Автор: Васильев А.Н. Кучеренко Н.Е. Бабенюк Ю.Д.
Теги: биологические науки в целом общая биохимия химия биология биохимия
ISBN: 5-11-000336-Х
Год: 1988
Текст
БИО
И
Практикум
ВБК 28.072я73
Б63
УДК 571.1
Авторы: Н. Е. Кучеренко (руководитель авт. коллектива), Ю. Д. Ба-
бенюк, А. Н. Васильев, Р. П. Виноградова, В. М. Войцицкий, М. Д. Кур-
ский, А. Р. Литвииеико, Б. А. Цудзевич.
Рецензенты: д-р биол. наук, проф. Я. В. Белик, д-р биол. наук,
проф. С. С. Костышин
Кучеренко Н. Е. и др.
Биохимия: Практикум / Н. Е. Кучеренко, Ю. Д. Бабенюк, А. Н. Ва-
сильев и др.— К-: Выща шк. Изд-во при Киев, ун-те, 1988.— 128 с.:
ил. 39.
ISBN-5-11-000336-Х.
Практикум является частью учебного комплекса по курсу «Био-
химия». С учетом новейших достижений современной биохимии из-
ложены лабораторные методы количественного и качественного иссле-
дований белков, гормонов, витаминов, липидов и нуклеиновых кислот.
Представлены реакции обмена основных биохимических компонентов.
Для студентов вузов биологических, медицинских, ветеринарных
специальностей.
УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ
Кучеренко Николай Евдокимович
Бабенюк Юрий Демьянович
Васильев Александр Николаевич и др.
БИОХИМИЯ
ПРАКТИКУМ
Зав. редакцией Е. М. Миронец
Редактор С. А. Дячинская
Художник обложки И. Л. Щур
Художественный редактор В. М. Петраков
Технический редактор Т. М. Пихота
Корректор М. М. Янчицкая
ИВ № 12122
Сдано в набор 23.12.87. Подп. в печать 03.03.88. БФ 03037. Формат 60x90/16. Бумаг?
кн.-журн. Лит. гари. Выс. печ. Усл. печ. л. 8,0. Усл. кр.-отт. 8,38. Уч.-нзд. л. 8,51.
Тираж 15 000 экз. Изд. № 2521-к. Зак. № 237. Цена 35 к.
Издательство при Киевском государственном университете* 252001, Киев, Крещатик, 10
Отпечатано с матриц Головного предприятия республиканского производственного объ-
единения «Полиграфкнига», 252057, Киев, ул. Довженко. 3 иа Белоцерковской книжной
фабрике, 256400, г. Белая Церковь, ул. К. Маркса, 4
2001040000-074
М224(04)-88
КУ-М2-287-1988
ISBN-5-11-000336-Х
ББК 28.072я73
Б63
© Издательское объединение
«Выща школа», 1988
Б
ПРЕДИСЛОВИЕ
Практикум представляет собой часть учебно-методи-
ческого комплекса по биологической химии и является ру-
ководством к проведению лабораторных занятий для
студентов.
Основная цель настоящего практикума — закрепление
теоретических знаний путем формирования практических
навыков в области статической, динамической и функцио-
нальной биохимии. В процессе выполнения предлагаемых
работ студенты овладевают современными методами
экспериментальных исследований, умением анализировать
полученные результаты.
В практикум вошли наиболее типичные лабораторные
работы, представляющие основные разделы биохимии:
углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, белки, фермен-
ты, витамины и гормоны. В каждом разделе работы при-
ведены в порядке возрастания сложности с учетом приоб-
ретаемых в процессе получения знаний. Вначале изучают-
ся общие и специфические физико-химические свойства био-
химически активных веществ, затем методы выделения
из биологического материала и установления их функцио-
нальной роли.
Лабораторные работы содержат изложение принципа
метода с указанием структурных формул и реакций
взаимодействующих веществ, перечень основных матери-
алов, реактивов и оборудования, подробное описание хода
работы и ожидаемых результатов. Построение работ
позволяет проводить их без дополнительных указаний,
что особенно актуально в настоящее время в связи с необ-
ходимостью подготовки студентов к самостоятельно-
му решению научных проблем.
ГЛАВА 1
УГЛЕВОДЫ
1.1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ
1.1.1 Моносахариды
Моносахариды, благодаря наличию свободной кетонной или
альдегидной группировки, способны окисляться до соответствую-
щих кислот, одновременно восстанавливая соли металлов. Это свой-
ство используется для ряда качественных и количественных реак-
ций.
ГЕКСОЗЫ
1. Реакция Троммера
Принцип реакции. Растворы гексоз, например, глюкозы и фрук-
тозы в щелочной среде восстанавливают при нагревании оксид
меди (II) в гемиоксид меди, а сами окисляются до альдоновых кислот.
Эту реакцию для глюкозы в общем виде можно представить уравне-
ниями
,О
СН2ОН (СНОН). + 2CuSO4 + 5NaOH
\Н
.О
-> СН2ОН (СНОН)4 С< + 2CuOH + 2Na2SO4 + 2Н2О
\ONa
2CuOH -► Cu2O + Н2О
Материалы и реактивы. Раствор глюкозы (5 %-ный), 5 %-ный
раствор гидроксида натрия, 5 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, капельницы, штатив для пробирок, горелка.
Ход работы. В пробирку к 3 мл раствора глюкозы добавляют
растворы гидроксида натрия (1 мл) и сульфата меди (5 капель).
Выпадает осадок гидроксида меди (II), который при перемешивании
или встряхивании пробирки растворяется, и раствор приобретает
голубой цвет. При его осторожном нагревании в пламени горелки
до кипения наблюдается выпадение желтого осадка гидроксида
меди (I) или красного осадка гемиоксида меди.
2. Реакция Фелинга
Принцип реакции. В реактиве Фелинга ионы меди (II) находят-
ся в виде комплексного соединения с тартратами. Механизм реакции
гексоз (и всех редуцирующих углеводов) с реактивом Фелинга та-
4
кой же, как и в реакции Троммера. Преимуществом реактива Фе-
линга является то, что медь при избытке реактива не выпадает в
виде окиси меди (II). Дисахариды и полисахариды взаимодействуют
с реактивом Фелинга после кипячения с минеральными кислотами.
Материалы и реактивы. Раствор глюкозы (5 %-ный), реактив
Фелинга, который состоит из двух растворов. Для приготовления
первого раствора 200 г сегнетовой соли и 150 г гидроксида натрия
растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. Для
приготовления второго — 40 г перекристаллизованного сульфида
меди растворяют в дистиллированной воде до объема 1 л. Равные
объемы первого и второго растворов смешивают перед работой.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, штатив для пробирок, горелка.
Ход работы. В пробирку вносят 1 мл раствора глюкозы и 1 мл
реактива Фелинга. Смесь перемешивают и нагревают в пламени го-
релки до кипения. Наблюдают образование красного осадка геми-
оксида меди.
3. Реакция с солями висмута (реакция Ниландера)
Принцип реакции. В щелочной среде нитрат гидроксида висму-
та в присутствии гексоз восстанавливается до металлического вис-
мута. Эту реакцию для глюкозы можно представить в виде следу-
ющих уравнений:
Bi (ОН)2 NO3 + NaOH Bi (ОН)8 + NaNO3
ZO
ЗСН2ОН (СНОН)4 c<f + 2Bi (ОН)8
\н
/О
ЗСН2ОН (СНОН)4 С< + 2Bi + ЗН2О
\эн
Материалы и реактивы. Раствор глюкозы (5 %-ный), 5 %-ный
раствор гидроксида натрия, сухой порошок нитрата гидроксида
висмута.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, лопаточки (или
шпатель), штатив для пробирок, горелка, пипетки.
Ход работы. В пробирку к 3 мл раствора глюкозы добавляют
1 мл раствора гидроксида натрия и на кончике лопаточки или шпа-
теля нитрат гидроксида висмута. Смесь перемешивают и нагревают
осторожно в пламени горелки. Наблюдают образование черного
осадка металлического висмута.
4. Восстановление аммиачного раствора гидроксида серебра
глюкозой
Принцип реакции. Глюкоза восстанавливает аммиачный раствор
гидроксида серебра, образуемый при взаимодействии нитрата се-
ребра с гидроксидом натрия и водным раствором аммиака, до метал-
лического серебра
AgNO3 + 3NH4OH [Ag(NH3)2] ОН + NH4NO3 + 2Н2О
5
СН2ОН (СНОН)4 C<f + 2 [Ag (NH3)2] ОН -н
-н СН2ОН (СНОН)4 с/ + 2Ag + 3NH3 + Н2О
\onh4
Материалы и реактивы. Раствор нитрата серебра (5 %-ный),
5 %-ный раствор гидроксида натрия, 10 %-ный водный раствор
аммиака, 5 %-ный раствор глюкозы.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, горелка.
Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора нитрата се-
ребра, 1 мл раствора гидроксида натрия и по каплям водный рас-
твор аммиака до растворения образующегося серого осадка. Затем
к содержимому пробирки добавляют 3 мл раствора глюкозы, пере-
мешивают и осторожно нагревают в пламени горелки до появления
бурого окрашивания. Далее реакция идет без нагревания. Наблю-
дают выпадение металлического серебра в виде черного осадка или
его осаждение на стенках пробирки в виде блестящего зеркального
налета.
5. Реакция с уксуснокислой медью (реакция Барфеда)
Принцип реакции. Гексозы в реакции с ацетатом меди приводят
к образованию гемиоксида меди. Суммарное уравнение реакции для
глюкозы имеет вид
/°
СН2ОН (СНОН)4 С^ + 2Си (СН3СОО)2 + 2Н2О ->
\н
/О
-н СН2ОН (СНОН)4 С< + Си2О Ч- 4СН3СООН
юн
Эта реакция протекает в среде со значением pH, близким к ней-
тральному (7,0). В этих условиях редуцирующие дисахариды не
окисляются, что дает возможность отличить их от моносахаридов.
Материалы и реактивы. Раствор глюкозы (5 %-ный), реактив
Барфеда (13,3 г ацетата меди растворяют в 200 мл горячей воды,
t 70 °C. Смесь фильтруют и к фильтрату добавляют 1,9 мл ледяной
уксусной кислоты).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, горелка.
Ход работы. В пробирку вносят 1 мл раствора глюкозы и 1 мл
реактива Барфеда. Смесь перемешивают и осторожно нагревают
в пламени горелки до кипения. Наблюдают образование красного
осадка гемиоксида меди.
6. Реакция с феиилгидразином
Принцип реакции. Гексозы, взаимодействуя с феиилгидразином,
приводят к образованию гидразонов или озазонов. Гидразоны воз-
никают, если реакция протекает в спиртовых растворах без кислоты.
6
В случае реакции с глюкозой уравнение имеет вид
СН2ОН (СНОН)4 4- H»N—NH—СвН8
ХН
-> СН2ОН (CHOH)4CH=N—NH—СвН8 + Н2О
Если реакция протекает в водном растворе в присутствии кисло-
ты, то образуются озазоны
/О
с\
рн
Н—с—он
I
но—С—н
| + 2HaN—NH—СвН8 ->
Н—С—ОН
Н—С—он
СН2ОН
CH=N—NH—CeH8
I
c=o
НО—С—H
—► I 4" NH3 4- NH2CeH8 4- H2O
H—C—OH
H— C— OH
I
CH2OH
CH=N—NH—CeH8
C=O
I
но—с—H
| 4- HaN—NH—CeH8 ->
H—C—OH
H—C-OH
I
CH2OH
1
CH=N—NH—С„НВ
C=N—NH—CeH8
HO—C—H
i + H2o
H—C—OH
H—C—OH
CH2OH
В зависимости от участвующих в реакции с фенилгидразином
моносахаридов возникают различные озазоны, по структуре и фор-
ме кристаллов которых можно судить о том, из каких моносаха-
ридов они образовались.
Материалы и реактивы. Насыщенные растворы фенилгидрази-
на и ацетата натрия, 5 %-ный раствор глюкозы.
Оборудование. Стеклянные пипетки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, водяная баня, часы.
Ход работы. В пробирку вносят 5 мл раствора глюкозы, по 2 мл
насыщенных растворов фенилгидразина и ацетата натрия, затем
перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 30—40 мин.
После охлаждения наблюдают образование желтых кристаллов
озазона.
7. Реакция Селиванова на кетозы
Принцип реакции. При нагревании фруктозы или других кетоз
с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол. Уравнение ре-
акции для фруктозы имеет вид
Оксиметилфурфурол с резорцином образуют соединение (про-
дукт конденсации), окрашенное в вишнево-красный цвет.
Материалы и реактивы. Кристаллический резорцин, 5 %-ный
раствор фруктозы, 25 %-ный раствор соляной кислоты.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, штатив для пробирок, баня водяная, термометр лабора-
торный, лопаточка или шпатель, часы.
Ход работы. В пробирку помещают 5 мл раствора фруктозы,
1 мл раствора соляной кислоты и несколько кристаллов резорци-
на. Смесь нагревают на водяной бане в течение 5—10 мин при
t 80 °C до появления вишнево-красного цвета.
8
ПЕНТОЗЫ И ИХ СВОЙСТВА
1. Реакция с орцином (реакция Биаля) и флорглюцином
Принцип реакции. Пентозы под действием концентрированной
соляной кислоты при нагревании превращаются в фурфурол. Реак-
ция для рибозы имеет вид
он он нн
Фурфурол с орцином в присутствии следов хлорида железа
(III) образуют соединение (продукт конденсации), окрашенное в
зеленый цвет, а с флорглюцином — соединение вишнево-красного
цвета.
Материалы и реактивы. Концентрированная соляная кислота,
0,1 %-ный раствор рибозы, кристаллический орцин, 0,1 %-ный
раствор флорглюцина.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, водяная баня, часы.
Ход работы. В две пробирки вносят по 2 мл раствора рибозы.
В одну из них добавляют также 2 мл соляной кислоты и несколько
кристаллов орцина, а в другую — 3 мл раствора флорглюцина и пе-
ремешивают. Пробирку с орцином кипятят на водяной бане 6 мин,
а с флорглюцином — нагревают до кипения. Наблюдают образование
зеленого окрашивания в пробирке с орцином и вишнево-красного —
в пробирке с флорглюцином.
2. Реакция дезоксипентоз с дифениламином
Принцип реакции. При нагревании 2-дезоксипентоз в кислой
среде образуется фурфуроловый спирт, оксилевулиновый альдегид
и сходные хромогены, которые, конденсируясь с дифениламином,
образуют соединения, окрашенные в синий цвет.
Материалы и реактивы. Раствор (0,2 %-ный) дезоксирибозы,
1 %-ный раствор дифениламина.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки химические, пи-
петки, штатив для пробирок, водяная баня, часы.
Ход работы. В пробирку наливают 1 мл раствора дезоксирибозы
и 1 мл раствора дифениламина, перемешивают и кипятят 10 мин.
Наблюдают образование соединений, окрашенных в синий цвет.
3. Реакция Подобедова — Милыша с а-нафтолом и тимолом
Принцип реакции. При взаимодействии концентрированной сер-
ной или соляной кислот с пентозами (например, рибозой) происхо-
дит дегидратация пентоз и образование из них фурфурола (или ок-
симетилфурфурола). Эти соединения, вступая в реакцию с сс-нафто-
лом и тимолом, образуют продукты конденсации красного цвета.
9
Материалы и реактивы. Концентрированная серная кислота,
0,1 %-ный раствор рибозы, 1 %-ные спиртовые растворы а-нафтола
и тимола.
Оборудование. Пробирки, пипетки, штатив для пробирок.
Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл раствора рибозы.
В одну из них добавляют также 2 мл раствора а-нафтола, а в дру-
гую — 2 мл раствора тимола. Затем в обе пробирки осторожно по
стенке пробирок добавляют по 3 мл концентрированной серной кис-
лоты, которая опускается на дно пробирок. На дне или же на гра-
нице раздела жидкостей образуются красные или фиолетово-крас-
ные кольца.
1.1.2. Ди сахариды
Редуцирующие дисахариды (например, лактоза и мальтоза)
способны окисляться до соответствующих кислот, восстанавливать со-
ли металлов, участвуя в реакциях, характерных для моносахаридов.
Однако нередуцирующие дисахариды (например, сахарозы) в такие
реакции не вступают. Наиболее широко для обнаружения подоб-
ных дисахаридов используют методы, в основе которых лежит гид-
ролиз дисахаридов до моносахаридов с последующим обнаруже-
нием продуктов гидролиза — моносахаридов.
1. Восстанавливающая способность лактозы и мальтозы
Принцип реакции. Благодаря наличию свободной альдегидной
группы в молекуле лактозы (в остатке глюкозы) и мальтозы (у вто-
рого остатка глюкозы) эти дисахариды обладают редуцирующими
свойствами и способны участвовать в реакциях восстановления,
в частности, мальтоза и лактоза дают положительную реакцию
Троммера (см. раздел 1.1.1, гексозы, работа 1).
Материалы и реактивы. Растворы лактозы, мальтозы, гидрок-
сида натрия и сульфата меди (5 %-ные).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, горелка.
Ход работы. В одну пробирку наливают 2 мл раствора лактозы,
а в другую — 2 мл раствора мальтозы. В обе пробирки затем вно-
сят по 1 мл раствора гидроксида натрия и по 5 капель раствора суль-
фата меди. Пробирки осторожно нагревают в пламени горелки и
наблюдают образование красного осадка закиси меди.
2. Определение восстанавливающей способности у сахарозы
и гидролиз сахарозы
Принцип реакции. В молекуле сахарозы связь между остатками
клюкозы и фруктозы образуется за счет двух гликозидных гидро-
ксилов. Сахароза не обладает восстановительными свойствами и
дает отрицательную реакцию Троммера.
После гидролиза сахарозы (кипячение в присутствии концентри-
рованной соляной кислоты) образуются моносахариды, которые
можно обнаружить с помощью реакции Троммера, а фруктозу —
и по реакции Селиванова (раздел 1.1.1, гексозы, работы 1 и 7).
Материалы и реактивы. Концентрированная соляная кислота,
10
25 %-ный раствор соляной кислоты, 5 %-ные растворы сахарозы,
гидроксида натрия и сульфата меди, кристаллический резорцин.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, капельницы, штатив для пробирок, водяная баня, тер-
мометр лабораторный, часы.
Ход работы. В две пробирки наливают по 6 мл раствора саха-
розы. В одну из них добавляют также 2 капли концентрированной
соляной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане при t 100 °C
в течение 15 мин. Вторая пробирка содержит контрольный раствор
сахарозы. Затем берут еще две пробирки и в одну из них вносят
3 мл нейтрализованного гидролизата сахарозы, а в другую — 3 мл
контрольного раствора сахарозы. К содержимому этих пробирок
добавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия и по 5 капель рас-
твора сульфата меди. Затем нагревают на водяной бане до кипения
(проводят реакцию Троммера). Отмечают образование красного
осадка закиси меди в пробирке, содержащей гидролизат (положи-
тельная реакция Троммера) и отсутствие такового в контрольной
пробе (отрицательная реакция Троммера).
С оставшимися 3 мл гидролизата сахарозы и контрольного рас-
твора сахарозы проводят реакцию Селиванова на обнаружение фрук-
тозы. С этой целью в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора со-
ляной кислоты и несколько кристаллов резорцина. Содержимое
пробирок нагревают на водяной бане в течение 5—10 мин при
t 80 °C. В пробирке, содержащей гидролизат сахарозы, наблюдают
появление вишнево-красного окрашивания (положительная реак-
ция Селиванова) и отсутствие такого окрашивания в контрольной
пробе.
1.1.3. Полисахариды
Полисахариды отличаются друг от друга химической природой
повторяющихся моносахаридных единиц, степенью разветвления
и длиной цепи. Полисахариды не содержат свободных редуци-
рующих групп, поэтому они не обладают восстанавливающей спо-
собностью. Полный гидролиз полисахаридов в присутствии кис-
лот или специфических ферментов приводит к образованию моноса-
харидов, обладающих редуцирующими свойствами.
1. Реакция крахмала и гликогена с иодом
Принцип реакции. При взаимодействии крахмала и гликогена
с иодом образуются комплексные адсорбционные соединения, ок-
рашенные в реакции с крахмалом в синий цвет, а с гликогеном —
в красно-бурый цвет. Различие в цвете комплексов обусловлено
химической структурой крахмала и гликогена. При нагревании ок-
раска исчезает, но появляется опять при охлаждении, что свидетель-
ствует об образовании нестойких комплексов крахмала и гликогена
с иодом. Обесцвечивание происходит также при добавлении гидрок-
сида натрия или калия. Исчезновение окраски при нагревании и до-
бавлении щелочи обусловлено тем, что в образовании комплексов
принимает участие молекулярный иод, а не иодит-ионы.
И
Материалы и реактивы. Реактив Люголя (1 г иода и 2 г йодис-
того калия растворяют в 15 мл дистиллированной воды и затем раз-
водят водой до объема 300 мл), 0,1 %-ные растворы крахмала и
гликогена, 10 %-ный раствор гидроксида натрия.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, водяная баня.
Ход работы. В одну пробирку помещают 2 мл раствора крахмала,
в другую — 2 мл раствора гликогена. Затем в обе пробирки вносят
по 1—2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок перемеши-
вают и наблюдают образование синего окрашивания в пробирке о
крахмалом и красно-бурого — с гликогеном. Затем из каждой про-
бирки по 1 мл жидкостей переносят в две другие пробирки, куда до-
бавляют по 1 мл раствора гидроксида натрия. Наблюдают обесцве-
чивание в каждой пробирке. Смеси, оставшиеся в пробирках, где
первоначально возникла окраска, нагревают на водяной бане. На-
блюдают исчезновение окрашивания, которое вновь появляется при
охлаждении.
2. Гидролиз крахмала
Принцип реакции. При нагревании раствора крахмала с мине-
ральными кислотами происходит гидролиз крахмала с образо-
ванием глюкозы, которую можно обнаружить характерными
реакциями на моносахариды, в частности, реакцией Троммера
(раздел 1.1.1, гексозы, работа 1).
Материалы и реактивы. Концентрированная соляная кислота,
1 %-ный раствор крахмала, 15 %-ный раствор гидроксида натрия,
1 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, капельницы, штатив для пробирок, водяная баня, часы.
Ход работы. В две пробирки помещают по 5 мл раствора крах-
мала. В одну из них вносят также 2—3 капли концентрированной
соляной кислоты и кипятят на водяной бане 15 мин. Вторая пробир-
ка является контрольной. Затем в обе пробирки приливают по 2 мл
15 %-ного раствора гидроксида натрия, и по 5 капель раствора
сульфата меди и нагревают (проделывают реакцию Троммера).
В пробирке, где проводился гидролиз крахмала соляной кислотой
при нагревании, наблюдают образование красного осадка гемиок-
сида меди (реакция Троммера положительная), а в контрольной
пробирке такой осадок не образуется (реакция Троммера отрица-
тельная).
3. Гидролиз клетчатки
Принцип реакции. Гидролиз клетчатки минеральными кислота-
ми проходит значительно медленнее, чем крахмала. Если же клет-
чатку предварительно обработать 80 %-ным раствором серной кис-
лоты, то процесс гидролиза клетчатки значительно ускоряется.
Материалы и реактивы. Вата (источник клетчатки), 3 %-ный
и 80 %-ный растворы серной кислоты, реактив Фелинга и Барфеда
(см. раздел 1.1.1, гексозы, работа 2 и 5).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пи-
петки градуировочные, водяная баня, часы.
12
Ход работы. Небольшое количество ваты (100—200 мг) помещают
в пробирку, заливают 3 %-ным раствором серной кислоты и кипятят
на водяной бане 10 мин. После нейтрализации содержимое пробир-
ки разделяют на две части.
В другой пробирке то же количество ваты предварительно обра-
батывают небольшим количеством (примерно 0,5 мл) 80 %-ного
раствора серной кислоты до полного растворения, затем разбавляют
водой до объема 1 мл и кипятят на водяной бане в течение 5 мин.
После нейтрализации содержимое пробирки делят также на две
части.
С одной частью смесей, содержащих обработанную и необрабо-
танную вату, проводят реакцию Фелинга (добавляют по 1 мл рас-
твора Фелинга и после перемешивания нагревают до кипения), а с
другой частью этих смесей — реакцию Барфеда (добавляют по 1 мл
раствора Барфеда и после перемешивания нагревают до кипения).
В пробирках, где находилась необработанная серной кислотой
вата, наблюдается отсутствие осадка красного цвета (отрицатель-
ные реакции Фелинга и Барфеда).
В пробирках, содержащих предварительно обработанную вату,
возникает красный осадок гемиоксида меди (положительные реак-
ции Фелинга и Барфеда), что свидетельствует об образовании глю-
козы.
1.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
1. Микрохимическое определение углеводов
Принцип реакции. Молекулы углеводов окисляются периодат-
ионами с образованием муравьиной кислоты, которую оттитровы-
вают раствором щелочи. Уравнение реакции глюкозы с периодат-
ионом имеет вид
/О
СН2ОН (СНОН)4 C<f + 510? 5НСООН + НСНО + 5ЮГ
\н
Материалы и реактивы. Сухой порошок исследуемого углевода
(гексозы, кетозы, пентозы), раствор перйодата натрия (0,25 моль/л),
этиленгликоль, перегнанный над гидролизатом натрия, раствор гид-
роксида натрия (0,01 моль/л), 1 %-ный раствор метиленового крас-
ного.
Оборудование. Пипетки, пробирки с притертой пробкой, колбы
конические (объем 25 мл), бюретка, водяная баня, штатив для про-
бирок, часы.
Ход работы. В одну пробирку с притертой пробкой помещают
1—3 мг сухого исследуемого углевода, добавляют 3 мл дистилли-
рованной воды и, перемешивая, растворяют. Затем наливают рас-
твор перйодата натрия, и полученную смесь кипятят 20—40 мин
на водяной бане. После охлаждения в пробирку вносят 0,2 мл пе-
регнанного над гидроксидом натрия этиленгликоля для разложе-
ния избытка перйодата.
13
Содержимое пробирки переносят в колбу, смешав с 2-3 капля-
ми индикатора метиленового красного. Затем готовят контрольную
пробу без добавления углеводов. Полученные смеси (проба и кон-
троль) титруют 0,01 моль/л раствором гидроксида натрия до изме-
нения окраски раствора.
По результатам титрования определяют принадлежность угле-
вода к определенному классу. При окислении 1 моля сорбозы или
фруктозы, пентозы или метилпентозы, а также альдогексозы обра-
зуется 3, 4 и 5 молей муравьиной кислоты соответственно.
2. Количественное определение глюкозы с помощью глюко-
зооксидазы
Принцип метода. Метод основан на каталитическом действии
глюкозооксидазы, ускоряющей окисление глюкозы кислородом воз-
духа до глюконовой кислоты
свн12ов + О2 + Н2О
Глюкозооксидаза _ „
----------------- свн12о7 + Н2О2
Образующийся в эквимолярном количестве пероксид водорода
под действием пероксидазы разлагается, а выделившийся атомар-
ный кислород окисляет добавленный к реакционной смеси хромоген-
ный кислородный акцептор о-толидин с образованием окрашенного
в синий цвет соединения. Определив колориметрически экстинкцию
исследуемого раствора и раствора, содержащего известное количест-
во глюкозы (стандарта), рассчитывают концентрацию глюкозы
в исследуемой пробе.
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор глюкозы (20—
200 мкг/мл), стандартный раствор глюкозы (100 мкг/мл), рабочий
реактив (к 70—80 мл 0,25 моль/л ацетатного буфера (pH 4,8) при
перемешивании добавляют 2 мг препарата глюкозооксидазы, 1 мг
сухой кристаллической пероксидазы, 1 мл 1 %-ного раствора
о-толидина и разводят до объема 100 мл ацетатным буфером).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. В одну из пробирок вносят 1 мл исследуемого рас-
твора глюкозы, в другую — 1 мл стандартного раствора глюкозы,
а в третью — 1 мл дистиллированной воды. Затем в каждую пробир-
ку добавляют по 3 мл рабочего реактива и оставляют стоять при ком-
натной температуре в течение 10 мин. По истечении этого времени
проводят измерение экстинкции исследуемого и стандартного рас-
творов глюкозы на фотоэлектроколориметре при красном светофиль-
тре (620 нм), используя раствор реактивов (содержимое третьей про-
бирки).
Массовую концентрацию глюкозы (мкг/мл) рассчитывают по
формуле
С = С0Е1/Е2,
где и Е2 — экстинкция исследуемого и стандартного раствора
глюкозы соответственно после протекания реакции; Со — массовая
концентрация глюкозы в стандартном растворе.
14
Этот метод может быть использован для определения содержа-
ния гликогена или крахмала. В этом случае данные полисахариды
подвергаются кислотному или ферментативному гидролизу до пол-
ного их превращения в глюкозу. Для определения содержания глю-
козы берут 1 мл нейтрализованного гидролизата с массовой кон-
центрацией глюкозы не более 200 мкг/мл.
3. Количественное определение глюкозы с помощью антро-
нового реактива
Принцип метода. Гексозы, дегидрируясь в присутствии концен-
трированной серной кислоты при нагревании, образуют производ-
ные фурфурола, которые при взаимодействии с антроном превра-
щаются в окрашенные в синий цвет соединения. Реакцию для глю-
козы можно представить в виде
снаон(снон)4сС° +
+ Н20
н н
Н-С(СН0Н).0НСН2
Определяя интенсивность окраски иа фотоэлектроколориметре
стандартного и исследуемого растворов после проведения реакции,
можно рассчитать содержание гексозы в последнем.
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор глюкозы (3—
30 мкг/мл), стандартный раствор глюкозы (20 мкг/мл), антроновый
реактив (0,2 г антрона, растворенного в 100 мл 95 %-ного раствора
серной кислоты), лед.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, штатив для про-
бирок, пипетки, водяная баня, термометр лабораторный, емкость
для льда, фотоэлектроколориметр, часы.
Ход работы. В одну из пробирок помещают 2,5 мл исследуемого
раствора глюкозы, в другую — 2,5 мл стандартного раствора глю-
козы, а в третью — 2,5 мл дистиллированной воды. Содержимое
пробирок охлаждают, ставя их на лед. Затем в каждую пробирку
вносят по 5 мл свежеприготовленного антронового реактива, кипя-
тят на водяной бане в течение 10 мин и снова охлаждают, опуская
в воду (t 0—4 °C). Полученные растворы синего цвета в первой
и второй пробирках колориметрируют против раствора реактивов
(содержимое третьей пробирки).
Its. Массовую концентрацию (мкг/мл) рассчитывают по формуле
с=ад/(ЕаУ),
где £г и £2 — экстинкция исследуемого и стандартного растворов;
Со — массовая концентрация глюкозы в стандартном растворе;
V — объем исследуемой пробы.
Этот метод может быть использован для определения массовой
концентрации гликогена. Проводят реакцию гидролиза и концен-
трацию глюкозы в исследуемой пробе с гликогеном рассчитывают
так же, как и в случае глюкозы, но для определения массовой
15
концентрации гликогена полученное значение для глюкозы ум-
ножают на 0,9 (молекулярная масса остатка глюкозы в гликогене
равна 162,1, а глюкозы— 180,1, таким образом, 162,1 : 180,1 —
0,8999 = 0,9).
4. Количественное определение фруктозы
Принцип метода. Определение фруктозы основано на реакции
Селиванова (раздел 1.1.1, гексозы, работа 7). Скорость образования
оксиметилфурфурола в реакции фруктозы с соляной кислотой при
нагревании во много раз больше, чем для альдогексоз, что обуслав-
ливает специфичность реакции Селиванова для фруктозы.
Величину экстинкции раствора, содержащего продукт конден-
сации образованного из фруктозы оксиметилфурфурола с резорци-
ном, определяют колориметрически. Для количественного опреде-
ления содержания фруктозы готовят стандартный раствор фрукто-
зы (контроль).
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор фруктозы (10—•
100 мг/мл), стандартный раствор фруктозы (25 мг/мл), 0,1 %-ный
раствор резорцина в 96 %-ном этиловом спирте, 30 %-ный раствор
соляной кислоты.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки с пришлифован-
ным воздушным обратным холодильником, пипетки, штатив для
пробирок, водяная баня, часы, термометр лабораторный, фотоэлек-
троколориметр.
Ход работы. В одну пробирку с пришлифованным обратным
холодильником вносят 2 мл исследуемого раствора фруктозы (про-
ба), в другую — 2 мл стандартного раствора фруктозы (контроль).
Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл раствора резорцина и по
6 мл раствора соляной кислоты. Содержание пробирок перемешива-
ют и нагревают на водяной бане в течение 8 мин при t .80 °C. После
нагревания растворы охлаждают и колориметрируют при 490 нм.
Экстинкцию измеряют, используя реактивы, заменяя 2 мл раствора
фруктозы 2 мл дистиллированной воды.
Массовую концентрацию фруктозы в исследуемой пробе (мкг/мл)
вычисляют по формуле
С = QEJE2,
где Ег и Е2 — экстинкция исследуемого и стандартного растворов
соответственно; Q —• коэффициент, который представляет собой
отношение массовой концентрации в стандартной пробе к объему
пробы.
Этим методом можно определить также массовую концентрацию
фосфорных эфиров фруктозы — фруктозо-1,6-дифосфата и фрукто-
зо-6-фюсфата.
Ход работы — такой же, как для фруктозы, но для расчета
концентрации фр у ктозо-1,6-дифосфата найденное значение для
фруктозы нужно умножить на 3,6, а для фруктозо-6-фосфата — на
2,39. Эти поправки вводятся с учетом того, что в фруктозо-1,6-ди-
фосфате и в фруктозо-6-фосфате фруктоза составляет 53 % и 60,5 %
соответственно, а интенсивность ее цветовой реакции —• 52,3 %
и 69,2 %.
16
5. Количественное определение пентозы по методу Мейбаума
Принцип метода. Количественное определение пентозы в иссле-
дуемой пробе по методу Мейбаума основано на измерении экстинк-
ции окрашенного в зеленый цвет продукта конденсации фурфурола,
образуемого в реакции центозы с соляной кислотой при нагревании
с орцином (раздел 1.1.1, пентозы, работа 1).
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор пентозы (5—
20 мкг/мл рибозы), стандартный раствор этой же пентозы (10 мкг/мл
рибозы) орциновый реактив (50 мг FeCl3 • 6Н2О растворяют в 250 мл
концентрированной соляной кислоты (плотность 1,14 г/см2), и пе-
ред опытом к нужному количеству этого раствора добавляют ор-
цин из расчета 4,76 мг/мл).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки с пришлифован-
ным воздушным обратным холодильником, пипетки, штатив для
пробирок, водяная баня, часы, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. В одну пробу с пришлифованным воздушным об-
ратным холодильником помещают 3 мл исследуемого раствора пен-
тозы, а в другую — 3 мл стандартного раствора. В обе пробирки
затем добавляют по 3 мл орцинового реактива и кипятят на во-
дяной бане 20 мин. После охлаждения содержимое обеих проби-
рок колориметрируют при 660 нм против раствора реактивов (вме-
сто исследуемого и стандартного раствора пентозы добавляют
3 мл дистиллированной воды). Массовую концентрацию пентозы
в исследуемой пробе (мкг/мл) определяют по формуле
С = С0Ег1Е2У,
где Ег и Е2 — экстинкция исследуемой пробы и стандарта соответ-
ственно; Со — массовая концентрация стандартного раствора пен-
тозы; V — объем исследуемой пробы.
Этим методом можно определить массовую концентрацию пен-
тозы в составе фосфорных эфиров, моно-, ди- и трифосфатов, нукле-
отидов и других соединений. В таких исследованиях необходимо
учитывать процентные содержания пентоз в изучаемом соединении
и интенсивность ее цветовой окраски по сравнению с эквимолярным
количеством свободной пентозы.
6. Определение глюкозы в присутствии фруктозы
Принцип метода. В основе этого метода лежит способность
молекулярного иода (12) в щелочной среде окислять только альде-
гидоспирты, не влияя на кетоспирты. Уравнение реакции для глю-
козы имеет вид
СН2ОН (СНОН)4 + 12 -|- ЗКОН ->
\н
/°
-> СН2ОН (СНОН)4 С< + 2KI + 2Н2О
\нк
Это уравнение представляет собой результат двух реакций
2КОН + I2 KOI + KI + Н2О
17
KOI + CH2OH (CHOH)4 с/ + кон ->
\н
-► СН2ОН (СНОН)4 С< + KI + Н2О
\нк
При внесении излишка иода непрореагировавший иод можно
определить в кислой среде титрованием тиосульфатом натрия (инди-
катор — раствор крахмала). Эта реакция протекает в две стадии
KOI + KI + 2НС1 I2 + 2КС1 + НаО
I2 + 2Na2S2O3 -> 2NaI + Na2S4Oe
Материалы и реактивы. Раствор гидролизата сахарозы, содер-
жащий до 100 мл глюкозы или инвертный сахар (5 г сахара раство-
ряют в 50 мл соляной кислоты и кипятят на водяной бане 30 мин,
после охлаждения раствор нейтрализуют 1 мл 1 моль/л раствора
гидроксида калия и разбавляют до объема 500 мл), 0,05 моль/л
раствор иода, 0,5 моль/л раствор гидроксида калия, 10 %-ный рас-
твор соляной кислоты, 0,05 моль/л раствор тиосульфата натрия,
1 %-ный раствор крахмала.
Оборудование. Стеклянные палочки, колбы конические (объем
50 мл), пипетки, капельницы, бюретка, часы.
Ход работы. В две колбы вносят по 50 мл раствора иода. В одну
из них (проба) добавляют 10 мл исследуемого раствора (гидролизат
сахарозы или инвертный сахар), а в другую (контроль) — 10 мл
дистиллированной воды. Затем добавляют каплями, перемешивая,
по 10 мл раствора гидроксида калия и оставляют стоять при комнат-
ной температуре в течение 15 мин. По истечении этого времени в обе
колбы доливают по 10 мл раствора соляной кислоты и 2—3 капли
раствора крахмала. Содержимое колб титруют раствором тиосуль-
фата натрия до исчезновения синего окрашивания, появившегося
после добавления крахмала.
Массовую концентрацию глюкозы в исследуемой смеси (мг/мл)
рассчитывают по формуле
C = (B-4)/QVo/Vi,
где А и В — объем раствора тиосульфата натрия, который необхо-
дим для титрования пробы и контроля соответственно; f — коэффи-
циент поправки на титр 0,05 моль/л раствора тиосульфата; Q —
масса глюкозы (9 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора
тиосульфида натрия; Vo — общий объем пробы; — объем иссле-
дуемой смеси, взятой для анализа.
7. Определение глюкозы с помощью реакции восстановления
оксида меди в гемиоксид
Принцип метода. В основе лежит способность солей меди (II)
в определенных условиях количественно окислять глюкозу. В ос-
нове метода лежит реакция Троммера (раздел 1.1.1, гексозы, рабо-
та 1).
18
В реакции Троммера происходит образование как альдоновых
кислот, так и гидроксида меди (II), что указывает на отсутствие
количественной связи между глюкозой и гемиоксидом меди. Однако
если к реакционной смеси добавляют сегнетовую соль, то образует-
ся комплекс, в котором медь реагирует с глюкозой в стехиометриче-
ском соотношении
COONa
НО—С— Н
| + CuSO4 + 2NaOH
НО—С—Н
соок
COONa
О—i—Н
-> Cu<f | + Na2SO4 4.2H2O
\O—C— H
COOK
COONa
.0
+ CH2OH(CHOH)4C<f +2H2O
COOK
COONa
НО—С—H .О
-> 2 | + CH2OH (CHOH)4 C< + Cu2O
HO—c—H \OH
cook
Количество закиси меди (Cu2O), эквивалентное окисленной глю-
козе, определяют йодометрическим методом
Cu2O + I2 -> СиО Си12
Эта реакция в присутствии солей щавелевой или винной кислот
протекает практически до конца.
Количество иода в излишке, которое не прореагировало с геми-
оксидом меди, можно определить титрованием тиосульфатом нат-
рия (индикатор — раствор крахмала)
2Na2S2O8 + I2 -> 2NaI -J- Na2S4Oe
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор глюкозы (1—
4 мг/мл), реактив Фелинга I и II (см. раздел 1,1.1, гексозы, рабо-
19
Таблица 1. Масса глюкозы, мт
V 0.00 0.01 0,02 0,03 0,04
0,0 0,385 0,382 0,379 0,376 0,373
0,1 0,355 0,352 0,350 0,348 0,345
0,2 0,331 0,329 0,327 0,325 0,323
0,3 0,310 0,308 0,306 0,304 0,302
0,4 0,290 0,288 0,286 0,284 0,282
0,5 0,270 0,268 0,266 0,264 0,262
0,6 0,251 0,249 0,247 0,245 0,243
0,7 0,232 0,230 0,228 0,226 0,224
0,8 0,213 0,211 0,209 0,208 0,206
0,9 0,195 0,193 0,191 0,190 0,188
1,0 0,177 0,175 0,173 0,172 0,170
1,1 0,159 0,157 0,155 0,154 0,152
1,2 0,131 0,139 0,138 0,136 0,134
1,3 0,124 0,122 0,120 0,119 0,117
1,4 0,106 0,104 0,102 0,101 0,099
1,5 0,088 0,086 0,084 0,083 0,081
1,6 0,070 0,068 0,066 0,065 0,063
1,7 0,052 0,050 0,048 0,047 0,045
1,8 0,034 0,032 0,031 0,029 0,027
1,9 0,017 0,015 0,014 0,012 0,010
Примечание: V — объем тиосульфата натрия (по вертикали — целые
та 2), насыщенный раствор щевелевой кислоты, 0,05 моль/л раствор
иода, 0,05 моль/л раствор тиосульфата натрия, 1 %-ный раствор
крахмала.
Оборудование. Стеклянные палочки, пипетки, конические кол-
бы (объем 50 мл), капельницы, водяная баня, бюретки, часы.
Ход работы. В две колбы помещают по 5 мл реактива Фелинга
I и II. В одну из колб (проба) добавляют 10мл исследуемого раство-
ра глюкозы, а в другую (контроль) — 10 мл дистиллированной во-
ды. Содержимое обеих колб нагревают до кипения, кипятят 5 мин,
и затем охлаждают. После этого в обе колбы наливают по 10 мл на-
сыщенного раствора щавелевой кислоты, по 10 мл раствора иода и
после перемешивания отстаивают в течение 5 мин. По истечении это-
го времени в колбы вносят по 5 капель раствора крахмала и титру-
ют раствором тиосульфата до исчезновения окраски, образовавшей-
ся после добавления крахмала.
Массовую концентрацию глюкозы в исследуемом растворе (мг/мл)
рассчитывают по формуле
С = (B — A)fQV0/V1,
где А и В — объем раствора тиосульфата натрия, затраченного на
титрование пробы и контроля соответственно; f — коэффициент
поправки на титр 0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; Q —
масса глюкозы (3,52 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора
тиосульфида натрия; Vo — общий объем пробы; — объем иссле-
дуемого раствора, взятого до анализа.
20
0,05 0*06 0,07 0,08 0,09
0,370 0,367 0,364 0,361 0,358
0,343 0,341 0,338 0,336 0,333
0,321 0,318 0,316 0,314 0,312
0,300 0,298 0,296 0,294 0,292
0,280 0,278 0,276 0,274 0,272
0,260 0,259 0,257 0,255 0,253
0,241 0,240 0,238 0,236 0,234
0,222 0,221 0,219 0,217 0,215
0,204 0,202 0,200 0,199 0,197
0,186 0,184 0,182 0,181 0,179
0,168 0,166 0,164 0,163 0,161
0,150 0,148 0,146 0,145 0,143
0,132 0,131 0,129 0,127 0,125
0,115 0,113 0,111 0,110 0,108
0,098 0,097 0,095 0,093 0,092
0,079 0,077 0,075 0,074 0,072
0,061 0,059 0,057 0,056 0,054
0,043 0,041 0,039 0,038 0,036
0,025 0,024 0,022 0,021 0,019
0,008 0,006 0,005 0,003 0,002
и десятые доли миллилитра, по горизонтали — сотые доли).
8. Определение содержания глюкозы в крови методом Хагендор-
на — Йенсена
Принцип метода. Метод основан на способности глюкозы в без-
белковом фильтрате крови в щелочной среде при нагревании вос-
станавливать красную кровяную соль (гексациано-(Ш) феррат ка-
лия — K3Fe (CN)e) в желтую кровяную соль (гексациано-(П) фер-
рат калия — K4Fe (CN)e). Уравнение реакции имеет вид
2K3Fe (CN)e + ЗКОН + СН2ОН (СНОН)4С<
\н
/°
СН2ОН (CHOH)4C<Q + 2K4Fe (CN)e + 2Н2О
Вследствие обратимости этой реакции гексациано-(П) феррат
калия под действием сульфата цинка переводят в нерастворимую
соль — цинк-гексациано-(П) феррат калия
2K4Fe (CN)e + 3ZnSO4 K2Zn3 [Fe (CN)e]2 + 3K2SO4
Гексациано-(Ш) феррат калия берут в избытке и неиспользован-
ный в реакции его остаток определяют иодометрически в кислой
среде (например, в присутствии уксусной кислоты), титруя коли-
чество образовавшегося иода тиосульфатом натрия
2K3Fe(CN)e + 2KI+ 8СН3СООН 2K4Fe (CN)e + I2 + 8CH3COOH
2Na2S2O3 + I2 Na2S4Oe + 2NaI
21
В качестве индикатора на молекулярный иод используют крах-
мал. Содержание глюкозы рассчитывают по специальной таблице
(табл. 1). Таблица составлена так, что в ней определенному объему
тиосульфата натрия, затраченного на титрование иода, а следова-
тельно избытка гексациано-(Ш) феррата калия, соответствует то
число миллиграммов глюкозы, которое прореагировало в реакция.
Материалы и реактивы. Вата гигроскопическая для фильтрова-
ния растворов, кровь экспериментального животного, 0,1 моль/л
раствор гидроксида калия, 0,45 %-ный раствор сульфата цинка, ще-
лочной раствор гексациано-(Ш) феррата калия (1,65 г K3Fe (CN)e
и 10,6 г безводного карбоната натрия растворяют в дистиллирован-
ной воде до объема 1 л), раствор сульфата цинка в растворе хлори-
да натрия (10 г сульфата цинка и 50 г хлорида натрия растворяют
в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 200 мл),
раствор иодита калия (5 г иодита калия растворяют в 25 мл дистил-
лированной воды), 2,5 ммоль/л раствор тиосульфата, 3 %-ный рас-
твор уксусной кислоты, 1 %-ный раствор крахмала.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, колбы кониче-
ские (объем 50 мл), воронки стеклянные, пипетки, капельницы, во-
дяная баня, бюретки, штатив для пробирок, чашки, часы.
Ход работы. В две пробирки помещают по 1 мл раствора гидрок-
сида калия. В одну из них (проба) добавляют также 0,1 мл крови,
а в другую (контроль) — 0,1 мл дистиллированной воды. Затем вно-
сят по 5 мл 0,45 %-ного раствора сульфата цинка и после переме-
шивания ставят на 2—3 мин на кипящую водяную баню. После
этого смеси фильтруют в конические колбы через ватный тампон,
вложенный в воронку. Воронку и ватный тампон промывают горя-
чей дистиллированной водой 3 раза по 2 мл, не наливая новой пор-
ции воды до полного оттока предыдущей. К фильтрату в каждой
колбе приливают 2 мл щелочного раствора гексациано-(Ш) феррата
калия, и смеси капятят на водяной баневтечение 15 мин. В каждую
колбу добавляют по 2,6 мл раствора сульфата цинка в растворе
хлорида натрия, по 0,4 мл раствора иодита калия и после переме-
шивания по 2 мл раствора уксусной кислоты и по 3 капли раствора
крахмала. Смесь титруют 2,5 ммоль/л раствором тиосульфата нат-
рия до исчезновения окраски, образовавшейся при добавлении крах-
мала. По затраченным на титрование пробы и контроля объемам тио-
сульфата натрия определяют, используя табл. 1, массу глюкозы
(мг) и вычисляют разность между массой глюкозы в контроле и
пробе.
Массовую концентрацию глюкозы (мг/мл) рассчитывают по фор-
муле
С = (В — A)lV,
где А и В — масса глюкозы, определенная по табл. 1, в пробе и конт-
роле; V — объем крови (мл), взятый для анализа.
9. Определение концентрации лактозы в молоке
Принцип метода. В основе метода лежит способность альдегид-
ной группы лактозы в щелочной среде окисляться молекулярным
22
иодом
C12H22OU +12 + 2NaOH -> С12Н22О12 + 2NaI + Н2О
Избыточное количество иода, которое не вступило в реакцию,
определяют титрованием тиосульфатом натрия, используя в качест-
ве индикатора крахмал.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, моло-
ко, 7 %-ный раствор сульфата меди, 2 %-ный раствор гидроксида
натрия, 5 %-ный раствор фторида натрия, 0,05 моль/л раствор иода,
5 %-ный раствор соляной кислоты, 0,05 моль/л раствор тиосульфа-
та натрия, 1 %-ный раствор крахмала.
Оборудование. Стеклянные палочки, пипетки градуировочные,
колбы мерные (объем 50 мл), колбы конические с притертой проб-
кой (объем 100 мл), воронки стеклянные, бюретки, капельницы,
часы.
Ход работы. В две мерные колбы вносят по 5 мл раствора суль-
фата меди, по 5 мл раствора гидроксида натрия и по 2,5 мл раствора
фторида натрия. В одну из них (проба) добавляют 5 мл молока,
в другую (контроль) — 5 мл дистиллированной воды, перемешива-
ют и доводят дистиллированной водой до объема 50 мл, через
30 мин фильтруют. Затем в конические колбы переносят по 20 мл
фильтрата пробы и контроля, вливают по 20 мл раствора иода и,
непрерывно перемешивая, по 10 мл раствора гидроксида натрия.
Тщательно закрывают. Через 20 мин к содержимому колб добавля-
ют по 10 мл раствора соляной кислоты, по 3 капли раствора крах-
мала и титруют раствором тиосульфата натрия до исчезновения ок-
раски, образовавшейся при добавлении крахмала.
Массовую концентрацию лактозы в молоке (мг/мл) рассчитывают
по формуле
C = (B-X)fQV0/V1V2,
где А и В — объем раствора тиосульфата натрия, затраченный на
титрование пробы и контроля; f — коэффициент поправки на титр
0,05 моль/л раствора тиосульфата натрия; Q — масса лактозы
(18,01 мг), эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора тиосульфата
натрия; Vo — общий объем пробы; Vi и V2 — объемы фильтрата и
молока соответственно, взятые для исследований.
10. Определение содержания углеводов методом тонкослойной
хроматографии
Принцип метода. При проведении хроматографического разде-
ления углеводов методом тонкослойной хроматографии пластинку
с тонким слоем пористого носителя (например, пластинку
Silufol), на которую нанесены растворы углеводов, помещают
в растворитель, который, продвигаясь за счет капиллярных сил,
перемещает углевод. По завершению хроматографии проводят об-
работку пластинки, позволяющую выявить пятна углевода, и рас-
четным методом определяют массу углевода в исследуемом растворе.
Материалы и реактивы. Пластинки Silufol или Silufol-UV,
исследуемый и стандартный (10 мкг в пробе) раствор углевода
23
(глюкозы, галактозы, фруктозы, сахарозы, мальтозы), раствори-
тель — смесь бутанол — ацетон — вода (4 i 5 i 1), в случае исполь-
зования пластинок Silufol нафторезорциновый реактив (свежепри-
готовленная смесь равных объемов 20 %-ного водного раствора
трихлоруксусной кислоты и 0,2 %-ного спиртового раствора нафто-
резорцина).
Оборудование. Микропипетки, пульверизатор в случае исполь-
зования пластинок Silufol или источник ультрафиолетового света
в случае использования пластинок Silufol-UV, хроматографиче-
ская камера, линейка, простой карандаш, планиметр, сушильный
шкаф.
Ход работы. На пластинке на расстоянии 2 см от нижнего края
(линия старта) аккуратно намечают карандашом три точки нане-
сения растворов углеводов. С помощью микропипетки в отмеченные
места наносят равные объемы исследуемого раствора углевода (5—
20 мкг в пробе), разбавленного исследуемого раствора углевода и
стандартного раствора углевода таким образом, чтобы получить
пятна одного диаметра. После высушивания пятен пластинку поме-
щают в хроматографическую камеру, на дне которой находится рас-
творитель — смесь бутанол — ацетон — вода (4:5: 1). Высота слоя
растворителя — 1 см. Хроматографию проводят до прохождения
растворителем 10 см от линии старта. После этого хроматограмму
высушивают и проявляют. При использовании пластинок Silufol
хроматограмму опрыскивают из пульверизатора раствором нафто-
резорцина и сушат в сушильном шкафу 5—10 мин при температуре
90—100 °C для проявления пятен углевода. Пятна глюкозы и галак-
тозы имеют сине-фиолетовый цвет, фруктозы — красно-черный,
сахарозы и мальтозы — красный, лактозы — красно-фиолетовый,
рамнозы — зеленый, ксилозы — светло-серый, манозы — светло-си-
ний, арабинозы — сине-зеленый.
В случае использования пластинок Silufol-UV пятна углевода
выявляют под ультрафиолетовым светом.
С помощью планиметра определяют площадь пятен. Массу угле-
вода в пробе исследуемого раствора (мкг) рассчитывают по формуле
lg М = 1g Л4СТ + ( 1g Р,
где Л4СТ — масса углевода в пробе стандартного раствора; SCT, S,
Sp — площади пятна стандарта; исследуемого раствора и разбав-
ленного исследуемого раствора; Р—фактор разведения.
1.3. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
1. Образование молочной кислоты при гликолизе
Принцип метода. Анаэробный распад углеводов (гликолиз) в
тканях животных завершается образованием молочной кислоты.
По количеству образовавшейся молочной кислоты судят об интен-
сивности гликолитических процессов. Одним из методов обнаруже-
24
ния молочной кислоты является ее перевод в уксусный альдегид
при нагревании в присутствии концентрированной серной кислоты
СН3 H2SO4, сн3
I „ нагревание I Л 4" _
н—С—ОН —!----------- Н—С=О \он
соон
Уксусный альдегид в реакции с вератролом образует комплексное
соединение, окрашенное в ярко-розовый цвет. Интенсивность окра-
шивания пропорциональна количеству уксусного альдегида и,
следовательно, молочной кислоты.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, мыш-
цы экспериментального животного (лягушки, кролика, крысы),
лед, 0,5 %-ный раствор гликогена или 5 %-ный раствор глюкозы,
2 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты, насыщенный раствор
сульфата меди (II), сухой порошок гидроксида кальция, 0,125 %-ный
спиртовый раствор вератрола, стандартный раствор литиевой, каль-
циевой или цинковой соли молочной кислоты, содержащей от 1 до
5 мкг молочной кислоты в 1 мл раствора.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, ворон-
ки стеклянные, штатив для пробирок, водяная баня, термостат,
шпатель, ножницы, часы, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. Мышцы экспериментального животного быстро
измельчают ножницами на холоде (t —4 °C) и по 0,5 г полученной
мышечной кашицы помещают в две пробирки, куда добавляют по
6 мл раствора гликогена или раствора глюкозы. В одну из проби-
рок (контрольная проба) сразу вносят 2 мл раствора трихлоруксус-
ной кислоты для инактивации ферментов перемешивают. Для со-
здания анаэробных условий в обе пробирки наслаивают по 10 ка-
пель вазелинового масла, помещают в термостат (/ 37 °C), через
час во вторую пробирку (исследуемая проба) добавляют 2 мл рас-
твора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Содержимое
обеих пробирок фильтруют, освобождая от белков. Для осаждения
углеводов в одну пробирку вносят 3 мл фильтрата контрольной про-
бы, а в другую — 3 мл фильтрата исследуемой пробы. К фильтратам
добавляют по 1 мл насыщенного раствора сульфата меди и по 0,23 г
гидроксида кальция. После тщательного перемешивания пробирки
оставляют на 15 мин, регулярно помешивая. Затем фильтруют
и по 0,2 мл прозрачного раствора вносят в сухие пробирки, которые
охлаждают на льду. К охлажденному фильтрату добавляют капля-
ми по стенке пробирок по 2 мл концентрированной серной кислоты,
осторожно перемешивая. Пробирки помещают на 4 мин на кипящую
водяную баню, сразу охлаждают в воде со льдом (Ю °C), вносят по
2 капли раствора вератрола и перемешивают. Через 20 мин наблюда-
ют образование ярко-розового окрашивания в исследуемой пробе,
обусловленного появлением молочной кислоты в процессе гликоли-
за. В контрольной пробе наблюдают слабо-розовое окрашивание,
вызываемое присутствием в мышцах следов молочной кислоты.
25
Количество молочной кислоты в пробах находят по калибровоч-
ной кривой, построенной на основании результатов колориметриро-
вания различных количеств стандартного раствора литиевой, каль-
циевой или цинковой соли молочной кислоты, содержащего от 1
до 5 мкг молочной кислоты в 1 мл раствора.
Стандартные растворы перед колориметрированием обрабатыва-
ют концентрированной серной кислотой и вератролом так же, как
контрольную и исследуемую пробу. Колориметрирование проводят
против растворов, содержащих вместо соли молочной кислоты эк-
вивалентное количество дистиллированной воды. При построении
калибровочного графика по одной оси откладывают величину эк-
стинкции, а по другой — массу (мкг) молочной кислоты в стандарт-
ных растворах.
Расчет массы молочной кислоты (мкг) в исследуемом образце
(1 г ткани) проводят по формуле
С= EVa/V^V^M,
где Е — масса молочной кислоты, соответствующая экстинкции ис-
следуемой пробы за вычетом экстинкции контрольной пробы и най-
денная по калибровочной кривой; Vo — общий объем пробы; —
объем пробы, взятой для осаждения углеводов; У2 — объем пробы,
взятой для определения содержания молочной кислоты; М — масса
образца.
2. Определение массовой концентрации пировиноградной ки-
слоты в биологических жидкостях с помощью модифицированного
метода Умбрайта
Принцип метода. При взаимодействии пировиноградной кисло-
ты в кислой среде с 2,4-динитрофенилгидразином образуется 2,4-
динитрофенилгидразон пировиноградной кислоты
Это соединение экстрагируется из биологических жидкостей
(например, мочи) толуолом. После добавления к толуольному эк-
стракту спиртового раствора щелочи развивается красно-оранже-
вое окрашивание, характерное для 2,4-динитрофенилгидразина пиро-
виноградной кислоты. Интенсивность окрашивания, определяемая
колориметрически, пропорциональна массовой концентрации пи-
ровиноградной кислоты в биологической жидкости.
Для определения массовой концентрации пировиноградной кис-
лоты в исследуемой биологической жидкости предварительно строят
калибровочный график по данным колориметрического определения
экстинкции стандартных растворов пировиноградной кислоты, со-
держащих 5—50 мкг/мл пировиноградной кислоты.
26
Материалы и реактивы. Исследуемая жидкость (например, мо-
ча), 0,1 %-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразона в 2 моль/л рас-
творе соляной кислоты, насыщенный водный раствор толуола (сме-
шивают равные объемы толуола и дистиллированной воды, энергич-
но встряхивают в делительной воронке, дают отстояться и верхний
слой используют для работы), 2,5 %-ный раствор гидроксида калия
в 96 %-ном растворе этилового спирта, стандартные растворы пи-
ровиноградной кислоты, содержащие от 5 до 50 мкг/мл вещества.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, конические колбы (объем 50 мл), часы, фотоэлектро-
колориметр.
Ход работы. В колбу вносят 1 мл исследуемой биологической
жидкости (например, мочи) и добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динит-
рофенилгидразина. Содержимое колбы перемешивают, через 5 мин
к нему вливают 25 мл насыщенного водой толуола и интенсивно
перемешивают в течение 1 мин. После расслоения жидкостей с верх-
него слоя, содержащего толуол, отбирают 1 мл раствора и переносят
в пробирку, куда добавляют 2 мл спиртового раствора гидроксида
калия и снова перемешивают. Наблюдают образование красно-
оранжевого окрашивания. Через 10 мин содержимое пробирки коло-
риметрируют, используя синий светофильтр.
Предварительно проводят аналогичные реакции с такими же
объемами реактивов со стандартными растворами пировиноград-
ной кислоты. По результатам колориметрирования строят калибро-
вочную кривую, откладывая по одной оси величину экстинкции
стандартных растворов, а по другой — массу пировиноградной
кислоты в этих растворах.
По калибровочной кривой после определения экстинкции иссле-
дуемой пробы, содержащей биологическую жидкость, находят массу
пировиноградной кислоты в 1 мл исследуемой биологической жид-
кости.
ГЛАВА 2
ЛИПИДЫ
2.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
1. Растворимость липидов и образование эмульсии
Принцип метода. Характерным свойством жиров является их
хорошая растворимость во многих органических растворителях
(ацетон, хлороформ, диэтиловый эфир и др.) и нерастворимость в
воде. При смешивании жиров с водой образуются эмульсии, стой-
кость которых зависит от среды, в которой она образуется. Наличие
в воде веществ — эмульгаторов (мыла, желчные кислоты, карбона-
ты) делает эмульсии более стойкими. Образование эмульсий обус-
ловлено тем, что в поверхностный водный слой, окружающий жиро-
вые капельки, устремляются поверхностно-активные частицы желч-
ных кислот, мыла, карбоната, которые обволакивают капельки
жира и препятствуют их слиянию.
Материалы и реактивы. Растительное масло, спирт, бензол,
хлороформ, 1 %-ный раствор Na2CO3.
Оборудование. Штатив с пробирками, капельницы, пипетки.
Ход работы. В четыре пробирки помещают по 0,2—0,3 мл рас-
тительного масла, затем в первую добавляют 5 мл воды, во вторую —
5 мл спирта, в третью — 5 мл бензола, в четвертую — 5 мл хлоро-
форма. Содержимое всех пробирок энергично встряхивают. В первой
пробирке масло и вода быстро разделяются на два слоя, во вто-
рой — образуется мутный раствор вследствие недостаточной рас-
творимости масла в спирте, в третьей и четвертой образуются про-
зрачные растворы. В две пробирки вносят по несколько капель мас-
ла. В одну из них добавляют 2 мл воды, в другую — 2 мл раствора
•Na2CO3. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают и наблю-
дают образование эмульсии. Отмечают различия в стойкости
эмульсий в двух пробирках.
2. Выявление ненасыщенности липидов
Принцип метода. Жиры растительного происхождения содержат
.большее количество остатков ненасыщенных жирных кислот, чем
жиры животного происхождения. Различная степень непредель-
ности липидов может быть выявлена на примере насыщения бромом
сливочного или подсолнечного масел.
Материалы и реактивы. Раствор сливочного масла в хлорофор-
ме, раствор подсолнечного масла в хлороформе, насыщенная бром-
ная вода (5 г брома с 100 мл воды в колбе с притертой пробкой встря-
28
хивают под вытяжкой, изредка приоткрывая пробку для удаления
скопившихся паров брома).
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы.
Ход работы. В одну пробирку вносят 1 мл раствора подсолнеч-
ного масла в хлороформе, в другую — 1 мл сливочного масла в
хлороформе. Затем в каждую пробирку вливают по каплям бром-
ную воду до прекращения обесцвечивания. Фиксируют количество
бромной воды, добавленной в каждую из пробирок.
3. Омыление жира
Принцип метода. Жиры под влиянием щелочей гидролизуются
с образованием мыла и глицерола
СН2—О—ОС—(СН2)7СН=СН—(СН2)7—СН3
СН—О—ОС—(СН2)16—СН3 + зкон ->
СН2—О—ОС—(СН2)14—СН3
СН2—ОН КООС—(СН2)7СН= СН—(СН2)7—сн3
I
-> СН—ОН + КООС—(СН2)16—сн3
СН2-ОН КООС—(СН2)14—сн3
Материалы и реактивы. Растительное масло, 50 %-ный спирто-
вый раствор КОН (NaOH).
Оборудование. Колба емкостью 50 мл, пипетки, газовая горелка.
Ход работы. В колбу с 1 мл растительного масла добавляют
20 мл спиртового раствора КОН (NaOH), содержимое перемешивают
и кипятят в течение 60 мин. После омыления раствор разводят до
объема 20 мл дистиллированной водой, и таким образом получают
раствор калиевого мыла (калиевых солей жирных кислот).
4. Образование свободных жирных кислот
Принцип метода. При добавлении к мылу концентрированной
соляной кислоты образуются свободные жирные кислоты
КООС—(СН2)16—СН3 + HCI -> КС1 + НООС—(СН2)16—СН3.
Материалы и реактивы. Раствор калиевого мыла (используют
полученный ранее при омылении жира), концентрированная НС1.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку с 2 мл раствора калиевого мыла добав-
ляют 0,5 мл концентрированной НС1. Образующиеся жирные кисло-
ты нерастворимы в воде и будут собираться в верхней части содер-
жимого пробирки. '
5. Образование нерастворимых кальциевых мыл
Принцип метода. При добавлении к раствору калиевого мыла
раствора солей кальция образуются нерастворимые соли жирных
кислот
2КООС—(СН2)16—СН3 + СаС12 ->
-> КС1 + Са [ООС-(СН2)16-СН3]2
29
Материалы и реактивы. Раствор калиевого мыла (используют
полученный ранее при омылении жира), 5 %-ный раствор СаС1а.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку с 2 мл раствора калиевого мыла вносят
1 мл раствора СаС1а. Наблюдают образование нерастворимых каль-
циевых мыл.
6. Определение числа омыления жира
Принцип метода. Числом омыления называется количество мил-
лиграммов едкого калия, необходимое для нейтрализации всех как
свободных, так и входящих в состав триацилглицеролов жирных
кислот, содержащихся в 1 г жира.
Материалы и реактивы. Жир, 0,1 %-ный раствор фенолфталеи-
на, раствор НС1 (0,5 моль/л), спиртовый раствор КОН (0,5 моль/л).
Для приготовления этого реактива растворяют 40 г КОН в
30 мл воды, в зависимости от концентрации спиртового раствора
берут соответствующее количество водного раствора КОН и разводят
перегнанным в присутствии NaOH (на 100 г спирта 5 г NaOH)
спиртом. Спирт с таким соотношением NaOH кипятят с обратным
холодильником в течение часа, затем переганяют. Раствор отстаи-
вают сутки, фильтруют и сохраняют в склянке темного стекла,
хорошо закупорив (защищают от углекислоты воздуха).
Оборудование. Колбы емкостью 50 мл, обратный холодильник,
водяная баня, пипетки, бюретки, капельницы.
Ход работы. В одну колбу (исследуемая проба) помещают 0,5 г
жира, в другую (контрольная проба) — 0,5 мл воды. В обе колбы
доливают по 15 мл спиртового раствора КОН и кипятят с обратным
холодильником на водяной бане в течение 50 мин до полного омыле-
ния глицеридов и нейтрализации свободных жирных кислот. Затем
в обе колбы доливают по 10 капель раствора фенолфталеина и тит-
руют в теплом виде раствором НС1 до исчезновения розовой окраски
(до нейтральной реакции).
Количество КОН (мг) или число омыления (ЧО), которое пошло
на нейтрализацию свободных жирных кислот в 1 г жира, равняется
ЧО = (В — A) fQ/a,
где В — А — разность результатов титрования контрольного и опыт-
ного образцов раствором соляной кислоты (0,5 моль/л) (мл); а —
навеска исследуемого жира (г); f — коэффициент поправки на титр
раствора НС1 (0,5 мольЛп); Q — количество КОН (28,05 мг), экви-
валентное 1 мл раствора КОН (0,5 моль/л).
7. Определение кислотного числа жира
Принцип метода. Кислотностью жира или кислотным числом
называется число миллиграммов едкого калия, необходимое для
нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 р
жира.
Материалы и реактивы. Спирт, нейтрализованный по фенол-
фталеину, раствор КОН (0,1 моль/л), 0,1 %-ный раствор фенолфта-
леина, жир (подсолнечное масло).
Оборудование. Колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки.
30
Ход работы. К 1 г жира добавляют 5 мл спирта, нейтрализован-
ного по фенофталеину, тщательно перемешивают для максимально-
го растворения свободных жирных кислот и титруют раствором
КОН до появления не исчезающей после взбалтывания розовой ок-
раски (окраска не должна исчезать в течение 0,5—1 мин).
Количество КОН, мг, или кислотное число (КЧ), которое пошло
на титрование свободных жирных кислот в 1 г жира, равняется
КЧ = AfQ/a,
где А—объем раствора КОН (0,1 моль/л), израсходованного на
титрование исследуемой пробы; а — навеска жира (г); f — коэффи-
циент поправки на титр раствора КОН (0,1 моль/л); Q — количест-
во КОН (5,61 мг) эквивалентное 1 мл раствора КОН (0,1 моль/л).
8. Определение эфирного числа жира
Принцип метода. Эфирным числом называется число миллиграм-
мов едкого калия, необходимое для нейтрализации всех жирных кис-
лот, образующихся при омылении триацилглицеролов, содержащих-
ся в 1 г жира. Это число определяют как разницу между числом омы-
ления данного жира и его кислотным числом.
9. Определение иодного числа жира
Принцип метода. Иодным числом называется количество грам-
мов иода, которое прореагировало с 100 г жира. Это число указы-
вает на содержание в жире непредельных жирных кислот.
Определение иодного числа основывается на реакции присоеди-
нения иода по месту двойной связи, которая протекает по уравне-
нию
R—СН=СН—R + Ia + НаО -> R-CH—CH—R + HI
1 ОН
Материалы и реактивы. Жир, спиртовый раствор иода
(0,1 моль/л), 1 %-ный раствор крахмала, раствор NaaSaO3
(0,05 моль/л).
Оборудование. Две конические колбы емкостью 50 мл, пипетки,
бюретки.
Ход работы. В первую колбу помещают навеску жира 0,1—
0,2 г (исследуемая проба), во вторую — 0,1—0,2 мл воды (кон-
трольная проба), прибавляют по 10 мл спиртового раствора иода
и перемешивают. Через 15 мин содержимое колб оттитровывают
раствором NaaSaO3 сначала до появления слабо-желтого окрашива-
ния, а потом, прибавив 1 мл раствора крахмала, титруют до исчез-
новения синего окрашивания.
Исходное число вычисляют по формуле
ИЧ = (В — Л) /Q • 100/(а • 1000),
где В — А —разность результатов титрования контрольного и опыт-
ного образцов в растворе гипосульфита (0,05 моль/л) (мл); а — на-
веска исследуемого жира (г); f — коэффициент поправки на титр
раствора NaaSaO3 (0,05 моль/л); Q — количество Ja (12,69 мг), эк-
вивалентное 1 мл раствора NaaSaO3 (0,05 моль/л).
31
10. Определение перекисного числа в прогорклом жире
Принцип метода. Перекисным числом называется число милли-
литров раствора Na2S2O3, которое необходимо для титрования сво-
бодного иода, который выделился при окислении KI пероксидной
группировкой 1 г жира.
Метод основывается на способности пероксидных группировок
жира реагировать с KI в кислой среде:
• • • —(CH2)„—CH—СН—(СН2)„— ... + 2KI + 2СН3СООН ->
I I
О---О
-> • • • —(СН2)„—CH—СН—(СН2)„— • •. +
V
+ 12 + 2СН3СООК + Н2о
Поскольку возможно образование иода при окислении KI кис-
лородом воздуха, необходимо проводить контрольные пробы.
Материалы и реактивы. Жир, насыщенный раствор KI, хлоро-
форм, раствор Na2S2O3 (0,005 моль/л), 1 %-ный раствор крахмала,
ледяная уксусная кислота.
Оборудование. Две конические колбы емкостью 50 мл, пипетки,
бюретки, капельницы.
Ход работы. В первую колбу помещают навеску жира 1 г (ис-
следуемая проба), во вторую — 1 мл воды (контрольная проба).
Затем в обе колбы прибавляют по 5 мл ледяной уксусной кислоты,
6 мл хлороформа и 1 мл свежеприготовленного насыщенного раство-
ра KI. После этого содержимое колб встряхивают в течение 5 мин
и титруют раствором Na2S2O3, добавляя 10 капель раствора крах-
мала в качестве индикатора.
Перекисное число (мл) вычисляют по формуле
С = (Л-В)Л
где (Л — В) разность результатов титрования опытного и контроль-
ного образцов раствором Na2S2O3 (0,005 моль/л); / — коэффициент
поправки на титр раствора Na2S2O3 (0,005 моль/л).
11. Разделение липидов методом тонкослойной хроматографии
на пластинках Silufol
Принцип метода. Метод основан на способности жидкой фазы,
продвигающейся по слою адсорбента за счет капиллярных сил,
перемещать с различными скоростями компоненты разделяемой
смеси. Положение пятен разделяемых веществ на хроматограмме
характеризуется значением Rf, которое представляет собой соотно-
шение расстояний, пройденных веществом и подвижной фазой от
точки старта.
Материалы и реактивы. Сыворотка крови, смесь хлороформа
и метанола (1 ’ 1), растворитель — смесь н-гексана, эфира и ук-
сусной кислоты (80 : 20 > 1), кристаллический иод, пластинки Si-
lufol, бумажные фильтры.
32
Оборудование. Пипетки, микропипетки, пробирки, воронки, ста-
кан, водяная баня, газовая горелка, термостаты с заданной темпера-
турой 50 и 100 °C.
Ход работы. К 1 мл сыворотки добавляют 10 мл смеси хлорофор-
ма и метанола и инкубируют в течение 5 мин при t 50 °C. Смесь после
инкубации фильтруют, а затем выпаривают. Сухой остаток раство-
ряют в 1 мл смеси хлороформа и метанола.
Пластинку Silufol (15 х 15 см) промывают растворителем (м-
гексан, эфир, уксусная кислота) и высушивают в термостате в те-
чение 30 мин при t 100 °C. На пластинку в двух сантиметрах от
нижнего края наносят раствор липидов в количестве 10—20 мкг и
проводят разделение восходящим способом в растворителе на рас-
стояние 10 см.
После высушивания пластин под тягой результаты разделения
выявляют в парах иода. Для этого в стеклянный стакан кладут не-
сколько кристаллов иода, накрывают его стеклом и ставят на во-
дяную баню (I 60 °C). Через несколько минут в стакан при комнат-
ной температуре вносят пластинку, выдерживая ее 3—5 мин. Липи-
ды проявляются в виде желтых и желто-коричневых пятен на белом
или слабо-желтом фоне пластинки.
Липиды сыворотки на хроматограмме располагаются в порядке
убывания величины Rf: эфиры холестерола, триацилглицерола,
жирные кислоты, холестерин, фосфолипиды.
2.2. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ
1. Реакция образования йодоформа при взаимодействии ацетона
с иодом
Принцип реакции. При добавлении раствора иода и щелочи к
моче, содержащей ацетон, жидкость мутнеет и выпадает осадок
йодоформа, обладающий характерным запахом. Реакция протекает
следующим образом:
СН3
С=О + I2 + 2NaOH -> CH3I + CH3COONa + Nal + Н2О
сн3
Эта реакция не является специфичной для ацетона, так как при
взаимодействии иода с ацетальдегидом и этанолом также образуется
йодоформ.
Материалы и реактивы. Моча (к 100 мл мочи прибавляют 2 мл
ацетона), 10 %-ный раствор NaOH, 10 %-ный раствор иода в иоди-
де калия.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. К 5 мл мочи добавляют 1 мл раствора NaOH, а за-
тем раствор иода в иодистом калии до появления слабо-желтого ок-
рашивания. В присутствии ацетона смесь мутнеет и приобретает за-
пах хлороформа.
2 237
33
2. Реакция на ацетон и ацетоуксусную кислоту
Принцип реакции. При взаимодействии ацетона и ацетоуксусной
кислоты с нитропруссидом натрия в щелочной среде образуется ком-
плексное соединение, окрашенное в оранжево-красный цвет
СН3
С=О + Na2 [Fe(CN)5 NO] + 2NaOH ->
сн3
Na4 [Fe (CN)5 NO=CHCOCH3] + 2H2O
При добавлении к реакционной смеси концентрированной ук-
сусной кислоты образуется соединение, окрашенное в темно-крас-
ный цвет,
Na4 |Fe (CN)6 NO=CHCOCH3] + CH3COOH ->
-* Na3 [Fe (CN)5 NOCH2COCH3] +CH3COONa
Реакция не является специфичной для ацетона и ацетоуксусной
кислоты, 1ак как креатинин мочи, реагируя с нитропруссидом, да-
ет аналогичное окрашивание, но в этом случае при добавлении кон-
центрированной уксусной кислоты жидкость не окрашивается в
темно-красный цвет.
Материалы и реактивы. Моча, 10 %-ный раствор NaOH, 10 %-
ный раствор нитропруссида натрия, концентрированная уксусная
кислота.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку, содержащую 5 мл мочи, прибавляют
1 мл раствора NaOH, 1 мл раствора нитропруссида натрия и пере-
мешивают. При наличии в моче ацетона или ацетоуксусной кислоты
раствор окрашивается в оранжево-красный цвет. При добавлении
в пробирку 2 мл концентрированной уксусной кислоты цвет раство-
ра становится темно-красным.
3. Реакция на ацетоуксусную кислоту (реакция Герхарда)
Принцип реакции. При взаимодействии ацетоуксусной кислоты
с хлоридом железа III образуется окрашенное в красный цвет со-
единение. Реакция обусловлена образованием комплексного со-
единения железа с енольной формой ацетоуксусной кислоты
СН3—С—СН2—СООН СН3—С=СН—СООН
II I
О он
Кето-форма ацетоуксусной Енольная форма ацетоуксусной
кислоты кислоты
Характерным для ацетоуксусной кислоты является то, что ок-
раска исчезает при нагревании или через продолжительный проме-
жуток времени вследствие самопроизвольного декарбоксилирова-
ния ацетоуксусной кислоты
СН3—С—СН2—СООН -> СН3—С—СН3 + со2
34
Материалы и реактивы. Моча нормальная, моча, содержащая
ацетоуксусную кислоту (в 100 мл мочи растворяют при взбалтыва-
нии 0,5 мл ацетоуксусного эфира), 10 %-ный раствор FeCl3, бумаж-
ные фильтры.
Оборудование. Пробирки, капельницы, воронки, пипетки.
Ход работы. В одну пробирку наливают 5 мл нормальной мочи,
а в другую — 5 мл мочи с ацетоуксусной кислотой. Затем в обе про-
бирки добавляют по каплям раствор FeCl3 до полного осаждения
фосфатов, отфильтровывают, к фильтрам добавляют еще по 3—
5 капель раствора FeCl3. В пробирке с фильтратом, где присутствует
ацетоуксусная кислота, раствор окрашивается в красный цвет.
4. Реакция на р-оксимасляную кислоту
Принцип реакции. После окисления перекисью водорода
0-оксимасляная кислота может взаимодействовать с нитропруссидом
натрия с образованием окрашенного в красный цвет комплексного
соединения.
Материалы и реактивы. Моча, концентрированная уксусная
кислота, 3 %-ный раствор Н2О2, 10 %-ный раствор нитропруссида
натрия, 25 %-ный раствор NH4OH.
Оборудование. Стакан химический термостойкий, газовая горел-
ка, капельницы, пипетки.
Ход работы. Мочу предварительно освобождают от ацетона и
ацетоуксусной кислоты. Для этого в химическом стакане к 10 мл
мочи прибавляют 10 мл воды и несколько капель концентрирован-
ной уксусной кислоты. Содержимое стакана наполовину выпарива-
ют, вливают 1 мл раствора перекиси водорода, нагревают в течение
1 мин и охлаждают. В результате такой обработки происходит
окисление Р-оксимасляной кислоты. Затем в стакан вносят 10 капель
раствора нитропруссида натрия, тщательно перемешивают и насла-
ивают 2 мл раствора NH4OH. В случае наличия в моче р-оксимасля-
ной кислоты через некоторое время в растворе образуется кольцо
пурпурного цвета.
5. Качественная реакция на желчные кислоты (реакция Пет-
тенкофера)
Принцип реакции. При взаимодействии желчных кислот с окси-
метилфурфуролом появляется красно-фиолетовое окрашивание.
Реакция обусловлена образованием окрашенных продуктов конден-
сации желчных кислот с оксиметилфурфуролом. Фурфурол обра-
зуется из фруктозы (сахарозы) при взаимодействии концентриро-
ванной серной кислоты
Фруктоза Оксиметилфурфурол
35
Материалы и реактивы. 20 %-ный раствор свежеприготовлен-
ной сахарозы, концентрированная серная кислота, желчь, разведен-
ная водой (1 : 2).
Оборудование. Чашка Петри или часовое стекло, капельницы,
стеклянные палочки.
Ход работы. На сухую чашку Петри или часовое стекло наносят
2 капли желчи, 2 капли раствора сахарозы и тщательно перемеши-
вают стеклянной палочкой. После этого доливают 7 капель концен-
трированной серной кислоты и снова перемешивают стеклянной па-
лочкой. Через несколько минут наблюдается красная окраска, ко-
торая при стоянии переходит в красно-фиолетовую.
6. Качественная реакция на глицерол (акролеиновая реакция)
Принцип реакции. При нагревании глицерола с гидросульфатом
калия происходит дегидратация, в результате которой глицерол
превращается в акролеин-ненасыщенный альдегид этилового ряда
со специфическим запахом
СН2ОН
СНОН Нагревание, KHSO4
СН2ОН
Г лицерол
СН2
II
СН + 2Н2О
СНО
Акролеин
Материалы и реактивы. Гидросульфат калия, растительное мас-
ло, глицерин.
Оборудование. Пробирки, капельницы, газовая горелка.
Ход работы На дно двух пробирок кладут несколько кристалли-
ков KHSO4, затем в одну пробирку вносят 5 капель растительного
масла, а в другую — 5 капель глицерола, нагревают в пламени
горелки. Образование акролеина определяют по характерному за-
паху альдегида — запах горелого сала. Наличие альдегида можно
обнаружить при внесении в выделяющийся пар фильтровальной
бумаги, смоченной аммиачным раствором серебра,— бумага при
этом темнеет.
7. Качественная реакция на лецитин
Принцип реакции. Лецитин является одним из представителей
фосфатидов, входящих в состав биологических мембран Лецитин
не растворяется в ацетоне и образует стойкую эмульсию с водой.
Материалы и реактивы Высушенный яичный желток, спирт,
ацетон, фильтровальная бумага.
Оборудование. Химические стаканы, пробирки, капельницы, во-
ронки, водяная баня, пипетки.
Ход работы. В химический стакан, содержащий 200—300 мг
высушенного и растертого яичного желтка, прибавляют 15 мл го-
рячего спирта и перемешивают. Через 10—15 мин смесь охлажда-
ют и фильтруют в сухую пробирку. В другую сухую пробирку
наливают 2—3 мл ацетона и каплями добавляют полученный филь-
трат. Наблюдают появление мути, а затем выпадение осадка леци-
тина, что указывает на нерастворимость лецитина в ацетоне. Если
36
в пробирку к 2—3 мл фильтрата прибавлять каплями дистиллиро-
ванную воду, образуется стойкая эмульсия.
8. Выделение холестерола из мозга
Принцип метода. Холестерол легко может быть получен из
тканей, где он содержится в значительном количестве. В первую
очередь — это ткани мозга. Препарат холестерола из тканей полу-
чают путем экстрагирования хлороформом.
Материалы и реактивы. Мозговая ткань, гипс (CaSO4), хлоро-
форм, уксусный ангидрид, концентрированная серная кислота,
фильтры.
Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком, стеклянные па-
лочки, предметные стекла, скальпель, сухие пробирки, воронки,
термостат (t 60 °C).
Ход работы. Тщательно растирают 3—5 г мозговой ткани в фар-
форовой ступке с 6—10 г гипса до гомогенной массы, которую рас-
пределяют тонким слоем стеклянной палочкой или скальпелем по
стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу (t 60 °C).
Высушенную с гипсом мозговую ткань соскабливают скальпе-
лем со стекла и мелко измельчают в ступке. К сухому порошку в
пробирке добавляют 5—6 мл хлороформа и экстрагируют в течение
5—10 мин. Для лучшей экстракции содержимое пробирки перио-
дически встряхивают Полученный экстракт в хлороформе филь-
труют в сухую пробирку и используют для проведения качествен-
ных реакций на холестерол.
9. Качественные реакции на холестерол
Принцип реакций. Реакции качественного обнаружения холе-
стерола основаны на его способности превращаться из вторичного
спирта в непредельный углеводород.
Раствор холестерола в хлороформе дает с уксусным ангидридом
и концентрированной серной кислотой красное окрашивание, пе-
реходящее затем в синее и зеленое. Таким образом, при наличии сер-
ной кислоты происходит дегидратация и окисление холестерола.
В результате две молекулы холестерола, потерявшие две молекулы
воды, соединяются между собой по третьему атому углерода. Обра-
зовавшиеся непредельные углеводороды с сопряженными двойными
связями дают различные производные с серной кислотой и уксус-
ным ангидридом
37
Дихолестадиен
Материалы и реактивы. Хлороформный раствор холестерола
(2—3 кристалла растворяют в 2—3 мл хлороформа), концентриро-
ванная серная кислота, уксусный ангидрид.
Оборудование. Штатив с пробирками, фарфоровая чашка, пипет-
ки, капельницы.
Ход работы.
А. Реакция Шиффа. В пробирку вносят 1 мл холестерола
в хлороформе. По стенке пробирки осторожно подслаивают 1 мл
концентрированной H2SO4. На границе раздела между серной кис-
лотой и раствором холестерола образуется кольцо красного цвета.
Б. Реакция Сальковского. В сухую пробирку, содержащую
0,5 мл раствора холестерола в хлороформе, добавляют 0,5 мл кон-
центрированной H2SO4 и осторожно встряхивают. После расслое-
ния фаз наблюдают за изменением окраски: верхний слой, содер-
жащий холестерол в хлороформе, окрашивается в пурпурно-красный
цвет, а нижний (слой серной кислоты) — в темно-красный цвет с зе-
леной флуоресценцией. Раствор холестерола в хлороформе сливают
в фарфоровую чашку. Окраска раствора со временем переходит в
фиолетовую, затем зеленую и, наконец, в желтую.
В. Реакция Либермана — Бурхарда. В сухую пробирку, со-
держащую 1 мл раствора холестерола в хлороформе, добавляют
10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной H2SO4.
Содержимое пробирки тщательно встряхивают и наблюдают обра-
зование красной окраски, которая переходит в красно-фиолетовую,
фиолетовую, синюю и, наконец, в зеленую.
При незначительном содержании холестерола в растворе образу-
ется сразу зеленое окрашивание.
10. Цветные реакции иа холестерол
Принцип реакций. Кроме описанных выше реакций, холестерол,
его эфиры и другие стерины и стероиды взаимодействуют с целым
рядом веществ (азотной кислотой, пропионовым ангидридом, бро-
мом, смесью формалина с серной кислотой), приводящих к образо-
ванию характерных окрашенных соединений (хромофоров) с различ-
ным цветом и оттенком.
Материалы и реактивы. Холестерол в кристаллах, концентри-
рованный раствор холестерола в хлороформе, холестерол в уксус-
ной кислоте, 0,05 %-ный или 0,3 %-ный раствор холестерола в хло-
роформе, концентрированная H2SO4, формалин, уксусный ангид-
рид, концентрированная азотная кислота, пропионовый ангидрид,
хлористый ацетил, прокаленный хлорид цинка, 5 %-ный раствор
брома в ледяной уксусной кислоте.
38
Оборудование. Штатив с пробирками, фарфоровая пластинка,
капельницы, пипетки.
Ход работы.
А. Реакция со смесью формалина и концентрированной серной
кислотой (реакция Уайтби). К 2 мл раствора холестерола в хлоро-
форме прибавляют 2 мл смеси концентрированной серной кислоты
с формалином (50 : 1) и встряхивают. Верхний слой окрашивается
в вишнево-красный цвет, а нижний — в буро-красный с интенсивной
зеленой флуоресценцией. Если верхний слой, содержащий холесте-
рол, слить в сухую пробирку и прибавить 2—3 капли уксусного
ангидрида, то образуется синее окрашивание, которое медленно
переходит в зеленое.
Б. Реакция с уксусным ангидридом и азотной кислотой. Не-
сколько кристаллов холестерола с каплей уксусного ангидрида на-
гревают на фарфоровой пластинке до плавления. Избыток уксусно-
го ангидрида удаляют и пластинку охлаждают. Холестерол смеши-
вают с каплей концентрированной азотной кислоты, в результате
чего появляется синее или сине-зеленое окрашивание.
В. Реакция с пропионовым ангидридом (реакция Обермюллера).
Небольшое количество холестерола сплавляют в пробирке с 2—3
каплями пропионового ангидрида. В результате образуется масса,
которая при охлаждении окрашивается в фиолетовый, затем синий,
зеленый, оранжевый и красный цвета.
Г. Реакция Чугаева. В пробирку к 1 мл хлористого ацетила
(под витяжкой!) добавляют 10 капель холестерола в уксусной кисло-
те и 100—200 мг хлорида цинка. Содержимое пробирки окрашива-
ется в розовый цвет.
Д. Реакция Виндауза. В пробирку к 0,5 мл концентрированного
раствора холестерола в хлороформе осторожно прибавляют капля-
ми несколько миллилитров 5 %-ного раствора брома в ледяной
уксусной кислоте до появления бурого окрашивания, которое не
исчезает в течение нескольких минут. Образующийся в ходе реакции
дибромхолестерол выделяется в виде кристалликов игольчатой
формы.
2.3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
1. Количественное определение свободных жирных кислот в
сыворотке крови
Принцип метода. Медные соли жирных кислот способны образо-
вывать с диэтилдитиокарбоматом натрия окрашенные комплексные
соединения, интенсивность окраски которых пропорциональна кон-
центрации свободных (неэтерифицированных) жирных кислот.
Материалы и реактивы. 0,1 %-ный раствор диэтилдитиокарбо-
мата натрия, перегнанного в м-бутаноле, медный реактив, состоя-
щий из 10 объемов 6,45 %-ного раствора CuNO3 • ЗН2О, 9 обемов
1 моль/л раствора триэтаноламина и 1 объема раствора уксусной
кислоты (1 моль/л), хлороформ, стандартный раствор пальмитиновой
39
кислоты (25,6 мг доводят хлороформом до объема 100 мл), сыворот-
ка крови.
Оборудование. Центрифуга, фотоэлектроколориметр, пробирки
центрифужные, пробирки с притертыми пробками, стеклянные па-
лочки.
Ход работы. В одну пробирку с притертой пробкой вносят 0,5 мл
сыворотки крови, в другую — 1 мл раствора пальмитиновой кисло-
ты в хлороформе. В опытную пробирку вливают 5 мл, а в стандарт —
4,5 мл хлороформа и по 2,5 мл медного реактива. Параллельно го-
товят контрольные пробы, добавляя к 5 мл хлороформа 2,5 мл мед-
ного реактива. Пробирки закрывают пробками и встряхивают в
течение 5 мин. Содержимое пробирок переносят в центрифужные
пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 2000 g. В результа-
те центрифугирования смесь в пробирках распределяется следую-
щим образом: хлороформ, белок, вода. Верхнюю водную фазу, со-
держащую избыток медного реактива, удаляют, белковую пленку
сдвигают на стенки пробирок, а хлороформный слой с экстрагиро-
ванными в них жирными кислотами переносят в пробирки, куда
наливают 0,5 мл раствора диэтилдитиокарбомата натрия и перемеши-
вают содержимое пробирок. Опытную и стандартную пробы коло-
риметрируют с синим светофильтром против контрольной пробы.
Молярную концентрацию свободных жирных кислот (мкмоль/л)
рассчитывают по формуле
С = £оп • 1000/(ЕCTV),
где Еоп — экстинкция опытной пробы; Ест — экстинкция стандарт-
ного раствора; V — объем сыворотки (мл).
2. Определение общего холестерола в сыворотке крови
Принцип метода. Холестерол в присутствии уксусного ангид-
рида и смеси уксусной и серной кислот дает зеленое окрашивание,
интенсивность которого определяют на фотоэлектроколориметре.
Материалы и реактивы. Сыворотка крови, стандартный раствор
(1,8 г/л) холестерола (180 мг холестерола растворяют в 100 мл
этилового спирта), реактив А — смесь ледяной уксусной кислоты
(30 мл), уксусного ангидрида (150 мл) и концентрированной серной
кислоты (30 мл) (1:5: 1). Готовить реактив необходимо при по-
стоянном охлаждении. Серную кислоту добавляют в последнюю оче-
редь, очень медленно, постоянно помешивая. Реактив хранят в хо-
лодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, микропипетки,
цилиндры, колба (вся посуда должна быть сухой), термостат (I 37 °C),
фотоэлектроколор иметр.
Ход работы. В сухую пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови,
Добавляют быстро 2,1 мл реактива А, немедленно перемешивают,
10 раз встряхивают и помещают в термостат (t 37 °C). Через 20 мин
смесь в пробирке окрашивается в зеленый цвет. Фотометрируют
против воды при красном светофильтре. Для определения молярной
концентрации холестерола в исследуемой пробе по оптической плот-
ности необходимо построить калибровочный график. Найденную
40
концентрацию холестерола умножают на 1000 (количество сыво-
ротки — 0,1 мл). Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л)
равен 0,0258.
Для построения калибровочного графика следует из стандарт-
ного раствора холестерола (в 1 мл содержится 1,8 мл холестерола)
взять по 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 мл и добавить реактив А до объема
2,2 мл в каждой пробирке. При этом в пробах будет содержаться
следующее количество холестерола: 0,09, 0,18, 0,27, 0,36, 0,45 мг
соответственно. После добавления реактива А пробирки энергично
встряхивают и помещают в термостат при t 37 °C. Через 20 мин
фотоколориметрируют. Строят график, где по оси ординат — эк-
стинкция, а по оси абсцисс — известные концентрации холестерола.
ГЛАВА 3
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
3.1. ВЫДЕЛЕНИЕ, КАЧЕСТВЕННЫЕ
И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ
1. Выделение нуклеопротеидов
Принцип метода. Дезоксирибонуклеопротеиды хорошо раство-
ряются в щелочных и солевых растворах и осаждаются после ней-
трализации растворов или разведении растворов солей. Рибонукле-
опротеиды также растворяются в щелочных растворах и могут быть
осаждены в изоэлектрической точке путем добавления неорганичес-
ких кислот (например, уксусной кислоты).
Материалы и реактивы. Ткань (зобная железа, селезенка, мо-
локи рыб), сухие дрожжи, 5 %-ный раствор хлорида натрия, содер-
жащий 0,04 % трехзамещенного цитрата натрия, 0,2 %-ный, 0,4 %-
ный и 0,02 моль/л растворы гидроксида натрия, 5 %-ный раствор
уксусной кислоты, фильтры.
Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком, стеклянные па-
лочки, центрифужные пробирки, пробирки, воронки, центрифуга.
Ход работы. 0,5 г селезенки (или другой ткани) измельчают в
фарфоровой ступке со 100 мг стеклянного порошка с 15 мл раствора
хлорида натрия в течение 15 мин. Содержимое переносят в центри-
фужные пробирки и центрифугируют 15 мин при 2000 g. К 90 мл воды
при помешивании стеклянной палочкой медленно, тонкой струей
вливают центрифугат. Нерастворимые в воде дезоксирибонуклео-
протеиды выпадают в осадок в виде нитей. Нити собирают на палоч-
ку или же, если образуется осадок, фильтруют, переносят в чистую
пробирку и растворяют в 0,2 %-ном растворе NaOH.
Для получения рибонуклеопротеидов навеску (10 г сухих дрож-
жей) тщательно растирают в фарфоровой ступке в течение 15 мин
с 50 мл 0,4 %-ного раствора едкого натрия, который добавляют
небольшими порциями и центрифугируют 10 мин при 2000 g. К цен-
трифугату доливают при помешивании 15—20 мл раствора уксусной
кислоты и выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок
после центрифугирования растворяют в 15—20 мл растворе щелочи
(0,02 моль/л). Полученные растворы нуклеопротеидов в дальней-
шем используются в качественных реакциях.
2. Обнаружение углеводов в составе нуклепротеидов
Принцип реакций. Нуклеопротеиды, в отличие от простых бел-
ков, вступают в специфические цветные реакции с рядом веществ,
42
что позволяет определить углеводный компонент в составе их моле-
кул. Так, нуклеопротеиды, содержащие в своей молекуле рибозу,
дают с орциновым реактивом сине-зеленую окраску; для дезоксири-
бонуклеопротеидов характерны цветные реакции с дифениламином,
индолом, фуксинсернисгой кислотой.
Материалы и реактивы. Щелочные растворы дезоксирибонуклео-
протеидов и рибонуклеопротеидов, полученные с помощью приве-
денного выше метода, орциновый реактив (50 мл FeCl3 • 6Н2О раст-
воряют в 250 мл концентрированной НС1 и хранят в посуде из тем-
ного стекла, а перед использованием добавляют орцин из расчета
4,76 мг на 1 мл раствора), 1 г дифениламинового реактива (дважды
перекристаллизованный из 70 %-ного спирта или петролейного эфи-
ра дифениламин растворяют в смеси концентрированной серной
кислоты (2,75 мг) и ледяной уксусной кислоты (100 мл), раствор
фуксинсернистой кислоты (растворяют 1 г основного фуксина в
200 мл кипящей дистиллированной воды, встряхивают в течение
5 мин, охлаждают до t 50 °C, фильтруют, доливают 20 мл раствора
соляной кислоты (1 моль/л), охлаждают до t 25 °C, вносят 1 г мета-
бисульфита натрия или калия, оставляют в темном месте на 14—
24 ч, затем добавляют 2 г активированного угля, встряхивают 1 мин,
фильтруют и хранят в темноте при t 0—4 °C), хлороформ, концен-
трированная соляная кислота, раствор соляной кислоты (1 моль/л),
0,04 %-ный раствор индола.
Оборудование. Штатив с пробирками, центрифужные пробирки,
пипетки, водяная баня, термостат (/ 60 °C).
Ход работы.
А. Реакция с орцином. К 1 мл раствора рибонуклеопротеидов
прибавляют равный объем орцинового реактива, перемешивают и
помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. Смесь охлаждают
и разбавляют дистиллированной водой до объема 4 мл. Пентоза с
орциновым раствором дает сине-зеленую окраску.
Б. Реакция с индолом. К 2 мл раствора дезоксирибонуклеопро-
теида добавляют 1 мл раствор индола и 1 мл концентрированной
соляной кислоты. Смесь перемешивают и помещают на кипящую
водяную баню на 10 мин. Возникает оранжевая окраска. После
охлаждения к раствору доливают 4 мл хлороформа и после исчез-
новения прежней окраски водный слой приобретает желтый цвет.
В. Реакция с дифениламином. В пробирку к 2 мл щелочного
раствора дезоксирибонуклеопротеида добавляют равный объем
дифениламинового реактива. Смесь нагревают в кипящей водяной
бане 15 мин. При нагревании дезоксирибонуклеопротеиды гидролизу-
ются, а освободившаяся дезоксирибоза реагирует с дифениламином
и дает синее.окрашивание. В другой пробирке нагревают с дифенила-
миновым реактивом раствор рибонуклеопротеида. Смесь окрашива-
ется в зеленый цвет.
Г. Реакция с фуксинсернистой кислотой. В центрифужную
пробирку к 0,5 мл раствора дезоксирибонуклеопротеида добавляют
2 мл раствора соляной кислоты, нагретого до / 60 °C и ставят про-
бирку на 10 мин в термостат при t 60 °C. После охлаждения смесь
43
центрифугируют, кислоту сливают, а к осадку приливают раствор
фуксинсернистой кислоты. Через некоторое время раствор окраши-
вается в фиолетовый цвет.
3. Обнаружение пуриновых оснований в составе нуклеопротеидов
Принцип метода. Метод основан на образовании комплексов
пуриновых оснований с солями серебра.
Материалы и реактивы. Концентрированный раствор аммиака,
1 %-ный раствор AgNO3, дрожжи (в круглодонную колбу для гид-
ролиза помещают 1 г пекарских дрожжей, доливают 20 мл 10 %-
ного раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды,
колбу закрывают пробкой, в которую вставлена в качестве холо-
дильника стеклянная трубка длиной 20—30 см, кипятят под тягой
в течение 1 ч на асбестовой сетке при слабом нагревании, после
окончания гидролиза жидкость охлаждают, доводят водой до пер-
воначального объема и фильтруют).
Оборудование. Колба, пипетки, пробирки, воронки, стеклянная
трубка длиной 25—30 см, газовая горелка.
Ход работы. К 1 мл гидролизата добавляют концентрированный
раствор аммиака до получения щелочной среды (по лакмусу) н
0,5 мл раствора AgNO3. Через 3—5 мин образуется рыхлый осадок
серебряных солей пуриновых оснований.
4. Обнаружение фосфорной кислоты в составе нуклеопротеидов
Принцип метода. Метод основан на взаимодействии фосфорной
кислоты с молибденовым реактивом с образованием окрашенного
соединения — фосфорной соли молибдата аммония
12 (NH4)2 МоО4 + Н3РО4 + 21HNO3
21NH4NO3 + (NH4)a РО4 • 12МоОа • 6Н2О + 6Н2О
Материалы и реактивы. Гидролизат нуклеопротеидов дрожжей
(способ приготовления см. работу 3), молибденовый реактив (7,5 г
молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл
32 %-ного раствора азотной кислоты с относительной плотностью
1,2 (полное растворение (NH4)2 МоО4 происходит после добавления
азотной кислоты).
Оборудование. Пробирки, пипетки, газовая горелка.
Ход работы. К 1 мл гидролизата добавляют 1 мл молибденового
реактива и кипятят. Жидкость окрашивается в лимонно-желтый
цвет, а при охлаждении выпадает кристаллический осадок желтого
цвета, обусловленный образованием фосфорномолибденовокислого
аммония.
5. Обнаружение белков в составе нуклеопротеидов
Принцип метода. Для подтверждения наличия белков в соста-
ве нуклеопротеидов проводят биуретовую реакцию. Эта реакция
характерна для соединений, содержащих не менее двух пептидных
связей. Такие полимеры (белки) в щелочной среде образуют с суль-
фатом меди окрашенные комплексные соединения, цвет которых за-
висит от длины полипептидной цепи. Раствор нативного белка дает
сине-фиолетовое окрашивание, а продукты его гидролиза (пепти-
ды) — красно-фиолетовое.
44
Материалы и реактивы. Гидролизат нуклеопротеидов дрожжей
(способ приготовления см. работу 3), 10 %-ный раствор гидроксида
натрия, 1 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельница.
Ход работы. В пробирку вносят 0,5 мл гидролизата, нейтрали-
зуют (по лакмусу) раствором NaOH, затем добавляют 0,5 мл раство-
ра NaOH и 2—3 капли раствора CuSO4. Смесь перемешивают и на-
блюдают появление окраски, что свидетельствует о присутствии
в пробе полипептидов, образующихся в результате гидролиза бел-
ковой части нуклеопротеидов.
6. Качественное определение ДНК по Дише
Принцип метода. Метод основан на способности углеводного
компонента нуклеиновых кислот (рибозы или дезоксирибозы) да-
вать специфические цветные реакции с солянокислым цистеином.
Материалы и реактивы. 0,01—0,1 %-ный водный раствор нат-
риевой соли ДНК, 5 %-ный раствор солянокислого цистеина, ра-
створ серной кислоты (6 мл воды и 15 мл концентрированной H2SO4).
Оборудование. Пробирки, пипетки, микропипетки, водяная баня.
Ход работы. К 1 мл раствора ДНК добавляют 0,04 мл раствора
солянокислого цистеина и 5 мл раствора серной кислоты. Смесь
нагревают на водяной бане при t 40 °C в течение 5 мин. Раствор ок-
рашивается в розоватый цвет, который не исчезает в течение не-
скольких часов.
7. Количественное определение ДНК по Броди
Принцип метода. Интенсивность окраски дезоксирибозы ДНК
с солянокислым цистеином зависит от количества ДНК в растворе.
Этим методом можно определить ДНК в растворах, содержащих
от 1 до 10 мкг ДНК.
Материалы и реактивы. Раствор ДНК (1—10 мкг вещества),
1 %-ный раствор солянокислого цистеина, концентрированная H2SO4.
Оборудование. Пробирки, пипетки, водяная баня, спектрофото-
метр.
Ход работы. К 0,5 мл раствора ДНК добавляют 0,05 мл раство-
ра солянокислого цистеина и смесь охлаждают в течение 10 мин в
холодной воде. Затем добавляют 5 мл охлажденной концентрирован-
ной серной кислоты и после перемешивания помещают на водяную
баню при t 25 °C на 20 мин. Окрашенный раствор спектрофотометри-
руют при длине волны (X) 474 нм.
8. Количественное определение нуклеиновых кислот по Спирину
Принцип метода. Метод основан на определении разницы в эк-
стинкциях хлорных экстрактов тканей при К 270 и 290 нм.
Материалы и реактивы. Ткань, раствор НС1О4 (0,5 моль/л).
Оборудование. Центрифужные пробирки, пипетки, водяная ба-
ня, центрифуга, спектрофотометр.
Ход работы. В центрифужную пробирку помещают 5—10 мл
раствора НС1О4 и навеску ткани (5—500 мг). Содержимое пробир-
ки нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После
охлаждения центрифугируют и используют надосадочную жидкость
для определения адсорбции в ультрафиолетовой части спектра на
45
спектрофотометре, сравнивая со «слепой» пробой раствором НС1О4
при X 270 и 290 нм в кварцевых кюветах шириной 1 см. В результа-
те деления разницы полученных величин на величину удельной эк-
стинкции (£уд) получим количество нуклеинового фосфора в 1 мл
испытуемого раствора. Удельная экстинкция, которая при X 270 нм
является практически одинаковой для РНК и ДНК, соответствует
массовой концентрации (1 мкг) нуклеиновой кислоты в 1 мл раство-
ра. Для пересчета количества фосфора на содержание нуклеиновых
кислот пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3 (для
РНК — 10,5, для ДНК — 10,1)
£фнк — £*270 £29о/£уд,
где СфНК — концентрация нуклеиновой кислоты (мкг/мл); Е —
оптическая плотность исследуемого раствора при соответствующей
длине волны; £уд—удельная экстинкция, равна 0,19.
3.2. ОБМЕН НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
1. Определение содержания АТФ в мышечной ткани
Принцип метода. Метод основан на измерении нарастания со-
держания неорганического фосфата в безбелковом фильтрате после
кислотного гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты в течение
7 мин при t 100 °C (АТФ предварительно выделяют в виде ртутной
соли).
Неорганический фосфор определяют колориметрическим мето-
дом Фиске—Суббароу. Суть этого метода заключается в том, что ор-
тофосфорная кислота образует с молибденовой кислотой комплекс-
ное соединение, которое легко восстанавливается с образованием
окрашенной в синий цвет молибденовой сини.
Материалы и реактивы. Мышцы, 10 %-ный раствор трихлорук-
сусной кислоты, 0,5 и 20 %-ные растворы ацетата ртути, растворы
соляной кислоты (0,1 и 2 моль/л), 0,5 %-ный спиртовый раствор фе-
нолфталеина, раствор гидроксида натрия (5 моль/л), 2,5% -ный ра-
створ молибдата аммония в растворе серной кислоты (2,5 моль/л),
0,1 %-ный раствор аскорбиновой кислоты, стандартный раствор
фосфата (0,1099 г КН2РО4 растворяют в мерной колбе в 1 л воды,
в 1 мл этого раствора содержится 0,025 мг фосфора), кварцевый
песок, фильтры.
Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком и гомогенизатор,
штатив с пробирками, пробирки центрифужные, пробирки мерные
(объем 10 мл), центрифуга, водяная баня, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. Гомогенизированные в гомогенизаторе или растер-
тые в фарфоровой ступке с кварцевым песком при охлаждении мыш-
цы (1 г) переносят в мерную пробирку, доводят раствором трихлор-
уксусной кислоты до объема 10 мл, перемешивают, оставляют на
30 мин и фильтруют. К 2 мл фильтрата добавляют 0,5 мл 20 % -ного
раствора ацетата ртути, хорошо перемешивают и через 15 мин цен-
трифугируют при 3000 g в течение 10 мин. Центрифугат сливают и
46
отбрасывают, а осадок два раза промывают 1—2 мл 0,5 %-ного
раствора ацетата ртути. Затем осадок растворяют в 1 мл раствора
соляной кислоты (0,1 моль/л), заливают водой до объема 3 мл, хо-
рошо перемешивают. Затем по 1 мл полученной смеси вносят в две
мерные пробирки. В одну доливают 1 мл раствора соляной кислоты
(2 моль/л), нагревают на кипящей водяной бане в течение 7 мин,
охлаждают, добавляют каплю фенолфталеина и нейтрализуют рас-
твором гидроксида натрия до появления едва заметного розового
окрашивания. В обе пробирки вносят по 1,2 мл раствора молибда-
та аммония и 1 мл раствора аскорбиновой кислоты (в методе Фис-
ке—Суббароу в качестве восстановителя применяется 1-амино-2-
нафтол-4-сульфоновая кислота или эйконоген), доливают водой до
метки, перемешивают. Через 20 мин колориметрируют в фотоэлек-
троколориметре против контрольной пробы при красном светофиль-
тре. Для приготовления контрольных растворов в мерные пробир-
ки емкостью 10 мл наливают по 0,5,1 и 2 мл стандартного раствора
фосфата и проводят такие же реакции, как и для исследуемых проб.
Рассчитывают массовую концентрацию фосфора (мг/мл) по фор-
муле
С = afonVoVji/fcTVjbV'j,
где С — содержание фосфора в исследуемом образце; Е„— экстинк-
ция стандартного раствора; Еоп — экстинкция исследуемого раство-
ра; Уо — объем исследуемого раствора (10 мл); Vj — объем исследу-
емого раствора, взятого для осаждения АТФ (2 мл); V2 — объем
исследуемого раствора после растворения осадка (3 мл); V3 — объем
исследуемого раствора, взятого для колориметрирования (1 мл);
а — количество фосфора в 10 мл стандартного раствора (мкг); b —
навеска мышц (г).
2. Определение активности рибонуклеазы
Принцип метода. Рибонуклеаза — это фермент, расщепляю-
щий полимерную молекулу РНК на низкомолекулярные фрагмен-
ты — моно- и олигонуклеотиды, количественное определение кото-
рых проводят спектрофотометрически при X 260 нм (максимум по-
глощения нуклеотидов).
Материалы и реактивы. Раствор дрожжевой РНК (1 мг/мл)
в ацетате натрия (0,1 моль/л), 0,2 %-ный водный раствор панкреа-
тической РНКазы, спиртово-магниевый осадитель — 80 %-ный
этанол, содержащий 0,01 моль/л MgCl2, лед.
Оборудование. Центрифужные пробирки, пипетки, термостат
(/ 37 °C), центрифуга, спектрофотометр.
Ход работы. К 0,4 мл раствора дрожжевой РНК в центрифуж-
ную пробирку вносят 0,2 мл раствора РНКазы (в качестве источ-
ника фермента можно использовать 5 %-ные водные гомогенаты тка-
ни объемом 0,5 мл, разбавленную в 10 раз слюну), перемешивают
и помещают в термостат на 30—60 мин при t 37 °C. В пробирку вно-
сят 1 мл спиртово-магниевого осадителя и помещают на ледяную
баню. Через час образуется осадок РНК, который удаляют центри
фугированием при 8000 g в течение 20 мин. Затем отбирают 2—3 про-
47
бы надосадочной жидкости (0,5 мл), прибавляют к каждой по
3 мл дистиллированной воды, перемешивают и измеряют оптическую
плотность раствора на спектрофотометре против воды. Параллельно
обрабатывают контрольную пробу, внося осадитель до прибавления
ферментного раствора.
Прирост поглощения в опытной пробе по отношению к контроль-
ной (ДЁгбо) служит показателем активности РНКазы и использу-
ется для расчета активности фермента по формуле
А =
где — объем пробы после разбавления; V2 — объем пробы после
осаждения РНК спиртово-магниевым раствором; Va— объем про-
бы, взятой для разбавления; Д£2во — прирост экстинкции опытной
пробы по отношению к контрольной; t — время инкубации (мин)
W — масса белка (фермента) в пробе (мг).
3. Определение активности дезоксирибонуклеазы по Олфри и
Мирскому
Принцип метода. Вследствие действия дезоксирибонуклеазы
на ДНК образуются кислотные группы, которые обесцвечивают
индикатор феноловый красный.
Материалы и реактивы. Ткань, раствор хлорида натрия
(0,14 моль/л), субстратный раствор, состоящий из 1 мл (2 мг) рас-
твора натриевой соли ДНК, 1 мл раствора сульфата натрия
(0,05 моль/л) и 0,4 мл раствора фенолового красного. Для приго-
товления индикатора фенолового красного необходимо 10 мг фе-
нолсульфофталеина, 0,28 мл раствора гидроксида натрия
(0,1 моль/л), 3 мл 96 %-ного этанола, 40 мл 0,02 моль/л раствора
фосфатного буфера (pH 7,55). Смесь заливают водой до объема
100 мл, pH субстратного раствора (2,4 мл) доводят до 7,55, добавляя
раствор гидроксида натрия (0,01 моль/л) и доливают водой до объе-
ма 3 мл; pH субстратного раствора проверяют путем сравнения с
окраской стандартного раствора, состоящего из 0,4 мл раствора
фенолового красного и 2,6 мл 0,02 моль/л раствора фосфатного бу-
фера (pH 7,55).
Оборудование. Пипетки, центрифужные пробирки, фарфоровая
ступка с пестиком, центрифуга, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. Быстро растирают 15 мг ткани в 10 мл охлажден-
ного раствора хлорида натрия. Гомогенат центрифугируют в тече-
ние 15 мин при 10 000 g. К 3 мл субстратного раствора прибавляют
1 мл полученной надосадочной жидкости ферментного раствора.
Смесь сразу же переливают в кювету и измеряют оптическую плот-
ность на фотоэлектроколориметре при t 25 °C и % 558 нм (зеленый
светофильтр) в течение 10—15 мин с интервалом в 1 мин. Активность
фермента определяют графически. По оси абсцисс откладывают
время в минутах, по оси ординат — значения оптической плот-
ности. Активность фермента выражают снижением оптической плот-
ности комплекса ДНК и красителя, разрушающегося в результате
гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты за первые 3 мин ин-
кубации.
48
4. Качественная реакция на мочевую кислоту
Принцип реакции. Мочевая кислота как конечный продукт обме-
на пуриновых оснований в присутствии HNO3 способна превра-
щаться, с одной стороны, в аллоксан, а о другой — в диалуровую
кислоту. Аллоксан и диалуровая кислота при действии аммиака
дают сначала пурпуровую кислоту, а затем мурексид (аммонийная
соль пурпуровой кислоты) темно-красного цвета
Диалуровая кислота Мочевина
+ NHj
Пурпуровая кислота
Материалы и реактивы. Мочевая кислота, концентрированная
азотная кислота, 25 %-ный раствор аммиака.
Оборудование. Фарфоровый тигель, капельницы, газовая горелка.
Ход работы. Несколько кристаллов мочевой кислоты помещают
в фарфоровый тигель, добавляют 2—3 капли концентрированной
HNO3, осторожно выпаривают и, охладив, прибавляют 1 каплю
раствора аммиака. Образуется мурексид пурпурно-красного цвета.
5. Количественное определение мочевой кислоты в моче
Принцип метода. Метод основан на способности мочевой кисло-
ты восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив, в результате
49
чего образуются более низкие окисли вольфрама синего цвета,
интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию моче-
вой кислоты и определяется путем титрования красной кровяной
солью. Эта соль окисляет окислы вольфрама, и синий цвет раство-
ра исчезает.
Материалы и реактивы. Фосфорновольфрамовый реактив (к
100 г вольфрамовокислого натрия добавляют 80 мл 85 %-ного рас-
твора фосфорной кислоты, 900 мл воды, кипятят в течение 2-х часов
в колбе с обратным холодильником и после охлаждения доводят
объем до 1 л), раствор феррицианида калия (к 3,292 г К3 [Fe (CN)e]
добавляют 2 г КОН и растворяют в 1 л воды), стандартный раствор
мочевой кислоты — 0,5 мг в 1 мл (к 0,5 г высушенной мочевой кис-
лоты прибавляют 0,5 г Li2CO3, 25 мл волы, нагревают при t 50—
60 °C до растворения, охлаждают и разбавляют водой до объема
1 л), 20 %-ный раствор карбоната натрия, моча.
Оборудование. Микробюретки, пипетки, пробирки, колбы.
Ход работы. К 1,5 мл мочи прибавляют 1 мл фосфорновольфра-
мового реактива, 1 мл раствора Na2CO3, перемешивают и титруют
раствором К3 [Fe (CN)e] до исчезновения синего окрашивания.
Для определения содержания мочевой кислоты в моче необхо-
димо знать, какое количество мочевой кислоты соответствует 1 мл
К3 [Fe (CN)el. Например, на титрование стандартной пробы, содер-
жащей 0,25 мг мочевой кислоты в 0,5 мл, пошло 0,34 мл ферри-
цианида калия. В этом случае 1 мл реактива соответствует
(0,25 : 0,34) 0,73 мг мочевой кислоты.
Массовую концентрацию мочевой кислоты в суточной моче (мг)
вычисляют по формуле
С = QAB/V,
где А — количество К3 [Fe (CN)el, затраченного на титрование про-
бы (мл); В — суточное количество мочи (мл); V — объем мочи,
взятой для исследования (мл); Q — количество мочевой кислоты,
соответствующее 1 мл феррицианида калия.
ГЛАВА 4
АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ
4.1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ
4.1.1. Цветные реакции на карбоновые
аминокислоты
I. Нингидриновая реакция
Принцип реакции. В результате взаимодействия «-аминокисло-
ты с нингидрином (трикетогидринденгидратом) образуется окрашен-
ное комплексное соединение.
При нагревании (до t 70 °C) а-аминокислоты окисляются нингид-
рином и подвергаются окислительному дезаминированию с обра-
зованием аммиака и декарбоксилированию с образованием альде-
гида и СО2, а нингидрин восстанавливается
Восстановленный нингидрин, конденсируясь с аммиаком и окис-
ленным нингидридом, образует соединение, которое, енолизируясь,
переходит в окрашенную форму, имеющую сине-фиолетовый цвет
51
В присутствии органических растворителей, на которых готовят
раствор нингидрина (ацетон, этанол), возможно протекание побочной
реакции с образованием соединения, содержащего в своем составе
радикал (7?) аминокислоты
Наличие радикала аминокислоты в составе этого соединения
обуславливает различную окраску (красную, желтую, голубую)
соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидри-
ном.
Реакция с нингидрином является специфической для аминокис-
лот, содержащих а-аминогруппу, и характерна как для некоторых
карбонозых, так и циклических аминокислот. В реакции глицина
с нингидрином образуется комплексное соединение, имеющее сине-
фиолетовую окраску.
Материалы и реактивы. Водный 1 %-ный раствор глицина,
0,1 %-ный раствор нингидрина в 95 %-ном растворе ацетона.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, капельницы, во-
дяная баня, термометр лабораторный, часы, штатив для пробирок.
Ход работы. В пробирку вносят 5 капель раствора глицина и
2 капли раствора нингидрина. Содержимое пробирки тщательно
перемешивают на водяной бане при t 70 °C в течение 5 мин. В пробир-
ке появляется сине-фиолетовая окраска.
2. Реакция с азотистой кислотой
Принцип реакции. В результате взаимодействия «-аминокисло-
ты с азотистой кислотой, образуемой в реакции нитрита натрия с
уксусной кислотой, происходит образование газообразного азота.
Для глицина уравнение реакции имеет вид
Н
Н-С—NH2 + NaNO2 + СН3СООН ->
СООН
Н
Н—С—ОН + CH3COONa + Н2О + N2
СООН
Материалы и реактивы. Водный 1 %-ный раствор глицина,
5 %-ный раствор нитрита натрия, концентрированная уксусная
кислота.
52
Оборудование. Пробирки, капельницы, штатив для пробирок.
Ход работы. В пробирку вносят 5 капель раствора глицина,
5 капель нитрита натрия, 2 капли концентрированной уксусной
кислоты и осторожно взбалтывают смесь. Наблюдается выделение
газа.
3. Образование комплексной соли меди
Принцип реакции. При нагревании аминокислоты с карбонатом
меди (II) образуется комплексное соединение меди, имеющее си-
нее окрашивание. В случае использования глицина уравнение реак-
ции имеет вид
н С\ N
I / О. / X сП
2Н-С-Ь1Н2 + CuC03 — Н2С >Си-' | 2 + Н2С0э
I \ *** \ г ।
СООН. N-' О"'у |
НН ° С02 + Н20
Материалы и реактивы. Водный 1 %-ный раствор глицина, су-
хой карбонат меди.
Оборудование. Пробирки, штатив для пробирок, держатель про-
бирок, горелка.
Ход работы. В пробирку вносят 1 мл раствора глицина, а на
кончике лопатки — сухой карбонат меди (II). Смесь нагревают
в пламени горелки до кипения. Раствор окрашивается в синий цвет.
4. Реакция Сакагучи на аргинин
Принцип реакции. В реакции аргинина, содержащего гуаниди-
новую группировку, с гипобромитом происходит образование окис-
ленной формы аргинина, которая при взаимодействии с а-нафтолом
образует соединение красного цвета
CHNH,
СООН »соон
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор аргинина,
10 %-ный раствор гидроксида натрия, 0,1 %-ный спиртовый рас-
твор а-нафтола, 2 %-ный раствор гипобромита натрия, 40 %-ный
раствор мочевины.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
рованные, капельницы, штатив для пробирок.
Ход работы. В пробирку вносят 2 мл раствора аргинина, 2 мл
раствора гидроксида натрия и 3 капли спиртового раствора а-наф-
тола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и добавляют
53
3 капли раствора гипобромида натрия. Для стабилизации быстро
развивающегося красного окрашивания немедленно вливают 1 мл
раствора мочевины.
5. Реакция Фоля на «слабосвязанную» серу цистеина и цистина
Принцип реакции. При кипячении цистеина и цистина в щелоч-
ной среде от них легко отщепляется сера в виде сероводорода, ко-
торый в щелочной среде образует сульфид натрия. Для цистеина
уравнение реакции имеет вид
СН2—SH СН2—ОН
CH—NH2 + 2NaOH НагРеванне , CH—NH2 + Na2S + Н2О
соон соон
Образование сульфида натрия можно обнаружить с помощью
ионов тяжелых металлов, например, ионов свинца, образующих
с ионами серы нерастворимый сульфид свинца черного цвета. Для
выявления сульфида серы можно использовать ацетат свинца, ко-
торый при взаимодействии с гидроксидом натрия образует плюмбит
натрия. В свою очередь пломбит натрия, реагируя с сульфидом нат-
рия, приводит к образованию сульфида свинца
Pb (СН3СОО)2 + 2NaOH -> Pb (ONa)2 + 2СН3СООН
Na2S + Pb (ONa)2 + 2Н2О -> PbS + 4NaOH
Материалы и реактивы. Водный 0,01-ный раствор цистеина,
ректив Фоля (к 10 %-ному раствору ацетата свинца добавляют
10 %-ный раствор гидроксида натрия до растворения образовавшего-
ся осадка), концентрированный раствор гидроксида натрия.
Оборудование. Стеклянные палочки, штатив с пробирками, пи-
петки, водяная баня, часы.
Ход работы. В пробирку вносят 1 мл раствора цистеина, 2 мл
концентрированного раствора гидроксида натрия и 1 мл реактива
Фоля. Смесь тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане
2 мин. Через 3—5 мин выпадает бурый или черный осадок сульфида
свинца.
6. Биуретовая реакция на пептидные связи
Принцип реакции. Аминокислоты, способные образовывать не
менее двух пептидных связей (—СО—NH—), в щелочном растворе
в присутствии сульфата меди (II) образуют комплексы с атомами
меди, окрашенные в фиолетовый цвет.
Впервые реакция образования таких комплексных соединений
меди была проведена для биурета, поэтому она и названа биуре-
товой.
Биурет, который может быть получен при нагревании мочевины
до t 180 °C, не является аминокислотой, но имеет две пептидные
связи
2H2N—СО—NH2 Нагр™е., H2N-CO-NH-CO-NH2 4- NH3
54
В щелочной среде биурет претерпевает енолизацию по схеме
H2N—СО—NH—СО—NH2 & HN=C— NH—C=NH
I I
OH OH
Две молекулы енольной формы биурета взаимодействуют с гид-
роксидом меди (II) и образуют комплекс, в котором координацион-
ные связи образованы за счет электронных пар атомов азота имин-
ных групп.
Гидроксид меди (II) для проведения биуретовой реакции полу-
чают, как правило, в результате реакции взаимодействия сульфата
меди (II) с гидроксидом натрия (или калия)
CuSO4 + 2NaOH -> Си (ОН)2 + Na2SO4
Образование комплекса биурета с медью происходит по следу-
ющей схеме:
2HSN-CO-NH-CO-NH2 + Cu(OH)2 + 2NaOH —
i I II
NaO H H ONa
+ 4H2O
Подобный комплекс с медью могут создавать некоторые амино-
кислоты, у которых пептидные связи возникают за счет карбоксиль-
ной и аминогрупп. Примером такой аминокислоты может быть ас-
парагин.
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор аспараги-
на, 10 %-ный раствор гидроксида натрия (или калия), 10 %-ный
раствор сульфата меди.
Оборудование. Стеклянные палочки, штатив с пробирками, пи-
петки, капельница.
Ход работы. В пробирке к 3 мл раствора аспарагина добавля-
ют 1 мл раствора гидроксида натрия (или калия), 1—2 капли рас-
твора сульфата меди и перемешивают. Содержимое пробирки окраши-
вается в сине-фиолетовый цвет.
4.1.2. Цветные реакции на циклические аминокислоты
1. Ксантопротеиновая реакция
Принцип реакции. В ароматических аминокислотах, содержа-
щих бензольные кольца (тирозин, триптофан, фенилаланин), под
действием азотной кислоты происходит реакция нитрования бен-
зольного кольца с образованием окрашенного в желтый цвет
55
нитросоединения, Рассмотрим эту реакцию на примере тирозина
он
СН2— он- СООН
nh2
В реакции гидроксида натрия о хиноидной формой динитротиро-
зина образуется натриевая соль динитротирозина, имеющая оран-
жевую окраску
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор тирозина,
концентрированная азотная кислота, 10 %-ный раствор гидрокси-
да натрия.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, штатив для про-
бирок, пипетки, горелка.
Ход работы. В пробирку вносят 3 мл раствора тирозина и 1 мл
концентрированной азотной кислоты. Смесь осторожно нагревают
до появления желтой окраски. После охлаждения в пробирку до-
бавляют раствор гидроксида натрия до появления оранжевой
окраски.
2. Реакция Милона на тирозин
Принцип, реакции. В реакции ароматической аминокислоты ти-
розина, содержащей фенольное ядро о реактивом Милона (смесь
нитратов и нитритов ртути (I) и (II), растворенных в концентриро-
ванной азотной кислоте) образуется ртутная соль тирозина, име-
ющая красную окраску
сн2-сн-соон
nh2
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор тирози-
на, реактив Милона (40 г ртути растворяют в 57 мл концентриро-
56
ванной азотной кислоты и разбавляют двумя объемами воды, дают
отстояться и используют надосадочную жидкость).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок, горелка, часы.
Ход работы. К 3 мл раствора тирозина добавляют 1 мл раствора
Милона, тщательно перемешивают. Через 10 мин раствор окрашива-
ется в красный цвет. Для ускорения появления окраски раствор
можно подогреть.
3. Реакция Адамкевича на триптофан
Принцип реакции. Триптофан в кислой среде вступает в реакцию
с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окра-
шенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор триптофа-
на, ледяная уксусная кислота, концентрированная серная кислота.
Оборудование. Пробирки, пипетки градуировочные, штатив для
пробирок, водяная баня, часы.
Ход работы. К 0,5 мл раствора триптофана добавляют 0,5 мл
ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое ко-
личество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагре-
вают, а затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по кап-
лям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 1 мл концентри-
рованной серной кислоты. Через 10 мин на границе раздела двух
слоев наблюдается образование красно-фиолетового кольца. Реак-
цию можно ускорить, поместив пробирку с реагирующей смесью
в капящую водяную баню.
4. Реакция Вуазене на триптофан
Принцип метода. Триптофан, конденсируясь с формальдегидом,
образует окрашенный продукт конденсации бцс-2-триптофанилме-
тан, который окисляется до бис-2-триптофанилкарбинола
соон
57
СООН СООН
I I,
CHNHa CHNHa
В присутствии минеральных кислот бис-2-триптофанилкарби-
нол образует соли, окрашенные в сине-фиолетовый цвет.
Материалы и реактивы. Водный 0,01 %-ный раствор триптофа-
на, водный 2,5-ный раствор формальдегида, концентрированная
серная кислота, 0,5 %-ный раствор нитрата натрия.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, часы, ванночка со льдом.
Ход работы. К 2 мл раствора типтофана добавляют одну каплю
раствора формальдегида, смесь перемешивают и вливают порциями
по несколько капель 6 мл концентрированной серной кислоты, ох-
лаждая пробирку в ванночке со льдом. Смесь опять перемешивают
и дают отстояться 10 мин. В дальнейшем при перемешивании в про-
бирку вносят 10 капель раствора нитрита натрия. Возникает интен-
сивная сине-фиолетовая окраска.
5. Реакция Паули на гистидин и тирозин
Принцип реакции. При взаимодействии сульфониловой кислоты
+ NaNOj + HCI
so;
+ 2Н2О + NaCI
№N
58
в кислой среде с нитритом натрия (калия) происходит реакция диа-
зотирования и образуется диазобензол-сульфоновая кислота, ко-
торая в реакции с гистидином (или тирозином) образует комплекс-
ное соединение вишнево-красного цвета
Материалы и реактивы. Водный 0,01 % -ный раствор гистидина,
1 %-ный раствор сульфониловой кислоты в 5 %-ном растворе соля-
ной кислоты, 0,5 %-ный раствор нитрита натрия, 10 %-ный рас-
твор карбоната натрия.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок.
Ход работы. К 1 мл раствора сульфониловой кислоты добавляют
2 мл раствора нитрита натрия. После перемешивания в смесь немед-
ленно вливают 2 мл раствора гистидина и после тщательного пере-
мешивания — 6 мл раствора карбоната натрия. После перемеши-
вания раствор окрашивается в вишнево-красный цвет.
4.1.3. Цветные реакции на белки
1. Биуретовая реакция на обнаружение пептидных связей в
белках
Принцип реакции. Белки (полипептиды) в щелочном растворе
в присутствии сульфата меди (II) образуют комплексные соединения
меди, окрашенные в сине-фиолетовый цвет, интенсивность которого
зависит от количества пептидных связей в молекуле белка.
Первоначально пептидные группы полипептида претерпевают
в щелочной среде енолизацию
ОН
I
NH2—СН—СО—NH—СН—СО—N Н—СН—СО
I I I
Ri R2 R3
ОН он он
I I I
-> NH2—СН—C=N—СН—C=N—СН—СО
I I !
Ri Ra R3
Енольная форма полипептида взаимодействует с гидроксидом
меди (II) и образуют окрашенный в сине-фиолетовый цвет комплекс
V3
О HC-COONa 11 1 С— ...... 1 с НС—N—- 1 II R. С—ONa 1 R, NaOOC-CH О 1 II —N—С :и • N—СН 11 1 NaO-C R, r2
59
Продукты неполного гидролиза белка (пептиды) дают красное
или розовое окрашивание в биуретовой реакции.
Материалы и реактивы. Разбавленный 1 %-ный раствор яич-
ного белка, 10 %-ный раствор гидроксида натрия (или калия),
1 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование. Стеклянные палочки, штатив с пробирками, пи-
петки, капельница.
Ход работы. К 3 мл раствора яичного белка добавляют 1 мл
раствора гидроксида натрия, 1—2 капли раствора сульфата меди,
перемешивают. Содержимое пробирки окрашивают в красно-фиоле-
товый цвет.
2. Цветные реакции с белками на обнаружение карбоновых
аминокислот
Принцип реакции. Для обнаружения с помощью цветных реак-
ций остатков карбоновых аминокислот, входящих в состав бел-
ков, используют характерные для этих аминокислот цветные реак-
ции (раздел 4.1.1). Так, при выявлении а-аминокислот используют
нингидриновую реакцию (раздел 4.1.1, работа 1), аргинина — реак-
цию Сакагучи (работа 4), цистеина и цистина — реакцию Фоля
(работа 5).
Материалы и реактивы. Раствор яичного белка (1 %-ный),
10 %-ный раствор гидроксида натрия, 2 %-ный раствор гипоброми-
да натрия, 0,1 %-ный спиртовый раствор а-нафтола, 1 %-ный рас-
твор нингидрина в 95 %-ном растворе ацетона, реактив Фоля (раз-
дел 4.1.1, работа 5).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, штатив для про-
бирок, пипетки градуировочные, водяная баня, термометр лабора-
торный, часы.
Ход работы.
А. Нингидриновая реакция. К 1 мл раствора яичного белка
добавляют 3 капли раствора нингидрина. Смесь перемешивают и
ставят на водяную баню при t 70 °C на 5 мин. Наблюдают образова-
ние сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующего о присут-
ствии в молекуле белка остатков а-аминокислот.
Б. Реакция Сакагучи. В пробирку вносят 0,5 мл раствора
яичного белка, 0,5 мл раствора гидроксида натрия, 3 капли раство-
ра а-нафтола и после перемешивания — 2—3 капли раствора гипо-
бромида натрия. Наблюдают образование красного окрашивания,
свидетельствующего о наличии в белке остатков аргинина.
В. Реакция Фоля. К 3 мл раствора яичного белка добавляют
3 мл реактива Фоля и после перемешивания кипятят на водяной
бане в течение 2 мин. После остывания наблюдают образование бу-
рого или черного осадка, свидетельствующего о наличии в молеку-
ле белка остатков цистеина и цистина.
3. Цветные реакции с белками на обнаружение циклических
аминокислот
Принцип реакции. Для обнаружения циклических аминокислот
в составе молекулы белка с помощью цветных реакций используют
характерные для этих аминокислот реакции (раздел 4.1.2). Так>
60
при выявлении остатков ароматических аминокислот используют
ксантопротеиновую реакцию (раздел 4.1.2, работа 1), тирозина —
реакцию Милона (работа 2), триптофана — реакцию Адамкевича
(работа 3), Вуазене (работа 4), гистидина и тирозина — реакцию
Паули (работа 5).
Материалы и реактивы. Раствор яичного белка (1 %-ный),
концентрированные азотная и серная кислоты, ледяная уксусная
кислота, 10 %-ный раствор гидроксида натрия, 10 %-ный раствор
карбоната натрия, 2,5 %-ный раствор формальдегида, 1 %-ный
раствор сульфаниловой кислоты в5%-ном растворе соляной кис-
лоты, 0,5 %-ный раствор нитрита натрия, реактив Милона (раз-
дел 4.1.2, работа 2).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки со штативом, пи-
петки градуировочные, капельницы, водяная баня, термометр ла-
бораторный, ванночка со льдом, часы, горелка.
Ход работы.
А. Ксантопротеиновая реакция. К 1 мл раствора яичного белка
добавляют 3 капли раствора нингидрина. Смесь перемешивают и
ставят на водяную баню при t 70 °C на 5 минут. Развивается сине-
фиолетовое окрашивание.
Б. Реакция Милона. В пробирку вносят 3 мл раствора яич-
ного белка и 1 мл реактива Милона. Содержимое пробирки тщатель-
но перемешивают. Через 10 мин выпавший белый осадок осторож-
но нагревают и наблюдают его окрашивание в красный цвет.
В. Реакция Адамкевича. К 0,5 мл раствора яичного белка до-
бавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, содержащей небольшие
количества глиоксиловой кислоты. Смесь нагревают до растворе-
ния образующегося осадка. К охлажденной смеси затем осторожно
(каплями) по стенке пробирки вливают 1 мл концентрированной
серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. Через 10 мин
на границе раздела двух жидкостей образуется красно-фиолетовое
кольцо. Реакцию можно ускорить, если пробирку поместить в кипя-
щую водяную баню. Чувствительность реакции можно повысить,
если в реагирующую смесь поместить небольшое количество меди
(5—10 капель 0,04 моль/л сульфата меди).
Г. Реакция Вуазене. В пробирку вносят 2 мл раствора яичного
белка и 1 каплю раствора формальдегида. К полученной смеси, тща-
тельно перемешивая, добавляют осторожно по каплям 6 мл концен-
трированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со
льдом. Черезд 10 мин в пробирку вливают, перемешивая, 10 капель
раствора нитрита натрия. Наблюдается сине-фиолетовая окраска.
Д. Реакция Паули. В пробирку вносят 1 мл раствора сульфани-
ловой кислоты в растворе соляной кислоты, 2 мл раствора нитрита
натрия и после тщательного перемешивания 2 мл раствора яичного
белка и 6 мл раствора карбоната натрия. После перемешивания
смесь окрашивается в вишнево-красный цвет.
61
4.2. СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ, МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ
И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1. Амфотерные свойства а-аланина
Принцип реакции. Аланин в водном растворе существует в форме
биполярного иона и обладает кислотными и основными свойствами.
Н Н
СНв—С—СОО“ 4- Н+ СН3—С—СООН
N+H3 N+H3
н н
СН3—С—СОСГ сн3—с—сосг+ н+
N+H3 NH2
Материалы и реактивы. Водный 1 %-ный раствор а-аланина,
0,1 %-ный раствор соляной кислоты, подкрашенный индикатором
конго в синий цвет (кислая среда), 0,1 %-ный раствор гидроксида
натрия, подкрашенный фенолфталеином в розовый цвет (щелочная
среда).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки со штативом, пи-
петки градуировочные, капельницы.
Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора а-ала-
нина. В одну из них добавляют, перемешивая, по каплям раствор
соляной кислоты до появления розово-красной окраски (щелочная
среда). В другую пробирку, постоянно перемешивая, вливают по
каплям раствор гидроксида натрия до исчезновения окраски (кис-
лая среда).
2. Выделение свободных аминокислот из биологического ма-
териала
Принцип метода. Свободные аминокислоты извлекают из био-
логического материала 75—80 %-ным водным раствором этанола.
Аминокислоты в вытяжке из биологического материала обнаружи-
вают реакцией с нингидрином (раздел 4.1.1, работа 1).
Материалы и реактивы. Сухой размолотый биологический мате-
риал (ткань экспериментального животного, фиксированная эта-
нолом при нагревании и переведенная в сухой порошок), складча-
тые фильтры бумажные, 70 %-ный водный раствор этилового спирта,
1 %-ный водный раствор соляной кислоты, 1 %-ный раствор нингид-
рина в 95 %-ном ацетоне.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, капельницы,
пипетки, ступка форфоровая с пестиком, чашка выпаривательная,
водяная баня, термометр лабораторный, воронки стеклянные, часы.
Ход работы. В ступку помещают 2 г размолотого сухого биоло-
гического материала и заливают 10 мл 75 %-ного раствора этило-
вого спирта, нагретого до t 60—70 °C на водяной бане. Полученную
смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через
62
вставленный в воронку складчатый бумажный фильтр в чашку для
выпаривания, используя ее в качестве приемника. Чашку помеща-
ют на кипящую водяную баню и полностью выпаривают спирт.
Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл раствора соляной
кислоты и тщательно его растирают стеклянной палочкой в течение
10—15 мин. Для обнаружения аминокислот в вытяжке к 5 каплям
смеси добавляют 2 мл дистиллированной воды (разводят вытяжку)
и 3—4 капли раствора нингидрина. Полученную смесь тщательно
перемешивают и нагревают на водяной бане при t 70 °C в течение
5 мин. Появляется сине-фиолетовая окраска, свидетельствующая
о наличии в пробе а-аминокислот.
Если плотность окраски вытяжки с нингидрином измерить с по-
мощью колориметра и сопоставить с плотностью окраски нингидри-
ном смеси а-аминокислот известной концентрации, то можно рас-
считать концентрацию а-аминокислот в исследуемой пробе.
3. Определение отдельных аминокислот хроматографическими
методами
Метод распределительной (радиальной)
хроматографии на бумаге
Принцип метода. Применение метода распределительной хрома-
тографии на бумаге для разделения аминокислот основано на раз-
личии в коэффициентах распределения отдельных аминокислот меж-
ду двумя несмешивающимися жидкостями. Используемая в качест-
ве инертного носителя хроматографическая бумага способна удер-
жать в порах большое количество неподвижной жидкой фазы.
Коэффициент распределения Rt (раздел 2.1.1, работа 11), опре-
деляемый как отношение расстояний, пройденных аминокислотой
и подвижной фазой от точки старта, является характерной величи-
ной для каждой аминокислоты в определенных условиях опытов
(состав растворителя, температура, сорт хроматографической бу-
маги).
Положение аминокислот на бумаге определяют с помощью цвет-
ной реакции с нингидрином (раздел 4.1.1, работа 1). В присутствии
нингидрина отдельные аминокислоты выявляются в виде пятен,
окрашенных в голубой, фиолетовый, желтый или другой цвет (в
зависимости от химической структуры аминокислоты).
Идентификацию аминокислот в смеси проводят по распределе-
нию известных аминокислот (стандартов).
Материалы и методы. Хроматографическая бумага, раствори-
тель — смесь н-бутанола, уксусной кислоты, воды (4:1: 1), смесь
аминокислот и их стандартные растворы (0,1 %-ный растворы ала-
нина, лейцина и глутаминовой кислоты), свежеприготовленный
нингидриновый реактив (95 мл 0,5 %-ного раствора нингидрина
в 95 %-ном ацетоне, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистил-
лированной воды).
Оборудование. Эксикатор или чашка Петри, пульверизатор,
микропипетки, сушильный шкаф, карандаш, линейка, часы.
Ход работы. Хроматографическую бумагу вырезают в форме
круга, диаметр которого равен поверхностному радиусу эксикатора
63
(или чашки Петри). Простым карандашом круг разделяют на сег-
менты, в центре делают небольшое отверстие (0,5—1 см), в которое
вставляют свернутую в трубочку фильтровальную бумагу (фитиль).
Изменяя толщину и длину фитиля, который опущен в раствори-
тель, регулируют скорость подачи растворителя на хроматографи-
ческую бумагу.
Карандашом у основания фитиля на хроматографической бума-
ге в каждом сегменте намечают точку нанесения аминокислот. На
один из сегментов с помощью микропипетки наносят смесь амино-
кислот (5—10 мкл раствора аланина, лейцина и глутаминовой кис-
лоты), на другой сегмент — такое же количество аминокислот —
стандартов. Затем хроматографическую бумагу высушивают на
воздухе в течение 10 мин. В эксикатор (или чашку Петри) налива-
ют растворитель — смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды
(4:1: 1) в таком объеме, чтобы фитиль был погружен в растворитель.
Круговую хроматограмму помещают в эксикатор (или между дву-
мя половинками чашки Петри). Хроматограмма с диаметром 12 см
образуется примерно через 1 ч, с диаметром 20 см — через 2 ч. Пос-
ле завершения распределения (фронт растворителя дошел до уста-
новленной отметки) хроматограмму высушивают и проявляют, оп-
рыскивая нингидриновым реактивом из пульверизатора и прогре-
вая в сушильном шкафу в течение 10 мин при температуре ПО °C.
Сравнивая положение пятен смеси аминокислот с положением
пятен аминокислот-стандартов, проводят идентификацию пятен
смеси аминокислот. С помощью линейки определяют расстояния,
пройденные фронтом растворителя и аминокислотами, и вычисляют
значения коэффициента распределения.
Разделение смеси аминокислот методом
распределительной хроматог р афии в тон-
ком слое целлюлозы
Принцип метода. На стеклянные пластинки наносят тонкий слой
пористого носителя, например, целлюлозы. Пластинки помещают
в растворитель (жидкая фаза), который, продвигаясь по слою за
счет капиллярных сил, перемещает с различными скоростями ком-
поненты смеси аминокислот. После проявления с помощью нингид-
риновой реакции на хроматограмме обнаруживаются пятна. Иден-
тификацию положения аминокислот в смеси проводят, сравнивая
положение пятен анализируемой смеси с положением пятен амино-
кислот-стандартов.
Принцип метода хроматографического разделения смеси амино-
кислот в тонком слое аналогичен методу хроматографии на бумаге.
Однако этот метод позволяет почти в 10 раз уменьшить концентра-
цию веществ, подвергающихся исследованию.
Материалы и реактивы. Целлюлоза, растворитель — смесь
н-бутанола, уксусной кислоты, воды (4:1: 1), смесь аминокислот
и их стандартные растворы (0,1 %-ные растворы лизина, глицина
и фенилаланина, приготовленные на 10 %-ном изопропиловом спир-
те, подкисленном соляной кислотой), свежеприготовленный нингид-
риновый реактив (95 мл 0,5 %-ного раствора нингидрина в 95 %-ном
64
ацетоне, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной
воды).
Оборудование. Хроматографическая камера, стеклянные плас-
тинки (13 X 18 см), пульверизатор, микропипетки, сушильный
шкаф, карандаш, линейка, апликатор.
Ход работы. Тщательно вымытые и обезжиренные стеклянные
пластинки покрывают с помощью апликатора суспензией целлюло-
зы в дистиллированной воде (3 г целлюлозы, 14 мл воды на 1 плас-
тинку) и высушивают при комнатной температуре в течение 12 ч.
На пластинку на расстоянии 2 см от ее нижнего края наносят по
20 мкл смеси аминокислот и их стандартные растворы. Пятна,
возникающие на пластинке при нанесении исследуемых веществ,
подсушивают для того, чтобы диаметр их находился в пределах 3—
4 мм.
Пластинку помещают в хроматографическую камеру, насыщен-
ную парами растворителя, погружая нижний край пластинки в
растворитель на 0,5—1 см. Хроматографию прекращают, когда
фронт растворителя достигнет отмеченного уровня — не менее
10 см (примерно 1 ч хроматографирования).
После хроматографирования пластинку высушивают и проявля-
ют, опрыскивая нингидриновым реактивом из пульверизатора и про-
гревая в течение 10 мин при температуре ПО °C. Сравнивая поло-
жение пятен смеси аминокислот с положением пятен их стандартов,
проводят идентификацию аминокислот. Определив с помощью
линейки расстояние, пройденное растворителем и аминокислотами,
рассчитывают коэффициент распределения Rf так же, как при раз-
делении липидов (раздел 2.1.1, работа 11) и аминокислот с по-
мощью метода радиальной хроматографии на бумаге.
Разделение аминокислот методом ионооб-
менной колоночной хроматографии
Принцип метода. В ионообменной хроматографии анализируе-
мые смеси разделяют на полизарядных материалах, которые нерас-
творимы в воде и содержат ионогенные группы. Метод разделения
основан на различных значениях изоэлектрической точки (ИЭТ)
разных аминокислот: основные аминокислоты (ИЭТ при pH 7),
нейтральные (ИЭТ при pH 5,5—6,5) и кислые (ИЭТ при pH 5).
Материалы и реактивы. Ионообменная смола Дауэкс (1 X 10),
1 моль/л и 3 ммоль/л соляная кислота, 0,05 %-ный раствор уксус-
ной кислоты, 0,2 %-ные растворы глутаминовой и аспарагиновой
кислот, 1 %-ный раствор нингидрина в 95 %-ном ацетоне.
Оборудование. Стеклянные палочки, пипетки, пробирки, штатив
для пробирок, капельницы, хроматографическая колонка (0,8 X
X 0,8 см), фотоэлектроколориметр.
Ход работы. Хроматографическую колонку, заполненную ио-
нообменной смолой Дауэкс (1 X 10), промывают 5 объемами 1 моль/л
раствора соляной кислоты, а затем дистиллированной водой.
В дальнейшем колонку промывают одним объемом (3 ммоль/л) раство-
ра соляной кислоты (pH 3,0) и наносят 3 мл смеси растворов глута-
миновой и аспарагиновой кислот (pH 3—4). Элюцию аминокислот
65
начинают раствором уксусной кислоты. Первой элюируется глута-
миновая кислота. Элюант контролируют по реакции с нингидрином
(раздел 4.1.1, работа 1), определяя экстинкцию на фотоэлектроколо-
риметре до тех пор, пока экстинкция раствора резко снизится, при-
ближаясь к нулю. После выхода глутаминовой кислоты начинают
элюирование аспарагиновой кислоты I моль/л раствором соляной
кислоты. Элюант аспарагиновой кислоты контролируют также, как
и глутаминовой кислоты.
По полученным значениям экстинкции строят кривые выхода
глутаминовой и аспарагиновой кислот из колонки — по оси абсцисс
откладывают значения экстинкции, а по оси ординат — номер проб.
Для определения количества аминокислот в разделяемой смеси
необходимо построить калибровочные графики для каждой из ами-
нокислот по стандартным их растворам. Хроматографирование сме-
си аминокислот и стандартов, а также определение экстинкции их
раствора с нингидрином необходимо строго проводить в одних ус-
ловиях. Суммируя значения, найденные во всех пробах, проверяют
полноту снятия с колонки аминокислот-стандартов. Определив эк-
стинкцию исследуемой аминокислоты из смеси, по калибровочным
графикам находят ее количество.
4. Определение аминокислот формолтитрованием по Сьоренсону
Принцип метода. Метод основан на способности аминокислот
реагировать с нейтральным раствором формальдегида с образова-
нием метиленаминокислот. Этот метод применяется для определения
карбоксильных групп аминокислот, которые титруют раствором ще-
лочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом.
Во время реакции с формальдегидом аминогруппа теряет основные
свойства, при этом образуется метиленаминокислота, которая оттит-
ровывается щелочью
Н Н
I 1
R—С—NH2 + Н—-> R—С—N=CH2 + Н2О
I ХН I
СООН СООН
н н
R—С—N=CH2 + NaOH -> R—С—N=CH2 + Н2О
СООН COONa
Определяя количество карбоксильных групп титрованием, мож-
но одновременно определить и количество а-аминогрупп, так как
количество карбоксильных групп эквивалентно количеству связан-
ных с формальдегидом а-аминогрупп.
Материалы и реактивы. Складчатый бумажный фильтр, сухой
хлористый барий, 1 %-ная смесь аминокислот (вытяжка аминокислот
из биологического материала или биологическая жидкость — моча),
0,1 %-ный спиртовый раствор фенолфталеина, 0,01 моль/л раствор
66
соляной кислоты, 0,05 моль/л раствор гидроксида калия, формоль-
ная смесь (к 50 мл 40 %-ного раствора формальдегида добавляют
10 капель 0,1 %-ного раствора фенолфталеина и по каплям 0,1 моль/л
раствор гидроксида калия до образования слабой розовой окраски).
Оборудование. Колбы мерные (объем 100 мл), капельницы, ворон-
ка стеклянная, бюретка, часы.
Ход работы. К 25 мл смеси аминокислот в колбе прибавляют
1 г хлористого бария, 10 капель раствора фенолфталеина и переме-
шивают. К смеси приливают насыщенный раствор баритовой воды
до появления едва заметного розового окрашивания. Колбу закры-
вают и оставляют на 15 мин. Затем разбавляют водой до объема
100 мл и отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр от
фосфорнокислых и углекислых солей бария. Готовят две колбы объ-
емом 100 мл. В одну вносят 40 мл фильтрата, что соответствует 10 мл
раствора аминокислот, во вторую — 40 мл дистиллированной воды.
Прибавляют по 10 капель раствора фенолфталеина и раствор соля-
ной кислоты (осторожно) до окрашивания растворов (контроля и
пробы) в едва заметный розовый цвет. Затем в обе колбы вносят по
10 мл формольной смеси и титруют из бюретки раствором гидроксида
калия до появления едва заметной розовой окраски. Цвет контроля
и пробы должен быть одинаковым.
Массовую концентрацию аминокислот (мг/мл) рассчитывают по
формуле
С = (Д-В)Ж,
где А и В — объемы раствора гидроксида калия, затраченные на
титрование пробы и контроля соответственно (мл); / — коэффи-
циент поправки на титр 0,05 моль/л раствора гидроксида калия;
Q — масса аминокислот, эквивалентная 1 мл 0,05 моль/л раствора
гидроксида калия (0,7 мг); V — объем раствора аминокислоты, взя-
того для анализа.
4.3. СВОЙСТВА ПРОСТЫХ БЕЛКОВ,
МЕТОДЫ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ
И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1. Реакции осаждения белков
Принцип реакций. Нарушение факторов, стабилизирующих
структуру молекулы белка, приводит к осаждению белков. Так,
при кипячении большинства белков нарушаются связи, свойствен-
ные нативному состоянию молекулы белка. Лучший способ осажде-
ния белков — кипячение в средах, имеющих значение pH, равное
изоэлектрической точке белков. Внесение в раствор белка нейт-
ральных солей (сульфата аммония, хлорида натрия и др.) облег-
чает и ускоряет осаждение при кипячении в результате возникаю-
щего дегидратирования белковых частиц.
Минеральные и некоторые органические кислоты, органические
растворители осаждают белки в результате денатурации и дегидра-
67
тации белковых молекул, а также в результате образования комп-
лексных солей белков с кислотами.
Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами (тани-
ном, пикриновой, гексациановой, фосфорно-вольфрамовой, фосфор-
но-молибденовой, ферритовой кислотами и их солями) обусловлен
образованием нерастворимых соединений этих реактивов с азоти-
стыми группами белка. В таких соединениях алкалоидные реактивы
являются анионами, а белки — катионами. Для придания молекуле
белка положительного заряда раствор белка подкисляют уксус-
ной кислотой. В результате этого положительно заряженные части-
цы белка легко взаимодействуют с отрицательно заряженными мо-
лекулами осадителя. Белки, имеющие положительный заряд (про-
тамины, гистоны), хорошо осаждаются алкалоидными реактивами в
среде без предварительного подкисления среды инкубации.
Соли тяжелых металлов (меди, ртути, цинка, серебра, свинца)
осаждают белки в результате образования комплексных соединений
с сульфгидрильными группами белков. Осадок белка в избытке со-
лей некоторых тяжелых металлов (ацетата свинца, сульфата меди)
растворяется. Это связано с тем, что избыток ионов этих металлов,
адсорбируясь на поверхности белковых частиц, вызывает перезаряд-
ку белкового комплекса, в результате чего он переходит в рас-
твор.
В водном растворе большинство белков и их частиц (мицелл)
заряжены и гидратированы, что обуславливает осаждение белков
в растворах. Но при высокой концентрации средних солей (сульфата
аммония, хлорида натрия), молекулы которых в водных растворах
гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых
молекул. В результате этого снижается электрический заряд белко-
вой молекулы адсорбирующимися на ней ионами соли, частицы бел-
ка слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок.
Материалы и реактивы. Раствор яичного белка (1 %-ный), на-
сыщенный раствор хлорида натрия, 10 %-ный раствор гидроксида
натрия, концентрированная азотная и серная кислоты, 20%-ный
раствор сульфосалициловой кислоты, 10 %-ный раствор трихлор-
уксусной кислоты, 10 %-ный раствор пикриновой кислоты, насы-
щенный раствор танина, 1 %-ный раствор гексоциано-(П)-феррата
калия, 0,1 %-ный раствор сульфата меди, 1 %-ный раствор ацетата
меди, 96 %-ный раствор этилового спирта, 95 %-ный раствор ацетона,
насыщенный раствор сульфата аммония, кристаллический сульфат
аммония.
Оборудование. Складчатые бумажные фильтры, стеклянные па-
лочки, пробирки со штативом, капельницы, пипетки, пробирки
центрифужные, воронки стеклянные, горелка, водяная баня, спект-
рофотометр.
Ход работы.
А. Осаждение белков нагреванием. В пробирку вносят 2 мл
раствора яичного белка и нагревают на кипящей водяной бане.
Наблюдают образование осадка (свертывание белка).
Чтобы сравнить зависимость осаждения белков от концентрации
68
водородных ионов, в пять пробирок помещают по 5 мл раствора яич-
ного белка. Нейтральный раствор белка в первой пробирке нагрева-
ют до кипения, он мутнеет, наблюдается опалесценция, обусловлен-
ная разрушением гидратной оболочки вокруг молекулы белка и уве-
личение белковых частиц. Но мицеллы белка несут заряд и потому
остаются в растворе, не выпадая в осадок. Раствор во второй про-
бирке нагревают до кипения, вливают 1 мл раствора уксусной кис-
лоты до слабокислой реакции. При стоянии белок выпадает в осадок.
В этих условиях частицы белка теряют заряд, потому что pH среды
близка к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку вносят
3 мл раствора уксусной кислоты для создания кислой реакции сре-
ды. При кипячении раствора осадок не образуется, так как моле-
кулы белка приобретают положительный заряд, что повышает их
устойчивость. В четвертую пробирку добавляют 5 мл раствора ук-
сусной кислоты, 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия и на-
гревают. Выпадает белый осадок. Его образование обусловлено
тем, что белок при взаимодействии с ионами хлорида натрия теряет
свой заряд. В пятую пробирку вносят 2 мл раствора гидроксида
натрия для создания щелочной среды. При кипячении жидкости
осадок не образуется, так как в щелочной среде увеличивается от-
рицательный заряд белка.
Б. Осаждение белков минеральными кислотами. В одну из про-
бирок вносят 3 мл концентрированной азотной кислоты и по стен-
кам пробирки осторожно, чтобы жидкости не перемешивались, 3 мл
раствора яичного белка. На границе раздела двух жидкостей обра-
зуется осадок в виде белкового кольца (проба Геллера). Содержимое
перемешивают, доливают избыток азотной кислоты и убеждаются,
что осадок не исчезает.
В другую пробирку вносят 3 мл раствора яичного белка и осто-
рожно по стенке пробирки вливают 2—3 капли концентрированной
серной кислоты. Выпадает осадок. Добавляют избыток серной кис-
лоты и наблюдают растворение осадка.
В. Осаждение белков органическими кислотами. В две пробирки
вносят по 5 мл раствора яичного белка. В одну добавляют 1 мл рас-
твора трихлоруксусной кислоты, в другую — 1 мл раствора сульфо-
салициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается выпадение
осадка белка.
Г. Осаждение белков реактивами на алкалоиды. В три пробирки
вносят по 1 мл раствора яичного белка, по 0,5 мл раствора уксусной
кислоты и по 2—3 капли: в первую — раствора пикриновой кисло-
ты, во вторую — насыщенного раствора танина, в третью — раство-
ра гексоциано-(П)-феррата калия. Наблюдают выпадение осадка.
При добавлении избытка раствора гексоциано-(П)-феррата калия
и раствора танина осадок растворяется.
Д. Осаждение белков ионами тяжелых металлов. В две пробир-
ки добавляют по 3 мл раствора яичного белка. В первую — 2—3
капли раствора сульфата меди, во вторую — 2—3 капли раствора
ацетата свинца. Наблюдают образование осадка (с солью меди —
голубого цвета, свинца — белого цвета). При добавлении избытка
69
растворов сульфата меди и ацетата свинца происходит растворение
образовавшегося осадка.
Е. Осаждение белков органическими растворителями. В две
пробирки вносят по 3 мл раствора яичного белка. В первую — 3 мл
этилового спирта, во вторую — ацетона. Растворы в обоих случаях
становятся мутными. Если к ним добавить по 1 мл насыщенного рас-
твора хлорида натрия, то через некоторое время белок выпадает
в осадок.
i Ж- Осаждение белков хлористым натрием. В пробирку вносят
3 мл раствора яичного белка и хлорид натрия до полного насыще-
ния, через несколько минут в осадок выпадают глобулины. Смесь
фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В фильтрате со-
держатся альбумины, которые не осаждаются в данном случае.
Если к фильтрату добавить 1 мл раствора уксусной кислоты и на-
греть смесь до кипения на водяной бане, то альбумины выпадут
в осадок.
3. Осаждение белков сульфатом аммония. В центрифужную про-
бирку вносят 3 мл яичного белка, 3 мл насыщенного раствора суль-
фата аммония и смесь перемешивают. Через 5 мин смесь центрифу-
гируют в течение 3—5 мин при 3000 g. Центрифугат, содержащий
альбумины, сливают в пробирку, а осадок, содержащий глобулины,
растворяют в 2 мл воды. Этот раствор используют для обнаруже-
ния глобулинов по биуретовой реакции (см. раздел 4.1.3, реакция 1).
К центрифугату добавляют при помешивании кристаллический
сульфат аммония до полного насыщения раствора, т. е. до появле-
ния на дне пробирки кристаллов сульфата аммония. В этих усло-
виях выпадают в осадок альбумины. Осадок альбуминов отделяют
центрифугированием (3—5 мин при 3000 g). Фильтрат проверяют
на содержание белка по биуретовой реакции. Отрицательная биуре-
товая реакция свидетельствует об отсутствии белка, т. е. о полном
осаждении белков из раствора.
2. Определение содержания белка в моче методом осаждения
Принцип метода. Одним из методов обнаружения белка в рас-
творах являются реакции осаждения. При нагревании белков в нейт-
ральной или слабокислой среде факторы, стабилизирующие струк-
туру молекул белка (водородные связи, гидрофобные взаимодействия
и др.), перестают действовать и белки денатурируют. Концен-
трированные минеральные кислоты (например, азотная кислота)
осаждают белки вследствие дегидратации белковых молекул и обра-
зования комплексных солей.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, моча,
содержащая белок, 1 %-ный раствор уксусной кислоты, концентри-
рованная азотная кислота.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, ка-
пельницы, водяная баня, штатив для пробирок, секундомер.
Ход работы. В пробирку вносят 3—5 мл предварительно про-
фильтрованной мочи и нагревают на кипящей водяной бане до ки-
пения. К горячему раствору добавляют 1—2 капли раствора уксус-
ной кислоты. При подкислении осадок фосфата растворяется, а
70
денатурированный высокой температурой белок оседает на дно про-
бирки.
Для осаждения белка мочи азотной кислотой (проба Геллера)
в пробирку добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты.
На кислоту в пробирке осторожно каплями по стенке пробирки на-
слаивают 1 мл профильтрованной мочи. В случае наличия белка в
моче на границе раздела двух жидкостей (азотной кислоты и мочи)
появляется мутно-белое кольцо осажденного белка.
Эта реакция используется для количественного определения
белка в моче по методу Робертсона — Стольникова — Брандберга.
Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,0033 %
белка, дают в пробе Геллера мутно-белое кольцо в конце второй —
начале третьей минуты после наслаивания раствора белка на кон-
центрированную азотную кислоту.
В пробирку вносят 1 мл концентрированной азотной кислоты и
каплями по стенке наслаивают 1 мл исследуемой мочи. Если кольцо
появляется сразу, то реакцию повторяют с мочой, разведенной в
10, 20, 30 и более раз. В результате находят такое разведение,
при котором едва заметное мутно-белое кольцо появляется между
второй и третьей минутами после приготовления пробы. Концентра-
цию белка (%) в моче определяют по формуле
С = С0Р,
где Со — концентрация белка, вызывающая появление кольца на
границе раздела азотной кислоты и мочи между второй и третьей
минутой (0,0033 %); Р — максимальная степень разведения мочи,
при которой еще появляется кольцо на границе раздела между вто-
рой и третьей минутой.
3. Количественное определение белка по методу Лоури
Принцип, метода. Метод Лоури основан на измерении интенсив-
ности окраски раствора белка, в котором осуществляется цветная
реакция Фолина на белок с тирозиновыми и цистеиновыми радика-
лами белковой молекулы. Реакция состоит в восстановлении смеси
фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот с образо-
ванием комплексного соединения синего цвета. Реакция инициирует-
ся комплексными соединениями меди, возникающими при взаимо-
действии белка со щелочным раствором сульфата меди.
Для определения концентрации белка в исследуемом растворе по
методу Лоури необходимо предварительно построить калибровочный
график — зависимость интенсивности окрашивания от концентра-
ции белка-стандарта. Поэтому этим методом можно определить абсо-
лютное содержание белка в исследуемом растворе только в том слу-
чае, если калибровочный график построен для того же белка, опре-
деление концентрации которого проводят.
Материалы и реактивы. Исследуемый раствор белка, содержа-
щий 0,25—0,5 мг/мл, свежеприготовленный щелочной раствор меди
(50 мл 2 %-ного раствора карбоната натрия в 0,1 моль/л растворе
гидроксида натрия смешиваю^ с 1 мл 0,5 %-ногораствора сульфата
меди в 1 %-ном растворе тартрата натрия— калия), реактив Фолина
(20 г фосфорно-вольфрамового натрия и 5 г фосфорно-молибденового
71
натрия растворяют в 140 мл дистиллированной воды. К раствору
добавляют 10мл 80 %-ного раствора ортофосфорной кислоты и 20 мл
концентрированной соляной кислоты. Полученную смесь кипятят
в колбе с обратным холодильником Либиха в течение 10 ч. Затем
добавляют 30 г сульфата лития, 10 мл дистиллированной воды,
2—3 капли брома, и, не пользуясь более обратным холодильником,
кипятят в вытяжном шкафу для удаления брома. Раствор охлажда-
ют, объем доводят дистиллированной водой до 200 мл и фильтруют.
Перед работой смесь разбавляют в два раза дистиллированной во-
дой).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки и микро-
пипетки, штатив для пробирок, часы, фотоколориметр.
Ход работы. К 0,2 мл раствора исследуемого белка добавляют
1 мл щелочного раствора меди. Смесь тщательно перемешивают и
дают постоять при комнатной температуре 10 мин, затем быстро
вносят 0,08 мл реактива Фолина, перемешивают. Через 30 мин рас-
твор окрашивается в синий цвет. Интенсивность окраски (оптическую
плотность) измеряют на фотоколориметре или спектрофотометре.
Если 1 мл исследуемого раствора белка содержит 5—25 мг белка, то
используют длину волны 750 нм, если содержание белка больше,—
500 нм. Нерастворимые белки или их осадки предварительно рас-
творяют в 0,1 моль/л растворе гидроксида натрия при комнатной
температуре.
• Концентрацию белка в исследуемом растворе определяют по ка-
либровочной кривой, построенной заранее по известной концентра-
ции исследуемого белка, а если это невозможно, то по стандартным
растворам других чистых белков (кристаллического яичного или
сывороточного альбумина, казеина и др.). Для построения калибро-
вочной кривой готовят растворы белка-стандарта, содержащие от 20
до 400 мг/мл и с ними проводят реакцию Фолина в таких же усло-
виях, как и для исследуемого раствора белка. Затем также измеряют
интенсивность окрашивания (оптическую плотность) всех проб бел-
ка-стандарта.
4. Диализ солевого раствора белка
Принцип метода. Метод диализа основан на способности малых
по геометрическим размерам молекул (кристаллоидов) диффузно
проникать через полупроницаемые мембраны, а макромолекул
(коллоидов) — не проникать. Белки являются высокомолекуляр-
ными коллоидными веществами и не диффундируют через полупро-
ницаемые мембраны (например, коллодиевую или целлофановую
пленки). Это свойство белков лежит в основе очистки белков от низ-
комолекулярных органических и молекулярных примесей.
Материалы и реактивы. Целлофановый или коллодиевый ме-
шочки, 1 %-ный раствор яичного белка, 10 %-ный раствор азотной
кислоты, 1 %-ный раствор нитрата серебра, 10 %-ный раствор гид-
роксида натрия, 1 %-ный раствор сульфата меди.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, капельницы, пи-
петки, диализатор (или стеклянный стакан объемом на 0,5 л), штатив
для пробирок.
72
Ход работы. Вначале с помощью биуретовой реакции (раздел
4.1.3, работа 1) определяют, содержит ли исследуемый раствор бе-
лок. К Ю каплям раствора белка добавляют 3 капли 10 %-ного рас-
твора гидроксида натрия, 1 каплю 1 %-ного раствора сульфата меди
и полученную смесь тщательно перемешивают. Красно-фиолетовая
окраска свидетельствует о наличии в растворе белка.
Целлофановый (коллодиевый) мешочек наполняют на х/3 объема
1 %-ным раствором исследуемого белка. Мешочек помещают в диа-
лизатор, заполненный дистиллированной водой (или в стеклянный
стакан с водой), зажимая у верхнего края двумя стеклянными па-
лочками, которые скреплены резиновыми колечками. Через 1,5 ч
с диализатом (наружная жидкость) и используемой для диализа
дистиллированной водой проводят реакцию на обнаружение хлори-
дов. Готовят две пробирки, в одну из них добавляют 1 мл дистилли-
рованной воды, в другую — 1 мл диализата, затем по 1 капле 10 %-
ного раствора азотной кислоты и 1 %-ного раствора нитрата серебра.
В пробирке, содержащей диализат, наблюдают выпадение белого
осадка хлорида серебра, а в пробирке с дистиллированной водой
такого осадка нет. Делают вывод о том, что при диализе солевого
раствора белка хлориды проникли в диализат через полупроницае-
мую мембрану.
Для проверки содержания белка в первую пробирку добавляют
3 мл диализата, во вторую — 3 мл диализируемой жидкости, а так-
же по 1 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия и 1—2 капли
1 %-ного раствора сульфата меди (проводят биуретовую реакцию).
Содержимое перемешивают и наблюдают красно-фиолетовый цвет
в пробирке, содержащей диализируемую жидкость. Такое окраши-
вание отсутствует в пробирке с диализатом. Делают вывод о том,
что белок не проникает через полупроницаемую мембрану.
5. Определение изоэлектрической точки белков
Принцип метода. Определение изоэлектрической точки белков
основано на способности белков под действием осадителей, вызы-
вающих дегидратацию белков, при значении pH среды, соответствую-
щей их изоэлектрической точке, легко осаждаться.
Материалы и реактивы. Растворы казеина и желатина (1 %-ные),
0,01, 0,1 и 1 моль/л растворы уксусной кислоты, 0,1 моль/л раствор
ацетата натрия, 96 %-ный этиловый спирт (или 95 %-ный ацетон),
дистиллированная вода.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, штатив
для пробирок. \
Определение изоэлектрической точки
казеина \
В отличие от другик белков, казеин осаждается в изоэлектриче-
ской точке без дегидратирующих средств. Изоэлектрическая точка
казеина соответствует pH 4,7.
Ход работы. Берут 8 пробирок. В каждую наливают воду, рас-
творы уксусной кислота и казеина в соотношениях, указанных в
табл. 2. Определяют изоэлектрическую точку казеина по макси-
мальной степени помутнения (pH 4,7).
73
Таблица 2. Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для
образования значения pH при выявлеинн изоэлектрической точки казеина
Вода СН.СООН (0,01 моль/л) сн.соон (0,1 моль/л) Раствор казеина (1 %-иый) pH Среды
8,4 0,6 1,о 5,9
7,8 1,3 1,0 5,6
8,8 —— 0,3 1,0 5,3
8,5 — 0,5 1,0 5,0
8,0 1,0 1,0 4,7
7,0 2,0 1,0 4,4
5,0 4,0 1,0 4,1
1,0 — 8,0 1,0 3,8
Таблица 3. Соотношение компонентов реакционной смеси (мл) для
образования pH при выявлении изоэлектрической точки желатина
Вода СН.СООН (ОД моль/л) сн.соон (1 моль/л) CH.COONa (0,1 моль/л) Раствор желатина (1 %-ный) pH среды
3,8 0,8 2,0 2,0 5,6
3,5 0,5 — 2,0 2,0 5,3
3,0 1,0 — 2,0 2,0 5,0
2,0 2,0 2,0 2,0 4,7
— 4,0 — 2,0 2,0 4,4
3,2 — 0,8 2,0 2,6 4,1
Определение изоэлектрич желатина е с к й точки
Ход работы. В 6 пробирок помещают соответствующее количест-
во (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия! дистиллирован-
ной воды и желатина (табл. 3). Содержание каждой пробирки пере-
мешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке доливают по
2 мл спирта (или ацетона). Через 30 мин определяют изоэлектри-
ческую точку. Она будет соответствовать pH пробирки с максималь-
ной степенью помутнения.
4.4. СВОЙСТВА, ВЫДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЯ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ
Свойства сложных белков определяются йе только белковой
частью молекулы, но и свойствами простатической группы. Харак-
терные реакции на белковую часть сложны? белков приведены в
разделах 4.1.3 и 4.3. /
Выделение нуклеопротеидов и качествемые реакции на состав-
ные части изложены в главе 3. /
1. Свойства гликопротеидов и определение их углеводного
компонента /
Принцип метода. Гликопротеиды содержат в качестве простати-
ческой группы углеводный компонент. Реакции определения глико-
Т4
протеидов основаны на выявлении их углеводного компонента, спо-
собного образовывать окрашенные продукты конденсации. Одним
из гликопротеидов является овомукоид, входящий в состав яичного
белка. Углеводный компонент этого белка можно обнаружить по
цветной реакции при нагревании вареного яичного белка с концент-
рированной соляной кислотой — возникает фиолетовое окрашива-
ние. Другим методом обнаружения углеводного компонента глико-
протеидов является реакция Подобедова. Образующийся при взаи-
модействии концентрированной серной кислоты с углеводом белка
фурфурол в реакции с а-нафтолом дает соединение синего цвета,
с тимолом — красного цвета.
Материалы и реактивы. Вареный яичный белок (100 мг), I %-ный
раствор яичного белка, 1 %-ный спиртовый раствор тимола, кон-
центрированная соляная кислота, концентрированная серная кис-
лота, 0,1 %-ный раствор а-нафтола.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, горелка.
Ход работы. В пробирку вносят кусочек вареного яичного бел-
ка и 3 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое про-
бирки осторожно нагревают в пламени горелки, не доводя до
кипения. Белок, а затем и жидкость приобретают фиолетовое окра-
шивание.
В две пробирки вносят по I мл 1 %-ного раствора яичного бел-
ка. Затем в первую добавляют 2—3 капли 0,1 %-ного раствора
а-нафтола, во вторую столько же на 1 %-ного раствора тимола.
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, осторожно по стен-
кам доливают по 0,5 мл концентрированной серной кислоты и дают
постоять. На границе раздела двух жидкостей в пробирке с а-наф-
толом наблюдаемся фиолетовое, а в пробирке с тимолом — красное
кольцо. '
2. Свойства, качественные реакции и определение хромопротеидов
Хромопротеиды — это сложные белки, простатической группой
которых являются порфирины, каротиноиды, витамины и др. Пред-
ставитель хромопротеидов — белок крови гемоглобин с простати-
ческой группой — гемом.
Качественные реакции на геминовую
группу гемоглобина
Принцип реакций. При добавлении к гемоглобину или разбав-
ленному раствору крови раствора гваяковой смолы (которая содер-
жит 70 % а- и Р-гваяковой кислоты, 11 % гваяковой смоляной
кислоты, 11 % эфцрных масел, ванилина) и пероксида водорода
жидкость окрашивается в синий цвет. Реакция основана на способ-
ности гемоглобина катализировать окисление гваяковой смоляной
кислоты пероксидом водорода в озонид гваяковой смоляной кисло-
ты синего цвета.
Так же проходит реакция с бензидином. Под влиянием гемогло-
бина бензидин окисляется пероксидом водорода в га-хинондиимид,
имеющий синюю окраску, которая через некоторое время становится
красной.
75
Обе реакции очень чувствительны и используются для опреде-
ления минимальных количеств крови в биологических объектах.
Материалы и реактивы. Разведенная 0,85 %-ным'раствором хло-
рида натрия кровь (1 ! 10), 1 % -ный спиртовый раствор гваяковой
смолы, 0,2 %-ный спиртовый раствор бензидина, 3 %-ный раствор
пероксида водорода.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки градуи-
ровочные, капельницы, штатив для пробирок.
Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5 мл раствора крови.
В одну из них добавляют 1—2 капли свежеприготовленного рас-
твора гваяковой смолы, в другую — 1—2 капли раствора бензи-
дина. Затем в обе пробирки после перемешивания доливают по 1—2
капли раствора перекиси водорода. Наблюдают окрашивание сме-
сей в пробирках в синий цвет. Через некоторое время смесь в про-
бирке, содержащей бензидин, окрашивается в красный цвет.
Количественное определение гемоглоби-
на в плазме крови
Принцип метода. В основе количественного определения раство-
ренного в плазме крови гемоглобина положена его способность
окислять в присутствии перекиси водорода бензидин в окрашен-
ное соединение (п-хинондиимид).
Материалы и реактивы. Кровь, плазма крови, физиологический
раствор (0,85 %-ный раствор хлорида натрия), ацетатный буфер,
pH 4,6 (4,9 мл 0,2 моль/л раствора CH3COONa • ЗН2О и 5,1 мл
0,2 моль/л раствора СН3СООН), 0,3 %-ный раствор перекиси во-
дорода, 0,1 %-ный спиртовый раствор бензидина.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, капель-
ницы, штатив для пробирок, фотоколориметр, часы.
Ход работы. В две пробирки вносят по 4 мл ацетатного буфера,
2 мл раствора пероксида водорода, 2 мл раствора бензидина. В одну
из пробирок (проба) добавляют 0,04 мл плазмы крови, а в другую
(контроль) — 0,04 мл физиологического раствора. Смеси в про-
бирках перемешивают и спустя три минуты фотометрируют при
680 нм.
В присутствии гемоглобина интенсивность синего окрашива-
ния возрастает в течение 4—5 мин, поэтому оптическую плотность
необходимо измерить два раза и записать максимальную величину.
Через 5—6 мин после фотометрирования окрашивание становится
лилово-бурого цвета и величина оптической плотности при 680 нм
уменьшается.
Массовую концентрацию гемоглобина в плазме крови определя-
ют' по калибровочному графику, который строят следующим обра-
зом. При-построении калибровочного графика исходят из того, что
в крови содержится в среднем 16,5 мг/мл гемоглобина. Для приго-
товления основного стандартного раствора крбви к 0,1 мл крови
добавляют 16,4 мл дистиллированной воды. В ,1 мл этого раствора
содержится 1 мг гемоглобина. Его используют, разбавляя дистил-
лированной водой, перед каждым построением калибровочного гра-
фика для приготовления рабочих растворов крови с содержанием
76
гемоглобина: 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10, 20, 30 мг/мл. По 0,04 мл каж-
дого рабочего раствора переносят в отдельные пробирки, куда до-
бавляют все необходимые реактивы для количественного определе-
ния гемоглобина. Фотометрирование проводят так же, как и в слу-
чае пробы с плазмой крови и физиологическим раствором. По ре-
зультатам измерений строят калибровочный график — зависимость
оптической плотности рабочих растворов крови от массовой кон-
центрации гемоглобина в этих рабочих растворах. Для определения
концентрации гемоглобина в пробе вычисляют разность между оп-
тической плотностью пробы (плазма крови) и контролем (физиоло-
гический раствор). Для этой разности по калибровочному графику
находят соответствующее значение массовой концентрации гемо-
глобина.
3. Выделение, свойства фосфопротеидов и определение их
содержания
Фосфопротеиды — это сложные белки, простетической группой
которых являются фосфорная кислота, связанная сложноэфирными
связями с остатками серина и треонина. Один из фосфопротеидов —
казеиноген молока, который содержится в молоке в виде раствори-
мой кальциевой соли. При ферментативном свертывании молока
(действие пепсина) казеиноген подвергается химическим превраще-
ниям с образованием казеина. Кальциевая соль казеина, в отличие
от кальциевой соли казеиногена, нерастворима в воде.
Выделение и качественный анализ ка-
зеина молока
Принцип метода. Изоэлектрическая точка казеиногена соответст-
вует pH 4,7. В подкисленном растворе (pH 4,7) кальциевая соль
казеиногена расщепляется на белок и фосфорную кислоту, кото-
рые можно определить по характерным реакциям: белок — по биу-
ретовой реакции, фосфорную кислоту — по реакции с молибдено-
вым реактивом.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, фильт-
ровальная бумага, сепарированное молоко, 0,1 %-ный раствор ук-
сусной кислоты, 0,1 %-ный раствор карбоната натрия, 96 %-ный
раствор этилового спирта, эфир, метиловый спирт, хлороформ,
10 %-ный раствор карбоксида натрия, 10 %-ный раствор азотной
кислоты, 1 %-ный раствор сульфата меди, молибденовый реактив
(7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл дистиллированной
воды и добавляют 100 мл 32 %-ного раствора азотной кислоты
(плотность 1,21)).
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, ка-
пельницы, стеклянные воронки, штатив для пробирок, лакмусо-
вая бумага, обратный холодильник, химические стеклянные ста-
каны, колбы, фарфоровая ступка с пестиком, водяная баня, часы.
Ход работы. К 30 мл сепарированного молока, разбавленного
в 4 раза, при осторожном помешивании добавляют каплями раствор
уксусной кислоты до прекращения осаждения казеина, который
отфильтровывают, промывают водой, вносят в раствор карбоната
натрия, чтобы очистить от жира и других веществ. Казеин в рас-
77
творе карбоната натрия растворяется, а жир находится в эмульги-
рованном состоянии. Смесь фильтруют сквозь влажный фильтр
(жир остается на фильтре).
Из фильтрата раствором уксусной кислоты опять осаждают
казеин. Осадок отфильтровывают, отжимают между листами фильт-
ровальной бумаги (по возможности досуха) и растирают в ступке
с 15—20 мл спирта с целью обезвоживания. Для обезжиривания
казеин смешивают сначала с 20 мл эфира, а потом с 20 мл смеси
метилового спирта и хлороформа (1 • 1). Обезжиренный казеин высу-
шивают на воздухе и растирают в порошок, который используют
для гидролиза казеина.
В пробирку помещают 50 мг измельченного в порошок казеина
и доливают 3 мл раствора гидроксида натрия. Гидролизуют с об-
ратным холодильником в течение 1 ч, смесь охлаждают и исполь-
зуют гидролизат для реакций на продукты гидролиза.
Для выявления белка в гидролизате в пробирку добавляют
0,5 мл гидролизата, 5 капель раствора гидроксида натрия и 1 кап-
лю сульфата меди (проводят биуретовую реакцию (раздел 1.1.3,
работа 1). Наблюдают красно-фиолетовое окрашивание, свидетельст-
вующее о наличии белка в гидролизате казеина.
Для выявления фосфорной кислоты к гидролизату (1—2 мл)
добавляют 12—15 капель раствора азотной кислоты до слабокислой
реакции на лакмус. После этого смесь фильтруют в сухую пробир-
ку, к 0,5 мл фильтрата вносят 2 мл молибденового реактива и кипя-
тят на водяной бане 2—3 мин. Наблюдают образование желтого
окрашивания, а при охлаждении смеси — осадок желтого цвета
аммонийной соли фосфорномолибденовой кислоты.
Определение содержания казеиногена в
молоке
Принцип метода. Определение содержания казеиногена в молоке
основано на том, что казеиноген имеет кислую реакцию и поэтому
разница между объемом раствора, необходимым для нейтрализации
собранного молока, и объемом, истраченным на нейтрализацию сы-
воротки после осаждения казеиногена,— это объем щелочи, кото-
рый требуется для нейтрализации казеиногена. Зная эквивалент-
ную массу казеиногена, можно определить его количество в молоке.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, сепа-
рированное молоко, 0,02 моль/л раствор серной кислоты, 1 %-ный
спиртовый раствор фенолфталеина, 0,1 моль/л раствор гидроксида
калия.
Оборудование. Конические колбы, воронки стеклянные, цилинд-
ры мерные, пипетки, бюретки, капельницы.
Ход.работы. Готовят две колбы (А и Б) объемом 200 мл. В колбу
А наливают 40 мл воды и 20 мл молока, в колбу Б — 20 мл воды и
10 мл молока. Затем в колбу А вносят каплями, перемешивая, рас-
твор серной кислоты до выпадения казеиногена в осадок. Фикси-
руют количество истраченного на титрование раствора серной кис-
лоты. В колбу Б также медленно доливают раствор серной кислоты,
объем которой равен половине объема, добавленного в колбу А.
78
Раствор в колбе А доливают дистиллированной водой до объема
100 мл и фильтруют в колбу At. Фильтрат, который является сыво-
роткой молока, из колбы Ах переносят в колбу Аа в объеме 50 мл.
В колбы Аа и Б добавляют по 1 мл раствора фенолфталеина и ти-
труют раствором гидроксида калия до появления слабо-розового
окрашивания.
Массовую концентрацию казеиногена в молоке (мг/мл) рассчи-
тывают по формуле
C = (A-B)fQ/V,
где А и В — объемы (мл) раствора гидроксида калия, истраченные
на титрование собранного молока и сыворотки соответственно;
f— коэффициент поправки на титр 0,1 моль/л раствора гидроксида
калия; Q — масса казеиногена, эквивалентная 1 мл 0,1 моль/л
раствора гидроксида калия (11,315 мг); V — объем молока, исполь-
зуемый для анализа (10 мл).
4.5. ПРЕВРАЩЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ, ОБМЕН БЕЛКОВ
И КОНЕЧНЫЕ ПРОДУКТЫ ОБМЕНА БЕЛКОВ
1. Переаминирование между глутаминовой и пировиноградной
кислотами
Принцип метода. Процесс переаминирования между глутами-
новой и пировиноградной кислотами с образованием а-кетоглута-
ровой кислоты и аланина катализируется ферментом глутамат-
пируват-аминотрансферазой. В качестве кофермента аминотранс-
фераза содержит пиридоксальфосфат, который в ходе катализируе-
мой реакции проходит стадию пиридоксаминофосфата
СООН соон
сна сн8 сна сн8
сн2 + с=о 1 1 t СНа + СН—NHa
1 1 СН—NHa СООН с=о СООН
СООН соон
Метод изучения переаминирования между глутаминовой и пиро-
виноградной кислотой основан на определении увеличения содер-
жания аланина (или снижении содержания глутаминовой кислоты)
после действия катализирующего реакцию фермента. Определение
содержания аминокислот проводится хроматографическим методом
(раздел 4.2, работа 3).
Материалы и реактивы. Пластинки для хроматографии Silufol,
складчатые бумажные фильтры, мышечная ткаиь эксперименталь-
ных животных, 2 %-ный раствор пировиноградной кислоты, 1 %-
ный раствор глутаминовой кислоты, 0,3 %-ный раствор гидрокар-
боната калия, 0,02 %-ный раствор монобромуксусной кислоты
79
10 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты, свежеприготовлен-
ный нингидриновый реактив (раздел 4.2, работа 3), 96 %-ный эти-
ловый спирт, насыщенный раствор аммиака.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, микро-
пипетки градуировочные, воронки стеклянные, штатив для проби-
рок, водяная баня, пульверизатор, термостат, капельницы, часы.
Ход работы. В две пробирки наливают по 0,5 мл раствора пиро-
виноградной кислоты и раствора глютаминовой кислоты. В каж-
дую пробирку добавляют по 0,5 мл раствора гидрокарбоната калия
(для получения оптимального pH) и по 0,25 мл раствора монобром-
уксусной кислоты (чтобы избежать гликолиза). В каждую пробирку
вносят по 0,5 г измельченной ножницами мышечной ткани, являю-
щейся источником глутамат-пируват-аминотрансферазы. Содержи-
мое одной из пробирок (контрольной) кипятят 2—3 мин для инак-
тивации ферментов мышц, затем охлаждают. Исследуемую и конт-
рольную пробирки закрывают пробками и ставят в термостат при
t 37 °C на 1 ч. Для осаждения белков в каждую пробирку добавляют
по 0,25 мл 10 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, и смеси
отфильтровывают.
Содержание аланина в фильтрате определяют хроматографиче-
ским методом, используя пластинки Silufol. На пластинку наносят
по 5—10 мкл фильтрата пробы, контроля и раствора аланина. Для
определения абсолютного значения увеличения содержания ала-
нина на пластинку наносят известные количества аланина. Разде-
ление аминокислот при хроматографии производят в смеси этанола
и аммиака (7 : 3). После высушивания пластинку опрыскивают нин-
гидриновым реактивом из пульверизатора и высушивают при
t 110 °C. Идентифицируют пятно аланина. Одним из методов коли-
чественного определения аминокислот при распределительной хро-
матографии (визуальное сравнение, денситометрия или элюции из
хроматограмм (раздел 4.2, работа 3)) определяют содержание ала-
нина в фильтрате пробы и контроля. При анализе полученных ре-
зультатов устанавливают увеличение содержания аланина в пробе
по сравнению с контролем.
2. Ферментативный гидролиз белков трипсином
Принцип метода. В основе этого метода лежит способность про-
теолитического фермента трипсина, источником которого может
быть панкреатин, расщеплять белки, гидролизуя пептидные связи.
Количество образовавшихся при гидролизе а-аминогрупп (а-ами-
нокислот), пропорциональное количеству расщепленных пептид-
ных связей, определяют по содержанию аминного азота, например
в реакции образования комплексной медной соли с аминокисло-
тами.
Материалы и реактивы. Раствор желатина (1 %-ный), 10 %-ный
раствор трихлоруксусной кислоты, 1 моль/л раствор гидроксида
натрия, материалы и реактивы для определения содержания амин-
ного азота в реакции образования комплексной медной соли с ами-
нокислотами.
Оборудование. Стеклянные палочки, колбы мерные объемом
80
25 мл, колбы конические объемом 100 мл, пипетки, капельницы,
воронки стеклянные, бюретки, термостат, часы, водяная баня.
Ход работы. В четыре пронумерованные колбы наливают по
2 мл раствора панкреатина, содержащего фермент трипсин. Две из
них (3 и 4) нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин
для инактивации фермента. В колбы 2 и 4 добавляют по 20 мл
дистиллированной воды, а в колбы 1 и 3 — по 20 мл раствора же-
латина. Смеси во всех колбах хорошо перемешивают и сразу отби-
рают по 5 мл из каждой колбы (в первую очередь из колбы 1, где
под действием активного фермента сразу начинается гидролиз белка)
в мерные колбы для определения аминного азота. В каждую из
мерных колб предварительно наливают по 2 мл раствора трихлор-
уксусной кислоты для осаждения белков и прекращения фермента-
тивной реакции. Содержимое мерных колб доводят дистиллирован-
ной водой до объема 25 мл, затем четыре колбы, из которых отби-
рали смесь в мерные колбы, помещают в термостат на 1 ч при t 38—
40 °C. Смесь в мерных колбах нейтрализуют раствором гидроксида
натрия и проводят определение образования комплексной медной
соли аминокислот.
Массу аминного азота (мг) в каждой колбе рассчитывают по
формуле
С = AQV^V^,
где А — объем раствора гипосульфида натрия; истраченный на тит-
рование (мл); Q — масса аминного азота, эквивалентная 1 мл
0,005 моль/л раствора гипосульфида натрия (0,28 мг); — общий
объем смеси, в которую вносили фермент (25 мл); У2— объем сме-
си, из которой отбирали фермент (22 мл); V3 — объем смеси, содер-
жащей фермент и взятый для анализа (5 мл); V4—объем смеси,
используемый для анализа (10 мл).
Полученные значения для колб 2 и 4 — это масса свободного
аминного азота в 2 мл раствора фермента. Разность между значе-
ниями для колб 3 и 4 — это масса аминного азота в 20 мл раствора
желатина. Разность масс аминного азота в колбах 1 и 2 должна
быть такой же, как между колбами 3 и 4. Она может быть несколь-
ко большей, так как до отбора проб фермент успевает частично
гидролизовать белок.
Через час повторяют определение массы аминного азота во всех
помещенных в термостат колбах, отбирая для анализа по 5 мл сме-
си. Определение массы аминного азота в отобранных смесях прово-
дят так же, как в смесях, не подвергаемых инкубации в термостате.
Разность между массами аминного азота в пробах, взятых нз колб
3 и 4, должна быть такой же, как и до инкубации в термостате, так
как в этих колбах находился инактивированный нагреванием фер-
мент и гидролиз желатина не происходил. Разница содержания
аминного азота в колбах 1 и 2 должна увеличиваться по сравнению
с начальной.
Определив разницу между массами аминного азота в колбах 1
и 2, а также 3 и 4, рассчитывают прирост аминного азота за 1 ч
81
инкубации, т. е. массу аминного азота, которая образовалась при
гидролизе желатина трипсином.
3. Количественные реакции на мочевину и определение ее
содержания в моче
Принцип метода. При нагревании в пробирке мочевина плавит-
ся и после остывания образует твердую массу, состоящую из биуре-
та и циануровой кислоты
NHa
С,
NHa
/NHa
OC^
Нагревание /NH
—-------- OC< 4- NH8
XNHa
NHa
yNHa
oc<
XNHa
/NHa
OC<
XNHa
,NHa
OC<
xNHa
zNHa
осб
*!=!» oc< + 2NH,
>NH
OC<
Биурет и циануровая кислота содержат пептидные связи, поэто-
му для них характерна биуретовая реакция (раздел 4.1.1, рабо-
та 6).
Гипобромид натрия в кислой среде и нитрит натрия способны
расщеплять мочевину до свободного азота, углекислого газа и воды
ОС (NHa)a + 3NaBrO N2 + СОа + 3NaBr + 2НаО
ОС (NHa)a + 2NaNOa + 2НС1 2Na + COa + 2NaCl + 3HaO
В реакции мочевины с нитратом ртути образуется малораствори-
мое соединение белого цвета
OC(NHa)a + Hg(NOg)a OC(NHa)a Hg(NO^a
Одним из эффективных методов обнаружения мочевины яв-
ляется ее реакция в присутствии уксусной кислоты с ксантгидро-
лом, в которой образуются кристаллы диксантилмочевины
,NHa
ОС< + 20 (С,Н4)а СНОН ->
XNHa
м- O^H^CH—NH—С—NH—HC(CeHJ2O + 2HSO
82
Определение содержания мочевины в биологических жидкостях
(моче) основано на способности мочевины под действием фермента
уреазы расщепляться до углекислого газа и аммиака. Образовав-
шийся аммиак оттитровывают раствором соляной кислоты.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, моча,
5 %-ный и 0,1 %-ный растворы мочевины, 10 %-ный раствор гид-
роксида натрия, 1 %-ный раствор сульфата меди, 3 %-ный раствор
нитрита натрия, 1 %-ный раствор гипобромита натрия, концентри-
рованная азотная кислота, ледяная уксусная кислота, 1 %-ный
раствор нитрата ртути, насыщенный раствор ксантгидрола, 0,1 %-
ный раствор хлорида ртути, 0,1 моль/л раствор соляной кислоты,
фосфатный буфер, pH 7,17 (7 мл 0,15 моль/л раствора Na2HPO4 х
X 2Н2О и 3 мл 0,15 моль/л КН2РО4), препарат уреазы, 0,2 %-ный
раствор метилового красного.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, ста-
каны стеклянные (объем 100 мл), воронки стеклянные, капельницы,
штатив для пробирок, бюретки, часы, горелка, термостат.
Ход работы. Первоначально проводят качественные реакции на
мочевину. Несколько кристалликов мочевины помещают в пробир-
ку и нагревают до плавления в пламени горелки. После остывания
расплавленной массы добавляют 1 мл дистиллированной воды,
5 капель раствора гидроксида натрия и 1 каплю раствора сульфата
меди (проводят биуретовую реакцию). Раствор приобретает после
перемешивания красно-фиолетовый цвет.
В три пробирки вносят по 2 мл 5 %-ного раствора мочевины.
В одну из них добавляют 1 мл свежеприготовленного раствора
гипобромида натрия, в другую — 1 мл раствора нитрита натрия и
2—3 капли концентрированной соляной кислоты, в третью — 1 мл
раствора нитрата ртути. В первых двух пробирках наблюдают вы-
деление пузырьков газообразного азота и углекислого газа, в
третьей — выпадение белого осадка.
Для проведения реакции мочевины с ксантгидролом в пробирку
добавляют 1 мл 0,1 %-ного раствора мочевины, 2 мл ледяной уксус-
ной кислоты и 0,5 мл насыщенного раствора ксантгидрола. После
перемешивания через 5—10 мин выпадают кристаллы диксантилмо-
чевины.
Для определения массовой концентрации мочевины в моче в два
стакана наливают по 5 мл отфильтрованной мочи. В один из них
(контрольный) добавляют 1 мл раствора хлорида ртути для инги-
бирования фермента, затем в оба стакана вносят по 10 мл фосфат-
ного буфера и по 10 мл препарата уреазы. Смеси помещают в термо-
стат при температуре 37 °C. Через час в оба стакана добавляют
по 10 капель раствора метилового красного, а в стакан, который яв-
ляется пробой,— еще 1 мл раствора хлорида ртути. Растворы в ста-
канах титруют раствором соляной кислоты до появления розового
окрашивания.
Массовую концентрацию мочевины в моче (мг/мл) рассчитывают
по формуле
С = (Д —В) • / • Q/V,
83
где А и В — объемы раствора соляной кислоты, истраченные на
титрование пробы и контроля соответственно (мл); f — коэффициент
поправки на титр 0,1 моль/л раствора соляной кислоты; Q — масса
мочевины, эквивалентная 1 мл 0,1 моль/л раствора соляной кис-
лоты (3 мг); V — объем мочи, взятый для анализа (5 мл),
4. Качественные реакции на креатинин и определение содер-
жания креатинина и креатина в моче
Принцип метода. При нагревании азотистого соединения креа-
тина до t 100 °C в кислой среде образуется его ангидрид — креати-
нин
H2N
Нагревание, НС1
Н3С—N—СН2—СООН
HN—СО
I
HN=C + Н2О
Н3С—N—СН2
Наибольшее количество креатинина образуется в мышцах при
дефосфорилировании креатинфосфата
/ОН
HN~P=O
| 4 ОН
HN=C
Н3С—N—СН2—СООН
HN—СО
+ АОФ -> АТФ + Н2О 4- HN=C
Н3С—N—СН2
В основе обнаружения и количественного определения креати-
нина положена цветная реакция креатинина в щелочной среде с
пикриновой кислотой, в результате которой образуется окрашенный
в оранжевый цвет пикрат креатинина
«N-СО
I |
HN=C
H3N-CH,
HN—С—ОН
N—О—NH,=C |
I II
Н4С—N—СН
По интенсивности окрашивания, определяемой колориметри-
чески, контрольной (стандартный раствор бихромата калия) и ис-
следуемой проб можно рассчитать массовую концентрацию креати-
нина в исследуемой смеси. При определении массовой концентра-
ции креатина в моче первоначально определяют в ней концентрацию
креатинина. Затем креатин переводят в креатинин кипячением мочи
в кислой среде и определяют также содержание креатинина. По раз-
ности между вторым и первым определением с учетом коэффициен-
та перевода креатинина в креатин рассчитывают количество креа-
тина в моче.
Материалы и реактивы. Складчатые бумажные фильтры, мышцы
экспериментального животного, моча, 20 %-ный раствор сульфоса-
лициловой кислоты, 10 %-ный раствор соляной кислоты, 10 %-ный
84
раствор гидроксида натрия, насыщенный раствор пикриновой кис-
лоты, стандартный (1 %-ный) раствор бихромата калия, соответст-
вующий по окраске 2,5 мг креатинина в 250 мл раствора.
Оборудование. Стеклянные палочки, пробирки, пипетки, ворон-
ки стеклянные, мерные колбы (объем 250 мл), конические колбы,
ступка с пестиком, штатив для пробирок, ножницы, водяная баня,
фотоколориметр, часы.
Ход работы. Для обнаружения креатинина в ткани мышц 1 г
измельченных мышц старательно растирают (15—20 мин) с 5 мл
дистиллированной воды, 5 мл полученной смеси переносят в про-
бирку, куда добавляют 5 мл раствора сульфосалициловой кислоты
для осаждения белков. Через 10 мин смесь фильтруют. В пробирку
добавляют 1—2 мл фильтрата, такое же количество раствора соляной
кислоты и кипятят на водяной бане в течение 1,5—2 ч, превращая
креатин в креатинин. Затем в пробирку добавляют 2 мл насыщен-
ного раствора пикриновой кислоты и 3 мл раствора гидроксида
натрия. Смесь тщательно перемешивают и наблюдают появление
оранжевой окраски.
Выявление креатинина в моче проводят следующим образом.
В пробирку добавляют 1 мл профильтрованной мочи, 5 мл дистил-
лированной воды, 0,5 мл раствора гидроксида натрия и 1 мл насы-
щенного раствора пикриновой кислоты. Смесь после тщательного
перемешивания приобретает оранжевый цвет.
Определение массовой концентрации креатинина и креатина в
моче проводят в двух порциях. В одной из них сразу определяют
содержание креатинина. С этой целью в мерную колбу добавляют
2,0 мл профильтрованной мочи, 5 мл насыщенного раствора пикри-
новой кислоты, 2 мл раствора гидроксида натрия и тщательно пере-
мешивают. Через 10 мин содержимое колбы доводят дистиллиро-
ванной водой до объема 250 мл и колориметрируют. Массовую кон-
центрацию креатинина в моче (мг/мл) вычисляют по формуле
Cr = D^/D^V,
где Д и Д — значения оптических плотностей стандартного рас-
твора бихромата калия и исследуемого раствора соответственно;
Q — масса креатинина в 250 мл раствора, эквивалентная по окрас-
ке 1 %-ному стандартному раствору бихромата калия (2,5 мг),
V — объем профильтрованной мочи, взятый для анализа (2 мл).
В другой порции мочи креатин превращают в креатинин и оп-
ределяют количество образуемого креатинина. Для этого в колбу
объемом 250 мл вносят 2 мл исследуемой мочи и 5 мл насыщенного
раствора пикриновой кислоты. Отмечают уровень жидкости в кол-
бе, добавляют еще 100 мл дистиллированной воды и кипятят в те-
чение часа. Если за это время жидкость в колбе выкипит больше
уровня метки, доливают дистиллированную воду, если меньше,—
жидкость упаривают до метки.
После охлаждения в колбу вносят 2 мл раствора гидроксида
натрия, через 10 мин переливают в мерную колбу объемом 250 мл,
добавляют дистиллированной воды до метки 250 мл и колориметри-
85
руют. Массовую концентрацию креатинина во второй порции мочи
рассчитывают по такой же формуле, как и первой.
Разница между значениями во второй и первой порции с учетом
коэффициента перевода креатинина в креатин, равна содержанию
массовой концентрации креатина в исследуемой моче
С = (С2-С1)К,
где Сх и С2 — массовая концентрация креатинина в первой и второй
порциях мочи соответственно; К. — коэффициент перевода креати-
нина в креатин (1,16).
ГЛАВА 5
ФЕРМЕНТЫ
5.1. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ
1. Действие амилазы
Принцип метода. Амилаза является ферментом, который ката-
лизирует гидролиз а-глюкозидной связи а-1-4-крахмала и глико-
гена до промежуточных продуктов, именуемых декстринами. Крах-
мал обладает способностью образовывать с иодом соединение си-
него цвета, амилодекстрин — фиолетового, эритродекстрин — крас-
но-бурого, ахродекстрин — желтого.
Материалы и реактивы. Раствор крахмала (0,2 %-ный), 0,1 %-
ный раствор иода в 0,2 %-ном растворе иодида калия, раствор слю-
ны — рот ополаскивают 2—3 раза водой для удаления остатков
пищи, отмеряют цилиндром 50 мл дистиллированной воды и ополас-
кивают ею рот в течение 3—5 мин в несколько приемов, собранную
жидкость фильтруют через вату и фильтрат используют в качестве
источника фермента.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы.
Ход работы. В две пробирки вносят по 5 мл крахмального клей-
стера, в одну из них добавляют 0,5 мл раствора слюны, содержа-
щей амилазу, хорошо перемешивают и оставляют стоять. Через
15 мин в обе пробирки прибавляют по 5 капель раствора иода.
В пробирке с амилазой слюны раствор через некоторое время
становится бесцветным, в пробирке без амилазы цвет раствора не
изменяется, т. е. остается сине-фиолетовым.
2. Действие липазы
Принцип метода. Липаза катализирует гидролиз триглицеролов
на глицерол и жирные кислоты, количество которых можно опре-
делить по изменению pH среды
О
II
СНа—О—С—Rj
О I СН2—ОН
II л I Липаза I
Ra—С—О СН + знао-------- СН—он +
СН2—О—С—R3 СНа—Он
Триацилглицерол Глицерол
+ 3R—СООН
Жирные кислоты
»7
Материалы и реактивы. Препарат липазы (вытяжка из подже-
лудочной железы) или 5—7 %-ный раствор панкреатина, расти-
тельное масло, 1 %-ный раствор карбоната натрия, 1 %-ный спир-
товый раствор фенолфталеина.
Оборудование. Колбы, пипетки, капельница, термостат.
Ход работы. В две колбы вливают по 1 мл подсолнечного масла,
4 мл дистиллированной воды, по 5 мл раствора NaHCO3, энергично
встряхивают до образования эмульсии (липаза воздействует только
на эмульгированные жиры), прибавляют по 5 капель спиртового
раствора фенолфталеина. Затем в одну из пробирок прибавляют
1 мл препарата липазы, перемешивают и ставят в термостат при
t 38 С.
Через некоторое время в зависимости от активности фермента
раствор в колбе с липазой вследствие образования жирных кислот
(жирные кислоты сдвигают pH среды в кислую сторону) становится
бесцветным, а в колбе без липазы розовая окраска не исчезает.
3. Действие пепсина
Принцип метода. Пепсин является ферментом, катализирующим
гидролитическое расщепление пептидных связей белков до полипеп-
тидов. Он содержится в желудочном соке животных и активируется
соляной кислотой.
Материалы и реактивы. Яичный белок, раствор пепсина (желу-
дочный сок), 1 моль/л раствор соляной кислоты.
Оборудование. Стеклянные трубки диаметром 2—3 мм, водяная
баня.
Ход работы. Две стеклянные трубки наполняют яичным белком
и подогревают до его осаждения (I 85 °C). Одну трубку опускают
в раствор пепсина, другую — в раствор НС1. Через некоторое время
в первой трубке белок начинает растворяться, а во второй — не из-
меняется.
4. Действие уреазы
Принцип метода. Уреаза ускоряет расщепление мочевины с об-
разованием двуокиси углерода и аммиака. По смещению pH раство-
ра в щелочную зону за счет образовавшегося аммиака судят о дейст-
вии уреазы.
NH2
I Уреаза
С=О + Н2О ——- 2NH3 + СО2
nh2
Материалы и реактивы. Раствор мочевины (5 %-ный), 1 %-ный
спиртовый раствор фенолфталеина, 0,01 %-ный раствор кристалли-
ческой уреазы или препарат уреазы (к 8 г соевой муки прибавляют
46 мл дистиллированной воды, 2 мл раствора HCI (0,1 моль/л), пе-
ремешивают, вносят несколько капель толуола и оставляют на
ночь, после чего фильтруют).
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл раствора моче-
вины и по 5 капель спиртового раствора фенолфталеина, в одну из
88
них прибавляют 5 мл препарата уреазы или раствор уреазы и пере-
мешивают. В пробирке с уреазой образуется аммиак, который сдви-
гает pH среды в щелочную сторону. При наличии фенолфталеина
раствор окрашивается в розовый цвет. В пробирке без уреазы
окраска раствора не изменяется.
5. Действие пероксидазы
Принцип реакции. Пероксидаза ускоряет реакцию окисления
органических веществ под влиянием пероксида водорода.
Субстрат/11 + Н,О, + 2Н3О
J ' 2 2 (окисленный) ' 2
Бензидин под действием пероксидазы окисляется с образова-
нием соединения оранжевого цвета. При наличии пероксидазы (вы-
тяжка хрена) пероксид водорода окисляет пирогаллол с образова-
нием пурпурогаллина — соединение красного цвета
Материалы и реактивы. Свежая кровь, вытяжка хрена (на тер-
ке натирают 100 г хрена, заливают 100 мл 0,05 %-ного раствора
углекислого натрия, настаивают в течение 4 ч и фильтруют), 0,5 %-
ный раствор бензидина в ледяной уксусной кислоте, 3 %-ный све-
жеприготовленный раствор пероксида водорода, 2 %-ный водный
раствор пирогаллола.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, во-
дяная баня.
Ход работы.
А. Реакция окисления бензидина. В две пробирки наливают
по 1 мл раствора бензидина и по 2 мл раствора пероксида водорода.
В одну из пробирок прибавляют 1 каплю крови и перемешивают.
Через некоторое время в пробирке с пероксидазой раствор становит-
ся оранжевым. Цвет раствора в пробирке без пероксидазы не из-
меняется.
Б. Реакция окисления пирогаллола. В пробирку наливают 5 мл
вытяжки хрена, кипятят в течение 3 мин и охлаждают. В 4 пробир-
ки (А, Б, В, Г) наливают по 2 мл раствора пирогаллола. В пробир-
ки А и Г прибавляют по 2 мг неинактивированного препарата пе-
роксидазы, в Б — 2 мл инактивированного препарата фермента
и в В — 2 мл воды. Затем в пробирки А, Б и В добавляют по 1 мл
раствора пероксида водорода, перемешивают и наблюдают обра-
зование кр’асного осадка пурпурогаллина. Осадок образуется толь-
89
ко в пробирке А, где присутствуют оба субстрата реакции (пиро-
галлол и пероксид водорода), а также активный фермент (перокси-
даза).
6. Действие каталазы
Принцип метода. Каталаза ускоряет реакцию расщепления пе-
роксида водорода на молекулярный кислород и воду
2Н2О2 ^ат^лаз^ 2НаО + О2
В этой реакции одна молекула пероксида водорода окисляется
и служит донором электронов, а другая восстанавливается и яв-
ляется акцептором электронов.
Материалы и реактивы. Свежеприготовленный раствор Н2О2
(3 %-ный), свежая кровь.
Оборудование. Пробирки, капельницы, пипетки.
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл раствора перок-
сида водорода. В одну из них добавляют каплю крови и перемеши-
вают. В пробирке с каталазой (кровью) вследствие образования
молекулярного кислорода появляется большое количество пузырь-
ков. В пробирке без каталазы пузырьки газа не образуются.
7. Действие тирозиназы
Принцип метена. Тирозиназа катализирует превращение ти-
розина в меланин (черный азотсодержащий пигмент) через окрашен-
ные в красный цвет промежуточные продукты: 3,4-диоксифенилала-
нин (ДОФА), который вследствие окисления и циклизации превра-
щается в 2,3-дигидро-5,6-диокси-0- индолкарбоновую кислоту (I).
Соединение (1), окисляясь, превращается в 2,3-дигидро-5,6-дикето-
0-индолилкарбоновую кислоту (II) — пигмент красного цвета
МелаНохром * Меланин
Материалы и реактивы. Препарат тирозиназы (10 г измельчен-
ного картофеля растирают в ступке с 30 мл воды и отжимают через
несколько слоев марли), насыщенный раствор тирозина.
90
Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком, пробирки, пипет-
ки, водяная баня, термостат (/ 40 °C).
Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл препарата тиро-
зиназы. Содержимое одной пробирки (контроль) кипятят в течение
3 мин и охлаждают. Затем в каждую пробирку прибавляют по 0,5 мл
насыщенного раствора тирозина и ставят в термостат (t 40 °C). Каж-
дые 5 мин пробирки встряхивают для лучшего соприкосновения
жидкости в пробирке с воздухом. В пробирке с неинактивированной
тирозиназой (опыт) жидкость постепенно окрашивается в розовый,
бурый и черный цвет.
8. Действие альдегидоксидазы
Принцип метода. Альдегидоксидаза ускоряет дегидрирование раз-
личных алифатических и ароматических альдегидов (ацетальдегида,
формальдегида, салицилового альдегида и других). В аэробных ус-
ловиях (в присутствии газообразного кислорода) фермент катализирует
реакцию дегидрирования путем переноса водорода на кислород с об-
разованием пероксида водорода
Нх .ОН
>С\ + Оа -> НСООН + Н2О
Нх ХОН
Гидрат формальдегида Муравьиная кислота
В присутствии метиленовой синей последняя служит акцепто-
ром, на который альдегидоксидаза переносит водород с окисляемо-
го альдегида
Н ОН
7^4 +
1н ОН
Метиленовый синий
(окисленная форма)
Алмегиа»
оксидаза
о
//
н-с +
он
Метиленовый синий
(восстановленная форма)
В аэробных условиях действие альдегидоксидазы может быть
обнаружено по обесцвечиванию метиленового синего.
Материалы и реактивы. Свежее молоко, 0,4 %-ный раствор
формальдегида, 0,01 %-ный раствор метиленового синего, вазели-
новое масло.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, газовая горелка,
водяная баня.
Ход работы. В три пробирки наливают по 5 мл молока, содер-
жимое одной пробирки кипятят 2—3 мин и охлаждают В проки-
пяченное молоко и в одну из пробирок с некипяченным молоком
91
добавляют 1 мл раствора формальдегида, в другую пробирку о
некипяченным молоком — 1 мл воды. Затем во все пробирки при-
бавляют по 1 мл раствора метиленового синего, перемешивают,
доливают по 0,5 мл вазелинового масла (для предотвращения попа-
дания кислорода воздуха) и ставят на водяную баню при t 40 °C.
Через некоторое время жидкость в пробирке с некипяченным моло-
ком обесцвечивается вследствие образования восстановленной фор-
мы метиленового синего. Если раствор в пробирке с восстанов-
ленным метиленовым синим перемешать на воздухе, то он снова
приобретает синее окрашивание. Поскольку в первой пробирке
фермент инактивирован нагреванием, а во второй пробирке с неки-
пяченным молоком отсутствовал субстрат (формальдегид), обесцве-
чивания метиленового синего не наблюдается.
9. Действие сукцинатдегидрогеназы
Принцип метода. Сукцинатдегидрогеназа (дегидрогеназа ян-
тарной кислоты) катализирует окисление янтарной кислоты в фу-
маровую кислоту. Сукцинатдегидрогеназа относится к флавиновым
ферментам, ее коферментом является ФАД (флавинадениндинуклео-
тид)
СООН
I
он
II
он
I
СООН
ФАД (восстановленный)
. В качестве акцептора водорода можно использовать 2,6-дихлор-
фенолиндофенол или его натриевую соль (см. стр. 93).
Активность сукцинатдегидрогеназы определяется по изменению
интенсивности окраски раствора натриевой соли 2,6-дихлорфенол-
индофенола. Окисленная форма окрашивается в синий цвет.
Материалы и реактивы. Фосфатный буфер (pH 7,4) — 81 мл
0,2 моль/л раствора Na2HPO4, 19 мл 0,2 моль/л раствора NaH2PO4
92
и общий объем доводится дистиллированной водой до 200 мл, 5 %-
ный раствор янтарной кислоты, 0,1 %-ный раствор гидроксида
натрия, 0,001 моль/л раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола, ткань
(поперечнополосатые мышцы).
СООН CI
Окисленная форма
Сукцинат-
дегидрогеназа
СООН
I
СН
II 4
СН
I
СООН
Оборудование. Пробирки, пипетки, набор инструментов для де-
капитации животного и препарирования мышц, термостат.
Ход работы. В две пробирки наливают по 3 мл фосфатного буфе-
ра. В одну из них (опыт) прибавляют 0,5 мл раствора янтарной
кислоты и 0,5 мл раствора гидроксида натрия для нейтрализации,
в другую (контроль) — 1 мл воды. В обе пробирки доливают по
1 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и вносят по 50 мг тща-
тельно измельченной ткани поперечнополосатой мышцы. Обе про-
бирки ставят на 20 мин в термостат при t 38 °C, затем сравнивают
интенсивность окрашивания.
10. Действие сахаразы
Принцип метода. Сахараза катализирует гидролиз сахарозы
до глюкозы и фруктозы
С12Н22Ои + Н2О —>• 2С6Н12Ов
Образовавшиеся моносахариды определяют реакцией Фелинга.
Сахароза не имеет свободной альдегидной группы и поэтому не об-
ладает восстановительными свойствами.
Материалы и реактивы. Препарат сахаразы (5 г пивных дрож-
жей растирают в фарфоровой ступке с 2—3 мл дистиллированной
воды и небольшим количеством стеклянного песка, к растертой
массе прибавляют около 8—10 мл воды, профильтровывают через
вату), 2 %-ный раствор сахарозы, реактив Фелинга, который со-
стоит из двух растворов: а) 40 г сегнетовой соли и 30 г гидроксида
натрия разводят в мерной колбе объемом 200 мл и доводят водой
до метки; б) 8 г CuSO4 • 5Н2О разводят в колбе такого же объема
и заливают водой до метки. Перед употреблением смешивают рав-
ные объемы этих растворов.
Оборудование. Пробирки, пипетки, фарфоровая ступка с пести-
ком, воронки, термостат, водяная баня, газовая горелка.
Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл препарата фер-
мента. Содержимое одной из них (контроль) кипятят в течение 3 мин
93
для разрушения сахаразы, после чего добавляют в обе пробирки
(охлажденные) по 3 мл раствора сахарозы, хорошо перемешивают
и ставят в термостат при 138 °C. Через 15 мин в обе пробирки вно-
сят по 2 мл реактива Фелинга, перемешивают и нагревают до ки-
пения. В контрольной пробирке осадка нет, а в пробирке с актив-
ным ферментом (опыт) образуется красный осадок гемиоксида меди.
5.2. СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ
5.2.1. Термолабильность ферментов
1. Влияние температуры на активность амилазы слюиы
Принцип метода. Скорость расщепления крахмала под влия-
нием амидазы зависит от температуры и определяется по интенсив-
ности окрашивания раствора крахмала или продуктов его превра-
щения суиодом.
Материалы и реактивы. 1 %-ный раствор крахмала, раствор
слюны (раздел 5J, работа 1), 0,1 %-ный раствор иода в 0,2 %-ном
растворе иодида калия, лед.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, водяная баня,
термостат, стеклянные палочки, стеклянные или фарфоровые пла-
стинки.
Ход работы. В четыре пробирки наливают по 5 мл раствора
крахмала. Первую пробирку помещают в кипящую водяную баню,
вторую — в термостат при t 40 °C, третью оставляют при комнат-
ной температуре, четвертую ставят на лед. Через 10—15 мин во все
пробирки, оставляя их в тех же условиях, прибавляют по 1 мл
раствора слюны и перемешивают стеклянной палочкой. Гидролиз
крахмала наблюдают в реакции с иодом. Для этого на стеклянную
или фарфоровую пластинку наносят несколько капель раствора
иода и смешивают их с каплями смеси, которую отбирают из каждой
пробирки через 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 мин. По изменению окраши-
вания раствора крахмала с иодом судят о степени гидролиза в каж-
дой пробирке. В пробирке, которая содержалась на водяной бане
при t 100 °C, смесь окрашивается в синий цвет. Фермент в этой
пробирке инактивирован и гидролиз крахмала здесь не происхо-
дит. В других пробирках окраска зависит от степени гидролиза
крахмала: в пробирке, находившейся в термостате при t 38 °C рас-
твор приобретает желтый цвет, в третьей и четвертой — красный
или фиолетово-красный.
2. Влияние температуры иа активность уреазы
Принцип метода. При различных значениях температуры уреа-
за в различной степени гидролизует мочевину, вследствие чего обра-
зуется различное количество аммиака, который при наличии фе-
нолфталеина дает окрашивание раствора различной интенсивности.
Материалы и реактивы. Препарат уреазы (раздел 5.1, работа 4)
или 0,01 %-ный раствор кристаллической уреазы, 5 %-ный рас-
твор мочевины, 1 %-ный спиртовый раствор фенолфталеина, лед.
94
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, во-
дяйая баня, термостат.
Ход работы. В три пробирки наливают по 3 мл раствора или
препарата уреазы. Раствор в первой пробирке кипятят в течение
5 Мин. Затем во все пробирки прибавляют по 1 мл раствора моче-
вины и по 5 капель раствора фенолфталеина. Вторую пробирку
быстро ставят на лед, а третью — в термостат при температуре 20—
25 °C.
Во второй и третьей пробирках вследствие образования аммиака
раетвор при наличии фенолфталеина приобретает розовую окрас-
ку* интенсивность и время появления которой зависит от темпера-
туры. Быстрее появляется окраска в третьей пробирке (наиболее
яркая), позже — во второй и совсем не окрасится раствор в первой,
гдё фермент инактивирован.
5.2.2. Влияние реакции среды
на активность ферментов
1. Влияние pH на активность амилазы
Принцип метода. О влиянии pH на активность амилазы судят
по изменению интенсивности окрашивания раствора крахмала с
иоДом. Для амилазы слюны оптимум pH — 6,8, а в кислой н щелоч-
ной среде активность амилазы снижается.
Таблица. 4
pH 0,2 моль/л Na»HPO4, мл 0.2 моль/л NaHjPO4, мл
5,8 4,00 46,00
6,2 9,25 40,75
6,6 18,75 31,25
6,8 24,50 25,50
7,2 36,00 14,00
7,6 43,50 6,50
8,0 47,35 2,65
Материалы и реактивы. Раствор слюны (раздел 5.1, работа 1),
Г%-ный раствор крахмала, 0,1 %-ный раствор иода в 0,2 %-ном
растворе йодида калия, фосфатный буфер с различными значениями
pH (табл. 4). Общий объем буферного раствора 100 мл.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, тер-
мостат.
Ход работы. В семь пробирок наливают по 2 мл буферного рас-
твора с различным значением pH (табл. 4). Затем приливают по 5 мл
раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны. Содержимое проби-
рок перемешивают и помещают в термостат на 10 мин при t 38 °C.
После инкубации в термостате во все пробирки прибавляют по
5 капель раствора иода, перемешивают, наблюдают окраску и отме-
чают активность. Для наглядности в каждую пробирку можно
добавить немного дистиллированной воды и размешать.
95
2. Влияние pH на активность пепсина
Принцип метода. Влияние pH на активность пепсина можно
определить по расщеплению этим ферментом белка фибрина при
различных значениях pH.
Материалы и реактивы. Фибрин, 1 %-ный раствор пепсина в
0,2 %-ном растворе соляной кислоты, фосфатноцитратный буфер
с различными значениями pH (табл. 5).
Таблица 5
pH 9,2 моль/л Na2HPO4X Х2Н2О мл 0,1 моль/л С,Н«(ОН)(СО,Н), X X Н,О, мл
2,2 0,40 19,60
4,0 7,71 12,29
6,0 12,63 7,37
7,0 16,47 3,53
8,0 19,45 0,55
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, термостат.
Ход работы. В пять пробирок наливают по 1 мл раствора пе-
псина и добавляют по 1 мл буферного раствора с различным значе-
нием pH (табл. 5). Затем во все пробирки вносят по кусочку фиб-
рина и ставят в термостат на 30 мин при t 38 °C. После инкубации
в термостате наблюдают расщепление кусочков фибрина.
5.2.3. Влияние активаторов и ингибиторов
на активность ферментов
1. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы
Принцип метода. Активатором амилазы является NaCl, а инги-
битором CuSO4. О влиянии этих веществ на активность амилазы
судят по степени гидролиза крахмала под влиянием фермента в
присутствии NaCl и CuSO4.
Материалы и реактивы. Раствор слюны (раздел 5.1, работа 1)
0,5 %-ный раствор крахмала, 0,1 %-ный раствор иода в 0,2 %-ном
растворе иодида калия, 1 %-ный раствор NaCl, 1 %-ный раствор
CuSO4.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, тер-
мостат.
Ход работы. Готовят три пробирки. В первую наливают 2,5 мл
воды, во вторую — 2 мл воды и 0,5 мл раствора NaCl, в третью —
2 мл воды и 0,5 мл раствора CuSO4. Во все пробирки вносят по
2,5 мл раствора слюны, перемешивают и добавляют по 2,5 мл раст-
вора крахмала, затем снова перемешивают н ставят в термостат при
138 °C. Через 5 мин прибавляют по 5 капель раствора иода.
Жидкость в первой пробирке окрашивается в фиолетовый или крас-
ный цвет, во второй — в красный или желтый, в третьей — в синий.
Полученные результаты свидетельствуют, что активатором амилазы
96
является NaCl (вторая пробирка), а ингибитором CuSO4 (третья
пробирка).
2. Влияние желчи на активность липазы
Принцип метода. Желчь содержит поверхностно-активные соли
желчных кислот, которые служат активаторами липазы. Желчь
способствует диспергированию жиров с образованием эмульсин,
что облегчает их взаимодействие в качестве субстратов с липазой
при гидролитических реакциях.
Материалы и реактивы. Препарат липазы (вытяжка из поджелу-
дочной железы), растительное масло, 10 %-ный спиртовый раствор
фенолфталеина, 10 %-ный раствор желчи, 0,05 моль/л или
0,02 моль/л раствор гидроксида калия.
Оборудование. Колбы конические, пипетки, бюретки, капельни-
цы, термостат.
Ход работы. В две колбы помещают по 2 мл растительного мас-
ла, в одну из них (контроль) прибавляют 6 мл дистиллированной
воды, а во вторую (опыт) — 6 мл раствора желчи. Затем в обе
колбы наливают по 4 мл препарата липазы, тщательно перемеши-
вают и ставят в термостат при t 38 °C. Через 30 мин прибавляют
по 3—4 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,05 моль/л или
0,02 моль/л раствором гидроксида калия. В присутствии желчи
(опыт) при титровании расходуется больше раствора гидроксида
калия, чем в ее отсутствии (контроль). Это свидетельствует о спо-
собности желчи повышать активность липазы.
3. Ингибирующее действие и-хлормеркурийбензоата на актив-
ность уреазы
Принцип метода. В активном центре уреазы имеются SH-rpyn-
пы, которые могут быть связаны n-хлормеркурийбензоатом, в ре-
зультате чего действие фермента не проявляется. Это пример некон-
курентного ингибирования ферментативной реакции
Уреаза—s[H + Clj-Hg-Z \ СООН —
— Уреаза-S-Hg-^СООН + HCI
Неактивный комплекс
Материалы и реактивы. Препарат уреазы (раздел 5.1, работа 4)
или 0,01 %-ный раствор кристаллической уреазы, 1 %-ный рас-
твор мочевины, 0,001 моль/л раствора n-хлормеркурийбензоата (мо-
лекулярная масса 356), 0,02 %-ный спиртовый раствор фенолфта-
леина.
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. В две пробирки наливают по 2,5 мл раствора или
препарата уреазы, затем в одну пробирку (контроль) прибавляют
0,5 мл дистиллированной воды, в другую (опыт) — 0,5 мл раствора
n-хлормеркурийбензоата. После этого в обе пробирки доливают
97
по 2,5 мл раствора мочевины и по 1 капле раствора фенолфталеина.
Через некоторое время жидкость в контрольной пробирке приобре-
тает розовое окрашивание, постепенно переходящее в малиновое,
а в опытной — раствор остается бесцветным.
4. Ингибирующее действие малоновой кислоты на активность
сукцинатдегидрогеназы
Принцип метода. В присутствии соединений, структурно сход-
ных с янтарной кислотой (малоновая, щавелевая, глутаровая, фе-
нилпропионовая), но не способных дегидрироваться, может проис-
ходить блокирование активного центра сукцинатдегидрогеназы и
тем самым тормозить протекание нормальной реакции. Это пример
конкурентного ингибирования.
Материалы и реактивы. Ткань (поперечнополосатые мышцы),
1 %-ный раствор малоновой кислоты, 1 %-ный раствор метилено-
вого синего, вазелиновое масло.
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельницы, термостат.
Ход работы. В три пробирки вносят по 3—4 г тщательно измель-
ченной ткани поперечнополосатой мышцы. В первую прибавляют
0,4 мл дистиллированной воды, во вторую — 0,2 мл раствора ма-
лоновой кислоты и 0,2 мл воды, а в третью — 0,4 мл раствора ма-
лоновой кислоты. Во все пробирки доливают по 1 мл раствора ян-
тарной кислоты и по 2—3 капли раствора метиленового синего.
Содержимое пробирок перемешивают, добавляют по 3—4 капли
вазелинового масла и выдерживают в термостате при t 38 °C. Через
5—10 мин наблюдают почти полное исчезновение голубой окраски
в первой пробирке, некоторое уменьшение интенсивности окраски
во второй пробирке и полное сохранение ее в третьей.
5.2.4. Специфичность ферментов
1. Специфичность действия амилазы и сахаразы
Принцип метода. Амилаза расщепляет полисахариды и не дей-
ствует на дисахариды (мальтозу или сахарозу). Сахараза расщеп-
ляет только сахарозу на глюкозу и фруктозу и не действует на крах-
мал и другие дисахариды.
Материалы и реактивы. Раствор слюны (раздел 5.1., работа 1),
0,5 %-ный раствор крахмала, 0,5 %-ный раствор сахарозы, 0,1 %-
ный раствор иода в 0,2 %-ном растворе иодида калия, реактив Фе-
линга и препарат сахарозы (раздел 5.1, работа 10).
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, тер-
мостат, водяная баня.
Ход работы. В две пробирки наливают по 3 мл раствора крахмала
и прибавляют в первую пробирку 1 мл раствора слюны (амилаза),
во вторую — 1 мл препарата сахаразы, перемешивают и ставят в
термостат при температуре 38 °C.
В две другие пробирки наливают по 3 мл 0,5 %-ного раствора
сахаразы и в первую пробирку прибавляют 1 мл препарата саха-
розы, во вторую — 1 мл раствора слюны и оставляют при тех же
условиях. Через 5 мин в первые две пробирки с крахмалом добав-
98
ляют по 5 капель раствора иода. В пробирке с амилазой синее окра-
шивание раствора исчезает вследствие расщепления крахмала ами-
лазой. В другой пробирке раствор окрашен в синий цвет, так как
сахараза не действует на крахмал.
В пробирках с раствором сахарозы действие фермента обнару-
живается по положительной реакции с реактивом Фелинга по на-
личию моносахаридов. Для этого в пробирки прибавляют по 1 мл
реактива Фелинга и нагревают до кипения. Сахароза не имеет сво-
бодных альдегидных групп и восстановительными свойствами не
обладает, поэтому в пробирке, где под влиянием сахаразы произош-
ло расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу, наблюдается
красное окрашивание вследствие образования гемиоксида меди.
2. Абсолютная специфичность действия уреазы
Принцип метода. Незначительные изменения в структуре субст-
рата приводят к тому, что фермент не оказывает действия на этот
субстрат. Так, субстратом для уреазы является мочевина, а тиомо-
чевина, отличающаяся от мочевины наличием атома серы, уреазой
не расщепляется:
NHa NH2
I I
c=o c=s
nh2 nh2
Мочевина Тиомочевина
Материалы и реактивы. Препарат уреазы (раздел 5.1, работа 4)
или 0,01 %-ный раствор кристаллической уреазы, 1 %-ный спирто-
вый раствор фенолфталеина, 5 %-ный раствор мочевины, 5 %-ный
раствор тиомочевины.
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельницы.
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл препарата или
раствора уреазы и по 5 капель раствора фенолфталеина. В одну
из них добавляют 1 мл раствора мочевины, а в другую — 1 мл рас-
твора тиомочевины. Обе пробирки оставляют на 20 мин при комнат-
ной температуре. Содержимое пробирок с мочевиной окрашивается
в розовый цвет вследствие образования аммиака при расщеплении
мочевины. Тиомочевина под действием уреазы не расщепляется,
поэтому раствор во второй пробирке не окрашивается.
3. Групповая специфичность действия сахаразы
Принцип метода. Сахараза специфична по отношению к фрук-
тозной части дисахарида сахарозы и трисахарида рафинозы и рас-
щеплению подвергается р-гликозидная связь, расположенная бли-
же к фруктозной части данных молекул. Продукты ферментативно-
го гидролиза сахарозы и рафинозы дают положительную реакцию
с реактивом Фелинга.
Материалы и реактивы. Препарат сахаразы и реактив Фелинга
(раздел 1.1.1, работа 2), 1 %-ный раствор рафинозы, 1 %-ный рас-
твор сахарозы.
99
Оборудование. Пробирки, пипетки, термостат, газовая горелка.
Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл препарата саха-
разы, в одну из них добавляют 2 мл раствора сахарозы, а в другую —
2 мл раствора рафинозы. Содержимое пробирок перемешивают и
ставят на 5—10 мин в термостат при t 38 °C. Затем в обе пробирки
прибавляют по 3 мл реактива Фелинга, тщательно перемешивают
и смесь нагревают до кипения. В обеих пробирках образуется крас-
ный осадок оксида меди.
5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
1. Определение активности амилазы слюны по методу Вольгемута
Принцип метода. Метод Вольгемута основан на определении
минимального количества фермента, способного при определенных
условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крах-
мала. Амилазная активность слюны выражается количеством мил-
лилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гид-
ролизовано 1 мл неразбавленной слюны при температуре 38 °C в те-
чение 30 мин. В норме амилазная активность равна 160—320. Ме-
тод Вольгемута широко используется в клинической практике для
определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении —
для определения амилазной активности солода. Резкое повышение
амилазной активности в крови и моче (в 10—30 раз) наблюдается
при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.
Материалы и реактивы. Слюна, разбавленная в 10 раз,
0,1 %-ный раствор крахмала, 0,1 %-ный раствор иода в 0,2 %-ном
растворе иодида калия.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы, тер-
мостат.
Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллиро-
ванной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в
10 раз слюны, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую
пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают, 1 мл
смеси переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из
последней пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Таким обра-
зом, в каждой последующей пробирке содержимое фермента в 2 раза
меньше, чем в предыдущей и разведение слюны в десяти пробирках
составит: 1 i 10, 1 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320, 1 : 640,
1 : 1280, 1 : 2560, 1 • 5120, 1 : 10240.
Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл рас-
твора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при t 38 °C
на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной
водой для прекращения действия фермента, добавляют по 2 капли
раствора иода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением
окраски. При реакции с иодом жидкость окрашивается в желтый,
розовый и фиолетовый цвет.
Отметив при каком разведении произошел полный гидролиз
крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с жел-
100
товатои окраской содержимого), по количеству неразведенной слю*
ны (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слю-
ны (А мл слюны расщепляет х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).
Например, желтоватый цвет появился в 4-й пробирке, где слюна
разведена в 160 раз. Это количество слюны способно гидролизовать
2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной слюны
в тех же условиях гидролизует 320 мл! х = 2 • 160/1. Следователь-
но, амилазная активность слюны равна 320.
2. Определение активности уреазы
Принцип, метода. Метод основан на определении количества
аммиака, образующегося в процессе действия уреазы на мочевину.
Материалы и реактивы. Препарат уреазы (раздел 5.1, работа 4),
2 %-ный раствор мочевины, 0,05 %-ный спиртовый раствор мети-
лового красного, 0,1 %-ный раствор HgCl2, раствор НС1 (0,1 моль/л).
Оборудование. Колбы емкостью 50 мл, пипетки, бюретки, ка-
пельницы, термостат, газовая горелка.
Ход работы. В две колбы вносят по 10 мл препарата уреазы.
Одну из них (контроль) нагревают до кипения. Затем в обе колбы
прибавляют по 5 мл раствора мочевины, хорошо перемешивают и
ставят на 30 мин в термостат при температуре 20 °C. Прибавляют
по 10 капель раствора метилового красного, по 2 мл раствора HgCl2
и выделившийся аммиак титруют раствором НО.
1 мл раствора НО (0,1 моль/л) соответствует 1,4 мг азота. Еди-
ница уреазного действия — это количество фермента, которое спо-
собно образовать из мочевины 1 мг азота аммиака в течение 5 мин
при 120 °C (pH 7,0).
Действие уреазы на мочевину в буферном растворе представ-
ляет собой реакцию нулевого порядка, которую можно выразить
уравнением х = kt, где х — количество мочевины, которая расще-
пилась в результате действия уреазы; t — время действия фермента
(мин); k — константа.
Если количество мочевины С, которое расщепилось при дейст-
вии уреазы, пропорционально времени действия уреазы, то актив-
ность уреазы можно рассчитать по формуле
C = (A-B)fVQ/t,
где А — В — разность результатов титрования раствором НО
(0,1 моль/л) исследуемого и контрольного образцов (мл); / — коэф-
фициент поправки на титр раствора НО (0,1 моль/л); t — время
(мин), на протяжении которого действовал фермент (время инку-
бации); V — количество мочевины в пробах (мл); Q — количество
азота, соответствующее 1 мл 0,1 моль/л раствора НО (мг).
3. Определение активности каталазы по Баху
Принцип метода. Метод основан на определении количества
пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы,
титрованием раствора КМпО4 в кислой среде. Реакция протекает
по уравнению
2К.МпО4 + 5Н2О2 + 3H2SO4 -> 2MnSO4 + K2SO4 + 8Н2О + 5Оа
101
1 мл 0,002 моль/л раствора перманганата калия соответствует 1,7 мк
пероксида водорода.
Материалы и реактивы. Препарат каталазы — 20 г картофеля,
порезанного на кусочки, растирают в фарфоровой ступке с неболь-
шим количеством кварцевого песка, настаивают в 100 мл воды в те-
чение 30 мин и фильтруют, 10 %-ный раствор HaSO4, 0,1 %-ный
раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH 7,0 (35,0 мл
0,2 моль/л Na2HPO4 и 13,6 мл 0,2 моль/л NaH2PO4), 0,002 моль/л
раствор КМпО4.
Оборудование. Колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, тер-
мостат.
Ход работы. В две колбы вносят по 5 мл препарата каталазы,
в одну из них (контроль) прибавляют 3 мл раствора H.jSC)4, затем
наливают по 10 мл раствора пероксида водорода, ставят в термостат
на 30 мин при температуре 37 °C. По истечении времени инкуба-
ции во вторую колбу (опыт) прибавляют 3 мл раствора H2SO4 и оба
раствора титруют раствором КМпО4 до появления стойкого розового
окрашивания от излишка перманганата калия.
Активность каталазы определяется количеством разложенного
пероксида водорода (мг) и рассчитывается по формуле
C = (B-A)/Q,
где В — А — разность результатов титрования контрольного и ис-
следуемого образцов 0,002 моль/л раствором КМпО4 (мл); f — коэф-
фициент поправки на титр 0,002 моль/л раствора КМпО4; Q — ко-
личество пероксида водорода (1,7 мг), соответствующее 1 мл
0,002 моль/л КМпО4.
4. Определение активности ацетилхолинэстеразы в сыворотке
крови
Принцип метода. Холинэстераза ускоряет реакцию гидролиза
ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты, в резуль-
тате чего изменяется pH буферного раствора. Мерой активности
фермента является величина изменения pH среды
Н3С—С—О (CHa)a-N (СН3)з
СГ + Н2О
Ацетилхолинхлорид
-> (НО—СН2—СН2—N (СН3)3( С1~ + СН3СООН
Холинхлорид
Материалы и реактивы. Раствор ацетилхолина (3,5 %-ный), сы-
воротка крови (свежую кровь помещают в центрифужные пробирки,
выдерживают 30 мин при / 30 °C в водяной бане и центрифугируют
в течение 15 мин при 3000g), веронал-мединаловый буферный рас-
твор, pH 8,4 (2,06 г мединала растворяют в 100 мл воды и 82,3 мл
этого раствора смешивают с 17,7 мл 0,1 моль/л раствора соляной
кислоты), 0,02 %-ный раствор фенолового красного в 0,025 моль/л
растворе НО.
102
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, термостат, фото-
электроколориметр .
Ход работы. В одну пробирку вносят 1 мл буферного раствора,
0,5 мл раствора ацетилхолина и 0,1 мл сыворотки, в другую — 1 мл
того же буферного раствора, 0,5 мл воды, 0,1 мл сыворотки крови.
Обе пробирки инкубируют в течение 60 мин при t 37 °C. За 2—3 ми-
нуты до окончания инкубации в каждую пробирку прибавляют
по 3,5 мл воды и 0,1 мл раствора фенолового красного. Пробы ко-
лориметрируют в кювете толщиной 10 мм при 536 нм (зеленый
светофильтр), расчет производят по стандартной кривой, для по-
Таблица 6
Состав буфера, мл pH
7,0 7,2 7.4 7.6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6
Основной меди- наловый раствор 5,36 5,54 5,81 6,15 6,62 7,16 7,69 8,23 8,71
Раствор соля- ной кислоты (0,1 моль/л) 4,64 4,46 4,19 3,85 3,38 2,84 2,31 1,77 1,29
строения которой готовят индикаторно-буферный ряд с различны-
ми значениями pH (табл. 6). Основной мединаловый раствор гото-
вят, растворяя 10,3 г мединала в 500 мл воды.
К Ю мл каждого буферного раствора прибавляют 0,1 мл рас-
твора фенолового красного и колориметрируют в тех же условиях,
что и опытные пробы.
При построении графика по оси ординат откладывают найденные
величины оптической плотности, а по оси абсцисс — соответствую-
щие значения pH раствора. Активность холинэстеразы оценивают
по величине изменения pH опытной пробы по сравнению с конт-
рольной.
5. Определение активности кислой фосфатазы в сыворотке
крови
Принцип метода. Метод основан на способности щелочной фос-
фатазы в определенных условиях гидролизовать эфирную связь в
паранитрофенилфосфате. Освобождающийся при гидролизе пара-
нитрофенол в щелочной среде дает желтое окрашивание, интенсив-
ность которого отражает активность фермента. Реакция гидролиза
протекает по уравнению
,—он л , // _ X _ , .. л ^и^лая OjN-/ /О ° + КР фосфатаза' '=/ ОН л - Нитрофенйлфасфат 'n-Z у-ОН + NaOH >- / \=/ О °aN-^ У~ОН + Н3РО, л-Нитрофенол NaO 44=/ )=О + Н,О / \=/ О ЮЗ
Материалы и реактивы. Сыворотка крови (раздел 5.3, работа 4),
субстратно-буферный раствор, pH 4,8 (410 мг лимонной кислоты,'
1,1257г цитрата натрия и 165 мг n-нитрофенилфосфата натрия рас-
творяют в 100 мл бидистиллированной воды), стандартный раствор
п-нитрофенола (13,9 мг n-нитрофенола растворяют в 100 мл
0,02 моль/л раствора гидроксида натрия), 0,1 моль/л и 0,02 моль/л
растворы гидроксида натрия.
Оборудование. Пипетки, колбы мерные на 50 и 100 мл, фото-
электроколориметр, термостат.
Ход работы. В две колбы емкостью 50 мл вносят по 5 мл субст-
ратно-буферного раствора, доведенного до температуры 37° С. За-
тем' в одну из колб (контроль) прибавляют 1 мл воды, а в другую
(опыт) — 0,1 мл сыворотки крови. Содержимое колб тщательно пе-
ремешивают и инкубируют в течение 30 мин в термостате при
t 37 °C. После окончания инкубации в обе колбы прибавляют по
5 мл 0,1 моль/л раствора гидроксида натрия. Перемешивают и
фотометрируют при X 420 нм в кювете толщиной 10 мм против
0,02 моль/л раствора гидроксида натрия.
За единицу активности принимают такое количество фермента,
которое освобождает 1 мкмоль n-нитрофенола в заданных условиях
(0,1 мл сыворотки крови, конечный объем исследуемого раствора
11,1'мл, время инкубации 30 мин, температура 37 °C).
Для определения активности кислой фосфатазы пользуются ка-
либровочным графиком, который строят следующим образом: в
колбы вносят 1, 2, 3, 5 и 7 мл стандартного раствора п-нитрофе-
нола, содержащих 1, 2, 3, 4 и 5 мкмоль вещества соответственно,
и добавляют необходимое количество 0,02 моль/л раствора гидрокси-
да натрия, чтобы общий объем в каждой колбе был 11,1 мл. Содер-
жимое колб перемешивают и измеряют величины экстинкции окра-
шенных растворов против раствора гидроксида натрия (0,02 моль/л)
при X 420 нм. По оси ординат откладывают значения экстинкций, а
по оси абсцисс — количество n-нитрофенола в пробе и рассчиты-
вают активность фермента.
6. Количественное определение альдолазы в сыворотке крови
Принцип метода. Метод основан на определении интенсивности
окраски гидразонов, которые образуются в результате взаимодейст-
вия продуктов ферментативного расщепления фруктозо-1,6-дифос-
фата-фосфотриоз (диоксиацетонфосфат и Д-глицеральдегид-З-фос-
фат) с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. Интенсив-
ность окраски растворов пропорциональна активности фер-
мента.
Материалы и реактивы. Сыворотка крови (раздел 5.3, работа 4),
0,005 моль/л раствор фруктозо-1,6-дифосфата в 0,056 моль/л рас-
творе гидразина, pH 8,2 (250 мг бариевой соли фруктозодифосфата
растворяют в 70 мл воды, добавляют 410 мл гидразинхлорида, до-
водят pH до 8,2 1 моль/л раствором гидроксида натрия, после чего
разводят водой до 100 мл), 2 моль/л раствор соляной кислоты,
0,1 %-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразин в 2 моль/л растворе
соляной кислоты, 0,6 моль/л раствор гидроксида натрия.
104
Оборудование. Пробирки, пипетки, микропипетки, термостат,
фотоэлектроколориметр.
Ход работы. В две пробирки вносят по 0,1 мл сыворотки крови,
а в одну из них (опыт) добавляют 0,5 мл раствора фруктозо-1,6-
дифосфата в гидразине. Обе пробирки помещают в термостат на
30 мин при t 37 °C. После инкубации для остановки реакции в обе
пробирки прибавляют по 0,1 мл раствора НО, а в одну из них (конт-
роль) вносят 0,5 мл раствора фруктозо-1,6-дифосфата в гидразине.
Затем в обе пробирки прибавляют по 0,5 мл раствора 2,4-динит-
рофенилгидразина, перемешивают и оставляют на 30 мин при ком-
натной температуре для развития цветной реакции. Спустя это
время приливают по 4,5 мл раствора гидроксида натрия, выдержи-
вают 20 мин в темноте, после чего фотометрируют против воды в
кювете толщиной 10 мм при X 536 нм.
Уровень активности альдолазы оценивается в условных едини-
цах по разнице в экстинкции опытной и контрольной проб.
ГЛАВА 6
ВИТАМИНЫ
6.1. ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
6.1.1. Реакции на тиамин (витамин
1. Реакция с диазореактивом
Принцип реакции. В основе реакции лежит способность витамина
Вт в щелочной среде с диазореактивом (смесь солянокислого или
сернокислого раствора сульфаниловой кислоты с раствором нит-
рита натрия) образовывать сложное комплексное соединение оран-
жевого или красного цвета.
Материалы и реактивы. Раствор сульфаниловой кислоты (1 %-
ный), 5 %-ный раствор нитрита натрия, 10 %-ный раствор бикарбо-
ната натрия, тиамин в порошке, или 5 %-ный его раствор.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, скальпель.
Ход работы. В пробирку приливают 1 мл раствора сульфанило-
вой кислоты и 1 мл раствора нитрита натрия. Образуется диазо-
реактив. Сюда же вносят небольшое количество (на кончике скаль-
пеля) порошка или 0,5 мл раствора тиамина и по стенке пробирки
осторожно добавляют 1 мл раствора Na2COs.
На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого или
красного цвета.
2. Реакция окисления тиамина в тиохром
Принцип реакции. Витамин Bi в щелочной среде под действием
гексоциано-Ш феррата калия окисляется в тиохром—пигмент жел-
того цвета, который в изобутиловом спирте дает интенсивно синюю
флюоресценцию:
C"S"C-CH-CH20H
N---С-СН.
Тиамин
сГ + 2K3Fe(CN)e + ЗКОН =
+ 2K„Fe(CN)e + KCI + ЗН4О
Тиохром
Материалы и реактивы. Тиамин в концентрации 5 мкг в 1 мл(
1 %-ный раствор K3Fe(CN)e, 30 %-ный раствор NaOH, изобутило-
вый спирт.
Оборудование. Источник ультрафиолетового излучения (флюоро-
скоп), штатив с пробирками, пипетки.
106
Ход работы. К 1 мл раствора витамина Bt прибавляют 2 мл
смеси (1 мл раствора K3Fe(CN)e и 1 мл раствора NaOH), тщательно
перемешивают и оставляют на три минуты. Затем прибавляют 5 мл
изобутилового спирта, энергично и равномерно встряхивают в те-
чение 2 мин. Изобутиловый экстракт тиохрома в ультрафиоле-
товых лучах имеет интенсивную синюю флюоресценцию. Это очень
чувствительная специфическая реакция.
3. Количественное определение тиамина в моче флюорометри-
ческим методом по Вангу и Харрису
Принцип метода. Определение основано на окислении тиамина
в тиохром (раздел 6.1.1, работа 2), экстракции тиохрома органи-
ческим растворителем и измерении интенсивности голубой флюо-
ресценции. Для количественного определения тиамина сравнивают
флюоресценцию окисленных стандартных и испытуемых растворов
тиаминхлорида на флюорометре.
Материалы и реактивы. Моча, 10 %-ный раствор гексациано-
(III) феррата калия, 20 %-ный раствор гидроксида натрия, рабочий
стандартный раствор тиамина (10 мкг в 1 мл), этанол, изобутанол.
Оборудование. Флюорометр, штатив с пробирками, пипетки, де-
лительные воронки.
Ход работы. В делительную воронку наливают 6—8 мл мочи,
прибавляют равный объем изобутанола и встряхивают в течение
2 мин. Промытую мочу (нижний слой) сливают в две сухие делитель-
ные воронки (по 2 мл) и прибавляют по 1 мл раствора гидроксида
натрия.
В опытную воронку по каплям вносят свежеприготовленный
раствор гексациано-(Ш) феррата калия до тех пор, пока окраска
HeJ ^сохранится в течение 30 с. В опытную и контрольную воронки
прибавляют по 5 мл дистиллированной воды, по 10 мл изобутанола
и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. Нижний слой мочи сли-
вают, а верхний (изобутанол) собирают в две сухие пронумерован-
ные пробирки.
В третью делительную воронку вносят 1 мл рабочего стандарт-
ного раствора тиамина и 1 мл воды, в четвертую — 2 мл дистилли-
рованной воды. В обе воронки прибавляют по 1 мл раствора гидро-
ксида натрия, по 10 капель раствора гексациано-(Ш) феррата ка-
лия, встряхивают, доливают по 5 мл воды, и по 10 мл изобутанола,
снова встряхивают в течение 2 мин. Нижний слой удаляют, а верх-
ний собирают в две сухие пронумерованные пробирки.
Для просветления растворов во все четыре пробирки — опыт-
ную, стандартную .и две контрольные добавляют по 2 мл этанола.
Проводят сравнение интенсивности флюоресценции исследуемой мо-
чи и контроля. Содержание тиамина определяют на флюорометре
по флюоресценции тиохрома.
Массовую концентрацию тиамина (мкг) в исследуемом материале
находят по формуле
х = С (Е0П — Дк) V q/EctV i,
107
где х — массовая концентрация тиамина в моче; С — концентра-
ция тиамина в 1 мл рабочего стандартного раствора (10 мкг); Vj —
объем мочи, взятой для анализа (2 мл); Уо — общий объем мочи за
сутки (мл); Еоп — интенсивность флюоресценции опытной пробы;
Ек контрольной; Ет — стандартной.
6.1.2. Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2)
Принцип реакции. Образующийся при добавлении металлическо-
го цинка к концентрированной соляной кислоте водород восстанав-
ливает желтый рибофлавин сначала в родофлавин (промежуточное
соединение) красного цвета, а затем в бесцветный лейкофлавин
Окисленная форма
Восстановленная форма
Материалы и реактивы. Концентрированная НС1, металличе-
ский цинк, 0,025 %-ный раствор витамина В2 (взвесь рибофлавина
в воде).
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку приливают 1 мл раствора витамина В2,
0,5 мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек
металлического цинка. Выделяющийся водород реагирует с рибофла-
вином, восстанавливая его, и жидкость постепенно окрашивается в
розовый цвет, а затем обесцвечивается. При взбалтывании обесцве-
ченного раствора лейкофлавин вновь окисляется кислородом возду-
ха в рибофлавин.
6.1.3. Реакции нв витамин РР (антипелларгический, В5)
1. Реакция с ацетатом меди
Принцип реакции. При нагревании витамина РР с раствором
ацетата меди образуется плохо растворимый синий осадок медной
соли витамина РР
о о
+ 2СН.С00Н
Витамин РР
Медная соль витамина РР
Материалы и реактивы. Витамин РР в порошке, 10 %-ный рас-
твор уксусной кислоты, 5 %-ный раствор ацетата меди.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
108
Ход работы. В пробирку кладут 5—10 мг витамина РР и раство-
ряют при нагревании в 1—2 мл раствора уксусной кислоты. К на-
гретому до кипения раствору прибавляют такой же объем раствора
ацетата меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голу-
бой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок медной соли нико-
тиновой кислоты.
2. Реакция с гидросульфитом натрия
Принцип реакции. Витамин РР восстанавливается гидросульфи-
том натрия с образованием соединения желтого цвета.
Материалы и реактивы. Витамин РР в порошке, 10 %-ный
раствор бикарбоната натрия, 5 %-ный раствор гидросульфита нат-
рия.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирку кладут 5—10 мг витамина РР, добав-
ляют 1,5 мл раствора гидрокарбоната натрия, перемешивают и при-
бавляют 1,5 мл свежеприготовленного раствора гидросульфита нат-
рия. Жидкость окрашивается в желтый цвет.
3. Реакция с 2,4-динитрохлорбензолом
Принцип реакции. Витамин РР при нагревании с 2,4-динитро-
хлорбензолом в присутствии щелочи образует окрашенное соеди-
нение.
Материалы и реактивы. 0,1 %-ный спиртовый раствор никоти-
новой кислоты (или никотинамида), 1 %-ный спиртовый раствор
2,4-динитрохлорбензола, спиртовый раствор гидроксида натрия.
Оборудование. Фарфоровая чашка, водяная баня, стеклянные па-
лочки, пипетки.
Ход работы. В фарфоровую чашку для выпаривания наливают
1 мл спиртового раствора никотиновой кислоты (или никотинами-
да), раствор выпаривают досуха на водяной бане. К сухому остатку
прибавляют 1 мл спиртового раствора 2,4-динитрохлорбензола и
тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Полученный рас-
твор снова выпаривают на водяной бане досуха (в вытяжном шка-
фу!), после чего нагревание продолжают в течение 10—15 мин.
Чашку охлаждают до комнатной температуры и к осадку прибав-
ляют 5 мл спиртового раствора гидроксида натрия. Возникает крас-
но-фиолетовое окрашивание, которое при стоянии светлеет и посте-
пенно исчезает.
6.1.4. Реакции на пиридоксин (витамин В6]
1. Реакция с хлоридом железа (III)
Принцип реакции. При взаимодействии пиридоксина с раствором
хлорида железа жидкость окрашивается в красный цвет вследствие
образования комплексной соли типа фенолята железа.
Материалы и реактивы. Водный раствор (1 %-ный) витамина
Be, 1 %-ный раствор FeCls.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. В пробирке смешивают 1 мл водного раствора пи-
ридоксина и 2 капли раствора хлорида железа. Смесь встряхивают.
Наблюдают окрашивание жидкости в красный цвет.
109
2. Обнаружение пиридоксиловой кислоты в моче
Принцип метода. Витамин Вв выделяется нз организма в виде
пиридоксиловой кислоты. Раствор лактона пиридоксиловой кислоты
имеет синюю флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах
СООН
4-Пиридоксиловая кислота
01“ + Н2О
Лактон 4-пиридоксиловой
кислоты
Материалы и реактивы. Моча, 10 %-ный раствор соляной кис-
лоты, 10 %-ный раствор гидроксида натрия, 1 %-ный раствор тет-
рабората натрия.
Оборудование. Пробирки, пипетки, водяная баня, флюорометр.
Ход работы. В пробирку наливают 0,5 мл мочи и 0,5 мл раство-
ра соляной кислоты, помещают на 20 мин в кипящую водяную ба-
ню для образования лактона пиридоксиловой кислоты. Пробирку
охлаждают, прибавляют 3 капли раствора гидроксида натрия
(pH 9,0) и раствор тетрабората натрия до половины объема про-
бирки, перемешивают. Наблюдают появление синей флюоресценции
в ультрафиолетовых лучах.
3. Количественное определение 4-пиридоксиловой кислоты по
Хаффу и Перлцфейгу
Принцип метода (раздел 6.1.4, работа 2).
Материалы и реактивы. Моча, подкисленная 50 %-ной уксус-
ной кислотой и профильтрованная, тетраборат натрия, 0,1 моль/л
раствор соляной кислоты, разведенная в 10 раз соляная кислота
(р = 1,19), универсальный индикатор. Стандартный раствор лак-
тона 4-пиридоксиловой кислоты (10 мг лактона пиридоксиловой
кислоты растворяют в 25 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты),
из этого раствора разведением в 10 раз 0,1 моль/л соляной кислотой
готовят разбавленный рабочий раствор, 1 мл которого содержит
40 мкг лактона.
Оборудование. Флюорометр, водяная баня, пробирки с притер-
тыми пробками, калиброванные на 5 и 10 мл, пипетки, чашки для
выпаривания на 5 мл.
Ход работы. В две пробирки на 10 мл с притертыми пробками
наливают по 1 мл отфильтрованной мочи и доводят объем до 10 мл
разведенной соляной кислотой (1 : 10). Затем одну из пробирок
(опытная) закрывают пробкой и ставят в кипящую водяную баню
на 15 мин, другую (контроль) оставляют без нагревания. Спустя
15 мин опытную пробирку охлаждают. Из каждой пробирки берут
пробы по 0,5 мл и помещают их в две другие пробирки, градуиро-
ванные на 5 и 10 мл, прибавляют в них 0,5 г тетрабората натрия и
разбавляют до объема 10 мл дистиллированной водой. После раство-
110
рения тетрабората натрия универсальным индикатором проверяют
pH раствора; при pH 9,0 появляется зеленая окраска со слабым
синим оттенком. На флюорометре сравнивают интенсивность флюо-
ресценции опытной и контрольной проб со стандартным раствором
лактона при А 450 нм. В последнем случае к 0,1 мл стандартного
раствора прибавляют 9,9 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты
(в 1 мл полученного раствора содержится 0,4 мкг лактона). Из этого
разбавленного раствора берут 1 мл, доливают к нему 9 мл дистил-
лированной воды и подщелачивают, прибавляя к содержимому про-
бирки 0,5 г тетрабората натрия (pH проверяют по универсальному
индикатору). Полученный таким образом стандартный раствор, со-
держащий 0,04 мкг лактона в 1 мл, флюорометрируют. Массовую
концентрацию 4-пиридоксиловой кислоты (мкг) вычисляют по фор-
муле
С = (Еоп — Ек) QakV/E„,
где Еоп — интенсивность флюоресценции опытного образца; Ек —
интенсивность флюоресценции контрольного образца; V — общий
объем мочи (мл); Q — содержание лактона пиридоксиловой кислоты
(0,04 мкг в 1 мл); а — разведение мочи, равное 200; Е„ — показания
флюорометра для стандартного раствора лактона 4-пиридоксило-
вой кислоты; k — коэффициент пересчета для перехода от лактона
4-пиридоксиловой кислоты к 4-пиридоксиловой кислоте (1,109).
6.1.5. Реакция на цианкобаламин (витамин В12)
Принцип реакции. При сплавлении витамина В12 с гидросульфи-
том калия (KHSO4) или при действии сильного окислителя проис-
ходит его разрушение. Кобальт, входящий в состав витамина, при.
этом высвобождается. Его обнаружение производят с помощью
а-нитрозо-Р-нафтола, с которым кобальт образует комплексное сое-
динение оранжево-красного цвета
Комплексная соль ct-нитрозо-р-нафтола
Материалы и реактивы. Препарат витамина В^, концентриро-
ванные азотная и соляная кислоты, 1 %-ный ацетоновый раствор
а-нитрозо-Р-нафтол, 10 %-ный раствор гидрофосфата натрия, лакмус
Оборудование. Фарфоровый тигель и газовая горелка, пипетки.
Ход работы. Половину содержимого витамина В12 из ампулы
переносят в фарфоровый тигель, выпаривают досуха и прокаливают
на небольшом огне. После охлаждения доливают 1 мл концентри-
рованной азотной кислоты и 3 мл концентрированной соляной кис-
лоты и кипятят в вытяжном шкафу до полного испарения жидкости
Ш
и охлаждают. Растворяют осадок в капле воды, прибавляют 1 каплю
ацетонового раствора а-нитрозо-0-нафтола и каплями раствор гид-
рофосфата натрия (Na2HPO4) до слабощелочной реакции (по лакму-
су). При наличии ионов Со^+ появляется буро-красное окрашива-
ние, если ионов Со^ нет, окрашивание — желто-зеленое.
6.1.6. Выделение фолиевой кислоты
из дрожжей и ее обнаружение
Принцип метода. Фолиевая кислота хорошо растворима в
0,1 моль/л растворе NaOH. При экстрагировании фолиевой кислоты
из дрожжей и ультрафиолетовом облучении наблюдается интенсивно
Голубая флюоресценция ее.
Материалы, и реактивы. Дрожжи пищевые, ледяная уксусная
кислота, 0,4 %-ный раствор перманганата калия, 3 %-ный раствор
пероксида водорода, 0,1 моль/л и 0,005 моль/л растворы гидрокси-
да натрия, индикаторная бумага, кварцевый песок.
Оборудование. Центрифуга, флюороскоп, центрифужные про-
бирки, ступка с пестиком, пипетки.
Ход работы. В ступку помещают 10 г дрожжей, прибавляют
10 мл 0,1 моль/л раствора NaOH, 2 г кварцевого песка и растирают
5 мин. Затем центрифугируют в течение 15 мин при 800 g.
К Ю каплям надосадочной жидкости приливают 20 капель ле-
дяной уксусной кислоты (pH 3,0) и 10 капель раствора КМпО4 так,
чтобы розовая окраска не исчезала в течение 10 мин (при ее исчез-
новении следует прилить еще несколько капель КМпО4). Через
10 мин избыток перманганата калия удаляют путем добавления
4—5 капель раствора Н2О2 и приливают 0,005 моль/л раствора
NaOH (около 5 мл) до pH 4,0 — 4,5 (в присутствии индикатора).
При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелоч-
ном растворе в флюороскопе наблюдается интенсивно голубая флюо-
ресценция.
6.1.7. Реакции на витамин Р
(витамин проницаемости, цитрин)
1. Качественные реакции на рутин
Принцип реакций. Хлорид железа (III) образует с рутином комп-
лексные соединения, окрашенные в изумрудно-зеленый цвет. Кон-
центрированная серная кислота образует с флавонами и флавоно-
лами флавилиевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую
окраску. ,
При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рути-
нозы. Затем рутиноза распадается на глюкозу и рамнозу, которые
обладают восстанавливающими свойствами (см. стр. 113).
Материалы и реактивы. Рутин (порошок и насыщенный водный
раствор), 1 %-ный раствор хлорида железа (III), концентрирован-
ная серная кислота, 0,5 %-ный раствор соляной кислоты, 10 %-ный
112
раствор гидроксида натрия, реактив Фелинга (раздел 1.1.1, ра-
бота 2).
Рутин
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки.
Ход работы.
к. Реакция рутина с хлоридом железа (III). К 2 мл насыщен-
ною водного раствора рутина прибавляют несколько капель рас-
твора FeCI3. Наблюдают появление зеленого окрашивания.
Б. Реакция рутина с концентрированной серной кислотой.
К 2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке
пробирки доливают 1 мл концентрированной серной кислоты. На
границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет
кольцо.
В. Реакция рутина с реактивом Фелинга. К 0,5 г рутина при-
бавляют 5 мл раствора соляной кислоты, кипятят в течение 1 мин,
затем фильтруют. К 5 мл фильтрата доливают 3 мл раствора гид-
роксида натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга.
Снова нагревают до кипения. Наблюдают образование красного
осадка гемиоксида меди.
2. Реакция восстановления кверцетина
Принцип метода. Кверцетин легко восстанавливается, образуя
цианидин с красно-розовой или фиолетово-красной окраской (в за-
висимости от концентрации кверцетина)
сГ + МдС12 + Н/>
Хлррид цйанвдина
113
Материалы и реактивы. Насыщенный спиртовый раствор
кверцетина, магний металлический, концентрированная соляная
кислота.
Оборудование. Пипетки, скальпель, капельницы, пробирки.
Ход работы. К 1 мл насыщенного спиртового раствора кверце-
тина добавляют небольшое количество (на кончике скальпеля) по-
рошка металлического магния и 3—4 капли концентрированной
соляной кислоты. Жидкость сначадй окрашивается в розовый цвет,
который при стоянии усиливается до малинового или фиолетово-
красного.
3. Количественное определение витамина Р в чае по Левенталю
Принцип метода. Метод основан на способности рутина окис-
ляться перманганатом калия; в качестве индикатора применяется
индигокармин, который вступает в реакцию с КМпО4 после того,
как окислится весь рутин. Экспериментально установлено, что 1 мл
0,02 моль/л раствора перманганата калия окисляется 6,4 мкг рутина.
Материалы и реактивы. Чай или готовый экстракт, 0,01 моль/л
раствор перманганата калия, индикатор индигокармин (1 г инди-
гокармина растирают в фарфоровой ступке, растворяют в 50 мл
концентрированной серной кислоты, заливают водой до объема ! л,
фильтруют и хранят в темной склянке).
Оборудование. Микробюретка, пипетки, стаканчики или кол-
бочки.
Ход работы. Навеску чая в количестве 100 мг заливают 50 мл
горячей дистиллированной воды и кипятят в течение 5 мин. Полу-
ченный экстракт охлаждают, отбирают 10 мл и переносят в другую
колбу или стаканчик, куда наливают еще 10 мл дистиллированной
воды и 5 капель индигокармина (появляется синее окрашивание).
Тщательно перемешивая жидкость в колбе, содержимое титруют
раствором КМпО4 до появления устойчивой желтой окраски. Раз-
ница между опытным и контрольным титрованием представляет со-
бой количество миллилитров 0,01 моль/л КМпО4, идущее на окисле-
ние рутина.
Для расчета содержания (мкг) витамина Р пользуются следую-
щей формулой:
х = AV^jV^P,
где k — стандартный пересчетный коэффициент титрования (3,2);
А — количество 0,01 моль/л раствора КМпО4, использованное на
титрование (мл); V1 — объем, в котором растворена взятая для
анализа навеска (мл); Va— объем раствора, взятого для титрования
(мл); Р — количество сухого вещества (г), взятое для анализа.
6.1.8." Реакции на аскорбиновую кислоту (витамин С)
1. Качественные реакции на витамин С
Принцип реакций. Аскорбиновая кислота способна легко всту-
пать в окислительно-восстановительные реакции и восстанавливать
2,6-дихлорфенолиндофенол, гексоциано-(Ш) феррат калия, нитрат се-
114
ребра, метиленовый синий. При этом окисленная форма 2,6-дихлор-
фенолиндофенола (синий цвет) и метиленовый синий восстанавли-
ваются в бесцветные лейкосоединения, a K3Fe(CN)e восстанавли-
вается до K4Fe(CN)e, который с ионами валентного железа дает
соль Fe4[Fe(CN)e]3 синего или зеленого цвета. Реакция восстанов-
ления метиленового синего происходит по уравнению
О
//
с-
Аскорбиновая.
Метиленовая синяя
кислота
I
с=о
I
с=о
I
НС---
носн
I
СН2ОН
Дегидроаскорбиновая
кислота
Лейкометиленовая синяя
HCI
Материалы и реактивы. 0,1 %-ный раствор 2,6-дихлорфенолин-
дофепола, 10 %-ный раствор соляной кислоты, 0,1 %-ный раствор
аскорбиновой кислоты, 0,01 %-ный раствор метиленового синего,
10 %-ный раствор Na2CO3, 1 %-ный раствор K3Fe(CN)e, 1 %-ный
раствор FeCl3.
Оборудование. Штатив с пробирками, капельницы, пипетки,
термостат.
Ход работы.
А. Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. В пробирку вносят
0,5 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 1—2 капли раствора
НС1 и каплями раствор аскорбиновой кислоты. Раствор 2,6-дихлор-
фенолиндофенола обесцвечивается.
Б. Реакция с метиленовым синим. В две пробирки вносят по 1
капле раствора метиленовой сини и по 1 капле раствора бикарбона-
та натрия. В первую вливают 5 капель раствора аскорбиновой кисло-
ты, во вторую — 5 капель воды и ставят обе пробирки в термостат
при t 37°—40 °C. Через некоторое время в пробирке с раствором
аскорбиновой кислоты жидкость обесцвечивается.
В. Реакция с гексациано-(Ш) ферратом калия. К 1 мл раствора
аскорбиновой кислоты прибавляют 1 мл раствора K3Fe(CN)e и 0,5 мл
раствора FeCl3. Наблюдают образование сине-зеленого окраши-
вания.
115
2. Количественное определение витамина С по Тильмансу
Принцип метода. Метод количественного определения аскорби-
новой кислоты основан на ее способности окисляться 2,6-дихлор-
фенолиндофенолом до дегидроаскорбиновой кислоты. По количеству
2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченного на титрование, опреде-
ляют количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале.
Как только все количество витамина С окислится, титруемый рас-
твор приобретает розовую окраску за счет образования недиссоции-
рованных молекул 2,6-дихлорфенолиндофенола (в кислой среде).
В щелочной среде 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет синюю окраску,
в кислой — красную, а при восстановлении обесцвечивается
/.-аскорбиновая
кислота
2,6 - Дихлорфенол индофе но л
(окрашенная форма)
Дегидроаскорбиновая
кислота
2,6-Дихлорфенолиндофенол
(лейкоформа)
Материалы и реактивы. Соляная кислота (2 %-ный раствор),
натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола, 0,0005 моль/л раствор
(молекулярная масса — 290, грамм-эквивалент — 145).
Оборудование. Пищевые продукты (капуста, хвоя, картофель,
шиповник), фарфоровая ступка с пестиком, коническая колба,
микробюретка, стаканы для титрования, пипетки, воронки, весы,
разновесы, стеклянный песок.
Ход работы. Взвешивают 1 г пищевого продукта, тщательно
растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком. К растер-
той массе прибавляют 9 мл раствора соляной кислоты и отстаивают.
Через 10 мин содержимое перемешивают и фильтруют. Для коли-
чественного'определения берут 3 мл фильтрата, помещают в кони-
ческую колбу и титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до
появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с. 1 мл
0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует
0,088 мг аскорбиновой кислоты.
Массовую концентрацию аскорбиновой кислоты (мг) рассчиты-
116
вают по формуле
С = QAV0/Via,
где Q — количество аскорбиновой кислоты (0,088 мг), соответствую-
щее 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; А —
количество 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола,
затраченного на титрование (мл); Vo —' общее количество экстракта
(мл); V, — объем экстракта, взятый для титрования (мл); а — ко-
личество пищевого продукта (г).
6.1.9. Разделение модельной смеси
водорастворимых витаминов
на пластинках Silufol
Принцип метода. Метод основан на способности жидкой фазы,
продвигающейся по слою адсорбента за счет капиллярных сил,
перемещать с различными скоростями компоненты разделяемой
смеси. Положение пятен разделяемых веществ на хроматограмме
характеризует значение Rf.
Материалы и реактивы. Смесь витаминов (тиамин, пиридоксол,
аскорбиновая кислота, рибофлавин, никотиновая кислота), при-
готовленная в 50 %-ном этаноле, растворитель № 1 —'бензол—•
метанол — уксусная кислота —• ацетон (70 : 20 : 5 : 5), раствори-
тель № 2 — бензол — метанол — уксусная кислота — ацетон (55 :
: 35 : 5 : 5), пластинки Silufol.
Таблица 7
Вещество Растворитель № 1 Растворитель № 2
Тиамин 0,00 0,00
Пиридоксол 0,17 0,60
Аскорбиновая кислота 0,48 0,16
Рибофлавин 0,53 0,22
Никотиновая кислота 0,68 0,44
Оборудование. Микропипетки, источник УФ-лучей, камера для
хроматографии.
Ход работы. В угол пластинки Silufol на расстоянии 2 см от
каждой стороны наносят раствор смеси витаминов по 5 мкл
(3 мкг/мкл) растворов тиамина, аскорбиновой и никотиновой кис-
лот, 10 мкл (3 мкг/мкл) раствора пиридоксола. Применяют двумер-
ное разделение: для первого направления используют растворитель
№ 1, подсушивают и проводят разделение в перпендикулярном на-
правлении в растворителе № 2. Затем пластины высушивают и выяв-
ляют пятна витаминов в ультрафиолетовом свете, используя зна-
чения Rf витаминов для растворителей № 1 и № 2 (табл. 7).
117
6.2. ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ
6.2.1. Реакции на витамин А
1. Качественные реакции на витамин А
Принцип реакций. Хлороформный раствор витамина А или
рыбьего жира при наличии трихлоруксусной сурьмы окрашивается
в специфический синий цвет. Витамин А в бензольном растворе с
концентрированной серной кислотой образует комплекс, окрашен-
ный в синий цвет, а при реакции с сульфатом железа (II) в кислой
среде дает красно-розовое соединение.
Материалы и реактивы. Хлороформный раствор трихлоруксус-
ной сурьмы (33 %-ный), хлороформ, 0,05 %-ный масляный раствор
витамина А в хлороформе или раствор рыбьего жира в хлороформе
в соотношении 1 : 5, концентрированная серная кислота, ледяная
уксусная кислота, насыщенная сульфатом железа (II).
Оборудование. Штатив с пробирками, капельницы.
Ход работы.
А. Реакция с трихлоруксусной сурьмой. В сухую пробирку
к 1—2 каплям раствора витамина А в хлороформе или раствора
рыбьего жира в хлороформе приливают 4—5 капель раствора три-
хлоруксусной сурьмы в хлороформе и перемешивают. Появляется
интенсивная синяя окраска.
Б. Реакция Друммонда. В пробирку к 2—3 каплям раствора
витамина А прибавляют 2—3 капли концентрированной серной кис-
лоты. Содержимое пробирки окрашивается в синий цвет, который
через некоторое время переходит в фиолетовый и бурый.
В. Реакция с сульфатом железа (II). В пробирку к 2—3 каплям
раствора рыбьего жира в хлороформе или масляного раствора
витамина А в хлороформе приливают 5—10 капель ледяной уксус-
ной кислоты, насыщенной сульфатом железа (II), 1—2 капли кон-
центрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание,
постепенно переходящее в красно-розовое. Каротины дают при этой
реакции зеленое окрашивание.
2. Качественное определение витамина А в рыбьем жире
Принцип метода. Метод основан на колориметрическом опреде-
лении интенсивности окраски, которая образуется при реакции ви-
тамина А с трихлористой сурьмой в присутствии уксусного ан-
гидрида.
Материалы и реактивы. Хлороформный раствор рыбьего жира
(2,5 мл рыбьего жира растворяют в 25 мл хлороформа), уксусный
ангидрид, трихлористая сурьма.
Оборудование. Фотоэлектроколориметр, кюветы, пипетки, ци-
линдры, колбы.
Ход работы. В пробирку к 0,4 мл хлороформного раствора рыбье-
го жира прибавляют 1—2 капли уксусного ангидрида (для пре-
дупреждения появления мути) и 4 мл раствора треххлористой сурь-
мы. Спустя 10 мин фотометрируют при X 620 нм (красный свето-
фильтр), используя раствор треххлористой сурьмы.
118
Концентрацию витамина А в рыбьем жире находят по калибро-
вочному графику, где каждому значению найденной экстинкции
соответствует определенное содержание витамина А в 0,4 мл рас-
твора.
Построение калибровочного графика производится с помощью
стандартного концентрата витамина А в рыбьем жире. Если содер-
жание витамина А в 1 мл концентрата составляет 500 ед. (интерна-
циональные единицы), то для приготовления первоначального рас-
твора берут 10 мл рыбьего жира и растворяют в 50 мл хлороформа.
В 1 мл этого раствора содержится 100 ед. витамина А. Из этого
раствора готовят еще 5—6 разведений с таким расчетом, чтобы
в 0,4 мл получаемых растворов содержалось от 20 до 70 ед. витамина
А. Это количество (0,4 мл) стандартных растворов обрабатывают
трихлористой сурьмой и определяют их оптическую плотность.
Полученные данные оптической плотности используют для пост-
роения калибровочного графика. Зависимость оптической плот-
ности раствора витамина А от его концентрации носит линейный
характер. Содержание витамина А в 1 мл рыбьего жира вычисляют
по формуле
С = aV/Q,
где С — содержание витамина А в 1 мл рыбьего жира (ед.), а —
количество витамина А в 1 мл исследуемого раствора (для получе-
ния этой величины необходимо найденное по графику количество
витамина А в 0,4 мл раствора разделить на 0,4); Q — взятое в ана-
лизе количество рыбьего жира (мл); V — общий объем исследуе-
мого хлороформного раствора рыбьего жира (мл).
6.2.2. Реакции на витамин D
1. Качественные реакции иа витамин D
Принцип реакций. Витамин D в хлороформном растворе с на-
сыщенным раствором хлорида сурьмы (V) приобретает желтое окра-
шивание. При нагревании хлороформного раствора витамина D
или рыбьего жира со смесью анилина и концентрированной соляной
кислоты раствор окрашивается в красный цвет. Раствор витамина D
или рыбий жир с раствором брома в хлороформе приобретает зеле-
но-голубой цвет.
Материалы и реактивы. Насыщенный раствор SbCl5, хлороформ-
ный раствор витамина D, хлороформ, анилиновый реактив — ани-
лин с концентрированной НО (15 : 1), раствор брома в хлорофор-
ме (1 : 60).
Оборудование. Штативе пробирками, капельницы, водяная баня.
Ход работы.
А. Реакция с хлоридом сурьмы (V). В сухую пробирку к 2 мл
раствора витамина D в хлороформе доливают 0,2 мл насыщенного
раствора SbCl5. Наблюдают появление желтого окрашивания.
Б. Реакция с анилином. В сухую пробирку к 1—2 каплям
рыбьего жира или раствора витамина D в хлороформе вносят
119
1 каплю анилинового реактива. После перемешивания образовав-
шаяся эмульсия желтого цвета при нагревании приобретает крас-
ную окраску. Через 1—2 мин эмульсия разделяется на два слоя,
из которых нижний окрашен в интенсивный красный цвет.
В. Реакция с бромом. В пробирку к 2—4 каплям раствора
витамина D в хлороформе или рыбьего жира добавляют 4—5 ка-
пель раствора брома в хлороформе. Смесь в пробирке окрашивается
постепенно в зелено-голубой цвет.
2. Количественное определение витамина D
Принцип метода. Определение основано на образовании желто-
вато-розовой окраски при реакции витамина D с трихлористой
сурьмой. Интенсивность окрашивания пропорциональна концент-
рации витамина D и определяется с помощью фотоэлектроколори-
метра.
Материалы и реактивы. Молочный жир, 96 %-ный этиловый
спирт, 50 %-ный раствор гидроксида калия, хлороформ, 23 %-ный
раствор SbCls в хлороформе, диэтиловый эфир, свежеприготовлен-
ный сульфат натрия, ацетилхлорид, спиртовый раствор витамина D
(10 мг кальциферола растворяют в 100 мл этанола, что соответствует
400 000 ед. витамина D).
Оборудование. Фотоэлектроколориметр, коническая колба с при-
тертой пробкой на 200 мл, делительные воронки, пипетки, водяная
баня.
Ход работы. В коническую колбу с обратным холодильником
вносят 10 г молочного жира, 40 мл этанола и 8 мл раствора гидро-
ксида калия. Колбу помещают в водяную баню, нагревают до тем-
пературы 85—90 °C. Через 40—50 мин содержимое колбы перено-
сят в делительную воронку и трижды экстрагируют циэтиловым
эфиром (порциями 50, 25 и 25 мл). Полученный эфирный экстракт
переносят в другую делительную воронку и прибавляют 7 г суль-
фата натрия. Высушивают его до полной прозрачности, фильтруют
и отгоняют эфир на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 5 мл
хлороформа. Затем к 1 мл этого раствора прибавляют 3 капли
ацетилхлорида и 6 мл раствора SbCl3. Через 5 мин инстенсивность
окраски измеряют в фотоэлектроколориметре при X 500 нм против
смеси из 1 мл хлороформа, 6 мл раствора SbCl3 и трех капель аце-
тилхлорида.
Концентрацию витамина D в исследуемом растворе рассчиты-
вают по калибровочному графику. Для построения калибровочного
графика готовят серию растворов кальциферола в хлороформе, со-
держащих в 1 мл от 200 до 1000 ед. витамина D, используя спирто-
вый раствор кальциферола и проводя цветную реакцию, как ука-
зано .выше. -
Массовую концентрацию витамина D (ед. в 1 г жира) рассчиты-
вают по формуле
С = xVp/a,
где х — количество витамина D, найденное по калибровочному гра-
фику (ед. в 1 мл раствора); V —• разведение (мл); а — масса жира
(г); р -- плотность жира (г/см3).
120
6.2.3. Реакции на витамин К
1. Качественные реакции на витамин К
Принцип реакций. Спиртовый раствор витамина К в щелочной
среде с диэтилмалоновым эфиром дает красно-фиолетовое окраши-
вание, а в присутствии диэтилдитиокарбомата в этих условиях об-
разует соединение, окрашенное в голубой цвет. При наличии ани-
лина спиртовый раствор витамина К окрашивается в красный цвет,
что обусловлено образованием 1-метил-2-фениламинонафтохинона.
Материалы и реактивы. 1 %-ный раствор диэтилмалонового
эфира, 1 %-ный раствор КОН, спиртовый раствор витамина К,
5 %-ный раствор диэтилдитиокарбомата, 4 %-ный спиртовый рас-
твор NaOH, раствор анилина, 0,05 %-ный спиртовый раствор ви-
касола.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельницы.
Ход работы.
А. Реакция с диэтилмалоновым эфиром. В пробирку к 2 мл
спиртового раствора витамина К прибавляют 0,5 мл раствора ди-
этилмалонового эфира и 0,1 мл раствора КОН. Развивается красно-
фиолетовое окрашивание.
Б. Реакция с диэтилдитиокарбоматом. В пробирку к 2 мл спир-
тового раствора витамина К прибавляют 2 мл раствора диэтилди-
тиокарбомата и 0,5 мл раствора NaOH в этаноле. Раствор приоб-
ретает голубое окрашивание.
В. Реакция с анилином. В пробирку к 1 мл спиртового раствора
викасола добавляют 2 капли анилина. После перемешивания со-
держимое пробирки окрашивается в красный цвет.
2. Количественное определение витамина К
Принцип метода. Смешивание витамина К с диэтилмалоновым
эфиром в щелочной среде приводит к образованию окрашенного
соединения, интенсивность окраски которого определяют с помощью
фотоэлектроколориметра.
Материалы и реактивы. Морковь, диэтиловый эфир, хлороформ,
карбонат натрия безводный, сульфат натрия безводный, 1 %-ный
спиртовый диэтилмалоновый эфир, 1 %-ный гидроксид калия, квар-
цевый песок, стандартный раствор витамина К (0,04 мкг в 1 мл).
Оборудование. Фотоэлектроколориметр, водяная баня, воронка
Бюхнера, колба Бунзена, ступка фарфоровая с пестиком, колбы
мерные, пипетки, терка, пробирки, весы, разновесы.
Ход работы. Измельченная на терке морковь (10—45 г) тща-
тельно растирается в ступке с кварцевым песком и небольшим коли-
чеством карбоната натрия. Затем в ступку приливают 10 мл диэти-
лового эфира и вновь растирают. Гомогенат переносят на воронку
Бюхнера, дважды ополаскивая ступку небольшими порциями эфи-
ра. Фильтруют и трижды промывают осадок на фильтре тем же
экстрагентом. Эфирные вытяжки соединяют и сушат безводным
сульфатом натрия, после чего эфир выпаривают на теплой водяной
бане, а остаток растворяют в 5 мл хлороформа. К полученному
раствору прибавляют 1 мл спиртового раствора диэтилмалонового
12i
эфира и 0,2 мл раствора гидроксида калия. Общий объем доводят
водой до 10 мл. Одновременно производят определение со стан-
дартным раствором витамина К. Окрашенный раствор колоримет-
рируют.
Массу витамина К (мкг) в 1 г моркови рассчитывают по формуле
С = C0EOIIV/E„a,
где Со — массовая концентрация стандартного раствора витамина
К (мкг/мл); V —• объем экстракта (10 мл); Еоп и Ест —• экстинкция
исследуемого и стандартного раствора соответственно; а —• масса
вещества, взятого для анализа (г).
6.2.4. Реакции на витамин Е
1. Качественные реакции на витамин Е
Принцип реакций. Взаимодействие а-токоферола с концентри-
рованной азотной кислотой приводит к окрашиванию реакционной
смеси в красный цвет. Это обусловлено тем, что продукт окисления
а-токоферола имеет хиноидную структуру. При взаимодействии с
хлорным железом (III) а-токоферол окисляется до а-токоферилхи-
нона —• соединения, окрашенного в красный цвет
сн3
1 1 РСНз СНз СНз СНз
H8C-^4^VqX\(CHj)_^h_(cH2)_^h_(ch^_^h_CH;) + FeCtj4. н20 —
сна
а-Токоферол
СН3
1 L гСНз СНз СНз СНз
^\(СНг) _сн—(СН2)3—СН—(СН8)а-сн-СН3 + FeCL + НС1
СН3
а-Токоферилхинон
Материалы и реактивы. 0,1 %-ный спиртовый раствор а-токо-
ферола, концентрированная азотная кислота, 1 %-ный раствор
хлорного железа (III).
Оборудование. Штатив с пробирками, капельницы, пипетки.
Ход работы.
А. Реакция с азотной кислотой. В сухую пробирку вносят
5 капель спиртового раствора витамина Е и добавляют 1 мл кон-
центрировацной HNO3. Пробирку интенсивно встряхивают и наблю-
дают постепенное появление красного окрашивания.
Б. Реакция с хлорным железом. В сухую пробирку вносят
0,5 мл спиртового раствора а-токоферола, затем 0,5 мл раствора
FeCl3 и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Наблюдают
появление красного окрашивания.
122
2. Количественное определение витамина Е
Принцип метода. При взаимодействии спиртового раствора
а-токоферола с концентрированной азотной кислотой смесь окраши-
вается в красный цвет, интенсивность которого пропорциональна
концентрации витамина Е и может быть определена с помощью фо-
тоэлектроколориметра.
Материалы и реактивы. Спиртовый (0,1 %-ный) раствор вита-
мина Е, 70 %-ный раствор азотной кислоты, абсолютный этиловый
спирт.
Оборудование. Штатив с пробирками, колбы, пипетки, водяная
баня, фотоэлектроколориметр.
Ход работы. В две пробирки наливают по 2,5 мл спиртового
раствора витамина Е, добавляют по 0,5 мл раствора азотной кисло-
ты и выдерживают в кипящей водяной бане 3 мин. Затем пробирки
охлаждают и ставят в темное место на 15 мин. Объем жидкости в
каждой пробирке доводят абсолютным этанолом до 5 мл, переме-
шивают и фотометрируют при X 470 нм (синий светофильтр).
Концентрацию витамина Е в исследуемом растворе определяют
по калибровочному графику, где каждому значению найденной экс-
тинкции соответствует определенное содержание витамина Е в 1 мл
раствора.
Для построения калибровочного графика используют спиртовый
препарат, содержащий в 1 мл 100 мг а-токоферола. С этой целью
0,5 мл такого препарата растворяют абсолютным этанолом в колбе
емкостью 50 мл (в 1 мл будет содержаться 1 мг препарата). Отсюда
в четыре пробирки наливают по 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 мл спиртового
раствора и доводят общий объем жидкости абсолютным спиртом до
2,5 мл в каждой пробирке.
На основании данных оптической плотности растворов, содер-
жащих разное количество витамина Е, строят калибровочный гра-
фик. На оси ординат наносят значение экстинкции, на ось абсцисс —
соответствующие концентрации витамина Е в 1 мл.
ГЛАВА 7
ГОРМОНЫ
7.1. Реакция на гормоны щитовидной
железы (тироксин)
Обнаружение иода
Принцип реакции. Гормоны щитовидной железы являются иод-
содержащими соединениями. При их разрушении образуется иодид
калия, который окисляется йодатом калия в кислой среде с обра-
зованием молекулярного иода
5KI + РЮ3 + 6НС1 -> 3I2 + 6КС1 + ЗН2О
Результатом реакции иода с крахмалом является соединение
синего цвета.
Материалы и реактивы. Таблетки тиреоидина или высушенная
ткань щитовидной железы, 10 %-ный раствор NaOH, 10 %-ный
раствор H2SO4, 1 %-ный раствор крахмала, 2 %-ный раствор КЮ3,
лакмус.
Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком, газовая горелка,
пипетки, колба, капельница.
Ход работы. В фарфоровой ступке тщательно растирают 5 таб-
леток тиреоидина или 100—200 мг измельченной и высушенной тка-
ни щитовидной железы. Образованную массу переносят в колбу для
гидролиза, добавляют 5 мл раствора NaOH и 5 мл воды. Кипятят
на асбестовой сетке в течение 10—15 мин. К 3 мл охлажденного
гидролизата прибавляют раствор серной кислоты до кислой реак-
ции на лакмус. После подкисления приливают 5 капель раствора
крахмала и 1 мл раствора КЮ3. Иод, который выделяется, дает
синее окрашивание с крахмалом.
7.2. Реакции на гормоны мозгового слоя
надпочечников(адреналин, норадреналин)
1. Реакция с хлоридом железа (III)
Принцип реакции. При добавлении к раствору адреналина хло-
рида железа (III) жидкость окрашивается в изумрудно-зеленый цвет
вследствие образования комплексного соединения типа фенолята
железа
124
Адреналин обладает слабощелочной реакцией, легко окисляется
на воздухе с образованием адренохрома, вследствие чего раствор
окрашивается в красный цвет.
Материалы и реактивы. 1 %-ный раствор FeCl3 10 %-ный рас-
твор NaOH, 0,1 %-ный раствор адреналина.
Оборудование. Пробирки, капельница, пипетки.
Ход работы. В пробирку вносят 1 мл раствора адреналина, при-
бавляют 1 каплю раствора FeCl3 и перемешивают. Наблюдают по-
явление изумрудно-зеленой окраски, затем добавляют '1 каплю
раствора щелочи — возникает вишнево-красное окрашивание.
2. Реакция с диазореактивом
Принцип метода. При взаимодействии диазореактива с адрена-
лином жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образова-
ния сложного соединения типа азокрасителя.
Материалы и реактивы. Раствор адреналина (1 : 1000), 1 %-ный
раствор сульфаниловой кислоты, 5 %-ный раствор нитрита натрия,
10 %-ный раствор Na2CO3.
Оборудование. Пробирки, пипетки.
Ход работы. К 1 мл раствора сульфаниловой кислоты прибав-
ляют 1 мл раствора нитрита натрия (смесь диазореактива), 1,5 мл
раствора адреналина и 1 мл раствора Na2CO3. Перемешивают, на-
блюдают окрашивание раствора, в красный цвет.
3. Реакция с йодатом калия
Принцип реакции. Адреналин в кислой среде с иодноватокислым
калием образует соединение красно-фиолетового цвета.
Материалы и реактивы. Раствор адреналина (содержимое ам-
пулы растворяют в 100 мл воды), 10 %-ный раствор КЮ3, 10 %-ный
раствор уксусной или ортофосфорной кислоты.
Оборудование. Пробирки, пипетки, капельница.
Ход работы. К 0,5 мл раствора адреналина прибавляют 1 мл
раствора КЮ3, 10 капель раствора уксусной или ортофосфорной
кислоты и смесь подогревают до температуры 60—65 °C. Появляет-
ся интенсивное красно-фиолетовое окрашивание.
7.3. Количественное определение
адреналина по Фолину
Принцип метода. Метод основан на колориметрическом опреде-
лении интенсивности синего окрашивания, возникающего при взаи-
модействии адреналина с реактивом Фолина.
Реактив Фолина состоит из солей фосфорновольфрамовой и фос-
форномолибденовой кислот. Эти соли при взаимодействии с адре-
налином восстанавливаются с образованием более низких окислов
металлов, комплексы которых окрашиваются в синий цвет.
Материалы и реактивы. Стандартный раствор адреналина (в мер-
ную колбу на 25 мл отмеривают 1 мл раствора адреналина (1 : 1000)
и доводят до метки водой — 1 мл такого раствора содержит 0,04 мг
адреналина), 10 %-ный свежеприготовленный раствор Na2CO3, реак-
тив Фолина (раздел 1.1.1, работа 2).
125
Оборудование. Фото колориметр, пробирки, пипетки, мерные кол-
бы на 25 мл.
Ход работы. Готовят две мерные сухие пробирки емкостью 10 мл.
В первую вносят 1 мл стандартного раствора адреналина, во вто-
рую — 1 мл исследуемого раствора, приливают по 4 мл раствора
Na2CO3 и по 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое обеих пробирок
встряхивают. Жидкость постепенно окрашивается в синий цвет,
достигающий наибольшей интенсивности через 3—5 мин. Далее
объем жидкости в пробирках доводят до метки раствором Na2CO3.
Содержимое пробирок перемешивают и окраску исследуемого рас-
твора сравнивают в колориметре с окраской стандартного раствора
адреналина.
Массовую концентрацию адреналина в исследуемом растворе
(мг/мл) рассчитывают по формуле
С = С0Еоп/ЕСт,
где Со — массовая концентрация адреналина в стандартном рас-
творе (0,04 мг/мл), Еоп и Ест — экстинкция исследуемого и стандарт-
ного растворов адреналина соответственно.
7.4. Реакции на гормон поджелудочной
железы [инсулин)
1. Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина
Принцип реакций. Инсулин дает ряд реакций, специфичных для
белков: биуретовую, Геллера, Фоля, Миллона (раздел 4.1.3). Для
качественных реакций используют раствор инсулина в ампулах.
Материалы и реактивы. Раствор инсулина в ампулах, 0,1 %-ный
раствор гидроксида натрия, 0,5 %-ный раствор уксусной кислоты,
20 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты.
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, капельница.
Ход работы.
А. Реакция с разбавленным раствором гидроксида натрия.
К 1—1,5 мл раствора инсулина прибавляют по каплям раствор
гидроксида натрия до выпадения хлопьевидного осадка, который
растворяется при подкислении раствором уксусной кислоты (до
pH 2,5—3,5).
Б. Осаждение инсулина сульфосалициловой кислотой. В про-
бирку к 1 мл раствора инсулина прибавляют 3—5 капель раствора
сульфосалициловой кислоты. Наблюдают выпадение осадка.
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биологическая химия. Практикум / Под ред. Ю. В. Хмелевского. К., 1985.
207с. 2. Виноградова Р. П., Кучеренко М. Е., Литвиненко А. Р. и др. Б1оло-
пчна xiMia: Практикум. К., 1977. 384 с. 3. Дроздов И. С., Матеранская Н. П.
Практикум по биологической химии. М., 1970. 256 с. 4. Кушманова О. Д.,
| Ивченко Г. М.| Руководство к лабораторным занитиям по биологической хи-
мии. М., 1983. 272 с. 5. Неменова Ю. М. Методи лабораториих юпшчних до-
слщжень. К., 1976. 408 с. 6. Петров К. П. Практикум по биохимии пищевого
растительного сырья. М., 1965. 330 с. 7. Практикум по биохимии / Под ред.
Н. П. Мешковой, С. Е. Северина. М., 1979. 430 с. 8. Практикум по химии уг-
леводов / Под ред. Ю. А. Жданова. М., 1973. 204 с. 9. Пятницкий М. П.,
Нестеренко Л. А. Краткий практикум по органической и биологической химии.
М., 1962. 102 с. 10. Руководство к лабораторным занятиям по биооргаиическэй
химии / Под ред. Н. А. Тюкавкиной. М., 1985. 256 с. И. Соловьев Г. А. Руко-
водство для малого практикума по биохимии животных. М., 1969. 62 с. 12. Фи-
липпович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей био-
химии. М., 1982. 318 с.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ
3
ГЛАВА 1. Углеводы
1.1. Качественные реакции...................................... 4
1.1.1. Моносахариды 4
1.1.2. Дисахариды ............................................. Ю
1.1.3. Полисахариды........................................... 11
1.2. Количественное определение .............................. 13
1.3. Обмен углеводов .......................................... 24
ГЛАВА 2. Липиды
2.1. Физнко-химнческчне свойства............................... 28
2.2. Качественные реакции ..................................... 33
2.3. Количественное определение ............................... 39
ГЛАВА 3. Нуклеиновые кислоты
3.1. Выделение, качественные и количественные реакции ... 42
3.2. Обмен нуклеиновых кислот.................................. 46
ГЛАВА 4. Аминокислоты и белки
4.1. Качественные реакции...................................... 51
4.1.1. Цветные реакции на карбоновые аминокислоты .... 51
4.1.2. Цветные реакции на циклические аминокислоты .... 55
4.1.3. Цветные реакции на белки................................ 59
4.2. Свойства аминокислот, методы их выделения н количествен-
ного определения................................................ 62
4.3. Свойства простых белков, методы их выделения и количествен-
ного определения............................................... 67
4.4. Свойства, выделение и определение содержания сложных белков 74
4.5. Превращение аминокислот, обмен белков и конечные продукты
обмена белков .................................................. 79
ГЛАВА 5. Ферменты
5.1. Изучение действия ферментов.............................. 87
5.2. Свойства ферментов....................................... 94
5.2.1. Термолабильность ферментов............................. 94
5.2.2. Влияние реакции среды на активность ферментов .... 95
5.2.3. Влияние активаторов н ингибиторов иа активность ферментов 96
5.2.4. Специфичность ферментов................................ 98
5.3. Определение активности ферментов........................... 100
ГЛАВА 6. Витамины
6.1. Водорастворимые витамины . . ................. 106
6.1.1. Реакции на тиамин (витамин ВО......................... 106
6.1.2. Реакция восстановления рибофлавина (витамина В2) . . 108
6.1.3. Реакции на витамин РР (антипелларгическнй. В5) . . . . 108
6.1.4. Реакции на пиридоксин (витамин В$).................... 109
6.1.5. Реакция на цианкобаламин (витамин Bts)................ Ill
6.1.6. Выделение фолиевой кислоты из дрожжей и ее обнаружение 112
6.1.7. Реакции на витамин Р (витамин проницаемости, цитрин) . 112
6.1.8. Реакции на аскорбиновую кислоту, (витамин С) 114
6.1.9. Разделение модельной смеси водорастворимых витаминов на
пластинках Silufol .......................................... 117
6.2. Жирорастворимые витамины ... ............ 118
6.2.1. Реакции на витамин А.................................. 118
6.2.2. Реакции иа витамин D.................................. 119
6.2.3. Реакции иа витамин К................................. 121
6.2.4. Реакции иа витамин Е................................. 122
ГЛАВА 7. Гормоны
7.1. Реакция на гормоны щитовидной железы (тироксин) ... 124
7.2. Реакции иа гормоны мозгового слоя надпочечников (адреналин,
норадреналин) ............................................... 124
7.3. Количественное определение адреналина по Фолину .... 125
7.4. Реакция на гормон поджелудочной железы (инсулин) ... 126
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 127