов
особый интерес у исследователей вызывал вопрос о том, какие кле¬
точные изменения могут происходить в изолированных клетках, раз¬
вивающихся на искуственных питательных средах, и причины, их вы¬
зывающие. С разработкой техники получения растений-регенеран-
тов из каллусной ткани появилась возможность создавать новые фор¬
мы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по
генетическим признакам от исходных растений. Такое разнообразие
клеточных линий и растений-регенерантов называют «сомаклоны»,
хотя в 70—80-е годы XX столетия было принято называть растения,
регенерировавшие из каллусной ткани, «калл и клонами», а из прото¬
пластов — «протоклонами».Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональ-
ной изменчивости пока мало изучены. Однако можно четко выделить
зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде все¬
го, от генотипической и эпигенетической изменчивости, индуцируе¬
мой условиями культивирования in vitro, составом питательных сред
и уровнем концентраций солей и регуляторов роста растений, а также
от генотипа и исходного экспланта.Дифференцированные клетки в нормальном растении могут
иметь разную степень плоидности, но для отдельных видов характер¬
но наличие только диплоидных клеток, плоидность которых может
изменяться в процессе онтогенеза. Однако в процессе онтогенеза мо¬
гут возникнуть клетки с разной плоидностью. Например, экспери¬
ментально доказано, что в меристемных тканях, наряду с факторами
видового постоянства числа хромосом, почти у 80 % покрытосемен¬
ных растений в процессе дифференцировки в соматических клетках
может происходить эндоредупликация хромосом и формирование
тканей различного уровня плоидности. Для вегетативно размножае¬
мых и апомиктичных растений характерно образование с высокой185
частотой анеуплоидных клеток. Усиление хромосомных перестроек,
приводящих к появлению химерности и миксоплоидии у растений,
наблюдается при изменении условий произрастания, особенно при
их резком ухудшении: засоление почв, повышенные или понижен¬
ные температуры, применение гербицидов или пестицидов, мине¬
ральных удобрений в повышенных дозах. Эти и другие факторы могут
приводить к физиологическим нарушениям, связанным, в первую
очередь, с появлением аномальных митозов и формированием клеток
с числом хромосом, отличающихся от такового в материнской ткани.Цитологические исследования показали, что вариабельность, ин¬
дуцируемая условиями культивирования in vitro, связана с генетиче¬
скими изменениями. Прежде всего одним из основных источников
появления фенотипических вариантов являются различные кариоло-
гические изменения и перестройки (З.Б. Шамина, 1989). Однако вы¬
явить, какие из них будут иметь фенотипический эффект и наследо¬
ваться как стабильная мутация генов, часто сложно. Как грубые, так и
тонкие хромосомные изменения могут вызывать существенные фе¬
нотипические изменения как в растениях-регенерантах, так и в по¬
следующем потомстве. Хромосомные изменения часто наблюдаются
при мейозе. Анализ мейоза клетки в регенерантах показал такие ин¬
тенсивные перестройки хромосом, как транслокация, инверсия, суб-
хроматидный обмен, частичная утрата хромосом.Некоторые случаи соматической изменчивости могут быть объяс¬
нены соматическим кроссинговером, который индуцируется усло¬
виями культуры тканей. Например, при культивировании сои в усло¬
виях in vitro частота соматического кроссинговера увеличивалась от
5,7 • 10-5 до 7,7 • 10-6. В этом случае обмены происходят несиммет¬
рично или даже между негомологичными хромосомами, причем в ус¬
ловиях культуры частота сестринских обменов очень велика. Мелкие
делеции часто обусловливают потерю гена, например выпадение до¬
минантной аллели, следствием чего часто бывают рецессивные мута¬
ции. В литературе это явление названо культуральным индуцирова¬
нием гемизигот (Л.А. Лутова, 2003). Это также является доказатель¬
ством того, что большая часть фенотипических изменений обуслов¬
лена генетическими механизмами.Генетическая природа сомаклональных изменений может быть
успешно установлена при помощи анализа фрагментов рестрикции
ДНК, который в настоящее время широко используется для класси¬
фикации и идентификации разновидностей, биоформ и даже сома¬
клональных вариантов. Одной из основных задач, связанных с про¬
блемой изучения сомаклональных вариантов, является разработка
методов, позволяющих выявлять генетические различия между реге-186
нерантами, полученными из каллусной ткани или из клеток, подверг¬
шихся действию стрессового фактора.Ранее молекулярный анализ сомаклональных вариантов прово¬
дился с использованием метода RFLP (restriction fragment length
polymorphism), основанном на выявлении полиморфизма рестрик¬
ционных фрагментов ДНК. Показано, что метод RFLP может быть
использован для классификации и идентификации сомаклональных
вариантов. При помощи этого метода был выявлен полиморфизм со¬
маклональных регенерантов кукурузы, полученных из каллусной
культуры, который выражался в изменении копийности гена и ряда
других небольших изменений специфических локусов; приведены
данные о перестройках нуклеотидной последовательности и метили¬
ровании ДНКу растений риса, полученных из каллусной ткани.В настоящее время наибольшее распространение при анализе ге¬
нома растений приобрел метод RAPD PCR (random amplyfied
polymorphic DNA polymerase chain reaction), основанный на амплифи¬
кации геномной ДНК при помощи случайных десятичленных прайме¬
ров. Метод RAPD по сравнению с методом RFLP является более деше¬
вым и быстрым и не требует большого количества растительного мате¬
риала для анализа, что позволяет анализировать индивидуальные рас¬
тения и отдельные каллусы.Молекулярные методы исследования применяются, например,
для определения уровня геномного полиморфизма у д лительно куль¬
тивируемых клеточных культур. На примере сахарного тростника, а
также ряда других культур было показано, что RAPD- спектры расте¬
ний-регенерантов, полученных из каллусной ткани, культивируемой
в условиях in vitro в течение двух лет, более полиморфны, чем спектры
растений-регенерантов, полученных из молодых эмбриональных
культур.Высокая разрешающая способность метода RAPD позволяет об¬
наружить изменения наследственной информации клеток на разных
этапах их культивирования, что может способствовать изучению при¬
роды сомаклональной изменчивости.Сказанное выше позволяет утверждать, что при клональном мик¬
роразмножении, клеточной селекции или при получении веществ
вторичного синтеза для различных культур следует учитывать воз¬
можность возникновения сомаклональной изменчивости в процессе
их длительного культивирования in vitro.Кроме сомаклональной вариабельности, связанной с наследуе¬
мыми перестройками генома, отмечены фенотипические изменения
(«эпигенетические»), которые могут стабильно передаваться дочер-187
Рис. 3.18. Изменение формы листьев у сомаклональных вариантов картофеля
сорта Смена. ДТ — исходный тип, цифрами обозначены номера различных ли¬
ний (JI. Хромова и др., 1984)ним клеткам, но не проявляться в растениях-регенерантах или их по-
ловом потомстве (рис. 3.18).Высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного
генотипа, природы и стадии развития экспланта. Например, у раз¬
личных злаков степень изменчивости среди сомаклонов может зна¬
чительно различаться: у пшеницы ( 2п = 6х = 42) из 192 исследован¬
ных растений-регенерантов 29 % были анеуплоидными, у гексапло-
идного овса (2п = 6х = 42) выявлены цитогенетические изменения с
такой же частотой, а для кукурузы частота возникновения анеуплоид-
ных растений не превышала 2—3 %. Образование полиплоидных и
анеуплоидных растений может наблюдаться и у других видов, напри¬
мер, на картофеле. Причем частота появления новых вариантов у ди¬
ких видов значительно ниже, чем у дигаплоидных линий культиви¬
руемого картофеля.Тип исходного экспланта также влияет на появление сомакло¬
нальных вариантов, отличающихся количественными и качествен¬
ными признаками. Для картофеля, например, аномальные растения
получены в 12 % случаев при использовании в качестве первичного
экспланта мезофильных тканей листа, а вслучае использования лепе¬
стков или оси соцветий частота формирования растений с фенотипи¬
ческими отклонениями от нормы составила 50 %.Условия культивирования и, в частности, нарушение гормональ¬
ного баланса питательной среды — одна из причин возникновения
генетического разнообразия культивируемых клеток вследствие на¬188
рушения клеточного цикла, в частности митоза. От соотношения фи¬
тогормонов, входящих в состав питательных сред, во многом зависит
цитогенетическая структура клеточных популяций. Одним из наибо¬
лее вероятных путей влияния фитогормонов на репрессию и дере¬
прессию генов является метилирование ДНК, вызывающее усиление
или ослабление экспрессии соответствующих генов или полное пре¬
кращение их функционирования на том или другом этапе органоге¬
неза. Количество присоединившихся или освободившихся метиль-
ных групп, места их локализации в боковых ветвях структур нуклео¬
тидных последовательностей ДНК оказывают при этом существен¬
ное влияние на функциональную активность генов, в состав которых
входят указанные структуры. Изменения в характере метилирования
ДНК влияют на процессы гетерохроматизации и компактизации хро¬
мосомного материала. Как известно, гетерохроматиновым участкам
свойственна задержка репликации, что может приводить к возникно¬
вению анафазных мостов и индукции хромосомных разрывов. В свою
очередь, хромосомные разрывы могут активировать мобильные гене¬
тические элементы и повышать мутабильность культивируемых кле¬
ток растений (JI.A. Лутова, 2003). Известно, что мобильные элементы
могут инактивировать структурные гены, изменять генную регуля¬
цию, реактивировать молчащие гены и генерировать дупликации и
делеции. Шок развития (выражение П. Ларкина применительно к ус¬
ловиям культивирования in vitro) могут индуцировать транспозиции
мобильных элементов, которые являются эффективным способом
повышения адаптивности клеток к стрессовым условиям.В настоящее время известны ферменты, например, ДНК-метила-
за, ответственные за метилирование ДНК в соответствии со следую¬
щим уравнением реакции:ДНК + S-аденозилметионин —» Метил-ДНК ++ S-аденозилгомоцистеин.С этим процессом связаны многочисленные факты возникнове¬
ния так называемых эпигенетических, ненаследуемых изменений у
растений.Морфологическая и цитогенетическая разнокачественность кле¬
точных популяций может возникнуть и вследствие влияния отдель¬
ных компонентов питательной среды: некоторых минеральных со¬
лей, сахарозы или другого источника углеродного питания, витами¬
нов, растительных экстрактов, а также от режима выращивания. Дли¬
тельное культивирование клеток in vitro также способствует
повышению генетического разнообразия сомаклонов. Причем для
некоторых видов показано, что, несмотря на присутствие в культуре189
in vitro клеток разной плоидности, регенерировавшие растения были
преимущественно диплоидными. Это явление было объяснено тем,
что в процессе культивирования отбирались растения-регенеранты с
более или менее нормальной морфологией, которые регенерировали,
как правило, в первую очередь.Различные типы морфогенеза — соматический эмбриогенез или
органогенез — также могут по-разному сказываться на генетических
изменениях и соответственно на фенотипе растений. Эксперимен¬
тально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время про¬
хождения цикла клетка — растение значительно короче, чем при ор¬
ганогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и ис¬
ходного родительского генотипа может быть значительно выше.На примере растений-регенерантов кукурузы было показано
многообразие природы сомаклональной изменчивости (Ю.И. Дол¬
гих, 2005). У растений-регенерантов, полученных из длительно куль¬
тивируемых каллусных тканей, обнаружены: 1) ненаследуемые моди¬
фикации, нормализующиеся в процессе онтогенеза; 2) изменения
экспрессии генов (как наследуемые, так и ненаследуемые); 3) истин¬
ные мутации, связанные с изменением первичной структуры ДНК.
Относительная цитогенетическая стабильность растений-регенеран¬
тов позволяет сделать заключение, что причиной значительной ва¬
риабельности морфологических и физиологических признаков не яв¬
ляются крупные хромосомные нарушения. Напротив, высокая часто¬
та вариабельности ДНК-маркеров свидетельствует о наличии точко-
вых мутаций или микрохромосомных перестроек. Проявление
сомаклональных вариаций в гомозиготной форме, нестабильность
наследования отдельных признаков указывают, возможно, на уча¬
стие в становлении сомаклональной изменчивости процессов мито¬
тической и мейотической рекомбинации или активации мобильных
генетических элементов.Вероятность проявления различных сомаклональных вариаций
неодинакова. По-видимому, наиболее характерным типом сомакло¬
нальных изменений являются вариации, так или иначе связанные с
дифференциацией и дедифференциацией. Возможно, не последнюю
роль играют в этом случае изменения гормонального баланса. Про¬
цесс введения в культуру in vitro и последующая регенерация расте¬
ний индуцируют множественные нарушения экспрессии генов. У са-
моклонов это проявляется в виде аномалий развития, нарушений
тканевой специфичности. Частота подобных изменений достигает у
некоторых сомаклонов 100 %. Высокая вариабельность in vitro коли¬
чественных полигенных признаков (десятки процентов), изменчи¬190
вость большинства качественных признаков, не связанных с развити¬
ем, на несколько порядков ниже (Ю.И. Долгих, 2005).Таким образом, частота, природа изменчивости, стабильность и
наследование в половом потомстве генетической и эпигенетической
изменчивости различны (табл. 3.8).Таблица 3.8. Генетическая и эпигенетическая изменчивость
(по Р. Г. Бутенко, 1999)ПризнакГенетическая изменчивостьЭпигенетическаяизменчивостьЧастота10“5—10”7 на регенера¬10“3 на регенерациюциюПрирода измененийСлучайнаяНаправленнаяСтабильностьСтабильнаЧасты инверсииНаследование в половомДаВозможнопотомствеТаким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что
клетки растений, культивируемые в условиях in vitro, подвергаются
ряду генетических, эпигенетических и морфофизиологических изме¬
нений. Сохранение клетками генетической стабильности может рас¬
сматриваться лишь как исключение. Прямые цитологические наблю¬
дения за числом и структурой хромосом клеток растений свидетель¬
ствуют, что кариотип культивируемых клеток легко подвергается мо¬
дификации. Часть таких клеток погибает, часть может размножаться
и вытеснять нормальные клетки. Установлено, что клетки с изменен¬
ными кариотипами могут обладать морфогенетическими потенция¬
ми и давать начало растениям-регенерантам с измененными числом
и структурой хромосом. Размер и частота хромосомных нарушений в
клетках растений, культивируемых на искусственных питательных
средах, достаточно велики.Установлено, что кроме изменений числа и структуры хромосом в
клетках растений in vitro происходят и генные (точечные) мутации,
частота которых достаточно велика и может быть использована для
повышения генетического разнообразия культивируемых растений.Сомаклональные варианты имеют практическое применение в
сельскохозяйственной практике в силу появления форм, отличаю¬
щихся от родительских по различным биохимическим, качествен¬
ным и количественным признакам, а также цитогенетическим харак¬
теристикам. Например, получены сомаклоны картофеля сорта Заре¬
во, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчиво¬191
стью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях
протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при
размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых ис¬
пытаний (В.В. Сидоров и др., 1984,1985). Для растений табака полу¬
чены через каллусную культуру сомаклоны, устойчивые к вирусу та¬
бачной мозаики, а для сахарного тростника получен новый сорт, ха¬
рактеризующийся высокой урожайностью и повышенной устойчи¬
востью к заболеваниям, в частности к болезни Fiji. В настоящее время
метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не
только кормовых и технических культур, но и декоративных, и лекар¬
ственных растений. Примером может служить новый сорт пеларго¬
нии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру.Таким образом, полученные положительные результаты свиде¬
тельствуют о необходимости более эффективного внедрения различ¬
ных приемов получения сомаклональных вариантов в практику се¬
лекционной работы, и наиболее реальным является применение со-
маклональной изменчивости д ля улучшения или «доработки» уже су¬
ществующих сортов или линий по отдельным недостающим
признакам.Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим и
биотическим стрессовым факторам методами клеточной инженерии.Засуха. Недостаток воды в почве наносит значительно больший
урон растениеводству, чем все остальные стрессовые факторы, вме¬
сте взятые. Засуха приводит к возникновению водного дефицита в
почве и соответственно в растениях, вызывая у них водный стресс.
Хотя термин «засуха» относится главным образом к почвенному вод¬
ному стрессу, он включает также воздействие жары на растения.
Стресс, вызванный водным дефицитом, может быть первичным в
случае засухи, а также вторичным при низкотемпературном, тепло¬
вом или солевом стрессах. Стресс, вызванный засухой, ведет к пря¬
мым или непрямым повреждениям растений, которые обусловлены
инактивацией ферментов, нарушением биохимических путей, нако¬
плением токсических веществ, утечкой ионов, дефицитом питания и
другими причинами.С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут при¬
меняться питательные среды, которые дополнены осмотически ак¬
тивными веществами, понижающими внешний водный потенциал.
В качестве такого селективного агента для селекции на устойчивость
к засухе были использованы полиэтиленгликоль (ПЭГ), представ¬
ляющий собой непроникающее в клетку осмотически активное ве¬
щество. Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, ус¬
тойчивых к стрессу, индуцированному ПЭГ, появилось в 1979 г.192
(Heyser, Nabors, 1979). Позже для селекции на засухоустойчивость
Р. Брессан с сотр. использовал клеточные линии томата, которые
подвергались водному стрессу при культивировании каллусной тка¬
ни в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 15 %. В результате опы¬
тов были отобраны устойчивые каллусные линии, однако устойчи¬
вость быстро терялась при культивировании каллуса на среде без ос-
мотика, что указывает на физиологическую природу адаптации. Тес¬
тирование каллусных линий нарост в присутствии ПЭГ предложено
для идентификации выносливых к засухе генотипов сои. Анализ рос¬
та каллусных тканей десяти сортов сои на средах с 0,15, 20 % ПЭГ
8000 свидетельствовал о корреляции засухоустойчивости у растений
и толерантности к ПЭГ культивируемых клеток. Для получения адап¬
тированных к водному стрессу клеточных линий также применялись
среды, содержащие в качестве осмотика 99—880 мМ маннитол. Как и
в предыдущем случае, осмотически адаптированные клетки обладали
повышенной выносливостью к солевому стрессу.Засоление. Одним из лимитирующих факторов сельскохо¬
зяйственной продуктивности является засоление почв. Около
900 млн га всех земель нашей планеты имеют повышенное содержа¬
ние солей, а количество засоленных почв с каждым годом возрастает.
Особую тревогу вызывает увеличение в почвах содержания солей, ко¬
торое происходит в результате их искусственного орошения. Реше¬
ние данной проблемы во многом зависит от разработки рациональ¬
ных агротехнических приемов, правильной методологии орошения,
использования для полива частично или полностью обессоленной
воды. С развитием биотехнологии растений потенциально возмож¬
ным является получение солевыносливых генотипов у важных сель¬
скохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических
клеток, слияния протопластов или переноса генов при использова¬
нии техники рекомбинантных молекул ДНК.Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обу¬
словлено как нарушением осмотического баланса клетки, так и пря¬
мым токсическим влиянием ионов натрия, хлора на физиологиче¬
ские и биохимические процессы в клетке. Результатом такого дейст¬
вия может быть уменьшение тургора клетки, ингибирование функ¬
ции мембран и активности ферментов, подавление фотосинтеза,
нехватки отдельных ионов из-за нарушения селективного транспорта
ионов, использование значительного количества энергии для под¬
держания толерантности. Основные типы реакций растений, возни¬
кающие в ответ на повышение концентрации солей во внешней сре¬
де, представлены на рис. 3.19.13-4266193
Рис. 3.19. Основные типы ответных реакций растений на засоление
(по Epstein, 1980)Экспериментальные данные, полученные многими учеными, по¬
казывают, что клеточные механизмы выносливости к засолению яв¬
ляются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых расте¬
ний и что селекция на клеточном уровне представляет реальную пер¬
спективу получения устойчивых к засолению форм растений.Большинство селекционных программ направлены на выделение
in vitro клеточных линий, толерантных к присутствию в среде для
культивирования клетокхлорида натрия. Так, показано, что выращи¬
вая гаплоидные каллусные клетки табака на среде с постоянно увели¬
чивающейся концентрацией солей, получены клеточные линии, спо¬
собные к росту в присутствии 1 % NaCl. М. Наборе с соав. предвари¬
тельно обработав суспензионную культуру табака мутагеном (0,15 %
ЭМС, 60 мин), путем одноступенчатой селекции выделили клеточ¬
ные линии, устойчивые к 0,5 % NaCl. Отмечено, что выносливость,194
полученных регенерантов к засолению, проявлялась на уровне целых
растений.На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ—МСХА
им. К.А. Тимирязева проводились исследования по получению соле¬
устойчивых растений на примере яровых твердых и мягких пшениц.
Первичным эксплантом служили как изолированные незрелые заро¬
дыши, так и гаплоиды. Клеточную селекцию проводили на каллусной
ткани, культивируемой на питательной среде, содержащей 0,3 %
NaCl или Na2S04 в течение 5—6 пассажей. В результате исследований
были получены устойчивые клеточные линии, а также растения-реге-
неранты. Тестирование на солеустойчивость первого семенного по¬
коления растений-регенерантов методом регистрации замедленной
флоуроесценции показало, что фотосинтетический аппарат некото¬
рых растений-регенерантов по устойчивости к засолению превосхо¬
дит исходный сорт (И.Д. Никифорова , 1993, 1994). Другие примеры
выделения клеточных линий, устойчивых к различным концентраци¬
ям хлорида натрия, и регенерации из них растений, сохраняющих то¬
лерантность к соли, представлены в табл. 3.9.Таблица 3.9. Примеры солевынослевых клеточных линий и растений,
полученных через культуру клетокИсходный материал для селекции
(плоидность)КонцентрацияNaClРезультаты клеточной селекцииMedicado sativa (2а?)0,17 MКаллусMedicago sativa (2л = 2х, 2л = 4х)0,08—0,17 MРастенияCitrus sinensis (2л)0,08-0,17 MКаллусNicotiana tabacum (2л)0,17 MСуспензия, растенияDatura innoxia (2л)0,17-0,34 MКаллус, растенияPennisetum americanum (2л)0,19 MЭмбриогенная суспензияIpomea batatas (2л)0,17 MСуспензияCrepis capillaris (2л)0,12 M»Oryza sativa (2л)0,17 MЭмбриогенный каллус, расте¬
нияСолевыносливость растений удается также повысить в результате
селекции к одному фактору засоления — осмотическому стрессу. На¬
пример, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуци¬
рованному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчиво¬
стью к NaCl. Повышенная толерантность к соли обнаружена у кле¬
точных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве
осмотика маннитол в высокой концентрации (99—870 мМ). Из этих195
результатов следует, что адаптация клеток к осмотическому стрессу
применима для отбора солевыносливых вариантов, а исследования
подобного рода представляют интерес для изучения как во взаимо¬
действии, так и независимо друг от друга.Металлы. Присутствие в почве в большом количестве ионов
металлов, токсически влияющих на растения, или недостаток ионов,
используемых растениями в качестве питательных веществ, могут
быть причиной ионного (минерального) стресса у растений. Особое
внимание ученых привлекает изучение стрессов, обусловленных на¬
личием в почве ионов тяжелых металлов, многие из которых токсиче¬
ски влияют как на растительные, так и на животные организмы.
Стрессовое состояние у растений может быть индуцировано ионами
таких тяжелых металлов, как цинк, кадмий, медь, ртуть; они также
довольно часто встречаются и в почвах. Механизмы устойчивости к
токсическим ионам могут включать уменьшение проницаемости
плазмалеммы, детоксикацию ионов в результате связывания с орга¬
ническими веществами, компартментализацию в вакуолях, а также
изменения структуры ферментов, которые являются их мишенями.Работы по клеточной селекции растений на устойчивость к ион¬
ным стрессам начаты недавно, но уже имеют положительный резуль¬
тат. Во всех экспериментах используется метод прямой селекции, при
котором в качестве селективного агента применяли токсические кон¬
центрации солей. Однако создание стрессовых селективных условий
in vitro, идентичных таковым в природе, крайне затруднительно.
В природных условиях помимо токсического действия ионов накла¬
дываются другие факторы, в частности наличие различных веществ,
кислотность почвы и т. д. Для селекции на клеточном уровне исполь¬
зуют питательные среды, которые хотя не полностью соответствова¬
ли естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экс¬
прессию признака устойчивости и давали возможность отбирать
нужные варианты.Путем прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии пету¬
нии, устойчивые к ртути, сорго — к алюминию, моркови — к алюми¬
нию и марганцу одновременно; суспензионные клеточные культуры
дурмана — к кадмию. На кафедре сельскохозяйственной биотехно¬
логии РГАУ—МСХА также проводились работы по получению кле-
точныхлиний и растений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к
соли нитрата кадмия, и изучалось действие этой соли на интактные
растения. Экспериментально показано, что присутствие ионов кад¬
мия в почве приводит к торможению роста стеблевой и корневой час¬
тей растения, к сокращению на 7—9 дней онтогенетических фаз раз¬
вития, следующих за фазой «елочки» по сравнению с контролем,196
культурные виды накапливают ионы кадмия в вегетативной массе, в
то время как дикие — нет. Мезо- и ультраструктурный анализ стеблей
льна-долгунца показал, что присутствие кадмия в субстрате приводи¬
ло к уменьшению количества клеток элементарных волоконец в пуч¬
ке, к некомпактному расположению клеток элементарных волоконец
в лубяных пучках, а также к формированию клеток элементарных во¬
локонец неодинаковых размеров в пределах одного пучка и к различ¬
ным срокам формирования вторичной клеточной стенки. В резуль¬
тате клеточной селекции были получены растения-регенеранты, об¬
ладающие устойчивостью к соли кадмия (Е.А. Гончарук, 2000).Экстремальные температуры. Причиной стрессо¬
вого фактора у растений могут быть относительно высокие или низ¬
кие температуры. Работ по клеточной селекции на устойчивость к
этим стрессам немного. В изученной нами литературе сведений о кле¬
точной селекции к тепловому шоку не обнаружено, хотя белки тепло¬
вого шока являются предметом пристального изучения биологов раз¬
личного профиля. Что касается работ по клеточной селекции к низ¬
котемпературным факторам, то они имеют место.Холодовой стресс у растений может быть вызван температурами
большого диапазона: от 10—15 доО °С. Такому стрессу наиболее под¬
вержены растения тропических и субтропических зон. Стойкость
растений к охлаждению обусловлена способностью липидов мембран
оставаться в жидком состоянии благодаря наличию большой пропор¬
ции ненасыщенных жирных кислот и/или повышенного содержания
стеролов. Повреждения, вызванные промораживанием растений
(температура ниже 0 °С), связаны прежде всего с формированием
внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное простран¬
ство приводит к вторичному эффекту, вызванному водным стрессом.
Нарушения, вызываемые отрицательными температурами, могут
быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьше¬
нием количества несвязанной воды при обезвоживании и увеличени¬
ем способности переохлаждаться. Большинство авторов отмечают,
что у растений происходят глубокие превращения запасных пита¬
тельных веществ, в частности, у морозоустойчивых древесных расте¬
ний накопление большого количества жиров, а у менее устойчи¬
вых — сахаров.Первые эксперименты, в которых описана возможность исполь¬
зования культивируемых растительных клеток для отбора выносли¬
вых к низким температурам клеточных линий, опубликованы в 1976 г.
(Dix, Street, 1976). Работы проводились на суспензионных культурах
табака и перца, которые после высева на агаризованные среды под¬197
вергались в течение 21 дня соответственно температурам — 3 и 4 °С.
Среди отобранных клонов обнаружены линии, стабильно сохраняю¬
щие повышенную холодоустойчивость.Основываясь на имеющихся в этой области исследований дан¬
ных, однозначный ответ о применимости прямой селекции in vitro
растений, выносливых к низкой температуре, давать пока рано. Не¬
сомненно, однако, что индукция in vitro генетического разнообразия
найдет применение для отбора более выносливых вариантов.Устойчивость к болезням. Для увеличения произ¬
водства продуктов питания экономически важным представляется
защита растений от болезней и вредителей. Уже сейчас просматрива¬
ются реальные перспективы применения клеточной селекции на ус¬
тойчивость. Если при селекции картофеля на устойчивость к болез¬
ням в течение года необходимо в полевых условиях провести оценку
от 50 до 100 тыс. сеянцев, то in vitro за один прием можно протестиро¬
вать около 20 млн протопластов, выделенных из 9 г листьев картофе¬
ля. Для клеточной селекции в качестве селективного агента с успехом
используют патотоксины, культуральные фильтраты и непосредст¬
венно патогены.Одним из главных защитных механизмов, лежащих в основе
сверхчувствительности растений к патогенам, является de novo син¬
тез растениями антимикробных веществ, называемых «фитоалекси¬
нами». Защитные реакции у растений, например продукция фитоа¬
лексинов, образование белков, связанных с патогенезом, лигнифика-
ция, могут быть индуцированы целым рядом веществ биотической
или абиотической природы, которые называют «элиситорами».
Абиотическими элиситорами могут быть ионы ртути, полиакриловая
и салициловая кислоты. К биотическим элиситорам относятся ком¬
поненты клеточных стенок грибов, вещества, присутствующие в
культуральных фильтрах.Наиболее простой подход в селекции in vitro на устойчивость к бо¬
лезням связан с культивированием клеток непосредственно в присут¬
ствии патогена. Этот подход может быть особенно полезным, когда
мало известно о токсических веществах, ответственных за патогенез,
или если патоген не продуцирует токсины. Однако этот способ селек¬
ции имеет некоторые сложности в проведении экспериментов. Для
правильной схемы селекции прежде всего необходимо знание жиз¬
ненного цикла патогена. Многие патогены, например грибы, имеют
различные стадии жизненного цикла, несколько стадий спороноше-
ния, в зависимости от которых могут изменяться выживаемость, рост
и эпидемиология. Поэтому необходимо учитывать стадию спороно-
шения, существенным для инфицирования могут быть световой и198
температурный режимы, относительная влажность, pH, наличие или
отсутствие питательных веществ, что сказывается на прорастании
спор.Исследования по культивированию растительных клеток в при¬
сутствии патогена были начаты в середине 60-х годов и направлены
на изучение корреляции устойчивости/чувствительности к патогену
in vivo и in vitro. Непосредственно эксперименты по клеточной селек-
ци и на устойчивость к патогенам не всегда были успешными. Однако
следует отметить, что китайскими учеными были получены два новых
высокоурожайных сорта риса, устойчивых к пирикуляриозу. Селек¬
ция проводилась на культуре изолированных пыльников, а в качестве
селективного фактора применяли смесь десяти линий гриба. В на¬
стоящее время новые сорта занимают в Китае более 140 тыс. га и дают
средний урожай 7,5 тыс. кг/га.Один из перспективных методов селекции устойчивых к болез¬
ням растений основан на использовании в качестве селективного
агента патотоксинов, которые обычно синтезируются патогенами.
Роль токсинов в болезнях растений не всегда ясна. Известно, что
только незначительное количество патотоксинов играет существен¬
ную роль в инициации и/или развитии болезни. По их действию не¬
которые авторы делят патотоксины натри категории. К первой отно¬
сятся токсины, которые не являются определяющими в заболева¬
нии, обладают неспецифическим токсическим действием по отно¬
шению к хозяину и токсичны для широкого круга растений.
Примером может служить табтоксин, продуцируемый Pseudomonas
cyringaepv. tabaci, являющийся возбудителем бактериальной рябухи и
табака. Другая категория патотоксинов обладает такой же специфич¬
ностью по отношению к растениям, как и патоген, но они также не
ответственны за развитие болезни. Сюда относится Т-токсин (или
HmT) Drechslera maydis (Helminthosporum maydis); патоген, вызываю¬
щий гельминтоспороз кукурузы. Третья категория включает патоток¬
сины, которые хозяиноспецифичны и вызывают типичные признаки
болезни. Хорошим примером является викторин (принятое сокраще¬
ние HV-токсин) возбудитель гельминтоспороза овса, вызывающий
корневую гниль и пятнистость листьев.Правомерность схем клеточной селекции на устойчивость может
непосредственно зависеть от механизмов действия токсинов. Отдель¬
ные виды патогенов поражают клетки, а затем выделяют токсин. Дру¬
гие — сначала выделяют токсины, которые убивают клетки, затем ис¬
пользуют продукты их распада для питания. Естественно, в первом
случае не будет корреляции между устойчивостью in vitro и in vivo,199
проведение селекции на клеточном уровне целесообразно лишь во
втором случае.Возможность отбора in vitro растений, устойчивых к болезням,
впервые продемонстрирована П. Карлсоном (1973), который, прово¬
дя селекцию табака на устойчивость к метионинсул ьфоксимину (ана¬
лог таботоксина), получил клеточные линии, а затем растения с по¬
вышенной устойчивостью к патогену. Некоторые результаты иссле¬
дований по клеточной селекции на устойчивость к патотоксинам
приведены в табл. 3.10.Таблица 3.10. Примеры клеточной селекции на устойчивость
к патотоксинам (по В.А. Сидорову, 1990)ПатогенХозяинУстойчивый материалLeptosphaeria maculansBrassica napusКлеточные линии, регенеран-
ты, потомствоPseudomonas syringaeNicotiana tabacumКлеточные линии, регенеран-pv. tabaciты, потомствоAlternaria alternataNicotiana tabacumКлеточные линии, регенеран-
ты, потомствоAlternaria solaniSolanum tuberosumКлеточные линииDrechslera sativumTriticum aestivumКлеточные линииPseudomonas syringaePhaseolus vulgarisКлеточные линии, регенеран-pv. phaseolicaтыHelminthosporiumSaccharumКлеточные линии, регенеран-sacchariofficinarumты, потомствоFusarium coeruleumSolanum tuberosumКлеточные линии, регенеран-
тыHelminthosporummaydisZea maysКлеточные линииВ отношении многих патогенов, для которых патотоксины в чис¬
том виде не выделены или не изучены, для селекции на устойчивость
реальным представляется использование культуральных фильтратов.
Необходимой предпосылкой их применения, однако, являются опре¬
деление их роли в заболевании, изучение корреляции устойчивости к
патогену у растений и культивируемых in vitro клеток. Первые обна¬
деживающие результаты по селекции приведены М. Бенке в 1980 г.,
применявшей нефракционированную культуральную жидкость
Phytophthora infestans в клеточной селекции картофеля. Были выделе¬
ны устойчивые клеточные клоны, давшие начало растениям. При ме¬
ханической инокуляции листьев спорами Phytophthora у 3 из 34 выде-200
Рис. 3.20. Растения-регенеран-
ты пшеницы (сорт Энита),
полученные после клеточной
селекции на устойчивость к
Septoria Nodorumленных растений обнаружились очаги поражения, значительно мень¬
шие по сравнению с контролем.На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии РГАУ—МСХА
им. К.А. Тимирязева также ведутся исследования по получению форм
растений, устойчивых к патогенам: пшеницы к септориозу, морко¬
ви — к альтернариозу, картофеля — к ризоктониозу, подсолнечника
к склеротиниозу. В качестве селектирующего фактора используют
культуральные фильтраты грибов. В результате проведенных иссле¬
дований были получены растения-регенеранты пшеницы (сорт Эни¬
та, Саратовская 29, Московская 35, Фортуна, Gaterin) (рис. 3.20). Се¬
мена первого поколения были проверены на устойчивость к патогену
Septoria nodorom (по прорастанию). В результате было установлено,
что у отобранных семян повышалась устойчивость к культуральному
фильтрату гриба на 10—15 % по сравнению с исходными генотипами
(Е.А. Калашникова, Лети Джое, 1998). Аналогичные работы были
проведены на пяти генотипах моркови. Клеточную селекцию прово¬
дили на суспензионной культуре, а в качестве селектирующего фак¬
тора использовали культуральный фильтрат гриба Altemaria radicina, в
результате чего были отобраны устойчивые клетки, из которых получе¬
ны растения-регенеранты (рис. 3.21) (Е.А. Калашникова, В.А. Раска-
лиева, 2000).Мутагены и их применение при клеточной селекции. В настоящее
время накоплены обширные экспериментальные сведения о мута¬
генной активности различных химических веществ, а также ионизи¬
рующих (рентеновские и гамма-лучи) и ультрафиолетового излуче¬
ний. Например, из химических мутагенов наиболее часто используют201
этилметансульфонат (ЭМС). После об¬
работки им клеток растений табака по¬
лучено 25 фенотипических вариантов.
Однако имеются данные, свидетельст¬
вующие о незначительном мутагенном
эффекте ЭМС. Другой мутаген, заслу¬
живающий внимания при работе с кле¬
точными культурами,— 1Ч-этил-1М-нит-
розомочевина (НЭМ). Данное химиче¬
ское соединение нестабильно, быстро
разрушается в питательной среде и мо¬
жет применяться для обработки клеток
без последующей его отмывки. Эффек¬
тивное мутагенное действие НЭМ про¬
демонстрировано на суспензионной
культуре гаплоидного табака, что позво¬
лило выделить мутанты, дефектные по
нитратредуктазе. Обработка НЭМ гап¬
лоидных протопластов табака увеличи¬
вала частоту возникновения хлорату-
стойчивых клонов в 20 раз, в то время
как при мутагенезе диплоидных прото¬
пластов этого же вида появление стреп-
томицинустойчивых клонов возросло в
30 раз. В качестве мутагенов могут быть использованы также N-ме-
mti-N-HHTpo-N-HHTpo- зогуанидин (НГ) и N-нитрозометилмочеви-
на (НММ).Наиболее широкий спектр мутаций наблюдается при использова¬
нии в качестве мутагена ионизирующего излучения. При рентгенов¬
ском облучении клеток получены пигментдефектные линии дурмана
и петуньи, устойчивые к параквату линии табака. Гамма-облученные
растения (лист) служили источником каллусной ткани и протопла¬
стов, из которых были выделены линии, устойчивые к гербициду и
валину. Устойчивые линии к валину были получены и при обработке
культивируемых in vitro клеток табака ультрафиолетовыми лучами.
Применение такого способа облучения гаплоидных протопластов та¬
бака приводило к возникновению разнообразных ауксотрофных му¬
тантов.Выживаемость клеточных колоний может быть различной в зави¬
симости оттого, на какой стадии развития культуры применяется об¬
работка мутагеном. При работе с единичными клетками целесообраз¬
но проводить обработку их мутагеном до первого деления клеток, так202Рис. 3.21. Растения-регенеран-
ты моркови, устойчивые к
Alternaria radicina, полученные
после клеточной селекции
как в другом случае возможно возникновение химерных линий.
На изолированных протопластах было показано, что радиочувстви¬
тельность протопластов зависит от этапов их культивирования. Экс¬
периментально установлено, что облучение протопластов предпоч¬
тительнее проводить либо сразу после их выделения, либо на следую¬
щий день. Поскольку из-за возможного образования в среде под дей¬
ствием ионизирующего излучения токсических для клеток веществ в
любом случае желательно отмыть протопласты от среды, в которой
проводили облучение.При работе с химическими мутагенами нередко проявляется их
токсическое действие на клетки. Высокий процент летальности при
их использовании может приводить к гибели всей популяции клеток,
поэтому при работе с химическими мутагенами используют в основ¬
ном невысокие дозы. При этом иногда мутагенные вещества не отмы¬
вают от протопластов и культивируют их в присутствии мутагена. Ио¬
низирующее излучение вызывает меньший токсический эффект. Бо¬
лее того, даже высокие дозы облучения подавляют лишь репродукци¬
онную и регенерационную способности клеток, сохраняя, однако, их
метаболическую активность.Гибридизация соматических клеток. Следующий метод клеточной
селекции — создание неполовых гибридов путем слияния изолиро¬
ванных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот ме¬
тод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды расте¬
ний, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызы¬
вать слияние трех и более родительских клеток, получать асиммет¬
ричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей
наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органел-
лами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток
дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких ви¬
дов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические
гены партнеров.Выделение, культивирование и слияние изолированных протопла¬
стов. Для применения методов соматической гибридизации необхо¬
дима разработка соответствующих технологий получения протопла¬
стов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение
протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и
механического разрушения клеточной стенки было осуществлено
еще в конце XIX в. Однако метод изолированных протопластов полу¬
чил развитие лишь после того, как И.К. Коккинг (1960) впервые осу¬
ществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил
голые протопласты.203
Рис. 3.22. Изолированные прото¬
пласты, полученные из семядоль¬
ной хвои сосны обыкновеннойВ настоящее время продолжается разработка и совершенствова¬
ние методов выделения и культивирования протопластов на искусст¬
венных питательных средах (рис. 3.22). Для культивирования прото¬
пластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изо¬
лированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для прото¬
пластов является повышенное осмотическое давление на начальных
этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концен¬
трацией маннита или СаСЬ.В процессе культивирования изолированные протопласты реге¬
нерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способ¬
ные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На фор¬
мирование колоний протопластами влияет состав питательной сре¬
ды. Дальнейшая задача — получение из каллусной ткани расте-
ний-регенерантов. Пока не удалось получить регенераты из
протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно
осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак,
картофель, томаты) и других культур.Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток
или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении прото¬
пластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на
сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой
и целлюлозой (рис. 3.23).Слияние изолированных протопластов может происходить спон¬
танно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных
протопластов впервые было получено в лаборатории И. Коккинга в
1970 г. его сотр. С. Пауэром и др. В качестве индуктора они использо¬
вали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и
сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее204
Каллус Суспензионная
культураП Г(2Э Qs (Z2 О8В » Ш # S&СтерилизацияВыделение протопластов°-о.-О оо о о о
ООО	2	оОVКультивированиепротопластовФильтрация ,, ,	Отмытыечерез нейлоновый Центрифугирование протопластыфильтрПервое делениеРегенерацияклеточнойстенкиМорфогенезРастения -
регенерантыРис. 3.23. Схема получения и культивирования протопластов
из клеток растенийэффективными из них оказались растворы с высоким pH (9—11) и
высокой концентрацией ионов кальция (100—300 мМ). Протопласты
предварительно агглютинируют концентрированными растворами
полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500—6000. У. Циммер¬
ман с сотр. разработали физический метод слияния протопластов жи¬
вотных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использова¬
лись импульсы электрического тока.205
Рис. 3.24. Схемы, иллюстрирующие наследование при парасексуальной гибриди¬
зации (Г.С. Муромцев и др., 1984):а — родительские ядерные (кружок) и внеядерные (овал) детерминанты при парасексуальной (сле¬
ва) и половой (справа) гибридизациях; б — при парасексуальной гибридизации с учетом как мини¬
мум двух независимых внеядерных генофоров; в — генетическое разнообразие парасексуальных
потомков, возникающее дополнительно к цитоплазматическим гетерозиготам вследствие сомати¬
ческой сегрегации внеядерных генофоровСлияние протопластов приводит к образованию либо гибрида,
либо цибрида (рис. 3.24). Цибридная клетка содержит цитоплазму
обоих партнеров, а ядро — одного. Это возможно в том случае, если
после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно
ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае,
если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано пу¬
тем облучения.Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несу¬
щие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности),
устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам.Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений полу¬
чен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов
табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii.206
В настоящее время методом парасексуальной гибридизации по¬
лучено большое число межвидовых, межсемейственных и межтриб-
ных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полу¬
ченные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Приме¬
ром может служить соматический гибрид между арабидопсисом и
турнепсом, который является растением-монстром. Возникающие
аномалии являются результатом хромосомной несбалансированно¬
сти (Ю.Ю. Глеба, 1982).Особый интерес представляют межцарственные клеточные гиб¬
риды, полученные от слияния протопластов растительных и живот¬
ных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов
крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами
моркови и человека, табака и человека и др.При соматической гибридизации эксперимент строится анало¬
гично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, ис¬
пользуются большие популяции клеток обоих родителей. При обра¬
ботке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них
сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся про¬
топласты. Все они, включая гибридные, в дальнейшем регенерируют
клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача — выде¬
лить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов мо¬
жет применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенера¬
ции и осуществляется несколькими методами.Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Напри¬
мер, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селек¬
тивных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и
красно-оранжевые хромопласты моркови.Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов,
является генетическая комплементация. Этот метод был применен
для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хло-
рофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплемен¬
тацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных
мутаций у табака вызывает светозависимую хлорофильную недоста¬
точность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращи¬
ваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. По¬
сле слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на сре¬
ду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету.Под методом физиологической комплементации, который также
используется для обнаружения соматических гибридов, подразумева¬
ют способность гибридных клеток жить и размножаться либо перехо¬
дить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские
клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родитель¬207
ских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а яв¬
ляется нормальной физиологической реакцией клетки на физиоло¬
гические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и
N. Langsdorfli имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гиб¬
ридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питатель¬
ных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и
была положена в основу метода селекции. После индуцированного
слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака
клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду,
не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные
расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции со¬
матических гибридов: смешанная физиологогенетическая компле¬
ментация, физическое обогащение (метод основан на разделении
протопластов при центрифугировании в связи с их различной плот¬
ностью), механическая изоляция.Использование изолированных протопластов в селекции расте¬
ний не ограничивается возможностью их индуцированного слияния
и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты
способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и орга-
неллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информа¬
цию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже прове¬
дена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты
петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужерод¬
ных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изо¬
лированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные
хлоропласты. Из этих протопластов Д. Карлсон получил расте-
ния-регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма.Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только
начинают развиваться. В целом использование изолированных про¬
топластов в генетической реконструкции клетки, как видим, откры¬
вает перспективы перед клеточной селекцией.3.12. ДОСТИЖЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ
В РАСТЕНИВОДСТВЕКлеточная селекция и сомаклональная вариабельность. Изучение
растений сомаклональных вариантов показало, что от растения-до¬
нора они отличаются не только моногенными качественными при¬
знаками, но и (что более важно практически) количественными по-
лигенными признаками, такими, как интенсивность роста, продук¬
тивность, толерантность к неблагоприятным факторам окружающей
среды (абиотические и биотические). Отмечены случаи появления208
сомаклональных вариантов, сочетающих признаки, которые невоз¬
можно или трудно соединить в одном генотипе методами традицион¬
ной селекции. Например, J1. Кучеренко (1986) отселектировала из со¬
маклональных вариантов, образовавшихся в каллусной ткани риса,
растения, сочетающие скороспелость и длиннозерность. На их осно¬
ве за короткий срок был создан новый сорт риса, названный Биориза,
в Китае на основе сомаклонов — сорт риса, сочетающий скороспе¬
лость и устойчивость к пониженным температурам.Практические результаты по использованию сомаклональных ва¬
риантов впервые были получены у сахарного тростника в начале 70-х
годов XX столетия на Гавайских островах. Среди регенерантов были
отобраны растения, устойчивые к вирусам мучнистой росы. В резуль¬
тате получены различные формы сахарного тростника, устойчивые к
болезням и с повышенным содержанием сахара до 20 %.Из длительно культивируемых каллусных тканей герани получе¬
ны растения-регенеранты с измененной морфологией листовых пла¬
стинок и цветков, а также с измененным составом эфирных масел.В нашей стране успешно развиваются работы по получению и
оценке сомаклональных вариантов картофеля (ВНИИ картофельно¬
го хозяйства, JI. Хромова и др.). Из большого числа линий, получен¬
ных из каллусной ткани двух изучаемых сортов картофеля отобраны и
проверены в полевых условиях на стабильность те, которые обладают
хозяйственно важными признаками, корректирующими отдельные
недостатки исходного сорта. Так, после трехлетних полевых испыта¬
ний сомаклонов сорта Любимец удалось выделить линии, превосхо¬
дящие сорт по урожайности, устойчивости к фитофторе и степени ус¬
тойчивости к вирусам.В Украинском ВНИИ картофельного хозяйства (А. А. Кучкой др.,
1987) уделяется значительное внимание протоклонам — растениям,
полученным из каллусной ткани, индуцируемой из протопластов, —
которые по отдельным хозяйственно-ценным признакам превосхо¬
дят исходные сорта. Полученные растения включены в конкурсное
сортоиспытание этого института.Создание сомаклонов имеет несомненное значение для селекции
зерновых культур, где традиционными методами создаются сорта на
узкой наследственной основе. Анализ сомаклонов, полученных раз¬
ными группами исследователей из каллусной ткани сортов озимой и
яровой пшеницы (Т. aestivum), показал большую изменчивость среди
сомаклонов и отличие их от исходного сорта по таким морфологиче¬
ским признакам, как высота растения, интенсивность кущения и
число побегов, отношение колоса к соломине, остистость или безос-
тость колоса, его форма, окраска семян. По физиологическим при¬209
знакам растения различались по времени вегетации, устойчивости к
низким температурам и условиям перезимовывания и устойчивости к
болезням (Р.Г. Бутенко, И.Д. Никифорова, 1988).Соматическая гибридизация. Гибридизация соматических клеток
методом слияния протопластов, без сомнения, обогатила клеточную
биологию. Появилась возможность изучать поведение гибридных
ядерных геномов при разной степени таксономической удаленности
партнеров. Межродовая соматическая гибридизация между картофе¬
лем (S. tuberosum) и томатом (Lycopersicon esculentum) позволила
Д. Мельхерсу с сотр. (1978) получить гибридные растения двух типов,
которые авторы назвали «томато» и «помато», в зависимости от родо¬
вой характеристики хлоропластов гибрида. В первом случае хлоро¬
пласты были томатные, во втором — картофельные. Эти растения не
обладали хозяйственно-полезными свойствами, но позволили на¬
блюдать проявление признаков партнеров.Ю.Ю. Глеба и Ф. Хоффман (1979) получили еще более отдален¬
ный межтрибный гибрид методом слияния изолированных прото¬
пластов из каллусных клеток арабидопсиса (A.thaliana) и мезофилла
листа турнепса (Brassica compestris). Цитологический и биохимиче¬
ский анализ подтвердил гибридную природу шести изученных кле¬
точных клонов. Хромосомы обоих партнеров долгое время сохраня¬
лись без элиминации. В трех клонах авторы наблюдали стеблевой ор¬
ганогенез и появление уродливых пробирочных растений. Хромо¬
сомный анализ подтвердил их гибридный характер. Эти гибридные
уродливые растения не цвели и не образовывали нормальных корней.
В некоторых линиях, где большинство хромосом турнепса элимини¬
ровалось при субкультивировании, возникали более нормальные, по¬
хожие на арабидопсис растения, при сохранении хлоропластного ге¬
нома турнепса. Для доказательства того, что полученные растения яв¬
ляются истинными ядерными гибридами, авторы обычно изучают
морфологические признаки, состав полипептидов малой субъедини¬
цы рибулезо-бис-фосфаткарбоксилазы, кодируемой ядерными гена¬
ми, проводят изозимный анализ, рестриктный анализ митохондри¬
альной и хлоропластной ДНК применяют для определения того, ка¬
кие цитоплазматические геномы унаследованы соматическим гибри¬
дом от партнеров по слиянию.При межвидовой соматической гибридизации могут возникнуть
как стерильные (Z pennelii, S. melongena + S. tisymrifolium), так и фер¬
тильные (S. tuberosum + S. chacoense, S. tuberosum + S. brevidens) расте¬
ния. В последнем случае возникает возможность получить потомство
от самоопыления или обратного скрещивания с культурными сорта¬210
ми. Последнее важно, так как часто у гибридов, например между сор¬
тами картофеля и дикими видами, преобладает признаки последних.Соматический гибрид между S. tuberosum сорт Приекульский ран¬
ний и S.chacoense, полученный в 1979 г. (Р.Г. Бутенко, Кучко, 1979),
имел ряд хозяйственно важных признаков. Была сделана попытка во¬
влечь его в практическую селекционную работу. Однако длительный
процесс беккроссирования не позволил получить формы, в которых
полностью отсутствовали признаки дикаря, хотя после восьми бек-
кроссов был получен гибрид, несущий полевую устойчивость к Y-ви-
русу и хорошую продуктивность.Гаплоидная селекция. Методом культуры пыльников в разных стра¬
нах созданы высокоурожайные и устойчивые сорта риса (170 ООО га)
и пшеницы (70 ООО га) — Китай. В Краснодаре этим же методом по¬
лучены различные сорта риса, табака. В Поволжье с успехом приме¬
нялся ячмень и тритикале. В разных центрах России с успехом был
применен метод «Бульбозум» (bulbosum). Для этого использовали
H.bulbosum (дикий ячмень). Хромосомы гибридного зародыша Fi и F2
скрещивали с определенными формами H.bulbosum. При оплодотво¬
рении яйцеклетки H.vulgare пыльцой H.bulbosum отцовские хромосо¬
мы илиминируются и развивается гаплоидный зародыш. Нормальное
развитие при этом тормозится, и выращивание происходит in vitro.
Гибридные проростки отбраковываются, а гаплоидные обрабатыва¬
ются колхицином для удвоения числа хромосом.В Канаде так созданы новые сорта ячменя. В Одессе вместо 10—12
лет получены этим же методом С. Лукьянюк и С. Игнатовой (1983)
сорта ячменя за 4—5 лет. При использовании метода «Бульбозум» эф¬
фективность получения негаплоидных растений невелика, растения
альбиносы не возникают. Этим же методом можно получить изоген-
ные линии пшеницы, но для других видов злаков преимущество
bulbosum не отмечалось.Широкому использованию техники получения гаплоидов в куль¬
туре пыльников мешает низкая эффективность, которую можно рас-
читать как: 1) процент изолированных пыльников, образовавших в
культуре эмбриоидов или каллус из микроспор, 2) процент гаплоид¬
ных растений-регенерантов в расчете на изолированный пыльник.
Недостатком метода является также появление в большом числе (осо¬
бенно у злаков) альбиносных растений-регенерантов (Р.Г. Бутенко,
1999).Таким образом, создание гаплоидных растений разными метода¬
ми in vitro позволяет быстро создать гомозиготные линии — и в этом
ценность данной технологии для селекции. Некоторый скептицизм,
проявляемый селекционерами, связан в частности с тем, что при ис¬211
пользовании Fi поколения рекомбинации могут произойти только в
одном мейотическом цикле, этого недостаточно для обмена призна¬
ками, контролируемыми полигенно. Как выход предлагается или ис¬
пользование F2 поколения или половая гибридизация полученных in
vitro регенерантов разных генотипов и повторный цикл получения га¬
плоидов in vitro у отселектированных половых гибридов.Клональное микроразмножение растений. Во многих странах мира
биоиндустрия микроклонального размножения поставлена на поточ¬
ную промышленную основу и представлена десятками активно функ¬
ционирующих предприятий. Например, во Франции 94 % всей про¬
дукции цветочных культур получают методом культуры изолирован¬
ных тканей. В США около 100 коммерческих предприятий получают
посадочный материал декоративных, овощных, полевых, плодовых и
лесных культур методом клонального микроразмножения. Ведущим
производителем оздоровленного посадочного материала цветочных
растений является Голландия, а подвоев яблони, сливы и персика —
Италия (до 250—500 тыс. ежегодно). В нашей стране также ведутся
интенсивные работы по клональному микроразмножению растений,
и в настоящее время многие научно-исследовательские институты и
промышленные лаборатории разрабатывают и усовершенствуют ме¬
тоды микроразмножения и оздоровления различных декоративных,
плодовых, ягодных, овощных, кормовых и древесных культур. На¬
пример, методы ускоренного размножения винограда, разработан¬
ные во Всесоюзном научно-исследовательском институте виноделия
и виноградарства «Магарач», позволяют получать из одного одно-
глазкового черенка 8 тыс. растений в течение четырех месяцев. Оздо¬
ровление промышленных посадок малины от комплекса вирусных
заболеваний путем сочетания термотерапии и культуры меристемы
повышает продуктивность культуры в 6—8 раз. Размножение и полу¬
чение безвирусного посадочного материала гвоздики, хризантемы,
антуриума Андре, розы, бегонии Элатиор и других ведется в специа¬
лизированных цветоводческих хозяйствах «Элита» Российской Фе¬
дерации и в меристематическом комплексе Республиканского кон¬
церна «Крымзеленстрой».Криоконсервация. Базовые коллекции — криобанки — обеспечи¬
вают практически вечное хранение растительного материала; значи¬
тельную экономию затрат по сравнению с обычными коллекциями и
даже депонированными; гарантируют не только сохранность образ¬
ца, но и сохранение всех его свойств без исключения; сохранение
столь важной и значительной по объему части их генотипа, как блоки
генов, отвечающие за рост культуры, пролиферацию клеток и био¬212
синтез вторичных соединений, синтезируемых исходным растением
и интересующих промышленность (табл. 3.11 и 3.12).Таблица 3.11. Клеточные штаммы растений, постоянно хранящиеся
в криобанке ИФРА РАН в жидком азоте (-196 °С) (Р.Г. Бутенко, 1999)ВидШтамм№ в коллекции СКК-ВРDaucus carotaМ-34Dioscorea deltoideaД-15ДМ-0,56ДМ-18ДМ-87Panax ginzengЖ13Ж21ЖЗ2Panax quinquefoliusжю16Nicotiana sylvestrisNrEs-1Medicago sativaЛ-123Solanum tuberosum (cv.Tava)КТ-4Rhaponticum carthamoidesRhs-1Rhs-248Triticum timofeeviiТ-134Triticum aestivumDioscorea balcanica (органогенная кал¬
лусная ткань)Dioscorea caucasica (органогенная кал¬
лусная ткань)ЦЮ-194(адаптирована к NaCl)Клеточные штаммы (ИФР РАН), регенерировавшие растения
после хранения в жидком азотеDioscorea balcanica (органогенная каллусная ткань)Dioscorea caucasica (органогенная каллусная ткань)Solanum tuberosum (cv.Tava) КТ-4
Daucus carota М-34Клеточные штаммы (ИФР РАН), спорадически возобновлявшие
рост после замораживания до жидкого азотаRauwolfia serpentina R-III
Digitalis lanata I
(наперстянка шерстистая) VII
(наперстянка шерстистая) эмбриоиды
Рапах japonicus (женьшень японский) Ж7213
Rhaponticum carthamoides Rhs-8
Polyscias filicifolia ПП-1Меристемы (ИФР РАН), возобновившие рост и регенерировавшие
растения после хранения в жидком азотеFragaria х ananassa (земляника садовая) 23 сорта
Solatium tuberosum (картофель) 9 сортов
Rubus idaeus (малина) 1 сорт
Ripes nigrum (черная смородина) 1 сорт
Digitalis lanata (наперстянка шерстистая)Chamomila recutita (ромашка лекарственная)Таблица 3.12. Криоконсервация меристематических верхушек земляники
и малины (О.Н. Высоцкая, 1997)Этап и его продолжитель¬
ностьПитательная средаУсловияРазмножение 1—4 ме¬
сяцаЗакаливание от 1 не¬
дели до 4 месяцевВыделение апикаль¬
ных верхушек от 2 до 6 чП редварител ьное
культивирование апи¬
кальных верхушек с
криопротекторами 19—
36 чЗамораживаниеа)	прямое — 1 — 10
мин до -196 °Сб)	программное —2-3 ч до -75 °СРазмораживаниеОтмывание от крио¬
протекторовРекультивированиеАгаризованная питательная
среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга с
цитокининами и сахарозой
3%Агаризованная модифици¬
рованная питательная среда
MS с цитокининами и повы¬
шенным содержанием сахаров4-6%Жидкая среда MS с цитоки¬
нинами и повышенным содер¬
жанием сахара 4—6 %Жидкая среда MS с цитоки¬
нинами, с повышенным содер¬
жанием сахаров 5—6 % и диме¬
тил сульфоксидом (DMSO)5-7%В растворе криопротекторов
5—6% сахаров, 5—10%
DMSO. В криоампулахВодяная баня / = 38 —
-40°С, оттаивание криоам¬
пулСреда MS, агаровая без гор¬
монов, 3 % сахараСреда MS с цитокининами/= 20-25 °С, 16 ч/сут,
освещенность 5—10 клкt = 2—8 °С, темнота или
свет до 8 ч/сут, освещен¬
ность 0,5— 0,8 клк/ = 15—20 °С, освещен¬
ность 0—0,8 клк/=15—20 °С, темнота
или свет до 0,8 клка)	/ = 0 °С, ледяная
баняб)	криобаня от 0 до
-30 °С/= 20-25 °С/=20°С, 16 ч/сут,
1—3 клк214
Окончание табл. 3.12Этап и его продолжитель¬
ностьПитательная средаУсловияУкоренение
Высадка в грунтРазмножениеСреда MS с цитокининами / = 20—25 °С, 16 ч/сут,5—8 клкСреда MS с цитокининами »Контрольные вопросы к главе 31.	Каковы главные направления использования культуры изолированных
клеток и тканей растений в биотехнологии?2.	Назовите основные компоненты основных типов питательных сред, ис¬
пользуемых для каллусогенеза, различных типов морфогенеза и клонального
микроразмножения.3.	Выделите основные этапы в истории развития метода культуры изолиро¬
ванных органов, тканей и клеток растений.4.	Что такое каллусная ткань? Как получить каллусную ткань и каковы воз¬
можности ее использования в биотехнологии?5.	Что такое дедифференцировка клеток и почему она является обязатель¬
ным условием перехода специализированной клетки к делению и каллусообра-
зованию? Какие гормоны являются индукторами дедифференцировки?6.	Почему каллусную ткань необходимо пассировать на свежие питательные
среды? Назовите фазы ростового цикла каллусных клеток.7.	Что представляют собой опухолевые и «привыкшие» ткани? Каково их
сходство и различие с каллусными?8.	Каковы причины генетической неоднородности каллусных клеток? Как
можно использовать ее в биотехнологии?9.	Что такое соматическая гибридизация? Каковы особенности получения и
культивирования изолированных протопластов?10.	Что такое тотипотентность каллусных клеток и какова частота ее реали¬
зации?11.	Назовите основные типы морфогенеза в культуре каллусных тканей.12.	Расскажите об основных этапах соматического эмбриогенеза. Каковы
причины его возникновения и какие условия требуются для его дальнейшего раз¬
вития?13.	Как можно индуцировать различные типы органогенеза в культуре кал¬
лусных тканей?14.	Что вам известно о генетических и эпигенетических основах морфогене¬
за и сомаклональной изменчивости? Что представляют собой белки-маркеры
морфогенеза?15.	Как получают и используют культуру клеточных суспензий?16.	Что такое клеточная селекция и каковы ее возможности?17.	Назовите биотехнологические методы ускорения селекционного про¬
цесса.18.	Что такое клональное микроразмножение растений?19.	Назовите основные этапы клонального микроразмножения растений.215
20.	Расскажите о размножении растений методом активации развития суще¬
ствующих в растении меристем.21.	Расскажите о размножении растений методом индукции возникновения
адвентивных почек непосредственно на экспланте.22.	Какова роль гормонов в клональном микроразмножении растений?23.	Перечислите пути оздоровления посадочного материала от вирусов.24.	Назовите условия, обеспечивающие микроразмножение растений.25.	Как генотип и возраст первичного экспланта влияют на клональное мик¬
роразмножение растений?26.	Какие физические факторы влияют на клональное микроразмножение
растений?27.	Назовите методы оптимизации условий клонального микроразмноже¬
ния растений.28.	Получение вторичных метаболитов в искусственных условиях фермен¬
тации.29.	Назовите методы клеточной биотехнологии, позволяющие создавать га¬
плоидные растения.30.	Что такое криосохранение и его практическое применение в клеточных
технологиях.31.	Назовите методы, позволяющие осуществлять межвидовую гибридиза¬
цию растений.32.	Что вам известно о достижениях клеточной биотехнологии в растение¬
водстве?ЛИТЕРАТУРАБиотехнология растений: культура клеток/Под ред. Р.Г. Бутенко.— М.:
Агропромиздат, 1989.Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология.— М.: Наука,
1986.Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии
на их основе.—М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Слияние протопластов и генетическое конст¬
руирование высших растений.— Киев: Наукова думка, 1982.Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений.— Киев: Нау¬
кова думка, 1984.Калашникова Е.А., Родин А.Р. Получение посадочного материала древес¬
ных, цветочных и травянистых растений, с использованием методов биотех¬
нологии.— М.: МГУЛ, 2004.Калинин Ф.Л. и др. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии
растений.— Киев: Наукова думка, 1980.Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклональ-
ного размножения растений.— Киев: Наукова думка, 1992.Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений.—
М.: Наука, 1983.Лутова Л.А. Биотехнология высших растений.— СПб.: Изд-во СПб.
ун-та, 2003.216
Максимов ГТ.Н. Многофакторный эксперимент в биологии.— М.: Изд-во
МГУ, 1980.Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г.Дихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы
сельскохозяйственной биотехнологии.— М.: Наука, 1990.Павловская Н.Е., Голышкин JI.B., Голышкина Л.В. и др. Введение в сель¬
скохозяйственную биотехнологию.— Орел: Изд-во ОГСХА, 1998.Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция.— Киев:
Наукова думка, 1990.Шевелуха B.C. Новая биотехнология в селекции и растениеводст-
ве//Вестник с.-х. науки. 1986. N92.Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе.— М.: Колос,
1992.Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные
труды.— М.: Воскресенье. Т. 1, Т. 2, 2000, 2001.
Глава 4БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ4.1.	БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ВОСПРОИЗВОДСТВА
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ животныхЭндокринный контроль воспроизводительной функции у животных.Достигнутые в последние 30 лет успехи в области биологии размно¬
жения сельскохозяйственных животных и прежде всего в эндокри¬
нологии значительно расширили возможности регулирования вос¬
производительной функции у животных биотехнологическими ме¬
тодами.Одним из наиболее выдающихся достижений первой половины
XX в. в области физиологии размножения животных, по-видимому,
следует считать открытие основных функций передней доли гипофи¬
за. Целая серия замечательных открытий в этой области позволила
установить, что через эту часть гипофиза осуществляется прямая или
опосредованная регуляция широкого спектра биологических процес¬
сов в организме. В настоящее время окончательно установлено, что
развитие половых желез и их функция особенно в более поздние ста¬
дии онтогенеза зависят в значительной степени от гонадостимули¬
рующих гормонов передней доли гипофиза.Передняя доля гипофиза у млекопитающих секретирует три гор¬
мона, которые оказывают стимулирующее и регуляторное действие
на функцию половых желез. К ним относятся: фолликулостимули¬
рующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ) и пролак-
тин, или лютеотропный гормон (ЛТГ), который, как выяснилось впо¬
следствии, проявляет лютеотропные свойства только у грызунов.Познание закономерностей процесса воспроизведения у самок
сельскохозяйственных животных базировалось на определении ди¬
намики секреции гонадотропных и половых гормонов в разные фазы
полового цикла. Уровни секреции гонадотропных и половых гормо¬
нов являются носителем обширной информации о функциональной
активности гипофиза и половых желез на разных стадиях репродук¬
тивной жизни животного, а также важным критерием активного кон-218
троля (биотехнологических методов) за эффективностью вмешатель¬
ства в процессы воспроизведения животных с целью их регулирова¬
ния.В первые 6—8 дней после отела концентрация ЛГ в крови коров
невелика. Затем этот показатель постепенно повышается. Этот про¬
цесс происходит параллельно с увеличением содержания ЛГ в гипо¬
физе, хотя скорость накопления его в гипофизе выше, чем увеличе¬
ние его уровня в крови коров. Преимущественное возрастание кон¬
центрации ЛГ в гипофизе обусловлено биологической необходимо¬
стью создания запаса этого гормона для его предовуляторного
выброса. Выделение из гипофиза другого гонадотропного гормо¬
на — ФСГ — также увеличивается одновременно с развитием фолли¬
кулов.С 7—10-го дня после отела тоническая секреция ЛГ переходит в
пульсирующую форму с интервалом 60—80 мин с последующим про¬
явлением предовуляторного подъема у овулировавших коров или не¬
больших подъемов у неовулировавших коров.С 1970 г. проведены многочисленные исследования уровня ЛГ в
периферической крови свиней радиоиммунологическим методом.
При этом все исследователи обнаруживали подъем уровня ЛГ почти у
всех животных в день охоты, а некоторые и в день, предшествовав¬
ший охоте. При взятии крови с интервалом 6 ч исследователи наблю¬
дали дополнительный подъем ЛГ в лютеиновую фазу цикла. Наи¬
больший подъем ФСГ наблюдался между 2-м и 3-м днями цикла,
хотя подъем концентрации гормона в крови начинался одновремен¬
но с подъемом предовуляторного уровня Л Г. Наряду с основным пи¬
ком ФСГ проявлялисьдополнительные пики вдругие периоды цик¬
ла, которые совпадали по времени с подъемом ЛГ.Примечательной особенностью в секреции ЛГ и ФСГ у свиней
является продолжительное повышение в предовуляторный период
(Л Г 1—2 сут, а ФСГ — около 3 сут), но этот подъем относительно не¬
высок по сравнению с базальным уровнем (ЛГ — в 2—4 раза, а
ФСГ — примерно в 2 раза).У овец предовуляторный пик ЛГ в крови проявляется в первые
12—16 ч после начала охоты и продолжается 8—10 ч. Величина его
превышает базальный уровень в 30—50 раз. Овуляция наступает меж¬
ду 21 и 26 ч после пика Л Г. Отдельные исследователи сообщали о не¬
большом подъеме Л Г на 14—15-й день цикла.Подъем концентрации ФСГ у овец установлен в день охоты
(200 нг/мл). В другие дни цикла концентрация ФСГ в сыворотке кро¬
ви овец составляет 100—160 нг/мл.219
У кобыл, в отличие от других видов сельскохозяйственных живот¬
ных, вместо короткого предовуляторного пика ЛГ концентрация это¬
го гормона повышается постепенно в течение эструса и достигает
пика через 1—2 дня после овуляции, а затем постепенно понижается в
течение нескольких дней. Длительное сохранение повышенного
уровня ЛГ в крови кобыл, приводящее к проявлению овуляции в пе¬
риод диэструса, в сочетании с длительным сохранением оплодотво¬
ряющей способности сперматозоидов жеребца в половом тракте ко¬
былы может быть причиной двойни у некоторых кобыл, несмотря на
то, что во время спаривания у них диагностируют один созревший
фолликул.Концентрация ФСГ в сыворотке крови кобыл повышается в кон¬
це эструса и после диэструса и повторно в середине диэструса, за
10—13 дней до следующей овуляции. Эти пики ФСГ примерно в че¬
тыре раза превышают базальный уровень.Важным звеном в понимании механизма регуляции полового
цикла у животных является изучение секреции половых гормонов
яичников. Эти наблюдения были сделаны в конце 60-х и начале 70-х
годов. Выявлена примерно одинаковая закономерность изменения
уровня половых гормонов в крови основных видов сельскохозяйст¬
венных животных. В конце полового цикла происходит резкое паде¬
ние уровня прогестерона. В отличие от жвачных, падение уровня про¬
гестерона в крови свиней начинается не за 2—4 дня, а за 6—7 дней до
начала охоты, что удлиняет фолликулярную фазу цикла у этого вида
животных. Уровень прогестерона в плазме крови свиней повышается
в течение 5 дней, а у овец — 4 дней. Это, по-видимому, обусловлено
большим числом желтых тел у свиней, чем у коров и овец.Концентрация прогестерона в сыворотке крови кобыл обычно
находится на низком уровне в период эструса, быстро повышается че¬
рез 24—28 ч после овуляции, достигая пика через 5—7 дней. Этот уро¬
вень сохраняется в последующие 5—6 дней, а затем резко понижается
между 14—16-м днями.Вслед за резким падением прогестерона в конце полового цикла у
животных наблюдается быстрый подъем концентрации эстрогенов.
Многими исследователями выявлен подъем уровня эстрогенов, пред¬
шествующий предовуляторному выделению Л Г, что характеризует
эстрогены как физиологический пускатель, стимулирующий необхо¬
димое для овуляции выделение Л Г у овец и коров. Уровни эстрогенов
в крови коров и овец повышаются в три раза в течение полового цик¬
ла: в начале цикла до подъема уровня прогестерона, в середине цикла
и перед регрессией желтого тела. Именно в эти периоды полового
цикла мы (М.И. Прокофьев и др., 1975) наблюдали заметное увеличе¬220
ние числа крупных фолликулов в яичниках коров. Ранее Раджакоски
(Rajakoski, 1960) наблюдал две волны роста фолликулов в течение по¬
лового цикла. Первая фаза роста фолликулов начинается на 3—4-й
день цикла. Один из них, крупный фолликул, функционирует до
1 i-го дня, а другие подвергаются атрофии к 4—7-му дню цикла. Это
позволило сделать вывод о существовании взаимосвязи между перио¬
дами ускоренного роста фолликулов и пиками эстрогенов в плазмекрови.Уровень эстрогенов в плазме крови коров в первые дни после
отела довольно высокий, он снижается примерно вдвое за две неде¬
ли до наступления первой охоты. Отметим для сравнения, что ба¬
зальный уровень эстрогенов в плазме крови коров в период нор¬
мального полового цикла находится на значительно более низком
уровне, чем в послеотельный период.Можно полагать, что постоянно высокая концентрация эстроге¬
нов в крови коров в ранний послеотельный период необходима для
поддержания высокого тонуса мускулатуры матки и быстрой ее инво¬
люции, а также для торможения процессов выделения ФСГ и J1 Г. Это,
по-видимому, необходимо для предупреждения преждевременного
проявления охоты и овуляции, когда еще не завершена инволюция
матки. С уменьшением концентрации эстрогенов в крови их тормо¬
зящее действие снижается, что способствует выделению обоих гона¬
дотропинов, росту и развитию фолликулов; новый короткий подъем
уровня эстрогенов в крови перед овуляцией стимулирует предовуля-
торный выброс ЛГ.Уровень прогестерона в крови у коров резко падает примерно за
24—28 ч до отела, а при наступлении отела снижается до минимума.
В первые 2—3 недели после отела концентрация прогестерона в кро¬
ви коров держится на низком уровне. При первом выбросе Л Г проис¬
ходит небольшое и кратковременное повышение секреции прогесте¬
рона. Возможно, именно это повышает чувствительность гипотала-
мо-гипофизарного комплекса, вследствие чего стимулируется секре¬
ция гонадотропных гормонов гипофиза, которая обеспечивает
предовуляторный выброс ЛГ и первую овуляцию.Повышение концентрации прогестерона в крови коров обычно
наблюдается в период, предшествующий первой охоте. Это явление
непродолжительно, оно происходит в течение 4—6 дней. Источником
увеличения прогестерона является желтое тело яичника, образовав¬
шееся в результате первой овуляции, которая в большинстве случаев
не влечет за собой проявление охоты.Одним из значительных достижений второй половины XX в. было
открытие гонадотропин-рилизинг гормона (ГН — РГ), или гонадо-221
либерина, контролирующего гонадотропную функцию гипофиза.
Осуществляется это следующим образом: нервные окончания из ги¬
поталамуса выделяют нейрогормональные вещества в капилляры
первичного сплетения портальной системы в срединном возвыше¬
нии, и эти нейрогормоны переносятся вниз через гипофизарную
ножку в синусы передней доли гипофиза и оказывают влияние на
секреторную активность гипофизарных клеток. Благодаря тому, что
нейросекреторные клетки совмещают нервную и эндокринную
функции, в гипоталамусе происходит переключение начального
нервного импульса в гуморальные звенья эфферентных цепей.Была установлена структура ГН — РГ, состоящего из 10 амино¬
кислот (декапептид), и идентичность его у животных разных видов.
Отсутствие видоспецифичности ГН — РГ, в отличие от гипофизар¬
ных гонадотропинов, и его несложная структура привлекли внима¬
ние исследователей в плане его химического синтеза и применения
для регулирования сроков овуляции у животных. И это предвидение
ученых подтвердилось. Вскоре он был синтезирован и созданы его
аналоги, в частности, сурфагон в нашей стране.Организация производства ГН — РГ рядом коммерческих фирм
создала возможность получения этого препарата вдостаточных коли¬
чествах, что позволило перейти к изучению его роли в регуляции вос¬
производительной функции не только у лабораторных, но и у сель¬
скохозяйственных животных.Еще одно открытие в области биологии размножения животных
второй половины XX в. касается лютеолитического фактора, простаг-
ландина F-2a.Многими исследователями было установлено, что после удаления
матки желтое тело функционирует в течение продолжительного пе¬
риода времени, и это является убедительным доказательством суще¬
ствования литического фактора в матке. Было установлено, что ма¬
точный лютеолизин переносится из яичниковой вены в близко про¬
ходящую яичниковую артерию посредством механизма обратного
тока и транспортируется прямо через артериальную кровь в яичник.У коров, свиней и овец ПГФга выделяется из матки в виде выбро¬
сов волнообразно, каждый продолжительностью несколько часов и с
определенными интервалами времени (Kindahletal., 1976). Регрессия
желтого тела обычно наступает через 2 сут после начала выделения
ПГФга, охота проявляется через 24—48 ч после регрессии желтого
тела.Регулирование полового цикла у животных. Метод регулирования
времени прихода в охоту групп животных в определенные сро¬
ки — синхронизация охоты. Это открывает целый ряд преимуществ222
для организации системы ведения животноводства. Сроки проведе-
н ця искусственного осеменения могут быть значительно сокращены,
д это значит, что время, затрачиваемое на выявление охоты, может
быть значительно уменьшено или по крайней мере строго лимитиро¬
вано, а следовательно, снижены трудовые затраты в связи с укороче¬
нием периода выявления охоты и искусственного осеменения. Более
того, если метод обеспечивает точное время овуляции, то возможно
осеменение без выявления охоты, т. е. в так называемое фиксирован¬
ное время. В результате исключается возможность проведения осеме¬
нения в неоптимальные сроки и старения зигот, с одной стороны, и
уменьшаются трудовые затраты на выявление животных в охоте, с
другой.Известные способы синхронизации половой охоты и овуляции у
животных основаны на двух основных подходах.Первый подход основан на удалении или прекращении функции
желтого тела. В результате этого все животные соответствующей
группы вступают в фолликулярную фазу полового цикла в одно и то
же время и таким образом одновременно приходят в состояние поло¬
вой охоты. С этой целью широкое применение нашел так называе¬
мый лютеолитический фактор простагландин F(2a> (ПГФга).Накопленные данные о нейроэндокринной регуляции полового
цикла у животных создали научную основу и для второго подхода к
синхронизации охоты, основанного на торможении развития фолли¬
кулов в период искусственного удлинения лютеиновой фазы цикла
до такой продолжительности, пока не произойдет регрессия желтого
тела у всех обработанных животных. Прекращение влияния ингиби¬
рующего фармакологического агента сопровождается ростом и раз¬
витием фолликулов у всех животных и приведением их одновременно
в фолликулярную фазу цикла с последующим синхронным проявле¬
нием охоты и овуляции. Большинство способов синхронизации охо¬
ты, основанных на этом подходе, базируются на применении прогес¬
терона или его синтетических аналогов — прогестагенов. Введение
последних в течение нескольких дней обеспечивает проявление по¬
ловой охоты одновременно у всех животных после окончания обра¬
ботки независимо от того, в какой фазе цикла они находились в нача¬
ле обработки.Крупный рогатый скот. Чтобы эффективно приме¬
нять способы регуляции воспроизводства, напомним основные взаи¬
мосвязи стадии проявления охоты и оплодотворяемости у коров, а
также закономерности эндокринного контроля полового цикла.Ни один фактор не играет более положительной или более отри¬
цательной роли в результативности искусственного осеменения, чем223
выявление охоты. Охота — это короткий период половой восприим¬
чивости коровы или телки, которая происходит каждые 18—24 дня.
Корова может быть плодотворно осеменена, если у нее произошло
выделение яйцеклетки — овуляция фолликула яичника в воронку яй¬
цевода. Овуляция наступает через 10—14 ч после окончания половой
охоты, которая продолжается у коров в среднем 18 «. Ввиду того, что
сперматозоидам требуется некоторое время находиться в половом
тракте коровы, чтобы приобрести способность к оплодотворению яй¬
цеклетки, что обозначается термином «капацитация», то осеменение
должно проводиться за несколько часов до овуляции.Это означает, что для получения высокой оплодотворяемости
коровы должны быть осеменены в течение последних 2/з продолжи¬
тельности охоты, или в пределах нескольких часов после выявления
охоты. Это приблизительно 24-часовой период после первых при¬
знаков прихода коровы в охоту. Коров обычно не замечают в охоте в
момент ее начала. Поэтому для выбора оптимального времени осе¬
менения можно пользоваться табл. 4.1.Таблица 4.1. Периоды осеменения коровПериод, предше¬
ствующий охотеОхота с прояв¬
лением рефлекса
неподвижностиОвуляцияПродолжительность жизни яйце¬
клетки6—10 чОсеменять
слишком рано18 чМожет быть
осеменение10—14 ч —
выделение яй¬
цеклеткиЛучшее вре¬
мя для осеме¬
нения6—10 чМожет быть Осеменение
осеменение слишком позд¬
ноКак уже говорилось выше, один из подходов для синхронизации
охоты основан на укорочении функции желтого тела. Для этой цели у
крупного рогатого скота нашли применение препараты простаглан-
дина.Введение простагландина в ранний период полового цикла до
формирования желтого тела (1—5-й дни) не оказывает эффекта. Если
желтое тело регрессирует в конце полового цикла (18—21-й дни), то
простагландин тоже не оказывает эффекта, но самки в этой стадии
полового цикла должны прийти в охоту примерно в то же время, что и
обработанные.Если простагландин вводят корове или телке со сформировав¬
шимся желтым телом (в основном с 6-го до 17-го дня полового цик¬
ла), то он вызывает регрессию желтого тела. Корова или телка прихо¬
дят в охоту и овулируют через 2—5 дней после инъекции.224
Применяются две схемы обработки коров и телок простагланди-
н0м: одно- и двукратная. Однократная инъекция простагландина в
л юбую фазу полового цикла после 4—5-го дня вызывает охоту у боль-
шинства обработанных животных. При этом около 60 % коров и те¬
лок приходят в охоту из тех, у которых было во время обработки сфор¬
мированное желтое тело, и 20 % животных с регрессирующим жел¬
тым телом, которые приходят в естественную охоту. Охота наступает
между 48—72 ч после обработки, а овуляция примерно через 24 ч по¬
сле индуцированной охоты. Таким образом, можно выявить в охоте и
осеменить животных после первой обработки, а оставшихся обрабо¬
тать простагландином через 10—12дней, когда у них будет сформиро¬
ванное желтое тело, и осеменить в течении 2—3-х последующих дней
по мере прихода в охоту.Двукратная обработка простагландином с 11-дневным интерва¬
лом сопровождается приходом 90—95 % циклирующих животных в
охоту в течение 5-дневного периода после второй обработки. Живот¬
ных обычно осеменяют однократно через 60—72 ч или двукратно че¬
рез 72 и 96 ч после второй обработки. При этом можно проводить осе¬
менение без выявления в охоте через 76—80 ч после второй обработки
простагландином. Большинство проявлений повторных охот проис¬
ходит через 32—38 дней после первой или через 20—26 дней после
второй инъекции простагландина. Планируемые сроки повторной
охоты и проявление ее в короткий период времени снижает также
трудоемкость по выявлению их в охоте и осеменению.Для второго подхода к синхронизации охоты, основанного на уд¬
линении лютеиновой фазы полового цикла, у крупного рогатого ско¬
та нашли применение препараты прогестерона или его производных.
Наиболее распространенным приемом в синхронизации охоты у
крупного рогатого скота с помощью прогестагенов является исполь¬
зование Синхромата-Б. Схема применения Синхромата-Б включает
подкожную имплантацию в ухо коровы препарата норгестамета, со¬
держащего синтетический прогестаген, и внутримышечную инъек¬
цию норгестамета (3 мг) и эстрадиола валерианата (6 мг). Имплантат
вводят коровам или телкам под кожу на внешней стороне уха. Во вре¬
мя введения имплантата инъецируют эстрадиол валерианат и норге-
стамет. Затем через 9 дней имплантат удаляют. В результате все обра¬
ботанные животные приходят в охоту через 24—36 ч. После удаления
имплантата осеменение может быть проведено без выявления охоты
через 48—54 ч или в сочетании с выявлением охоты.Другой прием синхронизации охоты у коров и телок основан на
применении внутривлагалищных устройств (ПРИД), пропитанныхI 5-4266225
прогестероном. ПРИД вводят во влагалище животных на период от
6 до 7 дней. Точность синхронизации охоты повышается, если за
1—2 сут до удаления устройств инъецируют ПГФга или его аналоги.
С целью вызывания более четкого проявления охоты и повышения
оплодотворяемости особенно у коров в послеотельный период непо¬
средственно перед или сразу после удаления ПРИД инъецируют
СЖК в дозе 3000 М.Е.С в и н ь и. В системе осеменения свиней используются три ос¬
новных биотехнологических приема: стимуляция половой охоты у
основных свиноматок после отъема поросят, синхронизация половой
охоты у половозрелых свинок, синхронизация овуляции у ремонтных
свинок и основных свиноматок.Основным биотехнологическим приемом для вызывания охоты у
свиноматок в оптимальные сроки является применение СЖК.Обработку свиноматок СЖК проводят через 24 ч после отъема по¬
росят. Свиноматкам первого опороса инъецируют СЖК внутримы¬
шечно в область шеи в дозе 1000 интернациональных единиц (и.е.)
или 4000 мышинных единиц (М.Е.), а свиноматкам с многократными
опоросами — 750—800 и.е. или 3000—3200 М.Е. СЖК. Охота насту¬
пает на 4—5-й день после отъема поросят или на 3—4-й день после
инъекции СЖК. Осеменяют свиней дважды в одну охоту с интерва¬
лом 16 ч. Доза семени на одно осеменение — 4 млн сперматозоидов.Широкое применение для контроля времени овуляции у свиней
нашел ГН — РГ и его аналоги. С этой целью ГН — РГ или его аналог
вводят через 56—68 ч после обработки СЖК, проведенной через 24 ч
после отъема поросят.	(Наиболее распространенным в настоящее время препаратом про¬
гестерона для торможения полового цикла у ремонтных свиней явля¬
ется Регумейт (Regumate) фирмы «Rousel — Uclaf», «Serum — Werk».
Он содержит активное вещество Альтреногест (Altrenogest). В 100 мл
масляного раствора содержится 0,4 г Альтреногеста. Ежедневная
доза препарата — 20 мг, инъекции проводят в течение 18-ти дней. Эф¬
фект синхронизации охоты выше, если через 24 ч после последней
инъекции Альтреногеста инъецируют 600—800 и.е. СЖК. В последнее
время показана высокая эффективность от применения Регумейта в
течение 15 дней в дозе 16 мг/голову/день. Осеменение проводят после
выявления охоты по обычной схеме.Целью синхронизации овуляции у свиней являются осеменение в
фиксированное время, т. е. без выявления охоты.Схема обработки следующая. Через 24 ч после отъема поросят
свиньям инъецируют СЖК. Свиноматкам первого опороса вводят226
1000 и.е. СЖК или 4000 М.Е., а многократно рожавшим — 800 и.е.
или 3000 М.Е. Для стимуляции овуляции у свиней используется хо-нический гонадотропин (ХГ). Интервал между инъекцией СЖК и
ХГ зависит от продолжительности периода подсоса свиноматок. Сви¬
номаткам с 5-недельным подсосным периодом ХГ вводят через
5б_58 ч после инъекции СЖК, а свиноматкам с 4-недельным подсос¬
ным периодом — через 72 ч. В последнее время ХГ часто заменяют
релизинг-гормоном гонадотропина (ГН — РГ). С этой целью исполь¬
зуют немецкий препарат Гонавет (Gonavet) или отечественный сур-
фагон. Ремонтным свиньям СЖК вводят через 24 ч после окончания
обработки Регумейтом и ХГ и через 78—80 ч после инъекции СЖК.
Искусственное осеменение в фиксированное время проводят дву¬
кратно: первое осеменение — через 24—26 ч после инъекции ХГ и
второе — 16 ч спустя или через 40—42 ч после инъекции ХГ.Овцы. У овец, как и у крупного рогатого скота, желтое тело чув¬
ствительно к лютей низирующему действию простагландинов только
в течение определенного периода его функционирования. Регрессия
желтого тела может быть вызвана однократной внутримышечной
инъекцией простагландина Фга или его аналога (100 мкг JCF 80996)
только в тот период, когда возраст желтого тела не менее трех дней,
т. е. с 4-го дня полового цикла.Ввиду того, что у овец, как и у крупного рогатого скота, желтое
тело чувствительно к лютеолитическому действию ГТГФга или его
аналогов только в течение определенного периода полового цикла,
лишь 65 % овец обычно реагируют на обработку простагландином,
если он вводится однократно группе овец без учета стадии полового
цикла. Чтобы вызвать у всех овец соответствующую стадию полового
цикла, применяют двукратную обработку простагландином с 8- или
9-дневным интервалом. Это обеспечивает высокую точность контро¬
ля времени начала охоты после второй обработки. Охота наступает в
среднем через 38,8 ± 1,3 ч, пик ЛГ — через 50,0+ 1,0 ч и овуля¬
ция — через 73,1 ± 1,6 ч после двух инъекций 100 мкг ICI 80996
циклирующим овцам с 8—9-дневным интервалом.Оплодотворяемость овец после естественного спаривания в син¬
хронизированную охоту не отличается от контроля.Второй, широко распространенный способ синхронизации охоты
у овец проводится с помощью внутривлагал ищных пессариев, пропи¬
танных прогестагенами, в частности кронолоном. Пессарии, содер¬
жащие достаточную дозу прогестагена (30—45 мг кронолона), вводят
во влагалище на 14—16 дней, чтобы затормозить проявление охоты и
привести всех овец группы к одинаковой фолликулярной стадии по¬227
лового цикла. После удаления пессариев большинство овец приходят
в охоту через 24—72 ч, обычно на второй день после удаления песса¬
риев. Инъекция 350—750 и.е. СЖК во время удаления пессариев по¬
вышает эффект синхронизации охоты и несколько ускоряет начало ее
проявления.Стимуляция охоты у овец во внеслучной сезон достигается путем
обработки гонадотропными гормонами без предварительной обра¬
ботки или с предварительной обработкой прогестероном в виде мно¬
гократных подкожных инъекций прогестерона в масляном растворе
или путем использования внутривлагалищных пессариев, пропитан¬
ных прогестагеном.Схема гормональной обработки может быть следующая. Во вне¬
случной сезон овцам вводят внутривлагалищные пессарии, пропи¬
танные одним из прогестагенов (флюгестерон аустат-ФГА, кроно-
лон, медроксипрогестерон ацетат-МАП) на 14 дней. Во время удале¬
ния пессариев инъецируют 500 и. е. СЖК. Овцы приходят в охоту вте-
чение двух дней после обработки. По меньшей мере 60 % овец,
осемененных в июне или июле после такой обработки, дают приплод.
При этом важно, чтобы при естественном осеменении было не мень¬
ше одного барана на десять обработанных овец и допуск баранов к ов¬
цам проведен не ранее чем через 48 ч после окончания обработки.Лошади. Однократная инъекция кобылам 1,25— 10 мг простаг¬
ландина Ф2аили две внутримышечные инъекции 300—600 мкгсинте¬
тического аналога простагландина JCJ 79939 вызывают охоту в тече¬
ние трех дней, если вводятся во время сформированного желтого
тела. Как и у коровы, желтое тело кобылы является невосприимчи¬
вым к действию простагландинов примерно до 5-дневного возраста
и поэтому обработка кобыл простагландином в первые четыре дня
полового цикла неэффективна.Несмотря на то что простагландин хорошо синхронизирует охоту
у кобыл в течение 3-х дней после обработки, овуляция синхронизиру¬
ется менее точно (7—12 дней после обработки) ввиду значительных
индивидуальных колебаний продолжительности охоты у этого вида
животных. Колебания в сроках проявления овуляции можно в значи¬
тельной степени уменьшить путем введения ХГ или ГН — РГ на 2-й
или 3-й день после начала охоты. Внутривенное введение, к примеру,
2000—2500 и.е. ХГ вызывает овуляцию у 90 % животных через 36—48 ч
после инъекции ХГ и благодаря этому сокращает число осеменений в
одну охоту с 2,7 до 1,8 при одновременном повышении оплодотворяе-
мости с 50 до 56 %.228
4.2. КЛЕТОЧНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ4.2.1.	Трансплантация эмбрионовразработка метода искусственного осеменения сельскохозяйст¬
венных животных и его практическое применение обеспечили боль¬
шой успех в области улучшения генетики животных. Использование
этого метода в сочетании с длительным хранением семени в заморо¬
женном состоянии открыло возможность получения десятков тысяч
потомков от одного производителя в год. Этот прием, по существу,
решает проблему рационального использования производителей в
практике животноводства.Что касается самок, то традиционные методы разведения живот¬
ных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю
жизнь. Низкий уровень воспроизводства у самок и длительный ин¬
тервал времени между поколениями (6—7 лет у крупного рогатого
скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Реше¬
ние этой проблемы ученые видят в применении метода транспланта¬
ции эмбрионов. Суть метода состоит в том, что генетически выдаю¬
щиеся самки освобождаются от необходимости вынашивания плода
и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью
увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии
ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом от¬
ношении реципиентам.Технология трансплантации эмбрионов включает такие основ¬
ные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осемене¬
ние донора, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургиче¬
ское), оценка их качества, кратковременное или длительное хране¬
ние и пересадка.Стимуляция суперовуляции. Самки млекопитающих рождаются с
большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых
клеток. Большинство из них постепенно погибают в результате атре-
зии фолликулов. Только небольшое число примордиальных фолли¬
кулов переходят в антральные в процессе роста. Однако практически
все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию,
которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок го¬
надотропинами в фолликулярной фазе полового цикла или в лютеи-
новой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого
тела простагландином Фг« (ПГФга) или его аналогами приводит к
множественной овуляции или так называемой суперовуляции.Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у
самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропина-229
ми, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой
крови жеребой кобылы (СЖК), начиная с 9—14-го дня полового цик¬
ла. Через 2—3 дня после начала обработки животным вводят простаг¬
ландин Ф2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.Проведены многочисленные испытания разных схем гормональ¬
ной обработки коров и телок с целью индукции полиовуляции. Наи¬
более широко в этих целях используют СЖК в дозе 2,5—3,0 тыс. и.е.
Известно, что период полужизни эндогенного СЖК у кобыл, уста¬
новленный гистеректомией, составляет около 6 дней, а при использо¬
вании радиоиммунологического метода выявлено наличие двух ком¬
плексов в СЖК —один с периодом полужизни 40,0—51,2 ч, вто¬
рой- 118,4-129,4 ч.Это свойство СЖК позволяет ограничиться однократным введе¬
нием его животным при вызывании суперовуляции и вместе с тем мо¬
жет иметь отрицательный эффект вследствие длительного действия
на функцию яичников не только в период, предшествующий охоте,
но и после нее. Это приводит к нарушению нормального уровня по¬
ловых гормонов и особенно их соотношения в организме животных.Для устранения этого нежелательного свойства СЖК в последнее
время применяют антитела к гонадотропину с целью увеличения чис¬
ла и улучшения качества эмбрионов, полученных при суперовуля¬
ции.Введение во время охоты коровам, обработанным 3000 и.е. СЖК
на 10-й день цикла и 37,5 мгПГФга на 12-йдень, моноклональных ан¬
тител или овечьей антисыворотки к СЖК уменьшило число неовули-
ровавших фолликулов (1,7 и 2,7 против 6,5 фолликула в контроле) и
повысило оплодотворяемость (>80 % против 60 % в контроле). Уро¬
вень эстрогенов в крови коров резко понижался вскоре после введе¬
ния антисыворотки и оставался низким до извлечения эмбрионов,
тогда как у контрольных животных уровень эстрогенов не снижался
до базального уровня во время охоты и снова увеличивался после охо¬
ты (Дж. Мауэрт и др., 1985).Для стимуляции полиовуляции у коров наряду с СЖК применяют
гипофизарные гонадотропины. С этой целью используют очищен¬
ный ФСГ отдельно или в сочетании с ЛГ. В отличие от СЖК препара¬
ты ФСГ и ЛГ вводят дважды в день в течение 4—5 сут.Наиболее распространенная схема гормональной обработки ко-
ров-доноров, применяемая в коммерческих целях, представлена в
табл. 4.2. При этом охота наступает через 40—50 ч после первой инъ¬
екции ПГФ2а. Осеменение проводят через 12 и 24 ч после наступле¬
ния охоты. Эмбрионы извлекают нехирургическим способом через
7—7,5 дней после осеменения.230
Таблица 4.2. Схема обработки коров гонадотропинами
(по В. Хансел, Б.А. Хилва, 1985)День обработкиФСГПГФ2адоза, мгвремя суток, чдоза, мгвремя суток, ч167; 18——247; 18——327; 18107427; 181212; 18В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных
животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения.
Первоначально рекомендовалось многократное осеменение коров с
использованием нескольких доз спермы. Обычно вводят 50 млн жи¬
вых сперматозоидов в начале охоты и через 12—20 ч осеменение по¬
вторяют. Более детальное изучение этого вопроса показало, что высо¬
кая эффективность оплодотворения может быть достигнута и при ис¬
пользовании одной дозы семени, если ее вводить через 24 ч после на¬
чала охоты.Овцы. Принципы вызывания суперовуляции у овец те же, что и
у крупного рогатого скота: СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой
фазы полового цикла (на 11—13-й день) или в лютеиновую фазу цик¬
ла — вместе с обработкой простагландином или во время окончания
обработки прогестагенами. СЖК вводят в дозе 20—45 и.е. на 1 кг
массы тела, или до 2000 и.е. на одну овцу. Например, аналог простаг¬
ландина простенол в дозе 100 мкг вводят между 4-м и 13-м днями по¬
лового цикла через 24—72 ч после обработки СЖК. Охота наступает
через 2—4 дня после обработки простагландином. ФСГ предпочти¬
тельнее вводить два раза вдень в течение двух дней в уменьшающейся
дозе (6,5—3,2 мг) по сравнению с обработкой равными дозами.Свиньи. У свиней, являющихся многоплодными животными,
большое число эмбрионов может быть получено без гормональной
обработки. Однако число овуляций у свиней может быть увеличено
после гормональной обработки.Лошади. Еще не разработаны надежные методы индукции су¬
перовуляции у кобыл, однако получение достаточного числа эмбрио¬
нов у них не составляет большого труда ввиду простоты нехирургиче¬
ского извлечения и повторного получения эмбрионов в каждый по¬
ловой цикл.Извлечение эмбрионов. Эмбрионы крупного рогатого скота посту¬
пают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты
(между 3-м и 4-м днем после овуляции), хотя у суперовулировавших231
коров небольшая часть эмбрионов остается в яйцеводе до 7-го дня.
Сроками продвижения эмбрионов в половом тракте коровы и опре¬
деляется извлечение их из яйцевода или рогов матки.В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно толь¬
ко из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после
начала охоты.Несмотря на то, что при хирургическом извлечении эмбрионов у
крупного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод
неэффективен — относительно дорогостоящий, неудобный для при¬
менения в условиях производства.Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в следующем
(рис. 4.1). Гибкий катетер с надувной манжеткой вводят во влагалище
и через шейку матки в один из рогов матки. Манжетка надувается и
закрывает каудальный выход рога матки, тем самым ограничивая
промывную полость. Катетер может быть двухканальным, что позво¬
ляет проводить проточное прохождение промывной жидкости. При
использовании одноканального катетера промывная жидкость вво¬
дится несколько раз (5—8 раз) и затем вытекает из рога матки. В обоих
случаях вводят 200—300 мл фосфатного буфера Дюльбекко.Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов —
6—8-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого
возраста наиболее пригодны для глубокого замораживания и могут
быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим спо¬
собом. Корову-донора используют 6—8 раз в год, извлекая по 3—6 эм¬
брионов.У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невоз¬
можно ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога
матки. Однако хирургическая операция у этих видов животных отно¬
сительно проста и непродолжительна. Доступ к репродуктивному
тракту осуществляется лапаротомией по белой линии живота. У сви¬
ней 1 -, 2- и 4-клеточные эмбрионы извлекают из яйцеводов в течение
40 ч после овуляции. При этом стеклянную канюлю вставляют в ист-
мус через маленькое отверстие в верхушке рога матки. Через канюлю
вводят 20—30 мл промывной жидкости и собирают ее из ампулярного
конца яйцевода в чашку Петри. Для извлечения эмбрионов из матки
промывают яйцевод и верхушку рога матки. Рог матки пережимают и
канюлю вставляют в рог матки. Обычно для вымывания используют
среду Дюльбекко с лактатом, пируватом и бычьим сывороточным
альбумином. Эмбрионы свиней можно извлекать до 12-го дня после
начала охоты. Эффективность извлечения эмбрионов обычно высо¬
кая (около 95 %). Можно делать 3—4 операции на одном животном
(С. Полдж, 1982).232
Рис. 4.1. Схема промывания матки крупного рогатого скота:I — флакон с физиологической средой; 2 — иглы; 3 — воздушный фильтр; 4 — шприц; 5 — двух-
позиционный краник или клапанное устройство; 6 — трубки; 7— сосуд для сбора смыва; 8 — без-
манжетный катетер, введенный в рог матки; 9 — шейка матки; 10 — рог матки; 11 — яичник
(стрелками показано направление движения жидкости; А — место пережатия рога матки)При извлечении эмбрионов у овец в ампулярный конец яйцевода
вводят стеклянную или полиэтиленовую канюлю и промывают из
рога матки в яйцевод. Независимо от времени вымывания поле охоты
эффективность извлечения эмбрионов составляет около 80 %.Пересадка эмбрионов. Параллельно с разработкой хирургического
метода извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота значитель¬
ный прогресс был достигнут и в нехирургической пересадке эмбрио¬
нов (рис. 4.2). В пайету набирают свежую питательную среду (столбик
длиной 1,0—1,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и да¬
лее основной объем среды с эмбрионом (2—3 см). После этого заса¬
сывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,0—1,5 см).
Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пере¬
садки хранят в термостате при 37 °С. Далее под ректальным контро-233
/Рис. 4.2. Схема нехирургической пересадки эмбрионов корове:1 — прямая кишка; 2 — тело матки; 3 — яичники; 4 — шейка матки; 5 — катетерлем катетер пропускают через шейку матки и осторожно вводят в рог
матки на расстоянии 5—7 см от ее тела. Нажатием на шток катетера
выдавливают содержимое пайеты вместе с эмбрионом в рог матки.Эффективность пересадки эмбрионов в значительной степени
определяется синхронностью проявления охоты у донора и реципи¬
ента. У крупного рогатого скота максимальное число беременностей
получают после синхронной пересадки.Введение эмбрионов в оба рога матки обеспечивает высокую эф¬
фективность пересадки. Этот прием успешно используют для получе¬
ния двойневости. Процедура получения двойневости включает пере¬
садку 7-дневных эмбрионов осемененному животному в рог, проти¬
воположный яичнику с желтым телом.Нехирургическая пересадка эмбрионов разработана также для ко¬
был. Высокая эффективность нехирургической пересадки эмбрионов
у лошадей была достигнута между 6-м и 8-м днями после овуляции.У овец и свиней пересадку эмбрионов проводят только хирурги¬
ческим способом. У реципиентов используется аналогичный хирур¬
гический подход, как и у доноров. Эмбрионы пересаживают в яйце¬
вод или матку в зависимости от стадии развития.Эмбрионы овцы, извлеченные на 1—4-й день после охоты, пере¬
саживают в яйцевод, а эмбрионы более старшего возраста — в матку.
Приживляемость составляет 70—75 %.У свиней приживляемость эмбрионов не снижается, если двух¬
клеточные эмбрионы извлекают из яйцевода и пересаживают в матку
реципиента на той же стадии развития. Эмбрионы свиньи рекомен-234
дуется пересаживать только в один рог матки, так как они мигрируют
и распределяются в обоих рогах матки. После пересадки 2—5-днев-
ных эмбрионов приживляемость составляет 60—70 %. Пересадка эм¬
брионов свиней на более поздних стадиях развития (7—8-дневных)
сопровождается либо отсутствием беременности, либо значитель¬
ным снижением приживляемости (С. Полдж, 1982).Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эм¬
брионов потребовало разработки эффективных методов их хранения
в период между извлечением и пересадкой. В производственных ус¬
ловиях эмбрионы обычно извлекают утром, а пересаживают в конце
дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют
фосфатный буфер с некоторыми модификациями при добавлении
эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной
температуре или температуре 37 °С.Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота
можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их по¬
следующей приживляемости.Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровожда¬
ется нормальной приживляемостью. Выживаемость эмбрионов в оп¬
ределенной степени может быть увеличена охлаждением их ниже
температуры тела. Чувствительность эмбрионов к охлаждению зави¬
сит от вида животного.Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока
не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ран¬
них стадиях развития после охлаждения их ниже 10—15 °С(С. Полдж,
1982).Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития
также очень чувствительны к охлаждению до 0 °С. Однако на более
поздних стадиях развития, таких как морула или бластоциста, они хо¬
рошо выдерживают охлаждение.Эмбрионы овец хорошо переносят охлаждение до 0 °С на любых
стадиях развития, от одно-, двухклеточной стадии до бластоцисты.
Понижение температуры хранения эмбрионов от 37 °С до 10 и 0 °С
угнетает или останавливает их развитие, но обменные процессы про¬
текают на уровне, обеспечивающем хранение до 5—6 сут. Для дли¬
тельного хранения эмбрионов необходимо не только затормозить их
развитие, но и значительно снизить или полностью остановить об¬
менные процессы. Такое состояние эмбрионов достигается при тем¬
пературе -195 °С или ниже.Эксперименты последних лет позволили определить оптималь¬
ные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эм¬
брионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы235
охлаждают медленно (1 °С/мин) до очень низкой температуры (ниже
-50 °С) с последующим переносом в жидкий азот, то они требуют и
медленного оттаивания (25 °С/мин или медленнее). Быстрое оттаи¬
вание таких эмбрионов может вызвать осмотическую регидратацию и
разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1 °С/мин)
только до -25 и 40 °С с последующим переносом в жидкий азот, то их
можно оттаивать очень быстро (300 °С/мин). В этом случае остаточ¬
ная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловид¬
ное состояние (С. Вилладсен, 1980).Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замо¬
раживания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В част¬
ности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35 °С в
течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения спе¬
циального оборудования с заданной скоростью повышения темпера¬
туры.В последние годы установлено, что замороженные и оттаявшие
эмбрионы могут быть успешно разбавлены одноступенчато в пайете,
где они были заморожены. Сущность метода состоит в следующем.
Замороженно-оттаянные эмбрионы переносят одноступенчато из
раствора криопротектора, в частности 1,5 М глицерина в фосфатном
буфере, в котором они были заморожены, в среду, содержащую ги¬
пертонический раствор не проникающего в клетку соединения, ка¬
ким является сахароза. Это обеспечивает постепенное удаление кри¬
опротектора из эмбриона без нарушения осмотического равновесия в
0,02 мл 1,5 М глицерина.При помощи воздушных пузырьков пайету делят на три камеры: в
первой — раствор криопротектора; во второй — эмбрион в растворе
криопротектора; в третьей — растворитель (1,08 М раствор сахаро¬
зы). После замораживания и оттаивания содержимое пайеты переме¬
шивают встряхиванием. Затем эмбрион может быть пересажен из
пайеты нехирургическим способом реципиенту. Этот метод позволя¬
ет пересаживать замороженно-оттаянные эмбрионы по типу искусст¬
венного осеменения. Сравнение методов одноступенчатого и много¬
ступенчатого оттаивания эмбрионов показало, что оба они дают оди¬
наковые результаты.Успешное замораживание и оттаивание эмбрионов овец впервые
было проведено С. Вилладсен и др. (1974). Эмбрионы медленно охлаж¬
дали (от 0,3 до 2,0 °С/мин) и медленно оттаивали (от 4 до 25 °С/ мин).
В качестве криопротектора применяли ДМСО. Позднее установлено,
что при использовании 1,5 М ДМСО в фосфатном буфере заморажи¬
вание со скоростью 1 °С/мин до —120 °С сопровождалось выживае¬
мостью эмбрионов только в том случае, если применялось быстрое236
ивание (360 °С/мин). Однако при замораживании со скоростью
пТ С/мин была сохранена выживаемость эмбрионов как при быст-
так и при медленном оттаивании (10 или 4 °С/мин). При даль-
Рейшем уменьшении скорости замораживания до ОД °С/мин в ин¬
тервале температур между -30 и -60 °С медленное оттаивание былообязательным.Первый жеребенок был получен после пересадки 11 заморожен-
но-оггаянных эмбрионов, извлеченных на 6-й день после овуляции.
Сообщалось о получении двух жеребят после хирургической пересад¬
ки четырех шестидневных замороженных эмбрионов трем реципиен¬
там.Таким образом, установлено, что эмбрионы крупного рогатого
скота в первые дни развития особенно чувствительны к охлаждению,
но когда они достигают стадии бластоцисты, то устойчивы к охлажде¬
нию в более широком диапазоне стадий развития. У свиней ни на од¬
ной стадии развития эмбрионы не выживают после охлаждения их до
температуры ниже 10— 15°С. Достигнуто успешное замораживание до
-196°С и оттаивание эмбрионов крупного рогатого скота, овец и ло¬
шадей на стадиях морулы и бластоцисты с получением живого потом¬
ства у всех трех видов животных. На практике этот прием используют
пока при разведении крупного рогатого скота.4.2.2.	Оплодотворение яйцеклеток вне организма животногоРазработка системы оплодотворения и обеспечения ранних ста¬
дий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного
(in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и
практических вопросов, направленных на повышение эффективно¬
сти разведения животных.Система оплодотворения in vitro может быть использована преж¬
де всего как ценный аналитический инструмент для изучения биохи¬
мических и физиологических факторов, включающихся в процесс
оплодотворения, соединения мужской и женской гамет. Только с ос¬
воением техники оплодотворения вне организма появилась реальная
возможность для широкого развертывания исследований по генной и
клеточной инженерии и особенно сельскохозяйственных животных.
Для этих целей необходимы эмбрионы на ранних стадиях развития,
которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцево¬
дов, что является трудоемким и не дает достаточного числа зароды¬
шей для проведения этой работы. К тому же существующие методы
гормональной регуляции воспроизводительной функции у сельско¬
хозяйственных животных не позволяют достичь высокой точности237
контроля времени овуляции и вследствие этого получить достаточное
число эмбрионов на желаемой стадии развития. Методы клеточной и
генной инженерии на животных предусматривают также проведение
длительных манипуляций с гаметами и эмбрионами вне организма.
Все эти проблемы могут быть решены в значительной степени с ис¬
пользованием системы оплодотворения яйцеклеток млекопитающих
вне организма.Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает
следующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию спер¬
матозоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.Созревание ооцитов in vitro. Большое число половых клеток в яич¬
никах млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и
свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источ¬
ник огромного потенциала воспроизводительной способности этих
животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с ис¬
пользованием возможностей нормальной овуляции. У этих видов жи¬
вотных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих
спонтанно во время охоты, составляет только незначительную часть
от тысяч ооцитов, находящихся в яичнике при рождении животного.
Остальные ооциты регенерируют внутри яичника или, как говорят
обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нель¬
зя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработ¬
ки и провести их дальнейшее оплодотворение вне организма живот¬
ного. В настоящее время не разработаны методы использования всего
запаса ооцитов в яичниках животных, но значительное число ооци¬
тов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего
их созревания и оплодотворения вне организма.Явление спонтанного возобновления мейоза ооцитов, выделен¬
ных из фолликулов кролика и помещенных в культуральную среду,
было впервые открыто Г. Пинкусом и Н. Энзманом (1935).Известно, что после выделения ооцита из фолликула, как и после
выброса эндогенного ЛГ в организме животного перед овуляцией,
ооцит освобождается из состояния мейотического торможения, что
сопровождается так называемым разрывом зародышевого пузырька.
В организме крупного рогатого скота разрыв зародышевого пузырька
происходит примерно через 5 ч после выброса Л Г, ооцит достигает
метафазы I через 12 ч и метафазы II через 24—25 ч. Вне организма
ядерная мембрана зародышевого пузырька крупного рогатого скота
также исчезает через 5—6 ч, через 12 ч хромосомы достигают метафа¬
зы I и через 20—24 ч — метафазы II.Видовые различия в проявлении мейотического созревания
ооцитов у коров, овец и свиней показаны в табл. 4.3.238
т блииа 4.3. Временные параметры проявления стадий мейоза ядра ооцитов
н видов животных на предовулягорный выброс гонадотропинов (Ч. Хантер, 1980)Вил ЖИВОТ¬
НОГОЛатентный
период после
стимуляции,
чСтадии мейотического созревания, чметафаза Iанафазателофазаметафаза IIКорова10-1214-21222324Овца10-1112-20212224Свинья17-1826-34353637Хотя большинство ооцитов, извлеченных из фолликулов яични¬
ков, возобновляют мейоз и достигают метафазы II, оплодотворение
их часто не обеспечивает полноценного развития зародышей. Пред¬
полагают, что основной причиной этого является неполноценное со¬
зревание ооцитов. Одной из причин может быть то, что при созрева¬
нии ооцита in vitro в цитоплазме не вырабатывается в достаточной
мере фактор, контролирующий формирование и развитие мужского
пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фак¬
тора, вызывающего созревание мужского пронуклеуса, необходимо
обеспечить индуктивное влияние нормального окружения ооцита в
фолликуле в течение не менее 6 ч после начала мейотического созре¬
вания.Это было подтверждено в опытах по оплодотворению in vitro
ооцитов свиней, извлеченных из фолликулов на разных стадиях мей¬
оза. С прогрессированием стадии развития в момент извлечения
ооцита из фолликула повышался процент нормально оплодотворен¬
ных зародышей: нормальное оплодотворение имело место у 31,7; 51,6
и 78,2 % культивируемых ооцитов со стадии зародышевого пузырька,
диакинеза и метафазы I соответственно.Установлено, что стероидные гормоны не требуются для запуска
мейоза у млекопитающих, но необходимы для полного физиологиче¬
ского созревания ооцита.В связи с тем, что стероидные гормоны и другие факторы, выраба¬
тываемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созре¬
вание ооцитов, было сделано предположение, что культивирование
ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их способ¬
ность к нормальному оплодотворению и последующему эмбриональ¬
ному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая био¬
синтез стероидов и синтез белков, регулируют гонадотропные гормо¬
ны. Поэтому при культивировании ооцитов внутри фолликулов или с239
фолликулярными клетками гонадотропины должны быть обязатель¬
ной составной частью среды.Необходимость прямого контакта между соматическими (фолли¬
кулярными) и половыми клетками обусловлена целым рядом при¬
чин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита.
Они обеспечивают энергетический субстрат ооциту, участвуют в пе¬
реносе некоторых предшественников аминокислот, нуклеотидов и
фосфолипидов в ооцит, генерируют инструктивные сигналы, кото¬
рые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных бел¬
ков. Инструктивные сигналы, требуемые для созревания ооцитов,
как было показано выше, наиболее важны в первые 6—8 ч после ини¬
циации.В настоящее время применение на практике нашло созревание in
vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из
яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извле¬
чения 1—2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от живот¬
ных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном
контейнере в течение 1,5—2,0 ч. В лаборатории яичники дважды
промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из
фолликулов, диаметр которых 2—6 мм, путем отсасывания или раз¬
резания яичника на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с
добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды
промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только
ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.В последнее время разработан способ прижизненного извлечения
ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или
лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр
которых не менее 2 мм, 1 —2 раза в неделю от одного и того же живот¬
ного. В среднем получают однократно 5—6 ооцитов на животное. Ме¬
нее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.Несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении воз¬
можность многократного использования животного, с учетом ин¬
формации о происхождении полученных ооцитов, открывает новые
перспективы применения метода оплодотворения in vitro в практиче¬
ских целях.Отобранные ооциты с компактным кумулюсом созревают в тече¬
ние 24 ч в среде ТСМ 199 с добавлением 20 %-й обработанной теп¬
лом сыворотки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток
(3—5 • 106 клеток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков
(50 и.е. пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулезные
клетки собирают из среды, в которой ооциты отделяют от фоллику-240
и центрифугируют дважды по 5 мин при 500 g. Осадок гранулез-
х клеток суспендируется в среде для созревания. Сокультивирова-
ие ооиитов и гранулезных клеток проводят при 38,5 °С в атмосфере
5% СОг в чашках Петри в 2 мл среды.Капацитация сперматозоидов. Важным этапом в разработке метода
оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капаци-
тации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Ау-
стин установили, что оплодотворение у млекопитающих наступает
только в том случае, если спермии в течение нескольких часов до ову¬
ляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдени¬
ях по изучению проникновения спермиев яйцеклетки крысы в раз¬
личные сроки после спаривания Г.Р. Аустин ввел термин капацита-
ции. Он означает, что в спермии должны произойти некоторые фи¬
зиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет
способность к оплодотворению.В последующих исследованиях в лаборатории М. К. Чанга были не
только определены оптимальные условия капацитации спермиев в
половом тракте самки, но и продемонстрирована возможность дека-
пацитации спермиев кролика, извлеченных из матки, обработанной
семенной плазмой кролика, человека и быка, рекапацитации этих
спермиев при внесении их в яйцеводы и, наконец, удаления декапа-
цитирующего фактора из семенной плазмы центрифугированием.Капацитация включает начальное изменение мембраны спермия,
что позволяет ему пройти вторую фазу (акросомную реакцию), а так¬
же слияние плазменной и внешней акросомной мембран. В настоя¬
щее время первую фазу обозначают как собственно капацитацию, а
вторую — как акросомную реакцию.Показано, что у спермиев крупного рогатого скота происходит ак-
росомная реакция исключительно в ампуле яйцевода, расположен¬
ной ипсилатериально к стороне яичника с овуляцией, и только во
время или непосредственно после овуляции. Эти наблюдения дают
основание предполагать, что капацитация происходит преимущест¬
венно в яйцеводе, расположенном на той же стороне, что и яичник с
овулирующим фолликулом. Установлено также, что содержимое, из¬
влеченное из яйцевода во время эструса, но не влютеиновую фазу по¬
лового цикла у овец, вызывает капацитацию и акросомную реакцию
спермиев быка.Глюкозоаминоглюканы in vitro вызывают акросомную реакцию
или капацитацию бычьих эпидидимальных спермиев. При анализе
гл юкозоаминоклюканов в смывах яйцеводов крупного рогатого скота
выявлена концентрация гепариноподобного материала.241
В опытах in vitro установлено, что гепарин — наиболее потен¬
циальный глюкозоаминоглюкан по способности вызывать акросом-
ную реакцию у эпидидимал ьных спермиев быка и капацитацию эяку¬
лированных спермиев.В организме коровы все спермии, прикрепленные к прозрачной
оболочке, были с акросомной реакцией. Кроме того, при помощи
электронной микроскопии обнаружено, что спермии быка, найден¬
ные в окружении и непосредственно в кумулюсной массе, в яйцеводе
сохранили акросомы в полном объеме и только спермии, прикреп¬
ленные к прозрачной оболочке, имели акросомную реакцию. Эти
данные свидетельствуют о том, что спермии быка капацитируются в
яйцеводе, а оплодотворяющий спермий завершает акросомную реак¬
цию около или в прозрачной оболочке.Разработано несколько методов капацитации эякулированных
спермиев домашних животных. Для удаления белков с поверхности
спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев,
была использована среда с высокой ионной силой.Однако наибольшее признание получил способ капацитации
сперматозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др.,
1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной
бане при 39 °С в течение 30—40 с. Примерно 250 мкл оттаянного се¬
мени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капа¬
цитации состоит из модифицированной среды Тиройда, без ионов
кальция. После инкубации в течение одного часа верхний слой среды
объемом 0,5—0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперма¬
тозоидов, удаляют из пробирки и промывают дважды центрифугиро¬
ванием при 500§втечение 7—10 мин. После 15 мин инкубации с гепа¬
рином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 млн
сперматозоидов в 1 мл.В Биотехцентре (Н.М. Сураева) было показано, что концентрация
спермиев при всплывании стабилизируется уже в первые 5 мин и не
меняется в течение последующего часа (табл. 4.4).Таким образом, согласно табл. 4.4, можно значительно сократить
продолжительность всплывания с 45—60 до 5—15 мин, что, в свою
очередь, ускоряет, а значит, и облегчает оплодотворение. Были про¬
ведены опыты по оплодотворению вне организма яйцеклеток круп¬
ного рогатого скота спермой, подвергшейся процедуре всплывания в
течение 15 и 60 мин. Эксперименты с использованием двух интерва¬
лов инкубации показали, что продолжительность инкубации заметно
не влияет на эффективность дробления оплодотворенных вне орга¬
низма яйцеклеток крупного рогатого скота.242
Таблица 4.4. Эффективность всплывания спермиев в зависимости
от продолжительности инкубации (Н.М. Сураева)ин"кубаиии, минЧисло ОПЫТОВЧисло спермиев • 106 в 1 мл553,3 ± 0,461563,8 ±0,533051,0 ±0,754552,8 ± 0,726063,0 ±0,41Полученные результаты открывают перспективы повышения вы-
хода живых спермиев из одной дозы размороженной спермы, так как
появилась возможность проведения процедуры всплывания сперми¬
ев с одним и тем же осадком несколько раз без потери их жизнеспо¬
собности.Используя прием многократной смены среды, можно в несколько
раз (в наших опытах в пять раз) увеличить эффективность использо¬
вания одной порции эякулята, что особенно важно при применении
спермы от высокоценных быков-производителей.Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эм¬
брионов. Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществля¬
ется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению
условий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. По¬
этому система оплодотворения in vitro была бы ценным аналитиче¬
ским инструментом для изучения биохимических и физиологических
факторов, включающихся в процесс успешного соединения гамет.
Более того, предполагалось, что эта система найдет применение в тех¬
нологии разведения животных.Крупный рогатый скот. Применяют следующую схе¬
му оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов
крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле
модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооци¬
ты частично очищают от окружающих экспандированных кумулюс-
ных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Сус¬
пензия сперматозоидов объемом 2—5 мкл добавляется к среде с ооци-
тами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях*’5 млн/мл. Через44—48 ч после осеменения определяют наличие
дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпите¬
лиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.Овцы. Оплодотворение у овец исследовали двумя путями: in
vitro и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной243
овцы. Как и у крупного рогатого скота, число оплодотворенных яйце¬
клеток было больше в том случае, когда фолликулярные и овулиро-
вавшие ооциты помещали в яйцевод со спермиями. При использова¬
нии системы оплодотворения in vitro таких клеток было меньше.Ооциты культивировали в среде ТСМ 199 с 10 %-й инактивиро¬
ванной фетальной сывороткой с добавлением гонадотропинов (ЛГ и
ФСГ) и эстрадиола — 17р. Затем ооциты оплодотворяют in vitro эяку¬
лированными спермиями, капацитированными в течение 8 ч в моди¬
фицированной среде ДМ с добавлением 10 мМ буфера Хепеса. Хи¬
рургическим путем переносят 2—4-клеточные эмбрионы в яйцеводы
ложнобеременным кроликам. Через три дня ооциты из яйцевода кро¬
лика извлекают и пересаживают в матку постоянного реципиента.С в и н ь и. К настоящему времени неизвестны какие-либо дан¬
ные об оплодотворении in vitro ооцитов свиней. Вместе с тем некото¬
рые исследователи наблюдали проникновение спермиев в ооциты
свиней после созревания их in vitro и пересадки осемененной эст-
ральной свиньи, но ни один ооцит не продолжал развитие и у многих
из них проявилась полиспермия.Другие авторы сообщали о нормальном оплодотворении и разви¬
тии в аналогичной системе ооцитов, полученных из яичников сви¬
ней, обработанных ХГ за 12 ч до ожидаемой овуляции. Можно пола¬
гать, что только после полного созревания ооцита в организме живот¬
ного происходит блокирование полиспермии, нормальное оплодо¬
творение и дальнейшее развитие эмбрионов этого вида.Более успешные результаты достигнуты при культивировании
ранних эмбрионов свиней in vitro. Так, после 48 ч культивирования1—4-клеточных эмбрионов свиней и последующей их хирургической
пересадки были получены беременности у двух из 13 свиней. После
культивирования 8-клеточных эмбрионов в течение 48 ч до стадии
бластоцисты и затем пересадки 19 свиньям-реципиентам 10 живот¬
ных были беременны во время убоя через 21 день, но только 51 из 229
эмбрионов были представлены живыми плодами.4.2.3.	Межвидовые пересадки эмбрионов и получение
химерных животныхПринято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть
осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрио¬
нов, например, овец козам и наоборот сопровождается их прижив-
ляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях
межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов
является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет имму¬
нологической реакции материнского организма на инородные анти¬244
гены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получени¬
ем химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.Сначала были получены химерные животные путем объединения
бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали слож-
ные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эм¬
брионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из рав¬
ного числа бластомеров эмбрионов от 2—8 родителей. При этом об¬
щее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличе¬
ния нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и
переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии
ранней бластоцисты. Нормально развивающиеся бластоцисты пере¬
саживали реципиентам и получали живых ягнят, большинство из ко¬
торых оказались химерными по данным анализа крови и внешним
признакам.Получены химерные овцы путем инъекций внутренней клеточной
массы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доно¬
ров в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бласто¬
цист доноров удаляли инкубированием в 0,5 %-й проназе и пипетиро-
ванием.Для восстановления их функции после обработки проназой эм¬
брионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрач¬
ной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клет¬
кам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сы¬
воротки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофоб-
ласта удаляли пипетированием, а изолированную внутреннюю
клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через
зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пере¬
садки этих бластоцист получены химерные ягнята как по признакам
групп крови, так и по внешним признакам.Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др.,
1985) соединением половинок 5—6,5-дневных эмбрионов. Пять из
семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегиро¬
ванных эмбрионов, не имели признаков химеризма. Один теленок
был химерой двух пород — бурой швицкой и голштинофризской. Од¬
нако масть бурой швицкой породы доминировала. Анализ крови это¬
го теленка показал присутствие групп крови только от родителей гол¬
штинофризской породы. Другой теленок был химерой неопределен¬
ного происхождения.Показана высокая эффективность получения химер крупного ро¬
гатого скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы полу¬
чили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой».
В этих исследованиях показано, что передача химерам родительского245
типа имеет случайный характер, т. е. потомство может развиваться из
клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эм¬
брионов. Половина всех химер представляет особый интерес.Наиболее показательно получение химер от объединенных частей
эмбрионов разных видов, например овцы и козы.Исследования С.В. Фехилли и др. (1984) показали, что бластоме¬
ры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4—5 сут в лига-
тированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные
бластоцисты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться
до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате
объединения по одному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы
и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась по¬
лучением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на
ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты во¬
лос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.4.2.4. Клонирование животныхЧисло потомков от одной особи, как правило, у высших живот¬
ных бывает небольшим, а специфический комплекс генов, опреде¬
ляющий высокую продуктивность, возникает редко и в последующих
поколениях претерпевает значительные изменения.Вместе с тем известно, что ядро соматической клетки обладает
полной генетической информацией о данном организме, и если соз¬
дать условия для реализации этой информации, то можно получить
практически неограниченное число генетических копий (клонов) оп¬
ределенной особи. Поскольку ядра большинства соматических кле¬
ток находятся в дифференцированном состоянии, то эту задачу на
первом этапе решали, используя эмбриональные клетки на опреде¬
ленной стадии развития зародыша, когда еще не произошла их диф¬
ференциация. Пересадка ядер (бластомеров) в зрелые ооциты дает
такую возможность, потому что цитоплазма ооцитов содержит спе¬
цифические факторы, способные репрограммировать пересажен¬
ное ядро и запускать программу развития нового эмбриона.Получение однояйцовых близнецов имеет большое значение для
животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от од¬
ного донора, а с другой — появляются генетически идентичные двой¬
ни. Получение идентичных двоен в большом количестве могло бы об¬
легчить оценку быков по качеству потомства, уменьшить стоимость
спермопродукции, ускорить и удешевить тестирование препаратов и
упростить исследования в области кормления животных.246
Возможность микрохирургического разделения эмбрионов мле-
питаюших на ранних стадиях развития на две и более части, чтобы
К жлая в последующем развивалась в отдельный организм, была вы¬
мазана несколько десятилетий назад. Первое потомство однояйцо¬
вых мышей было получено из механически изолированных бластоме¬
ров двухклеточных эмбрионов в 1970 г. Используя ту же технику раз¬
деления, но с применением метода заключения в агар, С.М. Виллад¬
сен (1979) описал получение однояйцовых двоен у овец разделением
2-клеточных эмбрионов. Последующие эксперименты показали, что
одинаковые двойни могут быть также получены из 4- и 8-клеточных
эмбрионов разделением бластомеров надве группы (С.М. Вилладсен,
1980). Половинки из 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов также жизне¬
способны, как и нормальные эмбрионы овец. Их можно хранить в за¬
мороженном состоянии, что позволило применить их в эксперименте
для получения монозиготных двоен разного возраста.Выживаемость четвертей эмбрионов клетки или 8-клеточных эм¬
брионов на четыре пары клеток ниже, чем нормальных. Выживае¬
мость эмбрионов, полученных из отдельных бластомеров 8-клеточ¬
ных эмбрионов, почти нулевая.Установлено, что бластоцисты, полученные из половинок эм¬
брионов, состоят из 32 клеток, т. е. составляют лишь 50 % нормально¬
го числа клеток. Отдельные бластомеры из 4-клеточного эмбриона
также способны развиться в бластоцисту. Однако бластоциста из та¬
кой четверти состоит из 16 клеток и меньше.На 8-клеточной стадии каждый бластомер имеет потенциальную
возможность развиваться в бластоцисту, но очень маленького разме¬
ра, примерно из восьми клеток. При пересадке таких бластоцист ме¬
нее 10 % из них развиваются до стадии рождения.На основе этих исследований можно предположить, что резкое
уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором,
понижающим способность этих эмбрионов развиваться в жизнеспо¬
собные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит
разделение, имеет малое значение.После того как для эмбрионов большинства животных заканчива¬
ется компактизация морулы, защита со стороны зоны пеллюциды
становится несущественной. Поэтому последующие разработки по
получению монозиготных двоен были направлены на использование
поздних морул и бластоцист.В настоящее время применяют простую технику разделения эм-
рионов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылу¬
пившейся бластоцисты) на две равные части одновременно с разре¬
зом зоны пеллюциды. При этом не выявлена существенная роль при¬247
сутствия зоны пеллюциды для эффективности развития разделенных
бластоцист.Использование эмбрионов на более поздних стадиях развития у
крупного рогатого скота для получения однояйцовых близнецов об¬
легчается тем, что их извлекают нехирургическим способом.Простая техника разделения разработана и для 6-дневных эм¬
брионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внутреннюю
клеточную массу эмбриона и примерно 40 % зоны пеллюцида. Затем
разрезают слой трофоэктодермы внутри зоны пеллюциды. Одну по¬
ловинку эмбриона в собственной зоне пеллюциды, а другую без зоны
пеллюциды пересаживают в рог матки 6-дневного реципиента на рас¬
стоянии 5 см от маточно-трубного соединения.Техника разделения на половинки эмбрионов успешно применя¬
ется на овцах и на козах.Деление на стадии поздней бластоцисты считается более удоб¬
ным, так как блестящая оболочка тоньше и цитоплазма эластичнее,
чем у ранней бластоцисты.При разработке оптимальных условий получения монозиготных
близнецов большое внимание уделялось продолжительности культи¬
вирования in vitro после разделения и трансплантации половинок эм¬
брионов, а также их хранению в замороженном состоянии.Установлено, что продолжительность культивирования полови¬
нок эмбрионов более 4 ч снижает результативность их последующей
приживляемое™. Культивирование in vitro половинок эмбрионов
крупного рогатого скота в течение 24 ч снижает их приживляемость
примерно в три раза по сравнению с культивированием in vitro в тече¬
ние 4—6 ч.Разделенные эмбрионы коров могут храниться в замороженном
состоянии.Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных кле¬
ток в энуклеированные яйцеклетки. После пересадки ядер эмбрио¬
нальных клеток в энуклеированные яйцеклетки ядро репрограмми-
руется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион.
Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же
генетическую основу и, таким образом, способны обеспечить разви¬
тие идентичных особей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки
ядер, в свою очередь, могут быть использованы как доноры ядер. По¬
сле нескольких генераций создается возможность получения сотен и
даже тысяч идентичных эмбрионов.Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три ос¬
новных этапа: выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооци-
та, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от ам-248
(Ьибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. По¬
этому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мем-
б н яйца и ооцита. Под действием электрического импульса
происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клет¬
ки донора и энуклеированным ооцитом-реципиентом. Технология
пересадки ядер клетки способствовалауспешному получению клони¬
рованных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого
скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплан-
таиионной стадии являются тотипотентными, но эффективность
этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была проде¬
монстрирована следующая эффективность этой технологии на каж¬
дом этапе (%): энуклеация — 70—80, развитие морулы-бластоцисты
клонированных эмбрионов — 20—30. В исследованиях К.Р. Вондио-
ли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из
одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последова¬
тельно клонированных эмбрионов. Однако последовательные пере¬
садки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эм¬
бриональными потерями в матке. В итоге не удалось получить телят
от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клониро¬
вания.При использовании в качестве доноров ядер более продвинутых в
развитии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневного возраста
(47—68 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточ¬
ных эмбрионов того же возраста (около 30 бластомеров), достигается
более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробле¬
ния эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В. И. Захарченко и
др., 1996). Эффективность развития клонированных эмбрионов
крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источ¬
ника бластомеров морул на стадии прекавитации. При этом свежевы¬
мытые морулы являются лучшими донорами ядер, чем развившиеся
in vitro.Осложняет пересадку ядер эмбриональных клеток получение те¬
лят с большой живой массой примерно на 15—30 % больше, чем у
контрольных животных. Это приводит к тяжелым родам (рождение
мертворожденных телят, задержка выхода последа).Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйце¬
клетки имеет много преимуществ по сравнению с технологией разде¬
ления эмбрионов. Эти преимущества следующие: отдельные эмбрио¬
нальные клетки, полученные из эмбриона на стадии до 64 клеток, мо¬
гут быть репрограммированы в одноклеточные зиготы и давать мно¬
жественные копии генетически одинаковых животных; повторное
клонирование путем пересадки ядер от клонированных эмбрионов249
повышает потенциальные возможности технологии в производстве
большего числа клонов.Клонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток
в энуклеированные яйцеклетки. Накопленный опыт клонирования эм¬
брионов путем пересадки ядер тотипотентных клеток из эмбрионов в
энуклеированные яйцеклетки послужил базой для разработки метода
клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток
в энуклеированные яйцеклетки. Принципиальное отличие состоит в
том, что клонирование путем пересадки ядер эмбриональных клеток
обеспечивает получение идентичных животных между собой, тогда
как пересадка ядер соматических клеток взрослого животного обес¬
печивает получение не только одинаковых между собой животных,
но и идентичных по генотипу с животным-донором соматических
клеток. Это открывает возможность получать неограниченное число
генетически идентичных потомков уже в первом поколении. Нет не¬
обходимости объяснять, насколько революционным может быть этот
прием в селекции и разведении сельскохозяйственных животных.Возможность получения клонов животных с использованием
ядер соматических клеток была впервые продемонстрирована в
1997 г. получением овцы Долли (Wilmul et al., 1997). Н. Вильмут с
коллегами трансплантировали ядра клеток молочной железы в энук¬
леированные яйцеклетки овцы.С этого момента работа многих лабораторий мира была направле¬
на на исследование способности репрограммирования клеток плода
и взрослого животного.Talbot et al. (1998) получили культуру фетальных фибропластов
100-дневного плода коровы и использовали для трансплантации
ядер. Получены четыре стельных реципиента (7 %), которые впо¬
следствии абортировали.Heyman et al. (1998) получили двух телят из клонированных эм¬
брионов с ядрами фибропластов, взятых из мышцы и кожи плода. Од¬
нако эффективность развития клонированных эмбрионов до стадии
бластоцисты была очень низкой (3—8 %).В опытах Zakhartcheto et al. (1999) эпителиальные клетки молоч¬
ной железы и фибробластно-подобные клетки уха были получены от2—3-летних симментальских коров и культивировались в среде
ДМЕМ с 10 %-й фетальной сывороткой теленка. После одного-пяти
пассажей концентрация фетальной сыворотки уменьшалась с 10 до
0,5 % в течение 4—6 дней, чтобы вызвать голодание. Созревание
ооцитов проводили по обычной методике (Stojkovic et al., 1995). Ко-
мулюсные клетки удаляли через 18—20 ч после созревания путем
микропипетирования или обработкой гиалуронидазой. Ооциты с по-250
тельцем энуклеировали путем удаления минимального цито-
лярны еск0Г0 объема. Через 20—22 ч отдельные донорские клетки
П^ма с энукЛеированными ооцитами, используя двойной элек-
СЛИческий импульс2,1 кВ/см втечение Юс. Через24чслившиеся ка-
оиопласт-цитопласт комплексы активировались 5-минутной инку¬
бацией в 7 %-м этаноле с последующим 5-часовым культивировани¬
ем в 10 мкг/мл цитоксимида и 5 мкг/мл цитохалазина В. Конструиро¬
ванные эмбрионы культивировали в среде CRJ (Rosenkrans a. First,1991)	с добавкой 10 %-й эстральной сыворотки коровы в течение 7
дней.После пересадки бластоцист, полученных из клеток молочной
железы и уха, соответственно 100 % (2/2) и 42 % (5/12) исследован¬
ных реципиентов были беременны на 42-й день. Во время публика¬
ции два реципиента имели беременность более 4 месяцев (клетки мо¬
лочной железы) и пять реципиентов — от 1,5 до 3 месяцев (клетки из
уха) (табл. 4.5). Результаты показывают, что взрослые клетки крупно¬
го рогатого скота могут быть успешно использованы для пересадки
ядер, но клеточные линии, используемые в этих исследованиях, от¬
личаются по потенциальным возможностям и развитию. Различия в
способности быть программированными, наблюдаемые с этими дву¬
мя линиями клеток, могут быть из-за их импринтинга (отпечатка)
или модификации хроматина.Таблица 4.5. Развитие in vitro эмбрионов с пересаженными ядрами,
полученными из клеток взрослых животных (по Zakharteheto et al., 1999)Клетки-донорыСлилось,%Дробилось,%Бластоцист,%Вылупившихся
бластоцистов, %Клетки молочной железы93/147(63)65(70)32(34)а23(25)аКлетки из уха
Раб < 0,05177/244(73)135(76)92(52)684(48)6Целью исследований Wells et al. (1999) было проклонировать по¬
следнюю оставшуюся островную корову в Исландии на острове Ин-
дерби с целью сохранения генетики самок этой эндогенной породы
крупного рогатого скота, приспособленного к субтропическим усло¬
виям. Несмотря на то, что семя от девяти уже не живущих быков было
заморожено, попытки в последние шесть лет добиться воспроизвод¬
ства у этой коровы завершились рождением одного бычка, который
был получен в результате оплодотворения in vitro прижизненно из¬
влеченных ооцитов. Качество яйцеклеток этой коровы было низкое,
возможно связанное с ее возрастом (13 лет) или генетикой. Поэтому
клонирование взрослого животного, возможно, являлось единствен¬251
ным приемом получения самок, которые потом могут быть осемене¬
ны семенем исландского быка, и создания возможности дальнейшей
племенной работы с этой породой.Клеточная линия была получена из гранулезных клеток, собран¬
ных путем аспирации фолликулов, используя ультразвуковой при¬
бор. Клетки культивировали в OMEM/F12, содержащей 10% фе¬
тальной сыворотки, и использовали для пересадки ядра между 4 и 8
пассажами. Донорские клетки были индуцированы голоданием сы¬
воротки крови в течение 9—23 дней и подвергнуты электрическому
слиянию с энуклеированными ооцитами, полученными после созре¬
вания in vitro.Реконструированные эмбрионы затем активировали и стимули¬
ровали одновременно слиянием. Слившиеся эмбрионы культивиро¬
вали в SOFa BSA, и бластоцисты пригодного качества пересаживали
по паре синхронизированным реципиентам коровам через 7—8 дней
после охоты.После пересадки 74 эмбрионов выживаемость эмбрионов на 30,
55 и 150 дни была 38,30 и 23 % соответственно. Из первых пересажен¬
ных 22 эмбрионов родились два теленка. Однако один пал через два
дня. Выживший теленок здоров. Микросателлитный анализ ДНК
подтверждает, что телята являются генетически идентичными с ост¬
ровной коровой Индерби. Дополнительные беременности развива¬
ются.Корейские ученые использовали в качестве доноров ядер феталь¬
ные фибробласты (от плодов 60—70-дневного возраста). Линии кле¬
ток культивировали, по меньшей мере, 7 пассажей. Эти клетки фиб¬
робласты были определены нормальными по результатам хромосом¬
ного анализа (окрашивание 5 %-й гимзой). Клетки были простиму¬
лированы голоданием сывороткой крови в течение 4—5 дней до
пересадки ядер. Все манипуляции проводили при комнатной темпе¬
ратуре в течение 3 ч в конце созревания in vitro. Созревшие in vitro
ооциты были энуклеированы после 22 ч созревания. Энуклеация
была подтверждена под ультрафиолетом после 10 мин инкубации с5	мг/мл Hochest 33342. Реконструированные эмбрионы помещали в
камеру для слияния в 0,28 М раствора манитола. Одиночный элек¬
трический импульс 1,75 кВ/см в течение 20 мкс применялся для одно¬
временного слияния клеток и активации оопласта. Слившиеся клет¬
ки культивировали в течение 1 ч в 5 мг/мл цитохалазина В. Успешно
слившиеся эмбрионы помещали в TALP, содержащий 4 мг/мл БСА
без жирных кислот, для культивирования in vitro эмбрионов, развив¬
шихся до компактной морулы.252
реконструированные эмбрионы успешно сливались (50/67;
77 8 ± 13,4 %), Дробились (26/50; 55,3 ± 21,5 %) и развивались до мору-
г/бластоцисты (11/26; 44,3 ± 13,8 %). В предварительном исследо¬
вании две из вылупившихся бластоцист были окрашены 5 %-й гим-
зой для подсчета клеток. В одной было 100, а в другой 70 клеток.
Одиннадцать компактных морул, или бластоцист, были пересажены
девяти реципиентам. Четыре реципиента были беременными
(44,4 %), подтверждено ультразвуком на 40—50-й день. Один реципи¬
ентабортировал на 60-й день, а у других беременность продолжается.Начиная с конца 80-х и в течение 90-х годов проводились широ¬
кие исследования по изучению возможности репрограммирования
герминативных клеток млекопитающих.Stewart et al. (1994) получили линию эмбриональных гермина¬
тивных клеток, которые имели характеристики эмбриональных
стволовых клеток, и использовали эти клетки при создании химер.
Причем клетки с геномом этой клеточной линии обнаруживались в
популяции половых клеток.Однако первые эксперименты по трансплантации ядер гермина¬
тивных клеток млекопитающих были мало эффективны. Лишь
1,6—16,3 % реконструированных эмбрионов развивались до стадии
бластоцисты (Delhaise et al., 1997; Heiman et al., 1998; Tsunoda et al.,1998). У кроликов клонированные эмбрионы не имплантировались
(Moens et al., 1996). У мышей имплантировались, но не развивались
до рождения потомства (Tsunode et al., 1989; Kato, Tsunoda, 1995).
У коров реконструированные эмбрионы имплантировались, но на
ранних стадиях развития (до 40 дней) беременность прекращалась
(Delthaise et al., 1995; Moens et al., 1996; Laveir et al., 1997).В 1998 г. на конференции «Генетическая инженерия и клонирова¬
ние животных» в штате Юта (США) Strelchenko et al. (1998) доложилио	рождении теленка, полученного методом трансплантации ядер гер¬
минативных клеток герминативной складки плода коровы
40—45-дневного возраста.Исследователи использовали не свежевыделенные герминатив¬
ные клетки, а после продолжительного культивирования, а также
применили реклонирование первоначально полученных морул.В следующем году Zakharteheto et al. (1999) использовали свеже¬
выделенные герминативные клетки для трансплантации ядер в неак¬
тивированные оопласты. В результате развитие клонированных эм¬
брионов до стадии бластоцисты достигло 38 % и завершилось получе¬
нием телят.В наших экспериментах у кроликов ядра фетальных фибробла-
стов репрограммировались и обеспечивали развитие эмбрионов до253
Рис. 4.3. Соматические клетки (фетальные фибробласты), используемые
для клонирования кроликовстадии бластоцистов с высокой эффективностью — 51 % (Galat et al.,1999)	(рис. 4.3, 4.4, 4.5, 4.6).В Биотехцентре РАСХН показаны различия в эффективности ре¬
программирования фибропластов, взятых из плода и взрослого кро¬
лика.Фетальные фибробласты в качестве доноров ядер для трансплан¬
тации в энуклеированные яйцеклетки были использованы и в работе
со свиньями Du et al. (1999).Собирали ооциты от суперовулировавших свиней-доноров через
50—54 ч после инъекции ХГ и удаления кумулюса
пипетированием и обработкой гиалуронидазы.
Ооциты активировали и сливали одновременно
через 54—56 ч, используя два повтора ВС пульсов
(1,5 кВ/см, 60 мкс х 2) с интервалом 30 мин с при¬
менением 0,3 М раствора маннитола, содержаще¬
го 0,1 мМ СаС12,0,1 мМ MgS04 и 0,01 % PVA. Фиб-
	 робласты получали от 25-дневных плодов и куль-„ . ,,	тивировали вДМЕМ плюс 10 % фетальной сыво-Рис. 4.4. Неоплодо-	т,	, ,	_творенная яйцеклет- Ротки- Клетки с 3-5 пассажами были подвергнутыка кролика с напра- голоданию при культивировании в течение 5 днейвительным тельцем с 0,5 % фетальной сыворотки. Эмбрионы с переса-
Рис. 4.5. Энуклеация: удаление ядерного материала
из яйцеклетки кроликаРис. 4.6. Клонированные бластоцисты кролика, полученные в результате
пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки
(Биотехцентр, РАСХН)
женными ядрами культивировали в течение 7 дней с 10 % фетальной
сыворотки, добавленной на 96 ч. Эффективность развития очень низ¬
кая.	jАналогичная, низкая эффективность развития до стадии бласто¬
цисты была в опытах Тао et al. (1999) —до 7%.Таким образом, в настоящее время показано, что к репрограмми-
рованию и обеспечению развития до стадии бластоцисты способнь
многие клетки взрослого организма: фибробласты (кро¬
лик — Mitalipovetal., 1998; Dinnyesetal., 1999; Lagutina etal., 1999; ко¬
рова — Zakhartchenkoetal., 1999; Vignon etal., 1999), клетки эпителш
молочной железы (овца — Wilmut et al., 1997; Zakhartchenko et al.
1998, 1999), гранулезные клетки (мышь — Wakayama et al., 1998; ко¬
рова — Collas, Barnes, 1994; Katoetal., 1998; Wells etal., 1999), клетм
эпителия яйцевода (корова — Kato et al., 1998); клетки Сертоли »
нейрональные клетки (мышь — Wakayama et al., 1998). Однако потом¬
ство получено только при трансплантации ядер клеток эпителия мо¬
лочной железы (овца — Wilmut et al., 1997; корова — Zakharteheto ei
al., 1999), фибробластов (корова — Zakharteheto et al., 1999; Vignon ei
al., 1999), гранулезных клеток (мышь — Wakayama et al., 1998; коро¬
ва — Kato et al., 1998; Wells et al., 1999) и клеток эпителия яйцеводг
(корова —Kato et al., 1998).Успешная демонстрация пересадки ядер соматических клеток j
животных расширяет возможности применения этой технологии дл*
решения новых задач в области воспроизводства и селекции сельско¬
хозяйственных животных. При использовании удобных источников
ооцитов и суррогатных самок эта технология может быть использова¬
на для сохранения других исчезающих пород животных, подобно
тому, как это было продемонстрировано для сохранения эндогенной
породы крупного рогатого скота, приспособленного к субтропиче¬
ским условиям в Исландии (Wells et al. 1999), и будет способствовать
разработке метода внутривидовой пересадки ядер клеток в будущем.Использование этой технологии открывает большие возможно-;
сти в повышении эффективности получения трансгенных животных!
и биомедицине.Резюмируя накопленные данные по клонированию животных,
можно отметить, что успех развития реконструированных эмбрионов
в значительной степени обеспечивается согласованием стадии кле¬
точного цикла донора ядер и цитоплазмой реципиента. Неадекват¬
ный выбор фазы клеточного цикла реципиента или донора во время
реконструкции может привести к разрушению ДНК и неправильной
плодии реконструированного эмбриона. Взаимосвязи между ядром
донора и цитоплазмой реципиента происходят на многочисленных256
внях, которые в настоящее время изучаются. Установлено, чтохронизация отдельных бластомеров на ранней стадии развития
°И яется полезным инструментом для изучения взаимосвязи клеточ-
ЯВ х циклов у разных видов животных, включая кроликов (P. Collas et
”ь 1992), крупный рогатый скот (К.Н. Campbell et al., 1993) и мышей
(Р j. Otaegu et al., 1994). Синхронизация бластомеров на Gl/S-фазе и
пересадка в ооциты на М 11 повышают эффективность развития эм¬
брионов у многих видов животных, включая кроликов (P. Collas et al.,1992)	и крупный рогатый скот (Н. Tanaka et al., 1995). Однако в каче¬
стве рутинного метода для клонирования эмбрионов эта техника не¬
достаточно надежна, так как во время раннего развития в любой пе¬
риод времени большинство ядер в эмбрионе находятся на S-фазе кле¬
точного цикла (F.L. Barnes et al., 1993).Если используются несинхронизированные бластомеры в качест¬
ве ядерных доноров, то наблюдается увеличение частоты развития,
когда цитоплазма реципиента активирована и активность фактора,
стимулирующего мейоз, понижена перед реконструкцией эмбриона
(К.Н. Campbell et al., 1994). Предварительно активированный ооцит
будет принимать G1 (GO), S- или С2-фазы клеточного цикла и опре¬
деляется термином «Универсальный реципиент» (К.Н. Campbell et
al., 1993).Анал из данных различных исследований, в которых были исполь-
зованы синхронизированные эмбриональные бластомеры в качестве
ядер доноров, показывает, что донорские клетки на поздних стадиях
G2 или ранней G1 клеточного циклаявляются наиболее пригодными
для повышения эффективности развития (O.Y. Kwenetal., 1996).Техника клонирования крупного рогатого скота путем пересадки со¬
матических клеток в энуклеированные яйцеклетки с применением мик¬
романипулятора. Техника микроманипуляций для пересадки ядра
была впервые разработана S.M. Willadsen (1986) для клонирования
эмбриональных клеток и в последующем приспособлена без значи¬
тельных изменений для клонирования соматических клеток. Это тех¬
ника используется в настоящее время почти во всех лабораториях
мира несмотря на дорогостоящее оборудование, трудоемкость, по¬
требность в высококвалифицированных кадрах и низкой эффектив¬
ности.Техника клонирования состоит из нескольких этапов: извлечение
°оцитов из фолликулов, их дозревание in vitro, энуклеация ооцитов,
приготовление соматических клеток, пересадка и электрослияние со¬
матической клетки с ооцитом, активация реконструированного
°оцита, культивирование эмбриона и пересадка реципиенту.
Извлечение и дозревание ооцитов. Яичники
транспортируют с мясокомбината в термосе в среде PBS без белка в
течение 2—5 ч при начальной температуре +30 °С. Ооциты отсасывав
ют из видимых фолликулов диаметром 2—8 мм при помощи шприца
или иглы, присоединенной к ваккуумному насосу. Аспирированную
фолликулярную жидкость переносят в чашку Петри или пробирку!
промывают средой 199 с 10 % фетальной сыворотки крови. Созрева-]
ние ооцитов проводят в среде 199 с добавкой 10 % фетальной сывоИ
ротки ФСГ (0,005 ед/мл), ЛГ, эстрадиола (1 мкг/мл) при 39 °С в 5 %
СОг в увлажненной атмосфере воздуха.Через 18—20 ч после созревания in vitro удаляют кумулюсный
клетки комплекса ооцит—кумулюсные клетки путем многократного!
пипетирования в 0,1 %-м гиалуронидазе и отбирают ооциты с первый
направительным тельцем.	jПриготовление соматических клеток, а) Фиб\
робласты взрослого животного. Проводят биопсию уха у взрослого!
животного. Кусок ткани разрезают на мелкие кусочки (3 мм2) и куль-!
тивируют в ДМЕМ плюс 10 % фетальной сыворотки крупного рога¬
того скота плюс 1 % пеницилина (10 000 уд/мл) и 1 % стрептомицина!
(10 000 мкг/мл) и затем культивируют при 37 °С в воздухе с 5 % СОг|
При культивировании в течение недели формируется монослой кле-j
ток фибробластов вокруг кусочков ткани. Кусочки ткани удаляют и
фибробластные клетки культивируют до слияния (монослоя). Когда
слияние клеток будет достигнуто, клетки трипсинизируют (0,1 %
трипсин) в течение 5 мин и подсчитывают общее число клеток. Из¬
влеченные клетки центрифугируют и осадок ресуспендируют до кон¬
центрации 1 млн клеток на 1 мл. Жидкую суспензию замораживают в
ДМЕМ-Р12, содержащей 10 % диметилсульфоксида (DMSO), и хра¬
нят при —80 °С или 250 000 клеток переносят в новую чашку, культи¬
вируют до слияния. Клетки пассируют путем трипсинизации и снова
подсчитывают.Таким образом проводят 5—6 пассажей. Для пересадки в ооцит
используют клетки, подвергнутые или не подвергнутые голоданию.
Для получения клеток, подвергнутых голоданию, проводят их куль¬
тивирование в ДМЕМ, содержащей 0,5 % фетальной сыворотки, в те¬
чение 2—3 дней. Затем отбирают отдельные клетки путем трипсини¬
зации монослоя и ресуспендирования клеток после центрифугирова¬
ния в PBS с добавкой 0,5 % фетальной сыворотки.б)	Фибробласты плода. 40—50-дневный плод удаляют хирургиче¬
ским путем или после убоя из матки коровы. Голову и внутренние ор¬
ганы удаляют, оставшуюся ткань плода разрезают на кусочки разме¬
ром 2—5 мм. Эти кусочки затем культивируют как описано выше.258
в)	Гранулезные клетки. Гранулезные клетки получают из комплек-кумулюс—ооцит после созревания in vitro. Кумулюсные клетки
С ул ьти виру ют в среде ДМ ЕМ с добавкой 10 % фетальной сыворотки в
течение 3 дней или дополнительно 5 дней в ДМЕМ с добавкой 0,5 %
фетальной сыворотки.Непосредственно перед пересадкой ядра суспензия донорских
клеток обрабатывается стандартной трипсинизацией. Клетки отделя¬
ют и ресуспендируют в среде SOF плюс 0,5 % фетальной сыворотки и
оставляют в этой среде до инъекции в ооцит.Энуклеация. Ооциты энуклеируют через 17—19 ч после со¬
зревания. Перед энуклеацией ооциты помещают на 15 мин в среду
SOF, забуференную Хепесом с 4 мг/мл BSA и 5 мкг/мл прижизненно¬
го красителя Hoechst 33342. В это время отбирают ооциты с полярны-
ми тельцами и гомогенизированной цитоплазмой. Пригодные ооци¬
ты энуклеируют в среде SOF с 7,5 мкг/мл цитохалазина, используя за¬
остренную стеклянную пипетку с внешним диаметром 25 мкм. Толь¬
ко ооциты, у которых будут удалены оба направительных тельца и
метафазная пластинка, подтвержденные ультрафиолетовым облуче¬
нием, включают в эксперимент.Электрослияние. Каждую донорскую клетку инъециру¬
ют в перивителиновое пространство энуклеированного ооцита и по¬
мещают ооциты в 0,27 М раствор манитола без Са2+ и Mg2+ (среда У и
мирермана). Слияние проводят путем применения двойного импуль¬
са 1,75 kv/см в течение 15 мкс. Реконструированные ооциты перено¬
сят в среду CR.ЩДк т и в а ц и я. Активацию ооцитов проводят через 3—5 ч после
ЮдеЬшя путем 4-минутной инкубации в 5 мкм мономицина с после¬
дующей обработкой их 1,9 шМ диметиламинопурина (ДМАР) в тече¬
ние 4 ч.Культивирование. Культивируют 5—10 реконструиро¬
ванных ооцитов, обработанных ДМАР в 25 мкл капле CR с добавкой
3 мг/мл DSA. На 4-й день переносят в среду с добавкой 10% феталь¬
ной сыворотки и 0,15 шМ глюкозы. Культивируют в течении 7 дней
после активации.Пересадка эмбрионов. Пересаживают бластоцисты
коровам-реципиентам. Половые циклы реципиентов синхронизиру¬
ют с тем, чтобы они соответствовали 7-дневному возрасту эмбрионов
после реконструирования ооцитов. Затем проводят нехирургическую
пересадку одного или двух бластоцист 6 раз на стороне желтого тела
яичника. Диагностику беременности проводят через 30 и 60 дней.Техника клонирования крупного рогатого скота путем пересадки со¬
матических клеток в яйцеклетки без применения микроманипулятора.259
Техника пересадки ядер соматических клеток в яйцеклетки без при¬
менения микроманипулятора (Vajta G et. al. 2003) может быть жизне¬
способной альтернативой традиционным методам. Она отличается
высокой эффективностью, меньшей трудоемкостью и низкой стои¬
мостью, что может иметь важное значение для более широкого при¬
менения пересадки ядер как для исследовательских целей, так и для
производства.Техника пересадки включает следующие основные этапы: извле¬
чение и дозревание ооцитов in vitro, удаление зоны пеллюциды и ин¬
кубация в демиколцине, приготовление цитопласта и соматических
клеток, электрослияние, активация и культивирование эмбрионов.Полученные на мясокомбинате ооциты коров подвергают созре¬
ванию как описано выше. Через 21—22 ч после начала созревания
100—150 комплексов ооцит—кумулюсные клетки помещают в 2 мл
эпиндорфовскую пробирку, содержащую 0,5 мг/мл гиалуронидазы,
растворенной в 500 мкл в среде 199 с Хэпесом (ТО) без добавки сыво¬
ротки крови крупного рогатого скота (СК). После двух минут инкуба¬
ции при 39 °С кумулюсные клетки удаляют сначала осторожным пи-
петированием, используя 1 мл автоматическую пипетку в течение
1 мин, а затем вортекс с максимальной скоростью 3 мин. С этого мо-'
мента все манипуляции проводят при 39 °С. Ооциты отделяют от дис¬
пергированных клеток кумулюса путем двух промывок в 35 мм чаш¬
ках Петри, каждая из которых содержит4 мл Т2 (Т + 20 % СК).Все инкубации проводят в лунках 4-луночных чашек в среде забу-
ферной Хэпесом без покрытия маслом.Ооциты переносят сначала в раствор проназы (1,5 мг/мл) в
600 мкл Т10 (Т + 10 % СК), и чашку двигают круговым движением,
используя горизонтальное вращение при 150 об/мин при 39 °С в тече¬
ние 10—15 мин, затем при 80 об/мин в течение 1 мин. В результате
вращения с медленной скоростью ооциты с удаленной зоной пеллю-
цида, собирают в середине лунки и затем переносят в другую лунку,
содержащую 2,5 мкг/мл цитохалазина В, растворенного в 800 мкл Т20
(Т + 20 % СК), где их инкубируют 3 мин.40—50 ооцитов с удаленными зонами пеллюцидами выстраивают
в одну линию в 35 мм чашки Петри с Т20 и 2,5 мкг/мл концентрацией
цитохалазина В. Деление пополам проводят под стереомикроскопом
ультраострым лезвием. Разделенные пополам ооциты собирают в се¬
редине чашки Петри путем кружения чашки и переносят в 800 мкл Т2
для хранения.Все половинки ооцитов окрашивают 10 мкг/мл флюорохрома
Hoechst 33342, растворенного в Т2 в течение 5 мин. Окрашенные по¬
ловинки быстро отмывают в Т2, помещают в 3 мкл капли в Т2 на дно
60 мм чашки Петри и покрывают маслом (3 половинки в капле). Ис-260
ользуя инвертированный микроскоп и ультрафиолетовое облуче-
Пие регистрируют положение цитопластов без окрашенного хрома¬
тина, используя магнитофон. Эти цитопласты затем собирают под
стереомикроскопом и переносят в 800 мкл Т20 капли для временногохранения.Готовят монослой соматических клеток как описано выше.Слияние проводят через 23—24 ч после начала созревания. Для
первого слияния половину от общего числа приготовленных цито¬
пластов переносят в первую лунку 4-луночной чашки, содержащей
800 мкл Т20.На дно в середине 4-луночной чашки, наполненной 4 мл Т2, оса¬
ждают 5 мкл суспензии соматических клеток.Цитопласты затем переносят по одному во вторую лунку, содер¬
жащую 500 мкг/мл фитогемоаглютинина, растворенного в 400 мкл Т2
на 3 с и затем быстро капают на единичную соматическую клетку, по¬
саженную на дно чашки.После прикрепления пару цитопласт—соматическая клетка снова
втягивают в пипетку и переносят в камеру слияния с расстоянием ме¬
жду электродами 0,5 мм.До применения удаляют клей из центральной 2-сантиметровой
зоны электродов при помощи хирургического лезвия. Электроды по¬
крывают 2 мл среды для слияния (0,3 М манитола 0,1 мМ MgSC>4,
0,05 мМ СаСЬ) при 26—27 °С. После инкубации в течение 2—3 мин в
среде для слияния пару (ооцит + фибробласт) присоединяют к одно¬
му из электродов, используя 15v АС и 700 KHz. Соматическую клетку
каждой пары позиционируют в дальнем конце от электрода. Слияние
проводят двумя импульсами по 65 v каждый в течение 20 мкс с интер¬
валом 0,1 с.Пару затем осторожно удаляют и переносят в 3-ю или 4-ю лунку4-луночной чашки, которые содержат по 800 мкл Т20. Пары инкуби¬
руютздесь 15—30 мин, чтобы определить, произошло ли слияние.После слияния 15—20 пар среду для слияния заменяют, чтобы
предотвратить разрушение, вызванное испарением.Для второго слияния все оставшиеся цитопласты и слившиеся
пары переносят в среду для слияния, покрывающую камеру для слия¬
ния. Чтобы избежать смешивания, цитопласты помещают севернее
от электродов (т. е. как можно дальше от оператора), а пары помеща¬
ют южнее от электродов.После инкубации примерно в течение 2 мин 10 цитопластов вы¬
равнивают в линию к одному электроду, используя тот же АС, как и
Для первого слияния. Одну слившуюся пару дня затем прикрепляют к
каждому цитопласту. Проводят двойной импульс с теми же парамет¬
рами, но при 45 v ДС. Затем триплету двойных цитопластов—грану¬261
лезная клетка — инкубировали в Т20 в течение 20 мин. Эти слившие¬
ся реконструированные эмбрионы переносят в лунку 4-луночной
чашки, содержащей 400 мкл культуральной среды, покрытой маслом,
и инкубируют в 5 % С02 в воздухе при 39 °С.Активацию начинают через 28 ч после начала созревания (при¬
мерно через 4 ч после слияния). Реконструированные эмбрионы сна¬
чала инкубируют в 1 мл Т20 содержащем 2 мкМ Са ионофора А23187 в
течение 5 мин при комнатной температуре. После двух последова¬
тельных промываний в Т20 реконструированные эмбрионы инкуби¬
руют отдельно (чтобы сохранить их от прикрепления одного к друго¬
му) в 5 мкл каплях культуральной среды, содержащей 2 мМ
G-dimethylamino-purin (6-ДМАР), и покрывают маслом, инкубируют
в атмосфере 5 % СОг в воздухе при 39 °С в течение 6 ч. Эмбрионы за¬
тем отмывают дважды в культуральной среде и культивируют раз¬
дельно в углублении лунки (WOWS) в 400 мкл культуральной среды,
покрытой 400 мкл масла. Эмбрионы культивируют при 39 °С в 5 %
С02, 5 % 02 и 90 % N2.Через 7 дней после реконструкции определяют число бластоцист и
проводят их пересадку нехирургическим путем или замораживанием.Высокая эффективность этой технологии и низкая стоимость
оборудования (не требуется микроманипулятор или связанные с ним
инструменты, такие как микрокузница и капиллляры) делают эту тех¬
нологию очень экономичной даже для лабораторий с ограниченным
финансированием. Эта технология клонирования эмбрионов круп¬
ного рогатого скота в модифицированном виде в нашей стране разра¬
ботана в отделе Биотехцентра ВНИИ ПЗК(Г. Моленкоидр., 2006).4.3.	ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ4.3.1.	Получение трансгенных животныхИсторически улучшение генетического потенциала домашних
животных достигается методами отбора и подбора при разведении.
Несмотря на то, что этот метод оказался достаточно эффективным
для улучшения продуктивных качеств (например, молочной продук¬
тивности), в течение длительного периода времени потребности по¬
вышения продуктивности между поколениями постоянно возраста¬
ют. Успехи в технологии получения рекомбинантных ДНК открыли
возможность получения новых полезных свойств у животного уже в
первом поколении, а также создания новых генотипов путем введе¬
ния, удаления или других изменений генома в первом поколении.262
j Gordon с сотр. (1980) впервые показали, что гетерогенное ДНКет быть введено путем инъекции в пронуклеус зиготы мыши, ни¬
трировано в хромосомы, реплифицировано и затем обнаружено в
тканях потомства. J. Gordon назвал этих новых, генетически модифи¬
цированных животных «Трансгенными». Другие исследователи в ко¬
поткие сроки повторили эти эксперименты, и метод инъекции ДНК в
поонуклеус зиготы стал длительное время основным методом для
создания трансгенных мышей, а затем и других видов животных.Благодаря разработки метода введения ДНК в пронуклеус заро¬
дыша появилась возможность более эффективного использования
животных для повышения их продуктивности и качества продукции,
резистентности к болезням и в производстве биомедицинских препа¬
ратов.Ввиду низкой эффективности получения трансгенных животных
путем микроинъекции гена в пронуклеус зиготы к настоящему време¬
ни предложен целый ряд других методов введения чужеродного гена в
организм животного. Ниже приведены основные из них.Методы введения чужеродного гена в организм животного. Мик¬
роинъекция гена. Получение трансгенных животных путем
микроинъекции гена включает извлечение эмбрионов на стадии про¬
нуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. Для получе¬
ния оплодотворенных яйцеклеток, необходимых для микроинъек¬
ции, у животных гормональной обработкой вызывают суперовуля¬
цию по определенной для каждого вида схеме, а затем извлекают яй¬
цеклетки, промывая яйцеводы у наркотизированных или убитых
ШИНютных.Для микроинъекции эмбрионов необходим стабильный рабочий
стол, на который устанавливают инвертированный микроскоп, два
микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной
пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На
столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со сре¬
дой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы.
Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством понижен¬
ного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъ¬
ецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной
пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором
ДНК. Для инъекции пипетку через прозрачную оболочку и клеточ¬
ную мембрану вводят в пронуклеус, после чего в него инъецируют
•—2 пкл раствора ДНК. О точности операции судят по набуханию
пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объема ядра сви¬
детельствует о том, что раствор ДНК был действительно введен в про¬263
нуклеус. После инъекции эмбрионы освобождаются от удерживаю¬
щей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в
соответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо
видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяй¬
ственных животных в цитоплазме имеются темные липидсодержа¬
щие гранулы, которые затрудняют визуализацию пронуклеусов.
В результате центрифугирования при 15 ООО g в течение 3—5 мин
(R.J. Wall et al., 1984) гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклет¬
ки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми
и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как прави¬
ло, не требуется центрифугирования: для визуализации пронуклеусов
достаточно применить оптику Номарского с интерференционным
контрастом. Несмотря на такую обработку, микроинъекция эмбрио¬
нов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть
выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей
и кроликов.После короткого (до нескольких часов) культивирования in vitro
эмбрионы трансплантируют в яйцевод синхронизированных реци¬
пиентов.Исключение составляет крупный рогатый скот, которому переса¬
живают инъецированные эмбрионы только после длительного куль¬
тивирования (7—8 дней), на более поздней стадии их развития, так
как эмбрионы на ранних стадиях развития у этого вида животных не
приживляются после пересадки.Синхронизация полового цикла реципиентов и доноров, от кото¬
рых получают эмбрионы, является необходимым условием для ус¬
пешного выполнения программ по переносу генов (эмбрионов), так
как яичники, яйцеводы и матка должны находиться в соответствую¬
щей стадии, чтобы физиологически обеспечить дальнейшее развитие
пересаженных эмбрионов.Коровам и кобылам эмбрионы вводят нехирургическим методом.Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают
20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы транс¬
плантируют в один яйцевод, а у мышей и кроликов — раздельно по
яйцеводам. У овец, коз и крупного рогатого скота каждому реципиен¬
ту пересаживают два-четыре эмбриона.Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индиви¬
дуально метят, берут у них пробу тканей или крови для доказательства
интеграции ДНК. Интеграцию ДНК проверяют PCR-диагностикой,
дот-, блот-гибридизацией по Саузерну.264
Несмотря на то, что этот метод работает достаточно надежно, эф¬
фективность получения трансгенных животных очень низкая: у круп¬
ного рогатого скота менее 0,1 % трансгенных животных к числу пере¬
саженных зигот. К примеру, в исследованиях Eystone (1999) на полу¬
чение одного трансгенного теленка использовано 1600 инъецирован¬
ных зигот. Это обусловливает и высокие затраты на получение одного
исходного трансгенного животного.В связи с низкой эффективностью получения трансгенных жи¬
вотных методом микроинъекции гена и, как следствие, их высокой
стоимостью, исследования были направлены на разработку альтерна¬
тивных методов повышения эффективности создания трансгенных
сельскохозяйственных животных.Существенное повышение эффективности получения трансген¬
ных животных и возможность снижения затрат на их получение стало
возможным с разработкой метода клонирования животных.Пересадка генетически тра сформиро в ан-
ных клеток в энуклеированные яйцеклетки.
В отличие от микроинъекции гена в пронуклеус зиготы этим методом
ген вводят в соматические клетки путем обычной трансфекции в
культуре клеток. В этой технологии в качестве соматических клеток
используют фетальные фибробласты, генетически модифицирован¬
ные разными методами (липофекция, электропарация и др.). Моди¬
фицированные фетальные фибробласты подсаживают к энуклеиро-
ванным ооцитам и соединяют их с цитоплазмой, как правило, элек¬
трослиянием.Реконструированные ооциты вступают в эмбриональное разви¬
тие и трансплантируются животным-реципиентам. Таким образом
осуществляется клонирование животных путем пересадки не обыч¬
ной, а генетически трансформированной соматической клетки в
энуклеированную яйцеклетку.Высокая эффективность получения трансгенных животных этим
методом достигается тем, что реципиентам трансплантируются толь¬
ко трансгенные эмбрионы. А достигается это тем, что в соматическую
клетку в процессе трансфекции вводят одновременно со структур¬
ным геном, который впоследствии у трансгенного животного будет
синтезировать и выделять определенный лекарственный белок, ген
устойчивости к неомицину. Последний позволяет выживать, только
генетически модифицированным клеткам в присутствии генитицина
G-418. Таким образом, происходит селекция генетически модифици¬
рованных клеток, которые затем и подсаживают в энуклеированные
ооциты.265
Трансгенные овцы, продуцирующие с молоком человеческий
фактор IX для лечения гемофилии, были получены Schnicke А. Е. et al(1997)	путем пересадки трансфецированных соматических ядер в
энуклеированные яйцеклетки. Аналогичным методом были получе¬
ны трансгенные козы (Keefer С. L. et al., 2000).С использованием метода клонирования в опытах I.B. Cibelli et al.(1998)	пересадка девяти реконструированных эмбрионов коро-
вам-реципиентам сопровождалась получением одного трансгенного
теленка, тогда как по сообщению Wall et al (1992) при использовании
техники микроинъекции гена должно быть проинъецировано и пере¬
сажено коровам-реципиентам около 500 эмбрионов, чтобы получить
одного трансгенного потомка. На фирме «Инфиноген» (США) на по¬
лучение одного трансгенного теленка, продуцирующего с молоком
человеческий сывороточный альбумин, было использовано 18 кло¬
нированных эмбрионов.Таким образом, использование метода клонирования эмбрионов
для получения трансгенных животных существенно сокращает время
и стоимость получения трансгенных животных.Этот прием позволяет получать только самок уже в первом поко¬
лении, так как существующие генетические методы позволяют ото¬
брать только плоды самок для получения фетальных фибробластов.
В результате не требуется дополнительное время на процесс разведе¬
ния исходных лактирующих трансгенных животных.С использованием метода пересадки ядер стадо, например, из5—10 трансгенных коров, достаточное для обеспечения потребности
фармацевтического рынка в лекарственном препарате, может быть
создано уже в первом поколении, тогда как при инъекции гена потре¬
бовалось бы получение как минимум двух и более поколений, чтобы
получить продуктивное стадо. Это позволяет сэкономить два года для
каждого поколения.Гормонально вызванная лактация у трансгенных телят позволяет
получить по 50 л молока от каждого трансгенного теленка уже через
15 мес после трансплантации трансгенного эмбриона корове-реци-
пиенту. Такого количества молока достаточно для отработки техники
его выделения и очистки, предклинического и клинического испыта¬
ния, а к моменту получения первой естественной лактации (через
33 мес от начала проекта) начать его коммерческое производство.Разработана технология получения клонированных птиц путем
извлечения зародышевых клеток из эмбрионов на стадии 0—6 дней и
пересадка их в ранние эмбрионы. Это позволяет получать половые
химеры, от которых уже в первом поколении можно получить копии
(клоны) исходных доноров. Разработка этой технологии открыла но¬266
вые возможности в создании трансгенных птиц. Это достигается тем,
что ген вводят в зародышевые клетки донора путем обычной транс-
(Ьекции в культуре клеток, как это делается наживотных. Трансфеци-
пованные зародышевые клетки снова пересаживают в зародыш реци¬
пиента, который продолжает развиваться до вылупления. Таким об¬
разом получают кур, продуцирующих с яйцом различные лекарствен¬
ные белки.Продуктивная группа трансгенных кур может быть создана через
12—18 мес, а лекарственный белок с яйцом получен уже через
6_7 мес после переноса гена.Пересадка гена с использованием ретро-
вируса. Одним из первых лабораторных приемов пересадки гена
у млекопитающих была пересадка посредством использования ви¬
руса. Этот метод был успешно применен на различных видах живот¬
ных: куры (M.J. Briskin et al., 1991); G. Sargent, 1999), мыши
(С. Spadafora,1998), а позднее пересадка гена с использованием рет¬
ровируса была применена и на крупном рогатом скоте (A.V. Chan et
al., 2001). В последних исследованиях было получено четыре из четы¬
рех трансгенных телят путем введения гена в ооцит на стадии метафа¬
зы II. Это является экстраординарным результатом для получения
трансгенного крупного рогатого скота. Однако авторы не сообщили
об экспрессии гена у трансгенных животных.Несмотря на высокую эффективность интеграции гена посредст¬
вом использования ретровируса этот прием имеет и значительные не¬
достатки. Одним из наиболее серьезных ограничений применения
ретровирусов для пересадки гена является относительно маленькое
количество генетической информации (< 10 кв), которое может быть
перенесено ввиду малого объема вирусных частиц. Это создает про¬
блему получения низкой экспрессии гена, что ограничивает практи¬
ческое использование этого приема.Другим потенциальным недостатком этого метода является его
сложность. Несмотря на то, что введение вирусных частиц в ооциты
требует наименее сложных манипуляций с эмбрионами, упаковка
трансгенов в вирус осложняется техникой изготовления генной кон-
струции, введения ее в геном ретровируса и последнего в упаковоч¬
ные клетки, которые выращивают для производства вирусов. После
того как вирусы будут сконцентрированы, они могут быть введены в
ооциты.Несмотря на то, что многие лаборатории включались в производ¬
ство трансгенных сельскохозяйственных животных, они не восполь¬
зовались этим методом. Нерешительность в отношении этих иссле¬
дований по использованию ретровирусов для переноса гена в значи¬267
тельной степени обусловлена общественным мнением. Это вызвано
возможным проявлением рекомбинантных явлений между вирусны¬
ми векторами и эндогенными ретровирусами, создающими новые
патогенные агенты, в частности онкогены.Пересадка гена путем введения его в спер-
м у. Что может быть более заманчивым, чем создание трансгенных
животных путем простого погружения спермиев в раствор, содержа¬
щий трансген, и затем использование этих спермиев для искусствен¬
ного осеменения?После первой демонстрации пересадки гена путем введения его в
сперму (B.G. Brackett et al.,1971) лишь некоторые исследователи об¬
ратили внимание на этот эксперимент. Однако М. Lavitrano et al
(1989), сообщившие о получении трансгенных мышей путем пересад¬
ки гена со спермой, снова привлекла внимание исследователей. Пер¬
воначальные попытки повторить работу М. Lavitrano были безуспеш¬
ными (R.L. Brinsteret al., 1989). Несмотря на большое число исследо¬
ваний в отношении фундаментального изучения механизма переноса
гена через спермии продолжали поддерживать возможность переноса
трансгена в ооциты путем использования спермиев. С. Spadafora с
сотр. (1998) разработали основные положения, которые позволяют
объяснить, как может работать пересадка гена через спермии. Пере¬
садка гена с использованием спермиев в настоящее время продемон¬
стрирована на нескольких видах животных: крупный рогатый скот и
куры (М. Shenesh et al., 2000), свиньи (F. Capello et al., 2000; J. Qian et
al., 2002; 1. Sciamanna et al.,2000), лосось (F.Y. Sin et al., 2000).Ученые в Израиле (M. Spemesh et al., 2000) использовали комби¬
нацию интеграции гена, разрезанного при помощи ферментов, с пере¬
садкой гена при помощи спермиев для получения трансгенного круп¬
ного рогатого скота и кур. Эффективность интеграции у крупного ро¬
гатого скота достигала 100 % (у 4 из 4 родившихся телят) и подобная
эффективностьукур(17/19цыплят). Эти предварительные исследова¬
ния очень интригующие. Однако они требуют подтверждения.Другая группа исследований на фирме BioAgri и UCLA сообщила,об	успешном получении трансгенных мышей, свиней и птиц путем
использования моноклональных антител, для соединения трансгена
со спермиями до осеменения (К. Chang etal., 2001; J. Qian etal., 2001).
Уровень интеграции гена был 20 %, и авторы предоставили убеди¬
тельные доказательства интеграции, экспрессии и передачи трансге¬
на следующему поколению. Однако моноклональные антитела пока
не доступны для коммерческого применения.Создание разных типов трансгенных животных. Мечтой многих ис-
следователей-селекционеров мира является разработка возможности268
не просто отбора животных с измененной хозяйственно-полезной
изменчивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направлен¬
ное создание желаемого типа животных. Это оставалось мечтой до тех
пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия — выявление
ДНК как носителя генетической информации, пока не были заложе¬
ны основы рекомбинантной техники (открытие рестракционных
энзим, клонирования ДНК и т. д.), или генной инженерии. В отно¬
сительно короткие сроки были разработаны методы выделения из ге¬
нома отдельных генов, создания эффективно функционируемых ген¬
ных конструкций. В последующие годы были разработаны методы
введения чужеродных генов в геном животных — реципиентов. Се¬
лекционеры получили в распоряжение могучий инструмент для соз¬
дания животных с совершенно новыми свойствами. Что касается
применения переноса генов у сельскохозяйственных животных, то
надежды ученых в настоящее время связаны с улучшением продук¬
тивности и качества животноводческой продукции, резистентности к
болезням и создания так называемых «генных форм» или трансген¬
ных животных-биореакторов ценных биологически активных ве¬
ществ.Трансгенные животные с новыми хозяйст¬
венно-полезными свойствами. Одним из основных
направлений генной инженерии на первом этапе было изменение на¬
следственности животных в отношении увеличения скорости роста,
повышения надоев и улучшение качества продукции.Рост животного является сложным процессом, который зависит
от действия генов, условий питания и факторов окружающей среды.
С генетической точки зрения особенно интересны гены, кодирую¬
щие протеины каскада гормона роста, а именно, непосредственно
гормон роста (ГР), рилизинг фактора гормона роста (РФ — ГР) и ин-
сулинподобный фактор гормона роста (ИФ ГР).Еще в 40-е годы XX в. было установлено стимулирующее действие
гипофизарного ГР на молочную продуктивность коров. Однако ввиду
высокой стоимости препаратов гипофизарного ГР и невозможности
его получения из гипофизов животных в больших количествах они не
нашли практического применения.К концу 70-х годов, с началом эры генной инженерии и появлени¬
ем дешевых гормональных препаратов, полученных путем микроби¬
ального синтеза на основе технологии рекомбинантной ДНК, был
синтезирован ГР. Было показано, что ГР микробного происхождения
оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост жи¬
вотного, как и гипофизарный ГР.269
При крупномасштабном применении рекомбинантного ГР (13 мг
в день ) увеличение удоев составляет 23—31 %. Разработаны формы
препарата пролонгированного действия, позволяющие проводить
обработку один раз в две недели и даже в месяц.Ежедневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота,
свиней и овец вызывают увеличение суточных привесов на 20—30 % и
сопровождаются сокращением расхода кормов на единицу прироста.
У молодняка свиней ускорение роста сопровождается увеличением
содержания белка и уменьшением содержания жира в тканях, что по¬
вышает ценность мясопродукции.Первые надежды по применению транспорта генов у сельскохо¬
зяйственных животных были связаны с положительным влиянием на
продуктивность. Были получены трансгенные мыши по гормону рос¬
та с четырехкратным увеличением скорости роста и удвоением ко¬
нечной живой массы (R.D. Palmifier et al, 1982). Однако у трансген¬
ных свиней (V.G. Pursel et al., 1988) и овец (С.Е. Rexroodetal., 1990) не
наблюдалось соответствующего ускорения роста.Различия между трансгенными мышами, с одной стороны, и
свиньями и овцами, с другой стороны, по гормону роста обусловлены
тем, что в используемых для транспорта генов линиях мышей не ве¬
лась предварительная селекция по их скорости роста, в то время как
большинство использованных овец и особенно свиней происходили
из популяций, в которых уже в течение десятилетий велась селекция
по оптимизации параметров роста. По-видимому, в имеющихся по¬
пуляциях сельскохозяйственных животных генетический потенциал
роста находится недалеко от потенциального плато. Поэтому путем
введения гена гормона роста в организм сельскохозяйственных жи¬
вотных нельзя добиться сколько-нибудь значительного эффекта.Известно, что для ускорения роста свиней при инъекции ГР необ¬
ходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием
протеина (18 % сырого протеина) и с дополнительным количеством
лизина. У потомства трансгенных свиней, получавших соответствую¬
щий модифицированный кормовой рацион, наблюдались на 16,5 %
более высокие среднесуточные привесы (Г. Брем и др., 1991).Трансгенные овцы с геном ГР и РФ ГР имели повышенный уро¬
вень ГР, но не обладали повышенной скоростью роста.Вместе с тем, все авторы единодушно отмечают, что трансгенные
свиньи имеют более чем двукратное уменьшение толщины шпика
(18—20 мм у контрольных свиней против 7—8 мм у трансгенных).
Аналогичным образом трансгенные овцы имели 5—7 % жира по срав¬
нению с 25—30 % у контрольных животных.270
Все исследователи отмечают увеличение содержания белка и
уменьшение содержания жира в тканях трансгенных животных с ге¬
нами гормона роста, что заметно повышает качество и товарную цен¬
ность получаемых мясопродуктов. По сообщению В.Г. Пурселя и др.
(1989), толщина шпика у трансгенных линий свиней на спине в об¬
ласти 10-го ребра составила (7,4 ± 2,3) мм по сравнению с толщиной
шпика у контрольных животных (сибсов) (21 ± 1,7) мм.Эти исследования дают основание предполагать, что молекуляр¬
ные методы повышения продуктивности и особенно улучшения ка¬
чества продукции будут играть важную роль в зоотехнической науке и
в развитии животноводства в целом.Трансгенные животные с устойчивостью к
заболеваниям. Потери, вызванные заболеваемостью у сель¬
скохозяйственных животных, составляют более 10 % стоимости про¬
дукции. Поэтому все более важное значение приобретает селекция
животных по резистентности к заболеваниям. Резистентность — это
наследственная генетически обусловленная восприимчивость жи¬
вотных к определенным микроорганизмам, вирусам, паразитам или
токсинам.К сожалению, попытки вести селекцию на устойчивость к разным
заболеваниям не дали радикальных результатов, хотя известны от¬
дельные положительные примеры. Созданы, в частности, популяции
крупного рогатого скота с примесью крови зебу, которые устойчивы к
ряду кровепаразиторных заболеваний. Резистентность к ряду заболе¬
ваний является полигенным признаком, как, например, трипанотоле-
рантность определенных африканских пород крупного рогатого скота,
которые, кроме резистентности к заболеваниям, отличаются хорошей
жаровыносливостью и нетребовательностью к условиям содержания и
кормления. Вместе с тем, имеются механизмы резистентности, кото¬
рые основываются на единичных генах, как, например, резистент¬
ность к диарее у новорожденных поросят, обусловленная Е. coli К88,
или резистентность к гриппу у мышей.Это послужило основанием для получения трансгенных живот¬
ных с чужеродными генами, которые, возможно, обеспечат невос¬
приимчивость таких животных к отдельным заболеваниям.Защитные механизмы от инфекционных заболеваний функцио¬
нируют путем препятствия вторжению возбудителя или путем изме¬
нения рецепторов. Вторжению или размножению возбудителей пре¬
пятствуют, главным образом, иммунные механизмы и экспрессия ге¬
нов главного комплекса гистосовместимости, а также иммунологиче¬
ские способности различных молекул, таких, как интерферон,
нейропептиды, гормоны и интерлейкины.271
Одним из примеров гена резистентности является ген Мх мыши.
Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов мле¬
копитающих, вырабатывает у Мх+-мышей иммунитет к вирусу грип¬
па А. Этот ген был выделен, клонирован и использован, в частности,
для получения трансгенных свиней, которые экспрессировали ген
Мх на уровне РНК (Г. Брем и др., 1991). Однако пока не получено
данных об экспрессии у трансгенных свиней Мх-протеина и доказа¬
тельства резистентности трансгенных свиней к вирусу гриппа.В Голландии исследуется возможность получения трансгенных
животных, способных повысить содержание лактоферина в тканях
молочной железы с целью повышения резистентности к маститу.Большой интерес представляют исследования по получению
трансгенных животных с генами антисмысловой (ас) РНК. Экспрес¬
сия антисмысловой РНК в клетках приводит к последующей гибри¬
дизации со смысловой РНК и, следовательно, к ингибированию реп¬
ликации вирусального генома.Т.И. Тихоненко была создана конструкция гена антисмысловой
РНК против аденовируса и в Биотехцентре (М.И. Прокофьев) полу¬
чены трансгенные кролики. На культуре клеток из почек этих живот¬
ных было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную
антисмысловую РНК, имели на 90—98 % более высокую резистент¬
ность против Ads по сравнению с контрольными линиями клеток.В других экспериментах этой же группы ученых продемонстриро¬
вана устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой
РНК против лейкоза крупного рогатого скота к заражению вирусом
лейкоза. У трансгенных кроликов с геном антисмысловой РНК про¬
тив лейкоза крупного рогатого скота, зараженных антигеном р24,
уровень антител был значительно ниже и не превышал титр 1 : 500 по
сравнению с контрольными, у которых он изменялся в пределах
1 : 6000 - 1 :8000.Показана возможность создания внутриклеточной иммуниза¬
ции против инфекционных вирусов. Эндогенные вирусные белки, в
особенности их мутационные формы, могут служить защитой от со¬
ответствующих вирусов. В частности, получены трансгенные куры,
устойчивые к вирусу лейкоза, у которых в клетках экспрессировался
белок вирусной оболочки.Приведенные выше данные открывают реальные перспективы
повышения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.Применение техники трансгеноза для
улучшения состава молока. Одним из наиболее эф¬
фективных путей расширения рынка и кардинального снижения
стоимости производства молочных продуктов может быть улучшение272
состава молока путем получения трансгенных животных. В резуль¬
тате генетической селекции в последние десятилетия молочная про¬
мышленность достигла значительного улучшения качества молочной
продукции. Однако новые генетические успехи, основанные на тра¬
диционных методах селекции, слишком медленны вследствие дли¬
тельного интервала между поколениями. Это ограничивается также
низкой наследуемостью этих качеств, взаимоотношениями между
ними и потому, что различные молочные продукты могут быть полу¬
чены от селекции в различных направлениях.Более реальные перспективы улучшения качества или состава
продуктов животноводства достигают введением соответствующих
генных конструкций в организм животного. Рассматривается, напри¬
мер, возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания
трансгенных овец или крупного рогатого скота, которые несут специ¬
фический для молочной железы промотор, сцепленный с геном лак¬
тозы. При этом становится возможным расщепление лактозы (мо¬
лочного сахара) на глюкозу и галактозу уже в молоке коров. Молоко
таких животных может использоваться теми людьми, у которых от¬
сутствует фермент лактозы.Традиционно стоимость молока оценивалась по содержанию
жира, но эта концепция меняется и отдается предпочтение таким
компонентам молока, как протеин.Ценные изменения в составе молока могут быть достигнуты коли¬
чественно, путем изменения соотношения компонентов молока или
качественно, т. е. добавлением других компонентов, не присутствую¬
щих в составе натурального молока, которые усилят его питательную
ценность.Изменения в составе белка молока. С экономической точки зрения
представляет интерес увеличение содержания казеина в молоке в свя¬
зи с его влиянием на производство сыра. Казеиновые мицеллы вовле¬
кают жир и воду во время формирования сыра, играя, таким образом,
важную роль в уменьшении к-казеина в молоке трансгенных мышей
(Gutierrez — A. Adan et al., 1996), сопровождаясь значительным увели¬
чением силы створаживания молока и уменьшением диаметра ми¬
целл. Уменьшение диаметра мицелл должно привести к увеличению
их поверхности, что в свою очередь способствует образованию более
плотного творожного сгустка, скорости его формирования и увеличе¬
нию выхода сыра. Эти измененные свойства молока представляют
большую пользу и интерес для молочной промышленности.Считается, что молочная железа имеет ограничения в способно¬
сти синтеза белка. Любое дополнительное производство белка ком¬
пенсируется уменьшением количества эндогенных белков молока.273
Основываясь на этом, имеется другой возможный путь увеличения
уровня казеинов, а именно, торможение производства других белков,
представляющих меньший интерес. Для этой роли подходит р-лак-
тоглобулин. Этот белок присутствует только в молоке жвачных и яв¬
ляется основным аллергеном молока коров, поэтому уменьшение
его количества могло бы улучшить состав молока. В целях уменьше¬
ния или торможения активности определенного гена были исполь¬
зованы антисенсы к РНК или рибосомы (D.L. Sokol et al., 1996).Уменьшение уровня лактозы в молоке. Лактоза является основным
сахаром в молоке и ответственна за нарушения пищеварения у боль¬
шого процента популяции взрослых, когда уменьшаются уровни фер¬
мента лактозы во время отъема. Этот фермент гидролизует лактозу на
моносахариды. Несколько промышленных приемов были направле¬
ны на получение молока с уменьшенным содержанием лактозы в мо¬
локе после доения. Это было бы полезно не только для человека, но и
в молочной промышленности. Оно способствовало бы увеличению
эффективности производства сыра (D.H. Hettinga, 1989).Трансгенная технология пытается решить эту задачу несколькими
путями. Во-первых, некоторые эксперименты основывались на про¬
изводстве молока с низким содержанием лактозы. С этой целью
а-лактальбумин-дефицитные мыши были получены через гомоло-
генную рекомбинацию (M.G. Stinnakre et al., 1994), так как этот белок
является одним из компонентов комплекса синтеза лактозы. Вслед¬
ствие этой генетической манипуляции мыши производили молоко с
низким содержанием или с отсутствием лактозы. Однако этот сахар
играет роль в регуляции осмотического давления молочной железы и
поэтому проявлялся отрицательно — мало молока с высокой вязко¬
стью и лактирующие животные были не способны прокормить по¬
томство.Другой подход уменьшения концентрации лактозы в молоке ос¬
нован на вызывании ее гидролиза in vivo подобно тому, как это дости¬
гается в молочной промышленности in vitro, чтобы адаптировать мо¬
локо нетолерантным человеческим потребителям. Лактоза гидроли¬
зуется путем экспрессии в тканях молочной железы. При этом одним
приемом решаются две проблемы, а именно, не нарушается продук¬
ция молока, так как осмотическая активность лактозы сохраняется, а
концентрация этого сахара значительно уменьшается в молоке, не
оказывая побочного влияния на молочные соски (В. Jost et al., 1999).Качественные изменения в составе молока. Молоко наряду с прису¬
щей ему ценностью может быть использовано в качестве транспорт¬
ного средства для других веществ, которые усиливают не только его
питательные, но также и функциональные свойства. Например, про¬274
дуцируется лактоферрин, кислый белок человеческого молока с бак-
териостатическими свойствами, который усиливает адсорбцию же¬
леза. Этот белок присутствует на очень низком уровне в молоке коров
и увеличением его концентрации могут быть достигнуты несколько
целей. Например, получены трансгенные мыши, экспрессирующие
человеческий лактоферрин (G.J. Platenburgetal., 1994). В этих опытах
показано, что лактоферрин увеличивает адсорбцию железа и защи¬
щает сохранность потомства, так как ограничивает наличие свобод¬
ного железа в межклеточном пространстве тракта, контролируя тем
самым размножение бактерий.Этот подход позволяет получать гуманизированное молоко, легче
переводить его в молоко для новорожденных. С учетом этого получен
трансгенный бык, несущий человеческий ген лактоферрина
(P. Krimpenfort et al., 1991).Бактериостатическое влияние может быть также достигнуто дру¬
гими белками, направленными непосредственно в молочную железу
и вызывающими уменьшение заболевания маститами. Например,
лизоцим (Е.А. Maga et al., 1995) оказывает не только антибактериаль¬
ное влияние, но также способствует увеличению выхода сыра вслед¬
ствие его связи с казеинами. Возможно, он также вызывает специфи¬
ческий пассивный иммунитет у новорожденных с секрецией специ¬
фических антител. Высокие титры нейтрализующих антител были
получены в молоке трансгенных мышей против специфических ви¬
русных агентов, вызывая экспрессию специфических иммуноглобу¬
линов в молочную железу (J. Castilla et al., 1998).Таким образом, в результате секреции человеческих белков в мо¬
локо коров возможно его гуманизировать и сделать более адекватным
для потребления человеком. Включения человеческого лактоферри¬
на, человеческого лизоцима или человеческих иммуноглобулинов
являются примером такой гуманизации молока коров. Но эти вклю¬
чения имеют дополнительную терапевтическую пользу. Можно так¬
же заменить животный белок его человеческим аналогом, не оказы¬
вая влияния на физиологическую активность животного.Трансгенные животные, продуцирующие
биологически активные вещества медицин¬
ского и технологического назначения. Боль¬
шинство наиболее важных изменений в составе молока были ини¬
циированы фармацевтической промышленностью. Коммерческий
рынок для биореакторов, оцененный в размере 3 млрд долларов в год,
в США привлек интерес фармацевтической промышленности. Они
вскоре реализовали потенциальную возможность синтеза и секреции
молочной железы, и несколько фармацевтических продуктов были275
синтезированы в молоке. Эффективность молочной железы в качест¬
ве биореактора настолько высока, что стоимость продукции может
быть многократно снижена даже если процесс очистки еще не доста¬
точно эффективный.Однако не только фармацевтические белки могут быть эффектив¬
но произведены в молочной железе. Биологически активные пепти¬
ды могут быть также получены с достаточно высокой эффективно¬
стью. Недавно у трансгенных кроликов был получен с молоком каль-
цитонин-пептид, ответственный за регуляцию обмена кальция и ис¬
пользуемый при oesteoporosis (Мс Кее С. et al., 1998). Важным
непрямым эффектом биофарминга, который ожидается в ближай¬
шем будущем, могут быть изменения в области получения трансген¬
ных продуктов с молоком, которые бы могли стать источником забо¬
ты о человеческом здоровье.Основа стратегии использования трансгенных животных как био¬
реакторов состоит во включении в клетки организма генов, которые
вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского и
технологического назначения.Раньше такие белки были выделены из тканей и биологической
жидкости тканей человека, таких как кровь (фактор свертываемости
крови и другие белки крови) и гипофиз (гормон роста). Вследствие
дороговизны и трудности получения человеческих тканей эти белки
могут производиться в малых количествах и к тому же являются объ¬
ектом контаминации патогенных организмов, таких как вирус гепа¬
тита и др.На первом этапе практического применения молекулярной гене¬
тики были созданы рекомбинантные микроорганизмы, а позднее
трансгенные клеточные линии млекопитающих, которые выращива¬
ются в системах биореакторов и способны производить белки, зако¬
дированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были
успешно использованы в получении ценных продуктов фармаколо¬
гического и медицинского назначения, таких как инсулин, некото¬
рые кровесвертывающие факторы, человеческий гормон роста и др.Трансгенные животные как продуценты ценных биологических
активных белков имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и
клеточными системами.Белки млекопитающих, продуцируемые микроорганизмами, не
могут быть нормально гликолизированы, гидроксилированы или кар-
боксилированы. В простых рекомбинантных системах микроорганиз¬
мов это в большинстве случаев или невозможно, или возможно, но с
недостаточной точностью, что приводит к изменению структуры про¬
теинов и, как следствие, к снижению их биологической активности.276
Получаемые новые белки в линиях генно-инженерных клеток мле¬
копитающих могут быть в некоторых случаях правильно модифициро¬
ваны с активностью, сравнимой с нативными протеинами, но выход
белка из культуральных клеток в основном низкий. Ктомуже создание
клеточных культур является сложной и дорогой процедурой.Промышленные реакторы, в которых выращиваются клетки, так¬
же являются дорогими. Трансгенные животные могут быть трудно соз¬
даваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких животных
воспроизводит себе подобных, они легко размножаются и их содержа¬
ние сравнительно дешево и, в принципе, они могут продуцировать
чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью.Гетерогенные белки могут быть получены большинством тканей
тела животного. Путем сочетания структурных генов со специфиче¬
скими регуляторными элементами можно добиться экспрессии
трансгена в определенных органах.Наибольший прогресс в производстве трансгенных биоректоров
был достигнут в целенаправленной трансгенной экспрессии в эпите¬
лиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком.
Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеи¬
на, в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной
железы.Выделение рекомбинантного белка с молоком, с одной стороны,
удобный прием его получения от животного с применением естествен¬
ного приема, обычного доения, а с другой стороны, безопасен для жи¬
вотного, так как удаление из организма чужеродных белков, как прави¬
ло биологически активных, не позволяет им оказывать какое-либо
вредное влияние на физиологическое состояние животного.Одним из основных этапов в получении трансгенных животных,
продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентифи¬
кация промотора, который будет направлять экспрессию в секретор¬
ный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены про¬
моторы aSl-казеина, р-казеина, а-лактоальбумина, Р-лактоглобули-
на и сывороточного кислого протеина (WAP).Использование молочной железы для производства чужеродных
протеинов обосновывается ее огромной синтетической белковой
продуктивностью. Общая концентрация эндогенных молочных бел¬
ков в зависимости от вида составляет 2—10 % (табл. 4.6), т. е. на уров¬
не 20—100 г на 1л. Если еще нет возможности получать такое же коли¬
чество рекомбинантного белка из 1 л молока, то выделение одного и
более граммов такого белка уже достаточно для коммерческого про¬
изводства фармацевтически важных белков.277
Таблица 4.6. Содержание белка в молоке разных видов животных
(по В.И. Георгиевскому)Вид животногоСреднее содержание
белка в молоке, %Вид животногоСреднее содержание
белка в молоке, %Кобыла2,2Овца5,8Корова3,3Собака7,1Коза3,7Крольчиха10,4Свинья4,9Среди рекомбинантных белков, полученных из молока трансген¬
ных животных, известны следующие: человеческий белок С, антиге-
мофильный фактор IX, альфа-1-антитрипсин, тканевый плазмино-
генный активатор, лактоферин, человеческий сывороточный альбу¬
мин, интерлейкин-2, урокиназа и химозин. За исключением аль¬
фа-1-антитрипсина и химозина работы по получению большинства
других белков не достигли стадии, которая бы представляла коммер¬
ческий интерес. В большинстве проектов эта работа на стадии экспе¬
риментов, когда генная конструкция оценивается лишь на трансген¬
ных мышах.Что же касается человеческого альфа-1-антитрипсина и химози¬
на, то получение этих рекомбинантных протеинов уже находится на
стадии, близкой к коммерческой. В 2006 г. разрешено производство и
реализация на фармацевтическом рынке сентритромбина, получен¬
ного из молока трансгенных коз (фирма «GTC Терапевтик»).Одним из основных преимуществ трансгенной технологии явля¬
ется ее высокая экономическая эффективность.Потребность мирового рынка в рекомбинантных белках в 1999 г.
оценивалась в 13 млрд долларов, а рынок антител в настоящее время
составляет более 1 млрд долларов. Производством белков фармако¬
логического назначения с помощью трансгенных животных занима¬
ются более 20 фирм во всем мире (Das, 2001). Если стоимость произ¬
водства одного грамма рекомбинантного белка в культуре клеток
биореактора колеблется в пределах 100— 1000 долларов в зависимости
от выхода белка и мощности биореактора, то затраты на его производ¬
ство с молоком сельскохозяйственных животных могут быть 40—50
долларов.Другим преимуществом этой технологии является высокая про¬
изводственная емкость молочной железы трансгенных животных.Если принять во внимание, что концентрация рекомбинантного
белка в молоке буде1 по меньшей мере 1 мг/мл, то можно подсчитать
число животных, необходимых для обеспечения количества того или
иного фармацевтического белка (табл. 4.7).278
Таблица 4.7. Расчетное число трансгенных животных, необходимых
лля обеспечения мировой потребности рынка отдельными фармацевтическими
белками (по Wall, 1999)ВидыФармацевтические белки (потребность рынка)F-VIII
(304 г)Белок С
(10 кг)Антитромбин III
(21 кг)Фибриноген
(150 кг)Альбумин
(315- I03 кг)Крыса34511 10324- 103171 • 103356 • 106Кролик217714315 000ОО225 • 106Свинья238815771212- 103Коза161283175 000Овца1364593 000Крупный рога¬
тый скот1231735 000Изтабл. 4.7 видно, что шести коз или пары коров достаточно, что¬
бы обеспечить годовую потребность мирового рынка в белке С, тогда
как для такого же его производства потребуется 5 млн л донорской
крови. Или возьмем другой белок — альбумин. Для обеспечения в
нем мирового рынка потребуется большое стадо коров, 35 ООО голов,
чтобы получить 400 т человеческого сывороточного альбумина. Одна¬
ко это позволит избежать сбора 16 млн л донорской крови. При этом
надо учесть, что использование трансгенных животных позволяет из¬
бежать переноса вирусной инфекции.Группа ученых в Эдинбурге (Великобритания) в 1992 г. получила
трансгенных овец с человеческим геном альфа-1-антитрипсина и бе-
та-глобулиновым промотором. У четырех овец содержание этого бел¬
ка составляет более 1 г/л, а одна овца сначала продуцировала 60 г/л, а
затем стабилизировалась на 35 г/л, что соответствует половине всех
белков в молоке. Все овцы здоровы и не имеют каких-либо наруше¬
ний лактации. При таком уровне может быть получено более 10 кг
белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при
лечении эмфиземы легких.Группа ученых в Москве (J1.K. Эрнст, Г. Брем, М.И. Прокофь¬
ев, И.Л. Гольдман и др.) получила трансгенных овец с геном химози¬
на, которые продуцируют с молоком в среднем 200—300 мг фермента
химозина в 1 л молока. Этот источник получения химозина — основ¬
ного компонента для производства сыра — может заменить традици¬
онный способ его получения из сычугов молочных телят и ягнят, но
его стоимость будет в 5—10 раз ниже.Однако у трансгенных овец наблюдалась закупорка молочных
протоков вследствие створаживания молока внутри вымени, что со¬279
провождалось выдаиванием лишь ничтожно малого количества мо¬
лока. Это обстоятельство исключило коммерческое использование
этих животных.Огромный интерес к новой технологии производства фармаколо¬
гических белков обусловлен, прежде всего, экономическими выгода¬
ми. Себестоимость производства фармакологических белков с ис¬
пользованием трансгенных животных в 100—1000 раз ниже по срав¬
нению с использованием существующих генно-инженерных микро¬
организмов и рекомбинантных линий клеток млекопитающих.Трансгенные животные как продуценты ценных лекарственных
белков имеют целый ряд преимуществ по сравнению с микроорга¬
низмами и клеточными системами. Белки млекопитающих, продуци¬
руемые рекомбинантными микроорганизмами, не могут быть
нормально синтезированы, т. е. гликозилированы или карбоксили-
рованы. В простых системах микроорганизмов это в большинстве
случаев или невозможно, или возможно с недостаточной точностью,
что приводит к изменению структуры белков и, как следствие, к сни¬
жению их биологической активности, стабильности и т. д.Лекарственные белки, получаемые в генно-инженерных клетках
млекопитающих, могут быть правильно синтезированы, с активно¬
стью, сравнимой с природными белками, но выход белка из культу¬
ральных клеток очень низкий. К тому же создание клеточных линий
является сложной и дорогой процедурой. Поэтому стоимость полу¬
ченных рекомбинантных белков, продуцируемых с помощью клеточ¬
ных систем, в 1000 раз превышает стоимость при их производстве с
использованием трансгенных животных.Огромный интерес к получению лекарственных белков с исполь¬
зованием трансгенных животных вызван также тем, что традицион¬
ная технология их получения из крови доноров сопровождается пере¬
носом человеческих инфекций (гепатит, СПИД и др.). Это исключа¬
ется при получении рекомбинантных белков при помощи трансген¬
ных животных.В мире получены трансгенные животные, продуцирующие с мо¬
локом целый ряд лекарственных веществ: VIII и IX факторы сверты¬
ваемости крови против гемофилии; тканевый плазменно-генный ак¬
тиватор, применяемый при лечении венозных тромбов и эмболии ле¬
гочной артерии; человеческий белок С для предотвращения образо¬
вания тромбов; моноклональные антитела для лечения различных
форм рака и др.И недалек тот день, когда привычные технологии получения ле¬
карственных препаратов из донорской крови человека или при помо¬
щи биореакторов с использованием генно-инженерных микроорга¬
низмов и клеточных линий будут в основном заменены трансгенны¬280
ми животными. В этом можно убедиться при посещении крупнейших
. м занимающихся этой проблемой: «Джинзайм» (США), «ППЛ
Терапевтике» (Англия — США), «Ред. Кросс» (США), «Фарминг»
г Голландия). По заказу фармацевтических фирм работает фирма
' Инфиген» (США) по получению трансгенных животных, продуци¬
рующих с молоком ценные лекарственные вещества.По данным Гематологического научного центра (г. Москва), об¬
щий объем закупок лекарственных препаратов из крови человека на
мировом рынке составляет 60 млрд долларов.Биотехцентр занимается получением трансгенных животных вте-
чение последних 7 лет. Получены трансгенные кролики, овцы, козы.В последнее время Биотехцентр направляет основные усилия на
получение трансгенных животных, продуцирующих с молоком цен¬
ные лекарственные вещества, используемые, главным образом, в он¬
кологии и кардиологии. При использовании трансгенных кроликов
препарат можетбыть получен в достаточном количестве для клиниче¬
ских испытаний через 10—12 мес после начала работы.Получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком гра-
нулоцитарный колониестимулирующий фактор, который использу¬
ется для лечения рака после применения химиотерапии и радиоте¬
рапии, при пересадке костного мозга, а также при острой лейкемии у
больных СПИДом (рис. 4.7).Начата работа по получению крупных трансгенных животных, в
частности коров, продуцирующих с молоком человеческий альбу¬
мин, так как потребность в мире в этом препарате огромная, около
100 ООО кг. Поэтому такое количество человеческого альбумина могут
обеспечить только коровы. Для обеспечения этого количества требу¬
ется 5400 трансгенных коров. На российском рынке потребность в
этом препарате занимает первое место и оценивается в 1 млрд долла¬
ров в год.Разрабатывается программа получения трансгенных животных,
продуцирующих с молоком моноклональные антитела. С использо¬
ванием технологии получения моноклональных антител можно тон¬
ко регулировать множество важных биологических процессов орга¬
низма, определять присутствие широкого спектра возбудителей с вы¬
сокой точностью, избирательно воздействовать на определенные
группы клеток организма, в частности раковые. Такие системы по¬
зволяют революционизировать клиническое лечение раковых забо¬
леваний.Начаты работы по получению трансгенных животных—доноров
органов и тканей по пересадке человеку. Путем пересадки соответст¬
вующих генных конструкций в зародыши животного могут быть по¬
лучены трансгенные животные, у которых могут быть подавлены ре-281
Рис. 4.7. Трансгенный кролик, продуци¬
рующий с молоком гранулоцитарный ко¬
лониестимулирующий фактор (ГКСФ), по¬
лученный в Биотехцентре РАСХНакции отторжения органов и тканей при трансплантации их человеку.
Ученые считают, что на первом этапе эта технология будет приме¬
няться для замены инсулинотерапии у больных диабетом пересадкой
человеку тканей островков Лангенгарса (бета-клеток).С учетом низкой себестоимости препаратов, полученных с ис¬
пользованием новой технологии, эти разработки будут иметь не толь¬
ко огромный экономический эффект, но и большое социальное зна¬
чение, так как открывают доступность ценных лекарственных
средств для широких слоев населения. Поэтому целесообразна под¬
держка этих разработок как частными фирмами, так и государством.Большинство исследователей, получавших трансгенных живот¬
ных с другими генами, как правило, не наблюдали каких-либо откло¬
нений в здоровье животных. Необходимо отметить, что за трансген¬
ными животными ведется индивидуальный контроль и те из них, у
которых отмечены какие-либо отклонения, не используются в даль¬
нейшем размножении (сразу же уничтожают). Поэтому появление та¬
ких отклонений у трансгенных животных не опасно для передачи их
потомству.Поданным американских исследователей (Pursel и др., 1990), по¬
ложительное влияние гена гормона роста на трансгенных свиней,
включая ускорение роста, повышение эффективности использова¬
ния корма и снижение содержания жира в туше, у некоторых живот¬
ных сопровождается хромотой и язвой желудка; метаболизм глюкозы
у них был несколько нарушен, воспроизводительная способность
трансгенных свиней, секретирующих рекомбинантный гормон рос¬
та, имела также некоторые отклонения от нормы. Авторы связывают
эти изменения в состоянии здоровья трансгенных свиней с длитель¬
ным воздействием повышенного содержания гормона роста в крови.В наших исследованиях на трансгенных овцах введение гена про¬
химозина не сопровождалось отклонениями в проявлении воспроиз¬282
водительной функции и в состоянии здоровья, но наблюдалось рез-
ое снижение удоя вследствие закупорки молочных протоков. В дру-
к наших исследованиях на трансгенных кроликах с геном грануло-
цитарного колониестимулирующего фактора у некоторых линий
животных наблюдалось нарушение воспроизводительной функции у
самок, но у других линий такие отклонения отсутствовали.В настоящее время идет дискуссия по поводу безопасности при¬
менения в пищу генномодифицированных продуктов. Однако доста¬
точной научно обоснованной методической достоверности этих ра¬
бот нет.Что же касается получения лекарств с использованием трансген¬
ных организмов, то эта технология уже многие годы широко исполь¬
зуется. Многие лекарственные белки, такие как инсулин, интерферо-
ны, интерликины и др., получают только с использованием трансген¬
ных микроорганизмов или клеток млекопитающих и их широко ис¬
пользуют в медицине во всем мире.В 2006 г. Европейский комитет по лекарственным препаратам дал
разрешение на производство и использование в медицине лекарст¬
венных белков, полученных с молоком трансгенных животных. Фир¬
ма GTC «Биотерапевтик» получила лицензию на производство и ис¬
пользование антитробина из молока трансгенных коз.Контрольные вопросы к главе 41.	Гормоны и их роль в репродуктивной функции животных.2.	Какие функции выполняют фолликулы и желтое тело в яичнике самок?3.	Какой механизм нейроэндокринного контроля полового цикла и овуля¬
ции у животных?4.	Дайте характеристику простагландина Ф2п и схемы его применения для ре¬
гуляции половой функции у самок.5.	Назовите методы синхронизации охоты у различных сельскохозяйствен¬
ных животных.6.	Перечислите наиболее распространенные нарушения функции яичников
у коров и телок, схемы гормональной обработки для нормализации этих функ¬
ций.7.	Опишите методы созревания ооцитов вне организма, оплодотворения и
культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота.8.	Что такое «капацитация сперматозоидов»?9.	Назовите методы клонирования эмбрионов у крупного рогатого скота и
других видов животных.10.	Трансгеноз, его основные этапы и особенности при получении различ¬
ных видов трансгенных животных.11.	Каковы методы выявления интеграции чужеродного гена в молекулу
ДНК? Особенности его наследования у трансгенных животных.12.	Какие ограничения существуют в использовании рекомбинантных мик¬
роорганизмов и линий генно-инженерных клеток животных при получении цен¬283
ных биологически активных веществ медицинского и технологического назна¬
чения?13.	Какие преимущества имеют трансгенные животные по сравнению с ре¬
комбинантными микроорганизмами и клеточными линиями млекопитающих в
получении ценных фармакологических веществ?14.	Чем обоснована возможность использования молочной железы у транс¬
генных животных для производства чужеродных протеинов?ЛИТЕРАТУРАГордон А. Контроль воспроизводства сельскохозяйственных живот¬
ных.— М.: ВО «Агропромиздат», 1988.Ernst L.K. et al. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targeted a
adenovirus AS., Theriogenology, 1991. C. 35, 6, 1267—1271.Лагутина И.С. и др. Влияние возраста клеток-доноров ядер на эффектив¬
ность развития клонированных эмбрионов кроликов. Онтогенез, 2001. Т. 32,
№ 2. С. 130-139.Лагутина И.С. и др. Исследование влияния факторов, влияющих на эф¬
фективность электрослияния энуклеированных яйцеклеток с клетками-до-
норами. Онтогенез. 2002. Т. 33. № 2. С. 100—106.Мирошниченко О.И. и др. Получение трансгенных кроликов геном
ас-РНК против EIA области аденовируса AS/УДоклады ВАСХНИЛ, 1988,
№5. С. 31-37.Моленко Г.П., Прокофьев М.И., Пилюгина М.В. и др. Получение клони¬
рованных эмбрионов крупного рогатого скота путем пересадки соматических
клеток в энуклированные ооциты без дозы пелегоциды. Известия РАН. Сер.
биологич. 2006. № 3. С. 284—291.Прокофьев М.И. Достижения и использование эмбриологии в животно-
водстве//Международный сельскохозяйственный журнал. 1987, № 3.
С. 43-50.Прокофьев М.И. Регуляция размножения сельскохозяйственных живот¬
ных. — Л.: Наука, 1983.Прокофьев М.И., Букреев Ю.М., Долгов В.В. Регуляция половой функ¬
ции у коров в послеотельный период//Зоотехния. 2002. № 9. С. 22—25.Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина М.Н. и др. Создание транс¬
генных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитар-
ный колониестимулирующий фактор//Сельскохозяйственная биотехноло¬
гия. 2003. N9 6. С. 49-54.Прокофьев М.И. Регуляция воспроизводства крупного рогатого скота. —
М.: Московский рабочий, 1989.Suraeva N.M. et al. Maturation of oocytes fertilization and development of
embryos of cattle in vitro, Theriogenology, 1992. C. 37, 8, 1311—1316.Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных жи¬
вотных. — М.: Колос, 1995.
Глава 5БИОТЕХНОЛОГИЯ В ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЕПеред ветеринарной медициной стоят важные задачи по разра¬
ботке и внедрению в производство эффективных методов борьбы с
наиболее распространенными и опасными заболеваниями сельско¬
хозяйственных животных на промышленных комплексах и в живот¬
новодческих хозяйствах и обеспечению производства безопасной для
человека животноводческой продукции.Решение этих задач осуществляется как традиционными ветери¬
нарными методами, так и с помощью новейших методов, применяе¬
мых в биотехнологии.Ее название происходит от греч. bios — жизнь, teken — искусство,
logos — слово, учение, наука. При помощи биотехнологии возможно
получение из сравнительно дешевых, доступных и возобновляемых
материалов разнообразных веществ и соединений.Искусственно синтезируемые вещества требуют больших капита¬
ловложений, плохо усваиваются организмом как животных, так и че¬
ловека, очень дороги. В биотехнологии используют микроорганиз¬
мы, которые в процессе своей жизнедеятельности вырабатывают ес¬
тественным путем необходимые нам вещества — витамины, фермен¬
ты, аминокислоты, органические кислоты, спирты, антибиотики,
биологически активные вещества и др. Биомасса некоторых бактерий
представляет большую ценность, поскольку содержит белки, углево¬
ды и компоненты, необходимые для жизнедеятельности организмов.В промышленном масштабе биотехнология представляет биоин¬
дустрию, в которой можно выделить такие отрасли, как промышлен¬
ная биотехнология (использование полимеров и сырья для текстиль¬
ной промышленности, получение метанола, этанола, биогаза, водо¬
рода в энергетике и химической промышленности), пищевая биотех¬
нология (производство белка, аминокислот, витаминов, ферментов
основано на широкомасштабном выращивании дрожжей, водорос¬
лей, бактерий), сельскохозяйственная биотехнология (увеличение
продуктивности сельскохозяйственных культур, получение гербици¬
дов, биоинсектицидов невозможно без клонирования и селекции285
различных сортов растений и выращивания растительных тканевых и
клеточных культур), экологическая биотехнология (очистка сточных
вод, переработка производственных и хозяйственных отходов, изго¬
товление компостов с применением микроорганизмов, утилизаций
вредных выбросов нефти, химикатов, загрязняющих почву и водуи
ветеринарная биотехнология, которая тесно связана с медициной
(производство профилактических и терапевтических препаратов:
противобактериальных, противогрибковых, противовирусных вак¬
цин, антигенов, аллергенов, интерферонов, гипериммунных и диаг¬
ностических сывороток, антибиотиков и др.).Объединяет все эти отрасли биотехнологии одно общее свойст¬
во — все упомянутые выше процессы основаны на использовании не
искусственных, а природных систем, а именно различных организ¬
мов — прокариотических, эукариотических, вирусов, грибов, про¬
стейших.Фундаментом современной биотехнологии являются молекуляр¬
ная биология, микробиология, генетика, биохимия, биофизика, при¬
боростроение. За последние 40—50 лет произошло скачкообразное
развитие этих наук, что привело к революции в производстве ветери¬
нарных и медицинских биопрепаратов, созданию трансгенных расте¬
ний и животных с заданными уникальными свойствами. Подобные
исследования являются приоритетными направлениями научно-тех¬
нического прогресса и в XXI в. займут ведущее место.При производстве ветеринарных препаратов в подавляющем
большинстве случаев используются питательные среды, необходи¬
мые для культивирования микроорганизмов и культур клеток.
В 1859 г. Л. Ластер для накопления биомассы микроорганизмов ис¬
пользовал жидкую питательную среду. Р. Коху в 1876 г. удалось вы¬
растить бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извле¬
ченной из глаза погибшей коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох
предложил метод культивирования бактерий на стерильных ломти¬
ках картофеля и затем — на агаризованных питательных средах.В результате этих исследований удалось доказать индивидуаль¬
ность микроорганизмов и получить их в чистых культурах. Более
того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и ис¬
пользован в целях воспроизведения соответствующих процессов
(бродильных, окислительных и др.), например: масляно-кислые бак¬
терии и вызываемое ими масляно-кислое брожение, лактобактерии и
молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и спиртовое
брожение, уксусно-кислые бактерии и окисление этанола до уксус¬
ной кислоты.286
В этот период было начато изготовление пищевых дрожжей, атак-
одуктов обмена бактерий (метаболизма) — ацетона, бутанола,
ЖС онной и молочной кислот. Тем не менее накопление большой
ли , однородных по возрасту клеток оставалось исключительно
трудоемким процессом. Это требовало принципиально иного подхо¬
да для решения многих задач в области биотехнологии.В 1933 году А. КлюйвериА.Х. Перкин опубликовали работу «Ме¬
тоды изучения обмена веществ у плесневых грибов», в которой изло¬
жили основные технические приемы, а также подходы к оценке полу¬
чаемых результатов при поверхностном и глубинном культивировании
грибов. В это время началось внедрение в биотехнологию крупномас¬
штабного герметизированного оборудования, обеспечивающего про¬
ведение процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок
в развитии промышленного биотехнологического оборудования был
отмечен в период становления и развития производства антибиоти¬
ков во время Второй мировой войны 1939—1945 годов в связи с воз¬
никновением острой необходимости в противомикробных препара¬
тах для лечения больных с инфицированными ранами.Все прогрессивное в области биотехнологических и технических
дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в
биотехнологии. Среди этих достижений необходимо отметить сле¬
дующие:1902 г. — Г. Хаберланд показал возможность культивирования
клеток различных растений в простых питательных растворах;1912	г. — Ц. Нейберг раскрыл механизм процессов брожения;1913	г. — J1. Михаэлис и M.J1. Ментен разработали кинетику фер¬
ментативных реакций;1953 г. — Ф. Крик и Дж. Уотсон расшифровали структуру ДНК.Эти факты стали побудительным мотивом для разработки спосо¬
бов крупномасштабного культивирования клеток различного вида
для получения клеточных продуктов и самих клеток для нужд челове¬
ка, животных и, прежде всего, таких препаратов, как пенициллин,
стрептомицин, тетрациклин, декстран, ряда аминокислот и многих
других веществ.К 1950 г. Ж. Моно разработал теоретические основы непрерывно¬
го управляемого культивирования микроорганизмов, которые разви¬
ли в своих исследованиях М. Стефенсон, И. Малек, М.Д. Иерусалим¬
ский и др.В России биотехнология как наука начала развиваться с 1896 г.
Толчком послужила необходимость создания профилактических и
терапевтических средства против таких болезней, как сибирская язва,
чума крупного рогатого скота, бешенство, ящур, трихинеллез. Такие287
выдающиеся отечественные ученые как Л.С. Ценковский, С.Н. Вы-
шелесский, Н.Н. Гинзбург и другие внесли неоценимый вклад в раз¬
витие биотехнологии, разработав основы производства вакцинных*
диагностических, лечебных и многих других препаратов.	IВетеринарная биотехнология тесно связана с жизнедеятельно!
стью различных групп микроорганизмов и, в первуь > очередь, бакте!
рий, вирусов, микроскопических грибов, риккетсий, при этом мик!
робиологические процессы, осуществляемые с их использованием*
имеют ряд особенностей:1)	процесс микробного синтеза, как правило, является частью
многостадийного производства, при это продукт биосинтеза не всег¬
да является конечной формой и в большинстве случаев подлежит
дальнейшей переработке;2)	при культивировании микроорганизмов обычно необходимо
поддерживать асептические условия, что требует стерилизации обо-?
рудования, коммуникаций, сырья и других материалов;	|3)	культивирование микроорганизмов осуществляют в гетероген-{
ных многообразных системах, физико-химические свойства которых
в ходе процесса могут существенно изменяться;4)	технологический процесс воспроизводства и накопления ха¬
рактеризуется высокой вариабельностью из-за наличия в системе
биологического объекта микроорганизмов, находящихся на разных
стадиях развития;5)	сложность биохимических механизмов регуляции роста мик¬
роорганизмов и биосинтеза продуктов метаболизма, ферментатив¬
ный характер регуляции;6)	неопределенность химического состава питательных основ и
сред;7)	автокаталитический характер процесса, т. е. влияние образую¬
щихся продуктов, в том числе, биомассы на скорость протекания
процесса;8)	относительно низкие концентрации субстратов, продуктов и
скорости реакций;9)	способность процесса к саморегулированию;10)	условия, оптимальные для роста микроорганизмов и для био¬
синтеза целевых продуктов, не всегда совпадают.5.1.	СТЕРИЛИЗАЦИЯ ОБОРУДОВАНИЯ И ОЧИСТКА ВОЗДУХАВсе процессы микробиологического синтеза проводят с чистыми
культурами микроорганизмов. Чистота посевных и готовых культур
является основным условием производства биопрепаратов.288
В течение всего микробиологического производства проводятсянообразные мероприятия, обеспечивающие сохранение чистоты
культуры на всех этапах технологического цикла — от хранения эта¬
лонных штаммом в лаборатории и промышленного выращивания
микроорганизмов в аппаратах-культиваторах (АКВ) до момента по¬
лучения готовой лекарственной формы биопрепарата.К первоочередным мероприятиям относятся: стерилизация обо¬
рудования и коммуникаций; обеспечение их герметичности; очистка
и стерилизация воздуха, подаваемого в аппарат; стерилизация пита-
тел ьных сред; специальные методы отбора проб и их анализ; внесение
в АКВ питательных веществ, пеногасителей, посевного материала и
процесс выращивания.Необходимость обеспечения асептических условий в биотехноло¬
гических процессах продиктована целым рядом факторов:во-первых, посторонние микроорганизмы — контаминанты —
потребляют компоненты питательных веществ и при этом выделяют
метаболиты, тормозящие рост основной культуры. Это тем более су¬
щественно, что такие наиболее распространенные контаминанты,
как Вас. subtilis, Вас. megaterium, Вас. stearothermophilis и другие, харак¬
теризуются очень высокими скоростями роста по сравнению с основ¬
ной культурой;во-вторых, развитие контаминантов неконтролируемо влияет на
условия роста и развития основной культуры;в-третьих, наличие в культуральной жидкости посторонней мик¬
рофлоры и продуктов ее жизнедеятельности затрудняет выделение
целевого продукта и снижает его качество.Посторонняя микрофлора может попадать с питательной средой,
водой, добавками, воздухом, подаваемым для барботирования, или
из окружающей среды с любым из видов сырья, а также при взятии
проб на анализ.Загрязненность воды и воздуха микроорганизмами характеризу¬
ется следующими данными:—	содержание микроорганизмов в 1 мл воды из артезианских
скважин до 103, из городского водопровода — 10 —104 из рек или во¬
дохранилищ— 104—106, в сточных водах — 108—10 ;—	содержание взвешенных частиц в воздухе составляет до 109 в1	м , в том числе микроорганизмов — 0,8 • 103 (104) в 1 м3. Среди этих
микроорганизмов обнаружены бактерии и их споровые формы, виру¬
сы, дрожжи, грибы и др.;—	среднее содержание бактерий и их спор достигает 1000—1500
микробных клеток в 1 м3 воздуха.
Методы, применяемые для исключения попадания в культуру по¬
сторонней микрофлоры, основаны на задержке или уничтожении
микроорганизмов. Добиться требуемой чистоты вещества возможно
установкой физической преграды для микроорганизмов или уничто¬
жив их до подачи в стерильный объект.	jК способам, основанным на принципе задержки микроорганиз-1
мов, относят стерилизующую фильтрацию воздуха и жидкостей, гер¬
метизацию технологического оборудования и коммуникаций. Эти
способы по своей сути являются физическими. К способам стерили¬
зации, основанным на уничтожении микроорганизмов, относят тер¬
мическую, химическую и радиационную стерилизацию, которые
применяют для обеззараживания оборудования, коммуникаций, пи¬
тательных сред и технологических растворов.В качестве стерилизующего агента при термической стерилиза¬
ции обычно используют водяной пар, подаваемый под различным
давлением и разной температурой.Химическую стерилизацию применяют для тех элементов обору¬
дования, которые не выдерживают нагревания до 130 °С, к их числу
относятся датчики, воздушные фильтры.В качестве агентов химической стерилизации используют фор¬
мальдегид, оксид этилена, пероксид водорода, щелочи, спирты, ки¬
слоты.Радиационная стерилизация вызывает гибель микроорганизмов
за счет воздействия ионизирующего излучения. В силу многих техни¬
ческих причин этот способ пока не нашел широкого применения в
микробиологической промышленности.Способ стерилизующей фильтрации обеспечивает полную или
частичную задержку микроорганизмов. Он широко применяется для
очистки газов (аэрирующего воздуха) и жидкостей (главным образом,
на конечных стадиях производства фармацевтических препаратов).Термическая стерилизация оборудования, коммуникаций, пита¬
тельных сред, отходов и других технологических жидкостей основана
на том, что при высоких температурах погибают как вегетативные
клетки, так и споры микроорганизмов. Режим стерилизации зависит
от вида микроорганизмов, их свойств, состава и других факторов.
Наиболее устойчивы к высоким температурам термофильные микро¬
организмы, способные не только выживать, но и размножаться при
температуре, губительной для большинства микроорганизмов. Тер¬
мофильные микроорганизмы (Вас. stearothermophilis) следует рас¬
сматривать как основу посторонней микрофлоры при расчете режи¬
мов термической стерилизации, гарантирующих их уничтожение.290
Поактическое применение термической стерилизации связаножде всего с характеристикой стерилизуемого объекта. Так, пустые
ПрС паты и коммуникации чаще всего стерилизуют насыщенным во-
аППым паром, питательные среды и другие жидкости — путем нагре¬
вания под давлением, в ряде случаев применяют горячий воздух (су¬
хой жар).Наибольшим бактерицидным эффектом обладает насыщенный
водяной пар, подаваемый под давлением. При стерилизации паром
время гибели спор, наиболее устойчивых термофилов, составляет
25 мин при 121 °С, 4 мин — при 132 °С, тогда как при использовании
сухого воздуха споры гибнут за 60 мин при 160 °С, при 180 °С за
10 мин. Инактивация таких спор в кипящей воде при 100°С происхо¬
дит чрезвычайно медленно — они гибнут через 7—10 ч.Гибель микроорганизмов под действием высоких температур
происходит в результате коагуляции белков. Важное значение при
этом играет объем воды, содержащейся в клетке, — чем больше воды,
тем ниже температура коагуляции белков. Именно этим объясняется
высокий стерилизующий эффект насыщенного водяного пара — он
не только нагревает, но и дополнительно увлажняет клетки, что по¬
вышает их термочувствительность.Сухой горячий воздух используют для стерилизации материалов и
предметов, которые могут быть испорчены при обработке паром: без¬
водные жиры, масла, порошки, предметы, подверженные коррозии.Гибель микроорганизмов под действием высокой температуры
происходит не мгновенно, концентрация клеток или спор постепен¬
но снижается в течение определенного промежутка времени до тех
пор, пока не погибнет последняя спора.Важным технологическим процессом в биологических производ¬
ствах является очистка от механических включений и стерилизация
воздуха, используемого для вентиляции цехов и боксов, передачи под
давлением стерильных культуральных жидкостей и растворов, под¬
держания избыточного давления в стерильных емкостях.В значительно больших объемах стерильный воздух используется
для аэрации процесса культивирования.Отводимый от оборудования, лабораторных и производственных
помещений воздух также должен подвергаться очистке от присутст¬
вующих в нем микроорганизмов и контролироваться на чистоту.Основным требованием к техническим системам очистки и сте¬
рилизации воздуха на биопредприятиях является очистка его от мик¬
рофлоры и других примесей. Кроме обеспечения этого требования,
рассматриваемые системы должны обеспечивать получение воздуха с
определенными термодинамическими характеристиками (темпера¬291
тура, влажность, давление), от которых, в конечном счете, зависит
эффективность работы систем в целом.Необходимость обеспечения высокой степени очистки воздуха от
микроорганизмов обусловила использование метода удаления аэро¬
зольных частиц из газа путем пропускания его через различные мате¬
риалы — волокнистые (бумага, картон) или пористые (полимеры,
металлы, керамика) и т. д.При выращивании микроорганизмов, клеток животных и вирусов
в глубинных условиях требуется подача стерильного воздуха или дру¬
гих газов в биореактор для аэрации культуральной жидкости. Воздух
или другие газы, подаваемые в биореактор, не только снабжают рас¬
тущую культуру кислородом, азотом, углекислым газом и другими, но
и отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяе¬
мое микроорганизмами в процессе биосинтеза, способствуют гомо¬
генизации суспензии, увеличивают скорость процессов массо- и теп¬
лообмена.Удаление любых частиц из газа (в том числе и бактерий) происхо¬
дит при минимальной производительности фильтра под действием
следующих механизмов: гравитационных, диффузионных и электро¬
статических сил захвата частиц, тогда как при высокой скорости газа
основную роль играют силы инерции.Большое значение также имеет относительная влажность стери¬
лизуемого воздуха или газа. Если она слишком высока, то работа
фильтра становится неустойчивой. Эффективность работы фильтров
для стерилизации воздуха определяется следующими факторами: эф¬
фективность и механическая прочность фильтрующего материала;
герметичность крепления фильтрующего материала в корпусе фильт¬
ра; удобство и быстрота смены фильтра.По конструкции фильтры для стерилизации воздуха делятся на
две группы:1)	фильтры глубинного типа с применением волокнистых фильт¬
рующих материалов;2)	фильтры с отдельными фильтрующими элементами.5.2.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВВсем организмам присущ постоянный обмен веществ с окружаю¬
щей средой. Для осуществления процессов питания и размножения
необходимы определенные условия и, в первую очередь, наличие пи¬
тательных материалов, из которых микробы синтезируют составные
части и получают путем окисления необходимую энергию.292
По типу питания бактерии подразделяют на аутотрофные (прото-
трофные) и гетеротрофные.Аут°тР°Фные (от Феч- autos — сам, trophe — пища)
икроорганизмы, обладают способностью создавать орга¬
нические вещества из неорганических, они не нуждаются в органиче¬
ских соединениях углерода. Синтез составных частей микроорганиз¬
мов осуществляется путем усвоения углекислоты, воды и простых
азотистых соединений (аммиака, его солей, солей азотистой кисло¬
ты). К микробам аутотрофного питания принадлежат нитрофици-
рующие бактерии, многие серобактерии, а также азотфиксирующие
бактерии (Azotbacter, некоторые виды Clostridium), которые усваивают
азот из атмосферы. Синтез сложных веществ происходит у них за счет
энергии, получаемой при окислении аммиака до нитратов
(Nitrosommonas) и нитритов (Nitrobacter), а серы, сульфидов, тио-
сульфатов — до серной кислоты (Thiobaillus thiooxidans).Некоторые виды микроорганизмов — анаэробные пурпурные и
зеленые серобактерии содержат хлорофилл и используют солнечную
энергию для фотосинтеза. При изучении аутотрофных бактерий было
установлено, что в процессе синтеза органических веществ клетки
используют углекислоту в качестве единственного источника углеро¬
да и не в состоянии усваивать более сложные соединения углерода, а
следовательно, не могут быть патогенными для человека и животных.Гетеротрофные (от феч. heteros — другой) бакте¬
рии нуждаются для своего питания в органическом углероде (угле-
роды, кето-, амино-, окси- и жирные кислоты), различных азотистых
соединениях (нитраты, аммиак), неорганических веществах (калий,
|р№ий, марганец, железо, фосфаты, сульфаты), микроэлементах и
•наминах. Гетеротрофные микробы подразделяются на сапрофиты
и паразиты.Сапрофиты (от феч. sapros — гнилой, phyton — растение) живут
за счет органических веществ, находящихся во внешней среде. К ним
относятся большинство видов бактерий, населяющих нашу планету.
Их иначе называют метатрофными.Паразиты (от феч. parasitos — нахлебник, живущий на поверхно¬
сти или внутри другого организма, хозяина и питающийся за его
счет). Эту группу составляет сравнительно небольшое количество ви¬
дов микроорганизмов, приспособившихся в ходе эволюции к парази¬
тическому образу жизни. Некоторые исследователи называют их па-
ратрофами, поскольку они питаются за счет органических соедине¬
нии животных и человека. Однако подразделение гетеротрофных
микробов на сапрофитов и паразитов не является абсолютным, по¬293
скольку невозможно установить резкую грань между этими подгруп¬
пами.Основное отличие гетеротрофных организмов от аутотрофных за¬
ключается в том, что они нуждаются в органических соединениях, со¬
держащих асимметрический атом углерода. Однако за последнее вре¬
мя доказано, что отдельные виды гетеротрофных бактерий, простей¬
ших, грибов, дрожжей, а также животные усваивают углекислоту и
аммиак, синтезируя из них сложные углеводы и аминокислоты.Эти данные подтверждают положение, высказанное в 1921 г.
А.Ф. Лебедевым, что абсолютно гетеротрофных микроорганизмов
нет. Усвоение углекислоты, как было установлено, не является моно¬
полией зеленых растений и пурпурных серобактерий, оно имеет
место и среди многих гетеротрофных микробов; не лишены этой спо¬
собности и патогенные виды.Отдельные виды патогенных для животных и человека микробов
могут существовать во внешней среде как сапрофиты и, наоборот, не¬
которые сапрофиты при неблагоприятных условиях могут вызывать у
людей и животных различные заболевания.В настоящее время установлено, что некоторые микроорганизмы,
раньше считавшиеся типичными гетеротрофами, хорошо растут в
синтетических средах с сернокислым аммонием и добавлением вита¬
минов. Многие патогенные микробы, культивируемые на средах, со¬
держащих кровь, асцитическую жидкость, сыворотку и т. д., можно
выращивать в синтетических средах.В питании микробов большое значение имеют азот и его соедине¬
ния. По характеру азотистого питания микроорганизмы подразделя¬
ются на группы: фиксирующие азот из воздуха; усваивающие мине¬
ральные формы азота (сульфат аммония); развивающиеся в присут¬
ствии отдельных аминокислот и их смеси; культивируемые в белко¬
вых питательных средах.Источниками углерода для микробов могут служить различные
углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.Наряду с пептонами, углеводами, жирными кислотами и неорга¬
ническими элементами бактерии нуждаются в специальных вещест¬
вах — витаминах или факторах роста, играющих роль катализаторов в
биохимических процессах клетки и являющихся структурными еди¬
ницами при образовании некоторых ферментов.В культурах плесневых грибов Я.Я. Никитинским в 1904 г. были
выявлены органические вещества — стимуляторы их роста. Значи¬
тельная часть микроорганизмов требует для своего развития наличия
биотина.294
Одни микробы не нуждаются в добавлении к питательной среде
нов, так как они сами могут их синтезировать, другие недоста-
ВИТЗ о хорошо растут в безвитаминных средах, но дают более пышный
Т°ст при добавлении витаминов; такие микробы, как пневмококк и
гемолитический стрептококк, совсем не культивируются в безвита¬
минных средах.Клетка микроорганизма является сложной биологическои систе¬
мой развивающейся при определенных условиях. Она состоит из
комплекса органических и минеральных веществ, причем их содер¬
жание в клетках различных микроорганизмов может колебаться в за¬
висимости от ее рода и вида, состава питательных сред, способов и ус¬
ловий культивирования, возраста культуры и т.д.5.3.	ХАРАКТЕРИСТИКА НЕОБХОДИМЫХ КОМПОНЕНТОВ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ПРИМЕНЯЕМЫХ В БИОТЕХНОЛОГИИДля размножения микроорганизмов должны быть созданы опти¬
мальные условия. При этом питательная среда должна содержать: ве¬
щества, необходимые для роста и размножения микроорганизмов, а
также для построения клеток — источники азота, углерода, водорода
и кислорода; неорганические соединения в виде различных солей;
бактериальные витамины или так называемые «факторы роста»; воду.Однако наличие всех указанных субстратов само по себе, без учета
физико-химических показателей среды, не обеспечивает оптималь¬
ных условий для существования микроорганизма. Такими показате¬
лями являются: pH среды; окислительно-восстановительный потен¬
циал; вязкость; плотность; влажность; осмотические свойства.Так как виды бактерий характеризуются значительными разли¬
чиями в обмене веществ, то естественно, что для их выращивания ис¬
пользуются разные питательные среды. При составлении питатель¬
ных сред особо важное значение имеет вопрос об источниках углеро¬
да и азота, так как кислород, водород и сера могут потребляться мик¬
роорганизмами из воды и сульфатов.В зависимости от состава и назначения питательные среды под¬
разделяют по консистенции на жидкие, полужидкие и плотные (твер¬
дые). К плотным средам относят обычно агаризованные среды, хотя в
качестве уплотняющих веществ можно использовать и другие веще¬
ства (желатина, агар-агар, селикагель, карбоксиметилцеллюлоза и
ДР.). К ним относятся также свернутая сыворотка, свернутый яичный
белок и т. п.На плотных средах легче проводить бактериологические исследо¬
вания культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой295
и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Для хранения
микроорганизмов, как правило, применяются плотные среды. Одна¬
ко поскольку плотные среды получают главным образом включением
в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве при¬
месей различные катионы, питательные вещества и ростовые факто¬
ры в количестве, достаточном для проявления роста некоторых куль¬
тур (имеются данные о росте микроорганизмов на агаре, приготов¬
ленном только на одной воде, без добавления питательных веществ).Жидкие среды используют для проведения более точных исследо¬
ваний, их составом проще варьировать.По составу питательные среды подразделяют на простые или
обычные — пептонная вода, мясо-пептонный бульон, мясо-пептон-
ный агар, питательная желатина — их иногда называют универсаль¬
ными, и сложные, политропные, или специальные — кровяной агар,
асцитический агар и бульон, свернутая сыворотка.По назначению питательные среды разделяют на дифференци¬
ально-диагностические, элективные, накопительные (среды обога¬
щения, насыщения), ингибиторные, селективные, индикаторные,
среды для консервирования. По составу бывают натуральные, синте¬
тические и полусинтетические.Дифференциально-диагностические — это сложные среды, на
которых микроорганизмы разных видов растут по-разному в зависи¬
мости от биохимических свойств культуры.Селективные, ингибиторные и элективные среды предназначены
для выращивания строго определенного вида микроорганизма. Для
других они неблагоприятны или недостаточно благоприятны. Эти
среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и
дифференцирования их от сходных видов. В их состав добавляют раз¬
личные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на
рост других.Среду можно сделать селективной за счет величины pH. Примера¬
ми являются среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким
pH, а также среды с pH от 8 до 9 для выделения холерного вибриона. В
последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный
характер, применяют антимикробные агенты, такие, как антибиоти¬
ки и другие химиотерапевтические вещества.Элективные среды нашли широкое применение при выделении
возбудителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой
или бриллиантовой зелени, солей желчных кислот, значительных ко¬
личеств хлорида натрия или лимонно-кислых солей подавляется рост
кишечной палочки, но рост патогенных бактерий кишечной группы296
не ухудшается. Некоторые элективные среды готовят с добавлениемантибиотиков.Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в них не
было селективных веществ, способных вызвать изменчивость куль¬
тур-Консервирующие среды, как правило, служат для первичного по¬
сева и транспортировки исследуемого материала.Накопительные среды (обогащения, насыщения) — это среды, на
которых определенные виды культур или группы культур растут бы¬
стрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих
средах обычно не применяют ингибиторные вещества, а наоборот,
создают благоприятные для определенного, присутствующего в сме¬
си вида, условия. Основой сред накопления очень часто являются
желчь и ее соли, тетратионат натрия, различные красители, селенито¬
вые соли, антибиотики и др.Натуральные среды — природные, комплексные, органические
среды неизвестного или неопределенного состава — включают раз¬
личные вещества растительного и животного происхождения. К ним
относятся пептоны, кровь, экстракты, сусло, молоко, сыворотка,
картофель и др.Синтетические среды готовят из точно определенных количеств
органических и неорганических химических соединений известного
состава и воды. Преимущество синтетических сред — постоянный
состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется
вносить различные добавки, в частности факторы роста.Полусинтетические среды, кроме органических и неорганиче¬
ских веществ известного состава, содержат в незначительных количе¬
ствах продукты природного происхождения. Примером может быть
картофельная среда с глюкозой, состав которой зависит от сорта и
возраста картофеля. Так, содержание аспарагина и глутамина в клуб¬
нях разных сортов картофеля может отличатся более чем в два раза.
Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рассматривать
как синтетические из-за сложности и недостаточной определенности
состава агара.Основополагающим принципом конструирования питательных
сред является полноценность их состава, который должен удовлетво¬
рять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов.
В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их
питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ,
составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в
клетках.297
Поступление питательных веществ в цитоплазму может осущест¬
вляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а
также с действием специальных транспортных систем. Причем необ¬
ходимые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны
находиться в определенной, легкоусвояемой форме. К основным
компонентам, формирующим клеточное вещество, относятся угле¬
род, азот, кислород и водород. Содержание этих элементов в различ¬
ных микроорганизмах практически постоянно.В работах Р. Снелла, Ф. Герхардта, М.К. Перта и других авторов
широко рассмотрены потребности микроорганизмов в тех веществах,
которые используются для синтеза клеточных компонентов, а также
их взаимосвязь между собой. Исследователи отмечают, что синтети¬
ческие возможности микроорганизмов и способы получения ими
энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуальны их
потребности в источниках питания. Отсюда ясно, что универсальных
сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроор¬
ганизмов и клеток, не существует.Ряд авторов в своих работах подчеркивает, что разнообразие мик¬
роорганизмов проявляется прежде всего в отношении к источникам
углерода и азота, эти элементы представлены в средах различными
веществами и именно они определяют специфичность сред.В зависимости от типов используемых азотистых соединений
микроорганизмы разделяют на две группы: протеолитические, рас¬
щепляющие высокомолекулярные белковые вещества и пептиды; де¬
заминирующие, требующие присутствия в среде готовых аминокис¬
лот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих при¬
родных аминокислотах, которые являются универсальными компо¬
нентами питания. Они целиком включаются в структуру клетки.
Было отмечено, что хотя такая потребность объясняется неспособно¬
стью к синтезу этих аминокислот, она все же не абсолютная. Напри¬
мер, аминокислота, необходимая в отсутствие витамина Вб, может
быть синтезирована в его присутствии.Исследователи подчеркивают, что баланс аминокислот в пита¬
тельной среде должен учитывать специфику обмена клеток, взаим¬
ный антагонизм аминокислот, способность многих из них изменять
мембранный потенциал и влиять на электрическую активность мик¬
роорганизмов и клеток.Проведенными исследованиями установлено, что из всех незаме¬
нимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также
аргинину, который имеет принципиальное значение для обезврежи¬
вания токсичных метаболитов незаменимых аминокислот и аммиака.298
Неорганические соли, входящие в состав питательных сред (ПС),
удовлетворяют потребности микроорганизмов в ионах К+, Mg2 ,
^1П2+ ре2 или Fe3 , РО4-, SO4- . Они же определяют необходимое
осмотическое давление среды, величину pH и буферную ем кость.В питательных средах необходимо также наличие некоторых дру¬
гих ионов, в частности Zn2+, Си +, Со2+, Са2+, СГ и др. Обычно они
присутствуют в достаточном количестве в виде примесей в питатель¬
ных основах, минеральных компонентах среды или содержатся в во¬
допроводной воде, используемой для приготовления ПС.Ионы металлов, необходимые микроорганизмам и клеткам, слу¬
жат активаторами и кофакторами многих ферментов, кроме того,
участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белко¬
вых комплексов.Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы рос¬
та, различные по химической природе соединения, главным образом
органические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты,
пуриновые и пиримидиновые основания), добавление которых в
очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение
микроорганизмов.Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процес¬
сах обмена веществ, отсутствие или недостаток их в среде приводит к
бактериостатическому эффекту.В настоящее время существует множество различных схем и алго¬
ритмов определения потребностей питания микроорганизмов, учи¬
тывающихся при конструировании ПС5.4.	ВЫБОР СЫРЬЕВЫХ ИСТОЧНИКОВ
ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРВДОсновным принципом конструирования питательной среды яв¬
ляется выбор сырьевых источников, т. е. питательной основы. Каче¬
ство питательной среды во многом определяется полноценностью со¬
става питательных субстратов и исходного сырья, используемого для
их приготовления. Определяющую роль в данном вопросе играют
прежде всего биохимические показатели состава сырья, от которых
зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее
полного и эффективного использования содержащихся в нем пита¬
тельных веществ. Для получения питательной среды с особо ценны¬
ми свойствами используют прежде всего традиционные источники
белка животного происхождения — мясо крупного рогатого скота
(КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Хорошо изучены и
широко применяются питательные среды на основе мяса КРС, киль¬299
ки, сухого криля, отходов переработки мяса криля, минтая и его пере¬
зрелой икры. Наибольшее распространение получила рыбная кормо¬
вая мука (РКМ), удовлетворяющая требованиям биологической цен¬
ности, доступности и относительной стандартности.Широкое распространение получили питательные среды на осно¬
ве казеина, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке:
жир, лактозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отме¬
тить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а
также повышением спроса на казеин на мировом рынке применение
его имеет несколько ограниченный характер.Из непищевых источников белка животного происхождения в ка¬
честве сырья для конструирования полноценных питательных сред
необходимо выделить кровь убойных животных, которая богата био¬
логически активными веществами и микроэлементами и, кроме того,
содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты
крови сельскохозяйственных животных используются в качестве за¬
менителей пептона в дифференциально-диагностических питатель¬
ных средах.К другим видам белоксодержащего сырья животного происхож¬
дения, которые могут быть использованы для конструирования пита¬
тельной среды, относятся: плацента и селезенка КРС, сухой белко¬
вый концентрат — продукт переработки мясных отходов, спилковая
обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних
птиц — отходы вакцинного производства, кровезаменители с истек¬
шим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллю¬
сков и ластоногих, мясо тушек пушных зверей.Питательные среды, приготовленные из сырья животного проис¬
хождения, имеют высокое содержание основных питательных ком¬
понентов, являются полноценными и сбалансированными по амино¬
кислотному составу, достаточно хорошо изучены и описаны в литера¬
туре.Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового
субстрата для питательной среды используют кукурузу, сою, горох,
картофель и др. Однако растительное сырье содержит белок, несба¬
лансированный состав которого зависит от условий выращивания
культур, а также липиды в количествах, больших чем в продуктах жи¬
вотного происхождения.Обширную группу составляют питательные среды, изготовляе¬
мые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бакте¬
рии и т. д.). Аминокислотный состав микроорганизмов, служащих
субстратом для приготовления питательной среды, хорошо изучен, и
можно лишь подчеркнуть, что биомасса используемых микроорга-300
мов является полноценной по составу питательных веществ и ха¬
рактеризуется повышенным содержанием лизина и треонина.Ра разработан целый ряд питательных сред комбинированного со¬
става из белковых субстратов различного происхождения. К ним от¬
носятся дрожжевая-казеиновая, дрожжевая-мясная и т. д. Основой
большинства известных питательных сред являются гидролизаты ка¬
зеина, мяса КРС и рыбы (до 70 %). Удельный же вес непищевого сы¬
рья в технологии конструирования питательных сред составляет все¬
го 30 % и в дальнейшем будет увеличиваться.Результаты исследования разных авторов показывают, что ис¬
пользуемое для получения питательной основы (ПО) непищевое сы¬
рье должно удовлетворять определенным требованиям: полноцен¬
ным по составу; доступным; технологичным; экономичным; стан¬
дартным.Выбор сырьевых источников питательных веществ имеет прин¬
ципиальное значение при конструировании сред для культивирова¬
ния микроорганизмов.В настоящее время широкое применение нашли питательные сре¬
ды, имеющие постоянный состав аминокислот, минералов, жирных
кислот, углеводов, витаминов, углеводородов, антибиотиков и других
компонентов.Многогранность и сложность проблемы стандартизации обуслов¬
ливает необходимость использования комплексного подхода к реше¬
нию данных задач, которые предусматривают не только разработку
требований к качеству исходного сырья, материалов, полуфабрика¬
тов, унификацию технологии оснастки оборудования, но также и раз¬
работку совокупности мероприятий, методов и средств, направлен¬
ных на обеспечение и поддержание необходимого уровня качества
препарата на всех стадиях его приготовления и применения. Наибо¬
лее качественными по составу являются сухие питательные основы и
питательные среды.Примером может служить технология приготовления сухого фер¬
ментативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепле¬
ния, который широко используется при конструировании многих
питательных сред, а также сухого экстракта кормовых дрожжей.Работы, направленные на повышение стандартности, приводят к
Удорожанию питательных сред, но это считается оправданным, так
как применение разнокачественных сред может привести к появле¬
нию брака и к получению различных по качеству иммунобиологиче¬
ских препаратов.301
Создание и развитие системы оценки стандартности состава и
свойств питательной среды, воспроизводимость технологии их при¬
готовления являются одними из основных принципов конструирова¬
ния питательной среды.5.5.	ОСНОВЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВДля осуществления любого биотехнологического процесса необ?
ходимы культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура
для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства
контроля и управления.Культивирование является основной стадией технологического
процесса и во многом определяет количественные и качественные ха¬
рактеристики производства биопрепаратов.На стадии культивирования осуществляется накопление как са¬
мой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности)
микроорганизмов.Иногда, например при производстве бактериальных препаратов,
целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продук¬
ты, синтезируемые клеткой, — антибиотики, ферменты, аминокис¬
лоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться
как внутри клеток, так и выделяться в среду культивирования. Необ¬
ходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продук¬
тов метаболизма) создаются в основном на стадии культивирования.
Основная задача на последующих стадиях состоит главным образом в
том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально
сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.Культивирование — это процесс выращивания микроорганизмов
в (на) питательной среде, в результате которого происходит размно¬
жение и накопление их биомассы и продуктов метаболизма (продук¬
тов микробного синтеза).В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой пита¬
тельной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в
эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования на¬
зывают поверхностным. При твердофазном культивировании клетки
растут на поверхности плотной питательной среды, содержащей дос¬
таточное количество влаги и питательных веществ.При глубинном способе культивирования микроорганизмы рас¬
пределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кисло¬
род и питательные вещества поступают к клеткам в результате интен¬
сивного перемешивания. Этот способ наиболее широко применяется
в настоящее время в производстве большинства препаратов по сле¬
дующим причинам.302
1 Позволяет получить большое количество бактериальной массы
ооткое время. Так, при культивировании микроорганизмов
33 ь! кишечной палочки в условиях состояния покоя количество
П>У""	превышает 1—2 млрд см3, а с применением принуди-МИ ной аэраиии урожайность, в зависимости от состава питательной
ТеЛды достигает 50—60 млрд см3. Это объясняется тем, что при аэра-и практически отсутствует начальная стационарная фаза и бакте¬
рии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логариф¬
мическую фазу.2.	Процесс легко управляем. При глубинном выращивании име¬
ются существенные различия в степени потребления углеродных и
азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации
культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размноже¬
ния не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования до¬
полнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при не¬
обходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.3.	Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глю¬
коза) и биологических стимуляторов, усиливает интенсивность раз¬
множения, что и приводит к увеличению концентрации микроорга¬
низмов. Данный способ позволяет легко корректировать pH среды в
процессе культивирования, что очень важно для достижения макси¬
мальной интенсивности размножения.4.	При данном способе культивирования отмечена максимальная
воспроизводимость результатов.Технологический процесс глубинного выращивания микроорга¬
низмов в аппаратах-культиваторах (ферментерах) складывается из
следующих этапов: отбор штаммов микроорганизмов и работа с
ними; приготовление посевной микробной культуры; приготовление
и стерилизация питательных сред; подготовка культиватора к посеву;
внесение посевного материала в культиватор; выращивание микро¬
организмов для контроля процесса культивирования.Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: стери¬
лизацию оборудования и коммуникаций; приготовление пеногасите-
лей и дополнительных растворов.Эталонные или референтные штаммы хранятся и поддерживают¬
ся в ВГНКИ. Эти штаммы, в свою очередь, являются производствен¬
ными, поскольку на их основе готовятся вакцины.При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из
высоковирулентных штаммов, а живые вакцины — из аттенуирован¬
ных (ослабленных), авирулентных штаммов.Наряду с производственными, эталонными штаммами в ВГНКИ
хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки ка¬303
чества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетиче-1
ски однородными популяциями микроорганизмов со стабильным^
морфологическими, специфическими и биологическими свойства^
ми. Основные требования к этим штаммам — их высокие антигенные]
и иммуногенные свойства.	;Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в
сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроЦ
ки после введения им микроорганизмов.	jИммуногенные свойства штаммов определяются по устойчиво^
сти привитых животных к заражению возбудителем болезни опреде>
ленной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражаю)
50 %-й дозой иммунногенности (ImDso) или по нарастанию титра aw
тител в сыворотке крови. При этом 80 % привитых животных должны
быть специфически невосприимчивы к инфекции.	!Безвредность (реактогенность) эталонного, производственной
штамма проверяют по показателю потери массы и по выраженное™
реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на
5—10-кратное увеличение прививочной дозы.	IПроизводственные, эталонные штаммы должны сохранять гене-j
тическую стабильность антигенных, иммуногенных и других присущ
щих им биологических свойств на протяжении 10 последовательных!
пересевов как in vivo, так и in vitro.Обычно производственное культивирование микроорганизмов
при приготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэто¬
му вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, на¬
ходящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ам¬
пуле, делают посевы в небольшие емкости на скошенный в пробир¬
ках агар, во флаконы емкостью 100 или 200 мл, заполненные наполо¬
вину питательной средой. Затем из пробирок и флаконов делают
пересевы в большие емкости — бутыли объемом 18—20 л.При хорошем накоплении микроорганизмов выросшую в 20-лит¬
ровых бутылях посевную культуру вносят в реактор. Необходимое ко¬
личество посевной культуры для производственного культивирова¬
ния микроорганизмов составляет от 1 до 10 % объема питательной
среды. Посевные микробные культуры контролируют на сохранение
ими типичных морфологических, культуральных, биохимических,
антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней
микрофлоры (ПМФ).В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в
отдельном цехе, обеспечивающем потребности всех основных цехов
предприятия. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими
мешалками, добавляя в определенной последовательности раствори-304
Ые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходи¬
мости отдельные компоненты подвергают дополнительной обработ¬
ке измельчению, просеиванию, отвариванию, экстрагированию. Для
лучшего растворения компонентов среду нагревают до 70—80 °С ост¬
рым паром. Когда в приготовлении питательной основы используют
гидролизаты, контролируемым показателем качества является содер¬
жание ам и иного азота, уровень которого доводят путем разведения до
необходимых величин. При приготовлении питательных сред для
глубинного культивирования особое внимание уделяют их тщатель¬
ной гомогенизации. Твердые частицы нерастворимых компонентов
должны быть достаточно мелкими, что обеспечивает надежность сте-
рилизации, поскольку крупные частицы медленнее прогреваются,
при этом повышается вероятность сохранения в них посторонней
микрофлоры, особенно при непрерывной стерилизации.Приготовленную питательную среду стерилизуют в установках
непрерывной стерилизации (УНС) и передают в цех культивирова¬
ния, заполняют ею предварительно простерилизованные реакторы.
В некоторых случаях среду стерилизуют непосредственно в культива¬
торе (обычно при небольших объемах среды). Реактор заполняют на
2/3 его объема. Перед началом культивирования берут пробы среды с
целью определения качества стерилизации. Это достигается путем
высева из отобранных проб на МПБ, МРБ, агар Сабуро или Чапека.Культиватор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения
водой с соответствующей запорной арматурой. Внутри реактора име¬
ется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со ско¬
ростью вращения 150—600 об/мин, устройство для подачи воздуха.
На крышке реактора имеются отверстия для подачи дополнительных
растворов, внесения посевного материала, отвода отработанного воз¬
духа, порточная ячейка Ph-метрии, смотровое окно, устройство для
взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных
веществ, а при необходимости и факторов роста. Современные реак¬
торы оснащены различными измерительными приборами.Глубинный способ выращивания в АКВ позволяет получать более
стабильные результаты по стерильности и накоплению микробной
массы.Выращивание микроорганизмов в биореакторе может осуществ¬
ляться с применением активной аэрации микробных культур, в по¬
коящемся состоянии без применения механических мешалок (без
аэрации), в состоянии анаэробиоза.Промышленное культивирование микроорганизмов с примене¬
нием активной аэрации осуществляют в реакторах объемом от 0,01 до
100 м , как правило, в асептичесих условиях. Пустой аппарат тща¬305
тельно моют, проверяют герметичность, стерилизуют острым паром.
Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор по¬
дают простерилизованную в УНС и охлажденную до 25—35 °С пита¬
тельную среду, вносят посевной материал в количестве 5—10 % объе¬
ма питательной среды, включают систему аэрации и перемешиваю¬
щее устройство. Так, для листерий и сальмонелл скорость вращения
механической мешалки составляет 150—180 об/мин, а культура мик¬
робов аэрируется подогретым до 37 °С очищенным, стерильным воз¬
духом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну ми¬
нуту. Коэффициент заполнения реактора равен 0,6. Превышение
этой величины может привести к значительному пенообразованию,
уносу ее воздухом и нарушению асептических условий.Температуру культивирования поддерживают путем подачи охла¬
ждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппа¬
рата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов раз¬
лична, обычно от 25 до 37 °С.Для регулирования pH культуральной жидкости в ходе культиви¬
рования добавляют соответствующие титрующие агенты — щелочи,
кислоты, раствор аммиака, глюкозы и др. Продолжительность выра¬
щивания микроорганизмов в культиваторе 18—24 ч, для спорообра¬
зующих она колеблется от 40 до 250 ч (для актиномицетов и микро¬
скопических грибов).Процесс культивирования контролируют по изменениям темпе¬
ратуры, pH, расхода воздуха, частоты вращения мешалки, содержа¬
нию Ог, а также путем периодического отбора проб (через 1—12 ч в за¬
висимости от длительности процесса). В пробах определяют содержа¬
ние углеводов, общего и аминного азота, наличие посторонней мик¬
рофлоры, исследуют морфологию микробных клетокТехнология культивирования в покоящемся состоянии без аэра¬
ции осуществляется с микроорганизмами, относящимися к группе
микроаэрофильных (возбудители бруцеллеза, лептоспироза, кампи-
лобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации
питательтной среды, в которой они выращиваются. Применяют бал-
лоный и реакторный способ культивирования. Баллоный способ
культивирования лептоспир заключается в том, что микробные куль¬
туры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в
20-литровых стеклянных бутылях с 10—12 литрами сывороточной
или альбуминно-сывороточной (производственной) средами при
27—28 °С в течение 5—7 суток. Реакторный способ культивирования
осуществляется в АКВ.К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые спо¬
собны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.зоб
13 силу биологических особенностей анаэробов методы культивиро¬
вания их в промышленности имеют свои особенности. При культи¬
вировании анаэробных микроорганизмов в реакторах создаются ус¬
ловия полного вытеснения из питательной среды свободного кисло¬
рода. Это достигается путем заполнения анаэробостатов газовой сме¬
сью водорода и диоксида углерода, остаточный кислород удаляется
путем каталитического связывания с воздухом. Анаэробные условия
могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливаю¬
щих агентов таких, как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой ки¬
слоты. Степень анаэробиоза определяется показателем окислитель¬
но-восстановительного потенциала. При культивировании анаэро¬
бов необходимо постоянно корректировать pH среды, поддерживая
се в пределах 7,2—7,8. В процессе выращивания анаэробов pH среды
очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибиро¬
ванию их роста.При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры мо¬
гут находиться в периодических или закрытых, и непрерывных — от¬
крытых системах.Закрытой называют такую систему, когда хотя бы один из компо¬
нентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систе¬
му, ни покидать ее. В такой системе скорость роста микроорганизмов
должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстра¬
та или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления ими
продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры
микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.Открытая (хемостатная) система — это когда питательные ком¬
поненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или
иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продуктов син¬
теза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т. д.)
или биомассы самих микроорганизмов. При этом скорость поступле¬
ния питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синте¬
за или биомассы можно регулировать в нужной среде размножения
м и кроорган измов.В периодическом состоянии динамика роста и размножения мик¬
роорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенно¬
стей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических гри¬
бов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном раз¬
витии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие про¬
исходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность
которых зависят от физиологического состояния клеток, определяе¬
мого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в ко¬
торой развивается популяция того или иного организма.307
Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количе¬
ственные и качественные изменения в их биомассе и окружающей
среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганиз¬
мов разные авторы выделяют от 4 до 8 и даже до 16 фаз.Рост микробной популяции изображают обычно графиками, от¬
кладывая на оси абсцисс — время роста, а на оси ординат — число
микробных клеток. Каждая фаза является суммированным выраже¬
нием размножения и отмирания клеток в микробной популяции.Каждая фаза роста и размножения микроорганизмов характери¬
зуется следующим образом:1.	Исходная фаза является фазой задержки (лаг-фаза) роста, когда
размножения микробных клеток не происходит.2.	Фаза положительного ускорения роста. Длительность этого пе¬
риода для большинства микроорганизмов составляет 2 ч и зависит от
температуры, состава питательной среды, качества посевного мате¬
риала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число
клеток остается постоянным из-за отсутствия в этот период клеточ¬
ного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется
как состояние приспособления к питательной среде. В этот период
усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в
них образуется большое количество индуцибельных ферментов.3.	Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (пока¬
зательного) роста характеризуется постоянной и максимальной ско¬
ростью роста клеток. Рост микробов в этой фазе происходит в геомет¬
рической прогрессии. Продолжительность генерации в лог-фазе у
разных микроорганизмов не одинакова. Так, величина g для сальмо¬
нелл равна 20—30 мин, для стрептококков и стафилококков
25—35 мин, для эшерихий 15—17 мин. На продолжительность гене¬
раций влияют температура, pH, состав среды, скорость оборотов ме¬
шалки и другие параметры культивирования. В период логарифмиче¬
ского роста величина микробных клеток по сравнению с лог-фазой
уменьшается и делается относительно постоянной.4.	Фаза отрицательного ускорения. В этой фазе скорость размно¬
жения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление
этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накопле¬
нием в культуральной жидкости токсических веществ, которые начи¬
нают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в этой фазе про¬
исходит наивысшие накопление микробной массы в единице объема.5.	Стационарная фаза роста или максимума, на протяжении кото¬
рой численность микробной популяции не уменьшается. В этой фазе
скорость разножения и отмирания клеток одинаковая. Концентра¬
ция живых клеток в этой фазе достигает максимума, и она называется308
^-концентрацией. В этой фазе биомасса микроорганизмов и продук-
ты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценно¬
стью.6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная попу-
1Яция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы
стационарного роста в стадию отмирания.Продолжительность стадии отмирания у различных микроорга¬
низмов не одинакова: у пневмококка она составляет 2—3 суток, у
эшерихий — несколько месяцев. В этот период в культуре значитель¬
но снижается уровень живых клеток, у них уменьшается биохимиче¬
ская и антигенная активность. Учитывая это, для изготовления ряда
биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в
фазе отрицательного ускорения роста или в начале стационарной
фазы, когда концентрация живых микробных клеток приближается к
максимальной.Хемостатное, или непрерывное, культивирование представляет
собой прочную систему в которой жизнеспособность микробной по¬
пуляции поддерживается непрерывной подачей свежей питательной
среды и постоянным отбором микробной биомассы или образовав¬
шихся продуктов метаболизма. При этом культура микроорганизмов
как бы фиксируется в стационарной фазе роста, что позволяет полу¬
чать нужные продукты обмена в максимальном количестве.Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроор¬
ганизмов с целью их всестороннего изучения служила простая перио¬
дическая культура. Только с переходом к методу хемостатного куль¬
тивирования обнаружился недостаток периодической культуры, ко¬
торая не дает полного представления обо всех изменениях, происхо¬
дящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в
ней процессы.Развитие хемостатного культивирования открыло возможность
управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганиз¬
мов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя ско¬
рость роста до задаваемых пределов путем воздействия на такую куль¬
туру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерыв¬
ному культивированию растет как в нашей стране, так и за рубежом.
Однако несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологи¬
ческой промышленности при производстве вакцин они не получили
еЩе достаточно широкого применения по следующим причинам: тех¬
нические трудности, в первую очередь связанные с созданием асеп¬
тических условий; не во всех случаях непрерывный процесс предпоч¬
тительнее периодического, поскольку при низкой удельной скорости
биомассы периодический процесс по эффективности не уступает не¬309
прерывному и более выгоден, так как его проще осуществить. Интен*
сивный биосинтез многих продуктов метаболизма происходит при
медленном росте биомассы, поэтому в периодических процесса*
концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычнс{
выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффекта в-i
ность стадий выделения и очистки продукта.	.]Все это свидетельствует о том, что периодические процессы в бу¬
дущем найдут более широкое применение.Вирусы являются внутриклеточными микроорганизмами, по¬
этому они на искусственных питательных средах не растут. Для выра*
щивания их используют живые лабораторные модели: лабораторный
или сельскохозяйственных животных, развивающиеся куриные эм-*
брионы (РКЭ) или эмбрионы других птиц, а также культуру клето^
приготовленную из тканей животных или людей.	*С начала открытия вирусов в течение многих лет выращивани<
вирусов осуществляли и продолжают осуществлять по настояще(
время заражением животных. Причем в начале развития вирусологии
этот метод являлся единственным методом культивирования виру¬
сов. С одной стороны, этот метод был необходим для изучения mhoi
гих вопросов вирусологии особенно при диагностике вирусных забо»
леваний, а также при приготовлении ряда противовирусных вакцин
В то же время этот метод культивирования вирусов вскоре стал серИ
езным препятствием в получении высококачественных и в достаточ¬
ном количестве вакцин для нужд животноводства и медицины. К.ро->
ме того, как было установлено, не все животные одинаково чувстви¬
тельны к различным вирусам.Но, несмотря на указанные ограничения, и сейчас некоторые
виды лабораторных и сельскохозяйственных животных используют
для культивирования вирусов. Обычно выбор животного зависит от
применяемого вида вируса. В качестве лабораторных моделей ис¬
пользуют белых мышей (иногда новорожденных) и крыс, желательно
инбредных линий, золотых сирийских хомяков, морских свинок,-
хорьков, кроликов, собак, кур, голубей, обезьян, овец, телят, жере-i
бят, поросят и др.Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются-
животные, свободные от специфических патогенных возбудителей
заболеваний, а также животные-гнотобионты (стерильные живот¬
ные).	1Перед заражением у животных обрабатывают место инъекции,;
после чего с учетом тропизма вируса вводят вирусосодержащий
материал оральным, ректальным, интраназальным, накожным, внут-
рикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутри-310
6рЮшинным способами, а также в мозг, на роговицу глаза, в тестику-
,|Ы и иногда другими методами.Зараженных содержат изолированно от здоровых животных и за
ними ведут клинические наблюдения. Признаками заражения жи¬
вотных является развитие типичных клинических симптомов заболе¬
вания или их гибель.При производстве противовирусных биопрепаратов лаборатор¬
ных животных используют для контроля, а также для приготовления
некоторых тканевых вирусных вакцин. Типичным примером являет¬
ся производство антирабической фенол-вакцины из мозга овец, зара¬
женных вирусом-фикс бешенства, формол-вакцины против ящура из
вирусов, полученных после заболевания крольчат (лапинизирован-
ный вирус), некоторых вакцин против оспы, изготовленных из тка¬
ней, содержащих вирус оспы, и т. д.Рассмотрим кратко технологию культивирования аттенуирован¬
ного штамма С113/86 вируса оспы овец, из которого в настоящее вре¬
мя готовят сухую живую вакцину против оспы данного вида живот¬
ных. Для этого 5—6 овец заражают вирусосодержащей суспензией
лиофилизированного вируса оспы указанного штамма, которую го¬
товят путем разведения 1:100. Предварительно у овец выстригают и
выбривают шерсть со стороны брюшной полости и тщательно обра¬
батывают ее дезинфицирующей жидкостью. Вирусосодержащий
материал вводят внутрикожно в несколько точек в области брюшной
стенки, вводя в каждую точку по 0,2—0,6 см3 вируса. После заражения
за животными ведут наблюдение. В соответствии со стадиями разви¬
тия оспенного процесса на месте введения вируса через 3—4 сут раз¬
вивается обильная кожная экзантема и на коже появляются красные
пятнышки. Примерно еще через 3—4 сут на месте заражения появля¬
ются плотные узелки (папулы), окруженные возвышающимся крас¬
ным пояском. На 7—10-е сутки, не ожидая следующих стадий разви¬
тия оспенного процесса, животных убивают. У них препарируют
кожу и со всей поверхности брюшной стенки срезают папулы. От ка¬
ждой овцы папулы собирают в отдельные специальные емкости. Соб¬
ранный материал хранят при —40°Сдо получения из него вакцины.Начало применения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ)
Для выращивания вирусов приходится на 1928—1935 годы. Этот пери¬
од австралийский ученый Вернет назвал «первой золотой эпохой»
Развития вирусологии, поскольку она открыла возможность культи¬
вирования вирусов в довольно удобной живой лабораторной моде¬
ли — в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), как правило, ин-
тактных по отношению ко многим возбудителям инфекционных бо¬
лезней.311
В РКЭ способно развиваться большинство вирусов. Это обусловь
лено тем, что куриный эмбрион содержит четыре различных естесад
венных питательных субстрата для размножения вирусов: амнион]
аллантоис, хориоаллантоисную мембрану и желточный мешок, клет]
ки которых, как и клетки самого эмбриона, являются высокочувствЦ
тельными к различным вирусам. Вследствие этого куриные эмбрион
ны пригодны для выделения вирусов из патологического материала]
получения антигенов, определения титров инфекционности вирусов^
постановки реакции нейтрализации и т. д. В силу высокой произвол
дительности и накопления некоторых вирусов РКЭ используют кай
модель для получения вакцин против ряда заболеваний животных d
человека.	^Для получения РКЭ используют яйца от белых леггорнов, имею!
щие тонкую скорлупу. Они должны быть свежими (не позднее десяти
суток). В противном случае развитие зародыша, несмотря на оплодо'
творение, сильно задерживается. Яйца должны быть чистыми, но ю
мытыми. Инкубацию проводят в обычных инкубаторах с автоматичен
ским приспособлением для переворачивания яиц, вентиляторов
термометром и гигрометром. Работу проводят при 37,2—38,7 °С i|
влажности 60—70 %. Возраст РКЭ, используемых для работы, зависит
от вируса, которым будут заражать куриные эмбрионы. Однако неза-f
висимо от этого яйца нужно овоскопировать через 3—4 суток, для!
того чтобы удалить неоплодотворенные яйца (болтуны) и яйца с по¬
гибшими эмбрионами. Дальнейшее развитие эмбрионов проводят й
соблюдением вышеуказанных условий. Обычно развивающиеся ку¬
риные эмбрионы заражают в возрасте 7—11 сут.Работу по заражению РКЭ проводят в стерильном боксе, где име¬
ются рабочие столы, стулья, куда подведены вода, газ, вакуум. Перед
началом работы стол дезинфицируют. Заранее готовят необходимые
инструменты, асептический раствор, йодированный спирт, согнутый
зубной зонд или бормашину для просверливания скорлупы. Зараже¬
ние эмбрионов проводят при помощи стерильных специальных
шприцов и игл. Расплавленным парафином заливают отверстия в
скорлупе после заражения. Кроме того, необходима емкость с дезин¬
фицирующей жидкостью для использованного инструмента. В боксе
должна быть специальная подставка для яиц. Вне зависимости от па¬
тогенности используемых вирусов работа производится в масках, за¬
щитных очках, резиновых перчатках, в специальных костюмах для
стерильных помещений.В настоящее время согласно международным требованиям
(GMP) работу с вирусосодержащим материалом проводят в ламинар-312
)lbix боксах, обеспеченных избыточным поддувом стерильного возду-
ча проходящего через мембранные фильтры.Заражение куриных эмбрионов проводят заранее подготовлен¬
ным вирусом в дозировках, оттированных по LD50. Чтобы иметь сте¬
рильную (без бактерий) суспензию вируса, полученную из куриного
)Мбриона, к инокулируемому вирусному материалу добавляют по
IQ0—1000 мг стрептомицина и 100—1000 ЕА пенициллина.Способы заражения куриных эмбрионов зависят как от вида ис¬
пользуемого вируса, так и от цели заражения. Введение вируса произ-
иодят в аллантоисную полость, в амнион, на хориоаллантоисную обо¬
лочку или в желточный мешок.В промышленных условиях на биопредприятиях при объемном
производстве антигенов и противовирусных вакцин наиболее часто
применяется метод заражения куриных эмбрионов в аллантоисную
полость. Остановимся на технологии получения вирусного материала
из куриных эмбрионов, зараженных этим способом.Перед получением вируса скорлупу над воздушной камерой де¬
зинфицируют и отделяют ножницами или пинцетом. Нижнюю плен¬
ку подскорлуповой оболочки, формирующую пугу, и хориоалланто¬
исную оболочку прокалывают и отсасывают пипеткой или специаль¬
ным аппаратом, аллантоисную жидкость. Из одного эмбриона в зави-
симости от его возраста можно собрать до 8—10 мл аллантоисной
жидкости. Полученную аллантоисную жидкость проверяют на сте¬
рильность путем высевов на питательные среды, а также на содержа¬
ние вируса и его количества путем постановки реакции гемагллюти-
нации.Способ культивирования вирусов в аллантоисной полости кури¬
мых эмбрионов в биопромышленности используется при получении
антигенов для диагностики гриппозных инфекций улюдей, лошадей,
птиц, а также для получения живых и инактивированных вакцин про-
тив гриппа у людей, животных и птиц, псевдочумы птиц из штамма
<Н», инфекционного ларинготрахеита птиц и др.В ряде случаев живые вакцины готовят из вирусов, выращенных
на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов (например, су¬
хая эмбрион-вакцина из голубиного вируса против оспы птиц). Для
получения вирусного материала в таком случае яйцо разрезают вдоль
До конца воздушной камеры. Эмбрион, желточный мешок и белок
Удаляют, а хориоаллантоисную оболочку собирают пинцетом, пере¬
носят в сосуд для промывания в растворе Хенкса. При просмотре хо-
риоаллантоисных оболочек на темном фоне можно хорошо видеть
множество очагов некроза, число которых указывает на степень раз¬
множения вирусов.313
Значительным вкладом в развитие вирусологии явилось примене¬
ние тканевых культур, что существенно продвинуло вперед вирусоло¬
гические исследования.Культивирование вирусов вне организма связано с открытием
возможности выращивания вирусов полиомиелита в экстраневраль-
ныхтканях (А. Эндерс, Н. Робинсон, С. Веллер, 1949) и усовершенст¬
вованием метода тканевых культур (Д. Дульбекко и др., 1952). Этому в
офомной степени также способствовало открытие антибиотиков,
создание синтетических и полусинтетических питательных сред.Широкое применение культивирования вирусов в клеточных
культурах началось в 1950—1957 гг. И этот период известным в мире
вирусологом Д. Бернетом назван «второй золотой эпохой» развития
вирусологии.Главным преимуществом перед другими методами культивирова¬
ния вирусов способ культур тканевых клеток является относительно
дешевым и благодаря этому он может быть использован для культи¬
вирования практически всех известных вирусов. При помощи куль¬
тур клеток можно получить достаточно «чистый» вирус, с небольшим
числом чужеродных антигенов, в виде клеточных компонентов, что
очень важно при приготовлении противовирусных вакцин, сыворо¬
ток и диагностикумов.В настоящее время на биопредприятиях Российской Федерации
на основе клеточных культур производится более 40 вирусных вак¬
цин, обеспечивающих надежную профилактику вирусных инфекций
у животных. В необходимых случаях на основе культур клеток произ¬
водят иммуноферментные и другие высокочувствительные диагно-
стикумы для выявления вирусных инфекций. Приготовление указан¬
ных препаратов требует высокой чистоты производства, создания
банков клеточных культур и вирусов.В вирусологии наиболее часто используют следующие культуры
клеток:—	однослойные (монослой) — это клетки тех или иных органов
или тканей, растущие в один слой на поверхности сосуда. Следует за¬
метить, что все клеточные культуры, фиксированные к стенке сосу¬
дов, в которых они выращиваются, являются однослойными. Это не¬
обходимо учитывать при характеристике других клеточных культур и
их линий;—	первичная — это такая культура, для которой использованы
клетки, органы или ткани, взятые непосредственно из организма;—	клеточная линия — получается из первичных культур клеток
после первого пассажа.314
В первичной культуре клеток представлено большое количество
щеточных линий. Основной из них является перевиваемая (стабиль¬
ная) клеточная линия. Она обладает способностью к неограниченно¬
му количеству пассажей (не менее 70 раз с 3-дневным интервалом);
диплоидная — линия клеток, 75 % которых имеют кариотип, свойст¬
венный нормальной клетке организма, из которого они выделены;
гетероплоидная — линия клеток, которая содержит менее 75 % дип¬
лоидных клеток. Такие клетки не обладают признаками новообразо¬
ваний. В то же время они не имеют ограничений способности роста in
vitro;—	субклеточная культура (субкультура). По сути это перевивае¬
мая линия, получаемая из первичной культуры клеток путем перено¬
са клеток из одной системы (емкости) в другую, т. е. это вторичная
культура клеток.По частоте использования клеточные культуры подразделяются
на первичные (периодические) и перевиваемые, или постоянные.
Первые используются в технологическом процессе, как правило, од¬
нократно. Вторые являются непрерывными, постоянными клеточ¬
ными линиями, которые в технологическом процессе используются
многократно.Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормаль¬
ных первичных клеток с ограниченным сроком жизни, являются
трансформированными. Другими словами, они изменены по ряду
признаков, главным из которых является «бессмертие» (В.А. Сергеев,
1993). Другие категории трансформации, например, онкогенность,
контактное торможение, приспособление к среде и т. д., у различных
линий проявляются неодинаково. Все они получены при спонтанной
или индуцированной трансформации клеток в организме или в куль¬
туре. Многие постоянные клеточные линии получены из опухолей
животных.Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной
клеточной линии, были успешными, когда первичную однослойную
культуру получали путем посева механически измельченной суспен¬
зии трипсинизированных клеток.Способы выращивания клеточных культур в промышленных услови¬
ях. Выращивают соответствующие клетки ткани в различных стек¬
лянных емкостях в состоянии покоя, роллерным или динамичным
методом и методом суспензионных клеточных культур.Выращивание клеточных культур в состоянии покоя удобнее все¬
го производить в стеклянных матрасах емкостью 1,5 л. В стерильные
матрасы наливают 300 см3 ростовой питательной среды, а затем вно¬
сят необходимое количество матровой культуры клеток соответст¬315
вующей концентрации. Матрасы помещают в термостаты предвари^
тельно пометив верхнюю стенку. На внутренней плоской поверхно»
сти другой стенки в процессе культивирования будет формироваться
монослой клеток.	^Культивирование клеточных культур роллерным методом осуще|
ствляется в 3-литровых бутылях, установленных на специальная
стеллажно-ярусных аппаратах, обеспечивающих вращение бутылей
В начале в подготовленные соответствующим образом стерильны*
бутыли наливают ростовую питательную среду в количестве '/юобъв!
ма сосуда. В среду вносят матровую культуру клеток концентрацией
600—800 тыс. на 1 мл. Затем бутыли устанавливают на стеллажу
но-ярусный аппарат и осуществляют культивирование клеток пр|
37 °С. Во вращающихся бутылях клеточный монослой располагаете!
по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся
сосудов. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Он
не должна быть слишком высокой, чтобы не препятствовать прикре
плению клеток. Но она должна быть и не слишком низкой, так ка|
длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия вд
питания. Обычно скорость вращения бутылей составляет 10—12 об/чЦРоллерный метод еще называется динамичным. Этот метод по|
зволяет получить большое количество клеток той или иной клеточ^
ной линии.Способностью к росту и размножению в роллерных условиях об¬
ладают первичные культуры клеток, субкультуры, перевиваемые кле¬
точные линии. Преимуществом роллерного способа культивирова¬
ния клеток по сравнению с традиционными методами выращивания
их в состоянии покоя (в матрасах или пробирках) является более эко¬
номичное использование питательных сред и более высокий выход
антигена при последующем культивировании в таких культурах кле¬
ток вирусов.Идентичным роллерному методу является выращивание моно-
слойных клеточных культур в ферментерах «Гироген». Такой фер¬
ментер впервые описан в 1978 г. Герардом, представителем швейцар¬
ской фирмы «Хеман АГ», которая с 1974 г. занимается разработкой
техники для суспензионного культивирования клеток млекопитаю¬
щих. Ферментер «Гироген» состоит из большого количества стеклян¬
ных трубок, где клетки растут не только на внутренней, но и на внеш¬
ней поверхностях стекла. Питательная среда вносится в ферментер
отдельно или вместе с клеточной суспензией. Весь технологический
процесс регулируется автоматически. При этом pH среды поддержи¬
вается в пределах 7,2—7,4 с помощью подачи газовой смеси из воздуха
и углекислого газа на поверхность питательной среды. Использова-316
пне установки «Гироген» обеспечивает повышение производитель¬
ности труда, экономию рабочего времени, сокращение трудовых ре¬
сурсов. Фирма «Хеман АГ» выпускает несколько разновидностей
ферментеров: лабораторные № 9, 16, 47; промышленные № 150,
300, 600.Кроме указанных способов выращивания клеточных культур,
растущих на поверхности стенок тех или других емкостей, в крупно¬
масштабном производстве используют метод выращивания суспен¬
зионных клеточных культур. Этот метод впервые описал С. Оуене
(1953). Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде
и свободно суспендированном состоянии. Клетки перевиваемых ли¬
ний могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии.
В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стенкам
культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию
среды.Способ суспензионного выращивания клеток в биологической
промышленности стал применяться сравнительно недавно.Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты.
Большие успехи достигнуты при получении суспензионных постоян¬
ных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса
бешенства, клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса
ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др. Выращивание кле¬
точных культур осуществляют в специальных реакторах емкостью
1000 и более литров при 36—37 °С, pH 7,4 и непрерывном перемеши¬
вании суспензии клеток при 300—350 об/мин.Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных куль¬
тур, на многих предприятиях биологической промышленности чаще
используются методы получения клеточных линий в состоянии по¬
коя или роллерным (динамичным) способом.5.6.	КЛАССИФИКАЦИЯ ВАКЦИН И ТЕХНОЛОГИЯ
ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯПод общим названием «вакцины» объединяют все препараты, по¬
лучаемые как из самих патогенных микроорганизмов или их компо¬
нентов, так и продуктов их жизнедеятельности, которые применяют¬
ся для создания активного иммунитета у животных и людей.В настоящее время появилась классификация, согласно которой
все вакцины подразделяются на две группы: корпускуляр-
н ы е (у вирусов — цельновирионные) и компонентные
(субъединичные). К первой группе относятся как живые, так и инак¬
тивированные вакцины.317
Живые гомологичные вакцины в свою очередь могут различаться
способом получения и быть представленными природно аттенуиро¬
ванными или икусственно ослабленными штаммами, включая ре¬
комбинантные и реассортантные.К компонентным (субъединичным) вакцинам относятся все
остальные, которые не вошли в первую группу. Такие вакцины вклю¬
чают толькоте компоненты, которые вызывают образование антител.К инактивированным, но не корпускулярным вакцинам относятся
анатоксины. Они по сути приближаются к субъединичным вакци¬
нам, но полной аналогии с ними делать не следует.	5Живые, инактивированные вакцины, анатоксины могут быть поА;
дивалентными, комбинированными, гомологичными, гетерологич-
ными.Вакцины, содержащие антигены более чем одного вида микроор¬
ганизмов, называют комбинированными или ассоциированными.Вакцины, содержащие антигены микроорганизма, против кото¬
рого предполагается создать иммунитет, называются гомологически¬
ми.Если болезнь, вызываемая одним видом микроорганизма, профи-
лактируется вакциной, приготовленной из другого вида микроорга¬
низма, то такая вакцина называется гетерологичной. Наиболее часто
такие вакцины готовят и применяют для профилактики вирусных ин¬
фекций.С учетом традиционной и современной классификации все вак¬
цины делятся:—	по направленности применения — противобактериальные,
противогрибковые, противовирусные;—	по способности микроорганизмов к размножению (реплика¬
ции) — живые, инактивированные, в том числе анатоксины;—	по сырьевым компонентам — корпускулярные (у вирусов —
цельновирионные); субъединичные; вакцины из экзопродуктов (ана¬
токсины).По совокупности признаков все вакцины классифицируются на:—	живые и инактивированные;—	поливалентные и ассоциированные;—	гомологичные и гетерологичные;—	корпускулярные и субъединичные;—	рекомбинантные и реассортантные;—	генно-инженерные и пептидные (синтетические).Живые (аттенуированные) вакцины представляют собой иммуно-
профилактические препараты, состоящие из наследственно изме¬
ненных форм возбудителей инфекционных заболеваний, суспенди¬318
рованных или высушенных в соответствующих физиологическихсредах.Вакцинные штаммы живых вакцин претерпели такие генетиче¬
ские изменения, в результате которых они безвозвратно потеряли
способность вызывать в восприимчивом организме патологические
изменения, ранее определяющие болезнь. Вместе с тем они сохрани¬
ли гены, определяющие способность вызывать специфические имму¬
нологические реакции, проявляющиеся выработкой антител.Живые вакцины готовят из специально полученных вакцинных
штаммов микроорганизмов с резко ослабленной вирулентностью и
хорошо сохранившимися иммуногенными свойствами.Убитые (инактивированные) вакцины. Данный тип вакцин пред¬
ставляет собой препарат, содержащий культуру высоковирулентных
штаммов возбудителей инфекционных болезней, обезвреженную
действием физико-химических факторов, утратившую способность к
репродуцированию, но сохранившую иммуногенные свойства возбу¬
дителя.Химические вакцины готовят из отдельных антигенов, которые об¬
ладают протективными свойствами.Для получения антигенов применяют различные химические ме¬
тоды. Однако при введении подобных антигенов в организм они бы¬
стро рассасываются и не обеспечивают необходимого длительного
иммуногенного раздражения. Поэтому к ним добавляют различные
адъюванты. В качестве адъювантов применяют гидрат оксида алюми¬
ния, алюминиево-калиевые квасцы, минеральные и животные масла.Иммунитет при ряде заболеваний (дифтерия, столбняк, ботулизм
и др.) имеет преимущественно антитоксический характер. Поэтому,
для профилактики этих заболеваний используют анатоксины (обез¬
вреженные токсины микроорганизмов). Метод приготовления ана-
гокисна заключается в том, что к токсину добавляется небольшое ко¬
личество формалина (0,3—0,4 %) и выдерживают его при 37 °С 30—
32 дня. В результате такой обработки они утрачивает токсичность, но
сохраняют иммуногенные свойства. Анатоксины очищают от балла¬
стных белков питательной среды и адсорбируют на депонирующих
веществах (адъювантах).Генно-инженерные вакцины — препараты, приготовление которых
связано с использованием методов генной инженерии. Существуют
технологии рекомбинантной ДНК для клонирования вирусных или
бактериальных белков (антигенов) в бактериальных, дрожжевых и
животных клетках.Синтетические вакцины — препараты известного состава, содер¬
жащие полученную искусственным путем антигенную детерминанту.319
Примером антибактериальных синтетических вакцин могут слу¬
жить синтезированные фрагменты стрептококкового белка М, диф¬
терийного токсина и холерного токсина. Очищенный белок М нельзя
использовать в качестве вакцины, так как он имеет эпитопы, общие с
клетками ткани сердца человека. Синтетические фрагменты белка М
приводят к эффективной защите против нескольких типов стрепто¬
кокков группы А, не вызывая выработки перекрестно-реактивных
антител к тканям человека.ДНК-вакцины. В качестве вакцин используют плазмидные векто¬
ры, кодирующие иммуногенные белки, при этом антигены патоген¬
ных микроорганизмов, индуцирующие иммунный ответ, синтезиру¬
ются клетками самого макроорганизма. Это новый способ иммуниза¬
ции, который интенсивно разрабатывается в последнее время.По количеству содержащих в вакцине антигенов различают моно¬
вакцины, приготовленные из одного возбудителя или антитела, и по¬
ливакцины, содержащие антигены против нескольких вариантов ин¬
фекций.5.7.	ТЕХНОЛОГИЯ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРИГОТОВЛЕНИЯВАКЦИНПолученный из ВГНКИ аттенуированный штамм того или иного
микроорганизма в условиях биопредприятий адаптируют к произ¬
водственным питательным средам. Затем его выращивают, как пра¬
вило, глубинным способом в реакторах и после получения бактериаль¬
ной культуры ее центрифугируют в суперцентрифугах (сепараторах)
для получения концентрата биомассы. Жидкая часть (культуральная
жидкость) удаляется. Концентрат бактериальной массы суспендиру¬
ют в среде высушивания (защитная среда) в соотношениях, необхо¬
димых для каждой вакцины концентрации микробных клеток. Чтобы
смесь была равномерной концентрации, суспендирование проводят в
работающем гомогенизаторе в течение определенного для каждого
препарата времени. Полученную концентрированную бактериаль¬
ную массу соединяют в определенных соотношениях с защитной сре¬
дой, разливают во флаконы или ампулы и подвергают лиофильной
сушке. После этого ампулы запаивают, а флаконы закрывают резино¬
выми пробками из нейтрального материала и герметизируют, обка¬
тывая флаконы алюминиевыми колпачками. После этикетировки
приготовленные серии вакцин сдают на контроль.Большинство живых вакцин выпускаются в сухом виде. Кроме су¬
хих, живые вакцины выпускаются и в жидком виде. По сути это куль¬
тура выросших аттенуированных штаммов, отстандартизированных320
путем сепарирования и суспендирования до необходимой концен¬
трации, ее фасуют во флаконы емкостью 50—100—200 мл и сдают наконтроль.Технология приготовления инактивированных вакцин. Инактиви¬
рованные вакцины готовят из высоковирулентных штаммов соответ¬
ствующего вида микробов. Поэтому полученную из него нативную
культуру необходимо обезвредить (инактивировать). Способы инак¬
тивации бывают разными. Они должны быть щадящими, не нару¬
шающими иммуногенности препарата. Есть так называемые гретые
иакцины, когда полученную культуру убивают воздействием темпе¬
ратуры в пределах 56—58 °С. Эти вакцины применяют редко. В вете¬
ринарии таким образом готовят колипротектант — взвесь убитой на¬
греванием, отмытой от токсинов и консервированной формалином
культуры одного штамма эшерихий. Для получения колипротектанта
культуру эшерихий культивируют в реакторах в бульоне Хоттингера с
добавлением углевода. По окончании культивирования бактериаль¬
ную массу в реакторе инактивируют (убивают) длительным нагрева¬
нием, затем охлаждают и сепарируют. Осадок бактериальной массы
суспензируют в физиологическом растворе, устанавливают нужную
концентрацию микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту
мутности и консервируют формалином.Чаще всего культуры микробов инактивируют (убивают) химиче¬
скими веществами — эфиром, фенолом, формалином, спиртом, аце¬
тоном, мертиолятом и др. Предпочтительным является формалин,
гак как он способен не только убивать микробную клетку, но и инак¬
тивировать микробные токсины и превращать их в так называемый
анатоксин.Инактивацию культуры микроорганизмов осуществляют путем
добавления к ней формалина с содержанием формальдегида 36 % и
выдержки ее при 37 °С в течение нескольких часов или суток. Боль¬
шинство формализованных вакцин являются концентрированными,
выросшую бактериальную массу концентрируют с использованием
сепараторов. Осажденную бактериальную массу выгружают в гомоге¬
низатор, где ее стандартизируют путем разбавления формалинизиро-
ВДнным физиологическим раствором до необходимой концентрации,
и затем смешивают с адъювантом, который одновременно является и
сорбентом микробных клеток. В качестве сорбентов наиболее часто
используют гидроксид алюминия (ГОА), алюмокалиевые квасцы,
маслоланолиновую смесь и др. Смысл использования указанных де¬
понентов заключается в том, что высокоочищенный концентриро¬
ванный препарат, введенный в организм без депонента, быстро выво¬
дится из него, не обеспечивая должного иммунологического ответа.21-4266	321
Антиген, введенный вместе с депонентом, задерживается на месте
введения (в депо), что обеспечивает создание иммунитета большей
напряженности и значительной длительности.После соединения бактериальной массы с адъювантом вакцину
фасуют во флаконы, закрывают их пробками из нейтральной резины
и для герметичности обкатывают алюминиевыми колпачками. На;
флаконы наносят этикетки с указанием биофабрики-изготовителя*
названия препарата, способа его применения и дозировки. После
этого препарат сдают на контроль.5.8.	МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, КОНЦЕНТРИРОВАНИЯИ ВЫСУШИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПРОДУКТОВМИКРОБНОГО СИНТЕЗА	;1В культуральной жидкости после окончания процесса фермента-;
ции содержатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, ;
остатки питательной среды, пеногаситель, растворимые и нераство-:
римые вещества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непо¬
средственно сами микроорганизмы либо их метаболиты, растворен-:
ные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток мик- |
роорганизмов.Почти во всех случаях для получения целевого продукта необхо-:
димо отделить взвешенную фазу —массу микроорганизмов — от;
культуральной жидкости.Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и
содержат большое число компонентов, многие из которых обладают!
близкими физико-химическими свойствами.Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами,;
белками и другими органическими веществами культуральные жид¬
кости содержат в значительном количестве полидисперсные колло¬
идные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только:
многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная j
фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганиз- j
мов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питатель¬
ных средах, — муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т. п.Содержание микроорганизмов в культуральной жидкости, как
правило, очень низкое. В 1 л содержится обычно 5—10 г сухой био¬
массы. Отделение такого количества взвешенной фазы — трудная
технологическая задача, которую приходится решать путем концен¬
трирования биомассы различными способами (флотирование, сепа-;
рирование, упаривание).322
В производственных условиях приходится затрачивать значитель¬
ное количество энергии на обработку больших объемов труднофильт-
руемых суспензий.Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от
культуральной жидкости можно разделить на механические (отстаи¬
вание, фильтрование, центрифугирование) и теплотехнические
(сушка).В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания
л их способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения
биомассы предварительно оценивают экономичность выбранного
способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации
микроорганизмов в культуральной жидкости и др.Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза
нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки,
например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению
pH среды, к многим физическим и химическим воздействиям. Очень
часто выделить целевой продукт одним методом практически невоз¬
можно, поэтому применяют комбинацию нескольких методов.Вьщеление и концентрирование микроорганизмов и продуктов мик¬
робного синтеза. При выборе метода выделения и концентрирования
того или иного продукта микробиологического синтеза необходимо
учитывать следующие факторы: физико-химические свойства куль¬
туральной жидкости; свойства выделяемого продукта (термолабиль¬
ность, стойкость к различным химическим агентам и др.); требования
к конечной форме продукта (степень чистоты и концентрирования);
технологические и технико-экономические показатели (выход про¬
дукта, производительность оборудования, необходимость дальней¬
шей обработки и др.).Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза
из культуральной жидкости делят на две группы:1)	экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация, если
целевой продукт в растворе;2)	осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирова¬
ние, если целевой продукт в виде твердой фазы.Часто невозможно выделить целевой продукт при помощи одного
метода, тогда применяют комбинацию нескольких методов и в про¬
цессе выделения переводят продукт из растворимой формы в нерас¬
творимую (или наоборот). Как правило, при выделении растворен¬
ных веществ культуральную жидкость подвергают предварительной
обработке и очистке при помощи осаждения, фильтрования, центри¬
фугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиа-
лиз, ультра- и микрофильтрация).323
Осаждение (седиментация) — это процесс расслоения дис¬
персных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной
фазы в виде осадка. Простейший случай седиментации — отстаива¬
ние применяют в следующих случаях:1)	при диаметре частиц более 3 мкм, когда броуновское движение
не оказывает существенного влияния на процесс отстаивания;2)	при выделении стабильных продуктов, когда фактор времени
не имеет решающего значения;3)	при более низких, чем при других методах, затратах;4)	в особых случаях, когда необходимо разделить частицы на
фракции по размеру или плотности на основании их различных ско¬
ростей осаждения;5)	если необходимо предварительно разделить суспензию на две
фракции — осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем
можно обрабатывать на различном оборудовании.Скорость осаждения биомассы из культуральной жидкости неве¬
лика и составляет порядка 10-6—10“ м/с.Дня ускорения процесса осаждения применяют:1)	коагулянты — вещества, переводящие взвешенные частицы в
агрегатно-неустойчивое состояние;2)	флокулянты — вещества, способствующие разрушению колло¬
идных структур и образованию крупных хлопьев.В качестве коагулянтов применяют обычно желатин, рыбный
клей, казеин, в качестве флокулянтов — метилцеллюлозу, пектин,
альгинат натрия и др.Центрифугирование — это разделение неоднородных
систем под воздействием поля центробежных сил. Для центрифуги¬
рования применяют центрифуги различных конструкций.Центрифуги, имеющие высокий фактор разделения и оснащен¬
ные тарельчатым барабаном, называют сепараторами. В микробио¬
логической промышленности сепараторы являются одним из самых
распространенных типов центрифуг. Они позволяют сконцентриро¬
вать осадок до влажности 60—90 %.В последние годы появились специальные герметичные сепарато¬
ры, позволяющие вести процесс сепарирования в автоматизирован¬
ном режиме, оптимально подобранном для специфических условий
конкретных культуральных жидкостей.Области применения центрифугирования:1)	выделение биомассы из культуральной жидкости (дрожжи,
бактерии, грибы);324
2)	отделение различных целевых продуктов микробиологическо-
, о синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и др.), переведенных
предварительно в твердую фазу;3)	разделение эмульсий, образующихся при экстракции.Главные достоинства центрифугирования и сепарирования —высокая производительность и высокая степень концентрирова¬
ния — позволяют успешно конкурировать с другими способами вы¬
деления и концентрирования как в промышленных, так и в лабора¬
торных условиях.Фильтрование — это разделение твердой и жидкой фаз
суспензии при пропускании ее через пористую перегородку.Конечная цель фильтрования — получение твердой или жидкой
фазы (когда одна из них является отходом), а также одновременное
получение твердой и жидкой фаз.Фильтрование — гидродинамический процесс, скорость которо¬
го прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обе¬
им сторонам фильтровальной перегородки, и обратно пропорцио¬
нальна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении
через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.На процесс фильтрования влияет ряд факторов, которые можно
разделить на две группы:1)	макрофакторы — разность давлений, толщина слоя осадка,
вязкость жидкой фазы и др. — заведомо известны и контролируются
приборами;2)	микрофакторы — размер и форма частиц осадка и пор фильт¬
ровальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на
поверхности частиц и др. — менее изучены и их характеризуют лишь
косвенными методами. Именно микрофакторы оказывают решаю¬
щее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его масштаби¬
рование.При фильтровании культуральной жидкости образуются большей
частью студенистые хлопьевидные или мелкозернистые осадки, об¬
ладающие большим сопротивлением. Средняя скорость фильтрации
при этом составляет всего 50 л/м2 в час.Для увеличения скорости фильтрования обычно используют два
приема: предварительная обработка суспензий; применение вспомо¬
гательных фильтровальных материалов.Предварительная обработка культуральной жидкости позволяет
более полно перевести целевой продукт в жидкую или твердую фазу,
обеспечить лучшее разделение фаз и получить продукт, годный для
дальнейшей очистки и выделения. В результате предварительной об¬
работки происходит коагуляция взвешенных частиц.325
Наиболее распространены следующие способы предварительной
обработки:1)	кислотная коагуляция (применяется для выделения антибио¬
тиков, стойких к низким pH);2)	обработка электролитами;3)	тепловая коагуляция (возможна в тех случаях, когда продукт
стоек к нагреванию до 70—80 °С);4)	образование наполнителей при добавлении химических аген¬
тов.В качестве вспомогательных фильтровальных материалов ис¬
пользуются фильтровальные порошки, которые вносят в фильтруе¬
мую жидкость как наполнители или предварительно наносят на рабо¬
чую поверхность фильтра в виде грунтового слоя.Экстракция — процесс разделения смеси твердых и жидких
веществ при помощи избирательных (селективных) растворителей.
Физическая сущность экстракции состоит в переходе извлекаемого
компонента из одной фазы (жидкой или твердой) в фазу жидкого экс¬
трагента при их взаимном соприкосновении. Экстрагируемые ком¬
поненты переходят из исходного раствора в растворитель вследствие
разности концентраций, поэтому данный процесс относится к числу
диффузионных.Процесс экстракции проводится обычно в двухфазных системах:
твердое тело — жидкость или жидкость — жидкость.Область применения экстракции: выделение и очистка антибио¬
тиков, витаминов и аминокислот.Ионообмен представляет собой сорбционный процесс.Адсорбция — это процесс поглощения одного или несколь¬
ких компонентов целевого продукта из газовой смеси или раствора
твердым веществом — адсорбентом.Процессы адсорбции (как и другие процессы массопередачи) из¬
бирательны и обычно обратимы. Благодаря этому становится воз¬
можным выделение поглощенных веществ из адсорбента, т. е. прове¬
дение процесса десорбции.Первые сорбционные методы выделения и очистки биологически
активных веществ и антибиотиков были основаны на применении
молекулярных сорбентов (активированные угли, оксид алюминия и
др.). Молекулярные сорбенты одинаково хорошо сорбируют выде¬
ляемое вещество и ряд примесей.В настоящее время разработаны ионообменные сорбенты (иони¬
ты), которые характеризуются различной избирательностью и высо¬
кой специфичностью.326
Иониты — это органические и неорганические вещества, практи¬
чески нерастворимые в воде и обычных растворителях, которые со¬
держат активные (ионогенные) группы с подвижными ионами, спо¬
собные обменивать эти ионы на ионы электролитов при контакте с их
растворами.Наиболее перспективны синтетические ионообменные смолы
(К.У-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-17, ЭДЭ-10 и др.).В зависимости от наличия ионогенных групп иониты можно раз¬
делить на два основных класса:1)	ионообменные сорбенты, содержащие кислотные группы —
катиониты (нерастворимые кислоты);2)	ионообменные сорбенты, содержащие основные группы —
аниониты (нерастворимые основания).Иониты нашли широкое применение в технологии производства
антибиотиков на этапе их сорбции из культуральной жидкости.Кристаллизация — это выделение твердой фазы в виде
кристаллов главным образом из растворов и расплавов. Кристаллиза¬
ция антибиотиков и других биологически активных веществ основа¬
на на резком уменьшении их растворимости в результате изменения
температуры раствора (обычно понижения, но иногда, например, в
случае эритромицина — повышения) или перевода их в другую плохо
растворимую химическую форму. Последнее достигается изменени¬
ем pH раствора или добавлением соответствующего реагента, часто с
одновременным снижением температуры.Кристаллизация является не только способом получения анти¬
биотиков в твердом виде, но и очень эффективным средством очист¬
ки от сопутствующих примесей, что является существенным преиму¬
ществом по сравнению с некоторыми другими методами разделения.Метод кристаллизации нашел применение в технологии получе¬
ния антибиотиков (тетрациклина, эритромицина и др.), витаминов,
полисахаридов.Упаривание — это процесс концентрирования жидких рас¬
творов путем частичного удаления растворителя испарением при на¬
гревании жидкости. В ряде случаев упаренный раствор подвергают
последующей кристаллизации.Концентрированные растворы и твердые вещества, получаемые в
результате упаривания, легче и дешевле перерабатывать, хранить и
транспортировать.Обычно упаривание в производстве антибиотиков осуществляют
при 60—70 °С под вакуумом, поэтому данный метод недопустим при
переработке термолабильных биологически активных веществ.327
Мембранные методы разделения. К мембранным методам разделе¬
ния относятся диализ и электродиализ; обратный осмос; микро¬
фильтрация; ультрафильтрация. В основе этих методов лежит явле¬
ние осмоса — диффузия растворенных веществ через полупроницае¬
мую перегородку, представляющую собой мембрану с большим коли¬
чеством (до 10 —101 на 1 м2) мелких отверстий — пор, диаметр
которых не превышает 0,5 мкм.Под мембраной принято понимать высокопористую или беспо-
ристую плоскую или трубчатую перегородку, выполненную из поли¬
мерных или неорганических материалов и способную эффективно
разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолеку¬
лы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или растворе. Ис¬
пользование мембран позволяет создавать экономически высокоэф¬
фективные и малоотходные технологии.Среди мембранных процессов особенно интенсивно развиваются
баромембранные. Если обратный осмос изучен достаточно полно, то
существенно в меньшей мере это касается микрофильтрации и тем
более ультрафильтрации, несмотря на ее очевидную перспектив¬
ность. Границы баромембранных методов разделения четко не опре¬
делены, что, по-видимому, принципиально невозможно, поскольку
микро- и ультрафильтрация и обратный осмос в широких пределах
перекрываются как в отношении их физико-химического описания,
так и решаемых задач. Следовательно, приведенная классификация
барометрических методов разделения в значительной мере условна.
Тем не менее каждый из указанных методов имеет свои характерные
особенности, на основании которых предложено несколько их клас¬
сификаций.Микрофильтрация, в основном, является гидродинамическим
процессом, близким к обычной фильтрации. Специфическая осо¬
бенность микрофильтрации — использование мембран с диаметром
пор от 0,1 до 10 мкм для отделения мелких частиц твердой фазы, в том
числе микроорганизмов, в этом случае ее называют стерилизующей
фильтрацией. Поэтому в отличие от процесса фильтрации при мик¬
рофильтрации явления диффузии (особенно при небольших разме¬
рах пор от 0,1 до 0,5 мкм) также играют определенную роль.В основе ультрафильтрации лежит использование мембран с диа¬
метром пор от 0,001 до 0,1 мкм. Ультрафильтрация применяется для
разделения клеток и молекул.Мембранные методы разделения, применительно к биологиче¬
ским суспензиям, обладают рядом преимуществ:1)	концентрирование и очистка осуществляются без изменения
агрегатного состояния и фазовых превращений;328
2)	перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и хими¬
ческим воздействиям;3)	механическое и аэродинамическое воздействие на биологиче¬
ский материал незначительно;4)	легко обеспечиваются герметичность и асептические условия;5)	аппаратурное оформление компактно по конструкции, отсут¬
ствуют движущиеся детали;6)	процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве
случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов.Высушивание микроорганизмов и продуктов микробного синтеза.
Необходимость стабилизации материалов биологического происхо¬
ждения, связанная с их чрезвычайной нестойкостью, возникла на
заре биологической науки. Известно, что в обычных условиях про¬
должительность сохранения большинства биологических продуктов
исчисляется несколькими днями. В связи с этим разрабатывались
различные способы консервирования биологических препаратов, ко¬
торые в настоящее время можно разделить на:—	консервирование при положительных температурах при помо¬
щи химических соединений (хлороформ, фенол, глицерин, форма¬
лин и т. д.);—	консервирование при низких температурах (замораживание);—	консервирование высушиванием.Высушивание является одним из наиболее совершенных процес¬
сов стабилизации свойств продуктов биологического (растительного,
животного, микробиологического) происхождения и позволяет со¬
хранять данные продукты в обычных условиях длительное время.
Кроме того, существенно уменьшенная масса позволяет значительно
снизить транспортные расходы и затраты на тару.Необходимо отметить, что обезвоживание — трудный технологи¬
ческий процесс, который часто является решающим этапом произ¬
водства, влияющим на качество выпускаемой продукции. Достоин¬
ством искусственного высушивания являются значительно меньшие
затраты времени на удаление влаги. Процесс сушки — это разнооб¬
разный комплекс тепловых, диффузионных, часто биологических и
химических явлений (особенно, когда дело касается интенсивной
сушки). Препараты биологического происхождения обычно пред¬
ставляют собой сложные объекты сушки, характеризующиеся рядом
показателей, важнейшими из которых являются начальная, конечная
и равновесная влажность, термические, электрофизические, струк¬
турно-механические и массообменные характеристики. Разнообра¬
зие свойств продуктов требует индивидуального подхода к разработке329
рациональных методов их сушки (с учетом требований к качеству го¬
тового изделия).Устойчивость термолабильных препара¬
тов биологического происхождения к факто¬
рам высушивания. Исходя из свойств материалов биологи¬
ческого происхождения необходимо выбирать оптимальные режимы
высушивания с учетом допустимой температуры нагрева материала,
т. е. температуры, при которой высушенный продукт получается
стандартного качества и обладает наилучшими технологическими
свойствами.Основными характеристиками термолабильных материалов мик¬
робиологического, растительного и животного происхождения как
объектов сушки являются:—	термостойкость — способность материала противостоять на¬
греву до температуры, при которой происходит необратимое измене¬
ние его качества (разрушение физической или химической структу¬
ры);—	термостабильность — способность материала длительное вре¬
мя выдерживать нагревание при определенной температуре без изме¬
нения свойств продукта (без его разложения).Материалы нетермостойкие и нетермоста¬
бильные в общем случае называют термола¬
бильными. Различная природа объектов сушки обусловила вы¬
бор диапазонов температур и экспозиций нагрева с учетом макси¬
мального сохранения числа жизнеспособных микроорганизмов и
биологической активности продуктов.Известно, что для вегетативных культур микроорганизмов термо¬
стойкость определяется в пределах 40—60 °С, а для спорообразующих
форм бактерий, антибиотиков и аминокислот — в диапазоне 80—
200 °С, дальнейшее повышение температуры ведет к полной инакти¬
вации клеток.Антибиотики и спорообразующие микроорганизмы при сравни¬
тельно мягком температурном режиме (110 °С) в течение первых 30 с
сохраняют активность на уровне 100 %, увеличение длительности до
60 с приводит к понижению активности на 25—40 %, за 15 мин нагре¬
ва при той же температуре активность падает на 60—65 %. В то же вре¬
мя кратковременный нагрев позволяет сохранить высокую актив¬
ность вещества (до 90 %) даже при 150 °С, правда при этой температу¬
ре резче проявляется отрицательное влияние продолжительности на¬
грева.Вегетативные бактерии при 40 °С сохраняют практически 100 %
жизнеспособных клеток. Повышение температуры до 60 °С и кратко¬330
временный контакт с теплоносителем (15 с) приводит почти кполной
гибели микроорганизмов (выживаемость не более 6—7 %).Термостойкость микроорганизмов и клеток зависит от ряда
внешних и внутренних факторов, состава среды выращивания, тем¬
пературы нагрева, влажности и кислотности среды, возраста куль¬
туры и особенностей химического состава клеток, условий фермента¬
ции и пр. Так, предполагается, что температура роста некоторым об¬
разом влияет на физико-химические свойства клетки, изменяя ее
стойкость к нагреву.Одним из важнейших факторов, влияющих на термоустойчивость
микроорганизмов, являются содержание и состояние внутриклеточ¬
ной воды. Экспериментально показано, что различие в термостойко¬
сти спор и вегетативных клеток связано, в первую очередь, не с коли¬
чеством воды, а с состоянием, в котором она находится или, иными
словами, с формой связи воды с твердым веществом. Уменьшение
свободной влаги в спорах предотвращает коагуляцию белка и способ¬
ствует повышению термоустойчивости спор. Но вместе с тем при
чрезмерном обезвоживании происходит дегидрационная инактива¬
ция микроорганизмов и клеток, жизнеспособность при этом сохра¬
няют наиболее выносливые.Помимо пагубного воздействия на клетку высоких положитель¬
ных температур резкое охлаждение также ведет к гибели биологиче¬
ских систем. У большинства клеток наступает «температурный шок»,
который ведет к необратимым структурным изменениям. Механизм
воздействия «температурного шока» в результате быстрого и сверх¬
быстрого охлаждения большинство исследователей объясняют быст¬
рыми физико-химическими, структурными и физиологическими из¬
менениями, возникающими в замораживаемом продукте. Эти изме¬
нения сопровождаются увеличением концентрации солей, повыше¬
нием осмотического давления и кристаллизацией воды внутри
клеток. Влияние данных факторов ведет к механическому поврежде¬
нию клеток и денатурации белка. Избежать температурного шока
можно путем медленного снижения температуры, что ослабляет ин¬
тенсивность изменения осмотического давления вследствие диффу¬
зии воды и кристаллизации ее в межклеточных пространствах. Это
явление называют Холодовой адаптацией.В процессе обезвоживания помимо температуры на микроорга¬
низмы оказывает воздействие давление. Экспериментально показа¬
но, что биологические препараты сохраняют жизнеспособность как
при избыточном давлении, так и в глубоком вакууме. Поэтому дан¬
ный фактор при сушке термолабильных препаратов не играет сущест¬
венной роли, так как давление (вакуум), создаваемое современными331
сушильными установками, на порядок ниже величины, при которой
происходит гибель микроорганизмов. Для снижения влияния нега¬
тивных факторов обезвоживания на жизнеспособность клеток и мик¬
роорганизмов разрабатывают для каждого из объектов сушки защит¬
ные среды. Защитные среды обычно представляют собой водные рас¬
творы, содержащие углевод, коллоид, окислитель и т. п. В качестве
углеводов используют полисахара (лактоза, галактоза и т. д.), которые
не принимают участия в метаболизме данного объекта и в процессе
сушки противостоят денатурации белка, замещая ОН-группу удаляе¬
мой воды. Коллоид, которым является высокомолекулярное вещест¬
во (желатин, полиглюкин и т. д.), создает структуру высушиваемого
вещества и регулирует скорость удаления влаги.Антиокислитель (аскорбиновая кислота, тиомочевина) блокирует
запуск окислительно-восстановительных реакций, возникающих в
процессе удаления влаги.Следовательно, помимо отработки режимов процесса сушки про¬
водят и отработку оптимального состава среды высушивания, прием¬
лемого для данного объекта.В настоящее время различают естественную сушку на открытом
воздухе и искусственную, в специальных устройствах с организован¬
ным и регулируемым подводом сушильного агента. По мнению ряда
авторов наиболее широкое внедрение на практике получили следую¬
щие методы сушки: лиофильный (сублимационный); конвективный;
контактный; терморадиационный; токами высокой частоты; комби¬
нированный.Одним из основных методов консервирования биопрепаратов,
позволяющих длительное время сохранять их активность, является
метод лиофильного высушивания. Он позволяет
сохранить практически без изменения первоначальные свойства жи¬
вых и реже инактивированных вакцин — диагностических и лечеб¬
ных сывороток, антигенов и других биологически активных препара¬
тов, используемых для профилактики, диагностики и лечения.Лиофильное высушивание состоит из двух приемов консервиро¬
вания — замораживания и высушивания. Влагу из замороженных
препаратов удаляют с использованием глубокого вакуума, минуя
жидкую фазу. В процессе сушки влага перемещается в препарате не в
виде жидкости, а в виде пара. В результате удается максимально со¬
хранить специфические свойства белков, свести к минимуму их дена¬
турацию, обеспечить живым клеткам и вирусам состояние длитель¬
ного анабиоза, что позволяет получить стандартизированные по ак¬
тивности биопрепараты.332
Консервирование биопрепаратов методом л иофильного высуши¬
вания имеет ряд преимуществ перед другими методами: снижается
масса биопрепарата; длительное время сохраняется исходная актив¬
ность (вакцин — до 12— 18 мес, сывороток — до 2—3 лет); прекраща¬
ется рост микробных контаминантов; высушенные препараты можно
хранить при 4—8 °С, допускается кратковременное повышение тем¬
пературы до 10— 15°С (на период транспортировки до 7 дней).Для лиофилизации биопрепаратов используют промышленные и
лабораторные аппараты. Из промышленных установок получили
распространение MAC-50, KS-30 (Чехословакия) и TG-50 (Герма¬
ния), из лабораторных TG-2, TG-10, TG-16 (Германия), ОЕ-960,
ОЕ-950 (Венгрия), LZ-45, LZ-90, LZ-92 (Чехословакия) и др. Эти ус¬
тановки комплектуются холодильными и вакуумными агрегатами.Технологический процесс лиофилизации включает ряд этапов.1.	Подготовка материала для сушки и выбор соответствующего
криопротектора (компонентов среды высушивания).2.	Подготовка аппарата для высушивания (охлаждение рассола).3.	Предварительное охлаждение препарата, подлежащего сушке,
после расфасовки в ампулы или флаконы. Определение эвтектиче¬
ских температур.4.	Сублимация и досушивание препарата при подогреве. Замора¬
живание и высушивание осуществляются по установленным режи¬
мам.5.	Вакуумная или обычная укупорка после сушки, т. е. создание
условий для длительного хранения сухих препаратов.6.	Определение активности, стерильности или наличия посто¬
ронних контаминантов, остаточной влажности и другие показатели
согласно техническим условиям.При замораживании биопрепаратов изменяются осмотическое
давление и концентрация водородных ионов, что может привести к
повреждению клеточных биомембран. Вещества, снижающие или
предотвращающие эти повреждения, были названы «криопротекто¬
ры» и первоначально использовались для длительного хранения му¬
зейных штаммов микроорганизмов. Они были подобраны эмпириче¬
ски и являются предметом изучения криобиологии, т. е. науки об ис¬
пользовании пониженных температур в биологических исследовани¬
ях и влиянии низких температур на живые системы, выяснении
причин устойчивости организмов к переохлаждению и замерзанию.Первоначально для этих целей использовали глицерин, позд¬
нее — диметилсульфоксид. Однако эти вещества не подходят для ис¬
пользования при лиофилизации. К настоящему времени разработа¬
ны требования к защитным веществам используемых для лиофилиза-333
ции вакцин и диагностических компонентов. В последнем случае
требования несколько снижены.Ввиду многообразия применяемых криозащитных сред их клас¬
сифицируют по отношению к мембранному аппарату клетки на про¬
никающие внутрь клетки — эндоцеллюлярные и непроникающие —
экзоцеллюлярные. Последние адсорбируются на внешней оболочке
клетки и снижают ее проницаемость для воды и биологически актив¬
ных веществ, замедляют процессы образования внутриклеточного
льда, защищают мембраны от механических повреждений растущи¬
ми кристаллами льда.Требования, предъявляемые к защитным средам, используемым
при лиофилизации вакцин: атоксичность; отсутствие антигенных
свойств; адъювантное действие; компоненты среды должны служить
структурирующим (опорным) материалом; среда должна ингибиро¬
вать гидролитические ферменты в биоматериале и обладать анти-
окислительной активностью.Практически всем этим требованиям соответствуют следующие
вещества: лактоза, сахароза, манитолл, сорбитол, пептон, белковые
гидролизаты, декетран желатина, поливинилпиромидон, глутамат
натрия, аминокислоты, тиомочевина и другие соединения. Большое
значение для повышения защитных свойств среды имеет добавление
катионов магния и кальция, оказывающих стабилизирующее влия¬
ние на мембранный аппарат клетки.Средняя скорость замораживания биопрепаратов перед сушкой
составляет 0,5—1 °С в минуту. Полное замораживание происходит
при температуре минус 32—39 °С. Материал замораживают непосред¬
ственно в камере или в специальных замораживателях, откуда его пе¬
реносят в камеру лиофильной сушки и высушивают по разработанно¬
му в экспериментальных условиях графику.Объем материала должен составлять 20—30 % объема ампулы или
флакона либо не должен превышать 0,5—0,6 % столба замороженного
биоматериала к диаметру флакона.После размещения в камере кассет с материалом, подлежащим
сушке, ее герметично закрывают, доводят температуру в соответствии
с графиком до необходимой и выдерживают 3—6 ч, создают вакуум и
начинают подогревать полки либо подавать тепло со скоростью
0,5—1,5 °С в час. С этого времени начинается сублимационная сушка,
т. е. удаление паров влаги из замороженного материала при помощи
вакуума. Вакуум достигает 5—6 Па, или 0,036—0,046 мм рт. ст.Собственно сублимацию условно подразделяют на два этапа:
сушка при минусовой температуре при повышении температуры на
1—2°С в час; сушка при плюсовой температуре. Иногда эти этапы на¬334
зывают периодом удаления из материала свободной влаги и периодом
удаления связанной влаги.Первый период заканчивается, когда температура материала при¬
ближается к нулю градусов. Во втором периоде досушивания темпе¬
ратуру поднимают до конечной температуры препарата, равной плюс
25—28 °С. Как правило, продолжительность первого периода значи¬
тельно больше второго. В первом периоде удаляется до 90 % влаги, во
втором остаточная влажность составляет 1—4 %. Признаком оконча¬
ния второго периода является достижение заданной температуры и
удержание ее на этом уровне 1—3 ч, при этом вакуум в системе посто¬
янно поддерживается на минимальном уровне. После окончания
сушки прекращают нагрев и выключают вакуум-насос, постепенно
уменьшают вакуум, впуская через специальный фильтр стерильный
атмосферный воздух либо инертный газ, обеспечивающий более дли¬
тельное хранение материала при плюсовых температурах.Сухой материал в ампулах запаивают под вакуумом, во флако¬
нах — герметически укупоривают, предварительно заполнив их
инертным газом (аргон, неон, азот).Качество высушенного биоматериала оценивают по внешнему
виду, наличию вакуума, величине остаточной влажности, биологиче¬
ской активности и другим показателям согласно нормативно-техни-
ческой документации.Сухой препарат должен иметь вид таблетки, однородной по цвету
и структуре. Остаточную влажность определяют по стандартной ме¬
тодике (метод определения влажности сухих биопрепаратов см.
ГОСТ 24061-80).Специфическую активность определяют по конкретной методике
в зависимости от вида биопрепарата — титр вируса, концентрация
жизнеспособных или споровых форм микроорганизмов, активность
ферментов, наличие посторонней микрофлоры, иммуногенная ак¬
тивность и др.Конвективный метод высушивания является
самым распространенным в биологической промышленности, на
нем основана работа подавляющего большинства сушильных устано¬
вок. В качестве сушильного агента применяют нагретый воздух, то¬
почные газы или перегретый пар. Сушильный агент передает теплоту
материалу, под действием которого из материала удаляется влага в
виде пара в окружающую среду. Таким образом, сушильный агент
при конвективной сушке является теплоносителем и влагопоглотите-
лем.Конвективный метод нашел применение в камерных сушильных
установках. В таких аппаратах сушка материала производится перио¬335
дически при атмосферном давлении. Сушилки имеют одну или не¬
сколько камер, в которых высушиваемый материал в зависимости от
его вида располагается на сетках, противнях, шестах и т. д. и сушится
в неподвижном состоянии. Поток нагретого воздуха проходит вдоль
высушиваемого продукта и испаряет из него влагу.Камерными сушильными установками непрерывного действия
являются туннельные сушилки, работающие при атмосферном дав¬
лении. Камеры представляют собой длинный герметично закрытый
тоннель, в котором высушиваемый материал перемещается прямо-
ил и в противотоке сушильного агента, на кюветах или по ленте транс¬
портера.В сушильной технике также используют барабанные сушильные
установки, представляющие собой полый цилиндр с внутренней на¬
садкой для непрерывного пересыпания и перемешивания высуши¬
ваемого материала, в который подается теплоноситель.Многие из ранее применявшихся конвективных сушильных уста¬
новок успешно вытесняются сушилками с использованием псевдо-
ожиженного (кипящего) слоя и его модификаций. Псевдоожижен-
ный (кипящий) слой широко используется для интенсификации про¬
цессов сушки сыпучих, хорошо псевдоожижаемых газом материалов.
Модификации кипящего слоя связаны, главным образом, с различ¬
ными механическими побудителями, которые способствуют дости¬
жению равномерного и устойчивого псевдоожижения, ликвидации
каналообразования и комкования материала, увеличению поверхно¬
сти фазового контакта и относительной скорости движения фаз. Роль
механических побудителей очень велика, они позволяют значитель¬
но расширить область эффективного применения кипящего слоя.
Появляются аппараты, позволяющие добиться устойчивой гидроди¬
намики: сушилки с виброкипящим слоем, сушилки со слоем инерт¬
ной насадки, работающие в кипящем и фонтанирующем слоях.Принцип данного метода состоит в том, что жидкий, гранулиро¬
ванный или пылевидный продукт воздушным потоком взрыхляется и
переводится во взвешенное состояние. Необходимый для этого воз¬
душный поток создается вентилятором. Засасываемый снаружи или
из рабочего помещения воздух подается сначала в воздушный нагре¬
ватель, где нагревается до требуемой температуры. Одновременно
производится фильтрование воздуха от находящихся в нем посторон¬
них частиц, затем поток горячего воздуха проходит снизу вверх через
находящийся в продуктовой емкости материал и в кратчайший срок
отнимает у него влагу. Дно продуктовой емкости представляет собой
перфорированную поверхность, которая покрыта металлической
сеткой из нержавеющей стали с тончайшими отверстиями. В зависи¬336
мости от выбора конструкции дна и скорости движения воздушного
потока можно увеличивать взвихрение материала. Готовый продукт
улавливается циклонами и собирается в сборники. Расположенный
над продуктовой емкостью фильтр предотвращает унос потоком воз¬
духа частичек даже тончайшего помола.Среди сушилок кипящего слоя можно выделить четыре основные
группы. К первой группе относятся сушилки, предназначенные для
сравнительно хорошо сжижаемых материалов, способных образовать
кипящий слой и без механических побудителей. Вместе с тем введе¬
ние в кипящий слой механических побудителей типа медленно вра¬
щающихся мешалок, шнеков и вращающихся решеток позволяет
улучшить его структуру, уменьшить канальный проскок, повысить
стабильность кипения и интенсифицировать процесс сушки.Во вторую группу входят сушилки, предназначенные для продук¬
тов, которые без механических побудителей не способны образовать
кипящий слой, хотя и являются дисперсными или кусковыми мате¬
риалами. Введение в слой быстро вращающихся мешалок — дезагре¬
гаторов или измельчителей позволяет создать устойчивый кипящий
слой и получить высушенный продукт требуемой дисперсности.К третьей группе относятся сушилки для паст, супензий и раство¬
ров, в которых механический побудитель — инертная насадка (ино¬
гда в сочетании с перемешивающими устройствами) является един¬
ственным источником создания кипящего слоя.Четвертую группу составляют вибросушилки, в которых механи¬
ческим побудителем служит вибрационное колебание корпуса су¬
шилки или погруженные в слой вибрирующие поверхности нагрева.Широкое внедрение метода сушки во взвешенном слое обуслов¬
лено следующими основными достоинствами:—	высокая интенсивность процессов переноса, достигаемая за
счет развитой удельной и суммарной поверхностей тепло- и массооб-
мена при непрерывном обновлении активной поверхности фазового
контакта и высоких значений коэффициента эффективной тепло¬
проводности и теплоотдачи;—	изотермичность системы, достигаемая в результате интенсив¬
ного перемешивания твердой фазы, что предотвращает локальный
перегрев частиц;—	сравнительно простое конструктивное оформление аппаратов
и возможность регулирования режима их работы;—	возможность создания многоступенчатых аппаратов, что по¬
зволяет повысить движущую силу процесса, улучшить равномер¬
ность сушки при автономном регулировании температурного режима337
в отдельных ступенях аппарата (это особенно важно при сушке тер¬
молабильных материалов).К основным недостаткам кипящего слоя следует отнести необхо¬
димость ограничения скорости сушильного агента величиной скоро¬
сти уноса материала, трудность обработки полидисперсных веществ,
механическое нарушение целостности частиц (истирание, слипа¬
ние). Таким образом, при склонности продукта к истиранию резко
возрастает пылеобразование и унос продукта. Если материал склонен
к образованию конгломератов, нарушается равномерное кипение
слоя, возможен локальный перегрев и термоинактивация продукта.Одним из наиболее эффективных способов конвективной сушки
жидких материалов является распылительное высушивание, которое
используется главным образом в тех случаях, когда желателен кратко¬
временный контакт продукта с теплоносителем и необходимо произ¬
водить высушивание непосредственно из раствора. Например, рас¬
пылительные сушилки применяют для сушки из растворов таких тер¬
молабильных продуктов, как экстракты лекарственных растений,
ферментные препараты, растворы сахаров, кровезаменители (бело¬
ксодержащие растворы) и в ряде других случаев.Высушивание распылением связано со следующими основными
процессами: распыление раствора; смешивание распыленных частиц
раствора с нагретым сушильным агентом; тепло- и массообмен меж¬
ду ними; выделение сухих частиц из потока сушильного агента.Совокупность этих процессов определяет эффективность и тех¬
нико-экономические показатели метода распыления. Одним из
принципиальных моментов распылительной сушки является получе¬
ние достаточно тонкого и равномерного диспергирования высуши¬
ваемого раствора. Средний диаметр капель при сушке распылением
обычно составляет 20—60 мкм.В сушильной технике существует три способа распыления раство¬
ров: механическими форсунками, пневматическими форсунками и
центробежными дисками, вращающимися с большой скоростью
(100-500 об/с).При сушке распылением большое значение имеет равномерное
распределение нагретого воздуха по всей камере. Равномерное рас¬
пределение газов в сушильной камере и быстрое смешение их с части¬
цами раствора зависит от правильно выбранного ввода воздуха в су¬
шильную камеру.В современных форсуночных сушилках, работающих по принци¬
пу смешанного или параллельного тока, наиболее распространен
тангенциальный ввод сушильного агента, чтобы получить закручен¬
ный поток воздуха и высушиваемых частиц. Такой ввод обеспечивает338
хорошее перемешивание газов с частицами раствора. В сушилках с
дисковыми распылителями газы вводятся вблизи диска в виде встреч¬
ного или параллельного потока, что зависит от расположения распы¬
лителя.В современных сушильных установках для очистки воздуха, выхо¬
дящего из сушильной камеры, используют в основном циклоны, ко¬
торые позволяют улавливать из воздуха 90—95% высушенного по¬
рошка. К преимуществам циклонов следует отнести не только высо¬
кую степень очищения газов от пыли, но и то, что улавливаемый по¬
рошок мгновенно ссыпается в приемник, избегая тем самым
дальнейшего воздействия повышенных температур.Контактный метод высушивания основывается
на передаче теплоты материалу при соприкосновении с горячей по¬
верхностью. В качестве греющего теплоносителя используют чаще
всего водяной пар, реже газы и высококипящие жидкости. Поток воз¬
духа (вакуум) при этом способе служит только для удаления водяных
паров из сушилки, являясь влагопоглотителем. По данным литерату¬
ры, коэффициент теплоотдачи при этом способе значительно выше,
чем при конвективной сушке.Простейшими контактными сушильными аппаратами являются
вакуум-сушильные шкафы периодического действия. Такая сушилка
представляет собой герметично закрывающуюся камеру, снабжен¬
ную рядом полок, внутри которых проходит теплоноситель. Высуши¬
ваемый материал укладывается непосредственно на полки, либо на
съемные противни. Образующиеся при сушке пары отсасываются ва-
куум-насосом. Будучи очень металлоемкими, эти сушилки в то же
время малопроизводительны, что объясняется неподвижностью слоя
высушиваемого материала и большей частью недостаточно полным
контактом с поверхностью нагрева.Широкое применение получили вальцовые сушильные установ¬
ки непрерывного действия различных конструктивных модифика¬
ций. В корпусе сушильной установки вращается полый барабан,
обогреваемый изнутри тепловым агентом. Исходный жидкий
материал непрерывно подается на барабан, где за один неполный
оборот последнего высушивается и срезается ножами. Для большей
производительности при контактном обезвоживании используются
двухвальцовые сушилки.Сущность терморадиационного метода сушки
состоит в том, что теплота материалу передается за счет невидимых
тепловых (инфракрасных) лучей. Инфракрасные лучи (ИКЛ) — это
лучи с длиной волны 0,77—340 мкм.339
По мнению ряда авторов при сушке ИКЛ к материалу подводится
тепловой поток в несколько десятков раз больше, чем при конвектив¬
ном способе, следовательно увеличивается и скорость сушки инфра¬
красными лучами по сравнению с конвективной, но не пропорцио¬
нально увеличению теплового потока. Так, например, для биологиче¬
ских препаратов растительного происхождения сушка ИКЛ ускоряет¬
ся по сравнению с интенсифицированными методами конвективной
сушки на 25—95%. Это можно объяснить тем, что скорость сушки за¬
висит не столько от скорости передачи теплоты, сколько от скорости
перемещения влаги внутри материала. Но в целях сохранения высо¬
ких химико-технологических показателей высушенного продукта
применение мощных потоков ИКЛ не рекомендуется.Для интенсификации терморадиационной сушки необходимо,
чтобы ИКЛ проникали в материал на возможно большую глубину,
что зависит как от пропускаемой способности материала, так и от
длины волны ИКЛ. Чем меньше длина волны, тем больше проникаю¬
щая способность инфракрасных лучей. Проницаемость материалов
зависит, в основном, от толщины слоя и влажности продукта.При сушке частиц биологических материалов, характеризующих¬
ся малой проницаемостью, может произойти быстрая сушка поверх¬
ностного слоя, и значительные градиенты температуры и влажности
внутри частиц материала приведут к вздутию и растрескиванию мате¬
риала.Известно, что при сушке инфракрасными лучами в материале
возникают перепады температур, под действием которых влага пере¬
мещается по направлению теплового потока вовнутрь материала.
Кроме того, влага частично испаряется с поверхности, в результате
возрастает градиент влагосодержания, величина которого становится
больше, и влага начинает перемещаться к наружной поверхности.Для материалов, у которых размер частиц больше глубины про¬
никновения инфракрасных лучей, рекомендуется прерывистое облу¬
чение. В период прекращения подачи ИКЛ температура на поверхно¬
сти частиц материала падает вследствие продолжающегося интенсив¬
ного испарения, температура внутри частицы больше, чем на поверх¬
ности, и влага начинает перемещаться из центральных слоев к
поверхностным под действием обоих градиентов: температуры и вла¬
госодержания.По характеру излучателей инфракрасных лучей различают термо¬
радиационные сушилки с электрическим и газовым обогревом. Су¬
шилки с электрическим обогревом компактны, просты в обращении
и эксплуатации, безинерционны. Однако высокий расход электро¬
энергии и неравномерность сушки ограничивают их применение.340
Наиболее широко используются на практике терморадиацион¬
ные сушилки с газовыми панельными излучателями.При сушке токами высокой частоты (частота коле¬
баний 10—3000 МГц) органический материал помещается между об¬
кладками конденсатора, к которым подается электрический ток вы¬
сокой частоты. Продукты биологического происхождения представ¬
ляют собой диэлектрики, имеющие некоторую проводимость, т. е.
обладающие свойствами полупроводников. В состав органических
материалов входят ионы электролитов, электроны, полярные и непо¬
лярные молекулы диэлектриков. Неполярные молекулы состоят из
жестких упругих диполей. Полярные молекулы с постоянным ди-
польным моментом ориентируются в электрическом поле. Под дей¬
ствием переменного электрического поля высокой частоты происхо¬
дит регулируемый нагрев материала.Обкладки конденсатора имеют противоположные заряды, по¬
этому электроны и ионы перемещаются внутри материала к той или
иной обкладке. При смене заряда на обкладках они перемещаются в
противоположных направлениях, в результате чего неизбежно возни¬
кает трение с выделением теплоты. Диполи в переменном электриче¬
ском поле будут колебаться то в одну, то в другую сторону, стремясь
занять положение относительно переменного поля. В результате та¬
ких колебаний диполей также возникает молекулярное трение с вы¬
делением теплоты. В полярных молекулах, состоящих из упругих ди¬
полей, кроме изменений ориентации молекул возможны и смещения
одних частей молекулы относительно других. Возникающий при
этом эффект деформации также сопровождается выделением тепло¬
ты за счет трения.Таким образом, энергия электромагнитных волн, затрачиваемая
на преодоление этих трений, будет переходить в теплоту.В электрическом поле высокой частоты нагрев частиц органиче¬
ского материала осуществляется за доли секунды. Поверхностные
слои материала теряют часть теплоты вследствие тепло- и влагообме-
на с окружающей средой, поэтому температура материала будет выше
внутри, чем снаружи. Под действием температурного градиента влага
изнутри перемещается к поверхности частиц.Преимущества сушки токами высокой частоты по сравнению с
конвективной и контактной состоят в возможности регулирования и
поддержания определенной температуры внутри материала и интен¬
сификации процесса. Однако большие затраты электроэнергии,
сложное оборудование и обслуживание, повышенные требования
техники безопасности ограничивают применение токов высокой час¬
тоты.341
В настоящее время для сушки термолабильных препаратов, кроме
рассмотренных выше методов, применяют их различные комбина¬
ции, которые позволяют достичь высокого качества получаемой про¬
дукции, повышения производительности и экономичности процес¬
са, уменьшения трудозатрат. Примерами комбинированных спосо¬
бов сушки могут служить распылительно-сублимационное высуши¬
вание, контактно-сорбционное обезвоживание.5.9.	НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В СОЗДАНИИ ВАКЦИНВакцинация — один из основополагающих способов борьбы с
инфекционными заболеваниями. Путем поголовной вакцинации
животных ликвидирована натуральная оспа, резко ограничено рас¬
пространение бешенства, ящура и многих других заболеваний. Суще¬
ственное экономическое значение имеет своевременная разработка
вакцин против болезней сельскохозяйственных животных и прово¬
димая с их помощью профилактика. Большинство вакцинных препа¬
ратов изготавливают на основе ослабленных или инактивированных
возбудителей болезней с использованием различных питательных
сред по общепринятым или вновь разработанным технологиям.Традиционные методы приготовления вакцинных препаратов
против инфекционных заболеваний подробно описаны в литературе.Современные биотехнологические разработки предусматривают
создание многочисленных вариантов вакцинных препаратов, наи¬
больший интерес из которых представляют рекомбинантные вакци¬
ны и вакцины-антигены. Вакцины обоих типов основаны на ген¬
но-инженерном подходе. Для получения рекомбинантных вакцин
обычно используют хорошо известный вирус коровьей оспы (осповак-
цины). В его ДНК встраивают чужеродные гены, кодирующие имму¬
ногенные белки различных возбудителей: гемаглютинин вируса
гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген ви¬
руса гепатита В, антиген малярийного плазмодия. К достоинствам
вакцин, полученных генно-инженерными методами, относится воз¬
можность создания поливалентных препаратов на основе объедине¬
ния участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса
осповакцины. Открывается возможность одномоментной комплекс¬
ной иммунизации крупного рогатого скота и других видов животных
против всех опасных инфекций данной местности.Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя болез¬
ни в Е. coli, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. В на¬
стоящее время клонирован ген поверхностного антигена HBS-вируса
гепатита (сывороточного гепатита), ген белка оболочки VP1 — вируса342
яшура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов. Методом
белковой инженерии удалось скомбинировать иммуногенные ком¬
поненты различных серотипов в рамках одной вакцин ы-ангтигена.Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевозке,
сравнительно просты в использовании (в том числе и при крупномас-
шатбном производстве), содержат минимальное количество белка и
поэтому малоопасны как аллергены. Они гарантированы от остаточ¬
ной вирулентности — способности вызвать инфекционную болезнь
вместо того, чтобы предохранять от нее. К сожалению, пока остается
проблема низкой иммуногенности вакцин-антигенов. Одной ее из
причин может быть то, что вакцина не включает всех компонентов
возбудителя, необходимых для создания иммунитета к нему. Так, ви¬
рус, покидая клетку, часто «одевается» ее мембраной. Компоненты
этой мембраны, отсутствующие в генно-инженерном белке, могут
обладать иммуногенными свойствами. Повышению иммуногенно¬
сти вацин-антигенов способствует добавление адьювантов, иммоби¬
лизация вакцин на носителях или их включение в липосомы. Боль¬
шинство экспериментальных подходов или направлений в биотехно¬
логических исследованиях связаны с медициной и ветеринарией, не
ослабевает внимание ученых к поиску новых антибиотиков, что свя¬
зано с токсичностью существующих препаратов, аллергическими ре¬
акциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных
микроорганизмов к применяемым препаратам, а также с необходи¬
мостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых
недостаточно эффективны известные антибиотики.Основными направлениями поиска в решении этой проблемы яв¬
ляются:—	испытание новых продуцентов, изучение микроорганизмов,
продуцирующих большое количество антимикробных агентов;—	химическая модификация антибиотиков в целях снижения их
токсичности для человека (например, амфотерицин В, используемый
по жизненным показателям при тяжелых микозах, вызывает необра¬
тимые поражения почек, получены метиловые эфиры амфотерици-
на, менее токсичные и сохраняющие противогрибковую активность;
при модификации пенициллинов и цефаллоспоринов используют
иммобилизованные ферменты);—	получение и применение мутантных штаммов, у которых бло¬
кирован синтез отдельных фрагментов молекул антибиотиков, ана¬
логи которых вносят в среду культивирования, микроорганизмы ис¬
пользуют эти аналоги для биосинтеза, в результате чего получают мо¬
дифицированный антибиотик;343
—	применение методов клеточной инженерии и получение гиб¬
ридных антибиотиков, например с новыми комбинациями агликона
сахаров;—	использование методов генетической инженерии — введение в
геном микроорганизма информации о ферменте, необходимом для
модификации продуцируемого антибиотика, например его метили¬
рования при помощи метил аз.В настоящее время проведены широкие клинические испытания
новой конъюгированной гриппозной вакцины, полученной с ис¬
пользованием консервативных антигенов вируса гриппа. Разработа¬
на и оптимизирована технология выделения и очистки антигенного
комплекса протективных поверхностных антигенов гемаглютинина
и найрамидазы внутренних белков вируса, связанных с иммуности¬
мулятором. Установлено, что эти два белка являются основными
факторами кроссреактивности (перекрестной иммуногенности) ме¬
жду актуальными эпидемическими штаммами, что может обеспечить
механизм перекрестной защиты вакцинированных животных от
большинства эпидемических штаммов.Основной принцип в создании генно-инженерных вакцин заклю¬
чается в присоединении к бактериальному или вирусному антигену
дополнительных биологически активных молекул, обеспечивающих
костимулирующее воздействие на клетки — эффекторы иммунного
ответа. Чаще всего для этой цели используются белковые носители,
конъюгируемые с полисахаридными антигенами. Однако для созда¬
ния полисахаридной вакцины против кишечных инфекций на основе
бифункциональных молекул была использована технология созда¬
ния в молекуле иммуногена иммуностимулирующего центра с ис¬
пользованием как полисахаридных, так и белковых антигенов. При
этом основой бифункциональных молекул могут быть антиген капсу¬
лы или клеточной стенки и активационный центр. В другом вариан¬
те — низкоэндотоксичный липополисахарид, включающий О-поли-
сахаридный антиген и липид А — иммуностимулирующего домена
молекулы, которые совместно со встроенным адъювантом — поли-
оксидонием являются основой вакцины Шигеллвак.Основой субъединичных вакцин являются рекомбинантные бел¬
ки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы ан¬
тигенов, активно распознаваемых иммунной системой. Использова¬
ние синтетических пептидов при разработке вакцин имеет целый ряд
преимуществ по сравнению с традиционными технологиями, однако
остается проблема, связанная с низкой иммуногенностью пептидных
вакцин. Низкая способность пептидов индуцировать иммунологиче¬
ские реакции обусловлена отсутствием в их составе структурных эле¬344
ментов, ответственных за взаимодействие с молекулами большого
комплекса гистосовместимости, в контексте которого происходит
распознавание антигена.Одно из эффективных решений этой проблемы было найдено
сравнительно недавно и основано на использовании «белков тепло¬
вого шока» в качестве универсальных носителей и «суперантигенов»
для стимуляции Т-клеточного иммунитета. В настоящее время разра¬
ботана технология конструирования гибридных белковых молекул,
состоящих из целевого антигена и белков теплового шока из
М. Tuberculosis Hsp 70 (Hsp 65 ESAT-6 CFP-10). С использованием
данной технологии разработаны вакцины против туберкулеза и опу¬
холей, ассоциированных с вирусами папиломы человека. При разра¬
ботке противотуберкулезной вакцины использовалась смесь белков
теплового шока М. Tuberculosis Hsp 70 и Hsp 65, а также два секретор¬
ных белка ESAT-6 CFP-10. На экспериментальных животных проде¬
монстрирована высокая протективная активность разработанных
вакцинных препаратов.Большое значение в связи с интесификацией животноводства от¬
водится профилактике инфекционных заболеваний сельскохозяйст¬
венных животных с применением рекомбинантных живых вакцин и
генно-инженерных вакцин-антигенов, ранней диагностике этих за¬
болеваний при помощи моноклональных антител и ДНК/РНК-проб.Расширяющееся в настоящее время применение вакцин в ветери¬
нарной медицине делает их производство важной сферой примене¬
ния методов генетической инженерии. Однако их использование ос¬
ложняется тем, что условием иммуногенной и антигенной активно¬
сти антигенных детерминант любого типа является экспонирование,
определяющееся их поверхностным расположением и степенью дос¬
тупности для взаимодействия с антителами. Иными словами, имму¬
ногенные и антигенные свойства вирусных белков сильно зависят от
их вторичной, третичной и четвертичной структур. Именно этот факт
является причиной значительно более низкой иммуногенной актив¬
ности субъединиц, в которых локализованы главные антигенные де¬
терминанты, по сравнению с таковой вириантов или образований из
элементов оболочки.До недавнего времени считалось, что наиболее реальным подхо¬
дом является микробиологический синтез тех поверхностных белков
вирусов или бактерий, в которых локализованы главные антигенные
детерминанты. Идя по этому пути, уже ставшим традиционным для
технологии рекомбинантной ДНК, удалось достичь определенных
успехов. Так, осуществлена экспрессия в бактериях вирусных генов,345
кодирующих гемагглютинин, поверхностные белки вируса гриппа,
ящура и некоторых других вирусов.Однако ни один их этих оболочечных белков, успешно синтези¬
руемых на матрице рекомбинантных плазмид в бактериальной клет¬
ке, не стал и вряд ли в ближайшем будущем станет вакциной субъеди-
ничного типа. Это связано с тем, что вирусные белки, синтезирован¬
ные в бактериальной системе, уступают по иммунногенности и по
выходу продуктов эукариотического синтеза. Сегодня широко при¬
меняется противоящурная синтетическая вакцина, представляющая
собой олигопептид, несущий главную антигенную детерминанту и
связанный с ним носитель, такие вацины абсолютно безопасны. Они
не обладают побочным действием, но их производство обходится
пока дорого. Более перспективным и технологичным является ген¬
но-инженерный путь синтеза полиантигенных детерминант к не¬
скольким видам или серотипам вирусов. Антигенные детерминанты
должны быть встроены в молекулы белка носителя, специально скон¬
струированного таким образом, чтобы обеспечить экспонирование
детерминантных участков белковой молекулы. Такая задача является
вполне разрешимой. Разработан методом, позволяющий рассчиты¬
вать вторичную и третичную структуру белков в растворе. В этом слу¬
чае иммунногенная активность таких белков не будет зависеть от их
способности формировать мультимерные агрегаты. Их иммунноген-
ность должна однозначно определяться первичной структурой моле¬
кулярной полипептидной цепи. В этом случае полиантигенные ген¬
но-инженерные вакцины второго поколения, разработка которых
уже началась, окажутся технологичными и в микробной системе.Но этой перспективой не ограничиваются возможности создания
искусственных вакцин. У многих вирусов антигенные детерминанты,
ответственные за появление вируснейтрализующих антител, распо¬
ложены в участках белка, первичная структура которых подвержена
сильной изменчивости. Поэтому вакцина, приготовленная против
одного серотипа вируса, плохо защищает от вируса этого же вида, но с
иным серотипом.Однако при иммунизации животных участками, изолированны¬
ми из консервативной зоны полипептида, в организме образуются
антитела и против этих малоизменчивых участков белка. Этого не на¬
блюдается при иммунизации цельным вирусом или изолированным
белком, содержащим антигенные детерминанты. Механизм этого фе¬
номена остается пока неизвестным. Он может быть использован при
создании вакцин широкого спектра действия. Антитела против кон¬
сервативных участков белка оболочки вируса гриппа А и В вызывают
нейтрализацию всех этих серотипов. Реализация такого подхода оз¬346
начала бы создание нового типа противовирусных вакцин широкого
спектра действия.Разработана общая теория, объясняющая наличие в белках неим-
муногенных участков, и ряд приемов, обеспечивающих повышение
иммуногенности «молчащих», но потенциально способных «загово¬
рить» участков белка.В настоящее время для профилактики инфекционных болезней
животных получены генно-инженерные вакцины против ящура, бе¬
шенства, диареи свиней и других вирусных болезней. Разработаны
препараты против бактериальных инфекций. Например, в США от¬
крыт белок, токсичный для стафилококков, которые в 55 % случаев
являются причиной мастита у КРС. Лабораторные исследования по¬
казали, что этот белок действует в течение нескольких минут и убива¬
ет клетки антибиотикорезистентных штаммов.Задача конструирования и производства генно-инженерных вак¬
цин будущего может быть решена лишь как составная часть фунда¬
ментальной проблемы — создание методами генной инженерии ис¬
кусственных белков с заранее заданными свойствами и структурой.Рекомбинантные ДНК могут быть широко использованы для вы¬
явления возбудителей методом молекулярной гибридизации. Этот
метод позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные бо¬
лезни. Может использоваться для пренатального диагноза генетиче¬
ских дефектов, выявления животных — носителей возбудителя. Ме¬
тод основан на использовании зондов — ДНК, меченые радиоактив¬
ными соединениями или бочипами, с последующей гибридизацией
зондов с образцами ткани животного — носителя возбудителя болез¬
ни. Это особенно ценно для выявления скрытых инфекций (хлами-
диозы, медленные инфекции). Использование молекулярных зондов
на основе ДНК позволяет индентифицировать близких по свойствам
возбудителей.Как и в медицине, в ветеринарной науке в перспективе возможно
применение генно-терапевтических методов лечения наследствен¬
ных заболеваний. Искусственное исправление генома особо ценных
животных может и должно быть осуществлено. Принципиальная схе¬
ма такой технологии и ее экспериментальная проверка в медицине
проводится. Пересадка определенного количества клеток с нормаль¬
ным геномом может при определенных условиях дать положитель¬
ный конечный результат. Эти условия изучаются и проверяются в ме¬
дицинской практике. Не менее важной задачей является повышение
эффективности биосинтеза известных антибиотиков. Значительных
результатов ученым и практикам удалось добиться в селекции шта-
мов-продуцентов с применением индуцированного мутагенеза и347
многоступенчатого отбора. Например, продуктивность штаммов
Penicillum по синтезу пенициллина увеличена в сотни раз. Опреде¬
ленные перспективы открываются в связи с возможностью клониро¬
вания генов «узких мест» биосинтеза антибиотика или в случае, если
все биосинтетические ферменты кодируются единым опероном.Перспективным подходом является инкапсулирование антибио¬
тиков, в частности их включение в липосомы, что позволяет прицель¬
но доставлять препарат к определенным органам и тканям, повышает
его эффективность и снижает побочное действие. Этот подход при¬
меним и для других лекарственных препаратов. Например, калазар,
болезнь, вызываемая лейшманией, поддается лечению препаратами
сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов токсична для челове¬
ка. В составе липосом препараты сурьмы избирательно доставляются
к органам, пораженным лейшманией,— селезенке и печени.Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его
продуцент, антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет
начало с работ И.И. Мечникова о подавлении гнилостной микрофло¬
ры в толстом кишечнике человека посредством молочнокислых бак¬
терий. Важную роль в возникновении кариеса зубов играет обитаю¬
щая во рту бактерии S. mutans, которая при введении в ротовую по¬
лость почти не образует коррозивных кислот, вытесняя дикий штамм.Для повышения продуктивности животных путем дачи полноцен¬
ного корма микробиологическая промышленность в настоящее вре¬
мя выпускает кормовые белки на базе различных микроорганиз¬
мов-бактерий, грибов, дрожжей, водорослей. Богатая белковая био¬
масса одноклеточных усваивается сельскохозяйственными животны¬
ми. Так, 1 т кормовых дрожжей позволяет получить 0,4—0,6 т
свинины, до 1,5 т мяса птиц, 25—30 тыс. яиц и сэкономить 5—7 т зер¬
на. Это имеет большое народнохозяйственное значение, поскольку
30 % площадей сельскохозяйственных угодий в мире отводятся для
производства кормов для скота и птицы:—	в пищевой промышленности это создание новых методов пере¬
работки и хранения пищевых продуктов, получение пищевых доба¬
вок (например, полимеров, продуцируемых микроорганизмами ами¬
нокислот), использование белка, синтезируемого одноклеточными
организмами, и ферментов при переработке пищевого сырья; приме¬
нение ферментов для усовершенствования средств диагностики, соз¬
дание тестовых систем на основе ферментов, использование микро¬
организмов и ферментов при производстве сложных лекарств (на¬
пример, стероидных), синтез новых антибиотиков и их использова¬
ние в терапии инфекционной патологии животных.348
Таким образом, применение биотехнологии и прежде всего гене¬
тической инженерии в ветеринарной медицине открывает широкие
возможности для более эффективного решения главной задачи —
обеспечение санитарного благополучия в животноводстве и получе¬
ние безопасной для человека животноводческой продукции.Контрольные вопросы к главе 51.	Назовите основные требования асептики при производстве ветеринарных
препаратов.2.	Питательные потребности микроорганизмов, питательные основы и сре¬
ды.3.	Классификация питательных сред.4.	Перечислите методы культивирования бактерий.5.	Перечислите методы культивирования вирусов.6.	Способы концентрирования микроорганизмов.7.	Высушивание биологических препаратов.8.	Классификация вакцин.9.	Перспективы развития ветеринарной биотехнологии.10.	Биотехнологические методы создания вакцин.11.	Основные пути защиты животных от инфекционных заболеваний био¬
технологическими методами.12.	Перечислите генно-инженерные вакцины, применяемые для повыше¬
ния устойчивости животных.ЛИТЕРАТУРАБаев А.А. Биотехнология. — М.: Наука, 1984.Беккер М.Е. Введение в биотехнологию. — М.: Пищевая промышлен¬
ность, 1978.Березин И.Н., Варфоломеев С.Д. Биокинетика. — М.: Наука, 1979.Биотехнология/Под ред. академ. РАСХ Е.С. Воронина/И.В. Тихонов,
Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева, А .Я. Самойленко, В.А. Гаврилов. — СПб.:
ГИОРО, 2005.Бич Г., Бест Д., Брайерли К. и др. Биотехнология. Принципы и примене¬
ние. — М.: Мир, 1988.Бирюков В.В., Каптере М.В. Оптимизация периодических процессов
культивирования микроорганизмов. — М.: Наука, 1985.Блинов Н.П. Основы биотехнологии. — СПб.: ИФ «Наука», 1995.Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические осно¬
вы микробиологических процессов. — М.: Высшая школа, 1990.Ветеринарные биопрепараты. Справочник/Сост. И.Н. Борисов, Jl.В. Ки¬
риллов; Под ред. А.Ф. Осидзе. — М.: Колос, 1981.Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. — М.: Изд-во МГУ,
1989.349
Каптере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических
производств. — М.: ВО «Агропромиздат», 1990.Красота В.Ф., Завертяев Б.П. и др. Биотехнология в животноводст¬
ве. — М.: Колос, 1994.Курская биофабрика. К 100-летию биологической промышленности
России. — Курск.: ГУИПП «Курск», 1996.Муромцев Г.С., Прокофьев М.И. и др. Основы сельскохозяйственной
биотехнологии. — М.: Мир, 1987.Никитин Е.Е., Завягин И.В. Замораживание и высушивание биологиче¬
ских препаратов. — М.: Колос, 1971.Основы биотехнологических процессов Ч. I. Способы поддержания
асептических условий при культивировании/И.В. Тихонов, Е.С. Воронин,
Т.Н. Грязнева и др. — М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2002.Основы биотехнологических процессов. Ч. II. Способы культивирования
микроорганизмов/И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, Т.Н. Грязнева и др. — М.:
МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2002.Основы биотехнологических процессов. Ч. III. Концентрирование й вы¬
сушивание биопрепаратов/И.В. Тихонов, Е.С. Воронин, Т.Н. Грязнева и
др. — М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2002.О сертификации ветеринарных препаратов/Социально-правовые осно¬
вы ветеринарной деятельности в России: Сб. нормативных актов и образцов
документов. — СПб., 1995.Проектирование и оборудование биотехнологических предприятий.
Ч. I/С.В. Ковалев, И.В. Тихонов, Н.И. Симонова. — М.: ВУ РХБЗ МО РФ,
2000.Сергеев В.А. Вирусные вакцины. — Киев.: Урожай, 1993.Сассон А. Биотехнология: Свершения и надежды. — М.: Мир, 1987.Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препара¬
тов. — Ставрополь, 1997.Физические основы и способы микрофильтрации и ее применение в тех¬
нологии производства ветеринарных иммунобиологических препаратов.Ч.	IV. Микрофильтрация/Е.С. Воронин, И.В. Тихонов, Д.А. Девришов и
др. — М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2000.
Глава 6БИОТЕХНОЛОГИЯ КОРМОВЫХ ПРЕПАРАТОВ6.1. ПОЛУЧЕНИЕ КОРМОВЫХ БЕЛКОВБелки являются обязательными компонентами клеток любого
живого организма, выполняющими жизненно важные функции: ка¬
талитические, регуляторные, транспортные, биоэнергетические, за¬
щитные от инфекции и действия стрессовых факторов, структурные,
запасные и др. В вегетативной массе растений на долю белков прихо¬
дится 5—15 % сухого вещества, в зерне злаков — 8—18 %, семенах
масличных растений — 16—28 %, зерне зернобобовых культур —
20—40 %. В различных тканях организма человека и животных содер¬
жание белков обычно от 20 до 80 % их сухой массы.Исходя из этого совершенно очевидно, что для образования кле¬
ток и тканей организма, а также поддержания его жизненных функ¬
ций должен осуществляться постоянный синтез структурных и дру¬
гих форм белков. Для синтеза белковых молекул все живые организ¬
мы используют 18 аминокислот и два амида (аспарагин и глутамин).
Однако после синтеза белков их молекулы могут подвергаться моди¬
фикациям, вследствие чего в составе белков обнаруживают до 26 ами¬
нокислот.Растения и большинство микроорганизмов способны синтезиро¬
вать все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ —
углекислоты, воды и минеральных солей, тогда как в организме чело¬
века и животных некоторые аминокислоты не могут синтезироваться
и должны поступать в организм в готовом виде как компоненты
пищи. Такие аминокислоты принято называть незаменимыми, к ним
относятся валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин,
триптофан, фенилаланин. Отсутствие в пище хотя бы одной незаме¬
нимой аминокислоты приводит к тяжелым заболеваниям человека, а
недостаток их в кормах снижает продуктивность сельскохозяйствен¬
ных животных.В связи с необходимостью обеспечения человека и животных не¬
заменимыми аминокислотами разработаны научно-обоснованные351
нормы их суточного потребления. Так, ежедневная потребность че¬
ловека в незаменимых аминокислотах составляет (г): валин — 5,0;
лейцин — 7,0, изолейцин — 4,0, лизин — 5,5, метионин — 3,5, трео¬
нин — 4,0, триптофан — 1,0, фенилаланин — 5,0.Главными источниками незаменимых аминокислот для человека
являются белки животного или растительного происхождения, вхо¬
дящие в состав пищи, а для сельскохозяйственных животных — глав¬
ным образом растительные белки. Поступающие с пищей или кор¬
мом белковые вещества под действием ферментов желудочного сока
гидролизуются до аминокислот, которые затем используются для об¬
разования белковых молекул человеческого или животного организ¬
ма. При этом первостепенное значение имеют незаменимые амино¬
кислоты, недостаток которых вызывает прекращение синтеза белкови,	следовательно, задержку роста и развития организма.Следует также учитывать, что все незаменимые аминокислоты
должны содержаться в белках пищи в определенных соотношениях,
отвечающих потребностям данного организма. Если хотя бы одна
аминокислота окажется в недостатке, то другие аминокислоты, ока¬
завшиеся в избытке, не будут использоваться для синтеза белков (в
соответствии с механизмом синтеза белков). В таких условиях для
обеспечения дальнейшего синтеза белковых веществ и поддержания
жизнедеятельности организма потребуется дополнительное количе¬
ство пищевого или кормового белка, вследствие чего увеличивается
расходование пищи или корма. Последнее особенно важно учитывать
в животноводстве, так как несбалансированность кормовых белков
по содержанию незаменимых аминокислот приводит к значительно¬
му перерасходу кормов и существенному повышению себестоимости
животноводческой продукции.Для предотвращения перерасхода кормов необходимо контроли¬
ровать, с одной стороны, сбалансированность белков корма по содер¬
жанию незаменимых аминокислот, а с другой стороны, количество
белка в корме. Для оценки аминокислотного состава белков опреде¬
ляют показатели, характеризующие их биологическую питательную
ценность. Кормовые и пищевые белки, имеющие оптимальное со¬
держание незаменимых аминокислот, называют биологически полно¬
ценными белками.В результате обобщения многочисленных данных по изучению
аминокислотного состава белков Международной организацией по
продовольствию и сельскому хозяйству (ФАО), образованной при
ООН, разработаны рекомендации, в которых дается оптимальное со¬
держание незаменимых аминокислот в пищевых и кормовых белках.
Эти нормативы используются в качестве эталона при оценке биоло-352
1‘ической питательной ценности различных белков. Например, если
принять за 100 % биологическую ценность эталонного по рекоменда¬
циям ФАО белка, то биологическая цен ность большинства животных
белков составляет 90—95 %; белков вегетативной массы бобовых
трав — 80—90 %; белков зерна зернобобовых и семян масличных
культур, клубней картофеля, корнеплодов, овощей, вегетативной
массы многих травянистых растений — 75—85 %; белков зерна боль¬
шинства злаковых культур — 60—70 %; особенно низкая биологиче¬
ская ценность белков зерна кукурузы — 52—58 %.В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно по¬
лучать с пищей от 60 до 120 г полноценного белка. Для правильного
кормления сельскохозяйственных животных необходимо, чтобы в их
кормовом рационе в расчете на каждую кормовую единицу содержа¬
лось 100—120 г хорошо перевариваемого и полноценного белка.Если содержание белков в растительной массе, используемой для
кормления сельскохозяйственных животных, ниже, чем требуется по
нормам, то во избежание перерасхода кормов и повышения себестои¬
мости животноводческой продукции количество белка в корме ба¬
лансируют путем добавления белковых концентратов. По такому же
принципу контролируют содержание в кормовом белке незаменимых
аминокислот. Недостающее до нормы количество какой-либо ами¬
нокислоты балансируют добавлением в корм чистых препаратов де¬
фицитных аминокислот или белковой массы, имеющей более высо¬
кое содержание данной аминокислоты по сравнению с принятым
эталоном.Характеристика аминокислотного состава различных раститель-
н ых белков дается в табл. 6.1, из которой видно, что наиболее сбалан¬
сированное содержание незаменимых аминокислот имеют белки зер¬
на сои, у нее отмечается лишь некоторый дефицит по метионину и
триптофану. Относительно высокую биологическую ценность имеют
также белки зерна риса и гороха. В то же время широко возделывае¬
мые в нашей стране зерновые культуры — пшеница, кукуруза, яч¬
мень — отличаются несбалансированным аминокислотным соста¬
вом белков. В белках зерна пшеницы и ячменя очень мало содержится
лизина, метионина и изолейцина, а в белках зерна кукурузы еще и
триптофана.Вследствие того, что белки сои хорошо сбалансированы по ами¬
нокислотному составу и их содержание в семенах достигает 35—40 %,
эта культура имеет важное значение как самый дешевый источник
пищевого и кормового белка. Крупнейшим поставщиком соевого
белка на мировом рынке являются США. В России, хотя и проводятся
работы по расширению посевов сои, ее возделывание ограничено23-4266353
вследствие неблагоприятных климатических условий. Однако ведет¬
ся поиск других источников полноценного белка. Одним из важных
путей в этом направлении является расширение посевов других зер¬
нобобовых культур, которые также, как и соя, способны накапливать
в зерне большое количество белка (25—35 %), имеющего высокую
биологическую ценность.Таблица 6.1. Содержание незаменимых аминокислот в различных белках(в г на 100 г белка)АминокислотыМоло¬
ко ко¬
ровыЭталонФАОСояГорохРисПшеницаКукурузаЯчменьЛизин6,64,26,66,53,52,62,53,2Триптофан1,41,41,30,81,31,30,61,2Метионин2,42,21,41,42,91,72,11,7Треонин4,62,83,83,83,52,63,22,9Валин6,94,25,44,56,54,64,45,4Лейцин9,94,87,96,58,06,911,27,2Изолейцин6,64,25,35,04,63,42,73,5Фенилаланин4,92,85,14,85,24,34,15,1Наряду с этим разрабатываются и реализуются научные програм¬
мы, связанные с созданием новых генотипов зерновых культур, отли¬
чающихся повышенным содержанием в зерне белков с улучшенным
аминокислотным составом. Возможность создания таких программ
стала реальной после открытия высоколизиновых мутантов кукурузы
с генами Опейк-2 и Флаури-2, в белках зерна которых содержится
значительно больше лизина и триптофана, чем у обычной кукурузы.В результате селекционной работы, проведенной в Краснодар¬
ском научно-исследовательском институте сельского хозяйства им.
П.П. Лукьяненко, на основе указанных генов получены высокобел¬
ковые и высоколизиновые гибриды кукурузы, которые по урожайно¬
сти не уступают районированным гибридам. В суммарном белке зер¬
на полученных новых генотипов кукурузы содержание лизина повы¬
шено на 50—80 %, триптофана — на 30—50 %. Использование зерна
такой кукурузы для кормления сельскохозяйственных животных по¬
зволяет существенно повысить их продуктивность и сократить затра¬
ты кормового белка на 20—25 %.Во многих научных лабораториях проводится селекционно-гене-
тическая работа по улучшению аминокислотного состава белков зер¬
на ячменя на основе скрещиваний с высоколизиновыми формами354
Хайпроли и Ризо 1508, осуществляется также поиск генетических ис¬
точников высокого содержания белка с улучшенным аминокислот¬
ным составом для пшеницы, тритикале и других зерновых культур.
Особые надежды возлагаются на новые методы создания ценных ге¬
нотипов сельскохозяйственных растений, основанные на использо¬
вании достижений генетической и клеточной инженерии.Зерновые культуры составляют большой удельный вес в структуре
кормопроизводства нашей страны. В среднем на долю белков зерна
приходится около 50 % от общего количества кормового белка, а в
свиноводстве и птицеводстве до 80 %. Для балансирования кормов,
включающих в качестве основного компонента зерно злаковых куль¬
тур, по белку и незаменимым аминокислотам применяются концен¬
трированные кормовые добавки — комбикорма.Для приготовления комбикормов обычно используют мясо-кост¬
ную и рыбную муку, отходы мясной и молочной промышленности,
жмыхи масличных растений, отруби, шроты зернобобовых культур.
Учитывая, что рыбная и костная мука, другие белковые отходы жи¬
вотного происхождения во все большем объеме направляются на по¬
лучение пищевых белков, требуется их полноценный заменитель,
способный сбалансировать недостаток белков и незаменимых ами¬
нокислот не только в зерновой части кормового рациона, но и в рас¬
тительных компонентах комбикормов.В результате изучения различных организмов было выяснено, что
высокой интенсивностью синтеза белков отличаются многие микро¬
организмы, причем белки микробных клеток имеют повышенное со¬
держание незаменимых аминокислот (табл. 6.2). В специальных опы¬
тах была проведена пищевая и токсикологическая оценка белковой
микробной массы, которая показывает, что клетки некоторых мик¬
роорганизмов можно использовать в качестве концентрированных
кормовых добавок, не уступающих по биологической ценности бел¬
ков соевому шроту или рыбной муке.Микроорганизмы в качестве источников кормового белка имеют
ряд преимуществ по сравнению с растительными и даже животными
организмами. Они отличаются высоким (до 60 % сухой массы) и ус¬
тойчивым содержанием белков, тогда как в растениях концентрация
белковых веществ значительно варьирует в зависимости от условий
выращивания, климата, погоды, типа почвы, агротехники и др. Наря¬
ду с белками в микробных клетках образуются и другие ценные в пи¬
тательном отношении вещества: легкоусвояемые углеводы, липиды с
повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, витами¬
ны, макро- и микроэлементы.355
Таблица 6.2. Содержание незаменимых аминокислот в белках некоторых
микроорганизмов (в г на 100 г белка)АминокислотаДрожжиБактерииВодорослиГрибыСоевыйшротЭталонФАОЛизин6-86-75-103-76,44,2Триптофан1—1,51 — 1,401ю1,4—21,41,4Метионин1-32-31,4—2,52-31,32,9Треонин4-64-53-6и>1ON4,02,8Валин5-74-65-75-75,34,2Лейцин6-95-116-106-97,74,8Изолейцин4-65-73,5-73-65,34,2Фенилаланин3-53-43-53-65,02,8При использовании микроорганизмов на ограниченной площади
можно организовать промышленное производство и получать боль¬
шое количество кормовых концентратов в любое время года, причем
микробные клетки способны синтезировать белки из отходов сель¬
ского хозяйства и промышленности и, таким образом, позволяют од¬
новременно решать другую важную проблему — утилизацию этих от¬
ходов в целях охраны окружающей среды.Микроорганизмы имеют еще одно ценное преимущество — спо¬
собность очень быстро наращивать белковую массу. Например, рас¬
тения сои массой 500 кг в фазе созревания семян способны в сутки
синтезировать 40 кг белков, бык такой же массы — 0,5—1,5 кг, а
дрожжевые клетки массой 500 кг — до 1,5 т белков. В качестве источ¬
ников кормового белка наиболее часто используются различные
виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные
водоросли, белковые коагуляты травянистых растений.Кормовые дрожжи. Дрожжи впервые стали использовать как ис¬
точник белка для человека и животных в Германии во время Первой
мировой войны, когда была разработана промышленная технология
культивирования пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), предна¬
значенных для добавления в продукты питания. В нашей стране пер¬
вый завод по производству кормовых дрожжей был пущен в 1935 г.
Дрожжи выращивали на гидролизатах из отходов древесины и друго¬
го целлюлозосодержащего растительного сырья, которые при гидро¬
лизе образуют легкоусвояемые для микроорганизмов формы углево¬
дов. В настоящее время нашей биотехнологической промышленно¬
стью на основе гидролиза растительного сырья производится значи¬
тельный объем кормовых дрожжей для сельского хозяйства.356
В качестве исходного сырья при такой технологии получения кор¬
мового белка обычно используются отходы целлюлозной и деревооб¬
рабатывающей промышленности, солома, хлопковая шелуха, кор¬
зинки подсолнечника, льняная костра, стержни кукурузных почат¬
ков, свекловичная меласса, картофельная мезга, виноградные вы¬
жимки, пивная дробина, верховой малоразложившийся торф, барда
спиртовых производств, отходы кондитерской и молочной промыш¬
ленности.Измельченное растительное сырье, содержащее большое количе¬
ство клетчатки, гемицеллюлоз, пентозанов, подвергается кислотному
гидролизу при повышенном давлении и температуре, в результате
чего 60—65 % содержащихся в них полисахаридов гидролизуются до
моносахаридов. Полученный гидролизат отделяют от лигнина, избы¬
ток кислоты, применяемой для гидролиза, нейтрализуют известко¬
вым молоком или аммиачной водой. После охлаждения и отстаива¬
ния в гидролизат добавляют минеральные соли, витамины и другие
вещества, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов.
Полученная таким образом питательная среда подается в ферментер-
ный цех, где осуществляется выращивание дрожжей.Для культивирования на гидролизатах растительных отходов наи¬
более эффективны дрожжи родов Candida, Torulopsis, Saccharomyces,
которые способны использовать в качестве источника углерода гек-
созы, пентозы и органические кислоты. При оптимальных условиях
из 1 т отходов хвойной древесины можно получить 200 кг кормовых
дрожжей.Для получения кормовых дрожжей применяется технология их
глубинного выращивания в специальных аппаратах — ферментерах
(рис. 6.1), в которых обеспечиваются режим постоянного перемеши¬
вания суспензии микробных клеток в жидкой питательной среде и
оптимальные условия аэрации. В целях поддержания заданного тем¬
пературного режима в конструкции ферментера предусматривается
система отвода избыточной теплоты. Рабочий цикл выращивания
культуры дрожжей длится около 20 ч. По окончании рабочего цикла
культуральная жидкость вместе с суспендированными в ней клетка¬
ми дрожжей выводится из ферментера, а в него вновь подается пита¬
тельный субстрат и культура дрожжевых клеток для выращивания.Выведенная из ферментера суспензия микробных клеток далее
подается на флотационную установку, на которой производится от¬
деление биомассы дрожжей от культуральной жидкости. В процессе
флотации происходит вспенивание суспензии, при этом микробные
клетки всплывают на поверхность вместе с пеной, которая отделяется
от жидкой фазы декантацией. После отстаивания дрожжевая масса357
Рис. 6.1. Ферментер для выращива¬
ния дрожжей в жидкой питатель¬
ной среде:1 — корпус ферментера; 2 — выход воздуха
в атмосферу через очистительный фильтр;
3— подача воздуха для аэрации и переме¬
шивания питательной среды; -/—охлаж¬
дающая рубашка; 5—теплообменник; 6 —
выход дрожжевой суспензии по окончании
ферментации; 7— кювета для направления
потока воздуха во внутреннюю полость теп¬
лообменника; 8— подача холодной воды в
теплообменник; 9—вывод теплой воды из
теплообменника; 10 — подача посевной
культуры; 11 — подача жидкой питательной
средыконцентрируется при помощи сепаратора. Для достижения лучшей
перевариваемости дрожжей в организме животных проводится спе¬
циальная обработка микробных клеток (механическая, ультразвуко¬
вая, термическая, ферментативная), обеспечивающая разрушение их
клеточных оболочек. Затем дрожжевая масса упаривается до необхо¬
димой концентрации и высушивается, влажность готового продукта
не должна превышать 8—10 %.В сухой дрожжевой массе содержится 40—60 % сырого белка,
25—30 % усвояемых углеводов, 3—5 % сырого жира, 6—7 % клетчатки
и зольных веществ, большое количество витаминов (до 50 мг%). По¬
средством обработки дрожжей ультрафиолетовыми лучами прово¬
дится их обогащение витамином D2, который образуется из содержа¬
щегося в них эргостерина. Для улучшения физических свойств гото¬
вого продукта кормовые дрожжи выпускают в гранулированном виде.На основе ферментации гидролизатов растительного сырья наря¬
ду с производством кормовых дрожжей получают также этиловый
спирт. В этом случае особенность технологии заключается в том, что
вначале проводится спиртовое брожение, в результате которого про¬
исходит утилизация содержащихся в гидролизате гексоз. После от¬
гонки спирта остается неиспользованный субстрат — барда, содер¬
жащая в основном пентозы. Эта послеспиртовая барда используется
далее как питательная среда для выращивания кормовых дрожжей.
Таким образом, из гидролизатов растительных отходов одновремен¬
но могут быть получены два вида ценной продукции.В России и некоторых других нефтедобывающих странах разрабо¬
таны технологии получения кормовых дрожжей из «-парафинов неф¬358
ти. Дрожжевые клетки могут использовать в качестве источников уг¬
лерода для их роста неразветвленные углеводороды с числом углерод¬
ных атомов от десяти до тридцати. Они представляют собой жидкие
фракции с температурами кипения 200—320 °С, которые выделяют
из нефти путем ее перегонки.Очищенные фракции углеводородов нефти, используемые для
выращивания дрожжей, могут быть получены тремя методами: низ¬
котемпературной кристаллизации, карбамидной депарафинизации и
адсорбции на молекулярных ситах. В соответствии с первым методом
проводится кристаллизация высококипящих фракций после раство¬
рения их в смеси органических растворителей при постоянном охла¬
ждении. Затем очищенные путем кристаллизации продукты исполь¬
зуются для приготовления питательной среды микроорганизмов.
Второй метод основан на способности «-парафинов нефти образовы¬
вать прочный комплекс с молекулами карбамида, который после от¬
деления от остальных фракций легко разлагается при нагревании, в
результате чего при помощи перегонки можно получить очищенную
фракцию «-парафинов. Третьим методом производится адсорбция
нужных фракций углеводородов нефти на молекулярных ситах (цео¬
литах), после чего проводят их десорбцию, и таким образом удается
выделить фракции высокой степени очистки.В других странах такая технология производства дрожжей не по¬
лучила развития вследствие высоких мировых цен на нефть. В нашей
стране первый завод по производству кормовых дрожжей из жидких
парафинов нефти вступил в действие в 1971 г.При выращивании микроорганизмов на «-парафинах нефти в
приготовленную из них питательную среду добавляют макро- и мик¬
роэлементы, необходимые витамины и аминокислоты, а в качестве
источника азота — аммиачную воду. В процессе культивирования
дрожжей в ферментере поддерживается оптимальный температур¬
ный режим и режим аэрации. Наиболее эффективны для выращива¬
ния на «-парафинах нефти отселектированные штаммы дрожжей
Candida guilliermondii. Выделение и сушка дрожжевой массы проводит¬
ся примерно по такой же технологии, как и в гидролизном производст¬
ве. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как
белково-витаминный концентрат (БВК) для кормления сельскохозяй¬
ственных животных, содержащий до 50—60 % белковых веществ. Со¬
держание остаточных углеводородов допускается не более 0,1 %.В целях более полного использования сырья и снижения в товар¬
ном продукте остаточных углеводородов разработаны усовершенст¬
вованные технологии получения БВК, включающие двухступенча¬
тую ферментацию и последующую экстракцию из дрожжей остаточ¬359
ных углеводородов бензином. При этом содержание сырого белка в
дрожжевой массе может быть повышено до 58—65 % в расчете на
сухую массу, а содержание остаточных углеводородов снижено до
0,05 %.Хороший субстрат для выращивания кормовых дрожжей — мо¬
лочная сыворотка, являющаяся производственным отходом при пе¬
реработке молока. В 1 т молочной сыворотки в среднем содержится
10 кг полноценного белка и 50 кг дисахарида лактозы, который легко
утилизируется микроорганизмами. Для выделения из молочной сы¬
воротки белков разработана эффективная технология с применением
метода ультрафильтрации низкомолекулярных веществ через мем¬
браны. Получаемые таким способом белки используются для приго¬
товления сухого обезжиренного молока или в качестве пищевой бел¬
ковой добавки. Остающиеся после отделения белков жидкие отходы
(пермеат), содержащие лактозу, могут быть затем переработаны пу¬
тем культивирования дрожжей в обогащенные белками кормовые
продукты.Часто дрожжеванию подвергается молочная сыворотка без пред¬
варительного выделения из нее белков, при этом выращиваются спе¬
циальные расы кормовых дрожжей из рода Torulopsis. На основе
дрожжевания молочной сыворотки производится три вида кормо¬
вых белковых продуктов: заменитель цельного молока для кормле¬
ния молодняка сельскохозяйственных животных — «БИО — ЗЦМ»;
жидкий белковый продукт «Промикс» с содержанием белков в
2,5—3 раза выше, чем в исходной молочной сыворотке; сухой обога¬
щенный дрожжевыми белками продукт «Провилакт», применяемый
как заменитель сухого обезжиренного молока.Кроме углеводов и углеводородов в качестве источников углерода
дрожжевые клетки могут также использовать низшие спирты — ме¬
танол и этанол, которые обычно получают из природного газа или
растительных отходов. Дрожжевая масса, полученная после культи¬
вирования дрожжей на спиртах, отличается высоким содержанием
белков (56—62 % от сухой массы) и в ней меньше содержится вредных
примесей, чем в кормовых дрожжах, выращенных на н-парафинах
нефти.Как показывают опыты по изучению питательных свойств кормо¬
вых дрожжей, они достаточно хорошо перевариваются в организме
животных (переваримость белков 80—90 %), по сумме незаменимых
аминокислот близки к эталону ФАО, а по содержанию в белках лизи¬
на, треонина, валина и лейцина существенно превышают эталон
ФАО (см. табл. 6.2). Вместе с тем белки дрожжей частично не сбалан¬360
сированы по метионину и в них содержится мало других серосодер¬
жащих аминокислот.По сравнению с растительными источниками белков кормовые
дрожжи имеют повышенное содержание нуклеиновых кислот
(4—6 % от сухой массы), которые в такой концентрации оказывают
вредное воздействие на организм. В результате их гидролиза образу¬
ется много пуриновых оснований, превращающихся затем в соли мо¬
чевой кислоты, которые откладываясь в организме, могут быть при¬
чиной мочекаменной болезни, остеохондроза и других заболеваний.
Вследствие этого оптимальная норма добавления дрожжевой массы в
корм сельскохозяйственных животных обычно составляет не более
5—10 % от сухого вещества или 10—20 % дрожжевого белка от общего
количества белка в кормовом рационе.Кормовые дрожжи, культивируемые на питательной среде из
«-парафинов нефти, могут содержать многие вредные примеси —
производные бензола, О-аминокислоты, аномальные липиды, раз¬
личные токсины и канцерогенные вещества, поэтому их подвергают
специальной очистке (экстракция бензином).При организации производства кормовых дрожжей во избежание
загрязнения окружающей среды возникают проблемы очистки газо¬
образных и жидких отходов, в связи с чем ведется работа по созданию
экологически чистых безотходных технологий с замкнутым циклом
водоиспользован ия.Кроме совершенствования производственной технологии, важ¬
ное значение имеет создание высокопродуктивных штаммов дрож¬
жей, способных накапливать много белка, быстро наращивать био-
масссу и эффективно использовать субстрат для своей жизнедеятель¬
ности. Для создания новых штаммов микроорганизмов применяются
как методы обычной селекции, так и генно-инженерная биотехноло¬
гия.Наряду с использованием дрожжевых белков в качестве кормовой
добавки при балансировании рационов сельскохозяйственных жи¬
вотных ставится задача сделать эти белки пригодными для питания
человека. Уже в 30-х — 40-х годах XX века в некоторых странах были
разработаны технологии культивирования пивных и других пищевых
дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Candida arborea, Candida utilis), ко¬
торые использовались как белковые добавки к различным пищевым
продуктам.При переработке в пищевой белок биомассу дрожжей тщательно
очищают. С этой целью клеточные оболочки дрожжевых клеток раз¬
рушают при помощи механической, щелочной, кислотной или фер¬
ментативной обработки и затем экстрагируют гомогенную дрожже¬361
вую массу органическим растворителем. После очистки от органиче¬
ских и минеральных примесей полученный дрожжевой продукт обра¬
батывают щелочным раствором для растворения белков, затем
белковый раствор отделяют от оставшейся массы дрожжей и направ¬
ляют на диализ. В процессе диализа из белкового раствора удаляются
низкомолекулярные примеси. Очищенные диализом белки осажда¬
ют, высушивают и полученную белковую массу используют в качест¬
ве добавок в различные пищевые продукты: сосиски, студни, паште¬
ты, мясные и кондитерские начинки.Белки дрожжей находят также применение при получении искус¬
ственного мяса, для этого проводится текстурирование белков — на¬
гревание с последующим быстрым охлаждением или продавливание
белковой пасты через отверстия малого диаметра. Для улучшения
свойств в белковую пасту добавляют полисахариды и другие компо¬
ненты. Гидролизаты белков используются в качестве вкусовых при¬
прав, для приготовления медицинских препаратов и лечебного пита¬
ния.Белковые концентраты из бактерий. Наряду с получением кормо¬
вых дрожжей важное значение для кормопроизводства имеют также
бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка
60—80 % от сухой массы. Известно более 30 видов бактерий, которые
могут быть использованы в качестве источников полноценного кор¬
мового белка. Бактерии способны наращивать биомассу в несколько
раз быстрее дрожжевых клеток и в белке бактерий содержится значи¬
тельно больше серосодержащих аминокислот, вследствие чего он
имеет более высокую биологическую ценность по сравнению с бел¬
ком дрожжей. Источником углерода для бактерий могут служить раз¬
личные газообразные продукты (природный и попутный газы, газо¬
вый конденсат и др.), низшие спирты (метанол и этанол), водород.При использовании в качестве сырья газообразных продуктов, ос¬
новным компонентом которых является метан, питательную смесь
под давлением подают в специальный ферментер струйного типа
(рис. 6.2). В целях лучшей утилизации сырья микроорганизмами в та¬
ком ферментере предусматривается рециркуляция газовой смеси.
Для обеспечения необходимой аэрации культуры бактерий произво¬
дится продувка ферментера воздухом или кислородом. Чаще всего на
газовых питательных средах выращивают бактерии рода
Methylococcus, способные при оптимальных условиях утилизировать
до 85—90 % подаваемого в ферментер метана. Все технологические
линии, связанные с культивированием бактерий в газовой среде, тре¬
буют точного контроля за составом этой среды и оснащения произ-362
Рис. 6.2. Ферментер для вы¬
ращивания микроорганизмов
на газообразных углеводоро¬
дах:/ — корпус ферментера; 2 — охлаж¬
дающая рубашка; 3 — регулятор дав¬
ления внутри ферментера; 4 — пода¬
ча посевной культуры; 5 — подача
жидкой питательной смеси; 6 — вы¬
пуск газа из ферментера; 7— привод
мешалки; 8 — выход газовой смеси
на рециркуляцию; 9— газоанализа¬
тор, подающий сигнал на регулирую¬
щее устройство клапана; 10 — пода¬
ча газообразных углеводородов; // —
мешалка; 12— выход дрожжевой
суспензии по окончании фермента¬
ции; 13 — улавливатель углекислого
газа; 14 — подача кислородсодержа¬
щего газаГводственных установок герметизированным, взрывобезопасным
оборудованием.По окончании ферментации клетки бактерий осаждают и отделя¬
ют от питательной среды на сепараторе. Полученную бактериальную
массу затем подвергают механической или ультразвуковой обработке
с целью разрушения клеточных оболочек, после чего высушивают и
используют для приготовления кормовых белковых концентратов.В связи с тем, что газовая среда из метана и воздуха взрывоопасна
и для лучшей утилизации метана бактериями требует постоянной ре¬
циркуляции, производство кормового белка из газообразных продук¬
тов является довольно сложным и дорогим. Более широкое примене¬
ние находит технология выращивания бактериальной белковой массы
на метаноле, который можно легко получить путем окисления метана.
При культивировании на питательной среде, содержащей метанол,
наиболее эффективны бактерии родов Methylomonas, Pseudomonas,
Methylophillus. Выращивают эти бактерии в обычном ферментере с ис¬
пользованием жидкой питательной среды.Широкомасштабное производство кормовых белков на основе
использования метанола впервые было организовано в Англии. Кон¬
церном «Ай-Си-Ай» выпускается кормовой белковый препарат с
коммерческим названием «Прутин». В нашей стране также разрабо¬
тана технология получения бактериальной белковой массы из мета¬
нола, коммерческое название препарата — «Меприн». Он содержите
своем составе до 70—74 % от сухой массы белков, до 5 % липидов,6363
около 10 % минеральных веществ, 10—13 % нуклеиновых кислот. На
основе культивирования бактерий рода Acinetobacterразрабатывается
технология получения кормового белка из этанола (название препа¬
рата «Эприн»), который может иметь также и пищевое назначение.Высокой интенсивностью синтеза белков характеризуются водо-
родокисляющие бактерии, способные накапливать в своих клетках до
80 % сырого белка в расчете на сухое вещество. Эти бактерии исполь¬
зуют энергию окисления водорода для утилизации углекислоты, а
некоторые штаммы и для усвоения атмосферного азота. Для культи¬
вирования водородокисляющих бактерий в составе газовой среды
обычно содержится 70—80 % водорода, 20—30 % кислорода и 3—5 %
углекислоты. Высокую эффективность при выращивании на такой
газовой среде имеют бактерии родов Pseudomonas, Alcaligenes,
Achromobacter, Corinebacterium и др.Обычно водород для производства белковой массы получают из
воды путем ее электролитического (электролиз) или фотохимическо¬
го разложения. Углекислота может быть использована из газообраз¬
ных отходов каких-либо промышленных производств, а также топоч¬
ных газов, что одновременно решает проблему очистки газовой сре¬
ды. Производство кормового белка на основе водородокисляющих
бактерий может быть также организовано вблизи химических пред¬
приятий, где в качестве побочного продукта образуется водород.Обычно кормовой белок бактериального происхождения добав¬
ляют в комбикорма в количестве 2,5—7,5 % от белка рациона, при
кормлении взрослых свиней — до 15 %. Основное препятствие, кото¬
рое не позволяет его использовать в большей концентрации, — повы¬
шенное содержание нуклеиновых кислот (10—25 %). Кроме того, в
бактериальной массе наряду с полезными компонентами в значи¬
тельном количестве синтезируются трудно усвояемые формы липи¬
дов; сложнее и дороже методы выделения и очистки бактериальных
белковых препаратов.Кормовые белки из водорослей. В России и ряде других стран для
производства кормового белка используются одноклеточные водо¬
росли Chlorella и Scenedesmus, а также сине-зеленые водоросли из рода
Spirulina, которые способны синтезировать белки и другие органиче¬
ские вещества из углекислоты, воды и минеральных веществ за счет
усвоения энергии солнечного света. Для их выращивания необходи¬
мо обеспечивать определенные режимы освещения и температуры, а
также требуются большие объемы воды. Чаще всего в естественных
условиях водоросли выращивают в южных регионах с использовани¬
ем бассейнов открытого типа, однако разрабатываются технологии их
культивирования в закрытой системе.364
Водоросли хлорелла и сценедесмус требуют для своего выращива-
ния нейтральной среды, их клетки имеют довольно плотную целлю¬
лозную оболочку, вследствие чего хуже перевариваются в организме
животных. Для лучшей их переваримости разрушают целлюлозные
оболочки посредством специальной обработки.Клетки спирулины в 100 раз крупнее хлореллы, однако они не
имеют прочной целлюлозной оболочки и поэтому лучше переварива¬
ются в организме животных. Выращивается спирулина в щелочной
среде (pH 10—11), при естественных условиях в щелочных озерах.По интенсивности накопления биомассы водоросли, хотя и усту¬
пают кормовым дрожжам и бактериям, значительно превосходят
сельскохозяйственные растения. При ихвыращивании в культивато¬
рах открытого типа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т
сухой биомассы в год, тогда как при возделывании пшеницы — 3—4 т,
риса — 5 т, сои — 6 т, кукурузы — 7 т.Содержание белков в клетках хлореллы и сценедесмус составляет
45—55 % в расчете на сухую массу, а в клетках спирулины достигает
60—65 %. Белки водорослей хорошо сбалансированы по содержанию
незаменимых аминокислот, недостаточно содержится лишь метио¬
нина. Наряду с высоким содержанием белковых веществ в клетках
водорослей довольно много синтезируется полиненасыщенных жир¬
ных кислот (являющихся, как и некоторые аминокислоты, незамени¬
мыми) и провитамина А — каротина (до 150 мг%). Каротина в био¬
массе водорослей в 7—9 раз больше, чем в травяной муке из люцерны,
отличающейся наиболее высоким содержанием этого провитамина
среди кормовых трав. Содержание нуклеиновых кислот в однокле¬
точных водорослях значительно ниже (2—4 %), чем у бактерий, одна¬
ко несколько выше по сравнению с растительными источниками бел¬
ка (1-2 %).Технология получения белковой массы из клеток водорослей
включает выращивание промышленной культуры в культиваторах
открытого или закрытого типа, отделение водорослей от массы воды,
приготовление товарного продукта в виде суспензии, сухого порошка
или пастообразной массы. Процесс отделения клеток водорослей от
массы воды энергоемкий, так как необходимо перерабатывать боль¬
шие объемы жидкости.Вначале отстаивают клеточную суспензию, затем клетки водорос¬
лей отделяют от воды декантацией. Для ускорения осаждения клеток
часто применяют метод химической флоккуляции, вызывающий бы¬
струю коагуляцию частиц. После осаждения клеточной биомассы ее
пропускают через сепаратор, в результате чего происходит концен¬
трирование суспензии до необходимой концентрации. Если требует¬365
ся получить пастообразный препарат, то полученную белковую массу
высушивают. Для улучшения переваримости биомассы клеток хло¬
реллы и сценедесмус проводят их обработку с целью разрушения кле¬
точных оболочек.В нашей стране наиболее распространено выращивание хлорел¬
лы, которая применяется для кормления сельскохозяйственных жи¬
вотных в виде суспензии (1,5 г/л сухого вещества) или сухого порош¬
ка. Суточная норма суспензии хлореллы при кормлении молодняка
крупного рогатого скота — 3—6 л, взрослых животных — 8—10 л.
При добавлении в корм жвачных животных муки хлореллы допуска¬
ется замена 50 % растительного белка белком водоросли.Важное значение имеет выращивание водорослей на стоках про¬
мышленных предприятий, тепловых электростанций, животновод¬
ческих комплексов, так как в этих случаях наряду с получением кор¬
мового белка одновременно решаются проблемы, связанные с защи¬
той окружающей среды. Так, например, выращивание культуры сце¬
недесмус или хлореллы на стоках животноводческих комплексов в
течение 15 сут позволяет почти полностью очистить их от органиче¬
ских веществ, исчезает запах и цвет. При культивировании водорос¬
лей на промышленных стоках или стоках тепловых станций исполь¬
зуется отводимый с этих объектов избыток теплоты, а также утилизи¬
руется углекислота, образуемая как побочный продукт технологиче¬
ских процессов и в результате сжигания различных отходов.Культиваторы открытого типа для выращивания водорослей име¬
ются во многих странах. Крупнейшая фирма по выращиванию хло¬
реллы «Хлорелла Сан Компани» имеется в Японии. В Болгарии на во¬
дах термальных источников культивируют водоросли хлорелла и сце¬
недесмус, причем болгарским ученым удалось получить штаммы хло¬
реллы без целлюлозной оболочки, вследствие чего биомасса таких
клеток хорошо переваривается в организме животных. В значитель¬
ном количестве белковые концентраты из водоросли спирулины про¬
изводятся в странах центральной Африки и Мексике, где имеются
щелочные озера. Крупнейшим производителем различной продук¬
ции из биомассы и белков спирулины является фирма «Соса Текско-
ко» (Мексика). В Италии разрабатывается технология выращивания
клетокспирулины на морской воде и в культиваторах закрытого типа.В связи с тем, что биомасса водорослей рода Spirulina легко пере¬
варивается ферментами желудочного сока и характеризуется высо¬
ким содержанием белков (до 70 % сухой массы), хорошо сбалансиро¬
ванных по аминокислотному составу, она в ряде стран используется
для приготовления продуктов питания, главным образом кондитер¬
ских изделий, обогащенных белком.366
Учитывая важное значение вводимых в промышленную культуру
водорослей как дополнительного источника полноценного белка для
кормления сельскохозяйственных животных и питания людей, уче¬
ными разных направлений — селекционерами, генетиками, биохи¬
миками — проводятся исследования по улучшению существующих
промышленных штаммов одноклеточных водорослей и получению
новых генотипов, которые должны сочетать в себе высокую интен¬
сивность фотосинтеза, холодоустойчивость, хорошую перевари¬
мость, способность синтезировать большое количество белка лучше¬
го качества (повышенное содержание незаменимых аминокислот) и
полнее утилизировать субстрат. Важная роль в реализации таких ис¬
следований отводится методам генетической инженерии.Белки микроскопических грибов. Ценным источником хорошо
сбалансированных по аминокислотному составу белков являются
клетки мицелия многих микроскопических грибов. По своим пита¬
тельным свойствам белки грибов приближаются к белкам сои и мяса,
вследствие чего могут использоваться не только для приготовления
кормовых концентратов, но и как добавка в пищу человека. Сырьем
для промышленного выращивания микроскопических грибов обыч¬
но служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллю¬
лозы, лигнин. При этом одновременно решаются две важные зада¬
чи — получение белковой массы и утилизация отходов растениевод¬
ства, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промыш¬
ленности, которые могут быть источниками загрязнения окружаю¬
щей среды.Особенно важно найти активные штаммы микроорганизмов,
способные утилизировать углерод лигнина, обладающего высокой
устойчивостью к разложению микрофлорой. В природе лигнин раз¬
лагается лишь грибами коричневой и белой гнили из родов Stropharia,
Pleurotus, Abortiporus, Coriolus, Stereum и др. В настоящее время в про¬
цессе исследований отобраны атоксичные быстрорастущие штаммы
мезо- и термофильных грибов для промышленного культивирования
из родов Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Trichoderma. Клетки мице¬
лия этих фибов имеют тонкую клеточную оболочку, вследствие чего
очень хорошо перевариваются в желудочно-кишечном тракте живот¬
ных. Они содержат в своем составе комплекс ароматических веществ,
улучшающих их вкусовые качества, богаты витаминами и легкоус¬
вояемыми липидами. По сравнению с дрожжевыми белки микроско¬
пических грибов отличаются повышенным содержанием серосодер¬
жащих аминокислот и лучшей усвояемостью. Концентрация нуклеи¬
новых кислот в грибном мицелии (1 —4 % от сухой массы) почти такая
же, как в тканях растительного организма. Вместе с тем в биомассе367
грибов значительно меньше, чем в дрожжах, синтезируется белков
(20—60 % от сухой массы) и у них относительно медленней происхо¬
дит рост биомассы (удвоение биомассы через 4—16 ч, тогда как у
дрожжей через 2—3 ч).Низшие мицелиальные грибы, культивируемые на целлюлозо- и
лигнинсодержащих растительных отходах, вследствие их способно¬
сти синтезировать комплекс гидролитических ферментов разлагают
целлюлозу и лигнин до простых веществ, из которых образуются ами¬
нокислоты и белки. В целях ускорения роста грибов проводится пред¬
варительная обработка растительного сырья, повышающая доступ¬
ность его компонентов для утилизации микроорганизмами. Чаще
всего применяют кислотно-щелочной способ обработки целлюлозо-
и лигнинсодержащих отходов, отпаривание под давлением, обработ¬
ку аммиаком и каустической содой. После такой обработки происхо¬
дит полное или частичное разложение трудногидролизуемых полиса¬
харидов и лигнина, что обеспечивает ускоренный рост грибной мас¬
сы и сокращает сроки промышленного культивирования грибов (до7—8 сут).В зависимости от способа подготовки растительного сырья для
культивирования микроскопических грибов применяют и соответст¬
вующие технологии их выращивания. Для культивирования грибов
на твердой питательной среде разработан метод твердофазной фер¬
ментации, который включает измельчение и обработку растительно¬
го сырья парами воды и аммиака, обогащение этого сырья минераль¬
ными веществами, посев и выращивание мицелия грибов в заданном
режиме аэрации и поддержания оптимальной температуры. Однако
при такой технологии культивирования грибов коэффициент ис¬
пользования растительного сырья невысокий, что предопределяет и
сравнительно невысокий уровень содержания белка в выращиваемой
фибной массе (20—30 % от сухой массы). Так, прямое культивирова¬
ние низших мицелиальных фибов на соломе и других отходах расте¬
ниеводства обеспечивает включение углерода из этих источников в
органическое вещество фибного мицелия на 17—25 %.Более высокий коэффициент использования сырья обычно дос¬
тигается при выращивании фибов на гидролизатах растительных от¬
ходов и жидких отходах деревообрабатывающей и целлюлозно-бу¬
мажной промышленности, для этих целей применяют метод глубин¬
ного культивирования, как и при выращивании кормовых дрожжей.
Содержание белков в фибной массе, выращенной на жидкой пита¬
тельной среде, может достигать 50—60 % от сухой массы. В целях бо¬
лее полного использования также практикуется совместное культи¬
вирование фибов и бактерий. Наряду с использованием раститель¬368
ных отходов разработаны технологии по переработке в грибной белок
торфа, навоза, экскриментов животных.Хорошая перевариваемость грибной белковой массы в организме
животных, а также низкий уровень содержания нуклеиновых кислот
позволяют использовать ее в качестве кормовой добавки в значитель¬
но большей концентрации, чем кормовые дрожжи. Обычно при
кормлении молодняка животных допускается введение в кормовые
рационы грибного белка в пределах 15—20 % от белка корма, а при
кормлении взрослых животных возможна замена в корме 50 % расти¬
тельного белка на грибной.Кормовые белковые концентраты из растений. В поисках источни¬
ков полноценного кормового и пищевого белка ученые уже давно об¬
ратили внимание, что дикие травоядные животные, для которых
единственным источником белка являются пастбищные травяни¬
стые растения, нормально развиваются и не имеют каких-либо от¬
клонений в обмене веществ, связанных с недостатком незаменимых
аминокислот. Все это свидетельствует о том, что белки вегетативной
массы трав и других растений имеют хорошо сбалансированный ами¬
нокислотный состав. Они различаются в основном по интенсивности
синтеза белков, тогда как аминокислотный состав их белков доволь¬
но близок (табл. 6.3).Таблица 6.3. Содержание незаменимых аминокислот в белках вегетативной
массы травянистых растений (в г на 100 г белка)АминокислотаБелки травянистых растенийЭталон ФАОИзолейцин4,5-5,54,2Лейцин8,8-10,24,8Лизин5,6-7,34,2Метионин1,6-2,62,2Фенилаланин5,5-6,82,8Треонин4,7-5,32,8Триптофан1,2-2,31,2Валин5,9-6,94,2По содержанию всех аминокислот белки трав не уступают или
значительно превышают эталон ФАО, и только лишь некоторый де¬
фицит отмечается по количеству метионина.Опыты показывают, что из всех травянистых растений наиболее
высокую биологическую ценность белков имеют бобовые кормовые
травы (80—90 %), несколько ниже биологическая ценность белков у
мятликовыхтрав (75—85 %). Бобовые растения также отличаются бо¬369
лее высоким содержанием белков в вегетативной массе (15—25 % от
сухой массы), чем мятликовыетравы (8—15 %). Особенно много бел¬
ков содержится в листьях люцерны.Благоприятный аминокислотный состав белков вегетативной
массы трав и способность многих из них к интенсивному синтезу в
листьях белковых веществ послужили реальной основой для разра¬
ботки технологии извлечения из растительной массы белков с целью
их использования на кормовые и пищевые нужды. Первые такие
опыты относятся к 1773 г. Белки в этих опытах выделяли из растений
путем отжатая сока.Однако позднее было выяснено, что в растительном соке содер¬
жится много вредных примесей, таких как фенолы, тяжелые металлы,
ингибиторы трипсина (фермент желудочного сока животных и чело¬
века), гемолизирующие вещества (свертывающие кровь), нуклеино¬
вые кислоты, алкалоиды, продукты разложения хлорофилла и др.
Больше таких веществ — в ядре, хлоропластах, митохондриях и мень¬
ше — в цитоплазме. Исходя из этого, для использования на кормовые
и пищевые цели наиболее пригодны цитоплазматические белки.В нашей стране промышленное производство белков из расти¬
тельных соков впервые было организовано в 1942 г., выпускался бел¬
ковый концентрат, содержащий в значительном количестве провита¬
мин А-каротин, он использовался для лечения раненых. К началу
1960-х годов были разработаны технологии получения растительного
белка для пищевых целей и использования в животноводстве.Небольшие промышленные установки для получения кормовых
белковых концентратов из вегетативной массы растений могут разме¬
щаться на территории любого хозяйства, имеющего собственный
кормоцех. Технология приготовления белковых концентратов вклю¬
чает измельчение растительной массы, отжим сока, коагуляцию сока,
разделение коагулята на зеленую творогообразную массу и коричне¬
вый сок, консервирование белково-витаминной пасты. Технологиче¬
ская схема работы одной из таких установок показана на рис. 6.3.Таким образом, в результате переработки растительной массы мо¬
гут быть получены три вида кормов: белковый коагулят, из которого
получают белково-витаминную пасту; ферментированный сок, обра¬
зующийся после отделения белкового коагулята; остатки раститель¬
ного материала после отжатия сока в виде жома.Белковый коагулят, содержащий 15—22 % белков на сухую массу,
обычно скармливают животным в зимний период. При пониженной
температуре он может храниться без добавления консервантов в тече¬
ние месяца. При скармливании жвачным животным белково-вита-370
Рис. 6.3. Технологическая схема получения кормовых белковых концентратов из
вегетативной массы растений:1 — приемник зеленой массы; 2 — транспортер для подачи зеленой массы в измельчитель; 3— из¬
мельчитель; 4 — пресс для получения растительного сока; 5 — сборник сока; 6 — транс портер для
удаления жома; 7 — насос подачи сока в ферментер; 8 — ферментер-коагулятор; 9 — сборник фер¬
ментированного сока; 10 — сборник коагулята; 11 — насос подачи коагулята; 12— сборник коагу¬
лятаминной пасты ее белок может составлять до 50 % от белка кормового
рациона.Ферментированный коричневый сок содержит 7—12 % сухого веще¬
ства, 1—3 % белков, 1—1,5 % органических кислот, 4 —5 % безазоти-
стых экстрактивных веществ (сумма легкоусвояемых углеводов),
1—2 % зольных веществ, 40—50 мг% каротина. Он используется для
добавления в корм сельскохозяйственным животным (свиньям, на¬
пример, 1,5 л на голову в сутки). Кроме того, коричневый сок можно
перерабатывать в кормовые дрожжи.Жом также может быть использован для кормления животных, в
его сухом веществе содержится 12—17 % белков, 3—4 % сырого жира,8—9 % зольных веществ, 35 % сырой клетчатки.Обычно для получения белково-витаминной пасты используют
листья люцерны, клевера, сахарной свеклы. Белковую массу из ли¬
стьев сахарной свеклы при соответствующей очистке можно также
перерабатывать в пищевой белок.6.2.	ПРОИЗВОДСТВО НЕЗАМЕНИМЫХ АМИНОКИСЛОТПолучение кормовых белковых концентратов с повышенным со¬
держанием незаменимых аминокислот позволяет балансировать кор¬
ма сельскохозяйственных животных главным образом по уровню
белка, тогда как оптимальный аминокислотный состав кормового
белка при таком способе балансирования полностью не достигается.371
По некоторым аминокислотам почти всегда требуется для доведения
их концентрации в кормовом рационе до оптимума добавление пре¬
паратов чистых аминокислот, полученных промышленным спосо¬
бом. В мире ежегодно производится не менее 300 тыс. т кормовых
препаратов незаменимых аминокислот. Расширяется их производст¬
во и в нашей стране.Возможны три способа промышленного получения незаменимых
аминокислот: гидролиз белков растительного и микробного происхо¬
ждения, микробиологический, а также химический синтез. Более
60 % всех производимых промышленностью чистых препаратов ами¬
нокислот получают путем микробиологического синтеза. На втором
месте по объему производства находится химический синтез. Основ¬
ным недостатком химического синтеза является получение смеси
аминокислот, состоящей из изомеров, относящихся как к D-, так и к
L-ряду, тогда как биологической активностью в организме человека и
животных обладают лишь L-формы. D-Формы аминокислот не
перевариваются ферментными системами этих организмов, а неко¬
торые из них токсичны для человека и животных. Исключением в
этом отношении является аминокислота метионин, у которой биоло¬
гически активны как D-, так и L-формы, в связи с чем данная амино¬
кислота производится преимущественно методом химического син¬
теза. Технологически получение аминокислот за счет гидролиза бел¬
ков экономически менее выгодно, поэтому не получило широкого
распространения.Путем микробиологического синтеза образуются L-аминокисло-
ты, являющиеся продуктами жизнедеятельности специально подоб¬
ранных и отселектированных штаммов микроорганизмов, которые
способны накапливать в культуральной жидкости до 150 г/л синтези¬
руемой аминокислоты. Чаще всего для микробиологического синтеза
аминокислот используются ауксотрофные мутантные штаммы, кото¬
рые получают методами обычной селекции или генной инженерии.
С помощью мутагенных факторов у таких ауксотрофных штаммов
индуцируется мутация, в результате которой прекращается или инги¬
бируется синтез одного из продуктов, оказывающих регуляторное
воздействие на ферментные системы, катализирующие образование
данной аминокислоты, в результате чего концентрация этой амино¬
кислоты в клетках мутанта и в культуральной жидкости повышается.На основе культивирования микроорганизмов с целью получения
чистых препаратов аминокислот применяются промышленные тех¬
нологии, включающие одно- и двухступенчатый синтез аминокис¬
лот. При одноступенчатом синтезе в промышленных культиваторах
выращивают ауксотрофные мутанты, являющиеся сверхпродуцента¬372
ми тех или иных аминокислот. После завершения рабочего цикла их
выращивания производится отделение культуральной жидкости от
клеток микроорганизмов, сгущение культуральной жидкости и полу¬
чение из нее товарного продукта с высокой концентрацией синтези¬
рованной микробами аминокислоты. В процессе двухступенчатого
синтеза аминокислоты вначале получают ее предшественника (часто
наиболее дешевым химическим синтезом), а затем с помощью фер¬
ментов, вырабатываемых микроорганизмами, производится превра¬
щение предшественника в аминокислоту, при этом образуется только
L-форма. В качестве источника фермента могут быть использованы
либо суспензия клеток микроорганизмов, либо полученный после
разрушения этих клеток ферментный раствор.Микробиологический синтез лизина. Белки семян зерновых куль¬
тур (пшеницы, ячменя, кукурузы и др.) не сбалансированы по содер¬
жанию незаменимых аминокислот и прежде всего лизина. Поэтому
для удовлетворения потребностей животноводства в нашей стране,
как и в ряде других стран (Япония, США, Франция, Испания, Юго¬
славия), организовано крупнотоннажное производство этой незаме¬
нимой аминокислоты. В основу производства положены технологии
с использованием одноступенчатого микробиологического синтеза,
которые включают промышленное культивирование ауксотрофных
мутантов бактерий из рода Corynebacterium, способных к сверхсинтезу
этой аминокислоты. Обычно у диких штаммов, из которых получены
ауксотрофные мутанты, сверхсинтеза лизина не наблюдается, так как
у них действуют механизмы саморегуляции. В клетках бактерий ами¬
нокислота лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты через ряд
промежуточных этапов, связанных с образованием полуальдегида ас¬
парагиновой кислоты, дигидропиколиновой кислоты и а,е-диамино-
пимелиновой кислоты, являющейся непосредственным предшест¬
венником лизина. Полуальдегид аспарагиновой кислоты является
также одним из предшественников в синтезе аминокислот — треони¬
на, метионина и изолейцина (схема 1).Процесс синтеза всех указанных аминокислот (лизина, треонина,
метионина и изолейцина) начинается фосфорилированием аспара¬
гиновой кислоты с участием фермента аспартаткиназы, активность
которого ингибируется совместным действием двух аминокис¬
лот — лизина и треонина, если они накапливаются в клетках бакте¬
рий в избыточной концентрации. Если каким-либо путем понизить
концентрацию одной из этих аминокислот, то синтез другой будет
осуществляться даже при условии, когда она накапливается вдоволь-
но высокой концентрации.373
Схема 1. Синтез лизина метионина, треонина и изолейцинаВ соответствии со схемой превращения аминокислот (см. схему 1)
для снятия регуляции синтеза лизина необходимо прекратить образо¬
вание треонина на стадии превращения полуальдегида аспарагино¬
вой кислоты в гомосерин, катализируемого ферментом гомосерин-
дегидрогеназой. Последнее достигается посредством мутагенеза.
Опыты показывают, что мутантные клетки, не образующие гомосе-
риндегидрогеназы, при их культивировании на искусственной пита¬
тельной среде обеспечивают высокий выход лизина. Дефицитные
аминокислоты, которые не синтезируются мутантными клетками
(гомосерин, треонин, метионин), вводятся в состав питательной сре¬
ды в таком количестве, чтобы они не были регуляторами синтеза ли¬
зина.В процессе приготовления питательной среды для культивирова¬
ния производственных штаммов ауксотрофных мутантов, обладаю¬
щих способностью к сверхсинтезу аминокислоты лизина, в качестве
источника углерода обычно используют смеси, включающие уксус¬
ную кислоту и свекловичную мелассу, в качестве источника азота —
соли аммония, мочевину, кукурузный экстракт, гидролизаты дрож¬
жей. Кроме дефицитных аминокислот, которые не синтезируются
клетками мутантов, в питательную среду также добавляют необходи¬
мые для жизнедеятельности микроорганизмов макро- и микроэле¬
менты (Р, Mg, Fe, Са, Мп и др.) и витамины (витамины группы В,
биотин и др.). В процессе культивирования микроорганизмов обес-374
Рис. 6.4. Схема технологической линии по производству кормовых концентра¬
тов лизина:/ — подогрев и растворение свекловичной мелассы; 2 — смешивание кукурузного экстракта, пита¬
тельных солей и мела в водной суспензии; 3 — нагревательная колонка; 4 — выдерживатель;
5 —теплообменник для охлаждения; б—аппараты для размножения и стерилизации посевной
культуры; 7— подача посевного материала; 8 — система фильтров для очистки и стерилизации
воздуха; 9 — ферментер для выращивания промышленной культуры; 10 — фильтры экологической
очистки выходящих газов; 11 — получение монохлоргидрата лизина; 12— подача в реактор соля¬
ной кислоты, бисульфита натрия; 13— монохлоргидрат лизина; 14— подогрев культуральной
жидкости, содержащей монохлоргидрат лизина; 15— выпарная установка; 16— сборник жидкого
концентрата лизина (ЖКЛ); /7—смешивание ЖКЛ с наполнителем; 18— распылительная су¬
шилка; 19— подача горячего воздуха; 20— отделение частиц сухого концентрата лизина от возду¬
ха; 21 — экологическая очистка воздуха перед сбросом в атмосферу; 22 — приемник сухого кормо¬
вого концентрата лизина (ККЛ)печивается подача стерильного воздуха при помощи специальных
турбинных мешалок, для предотвращения вспенивания субстрата и
клеточной суспензии в среду культивирования добавляется пенога-
ситель. Схема технологической линии по производству лизина пока¬
зана на рис. 6.4.375
Посевной материал, предназначенный для производственной
ферментации, вначале выращивают в посевных аппаратах при
28—32 °С, pH 7—7,2 в течение 18—24 ч, а затем полученная суспензия
клеток подается в производственные ферментеры емкостью 50—
100 м3, в которых поддерживается постоянный режим аэрации, необ¬
ходимое давление, осуществляется контроль за всеми компонентами
и параметрами среды. Время ферментации 55—72 ч. Накопление в
культуральной жидкости лизина начинается после 25—30 ч выращи¬
вания промышленной культуры и к концу ферментации достигает
40—50 г/л. Культуральную жидкость отделяют от культуры клеток
продуцента фильтрованием и используют для получения препаратов
лизина.На основе промышленной культуры синтезирующих лизин бак¬
терий организовано производство нескольких видов товарной про¬
дукции: жидкий концентрат лизина (ЖКЛ), сухой кормовой концен¬
трат лизина (ККЛ), высококонцентрированные кормовые и высоко-
очищенные кристаллические препараты для пищевой и медицин¬
ской промышленности.Жидкий концентрат лизина получают путем упаривания культу¬
ральной жидкости на вакуумной установке до концентрации сухого
вещества 40 %. Для предотвращения деградации лизина в процессе
нагревания в культуральную жидкость добавляют бисульфит натрия
и соляную кислоту до pH 4,5—5,0, в результате чего образуется
соль — монохлоргидрат лизина.В процессе получения сухого кормового концентрата лизина
ЖКЛ высушивают горячим воздухом на распылительной сушилке
при температуре 90 °С до влажности препарата 4—8 %. Высушенный
таким образом препарат содержит 15—20 % монохлоргидратализина,
15—17 % белков, 14 % других аминокислот, витамины группы В, ми¬
неральные вещества. В целях снижения гигроскопичности препарата
в него добавляют наполнители: костную муку, негашеную известь,
бентонит, пшеничные отруби. Чаще всего в качестве наполнителя ис¬
пользуют отруби, которые добавляются в ЖКЛ после упаривания.
Полученную в результате тщательного перемешивания пасту высу¬
шивают на вальцово-ленточной сушилке и гранулируют. Гранулиро¬
ванный препарат ККЛ негигроскопичен, содержит 7—10 % лизина.Для получения очищенного высококонцентрированного препа¬
рата лизина культуральную жидкость после фильтрования подкисля¬
ют соляной кислотой до pH 1,6—2,0. Образовавшийся в результате
взаимодействия с соляной кислотой раствор монохлоргидрата лизи¬
на направляется на колонки с катионитом, где происходит сорбция
аминокислоты и отделение ее от культуральной жидкости. Затем про-376
нодится десорбция аминокислоты путем элюирования 0,5—5 %-м
раствором аммиака. Элюат упаривается под вакуумом при 60 °С до
концентрации сухого вещества 30—50 %, после чего подкисленный
соляной кислотой раствор монохлоргидрата высушивается и исполь¬
зуется как кормовой концентрат. Путем перекристаллизации полу¬
ченной соли можно получить препараты лизина с содержанием мо¬
нохлоргидрата 97—98 %.В процессе производства лизина кроме основного продукта по¬
лезное применение находят также побочные продукты и отходы. Так,
после отделения культуральной жидкости в осадке остаются клетки
бактерий-продуцентов, фосфаты и другие компоненты питательной
среды, которые после их высушивания могут быть использованы в
качестве кормовой белковой добавки. С другой стороны, технологи¬
ческие стоки и промывные воды после выделения монохлоргидрата
лизина, содержащие в растворенном состоянии аминокислоты, дру¬
гие ценные компоненты культуральной жидкости, остаточный ли¬
зин, объединяют и полученную смесь упаривают, а затем высушива¬
ют с наполнителем до влажности 10 %, в результате получают кормо¬
вой препарат с высоким содержанием белков (до 40 %) и незамени¬
мых аминокислот.В ряде стран (Япония, США) для получения лизина применяется
химико-энзиматический метод, позволяющий создать высокоэф¬
фективные технологии, сочетающие достоинства химического и
микробиологического синтеза. Эти технологии основаны на фермен¬
тативной конверсии в лизин а-амино-е-капролактама, который по¬
лучают путем химических реакций из циклогексана:В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь
D- и L-капролактама. Эта смесь направляется в реактор с ферментом
гидролазой а-амино-е-капролактама, который катализирует превра¬
щение L-капролактама в L-лизин. D-Изомер капролактама далее
подвергается превращению в L-форму с участием специфической ра-
цемазы. При такой технологии получения лизина его содержание в
реакционной смеси по завершении рабочего цикла достигает свыше
• 50 г/л.Н2Ссн	?H-Cf H,NnI 2	„ Н2С CHNH2—^Н2С CHNH,I	2I I 2 2| I 2CH2	H2cs ^сн2 H2C^ ^сн2H2CV ^сн
\ /
сн2циклогексан377
Продуцентами гидролазы а-амино-е-капролактама служат неко¬
торые штаммы дрожжей из родов Cryptococcus, Candida, Trichosporon.
Дрожжи выращиваются в щелочной среде на оптимизированной для
синтеза фермента питательной среде, содержащей активаторы —
Mn2+, Mg +, Zn2+. Для ферментативной реакции превращения капро-
лактама в лизин может использоваться клеточная суспензия дрожже¬
вых клеток с активным ферментом, клеточный экстракт (после разру¬
шения и отделения клеток) или очищенный фермент. Рацемазу, ката¬
лизирующую превращение D-капролактама в L-изомер, получают из
бактерий Achromobacter, Flavobacterium и др.Процессы изомеризации D-капролактама в L-изомер и превра¬
щение L-капролактама в лизин можно проводить одновременно. Для
этого в водный раствор D-, L-капролактама вводится необходимое
количество дрожжевых и бактериальных клеток, задаются оптималь¬
ные режимы температуры, pH, аэрации. На выходе из реактора обра¬
зуется преимущественно один продукт — L-лизин, который выделя¬
ют из смеси и далее очищают и сушат. Кроме изложенной выше тех¬
нологии получения чистых препаратов лизина разрабатываются и
другие методы, сочетающие в себе использование химического син¬
теза для получения предшественников лизина и энзиматическое пре¬
вращение их в лизин на конечной стадии производства, что позволяет
значительно интенсифицировать производственный процесс и сни¬
зить себестоимость продукции.Микробиологический синтез триптофана. Наряду с лизином разра¬
ботаны промышленные технологии получения кормовых и высоко-
очищенных препаратов другой незаменимой аминокислоты — трип¬
тофана. Для производства этой аминокислоты применяется как од¬
ноступенчатый синтез при помощи бактериальных ауксотрофных
мутантов с нарушенной регуляцией, так и двухступенчатый синтез,
включающий вначале получение предшественника триптофана, а за¬
тем его ферментативное превращение в конечный продукт — трип¬
тофан.У бактерий и многих других организмов аминокислота триптофан
образуется из эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпировиноградной ки¬
слоты через ряд последовательных реакций, включающих образование
шикимовой и хоризмовой кислот, а непосредственным предшествен¬
ником триптофана в процессе его синтеза является антраниловая ки¬
слота (схема 2).Синтез указанных в схеме аминокислот ингибируется конечными
продуктами, которые действуют на ферменты, катализирующие на¬
чальные этапы превращений, связанные с образованием хоризмовой
кислоты. Из схемы 2 видно, что для смещения метаболических реак-378
Схема 2. Синтез триптофана, фенилаланина и тирозинаций по пути преимущественного образования триптофана необходи¬
мо блокировать превращение хоризмовой кислоты в префеновую.
Такое блокирование достигается действием мутагенных факторов.
У мутантов с пониженной активностью ферментов, катализирующих
превращение хоризмовой кислоты в префеновую, наблюдается по¬
вышенный синтез аминокислоты триптофана, однако для нормаль¬
ного развития этих мутантов в питательную среду необходимо добав¬
лять дефицитные аминокислоты — фенилаланин и тирозин в коли¬
чествах, не вызывающих регуляторное ингибирование ферментов
синтеза триптофана.Для промышленного получения незаменимой аминокислоты
триптофана разработаны технологии на основе использования ауксо-
трофных мутантов бактерии Bacillus subtilis с нарушенным синтезом
фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организо¬
ваны примерно по такой же схеме, как и получение лизина при помо¬
щи мутантов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37 °С,
концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает
•О г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий379
она упаривается и высушивается при 110—120 °С. Высушенный пр<
дукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ).При получении высококонцентрированных препаратов триптс
фана культуральную жидкость подвергают дополнительной очистк
Вначале ее подкисляют соляной кислотой до pH 1,0, затем центриф
гированием отделяют образовавшийся осадок. Далее центрифуга
содержащий триптофан, пропускают через ионно-обменные коло]
ки с катионитом, в результате чего происходит связывание амтц
кислоты катионитом и выделение ее из культуральной жидкост
После промывки колонок производится десорбция триптофан
5 %-м раствором аммиака в смеси изопропанола и воды. Элюат hi
правляется в вакуумный выпариватель, после чего проводится кр)
сталлизация аминокислоты при 4—8 °С. Выделенная в кристалл ич<
ском виде соль триптофана промывается этанолом и высушивает»?
под вакуумом при 60 °С. Высушенный кристаллический препарате*
держит не менее 99 % триптофана в виде хлорида. Осадок после отд<
ления культуральной жидкости, содержащий клетки культуры баки
рий, также высушивают и используют как высокобелковую корма
вую добавку, содержащую, кроме того, повышенное количеств<
триптофана.В нашей стране синтез триптофана производится по двухступен¬
чатой схеме. Вначале методом химического синтеза получают пред¬
шественник триптофана — антраниловую кислоту, которую затем d
участием ферментов микробного происхождения превращают в
триптофан. Биохимическое превращение антраниловой кислоты в!
триптофан проходит в три этапа:	<соон фрпф	нонои 	НООС ГР)ОС-С-<бозилпирофосфата (ФРПФ) образуется аминогликозид-1Ч-(5'-фос-!
форибозил)-антраниловая кислота, которая далее в результате внут-;
римолекулярной перегруппировки и декарбоксилирования превра¬
щается в индол-3-глицерофосфат. На последнем этапе поддействием
фермента триптофансинтетазы из индолглицерофосфата и амино¬
кислоты серина осуществляется синтез триптофана. В связи с тем чтоН Н 1антраниловаякислота2 индол-3- глицери- трипто-
глицеро- новый Фан
фосфат альдегидН 3-фосфо-ОН ОНМ-(5’-фосфорибозил)-
антраниловая кислотаНа первом этапе из антраниловой кислоты с участием фосфори- j380
„ качестве активной группы у фермента триптофансинтетазы служит
пиридоксальфосфат, от наличия в среде этого кофермента зависит
скорость превращения антраниловой кислоты в триптофан. В качест¬
ве источника ферментов для указанных реакций используют дрожжиС. utilis.Производственный процесс биохимического превращения ан¬
траниловой кислоты втриптофан проводится вдве стадии. На первой
стадии наращивается биомасса дрожжей, являющихся продуцентами
ферментов. Питательная среда для выращивания дрожжей готовится
из свекловичной мелассы, мочевины и минеральных солей. Фермен¬
тация продолжается в течение 24 ч при 30 °С. Далее в ферментер на¬
чинают вводить спиртовой 5 %-й раствор антраниловой кислоты и
50 %-й раствор мочевины. Через 3—4 ч после добавления антранило¬
вой кислоты в ферментер дополнительно подается углеродный суб¬
страт — меласса в виде 25 %-го раствора. На последующих этапах
ферментации периодически производится подача антраниловой
кислоты и мочевины через каждые 6 ч и раствора мелассы — через
каждые 12 ч. Длительность ферментации около 120 ч, а с учетом вре¬
мени наращивания биомассы дрожжей — 144 ч. Содержание трипто¬
фана в культуральной среде составляет 0,3—0,5 %, или примерно 6
г/л. После упаривания и сушки получают кормовой концентрат трип¬
тофана (ККТ), содержащий 90 % сухого вещества, 48—54 % белков,
1—3 % триптофана, 1,5^1,9мг% витамина Вь 2,5—3,3 мг% витамина
В2, 62—68 мг% витамина PP.Для получения высококонцентрированных препаратов трипто¬
фана его выделяют из культуральной жидкости и очищают по методи¬
ке, указанной выше (см. с. 376—377).6.3.	ПРОИЗВОДСТВО КОРМОВЫХ ВИТАМИННЫХ ПРЕПАРАТОВВажным фактором повышения питательной ценности кормов
сельскохозяйственных животных является наличие в них витами¬
нов — биологически активных веществ разного химического строе¬
ния, необходимых для поддержания жизнедеятельности организмов.
Биологическая активность витаминов определяется тем, что они в ка¬
честве активных группировок входят в состав каталитических цен¬
тров ферментов. Поэтому при недостатке этих веществ понижается
активность соответствующих ферментов и, как следствие, ослабля¬
ются или полностью прекращаются биохимические процессы, про¬
исходящие с участием данных ферментов. Последнее является при¬
чиной ряда серьезных заболеваний, вызванных недостатком витами¬
нов.381
Как установлено, организмы человека и животных не способш
синтезу витаминов, тогда как растения при нормальных услов»
развития полностью обеспечивают себя необходимыми витамина
(за исключением витамина В12). Микроорганизмы также синтези|
ют большинство необходимых им витаминов. Исходя из этого вид]
что продукты растительного и микробного происхождения предел
ляют собой незаменимые источники витаминов как для животш
так и для человека.Удовлетворение потребности этих организмов в витаминах о<
ществляется двумя путями — поступление с пищей и синтез мик[
флорой желудочно-кишечного тракта. Для организмов с однокам»
ным желудком, имеющим значительно меньше микрофлоры, главн
путь обеспечения витаминами — потребление с пищей или непоср<
ственно витаминов, или их метаболических предшественников
провитаминов, которые в организме человека и животных превраи
ются в витамины. В то же время жвачные животные, имеющие в пр<
желудках обильную микрофлору, способную к синтезу витаминоЕ
значительной степени удовлетворяют свою потребность во mhoi
витаминах за счет переваривания клеток отмерших микрооргаш
мов.В связи с тем что основные компоненты кормов сельскохозяй(
венных животных — продукты растительного происхождения
имеют не оптимальный состав и постоянно меняющееся содержан
необходимых животным витаминов, при составлении кормовых i
ционов возникает необходимость добавлять в корма препараты, оС
гащенные витаминами, которые получают из культур микрооргаш
мов. Микробиологическая промышленность нашей страны выпуа
ет два вида кормовых витаминных препаратов — кормовой рибоф.1
вин, содержащий витамин B2, и КМБ-12, имеющий в своем состг
витамин В12-Кормовые препараты витамина B2. Витамин B2 (рибофлавин) ни ;
химической природе представляет собой азотистое основание 6,7-ди-
метилизоаллоксазин, соединенное со остатком спирта D-рибита:Этот витамин входит в состав активных групп окислительно-вос¬
становительных ферментов — флавинмононуклеотида (ФМН) исн2-снон-снон-снон-сн2оновитамин В2382
флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поэтому при его недостатке на¬
блюдается ослабление окислительно-восстановительных процессов
в организме. По нормам кормления свиньям этого витамина требует¬
ся не менее 2—7 мг, лошадям и птице — 2—5 мг на 1 кг сухого корма.
Однако в растительной продукции, используемой в кормопроизвод¬
стве, витамина Вг содержится недостаточно. Много рибофлавина мо¬
гут синтезировать микроорганизмы — различные виды бактерий, ак-
тиномицеты, дрожжевые клетки, некоторые из них способны накап¬
ливать в культуральной среде до 1 мг/мл витамина Вг.В качестве промышленных продуцентов кормового рибофлавина
используются отселектированные штаммы дрожжей Eremothecium
ashbyii. Рибофлавин накапливается в вакуолях дрожжевых клеток и
придает культуре характерную желтую окраску. Для производствен¬
ной ферментации готовятся отдельно жидкая питательная среда и по¬
севной материал культуры дрожжей, выращенный в специальном по¬
севном аппарате.Питательная среда в необходимых концентрациях включает со¬
евую муку, кукурузный экстракт, мел, гидрол, сахар, К2НРО4, NaCl.
Перед подачей в ферментер она подвергается стерилизации. В каче¬
стве посевного материала используются споры Е. ashbyii, выращен¬
ные на пшене.Промытое пшено в течение 30—35 мин выдерживается в молоч¬
ной сыворотке для набухания, затем оно подсушивается и расфасо¬
вывается по 50—60 г в простирилизованные флаконы. В флаконах
пшено подвергается трехкратной стерилизации, после чего произво¬
дится его засев водной суспензией спор культуры дрожжей. Флаконы
с засеянной культурой в течение 7—8 дней инкубируют при 29—30 °С,
после чего подсушивают в вакуум-сушильной установке и далее на¬
правляют для приготовления жидкого посевного материала, который
после стерилизации подается в производственный ферментер.Культивирование продуцентов кормового рибофлавина прово¬
дится при 28—30 °С в течение 72 ч. Через каждые 8 ч ферментации от¬
бираются пробы для контроля за развитием микробных клеток, со¬
ставом среды и накоплением целевого продукта. Готовая культураль¬
ная жидкость по окончании ферментации должна содержать до 5 %
сухих веществ и 1,4 мг/мл рибофлавина.В целях стабилизации витамина в процессе высушивания культу¬
ральную жидкость подкисляют соляной кислотой до pH 4,5—5,0, по¬
сле чего она концентрируется в вакуум-выпарной установке. Полу¬
ченный концентрат обычно содержит 5,6 мг/мл витамина и 20 % су¬
хих веществ. После выпаривания избытка растворителя концентрат
рибофлавина высушивается на распылительной сушилке до влажно¬383
сти 5—10 %, затем смешивается с отрубями или кукурузной мукой и
расфасовывается по 20 кг в полиэтиленовые пакеты, которые упако¬
вываются в крафт-мешки. В готовом продукте содержится не менее
1 % витамина. Срок хранения сухого препарата — 1 год.Кормовые препараты витамина В^. Витамин В12 представлен груп¬
пой биологически активных веществ, содержащих в своем составе
трехвалентный кобальт, аминные и цианистые группировки, кото¬
рые могут быть замешены другими радикалами — ОН, С1, Вг. Этот
витамин стимулирует образование крови в костном мозге, улучшает
усвоение белков, участвует в синтезе аминокислот и азотистых осно¬
ваний. Витамин В12 не содержится в продуктах растительного проис¬
хождения и его единственным источником для сельскохозяйствен¬
ных животных являются микроорганизмы.Для промышленного получения кормовых препаратов витамина
В12 выращивается специально подобранный биоценоз микроорга¬
низмов, осуществляющих термофильное метановое брожение, в ко¬
торый входят целлюлозоразлагающие, аммонифицирующие, угле-
водсбраживающие, сульфитвосстанавливающие и метанообразую¬
щие бактерии. На первом этапе ферментации этих микроорганизмов
(в течение 10—12 дней) наблюдается бурное развитие термофильных
аммонифицирующих и углеводсбраживающих бактерий, которое
происходит в слабокислой среде (pH 5,0—7,0). Другие группы бакте¬
рий данного биоценоза достигают интенсивного развития при пере¬
ходе брожения в щелочную фазу (pH 7,0—8,5). Преобладающими в
этот период являются метанообразующие бактерии, которые синте¬
зируют в 4—5 раз больше витамина В12, чем другие микроорганизмы
биоценоза. Главные субстраты для развития метанообразующих бак¬
терий — жирные кислоты и низшие спирты, поэтому их добавление в
питательную среду значительно увеличивает выход витамина.Для приготовления питательной среды обычно используется бар¬
да ацетоно-бутилового производства, которая декантацией очищает¬
ся от твердых примесей, в нее добавляется хлорид кобальта (4 г/м3) и
0,5 % метанола.В процессе промышленного культивирования бактерий вначале
производится выращивание посевного материала (15—20 дней) в ап¬
паратах емкостью 250 м3, затем посевной материал подается в железо¬
бетонные ферментеры емкостью 4200 м3, в которых происходит мета¬
новое брожение. Свежая барда подается в нижнюю часть ферментера
в количестве 25—30 % от его объема за сутки. Отбор метановой браж¬
ки, содержащей витамин В12, производится в верхней части фермен¬
тера. В течение рабочего цикла в ферментере строго контролируется
pH среды, концентрация летучих жирных кислот, содержание аммо-384
иийного азота, поддерживается оптимальная температура (55—
57 °С). В результате брожения образуется газовая смесь, состоящая
Главным образом из метана (65 %) и диоксида углерода (30 %), кото¬
рая может быть использована как источник теплоты при сжигании.Готовая культуральная жидкость, образующаяся как продукт фер¬
ментации, обычно содержит 2—2,5 % сухих веществ и 1,1—1,7 мг/л
витамина В12. Для предотвращения разрушения витамина в процессе
сушки культуральную жидкость подкисляют соляной или фосфорной
кислотой до pH 6,3—6,5 и добавляют 0,2—0,25 % сульфита натрия.Подготовленная таким образом культуральная жидкость дегази¬
руется, упаривается на вакуум-выпарной установке, полученный
концентрат затем высушивается в распылительной сушилке до влаж¬
ности 5—10 %. В целях улучшения физических свойств сухой продукт
смешивается с отрубями или кукурузной мукой, расфасовывается по
25—30 кг в полиэтиленовые пакеты и упаковывается в крафт-мешки.
Содержание витамина В12 в готовом кормовом препарате составляет
2,5 мг%, срок хранения сухого препарата — 1 год. Препарат имеет
коммерческое название — К.МБ-12 (концентратмикробный вита¬
мин). Кроме витамина В(2 КМБ-12 содержит также другие витамины
группы В, незаменимые аминокислоты.6.4.	КОРМОВЫЕ ЛИПИДЫКроме белков, углеводов и витаминов неотъемлемым компонен¬
том кормов сельскохозяйственных животных являются липиды, со¬
держащие полиненасыщенные жирные кислоты — линолевую, ли-
ноленовую, арахидоновую, которые не могут синтезироваться в орга¬
низме животныхи, следовательно, должны поступать с пищей. Поли¬
ненасыщенные жирные кислоты, называемые незаменимыми,
участвуют в построении клеточных мембран, входя в состав структур¬
ных липидов. При недостатке незаменимых жирных кислот снижает¬
ся интенсивность роста сельскохозяйственных животных, угнетается
их репродуктивная функция, понижается сопротивляемость орга¬
низма инфекции.Основной источник незаменимых жирных кислот для сельскохо¬
зяйственных животных — различные растительные продукты, входя¬
щие в состав кормов. Однако очень часто в растительных кормах со¬
держится мало липидов или они имеют неблагоприятный состав
жирных кислот, что ухудшает питательную ценность кормов. В целях
балансирования кормовых рационов сельскохозяйственных животг
ных по содержанию незаменимых жирных кислот осуществляется
поиск новых источников биологически полноценных липидов, кото-:5'4266 ^	385
рые можно было бы использовать в качестве высококонцентрирован¬
ных кормовых добавок. Опыты показывают, что наиболее перспек¬
тивными промышленными продуцентами липидов, близкими по со¬
ставу к растительным жирам и пригодными для использования в кор¬
мовых целях, являются дрожжи и микроскопические грибы, которые
чаще всего накапливают внутриклеточные липиды, однако известны
виды, способные выделять липиды в культуральную жидкость.
В клетках этих микроорганизмов обычно содержится от 25 до 70 %
липидов в расчете на сухую массу, которые на 40—90 % представлены
триацилглицеринами и на 5—50 % — фосфолипидами. В них также
содержится много стероидных веществ (до 1—1,5 % на сухую массу),
представленных главным образом эргостерином, из которого в орга-.
низме животных образуется витамин D2.Таблица 6.4. Состав жирных кислот растительных масел и липидов некоторых
микроорганизмов (в % от суммы)Источник жирных ки¬
слотКислотамирис-
ти новаяпаль¬ми¬тиноваяпаль-мито-олеи-новаястеари¬новаяолеино¬ваялиноле-ваялиноле-новая!Оливковое масло—10—1,0827,0—Соевое масло0,511—4,522538,0Подсолнечное масло0,56,5—3,523650,5Льняное масло—7,0—14181447Candida Sake—2-110,3-41-421-924-231-17Candida scotti—0,1-100,1-11-431-4920-390,1-5Candida lipolitica—11-166-151-624-3531-510,1-9Rhodotorula glutinus—10-221-43-9025-4821-493-17Lipomyces lipoterus—13-231-22-325-3539-512-3Blakeslea trispora0,1-116-250,1-14-1336-4311-1911-12Rhizopus cohnii0,1-215-330,1-35-1334-4615-223-19Trichodermaharzianum0,2-78-300,1-13-718-3729-520,1-4Липидные компоненты дрожжей и микроскопических грибов
имеют довольно благоприятный состав жирных кислот (табл. 6.4), в
них много содержится олеиновой (20—50 % от общего количества
жирных кислот), линолевой (до 50 %), линоленовой (до 17—19 %) ки¬
слот и мало трудноусвояемых организмом животных кислот (окси-
кислот, кислот с нечетным числом углеродных атомов или разветв-386
денной цепью). Много липидов (50—60 % от сухой массы) способны
накапливать некоторые штаммы дрожжей Rhodotorula, Lipomyces,
Cryptococcus. Клетки дрожжей рода Candida синтезируют меньше ли¬
пидов (20—40 %), однако отличаются высокой скоростью роста и
способностью хорошо утилизировать разнообразные источники сы¬
рья. Микроскопические грибы могут синтезировать до 40—50 % вы¬
сокоценных липидов, сходных по составу жирных кислот с расти¬
тельными маслами.Из-за образования в клетках микроорганизмов активных ком¬
плексов гидролитических ферментов они способны утилизировать в
качестве источников углерода различные субстраты — гидролизаты
растительных отходов, послеспиртовую барду, молочную сыворотку,
мелассу, отходы зерноперерабатывающей промышленности, углево¬
дороды нефти, низкомолекулярные спирты (метанол, этанол). В ка¬
честве источника азота в питательную среду добавляют дрожжевой
или кукурузный экстракт, соли аммония, мочевину, но при этом
строго контролируют соотношение углерода и азота, так как при из¬
бытке азота снижается образование липидов в клетках микроорга¬
низмов (оптимальное соотношение С : N = 320—400).Кроме источников углерода и азота в питательную среду также до¬
бавляют Р, К, Mg, Zn, Fe, Мп, витамины группы В, токоферол. В про¬
цессе выращивания на питательной среде вначале наблюдается ин¬
тенсивный рост микроорганизмов и сравнительно небольшое накоп¬
ление липидов. Усиленный синтез липидов отмечается в начале ста¬
ционарной фазы развития микроорганизмов.При выращивании продуцентов кормовых липидов поддержива¬
ется температура 20—30 °С, так как при более высокой температуре
снижается выход липидов, а в липидах уменьшается доля полинена-
сыщенных жирных кислот. В процессе ферментации требуется под¬
держивать режим интенсивной аэрации, так как д ля окисления угле¬
родных субстратов необходим кислород. Кислород также необходим
для синтеза ненасыщенных жирных кислот, поэтому улучшение
аэрации стимулирует увеличение выхода незаменимых жирных ки¬
слот.По окончании ферментации микробная масса отделяется от ос¬
татков субстрата и высушивается примерно по такой же технологии,
как кормовые дрожжи. Для улучшения физических свойств к высу¬
шенному продукту добавляют отруби или кукурузную муку.Наряду с получением кормовых липидов на основе ферментации
микроорганизмов разрабатываются также технологии производства
комплексных микробных препаратов, содержащих белки, липиды,
каротиноиды и другие ценные питательные вещества, которые по¬387
зволяют балансировать корма одновременно по нескольким компо¬
нентам. Так, например, получен высокий эффект при введении в
кормовой рацион птиц белково-липидной биомассы дрожжей
Lipomyces lipoterus, содержащей 18—20 % белков и 27—29 % липидов,
а также биомассы гриба Blakeslea trispora с содержанием белков 30 % и
липидов 28 %. Следует отметить, что липиды микроорганизмов могут
быть использованы не только в кормопроизводстве, но и как замени¬
тель растительных пищевых жиров, используемых на технические
нужды (лакокрасочная, химическая промышленность), так как при¬
мерно 20 % от производимых в мире растительных жиров расходуется
на технические, непищевые цели.6.5.	ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫОдним из важных направлений современной биотехнологии яв¬
ляется получение на основе культивирования микроорганизмов и ис¬
пользование в сельском хозяйстве различных ферментных препара¬
тов, которые могут применяться в процессе приготовления кормов
для сельскохозяйственных животных как добавки к кормам для улуч¬
шения их усвояемости, а также в ветеринарии для профилактики и
лечения желудочных и паразитарных заболеваний.Основной компонент кормов сельскохозяйственных живот¬
ных — растительная продукция (зерно, силос, грубые корма и др.),
содержащая довольно много трудноперевариваемых веществ, —
клетчатка, лигнин, гемицеллюлоза. Даже у жвачных животных, со¬
держащих в преджелудке (рубце) активные штаммы целлюлозоразла¬
гающих микроорганизмов, клетчатка переваривается на 40—65 %. Не
полностью перевариваются также растительные белки (60—80 %),
липиды (60—70 %), крахмал и полифруктозиды (70—85 %), пектино¬
вые вещества.Для улучшения перевариваемости и повышения эффективности
использования растительных кормов в рационы сельскохозяйствен¬
ных животных вводят ферментные препараты (0,1—1,5 % от сухой
массы корма), полученные из микроорганизмов и содержащие актив¬
ные комплексы гидролитических ферментов. Препараты микробных
ферментов обычно получают из культур бактерий или микроскопи¬
ческих грибов (табл. 6.5). Некоторые виды бактерий (например, Вас.
Subtilis) выделяют гидролитические ферменты в культуральную сре¬
ду, поэтому их ферментные препараты производят путем концентри¬
рования и высушивания при определенных условиях (лиофилизаци-
ей) культуральной жидкости. Если источником ферментов являются388
микроскопические грибы (Aspergillus, Trichoderma, Fusarium), то фер¬
ментный препарат готовят высушиванием поверхностной культуры
этих микроорганизмов. Очищенные ферментные препараты получа¬
ют экстракцией ферментов из клеток микроорганизмов подходящим
растворителем и осаждением фермента этанолом.Таблица 6.5. Важнейшие ферментные препараты, применяемые
в сельском хозяйствеНазвание препаратаОбласть примененияАмилосубтилин ГЗх
Протосубтилин ГЗхГлюкаваморин ПхП10х
Пектаваморин ПхП10хПектофоетидин ГЗх
П10хАмилоризин ПхДрожжелитин ГЗх
Целловиридин ГЗхГликозидаза ГЗхЛизосубтилин ПОхДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных и птиц; получение ферментативных гидролиза¬
тов; лечение и профилактика желудочных, паразитарных
заболеванийДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных, птиц и рыбы; получение ферментативных гид¬
ролизатов; лечение и профилактика желудочных и парази¬
тарных заболеванийДобавление в кормовые рационы телят и ягнят, свиней,
крупного рогатого скота; при силосовании картофеля, бо¬
бовых трав; для получения соломоконцентратовДобавление в кормовые рационы молодняка свиней и
крупного рогатого скотаДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных и птиц; при силосовании соломы, бобовых трав,
картофеляДобавление в кормовые рационы крупного рогатого ско¬
та, лечение и профилактика паразитарных заболеваний
птицДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных и птиц; гидролиз БВК и растительных отходов;
получение соломоконцентратов; силосование бобовых
травГидролиз дрожжейДобавление в кормовые рационы ягнят и при откорме
свиней; силосование картофеляПолучение ферментативных гидролизатовДобавление в кормовые рационы крупного рогатого ско¬
та и птиц; гидролиз растительных отходов; силосование со¬
ломы, бобовых травДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных и птиц; получение ферментативных гидролиза¬
товПолучение ферментативных гидролизатов; лечение и
профилактика паразитарных заболеваний крупного рога¬
того скота389
Окончание табл. 6.5Название препаратаОбласть примененияПротезим ГЗхДобавление в кормовые рационы свиней и птицЛизоцеллюлозинГидролиз дрожжей и растительных отходов; добавлениеПОхв кормовые рационы птицЛизогризеин ПОхГидролиз дрожжей и растительных отходовМальтаваморин ПОхГидролиз растительных отходовЦеллолигнорин ПхГидролиз растительных отходов; силосование соломы,
бобовых травЦеллокандин ГЗхГидролиз растительных отходов; силосование соломы,
бобовых травЛизоцим ГЗхДобавление в кормовые рационы сельскохозяйственных
животных и птиц; лечение и профилактика паразитарных
заболеванийКаждый ферментный препарат обозначается определенным бук¬
венным и цифровым индексом. Буква «Г» в названии препарата ука¬
зывает на то, что он получен из культуральной жидкости при глубин¬
ном способе выращивания микроорганизмов, тогда как буква «П»
свидетельствует о том, что ферментный препарат получен из поверх¬
ностной культуры микроскопических грибов. Индекс «2» в названии
препарата показывает, что это концентрированный сироп, «3» — су¬
хой ферментный препарат, «10» — очищенный ферментный препа¬
рат. Индекс «Пх» обозначает, что ферментный препарат представляет
собой высушенную поверхностную культуру грибов.В рационе крупного рогатого скота значительный удельный вес
занимают сочные и грубые корма, богатые клетчаткой, пентозанами,
пектиновыми веществами, которые медленно перевариваются мик¬
роорганизмами рубца, снижая усвояемость организмом других пита¬
тельных веществ. Значительное улучшение перевариваемости этих
веществ наблюдается при добавлении в корм ферментных препаратов
с активным комплексом гидролитических ферментов, таких как пек-
тофоетидин ГЗх и целловиридин ГЗх (в соотношении 1:1), амило-
субтилин ГЗх и глюкаваморин Пх. При этом не только повышается
общая продуктивность животных, но и существенно снижается рас¬
ход кормов на создание одной единицы животноводческой продук¬
ции (на 8—10%).При откорме свиней положительное действие оказывают фер¬
ментные препараты с амилолитической и протеолитической актив¬
ностью — амилосубтилин ГЗх, протосубтилин ГЗх, амилоризин Пх,
глюкаваморин Пх, протезим ГЗх.390
Особенно важное значение имеет применение ферментных пре¬
паратов при кормлении молодняка сельскохозяйственных животных.
Так, например, у телят формирование рубца происходит к 2—3-ме-
сячному возрасту, вследствие чего наблюдается слабое переварива¬
ние грубых и сочных кормов. Поэтому для замены молока раститель¬
ными кормами и лучшего их использования в рацион телят целесооб¬
разно вводить ферментные препараты — пектофоетидин ГЗх, амило-
субтилин ГЗх, протосубтилин ГЗх и глюкаваморин Пх, содержащие
комплекс амилолитических и протеолитических ферментов.У поросят-сосунов ферментные системы желудочно-кишечного
тракта начинают нормально функционировать лишь в 3—4-месяч¬
ном возрасте и для улучшения перевариваемости питательных ве¬
ществ корма им рекомендуется добавлять в корм ферментный препа¬
рат протезим ГЗх. При кормлении ягнят в целях улучшения перевари¬
ваемости белков и углеводов в их кормовые рационы вводят глюкава¬
морин Пх и амилоризин Пх, в результате чего привесы
увеличиваются на 11 — 15%.Пищеварительные железы птиц не образуют ферменты, катали¬
зирующие гидролиз клетчатки и пектиновых веществ, а микрофлора
кишечника у них малочисленна, поэтому в их кормовые рационы до¬
бавляют ферментные препараты с целлюлолитической, пектолитиче-
ской и протеолитической активностью — пектофоетидин ГЗх, целло-
виридин ГЗх, амилосубтилин ГЗх, глюкаваморин Пх, пектаваморин
Пх, протосубтилин ГЗх, гликозидазу ГЗх, лизоцим ГЗх, протезим ГЗх.
В результате применения указанных препаратов яйценосность кур
повышается на 5 %, привесы бройлеров увеличиваются на 7—15 %,
тогда как расход корма на создание единицы продукции снижается на
4-7 %.Применение ферментных препаратов также эффективно при
кормлении рыб. При добавлении в кормовые рационы рыб протосуб-
тилина ГЗх, амилосубтилина ГЗх, пектаваморина Пх в количестве
0,1—0,15 % значительно улучшается перевариваемость белков и дру¬
гих питательных веществ корма.Ферментные препараты используются также в кормопроизводст¬
ве чаще всего при силосовании бобовых трав, соломы, картофеля и
приготовлении соломоконцентратов. Зеленая масса бобовых трав со¬
держит большое количество буферных веществ (белки, аминокисло¬
ты, щелочные соли), которые препятствуют понижению pH в процес¬
се молочнокислого брожения, кроме того в ней имеется недостаточно
сахаров, являющихся субстратами молочнокислых бактерий. Если
путем добавления ферментов обеспечить частичный гидролиз поли¬
сахаридов — клетчатки, крахмала, пектиновых веществ, гемицеллю¬391
лоз, то образуется больше сахаров для жизнедеятельности молочно¬
кислых бактерий, в результате в силосируемой массе повышается
концентрация молочной кислоты, обеспечивая снижение потерь пи¬
тательных веществ и улучшение питательных свойств полученного
таким путем корма. Хорошую эффективность при силосовании бобо¬
вых трав показали следующие ферментные препараты: целловиридин
ГЗх, пектофоетидин ГЗх, пектаваморин Пх, глюкаваморин Пх, цел-
локандин ГЗх, целлолигнорин Пх. При силосовании картофеля реко¬
мендуется применять амилоризин Пх, глюкаваморин Пх, пектавамо¬
рин Пх, при этом кормовая ценность получаемой силосной массы по¬
вышается на 15—18 %.Ферментные препараты имеют существенное значение в техноло¬
гиях приготовления кормов из соломы злаковых культур. Солома ха¬
рактеризуется высоким содержанием трудноусвояемых веществ —
целлюлозы, ксиланов, лигнина — и низким содержанием белков.
В ней почти нет растворимых углеводов, необходимых для развития
молочнокислых бактерий. Поэтому при силосовании соломы приме¬
няются целлюлозоразлагающие ферментные препараты — целлови¬
ридин ГЗх, целлолигнорин Пх, целлокандин ГЗх, пектаваморин Пх.
В результате действия этих препаратов в силосируемой массе повы¬
шается концентрация растворимых сахаров, за счет синтеза микроор¬
ганизмами увеличивается содержание сырого протеина (на 50 %).Для получения соломоконцентратов обычно применяется смесь
двух ферментных препаратов пектофоетидина ГЗх и глюкаваморина
Пх, которые обеспечивают гидролиз полисахаридов. Затем на про¬
дуктах гидролиза выращивают кормовые дрожжи. Для лучшего роста
дрожжей в соломоконцентрат добавляют мелассу, мочевину, каль-
циймонофосфат, хлорид натрия, необходимое количество воды. По¬
лучаемый таким способом корм имеет консистенцию силоса, а по пи¬
тательной ценности приближается к хорошему луговому сену.Соломоконцентраты могут быть получены в гранулированном
виде и в этом случае могут сохранять свои питательные свойства дли¬
тельное время — до 1 года. Переваримость клетчатки в таком корме
повышается до 75—80 %, содержание белков достигает 10—12 % от
сухой массы.Ферментные препараты применяются в процессе получения за¬
менителей цельного молока для молодняка крупного рогатого скота
из кормовых дрожжей, которые подвергаются гидролизу. В резуль¬
тате гидролиза разрушается клеточная оболочка дрожжевых клеток и
микробная биомасса переводится в легкоусвояемую форму, повыша¬
ется содержание растворимых углеводов, незаменимых аминокислот
и полиненасыщенных жирных кислот. Для гидролиза кормовых392
дрожжей обычно используют препараты — пектофоетидин ГЗх,
дрожжелитин ГЗх, лизосубтилин ПОх.Микробные ферментные препараты широко применяют в вете¬
ринарии для лечения и диагностики многих заболеваний сельскохо¬
зяйственных животных и птиц. Например, ферменты, способные
разрушать клеточную оболочку и обладающие лизирующим действи¬
ем, используются в лечении бактериальных и других заболеваний
(сальмонеллез и популлороз у птиц, эндометриты у коров и др.). Для
этих целей применяются выпускаемые промышленностью фермент¬
ные препараты — лизоцим ГЗх, гликозидаза ГЗх, лизосубтилин ПОх,
мальтаваморин ПОх, дрожжелитин ГЗх.В результате того, что амилосубтилин ГЗх и протосубтилин ГЗх
оказывают влияние на редукционную способность бактерий в желу-
дочно-кишечном тракте животных, количество и подвижность инфу¬
зорий, переваривание целлюлозы и других трудноусвояемых углево¬
дов, эти препараты используют для профилактики и лечения желу¬
дочных заболеваний, в частности алиментарных атоний преджелуд-
ков у жвачных животных. Ферменты, содержащиеся в этих
препаратах, вызывают также гидролиз оболочек яиц гельминтов.Наряду с производством ферментных препаратов, выделяемых из
микробных клеток, разработаны технологии получения биопрепара¬
тов на основе живых микроорганизмов — симбионтов желудоч¬
но-кишечного тракта животных, которые в процессе своей жизнедея¬
тельности синтезируют различные ферменты, витамины, незамени¬
мые аминокислоты, антибиотики, вещества, обладающие гормо¬
нальным действием, и таким образом активно участвуют в процессах
пищеварения и синтеза веществ, не образующихся в клетках живот¬
ных, защите от микробной инфекции.Эффективные микробные препараты, широко использующиеся в
животноводстве, производятся на основе пропионовокислых (про-
пиовит) и ацидофильных (пропиацид) бактерий, а также азотобакте¬
рий (азотацид).Пропиовит представляет собой порошок серовато-песчаного цве¬
та, содержащий в 1 г препарата 4—6 млрд бактерий и 80—100 мкг ви¬
тамина В12» применяется для профилактики и лечения болезней же-
лудочно-кишечного тракта у телят, поросят, цыплят. При его приме¬
нении нормализуется рост и развитие молодняка сельскохозяйствен¬
ных животных, повышается их устойчивость к инфекционным
заболеваниям.Пропиацид и азотацид — сухие препараты комбинированного
действия, способствуют образованию в желудочно-кишечном тракте393
животных уравновешенных биоценозов, особенно они эффективны
против дисбактериозов.Для борьбы с бактериальными и вирусными желудочно-кишеч¬
ными заболеваниями применяются бактериальные препараты наос-
нове Вас. sublilis, licheniformis, mucilaginosis, которые, вероятно, дейст¬
вуют как источники биологически активных веществ — ферментов,
витаминов, антибиотиков, гормонов.Важной задачей ученых и специалистов, работающих в области
сельскохозяйственной биотехнологии, является создание и внедре¬
ние в природные экосистемы желудочно-кишечного тракта живот¬
ных высокоактивных штаммов микроорганизмов, способных к луч¬
шему перевариванию целлюлозы и других углеводов, растительных
белков и липидов, сверхсинтезу незаменимых аминокислот и вита¬
минов. Важное значение имеют исследования по изучению микроб¬
ных популяций рубца (преджелудка) жвачных животных, в котором
подвергается перевариванию 70—85 % всего сухого вещества корма,
проходящего через желудочно-кишечный тракт этих животных.Рубец представляет собой высокоэффективную природную сис¬
тему непрерывного культивирования анаэробных микроорганиз¬
мов — бактерий (Ruminococus, Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium,
Eubacterium и др.) и простейших (Diplodinium, Entodinium,
Ophryoscolex, lsotricha и др.).Слизистая оболочка рубца не образует собственных ферментов, и
процесс переваривания пищи полностью происходит с помощью
ферментных белков, вырабатываемых микроорганизмами. В резуль¬
тате жизнедеятельности микрофлоры в преджелудках жвачных жи¬
вотных гидролизуются практически все формы сложных углеводов
(крахмал, пектиновые вещества, гемицеллюлозы, клетчатка, дисаха¬
риды), белки и липиды, подвергаются брожению моносахариды
(глюкоза, фруктоза, манноза). Образующиеся в результате гидролиза
сложных веществ моносахариды, аминокислоты и жирные кислоты
используются животными в качестве источников энергии и в биосин¬
тетических процессах. Сами микроорганизмы после их отмирания
также перевариваются в рубце и становятся для животных источника¬
ми полноценных белков, незаменимых аминокислот, полиненасы-
щенных жирных кислот, витаминов.Создание высокоактивных штаммов микроорганизмов и сбалан¬
сированных экосистем желудочно-кишечного тракта животных про¬
водится как обычными методами генетики и селекции, так и с ис¬
пользованием мутагенеза и клонирования генов. Применение этих
методов позволит целенаправленно изменять экосистемы желудоч-394
но-кишечного тракта животных в нужном направлении, добиваясь
улучшения усвояемости корма, усиления синтеза полезных веществ,
подавления патогенной микрофлоры.Контрольные вопросы к главе 61.	Как балансируются корма для сельскохозяйственных животных по коли¬
честву белков и незаменимых аминокислот?2.	Каковы основные пути улучшения биологической питательной ценности
кормовых белков?3.	Какие разработаны биотехнологии получения кормовых белковых препа¬
ратов из дрожжей?4.	В чем заключаются особенности производства белковых концентратов из
бактерий?5.	Как получают кормовые белки из водорослей и микроскопических гри¬
бов?6.	Какие известны технологии получения высокобелковых кормов из веге¬
тативной массы растений?7.	Каковы питательные свойства кормовых белковых концентратов из дрож¬
жей, бактерий, водорослей, микроскопических грибов, вегетативной массы рас¬
тений и особенности их применения в кормопроизводстве?8.	В чем преимущество микробиологического получения кормовых препа¬
ратов незаменимых аминокислот и витаминов по сравнению с их химическим
синтезом?9.	Какие технологии применяются для промышленного получения кормо¬
вых препаратов лизина и триптофана?10.	Какие биотехнологические принципы положены в основу получения
биопрепаратов, обогащенных витаминами В, и В12?11.	Каковы основные пути улучшения кормов по содержанию полноценных
липидов?12.	В чем особенности биотехнологий получения кормовых липидных пре¬
паратов?13.	Какие ферментные препараты используются при кормлении различных
групп сельскохозяйственных животных для улучшения перевариваемости кор¬
мов?14.	Для чего необходимо применять ферментные препараты при силосова¬
нии бобовых трав и картофеля, а также в процессе приготовления соломокон-
центратов?15.	В чем заключается биологическое действие ферментных и микробных
препаратов, используемых в животноводстве?ЛИТЕРАТУРАБакай С.М. Биотехнология обогащения кормов мицелиальным бел¬
ком.— Киев: Урожай, 1987.Биотехнология кормопроизводства и переработки отходов.— Рига: Зи-
натне, 1987.Биотехнология. Принципы и применение.— М.: Мир, 1988.395
Быков В.А. и др. Микробиологическое производство биологически ак¬
тивных веществ и препаратов.— М.: Высшая школа, 1987.Гаврилова Н.Н. Липиды микроорганизмов для кормовых целей.— М.,
ВНИИСЭНТИ, 1985.Глемжа А.А. и др. Микробные ферменты в народном хозяйстве.— Виль¬
нюс: Мокслас, 1985.Микробные ферменты и биотехнология.— М.: Агропромиздат, 1986.Наумова Г.В. Торф в биотехнологии.— Минск: Наука и техника, 1987.Основы биохимической инженерии.— М.: Мир, 1989.Технология биоконверсии свекловичной мелассы. — Киев: НПО «Са¬
хар», 1987.Удалова Э.В. и др. Энзиматическая конверсия растительного сырья и от¬
ходов сельскохозяйственного производства.— М.: ВНИИ систем управле¬
ния, экологических исследований и научно-технической информации, 1990.Хазин Д.А. Производство кормового микробного белка и его использова¬
ние в кормлении сельскохозяйственных животных.— М.: ВНИИТЭИ, 1987.
Глава 7ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
В СИМБИОТИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИОдним из основных факторов, лимитирующих развитие расте¬
ний, является недостаточная обеспеченность соединениями азота.
Только в некоторых почвах, например в черноземах, содержание под¬
вижных азотных соединений может полностью удовлетворить по¬
требности растений. Вусловияхдефицитаазотногопитания растения
«купаются» в молекулярном азоте (N2), составляющем около 80 % ат¬
мосферы. Этот азот не может быть использован растениями непосред¬
ственно, ибо для его фиксации необходим фермент нитрогеназа, кото¬
рый у растений, как и других эукариот, отсутствует. Способностью
фиксировать N2 обладают лишь некоторые прокариотические орга¬
низмы, с которыми многие растения вступают в симбиотические отно¬
шения. Разработка генетики систем симбиотической азотфиксации
является необходимым этапом для их направленного конструирова¬
ния и широкого использования в сельском хозяйстве.7.1.	РАЗНООБРАЗИЕ И ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА
АЗОТФИКСИРУЮЩИХ СИСТЕМАзотфиксаторы не составляют какого-либо определенного таксо¬
на микроорганизмов. Они встречаются во всех основных группах
прокариот: среди грамотрицательных и грамположительных эубакте-
рий, цианобактерий, актиномицетов и архебактерий. Большинство
азотфиксирующих микробов являются диазотрофами, т. е. могут
использовать N2 в качестве единственного источника азота. В то же
время некоторые азотфиксаторы могут фиксировать N2 лишь в
симбиозе с растениями (Rhizobium, Frankia). И наконец, ряд мик¬
робов (Azorhizobium, Anabaena, Nostoc) совмещает способность к
диазотрофии и к симбиозу с растениями.Нитрогеназная реакция. Восстановление молекулярного азота ка¬
тализируется ферментом нитрогеназой (рис. 7.1), которая состоит из397
КЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМРедуктаза
динитрогеназы
Fe-белок у2
(65 КД)Динитрогеназа
М о Fe-белок а2Р2
(220 КД)6Н +N2nif Ксн2=сн2CH4+NH3ch3nh2Рис. 7.1. Структура и функции нитрогеназытрех типов белков (а, Р и у) и двух кофакторов: молибден-желе-
зо-(МоРе)-содержащего и железо-(Ре)-содержащего. Нитрогеназа
состоит из двух субъединиц: большой — динитрогеназы, в состав ко¬
торой входит MoFe-кофактор (ее называют также компонентом II), и
малой — редуктазы динитрогеназы, содержащей Fe-кофактор (ком¬
понент I). Восстановление молекулы N2 происходит при ее взаимо¬
действии с MoFe-кофактором, т. е. на динитрогеназе. Функция ре¬
дуктазы заключается в передаче электронов на динитрогеназу. Ионы
железа входят в состав обоих компонентов в геминовой (редуктаза ди¬
нитрогеназы) или негеминовой (динитрогеназа) формах.Нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью: она
способна восстанавливать широкий спектр соединений с тройной
связью, в том числе превращать ацетилен в этилен. Эта реакция лежит
в основе «ацетиленового метода» определения нитрогеназной актив¬
ности, основанного на легкости хроматографического разделения аце¬
тилена и этилена. Несмотря на некоторые ограничения (изменение ка¬
талитических свойств нитрогеназы при взаимодейтвии с ацетиленом;
в случае микробнорастительных симбиозов — влияние ацетилена на
физиологические свойства растительных тканей), ацетиленовый ме¬
тод широко используется в генетических и селекционных работах.Суммарная реакция, катализируемая нитрогеназой, выражается
уравнением:398
N2 + 8H+ + 8e“ + 16АТФ = 2NH3 + H3 + 16АДФ + 16ФНИз уравнения видно, что нитрогеназная реакция весьма энерго¬
емка. Больших энергетических затрат требует также синтез нитроге-
назы и обслуживающих ее ферментов (которые контролируют созре¬
вание белков нитрогеназы, синтез кофакторов, передачу электронов
и ассимиляцию продуктов азотфиксации). Подсчитано, что для фик¬
сации 1 г азота необходимо затратить 100—200 г глюкозы. Поэтому
ясно, что микробы синтезируют нитрогеназный комплекс только в
условиях резкого дефицита связанного азота и достаточного обеспе¬
чения энергией.Наиболее эффективными источниками энергии для микроорга¬
низмов являются окислительное фосфорилирование и фотосинтез.
Однако сопряжение азотфиксации с этими процессами затруднено
тем, что нитрогеназа очень чувствительна к свободному кислороду:
она необратимо инактивируется даже при небольших концентрациях
Ог. Поэтому у микробов-азотфиксаторов имеются разнообразные
механизмы, позволяющие решать возникающий «кислородный па¬
радокс», т. е. защищать нитрогеназу от свободного кислорода, сохра¬
няя высокую интенсивность получения энергии. У свободноживу-
щих диазотрофов это достигается либо тем, что кодирующие нитро¬
геназу гены активируются только в анаэробных или микроаэрофиль-
ных условиях (свободноживущие эубактерии, архебактерии), либо
тем, что азотфиксирующие клетки образуют плотную оболочку, ко¬
торая очень медленно пропускает кислород (гетероцисты цианобак¬
терий). При симбиозах между микробами-азотфиксаторами и расте¬
ниями функцию защиты нитрогеназы от кислорода выполняет, как
правило, хозяин.Синтез и созревание нитрогеназы кодируются сложной системой
«//-генов, многие из которых являются общими для всех азотфикса-
торов. У наиболее изученного из них — энтеробактерии Klebsiella
pneumoniae — эта система включает 25 генов, собранных в единый
кластер и организованных в семь транскрипционных единиц. Гены
nifH, nifD, nifK кодируют структуру у-, а- и Р-белков нитрогеназы;
гены nifM, nifS, nifU, nifY — процессинг этих белков. Специальная
группа генов (nifB, nifE, nifN, niJV) контролирует синтез Mo-Fe-Ko-
фактора. Помимо генов, кодирующих структуру компонентов нитро-
геназного комплекса, л//-оперон Klebsiella содержит два регулятор¬
ных гена. nifA кодирует белок, активирующий транскрипцию генов
nifHDK и других «//-генов, а продукт гена nifL репрессирует транс¬
крипцию «//-генов в присутствии кислорода или связанного азота.
Однако у многих азотфиксаторов nifL отсутствует, и его функцию вы¬
полняют другие гены.399
Симбиозы растений с азотфиксаторами. Одним из важных факто¬
ров, обеспечивающих широкое распространение способности к азот¬
фиксации среди микробов, является образование симбиозов с орга¬
низмами, лишенными этого свойства и вследствие этого испытываю¬
щими недостаток азота. Наибольшую потребность в симбиозе с азот¬
фиксаторами испытывают растения, лишенные способности
извлекать азотистые вещества из других организмов (как это делают
животные) или из органических остатков (как грибы).Способность к тесному взаимодействию с растениями выявлена
во всех группахазотфиксаторов, за исключением архебактерий. Азот-
фиксирующие микробы, которые вступают в симбиоз с растениями,
могут быть разделены натри группы: 1) внутриклеточные симбионты
(Rhizobium, Frankia, Nostoc в симбиозе с Gunnera); 2) микробы, кото¬
рые находятся внутри растений, но не проникают в клетки (Anabaena
или Nostoc в симбиозе с Azolla; эндофитные бактерии Acetobacter и
Azoarcus); 3) ассоциативные диазотрофы, живущие на корнях
(Azospirillum, Flavobacterium). Взаимодействие партнеров в азотфикси¬
рующих симбиозах характеризует общая стратегия: а) микроб экс¬
портирует продукты азотфиксации в клетки (ткани) хозяина, эколо¬
гический потенциал которого при этом существенно возрастает из-за
ослабления зависимости от связанного азота; б) хозяин предоставля¬
ет микросимбионту экологическую нишу (в которой он «уходит» от
конкуренции со свободноживущими микроорганизмами), а также
покрывает энергетические расходы на азотфиксацию.В симбиозах азотфиксирующих микробов с фототрофными орга¬
низмами осуществляется симбиогенное сопряжение двух фундамен¬
тальных биохимических процессов — азотфиксации и фотосинтеза.
Однако было бы не совсем точным представлять симбиотическое
взаимодействие как «натуральный обмен» N-метаболитов на фото-
синтаты. В процессе взаимодействия многих растений с азотфикси-
рующими бактериями наблюдается весьма тесная структурно-функ-
циональная интеграция партнеров, которая основана на перекрест¬
ной регуляции и координированной экспрессии бактериальных и
растительных генов. Она может сопровождаться глубокой дифферен-
цировкой клеток партнеров, а также установлением между ними тес¬
ных регуляторных отношений.7.2.	БОБОВО-РИЗОБИАЛЬНЫЙ СИМБИОЗСимбиоз, образуемый бобовыми растениями (сем. Fabaceae) и
клубеньковыми бактериями (ризобиями),— одна из наиболее изу¬
ченных надорганизменных систем. Это обусловлено несколькими
причинами. Ризобии (Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium,400
Rhizobium, Sinorhizobium) являются факультативными симбионтами,
которые легко культивируются explanta и доступны для изучения все¬
ми современными молекулярно-генетическими методами. Клубень¬
ки бобовых оказались очень удобной моделью для анализа ряда клю¬
чевых функций растения: сигнальных процессов и экспрессии генов,
клеточной дифференцировки и органогенеза, азотного и углеродного
обмена. И наконец, важным стимулом для изучения бобово-ризоби-
ального симбиоза является его практическая значимость: многие бо¬
бовые относятся к числу важных сельскохозяйственных культур, по¬
вышение продуктивности которых весьма актуальная задача.Взаимодействие ризобий и растений характеризуется высокой
специфичностью (табл. 7.1). Она выражается, во-первых, в том, что
образование симбиоза ограничено почти исключительно семейством
бобовых; единственным небобовым, образующим клубеньки с ризо-
биями, является Parasponia (сем. Ulmaceae). Во-вторых, большинство
ризобий вступают в симбиоз лишь с ограниченным кругом бобовых,
относящихся к одному роду (R.galegae, R. leguminosarumbv.trifolii) или
к нескольким таксономически близким родам (Rhizobium meliloti,
R. leguminosarum bv. viceae).Таблица 7.1. Специфичность взаимодействия клубеньковых бактерий
и бобовых растенийБактерииРастенияRhizobium melilotiMedicago (люцерна), Melilotus (дон¬
ник), Trigonella (пажитник)R. leguminosarum bv. trifoliiTrifolium (клевер)R. leguminosarum bv. viceaePisum (горох), Vicia (вика), Lathyrus (го¬
рошек), Lens (чечевица)R. leguminosarum bv. phaseoli (R. etli), R.
tropiciPhaseolus (фасоль)R. galegaeGalega (козлятник)Sinorhizobium frediiGlycine (соя)Mesorhizobium lotiLotus (лядвенец), Lupinus (люпин)Bradyrhizobium japonicumGlycine (соя)Развитие бобово-ризобиального симбиоза — сложный многоста¬
дийный процесс, который включает четыре группы процессов: ран¬
ние (преинфекционные) взаимодействия; морфогенез клубеньков;
регуляция развития эндосимбионтов; функционирование клубень¬
ков как органов азотфиксации. Все эти процессы находятся под стро¬
гим контролем как бактерий, так и растения-хозяина.Преинфекционные (сигнальные) взаимодействия. Обмен партнеров
молекулярными сигналами происходит при любых симбиотических401
R4R5СН//HCvСННС.у//сн2\СН,СН,НСIIНС\/сн2СН,СН,сн2)сн2сн3С 18:4
(ризобии вики,
гороха)сн2СН2
)=Н2сн2сн2СН,IIНС)сн2сн2сн2сн2сн2сн3С18:1
(ризобии сои)R5 = сульфат (ризобии люцерны)
метилфукоза (ризобии сои)
Н (ризобии вики, гороха)Rhizobium leguminosarum
взаимодействиях. На ранних этапах симбиоза сигналлинг обеспечи¬
вает переход организмов из свободноживущего в симбиотическое со¬
стояние, на более поздних этапах — метаболические и морфогенети¬
ческие процессы, обеспечивающие функционирование симбиоза.
Сигналы часто действуют на уровне транскрипции и трансляции ге¬
нов-мишеней, что делает симбиозы очень удобными моделями для
изучения дифференциальной экспрессии генов высших организмов.Синтез и выделение сигналов. Образование симбиоза клубенько¬
вых бактерий и бобовых растений начинается с реакции ризобий на
растительные флавоноиды, которые активируют бактериальные гены
вирулентности (nod, от англ. nodulation — клубенькообразование).
Под контролем этих генов ризобии синтезируют липо-хито-олигоса-
харидные Nod-факторы, которые инициируют ранние стадии разви¬
тия клубеньков (рис. 7.2). К настоящему времени у ризобий найдено
более 50 генов вирулентности. Одни из этих генов являются «общи¬
ми» (структурно и функционально гомологичными) для всех ризо¬
бий, а другие — специфичны для каждого вида или даже штамма. Му¬
тации в «общих» яо^-генах (nodA, nodB, nodQ приводят к нарушению
самой ранней стадии развития симбиоза — скручивания корневых
волосков. При мутациях генов хозяйской специфичности (nodH,
nodP, nodQ, nodZ, nodX) обычно нарушаются более поздние стадии
взаимодействия, связанные с формированием инфекционных нитей
и клубеньковых меристем. Важные различия между этими группами
генов вирулентности выявляются и при переносе их между разными
видами ризобий. Перенос генов хозяйской специфичности обычно
приводит к тому, что штамм-реципиент приобретает способность
формировать клубеньки у растений-хозяев штамма-донора. При пе¬
реносе «общих» nod-генов такого эффекта не наблюдается, однако
если реципиентом являлся авирулентный мутант с нарушением соб¬
ственных «общих» nod-генов, то у него наблюдается восстановление
способности формировать клубеньки на исходных растениях-хозяе-
вах.Гены обеих групп являются индуцибельными: их активность пер¬
воначально удавалось зарегистрировать только после попадания ри-Рис. 7.2. Система сигнальных взаимодействий между бобовыми растениями и
клубеньковыми бактериями:я — структура Nod-факторов ризобий (показаны наиболее важные заместители: ацильная группа
на нередуцирующем конце (С 18 : I или С18 : 4) и варианты заместителей в позиции R5 на редуци¬
рующем конце); б — схема обмена сигнальными молекулами между горохом и бактерией Rhizobium
leguminosarum (корни растений выделяют специфические флавоноиды, которые в комплексе с бак¬
териальным белком NodD активируют синтез бактериальных сигнальных молекул — Nod-факто-
ров. Биосинтез последних кодируется /кк/-генами, расположенными на Sym-плазмиде)403
зобий в ризосферу растения. При этом флавоноиды, выделяемые в
почву семенами или корнями бобовых, взаимодействуют с бактери¬
альным белком NodD, который в результате приобретает способ¬
ность активировать транскрипцию остальных яо^-генов (nodD—
единственный конститутивно работающий ген вирулентности ризо-
бий). Ген nodD является представителем семейства регуляторов
транскрипции, куда относятся такие хорошо изученные гены, как
lysR и агаС. В белке NodD выявлено два домена: наиболее консерва¬
тивный N-концевой, который связывается с ДНК, и менее консерва¬
тивный С-концевой, который предположительно взаимодействует с
флавоноидами. Белок NodD связан с внутренней мембраной ризоби-
альной клетки, через которую проникают флавоноиды. Взаимодейст¬
вуя с ними, белок NodD изменяет свою конформацию, в результате
чего становится возможным его связывание с консервативной после¬
довательностью mod-box», расположенной в промоторах индуцибель-
ных генов вирулентности. В результате повышается сродство этих про¬
моторов к РНК-полимеразе и индуцируется их транскрипция.Конечным продуктом действия генов вирулентности являются
Nod-факторы, способность к синтезу которых — уникальное свойст¬
во ризобий. Эти факторы представляют собой модифицированные
липо-хито-олигосахариды, которые состоят из 3—6 остатков N-аце-
тил глюкозами на и радикала ненасыщенной жирной кислоты, содер¬
жащего 16—20 атомов углерода (рис. 7.2, а). Биосинтез этих факторов
включает следующие процессы (рис. 7.3):1)	полимеризация N-ацетилглюкозамина (синтезируемых из фу-
козы под контролем белка NodM) с образованием 1—4-р-гликозид-
ных связей. Эта реакция, катализируемая белком NodC, приводит к
образованию олигомеров хитина;2)	деацетилирование «нередуцирующего» концевого остатка глю-
козамина в положении R1 (катализируется блоком NodB) и после¬
дующее присоединение к атому азота жирнокислотного остатка (ка¬
тализируется белком NodA);3)	модификации образовавшегося липо-хито-олигосахарида (ко-
ровая часть Nod-фактора): атомы водорода на «редуцирующем» и
«нередуцирующем» концах замещаются на различные радикалы (фу-
козил, сульфат, метил, ацетил и др.).Важно отметить, что эти стадии биосинтеза Nod-фактора контро¬
лируются разными группами ло^-генов: синтез коровой части проис¬
ходит под контролем «общих» nod-генов, а его модификация — под
контролем генов хозяйской специфичности.Очищенные Nod-факторы в концентрации всего 10—8—10—12 М
инициируют ранние стадии формирования симбиоза: скручивание
корневых волосков, закладку клубеньковых меристем, а у некоторых404
но
но
ноо=с;NHСН,Fructose-6-Р
jNodM
Glucosamine-6-Р
♦НО
НОНО o-c'NHI чгнGlcNAcLJr"3
jfNodCНО
НО0-UDPл _ЛМНо=счIл _xNH
NCHjNodZR5=Fucose
NolL INodBR5=AcctyIfucose
Acetyl CoAHO-
HO"
HO-K3u-\^v 0H«v^01U NH, MUtT .NH	^/NH0=C^HR50iSл n/NH
CH,NodLSAMNodSR4=Acetyl —|-Rl=Methyl -R4
HO
HONodENodF°ч.0
,NR1
acylacyl donor"ноHOJNodAOv ” R50-OHX lrrv\ СR5*=H0=C4PAPS0=CNCH,NodH■ R5=SulfatylРис. 7.3. Биосинтез Nod-факторов:GlcNAc — N-аиетилглюкозамин; GDP-Fucose — гуанозиндифосфофукоза; Acetyl CoA — ацетил-
кофермент A; PAPS — З'-фосфоаденозин-б'-фосфосульфат; SAM — S-аденозилметионинбобовых (люцерна) — даже начальные стадии гистогенеза клубень¬
ков. У Vicia sativa уже 5—10 мин воздействия Nod-факторов достаточ¬
но для начала деформации корневых волосков, которая проявляется
через 1 ч, а через 3 ч в восприимчивых зонах корня может деформиро¬
ваться более половины волосков. Первыми биохимическими реак¬
циями, которые вызывают Nod-факторы, являются деполяризация
клеточной мембраны корневого волоска (происходит через 10 мин
после инокуляции), а также модуляция ионных потоков в клетках
эпидермиса.Важно отметить, что Nod-факторы — это те сигналы, которые в
значительной степени определяют специфичность всего симбиоти¬
ческого взаимодействия. Наибольшую роль в этом играют модифика¬405
ции Nod-факторов, осуществляемые под контролем генов хозяйской
специфичности. Так, сульфатирование положения R6 на «редуци¬
рующем конце», характерное для ризобий люцерны (R. meliloti), необ¬
ходимо для индукции ранних симбиотических реакций у «гомоло¬
гичного» хозяина (люцерны), тогда как в отсутствие сульфатной
группы наблюдают индукцию этих же реакций у вики. При мутаци¬
ях, инактивирующих белок NodH, который катализирует сульфати¬
рование, R. meliloti утрачивает вирулентность по отношению к лю¬
церне, но приобретает вирулентность к вике, симбионты которой
(R. leguminosarum bv. viceae) лишены гена nodH.Наиболее изученный пример участия модификации Nod-фактора
в контроле хозяйской специфичности — это ацетилирование поло¬
жения R6 на «редуцирующем конце», катализируемое геном nodX. Та¬
кая модификация обеспечивает клубеньковым бактериям гороха
(R. leguminosarum bv. viceae) способность инфицировать «афганские»
горохи, которые невосприимчивы к инокуляции большинством этих
бактерий из-за гомозиготности растений по аллели sym2. При пере¬
носе nodX в лишенные его штаммы они приобретают способность
синтезировать ацетилированный Nod-фактор и формировать клу¬
беньки на «афганских» горохах. Неожиданным оказалось то, что спо¬
собность преодолевать 5уот2-контрол ируемую устойчивость растений
приобретается также при переносе в ризобии гена nodZ, который оп¬
ределяет фукозилирование положения R6. Этот ген был выделен из
клубеньковых бактерий сои, которые не способны вызывать даже са¬
мые ранние симбиотические реакции у «афганских» Горохов.Растения обладают хорошо развитой системой распознавания
сигнальных молекул, выделяемых микроорганизмами — хитоолиго-
сахаридов, полисахаридов, гликопептидов. Среди симбиотических
сигналов наиболее изучены липо-хито-олигосахаридные Nod-факто-
ры, которые продуцируются ризобиями в ответ на флавоноиды, экс-
третируемые семенами и корнями бобовых. Биологическая актив¬
ность Nod-факторов проявляется при очень низких концентрациях
(1—100 нМ), что подразумевает наличие у растений специфических
рецепторов. По структуре Nod-факторы представляют собой олиго¬
меры N-ацетилглюкозамина, соединенные р-1,4-гликозидными свя¬
зями, содержащие остаток жирной кислоты и декорированные раз¬
ными химическими группами. Углеводная природа Nod-факторов
указывает на то, что их рецепторы должны обладать свойствами лек-
тинов или хитин-связывающих белков, например хитиназ.Первые попытки выявить рецепторы Nod-факторов были связа¬
ны с выделением связывающих их белков или мембранных фракций.
Методом аффинной хроматографии из бобовых была получена лек-
тиннуклеотидфосфогидролаза (LNP), обладающая способностью
связывать Nod-факторы и расщеплять нуклеозидфосфаты. Другая406
стратегия в поиске рецепторов к Nod-факторам заключалась в выяв¬
лении у растений белков, гомологичных хорошо охарактеризован¬
ным рецепторам животных. Наиболее распространенными среди
выявленных белков являются киназы, сходные с рецепторами
(receptor-like kinases, RLK), в состав которых входит внеклеточный
домен, трансмембранный участок и киназный домен. Эти рецепторы
связывали хитоолигосахариды, которые по структуре похожи на
Nod-факторы, что согласуется с гипотезой об участии хитиназопо-
добных RLK в их рецепции. У Mtdicago truncatula, Pisum sativum и Lotus
japonicus был выявлен ряд генов, вовлеченных в рецепцию Nod-фак-
торов и ранние симбиотические ответы. Мутации по данным генам
приводят к Nod-фенотипам, анализ которых позволил определить
последовательность включения генов в процессе инфекции. Недавно
были клонированы гены, необходимые для наиболее ранней рецеп¬
ции Nod-факторов: Sum 10 у Pisum sativum, NFR1 и NFR5 у Lotus
japonicus. Гены MtDMI lyM. truncatula и PsSym8y гороха кодируют бел -
ки, сходные с лигандоперируемыми катионными каналами. Эти белки
имеют трансмембранные домены и пролинбогатые участки связыва¬
ния с другими белками, что позволяет рассматривать их как части мно-
гокомпанентных рецепторов. Одним из наиболее ранних ответов на
действие Nod-факторов является быстрый вход ионов кальция в клет¬
ки корневых волосков и генерация в них «кальциевых волн» — колеба¬
ний концентраций Са + с определенной частотой и амплитудой.Помимо активации растительных .Sym-генов, Nod-факторы инду¬
цируют собственную деградацию ферментами растений, и их устой¬
чивость к гидролизу зависит от особенностей химического «декора».
Параллельное варьирование структуры Nod-факторов и специфич¬
ности ферментов, отвечающих за их деградацию, еще более усложня¬
ет систему узнавания.Развитие структурной основы симбиоза. Клубеньки бобовых вы¬
полняют комплекс взаимосвязанных функций, обеспечивая эколо¬
гическую нишу для эндосимбионтов, структурную основу для обмена
партнеров метаболитами, а также для контроля над численностью и
физиологической активностью бактерий. Эти органы являются'уни¬
кальной моделью для изучения генетики развития растений. Разви¬
тие клубеньков, как и других органов, базируется на сигнальных про¬
цессах, вызывающих дифференциальную экспрессию генов. Однако
в случае симбиоза эти процессы связаны с экзогенными сигналами,
поступающими в растения от партнера, а значит действие сигналов в
ряде случаев может быть относительно легко изучено в лабораторных
условиях, в том числе с использованием систем in vitro. Кроме того,
формирование клубеньков является для растений факультативным,
не обязательным для нормального развития и репродукции, что по¬
зволяет получать максимально широкую картину генетической из-407
Скручивание
корневого волеЭндодерма клубеньканитьМежклеточнаяинфекционнаянитьПроникновение
в эпидермисИнфицированная
тканъ ^
Не инфицированная!
паренхима 	—fНаружный	/кортекс	7jПроводящая "
ткань	/ АЭндоцитозЭндодерма корняДеление , Диф
симбиосомы каДифференциров- и перицикл
ка бактериодабаРис. 7.4. Развитие и структура азотфиксирующего клубенька гороха:а — основные этапы формирования системы эндосимбиотических компартментов; б — гистологи¬
ческая структура клубенька (недетерминированный тип)менчивости процесса развития. Основная генетическая информа¬
ция, необходимая для морфогенеза клубеньков, находится в геноме
растительного партнера симбиоза. Тем не менее, часть морфогенов
содержится в геноме ризобий. Это еще больше расширяет возможно¬
сти генетического анализа развития клубенька, так как позволяет мо¬
дифицировать и изучать наследственную программу развития расти¬
тельного органа, не вмешиваясь в геном самого растения.Морфогенез клубеньков. Рассмотрим развитие структурной основы
симбиоза на примере наиболее изученных клубеньков «недетерми¬
нированного стеблевого» типа, характерного для таких бобовых, как
горох, клевер и люцерна (рис. 7.4).Инфицирование этих бобовых ризобиями происходит через кор¬
невые волоски, которые при этом скручиваются, принимая форму
«ручки зонтика» (стадия Нас, от англ. Hair curling). В месте наиболее
резкого сгиба волоска происходит гидролиз клеточной стенки и глу¬
бокая инвагинация плазмалеммы, в которой участвуют мембранные
структуры растительной клетки (аппарат Гольджи, эндоплазматиче-
ский ретикулюм). Таким образом, наблюдается не активное внедре¬
ние бактерий в корневые волоски, а скорее захват последними мик¬
росимбионта. В результате вокруг бактериальных клеток образуется
особый туннель — инфекционная нить (ИН), стенки которой сходны
со стенками растительных клеток, а внутреннее пространство запол¬408/
нено матриксом, в образовании которого участвуют оба партнера
(стадия Itf, от англ. Infection thread formation).Параллельно с развитием ИН происходит закладка клубеньковой
меристемы, связанная с митотической реактивацией, дедифферен-
цировкой и пролиферацией клеток кортекса, индуцируемой
Nod-факторами (стадия Ced, от англ. Cortical cell division). В возни¬
кающем клубеньковом примордии начинаются процессы гистогенеза
(стадия Ntd, от англ. Nodule tissue differentiation), в результате его фор¬
мируются покровная, проводящая и азотфиксирующая ткани клу¬
бенька. ИН, которая через 2—3 суток после инокуляции достигает ос¬
нования корневого волоска, проникает в кортекс, а затем и в растущий
клубенек, где разрастается и ветвится.Ключевой стадией развития эндосимбиоза является переход бак¬
терий из ИН в растительные клетки, происходящий путем эндоцито-
за (стадия Ваг, от англ. Bacterial release). В месте впячивания ИН в рас¬
тительную клетку образуются временные структуры — инфекцион¬
ные капли, от которых отшнуровываются мембранные пузырьки, со¬
держащие бактерии. Таким образом, бактерии никогда не
располагаются свободно в растительной цитоплазме: они заключены
в «перибактероидные» мембраны (ПБМ), которые образуются с уча¬
стием телец аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулюма,
однако содержат и бактериальные белки. Бактериальная клетка
(группа клеток), окруженная ПБМ, является основной субклеточной
единицей симбиоза — симбиосомой.Некоторое время после выхода из ИН ризобии сохраняют свои
размеры и палочковидную форму, а затем дифференцируются в осо¬
бые формы — бактероиды (стадия Bad, от англ. Bacteroid
differentiation). Последние имеют значительно (в 3—5 раз) большие
размеры, чем свободноживущие бактерии, а их форма варьирует от
шаро- и грушевидной у клевера до Y- или Х-образной у гороха.Важно отметить, что дифференцировка бактерий связана с ре¬
прессией многих генов, необходимых для автономного роста. Подан¬
ным ряда авторов, эта репрессия столь глубока, что бактероиды уже
не могут превращаться в свободноживущие клетки и гибнут после от¬
мирания клубеньков. В бактероидах активируется синтез нитрогена-
зы, катализирующей восстановление N2 в NH"!», а также других фер¬
ментов, обслуживающих нитрогеназНую реакцию, после чего начи¬
нается фиксация атмосферного азота (стадия Nif, от англ. Nitrogen
fixation). Таким образом, бактероиды могут рассматриваться как вре¬
менные органеллы растительных клеток, ответственные за снабже¬
ние хозяина связанным азотом.Параллельно с формированием симбиосом происходит и диффе¬
ренцировка инфицированных растительных клеток. Она выражается
в возрастании количества внутриклеточных мембранных структур,409
которые участвуют в формировании ПБМ и в биосинтетических про¬
цессах. Для инфицированных клеток характерна полиплоидизация и
деконденсация хроматина, связанная с усилением транскрипцион¬
ной активности. На биохимическом уровне их дифференцировка вы¬
ражается в синтезе de novo ряда белков.Описанный процесс завершается формированием сложно устро¬
енного клубенька «недетерминированного» типа. Его основными
структурами являются: а) инфицированная бактериями ткань, в ко¬
торой происходит фиксация молекулярного азота; б) проводящие
пучки, по которым поступают растительные фотосинтаты и выносят¬
ся продукты азотфиксации; в) апикальная меристема, за счет которой
происходит рост клубенька. Последняя обеспечивает постоянное об¬
новление азотфиксирующей ткани, в результате чего наблюдается
дифференцировка центральной части клубенька на зоны, соответст¬
вующие разным этапам симбиоза. Основным результатом морфоге¬
неза клубеньков является формирование интегрированной системы
симбиотических компартментов, обеспечивающих переход бактерий
из межклеточного (в инфекционных нитях) во внутриклеточное
(в симбиосомах) состояние.Генетический анализ. В настоящее время активно изучаются две
группы «симбиотических» генов бобовых. Гены первой группы выяв¬
ляют с использованием методов формальной генетики — путем по¬
лучения и анализа мутантов с дефектами развития симбиоза. Гены
второй группы выявляют при помощи методов «обратной генети¬
ки» — анализ генных продуктов (белков, мРНК), которые синтезиру¬
ются при симбиозе.Растительные мутанты, неспособные формировать клубеньки
(Nod) или индуцировать в них азотфиксирующую активность (Fix-),
отбирают по признаку угнетенного роста на безазотной среде. У бобо¬
вых (горох, соя, клевер, люцерна, фасоль, нут, кормовые бобы, дон¬
ник) с использованием таких мутантов идентифицировано более 100
генов, участвующих в становлении и функционировании симбиоза
(табл. 7.2). Более 40 генов выявлено у гороха посевного (Pisum sativum
L.) — одного из наиболее удобных объектов для изучения генетики
симбиоза. Мутантные аллели, контролирующие неспособность рас¬
тений к образованию клубеньков, являются, за редким исключением,
рецессивными. Аллели, контролирующие неспособность к азотфик¬
сации, могут быть как рецессивными (горох, клевер, люцерна), так и
доминантными (соя). Иногда мутации, нарушающие развитие сим¬
биоза, влияют на морфологию, скорость развития и фертильность
растений.410
Таблица 7.2. Гены бобовых растений, контролирующие основные этапыразвития симбиозаЭтапы развитияКодыГены, контролирующие данный этапИндукция генов ви¬
рулентности ризобийДеформация корне-
пых волосковNgiПреинфекцияНе выявленыНас	PsSym8 = MtDMll = LjCASTOR, LJPOLLUX,PsSym9 = Ml DM 13,PsSym 10 = LjNFR5 = MtNFP,PsSym 19 = LjSYMRK = MsNORK = MtDMI2,
LjNFRl, GmNodIМорфогенез клубеньковФормирование ин¬Itf, ItiPsSym 7 = MtNSP2, PsSym 14, PsSym35 = LjNin,фекционных нитейMtNSPly MaSyml, MaSym5, TpR, TpT1thPsSym2, PsSym36, PsSym37 = MtHCL(MtL YK3)ItrPsSym5, PsSym 16, PsSym34Развитие клубенько¬NdmPsSym 12, PsSym21t PsSym39вого примордияДифференцировкаNtdPsSym33тканей клубенькаЭндоцитоз бактерийBar, ItnPsSym 33, TpD, Tplв растительную цито¬IddPsSym40, PsSym41плазмуДифференцировкаBadPsSym31, PsSym32, Mslnl, Msln2, Msln3y Msln4yбактероидовMsJnSАвторегуляция об¬
разования клубеньковФиксация азотаСтабильность клу¬
беньковРегуляция развития эндосимбионтов
AutPsNod3, PsSym28, PsSym29 = LjHarl = GmNARK,
GmNodl, GmNod2, GmNod3, PvNod, J£S>vw5Функционирование клубеньковNifNopРастительные мутанты с нарушением этой
стадии имеют фенотипы Ваг-, Bad- или Nop-PsSymJ3, PsSym25f PsSym26, PsSym27, LjSSTlВ названии генов использованы аббревиатуры:Са — Cicerarientinum L.;Gm — Glycine max (L.) Merr.; Lj — Lotusjaponicus (Regel.)
Larsen; Ma — Melilotus albus Medik.; Ms — Medicago sativa L.\ Mt — Medicago
truncatula Gaertn.; Pv — Phaseolus vulgaris L.\ Ps — P/swm sativum L.; Tp —
Trifolium pratense L.; Vf — We/я faba L.Ортологичные гены у различных видов бобовых растений обозначены знаком
«равно» (=).411
Генанализ развития симбиоза показал, что крупные этапы, выяв¬
ляемые при изучении клубеньков «дикого типа», могут быть разделе¬
ны на более мелкие («элементарные») стадии, каждая из которых
контролируется небольшим количеством (или даже единичными) ге¬
нами. Например, этап Itf может быть разделен натри стадии: Iti (ини¬
циация формирования ИН), Ith (рост ИН в корневом волоске) и hr
(рост И Н в кортексе корня), а этап Ваг — на две стадии: Itn (рост ИН в
тканях и клетках клубенька) и Idd (дифференцировка «инфекцион¬
ной капли»).Симбиотические гены бобовых, выявляемые путем идентифика¬
ции их продуктов (а часто и сами эти продукты), называют нодулина-
ми (если в клубеньках они активируются de novo) или Nst-генами
(если их активность существенно возрастает в клубеньках по сравне¬
нию с корнями). Для выявления этих генов сравнивают спектры бел¬
ков (РНК), синтезируемых либо в клубеньках и стерильных корнях^
либо в фиксирующих и нефиксирующих азот клубеньках. Соответст¬
венно, нодулины и Nst-гены разделяют на «ранние» (активируются
до начала азотфиксации) и «поздние» (активируются с началом или
во время азотфиксации).Для ряда клубенек-специфичных белков выяснена субклеточная
локализация (цитозоль растительной клетки, перибактероидная
мембрана, стенка инфекционной нити) или ферментативная актив¬
ность (многие «поздние» нодулины являются клубенек-специфич-
ными изоформами ферментов азотного или углеродного обмена).
Некоторые нодулины непосредственно участвуют в формировании
структурной основы симбиоза (табл. 7.3). К их числу относятся ран¬
ний нодулин ENOD2, который активно синтезируется в паренхиме
клубенька, а также ENOD5 и ENOD12, которые накапливаются в
стенках ИН. Нодулин N-26, который синтезируется при эндоцитозе,
входит в состав ПБМ и, по-видимому, необходим для транспорта ре¬
гуляторных или трофических факторов между партнерами.Большой интерес представляет изучение роли фитогормонов в
развитии клубеньков. Показано, что обработка корней бобовых ин¬
гибиторами транспорта ауксинов может вызывать образование клу¬
бенькоподобных структур. Выявлен нодулин ENOD40, участвующий
в определении гормонального статуса растущего клубенька. Его
функция связана с контролем баланса ауксинов и цитокининов, ко-j
торый изменяется под действием эндосимбионта и играет важнукй
роль в образовании клубеньковых примордиев и в гистогенезе клу¬
беньков. В то же время необходимо отметить, что гипотезы о функ¬
циях большинства нодулинов основаны на анализе сходства их ами-’412
нокислотных последовательностей с выявленными ранее белками.
Прямые доказательства того, что нодулины выполняют именно эти
функции в ходе развития симбиоза, в большинстве случаев отсутст¬
вуют.Таблица 7.3. Ранние нодулины бобовых растенийГеныРастенияХарактеристикинодулиновЛокализация в
клубенькеПредполагаемыефункцииENOD2Горох, соя,
вика, люцер¬
на, клеверГидроксипро-
лин — богатый
белок типа экс-
тенсинов клеточ¬
ной стенкиПаренхимаФормирова¬
ние кислородно¬
го барьераENOD5ГорохИмеет сиг¬
нальные после¬
довательности и
пролин — бога¬
тый доменЗона инфек¬
ции и клетки, со¬
держащие концы
инфекционных
нитейУчастие в ин¬
фекционном
процессеENOD12Горох, фа¬
соль, люпин,
маш, нут,
бобыИмеет про¬
лин — богатые
участкиЗона инфек¬
цииПостроение
клеточных сте¬
нок и инфекци¬
онных нитейENQD40Горох, сояСтруктурнонапоминаетРНК-регуляторПерицикл
проводящих пуч¬
ковОпределениегормональногобалансаРефляция развития эвдосимбионтов. Развитие структурной осно¬
вы симбиоза сопровождается тесными регуляторными взаимодейст¬
виями партнеров, результатом которых является оптимизация разви¬
тия симбиотических структур и, соответственно, скорости размноже¬
ния и численности ризобий. Такая регуляция очень важна, так как
потенциальная скорость деления у бактерий намного выше, чем у
растительных клеток. Неконтролируемое размножение эндосимбио-
тических микробов часто оказывается вредным для хозяина, и его
способность строго контролировать размножение симбионтов явля¬
ется одним из ключевых отличий мутуалистического симбиоза от па¬
разитизма.Диалог симбионтов с защитными системами хозяина. При образо¬
вании симбиоза у бобовых растений индуцируется ряд процессов,
весьма сходных с защитными реакциями, наблюдаемыми при вне¬
дрении патогенных микробов. Это синтез флавоноидов, фенолов, хи-
тиназ, каллозы и пероксидаз. Однако в клубеньках эти реакции выра¬
жены не столь сильно, как при инфицировании патогенами, и их
результатом является не инактивация микроорганизмов, а регуляция413
их размножения и метаболической активности. Это происходит по¬
тому, что в процессе развития симбиотической системы наблюдается
тонко сбалансированное взаимодействие бактерий с защитными сис¬
темами растений.Балансировка отношений партнеров определяется наличием у
ризобий ряда генов, благодаря которым происходит диалог с защит¬
ными системами хозяина. Мутации в этих генах блокируют развитие
симбиоза, и вместо нормальных клубеньков обычно образуются
«псевдоклубеньки», которые не содержат инфекционных нитей и
бактериальных клеток, а заполнены неорганизованной тканью (фе¬
нотип таких мутантов обозначен Nod+Inf“). Среди бактериальных ге¬
нов, ответственных за «выяснение отношений» с хозяином, наиболее
изучены гены, кодирующие синтез различных компонентов клеточ¬
ной поверхности — экзополисахаридов и циклических глюканов.
Мутанты по этим генам были первоначально отобраны по изменен¬
ной морфологии колоний, а также по их неспособности адсорбиро¬
вать флуоресцирующий краситель калькофлуор.Наиболее изученным поверхностным компонентом ризобий, от¬
ветственным за диалог с защитными системами растений, является
кислый экзополисахарид или сукциноглюкан (ЭПС-1). У ризобий
люцерны (Rhizobium meliloti) его синтез контролируется более чем
20 ехо-генами, большая часть которых располагается кластером на
одной из двух имеющихся у этих бактерий мегаплазмид. Для ряда
е;со-генов выяснена первичная структура и механизмы экспрессии,
что позволяет построить достаточно целостную картину синтеза
ЭПС-1, включающую: образование предшественников, синтез из
них мономеров (состоящих из восьми моносахаридных остатков), их
модификации (присоединение сукцинильных, пирувильных и аце¬
тильных групп), полимеризацию и экспорт в периплазму.Авторегуляция образования клубеньков. Регуляция развития сим¬
биоза, осуществляемая защитными системами бобовых, не исчерпы¬
вает всего многообразия механизмов, при помощи которых растения
контролируют развитие . эндосимбиотических микроорганизмов.
Большой интерес представляют также специфичные для бобовых ме¬
ханизмы авторегуляции процесса образования клубеньков, которые
позволяют растениям избегать избыточного клубенькообразования и
тем самым экономить энергию, которая при симбиозе всегда в дефи¬
ците. Бобовые способны к достаточно жесткой авторегуляции клу¬
бенькообразования, которая опосредована надземной частью, т. е.
имеет «системный» характер.414
Мутации, нарушающие авторегуляцию образования клубеньков,
получены у ряда бобовых. Их отбирают по фенотипу суперклубенько-
образования (Nod ), который заключается в повышении числа клу¬
беньков (в 2—10 раз по сравнению с «диким типом»). Обычно такие
мутанты формируют клубеньки в присутствии высоких доз нитратов,
ингибирующих развитие симбиоза у исходных растений (фенотип
Nts — Nitrate tolerant symbiosis). У Nod++ мутантов общая нитрогеназ-
ная активность (вычисляемая на одно растение) повышена, а специ¬
фическая нитрогеназная активность (на единицу массы клубеньков)
снижена.Важно отметить, что у большинства Nod++ мутантов наблюдается
снижение надземной массы растений. По всей видимости, это обу¬
словлено перерасходом энергии на образование большого числа азот¬
фиксирующих клубеньков. Таким образом, на примере данных му¬
тантов видно, что строгий контроль над количеством эндосимбион¬
тов является важным условием поддержания мутуалистического ха¬
рактера взаимодействия. При ослаблении этого контроля отношения
партнеров могут переходить в паразитарные несмотря на то, что клю¬
чевой биохимический процесс, который лежит в основе симбиоза
(фиксация N2), не нарушен.Фиксация азота. Заключительный этап развития симбиоза, на ко¬
тором ризобии переходят к активной азотфиксации и к экспорту ее
продуктов в растение, у большинства бобовых начинается после эн-
доцитоза бактерий в растительные клетки и формирования бактерои¬
дов. В бактероидах очень активно синтезируется нитрогеназа, кото¬
рая может составлять до 30 % от их общего белка. Однако образова¬
ние нитрогеназы — это наиболее важный, но не единственный про¬
цесс, определяющий функционирование клубеньков как органов
симбиотической азотфиксации. Другими значимыми процессами яв¬
ляются: формирование систем защиты нитрогеназы от молекулярно¬
го кислорода, обеспечение энергетических потребностей нитроге-
назного комплекса и ассимиляция продуктов азотфиксации (табл.
7.4). Все эти функции выполняются бактериями и растениями совме¬
стно, что обеспечивается тесной структурной и функциональной ин¬
теграцией партнеров симбиоза.Биогенез нитрогеназного комплекса. У ризобий, как и у других азот¬
фиксирующих микроорганизмов, имеются гены nifHDK, кодирую¬
щие структуру белков нитрогеназы, а также другие «//-гены, опреде¬
ляющие образование ее кофакторов, регуляцию синтеза и созрева¬
ние. У ризобий, как и у несимбиотических азотфиксаторов, транс¬
крипция структурных генов нитрогеназы активируется геном nifA.415
Таблица 7.4. Ключевые биохимические процессы,
обеспечивающие симбиотическую азотфиксациюПроцессыВклады партнфовмикросимбионтХОЗЯИНБиогенез нитроге-
назного комплексаЗащита нитрогена¬
зы от кислородаОбеспечение энер¬
гетических потребно¬
стей клубенькаАссимиляция про¬
дуктов азотфиксацииСинтез белков и кофакто¬
ров нитрогеназы (л//-гены),
формирование регуляторного
каскада (FixU + FixK)Двухкомпонентная регуля¬
торная система FixU и транс¬
крипционный активатор NifAТранспорт в бактероиды
дикарбоновых кислот (dct-ге¬
ны), синтез клубенек-специ¬
фичной цитохром-оке идазы
cbb3 (гены fixN OPQ, fixGHlS)Экспорт аммония в расти¬
тельную клетку (частично в
форме аланина)Возможно, регуляция генов
нитрогеназы (имеются пред¬
варительные данные о специ¬
фичности индукции т^генов
у разных форм растений)Леггемоглобин и кислород¬
ный барьерТранспорт в клубеньки
больших количеств фотосин-
татов (сахароза), синтез клу¬
бенек- специфичных изофер¬
ментов С-мётаболизмаСинтез клубенек-специ-
фичных изоферментов N-ме-
таболизмаВ то же время у ризобий выявлена специфичная для симбиотиче¬
ской азотфиксации система регуляции, состоящая из генов ftxL,flxJ и
fix К. Гены fizLJ кодируют двухкомпонентную регуляторную систему
(FixL — мембранный белок-сенсор, обладающий киназной и фосфа-
тазной активностями; FixJ — цитоплазматический фосфорилируе-
мый регулятор транскрипции). Активация этой регуляторной систе¬
мы происходит лишь в микроаэрофильных условиях, поскольку FixL
выполняет функцию сенсора Ог, что обусловлено присутствием гема.
Белок FixK — это транскрипционный регулятор, относящийся к се¬
мейству Crp-Fnr. У ризобий система регуляции азотфиксации, поми¬
мо структурных генов нитрогеназы, контролирует экспрессию генов
dctABD (они кодируют транспорт в бактероиды дикарбоновых ки¬
слот, являющихся основным источником энергии для азотфикса¬
ции), ftxNOPQ и fizGHIS (кодируют синтез бактероидной цитохро-
моксидазы типа cdch, обеспечивающей транспорт электронов в дыха¬
тельных цепях бактероидов) и гены биосинтеза гема.В отличие от системы регуляции я//-генов у несимбиотических
азотфиксаторов ризобиальная система не содержит элементов, ответ¬
ственных за репрессию «//-генов связанным азотом, подобных гену
nifL Klebsiella. Это связано с тем, что азотфиксация в клубеньках про¬
исходит в условиях избытка связанного азота, а регуляцию образова¬416
ния клубеньков и азотфиксации при избытке связанного азота осу¬
ществляет растение-хозяин.Защита нитрогеназы от кислорода. Важным условием функцио¬
нирования клубенька является поддержание в нем анаэробных усло¬
вий, так как синтезируемая бактериями нитрогеназа быстро и необ¬
ратимо инактивируется кислородом. Однако энергоемкий процесс
азотфиксации возможен лишь при высокой интенсивности окисли¬
тельного фосфорилирования, для чего необходимо поступление
больших количеств Ог к бактериальным цитохромоксидазам. Реше¬
ние возникающего «кислородного парадокса» происходит благодаря
координированной работе генетических систем обоих партнеров.
У бактерий кислород-чувствительность синтеза нитрогеназы осуще¬
ствляется на уровне систем FixLJ и NifA (см. выше). Растения также
имеют два механизма «кислородной защиты» азотфиксации: а) мно¬
гокомпонентный диффузионный барьер в покровных тканях клу¬
бенька, где наиболее важную роль в защите от кислорода играет внут¬
ренняя кора; б) гемоглобин — подобный белок легоглобин, который
связывает кислород и обеспечивает его транспорт к симбиосомам
(легоглобин составляет до 30 % от общего количества белка клубень¬
ков).Долгое время синтез легоглобина рассматривали как наиболее
яркое проявление симбиоза на молекулярном уровне. Считалось,
что его полипептидная часть (глобин) кодируется растительными
генами, а гемовая часть — генами микросимбионта.Это мнение ба¬
зировалось на данных о неспособности к азотфиксации мутантов
ризобий, дефектных по синтезу гема или его предшественника, ами-
нолевулиновой кислоты. Однако последующие работы показали,
что обе части молекулы легоглобина синтезируются растительными
клетками. Бактероиды, находящиеся в клубеньках, также синтези¬
руют гем, но его участие в азотфиксации состоит в биогенезе цито-
хромов, обеспечивающих транспорт электронов к нитрогеназе.У бобовых растений синтез легоглобинов кодируется семейством
из нескольких сцепленных Lb-генов. В настоящее время подробно
изучена структурно-функциональная организация этих генов: выяв¬
лена их интрон-экзонная структура, изучена организация промото¬
ров, расположение кодирующих и некодирующих участков. Экспрес¬
сия Lb-генов в клубеньках, по всей видимости, основана на обмене
партнеров регуляторными сигналами. Об этом говорит присутствие в
промоторах этих генов последовательностей, которые гомологичны
некоторым бактериальным промоторам и могут быть мишенями для
сигнальных молекул, поступающих в растительные клетки от бакте-27-4266417
рий. Удалось выявить и бактериальные ДНК-связывающие белки,
которые взаимодействуют с промоторами легоглобиновых генов.В связи с микроаэрофильными условиями в клубеньках эндосим-
биотические бактерии стоят перед проблемой совмещения интенсив¬
ного дыхания (без которого невозможно поддерживать высокую ак¬
тивность симбиотической азотфиксации) и активной работы нитро¬
геназы. Это обеспечивается наличием у ризобий разветвленных элек¬
тронно-транспортных цепей, в которых одни компоненты работают в
аэробных условиях (ex planta), а другие — в анаэробных (микроаэро-
фильных) условиях, в том числе в клубеньках. Наиболее важную для
симбиоза роль в этих цепях играет цитохромоксидаза сЬЬз, кодируе¬
мая генами fixNOPQ и fixGHIS. Мутации по этим генам нарушают
симбиотическую азотфиксацию, но не влияют на дыхательную ак¬
тивность свободноживущих бактерий. В то же время мутации ризо¬
бий, нарушающие образование других цитохромоксидаз, не влияют
на симбиотическую азотфиксацию.Энергетическое обеспечение азотфиксации. Основным источни¬
ком энергии для симбиотической азотфиксации является фотосин¬
тез, осуществляемый в надземных органах растения. Фотосинтаты
транспортируются в клубеньки преимущественно в форме сахарозы.
Затем растение осуществляет анаэробный этап катаболизма сахарозы
(гликолиз), в ходе которого вырабатывается относительно небольшое
количество энергии. На долю микросимбионта приходится выполне¬
ние наиболее энергетически выгодной части катаболизма — цикла
трикарбоновых кислот (ЦТК). Основными углеводами, поступаю¬
щими в бактероиды от растения-хозяина, являются С4-дикарбоновые
кислоты (главным образом, сукцинат и малат), которые непосредст¬
венно включаются в ЦТК. Поэтому интенсивность работы нитроге-
назной системы бактероидов в значительной степени определяется
генами, обеспечивающими транспорт в бактероиды дикарбоновых
кислот. Основную роль в этом процессе играют три гена: dctA (коди¬
рует мембранную сукцинат-пермеазу), dctB и dctD (кодируют белки
двухкомпонентной регуляторной системы, определяющие транс¬
крипцию dctA). Белок DctB является сенсором, встроенным в мем¬
брану бактероидов и реагирующим на присутствие дикарбоновых ки¬
слот, a DctD взаимодействует с промотором гена dctA, облегчая по¬
садку на него PHK-полимеразы. Важно отметить, что система транс¬
порта дикарбоновых кислот является одним из «узких мест»,
лимитирующих интенсивность симбиотической азотфиксации. Об
этом говорит возможность существенного увеличения азотфикси-
рующей активности и эффективности симбиоза за счет введения в
ризобии дополнительных копий dct-генов.418	/
Со стороны растения-хозяина энергетика клубеньков обеспечи¬
вается синтезом клубенек-специфичных изоформ ферментов С-ме-
таболизма (табл. 7.5, рис. 7.5). Среди них одно из центральных мест
занимает сахарозосинтаза (SS), гидролизующая сахарозу с участием
уридиндифосфата. В клубеньках сои SS составляет 3—4 % от общего
количества растворимых белков цитозоля. Образующиеся в резуль¬
тате гидролиза гексозы (глюкоза и фруктоза) претерпевают обычный
путь катаболизма — гликолиз. Альтернативный путь — пентозофос-
фатный цикл, по-видимому, имеет в клубеньках второстепенное зна¬
чение.Таблица 7.5. Растительные ферменты, специфичные для азотфиксирующихклубеньковФерментыРастенияМеханизмы усиления активности вклубенькахУглеродный обменСахарозосинтазаМалатдегидрогеназаАлкогольдегидроге-назаЛактатдегидрогеназаФосфоенолпируват-карбоксилазаФосфофруктокиназаГл утам и нсинтетазаNADH-зависимаяглутаматсинтазаAsp-аминотрансфе-разаG ln-зависимая аспа-
рагинсинтетазаУриказаСояЛюпин, горох
ЛюпинГорох, бобы, фа¬
соль, люпин, люцер¬
наЛюпинСинтез новой изоформы (ноду¬
лин N-100)Синтез новых изоформ (нодули-
нов) и/или усиление синтеза
N st-формСинтез четырех новых изоформ
(нодулинов)Синтез четырех новых изоформ
(нодулинов)Синтез новой изоформы (ноду-
лина), усиление синтеза Nst-формыУсиление синтеза Nst-формыАзотный обменФасоль, люцерна,
горох, сояФасоль, люпинЛюцерна, люпин,
горохЛюпин, соя, лю¬
церна, бобы, горохСоя, фасольСинтез новой изоформы (ноду-
лина), усиление синтеза Nst-формыСинтез новой формы (нодулина),
усиление синтеза Nst-формыУсиление синтеза Nst-формыУсиление синтеза Nst-формы AS 1
и AS2Синтез новой изоформы (ноду¬
лина)419
САХАРОЗА|CУДФФРУКТОЗАУДФ- ГЛ ЮКОЗА!сСО,нсо.IРЕРНАДНАДН.Н+ОАJCНАДН.ННАД+АТФМАЛАТАДФ +ФН НАДН.НРис. 7.5. Метаболическая интеграция партнеров при образовании азотфикси-рующего симбиоза:SSase-сахарозосинтаза; РЕР — фосфоенолпируват; PEPCase — фосфоенолпируваткарбоксилаза;
ОА — оксалоацетат; MDH — малатдегидрогеназа; DctA — сукцинатпермеаза; GS — глутаминсин-
тетаза; GOGAT — глутаматсинтаза; dcA — дикарбоновые кислоты (сукцинат, малат); ТСА — цикл
трикарбоновых кислот; GLU — глутамин; GLN — глутамат; aketoGLU — a-кетоглутарат;
FixGHIS и FixNOQP — специфические для бактероидов цитохромы с высоким сродством к кисло¬
роду; РВМ — перибактероидная мембрана; ВМ — мембрана бактероида
Поскольку количество углерода в клубеньках является одним
из основных факторов, лимитирующих азотфиксацию, важное
значение приобретает нефотосинтетическая (темновая) фиксация
СО2, катализируемая фосфоенолпируваткарбоксилазой (РЕРС):
фосфоенол пиру ват + СОг = малат. Эта реакция является источни¬
ком приблизительно 25 % атомов углерода, поступающих в составе
малага и других энергетических субстратов в бактероиды. Таким об¬
разом, за счет работы РЕРС рециклизуется существенная часть угле¬
кислоты, выделяемой придыхании, которое в клубеньках происходит
очень активно.Ассимиляция фиксированного азота. С-соединения, поступающие
в клубеньки, являются источниками не только энергии для азотфик¬
сации, но и углеродных «скелетов» для ассимиляции фиксированно¬
го азота. Образовавшийся в процессе азотфиксации аммоний посту¬
пает из бактероидов в цитоплазму растительных клеток клубенька
либо в свободной форме, либо в составе аланина (который образуется
из-за активности бактериальной аланин-дегидрогеназы). Фиксиро¬
ванный азот и включается в метаболизм растительной клетки. При
этом различают стадии первичной ассимиляции азота (вовлечение
аммония в клеточный метаболизм), образования транспортных
форм фиксированного азота (которые поступают из клубеньков в
проводящую систему корня) и транслокации фиксированного азота
(его перераспределение между разными органами растения). В пер¬
вичной ассимиляции и образовании транспортных форм фиксиро¬
ванного азота ключевую роль играют клубенек-специфичные фор¬
мы ферментов азотного обмена, синтезируемые растением (см.
табл. 7.5).В растительных клетках первичная ассимиляция аммония начи¬
нается реакциями, которые контролируются ферментами «глутамат-
синтазного цикла» — глутаминсинтетазой (GS) и NADH-зависимой
глутаматсинтазой (NADH-GOGAT). GS, выделенная из клубеньков
фасоли, представляет собой октамерный фермент, состоящий из
субъединиц одинаковой молекулярной массы — около 40 кДа. Выяв¬
лены три изофермента (GSni, GSn2 и GSu), причем два первых лока¬
лизованы в цитоплазме, а третий — в пластидах инфицированных
растительных клеток. При этом клубенек-специфичной изоформой
(нодулином) является только GSni, а точнее — лишь одна из ее субъ¬
единиц.Вторым ферментом глутаматсинтазного цикла является
NADH-GOGAT, локализованная, в отличие от клубенек-специфи-
ческой GS, в пластидах растительных клеток. Таким образом, в клет¬
ках клубенька обнаружено разобщение ферментов глутаматсинтаз-421
ного цикла (GS — в цитоплазме, a NADH-GOGAT — в пластидах).
Многие данные показывают, что именно реакция, катализируемая
NADH-GOGAT, является лимитирующей стадией в ассимиляции
фиксированного азота: активность NADH-GOGAT невысока даже в
эффективных клубеньках. В неэффективных же клубеньках актив¬
ность этого фермента (как и наличие его мРН К), часто не удается за¬
регистрировать. Клубеньковая NADH-GOGAT у люпина, люцерны и
гороха представлена одной молекулярной формой с массой более 200
кДа, индуцирующейся при клубенькообразовании. В клубеньках фа¬
соли синтезируются два изофермента NADH-GOGAT, один из кото¬
рых является клубенек-стимулируемым.Помимо глутамина, главной транспортной формой азота у боль¬
шинства бобовых растений, произрастающих в умеренных широтах
(например, у гороха и люцерны), являются амиды — в основном, ас¬
парагин. Эти бобовые выделяют в «амидный» тип. У других бобовых
(фасоль, соя, вигна) транспорт азота происходит в форме уреи-
дов — аллантоина и аллантоиновой кислоты. Эти бобовые относят к
«уреидному» типу.У «амидных» бобовых все основные реакции ассимиляции фик¬
сированного азота происходят в тех же клетках, которые содержат
симбиосомы. При этом важную роль играет аспартатаминотрансфе-
раза (ААТ), которая катализирует реакцию образования аспарта-
та — предшественника аспарагина. В метаболизме «уреидных» клу¬
беньков важную роль играет уриказа. Она осуществляет один из ко¬
нечных этапов биосинтеза уреидов — образование аллантоина путем
окисления мочевой кислоты, образующейся при окислении пуринов.7.3.	СИМБИОЗЫ РАСТЕНИЙ С ЦИАНОБАКТЕРИЯМИАзотфиксирующие цианобактерии образуют симбиозы с очень
широким спектром растений, включающим покрытосемянные, голо¬
семянные, папоротники, мхи и даже одноклеточные морские диато¬
мовые водоросли. Наиболее изученными являются эндосимбиозы ге-
тероцистных цианобактерий Anabaena (Nostoc) с водным папоротни¬
ком Azolla, а также Nostoc с цветковым Gunnera и печеночником
Anthoceros. Симбиоз Nostoc-Gunnera является внутриклеточным,
остальные симбиозы — внеклеточными (у Azolla цианобактерия
располагается в полости листа, у Anthoceros — в полостях, располо¬
женных на дорзальной стороне таллома).Микроорганизмы в отсутствие связанного азота могут расти диа-
зотрофно как на свету (на минимальной среде, т. е. при автотрофном
С-питании), так и в темноте (на среде с источниками углерода, т. е.422
при гетеротрофном С-питании). Это открывает широкие возможно¬
сти для генетического анализа процессов, связанных с азотфиксаци-
ей у симбиотических цианобактерий. Для растений зависимость от
симбиоза с цианобактериями выражена в разной степени: для Azolla
он является облигатным, а для Gunnera и Anthoceros — факультатив¬
ным.Некоторые симбиозы, образуемые азотфиксирующими циано¬
бактериями, имеют экологическое и сельскохозяйственное значение.
Так, система «Azolla-АпаЬаепа» является весьма эффективным источ¬
ником азота при выращивании риса. Симбиоз «Nostoc-Gunnera» мо¬
жет рассматриваться как модель, разработка которой позволит при¬
дать способность к азотфиксирующим симбиозам широкому кругу
небобовых растений.Клеточная дифференцировка. При переносе АпаЬаепа в безазотную
среду приблизительно 10 % клеток, распределенных случайно по
длине нити, претерпевает дифференцировку в гетероцисты. Эти
клетки увеличиваются в размерах и окружаются плотной оболочкой,
которая блокирует доступ в цитоплазму свободного кислорода. Фото¬
синтез в гетероцистах отсутствует, из-за чего в них создаются микро-
аэрофильные условия, необходимые для азотфиксации. Это позволя¬
ет цианобактериям фиксировать азот в аэробных условиях.У АпаЬаепа выявлена сложная система генов, контролирующих
образование гетероцист. Среди них наиболее изучен ген hetR, инак¬
тивация которого приводит к неспособности формировать гетероци¬
сты. Мутанты по гену hetR могут фиксировать азот при росте на без-
азотной среде в микроаэрофильных условиях, но не могут — в аэроб¬
ных условиях. Если же ген Ае/Ламплифицировать в составе многоко-
пийной плазмиды или усилить его экспрессию, поставив под
«сильный» промотор, то формирование гетероцист индуцируется
даже на среде с аммонием.У штамма АпаЬаепа с введенным в него многокопийным геном
hetR можно получить транспозоновые мутанты, у которых дополни¬
тельные гетероцисты не образуются. Инсерции транспозона у этих
мутантов локализованы в генах pat А и patB. Мутации в гене patA при¬
водят к необычному нарушению процесса клеточной дифференци-
ровки: гетероцисты образуются только на концах клеточной цепочки.
Мутации в гене patB приводят к задержке образования гетероцист:
если у штамма АпаЬаепа 7120 «дикого типа» они появляются уже через
24 ч после переноса на безазотную среду, то у patB мутанта — только
через 48 ч. Однако общее число гетероцист, образуемых после про¬
должительного культивирования на безазотной среде, повышено по
сравнению со штаммом дикого типа. При совмещении мутации patF423
с мутацией patA (или с многокопийностью по гену hetR) цианобакте¬
рия гибнет.Некоторые мутации у Anabaena приводят к образованию морфо¬
логически нормальных гетероцист, которые не могут защищать нит-
рогеназу от кислорода. Поэтому у данных мутантов азотфиксация в
аэробных условиях невозможна, хотя в микроаэрофильных условиях
она не нарушена. С помощью этих мутаций было выявлено семейство
генов hglB, -С, -D, -К, которые контролируют накопление гликоли¬
пидов в клеточной стенке гетероцист. По-видимому, эти гены коди¬
руют синтез жирных кислот, которые входят в состав гликолипидов
клеточной стенки, препятствующих диффузии Ог в гетероцисты.Молекулярная дифференцировка. Переход Anabaena к азотфикса¬
ции сопровождается репрессией генов, контролирующих фиксацию
СО2, благодаря чему в гетероцистах прекращается выработка молеку¬
лярного кислорода. Кроме того, активируются некоторые гены азот¬
ного метаболизма, необходимые для ассимиляции аммония (напри¬
мер, gin А). Глутамин, образующийся в результате этого процесса,
транспортируется в вегетативные клетки цианобактерии или экспор¬
тируется в организм хозяина.Уникальной особенностью азотфиксирующей системы у гетеро-
цистных цианобактерий являются перестройки ш/-генов, предшест¬
вующие синтезу нитрогеназы. В вегетативных клетках Anabaena син¬
тез нитрогеназы невозможен, так как внутри гена nifD находится
фрагмент ДНК размером 11 т.п.н. Этот фрагмент содержит ген xisA,
кодирующий эндонуклеазу. При дифференцировке гетероцист эндо¬
нуклеаза осуществляет точное вырезание фрагмента, так что целост¬
ность гена nifD восстанавливается, а ген xisA переходит в экстрахро-
мосомное состояние. Кроме того, xisA определяет эксцизию еще од¬
ного фрагмента ДНК размером 55 т.п.н., который расположен между
генами nifSи fdxN. В результате этого в азотфиксирующих гетероци¬
стах из трех исходно разобщенных групп генов возникает единый
оперон, который состоит из семи генов и кодирует синтез нитроге-
назного комплекса.Важно отметить, что перестройка «//-генов в гетероцистах
Anabaena происходит в значительной степени независимо от генов,
контролирующих морфогенез гетероцист. Так, у мутантов по гену
hetR в анаэробных условиях эти перестройки происходят нормально,
что выражается в индукции нитрогеназной активности. В свою оче¬
редь, мутации, инактивирующие структурные гены нитрогеназы
(nifHDK) или нарушающие процессинг ДНК (хisA'), приводят к не¬
способности фиксировать азот, однако формирование гетероцист в
безазотной среде сохраняется.424
Развитие симбиоза. Развитие симбиоза азотфиксирующих циано¬
бактерий с растениями было изучено на примере системы
«Nostoc-Gunnera», образование которой является факультативным
для обоих партнеров. Взаимодействие этих организмов не является
высокослецифичным: симбиоз могут формировать штаммы Nostoc,
выделенные не только из Gunnera, но также из голосемянного
Macrozamia печеночника Anthoceros и даже из лишайника Peltigera.
В то же время, далеко не все изоляты Nostoc могут формировать сим¬
биотическую систему.Цианобактерии обитают в специальных железах, находящихся у
основания черешков листьев. Эти железы содержат папиллы, между
которыми имеются каналы, ведущие в глубь растительных тканей.
При попадании в железу совместимого штамма цианобактерий у
партнеров индуцируется ряд морфогенетических процессов, из кото¬
рых первым является образование подвижных форм цианобакте¬
рий — гормогоний (короткие нити, состоящие из мелких клеток с
воздушными вакуолями, не содержат гетероцист), которые активно
проникают в глубь железы.Цианобактерии, проникающие внутрь симбиотической железы,
активно размножаются и инфицируют растительные клетки. В местах
наиболее тесного контакта партнеров стенки растительных клеток
лИзируются. После этого эндосимбионты проникают в клетки расте¬
ния, а затем их стенки восстанавливают свою целостность. Внутри
растительных клеток цианобактерии дифференцируются в гетероци¬
сты, в которых индуцируется нитрогеназная активность. У эндосим-
биотических цианобактерий гетероцисты образуют 60—80 % клеток,
а у свободноживущих — лишь 5—10 %. Образование неподвижных
спор (акинет), характерных для свободноживущих цианобактерий,
внутри симбиотических желез Gunnera не наблюдается.При симбиозе с Gunnera цианобактерии не ассимилируют аммо¬
ний, образовавшийся в результате нитрогеназной реакции, а экспор¬
тируют его в растительную клетку. Первичную ассимиляцию аммо¬
ния в этой симбиотической системе (как и в случае бобово-ризоби-
ального симбиоза) выполняет хозяин.7.4.	КОНЦЕПЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ И ЭВОЛЮЦИИАЗОТФИКСИРУЮЩИХ СИМБИОТИЧЕСКИХ БИОСИСТЕМСимбиозы растений с азотфиксаторами являются одной из наи¬
более широко распространенных и изученных форм раститель¬
но-микробного взаимодействия. Образуемые симбиозы являются в
своей основе взаимовыгодными (мутуалистическими), однако при
определенных условиях (высокое содержание в среде связанного азо¬425
та, недостаточное питание, генетические изменения) взаимодейст¬
вие может переходить в паразитизм. Более того, механизмы взаимо¬
действия бобовых с ризобиями имеют ряд общих стадий со взаимо¬
действием между растениями и фитопатогенами. Таким образом,
изучение азотфиксирующих симбиозов подтверждает правильность
концепции симбиоза, предложенной более 120 лет назад Антоном
Де Бари. Этот ученый предложил считать главным отличительным
признаком симбиоза не его «полезность» или «вредность», а длитель¬
ность взаимодействия партнеров. Такой подход позволяет рассмат¬
ривать симбиотические системы как стабильные надорганизменные
комплексы, входя в которые организмы приобретают новые экологи¬
ческие и метаболические возможности, которых они были лишены в
свобод ножи вущем состоянии.При рассмотрении данных о генетическом контроле двух разных
типов азотфиксирующих систем — бобово-ризобиального симбиоза
и симбиоза растений с цианобактериями — можно видеть ряд общих
черт, характеризующих эти взаимодействия (табл. 7.6). Во-первых,
обе группы симбиозов базируются на сигнальных взаимодействиях
партнеров, причем сигналы воздействуют непосредственно на экс¬
прессию генов. В результате наблюдается координированная регуля¬
ция и дифференциальная экспрессия генов партнеров, которая при¬
водит к морфогенезу симбиотических структур и к тесной метаболи¬
ческой интеграции растений и бактерий. Во-вторых, в обеих системах
основные эффекты взаимодействия — азотфиксация и развитие
структур симбиоза — контролируются разными генными системами
и могут быть разобщены с помощью генетических методов.Таблица 7.6. Сравнение двух типов азотфиксирующего
растительно-микробного симбиозаПараметрыБобово-ризобиальныйсимбиозСимбиозы «цианобакте¬
рии-растения»Действия ранних расти¬
тельных сигналов на мик¬
роорганизмыЦитодифференцировкамикросимбионтовЗащита нитрогеназы от
кислородаИзменение организации
«//-генов при переходе
микроба к азотфиксацииАктивация ло*/-генов
(под действием раститель¬
ных флавоноидов)Только в растении (бак¬
тероиды)Бактериями (белки NifA
и FixU) и растениями (ле¬
гоглобин, диффузионный
барьер в тканях клубенька)Не выявленоФормирование подвиж¬
ных гормогонийВ растении и в чистой
культуре (гетероцисты)Только бактериями (ге¬
тероцисты)Выявлено426
Окончание табл. 7.6ПараметрыБобово-ризобиальныйсимбиозСимбиозы «цианобакте¬
рии—растения»Индукция микросимби¬
онтом морфогенетических
процессов у растенийСпособность микросим¬
бионта к диазотрофии и
фототрофииОбязательность симбио¬
за для партнеровСпецифичность взаимо¬
действияМитотическая реактива¬
ция кортикальных клеток
или индукция развития за¬
чатка бобового корня в
клубенекОбычно отсутствуетФакультативный для
обоих партнеровОграничена сем. бобо¬
выхРост симбиотической
железыИмеетсяДля микробов факульта¬
тивный, для хозяев или об¬
лигатный (Azolla), или фа¬
культативный (Gunnera)Для Nostoc включает раз¬
ные типы наземных расте¬
нийВ то же время очевиден и ряд различий между рассмотренными
системами. Первое различие связано с тем, что большинство циано¬
бактерий фиксируют азот в чистой культуре, сочетая это с фототроф-
ностью, тогда как большинство ризобий в чистой культуре азот не
фиксируют и фототрофами не являются. В связи с этим у цианобакте¬
рий имеется специальный механизм образования азотфиксирующих
клеточных форм — гетероцист, в которых отсутствует фотосинтез, а
защита нитрогеназы от кислорода обеспечивается прочной клеточ¬
ной стенкой. У цианобактерий имеется сложная система генов диф¬
ференцировки гетероцист, которая, по-видимому, сформировалась
как адаптация к диазотрофному росту, однако используется и в сим¬
биотической системе. У ризобий цитодифференцировка в норме осу¬
ществляется только in planta и не связана с защитой нитрогеназы от
кислорода.Чрезвычайно интересным является вопрос о происхождении и
эволюции азотфиксирующих симбиозов. Полученные в последние
годы данные о молекулярной структуре симбиотических генов бо¬
бовых позволяют пролить свет на эти вопросы. Например, у лядвен-
ца {Lotus japonicus) выявлен ген nin, мутации в котором приводят к
отсутствию клубеньков (блокировано развитие инфекционных ни¬
тей), однако не влияют на развитие других органов растения. Белко¬
вый продукт этого гена оказался гомологичным фактору Mid
Chalomydomonas, контролирующему гаметогенез в условиях азотно¬
го голодания. Таким образом, в симбиотической системе данный ген427
сохранил эволюционно древнюю функцию регуляции процессов раз¬
вития, осуществляемой при воздействии метаболического стресса
(недостаток азота). Сходным образом могли эволюционировать сис¬
темы синтеза различных нодулинов и Nst-белков. Так, гомологи ге¬
нов леггемоглобина выявлены у широкого спектра растений, не обра¬
зующих клубеньков, причем белки-продукты этих генов, так же как и
леггемоглобин, связывают кислород, выполняя роль его сенсоров.
Гомологи практически всех нодулинов, в том числе и клубенек-спе-
цифических ферментов С- и N-метаболизма, либо выявлены у расте¬
ний, не образующих клубеньков, либо функционируют в надземных
органах бобовых. Следовательно, на молекулярно-генетическом
уровне эволюция симбиоза может быть представлена как вовлечение
анцестральных генов, выполнявших не связанные с симбиозом
функции, в регуляторную систему растительно-микробных взаимо¬
действий.Другим важным достижением последних лет является выяснение
тесной связи азотфиксирующего симбиоза с арбускулярной микори¬
зой (AM). Применение формально- и молекулярно-генетических ме¬
тодов показало, что развитие бобово-ризобиального симбиоза и AM
контролируется рядом «общих» генов. Эти симбиозы сопровождают¬
ся синтезом гомологичных растительных продуктов, в том числе бел¬
ков перибактериодной и периарбускулярной мембран, а также неко¬
торых нодулинов. Особый интерес представляет тот факт, что при об¬
разовании AM и клубеньков происходят реакции, характерные для
защиты растений от патогенов. Однако по характеру регуляции эти
реакции различаются, что может быть связано с выполняемыми
функциями: инактивация микроорганизмов при антагонизме и регу¬
ляция их активности (численности) при мутуализме. Учитывая древ¬
ность AM по отношению к другим типам микробно-растительных
взаимодействий, логично предположить, что первичной функцией
защитных систем растений была регуляция развития эндомикориз-
ных грибов inplanta. В ходе дальнейшей эволюции растений эти сис¬
темы могли приобрести функции защиты от патогенов, а также кон¬
троля над поддержанием азотфиксирующих симбионтов.Общими для образования клубеньков и AM Moiyr быть также
гены рецепции и процессинга ризобиальных Nod-факторов, близких
к олигомерам хитина — основного компонента клеточной стенки
грибов. Nod-факторы, активирующие клубенькообразование, стиму¬
лируют и микоризацию, а синтез бобовыми хитиназ, расщепляющих
Nod-факторы, индуцируется как ризобиями, так и АМ-грибами. Эти
данные показывают, что в процессе коэволюции с растениями ризо-428
бии «научились» синтезировать те же сигнальные факторы, что и ми¬
коризные грибы.Таким образом, значительная часть генетической системы, кон¬
тролирующей развитие клубеньков, возникла в ходе коэволюции рас¬
тений с АМ-грибами. Поэтому способность к образованию AM необ¬
ходимо рассматривать как одну из ключевых преадаптаций растений,
обусловивших возникновение азотфиксирующих симбиозов. Однако
в процессе коэволюции бобовых и ризобий возник ряд новых стадий
взаимодействия (наиболее существенными из них был эндоцитоз и
формирование автономных симбиосом), обеспечивших усложнение
морфологии системы и глубокую функциональную интеграцию
партнеров.Общей чертой всех систем симбиотической азотфиксации явля¬
ется то, что интенсивность этого процесса координируется генами
обоих партнеров. Поэтому улучшение азотфиксирующих симбиозов,
также как и других систем растительно-микробного взаимодействия,
требует координированной генно-инженерной и селекционной ра¬
боты с микроорганизмами и растениями. Без выяснения организа¬
ции функций тесно интегрированных систем симбиотических генов
растений и бактерий вряд ли можно серьезно говорить об улучшении
симбиотических систем и тем более о создании новых симбиозов.
С учетом этого факта проводятся селекционные работы по достиже¬
нию максимального эффекта синергического эффекта в микроби¬
ально-растительной азотфиксирующей системе. Практически уже
получены варианты с оптимальным сочетанием эффективных штам¬
мов микроорганизмов и сортов бобовых растений.Серьезные разработки требуются для создания высокоспецифич¬
ных систем узнавания, улучшения совместимости микросимбионтов
с защитными и метаболическими системами растений. В связи с вы¬
сокой энергоемкостью многих симбиозов весьма актуальной задачей
является оптимизация взаимодействия эндосимбионтов с системами
обеспечения растений энергией, в первую очередь, с аппаратом фото¬
синтеза. Решение всего этого комплекса фундаментальных и при¬
кладных проблем требует проведения междисциплинарных исследо¬
ваний, в которых участвуют специалисты разных профилей. Природ¬
ные симбиотические системы могут быть познаны и улучшены толь¬
ко «научными симбиозами» — сообществами ученых, владеющих
знаниями и методами в областях изучения растений и микробов. Ор¬
ганизация таких сообществ — очень актуальная задача, для решения
которой должны быть использованы организационные и финансо¬
вые возможности современной науки.429
Контрольные вопросы к главе 71.	Охарактеризуйте основные функции микроорганизмов, способствующие
установлению симбиозов с растениями.2.	Опишите основные свойства нитрогеназного комплекса и укажите осо¬
бенности его влияния в системе микробно-растительных взаимодействий.3.	Какова природа сигнальных молекул, обеспечивающих узнавание парт¬
неров бобово-ризобиального симбиоза?4.	Какие генетические системы контролируют сигнальное взаимодействие
со стороны клубеньковых бактерий и бобовых растений?5.	Охарактеризуйте основные группы генов, контролирующих развитие клу¬
беньков у бобовых растений.6.	В чем заключается методология изучения структуры и функций нодули¬
нов?7.	Каковы механизмы интеграции систем С- и N-метаболизма бобовых рас¬
тений и клубеньковых бактерий?8.	Опишите уровни и механизмы регуляции образования клубеньков расте¬
нием.9.	В чем состоит сходство и различие симбиозов растений с ризобиями и
цианобактериями?10.	Каковы возможные пути происхождения и эволюции симбиотической
азотфиксации?11.	Укажите особенности селекции симбиотических пар азотфиксирующих
микроорганизмов и бобовых растений на эффективность симбиотического взаи¬
модействия.ЛИТЕРАТУРАКретович ВЛ. Биохимия усвоения азота воздуха растениями.— М.: Нау¬
ка, 1994.Лугова Л .Ам Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития расте-
ний/Под ред. С.Г. Инге-Вечтомова.— СПб.: Наука, 2000.Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляци-
онный процесс.— М.: Наука, 1973.Симаров Б.В. Генетические основы селекции клубеньковых бакте¬
рий.—Л.: Агропромиздат, 1990.Тихонович ИЛ., Проворов НА. Генетика симбиотической азотфиксации
с основами селекции.—СПб.: Наука, 1998.Проворов Н.А. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе//
Общая биология. 2001. Т. 62. № 6. С. 472—495.Spaink Н., Kondorosi A., Hooykaas P.J.J. The Rhizobiaceae. Dordrecht,
Boston, London: Kluwer Acad. Publ. 1998.Stacey G., Burris R.H., Evans H.J. Biological Nitrogen Fixation. New York,
London: Chapman and Hall. 1992.
Глава 8БИОКОНВЕРСИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ8.1.	ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОГАЗАОбострение экологических проблем, истощение запасов невозоб¬
новляемых энергоресурсов, рост цен на них обусловили глобальный
интерес к разработке и использованию технологии биоконверсии ор¬
ганических отходов для получения тепловой и других видов энергии.Известно, что животные плохо усваивают энергию растительных
кормов и более половины ее уходит в навоз, который прежде всего яв¬
ляется ценнейшим видом органических удобрений. Вместе с тем, он
может быть использован в качестве возобновляемого источника
энергии. Концентрация животных на крупных фермах и комплексах
обусловила увеличение объемов навоза и навозных стоков, которые
должны утилизироваться, не загрязняя окружающую среду.Одним из путей рациональной утилизации навоза и навозных сто¬
ков является их анаэробное сбраживание, которое обеспечивает обез¬
вреживание навоза и сохранение его как важнейшего органического
удобрения при одновременном получении биогаза.Очистные сооружения, использующие анаэробное брожение для
обработки органических отходов, известны с конца XIX столетия.
Первый такой опыт относится к 1895 г., когда в английском городе
Экзетер был введен в эксплуатацию так называемый септиктенк для
очистки коммунальных отходов. Помимо чисто санитарных задач,
эта установка обеспечивала получение биогаза, который использо¬
вался для освещения улиц.Анаэробный метод обработки отходов долгое время применялся
для стабилизации осадков водоочистных станций и отходов животно¬
водства. Однако с началом энергетического кризиса 1970-х годов этот
метод привлек особое внимание в связи с идеей получения биогаза в
основном из навоза сельскохозяйственных животных.Анаэробное сбраживание навоза с получением биогаза осуществ¬
ляется в специальных биогазовых установках, основными элемента¬
ми которых являются герметические емкости (рис. 8.1).431
на поляРис. 8.1. Технологическая схема биогазовой установки для переработкижидкого навоза:/ — животноводческое помещение; 2 — навозоприемник; 3 — насос; 4 — метантенк; 5 — газголь¬
дер; 6 — теплообменник; 7—котел; 8— навозохранилище; 9— аэротенкТехнологический процесс обработки навоза осуществляется сле¬
дующим образом. Из животноводческого помещения 1 навоз посту¬
пает в накопительную емкость 2, далее фекальным насосом 3 его за¬
гружают в метантенк 4 (емкость для анаэробного сбраживания наво¬
за). Биогаз, образующийся в процессе брожения, поступает в газголь¬
дер 5 и далее к потребителю. Для нагрева навоза до температуры
брожения и поддержания теплового режима в метантенке установлен
теплообменник 6, через который протекает горячая вода, нагревае¬
мая в котле 7. Сброженный навоз выгружают в навозохранилище 8.В метантенке обеспечиваются все необходимые параметры про¬
цесса (температура, концентрация органических веществ, кислот¬
ность и др.). Метантенк имеет тепловую изоляцию, позволяющую
обеспечивать и поддерживать на заданном уровне температурные ре¬
жимы сбраживания, в нем также имеется устройство для постоянного
перемешивания навоза. Поступление навоза в метантенк регулирует¬
ся так, чтобы процесс сбраживания протекал равномерно.Во время сбраживания в навозе развивается микрофлора, которая
последовательно разрушает органические вещества до кислот, а по¬
следние под действием синтрофных и метанообразующих бактерий
превращаются в газообразные продукты — метан и углекислоту. Сте¬
пень разложения органического вещества при анаэробном сбражива¬
нии навоза составляет 25—45 %.Детальную расшифровку процесса метанового брожения с уста¬
новлением роли отдельных групп и видов бактерий, трофических432
взаимосвязей между ними, регулирующих факторов в сообществе ос¬
новано на физиологии и биохимии чистых культур бактерий и их
комбинаций.Метановое брожение органических отходов представляет собой
многоступенчатый процесс разложения смеси разнообразных орга¬
нических веществ в анаэробных условиях под действием консорциу¬
ма микроорганизмов с образованием метана и углекислоты в качестве
конечных продуктов.Изучение химизма метанового брожения еще в конце ХХ-го —
начале XXI века привело к установлению наличия двух фаз процесса.
Называли их по-разному: «вонючая» и «без запаха», «кислая» и «ще¬
лочная», «кислотогенная» и «метаногенная», «водородная» и «мета¬
новая». Первая связана с образованием летучих жирных кислот как
основных промежуточных продуктов, накопление которых снижает
кислотную реакцию среды, вторая — с использованием этих кислот и
образованием метана. Микробиологи выделяют четыре основных
этапа процесса, осуществляемых различными группами микроорга¬
низмов, действующими в определенной последовательности и тес¬
ной взаимосвязи, а именно: гидролиз полимеров, кислотогенез, аце¬
тогенез, собственно метаногенез. Первые два этапа в общих чертах
соответствуют кислотогенной фазе, два других — метаногенной.
Следует отметить, что это деление достаточно условно, так как гидро¬
лиз трудно разлагаемых полимерных соединений продолжается и в
метаногенной фазе, а образование ацетата, основного предшествен¬
ника метана, осуществляется гидролитической, бродильной, син-
трофной и гомоацетатной микрофлорой. Реакция превращения аце¬
тата в метан является ключевой и определяет скорость процесса.
В метаногенном сообществе между микроорганизмами существуют
сложные взаимосвязи, в том числе и обратные, и деятельность сооб¬
щества следует рассматривать как единое целое.В состав метаногенного сообщества входит большое количество
разнообразных бактерий, основными являются группы гидролитиче¬
ских, бродильных, синтрофных, гомоацетатных и метановых бакте¬
рий. Первичные анаэробы осуществляют разложение органических
веществ до предшественников метана: водорода и углекислоты, аце¬
тата, метанола, метиламинов, формиата. Ввиду субстратной специ¬
фичности метаногенов их развитие без трофической связи с бакте¬
риями предыдущих стаций невозможно. В свою очередь, метановые
бактерии, используя вещества, продуцируемые первичными анаэро¬
бами, определяют возможность и скорость реакций, осуществляемых
этими бактериями. Центральным метаболитом, осуществляемым ре¬
гуляторную функцию в метанообразующем сообществе, является во¬433
дород. Его используют метанообразующие бактерии, снижая концен¬
трацию до 10_3 % в термофильных условиях и до 10-4 % — в мезо-
фильных. За счет поддержания низкого парциального давления водо¬
рода в системе становится возможным его межвидовой перенос,
меняющий метаболизм первичных анаэробов в сторону образования
непосредственных предшественников метана. Если водород из сис¬
темы не удаляется, то образуются более восстановленные продук¬
ты — летучие жирные кислоты и спирты. Метаболизм этих соедине¬
ний осуществляется синтрофными бактериями, для жизнедеятельно¬
сти которых связывание образующего водорода метановыми бакте¬
риями необходимо.Первая фаза процесса анаэробного разложения органических со¬
единений осуществляется гидролитической и бродильной микро¬
флорой. Основными природными полимерами являются полисаха¬
риды, в первую очередь целлюлоза, ксилан, крахмал, пектин, а также
белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды. Лигнин ус¬
тойчив к разложению в анаэробных условиях, однако его низкомоле¬
кулярные фракции метаболизируются. Для микроорганизмов, обла¬
дающих гидролизами, необходим тесный контакт с субстратом. Про¬
дукты гидролиза, мономеры, используются для роста самих гидроли-
тиков.Микрофлора брожения или необлигатные протоны, восстанавли¬
вающие бактерии, потребляют продукты гидролиза и многомерные
соединения, присутствующие в исходном субстрате. Эта микрофлора
не способна к гидролизу и использует только низкомолекулярные ве¬
щества, часто присутствующие в малой концентрации. Организмы
этой группы должны иметь более эффективные транспортные систе¬
мы, чем гидролитики. Продукты обмена у бактерий двух первых
групп примерно одни и те же: водород, углекислота, летучие жирные
кислоты, спирты, ацетат. По образуемым продуктам эта первая фаза
брожения, осуществляемая первичными анаэробами, получила на¬
звание кислотогенной, или водородной.Разложение летучих жирных кислот и спиртов осуществляют об¬
лигатные синтрофные или протонвосстанавливающие бактерии. Ис¬
пользование таких кислот, как масляная, пропионовая, пальмитино¬
вая, валериановая и другие, а также этанола и других спиртов, может
осуществляться только в результате комбинированного действия двух
культур, одной из которых является метановая или другая бактерия,
использующая водород, например сульфатвосстанавливающая. Про¬
дуктами жизнедеятельности синтрофных ассоциаций являются аце¬
тат и метан, образующийся из водорода и углекислоты метановых
бактерий. Между собой метановые бактерии различаются морфоло¬434
гическими и физиолого-биохимическими признаками, но в целом
представители этой группы обладают рядом общих для них свойств,
существенно отличающих эту группу от других микроорганизмов:
особое строение клеточных стенок, своеобразный состав липидов,
коферментов и кофакторов, отсутствующих у других бактерий.Группа ацетатиспользующих метаногенов является наиболее важ¬
ной для метаногенеза из органических субстратов, так как при сбра¬
живании сточных вод и навоза из ацетата как промежуточного про¬
дукта образуется более 70 % метана. Разложение ацетата с образовани¬
ем метана и угольной кислоты способны осуществлять представители
только двух родов метаносарцина и метанотрикс. Метаносарцины
склонны к более высоким концентрациям ацетата и, как правило, об¬
наруживаются в метантенках с высокой скоростью процесса. Мета-
нотриксы имеют большее сходство с ацетатом и способны использо¬
вать его в концентрациях в 5 раз ниже, чем метаносарцина.Метаногенное сообщество функционирует с наибольшей скоро¬
стью при сбалансированной численности бактерий в разных группах.
Наибольшая скорость процесса достигается, когда численность мета¬
новых бактерий достаточна для поддержания низкой концентрации
водорода и ацетата. Поэтому в первую очередь в метантенке нужно
удерживать и увеличивать численность именно этих бактерий, так
как скорость роста метановых бактерий на порядки ниже, чем пер¬
вичных анаэробов. Особенно медленно растут ацетатиспользующие
метанотриксы. У мезофильного метанотрикса время удвоения
200—300 ч, у термофильного — примерно в 5 раз меньше, у метано¬
сарцина — 20—30 ч. Первичные анаэробы имеют высокую скорость
роста: численность гидролитиков удваивается за 10—20 ч, а бродиль-
щиков — за 1—3 ч. Медленно растут и синтрофные бактерии, их вре¬
мя удвоения оценивается примерно в 100 ч.Метаногенные сообщества природных экосистем развивались и
сложились в процессе эволюции, и приспособление к меняющимся
условиям происходили за длительные промежутки времени.В искусственных сооружениях для анаэробной обработки отходов
также происходит развитие метаногенного сообщества, которое в
конце концов становится специализированным для данного субстра¬
та и физико-химических условий среды.При сбраживании отходов в периодическом режиме четко выде¬
ляются две фазы процесса — кислотогенная, или водородная, и соб¬
ственно метаногенная. Эти фазы отчетливо прослеживаются и при
запуске анаэробного реактора. Сначала разлагаются простые соеди¬
нения с образованием органических кислот и водорода, потом водо¬
род начинает потребляться с образованием метана; примерно в это же435
время нарастает гидролиз полимеров. Снижение концентрации водо¬
рода позволяет развиваться синтрофным бактериям, а нарастание
численности ацетатиспользующих метановых бактерий приводит к
снижению концентрации кислот. Для достижения стационарных
концентраций различных групп микроорганизмов требуются иногда
десятки суток. Это время можно сократить при употреблении в каче¬
стве заквасок осадка из работающего метантенка, отселекциониро-
ванных ассоциаций микроорганизмов или специально выращенных
метановых и синтрофных бактерий.На практике метановое брожение навоза КРС или свиней часто
развивается спонтанно в местах скопления или хранения навоза, на¬
пример в навозохранилищах. Запуск метантенков для обработки на¬
воза, особенно КРС, также может быть произведен без применения
какого-либо посевного материала. Однако период выхода установки
на рабочий режим достаточно длителен, он может занимать до не¬
скольких месяцев, часто в этот период наблюдается «закисле-
ние» — накопление пропионовой и других летучих жирных кислот,
что ведет к необратимой остановке процесса. Все это связано с фор¬
мированием метаногенного микробного сообщества.Считается, что в навозе КРС имеется в достаточном количестве
полный набор необходимых для его сбраживания микроорганизмов,
так как известно, что в рубце и кишечнике жвачных идет процесс ме-
танообразования. Однако там процесс анаэробного разложения орга¬
ники кончается на этапе образования жирных кислот, которые вса¬
сываются в желудочно-кишечном тракте, а образование метана слу¬
жит защитной реакцией для связывания водорода и углекислоты.
Процесс переваривания пищи в желудочно-кишечном тракте идет
при 39 °С. Чтобы сбраживание навоза шло с высокой скоростью, не¬
обходимо накопление соответствующей микрофлоры, в первую оче¬
редь ацетатиспользующих метановых и синтрофных бактерий. Для
сбраживания навоза необходима существенно отличная от рубцовой
микробная система, тем более для термофильного процесса. Такие
ассоциации могут быть получены методом автоселекции как в лабо¬
раторных, так и в крупных установках.В практике обычно применяют два режима метаногенеза: мезо-
фильный при 35—40 °С и термофильный при 50—55 °С. В этих преде¬
лах находятся температурные оптимумы развития большинства пред¬
ставителей основных групп мезофильных и термофильных анаэроб¬
ных бактерий, участвующих в разложении сложных органических ве¬
ществ с образованием метана в рубце жвачных, желудочно-кишечном
тракте моногастричных животных, метантенках, ил ах пресноводных
водоемов, почве.436
Для мезофильного сообщества из навоза КРС оптимальной явля¬
ется температура 36—40 °С, при этом скорость образования метана на
20—30 % выше, чем при 35 °С.Использование осадка из работающего реактора или отселекцио-
нированной ассоциации микроорганизмов в качестве засевного ма¬
териала («закваски») в количестве 10—20 % обеспечивает быстрое
развитие сообщества и стабильное течение процесса брожения.
Сброженный навоз КРС является хорошим инокулянтом для ини¬
циативы метанового брожения свиного навоза, хотя активная ассо¬
циация из него может быть получена и в результате автоселекции.
Иногда для запуска реакторов для сбраживания навоза используют
сброженный осадок из метантенков городских станций по очистке
воды.Скорость сбраживания отходов животноводства в термофильном
режиме по сравнению с мезофильным при прочих равных условиях
(одинаковый субстрат и конструкция реактора) обычно в 1,5—2 раза
выше, хотя при 39—40 °С скорость процесса может быть всего на
20—30 % ниже, чем при 50 °С. При анаэробной обработке навоза при
40 °С достигается интенсивная гибель яиц гельминтов, патогенной
микрофлоры и семян сорняков.Деградация органических веществ при метаногенезе осуществля¬
ется как многоступенчатый процесс, в котором углеродные связи по¬
степенно разрушаются под действием различных групп микроорга¬
низмов. Анаэробное превращение органического вещества в биогаз
проходит через четыре стадии:—	гидролиз сложных биополимерных молекул (белков, липидов,
полисахаридов и др.) на более простые мономеры: аминокислоты, уг¬
леводы, жирные кислоты и др.;—	ферментация (брожение) образовавшихся мономеров до еще
более простых веществ — низших кислот и спиртов, при этом образу¬
ются также углекислота и водород;—	ацетогенная стадия, на которой образуются непосредственные
предшественники метана: ацетат, водород, углекислота;—	метаногенная стадия, которая ведет к конечному продукту рас¬
щепления сложных органических веществ — метану.На рис. 8.2 представлена схема трофических связей между различ¬
ными группами микроорганизмов и их взаимной регуляции при ана¬
эробной деградации органических веществ метановым биоценозом.
Первичные анаэробы разлагают органические вещества до предшест¬
венников метана: водорода и углекислоты, ацетата, метанола, мети-
ламидов, формиата. Ввиду субстратной специфичности метаногенов
их развитие без трофической связи с бактериями предыдущих стадий
невозможно. В свою очередь, метановые бактерии, используя веще-437
Рис. 8.2. Схема действия микробного сообщества (по Г.А. Заварзину)
при получении биогаза из навоза и других органических отходовства, продуцируемые первичными анаэробами, определяют возмож¬
ность и скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Цен¬
тральным метаболитом, осуществляющим регуляторную функцию в
метанообразующем сообществе, является водород. За счет поддержа¬
ния низкого парциального давления водорода в системе становится
возможным его межвидовой перенос, меняющий метаболизм пер¬
вичных анаэробов в сторону образования непосредственных предше¬
ственников метана. Если водород из системы не удаляется, то образу¬
ются более восстановленные продукты — летучие жирные кислоты и
спирты. Метаболизм этих соединений осуществляется синтрофными
бактериями, для жизнедеятельности которых необходимо связыва¬
ние образующегося водорода метановыми бактериями.Необходимые условия для активного метанообразования приве¬
дены в табл. 8.1.Метанообразующие бактерии предъявляют к условиям своего су¬
ществования значительно более высокие требования, чем кислотооб¬
разующие — они нуждаются в абсолютно анаэробной среде и требу¬
ют более длительного времени для воспроизводства.Физические свойства биогаза (табл. 8.2 и 8.3) позволяют судить о
возможностях его использования. Объемная теплота сгорания, тем¬
пература воспламенения и предел воспламеняемости определяются в
основном содержанием СН4, поскольку незначительное количество
Н2 и H2S на этот показатель почти не оказывает влияния.438
Таблица 8.1. Условия метанообразованияПоказательОптимальные значенияПредельные значенияpH6,8-7,46,4-7,8Содержание летучих кислот50-5002000(по СН3СООН), мг/лОбщая щелочность (по1500-5001000-3000СаСОз), мг/лСостав производимого газа:65—70 % метана, 30—35 % диоксида углерода и
других газовСоли, мг/лNH4 (по N)300Na3500-5500К2500-4500Са2500-4500Температура, °С33-37Производство метана, м3/кг0,3—0,4 сухого органического веществаТаблица 8.2. Физические свойства биогазаПоказательКомпонентыСмесь 60 %
СН4 + 40 % С02СН4С02н2H2SОбъемная доля, %Объемная теплота сгора¬
ния, МДж/м3Температура воспламе¬
нения, °СПлотность, г/лнормальнаякритическаяТаблица 8.3. Соотт55-7035,8650-7500,72102>шение теш
(без у27-441,98408юты сгора
чета КПД110,85850,0931НИЯ ТОШ)322,81,543491ива разл10021,5650-7501,203201ИЧНЫХ видовВид топлива (теплота
сгорания)Биогаз (на 1 м3) с
содержанием СН4,
%При¬
родный
газ (на
1 м3)Пропан
(на
1 кг)Котель¬
ное то¬
пливо
(на
1 кг)Дизель¬
ное то¬
пливо
(на
1 л)Элек¬
тричес¬
кий
ток (на
кВт • ч)566270Биогаз с 56 %
СН4(20,0 МДж/м3)Природный газ
(33,5 МДж/м3)Котельное топли¬
во (42,3 МДж/кг)1,001,682,120,911,521,910,801,341,690,601,001,260,440,730,780,470,791,000,560,931,175,69,311,7439
Биогаз успешно применяется как топливо. Его можно сжигать в
горелках отопительных установок, водогрейных котлов, газовых
плит, использовать в холодильных установках абсорбционного типа,
в инфракрасных излучателях, в автотракторных двигателях, в газовом
цикле Отто (с искровым зажиганием) и газодизельном цикле (с впры¬
скиванием небольшой дозы запального дизельного топлива). Карбю¬
раторные двигатели легко переводятся на газ: достаточно заменить
карбюратор на смеситель.При производстве электроэнергии из биогаза в электрический
ток преобразуется всего 30 % его энергоресурса, остальная часть —
отбросная теплота. Ее можно использовать при нагревании воды для
бытовых нужд и содержания скота, отопления жилых помещений и
теплиц, подогрева воздуха для сушилок, а также при регулировании
микроклимата в животноводческих помещениях и нагреве навоза до
нужной температуры брожения в биогазовых реакторах.Выход навоза от сельскохозяйственных животных и птицы и ко¬
личество получаемого из него биогаза приведены в табл. 8.4.Таблица 8.4. Показатели выхода биогаза из навозаПоказательМолочные ко¬
ровыПтицаСвиньиВыход навоза, кг/гол/сут55,00,23,5Выход биогаза, м3/гол/сут1,620,020,32Объем биогаза, м3 на 1 т сухого вещества
навоза300600500Кроме того, метановое сбраживание навоза обеспечивает его де¬
зодорацию, дегельминтизацию, уничтожение способности семян
сорных растений к всхожести, перевод удобрительных веществ в лег¬
коусвояемую растениями минеральную форму. При этом питатель¬
ные (для растений) вещества — азот, фосфор и калий — практически
не теряются. Химический состав сброженного навоза, полученного
на биогазовой установке ВИЭСХ, приведен в табл. 8.5.При анаэробной обработке навоза фосфор и калий практически
полностью сохраняются в сброженной массе. Потери азота, которые
при других методах обработки навоза составляют до 30 %, в процессе
метаногенеза не превышают 5 %. При этом значительная часть азота,
присутствующего в свежем навозе в форме органических соедине¬
ний, в сброженном содержится в аммиачной форме, которая быстро
усваивается растениями.440
Таблица 8.5. Химический состав навоза в зависимости от длительности сбра¬
живания (% на сырое вещество)Продолжительность
сбраживания, суткиАзотРАК20С:общий Nаммонийныйn-nh40 (контроль)0320,130,110,2412,250310,130,110,2411,9100310,160,110,2410,5150310,160,110,249,6Экономическими критериями невозможно оценить тот факт, что
анаэробная переработка навоза животных находится в полном согла¬
сии со все более строгими требованиями к соблюдению принципов
охраны окружающей среды. Навоз после анаэробной обработки яв¬
ляется дезодорированным, биологически стабилизрованным, не
привлекает насекомых.После анаэробной обработки в навозе значительно уменьшается
содержание пахнущих веществ (табл. 8.6).Таблица 8.6. Содержание сильно пахнущих веществ в сброженном навозеСоединенияНативный навоз, %Сброженный навоз, %Фенол1004Крезол «П»10010Скатол10079Масляная кислота1003При анаэробной обработке наличие поливирусов снижается на98,5	%, индекс Э. коли — от 108 до 105—104 и зародышей паразитов —
на 90-100 %.Экологические требования к природоиспользованию приобрета¬
ют особое значение в условиях хозрасчета, когда требуется возмеще¬
ние использованных природных ресурсов законодательными актами.
При высоких ценах на энергию перспективной становится малоэнер¬
гоемкая анаэробная биологическая очистка с положительным выхо¬
дом энергии в виде биогаза. Анаэробную очистку навоза следует рас¬
сматривать не только как дополнительный источник энергии, но и
как энергосберегающую технологию.441
8.2.	БИОГАЗОВЫЕ УСТАНОВКИ
И ИХ ТЕХНИКО-ЭКОНОМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИГлавным звеном биогазовой установки является реактор для сбра¬
живания навоза, по типу которого составлена классификация биога-
зовых установок, предназначенных для анаэробного сбраживания
навоза различного вида и состава (рис. 8.3).Различные конструктивные и технологические решения относят¬
ся к так называемым реакторам первого поколения — традиционным
метантенкам. Эти метантенки иногда имеют две или более секций, в
которых осуществляется частичное разделение стадий анаэробного
сбраживания.Конструкции метантенков достаточно разнообразны, отличаются
главным образом гидравлическим режимом (проточные или перио¬
дического наполнения) и способами загрузки (непрерывный или пе-442
риодический). При непрерывной (проточной) схеме навоз загружают
через определенные промежутки времени (до 10 раз в сутки), удаляя
такое же количество сброженной массы. При соблюдении всех усло¬
вий сбраживания такая схема позволяет получить максимальный вы¬
ход биогаза.При периодической схеме метантенки (их обычно два) загружают
по очереди. При этом свежий навоз смешивают с остатками сброжен¬
ного навоза. Газ начинает образовываться по истечении 5—10 сут и
при достижении максимального количества постепенно снижается
до минимума. Затем сброженный навоз выгружают и метантенки
снова загружают свежим навозом.В анаэробных навозохранилищах предусматривается применение
синтетических покрытий для сбора биогаза, поддержание температу¬
ры и pH, осторожное перемешивание, рециркуляция находящегося в
них навоза. Преимуществом анаэробных навозохранилищ является
простота их устройства, а также низкая чувствительность к содержа¬
нию взвешенных веществ; недостатком — потребность в больших
площадях, а также большие потери теплоты в зимнее время.Большинство биогазовых установок имеют одноступенчатый ре¬
актор проточного типа с полным перемешиванием (68 % от всех ти¬
пов реакторов, находящихся в эксплуатации). Вместе с этим опыт
эксплуатации отечественных и зарубежных установок для анаэроб¬
ного сбраживания навоза показывает, что при использовании одно¬
ступенчатых реакторов бывают «проскоки» необработанного навоза,
что снижает их эффективность при производстве биогаза.Проточные метантенки считаются наиболее приемлемыми для
получения биогаза из жидкого или полужидкого навоза влажностью
91—96 %. Однако для анаэробной обработки навозных стоков, избы¬
точного активного ила, фугата (навозных стоков) и осадков очистных
сооружений такие реакторы неэффективны. Указанные отходы со¬
держат незначительное количество органических веществ (менее2	%), из которых образуется активная анаэробная биомасса, и в ме-
тантенках происходит постоянное ее вытеснение. Поэтому для обра¬
ботки таких стоков применяются конструкции реакторов, исполь¬
зующих принцип удержания биомассы. В таких реакторах создают
плавающие или фиксированные насадки, производят рециркуляцию
биомассы или делают реактор из нескольких секций. Реакторы с та¬
кими устройствами обычно относят к группе реакторов под названи¬
ем биофильтры. В практике сбраживания низкоконцентрированных
отходов наибольшее распространение получили биофильтры с при¬
крепленной или со взвешенно-сидиментирующей биомассой.443
В биофильтре навозные стоки обтекают поверхность загрузочно¬
го материала, покрытого биологической пленкой, образуемой мик¬
роорганизмами, которые при контакте с навозными стоками разлага¬
ют находящиеся в них органические вещества с образованием биога¬
за. Биофильтр с восходящим потоком, предложенный в 1967 г. Янгом
и Маккарти, является первым анаэробным реактором с прикреплен¬
ной биомассой. В этом сооружении сточная вода подается через дон¬
ную распределительную систему, проходит через слой загрузочного
материала и отводится из верхней части реактора. В современных
анаэробных биофильтрах в качестве загрузочного материала приме¬
няют плоскостные пластмассовые изделия, а также такие объемные
материалы, как гравий, щебень, шлак и др.Биомасса в анаэробных биофильтрах удерживается в виде флокул
и гранул, расположенных в пустотах загрузочного материала, а также
в виде биопленки, прикрепленной к его поверхности.Опыт применения подобных устройств для получения биогаза в
системах очистки навозных стоков (фугата) незначителен и не позво¬
ляет пока создать эффективные установки.Контактный реактор состоит из непрерывно загружаемого резер¬
вуара с перемешивающим устройством и наружного устройства для
отделения биомассы (отстойника). Бактерии, находящиеся в кон¬
тактном реакторе в виде флокул (хлопьев ила), поддерживаются во
взвешенном состоянии за счет перемешивания. Иловая смесь разде¬
ляется в отстойнике, удержанная биомасса возвращается в реактор,
где вновь смешивается с поступающим субстратом. В результате про¬
исходит интенсивное анаэробное разложение органических веществ
с получением биогаза.Для сбраживания подстилочного и полужидкого навоза влажно¬
стью менее 90 % наибольшее распространение получили установки с
рециркуляцией жидкой фракции сброженного навоза после его раз¬
деления.Жидкая фракция возвращается в реакторы для поддержания в них
нужного гидравлического режима, что обеспечивает возможность об¬
работки высококонцентрированного навоза, к которому относится
как подстилочный, так и полужидкий навоз.Рассмотренные биогазовые установки обеспечивают производст¬
во биогаза при сбраживании навоза с различными физико-механиче¬
скими свойствами. Подавляющая часть биогазовых установок, дейст¬
вующих в западноевропейских странах, работает в мезофильном ре¬
жиме, т. е. сбраживание осуществляется при 30—37 °С. В Японии,
Германии и Швейцарии намечается тенденция к использованию
психрофильных процессов брожения, протекающих при температу-444
pax окружающей среды (табл. 8.7). По мнению западных экспертов,
это направление как более экономичное может получить дальнейшее
развитие в ближайшей перспективе.Таблица 8.7. Характеристики биогаэовых установок европейских странСтранаФермы и количе¬
ство уел. единицПро¬дол¬жи-тель-ностьобра¬боткиТем¬
перату¬
ра ре¬
жима,
°СВыход
биогаза,
м3 су¬
тки/ус л.
гол.Объем
метан-
тенков,
м3Стои¬
мость ус¬
танов¬
киФир-ма-изго-то-вительГерманияСвиноферма
откорм 700 уел.
гол.—37—100120 000
DMВарчФинлян¬дияФерма КРС
150 гол.—362 м3—130 000 $АОАВЭФранцияФерма КРС
на 40 гол.15351 м3180250 000
франков«Био-ма-газ»Швейца¬рияФерма КРС
100 гол.—351,5—1 967 000
франков«Га¬бор»Велико¬британияСвиноферма
откорм 25 000
гол ./год10350,52 988 000
фунтов
ст.«Эк-ви-ментЛТД»ВенгрияФерма КРС
на 700 гол.—301650
м /сут180021 000 000
форинтов—Использование термофильных процессов для сбраживания наво¬
за при 50—55 °С редко встречается в практике указанных стран.Из представленных данных следует, что до сих пор нет единого
мнения о наиболее экономичном температурном режиме анаэробно¬
го сбраживания. Это же относится и к режимам работы установок,
построенных в нашей стране, в которых навоз обрабатывается при
температуре 35 °С (Истра), 40 °С (КОБОС) и 55 °С (БФ-500)
(табл. 8.8).По продолжительности обработки навоза и дозе суточной загруз¬
ки использующиеся в практике биогазовые установки значительно
отличаются (от 5 до 30 суток — время обработки и соответственно от
3,3 до 20 % — доза суточной загрузки). Удельный объем метантен-
ков в расчете на одну условную голову составляет от 2,57 м3/гол
(Венгрия) до 0,625 м3/гол (КОБОС); удельный выход биогаза от 0,5 до2,0	м /гол.445
Таблица 8.8. Технические характеристики биогазовых установок РоссииПоказателиУстановкиКОБОС-1БФ-500БГУ-25БГУ-50БГУ-100Производительность по навозу,
м3/сут35-5080248Выход биогаза, м3/сут260200204080Объем реактора, м32х 12550025502x50Продолжительность обработки, сут5-105101010Температура обработки, °С4055353535Масса комплекта, т90435711Необходимо отметить, что метаногенез требует значительных за¬
трат тепловой энергии на осуществление процесса. Чем выше темпе¬
ратура, тем выше затраты дополнительного тепла. Поэтому повыше¬
ние скорости метаногенеза за счет температурного эффекта имеет не¬
которые негативные стороны. Экономическая эффективность биога-
зовых установок зависит от конкретных условий региона и хозяйства,
где планируется их использование.В северных районах в целях экономии топлива предпочтительнее
использовать мезофильный режим, при котором увеличиваются вре¬
мя удержания и рабочий объем реакторов. Примером могут служить
конструкции биогазовых установок, разработанных фирмой «АВ
Enbom» (Финляндия), работающих в условиях Лапландии при темпе¬
ратурном режиме ферментации 33 С.В отдельных случаях с целью снижения тепловых затрат и для уве¬
личения выхода товарного биогаза процесс метаногенерации разде¬
ляют на две фазы: кислото- и метаногенную. Первую осуществляют
при 30—35 °С, вторую — при 55 °С.Показатели выхода биогаза на этих реакторах находятся в полном
соответствии с удельной нагрузкой на единицу объема реакторов и
составляют от 0,67 до 2,55 м3/сут.Установка КОБОС-1 предназначена для переработки жидкого
навоза влажностью 89—96 % в качественное, частично обеззаражен¬
ное и дезодорированное удобрение с одновременным улучшением
санитарного состояния зоны животноводческих комплексов и полу¬
чением биогаза. Применяется в составе технологических линий пере¬
работки навоза на комплексах и фермах с механическим и гидравли¬
ческим способами удаления навоза.Биофильтр БФ-500 предназначен для анаэробной очистки жид¬
кого свиного навоза после его предварительного разделения на фрак¬
ции с получением биогаза.446
Биогазовые установки БГУ-25, БГУ-50 и БГУ-100 разработаны
для фермерских хозяйств, например для свиноферм на 100, 250 и 500
голов, для санитарной обработки навоза и получения биогаза, кото¬
рый используется для приготовления кормов.Эффективность биогазовых установок изменяется в широких
пределах, поскольку она сильно зависит от природно-климатических
условий, эксплуатации, вида, состава и состояния исходных материа¬
лов для сбраживания, технологических и технических параметров ус¬
тановки и режима ее работы. Чем выше цена энергоносителя, с кото-
рым#едется сравнение (жидкое топливо), тем более эффективными
будут биогазовые установки. На основании проведенных в Германии
экономических расчетов было установлено, что можно гарантиро¬
вать экономичность биогазовых установок, если удельные первона¬
чальные капитальные вложения на 1 уел. гол. не превышают
1000—2000 немецких марок, а удельный выход полезно используемо¬
го газа не менее 0,4 м с 1 кг сухого органического вещества.По данным американских исследователей себестоимость произ¬
водства биогаза составляет для биогазовых установок, работающих в
непрерывном режиме, 0,27—0,52 долл./м3. При этом биогазовая уста¬
новка должна удовлетворять энергетические потребности производ¬
ства при температуре окружающего воздуха не ниже 2 °С. В условиях
более холодного климата необходим внешний приток энергии.С учетом эффекта от дезодорации и использования высококаче¬
ственного удобрения себестоимость производства 1 м3 биогаза сни¬
жается на 15—20 % по сравнению с затратами только на получение
биогаза.Показатели капитальных удельных вложений и ежегодных экс¬
плуатационных затрат при производстве биогаза из навоза на круп¬
ных откормочных площадках с поголовьем от 1 до 100 тыс. КРС (для
условий США) приведены в табл. 8.9.Таблица 8.9. Стоимостные показатели производства биогаза
на откормочных площадках СШАСкот на откор¬
ме, тыс. гол.Потребные капиталовложенияГодовые производственные издержкидолл ./гол.в % к 1000 гол.долл ./гол.в % к 1000 гол.137110012910022807591715170465341101313539302589242620507620211610066181915447
Из табл. 8.9 видно, что экономически наиболее целесообразно
производить биогаз на средних (от 1 до 10 тыс. гол.) и крупных (свыше
10 тыс. гол.) откормочных площадках. Данные табл. 8.9 свидетельст¬
вуют также о том, что себестоимость производства биогаза чрезвы¬
чайно высока и в отдельных случаях может быть на порядок выше,
чем себестоимость традиционного вида топлива. Э го связано с тем,
что этот показатель рассчитывается без учета других экономических
эффектов, связанных с использованием биогазовых установок. Так, в
расчетах не учтены стоимость получаемого удобрения или белко¬
во-витаминных концентратов, а также экологический эффект. Эти
составляющие могут быть весьма существенными. По данным спе¬
циалистов Непала, стоимость переработанного навоза как удобрения
в семь раз превышает стоимость биогаза, получаемого из этой же био¬
массы.Надо учитывать также и природоохранный эффект биогазовых
систем, который может быть весьма значительным. Обеззараживание
навоза в биогазовых установках (по сравнению с термическим спосо¬
бом) позволяет экономить нефтяное топливо. По расчетам специали¬
стов ВНИИПИэнергопрома, сжигание биогаза в котлах приводит к
уменьшению вредных выбросов в атмосферу.Себестоимость производства биогаза может быть значительно
снижена, если биогазовые установки будут применяться в технологи¬
ческих линиях утилизации навоза на фермах. В этом случае анаэроб¬
ное сбраживание навоза с получением биогаза может рассматривать¬
ся как альтернативный или дополнительный метод его обработки.Из изложенного выше следует, что для объективной оценки эф¬
фективности производства биогаза необходимо учитывать все пре¬
имущества, которые дает анаэробная обработка навоза.Имеющийся опыт по внедрению процесса метаногенеза в сель¬
скохозяйственную практику показывает, что первое место пока зани¬
мает его экологический аспект, затем следует эффект от получения
высококачественных удобрений и только третье место занимает не¬
дооцениваемая или изолированно оцениваемая энергетическая со¬
ставляющая процесса.Однако при отсутствии или недостатке других источников энер¬
гии, особенно для бытовых целей, биогаз будет приобретать все боль¬
шее значение как возобновляемый источник энергии.Многие хозяйственники считают, что главным назначением био¬
газовых установок является получение биогаза, служащего дополни¬
тельным источником местного энергоснабжения. При этом они учи¬
тывают и то обстоятельство, что биогазовые установки являются до¬
полнительным оборудованием для переработки навоза и навозных448
стоков, а поэтому затраты на их создание и эксплуатацию должны
быть отнесены к оборудованию, необходимому для обеззараживания
навоза и производства удобрений и к системе мер по защите окру¬
жающей среды. В этом случае биогазовые установки всегда будут
иметь положительный экономический эффект.Для оЦенки экономической эффективности этих установок раз¬
работана специальная методика, основанная на сравнении альтерна¬
тивных вариантов утилизации навоза — с применением биогазовых
установок или без них.Критерием оценки эффективности в сфере эксплуатации биога¬
зовых установок является годовой экономический эффект:Э = (Яуст - Щ)Рп& + ЕЭФ + Э6 + Эуа,	(8.1)где (Яуст — Яб) — удельные приведенные затраты новой и базовой
технологической линии; Рта — годовой объем работ; ХЭф — эффект
от ликвидации ущерба, причиненного техногенными загрязнениями;
Эб — эффект от получения топлива; Эуд — эффект от использования
высококачественного удобрения.Удельные приведенные затраты по новой и базовой технологиям
определяются по формулам:Яуст = + ЕцКв,	(8.2)Яб = Q, + Д,АГ„,	(8.3)где Сб и Сн — себестоимость единицы продукции по сравниваемым
вариантам, руб/т; К§, К^ — удельные капитальные вложения сравни¬
ваемых вариантов в расчете на единицу продукции, руб/т; Ен — нор¬
мативный коэффициент эффективности капитальных вложений,
равный 0,15.Эффект от предотвращения ущерба от загрязнения воздуха ам¬
миаком, выделяющимся при хранении навоза:Эвг = УвОк/в'ИмнзЛ, (руб/год),	(8.4)где mNH3 — масса выброса NH3 в атмосферу за девять месяцев хране¬
ния навоза_ _ -^NPKЛедопад9.	(8.5)»>«■>	П	’<тк — показатель относительной опасности загрязнения атмосферно¬
го воздуха (ок = 10);УЙ — коэффициент, учитывающий характер рас¬
сеивания примесей в атмосфере (fB = 1,0); Кпал — коэффициент потерь
аммиачного азота во время хранения (Кпля = 0,1); ЛЫРК — количество
аммиачного азота, теряемого за время хранения 1 т наитивного навоза
C^npk = 2,8 кг/т).29-4266449
Эффект от предотвращения загрязнения прилегающих водоемов
получают за счет того, что в сброженном навозе содержание БПК5 со¬
ставляет 1,458 кг/м3, в несброженном — 15,9 кг/м . В грунтовые воды
вымывается 'Д внесенных загрязнений (для песчаных почв).Исходя из этого, приведенная масса годового сброса загрязнений
в прилегающие водоемы составляет:М — ЪАр{тъпк — л*Бпк,сбр)Лх>дУ4»	(8.6)где Ар — показатель агрессивности уел. т/т, (Ар = 0,33); т — содер¬
жание БПК, кг/м3.Эффект от предотвращения загрязнения прилегающих водоемов
при использовании биоэнергетических установок составляет:Э	= УвСвМ,	(8.7)где ув — условный множитель руб/т (ув = 400); ов — показатель опас¬
ности загрязнений водоема (ав = 0,5).Эффект от получения товарного биогаза подсчитываем по стои¬
мости замещенного биогазом мазута, сжигавшегося в котельной,3> = VtT6CJTm,	(8.8)где VT — общий выход товарного биогаза, м3/год; Т6 — теплотворная
способность биогаза, 5360 кКал/м3; Тм — теплотворная способность
мазута, равная 8200 ккал/т; См — стоимость 1 т мазута, руб.Эффект от дополнительной прибавки урожая за счет предотвра¬
щения потерь NPK при девятимесячном хранении несброженного
навоза рассчитывают по формуле■^NPK = (/Ty^rrp)^NPK Дз.ея^годкд/100,	(8.9)где Яу — прибавка урожая от 1 кг NPK, равная 11, из расчета на мно¬
голетние травы, сено; АГпр — коэффициент пересчета в зерновые еди¬
ницы; /4ЫРК — количество аммиачного азота, теряемого во время
хранения 1 т навоза, равное 2,3 кг; Цз ел — стоимость зерновой едини¬
цы; Ргоа — годовой объем работ; ка — коэффициент сохранности
NPK, равный 0,1.8.3.	БИОИНЖЕНЕРНЫЕ РАСЧЕТЫ ПАРАМЕТРОВ
БИОГАЗОВЫХ УСТАНОВОКОт совокупности основных проектных и эксплуатационных пока¬
зателей биогазовых установок существенно зависят капитальные и
эксплуатационные затраты на производство биогаза.450
Решения задач по определению показателей технологического
регламента обработки навоза и конструктивных параметров биогазо¬
вых установок основано на методе, сущность которого сводится к
следующему,Практически все современные биогазовые установки основаны
на использовании подогреваемых реакторов, т. е. для осуществле¬
ния процесса метаногенеза необходимо постоянно расходовать
энергию (тепловую, электрическую или любой другой ее вид, в том
числе и возобновляемую).Эффективное производство биогаза возможно лишь в случае, ко¬
гда суммарная энергия полученного биогаза будет значительно пре¬
вышать расходы энергии на его производство, т. е. должно выпол¬
няться условие получения товарного биогаза, которое в общем виде
может быть представлено каку — у _ бсн	(8.10)VT VT	Г 9где VT — количество товарного биогаза, м3; Vr — общее количество
полученного биогаза, м3; QCH — расход энергии на собственные нуж¬
ды установки, кДж; X — теплотворная способность биогаза, кДж/м3.На рис. 8.4 показаны дифференциальные суточные расходы энер¬
гии dQ/dx и энергии получаемого биогаза dVr/dx в зависимости от
Уг, л/сут	е, кДж30252015105:'Й?::Тепло- и энергопотери14 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 т, суг|Рис. 8.4. Зависимости энергии биогаза и ее расходов на собственные
нужды от времени обработки451
времени обработки навоза в метантенке при циклическом режиме его
работы.По мере получения биогаза его количество при х = xmjn достигает
величины, которой достаточно для полной компенсации расходов те¬
плоты на нагрев навоза и всех других тепло- и энергопотерь
(VTX= Оси)- Далее идет накопление товарного биогаза, поскольку
дифференциальное значение энергии получаемого биогаза d VrX/dx
на участке х > xmi„ значительно больше текущего значения расходов
энергии на компенсацию последующих тепло- и энергопотерь
(AQJdx). При достижении равенства значений dKrX./dx = d^/dx про¬
цесс анаэробного сбраживания навоза следует прекратить, так как
при дальнейшем удержании навоза в метантенке энергия теплопо-
терь не будет компенсирована энергией полученного биогаза. При
этом проекция точки пересечения зависимостей УГХ =_Дх) и QK = Дх)
на ось абсцисс указывает на значение х, при котором прекращается
накопление товарного биогаза.Аналитическое решение задачи получения товарного биогаза [см.
уравнение (8.10)] сводится к установлению зависимостей выхода
биогаза VT=fix) и расхода энергии на процесс его производст¬
ва — Оси =Ах) с последующим определением по ним оптимального
времени сбраживания навоза в метантенке х0Пт.Для определения зависимости Уг =Дт)в практике исследований
и проектирования установок анаэробного сбраживания различных
видов жидких отходов обычно пользуются эмпирическими моделями
процессов, основанных на уравнениях микробной кинетики и теории
хемостата.Функциональная зависимость VT =Дх) может быть рассчитана,
если известны численные значения кинетических констант и пара¬
метров роста и отмирания биомассы. К настоящему времени значе¬
ния этих констант известны только для ряда отдельных субстратов,
таких как глюкоза, уксусная кислота, пропионовая и масляная кисло¬
ты и др. При этом определение констант и их использование приме¬
нительно к сбраживанию навоза должно быть связано с предвари¬
тельным определением химического состава навоза или навозных
стоков и содержанием в нем указанных субстратов.Применительно к процессам обработки навоза и навозных стоков
в анаэробных реакторах аналогичных данных пока еще нет. Поэтому
нами предложено зависимость VT =Дх) определять эксперимен¬
тально, на лабораторной или пилотной установке для навоза, вид и452
химический состав которого зависит от конкретных условий каждой
животноводческой фермы.Опыты по определению удельного выхода биогаза при сбражива¬
нии навоза и математическая обработка их результатов показали, что
зависимости dKr/dx =Дх) соответствует эмпирическое уравнениеdVT х	/ з, ч	(8.11)-г-= , .	К„(м/сут),	vd t ах +tn+cгде а, b, с — эмпирические коэффициенты, численное значение ко¬
торых определяется по результатам обработки опытных данных;
VH — объем сбраживаемого навоза, м3.Для определения QCH — fix) составлена расчетнаясхема теплового
баланса биогазовой установки, из которой следует, что расход энер¬
гии на собственные нужды может быть представлен какОси = Он + (?пх (кДж),	(8.12)где Q„ — расход энергии на предварительный нагрев навоза до темпе¬
ратуры брожения; Qn — суточный расход энергии на компенсацию
всех тепло- и энергопотерь.Расход энергии на предварительный нагрев навоза определяетсякакQH =	) (кДж),	*8, 1где Сн —теплоемкость навоза, кДжДкг • К); рн — плотность навоза,
кг/м3; Тн — конечная температура нагрева навоза, К; Т1 — исходная
температура навоза, К; г\ — КПД установки для нагрева навоза.Количество теплоты, необходимое для компенсации теплопотерь
через ограждающие поверхности метантенка в сутки,№0w^№),	(8.14)Лгде к — коэффициент теплопередачи, кДж/м2Кч; F— площадь огра¬
ждающих поверхностей метантенка, м2; Тъ — температура наружного
воздуха, К; Тн — температура навоза в метантенке, К.Теплопотери, связанные с выделением биологического газа, оп¬
ределяются по формуле<2в = КСуТ'/ц (кДж),	(8.15)453
где Vr — суточный объем выделившегося биологического газа, м3/сут;
Ср— объемная теплоемкость биологического газа, кДж/(м3 • град);
Тт — температура биологического газа на выходе из метантенка, К.Затраты энергии на привод перемешивающих устройств и вспо¬
могательного оборудованияQ» = Nu К„/( WHлт) (кДж),	(8.16)где NM — потребная мощность насосов или перемешивающих уст¬
ройств; WH — производительность насосов, м3/ч; m — коэффициент
пересчета кВт • ч в кДж.Затраты энергии с удаляемой биомассой энергией, расходуемой
на нагрев навоза QH, при сбраживании навоза в циклическом режиме
равны нулю, так как удаления не происходит.На основе вышеприведенных зависимостей составлено уравне¬
ние, решение которого позволяет определить продолжительность об¬
работки навоза в метантенке, соответствующее максимальному полу¬
чению товарного биогаза:—	Мн(\-у)Х = кПТъ-Ти)24/л + NmVJ(WHr\m). (8.17)ОХ +0Т +сПри этом х должно быть больше Tmj„, в течение которого накапли¬
вается биогаз, необходимый для компенсации всех тепло- и энерго¬
потерь:minJ —гЛ	Л/н (1-уЯ = Л/нС„р„( Т2 - Т\)/г\ + [кЦ Ть - (8.18)J0 ах+Ьх+с- Г„)24/л + NMVJWH\\m\xmin .Полученные уравнения отражают взаимосвязь между характери¬
стиками навоза, технологическими режимами его сбраживания при
различной температуре окружающей среды и параметрами биогазо-
вой установки. Эти уравнения являются основными и могут быть ис¬
пользованы для проектирования и расчета биогазовых установок с
положительным энергетическим балансом и способных обеспечить
получение товарного биогаза.В качестве исходных данных для расчета биогазовых установок
принимаются характеристики выхода биогаза, которые определяют¬
ся экспериментально применительно к условиям фермы, на которой
планируется построить биогазовую установку.Доза суточной загрузки метантенка принимается в зависимости
от суточной производительности животноводческой фермы по наво¬
зу и требований СНиП.454
Коэффициент теплопередачи ограждающих поверхностей метатен-
ка в окружающую среду принимается в зависимости от ввда и толщины
теплоизоляции, обычно для метатенков к = 0,3 — 0,5 Вт • м2 • К.Температура навоза в метатенке — Ти = 37 ± 1°С и Тн = 55 ± 1°С
соответственно для мезофильного и термофильного режимов.Температура окружающей среды принимается в зависимости от
климатического района Гв = — 9,8; + 4,8; + 7,2; + 16,3 °С соответст¬
венно для I, II, III и IV природно-климатических зон России.На основе приведенных данных по формуле (8.17) определяется
значение главного параметра — продолжительность обработки наво¬
за в метатенках, а затем по формулам (8.10) — (8.18) — потребный
объем метатенка, его производительность, общий выход биогаза, рас¬
ход его на собственные нужды и количество товарного биогаза, кото¬
рое может быть использовано для технологических нужд животно¬
водческой фермы.Мировой опыт биоконверсии навоза в биогазИнтерес к использованию биомассы в качестве источника энер¬
гии вызван тем, что биомасса постоянно возобновляется; энергия, за¬
пасенная в биогазе, может храниться и использоваться в течение дли¬
тельного времени и конвертироваться в различные виды топлива; в
ряде регионов биотопливо является экономически более выгодным
или основным видом энергии; биогаз является источником экологи¬
чески чистой энергии, при его использовании не образуются вредные
газообразные оксиды серы, не меняется баланс углекислого газа в
биосфере.Себестоимость производства биогаза может быть значительно
снижена, если биогазовые установки будут применяться в технологи¬
ческих линиях утилизации навоза на фермах. В этом случае анаэроб¬
ное сбраживание навоза с получением биогаза может рассматривать¬
ся как альтернативный или дополнительный метод обработки.В США придают большое значение производству биогаза из наво¬
за: во-первых, в энергетическом аспекте, во-вторых, в связи с тем, что
из всего объема ежегодно образующегося на животноводческих фер¬
мах навоза, экономически приемлемого для переработки в биогаз,
примерно половина приходится на интенсивные производственные
системы (крупные откормочные комплексы и площадки КРС, про¬
мышленные свиноводческие и птицеводческие комплексы).В животноводстве Германии ежегодный выход навоза составляет
в настоящее время 200 млн т, в том числе 70 млн т в жидком виде. Не¬
обходимость в утилизации всего объема навоза в условиях ограничен¬455
ных сельскохозяйственных площадей и повышенных требований к
охране окружающей среды ставит перед специалистами и фермед^
скими хозяйствами задачу по разработке метода полного обеззаражи¬
вания навоза и приготовления из него высококачественного органи¬
ческого удобрения. В последние годы в стране возобновились интен¬
сивные разработки метода анаэробного метанового сбраживания
жидкого навоза. По подсчету западногерманских специалистов, при
анаэробной переработке такого объема навоза в биогаз можно полу¬
чать энергию, равную 4 % общенациональной потребности.В Великобритании доля биогаза потенциально составляет до
3,2 % от общего количества потребляемого в стране природного газа.
Переработка навоза от всего поголовья КРС, свиней и птицы позво¬
лит получать ежегодно количество газа, эквивалентное 2,3 млн т
нефти.В сельском хозяйстве Японии ежегодно образуется 56,5 млн т на¬
возных стоков. С переходом на интенсивное производство животно¬
водческой продукции при современном уровне технологии специали¬
сты считают экономически целесообразным перерабатывать всю на¬
возную массу для получения биогаза в объеме 1,7 млрд м3 или 1 млн т
нефти.Россия располагает значительными потенциальными возможно¬
стями производства биогаза из навоза сельскохозяйственных живот¬
ных.Ежегодно на животноводческих фермах страны образуется
665 млн т навоза, из каждой тонны которого после обработки в биога¬
зовых установках можно получать от 10 до 20 м3 биогаза с теплотвор¬
ной способностью 5600—6300 ккал/м .Объемы различных видов навоза и навозных стоков на фермах
России, которые могут быть использованы для производства биогаза,
составляют 408,5 млн т в год с общим содержанием сухих веществ
34,6 млн т, энергетический потенциал этого навоза — 6025 млн м3
биогаза в год, а его использование для технологических нужд ферм
обеспечит экономию 4,340 млн т жидкого условного топлива.Контрольные вопросы к главе 81.	Что такое биогаз и как он образуется?2.	Расскажите о процессах деградации навоза и других органических отходов
при их конверсии в биогаз.3.	Перечислите основные требования к субстрату и условия образования
биогаза.4.	Назовите основные физические свойства биогаза и возможности его ис¬
пользования на производственные и бытовые нужды.456
5.	Какое количество биогаза получается при анаэробной переработке навоза?6.	Чем отличается сброженный навоз от нативного?7.	Назовите основные типы биогазовых установок и их назначение.8.	Как определить расход теплоты на собственные нужды биогазовой уста¬
новки?9.*Как	рассчитать параметры биогазовой установки?10.	Какие основные факторы необходимо учитывать при расчете эффектив¬
ности биогазовых установок?11.	Дайте оценку физических свойств биогаза в сравнении с другими вида¬
ми энергоносителей.12.	Перспективы использования биогаза в экономике страны.ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ1.	Устройство и принцип действия биогазовых установок на макетных и
опытно-промышленных образцах.2.	Методика проектирования и строительства биогазовых установок для
обработки навоза и получения биогаза на животноводческих фермах.ЛИТЕРАТУРААлексеев В.В., Синюгин О.А. Технико-экономическая оценка традицион¬
ной, атомной и альтернативной энергетики//Российский химический жур¬
нал. Т. 41. № 6.- М., 1997.Ковалев А.А., Ножевникова А.Н. Технологические линии утилизации от¬
ходов животноводства в биогаз и удобрения.— М., 1990.Ковалев АЛ. Энергетические аспекты использования биомассы на жи¬
вотноводческих фермах России//Российский химический журнал. Т. 41.
1997. №6. С. 100-105.Ковалев А. А. Эффективность производства биогаза на животноводческих
фермах//Техника в сельском хозяйстве. 2001. № 3. С. 30—33.Ковалев А.А. Производство газообразного топлива из отходов животно-
водства//Энергетическая политика. 2004. № 1.Ковалев А.А., Чернышев А.А. Биогазовая установка нового поколения для
анаэробной обработки навоза. Материалы Ш-й международной научно-тех-
нической конференции «Аграрная энергетика в XXI столетии». Минск, 2005.Ковалев А.А., Мартынов Е.В. Пилотная биогазовая установка для обра¬
ботки помета и результаты испытаний/Дехника в сельском хозяйстве. 2006.
№ 4.Стребков Д.С., Ковалев А.А. Биогазовые установки и опыт их применения
в АПК//Техника и оборудование для села. 2006. № 9.Ковалев Д.А. Анаэробная обработка отходов животноводства//Сельский
механизатор. 2007. № 3.
Глава 9БИОЭНЕРГЕТИКА В СЕЛЕКЦИИ, РАСТЕНИЕВОДСТВЕ
И БИОТЕХНОЛОГИЯХ9.1.	БИОТЕХНОЛОГИИ, ИНФОРМАЦИЯ И САМООРГАНИЗАЦИЯПРИРОДЫБиотехнологии являются информационными технологиями.
В большинстве случаев современные биотехнологии — это преобра¬
зования (операции), проводимые с генетической информацией орга¬
низмов, являющихся самоорганизующимися живыми системами. Ин¬
форматика и самоорганизация — относительно новые отрасли зна¬
ний. Их пока изучают не во всех учебных заведениях, выпускники ко¬
торых работают по биотехнологиям. Рассмотрим кратко самые важные
для биотехнологов сведения по информации и самоорганизации.Система жизнеобеспечения организмов состоит из трех основных
подсистем: обмена веществ, энергообмена и информационных или
управляющих процессов. Аналитическое выделение этих, физически
неразделимых подсистем, позволяет выявить их соподчиненность и
характерные особенности. Подсистема обмена веществ в сообщест¬
вах организмов, экосистемах частично или полностью замкнута. Она
принципиально не ограничивает развитие организмов.В популяциях, способных к размножению, генетическая инфор¬
мация при благоприятных условиях может неограниченно долго цир¬
кулировать, переходя от поколения к поколению. В анабиозном со¬
стоянии генетическая информация может сохраняться очень долго.
Подсистема информационных или управляющих процессов также
принципиально не ограничивает развитие организмов.Энергия, использованная организмом, большей частью рассеива¬
ется, деградирует и повторно не может использоваться подобными
организмами. Подсистема энергообмена разомкнута, однонаправле-
на. Свободная энергия, доступная для организмов, принципиально
ограничивает их развитие. Биотехнологу важно знать, что подсисте¬
мы информационная и обмена веществ подчинены подсистеме энер¬
гообмена организма. Эволюционное развитие информационной458
подсистемы и подсистемы обмена веществ направлены в основном
на совершенствование подсистемы энергообмена.Величины (понятия) количества информации, традиционно ис¬
пользуемой в современной «теории информации», являющейся по
существу теорией связи, недостаточно для характеристики биологи¬
ческой (генетической) информации. Наряду с количеством инфор¬
мации для применения биологической информации особо важно
оценивать ее ценность (качество). Этот показатель информации оп¬
ределяют посредством представления о достижении определенной
цели. Информация ценна в той мере, в какой она приближает к дос¬
тижению желаемой (требуемой) цели. В связи с отмеченной выше со-
подчиненностью информационной подсистемы подсистеме энерго¬
обмена качество биологической информации в общем случае количе¬
ственно целесообразно оценивать посредством учета изменения
энергетической эффективности биологического объекта, которым
получена определенная информация. Следует отметить, что ценность
информации зависит от цели, которую преследует ее получатель (ре¬
цептор).Ранее прилагательные «ценная» и «осмысленная» применительно
к информации использовались без соответствующих определений в
расчете на то, что они понятны интуитивно. Понятие ценность ин¬
формации является весьма важным, центральным как в биотехноло¬
гии, так и в развиваемой современной теории информации. Ценность
информации определяется мерой приближения к достижению цели
при использовании полученной информации. Если преследуемая
цель надежно достижима несколькими путями, то ценность инфор¬
мации можно определять уменьшением материальных, энергетиче¬
ских или временных затрат благодаря использованию данной инфор¬
мации.В случае если достижение цели вероятно, но не обязательно, мож¬
но использовать следующий критерий ценности информации:У=\оё2(Р/р),	(9.1)где р — вероятность достижения цели до получения информации;
Р — тоже, после получения информации (Д.С. Чернавский, 2004).В соответствии с уравнением (9.1), ценность информации зависит
от величины р, т. е. от того, какой предварительной априорной ин¬
формацией уже располагает рецептор. Если она отсутствует, то апри¬
орная вероятность во всех возможных вариантах (я) одинакова и рав¬
на р = 1/я. В этом случае величинар выполняет роль нормировочного
множителя. Если после получения информации в этом случае цель
достигается наверняка (Р= 1), то ценность этой информации макси¬459
мальна и равна V= Kna* = log2«, при этом ценность информации сов¬
падает с максимальным количеством информации, традиционно оп¬
ределяемой в теории связи, и при этом ценность информации можно
понимать как количество ценной информации.В традиционной теории информации (теории связи) величина
энтропии, отображающая второе начало, получила необоснованное
распространение под названием «информационная энтропия». На
основе положений самоорганизации выявлена ошибочность термо¬
динамической трактовки понятия (определения) информации по¬
средством этого термина. Ошибочным также является использование
термина «негэнтропия» и утверждение о том, что «информация есть
негэнтропия».Из большого количества понятий (определений) информации,
используемых различными авторами, наиболее совершенным, исхо¬
дя из положений самоорганизации, принято определение информа¬
ции, предложенное Г. Кастлером (Чернавский, 2004). Это определе¬
ние следующее: информация есть случайный и запомненный выбор
одного варианта из нескольких возможных и равноправных. Такое
определение информации не имеет никакого отношения к понятиям
«информационная энтропия» и «негэнтропия».Наиболее важным достижением фундаментальной науки в по¬
следние десятилетия является развитие ее новой отрасли — самоор¬
ганизации (синергетика, неравновесная термодинамика, динамика
сложных нелинейных систем). Исходя из самоорганизации, наряду с
традиционным делением природы на живую и неживую, не менее
важно делить ее на самоорганизующуюся (неравновесную) и несамо-
организующуюся (равновесную). Самоорганизующиеся физико-хи-
мические системы по своим важным свойствам, например энерго¬
преобразующим, более близки к живым, чем к равновесным физи¬
ко-химическим. Главным принципом этой новой отрасли науки яв¬
ляется принцип энергетической экстремальности самоорганизации
и прогрессивной эволюции. Этот принцип состоит из второго начала
термодинамики и противоположного ему по сущности закона выжи¬
вания. Второе начало приложимо только к равновесным (несамоор-
ганизующимся) системам, а закон выживания — к самоорганизую¬
щимся (неравновесным).Принцип энергетической экстремальности самоорганизации,
представляющий диалектическое единство противоположной сущ¬
ности двух названных законов, позволил решить столетние проблемы
равновесной термодинамики, в том числе проблему «вопиющего»
противоречия между эволюцией природы по второму началу термо¬
динамики и теорий биологической эволюции (дарвиновской, синте¬460
тической). В самоорганизации выявлен и второй важный прин¬
цип — принцип подчинения синергетики. Сущность его в том, что из
большого числа переменных, характеризующих систему, выбирают
одну наиболее быстро изменяющуюся переменную (от которой в
наибольшей мере зависит состояние системы), называемую перемен¬
ной порядка. Затем определяют несколько (2—3) параметров управ¬
ления и при помощи их и переменной порядка определяют состояние
системы и управляют ею.Самоорганизующиеся живые организмы избирательно потребля¬
ют из среды доступную свободную энергию, накапливают ее и ис¬
пользуют на свои жизненные процессы. Самоорганизующиеся систе¬
мы (структуры) называют еще «диссипативными», так как они живут
за счет рассеяния, диссипации энергии. Все этапы эволюционного
развития самоорганизующейся природы (физико-химический, био¬
логический, социальный) имеют, в соответствии с принципом энер¬
гетической экстремальности самоорганизации, общую энергоэко¬
номную (высоко энергоэффективную) направленность живых сис¬
тем. Важным принципом биологической информации является мак¬
симум полезной (ценной) информации в минимуме массы и объема,
а также минимум затрат энергии на сохранение и функционирова¬
ние. Этот принцип позволяет биотехнологу составить представление
о том, в каком направлении будет эволюционировать созданный им
объект на основе генной инженерии.9.2.	БИОЭНЕРГЕТИКА НА МОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕБиоэнергетика изучает механизмы и законы преобразования
энергии в процессах жизнедеятельности организмов. Слово «био¬
энергетика» впервые использовал для названия своей книги амери¬
канский биохимик (венгерского происхождения) А. Сент-Дьерди в
1956 г. Официально название «биоэнергетика» за этим разделом зна¬
ний было закреплено на симпозиуме биохимиков в Италии в 1967 г.
Началом исследований в биоэнергетике являются работы немецкого
врача Ю.Р. Майера (1841 г.), который открыл закон единства сохра¬
нения и превращения энергии в живой и неживой природе. Вначале
энергообмен живой природы изучали на орган измен ном и надорга-
низменном уровнях. С развитием биохимии биоэнергетику начали
развивать на молекулярном уровне.Живые организмы отличаются большой метаболической гибко¬
стью и энергоэкономностью в соответствии с принципом энергети¬
ческой экстремальности самоорганизации и прогрессивной эволю¬
ции. В известных пределах они могут изменять свой метаболизм в за¬461
висимости от того, какие питательные вещества (или иной вид дос¬
тупной свободной энергии) имеются в окружающей среде.
Например, бактерия Е. coli, являющаяся хемоорганотрофом, может
использовать в качестве единственного источника углерода не только
глюкозу, но и другие сахара, глицерин, аминокислоты и даже такие
простые соединения, как этиловый спирт и уксусная кислота.Любое проявление жизни связано с затратами энергии. Организ¬
мы и их составляющие — самоорганизующиеся диссипативные сис¬
темы, живущие за счет потребления из окружающей среды свободной
энергии. Основные биоэнергетические процессы — фотосинтез (хе¬
мосинтез), дыхание, брожение — не случайно консервативны в эво¬
люционном отношении. Возникнув у самых древних организмов,
они в неизменном виде сохранились в современных (в высших расте¬
ниях, организме человека). Это свидетельствует об их безальтерна-
тивности и фундаментальности, а также ведущей роли энергообмена
в жизнеобеспечении организмов. Принято считать, что к превраще¬
ниям энергии в организме применимы законы термодинамики, фи¬
зики и химии.Однако самоорганизующаяся сложность и специфичность биоло¬
гических структур, а также протекающих в них самоорганизующихся
процессов обусловливают ряд глубоких различий между биоэнерге¬
тикой и энергетикой не самоорганизующейся природы, в частности,
технической энергетикой. Фундаментальная особенность биоэнерге¬
тики состоит в том, что организмы являются открытыми самооргани¬
зующимися системами. Они функционируют только в условиях по¬
стоянного обмена веществом и энергией с окружающей средой. Пре¬
образование энергии в таких системах принципиально отличается от
преобразований ее в тепловых машинах. Основополагающее для рав¬
новесной термодинамики понятие о равновесном состоянии заменя¬
ется в биологии представлением неравновесной термодинамики о
стационарном состоянии. Второе начало термодинамики (принцип
возрастания энтропии) заменяется на противоположный ему по сущ¬
ности закон выживания или принцип минимизации удельного про¬
изводства внутренней энтропии Пригожина, в соответствии с кото¬
рым энтропия в самоорганизующейся системе не возрастает, а умень¬
шается.Вторая важнейшая особенность биоэнергетики связана с тем, что
процессы преобразований энергии происходят при отсутствии пере¬
падов температуры, изменений давления и объема. Из-за этого пере¬
ход теплоты в работу в организме невозможен. В процессе эволюции
организмы выработали специфические механизмы прямого преобра¬
зования одного вида свободной энергии в другой, минуя ее переход в462
теплоту. В организме лишь небольшая часть освобождающейся энер¬
гии превращается в теплоту и теряется. Большая ее часть преобразу¬
ется в форму свободной химической энергии особых соединений, в
которых она чрезвычайно мобильна. Она может при постоянной тем¬
пературе; превращаться в иные формы, в частности, совершать работу
или использоваться для биосинтеза, чем обеспечивается высокая эф¬
фективность биоэнергетических процессов. Например, КПД работы
мышц достигает 30 %. Биоэнергетические процессы на молекуляр¬
ном уровне протекают одновременно с биохимическими процессами
метаболизма.Обмен веществ состоит из двух процессов: катаболизма и анабо¬
лизма (В.П. Скулачев, 1989). При катаболизме происходит фермен¬
тативное расщепление сравнительно крупных молекул пищи — угле¬
водов, жиров, белков, происходящее преимущественно за счет реак¬
ций окисления. При этом образуются более мелкие молекулы, напри¬
мер молочной кислоты, СОг, уксусной кислоты, аммиака или
мочевины. Катаболизм сопровождается выделением свободной
энергии из сложных структур крупных пищевых молекул и запасается
в более доступной форме в виде фосфатных связей в аденозинтри-
фосфатах (АТФ). Катаболические процессы являются экзергониче-
скими. Они идут с уменьшением свободной энергии. Анаболические
процессы — эндергонические — протекают с увеличением свобод¬
ной энергии.Анаболизм представляет собой ферментативный синтез сравни¬
тельно крупных молекул клеточных компонентов (например, поли¬
сахаридов, нуклеиновых кислот, белков или жиров) из простых со¬
ставляющих. Усложнение структур и увеличение размеров молекул
при синтезе сопровождается затратами свободной энергии, запасен¬
ной в фосфатных связях АТФ. В клетках катаболизм и анаболизм
протекают одновременно. В результате последовательных фермента¬
тивных реакций, при которых происходит соответственно разруше¬
ние (катаболизм) или синтез (анаболизм) ковалентного остова дан¬
ной биомолекулы, образуются промежуточные продукты. Их называ¬
ют метаболитами, а всю цепь превращений объединяют названием
промежуточный метаболизм. Каждая из ферментативных реакций
промежуточного метаболизма сопровождается соответствующим
превращением энергии. На некоторых этапах катаболизма химиче¬
ская энергия метаболитов запасается (в форме фосфатных связей), а
на определенных этапах анаболизма она расходуется. Эту особен¬
ность метаболизма принято называть сопряжением энергии. Проме¬
жуточный метаболизм и сопряжение энергии — взаимосвязанные и
взаимозависимые понятия. Поэтому при изучении метаболизма не¬463
обходимо анализировать как реакции, в результате которых изменя-
ются ковалентные структуры предшественников и образуется про¬
дукт, так и энергетические изменения, сопровождающие эти превра¬
щения.АТФ называют «разменной энергетической монетой». Она —
важнейшее вещество, играющее для всего живого мира роль почти
единственного трансформатора и передатчика энергии. АТФ может
расщепляться до аденозиндифосфорной кислоты (АДФ) или до аде-
нозининмонофосфорной кислоты (АМФ). Отщепление от АТФ ко¬
нечной фосфатной группы (гидролиз) протекает по формуле
АТФ + Н2О -»АДФ + фосфат. Эта реакция сопровождается выделе¬
нием свободной энергии ДF. Если эта реакция протекает при концен¬
трации всех реагентов и продуктов в 1,0 моль при 25 °С и pH 7,0, то
свободная энергия АДФ оказывается меньше свободной энергии
АТФ на 7 ккал/моль. В клетке это изменение свободной энергии
больше — 12 ккал/моль.Значения AFв клетке для реакции АТФ -»АДФ выше, очевидно
не случайно, чем у большинства реакций гидролиза. Это различие
очевидно обусловлено энергоэффективным синергизмом процессов
клетки в соответствии с принципом энергетической экстремальности
самоорганизации и прогрессивной эволюции. Связи третьей (конеч¬
ной) и второй фосфатных групп в молекуле АТФ называют макроэр-
гическими.Под энергией этих связей в биоэнергетике понимают не действи¬
тельную энергию ковалентных связей между атомами фосфора и ки¬
слорода (или азота), как это принято в физической химии, а лишь
разность между свободной энергией (AF) исходных реагентов реак¬
ций гидролиза АТФ или других аналогичных реакций и конечных
продуктов этих реакций. «Энергия связи», в точном понимании этого
термина, не локализована в данной связи, а характеризует реакцию в
целом как самоорганизующийся процесс. Энергия макроэргических
связей АТФ — универсальная форма запасания свободной энергии
для всей живой самоорганизующейся природы: от микроорганизмов
до человека. Все преобразования энергии в процессах жизнедеятель¬
ности происходят посредством аккумуляции энергии в этих связях, а
ее использование — при их разрыве. Порции энергии макроэргиче¬
ских связей обеспечивают высокую биоэнергетическую эффектив¬
ность живой самоорганизующейся природы, тождественно этой роли
кванта действии, открытого более ста лет назад М. Планком, в кван¬
товой физике. Макроэргическую связь Д/1 можно назвать биологиче¬
ским квантом действия.464
9.3. БИОТЕХНОЛОГИИ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМАНачало 70-х годов XX столетия ознаменовалось выявлением ми¬
рового энергетического кризиса. За период с 1972 по 1982 гг. мировые
цены на нефть и нефтепродукты возросли в 10 раз. Этот рост продол¬
жается и в настоящее время (И.И. Свентицкий, 1982, 2001). Практи¬
ческая причина этого — приближение исчерпаемости невозобнов¬
ляемых горючих ископаемых — основного первичного источника
промышленной энергетики и транспорта. Теоретически эту причину
позволяет объяснить принцип энергетической экстремальности са¬
моорганизации. В РФ принята долгосрочная (до 2010 г.) федеральная
программа «Энергоэффективная экономика», которой предусмотре¬
но повышение эффективности использования энергоресурсов во
всех министерствах и ведомствах. Приоритетным мировым направ¬
лением научных исследований стало выявление возобновляемых аль¬
тернативных источников энергии и высокоэффективное использова¬
ние энергетических ресурсов (энергосбережение).В чем естественнонаучная причина энергетической проблемы?
Новейшие положения самоорганизации (неравновесной термодина¬
мики, синергетики, динамики сложных нелинейных систем) позво¬
ляют однозначно ответить на этот вопрос. Наиболее важным дости¬
жением самоорганизации является обоснование принципа энергети¬
ческой экстремальности самоорганизации и прогрессивной эволю¬
ции (И.И. Свентицкий, 2001). Этот принцип состоит из второго
начала равновесной термодинамики и противоположного ему по
сущности закона, названного законом выживания. Начало и закон
логически концептуально объединены динамической зеркальной
симметрией. Второе начало объясняет преобразование энергии в рав¬
новесных (несамоорганизующихся) замкнутых системах, например
тепловых машинах, в которых энергия преобразуется благодаря ис¬
пользованию температурного градиента. Оно выполнило и выполня¬
ет важную роль в прогрессивном развитии традиционной градиент¬
ной энергетики.Однако, необоснованное распространение приложения второго
начала равновесной термодинамики к высоко энергоэффективным
природным самоорганизующимся (открытым, неравновесным) сис¬
темам обусловило ряд проблем фундаментальной науки. Этим обу¬
словлен также своеобразный теоретический запрет на развитие не¬
традиционной энергетики, основанной на использовании самоорга¬
низующихся процессов, в частности фазовых переходов. Принцип
энергетической экстремальности самоорганизации и входящий в
него закон выживания позволили решить эти проблемы и выявить ес-465
тественнонаучную причину возникновения энергетической пробле¬
мы. В соответствии с этим принципом энергетической экстремально¬
сти самоорганизации и законом выживания все этапы эволюции при¬
роды (физико-химический, биологический, социальный) имеют об¬
щую энергоэффективную направленность. Природа на протяжении
всей своей эволюции «решает проблему энергосбережения». В созна¬
тельной деятельности человек, не учитывая этот закон, допустил
энерго- и ресурсорасточительство. Этим и обусловлено возникнове¬
ние энергетической проблемы. Человек и его общество, как и все
иные части природы, подчинены принципу энергетической экстре¬
мальности самоорганизации и прогрессивной эволюции. Проблема
высокоэффективного использования доступной свободной энергии
не преходяща. Человек неизбежно должен ее решать на протяжении
всего своего существования.В связи с этим не случайно наиболее важным фактором, опреде¬
ляющим уровень развития общества, является его энерговооружен¬
ность. Она определяет все стороны общественного производства.
Интенсивное развитие всех отраслей народного хозяйства связано с
неизбежной необходимостью увеличения потребления энергии. Яр¬
ким примером является интенсификация сельскохозяйственного
производства. Получение продовольствия становится все более энер¬
гоемким. В настоящее время на 1 кал, запасенной в продовольствии,
затрачивают более 10 кал техногенной энергии. Потребление энергии
на одного человека в развитых странах за исторический период разви¬
тия возросло более чем в 100 раз и продолжает расти.В решении энергетической проблемы важную роль могут выпол¬
нить биотехнологии. Основной возобновляемый источник энер¬
гии — энергия оптического диапазона солнечного излучения. По
прогнозам только техническое преобразование этой энергии к 2020 г.
в общем энергетическом балансе США должно составить 26 %. Боль¬
шие возможности в самообеспечении сельского хозяйства энергией
открывает биоконверсия солнечной энергии растениями с последую¬
щим получением моторных топлив (жидкого, газообразного) из био¬
массы. В последние годы в ряде стран, например в Чехии, построены
крупнотоннажные заводы по производству дизельного топлива из
масла семян рапса. При урожае семян рапса 30 ц/га и выше в условиях
Чехии такое топливо конкурентоспособно с дизельным топливом,
получаемым из нефти. Биотоплива, получаемого с урожая рапса, вы¬
ращенного на 1 га, достаточно для обеспечения машинных техноло¬
гий по выращиванию растений на 8—10 га.В энергетической культуре рапса используют сорта и гибриды,
выведенные для пищевых и кормовых целей. Эффективность энерге-466
Рис. 9.1. Схема процессов преобразований энергии:сплошные линии — реализованные; пунктирные — разрабатываемые и возможные в будущем
(из книги С.Д. Варфоломеева «Конверсия энергии биокаталитическими системами».М., Изд-во МГУ, 1981).тических культур можно существенно повысить выведением специа-
лизированных сортов и гибридов на основе биотехнологий не только
рапса, но и других видов растений, в том числе и микроводорослей,
например хлореллы. Прогнозное расчетное определение эффектив¬
ности выводимых энергетических сортов и гибридов можно надежно
проводить, используя компьютерную технологию (см. 9.7).Потребительская стоимость энергии зависит от ее формы. На рис.9.1	приведены способы конверсии различных форм энергии (в после¬
довательности их ориентировочной иерархической ценности). Суще¬
ствующие технологические способы изображены сплошными ли¬
ниями, разрабатываемые и возможные в будущем — пунктирными.
Каждый этап преобразования энергии охарактеризован ориентиро¬
вочным значением КПД. Отметим, что КПД преобразования энергии
в процессе фотосинтеза растений в 2,5 раза на схеме занижен в связи с467
неточным определением эксергии солнечного излучения в отноше¬
нии фотосинтеза растений (И.И. Свентицкий, 1982).Электрическая энергия по многим показателям является наибо¬
лее удобной и чистой формой энергии (ее работоспособность — эк-
сергия — составляет практически 100 %). В то же время наибольшую
ценность представляют энергоемкие метаболиты, обеспечивающие
локальные биоэнергетические процессы живых организмов. Значи¬
тельная, если не большая часть всей техногенной энергии затрачива¬
ется человечеством на получение, транспортирование и распределе¬
ние продовольствия.Роль топлива как источника и накопителя (аккумулятора) энер¬
гии будет очевидно возрастать. В связи с этим привлекательна кон¬
цепция водородной энергетики. Водород по оценкам многих экспер¬
тов является наиболее перспективным веществом для использования
в качестве синтетического топлива. Он обладает достаточно высокой
энергоемкостью. По этому показателю он превосходит все другие со¬
единения, которые могут служить в качестве топлива: природный
газ — в 2,5 раза, жидкие углеводороды нефти — в 3,3 раза, мета¬
нол — в 6,6 раза, целлюлозу — в 8,3 раза. Водород экологически чис¬
тое топливо, не вызывающее загрязнений окружающей среды. Ос¬
новной, практически единственный продукт его сгорания — вода.
Побочным экологически негативным продуктом сгорания водорода
в воздухе является оксид азота, который образуется в ничтожных ко¬
личествах.Принципиальное значение для успешного применения водород¬
ной энергетики имеет выбор первичного источника энергии для по¬
лучения водорода, а также его безопасное хранение и транспортиро¬
вание. Положительной особенностью водорода является возмож¬
ность высокоэффективного преобразования его энергии в электро¬
энергию при помощи топливных элементов (электрохимических
генераторов), КПД которых достигает 80 %. Такой высокий КПД обу¬
словлен тем, что в топливных элементах химическая энергия непо¬
средственно преобразуется в электрическую. Аналогично преобразо¬
ванию ее в организмах в другие необходимые виды энергии, в том
числе и в электрическую. Альтернативны для получения водорода в
настоящее время два вида первичной энергии: атомная и солнечная.Недостатками использования для этой цели солнечной энергии
являются: низкая плотность потоков энергии, отсутствие в настоя¬
щее время экономически конкурентоспособной технологии ее ис¬
пользования. Большие надежды в исследованиях по водородной
энергетике возлагают на возможность принципиального (в несколь¬
ко раз) уменьшения затрат первичной энергии на получение водорода
при электролизе воды. Предполагается, что воздействие на воду то¬468
ком высокой (сверхвысокой) частоты, обеспечивающей резонанс с
частотой собственных колебаний молекул воды, во много раз может
уменьшить затраты энергии на выделение водорода из воды в процес¬
се электролиза. Явления резонанса играют важную роль в процессах
самоорганизации, обеспечивая высокую эффективность преобразо¬
ваний энергии. Практическая возможность резонансного уменьше¬
ния затрат энергии на выделение водорода вполне реальна.9.4.	НЕОБХОДИМОСТЬ УЧЕТА БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ В БИОТЕХНОЛОГИЯХИз общего количества энергии, используемой при производстве
сельскохозяйственной продукции, техногенная (промышленная)
энергия составляет не более 3—4 %. Главная ее часть приходится на
природную энергию — электромагнитную энергию солнечного света
(И.И. Свентицкий, 1982,2001). Эту энергию первоначально преобра¬
зуют и запасают растения, а затем используют другие организмы (че¬
ловек, животные, микроорганизмы) и их сообщества. Большие коли¬
чества природной энергии накоплены в органическом веществе поч¬
вы, где она также преобразуется живыми почвенными организмами,
которые формируют и поддерживают почвенное плодородие.Конечная цель агро- и биотехнологий — получение определен¬
ного вида высококачественной продукции при низких энергетиче¬
ских и материальных затратах, а также негативном минимальном воз¬
действии на природную среду (B.C. Шевелуха, 1992).Сущность общебиологического закон биоэнергетической общей
направленности структур и функций живых систем, названного зако¬
ном выживания, состоит в том, что все элементы живой природы в
своем развитии самопроизвольно направлены к наиболее полному
(эффективному) использованию доступной свободной энергии. Под
свободной энергией понимается та часть общей энергии, которая по¬
тенциально может быть использована данным элементом природы на
свои процессы или преобразована в требуемый вид энергии. Важное
практическое следствие этого закона — необходимость количествен¬
ной оценки этой энергии на входе в любой ее преобразователь (потре¬
битель), а также на выходе из него.В селекции возникло и развивается направление по выведению
энергоэкономных сортов (гибридов) растений, пород животных,
штаммов микроорганизмов (B.C. Шевелуха, 1992). При такой селек¬
ции важно иметь прогнозную (расчетную) оценку на энергоэконом¬
ность исходного селекционного материала. Эта оценка должна учи¬
тывать конкретные экологические условия, в которых будут выращи¬
ваться новые сорта, гибриды, породы, штаммы.469
Надежный анализ энергопреобразующих процессов как в техни¬
ческих, так и в биологических системах можно проводить на основе
законов термодинамики и закона выживания. Законы термодинами¬
ки разрабатывались применительно к техническим преобразовате¬
лям энергии — тепловым машинам. Эти законы применимы и для
анализа преобразований энергии живыми системами, но их не доста¬
точно для объяснения особенностей их развития и функционирова¬
ния. Эти особенности можно объяснить на основе закона выжива¬
ния — общей биоэнергетической направленности структур и функ¬
ций самоорганизующихся живых систем.9.5.	ЗАКОНЫ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ТЕРМОДИНАМИКИОбмен веществ в живых системах происходит благодаря энергети¬
ческим и информационным процессам. Он слагается из химических
и физических реакций и подчиняется законам термодинамики.Наиболее важными понятиями термодинамики являются: систе¬
ма, процесс, параметры состояния системы. Подсистемой понимают
комплекс взаимосвязанных элементов (природных или созданных
человеком), который способен потреблять, преобразовывать и нака¬
пливать энергию. Системы бывают открытыми, закрытыми и замк¬
нутыми. Открытые системы обмениваются с внешней средой и веще¬
ством, и энергией. Закрытые системы обмениваются с внешней сре¬
дой только энергией и не обмениваются веществом. У замкнутых сис¬
тем нет обмена с внешней средой ни веществом, ни энергией.
Природные системы, в том числе живые, являются открытыми. Раз¬
личают самоорганизующиеся (неравновесные) и несамоорганизую-
щиеся (равновесные, косные) системы.Живые самоорганизующиеся системы способны самопроизволь¬
но потреблять из внешней среды свободную энергию и за счет этого
поддерживать свои внутренние интенсивные параметры (температу¬
ра, давление, уровень концентрации, градиент вещества и энергии и
др.), отличные от таковых внешней среды. Из-за этого их называют
также неравновесными (диссипативными) системами. Косные сис¬
темы не обладают такой способностью. Их интенсивные параметры
самопроизвольно сравниваются с аналогичными параметрами внеш¬
ней среды. Такие системы называют равновесными.Необходимо учитывать первый и второй законы термодинамики.
Согласно первому закону термодинамики, закону сохранения и пре¬
вращения энергии, ее общее количество в замкнутой системе сохра¬
няется неизменным. Энергия не исчезает и не возникает, а только
преобразуется из одного вида в другой.470
Второй закон термодинамики налагает определенные ограниче¬
ния на возможные самопроизвольные превращения разных видов
энергии. Все процессы в природе самопроизвольно протекают в од¬
ном направлении, а именно, в направлении снижения качества энер¬
гии, уменьшения ее работоспособности. Все градиенты (температура,
давление и др.) самопроизвольно уменьшаются. Снижение качества
энергии характеризуют ростом энтропии. Применительно к тепло¬
вым машинам эту величину называют приведенной теплотой. Она
равна отношению количества теплоты к температуре, при которой
эта теплота находится (содержится в системе или теплоносителе).
Чем выше энтропия, тем ниже работоспособность этого вида энергии
и тем меньше в этой общей энергии содержится свободной энергии,
или эксергии.9.6.	СПОСОБЫ АНАЛИЗА ПРЕОБРАЗОВАНИЙ ЭНЕРГИИИзвестны три способа анализа энергопреобразующих процессов:
по величине общей энергии, по величине энтропии и по величине
свободной энергии, или эксергии. При анализе (балансе) общей
энергии учитывается только первый закон термодинамики и не при¬
нимается во внимание второй ее закон, отсутствует учет качества (по¬
тенциальной превратимости) различных видов энергии. Этот метод
анализа не точный и может привести к серьезным ошибкам.В агроэнергетике необходимо проводить совместный анализ как
технических преобразований энергии, так и ее биоконверсию — пре¬
образование ее живыми организмами. Сельскохозяйственному про¬
изводству основные энергетические ресурсы поставляет промыш¬
ленная энергетика, в которой используют эксергетический анализ.
Это благоприятствует применению эксергетического анализа как в
агротехнологиях, так и в биотехнологиях. Аграрное производство —
один из основных пользователей экологических ресурсов. В экологии
до настоящего времени энергетический анализ проводят на основе
баланса общей энергии, но уже разработаны положения эксергетиче¬
ского анализа для экологии и есть надежда, что в этой отрасли знаний
будет применяться эксергетический анализ.В экологии и сельскохозяйственном производстве первичными
преобразователями основного вида энергии являются фотоавтотроф-
ные растения. Они включают электромагнитную энергию оптическо¬
го солнечного излучения во все жизненные процессы природы и об¬
щества. Рассмотрим эксергетический анализ при энергосберегающей
оптимизации производства продукции растениеводства посредством
агротехнологий и биотехнологий.471
9.7.	ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩАЯ ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА
ПРОДУКЦИИ РАСТЕНИЕВОДСТВА НА ОСНОВЕ
ЭКСЕРГЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗААнализ удобно начать с определения эксергии оптического излу¬
чения (света) в отношении фотосинтеза и формирования продуктив¬
ности растениями. Под этой величиной понимается та часть общей
энергии излучения, поступающей к растениям, которая потенциаль¬
но, при всех других благоприятных условиях, может бьггь использо¬
вана ими на фотосинтез. Эту величину называют также свободной
энергией в отношении фотосинтеза растений или фотосинтезной
энергией.Фотофизические и химические реакции фотосинтеза растений
протекают при практически постоянных температуре и давлении.
Эти параметры состояния, интенсивные для тепловых преобразова¬
телей, не оказывают существенного влияния на энергопреобразую¬
щие процессы живых организмов. Интенсивным параметром энерго¬
носителя (излучения) в данном случае является энергия фото¬
на — кванта излучения, которая определяется длиной его волны (А.).
Чем больше длина волны излучения, тем меньше величина энергии
его кванта — фотона (е), которая определяется выражениеме = /гу,	(9.2)где h — постоянная Планка, равная 6,625 • 10-34 Дж • с; у — частота
излучения.В соответствии с законом квантовой эквивалентности число осу¬
ществленных фотохимических актов пропорционально не количест¬
ву подведенной общей энергии излучения, а числу поглощенных фо¬
тонов. Фотохимические элементарные акты в фотосинтезе растений
могут осуществлять только фотоны определенной энергии, которые
соответствуют длинам волн от 300 до 750 нм. Энергия фотонов излу¬
чения с длинами волн больше 750 нм уже недостаточна для осуществ¬
ления элементарного фотохимического акта фотосинтеза, а энергия
фотонов с длинами волн меньше 300 нм настолько велика, что вызы¬
вает разрушение белковых молекул фотосинтезирующих структур.Зеленые растения избирательно поглощают излучения разных
длин волн. Больше всего они отражают и пропускают их в зеленой об¬
ласти спектра. Пропущенная и отраженная части падающей на расте¬
ния энергии излучения являются потерями и потенциально не могут
быть использованы на фотосинтез. На каждый элементарный фото¬
химический акт используется только часть энергии фотона (исключе¬
ние составляют только фотоны с длиной волны 680 нм, которой соот¬472
ветствует максимальная спектральная эффективность фотосинтеза).
Неиспользованная часть фотона деградирует в теплоту и принципи¬
ально не может быть использована на процесс фотосинтеза.Определить эксергию (свободную энергию) излучения примени¬
тельно к фотосинтезу растений можно путем вычитания из общей
приходящей энергии излучения рассмотренные две составляющие
потенциальных потерь: отраженную и пропущенную, а также избы¬
точную энергию фотонов, неизбежно превращаемую в теплоту.Так как эти потенциальные потери различны для излучений раз¬
ных длин волн, то учитывать их необходимо на основе спектрального
состава излучения, который характеризуют функцией распределения
энергии солнечного излучения по спектру (<р(А.)с), и функции спек¬
тральной эффективности фотосинтеза (АШф). Первую функцию оп¬
ределяют при помощи спектрофотометра. Вторую можно рассчиты¬
вать по спектрам поглощения фотосинтетических пигментов (хлоро¬
филлы, каротиноиды) и их концентрации в листе растений на основе
закона квантовой эквивалентности или установить эксперименталь¬
но. Численные ее значения приведены в отечественных отраслевых
стандартах и немецких национальных нормах D1N. Эксергия солнеч¬
ного излучения в отношении фотосинтеза растений (ес) определяется
по зависимостигде 0,95 — максимальная спектральная эффективность излучения с
длиной волны 680 нм.По выражению (9.3) методом графического интегрирования мож¬
но рассчитать величины ес за одну секунду (мощность эксергии). Ум¬
ножив ее на время облучения можно получить значение ес за этот про¬
межуток времени. При разработке и исследовании объектов биотех¬
нологий часто используют облучение искусственными источниками.
По формуле (9.3) можно рассчитать эксергию и для излучения искус¬
ственных источников любого спектрального состава, заменив <р(Х.)с
на функцию распределения излучения по спектру для примененного
источника.Спектральный состав прямого солнечного излучения у поверхно¬
сти Земли может существенно изменяться в зависимости от высоты
Солнца и состояния атмосферы. Однако спектральный состав сум¬
марного излучения (прямое + рассеянное) постоянен и не зависит от
этих условий. По расчетам и измерениям эксергия суммарного сол¬
нечного излучения у поверхности Земли равна 20 % от общей сум¬(9.3)473
марной энергии излучения. Это позволяет рассчитывать величину ес
по простой зависимости:ес = 0,2 Q,(9.4)где Q — энергия общего суммарного солнечного излучения у поверх¬
ности Земли, измеряемая существующей сетью метеостанций.Возможности биотехнологии во многом определяются способно¬
стями человека изменить генетический аппарат организма, заставить
его клетки работать в десятки, сотни и тысячи раз более эффективно
для получения требуемого продукта. Но полученный биотехнологами
организм, тратя энергию на бесполезный (сточки зрения этого орга¬
низма) продукт, может замедлять рост, развитие. В случае микроор¬
ганизмов высокопродуктивные штаммы могут легко вытеснять из
биореактора (ферментера) дикие собратья. Необходимо улучшать
условия культивирования.Высокопродуктивные сорта и гибриды, полученные методами
биотехнологий, как правило, более требовательны к экологическим
условиям, режимам питания. Для них в значительно большей мере,
чем для традиционных сортов и гибридов, необходимо более точно
проводить районирование, мелиорацию земель и совершенствовать
агротехнологии. Следовательно, требуется количественно оценивать
соответствие агроклиматического потенциала земли и ее плодородия
потребностям (характеристикам) новых сортов и гибридов, а также
требуемый для них вид и уровень мелиорации, совершенствовать
сортовую и зональную агротехнологии. Названные величины коли¬
чественно можно определять на эксергетической основе. Исходной
величиной при этом может служить величина эксергии солнечного
излучения в отношении фотосинтеза и продуктивности растений.Для определения на количественной основе соответствия погод¬
но-климатических условий земельного угодья эколого-физиологиче-
ским характеристикам растений данного вида, сорта, гибрида можно
воспользоваться понятием эксергии агроклиматического потенциала
(еап), под которой понимается то количество приходящей на поверх¬
ность Земли энергии солнечного излучения, которое при существую¬
щих погодно-климатических условиях и благоприятных других фак¬
торах может быть потенциально использовано на фотосинтез и фор¬
мирование продуктивности растений. Значение этой величины мож¬
но определить по выражениюп(9.5)474
где Аес — эксергия солнечного излучения за промежуток времени, в
течение которого значение Кф min остается постоянным; КфМп — ко¬
эффициент оптимальности фактора, находящегося в относительном
минимуме за этот промежуток времени; п — число промежутков вре¬
мени, за которые учитывается значение агроклиматического потен¬
циалу.Значение Кф можно определить по выражениюгде сфд — скорость фотосинтеза или формирования продуктивности
данным видом (сортом, гибридом) растений при существующем зна¬
чении фактора; сф 0 — та же величина, но при оптимальном значении
этого же фактора.Коэффициент оптимальности определяют для всех учитываемых
погодно-климатических факторов. Сопоставляя эти значения, опре¬
деляют фактор, находящийся в данный промежуток времени в отно¬
сительном минимуме.По выражению (9.6) можно определить эксергию плодородия
земли (ет), если в число учитываемых факторов, наряду с погод-
но-климатическими, включить и факторы, характеризующие свойст¬
ва плодородия почвы. При этом можно воспользоваться бонитиро-
вочной оценкой плодородия по отдельным свойствам почв, но бони-
тетные баллы (от 1 до 100) перевести в относительное исчисление (от
0 до 1). Под эксергией плодородия Земли понимается то количество
солнечной энергии, приходящей на поверхность земли, которое при
существующих погодно-климатических условиях и свойствах почвы
может быть использовано данным видом (сортом, гибридом) на фо¬
тосинтез и формирование продуктивности.По эксергии плодородия земли можно определить потенциаль¬
ную (максимальную) продуктивность растений данного вида, сорта,
гибрида в заданных экологических условиях. Значение этой величи¬
ны можно получить умножением эксергии плодородия на коэффи¬
циент (А"д), который учитывает затраты энергии на дыхание. Числен¬
ное значение этого коэффициента при отсутствии эксперименталь¬
ных данных для нормальных условий выращивания можно прини¬
мать от 0,2 до 0,3 в зависимости от особенностей вида (сорта,
гибрида).Можно определить эксергию мелиоративного потенциала зе¬
мельного угодия (еМп)> пользуясь выражением£ф j\J Сф,0>(9.6)п(9.7)475
где Аес — значение эксергии солнечного излучения за учитываемый
промежуток времени; А^м — значение коэффициента оптимальности
мелиорируемого фактора; K^ttrin2 — коэффициент оптимальности
фактора, находящегося во втором относительном минимуме после
мелиорируемого.Эта общая методика обеспечивает возможность количественного
взаимно согласованного определения ключевых величин растение¬
водства (агроклиматический и мелиоративные потенциалы земли, ее
плодородие, максимальная продуктивность растений) и выражения
их в абсолютных значениях в одинаковых энергетических (точнее в
эксергетических) единицах. Определение мелиоративного потенциа¬
ла земли [см. формулу (9.7)] возможно в отношении любого экологи¬
ческого фактора (погодно-климатический, свойства почвы). При та¬
ком определении учитываются: особенности свойств конкретных ви¬
дов (сортов, гибридов) растений, а также динамика влияния каждого
экологического фактора как на величину мелиоративного потенциа¬
ла, так и на другие рассмотренные величины.Только при определе¬
нии их на единой методической основе возможно расчетное установ¬
ление их при помощи ЭВМ.Для характеристики эффективности биотехнологии или агротех¬
нологии любой культуры целесообразно использовать три основных
критерия (показателя): коэффициент полезного действия эксергети-
ческий по использованию плодородия земли (Лепз); показатель по¬
лезного действия эксергетический по затратам техногенной энергии
(Яет); показатель эксергетический технико-экономический (Пт).
Чтобы определить эти показатели, требуется установить продуктив¬
ность (урожай), которую обеспечивает данная биотехнология (>);
приведенные затраты на единицу продукции (3„); затраты техноген¬
ной эксергии на получение единицы продукции (ет). Эксергию про¬
дукции (е„) определяют по энергии содержащихся в продукции пита¬
тельных веществ (белки, жиры, углеводы). В первом приближении за
эту величину можно принять энергосодержание данной продукции,
которое приводится в справочниках.Показатели эффективности биотехнологии можно определить по
зависимостям:Лепз ^п/^пз» Яет	^етэ	(9*8)Используя выражения (9.1) — (9.7), можно разработать основные
алгоритмы для программы расчета на ПЭВМ основных показателей
эффективности альтернативных биотехнологий (агротехнологий) и
выбрать наиболее результативную из них. Базовая блок-схема такой
программы приведена на рис. 9.2.476
Рис. 9.2. Базовая схема компьютерной программы энергосберегающей оптимиза¬
ции производства продукции растениеводства
По такой программе рассчитали показатели энергетической эф¬
фективности производства зерна яровой пшеницы (сорт Москов-
ская-35) для почвенных и метеорологических условий Московской
области (данные Метеорологической обсерватории МГУ, средние
значения за период 1971—1978). При урожае 40 ц/га, полученном По¬
левой опытной станцией Института почвоведения и фотосинтеза АН
СССР, накопленная в зерне эксергия равна 5,6 МДж/м2, затрат эк¬
сергии техногенной энергии — 1,56 МДж/м2. Природная эксер¬
гия — эксергия плодородия земли — составила 162,4 МДж/м2. При
этом показатель полезного действия эксергетический по затратам
техногенной энергии составил 3,6, а коэффициент полезного дейст¬
вия по использованию эксергии плодородия земли равен 3,4 %, что
свидетельствует о больших возможностях повышения урожая.На практике во многих случаях в Московской области урожай
этой культуры существенно ниже. Соответственно меньше и показа¬
тели энергетической эффективности. Например, в таких же почвен¬
но-климатических условиях в совхозе «Заокский» Московской об¬
ласти, земли которого расположены рядом с Полевой станцией, в
этот же период при одинаковом значении эксергии плодородия зем¬
ли получен урожай зерна яровой пшеницы сорта Московская-3518,5	ц/га. Затраты эксергии техногенной энергии на агротехноло¬
гии (которая была принята без прогнозных расчетов на соответст¬
вие экологическим условиям земли) составила 1,98 МДж/м2. В этом
случае коэффициент полезного действия эксергетический по ис¬
пользованию эксергии плодородия земли составил примерно 1,4, а
показатель полезного действия по использованию техногенной энер¬
гии—только 1,1.Данные влияния сортовых особенностей на энергетическую эф¬
фективность разных сортов яровой пшеницы и ячменя, рекомендо¬
ванных для возделывания в Центральном регионе РФ, представлены
в табл. 9.1.Наиболее высокие энергетические показатели по сортам пшени¬
цы обеспечил сорт Энита: КПД использования эксергии плодородия
земли —3,14%; показатель использования техногенной эксер¬
гии — 3,28. Самые низкие эти показатели у сорта Краснозерная (со¬
ответственно 2,32 и 2,41 %). У четырех сортов ячменя эти показатели
выше, чем у пшеницы. У сорта Эльф самый высокий КПД использо¬
вания эксергии плодородия земли (3,66) и показатель использования
эксергии техногенной энергии (3,81), а самый низкий у сорта Винер
(соответственно 3,31 и 3,45 %). Однако этот сорт, районированный
еще в 1929 г., имеет самый малый разброс урожайности по годам (ме¬478
нее 1,7), а у самого высокоурожайного сорта Эльф этот показатель
превышает 7. Для большинства сортов пшеницы и ячменя этот пока¬
затель имеет высокие значения, что свидетельствует о высокой зави¬
симости их урожайности от погодных условий.Таблица 9.1. Показатели оценки энергетической эффективности сортов яровой
пшеницы и ячменя, рекомендованных для возделывания в Центральном регионе
РФ, рассчитанные по результатам определения урожайности в конкурсном
сортоиспытании НИИСХ ЦРНЗ (Московская область) в 1954—2000 гг.(Э.Д. Нетгевич, 2001)СортУрожайность, т/гасредняяпределыЭксергияурожая,МДж/мКПД эксер¬
гии плодоро¬
дия земли,
%Показатель ис¬
пользования тех¬
ногенной эксер¬
гии, отн. ед.Пшеница яроваяКраснозерная2,691,59-3,893,862,322,41Московская-353,581,62-6,775,023,093,22Энита3,651,59-7,295,113,143,28Приокская3,621,85-7,275,063,113,24Лада3,521,73-5,964,922,993,15Яровой ячменьВинер3,472,63-4,434,512,782,89Московский 214,142,85-5,665,383,313,45Зазерский 854,451,23-7,585,783,563,71Биос 14,261,58-6,255,543,413,55Эльф4,571,36-8,275,943,663,81Влияние сортовых особенностей пшеницы на показатель исполь¬
зования эксергии техногенной энергии невелико (не превышает
32 %), а по КПД использования эксергии плодородия земли лишь не¬
значительно больше — 35 %. Для сортов ячменя эти различия соот¬
ветственно составили 33 и 31 %.О	влиянии сортовых особенностей на энергетическую эффектив¬
ность этой культуры можно судить также по результатам испытаний
новых сортов яровой твердой пшеницы, проведенных в НИИСХ
ЦЧП им. В.В. Докучаева. Поданным четырехлетних полевых опытов
(1988—1992) из пяти сортов наибольшую среднюю урожайность обес¬
печил сорт Светлана (25,2 ц/га), а самую низкую — Харьковская-46
улучшенная (20,7 ц/га). Различия в урожайности и соответственно479
показателях энергетической эффективности составили около 22 %,
В вариантах опыта использовалась одинаковая агротехнология. При
использовании сортовых агротехнологий, приспособленных к харак¬
теристикам испытываемых сортов, это различие очевидно могло быть
существенно большим.Использование рассмотренной компьютерной технологии позво¬
ляет достичь более высоких результатов при выборе альтернативных
культур, например при выращивании кормов (табл. 9.2).Таблица 9.2. Показатели энергетической эффективности культур ■ кормовом
пятипольном севообороте в Московской области на серых лесных почвахКультураСредний
урожай) су¬
хое вещест¬
во, ц/гаЭксергияурожая.МДж/мЭксергиятехногеннойэнергии,МДж/гаКПД эксер¬
гии плодо¬
родия земли,
%Показатель
использова¬
ния техно¬
генной эк¬
сергии, отн.
ед.Кукуруза на
силос85,410,70172846,66,19Клевер пер¬
вого года поль¬
зования84,010,5886466,512,23Клевер вто¬
рого года поль¬
зования37,64,7443352,910,93Озимая пше¬
ница32,84,59157302,82,92Ячмень27,03,78145202,32,60Наибольший КПД использования эксергии плодородия земли
обеспечивала кукуруза (6,6 %). Близкое значение этого показателя
получено и для клевера первого года пользования (6,5 %). Самое низ¬
кое значение КПД у ячменя (2,3 %). Различия почти в 2,9 раза. Са¬
мый высокий показатель использования эксергии техногенной энер¬
гии обеспечил клевер первого года пользования (12,23). Высокое зна¬
чение этого показателя и у клевера второго года пользования (10,93),
а самое низкое — у ячменя (2,60). Различие значений этого показате¬
ля у культур, использованных в севообороте, более чем в 2,5 раза. Зер¬
новые культуры, как видно из этого анализа, малопригодны для ис¬
пользования в кормовом севообороте.480
Социально-экономическое значение биоэнергетического-эксергети-
ческого анализа преобразований энергии. Представленный эксергети¬
ческий анализ биоконверсии энергии растениями и преобразований
техногенной энергии в агротехнологиях имеет важное теоретическое
и практическое значение. Это видно из следующего примера. Подан¬
ным директора института энергетической стратегии В.В. Бушуева, в
1970 г. энергоемкость отечественной внутренней валовой продукции
(ВВП) была на уровне среднемирового значения. К 2005 г. этот пока¬
затель оказался примерно в 3 раза выше среднемирового и в 5,5 раза
выше этого показателя в западноевропейских странах. Известно, что
себестоимость сельскохозяйственной продукции, прямо пропорцио¬
нальна ее энергоемкости. Ущербное состояние по энергоемкости
ВВП Российской Федерации обрекает ее на роль сырьевого придатка
мирового сообщества, если не принять необходимых мер.Учеными выявлено, что высокая энергоемкость ВВП РФ обу¬
словлена низкой эффетивностью использования первичных энерго¬
носителей в так называемой малой энергетике — котельных и тепло¬
генераторах (без выработки электроэнергии), используемых для
обогрева бытовых, производственных помещений и в технологиче¬
ских процессах. В сельском хозяйстве в этих устройствах используют
примерно 50 % энергоносителей потребляемой в этой отрасли.Замена устаревших котельных и теплогенераторов на современ¬
ные мини-ТЭЦ и тепловые насосы позволяет повысить КПД этих
систем обогрева в 3—4 раза и приблизить энергоемкость сельскохо¬
зяйственной продукции к среднемировому значению этого показате¬
ля, повысить ее конкурентоспособность на мировом рынке.Контрольные вопросы к главе 91.	Дайте определение термодинамической системы.2.	Чем отличается закрытая термодинамическая система от открытой?3.	В чем особенность замкнутой термодинамической системы?4.	В чем сущность первого и второго законов термодинамики?5.	Можно ли использовать законы термодинамики для анализа энергопре¬
образующих процессов в живых объектах?6.	Достаточно ли законов термодинамики для объяснения особенностей
развития и функционирования живых систем?7.	Чем отличаются живые самоорганизующиеся системы от неживых?8.	Каким законом можно объяснить особенности развития и функциониро¬
вания живой природы?9.	Что такое энтропия и как она влияет на потенциальную работоспособ¬
ность (превратимость) энергии?10.	Назовите способы анализа преобразований энергии и их различия.31-4266	481
11.	Какой способ анализа преобразований энергии наиболее пригоден для
биотехнологий и агротехнологий?12.	Дайте определения величины эксергии или свободной энергии.13.	Как определяют эксергию оптического излучения в отношении процесса
фотосинтеза растений?14.	Какое количество эксергии в отношении фотосинтеза растений содер¬
жится в суммарной энергии солнечного излучения, поступающего на поверх¬
ность земли?15.	Как определить эксергию агроклиматического потенциала?16.	Как определить эксергию мелиоративного потенциала по заданному
экологическому фактору (свойству почвы, климатическому)?17.	Как установить значение эксергии плодородия земли?18.	Какие показатели можно использовать для характеристики энергетиче¬
ской эффективности биотехнологий и агротехнологий?19.	Расскажите о программе энергосберегающей оптимизации производства
продукции растениеводства на основе эксергетического анализа.20.	Что такое энергетическая эффективность биотехнологий и агротехноло¬
гий?ЛИТЕРАТУРАБродянский В.М., Фратшер В., Михалек К. Эксергетический метод и его
приложения.— М.: Энергоатомиздат, 1988.Бродянский В.М. Эксергетический метод термодинамического анали¬
за.— М.: Энергия, 1973.Бушуев В.В. Энергетический потенциал и устойчивое развитие ИАУ.—
М.: Энергия, 2006.ОСТ 60.689—74 Минэлектротехпрома СССР. Фотосинтетически эффек¬
тивные источники излучения, 1974.ОСТ 46.140—83 Минсельхоза СССР. Излучение оптическое. Оценка фо-
тосинтезной эффективности. Термины и определения.— М.: МСХ СССР,
1983.Свентицкий И.И. Экологическая биоэнергетика растений и сельскохо¬
зяйственное производство.— Пущино, НЦБИ АН СССР, 1982.Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии.—
М.: Высшая школа, 1989.Свентицкий И.И. Принципы энергосбережения в АПК. Естественнона¬
учная методология. — М.: Изд-во ВИЭСХ, 2001.Чернавский Д.С. Синергетика и информатика.— М.: УРСС. 2004.Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе.— М.: Колос,
1992.Deutsche normen DIN/5031: Teil. 10. Strahlungs phusic in optishce Bericht
und Lichttechnik/Grossen. Formel- und Kurzzeichen ftir photobiologisch
wirksame Strahlung, 1979, Berlin.
Глава 10БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОДУКЦИОННОГО ПРОЦЕССА,
СИСТЕМЫ ЕГО РЕГУЛИРОВАНИЯ И УРОВНИ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ У РАСТЕНИЙ10.1.	ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ УРОВНИГенетический. Характер процессов роста и развития, соотношение
между ними обусловлены, прежде всего, генетическими факторами.
Тип развития каждого индивидуума определяется программой, зало¬
женной в его коде. Физиологическая функция генов заключается в
передаче информации клетке через матричную рибонуклеиновую ки¬
слоту (мРНК) и ферменты. Причем, никогда не происходит одновре¬
менной передачи всей имеющейся информации, т. е. не синтезиру¬
ются одновременно все потенциально возможные ферменты. В связи
с этим существуют одновременно активные (продуцирующие РНК) и
неактивные гены. Благодаря генной регуляции происходит актива¬
ция генов (индукция) и инактивация (репрессия) (Н.П. Дубинин,
1986; Льюин, 1987). Таким образом, рост и развитие растений пред¬
ставляет собой процесс, связанный с избирательной экспрессией ге¬
нов.Общий генетический контроль осуществляется через биосинтез
белка, ответные функциональные и двигательные реакции у расте¬
ния, проявляющиеся через свойство раздражимости протоплазмы,
множественные коррелятивные связи между процессами и органами,
а также атграгирующие и распределительные функции ростовых про¬
цессов, обеспечивающие постоянное взаимодействие всех органов и
систем, экологическую адаптацию и реализацию морфогенеза в соот¬
ветствии с многовариантной генетической программой развития.В основе продукционного процесса лежит постоянное взаимо¬
действие организма и среды. Генетическая программа и потенциал
продуктивности растений реализуются через эндогенные регулятор¬
ные механизмы и системы, которые во взаимодействии с экзогенны¬
ми факторами и технологическими приемами формируют опреде-483
ленный тип морфоструктуры растений, уровень продукционного
процесса и конечную величину урожая, его качество (B.C. Шевелуха,
1992).В зависимости от генетической детерминации и влияния напря¬
женности природных факторов, приемов выращивания растений на¬
блюдаются циркадные (околосуточные), сезонные, годовые онтоге¬
нетические, эволюционные ритмы и другие колебания интенсивно¬
сти и направленности продукционного процесса у растений.Доминирование экзогенных компонентов в суточных ритмах рос¬
та создает объективную основу для практического регулирования
продукционного процесса у растений приемами агротехники в целях
повышения урожайности и устойчивости посевов.В современном растениеводстве главная задача состоит в том,
чтобы с помощью методов генетической трансформации и рекомби-
ногенеза получить новые, в том числе трансгенные гибриды и сорта, в
первую очередь экономически важных сельскохозяйственных куль¬
тур с более высокой потенциальной продуктивностью и устойчиво¬
стью; далее потребуется разработать и реализовать методы макси¬
мальной реализации этого потенциала в производстве путем оптими¬
зации хода и соотношения физиологических процессов, обеспечи¬
вающих формирование высокого урожая и качества продукции.Гормональный. Природные фитогормоны и синтетические регу¬
ляторы роста и развития растений, или фиторегуляторы, являются
мощным химическим средством управления онтогенезом и продук¬
ционным процессом растений и посевов (JI. Дж. Никелл, 1984). По¬
этому они широко применяются в биотехнологии сельскохозяйст¬
венных растений и в практическом растениеводстве. Фиторегулято¬
ры — важное средство регулирования дифференцировки клеток,
клеточных делений, образования новых тканей и органов, темпов
роста и развития растений, их продуктивности и качества урожая. Ге¬
нетическая инженерия растений также опирается на знания о фито¬
регуляторах. Решающее значение в управлении онтогенезом расте¬
ний и их продуктивностью имеет изучение и мониторинг фитогормо¬
нального статуса.В современном растениеводстве фиторегуляторы применяются
для повышения урожайности и устойчивости агроценозов к неблаго¬
приятным факторам среды, позволяют существенно облегчить ряд
технологических операций.Гормональная система растений. Понятие о фитогормо¬
нах. Гормональной регуляции живого организма принадлежит важ¬
ная роль в реализации наследственной программы и адаптации к ме¬
няющимся условиям среды (К.Дерфлинг, 1985).484
Впервые мысль о наличии у растений веществ регуляторной при¬
роды высказана Ч. Дарвиным в работе «Способность к движению у
растений» (1880) на основании экспериментов с изгибами пророст¬
ков по направлению к источнику света. Одновременно с Ч. Дарви¬
ным выдающийся немецкий ботаник и физиолог растений Ю. Сакс
постулировал присутствие в растении веществ, ответственных за
формирование и развитие стебля, листа и корня. Однако эти предпо¬
ложения не получили признания ученых того времени.Интенсивные исследования по изучению и выделению регуля¬
торных веществ растений начались в XX в. В 1909—1910 гг. Г. Фит-
тингом было обнаружено вещество, вызывающее разрастание завязи
и образование бессемянных плодов орхидей, названное им, по анало¬
гии с регуляторными веществами животных, гормоном. За несколько
лет до этого была установлена высокая рострегулирующая актив¬
ность этилена, а в конце 20-х годов — выделен из растений ауксин. В
это же время Н.Г. Холодным и Ф. Вентом была разработана теория
тропизмов растений, названная по именам ее создателей, а в конце
30-х годов М.Х. Чайлахян выступил с гипотезой флоригена — гипо¬
тетического фиторегулятора, обусловливающего переход растения к
формированию генеративных органов и цветению.Продуктивными в изучении гормонов растений оказались
50—60-е годы, когда были выделены гиббереллины, цитокинины и
абсцизовая кислота и описаны их свойства. В наше время выделено
еще несколько эндогенных регуляторных веществ — брассиносте-
роиды, фузикокцины, жасминовая и салициловая кислоты, некото¬
рые олигосахариды, негормональные регуляторы роста растений —
полиамины, ряд фенольных соединений, другие вещества.Одновременно предпринимались попытки поиска, создания и
использования ряда регуляторных веществ в растениеводстве. Внача¬
ле это были синтетические аналоги ауксина для индукции корнеобра-
зования при вегетативном размножении растений. На рубеже 60-х го¬
дов были открыты ретарданты — вещества, замедляющие осевой ве¬
гетативный рост. Они являются наиболее распространенными фито¬
регуляторами, применяемыми в сельском хозяйстве. В настоящее
время ведется активный поиск фиторегуляторов с другими ценными
свойствами, особенно препаратов с антистрессовым и репаративным
действиями.Согласно современным представлениям о регуляторах роста и
развития растений фитогормонами называют вещества, которые син¬
тезируются в растениях, транспортируются по ним и в малых концен¬485
трациях способны вызывать ростовые или формативные эффекты по
месту образования и на расстоянии от него.Таким образом, первая особенность фитогормонов — эндогенное
происхождение. Большинство фитогормонов образуется из органи¬
ческих кислот, в частности — аминокислот. Изменения в интенсив¬
ности синтеза того или иного фитогормона, вызванные внутренними
или внешними причинами, приводят и к ответной реакции расте¬
ния — изменению показателей ростовых или формативных процес¬
сов.Вторая особенность фитогормонов — передвижение их по расте¬
нию. Биологический смысл этого условия заключается в том, что фи¬
тогормон, образовавшийся в одном органе, например в апикальной
меристеме стебля, обладает свойством регуляции ростовых процес¬
сов в других органах, например в корне. Именно таким образом дос¬
тигается взаимовлияние органов и целостность растения. Ряд ве¬
ществ, обладающих высокой регуляторной способностью, например
некоторые фенольные соединения, не могут быть признаны фито¬
гормонами, так как неспособны к передвижению по растению и воз¬
действуют лишь в месте своего синтеза.Третья особенность — способность в малых концентрациях вы¬
зывать заметные ростовые или формативные эффекты. Фитогормо¬
ны действуют на растение в малых концентрациях (10-13—10“ М).
Примером ростового эффекта может служить ускорение или замедле¬
ние роста стебля, а формативного — дефолиация.Четвертая особенность — действие не только в местах образова¬
ния, но и на расстоянии от них.Не следует смешивать понятия гормона животных и гормона рас¬
тений (фитогормона). Гормоны животных синтезируются в специ¬
альных органах — железах внутренней секреции, в то время как у рас¬
тений такая специализация тканей и органов отсутствует. Гормоны
животных не действуют в месте своего синтеза, а фитогормоны спо¬
собны влиять на клетки, в которых они образуются. В этом отноше¬
нии фитогормоны близки к гистогормонам животных.Молекулярные механизмы действия фито¬
гормонов. Практическое использование фитогормонов основа¬
но на глубоком знании молекулярных механизмов их действия, изу¬
чению которых в связи с этим придается большое значение. В настоя¬
щее время выявлена общая принципиальная схема образования фи¬
тогормонов, реализации их регуляторного действия, включающая
биосинтез предшественников, связывание со специфичным к данно¬
му гормону белковым рецептором с образованием активированного
гормон-рецепторного комплекса, воздействие этого комплекса на ге-486
Ацетил-
кофермент АМевалоноваякислотаАденин -ЦИТОКИНИНЫ^Изопентенил-
пирофосфатl-i г-1Геранилпирофосфат*Фарнезилпирофосфат •
tГеранилгеранил- _
пирофосфат♦Ent-каурен —3,3-Диметил-
аллилпирофосфатАБСЦИЗОВАЯКИСЛОТАБРАССИНО-СТЕРОИДЫГИББЕРЕЛЛИНЫРис. 10.1. Схема биосинтеза фитогормонов (Г.С. Муромцев и др., 1987,дополненная)ном растения и (или) на активность определенных ферментативных
систем.Фитогормоны синтезируются в растении из органических кислот,
причем у нескольких фитогормонов может быть один и тот же пред¬
шественник. Так, мевалоновая кислота является исходным вещест¬
вом для синтеза четырех классов фитогормонов: стимуляторов —
гиббереллинов, цитокининов, брассиностероидов и ингибитора —
абсцизовой кислоты (рис. 10.1).При изменении условий внешней среды в растении происходят
изменения в синтезе того или иного фитогормона. Ключевые фер¬
менты, действующие на развилках путей биосинтеза фитогормонов,
проявляют высокую чувствительность к изменению факторов среды
(освещенность, температура и др.), что приводит к преимуществен¬
ному синтезу определенного фитогормона. Примером такого воздей¬
ствия внешних условий может служить повышенный синтез гиббе¬
реллинов при увеличении продолжительности освещения и наобо¬
рот, снижение содержания ауксина и увеличение уровня фенольных
ингибиторов роста при избыточной инсоляции.Образовавшаяся молекула фитогормона транспортируется по
растению от места своего синтеза к клеткам-мишеням, т. е. клеткам,
чувствительным к данному фитогормону. Транспорт фитогормонов
происходит по проводящей системе растения, с током пасоки и асси-
милятов, а также по межклеточному пространству.Молекулы фитогормонов способны проникать в клетки-мишени
двумя способами: перемещаться в соответствии с градиентом кон¬487
центрации по плазмодесмам — протопластным каналам, связываю¬
щим соседние клетки; путем активного транспорта через погранич¬
ную мембрану клетки — плазмалемму.Установлено, что гормональные эффекты реализуются путем
конформационных изменений белковых молекул (варьирование
формы и пространственной структуры), занимающих в клетке стра¬
тегически важное положение. Такие белки могут функционировать
как рецепторы фитогормонов, преобразователи сигнала между ре¬
цептором и определенной ферментативной системой, а также как
ферменты, активаторы или ингибиторы ферментов, компоненты
мембранных транспортных систем. Гормональные эффекты во всех
чувствительных клетках можно представить как цепь скоординиро¬
ванных изменений формы множества специфичных для данной клет¬
ки белков.Первичная структура белка (определенная последовательность
аминокислот) уже содержит необходимую информацию для приоб¬
ретения белковой молекулой вторичной и третичной структур.В клетке молекула фитогормона взаимодействует со своим специ¬
фическим белковым рецептором и обратимо связывается с ним, об¬
разуя гормон-рецепторный комплекс (ГРК), вследствие чего проис¬
ходит активация белковой молекулы рецептора за счет его взаимо¬
действия с фитогормоном.Рецепторы фитогормонов в настоящее время еще недостаточно
изучены. Имеющиеся данные указывают, что, по-видимому, боль¬
шая их часть представляет собой глобулярные белки с очень высоким
сродством, связывающие фитогормоны. В одной клетке может нахо¬
диться несколько видов рецепторов одного и того же фитогормона,
что обусловливает и различные виды реакции растения на один и тот
же фитогормон, т. е. полифункциональность действия фитогормона.Интенсивность реакции на фитогормон определяется не только
собственно концентрацией фитогормона, но и концентрацией его
рецептора, так как полной физиологической активностью обладает
их комплекс, а не отдельные компоненты. Это обусловливает различ¬
ную чувствительность клеток к одному и тому же гормону. Как прави¬
ло, клетки-продуценты данного фитогормона имеют малую чувстви¬
тельность к нему, обусловленную низкой концентрацией рецепто¬
ров.С момента образования гормон-рецепторного комплекса воз¬
можны два основных пути реализации фитогормональной активно¬
сти.Первый путь связан с появлением новых ферментов или значи¬
тельным изменением в содержании уже существующих ферментов488
клетки. Он обусловлен воздействием фитогормонов на генетические
процессы. В связи с тем что в этом случае происходит репрограмми¬
рование работы генов и синтез новых белков, проходит значительное
время (от десятков минут до нескольких часов) от момента изменения
концентрации фитогормона до проявления его эффекта.Второй путь обусловлен изменением активности белков, главным
образом — ферментов, уже существовавших в клетке до изменения
концентрации фитогормона, за счет изменения их пространственной
конформации. Поскольку второй путь не связан с синтезом новых
белков, время проявления эффекта фитогормона в этом случае гораз¬
до меньше — всего несколько минут.Регуляция экспрессии генов. Фитогормональная регуляция экс¬
прессии генов обусловливает такие важнейшие процессы в жизни
растительной клети, как дифференцировка и дедифференцировка,
деление, рост и адаптация к новым метаболическим условиям. Сред¬
нее время фитогормональной регуляции работы генома исчисляется
несколькими часами. В то же время растение способно ответить на
изменение уровня некоторых гормонов всего за несколько десятков
минут. Эти «быстрые» реакции связаны со способностью фитогормо¬
нов регулировать активность уже существующих ферментов расти¬
тельной клетки.Регуляция активности ферментов. Вторичные посредники фитогор¬
монов. В этом случае реакция на фитогормон проявляется в течение
нескольких минут с момента резкого повышения его концентрации.
Такие эффекты объясняются изменением активности ферментов,
причем общее число молекул того или иного фермента практически
не меняется, но их активность возрастает или снижается вследствие
взаимодействия с аллостерическим эффектором, в роли которого мо¬
жет выступать фитогормон или его метаболит, что приводит к изме¬
нению сродства фермента к субстрату. Таким образом, быстрые от¬
ветные реакции на фитогормон объясняются изменением активно¬
сти уже существующих в клетке ферментов.Ярким примером «быстрых» реакций растения на фитогормон
может служить стимуляция растяжения клеток колеоптиля под дей¬
ствием ауксина, которая отмечается уже через 5 мин после начала об¬
работки. Данный эффект объясняется тем, что ауксин при взаимо¬
действии со своим рецептором, локализованным в плазмалемме, ак¬
тивирует работу протонной помпы — ферментативной транспортной
системы, производящей перенос протонов из клетки в область кле¬
точной стенки. Происходящее при этом подкисление гемицеллюлоз
и пектиновых веществ, входящих в состав клеточной стенки, приво¬489
дит к тому, что связи между ее компонентами ослабляются и за счет
тургорного давления, создаваемого вакуолью, клетка растягивается.В последнее время активно проводятся исследования вторичных
посредников (мессенджеров) фитогормонов. В общем виде действие
вторичного посредника заключается в том, что небольшое число мо¬
лекул гормона в клетке вызывает продукцию гораздо большего числа
молекул вторичного посредника, а последние в свою очередь поло¬
жительно или отрицательно влияют на активность белковых молекул.
Таким образом происходит умножение сигнала, возникшего при свя¬
зывании гормона с рецептором.Классификация, структура и функции ф и -
т о г о р м о н о в. В настоящее время известно семь групп фитогор¬
монов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен, абсцизовая
кислота, брассиностероиды, фузикокцины. По-видимому, список
гормонов растений ими не исчерпывается. Открытие нового фито¬
гормона — очень редкое событие, так как эти вещества присутству¬
ют в растении в очень небольших концентрациях. Тем не менее, оче¬
виден прогресс в изучении регуляторных систем растения, связанный
с совершенствованием методов исследования.Ауксины открыты в 20-е годы как фактор тропизмов растений.
В начале 30-х годов Ф. Кегль выделил в чистом виде и установил хи¬
мическое строение природного ауксина — индолил-3-уксусной ки¬
слоты (ИУК).Основным местом синтеза ауксинов являются апикальные мери¬
стемы стебля, откуда они поступают в другие органы. В меньшей сте¬
пени синтез этого фитогормона происходит в листьях, причем в мо¬
лодых листьях ауксина образуется больше, чем в старых.Механизм поглощения ауксина клеткой включает две фазы:1)	быстрое обратимое поглощение, происходящее по механизму,
бл изкому к диффузии, когда между клеткой и окружающей ее средой
устанавливается равновесие в концентрации ауксина. Достижение
этого равновесия зависит не только от разницы концентраций ИУК в
растворе и клетке, но и от pH раствора и цитоплазмы. Возможно, что
в поступлении ИУК в клетку участвуют и специфические переносчи¬
ки, роль которых особенно велика при pH, близком к нейтральному.
Продолжительность этой фазы 25—30 мин; 2) метаболическое накоп¬
ление. В это время ауксин связывается с различными компонентами
клетки, чаще всего с образованием глюкозного эфира или индо-
лил-3-ацетиласпарагиновой кислоты. Связанный ауксин не участву¬
ет в клеточной регуляции и представляет собой запасную форму гор¬
мона.490
Физиологические эффекты ауксина связаны с его действием на
клеточном уровне, которое проявляется в регуляции растяжения, де¬
ления и дифференцировки.Как уже отмечалось, механизм растяжения клеток под действием
ауксина обусловлен активацией протонной помпы, приводящей к
подкислению клеточной стенки, и ее последующим растяжением за
счет тургорного давления вакуоли.Растяжение клеток и размягчение клеточных стенок под действи¬
ем ауксин-активируемой протонной помпы может играть важную
роль в процессах дедифференцировки и последующего деления наря¬
ду с активацией ферментов, участвующих в разрыхлении клеточной
стенки — целлюлазы и пектиназ.Индукция ауксином клеточных делений также обусловлена и тем,
что он создает условия, необходимые для репликации ДНК, вклю¬
чающие в себя стимулирование дыхания, синтеза РНК и белков.Ауксин вызывает не только дедифференцировку. Он способен
стимулировать дифференциацию меристематических или дедиффе-
ренцированных клеток в клетки проводящих тканей. Под действием
ауксина отмечается формирование проводящих флоэмных и ксилем-
ных элементов в каллусной ткани, что имеет большое значение в био¬
технологии и практике растениеводства.Атграгирующее (т. е. притягивающее) свойство ауксина опреде¬
ляет и такое важное в жизни растения свойство, как апикальное до¬
минирование. Апекс, продуцирующий этот фитогормон, представля¬
ет собой мобилизационный центр, к которому притекают питатель¬
ные вещества и другие фитогормоны (гиббереллины и цитокинины).
Вследствие этого питательные вещества и фитогормоны практически
не поступают к пазушным почкам, которые поэтому не растут или
растут гораздо медленнее, чем верхушечная почка (А.Л. Курсанов,
1976). Механизм аттрагирующего действия практически не изучен.
Есть основания полагать, что он связан с активацией протонной
помпы.Цитокинины открыты в 1955 г. как факторы, стимулирующие де¬
ление клеток. Первый природный цитокинин был назван зеатином,
так как это вещество выделено из незрелых семян кукурузы. Сейчас
известно еще 12 цитокининов, их химическое строение близко к
строению зеатина. Показана высокая цитокининовая активность у
дифенилмочевины и ряда ее производных.Цитокинины синтезируются главным образом в апикальных ме¬
ристемах корня, откуда активно транспортируются с пасокой по кси¬
леме. Поэтому скорость передвижения цитокининов гораздо выше,
чем ауксинов. Направление транспорта — акропетальное, особенно491
много цитокинннов обнаруживается в активных меристемах и семе¬
нах.Стабильность цитокининов в растении невысока, время полурас¬
пада зеатина составляет в зависимости от вида растения и его органа
от 6 до 20 ч. Скорость разрушения в молодых тканях ниже, чем в ста¬
рых. Медленнее всего этот процесс идет в корнях. Деструкция цито¬
кининов начинается с конъюнгирования с сахарами (рибоза, глюко¬
за) и аминокислотой аланином. При этом путь образования О-глюко-
зидов цитокинина можно рассматривать как запасание этого гормо¬
на, а другие — как необратимую деструкцию. Недавно открыт
фермент цитокининоксидаза, окисляющий цитокинин без предвари¬
тельного гликозидирования. Окисление при этом происходит по мес¬
ту присоединения алифатической части к аденину.Основной физиологический эффект цитокинина заключается в
активации клеточных делений. В отличие от ауксина, создающего не¬
обходимые условия для митоза, выражающиеся вдедифференциров-
ке и репликации ДНК, т. е. в инициировании митоза, цитокинин ак¬
тивирует следующие стадии: работу РНК-полимераз, образование
РНК и синтез белков. Возможно, что эти эффекты связаны с атграги-
рующим действием цитокинина.Аттрагирующее действие частично обусловливает и ряд других
эффектов данного фитогормона, к числу которых можно отнести
стимулирование роста клеток листьев и семядолей, снятие апикаль¬
ного доминирования, задержку старения листьев и регуляцию пере¬
движения веществ в растении.Значительную роль цитокинин играет и в регуляции органогене¬
за. Преобладающая концентрация этих гормонов задерживает обра¬
зование корней и ускоряет закладку стеблевых почек. Они также спо¬
собны индуцировать зацветание некоторых видов растений в услови¬
ях неблагоприятного фотопериода.Под действием цитокинина покоящиеся семена и клубни ряда
культур выходят из состояния покоя. Возможно, что это связано с ак¬
тивацией синтеза гидролитических ферментов.Цитокинины не только задерживают старение листьев, но и регу¬
лируют формирование хлоропластов на ранних стадиях развития
листа, а также их рост и деление за счет стимулирования синтеза хло-
ропластных РНК и белков.Цитокинины участвуют также в регуляции транспирации листь¬
ев, открывая устьица, что наряду со стимулированием формирования
хлоропластов и задержкой старения листьев приводит к большей фо-
тосинтетической активности.492
Очень важным свойством цитокининов является их способность
повышать устойчивость клеток растения к различным неблагоприят¬
ным воздействиям — повреждающим температурам, недостатку
воды, повышенной засоленности, рентгеновскому излучению, фито¬
токсичным воздействиям пестицидов. Механизм такого защитного
действия еще не совсем ясен. Однако установлено, что повышение
уровня цитокининов при неблагоприятных условиях жизни растения
стимулирует синтез стрессовых белков, защищающих клетку.Гиббереллины были открыты (1926) и выделены (1938) в Японии
как продуценты патогенного гриба Gibberella fujjcuroi, вызывающие
чрезмерный вегетативный рост риса. В середине 50-х годов была уста¬
новлена их химическая структура и присутствие этих веществ во мно¬
гих видах растений.Изучение гиббереллинов активно продолжается. Уже известно
около 70 представителей этих веществ, в том числе 45 выделены из
растений.Известен ряд соединений, которые способны блокировать био¬
синтез гиббереллинов. Практически все эти вещества обладают ре-
тардантным действием, т. е. тормозящим рост. Прерывание биосин¬
теза гиббереллина происходит за счет блокирования определенных
ферментов. Так, хлорхолинхлорид и другие четвертичные аммоние¬
вые соединения прерывают образование энт-каурена, блокируя пер¬
вую стадию реакции образования каурена, происходящую в цито¬
плазме, в отличие от второй стадии, происходящей в хлоропластах.
Обе стадии осуществляются одним и тем же ферментом — энт-кау-
ренсинтазой. Триазольные вещества прерывают образование
энт-кауреновой кислоты, блокируя три последовательные реакции
окисления энт-каурена.Транспорт гиббереллинов неполярен. Они перемещаются акро-
петально и базипетально по сосудам ксилемы и флоэмы с током вод¬
ных растворов. В связи с таким характером транспорта скорость рас¬
пространения этого фитогормона сравнительно высока.Физиологическое действие гиббереллинов проявляется главным
образом в стимуляции ростовых процессов за счет усиления растяже¬
ния клеток и повышения митотической активности меристематиче-
ских тканей. Стимулирование растяжения клеток под действием гиб¬
береллина не связано с активацией протонной помпы, в отличие от
действия ауксинов, а обусловлено усилением синтеза материала кле¬
точной стенки.Наблюдается определенная специфика в ростовых реакциях рас¬
тений различных семейств на тот или иной гиббереллин. Так, расте¬
ния семейства тыквенных и некоторые крестоцветные не изменяют493
своего роста под действием ГКз, но активно реагируют на ГК4, кото¬
рый, в свою очередь, не изменяет интенсивность роста представите¬
лей ряда других семейств.Помимо видовой специфичности на гиббереллин ярко выражена
специфичная реакция органов одного и того же растения на повыше¬
ние уровня этого фитогормона. Вызывая активный рост стебля, гиб¬
береллин практически не влияет на рост листа и угнетает рост корней.
Отрицательное действие гиббереллина на корни может быть связано
с перераспределением питательных веществ на преимущественное
развитие активно растущей надземной системы.Дефицит гиббереллинов может определять карликовость расте¬
ний. Причины карликовости в этом случае, как правило, обусловле¬
ны нарушением работы ферментативной системы биосинтеза этих
фитогормонов.Гиббереллины играют большую, но недостаточно изученную роль
в процессах перехода к формированию генеративных органов и за¬
цветанию. Показано на многолетних растениях, что повышение
уровня гиббереллинов на стадии детерминации генеративного пути
развития меристем приводит к подавлению образования генератив¬
ных органов. В то же время снижение уровня гиббереллинов на более
поздних этапах формирования элементов цветка в меристеме так же
неблагоприятно сказывается на генеративном развитии.У некоторых розеточных растений обработка гиббереллином ин¬
дуцирует зацветание даже в условиях неблагоприятного светового
дня. Это дало основания академику М.Х. Чайлахяну (1988) для пред¬
ставления гиббереллина как необходимой части гипотетического
гормона флоригена. Предполагается, что помимо гиббереллина в со¬
став флоригена входят антезины — еще не выделенные фитогормо¬
ны.Введение гиббереллина извне часто вызывает угнетание развития
семян и формирование партенокарпических плодов. У растений с
раздельнопольными цветками отмечен эффект сдвига сексуализации
в сторону преобладающего формирования мужских цветков.Гиббереллины способны выводить семена и клубни растений из
состояния покоя. Это связано с индуцированием ими синтеза ряда
гидролитических ферментов, главным образом а-амилазы, расщеп¬
ляющей запасной крахмал и делающий его доступным для питания
зародыша.Этилен. В 1901 г. Д.Н. Нелюбов из Петербургского университета
сообщил о том, что этилен, входящий в состав светильного газа, сти¬
мулирует опадение листьев и нарушает фототропизм проростков го¬
роха. В 1934 г. этилен был обнаружен в газообразных выделениях хра-494
няшихся яблок. Это послужило основанием для того, чтобы считать
его фитогормоном.Этилен—единственный известный газообразный фитогормон
очень простого строения. Дезактивация этилена кроме выделения его
в окружающую среду происходит путем образования окиси этилена.
Установлено, что максимальная активность этилена совпадает по
времени с его максимальным окислением, а искусственное прекра¬
щение окисления останавливает действие этого фитогормона. Все
это дает возможность предполагать, что окисление этилена каким-то
образом связано с реализацией его фитогормональной активности.Способностью к биосинтезу этилена обладают практически все
живые клетки растения. В онтогенезе характер образования этого фи¬
тогормона резко изменяется. У ювенильного растения этилен синте¬
зируется главным образом в меристематических тканях. В дальней¬
шем наибольшие количества этилена образуют созревающие плоды.
Биосинтез этилена также резко усиливается при травмах или стрессо¬
вых воздействиях на растение.Как и большинство фитогормонов, этилен обладает широким
спектром регуляторных эффектов, причем даже в пределах одного
растения возможны различные реакции клеток на этот фитогормон.Этилен способен вызывать изодиаметрическое растяжение кле¬
ток (утолщение), что связано с изменением ориентации микротрубо¬
чек, вследствие чего вновь синтезируемые микрофибриллы целлюло¬
зы располагаются вдоль новой оси растяжения.Ряд эффектов этилена объясняется его антиауксиновым действи¬
ем. В отличие от ауксина, этилен вызывает формирование отдели¬
тельного слоя, т. е. приводит к опадению листьев, цветков, завязей и
плодов. Это обусловлено тем, что он индуцирует синтез ферментов
эндополигалуктороназы и целлюлазы, разрушающих клеточные
стенки. Под действием этилена прекращается индуцированное аук¬
сином растяжение клеток, подавляется митотическая активность.
Этилен также блокирует транспорт ауксина.Этилен не только вызывает опадение плодов, но и ускоряет их со¬
зревание. Под действием этого фитогормона повышается выход ла¬
текса у каучконосных растений.По-разному действует этилен на рост растений. У большинства
растений он тормозит вегетативный рост, подавляя процессы деле¬
ния и растяжения клеток. Однако в ряде случаев, например для про¬
ростков риса, повышение его концентрации приводит к активации
роста.Значительный интерес представляет защитное действие этилена.
Как уже отмечалось, образование этилена резко увеличивается при495
стрессовых воздействиях и механических повреждениях. Возможно,
что это первый ответ растения на потенциальную опасность. Стрес¬
совый этилен индуцирует синтез фитоалексинов (защитных веществ)
и фермента хитиназы, разрушающего клеточные стенки патогенных
грибов, а также некоторых фенольных соединений.Кроме того, повышение уровня этилена приводит к стимуляции
образования другого фитогормона, также принимающего участие в
защитной реакции растений — абсцизовой кислоты.Абсцизовая кислота (АБК) впервые выделена в 1964 г. из молодых
коробочек хлопчатника. Она представляет собой сесквитерпен, син¬
тезируемый в растении из мевалоновой кислоты.Возможно также образование АБК из продуктов распада ксанто¬
филла виолаксантина под действием света или фермента липоксиге-
назы. Это, по-видимому, объясняет резкое увеличение данного фито¬
гормона при стрессе. АБК синтезируется во всех органах растения.
Интенсивность ее образования увеличивается по мере старения, а
также при неблагоприятных воздействиях, особенно при недостатке
влаги. Наибольшее содержание этого фитогормона в хлоропластах
старых листьев, зрелых плодах, покоящихся семенах и почках. По
мере созревания зародыш семени сам приобретает способность син¬
тезировать АБК, регулируя таким образом процесс собственного по¬
коя и устойчивости. Синтез АБК имеет четкую фоторитмичность,
возрастая в 50—60 раз ночью по сравнению с днем. На уровень АБК
стимулирующе действует снижение температуры и уменьшение в со¬
ставе света синих и ультрафиолетовых квантов.АБК транспортируется акропетально и базипетально по флоэме и
ксилеме. Скорость передвижения довольно высока. Апрагирующи-
ми центрами для АБК являются активно делящиеся меристемы. Ме¬
таболизм АБК может осуществляться через образование конъюгата с
сахарами (гликозидирование), которое может быть обратимым и не¬
обратимым, а также окислением через фазеевую кислоту.Фитогормональные эффекты АБК весьма разнообразны. Они
связаны как с ингибированием, так и со стимуляцией важнейших фи¬
зиологических процессов. Абсцизовая кислота — фитогормон с
мощным ингибиторным действием. Она ускоряет распад нуклеино¬
вых кислот, белков, хлорофилла, ингибирует активность протонной
помпы. Под действием АБК закрываются устьица и прерывается фо-
тосинтетическое фосфорилирование.Покой семян, почек и клубней регулируется АБК: стимуляция
развития партенокарпических плодов у розы и образования клубней
картофеля, удлинение гипокотиля огурца, образование корней у че¬496
ренков фасоли. Значительные изменения вызывает этот фитогормон
и в составе запасных белков зерновых культур.Очень важна роль абсцизовой кислоты в устойчивости растений к
стрессу. Она, так же как и цитокинин, индуцирует синтез стрессовых
белков, в том числе и особой группы — белков синикации. Данные
вещества ответственны за обезвоживание семян, что обеспечивает их
покой. Растения, не способные к синтезу этого гормона, быстро по¬
гибают.Брассиностероиды. Этот класс фитогормонов открыт сравнитель¬
но недавно и сейчас активно изучается. Особый интерес исследовате¬
лей вызывал тот факт, что брассиностероиды до недавнего времени
были единственными известными гормонами растений стероидной
природы. Учитывая, что у насекомых и животных стероиды играют
огромную роль в процессах гормональной регуляции, сведения о
брассиностероидах могли бы быть очень важными для осмысления
эволюции гормональных систем растительного и животного мира.Процессы биосинтеза и транспорта брассиностероидов слабо изу¬
чены. Известно, что малые количества этих фитогормонов содержат
ткани цветка, листья и молодые стебли растений. Максимальная кон¬
центрация брассиностероидов отмечена в пыльце, из которой они и
были выделены в 1970 г.Физиологическое действие брассиностероидов близко к дейст¬
вию других фитогормонов. Подобно ауксину, брассиностероиды сти¬
мулируют растяжение клеток, подобно гиббереллину — стимулиру¬
ют рост изолированных семядолей огурца. Брассиностероиды обла¬
дают также некоторыми факторами, сходными с этиленом. Специ¬
фичным действием этих фитогормонов можно считать регуляцию
роста семяпочки. Микроколичества брассиностероидов, попадая с
пыльцой в семяпочку, стимулируют ее развитие и образование семян.
Большой интерес вызывает недавно обнаруженный эффект стимули¬
рования брассиностероидами устойчивости растений к стрессам и
грибным заболеваниям. Причины такого действия скорее всего свя¬
заны с повышением образования стрессовых белков, а также фитоа¬
лексинов и других компонентов системы фитоиммунитета. В настоя¬
щее время исследования брассиностероидов активно проводятся во
многих странах в целях повышения продуктивности и устойчивости
сельскохозяйственных растений.Фузикокцины. Фузикокцин — стероидное вещество, ранее извест¬
ное лишь как продуцент жизнедеятельности грибов, является фито¬
гормоном, т. е. синтезируется в растении и регулирует ростовые про¬
цессы (Г.С. Муромцев, 1996). Важнейшие эффекты фузикокцина:
стимуляция растяжения клеток, усиление транспирации, открыва-497
- -► I — Этилен -	|Ауксины -JСLiftБрассино-Г" стероиды, I
фузикокцины 1Гиббереллины ■1	Цитокинины» *_1————Абсцизовая ————
————— кислота -Рис. 10.2. Гормональные взаимодействия, приводящие к повышению
(сплошные линии) или к понижению (пунктирные линии) уровня того
или иного гормона (по D.S. Letham, 1978, дополненный)ние устьиц в темноте, выведение семян из состояния покоя, ускоре¬
ние их прорастания и др.Взаимодействие фитогормонов в расте¬
ниях. Гормоны растений активно влияют на синтез, распад и
транспорт друг друга. Изменение уровня одного из компонентов фи¬
тогормональной системы неизбежно приводит к изменениям всей
системы (рис. 10.2).Гормональный статус у растений. Гормональный
статус — состояние фитогормональной системы в онтогенезе расте¬
ний, уровни фитогормонов и соотношение между ними в процессах обра¬
зования, передвижения, использования и инактивации в ответ на внеш¬
ние воздействия. Гормональные статусы изучены слабо. Это объясня¬
ется трудностью количественного определения фитогормонов. Ис¬
следования гормонального статуса сельскохозяйственных растений
развернуты на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА
им. К.А. Тимирязева с использованием современных приборов и ме¬
тодов анализа (B.C. Шевелуха, В.М. Ковалев, П.Б. Курапов, 1995).Синтетические регуляторы роста и развитие растенийЗнание механизмов фитогормональной регуляции представляет
большие возможности для регуляции роста и развития растений с це¬
лью достижения большей продуктивности, устойчивости и техноло¬
гичности.Направленное воздействие на фитогормональную систему расте¬
ния осуществляется при помощи регуляторов роста и развития расте¬
ний (см. приложение).498
Фиторегулятором называют природное или синтетическое вещест¬
во, способное вызывать ростовые или формативные эффекты и не яв¬
ляющееся в применяемых концентрациях источником питания или фи¬
тотоксином. Таким образом, любое вещество, влияющее на рост и
развитие растений, если оно не стимулирует рост как удобрение и не
угнетает его как гербицид, является фиторегулятором. Известно око¬
ло 5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, одна¬
ко в практике применяется л ишь несколько десятков (около 1 %).Физиологическая активность подавляющего большинства фито¬
регуляторов обусловлена их способностью влиять на какой-то ком¬
понент фитогормональной системы. Это достигается за счет повыше-
ния уровня фитогормона при введении извне его аналога; воздейст¬
вия на биосинтез фитогормона (стимулирование или подавление);
блокирования транспорта фитогормона; воздействия на систему
инактивации фитогормона (стимулирование или подавление); кон¬
куренции за присоединение к рецептору фитогормона; инактивации
фитогормонрецепторного комплекса.Действие синтетических ре1уляторов на гормональную систему рас¬
тения. Аналоги и антагонисты ауксинов. Среди регуляторных соедине¬
ний, влияющих на ауксины, наиболее широкое применение нашли
синтетические аналоги этих фитогормонов, используемые для стиму¬
лирования корнеобразования: индолил-3-уксусная кислота (ИУК),
индолил-3-масляная кислота (ИМК), 1-нафтилуксусная кислота
(НУК), ее соли и амид. Эти соединения используют при вегетативном
размножении растений методом черенкования в биотехнологиче¬
ском процессе и в классическом растениеводстве. Обработку прово¬
дят введением препарата в питательную среду с концентрацией от1	до 10 мг/л, кратковременным погружением базального конца че¬
ренка в спиртовой раствор препарата концентрацией около 200 мг/л
или 12—24-часовым замачиванием черенков в водном растворе кон¬
центрацией 25—50 мг/л. Все эти соединения малотоксичны, а то, что
их применение не связано напрямую с получением пищевых продук¬
тов, делает их полностью безопасными.Среди аналогов ауксина особое место занимает группа фенилпро-
изводных: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д); 4-хлор-
феноксиуксусная кислота (4-Х); 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная
кислота (2,4,5-Т); 2(2,4,5-трихлорфенокси) пропионовая кислота
(2,4,5-ТП). Все эти соединения обладают крайне высокой ауксино-
вой активностью в том участке спектра действия этого фитогормона,
который связан с активностью протонной помпы и обусловливает
процессы тропизмов, растяжения клеток, дедифференцировки. В ма¬
лых концентрациях (0,5—2,0 мг/л) указанные вещества применяют499
при получении каллусной ткани, а в больших — как гербициды, дей¬
ствие которых основано на необратимой разбалансировке гормо¬
нальной системы растений. Токсичность аналогов ауксина данной
группы несколько ниже, чем у представителей других групп, однако
они имеют существенную экологическую опасность из-за мощного
мутагенного воздействия.Известен ряд фиторегуляторов, являющихся антиауксинами,
действие которых связано с блокированием транспорта этих гормо¬
нов: морфактины, нафтилфталаминовая кислота и ее соли, а также 2,
3, 5-трииодбензойная кислота (ТИБК). Действие ТИБК выражается
в нарушении апикального доминирования, обусловленного аукси¬
ном, что выражается в увеличении пробудимости почек и на некото¬
рых культурах, например сое, способно привести к значительному
повышению урожая за счет увеличения числа продуктивных побегов.Аналоги и антагонисты цитокининов. В последнее время резко воз¬
рос интерес к цитокининовым препаратам в связи с установлением их
антистрессового эффекта. Этим свойством обладают близкие синте¬
тические аналоги цитокининов ряда зеатина (кинетин, 6-бензилам и-
нопурин) и весьма отдаленные (картолины). В меньшей степени ан¬
тистрессовым свойством обладает аналог цитокининового ряда ди-
фенилмочевины — дропп (тидиазурон).В биотехнологии растений цитокинины применяют для актива¬
ции деления клеток при получении каллусных тканей, индукции
дифференцирования побегов в каллусе, а также для снятия апикаль¬
ного доминирования и повышения коэффициента размножения при
клональном микроразмножении. Особенно часто с этими целями
применяют 6-БАП и кинетин.Аналоги цитокининов вследствие их аттрагирующей способности
применяют для снятия апикального доминирования у плодовых са¬
женцев в питомнике с целью более ранней и качественной закладки
кроны, а также для увеличения размера и массы ягод бессемянных
сортов винограда. Наилучшие результаты в этих случаях достигаются
при использовании аналогов цитокинина совместно с синтетически¬
ми гиббереллинами.Препарат дропп хорошо зарекомендовал себя как дефолиант
хлопчатника. Его действие основано на стимулировании образова¬
ния эндогенного этилена, который и обусловливает данный эффект.
По данным наших исследований, применение этого препарата эф¬
фективно в биотехнологии для изменения морфогинезом растений in
vitro (В.М. Ковалев, Т.Н. Глушкова, Е.А. Калашникова, 2002).Аналоги цитокининов в весьма ограниченных объемах применя¬
ют и для задержки старения срезанных зеленых овощей, сдвига пола вsoo
женскую сторону, а также для прерывания состояния покоя и стиму¬
лирования прорастания семян. Антагонисты цитокининов известны,
но в практике пока не применяются и имеют лишь научную значи¬
мость.Аналогии антагонисты гиббереминов. Аналоги гиббереллинов по¬
лучают путем микробиологического синтеза из патогенного гриба
Gibberella fujicuroi. Они представляют собой точные копии гибберел¬
линов, продуцируемых растениями. Наиболее распространены в
промышленном применении гиббереллины ГКз, ГК4, ГК7. Основные
объемы использования этих веществ связаны со стимулированием
роста ягод бессемянных сортов винограда.Другим прогрессирующим аспектом применения гиббереллинов
является снятие состояния покоя семян и клубней, что обеспечивает
их лучшую всхожесть. Эти препараты используют также для сдвига
пола растений в мужскую сторону.В биотехнологии растений гиббереллины применяют для получе¬
ния безвирусного посадочного материала, для стимуляции деления и
растяжения клеток апикальной меристемы, что создает дополнитель¬
ные благоприятные условия для освобождения от вирусной инфек¬
ции.Антагонисты гиббереллинов применяют в сельскохозяйственном
производстве несравненно шире аналогов. Практически все антаго¬
нисты гиббереллина обладают ретардантным действием.Аналоги и антагонисты брассиностероидов. Одновременно с выде¬
лением из растительных источников, начались работы по химическо¬
му синтезу аналогов брассиностероидов (БС).Большинство синтезированных к настоящему времени аналогов
БС отличаются от их природных фитогормонов структурой боковой
цепи. К наиболее распространенному типу аналогов БС относятся
соединения 22S, 23S — изомеры: гомобрассинолиды, норбрассино-
лиды (В.А. Хрипач и др., 1993).Имеются данные о том, что БС и их аналога могут успешно кон¬
курировать с экдистероидами за связывание с экдизоновыми рецеп¬
торами, выступая в роли антиэкцизонов. Наряду с экдизонами, близ¬
кородственны к БС в структурном отношении также некоторые дру¬
гие представители класса гомоксистероидов (хиограстерины, азера-
рахол).Аналоги и антагонисты фузикокцинов. Характер физиологической
активности фузикокцина (ФК), типичный для фитогормонов, позво¬
лил рассматривать его как имитатор, физиологический аналог по¬
следних. Особенно велика аналогия ФК. с гиббереллинами, они оба
обладают высокой и разносторонней регуляторной активностью,501
продуцируются в значительных количествах фитопатогенными гри¬
бами и относятся к одной группе химических соединений — диди¬
терпенам.К терпеноидам принадлежат брассиностероиды и абсцизовая ки¬
слота, эти фитогормоны также синтезируются фитопатогенными
грибами. На основе этого Г.С. Муромцев (1987) высказал предполо¬
жение о гормональной природе ФК и обнаружил его в высших расте¬
ниях.А. Баллио с сотр. (Ballio et al., 1979) обнаружили в плазматической
мембране рецептор ФК — гликопротеин с молекулярной массой
40 тыс. дальтон. Эти исследователи обнаружили в корнях проростков
кукурузы эндогенный ингибитор активного транспорта прото¬
нов — антагонист ФК. Высказана возможность косвенной актива¬
ции ФК транспортной мембранно-связанной АТФ-азы. ФК взаимо¬
действует с локализованными в плазмалемме дыхательными цепями,
которые могут регулировать функционирование системы активного
транспорта протонов.Аналоги и антагонисты этилена. Применение аналогов этилена в
растениеводстве стало возможным вследствие открытия свойств
2-хлорэтилфосфоновой кислоты (2-ХЭФК, этефон) распадаться с
выделением этилена при pH > 4,0.На основе 2-ХЭФК разработаны многие препараты, в частности
этрел, кампозан, флордимекс, гидрел, дигидрел, декстрел. 2-ХЭФК и
препараты на ее основе практически не токсичны для теплокровных
(LD50 для крыс при пероральном введении составляет более
4000 мг/кг). Исключением являются гидрел и дигидрел, при синтезе
которых используют несимметричный диметилгидразин, следовые
количества которого в данных препаратах обусловливают их боль¬
шую токсичность, мутагенность и тератогенность.Этиленпродуценты применяют для самых различных воздейст¬
вий: как ретардант, как вещество, стимулирующее образование отде¬
лительного слоя, как индуктор и стимулятор состояния покоя расте¬
ний и устойчивости.В последнее время разработан ряд этиленпродуцентов на основе
кремнийорганики, наиболее перспективным из которых является
ситрел. Он практически лишен недостатков, присущих 2-ХЭФК, а
кроме того, менее токсичен для теплокровных организмов.В ряде случаев необходимо снизить уровень эндогенного этилена
в растении. В частности, это необходимо для предотвращения сброса
завязи на ряде плодовых культур, а также при некоторых биотехноло¬
гических операциях. Для этого используют вещества, блокирующие
биосинтез этилена. К ним относятся Ag+ аминооксиуксусная кислота502
(АУК), ризобиотоксин и аминоэтоксивинилглицин (АВГ). Однако
из-за высокой стоимости перечисленные препараты не получили ши¬
рокого применения.Аналоги и антагонисты абсцизовой кислоты. Структурные аналоги
абсцизовой кислоты, обладающие физиологической активностью, не
применяются в сельском хозяйстве из-за высокой стоимости. Однако
уровень этого фитогормона можно повысить, активировав его обра¬
зование в растении. В качестве индуктора и стимулятора образования
абсцизовой кислоты выступает другой фитогормон — этилен или его
продуценты.Увеличение уровня абсцизовой кислоты представляет интерес в
связи с индукцией этим фитогормоном синтеза стрессовых белков,
ответственных за связывание воды, а также его способностью стиму¬
лировать состояние покоя, что обеспечивает сокращение потерь рас¬
тениеводческой продукции при хранении.Специфические антагонисты абсцизовой кислоты пока неизвест¬
ны, а к числу неспецифичных можно отнести все гормоны со стиму-
ляторным характером действия.Генетический риск применения ре1уляторов роста в растениеводст¬
ве. В целях экологически безопасного применения регуляторов роста
важное место должно уделяться оценке генетического риска их при¬
менения уже на этапе государственного испытания. Работы в этом
направлении развернуты в МСХА им. К.А. Тимирязева на кафедре
сельскохозяйственной биотехнологии (B.C. Шевелуха, И.К. Блинов-
ский, Л.И. Хрусталева, 1992).В лабораторных опытах мутагенный эффект ССС не был обнару¬
жен ни на одном из испытанных сортов ячменя. При использовании
ХЭФК цитогенетический эффект проявлялся на сортах Москов¬
ский 3, Московский 2, Носовский 9. Доля анафаз с нарушениями в
3,3—7,3 раза превышала этот показатель в контроле. Сорт ячменя
Московский 121 оказался устойчивыми к воздействию ХЭФК. Цито¬
генетическое действие регуляторов роста сохранялось в следующем
семенном поколении, хотя доля аберрантных анафаз была несколько
ниже, чем в год обработки.На пшенице цитогенетический эффект был отмечен при приме¬
нении картолина. В следующем поколении это действие сохранялось.
Данные исследования указывают на необходимость обязательной
оценки цитогенетического действия перспективных, а также уже
применяемых в производстве регуляторов роста растений в целях со¬
хранения их генофонда. Препараты, вызывающие нарушения хромо¬
сом, должны быть исключены из использования в семеноводстве.503
Фитогормоны и синтетические регуляторы роста и развития
растений в биотехнологииФиторегуляторы занимают особое место в арсенале средств био¬
технологии растений, поскольку являются главными инструмента¬
ми, позволяющими управлять процессами каллусообразования, диф-
ференцировки, роста и развития растений-регенерантов.Регуляция органогенеза. Ю. Сакс еще в 1880 г. предсказал наличие
регуляторных веществ, ответственных за дифференцировку и разви¬
тие основных органов растения — корня, стебля и листа, назвав их
соответственно ризоколином, кауликолином и фолиоколином. Вре¬
мя во многом подтвердило справедливость таких взглядов, не поддер¬
жанных его современниками. Дальнейшим развитием их стала тео¬
рия флоригена, предложенная выдающимся отечественным исследо¬
вателем М.Х. Чайлахяном (1988). И хотя поиски флоригена еще не
увенчались успехом, они показали правомочность этой теории, так
же как и современные данные о регуляции развития и роста корня под
действием ауксина, а побега — под действием цитокинина подтвер¬
ждают справедливость взглядов Ю. Сакса.В связи с развитием биотехнологии сельскохозяйственных расте¬
ний значимость сведений о фитогормональной регуляции органоге¬
неза неуклонно возрастает, поскольку именно фитогормоны являют¬
ся основным инструментом при различных манипуляциях с культу¬
рами клеток и тканей растений in vitro.Корнеобразование. Искусственное укоренение побега, листа или
стебля широко применялось в растениеводстве во все времена, одна¬
ко этот путь размножения был пригоден далеко не для всех случаев,
трудоемок и дорог. Лишь с открытием ауксина в начале 30-х годов и
его способности индуцировать образование адвентивных корней и
стимулировать развитие корневой системы появилась возможность
массового размножения практически всех видов растений черенко¬
ванием.В настоящее время, несмотря на значительную модернизацию,
суть данного способа размножения осталась неизменной — обработ¬
ка черенков аналогом ауксина перед высадкой на укоренение.Образование адвентивного корня происходит из клеток камбия,
причем строго в зоне сочленения его с сердцевинным лучем. Наибо¬
лее эффективно этот процесс идет в период максимальной пролифе¬
рирующей активности камбиальной ткани. Формирование корня из
клеток меристематической ткани детерминировано генетически. Из¬
менение транскрипции генетических программ, приводящее к ризо-
генезу, контролируется ауксином, который после взаимодействия с504
определенным рецептором и образования соответствующего гор-
мон-рецепторного комплекса запускает систему ответа, приводящую
к снятию репрессорной блокады с оперонов генов ферментов, изме¬
няющих метаболизм и приводящих к корнеобразованию.Не все синтетические аналоги ауксина обладают способностью
индуцировать корнеобразование. Так, ризогенная активность индо-
лил-3-масляной (ИМК) и нафтилуксусной (НУК) кислот, синтети¬
ческих аналогов ауксина, значительно превышает то же действие на¬
стоящего природного фитогормона — ИУК. Это связано с большей
стабильностью синтетических регуляторов в клетке, обусловленной
меньшим сродством их к ферментам дезактивации гормона. В то же
время другой аналог ауксина — 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота
(2,4-Д) — практически неспособна вызывать ризогенез, и при дли¬
тельном применении этого вещества обработанная ткань утрачивает
способность к корневому морфогенезу.Корнеобразующая активность синтетических ауксинов стимули¬
руется при совместном применении с ними витаминов, в частности
аскорбиновой кислоты, которая в этом случае, вероятно, действует
как антиоксидант, препятствующий деструкции ауксина.Значительное стимулирование корнеобразования дает предвари¬
тельная обработка маточных растений ретардантами. Этот эффект
показан на многих культурах: землянике, картофеле, яблоне, вишне,
смородине, крыжовнике и др. Во всех случаях обработка маточных
растений перед срезкой черенков или выделением меристем приво¬
дила к лучшему формированию корневой системы растения. Объяс¬
нение этого факта может быть связано с рядом причин, наиболее ве¬
роятной из которых является антагонизм между ауксином и гиббе-
реллином в их влиянии на процесс корнеобразования. Ретарданты,
являющиеся антигиббереллинами, изменяют соотношение гормонов
в пользу ауксинов, стимулируя тем самым процесс ризогенеза.Побегообразование. Органогенез побега главным образом контро¬
лируется другой группой фитогормонов — цитокининами. Это пока¬
зано на каллусной культуре практически всех растительных видов.
Повышение уровня цитокинина в среде приводит к индуцированию
закладки зачатков почек в каллусе. При направленном стимулирова¬
нии формирования зачатков вегетативных почек в каллусе особое
внимание следует уделить абсолютному уровню ауксинов и цитоки¬
нинов в питательной среде и соотношению этих фитогормонов.Внимания биотехнологов заслуживает альтернативность морфо¬
генеза из каллуса: начавшийся корневой органогенез подавляет фор¬
мирование зачатков почек, и наоборот.505
Участие цитокининов в регуляции органогенеза у недифференци¬
рованной ткани каллуса табака было впервые показано Ф. Скугом и
К.О. Миллером. В опытах при помощи ИУК и кинетина вызывали
образование у каллуса корней и побегов. Причем дифференциация
каждого из этих органов требовала определенных концентраций обо¬
их фитогормонов.Одним из частных случаев побегового органогенеза, имеющим
важнейшее значение для сельскохозяйственного производства, явля¬
ется клубнеобразование. Этот процесс блокируется ауксинами, что
допускает проведение параллелей с органогенезом в каллусной куль-:
туре — как и в том случае, под действием повышенных доз ауксинов
стимулируется корнеобразование и подавляется формирование клуб¬
ней.По мнению М.Х. Чайлахяна, получившему подтверждение других
исследователей, фитогормональная регуляция клубнеобразования
осуществляется гиббереллинами и абсцизовой кислотой (АБК) в сле¬
дующей последовательности: сначала под действием гиббереллинов
стимулируется образование и рост столонов, а на следующем этапе
под действием АБК рост столонов прекращается, при этом они утол¬
щаются и формируют клубень на столоне. Обработка растений карто¬
феля АБК существенно повышает урожайность за счет увеличения
массы клубня.Гормональная регуляция каллусообразования. Один из основных
этапов работы биотехнологов растений связан с получением каллус¬
ной ткани из дифференцированных тканей листа, побега, корня. Ос¬
нова получения каллуса — дедифференцировка растительных клеток
экспланта, их возврат в меристематическое, пролиферирующее со¬
стояние. Для этого должно произойти следующее: 1) модификация
тех элементов структуры клетки, которые мешают процессу деления
(прежде всего — истоньшение толстой вторичной клеточной стен¬
ки); 2) экспрессия генов, ответственных за процесс митоза.Каллусообразование происходит в растительном мире довольно
широко. Открытые раны растений способны достаточно быстро затя¬
нуться каллусной тканью, которая впоследствии дифференцируется.
В подавляющем большинстве каллус образуется из меристематиче-
ской ткани, главным образом камбия. При этом не возникает необхо¬
димость в модификации клеточной структуры.При получении каллуса in vitro часто применяется посадка экс¬
планта на питательную среду с высоким содержанием синтетическо¬
го аналога ауксина — 2,4-Д, который стимулирует процесс дедиффе¬
ренцировки. Механизм такого стимулирования можно объяснить ре¬
гуляторными эффектами ауксина: активацией протонной помпы и506
связанного с ним истоньшения клеточной стенки за счет эффекта
«кислого роста», индукцией синтеза ряда ферментов, вызывающих
частичный гидролиз клеточной стенки, а также индукцией реплика¬
ции ДНК. Кроме того, следует отметить, что именно 2,4-Д способен
стимулировать деление клеток по способу действия цитокинина, сти¬
мулируя синтез нуклеиновых кислот.При длительном пассировании каллусной ткани возможно ее пе¬
рерождение в опухолевую, т. е. ткань, рост которой не контролирует¬
ся организмом. Причина этого явления заключается в приобретении
способности синтезировать фитогормоны (ауксины и цитокинины),
необходимые для ее деления внутри себя, а не получать их от других
органов. Опухолевая ткань в культуре in vitro, не реагирующая на из¬
менение концентрации фитогормонов во внешней среде, называется
гормоннезависимой или «привыкшей».Явление приобретенной гормоннезависимости существенно ог¬
раничивает возможности биотехнологии растений, поскольку клетки
тканей, обладающие данным свойством, практически не способны к
дифференцировке, а следовательно, и к регенерации целого расте¬
ния. Изучение причин и механизмов приобретения гормоннезависи¬
мости крайне важно, поскольку может дать ключ не только к реше¬
нию проблем сельскохозяйственной биотехнологии, но и к лечению
онкологических заболеваний человека.Возможные подходы к преодолению гормоннезависимости кал¬
луса при длительном пассировании могут быть связаны с блокирова¬
нием синтеза избыточного количества как фитогормонов, так и их ре¬
цепторов. Очень интересные результаты по индукции морфогенеза
ауксиннезависимого каллуса табака получены немецкими исследова¬
телями, показавшими, что при введении в гормональную среду дру¬
гих фитогормонов — брассиностероидов каллус приобретает способ¬
ность к образованию эмбриоидных структур. Эмпирически был най¬
ден и другой путь повышения морфогенной способности каллуса при
пассировании — включение в питательную среду азотнокислого се¬
ребра, блокирующего образование этилена.Получение трансгенных растений с измененным гормональным ста¬
тусом. Процесс получения трансгенной растительной ткани с изме¬
ненным фитогормональным статусом происходит в природе без вме¬
шательства человека. В ходе эволюции у двух видов агробактерий
(Agrobacterium tumifaciens и A. rizogenes) сформировался механизм, по¬
зволяющий им не только синтезировать необходимые белки, исполь¬
зуя генетический аппарат растения-хозяина, но и обеспечивать по¬
стоянный приток пластических веществ, дедифференцировку и про¬
лиферацию зараженных клеток.507
Основа паразитического механизма агробактерий — введение в
растительную клетку плазмиды, встраивающейся в хромосомную
ДНК растения и содержащей наряду с генами специфических бакте¬
риальных белков (наполина и октапина) гены ферментов синтеза фи-*
тогормонов — ауксина и цитокинина. При этом уровень этих гормо¬
нов повышается, специализированная растительная клетка дедиффеч
ренцируется и бесконечно делится, образуя галл при заражении
A. tumifaciens и множество нитевидных воздушных корней при зара-i
жении A. rizogenes. Значительный интерес представляют новейшие
научные данные, свидетельствующие о том, что при внедрении плаз-;
миды в геном растения-хозяина подавляется синтез фитогормонов*
ранее присущих данной клетке.На основе плазмид агробактерий созданы векторные системы для
переноса генов в хромосомный геном растения.В настоящее время работы в области генетической инженерии
растений связаны главным образом с получением исходных форм*
обладающих устойчивостью к гербицидам, патогенам или насеко-?
мым-вредителям. Такая достаточно узкая направленность обусловлен
на, в основном, двумя причинами. Во-первых, придание растениям
вышеперечисленных свойств значительно сокращает необходимость
применения ядохимикатов и, следовательно, обеспечивает большую
экологическую безопасность растениеводства; а во-вторых, уровень
развития генетической инженерии растений сегодня позволяет вво¬
дить в растительный геном и добиваться экспрессии лишь крайне ог¬
раниченного числа генов.В практике промышленного растениеводства бывает крайне важ¬
но получить растение не только высокопродуктивное и устойчивое*
но и имеющее определенный характер роста, что делает его приспо-;
собленным к погодным и агротехническим условиям выращивания и:
сельскохозяйственной технике. Особое значение это имеет при меха-i
низации процессов уборки урожая. По всей видимости, в подобных
ситуациях перспективно управлять фитогормональным статусом*
увеличивая или уменьшая продукцию того или иного фитогормона за
счет изменения «дозы» генов ферментов его синтеза или за счет заме¬
ны промотора.В связи с очевидной перспективностью создания растений с из¬
мененным фитогормональным статусом эта работа активно прово¬
дится во многих лабораториях мира, в том числе и в России
(В.М. Юсибов, Э.С. Пирузян и др., 1991). Например, во ВНИИ кор¬
мов им. В.Р. Вильямса (РАСХН) получены трансгенные растения лю¬
церны изменчивой с другим фитогормональным статусом (И.В. Кор¬
неева, В.В. Мазин, М.Н. Агафодорова, 1999). В работе использовали508
семена и растения сорта Рамбер клона 868. Трансформацию расте¬
ний проводили при помощи штамма Ag. tumefaciens С 58 с «разору¬
женной» Ti-плазмидой pGV3850 и бинарным вектором GLTr4, не¬
сущим гены NPT И, и синтеза изопентиниладенина (ipt), который
был получен из ИМГ (РАН) в отделе профессора Э.С. Пирузяна.Трансформанты отличались по габитусу надземной части, про¬
должительности сохранения зеленого цвета листьев, длине побега,
числу междоузлий и стеблей в кусте, массе корней, способности к ри-
зогенезу, морфофизиологическим характеристикам репродуктивных
органов, по содержанию свободного пролина, сырого протеина, хло¬
рофиллов и каротиноидов. Авторы объясняют эти отличия корреля¬
ционными и адаптивными процессами в растениях в ответ на экс¬
прессию гетерологичных генов и сдвигами в концентрациях и соот¬
ношениях фитогормонов и гормоноподобных веществ в растениях.
Длительное сохранение листьями зеленого цвета связано с повышен¬
ным содержанием в них цитокинина, задерживающего старение и
распад хлорофилла в листьях.Трансформированные растения могут использоваться как цен¬
ный селекционный материал в качестве источников хозяйствен¬
но-ценных признаков: улучшение кормовых качеств люцерны, повы¬
шение семенной продуктивности и устойчивости к стрессам, созда¬
ние пастбищевыносливых и конкурентоспособных ее сортов.Биотехнологические методы получения фитогормонов
и фиторегуляторовОчень часто перед учеными и практиками стоит задача получить
тот или иной фиторегулятор. Учитывая сложность строения некото¬
рых аналогов фитогормонов, наладить их синтез in vitro или не пред¬
ставляется возможным, или связано с высокими затратами. Решение
проблемы в таких случаях часто находят, полностью или частично
синтезируя необходимую молекулу при помощи микроорганизмов.
Именно таким образом получают все гиббереллины, фузикокцин,
налаживают производство абсцизовой кислоты, производят необхо¬
димые продукты для дальнейшего синтеза брассиностероидов.В последнее время появилось много высокоэффективных фито-
Регуляторов, как правило, общестимуляторного действия, выделен¬
ных из микроорганизмов, особенно из компонентов комплекса вези-
кулярно-арбускулярной микоризы, а также и других симбионтов
высших растений. Примером удачного препарата этой группы может
служить выделенный в нашей стране симбионт-2 и эмистим. Эти со¬
единения проявляют эффективность действия по типу ауксинов и509
цитокининов, а также имеют ряд особенностей, по-разному прояв¬
ляющихся на той или иной культуре.Большинство распространенных препаратов микробиологиче¬
ского синтеза оказывает действие по типу витаминов, активируя ряд
биохимических реакций, в результате приводящих к повышению
урожайности или к проявлению каких-либо других желательных при¬
знаков. К серьезным недостаткам таких препаратов относится их
многокомпонентность, существенно затрудняющая выделение дей¬
ствующего начала, определение токсичности компонентов регуля¬
торной смеси, всего препарата в целом и контроль за уровнем оста¬
точных количеств.Фитогормоны и регуляторы роста в растениеводствеРегуляторы роста и развития растений, промышленное примене¬
ние которых, начатое в 50—60-х годах, сначала — для стимуляции
корнеобразования черенков некоторых многолетних культур, за¬
тем — для борьбы с полеганием зерновых, в настоящее время распро¬
странилось практически на все интенсивные технологии выращива¬
ния сельскохозяйственных растений. При помощи фиторегуляторов
удается значительно повысить устойчивость растений к неблагопри¬
ятным внешним воздействиям, увеличить продуктивность сельско¬
хозяйственных культур, устранить некоторые недостатки высокоуро¬
жайных сортов.Рефляция онтогенеза. Покой и способы его регуляции. Состояние
покоя — эволюционное приспособление к перенесению организмом
неблагоприятных внешних условий. Оно сформировалось как способ
переживания низкой температуры зимой. Известны и другие условия
формирования состояния покоя, к наиболее значимым из которых
относится засуха в полупустынях. В этих условиях сформировались
растения-эфемеры с очень коротким периодом вегетации, уклады¬
вающимся в несколько десятков дней от прорастания запасающего
органа (как правило — луковицы или клубнелуковицы) до образова¬
ния семян. Переход растения в состояние покоя может индуциро¬
ваться как эндогенными, так и внешними факторами, наибольшее
значение из которых имеет изменение длины дня, указывающее орга¬
низму на предстоящее изменение температуры и влажности.В состояние покоя может вступать как все растение целиком, так
и его отдельные части или органы. Примерами такого состояния яв¬
ляются покой луковиц и клубней, покой почек и семян растений во
время продолжения активного роста надземной и корневой систем.510
Существуют различные формы покоя. В случае когда рост расте¬
ния прекращается под действием неблагоприятных факторов и не¬
медленно возобновляется с улучшением условий произрастания,
принято говорить о вынужденном покое. Многие травянистые расте¬
ния, например различные злаки и двудольные сорняки, в средних
широтах зимой пребывают в состоянии вынужденного покоя, обу¬
словленного низкой температурой, близкой к О °С, и недостаточной
для вегетации. При повышении температуры такие растения вновь
переходят к росту.Глубокий (физиологический, внутренний) покой не зависит от
внешних условий. Многие древесные растения в течение лета и осе¬
ни, т. е. при вполне благоприятных для роста условиях, образуют по¬
коящиеся, снабженные защитными чешуями семена и зимующие
почки. Выход растения из состояния глубокого покоя в большинстве
случаев связан с достаточно длительным (250— 1 ООО ч) пребыванием в
условиях пониженной температуры (0—5 °С). После этого наступает
так называемый дополнительный покой, который по сути соответст¬
вует вынужденному покою, так как в этой фазе при благоприятных
внешних условиях рост может возобновиться.Возможность управления состоянием покоя растений, а в конеч¬
ном итоге такими основополагающими процессами, как прорастание
семян, распускание почек, открывает большие возможности перед
агрономами, так как позволяет обеспечить начало ростовых процес¬
сов в оптимальных условиях, что в конечном итоге приводит к лучше¬
му развитию растений и повышению урожайности.Повышение прорастания семян может быть достигнуто за счет
ряда воздействий, как регуляторного, так и других. Так, у семян мно¬
гих плодовых культур, принадлежащих к семейству Розанных, дли¬
тельность покоя семян определяется во многом непроницаемостью
семенных оболочек, и лишь длительное пребывание в условиях с по¬
вышенной деятельностью микрофлоры, выделяющей вещества, спо¬
собные растворить семенной покров, стимулирует прорастание се¬
мян в естественных условиях. В таком случае ускорить прорастание
можно с помощью скарификации, т. е. каким-либо образом разру¬
шить семенной покров.Как правило, основной причиной медленной всхожести семян
являются ингибиторные вещества, присутствующие в семени. По
мере формирования зародыша ингибиторы роста накапливаются не¬
посредственно в нем или окружающих его тканях, постепенно посту¬
пая туда с ассимилятами за счет аттрагирующей способности зароды¬
ша или непосредственно синтезируясь в тканях, прилегающих к заро¬
дышу. В качестве природных ингибиторов роста выступают как фи-511
тогормоны — абсцизовая и жасминовая кислоты, так и ряд
фенольных соединений, недостаточно изученных в настоящее время*.Другой причиной низкой всхожести семян является недостаток !
стимуляторных веществ, прежде всего гиббереллинов, повышающие
активность гидролаз, которые расщепляют запасные вещества до лепЛ
ко растворимых мономеров, необходимых для роста зародыша, и циЯ
токининов, активирующих процессы деления клеток. Недостаток
стимуляторных веществ может быть обусловлен ранним отторжени-Л
ем зародыша от материнского растения, недостаточной способной!
стью зародыша продуцировать собственные фитогормоны, низком
активностью ферментов, переводящих фитогормоны из запасном
формы в активную, высокой активностью гормон-разрушающия
ферментативных комплексов.	ЯСоответственно, фиторегуляторы, повышающие уровень стиму-я
ляторов или снижающие уровень ингибиторов, будут ускорять прздя
растание семян и наоборот.Стимулирование прорастания семян при помощи фиторегулятоЯ
ров широко используется на многих культурах. При этом повышается!
использование почвенной влаги, конкурентоспособность с сорнякаЛ
ми, что приводит к повышению урожайности. Особенно хорошие роЯ
зультаты в этом направлении получены на овощных культурах и щШ
харной свекле.	JV|Значительный практический интерес представляет и обратиыК
прием — подавление прорастания. Особенное значение это имеет|
для культур со слабо выраженным покоем семян, способных при по-1
вышенной влажности в период сбора к энзимо-микозному истоще-Я
нию (ЭМИС) или прорастанию их еще на материнском растении, чхет
приводит к большим потерям урожая. Для борьбы с отмеченным им
достатком перспективно применение фиторегуляторов антигиббвЯ
реллинового действия, снижающих уровень или активность этощН
фитогормона и, следовательно, активность гидролитических ферЯ
ментов, а также фиторегуляторов, повышающих уровень ингибитоЯ
ров роста, например продуцентов этилена. Превентивная обработка!
фиторегуляторами против ЭМИС также обладает дополнительным!
положительным воздействием — снижением потерь зерна при хране-1НИИ.	1Стимулирование покоя семян существенно и при подзимних по- §
севах сельскохозяйственных растений. В этом случае семя, высеян-1
ное осенью, прорастает рано весной, при этом проросток получит |
возможность использовать для своего роста и развития большую 1
часть влаги растаявшего снега, что обеспечивает и больший урожай, |
особенно в резко континентальном климате с изобилием осадков в 1512
виде снега зимой и сухим жарким летом. В то же время в случае про¬
должительной оттепели семена, вышедшие к этому времени из со¬
стояния глубокого покоя, могут прорасти, а последующий возврат¬
ный заморозок может нанести непоправимый урон такому посеву.
Возможность регулирования продолжительности глубокого покоя в
данном случае позволила бы найти оптимальные условия, уберегаю¬
щие семя от провокации оттепелей, но в то же время позволяющие в
максимальной степени использовать почвенную влагу. В связи с этим
перспективно применение фиторегуляторов ростингибиторного дей¬
ствия совместно с предпосевным покрытием семян гидрофобной
пленкой.Механизмы управления покоем и прорастанием для вегетативных
органов и семян практически идентичны. Идентичны также цели и
приемы такой регуляции.Наибольшее практическое значение при стимулировании про¬
растания имеет снятие состояния покоя с клубней картофеля для по¬
лучения второго урожая в южных районах нашей страны. В данном
случае состояние глубокого покоя клубней первого урожая легко сни¬
мается при их кратковременном замачивании в растворе гибберелли-
на и тиомочевины.Обратный прием — стимулирование состояния глубокого по¬
коя — предотвращает прорастание клубней, корнеплодов и луковиц
сельскохозяйственных культур, что резко сокращает их потери при
хранении. Пролонгирование состояния покоя достигается за счет об¬
работки продуцентами этилена клубней перед закладкой на хранение
или растений в поле непосредственно перед уборкой урожая. В дан¬
ном случае используется способность этилена стимулировать био¬
синтез другого фитогормона, ответственного за покой,— абсцизовой
кислоты. Повышение качества хранения обусловливается также и
тем, что этилен индуцирует образование фитоалексинов — веществ,
при помощи которых растение борется с грибами-патогенами, а так¬
же активирование хитиназы — фермента, лизирующего клеточные
оболочки патогенных грибов.Приемы управления покоем и прорастанием имеют особое значе¬
ние для культуры многолетних древесных растений, чья крона не за¬
щищена снежным покровом от действия низкой температуры, а их
защита от неблагоприятных условий зимой полностью обусловлена
нахождением растений в состоянии покоя. В настоящее время ведут¬
ся активные поиски приемов стимуляции покоя плодовых.Регуляция роста стебля. Рост растения — комплексный биологи¬
ческий процесс, складывающийся из процессов деления и растяже¬
ния клеток, обеспечиваемых дыханием, фотосинтезом, транспортом
веществ в растении, поступлением воды и минерального питания.
Применение любого фиторегулятора так или иначе влияет на рост.В мире растений наблюдаются факты гигантизма и карликовости*
получившие широкое применение в практическом растениеводстве.
Основной причиной этого являются нарушения в системе фитогор¬
мональной регуляции, приводящие к разбалансировке роста и, соот¬
ветственно, избыточному или недостаточному росту.Существует четкая специфичность фитогормонов по стимуляции
и подавлению роста отдельных органов. Так, рост корневой системы
стимулируется главным образом ауксином, стебля — гиббереллина-
ми, генеративных органов — брассиностероидами, гиббереллинами
и цитокининами. Преобладание какого-либо из этих фитогормонов
определяет преимущественное развитие соответствующего органа за
счет других.Рост побегов большинства растений стимулируется гибберелли-
ном, активирующим деление клеток и растяжение в субапикальной
зоне, а ингибируется этиленом, абсцизовой кислотой и некоторыми
фенольными веществами. Характер роста побега определяется аукси¬
нами, стимулирующими апикальное доминирование, и цитокинина¬
ми, подавляющими этот процесс. Увеличение уровня гиббереллинов
при введении в растение их аналогов существенно стимулирует рост,
приводя к удлинению побега главным образом за счет увеличения
длины междоузлий. Однако при этом уменьшается диаметр побега,
снижается его механическая прочность и степень одревеснения. Сле¬
дует отметить различную чувствительность представителей отдель¬
ных семейств к гиббереллинам. Так, рост побегов тыквенных активи¬
руется лишь ГК4 и ГК7, а рост злаков — ГК] и ГК3.В практике прием активации вегетативного роста побегов пока не
получил распространения, что обусловлено высокой стоимостью
аналогов гиббереллина. С разработкой более дешевой технологии по¬
лучения этих препаратов их применение может быть перспективно
при выращивании зеленой массы растений.Увеличение роста побега отмечается и при обработке растений
аналогами брассиностероидов и фузикокцином, однако этот прием
не применяется из-за высокой стоимости этих препаратов.Активация роста побега может быть достигнута при обработке
растений препаратами гуминовых и фульвокислот, а также рядом
препаратов микробиологического синтеза, полученных из симбиоти¬
ческих бактерий и грибов. Механизмы действия этих препаратов еще
во многом не ясны.514
В практике растениеводства несравненно большее распростране¬
ние получил противоположный прием — замедление избыточного
роста побега.Значительное место среди фиторегуляторов занимают препараты,
тормозящие вегетативный рост,— ретарданты. Первый препарат это¬
го класса фиторегуляторов, имеющий промышленное значение, был
синтезирован в конце 50-х годов в США профессором Толбертом и
практически сразу нашел применение как эффективное средство
борьбы с полеганием пшеницы. В последующие годы этот класс фи¬
торегуляторов дополнился представителями других групп химиче¬
ских соединений, обладающими рострегулирующей активностью на
культурных растениях других семейств.Различия в механизме действия ретардантов позволили разрабо¬
тать композиции этих препаратов с синергическим действием компо¬
нентов. Синергизмом обладают смеси этиленпродуцентов с четвер¬
тичными солями аммония и с триазолпроизводными, а также гидра-
зинпроизводными. Синергизм проявляется при определенных кон¬
центрациях и соотношениях компонентов и основан на воздействии
препаратов, входящих в состав смеси, на различные этапы биосинте¬
за или реализации фитогормональной активности гиббереллинов.Применение ретардантов для борьбы с полеганием зерновых мно¬
гократно показало свою высокую эффективность.Регуляция фотосинтеза. Все компоненты фитогормональной сис¬
темы так или иначе влияют на фотосинтез. Однако в наибольшей сте¬
пени этот процесс контролируется цитокининами и абсцизовой ки¬
слотой.Цитокинины стимулируют синтез хлорофилла и дифференци¬
ровку хлоропластов, индуцируют открытие устьиц. АБК приводит к
закрыванию устьиц.Действие фиторегуляторов на процессы фотосинтеза может быть
связано с морфологией, например продуктивность фотосинтеза мо¬
жет значительно варьировать при изменении угла наклона листовой
пластинки относительно стебля.В последнее время появились новые фиторегуляторы отечествен¬
ного и зарубежного производства (активатор фотосинтеза, брассино-
стероиды), позволяющие в некоторой степени управлять процессами
ассимиляции углекислоты (В.М. Ковалев, 1995).На процессы фотосинтеза влияют ретарданты. Применение этих
препаратов для сокращения вегетативного роста и стимулирования
процессов закладки генеративных органов часто сопровождается уве¬
личением площади листа, содержания хлорофилла, большей концен¬
трацией сахаров в листьях.515
Особое место среди препаратов, повышающих суммарную про¬
дуктивность фотосинтеза, занимают регуляторы фотодыхания.Механизм действия фиторегуляторов, снижающих фотодыхание
(миксталол и др.), в настоящее время изучен недостаточно. Представ¬
ляется маловероятным, что они оказывают действие непосредствен¬
но на строение РДФК, весьма консервативного фермента.Регуляция транспорта веществ и качества урожая. Вопросы гор¬
мональной регуляции транспорта веществ в растениях пока мало ис¬
следованы. Ясно, что в управлении этим процессом участвуют во
взаимодействии ауксины, гиббереллины и цитокинины.Установлен факт аттрагирующего действия фитогормонов, но до
настоящего времени практически ничего не известно о механизме
этого действия. Скорее всего он связан с регуляцией фитогормонами
проницаемости клеточных мембран.Создан ряд синтетических фиторегуляторов, способных стимули¬
ровать отток продуктов фотосинтеза из листьев в запасные органы.
Наиболее эффективными среди них являются метиловый эфир
3,6-дихлор-2-метоксибензойной кислоты (дизугран или ракуза) и
1Ч,М-6кс-(фосфонометил)глицин (глифосин или лоларис). Первый
более эффективен на сахарной свекле, второй — на сахарном трост¬
нике. Активируя отток ассимилятов из листьев, фиторегуляторы кос¬
венно повышают суммарную продуктивность фотосинтеза, улучша¬
ют качество урожая.Регуляция устойчивости к абиотическим стрессам. Глобальное по¬
тепление климата Земли и обусловленное этим увеличение площади
засушливых регионов уже в ближайшее время может привести к су¬
щественному сокращению производства сельскохозяйственной про¬
дукции. Для того чтобы этого не допустить, ведется селекция устой¬
чивых сортов растений, разрабатываются агроприемы, направлен¬
ные на преодоление неблагоприятного действия недостатка влаги и
повышенной температуры. Большое внимание при этом уделяется
фиторегуляторам, обладающим антистрессовым действием.Известно, что фитогормоны — цитокинины, абсцизовая кислота
и брассиностероиды — повышают устойчивость растений к стрессо¬
вым воздействиям. Такое повышение устойчивости связано со спо¬
собностью данных фитогормонов стимулировать синтез стрессовых
белков.Стрессовые белки — особый механизм самозащиты живого орга¬
низма от стрессового воздействия, присущий большому числу биоло¬
гических объектов, от простейших до человека. Эти вещества выраба¬
тываются организмом в ответ на резкое изменение условий внешней
среды, причем в зависимости от вида стресса можно выделить общуюS16
часть стрессовых белков, появляющуюся при любом виде стресса, и
специальную, т. е. характерную именно для этого вида раздражения.Интенсивное изучение стрессовых белков растений началось во
второй половине 80-х годов. Получено некоторое представление о
роли и строении этих веществ, хотя еще в данном вопросе много не¬
ясного. Наиболее полно изучена группа белков теплового шока
(БТШ).БТШ были впервые открыты в 1974 г. у животных, а несколько
позже — и у растений: Большой интерес представляет тот факт, что
ряд БТШ одинаков у простейших, растений, насекомых, птиц, мле¬
копитающих. Это свидетельствует о консервативности и древности
происхождения белков данной группы. БТШ начинают синтезиро¬
ваться в организме при наступлении температурного стресса — по¬
вышении температуры на 8—10 °С выше нормы. При этом у разных
растений температурные оптимумы синтеза БТШ неодинаковы, на¬
пример у арабидопсиса — 37 °С, пшеницы — 40 °С, риса — 45 °С.
Скорость синтеза БТШ довольно высока: мРНК БТШ появляется
спустя 5 мин после начала стресса, а еще через 10 мин обнаружива¬
ются сами БТШ. Максимальной концентрации в клетке БТШ дости¬
гают через 1,5—2 ч после начала стресса, и этот уровень поддержива¬
ется около 2—4 ч. При продолжении стрессового воздействия, как
правило, наступает гибель организма. Через 2 ч после снятия стресса
биосинтез БТШ прекращается, а сами БТШ обнаруживаются в расте¬
нии еще в течение примерно двух суток.Регуляция биосинтеза БТШ осуществляется на генном уровне
при помрщи особого регуляторного элемента (RE), расположенного
в промоторной области генов БТШ, а также регуляторного белка
транс-фактора (tF). При наступлении стресса транс-фактор обрати¬
мо взаимодействует с регуляторным элементом и разрешает тем са¬
мым синтез БТШ.Общность и древность происхождения БТШ подтверждается тем,
что строение регуляторного элемента и транс-фактора у простейших,
растений и животных очень похоже, а следовательно, консервативен
и механизм регуляции работы генов этих белков.С началом синтеза БТШ .синтез других белков в клетке замедляет¬
ся ил и останавливается. Это может быть связано со следующими осо¬
бенностями: как правило, у гера БТШ интроны отсутствуют, что рез¬
ко сокращает временное и энергетические затраты на процессинг;
матрицы БТШ имеют преимущество перед м PH К других белков при
образовании полисомы. Это связано со строением их лидирующей
последовательности и З'-конца.517
Абсолютное количество БТШ и других стрессовых белков даже в
максимуме их концентрации весьма незначительно и фиксируется
лишь при помощи радиоактивной метки. Всего описано около 100
различных индивидуальных БТШ.Помимо БТШ, синтез которых стимулируется главным образом
цитокининами и брассиностероидами, растение способно синтези¬
ровать еще ряд групп стрессовых белков, большое внимание среди
которых вызывают белки синикации (БС), активируемые абсцизовой
кислотой. Эти белки обеспечивают связывание воды в растении, а
следовательно, и такие процессы, как высыхание семян, противо¬
стояние осмотическому и солевому стрессам, резким потерям воды
при усиленной транспирации.БС изучены гораздо хуже БТШ, о них пока известно лишь то, что
они представляют собой белки с очень высокой степенью гидрофиль-
ности. Это обусловливает их свойство образовывать коллоидные рас¬
творы, создавая в клетке запас воды, подобно губке.Уровень БС, образующихся в ответ на осмотический или солевой
стресс, все чаще используют в качестве показателя засухо- и соле-
устойчивости растений.В практике растениеводства давно используется закаливание, по¬
зволяющее, постепенно воздействуя внешними факторами, подгото¬
вить растение к пересадке в более жесткие условия выращивания.
Физиологическая суть закаливания заключается именно в постепен¬
ном увеличении уровня стрессовых белков, что обеспечивает выжи¬
вание организма в изменившихся условиях внешней среды. С откры¬
тием этого свойства фитогормонов появились дополнительные воз¬
можности по повышению устойчивости растений к абиотическим
стрессам.Химики и физиологи растений во всем мире сейчас активно ищут
препараты, обладающие антистрессовым действием. Показано, что
аналоги цитокинина могут успешно проявлять такой эффект. Однако
близкие структурные аналоги цитокининов (6-БАП, кинетин) из-за
высокой стоимости не получили широкомасштабного применения.
Возможно, что выход из создавшегося положения найден с производ¬
ством в стране картолинов — отдаленных структурных аналогов ци¬
токининов. Общий характер регуляторного действия в этом случае
достигается близкой конфигурацией молекул и сходным расположе¬
нием вероятных сайтов связывания с белковым рецептором.Картолины были вначале отобраны как заменители цитокининов
для поддержания роста культуры растительных клеток. При после¬
дующих исследованиях оказалось, что эти вещества обладают широ¬
ким спектром действия, например придают обработанным растени¬518
ям зерновых (ячмень, пшеница, рожь) устойчивость к недостатку
влаги, высоким и низким температурам, а также к грибным патоге¬
нам.Такая полифункциональность обусловлена присущим картоли-
нам свойствам стимулировать синтез различных стрессовых белков,
активность генома и метаболизм растений. Повышение морозо¬
устойчивости озимой пшеницы и ячменя, обработанных картоли-
ном, достигается за счет возрастания отношения сухой массы к сы¬
рой, количества связанной в клетках воды к свободной, а также нако¬
пления углеводов и водорастворимых белков. Это указывает на ин¬
тенсификацию биосинтетических процессов, вследствие которой
задерживается рост клеток растяжением, а следовательно, их вакуо¬
лизация, растет объем цитоплазмы, поддерживается структурная и
пространственная организация, позволяющая тканям переносить
сильное промораживание.Активизация метаболизма отмечается и при развитии засухоус¬
тойчивости у обработанных картолином растений. Она является
результатом стимулирования в клетках, испытывающих водный де¬
фицит, РНК-полимеразной активности, ускорения синтеза белков и
повышения температурного порога их денатурации, предотвращения
распада полисом, стабилизации мембранной системы хлоропластов,
обеспечивающей поддержание биосинтеза хлорофилла и его фотохи¬
мической активности.Другой возможностью повысить устойчивость растений к стрес¬
совым воздействиям является применение адаптогенов. В нашей
стране разрешены для промышленного применения два представите¬
ля данного класса препаратов — кремнийорганические соедине¬
ния — мивал и крезацин. Это экологически безвредные препараты,
обладающие широким спектром действия.Адаптогенное действие данных препаратов связано с их способ¬
ностью в стрессовых условиях стабилизировать клеточные мембра¬
ны, причем их действие проявляется как на растительных организ¬
мах, так и на животных. При повышении температуры до 40—45 °С
снижается степень упорядоченности мембранных липидов, а следо¬
вательно, нарушается один из основных биологических процессов —
избирательное проникновение веществ через мембраны, резко акти¬
вируется окисление липидов мембран пероксидами, образующимися
в аэробной стадии дыхания.Мивал в растительной клетке метаболизируется на два основных
структурных компонента — триэтаноламин и хлорметилполисилок-
сан. Фундаментальное свойство полисилоксанов — гидрофобизация
смачиваемых поверхностей. Именно это и определяет тот факт, что519
под действием мивала упрочняются белково-липидные связи и уси¬
ливается структурная целостность мембран. Положительное дейст¬
вие мивала прослеживается на все мембраны клетки, однако особен¬
но благоприятно он действует на мембрану хлоропласта, что обеспе¬
чивает большую продуктивность фотосинтеза при повышенной тем¬
пературе и общую прибавку массы растения.Крезацин стимулирует образование витамина Е в растении (в жи¬
вотном организме кроме того и витамина А) — основных компонен¬
тов антиоксидантного комплекса. Витамин Е (токоферол) ингибиру¬
ет перекисное окисление липидов мембран.Усиление антиоксидантных свойств клеток может приводить к
синхронизации клеточной популяции в Gi-периоде клеточного цик¬
ла, в котором клетки наиболее устойчивы также к низким температу¬
рам, и, следовательно, крезацин способен выступать как криопротек¬
тор.Антиоксидантное действие крезацина стимулирует генеративное
развитие какживотных, так и растений, что подтверждают многие ис¬
следователи. В частности, урожай зерновых культур и картофеля по¬
вышался в опытах под действием крезацина на 40—60 %.Фиторегуляторы в системе защиты растений. Возможность ис¬
пользования фиторегуляторов в борьбе с вредителями и болезнями
сельскохозяйственных растений была показана уже на рубеже
40—50-х годов, однако только сейчас, с развитием современных пред¬
ставлений о гуляторных взаимоотношениях между патогеном или
вредителем, с одной стороны, и растением-хозяином, с другой, появ¬
ляется реальная возможность эффективно и направленно использо¬
вать фиторегуляторы в системе защиты растений.Вредители и возбудители заболеваний оказывают регуляторное
действие на растение-хозяина, создавая тем самым для себя благо¬
приятные условия.Очень многие паразитические организмы синтезируют аналоги
цитокининов, обогащают ими зараженные клетки и тем самым обес¬
печивают приток к месту своего развития питательных веществ из
других частей растения. Например, повышенным содержанием цито¬
кининов отличаются участки развития грибной инфекции на листь¬
ях, в результате чего эти участки остаются «зелеными островками» на
пожелтевших листьях, из которых они оттягивают питательные веще¬
ства. Такие же «зеленые островки» образуют на листьях растений ли¬
чинки насекомых, которые впрыскивают в клетки листа из слюнных
желез цитокинины. Паразитическое растение повилика (Cuscuta
rejlexa) также обладает высоким содержанием цитокининов, кото¬520
рые, по-видимому, помогают ей получать питательные вещества из
клеток растения-хозяина.В ряде исследований, проведенных в последние годы, показано,
что насекомые нуждаются для своего развития в некоторых гормонах
растений, которые в организме насекомого превращаются в их собст¬
венные регуляторные вещества. Впервые это было показано на пус¬
тынной саранче, требующей для нормального полового созревания
гиббереллин ГКз, в норме поступающий с кормом. Другой фитогор¬
мон, брассинолид, ускоряет время наступления линьки насекомых,
что, по-видимому, связано со схожестью химического строения брас¬
синостероидов и экдизона. Сходным строением обладают абсцизовая
кислота с ювенильным гормоном насекомых и триспоровой кисло¬
той — гормоном полового развития низших грибов.Необходимость получения гормонов растений с пищей для нор¬
мального развития вредителей обратили внимание исследователей на
необходимость применения данных или близких по строению ве¬
ществ как нового поколения инсектицидов. При использовании этих
препаратов снижение численности насекомых или сокращение вы¬
зываемых ими повреждений может достигаться не за счет блокирова¬
ния какого-либо необходимого звена метаболизма, а за счет измене¬
ния времени наступления метаморфоза или влияния на половое со¬
зревание.В ходе эволюции растения выработали собственную систему за¬
щиты от патогенов и вредителей. Сигнальным и регуляторным цент¬
ром этой системы является фитогормон этилен. Биосинтез этилена
резко усиливается под действием повреждений, вызываемых вреди¬
телем или патогеном. Свойство автокатализа синтеза этилена приво¬
дит к тому, что концентрация этого фитогормона повышается не
только в зоне поражения, но и во всем растении. При этом может на¬
блюдаться и аллелопатический эффект этилена, обусловленный его
способностью диффундировать из растения и разноситься ветром,
увеличивая, вследствие автокатализа, уровень данного гормона в рас¬
тениях, находящихся в зоне его распространения.Повышение уровня этилена в растении стимулирует образование
фитоалексинов (веществ, выполняющих роль антибиотиков у расте¬
ний), повышает активность хитиназы (фермента, разрушающего хи¬
тин пищеварительного тракта насекомых или хитиноподобное веще¬
ство, из которого состоят стенки гифов патогенных грибов, после
чего их протопласты лизируются ферментами растительной клетки),
стимулирует синтез другого фитогормона — абсцизовой кислоты, за¬
тормаживающей процессы роста и деления клеток и стимулирующей
синтез стрессовых белков. У некоторых растений этилен увеличивает521
содержание фенольных веществ, вредных для многих животных и ин¬
гибирующих рост растений.Защитное действие этилена успешно применяется для сокраще¬
ния потерь от болезней при хранении некоторых видов продукции
растениеводства: картофеля, луковичных культур, корнеплодов. Об¬
работку с этой целью проводят методом замачивания или опрыскива¬
ния продукции растворами этиленпродуцентов перед закладкой на
хранение. Проведенные в МСХА им. К.А. Тимирязева исследования
показали, что такой же эффект при хранении картофеля оказывает
обработка вегетирующих растений в фазе бутонизации и клубней
брассиностероидами, что связано с повышением интенсивности об¬
разования фитоалексинов.При испытании регуляторов роста и развития растений исследо¬
ватели часто отмечали, наряду с собственно регуляторным ростовым
или формативным эффектом препаратов, также и повышение устой¬
чивости растений к вредоносным организмам. Это может быть обу¬
словлено следующими причинами:1)	препарат, помимо регуляторного действия, является токсином
для какого-либо паразита. Таким свойством в отношении мучнистой
росы и парши яблони и груши обладает ретардант паклобутразол
(культар);2)	улучшение каких-либо морфологических показателей и обще¬
го состояния растения под действием фиторегулятора делает его ме¬
нее уязвимым для атаки вредителями и болезнями. Например, пре¬
дотвращение полегания растений пшеницы, некоторое утолщение
листа и более глубокое заложение узла кущения значительно снижает
повреждение грибными заболеваниями при применении хлорхолин-
хлорида;3)	неблагоприятное для паразита изменение под влиянием фито-
регулятора метаболизма растения-хозяина;4)	изменение фазы развития растения-хозяина относительно
фазы паразита, что обеспечивает сокращение периода питания, а сле¬
довательно, и снижение вредоносного действия (как правило, подоб¬
ный эффект отмечается при ускорении развития культурного расте¬
ния за счет стимулирования всхожести семян и ранних этапов роста
проростка).В целом, изучение и применение регуляторов роста и развития
сельскохозяйственных растений в системе защиты их от болезней и
вредителей находится в самом начале своего развития, но несомнен¬
но, что в самом близком будущем позволит значительно сократить
потери растениеводческой продукции.522
ФизиологическийИнтенсификация фотосинтетической деятельности растений в посе¬
вах. Фотосинтез — это процесс поглощения и трансформации энер¬
гии света в химический потенциал богатых энергией органических
соединений в виде углеводов, жиров, белков. Из определения следу¬
ет, что в практических целях важно повышать КПД использования
солнечной энергии растениями. Для решения этой задачи важное
значение имеет создание трансгенных растений, обладающих «силь¬
ными» хлоропластами, с «мощными» реакционными центрами. При¬
мером могут быть С4-растения, более «сильные» растения эволюци-
онно приспособленные к новым условиям.А.	Ничипорович (1982) разработал количественную теорию фото¬
синтетической продуктивности растений, основанную на оптимиза¬
ции размеров листовой поверхности, радиационного режима, аэра¬
ции, минерального питания, водообмена и других факторов. Показа¬
но, что даже в современных условиях ведения земледелия можно уве¬
личить коэффициент использования физиологически активной
радиации (ФАР) от 0,5—1 до 3—5 %.Голландский ученый Ван Ниль в 1937—1941 гг. высказал предпо¬
ложение, что первичная фотохимическая реакция фотосинтеза со¬
стоит в диссоциации воды, а не в разложении СОг, как предполага¬
лось ранее (В.В. Полевой, 1989). Так как весь кислород фотосинтеза
выделяется из воды, общее уравнение фотосинтеза имеет вид:6СО2 + 12НгО + свет —» СбН^Ов + 6Н2О + 6O2Из этого уравнения можно рассчитать максимальный теоретиче¬
ски возможный КПД ФАР. На усвоение одной молекулы СОг в про¬
цессе фотосинтеза требуется порядка 8—10 квантов света. Энергия
поглощенных 10 моль квантов ФАР в среднем равна 500 ккал, а на ус¬
воение одной грамм-молекулы СОг используется 112 ккал, что со¬
ставляет 22,4 % поглощенной энергии. На дыхание растения затрачи¬
вают 20—30 % запасенной энергии. Таким образом, теоретически
возможный максимальный КПД поглощенной ФАР может быть ра¬
вен 16,8 % (А.А. Ничипорович, 1978).Поданным наших опытов, за период вегетации многолетние тра¬
вы и уплотненные посевы однолетних культур при оптимальных тем¬
пературных условиях, влажности и питании могут усвоить 55—60 %
приходящей ФАР. Коэффициент полезного действия ФАР в таком
случае составляет 9—10 %. Из этого количества усвоенной ФАР у
многолетних трав в среднем 55% аккумулируется в урожае,
30—35 % — в корнях и пожнивных остатках, 5—10 % затрачивается523
ф - — т	..■*	тт *' СI I I—I I I I—I—I—I—|—I—I—I—I—I—г 40
6 8 10 12 14 16 18 20 22
Время суток, чРис. 10.3. Суточная динамика интенсивности фотосинтеза, дыхания и роста у
озимой пшеницы на IV этапе органогенеза (сорт Мироновская 808):I — интенсивность фотосинтеза, Ф, 2— интенсивность дыхания, Д;3— линейная скорость роста
растений, У; 4 — температура воздуха, г, 5— относительная влажность воздуха, W-, 6— продолжи¬
тельность солнечного сияния, Rна корневые выделения, отмирания корней и листьев, азотфиксацию
у бобовых культур; у кукурузы в урожае аккумулируется около 65 %
усвоенной ФАР. Следовательно, КПД приходящей ФАР для много¬
летних трав и уплотненных посевов однолетних культур равен в сред¬
нем 5 %, для кукурузы около 6 % (В.М. Ковалев, 1995).Среди факторов, оказывающих большое влияние на КПД фото¬
синтеза, одним из решающих является аттрация продуктов фотосин¬
теза органами растений, выраженная во временных характеристиках
ростовой функции.На рис. 10.3 приведены наши результаты исследований суточного
хода роста, фотосинтеза и дыхания у озимой пшеницы (B.C. Шевелу¬
ха, В.М. Ковалев, 1973). Наблюдается тесная корреляция суточной
периодичности роста с суточной динамикой интенсивности дыхания
растений (г = 0,92 ± 0,14), а между интенсивностью роста и фотосин¬
теза отсутствует постоянная временная связь (г = 0,105 ± 0,37). С по¬
вышением температуры в утренние часы процессы роста и дыхания
усиливаются и достигают максимума соответственно в 14 и 16 ч. Наи¬
большая относительная интенсивность наблюдаемого фотосинтеза
отмечалась в данном опыте в утренние (10) и вечерние (18) часы, а в524
дневное время имела место его депрессия. Однако при сравнении по¬
казателей роста и фотосинтеза за достаточно продолжительные про¬
межутки времени (3—5 сут и более) проявлялась между ними доволь¬
но четкая корреляция.Дневная депрессия фотосинтеза обусловлена нарушением дея¬
тельности фотосинтетического аппарата и оттока ассимилятов при
перегреве, поскольку температура листа в этот период может превы¬
шать температуру воздуха на 5—10 °С. Если потери воды в тканях ве¬
лики и наблюдается усиление фотодыхания, то устьица в это время
закрываются (В.В. Полевой, 1989). Засухоустойчивые формы сель¬
скохозяйственных растений характеризуются менее выраженной де¬
прессией в полуденные часы и соответственно более плавным ходом
суточной кривой фотосинтеза. Установлено, что в условиях достаточ¬
ного увлажнения засухоустойчивые виды растений по интенсивности
фотосинтеза уступают неустойчивым. Однако у последних при выра¬
щивании в районах с умеренным климатом в случае наступления за¬
сухи показатели этого процесса в 1,5—2 раза ниже, чем у растений,
менее чувствительных к недостатку воды (Б.А. Рубин, 1979).Выравненность суточного хода важнейших физиологических
процессов характерна для более пластичных и продуктивных сортов,
спбсобных в диапазоне значений каждого фактора внешних условий
обеспечивать устойчивую продуктивность растений. Так, показано,
что продуктивные сорта зерновых культур в отличие от менее продук¬
тивных характеризуются более равномерным суточным ходом росто¬
вых процессов. Они имеют более высокие значения индекса равно¬
мерности суточного хода скорости роста, который представляет со¬
бой отношение минимальных (ночных) к максимальным (дневным)
приростам. Коэффициент корреляции между индексом равномерно¬
сти суточного хода скорости линейного роста и продуктивностью
сортов пшеницы, ячменя, овса, ржи составляет в среднем 0,75 и выше
в зависимости от погодных и других условий (B.C. Шевелуха,В.М. Ковалев, 1988).Установлены существенные видовые и сортовые различия по ин¬
тенсивности газообмена. В табл. 10.1 приведены обобщенные коли¬
чественные и качественные характеристики фотосинтетической про¬
дуктивности Сз- и С4-растений. Скорость фотосинтеза различных
видов растений в значительной мере зависит от большого числа
внешних факторов, среди которых наиболее важными являются: свет
(интенсивность и спектральный состав), температура, концентрация
С02 и 02, водный режим, минеральное питание, а также внутренних525
особенностей — возраста, содержания хлорофилла и ферментов, ко¬
личества воды в листе, структуры листа, степени открытости устьиц
и т. д.Таблица 10.1. Количественные и качественные характеристики фотосинтетиче
ской продуктивности С,- и С4-растеннйПоказательС3-растенияС4-растснияИсточникХлоропласты парен¬
химной обкладкиОтсутствуютИмеютсяЭдвардс и др.,
1986; Бассем и др.,
1987Продукты первичной
фиксации С02ФГКЯблочная или
аспарагиновая ки¬
слотаТо жеОптимальная темпе¬
ратура для фотосинтеза,20-2530-40Raghawendra,
1978; Быков, 1980;
Берри и др., 1987Световое насыщение
фотосинтеза, клк20-4060-90Raghawendra,
1978; Рубин, 1979;
Быков, 1980С02-компенсацион-
ный пункт, %> 0,005<0,005Рубин и др., 1977;
Raghawendra, 1978Оптимальная кон¬
центрация С02 в возду¬
хе, %0,07-0,100,03-0,04То жеИнгибирование ско¬
рости фотосинтеза 02ЗначительноеНе поддается
измерениюНатр, 1984; Эд¬
вардс и др., 1987Максимальная ин¬
тенсивность фотосинте¬
за, мг (С02) дм"2 • ч_!25-4050-90Salep, 1977; Натр,
1984Максимальные су¬
точные приросты био¬
массы, ц/га сутки1,5-38-9Устенко, 1978Т ранспирационный
коэффициент, Н20 г
сух. массы сут”1400-500200-400Быков, 1980В литературе приводятся данные, свидетельствующие о возмож¬
ности повышения активности первичных реакций фотосинтеза фи¬
зиологически активными веществами, относящимися к группе цито¬
кининов, гиббереллинов и ауксинов (Н.И. Якушина с сотр. 1971,
1982).526
В наших опытах опрыскивание растений в период бутонизации
клевера цитокининоподобным препаратом картолин 2 существенно
повышало активность первичных реакций фотосинтеза и других фи¬
зиологических процессов: заметно возрастала интенсивность фото-
синтетического фосфорилирования и фотохимическая активность в
хлоропластах, в 1,5—2 раза повышалась азотфиксирующая способ¬
ность клубеньков и аттрагирующая активность соцветий. При этом
отмечено увеличение числа семян в головке, количества зрелых голо¬
вок,асбор семян повышался на 12,5—13,0 %(В.М. Ковалев, 1995).Как отмечает А.Т. Мокроносов (1988), на протяжении столетий до
последнего времени практическая селекция обеспечивала выведение
все более продуктивных сортов растений, основываясь на экстенсив¬
ном типе продукционного процесса. Иными словами, создавались
сорта, позволяющие разместить все большее количество фотосинте¬
зирующих единиц (хлоропластов, площади листьев) в единице объе¬
ма и площади посева при максимально возможной продолжительно¬
сти активного фотосинтеза. Эти сорта отличались способностью
формировать в фитоценозе высокий ассимиляционный потенциал
(м • сут), но их фотосинтетический аппарат, его активность почти не
затрагивались и сохранялись на уровне, близком к фотосинтезу ис¬
ходных форм.Однако положительная взаимосвязь между фотосинтетической
продуктивностью и площадью листовой поверхности ограничивается
определенными размерами последней. Например, у зерновых^куль-
тур этот показатель равен 4 —5 м /м посева, у сортов с улучшенной
формой листьев и оптимальным распределением их в пространстве
при достаточном уровне питания — 6—7 м /м (А.А. Ничипорович,
1982; В.А. Кумаков, 1980; И.С. Шатилов, А.Г. Замараев, Г.В. Чапов-
ская, 1988). Дальнейшее увеличение фотосинтетического аппарата на
единице площади ограничивается прежде всего в обеспечении листь¬
ев ФАР.Сорта с повышенной продуктивностью фотосинтеза способны
более эффективно использовать солнечную энергию, элементы пита¬
ния, воду и формировать высокий урожай при относительно неболь¬
шой площади листьев, что снижает опасность полегания посевов.
Показано, что у современных сортов зерновых культур с уменьшени¬
ем высоты стебля и фотосинтезирующей поверхности листьев усили¬
вается перемещение продуктов фотосинтеза в генеративные органы.
Это способствует лучшему питанию цветков, увеличению процента
оплодотворения и завязывания семян и росту продуктивности колоса.Со времени открытия С4-метаболизма и факта практического от¬
сутствия у Севидов фотодыхания при хороших условиях роста суще¬
ственный интерес вызвала перспектива включения такого метабо¬527
лизма или хотя бы части его в важные сельскохозяйственные куль¬
туры с Сз-метаболизмом (Сз-типа). По расчетам исследователей, по¬
вышение продуктивности фотосинтеза у зерновых умеренной
климатической зоны до уровня наиболее продуктивных тропических
и субтропических культур (тип фотосинтеза Q) позволило бы под¬
нять их физиологический потенциал до 150—200 ц/га зерна (Austin,
1982).Характер фотосинтеза — генетически детерминированный при¬
знак. Тот факт, что С4-ТИП фотосинтеза широко распространен и час¬
то варьирует по проявлению внутри одного и того же таксона, свиде¬
тельствует о том, что генетическими или селекционными методами
его можно передать в системы, где он отсутствует. В США, Японии,
Канаде, Австралии и других странах ведется детальное изучение био¬
химической и генетической сущности фотосинтеза См4-типа, с тем
чтобы с помощью метода рекомбинантной ДНК повысить его про¬
дуктивность в первую очередь у зерновых культур (Bodde, 1982).Как показали многочисленные исследования, большинство фо-
тосинтетических показателей полигенны и поддаются селекционно¬
му улучшению наряду с традиционно селектируемыми признаками
(Ю.С. Насыров, 1982; 1986; М. Джиффорд, Л.Д. Дженкинс, 1987; Бы¬
ков, Зеленский, 1987; Зеленский, 1995). Установлены статистически
достоверные сортовые различия по фотосинтетической активности
(интенсивность ассимиляции СО2, содержание хлорофилла, пло¬
щадь флагового листа зерновых, фотовосстанавливающая и кислоро¬
довыделяющая активность хлоропластов, чистая продуктивность фо¬
тосинтеза) у пшеницы, ячменя, овса, кукурузы, сои, вики и др. Пока¬
зан широкий размах изменчивости по этим признакам и выделены
лучшие образцы, характеристики которых стабильно превосходили
средний уровень на 30—60 %. Поэтому поиск форм с высокой фото¬
синтетической активностью и вовлечение их в селекционный про¬
цесс, по мнению ряда авторов (А.А. Ничипорович, 1972; В.А. Кума-
ков, 1980; Образцов, 1981 и др.), является важнейшей задачей иссле¬
дования.Активность ферментов, принимающих участие в ассимиляции
СОг, является одним из важнейших факторов интенсивности фото¬
синтеза и может служить селекционным признаком для отбора гено¬
типов на продуктивность и качество. Изменение активности ключе¬
вых карбоксилирующих ферментов фотосинтеза — РДФК в цикле
Кальвина и ФЕП-карбоксилазы в цикле Хетча—Слэка является од¬
ним из важнейших механизмов регуляции фотосинтеза растений
(Доман, 1972; Андреева, 1974). Установлено, что не только интенсив¬
ность фотосинтеза зависит от количества и активности карбоксили-328
руюшего фермента, но и сам фотосинтез контролирует его уровень в
ткани (Б.А. Рубин, 1977).Ю.С. Насыровым (1986) предложена модель генетической моди¬
фикации реакций карбоксилирования и активации транспорта угле¬
рода в клетках для повышения эффективности фотосинтеза Сз-расте-
ний. В основу этой модели положены представления о том, что в ци¬
топлазме Сз-растений имеются ферменты ФЕП-системы, но их ак¬
тивность в несколько раз ниже, чем у С4-растений. Путем
экспериментального мутагенеза, с последующим генетическим отбо¬
ром мутантов и «разложением» генотипа гибридов в жестких услови¬
ях (хлоридный солевой стресс) выделены формы сахарной свеклы и
хлопчатника с высокой активностью ФЕП-системы, включающие
механизмы регенерации акцептора СО2 через ФЕП-карбоксилазу
или пируватдикиназу. Эта система, по-видимому, служит дополни¬
тельным каналом цитоплазматического связывания и переноса СО2 в
хлоропласты, ограничивает оксигеназную функцию РДФ-карбокси-
лазы — оксигеназы и обеспечивает реассимиляцию СО2 фотодыха¬
ния.У отобранных форм сахарной свеклы и хлопчатника была выше
активность фотосинтетического аппарата и ниже фотодыхание. По¬
лученная форма сахарной свеклы имела большую массу корнеплода и
повышенную сахаристость корня (на 0,8 %). Формы хлопчатника ИФ
и БР-1, БР-2 по качеству волокна относились к IV и V типам соответ¬
ственно, превосходили контрольные растения по урожайности на
10—15 %, а созревание их ускорялось на 5—7 дней.Важным аспектом проблемы отбора по признаку активности фо¬
тосинтеза является влияние на этот процесс интенсивности роста,
т. е. лимитирование фотосинтеза аттрагирующими центрами
(Д.А. Ничипорович, 1988; А.Т. Мокроносов, 1987; М. Джиффорд,
Л.Д. Дженкинс, 1987; М.И. Зеленский, 1995 и др.). Бесполезно повы¬
шать интенсивность фотосинтеза, если активные потребители асси-
милятов (аттрагирующие органы) не соответствуют увеличенному
потоку ассимилятов. Поэтому предварительным условием отбора же¬
лательных форм растений на повышенную интенсивность фотосин¬
теза является наличие сил ьного л имитирования аттрагирующих орга¬
нов продуктами фотосинтеза.Селекционно-технологическийДостижения в области химии, генетики, физиологии растений и
других фундаментальных наук в последние десятилетия явились ба¬
зой для создания в экономически развитых странах широкого спек¬529
тра химических удобрений, пестицидов, регуляторов роста, новых
сортов. Это и послужило основой интенсификации производства,
особенно в последние 25—30 лет (Wittwer, 1979). Однако повышение
урожайности в 2—3 раза в США и странах Западной Европы сопрово¬
ждалось ростом затрат невосполнимой энергии (на удобрения, пести¬
циды, орошение, технику) в 10—15 раз и более (Pimentel, 1981). Наи¬
более затратным фактором в техногенной интенсификации расте¬
ниеводства явилось азотное удобрение, на долю которого приходится
до 1/3 расхода энергии, получаемой из ископаемого топлива. Второе
место занимает орошение — до 20 % используемой энергии. На долю
пестицидов приходится примерно 5 % в общем балансе расходуемой
энергии. Кроме того, возникающие энергетические противоречия
преимущественно техногенной интенсификации растениеводства
обострились его экологической безопасностью.В настоящее время общепризнанным является необходимость пе¬
рехода к так называемой «биологизации» технологий, т. е. макси¬
мального согласования их с биологическими требованиями культуры,
к стратегии адаптивной интенсификации растениеводства, предусмат¬
ривающей более дифференцированное и комплексное использование
генетических, природных ресурсов и техногенных факторов для обес¬
печения устойчивого роста продуктивности, ресурсосбережения и
экологической безопасности (Th. US Drummond, 1975; S.H. Wittwer,
1979; С.Б. Маркарьян, 1987; A.A. Жученко, 1989, 1990).Такой подход предполагает оптимизацию генетических парамет¬
ров растений, повышение их устойчивости к абиотическим и биоти¬
ческим стрессам (засолению и повышенной кислотности почв, высо¬
ким и низким температурам, вредным организмам и др.). При этом,
чем менее благоприятны почвенно-климатические и погодные усло¬
вия, тем роль биологических факторов должна повышаться. Приме¬
нение техногенных факторов (удобрений, пестицидов, регуляторов
роста, орошения и др.) не заменяет, а лишь дополняет интенсифика-
ционные процессы в растениеводстве, базирующиеся на селекцион¬
ном улучшении выращиваемых растений, их оптимальном агроэко-
логическом районировании, конструировании продуктивных и ус¬
тойчивых агроэкосистем.Селекция растений на повышение продуктивности
и устойчивости к стрессамВ 50—60-е годы XX столетия достижения биологической и сель¬
скохозяйственной науки обеспечили в экономически развитых стра¬
нах увеличение урожайности зерновых культур в 2—3 раза и более.530
При этом в среднем треть прироста урожайности была получена за
счет внедрения короткостебельных сортов, повышения устойчивости
растений к болезням и вредителям, отзывчивости на факторы интен¬
сификации земледелия (В.М. Ковалев, 2003).В развивающихся странах (Индия, Мексика) быстрый рост уро¬
жайности зерновых в 60—70-х годах связывают с сортосменой. В эко¬
номически развитых странах, где темпы роста урожайности в этот пе¬
риод были не менее значительными, а абсолютные приросты — на¬
много выше (табл. 10.2), ведущая роль в увеличении производства
зерна отводилась интенсификации земледелия, которая требовала
создания более отзывчивых на данные факторы сортов. Так, в ФРГ в
период с 1952 по 1975 гг. ежегодный прирост урожайности озимой
пшеницы составил 92 кг/га, в том числе 62 % обусловило совершен¬
ствование технологии и 38 % — внедрение новых сортов; яровой
пшеницы — соответственно 82 кг/га, 68 и 32 %; озимого ячменя —
93 кг/га, 81 и 19 %; ярового ячменя — 59 кг/га, 49 и 51 %; овса —
58 кг/га, 59 и 41 %; кукурузы на зерно — 196 кг/га, 65 и 34 %; озимой
ржи —62 кг/га, 13 и 87% (Schuster, 1978).Таблица 10.2. Среднегодовые приросты урожайности зерновых культур в мире
и некоторых зернопроизводящих странах с 1948 по 1988 it. (по данным ФАО)Страна1948/52-1961/651961/65—1967/691967/69—1973/751973/75—1979/811979/81—1986/88ц/га%ц/га%ц/га%ц/га%ц/га%Мир — всего0,292,50,403,30,332,30,533,20,502,3СССР*0,192,40,595,80,251,90,120,80,554,0Великобритания0,853,10,140,50,732,31,173,21,232,6Канада0,161,30,403,10,271,70,472,80,110,5США0,814,00,763,30,401,61,334,30,360,8Франция0,854,31,586,50,933,00,932,61,413,0ФРГ0,492,21,405,40,682,10,551,61,363,1* Зерновые и зернобобовые (с кукурузой) по данным Госкомстата СССР.По данным Национального института агроботаники Великобри¬
тании, до 1957 г. основную роль в росте урожайности зерновых в стра¬
не играли гербициды и удобрения, в последующее десятилетие — по¬
вышение норм азота при возделывании новых, устойчивых к полега¬
нию сортов, после 1967 г.— сортосмена. Удельный вес селекции в531
приросте урожайности пшеницы по этим периодам составлял соот¬
ветственно 38,42 и 60 % (Silvey, 1978). Созданные в Великобритании
в 70—80-е годы короткостебельные высокопродуктивные сорта ози¬
мой пшеницы позволили полностью обновить сортимент культуры.
Потенциал продуктивности современных сортов английской селек¬
ции достиг 140 ц/га. Они толерантны к повышению уровня азотного
питания, высокой плотности стеблестоя и практически не нуждаются
в применении ретардантов.Уборочный индекс английских пшениц (0,6) приблизился, по
мнению специалистов, к максимально возможному (Austin, 1982).В США наиболее резкое повышение продуктивности зерновых
наблюдалось в 50—70-е годы в результате изменения структуры посе¬
вов в пользу более урожайных культур, сортосмены, использования
лучших семян, широкого применения удобрений, пестицидов и оро¬
шения, совершенствования сельскохозяйственной техники (Heady,
Auer, 1966; Smith, 1985).В бывшем СССР наибольшие среднегодовые приросты урожай¬
ности зерновых культур наблюдались в 60-х и 80-х годах, соответст¬
венно, 0,59 и 0,55 ц/га (табл. 10.2). В 60-х и примерно до середины
70-х годов прогресс в селекции зерновых соответствовал возросшему
уровню интенсификации и культуры земледелия. С появлением сор¬
тов полуинтенсивного типа — пшеницы Мироновская 808, Безос¬
тая 1, ячменя Московский 121, ржи Восход 1 и Восход 2 и др., сущест¬
венно возросли в стране урожайность и валовые сборы зерна. Однако
в дальнейшем это равновесие было нарушено. Быстрые успехи селек¬
ции в создании высокопродуктивных короткостебельных сортов ин¬
тенсивного типа, требовавших высокого агрофона и дифференциро¬
ванной агротехники, максимально точного учета биологии сорта и
растений, не сопровождались соответствующим прогрессом земледе¬
лия в производственных условиях. В результате сорта, обеспечиваю¬
щие весомые прибавки урожая в условиях высокой культуры земледе¬
лия на этапах их создания и сортоиспытания, в производстве резко
снизили урожайность. С другой стороны, адаптивные свойства ин¬
тенсивных сортов часто не отвечали экологическим условиям возде¬
лывания. Например, повсеместная замена в конце 70-х — начале 80-х
годов в Нечерноземной зоне России сорта ячменя Московский 121 на
высокопродуктивные, более устойчивые к полеганию сорта зарубеж¬
ной селекции (Надя, Эльгина, Дворан и др.) на 80 % площадей посева
не дали должной отдачи из-за несоответствия культуры поля требова¬
ниям этих сортов и их биологии в более экстремальных условиях Не¬
черноземья (Неттевич, 1986).532
Повышение среднегодовых приростов урожайности зерновых в
80-х годах обусловлено широкомасштабным применением в этот пе¬
риод интенсивных технологий их возделывания, связанных с резким
увеличением уровня техногенных факторов. Однако, как показал
опыт освоения интенсивных технологий за ряд лет, их отдача в целом
по стране оказалась намного ниже нормативной. Тормозом на пути
технологического обновления производства во многих случаях стали
недостаточно устойчивые к стрессовым факторам среды сорта и гиб¬
риды сельскохозяйственных культур. В решении этой проблемы
большое значение имеют методы биотехнологии и биоинженерии.10.2. МОНИТОРИНГ ПРОДУКЦИОННОГО ПРОЦЕССАПродукционный процесс следует рассматривать как сумму и взаи¬
модействие между собой одновременно протекающих в растении физио¬
логических, биохимических, биофизических и других процессов, обеспечи¬
вающих формирование хозяйственно-ценных органов растения и продук¬
тов вторичного обмена путем оптимизации и координации этих процес¬
сов на основе генетической, гормональной детерминации и донорно-ак-
цепторных отношений.Для принятия необходимых мер в ходе формирования урожая тре¬
буется диагностика состояния посевов. Этой цели служит биологиче¬
ский контроль — система мониторинга показателей биологических
процессов у растений в онтогенезе, коррелирующих с ходом формирова¬
ния урожая посевами в конкретных условиях выращивания.С целью получения непрерывной информации о ходе продукцион¬
ного процесса у растений разрабатываются и применяются методы ав¬
томатической прижизненной регистрации важнейших его показате¬
лей: фотосинтеза (А.Т. Мокроносов, 1988), роста (B.C. Шевелуха,
1992), проводится диагностика минерального питания растений в он¬
тогенезе (Церлинг, 1990) и др.На основании полученной информации принимаются решения о
необходимости применения соответствующих технологических и
других приемов (орошение, удобрение, регуляторы роста, средства
защиты растений и т. п.) для управления продукционным процессом
у растений, ходом формирования урожая и его качеством.С позиций комплексного подхода растительный организм пред¬
ставляет собой открытую, неравновесную, саморегулирующуюся и
саморазвивающуюся систему, способную к самовоспроизведению.
Его целостность обеспечивается генетической детерминацией и
функционированием гормональной, трофической, электрофизиоло-
гической и других систем регуляции. Усиливая или ослабляя рост,533
развитие и другие процессы, эти системы во взаимодействии с факто¬
рами внешней среды и приемами агротехники определяют тип мор¬
фогенеза, структуру, продуктивность, качество и адаптацию расте¬
ний.Контрольные вопросы к главе 101.	Как происходит генетическая регуляция роста и развития у растений?2.	С помощью каких механизмов осуществляется регуляция синтеза фито¬
гормонов?3.	От каких процессов зависит уровень фитогормонов в определенном орга¬
не?4.	В чем различия между понятиями «фитогормон» и «фиторегулятор»? Гор¬
мональный статус растений и методы его мониторинга.5.	Какими способами можно увеличить содержание абсцизовой кислоты в
растении?6.	От каких факторов зависит эффективность применения фиторегуляторов
на посевах сельскохозяйственных культур?7.	Генетическая и экологическая безопасность применения регуляторов
роста в растениеводстве. Методы контроля.8.	В чем состоят различия в интенсивности газообмена у С3- и С4-растений?9.	Биотехнологические методы повышения продуктивности фотосинтети-
ческого аппарата растений.10.	Применение методов биоинженерии для создания форм сельскохозяй¬
ственных растений с повышенной активностью фотосинтеза.11.	Суточная динамика интенсивности фотосинтеза, дыхания и роста у сель¬
скохозяйственных растений в онтогенезе. Пути повышения КПД ФАР в посевах.12.	Назовите основные биотехнологические факторы повышения продук¬
тивности растений и устойчивого роста урожая.13.	Какие биотехнологические приемы в селекции направлены на повыше¬
ние продуктивности и устойчивости растений к стрессам?14.	Что такое продукционный процесс?15.	Биологический контроль в посевах: назначение, методы.16.	Методы мониторинга продукционного процесса у растений и в посевах.ЛИТЕРАТУРАДеева В.П., Шелег З.И., Санько Н.В. Избранное действие химических
регуляторов роста на растение. Физиологические основы.— Минск: Наука и
техника, 1988.Дубинин Н.П. Новое в современной генетике.— М.: Наука, 1986.ДерфлингК. Гормоны растений. Системный подход.— М.: Мир, 1985.Жученко А.А. Адаптивное растениеводство (эколого-генетические осно¬
вы) — Кишинев: Штиинца, 1990.Кефели В.И. Физиологические основы конструирования габитуса расте¬
ний.— М.: Наука, 1994.Ковалев В.М. Теория урожая.— М.: МСХА, 2003.534
Ковалев В.М. Агрофизиологическое обоснование параметров комплекс¬
ной модели потенциальной продуктивности кормовых культур и способов ее
повышения экзогенными регуляторами роста//Дис. ... докт. биол. наук в
форме научного доклада.— М.: МСХА, 1995.Ковалев В.М., Глушкова Т.Н., Калашникова Е.А. Особенности морфоге¬
неза картофеля in vitro при использовании цитокининов//С.-х. биология.
2002. № 1. С. 88-90.Корнеева И.В., Мазин В.В., Агафодорова М.Н. Изучение трансформантов
люцерны изменчивой (Medicago varia шар1)//Физиология и биохимия куль¬
турных растений.—М., 1999. Т. 31, №3. С. 186—195.Кумаков В.А. Физиология яровой пшеницы.— М.: Колос, 1980.Курсанов АЛ. Транспортассимилятов в растении.— М.: Наука, 1976.Леопольд А. Рост и развитие растений.— М.: Мир, 1968.Мокроносов А.Т. Фотосинтез и продукционный процесс//Физиология
растений на службе продовольственной программы. Сер. Биология.— М.,
1988. С. 3-18.Муромцев Г.С. Достижения и перспективы исследований по биотехноло¬
гии сельскохозяйственных растений//С.-х. биология. — М.: 1996. № 5.
С. 3-9.Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н. и др. Основы химической
регуляции роста и продуктивности растений.— М.: Агропромиздат, 1987.Насыров Ю.С. Физиологическая стратегия селекции растений//Селек-
ция продуктивных сортов. Сер. Биология.—М., 1982. С. 31—43.Никелл JI. Дж. Регуляторы роста растений.— М.: Колос, 1984.Ничипорович А.А. Физиология фотосинтеза и продуктивность расте-
ний//Физиология фотосинтеза.— М.: Наука, 1982. С. 7—33.Полевой В.В. Физиология растений.—М.: Высшая школа, 1989.Рубин Б.А. Физиология сельскохозяйственных растений. Т. 6.— М.:
МГУ, 1970.Сельскохозяйственная биотехнология/Под ред. B.C. Шевелухи.— М.:
Высшая школа, 1998.Сельскохозяйственная биотехнология/Под ред. B.C. Шевелухи.
Том 1.— М.: Воскресенье, 2000.Сельскохозяйственная биотехнология. Том 2.— М.: Воскресенье, 2001.Тимирязев К.А. Земледелие и физиология растений.— М.: Сельхозгиз,
1957.ХрипачВ«А.идр. Брассиностероиды.— Минск.: Наука и техника, 1993.ЧайлахянМ.Х. Регуляция цветения высших растений.— М.: Наука, 1988.Шевелуха B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе.— М.: Колос,
1992.Шевелуха B.C., Блиновский И.К., Хрусталева Л.И. и др. Методические
рекомендации по комплексной оценке генетического риска применения фи¬
торегуляторов в растениеводстве.— М.: МСХА, 1992.Шевелуха B.C., Ковалев В.М. Связь суточной периодичности линейного
роста с фотосинтезом, дыханием и ходом накопления урожая у озимой пше¬535
ницы в онтогенезе//Периодичность и ритмичность роста сельскохозяйст¬
венных растений. Т. 107.— Горки: БСХА, 1973. С. 25—34.Шевелуха В.С., Ковалев В.М. Ауксанографический способ в оценке ус¬
тойчивости растений//Диагностика устойчивости растений к стрессовым
действиям. Методическое руководство.—Л.: ВИР, 1988. С. 211—216.Шевелуха B.C., Ковалев В.М., Курапов П.Б. Регуляторы роста и пробле¬
мы селекции растений//Физиологические основы селекции. Теоретиче-
ские основы селекции. Т. II, ч. 1.—СПб.: ВИР, 1995. С. 259—292.Юсибов В.М., Адрианов В.М., Пирузян Э.С. и др. Получение и анализ
трансгенных растений картофеля с измененным балансом фитогормо-
нов//Материалы 1-го Всесоюзного симпозиума «Новые методы биотехноло¬
гии растений».— Пущино, 1991. С. 51.
Глава 11БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
В БИОТЕХНОЛОГИИИзучение и использование биохимических процессов в биотехно¬
логиях имеет как теоретическое, так и практическое значение в сле¬
дующих важнейших направлениях:—	выявление биохимических особенностей генома у прокариоти¬
ческих и эукариотических организмов;—	выявление участия генов в процессах усвоения растениями мо¬
лекулярного и нитратного азота;—	определение отдельных этапов биосинтеза аминокислот (их ак¬
тивации) и биосинтеза белка, катализируемого специфическими
ферментами — участвующими в процессах репликации, транскрип¬
ции, трансляции.По этим направлениям составлена классификация механизмов
внутриклеточной регуляции активности генов; дана биохимическая
характеристика морфогенеза и регенерации организмов и др.Слабо изученными остаются вопросы биохимии экспрессии ге¬
нов в процессе трансгеноза, недостаточно охарактеризованы генети¬
чески модифицированные организмы с точки зрения их химического
состава, питательной ценности. Неизвестна пригодность ГМО для
использования в качестве эффективных источников новых фермен¬
тов, биологически активных веществ, которые можно использовать в
медицине, сельском хозяйстве и других отраслях.Отстают работы по инженерной энзимологии, выделении наибо¬
лее эффективных адсорбентов — носителей иммобилизованных на
них ферментов, которые при многоразовом использовании сохраня¬
ли бы свою активность и были бы экономически выгодными. В на¬
стоящее время перспективным направлением в области биокатализа
иммобилизованными ферментами представляется использование
макроструктурированных носителей сложной геометрической фор¬
мы, таких как сотовые монолиты, ячеистые пеноматериалы и т. п.537
Одним из важнейших современных направлений биохимии в
биотехнологии является так называемая метаболическая инженерия,
разрабатываемая все еще на бактериальных клетках.Исследователи, работающие в области молекулярной биологии и
биотехнологии, стали решать задачи оптимизации экспрессии го-
мо- и гетерологичной генетической информации в бактериальных
клетках фактически сразу после появления прецизионных методов
конструирования рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Формально
датой выделения этого направления в относительно самостоятель¬
ный отдел биотехнологии можно считать 1978 г., когда задача «Мак¬
симизация экспрессии генов» была сформулирована в названии ста¬
тьи группы, руководимой лауреатом Нобелевской премии проф.
Mark Ptashne. В этой работе было показано, что для достижения эф¬
фективной экспрессии целевого гена в бактериальной клетке необхо¬
димо создание и использование искусственных прокариотических
регуляторных элементов, способных обеспечить высокоэффектив¬
ную инициацию транскрипции соответствующей ДНК и инициацию
трансляции образующейся мРНК. В дальнейшем подобные исследо¬
вания проводились многими учеными в зарубежных и отечественных
лабораториях. Была подробно изучена роль отдельных этапов реали¬
зации генетической информации:—	исследовали различные по «силе» регулируемые и конститутив¬
ные прокариотические промоторы, обеспечивающие инициацию
транскрипции целевых генов;—	создавали искусственные участки взаимодействия с рибосома¬
ми (RBS), структура которых определяла эффективность инициации
трансляции образующихся мРНК;—	предпринимали попытки защиты мРНК от деградации бакте¬
риальными РНКазами, увеличения эффективности трансляции гете-
рологичных генов, содержащих редкие для бактериальной клет¬
ки-хозяина аминокислотные кодоны;—	изучали различные способы стабилизации образующегося бел¬
кового продукта.Принципиально по-иному решается проблема оптимизации экс¬
прессии генов в том случае, когда задачей исследователя является
создание штамма-продуцента природного метаболита бактериальной
клетки, образование которого в естественных условиях является
результатом скоординированной деятельности нескольких, а то и не¬
скольких десятков ферментов, например при создании продуцентов
витаминов, аминокислот, нуклеотидов. Само решение поставленной538
задачи немыслимо без проведения предварительных значительных
модификаций бактериального генома:—	инактивация генов некоторых репрессоров;—	введение мутаций по генам ключевых ферментов, снимающих
их способность ингибироваться конечным продуктом цепи целевых
реакций, и др.Здесь необходима истинная «оптимизация» и координация рабо¬
ты большого числа генетических систем, изначально находящихся к
тому же под сложным контролем различных типов метаболической
регуляции. Сведения о системах метаболической регуляции в настоя¬
щее время стремительно пополняются, особенно в связи с бурным
развитием таких направлений исследования «организмов как целост¬
ных систем», как «DNA array», «Протеомика», «Метаболомика», ана¬
лиз распределения потоков углерода в центральном метаболизме
и т. п.Все эти исследования являются основой нового направления био¬
технологии XXI века — «Metabolic Control Engineering».11.1.	БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМА
ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОКГеном эукариотических клеток устроен значительно сложнее, чем
у прокариот, что определяется большим объемом информации, необ¬
ходимой для нормальной жизнедеятельности многоклеточного орга¬
низма, состоящего из специализированных клеток, органов, тканей.
Поэтому в ходе эволюции по мере усложнения клетки как правило
возрастает масса ДНК в хромосомах и становится более сложной вся
система управления и регуляции экспрессией генов.Гены и геном эукариотических клеток в целом экспрессируются
через генетические и биохимические процессы.В хроматине ядра ДНК связаны с комплексами основных белков
(гистонов), а также с негистоновыми белками, РНК и небольшим ко¬
личеством липидов. Гистоны и двойная спираль ДНК вместе пред¬
ставляют собой правильную структуру, состоящую из нуклеосом и
участков молекулы ДНК между ними. Нуклеосома — это комплекс
из восьми молекул гистоновых белков, на который «нанизаны» петли
ДНК из 140...200 пар нуклеотидов. В составе нуклеосом ДНК менее
доступна действию эндонуклеаз, которые легче расщепляют ДНК,
занимающие междунуклеосомные участки.Почти все гены (цистроны) эукариот, кодирующие функциональ¬
но связанные белки, находятся на разных участках хромосом. Исклю¬539
чение составляют только гистоновые гены и гены рРНК. Напротив, у
прокариот все гены объединены в опероны.Почти все молекулы РНК синтезируются в виде более высокомо¬
лекулярных предшественников (проРНК). После синтеза первично¬
го транскрипта происходит его процессинг (созревание), включающий
в себя кэпирование, метилирование, полиаденилирование, фрагмента¬
цию и сплайсинг. Полупериод жизни большинства молекул мРНК эу¬
кариот составляет 3—48 ч.Как правило, в ДНК эукариот нараду с уникальной последова¬
тельностью нуклеотидов обнаруживается огромное количество по¬
второв, т. е. повторяющихся последовательностей. В большинстве ге¬
номов растений число уникальных участков в геноме составляет все¬
го 20—30 %. Ученые считают, что повторы также важны с биохимиче¬
ской точки зрения, так как они необходимы для регуляции экспрессии
генов.11.2.	БИОХИМИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
В АЗОТНОМ И БЕЛКОВОМ ОБМЕНАХ У РАСТЕНИЙПервичным источником белка на нашей планете являются расти¬
тельные организмы с их замечательной способностью синтезировать
белок из углекислоты, воды и неорганических источников азота. По¬
этому понятно, какое большое теоретическое значение имеет иссле¬
дование генетических и биохимических механизмов процессов, ле¬
жащих в основе усвоения азота растениями и его превращений в ами¬
нокислоты и белки. Ассимиляция нитрата у большинства куль¬
тур — это основной способ превращения неорганического азота в
органические соединения. При этом нитрат превращается в аммоний
за счет действия механизма поглощения нитрата и двух ферментов:
нитратредукгазы (HP) и нитритредуктазы (НИР). Таким образом,
азот становится доступным для многих биосинтетических процессов,
наиболее важным из которых с количественной точки зрения являет¬
ся синтез белка. Известно, что в регуляции процессов на этом пути
определенную роль играют доступность нитрата и гормонов, свет и
конечные продукты реакции. Данные физиологических и биохими¬
ческих исследований, однако, почти не раскрывают молекулярные
механизмы, лежащие в основе развития и регуляции реакций, входя¬
щих в этот процесс. Такая информация очень важна, если ученые
стремятся понять, каким образом новые методы молекулярной био¬
логии могут быть использованы для повышения эффективности ас¬
симиляции нитрата и, следовательно, повышения содержания белка
в растениях.540
За последние 10—15 лет в изучении генетики ассимиляции нитра¬
та достигнут значительный прогресс, поэтому этот процесс — наибо¬
лее подробно охарактеризованный путь метаболизма высших расте¬
ний. Генетические исследования представляют собой первый важ¬
ный шаг в изучении данного метаболического пути на молекулярном
уровне.Кодирование белков HP и НИР. Среди двух ключевых ферментов
ассимиляции нитратов HP и НИР последняя изучена лучше с точки
зрения генетического контроля ее биосинтеза. Среди высших расте¬
ний лучше всего охарактеризована НИР шпината, имеющая один че-
тырехядерный кластер, содержащий железо и серу (Fe4S4>, и один си-
рогем на каждую пептидную цепь с молекулярной массой 60 ООО. Си-
рогем представляет собой диметилуротетрагидропорфирин изобакте-
риохлоринового типа. Сейчас известны некоторые характеристики,
касающиеся кодирования белка НИР. Например, НИР овса кодиру¬
ется ядром, НИР пшеницы с молекулярной массой 60 500 синтезиру¬
ется на рибосомах цитоплазмы в виде предшественника с молекуляр¬
ной массой 64 000. Известно, что ряд других локализованных в хлоро-
пластах белков синтезируется в цитоплазме в виде продуктов с более
высокой молекулярной массой, а затем переносится в хлоропласты,
где происходит их процессинг с образованием зрелой формы.Исследователи считают, что отбирать HP-дефицитные или
HP-минус мутанты на уровне культуры клеток — дело трудное. Не¬
достатком отбора мутантов в культуре клеток является то, что не всег¬
да удается регенерировать целые фертильные растения. Это мешает
изучению мутаций при помощи обычного генетического анализа.
Известно, что наиболее убедительным доказательством того, что му¬
тация действительно произошла, служит возможность регенерации
фертильных растений из клеточных линий и передачи признаков по¬
лученного варианта потомству от половых скрещиваний. Пока это не
будет сделано, полученные изоляты можно описывать как «феноти¬
пические варианты» или «клеточные линии», а не как мутанты. Не¬
возможность регенерации мутантов препятствует изучению физио¬
логии и биохимии интактного растения и ограничивает их ценность
для соматической гибридизации и трансформации растений.Биосинтез аминокислот. Исходными веществами для синтеза ами¬
нокислот являются органические кислоты и аммиак, которые посту¬
пают из почвы, атмосферы в результате распада белков или же образу¬
ются в цепи редукции нитратов.Аминокислоты — основные структурные единицы, из которых
построены молекулы всех белковых веществ. Это производные ки¬541
слоты жирного или ароматического рядов, содержащие одновремен¬
но аминогруппу NH2 и карбоксильную группу— СООННIR - С -ООНInh2Аминогруппа может быть расположена в а*, (J- и у-положениях по
отношению к карбоксилу. Существуют разнообразные способы клас¬
сификации аминокислот, основанные на различной природе
R-групп. Этот способ касается «слов» генетического кода, который
соответствует определенным аминокислотам, встречающимся в бел¬
ках. Обычно аминокислоты обозначают трехбуквенными символами.
Недавно была принята однобуквенная система, чтобы облегчить
сравнение аминокислотных последовательностей в гомологичных
белках. Например, написание незаменимых кислот выглядит так:Лизин — Лиз Lys — К;Триптофан — Три Try — W;Гистидин — ГС His — Н;Лейцин — Лей Leu — L;Изолейцин — Иле lieu — I;Треонин — Тре Thr — Т;Метионин — Мет Met — М;Валин — Вал Val — V.Для каждой из 20 аминокислот имеется соответствующая аминоа-
цил-тРНК-лигаза, которая в цитоплазме соединяет аминокислоту с
TPHK(tRNA) (рис. 11.1). Процесс активации аминокислот осуществ¬
ляется в две стадии.Элементы биохимической генетики азотфиксации. За последние
годы достигнуты большие успехи в биохимической генетике азот¬
фиксации. Первоначально ученые предполагали, что имеется немно¬
го генов, кодирующих нитрогеназу (nif-гены). Было установлено, что
nif-гены у К. pneumoniae располагаются в хромосоме рядом с генами,
кодирующими биосинтез гистидина, и если гистидиновый оперон
(his) с прилегающим к нему участком ДНК перенести путем конъюга¬
ции в Е. coli, то этот последний микроб приобретает способность к
фиксации азота. Было показано, что гены азотфиксации располага¬
ются рядом с his-опероном (рис. 11.2). При дальнейших исследовани¬
ях было обнаружено, что nif-оперон устроен гораздо сложнее, чем это
предполагали сначала. В настоящее время у К. pneumoniae известно по542
Нормальныйглобиновый Мутантный
ген ф-цепь) глобиновый генCCTGAGGAG5'CCTGAGGAG.Оодстсстс3'GGACACCTCI	IТранскрипция Транскрипцияt mRNA t
Vl CCUGAGGAG) Vl CCUGUGGAG \С A T = His
Пример прочтения
кода—Pro—Glu—Glu— —Pro—Val—Glu—МутацияАминокислотаAdeАнтикодон — узнающий доменtRNAAsp1 ATPАминоациладенилат*H3N О
31 II5'r-c-c-®-o-ch2'	LoHO OHAdeГ4'|-O-CHj
OHbLl^H H^H'Ni H° °HATP|fCyt®H3N О
R-C-C-0 OHmАминоацил ф”° 2 Ade
tRNA о он‘ гКн Амино¬
ацил
o' i* tRNA
CytАктивный
центр ^Белок	tRNA^PРис. 11.1. Генетический код, активация трансляции:а — генетический код; б — активация аминокислот; в — Asp-tRNA-лигаза (димер)
(Koolman J., Rohm К.Н., 2004)
НитрогеназаРис. 11.2. Схема организации nif-генов в хромосоме Klebsiella pneumoniae(Denarii etal, 1981):FeMo-co — железомолибденовый кофактор; KP1 — FeMo-белок нитрогеназы Klebsiella
pneumoniae; Kp2 — Fe-бёлок К.1. pneumoniae (no A. Dixon, 1984)крайней мере 17 генов, кодирующих различные компоненты процес¬
са азотфиксации (A. Dixon, 1984).Расположение этих генов в хромосоме К. pneumoniae схематиче¬
ски показано на рис. 11.2: гены располагаются в один ряд, один за
другим и сгруппированы они в 8 оперонах.Ген nif-F кодирует флаводоксин, a nif-J — восстановление в ана¬
эробном метаболизме йод действием пируват-флаводоксин-оксидо-
редуктазы. Три гена (nif-H, nif-D, nif-K), расположенные в одном
опероне, кодируют структурные белки нитрогеназы, а гены nif-B,
nif-N, nif-V кодируют кофакторы FeMo-co. От гена nif-Q зависит по¬
глощение молибдена, необходимого для синтеза нитрогеназы. Гены
nif-L и nif-Aрегулируют процесс транскрипции компонентов nif-one-
рона. Доказано, что экспрессия nif-генов у К. pneumoniae происходит
только в отсутствие ионов аммония и в анаэробных условиях, что
свидетельствует о том, что переносятся не только структурные, но и
регуляторные гены нитрогеназы. «Перенос» nif-генов был осуществ¬
лен не только в Е. coli, но и в Salmonella typhimurium, Pseudomonas sp.,
Agrobacterium tumefaciens и др.Среди азотфиксирующих организмов ученые обнаружили суще¬
ственные различия. У некоторых Rhizobium в зависимости от скоро¬
сти их роста nif-гены локализованы в плазмиде с молекулярной мас¬
сой от 35 ООО до 300 ООО. Существенно различаются по своей структуре
участки ДНК, кодирующие nif-гены у Rhizobium и К. pneumoniae: у
К. pneumoniae участок ДНК, содержащий nif-гены, охватывает сег¬
мент, состоящий из 24 килооснований, например, у Rh. melioti по¬
добный участок содержит всего 14—15 килооснований, причем неко¬544
торые гены располагаются в других участках ДНК. Намечаются суще¬
ственные различия и в локализации структурных генов нитрогеназы.
Например, у Klebsiella, Anabaena и медленнорастущих ризобиумов
структурные гены нитрогеназы находятся в хромосоме, а у быстрора¬
стущих Rhizobium они расположены в плазмидах.Нотрогеназа — это фермент со смешанными функциями: она ка¬
тализирует не только восстановление N2 до аммиака, но и восстанов¬
ление других соединений и частиц, в том числе частиц до молекуляр¬
ного водорода клубеньками гороха, корневыми клубеньками сои,
красного клевера. Как было показано исследованиями Г. Жизнев-
ской (1985), корневые клубеньки красного клевера с высоким содер¬
жанием фитоглобина до 68 % энергии расходовали на выделение Н2,
причем этот процесс блокировался, если усиливалась азотфиксация.
Ученые доказали, что гидрогеназа, сосредоточенная в бактероидах
некоторых сортов сои, способна не только выделять водород, но и ак¬
тивно поглощать его и окислять, т. е. катализирует его рециклизацию.
Такая система названа Ьир-гидрогеназой (hydrogen uptake).Сейчас доказано, что главная функция Ьир-гидрогеназы заключа¬
ется в предохранении нитрогеназы от повреждения кислородом.Кроме nif- и hup-генов в клубеньках содержатся также nod-гены,
от которых зависит процесс образования клубеньков и содержащихся
в них специальных белков — нодулинов. Это гены растительного про¬
исхождения. Например, в клубеньках сои содержится по крайней
мере три типа нодулинов:—	белки, обеспечивающие структуру клубенька,-белки-ферменты, необходимые для ассимиляции азота,—	белки, обеспечивающие функционирование бактероидов.К последней группе принадлежит фитоглобин, найденный в клу¬
беньках всех бобовых растений.Биохимический и молекулярный анализы функций растений. В про¬
цесс образования клубеньков и азотфиксации включено большое ко¬
личество генных продуктов, многие из которых выполняют в расте¬
ниях «нормальные» функции и используются в иных метаболических
путях развития. Другие продукты могут быть более или менее специ¬
фичными. В последние десять лет молекулярный анализ был сосре¬
доточен на специфических белках. К нодулину можно также отнести
белки, накапливающиеся в клубеньке. В настоящее время данное оп¬
ределение в основном относится к корням как контрольным тканям,
но не всегда, потому что в некоторые симбиотические функции могут
быть включены гены, которые экспрессируются только в других тка¬
нях и в другое время в процессе онтогенеза растений.35-4266
Биохимики достигли больших успехов при изучении нодулинов
гороха, сои. У гороха Бисселинг с сотр. (1985) идентифицировали во¬
семь нодулинов, которые согласованно экспрессировались вместе с
леггемоглобином тогда, когда клубенек инфицирован бактерией,
способной или неспособной к азотфиксации. Подобным образом
хромосомальный репликон (в сравнении с плазмидой) был необхо¬
дим для полной экспрессии нодулинов Rhizobium, в то время как
трансконъюганты Agrobacterium tumefaciens содержали только один
нодулин. Такие же результаты известны для сои и люцерны.11.3.	БИОСИНТЕЗ БЕЛКА И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ
НА ГЕНЕТИЧЕСКОМ УРОВНЕБелки занимают первое место среди органических соединений,
встречающихся в клетке, — на их долю приходится не менее 50 % су¬
хого веса клетки. Они играют первостепенную роль в структуре и
функции клетки, так как именно они являются теми «молекулярны¬
ми инструментами», при помощи которых реализуется генетическая
информация.Генетический код, активация аминокислот. А. Генетический код.
Большая часть генетической информации, содержащейся в ДНК, ко¬
дирует последовательность аминокислот. Процесс экспрессии гене¬
тической информации включает транскрипцию «текста», записанно¬
го на «языке белков». Таково происхождение термина трансляция
(дословно — перевод), используемого для обозначения процесса
биосинтеза белков. Правила, которым следует трансляция, называют
генетическим кодом.Поскольку в биосинтезе участвуют 20 аминокислот, называемых
протеиногенными, «язык» нуклеиновых кислот должен содержать по
крайней мере 20 слов (кодонов). Однако в аминокислотном «алфави¬
те» имеется только четыре «буквы» (А, Г, Ц и У или Т (или в англ.
транскрипции: A, G, С и U или Т), так что для получения 20 различ¬
ных слов каждое должно состоять по крайней мере из трех букв. Ко¬
доны действительно включают три азотистых основания (триплет
нуклеотидов). На схеме 1 (см. рис. 11.1, а) представлен стандартный
код ДНК (последовательность триплетов в некодирующей цепи),
изображенный в виде круга. Схема читается от центра наружу, так
что, например, триплет CAT кодирует аминокислоту гистидин.
ДНК-кодоны идентичны таковым в мРНК (mRNA), за исключением
того, что 4-е азотистое основание в РНК — это урацил, а в состав546
ДНК вместо урацила входит тимин (Т). В качестве примера прочте¬
ния кода на схеме 2 (см. рис. 11.1, а) показаны короткие участки нор¬
мального и мутантного гена Р-глобина вместе с соответствующими
последовательностями мРНК и аминокислот. Здесь показаны отно¬
сительно часто встречающиеся такие мутации, в результате которых
остаток глутаминовой кислоты в положении 6 P-цепи заменен на ва-
лин. Такой мутантный гемоглобин в дезоксиформе склонен к агрега¬
ции, что вызывает деформацию эритроцитов и уменьшает эффектив¬
ность транспорта кислорода (серповидноклеточная анемия).В триплетном генетическом коде для 20 аминокислот существует
43 = 64 кодона. Таким образом, большинство аминокислот записыва¬
ется несколькими кодонами, т. е. генетический код является вырож¬
денным. Кроме того, имеются три триплета, которые обозначают ко¬
нец транскрипции (стоп-кодоны). Еще один специальный кодон,
стартовый (инициирующий) кодон, маркирует начало трансляции.
Генетический код, показанный на рис. 11.1, а схема 1, является почти
универсальным. Этому стандарту не полностью соответствуют только
митохондрии и некоторые микроорганизмы.Б. Активация аминокислот. Ранее упоминалось, что процесс акти¬
вации аминокислот осуществляется в две стадии (см. рис. 11.1, б).
Сначала аминокислота связывается с ферментом (соответствующей
аминоацил-тРНК-лигазой) и реагирует с АТФ (АТР), образуя макро-
эргический смешанный ангидрид — аминоациладенилат. Затем ами-
ноацильный остаток переносится на концевую З'-ОН-группу конце¬
вого остатка рибозы тРНК (другой группой лигаз аминоацил перено¬
сится на 2'-ОН-группу). В аминоацил-РНК карбоксильная группа
аминокислотного остатка этерифицируется остатком рибозы З'-кон-
цевого остатка аденозина, входящего в последовательность....
ССА-3'.Точность трансляции зависит от субстартной специфичности
аминоацил-тРНК-лигаз. Корректирующий механизм активного
центра лигазы обеспечивает немедленное удаление ошибочно при¬
соединенных аминокислотных остатков. В среднем встречается толь¬
ко одна ошибка на 1300 аминокислотных остатков — поразительно
высокая точность «работы», если представить, насколько близки
структуры некоторых аминокислот.В. Asp-tPHK-лигаза (димер). Процесс активации аминокислот рас¬
смотрим на примере лигазы, специфичной для аспарагиновой кисло¬
ты (см. рис. 11.1, в). Молекулы фермента связаны между собой в ди¬
мер, причем каждая субъединица ассоциирована с одной молекулой
тРНК. В активном центре присутствует остаток АТФ, связанный с547
З'-концом тРНК. Другой домен белка (слева вверху) отвечает за «уз¬
навание» антикодона тРНК.Генетическое кодирование аминокислотных последовательностей в
белках. Известно, что последовательность аминокислот в каждом
белке определяется последовательностью мононуклеотидных строи¬
тельных блоков в отдельных отрезках линейной молекулы дезоксири¬
бонуклеиновой кислоты (ДНК). Определенные триплеты мононук¬
леотидов в цепи ДНК, так называемые кодоны, соответствуют опреде¬
ленным аминокислотам. Последовательность кодонов в ДНК колли-
неарна аминокислотной последовательности кодируемой ею
полипептидной цепи. Участок молекулы ДНК, кодирующий одну
полную полипептидную цепь, называется цистроном или геном. В на¬
стоящее время накоплено много сведений о белках и их биологиче¬
ской активности на основе исследования молекулярных взаимодей¬
ствий между генами и белками, поскольку структура и функция бел¬
ков в конечном итоге являются отражением их аминокислотной по¬
следовательности. Установление взаимосвязи генов и белков
позволило ученым по-новому взглянуть на проблемы биохимии бел¬
ков и эволюции белковых молекул.В процессе биосинтеза белка случаются ошибки, следствием ко¬
торых является изменение нормальной последовательности амино¬
кислотных остатков. Образующийся аномальный белок, лишенный
биологической активности, является результатом генетической мута¬
ции. Она происходит, если в ДНК, кодирующей данную полипептид¬
ную цепь, химически изменяется или выпадает одно мононуклеотид-
ное звено или же если в эту ДНК включается один лишний мононук¬
леотид. При этом нормальная, непрерывная последовательность ко¬
дирующих триплетов в гене изменяется и соответствующим образом
изменяется аминокислотная последовательность полипептидной
цепи, кодируемой этим геном. В большинстве случаев процесс огра¬
ничивается заменой одной-единственной аминокислоты на другую.
Исследование таких мутантных белков (т. е. белков с каким-либо из¬
менением, являющимся результатом мутации) представляется очень
важным, так как оно дает возможность обнаруживать те аминокис¬
лотные остатки полипептидной цепи, которые играют существенную
роль в определении структуры и функции белка.Рибосомы: инициация трансляции. Биосинтез белка (трансляция),
как и активация аминокислот, происходит в цитоплазме. Она осу¬
ществляется нуклеопротеидными частицами, называемыми рибо¬
сомами.А.	Структура рибосом эукариот. Рибосомы состоят из двух раз¬
личных субчастиц, каждая из которых построена из рибосомальной548
РНК [рРНК (rRNA)] и многих белков. Рибосомы и их субчастицы
обычно классифицируют не по массам, а в соответствии с коэффици¬
ентами седиментации. Коэффициент седимендации зависит от моле¬
кулярной массы (М) частицы, ее_формы (коэффициент трения J),
парциального удельного объема v (величина, обратная плотности
частицы) и выражается в единицах Сведберга S (IS = 10-13 с). Так,
коэффициент седиментации полной эукариотической рибосомы со¬
ставляет около 80 единиц Сведберга (80S), а коэффициент седимен¬
тации ее субчастиц составляет 40S и 60S.Меньшая 408-субчастица состоит из одной молекулы 18S — РНК
и 30—40 белковых молекул. Большая бОБ-субчастица содержит три
типа рРНК с коэффициентами седиментации 5S; 5,8S и 28S и 40—50
белков (например, рибосомы гепатоцитов некоторых животных
включают49 белков). В присутствии мРНК (mRNA) субчастицы объ¬
единяются с образованием полной рибосомы, масса которой пример¬
но в 650 раз больше массы молекулы гемоглобина. Рибосомы имеют
диаметр 20—200 нм и их можно видеть в электронный микроскоп.
Структурная организация рибосом полностью не выяснена. Однако
известно, что молекулы мРНК проходят через щель около характер¬
ной структуры в виде «рога» на малой субчастице, причем эта щель
ориентирована как раз в промежуток между двумя субчастицами.
тРНК также связываются вблизи этого участка. Для сравнения на схе¬
ме (рис. 11.3) в том же масштабе показана молекула тРНК.Рибосомы прокариот имеют аналогичную структуру, но они не¬
сколько мельче, чем эукариотические (коэффициенты седиментации
полной рибосомы 70S, а субчастиц — 30S и 50S). Рибосомы митохон¬
дрий и хлоропластов близки к прокариотическим.Б. Полисома. Клетки, в которых происходит активный синтез бел¬
ков, часто содержат рибосомы, расположенные одна задругой подоб¬
но жемчужинам на нитке, в виде так называемой полисомы. Это объ¬
ясняется тем, что одна молекула мРНК может трансформироваться
одновременно несколькими рибосомами. Первой стадией трансля¬
ции является связывание рибосомы со стартовым (инициирующим)
кодоном (AUG) вблизи 5'-конца шРНК (см. выше). По мере трансля¬
ции рибосома движется по направлению к З'-концу до тех пор, пока
не дойдет до терминирующего кодона (стоп-кодона) (UAA, UAG или
UGA). Как только рибосома достигает стоп-кодона, происходит ос¬
вобождение синтезированного белка и диссоциация рибосомы на от¬
дельные субчастицы (рис. 11.3).В.	Инициация трансляции в Е. coli. Синтез белка у прокариот в ос¬
новном аналогичен синтезу у эукариот. Здесь все этапы синтеза белка
обсудим на примере бактерии Е. coli.549
Большая
субчастица (60S)■> 2,8 • 106 DaРибосома (80S)
4,2- 10/ DatRNA49 белков 28S-RNA (4718 нт)tRNAв,33 белка 18S-RNA (1874 нт)
| нт-нуклеотид |Малая
субчастица (40S)1,4 • 106 DaГемоглобин»
в таком же <
масштабеtRNAСтарт-кодон(AUG)mRNAчастицаНаправлениедвижениярибосомычастицаРастущий
пептид NБелокtRNAТерминация70S-иниции-рующийкомплексЭлонгацияБелокinRNA-rRNA^ Стоп-
кодон
(UAA.UAG
или UGA)Формил-мстионинб в
Рис. 11.3. Рибосомы — инициация трансляции:а — структура рибосом эукариот; б — полисома; в — инициация трансляции в Е. coli (Koolman, J.,ROhm K.H., 2004)
Первую фазу трансляции — инициацию — можно разделить на
несколько стадий (рис. 11.3, в). На первой стадии два белковых фак¬
тора инициации IF-1 и IF-2 связываются с ЗОБ-субчастицей (1). Затем
еще один белковый фактор, IF-2, образует комплекс с ГТФ (GTP) (2),
что облегчает ассоциацию 30S-субчастицы с мРНК (mRNA) и связы¬
вание тРНК (tRNA), соответствующей инициирующему кодону (3).
У прокариот стартовая тРНК несет N-формилметионин (f-Met), у эу¬
кариот—метионин. В завершение 508-субчастица связывается с вы¬
шеупомянутым комплексом (4). На третьей и четвертой стадиях идет
освобождение факторов инициации и гидролиз связанного с IF-2
ГТФ до ГДФ (GDP) и неорганического фосфата Р,. Таким образом,
связанный с 708-рибосомой инициирующий комплекс содержит
формилметионин-тРНК в тРНК-связывающем участке, называемом
пептидильным участком (Р). Второе место связывания, акцепторный
участок (А), во время этой фазы трансляции остается свободным.Рибосомы: элонгация, терминация. После завершения стадии ини¬
циации к растущей полипептидной цепи присоединяются другие
аминокислоты (элонгация) до тех пор, пока рибосома не достигнет
стоп-кодона на мРНК и процесс не прекратится (терминация).А. Элонгация и терминация биосинтеза белка в Е. coli. Элонгацию
можно разделить на три стадии. В первой пептидильной участок (Р)
рибосомы занимает тРНК (tRNA), несущая на З'-конце растущую
пептидную цепь (рис. 11.4). Затем вторая тРНК, соединенная с соот¬
ветствующей аминокислотой (на рис. 11.4 показана Val-тРНК), взаи¬
модействует своим антикодоном с кодоном мРНК, фиксированным
на акцепторном участке А (в данном случае GUG).тРНК связывается в виде комплекса с ГТФ-содержащим белком,
фактором элонгации Tu (EF-Tu) (la). Диссоциация комплекса про¬
исходит только после того, как связанный ГТФ (GTP) гидролизуется
до ГДФ (GDP) и фосфата (lb). До гидролиза 1ТФ взаимодействие
тРНК с мРНК (mRNA) относительно слабое. Таким образом, гидро¬
лиз ГТФ с участием комплекса является лимитирующим фактором,
дающим время для проверки, правильно ли связана тРНК. Затем сле¬
дующий белок, фактор элонгации Ts (EF-Ts), катализирует обмен
ГДФ на ГТФ и таким образом регенерирует комплекс EF-Tu • GTP.Собственно синтез пептидной связи происходит на следующей
стадии (2). Рибосомальная «пептидилтрансфераза» катализирует (без
потребления АТФ) перенос растущей пептидной цепи от тРНК, на¬
ходящейся в P-участке, на аминогруппу валинового остатка, присое¬
диненного к тРНКУа|, связанной наА-участке. Пептидилтрансфераз-
ная активность рибосом зависит не от какого-либо рибосомального
белка, а, скорее всего, связана с 28S-PHK. Каталитически активные551
Элонгация(^3Пептидилтрансфераза2.3.2.12ВалиншлчЕЕЗVal-tRNAЧЕЕЗз'©АТолько если стоп-кодон
в A-участке рибосомыБелокРис. 11.4. Рибосомы: элонгация, терминация биосинтеза белка (Koolman, J.,ROhm К.Н., 2004)РНК получили название рибозимов. Предполагают, что существую¬
щие рибозимы можно рассматривать как реликты «мира РНК» ран¬
него периода биохимической эволюции, когда белки еще не получи¬
ли такого распространения и не приобрели такого значения, как в по¬
следующие периоды.552
После переноса растущей цепи в A-участок свободная ами-
ноацил-тРНК диссоциирует от Р-участка (3) и с рибосомой связыва¬
ется другой ГТФ-содержащнй фактор элонгации (EF-gGTP). Гидро¬
лиз ГТФ этим фактором дает энергию для транслокации рибосомы
(3). Во время этого процесса рибосома сдвигает мРНК на три основа¬
ния в направлении З'-конца. Поскольку тРНК, несущая полипептид-
ную цепь, не меняет положения относительно мРНК, она попадает в
P-участок рибосомы, в то время как следующий кодон мРНК (в дан¬
ном случае GUG) попадает в A-участок. Теперь рибосома готова для
вступления в следующий цикл элонгации (4).Когда один из стоп-кодонов (UAG, UAA или UGA) попадает в
A-участок, наступает терминация трансляции (5). Для стоп-кодонов
нет соответствующих тРНК. Вместо этого с рибосомой связываются
два белковых высвобождающих фактора (англ. relising factor, RF).
Один из них, RF-1, катализирует гидролитическое расщепление
эфирной связи между тРНК и С-концом пептида, тем самым высво¬
бождая белок. Энергию для диссоциации комплекса на составляю¬
щие компоненты поставляет ГТФ-содержащий фактор RF-3 (6).Синтез белка требует высоких энергетических затрат. При при¬
соединении одной аминокислоты к растущему полипептиду гидро¬
лизуется четыре макроэргические связи. Две молекулы АТФ гидро¬
лизуются при активации аминокислоты (АТФ -» АДФ + неоргани¬
ческий фосфат), и две молекулы ГТФ расходуются во время элонга¬
ции. Кроме того, при инициации и терминации на каждую молекулу
белка расходуется по одной молекуле ГТФ.Итак, синтез белка в рибосоме представленный в виде упрощен¬
ной схемы на рис. 11.5, протекает в такой последовательности:1.Инициация:	а) мРНК связывается своим стартовым ко¬
доном с малой субъединицей рибосомы (40S), что осуществляется
при участии водородных связей между ИНг-группами рРНК и фос¬
фатными остатками мРНК;б)	первая аминоацил-тРНК связывается своим антикодоном со
стартовым кодоном;в)	присоединяется большая субъединица рибосомы (60S).2.	Транслокация: мРНК продвигается по рибосоме на
один кодон.3.	Спаривание оснований: следующая аминоацил-тРНК
связывается со следующим кодоном.4.	Перенос: фермент большей субъединицы — пептидил-
трансфераза — переносит первую аминокислоту (или уже готовый
участок полипептидной цепи) с тРНК на присоединившуюся послед¬
ней аминокислоту с образованием пептидной связи, после чего осво-553
ГенXvOOOOOCXтРНКЦитоплазмаРис. 11.5. Синтез белка в рибосоме (по А.С. Спирину, 1977)бодившаяся тРНК покидает рибосому. Этапы 16, 2 и 3 становятся
энергетически возможными благодаря экзергоническому расщеп¬
лению гуанозинтрифосфата (ГТФ —» ГДФ + Фн). Этапы 2, 3, 4
многократно повторяются с постепенной элонгацией полипептид¬
ной цепи, которая до длины приблизительно в 30 аминокислотных
остатков, как считают ученые, располагается в бороздке
бОБА-субъединицы и поэтому не может приобрести третичную
структуру.5.	Терминация: когда терминирующий кодон (например,
УАГ) достигает рибосомы, белоксинтезирующий комплекс сложным
путем распадается на составные части: мРНК, тРНК, полипептид и
обе рибосомные субъединицы (40S и 60S).Рибосома имеет два основных активных участка с различными
свойствами: акцепторный участок, или вход, и донорный участок,554
или выход, а также участки инициации и терминации. Итак, в рибо-
сомном белковом синтезе участвуют многочисленные белки цито¬
плазмы (некоторые окончательно не изучены) и рибосом, а именно:
инициирующие факторы (этап 1), факторы связывания (этап 3), фак¬
торы транслокации, переноса и терминации.Известно, что клетки эукариот содержат больше факторов ини¬
циации и вследствие этого имеют более сложную структуру комплек¬
са инициации. Главную роль в инициации играет КЭП-структура
5'-конца эукариотической мРНК, хотя элонгация и терминация про¬
текают по аналогичной схеме. Установлено также, что отдельные ста¬
дии трансляции в бактериях могут ингибироваться антибиотиками.11.4.	БИОХИМИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВКлассификация механизмов внутриклеточной регуляции. Механиз¬
мы регуляции, замедляющие или ускоряющие реакции отдельных
путей обмена веществ, связаны с переключением процесса обмена с
одного пути на другой. Регулирующие факторы могут быть различны¬
ми: промежуточные продукты, образующиеся в обмене веществ; не¬
органические и органические вещества, поступающие с пищей; фак¬
торы внешней среды; гормоны.Тесно переплетающуюся сеть метаболических реакций часто на¬
зывают «картой метаболизма». Наряду со сложным лабиринтом «ка¬
налов», по которым проходит путь метаболитов, существует и высо¬
кокоординированная система «регулирования движения», благодаря
которой скорости и направления метаболических потоков всегда со¬
гласуются с общими интересами клеточного «хозяйства». Без этих ре¬
гуляторов, их соответствующей расстановки и надлежащего исполь¬
зования огромный каталитический потенциал всей системы метабо¬
лизма был бы совершенно бесполезен.В настоящее время ученые пользуются следующей классифика¬
цией механизмов внутриклеточнй регуляции:1)	метаболитные регуляции (путем изменения концентраций ме¬
таболитов, не затрагивающие активности или числа ферментных мо¬
лекул);2)	ферментные регуляции (путем изменения активности имею¬
щихся молекул ферментов); регулирующие факторы в этом случае
действуют непосредственно на фермент. Активность ферментов, не¬
зависимо оттого, катализируют ли они процессы биосинтеза или ка¬
таболизма, зависят от энергетического заряда адениловой системы:555
Эз _ [АТФ]+1 / 2[АДФ]
[АМФ]+[АДФ]+[АТФ] ’где все компоненты приведены в молярной концентрации;3)	генные регуляции (путем включения или выключения синтеза
ферментов); регулирующие факторы, действуют на генетический
материал (ДНК) или непосредственный его продукт (РНК).Ферментная регуляция затрагивает только один фермент, но про¬
исходит очень быстро (доля секунд) и служит для «тонкой настройки»
путей обмена веществ. Генная регуляция, затрагивающая обычно не¬
сколько ферментов одновременно, более экономична по сравнению
с ферментной, поскольку ферменты, в которых нет необходимости,
просто не синтезируются; генная регуляция занимает больше време¬
ни, так как включается трансляция и чаще всего также и транскрип¬
ция. Эта форма регуляции служит для «грубой настройки» обмена ве¬
ществ и имеет большое значение для процессов развития.Генная регуляция биохимических процессов. Физиологическая
функция генов заключается в передаче информации клетке через
мРНК и ферменты. Никогда не происходит одновременной передачи
всей имеющейся информации, иначе говоря, никогда не синтезиру¬
ются одновременно все потенциально возможные ферменты. Следо¬
вательно, существуют одновременно активные (продуцирующие
РНК) и неактивные гены. Благодаря генной регуляции осуществля¬
ется активация генов (индукция) и инактивация (репрессия); одним
из самых первых, экспериментально уловимых, специфических по¬
следствий генной регуляции является появление или исчезновение
того белка (фермента), за синтез которого отвечает регулируемый ген
(индукция и репрессия ферментов).Для регуляции на уровне генов справедливы те же закономерно¬
сти, как и при ферментной регуляции:—	активации ферментов субстратом соответствует генетическая
субстратная индукция;—	торможению ферментов конечным продуктом — репрессия ге¬
нов продуктом реакции;—	оба механизма регуляции в равной степени запускаются мета¬
болитами, различны лишь уровни, на которых осуществляется регу¬
ляция (рис. 11.6).Генные регуляции вызываются, кроме того, стимуляторами раз¬
вития, например, гормонами, светом, и играют важную роль в эм¬
бриональном развитии эукариотических организмов. Эксперимен¬
тально можно отличить генные регуляции от ферментных потому,
что первые в отличие от вторых выключаются под действием ингиби-556
днкднкдУУФерментА_Ферментв_^_^^хабРис. 11.6. Генная регуляция (регуляция активности генов):а — активация субстратом (контурная стрелка) и индукция субстратом (черная стрелка); б — тор¬
можение конечным продуктом (контурная стрелка) и репрессия продуктом (черная стрелка) (поЭ. Либберту, 1976)торов синтеза белка и РНК (актиномицин D, у-метилпурин, пуроми-
цин, этионин и др.).Репрессия ферментов. Репрессия ферментов продуктами их дейст¬
вия встречается прежде всего в процессах анаболизма; репрессирую¬
щий метаболит (корепрессор) в первую очередь подавляет активность
ферментов, катализирующих его синтез. Например, аргинин репрес¬
сирует все восемь ферментов, участвующих в его синтезе. Синтез гис¬
тидина подчиняется двойственному ретроингибированию:—	торможению конечным продуктом (гистидин аллостерически
подавляет первый фермент в последовательности ферментов биосин¬
теза гистидина — рибозо-фосфат-пирофосфокиназу);—	репрессии продуктом (гистидин репрессирует все девять фер¬
ментов его биосинтеза).Репрессия ферментов, как и индукция ферментов, свойственна
всем живым организмам. Но относительно репрессии у высших орга¬
низмов сведений мало. Предполагают, что:—	ионы аммония репрессируют нитратредуктазу, синтез которой
индуцируется нитратом;—	фосфат репрессирует освобождающую фосфат фитазу (фи¬
тин —> миоинозит + Ф„);—	фруктоза репрессирует локализованную в вакуоли инвертазу
(сахароза —»глюкоза + фруктоза).Во всех этих случаях мы имеем дело с репрессией катаболических
ферментов продуктами их действия.Механизм генной рефляции: модель Жакоба — Моно. Согласно
модели Жакоба — Моно (рис. 11.7), в ДНК существуют наборы не¬
скольких генов («структурные гены»), объединенных в оперон и под¬
лежащих общей регуляции. «Оперон лактозы», например, содержит
гены для трех индуцируемых лактозой ферментов — Р-галакто-557
Оперон4**	♦ I I^^да^^Г^епр1<^'ак7Ивация \ \ \Корепрессор	ИндукторРис. 11.7. Схема Жакоба — Моно, объясняющая механизм индукциии репрессии:Р — регулятор; П — промотор; О — оператор; Репр. — репрессор (по Э. Либберту, 1976)зид-пермеазы, Р-галактозидазы и ацетилтрансферазы. Оперон транс¬
крибируется целиком; образующаяся мРНК содержит информацию
для синтеза нескольких полипептидов (полигонная мРНК). Моно-
генной мРНК может быть только в том случае, если оперон содержит
один ген.Транскрипция оперона начинается не с первого гена. Первому
гену предшествуют две специфичные нуклеотидные последователь¬
ности, а именно промотор («промоторный ген»), который иницииру¬
ет начало транскрипции и к которому присоединяется РНК-полиме-
раза, и оператор («операторный ген») — место приложения регули¬
рующих воздействий.За пределами оперона в ДНК имеется подчиненный оперону ре¬
гулятор («регуляторный ген»). Функцией его является синтез ре-
прессора (называемого также апорепрессором), специфически свя¬
зывающегося со «своим» оператором и тем самым ингибирующего
транскрипцию оперона.Свойства репрессоров.Репрессор — этоаллостериче-
ский белок. Репрессоры могут быть неактивными и могут активиро¬
ваться путем взаимодействия с соответствующим корепрессором,
принимая конформацию, позволяющую осуществляться реакции с
оператором,— репрессия фермента. Репрессоры могут образовы¬
ваться и в активной форме. Тогда действие соответствующего индук¬
тора заключается в таком изменении молекул репрессора, при кото¬
ром разрушается их связь с оператором,— индукция фермента. Гены
ферментов, синтез которых не зависит от регуляции (конститутивные
ферменты), вообще не имеют репрессора, или же он биологически
неактивен. Выделенные до настоящего времени репрессоры (из бак¬
терий) представляют собой кислые белки с молекулярной массой в
пределах 30 000—150 000. В клетке одновременно присутствуют при-558
близительно 5—10 молекул репрессора. Репрессоры связываются
только с двухцепочечной спиралью ДНК, но не с одноцепочечной,
денатурированной ДНК. До сих пор до конца не выяснен механизм
«распознавания» репрессором соответствующего оператора.Реализация регуляторных механизмов. Са¬
мой главной предпосылкой для реализации регуляторных механиз¬
мов является быстрое исчезновение информации, поступившей от
ДНК, т. е. малая продолжительность жизни мРНК и ферментов.
В противном случае репрессия ранее активных генов была бы беспо¬
лезной, а однократная индукция продолжалась бы бесконечно. У бак¬
терий, которые вообще очень легко перестраиваются в ответ на изме¬
нение условий внешней среды, мРНК характеризуется малой про¬
должительностью жизни (1—2 мин). У высших организмов, которые
обычно сохраняют одно и то же состояние метаболизма в течение до¬
вольно длительного времени, существуют две формы мРНК: корот-
коживущая и долгоживущая, например у растений хлопчатника более
16 ч, у зеленой водоросли Acetabularia несколько недель. Время полу-
жизни ферментов у высших растений составляет от одного часа до
пяти суток.Отступления от теории Жакоба —Мон о. Экс¬
периментально было показано, что теория Жакоба — Моно не всегда
оправдывается.1.	При помощи этой модели трудно объяснить катаболическую
репрессию, т. е. репрессию индуцибельного оперона промежуточны¬
ми продуктами дыхания или брожения: репрессию оперона лактозы
глюкозой или продуктами ее диссимиляции. Такого рода репрессия
функционирует и при отсутствии репрессора, если наблюдается му¬
тация регулятора. Вероятно репрессирующие метаболиты взаимо¬
действуют с опероном непосредственно, хотя и неясно каким обра¬
зом.2.	Совместно регулируемые гены не обязательно должны быть
объединены пространственно в одном опероне. Например, у Е. coli
все гены для восьми репрессируемых аргинином ферментов синтеза
аргинина расположены в пяти пространственно разграниченных уча¬
стках ДНК. Такое функциональное, но не пространственное, объеди¬
нение генов называютрегулоном. Ученые считают, что перед всеми ге¬
нами одного регулона пространственно подключены идентичные
операторы. У эукариот, начиная с Neurospora (низшие грибы), число
регулонов увеличивается за счет оперонов. У высших растений и жи¬
вотных регулоны вообще неизвестны.3.	У высших растений также обнаружены регуляторные гены. На¬
пример, если у кукурузы путем мутации модифицируется регулятор¬559
ный ген синтеза антоцианов, то в эндосперме активируются ранее ре¬
прессированные гены для всех ферментов, участвующих в синтезе ан¬
тоцианов. Но это еще не означает, что механизм регуляции осуществ¬
ляется в соответствии с моделью Жакоба — Моно.4.	У гриба Aspergillus регуляторный ген HP, очевидно, вообще не
дает репрессора, а наоборот регулирует образование какого-то поло¬
жительно влияющего генного продукта, который, активируясь нит¬
ратом, инициирует синтез мРНК. Исследователи считают, что такого
рода механизм имеется и у высших растений, HP которых известна
как индуцибельный фермент (А. Ленинджер, 1985; Л. Страйер, 1985).11.5.	БИОХИМИЧЕСКИЕ ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
СУЩНОСТИ ДНК И ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДАРассмотрим доказательства генетической функции ДНК, кото¬
рые были получены различными способами.1.	Показано, что содержание ДНК в любой клетке или организме
строго постоянно и не зависит от условий среды, от питания или от
воздействия различных факторов, влияющих на метаболизм клетки.
Эта особенность ДНК вполне соответствует предполагаемым свойст¬
вам генетического материала.2.	Содержание ДНК в клетке, как правило, увеличивается с воз¬
растанием сложности клетки и, следовательно, с возрастанием коли¬
чества генетической информации в клетке (табл. 11.1).Таблица 11.1. Приблизительное содержание ДНК в некоторых клетках
и вирусах (Лениццжер А., 1974)ОрганизмыСодержание ДНК в пико¬
граммах на клетку или на
вирусную частицуЧисло нуклеотидных
пар, млнМлекопитающие65500Рыбы22000Птицы22000Ракообразные32800Высшие растения2,52300Грибы0,02-0,1720Бактерии0,002-0,0620Бактериофаг Т4 (на одну ви¬
русную частицу)0,000240,22Данные, приведенные в табл. 11.1, свидетельствуют о том, что чем
сложнее организм, тем больше ДНК содержится в его клетках. Бакте¬560
рии содержат около 0,01 • 10-6 мкг ДНК на клетку (примерно 1 % сы¬
рой массы), а у высших организмов содержание ДНК составляет при¬
близительно 6 • ДО-6 мкг на клетку. ДНК-Содержащие вирусы бакте¬
рий (бактериофаги) и вирусы животных, имеющие лишь несколько
генов, содержат очень мало ДНК.3.	Результаты экспериментов по репликации бактериофагов так¬
же свидетельствуют о генетической функции ДНК. Особенно показа¬
тельными в этом отношении были опыты А.Д. Херши и М. Чейза.
Они метили или только белок или только ДНК вирусных частиц, ин¬
кубируя инфицированные бактерии в среде, содержащей соответст¬
вующие радиоактивные предшественники. Используя меченые по
белку или по ДНК вирусные частицы, А.Д. Херши и М. Чейз показа¬
ли, что только вирусная ДНК (но не вирусный белок) проникает в
бактериальную клетку. Позднее эти исследователи показали, что
очищенная от примесей белков вирусная нуклеиновая кислота обла¬
дает инфекционностью, т. е. при введении в бактериальную клетку
приводит к образованию полноценных вирусных частиц. В пользу ге¬
нетической функции ДНК говорят также следующие аргументы:—	препараты ДНК, выделенные из различных тканей одного и
того же организма, имеют одинаковый нуклеотидный состав;—	нуклеотидный состав ДНК у разных видов различен;—	нуклеотидный состав ДНК у организма данного вида не зави¬
сит от возраста организма, условий питания и внешней среды;—	почти во всех исследованных препаратах ДНК число остатков
аденина равно числу остатков тимина (А = Т), а число остатков гуа¬
нина равно числу остатков цитозина (Г = Ц). Число пиримидиновых
остатков равно числу пуриновых остатков, т.е. А+Г = Ц + Т;—	ДНК близких видов имеют весьма сходный нуклеотидный со¬
став, тогда как эволюционно отдаленные организмы заметно отлича¬
ются один от другого по своему нуклеотидному составу. Таким обра¬
зом, нуклеотидный состав ДНК может быть использован как таксо¬
номический признак.11.6.	БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ
ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ (МОРФОГЕНЕЗА)Дифференциальная активация генов. Эмбриональная, т. е. еще неспециализированная, меристематическая клетка может развиваться
различными путями. Это зависит от особого набора белков, посколь¬
ку каждая специализированная клетка вырабатывает лишь часть ге¬
нетически возможных ферментов. Например, высокая концентрация
а-амилазы наблюдается у ячменного зерна только в алейроновом561
слое. Фенолоксидазы содержатся в эндодерме, но не в коре корня,
Поскольку синтез каждого белка, каждого фермента управляется при
посредстве мРНК одним геном, а следовательно, ДНК, образование
различных наборов ферментов в разных типах клеток является, веро-*
ятно, следствием дифференциальной активации генов (активация
одной группы генов при одновременной активации других).В процессе развития при постоянной структуре ДНК последовав
тельно изменяется состав РНК (состав оснований) и белков (электро¬
форетические свойства, ферментативная активность). Эта биохимии
ческая дифференциация является не следствием, а причиной морфо¬
логической дифференцировки. Механизм активации и блокирова¬
ния генов до конца не изучен. Ученые полагают, что по-видимому
имеют место хромосомные регуляции при участии гистонов — ядер-
ных белков и процессы индукции и репрессии согласно теории Жа¬
коба — Моно.Благодаря дифференциальной активации генов образуется
мРНК, которая участвует в морфогенезе и называется морфогенети¬
ческой. На примере ацетабулярии исследователи часто демонстриру¬
ют морфогенетическую функцию РНК в опытах с рибонуклеазой и
актиномицином. Необходимость синтеза белка д ля проявления мор¬
фологического действия РНК доказывается опытами с пуромици-
ном. При прививках или трансплантации ядер изменяется также спе¬
цифический для каждого вида, электрофоретически различимый
изоферментный спектр в соответствии с видовой принадлежностью
имеющегося клеточного ядра.В особо значительных процессах дифференциальной активации
генов, например при детерминации развития эмбриональной клетки
в определенном направлении, участвуют многие гены. Вряд ли мож¬
но представить, что включающий фактор, например гормон, отдель¬
но активирует каждый ген или каждую группу генов (оперон), т. е.
при упорядоченном ходе развития гены становятся активными один
за другим. Многие гены объединены в функциональные единицы,
которые можно сравнить с программами, заложенными в ЭВМ. Ге¬
ном содержит ограниченное число программ, которые могут быть за¬
пущены определенными факторами. Как и в ЭВМ, в состав програм¬
мы входят подпрограмма, подподпрограмма и т. д. Например, в про¬
грамму «палисадная клетка» — формирование хлоропластов и синтез
хлорофилла, в программу «цветок» — тычинка и пыльцевое зерно.
Последний пример показывает, что такого рода программа предна¬
значена для развития не только клеток, но и целых органов. Некото¬
рые подпрограммы относятся только к одной-единственной про¬
грамме (тычинка — к цветку), другие — к нескольким (ксилема — к562
побегу и к корню). Все имеющиеся в настоящее время схемы коорди¬
нированной активации генов объясняют два известных факта:1)	у высших организмов во многих участках ДНК последователь¬
ности азотистых оснований неоднократно повторяются — это могли
бы быть гены-интеграторы (доноры) и рецепторы;2)	большая часть мРНК разрушается в ядре — это, возможно,
РНК, образованная генами-интеграторами.Уже упоминалось, что участвующие в процессе развития гены ак¬
тивируются друг за другом в определенной последовательности (вре¬
менная генная модель).Дифференциальная активация генов гор¬
монами. 1. Наиболее наглядным примером, свидетельствующим
об активации генов гормонами, является индукция гиббереллином
а-амилазы в семенах злаков, отвечающей за расщепление крахмала
при прорастании зерна. К началу прорастания семян гиббереллин
вызывает образование а-амилазы живым алейроновым слоем и выде¬
ление ее в мертвые клетки эндосперма, где откладывается запасной
крахмал. Источником гиббереллина является зародыш. Опыты с С- и
Н-изотопами доказывают, что а-амилаза не активируется, а синтези¬
руется de novo из аминокислот. Для этого необходим синтез РНК. Ак¬
тивация генов под действием этого гормона является дифференци¬
альной: наряду с а-амилазой гиббереллин индуцирует рибонуклеазу
и протеазы.2.	Другие убедительные примеры активации генов гормонами.
Цитокинины индуцируют изоцитратлиазу, протеиназы (эвдопепти-
дазы), нитратредуктазу и др. Ауксины индуцируют ферменты, синте¬
зирующие целлюлозу, инвертазу и др. Ауксин и особенно цитокини¬
ны индуцируют ДНК-полимеразу, ответственную за синтез ДНК,
ИТ. д.3.	Характер реакции зависит от воздействующего гормона и от
генной модели воспринимающей клетки. Например, образование
а-амилазы в алейроновом слое ячменя может индуцироваться гиббе¬
реллином только у зрелых зерен, а в гипокотиле фасоли оно вызыва¬
ется цитокинином. В очень молодых проростках риса цитокинин ин¬
дуцирует фосфоглюконатдегидрогеназу, а в более старых — рибуло-
зодифосфаткарбоксилазу и триозофосфатдегидрогеназу.Вызванная гормонами индукция ферментов может, конечно, по¬
влечь за собой сопутствующие явления индукции и репрессии, веду¬
щие к изменению метаболизма всей клетки.Образование РНК, индуцированное гормо¬
нами. РНК выполняет функцию промежуточного звена между пер¬563
вичным действием гормонов и их влиянием на рост и развитие. Пер¬
вичное действие проявляется не только в стимулировании синтеза
РНК in vivo и in vitro, но и в изменении состава оснований РНК.
Влияние гормонов на рост и развитие через индукцию синтеза РНК
доказано в следующих экспериментах: обработка гормоном, экстра¬
гирование РНК из обработанной ткани, введение этой РНК в ткань,
не содержащую гормона, и наблюдение за специфичным дляданного
гормона действием в этой ткани. Такие эксперименты проводились с
гиббереллином и животными гормонами — экдизоном и эстрогеном.
Гиббереллин способствует тому, что дрожжи (а также ткани из топи¬
намбура) приобретают способность реагировать на ауксин растяже¬
нием клеток. Такой же эффект вызывает экстрагируемая РНК, обра¬
зующаяся в клетках дрожжей (или клубнях топинамбура) после обра¬
ботки гиббереллином.Биохимия эмбрионального роста. Под эмбриональным ростом объ¬
единяют два процесса: деление клеток и рост протоплазмы, происхо¬
дящие в меристеме (эмбриональной зоне).Рост протоплазмы. Клетка начинает свое существование
вследствие деления эмбриональной материнской клетки, способной
к делению. Благодаря росту протоплазмы она вырастает приблизи¬
тельно до размеров материнской клетки. При этом все плазматиче¬
ские структуры, например пропластиды, митохондрии, субструктуры
(элементарные мембраны) и вещества (ДНК, РНК, белки, липиды и
т. д.), количественно удваиваются, т. е. достигают первоначального
их количества в материнской клетке. Рост протоплазмы состоит из
хорошо известных процессов:—	репликации ДНК;—	последовательности реакций ДНК -> РНК -> фермент (бе¬
лок) -»продукт, которые включают в себя транскрипцию, трансля¬
цию и многие ферментативные реакции.Продуктом считаются все плазматические структуры и вещества
несмотря на то, что последний этап этой последовательности реак¬
ций, а именно связь на молекулярном уровне между структурой бел¬
ков и плазматическими (субморфологическими) структурами изу¬
чена недостаточно.Деление клеток. В профазе митоза, самое позднее в нача¬
ле метафазы синтез РНК приостанавливается, рибосомы блокируют¬
ся и рост протоплазмы приостанавливается, параллельно понижается
интенсивность обмена веществ (например, дыхания и др.) во время
митоза.1.	Состояние ДНК в процессе митоза. Между каждыми двумя ми¬
тозами происходит удвоение (репликация) ДНК. Синтез ДНК, хотя и564
являющийся предпосылкой следующего митоза, не обязательно дол¬
жен приводить к митозу. Об этом свидетельствует обнаружение эндо¬
репликации (репликации ДНК без митоза), приводящей, как прави¬
ло, к образованию чрезвычайно богатых ДНК (политенных) хромо¬
сом слюнных желез у двукрылых. Но если имеются все остальные ус¬
ловия для митоза, то синтез ДНК может быть ограничивающим
фактором и, таким образом, служить причиной, вызывающей митоз.
Например, у различных микроорганизмов можно вызвать синтез
ДНК температурным шоком; в результате происходйт деление клет¬
ки.2.	Регуляция синтеза ДНК. Определенную роль играет фермент
тимидинкиназа — индуцибельный фермент, индукция которого воз¬
можна только во время короткого периода интерфазы, незадолго до
начала репликации ДНК. Вне этого промежутка времени фермент за¬
блокирован. Ученые считают, что ген для тимидинкиназы имеет вре¬
менную регуляцию. Это же касается и ДНК-полимеразы, которая ак¬
тивируется почти одновременно с тимидинкиназой. Тиминдинкина-
за (тимидин -> ТМФ) — фермент, необходимый для образования
ТТФ, участвует в репликации ДНК. Как участник указанного пути
обмена фермент включается в регуляцию процессов ядерного и кле¬
точного деления.Если бы эта временная регуляция вызывалась предшествующим
митозом, то мог бы существовать цикл следующих друг за другом про¬
цессов: митоз приводит к уменьшению числа ДНК на одну клетку;
как следствие через механизм обратной связи (вышеупомянутая «вре¬
менная регуляция») вызывается синтез ДНК, а затем опять митоз.Дифференцировка клеток как процесс репрессии и дерепрессии бел¬
кового синтеза. Ранее ученые считали, что процесс дифференцировки
клеток в эмбриогенезе, приводящий к возникновению различных
специализированных типов клеток, обусловлен избирательной необ¬
ратимой утратой различных генов геномом эмбриона. В настоящее
время твердо установлено, что все клетки высшего организма содер¬
жат полный набор генов, характерный для данного организма, но в
клетках каждого типа большинство генов репрессировано («выклю¬
чено»). Например, все клетки позвоночных, по-видимому, имеют
гены для миозина, но эти гены «включены» только в мышечных клет¬
ках. Генетическую «универсальность» соматических клеток можно
продемонстрировать на некоторых высших растениях: в определен¬
ных условиях из отдельной дифференцированной клетки растения
томата можно вырастить целое растение. В пользу представления об
идентичности геномов всех диплоидных клеток данного организма565
свидетельствует и тот факт, что все соматические диплоидные клетки
организма содержат одно и то же число ДНК.Регуляция синтеза генного продукта в;
процессе развития и дифференцировки(эпи¬
генетика). Как упоминалось ранее, Жакоб и Моно обобщили ги¬
потезу оперона и регуляторного гена для случая регуляции синтеза
генного продукта в процессе развития и дифференцировки. Эта об¬
ласть исследований называется эпигенетикой. Применительно к выс¬
шим организмам гипотеза оперона должна быть изменена в несколь¬
ких отношениях.1.	Поскольку в большинстве клеток высшего организма репрес¬
сирована большая часть генома, в них должно использоваться огром¬
ное число различных типов репрессорных молекул. Поэтому меха¬
низмы репрессии, используемые у бактерий, в случае высших орга¬
низмов могут оказаться «неэкономными».2.	Процесс клеточной дифференцировки характеризуется суще¬
ственно меньшей степенью «обратимости» по сравнению с процесса¬
ми индукции и репрессии ферментов.Например, культивируемые in vitro нервные клетки продолжают
оставаться морфологически и биохимически «похожими» на обыч¬
ные нервные клетки, и до сих пор не удалось найти ни одной воспро¬
изводимой методики «обратной дифференцировки» этих клеток к ис¬
ходным «универсальным» (тотипотентным) клеткам или трансфор¬
мации нервных клеток в другие «специализированные» клетки, на¬
пример в клетки почек. Следовательно, если дифференцировка
обусловлена репрессией определенных совокупностей оперонов, то
соответствующие репрессоры должны быть весьма устойчивыми.Биохимические механизмы стойкой ре¬
прессии. Биохимические механизмы гипотетических постоянно
действующих репрессоров остаются не до конца изученными.1.	Роль гистонов в процессе дифференцировки. Функции постоян¬
но действующих репрессоров частично или полностью выполняют
гистоны — сильноосновные белки, связанные с ядерной ДНК в эука¬
риотических клетках с молекулярной массой 10 000—21 ООО; моляр¬
ное содержание лизина и аргинина в молекулах гистонов достигает
25—30 %. Гетерогенность гистонов по первичной структуре сравни¬
тельно невелика. В большинстве клеток эукариотов содержится пять
основных гистоновых фракций, некоторые из которых можно разде¬
лить еще на 3—5 субфракций, гомогенных по аминокислотной после¬
довательности. Общее число гомогенных по первичной структуре
гистоновых фракций не превышает 10—12. Высокий, равномерно
распределенный положительный заряд молекул гистонов обусловли¬566
вает образование прочных комплексов гистон — ДНК. В ядрах эука¬
риотических клеток значительная часть ДНК находится в форме де-
зоксирибонуклеогистонных комплексов. Например, прокариоты не
обладают способностью кдифференцировке по причине отсутствия в
них сильноосновных белков. Итак, присутствие больших количеств
гистонов в ядрах эукариот указывает на существенную роль гистонов
в процессе дифференцировки.2.	Ферментативное метилирование оснований ДНК. Другой воз¬
можный биохимический механизм стойкой репрессии генома — из¬
бирательное ферментативное метилирование определенных азотсо¬
держащих оснований в молекуле ДНК. В настоящее время известны
ферменты, например ДНК-метилаза, ответственные за метилирова¬
ние ДНК в соответствии со следующим уравнением реакции:ДНК + S-аденозилметионин -> метил-ДНК ++ S-аденозилгомоцистеин.11.7.	БИОХИМИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ КАЧЕСТВА
РАСТЕНИЕВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИОсновная цель возделывания сельскохозяйственных культур свя¬
зана с получением полноценных продуктов питания, сбалансирован¬
ных по содержанию белков, углеводов, жиров, минеральных элемен¬
тов и витаминов. У любого вида растений особенности метаболизма и
способность к запасанию определенных химических веществ сфор¬
мировались в ходе эволюции и закреплены генетически. Изменения в
метаболизме наблюдаются при воздействии различных факторов, в
том числе и под воздействием мутагенов, в результате гибридизации и
переноса генов. Это может послужить основой для создания новых
сортов, новых генотипов растений, характеризующихся более высо¬
кой продуктивностью, лучшими показателями качества.Биохимическая сложность и генетическая изменчивость белков эн¬
досперма. Основным источником пищевого белка для большинства
жителей Земли являются злаки, поэтому становится понятным, поче¬
му количеству и качеству белка уделяется особое внимание во многих
программах селекции зерновых культур, а их биохимия и генетика
интенсивно изучаются. Многие ученые в своих опытах используют
мутации, затрагивающие структурные гены белков эндосперма или
гены, ответственные за образование этих белков, используют биохи¬
мические методы для выяснения структуры, процессов синтеза белка
и его регуляции.567
В процессе эволюции гены, в частности гены проламинов, дупли¬
цировались и претерпели мутационные изменения, что привело к об¬
разованию семейств различающихся, но родственных генов. Со вре¬
менем эти семейства частично разошлись за счет хромосомных пере¬
строек:—	образовались индивидуальные сорта злаков, содержащих
сложные по составу смеси белков эндосперма;—	проявилась значительная межсортовая изменчивость по типу
белка.Контроль за белковым составом эндосперма зерновых культур
проводится различными методами. Например, при помощи двумерно¬
го электрофореза белков эндосперма одного из сортов мягкой пшени¬
цы было обнаружено 60 основных компонентов и вдвое больше ми¬
норных. Состав белков у пшеницы осложняется из-за того, что она со¬
держит три различных генома, причем запасные белки каждого генома
различаются. Спектры белков одного из сортов диплоидного ячменя
проще, хотя на фореграмме обнаруживается по меньшей мере 40 ком¬
понентов. Исследователи наблюдали, что сходной степенью сложно¬
сти обладают спектры белков эндосперма кукурузы.Этот метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутст¬
вии додецилсульфата (SDS-PAGE) фракционирует белки в основном
по молекулярной массе. На основании результатов такого разделения
ученые пришли к выводу, что глобулиновые запасные белки злаков
характеризуются меньшей сортовой изменчивостью, чем пролами¬
ны. Метод SDS-PAGE обнаруживает незначительные различия среди9	сортов овса и лишь немногим более — методом изоэлектрического
фокусирования (IEF). Более выраженной оказалась изменчивость
при анализе проламинов (авенинов) из тех же сортов вышеупомяну¬
тыми методами. Крайне низкой оказалась также электрофоретиче¬
ская изменчивость глобулинов риса.Возможное объяснение различий между результатами, получен¬
ными при исследовании глобулинов и проламинов, по мнению уче¬
ных заключается в том, что эволюционные изменения проламинов
происходили быстрее. Они считают, что причиной этого является
значительно более сложная система упаковки в белковые тельца у
глобулинов по сравнению с проламинами. Полипептиды глобулинов
уложены в упорядоченную структуру с молекулярной массой около
300 ООО, что накладывает определенные ограничения на форму моле¬
кулы с точки зрения аминокислотной последовательности. У прола¬
минов, имеющих в основном намного более гидрофобную природу,
отложение белков в белковых тельцах происходит, по результатам
ученых, только за счет осаждения (Encycl. Plant Physiol., 1982).568
Различия между сортами злаков по белкам эндосперма возникли
несколько тысячелетий назад в результате мутаций структурных ге¬
нов, а также мутаций генов, регулирующих синтез этих белков. Даль¬
нейшие изменения регуляторных генов можно вызвать при помощи
облучения или химических соединений. Мутации в единичных
структурных генах мало изменяют состав запасных белков семян, по¬
скольку почти всегда эти гены образуют большие семейства, однако в
случае хромосомных мутаций этот эффект оказывается заметным.Биологическая питательная ценность белков. Определение белков
и белковых фракций в растительной продукции связано с тем, что
белки как компоненты пищи являются источниками аминокислот
для человека и животных, в организмах которых отдельные амино¬
кислоты не синтезируются. Это в первую очередь группа незамени¬
мых аминокислот, о которых уже упоминалось. Для того чтобы орга¬
низм был обеспечен незаменимыми аминокислотами, необходимо в
сутки потреблять определенное количество белков: человеку-
60—100 г полноценного белка, животным — 100—110 г такого белка в
расчете на каждую кормовую единицу (одна кормовая единица — это
питательная ценность 1 кг овса, 0,6 кг крахмала). В100 г потребляемо¬
го белка должно содержаться следующее количество незаменимых
аминокислот (табл. 11.2).Таблица 11.2. Ориентировочная надежная и оптимальная потребность взросло¬
го человека в незаменимых аминокислотах (г/100 г белка) (Г.А. Воробейков, 1990)АминокислотаНадежный уровеньОптимальный уровеньМинздрав СССР (1983)ФАО/ВОЗИзолейцин1,84,04,0Лейцин2,56,07,0Лизин2,25,05,5Метионин + цистин2,44,03,5Фенилаланин + тирозин2,54,06,0Треонин1,33,04,0Триптофан0,651,01,0Валин1,84,05,0Использование методов генной инженерии для улучшения питатель¬
ной ценности белков растения. Направленная селекция растений со
строгим наблюдением за фракционным и аминокислотным составом
белков проводится с целью улучшения качества растительных бел¬
ков, определяемых, например, большим содержанием в них опреде¬569
ленных незаменимых аминокислот (см. 11.1). Еще в 60-е годы ученые
приступили к работе над улучшением состава белков зерна кукурузы
на генетической основе по созданию новых генотипов кукурузы, зеин
которой изначально не содержит лизина и в нем очень мало трипто¬
фана. Американские исследователи Мертц и Нельсон вырастили му¬
танты кукурузы Опейк-2 и Флаури-2, в зерне которых по сравнению с
обычной кукурузой содержится в два раза больше лизина и триптофа¬
на, на 30 % больше аргинина, аспарагиновой кислоты и глицина, а
содержание аланина, глутаминовой кислоты, тирозина и фенилала¬
нина снижено. В связи с этим мутанты имеют хорошо сбалансиро¬
ванный аминокислотный состав и биологическая питательная цен¬
ность их белков приближается к ценности белков молока.В настоящее время во многих странах проводятся работы по скре¬
щиванию этих мутантов с обычной кукурузой для получения новых
форм высоколизиновой кукурузы, которые внедряются в производ¬
ство. На основе высоколизинового ячменя Гипроли также проводят¬
ся работы по выведению новых сортов этой культуры, характеризую¬
щихся улучшенным аминокислотным составом.Белковая инженерия (терапия) — относительно новая ветвь физи¬
ко-химической биологии, родившейся на стыке физики и химии бел¬
ков, а также генетической инженерии. Если генно-инженерные опе¬
рации не преследуют цель изменить первичную структуру синтези¬
руемого продукта, то белковая инженерия решает задачу создания
гибридных молекул белков или пептидов, которые бы обладали за¬
данными характеристиками.Создание гибридных белков и синзимов —
искусственных ферментов. Для этого существует по¬
тенциальная возможность, так как в природе сходные биологические
функции у разных организмов обеспечиваются белками, проявляю¬
щими самые разнообразные физико-химические свойства. Когда бу¬
дут разработаны способы комбинирования этих свойств, можно бу¬
дет получать гибридные белки, отвечающие определенным техноло¬
гическим требованиям. У белков-ферментов при помощи генетиче¬
ской инженерии можно изменить следующие параметры:—	субстратную специфичность;—	температурный и pH-оптимум;—	термостабильность, стабильность и активность в неводных
растворах;—	устойчивость к протеазам, способность к аллостерическому ре¬
гулированию;—	молекулярную массу, число субъединиц.570
Это возможно осуществить, если будут известны конкретные фи-
зико-химические свойства и функции белка, а также то, в какой сте¬
пени они определяются его молекулярной структурой. На основе
этой информации можно конструировать искусственные белки-фер-
менты, в частности синтетические ферменты, которые называются
синзимами. Простейший путь к разрешению данной проблемы заклю¬
чается в предсказании структуры, в осуществлении синтеза и в после¬
дующей экспрессии в реципиентных клетках гена, который кодирует
такой белок.Открытия и перспективы использования
белковой инженерии. Это уже упомянутые высоколизино-
вые мутанты кукурузы и ячменя, это отработка новых технологий, по¬
зволяющих по структуре гена предсказать положение участков моле¬
кул белка, определяющих его антигенную активность. Например, та¬
кие участки выявлены у вирусных белков, что дало возможность син¬
тезировать соответствующие им олигонуклеотиды (10—15 аминокис¬
лотных остатков) и использовать их при вакцинации животных.Можно назвать следующие перспективы использования белковой
инженерии:дыБиопродукты	Применение1. Аминокислоты, ви- Создание новых генотипов растений с улуч-
тамины, короткие пепти- шенными питательными свойствами;лечение и профилактика различных заболе¬
ваний, контроль системы кровообращения;кормовые добавки, факторы ростаЛечение нарушений метаболизмаВакциныТехнологические процессы, различные ди¬
агностические и терапевтические процедуры;создание энзиматических «ловушек» для
анализа АТФ, АДФ;иммуноферментативные системы для ана¬
лиза нанограммовых количеств пестицидовТерапевтические средства, например чело¬
веческий интерферон, серумальбумин;интерфероноподобные, стрессовые белки
растений, хит-белки или БТШ2.	Пептиды, гормоны3.	Вирусные антигены4.	Ферменты5. Другие белкиВ настоящее время намечаются следующие пути селекционного
улучшения генотипов растений на основе белковой инженерии.571
1.	Снижение концентрации неполноценных белков и усиление
экспрессии генов полноценных белков.2.	Улучшение аминокислотного состава неполноценных белков
или путем изменения нуклеотидной последовательности генов, или
путем синтеза искусственных генов с заданными свойствами и пере¬
несение их в клетки растений. Например, американский исследова¬
тель Джейнс синтезировал ген, кодирующий белок, содержащий в
своем составе 80 % незаменимых аминокислот. Разработаны пути пе¬
реноса этого гена в клетки злаковых растений.3.	Стимуляция синтеза общего белка в растениях и разработка
экспресс-методов оценки белкового статуса растений.Создание перспективных штаммов микроорганизмов методом генной
инженерии. 1. Бактериальные удобрения, которые под¬
держивают биологическую активность почв за счет:—	фосфобактерина — препарата бактерий, разлагающих органи¬
ческие соединения фосфора в почве;—	за счет азотогена или азотобактерина, обогащающего почву
свободно-живущими азотфиксаторами;—	за счет нитрагина, содержащего клубеньковые бактерии, спо¬
собствующие образованию клубеньков на корнях бобовых, что уси¬
ливает фиксацию неорганического азота;—	за счет силикатных бактерий, ответственных за разрушение
почвенных калийных силикатов и улучшающих калийное питание
растений.2.	Инокуляция в почву агрономически цен¬
ных новых штаммов микроорганизмов, создан¬
ных на основе генной инженерии. Такие микроорганизмы являются
единственными биологическими организмами, способными разру¬
шить (деструктурировать) поступившие в почву пестициды, которые
по своей природе являются ксенобиотиками — органическими со¬
единениями, созданными в результате синтеза. Механизм действия
почти всех агрономически ценных бактерий, грибов и актиномице-
тов заключается в том, что последние используют углерод, азот, фос¬
фор, входящие в состав ксенобиотиков в качестве питательных эле¬
ментов.11.8.	ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
Иммобилизация и стабилизация ферментовИдея иммобилизации ферментов отнюдь не нова. Еще в 1916 г.
английские химики Нельсон и Гриффин установили, что адсорбиро¬
ванная на алюмогеле инвертаза сохраняет свою активность. Однако572
широкие масштабы исследования по иммобилизации ферментов
приняли лишь в 60—70-х годах, когда назрела потребность в разра¬
ботке технологических ферментативных катализаторов.Гетерогенные катализаторы обладают по сравнению с гомоген¬
ными рядом преимуществ. Они легко отделяются от реакционной
среды, что позволяет их многократно использовать и получать про¬
дукты, не загрязненные ферментами. Они позволяют вести процесс
непрерывно, что, как правило, значительно выгоднее, чем проведе¬
ние периодического процесса. Но есть и свои особенности при иммо¬
билизации ферментов: носитель может оказывать сильное влияние
на стабильность и активность иммобилизованного фермента. При
правильном использовании этого обстоятельства можно одновре¬
менно решить и проблему стабилизации фермента к действию темпе¬
ратуры и среды.Методы иммобилизации ферментов. Физические методы:1)	адсорбция фермента на твердом носителе неорганической (си¬
ликагель, оксид алюминия, активированный уголь и т. п.) или орга¬
нической (иониты, полисахариды и т. п.) природы — самый простей¬
ший и наиболее старый метод. Неорганические носители обладают
хорошими механическими свойствами. К недостаткам метода отно¬
сятся значительная неспецифическая сорбция посторонних веществ
и часто недостаточно прочное удерживание фермента на носителе;2)	включение ферментов в различные полимерные гели. Суть метода
состоит в том, что фермент вводят в раствор мономера и подходящего
сшивающего реагента, а затем проводят полимеризацию, в результате
чего образуется трехмерная сетка геля, в ячейках которой «застрева¬
ют» крупные молекулы фермента. В то же время для низкомолекуляр¬
ных субстратов такой гель проницаем. Поэтому активность фермента
по отношению к таким субстратам сохраняется, но в случае высоко¬
молекулярных субстратов метод не пригоден;3)	включение ферментов в полиакриламидный гель. Фермент вводят
в раствор акриламида (СН2 = CHCONH2) и сшивающего реагента
бисакриламида (СН2 = CHCONHCOCH = СНг), добавляют ини¬
циатор полимеризации, например (NH^SjOs, получают гель с им¬
мобилизованным ферментом, который обычно используют в виде
гранул. Полимеризацию можно проводить и без инициатора под дей¬
ствием у- излучения (система не загрязняется продуктами распада
инициатора и можно обойтись без сшивающего реагента). Кроме ак-
риламидных гелей используют (в меньшей степени) гели поливини¬
лового спирта, поливинилпирролидона, полиметакриловой кислоты
и ряд других;573
4)	включение фермента в микрокапсулы и волокна. В обоих методах
фермент остается в своем обычном водном окружении, что обеспечи¬
вает сохранение его активности и специфичности. При микрокапсу-
лировании капельки водного раствора фермента диспергируют (рас¬
пыляют) в органическом растворителе, и на границе раздела фаз воз¬
никает оболочка (мембрана) за счет межфазной полимеризации или
понижения растворимости подходящего полимера, первоначально
присутствующего в одной из фаз. Как и у гелей, мембрана микрокап¬
сулы проницаема для фермента. Размеры капсул составляют десятки
или сотни микрон и они легко отделяются от раствора фильтровани¬
ем. Технология включения ферментов в волокна предусматривает
следующие этапы: сначала получают эмульсию водного раствора
фермента (либо суспензию сухого фермента) в органическом раство¬
рителе, содержащем полимер, способный образовывать волокна
(триацетатцеллюлоза, нитроцеллюлоза, этилцеллюлоза и т. п.); затем
эту эмульсию продавливают через тонкие отверстия в другой раство¬
ритель, вызывающий коагуляцию полимера. Получаются волокна,
содержащие микрокапельки (порядка 1 микрона) водного раствора
фермента.Не меньшее распространение, чем физические, получили хими¬
ческие методы иммобилизации ферментов. Суть их заключается в об¬
разовании ковалентных связей между носителем и ферментом. Кова¬
лентная иммобилизация является наиболее надежным способом гете-
рогенизации (удержания фермента на носителе).Очень перспективен метод сочетания ковалентной пришивки с
включением в гель. В этом случае предварительно модифицируют
фермент мономером, например остатком акриловой кислоты. Для
этого ацилируют аминогруппы белка хлорангидридом акриловой ки¬
слоты. Затем сополимеризуют модифицированный белок с акрила-
мидом и бисакриламидом.Более сложной является проблема стабилизации ферментов, но
для того, чтобы перейти к методам их стабилизации, нужно сначала
затронуть следующие факторы, приводящие к инактивации фермен¬
тов.1)	Как все белки, ферменты могут быть «съедены» микроорганиз¬
мами, присутствующими в окружающей среде.2)	Может происходить межмолекулярная агрегация белковых мо¬
лекул, а в случае гидролитических ферментов так называемый авто¬
лиз, т. е. гидролиз молекул фермента под его собственным воздейст¬
вием.3)	Молекула фермента может потерять свою трехмерную структу¬
ру (конформацию) в результате нарушения взаимодействий боковых574
групп полипептидной цепи под действием теплоты, повышения или
понижения кислотности среды, органических растворителей и т. д.
Как правило, белковая глобула при этом разворачивается и переходит
в клубок. Это приводит к разрушению активного центра фермента и
потере его активности.4)	Инактивация может происходить за счет химической модифи¬
кации функциональных групп, например вследствие аутоокисления
или реакций с примесями.Первая из указанных причин частично снимается при иммобили¬
зации ферментов в пористых носителях, размеры пор которых тако¬
вы, что фермент как бы экранирован от действия микробов. Более
универсальный путь — это проведение процесса в условиях пастери¬
зации (при температурах около 70 °С). Но нагревание приводит к
инактивации большинства ферментов по третьей из указанных выше
причин. В настоящее время разработаны приемы стабилизации фер¬
ментов в условиях повышенных температур, препятствующие разво¬
рачиванию белковой глобулы.Суть большинства этих подходов заключается в том, что искусст¬
венно закрепляют каталитически активную исходную конформацию
фермента. Для этого обрабатывают фермент каким-либо сшиваю¬
щим реагентом, например глутаровым диальдегидом (глутаровый
альдегид — НОС(СН2)зСОН). В результате его взаимодействия с
аминогруппами фермента появляются дополнительные связи между
участками полипептидной цепи, которые и препятствуют ее развора¬
чиванию. Активная конформация фермента будет стабилизироваться
и тогда, когда при иммобилизации белковая глобула будет связывать¬
ся не в одной, а в нескольких точках. Увеличение стабильности (за¬
медление инактивации) ферментов коррелирует, как правило, с чис¬
лом связей между носителем и ферментом.Третий подход состоит в том, что фермент включают в небольшие
«тесные» для него поры носителя. Тогда стенки поры препятствуют
разворачиванию глобулы, однако при этом происходит резкое паде¬
ние ее подвижности.Иммобилизация на твердых носителях резко препятствует меж-
молекулярным процессам инактивации, в частности агрегации и ав¬
толизу.В последнее время разработан метод реактивации денатурирован¬
ных ферментов. Денатурированный белок, как правило, находится в
промежуточном состоянии между полностью статистическим клуб¬
ком и глобулой, так как часть внутримолекулярных связей, например
дисульфидных связей —S—S— , при тепловой инактивации сохраня¬
ется. Если такую молекулу фермента полностью развернуть (а это575
достигается действием сильных, но обратных денатуратов, таких как
мочевина или гуанидин, в сочетании с восстановителями типа дити-
отреитола, восстанавливающими связи —S—S—до —SH), а затем
дать ей возможность медленно свернуться (убрав денатураты и заме¬
нив восстановитель на окислитель, обычно кислород воздуха), то об-*
разуется вновь активная молекула, т. е. восстанавливается исходная
конформация глобулы.Разработанными приемами можно достичь стабилизации фер¬
ментов в сотни, тысячи и даже миллионы раз. При помощи такой тех¬
нологии можно увеличить время жизни фермента при 60—70 °С от
нескольких минут до месяцев, что очень важно для практики.В настоящее время ведется интенсивный поиск и культивирова¬
ние микроорганизмов, живущих в горячих источниках Камчатки при
температурах 60—70 °С (и даже до 110 °С), а также выделение из них
ферментов.Иммобилизуют не только выделенные ферменты, но и целые
клетки микроорганизмов. Чаще всего их включают в полиакриламид¬
ный гель, либо в гель каррагинана — полисахарида из морских водо¬
рослей. Использование клеток по сравнению с выделенными фер¬
ментами имеет ряд преимуществ. Процесс обходится значительно де¬
шевле, кроме того, ферменты в клетках намного стабильнее, чем в
выделенном состоянии. К недостаткам применения клеток относит¬
ся очень низкая проницаемость клеточных оболочек для субстратов.Применение ферментов1.	Получение амино- и оксикислот. Химический синтез всех ами¬
нокислот — давно решенная и не очень сложная задача. Однако хи¬
мические методы дают всегда рацемическую смесь аминокислот и, в
связи с этим необходима дополнительная стадия разделения энан-
тиомеров. Чисто химически это сделать очень трудно. В то же время
ферменты способны «узнавать», а значит, и по-разному реагировать
на L- и D-формы аминокислот или их производные. Преимущест¬
венное расщепление одного из энантиомеров под действием фермен¬
тов настолько предпочтительно, что, как правило, они быстро реаги¬
руют с L-изомером, совершенно не затрагивая D-изомер. Это обстоя¬
тельство, т. е. энантиоселективность, и было положено в основу фер¬
ментативного разделения рацемических смесей аминокислот.Промышленный процесс выглядит следующим образом. Исход¬
ными веществами служат модифицированные по аминогруппе
D.L-аминокислоты (так обозначается рацемическая смесь), получен¬
ные в процессе химического синтеза. На эту смесь воздействуют им¬576
мобилизованной аминоацилазой. Фермент гидролизует амидную
связь только у L-изомера. В результате образуется свободная L-ами-
нокислота, обладающая более высокой растворимостью, чем ациль-
ное производное. Образовавшуюся смесь свободной L-аминокисло-
ты и ацилированной D-аминокислоты разделяют простыми физиче¬
скими методами, пользуясь их различной растворимостью. Остав¬
шийся после разделения D-изомер рацемизируют при повышенной
температуре, т. е. превращают в исходную D.L-смесь, и снова пуска¬
ют в реакцию с ацилазой. В итоге добиваются высокой концентрации
L-аминокислоты. Фермент аминоацилаза мало чувствителен к типу
аминокислоты, и поэтому одна установка с иммобилизованным фер¬
ментом может использоваться для получения самых разнообразных
L-аминокислот.Иммобилизацию аминоацилазы проводят адсорбированием на
специально подобранном полимерном носителе. Когда активность
аминоацилазы падает, в реактор добавляют свежую порцию фермен¬
та, которая тут же адсорбируется на носителе.Введены в производство или находятся в стадии полупромышлен¬
ной и лабораторной разработки процессы ферментативного получе¬
ния L-аспарагиновой кислоты, L-тирозина, ДОФА (L-диоксифени-
лаланин — лекарство от болезней Паркинсона), L-триптофана,
L— лизина, D,a — аминофенилуксусной кислоты. В этом технологи¬
ческом процессе участвуют следующие ферменты: аспартаза, тиро-
зинфеноллиаза, тирозиназа, триптофаназа, а-аминокапролактам-
гидролаза, гидантоиназа и другие ферменты. Главная проблема,
встречающаяся здесь, — это регенерация кофакторов, которые нуж¬
ны для прохождения большинства этих ферментативных реакций.Наиболее успешно эта энзимологическая технология использует¬
ся в синтезе органических кислот, например, L-яблочной кислоты,
которая широко применяется как заменитель лимонной кислоты в
пищевой промышленности. Химически может быть получена только
рацемическая D.L-яблочная кислота. В то же время чистую L-яблоч-
ную кислоту можно получать по реакции гидратации фумаровой ки¬
слоты в присутствии фумаразы. В качестве катализатора используют
клетки микроорганизмов, иммобилизованные в геле каррагинана.2.	Превращение углеводов. В 70-х годах в производстве стали при¬
менять фермент глюкозоизомеразу, которая катализирует взаимо¬
превращения глюкозы и фруктозы:Глюкоза «=* ФруктозаПроцесс проходит следующим образом. В колонку высотой до 5 м
загружают иммобилизованный фермент в виде гранул и затем непре¬37-4266577
рывным потоком пускают водный раствор глюкозы. На выходе полу*
чают так называемый глюкозо-фруктозный сироп. Этот сироп можно
использовать непосредственно или же, отделив фруктозу, вновь изо-»
меризовать оставшуюся глюкозу до смеси фруктозы и глюкозы и т. д.
Прежде глюкозо-фруктозный сироп получали в результате гидролизе
сахарозы под действием фермента инвертазы. Фруктозу применяю!
для лечения больных сахарным диабетом, так как ее превращения в
организме человека не связаны с наличием инсулина.С помощью другого фермента — лактазы получают безлактозное
молоко, предназначенное для людей, в организме которых лактаза
отсутствует.В последнее время потребление сахара возросло настолько, что
его природные источники оказываются недостаточными. Это застав-*
ляет интенсивнее использовать другие источники глюкозы — высо¬
комолекулярные углеводы крахмал и целлюлозу. Промышленная пе¬
реработка крахмала идет под действием двух ферментов: а-амилазы и
глюкоамилазы, катализирующих его гидролиз до глюкозы. Еще более
мощный источник глюкозы — целлюлоза. Гидролиз целлюлозы до
глюкозы идет под действием ферментов, называемых целлюлозами.3.	Модификация 0-лактамных антибиотиков. В этой области про¬
изводства весьма перспективен метод ферментативного катализа реак¬
ции гидратации бензинпенициллина до образования 6-АПК (6-ами-
нопенициллиновой кислоты), под действием пенициллинамида-
зы:Бензилпенициллин + Н20 +* 6-АПК + Фенилуксусная кислотаФермент пенициллинамидаза по механизму гидролиза близокх
химотрипсину, легко включается в полиакриламидный гель, моди¬
фицированный глутаровым альдегидом, и обладает благодаря этому
достаточно высокой активностью.Внедрение этого процесса в практику в последние годы открыло
доступ к широкомасштабному производству многих «полусинтетиче-
ских» пенициллинов, обладающих высокой устойчивостью в кислых
средах, высокой активностью по отношению к большому количеству
микробов, низкой токсичностью для организма человека, а также ус¬
тойчивостью к ферменту р-лактамазе, гидролизующему в отличие от
пенициллинамидазы лактамное кольцо, что приводит к полной поте¬
ре антибиотической активности (это очень важно, поскольку многие
микробы содержат Р-лактамазу).На этом, однако, возможности инженерно-энзимологических
подходов в данной области не исчерпываются. Пенициллинамидазе
присуща уникальная специфичность также и по отношению к гидро¬578
лизу цефалоспоринов: отщепляется только боковая группа, а Р-лак-
тамазный цикл остается нетронутым. Это свойство используют для
получения 7-ДЦЦК (7-аминодезацетоксицефалоспорановой кисло¬
ты) в реакции гидролиза соответствующего фенилацетатного произ¬
водного. Таким образом, открывается путь к получению очень пер¬
спективных лекарственных средств на основе «полусинтетических»
цефалоспоринов.4.	Инженерная энзимология в тяжелом органическом синтезе. Неко¬
торые из рассмотренных процессов, например получение аминокис¬
лот и антибиотиков, можно отнести к тонкому органическому синте¬
зу. Рассмотрим некоторые перспективные направления развития ин¬
женерной энзимологии для целей тяжелого органического синтеза
(крупнотоннажное производство кислот, мономеров, сшивающих
агентов и т.д.).Одно из направлений в этой области — синтез эпоксидов (окислы
олефинов) из алкенов при помощи фермента монооксигеназы:RCH =» СН2 + 1/20г <=* RCHCH20В этом процессе используют непосредственно клетки микроорга¬
низмов, содержащих монооксигеназу, включенную (иммобилизо¬
ванную), например, в гель. Для ее функционирования необходим ко¬
фактор — восстановленный НАД (НАД-Н).Если в качестве субстрата монооксигеназы использовать не ал-
кен, а алкан, то этот фермент катализирует другую важную реакцию:
концевое гидроксилирование углеводорода до первичного спиртаС„Н2л + J+1/20Jз* Сл_,Н2яСН2ОНПервичные спирты — очень ценные полупродукты для получе¬
ния различных моющих средств.Еще один пример потенциально важного крупнотоннажного про¬
цесса — ферментативное получение акриламида и акриловой кисло¬
ты из акрилонитрила (СН2 — CHCN). Гидролиз нитрильной группы
можно проводить и химически, но в довольно жестких условиях.
Фермент нитрилгидратаза катализирует эту реакцию при комнатной
температуре в нейтральной среде:СН2= CHCN + Н20 за CH2CHCONH2А в присутствии амидазы можно продолжить реакцию до получе¬
ния акриловой кислоты:СН2 = CHCONH2 + Н20 ** СН2= СНСООН + NH3579
5.	Биоэлектрокатализ. Ферменты, участвующие в биоэлектрока¬
тализе, могут находиться как в растворе, так и в иммобилизованном
состоянии прямо на поверхности электрода. К биоэлектрокатализу
относят не только системы, в которых фермент ускоряет саму элек¬
тродную реакцию, но и такие, в которых ферментативной является
предшествующая реакция, генерирующая электрохимически актив¬
ные частицы. К последнему типу реакций относятся реакции окисле¬
ния глюкозы до глюконовой кислоты с участием глюкозооксидазы и
последующее окисление иодид-иона до иода за счет пероксида водо¬
рода, выделившегося в пероксидазной реакции.Ферменты, участвующие непосредственно в катализе электрод¬
ных процессов (гидрогеназа, лактаза и т. д.), могут быть как раствори¬
мыми, так и иммобилизованными на электроде. Очень удачным спо¬
собом иммобилизации оказалась адсорбция фермента на саже, иду¬
щая практически необратимо и почти с полным сохранением его ак¬
тивности.6.	Фотографические материалы на основе ферментов. Еще одна до¬
вольно неожиданная область применения иммобилизованных фер¬
ментов — создание на их основе фотографических материалов.
Принцип ферментативной фотографии, часто называемой «фотоэн-
зография», основан на том, что подходящий фермент Е превращают в
неактивную форму Е", причем обратный переход может быть осуще¬
ствлен под действием кванта света: Е" ^ Е.Активный фермент может переработать практически сколько
угодно молекул субстрата (S) в продукт (Р): S ^ Р.Таким образом
достигается усиление светового сигнала, так как один квант света ге¬
нерирует много молекул продукта Р. Если этот продукт будет окра¬
шен, то попадание света на пластинку или пленку, содержащую фер¬
мент и субстрат, будет сопровождаться появлением окраски. Ее ин¬
тенсивность пропорциональна количеству образованной активной
формы Е, т.е. интенсивности освещения отдельных участков пленки.
Таким образом возникает изображение. Чтобы оно не расплылось,
необходимо подобрать субстрат, дающий не только окрашенный, но
и нерастворимый продукт. Например, одна из первых и очень удач¬
ных систем была основана на реакциях взаимодействия гидролитиче¬
ского фермента химотрипсина с производными коричной кислоты.Чувствительность фотоэнзографических материалов выше, чем
серебряных. Кроме того, они обладают и более высокой разрешаю¬
щей способностью, так как в них нет зерен, которые формируют изо¬
бражение в обычной фотографии. Есть у фотоэнзографии и свои
трудности. Главная из них — получение фоточувствительных пред¬
шественников ферментов, реактивируемых видимым светом (напри¬580
мер, та же система на основе производных коричной кислоты работа¬
ет только в ультрафиолетовой области спектра).7.	Другие области применения и перспективы инженернойэнзимоло-
гии. Что же касается аналитического применения ферментов, то здесь
надо сказать о биолюминесцентных методах анализа, позволяющих
определять до 10—14 моль/л АТФ, а также НАД. Они основаны на
том, что под действием фермента люциферазы, выделяемой из неко¬
торых светлячков, происходит окисление довольно сложной молеку¬
лы люциферина, которое сопровождается испусканием кванта света
и гидролизом одной молекулы АТФ. Лучше всех изучен люциферин
светляка Luciola mingrelica, наиболее часто используемого в техноло¬
гии биолюминесцентного определения АТФ.Современные приборы позволяют регистрировать излучение со¬
вершенно ничтожной интенсивности, и это дает возможность опре¬
делять очень низкие концентрации АТФ.Широко внедряются в медицинскую практику методы иммуно-
ферментного анализа (ИФА). Они предназначены для определения
низких концентраций разнообразных биологически активных ве¬
ществ (лекарств, гормонов, иммуноглобулинов, вирусных и бактери¬
альных антигенов, антител к различным антигенам и т. д.) по их им-
мунохимическим свойствам. Дело в том, что попадание в организм
постороннего вещества (антигена) вызывает ответную реак¬
цию — выработку антител, предназначенных для данного антигена, и
взаимодействуют с ним в очень низких концентрациях. Этими свой¬
ствами иммунной системы и пользуются для создания ИФА (опреде¬
лять можно как антитела, так и антигены).Одними из основных методов ИФА являются твердофазный метод
ELISA (ensyme linked immunosorbent assay) и обладающий более высо¬
кой экспрессивностью гомогенный метод EMIT (ensyme multiplay
immunotechnic). Последний применяется для быстрого определения
отравлений лекарственными и наркотическими средствами.Еще одна область применения ферментов в медицине — устране¬
ние дефицита некоторых ферментов в организме с целью компенса¬
ции функциональной недостаточности; удаление уже отмерших де¬
натурированных структур под действием, главным образом, гидроли¬
тических ферментов, лизис тромбов и детоксикация организма.Также ферменты применяются для катализа реакций синтеза ко¬
факторов, необходимых для активации некоторых ферментов. На¬
пример, синтез АТФ в реакции диспропорционирования 2 мольАДФ
с участием аденилаткиназы (в растениях) или миокиназы (в живот¬
ных тканях):581
2АДФ АТФ + АМФ!Из всех рассмотренных процессов инженерной энзимологии,
созданных в последнее время, внедрено в практику лишь производств i
во пищевых продуктов и медицинских препаратов. Такое ограничё-^
ние современных реальных возможностей инженерной энзимологи$
вызвано, например, сильной конкуренцией со стороны уже существ
вующих химических и микробиологических производств, технология
которых за длительный период доведена до определенного совершен¬
ства.	1Контрольные вопросы к главе 111.	Участие и использование биохимических процессов в биотехнологии.2.	В чем различия между геномом прокариотических и эукариотических кле¬
ток?3.	Кодирование белков-ферментов, ответственных за ассимиляцию нитра¬
тов.4.	Классификация аминокислот и их активация.	j5.	Элементы биохимической генетики в процессе азотфиксации. Понятие о
нодулинах.6.	Биосинтез белка и его регуляция на генетическом уровне.7.	Генетический код. Вырожденность генетического кода.8.	Генетическое кодирование аминокислотных последовательностей в бел¬
ках.9.	Структура и функции рибосом эукариот.10.	Рибосомы: инициация трансляции.11.	Рибосомы: элонгация, терминация.12.	Что такое полисомы?13.	Какие механизмы внутриклеточной регуляции обмена веществ вы знае¬
те?14.	Понятие о генной регуляции биохимических реакций.	]15.	Механизм генной регуляции: модель Жакоба—Моно. Отступления от ;
теории Жакоба—Моно.16.	Какие биохимические доказательства генетической сущности ДНК вы
знаете?17.	Объясните сущность биохимической регуляции морфогенеза и регене¬
рации организмов.18.	В чем сущность биохимической регуляции формирования качества рас- ]
тениеводческой продукции?19.	Использование методов генной инженерии для улучшения питательной
ценности белков растений.20.	Понятие о белковой инженерии и технологии создания синзимов — ис¬
кусственных каталитических белков.21.	Какова практическая роль биохимической и генетической инженерии?22.	Что такое инженерная энзимология?23.	Назовите методы иммобилизации ферментов.24.	Приведите примеры использования ферментов в производстве и меди¬
цине.582
ЛИТЕРАТУРААлберте Б. и др: Молекулярная биология клетки/Пер. с англ. — М.: Мир,1993.Albert В. et al. Molekularbiologie der Zelte, Verlag Chemie, Weinheim, 3. Auff.,1995.Branden C., Tooze J. Introduction to protein structure, Garland Publishing
Inc., New York, 1991.Buddecke E. Grundriss der Biochemie, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, 9.
Auff., 1994.Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия/Пер. с англ. — М.: Мир, 1983.
Землянухин А.А., Иванов Б.Ф. Биохимия растений. Изд-во Воронежского
ГПУ, 1997.Иванов В.Т., Липкин В.М. Белки и пептиды. — М.: Наука, 1995.
Калоус В,, Павличек 3. Биофизическая химия/Пер. с чешек. — М.: Мир,1985.Karlsoit P. et al. Kurzes Lehrbuch der Biochemie, Georg Thime Verlag,
Stuttgart, 14. Auff., 1993.Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. — М.: Высшая школа,2003.Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия. — М.: Дрофа, 2004.Koolman J., R6hm К.Н. Taschenatlas der Biochemie, 2. Auff. — Stuttgart —
New York: Georg Thieme Verlag, 1998.КретовичВЛ. Основы биохимии растений. — М.: Высшая школа, 1986.
Леницджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функций
клетки/Пер. с англ. — М.: Мир, 1974, 1976.ЛенииджерА. Основы биохимии: в 3-х т.: Пер. с англ. — М.: Мир, 1985.
Uffiler G., Petrides Р.Е. Physiologische Chemie, Springerverlag, Berlin, 5.
Auff., 1997.Льюин Б. Гены/Пер. с англ. — М.: Мир, 1987.Малыгин А.Т. Метаболизм карбоновых кислот (периодическая схе¬
ма). — М.: Наука, 1999.Матвеева О.А. Некоторые вопросы биохимической генетики.—Тамб.
ГПУ, 1977.Мецлер Д. Биохимия: В 3-х т./Пер. с англ. — М.: Мир, 1980.Murray R.R. et al. Harpers Biochemistry, Prentice Hall, International,
London, 24 ed., 1996.Мусил Я. и др. Современная биохимия в схемах/Пер. с англ. — М.: Мир,
1981, 1984.Новиков Н.Н. Биохимия, ч. 1, ч. 2. — М.: МСХА, 2004.Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. — М.: Просвещение, 1987.
Основы биохимической инженерии.— М.: Мир, Т. 1—2, 1989.
Плакунов В.К. Основы энзимологии. — М.: Логос, 2001.Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений. — М.: МСХА,
1987.583
Попов Е.М. и др. Проблемы белка: Химическое строение белка. — М.:
Наука, 1995.Пронина Н.Б. Биохимия: сборник тестов, количественных и логических
задач. — М.: МСХА, 2005.Пронина Н.Б. Биохимические основы генетической инженерии, биотех¬
нологии и растениеводческой продукции (конспективный курс лек¬
ций). - М.: МСХА, 2003.Пронина Н.Б. История биохимии в датах (хронологическая лето¬
пись). - М.: МСХА, 2005.Пронина Н.Б. Биохимическая технология (словарь, толкование терми¬
нов).- М.: МСХА, 2007.Проскуряков М.Т. Биохимия и молекулярная биология. — Краснодар:
Кубанский университет, 1993.Сб. Генетическая инженерия. Структура и функции биополимеров/Ред.
Г. Мацука.— М.: Наука, 1998.Сб. Генетические и биохимические механизмы регуляции функций жи¬
вых систем. — Иркутск, 1984.Сб. Генетический подход к биохимии растений. — М.: Агропромиздат,
1990.Страйер JI. Биохимия. Т. 3. — М.: Мир, 1985.Сухомлин К Г. и др. Биохимия с основами физической и коллоидной хи¬
мии. — Краснодар: Кубанский гос. аграр. унив., 2003.Уайт А. и др. Основы биохимии: В 3-х т./Пер. с англ. — М.: Мир, 1981.Stryer L. Biochemie, Spektrum der Wissenschaft, Verlaggesellschaft,
Heidelberg, 4. Auff, 1996.Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. — М.: Высшая школа, 1993.Хочачка П., Сомеро Д. Стратегия биохимической адаптации. — М.: Мир,
1977.Voet D., Voet J.G. Biochemie.Webb E.S. (ed.) Enzyme Nomenclature 1992, published for IUBMB, Academic
Press, San Diego, 1992.Rawn J. D. Biochemistry, Neil Patterson Publishers, Burlington, 1989.
Глава 12БИОТЕХНОЛОГИЯ В экологии12.1.	ПОНЯТИЕ ЭКОЛОГИИ И ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ
БЕЗОПАСНОСТИЭкология — это наука об отношениях растительных и животных
организмов в сообществах, образуемых ими между собой и с окру¬
жающей средой (О.В. Богданович, 2002). В определении О.В. Богда¬
новича имеются два существенных недостатка: отсутствие в цепи
взаимоотношений со средой человека как главного звена в экологи¬
ческом треугольнике взаимодействия: человек — флора и фауна —
неорганическая среда. В конечном итоге экологический эффект от
взаимодействия трех составляющих среды сводится к взаимодейст¬
вию генотипа человека, растения и животного с факторами неорга¬
нического мира.Число факторов, оказывающих отрицательное или положитель¬
ное экологическое влияние на человека и природу, постоянно воз¬
растает, особенно за счет расширения количества факторов техноген¬
ной природы.Резкие колебания напряженности факторов внешней среды, осо¬
бенно мутагенных, таких как тяжелые металлы, радионуклиды, сво¬
бодные радикалы, запредельные дозы облучения видимыми и неви¬
димыми участками спектра солнечного света и радиоволн, потоками
протонов, нейтронов и других элементарных частиц, оказывают сти¬
мулирующее или угнетающее воздействие на человека, растения, жи¬
вотных и микроорганизмы, положительное или отрицательное воз¬
действие на их генетическую систему, мутагенные изменения в на¬
следственности.Масштабы отрицательных экологических последствий во всем
мире в настоящее время достигли такого уровня, что стали причина¬
ми крупнейших экологических катастроф и угрожают самому суще¬
ствованию людей и цивилизации в целом. На первое место вышли
масштабные поражения человека и природы продуктами ядерных
взрывов и аварий на атомных электростанциях, утечки химических585
соединений, потери нефтепродуктов, применения средств химиче¬
ской защиты растений от вредителей и болезней. Чернобыльская ка-j
тастрофа была самой большой в ряду многочисленных аварий н£
атомных электростанциях всего мира. Значительно уменьшилась
экологическая опасность от химизации сельского хозяйства в РоссиЦ
в связи с резким снижением объемов применения средств химизации
в условиях так называемого реформирования отрасли. Разработан*
ные в России меры по защите человека и природы от опасного воз¬
действия экологических факторов проводятся на основе утвержден^
ной Правительством Экологической доктрины Российской Федера-1
ции.12.2. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ДОКТРИНА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИДальнейшая деградация природных систем ведет к дестабилиза¬
ции биосферы, утрате ее целостности и способности поддерживать
качество окружающей среды, необходимое для жизни людей. Пре¬
одоление кризиса возможно только на осйЬве формирования нового
типа взаимоотношений человека и природы, исключающих возмож¬
ность разрушения и деградации природной среды. Ее сохранение и
восстановление должно быть одним из приоритетных направлений
деятельности государства и общества.В Экологической доктрине определены основные факторы дегра¬
дации природной среды на мировом уровне и в Российской Федера¬
ции. К важнейшим факторам мирового уровня относятся: рост по¬
требления природных ресурсов при сокращении их запасов; увеличе¬
ние численности населения планеты Земля при сокращении террито¬
рий, пригодных для проживания людей; возможное изменение
климата и истощение озонового слоя земли; возрастание экологиче¬
ского ущерба от стихийных бедствий и техногенных катастроф; про¬
должающиеся военные конфликты и террористические акты.К числу основных факторов деградации природной среды Рос¬
сийской Федерации относятся: преобладание ресурсодобывающих и
ресурсосодержащих секторов в структуре экономики; низкая эффек¬
тивность природопользования и охраны окружающей среды; резкое
ослабление управленческих и прежде всего контрольных функций
государства в области природопользования и охраны окружающей
среды; высокая доля теневой экономики в использовании природных
ресурсов; низкие технологический и организационный уровни эко¬
номики, высокая степень износа основных фондов; последствия эко¬
номического кризиса и невысокий уровень жизни людей; низкийS86
уровень экологического сознания и экологической культуры населе¬
ния страны.Все указанные факторы должны учитываться при проведении в
Российской Федерации единой государственной политики в области
экологии.12.2.1.	Стратегическая цель, принципы и основные направления
государственной политики в области экологииСтратегической целью государственной политики в области эко¬
логии является сохранение природных систем, поддержание их цело¬
стности и жизнеобеспечивающих функций для устойчивого развития
общества, повышения качества жизни, улучшения здоровья населе¬
ния и демографической ситуации, обеспечение экологической без¬
опасности страны.Государственная политика в области экологии базируется на сле¬
дующих принципах: признание невозможности развития человече¬
ского общества при деградации природы; приоритетности жизне¬
обеспечивающих функций биосферы по отношению к прямому ис¬
пользованию ее ресурсов; отказа от хозяйственных и иных проектов,
связанных с воздействием на природные системы, если их последст¬
вия непредсказуемы для окружающей среды; предотвращение нега¬
тивных экологических последствий в результате хозяйственной дея¬
тельности, учет отдаленных экологических последствий; открытость
экологической информации; участие гражданского общества, орга¬
нов самоуправления и деловых кругов в подготовке, обсуждении,
принятии и реализации решений в области охраны окружающей сре¬
ды и рационального природопользования.Из главной стратегической цели, принципов и научных разрабо¬
ток вытекают основные направления государственной политики и
приоритетные направления деятельности всех государственных и
иных структур и движений по обеспечению экологической безопас¬
ности Российской Федерации при разработке и осуществлению ме¬
тодов, путей и средств реализации государственной политики в об¬
ласти экологии.Главными из них являются: обеспечение устойчивого природо¬
пользования; снижение загрязнения окружающей среды и ресур¬
сосбережение; сохранение и восстановление природной среды; пре¬
дотвращение и снижение экологических последствий чрезвычайных
ситуаций; предотвращение терроризма, создающего опасность для
человека и окружающей среды; нормативно-правовое обеспечение и
правоприменение.587
Важнейшими направлениями деятельности государства в областц
обеспечения экологической безопасности страны являются научно!
обеспечение и контроль над использованием и распространением чу*
жеродных видов и генетически измененных (модифицированный
организмов. В экологической доктрине Российской Федерации этикЦ
проблемам уделено значительное место.	%I12.2.2.	Научное обеспечение доктрины	IdОсновными задачами научного обеспечения по защите окружаю-i
щей среды являются получение и эффективное использование новых
научных знаний об экологических основах устойчивого развития;
выявление экологических рисков, порожденных развитием обществ
ва, а также природными процессами и явлениями. Важнейшими на¬
правлениями научного обеспечения экологической безопасности
страны л доктрине определены: формирование теоретических и тех¬
нологических основ перехода к устойчивому развитию Российской
Федерации; разработка экологической составляющей стратегическо¬
го прогноза развития России; изучение возможного глобального и ре¬
гионального изменения климата и его последствий для природной
среды. К ним .относятся также: разработка экологически эффектив¬
ных и ресурсосберегающих технологий, производств, видов сырья,
материалов, продукции и оборудования; формирование научных
принципов и технологий использования возобновляемых энергети¬
ческих, биологических и иных источников и ресурсов, обеспечиваю¬
щих их устойчивое воспроизводство; разработка эффективных мето¬
дов сохранения биологического разнообразия; создание научных ос¬
нов определения экологических рисков в целях создания системы
управления качеством природной среды. Крайне важными являются
также: разработка средств и методов предупреждения и ликвидации
загрязнений, реабилитации окружающей среды и утилизации опас¬
ных отходов; изучение связи между заболеваниями людей и измене¬
ниями качества окружающей среды; разработка современных мето¬
дов экологического мониторинга, а также информационных техно¬
логий. В состав основных задач входят также: разработка методоло¬
гии и методов эколого-экономической оценки для использования
при принятии решений в различных отраслях экономики Россий¬
ской Федерации.С учетом большой обеспокоенности общественности многих
стран мира по поводу возможных отрицательных экологических по¬
следствий при использовании современных методов биотехнологии
и биоинженерии в народном хозяйстве в разделе научного обеспече¬588
ния экологической безопасности России предусмотрен специальный
пункт, в котором содержится порядок анализа распространения чу¬
жеродных и генетически измененных видов живых организмов и раз¬
работка соответствующих методов контроля и снижения негативных
последствий этих процессов.12.2.3.	Экологическое образование и просвещениеИх целью является повышение экологической культуры населе¬
ния, образовательного уровня и профессиональных навыков и зна¬
ний в области экологии. Реализация этой задачи должна осуществ¬
ляться на основе выполнения следующих основных мероприятий:
создание государственных и негосударственных систем непрерывно¬
го экологического образования и просвещения; включение вопросов
экологии в учебные планы на всех уровнях образовательного процес¬
са; подготовка и переподготовка в области экологии педагогических
кадров для всех уровней системы образовательного процесса и про¬
свещения; государственная поддержка деятельности образования и
просвещения; развитие системы подготовки в области экологии ру¬
ководящих работников различных сфер производства, экономики и
управления, а также повышения квалификации специалистов приро¬
доохранных служб, правоохранительных и судебных органов; под¬
держка и публикация материалов по вопросам экологии в средствах
массовой информации.12.2.4.	Биотехнология и биоинженерия — стратегические резервы
для увеличения производства продовольствия и экологически
чистой продукцииТрансгеноз биологических объектов, их генетическая трансфор¬
мация относится к разряду высоких технологий, используемых для
получения устойчивых к биотическим и абиотическим факторам сре¬
ды растений, животных и микроорганизмов с высокими функцио¬
нальными и качественными показателями. За последние 20 лет био¬
технология, используя рекомбинантные ДНК, превратилась в неоце¬
нимый новый научный метод исследования и производства продук¬
ции сельского хозяйства. Это беспрецедентное проникновение
мысли ученых в глубины генома на молекулярный уровень. Его сле¬
дует рассматривать как одно из важнейших направлений на пути бес¬
конечного познания природы. Рекомбинантные ДНК позволяют се¬
лекционерам отбирать и вводить в растения гены «поодиночке», что
не только сокращает время исследований по сравнению с традицион¬589
ной селекцией, но и дает возможность получать «полезные» гены из
самых разных видов растений. Генетическая трансформация сулит
огромную пользу для производителей сельскохозяйственной продук¬
ции, в частности, повышения устойчивости растений к насеког
мым — вредителям, болезням и гербицидам (Н.Э. Борлауг, 2004).В 2002 г. трансгенные сорта дали в мире сельскохозяйственной
продукции на 1,8 млрд т больше, чем обычные на тех же площадях,
при этом пестицидов использовано на 21 тыс. т меньше, а доходы уве¬
личились на 1,5 млрд долларов США. Кроме финансовой прибыли
выращивание ГМО имеет ощутимые социальные и экологические
выгоды и последствия: сокращаются расходы на производство сель¬
скохозяйственной продукции, снижается химическая загрязнен¬
ность воды и почвы (А.П. Ерминсен, 2004).Направленный перенос генов других видов генетического мате¬
риала из генома растений-доноров в геномы растений-реципиентов
при соблюдении оптимальной технологии сопровождается получе¬
нием ГМО с заданными свойствами. На первом месте в этих работах
стоит задача получить генетически устойчивые к наиболее опасным
вредителям и болезням растений и животных, возделывание и содер¬
жание которых возможно без применения или при резком сокраще¬
нии объемов химических средств защиты, что обеспечит получение
экологически чистой продукции. Посевы трансгенных растений в
мире, главным образом, в США, Канаде, Аргентине, Китае и Индии
составляют уже более 105 млн га, из них 71 % составляюттрансгенные
растения, устойчивые к гербицидам, 22 % — устойчивые к вредите¬
лям, остальные 7% — устойчивые к болезням. Более половины посе¬
вов сои в мире заняты трансгенными сортами, кукурузы — свыше
25 %, остальные площади заняты трансгенным хлопчатником, карто¬
фелем, рапсом и томатами. В России, до настоящего времени нет ни
одного гектара посевов трансгенных растений.В мире, в том числе в России, получены трансгенные коровы,
овцы, свиньи, кролики, птица, обладающие повышенной устойчиво¬
стью к болезням, способностью вырабатывать фермент хитозин в мо¬
лочной железе, гормон роста соматотропин и другие биологически
активные вещества, повышающие продуктивность скота и качество
продукции.Основное беспокойство людей, главным образом, в странах ЕС
вызывает широко распространенное в средствах массовой информа¬
ции мнение о генетическом риске и опасности для здоровья человека
продуктов питания, полученных из генетически модифицированных
организмов — растений и животных. Из более чем 30-летней практи¬
ки получения и использования ГМО в мире не было случаев гибели590
или нанесения ущерба здоровью людей или экологии среды от созда¬
ния, распространения или использования трансгенных организмов.
Беспокойство, опасения и категорические возражения против ГМО в
ряде стран ЕС связано с неподтвержденными фактами сообщений
СМИ о гибели и заболеваниях людей и нанесении большого ущерба
природе. Наоборот, широкое использование трансгенных техноло¬
гий в сельскохозяйственной науке и практике позволяет создавать ге¬
нетически контролируемые системы высокой устойчивости в расте¬
ниеводстве, животноводстве, переработке, хранении и использова¬
нии пищевых продуктов, резко сократить применение пестицидов в
сельскохозяйственном производстве, свести до минимума пестицид-
ную нагрузку на человека и окружающую среду, стратегически ре¬
шить эту сложную и важную проблему на перспективу.Нынешнее сокращение объемов применения пестицидов и мине¬
ральных удобрений, связанное с резким уменьшением их производ¬
ства в России, вызвано проводимыми в стране реформами промыш¬
ленности и сельского хозяйства и привело к сокращению объемов ва¬
лового производства сельскохозяйственного производства почти в
два раза и является одной из причин потери Россией продовольствен¬
ной безопасности. При восстановлении технологических регламен¬
тов в сельском хозяйстве и использовании новейших научных дости¬
жений, в том числе ГМО растений и животных, в стране будет восста¬
новлен прежний уровень производства продовольственных продук¬
тов при одновременном решении экологической безопасности
сельского хозяйства.В растениеводстве применяются также нетрансгенные биотехно¬
логии, снижающие уровень загрязнения среды и повышающие эко¬
логическую биобезопасность территорий и производства, Среди них
наиболее эффективными являются технологии создания и примене¬
ния биопрепаратов, полученных на основе грибковых, вирусных и
бактериальных антагонистов патогенов, вырабатывающих специфи¬
ческие белки, в том числе ферменты, противодействующие развитию
патогенных возбудителей болезней и распространению опасных вре¬
дителей сельскохозяйственных растений. Во многих странах, в том
числе в и России, выявлены многие штаммы грибов и бактерий, виды
насекомых — антагонистов возбудителей болезней и вредителей.
С их помощью резко снижается уровень поражения посевов картофе¬
ля колорадским жуком, хлопчатника — совкой, овощных культур в
теплицах — белокрылкой, различных вредителей в садах с использо¬
ванием трихограммы. Выпускаемые биопрепараты и в целом биоло¬
гические методы борьбы с вредителями и болезнями пока не облада¬
ют достаточной эффективностью и их применение в сельском хозяй¬591
стве России весьма ограничено. Отрицательное влияние на развитие
биометода в аграрном секторе экономики оказали также проводимые
реформы, которые привели к разрушению созданных ранее биофаб¬
рик и предприятий по выпуску автоматизированных линий по произ¬
водству трихограммы, антрактантов и репеллентов, бактериальных и
грибных препаратов по борьбе со склеротиниозом и фомопсисом на
подсолнечнике и др.Выпуск генно-инженерных моно- и поливалентных вакцин для
профилактики и терапии опасных болезней в животноводстве также
крайне 01раничен. Выпускаются в больших количествах только вак¬
цины и другие биопрепараты для профилактики и лечения таких осо¬
бо опасных болезней, как ящур, сибирская язва, сап, бешенство, хо¬
лера. Не решены проблемы защиты скота от туберкулеза, лейкоза,
других онкологических заболеваний.Резко сократились работы по синтезу, производственной провер¬
ке и применению в производстве синтетических регуляторов роста и
развития растений, обладающих эффектом их иммунизации. Объем
применения природных фитогормонов и синтетических препара¬
тов — стимуляторов и ретардантов в сельском хозяйстве России рез¬
ко сократились, обработка посевов зерновых против полегания рас¬
тений ретардантом «ССС» практически прекратились, тогда как до
проведения аграрных реформ она достигала 11 млн га в год.Большое экологическое значение в сельскохозяйственном произ¬
водстве имеет биоконверсия органических отходов, переработка их на
биогаз и удобрения, используемые на производственные и бытовые ну¬
жды и повышение плодородия почв. На первом месте в мире по ис¬
пользованию биогаза, получаемого из навоза свиней и других видов
скота, стоит Китай. Около 80 % крестьянских хозяйств имеют у себя
малогабаритные биогенераторы (метантенки) кустарного производ¬
ства, рассчитанные на переработку суточного выхода навоза. Полу¬
чаемый при этом газ — метан используется на месте для отопления,
нагрева воды и т.п. Проблема конверсии навоза для России является
спорной. На 120 млн га российских низкоплодородных деградиро¬
ванных почв навоз необходим как главное средство повышения их
плодородия и восстановления структуры. Особенно эта проблема
обострилась в условиях ликвидации более чем на 50 % поголовья
крупного рогатого скота и на 70 % поголовья овец и свиней. Для без¬
дефицитного по гумусу и плодородию почв ведения растениеводства
в расчете на каждый гектар пашни необходимо вносить ежегодно не
менее 10—15 т навоза, а фактически вносится в настоящее время
1,5—2,0 т органических удобрений. Наряду с расширением посевов592
бобовых культур, использованием сидеральных удобрений он являет¬
ся решающим фактором биологизации земледелия и решения про¬
блемы экологической безопасности в агропромышленном производ¬
стве.С другой стороны, при бесхозяйственном ведении животноводст¬
ва и растениеводства, избыточного накопления навоза возле ферм и
особенно возле животноводческих комплексов, при неправильном
его хранении, смыва его в водоемы и овраги происходит загрязнение
территорий, проникновение жидкой фракции навоза в подпочвен¬
ные воды и водоносные горизонты, чем создается огромная опас¬
ность загрязнения всех водных источников инфекциями, болезне¬
творными микроорганизмами. Строительство современных биоло¬
гических очистных сооружений требует огромных финансовых и
материальных затрат и не решает в полной мере проблемы экологиче¬
ской безопасности.Новейшие разработки биотехнологии России для решения эколо¬
гических проблем были широко продемонстрированы на Москов¬
ских международных биотехнологических конгрессах в 2003, 2004 и
2005 годах. Важнейшими направлениями указанных разработок были
методы и технологии биоремедиации загрязненных природных и тех¬
ногенных сред. Они основаны на использовании специализирован¬
ных биопрепаратов, представляющих собой популяции микроорга¬
низмов одного или нескольких штаммов деструкторов (Н. Б. Градова,
И.И. Щеблыкин с соавт.); агротехнических методов стимуляции ак¬
тивности природных микроорганизмов деструкторов; использова¬
нии фиторемедиации, стимуляции ризосферных микроорганизмов,
стимулирующих в свою очередь рост растений (О.В. Туровская с со¬
авт., Боуспаев с соавт., В.М. Кадошников и др.)Разработано второе поколение биоремедиационных технологий.
Созданы специальные установки — биореакторы для предваритель¬
ной обработки сильно загрязненных сред нефтепродуктами, в которых
создаются оптимальные условия для развития как природных, так и
индуцированных микроорганизмов-деструкторов (И.Н. Щеблыкин с
соавт., Т.Н. Кондращенко с соавт.).Новое поколение биопрепаратов характеризуется использовани¬
ем иммобилизованных микроорганизмов на органических и неорга¬
нических биосорбентах (Розанова с соавт., Т.Н. Кондращенко с со¬
авт., Т.В. Сахно с соавт.). Новейшие препараты, созданные для этих
целей, содержат элементы минерального питания, витамины, компо¬
ненты — переносчики кислорода (А.В. Леднев, Курсиновссоавт.).593
Осуществлена модификация биологических методов очистки
сточных вод за счет использования иммобилизационных клеток и со¬
вместного применения аэробных и анаэробных условий (НА. Зале»
това), биосорбентов, формирования активного ила в микрогранулы
(Н.С. Сироткин и др., Г.И. Шагинурова и др.), использования ана¬
эробных биоректоров с глинистыми полиэтиленовыми пластинами
для образования биопленок и иммобилизации клеток активного ила
(Д. Вантер). Разработана гибридная технология для биодеструкции
ксенобиотиков (О.В. Турковская с соавт.).Для очистки газовоздушных выбросов созданы биокатализаторы
на основе иммобилизационных клеток и новых конструкций биоре¬
акторов (А.А. Попов с соавт.).В области переработки и утилизации отходов вместо дорогостоя¬
щих энергоемких и неэкологичных методов сжигания предложена
технология получения удобрений с использованием аэробной фер¬
ментации или анаэробной трансформации органических компонен¬
тов (Б.А. Горлецкий и др., Сильман). Имеется технология получения
из твердых отходов биопластика для производства древесно-стружеч¬
ных плит (Е.А. Прутенская,Т.Н. Кондращенко с соавт.), разработана
гетерофазная технология переработки целюлозо- и крахмалсодержа¬
щего сырья с получением белково-углеводных кормовых продуктов
(А.В. Васильев и др.).Разработаны методы биотестирования биоремедиационных тех¬
нологий и генотаренкантов. Для мониторинга трансгенных микроор¬
ганизмов предложена методика оценки их стабильности при исполь¬
зовании в качестве маркера клонированных в плазмиды Lux-генных
бактерий.Развиваются исследования в области микробиологической кор¬
розии различных материалов, биодеструкции бетонных контейнеров
для хранения радиоактивных отходов. Получены микробиологиче¬
ские вещества для защиты целлюлозосодержащих материалов
(В.И. Сухаревич с соавт.)Биодеградация отходов сельскохозяйственного производства, как
и других отраслей народного хозяйства, а также городского мусора
приобретает в современных условиях все большее значение и мас¬
штабы. При прогнозируемом увеличении численности населения на
земле до 12 млрд человек количество отходов производства и мест
проживания людей достигнет двух-трехкратного увеличения. Циви¬
лизация может утонуть в них. Поэтому научно-технические разработ¬
ки в этой области должны быть под постоянным государственным
контролем при финансовой и материально-технической поддержке.594
12.2.5.	Приостановка деградации почв, восстановление
и повышение их плодородияСокращение в 3 раза внесения в почву органических удобрений в
течение 15 лет перестройки и реформирования сельскохозяйственно¬
го производства России, уменьшение площадей под бобовыми куль¬
турами, нарушение севооборотов и технологии возделывания сель¬
скохозяйственных культур привело к усилению деградации почв,
уменьшению на 1,5—2,0 % содержания гумуса в них и уменьшению
валового производства продукции сельского хозяйства почти в два
раза. Поэтому восстановление почвенного плодородия во всех зонах
сельскохозяйственного производства является особо важной страте¬
гической задачей науки и производства, в том числе за счет развития
биологического земледелия. Основным фактором биологизации яв¬
ляется увеличение производства и внесения органических удобрений
в почвы как минимум в 3 раза по сравнению с нынешним уровнем,
расширение посевов бобовых культур в севооборотах не менее чем в10	раз, использование высокоэффективных трансгенных штаммов
азотфиксирующих клубеньковых и ассоциативных микроорганиз¬
мов. Доля биологического азота в земледелии может и должна быть
доведена до 50 % его общей потребности для производства необходи¬
мых стране объемов растениеводческой продукции. При этом эколо¬
гическая ситуация в АПК резко улучшится за счет сокращения ис¬
пользования технического азота и уменьшения содержания нитратов
в продовольственной овощной и другой продукции.12.2.6. Биотехнологические методы улучшения экологической
обстановки в животноводствеОстрота экологической проблемы в использовании навоза в сель¬
ском хозяйстве России снизилась в связи с ликвидацией половины
поголовья скота и резким сокращением производства органических
удобрений, что ставит на грань катастрофы выполнение задачи по
восстановлению продовольственной безопасности государства. Но
это временное явление. В перспективе будет восстановлено в стране
поголовье скота, и объемы производства животноводческой продук¬
ции, и выход органических удобрений. Для обеспечения биологиче¬
ской безопасности с их использованием должно быть гарантировано
выполнение разработанных наукой технологий по производству, хра¬
нению и использованию навоза и других органических удобрений,
сохранению в них стандартных количеств действующего вещества, к
обеззараживанию навоза, компостов и сточных вод, недопущению595
загрязнения навозом и продуктами его разложения жилых террито¬
рий и водных источников, организации переработки части навоза и
твердых отходов населенных пунктов на биогаз. Отношение к навозу
и другим органическим удобрениям в сельском хозяйстве должно
быть восстановлено и доведено до уровня особо важных производст-
венных, экологических и экономических проблем.Вторым экологически важным и эффективным средством в жи¬
вотноводстве является генетическая инженерия. На ее основе созда¬
ются устойчивые к опасным болезням трансгенные животные круп¬
ного рогатого скота, овец, свиней, коз, кроликов, птицы, не нуждаю¬
щиеся в обработке химическими средствами защиты от вредителей и
опасных болезней (JI.K. Эрнст). Важнейшим направлением генной
инженерии сельскохозяйственных животных является создание
трансгенных организмов, способных продуцировать биологически
активные вещества для использования в медицине, ветеринарии и
технологиях переработки продукции сельского хозяйства. Многие
биологически активные вещества, необходимые для человека, могут
продуцироваться только животными, в том числе трансгенными мно¬
гоклеточными организмами, в частности, позвоночными и прежде
всего, млекопитающими, что связано с белковосинтезирующей
функцией их молочных желез, особенно крупного рогатого скота.
Разработаны технологии получения таких веществ на базе использо¬
вания культур трансгенных клеток вне организма.В последние годы возникло новое направление в получении
трансгенных животных. Использование специальных векторов по¬
зволяет интегрировать чужеродную генную конструкцию не во все
клетки организма, а в определенные клеточные популяции организ¬
ма, например в секреторные клетки молочной железы. Это позволяет
сделать животное продуцентом определенных биологически актив¬
ных веществ без изменения в целом его генома. Такие животные спо¬
собны продуцировать в молочной железе коров, коз, свиней эритро-
поетин человека — ценнейший лекарственный препарат.В ВИЖе совместно с профессором Т. Бремом (Германия) ведутся
работы по получению животных для ксенотрансформации клеток и
органов. Предварительные результаты подтвердили перспективность
этого направления биотехнологии.В целом экологическая безопасность животноводства может быть
обеспечена при быстром развитии генно-инженерных и других ис¬
следований, на основе которых будет успешно решена проблема соз¬
дания высокопродуктивных, устойчивых к опасным болезням живот¬
ных, обеспечения животноводства высококачественными, обога¬
щенными белками и незаменимыми аминокислотами, создание оп¬596
тимальных условий среды при содержании скота. Эта важнейшая
отрасль находится в запущенном, катастрофическом состоянии. Стра¬
на обеспечена продуктами животноводства собственного производст¬
ва только на половину.12.3.	ЛИКВИДАЦИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ
РАДИАЦИОННЫХ АВАРИЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ
И ДРУГИМИ МЕТОДАМИРадиация является неблагоприятным фактором жизни человека.
За счет естественных источников ионизирующего излучения, по
оценкам ООН, среднегодовая эквивалентная доза надушу населения
от всех естественных (космического и земного происхождения) ис¬
точников радиации составляет 2,4 м Зв (10~3 единицы измере¬
ния — Зиверта).Большие дозы радиации вызывают серьезные поражения тканей
и даже их гибель, а малые дозы могут вызвать рак и индуцировать ге¬
нетические эффекты, которые могут проявляться у детей и внуков че¬
ловека, подвергшегося облучению. В своих оценках последствий об¬
лучения Комитет НКДАР ООН отмечает, что «... не существует ника¬
кой пороговой дозы, за которой отсутствует риск заболевания раком»
и что «...вероятность или риск заболевания возрастает прямо пропор¬
ционально дозе облучения...». В связи с этим важнейшим выводом во
многих странах мира, в том числе и в Российской Федерации, законо¬
дательно установлена максимально допустимая доза облучения насе¬
ления (сверх естественного и техногенного радиационного фона для
данной местности) — 1 мЗв (Б.Н. Анненков, А.В. Егоров, Р.Г. Илья-
зов).Чрезвычайные ситуации по резкому повышению радиационного
фона на Земле за счет выброса огромной массы радионуклидов и за¬
грязнения ими обширных сельскохозяйственных и промышленных
территорий происходили при авариях на атомных электростанциях:
Южно-Уральской (1957), в Ундкалле, США (1957), на Чернобыль¬
ской АЭС (1986), а также в результате многочисленных испытаний
ядерного оружия. Катастрофические последствия аварий и испыта¬
ний, особенно авария на Чернобыльской АЭС, коренным образом
изменили отношение науки, общества и лидеров всех стран мира к
проблеме использования ядерной энергии и обеспечения ее биобезо¬
пасности. Важнейшими в этой связи являются три проблемы: созда¬
ние новых ядерных реакторов с высочайшей степенью надежности и
безопасности; оптимизация структуры энергетического баланса;597
обеспечение биозащиты и биобезопасности человека и природы в
чрезвычайной радиационной ситуации. Безопасность использования
продукции сельского хозяйства для питания людей, кормления ско¬
та, защита всего АПК, перерабатывающей промышленности стано¬
вятся острейшими проблемами науки, производства и всех государ¬
ственных структур. Биологические и сельскохозяйственные научные
учреждения и организации выполнили за многие годы огромный
объем исследований по важнейшим направлениям радиационной
биологии и разработок технологий, обеспечивающих снижение отри¬
цательных последствий загрязнения территорий и производимой
сельскохозяйственной продукции.Начало всем этим работам было положено созданием в 1947 году
по предложению академика И.В. Курчатова Биофизической лабора¬
тории Тимирязевской сельскохозяйственной академии (БФЛ ТСХА)
под руководством академика ВАСХНИЛ В.М. Клечковского. Нацио¬
нальные лаборатории и другие научные учреждения такого профиля
были созданы в США, Франции и других странах. В ВАСХНИЛ был
создан и успешно работает НИИ сельскохозяйственной радиологии.Обстоятельно разработаны фундаментальные основы поведения
радионуклидов в почвах и растениях, закономерности их метаболиз¬
ма; последствия влияния ионизирующих излучений на растения и
животных; разработаны мероприятия по снижению ущерба и ликви¬
дации последствий радиационного поражения в сельском хозяйстве в
ранний и отдаленный периоды после поражения. Разработаны агро¬
технические и агрохимические приемы снижения поступления ра¬
дионуклидов в урожай различных сельскохозяйственных культур, по¬
казана высокая активность поглощения радионуклидов из почвы
растениями семейства бобовых, выявлена относительная «безопас¬
ность» молочной продукции по сравнению с мясной по накоплению
в них радионуклидов. Разработаны и применяются рекомендации по
особенностям летнего и зимнего кормления скота на пастбище и в
помещении, предотвращению всасывания радионуклидов в пищева¬
рительный тракт, прижизненному «очищению» животных от радио¬
нуклидов, накопленных в организме; механической очистке радио¬
нуклидов, термической обработке продукции, технической ее пере¬
работке.Выявлены сортовые и видовые особенности сельскохозяйствен¬
ных культур по накоплению радионуклидов в растениях и выданы ре¬
комендации по их практическому использованию. К сожалению,
многие острейшие проблемы действия и последствия радиационного
облучения и загрязнения сельскохозяйственных территорий особен¬598
но основными дозообразующими радионуклидами 90Sr и 137Cs оста¬
ются нерешенными, что усугубляет общую ситуацию с восстановле¬
нием загрязненных территорий, здоровья и миграции населения и
предотвращением опасных генетических нарушений в последующих
поколениях людей.Генетические мутации и хромосомные аберрации в зонах радиа¬
ционных катастроф в настоящее время возросли в несколько раз по
сравнению с периодом естественного радиационного фона. В после¬
дующих поколениях людей и генераций растений и животных их ко¬
личество еще более возрастет. Число раковых заболеваний среди на¬
селения в этих районах достигло пяти-шестикратного увеличения.
Биотехнологами совместно с медиками, фармацевтами и биохимика¬
ми получены и проходят клинические испытания десятки противо-
онкологических препаратов для лечения раковых опухолей, особенно
из морских организмов. Но эффективность большинства из них оста¬
ется невысокой. Особую надежду генетики и генные инженеры меди¬
цинского профиля возлагают на генотерапию и использование ство¬
ловых клеток, пересадки костного мозга, позволяющих устранить ге¬
нетические дефекты в молекулах ДНК, во всем геноме облученного
организма при пересадке небольших количеств здоровых, нормаль¬
ных клеток.Возможна селекция растений с повышенной устойчивостью к ра¬
диационному облучению, к накоплению радиоклидов в вегетативных
и генеративных органах. Генофонд таких растений по ряду культур
уже выявлен. Необходимо разработать государственную программу
по этой проблеме и обеспечить ее финансовую поддержку. Крупный
государственный инновационный проект должен быть создан и по
получению трансгенных растений и животных с измененным гено¬
мом, обеспечивающих резкое снижение уровня наполнения радио-
нуклеидов в продовольственной части урожая.Разумеется, никакие биологические структуры неспособны вы¬
держать радиационное облучение в дозах, превышающих их естест¬
венные пределы. Поэтому главным условием биобезопасности суще¬
ствования человека и природы являются строжайшие требования к
конструированию и эксплуатации всех источников радиации — ядер¬
ных реакторов и систем их обеспечения, полного запрета на произ¬
водство и испытания ядерного оружия, запрета атомной энергетики и
замены ее возобновляемыми экологически чистыми видами энер¬
гии — водородной, солнечной, биологической.599
12.4.	ЭКОЛОГИЧЕСКИ БЕЗОПАСНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИЭкологически чистое растениеводство предусматривает соблюде¬
ние следующих важнейших условий:—	оптимальное соотношение биологических и техногенных фак¬
торов производства с постепенным расширением этого показателя в
сторону биологизации;—	создание нового поколения генетически трансформированных
(трансгенных) растений и животных, комплексно устойчивых к опас¬
ным вредителям и болезням;—	восстановление до оптимального уровня почвенного плодоро¬
дия сельскохозяйственных угодий, главным образом за счет повыше¬
ния содержания гумуса в почвах;—	идентификация и максимальное использование насекомых и
микроорганизмов, являющихся антагонистами для вредных организ¬
мов (патогенных грибов, микроорганизмов и насекомых);—	сведение до минимума применения пестицидов и гербицидов с
учетом эффективности и предельно допустимыхдоз применения;—	наведение жесткого порядка в использовании и хранении удоб¬
рений, средств защиты растений и нефтепродуктов, строжайший
контроль за соблюдением технологий их применения.Перечисленные принципы обеспечения экологической безопас¬
ности в сельском хозяйстве должны быть заложены во все технологии
производства сельскохозяйственной продукции.Отсутствие отечественного производства средств защиты расте¬
ний от вредителей и болезней, разрушение отрасли сельскохозяйст¬
венного машиностроения явилось главной причиной закупки за ру¬
бежом технологий производства сельскохозяйственной продукции —
картофеля, льна, кукурузы, овощей с применением больших доз пес¬
тицидов и гербицидов, что ведет к ухудшению экологической ситуа¬
ции в сельском хозяйстве России. В то же время отечественные техно¬
логии возделывания указанных культур с оптимальными дозами хи¬
мических средств защиты имеют значительное преимущество перед
зарубежными в экологическом отношении. Доработка их с учетом пе¬
речисленных выше принципов и требований обеспечит экологиче¬
скую безопасность их применения в растениеводстве и животновод¬
стве. В этом важном деле есть определенные пределы возможностей.Сокращение объемов химической защиты растений и животных
возможно только при повышении качества и объемов применения
биологических методов защиты, их эффективности. Для достижения
этой цели требуется коренным образом улучшить исследования по600
биологическим методам защиты растений и животных, добиться вы¬
явления и использования новых видов антагонистов вредных орга¬
низмов, создания на их основе новых высокоэффективных биопре¬
паратов для растениеводства и животноводства таких, как агата
25 (биовит) для обработки посевов озимой пшеницы, гумикапа в
борьбе с комплексом болезней зерновых культур, лепидоцида на по¬
севах кукурузы, битоксибацилина с малыми дозами ингибиторов
синтеза хитина против личинок колорадского жука, энтомокариофа-
гов в комплексной системе биозащиты тепличных культур от вреди¬
телей и других хищных аригофагов в теплицах, энкарзина и апплауда
в борьбе с оранжевой белокрылкой и др.Многие годы пропагандируется в России биологический метод
защиты растений как важнейшее средство обеспечения экологиче¬
ской безопасности, главным образом, в растениеводстве. К сожале¬
нию, его масштабы и эффективность не отвечают интересам произ¬
водства. Предстоит осуществить новый этап решения этой пробле¬
мы, мобилизовав для этого необходимые кадровые, финансовые и
материально-технические ресурсы.12.5.	ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКАХарактер взаимодействия организма (генотип) со средой опреде¬
ляется нормой его реакции на внешние воздействия, уровень напря¬
женности и сочетания факторов, динамики их временных градиен¬
тов. Результат такого взаимодействия организмов и их сообществ со
средой проявляется в морфогенных и морфофизиологических реак¬
циях, количественных и качественных признаках на всех уровнях
структурной и функциональной организации организмов, включая
конечную величину их продуктивности, урожайности и качества.Проблема вклада генотипа и среды в формирование количествен¬
ных, качественных признаков организма и конечной величины про¬
дуктивности и урожайности растений и животных является спорной.
Противоречия в оценках разрешаются при точном учете лимитирую¬
щих факторов и генетической нормы реакции.Управление формообразовательным процессом, планирование и
прогнозирование параметров количественных признаков растений,
животных и конечных показателей их продуктивности и урожайно¬
сти возможно и необходимо путем направленной селекции и регули¬
рованием напряженности факторов внешней среды агрохимически¬
ми и зоотехническими приемами.Наибольшего эффекта в управлении формообразовательным и
продуционным процессами можно достичь при использовании601
трансгенных технологий в селекции и автоматизированного направ¬
ленного мониторинга за изменением факторов среды (особенно ли¬
митирующих) и ответными ростовыми и другими реакциями орга¬
низмов, отражающими их физиологическое состояние и результат
взаимодействия организма и среды во времени и пространстве.Для этого в системе Гидрометеоцентра Российской Федерации на
метеостанциях должны быть организованы пункты постоянного мо¬
ниторинга за показателями продукционного процесса, ходом форми¬
рования урожая посевами и выдачи сельскохозяйственным органам
рекомендаций и предложений о необходимости и сроках проведения
соответствующих агротехнических мероприятий.В основе адаптивных реакций растений и животных в ответ на
взаимодействие факторов внешней среды лежат физиолого-биохи-
мические и морфофизиологические процессы, контролируемые и де¬
терминируемые генами и генетическими системами. Расшифровкой
действия этих генов и генетических систем и занимается сравнитель¬
но новая наука — экологическая генетика.Основным предметом исследований экологической генетики в
широком понимании этой области знаний является генетическая
природа адаптивного потенциала организмов (А.А. Жученко, 2005).
Из этого определения (дефиниции) возникают три принципиальных
положения, определяющих ее место в системе новейших приорите¬
тов.1.	Термин «генетика» определяет важное место нового научного
направления в поиске и выявлении (идентификации) конкретных,
эффективных генов и генетических систем, ответственных за адапта¬
цию организмов к конкретным факторам среды и прежде всего стрес¬
совым — биотическим и абиотическим. А так как в детерминации
адаптивных реакций участвуют все или почти все гены, весь геном ор¬
ганизма, то экологическая генетика заинтересована в структурном и
функциональном их изучении, как и общая и частная генетика.2.	Термин «экологическая» означает не адекватную изменчивость
генотипа под воздействием стрессовых и других факторов среды, а
выявление наличия у генов и генетических систем функциональных
возможностей, обеспечивающих проявление адаптивных реакций у
растений и животных и их защиту от таких факторов и условий в пре¬
делах генетической нормы реакции. В случае отсутствия в геноме ор¬
ганизмов таких генов и их систем возникает необходимость в транс¬
формации существующих генотипов классическими селекционными
методами или новейшими с использованием ДНК-технологий —
трансгеноза и др.602
3.	Экологическая генетика включает в себя и трансгенные техно¬
логии, так как она не только объясняет в общем виде свою задачу по
изучению природы комплементарности генотипа и среды как глав¬
ной цели селекционного процесса, но участвует также в расшифров¬
ке механизмов этой комплементарности в постгранскрипционный
период, между экспрессией генов и их систем и формированием ко¬
личественных и качественных признаков создаваемых сортов*В структуре экологической генетики культурных растений цен¬
тральное место занимает та часть результатов генетических исследо¬
ваний, которые, во-первых, связаны с управлением адаптивным по¬
тенциалом культурных растений как в отногенезе, так и филогенезе,
а во-вторых, имеют непосредственное отношение к теории и прак¬
тике стратегии адаптивной интенсификации сельского хозяйства
(А.А. Жученко, 2005).12.6.	ЭПИГЕНЕТИКА В ЭКОЛОГИИВ жесткую схему последовательности нуклеотидов в молекуле
ДНК как единственного механизма закрепления наследственности и
проявления изменчивости организмов не вписываются многочис¬
ленные факты варьирования этих фундаментальных свойств орга¬
низмов. Для их объяснения потребовался многолетний поиск иных
механизмов, прямо или косвенно связанных со структурой и функ¬
ционированием других структур, возникающих на основе ДНК. Наи¬
более продвинутым разделом генетики, объясняющим указанные
выше факты, в настоящее время является эпигенетика.Термин «эпигенетика» происходит от греч. epigenesis (epi — над,
сверх, после и genesis — возникновение, происхождение...). Эпигене¬
тика в отличие от классической генетики (менделизма) изучает во¬
просы наследственности не в статике (число единиц наследственно¬
сти, их локализацию в хромосомах, анализ рекомбинационных собы¬
тий, анализ нуклеотидных последовательностей в молекулах ДНК и
РНК и др.), а в их динамике (изменения и новообразования, происхо¬
дящие в самих единицах наследственности в ходе индивидуального
развития особей).Предмет эпигенетики — изменчивость единиц наследственности
(в ядре и цитоплазме) и сопутствующая им изменчивость признаков и
свойств особей на уровне целого организма. В отличие от классиче¬
ской генетики эпигенетику метафорически иногда называют «дина¬
мической генетикой» (С.И. Малецкий, 2005).От понятия «преформизм» понятие «эпигенезис» отличается ос¬
новополагающей сущностью — развитие при эпигенезе осуществля¬603
ется путем новообразования из бесструктурной субстанции с оплодо¬
творенной яйцеклеткой, а по определению преформистов — разви¬
тие происходит лишь путем повторения ранее заложенных метатеров
и увеличения их размеров.С понятием эпигенезиса тесно связано понятие эпигена — цик¬
лической системы генов, имеющей не менее двух режимов функцио¬
нирования подчиненных ей генов и способной сохранять каждый из
режимов в последовательном ряду поколений (В.И. Чураев, 1975).Это определение расширяет представление о единицах наследст¬
венности: носителем наследственной информации, по Чураеву, явля¬
ются не только порядок нуклеотидов в молекулах ДНК, но и дискрет¬
ные состояния единиц наследственности в геноме прокариот (два ре¬
жима их функционирования).Очевидно, что не может быть единого определения эпигена для
наследованных систем разного уровня сложности — вирусов, прока¬
риот и эукариот. Если наследственное вещество у вирусов и прокари¬
от — молекулы ДНК (или РНК), то у эукариот — хроматин. В свою
очередь, элементарные единицы наследственности эукариот (гены и
локусы) — это последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК, а
также композитные единицы наследственности эукариот, как эпиге¬
ны, суперлокусы (гаплотипы) и хромосомы — это структурные ком¬
поненты хроматиновой нити. Эпиген для эукариот — это фрагмент
хроматиновой нити, включающей один или неколько локусов и являю¬
щийся самостоятельной единицей наследственности и сегрегации.К эпигенетической форме передачи наследственной информа¬
ции, по мнению С.И. Малецкого, могут быть отнесены полимерные
белковые молекулы, работающие как цифровые устройства в режиме
2/3 процесс (2 против 3 водородных связей в парах оснований А: Т и
G:C). Аналоговая же форма информации «кодируется» особенностя¬
ми структуры молекул или супермолекул. Белки представляют собой
пример аналоговой формы хранения и передачи информации. В ос¬
нове их взаимодействия с другими полимерными компонентами
клетки лежит принцип «ключ—замок». В этом состоит коренное от¬
личие пептидных полимеров и белков от полимеров нуклеиновых ки¬
слот (С.И. Малецкий, 2005).Единицей наследственности и изменчивости всего генома может
рассматриваться и клетка как биологическое образование, ограни¬
ченное мембраной и способное к саморепродукции. На уровне клет¬
ки осуществляются главные цитологические процессы — митоз, ос¬
нова роста и регенерации организма, пролиферация и интеграция
всех качеств в реализации адаптивного потенциала генома в конкрет¬
ной экологической ситуации.604
Наиболее значимым в настоящее время разделом эпигенетики яв¬
ляется изучение процесса метилирования — насыщение молекул
ДНК и РНК метальными группами. Метилирование обеспечивает
присоединение метального радикала к свободным или замещенным
валентным связям в полимерных молекулах ДНК и РНК, что придает
ей и входящим в ее структуру генам повышенную экспрессию.Химическая модификация хроматина, наследуемого в ряду спо-
рофитных поколений как внутренними, так и внешними условиями,
в том числе и метилированием. Метилирование цитозина в нуклео¬
тидных парах С-G модифицирует структуру хроматина, но не затра¬
гивает кодирующие свойства генов (транскриптов): гены с метилиро¬
ванным С-нуклеотидом кодируют те же самые полипептиды, что и
гены без метилирования этих нуклеотидов. Передача эпигенетиче¬
ской информации в ряду клеточных поколений на уровне молекул
ДНК (метилирование С-нуклеотадов) происходит при участии осо¬
бых ферментов — метилаз поддержания. После репликации метили¬
рованного участка ДНК метилаза поддержки способна его найти,
распознать и дометилировать комплементарную цепь, и в итоге полу¬
чаются две комплементарные метилированные цепи ДНК (С.И. Ма-
лецкий).В работах С.И. Малецкого (2005) показана высокая эффектив¬
ность эпигенетической изменчивости и наследования признака раз¬
дельно-, сростноцветковости у сахарной свеклы. Данный тип измен¬
чивости и наследования использован в селекции этой культуры на од-
норостковость, имеющей важное значение для резкого снижения за¬
трат на производство сахарной свеклы.В технологиях in vitro метилирование может найти широкое при¬
менение как дополнительный или основной источник изменчивости
растений. В работах кафедры сельскохозяйственной биотехнологии
Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева
(Е.А. Калашникова, 2004) по клеточной селекции получены формы
моркови, устойчивые к альтернарии, и яровой пшеницы — к септо-
рии, картофеля — к ризоктонии. Отборы проводились на селектив¬
ных средах с токсином патогенных грибов. Измененные формы ука¬
занных культурных растений сохраняли устойчивость в патогенном
потомстве. Природа этой устойчивости связана с сомаклональной ва¬
риабельностью, вызванной действием мутагенных факторов. Разви¬
тие работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro потре¬
бует применения всех известных и новых эпигенетических методов
трансформации. При отсутствии эффективных генов устойчивости
метод эпигенеза позволит расширить масштабы трансформации и ре¬605
шить ряд ключевых задач по селекции растений на устойчивость к
опасным грибным, бактериальным и вирусным болезням. Экологи¬
ческое значение этих работ трудно переоценить. Это один из важных
путей повышения экологической безопасности в сельскохозяйствен¬
ном производстве. Эпигенетика вместе с генетической инженерией
должна быть взята на вооружение во всех селекционных учреждениях
России.Заключение1.	Основными источниками экологического загрязнения в аграр¬
ной сфере России являются накопление органических отходов в сель¬
скохозяйственном производстве; радиационные загрязнения терри¬
торий в результате атомных аварий, катастроф и использования атом¬
ного оружия, нарушений в технологии химизации земледелия и жи¬
вотноводства; возделывание неустойчивых сортов и гибридов
сельскохозяйственных культур, требующих многократных обработок
пестицидами.2.	Распоряжением Правительства Российской Федерации от
31 августа 2002 г. № 1225р одобрена Экологическая доктрина Россий¬
ской Федерации, в которой определяются стратегическая цель, зада¬
чи и принципы государственной политики в области экологии, ос¬
новные направления, а также меры по научному обеспечению эколо¬
гической безопасности Российской Федерации.3.	Разработаны методы и технологии по снижению отрицатель¬
ных экологических последствий, вызванных загрязнением террито¬
рий и сельскохозяйственного производства органическими отхода¬
ми, техногенными продуктами и радионуклидами. Существенное
место среди них отводится трансгенным и биотехнологическим прие¬
мам, генетическим, эпигенетическим, эколого-генетическим, селек¬
ционным и другим методам, эффективность и масштабы применения
которых являются пока недостаточными.4.	Решающее значение в ближайшей перспективе будут иметь
трансгенные технологии, позволяющие решить проблему повыше¬
ния устойчивости растений и других организмов к повышенным до¬
зам факторов загрязнения среды, а главное — к биотическим стрес¬
сам и резко сократить загрязнение среды пестицидами и продуктами
техногенного поисхождения.5.	Экологическая безопасность по своей остроте и значимости
ставится сегодня в ряд важнейших приоритетов науки и государства606
наряду с энергетической, продовольственной, военной и другими ви¬
дами безопасности. На ее решение должен быть выделен необходи¬
мый объем средств и материально-технических ресурсов.Контрольные вопросы к главе 121.	Дайте определение понятия «экология».2.	В чем состоит сущность экологической доктрины Российской Федера¬
ции?3.	Сформулируйте основные направления государственной политики в об¬
ласти экологии.4.	Назовите источники и масштабы экологического загрязнения среды в
сельском хозяйстве.5.	В чем состоит роль трансгенных технологий в обеспечении экологической
безопасности?6.	Назовите биотехнологические приемы и методы редеградации среды, за¬
грязненной техногенными отходами.7.	Какие вы знаете приемы, методы и технологии снижения отрицательных
последствий радиационных катастроф?8.	Назовите биотехнологические методы восстановления почвенного пло¬
дородия.9.	Назовите генетические методы обеспечения экологической безопасности
в сельскохозяйственном производстве.10.	Что понимают под эпигенетическими методами обеспечения экологиче¬
ской безопасности?11.	Что такое экологическая генетика и ее использование в решении пробле¬
мы адаптации, реадаптации и экологической безопасности?12.	Дайте определение конверсии отходов в сельском хозяйстве и в оздоров¬
лении экологической ситуации в аграрном секторе экономики.13.	Экологическая безопасность как приоритет XXI века.ЛИТЕРАТУРААнненков Б.Н., Егоров А.В., Ильязов Р.Г. Радиационные аварии и ликви¬
дация их последствий в агросфере.— Казань: ФЭН АН РТ, 2004.Богданкевич О.В. Лекции по экологии.—М.: Физматиздат, 2002.Борлауг Н.Э. Для чего все это. «Зеленая революция»: вчера, сегодня, зав¬
тра. Современная биотехнология. Мифы и реальность.— М.: Тайдекс. Ко.
2004.Быстров Г.Е. Экологическое право.— М.: Проспект, 2007.Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы. Мифы и ре¬
альность.— Минск: Технология, 2004.Жученко А.А. Экологическая генетика.— М.: Агрорус, 2004.Жученко АЛ. Экологическая генетика культурных растений как само¬
стоятельная научная дисциплина. Материалы школы молодых ученых «Эко¬
логическая генетика культурных растений».— Краснодар, 2005.607
Малецкий С.И. Иерархия единиц наследственности, изменчивость, на¬
следование признаков и видообразование у растений. Эпигенетика расте-
ний/Сб. научных трудов.— Новосибирск, 2005.Малецкий С.И. Эпигенетическая изменчивость признаков раздельно-,
сростноцветковости у сахарной свеклы (Beva vuegoris L.) Эпигенетика расте-
ний/Сб. научных трудов.— Новосибирск, 2005.Шевелуха B.C. Биоинженерия в XXI веке (Опасность отставания Рос-
сии)//Наука и технология в промышленности. N° 3 (10)—4(11). 2002.Шевелуха B.C. Ядерная биология — стратегический резерв получения
биологически чистой продовольственной продукции//Ваше питание. № 1.
2001.Экологическая доктрина Российской Федерации.— М.: 2003.Эрнст JI.K. Современное состояние и перспективы биотехнологии в жи-
вотноводстве//Достижения науки и техники в АПК. № 10. 2003.
Глава 13ПРИКЛАДНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ И БИОИНЖЕНЕРИЯ
В АГРОПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ13.1.	ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯБиотехнологические и биоинженерные методы применяются во
многих областях науки и отраслях производства. Их использование,
особенно генетической инженерии, может оказать колоссальное
влияние на развитие агропромышленного комплекса России и мира.
С учетом реальных достижений и значимости указанных приоритет¬
ных направлений науки ведущие биотехнологи и экономисты мира
прогнозируют увеличение масштабов реализации биотехнологиче¬
ской продукции на мировом рынке в ближайшие годы до 20—25 % от
общего объема товарооборота.На первом этапе становления биотехнологии как науки ученые и
практики преувеличивали возможные темпы ее развития и получе¬
ния экономически значимых результатов. Сегодня уже мало кто со¬
мневается в том, что их достижения — дело ближайшего времени.
Вначале дискуссия развернулась главным образом вокруг того, в ка¬
ких областях экономики могут быть достигнуты наибольшие резуль¬
таты. В дальнейшем она приобрела направленность, связанную с био¬
безопасностью, что оказало отрицательное влияние на темпы и масшта¬
бы научного поиска и усвоения достигнутых результатов в производст¬
ве, особенно в биоинженерии. Без биотехнологии и биоинженерии
мировое сообщество не сможет решить коренные проблемы развития
цивилизации.13.2.	СЕЛЕКЦИЯ И РАСТЕНИЕВОДСТВОВажнейшее место биотехнологии и биоинженерии принадлежит в
современной селекции растений на устойчивость и качество продук¬
ции, создание нового поколения сортовых ресурсов страны и мира.
Основные исследования биотехнологов направлены на создание39-4266609
улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйствен¬
ных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной
устойчивостью к биотическим или абиотическим стрессовым факто¬
рам среды при сохранении и повышении их продуктивности и каче¬
ства. Эпифитотийный характер распространения наиболее опасных
грибковых, вирусных и бактериальных заболеваний культурных рас¬
тений, уничтожающих до 30 % (и более) урожая, создали в России и
ряде других стран мира ситуацию, при которой потребность в обнов¬
лении сортовых ресурсов сельскохозяйственных культур на основе
сочетания традиционных и новых методов селекции и биотехнологии
стала исключительно острой.Посевы пшеницы, ячменя и других зерновых культур на огром¬
ных территориях во всех сельскохозяйственных регионах страны по¬
ражаются комплексным заболеванием — корневыми гнилями, а так¬
же ржавчинами, септориозом, гельминтоспориозом, мучнистой ро¬
сой и др. Поражение посевов озимой пшеницы фузариозом колоса
(Fusarium nivale) на Северном Кавказе приводит к накоплению в зер¬
не опасных для здоровья людей и животных микотоксинов. В отдель¬
ные, влажные годы этой болезнью поражалась половина собранного
урожая зерна. Поражение подсолнечника в этой зоне склеротинией и
фомопсисом в годы с пониженной температурой и повышенной
влажностью среды возрастает до 50 % и более. Картофель и томаты
повсеместно поражаются фитофторозом, что резко снижает урожай
этих ценных продовольственных культур и приводит к большим по¬
терям при хранении. Пероноспороз почти ежегодно уничтожает на
больших площадях посевы огурцов и лука.Частые, обширные и жесточайшие засухи вызывают повреждения
и гибель посевов зерновых и других культур, резко снижают валовые
сборы зерна и всей продукции растениеводства. Низкие температуры
и другие неблагоприятные факторы перезимовки приводят к изрежи-
ванию и гибели посевов озимых и зимующих культур на больших
площадях, достигающих 50 % и более.Недобор урожая имеет место на кислых и засоленных почвах, пло¬
щади которых составляют в России соответственно 68,9 и 16,3 млн га
сельскохозяйственных угодий страны. Выбросы в атмосферу про¬
мышленными предприятиями ядовитых соединений, загрязнение
воздуха, воды и почв тяжелыми металлами и другими вредными про¬
дуктами техногенного происхождения приводят к повреждению по¬
севов, накоплению ими опасных для людей веществ. Значительная
часть земель в западном и центральном регионах России загрязнена
радионуклидами — как следствие чернобыльской и других катаст¬
роф.610
Попытки селекционеров создать комплексно устойчивые сорта и
гибриды сельскохозяйственных культур только традиционными ме¬
тодами селекции не привели к желаемым результатам. Использова¬
ние трансгрессивной селекции, основанной на отдаленной гибриди¬
зации, позволило решить ряд частных проблем устойчивости куль¬
турных растений к стрессовым факторам среды. Однако в целом эта
проблема остается исключительно острой. В перспективе, в связи с
прогнозируемым возможным ухудшением климата, она может стать
еще более опасной.Клеточные и генные инженеры, используя новые и новейшие, в
том числе биотехнологические методы, создали ряд генотипов расте¬
ний с улучшенными или принципиально новыми качествами, с оди¬
ночной, групповой реже комплексной устойчивостью к биотическим
и абиотическим факторам среды.Решающее значение для выполнения этой задачи имеют усилия
генетиков, биотехнологов и селекционеров, направленные на иден¬
тификацию эффективных генов, детерминирующих важнейшие при¬
знаки устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрес¬
совым факторам среды. Эту сложную работу осуществляют специа¬
листы ряда генетических центров и лабораторий мира, в том числе
России, на основании сбора, изучения и использования мировых
растительных ресурсов. Для этого в первую очередь используются вы¬
явленные и изученные источники и доноры устойчивости растений,
созданные в ВИРе и селекционных центрах страны. Ведется работа
по созданию современных банков эффективных генов во многих
странах мира.Важным этапом работы по генетической трансформации расте¬
ний является выделение и клонирование генов, создание на их основе
векторов для переноса чужеродных генов из клеток-доноров в клет¬
ки-реципиенты. Использование плазмидных, транспозонных, ви¬
русных, пневмобаллистических и других векторных систем позволяет
исследователям осуществлять трансформацию растительных геноти¬
пов и получать трансгенные (модифицированные) растения с задан¬
ными или близкими к ним свойствами и качественными характери¬
стиками.По генно-инженерной технологии в ведущих биотехнологиче¬
ских центрах и лабораториях мира, и прежде всего в США, Аргенти¬
не, Канаде, Китае, а также Японии, Германии, Голландии, Франции,
Индии, получены формы сои, кукурузы, хлопчатника, сахарной
свеклы, рапса, картофеля, томатов и других культур, устойчивых к
гербицидам и насекомым; риса — к перекуляриозу, картофеля — к
колорадскому жуку и фитофторе, пшеницы — к засолению, ржавчи¬611
не и фузариозу колоса, септориозу, сахарной свеклы — к церкоспо-
розу, ризомани, рапса — к насекомым и грибным заболеваниям. По¬
севные площади, занятые под трансгенными сортами и гибридами
сельскохозяйственных растений, в мире уже достигают 10S млн га и
они постоянно расширяются. Существовавший ранее тотальный за¬
прет на внедрение в производство трансгенных растений и других ор¬
ганизмов, полученных генно-инженерными методами, постепенно
ослабевает при сохраняющемся высоком уровне государственного
контроля, надежности и биобезопасности их использования. Благо¬
даря поддержке руководителей ряда государств мира темпы развития
генно-инженерных работ и расширение посевов трансгенных расте¬
ний в последние годы резко возросли.Основные площади посевов трансгенных культур сосредоточены
в четырех странах — США, Аргентина, Канада и Китай. На долю сои
и кукурузы приходится 80 % посевов всех трансгенных культур. Поч¬
ти все площади трансгенных культур заняты сортами и гибридами,
устойчивыми к гербицидам (71 %) и насекомым (22 %).К сожалению, в России пока нет ни одного гектара производст¬
венных посевов генетически модифицированных растений отечест¬
венного и зарубежного производства. До сих пор в нашей стране не
зарегистрировано ни одного отечественного трансгенного сорта или
гибрида сельскохозяйственных культур. В центре «Биоинженерии»
РАН созданы и проходят испытания новые отечественные линии
картофеля, устойчивого к колорадскому жуку и фитофторе
(К.Г. Скрябин).В биотехнологических и селекционных центрах и других науч¬
но-исследовательских учреждениях нашей страны работы по созда¬
нию генетически трансформированных сельскохозяйственных рас¬
тений были развернуты, начиная с 1986 г., после принятия известного
постановления директивных органов страны, утвердивших первую
национальную программу по биотехнологии.В настоящее время работы по биотехнологии и биоинженерии
растений получили развитие во Всероссийском НИИ сельскохозяй¬
ственной биотехнологии РАСХН — Российском государственном
аграрном университете им. К.А. Тимирязева, в Московской сельско¬
хозяйственной академии им. К.А.Тимирязева, в НИИСХ Юго-Вос¬
тока, во ВНИИ сахарной свеклы и сахара, ВНИИ кормов, ВНИИ се¬
лекции и семеноводства овощных культур, ВНИИ риса, ВНИИ кар¬
тофельного хозяйства, ВНИИ генетики и селекции плодовых и ягод¬
ных культур, в НИИСХ центральных районов Нечерноземной зоны,
в НИИСХ Северо-Востока РАСХН.В Российской Академии наук (РАН) исследования по трансгенозу
интенсивно проводятся в Центре «Биоинженерия», Институте фи¬612
зиологии растений, в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова,
Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда, Институте
молекулярной генетики, Институте биоорганической химии им.
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Институте биологии гена
и др.Учитывая сложность и большую наукоемкость генно-инженер-
н ых работ на первом этапе развития биотехнологии в научных учреж¬
дениях сельскохозяйственного профиля, основное внимание было
уделено проблемам клеточных технологий, позволивших создать
большое разнообразие сомаклональных вариантов растений пшени¬
цы, ячменя, клевера, люцерны, картофеля, сахарной свеклы, тома¬
тов, плодовых и других культур. Для этого целях использовались гап¬
лоидные, автодигаплоидные варианты пыльниковой и пыльцевой
культуры; регенранты из эмбриоидов, сформировавшиеся в каллус¬
ных тканях, полученных из незрелых зародышей и других органов
растений.Почти два десятилетия активной работы биотехнологов в селек¬
ционных и биотехнологических центрах страны позволили получить
сотни и тысячи регенерантов растений, в том числе десятки и сотни с
ценными свойствами: повышенной устойчивостью к засухе, высоким
и низким температурам, засолению, опасным фибковым, бактери¬
альным и вирусным заболеваниям, повышенной кислотности почвы.
На их основе получены новые ценные сорта ярового ячменя во
ВНИИ центральных районов Нечерноземной зоны и НИИ Севе¬
ро-Востока; яровой пшеницы — в НИИ Юго-Востока; озимой пше¬
ницы — в Краснодарском НИИСХ; клевера и люцены — во ВНИИ
кормов, сахарной свеклы — во ВНИИСХ, картофеля — во ВНИИ
картофельного хозяйства; плодовых культур — во ВНИИ генетики и
селекции плодовых растений, Всероссийском селекционно-техноло¬
гическом институте садоводства и питомниководства. В Государст¬
венный реестр внесены первые отечественные сорта зерновых и дру¬
гих культур, полученные отечественными селекционерами с исполь¬
зованием линий, созданных на основе биотехнологических методов
гаплоидной и клеточной селекции, соматической гидрадизации и др.В России, как и во многих странах мира, впервые создана право¬
вая база для осуществления генно-инженерных и других биотехноло¬
гических работ с использованием в производстве новых трансформи¬
рованных генотипов растений, животных и микроорганизмов. Приня¬
ты и действуют законы: «О государственном регулировании в области
генно-инженерной деятельности», «О селекционных достижениях»,
«О племенной работе», «О семеноводстве» и др.613
Широкое распространение в мире и России получили исследова¬
ния по природным фитогормонам и синтетическим регуляторам рост
та и развития растений как веществам, обладающим значительными
биотехнологическими эффектами. Они являются составной частью
питательных и селективных сред в биотехнологических исследовани¬
ях. Их использование позволяет решать практические задачи агро¬
промышленного производства: регулирование онтогенеза растений и
сроков созревания урожая, повышения его качества, устойчивости
организмов к стрессовым факторам среды. Наибольшее распростра¬
нение в практике АПК получили в свое время препараты ретардант-
ного (хлорхолинхлорид) и антистрессового (картолин) действия.
К сожалению, в последние годы производство регуляторов роста и
развития растений и их применение в производстве резко сократи¬
лось. С учетом выявленной эффективности регуляторы роста расте¬
ний в перспективе должны получить широкое распространение в
науке и производстве.13.3.	БИОТЕХНОЛОГИЯ В КОРМОПРОИЗВОДСТВЕ.КЛЕТОЧНАЯ И ТКАНЕВАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ КОРМОВЫХКУЛЬТУР*Применение биотехнологических методов интенсификации рас¬
тениеводства начиналось в России с кормопроизводства как приори¬
тетной отрасли растениеводства и животноводства.Важнейшими задачами были и остаются повышение эффектив¬
ности селекции и семеноводства кормовых культур. Определенную
трудность представляют в этом отношении гетерозиготные перекре-
стноопыляемые кормовые культуры и в первую очередь люцерна и
клевер луговой.• Селекционные сортообразцы, используемые в качестве исходно¬
го материала в клеточных биотехнологиях, представляют собой гете¬
розиготные, перекрестноопыляемые популяции, состоящие из сово¬
купности генотипов с высокой степенью самостерильности. Они от¬
личаются рядом существенных особенностей, без учета которых не¬
возможно получить положительный результат в работе с культурой
клеток и тканей. Это определяет специфичность манипуляций на
всех этапах регенерации растений от экспланта до генетического ана¬
лиза полученных растений-регенерантов.*	Подраздел 13.3 написан сотрудниками Всероссийского НИИ кормов
канд. биол. наук Л.А. Солодкой и М.Н. Агафодоровой.614
Число генотипов в сортообразцах кормовых культур, способных к
образованию высокоэмбриогенных клеточных линий при первичном
введении в культуру in vitro, варьирует от 0,1 до 40%.Существует несколько приемов для получения дедифференциро¬
ванных клеточных культур с высокой регенерационной способно¬
стью (PC): генотипы с PC отбирают на средах, разработанных для мо¬
дельных сортов клевера и люцерны; для генотипов с хозяйствен¬
но-ценными признаками, представляющими интерес для селекцио¬
неров, экспериментальным путем определяют состав гормонов и их
концентрации, обеспечивающие PC; у селекционно-ценных геноти¬
пов регенерационную способность индуцируют путем скрещивания
их с растениями-регенерантами того же селекционного образца.При повторном введении в культуру in vitro исходных растений
количественные показатели PC остаются на прежнем уровне, тогда
как у полученных из них растений-регенерантов при введении их в
культуру in vitro экспрессия признака PC возрастает в 10—15 раз. Об¬
разование морфогенных каллусов, пригодных для получения суспен¬
зий, происходит на питательных средах с уменьшенной концентра¬
цией гормонов до 2 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина на 9— 10-й день вме¬
сто 14—15 дней у исходного растения. Количество эмбриогенных
структур, образующихся в каждом миллилитре суспензии, значитель¬
но возрастает, а время от помещения проэмбриоидов на регенераци¬
онную среду до формирования растений сокращается по сравнению с
культурой проэмбриоидов, полученных от исходных растений.Культура каллусных тканей. Листовая ткань вегетирующих расте¬
ний клевера и люцерны отличается большой внутренней инфициро-
ванностью. Поэтому для получения первичных каллусов в качестве
эксплантов используют листовые пластинки, черешки и отрезки
стеблей асептически выращенных растений. Исходные растения на
всем протяжении эксперимента сохраняют или в культуре in vitro,
или в вегетационных сосудах.Первичные каллусы клевера лугового и люцерны изменчивой с
высоким морфогенным потенциалом индуцируют на питательной
агаризованной среде Гамборга В5, но с увеличенной втрое концентра¬
цией хелата железа и высоким содержанием гормонов (5—6 мг/л2,4-Д и 8 мг/л кинетина) на свету (8—9 тыс. лк) в условиях 100 %-й от¬
носительной влажности воздуха и температуре не выше 20±2°С
(А.В. Мезенцев, 1980; А.В. Мезенцев, Л.А. Любавина, 1983).Изменение условий культивирования приводит к снижению у
каллусных культур морфогенного потенциала и, как следствие, нару¬
шению процесса редифференцировки и регенерации растений.61S
Культура клеточных суспензий. На реализацию морфогенного по¬
тенциала каллусными культурами в процессе получения клеточных
линий клевера лугового и люцерны оказывают влияние условия осве¬
щения, встряхивания и продолжительность культивирования. Эм-
бриоиды и эмбриогенные структуры формируются только при непре¬
рывном освещении. Клеточные суспензии клевера и люцерны с вы¬
сокой PC получают при культивировании каллусов в жидкой пита¬
тельной среде Гамборга В5 в условиях непрерывного освещения и
встряхивания. Темп пролиферации и период времени, необходимый
для образования первичной суспензионной клеточной культуры оп¬
тимальной плотности (500 тыс. клеток/мл суспензии), достаточной
для последующего субкультивирования, сильно варьирует в зависи¬
мости от происхождения клеточной линии. Интервал времени между
пересадками определяют индивидуально для каждой клеточной ли¬
нии по достижении плотности до 500 тыс. клеток/мл суспензии. Ис¬
ходная плотность клеток в пассируемой культуре клевера и люцерны
не должна быть ниже 100 тыс. клеток/мл суспензии. В противном
случае в новопересаженной культуре в 5—10 раз снижается темп про¬
лиферации клеток и нарушается образование морфогенных структур.
Увеличение же плотности клеток в суспензии клевера и люцерны (бо¬
лее 500 тыс. клеток/мл) без пересадки приводит к их гибели в течение
2—3 дней.Клеточные суспензионные культуры после неоднократного суб¬
культивирования в безгормональной среде Гамборга В5 образуют в
массовом количестве проэмбриоиды и эмбриоиды (до 100 шт./мл
суспензии). Проэмбриоиды после пересадки на агаризованную среду
Гамборга В$ без гормонов и с уменьшенным вдвое содержанием всех
входящих в нее компонентов разрастаются, образуя морфогенную
каллусную ткань, в которой формируются почки, проростки и расте-
ния-регенеранты. Эмбриоиды развиваются в проростки, с семядоль¬
ными листочками, с первичным одинарным, а в дальнейшем — трой¬
чатыми листьями и корешком. У проростков, формирующихся в мор¬
фогенной каллусной ткани, образуются только тройчатые листочки.Для изучения регенерантов по их морфогенетическим показате¬
лям в стадии 2—3 настоящих тройчатых листьев их высаживают в ве¬
гетационные сосуды, а затем выращивают или в условиях селекцион¬
но-тепличного комплекса, или в поле до созревания семян. Барьер
самонесовместимости преодолевают, переопыляя регенеранты кле¬
вера лугового с исходным растением или регенерантами другой кле¬
точной линии, но того же сортообразца. У люцерны семена получают
от самоопыления регенерантов.616
Регенерация растений при генетической трансформации. Существу¬
ет несколько способов регенерации растений при генетической
трансформации. Большая часть из них основана на образовании де-
дифференцированных клеточных культур. При трансформации кор¬
мовых растений методами листовых дисков и разобщенных домини¬
рующих центров регенерацию растений осуществляют из каллусной
ткани, образующейся на поверхности срезов эксплантов, инокулиро-
ванных агробакгериями с целевыми и маркерными генами. Расте¬
ния-трансформанты, регенерированные из морфогенных культур од¬
ной и той же клеточной линии, характеризуются нежелательной гете¬
рогенностью и отличаются от исходного генотипа по ряду морфоло¬
гических и физиолого-биохимических признаков. Морфогенные
культуры к 5—8 пассажу полностью теряют регенерационную спо¬
собность как на безгормональных, так и на средах, содержащих фито¬
гормоны в различных концентрациях.Для направленного создания методом генетической трансформа¬
ции форм клевера лугового с одним из признаков (устойчивость к бо¬
лезням, вредителям и т. д.) разработан способ прямой регенерации
растений, сохраняющих высокий морфогенетический потенциал и
ценные селекционные признаки исходных генотипов при длитель¬
ном культивировании на канамицинсодержащих питательных средах
(J1.A. Солодкая и др., 2005).Указанная цель достигается тем, что растения клевера лугового
получают способом прямой регенерации (без образования дедиффе-
ренцированной ткани — каллуса) из морфогенных культур, индуци¬
рованных из гипокотильных эксплантов на питательной среде Гам-
борга В5 с 4,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 1,0 мг/л кинетина и
0,05 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК). Эпикотильную часть
проростков для сохранения и поддержания в культуре in vitro и in vivo
растений исходного генотипа отделяют и культивируют на модифи¬
цированной среде Гамборга В$ без гормонов или для микроразмно¬
жения на среде того же состава с добавлением 2 мг/л БАП. Побеги и
растения клевера лугового, полученные в процессе трансформации,
укореняют на средах Гамборга В5 с 40 мг/л канамицина и 0,05 мг/л
НУК без добавления цефотаксима. Полученные из гипокотильных
эксплантов способом прямой регенерации растения по генетическим
и морфологическим признакам не отличаются от исходных геноти¬
пов и сохраняют способность к активной пролиферации и массовому
образованию зеленых побегов до 24-го пассажа на питательной среде
с 50 мг/л канамицина.В течение одного пассажа (1 месяц) из морфогенной ткани с од¬
ной чашки Петри получают в среднем более 100 зеленых побегов, и617
общее число их составляет 1000 шт. и более и ограничивается только
потребностями практической селекции и площадью в фитотроне.Для контроля изменчивости определяют количество хромосом¬
ных и хроматидных перестроек в клетках растений-регенерантов, по¬
лученных методом прямой регенерации из гипокотилей, и исходных
растений. Подсчитывают число хроматидных перестроек с фрагмен¬
тами и мостами, общий процент аберраций, митотический индекс,
плоидность.Сравнительную оценку по морфологическим и хозяйствен¬
но-ценным признакам растений исходных генотипов и растений-ре-
генерантов, полученных методом прямой регенерации, проводят в
вегетационных и полевых условиях.Таким образом, новый способ прямой регенерации позволяет в
процессе генетической трансформации на основе одного и того же ге¬
нотипа, используя конструкции, несущие различные целевые гены,
направленно создавать генетические аналоги, полностью сохраняю¬
щие все ценные признаки исходного образца; получать и поддержи¬
вать in vitro морфогенные культуры, способные к длительной проли¬
ферации на селективных средах и массовой регенерации канамици-
нустойчивых растений; контролировать сомаклональную изменчи¬
вость и проводить сравнительный генетический анализ полученных
селекционных номеров в процессе генетической трансформации.Клеточная селекция. Для получения интактных растений клевера
лугового и люцерны из культуры клеток и тканей разработаны надеж¬
ные системы регенерации и методы повышения гетерогенности ис¬
ходных клеточных популяций. Они являются основой для создания
исходного материала люцерны и клевера лугового с повышенной ус¬
тойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам (рис. 13.1).Основным источником гетерогенности исходных клеточных по¬
пуляций клевера лугового и люцерны служит сомаклональная измен¬
чивость, возникающая в процессе культивирования in vitro.Сомаклональная изменчивость. Исследования показали, что часть
растений-регенерантов клевера и люцерны, полученных из каллус¬
ных и суспензионных культур, отличаются от исходных растений по
ряду морфологических (открытый тип цветения, укороченная цве¬
точная трубочка и др.) (рис. 13.2,13.3) и физиологических признаков
устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам.Установлено, что характер и количество сомаклональных изме¬
ненных растений зависят от генотипа исходного растения, его проис¬
хождения и длительности культивирования клеточных линий.Среди регенерантов клеточных линий, полученных от исходных
растений гибридного происхождения, наблюдается наибольшее чис-618
Рис. 13.1. Схема создания исходного материала для селекции кормовых
растений методами биотехнологииа	бРис. 13.2. Соцветие регенерантов клевера лугового:
а — открытый цветок; б — закрытый цветок
а	б	в	г	дРис. 13.3. Цветки клевера лугового:а — нормальный цветок; б — цветок с укороченной цветочной трубочкой;
в, г, д — измененные цветкило измененных растений. С увеличением числа пассажей клеточных
культур растет процент измененных форм, тогда как общее количест¬
во выживших после высадки в почву растений-регенерантов снижа¬
ется.Сомаклональная изменчивость растений-регенерантов клевера
лугового и люцерны имеет физиологическую, эпигенетическую и ге¬
нетическую природу. Хлороз, гофрированность листьев исчезают в
процессе вегетации растений и при отрастании после скашивания.
Часть морфологических изменений является результатом мутаций.
Для определения природы сомаклональных изменений проводят
скрещивания с исходной формой. Генетический анализ показал, что
растения-регенеранты Ро имеют сомаклональные изменения, обу¬
словленные рецессивными генами как в гомозиготном, так и гетеро¬
зиготном состояниях (фенотип регенеранта идентичен исходному
растению). Например, в Рг потомстве диплоидных растений количег
ство генотипов с признаком «открытый тип цветения» составляет
приблизительно четвертую часть всех изученных в Рг растений каж¬
дого регенеранта. При этом совпадение фактически и теоретически
ожидаемой численности растений с названным выше признаком с
вероятностью 0,16—0,34 согласовывается с гипотезой, что в Рг расще¬
пление по фенотипу происходит в соотношении 3:1 [в Pi все получен¬
ные растения идентичны исходному (рис. 13.4)].В зависимости от генотипа исходного растения (Аа) и расте¬
ний-регенерантов (Аа) в соответствии с законом Менделя наблюда¬
ются и другие соотношения в расщеплении (Л.А. Солодкая, 1987).Использование селективных систем. В качестве селективного фак¬
тора для отбора пролиферирующих, не теряющих способностей к эм¬
бриогенезу клеточных суспензий используется NaCl в концентрации0,98% (Agafodorova et.al.,1999).620
Исходное растение X Растение-регенерант
АА	I	аа»р.Аа3	1Рис. 13.4. Скрещивание исходного растения и растения-регенеранта
клевера лугового (2л = 14)Растения-регенеранты и их потомство lj, Ь,..., 1„, полученные из
эмбриоидов, сформировавшихся в селективных условиях, и показав¬
ших устойчивость в песчаной культуре при засолении 1,53—1,95 %
NaCl, а затем в поле на естественном засолении, использованы со¬
вместно с селекционерами для создания сорта люцерны Солеустой¬
чивая, районированного в двух регионах страны. В условиях хлорид-
но-сульфатно-натриевого засоления при общей концентрации солей0,6 % сорт имел 100 %-ю всхожесть, в то время как у местных сортов
она не превышала 10—20 %. Урожайность зеленой массы сорта Соле¬
устойчивая составила 80—85 т/га, сухой массы—15—18 т/га, се¬
мян — 1,6—3,4 ц/га, сбор протеина 2,8—3,5 т/га, а у стандартного
сорта Ленинская местная соответственно 65—78;13,6—16; 2,5—2,8;2,5-3,0.Для получения форм люцерны с повышенной устойчивостью к
комплексу солей используют сложные селективные системы, в кото¬
рые наряду с солевым компонентом включают аналог проли-
на — гидроксипролин (М.Н. Агафодорова, Л.А. Солодкая, С.И. Ива-
шута, 1997).При клеточной селекции клевера лугового и люцерны, изменчи¬
вой на устойчивость к фитопатогенным грибам, разрабатывают раз¬
личные подходы. В качестве селективного фактора используют куль¬
туральные фильтраты гриба (Л.А. Солодкая, 1987).Селекция in vitro кислотоустойчивых форм. Использование метода
суспензионных культур в селекции клевера лугового на устойчивость
к высоким концентрациям трехвалентного алюминия и низкому pH
среды вследствие высокой сомаклональной изменчивости длительно
культивируемых клеточных популяций приводило к негативным из¬
менениям полученных кислотоустойчивых растений-регенерантов.
Они были низкорослы и полностью стерильны, что делало невозмож¬621
ным включение их в селекционный процесс. В связи с этим дальней¬
шую работу по созданию селекционного материала с повышенной ус¬
тойчивостью к токсическим факторам почв с повышенной кислотно¬
стью проводят методом отбора in vitro (JI.A. Солодкая, М.Н. Агафо-
дорова, 2002).Способ основан на скрининге и микроклональном размножении
кислотоустойчивых генотипов, выделенных из районированных сор¬
тов и селекционных образцов клевера лугового и люцерны, полно¬
стью сохраняющих другие показатели исходных форм.В селекции in vitro используют генотипы клевера лугового, ото¬
бранные в жестких селективных условиях (pH 2,6—3,2 и 500 мг/л А13+)
и отличающиеся хорошим ростом побегов и корней в селективных
условиях в течение 30-дневного культивирования на агаризованной
среде Гамборга В5 с 100 мг/л трехвалентного иона алюминияОднократный отбор in vitro повышает частоту устойчивых геноти¬
пов в популяции в 3—5 раз.В качестве исходного селекционного материала используют Ft,
F2,..., F„ растений-регенерантов клевера лугового, прошедших пред¬
варительный отбор в культуре in vitro и показавших устойчивость к
действию токсических факторов почв с повышенной кислотностью
(pH 4,2, обменного алюминия 15 мг/100 г воздушно-сухой почвы) в
вегетационных и полевых опытах. На основе 2000 растений-регене¬
рантов клевера лугового ультрараннеспелых селекционных образцов,
отобранных в культуре in vitro на устойчивость к трехвалентному иону
алюминия, в условиях Фаленской селекционной станции на почвах с
кислой реакцией почвенной среды и высоким содержанием подвиж¬
ного алюминия создан исходный селекционный материал. Выделен¬
ные номера превышают по кислотоустойчивости исходные формы и
стандарты по основным хозяйственно ценным признакам в условиях
эдафического стресса. В опыте (почвы с pH 3,8—4,0 и обменного алю¬
миния 10—12 мг/100 г воздушно-сухой почвы) на второй год жизни их
зимостойкость составляла 115,6 % к стандарту и 123,5 % к исходной
форме. При этом растения-регенеранты характеризовались дружным
цветением и на две недели более ранним созреванием по сравнению с
контролем. По семенной продуктивности они превышали стандарт в
1,4 раза. Растения-регенеранты отличались повышенным содержа¬
нием сырого протеина (20,2—20,8 %) при 18,6 % у стандарта. Сущест¬
венные различия (на 39,8—98,0 %) выявлены также между кислото¬
устойчивыми клонами и их исходными образцами по урожайности
зеленой массы.Таким образом, растения-регенеранты клевера лугового, полу¬
ченные из кислоточувствительных форм методом селекции in vitro и622
показавшие высокую устойчивость на агаризованных селективных
средах с 100 мг/л трехвалентного алюминия и pH 3,2, в полевых усло¬
виях имели также высокую устойчивость к токсическим факторам
почв с повышенной кислотностью (15 мг обменного алюминия/100 г
воздушно-сухой почвы, pH 4,5).Созданный исходный материал включен в селекционный процесс
ВНИИСХ Северо-Востока и ВНИИ кормов РАСХН.Воздействие на гаметофит люцерны физиологически активными ве¬
ществами. Селекционно-ценные формы растений можно также соз¬
давать, воздействуя на половые клетки физиологически активными
веществами. В отделе биотехнологии ВНИИ кормов разработан спо¬
соб воздействия физиологически активными веществами на генера¬
тивную сферу люцерны с помощью вакуумной инфильтрации. Такой
прием обеспечивает проникновение раствора ФАВ в межклеточное
пространство тканей-генеративных органов, создавая тем самым ус¬
ловия для непосредственного контакта половых клеток с действую¬
щим веществом. Генеративные органы растения в момент обработки
находятся на начальных этапах развития и до окончания в них мик-
ро- и макрогаметогенеза. После образования из обработанных буто¬
нов зрелых цветков проводят искусственное самоопыление или пере¬
крестное опыление нескольких обработанных растений (у самонесо-
вместимых форм). Способ позволяет в зависимости от используемых
веществ добиваться различных результатов.Обработка фитогормонами (2,4-Д, кинетин, НУК) тетраплоидной
люцерны изменчивой позволяет получать растения разного уровня
плоидности, в частности, дигаплоидные и триплоидные формы. Фи¬
тогормоны вызывают дополнительное редукционное деление поло¬
вых клеток, в результате чего наряду с дигаплоидными образуются
жизнеспособные гаметы с моногаплоидным набором хромосом.
Слияние при оплодотворении гамет с моногаплоидным и дигаплоид-
ным набором хромосом приводит к образованию триплоидной зиготы,
формированию из нее триплоидного зародыша, а затем и растения. Ве¬
роятность слияния при оплодотворении гамет с моногаплоидным на¬
бором хромосом и образование дигаплоидного зародыша значитель¬
но ниже, чем для триплоидного (соответственно в пределах 1 и 10 %).
В результате мутагенного действия фитогормонов получены источ¬
ники мужской и женской стерильности с соцветием «сложная кисть»,
имеющие в своем геноме в гетерозиготном состоянии два неаллель¬
ных рецессивных гена, которые в гомозиготном состоянии определя¬
ют полную мужскую и женскую стерильность (тип соцветия «цветная
капуста»). Данный признак может использоваться как фенотипиче¬
ский маркер. Созданы гибридные популяции, показано наличие в ка¬623
ждой из них с частотой около 1 % растений с соцветием типа «цветная
капуста». На основе сорта Полава создан перспективный селекцион¬
ный образец с данным маркерным признаком.Использование культурального фильтрата (КФ) грибов рода
Fusarium позволило разработать метод гаметной селекции, основан¬
ный на избирательной элиминации как микро- , так и макроспор в
незрелых соцветиях в селективных условиях. Одновременный отбор
микро- и макроспор очень важен для перекрестноопыляющихся рас¬
тений, поскольку зигота, образованная из таких гамет, имеет гомози¬
готный по селектируемым признакам генотип и сохраняет свойство
устойчивости у семенного потомства в последующих поколениях.С использованием метода гаметной селекции во ВНИИ кормов
созданы образцы и на их основе перспективный селекционный
материал люцерны с повышенной на 20—40 % устойчивостью к воз¬
будителям фузариоза (М.Н. Агафодорова и др., 2002).13.4.	ЖИВОТНОВОДСТВОНаиболее продвинутыми в области животноводства в мире явля¬
ются работы по трансплантации оплодотворенных яйцеклеток и эм¬
брионов в целях ускоренного размножения высокопродуктивных,
высокоценных генотипов животных (по материнской линии). Этот
метод сегодня используется для создания высокопродуктивных стад
крупного рогатого скота, овец, свиней и птицы. Тщательно отработа¬
ны и используются в производстве технологии стимулирования про¬
цессов овуляции, образования и вымывания зигот, их оплодотворе¬
ния in vitro, трансплантации оплодотворенных яйцеклеток и эмбрио¬
нов в половые органы животных-реципиентов, деления гаструл для
получения однояйцовых двоен. Многие фирмы и научные учрежде¬
ния США, Англии, Германии, Франции, Австралии и других разви¬
тых стран проводят эту работу не только в своих государствах, но и во
многих развивающихся странах, обеспечивая по договорам и кон¬
трактам выполнение наукоемких проектов и заказов по развитию жи¬
вотноводства. В России методы трансплантации животных разрабо¬
таны и усовершенствованы во ВНИИ животноводства, в научно-про-
изводственном биотехнологическом центре животноводства ВИЛАР,
в племцентре Министерства сельского хозяйства РФ. Масштабы
трансплантации эмбрионов высокопродуктивных животных в нашей
стране значительно отстают от объемов работ, которые выполняются
в ведущих зарубежных государствах. Главными причинами такого от¬
ставания является резкое ухудшение положения дел в животноводст¬
ве: сокращение поголовья всех видов скота в 1,5—3,0 раза, рост паде¬624
жа, снижение производства кормов и ухудшение их качества, значи¬
тельное ухудшение племенной работы, быстрая деградация животно¬
водческой отрасли в целом.В этих условиях общественные, индивидуальные и частные сель¬
скохозяйственные предприятия, абсолютное большинство которых в
условиях проводимых в стране реформ оказались банкротами, не рас¬
полагают необходимыми средствами для применения достижений
современной биотехнологии и рекомендаций науки.Работая на перспективу, ученые-биотехнологи России совместно
с селекционерами, ветврачами и другими специалистами решают
приоритетные проблемы животноводства. Важнейшими из них явля¬
ются получение трансгенных животных: крупного рогатою скота,
овец, свиней, кроликов и птицы, отличающихся устойчивостью к
опасным вирусным и другим инфекциям. На очереди получение
трансгенных животных, устойчивых к лейкозу, туберкулезу, бруцел¬
лезу и другим болезням.Принципиально новым биотехнологическим направлением в жи¬
вотноводстве является получение трансгенных особей — доноров ор¬
ганов и тканей, используемых для лечения человека. Для этих целей в
настоящее время имеются соответствующие генные конструкции и
проводятся эксперименты по получению трансгенных свиней, орга¬
ны которых в наибольшей степени подходят для трансплантации в
организм человека.Созданы и совершенствуются генные конструкции для интегра¬
ции в геном сельскохозяйственных животных — генов эритропоэти-
на, инсулиноподобного фактора, инсулина человека и др.Во ВНИТИ птицеводства впервые были получены трансгенные
куры и перепелки с различными генными конструкциями. Открыва¬
ются широкие возможности создания новых линий и пород кур с по¬
вышенной продуктивностью и устойчивостью к болезням в условиях
промышленного и индивидуального производства.Важнейшим результатом эффективного использования биотех¬
нологии в животноводстве является разработка и получение принци¬
пиально новых биостимуляторов рекомбинантного бычьего гормона
роста — соматотропина и других веществ для повышения продуктив¬
ности животных, а также для иммунокоррекции соматостатина при
помощи спектра препаратов химерных белков, показывающих высо¬
кую эффективность на крупном рогатом скоте, свиньях и пушных
зверях.Разработаны и применяются на практике основные принципы ге¬
нетического клонирования животных, в том числе путем хирургиче¬
ского разделения ранних эмбрионов.625
Большой вклад в развитие биотехнологии в животноводстве вно¬
сят коллективы ученых ВНИИ животноводства, ВНИТИ птицевод¬
ства, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, ВНИИ генетики
и разведения сельскохозяйственных животных, ВНИИ физиологии,
биохмии и питания сельскохозяйственных животных, научно-произ¬
водственного биотехнологического центра животноводства ВИЛАР,
ВНИИ свиноводства, Краснодарского НИИ животноводства, ВНИИ
кролиководства и звероводства, ВНИИ экспериментальной ветери¬
нарии.В реализации биотехнологических программ в области животно*
водства активно участвуют также коллективы ученых институтов
РАН — Центра «Биоинженерия», Института молекулярной биоло¬
гии им. В.А. Энгельгарда, Института молекулярной генетики, Инсти¬
тута биологии гена, Института физико-химической биологии им.
А.Н. Белозерского, Института питания АМН, Института биооргани-
ческой химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, ВНИИ ге¬
нетики промышленных микроорганизмов, Института эксперимен¬
тальной медицины Министерства здравоохранения Российской Фе¬
дерации, а также институтов других стран, бывших республик СССР:
Института микробиологии и вирусологии им. А.Г. Кирхенштейна
(Латвия), Института гематологии и переливания крови республики
Беларусь.По отдельным направлениям ведется сотрудничество со странами
дальнего зарубежья, в том числе США, Германии, Индии, Японии,
Польши, Австралии, Чехии, Словакии и Бельгии. Создана система
научной координации, способствующая объединению усилий уче¬
ных биотехнологов стран СНГ и мира по решению важнейших про¬
блем животноводства.13.5.	ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНАНаибольших результатов в ветеринарной биотехнологии и меди¬
цине ученые добились в микробиологии при решении профилакти¬
ческих и терапевтических задач по защите различных видов скота и
птицы от болезней, обеспечении условий для ветеринарной безопас¬
ности животноводства. Совместно с ветеринарными специалистами
разработаны методы получения и организовано промышленное про¬
изводство одно- и поливалентных сывороток профилактического и
препаратов терапевтического действия, полученных генно-инженер¬
ными методами.Разработаны также способы массового культивирования клеток и
вирусов на биофабриках, что позволяет выпускать более 40 ви¬626
рус-вакцин против наиболее опасных вирусных инфекций — бе¬
шенства, инфекционного ринотрахеита, чумы и других заболева¬
ний, в том числе вызываемых бактериальными и грибковыми возбу¬
дителями.Созданы и применяются в производстве высокочувствительные
диагностические препараты на основе метода ИФА (иммунофер-
ментного анализа), ДНК-зондов, внедрения полимеразной цепной
реакции (ПЦР). Используются моноклональные антитела, получен¬
ные методом гибридомной технологии. Получены генетически
трансформированные кролики с геном ас РНК, устойчивые к вирусам
лейкоза, а также трансгенные кролики с геном альфа-2 интерферона.
Разработана рекомбинантная вакцина против лейкоза крупного ро¬
гатого скота на основе оспенного вектора. На культуре клеток нараба¬
тывается антиген и производится даигностика лейкоза крупного ро¬
гатого скота. Генно-инженерные вакцины против ящура и сибирской
язвы производятся в объемах, обеспечивающих потребности в них
России, стран СНГ и ряда других государств мира.13.6.	СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯВ биотехнологии и биоинженерии наметилось четыре наиболее
существенных направления: 1) изучение генетических основ повы¬
шения эффективности использования клубеньковых и свободно жи¬
вущих в почве азотфиксирующих микроорганизмов; 2) создание но¬
вых высокоэффективных и экологически безопасных микробиологи¬
ческих препаратов для защиты растений и животных от вредителей и
болезней; 3) создание новых ветеринарных препаратов на генноин¬
женерной основе; 4) получение новых штаммов азотсодержащих и
продуцирующих белок и биологически активные и иммуномодули¬
рующие вещества в кишечном тракте животных микроорганизмов.ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХ активно
развивает направление о сопряженной селекции растений-хозяев и
ризобильных штаммов бактерий — азотфиксаторов. Получены эф¬
фективные «пары» — сорт-штамм, обеспечивающие увеличение на¬
копления биологического азота в 1,5—2,0 раза и более по сравнению с
их природными аналогами. Созданные в институте штаммы свобод¬
но живущих и ризобиальных азотфиксирующих микроорганизмов по
заключенному контракту используется во Вьетнаме (СРВ) на посевах
риса.По второму направлению наиболее эффективно работают ВНИИ
защиты растений, ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии,
ВНИИ фитопатологии РАСХН, где созданы новые микробиологиче¬627
ские препараты по борьбе с колорадским жуком, а также фузариоза-
ми и другими болезнями растений. Это направление развивается
очень медленно и требует большой финансовой подцержки и вни¬
мания со стороны Министерства сельского хозяйства РФ и Россель-
хозакадемии.13.7.	ПЕРЕРАБОТКА И ХРАНЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙПРОДУКЦИИБиотехнологические методы и приемы направлены на сохране¬
ние и улучшение вкусовых и других качеств продукции, основанных
на применении биологических компонентов-добавок — консерван¬
тов и пищевкусовых соединений растительного и синтетического
происхождения; мембранной технологии, трансгенных микроорга¬
низмов, обеспечивающих надежную и длительную сохранность про¬
дукции. Современная промышленность, производящая витамины,
аминокислоты, кормовые и пищевые добавки, почти полностью ос¬
нована на современных методах биотехнологии. Объем их производ¬
ства пока не удовлетворяет потребности заинтересованных отраслей
и предприятий. В целом перерабатывающие отрасли находятся в де¬
прессивном состоянии: не проводится своевременное обновление
технологического оборудования; в два раза сокращено поступление
сельскохозяйственного сырья.Предстоит большая работа по восстановлению и развитию пере¬
рабатывающих предприятий — заводов по переработке продукции
растениеводства и животноводства, широкому применению на них
современных биотехнологических методов.Наиболее существенный вклад в разработку и совершенствование
биотехнологических методов переработки и хранения животноводче¬
ской продукции вносит Биотехнологический университет по перера¬
ботке продукции животноводства.13.8.	БИОКОНВЕРСИЯ И БИОЭНЕРГЕТИКАОколо половины валовой продукции растениеводства — солома
и ботва сельскохозяйственных растений, около 300 млн т навоза со¬
ставляют органические отходы сельскохозяйственного производства.
Только половина соломы и не более 30 % ботвы используется на корм
скоту. Остальная солома и ботва практически не используется, сжи¬
гается или сгнивает на полях, в местах временного хранения.Около половины навоза используется на удобрения, вторая поло¬
вина — попадает в овраги, лесополосы, водостоки и загрязняет окру-628
жаюшую среду. Главная задача по использованию органических от¬
ходов состоит в том, чтобы они вносились в почву для повышения их
плодородия.Одновременно биотехнологи и инженеры предложили способы
их биоконверсии — преобразования в биогаз. Из одной тонны сухого
вещества навоза можно получить в специальных конверсионных ус¬
тановках до 400 м метана. Каждый кубометр метана при сжигании
дает 8 тыс. мгДж энергии. Оставшиеся после биоконверсии навоза
органические отходы содержат углерод, фосфор, калий, кальций,
микроэлементы и могут быть использованы в виде органического
удобрения. Биоконверсия навоза и других органических отходов мо¬
жет быть постоянным возобновляемым источником энергии и давать
до 5 % от общего количества потребляемой энергии в сельском хозяй¬
стве. Экспериментальные биоконверсйонные установки в нашей
стране созданы во Всероссийском институте электрификации сель¬
ского хозяйства и используются в ряде сельскохозяйственных пред¬
приятий, а также предприятий коммунального хозяйства.Массовое производство биогаза из навоза и других органических
отходов на мелких биоконверсионных установках имеет место в коо¬
перативных и индивидуальных сельскохозяйственных предприятиях
Китая. Получаемый биогаз (метан) используется на бытовые и произ¬
водственные нужды. В России этот возобновленный источник энер¬
гии практически не используется.Биотехнологи и растениеводы предложили оценивать техноло¬
гии, сорта, получаемую продукцию в сельском хозяйстве по коэффи¬
циенту энергетической эффективности. Разработаны и применяются
методы такой оценки на основе учета энергозатрат на производство
единицы продукции и фактического содержания энергии в единице
полученного урожая. Энергетическая эффективность выражается в
относительно абстрактных единицах по уравнениюгде — коэффициент энергетической эффективности; Ес — коли¬
чество энергии в единице произведенной продукции; Е3 — количест¬
во затраченной энергии на единицу произведенной продукции.Сорта, технологии, системы производства считаются эффектив¬
ными, если Аэф составляет 2—3 и более единиц.При Х'эф < 1 сорта, технологии и системы производства не могут
быть аттестованы, так как при этом затраты энергии на производство
единицы продукции превышают ее выход с единицы полученной
продукции.629
Рациональное использование всех ресурсов на основе науч¬
но-обоснованных оптимальных технологий и применяемых сор¬
тов-гибридов сельскохозяйственных культур, пород животных и
птиц обеспечивает высокий коэффициент использования солнечной
энергии (до 3 %) в растениеводстве и повышение конверсии кормов в
животноводстве, что в конечном итоге обеспечивает высокий коэф¬
фициент энергетической эффективности производства сельскохо¬
зяйственной продукции. Применение биотехнологических методов
оценки энергетической эффективности использования всех ресурсов
в сельскохозяйственном производстве — важнейшая задача в возро¬
ждении отечественного продовольственного цеха.Контрольные вопросы к главе 131.	Расскажите о достижениях и перспективах использования генетически
модифицированных растений (ГМР) в продовольственном обеспечении страны
и мира.2.	Какие биотехнологические методы используются для оздоровления по¬
севного и посадочного материала в растениеводстве? Состояние и перспективы
применения.3.	Какие методы биотехнологии и биоинженерий применяются в селекции
растений на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам среды?4.	Какие вы знаете особенности культуры каллусных тканей и клеточных
суспензий перекрестно-опыляемых кормовых культур на примере клевера и лю¬
церны?5.	Расскажите об основных отличиях регенерации растений клевера и лю¬
церны при клеточной селекции и генетической трансформации.6.	Как проводится генетический анализ сомаклональных изменений пере-
крестно-опыляемых кормовых культур на примере клевера и люцерны?7.	Расскажите о методах биотехнологии, применяющихся в селекции кор¬
мовых культур на устойчивость к фузариозу, засолению и кислотности почв.8.	Какие физиологически активные вещества используются для создания
исходного материала люцерны путем воздействия на гаметофит?9.	Что вы знаете о достижениях биотехнологии и биоинженерии в ветери¬
нарной медицине? Какие перспективы их применения в решении проблем повы¬
шения устойчивости сельскохозяйственных животных к опасным заболевани¬
ям?10.	Расскажите о сущности технологии трансплантации эмбрионов в живот¬
новодстве. Достижения и перспективы использования метода.11.	Что такое клонирование сельскохозяйственных животных? Результаты,
проблемы и перспективы применения этой технологии.12.	Расскажите о технологии получения трансгенных животных — результа¬
тах, проблемах и перспективах применения метода трансгеноза.13.	Каковы результаты и перспективы использования биоинженерии в се¬
лекции микроорганизмов на повышение нитратредуктазной активности (интен¬
сивной биологической азотфиксации)?14.	Каковы результаты использования биотехнологических методов в хране¬
нии и переработке сельскохозяйственной продукции.630
15.	Расскажите о биотехнологических методах биоконверсии органических
отходов в сельском хозяйстве. Расчет конструкции, схема действующих и типы
биогазовых установок.16.	Что такое энергетическая эффективность сельскохозяйственных техно¬
логий, КПД солнечной энергии как активно возобновляемого потока энергии в
сельском хозяйстве?17.	Назовите примерные энергетические уровни для обеспечения устойчи¬
вого развития человечества.18.	Каковы основные виды возобновляемых источников энергии, их мас¬
штабы и эффективность применения.ЛИТЕРАТУРААгафодорова М.Н., Солодкая Л.А., Ивашута С.И. Биотехнология кормо¬
вых культур/Сб. Кормопроизводство России.— М.: 1997. С. 298—309.Агафодорова М.Н., Солодкая JI.A. и др. Создание исходного материала
методами биотехнологии. Адаптивное кормопроизводство: проблемы и ре¬
шения.- М.: 2002. С. 375-385.Agafodorova M.N., Solodkaya L.A. et al. Application of Biotechnological
Methods to Develop Alfalfa and Red Clover Cultivars Tolerant to Abiotic Stresses.
Proceedings of the International Workshop on Opening for Low-input Sustainable
Forage Production and Use, Lugovaya, Moscow reg., Russia, 1999, P. 130—137.Биотехнология-2001. Тезисы. Пущино, 2001.Биотехнология — возрождению сельского хозяйства России в
XXI веке/Сборник материалов Всероссийской научно-практической конфе¬
ренции молодых ученых.—СПб., 2001.Изучение генома и генетическая трансформация растений/Под ред. Р. К.
Саляева. Материалы Всероссийского симпозиума. 23—27 августа 1999 г. Ир¬
кутск.—М.: 2001.Кирьян И.Г., Мазин В.В. Клеточная селекция клевера лугового на устой¬
чивость к фузариозу. Новые методы биотехнологии растений.— Пущино,
1991. С. 66-67.Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н. и др. Получение in vitro нового селек¬
ционного материала клевера и люцерны. Резервы интенсификации кормо¬
производства. Материалы III Всесоюзной научной конференции.— М: 1987.
С. 85-90.Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н. и др. Методы биотехнологии в селе¬
кции клевера лугового. Методические указания по селекции и первичному
семеноводству клевера.— М.: 2002. С. 30—33.Солодкая Л.А., Клименко И.А. и др. Основные направления, методы и ре¬
зультаты биотехнологии кормовых культур. Основные итоги и приоритеты
научного обеспечения АПК Евро-Северо-Востока.— Киров, 2005. С. 61—65.Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации и
размножению клевералугового в культуре in vitro.— М.:ВАСХНИЛ, 1983.Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихонович Т.И. и др. Основы сельскохозяй¬
ственной биотехнологии.— М.: Агропромиздат, 1990.631
Основные итоги работы Российской академии сельскохозяйственных
наук за 1997—2001 гг.— М.: 2005.Отчет о деятельности Российской академии наук в 1997—2001 гг.— М.:
2001.Отчет о деятельности Российской академии наук в 2000 г.— М.: 2005.Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы. В 2-х т./Под
ред. B.C. Шевелухи.— М.: Воскресенье, 2000.Солодкая JI.A. Генетические особенности соматических клеток клевера
лугового (Trifolium pratense L.) в культуре и их использование в селекции.
Дисс. на соиск. ученой степени канд. биол. наук. — М.: 1987.Соложенцев П.Д., Мазин В.В. и др. Способ получения триплоидных рас¬
тений люцерны. Авторское свидетельство № 1595408 СССР, БИ, 1990, №36.Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии. Материалы
Всесоюзной конференции. Москва. Июнь. 1986, Ленинград, 1986.Эрнст JI.K., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных жи¬
вотных.— М.: Колос, 1995.
Глава 14БИОТЕХНОЛОГИЯ И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ14.1.	СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫБиотехнология и ее фундаментальное, стратегическое ядро —
биоинженерия затрагивают коренные механизмы формирования
важнейших признаков и свойств живых организмов — их наследст¬
венности, изменчивости, энерго- и массообмена, адаптации и устой¬
чивости, продуктивности и качества. Искусственное вмешательство в
генетические структуры, их модификация в целях совершенствова¬
ния биологических объектов вызывает структурную и функциональ¬
ную перестройки генома всего организма, последствия которых не
всегда могут быть точно и своевременно спрогнозированы, что явля¬
ется серьезной причиной обеспокоенности людей во многих странах
Европы и мира, в том числе и в России.Движение «гринписовцев» и других «защитников» природы и че¬
ловека от использования генетически модифицированных растений,
животных и микроорганизмов стало заметной общественной силой,
которая способна оказать отрицательное необъективное влияние на
темпы развития биотехнологии и прежде всего ее стратегического
ядра — биоинженерии как науки и резко сократить масштабы эконо¬
мического и других видов полезных и важных эффектов от примене¬
ния их результатов в практических целях общества и государств.Сопоставляя уже полученные и ожидаемые результаты развития
биотехнологии и биоинженерии как научных приоритетов XXI века с
масштабами возможного риска и опасности отрицательных послед¬
ствий, большинство ученых мира, работающих в этой области, уве¬
ренно заявляют о возможности научно обоснованного и безопасного
развития этой области науки и производства. Об этом же свидетельст¬
вует и реально сложившаяся ситуация в биотехнологии и биоинжене¬
рии на протяжении всего полувекового периода их становления и
развития от момента зарождения этих наук до наших дней. Каковы
научные основы гарантии дальнейшего безопасного развития био-633
технологии и биоинженерии и возможного риска от использования
их результатов для человека и окружающей среды?Россия занимает одно из последних мест в мире по развитию
трансгенных технологий и одно из первых мест по эпифитотийной
ситуации. До сих пор в нашей стране нет ни одного гектара посевов
трансгенных растений, ни одного зарегистрированного отечествен¬
ного трансгенного организма для использования в производстве.Фирма «Монсанто» развивала свои творческие и коммерческие
связи с Министерством сельского хозяйства России и Российской
академией сельскохозяйственных наук, но теперь прекратила заклю¬
чение договоров и практически свела к нулю все контакты. В связи с
реформированием управления по экономике и науке страны ликви¬
дирована Государственная система управления генно-инженерной
деятельностью — Межведомственная комиссия по генно-инженер-
ной деятельности и биобезопасности, экспертный совет по регистра¬
ции ГМО и другие государственные структуры, связанные с ген-
но-инженерной деятельностью.Научный потенциал России в развитии биотехнологии и генети¬
ческой инженерии является крайне недостаточным. Основные ис¬
следования по этим проблемам сконцентрированы в России в Центре
«Биоинженерия» РАН, в институтах РАН: общей генетики, молеку¬
лярной генетики, биологии гена, в Российском государственном аг¬
рарном университете — Московской сельскохозяйственной акаде¬
мии им. К.А.Тимирязева, во ВНИИ сельскохозяйственной биотехно¬
логии РАСХН, в ряде НИИ других госакадемических министерств и
ведомств. Это отставание будет дорого стоить нашему государству,
оно потребует огромных финансовых затрат на закупку за рубежом
новых биотехнологических и биоинженерных технологий. Требуется
коренное изменение в решении этой проблемы, выхода России на пе¬
редовые рубежи в мире.Необходима твердая и последовательная научно-технологическая
политика, одобренная и поддержанная государственными структура¬
ми и государственным финансированием. Никаких других объектив¬
ных причин для отставании России в реализации важнейшего науч¬
ного и технического приоритета XXI века в России нет. Главной при¬
чиной слабого развития биотехнологии и биоинженерии является
субъективный фактор, недооценка особой роли новейшего направле¬
ния науки государственными структурами.14.2.	ПОНЯТИЕ О БЕЗОПАСНОСТИПриродные, техногенные и другие факторы оказывают постоян¬
ное и значительное воздействие на человека и среду его обитания.
Эти воздействия могут быть положительными и отрицательными.634
Лекарства, вакцины, средства диагностики болезней/Использование в репродукции человека (искусственное
оплодотворение, ранняя диагностика наследственных
заболеваний и т.д.)Здравоохранение—-Генная терапияКсенотранспланталогияСбалансирование пищевого рациона, производство
диетических пищевых продуктов и добавок (заменители
сахара, аминокислоты, витамины и пр.)ПитаниеПрименение в пищевой промышленности (хлеб, сыр,
вино, пиво, вкусовые добавки, ароматизаторы и т.д.)*Получение новых трансгенных растений и животных
с заданными свойствамиСредства защиты растений и животных, бактериальные
удобренияСельскоехозяйствоПроизводство и обогащение кормов, кормовые добавки
Искусственное оплодотворение и разделение эмбрио¬
нов животных-Ускоренное размножение элитных растений, получение
безвирусного посадочного материалаУтилизация бытовых, сельскохозяйственных и
промышленных отходовДеструкция трудноразлагаемых загрязняющих веществ
(нефть, полимеры, пестициды и пр.)Создание биоразлагаемых заменителей традиционных
продуктов, загрязняющих окружающую среду (биопес¬
тициды, пластмассы и пр.)ЭкологияСоздание альтернативных технологий в различных
отраслях-Создание замкнутых производственных цикловПоддержание биоразнообразия, сохранение редких
видов растений и животных, восстановление популяцийВосстановление лесов—Добыча ископаемых, в том числе из бросового сырья и
отходов (биометаллургия, оживление нефтянных сква¬
жин и др.)Проблема истощения
природных ресурсовБиоэнергетика (биогаз, топливный спирт, водород и т.д.)Получение химических веществ из возобновляемого
сырья для использования в различных отрасляхРис. 14.1. Позитивные аспекты влияния биотехнологии на невоенные аспектыбезопасностиНаука, общество, государство должны разрабатывать и эффективно
использовать системы мер по защите человека и окружающей среды
от вредных воздействий любых опасных факторов. Жизнь человека и
общества, существование и деятельность государства должны быть
надежно защищены от любых внутренних и внешних воздействий.
В этом состоит одна из главных задач любого общества, государства,
цивилизации в целом. Из этого важнейшего положения вытекает об¬
щее понятие о безопасности человека, общества, государства и циви¬635
лизации, под которым понимается устойчивое состояние защищен¬
ности жизненно важных интересов личности и самой жизни челове¬
ка, общества и государства, человеческой цивилизации в целом от
внешних и внутренних угроз.Главнейшим объектом безопасности является человек. Безопас¬
ность человека не может быть обеспечена без защиты среды его обита¬
ния и жизнедеятельности, без защиты общества, в котором он живет.
Одним из основных принципов безопасности является взаимная от¬
ветственность человека, общества и государства. Достижение безопас¬
ности — это результат действия системы, предполагающей приведе¬
ние вдейсгвие мер, адекватных угрозам жизненно важных интересов.Безопасность может быть биологической, экологической, эконо¬
мической, продовольственной, военной и другой — в зависимости от
факторов, масштабы, направленность и степень воздействия которых
угрожают деятельности, существованию и самой жизни социальных
и биологических объектов — человека, общества, государства, циви¬
лизации в целом от внутренних и внешних угроз. Общее представле¬
ние о взаимосвязи видов безопасности и влиянии на них биотехноло¬
гии показано на приведенной схеме Т.Е. Поповой (рис. 14.1).14.3.	ПОНЯТИЕ О БИОБЕЗОПАСНОСТИБиобезопасность стала одной из важнейших проблем безопас¬
ности человека, общества, государства и цивилизации в целом. Под
биобезопасностью понимается защищенность человека, общества,
цивилизации и окружающей среды от вредного воздействия, опасно¬
го для жизни и здоровья людей токсичных и аллергенных биологиче¬
ских веществ и соединений, содержащихся в природных или ген¬
но-инженерно-модифицированных биологических объектах и полу¬
ченных из них продуктов. Биологически опасные организмы и их
продукты представляют собой угрозу для существования не только
человека, но и для растений, животных и полезных микроорганиз¬
мов, вызывая различную степень их поражения или гибель, лишая че¬
ловека продовольственных и других источников и возможностей су¬
ществования.Проблемы биобезопасности существуют в мире давно, так как и в
природе, и в производстве различных, необходимых человеку и обще¬
ству веществах — продуктах питания, гигиены, лекарствах и других,
нередко встречаются и продукты, содержащие опасные для здоровья
и жизни человека соединения.Во всех государствах мира разработаны различные методы мони¬
торинга и контроля за технологическими процессами и качеством636
вновь вовлеченных в сферу использования человеком новых биоло¬
гических объектов и веществ, их токсичностью, аллергенностью и об¬
щей безопасностью для здоровья людей и состояния окружающей
среды.Большую опасность для здоровья и жизни людей представляют
ядовитые грибы.Самым опасным и часто трагичным остается алкогольная токси-
кация людей. Равной ей по масштабу опасности для здоровья и жизни
людей может быть только вооруженный или химический геноцид.
Над проблемой алкогольной безопасности работают во всем мире. Но
эффективных результатов пока не достигнуто. Самой опасной для
нынешних и будущих поколений является наркомания. Наркотики
всех видов, в том числе растительного происхождения, парализуют
волю людей, разрушают их как личности и являются причиной гибе¬
ли. Общество и цивилизация в целом стоит перед опасностью нарко¬
тического автогеноцида.14.4.	БИОБЕЗОПАСНОСТЬ В КЛЕТОЧНЫХ, ТКАНЕВЫХ
И ОРГАНОГЕННЫХ БИОТЕХНОЛОГИЯХОпыты с растительными и животными клетками и их органелла-
ми, а также с одноклеточными микроорганизмами осуществляются в
научных лабораториях АПК, медицинской, пищевой и других видах
промышленности давно. Они основаны на фундаментальных иссле¬
дованиях биологии и цитологии клеток и тканей, открытии явления
тотипотентности клеток — способности регенерировать взрослые
организмы, а также на выявлении способности соматических клеток
к слиянию. — соматической гибридизации, обмену органеллами,
дифференциации и дедифференциации. В клеточных технологиях
используется спонтанный и направленный мутагенез, получение
клеток с измененной наследственностью. Это — главная причина ге¬
нетической гетерогенности клеток, полученных из одного и того же
генотипа. Поэтому в клеточных биотехнологиях необходим постоян¬
ный мониторинг за спектром соматической вариабельности, появле¬
нием мутантов с положительными и отрицательными свойствами.
В большинстве случаев соматическая вариабельность не выходит
за рамки положительных, доброкачественных изменений и позволя¬
ет получать исходный материал для селекции растений с улучшенны¬
ми или исходными свойствами в границах генетической нормы реак¬
ции и обеспечения биобезопасности.Главное, чего добиваются клеточные биотехнологи, — получение
генотипов сельскохозяйственных растений с повышенной и высокой637
биотической и абиотической устойчивостью. Распространение неус¬
тойчивых к вредным организмам и абиотическим факторам среды
сортов и гибридов сельскохозяйственных растений может привести к
большим потерям урожая. В этой связи лабораторный и полевой мо¬
ниторинг за полученными клеточными регенерантами растений яв¬
ляется крайне важным с точки зрения экологической безопасности
при их использовании в производстве. Система государственного ис¬
пытания и регистрации сортов и гибридов при ее строгом соблюде¬
нии позволяет значительно снизить такую опасность.Технология получения продуктов вторичного метаболизма в био¬
реакторах на основе культуры клеток и суспензий позволяет непре¬
рывно, автоматически контролировать и своевременно выявлять воз¬
можные отклонения от нормы основных ее параметров и качества по¬
лучаемой продукции, не допускать опасных отклонений в любом зве¬
не технологического процесса. Биотехнологи, работающие с
животными тканями и клетками, отмечают случаи накопления ток¬
сичных веществ в тканях при нарушении техники и технологии их
хранения и использования. Таким образом, в клеточных биотехноло¬
гиях с растениями в целом складывается безопасная ситуация с их ис¬
пользованием в селекции растений, получения продуктов вторично¬
го синтеза для фармацевтической и пищевой промышленности. В то
же время требуется более жесткий контроль за использованием кле¬
точных и тканевых технологий в животноводстве, где выявлены фак¬
ты снижения уровня физиологических и репродуктивных функций у
трансгенных организмов.14.5.	О ГЕНЕТИЧЕСКОМ РИСКЕ И БИОБЕЗОПАСНОСТИ
В БИОИНЖЕНЕРИИ И ТРАНСГЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЯХВстраивание в ДНК реципиентной клетки чужеродного донор¬
ского гена сопряжено с определенными трудностями, главными из
которых являются обеспечение адресной вставки гена или группы ге¬
нов, а также их нормального функционирования — экспрессии. Эти
проблемы существуют постоянно, и их решение во многих случаях
пока имеет бессистемный случайный характер.Еще более важной является проблема генетического риска, воз¬
можного получения мутантов с содержанием токсичных или аллер¬
генных для человека и животных белков ил и других опасных соедине¬
ний. Реальный риск, связанный с поведением чужеродного гена в ре¬
ципиентной клетке, гипотетически существует всегда. Это прежде
всего может вызываться плейотропным эффектом при взаимодейст¬
вии и взаимозаменяемости чужеродных и собственных генов. По638
мнению К. Г. Газаряна, дестабилизация генома при трансгенозе мо¬
жет происходить не только за счет обогащения генома новыми гена¬
ми или мутагенного эффекта вставки, а возможно, в силу индуциро¬
вания эндогенных систем рекомбинации и активации «молчащих»
генов. Все это дает основания считать теоретически возможным по¬
явление при трансгенозе опасных для здоровья и жизни человека ге¬
нотипов.Риск получения таких мутантов значительно возрастает при ис¬
пользовании искусственных, синтетических генов для создания
трансгенных растений, животных и микроорганизмов с улучшенны¬
ми и принципиально новыми свойствами. Именно эти обстоятель¬
ства в определенной мере оправдывают тревогу многих людей, их на¬
стойчивое требование запретить создание и особенно использование
генетически модифицированных организмов и получаемых из них
пищевых и других продуктов или хотя бы ввести систему их обяза¬
тельного маркирования.К двум причинам можно добавить и третью — спонтанный пере¬
нос с пыльцой генов-модификаторов в другие растения, их взаимо¬
действие с генами третьих генотипов, что может привести к появле¬
нию новых генотипов с опасными свойствами для человека, живот¬
ных и окружающей среды.Известно, что начало дискуссии по проблеме биобезопасности в
науке и обществе положили сами основатели нового направления —
биоинженерии. В 1974 г. одиннадцать ведущих молекулярных биоло¬
гов мира во главе с отцом генной инженерии П.Бергом, создавшим
первую рекомбинантную молекулу ДНК, обратились к мировому со¬
обществу с письмом через журнал «Science», в котором предложили
отказаться от экспериментов с рекомбинантными ДНК до проведе¬
ния международной конференции по этой проблеме. Однако уже в
1975 г. на конференции в Асиломаре (США) эти и другие ученые
пришли к выводу, что эксперименты в области генной инженерии,
новейшей биотехнологии, не более опасны, чем аналогичные работы
в других отраслях, что в них, как и везде, необходим строгий научный
контроль за соблюдением мер безопасности.В 1976 г. в США были приняты первые правила, регламентирую¬
щие работу с рекомбинантными микроорганизмами. В них запреща¬
лось выпускать их за стены лабораторий. В конце 70-х годов в боль¬
шинстве стран мира было разработано соответствующее законода¬
тельство. Постепенно эти правила корректировались в сторону смяг¬
чения жесткости требований к трансгенным организмам и
получаемым из них пищевым и другим продуктам.639
Более тридцати лет интенсивных работ по новейшей биотехноло¬
гии — генетической инженерии — в мире подтвердили их безопас¬
ность.В лабораториях, осуществляющих генно-инженерные исследова¬
ния и получение трансгенных организмов, не связанных с созданием
биологических средств поражения людей и природы, не зарегистри¬
ровано случаев получения опасных для здоровья и жизни человека, а
также для окружающей среды генотипов растений и животных. Мик¬
робиологи целенаправленно ведут работы по усилению или ослабле¬
нию вирулентных и других свойств бактерий, решая ряд важных про¬
блем медицинской биобезопасности и защиты государства от бакте¬
риологического оружия и агрессии.К сожалению, мировой терроризм не останавливается перед вы¬
бором средств для своих преступлений. Он использует в этих целях и
опасные для жизни людей биоресурсы. Мировому сообществу пред¬
стоит срочно выработать и осуществить систему самых эффективных
мер по пресечению терроризма и недопущению использования дос¬
тижений биологической науки в его зловещих целях.Ученые в состоянии обеспечить многолетнюю стабильность био¬
безопасности в биоинженерии. В пользу этого важнейшего тезиса
можно выдвинуть следующие основные положения.1.	Биоинженеры используют в своих работах природные гены, ко¬
торые на протяжении всей эволюции участвовали и участвуют в их ре-
комбиногенезе, подвергаются отбору и элиминации, вследствие чего
выработались механизмы на всех уровнях организации биологиче¬
ских объектов, обеспечивающие устойчивый характер репарации
процессов биосинтеза белков и их качества.2.	Во всех биоинженерных лабораториях разработаны и постоян¬
но применяются эффективные методы мониторинга за качеством по¬
лучаемых трансгенных организмов и, прежде всего, за качеством и
свойствами белковых и других компонентов вновь созданных геноти¬
пов. Это позволяет заблаговременно, на этапе создания ГМО в лабо¬
ратории, выявлять опасные для человека и окружающей среды гено¬
типы и не допускать их выпуска из лаборатории.По мнению большинства генных инженеров, методическая осна¬
щенность мониторинга за созданием и использованием ГМО нужда¬
ется в дальнейшем совершенствовании. Должны быть разработаны
новые методы для своевременного выявления токсичных и аллерген¬
ных веществ у трансгенных объектов, охватывающие соответствую¬
щие группы и классы соединений, в том числе низкомолекулярной
природы.640
3.	Для создания генетически модифицированных организмов
специалисты отбирают известные, проверенные природные гены и
их регуляторные генетические структуры. Созданные на их основе
векторы обеспечивают получение трансгенов с заданными свойства¬
ми. В конечном итоге это и обеспечивает создание безопасных для
людей и окружающей среды новых генотипов, получающих разреше¬
ние на использование в производстве и быту.4.	В целом ситуация с генно-инженерными исследованиями и ра¬
ботами по трансгенозу должна оставаться под строжайшим контро¬
лем ученых и государства. По мнению ряда исследователей, техноло¬
гия получения трансгенных животных далека от совершенства. Не¬
предсказуемость результатов переноса чужеродных генов и появление
неожиданных эффектов ограничивает по их мнению практическое
применение методов трансгеноза в животноводстве. Ученые биоинже-
нерных центров — мировых и национальных — должны активно раз¬
вивать работы по совершенствованию техники, методов, технологий
и критериев биобезопасности генетически модифицированных орга¬
низмов (ГМО). И только на такой основе они смогут ускорить про¬
цесс создания принципиально новых генотипов растений, животных
и микроорганизмов для повышения устойчивости и продуктивности
агропромышленного производства, решения сложных проблем со¬
временной медицины и других направлений науки и экономики.14.6.	ГОСУДАРСТВЕННОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
И БИОБЕЗОПАСНОСТИВо всех государствах с развитой генно-инженерной инфраструк¬
турой в науке и производстве в настоящее время приняты законы,
правительственные постановления и другие акты, на государствен¬
ном уровне создающие нормативно-правовую базу для безопасного
использования биотехнологии и биоинженерии в практических це¬
лях общества.Государственное регулирование распространяется на следующие
этапы деятельности: получение ГМО и их исследование в замкнутых
системах; ограниченные полевые испытания; испытания ГМО на
биобезопасность; первый выпуск ГМО в окружающую среду. В боль¬
шинстве своем национальные законы различных государств адапти¬
рованы по главным принципиальным вопросам к международным
требованиям и правилам в этой области науки и производства, за¬
фиксированным в документах ООН, ФАО, ЮНЕСКО и других меж¬
дународных организациях соответствующего профиля.'/,-4266641
В России Федеральный закон «О государственном регулировании
в области генно-инженерной деятельности» принят Государственной
думой и подписан Президентом РСФСР 5 июня 1996 г. за № 86-ФЗ.Закон является рамочным, прямого и непрямого действия. Он ре¬
гулирует отношения в сфере природопользования, охраны окружаю¬
щей среды и обеспечения экологической безопасности, возникаю¬
щие при осуществлении генно-инженерной деятельности с биологи¬
ческими объектами, за исключением человека, его клеток и тканей,
работы с которым регулируются отдельным, специальным законода¬
тельством.В законе определены задачи и основные направления государст¬
венного регулирования, а также система безопасности в области ген¬
но-инженерной деятельности в России.Государство обязано по этому закону устанавливать основные на¬
правления деятельности федеральных органов государственной вла¬
сти, органов государственной власти субъектов Российской Федера¬
ции, органов местного самоуправления, юридических лиц и граждан
(физических лиц) в области генно-инженерной деятельности; уста¬
навливать основные положения правового регулирования отноше¬
ний, возникающих в области генно-инженерной деятельности; опре¬
делять механизмы, обеспечивающие безопасность граждан и окру¬
жающей среды в процессе осуществления генно-инженерной дея¬
тельности и использования ее результатов; устанавливать правовые
основы международного сотрудничества Российской Федерации в
области генно-инженерной деятельности; создавать условия для раз¬
вития приоритетных направлений в этой области.Для реализации указанных задач закон предусматривает приня¬
тие федеральных и региональных программ в области развития ген¬
но-инженерной деятельности.В законе четко сформулированы основные положения системы
безопасности в области генно-инженерной деятельности. Законом
установлены четыре уровня риска потенциально вредного воздейст¬
вия генно-инженерной деятельности на здоровье человека, в соответ¬
ствии с которыми устанавливаются требования по строгому соблюде¬
нию условий при их осуществлении.Первый уровень риска соответствует работам, которые не пред¬
ставляют опасности для здоровья человека и сопоставимы с риском
при работе с непатогенными микроорганизмами.Второй уровень риска соответствует работам, которые представ¬
ляют незначительную опасность для здоровья человека и сопостави¬
мы с опасностью при работах с условно-патогенными микроорганиз¬
мами.642
Третий уровень риска соответствует работам, которые представ¬
ляют умеренную опасность для здоровья человека и сопоставимы с
опасностью при работах с микроорганизмами, потенциально способ¬
ными к передаче инфекции.Четвертый уровень риска соответствует работам, которые пред¬
ставляют опасность для здоровья человека и сопоставимы с опасно¬
стью при работах с возбудителями особо опасных инфекций.Генно-инженерная деятельность в условиях открытых систем
приравнивается к третьему и четвертому уровням риска. Закон содер¬
жит требования к лицам, которые осуществляют генно-инженерную
деятельность, главными из которых являются обязательная профес¬
сиональная подготовка и состояние здоровья, соответствующие тре¬
бованиям правил безопасности генно-инженерной деятельности; на¬
личие соответствующих помещений, отвечающих тем же правилам;
обязательное получение разрешения (лицензий) при работах, соот¬
ветствующих третьему и четвертому уровням риска.В законе определены требования по стандартизации и сертифика¬
ции генно-инженерной продукции (услуг). Она должна соответство¬
вать требованиям экологической безопасности, санитарным нормам,
фармакопейным статьям, обязательным требованиям государствен¬
ных стандартов Российской Федерации. Продукция и услуги, полу¬
ченные и предоставленные с применением генно-инженерно-моди-
фицированных организмов, подлежат в соответствии с федеральны¬
ми правовыми актами обязательной сертификации, должны иметь
сертификат качества и знак соответствия, выданные или признанные
уполномоченным на то органом.Закон определяет ответственность юридических лиц и граждан
(физических лиц), которые осуществляют генно-инженерную дея¬
тельность, их действия или бездействия, ставшие причиной нанесен¬
ного вреда здоровью людей или окружающей среде, несут ответствен¬
ность за нарушение законов Российской Федерации.Финансирование генно-инженерной деятельности и ее безопас¬
ности, согласно закону, осуществляется в установленном порядке за
счет средств соответствующих бюджетов, целевых средств организа¬
ций и фондов, а также иных источников, не запрещенных законода¬
тельством Российской Федерации.«Российская Федерация — указано в законе — заключает между¬
народные договоры в целях дальнейшего развития и укрепления меж¬
дународного сотрудничества в области генно-инженерной деятель¬
ности».На основании Федерального закона «О государственном регули¬
ровании в области генно-инженерной деятельности» Правительст¬643
вом Российской Федерации принят ряд постановлений, обеспечи¬
вающих его реализацию. Ими предусмотрено создание Межведомст¬
венной комиссии по проблемам генно-инженерной деятельности,
контролю за выполнением закона и постановлений правительства в
этой области.Правительство Российской Федерации постановлением от
16 февраля 2001 г. № 120 утвердило положение о государственной ре¬
гистрации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО),
предназначенных для первого на территории Российской Федерации
выпуска в окружающую среду, промышленного использования или
импорта. Регистрацию таких организмов и ведение сводного государ¬
ственного реестра Правительство возложило на Министерство обра¬
зования и науки Российской Федерации.Биобезопасность применительно к указанному положению озна¬
чает отсутствие фактического или прогнозируемого нежелательного
воздействия модифицированного организма (в сравнении с исход¬
ными немодифицированными) на окружающую среду.Положением утвержден также срок действия свидетельства о го¬
сударственной регистрации модифицированного организмадо5летс
даты включения его в реестр. Срок действия свидетельства может
быть продлен по заявлению его владельца на следующие 5 лет. При
появлении в период срока действия свидетельства о государственной
регистрации модифицированного организма новых научно обосно¬
ванных данных о биобезопасности модифицированного организма (в
сравнении с исходным ^модифицированным организмом) Мини¬
стерство образования и науки Российской Федерации может по пред¬
ставлению Экспертного совета принять решение о его перерегистра¬
ции без проведения экспертизы. В случае выявления негативного
воздействия модифицированного организма на окружающую среду,
подтвержденного экспертизой, проведенной в соответствии с указан¬
ным выше положением, по инициативе федеральных органов испол¬
нительной власти, органов местного самоуправления, заинтересо¬
ванных организаций и граждан государственная регистрация моди¬
фицированного организма может быть аннулирована.В соответствии с постановлением Правительства Российской Фе¬
дерации от 16 февраля 2001 г. № 120 «О государственной регистрации
генно-инженерно-модифицированных организмов» Министерство
образования и науки Российской Федерации создало Экспертный со¬
вет Минобрнауки России по вопросам биобезопасности и утвердило
Положение о нем, согласно которому он является постоянно дейст¬
вующим органом, обеспечивающим объективность и надлежащий644
уровень качества проверки предоставляемых заявителями сведений о
биобезопасности генно-инженерно-модифицированных организ¬
мов. Указанный совет организует и проводит экспертизу представ¬
ленных заявителями в Минобрнауки России сведений о биобезопас¬
ности модифицированных организмов, устанавливает наличие или
отсутствие фактического или прогнозируемого нежелательного воз¬
действия модифицированных организмов (в сравнении с исходными
немодифицированными) на окружающую среду, дает, по согласова¬
нию с Межведомственной комиссией по проблемам генно-инженер¬
ной деятельности, заключение о биобезопасности модифицирован¬
ных организмов и возможности их государственной регистрации или
об отказе в такой регистрации и представляет его в установленном по¬
рядке.Состав Экспертного совета формируется из ведущих ученых и вы¬
сококвалифицированных специалистов в области генно-инженер-
ной деятельности.Государственный контроль за биобезопасностью охватывает так¬
же области производства и использования новых пищевых продук¬
тов, материалов и изделий, полученных из генетически модифициро¬
ванных и других биологических объектов. В Российской Федерации
принят Федеральный закон «О качестве и биобезопасности пищевых
продуктов» № 29-ФЗ от 02.01.2000 г. В соответствии с этим законом
Правительство Российской Федерации приняло Постановление
«О государственной регистрации новых пищевых продуктов, мате¬
риалов и изделий» № 988 от 21.12.2000 г. и утвердило Положение по
этому вопросу.В соответствии с этим постановлением Правительства в нашей
стране введена государственная система регистрации новых пищевых
продуктов, материалов и изделий и введен государственный реестр на
указанные виды товаров, разрешенных для изготовления на террито¬
рии Российской Федерации, или ввоза на ее территорию из-за рубежа
и оборота этих товаров. Эту работу правительство поручило осущест¬
влять Министерству здравоохранения России, а по продуктам живот¬
новодства — совместно с Министерством сельского хозяйства Рос¬
сийской Федерации.Согласно утвержденному Правительством положению, под новой
понимается впервые разработанная и внедренная д ля промышленно¬
го изготовления на территории Российской Федерации продукция, а
также впервые ввозимая и ранее не реализовывавшаяся на террито¬
рии Российской Федерации. Государственная регистрация этой про¬
дукции проводится на этапе ее подготовки к производству, а импорт¬И-4266	645
ной продукции — до ее ввоза на территорию Российской Федерации.
С 2004 г. в России установлена система обязательной маркировки пи¬
щевых продуктов, полученных из генетически модифицированных
источников. Ее введение обеспечит условия выбора гражданами про¬
довольственной и другой продукции с учетом ее генетической приро¬
ды и личного отношения граждан к такой продукции. Вопрос цены на
такую продукцию будет решаться по формуле «+» — «—» = 0.14.7.	КРИТЕРИИ И ПОКАЗАТЕЛИ БИОБЕЗОПАСНОСТИ ГМООбщие принципы оценки биобезопасности. Целью проведения
оценки биобезопасности в биоинженерии является выявление при
помощи современных стандартизированных методов возможного
потенциально неблагоприятного воздействия ГМО на человека и ок¬
ружающую среду с учетом рисков для здоровья человека. Первичная
оценка риска работ, проводимых с ГМО, является обязанностью Ко¬
миссии по генной инженерии в научной организации или научном
учреждении. При оценке ГМО на биобезопасность сравнивают их ха¬
рактеристики с показателями исходного немодифицированного ор¬
ганизма (растения, животного или микроорганизма) или организма
реципиента (или ближайшего аналога) и его использованием в соот¬
ветствующих ситуациях.Этапы оценки риска должны включать идентификацию потен¬
циально неблагоприятных, вредных эффектов ГМО на окружающую
среду, включая здоровье человека; оценку их вероятности, оценку
выявленных рисков; рассмотрение стратегий управления рисками.Оценка риска, связанного с использованием ГМО, должна быть
основана на анализе известных научных данных и результатов экспе¬
риментальных исследований, касающихся основных параметров: ха¬
рактеристики ГМО, организма реципиента, организма донора, век¬
тора, нового признака(-ов), предполагаемого выпуска ГМО в окру¬
жающую среду, включая его масштаб, потенциальной принимающей
среды, взаимодействия между ними.Отсутствие научных знаний или научного консенсуса не должно
обязательно истолковываться как указание определенного уровня
наличия риска. При появлении новой информации о ГМО и его воз¬
действии на здоровье человека и окружающую среду оценки рисков
должны быть пересмотрены.Меры по обеспечению биобезопасности должны соответствовать
степени оцененного потенциальною риска.Конкретные критерии и показатели биобезопасности ГМР. Крите¬
рии оценки биобезопасности должны быть надежными, максималь¬646
но полными и базироваться на самых современных методах исследо¬
вания.Для организма реципиента оцениваются: инвазивность; способ¬
ность к скрещиванию с сорняками; способ рассеивания семян; сред¬
ства передачи генетического материала другим организмам.Для вектора: естественная среда обитания и характеристики без¬
опасности вектора; частотность, с которой вектор приобретает мо¬
бильность или может переноситься в другие организмы; факторы, ко¬
торые могут влиять на способность вектора адаптироваться в других
организмах-хозяевах.Для рекомбинантной ДНК: источник введенной ДНК — от пато¬
генного организма; фрагмент ДНК или полноразмерная копия гена;
патогенность и токсичность (известные или потенциально возмож¬
ные); гены устойчивости к антибиотикам.Для экспрессируемого белка: токсичность и аллергенность (из¬
вестные или потенциально возможные) по отношению кчеловеку и к
другим организмам; естественным обитателям окружающей среды.Для ГМР: инвазивность по отношению к естественным обитате¬
лям; болезнетворность, токсичность и аллергенность в отношении
людей и других организмов; способность к передаче рекомбинантной
ДНК/генов другим организмам; возможность превращения в сорняк;
возможность взаимодействий между ГМР и целевыми организмами,
включая влияние на уровень популяции конкурирующих видов и бо¬
лезнетворных организмов.Для принимающей окружающей среды: географическое располо¬
жение места планируемого выпуска ГМР; близость места выпуска к
местам проживания и центрам происхождения исходных немодифи-
цированных растений; наличие половой совместимости с дикими
или сорными видами; способность организмов в потенциальной при¬
нимающей среде получить гены от ГМР в результате выпуска; данные
о флоре, фауне и экосистемах, которые могут пострадать от выпуска
ГМР.Методические вопросы оценки ГМР на биобезопасность. Методи¬
ческие указания оценки ГМР на биобезопасность будут претерпевать
необходимые изменения, но основные подходы и принципы оценки
риска останутся теми же, с сохранением дифференцированного под¬
хода к каждому новому ГМР в зависимости от вида растения, типа его
генетической модификации.1.	Описание организма-реципиента: природные токсины и гене¬
тика реципиента; скрещиваемость с дикими родственниками; семе¬
новодство.647
2.	Молекулярно-генетическая характеристика ГМР: способы ге¬
нетической трансформации, характеристика вектора для трансфор¬
мации; характеристика клонированных фрагментов экзогенной
ДНК; молекулярная характеристика вставки.3.	Молекулярная дактилоскопия исходной и ГМ-линии (ПЦР-
анализ).4.	Экспрессия целевого гена.5.	Сравнительная характеристика нового белка: структурная эк¬
вивалентность природному аналогу; аллергенность, токсичность по
отношению к человеку, животным, насекомым; способность к био¬
деградации.6.	Общие свойства ГМР: способы размножения, распростране¬
ния, выживаемость, фенотипическая стабильность, анализ компози¬
ционного состава, восприимчивость к болезням и вредителям, уро¬
жайность и качество продукции; последствия культивирования ГМР
для окружающей среды, возможность вертикального и горизонталь¬
ного переноса гена, потенциальная возможность превращения ГМО
в сорняк, воздействие ГМР на целевые организмы и трофически со¬
пряженные с ними не целевые организмы, устойчивость к гербици¬
дам, стратегия и/или план по контролю за вредителями и возникно¬
вением резистентных форм вредителей к ГМР.Обязательной и крайне важной является также медикобиологиче¬
ская оценка пищевой продукции, полученной из ГМО.Институтом питания РАМН, институтом вакцин и сывороток
Н.И. Мечникова РАМН, Министерством здравоохранения РФ (Де¬
партамент Госсанэпиднадзора), Московской медицинской академи¬
ей им. И.Т. Сеченова Минздрава РФ, Центром «Биоинженерия»
РАН, Медико-генетическим центром РАН, Московским госунивер-
ситетом прикладной биотехнологии разработаны методические ука¬
зания «Медико-биологическая оценка пищевой продукции из гене¬
тически модифицированных источников». Они введены в действие
Минздравом РФ 1 июня 2000 г. Методическими указаниями установ¬
лены порядок гигиенической экспертизы и государственной регист¬
рации пищевой продукции, полученной из генетически модифици¬
рованных источников. Утверждены методики медико-гигиениче-
ской, медико-биологической оценки и клинических испытаний но¬
вых видов пищевой продукции, полученной из генетически
модифицированных источников. Методические указания являются
официальным изданием и их выполнение должно строго контроли¬
роваться Минздравом РФ, а также соответствующими юридически¬
ми и правовыми органами РФ.648
14.8.	ПОЛУЧЕНИЕ, ИССЛЕДОВАНИЕ И ИСПЫТАНИЕ ГМРПолучение и исследование ГМР: реализация путем генно-инже-
нерной модификации генетического материала традиционных сор¬
тов, как правило, в замкнутых системах — лабораториях, фитотро¬
нах, фитоустановках, теплицах. Исследование ГМР, определение их
качества и основных молекулярно-генетических характеристик так¬
же проводится в замкнутых системах с использованием достоверных
методов анализа и контроля на их соответствие национальным и меж¬
дународным требованиям. Обязательные методы изучения определя¬
ются соответствующими методическими указаниями. Такое изуче¬
ние проводит организация-разработчик с привлечением при необхо¬
димости других научных организаций и учреждений. Лабораторные
работы и испытания в замкнутых системах, соответствующие I—II
уровням риска, регистрируются в Комиссии по генной инженерии в
организации (учреждении), осуществляющей генно-инженерную
деятельность. Для проведения научно-исследовательских работ по
изучению созданных ГМР, соответствующих III и IV уровням риска,
Комиссия по генной инженерии данной организации направляет за¬
явку для получения разрешения этих работ в Минобрнауки РФ, кото¬
рое принимает решение о выдаче разрешения на осуществление НИР
III—ГУ уровней риска при соответствии условий предполагаемой
деятельности требованиям Госсанэпиднадзора, наличии положи¬
тельного заключения Межведомственной комиссии по генно-инже¬
нерной деятельности (МВКГИД).Результаты исследования ГМР в замкнутых системах являются
основанием для решения вопроса о возможности проведения сле¬
дующего этапа их оценки — ограниченных полевых испытаний.Ограниченные полевые испытания ГМР проводятся в исследова¬
тельских целях для изучения ГМР на выраженность и стабильность
введенного признака (нового свойства) и хозяйственную полезность,
включая мониторинг, с соблюдением повышенных мер безопасности
для представляющих вероятность возможного горизонтального и
вертикального переноса генетической вставки другим организмам.14.9.	ГОСУДАРСТВЕННЫЕ ПОЛЕВЫЕ ИСПЫТАНИЯ ГМРНА БИОБЕЗОПАСНОСТЬЦелью государственных полевых испытаний ГМР на биобезопас¬
ность является оценка реализации возможных рисков ГМР для окру¬
жающей среды. Разрешение на их проведение выдает Минобрнауки
РФ. Такие испытания проводятся организациями или учреждения¬649
ми, имеющими специальное разрешение и условия для проведения
испытаний в открытом грунте на огороженных и охраняемых участ¬
ках — полигонах, сертифицированных МВКГИД. При отсутствии у
заявителя/заказчика сертифицированного участка он может обра¬
титься в аккредитованные Минобрнауки РФ центры по сертифика¬
ции ГМР.Программа испытаний ГМР должна содержать задачи, выполне¬
ние которых обеспечит получение всех данных, необходимых для
принятия решения Минобрнауки РФ о возможности последующего
испытания в рамках Государственного испытания ГМР на биобезо¬
пасность или принятия решения о безопасности ГМР для окружаю¬
щей среды. Главным требованием к содержанию государственных
испытаний являются: сертификационные испытания растений (про¬
верка соответствия генетического материала ГМР заявленному) как
непосредственно перед высевом (посадкой) в грунт, так и во время
вегетации и после уборки урожая; проверка возможности передачи
генетической конструкции в потенциальную принимающую среду
(качественная оценка вертикальной и горизонтальной передачи ге¬
нов); оценка способности исследуемого объекта образовывать сохра¬
няющиеся в агроценозе растения-самосевы; оценка исследуемых
объектов на устойчивость и сохранение репродуктивных свойств в
ходе полного сезонного цикла или оставлении его в открытом фун¬
те; влияние на численность полезных и вредных насекомых и устой¬
чивость ГМР к биотическим и абиотическим стрессовым факторам
среды.Заявка на проведение испытания на биобезопасность подается в
Минобрнауки РФ не позднее 4 марта для весенней посадки или не
позднее 1 июня для осенней посадки.Экспертизу заявки проводит Экспертный совет по вопросам био¬
безопасности Минобрнауки РФ.14.10.	ГОСУДАРСТВЕННАЯ РЕГИСТРАЦИЯ ГМР И ПЕРВЫЙ
ШИРОКОМАСШТАБНЫЙ ВЫПУСК ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЙ В ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУРегистрация ГМР — сложный и ответственный процесс постис-
пытательного периода. Заявитель представляет в Минобрнауки РФ
заявление о государственной регистрации ГМР с указанием его так¬
сономического статуса, материалы о заявителе-разработчике ГМР,
заполненную анкету, результаты исследований в замкнутой системе,
Офаниченных полевых испытаниях, государственных полевых испы¬650
таниях на биобезопасность, а также научные данные, известные в ме¬
ждународной и отечественной практике.Порядок государственной регистрации определен Положением
«О государственной регистрации генно-инженерно-модифициро¬
ванных организмов», утвержденным постановлением Правительства
Российской Федерации от 16 февраля 2001 г. № 120.Экспертиза представленныхдокументов проводится Экспертным
советом по вопросам биобезопасности Минобрнауки РФ. На основа-
нии заключения Экспертного совета, согласованного с МВКГИД,
Минобрнауки РФ принимает одно из следующих решений: 1) о госу¬
дарственной регистрации ГМО; 2) о необходимости получения до¬
полнительной информации; 3) о проведении дополнительных иссле¬
дований; 4) о мотивированном отказе в государственной регистра¬
ции. В случае положительного решения Минобрнауки РФ вносит
сведения о ГМР в реестр с присвоением регистрационного номера.
В случае возникновения спорных вопросов в роли государственного
арбитра выступает МВКГИД.Государственная система контроля безопасности ГМР включает
Государственные органы исполнительной власти (Госсанэпиднадзор
РФ, МВКГИД, НИИ учреждения, институты, лаборатории для раз¬
работки, исследования и осуществления безопасного использования
ГМО), общественный контроль посредством использования средств
массовой информации, обеспечивающий население достоверной ин¬
формацией в местах планируемого выпуска ГМР.Многие органы и средства контроля биобезопасности ГМО не
выполняют в полном объеме свои функции, особенно в части инфор¬
мирования населения о безопасности ГМО, а СМИ в этих условиях
дают необъективную информацию для населения, в результате чего
создают волну массового протеста людей против решения важнейше¬
го научного приоритета и сдерживают его развитие в России.Правительство РФ не занимает четкой, объективной позиции по
этой проблеме и тем самым способствует сдерживанию развития био¬
технологии и генной инженерии в стране.Первый широкомасштабный выпуск трансгенных растений в ок¬
ружающую среду производится только после обязательной их регист¬
рации и внесения в сводный государственный реестр, осуществляе¬
мый Минобрнауки РФ. Достоверная информация о выпуске ГМР в
окружающую среду должна содержаться в официальных публикациях
и объявлениях средств массовой информации, специализированных
печатных изданиях, на web-сайте М ВКГИД интернета, а также в виде
научных публикаций. При обнаружении у ГМО в производственных651
условиях после их регистрации отрицательных признаков и свойств,
характеризующих потерю ими биобезопасности, Комиссия по реги¬
страции и биобезопасности Минобрнауки РФ при получении необ¬
ходимой информации принимает решение об отмене регистрации
указанных объектов независимо от продолжительности его использо¬
вания в условиях производства.14.11.	СТАНДАРТИЗАЦИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ
И БИОИНЖЕНЕРИИОбязательным требованием для производства и реализации всех
товаров в стране, в том числе и к товарам, полученным из ГМО, долж¬
на быть их стандартизация.Госстандарт России предложил создать федеральную программу
«Проблемы производства и реализации продуктов питания, получен¬
ных из генно-инженерно-модифицированных источников пищи»,
одной из главных задач которой будет нормативное и норматив-
но-методологическое обеспечение качества и генетической безопас¬
ности генно-инженерно-модифицированных продуктов питания и
продовольственного сырья путем разработки и стандартизации доку¬
ментов, регламентирующих их производство, методы испытания,
хранения и реализацию. Для этого должны быть проведены соответ¬
ствующие научные разработки.Основным приоритетным направлением научных исследований в
области нормативного обеспечения Госстандарт России считает раз¬
работку «Концепции стандартизации генно-модифицированных
продуктов», внесение изменений в действующие нормативные доку¬
менты на пищевую продукцию, продовольственное сырье и методы
испытания в части включения дополнительных требований по гене¬
тической чистоте, нормам использования и методам испытания,
идентификации и маркировке генно-инженерно-модифицирован¬
ных продуктов питания; на пороговые уровни потребления для чело¬
века ГМ-продуктов питания. Перед наукой ставятся также задачи по
разработке и совершенствованию правил и порядка оценки соответ¬
ствия ГМ-продуктов питания требованиям генетической безопас¬
ности; нормативных документов по государственному контролю и
надзору за производством, хранением, реализацией и обращением
ГМ-продуктов питания. Перечисленные нормативно-правовые до¬
кументы крайне необходимы для повышения уровня мониторинга и
контроля за биобезопасностью в биоинженерии и использования ее
результатов в производстве и продовольственном обеспечении насе¬652
ления страны и вывоза продукции на экспорт. Отсутствие таких доку¬
ментов сдерживает реализацию научных достижений биотехнологии
и биоинженерии в стране. Этот пробел должен быть устранен в самое
ближайшее время.14.12.	ОСОБЕННОСТИ ГОСУДАРСТВЕННОГО РЕГУЛИРОВАНИЯ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И КОНТРОЛЯ
ЗА БИОБЕЗОПАСНОСТЬЮ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ
И ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГМО В РОССИИ И СШАМасштабы и достижения биоинженерных работ в США значи¬
тельно превышают российские. Это объясняется прежде всего устой¬
чивой положительной позицией государственных органов США по
отношению к созданию и использованию ГМО, а также финансовой
поддержкой биоинженерных и генно-инженерных работ со стороны
государства. В стране приняты законы и постановления Конгресса и
президента, разрешающие использование генетически модифициро¬
ванных организмов (ГМО) в производстве. 80 % посевов сои и чет¬
вертая часть посевов кукурузы в фермерских хозяйствах США заняты
трансгенными сортами и гибридами. США занимают первое место в
мире по объемам производства генетически модифицированной про¬
дукции.Система государственного контроля за развитием генно-инже-
нерных работ, созданием и использованием генно-инженерно-моди-
фицированных организмов в США в основе своей мало отличается от
российской. Но она имеет и свои особенности. В США за государст¬
венную регистрацию генетически модифицированных организмов
отвечают три ведомства — министерство здравоохранения, мини¬
стерство сельского хозяйства и министерство экологии. Принятие
решения о регистрации или не регистрации модифицированных ор¬
ганизмов каждое из этих министерств принимает самостоятельно.
Положительное решение может быть принято только на основании
консенсуса всех трех ведомств. Департамент сельского хозяйства
США (USDA), его Служба ветеринарной инспекции и защиты расте¬
ний (APHIS) в соответствии с утвержденными правилами и процеду¬
рой уведомления (нотификацией) принимают решения о передвиже¬
нии генетически модифицированных организмов между штатами, об
импорте и выпуске их в окружающую среду. Эти правила впервые
были опубликованы и вступили в силу в США еще в марте 1993 года.Своевременное создание эффективной нормативно-правовой
базы биотехнологии и биоинженерии в США было еще одним факто¬
ром, обеспечивающим ускоренное развитие науки и практики в об¬
ласти генно-инженерной деятельности. Главное направление в био¬653
инженерии США — создание генетически модифицированных сор¬
тов и гибридов сои, кукурузы, хлопчатника, сахарной свеклы, карто¬
феля, томатов, рапса и других культур, устойчивых к тотальному
гербициду раундапу (глифосату), грибковым болезням и насекомым.
Интенсивно также ведутся исследования по созданию сортов пшени¬
цы и других культур, устойчивых к грибковым и вирусным заболева¬
ниям.Никаких проблем с выращиванием и реализацией семян и зерна
генетически модифицированных сортов и гибридов сои, кукурузы и
других культур фермеры США не испытывают и не выдвигают. От ис¬
пользования ГМО они получают существенную добавку к прибыли,
сокращая затраты на уход за посевами.Обязательного маркирования продовольственных товаров, полу¬
ченных из генетически модифицированных сортов и гибридов, в
США пока не вводили. По желанию покупателей его могут ввести на
любом торговом предприятии в любое время.В России по требованию общественности введена система обяза¬
тельного маркирования генетически модифицированных организ¬
мов и полученных их них продуктов.В США создан и действует Национальный центр информации по
биотехнологии, главной задачей которого является увеличение объе¬
ма сбора, хранения, поиска и распространения результатов исследо¬
ваний в области биотехнологии и биоинженерии путем применения
новейших информационных систем.В США также создана и действует Национальная комиссия по
развитию биотехнологий и Экспертный совет для оценки ГМО и по¬
лучаемой из них продукции. В исполнительной ветви Федерального
правительства создана Комиссия по национальной стратегии в об¬
ласти биотехнологии. В комиссию в качестве членов входят минист¬
ры: сельского хозяйства, торговли, обороны, энергетики, председа¬
тель комитета по продуктам питания и медикаментам, руководитель
агентства по экологии, директор национального научного фонда, ди¬
ректора многих научно-исследовательских институтов, департамен¬
тов и отделов различных министерств и ведомств и другие должност¬
ные лица и ведущие ученые биотехнологической науки. Комиссия
имеет широкие полномочия. Она изучает и одобряет программы и
деятельность Федерального правительства в области биотехнологии
и биоинженерии и представляет по мере необходимости свои реко¬
мендации президенту и конгрессу страны по всем основным вопро¬
сам состояния и развития биотехнологии и биоинженерии в США.В США, России и других странах в соответствии с международ¬
ным Картагенским Протоколом по биобезопасности (Cartagena654
Protocol of Biosafety) в рамках конвенции по биологическому разно¬
образию, принятой в Монреале, должно быть подготовлено и рати¬
фицировано соглашение, гарантирующее адекватный уровень защи¬
ты в области биобезопасности транспортировки, маркетинга и ис¬
пользования ГМО, получаемых с помощью современной биоинжене¬
рии. Система слежения — мониторинг на всем пути движения
объектов ГМО (IP — Identity Preservation) широко используется в
странах Америки и Европы для многих растительных и животных ор¬
ганизмов и полученных из них продуктов.Таким образом, в США создана мощная государственная система
по организации, контролю и управлению развитием биотехнологии и
биоинженерии, безопасности в науке и производстве, их финансиро¬
вания и использования.В России происходит деградация ранее созданных структур и мер
государственного регулирования в области генно-инженерной дея¬
тельности, созданных в соответствии с законом, принятым в 1996
году.По мере развития и создания единой международной системы био¬
безопасности в биотехнологиях и биоинженерии всех стран мира будут
внесены соответствующие дополнения и изменения, повышающие ее
эффективность за счет адаптации к современным условиям.14.13.	РЕАКЦИЯ МИРОВОЙ ОБЩЕСТВЕННОСТИ НА РАЗВИТИЕ
БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОИНЖЕНЕРИИ В РОССИИ И МИРЕВо многих странах ЕЭС сложилось отрицательное отношение об¬
щественности к развитию биотехнологии, главным образом, к созда¬
нию и использованию генно-инженерно-модифицированных орга¬
низмов. Европарламент и правительство ЕЭС приняли ряд специаль¬
ных документов, ограничивающих и даже запрещающих выпуск в ок¬
ружающую среду генетически модифицированных растений и других
организмов.В то же время в США, Великобритании, Франции, странах Вос¬
точной Европы приняты важные правительственные решения в под¬
держку биотехнологии и биоинженерии, разрешающие использова¬
ние генно-модифицированных сортов и гибридов сельскохозяйст¬
венных культур.В России также приняты закон и другие нормативно-правовые акты
государственного регулирования генно-инженерной деятельности.Среди активных противников биоинженерных модификаций,
как правило, ученых почти нет. В большинстве своем это политики,
предприниматели, представители СМИ. Научно обоснованных, про¬655
веренных аргументов против создания и использования генно-моди¬
фицированных организмов и полученных из них продуктов ими не
выдвигаются. А названные ими факты о, якобы, имевших место слу¬
чаях нанесения ущерба здоровью людей или их гибели от использова¬
ния генно-модифицированной пищи на поверку оказались не имею¬
щими никакого отношения к трансгенным организмам и получен¬
ным из них продуктам.Научно-обоснованный прогноз событий вокруг проблемы транс¬
генных организмов свидетельствует о том, что общественная волна
протеста в мире, в том числе и в России, достигает своего апогея и при
строгом соблюдении всех требований законов и углубленном науч¬
ном мониторинге всего биоинженерного процесса в дальнейшем бу¬
дет постепенно затухать.По мнению специалистов-биотехнологов страны, которые искус¬
ственно выдвигают различные причины, задерживающие развитие
биотехнологии и биоинженерии и использование их достижений в
производстве, в конечном итоге понесут значительный экономиче¬
ский урон, так как объем важнейшей биотехнологической и генно-ин¬
женерной продукции на мировом рынке будет постоянно возрастать, и
они вынуждены будут тратить значительную часть своих валютно-зо-
лотых запасов на покупку этих товаров на мировом рынке.Причины различного отношения людей, стран и даже континен¬
тов к проблеме современной биоинженерии и генетически модифи¬
цированной продовольственной продукции четко определил лауреат
Нобелевской премии, один из основных авторов «Зеленой револю¬
ции», профессор кафедры Международного сельского хозяйства Те¬
хасского университета ASCM Norman Borlaug Е.: «Наука и техноло¬
гия подвергаются нападкам в благополучных странах, где неверно
информированные защитники окружающей среды утверждают, что
высокопроизводительные сельскохозяйственные технологии, в том
числе технологии производства генетически модифицированных
растений, отравляют потребителей».Почему же так получается, что многие, на первый взгляд, «образо¬
ванные» люди оказываются столь неграмотными в отношении науки?
Судя по всему, существует определенный страх перед наукой, кото¬
рый растет по мере того, как научно-технические преобразования на¬
бирают темпы. И далее: «Мы должны найти выход из этого тупика.
Мы не должны забывать о стоящей перед нами задаче — прокормить
10—11 миллиардов населения Земли. Многие из этих людей, может
быть, большинство из нас, начнут свою жизнь в жалкой бедности...
Сегодня я говорю, что мы либо уже разработали, либо находимся на
завершающих стадиях разработки технологий, которые позволят656
прокормить население численностью более 10 миллиардов человек.
Самый актуальный вопрос сейчас — смогут ли фермеры и другие
производители использовать эти новые технологии». В первую оче¬
редь Norman Borland Е имеет в виду биотехнологию и биоинженерию
в сельском хозяйстве. Подобную позицию заняли в этой проблеме и
многие другие видные ученые мира и руководители государств.14.14.	ПУТИ ПРЕОДОЛЕНИЯ ОТСТАВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ,
БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОБЕЗОПАСНОСТИ В РОССИИ*Россия, к сожалению, очень отстала в развитии биотехнологии и
биоинженерии. В нашей стране до сих пор не зарегистрировано ни
одного генно-инженерно-модицифицированного сорта или гибрида
сельскохозяйственных культур отечественного производства. Созда¬
лась реальная опасность длительного отставания России в XXI веке в
развитии биоинженерии от мирового уровня.По этому поводу нами (B.C. Шевелуха) в 2003 году направлено
специальное письмо президенту страны В.В. Путину «Об опасности
отставания России в генно-инженерной деятельности». Важнейши¬
ми мерами, предусмотренными в этом письме, являются:—	создание и реализация утвержденной федеральным законом
научной программы по биотехнологии, биоинженерии и биобезопас¬
ности;—	признание важнейшим приоритетом XXI века ядерной биоло¬
гии, стратегической части биотехнологии;—	приоритетное финансовое обеспечение развития биотехноло¬
гии, биоинженерии и биобезопасности;—	оснащение биоинженерных научных учреждений современ¬
ным научным оборудованием;—	привлечение для выполнения федеральной программы по био¬
технологии, биоинженерии и биобезопасности молодых, талантли¬
вых исследователей, создание им оптимальных производственных,
жилищных и финансовых условий;*	В данном разделе использованы разработки: Дайджесты Центра «Био¬
инженерия» РАН (Дорохов Д.Б., Игнатов А.Н., Скрябин К.Г. и др.).
2001—2005 гг.; Всероссийского НИИ института фитопатологии (Джава-
хия В.Г., Козловский Б.Е., Санин С.С.) РАСХН; Всероссийского НИИ био¬
логической защиты растений РАСХН (Агасьева И.С., Исмаилов В.Я., На-
дыкта В.Д. и др.); Министерства сельского хозяйства РФ (Гончаров В.Д. и
др.); Департамента сельского хозяйства США; Резолюции и постановления
Парламента и Правительства ЕЭС.657
—	обеспечение постоянного объективного информирования все¬
го населения страны о содержании и результатах исследований по
биотехнологии, биоинженерии и биобезопасности;—	совершенствование законодательной и другой норматив¬
но-правовой базы по биотехнологии, биоинженерии и биобезопас¬
ности;—	создание в стране специального Федерального совета по био¬
технологии, биоинженерии и безопасности;—	активная интеграция России в мировой научный исследова¬
тельский процесс по биотехнологии и биоинженерии.Для России самой острой, экономически наиболее важной явля¬
ется проблема вывода из глубокого экономического кризиса продо¬
вольственного цеха страны — сельского хозяйства, без чего практи¬
ческое использование достижений биотехнологии невозможно. Вто¬
рой проблемой является ускоренное развитие биотехнологии и био¬
инженерии. Вопросы биобезопасности могут и должны быть
обеспечены на основе углубленных научных исследований и стро¬
жайшего выполнения закона, правительственных постановлений и
высокой ответственности ученых и специалистов и практиков, рабо¬
тающих в области биотехнологии и биоинженерии. В решении этих
задач очень важным является развитие международного сотрудниче¬
ства на уровне государств, научных организаций и ученых. Выполне¬
ние совместных международных проектов позволит нашей стране
преодолеть отставание и стать в этой области науки и производства в
ряд с высокоразвитыми государствами мира.Контрольные вопросы к главе 141.	Что такое безопасность и биобезопасность?2.	Какова природа генетического риска в биоинженерии?3.	Какие задачи и основные направления государственного регулирования в
области генно-инженерной деятельности? Изложите основные идеи закона о
генно-инженерной деятельности.4.	Каковы критерии и показатели биобезопасности в биотехнологии и био¬
инженерии?5.	Назовите особенности системы Государственного регулирования в облас¬
ти генно-инженерной деятельности в России и США.6.	Изложите задачи стандартизации и сертификации продукции (услуг) в об¬
ласти генно-инженерной деятельности и биобезопасности.7.	Назовите порядок государственной регистрации генно-инженерно-мо¬
дифицированных организмов и получаемых из них новых пищевых продуктов в
Российской Федерации.8.	Объясните причины и содержание общественного протеста против био¬
инженерии в России и мире.658
9.	Назовите главные причины отставания России в области биоинженерии и
биобезопасности от мирового уровня и пути его преодоления.10.	Каковы задачи и функции Правительства, Межведомственного совета
при Правительстве РФ, Минобрнауки РФ и Экспертного совета в области ген-
но-инженерной деятельности и биобезопасности?ЛИТЕРАТУРАБорлауг Норман Е. Зеленая революция вчера, сегодня и завтра // Эколо¬
гия и жизнь. 2001. N° 4 (21).Borlaug Norrrian Е. International Herald Tribune. Centre «Bioengineering».
RAS Information Сетге//Информационный дайджест. 2000. N° 1.Гончаров Ю.Л. Общие положения опытов в оценке биобезопасности
трансгенных растений. Современные направления борьбы с сорняками с ис¬
пользованием новых классов гербицидов и трансгенных растений, устойчи¬
вых к гербицидам. Центр «Биоинженерия». — М., Информационный центр.
2001.Генно-инженерные организмы и продукты. Упрощение требований и
процедур для генно-инженерных организмов. Федеральный регистр. Т. 62.
N° 85. Правила регулирования. Департамент сельского хозяйства США, 1997.Донченко Л.В., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции. — М.:
Пищерпромиздат, 2001.Ермакова И.В. Генетически модифицированная соя приводит к сниже¬
нию веса и увеличению смертности крысят первого поколения.— Экосин-
форм. N° 1. 2006. С. 4-10.Зиновьева Н.А. Трансгенные технологии в получении сельскохозяйст¬
венных животных — продуцентов фармакологических белков//Достижения
науки и техники АПК. 2003. N° 10.Калашникова Е.А. Проблемы и перспективы использования генетически
модифицированных сельскохозяйственных животных. Аграрная Россия.
N° 5. — М.: Фолиум, 2000.Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. — М.: Высшая школа,
2003.Лутова Л.А., Проворов Н.А., Тиходеев О.Н. и др. Генетика развития расте¬
ний. — СПб.: Наука, 2000.Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из ге¬
нетически модифицированных источников. Методические указания. Изда¬
ние официальное. Минздрав России. — М., 2000.Наука и безопасность России. — М.: Наука, 2000.Патрушев Л.И. Экспрессия генов. — М., 2000.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. — М.: Наука,
1988.Постановление Правительства Российской Федерации «О государствен¬
ной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов».
N° 120 от 16 февраля 2001.659
Постановление Правительства Российской Федерации «О государствен¬
ной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий». № 988
от 21 декабря 2000 г.Blair Tony. Al Biotech Infonet, 2001. Clarhn and La Republica 2001. «Биотех¬
нология — оружие, заряженное будущим». Centre «Bioengineering»//HH<t>op-
мационный дайджест. 2001. № 6.Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы/Под ред.
B.C. Шевелухи. В 2-х т. — М.: Воскресенье, 2001.Transgenic plant and world agriculture. Information note. Plant varieties and
skeds, 13. 2000.Федеральный Закон «О государственном регулировании в области ген-
но-инженерной деятельности». № 86-ФЗ. Российская газета. Июль, 1996.Филимонов П.И. О национальной безопасности и пути державного воз¬
рождения России. — М., 2000.Шевелуха B.C. Ядерная биология — стратегический резерв получения
экологически чистой продукции//Ваше питание. 2001. № 1.Шевелуха B.C. Биотехнология и биобезопасность//Природно-ресурс-
ные ведомости. № 25(80). 2001.Шевелуха B.C. Гены и биобезопасность//Независимая газета.
№ 187(2249). 2001.Шевелуха B.C. Ядерная биология: когда взорвется бомба. Об опасности
отставания России в развитии современной биоинженерии//Известия. 2001.
№ 179(26017).Эрнст JI.K. Современное состояние и перспективы биотехнологии в жи-
вотноводстве//Достижения науки и техники АПК. 2003. N° 10.
ПРИЛОЖЕНИЕ*Фиторегуляторы, разрешенные для применения в растениеводстве№п/пНазвание и дейст¬
вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения1Агат-25к, тпс
(культура
Pseudomonas
aureofaciens
HIG, титр 5—
8 х 1010 до
инактивации)Овес, яч¬
мень, пшени¬
ца яровая и
озимая, рожь
озимаяПшеница,
рожь озимаяСвекла са¬
харная, свекла
столоваяКартофельТоматПредпосевная обработка семян 0,11—
0,14 %-м раствором препарата (11—14 г/т) для
повышения всхожести, общей и продуктив¬
ной кустистости, урожайности, снижения за¬
болеваемости. Расход рабочего раствора — 10 лДОпрыскивание посевов в фазе выхода в
трубку 0,005 %-м раствором препарата
(14 г/га) и повторно в фазу цветения для по¬
вышения качества зерна и урожайности,
снижения заболеваемости. Расход рабочего
раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка семян 1,0—
1,35 %-м раствором препарата (106—
135 г/т) для повышения всхожести, урожай¬
ности, стимулирования иммунной системы,
снижения заболеваемости. Расход рабочего
раствора 10 л/т. Предпосевная обработка се¬
мян 0,3—0,45 %-м раствором препарата
(106—135 г/т). Расход рабочего раствора
30 л/т и опрыскивание посевов в фазе смыка¬
ния рядков 0,0046 %-м раствором препарата
(14г/га). Расход рабочего раствора — ЗООл/гаОпрыскивание клубней перед посадкой
(7 г/0,5 л воды) для повышения всхожести,
урожайности, снижения заболеваемости в
т. ч. фитофторозом и паршой. Расход рабоче¬
го раствора — 0,5 л/50 кг клубнейЗамачивание семян в течение 3 ч в
0,35 %-м растворе препарата (7 г/кг семян)
для повышения всхожести, урожайности,
снижения заболеваемости в т. ч. фитофторо¬
зом, стимулирования иммунной системы.
Расход рабочего раствора 2 л/кг. Опрыскива¬
ние растений в фазе 2—3 листьев (14 г/га) че¬
рез 20 дней после первой обработки. Расход
рабочего раствора — 300 л/га•Подготовлено канд. биол. наук, доцентом кафедры биологии и биотехнологии
РГАУ— МСХА им. К.А. Тимирязева Н.П. Корсункиной.661
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияАльфа-НУК,98	%-й кр. п.
(альфанафти-
луксусная ки¬
слота)Амбиол,98,4	%-й кр. п.
(2-метил-4-ди-
метиламиноме-
тилбензимида-
зол-5-ол дигид¬
рохлорид)Городские
зеленые наса¬
жденияКомнатныецветочныерастенияПлодовые,декоративные,лесныеТабакКукурузаОгурецРисЛенОпрыскивание растений в первой полови¬
не вегетации 0,01—0,03 %-м раствором пре¬
парата (1—3 г/10 л воды) для повышения
жизнеспособности и устойчивости к заболе¬
ваниям, улучшения декоративных качеств.
Расход рабочего раствора 2 л/куст, Юл/дере¬
во высотой 5—10 м и 20 л/дерево высотой
10—20 мОпрыскивание растений до бутонизации
0,01—0,03 %-м раствором препарата (1 —3	г/10 л воды) и повторно через 14 дней после
первой обработки для повышения жизнеспо¬
собности и устойчивости к заболеваниям,
улучшения декоративных качествЗамачивание зеленых черенков в 0,0025—0,005 %-м растворе препарата (25—
50 мг/л) в течение 6—8 ч (полуодревеснев-
ших черенков 12—18 ч) для стимулирования
корнеобразованияОпрыскивание рассады за 5—10 дней до
высадки 0,001—0.0015 %-м раствором препа¬
рата (41—76 мг/м ) для стимулирования кор¬
необразования. Расход рабочего раство¬
ра—4—5 л/м2. Опрыскивание растений в
период бутонизации — начала цветения0,17 %-м раствором препарата (0,85 кг/га)
для торможения роста пасынков, сближения
сроков созревания нижних и верхних листь¬
ев. Расход рабочего раствора — 500 л/гаПредпосевная инкрустация семян (10—
100 мг/т) для повышения урожайности и за¬
сухоустойчивости . Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тПредпосевное замачивание семян в тече¬
ние 6 ч (1—10 мг/кг) для повышения урожай¬
ности и выхода семян. Расход рабочего рас¬
твора — 1 л/кгПредпосевная обработка семян (10 мг/т)
для повышения урожайности. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (20 мг/т)
д ля повышения урожайности. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/т662
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияАгрохит,40 %-й в. р.
(лактат хитоза-
ния)Бисол-2,60 %-й в. р. (ща¬
велевокислый
тетраметилме-
тиленд иамин)Биоэнергия,
п. (продукт жиз¬
недеятельности
микроорганиз¬
мов и грибов)ПшеницаЭхинацеяпурпурнаяСвекла са¬
харнаяПодсолнеч¬никКартофельЯблоня (са¬
женцы)ХлопчатникЯровая пше¬
ницаТо жеПредпосевная обработка семян (40 мг/т)
для повышения урожайности. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тПредпосевное замачивание семян (1 мг/кг)
на 4—5 ч для повышения всхожести семян и
урожайности. Расход рабочего раствора —1	л/кгПредпосевная обработка семян (100 мг/т)
для повышения урожайности, сахаристости,
устойчивости к болезням. Расход рабочего
раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (10 мг/т)
для повышения урожайности, устойчивости к
болезням. Расход рабочего раствора — Юл/тОбработка клубней перед посадкой
(1,5 л/т) для стимуляции роста и развития.
Расход рабочего раствора — 5 л/тОпрыскивание растений 0,0005 %-м рас¬
твором препарата (1,5 л/га) в фазе смыкания
ботвы и повторно в фазе бутонизации для по¬
вышения урожайности и устойчивости к забо¬
леваниям, увеличения выхода здоровых клуб¬
ней. Расход рабочего раствора— 300л/гаОпрыскивание саженцев 0,001 %-м рас¬
твором препарата соответственно отраста¬
нию побегов на 10, 30 и 50 см (0,1 л/дерево)
для усиления роста побегов и повышения ус¬
тойчивости к заболеваниям коры и древеси¬
ны. Расход рабочего раствора — Юл/деревоПредпосевное замачивание семян в тече¬
ние 24 ч (1 л/т) для повышения устойчивости
к грибным заболеваниям, увеличения уро¬
жайности и улучшения технологических
свойств волокна. Расход рабочего раствора —
1000 л/т. Опрыскивание растений в период
бутонизации — начала цветения. Расход ра¬
бочего раствора — 400 л/гаИнкрустация семян (30 г/т) для повыше¬
ния урожайности. Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тОпрыскивание растений для повышения
урожайности в фазе кущения (0,012 кг/га).
Расход рабочего раствора — 250 л/га663
Продолжение прилож.Neп/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияГетероаук¬
син, 92 %-й р. п.
(индолил-3-ук-
сусная кислота)Гибберрос,17 %-й п. (на¬
триевые соли
гибберелл и но¬
вых кислот)Гибберсиб,50 %-й кр. п.
(натриевые
соли гибберел-
линовых ки¬
слот)Плодовые,
ягодные куль¬
турыВиноград¬
ная лозаТомат от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаВиноград(бессемянныесорта)Виноград¬
ная лоза (бес¬
семянные сор¬
та)Томат от¬
крытого и за¬
щищенного
фунтаОгурцы от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаЛук репча¬
тыйЗамачивание черенков перед высадкой в
грунт в 0,005—0,02 %-м растворе препарата
(0,05—0,2 г/л) в течение 10—24 ч для стиму¬
лирования корнеобразованияКратковременная предпрививочная обра¬
ботка нижней части привоя (1—1,5 с) и верх¬
ней части подвоя 0,1—0,3 %-м раствором
препарата (1—3 г/л) для улучшения сраста¬
нияОпрыскивание растений в начале цветенияI,	2 и 3 кисти 0,01—0,013 %-м раствором
(30—40 г/га) для стимуляции образования за¬
вязей, ускорения созревания. Расход рабоче¬
го раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,06—0,08 %-м раствором в
конце цветения для повышения урожайно¬
сти и улучшения товарных качеств ягод. Рас¬
ход рабочего раствора — 1500 л/гаОпрыскивание растений в конце цветения0.06—0,08	%-м раствором препарата (0,9—1,2	кг/га) для повышения урожайности и
улучшения товарных качеств ягод. Расход ра¬
бочего раствора — 1500 л/гаОпрыскивание растений в начале цветения1,	2 и 3 кисти 0,01— 0,013 %-м раствором
препарата (30— 40 г/га) для стимуляции об¬
разования завязей, ускорения созревания.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в начале фазы
цветения и в период массового цветения
0,0035—0,005 %-м раствором препарата
(21—30 г/га) для повышения раннего и обще¬
го урожая плодов. Расход рабочего раство¬
ра — 600 л/гаОпрыскивание растений в фазе массового
стрелкования и через 4—6 дней после первой
обработки 0,01 %-м раствором препарата
(30 г/га) для повышения семенной продук¬
тивности. Расход рабочего раствора —
300 л/га664
Продолжение прилож.N°п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения10Гиббереллин,
80 %-й кр. п.
(гиббереллин
А3)Гиббереллин,
80 %-й кр. п.+
тиомочевина,99,9	%-й кр. п.
(гиббереллин
А3 + тиомоче¬
вина)ЛюцернаКартофельКайустаранняяКапустапоздняяХлопчатникВиноград¬
ная лоза (бес¬
семянные сор¬
та)КартофельОпрыскивание растений в фазе бутониза¬
ции и в начале фазы цветения 0,01 %-м рас¬
твором препарата для повышения семенной
продуктивности. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/гаОпрыскивание растений в начале фазы
цветения, в период массового цветения и че¬
рез 7 дней после второй обработки 0,005 %-м
раствором препарата (15 г/га) для повыше¬
ния урожайности. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе 6—8 листь¬
ев, в период начала завязывания кочана и че¬
рез 10—12 дней после второй обработки
0,007 %-м раствором препарата (21 г/га) для
повышения качества продукции и урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе 6—8 листь¬
ев и в фазе начала завязывания кочана
0,007 %-м раствором препарата для повыше¬
ния качества продукции и урожайности. Рад-
ход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в период начала
бутонизации — цветения за 3—5 дней до
полива и через 10—15 дней после первой об¬
работки 0,013 %-м раствором препарата
(40 г/га) для улучшения качества хлоп-
ка-сы0ца. Расход рабочего раствора —
300 л/гаОпрыскивание соцветий в период массо¬
вого цветения или завязывания — начала
роста ягод 0,0125 %-м раствором препарата
(25—50 г/га) для улучшения плодообразова-
ния, увеличения размера ягод гроздей. Рас¬
ход рабочего раствора — 200—400 л/га. Оп¬
рыскивание растений в конце цветения
0,019 %-м раствором препарата (190 г/га).
Расход рабочего раствора —1000—1500л/гаЗамачивание клубней в течение 30 мин в
растворе, содержащем 0,00025—0,0005 % ГК
и 2 % тиомочевины (0,5— 1 г/т + 4 кг/т) для
ускорения прорастания свежеубранных
клубней и получения второго урожая. Расход
рабочего раствора — 200л/т (для южных рай¬
онов)42-4266665
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения11Гидрогумат,
10 %-й в. р. (гу-
миновые ки¬
слоты)12Гумат натрия,
30 %-й в. р. (на¬
триевые соли
гуминовых ки¬
слот)13Гумоксин-Ж,
25%-я ж. (ам¬
мониевые соли
гуминовых ки¬
слот)Пшеница
озимая, рожь,
ячмень яро¬
вой, тритика¬
ле, кукурузаКартофельПшеница
озимая, яч¬
мень яровой,
овес, подсол¬
нечникПшеницаозимаяКукурузаЯчмень яро¬
войПшеница
озимая, яч¬
мень яровой,
овесПредпосевная инкрустация семян совме¬
стно с протравителем 2—5 %-м раствором
препарата (0,2—0,5 л/т) для повышения ус¬
тойчивости к болезням и увеличения уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
10 л/т. Опрыскивание растений в фазе куще¬
ния — выхода в трубку 0,16—0,33 %-м рас¬
твором препарата (0,5— 1 л/га). Расход ра¬
бочего раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка клубней 0,4—
0,5 %-м раствором препарата (0,2—
0,25 л/т) для повышения устойчивости к бо¬
лезням и увеличения урожайности. Расход
рабочего раствора — 50 л/т клубней. Опры¬
скивание растений по полным всходам и в
фазе бутонизации 0,3—0,5 %-м раствором
препарата (1—1,5 л/га) для повышения им¬
мунитета к болезням и увеличения урожай¬
ности. Расход рабочего раствора — 300 л/гаПредпосевная инкрустация семян 7,5 %-м
раствором препарата (0,75 кг/т) для усиления
роста корневой системы и надземной массы,
адаптации к неблагоприятным воздействиям
внешней среды, пестицидам. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тОпрыскивание посевов в период колоше¬
ния — налива зерна для повышения содер¬
жания клейковины и увеличения урожайно¬
сти зерна 0,0275—0,04 %-м раствором препа¬
рата. Расход рабочего раствора — 200 л/гаПредпосевная инкрустация семян 6 %-м
раствором препарата (0,6 кг/т) для усиления
роста корневой системы и надземной массы,
адаптации к неблагоприятным воздействиям
внешней среды, пестицидам. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тИнкрустация семян 7,9 %-м раствором пре¬
парата (0,72 л/т) для увеличения общей и про¬
дуктивной кустистости, повышения урожай¬
ности. Расход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений в фазе кущения
0,2 %-м раствором препарата (0,6 л/га) для
повышения урожайности. Расход рабочего
раствора — 300 л/га666
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения1415Декстрел,95 %-й р. п.
(Д-(+) трео-1-
(л-нитрофе-
нил-1,3-диок-
сиизопропи-
ламмоний-2-хлорэтилфос-
фоновая кисло¬
та)Завязь, 1,5%
кр. п. (гиббе-
реллиновых ки¬
слот, натриевые
соли)Томат от¬
крытого грун¬
таМорковь(семенники)Томат от¬
крытого защи¬
щенного грун¬
таБаклажаныОгурец от¬
крытого грун¬
таКапустаранняяКапустапоздняяОпрыскивание растений в начале созрева¬
ния 0,26—0,53 %-м раствором препарата
(1,6—3,2 г/га) для повышения дружности со¬
зревания, повышения доли раннего урожая.
Расход рабочего раствора — 400—800 л/гаОпрыскивание растений при высоте цен¬
трального побега 10 см и повторно через7	дней 0,05 %-м раствором препарата
(300 г/га) для повышения семенной продук¬
тивности. Расход рабочего раствора —
600 л/гаОпрыскивание в начале цветения 1, 2 и 3
кисти 0,1—0,2 %-м раствором препарата
(10—20 г/10 л воды) для стимулирования об¬
разования завязей, ускорения созревания пло¬
дов. Расход рабочего раствора — 4 л/ 100 м2Опрыскивание в фазах начала бутониза¬
ции и начала цветения (10 % распустившихся
цветков) 0,2—0,25 %-м раствором препарата
(20—25 г/10 л воды) для стимулирования обра¬
зования завязей, ускорения созревания пло¬
дов. Расход рабочего раствора — 4 л/100 м2Опрыскивание в фазах начала цветения
(появление единичных цветков) и массово¬
го цветения 0,2—0,25 %-м раствором препа¬
рата (20—25 г/10 л воды) для стимулирова¬
ния образования завязей, ускорения созре¬
вания плодов. Расход рабочего раствора —
6 л/100 м2Опрыскивание в фазах 6—8 листьев, нача¬
ла завязывания кочана и через 10—12 дней
после 1-й обработки 0,08—0,12 %-м раство¬
ром препарата (8—12 г/10 л воды) для повы¬
шения качества продукции и урожайности.
Расход рабочего раствора — 4 л/100 м2Опрыскивание в фазах 6—8 листьев, нача¬
ла завязывания кочана 0,12 %-м раствором
препарата (12 г/10 л воды) для повышения
качества продукции и урожайности. Расход
рабочего раствора — 4 л/100 м2667
Продолжение прилож.N9п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения1617Ивин,99,9	%-я ж.
(М-окси-2,6-лу-
тидина)Ивин-П,99,9	%-й кр. п.
(соль N-ок-
си-2,6-лутиди-
на с пиколино-
вой кислотой)Лук репча¬
тый (семенные
посадки)КартофельФасоль, го¬
рох овощнойКапуста бе¬
локочанная,
баклажанОгурец и то¬
мат защищен¬
ного и откры¬
того фунтаТомат и
огурец откры¬
того и защи¬
щенного грун¬
таМорковьОгурец от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаОпрыскивание в фазах массового стрел¬
кования и через 4—6 дней после первой об¬
работки 0,2 %-м раствором препарата
(20 г/10 л воды) для повышения семенной
продуктивности. Расход рабочего раствора —
10 л/250 м2Опрыскивание в начале фазы массового
цветения и через 10 дней после первой обра¬
ботки 0,1—0,2 %-м раствором препарата
(10—20 г/10 л воды) для повышения урожай¬
ности. Расход рабочего раствора — 4л/100 м2Опрыскивание в фазах бутонизации и на¬
чала цветения 0,1—0,2 %-м раствором пре¬
парата (10—20 г/10 л воды) для стимулирова¬
ния образования завязей, ускорения созре¬
вания плодов. Расход рабочего раствора —4	л/100 м*Замачивание семян в течение 48 ч в
0,03 %-м растворе препарата (0,3 г/кг) для
повышения урожайности. Расход рабочего
раствора — 1 л/кгЗамачивание семян в 0,03 %-м растворе
препарата в течение 24—72 ч, полив почвы в
рассаднике после посева семян, появления
всходов и пикировки, а также опрыскивание
растений после высадки рассады в фазе буто¬
низации и начала цветения 0,015 %-м рас¬
твором препарата для повышения урожайно¬
стиПредпосевное замачивание семян в тече¬
ние 24 ч в 0,0005 %-м растворе препарата
(0,011 мл/кг) для повышения всхожести, вы¬
хода стандартной продукции, раннего и об¬
щего урожая. Расход рабочего раствора —
2 л/кгТо же, но концентрация раствора препара¬
та 0,00025 %Предпосевное замачивание семян в тече¬
ние 24 ч в 0,001—0,002 %-м растворе препа¬
рата (20—40 мг/кг) для повышения раннего и
общего урожая. Расход рабочего раство¬
ра — 2 л/кг668
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения18192021ИМК, 98 %-й
р. п. (индо-
лил-3-масляная
кислота)Иммуноци¬
тофит, таб.
(арахидоновая
кислота)Кампозан-М,
26 %-й в. р.
(этефон), Гер¬
манияКампозан-М
3Kctpa, 50 %-й
в. р. (этефон),
ГерманияМорковьГруша, яб¬
лоня, слива,
черешня, пер¬
сик, цитрусо¬
вые, виноград¬
ная лоза, смо¬
родинаКартофельТо жеРожь озимаяЯчмень ози¬
мыйЛен-долгу¬
нецКлевер лу¬
говойПредпосевное замачивание семян в тече¬
ние 24 ч в 0,00001 %-м растворе препарата
(0,2 мг/кг) для повышения полевой всхоже¬
сти, дружности появления всходов, раннего
и общего урожая. Расход рабочего раство¬
ра — 2 л/кгЗамачивание черенков перед высадкой в
грунт в 0,0025—0,005 %-м растворе препара¬
та (25—50 мг/л) в течение 12—24 ч для стиму¬
лирования корнеобразованияОбработка клубней перед посадкой (75 мг/т).
Расход рабочего раствора — 30 л/тОпрыскивание в фазе бутонизации
(0,3 кг/га) для повышения урожайности и
устойчивости к болезням. Расход рабочего
раствора — 400 л/га.Опрыскивание посевов в фазу выхода в
трубку для предотвращения полегания.
Авиационное — 8—12 %-м раствором или
3—4 л/га препарата (расход рабочего раство¬
ра—25—50 л/га), наземное — 1,3— 2 %-м
раствором препарата (расход рабочего рас¬
твора— 150—300 л/га)То же, но за 10—12 дней до фазы колоше¬
ния в дозе 2—3 л/гаОпрыскивание посевов в начале фазы бу¬
тонизации 0,5—0,6 %-м раствором препарата
(1—1,2 л/га) для предотвращения полегания.
Расход рабочего раствора — 200 л/гаОпрыскивание растений в осенний период
1,93 %-м раствором препарата (5,8 л/га) че¬
рез 20—30 дней после проведения последнего
укоса для повышения зимостойкости и выхо¬
да кормовых единиц. Расход рабочего рас¬
твора — 300 л/гаТо же, но в дозах: 1,5—2 л/га рожь озимая,1—1,5 л/га ячмень озимый, 0,5—0,6 л/га
лен-долгунец669
Продолжение прилож.N9п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения222324Кампозан-М,
26 %-й	в.р. + ТУР,60 %-й в. р.
(этефон +хлор-
холинхлорид)КАНУ,94	%-й р. п. (ка¬
лиевая соль аль-
фа-нафтилук-
сусной кисло¬
ты)Квартазин,95	%-й кр. п.
(хлорид-N, N-
диметил-N-)-
(2-хлор-этил)-
гидрозония)Ячмень яро¬
войЯчмень ози¬
мыйРожь озимаяПшеницаозимаяЯблоняКартофельПшеница
яровая, пше¬
ница озимая,
ячмень яро¬
вой, рожь ози¬
мая, тритикалеЯблоняКлевер лу¬
говойОпрыскивание растений в конце фазы вы¬
хода в трубку, начиная с появления флагово¬
го листа для предотвращения полегания
(0,5—1 л/га + 3—6 л/га). Расход рабочего рас¬
твора при авиаобработке — 25—50 л/га, на¬
земной — 150—300 л/гаТо же, но за 10—12 дней до колошения в
дозе 1—2 л/га + 3 л/гаОпрыскивание растений в фазе от начала
выхода в трубку до середины трубкования
(1,5—2 л/га+ 3—3,3 л/га)То же, но в дозе 1—2 л/га + 3—5 л/га1—2-кратное опрыскивание кроны деревь¬
ев летних сортов за 15 дней до уборки, зимних
сортов за 30 и 15 дней до уборки 0,016 %-м
раствором препарата (240 г/га) для предот¬
вращения опадания плодов. Расход рабочего
раствора — 1500 л/гаОпрыскивание растений в начале бутониза¬
ции 0,25 %-м раствором препарата (1 кг/га) для
улучшения качества клубней, повышения
урожайности. Расход рабочего раствора —
400 л/гаИнкрустация семян совместно с протра¬
вителями 0,25 %-м раствором препарата
(25 г/т) для уменьшения стекания зерна, по¬
вышения урожайности. Расход рабочего рас¬
твора — 10 л/т. Опрыскивание посевов в
фазе кущения 0,25 %-м раствором препарата
(0,5 кг/га). Расход рабочего раствора —
200 л/гаОпрыскивание деревьев через 25—30 дней
после цветения 0,02 %-м раствором препара¬
та (0,16—0,2 кг/га) для стимулирования обра¬
зования плодовых почек. Расход рабочего
раствора — 1000 л/гаОпрыскивание семенных посевов в фазе
бутонизации 0,5 %-м раствором препарата
(1,6 кг/га) для повышения семенной продук¬
тивности. Расход рабочего раствора —
300 л/га670
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения252627Кротонолок-
тон, 35 %-я ж.
(2-оксо-2,5-ди-
гидрофуран)Культар,25 %-й к. э.
(паклобутра-
зол), АнглияКрезацин,95 %-й кр. п.
(ортокрезокси-
уксусной ки¬
слоты триэта-
ноламмониевая
соль)КукурузаРисЯблоня (мо¬
лодые насаж¬
дения)Яблоня
(взрослые на¬
саждения)ТоматКартофельОгурецОбработка семян перед посевом 1,23 —
1,7 %-м раствором препарата (235 мл/т) со¬
вместно с протравителями для повышения
полевой всхожести и урожайности. Расход
рабочего раствора — 15 л/тОбработка семян перед посевом 0,1 %-м
раствором препарата (20—25 мл/т) совместно
с протравителями для повышения урожайно¬
сти и качества зерна. Расход рабочего раство¬
ра — 20 л/тОпрыскивание растений через 25 дней по¬
сле цветения и повторно через 14 дней после
первой обработки 0,16 %-м раствором препа¬
рата (1 л/га) для стимуляции образования ге¬
неративных органов, повышения урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 600 л/гаТоже, новдозе 1,64 л/га при расходе рабо¬
чего раствора 1000 л/гаЗамачивание семян перед посевом на
30 мин в 0,05 %-м растворе препарата (1 г/кг)
для повышения урожайности и устойчивости
к болезням, ускорения созревания, повыше¬
ния холодостойкости, снижения содержания
нитратов, расход рабочего раствора 2 л/кг.
Опрыскивание в фазе цветения 1 кисти
0,005 %-м раствором препарата (15 г/га).
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОбработка клубней перед посадкой 0,012—
0,016 %-м раствором препарата (1,2—
1,6 г/т) для повышения урожайности и ус¬
тойчивости к болезням, ускорения созревания,
повышения лежкости, снижения содержания
нитратов. Расход рабочего раствора^- Юл/тЗамачивание семян перед посевом в 0,2—
0,3 %-м растворе препарата (2—3 г/кг) для по¬
вышения урожайности и устойчивости к бо¬
лезням, ускорения созревания, повышения
холодостойкости, снижения содержания
нитратов, снижения опадания завязей. Рас¬
ход рабочего раствора 1 л/кг. Опрыскивание
растений в начале бутонизации 0,0016—
0,003%-м раствором препарата (5—10 г/га).
Расход рабочего раствора — 300 л/га671
Продолжение прилож.Noп/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения28Корневин,0,5 %-й с. п. ин¬
дол илмасляная
кислотаПшеница
озимая и яро¬
вая, ячменьОвесРисКукурузаЯблоняЧеренки
плодовых,
ягодных, деко¬
ративных
культурСаженцы
плодовых,
ягодных, деко¬
ративных
культурИнкрустация семян (0,3—0,5 г/т) для по¬
вышения урожайности и устойчивости к бо¬
лезням, повышения холодостойкости узла
кущения, снижения полегания. Расход рабо¬
чего раствора — 10 л/т. Опрыскивание в фазе
кущения — выхода в трубку 0,0013—
0,002%-м раствором препарата (4—6 г/га).
Расход рабочего раствора — 300 л/гаИнкрустация семян (0,3—0,5 г/т) для по¬
вышения энергии прорастания, повышения
урожайности и устойчивости к болезням.
Расход рабочего раствора — 10 л/тИнкрустация семян (0,3—0,5 г/т) для по¬
вышения урожайности и устойчивости к бо¬
лезням, повышения озерненности, кустисто¬
сти, длины главной и боковых метелок. Рас¬
ход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений в фазе 4—8 листь¬
ев 0,003 %-м раствором препарата (10 г/га)
для повышения урожайности зерна и зеленой
массы, повышения устойчивости к болез¬
ням, ускорения сроков созревания. Расход
рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание через 4—5 недель после
цветения 0,001 %-м раствором препарата
(Юг/га) для повышения урожайности, уве¬
личения лежкости плодов, снижения содер¬
жания нитратов, увеличения содержания уг¬
леводов и витаминов. Расход рабочего рас¬
твора — 1000 л/гаОпудривание среза черенка (10—20 г/100
черенков) для стимулирования корнеобразо¬
ванияЗамачивание корневой системы (1 г/л) на
6 ч для стимулирования корнеобразования.
Расход рабочего раствора — 100 л/100 расте¬
нийПолив под корень (1 г/л) через 10 дней по¬
сле высадки для стимулирования корнеобра¬
зования. Расход рабочего раствора — 100 л/200
растений672
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения29Краснодар-1,99	%-й кр. п.(5-ЭТИЛ-5-ГИД-роксиметил-2-(фурил-2)-1,3-диоксан)30Лариксин,5	%-я в. э. (ди-гидрокверце-тин)ПшеницаозимаяТоматПерец слад¬
кийКартофельСвекла са¬
харнаяАрбуз, тык-Горох овощ¬
нойРисПшеницаозимаяОпрыскивание 0,0005 %-м раствором
(2 г/га) в фазе выхода в трубку и перед коло¬
шением для ускорения созревания, повыше¬
ния качества зерна и урожайности. Расход
рабочего раствора — 400 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) в фазе цветения 1 и 2 кисти для уско¬
рения созревания плодов и повышения уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
300 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) в начале массового цветения, вторая
и третья обработки с интервалом 10 дней для
повышения урожайности, снижения осыпа¬
ния завязи. Расход рабочего раствора —
300 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) в фазе 5—7 листьев и в фазе бутониза¬
ции для повышения урожайности. Расход ра¬
бочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) растений при наличии трех пар ли¬
стьев и повторно через 10 дней для повыше¬
ния урожайности, сахаристости. Расход ра¬
бочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) в фазе бутонизации и цветения для
повышения урожайности, сахаристости. Рас¬
ход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,0007 %-м раствором
(2 г/га) в фазе бутонизации и цветения для
повышения урожайности. Расход рабочего
раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка семян (0,2 г/т)
для повышения урожайности и качества зер¬
на, ускорения созревания. Расход рабочего
раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (50 мл/т)
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
10 л/тОпрыскивание растений 0,013 %-м раство¬
ром (40 мл/га) в фазе начала выхода в трубку и
колошения (по флаговому листу) для повы¬
шения урожайности, устойчивости к заболе¬
ваниям. Расход рабочего раствора — 300 л/га673
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияПшеницаяроваяЯчмень яро¬
войКартофельПротравливание семян с увлажнением пе¬
ред посевом (100—250 мл/т) для повышения
устойчивости к гельминтоспориозным и фу-
зариозным корневым гнилям. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (100 мл/т)
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
10 л/тОпрыскивание растений 0,01 %-м раство¬
ром (30 мл/га) в фазе начала выхода в трубку
и повторно в фазе появления флагового лис¬
та для повышения урожайности, устойчиво¬
сти к заболеваниям. Расход рабочего раство¬
ра—300 л/гаПротравливание семян с увлажнением пе¬
ред посевом (100—250 мл/т) для повышения
устойчивости к гельминтоспориозным и фу-
зариозным корневым гнилям. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (100 мл/т)
для ускорения созревания, повышения уро¬
жайности, устойчивости к заболеваниям.
Расход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений 0,01 %-м раство¬
ром (30 мл/га) в фазе начала выхода в трубку
и повторно в фазе появления флагового лис¬
та для ускорения созревания, повышения
урожайности, устойчивости к заболеваниям.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений 0,03 %-м раство¬
ром (100 мл/га) в период массового цветения
и повторно через 20 дней после обработки
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
300 л/гаПредпосевная обработка клубней (20 мл/т)
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
10 л/тОбработка семенных клубней (100—
250 мл/т) для повышения устойчивости к ри-
зоктониозу. Расход рабочего раствора — 2—л/т674
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияВиноградПодсолнеч¬никЛен-дол гу-
нецСвекла са¬
харная31Мивал,95 %-й кр. п.(1-хлорметил-силатран)ХлопчатникОпрыскивание растений 0,04 %-м раство¬
ром (250 мл/га) в фазе цветения и повторно
через 15—25 дней после первого для увеличе¬
ния массы грозди, повышения сахаристости
и урожайности. Расход рабочего раствора —
600 л/гаПредпосевная обработка семян (100 мл/т)
для повышения урожайности, масличности
семян, устойчивости к заболеваниям. Расход
рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений 0,03 %-м раство¬
ром (100 мл/га) в начале цветения и в период
массового цветения для повышения урожай¬
ности, масличности семян, устойчивости к
заболеваниям. Расход рабочего раствора —
300 л/гаПротравливание семян с увлажнением пе¬
ред посевом (250 мл/т) для повышения ус¬
тойчивости к антракнозу, крапчатости, бак¬
териозу. Расход рабочего раствора — 3—5 л/тПредпосевная обработка семян (100 мл/га)
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
10 л/тОпрыскивание растений 0,03 %-м раство¬
ром (100 мл/га) в фазе «елочки» для повыше¬
ния урожайности, устойчивости к заболева¬
ниям. Расход рабочего раствора — 300 л/гаПротравливание семян с увлажнением пе¬
ред посевом (100—250 мл/т) для повышения
устойчивости всходов к корнееду. Расход ра¬
бочего раствора — 8—10 л/тПредпосевная обработка семян (250 мл/т)
для повышения урожайности, сахаристости,
устойчивости к заболеваниям. Расход рабо¬
чего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений 0,03 %-м раство¬
ром (100 мл/га) в фазе 8—10 листьев и через
15 дней после первого для повышения уро¬
жайности, сахаристости, устойчивости к забо¬
леваниям. Расход рабочего раствора — 300 л/тОбработка оголенных семян перед посе¬
вом (6 г/т) для повышения полевой всхоже¬
сти, ускорения созревания, увеличения уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
30 л/га675
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияКартофельТоматПшеница
озимая и яро¬
вая, ячменьОвесКукурузаОбработка опушенных семян перед посе¬
вом в течение 24 ч (100 г/т) для повышения
полевой всхожести, ускорения созревания,
увеличения урожайности. Расход рабочего
раствора — 500 л/тОпрыскивание растений 0,03 %-м раств
ром (100 мл/га) в фазе цветения — нача
плодообразования для повышения полев
всхожести, ускорения созревания, увеличу
ния урожайности. Расход рабочего рас
ра — 300 л/гаОбработка клубней перед посадкой (10г/ф'
для усиления ростовых процессов, ускорений
созревания, повышения урожайности: Рас¬
ход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание 0,0015 %-м раствором *
фазе бутонизации (4—8 г/га) для усиления
ростовых процессов, ускорения созревания^
повышения урожайности. Расход рабочего^
раствора — 300 л/гаЗамачивание семян перед посадкой на
30 мин (4—8 г/кг) для повышения всхожести
и энергии прорастания семян, ускорения со¬
зревания плодов, увеличения раннего и обще¬
го урожая. Расход рабочего раствора — 2л/кгОпрыскивание растений 0,0015 %-м рас¬
твором в фазе цветения 1 кисти (4—8 г/кг)
для повышения всхожести и энергии прорас¬
тания семян, ускорения созревания плодов,
увеличения раннего и общего урожая. Расход
рабочего раствора — 300 л/гаИнкрустация семян (1 г/т) для повышения
всхожести и энергии прорастания семян, ус¬
корения созревания, увеличения урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 10 л/тИнкрустация семян (2 г/т) для повышения
всхожести и энергии прорастания семян, ус¬
корения созревания, увеличения урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 10 л/тИнкрустация семян (5—10 г/т) для повыше¬
ния всхожести и энергии прорастания семян,
сокращения сроков созревания до стадии мо¬
лочно-восковой спелости, увеличения уро¬
жайности. Расход рабочего раствора — Юл/т676
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения323334Нарцисс,8	%-й в.р. (сук-
цинат хитоза-
ний глютами-
ния)НИКФАН
(Симбионт-2),
0,05 %-я ж.
(продукт мета¬
болизма гри-
бов-эндофитов
облепихи)Оксигумат,10 %-й в. р. (гу-
миновые ки¬
слоты)Рис, пшени¬
ца, ячменьПодсолнеч¬
ник, огурецОгурец за¬
щищенного
грунтаКартофельПшеница
яровая, пше¬
ница озимая,
ячмень яровойПшеница
озимая, рожь
озимая, яч¬
мень яровой,
тритикалеПредпосевная обработка семян (1 л/т) за1—3 суток до посева для увеличения зеленой
массы, повышения урожайности, устойчиво¬
сти к заболеваниям. Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тПредпосевная обработка семян (2,5 л/т) за1—3 суток до посева для увеличения зеленой
массы, повышения урожайности, устойчиво¬
сти к заболеваниям. Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тЗамачивание семян (5 мл/кг) в течение 12 ч
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
2 л/кгПолив рассады (150—300 мл/растение) по¬
сле высадки в грунт (30—50 л/га) для повы¬
шения урожайности, устойчивости к заболе¬
ваниям. Расход рабочего раствора — 12 000—
20 000 л/гаОпрыскивание растений (10—20 л/га) че¬
рез 30 дней после высадки рассады в грунт
для повышения урожайности, устойчивости
к заболеваниям. Расход рабочего раствора —
2000-3000 л/гаПредпосевная обработка клубней (без
совмещения с другими обработками)
0,01 %-м раствором препарата (1 мл/т) с до¬
бавлением 0,2 г/т медного купороса для сти¬
муляции роста и развития, повышения ус¬
тойчивости к заболеваниям и урожайности.
Расход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений (без совмещения
с другими обработками) 0,001 %-м раство¬
ром препарата (1 мл/га) с добавлением
0,2 г/га медного купороса: яровые — в фазе3—5 листьев, озимые — ранней весной для
повышения устойчивости и урожайности.
Расход рабочего раствора — 100— 200 л/гаИнкрустация семян совместно с протрави¬
телями 2—5 %-м раствором препарата (0,2—
0,5 л/га) для повышения устойчивости к за¬
болеваниям и урожайности. Расход рабочего
раствора — 10 л/т677
Продолжение прилож.п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения35363738Оксикарбам,
30 %-я ж.
(О-изопро-
пил-1^-2-гидро-
ксиэтил-карбо-
мат)Пике, 5 %-й
в. р. (мепикват-
хлорид), Герма¬
нияПотейтин,99,5	%-й кр. п.
(комплекс
N-OKCH-2,6-My-
тидина + ян¬
тарная кислота)Силк, 5 %-я
в. э. (тритерпе-
новые кислоты)КукурузаКартофельОгурец и то
мат открытого
и защищенно¬
го грунтаПшеницаяроваяЯчмень яро¬
войХлопчатникКартофельТоматЛук репча¬
тый (на семе¬
на)Опрыскивание растений в фазе куще¬
ния — выхода в трубку 0,17—0,33 %-м рас¬
твором препарата (0,5—1 л/га) для повыше¬
ния урожайности. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/гаПредпосевная обработка клубней 0,4—
0,5 %-м раствором препарата (0,2—
0,25 л/га) для повышения устойчивости к за¬
болеваниям и урожайности. Расход рабочего
раствора — 50 л/т2-кратное опрыскивание растений по
всходам и в фазе бутонизации 0,3— 0,5 %-м
раствором препарата (1—1,5 л/га). Расход ра¬
бочего раствора — 300 л/гаПредпосевное замачивание семян в 0,1 %-м
растворе препарата 24 ч для повышения ус¬
тойчивости к заболеваниям и урожайности.
Расход рабочего раствора — 2 л/кгОпрыскивание посевов в фазе кущения
0,066—0,16 %-м раствором препарата (0,2—
0,5 л/га) для повышения морозо- и засухоус¬
тойчивости. Расход рабочего раствора —
300 л/гаТо же, но в фазе выхода в трубку 0,16 %-м
раствором препарата2-кратное опрыскивание растений в нача¬
ле цветения и в период массового цветения
0,4—0,6 %-м раствором препарата (1—1,5	л/га) для ускорения созревания коробо¬
чек. Расход рабочего раствора — 250 л/гаОбработка клубней перед посадкой (100—
300 мг/т) для повышения раннего и общего
урожая. Расход рабочего раствора — ЗОл/тОпрыскивание растений в фазе цветения 1,2	и 3 кисти 0,1 %-м раствором для ускорения
созревания, повышения урожайности и ус¬
тойчивости к болезням, расход рабочего рас¬
твора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе массового
стрелкования и через 7 дней после первой об¬
работки 0,2 %-м раствором препарата для по¬
вышения урожайности и устойчивости к бо¬
лезням. Расход рабочего раствора — 300 л/га678
Продолжение прилож.J*п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияЛук репча¬
тыйКартофель39Симбионт-1,
ж. (продукт ме¬
таболизма гри-
бов-эндофитов
женьшеня)ОгурецКапустаСояГречихаПшеница
яровая и ози¬
маяКартофельОпрыскивание растений в фазе 4 листьев и
через 15 дней после первой обработки
0,2 %-м раствором препарата для улучшения
лежкости репки, повышения урожайности и
устойчивости к болезням. Расход рабочего
раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в начале цвете¬
ния, в фазе массового цветения и через 7 дней
после второй обработки 0,2 %-м раствором
препарата для ускорения созревания, повы¬
шения урожайности и устойчивости к болез¬
ням. Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе 2—3 листь¬
ев, начала цветения, в фазе массового цвете¬
ния и через 7 дней после третьей обработки
0,03 %-м раствором препарата для повыше¬
ния урожайности и устойчивости к болезням.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе 6—7 листьев и
в фазе массового завязывания кочанов 0,08 %-м
раствором препарата для повышения уро¬
жайности, содержания сахара и витамина
С. Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе начала
цветения 0,04 %-м раствором препарата для
повышения урожайности, увеличения мас-
личности семян. Расход рабочего раствора —
300 л/гаОпрыскивание растений в фазе начала рас¬
крытия цветков нижних соцветий и массово¬
го цветения 0,1 %-м раствором препарата для
повышения урожайности и товарных качеств
семян, ускорения созревания. Расход рабоче¬
го раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка семян 0,1 %-м
раствором препарата для повышения уро¬
жайности и устойчивости к болезням, расход
рабочего раствора — 10 л/т. Опрыскивание в
фазе кущения и колошения 0,06 %-м раство¬
ром препарата. Расход рабочего раствора —
300 л/гаПредпосевная обработка клубней 0,01 %-м
раствором препарата (1 мл/т) с добавлением
0,2 г/т медного купороса для стимуляции
роста и развития, повышения устойчивости к
заболеваниям и урожайности. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/т679
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения40ТУР, 60 %-й
в. р. (хлорхо-
линхлорид)Пшеница
яровая, ози¬
мая, ячмень
яровойПшеница
яровая, озимаяВиноград¬
ная лозаГруша, яб¬
лоняЗемляникаТомат (рас¬
сада)Опрыскивание растений 0,001 %-м рас¬
твором препарата (1 мл/га) с добавлением
0,2 г/га медного купороса: яровых — в фазе3—5 листьев, озимых — ранней весной для
повышения устойчивости к болезням и уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
100-200 л/гаПредпосевная обработка семян за 25—30
дней до посева (6 л/т) совместно с протрави¬
телями для повышения морозо- и засухоус¬
тойчивости, предотвращения полегания.
Расход рабочего раствора — 10 л/тОпрыскивание растений в конце фазы ку¬
щения — начала выхода в трубку (3—6 л/га)
для предотвращения полегания. Расход рабо¬
чего раствора при наземной обработке —
150—300л/га, авиаобработке — 25— 50л/гаОпрыскивание растений за 14 дней до цве¬
тения (1,2—1,5 л/га) для торможения роста
лозы сортов с рыхлой и среднеплотной гроз¬
дью, повышения урожайности, получения
высококачественного посадочного мате¬
риала. Расход рабочего раствора — 750—
1000 л/гаОпрыскивание кроны деревьев через 10—
15дней после цветения и повторно через 10—
15 дней после первой обработки (3,1—7,6 л/га)
для ускорения начала плодоношения и повы¬
шения урожайности. Расход рабочего раство¬
ра — 500 л/га для насаждений до 5 лет,
1000 л/га — старше 5 летОпрыскивание плантаций (11,2—22,3 л/га)
для ограничения роста усов, получения вы¬
сококачественного посадочного материала:
плодоносящих — после сбора урожая, ма¬
точных — в начале массового образования
усов. Расход рабочего раствора соответствен¬
но 1200 и 1000 л/гаОпрыскивание растений: в фазе 3—4 ли¬
стьев и два последующих через 5—8 дней (2,2—4,5	л/га) для предотвращения перерастания.
Расход рабочего раствора — 0,3 л на Юм2680
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения41Универсаль¬
ный, 85 %-й
кр. п. (янтарная
кислота)42Урожайный,
1,98 %-я ж.
(хвойное эфир¬
ное масло +
хлорофиллока¬
ротиновая пас¬
та)Кострец, ти¬
мофеевка, ежа
сборная (се¬
менники)Капуста бе¬
локочаннаяСвекла са¬
харнаяВиноградЗемляникаЧерешня,
вишня, алыча,
абрикосТоматПерецОпрыскивание растений в фазе куще¬
ния — начала выхода в трубку (1,5—6 л/га)
для предотвращения полегания и повыше¬
ния урожайности семян. Расход рабочего
раствора при наземной обработке — 75—
200 л/га, авиаобработке — 25—50 л/гаОпрыскивание рассады в фазе 2—4 настоя¬
щих листьев 0.3 %-м раствором препарата
(200—250 мл/м ) с последующей обработкой
маточников для повышения устойчивости к
болезням при хранении, семенной продук¬
тивностиОпрыскивание маточников в фазе интен¬
сивного роста кочана (10—13,4 л/г) для повы¬
шения урожайности семян. Расход раство¬
ра — 1000 л/гаПредпосевная обработка семян (250 г/т) для
повышения энергии прорастания и всхожести
семян, урожайности и сахаристости корне¬
плодов. Расход рабочего раствора — 50 л/тОпрыскивание кустов 0,008 %-м раство¬
ром (80 г/га) для повышения урожайности,
сахаристости, повышения содержания вита¬
мина С и ускорения созревания. Расход рабо¬
чего раствора — 1000 л/гаОпрыскивание 0,0075 %-м раствором в
фазе цветения (30 г/га) для повышения уро¬
жайности, сахаристости, ускорения созрева¬
ния. Расход рабочего раствора — 400 л/гаОпрыскивание 0,0025 %-м раствором в пе¬
риод массового цветения (30 г/га) для повы¬
шения урожайности, сахаристости. Расход
рабочего раствора — 1200 л/га *Опрыскивание 0,5 %-м раствором (5 мл/л)
в фазе цветения 1,2 и 3 кисти с целью стиму¬
ляции опыления, увеличения плодообразо-
вания. Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,2 %-м раствором (2 мл/л)
в фазе 4—5 листьев, повторно в фазе бутони¬
зации и третье — в фазе массового цветения с
целью стимуляции опыления, увеличения
плодообразования. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/га43-4266681
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения434445Фавихол,85 %-й кр. п.
(N-(2-3tok-ch-
этил)-тримети-
ламмонийхло-
рид)Фитохит,95	%-й в. р. п.
(маннитсукци-
нат хитозония)Фоспинол,
95-99 %-й р. п.
(1, 2, 5-триме-
тил-4-диметил-
фосфонпипе-
ридол-4)ОгурецХлопчатникПшеница
озимая, яч¬
мень, рисКартофельПодсолнеч¬никОгурецСвекла са¬
харная и сто¬
ловая, мор¬
ковьКартофельОпрыскивание 0,3 %-м раствором (3 мл/л)
в фазе 2—4 листьев, второе и третье опрыски¬
вание с интервалом 20 дней с целью стимуля¬
ции опыления, увеличения плодообразова-
ния. Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание растений в фазе образова¬
ния 19—21 плодоэлемента 0,2 %-м раствором
препарата (0,4 кг/га) для химической чекан¬
ки, ускорения созревания, повышения уро¬
жайности первых сборов хлопка-сырца. Рас¬
ход рабочего раствора — 200 л/гаОбработка семян перед посевом 0,8 %-м
раствором препарата (80 г/т) д ля повышения
полевой всхожести, раннего и дружного цве¬
тения, урожайности. Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тОбработка клубней перед посадкой 2 %-м
раствором препарата (200 г/т) для регуляции
ростовой активности, стимулирования им¬
мунной системы, продления сроков хране¬
ния клубней. Расход рабочего раствора —
10 л/тИнкрустация семян (200 г/т) для регуля¬
ции ростовой активности, стимулирования
иммунной системы, генеративного размно¬
жения. Расход рабочего раствора — 10 л/тОбработка семян перед посевом 2 %-м рас¬
твором препарата (20 г/100 кг) для регуляции
ростовой активности, стимулирования им¬
мунной системы, генеративного размноже¬
ния, продления сроков хранения сельскохо¬
зяйственной продукции. Расход рабочего
раствора — 1 л/100 кгОбработка семян перед посевом 2 %-м рас¬
твором препарата (20 г/100 кг) для регуляции
ростовой активности, стимулирования им¬
мунной системы, продления сроков хране¬
ния корнеплодов. Расход рабочего раство¬
ра — 1 л/100 кгОпрыскивание растений в фазе бутони¬
зации 0,0001 %-м раствором препарата
(1 г/га) для повышения урожайности. Расход
рабочего раствора — 800 л/га682
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения46474849Фузикокцин,
90 %-й кр. п.
(метаболит гри¬
ба Fusicoccum
amigdali)Фумар,10 %-й в. р. в
ДМСО (диме-
тиловый эфир
аминофумаро-
вой кислоты)Фу ролан,98,9	%-я ж.(2-(2-фурил)-1,3-диоксолан)Р.2-ХЭФК,50 %-й в.
(2-хлорэтил
фосфоновая ки¬
слота)Свекла са¬
харнаяМорковьРисВиноград¬
ная лозаЯблоняПерсик,
слива, череш¬
ня, алыча, аб¬
рикосРожь озимаяТомат от¬
крытого грун¬
таОгурец от¬
крытого грун¬
таИнкрустация семян (340 мг/т) совместно с
протравителями для повышения урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 30 л/тЗамачивание семян в течение 6 ч не более
чем за 10 дней до посева (1,9—3,8 мг/кг) для
повышения полевой всхожести и урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 0,5 л/кгПредпосевное увлажнение семян 0,001 %-м
раствором препарата (100—200 мг/т) для сти¬
муляции роста и развития корневой системы,
увеличения ассимиляционной поверхности
листьев, повышения солеустойчивости. Рас¬
ход рабочего раствора — 10 л/тКратковременное погружение мест спаек
привоя и подвоя для улучшения срастания
(0,5—1,0 мл/л)Кратковременное погружение «пяток» од¬
ревесневших черенков подвоя для повыше¬
ния выхода стандартных подвоев (15 мл/л)Опрыскивание кроны деревьев в период
массового цветения (2—8 г/га) для повыше¬
ния завязываемости плодов, уменьшения их
осыпания, увеличения размера плодов и уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
400—1000 л/гаОпрыскивание посевов в середине фазы
трубкования 0,7—1 %-м раствором препарата
(1,5—2,1 л/га) для предотвращения полегания.
Расход рабочего раствора— 150—300 л/гаОпрыскивание растений при наличии 10 —
20 % побуревших плодов 0,45—0,67 %-м рас¬
твором препарата (2,7—4 л/га) для повыше¬
ния дружности созревания. Расход рабочего
раствора — 600 л/гаОпрыскивание растений в фазе 2—3 листь¬
ев 0,07—0,09 %-м раствором препарата (0,3—
0,36 л/га) для ускорения начала плодоноше¬
ния, повышения урожайности. Расход рабо¬
чего раствора — 400 л/га683
Продолжение прилож.N9п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения502-ХЭФК,50 %-й в. р. +
ТУР, 60 %-ный
в. р. (2-хЛорэ-
тилфосфоновая
кислота + хлор-
холинхлорид)Лук репча¬
тыйЛук репча¬
тый (семенни¬
ки)КартофельХризантемакорейскаяПшеницаозимаяРожь озимаяЯблони по-
луслаборос-
лых отзывчи¬
вых сортовЯблони
зимних сортовОпрыскивание растений в конце вегета¬
ции при наличии 15—20% усохшего пера
0,16 %-м раствором препарата (330 мл/га)
для сокращения потерь от прорастания и бо¬
лезней при хранении. Расход рабочего рас¬
твора — 200 л/га. Реализация продукции раз¬
решается через 5 месяцев после обработкиОпрыскивание растений в фазе массового
отрастания листьев и наличия 30—35 % цве¬
тоносов 0,16 %-м раствором препарата
(1,25 л/га) для повышения устойчивости к
полеганию, урожайности семян. Расход ра¬
бочего раствора — 800 л/гаОпрыскивание клубней перед закладкой
на хранение 1 %-м раствором препарата
(20 мл/т) для сокращения потерь от прорас¬
тания и болезней при хранении. Расход рабо¬
чего раствора — 2 л/т. Реализация продук¬
ции разрешается через 5 месяцев после обра¬
ботки2-кратное опрыскивание растений 0,2 %-м
раствором препарата (1 мл/м2) для снижения
высоты, замедления цветения. Расход рабо¬
чего раствора —0,5 л/мОпрыскивание растений в период от нача¬
ла до середины тру(бкования (0,5 л/га + 5 л/га)
для предотвращения полегания (на высоких
фонах удобрений 1 л/га + 3 л/га). Расход ра¬
бочего раствора при наземной обработке —
150—300 л/га, авиаобработке — 25— 50 л/гаОпрыскивание растений в фазе трубкова-
ния (0,75—1 л/га + 3—3,5 л/га) для предот¬
вращения полеганияОбработка кроны (3—5-й год после посад¬
ки) через 20—25 дней после цветения
(0,15 л/га + 5,4 л/га) для стимуляции заклад¬
ки плодовых почек, ограничения вегетатив¬
ного роста побегов. Расход рабочего раство¬
ра — 600 л/га2-кратная обработка деревьев (3—5-й год
после посадки): через 20 дней после цветения
и повторно через 10 дней после первой обра¬
ботки (0,19 л/га+3,67 л/га)684
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬
вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения51Циркон,0,01 %-й р. (гид-
роксикоричные
кислоты
(смесь))КартофельПерец, бак¬
лажан откры¬
того грунтаТомат от¬
крытого грун¬
таОгурец от¬
крытого фун¬
таПшеницаозимаяРоза, саку¬
ра, туя запад¬
наяХризанте¬
мы, гелениумГладиолусыЯблоняОпрыскивание в фазы полных всходов и в
начале бутонизации (10 мл/га) с целью усиле¬
ния процессов роста и развития, снижения
поражения ризоктониозом, фитофторозом и
паршой обыкновенной на вегетирующих
растениях и клубнях, повышения урожайно¬
сти. Расход рабочего раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка семян в течение
1 ч (10 мп/кг) с целью повышения энергии
прорастания, всхожести, усиления ростовых
процессов, повышения урожайности. Расход
рабочего раствора — 2 л/кгПредпосевная обработка семян в течение
1 ч (6 мл/кг) для повышения всхожести, уси¬
ления ростовых процессов, повышения уро¬
жайности. Расход рабочего раствора —
1,5 л/кгПредпосевная обработка семян в течение
1 ч (12,5 мл/кг) для повышения всхожести,
усиления ростовых процессов, повышения
урожайности. Расход рабочего раство¬
ра —1,5 л/кгПредпосевная обработка семян (2 мл/т)
для повышения полевой всхожести, сниже¬
ния пораженности бурой ржавчиной и муч¬
нистой росой, повышения урожайности.
Расход рабочего раствора — 10 л/тЗамачивание черенков в течение 14 ч
(1 мл/500 шт.) для ускорения появления кал¬
луса и корней, увеличения их количества,
стимуляции прироста их наземной части.
Расход рабочего раствора — 1 л/500 шт.Опрыскивание вегетирующих растений
перед формированием бутонов (30 мл/га) для
ускорения цветения. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/гаЗамачивание клубнелуковиц на 20—22 ч
перед посадкой (1 мл/кг) для ускорения цве¬
тения. Расход рабочего раствора — 1 л/кгОпрыскивание 0,01 %-м раствором в фазе
бутонизации (80 мл/га) для повышения уро¬
жайности и снижения поражаемости паршой
обыкновенной на вегетирующих растениях и
плодах. Расход рабочего раствора — 800 л/га685
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения52Черказ, 96 %
кр. п. (этилси-
латран)ЗемляникаСмородиначернаяПустырниксердечный,змееголовникмолдавскийВалерианалекарственнаяНаперстян¬
ка шерстистаяПшеница
яровая и ози¬
маяЯблоняОпрыскивание 0,01 %-м раствором в фазе
бутонизации (30 мл/га) для повышения уро¬
жайности и снижения поражаемости плодов
серой гнилью и листьев бурой пятнистостью.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,01 %-м раствором в фазе
бутонизации (30 мл/га) для повышения уро¬
жайности и снижения поражаемости плодов
серой гнилью и листьев бурой пятнистостью.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,012 %-м раствором в на¬
чале вегетации растений и через 7—8 дней
(35 мл/га) для повышения ростостимули¬
рующей, антистрессовой активности и уро¬
жайности. Расход рабочего раствора — 300—
400 л/гаЗамачивание семян на 4 ч (0,02 мл/кг) для
повышения энергии прорастания и всхоже¬
сти семян. Расход рабочего раствора — 1 л/кгОпрыскивание 0,01 %-м раствором расте¬
ний в фазе 2—4 листьев и повторно через
7—10 дней (30 мл/га) для стимулирования
роста и развития, повышения урожайности.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание 0,012 %-м раствором веге¬
тирующих растений в начале отрастания
культуры и повторно через 7—10 дней
(35 мл/га) для стимулирования роста и раз¬
вития растений, повышения урожайности и
устойчивости к возбудителям септориоза.
Расход рабочего раствора — 300 л/гаПредпосевная обработка семян 0,0075 %-м
раствором препарата (0,75 г/т) для увеличе¬
ния полевой всхожести, количества продук¬
тивных стеблей, массы зерен. Расход рабоче¬
го раствора — 10 л/тОпрыскивание через месяц после цветения
и за 2 недели до съема плодов 0,0075 %-м рас¬
твором препарата (30 г/га) для улучшения
биохимического состава плодов и их вкусо¬
вых качеств, увеличения выхода стандартной
продукции. Расход рабочего раствора —
400 л/га
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияТо жеКартофель53Экост, 1/3
99,3 %-й р. п.
(кремния-диок-
сид + микро¬
элементы)Ячмень
Лен-долгунецЛук-чер-
нушка, капус¬
та белокочан¬
ная, лук на
репкуКартофельХлопчатник54Эль-1,0,12 %-й р(арахидоноваякислота)КартофельОпрыскивание плодов перед закладкой на
хранение (0,75 г/т) для повышения выхода и
сроков лежкости при хранении, устойчиво¬
сти к. заболеваниям. Расход рабочего раство¬
ра — 30 л/тОбработка клубней перед посадкой
(0,75 г/т) для увеличения выхода стандарт¬
ных клубней, устойчивости к заболеваниям,
снижения содержания нитратов. Расход ра¬
бочего раствора — 10 л/т. Опрыскивание
растений в фазе бутонизации и за 2 недели до
уборки (22,5 г/га), расход рабочего раствора
300 л/га. Опрыскивание клубней перед за¬
кладкой на хранение 0,0075 %-м раствором
препарата (0,75 г/т). Расход рабочего раство¬
ра — 10 л/тПредпосевная обработка семян не позднее
чем за неделю до посева (400 г/г) для повы¬
шения полевой всхожести, урожайности и
качества продукции, устойчивости к болез¬
ням. Расход рабочего раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян и луковиц
(1 кг/т) для повышения полевой всхожести,
урожайности и качества продукции, устой¬
чивости к болезнямОбработка клубней перед посадкой (100 г/т)
для повышения урожайности и качества про¬
дукции, снижения клубневой инфекции и
поражения болезнями в период вегетации.
Расход рабочего раствора — 30 л/тПредпосевная обработка семян не ранее
чем за 3 года и не позднее чем за неделю до
посева (5 кг/т) для повышения полевой всхо¬
жести, урожайности и качества продукции,
снижения семенной инфекции и поражения
болезнями в период вегетации. Расход рабо¬
чего раствора — 10 л/тОбработка клубней перед посадкой
(1,4 мл/т) для регуляции ростовой и анти¬
стрессовой активности, повышения устой¬
чивости к болезням, расход рабочего рас¬
твора 10 л/т. Опрыскивание в фазе бутони¬
зации (0,03 мл/л) для повышения устойчи¬
вости к болезням. Расход рабочего раство¬
ра — 300 л/га687
Продолжение прилож.N9п/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияТоматПодсолнеч¬никПшеницаозимая55Эмистим,
в. р. (гриба сим-
бионтного
Acremonium
Iichenicola про¬
дукты метабо¬
лизма)РисСвекла сто¬
ловаяСвекла са¬
харнаяСвекла кор¬
моваяКартофельХлопчатникЗамачивание семян перед посевом на 3—6	ч (1 мл/кг) для регуляции ростовой и анти¬
стрессовой активности, повышения устой¬
чивости к болезням, расход рабочего раство¬
ра — 2 л/кг, а также опрыскивание в фазу
цветения первой кисти (0,03 мл/л). Расход
рабочего раствора — 300 л/гаИнкрустация семян (0,05 мл/л) для регуля¬
ции ростовой и антистрессовой активности,
повышения устойчивости к болезням, расход
рабочего раствора — 10 л/т, а также опры¬
скивание в фазу 3—6 листьев (10 мл/га). Рас¬
ход рабочего раствора — 300 л/гаОпрыскивание в фазу кущения и выхода в
трубку (0,03 мл/л) для регуляции ростовой и
антистрессовой активности, повышения ус¬
тойчивости к болезням. Расход рабочего рас¬
твора — 300 л/гаИнкрустация семян (0,1 мл/л) для регуля¬
ции ростовой антистрессовой активности,
повышения устойчивости к болезням. Расход
рабочего раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (0,01 мл/т)
для повышения полевой всхожести и уро¬
жайности, содержания сахара и витаминов.
Расход рабочего раствора — 30 л/тПредпосевная обработка семян (0,3 мл/т)
для повышения полевой всхожести и уро¬
жайности, содержания сахара и витаминов.
Расход рабочего раствора — 30 л/тПредпосевная обработка семян (0,03 мл/т)
для повышения полевой всхожести и уро¬
жайности, содержания сахара и витаминов.
Расход рабочего раствора — 30 л/тОбработка клубней перед посадкой (1 мл/т
+ 2 г медного купороса) для повышения уро¬
жайности, снижения содержания нитратов.
Расход рабочего раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (10—
30 мл/т + 20 г медного купороса) для повы¬
шения полевой всхожести и урожайности.
Расход рабочего раствора — 200—400 л/т688
Продолжение прилож.№п/пНазвание и дейст¬
вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения56Эпин-экстра,
0,0025 %-й р.
(эпибрассино-
лид)КартофельРастения
картофеля in
vitroТомат от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаПредпосевная обработка клубней (20 мл/т)
для улучшения клубнеобразования, повыше¬
ния урожая и пищевой (питательной) ценно¬
сти клубней, стимулирования иммунной
системы, повышения устойчивости к фитоф-
торозу, снижения аккумуляции нитратов, со¬
лей тяжелых металлов и радионуклидов. Рас¬
ход рабочего раствора — 5 л/тОпрыскивание в фазе бутонизации
(80 мл/га) для улучшения клубнеобразова-
ния, повышения урожая и пищевой (пита¬
тельной) ценности клубней, стимулирования
иммунной системы, повышения устойчиво¬
сти к фитофторозу, снижения аккумуляции
нитратов, солей тяжелых металлов и радио¬
нуклидов. Расход рабочего раствора —
300 л/гаДобавление к стандартной питательной
среде Мурасиге—Скуга при оздоровлении от
вирусной инфекции и микроклональном
размножении (1 мл/л питательной смеси) для
сокращения периода роста, увеличения чис¬
ла междоузлий, стимуляции развития корне¬
вой системы, увеличения количества расте¬
ний, пригодных к черенкованиюДополнительная обработка растений в
фазе бутонизации (0,008 мл/л воды) для уве¬
личения урожая и количества клубней, повы¬
шения устойчивости к фитофторозу. Расход
рабочего раствора — 3 л/100 мЗамачивание семян (0,5 мл/кг) на 2 ч для
повышения энергии прорастания и всхоже¬
сти, усиления защитных свойств к неблаго¬
приятным условиям внешней среды. Расход
рабочего раствора — 2 л/кгДополнительная обработка 0,035 %-м
раствором в фазе бутонизации — начала
цветения 1-й кисти (100 мл/га) для увеличе¬
ния количества завязей, предотвращения их
опадения, ускорения созревания плодов и
улучшения их качества, повышения устой¬
чивости к заболеваниям, фунгипротектор-
ного действия, снижения аккумуляции ра¬
дионуклидов, нитратов, солей тяжелых ме¬
таллов. Расход рабочего раствора — 300—
400 л/га689
Продолжение прилож.Noп/пНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время примененияОгурец от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаПерец за¬
щищенного
фунтаЯблоняГрибы ве¬
шенкиЗамачивание семян (0,25 мл/кг) на 2 ч для
повышения энергии прорастания и всхоже¬
сти, усиления защитных свойств к неблаго¬
приятным условиям внешней среды. Расход
рабочего раствора — 1 л/кгДополнительное опрыскивание в фазе 2—3
настоящих листьев и повторно в фазе буто¬
низации (100 мл/га) для ускорения образова¬
ния и предотвращения опадения завязей, по¬
вышения раннего и общего урожая, стимули¬
рования иммунной системы, повышения ус¬
тойчивости к пероноспорозу, снижения
содержания нитратов и накопления тяжелых
металлов. Расход рабочего раствора — 300—
400 л/гаЗамачивание семян (0,1 мл/кг) на 2 ч для
повышения энергии прорастания и всхоже¬
сти, усиления защитных свойств к неблаго¬
приятным условиям внешней среды. Расход
рабочего раствора — 2 л/кгДополнительное опрыскивание 0,017 %-м
раствором (50 мл/га) в начале бутонизации и
повторно в фазе цветения для ускорения об¬
разования завязей и предотвращения их опа¬
дения, повышения урожая, стимулирования
иммунной системы, снижения содержания
радионуклидов и накопления солей тяжелых
металлов. Расход рабочего раствора — 300—
400 л/гаОпрыскивание по розовому бутону
0,04 %-м раствором (200 мл/га) и повторно
после цветения с интервалом 20 дней для сти¬
мулирования образования завязей, предот¬
вращения их опадения, повышения урожая
и засухоустойчивости, стимулирования им¬
мунной системы, повышения устойчивости
к парше обыкновенной, снижения содер¬
жания радионуклидов и накопления тяже¬
лых металлов. Расход рабочего раствора —
500 л/гаОбработка зернового мицелия (0,002 мл/1,2	кг мицелия) с целью стимуляции плодо-
образования, повышения урожая. Расход ра¬
бочего раствора — 100 мл/1,2 кг мицелия690
Продолжение прилож.№ri/nНазвание и дейст¬вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения57Этамон,5	%-й в. р. (ам¬
моний диме-
тил-фос форно-
кислый)Грибы шам¬
пиньоныПустырниксердечный,змееголовникмолдавскийСвекла са¬
харнаяСвекла сто¬
ловаяОгурец (в
условиях ма¬
лообъемной
гидропоникиТомат, пе¬
рец сладкий,
баклажан (в
условиях ма-
лообъемной
гидропоники)Огурец от¬
крытого и за¬
щищенного
грунтаОпрыскивание в период плодообразова-
ния (0,005 мл/м2) с целью стимуляции плодо-
образования, повышения урожая. Расход ра¬
бочего раствора — 0,25 мл/м2Внесение с поливом в фазе начала плодо-
образования перед каждой волной плодоно¬
шения (0,005 мл/м2) с целью стимуляции
плодообразования. Расход рабочего раство¬
ра—0,8--1 л/м2Опрыскивание 0,017 %-м раствором
(50 мл/га) в фазе 2—3 листьев и повторно че¬
рез 6—7 дней с целью стимуляции ростовых
процессов и повышения урожайности. Рас¬
ход рабочего раствора— 300л/гаПредпосевная обработка семян (10 мл/т)
для повышения урожайности, сахаристости.
Расход рабочего раствора — 10 л/тПредпосевная обработка семян (0,01 мл/кг)
для повышения урожайности и содержания
сахара, витамина С. Расход рабочего раство¬
ра — 1 л/кгВнесение в почву вместе с капельным по¬
ливом: первое — после высадки рассады,
второе — в фазе начала плодоношения (SO¬
SO мл/га) с целью улучшения приживаемости
рассады, повышения урожайности. Расход
рабочего раствора — 3000 л/гаОпрыскивание растений после высадки
рассады в грунт, в период массового цвете¬
ния и через 7—10 дней после второй обработ¬
ки (100 мл/га) с целью улучшения приживае¬
мости рассады, повышения урожайности.
Расход рабочего раствора — 400—600 л/га691
Окончание прилож.№п/пНазвание и дейст¬
вующее веществоКультураСпособ, цель и время применения58Янтарная ки¬
слота, 85 %-й
кр. п.(этан-1,2-ди-
карбоновая ки¬
слота)СахарнаясвеклаВиноградЗемляникаВишня,
алыча, череш¬
ня, абрикосОбработка семян перед посевом 0,5 %-м
раствором препарата (250 г/т) для повыше¬
ния энергии прорастания, всхожести и уро¬
жайности. Расход рабочего раствора — 50 л/тОпрыскивание растений в фазе цветения
0,008 %-м раствором препарата (80 г/га) для
снижения осыпания завязи, ускорения сро¬
ков созревания и повышения урожайности.
Расход рабочего раствора — 1000 л/гаОпрыскивание растений в фазе цветения
0,0075 %-м раствором препарата (30 г/га) для
ускорения сроков созревания и повышения
урожайности ягод. Расход рабочего раство¬
ра — 400 л/гаОпрыскивание растений в фазе цветения
0,0025 %-м раствором препарата (30 г/га) для
ускорения сроков созревания, повышения
урожайности и содержания сахаров в плодах.
Расход рабочего раствора — 1200 л/гаУсловные обозначеният. п. — текучая паста;кр. п.— кристаллический порошок;в. р.— водный раствор;р. п.— растворимый порошок;ж.—жидкость;к. э.— концентрат эмульсии;
с. п.— смачивающийся порошок;
в. э.— водная эмульсия;в.	р. п.— водорастворимый порошок
СЛОВАРЬ ОСНОВНЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХТЕРМИНОВАДВЕНТИВНЫЕ ПОЧКИ (Adventive bud) — почки, возникшие из клеток
и тканей в растениях, обычно их не образующих.АКРОПЕТАЛЬНЫЙ ТРАНСПОРТ (Acropetal transport) — транспорт ве¬
ществ в растении снизу вверх по направлению к апикальным (верхушечным)
меристемам стебля.АЛЛЕЛИ (Alleles) — гены, занимающие одинаковые места в гомологич¬
ных молекулах ДНК и выполняющие сходные функции.АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ (Allosteric enzymes) - ферменты,
изменяющие свою активность в результате присоединения к их регуляторно¬
му (аллостерическому) центру вещества-эффектора.АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ (Aminoacyl-tRNA synthetase activating
enzymes) — ферменты, осуществляющие ковалентное присоединение амино¬
кислот к 2'- или З'-ОН концам тРНК.АМПЛИФИКАЦИЯ (Amplification) — образование дополнительных ко¬
пий хромосомных последовательностей ДНК.АНАЭРОБНОЕ БРОЖЕНИЕ (Anaerobic fermentation) — процесс разло¬
жения субстрата анаэробными микроорганизмами (не нуждающимися
для нормальной жизнедеятельности в наличии кислорода).АНДРОГЕНЕЗ (Androgenesis) — процесс возникновения растения из
микроспоры или пыльцевого зерна через соматический эмбриогенез либо че¬
рез образование каллуса.АНЕУПЛОИД (Aneuploid) — ядро, клетка, организм с числом хромосом,
отклоняющимся от нормального кариотипа (X) или от чисел, кратных X.АНТИГЕНЫ (Antigens) — белки, индуцирующие образование в иммун¬
ной системе антитела, способного к специфическому взаимодействию с ним.АНТИСТРЕССОВЫЕ ПРЕПАРАТЫ (Antistress preparations) — препара¬
ты, повышающие устойчивость растения к стрессовым факторам. Как прави-693
ло, их действие связано с активацией синтеза организмом антистрессовых
белков.АНТИСЫВОРОТКА (Antiserum) — сыворотка иммунизированного жи¬
вотного (человека), содержащая антитела против чужеродных белков и дру¬
гих агентов.АНТИТЕЛА (Antibodies) — белки, вырабатываемые иммунной системой,
блокирующие действие чужеродных патогенных агентов, в том числе белко¬
вой природы.АПИКАЛЬНОЕ ДОМИНИРОВАНИЕ (Apical domination) - явление по¬
давления роста боковых почек побега фитогормонами.АР-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ (AR-endonucleases) — ферменты, разрезающие
ДНК в апуриновых или апиримидиновых участках.АТТРАГИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ (Attractive ability) — способность
активировать усиленный транспорт продуктов фотосинтеза и метаболизма к
органам с наибольшей концентрацией фитогормонов-стимуляторов (аукси¬
ны, гиббереллины, цитокинины, брассиностероиды) и увеличивающие рост
органов и накопление веществ в запас.АУКСОТРОФНЫЕ МУТАНТЫ (Auxotrophic mutants) — мутантные
штаммы микроорганизмов, не способные к синтезу определенных фермен¬
тов.АУТОСОМЫ (Autosomes) — набор хромосом генома, не включающий по¬
ловые хромосомы (обозначаются цифрами: 1, 2, 3 и т.д.).БАЗИПЕТАЛЬНЫЙ ТРАНСПОРТ (Basipetal transport) — транспорт ве¬
ществ в растении сверху вниз по направлению к основанию стебля и апикаль¬
ным меристемам корня.БАКТЕРИОФАГИ (ФАГИ) (Bacteriophages (phages)) — вирусы, инфици¬
рующие бактерии.БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА (БТШ) (Heat-acute proteins) — антистрес¬
совые белки, вырабатываемые организмом в ответ на сверхоптимальное по¬
вышение температуры.БЕЛКОВО-ВИТАМИННАЯ ПАСТА (Protein-vitamin paste) — белковый
коагулят, образующийся в процессе ферментации и осаждения растительно¬
го сока.БЕЛКОВО-ВИТАМИННЫЙ КОНЦЕНТРАТ (БВК) (Protein- vitamin
concentrate (-PVQ) — белковый концентрат из кормовых дрожжей, выращи-
ваемых на углеводородных источниках углерода.БЕССМЫСЛЕННЫЙ КОДОН (Nonsense codon) — один из трех трипле¬
тов, UAG, UAA, UGA, вызывающих терминацию синтеза белка (UAG извес¬694
тен как amber-кодон,UAA — как осИге-кодон, UGA —как ора1-кодон), а
также терминацию трансляции.БИБЛИОТЕКА ГЕНОМА (Genome library) — набор клонированных
фрагментов ДНК, содержащий весь геном.БИОБЕЗОПАСНОСТЬ (Biosafety) — защищенность человека, общества,
цивилизации и окружающей среды от вредного воздействия токсических и
аллергенных биологических веществ и соединений, содержащихся в природ¬
ных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и
полученных из них продуктах.БИОГАЗ (Biogas, biofuel) — биологический газ, образующийся в резуль¬
тате анаэробного брожения органического субстрата, состоит в основном из
метана (до 60 %), углекислого газа (35—40 %) и незначительного количества
других газов: сероводород, водород (до 2 %).БИОГЕНЕЗ (Biogenesis) — образование органических соединений живы¬
ми организмами.БИОКОНВЕРСИЯ (Bioconvertion) — получение биогаза (метана) из ор¬
ганических отходов — навоза и других методом их сбраживания.БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ ЦЕННОСТЬ БЕЛКОВ (Biological
nutritious value of proteins) — показатель, выражающий сбалансированность
белка по содержанию незаменимых аминокислот.БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЗА ПОСЕВАМИ {Crop biological
monitoring) — система мониторинга показателей биологических процессов у
растений в онтогенезе, коррелирующих с ходом формирования урожая посе¬
вами в конкретных условиях выращивания.БИОМАССА (Biomass) — общая масса особей одного вида, группы видов
или сообщества в целом на единицу поверхности или объема местообитания.БИОТЕХНОЛОГИЯ КЛАССИЧЕСКАЯ (Classic or traditional
biotechnology) — наука о методах и технологиях производства, хранения и пе¬
реработки сельскохозяйственной и другой продукции с использованием
обычных, нетрансгенных растений, животных, микроорганизмов и продук¬
тов их жизнедеятельности в природных (естественных) и искусственных ус¬
ловиях.БИОТЕХНОЛОГИЯ НОВЕЙШАЯ (Modern biotechnology) — наука о ген¬
но-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использова¬
ния генетически трансформированных (модифицированных) растений, жи¬
вотных, микроорганизмов и вирусов в целях интенсификации производства
и получения новых видов продуктов различного назначения.695
БИОФИЛЬТР (Biofilter) — сооружение для биологической очистки сточ¬
ных вод. Представляет собой круглый или прямоугольный резервуар с двой¬
ным дном, наполненный фильтрующими материалами.БИОХИМИЯ (Biochemistry) — наука о биологических веществах и соеди¬
нениях, входящих в состав организмов, их структуре, взаимодействии, рас¬
пределении, превращениях и функциях, а также о химических процессах, ле¬
жащих в основе жизнедеятельности организмов.БИОЦЕНОЗ (Biocoenosis, plant association) — совокупность растений, жи¬
вотных и микроорганизмов, населяющих данный участок суши, воздуха или
водоема и характеризующихся определенными отношениями между собой и
приспособленностью к условиям окружающей среды.БИОЭНЕРГЕТИКА (Bioenergy) — раздел науки о закономерностях нако¬
пления и преобразования энергии в процессах жизнедеятельности организ¬
мов.БЛАСТУЛА (Blastula) — вторая, после морулы, стадия развития эмбрио¬
на, содержащая полость (бластоцель).БЛОК ПРИБНОВА (Pribnow’s block) — каноническая последователь¬
ность нуклеотидов TATAATG, находящаяся на расстоянии около 10 п. н. пе¬
ред стартовой точкой транскрипции бактериальных генов. Представляет со¬
бой часть промотора, отвечающую за связывание РНК-полимеразы.БЛОТТИНГ ДНК ПО САУЗЕРНУ (Southern blotting) — процедура пере¬
носа денатурированной ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный
фильтр для гибридизации с комплементарными нуклеотидными последова¬
тельностями.БЛОТТИНГ РНК (Blotting RNA, northern blotting) — перенос РНК из ага¬
розного геля на нитроцеллюлозный фильтр для последующей гибридизации
с комплементарной ДНК.БРЕШЬ (ПРОБЕЛ ДИЛЕЦИЯ) В ДНК (Gap) — отсутствие одного или
нескольких нуклеотидов в цепи ДНК.ВЕДУЩАЯ ЦЕПЬ (Leading chain) — цепь ДНК, синтезирующаяся в
5'— З'-направлении.ВЕКТОР (Vector) — самореплицирующаяся (автономная) молекула ДНК,
используемая в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в
организм-реципиент, а также для клонирования нуклеотидных последова¬
тельностей.ВЕРТИКАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ (Vertical genes transfer) - перенос
генетической информации от клетки или организма к потомству при помощи
обычных генетических механизмов.696
ВТОРИЧНЫЙ ПОСРЕДНИК (Secondary mediator) — физиологически
активное регуляторное вещество, специфически стимулирующее активность
протеинкиназ-ферментов, переносящих остаток фосфорной кислоты на дру¬
гие белки, что приводит к изменению их конформации и биологической ак¬
тивности.ВЫПУСК ГМР В ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ (GMP release into
environment) — разрешенный в правовом отношении перенос генетически
модифицированных организмов за пределы научно-исследовательской ла¬
боратории.ВЫСОКОЛИЗИНОВЫЕ ГЕНОТИПЫ РАСТЕНИЙ (High lysine genotypes
of plants) — генотипы растений с повышенным содержанием в белках незаме¬
нимой аминокислоты лизина.ГАЗГОЛЬДЕР (Gas holder) — стационарное, стальное сооружение для
приема, хранения и выдачи газа в разделительные газопроводы или установ¬
ки по его переработке или применению.ГАПЛОИД (Haploid) — ядро, клетка, организм, характеризующиеся оди¬
нарным (половинным) набором хромосом от свойственного виду их количе¬
ства (символ п).ГЕН (Gene) — элементарная единица наследственного вещества и ин¬
формации; локализированный участок хромосомы (локус), содержащий
ДНК и обусловливающий передачу наследственной информации от клетки к
клетке и ее реализацию путем синтеза информационной, матричной и рибо-
сомальной РНК; участок хромосомы (молекулы ДНК), кодирующий струк¬
туру одной или нескольких полипептидных цепей, или молекул РНК, или
определенную регуляторную функцию (см. АЛЛЕЛИ).ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД (ГК) (Genetic code, GQ — система записи наслед¬
ственной информации в виде последовательности нуклеотидов в молекулах
нуклеиновых кислот. Единицей ГК служит кодон, или триплет (тринуклео-
тид). ГК определяет порядок включения аминокислот в синтезирующуюся
полипептидную цепь.ГЕНЕТИЧЕСКИЙ РИСК (Genetic risk) — возможность проявления не¬
предсказуемых, опасных для здоровья и жизни человека и для окружающей
среды наследственных изменений генома и качества организмов.ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (Geneengineering) — совокупность приемов, ме¬
тодов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных ри¬
бонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению единич¬
ных или нескольких генов из организма, осуществлению манипуляций с ге¬
нами и введению их в другие организмы.697
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ (Genetic engineering) — совокупность
приемов, методов и технологий, используемых для перенесения в реципи- g
ентную клетку и организм генетических структур от единичного гена до локу- 1
сов ДНК, хромосом, ядер клеток и всего генома.	щГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ (Gene-engineering activity) - j
деятельность ученых, специалистов, научных организаций и государствен-Я
ных органов, направленная на получение, испытание, транспортировку и ис- Щ
пользование генетически модифицированных организмов (ГМО) и получен- 1
ных из них продуктов.	1ГЕНОМ (Genome) — совокупность генов, содержащихся в гаплоидном |
(одинарном) наборе хромосом данного организма; гаплоидный набор хромо- а
сом с локализованными в нем генами. В более широком понимании это сово- J
купность ядерных элементов генетической конституции организма. )
ГЕНОТЕРАПИЯ (Gene therapy) — лечение наследственных болезней при ;
помощи введенных в геном реципиента чужеродных генов.	]ГЕНОТИП (Genotype) — конкретный набор генов особи.	|ГЕНОФОНД (Gene pool, genofond) — совокупность генов популяции. ;
ГЕТЕРОЗИС (Heterosis) — повышение уровня жизнеспособности особей
гибридов первого поколения в результате скрещивания исходных родитель¬
ских форм, отличающихся по ряду признаков и свойств.ГИНОГЕНЕЗ (Gynogenesis) — процесс регенерации растения из клеток
зародышевого мешка пестика.ГМО (GMO) - См. ТРАНСГЕННЫЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИ¬
ФИЦИРОВАННЫЕ ОРГАНИЗМЫ.ГМР (GMP) — генетически модифицированные растения.ГОЛЬДЖИ АППАРАТ (Golgiapparatus, Golgibody) — высокоспециализи¬
рованная мембранная структура клетки, локализованная у ее полюсов.ГОМОЗИГОТНОСТЬ (Homozygosity) — отсутствие различий между
идентичными генами родителей.ГОНАДОТРОПНЫЕ ГОРМОНЫ (Gonadothropic hormones) — гормоны,
регулирующие секрецию половых гормонов яичника.ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ (Horizontalgene transfer) - ме-
ханизм передачи генов между одновременно существующими организмами.ГОРМОНАЛЬНАЯ СИСТЕМА РАСТЕНИЙ (Hormone system of
plants) — комплекс фитогормонов, их рецепторов и вторичных посредников.ГОРМОНАЛЬНЫЙ СТАТУС (Hormone status) — набор, содержание,
структура, состояние и изменчивость гормонов в онтогенезе растений и жи¬
вотных, уровень и соотношение между ними в процессах образования, пере-698
движения, использования и инактивации в ответ на эндогенные и экзоген¬
ные воздействия.ГОРМОН-РЕЦЕПТОРНЫЙ КОМПЛЕКС (Hormone-receptor complex) —
соединение гормона и белкового рецептора, первый шаг в реализации дейст¬
вия фитогормона.ГОСУДАРСТВЕННОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ
ДЕЯТЕЛЬНОСТИ {State (official, governmental) regulation of gene-engineering
activities) — регулирование государственными органами в соответствии с за¬
конами и другими правовыми актами отношений между участниками ген-
но-инженерной деятельности в сфере разработки и использования трансген¬
ных технологий, организмов и продуктов их жизнедеятельности в целях эф¬
фективного природопользования, охраны окружающей среды и обеспечения
экологической безопасности.Д1ЩИФФЕРЕНЦИАЦИЯ (De-differentiation) — переход специализиро¬
ванных, неделящихся клеток к образованию недифференцированных деля¬
щихся каллусных клеток.ДЕСТРУКЦИЯ (Destruction) — разрушение вещества, сопровождаемое
потерей его физиологической активности.ДЕТЕРМИНАЦИЯ РАЗВИТИЯ (Determination of development) — приоб¬
ретение клеткой, тканью, органом или организмом состояния готовности к
развитию по определенной программе, сопровождающееся одновременным
ограничением возможностей развития в других направлениях. В период де¬
терминации создаются необходимые внутренние условия для последующей
морфологической реализации нового направления развития.ДИПЛОИД (Diploid) — ядро, клетка, организм, характеризующийся
двойным набором гомологичных хромосом, представленных числом, харак¬
терным для данного вида (символ 2 л).ДИПЛОИДИЗАЦИЯ (Diploidyzation) — превращение гаплоидного на¬
бора хромосом в диплоидный путем удвоения каждой хромосомы.ДИПЛОИДНЫЙ НАБОР ХРОМОСОМ {Diploid chmmosome number) -
два гаплоидных набора хромосом, содержащих хромосомы только одного
или обоих родителей.ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ (Differentiation) — комплекс процессов, приводя¬
щих к различиям между дочерними клетками, а также между материнскими и
дочерними клетками.ДНК (DNA) — молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты, состоящей
из нуклеотидов (аденин, гуанин, цитозин, тимин), дезоксирибозы и остатков
фосфорной кислоты.699
ЖЕЛТОЕ ТЕЛО (Yellow body) — железистая ткань, возникающая на месте
разорвавшегося фолликула при наступлении беременности.ЗАПАСНЫЕ БЕЛКИ СЕМЯН (Reserve proteins of seeds) — глобулины и
глютенины, первые — растворимые в жидкой фазе нейтральных солей и оса¬
ждающиеся полунасыщенным раствором сульфата аммония; вторые — рас¬
творимые в слабых растворах кислот и щелочей.ЗАТРАВКА (Primer) — короткая последовательность нуклеотидов, ком^
плементарно взаимодействующая с одной из нитей ДНК; образует свобод¬
ный 3-ОН-конец, используя который ДНК-полимераза начинает синтез де*
зоксирибонуклеотидной нити.ЗИГОТА (Zygote) — оплодотворенная яйцеклетка.ИНВЕРТИРОВАННЫЕ ПОВТОРЫ (Inverted repeats, IR) - две копии
одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находя¬
щиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инверти¬
рованные повторы образуют палиндром.ИНТРОН (Intron) — «молчащий», транскрибируемый участок гена, не
содержащий кодонов и удаляющийся из молекулы РНК при ее процессинге.КАЛЪМОДУЛИН (Calmodulin) — вторичный посредник гормонов расте¬
ний и животных. После присоединения двух ионов кальция из него выделя¬
ется активная субъединица, активирующая определенные протеинкиназы.КАРИОТИП (Karyotype) — внешний вид — количество и морфология га¬
плоидного набора хромосом клетки организма.КЛЕТКИ-МИШЕНИ (Cells-targets) — клетки, имеющие рецепторы того
или иного фитогормона и изменяющие метаболизм при изменении концен¬
трации фитогормона.КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ (Cellselection) — метод выделения мутантных
и сомаклональных вариаций клеток с помощью селективных факторов.КЛОН (Clone) — большое число клеток или молекул, идентичных одной
родоначальной клетке или молекуле.КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ (Clonal micropropaga- tion) -
получение in vitro соматическим (неполовым) путем растений, генетически
идентичных исходному растению.КЛОНИРОВАНИЕ ОРГАНИЗМОВ (Cloning of organisms) — получение
генетически идентичных популяций организмов.КОДОН (Codon, triplet, coding triplet) — триплет нуклеотидов, кодирую¬
щий образование определенной аминокислоты и соответствующий терми¬
нирующему сигналу; единица генетической структуры (гена), кодирующая
положение одной аминокислоты в молекуле белка.700
КОМПЛЕМЕНТАРНАЯ ЦЕПЬ (НИТЬ) (Complementary strand) — одна из
цепей ДНК, используемая в качестве матрицы для синтеза РНК и соответст¬
вующая ей по взаимодействию пар нуклеотидов.КОМПЕТЕНЦИЯ (Competence) — способность клетки, ткани, органа,
организма воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реаги¬
ровать на него изменением развития.КОРМОВОЙ КОНЦЕНТРАТ ЛИЗИНА (ККЛ) {Fodder (feed) concentrate of
lysine) — промышленный кормовой препарат, обогащенный незаменимой
аминокислотой лизином (до 10%).КОРМОВОЙ КОНЦЕНТРАТ ТРИПТОФАНА (ККТ) (Fodder (feed)
concentrate of tryptophane) — промышленный кормовой препарат, обогащен¬
ный триптофаном (до 3 %).КОРМОВЫЕ ВИТАМИННЫЕ ПРЕПАРАТЫ (Feed vitamin
preparations) — промышленные кормовые препараты, обогащенные витами¬
нами.КОРМОВЫЕ ДРОЖЖИ (Feed yeasts) — отсел вотированные штаммы
дрожжей, используемые для промышленного получения кормовых белков.КОЭФФИЦИЕНТ СЕДИМЕНТАЦИИ (Sedimentation coefficient) - пока¬
затель скорости движения частицы при центрифугировании на единицу цен¬
тробежной силы. Коэффициент выражается в единицах Сверберга (S), рав¬
ных 10"13 с.ЛАКТОГЛОБУЛИН (Lactoglobulin) — один из белков молока.ЛИГИРОВАНИЕ (Ligation) — образование фосфодиэфирной связи меж¬
ду двумя основаниями одной цепи ДНК, разделенными разрывом. Этот тер¬
мин употребляют также в случае соединения тупых концов участков молеку¬
лы ДНК и при образовании связи в РНК.ЛИПКИЙ КОНЕЦ (Stricky end) — свободный одноцепочечный конец
двуцепочечной ДНК, комплементарный одноцепочечному концу.ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩИЙ ГОРМОН (Luteinizinghormone, LH) - гормон
передней доли гипофиза, вызывающий овуляцию.МАРКЕР (ДНК) (Marker) — фрагмент ДНК известного размера, исполь¬
зуемый для калибровки фрагментов в электрофоретическом геле.МАРКЕРНЫЙ ГЕН (Markergene) — ген, идентифицированный по месту
расположения и имеющий четкое фенотипическое проявление.МАРКИРОВКА ПРОДУКТОВ ИЗ ГМО (Labelling of GMOproducts) - на¬
несение специальных меток-обозначений (символов) на упаковке товаров и
продуктов, полученных с использованием ГМО и продуктов их переработки
при реализации.701
МЕЙОЗ (Meiosis) — процесс деления, происходящий в развивающихся
половых клетках и приводящий к редукции числа хромосом и к рекомбинат
ции генов.МЕРИСТЕМА (Meristem) — образовательные ткани с активно делящи¬
мися клетками.МЕТАБОЛИЗМ (Metabolism) — промежуточный обмен, т. е. превраще¬
ние веществ внутри клеток с момента их поступления до образования конеч¬
ных продуктов.МЕТАН (Methan) — болотный или рудничный газ (СН4) — простейший
насыщенный углеводород. Газ без цвета и запаха.МЕТАНТЕНК (Methan tank) — резервуар для получения биогаза (метана)
из навоза и других органических отходов и их обеззараживания с помощью
бактерий и других микроорганизмов без доступа воздуха.МИТОЗ (Mitosis) — деление эукариотической соматической клетки.МИТОХОНДРИИ (Mitochondria) — клеточные органеллы, имеющие
форму нитей, палочек, шариков или чечевичек. Они обладают мощным фер¬
ментативным аппаратом, в них осуществляются основные процессы дыха¬
тельного метаболизма.МИХАЭЛИСА КОНСТАНТА (Michaelis* constant) Кт — количественная
характеристика кинетики ферментативной реакции; равна концентрации
субстрата, при которой достигается половина максимальной скорости реак¬
ции.МОНОЗИГОТИЧЕСКИЕ БЛИЗНЕЦЫ (Monozygotic twins) - близнецы,
развивающиеся из одной зиготы в результате ее разделения на две равные или
неравные части.МОРУЛА(Моги1а) — эмбрион начальной стадии развития, образующий¬
ся в результате дробления зиготы.МОРФОГЕНЕЗ (Morphogenesis) — процесс формирования, роста и раз¬
вития органов (органогенез), тканей (гистогенез) и клеток (цитогенез, или
клеточная дифференцировка).МУТАГЕНЫ (Mutagenes) — факторы, увеличивающие частоту возник¬
новения мутаций, вызывая изменения в ДНК.МУТАЦИЯ (Mutation) — спонтанное или индуцйрованное изменение
гена, последовательности нуклеотидов хромосомы, генома, приводящее к
изменению тех или иных признаков.НЕЗАМЕНИМЫЕ АМИНОКИСЛОТЫ (Essential amino acids) - амино¬
кислоты, которые не синтезируются в организме человека и животных.
702
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (Nucleic acids) — это наиболее высокомо¬
лекулярные природные соединения (полимеры), состоящие из остатков раз¬
личных нуклеотидов. Существует два типа нуклеиновых кислот: РНК, ДНК.ОВУЛЯЦИЯ (Ovulation) — высвобождение созревающей яйцеклетки из
фолликулы яичника.ОМОЛОЖЕНИЕ (Rejuvenation) — усиление жизнедеятельности, связан-/ное с интенсификацией синтеза белков и нуклеиновых кислот, активацией
роста и клеточных делений, возникновением и накоплением эмбриональных
тканей и общим усилением генетических, физиологических и биохимиче¬
ских функций.ОПАСНОСТЬ (Danger) — незащищенность или слабая защищенность
человека, общества, природы и цивилизации от разрушительных факторов.ОПЕРОН (Орегоп) — единица генетической экспрессии, в состав кото¬
рой входят один или несколько связанных между собой структурных генов, а
также промоторный, операторный и другие регуляторные участки, контро¬
лирующие транскрипцию оперона.ОРГАНОГЕНЕЗ (Organogenesis) — процесс возникновения и развития в
неорганизованно растущей массе каллусных клеток зачатков органов листь¬
ев, стеблей, корней, побегов и других органов.ОТРИЦАТЕЛЬНАЯ СУПЕРСПИРАЛИЗАЦИЯ (Negative supercoi- ling) -
введение в двуцепочечную ковалентно замкнутую ДНК супервитков, направ¬
ление которых противоположно направлению витков цепей молекулы.ОЦЕНКА РИСКА (Evaluation of risk, risk evaluation) — определение степе¬
ни опасности последействия факторов на безопасность человека, других ор¬
ганизмов и природу.ПАРТЕНОГЕНЕЗ (Parthenogenesis) — развитие особи с участием только
материнских генов.ПЛАВЛЕНИЕ ДНК (DNA melting) — денатурация ДНК.ПЛАЗМИДА (Plasmid) — кольцевая одноцепочечная ДНК, способная к
автономной репликации.ПОЛЕВЫЕ ИСПЫТАНИЯ (Field tests) — проведение экспериментов в
полевых условиях.ПОЛИАДЕНИЛИРОВАНИЕ (Polyadenilation) — присоединение после¬
довательности полиаденилиновой кислоты к 3-концу эукариотической РНК
после завершения ее синтеза.ПОЛИПЛОИД (Polyploid) — ядро, клетка, организм, характеризующие¬
ся умноженным основным числом хромосом (символы ЗХ, 4Х и т.д.).703
ПОЛОВАЯ ОХОТА (Sexual heat) — природный рефлекс, вызванный био¬
логическим влечением к спариванию у самки животных.ПОЛОВОЙ ПРОЦЕСС (Sexualprocess) — слияние мужской (спермий) и
женской (яйцеклетка) половых клеток, в ходе которого образуется диплоид¬
ная клетка (зигота) и определяется пол будущей особи.ПОЛОВОЙ ЦИКЛ У ЖИВОТНЫХ (Sexual cycle for animals) - интервал
времени от одной половой охоты до другой.ПОЛОВЫЕ ХРОМОСОМЫ (Sexualchromosomes) — хромосомы, опреде¬
ляющие пол особи (обозначаются буквами: X, Y, W, Z и т.д.).ПРОДУКЦИОННЫЙ ПРОЦЕСС (Production process) — сумма всех од¬
новременно протекающих в растении физиологических, биохимических,
биофизических и других процессов метаболизма, обеспечивающих форми¬
рование хозяйственно-ценных органов и признаков растения, продуктов
вторичного обмена на основе генетического контроля и донорно-акцептор-
ных отношений.ПРОЛИФЕРАЦИЯ (Proliferation) — новообразование клеток и тканей
путем размножения.ПРОМОТОР (Promotor) — участок гена, ответственный за начало его
транскрипции.ПРОНУКЛЕУС (Pronucleus) — ядро (мужское, женское) оплодотворен¬
ной яйцеклетки.ПРОТОННАЯ ПОМПА (Proton pump) — белки, переносящие протоны
через клеточные мембраны.ПРОТОПЛАСТ (Protoplast) — содержимое растительной клетки, лишен¬
ной клеточной стенки при помощи ферментативного разрушения или меха¬
ническим способом.ПРОФАГ (Prophage) — фаговый геном, интегрированный в бактериаль¬
ную хромосому.ПСИХРОФИЛЫ, МЕЗОФИЛЫ И ТЕРМОФИЛЫ (Psichrophils,
mesophils, thermophils) — организмы, нормально существующие и размно¬
жающиеся соответственно при относительно низких (не выше 10 °С), сред¬
них (20—40 °С) и выше 45 °С температурах.РАЗВИЛКИ ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ФИТОГОРМОНОВ (Phyto¬
hormones biosynthesis routes) — путь ферментативного биосинтеза фитогормо¬
на из общего для нескольких фитогормонов предшественника, определяе¬
мый генетическим контролем и комплексом внешних условий.РАЗРЫВ В ДУПЛЕКСЕ ДНК (DNA duplex break) — отсутствие фосфоди-
эфирной связи между двумя соседними нуклеотидами в одной из цепей дву¬
цепочечной ДНК.704
РЕ(ДУ)ПЛИКАЦИЯ ДНК (DNA re(du)plication) — самоудвоение молеку¬
лы ДНК путем образования ее копии при помощи набора ферментов
(ДНК-полимераз, лигаз и др.).РЕЖИМЫ СБРАЖИВАНИЯ (Fermentation regimes) — (психрофильный,
мезофильный и термофильный) температурные режимы, обеспечивающие
наиболее благоприятные условия для жизнедеятельности соответственно
психрофильных, мезофильных и термофильных микроорганизмов.РЕКОМБИНАНТНЫЙ ГЕН (Recombinant gene) — ген, состоящий из
компонентов различных генов.РЕКОМБИНАЦИЯ (Recombination) — перераспределение генетического
материала родителей, приводящее к наследственной комбинативной измен¬
чивости.РЕПРЕССОР (Repressor) — вещество, образуемое геном-регулятором и
способное само по себе либо совместно с корепрессором репрессировать
структурные гены соответствующего оперона.РЕТИКУЛУМ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ (ЭНДОПЛАЗМА-
ТИЧЕСКАЯ СЕТЬ) (Endoplasmic reticulum) — система мелких трубчатых или
пузыревидных плазматических образований (диаметром 70—150 ммк), окру¬
женных непрерывной мембраной и гомогенным бесструктурным содержи¬
мым (цитоплазматическим матриксом). В большинстве клеток эти элементы
составляют единую сеть, связанную с другими компонентами клеток.РИБОСОМЫ (Ribosomes, Palades*granules) — плотные сферические ци¬
топлазматические гранулы диаметром около 150—350 А, являющиеся глобу¬
лярными молекулами рибонуклеопротеида и участвующие в синтезе белка.
Относятся к базофильной части плазмы и локализованы на поверхности эн-
доплазматической сети или свободно лежат в цитоплазме. Рибосомы содер¬
жат 80—90 % всей РНК клетки.' РИСК (РАДИАЦИОННЫЙ, ГЕНЕТИЧЕСКИЙ) (Risk — radiatio- nal,
genetic) — вероятность отдаленных последствий воздействия на организм ра¬
диационных излучений, генетических модификаций и др.РНК (RNA) — молекула рибонуклеиновой кислоты, в состав которой
входят нуклеотиды (аденин, гуанин, цитозин, урацил), рибоза, остатки фос¬
форной кислоты.САМКА-ДОНОР (Female-donor) — донор яйцеклеток или эмбрионов —
самка в начальной стадии беременности, из половых путей которой извлека¬
ют яйцеклетки (эмбрионы).САМКА-РЕЦИПИЕНТ (Female-recipient) — самка, в половые пути кото¬
рой вводят яйцеклетки (эмбрионы) для дальнейшего вынашивания (синони¬
мы: приемная мать, ложнобеременная самка).705
СЕПТИК (Septic) — сооружение для очистки небольших количеств (до
50 м3/сут) сточных вод или навозных стоков.СЖК (Pregnant mare's serum gonadotropin) — гонадотропин сыворотки же¬
ребой кобылы.СИНЕРГИЗМ (Synergism) — эффект взаимоусиления действия веществ,
процессов и других факторов.СИНХРОНИЗАЦИЯ ОХОТЫ (Sexual heat synchronization) — искусствен¬
но вызванная одновременная половая охота у группы животных.СИСТЕМА ОТКРЫТАЯ (Open system) — система, обменивающаяся с
внешней средой веществом и энергией.СИСТЕМА ЗАКРЫТАЯ (Closed system) — система, обменивающаяся с
внешней средой только энергией и не обменивающаяся веществом.СИСТЕМА ЗАМКНУТАЯ (Reversedsystem) — система, не обменивающая¬
ся с внешней средой ни веществом, ни энергией.СИСТЕМА САМООРГАНИЗУЮЩАЯСЯ (НЕРАВНОВЕСНАЯ, ДИС¬
СИПАТИВНАЯ) (Self-organizing (disequilibrated) system) — система, способная
самопроизвольно потреблять из внешней среды свободную энергию, за счет
этого поддерживать стабильный гомеостатический уровень своих параметров
(температура, концентрация веществ и др.) в меняющихся условиях внешней
среды. Все живые организмы и их сообщества являются самоорганизующими¬
ся и саморегулирующимися системами.СИСТЕМА НЕСАМООРГАНИЗУЮЩАЯСЯ (РАВНОВЕСНАЯ, КОС¬
НАЯ) (Non-self-organizing (equilibrated, inflexible) system) — система, у которой
показатели (параметры) — температура, концентрация и другие самопроиз¬
вольно, на основе законов диффузии, выравниваются с таковыми внешней
среды. Содержащаяся в равновесной системе свободная энергия самопроиз¬
вольно уменьшается, а энтропия растет.СИСТЕМА ТЕРМОДИНАМИЧЕСКАЯ (Thermodinamic system)- ком¬
плекс взаимно связанных элементов, способных поглощать, преобразовы¬
вать, накапливать и использовать энергию.СОМАКЛОНЫ (Somaclones) — растения, полученные из любых форм
вегетативных культивируемых клеток.СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ (Somaclonal variabi- lity) -
размах колебаний и различия признаков у растений, регенерировавших из
культивируемых клеток.СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ (Somatic hybridization) - процесс
получения гибридных клеточных линий путем слияния изолированных про¬
топластов.706
СОМАТИЧЕСКИЙ ГИБРИД (Somatic hybrid) — растение, полученное
путем гибридизации соматических клеток.СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ (Somatic embryogenesis) — процесс
образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) в культуре сомати¬
ческих клеток и тканей.СТАНДАРТНЫЕ ТЕМПЕРАТУРА И ДАВЛЕНИЕ (Standard temperature
and pressure) — О °C и 760 мм рт. ст.СТРЕССОВЫЕ БЕЛКИ (Stress proteins) — белки, синтезируемые орга¬
низмом в неблагоприятных условиях и обеспечивающие снижение вредонос¬
ного на них воздействия этих условий существования.СУБЪЕДИНИЦЫ (Sub-units) — белковые глобулы, из которых форми¬
руются молекулы белков (четвертичная структура).СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ (Sub-cultivation) — перенос трансплантов
(инокулюма) в другой культуральный сосуд на свежую питательную среду.СУСПЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА (Suspensium culture) — выращивание
отдельных клеток или небольших их групп во взвешенном состоянии в жид¬
кой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и пе¬
ремешивание.СУПЕРОВУЛЯЦИЯ (Superovulation) — вызываемая гормонами, множе¬
ственная овуляция у самок.ТЕЛАССЕМИЯ (ГАдЛше/яш) — наследственное заболевание крови, обу¬
словленное изменением экспрессии гена белковой части гемоглобина эрит¬
роцитов.ТЕХНОЛОГИЯ ГЛУБИННОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ (Deep fermentation
technology) — процесс с использованием микроорганизмов в жидкой пита¬
тельной среде для получения продуктов брожения.ТЕХНОЛОГИЯ ТВЕРДОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ (Solid phase
fermentation technology) — процесс использования микроорганизмов на твер¬
дой питательной среде для получения продуктов брожения.ТОТИПОТЕНТНОСТЬ (Totipotensy) — свойство соматических клеток
растений полностью реализовывать свою программу онтогенетического раз¬
вития при определенных условиях выращивания вплоть до образования
взрослых растений и семян.ТРАНСГЕНОЗ (Transgenesis) — перенос донорских, чужеродных генов в
клетки реципиентных растений, животных и микроорганизмов.ТРАНСГЕННЫЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ОРГА¬
НИЗМЫ (ГМО) (Transgenic, genetic modified organisms (GMO)) — растения,
животные, микроорганизмы и вирусы с измененной наследственностью, вы¬707
званной включением в их геном чужеродных генов при помощи генно-инже-
нерных методов.ТРАНСЛЯЦИЯ (Translation) — синтез белка на рибосомах при участии
информационной, транспортной РНК и других факторов.ТРАНСКРИПЦИЯ (Transcription) — образование матричной РНК-ко-
пии ДНК с помощью фермента РНК-полимеразы.ТРАНСПЛАНТ (ИНОКУЛЮМ) (Transplant (Inoculum)) — часть каллус¬
ной (суспензионной) культуры, используемой для пересадки на свежую пи¬
тательную среду.ФАКТОР(Ы) СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ (Blood clotting factors), blood
coagulation factor(s)) — белковые факторы, обусловливающие свертывание
крови при повреждении сосудов.УМЕНЬШЕНИЕ РИСКА (Decrease of risk) — обеспечение снижения
опасности отрицательного воздействия на человека и природу генетических,
техногенных и других факторов.ФЕНОТИП (Phenotype) — набор признаков организмов, определяемых
генотипом и условиями внешней среды.ФЕРМЕНТИРОВАННЫЙ СОК (Fermentedjuice) — жидкий раствор, об¬
разующийся в процессе ферментации растительного сока.ФИТОАЛЕКСИНЫ (Phytoalexins) — компоненты системы устойчивости
(«иммунитета») растений к болезням, замедляющие развитие патогена.ФИТОРЕГУЛЯТОРЫ (Phytoregulators) — природные и синтетические
препараты, вызывающие ростовые или формативные эффекты и не обладаю¬
щие действием удобрений и гербицидов.ФОЛЛИКУЛ (Follicle) — полость в яичнике, в которой происходит раз¬
витие и созревание женской половой клетки.ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩИЙ ГОРМОН (Follicle-stimu- lation
hormone, FSH) — гормон передней доли гипофиза, вызывающий рост фолли¬
кулов яичника и секрецию эстрогенов.ХГ (XG) — хорионический гонадотропин человека, вызывающий овуля¬
цию у животных.ХЛОРОПЛАСТЫ (Chloroplasts) — хлорофилосодержащие пластиды, ор-
ганеллы протопласта растительной клетки, состоящие из гран и тилакоидов,
образующих ^амеллу.ХРОМОСОМЫ (Chromosomes) — структурные элементы ядра клетки,
содержащие ДНК, в которой заключена наследственная информация орга¬
низма, и гистоновые белки хроматина, в котором упакованы молекулы Д Н К.ЭКСПЛАНТ (Explant) — фрагмент ткани или органа, инкубируемый на
питательной среде самостоятельно или используемый для получения первич¬
ного каллуса.708
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА (Gene expression) — функциональное проявление
генетической информации, записанной в гене, в форме рибонуклеиновой
кислоты, белка и фенотипического признака.ЭЛЕКТРОПОРАЦИЯ (Electroporation) — метод переноса генов в клетки с
помощью электрического разряда, вызывающего образование пор в клеточ¬
ной мембране.ЭЛЕКТРОФОРЕЗ (Electrophoresis) — движение частиц (ионов, заряжен¬
ных или амфотерных молекул) в электрическом поле. На основе электрофо¬
реза разработаны методы разделения веществ, отличающихся своей подвиж¬
ностью в электрическом поле.ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ПОДВИЖНОСТЬ (Electrophoretic mobility) -
скорость движения частиц в электрическом поле в расчете на единицу потен¬
циала. На различиях электрофоретической подвижности веществ основано
их разделение при электрофорезе.ЭНТРОПИЯ (Entropy) — величина, характеризующая качество энергии,
ее работоспособность. Чем выше энтропия, тем ниже работоспособность
этого вида энергии. Применительно к тепловой энергии энтропию называют
приведенной теплотой. Она равна отношению количества теплоты к темпе¬
ратуре, при которой эта теплота находится (содержится в системе или тепло¬
носителе).ЭКСЕРГИЯ (Exergie) — часть общей энергии данного вида, которая по¬
тенциально может быть превращена данным видом преобразователя в необ¬
ходимый другой вид энергии.ЮВЕНИЛЬНАЯ ФАЗА РАЗВИТИЯ (Juvenile stage of develop- ment) — пе¬
риод заложения, роста и развития вегетативных органов от прорастания се¬
мени или вегетативной почки до начала образования репродуктивных орга¬
нов.АТГ-САЙТЫ (Att sites) — участки фаговой и бактериальной хромосом,
рекомбинация между которыми приводит к интеграции или исключению
фага.СААТ (SAAT) — участок консервативной последовательности, располо¬
женной примерно на расстоянии 75 пар оснований перед стартовой точкой в
транскрипционных единицах эукариот.G-БЕЛКИ (G-proteins) — регуляторные белки, активирующие фермент,
синтезирующий вторичный посредник.IN VITRO — выращивание живого материала «в стекле», на искусствен¬
ных питательных средах в стерильных условиях.IN VIVO — выращивание живого материала в естественных условиях.LD50 — смертельная концентрация вещества (фактора), вызывающая ги¬
бель 50 % опытных животных.
Учебное изданиеШевелуха Виктор Степанович, Калашникова Елена Анатольевна,
Воронин Евгений Сергеевич, Ковалев Владимир Михайлович,
Ковалев Александр Андреевич, Кочиева Елена Зауровна,
Новиков Николай Николаевич, Проворов Николай Александрович,
Прокофьев Михаил Иванович, Пронина Наталья Борисовна,
Свенпщкий Иван Осипович, Тихонов Игорь Владимирович,
Тихонович Игорь АнатольевичСЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯРедактор Т. С. Костян
Внешнее оформление К. И. Мандель
Технический редактор ЛА. Маркова
Компьютерная верстка ЕЖ Есакова
Корректоры Е.И. Борисова, Т.Д. ВавиловаИзд. № РЕНТ-458. Подп. в печать 17.12.07. Формат 60x88Vi6*
Бум. офсетная. Гарнитура «Ньютон». Печать офсетная.Объем 43,61 уел. печ. л., 44,35 уел. кр.-отг.Тираж 3000 экз. Заказ № 4266.ОАО «Издательство «Высшая школа»,127994, Москва, Неглинная ул., 29/14, стр. 1.Тел.: (495) 694-04-56
http://www.vshkola.ru. E-mail: info__vshkola@mail.ruОтдел реализации: (495) 694-07-69, 694-31-47, факс: (495) 694-34-86
E-mail: sales__vshkola@mail.ruОтпечатано в ОАО «Ивановская областная типография».
153008, г. Иваново, ул. Типографская, 6.E-mail: 091-018@rambler.ru
Издательство «Высшая школа»
предлагает следующие книги:Биологая: В 2 кн.: Учебник/В.Н. Ярыгин, В.И. Васильева, И.Н. Вол¬
ков и др.; Под ред. В.Н. Я р ы г и н а. — 8-е изд., стер. — 2007.В учебнике освещены основные свойства жизни и эволюционные
процессы на молекулярно-генетическом и онтогенетическом уровнях орга¬
низации. Изложены особенности проявления общебиологических законо¬
мерностей в онтогенезе и популяциях людей, их значение для медицин¬
ской практики. Уделено внимание биосоциальной сущности человека и
его роли во взаимосвязях с природой. Отражены современные достижения
биологической науки, играющие большую роль в практическом здраво¬
охранении.Для студентов медицинских вузов.Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений: Учеб¬
ник. — 2-е изд., перераб. — 2007.С учетом последних достижений российской и зарубежной науки в
учебнике рассмотрены вопросы физиологии клетки, фотосинтеза, водного
обмена, дыхания, минерального питания, роста и развития растений, их
устойчивости к неблагоприятным абиотическим факторам. Специальный
раздел посвящен молекулярным основам физиологических процессов. В
отличие от существующих учебников большое внимание уделено влиянию
экологических факторов на растительный организм, вопросам адаптации и
регуляции растений. В качестве примеров рассмотрены представители не
только умеренной, но тропической и субтропической флоры.Для студентов агрономических специальностей: агрономов, почвоведов,
агрохимиков, защитников растений, а также для лесоводов, ботаников, эко¬
логов, зоологов, учителей биологии, фармацевтов.Лысов П.К., Акифьев А.П., Д о б р о т и н а Н. А. Биология с
основами экологаи: Учебник. — 2007.Творческий союз морфолога, генетика и эколога позволил создать ин¬
тересную, самобытную книгу, выгодно отличающуюся от ряда действую¬
щих учебников. Главная цель, которую преследовали авторы, — сформи¬
ровать у читателей основы биологического мышления, способствующего
повышению качества жизни, гармоничным взаимоотношениям людей с
природой и между собой.Для студентов естественнонаучных, технических и гуманитарных на¬
правлений и специальностей вузов.
Сидоренко В.М. Молекулярная спектроскопия биологических
сред: Учебник. — 2004.В книге рассмотрены основные экспериментальные методы и техни¬
ческие средства проведения спектральных исследований биологических
сред с учетом их специфики как предмета исследования; вопросы совре¬
менного состояния и использования методов молекулярной спектроско¬
пии в биологии, медицине и экологии; новые направления и методы моле¬
кулярной спектроскопии биологических сред; общий подход к спектраль¬
ным исследованиям биологических сред, позволяющий извлекать инфор¬
мацию о спектральных характеристиках молекул из наблюдаемых спектров
биологической среды.Для студентов вузов, обучающихся по специальностям «Биотехнические
и медицинские аппараты и системы», «Инженерное дело в медико-техниче-
ской практике», а также «Биомедицинская инженерия». Может быть поле¬
зен преподавателям и научно-инженерным работникам, изучающим методы
спектроскопии биологических объектов.Юсуфов А.Г., Магомедов М.А. История и методоология био¬
логии: Учеб. пособие. — 2003.В книге показан путь развития основных идей и концепций о живой
природе в общечеловеческом масштабе, последовательные этапы диффе¬
ренциации биологии, взаимосвязь развития разных областей естествозна¬
ния и биологии.Для студентов вузов, обучающихся по биологическим специальностям.Я б л о к о в А.В., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение: Учеб¬
ник. — 6-е изд., испр. — 2006.В учебнике отражены предмет и задачи теории эволюции, доказатель¬
ства и методы изучения эволюции, проблемы микро- и макроэволюции.
Настоящее издание дополнено сведениями по молекулярной биологии,
материалами о новых находках палеонтологов.Для студентов биологических специальностей вузов,Ярмоненко С.П., В а й н с о н А.А. Радиобиология человека и
животных: Учеб. пособие. — 4-е изд., перераб. и доп. — 2004.В книге изложены вопросы молекулярно-клеточной радиобиологии и
радиобиологии организма. Рассмотрены физические основы биологиче¬
ского действия ионизирующего излучения, теория и механизмы радиобио¬
логического эффекта, основные радиационные синдромы, непосредствен¬
ные (детерминированные) радиационные эффекты и отдаленные (стохас¬
тические) последствия облучения, противолучевая защита и лечение луче¬
вой болезни, а также радиобиологические основы лечебного применения
ионизирующего излучения. Книге переработана и дополнена новыми дан¬
ными. Особое внимание уделено вопросам радиационной безопасности и
научным принципам регламентации радиационного воздействия на чело¬
века с учетом мирового опыта изучения медицинских последствий рад стан¬
ционных аварий и возможностей их ослабления.Для студентов медицинских и биологичесвких специальностей вузов.