/
Теги: биологическая техника, экспериментальные методы и оборудование в целом общая генетика
ISBN: 978-5-9963-0738-8
Текст
МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ
МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
И БИОХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ
РАСТЕНИЙ
УДК 57.08
ББК 28.04
М75
Серия основана в 2010 г.
Рецензенты:
чл.-корр. РАН Р. К. Саляев
проф. Я. И. Бурьянов
Молекулярно-генетические и биохимические методы в совре-
М75 менной биологии растений / под ред. Вл. В. Кузнецова, В. В. Куз-
нецова, Г. А. Романова. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний,
2012.—487 с. : ил.— (Методы в биологии).
ISBN 978-5-9963-0738-8
Книга содержит изложение более 30 методов современной экспери-
ментальной биологии, активно используемых при исследовании растений.
Подробно рассмотрены методы генной инженерии и биоинформатики,
функциональной геномики, белковой химии и гистохимии, методы изучения
биологически активных соединений и трансдукции сигналов, а также
биологии клетки и анализа субклеточных структур. Ряд методов был
разработан или модифицирован самими авторами статей, специалистами
Института физиологии растений и других институтов РАН. Структура
и способ изложения материала максимально облегчают задачу освоения
того или иного метода, помогают избежать ошибок в ходе эксперимента
и корректно интерпретировать полученные результаты. Многие описанные
методы широко применяются как при изучении растительных объектов,
так и объектов других царств живых организмов. Данный сборник будет
способствовать грамотному использованию наиболее современных методов
исследования в практике отечественной биологической науки.
Для студентов, аспирантов, научных сотрудников, проводящих фунда-
ментальные или прикладные исследования в области биологии растений
и сельского хозяйства
УДК 57.08
ББК 28.04
Первый тираж издания осуществлен при финансовой поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 11 -04-07082
Научное издание
Серия: «Методы в биологии»
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Ведущий редактор канд. биол. наук В. В. Гейдебрехт
Редактор канд. биол. наук Т. В. Липина
Художник Н. А. Новак
Технический редактор Е. В. Денюкова. Корректор 'Д. И. Мурадян
Компьютерная верстка: Н. Ю. Федоровская
Подписано в печать 08.11.11. Формат 70x100/16.
Усл. печ. л. 39,65. Тираж 700 экз. Заказ 1289.
Издательство «БИНОМ. Лаборатория знаний»
125167, Москва, проезд Аэропорта, д. 3
Телефон: (499)157-5272, e-mail: binom@Lbz.ru, http://www.Lbz.ru
Отпечатано в ООО ПФ «Полиграфист», 160001, г. Вологда, ул. Челюскинцев, 3.
ISBN 978-5-9963-0738-8
© БИНОМ. Лаборатория знаний,
2011
Предисловие
За последние 2-3 десятка лет экспериментальная биология расте-
ний достигла впечатляющих успехов. Получены принципиально
новые знания о механизмах регуляции интегральных физиологи-
ческих процессов у растений, таких как водный статус, транспира-
ция, фотосинтез, рост, морфогенез, стресс, адаптация и выживание
растений в неблагоприятных условиях. Расшифрована природа сиг-
налов цветения, идентифицированы рецепторы основных классов
фитогормонов, достигнуты крупные успехи в понимании принци-
пов функционирования внутриклеточных сигнальных сетей и диф-
ференциальной регуляции экспрессии генома. Одним из первых выс-
ших организмов, геном которого был полностью секвенирован, ока-
залось модельное растение Arabidopsis thaliana.
Все эти успехи во многом стали возможны благодаря активному
использованию в биологии растений идеологии и методов физико-хи-
мического анализа. Физиологи растений сделали существенный шаг
по пути освоения языка молекулярной и физико-химической биоло-
гии и активного использования методического арсенала этих наук
для исследования разнообразных биологических проблем. Одновре-
менно возрос интерес молекулярных биологов к современным проб-
лемам физиологии растений. В настоящее время невозможно пред-
ставить добротную экспериментальную работу, выполненную без
создания трансгенных растений и их анализа, без использования
методов молекулярной генетики и генной инженерии, которые все
более и более превращаются в рутинные методы экспериментальной
биологии растений.
В этих условиях остро стоит вопрос об издании необходимых
пособий с изложением методов физико-химической биологии, адап-
тированных к растительным объектам. К сожалению, следует кон-
статировать, что монографий, охватывающих широкий спектр мо-
лекулярно-генетических и биохимических методов, применяемых в
современной биологии растений и написанных крупными специа-
листами, работающими в данной области исследований, пока в Рос-
сии нет, несмотря на то, что потребность в такого рода методической
книге чрезвычайно высока.
Авторы данного сборника — квалифицированные специалисты
Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской
академии наук и некоторых других институтов РАН, хорошо знаю-
щие описываемые методы и применяющие их в своей практической
работе, что придает данной монографии особую ценность. Ряд мето-
4
ПРЕДИСЛОВИЕ
дов был разработан или модифицирован самими авторами статей.
Так, например, авторами разработан метод применения трансгенных
бактерий для изучения мембранных рецепторов растений; совместно
с Институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН
предложен метод идентификации трансгенов с помощью биочипа;
адаптирован метод run-on транскрипции для изучения регуляции
экспрессии пластидного и митохондриального геномов; оптимизи-
рован метод получения и культивирования изолированных ген-
но-модифицированных корней растений; предложен новый подход
для трансформации растений с использованием агробактериального
газона; разработаны методы культивирования изолированных кле-
ток растений; созданы гистохимические методы определения лока-
лизации тяжелых металлов и активности ферментов углеводного
обмена в тканях высших растений; предложен метод термопарной
изопиестической психрометрии для определения основных харак-
теристик водного баланса растений и др.
Предлагаемое вниманию читателя издание есть ни что иное, как
попытка его авторов поделиться своими знаниями и накопленным
методическим опытом, который может оказаться полезным не толь-
ко молодым исследователям, но и маститым ученым. Сборник со-
держит большой набор основных методов исследования, написан-
ных по единому плану и с подробными комментариями, что дает
возможность их самостоятельного воспроизведения в любой совре-
менной лаборатории физиологии и биохимии растений. В каждом
случае даются теоретические основы описываемых методов, что поз-
воляет рассматривать данную книгу в качестве фундаментального
научного труда. Структура и способ изложения материала организо-
ваны так, чтобы максимально облегчить задачу исследователям в
освоении того или иного нового метода, помочь им избежать ошибок
в ходе эксперимента и корректно интерпретировать полученные ре-
зультаты. Многие описанные здесь методы дают возможность их
широкого применения, как при изучении растительных объектов,
так и других объектов живой природы.
Данный методический сборник будет способствовать активному
использованию наиболее современных методов физико-химической
биологии и физиологии растений для решения крупных фундамен-
тальных проблем. Он может быть полезен для самого широкого кру-
га исследователей, использующих или планирующих использовать
в своей работе методы генной инженерии и биоинформатики, моле-
кулярной биологии и функциональной геномики, методы белковой
химии и гистохимии, методы изучения биологически активных
соединений и трансдукции сигналов, методы биологии клетки и
анализа субклеточных структур.
Член-корр. РАН Вл. В. Кузнецов
Глава 1
МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И БИОИНФОРМАТИКИ
1.1. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
МЕТОДОМ АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ
ТРАНСФОРМАЦИИ
Г. И. Ралдугина, С. А. Данилова, Н. О. Юрьева
Введение
Трансгенные растения широко используются в фундаментальных
исследованиях по биологии, особенно в молекулярной биологии и
молекулярной генетике. Генно-модифицированные растения нашли
широкое применение в сельском хозяйстве, медицине и других об-
ластях. При создании трансгенных растений встречается ряд труд-
ностей, которые ограничивают генетическую модификацию многих
видов растений, поэтому биотехнологи постоянно работают над усо-
вершенствованием методов получения трансгенных растений.
Одним из важных свойств растений является способность к реге-
нерации in vitro из недифференцированных соматических тканей с
получением нормальных, фертильных организмов. Это свойство
(тотипотентность) позволяет получать генно-модифицированные
(трансгенные) растения через культуру тканей.
Получение стабильно трансформированных растений состоит из
нескольких этапов.
I. Выбор генов, которые будут вводиться в геном, и подготовка
вектора для их переноса в геном растения.
П. Введение вектора в растительные клетки методом, наиболее
подходящим для определенного вида растения или выбранного
экспланта.
III. Отбор трансформантов, а также подтверждение наличия и экс-
прессии введенных генов в геноме растения.
IV. Проверка наследуемости встроенного гена.
6 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Получение генов и подбор вектора
Ген, который хотят ввести в растение, чтобы придать последнему
новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса. В
растение можно встроить практически любой ген, который молено
получить из ДНК любого организма. Встроенный чужеродный ген
называется трансгеном. Ген можно синтезировать, зная первичную
структуру ДНК или белка, или получить кДНК на основе выделен-
ной мРНК с помощью реакции обратной транскрипции.
Для того чтобы ввести в клетку-реципиент требуемую ДНК,
встроить ее в геном, провести идентификацию трансформирован-
ных клеток и обеспечить стабильную экспрессию введенного гена,
используют векторы.
Вектор — кольцевая молекула ДНК небольшого размера, спо-
собная к автономной репликации (в бактериях) и служащая для пе-
реноса и клонирования чужеродного гена. Векторы должны иметь
область (полилинкер), чувствительную к определенным рестрик-
ционным эндонуклеазам. Они расщепляют вектор только в одном
участке, превращая его из кольцевой формы в линейную, к которой
с помощью ферментов-лигаз можно присоединять ген или гены. В
составе вектора должен быть маркерный ген, который, как прави-
ло, придает устойчивость к селективному агенту (антибиотик, гер-
бицид) и позволяет выращивать трансформированные клетки на
селективной среде, что указывает на успешность трансформации.
Целевые и маркерные гены из векторной молекулы должны экс-
прессироваться в клетках трансформируемых организмов, поэтому
в векторную молекулу должны быть встроены регуляторные после-
довательности, отвечающие за экспрессию генов: промоторы, тер-
минаторы и, возможно, энхансеры (см. рис. 1.1.1).
Промоторы — последовательности нуклеотидов ДНК, располо-
женные обычно перед началом структурного гена, узнаваемые фер-
ментом РНК-полимеразой и являющиеся стартовой площадкой для
начала транскрипции. Для растений часто используют промоторы
от растительных вирусов, которые эволюционно приспособлены к
функционированию в растительной клетке.
Промоторы могут быть:
1) конститутивными, действующими во всех тканях в течение
всей жизни растения. К наиболее сильным и широко используе-
мым конститутивным промоторам, функционирующим в расте-
ниях, относятся 35S-пpoмотop вируса мозаики цветной капусты
(p35S CaMV) и промотор гена нопалинсинтазы из Agrobacterium
tumefaciens (nos). Применяют также модификации промотора
35S, включая конфигурацию с двумя тандемными З5S-промото-
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
7
Рис. 1.1.1. Схема бинарного вектора. pNOS — промотор гена октопинсин-
тазы; p35S — промотор из вируса мозаики цветной капусты; NOS, OCS —
терминаторы; Т-ДНК — переносимая ДНК; LB, RB — левая и правая грани-
цы Т-ДНК; Ori — сайт инициации репликации
рами, что позволяет достичь более высоких уровней генной экс-
прессии по сравнению с единичной копией Збв-промотора. Для
трансформации однодольных растений часто используют про-
моторы генов, выделенных из генома злаков, например промо-
тор гена актина 1 риса (Actl) или промотор гена убиквитина ку-
курузы (Ubi-1);
2) специфическими, действующими в определенных тканях, на-
пример промотор гена пататина картофеля, который работает в
основном только в клубнях. Имеются также промоторы, актив-
ность которых проявляется в листьях, корнях, меристемах или
других местах специфической локализации. Другие промоторы
активны в клетках на определенных стадиях роста и развития
растения;
3) индуцибелъными, работающими при определенных условиях
(температуры, освещения, концентрации фитогормонов или
других соединений). Такие промоторы используют в случаях,
если исследователь ставит задачи достичь более тонкой регуля-
ции активности трансгенов в пространстве (в определенных тка-
нях) и времени (в определенный период развития). Многие из
таких промоторов достаточно универсальны, например некото-
рые промоторы генов теплового шока. В частности, промотор
гена hsp70 из дрозофилы эффективно работает и в клетках рас-
тений. Особый интерес представляют промоторы, индуцируе-
мые низкомолекулярными химическими эффекторами, часто
не свойственными растениям. Эти промоторы очень важны для
8 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
фундаментальных исследований с помощью трансгенных расте-
ний, позволяя четко дифференцировать первичные и вторич-
ные эффекты изучаемого гена. Они перспективны также для био-
технологии, т. к. позволяют вызвать экспрессию гена в задан-
ный период, когда она уже либо не препятствует нормальному
росту и развитию растения, либо не вызывает иных отрицатель-
ных последствий. Регулируемые извне индуцибельные промо-
торы, контролирующие соответствующие гены, могут способ-
ствовать одновременному прохождению растениями основных
стадий онтогенеза (переход к цветению, опадение листьев и др.).
Существуют промоторы, индуцирующиеся при поранении или
при обработке растения элиситорами.
Терминатор — нуклеотидная последовательность, расположен-
ная на 3'-конце гена и являющаяся сигналом завершения транс-
крипции. Терминатор предотвращает транскрипцию РНК-полиме-
разой генов, расположенных вслед за трансгеном. При трансформа-
ции растений часто используют терминаторную последовательность
гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens.
Экспрессию чужеродных генов могут усиливать другие элемен-
ты ДНК, например модуляторы, а также энхансерные последова-
тельности, действующие независимо от своей ориентации относи-
тельно кодирующей части гена и расстояния от сайта инициации
транскрипции.
Векторы для трансформации растений
Удобный способ доставки чужих генов в геном был подсказан самой
природой — трансформация растений с помощью Agrobacterium
tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. Это почвенные бактерии,
имеющие плазмиды1, так называемые Ti-плазмиды (от англ.
tumor-inducing — опухолеобразующие), найденные в Agrobacterium
tumefaciens, или Ri-плазмиды (от англ. root-inducing — корнеобра-
зующие), найденные в Agrobacterium rhizogenes (см. раздел 1.3).
Эти плазмиды оказались лучшим инструментом для генной инже-
нерии, так как они способны встраивать в растительный геном свои
гены.
В геноме Agrobacterium находится несколько генетических ло-
кусов, необходимых для трансформации растительной клетки. При
этом один локализован на агробактериальной хромосоме — это сис-
тема Chv-генов, которые индуцируются первыми, обеспечивая функ-
Плазмиды — бактериальные внехромосомные автономно реплицирующиеся
двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
9
ционирование других систем. На Ti- или Ri-плазмиде находятся три
других локуса. Это vir1 -система, кодирующая гены, контролирую-
щие синтез и перенос Т-ДНК (от англ. transferred DNA — перено-
симая ДНК) в растение. Vir-гены находятся на основной части
плазмиды и обычно не переносятся в растительную клетку, а экс-
прессируются под воздействием сигнальных молекул, образуя белки,
которые обеспечивают отделение переносимой в растение Т-ДНК от
Ti- или Ri-плазмид. Индукция vir-генов обратима, и каскад реак-
ций может быть прерван, что важно для патогена: в случае, если хо-
зяин маложизнеспособен, перенос Т-ДНК в его клетки не происхо-
дит. После активации vir-генов в оболочке бактерии образуется раз-
рыв, через который Т-ДНК проникает в растительную клетку. Другие
два генетических локуса находятся на самой Т-ДНК: гены синтеза
ферментов, вызывающие формирование опухолей на растении2 (онко-
генов), а также гены синтеза опинов. Т-ДНК после встраивания не
может переноситься вторично, так как не имеет генов, ответствен-
ных за перенос.
Т-ДНК ограничена двумя прямыми повторами из 25 нуклеоти-
дов, которые важны для переноса этой последовательности в геном
клетки. Правый конец Т-ДНК обозначается RB (от англ. right border),
левый соответственно LB (от англ. left border) (рис. 1.1.1). Макси-
мальный размер фрагмента ДНК, который может быть перенесен,
достигает 150 тыс. п.н. и более.
После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК встраивает-
ся в геном в виде одной или нескольких копий. В ходе переноса одна
из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет незаконной
рекомбинации с участком ДНК клетки-хозяина может включиться
в хромосому или внехромосомную единицу.
В начале 1980-х годов Ti-плазмиды были модифицированы
(«обезоружены») путем удаления онкогенов из Т-ДНК и фрагментов
ДНК, ненужных для клонирования. При этом был добавлен сайт
инициации репликации, вырезанный из плазмиды кишечной па-
лочки Е. coli, чтобы можно было наращивать плазмиды (клониро-
вать) в этой бактерии (о клонировании см. раздел 3.4). Модифициро-
ванные плазмиды (векторы) не содержали каких-либо онкогенных
последовательностей, и поэтому после переноса с их помощью ДНК
в ядро растительной клетки опухолевого перерождения клеток не
происходило. В данные векторы можно вставить нужные гены: один
vir — virulence inducing region.
Так, Agrobacterium tumefaciens вызывает образование опухолей в виде тератом
или «корончатых галлов», a A. rhizogenes — в виде пучка корней — «hairy root»
или так называемые «бородатые корни».
20 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
или несколько целевых (в Т-ДНК) и не менее двух маркерных, кото-
рые позволяют отобрать сначала бактериальные клетки с рекомби-
нантной плазмидой, а потом растительные клетки, в которые пере-
нос генов прошел удачно.
Перенос ДНК в клетки растений
При агробактериальных методах переноса используется, как прави-
ло, метод совместного культивирования эксплантов в течение неко-
торого времени (от 2-3 ч до 2-3 суток) с суспензией агробактерии
(co-cultivation). Затем экспланты переносят для регенерации каллу-
са или прямого побегообразования на среду, содержащую антибио-
тики для подавления роста бактерий. Этот метод достаточно универ-
сален и пригоден для трансформации многих видов растений, χοροπιο
образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени
было получено большинство трансгенных растений различных ге-
нотипов. Однако успех получения трансгенных растений зависит от
многих факторов, например от наличия систем культуры тканей и
регенерации растений, от подбора соответствующего штамма агро-
бактерии. В каждом конкретном случае приходится подбирать строго
индивидуальные условия для каждого генотипа растения (деталь-
ные протоколы приведены ниже).
Отбор трансформированных растений
Важное значение при получении трансгенных растений имеет отбор
их из образовавшихся регенерантов. Для этого обычно используются
селективные гены. Наиболее распространенными являются гены
устойчивости к антибиотикам1 или гены, делающие растения устой-
чивыми к гербицидам2. При помещении эксплантов на среды, в ко-
торых присутствует селективный агент, образовавшиеся из транс-
формированных клеток побеги остаются живыми, а остальные по-
гибают.
Для отбора используют также репортерные гены, обусловлива-
ющие легко тестируемую энзиматическую активность (GUS, CAT,
NOS и др.), или гены (GUS, GFP и др.) для визуального тестирова-
ния in situ (см. раздел 1.4).
Ген неомицинфосфотрансферазы nptll, придающий трансгенным растениям
устойчивость к канамицину, или hpt ген — устойчивость к гигромицину.
bar устойчивость к биалафосу; dhfr — к метотрексату; epsps — к Раундапу.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
11
Доказательство трансгенности трансформированных
растений, т. е. наличия в их геноме трансгена
После первоначального отбора трансформированных растений или
тканей с помощью маркерных или селективных генов проводят тес-
тирование на присутствие вводимого целевого гена с использовани-
ем молекулярных методов, в первую очередь методов анализа ДНК.
Наиболее употребительными являются методы полимеразной цепной
реакции (ПЦР) (см. раздел 1.6), ДНК-гибридизации (Саузерн-блот-
тинга, см. раздел 2.1), ПЦР реального времени (см. раздел 2.7) и
ДНК-гибридизации на микрочипах (см. раздел 2.2).
Экспрессия интродуцированных генов
Доказав трансгенность полученных после трансформации регене-
рантов, необходимо показать экспрессию встроенных целевых ге-
нов, так как их экспрессия является конечной целью трансформа-
ции растения.
Для выявления активности гена используют также молекуляр-
ные методы. Основные из них — дот-блот анализ (dot-blot analysis) и
нозерн-блоттинг (см. раздел 2.3), позволяющие оценить уровень
экспрессии введенных генов по наличию и количеству специфичес-
ких транскриптов. Однако в ряде случаев экспрессию гена проще и
надежнее контролировать по конечному белковому продукту (Вес-
терн-блоттинг, см. раздел 3.3) или тому эффекту, который этот бе-
лок вызывает.
Активность трансгенов может зависеть от того, в какую область
ядерного генома попал введенный ген, что связано со случайным ха-
рактером вставки трансгенов в геном. Это явление получило назва-
ние «эффект положения трансгена». Экспрессия трансгена, как пра-
вило, высока при его попадании в область активного хроматина, но
низка в составе гетерохроматина. Экспрессия часто снижена и в слу-
чае многокопийности трансгена. Снижение экспрессии может про-
исходить из-за существенных изменений ДНК при встраивании
генетической конструкции в ядерный геном (перестройки, дупли-
кации, инверсии и т. д.). Генотипы с несколькими копиями транс-
генов или те, в которых встраивание прошло с изменениями, не об-
ладают требуемыми признаками и обычно выбраковываются в ходе
селекционного процесса.
Наиболее ценны те трансформанты, у которых достаточно высок
уровень экспрессии трансгена и при этом не наблюдаются изъяны,
индуцированные вставкой чужеродной ДНК. Для создания таких
растений обычно получают большое количество (до тысячи) первич-
ных трансформантов, из которых в дальнейшем отбирают жела-
12 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
тельные генотипы. Нивелировать эффект положения трансгена мож-
но и с помощью чисто генно-инженерных подходов: путем введения
в трансгенные конструкции так называемых MARs (от англ. matrix
attached regions) — специальных последовательностей, позволяю-
щих образовать независимую петлю хроматина или включиться в
состав транскрибируемого эухроматина.
Наследование трансгенов
Наследуемость встроенного гена наряду с данными молекулярного
анализа о присутствии в геноме чужеродной ДНК является доказа-
тельством трансгенности полученных после трансформации расте-
ний. Присутствие введенного гена у потомков изучают теми же ме-
тодами, которыми первоначально тестируют исходные трансформан-
ты: а) выявляя наличие целевого гена в геномной ДНК трансгенного
организма; б) оценивая уровень транскрипции введенного гена;
в) контролируя экспрессию гена по конечному белковому продукту
или эффекту. Использование разных методов для доказательства
истинной трансгенности данного растения необходимо для того,
чтобы исключить «псевдотрансгенные» черты, вызванные сомакло-
нальной (эпигенетической) изменчивостью, химерностью или не-
полной элиминацией агробактерий.
Перенесенные в ядерный геном чужеродные ДНК, как правило,
наследуются в соответствии с законами Менделя. Если трансгены в
потомстве самоопыленных трансгенных растений наследуются как
единый менделевский признак, сегрегируя в отношении 3:1 (1:2:1),
значит, произошла единичная вставка гена, т. е. чужеродная ДНК
ведет себя как любая эндогенная мутация. При проведении скрещи-
вания такого трансформанта с нетрансформированным растением
соотношение мутация:норма в Τ1-поколении должно быть пример-
но 1:1. Если произошло встраивание двух или более вставок ДНК в
разные хромосомы, то наследуемый трансген будет распределяться
в потомстве самоопыленных растений с частотой не 3:1, а, напри-
мер, 15:1 в случае 2 вставок.
При изучении наследования трансгенов надо иметь в виду, что
комбинированная вставка ДНК, составленная из нескольких генов
(например, последовательностей целевого и селективного гена), мо-
жет сегрегировать в Т1-поколении, приводя к экспрессии только од-
ного из генов. Это явление может быть следствием мейотической ре-
комбинации хромосом. В некоторых случаях у растений-потомков
наблюдается значительное снижение экспрессии трансгена или даже
полное «замолкание» его. Чтобы снизить вероятность такого замол-
кания, следует выполнять определенные практические рекоменда-
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
13
ции, в частности в трансформанте должна быть только одна копия
трансгена, сигнальные части трансгена (промоторы, терминаторы и
др.) не должны иметь длинных гомологии (более 100-300 п.н.) с
участками хозяйского генома, фрагменты векторной плазмидной
ДНК должны быть по возможности полностью удалены из конст-
рукции.
Методики трансформации отдельных видов растений
Классический метод трансформации основан на совместной инкуба-
ции растительных тканей с суспензионной культурой агробакте-
рии, что нередко негативно влияет на морфогенетический потенци-
ал эксплантов, а также способствует развитию массированной бак-
териальной инфекции, приводящей к гибели клеток растений. Мы
модифицировали этот метод в применении к широкому кругу расте-
ний, таких как табак, рапс, и даже таких зерновых, как кукуруза и
др. Особенность этого метода заключается в том, что растительные
экспланты во время совместного культивирования не погружают в
суспензию бактерий, а размещают на поверхности агаризованной
среды, покрытой монослоем агробактерий (так называемый агро-
бактериальный газон). В этом случае бактерии не угнетают образо-
вание, рост и развитие каллуса и образование побегов.
Оборудование и среды
При использовании методов генетической трансформации необхо-
димы оборудование, посуда и реактивы, используемые при работах
с культурой ткани растений для обеспечения полной стерильности
(см. раздел 5.1).
Хотя методы трансформации растений с помощью агробактерий
имеют много общего, однако в зависимости от вида растений мето-
дические подходы различаются использованием разных типов экс-
плантов, составом сред для регенерации или числом субкультивиро-
ваний. Очень многие исследователи в своих опытах используют сре-
ду Мурасиге-Скуга (МС). Ее состав представлен в табл. 1.1.1.
Как правило, все опыты с растительными тканями in vitro про-
водят на агаризованных средах. При этом содержание агара зависит
от его марки. Чаще всего применяют концентрацию 0,5-0,8% . Мо-
гут быть также использованы и другие желирующие агенты, разра-
ботанные в последнее время: фитогель, фитагар и др. Необходимо
только иметь в виду, что в этом случае концентрация желирующих
соединений может быть иной, чем агара.
Для приготовления маточных (концентрированных) растворов
макро- и микросолей каждую соль последовательно растворяют в
t4 ГЛАВА 1 ■ МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
отдельном сосуде, затем сливают вместе и доводят до нужного объе-
ма. В смесь микросолей последним (для предотвращения выпадения
осадка) добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли — раст-
вор солей магния.
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (серно-
кислое железо + ЭДТА) готовят и хранят отдельно от других солей.
Маточные растворы стерилизуют автоклавированием.
Концентрированные растворы витаминов готовят на дистилли-
рованной воде, а регуляторы роста растворяют в диметилсульфокси-
де (ДМСО), подбирая концентрации, удобные для приготовления
рабочих растворов.
Для элиминации агробактерий используют антибиотики цефа-
лоспориновой группы, такие как клафоран, цефотаксим (Цт), цефа-
золин (Цз), цефуроксим, цефалексин или другие, обычно начинаю-
щиеся на «цеф». В качестве селективного агента часто применяется
антибиотик канамицин (Км), так как в Т-ДНК обычно присутствует
маркерный ген nptll. Водорастворимые антибиотики растворяют в
стерильной воде в концентрации 100 мг/мл.
Приготовление агробактериального газона
Агробактерий, содержащие генетическую конструкцию, выращи-
вают на агаризованной среде LB с добавлением антибиотиков, необ-
ходимых для селекции используемого штамма (табл. 1.1.2). Затем
готовят суспензионную «ночную культуру» агробактерий. Для это-
го небольшое количество культуры агробактерий переносят прока-
ленной петлей с чашки Петри в 5-10 мл жидкой среды LB с подходя-
щими антибиотиками на 12-14 ч. Для проведения генетической
трансформации бактерии используют в логарифмической стадии
роста.
Суспензию агробактерий плотностью около 106-109 кл/мл вно-
сят по 0,05-0,1 мл в чашку Петри на агаризованную питательную
среду для каллусогенеза и равномерно распределяют по всей поверх-
ности микробиологическим шпателем. Полученный агробактери-
альный газон подсушивают перед помещением на него раститель-
ных эксплантов в ламинар-боксе в течение 10-15 мин.
Трансформация табака
Для трансформации табака используют стерильные молодые листья
растений, разрезанные на сегменты площадью приблизительно
0,5-1 см2, которые укладывают в чашки Петри нижней стороной
вниз на поверхность агробактериального газона, нанесенного на сре-
ду для каллусогенеза (табл. 1.1.3), и культивируют в течение 2-3 су-
ток при температуре 25-27 °С без освещения.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
15
Для регенерация растений in vitro экспланты переносят на среду
для морфогенеза табака (табл. 1.1.3), дополненную антибиотиками
Цт, Цз и Км, и культивируют при температуре 25-27 °С с фотоперио-
дом 16/8 ч (день/ночь) и интенсивностью освещения 5 клк. Каж-
дые 3 недели экспланты переносят на свежую среду того же состава,
постепенно уменьшая концентрацию Цт и Цз до 100 мг/л. Через
2-3 пассажа на срезах эксплантов начинается образование первич-
ного каллуса, на котором в дальнейшем сначала формируются поч-
ки, а затем и регенеранты. Сформировавшиеся растения скальпе-
лем отделяют от экспланта и переносят на среду для укоренения та-
бака (табл. 1.1.3). На этой стадии можно тестировать полученные
растения на присутствие трансгена.
Надо иметь в виду, что устойчивость растений к Км (зеленые
листья), так же как и проверка только на наличие гена nptll, не яв-
ляется достаточной. Все полученные растения необходимо прове-
рять на присутствие целевого гена, так как иногда при встраивании
сложной генетической конструкции в геноме растения присутству-
ет только один из трансгенов.
На последней стадии антибиотики, ингибирующие рост бакте-
рий, не добавляют, чтобы спровоцировать рост агробактерий, если
не прошла их элиминация. Км в концентрации 100 мг/л в средах
для регенерации табака присутствует постоянно. Этот антибиотик
является селектирующим фактором и на стадии корнеобразования,
так как у растений с отсутствием или слабой экспрессией гена nptll
(устойчивости к Км) корни в этих условиях не образуются. Подрос-
шие растения можно размножать черенкованием.
Получение трансгенных растений рапса
Для получения трансгенных растений рапса обычно в качестве экс-
плантов используют семядоли 3-6-дневных проростков, на которых
при срезании оставляют 2-3 мм черешка, или молодые листья, сре-
занные со стерильных растений in vitro; при этом чаще берут семя-
доли. Для получения проростков in vitro семена стерилизуют, обра-
батывая их сначала в течение 5 мин 70% этанолом, затем в течение
30 мин раствором, содержащим гипохлорит Na (0,5% активного
хлора)1, и далее 5-7 раз промывают стерильной дистиллированной
водой. Продезинфицированные семена проращивают при 20 °С и
16-часовом световом дне на среде, содержащей макросоли МС в по-
ловинной концентрации, микросоли МС в полной концентрации,
5 г/л сахарозы и агар 0,7% .
В качестве исходного средства можно использовать бытовые средства для отбели-
вания и дезинфекции, например, «Белизну» или «Доместос» 20-30% .
16 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Трансформацию проводят при культивировании эксплантов на
агробактериальном газоне, нанесенном на среду для каллусогенеза
(табл. 1.1.4). Экспланты помещают в чашки Петри по 30-40 штук
нижней стороной семядоли вниз. Совместное культивирование про-
водят в течение 2-3 дней без освещения при 22-25 °С. После оконча-
ния совместного культивирования экспланты переносят на среду
для морфогенеза, содержащую Цт в концентрации 500 мг/л и Цз в
концентрации 300 мг/л1.
Следующим этапом является перенос эксплантов через 14-16 су-
ток на такую же среду, но дополненную Км. На этой среде на экс-
плантах начинают формироваться почки, из которых в дальнейшем
развиваются побеги. Через 21-24 дня экспланты переносят на среду
для роста побегов, на которой образовавшиеся побеги вытягивают-
ся. Подрастающие зеленые побеги отделяют скальпелем от эксплан-
тов и высаживают на среду для укоренения (табл. 1.1.4) без добавле-
ния Км. Корни образуются на 5-10-й день после переноса побегов.
Продолжительность времени формирования корней зависит от ге-
нотипа экспланта. На этой стадии побеги обычно анализируют мето-
дом ПЦР, определяя наличие целевого гена, и отбраковывают расте-
ния, не содержащие его.
Количество антибиотиков (Цт и Цз), ингибирующих рост агро-
бактерий, при каждой последующей пересадке снижают на 300 мг/л
(200 мг/л Цт и 100 мг/л Цз), оставляя на среде для укоренения толь-
ко 100 мг/л Цт. Побеги рапса можно размножать черенкованием,
поддерживая их рост на среде для укоренения.
Трансформация картофеля
При трансформации картофеля в качестве эксплантов используют
сегменты стеблей размером 5-7 мм без пазушной почки, сегменты
микроклубней или листья, на которых поперек центральной жилки
делают скальпелем насечки с интервалом 1 мм. Экспланты помещают
в чашки Петри с суспензией «ночной» культуры агробактерий2, нахо-
дящейся в среде для совместного культивирования (табл. 1.1.5).
Листовые экспланты при этом располагают верхней стороной вниз и
культивируют в течение 15 мин, перекладывают затем на питатель-
ную среду для каллусогенеза (табл. 1.1.5) без антибиотиков, на ко-
торой выдерживают в течение 18-24 ч. Совместное культивирова-
ние с агробактериями и последующее культивирование после обра-
ботки агробактериями проводят на рассеянном свету при 22 °С и
влажности 75%.
1 Можно использовать только Цт в концентрации 800 мг/л.
2 В данном методе агробактериальный газон не используется.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
17
После окончания совместного культивирования экспланты
переносят на среду для каллусогенеза (табл. 1.1.5), содержащую
800-900 мг/л Цт, и чашки Петри с эксплантами инкубируют так-
же на рассеянном свету при температуре 22-24 °С.
Для регенерации растений in vitro через 5-7 дней экспланты
переносят в чашки Петри со средой для регенерации (табл. 1.1.5)
с тем же количеством Цт и инкубируют в течение 10-14 дней без Км.
Затем экспланты помещают в 100 мл сосуды со средой того же соста-
ва, но с добавлением Км, и пересаживают каждые 3 недели, последо-
вательно понижая содержание Цт на 100 мг/л при каждом субкуль-
тивировании. Регенерация побегов начинается через 2-3 пассажа.
Регенеранты, достигшие длины 7-10 мм, скальпелем отделяют
от экспланта и помещают в стеклянные пробирки (диаметром 16 мм)
с агаризованной средой для роста регенерантов (табл. 1.1.5) с добав-
лением 50 мг/л Км и 200 мг/л Цт. Побеги, сохранившие через
20-30 суток зеленую окраску стебля, разрезают на 2-4 черенка и
помещают по одному в пробирки с аналогичной средой. Для роста
побегов требуется температура 23-24 °С, освещенность 8-10 клк,
влажность 75%.
Через 3-4 недели растения, образовавшие корни в присутствии
Км, можно анализировать для определения их трансгенности. По-
лученные трансформанты картофеля, а также исходный материал
выращивают при температуре 23-25 °С, освещенности не менее
6 клк и влажности 75%.
Трансформация кукурузы
При трансформации кукурузы в качестве эксплантов используют
эмбриогенный каллус или незрелые зародыши. Каллус получают из
незрелых зародышей, выделенных на 11-12-й день после опыле-
ния. Зерновки вычленяют из початков и поверхностно стерилизу-
ют коммерческим отбеливателем «Белизна» (гипохлорит натрия,
7-9% активного хлора) в течение 20 мин и трижды промывают сте-
рильной дистиллированной водой. Из стерильных зерновок выделя-
ют зародыши. Для индукции и культивирования каллуса использу-
ют среду МС для морфогенеза с 2,4-Д (табл. 1.1.6). Через каждые
15-20 суток каллус переносят на свежую среду того же состава.
Трансформацию проводят путем переноса эксплантов кукурузы
на агробактериальный газон, в который для повышения вирулент-
ности агробактерий добавляют ацетосирингон (100-500 мг/л) или
экстракт растений табака in vitro. Активация бактерий существен-
на только для трансформации однодольных растений. Культивиро-
вание эмбриогенного каллуса или незрелых зародышей кукурузы
на газоне длится в течение 15-20 дней.
18 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Затем каллусы переносят на среду для морфогенеза (табл. 1.1.6)
с антибиотиком Цт в концентрации 150-200 мг/л для элиминации
агробактерий и стимуляции регенерации. Каллус культивируют на
среде с Цт в течение 6-7 пассажей, что способствует полной диффе-
ренциации побегов. Развившиеся регенеранты пересаживают на пи-
тательную среду того же состава, содержащую 150 мг/л Цт и необхо-
димый селективный агент в заданной концентрации (если это анти-
биотик Км, то его добавляют в концентрации 25 мг/л).
Развившиеся побеги пересаживают на среду МС для укоренения
регенерантов (табл. 1.1.6). Укоренившиеся растения высаживают в
почвенную смесь (почва, торф и песок в равных соотношениях).
Каллус и растения выращивают при температуре 26±1 °С, 16-часовом
фотопериоде и интенсивности освещения 5 клк.
Проверка наследуемости встроенных генов
у трансформированных растений
Укорененные растения из сосудов с агаром высаживают в почву для
получения семян. Как правило, выжившие в почве растения имеют
нормальный фенотип и в благоприятных условиях цветут и форми-
руют семена. Для исключения неконтролируемого опыления обра-
зующиеся цветоносы закрывают изоляторами до завязывания се-
мян. Созревшие семена с каждого растения собирают в отдельные
бумажные пакеты.
Для проверки семян на присутствие трансгена их дезинфициру-
ют способом, описанным ранее для семян рапса1, и высаживают на
среду для семян2. При высеве семян в среду добавляют селективный
агент. Это чаще всего Км в концентрации 100 мг/л для табака и
25 мг/л для кукурузы. При высеве семян рапса селективные агенты
не добавляют.
Выросшие на среде с антибиотиком зеленые растения табака,
кукурузы проверяют на наличие встроенных генов и пересаживают
по одному в сосуды на среды для укоренения растений. Семена рапса
проращивают на среде без антибиотика, поэтому необходимо прове-
рять каждое растение, полученное из семян.
Таким образом, мы рассказали об агробактериальных методах
получения нескольких видов трансгенных растений. Из изложенно-
го ясно, что в основном эти способы похожи, различаясь применяе-
1 70% этанол 3-4 мин, гипохлорит натрия (0,5-7% активного хлора) 20-30 мин,
промывка дистиллированной водой.
2
Половинная концентрация макро и микросолей по МС, 0,5% сахароза и 0,7%
агар.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
19
мыми для получения растений-регенерантов питательными среда-
ми. Поэтому главное для описанных методов — это подбор условий
регенерации, подходящих для данного вида и экспланта растений.
И только тогда, когда подобраны условия, при которых происходит
множественная регенерация (частота не менее 30-50%), можно
приступать к созданию трансгенных растений данных видов.
Однако некоторые виды растений можно трансформировать, ис-
пользуя не методы культуры тканей, а так называемые методы
трансформации in planta. Это может быть нанесение суспензии агро-
бактерий на срез побега, образовавшегося на растении, или метод
инъекции агробактериальной суспензии в меристематическую почку.
В дальнейшем побег отделяют от растения, проверяют на трансген-
ность и укореняют. Одним из методов in planta является метод по-
гружения соцветий в суспензию агробактерий. Таким способом
можно получать, например, трансгенные растения Arabidopsis.
Трансформация Arabidopsis thaliana
методом цветочного погружения
Этот метод в настоящее время наиболее широко используется для
создания трансгенных растений арабидопсиса. Трансформация га-
мет осуществляется простым погружением развивающихся цветков
на несколько секунд в 5% раствор сахарозы с суспензией агробакте-
рий, содержащий 0,01-0,05% Silwet L-771. Пропитанные растения
дают семена, которые затем выращивают на селективной среде для
того, чтобы отобрать трансформированные растения. Частота транс-
формации при этом составляет как минимум 1% . Таким образом, от
20-30 растений можно получить несколько сотен независимых
трансгенных линий уже через 2-3 месяца.
Растения арабидопсиса выращивают в почве в растительной ка-
мере в условиях короткого дня (8/16 — день/ночь) в течение 3-4 не-
дель, затем, чтобы вызвать цветение, перемещают их в условия
длинного дня (14/10). После формирования цветочных кистей2 про-
водят трансформацию, перед которой накрывают почву нейлоном
или куском марли и закрепляют резинкой, чтобы предотвратить ее
осыпание, когда растения будут перевернуты для погружения.
«Ночную» суспензионную культуру агробактерий, выращен-
ную в среде LB, центрифугируют при скорости 4500 об./мин в тече-
ние 10 мин при комнатной температуре. Осадок суспендируют в све-
1 Silwet L-77 — Lehle Seeds, cat.No VIS-02, PO Box 2366 Round Rock Tx 78680 USA,
www.Arabidopsis.ru
Оптимальные растения имеют много незрелых цветочных пучков и немного опло-
дотворенных.
20 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
жеприготовленном 5% растворе сахарозы, затем добавляют Silwet
L-77 в концентрации 0,02% (100 мл на 500 мл раствора). В эту сус-
пензию погружают надземную часть растений, выдерживают при
слабом помешивании в течение 10 с. Затем растения вынимают из
раствора и обсушивают 3-5 с. Обработанные растения плотно на-
крывают сосудом или полиэтиленовым пакетом и оставляют на 24 ч
в неосвещенном месте. Затем снимают пакет и перемещают расте-
ние обратно в световую камеру. Через 1 месяц, когда семена созреют
и станут коричневого цвета, прекращают полив растений. Пример-
но через неделю после этого семена собирают. Они могут храниться в
течение нескольких месяцев при комнатной температуре или как
минимум год при 4 °С. Для проверки трансгенности собранные се-
мена стерилизуют, как описано ранее, и высевают в чашки Петри на
среду для проращивания семян (см. выше), содержащую 100 мг/л
Км. Чашки Петри с высеянными семенами помещают на 2 суток при
4 °С, а затем переносят в растительную камеру в условия длинно-
го дня. Через 7-10 дней потенциально трансформированные рас-
тения, оставшиеся зелеными, можно пересаживать в почву. Через
10-14 дней их можно проверить на трансгенность. Через 4-5 поко-
лений растения выходят в гомозиготное состояние и тогда все полу-
чаемые семена будут трансгенными.
Литература
1. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962.
V. 15. P. 473-497.
2. Малышенко С. И., Тюлъкина Л. Г., Зверева С. Д., Ралдуги-
наГ.Н. Получение трансгенных растений Brassica campestris,
экспрессирующих ген gfp // Физиология растений. 2003. Т. 50.
С. 309-315.
3. Ф. Баятп, Б. Ширак, Д. В. Беляев, Н. О. Юрьева, Г. И. Соболъко-
ва, X. Ализаде, М. Ходамбаши, А. В. Бабаков. Повышенная
устойчивость к засолению растений картофеля, трансформи-
рованных геном вакуолярного Na /H -антипортера ячменя
ΗνΝΗΧ2 // Физиология растений. 2010. Т. 57. С. 744-755.
4. Данилова С. А. Методы генетической трансформации зерновых
культур // Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5. С. 645-658.
5. Данилова С. Α., Кузнецов В. В., Долгих Ю.И. Новый эффек-
тивный метод трансформации кукурузы с использованием агро-
бактериального газона // Физиология растений. 2009. Т. 56.
С. 285-290.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
21
6. Draper J., Scott R., Armitage P., Walden R. Plant Genetic
Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual.
Oxford: Blackwell Sci. 1988. 408 p.
7. Maniatis Т., Fritsch F., Sambrook. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Lab., 1982. 545 p.
8. Рукавцова Ε. Б., Захарченко Η. С, Пиголева С. В., Юхмано-
ваА.А.у Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я. И. Получение безмар-
керных трансгенных растений // Доклады Академии наук. 2009.
Т. 426. С. 261-264.
9. Бурьянов Я. И. Успехи и перспективы генно-инженерной био-
технологии растений // Физиология растений. 1999. Т. 46.
С. 930-944.
10. Романов Г. А. Генетическая инженерия растений и пути реше-
ния проблемы биобезопасности // Физиология растений. 2000.
Т. 47. С. 342-353.
11. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Сибир. универс. из-
дание, Новосибирск. 2004. 496 с.
12. Шевелуха B.C. (ред.) Сельскохозяйственная биотехнология.
«Высшая школа», Москва. 2003. 470 с.
13. ЛутоваЛ.А. Биотехнология высших растений. Изд-во СПб-уни-
верситета, 2010. 238 с.
Приложение
Состав сред, применяемых при получении
трансгенных растений
Таблица 1.1.1. Приготовление маточных растворов для среды Мураси-
ге—Скуга (МС)
Компоненты среды Количество вещества
Раствор макросолей (готовят в 20-кратной концентрации) (г/л)
ΚΝO3 38
NH4NO3 33
КН2PO4 3,4
MgSO4 χ 7Η20 7,4
или МдБОд безводный 3,6
Раствор микросолей (готовят в 1000-кратной концентрации) (мг/л)
CoCI2 χ 6H2O
2,5
22 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Таблица 1.1.1. Приготовление маточных растворов для среды Мураси-
ге—Скуга (МС) (окончание)
Компоненты среды
CuSO4 χ 5H2O
H3ВОз
MnSO4 х 5H2O
или MnSO4 х 4H2O
ZnSO4 х 7H2O
KJ
Na2Mo04 х 2H2O
Количество вещества
2,5
620
2410
2230
860
83
25
Раствор хелата железа (мг/л)
FeSO4
Na2 ЭДТА
557
745
Раствор CaCI2 (г/л)
CaCI2 безводный
200
Маточные растворы, как правило, готовят в мерной посуде, раст-
воряя компоненты по отдельности в небольшом количестве дистил-
лированной воды, а затем сливают их в очередности, указанной в
таблице. Перед приготовлением среды в сосуд необходимо налить
100-200 мл воды, а затем после добавления всех компонентов довес-
ти объем раствора до 1 л.
Хелат железа готовят, растворяя компоненты по отдельности,
затем сливают их и подогревают раствор, не доводя до кипения, до
образования раствора темно-желтого цвета.
Таблица 1.1.2. Состав агаризованной среды LB
Компоненты среды Количество на 1 л раствора
Пептон 10 г
Бакто-дрожжевой экстракт 5 г
NaCI 10г
NaOH 167 мкл 10 Η раствора
Агар 15 г
H2O До 1 литра
рН среды перед автоклавированием 7,7.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
23
Таблица 1.1.3. Среды для регенерации и укоренения растений табака
(для 1 л)
Компоненты среды
Макросоли МС
Микросоли МС
СаСl2 20%
Хелат железа
Сахароза
Инозит
Среда
для морфогенеза
50 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
30 г
100 мг
Среда
для укоренения
25 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
Юг
—
Витамины
Тиамин
Никотиновая кислота
Пиридоксин
2 мг
2 мг
2 мг
—
—
—
Регуляторы роста
БАП
НУК
2 мг
0,2 мг
—
—
рН сред перед автоклавированием 5,5-5,8.
Таблица 1.1.4. Состав сред для культивирования эксплантов рапса
(для 1 л)
Компоненты
среды
Среда Среда
для каллусо- для морфо-
генеза генеза
Среда Среда для
для роста укоренения
побегов побегов
Макросоли МС
Микросоли МС
СаСl2 20%
Хелат железа
Инозит
Сахароза
50 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
100 мг
30 г
50 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
100 мг
Юг
50 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
100 мг
Юг
25 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
—
7г
Витамины
Тиамин
1 мг
1 мг
1 мг
24 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Таблица 1.1.4. Состав сред для культивирования эксплантов рап-
са (для 1 л) (окончание)
Компоненты
среды
Среда Среда
для каллусо- для морфо-
генеза генеза
Среда Среда для
для роста укоренения
побегов побегов
Никотиновая
кислота
Пиридоксин
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
Регуляторы роста
Кинетин
2,4-Д
6-БАП
НУК
АБК
AgN03
4 мг
0,1 мг
—
0,1 мг
—
—
—
—
+1
+1
3 мг
30 мг
—
—
—
—
—
—
—
—
—
0,1 мл
—
—
рН сред перед автоклавированием 5,6—5,8·
Таблица 1.1.5. Состав сред, используемых при трансформации картофе-
ля (для 1 л)
Компоненты
среды
Среда
для со-
вместного
культиви-
рования
Среда
для кал-
лусоге-
неза
Среда
для мор-
фогенеза
Среда
ДЛЯ
роста
побегов
Среда
для уко-
ренения
побегов
Макросоли
МС
Микросоли
МС
Fe-хелат
СаСl2 20%
Тиамин
Пиридоксин
50 мл
1 мл
5 мл
5 мл
1 мг
1 мг
50 мл
1 мл
5 мл
5 мл
1 мг
1 мг
50 мл
1 мл
5 мл
5 мл
1 мг
1 мг
50 мл
1 мл
5 мл
5 мл
1 мг
1 мг
50 мл
1 мл
5 мл
5 мл
1 мг
1 мг
1 Содержание 6-БАП и НУК может меняться в зависимости от сорта рапса. Подби-
рается концентрация, на которой лучше всего идет регенерация.
Раздел 1.1. Получение трансгенных растений
25
Таблица 1.1.5. Состав сред, используемых при трансформации картофе-
ля (для 1 л) {окончание)
Компоненты
среды
Сахароза
Глюкоза
Гидролизат
казеина
Мезоинозит
6-БАП
Аденин
НУК
Биотин
Са-панте-
тонат
Транс-зеа-
тин
Канамицин
Цефотаксим
Агар
Среда
лля сп-
вмсстного
ifvni^TMnu —
IVy J ID I rltJrl'
рования
16r
5 мг
Среда
для кал-
лусоге-
неза
16 г
1 г
100 мг
0,1 мг
5 мг
800-900
мг2
7г
Спела
для мор-
ffaflrOUO'SSl
16г
1 Г
100 мг
0,1 мг
40 мг
0,01 мг
1 мг
5 мг
1,5-2,2 мг
15 мг1
от 800 до
500-300
мг
7г
Среда
для
роста
побегов
20 г
7г
Среда
для уко-
ренения
побегов
80 г
7г
рН всех сред 5,8-5,9.
Таблица 1.1.6. Состав сред для культивирования кукурузы (для 1 л)
Компоненты среды
Среда для
морфогенеза
Среда для укоренения
регенерантов
Макросоли МС
Микросоли МС
СаС12 20%
50 мл
1 мл
3,3 мл
25 мл
1 мл
3.3 мл
Зависит от исходного генотипа растения.
Зависит от агробактериального штамма.
26 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Таблица 1.1.6. Состав сред для культивирования кукурузы (для 1 л)
(окончание)
Компоненты
Хелат железа
Инозит
Сахароза
Агар
среды
Среда для
морфогенеза
5 мл
100 мг
30 г
7г
Среда для укоренения
регенерантов
5 мл
—
10 г
7г
Витамины
Тиамин
Никотиновая
Пиридоксин
кислота
50 мкл
100 мкл
100 мкл
—
—
—
Регуляторы роста
2,4-Д
1 мг
—
рН сред = 5,6-5,8.
1.2. ПОЛУЧЕНИЕ
ТРАНСПЛАСТОМНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА
МЕТОДОМ БАЛЛИСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ
С. А. Данилова
Введение
Применение технологии генетической трансформации растений от-
крывает новые возможности для решения фундаментальных проб-
лем практически во всех областях биологии, в том числе в физиоло-
гии растений. Введение чужеродных генов в ядерный или пластид -
ный геном растений помогает изучать как функции отдельных
генов, так и функционирование различных метаболических путей и
регуляторных систем растений. Такая манипуляция генами позво-
ляет получать растения с новыми свойствами за очень короткий
срок в сравнении с подходами, применяемыми классической селек-
цией. Внедрение чужеродных генов в геном растений дало возмож-
ность получать новые сорта сельскохозяйственных культур с улуч-
шенным качественным и количественным составом белков, жиров,
углеводов и витаминов. Трансгенные растения могут приобрести по-
Раздел 1.2. Получение транспластомных растений табака
27
вышенную устойчивость к гербицидам, неблагоприятным погод-
ным условиям и фитопатогенам. В настоящее время трансгенные
растения начинают использоваться как источник получения гормо-
нов, вакцин и других белков медицинского назначения. Однако ис-
кусственный трансгенез не всегда приводит к ожидаемым результа-
там и, наоборот, часто создает новые медицинские и экологические
риски. Часть этих недостатков отсутствует у так называемых транс-
пластомных растений (ТПР), методы получения которых представ-
ляют большой теоретический и практический интерес.
Преимущества транспластомной трансформации
Цель транспластомной трансформации заключается в создании рас-
тений с новыми или измененными функциями генов в пластидном
геноме. Пластидная трансформация имеет ряд преимуществ перед
трансформацией ядерного генома.
• Привлекательной стороной транспластомной трансформации
является высокий уровень синтеза целевого белка. Это дости-
гается за счет большого числа копий пластидной ДНК в клет-
ках растения. Активная экспрессия чужеродных генов в плас-
тидах позволяет накапливать более 20% целевого белка в рас-
чете на суммарный растворимый белок в клетке, тогда как в
ядерных трансформантах доля инородного белка составляет,
как правило, не более 1%.
• У ТПР целевой ген встраивается в определенный участок плас-
тидного генома. Это достигается за счет специальных векторов,
применяемых для переноса чужеродных генов (рис. 1.2.1). Осо-
бенность векторов заключается в том, что с обеих сторон от
участка ДНК, предназначенного для встраивания в пластид-
ный геном, присутствуют последовательности ДНК, которые
Пластидная
ДНК
LTR
RTR
Вектор
Маркерный
LTR
Целевой С
Трансформированная
пластидная
ДНК
RTR
Рис. 1.2.1. Схема гомологичной рекомбинации целевого гена в пластид-
ный геном
28 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
полностью гомологичны определенным участкам пластидного
генома. Когда такой вектор попадает в хлоропласт, за счет го-
мологичной рекомбинации происходит встраивание целевого
гена в пластидный геном в области гомологии.
• У ТПР отсутствует «эффект положения», т. е. влияния облас-
ти встраивания на экспрессию. У них можно осуществить экс-
прессию нескольких генов одного метаболического пути в со-
ставе оперона.
Исключительно важно, что ТПР экологически более безопасны,
поскольку пластидные гены передаются, главным образом, по мате-
ринской линии (отсутствуют в пыльце), и поэтому трансгены не мо-
гут распространяться в экосистемах через опыление близкородст-
венных растений.
Методы получения транспластомных растений
В клетках растений присутствуют несколько типов пластид с разны-
ми функциями: в зеленой пластиде — хлоропласте — происходит
фотосинтез, в амилопластах синтезируется и откладывается в запас
крахмал, в хромопластах накапливаются пигменты — каротиноиды
[1]. Для пластид характерна оболочка, состоящая из двух различ-
ных по свойствам мембран (рис. 1.2.2). Пластиды имеют собствен-
ный генетический аппарат и белоксинтезирующую систему и спо-
Рис. 1.2.2. Хлоропласты в клетках растений (http: //en. wikipedia . org/
wiki/Chloroplast). См. цвет, вклейку,рис. 1
Раздел 1.2. Получение транспластомных растений табака
29
собны делиться внутри клетки. В отличие от линейных молекул
ДНК в хромосомах ядра хлоропластная ДНК представляет собой
замкнутую кольцевую молекулу. Ее размеры варьируют у разных
видов растений большей частью в интервале от 130 до 160 тыс. пар
оснований. Хлоропластный геном имеет не более 100 генов, одна-
ко в хлоропласте обнаруживается около 3500 белков, которые ко-
дируются в основном ядерным геномом. Генетический материал
хлоропластного генома передается потомству, главным образом,
по материнской линии и не принимает участия в процессе опыле-
ния, что препятствует переносу трансгенов при помощи пыльцы.
Первые сообщения об успешной трансформации хлоропластов
одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii были опуб-
ликованы [2]. Методом баллистики был перенесен пластидный ген
atpB в пластом мутанта С. reinhardtii с поврежденным геном atpB.
А в 1990 г. Maliga и др. [3] получили первые стабильные хлоропласт-
ные трансформанты высших растений {Nicotiana tabacum L.) тем же
методом. Позднее (1993 г.) для трансформации хлоропластов был
применен метод с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) для пе-
реноса ДНК в изолированные протопласты — растительные клетки,
лишенные клеточной стенки [4]. Хотя последний метод достаточно
трудоемкий и имеет низкую эффективность, в некоторых лаборато-
риях его все же применяют, особенно для исследований транзиент-
ной экспрессии. На сегодняшний день самый востребованный метод
трансформации хлоропластов — это встраивание чужеродных генов
с помощью биобаллистики [5-12].
Принцип метода баллистической трансформации
Бомбардировка микрочастицами, или биобаллистика, — наиболее
широко используемый метод введения ДНК в пластидный геном
растительной клетки. Существует несколько моделей пушек раз-
ных производителей (Helios Gene Gun System, PDS-1000/He and
Hepta Systems фирмы «Bio-RAD» (США), см. рис. 1.2.3); в нашей
стране применяют пушки отечественного производства, при этом
все они имеют общий принцип работы.
Вначале золотые или вольфрамовые сферические частицы диа-
метром 0,4-1,0 мкм покрывают векторной ДНК, осажденной СаС12
и спермидином, затем наносят на мембрану, которую помещают
внутрь баллистической пушки. Чашки Петри с эксплантами поме-
щают под пушку на расстоянии 10-15 см. Создают разряжение воз-
духа 0,9-0,95 атм. В момент «выстрела» сжатым воздухом или ге-
лием частицы разгоняются до скорости 300-600 м/с и пробивают
30 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.2.3. Баллистическая пушка фирмы «Bio-RAD»
клеточную стенку и мембраны, попадая в цитоплазму, пластиды
или ядро растительных клеток. При этом количество частиц в рас-
чете на клетку невелико, и клетки практически не повреждаются.
Попав внутрь пластиды (хлоропласта), ДНК-вектор при удачном
стечении обстоятельств за счет гомологичной рекомбинации может
встроить целевые гены в пластидный геном (рис. 1.2.1 и 1.2.4). Благо-
даря хлоропласт-специфичным промоторам вводимые гены экспрес-
сируются только в пластидах, а дальнейшая селекция трансформи-
рованных клеток позволяет отобрать только те трансформанты,
в которых произошла интеграция чужеродного гена в пластидный
геном. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансфор-
мировать растения самых разных видов. Однако к настоящему вре-
мени только для немногих растений отработана эффективная техно-
логия трансформации пластид. Здесь приводится протокол получе-
ния ТПР табака, поскольку метод получения для данного вида
разработан наиболее детально.
Материалы и среды
Вектор для трансформации
Векторами для трансформации хлоропластов, как правило, служат
модифицированные плазмиды Е. coli, которые содержат пластид-
ную ДНК для гомологичной рекомбинации, маркерный ген, кото-
Раздел 1.2. Получение транспластомных растений табака
31
рый придает клеткам устойчивость к селективному агенту, а также
целевой ген для переноса в хлоропластный геном. В качестве мар-
керных могут быть гены устойчивости к антибиотикам: канамицину
(nptll), спектиномицину (aadA) или гербицидам, таким как Раун-
дап (глифосат) (EPSPS) или Баста (глюфосинат) (bar). В конструк-
ции используют промоторы и терминаторы пластидных генов.
Растительный материал
Семена табака стерилизуют коммерческим отбеливателем типа «Бе-
лизна», содержащим в качестве активного вещества гипохлорит нат-
рия, в течение 10 мин. Затем четыре раза промывают стерильной во-
дой и высаживают на среду для проростков (Р) (табл. 1.2.1). Расте-
ния культивируют при 26 °С в темноте (проращивание), далее в
условиях 16-часового фотопериода (16/8 ч — день/ночь) в течение
3-4 недель. Для трансформации используют зеленые листья сред-
ней величины (исключая листья верхнего и нижнего ярусов).
Состав сред
В состав всех питательных сред входят макро- и микросоли по Мура-
сиге—Скугу, витамины, фитогормоны и углеводы (табл. 1.2.1). Пе-
ред автоклавированием рН среды доводят до 5,6-5,8 с помощью
КОН. Стерилизацию среды осуществляют в автоклаве при давлении
1,2 атм. 2 раза по 15 мин.
Таблица 1.2.1. Среды для растений табака (для 1 л)
„ Среда Μ Среда Ρ
Компоненты среды л.
к " для морфогенеза для укоренения
Макросоли МС1
Микросоли МС1
CaCI2 20%
Хелат железа
Инозит
Тиамин
БАП
50 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
100 мг
1 мг
1 мг
25 мл
1 мл
3,3 мл
5 мл
—
—
—
1
Приготовление растворов макро- и микросолей по прописи МС приведено в разде-
ле 1.1.
Компоненты среды
НУК
Сахароза
Агар
Среда Μ
для морфогенеза
0,1 мг
30 г
7г
Среда Ρ
для укоренения
—
30 г
7г
32 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Таблица 1.2.1. Среды для растений табака (для 1 л) (окончание)
рН сред 5,6-5,8 — для подведения рН используют 1 N КОН.
Процедура трансформации
Этап I
За день до планируемой трансформации проводят предварительную
подготовку растительных эксплантов и частиц золота (или воль-
фрама).
Подготовка растительного материала
Стерильные зеленые листья табака кладут нижней стороной кверху
в центр стерильного фильтровального диска, который помещают на
среду для морфогенеза (М) (табл. 1.2.1) в чашки Петри и оставляют
на ночь при 26 °С. Как правило, для трансформации одной конст-
рукцией ДНК используют не менее 15-25 листьев.
Подготовка золотых частиц
(за основу взят протокол, предложенный фирмой «Bio-Rad»)
Для хлоропластной трансформации чаще используют золотые час-
тицы размером 0,6 мкм. В 1,5-мл пробирке типа Эппендорф взвеши-
вают 30 мг частиц (как правило, этого количества хватает на 100 выс-
трелов) и добавляют 1,0 мл охлажденного 70% этилового спирта,
после чего содержимое пробирки встряхивают на вортексе в течение
5 мин. Оставляют пробирку на 15 мин при комнатной температуре
для осаждения частиц, после чего центрифугируют при 3000 об./мин
в течение 1 мин. Затем сливают спирт и дважды промывают 1 мл
охлажденной, стерильной дистиллированной воды, встряхивая на
вортексе 2 мин. Оставляют на 10 мин при комнатной температуре
для осаждения частиц. Центрифугируют при 5000 об./мин в тече-
ние 15 с. После удаления воды добавляют 500 мкл 50% глицерина и
перемешивают в течение 1 мин на вортексе. После этого этапа подго-
товленные золотые частицы можно хранить при комнатной темпе-
ратуре в течение 2 недель.
Раздел 1.2. Получение транспластомных растений табака 33
Этап II
Нанесение ДНК на золотые частицы
Его проводят непосредственно перед применением пушки. Золотые
частицы после хранения перемешивают в растворе глицерина на
вортексе в течение 5 мин. Постоянно встряхивая на вортексе, пере-
носят по 50 мкл суспензии (этого количества хватает на 10 выстре-
лов) в десять 1,5-мл пробирок, которые сразу помещают на вортекс.
Затем в каждую пробирку по очереди, с последующим немедлен-
ным перемешиванием в течение 1 мин, добавляют: а) 5 мкл ДНК
(1 мкг/мкл); б) 50 мкл 2,5 Μ СаС12; в) 20 мкл 0,1 Μ спермидина
(«Sigma», США). После объединения всех компонентов содержимое
пробирок перемешивают на вортексе в течение 5 мин и центрифуги-
руют при 3000 об./мин в течение 1 мин. Супернатант сливают и к
осадкам добавляют по 140 мкл 70% этилового спирта. Содержимое
перемешивают, слегка встряхивая пробирки пальцем, до получе-
ния однородной суспензии. Центрифугируют при 3000 об./мин в те-
чение 1 мин. Супернатант сливают и добавляют 140 мкл 96% этило-
вого спирта, осторожно перемешивают осадок, центрифугируют не
более 15 с при 5000 об./мин. Вновь сливают супернатант, добавляют
100 мкл 96% этилового спирта и слегка перемешивают; на этом эта-
пе осадок быстро переходит в раствор. Перед выстрелами пробирки
с частицами вновь устанавливают на вортекс и перемешивают на
низкой скорости в течение 5 мин. Одна пробирка используется на
10 выстрелов (по 10 мкл или 0,2-0,3 мг частиц на выстрел).
Обстрел листьев
Как правило, всю работу проводят в чистой комнате, а пушку поме-
щают в ламинар-бокс для стерильных работ. Для каждого выстрела
необходимы разрывной диск 1100 p.s.i. (p.s.i. — от англ. pound per
square inch, т. е. фунт на кв. дюйм — 0,07 кг/см2), проходная мем-
брана (на которую наносят ДНК) и защитная сеточка (сдерживаю-
щая проходящую мембрану). Весь необходимый материал поставля-
ется вместе с пушкой или его можно заказать как отдельный набор в
фирме, производящей пушки. Перед применением все компоненты,
которые используются в процессе обстрела, необходимо стерилизо-
вать. Мембраны, разрывные диски, металлические сеточки, держа-
тели помещают в чашку Петри, наполненную этиловым спиртом, на
10-15 мин для стерилизации, затем подсушивают в ламинар-боксе
перед использованием. Все рабочие поверхности протирают 70%
спиртом. Подробный протокол по проведению выстрелов приводит-
ся в инструкции по применению пушки. Открытую чашку Петри с
листьями помещают в камеру пушки под заправленный патрон на
34 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.2.4. Хлоропластная трансформация — этапы селекции. (А) Разре-
зание листа табака после обстрела частицами. (Б) Первый этап селекции
после обстрела листьев. (В) Второй этап селекции: фрагменты листьев ре-
генерантов, выросших на селективной среде, повторно переносят на сре-
ду с антибиотиками. (Г) Укоренение и подращивание регенерантов перед
их высадкой в почву
среднюю полочку (рис. 1.2.3). После выстрела чашку с листьями за-
крывают и оставляют в климатической камере на 2 суток при темпе-
ратуре при 26 °С.
Селекция трансформантов
Через два дня после обстрела листья разрезают на фрагменты разме-
ром 1-1,5 см2 (рис. 1.2.4.А) и помещают на среду Μ (табл. 1.2.1)
с антибиотиком (или с другим селективным агентом) в нужной кон-
центрации. Через 5-6 недель на эксплантах появляются регенеран-
ты, устойчивые к антибиотику (рис. 1.2.4.Б). При этом устойчи-
вость может определяться двумя причинами: а) в пластидной ДНК
экспрессируется встроенная генетическая конструкция с геном
устойчивости к антибиотику; б) устойчивость явилась результатом
случайной мутации. Поэтому на этом этапе трансформанты тестиру-
ют молекулярными методами, такими как ПЦР (см. разделы 1.6 и
2.7), Саузерн-гибридизация (см. раздел 2.1) или гибридизация на
биочипах (см. раздел 2.2) на наличие вводимых генов. Если в качест-
ве маркерного гена используют ген aadA1, то проводят второй этап
селекции, но уже с двумя антибиотиками — спектиномицином и
стрептомицином по 500 мг/л каждого. Фрагменты листьев устойчи-
Ген aadA часто используют в качестве маркера при хлоропластной трансфор-
мации.
1
Раздел 1.2. Получение транспластомных растений табака
35
Рис. 1.2.5. Результаты Саузерн-гибридизации. Тотальная ДНК из лис-
тьев табака обработана рестриктазой EcoRI и гибридизирована с
ApaI/BamHI-фрагментом хлоропластного гена rrn16. (А) Дикий тип.
(Б) Гомопластомный набор трансформированных хлоропластов. (В) Гете-
ропластомный набор хлоропластов
вых к спектиномицину регенерантов переносят на среду с двумя ан-
тибиотиками, где истинно трансформированные клетки остаются
зелеными и продолжают расти, а случайные мутанты, как правило,
погибают (рис. 1.2.4.В). Листовые сегменты регенерантов, которые
предположительно содержат трансформированные хлоропласты,
вторично переносят на среду с селективным агентом, и уже после вто-
рого цикла селекции регенеранты переносят на среду Ρ (без гормонов)
(табл. 1.2.1) для образования корней и подращивания растений
(рис. 1.2.4.Г). Затем ТПР высаживают в почву для получения семян.
Молекулярный анализ наличия перенесенных генов
На разных этапах получения ТПР применяют молекулярно-биоло-
гические анализы для подтверждения наличия перенесенных генов
в пластоме растения. Для подтверждения трансформации после вто-
рого этапа селекции, как правило, используют метод ПЦР или Сау-
зерн-гибридизацию. Если ПЦР-анализ показывает только наличие
целевого гена в ДНК, то метод Саузерн-гибридизации позволяет
определить, помимо присутствия внедряемого гена, также неодно-
родность популяции пластидной ДНК в случае, когда в ТПР присут-
ствует комбинация трансформированных и ^трансформированных
хлоропластов (гетеропластомный набор, рис. 1.2.5).
Заключение
В настоящее время получение ТПР ограничено из-за применения до-
рогостоящего оборудования. Однако очевидные преимущества плас-
тидной трансформации растений побуждают исследователей к совер-
36 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
шенствованию методических подходов и расширению круга объектов
для этой трансформации. Важно подчеркнуть, что ТПР перспектив-
ны как для фундаментальной науки, так и особенно для коммерчес-
кой биотехнологии в связи с их более высокими продуктивностью и
биобезопасностью по сравнению с геномными трансформантами.
Литература
1. Даниленко Н. Г., Давыденко О. Г. Миры геномов органелл. Мн.:
Тэхналотя, 2003. 494 с. ISBN 985-458-077-6.
2. Boynton J. E., Gillham N. W., Harris Ε. Η., Hosier J. P.,
Johnson A. M.f Jones A. R., et al. Chloroplast transformation in
Chlamydomonas with high velocity microjectiles // Science. 1988.
V. 240(4858). P. 1534-1538.
3. Svab Z., Hajdukiewicz P., Maliga P. Stable transformation of
plastids in higher plants // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87(21).
P. 8526-30.
4. Golds Т., Maliga P., Koop H. U. Stable transformation in
PEG-treated protoplasts of Nicotiana tabacum // Biotechnology.
1993. V. 11. P. 95-97.
5. Daniell H., Kumar <S., Dufourmantel N. Breakthrough in chloroplast
genetic engineering of agronomically important crops // Trends
Biotechnol. 2005. V. 23(5). P. 238-45.
6. Kofer W., Eibl C, Steinmiiller K. and Koop H. U. PEG mediated
plastid transformation in higher plants // In vitro Cell Dev Biol —
Plant. 1998. V. 34. P. 303-309.
7. Maliga, P. Plastid transformation in higher plants. // Annu Rev
Plant Biol. 2004. V. 55. P. 289-313.
8. Meyers В., Zaltsman Α., Lacroix В., Kozlovsky S. V., Krichevsky A.
Nuclear and plastid genetic engineering of plants: Comparison of
opportunities and challenges // Biotechnology Advances. 2010.
V. 28. P. 747-756.
9. Lossl A. D., Waheed Μ. Τ. Chloroplast-derived vaccines against
human diseases: achievements, challenges and scopes // Plant
Biotechnology Journal. 2011. V. 9. P. 527-539.
10. Rogalski M., Carrer H. Engineering plastid fatty acid biosynthesis
to improve food quality and biofuel production in higher plants //
Plant Biotechnology Journal. 2011. V. 9. P. 554-564.
11. Wani S.H., Haider N., Kumar H., Singh N.B. Plant Plastid
Engineering // Current Genomics. 2010. V. 11. P. 500-512.
12. Wang H.H., Yin Wei-Bo, Ни Zan-Min. Advances in chloroplast
engineering // J. Genet. Genomics. 2009. V. 36. P. 387-398.
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 37
1.3. ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫЕ КОРНИ
КАК МОДЕЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ КОРНЕВОЙ СИСТЕМЫ
ЦЕЛОГО РАСТЕНИЯ
И. Н. Кузовкина, М. Ю. Вдовитченко
Введение
Существенная роль в успешном развитии современных исследова-
ний в области физиологии и биохимии растений принадлежит не
только постоянно совершенствующимся аналитическим методам,
но и модернизации приемов по созданию модельных систем, позво-
ляющих изучать детали сложных процессов, протекающих в интакт-
ном растении. Основным требованием к таким модельным систе-
мам, наряду с некоторым упрощением составных элементов, явля-
ется их максимальное соответствие событиям, которые происходят
в органах целого растения. К числу модельных систем, которые ак-
тивно использовались в физиологии и биохимии на протяжении
прошлого столетия, можно отнести культивирование в условиях in
vitro клеток, тканей и органов растений.
Особое место в этом наборе занимает метод культивирования
изолированно растущих корней растений, который начиная с сере-
дины 80-х годов прошлого столетия был обогащен использованием
целенаправленной генетической модификации растительных кле-
ток с помощью Agrobacterium rhizogenes. Это позволило получать
корневые культуры, которые способны к длительному росту в усло-
виях in vitro на безгормональных питательных средах. В основе дан-
ного приема лежит уникальный и чисто природный феномен, за-
ключающийся в развитии событий, которые происходят в результате
проникновения в поврежденный корневой или прикорневой участок
растения грамотрицательной почвенной бактерии Agrobacterium
rhizogenes. Попадая в поврежденную часть растения, бактерия всту-
пает в контакт с его клеткой и интегрирует в ее ядерный геном опре-
деленные фрагменты своей плазмидной Т-ДНК, что вызывает акти-
вацию неопластического роста в этой части растения. Пролифера-
ция клеток в данном случае проявляется в виде образования массы
быстро растущих и ветвящихся адвентивных корней, которые явля-
ются признаком заболевания, получившего название «синдром во-
лосатого корня» (от англ. «hairy root disease»). Отделение апикаль-
ных частей образующихся корней при условии соблюдения стериль-
ности позволяет получать хорошо растущую корневую культуру,
38 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
для поддержания роста которой не требуются экзогенные ростовые
вещества. Это связано с тем, что Т-ДНК Ri плазмиды (pRi), фрагмен-
ты которой интегрируются в ядерный геном растительной клетки,
состоит из двух частей — TL и TR, и в ее состав входят локусы rol ге-
нов А, В, С и D, которые локализованы в TL области. Встраивание
этих локусов pRi Т-ДНК в ядерный геном растительной клетки при-
водит к увеличению чувствительности ее ауксиновых рецепторных
белков, что существенно изменяет гормональный статус клетки и
обеспечивает независимость ее роста от экзогенно вводимых росто-
вых веществ. Результатом изменения гормонального состояния рас-
тительной клетки является проявление ее неопластического роста в
месте поранения и инфицирования растения почвенной бактерией.
Копирование в лабораторных условиях давно известного явле-
ния естественно происходящей в природе pRi Т-ДНК трансформа-
ции растений привело к появлению в середине 80-х годов прошлого
столетия метода культивирования генетически модифицированных
корней растений, который моментально был взят на вооружение
многочисленными исследователями в лабораториях различных
стран. В течение 25 лет, прошедших со времени первых публикаций
с использованием данного метода, были введены в культуру in vitro
корни более 140 видов растений, относящихся к 40 семействам. По
результатам этих работ опубликован ряд ценных статей и обзоров, в
которых можно найти разделы, посвященные истории появления
метода [1], механизму интеграции pRi Т-ДНК в растительный геном
[2], различным направлениям исследований с его использованием
[3-5], а также перспективам его практического применения [6-7].
Наиболее полная информация по этим разделам представлена в мо-
нографии под редакцией Doran [8].
Несколько слов о терминологии, которая применяется в русско-
язычных публикациях, посвященных данному методу. Произволь-
ный перевод понятия «hairy root disease», которое было взято за
основу термина «hairy root culture» в англоязычной литературе, в
отечественной печати привел к использованию таких выражений,
как «культура косматого корня» или «культура бородатого корня».
На самом деле корни, введенные в культуру in vitro в результате ге-
нетической трансформации с помощью pRi Т-ДНК, теряют свой пер-
воначальный «космато-волосатый» вид, характерный для проявле-
ния заболевания, называемого «hairy root disease». Они выглядят
как обычные быстро растущие первичные корни растений и отлича-
ются от них только нарушенным апикальным доминированием,
которое обусловливает их интенсивное ветвление. В дальнейшем в
данном разделе будет использовано более точное определение этого
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 39
метода, а именно «культура pRi трансформированных корней» или
«культура генетически трансформированных корней».
Характерной морфологической особенностью введенных в куль-
туру генетически трансформированных корней, помимо их быстро-
го роста на питательных средах без гормонов, является утрата гео-
тропической ориентации корней и проявление у них плагиотропно-
го роста. Параллельно с этим корни сохраняют в условиях in vitro
генетическую стабильность и способность к синтезу корнеспецифич-
ных для данного растения вторичных метаболитов, что кардиналь-
но отличает их от культуры не дифференцированно растущих кле-
ток и тканей. Биохимическим (маркерным) признаком культуры
pRi трансформированных корней служит их способность к образо-
ванию опинов — маннопина или агропина, что обусловлено встраи-
ванием в ядерный геном растения определенных фрагментов ДНК,
расположенных в TR области плазмидной Т-ДНК почвенной бакте-
рии, обеспечивающей таким образом поддержание условий для сво-
его питания.
Следует отметить, что вирулентность почвенной бактерии не
проявляется в природных условиях у однодольных растений, а так-
же у ряда двудольных растений, относящихся к некоторым семей-
ствам (например, Brassicaceae, Papaveraceae). В связи с этим для
проведения в лабораторных условиях генетической трансформации
растений, устойчивых к Agrobacterium rhizogenes, следует исполь-
зовать иные, более сложные способы введения pRi Т-ДНК в расти-
тельные клетки, информация о которых в данном разделе отсут-
ствует.
Протокол проведения
генетической трансформации растений
с помощью pRi Τ- ДН К Agrobacterium rhizogenes
(см. приложение)
Растительный материал
Для проведения генетической трансформации растений и последую-
щего получения аксенично растущей культуры корней используют
чаще всего стерильно выращенные в пробирках проростки расте-
ний. Сложнее проводить трансформацию с нестерильными растени-
ями, так как предварительная обработка частей растений стерили-
зующими агентами не всегда бывает удачной, что может вызвать
или проявление нежелательной инфекции (контаминации), или по-
вреждение растительных эксплантов в результате их стерилизации.
Исключение составляют запасающие органы растений (например,
корнеплоды моркови, свеклы), которые переносят достаточно жест-
кие условия предварительной стерилизации, после чего их нареза-
40 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
ют на сегменты, удаляя предварительно поверхностную часть мя-
систого корнеплода. Наиболее удобными частями целых растений
для проведения трансформации являются семядоли и гипокотили
проростков. Листовые пластинки первых настоящих листьев ис-
пользуются в том случае, если они имеют выраженное жилкование.
Часто для проведения трансформации берут черешки листьев. Под-'
готовку растительных фрагментов (эксплантов) к трансформации,
как и все последующие операции, проводят в стерильном боксе (ла-
минаре), соблюдая при этом обычные правила асептически проводи-
мой работы.
Проростки растений извлекают из пробирок, удаляют корни и
подготавливают для работы наиболее хорошо сформированные части
ювенильных растений. Отделение семядолей, листьев с черешками
и гипокотилей проводят острыми скальпелями или бритвенными
лезвиями, используя в качестве подложки основание чашек Петри
или специально подготовленные для работы «матрасики», состоя-
щие из нескольких слоев бумаги Крафт. Отделенные части гипоко-
тиля и листовых черешков нарезают на 1-2 см сегменты, листовые
пластинки в случае крупных первых листьев разрезают на несколь-
ко частей, осторожно накалывая при этом острой иглой участки вы-
раженного жилкования. Аналогично накалывают сегменты гипоко-
тилей и семядоли, которые разрезают пополам, если они достаточно
крупные. Для поранения наиболее нежных растительных эксплан-
тов удобны тонкие иглы аптечных инсулиновых шприцев, которые
не требуют дополнительной стерилизации. Подготовку раститель-
ного материала проводят быстро, стараясь не допускать его обезво-
живания.
Корни, отделенные от проростков, могут быть в дальнейшем ис-
пользованы в качестве контроля при проведении биохимических
анализов введенных в культуру in vitro генетически трансформиро-
ванных корней (электрофоретического определения опинов и ана-
лиза содержания в корнях вторичных метаболитов). Поэтому реко-
мендуется их высушить путем лиофилизации или в термостате при
температуре 60-65 °С, после чего сохранить до проведения анали-
зов в эксикаторе при комнатной температуре.
Подготовка бактерий
Для обработки растительных эксплантов служат дикие штаммы
Agrobacterium rhizogenes (A 4, 15834, R-1000, 8196, 9402) или нес-
колько видоизмененные дикие штаммы со встроенными в их Т-ДНК
маркерными генами устойчивости к ряду антибиотиков (А-4 в,
R-1601). Штаммы почвенных бактерий желательно получать в тех
лабораториях, где они поддерживаются в надежных условиях. Бак-
терии выбранного для проведения работы штамма высаживают на
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 41
агаризованную питательную среду YEB [9] и выращивают в течение
24-48 ч при температуре 26-30 °С в темноте.
Следует учитывать, что привлечение к проведению генетичес-
кой трансформации растений модифицированных конструкций, со-
зданных на основе pRi Т-ДНК, но несущих гены бактериального или
иного происхождения, может вызвать в дальнейшем серьезные ослож-
нения в том случае, если в итоге планируется практическое исполь-
зование полученной культуры корней. Поэтому в данном разделе
излагается последовательность проведения генетической трансфор-
мации растений с помощью именно диких штаммов агробактерий с
целью получения хорошо растущих корней лекарственных расте-
ний, которые далее могут быть использованы в качестве альтерна-
тивного лекарственного сырья в медицинской и пищевой промыш-
ленности.
Способы проведения трансформации
Возможна непосредственная инокуляции стерильных проростков,
без извлечения их из пробирок, если в арсенале лаборатории имеются
удобные для такой работы стоматологические инструменты. В этом
случае проводится легкое повреждение гипокотиля тонкой изогну-
той иглой, после чего место повреждения смазывается пастообраз-
ной массой подготовленных агробактерий, извлеченных бактери-
альной петлей из чашки Петри. Пробирка с обработанным таким пу-
тем растением помещается в термостатированные условия (24-26 °С),
где имеется освещение.
Второй, более часто используемый способ, состоит в кокульти-
вировании подготовленных растительных эксплантов с разбавлен-
ной в питательной среде Мурасиге—Скуга (МС) суспензией бакте-
рий [10]. С этой целью растительные экспланты помещают в колбу
Эрленмейра емкостью 100 мл, содержащую 30 мл среды МС, после
чего в нее добавляют небольшое количество суспензии бактерий,
разбавленной средой МС. Перевод бактерий в жидкую среду прово-
дят таким способом: в чашку Петри, в которой были выращены в те-
чение 48 ч бактерии, наливают небольшое количество среды МС,
взмучивают бактерии с помощью стерильной стеклянной палочки и
полученную густую суспензию бактерий осторожно переносят в пус-
тую колбу Эрленмейера, разбавляют ее средой МС и перемешивают.
Через 15-20 мин, когда основная часть бактериальной слизи осядет
на дно колбы, небольшое количество надосадочной суспензии бакте-
рий наливают в колбу со средой МС, содержащую подготовленные
растительные экспланты. Концентрация бактерий при проведении
инокуляции не должна быть большой. Рекомендуется вносить в
колбу с эксплантами такое количество суспензии, чтобы была за-
42 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
метна лишь легкая опалесценция питательной среды. После этого
колба с растительными эксплантами и суспензией бактерий поме-
щается для их кокультивирования на качалку (90 об./мин) в тер-
мостатированные условия (24-26 °С) без освещения на 18-20 ч.
В том случае, если кокультивирование бактерий и раститель^-
ных эксплантов не приводит к желательным результатам, возмож-
но кратковременное использование ультразвука (сонификация на
ультразвуковой бане) для лучшего проникновения бактерий в ткани
растительного объекта. Иногда для повышения результативности
прохождения генетической трансформации рекомендуется добав-
лять в жидкую питательную среду, в которой проводится кокульти-
вирование бактерий и растительных фрагментов, ацетосирингон в
концентрации 20-50 мкМ, что приводит к активации Vir области
Ri-плазмиды и таким образом обеспечивает перенос рШ Т-ДНК в
клетки поврежденных растительных эксплантов. По окончании ко-
культивирования растительных эксплантов с бактериями содер-
жимое колб фильтруют через бумажный фильтр, помещенный в
стеклянную воронку, которая вставлена в колбу емкостью 250 мл,
и отделяют растительные экспланты от питательной среды, содер-
жащей избыток бактерий. Затем растительные экспланты, находя-
щиеся на фильтре, тщательно промывают питательной средой МС,
удаляя таким путем бактерии с их поверхности. Промытые расти-
тельные экспланты переносят в чашки Петри с безгормональной
агаризованной питательной средой МС, содержащей антибиотик
клафоран в концентрации 500 мг/л для элиминирования почвенной
агробактерии. Растительные экспланты следует размещать в чаш-
ках Петри не слишком плотно, чтобы была сохранена возможность
свободного манипулирования с отдельными объектами. Чашки Пет-
ри с проинокулированными эксплантами помещают в кондициони-
рованное помещение (26 °С) с освещением, снижая его интенсив-
ность за счет прикрытия чашек Петри двойным слоем марли (в связи
со светочувствительностью клафорана). При ежедневном контроле
инокулированного растительного материала выявляют и удаляют
чашки Петри с дефектами проведенной работы (контаминация экс-
плантов или среды, нежелательная активация роста не полностью
элиминированных агробактерии, сильное потемнение эксплантов
и т. д.). Кроме того, своевременно отмечают растительные эксплан-
ты с проявлением ризогенеза или с признаками каллусообразова-
ния, который часто предшествует формированию корней. Изменения
в состоянии растительных эксплантов удобно фиксировать с по-
мощью сканирования чашек Петри, что позволяет получать доста-
точно качественные фотографии при двукратном увеличении выде-
ленного объекта.
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 43
Рис. 1.3.1. Ризогенез, индуцированный почвенной агробактерией, на стебле
ювенильного растения Peganum harmala
Рис. 1.3.2. Ризогенез на фрагментах листьев Leuzea carthamoides после
их кокультивирования с почвенной агробактерией
Для проявления признаков ризогенеза, индуцируемого почвен-
ной бактерией, требуется от 2 до 4 недель. Корни, образующиеся в
месте поранения растительных эксплантов, растут обычно беспоря-
дочно, образуя как на стеблях и гипокотилях проростков, так и на
фрагментах листовых пластинок своеобразную ризогенную компо-
зицию (рис. 1.3.1 и 1.3.2). Клафоран в концентрации 500 мг/л сильно
ингибирует рост образующихся корней, однако признаки ризогене-
за проявляются достаточно четко. Первое отделение образовавшихся
корней проводят иногда с сохранением части исходных эксплантов.
44 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.3.3. Первичная культура трансформированных корней Altheae
officinalis после полного элиминирования бактерий
В любом случае образовавшиеся корни — корневые инокуляты —
при первом пассаже помещают снова на агаризованную безгормо-
нальную среду МС, содержащую уменьшенную в 2 раза дозу клафо-
рана (250 мг/л), чтобы добиться полного элиминирования агробак-
терии. В ряде случаев для достижения полной стерильности образо-
вавшихся корней может потребоваться их дополнительный перенос
на среду со 125 мг/л клафорана.
Следует отметить, что интеграция Т-ДНК почвенной бактерии в
геном растительных клеток носит случайный характер и при этом
происходит генетическая трансформация одной растительной клетки.
В результате корни, отделенные от каждого из инокулятов, дают на-
чало определенной линии pRi трансформированных корней [11].
Наблюдения за интенсивностью роста корней, появившихся на раз-
личных эксплантах, позволяют отбирать наиболее интенсивно рас-
тущие линии корневой культуры для их последующего культивиро-
вания (рис. 1.3.3).
После 2-3 пассажей на агаризованной среде экспланты полу-
ченных корней переводят в жидкую питательную среду, не содер-
жащую гормонов, и выращивают их в колбах на качалке (90 об./мин),
В течение первого пассажа рекомендуется использовать неболь-
шие объемы жидкой питательной среды для обеспечения хорошей
аэрации корневых инокулятов при качании. В дальнейшем, после
адаптации корней к росту в погруженных условиях, объем пита-
тельной среды можно увеличить до 30-50 мл в зависимости от объ-
ема используемых при культивировании колб и интенсивности
роста корней. Полученные хорошо растущие корневые культуры
нуждаются в регулярных пересадках, которые проводят каждые
4 недели (рис. 1.3.4).
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 45
Рис. 1.3.4. Трехнедельные корни Rauwolfia serpentina при культивиро-
вании в жидкой питательной среде
Опыт работы с генетически трансформированными корнями пока-
зал, что для обеспечения оптимального роста корней каждого вида
растений следует подбирать определенную питательную среду из
числа наиболее часто используемых, как то среда Мурасиге—Скуга
(МС), среда Гамборга (В 5) или среда Стрита (S) [10, 12-13]. Для сре-
ды МС характерно высокое содержание азота, причем именно в ам-
миачном виде, что часто приводит к проявлению каллусоподобного
роста у полученных корней. Двукратное снижение в этой среде содер-
жания азота (аммиачного и нитратного) способствует сохранению
обычной структуры полученных корней, которые по своим морфо-
логическим признакам практически мало отличаются от молодых
корней ювенильного растения (рис. 1.3.4). Среда В 5 оптимальна
для поддержания стабильного роста хорошо сформированных гене-
тически трансформированных корней разных видов растений, и кон-
центрация азота в ней примерно такая же, как в среде МС с умень-
шенным вдвое содержанием азота. В ряде случаев бывает полезно
использовать самую обедненную азотом питательную среду С, что
устанавливают опытным путем.
Об интенсивности роста введенных в культуру in vitro корней
судят по измерению их ростового индекса (РИ), который представ-
ляет собой отношение конечного веса свежих корней к их исходно-
му весу. Время удвоения стабильно растущих в культуре генетичес-
ки трансформированных корней составляет 24-48 ч, а РИ для ряда
культур достигает 80 за период их 4-недельного культивирования
(рис. 1.3.5). Иногда при интенсивном росте полученной корневой
культуры наблюдается быстрое поглощение питательной среды, и в
этом случае целесообразно добавить свежую среду в культуральную
колбу. За степенью поглощения растущими корнями минеральных
компонентов из питательной среды в течение пассажа можно еле-
46 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.3.5. Четырехнедельные корни Peganum harmala, растущие в жид-
кой питательной среде
Рис. 1.3.6. Плагиотропный рост корней Cucumis sativus, растущих в
условиях погруженной культуры
дить по изменению ее электропроводности. Измерение этого пара-
метра позволяет установить период критического снижения обеспе-
ченности корней питательными компонентами, когда целесообраз-
но добавление свежей порции питательной среды.
Введенные в культуру in vitro корни обладают рядом морфоло-
гических признаков, которые уже визуально свидетельствуют о том,
что они являются генетически трансформированными. Помимо того,
что корни хорошо растут и интенсивно ветвятся на питательной среде
без гормонов, их рост является плагиотропным, что особенно заметно
при их культивировании в жидкой питательной среде (рис. 1.3.6).
Для подтверждения генетической природы их происхождения ис-
пользуется определение биохимических показателей онкогенного
роста корней, простейшим из которых можно считать определение
содержания в них опинов (маннопина и агропина). Метод определе-
ния опинов в корнях, полученных в результате проведения генети-
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 47
ческой трансформации, является косвенным доказательством ее ре-
зультативности. Для его проведения требуется наличие, помимо не-
большого количества полученных при трансформации корней, также
контрольного материала — корней проростков и стандартов опи-
нов — маннопина и агропина. Техника проведения определения
опинов описана в работе Petit et al. [14]. Отмечено, что при продол-
жительном культивировании pRi-трансформированных корней их
способность к образованию опинов снижается, и в ряде случаев они
могут прекратить их синтезировать [4, 7], поэтому при необходимости
точного доказательства генетической модификации корневой куль-
туры следует использовать прямые методы анализа ДНК — ПЦР
или Саузерн-блот гибридизацию.
В связи с тем что генетически трансформированные корни при
длительном культивировании сохраняют генетическую стабиль-
ность и обусловленную этим способность к синтезу корнеспецифич-
ных для данного вида растения вторичных метаболитов, они пред-
ставляют большой практический интерес как источники получения
экологически чистого лекарственного сырья нового типа и, следова-
тельно, ценных физиологически активных соединений. Разработа-
на определенная стратегия оптимизации роста корней в условиях in
vitro, интенсивность которого является составляющей продуктив-
ности культивирования корней. Помимо первоначальной селекции
линий наиболее активно растущих корней, к числу способов опти-
мизации роста каждой перспективной корневой культуры относятся
такие факторы, как подбор состава компонентов питательной сре-
ды, вариации соотношения веса инокулюма и объема питательной
среды, а также условий аэрации корневой культуры [4]. При полу-
чении большой массы корней, выращиваемых в колбах, положи-
тельно зарекомендовал себя способ пролонгированного культивиро-
вания корней, который заключается в предварительном выращива-
нии инокулята в колбах малого объема (100 мл) и в последующем
переносе подросших корней в колбы большего объема. По мере роста
перенесенного корневого экспланта проводится добавление свежей
питательной среды, что в итоге способствует существенному увеличе-
нию РИ корневой культуры (до 100). Второй составляющей продук-
тивности корневой культуры является концентрация образующих-
ся в ней вторичных метаболитов. К факторам, которые могут быть
использованы для увеличения содержания в корневой культуре вто-
ричных веществ, относятся увеличение содержания в питательной
среде основного энергетического источника углерода — сахарозы,
экзогенное введение предшественников биосинтеза конечных про-
дуктов, элиситация корневых культур, а также введение в пита-
тельную среду абсорбентов, способных поглощать экскретируемые в
нее вторичные метаболиты. Некоторые из этих факторов (напри-
48 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
мер, элиситация) могут снижать ростовую активность, поэтому це-
лесообразно двухступенчатое воздействие на корневую культуру:
сначала — увеличение ростовой активности, затем в фазе стацио-
нарного роста корневой культуры — индукция образования в ней
вторичных метаболитов.
Ввиду того что введение в культуру in vitro генетически транс-
формированных корней является длительной и трудоемкой рабо-
той и последующее поддержание каждой культуры, особенно в слу-
чае перспективности ее практического использования, также требу-
ет определенных затрат, целесообразно рассмотрение способов ее
сохранения. Как показала практика, криосохранение в данном слу-
чае затруднено в связи с повышенной чувствительностью корневых
апексов к обезвоживанию. К способам сохранения корневых куль-
тур можно отнести приемы, снижающие активность роста культур,
например перевод корней в чашки Петри на агаризованную пита-
тельную среду и их сохранение при пониженной положительной
температуре, при которой апикальная меристема корней сохраняет
свою жизнеспособность (10-18 °С). Второй способ — это сохранение
корневых инокулятов в виде так называемых «искусственных се-
мян», полученных путем капсулирования корневых сегментов раз-
мером в 2-3 мм в альгинате натрия с последующим замещением нат-
рия на кальций, приводящим к образованию мембранной оболочки;
и дальнейший перевод искусственных семян в условия низкой поло-
жительной температуры (4 °С). Опыт работы с искусственными се-
менами показал, что они могут быть полезны не только для сохране-
ния наиболее ценных корневых культур и сокращения частоты их
пересадок, но и для индукции стеблевого органогенеза генетически
трансформированных корней, а также для оздоровления корневых
культур и элиминирования из них бактериальной инфекции [15].
Таким образом, метод получения генетически трансформиро-
ванных корней обеспечил создание новой модельной системы —
культивируемых в условиях in vitro корней растений, которая поя-
вилась недавно по сравнению с давно существующей моделью —
культурой недифференцированных клеток и тканей растений. Стре-
мительное развитие нового метода, совпавшее по времени с успеха-
ми в области совершенствования современных методов молекуляр-
ной биологии и генетики растений, существенно расширило области
его использования в фундаментальных и прикладных исследованиях
и тем самым внесло много нового в развитие и применение общего
метода — культивирования в условиях in vitro растительных кле-
ток, тканей и органов.
Возможности метода культивирования генетически трансфор-
мированных корней не ограничиваются реальной перспективой его
практического использования для биотехнологического получения
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 49
альтернативного и экологически чистого лекарственного сырья.
Метод оказался намного шире и продемонстрировал свою результа-
тивность при проведении других прикладных и фундаментальных
исследований. Так, культивируемые in vitro корни растений нашли
свое применение при изучении механизмов установления контакта
корней и арбускулярно-микоризных (AM) грибов и процессов, кото-
рые активируются в корневых тканях при функционировании ми-
коризы. Опыт работы с этой двойной системой показал возможность
использования генетически трансформированных корней для под-
держания в стерильных условиях нормального цикла развития AM
грибов, что может обеспечить не только получение большого коли-
чества спор грибов, но и длительное сохранение аксеничных иноку-
лятов AM грибов.
Культивируемые в условиях in vitro корни ряда растений успешно
используются при исследовании механизмов, обусловливающих
установление контактов корней с другими представителями ризо-
сферы, в том числе с азотофиксирующими бактериями и нематода-
ми. Недавно метод был дополнен новым приемом получения так на-
зываемых «композитных» растений, у которых корневая система
является полностью или частично генетически трансформированной,
в то время как надземная часть остается немодифицированнои. Такие
растения, которые способны расти также в условиях ex vitro, исполь-
зуются в настоящее время для исследования механизмов экспрессии
генов в азотофиксирующих и эндомикоризных ассоциациях [16].
Проявление стеблевого органогенеза в культивируемых генети-
чески трансформированных корнях ряда растений, активируемое
только Ri плазмидой Agrobacterium rhizogenes, нашло свое приме-
нение также при микроклональном размножении редких видов рас-
тений [17].
Интенсивно ветвящиеся генетически трансформированные кор-
ни, образующие большое количество корневых апексов, оказались
удобным объектом для изучения функции так называемых погра-
ничных клеток, которые представляют собой клетки корневого чех-
лика, отделяющиеся от кончика корня во время его роста. Они пер-
выми вступают в непосредственный контакт с различными предста-
вителями ризосферы и играют существенную роль в образовании
специфичного для каждого растения почвенного гомеостаза, кото-
рый также предопределяет и аллелопатические взаимоотношения
растений.
Диапазон точек приложения метода культивирования генети-
чески трансформированных корней в физиологических и биохими-
ческих исследованиях расширяется с каждым годом. Это происхо-
дит благодаря использованию при проведении направленной модифи-
кации растительных клеток рекомбинантными Т-ДНК, содержащими
50 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
определенные векторные фрагменты pRi Т-ДНК Agrobacterium
rhizogenes [7, 16].
У метода получения и культивирования генетически трансфор-
мированных корней имеются определенные недостатки. К ним сле-
дует отнести сложность проведения генетической трансформации
однодольных растений и получения от них корневых культур. Вто-
рой недостаток состоит в невозможности активации у введенных в
культуру корней вторичного роста за счет их утолщения, как это
происходит у корней нативных растений. Корни основной массы
растений, у которых биосинтез ценных вторичных метаболитов
корнеспецифичен, накапливают их в тканях, формирующихся при
проявлении в корнях камбиальной активности, обеспечивающей их
утолщение. Культивируемые in vitro корневые культуры лишены
вторичного утолщения, но они с успехом компенсируют этот недоста-
ток за счет своего активного круглогодичного роста и интенсивного
ветвления при выращивании на простых питательных средах, не со-
держащих ростовые гормоны. Кроме того, не имея возможности ак-
кумулировать в своих клетках вторичные метаболиты в больших
количествах, культивируемые in vitro корни ряда растений экскре-
тируют их в питательную среду, что позволяет их абсорбировать на
различных ионообменных смолах.
Заключение
Генетическая стабильность культивируемых в безгормональной пи-
тательной среде генетически трансформированных корней и сохра-
нение в них способности к образованию характерных для данного
растения вторичных метаболитов на уровне, сопоставимом с их кон-
центрацией в корнях целого растения, представляют большой прак-
тический интерес для биотехнологического производства физиоло-
гически активных низкомолекулярных соединений, необходимых
для медицинской и пищевой промышленности. Одновременно с этим
метод открывает большие возможности для исследования механиз-
мов взаимодействия растущих в контролируемых условиях корней
растений с представителями ризосферы (AM грибами, нематодами и
другими организмами) и изучения их вклада в формировании опре-
деленного почвенного гомеостаза, создаваемого корневой системой
растений.
Литература
1. Chilton M.D., Tepfer D.A., Petit Α., Casse-Delbart F., Tempi J.
Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the
host plant root cells // Nature. 1982. V.295. P. 432-434.
Раздел 1.3. Трансформированные корни как модельная система 51^
2. TepferD. Genetic transformation using Agrobacterium rhizogenes //
Physiol. Plant. 1990. V. 79. P. 140-146.
3. Giri Α., Narasu M. L. Transgenic hairy roots: recent trend and
applications // Biotechnology Advances 2000. V. 18. P. 1-22.
4. Sevon N., Oksman-Caldentey K.-M. Agrobacterium rhizogenes-
mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids //
Planta Med. 2002. V. 68. P. 859-868.
5. Kuzovkina I. N., Schneider B. Genetically transformed root
cultures — generation, properties and application in plant
sciences // Progress in Botany / Eds. Esser K., Liittge U.,
Beyschlag W., Murata. Sprinder-Verlag. 2006. V. 67. P. 275-314.
6. Guillon S., Tremouillaux-Guiller J., Kumar P.P., Rideau M.,
Gantet P. Harnessing the potential of hairy roots: dawn of a new
era // Trends in Biotechnology. 2006. V. 24. P. 403-409.
7. Georgiev M. I., Pavlov A. I., Bley Th. Hairy root type plant in vitro
system as sources of bioactive substances // Appl. Microbiol.
Biotechnol. V. 74. P. 1175-1185.
8. Doran P. M. (ed). Hairy roots: culture and applications // Harwood
Academic Publishers, Amsterdam. 1997. 239 p.
9. Chee P. P. & Slightom J. L. Transformation of soybean via
Agrobcterium tumefaciens and analysis of transformed plants //
Methods in Molecular Biology. V. 44. Agrobacterium Protocols /
Eds. Gartland Κ. Μ. Α., Davey M. R. Totowa: Humana Press Inc.,
1995. P. 91.
10. Murashige T. & Skoog F. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962.
V. 15. P. 473-497.
11. Aird E.H., Hamill J.D., Rhodes M.J.С Cytogenetic analysis of
hairy root cultures from a number of plant species transformed
with Agrobacterium rhizogenes // Plant Cell Tiss. Org. 1988. V. 15.
P. 47-57.
12. Gamborg O.L., Miller R., Ojima K. Nutrient requirements of
suspension cultures of soybean root cell // Exp. Cell Res. 1968.
V. 50. P. 151-158.
13. Street H. E. Growing roots without plants // Discovery. 1954. V. 15.
P. 286-292.
14. Petit Α., David C, Dahl D.A., Ellis J.G., Guyon P.,
Casse-Delbart F., Tempo, J. Further extension of the opine concept:
plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine
degradation // Mol. Gen. Genet. 1983. V. 190. P. 204-214.
52 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
15. Вдовитченко М. Ю., Кузовкина И. Н. «Искусственные семена»
как способ сохранения и оздоровления культивируемых in vitro
корней лекарственных растений // Физиология растений. 2011.
(в печати).
16. Veena V., Taylor Ch. G. Agrobacterium rhizogenes: recent
development and promising applications // In Vitro Cell.Dev.
Biol.-Plant. 2007. V. 43. P. 383-403.
17. Christey M. C. Use of Ri-mediated transformation for production
of transgenic plants // In Vitro Cell Dev.Biol.-Plant. 2001. V. 37.
P. 687-700.
Приложение
Что требуется для проведения
pRi Т-ДНК генетической трансформации растений:
• стерильный растительный материал (стерильные проростки)
и определенный штамм почвенных бактерий;
• острые ланцеты, длинные пинцеты с тонкими концами, стек-
лянные палочки с оплавленными концами, бактериальные
петли;
• чашки Петри или «матрасики» из бумаги Крафт для подготов-
ки и нарезания растительных инокулятов;
• острые иглы различного назначения или иглы аптечных инсу-
линовых шприцев одноразового использования;
• колбы Эрленмейера емкостью 100 мл для разбавления бакте-
рий и для совместного культивирования растительных фраг-
ментов с бактериями;
• устройство для промывания корневых инокулятов после их
культивирования с бактериями;
• конические колбы емкостью 250 мл со стеклянными воронка-
ми, в которые помещены неплотные бумажные фильтры, за-
крытые сверху фольгой;
• жидкая питательная среда МС для подготовки бактерий, их
кокультивирования с растительными инокулятами и их после-
дующего отмывания от избытка бактерий;
• антибиотик цефотаксим или клафоран (Claforan), 1 г которого
растворяют в 5 мл стерильной воды, после чего раствор разли-
вают в пробирки Эппендорфа и сохраняют при температуре
минус 18-20 °С;
• агаризованная среда МС, в которую после автоклавирования и
частичного остывания добавляют определенное количество
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
53
водного раствора клафорана, соответствующее конечной кон-
центрации антибиотика (125-500 мг/л);
• колбы различного объема для культивирования корней;
• качалка (до 90 об./мин) для инкубации растительных иноку-
лятов с бактериями и культивирования генетически транс-
формированных корней в жидкой питательной среде;
• кондуктометр и рН-метр для контроля за параметрами жид-
кой питательной среды.
1.4. ПРИМЕНЕНИЕ КОНСТРУКЦИЙ ДНК
С РЕПОРТЕРНЫМИ ГЕНАМИ
В ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ
Г. А. Романов
Введение
Репортерные гены кодируют белки нерастительного происхожде-
ния, наличие или активность которых (т. е. белков) относительно
легко и удобно тестировать в растительных тканях и клетках [1]. В
настоящее время репортерные гены представляют собой уникаль-
ный молекулярный инструмент для анализа разнообразных сторон
генной экспрессии у растений. Идеальный репортерный ген должен
быть нейтрален для растения, в котором экспрессируется. Иными
словами, его присутствие и активность не должны сказываться ни
на физиологии, ни на биохимии растительного организма. При этом
кодируемые репортерными генами белки должны давать возмож-
ность несложного, быстрого и чувствительного тестирования, в том
числе при массовом анализе растений. Для этого необходимо отсут-
ствие у растений собственной аналогичной активности, которая
иначе создавала бы фон, затрудняющий выявление экспрессии ре-
портерного гена. Очень желательно, чтобы обнаружение продукта
репортерного гена было минимально деструктивным для растения,
в идеале давая возможность прижизненных измерений. Важным
качеством для репортерных белков является сохранность их актив-
ности при соединении с другими белками, что существенно расши-
ряет спектр их возможных применений.
За последние годы было предложено лишь небольшое число ге-
нов, в той или иной степени отвечающих вышеперечисленным кри-
териям. Для растений в качестве репортерных были использованы
агробактериальные гены октопинсинтетазы (OCS) и нопалинсинте-
тазы (NOS); бактериальные гены β-глюкуронидазы (GUS), β-галак-
тозидазы (LacZ) и хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT); ген
54 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
люциферазы (LUC) светлячка и большое семейство генов природ-
ных и искусственных флуоресцентных белков, родоначальником
которых был ген GFP из люминесцирующей медузы Aequorea
victoria. В настоящее время из этого арсенала чаще других применяют
гены GUS и GFP (включая аналоги); гены LUC и CAT используют в
меньшей степени. Российскими учеными предложена интересная
репортерная система, основанная на использовании гена лихеназы
(LicB) из термофильной бактерии Clostridium thermocellum [2].
Принцип метода
Методология применения репортерных генов основана на создании
трансгенных растений, экспрессирующих чужеродный белок. Поэ-
тому необходима процедура трансформации растения. Для этого со-
здается трансформирующий вектор, содержащий репортерный ген,
экспрессируемый под тем или иным промотором, активным в расти-
тельной клетке. В зависимости от цели работы конструкция транс-
формирующего вектора может быть различной. Для доказательства
встраивания чужеродной ДНК в растительный геном репортерный
ген достаточно поставить под конститутивный промотор типа 35S
CaMV. Однако желательно при этом снабдить ген интроном, чтобы
исключить экспрессию репортера в клетках бактерий (при агробак-
териальной трансформации).
Однако область применения репортерных генов шире, чем прос-
то контроль трансгеноза. Другое и, очевидно, более важное назначе-
ние репортерных генов состоит в том, чтобы выявлять (по возмож-
ности количественно) временные и пространственные особенности
экспрессии изучаемого гена, будь то собственного или чужеродного.
В зависимости от конкретных задач исследования репортерный ген
в виде белок-кодирующей (экзонной) последовательности ДНК мо-
жет замещать собой в создаваемой конструкции ту или иную об-
ласть целевого гена. Присоединение репортерного гена к одной
лишь промоторной области позволяет исследовать в «чистом виде»
ее роль в регуляции экспрессии изучаемого гена на уровне транс-
крипции. Замена белок-кодирующей области гена на репортерную
при сохранении участка, кодирующего 5'-концевую нетранслируе-
мую последовательность мРНК, позволяет оценить роль этой после-
довательности в процессах транспорта мРНК из ядра в цитоплазму и
инициации трансляции. Дальнейшее отступление в З'-направлении
рамки считывания воспроизводит также 5'-концевую область ис-
ходного белка, которая нередко содержит так называемые лидер-
ные последовательности, важные для окончательной локализации
белка в том или ином компартменте клетки. Это дает возможность
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
55
отслеживать внутриклеточный транспорт изучаемого полипептида.
И наконец, соединение обеих белок-кодирующих областей исследу-
емого и репортерного генов позволяет в ряде случаев непосредствен-
но выявлять локализацию и количество активного белка в клетке,
его взаимодействие с другими компонентами: полипептидами, нук-
леиновыми кислотами, мембранами и т. д. Инсерция белок-кодиру-
ющей (экзонной) области гена без промотора позволяет выявлять
эндогенные промоторы (от англ. promoter tagging) и определять их
специфичность in planta.
После успешной трансформации следующим этапом является
выведение трансгенных линий, стабильно экспрессирующих вве-
денную конструкцию ДНК с репортерным геном. Для этого обычно
отбирают гомозиготные линии, не подверженные или слабо подвер-
женные сайленсингу (замолканию) трансгена. Однако возможен и
вариант с транзиентной (временной) экспрессией конструкции ДНК,
для чего чаще всего используют введение вектора с помощью ин-
фильтрации листьев агробактериями. Результаты транзиентной экс-
прессии можно наблюдать уже через 3-5 дней после инфильтрации.
Последний этап методологии — это тестирование активности ре-
портерного белка. Способы такого тестирования могут быть самыми
разнообразными в зависимости от типа репортера и поставленной
задачи: определение может быть как количественным в клеточных
экстрактах, так и качественным при гистохимическом или флуорес-
центном окрашивании тканей. Здесь мы познакомимся с методами
тестирования экспрессии двух наиболее популярных репортерных
генов: GUS и GFP (EGFP).
Ген GUS
Используемый в настоящее время как репортерный ген GUS являет-
ся модифицированным геном из Escherichia coli (прежнее назва-
ние — uidA), кодирующим β-глюкуронидазу с мол. м. 68,2 кД. Из
природного белка путем точечного мутагенеза были удалены два
сайта потенциального N-гликозилирования, внутриклеточная мо-
дификация которых могла снижать активность фермента. GUS ак-
тивен в виде гомотетрамерного белка в широком диапазоне условий
среды с оптимумом при рН 5-8 и 37 °С. Фермент достаточно стаби-
лен: он устойчив к нагреванию (время полужизни при 55 °С состав-
ляет около 2 ч) и к действию детергентов. Он может гидролизовать
обширный спектр природных и синтетических глюкуронидов, что
позволяет подбирать соответствующие субстраты для спектрофото-
метрического или флуориметрического определения активности
фермента, а также для гистохимического окрашивания тканей in
situ [1-4]. Все эти субстраты содержат D-глюкопиранозид-уроновую
56 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
кислоту, соединенную гликозидной связью с хромогенной или флуо-
рогенной молекулой. Качества этой молекулы проявляются только
при отщеплении остатка глюкуроновой кислоты, которое происхо-
дит при специфическом воздействии GUS.
Методика выявления активности GUS.
А) Количественное определение в клеточных экстрактах
Флуориметрическое определение активности GUS основано на реак-
ции отщепления остатка глюкуроной кислоты от 4-метилумбелли-
ферил-в-О-глюкуронида (4-MTJG) (рис. 1.4.1):
4-MUG + H2O Gus > 4-MU + глюкуроновая кислота
СГ^о
Образующийся 4-метилумбеллиферон (4-MU, 7-окси-4-метил-
кумарин) может быть легко детектирован, так как способен флуо-
ресцировать при облучении длинноволновым УФ.
Оборудование и реактивы
Спектрофлуориметр, фосфоимэджер или анализатор плашек, спо-
собные детектировать флуоресценцию при облучении в диапазоне
УФ или видимого света; спектрофотометр или анализатор плашек
видимого диапазона; гомогенизатор ткани для микропробирок; тер-
мостат для микропробирок; вортекс; дозаторы переменного объема.
GUS-экстракционный буфер (ГЭБ): 50 мМ Na-фосфатный буфер,
рН 7-8; 10 мМ β-меркаптоэтанол; 10 мМ Na2-ЭДTA; детергенты:
0,1% Na-лауроил-саркозин (предпочтительнее) или Na-додецилсуль-
фат, 0,1% Тритон Х-100. Раствор субстрата: 0,2 Μ 4-MUG в диме-
тилсульфоксиде (ДМСО), может храниться годами в темноте при
-20 °С. Стоп-раствор: 0,2 Μ Na2C03 (21,2 г в 1 л дистиллированной
воды). Калибровочный раствор: 1 мМ 4-MU в дистиллированной
воде (концентрат), хранится в темноте на холоду; рабочий раст-
вор — 20-50 нМ 4-MU в стоп-растворе.
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
57
Ход определения
• Для анализа используют либо свежий материал, либо заморо-
женный в жидком азоте и хранящийся при -40-70 °С.
· Нумеруют серию чистых эппендорфовских пробирок и ставят
их в ледяную баню.
• 50-200 мг растительной ткани помещают в пробирку и гомоге-
низируют в 100 мкл холодного ГЭБ с помощью пестика, жела-
тельно, вращаемого мотором (30-40 с).
• Ставят пробирки на лед и добавляют по 80 мкл холодного ГЭБ.
• Встряхивают пробирки на вортексе при максимальной интен-
сивности 10—15 с.
• Центрифугируют пробирки при максимальной скорости
(13 000-14 000 об./мин) 3-4 мин при 4 °С.
• 90 мкл супернатанта аккуратно переносят (не захватывая
осадка) в чистые пробирки на ледяной бане.
• Из этого объема отбирают 2 аликвоты по 30 мкл в отдельные
пробирки или ячейки плашки для определения содержания
белка.
• В 3 чистые контрольные пробирки добавляют по 30 мкл ГЭБ.
• Готовят буфер с субстратом, смешивая ГЭБ с раствором MUG в
пропорции 100:1, т. е. 10 мкл 0,2 Μ раствора 4-MUG (в ДМСО)
на 990 мкл ГЭБ.
• К оставшимся после отбора аликвот 30 мкл супернатанта
быстро (желательно степпером) добавляют равный объем ГЭБ
с субстратом.
• Те же 30 мкл ГЭБ с субстратом добавляют в контрольную про-
бирку с 30 мкл чистого ГЭБ (конечная концентрация 4-MUG в
пробах ~1 мМ).
• Пробы сразу помещают в термостат на 37 °С, на 1 ч в темноте
(желательно в термостат типа термомиксера при умеренном
встряхивании).
• Во время этой инкубации определяют содержание белка в ото-
бранных аликвотах, например, по методу Брэдфорд, с исполь-
зованием в качестве контролей на буфер 2 пробирок или ячеек
плашки с чистым ГЭБ.
• После инкубации проб при 37 °С к ним быстро (желательно
спеппером) добавляют по 0,5 мл стоп-раствора (0,2 Μ Na2C03).
• Калибруют спектрофлуориметр или аналогичный прибор стан-
дартным раствором 4-MU (20-50 нМ в стоп-растворе), оптимум
длин волн возбуждения 365 нМ, испускания — 455 нМ.
58 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
• В тех же условиях измеряют флуоресценцию изучаемых образ-
цов, для измерений обычно достаточно аликвот по 10-20 мкл,
разведенных в 1-2 мл стоп-раствора.
• Результаты измерения флуоресценции пересчитывают на ве-
личины количеств белка в пробе, получают значения в (мик-
ро)молях образованного 4-MU на единицу белка в час.
Примечания
Для определения активности GUS свежий биологический материал
удобно замораживать сразу в ГЭБ; в этом случае гомогенизацию
можно начинать сразу после размораживания проб. Разные серии
пробирок желательно нумеровать цифрами разного цвета, чтобы из-
бежать ошибок при разнесении аликвот. ГЭБ влияет на окраску бел-
ка по прописи Бредфорд (см. раздел 3.1), поэтому для построения
калибровочной кривой белок необходимо растворять в ГЭБ (по 30 мкл
раствора белка на точку). Количественное определение в упрощен-
ном варианте основано на предположении о линейном характере
процесса образования 4-MU под действием GUS в условиях опыта.
Для проверки линейности этого процесса определяют зависимость
увеличения флуоресценции от времени, обычно по 4 точкам через
равные интервалы в 5-15 мин [1]. Для большей точности определе-
ния, особенно в случае малоопытных исследователей, после центрифу-
гирования допускается отбор несколько большего объема супернатан-
та (-95-100 мкл), который можно разнести по 30 мкл на 3 серии про-
бирок (одну на испытание активности GUS и две на определение
дозы белка). Однако при профессиональной работе это не дает боль-
шого выигрыша в точности, но удлиняет процедуру тестирования и
увеличивает расход пробирок.
Б) Гистохимическое определение активности GUS
в тканях растения
Гистохимическое определение основано на реакции:
X-Gluc + H2O —GUS > глюкуроновая кислота +
+ 5-бромо-4-хлороиндол.
Последний продукт при окислении подвергается димеризации с
образованием нерастворимого соединения (5-бромо-4-хлоро)индиго
интенсивно синего цвета. Это позволяет достаточно точно фиксиро-
вать локализацию фермента GUS на тканевом, клеточном и иногда
даже субклеточном уровнях [1-4].
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
59
Оборудование и реактивы
Оборудование зависит от цели исследования. В случае анализа на
клеточном/субклеточном уровне необходимо соответствующее мик-
роскопическое оборудование. Очень желательно иметь хотя бы про-
стейшее приспособление для вакуумной инфильтрации.
Реактивы: X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронид) раст-
воряют в ДМСО или диметилформамиде в концентрации 100 мг/мл
и хранят при -20 °С в бескислородной среде. Рабочий раствор суб-
страта: 1-2 мМ X-Gluc в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7 (50 мкл
исходного раствора X-Gluc разводят в 5-10 мл фосфатного буфера),
в который желательно (но необязательно) добавить следующие ком-
поненты: 0,1-0,5% Тритон Х-100 для лучшего смачивания объекта,
0,5 мМ феррицианид и 0,5 мМ ферроцианид для ускорения реакции
окисления при образовании индиго, 1-10 мМ ЭДТА для удаления
ингибирующих реакцию двухвалентных катионов, а также для
уменьшения ингибирующего эффекта ферри/ферроцианидов. Фик-
сирующие растворы: 0,1-1% -й глутаральдегид в 25 мМ Na-фосфат-
ном буфере, рН 7; либо 2-3%-й формальдегид в 100 мМ Na-фос-
фатном буфере, рН 7, с 1 мМ ЭДТА.
Ход определения
• Тонкие срезы или целые органы инкубируют в фиксирующем
растворе от 5 до 30 мин, желательно с предварительной корот-
кой вакуум-инфильтрацией (стадия факультативна — см. при-
мечания).
• Образцы дважды отмывают от фиксатора фосфатным буфе-
ром.
• Сразу после отмывки образцы помещают в раствор субстрата
так, чтобы раствор полностью покрывал поверхности тканей,
и накрывают пленкой во избежание испарения реакционной
смеси.
• Проводят вакуумную инфильтрацию (примерно при 20 мбар)
10 с.
• Инкубируют при 37 °С от 30 мин до 2 суток с периодическим
контролем, чтобы избежать перекрашивания.
• Останавливают реакцию отмывкой образцов дистиллирован-
ной водой или буфером.
• Отмывают ткани от маскирующих пигментов и избытка кра-
сителя либо сразу 70% -м этанолом, либо ступенчато, повышая
концентрацию этанола от 25 до 100%.
• Для последующего исследования с использованием светового
микроскопа из ткани далее может быть изготовлен постоян-
60 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
ный препарат, а для электронной микроскопии ткань можно
заключить в соответствующую смолу.
Примечания
Время фиксации можно сократить до 2-4 мин (на льду), применяя
более концентрированные фиксаторы: забуференные 2-3% -й глу-
таральдегид или 4-6%-й формальдегид. При выявлении транс-
генных растений, у которых ген GUS поставлен под какой-либо
сильный промотор, гистохимический метод применяется в наибо-
лее простом варианте, т. е. без предварительной фиксации. Однако
фиксация необходима в тех случаях, когда исследуется клеточная и
субклеточная локализация фермента, иначе GUS может мигриро-
вать из поврежденных клеток и давать артефактную локализацию.
Стандартные фиксаторы обычно инактивируют GUS, поэтому фик-
сацию следует проводить в мягких условиях. Важно учесть и то, что
в живых клетках сама процедура длительной инкубации в ходе гис-
тохимического окрашивания может менять экспрессию изучаемого
промотора или гена. Чтобы избежать этого, наряду с фиксацией тка-
ней, на период окрашивания к ним можно добавить циклогексимид
для блокирования белкового синтеза de novo. Для подавления эндоген-
ной GUS-активности и коричневения тканей применяют 10-100 мМ
аскорбат, рН 8 и/или 20% -й метанол. Помимо живых или фиксиро-
ванных тканей, этим методом можно эффективно окрашивать также
белковые гели и блоты. Для гистохимического окрашивания можно
использовать и флуориметрический метод с 4-MUG в качестве суб-
страта, однако это окрашивание нестабильно и для его выявления
требуется дополнительное оборудование.
Гены GFP и других автофлуоресцентных белков
Еще проще методология обнаружения белка GFP (рис. 1.4.2). Он
способен флуоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при
облучении длинноволновым УФ. Эта флуоресценция обусловлена
непосредственно белком, для ее проявления не требуется субстратов
или кофакторов. Благодаря этому свойству ген GFP позволяет прово-
дить разнообразные прижизненные (недеструктивные) исследования
с трансгенными организмами [1, 2, 5-13]. Хромофор GFP образу-
ется посттрансляционно путем автокаталитической циклизации
трех соседних аминокислот (Сер-65, Тир-66 и Гли-67) с окислени-
ем оксибензильной группы тирозина. Этот процесс длится in vivo
порядка 4 ч и требует присутствия кислорода. Белок GFP (мол. м.
27 кД) очень стабилен и выдерживает экстремальные воздействия
(70 °С, рН 4-11, 1% -й ДДС-Na, 6 Μ гуанидинхлорид, 8 Μ мочевину,
протеазы кроме проназы) в течение многих часов. В настоящее вре-
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
61
Рис. 1.4.2. Модель ЗD-структуры GFP (http://en.wikipedia.org/
wiki/Green_f luorescent_protein). См. цвет. вклейку, рис. 2
мя в исследованиях используют модифицированные варианты GFP
(Enhanced FP) с улучшенными качествами в первую очередь сущест-
венно увеличенным коэффициентом экстинкции, а также со сме-
щенными спектрами возбуждения/эмиссии в длинноволновую об-
ласть (табл. 1.4.1). В частности, флуоресценция Enhanced GFP (EGFP)
возбуждается не УФ, а синим светом с максимумом 488 нм.
Таблица 1.4.1. Примеры основных форм автофлуоресцентных белков,
применяемых в качестве репортеров у эукариот
Название
Максимум
возбуждения
Максимум
эмиссии
Коэффициент
мол. экстинк-
ции
GFP дикого типа
EGFP (enhanced
GFP)
EBFP (enhanced
blue FP)
ECFP (enhanced
cyan FP)
EYFP (enhanced
yellow FP)
DsRed
TurboRFP
mCherry
395 (УФ)
488 (синий)
380 (УФ)
434, 452 (синий)
514 (зеленый)
558 (оранжевый)
553 (оранжевый)
587 (красный)
509 (зеленый)
508 (зеленый)
446 (синий)
476, 505
(сине-зеленый)
527 (желтый)
583 (красный)
574 (красный)
610(дальний
красный)
21 000
55 000
31 000
32 000
84 000
75 000
92 000
72 000
62 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Методика обнаружения флуоресценции EGFP (GFP)
Обнаружение и количественная оценка EGFP (GFP) основана на
анализе флуоресценции при длинах волн, близких к 508-510 нм,
возбуждаемой источником излучения с длинами волн, близкими к
488 (395) нм.
Оборудование и реактивы
Флуоресцентный и/или конфокальный микроскоп. Реактивы:
ФСБ-буфер (58 мМ Na2HPO4, 17 мМ NaH2PO4, 68 мМ NaCl, pH 7,4)
или аналогичный 4% -й раствор формальдегида в ФСБ-буфере (фа-
культативно). Расплавленная агароза или парафин (факультативно).
Ход определения
• На стерильное предметное стекло переносят эксплант, клеточ-
ную культуру или часть листа, аккуратно удаляют остатки
питательной среды.
• Образцы либо фиксируют в растворе формальдегида 30 мин
при комнатной температуре, либо анализируют живыми.
• На предметное стекло наносят несколько капель ФСБ-буфера
или дистиллированной воды и мягко опускают покровное
стекло.
• Избыток буфера отсасывают, а стекла при желании склеивают
агарозой или парафином.
• Препарат в случае живых клеток немедленно исследуют под
микроскопом; если клетки фиксированы, препарат можно хра-
нить при 4 °С в течение 2-3 недель.
Примечания
При облучении УФ надо оставлять поверхность образца открытой
или применять стекла, проницаемые для этой части спектра. Интен-
сивность источника излучения надо установить по контрольному
(без флуоресцентных белков) препарату: в контрольном образце не
должно быть фоновой флуоресценции. При наблюдениях зеленых
тканей необходимо «отсечь» (ограничением спектра источника све-
та и/или фильтрацией спектра индуцированного излучения) флуо-
ресценцию хлорофилла. Использование сразу 2-3 типов автофлуо-
ресцентного белка с различными адресными последовательностями
и спектральными характеристиками позволяет маркировать одно-
временно 2-3 типа субклеточных структур. Альтернативно при
использовании одного типа автофлуоресцентного белка клеточные
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
63
структуры или органеллы можно маркировать с помощью известных
флуоресцентных красителей, правда, на уже фиксированных пре-
паратах. В отличие от GUS фиксация тканей глутаральдегидом или
формальдегидом совершенно не препятствует флуоресценции GFP и
большинства других автофлуоресцентных белков. Следует, однако,
избегать применения лака для ногтей для склеивания стекол при
микроскопии, так как этот лак ингибирует GFP.
Возможные проблемы при интерпретации результатов
В связи с многообразием репортерных генов и белков, а также реша-
емых с их помощью задач можно дать только самые общие рекомен-
дации по интерпретации результатов работ с такими системами. В
случае использования репортерных ферментов, нуждающихся в
субстрате, при сравнительном анализе необходимо учитывать воз-
можные различия в скорости проникновения субстрата в разные
ткани и компартменты клетки. Кроме того, как уже отмечалось,
важно блокировать синтез репортера de novo в ходе окрашивания.
Для созревания автофлуоресцентных белков и гистохимического
окрашивания на активность GUS необходим кислород, поэтому в
тканях с низким содержанием кислорода репортерные системы мо-
гут не работать или проявляться с большой задержкой. В связи с вы-
сокой стабильностью многих репортерных белков, таких как GUS,
GFP, EGFP и других, их нельзя использовать для исследования ди-
намических изменений экспрессии генов, так как данные белки бу-
дут постоянно накапливаться в живых тканях. Для динамических
исследований применяют, в частности, репортер LUC (время полу-
распада в живых клетках 2-3 ч) или специальные варианты авто-
флуоресцентных белков с укороченным временем созревания и рас-
пада.
Для маркирования клеточных органелл в настоящее время в ка-
честве репортеров используют разнообразные автофлуоресцентные
белки. Эти же белки применяют и для прижизненных испытаний
экспрессии чужеродных генов и субклеточной локализации «хозяй-
ских» белков. Однако надо учесть, что чувствительность систем с ав-
тофлуоресцентными белками уступает системам на основе репорте-
ров GUS или CAT. Усиление интенсивности источника света не всегда
эффективно, так как яркий свет провоцирует быстрое обесцвечива-
ние флуоресцентных белков, а, кроме того, вызывает фоновую флу-
оресценцию своеродных клеточных макромолекул.
Примеры окрашивания тканей/клеток на основе активности GUS
и флуоресценции GFP приведены на рис. 1.4.3.
64 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.4.3. Примеры окраски растительных тканей. (А) Флуоресценция
EGFP в клетке эпидермиса табака при транзиентной экспрессии кон-
структа с EGFP, слитого с рецептором цитокининов арабидопсиса АНКЗ.
(Б) Выявление активности GUS у проростков ARR5::GUS арабидопсиса
после индукции цитокинином (слева) и в контроле (справа). См. цвет,
вклейку, рис. 3
Заключение
Достижения последних лет значительно расширили палитру приме-
нения репортерных генов и соответствующих белков в современной
биологии. Это в первую очередь относится к генам флуоресцент-
ных белков. С помощью таких белков можно флуоресцентно ме-
тить любые клеточные органеллы и прослеживать судьбу изучаемого
белка: его экспрессию, локализацию, подвижность, скорость дегра-
дации и взаимодействие с другими белками. Кроме того, сенсоры
(зонды) на основе флуоресцентных белков позволяют оценить внутри-
клеточную концентрацию самых разнообразных молекул, в том чис-
ле ионов водорода (рН), кальция, хлорид-ионов, перекиси водорода,
ионов металлов, различных углеводов и ряда других соединений, а
также активности многих ферментов, в том числе регуляторных.
Для более полного знакомства с областями применения репортер-
ных генов см. приведенную литературу.
Литература
1. Зверева С. Д., Романов Г. А. Репортерные гены для генетичес-
кой инженерии растений: характеристика и методы тестирова-
ния // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 479-488.
2. Пирузян Э. С, Голденкова И. В., Мусийчук К. Α., Авдеев Р. М.,
Волкова Л. В., Кобец Н. С. Новая репортерная система, основан-
ная на высокой термостабильности лихеназы, для изучения ре-
гуляции экспрессии генов у растений // Физиология растений.
2000. Т. 47. С. 382-389.
Раздел 1.4. Применение конструкций ДНК
65
3. Jefferson R.A., Kanavagh Т. Α., Bevan M.W. GUS Fusions:
β-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker
in Higher Plants // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.
4. Jefferson R.A. Assaying Chimeric Genes in Plants: the GUS Gene
Fusion System // Plant Mol. Biol. Reporter. 1987. V. 5. P. 387-405.
5. Чудаков Д. М., Лукьянов К. А. Использование зеленого флуо-
ресцентного белка (GFP) и его гомологов для изучения подвиж-
ности белков in vivo // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1166-1172.
6. Лабас Ю.А., Гордеева А. В., Фрадков А.Ф. (2003). Флуоресци-
рующие и цветные белки // Природа. 2003. № 3. С. 34-43.
7. Chudakov D. Μ., Lukyanov К. A. Fluorescent Proteins as a Toolkit
for in vivo Imaging // Trends Biotechnol. 2005. V. 23. P. 605-613.
8. Степаненко О. В., Верхуша В. В., Кузнецова И. М., Турове-
ров К. К. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства
и использование в клеточной биологии // Цитология. 2007.
Т. 49. С. 395-420.
9. Суслова Ε. Α., Чудаков Д. М. Генетически кодируемые внутрикле-
точные сенсоры на основе флуоресцентных белков // Биохимия.
2007. Т. 72. С. 837-855.
10. Шкроб М.А., Мишин А. С, Чудаков Д. М. Хромобелки семей-
ства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение //
Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. С. 581-590.
11. Fernandez-Suurez Μ., Ting A. Y. Fluorescent probes for
super-resolution imaging in living cells // Nature Reviews
Molecular Cell Biology. 2008. V. 9. P. 929-943.
12. Prescott M., Salih A. Genetically encoded fluorescent probes: some
properties and applications in life sciences // In: Fluorescence
Application in Biotechnology and Life Sciences (ed. Goldys Ε. Μ.).
Wiley-Blackwell, USA, 2009, Chpt. 3, P. 47-73.
13. Петкевич К. Д., Ефременко Ε. Η., Верхуша В. В., Варфоломе-
ев С. Д. Красные флуоресцентные белки и их свойства // Успехи
химии. 2010, Т. 79. С. 273-290.
14. Сайты Интернета:
http://www.microscopyu.сот/articles/liveсе11imaging/
fpintro.html;
http://www.scholarpedia.org/article/
Fluorescent_proteins;
http://ru.wikipedia.org/wiki/
зеленый флуоресцентный_белок.
66 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
1.5. ИНСЕРЦИОННЫЕ МУТАНТЫ ARABIDOPSIS THALIANA
И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИИ ГЕНА
А. В. Демиденко
Введение
В наши дни одним из основных путей для выявления функции гена
является использование подхода «обратной генетики». Этот подход
назван так, поскольку по направлению исследования он противопо-
ложен прямому генетическому скринингу, используемому в класси-
ческой генетике. Другими словами, «прямая генетика» ведет поиск
генетической базы определенного, найденного в результате скри-
нинга, фенотипа, тогда как «обратная генетика» выявляет фенотип,
вызываемый изменением экспрессии определенного гена.
Развитие автоматического секвенирования привело к накопле-
нию большого количества генетической информации. Для многих
организмов были секвенированы полные геномы, в том числе и для
двудольного растения Arabidopsis thaliana, которое является одним
из основных модельных объектов в физиологии, генетике и молеку-
лярной биологии растений. Однако знание генетической последова-
тельности является лишь первым шагом на пути к пониманию коди-
руемых ею функций.
Для выявления влияния отдельного гена на фенотип растения
существует два подхода: ген либо «выключают», нарушая тем или
иным способом его экспрессию (транскрипцию самого гена или
трансляцию соответствующей ему РНК), либо многократно ее уси-
ливают — это называется «сверхэкспрессией» (overexpression).
Принцип метода
Для получения растений с инактивированными генами широкое
распространение получил метод генетической трансформации по-
средством Agrobacterium tumefaciens. Клетки этого вида почвенных
бактерий обладают специализированным молекулярным механиз-
мом, способным переносить часть собственного генетического мате-
риала (так называемую трансферную область ДНК мегаплазмиды,
или Т-ДНК) в клетки растений, целенаправленно доставлять его в
ядро и встраивать в геном растения (подробнее о Т-ДНК см. раз-
дел 1.1). Считается, что встраивание Т-ДНК происходит случайным
образом, поэтому потенциально вставка может осуществляться в
любом участке генома. Поскольку Т-ДНК достаточно протяженна
(длина в различных вариантах векторов для трансфекции колеблет-
Раздел 1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana 67
ся от 3 до 6 и более тысяч п.н.), такая инсерция при встраивании в
кодирующую, а иногда и в некодирующую область гена нарушает
его нормальную транскрипцию. Если вставка Т-ДНК происходит в
начале или середине кодирующей последовательности, то при усло-
вии наличия вставки в двух наборах хромосом (т. е. гомозиготной
инсерции) не происходит синтеза полноразмерной мРНК и, следова-
тельно, не образуется функциональный белковый продукт. В этом
случае можно говорить о получении «чистой линии» инсерционного
мутанта с единичным инактивированным геном.
Инсерционные мутанты могут демонстрировать фенотип отлич-
ный от дикого типа. Ярким примером успешного использования
подхода обратной генетики является изучение фенотипа инсерцион-
ных мутантов по генам транскрипционных факторов [1-3]. Отсут-
ствие функционального белка транскрипционного фактора, как
правило, приводит к изменениям в уровне экспрессии большого
числа регулируемых этим фактором генов, что заметно отражается
на фенотипе целого растения. Однако для растений характерно яв-
ление генетической избыточности, когда та или иная функция орга-
низма может обеспечиваться не одним белком, а целым их семей-
ством, и «выключение» одного гена семейства практически не влияет
на фенотип. В этом случае также возможно использование подхода
обратной генетики, но он должен быть сопряжен с предваритель-
ным биоинформационным поиском, направленным на выявление
генов семейства, и последующим получением «кратных» мутантов,
несущих инактивирующие инсерции одновременно в нескольких
генах этого семейства. Результирующий фенотип будет характери-
зовать функцию, выполняемую белками, кодируемыми генами изу-
чаемого семейства, причем чем выше «кратность» мутанта (т. е. чем
больше генов семейства находятся в инактивированном состоянии),
тем ярче будет проявляться соответствующий фенотип.
Методом агробактериальной трансформации получены большие
коллекции инсерционных мутантов, которые широко используют-
ся во всем мире с целью изучения функций отдельных генов расте-
ний. Обычно такие коллекции поддерживаются в рамках научных
сток-центров (от англ. Scientific resource stock centers), где кроме
сток-линий семян также можно найти множество других полезных
ресурсов (полноразмерные кДНК генов, векторы для транзиентной
и агробактериальной трансформации, библиотеки для дрожжевого
дигибридного скрининга и др.; примером может служить каталог
сток-центра ABRC, Arabidopsis Biological Resource Center на сайте
arabidopsis.org). Существует возможность получения сток-линий
семян интересующих инсерционных мутантов с использованием
баз данных и форм заказа, доступных на сайтах соответствующих
сток-центров (см. табл. 1.5.1).
68 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Таблица 1.5.1. Список крупных международных сток-центров инсерци-
онных мутантов
Сток-центр Веб-ресурс
Arabidopsis Biological Resource http: //arabidopsis . org/
Center
European Arabidopsis Stock http: //arabidopsis .info/
Centre
RIKEN BioResource Center http://www.brc.riken.jp/lab/epd/Eng/
Experimental Plant Division
GABI-Kat (Max-Planck-lnstitute http://www.gabi-kat.de/
of Plant Breeding Research)
Cold Spring Harbor Laboratory http://genetrap.cshl.org/
The Institut Jean-Pierre Bourgin, http: //www-ijpb. Versailles . inra. f r/
Versailles T-DNA insertion lines en/cra/cra_accueil. htm
Получение семян инсерционных мутантов
Рассмотрим кратко процедуру получения семян из уже упомянутого
ABRC, так как этот сток-центр на сегодняшний день является наибо-
лее крупным и удобным источником для получения инсерционных
мутантов A. thaliana и других биологических ресурсов. Нужно ска-
зать, что каталог этого сток-центра находится на сайте научного
Интернет-портала TAIR, The Arabidopsis Information Resource
(arabidopsis . org), объединяющего и предоставляющего в удобном
виде огромное количество генетической и молекулярно-биологичес-
кой информации в рамках проекта по изучению модельного расте-
ния A. thaliana. Территориально ABRC базируется в государствен-
ном университете Огайо, США (The Ohio State University).
Итак, чтобы сделать заказ в ABRC, необходимо пройти процеду-
ру регистрации. Стандартная процедура регистрации позволяет со-
здать на сайте собственный информационный профиль, включаю-
щий личную (ФИО, ключевые слова, публикации) и контактную
(адреса научных организаций) информацию. Каждому пользовате-
лю выделяется виртуальный личный кабинет, в котором хранится
информация о сделанных им заказах и отображается статус их под-
готовки. Однако необходимым условием для получения возможнос-
ти заказывать биологические ресурсы из каталога ABRC является
регистрация лаборатории и заведующего лабораторией. Таким об-
разом, если регистрация на ресурсе ΤAIR производится впервые,
лучше ее проводить в такой последовательности: регистрация заве-
дующего лабораторией и лаборатории и после этого регистрация со-
Раздел 1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana 69
трудников лаборатории с прикреплением к созданной лаборатории.
Если все процедуры сделаны корректно, лаборатория отображается
в графе Affiliated Organizations личного профиля. После заполне-
ния электронных регистрационных форм на сайте на указанный в
форме адрес e-mail приходит сообщение о подтверждении регистра-
ции. Зарегистрировавшись, из личного кабинета можно проводить
поиск необходимых биологических ресурсов (ДНК — Search DNA
Stocks, семян — Search Seed Stocks) и добавлять их в корзину. Необ-
ходимо отметить, что стоимость биологических ресурсов, предостав-
ляемых ABRC, в разы ниже стоимости продуктов коммерческих
фирм. Для сравнения: стоимость одного генетического вектора в
ABRC для пользователей из некоммерческих организаций на 2010 г.
равна 5 USD, тогда как в коммерческих фирмах стоимость самого про-
стого вектора, как правило, выше 100 USD. Линия семян A. thaliana
также оплачивается в размере 5 USD. За подготовку и отправку за-
каза взимается дополнительная плата в размере 15 USD, поэтому
лучше заказывать сразу несколько линий или образцов ДНК. Зака-
зы на семена и на образцы ДНК формируются и оплачиваются раз-
дельно. Оплата осуществляется путем электронного платежа с по-
мощью электронной пластиковой карты Visa. Возможна также оплата
по чеку, однако в России это затруднительно — немногие банки
предоставляют подобную возможность.
Получение анализирующих праймеров
Как правило, большинство линий семян, предоставляемых сток-цент-
рами, не являются «чистыми линиями» по соответствующей инсер-
ционной мутации. Это обусловлено различными причинами: замед-
ленным ростом мутантов, низкой продуктивностью, нефертильнос-
тью и т. д., что затрудняет поддержание «чистых линий». В случае
когда инсерция находится в гене с неизвестной функцией, причи-
ной может быть то, что с данной линией мутантов еще никто не рабо-
тал и не проводил отбора «чистой линии». Поэтому после получения
семян из центра необходимо отобрать или создать линии, в которых
инсерция в целевой ген будет присутствовать в гомозиготном состоя-
нии. Определение растений «чистой линии» по вставке в целевой
ген проводят с помощью ПЦР с праймерами на область слияния
Т-ДНК с целевым геном и ПЦР с праймерами, фланкирующими об-
ласть вставки (см. рис. 1.5.1 и 1.5.2).
Как узнать, к какой области целевого гена и Т-ДНК подбирать
праймеры. В случае с праймерами к последовательности Т-ДНК
вопрос решается довольно просто, так как получение коллекций
инсерционных мутантов, как правило, ведется с помощью бинарных
векторов, последовательность которых (или ссылку на нее) можно
70 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Диет.
Т-ДНК
Последовательность
гена
Фланкир.
последовательность
дт гтз , гмз
Дист.+N
Рис. 1.5.1. Принципиальная схема анализа инсерционных мутантов ара-
бидопсиса с использованием программы T-DNA Primer Design (вверху) и
ожидаемый результат электрофореза после ПЦР с подобранными прайме-
рами (внизу). Обозначения: Инс. диапазон — предположительный диа-
пазон нахождения инсерции, примерно определенный по результатам
секвенирования FST (по умолчанию 300 п.н.); N — положение инсерции
(0-300 п.н.); Отступ 5' и Отступ 3' — диапазоны с 5' и 3' концов Инс. диа-
пазона, не используемые для подбора праймеров (определяются програм-
мой); LP и RP — праймеры, подбираемые программой слева и справа от
инсерции соответственно; Зоны подбора — диапазоны, в которых про-
грамма проводит подбор LP и RP праймеров (по умолчанию 100 п.н.);
ВР — стандартный праймер на границу Т-ДНК (последовательности
даны на сайте); Диет. — расстояние от ВР до границы инсерции; ДТ — ди-
кий тип, ГТЗ — гетерозигота, ГМЗ — гомозигота; LPoRP — ампликон,
получаемый с праймерами LP и RP
найти в описании коллекции или линии из этой коллекции. Ко мно-
гим коллекциям прилагаются стандартные последовательности прай-
меров для Т-ДНК. В качестве примера можно привести коллекцию
инсерционных мутантов SALK (название происходит от имени ин-
ститута, где эта коллекция была получена — Jonas Salk Institute,
La Jolla, California, США). Эта коллекция была получена в лаборато-
рии геномного анализа под руководством J. R. Ecker'a (Genomic
Analysis Laboratory — http://signal.salk.edu/index.html) с
помощью агробактериальной трансформации растений A. thaliana
Раздел 1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana 71_
А
LBpr
FST \ Т-ДНК
Flank S \ \ TD S \ TD AS
Целевой ген с инсерцией Т-ДНК
Б В
Т-ДНК ЛевГр ПравГр Μ 1кб НатГ Т-ДНК ЛевГр ПравГр Μ 1кб НатГ
Г Д
Т-ДНК ЛевГр ПравГр Μ 1кб НатГ Т-ДНК ЛевГр ПравГр Μ 1кб НатГ
Рис. 1.5.2. Пример анализа места и зиготности вставки в целевой ген.
(А) Схема инсерции в целевой ген с обозначением местоположения FST
(flanking sequence tag) и праймеров для проведения ПЦР-анализа (на-
правления праймеров указаны стрелками). Электрофореграммы: (Б) Ре-
зультат ПЦР с ДНК дикого типа; (В) Результат ПЦР с ДНК мутанта с гомо-
зиготной вставкой; (Г) Результат ПЦР с ДНК мутанта с гетерозиготной
вставкой; (Д) Проблемный случай определения вставки в целевой ген у
инсерционного мутанта
экотипа Columbia-Ο бинарным вектором pROK2, карту и последо-
вательность которого можно найти на сайте лаборатории в разде-
ле «T-DNA Recovery Protocol» (http://signal.salk.edu/tdna_
protocols. html).
Существует также возможность автоматического подбора
праймеров с помощью программы T-DNA Primer Design, веб-ин-
терфейс которой размещен по адресу http : //signal. salk . edu/
tdnaprimers.2.html. На этой же странице подробно изложена
процедура использования этой программы. Кроме последователь-
ностей праймеров программа выдает удобную схему вставки Т-ДНК
в последовательность гена и расположения на ней мест посадки
72 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
(отжига) праймеров, а также схему электрофореграммы, иллюстри-
рующую ожидаемые результаты ПЦР с подобранными праймерами.
Пример использования программы T-DNA Primer Design приведен
на рис. 1.5.1.
В этом разделе сайта также присутствуют ссылки на публика-
ции, в которых описан протокол картирования вставок в растениях
[4], использованный при получении этой коллекции — в них можно
найти последовательности стандартных праймеров к левой границе
Т-ДНК.
Праймеры на последовательность целевого гена (геномные прай-
меры) исследователь может подбирать и самостоятельно. Однако ге-
номные праймеры необходимо подбирать таким образом, чтобы они
фланкировали место вставки Т-ДНК. Сайт инсерции определяется
для каждой линии в процессе создания коллекции с помощью мето-
дик картирования инсерции [4-6], в результате каждой линии с мо-
ногенной инсерцией соответствует секвенированная в процессе кар-
тирования последовательность — FST (flanking sequence tag). Ссыл-
ка на такую последовательность присутствует в описании к каждой
линии семян инсерционных мутантов.
Очень удобным инструментом для поиска инсерционных мутантов
в различных источниках и фланкирующих последовательностей
(FST), соответствующих инсерциям, является ресурс T-DNA Express:
Arabidopsis Gene Mapping Tool (http://signal.salk.edu/cgi-bin/
tdnaexpress), который также поддерживается лабораторией ге-
номного анализа J. R. Ecker'a.
Оборудование и реактивы
Оборудование
Компьютер с доступом в сеть Интернет и программным обеспечени-
ем для операций с нуклеотидными последовательностями (напри-
мер, Vector NTI Suite, Invitrogen), инкубационная камера для выра-
щивания растений, микроцентрифуга, вортекс, программируемый
термостат (амплификатор), прибор для горизонтального агарозного
электрофореза, автоматические дозаторы.
Реактивы
Для выделения ДНК растений: компоненты растворов для выделе-
ния ДНК — Трис, соляная кислота, хлорид натрия, SDS, Na-Sarcosyl,
ЭДТА, фенол, хлороформ, изопропанол, натрия ацетат, рибонукле-
аза А (по методу выделения ДНК, см. раздел 2.1).
Для проведения ПЦР-анализа: Taq-полимераза, буфер для Taq-no-
лимеразы, дезоксирибонуклеотид трифосфаты (А, Ц, Г, Т), агароза
Раздел 1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana
73
для электрофореза ДНК, компоненты для Трис-ацетат-ЭДТА буфе-
ра (ТАЕ-буфера для проведения агарозного электрофореза), молеку-
лярный маркер ДНК, соответствующий по диапазону размеру ана-
лизируемых ампликонов (подробнее о проведении ПЦР см. раз-
дел 1.6).
Возникающие проблемы и их решения
А) Область слияния вставки и целевого гена не амплифицируется
(рис. 1.5.2.Д), хотя обнаруживается ампликон на внутреннюю об-
ласть Т-ДНК. Также присутствует ампликон на неповрежденный
ген.
Возможные причины:
1) Праймер на область Т-ДНК не работает с праймером на область
целевого гена либо ошибочно подобран праймер на область це-
левого гена. Вариант решения: с помощью специального прог-
раммного обеспечения (например, Vector NTI Suite, Invitrogen)
оценить температуры отжига праймеров в паре — возможно,
праймеры сильно отличаются по температуре плавления дуп-
лексов либо образуют тугоплавкие димеры друг с другом (AG
при температуре отжига имеет отрицательное значение ниже
-5 ккал/моль). Необходима замена одного из праймеров (лучше
геномного) (о подборе праймеров см. раздел 1.6).
2) Ошибка картирования. Вариант решения: так как картирование
вставок в гены в процессе создания коллекции происходит по-
точно, возможны ошибки картирования (т. е. вставка в целевом
гене локализована ошибочно, а в действительности присутству-
ет в другом гене). Удостовериться в том, что произошла подоб-
ная ошибка, можно самостоятельно, определив место вставки с
использованием одного из методов картирования инсерций, на-
пример TAIL-PCR [5]. В этом случае необходим заказ другой ли-
нии со вставкой в изучаемый целевой ген.
3) Ошибка со стороны сток-центра — выслали не ту линию. Вари-
ант решения: удостовериться в том, что произошла подобная
ошибка, можно самостоятельно, определив место вставки с ис-
пользованием одного из методов картирования инсерций, на-
пример TAIL-PCR [5]. В этом случае необходим повторный за-
каз этой или другой линии со вставкой в изучаемый целевой
ген.
4) Контаминация (загрязнение) реактивов или оборудования ам-
пликоном, полученным с внутренней области Т-ДНК. Необхо-
димо провести процедуры по избавлению от контаминации: за-
74 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
мена реактивов, отмывка оборудования. Еще одним вариантом
ухода от контаминации является подбор другой пары прайме-
ров, не пересекающейся с ампликоном, для которого был выяв-
лен случай контаминации.
Б) Область слияния вставки и целевого гена амплифицируется, но
всегда присутствует ампликон на неповрежденный ген.
Возможные причины:
1) Гомозиготы по инсерции в данный ген летальны. Вариант про-
верки: высадить семена на стерильную среду, собрать непророс-
шие семена, выделить из отдельных семян ДНК и повторить
скрининг с ДНК из семян. Однако, если мутация затрагивает
процесс завязывания семян или раннего эмбриогенеза, этот ва-
риант проверки не сработает.
Литература
1. Ren X., Chen Ζ., Liu Υ., Zhang Η., Zhang Μ., Liu Q., Hong X.,
ZhuJ.K., Gong Z. (2010) АВОЗ, a WRKY Transcription Factor,
Mediates Plant Responses to Abscisic Acid and Drought Tolerance
in Arabidopsis // Plant J. 2010, V. 6: Epub ahead of print.
2. Carviel J.L., Al-Daoud F., Neumann M., Mohammad Α.,
Provart N. J., Moeder W., Yoshioka K., Cameron R. K. (2009)
Forward and Reverse Genetics to Identify Genes Involved in the
Age-Related Resistance Response in Arabidopsis thaliana // Mol
Plant Pathol. 2009., V. 10. P. 621-634.
3. Airoldi C.A., Rovere F.D., Falasca G., Marino G., Kooiker M.,
Altamura Μ. Μ., Citterio S., Kater Μ. Μ. (2010) The Arabidopsis
BET Bromodomain Factor GTE4 is Involved in Maintenance of the
Mitotic Cell Cycle During Plant Development // Plant Physiol.,
2010. V. 152. P. 1320-1334.
4. O'Malley R.C., Alonso J.M., Kim C.J., Leisse T.J., Ecker J.R.
(2007) An Adapter Ligation-Mediated PCR Method for
High-Throughput Mapping of T-DNA Inserts in the Arabidopsis
Genome // Nat. Protoc. 2007. V. 2. P. 2910-2917.
5. Liu Y. G., Chen Y., Zhang Q. (2005) Amplification of Genomic
Sequences Flanking T-DNA Insertions by Thermal Asymmetric
Interlaced Polymerase Chain Reaction // Methods Mol. Biol., 2005.
V. 286. P. 341-348.
6. Alonso J. M. et al. (2003) Genome-Wide Insertional Mutagenesis of
Arabidopsis thaliana // Science. 2003. V. 301. P. 653-657.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
75
1.6. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ.
СТРАТЕГИЯ ПОДБОРА ПРАЙМЕРОВ
ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Е. А. Лысенко
ПЦР: Теория и применение. Базовая информация
Введение
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — один из самых используе-
мых методов как в молекулярной биологии, так и далеко за ее преде-
лами. Метод ПЦР был предложен в начале 80-х гг. XX века Кари
Маллисом (Kary В. Mullis). В 1993 г. он получил за изобретение
ПЦР Нобелевскую премию по химии [1]. С момента появления ПЦР
в метод вносили разнообразные изменения, были предложены раз-
личные разновидности ПЦР, однако в основе всего этого разнообра-
зия лежит базовый принцип, разработанный Маллисом.
Принцип метода
Реакция ПЦР основана на том, что фермент синтеза ДНК — ДНК-за-
висимая ДНК-полимераза (далее просто ДНК-полимераза) — не мо-
жет вести синтез нити ДНК «с нуля», она обязательно удлиняет уже
имеющийся фрагмент. В качестве затравки для ДНК-полимеразы
используют небольшой однонитевой фрагмент ДНК, состоящий
примерно из 20 + 1-5 нуклеотидов. Такой фрагмент по размеру на-
зывают олигонуклеотидом, а по функции — затравкой, или прайме-
ром. Маллис догадался вести реакцию матричного синтеза ДНК од-
новременно с двух различных антипараллельных праймеров, на-
правляющих синтез ДНК навстречу друг другу. В результате стало
возможным, во-первых, в каждом цикле синтезировать обе нити
ДНК, а значит, удваивать исходное количество данного фрагмента.
Если в каждом цикле фрагменты ДНК удваиваются, то их количест-
во растет в геометрической прогрессии, и реакция справедливо на-
зывается цепной. Во-вторых, фрагмент, синтезируемый в геометри-
ческой прогрессии, оказывается вполне определенного размера,
зависящего от места прикрепления праймеров. Амплифицируемый
фрагмент (ампликон или ПЦР-продукт) является, как правило,
уникальным и простирается практически от первого нуклеотида од-
ного праймера до первого нуклеотида другого.
Рассмотрим процесс синтеза подробнее. Для реакции нужны не-
сколько компонентов: ДНК, которая будет матрицей для синтеза
ампликонов; праймеры (обычно два разных); ДНК-полимераза; бу-
фер, обеспечивающий оптимальный состав среды для активности
76 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
фермента; и все четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Типич-
ный состав ПЦР-смеси представлен в табл. 1.6.1.
Таблица 1.6.1. Типичный состав ПЦР-смеси
Компоненты
реакции
Объем, мкл Примечания
ПЦР-смесь сначала прогревают (94-95 °С) для того, чтобы ДНК,
которая будет матрицей для синтеза ампликонов, денатурировала
и образовались однонитевые молекулы ДНК. Затем температуру
снижают, чтобы праймеры связались с комплементарными им участ-
ками однонитевой ДНК-матрицы. Данный процесс называют отжи-
гом (annealing) праймеров. Температура отжига праймеров зависит
от их последовательности и варьирует в диапазоне 42-70 °С; для так
называемых случайных праймеров используется более низкая тем-
пература отжига. Праймеры образуют двунитевые участки с тяжа-
ми ДНК быстрее, чем длинные нити, так как, во-первых, праймеров
гораздо больше, и, во-вторых, подвижность длинных нитей значи-
тельно меньше. Затем температуру доводят до оптимальной для ак-
тивности ДНК-полимеразы, и начинается этап синтеза. Для актив-
ности широко используемой ДНК-полимеразы Taq (Тад-полимеразы)
оптимальная температура +72 °С. Длительность синтеза зависит
от протяженности ампликона. Обычно на полимеризацию каждой
тысячи нуклеотидов отводят (с избытком) 1 мин. На этом цикл за-
канчивается, и можно начинать следующий цикл: денатурация
ДНК — отжиг праймеров — синтез ДНК. Число циклов ПЦР мо-
жет быть разным, иногда программа включает несколько разных
циклов, отличающихся по температуре и/или времени для раз-
ДНК
Праймеры
ДНК-пол имераза
10Х буфер
ДНК-полимеразы
Дезоксирибонук-
леозидтрифос-
фаты
Вода
0,5-2
по 0,5-2
0,2
2
2
ДО 20
0,1-1 мкг геномной растительной ДНК,
ДНК меньших геномов пропорциональ-
но меньше
по 4-10 пикомоль, или 30-50 нг до ко-
нечной концентрации 0,1-0,5 мкМ, каж-
дого
= 1 ед. активности
(dA, dT, dG, dC концентрация каждого в
смеси 2 мМ)
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
77
личных стадий. Наиболее простая и типичная ПЦР состоит из
25-40 циклов:
Денатурация 94-95 °С 1-5 мин
Денатурация 94-95 °С 10-30 с
Отжиг праймеров 50-62 °С 5-30 с 25-40 раз
Синтез ДНК 72 °С 0,5-2,5 мин
Достройка концов ДНК 72 °С 5-10 мин
Хранение 6-16 °С оо
}
Обычные Taq-полимеразы позволяют получать ампликоны до
3-5 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), для более устойчивых фермен-
тов выпускающие их фирмы заявляют возможность синтеза ампли-
конов длиной до 40 т.п.н., а возможно, и больше.
ПЦР проводят с использованием специальных приборов, назы-
ваемых термоциклерами, или амплификаторами. Современные при-
боры имеют два режима контроля температуры: режим реальной
температуры термоэлемента, в котором находятся пробирки с реак-
ционной смесью (BLOCK), и режим расчета температуры в пробирке
(TUBE). В первом случае отсчет времени на каждый этап начинается
с момента, когда термоэлемент достигает заданной температуры. Во
втором случае необходимо указать прибору тип пробирки и объем
реакционной смеси, и программа будет делать определенную паузу
между достижением заданной температуры в термоблоке и началом
отсчета времени этапа. За время этой паузы температура термобло-
ка и всего объема реакционной смеси выровняется. Поэтому при ра-
боте во втором режиме можно давать более короткие временные ин-
тервалы для каждого этапа.
Современные амплификаторы имеют функцию нагрева крышки
(обычно 103-105 °С), чтобы на крышке пробирки не образовывался
конденсат, иначе большая часть реакционной смеси может испа-
риться и конденсироваться на крышке. Альтернативно можно на-
слаивать поверх реакционной смеси 1-2 капли минерального масла,
которое продают ряд специализированных фирм. Многие амплифи-
каторы позволяют задать неопределенно долгий режим хранения
проб при низкой температуре после завершения всех циклов.
Теперь, после того как приготовлена реакционная смесь, зало-
жена определенная программа для термоциклера и нажата кнопка
«Старт», посмотрим, что происходит внутри пробирки. Схематично
этот процесс отображен на рис. 1.6.1. В первом цикле праймеры от-
жигаются на условно бесконечно длинные нити исходной ДНК, и
78 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
ι
Рис. 1.6.1. Схема процессов матричного синтеза ДНК при ПЦР. Для всех
циклов нити ДНК, выступающие в качестве матриц для синтеза, даны
сплошной линией, а вновь синтезируемые — прерывистой. Нить ДНК, син-
тезированная в одном цикле, становится матрицей во всех последующих.
Серые стрелки обозначают праймеры. На концах нитей многоточие обо-
значает, что конец нити неопределенно длинный, круг — нить заканчива-
ется на определенном нуклеотиде. В ходе ПЦР количество «бесконечных»
матриц (исходный препарат ДНК) не увеличивается. Количество синтези-
руемых на них матриц с одним определенным и одним неопределенно
длинным концом увеличивается в арифметической прогрессии. Коли-
чество матриц определенного размера (ампликонов) увеличивается в гео-
метрической прогрессии
удлинение этих праймеров идет на неопределенно большое расстоя-
ние (например, до 5 т.п.н.). Такие вновь синтезированные нити ДНК
(обозначим их А) имеют определенное начало (начало праймера)
и неопределенный конец. Они образуются с исходной матричной
ДНК в каждом цикле, и их количество (С) определяется по формуле:
СА1+А2 = 2ΝΧ,
где Α1 и А2 — фрагменты, полученные удлинением разных прайме-
ров, N — это число циклов в ПЦР, а X — число амплифицируемых
участков в исходном препарате ДНК. Во втором цикле синтез идет
как с бесконечно длинных нитей, так и с фрагментов А, синтезиро-
ванных в первом цикле. Если в качестве матрицы был фрагмент А,
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
79
то полученный новый фрагмент (Б) будет иметь определенное нача-
ло (начало праймера) и определенный конец (начало фрагмента А
как конец для матричного синтеза). Фрагмент Б и является ампли-
коном. В третьем и последующих циклах фрагменты Б образуются,
если в качестве матрицы выступают фрагменты А или Б, количест-
во которых нарастает с каждым циклом. Количество двунитевых
фрагментов Б (ампликонов), синтезированных с таких же фрагмен-
тов Б, определяется формулой:
СБ = Χ x 2N-2,
при этом еще дополнительное количество ампликонов образуется
с матрицы фрагментов А. Согласно этим формулам, после 22-го
ПЦР-цикла количество исходной («бесконечно длинной») ДНК не
изменится, количество фрагментов А увеличится в 22 раза, а коли-
чество двунитевых ампликонов (фрагментов Б) возрастет более чем
в миллион раз относительно начального числа сайтов амплифика-
ции. В реальности реакции не проходят на 100%, поэтому на прак-
тике в хорошо отлаженной ПЦР коэффициент прироста амплико-
нов ближе к 1,9 (С = Χ x 1,9Ν-2). Однако и в этом случае рост количест-
ва ампликонов Б происходит в геометрической прогрессии, сильно
опережая аналогичный рост фрагментов А, прирастающих в ариф-
метической прогрессии.
Применение ПЦР
Использование ПЦР развивается в двух направлениях: препаратив-
ном и аналитическом. Изначально ПЦР была задумана для препара-
тивного синтеза определенных фрагментов ДНК. Полученные ам-
пликоны можно использовать для дальнейших молекулярно-биоло-
гических или генно-инженерных манипуляций. Однако оказалось,
что благодаря высокой специфичности метода его можно использо-
вать и для анализа. Если подобрать пару праймеров таким образом,
чтобы она обеспечивала амплификацию только одного фрагмента
ДНК, уникального для одного конкретного организма, то можно
тестировать материал на присутствие-отсутствие этого организма в
пробе. Поэтому, чтобы выяснить, например, какая инфекция име-
ется у пациента, у него берут кровь (или иную биологическую жид-
кость), выделяют из нее ДНК и ставят реакцию ПЦР с определенными
парами праймеров, специфичными для какого-либо одного генома
бактерии или вируса. Так же можно определять и патогены расте-
ний, а также выявлять, из каких сырьевых ингредиентов были из-
готовлены продукты питания (за исключения сильно очищенных —
сахара, масла и т. д.).
80 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
ПЦР предоставляет возможность не только определить, имеется
ли данный фрагмент в пробе, но и оценить количество соответствую-
щих сайтов в препарате нуклеиновых кислот. Наиболее широкое
применение это нашло для оценки содержания определенных моле-
кул РНК, что позволяет судить об экспрессии генов, кодирующих
эти РНК. Для этого с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-по-
лимеразы (называемого обратной транскриптазой или ревертазой)
на РНК-матрицах синтезируют комплементарную им первую нить
ДНК (кДНК), определенный фрагмент которой затем амплифици-
руют посредством ПЦР. Такое сопряжение обратной транскрипции
и ПЦР называют ОТ-ПЦР. Если реакция отлажена должным обра-
зом, то по соотношению полученных ампликонов можно судить о со-
отношении количества определенных молекул РНК в биологичес-
ких образцах (см. также разделы 2.3-2.7).
На сегодняшний день технология проведения ПЦР хорошо отра-
ботана и, за исключением особо изощренных модификаций, вполне
доступна лаборанту с небольшим опытом работы. Единственным эта-
пом, не вполне поддающимся формализации, остается подбор прай-
меров для амплификации.
Стратегия подбора праймеров
Выбор последовательностей для амплификации
Подбор праймеров для ПЦР начинается с ответа на вопрос: что
именно мы планируем исследовать? ПЦР для геномной ДНК и
ОТ-ПЦР имеют свои особенности. Не менее важен и другой вопрос:
планируем ли мы изучать уникальную последовательность или
семейство последовательностей? В любом геноме присутствуют как
семейства генов, так и семейства повторов некодирующих после-
довательностей. Существуют разнообразные подходы (например,
ISSR-праймеры), позволяющие работать с некодирующими повтора-
ми в ДНК, но в данной статье мы сосредоточимся на методических
приемах, позволяющих анализировать экспрессию генов.
Подходы к анализу генов, входящих в семейства
Для анализа уровня мРНК методом ОТ-ПЦР также важно, какие
гены будут изучаться. Если поставлена задача исследовать уникаль-
ные гены, то следует сначала найти внутри этих генов уникальные
мотивы и использовать их для подбора праймеров. Если ставится
задача изучать гены, принадлежащие к какому либо семейству,
то здесь также возможны два варианта действий. Можно пытаться
анализировать суммарно все семейство, а можно изучать отдельно
экспрессию каждого гена данной группы. Оба подхода имеют свои
достоинства и недостатки.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
81
В первом случае следует собрать последовательности всех генов
данного семейства у интересующего организма, сравнить их и найти
консервативные участки. Подробную информацию о процедуре вы-
равнивания последовательностей можно найти в разделе 1.7. Если
будут найдены участки, не обладающие сходством с последователь-
ностями других генов, то их можно использовать для создания пары
праймеров, позволяющей синтезировать ПЦР-продукт, специфич-
ный для всех генов этой группы и только для них. На рисунке 1.6.2
приведена схема расположения праймеров, позволяющих анализи-
ровать экспрессию всех генов группы и/или каждого его представи-
теля отдельно (рис. 1.6.2.А), а также конкретный пример выбора
последовательности праймера (одного из пары) для консерватив-
ного участка (рис. 1.6.2.Б). Праймер на рис. 1.6.2.Б позволяет ам-
плифицировать участки всех генов/кДНК, кодирующих ферменты
Fe-СОД, и избежать синтеза ПЦР-продуктов с гомологичной группы
генов/кДНК, кодирующих Mn-СОД. Данный пример осложнен сход-
ством семейства, выбранного для исследования, с другим семей-
ством генов. В большинстве случаев найти зону, консервативную и
уникальную для данной группы генов, бывает значительно проще.
На рисунке 1.6.3 показана электрофореграмма ПЦР-продукта, по-
лученного при помощи пары праимеров к консервативному участку
семейства генов актина кукурузы.
Большим преимуществом данного подхода является то, что при
помощи всего одной пары праимеров и одной ПЦР-реакции можно
проследить, как изменяется суммарный уровень мРНК всех генов
выбранного семейства. Основной недостаток — невозможность су-
дить о вкладе индивидуальных генов в наблюдаемые изменения.
Например, суммарное количество мРНК поддерживается на одном
уровне, при этом экспрессия одних генов семейства может усили-
ваться, других — уменьшаться. Кроме того, применение такого под-
хода может быть осложнено еще по ряду причин. У изучаемого орга-
низма могут быть известны не все гены данного семейства. Семей-
ство может иметь большое сходство с другими генами (рис. 1.6.2.Б).
Наконец, семейство может быть очень обширным, а последователь-
ности его генов столь сильно отличаться друг от друга, что в принципе
нельзя подобрать праймеры, позволяющие анализировать все гены
этой группы.
Если семейство генов не очень велико (или если велики ресурсы
и желание), то можно подобрать последовательности, уникальные
для каждого гена этого семейства. В этом случае можно пытаться
сделать для каждого гена оба праймера уникальными или один
праймер уникальным, а другой консервативным (рис. 1.6.2. А). Дос-
тоинством этого подхода является возможность отследить «поведе-
82 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Б
Antirrhinum m FeSodl
Nicotiana pi FeSod
Solanum 1 FeSodl
Solanum 1 FeSod2
Solanum t FeSod
AtFeSodl
AtFeSod2
Antirrhinum m FeSod2
Triphysaria ρ FeSodl
Triphysaria ρ FeSod3
Triphysaria ρ FeSod2
AtFeSod3
OsFeSod
ZmFeSod
AtMnSodx
HvMnSod
AtMnSodl
Ocimum b MnSod2
Olea e MnSod
Digitalis 1 MnSod
Avicennia m MnSod
Ocimum b MnSod
Консенсус
(331)
(186)
(325)
(325)
(137)
(211)
(33-7)
(48)
(72)
(358)
(361)
(331)
(307)
(316)
(278)
(698)
(263)
(243)
(96)
(242)
(245)
(248)
(710)
Праймер
Рис. 1.6.2. Подбор праймеров для амплификации группы генов. (А) Схе-
ма подбора праймеров для условного семейства гомологичных последова-
тельностей. Консервативные участки выделены серым фоном. Праймеры
на консервативные участки обозначены стрелками со сплошной линией.
Такая пара праймеров позволит амплифицировать соответствующий
участок со всех последовательностей. Праймеры на уникальные участки
показаны стрелками с прерывистой линией. Для амплификации участка
только одной последовательности из семейства можно использовать два
праймера на уникальные последовательности, при этом часть праймера
(но не З'-конец) может приходиться на консервативный участок или один
праймер на уникальный и один праймер на консервативный участок.
(Б) Фрагмент множественного выравнивания для подбора праймеров,
позволяющих амплифицировать участок со всех последовательностей
(к)ДНК генов Fe-СОД Salvia officinalis. На момент подбора праймеров по-
следовательности генов Fe-СОД S. officinalis не были идентифицированы,
поэтому их нет в данном выравнивании. Семейства генов Fe- и Mn-СОД го-
мологичны и обладают довольно большим сходством, поэтому в выравни-
вание включены последовательности генов Mn-СОД для того, чтобы вы-
бранный праймер не позволял амплифицировать участки (к)ДНК генов
Mn-СОД. Консенсус — обобщенная последовательность, наиболее харак-
терная для всех индивидуальных последовательностей. Выбранная по-
следовательность прямого праймера приведена в нижней строчке. В еди-
нственной вариабельной для генов Fe-СОД позиции выбран нуклеотид С,
как наиболее часто встречающийся у представителей таксона lamiids, к
которому принадлежит S. officinalis. Парный праймер (обратный) подо-
бран сходным образом. Праймеры проверены экспериментально и удов-
летворяют поставленной задаче
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
83
ние» каждого гена семейства. Недостатков два: такой подход требу-
ет больше труда и денежных затрат, и, применяя его, можно «из-за
деревьев не увидеть леса». Для генов одного семейства можно полу-
чить набор разнонаправленных изменений; можно зарегистрировать
однонаправленные изменения, но разной силы (от почти не досто-
верных до очень больших). При этом следует помнить, что базовый
уровень (в контроле) экспрессии разных генов в семействе может
сильно отличаться и что разные праймеры могут давать сигнал раз-
ной интенсивности для равного числа исходных матриц. Все это
сильно затрудняет понимание того, каким образом изменяется уро-
вень мРНК для всего семейства в целом.
Приведу гипотетический, но вполне реалистичный пример: уро-
вень мРНК гена А при стрессовом воздействии увеличивается в 5 раз,
а гена В — в 1,5 раза при одном и том же числе циклов ПЦР и близ-
кой интенсивности наблюдаемых полос. Сумма же их мРНК увели-
чивается менее чем в 2 раза из-за того, что ген А экспрессируется го-
раздо слабее, но праймеры с ним дают более сильный сигнал, чем с
геном В. Поэтому сначала нужно определиться, какая информация
более важна: о семействе в целом или об его отдельных членах. Иногда
бывает полезно совмещать оба подхода.
На практике существует и третий подход. Исследователь хочет
изучать экспрессию генов из семейства, но для своего объекта нахо-
дит только одну последовательность. Далее следует подбор прайме-
ров без учета консервативности или вариабельности участков гена,
затем — получение результатов. При таком подходе нуклеотидные
последовательности ПЦР-продуктов, как правило, не секвенируют,
и остается совершенно не ясно, что же именно изучалось: экспрес-
сия одного гена, или всего семейства, или какой-то части генов этого
семейства. Такой поход не может быть рекомендован для биологи-
ческих исследований. Если удается найти только одну последова-
тельность, то нужно сравнить ее с гомологичными генами других
организмов, найти консервативные и вариабельные участки и ис-
пользовать первый или второй подход.
Подходы к подбору праймеров
для неизвестных последовательностей
Еще одна трудность, с которой приходится сталкиваться довольно
часто, — это отсутствие в базах данных последовательностей инте-
ресующих генов для того растения, с которым работает эксперимен-
татор. Иногда в такой ситуации подбирают праймеры «по арабидоп-
сису», т. е. по полностью секвенированному геному другого растения
(риса, тополя, винограда и др.). Однако такой подход ненадежен,
даже если исследуемое растение таксономически близко к «араби-
84 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
допсису ». В геноме и в отдельных генах существуют консервативные
и вариабельные участки. Если подобрать праймеры на вариабель-
ный участок растения другого вида, то можно не получить реакции
или даже получить ложный результат. Поэтому в такой ситуации
следует начать с поиска консервативных участков у гомологичных
генов. Для этого лучше взять последовательности всех генов данно-
го семейства из полностью секвенированного генома (выбрав тот ге-
ном, который таксономически ближе к интересующему растению)
и дополнить выборку последовательностями гомологичных генов
растений, наиболее близких к интересующему виду (принадлежа-
щих к тому же роду, семейству или хотя бы к близкородственному
семейству). Затем применить процедуру выравнивания (alignment)
и найти участки, консервативные у всех гомологичных генов. За-
частую такой подход дает хорошие результаты, и праймеры, подо-
бранные на участки, консервативные у различных видов, дают чет-
кий и специфичный сигнал с (к)ДНК изучаемого вида. Вероятнее
всего, данные праймеры будут амплифицировать совокупность гомо-
логичных кДНК данного вида. На рисунке 1.6.2. Б показан пример
подбора праймера (одного из пары) для вида, у которого нуклеотид-
ная последовательность интересующих генов еще не была определена.
На основании сравнения доступных последовательностей предста-
вителей порядка Lamiales (Antirrhinum majus и Triphysaria pusilla)
и родственного порядка Solanales (Solanum lycopersicum, S. tuberosum
и Nicotiana plumbaginifolia), а также неродственных видов дву-
дольных и однодольных растений удалось подобрать праймеры, по-
зволившие успешно амплифицировать (к)ДНК генов Fe-СОД у еще
одного представителя порядка Lamiales — Salvia officinalis. Слу-
чаи, когда последовательности ДНК гомологичных генов настолько
вариабельны у разных организмов, что не удается найти достаточно
протяженных консервативных участков, очень редки, но все же
встречаются. В таком случае лучше или отказаться от анализа дан-
ного гена у данного растения, или попытаться установить последо-
вательность с привлечением других методов (например, ДНК-ДНК
или ДНК-РНК гибридизации).
Если праймеры подбираются для неизвестной последователь-
ности, то обязательно следует определить последовательность нук-
леотидов ампликона и доказать, что он действительно соответствует
участку искомого гена.
Использование интронов
При подборе праймеров стоит вспомнить еще один полезный под-
ход. Как известно, многие гены имеют мозаичную или прерывистую
структуру: в них кодирующие участки (экзоны) прерываются неко-
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
85
500 нт
400 нт
Рис. 1.6.3. Амплификация консервативного участка семейства генов ак-
тина кукурузы
дирующими вставками (интронами). После транскрипции участки
интронов удаляются посредством механизма сплайсинга РНК, и
зрелая РНК уже не содержит этих последовательностей. В ядерных
генах растений подавляющее большинство интронов имеют неболь-
шой размер (100-150 п.н.) [2]. Включение сайта сплайсинга в ам-
пликон оказывается очень полезным, поскольку позволяет, несомнен-
но, отличить ПЦР-продукт с геномной ДНК (который будет больше по
размеру за счет присутствия интрона) от продукта амплифика-
ции кДНК (меньшего размера, т. к. интрон из РНК был удален)
(рис. 1.6.3). Такой подход дает уверенность в том, что данный
ПЦР-продукт получен действительно и только с кДНК, а не явля-
ется результатом загрязнения препарата РНК остатками геномной
ДНК. Даже если в препарате есть следы геномной ДНК, то такой
ПЦР-продукт будет отличаться по размеру. Это особенно актуально
для генов-регуляторов с относительно низким уровнем экспрессии.
Включить в ампликон сайт сплайсинга РНК удается гораздо чаще,
чем в половине случаев (точнее — в 80-90% случаев). Более того, это
возможно даже для неизвестных последовательностей. Расположение
многих интронов консервативно у различных растений, а иногда —
даже у растений и животных. И если в соответствующих участках
гомологичных генов есть интрон, то, скорее всего, он будет и в иско-
мом гене анализируемого растения. Подтвердить это можно будет,
определив нуклеотидную последовательность ампликона.
Подбор праймеров
После того как определились с тем, на какие именно участки генов
следует подбирать праймеры, можно обратиться к программе по под-
86 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
бору праймеров. Такие программы существуют, в том числе и в сво-
бодном доступе на некоторых Интернет-сайтах. Так на сайте NCBI
доступна программа Primer-BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/tools/
primer-blast/), на сайте Invitrogen — OligoPerfect™ Designer
(http://ru.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-
Services/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-
Expression-Prof iling/Oligonucleotide-Design/Primer-Design-
Tools .html?), на ряде сайтов доступна программа Primer3 (напри-
мер, biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi или frodo.
wi.mit. edu .primer3/). Можно пользоваться и коммерческими про-
дуктами, например программой Primer Design, входящей в пакет
программ Vector NTI Suite. Работа с каждой из этих программ имеет
свои особенности, поэтому имеет смысл ограничиться изложением
принципиальных моментов.
Сначала следует загрузить последовательность кДНК (полную
или частичную) и задать границы для подбора праймеров. Все вы-
шеуказанные программы позволяют задать большое количество па-
раметров, которые будут учитываться при подборе последователь-
ностей праймеров. По умолчанию, для всех этих параметров обычно
заданы какие-то значения. Начинающему пользователю не следует
заниматься переформатированием всех параметров поиска, а ограни-
читься лишь некоторыми, наиболее важными, о которых речь пойдет
ниже [3-9].
Размер ампликона
Для полуколичественного ОТ-ПЦР оптимальным является ПЦР-про-
дукт размером 200-500 п.н. Для ампликонов размером менее
150-200 п.н. трудно получить четкую и яркую полосу в 1-2% -м ага-
розном геле, а фрагменты более 500 п.н. избыточны по размеру (мо-
гут сказываться на относительной эффективности ПЦР), и точность
в определении их размера в агарозном геле снижается до+/- 50 п. н.,
что также способствует маскировке возможных неспецифичных
ПЦР-продуктов.
Температура отжига праймера(Тт)
При работе с программами обычно задают Тm праймеров от 55 до
60 °С, и получают праймеры, как правило, успешно работающие в
диапазоне 52-63 °С. Температуры плавления праймеров должны
быть как можно более близки и различаться не больше чем на 1-2 °С.
Однако из этих правил бывают и исключения, о чем подробнее будет
рассказано в следующем разделе.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция 87
Нуклеотидный состав
Как известно, GC-пары образуют три водородные связи и связыва-
ются между собой сильнее, чем АТ-пары, образующие только две во-
дородные связи. GC-богатые праймеры повышают риск неспеци-
фичного отжига в GC-богатых последовательностях. Поэтому опти-
мальное количество GC-пар должно быть чуть меньше половины
(40-45% , вполне возможно и 35-50%). В многочисленных руковод-
ствах рекомендуется использование праймеров с GC-составом от 40
до 60%. При этом имеет значение, как распределены GC-пары по
длине праймера. Важно, чтобы на З'-конце праймера не было преоб-
ладания GC-nap.
Длина праймеров
Стандартной считается длина 20 нуклеотидов (нт), но в литературе
можно встретить праймеры от 17 до 25 нт и больше. Все зависит от
конкретной последовательности. Для повышения специфичности
может быть полезно несколько уменьшить содержание GC (до 40% и
ниже) и увеличить длину праймеров до 21-22 нт. Иногда в праймер
вводят «довесок», дополнительную последовательность (6-10 нт),
которая некомплементарна соответствующей ДНК, однако необхо-
дима для каких-то целей. Например, при конструировании генети-
ческих векторов таким способом вводят сайты рестрикции, сайты
сплайсинга белков, сайты для дополнительных праймеров. Это
удлиняет праймер(ы). Такое расширение нужно задать программе,
и она может найти участки, где некоторые нуклеотиды требуемого
расширения будут соответствовать последовательности амплифици-
руемой ДНК. В случае «довеска» температуру отжига следует рас-
считывать только для той части праймера, которая комплементарна
ДНК-матрице.
Величина диапазона параметра
Каждый из перечисленных параметров можно задать в некотором
диапазоне. Чем уже диапазон, тем более сходны будут праймеры и
тем меньше потенциальный набор вариантов. Поэтому можно начи-
нать с минимального различия, а затем расширять диапазон. Наи-
более важно, чтобы праймеры имели максимально близкую тем-
пературу отжига, что может быть достигнуто при разной длине и
GC-составе праймеров. В любом случае, в первую очередь програм-
ма будет выдавать те пары праймеров, которые имеют минимальное
различие по Тт.
88 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Выбор параметра оценки связывания праймера с ДНК
Кроме температуры (Тт), программа рассчитывает энтропию (AS),
энтальпию (АН) и свободную энергию Гиббса (AG). Из этих парамет-
ров при подборе праймеров полезно учитывать в первую очередь
температуру плавления и свободную энергию Гиббса. Нормальный
интервал для праймера — это AG от -30 до -34 ккал/моль, для
З'-конца из 7 нт — от -10 до -12 ккал/моль.
3'-конец
К этому концу присоединяется ДНК-полимераза и начинает достраи-
вать нить ДНК, поэтому этот конец праймера наиболее важен для
взаимодействия и специфичности связывания. Программы позво-
ляют отдельно рассчитать параметры связывания З'-концов прайме-
ров (можно задать размер З'-конца, например, 7 последних нт) и вы-
брать — какие именно нуклеотиды могут находиться в последних
позициях. Обычно я исключаю из последних двух позиций G и С
нуклеотиды, чтобы уменьшить силу связывания этой части прайме-
ра с матрицей и вероятность неспецифичного отжига. Оптималь-
ным, на мой взгляд, является праймер с довольно высокой силой
связывания за счет нуклеотидов 5'-конца и центра и более слабо свя-
зывающимся З'-концом. Такой тип праймера позволяет вести реак-
цию при высоких температурах, что сильно затрудняет неспеци-
фичный отжиг одной только З'-части. В случае же неспецифичного
отжига праймера без отжига З'-конца присоединение ДНК-полиме-
разы и элонгация праймера становится невозможной.
Палиндромы и шпильки и повторы
Поскольку праймер — однонитевая молекула ДНК, он может обра-
зовывать двунитевые структуры в пределах одной молекулы (шпиль-
ки) или с другой молекулой праймера того же типа или парного ему.
Следует избегать праймеров, образующих достаточно стабильные
шпильки или димеры, с AG выходящими за пределы -5-7 ккал/моль.
Для этого молено воспользоваться доступными программами, напри-
мер по адресу http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/
OligoAnalyzer/. Такие структуры обычно легко разрушаются на
стадии начальной денатурации ДНК, и их можно не учитывать, но в
некоторых случаях они могут создавать определенные трудности.
Если не использовать ДНК-полимеразу, активную исключительно
при высоких температурах (так называемую hot start полимеразу,
которую нужно прогревать для активации), то реакция может идти
и при комнатной температуре, хотя и с низкой эффективностью.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
89
В микропробирке для ПЦР есть немного ДНК и очень много
праймеров. Если праймеры отжигаются друг на друга так, что их
З'-концы остаются неспаренными, то это не приведет к их модифи-
кации. Однако если З'-конец праймера образует прочный комплекс
с другим праймером таким образом, как это показано на рис. 1.6.4
(А-Г), то ДНК-полимераза может достраивать этот З'-конец. Полу-
ченное расширение вряд ли будет соответствовать той последова-
тельности, для которой исходно предназначен праймер, зато может
соответствовать какой-либо другой последовательности в геноме
или в препарате кДНК. Такие праймеры снизят эффективность син-
теза целевого ампликона и могут приводить к появлению неспеци-
фичных продуктов. К сожалению, широко используемые програм-
мы расчета параметров праймеров не учитывают эту возможность.
Поэтому вероятность гибридизации и удлинения З'-концов прихо-
дится просчитывать самостоятельно.
Следует также избегать монотонных последовательностей из мо-
нонуклеотидов. Повторы одного нуклеотида неприятны тем, что точ-
но соответствующие монотонные последовательности (типа ТТТТТ)
в геноме встречаются чаще, чем немонотонные (типа TGCAT). Также
на монотонных последовательностях возможно «проскальзывание»
праймеров (рис. 1.6.4, Д-Е). Таких повторяющихся мононуклео-
тидов в праймере должно быть не более четырех (лучше трех).
GC-состав ампликона
Если планируется использовать ампликон в качестве гибридизаци-
онного зонда, то важен его GC-состав. Нужное значение или диапа-
зон состава также можно задать при выборе праймеров.
Кроме того, во всех программах можно ввести ранее выбранную
последовательность одного праймера и подобрать для него парный.
Особенностью программы подбора праймеров в комплексе Vector
NTI является то, что она сначала выбирает один смысловой праймер
и перебирает все возможные варианты антисмысловых праймеров.
Только потом переходит к следующему варианту смыслового прай-
мера, причем зачастую этот новый отличается всего на один нуклео-
тид от первого. Поэтому если эта последовательность не устраивает,
то лучше сократить зону подбора праймера с 5'-конца последова-
тельности, чтобы программе пришлось искать действительно новый
смысловой праймер.
Выбранные последовательности праймеров можно сравнить с ге-
номом или со всей совокупностью известных последовательностей
организма, с которым предстоит работать. Это можно сделать при
помощи программы BLAST (см. раздел 1.7). Поскольку праймер мо-
жет отжигаться на участках, отличающихся на несколько нуклеоти-
90 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.6.4. Достраивание последовательностей праймеров ДНК-полиме-
разой при гибридизации их З-'концов (А-Г) и эффект «проскальзывания»
праймера в неспецифичном сайте гибридизации на монотонных последо-
вательностях (Д-Е). (А) Гибридизация праймеров. (Б) Результат достраи-
вания праймера. (В) Гибридизация праймера с целевой последовательнос-
тью в геноме (или на кДНК) и отсутствие взаимодействия с ДНК-полиме-
разой из-за неспаривания З'-концевых нуклеотидов. (Г) Гибридизация
расширенного праймера с непредусмотренной последовательностью в ге-
номе за счет удлинения З'-конца. + — вариант с нематричным присое-
динением А при образовании «тупых» концов, характерно для ДНК-по-
лимераз, лишенных 3' —> 5'-корректирующей активности (например,
Тaq-полимеразы). Достроенные последовательности праймеров выделены
подчеркиванием. Для праймеров использована одна и та же последова-
тельность, т. е. схематично показано, как могут гибридизоваться две оди-
наковые однонитевые молекулы. (Д), (Е) Гибридизация праймеров в не-
специфичных сайтах со сходными блоками последовательностей.
Комплементарные блоки последовательностей выделены серым фоном.
Последовательности совпадающих последовательностей немонотонны (Д)
или монотонны (Е). Для удобства восприятия отмечен только 5'-конец, соот-
ветственно, противоположный конец — это З'-конец. На рисунке крест обо-
значает неспособность ДНК-полимеразы связываться и вести элонгацию с
дов, то подобрать абсолютно уникальный праймер довольно сложно.
Однако полезно убедиться, что праймер не совпадает с семействами
последовательностей, широко распространенными в геноме.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
91
Отработка условий ПЦРдля пар праймеров
После того как выбраны последовательности для праймеров и синте-
зированы сами праймеры, надо убедиться в том, что они работают,
причем должным образом: дают целевые ДНК-продукты нужного
количества и размера и не дают неспецифичных продуктов. Жела-
тельно сначала опробовать праймеры, используя в качестве матри-
цы стабильный и проверенный препарат ДНК. В этом случае, если
сигнала не будет, то будет понятно: что-то не то с праймерами (до-
вольно редко, но бывают ошибки при их синтезе) или с условиями
ПЦР. Например, из полдюжины пар праймеров, подобранных по
одинаковым критериям, все пары, кроме одной, работали в сходных
условиях, но одна пара вообще не давала ПЦР-продуктов с геномной
ДНК. Пришлось снизить температуру отжига праймеров на 10 °С,
и только после этого реакция пошла. А для работы с к ДНК пришлось
ее снизить еще на 4 °С. Кроме того, все праймеры имеют свой диапа-
зон рабочих температур. Обычно этот диапазон составляет 5-10 °С,
но бывают и исключения. Например, стандартные праймеры М13
работают в диапазоне температур около 20 °С, а праймеры McFer поз-
воляли получить ПЦР-продукт в диапазоне всего 2-3 °С (рис. 1.6.5),
и этот диапазон важно было не пропустить. В таких случаях работа с
проверенным препаратом ДНК придает уверенности и не позволяет
преждевременно списать пригодные праймеры.
Если сигнал есть и обнаруживается ампликон нужного размера,
то можно либо продолжать отработку условий реакции на геномной
ДНК, либо сразу переходить к работе с кДНК. Набор неспецифич-
ных полос, получаемых при помощи одной пары праймеров с геном-
ной ДНК и с кДНК, может не совпадать, но обычно условия, подо-
бранные на геномной ДНК, оказываются близки к условиям, необ-
ходимым для работы с кДНК (рис. 1.6.3).
М13 McFer
Рис. 1.6.5. Зависимость синтеза ПЦР-продуктов от температуры на ста-
дии отжига праймеров для различных пар праймеров: стандартные прай-
меры М13 и праймеры McFer. Фотография ПЦР-продуктов праймеров
McFer любезно предоставлена к. б. н. Ешинимаевой Б. Ц.
92 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Как правило, в результате ПЦР требуется получить только один
целевой ампликон и, соответственно, одну полосу в геле (если речь
идет не о мультиплексной ПЦР). Однако часто после первой реак-
ции в геле обнаруживается несколько полос. Как это расценивать?
Первое и самое вероятное — синтез неспецифичных ПЦР-продук-
тов, количество которых иногда может делать незаметным целевой
продукт. Но это не единственная возможность. ДНК может образо-
вывать вторичные структуры, что влияет на подвижность таких мо-
лекул в геле (обычно они идут быстрее). Обычно стабильные вторич-
ные структуры образует небольшая доля молекул, и они дают полосы,
отличающиеся по подвижности от основной полосы. В ряде случаев
прогревание (65-70 °С 10 мин) помогает привести все ампликоны к
единой конформации. Еще одна возможность связана с присутстви-
ем интронов. Если праймеры подобраны на консервативный учас-
ток семейства генов, то ампликоны представляют несколько разных
гомологичных генов. В одних из них интрона может не быть вообще,
в других он есть (как вы и рассчитываете), а в-третьих — интрон
значительно увеличен в размерах или их два. В этом случае после
ПЦР с ДНК будет наблюдаться набор полос, а с препарата кДНК (где
все интроны удалены) — только одна. Довольно редко, но все же воз-
можно неудаление интрона из РНК, что приведет к возникновению
дополнительной полосы после ПЦР с кДНК. Однако эту возмож-
ность стоит рассматривать в последнюю очередь. Чаще дополнитель-
ная полоса ампликона большего размера может свидетельствовать о
загрязнении препарата кДНК геномной ДНК (см. выше).
Если все же дополнительные полосы являются результатом от-
жига праймеров в непредусмотренных сайтах и синтеза нежелатель-
ных ампликонов, то как с этим бороться. Существует несколько под-
ходов.
1. Увеличить температуру отжига праймеров. Это самый общий
и результативный подход (рис. 1.6.6.А). Именно с него следует
начинать. Однако следует помнить, что иногда этот подход не-
эффективен.
2. Уменьшить температуру отжига праймеров. Парадоксально,
но иногда срабатывает этот подход. В некоторых случаях с рос-
том температуры количество целевого ПЦР-продукта уменьша-
ется, а количество неспецифичных ампликонов не изменяется
(рис. 1.6.6.Б). В иных случаях при увеличении температуры по-
является неспецифичный продукт, а специфичный ампликон
исчезает (рис. 1.6.6.В). С точки зрения теории ПЦР, этот фено-
мен трудно объяснить, но на практике к этому тоже надо быть
готовым.
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
93
3. Уменьшить концентрацию ионов в реакционной смеси. В
этом случае ДНК-полимераза будет слабее взаимодействовать с
ДНК, особенно с теми дуплексами, где праймер не идеально свя-
зан с нитью ДНК (т. е. в месте неспецифичного отжига). Произ-
водители, наряду с обычным буфером для ПЦР, предлагает бу-
фер без Mg и раствор солей Mg. Однако следует учитывать, что в
таких условиях, возможно, придется уменьшить температуру
отжига праймеров, чтобы получить сигнал достаточной силы
(рис. 1.6.7).
4. Уменьшить время отжига праймеров. Это еще один довольно
простой и нередко эффективный способ предотвращения неспе-
цифичного отжига праймеров. На современных амплификато-
рах, обладающих алгоритмом расчета динамики температуры
внутри пробирки, для отжига многих пар праймеров бывает
достаточно 5 с (рис. 1.6.8). Правда для некоторых пар и 10 с бы-
вает недостаточно. Я пока не встречал такой пары праймеров,
которой в режиме расчета температуры внутри пробирки для
отжига было бы недостаточно 15 с.
5. Уменьшить число циклов. На завершающих циклах рост неспе-
цифики (если ее гораздо меньше) может идти все еще в геомет-
рической прогрессии, тогда как специфичный ампликон, буду-
Рис. 1.6.6. Изменение спектра ПЦР-продуктов с изменением температу-
ры на стадии отжига праймеров. Праймеры: (A) ZmCaf2 S/AS. (Б) rpl2
94 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Рис. 1.6.7. Изменение спектра ПЦР-продуктов с изменением концентра-
ции Mg 2+. Праймеры к межгенному спейсеру между генами rrnl8 и rrn26
ячменя. Показаны параметры ПЦР для каждой реакции: температуры
отжига праймеров (сверху) и концентрации MgCl2 (снизу); все ПЦР-про-
дукты по одну сторону от маркера получены при одинаковой концен-
трации MgCl2. В стандартных буферах для Таq-полимераз различных
производителей концентрация MgCl2 обычно варьирует в диапазоне
1,5-2,5 мМ. Стрелка указывает на специфичный ПЦР-продукт. Фотогра-
фия любезно предоставлена профессором Кузнецовым В. В.
petB
rpl2
Рис. 1.6.8. Изменение спектра ПЦР-продуктов с изменением времени от-
жига праймеров. Праймеры: крайняя дорожка справа — petB S/AS, все
остальные — rpl2 S2/AS. Стрелки указывают на специфичный ПЦР-про-
дукт. Время отжига праймеров: 5" = 5 с
чи в избытке, прирастает только в арифметической прогрессии.
А это неминуемо приводит к росту доли неспецифичных фраг-
ментов.
6. Устранить влияние контаминации. В некоторых случаях ис-
точник неспецифики может привноситься извне. Так, напри-
мер, при работе с генами бактериального происхождения (мно-
гие гены белков митохондрий и пластид), особенно с высоко
консервативными, источником контаминации может быть ДНК
Раздел 1.6. Полимеразная цепная реакция
95
бактерий, обитающих на нашей коже (особенно рук) и волосах.
При высокой температуре бактериальные клетки легко разру-
шаются, их ДНК выходит из клеток и участвует в реакции.
7. Поставить реакцию на другом амплификаторе с улучшенны-
ми параметрами перехода между стадиями цикла.
8. Подобрать новый праймер. Если не удается избавиться от не-
специфики другими средствами, то нужно подбирать праймеры
заново. Но если нет серьезных подозрений в том, что неудачна вся
пара, то для начала можно заменить только один из праймеров.
Что делать, если после первой реакции вообще нет ПЦР-продук-
тов? Во-первых, проверить, не было ли ошибки в постановке реак-
ции и все ли необходимые компоненты реакционной смеси оказа-
лись в пробирке. Для этого всегда полезно иметь положительный
контроль, где к реактивам добавляются проверенные ДНК (плазми-
да) и праймеры, которые заведомо обеспечивают ПЦР. Следует убе-
диться в том, что препарат матричной кДНК пригоден для ампли-
фикации. Во-вторых, можно поварьировать температуру отжига
праймеров. Для этого полезно воспользоваться амплификатором,
способным создавать температурный градиент. Главное — не про-
пустить подходящую температуру, если данные праймеры работают
в очень узком диапазоне (рис. 1.6.3). В-третьих, можно увеличить
время для отжига праймеров, хотя иногда полезным может оказать-
ся уменьшение этого времени. Если ожидаемый ампликон очень
большой (>> 2 т.п.н.), то можно попробовать увеличить время син-
теза или воспользоваться ДНК-полимеразой типа «long reading».
Подбирая условия ПЦР, следует помнить общее правило: при
повышении температуры отжига снижается неспецифика и немно-
го уменьшается выход целевого ампликона. Но это правило может и
не сработать, поэтому следует быть готовым проявить гибкость
мышления и твердость духа в подборе экспериментальных условий.
Если опыт показывает, что пара праймеров постоянно работает не-
эффективно (слабый сигнал целевого продукта и много неспецифич-
ных продуктов, которые не убираются), то следует подобрать новый
праймер(ы). Усилия, реактивы и время, потраченные на подбор
уникальных условий амплификации, могут стоить гораздо дороже,
чем заказ нового праймера.
Литература
1. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/
1993/mullis-lecture.html
2. Yu J., Ни S., Wang J. et al. A draft sequence of the rice genome
{Oryza sativa L. ssp. indica) // Science. 2002. V. 296. P. 79-92.
96 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
3. Mullis К. Б., Faloona F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a
polymerase-catalyzed chain reaction // Methods in Enzymology.
1987. V. 155. P. 335-350.
4. Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning: A laboratory manual.
3rd ed. N.-Y., Cold Spring Harbor: CSHL Press, 1999.
5. Ежова Τ. Α., Лебедева О. В., Огаркова О. Α., Ленин Α. Α., Солда-
това О. /Т., Шестаков С. В. Arabidopsis thaliana — модельный
объект генетики растений. М.: Макс Пресс, 2003.
6. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. Т. 1:
Генная и белковая инженерия. М.: Наука, 2004. 526 с.
7. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Сиб. унив. изд-во,
2004.
8. Altshuler M.L. PCR Troubleshooting: The Essential Guide Book.
Caister Academic Press, 2006.
9. PCR Troubleshooting and Optimization: The Essential Guide Book /
Eds. Kennedy S., Oswald N. Caister Academic Press, 2011.
1.7. СРАВНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК
И БЕЛКОВ
Ε. А. Лысенко
Введение
В настоящее время накоплена огромная информация о первичной
структуре многих нуклеиновых кислот и белков. Определена пол-
ная нуклеотидная последовательность генома человека, огромного
количества геномов бактерий. Экспериментальная биология растений
может «похвастаться» секвенированием геномов красной водоросли
Cyanidioschyzon merolae [1], зеленой водоросли Chlamidomonas
reinhardtii [2], мха Ρhyscomitrellapatens [3], однодольного растения
Oryza sativa [4], и нескольких двудольных растений: Arabidopsis
thaliana, тополя, винограда [5-7]. На стадии завершения находятся
еще несколько геномов растений. Для завершенных геномов пред-
сказаны последовательности кодируемых ими белков, делаются по-
пытки предсказания последовательностей микроРНК. Умение рабо-
тать с последовательностями генов и белков дает исследователю
большие возможности. В свободном доступе имеется целый ряд прог-
рамм, позволяющих работать с этими последовательностями. Да-
вайте рассмотрим, чем эти программы могут помочь и как с ними
работать.
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 97
Попарное сравнение. BLAST
Самым простым и распространенным подходом является попарное
сравнение последовательностей. Если вы получили (эксперимен-
тально или из базы данных) последовательность и пытаетесь понять
ее функциональное предназначение, то проще всего сделать запрос
на сравнение этой последовательности с имеющимися в базе дан-
ных. Программа сравнит эту последовательность поочередно с каж-
дой последовательностью в базе и выдаст наиболее сходные пары.
Если окажется, что анализируемая последовательность имеет наи-
большее сходство с 18S рРНК из разных организмов, то она явно
имеет отношение к РНК малой субъединицы эукариотической рибо-
сомы. Если самое большое сходство с последовательностью кукуру-
зы, то ваша последовательность, скорее всего, получена из этого
организма. Простой пример: моя коллега пыталась встроить в век-
тор известную последовательность пластидной ДНК ячменя. После
встраивания продукт был секвенирован, попарное сравнение с по-
следовательностями в базе данных показало, что полученная после-
довательность имеет самое большое сходство с ядерным геном куку-
рузы. Исследователь сделала определенные выводы, повторила про-
цедуру клонирования и получила правильный результат.
В настоящее время самой популярной программой для попарно-
го сравнения последовательностей является программа BLAST [8].
Ее название является аббревиатурой английских слов Basic Local
Alignment Search Tool (основной инструмент для поиска локального
сходства) и является омофоном другого английского слова — blust
(взрыв). Действительно, эффект от появления этой программы был
подобен взрыву. В настоящий момент большинство крупных банков
последовательностей дают возможность использовать BLAST для
работы со своим содержимым. Рассмотрим подробнее возможности,
предоставляемые наиболее популярным сайтом NCBI. Организация
сайта периодически меняется, но на главной странице (www.ncbi.
nlm.nih.gov) всегда можно найти «кнопку» «BLAST». В разделе
BLAST представлены несколько разновидностей программы: blastn —
для сравнения нуклеотидных последовательностей, blastp — для
аминокислотных последовательностей и еще три варианта, позво-
ляющих сравнивать нуклеотидные и аминокислотные последова-
тельности за счет превращения первых во вторые (т.н. виртуальная
трансляция). Внутри раздела blastn также есть три разных режима
работы: megablast для анализа наиболее сходных последовательнос-
тей, а также discontiguous megablast и blastn для работы с менее
сходными последовательностями. То же и в разделе blastp: blastp —
для работы с последовательностями с высокой степенью сходства, а
также PSI-BLAST и PHI-BLAST — для поиска мотивов, в которых
98 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
консервативны лишь отдельные аминокислоты в наиболее важных
положениях. Для рутинного сравнения своей последовательности с
содержимым банка данных следует использовать megablast или
blastp.
Работа со всеми вариантами BLAST очень сходна. Сначала нуж-
но загрузить последовательность, или файл с последовательностью,
или ввести идентификационный номер (ID) этой последовательнос-
ти. Далее эта последовательность будет называться «Query» («за-
прос»), а сравниваемые последовательности из банка — «Sbjct». Для
поисков в нуклеотидных последовательностях необходимо указать,
следует ли вести поиск среди последовательностей человека, мыши
или остальных. По умолчанию всегда задан поиск в последователь-
ностях человека. В остальных разновидностях BLAST этого делать
не нужно. Собственно, после этого можно найти кнопку «BLAST»,
нажать на нее и начать разбираться с результатами. Однако прог-
рамма предоставляет еще ряд полезных функций.
Во-первых, можно выбрать, в каком подразделе банка последо-
вательностей следует вести поиск. Так, для нуклеотидных последо-
вательностей поиск можно проводить в более чем 10 подразделах, из
которых наиболее полезными являются «nucleotide collection» (все
аннотированные последовательности нуклеотидов, задается по умол-
чанию), «reference mRNA sequences» (только последовательности
мРНК/кДНК), «NCBI Genomes (chromosome)», (только полные по-
следовательности хромосом), expressed sequenced tags (означает: все,
что экспрессируется, любая последовательность РНК). Когда можно
ожидать большое количество результатов, удобно ограничить поиск
(только мРНК, только хромосомы). Например, ограничить поиск
разделом «NCBI Genomes (chromosome)» бывает полезно, если ста-
вится задача понять, сколько гомологов интересующего гена имеет-
ся в геноме модельных видов растений (арабидопсиса, риса и др.).
Вы получите для каждого хромосомного локуса только один резуль-
тат (сравнение). При поиске в общей базе будет найдено огромное
количество геномных последовательностей, полученных разными
исследователями и многократно дублирующими друг друга; вы по-
тратите много времени, пытаясь свести максимальное число после-
довательностей к минимальному числу реальных генов.
Во-вторых, можно ограничить круг организмов, последователь-
ности которых будут использованы для сравнения, например одним
видом или группой организмов (родом, семейством или любым
крупным таксоном без ранга, например «asterids (taxid:71274)»,
«Viridiplantae (taxid:33090)», «plants (taxid:3193)», «Eukaryota
(taxid:2759)»). Если нужно уточнить, насколько уникальна данная
последовательность для одного конкретного организма, то нет нуж-
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 99
ды тратить время на тщательный просмотр огромного листа резуль-
татов сравнений с гомологичными последовательностями других
растений (или даже бактерий). Еще одно применение: нужно пред-
ставить, какой может быть последовательность, отсутствующая в
базах данных. Для этого следует собрать гомологичные последова-
тельности из таксономически наиболее близких организмов. Удоб-
нее всего бывает взять в качестве «запроса» хорошо изученную по-
следовательность A. thaliana и ограничить поиск сначала интересу-
ющим родом, а потом постепенно расширять поиск, пока не будет
собран достаточный набор последовательностей. В таких случаях
бывают полезны некоторые знания по систематике, которые можно
пополнить на этом же сайте в разделе Taxonomy (www.ncbi.
nlm. nih. gov/ taxo_Hl127102837 6nBM_l_omy). Недавно данная опция
была расширена: теперь можно ограничить поиск несколькими так-
сонами разного ранга и можно указать, какие виды или таксоны
следует исключить из анализа (например, нужно сделать обзор од-
ной последовательности у широкого круга двудольных и не утонуть
в вале последовательностей A. thaliana).
Кроме того, есть еще ряд возможностей. Можно указать, какой
район использовать для сравнения. Например, можно загрузить пол-
ную последовательность мРНК, но поиск ограничить только зоной,
кодирующей белок. Можно дать название данному поиску. Для ва-
риантов BLAST, позволяющих сравнивать нуклеотидные и амино-
кислотные последовательности (blastx, tblastn, tblastx), можно вы-
брать вариант генетического кода, который будет использован для
виртуальной трансляции (превращения последовательности нук-
леотидов в последовательность аминокислот); по умолчанию задан
стандартный генетический код. Можно включить функцию «Align
two or more sequences» (сравнить две и более последовательности), и
тогда программа даст возможность сравнить между собой попарно
последовательности, заданные вами. Можно включить функцию
«Show results in a new window» (показать результат в новом окне),
что очень удобно: пока BLAST осуществляет поиск в банке дан-
ных, можно задать новый поиск. Наконец, можно открыть раздел
«Algorithm parameters» (настройки), но без представления о меха-
низме работы программы BLAST не стоит изменять настройки, за-
данные по умолчанию.
Теперь можно найти кнопку «BLAST» и нажать на нее. Прог-
рамма попросит подождать, пока не закончится поиск. Чем уже
круг анализируемых последовательностей, тем быстрее завершится
поиск. Затем программа представит результат анализа. В получен-
ной информации можно выделить две смысловые части: собственно
сравнения последовательностей, буква к букве (рис. 1.7.1), и не-
100 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
>Г1аЬпIAK331374.1I Ш Triticum aestivum cDNA, clone: WT007_F11, cultivar: Chinese Spring
Length=1351
Score = 1179 bits (638), Expect = 0.0
Identities = 887/1004 (88%), Gaps = 29/1004 (2%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 ATGGCAGCATCGCTCCAAGCCGCGGCCACCCTGATGCAGCCGGCCAAGCTCGGCGGCCGG 60
I I II I I I I II I I I I II I I III Μ II I I I I I I I I II I I I II I I I I II I I I I I I I
Sbjct 45 ATGGCAGCGTCTCTCCAAGCCGCGGCCACGCTGAT GCCGGCCAAGATCGGCGGCCGG 101
>l~lemb| CAA75859.il Sigl [Sinapis alba]
Length=481
Score = 816 bits (2108), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust.
Identities = 425/508 (83%), Positives = 448/508 (88%), Gaps = 33/508 (6%)
Query 1 MATAAVIGLNTGKRLLSSSFYHSDVTEKFLSVNDHCSSQyHIASTKSGITAKKASNYSPS 60
MAT AVIGLN GKRLLSSSFY+SDVTEKFLSVND CSSQYH T+SGITAKK S+ S S
Sbjct 1 MATTAVIGLNAGKRLLSSSFYYSDVTEKFLSVNDLCSSQYH TRSGITAKKTSSSSSS 57
Рис. 1.7.1. Попарное сравнение последовательностей программой BLAST.
Сверху приведен фрагмент сравнения нуклеотидных последовательнос-
тей, снизу — аминокислотных. Каждое сравнение начинается с иденти-
фикационного номера последовательности из банка данных (Sbjct), срав-
ниваемой с последовательностью—запросом (Query); нажав на этот номер,
молено перейти на страницу с полным описанием этой последовательнос-
ти. После идентификационного номера следует краткое описание после-
довательности (включая вид-источник и размер последовательности).
Ниже — статистические данные, описывающие сходство последователь-
ностей в данной паре (пояснения в тексте). Еще ниже — первые строки вы-
равниваний: цифры обозначают порядковый номер «буквы» в последова-
тельности; между идентичными нуклеотидами проведена вертикальная
черта, между идентичными аминокислотами стоит та же самая «буква»,
между аминокислотами со сходными химическими свойствами амино-
кислотных остатков стоит знак « + »; разрыв последовательности обозна-
чен знаком «-». На выравнивании нуклеотидов разрыв имеет протяжен-
ность 3 нуклеотида, что характерно для вставки/делеции одного кодона
без сдвига рамки считывания; на выравнивании аминокислот разрыв так-
же состоит из 3 аминокислот, что не имеет принципиального значения
сколько интегральных оценок, позволяющих сравнить степень схо-
дства внутри каждой пары. Самый простой и привычный способ
оценки — определение процента сходства последовательностей —
обладает важным недостатком: он не учитывает, насколько протя-
женно сходство. 100% -е сходство 20 нуклеотидов дает гораздо мень-
ше оснований для выводов, чем 90%-е сходство 300 нуклеотидов.
Кроме того, BLAST исключает участки с низким сходством; если
за этим участком находится последовательность со 100%-м сход-
ством, но очень короткая, то она тоже будет исключена. Во многих
парах сравнение начинается не с первой буквы и может заканчи-
ваться задолго до последней (в таблице, приводимой вначале, для
каждой пары указывается доля покрытия — Query coverage). Поэто-
му более информативны два интегральных показателя, учитываю-
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 101
щих процент и протяженность сходства: Score (баллы) и e-value. Па-
раметр e-value (представляется в виде Ye-X, подразумевается Y.e-x,
например 2е-90 = 2.е-90) показывает, какова вероятность того, что
сходство данных последовательностей случайно. Иными словами,
какова вероятность того, что две столь сходные последовательности
могли возникнуть независимо друг от друга, а не произошли от об-
щей предковой последовательности. Чем выше степень сходства и
чем оно протяженнее, тем больше баллов (Score) получает пара, и
тем меньше для нее показатель e-value (для очень сходных последо-
вательностей e-value = 0). За пределами таблицы значения e-value
представляются как «Expect» (ожидаемая вероятность события).
Каждое парное выравнивание начинается с идентификационно-
го кода (ID) сравниваемой последовательности (Sbjct), нажав на ко-
торый можно перейти к странице этой последовательности. Иногда
таких кодов бывает много. В таких случаях объединяются одинако-
вые последовательности, помещенные в банк разными авторами под
разными ID.
Сравнивая последовательности нуклеиновых кислот, програм-
ма показывает, в каком направлении производилось выравнивание.
Если обе последовательности выравнивались в одном и том же на-
правлении, то это обозначается как «Strand=Plus/Plus». Если по-
следовательности оказываются комплементарны друг другу, то для
выравнивания одна из них «переворачивается», т. е. заменяется на
комплементарную самой себе. NCBI BLAST «переворачивает» по-
следовательность из базы (Sbjct), что обозначается как «Strand =
= Plus/Minus»; при этом нумерация нуклеотидов в «перевернутой»
последовательности сохраняется и идет от конца к началу. В других
базах BLAST может «переворачивать» и последовательность-запрос
(Query).
При сравнении последовательностей белков в суммарную статис-
тику включают как процент идентичных (Identities), так и процент
близких по своим свойствам аминокислотных остатков (Positives).
Сравнивая степень консервативности белков, полезнее ориентиро-
ваться на последний показатель.
Кроме формальных показателей существует еще ряд соображе-
ний, которые полезно учитывать. В процессе эволюции в последова-
тельностях накапливаются мутации, в том числе инсерции (встав-
ки) и делеции (удаления). Поэтому, чтобы корректно выровнять две
последовательности относительно друг друга, иногда приходится
вводить разрыв (gap) в одну из последовательностей. Обычно разрыв
обозначают знаком «-». При парном сравнении разрыв означает,
что либо в одной из последовательностей произошла инсерция, либо
в другой последовательности произошла делеция; для таких неопре-
102 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
деленных ситуаций придуман термин «индель» (инсерция или деле-
ния), добиться определенности можно проведя множественное вырав-
нивание. При попарном выравнивании последовательностей нуклеи-
новых кислот иногда разрывы вводятся неоправданно. Например,
если в белок-кодирующей зоне в обе последовательности введено
по одному мононуклеотидному разрыву на небольшом расстоянии
(2-5 нуклеотидов), то, скорее всего, это ошибка программы. А если
разрыв введен в одной последовательности и число нуклеотидов в
нем кратно трем (3, 6, 9), то, скорее всего, это правильный резуль-
тат, отражающий индель одного или нескольких кодонов, и не при-
водящий к сдвигу рамки считывания белка. Количество и протя-
женность введенных разрывов учитывается в итоговой статистике
отдельно (Gaps).
Если последовательность запроса представляет кДНК, то, со-
поставляя ее выравнивания с последовательностями мРНК и хро-
мосомной ДНК одного и того же гена у одного организма, можно
точно определить положение интронов (если они есть).
Если вы пытаетесь идентифицировать последовательность из
организма, геном которого еще не идентифицирован полностью, то
следует внимательнее относиться к аннотациям и зонам идентич-
ности. Аннотация — это описание того, что представляет данная по-
следовательность, однако иногда описание ограничивается только
одной составляющей последовательности, которую авторы посчита-
ли наиболее интересной. Часто последовательность запроса имеет
сходство с найденной последовательностью (Sbjct) не на всем ее про-
тяжении, а только с какой-то ее частью. Под зоной идентичности ав-
тор подразумевает ту часть найденной последовательности, которая
имеет сходство с последовательностью запроса. Следует иметь в виду,
что зона идентичности может не совпадать с той частью последова-
тельности, название которой вынесено в аннотацию. Пример: после-
довательность запроса показала очень высокое сходство с несколь-
кими последовательностями фрагментов хромосомы кукурузы. Эти
последовательности («Sbjct») имели различные аннотации: «ретро-
транспозон типа Opie-2» (DQ186876), «некодирующий регион между
генами грЗ-1 и rp3-2t» (AY574035) и «псевдоген rpl26» (AY574035).
После проверки зон идентичности удалось установить, что последо-
вательность запроса имеет максимальное сходство с последователь-
ностью, находящейся в большом некодирующем регионе между ге-
нами грЗ-1 и rp3-2t, рядом с псевдогеном rpl26, и имеет несколько
меньшее (хотя и высокое) сходство с ретротранспозоном. Был сде-
лан вывод, что последовательность представляет транспозон друго-
го типа, расположенный рядом с псевдогеном rpl26 между генами
rpЗ-1 и rp3-2t.
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 103
В настройку программ могут быть включены различные фильтры,
в результате чего некоторые последовательности нуклеотидов могут
быть исключены из рассмотрения (все буквы заменены на N). В та-
ком случае, если вы попытаетесь сравнить последовательность саму
с собой, то получите сходство меньше, чем 100% . Еще одним источ-
ником отличий являются ошибки при секвенировании и внутриви-
довой полиморфизм, поэтому одни и те же последовательности из
разных источников вполне могут отличаться на 1% нуклеотидов.
При сравнении последовательностей белков NCBI BLAST в са-
мом начале приводит графическую схему консервативных доменов
в вашей последовательности.
Множественное выравнивание
После идентификации последовательности часто возникает задача
сравнить ее с последовательностями других гомологичных генов из
того же и/или других организмов. Для этого используют подход, на-
зываемый множественным выравниванием (multiple alignment). Как
и при попарном сравнении, последовательности не просто сопостав-
ляются, но выравниваются относительно консервативных мотивов
друг друга посредством введения разрывов нужной длины. При этом
если последовательности обладают более или менее высоким сход-
ством, то число неоправданных разрывов стремится к нулю, и всегда
можно понять, какое именно мутационное событие (инсерция или де-
леция) имело место. Множественное выравнивание позволяет понять,
какие участки у данной группы последовательностей эволюционно
консервативны, а какие изменчивы. Это бывает полезно как для тео-
ретических построений (анализа эволюции), так и для практичес-
ких целей (подбор участков для создания праймеров и антител).
Если нужно доказать, что вновь идентифицированная последова-
тельность принадлежит к какой-то группе последовательностей (на-
пример, к определенному семейству генов), то это тоже следует де-
лать при помощи множественного выравнивания.
Существует ряд программ для множественного выравнивания.
Одной из самых популярных является семейство Clustal (W, X, W2)
[9, 10]. Программа находится в свободном доступе на сайте авторов
(www.ebi.ac._Hlt27 0 934 328_Hlt27 0 934 32 9uBM_2_BM_3_k/_Hlt2
71028359tBM 4 ools/clustalw2); там же можно найти и другие
программы для множественного выравнивания. Еще одну програм-
му для множественного выравнивания предлагает NCBI (www. ncbi .
nlm.nih_Hlt2 7102 8 3 52.BM_5_gov/tools/cobalt/cobalt.cgi).
Кроме того, Clustal W может быть найдена и на других сайтах и вхо-
дит в пакет программ Vector NTI Suit. Она позволяет выравнивать
оба типа последовательностей (нуклеотидные или аминокислотные).
104 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
В разных вариантах программа имеет разный интерфейс, но во всех
вариантах довольно проста в использовании; на сайте EBI можно най-
ти наглядное и краткое объяснение того, как работать с программой
(www.ebi.ac.uk/2can/tutorial_Hlt27102 8344sBM_6_/nucleotide/
clustalwl .html). В оболочке Vector NTI программа выделяет цве-
том позиции с разной степенью консервативности (у всех, у больши-
нства, у многих), для белков учитывает сходство аминокислотных
последовательностей с разделением на сильное и слабое сходство,
позволяет редактировать полученное выравнивание «вручную».
Для работы в пакете Vector NTI нужно сначала ввести последова-
тельности нуклеотидов или аминокислот в персональную базу дан-
ных, затем (при помощи мышки и клавиш Ctrl или Shift) выделить
все последовательности для множественного выравнивания, на па-
нели управления выбрать раздел «Align», в нем — « AlignX — Align
Selected Molecules». Программа откроет новое окно с выбранными
последовательностями. Нужно снова выделить все последователь-
ности для множественного выравнивания; можно добавить последо-
вательности из других подразделов персональной базы, перетащив
их при помощи компьютерной мыши. Затем на панели управления
выбрать раздел «Align», в нем — «Align Selected Sequences» и про-
грамма выполнит выравнивание (рис. 1.7.2). На основании вырав-
нивания программа может конструировать эволюционное древо, от-
ражающее близость последовательностей и их эволюцию.
Отдельный вопрос — как подбирать последовательности для
множественного выравнивания. Здесь все зависит от постановки за-
дачи. Если впервые идентифицирована последовательность из дан-
ного организма и поставлена задача показать, какую роль она мо-
жет выполнять, то в множественное выравнивание нужно включить
два типа последовательностей. Во-первых, гомологичные последо-
вательности, для которых молекулярная функция продемонстриро-
вана экспериментально; во-вторых, гомологичные последователь-
ности (для которых молекулярная функция уже была предсказана
на основании такого же подхода) из таксономически наиболее близких
групп. Если выяснится, что последовательность принадлежит к се-
мейству генов, то можно перейти к задаче другого типа: проанализи-
ровать, к какому подразделу семейства она относится. Если семейство
не велико, то следует взять последовательности всех его представи-
телей. Если велико, то выбрать представителей основных подразде-
лов, определить к какому подразделу принадлежит интересующая
последовательность; сузив круг поиска, постараться сравнить с по-
следовательностями всех представителей подгруппы. Если семей-
ство очень велико и вариабельно, то может быть разумным ограни-
читься сравнением с последовательностями только одного модельного
вида (например, арабидопсиса или риса). Все же более информатив-
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 105
(ЗБЗ) 363 370 380 390 400 410 420 430 440
Aeig1(272)MSIACRYD—HLGAEHS LV G-Ll URC-IEK"DSSKGFRTS "VW ' RQGVSRAbVOHSRrbRL"'THbHERbGLIRKAKLRL
OsSig1(289)lSIA,KiD---HLG¥EJ,A LI.6 II LiRGIEK DfcSRGFRiS .7 TO" .RQ6¥SRM,AE1SK"1TRL■ TYbHERblAIRGAKYEI..
AtSig4(1S2)VSIATG7C —GKGLHLQ- LIE SI LbRGAER "0?Г«6ИС,3 "7?W :"KQAILRAXAe;KSRbVKL" GSIKJELTAKVAEASKVL·
AlSig2(345)lSIAKHVC—GAGMbQ -LV E; CR LVRGAEK O&TKGFKFS ffl(J KQAWKSLSDQSRHIRL1 FHHyEATYRVKEARKQL
0$Sig2A(336)lSIAREFE—-GPGffiLY LI £. HQ L1RGAEK DftSKGFRFS SHU KQAKRKSTSEQS.Jli'P.L: AHMVEASYRVKEk" IKRL.
OsSig2B(312JlSIAKEFE —GPGKE^S LI Ε IQ LVRGAEK 0&SKGFRFS" " SffiJ ' KQAIRKSVLSffl· JIIRL" AHHAEASSRVKECRKRL.
ASig3P45)tFi.ARKYR—gugiahe li a yv VbjGAER dhtrghcfs 7; у :RK8Hsnws:-: HARGfKi's55Iiptih;;io>:arktl:
OsSig3-M(332)KYIARTYAG--»'~IiG7fi'E Lb А КИ WiGAEK DSOKGCKFS 7Ι·Τ RKAMLa,LbAEMSG?lC-Ll ARHEGIXRKVREAPRAI'
AlSig5(292)bFI?ffi;K,i-FHEFrHG?i<;7a LC A MR LITAIBK E'^RKFRi.S 'ИГ RHAIIRSHTTSK-FTRVi FGLEiiVRVEIYKAiCEL"
0$Sg5P76)LYrriKYYPDMSH; £R:'I> 1С A AH LITAIDR E'VRGFRTS ALF ' R|!SIVRAT!'L:;!-;-F.-R:·· FME7ERC«i:7ARi:EL
AlSig6J320)VHIAKuYQ~ —MRGWIFQ Lb E"SI LffiC7"EK !■::■'·ijJGCRFfe 7»W RQSIRKSlPjiSRTIRL' SIW'fHLbGKVSEAPJCTC
OsSigBP46)lHVARKYEG---YGLDIQ LY : CS LffiCTTEK ;.TSKGCRF7 AVU RQSIKKSIFKISPS,IRL, ESVYALbRKVGXilRMEC
Consensus(363) ISIAR Υ GL L DLIQEG IGLLRGAEKFOASKGFRFSTYA'fb'WIRGAI KSXAEMSRIIRLP Η Ε L KVKE&RK L
Рис. 1.7.2. Фрагмент множественного выравнивания последовательнос-
тей программой Clustal W в пакете Vector NTI. Слева указаны названия
выравниваемых белков, за ними цифры, обозначающие порядковый но-
мер представленной рядом аминокислоты в этой последовательности;
цифры сверху нумеруют положения в выравнивании в целом; им соответ-
ствует нумерация в консенсусной последовательности, приведенной в
нижней строке. Разрывы последовательности обозначены знаком «-».
Цветовые обозначения (см. цвет, вклейку, рис. 4): красные буквы на жел-
том фоне — идентичные во всех последовательностях; синие буквы на го-
лубом фоне — идентичные в большинстве последовательностей; черные
буквы на зеленом фоне — аминокислоты с высоким сходством; зеленые
буквы на белом фоне — аминокислоты со слабым сходством; черные бук-
вы на белом фоне — аминокислоты, не имеющие сходства
но сравнение интересующей последовательности с несколькими ви-
дами. В зависимости от конкретной ситуации, можно использовать
максимально широкий подход, сравнивая с последовательностями
красной (С. merolae) и зеленой (С. reinhardtii) водорослей, мха
(P. patens), однодольного (Oryza sativa) и двудольного (A. thaliana)
растений. Или использовать более узкий подход: например, если
интересующий вид входит в таксон rosids, объединяющий большую
группу семейств двудольных растений, то сравнивать с представи-
телями этой группы, геном которых уже известен (A. thaliana,
P. trichocarpa, V. vinifera).
Последовательности для множественного сравнения можно по-
лучить из литературы или провести поиск в базах данных при помо-
щи программы BLAST. Если интересующая последовательность не
кодирует белок, или если необходимо обнаружить консервативные
и вариабельные мотивы именно в последовательности нуклеотидов
(например, для подбора праймеров, сайтов рестрикции и т. д.), то
Для множественного выравнивания следует использовать нуклео-
тидные последовательности. В остальных случаях лучше брать ами-
нокислотные последовательности. Во-первых, аминокислотный код
состоит из большего числа «букв», что уменьшает вероятность
«ложных выравниваний». Во-вторых, часть замен нуклеотидов не
106 ГЛАВА 1 . МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
влияет на кодируемую аминокислоту (синонимичные замены), а за-
мена одной аминокислоты на другую со сходными химическими
свойствами почти не влияет на свойства белка. Учесть это возможно
при сравнении аминокислотных последовательностей. Кроме того,
аминокислотные последовательности втрое короче, поэтому их лег-
че представить на рисунках. В случае низкой степени сходства бел-
ков программы могут учитывать не только первичную структуру, но
и вторичные конформации, которые могут образовывать последова-
тельности аминокислот в белковой молекуле.
На практике исследователь гораздо чаще получает последова-
тельность нуклеотидов. Однако и в этом случае можно легко перей-
ти к последовательностям аминокислот и использовать их для срав-
нений.
Виртуальная трансляция
Довольно часто встречается ситуация, когда исследователь получил
последовательность нуклеотидов и хочет узнать, какой белок она мо-
жет кодировать. Помочь в этом могут программы, осуществляющие
виртуальную трансляцию. Такая программа может быть найдена на
сайте ExPASy (http: //expasy._Hlt271028325cBM_7_h/tools/dna_
Hlt287389372_Hlt287389373.BM_8_BM_9_html). Программа не
требует указать, является ли эта последовательность кодирующей,
или она является комплементарной кодирующей последователь-
ности, не требует указать рамку считывания и старт-кодон. Следует
загрузить нуклеотидную последовательность и нажать на кнопку
«Translate sequence». Далее программа покажет все шесть возмож-
ных вариантов трансляции: три варианта рамки считывания при
прочтении этой последовательности в заданном виде и три рамки
считывания при прочтении комплементарной последовательности,
и предоставит возможность самостоятельного выбрать нужный ва-
риант. Обычно это несложно. Из 64 кодонов три — стоп-кодоны,
т. е. статистически каждый 21-й кодон — терминирующий. Поэто-
му, только белок-кодирующие последовательности (в соответствую-
щем направлении и рамке считывания) очищены от стоп-кодонов на
достаточно длинную дистанцию. Трудности начинаются с определе-
ния старт кодона. У подавляющего большинства белков это метио-
ниновый кодон ATG/AUG. Но даже если вы располагаете полной
последовательностью зрелой мРНК, то нужно выбрать, с какого
именно метионинового кодона начинается последовательность бел-
ка. Обычно выбирают первый, но это не всегда так и иногда может
приводить к ошибкам в предсказании размера и функциональных
свойств белка [11]. Кроме того, в ряде генетических систем (напри-
мер, в пластидах) старт-метионин может кодироваться кодоном, от-
Раздел 1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков 107
личающимся на один нуклеотид от ATG/AUG. Если вы подозревае-
те, что в наличии только часть белок-кодирующей последователь-
ности, то надо выбрать самый первый кодон, независимо от того,
какой он (это также возможно). После того как вы нажмете на соот-
ветствующую аминокислоту, программа покажет последователь-
ность полипептида от первой аминокислоты до стоп-кодона и рас-
считает для него молекулярную массу и изоэлектрическую точку.
Данная программа понимает только однозначные нуклеотиды
(А, Т, G, С), однако иногда возникают ситуации, когда требуется
транслировать неоднозначные последовательности нуклеотидов.
Например, нужно выяснить, какой белок может кодировать получен-
ный ПЦР-продукт, а для этого провести его виртуальную трансляцию
и сравнивать с аминокислотными последовательностями белков, что
делает сравнение более информативным. Однако этот ПЦР-продукт
состоит из набора сходных, но не идентичных последовательностей.
Такая ситуация может возникнуть в случае, если праймеры подо-
браны на консервативные участки и амплифицируют набор после-
довательностей (например, мРНК всех генов из небольшого семей-
ства). При секвенировании видно, что в ряде позиций встречается
более одного нуклеотида. Однако благодаря вырожденности гене-
тического кода замена нуклеотида не всегда ведет к изменению ко-
дируемой аминокислоты, и синонимичные замены происходят чаще
несинонимичных. Такие позиции можно обозначить при помощи
стандартных обозначений (табл. 1.7.1). Однако в этом случае пона-
добится другая программа для виртуальной трансляции. Такая про-
грамма доступна на сайте Европейского биоинформационного ин-
ститута (www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/tra_Hlt271028206_Hlt
271028207nBM_10_BM_ll_seq/index .html). Она несколько менее
удобна, зато понимает обозначения неоднозначных нуклеотидов.
И если наличие в данной позиции любого из возможных нуклеоти-
дов обеспечивает кодирование одной и той же аминокислоты, то
программа транслирует такие кодоны.
Таблица 1.7.1. Принятые однобуквенные обозначения нескольких соче-
таний нуклеотидов
R = A/G
W = A/T
S = G/C
K = G/T
M=A/C
Y=T/C
D = A/G/T
Η = А/С/T
V = A/C/G
В = C/G/T
N = А/T/G/C
108 ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ
Литература
1. Matsuzaki Μ., Misumi О., Shin-I Т. et al. Genome sequence of the
ultrasmall unicellular red alga Cyanidioschyzon merolae 10D //
Nature. 2004. V. 428. P. 653-657.
2. Merchant S. S., Prochnik S. E., Vallon O. et al. The Chlamydomonas
genome reveals the evolution of key animal and plant functions //
Science. 2007. V. 318. P. 245-250.
3. Rensing S.A., Lang D., Zimmer A.D. et al. The Physcomitrella
genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by
plants// Science. 2008. V. 319. P. 64-69.
4. Yu J., Ни S., Wang J. et al. A Draft sequence of the rice genome
(Oryza sativa L. ssp. indica) // Science. 2002. V. 296. P. 79-92.
5. Arabidopsis genome initiative. Analysis of the genome sequence of
the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408.
P. 796-815.
6. Tuskan G.A., DiFazio S., Jansson S. et al. The genome of black
cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray) // Science. 2006.
V.313. 1596-1604.
7. Jaillon O., Aury J.M., Noel B. The grapevine genome sequence
suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla //
Nature. 2007. V. 449. P. 463-467.
8. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., Lipman D. J. Basic
local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.
9. Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J. CLUSTAL W:
Improving the sensitivity of progressive multiple sequence
alignment through sequence weighting, position-specific gap
penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994,
V. 22. P. 4673-4680.
10. Larkin L.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R.,
McGettiganP.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M.,
Wilm Α., Lopez R., Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G.
Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. 2007..
V. 23. P. 2947-2948.
11. Kodama Y., Sano H. Evolution of a basic helix-loop-helix protein
from a transcriptional repressor to a plastid-resident regulatory
factor: involvement in hypersensitive cell death in tobacco
plants // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 35369-35380.
Глава 2
МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА
И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
2.1. САУЗЕРН-БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ
Д. В. Беляев
Введение
Метод гибридизации геномной ДНК с меченым ДНК- или РНК-зон-
дом был впервые опубликован английским биохимиком Эдвином
Саузерном (Е. Southern) в 1975 г. [1] и носит его имя. После этой пуб-
ликации последовали значительные улучшения метода, и сейчас он
достаточно чувствителен для обнаружения уникальных последова-
тельностей даже в таком большом геноме, каким является геном
пшеницы (1,68х1010 п. н. [2]). Однако метод менее чувствителен,
чем метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, см. раздел 1.6), т. е.
не реагирует на следовые количества ДНК. Это важно для доказа-
тельства трансгенности трансформированных растений, так как при
использовании ПЦР может возникнуть ложноположительный сиг-
нал от отдельных ампликонов (контаминация) или от бактерий, со-
храняющихся в межклетниках. Саузерн-гибридизация позволяет
идентифицировать сорта, подтвердить факт трансгеноза растений и
измерить число копий в геноме как собственного, так и чужеродного
гена (трансгена). Существует модификация метода — метод ПДРФ
(полиморфизм длин фрагментов рестрикции) [3], который ранее, до
изобретения ПЦР, широко применялся для идентификации сортов
и индивидуумов. Сейчас ПДРФ используют для других задач, в част-
ности, для анализа точечных полиморфизмов (SNP) с неизвестной
нуклеотидной последовательностью. ПДРФ широко используется в
генетических исследованиях популяций, поскольку наличие в гено-
ме исследуемого организма рестрикционного фрагмента ДНК опре-
деленной длины является прекрасным генетическим маркером и од-
новременно фенотипическим признаком, тесно связанным с геноти-
пом организма.
110 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Саузерн-блоттинг был родоначальником других популярных
методов блоттинга, таких, как нозерн-блоттинг (см. раздел 2.3) и
Вестерн-блоттинг (см. раздел 3.3), также широко используемых в
молекулярно-биологических исследованиях. В данном разделе опи-
сана методология, позволяющая, исходя из имеющихся ДНК-зондов
и экспериментальных растений, получить радиоавтограф, указыва-
ющий на размер вырезанного рестриктазами фрагмента геномной
ДНК, содержащего комплементарную или квазикомплементарную
зонду последовательность. Описываемый метод дает важную инфор-
мацию о числе копий сходной с зондом последовательности ДНК в
геноме. С помощью данного метода возможно оценить и степень сход-
ства с зондом изучаемого фрагмента ДНК генома.
Принцип метода
Из растений, бактерий или других организмов выделяют ДНК и рас-
щепляют ее теми или иными рестриктазами. Затем фрагменты ДНК
разделяют в агарозном геле, денатурируют щелочью и переносят на
специальную мембрану, чаще нейлоновую. ДНК ковалентно связы-
вается с мембраной с помощью УФ-облучения или воздействия тем-
пературы 65-80 °С. Для выявления интересующей нуклеотидной
последовательности ДНК синтезируют комплементарный фрагмент
ДНК (зонд) из меченых аналогов дезоксинуклеозидтрифосфатов,
который затем также денатурируют и далее инкубируют с мембра-
ной в буфере, часто содержащем и немеченые фрагменты ДНК иной
первичной структуры для повышения специфичности гибридиза-
ции. Зонд гибридизуется, то есть образует двойную спираль с (час-
тично) комплементарными ему фрагментами ДНК, иммобилизован-
ными на мембране, а присутствие немеченых фрагментов ДНК
подавляет неспецифическое связывание зонда с мембраной. Таким
образом, мембрана с геномной ДНК содержит комплементарные
фрагменты, которые должны гибридизоваться с зондом на фоне про-
чих многочисленных и не имеющих отношения к зонду фрагмен-
тов, и поэтому сигналы гибридизации появляются только там, где
на мембране присутствуют специфичные к зонду фрагменты. Пос-
ле отмывки с мембраны неспецифично связавшейся меченой ДНК
мембрану прикладывают к фоточувствительной (часто рентгенов-
ской) пленке или, если метка нерадиоактивная, используют дру-
гой способ выявления мест связывания зонда с ДНК на мембране.
В результате становятся видны места (полосы), где в агарозном
геле были фрагменты ДНК, комплементарные последовательнос-
ти зонда.
Раздел 2.1. Саузерн-блот-гибридизация
111
Материалы и реактивы
Материалы и реактивы, требующие подготовки, выделены курси-
вом в методике.
Фарфоровая ступка и пестик, пробирки из полипропилена
фирмы Nalgene (кат. №3119-0050), а также вся посуда, используе-
мая для анализа, для удаления следов нуклеиновых кислот должны
быть обработаны в 0,5М NaOH в течение 1-2 ч и затем тщательно
промыты стерильной дистиллированной водой. Пробирки и колбы
необходимо стерилизовать автоклавированием в течение 20 мин при
1 атм.
Буфер для экстракции: 100 мМ Tris-HCl pH 8,0, 500 мМ NaCl,
10 мМ меркаптоэтанол, 1% SDS. Вода должна быть деионизована и
автоклавирована.
5 Μ ацетат калия готовят из ацетата калия возможно лучшей
чистоты на деионизованной воде и стерилизуют пропусканием через
стерильный фильтр с размером пор 0,45 мкм.
5 Μ NaCl. Растворяют хлорид натрия в деионизованной воде и
авток лавируют.
0,125М НС1. Смешивают 5,5 мл концентрированной (35-38%)
соляной кислоты и 494 мл дистиллированной воды.
Денатурирующий раствор. Растворяют 87,66 г хлорида натрия
и 20 г гидроксида натрия в 800 мл дистиллированной воды, доводят
объем до 1 л. Хранят в плотно закрытой пластмассовой посуде.
Нейтрализующий раствор. Растворяют 87,66 г хлорида натрия
и 60,5 г Tris в 800 мл дистиллированной воды. Доводят рН до 7,5
концентрированной соляной кислотой. Доводят объем до 1 л.
SSC буфер. 20х SSC буфер готовят растворением 88,23 г цитрата
натрия трехзамещенного и 175,32 г хлорида натрия в примерно
800 мл дистиллированной воды, затем рН доводят до 7-8. Объем до-
водят водой до 1 л. Для Зх SSC буфера и других, 20х SSC буфер раз-
водят водой и при необходимости в него добавляют нужное количест-
во 10% SDS.
Предгибридизационный буфер содержит 7% SDS, 0,25 Μ фос-
фат натрия рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, 10 г/л BSA и 50 мг/л низкомолеку-
лярной ДНК.
Исходные растворы: 10% (w/v) SDS; 1 Μ фосфат натрия рН 7,4
готовят из 1 Μ NaH2PO4 и 1 М Na2HPO4; измеряя рН одного из них,
вливают в него другой раствор, пока рН не станет 7,4 (примерные со-
отношения объемов даны в биохимических справочниках); EDTA
0,5М рН 8,0; BSA, предпочтительнее растворимая фракция V, до-
бавляют в сухом виде в готовящийся буфер и подогревают его (мож-
но почти до кипения), пока BSA не растворится; чтобы добавить
112 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
ДНК, непосредственно перед использованием в нагретый до 65 °С
буфер внесите раствор 0,5 г/л ДНК из пробирки типа Эппендорф,
плавающей в кипящей водяной бане.
Гибридизационный буфер готовят так же, как и предгибридиза-
ционный, однако непосредственно перед использованием в него до-
бавляют радиоактивно-меченную пробу, предварительно денатури-
рованную при 100 °С на водяной бане. Гибридизационные мембраны
выпускаются несколькими фирмами. Мы с успехом использовали
мембраны разных производителей. При выборе мембраны следует
отдавать предпочтение, естественно, нейлоновым мембранам для
связывания исключительно нуклеиновых кислот и положительно
заряженным, как, например, Hybond-N+ («GE Healthcare», США).
Ход определения
Выделение растительной геномной ДНК [4]
Методику можно масштабировать в большую или меньшую сторону,
то есть пропорционально увеличивать или уменьшать количества
исходного материала и растворов на всех ступенях очистки. Однако
описываемый ниже вариант выделения ДНК обычно позволяет полу-
чить ее количество, достаточное для стандартной Саузерн-гибридиза-
ции. Работать желательно в комнате, в которой отсутствует загрязне-
ние плазмидами или ПЦР-фрагментами, так как выделенная расти-
тельная геномная ДНК может быть использована и для ПЦР-анализа.
Включают центрифугу, чтобы охладить ротор и центрифужную
камеру до 4 °С. Включают водяную баню на 65 °С. Быстро взвеши-
вают 1 г свежих листьев или другого растительного материала, на-
ливают полную фарфоровую ступку жидкого азота, бросают туда
листья или другой биологический материал и кладут фарфоровый
пестик. Можно использовать замороженный материал, если он хра-
нился при -70 °С, но его надо сразу перенести еще в замороженном
состоянии в жидкий азот. Как только весь азот испарится, листья
растирают до состояния пудры. Наливают в ступку 16 мл буфера для
экстракции и распределяют буфер пестиком по замороженному ма-
териалу. Буфер замерзает. Когда он растает, суспензию перемеши-
вают пестиком и выливают в центрифужную пробирку объемом
32-50 мл для среднескоростной центрифуги. Рекомендуется ис-
пользовать пробирки фирмы Nalgene из полипропилена, которые
отличаются долговечностью, достаточно прозрачны и стойки к
большинству органических веществ, применяемых для экстракции
белков и нуклеиновых кислот. Пробирку инкубируют на водяной
бане при 65 °С в течение 15 мин, затем добавляют 5 мл 5 Μ ацетата
Раздел 2.1. Саузерн-блот-гибридизация
113
калия, встряхивают закрытую пробирку и инкубируют на льду
30 мин. Центрифугируют 15 мин при 12 000 g, 4 °С и отбирают
над осадочную жидкость в такую же пробирку, содержащую 10 мл изо-
пропанола. Пробирку закрывают, перемешивают содержимое, осто-
рожно переворачивая пробирку, и инкубируют при -20 °С 30 мин.
ДНК осаждают центрифугированием 15 мин при 12 000 g, 4 °С ,
удаляют надосадочную жидкость, осадок высушивают. Осадок ДНК
растворяют в 0,8 мл стерильной воды, измеряют концентрацию
ДНК с помощью спектрофотометра, переносят раствор ДНК в про-
бирку типа Эппендорф, добавляют 16 мкл 5 Μ NaCl и 0,6 мл изопро-
панола, перемешивают и инкубируют на льду 10 мин. ДНК осажда-
ют центрифугированием на максимальной скорости 5 мин при ком-
натной температуре, удаляют надосадочную жидкость, добавляют
500 мкл этанола, закрывают и встряхивают пробирку на вортексе.
Центрифугируют 1 мин, удаляют спирт, коротко центрифугируют и
отбирают остатки спирта пипеткой. Растворяют ДНК в стерильной
воде, оптимальная концентрация ДНК 1-2 мг/мл.
Обработка ДНК ферментами рестрикции,
гель-электрофорез и перенос ДНК с геля на мембрану
Для обработки ДНК ферментами рестрикции смешивают компонен-
ты в указанном порядке в 1,5 мл-пробирке типа Эппендорф до ко-
нечного объема 25 мкл:
20 мкг ДНК 10-20 мкл
1х буфер для рестриктазы 2,5 мкл 10х буфера
автоклавированная до конечного объема 25 мкл
деионизованная вода
-30U рестриктазы 1-3 мкл + 1-3 мкл (см. текст ниже)
Выбор ферментов рестрикции зависит от имеющейся информа-
ции об анализируемой последовательности в геномной ДНК. Если
известна полная последовательность трансгена, то для анализа
трансгенных растений можно выбрать рестриктазу (рестриктаза 1
на рис. 2.1.1), которая разрезает переносимую в растения последо-
вательность по обе стороны от зонда; и тогда нужные полосы на ра-
диоавтографе будут известного размера и их, скорее всего, можно
будет отличить от других полос, с которыми зонд оказался случайно
сходен. Но в этом случае нельзя судить о числе копий трансгена или
о числе мест его встраивания в геном. Если выбрать другой фермент,
который разрезает встраиваемую последовательность только один
114
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Рестриктаза 1
Рестриктаза 2
Рестриктаза 3
Вставка Т-Д Η К
Зонд
Зонд
Трансген
Рестриктаза 1 Рестриктаза 2 Рестриктаза 3
Рис. 2.1.1. Схема разрезания ДНК для Southern и примеры результатов
гибридизации зонда с ДНК различных трансформантов, обработанной
указанными рестриктазами. Общая длина ДНК дана не в масштабе. Пояс-
нения см. в тексте
раз или вообще не режет (рестриктазы 2 или 3 на рис. 2.1.1), то
встроенные в разные локусы трансгены, вероятнее всего, будут
иметь разные длины фрагментов рестрикции, и по числу полос мож-
но определить число локусов генома, содержащих трансген. Можно
ожидать, что после разрезания рестриктазой 3 длины гибридизую-
щихся фрагментов будут больше, чем после использования рестрик-
тазы 2.
Необходимо иметь в виду, что некоторые полосы на геле могут
произойти от фрагментов ДНК генома, не имеющих отношения к
трансгену. Для однозначного ответа о природе полос на радиоавтог-
рафе необходимы отрицательный контроль (ДНК нетрансформиро-
ванного растения) и положительные контроли, например, ДНК из за-
ведомо трансгенного растения и сильно разбавленная (до ~10 нг/до-
рожку геля) плазмидная ДНК с последовательностью зонда или
сама ДНК данного зонда (немеченая). Рестриктазы обычно продают-
ся с 10х буфером для реакции, и фермент имеет исходную концен-
трацию около 10 U/мкл. Одна единица активности фермента обыч-
но определяется как количество фермента, расщепляющего 1 мкг
контрольной ДНК за 1 ч. Трехкратный избыток фермента обычно
гарантирует полное разрезание ДНК по всем сайтам. Следует обра-
щать внимание на чувствительность рестриктазы к метилированию
ДНК. Например, часто применяемая рестриктаза PstI чувствитель-
Раздел 2.1. Саузерн-блот-гибридизация
115
на к метилированию и плохо режет растительную ДНК, которая в
значительной степени метилирована. Все растворы, особенно буфе-
ры для реакции, после размораживания должны быть хорошо пере-
мешаны (на вортексе). Рестриктазы хранятся в глицерине и не за-
мерзают при -20 °С, но после добавления рестриктазы в реакционную
смесь последнюю надо тщательно перемешать, пипетируя несколь-
ко раз наконечником дозатора. Затем смесь инкубируют (лучше в
воздушном термостате) при 37 °С 1-2 ч. В открытой водяной бане
или открытом металлическом блоке вода испаряется из реакцион-
ной смеси и конденсируется на более холодной крышке пробирки,
что нежелательно. Затем нужно добавить еще 30 U фермента и инку-
бировать при 37 °С в течение ночи. Разрезанную ДНК можно хра-
нить при -18-20 °С, как любую ДНК.
Продукты рестрикции смешивают с буфером для нанесения ДНК
на агарозный гель в пропорции 5:1 и наносят на агарозный гель,
приготовленный на 0,5х ТАЕ буфере. Для эффективного разделе-
ния фрагментов вполне достаточен гель длиной 12 см. Процент ага-
розы в геле зависит от размеров интересующих фрагментов ДНК,
при этом гель в концентрации 1,2% является стандартным. Разде-
ление фрагментов ДНК проводят при напряженности поля 7 В/см2,
пока маркерный краситель бромфеноловый синий не пройдет 3/4 дли-
ны геля. Затем гель окрашивают в растворе 0,5 мг/л бромистого эти-
дия в течение 10 мин, промывают 5 мин дистиллированной водой и
фотографируют на УФ-трансиллюминаторе с измерительной линей-
кой. После этого гель инкубируют при небольшом покачивании на
качалке или вручную в различных растворах объемом, по крайней
мере, 4 объема геля без промежуточных промывок. Сначала поме-
щают гель в кювету с 0,125 Μ НСl для частичной депуринизации и
расщепления длинных фрагментов ДНК, что улучшает эффектив-
ность переноса. Инкубируют 5-10 мин, не более! Затем удаляют
жидкость, придерживая гель специальной пластиковой лопаткой, и
наливают в кювету денатурирующий раствор, чтобы ДНК, исполь-
зуемая в гибридизации, была одноцепочечной и могла формировать
дуплексы с зондом. Инкубируют 30 мин, помещают гель в нейтра-
лизующий раствор на 30 мин, затем переворачивают гель нижней
стороной кверху.
После денатурации и нейтрализации гель укладывают на два
листа бумаги типа Whatman ЗМ, предварительно смоченных в Зх
SSC, в аппарат для капиллярного переноса ДНК на мембрану
(рис. 2.1.2). На гель кладут смоченную в Зх SSC буфере нейлоновую
мембрану Hybond-N+ или аналогичную. Можно использовать лю-
бую мембрану, предназначенную для гибридизации нуклеиновых
кислот. В общем, заряженные мембраны более чувствительны, чем
116 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Рис. 2.1.2. Общая схема конструкции для капиллярного переноса ДНК
на мембрану. 1 — стопка фильтровальной бумаги, 2 — нейлоновая мем-
брана, 3 — агарозный гель, 4 — два листа фильтровальной бумаги под ге-
лем с краями в 20х SSC, 5 — стекло 3-5 мм, немного большее геля, 6 — ре-
зиновые пробки или другие подкладки под стекло, 7 — кювета с 20х SSC
нейтральные, но могут давать более высокий фон. Мембрану следу-
ет вырезать так, чтобы она выступала за границы геля по 1 мм с
каждой стороны. Мембрану лучше брать пинцетом только за края.
На мембрану накладывают 2-3 листа смоченной в Зх SSC буфере
фильтровальной бумаги или бумаги Whatman 3M того же размера,
что и мембрана, на них стопку сухой влагоемкой бумаги того же раз-
мера. Высота стопки должна быть не менее 5-10 см, на нее кладут
стекло и сверху помещают груз около 0,5 кг. В кювету наливают бу-
фер 20х SSC слоем 1-2 см. Перенос осуществляют в течение 12-16 ч
(обычно в течение ночи), желательно, чтобы самые верхние листы
стопки оставались сухими. Затем бумагу удаляют. Мембрану необ-
ходимо отделить от геля, подняв ее с одного края пинцетом, не сдви-
гая, и промыть в Зх SSC для удаления следов агарозы. Затем мем-
брану высушивают на фильтровальной бумаге. Мембрану следует
пометить так, чтобы знать, где отпечатки верха и низа геля, и на ка-
кой стороне мембраны находится ДНК. Затем мембрану следует по-
ложить на стекло УФ-трансиллюминатора содержащей ДНК сторо-
ной к лампам и включить ультрафиолет (254 нм) на 2 мин. После
этого высушенную и обработанную УФ-светом мембрану можно по-
ложить в чистый конверт и хранить неограниченное время. Можно
сфотографировать мембрану в УФ-свете, чтобы убедиться в том, что
ДНК перенесена на мембрану, и чтобы увидеть фрагменты маркера
молекулярной массы ДНК.
Подготовка меченой пробы (зонда) и гибридизация
ДНК для мечения должна быть линейной и не содержать посторон-
них последовательностей. Если требуется обнаружение трансгена в
геноме растения, то можно использовать любую часть переносимой
в растения ДНК, например, фрагмент, вырезаемый удобными рест-
риктазами. В этом случае последовательность ДНК зонда совпадает
только с единственной последовательностью геномного фрагмента,
причем на 100%. Такая однозначность, однако, бывает далеко не
Раздел 2.1. Саузерн-блот-гибридизация
117
Рис. 2.1.3. Пример результата, полученного при использовании Сау-
зерн-блот-гибридизации. Гибридизация проводилась на промотор RbcS,
который присутствует в геноме всех исследованных здесь растений и был
дополнительно введен в геном трансформированных растений. Препара-
ты ДНК были обработаны рестриктазой Hindlll, которая имеет сайты
узнавания по обеим сторонам промотора во вставке трансгена в геномную
ДНК (нижние полосы). Сайты узнавания рестриктазы в геноме находятся
на некотором расстоянии от собственного RbcS-промотора, поэтому зоны с
исходно присутствовавшим в геноме промотором находятся выше (фраг-
менты большего размера). Во второй слева дорожке — ДНК нетрансфор-
мированного растения; в пятой слева дорожке — ДНК растения, вероят-
но, имеющего две вставки Т-ДНК
всегда. При анализе трансгенных растений надо иметь в виду, что в
геноме нетрансформированных растений могут содержаться (или
содержатся, как в случае на рис. 2.1.3) гены, идентичные или сход-
ные по последовательности с зондом. Обычно включение в анализ
ДНК нетрансформированного растения в качестве отрицательного
контроля отвечает на вопрос, какие сигналы происходят от трансгена.
При гибридизации зонда с геномом другого вида растений, неизвест-
ного в отношении изучаемого гена, когда степень сходства гибриди-
зующихся последовательностей неизвестна, гибридизацию прихо-
дится проводить при более низкой температуре (см. ниже), при кото-
рой возможно образование не полностью комплементарных дуплексов
ДНК. В качестве терминологического отступления заметим, что не-
редко использующийся термин «гомология» вместо «сходство» не-
применим к любым парам последовательностей. Равно как и пред-
ставляется неудачным использование словосочетаний «высокая го-
мология» и «низкая гомология». Гомологичными генами, белками,
органами следует называть те, что имеют общее происхождение,
при этом можно отмечать дальнюю или ближнюю гомологию.
Для мечения зонда рекомендуется один из коммерческих набо-
ров, в основном, в них в качестве ДНК-полимеразы используется
так называемый фрагмент Кленова (Klenow fragment) ДНК-полиме-
разы Ι Ε. coli, так как у этого фермента высокое сродство к дезокси-
нуклеотидтрифосфатам (Km -1 мкМ, в то время как у Taq-полиме-
разы Km -40 мкМ) и отсутствует 5' —> 3' экзонуклеазная активность.
Такие наборы включают случайные праймеры и один из 32Р-а-мече-
118 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
ных дезоксинуклеотидтрифосфатов. Также в качестве зонда можно
заказать олигонуклеотид длиной 25-40 нуклеотидов и пометить его
нуклеотидкиназой PNK, для этого будет также нужен один из
32Р-g-меченых дезоксинуклеотидтрифосфатов. До начала гибриди-
зации желательно провести предгибридизацию, которую удобно
проводить параллельно с мечением зонда. Для этого помещают су-
хую нейлоновую мембрану с ДНК в сухой сосуд для вращающегося
гибридизационного инкубатора и наливают в сосуд 5 мл прогретого
до 65 °С пред гибридизационного буфера, закрывают и вставляют
(с противовесом) в инкубатор при температуре 65 °С. Инкубируют
2-6 ч, потом быстро сливают буфер и вносят в сосуд 3-5 мл (объем
зависит от размеров сосуда и мембраны) горячего (65 °С) гибридиза-
ционного буфера с радиоактивным зондом. Пробирку закрывают и
ставят на ночь при 65 °С или меньшей температуре, если последова-
тельности зонда и соответствующего фрагмента геномной ДНК не
идентичны на 100% . В общем, чем менее сходны зонд и соответству-
ющий ему участок или участки, тем ниже должна быть температура
гибридизации. Однако если цель гибридизации — поиск похожих,
но не идентичных зонду гомологичных (sic!) последовательностей,
то некоторые сигналы могут быть от фрагментов ДНК, которые не
имеют ничего общего с семейством генов зонда, а быть просто на
него похожи. Точную температуру гибридизации в последнем слу-
чае приходится подбирать экспериментально. По окончании време-
ни гибридизации жидкость из сосуда удаляют в радиоактивные от-
ходы и наливают примерно 1/2 объема сосуда горячего (65 °С) раст-
вора lx SSC с 0,1%SDS. Ставят сосуд вращаться в инкубатор на
30 мин при 65 °С, сливают раствор, операцию повторяют, затем за-
полняют примерно 1/2 объема сосуда горячим (65 °С) раствором 0,1х
SSC с 0,1% SDS и инкубируют при вращении 30 мин при 65 °С. Таким
образом, постепенно повышают жесткость отмывки. Чем мень-
ше ионная сила и чем больше температура и/или концентрация
SDS, тем жестче отмывка. В большинстве случаев оказывается, что
3-4 отмывки, как указано здесь, достаточны для того, чтобы изба-
виться от фона, при сохранении сигналов гибридизации. Мембрану
вынимают из сосуда пинцетом, укладывают на пищевую пленку и
накрывают этой же пленкой во влажном состоянии. Затем измеря-
ют уровень радиоактивности мембраны. Мембрана должна содер-
жать радиоактивность, обычно не более чем в 2-3 раза превышаю-
щую уровень фона, если гибридизуется малоповторенный фрагмент
ядерного генома. Если уровень радиоактивности выше, повторяют
последнюю промывку. К мембране в пищевой пленке прикладыва-
ют рентгеновскую пленку максимальной чувствительности, напри-
Раздел 2.1. Саузерн-блот-гибридизация
119
мер, RETINA XBM, и экспонируют в кассете для радиоавтографии
2-3 недели или меньшее время, если уровень радиоактивности дос-
таточно высок. Желательно проводить экспозицию при низкой тем-
пературе (-70 °С) для снижения уровня фона пленки. Мы не совету-
ем проводить пробные короткие экспозиции, так как при этом часть
радиоактивности распадается. Если после 2-3 недель пленка слиш-
ком почернела, можно перезаложить мембрану с новой пленкой на
меньшее время и оптимизировать время экспозиции. Пленка прояв-
ляется в проявителе для черно-белой фотобумаги (желательно све-
жем), промывается водопроводной водой, выдерживается в фиксаже
и промывается водой и дистиллятом. Как альтернативный способ,
можно заложить радиоактивную мембрану в кассету Phospholmager
на 2-3 недели или на меньшее время и отсканировать в
Phospholmager.
Особенности применения метода
Несмотря на появление более чувствительных и/или быстрых мето-
дов типа ПЦР (см. раздел 1.6) или гибридизации на микрочипах
(см. раздел 2.2), Саузерн-гибридизация находит применение для
подтверждения трансгенности растений, выяснения числа копий
гена или трансгена и анализа генных семейств. Возможно сочетание
данного метода с ПЦР, что повышает его чувствительность и изби-
рательность (Д. Беляев, неопубликованные данные).
К недостаткам Саузерн-гибридизации можно отнести относитель-
ную трудоемкость, использование радиоактивной метки, невозмож-
ность анализа последовательностей гибридизовавшихся фрагментов
ДНК и, как следствие, вероятность наличия мутаций в выявленных
комплементарных последовательностях. Еще одним недостатком яв-
ляется необходимость относительно большого количества материа-
ла для анализа (до 1 г сырой массы). Температуру гибридизации
можно уменьшить, добавив в гибридизационный раствор формамид
(до 30-50%), который снижает температуру плавления ДНК. Для
того, чтобы избежать применения радиоактивной метки, ДНК-зонд
для Саузерн-блоттинга можно метить флуоресцентными красителя-
ми или биотином, однако чувствительность такого анализа снижа-
ется, а стоимость возрастает.
В настоящее время, помимо «классического» раствора Дернхард-
та, для Саузерн-гибридизации используют много разных модифика-
ций растворов, один из которых (простой и эффективный) приведен
в данном разделе. Этот раствор для гибридизации позволяет прово-
дить чувствительный анализ изучаемого генома даже без примене-
ния балластной ДНК.
120 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Литература
1. Southern Ε. Μ. Detection of specific sequences among DNA
fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975.
V. 98. P. 503-517.
2. Tereshonok D. V., Stepanova A. Yu., Dolgikh Y. I., Osipova E. S.,
Belyaev D. V., Vartapetian В. В. Tolerance to root flooding of wheat
plants {Triticum aestivum L.) produced with biotechnological
approaches // Plant Stress, 2011. V. 4 P. 79-82.
3. Botstein D., White R. L., Skolnick M., Davis R. W. Construction of
a genetic linkage map in man using restriction fragment length
polymorphisms // Am J Hum Genet. 1980. V. 32 P. 314-331.
4. Dellaporta S. L., Wood J., Hicks J. B. A plant DNA minipreparation:
Version II // Plant Molecular Biology Reporter, 1983. V. 1 P. 19-21.
5. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молеку-
лярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984.
6. Дрейпер Дж. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное
руководство: Пер. с англ. М.: Мир, 1991.
2.2. ПРИМЕНЕНИЕ ГИДРОГЕЛЕВЫХ БИОЧИПОВ
ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ГЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Д. А. Грядунов, И. А. Гетман, Г. А. Романов
Введение
Быстрое распространение генно-модифицированных источников
(ГМИ) и полученных на основе ГМИ продуктов питания ставит неот-
ложный вопрос о контроле за их потоками для оценки возможных
биологических и экологических рисков [1]. В странах Европейского
Сообщества (ЕС) законодательно введены строгие ограничения по
выращиванию трансгенных культур и обязательная маркировка
продуктов питания на присутствие трансгенных добавок, если их
доля в составе продукта превышает 0,9% [2]. В большинстве других
развитых стран также введены требования маркировки продуктов
питания при превышении порогового содержания ГМИ. В России
выработана аналогичная нормативная база, необходимая для орга-
низации и проведения эффективного надзора за пищевыми продук-
тами, содержащими компоненты, полученные с применением ГМИ.
За последние годы на территории РФ официально были разрешены
к использованию в качестве пищевых ингредиентов 18 сортов транс-
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
121
генных культур, среди них 8 линий кукурузы, 3 линии сои, 2 линии
свеклы, одна линия риса и 4 линии картофеля.
С 12.12.2007 в РФ в соответствии с поправками в Федеральный
Закон от 7.02.1992 № 2300-1 «О защите прав потребителей» предель-
ный немаркируемый процент содержания ГМИ в продуктах пита-
ния составляет, как в странах ЕС, 0,9%. Продукты, содержащие
больший процент ГМИ, должны подвергаться обязательной марки-
ровке [3]. Данная норма введена для защиты прав потребителей на
информирование о технологии производства пищевых продуктов, а
также с целью гармонизации с требованиями ЕС по этикетированию
пищевых продуктов, полученных с использованием ГМИ.
Все вышеизложенное показывает, насколько важна и актуальна
разработка адекватных методов идентификации детерминант транс-
генности в растительном сырье и продуктах из него. Современные
методы выявления ГМИ основаны на анализе ДНК методом ПЦР и
используют в качестве мишеней широко распространенные элемен-
ты ДНК-конструкций, применяемых для трансформации растений.
В качестве основных детерминант трансгенности долгое время слу-
жили, как правило, два фрагмента ДНК: 35S промотор вируса мо-
заики цветной капусты (CaMV) и NOS терминатор Ti-плазмиды
Agrobacterium tumefaciens [4]. Однако постоянное появление транс-
генного растительного материала, созданного на базе новых конст-
рукций ДНК, потребовало разработки альтернативных подходов,
позволяющих в одном эксперименте идентифицировать широкий
спектр трансгенных мишеней. Этому критерию удовлетворяет в
первую очередь технология биологических микрочипов. В послед-
ние десятилетия было предложено несколько вариантов выявления
детерминант трансгенности в продуктах питания и растительном
сырье с использованием ДНК-микрочипов [5-9]. Одним из лидеров
данного направления стала Россия, где метод идентификации транс-
генных последовательностей ДНК на основе биологических микро-
чипов (биочипов), разработанный совместно ИФР РАН и ИМБ РАН
[10], был впервые в мире утвержден в качестве национального стан-
дарта (ГОСТ Ρ 52174-2003). Этот метод основан на разработанной в
ИМБ РАН технологии гидрогелевых биочипов, которая сегодня
успешно используется в фундаментальных исследованиях, а также во
многих областях клинической лабораторной диагностики [11, 12].
В настоящем разделе описана усовершенствованная методика
обнаружения ГМИ на основе биочипов, отличающаяся высокой чув-
ствительностью (способностью выявлять менее 1% трансгена в сме-
си ДНК) и позволяющая идентифицировать десять последователь-
ностей фрагментов трансгенных элементов (промоторов и термина-
торов) и маркерных генов, а также присутствие ДНК сои, кукурузы,
картофеля и риса.
122
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Принцип метода
Выявление детерминант трансгенности при использовании биочи-
пов осуществляется проведением ряда последовательных этапов,
включающих выделение ДНК из образца пищевого продукта, ста-
дию мультиплексной ПЦР, гибридизацию полученных ПЦР-про-
дуктов (ампликонов) на биочипе, регистрацию и интерпретацию
полученных результатов. Предварительно необходимо выбрать под-
ходящие для массовых анализов ДНК-мишени трансгенности и ви-
доспецифичности, подобрать праймеры для амплификации и олиго-
нуклеотиды для иммобилизации на биочипе. В нашем случае для
выбора ДНК-мишеней трансгенности использовали созданную в
ИФР РАН базу данных по коммерческим ГМ-культурам с учетом
в первую очередь культур, продукты которых разрешены для приме-
нения на территории РФ. Список и описание детектируемых ДНК-ми-
шеней представлены в табл. 2.2.1.
Таблица 2.2.1. (1) Обозначение и назначение олигонуклеотидов, иммо-
билизованных на биочипе
Наименование
олигонуклео-
тида
Детектируемая
мишень
Назначение олигонуклеотида
pIDNA
GM/ST1
ZM1
0S1
GM2
ZM/0S2
ST2
Le1(Gm)
ген rbcL
ген rbcL
ген rbcL
ген rbcL
ген rbcL
ген rbcL
ген rbcL
ген лектина (LЕ1)
Зонд для идентификации ДНК рас-
тительного происхождения в ана-
лизируемом материале
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК сои и/или карто-
феля
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК кукурузы
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК риса
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК сои
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК кукурузы и/или
риса
Видоспецифичный зонд для иден-
тификации ДНК картофеля
Специфичный зонд для идентифи-
кации ДНК сои
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
123
Таблица 2.2.1. (1) Обозначение и назначение олигонуклеотидов, иммо-
билизованных на биочипе(окончание)
Наименование
олигонуклео-
тида
Детектируемая
мишень
Назначение олигонуклеотида
Биочип представляет собой пластиковую подложку с упорядо-
чение расположенными ячейками полиакриламидного геля, содер-
жащими ковалентно-фиксированные олигонуклеотидные зонды, по-
Zein (Zm)
UDP-GP(St)
SPS (Os)
nptll
35S_p CAMV
35S_p FMV
Act1_p
Gus
nost
35SJ CAMV
rbcSj
Ocsj
Bar
ген IVR1
ген фосфорилазы
УДФ-глюкозы
ген фосфат-синта-
зы риса
ген npt
промотор 35S
промотор FMV
ген актина АСТ1
ген gus
терминатор nos
терминатор 35S
терминатор гена
rbcS
терминатор Ocs
ген BAR
Специфичный зонд для идентифи-
кации ДНК кукурузы
Специфичный зонд для идентифи-
кации ДНК картофеля
Специфичный зонд для идентифи-
кации ДНК риса
Специфичный зонд для идентифи-
кации маркерного гена nptll из
транспозона Тп5
Специфичный зонд для идентифи-
кации 35S промотора вируса моза-
ики цветной капусты
Специфичный зонд для идентифи-
кации 35S FMV промотора каули-
мовируса мозаики норичника
Специфичный зонд для идентифи-
кации промотора гена актина риса
Специфичный зонд для идентифи-
кации маркерного гена gus
Специфичный зонд для идентифи-
кации терминатора nos из агробак-
терии Agrobacterium tumefaciens
Специфичный зонд для идентифи-
кации 35S терминатора вируса
мозаики цветной капусты
Специфичный зонд для идентифи-
кации терминатора гена rbcS
гороха
Специфичный зонд для идентифи-
кации терминатора ocs из агробак-
терии Agrobacterium tumefaciens
Специфичный зонд для идентифи-
кации маркерного гена BAR
124 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
следовательности которых комплементарны последовательностям
ДНК-мишеней, перечисленных в табл. 2.2.1. Каждая ячейка полу-
сферической формы диаметром 100 мкм и объемом 0,1 нанолитра
содержит индивидуальный олигонуклеотидный зонд. Трехмерная
структура гидрогелевого элемента биочипа обеспечивает в условиях
гибридизации диффузию фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеоти-
дов.
В структуру биочипа введены гелевые ячейки, выполняющие
роль отрицательного контроля, а также флуоресцентные ячейки,
служащие для правильной ориентации биочипа. Схема биочипа
приведена на рис. 2.2.1.А. Обозначение ячеек дано в соответствии с
перечнем и назначением олигонуклеотидов, указанных в табл. 2.2.1.
Олигонуклеотиды выбирают таким образом, чтобы их последова-
тельности были комплементарны внутренней области исследуемого
фрагмента ДНК, фланкированного праймерами, что повышает спе-
цифичность анализа.
Выделенная ДНК из анализируемых образцов используется в
качестве матрицы для амплификации трансгенных и видоспеци-
фичных последовательностей-мишеней. В реакционную смесь до-
бавляют флуоресцентно-меченный субстрат (дезоксиуридинтри-
фосфат, содержащий флуоресцентную метку). С целью получения
преимущественно одноцепочечных фрагментов, комплементарных
иммобилизованным олигонуклеотидам, мультиплексную амплифи-
кацию проводят по асимметричному типу, при котором в каждой
паре праймеров один из них добавляется в реакционную смесь в
5-10-кратном избытке по отношению к второму. Таким образом, в
результате проведения ПЦР образуются одноцепочечные флуорес-
центно-меченные фрагменты ДНК, последовательности которых
комплементарны последовательностям иммобилизованных на био-
чипе олигонуклеотидов.
Полученные ПЦР-продукты гибридизуют с олигонуклеотидами,
иммобилизованными на биочипе. При гибридизации на биочипе
одноцепочечный флуоресцентно-меченный продукт образует высо-
костабильный гибрид только с полностью комплементарным иммо-
билизованным зондом (т. е. каждый нуклеотид изучаемой мишени
образует совершенный гибридизационный дуплекс с соответствую-
щим нуклеотидом в составе зонда). При наличии неспаренных осно-
ваний эффективность гибридизации молекулы-мишени с иммоби-
лизованным зондом снижается, флуоресцентный сигнал в соответ-
ствующей ячейке падает, а после процедуры отмывки снижается до
уровня фонового шума. Таким образом, ячейки, содержащие пол-
ностью комплементарные к молекуле-мишени олигонуклеотиды,
имеют сигнал флуоресценции, по меньшей мере в несколько раз
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
125
А Б
Рис. 2.2.1. (А) Схема биочипа для идентификации ГМИ. Обозначения
ячеек даны в соответствии с названиями олигонуклеотидов в табл. 2.2.1.
Ячейки с индексом «О» не содержат олигонуклеотидов и выполняют
функцию отрицательного контроля. Ячейки с индексом «М» предназна-
чены для правильного позиционирования биочипа (захвата изображе-
ния). (Б, В) Флуоресцентное изображение и распределение нормирован-
ных сигналов ячеек биочипа при анализе ДНК трансгенной сои (Б) и кар-
тофеля линии 1/2 (В). Ячейки, в которых образовались совершенные
гибридизационные дуплексы, указаны стрелками, а также выделены
жирным шрифтом в таблице значений флуоресцентных сигналов
превосходящий сигналы ячеек, в которых не образовалось совер-
шенных гибридизационных комплексов.
Результаты гибридизации в виде флуоресцентной картины ре-
гистрируют с помощью специализированного прибора-анализатора
флуоресценции. Анализируя распределение флуоресцентных сиг-
налов биочипа по окончании гибридизации, выявляют ячейки, в ко-
торых образовались совершенные комплексы, используя заданный
алгоритм сравнения, таким образом делают заключение о нали-
126 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
чии/отсутствии ДНК растительного происхождения, ДНК одной или
нескольких культур (соя, кукуруза, картофель, рис), отсутствии/
наличии генетических детерминант трансгенности.
Материалы и реактивы
Для проведения анализа требуются реагенты или наборы для выде-
ления ДНК из продуктов питания или растительного сырья. В Рос-
сии такие наборы производят фирмы «Синтол», «ДНК-технология»,
«Бионем», «Биоком» и др.
Реактивы: гуанидинтиоцианат; ЭДТА; буферы Трис-ЭДТА и
ХЕПЕС; вода, не содержащая нуклеаз; раствор дезоксинуклеозидтри-
фосфатов («Силекс», Россия); термостабильная «HotTaq» ДНК-поли-
мераза («Силекс», Россия) с соответствующим буфером; флуорес-
центный субстрат «IMD515-дУТФ» (ИМБ РАН, Россия); контрольные
ДНК из заведомо трансгенных и заведомо нетрансгенных растений
(ИФР РАН, Россия).
Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе и праймеры
для амплификации получают на автоматическом синтезаторе
ABI-394 DNA/RNA synthesizer («Applied Biosystems», США) с при-
менением стандартного фосфорамидитного метода и очищают мето-
дом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Олигонуклеотиды для иммобилиза-
ции в гелевых элементах биочипа содержат спейсер со свободной
аминогруппой, введенной в процессе синтеза с использованием
5'-Amino-Modifier C6 («Glen Research», США). Смеси ПР-1 и ПР-2
включают праймеры для амплификации трансгенных мишеней
(табл. 2.2.1) в оптимальных комбинациях.
Гидрогелевые биочипы изготавливают согласно ранее опубли-
кованному протоколу [13]. Полимеризационную смесь, содержащую
гелеобразующие мономеры и олигонуклеотидные зонды, наносят на
пластиковую поверхность с помощью робота, с целью получения
ячеек полусферической формы диаметром 100 мкм, отстоящих друг
от друга на расстояние 150 мкм. Биочипы содержат составную реак-
ционную камеру, имеющую отверстия для заливки анализируемого
образца и обеспечивающую герметичность при проведении реакции
гибридизации.
Ход определения
Выделение ДНК из сырья и продуктов питания осуществляли с ис-
пользованием наборов «ДНК-Экстран» (ЗАО «Синтол», Россия),
«Проба-ЦТАБ» (ООО «НПО ДНК-технология», Россия) согласно ре-
комендациям производителя. Выделенная ДНК должна быть прове-
рена на количество (флуоресцентный и/или УФ-методы) и качество
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов 127
(чистота по спектральным характеристикам А260/28о и -A260/230; диа-
пазон размеров по данным электрофореза с маркерами длин ДНК).
Обычно на анализ берут 0,5-1 мкг ДНК. Эта ДНК не должна содер-
жать примесей, ингибирующих ПЦР (фенол, хлороформ, спирты,
детергенты, гепарин и др.).
Мультиплексную ПЦР проводят следующим образом. На каж-
дый анализируемый образец готовят две микропробирки, в которые
добавляют по 5 мкл раствора выделенной растительной ДНК и по
20 мкл реакционной смеси. Для эффективной амплификации всех
мишеней, указанных выше, ПЦР проводят в этих двух пробирках, в
одну из которых вносят реакционную смесь с праймерами ПР-1, а в
другую — с праймерами ПР-2.
Реакционная смесь (20 мкл) содержит 2,5 мкл 10-кратного буфе-
ра для ПЦР (700 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 166 мМ (NH4)2SO4, 25 мМ
MgCl2), 200 мкМ каждого из дНТФ, 1 мкл флуоресцентного субстра-
та «IMD515-дУТФ», 2 мкл «HotTaq» ДНК-полимеразы и 1 мкл сме-
си праймеров «ПР-1» либо «ПР-2». ПЦР проводят в соответствии со
следующим режимом: 95 °С — 12 мин; затем 55 циклов (95 °С —
30 с, 51 °С — 30 с, 72 °С — 30 с); завершающий этап при 72 °С в те-
чение 10 мин.
По окончании амплификации в одну пробирку, содержащую
18 мкл гибридизационного буфера (1,5 Μ гуанидинтиоцианата,
75 мМ ХЕПЕС-буфера, рН 7,5, 7,5 мМ ЭДТА), добавляют (в специ-
альном помещении под тягой) по 9 мкл реакционной смеси из обеих
пробирок (после ПЦР), содержащих праймеры ПР-1 и ПР-2. Гибри-
дизацию проводят в течение трех или более часов при 37 °С. По
окончании гибридизации биочип дважды (по ~30 с) промывают
35 мкл воды, прогретой до 37 °С, затем последовательно споласки-
вают 96% -м этанолом, водой и высушивают при комнатной темпера-
туре. Отмывку биочипов необходимо производить под тягой также в
специальном помещении, чтобы исключить контаминацию лабора-
тории ампликонами. Для подавления контаминации возможно также
использование урацил-ДНК-гликозилазы, катализирующей гидролиз
N-гликозильной связи между урацилом и сахарным остатком.1
Регистрацию результатов гибридизации проводят на Универ-
сальном аппаратно-программном комплексе (УАПК) для анализа
биочипов (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия), оснащенном програм-
мным обеспечением «ImageWare» (ООО «БИОЧИП-ИМБ») для вы-
числения и нормировки флуоресцентных сигналов ячеек биочипа.
В процессе тестирования каждой серии образцов предусмотрено
использование положительного и отрицательного контролей срав-
При амплификации ДНК дТТФ заменяется на дУТФ.
128
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
нения — образцов ДНК, выделенной из охарактеризованных транс-
генных и нетрансгенных растений соответственно.
Интерпретация результатов
Алгоритм интерпретации результатов гибридизации, заложенный
в программу «ImageWare», функционирует поэтапно следующим
образом. На первом этапе определяются достоверные сигналы в ячей-
ках, при которых возможно образование совершенных гибридиза-
ционных дуплексов. Для этого нормированные сигналы интенсивнос-
ти флуоресценции всех ячеек биочипа сортируются по возрастанию и
сравниваются с усредненным сигналом (Iref) в ячейках, не содержа-
щих олигонуклеотидов (ячейки с индексом «О» на рис. 2.2.1.А).
Достоверными сигналами считаются такие, которые превосходят
Iref, по меньшей мере, в 1,5 раза.
На втором этапе анализируются сигналы в группе ячеек «plDNA»,
содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL. При нали-
чии достоверных сигналов, т. е. превосходящих Iref, не менее чем в
1,5 раза, делается заключение о наличии растительной ДНК в иссле-
дуемом образце. При отсутствии достоверных сигналов в данной
группе выдается заключение об отсутствии ДНК растительного про-
исхождения в исследуемом образце, и анализ остальных ячеек био-
чипа не проводится.
На следующем этапе рассматриваются достоверные сигналы в
двух группах ячеек, содержащих зонды, последовательности кото-
рых были комплементарны видоспецифичным последовательностям
фрагмента гена RBCL (группы выделены индексами «1» и «2» на
рис. 2.2.1). Выделяются максимальные сигналы внутри каждой
группы ячеек, превосходящие другие достоверные сигналы в дан-
ной группе не менее, чем в 1,5 раза, и устанавливается принадлеж-
ность анализируемой ДНК к одной (или нескольким) из культур
(соя, кукуруза, картофель или рис).
С целью подтверждения присутствия ДНК, выделенной из опреде-
ленной культуры, анализируются сигналы в ячейках «Lei», «Zein»,
«UDP-GP», «SPS», содержащие олигонуклеотиды, специфичные к
последовательностям генов, уникальных для генома каждой из
культур (соя, кукуруза, картофель или рис). В случае обнаружения
достоверного сигнала в данной группе ячеек, делается окончатель-
ное заключение о наличии ДНК определенной культуры в исследуе-
мом материале.
Наконец, проводят анализ сигналов в ячейках «nptll», «35S_p
CAMV», «35S_pFMV», «Actl_p», «Gus», «nos_t», «35S_t CAMV»,
«rbcSt», «Ocs_t», «Bar», содержащих зонды, специфичные к эле-
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
129
ментам векторных конструкций и маркерным генам, являющимся
генетическими детерминантами трансгенности. В случае, если сиг-
нал в какой(их)-либо из данных ячеек превышает(ют) пороговое
значение Iref более, чем в 1,5 раза, делается заключение о том, что
исследуемая ДНК является трансгенной, и выдается информация об
обнаруженной детерминанте трансгенности. При отсутствии досто-
верных сигналов указанных ячеек биочипа отмечается, что в анали-
зируемом продукте ГМИ нет.
Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элемен-
ты, представлен на рис. 2.2.1.Б. В соответствии с алгоритмом интер-
претации результатов было вычислено значение Iref, как средний
сигнал в ячейках, не содержащих олигонуклеотидов. В данном слу-
чае это значение составило 0,29. Далее был проведен поиск досто-
верных сигналов в ячейках. Сигналы в ячейках «plDNA» (8,43; 8,50)
превышали пороговое значение Iref гораздо больше, чем в 1,5 раза.
Следовательно, исследуемый образец содержал ДНК растительного
происхождения.
Анализ двух рядов ячеек, содержащих зонды, комплементар-
ные видоспецифичным последовательностям фрагмента гена RBCL,
выявил следующее. В верхнем ряду достоверный сигнал наличест-
вовал в ячейках «GM/ST1» (10,31) и «ZM1» (1,87), при этом сигнал
в первой ячейке превосходил сигнал во второй более, чем в 1,5 раза.
Во втором ряду достоверный сигнал принадлежал только ячейке
«GM2» (9,37). В обеих группах гибридизационные дуплексы с ис-
следуемым фрагментом гена RBCL были образованы зондами, спе-
цифичными к ДНК сои. Данное обстоятельство подтверждало и на-
личие достоверного сигнала (6,72) в элементе биочипа, содержащем
зонд, специфичный к фрагменту гена лектина LE1, уникального
для генома сои. Таким образом, в исследуемом образце присутство-
вала ДНК сои.
Анализ элементов, содержащих зонды, специфичные к фраг-
ментам векторных конструкций и маркерных генов, выявил следую-
щие достоверные сигналы: «35S_p CAMV» (7,88), «nost» (5,50).
Следовательно, в данных ячейках образовались совершенные гиб-
ридизационные дуплексы с соответствующими ПЦР-продуктами, а
исследуемая ДНК сои являлась трансгенной.
Анализ ДНК картофеля линии 1/2 (рис. 2.2.2.В) проводили ана-
логичным образом. В данном случае значение Iref составило 0,88.
Достоверные сигналы в ячейках «plDNA» (9,76; 9,68) свидетель-
ствовали о наличии в образце растительной ДНК. Идентификация
ДНК картофеля была проведена на основании сигналов в ячейках,
содержащих видоспецифичные зонды «Gm/Stl» (10,86) и «St2»
(16,23), а также сигнала в ячейке «UDP-GP (St)» (4,49), превосходя-
130
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
0%ГМИ 0,5% ГМИ 1%ГМИ 2%ГМИ 5% ГМИ
0%ГМИ 0,5% ГМИ 1%ГМИ 2% ГМИ 5% ГМИ
Рис. 2.2.2. Гистограммы нормированных флуоресцентных сигналов яче-
ек «35S_p CAMV» и «nostt» при анализе калибровочных стандартов
фирмы «Синтол », содержащих различное количество (0-5%) ДНК ГМ-ку-
курузы линии MON 810 (А) и сои Roundup Ready™ линии GTS 40-3-2 (Б).
Пороговое значение флуоресценции Iref на каждой гистограмме указано
сплошной толстой линией
щих Iref значительно больше, чем в 1,5 раза. Поиск достоверных
сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к последова-
тельностям векторных конструкций и маркерных генов, показал
наличие таковых в элементах «nptII» (6,24), «35S_p CAMV» (7,87),
«Gus» (9,06), «nos_t» (2,58), «35S_t CAMV» (9,31). Таким образом,
данный образец ДНК картофеля линии 1/2 является трансгенным, а
тестирование на биочипе позволило идентифицировать множест-
венные элементы векторной конструкции в геноме.
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
131
Оценка метода, возможные проблемы
Оценку эффективности выявления трансгенной ДНК в смесях прово-
дили с использованием калибровочных образцов, содержащих 0,5%,
1%, 2%, 5% ДНК ГМ-сои GTS 40-3-2 и 0,5%, 1%, 2%, 5% ДНК
ГМ-кукурузы MON 810 из наборов для количественного определе-
ния ГМ-сои и ГМ-кукурузы фирмы «Синтол». Эксперимент с каж-
дой из ДНК-матриц повторяли не менее трех раз. Выявление ДНК
ГМ-сои или кукурузы при различном процентном содержания ДНК
ГМ-культур проводили, оценивая сигналы в ячейках «35S_p CAMV»
и «nos_t», содержащих зонды, специфичные к целевым мишеням в
геноме ГМ-культур. Результаты представлены на рис. 2.2.2. Как
свидетельствуют полученные результаты, разработанная методика
позволяет выявлять менее 1% трансгенной ДНК. При содержании
ГМИ менее 0,1% тестирование на биочипах будет давать в основном
отрицательные результаты. Это позволит исключить из дальнейше-
го рассмотрения пищевые объекты с низким и сверхнизким содер-
жанием ГМИ, которые не подлежат этикетированию согласно дей-
ствующему законодательству.
Аналитическую чувствительность разработанного метода оце-
нивали путем последовательных десятикратных разведений ДНК
картофеля линии 1/2 и проведением анализа согласно вышеописан-
ному протоколу. Предложенная методика позволяет воспроизводи-
мо выявлять маркерные гены при концентрации растительной ДНК
от 104 геном-эквивалентов в 1 мкл образца.
Разработанный метод идентификации ГМИ позволяет выявлять
до десяти различных трансгенных элементов в ДНК сои, кукурузы,
картофеля и риса при содержании трансгенной ДНК менее 1% в ис-
следуемом образце. Это дает возможность определить тип ГМИ и те
детерминанты трансгенности, по которым возможен последующий
количественный анализ в случае его необходимости. Дизайн прай-
меров и олигонуклеотидов обеспечивает абсолютную специфичность
их взаимодействия с искомыми трансгенными последовательностя-
ми ДНК. При этом большое число детектируемых последователь-
ностей не делает процедуру более сложной в исполнении, так как
стадия ПЦР-амплификации фрагментов ДНК и стадия гибридиза-
ции на микрочипе выполняются в один прием независимо от числа
испытуемых последовательностей. Важно также то, что у трансген-
ных растений имеется, как правило, несколько разных встроенных
в геном детерминант трансгенности. Поэтому, в случае присутствия
в образце ГМИ, флуоресцентный сигнал будет чаще всего наблю-
даться сразу в нескольких ячейках, каждая из которых послужит
независимым подтверждением положительного результата тестиро-
вания, что снижает вероятность ложноположительных результатов.
132
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Большое число тестируемых последовательностей ДНК делает ма-
ловероятными и ложноотрицательные результаты, т. к. вероят-
ность обнаружить хотя бы один фрагмент чужеродной ДНК прибли-
жается здесь к 100%. Длины амплифицируемых фрагментов ДНК
не превышают 250 п.н. (в среднем около 150 п.н.), что дает воз-
можность выявлять трансгенные последовательности даже в сильно
деградированных образцах ДНК. Высокие чувствительность и спе-
цифичность метода обусловлены тем, что он объединяет преимущест-
ва двух наиболее чувствительных и специфичных способов анализа
генома: ПЦР и гибридизации на биочипе с иммобилизованными
зондами. ПЦР увеличивает концентрацию искомых последователь-
ностей ДНК в миллион и более раз, что вполне достаточно для досто-
верной детекции флуоресцентного сигнала. Разработанный метод
высокотехнологичен и не требует значительных трудовых затрат.
Компоненты для ПЦР могут быть приготовлены заранее, а сама ре-
акция ПЦР занимает не более 2,5 ч. Гибридизация на биочипе про-
ходит без участия персонала и может проводиться и в нерабочее вре-
мя, т. е. в течение ночи. Отмывка биочипа после гибридизации и
анализ флуоресценции ячеек на аппаратно-программном комплексе
УАПК требуют минимума трудовых затрат и могут быть проведены
в течение нескольких минут. Анализ результатов гибридизации
производится в автоматическом режиме на основе специализирован-
ного программного обеспечения, использующего алгоритм интерпре-
тации гибридизационных картин, описанный выше. Срок хранения
биочипов с прогибридизовавшимся флуоресцентно-меченным матери-
алом составляет несколько лет, при этом повторная регистрация флуо-
ресценции может быть проведена в любой момент. Комплекс УАПК
позволяет сохранять в памяти компьютера как изображения, так и
цифровые значения интенсивности флуоресцентных сигналов. Преи-
мущества метода не ограничены приведенными примерами, так как
обусловлены возможностью постоянно дополнять набор ячеек биочи-
па по мере освоения генной инженерией новых регуляторных участ-
ков ДНК и маркерных генов для создания трансгенных растений.
Однако время проведения анализа составляет шесть и более ча-
сов, из которых не менее трех занимает процедура гибридизации на
биочипе. Это обусловлено замедленной диффузией фрагментов ДНК
в гелевых элементах биочипа, в сравнении с кинетикой гибридиза-
ции на микрочипах, в которых зонды иммобилизованы на двумер-
ной поверхности. При этом флуоресцентные сигналы элементов гид-
рогелевого микрочипа превышают аналогичные на поверхностном
микрочипе в 5-20 раз, а дискриминация между совершенными и не-
совершенными гибридизационными дуплексами оказывается выше
в 2—4 раза [23]. Данное обстоятельство позволяет использовать более
простые и дешевые флуоресцентные анализаторы для регистрации
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
133
Рис. 2.2.3. Анализ продуктов питания с использованием разработанного
метода. Ячейки, содержащие совершенные гибридизационные дуплек-
сы, указаны стрелками. (А) Идентификация нетрансгенной кукурузы в
образце корма «Мясо со злаками для собак, Pedigree». (Б) Идентифика-
ции нетрансгенного картофеля. (В) Выявление трансгенной сои в корме
«Васька» («Мясное ассорти с овощами для кошек»). (Г) Обнаружение
трансгенной кукурузы в куриных наггетсах («Sadia», Бразилия)
сигналов на биочипе. Кроме того, несмотря на простоту процедуры
отмывки биочипа, следует отметить необходимость строгого соблю-
дения температурно-временных параметров данного этапа, в про-
тивном случае повышенный флуоресцентный фон может привести
как к ложноположительным, так и к ложноотрицательным ре-
зультатам гибридизации. Необходимо также обратить внимание на
меньшую, в сравнении с методикой ПЦР с детекцией в режиме ре-
ального времени, устойчивость процедуры к контаминации ПЦР-про-
дуктами, особенно на этапе отмывки биочипа, который следует про-
водить в отдельном помещении, изолированном от места подготов-
ки реакционной смеси и проведения ПЦР. Вышеперечисленные
недостатки разработанной методики не являются ее ограничениями
и не возникают при точном соблюдении протокола анализа.
В целом метод отличается воспроизводимостью, простотой вы-
полнения анализа и может быть использован для быстрого массово-
го скрининга на наличие ГМИ продуктов питания и кормов, реали-
зуемых в торговых сетях (рис. 2.2.3). Он прекрасно подходит как
первый этап тестирования для отбора заведомо трансгенных образ-
134
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
цов из большой их выборки для последующего анализа количест-
венного содержания трансгена [14]. Помимо этого разработанные
методики имеют хорошие перспективы и уже нашли успешное при-
менение для фундаментальных научных исследований, в частности,
для подтверждения встраивания того или иного комплекса целевых
и маркерных генов в геном лабораторных растений, трансформиро-
ванных для исследовательских целей [15, 16].
Стоит отметить, что данный метод не связан с применением ток-
сических или радиоактивных соединений, т. е. не представляет
опасности для здоровья персонала и для окружающей среды. В свя-
зи с тем, что в процессе тестирования используются лишь микрообъ-
емы жидких сред, не возникает проблемы с утилизацией или захо-
ронением отходов.
Работа выполнена при поддержке Государственного контракта с
Министерством образования и науки РФ№ 02.522.11.2019, а также
программы Президиума РАН, подпрограммы «Генофонды и генети-
ческое разнообразие».
Литература
1. Кузнецов Вл. В., Куликов A.M. Генетически модифицирован-
ные организмы и полученные из них продукты: реальные и по-
тенциальные риски // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им.
Д. И. Менделеева). 2005. Т. XLIX. № 4. С.70-83.
2. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parliament and of
the Council of 22 September 2003 on Genetically Modified Food
and Feed.
3. Онищенко Г. Г. О надзоре за оборотом пищевых продуктов, со-
держащих ГМО // Постановление Главного государственного
санитарного врача Российской Федерации от 30.11.2007. № 80.
4. Lipp Μ. et al. IUPAC collaborative trial study of a method to detect
genetically modified soy beans and maize in dried powder // J.
AOAC Intern. 1999. V. 82. P. 923-928.
5. Leimanis S., Hernandez M., Fernandez S., Boyer F., Burns M.,
Bruderer S., Glouden Т., Harris N., Kaeppeli O., Philipp P., Pla M.,
Puigdomenech P., Vaitilingom M., Bertheau Y., Remade J.
A microarray-based detection system for genetically modified
(GM) food ingredients // Plant Molecular Biology. 2006. V. 61.
P. 123-139.
6. Xu J., Miao H., Wu H., Huang W., Tang R., Qiu M., Wen J.,
Zhu S., Li Y. Screening genetically modified organisms using
multiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray // Biosens
Bioelectron. 2006. V. 22(1). P. 71-77.
Раздел 2.2. Применение гидрогелевых биочипов
135
7. Schmidt A.M., Sahota R, Pope D.S., Lawrence T.S., BeltonM.P.,
Rott Μ. Ε. Detection of genetically modified canola using multiplex
PCR coupled with oligonucleotide microarray hybridization // J.
Agric. Food Chem. 2008. V. 56(16). P. 6791-800.
8. Kim J. H., Kim S. Y., Lee H., Kim Y. R., Kim Η. Υ. An event-specific
DNA microarray to identify genetically modified organisms in
processed foods // J. Agric. Food Chem. 2010. V. 58(10).
P. 6018-6026.
9. von G'otz F. See what you eat—broad GMO screening with
microarrays // Anal Bioanal Chem. 2010. V. 396(6). P. 1961-1967.
10. Мирзабеков А. Д., Грядунов Д. Α., Михайлович В. М., Заседа-
телев А. С, Романов Г. Α., Кузнецов В. В., Цыдендамбаев В. Д.,
Крылова Ε. Μ. Способ идентификации трансгенных последова-
тельностей ДНК в растительном материале и продуктах на его
основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления
этого способа // Патент № 2270254 (РФ). Б.И. 2006. № 5.
11. Mikhailovich V., Gryadunov D., Kolchinsky Α., Makarov Α. Α.,
Zasedatelev A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases //
Bioessays. 2008. V. 30. P. 673-682.
12. Nasedkina T. V., Guseva N.A., GraO.A., Mityaeva O.N.,
Chudinov A. V., Zasedatelev A. S. Diagnostic microarrays in
hematologic oncology: applications of high- and low-density
arrays // Mol Diagn Ther. 2009. V. 13. P. 91-102.
13. Rubina A.Y., Pan'kov S.V., Dementieva E.I., Pen'kov D.N.,
Butygin A. V., Vasiliskov V.A., Chudinov A.V., Mikheikin A.L.,
Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D. Hydrogel drop microchips
with immobilized DNA: properties and methods for large-scale
production // Anal Biochem. 2004. V. 325. P. 92-106.
14. Колотовкина Я. Б., Наумкина Ε. Μ., Чижова С. И., Гет-
ман И. Α., Кузнецов В. В., Цыдендамбаев В. Д., Кузнецов Вл. В.,
Романов Г. А. Методы идентификации и мониторинг трансген-
ных компонентов в продуктах питания // Доклады РАСХН. 2008.
№ 5. С. 44-47.
15. Наумкина Е.М., Болякина Ю.П., Романов Г. А. Органоспеци-
фичность и индуцибельность функционирования промотора гена
пататина класса I картофеля в трансгенном арабидопсисе // Фи-
зиология растений. 2007. Т. 54. № 3. С. 397-408.
16. Баврина Т. В., Миляева Э. Л., Гетман И. Α., Романов Г. А. Осо-
бенности проявления и наследования TPD1-фенотипа у инсер-
ционного мутанта табака с длительным периодом цветения //
Физиология растений. 2007. Т. 54. № 5. С. 730-737.
136 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО
КОЛИЧЕСТВА ТРАНСКРИПТОВ
РАСТИТЕЛЬНЫХ ГЕНОВ
МЕТОДОМ НОЗЕРН-БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИИ
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко
Введение
Нозерн-гибридизация применяется для изучения экспрессии генов
на уровне тотального содержания РНК в целых растениях, их орга-
нах, тканях или группах клеток на разных стадиях развития, а так-
же под действием разнообразных внешних и внутренних факторов.
Данный метод был разработан в 1977 г. [1]. Модификации этого ме-
тода позволяют оценивать относительное количество мРНК, рРНК,
тРНК, микро-РНК и выявлять отдельные формы созревания или
деградации РНК. Наиболее детальное изложение нозерн-гибриди-
зации представлено в методическом издании всемирно известной
лаборатории Cold Spring Harbor [2]. Преимуществом данного метода
является возможность выявлять размеры различных форм РНК и
наглядно оценивать количественные изменения этих форм под дей-
ствием разных факторов относительно контрольных генов. Основ-
ной недостаток метода состоит в том, что отсутствие этапа амплифи-
кации сигнала не позволяет эффективно использовать его для визуа-
лизации тех РНК, количество которых очень низко в растении,
например, ряда транскрипционных факторов.
Принцип метода
Для проведения нозерн-гибридизации необходимо выделение РНК
и ее электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях с
последующим перенесением из геля на специальную мембрану (нейло-
новую или нитроцеллюлозную), к которой РНК ковалентно «приши-
вается». Полученные мембраны гибридизуются с мечеными ген-спе-
цифичными ДНК или РНК пробами для выявления размера и коли-
чества интересующих РНК. Стоить отметить, что на каждом из
вышеперечисленных этапов возможно применение различных под-
ходов. Так, выделение РНК можно выполнять классическим мето-
дом с применением фенол-хлороформа, TRIzol реагента с последую-
щим осаждением РНК спиртом из водной фазы или с очисткой РНК
через колонки; также иногда применяется очистка РНК с помощью
хроматографии на олиго-дТ-целлюлозе, чтобы обогатить фракцию
мРНК, содержащую концевые поли(А)-последовательности. Элек-
трофоретическое разделение РНК обычно проводят в 0,8-1,2 % ага-
Раздел 2.3. Определение количества транскриптов
137
розном геле, содержащем формальдегид как денатурирующий агент.
Для получения хорошего разрешения при исследованиях низкомо-
лекулярных РНК применяют разделение РНК в полиакриламидном
геле, содержащем другой денатурирующий агент — мочевину. «При-
шивание» РНК к мембране возможно при помощи УФ-облучения
или нагревания. Наконец, в качестве проб можно использовать
одно- или двухцепочечные фрагменты ДНК, а также РНК. Мечение
проб можно осуществлять включением радиоактивно- или флуорес-
центно-меченных молекул в процессе ПЦР, in vitro транскрипции
или в ходе киназной реакции. Для детекции полученных сигналов
разработаны специальные сканеры, но можно применять и рентге-
новскую пленку. Ввиду столь широкого разнообразия возможнос-
тей проведения отдельных этапов нозерн анализа в данной статье
мы ограничимся описанием определения относительного количест-
ва растительной РНК методом нозерн-блот гибридизации, успешно
применяемым для детекции ядерных и хлоропластных транскрип-
тов размером от 70 до 5000 нуклеотидов.
Материалы и оборудование
Диэтилпирокарбонат (DEPC); изопропанол, 96% и 75% этанол; 3 Μ
ацетат натрия (рН 5,6; TRIzol реагент (Invitrogen или самостоятель-
но приготовленный: 38% фенол; 0,8 Μ гуанидин тиоционат; 0,4 Μ
аммониум тиоционат; 0,1 Μ ацетат натрия, рН 5,0; 5% глицерин),
хранить при +4 °С; 10х MOPS буфер (0,2 Μ MOPS, pH 7,0; 20 мМ
ацетат натрия; 10 мМ ЕДТА; рН 8,0), хранить при +4 °С; буфер для
нанесения РНК на электрофорез (2,5 мл формамида; 875 мкл 37%
формальдегида; 800 мкл 10х MOPS буфера; 800 мкл глицерина;
30 мкл бромистого этидия; 0,25% бромфенолового синего; 0,25%
ксилен цианола), сделать аликвоты и хранить при -20 °С; РНК мар-
кер (например, High Range RNA Ladder, Fermentas); 20x SSC (0,3 Μ
цитрат натрия, 3 Μ NaCl); QuantiTect Rev. Transcription Kit, Qiagen,
или аналогичный набор реактивов для синтеза кДНК; Taq ДНК по-
лимераза (например, Fermentas); наборы 5 мМ дНТФ, 5мМ НТФ (на-
пример, Fermentas); MAXIscript, Ambion или аналогичный набор
реактивов для проведения Т7 транскрипции in vitro; (а)-32Р-УТФ,
(а)-32Р-дЦТФ или (γ)-32Ρ-ΑΤΦ; 20% SDS; гибридизационный буфер
(ГБ: 250 мМ Na2HPO4, рН 7,2; 7% SDS; 2,5 мМ ЭДТА, рН 8,0); 1%
денатурирующий агарозный гель: для приготовления 100 мл геля
необходимо 1 г агарозы, 10 мл 10х MOPS буфера, 2,5 мл 37% форм-
альдегида.
Набор автоматических микропипеток (10 мкл, 20 мкл, 200 мкл,
1000 мкл); центрифуга с охлаждением («Heraeus Biofuge Fresco»,
138 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Великобритания), вортекс (Vortex-Genie 1 Touch Mixer, «Scientific
Industries», США); прибор для проведения горизонтального элек-
трофореза; термостат от 37 до 95 °С (например, «Eppendorf»). ЗММ
бумага; Hybond N+ нейлоновая мембрана; пленка, не пропускаю-
щая жидкость (например, Saranwrap); спектрофотометр (например,
Spectro SC, «Labomed, Inc.», США); УФ трансиллюминатор (напри-
мер, Molecular Imager Gel Doc XR System, BioRad); амплификатор
(например, С1000 Thermal Cycler, BioRad); T4 Polynucleotide
Kinase, Fermentas; G-50 или G-25 колонки, GE Healthcare; QIAquick
Gel Extraction Kit, Qiagen или аналогичный набор реактивов для
экстракции ПЦР фрагментов из геля; гибридизационная печь (на-
пример, Hybridization Oven/Shaker 220/240 V, 50Hz, «Amersham»).
Выделение РНК
Работа с РНК обычно связана с риском ее деградации РНКазами.
Поэтому необходимо выполнять всю работу в перчатках, исполь-
зовать посуду и расходные материалы или одноразовые, не содер-
жащие РНКаз, или обработанные диэтилпирокарбонатом (DEPC).
Обработка воды осуществляется при 37 °С в течение как минимум
1 ч 0,1% раствором DEPC. Затем воду необходимо проавтоклавиро-
вать, чтобы дезактивировать DEPC.
Рабочее место, прибор для электрофореза, перчатки и прочие не-
обходимые предметы протирают спиртом. Раствор РНК необходимо
всегда ставить в кювету со льдом. Размораживают РНК также мед-
ленно во льду.
Обычно выделение РНК для нозерн-блот анализа проводится с
использованием TRIzol реагента (Invitrogen) по прилагаемому про-
токолу. Выделять РНК необходимо в вытяжном шкафу из-за ток-
сичности многих используемых веществ. Растительный материал
(0,1-0,5 г) фиксируется в жидком азоте. Проба растирается до пуд-
рообразного состояния с жидким азотом в ступке, к ней добавляется
по каплям TRIzol реагент (1 мл на 0,2 г растительной ткани) и тоже
растирается до порошка. Полностью размороженная смесь TRIzol
реагента и ткани переносится в пробирку и инкубируется 5 мин при
комнатной температуре. К ней добавляется 200 мкл хлороформа на
1 л TRIzol реагента, смесь необходимо перемешать в течение 15 с
встряхиванием, инкубировать при комнатной температуре 3 мин и
провести разделение фаз центрифугированием в течение 15 мин при
11 000 об./мин. Все этапы центрифугирования при выделении РНК
следует проводить на центрифуге, охлажденной до +4 °С («Heraeus
Biofuge Fresco», Великобритания). Верхняя водная фаза содержит
РНК, ее необходимо перенести в новую пробирку, стараясь не за-
Раздел 2.3. Определение количества транскриптов
139
брать интерфазу. Для осаждения РНК к водной фазе добавляется
0,7-1 объем изопропанола, который перемешивается с водной фазой
инвертированием пробирки. Осаждение ведется в течение 10 мин при
комнатной температуре с последующим центрифугированием в те-
чение 10 мин при 11 000 об./мин. Осадок промывается 1 мл 75% эта-
нола, еще раз центрифугируется в течение 5 мин при 7000 об./мин.
Спирт отбрасывается, его остатки со стенок пробирки собирают цент-
рифугированием в течение нескольких секунд и также отбрасыва-
ют. Осадок подсушивается при инкубировании открытой пробирки
10 мин во льду и растворяется в деионизованой воде (400-600 мл),
не содержащей РНКаз.
Измерение концентрации РНК
При проведение нозерн-анализа необходимо выровнять концентра-
цию РНК в разных образцах перед нанесением ее на гель. Концен-
трация РНК определяется измерением ее оптической плотности
на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Желательно, чтобы
значения оптической плотности препарата РНК при А260 были не
ниже 0,15 о. е. Одна единица оптической плотности при длине волны
260 нм (А2б0 =1) соответствует концентрации РНК 40 мкг/мл. При-
чем, это справедливо только для водного раствора РНК и только в
том случае, если препарат РНК имеет незначительное количество
примесей белков и полисахаридов. Для оценки чистоты РНК ис-
пользуют соотношение значений оптической плотности при длинах
волн 260 нм и 280 нм (А260/А280), которое говорит о примеси белка,
и должно быть не ниже 1,8. Наличие в препарате РНК полисахари-
дов характеризуется соотношением А260/А230. При допустимом
уровне полисахаридов это соотношение должно быть не ниже 1,8.
Для большей наглядности приведем пример расчета концентрации
РНК. Исходный образец РНК был разведен в 50 раз; значения опти-
ческой плотности А260 = 0,5 о. е., А280 = 0,25 о. е. Концентрация
РНК вычисляется по формуле:
Концентрация РНК = 40 χ Α260 x разведение = 40 χ 0,5 χ 50 =
= 1000 мкг/мл = 1мг/мл.
Чистота РНК определяется по следующей формуле:
А260/А280 = 0,5/0,25 = 2; 2>1,8
и А260/А230 = 0,5/0,23 = 2,17;
2,17 > 1,8,
что означает, что образец РНК достаточно чист, и концентрация
РНК может быть определена с помощью спектрофотометра.
140 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
В настоящее время наиболее удобно использовать специальные
спектрофотометры (например, NanoDrop, «Thermo Fisher Scientific
Inc.»), позволяющие измерять концентрацию РНК в 1мкл неразве-
денного раствора и автоматически рассчитывающие концентрацию
РНК и соотношения А260/А280 и А260/А230·
Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле
Для электрофоретического разделения РНК используют денатури-
рующий агарозный гель 0,8-1,2% . Приготовление геля необходимо
проводить в вытяжном шкафу из-за токсичности формальдегида.
Компоненты геля за исключением формальдегида кипятят до раство-
рения агарозы и затем охлаждают до температуры 60-65 °С. Если
при кипячение объем геля уменьшается, его необходимо довести во-
дой до начального объема. Формальдегид добавляют непосредствен-
но перед заливкой геля и тщательно перемешивают. Залитый в го-
ризонтальную ячейку гель застывает в течение как минимум одного
часа. Хранение геля не рекомендуется.
Количество РНК, используемое для электрофоретического раз-
деления, в основном зависит от интенсивности экспрессии изучае-
мого гена. Так, например, при изучении генов с сильной экспресси-
ей (гены, кодирующие актин, рРНК, РБФК и т. д.) достаточно
1-5 мкг РНК, тогда как при изучении генов со слабой экспрессией
возможно нанесение до 50 мкг РНК. Пробы РНК подготавливаются
в чистых, не содержащих РНКаз пробирках во льду. В зависимости
от вместимости ячеек в геле определяется объем проб. На 15 мкл
надо взять 3 мкл буфера для нанесения РНК, необходимый объем
РНК, соответствующий нужному количеству РНК, и довести водой
до конечного объема, тщательно перемешать, используя вортекс
(Vortex-Genie 1 Touch Mixer, «Scientific Industries», США) или пи-
петированием, денатурировать РНК 5 мин при 75 °С и незамедли-
тельно поставить пробирки в лед. Быстрое перенесение денатуриро-
ванных образцов РНК в лед не позволяет РНК восстановить вторич-
ную структуру. При использовании РНК маркера (например, High
Range RNA Ladder, Fermentas), его подготовка происходит так же,
как и остальных образцов. Разделение РНК проводят в приборе для
горизонтального электрофореза в lx MOPS буфере. Рекомендуется в
течение 5 мин до нанесения образцов РНК провести предваритель-
ный электрофорез при напряженности поля 5 V/см. Затем наносят
образцы РНК, при возможности оставив крайние дорожки геля пус-
тыми, и проводят разделение РНК при 4-5 V/см. При такой нап-
ряженности поля электрофорез продолжается примерно 4-5 ч до
тех пор, пока бромфеноловый синий не пройдет примерно 8 см. Воз-
можно проведение электрофореза при более низкой напряженности
Раздел 2.3. Определение количества транскриптов 14-1
поля в течение 12-15 ч. В таком случае электрофорез лучите выпол-
нять при +4 °С. Визуализацию РНК в геле после разделения прово-
дят с помощью УФ трансилюминатора (например, Molecular Imager
Gel Doc XR System, «BioRad»). После электрофореза становится
видно качество выделенной РНК. Если видны четкие полосы наибо-
лее обогащенных фракций РНК: 28S и 18S ядерных рРНК, а также
хлоропластных и митохондриальных рРНК (рис. 2.3.1), то это озна-
чает, что при выделении и электрофорезе РНК не была повреждена
РНКазами.
А Б
RAB18 АСТ2
-5000
-4000
-3000
-2000
-1500
-1000
- 500
Рис. 2.3.1. Нозерн-гибридизация с двумя пробами на ядерные гены и де-
натурирующий электрофорез РНК. (А) Нозерн-гибридизация мембран с
пробой на RAB18 (Responsible to ABA) ген (« ГБ ») и соответствующий мем-
бране денатурирующий РНК гель («Гель»), содержащий справа РНК мар-
кер. На гель была нанесена РНК в количестве 5 и 10 мкг, выделенная из
проростков Arabidopsis, обработанных в течение 12 ч водой (H2O) или абс-
цизовой кислотой (АБК). Черной стрелкой отмечены специфичные сигна-
лы RAB18 гена, серыми стрелками — сигналы, возникшие в результате
небольшой деградации РНК. На радиоавтографе видны два различных по
размеру транскрипта RAB18 гена. Оба транскрипта активируются АБК,
но один из них накапливается в существенно больших количествах.
(Б) Нозерн-гибридизация мембран с пробой на АСТ2 ген и соответствую-
щий мембране денатурирующий РНК гель. На гель были нанесены такие
же образцы РНК как на рис. 1А. Радиоавтограф данной гибридизации
представляет собой яркий пример кросс-гибридизации пробы с отдельны-
ми формами рибосомных РНК, что важно иметь в виду при интерпрета-
ции результатов, полученных данным методом
142
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Перенос РНК с геля на мембрану
Наиболее эффективно перенос РНК с геля осуществляется на нейло-
новую положительно заряженную мембрану (Hybond N+) методом
капиллярного переноса в 10х SSC. Гель предварительно подготав-
ливают к переносу. Отрезают слоты, края и другие ненужные облас-
ти геля, что делает его более ровным и удобным, и промывают в
10х SSC, по объему как минимум в 10 раз больше, чем объем самого
геля, 20-30 мин, чтобы вымыть формальдегид, который ухудшает
перенос, и насытить гель раствором для переноса. Для капиллярно-
го переноса необходима кювета, в которую помещают подставку для
геля и наливают 10х SSC (рис.2.3.2). На эту подставку помещают
смоченный в 10х SSC фитиль из фильтровальной бумаги Whatmann
ЗММ («Whatmann», Великобритания), края которого должны ка-
саться дна кюветы. Далее, на фитиль помещают поочередно гель,
мембрану, три слоя Whatmann ЗММ, стопку бумажных салфеток и
груз. Мембрану и бумагу Whatmann ЗММ необходимо предварительно
вырезать и смочить в 10х SSC. Пространство на фитиле, примыкаю-
щее к гелю, закрывают тонкой не промокающей пленкой (напри-
мер, типа Saran Wrap или удобно использовать также Parafilm),
чтобы предотвратить подъем SSC в обход мембраны. Перенос РНК
ведут в течение ночи. После того как мембрана была положена на
гель, ее больше нельзя передвигать, поскольку перенос РНК начи-
нается сразу при соприкосновении геля с мембраной. Каждый слой
Груз
Бумажные салфетки
3 слоя ЗММ
Мембрана
Гель
Фитиль из ЗММ
10xSSC
Кювета
Подставка для геля
Рис. 2.3.2. Схема перенесения РНК на мембрану капиллярным методом в
растворе 10х SSC. В кювету помещена подставка для геля, на которую
кладется фитиль из Whatmann ЗММ, смоченный в растворе 10х SSC таким
образом, чтобы его загнутые края касались дна кюветы. В кювету налива-
ется примерно на высоту 2-3 см 10х SSC, который необходим для переноса
РНК. На фитиль помещается предварительно подготовленный гель лице-
вой стороной кверху. Пространство вокруг геля на фитиле закрывается
пленкой для предотвращения просачивания SSC в обход геля. На гель по-
мещается мембрана, например, Hybond N+ и три слоя Whatmann ЗММ,
предварительно смоченные в 10х SSC, выше помещается стопка бумаж-
ных салфеток и груз. Перенос РНК длится в течение ночи
Раздел 2.3. Определение количества транскриптов 143
системы переноса необходимо прикатывать пробиркой или другим
подходящим предметом, чтобы удалить пузырьки воздуха. Мембра-
ну после переноса высушивают, проверяют качество переноса в УФ
свете. «Пришивание» РНК к мембране производится при освеще-
нии мембраны УФ светом (длине волны 254 нм) в течение 2 мин. Го-
товую высушенную мембрану можно хранить при комнатной темпе-
ратуре, обернутой в пластиковую пленку.
Синтез меченых проб
Детекция сигналов РНК на мембране осуществляется с помощью
гибридизации мембран с пробами, гомологичными изучаемой РНК.
Пробы могут быть радиоактивно- или флуоресцентно-меченные. В
данном разделе мы опишем приготовление радиоактивно-меченных
проб при помощи ПЦР, in vitro транскрипции и киназной реакции.
Выбор пробы и метода ее мечения приходится делать в каждом кон-
кретном случае в зависимости от цели эксперимента.
Наиболее распространенный метод получения проб проводит-
ся с помощью ПЦР. Необходимо подобрать праймеры, используя
последовательность кДНК изучаемого гена, амплифицирующие
200-1000 пар нуклеотидов. Выделить РНК (TRIzol, Invitrogen),
синтезировать с нее кДНК (QuantiTect Rev. Transcription Kit, Qiagen)
и провести ПЦР (Taq DNA polymerase, Fermentas). Очистить из геля
амплифицированный фрагмент после проведения электрофореза
(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen). Провести ПЦР с одним обрат-
ным праймером и (а)-32Р-дАТФ (на 20 мкл: 1 мкг ПЦР фрагмента;
1 мкл 5 мМ дАТФ; 1 мкл 5 мМ дТТФ; 1 мкл 5 мМ дГТФ; 1 мкл
0,05 мМ дЦТФ; 2 мкл 10х буфера; 3 мкл (100 пМ) обратного прайме-
ра; 0,5 мкл Taq полимеразы (5 е. а.); 50 микроКюри (a)-32Р-дАТФ;
довести водой до 20 мкл). Очистить пробу от невключенных дЦТФ
на G-50 колонках (GE Healthcare). Оценить счетчиком, произошло
ли включение меченого соединения. Иногда допустимо проведение
ПЦР-мечения и с двумя праймерами, в результате которого синте-
зируется двуцепочечная ДНК, что может привести к нежелательной
кросс-гибридизации.
Для синтеза одно-цепочечных меченых проб РНК лучше всего
использовать in vitro транскрипцию с промотора Т7 РНК полиме-
разы. Для этого сначала проводится ПЦР с кДНК. Обратный
праймер должен содержать последовательность праймера Т7 (5'-
cagagatgcataatacgactcactatagggaga-З'). Полученный ПЦР продукт
фракционируют в агарозном геле, выделяют из геля (например,
QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) и используют его (0,5 мкг) как
матрицу для синтеза РНК посредством Т7 РНК полимеразы (напри-
144 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
мер, MAXIscript, Ambion). Для мечения используют 50 микроКюри
(а)-32Р-УТФ. Очистку от невключенных нуклеотидов проводят пере-
осаждением РНК этанолом (добавлением 0,1 объема 3 Μ ацетата нат-
рия рН 5,2 и 3 объема 96% этанола). Осадок РНК растворяют в воде
или гибридизационном буфере и используют в качестве пробы для
нозерн-гибридизации.
Если в качестве пробы планируется использовать химически син-
тезированный олигонуклеотид, то для его мечения применяется
киназная реакция, проводимая ферментом полинуклеотидкиназой
(Т4 Polynucleotide Kinase, «Fermentas»), в которой к 5'-концу оли-
гонуклеотида присоединяется радиоактивный фосфат, полученный
от (γ)-32Ρ-ΑΤΦ. В качестве проб для нозерн-гибридизации подходят
олигонуклеотиды длиной от 25 до 100 нуклеотидов. Стоит отметить,
что с помощью киназнои реакции также можно получать радиоак-
тивно-меченные пробы на основе фрагментов ПЦР и молекул РНК.
При проведении киназнои реакции всегда используются протоколы
производителя фермента. После реакции пробу очищают от невклю-
ченных (γ)-32Ρ-ΑΤΦ на колонках с Сефадексом G-50 или G-25 («GE
Healthcare»), в зависимости от размера олигинуклеотида, ДНК или
РНК фрагмента и оценивают счетчиком, произошло ли мечение.
Нозерн-гибридизация
Для проведения нозерн-гибридизации необходимы мембрана с пе-
ренесенной на нее РНК и ген-специфичная проба. Мембрану пред-
гибридизуют в течение 1 ч в чистом гибридизационном буфере (ГБ)
при температуре 65 °С и затем заменяют ГБ на свежую порцию, в
которой будет проводиться гибридизация. Для гибридизации ис-
пользуют специальные печи (например, Hybridization Oven/Shaker
220/240 V, 50Hz, «Amersham») с вращающимся ротором, к которо-
му крепятся специальные пробирки для гибридизации. В пробир-
ках на 100 мл гибридизация обычно ведется в 10 мл ГБ. Перед добав-
лением пробы мембрана и пробирка со свежим ГБ должны быть
нагреты до температуры, при которой будет проводиться гибридиза-
ция. Подготовка пробы заключается в том, что ее объем доводят до
100-150 мкл ГБ и затем денатурируют в течение 5 мин при 95 °С в
случае ДНК или при 75 °С в случае РНК. Денатурированную пробу
немедленно помещают в ГБ, находящийся в пробирке для гибриди-
зации, не задевая мембрану. Готовую пробирку с мембраной и про-
бой устанавливают в ротор гибридизационной печи, и ведут гибри-
дизацию при постоянном вращении ротора в течение 4-16 ч (чаще
всего в течение ночи) при заранее подобранной температуре (обычно
Раздел 2.3. Определение количества транскриптов
145
60-65 °С). В случае гетерологичной гибридизации температура гиб-
ридизации может быть значительно снижена.
После гибридизации необходимо отмыть мембрану от пробы, ко-
торая не связалась с изучаемой РНК. Для этого мембрану промыва-
ют в растворах, содержащих 0,1% SDS и разные концентрации SSC.
Отмывку проводят обычно при температуре гибридизации. Отмыв-
ка мембран происходит в растворах с каждым разом уменьшающей-
ся концентрацией солей: сначала промывают мембрану в растворе 2χ
SSC, затем lx SSC, 0,5x SSC и, наконец, 0,2х SSC. Каждый этап от-
мывки длится 10-30 мин. Счетчиком контролируется наличие сиг-
нала. Для каждой пробы предварительно подбирают условия гиб-
ридизации и отмывок. Отмытую мембрану заворачивают в пленку и
экспонируют с рентгеновской пленкой или со специальным экраном
различное время, которое зависит от силы сигнала.
Интерпретация результатов
Полученное изображение сопоставляют или с фотографией геля с
окрашенной РНК, или с изображением гибридизации этой же мем-
браны с контрольным геном, экспрессия которого не меняется в из-
учаемых условиях. При сопоставлении приблизительно оценивают
размер молекул РНК, сравнивая их с маркером или с расположени-
ем наиболее выраженных пятен рРНК. Для примера на рис. 2.3.1.А
представлены результаты нозерн-гибридизации для транскриптов
RAB18 гена, который сильно активируется абсцизовой кислотой в
данных образцах РНК. Оценивают наличие неспецифичной, так на-
зываемой, кросс-гибридизации (рис. 2.3.1.Б). Обычно при кросс-гиб-
ридизации распределение пробы на мембране выглядит как точная
копия распределения всех или только отдельных пятен рРНК в
геле. Сравнение интенсивности сигналов изучаемого гена в раз-
ных вариантах осуществляется с использованием специальных про-
грамм (QantityOne, «BioRad», США), позволяющих выразить ее ко-
личественно.
Оценка метода, возможные проблемы
Нозерн-гибридизация до сих пор остается незаменимым методом
определения относительного количества транскриптов в экспери-
ментальных образцах. Данный метод также позволяет оценивать
размер изучаемых молекул РНК, что является существенным преи-
муществом по сравнению с методами, основанными на применении
полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). На полученном после экс-
перимента радиоавтографе видны различные формы РНК: как пер-
146 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
вичные транскрипты, так и процессированные. Это позволяет полу-
чить дополнительную информацию, например, о скорости деградации
отдельных форм РНК или нарушениях процессинга транскриптов,
что, например, было показано для rpl16 транскриптов под воздей-
ствием кадмия в проростках ячменя [3]. В то же время, по наличию
полос на радиоавтографе, не соответствующих размерам изучаемых
транскриптов, легко выявляется неспецифичная гибридизация.
Относительная простота метода, наглядность результатов и возмож-
ность легко выявлять ложноположительные сигналы определяют
его широкое применение учеными всех стран мира в течение послед-
них 30 лет.
В то же время, как и любой метод, нозерн-гибридизация имеет
свои недостатки. Основной недостаток связан с отсутствием возмож-
ности определить уровень транскриптов слабо экспрессирующихся
генов. Гибридизация между РНК и пробой происходит не во всем объ-
еме гибридизационного буфера, а в строго ограниченном месте на
мембране, в котором иммобилизированы изучаемые транскрипты.
Это ограничивает количество молекул меченой пробы, которые спо-
собны связаться с транскриптами. Кроме того, при использовании
нозерн-гибридизации невозможна амплификация сигнала до детек-
тируемого уровня, что происходит при применении методов, осно-
ванных на ПЦР. Встречаются также определенные трудности при
изучении данным методом уровня транскриптов генов, имеющих
высокую степень гомологии.
Другим недостатком, свойственным впрочем всем методам, при-
меняемым при тестировании тотального содержания РНК, являет-
ся то, что полученные результаты дают представление об изменении
количества изучаемых транскриптов или относительно общего ко-
личества транскриптов в образце, или относительно количества РНК
контрольного гена, экспрессия которого наиболее стабильна в изу-
чаемых условиях. В случаях, когда происходят изменения тоталь-
ного содержания РНК в клетках (например, при сравнении экспрес-
сии генов в разных тканях или на разных стадиях развития), стоит
принимать во внимание возможность получения несколько иска-
женных результатов при различных контролях нанесения образ-
цов.
Литература
1. Alwine J. С, Kemp D. J., and Stark G. R. Method for detection of
specific RNAs in agarose gels by transfer to
diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA
probes // PNAS. 1977. V. 74. P. 5350-5354.
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 147
2. Sambrook J. and Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
3. Зарипова Η. P., Зубо Я. О., Кравцов А. К., Холодова В. П., Куз-
нецов В. В., Кузнецов Вл. В. Тяжелые металлы вызывают диф-
ференциальную регуляцию транскрипции пластидных генов и
блокирование сплайсинга мРНК // Доклады Академии наук.
2008. Т.423. С. 124-128.
2.4. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ГЕНОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
МЕТОДА RUN-ON ТРАНСКРИПЦИИ
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко, В. В. Кузнецов
Введение
Метод run-on транскрипции применяется для изучения регуляции
скорости транскрипции ядерных, хлоропластных или митохондри-
альных генов, что важно для понимания механизма действия фито-
гормонов, света, температуры и других факторов. Этот метод был
впервые предложен для изучения скорости транскрипции ядерных
генов [1], а позднее был адаптирован к хлоропластам и митохондриям
[2,3]. Значительная вариабельность и сравнительно слабая экспрес-
сия многих ядерных генов ограничивают применение этого метода
для изучения регуляции экспрессии ядерного генома. В хлороплас-
тах экспрессия большинства генов обнаруживается довольно легко,
а небольшое их количество (около 130) позволяет при необходимости
оценить интенсивность транскрипции сразу всех генов [4]. Кроме
того, хлоропластные гены очень консервативны, что дает возмож-
ность использовать фрагменты генов одного вида растения для ана-
лиза транскрипции аналогичных генов у других видов.
Принцип метода
Метод run-on транскрипции основан на способности изолированных
органелл (имеющих собственную ДНК) в течение некоторого време-
ни после их выделения осуществлять транскрипцию генов при на-
личии всех необходимых компонентов, которые могут быть введены
в состав транскрипционного буфера. При этом транскрипция идет
на эндогенной ДНК с участием РНК-полимераз и регуляторных бел-
ков органельного и ядерного кодирования. Влияние изучаемого
фактора на растение происходит до момента выделения органелл,
148 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
а оценивается этот эффект по интенсивности синтеза РНК изоли-
рованными органеллами. Во всех органеллах обычно присутствует
большое количество уже синтезированных транскриптов. Введе-
ние в транскрипционную реакцию радиоактивно-меченного пред-
шественника РНК (обычно это a-32Р-УТФ) позволяет детектировать
только те молекулы РНК, которые были синтезированы в течение
реакции транскрипции in vitro. По существующим представлениям
случаи инициации транскрипции в ядерных, хлоропластных и мито-
хондриальных лизатах достаточно редки, поэтому в таких условиях
идет, главным образом, элонгация нитей РНК, синтез которых был
инициирован in vivo.
Метод run-on транскрипции можно условно разделить на четыре
этапа: 1 — выделение ДНК-содержащих органелл; 2 — проведение
реакции транскрипции in vitro и выделение 32Р-меченых вновь син-
тезированных транскриптов; 3 — подготовка мембран с фрагмента-
ми изучаемых генов; 4 — ДНК—РНК-гибридизация, анализ полу-
ченных данных.
В данном разделе описывается метод применительно к изуче-
нию интенсивности транскрипции пластидных генов, хотя основ-
ные его принципы будут справедливы также для изучения регуля-
ции транскрипции в ядрах и митохондриях.
Реактивы и оборудование
Буфер для гомогенизации растительной ткани — 0,33 Μ сорбит;
50 мМ трицин, рН 8,0; 2 мМ ЭДТА; 5 мМ β-меркаптоэтанол; 40 и
70% перкол; буфер для ресуспендирования хлоропластов — 50 мМ
Tris-HCl, рН 7,0, 10 mM MgCl2, 10 тМ КС1, 4тМ β-меркаптоэтанол,
транскрипционный буфер — 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 10 мМ MgCl2;
10 мМ β-меркаптоэтанол; по 0,2 мМ ЦТФ, ГТФ, АТФ; 0,01 мМ УТФ;
2 МБК а32Р-УТФ (110 ТБК/мМ, «Amersham Bioscience», Великобри-
тания, возможно российского производства); 20 ед. активности РНКа-
зина («Fermentas», Литва); буфер для остановки реакции транкрип-
ции — 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 25 мМ ЭДТА, рН 7,5; 5% Na-лаурил-
саркозил; смесь фенол : хлороформ (1 : 1), хлороформом; 96 и 75%
этанол; изопропанол; 3 Μ ацетат натрия, рН 5,2; все реактивы и
праймеры, необходимые для амплификации фрагментов ДНК; все
реактивы необходимые для фракционирования ДНК в агарозном
геле; NaOH; нейлоновая мембрана, обладающая высокой связываю-
щей способностью (например, Hybond N+ размер пор 0,45 мкм,
«Amersham Bioscience»); 0,2х и 2х SSC буфер (20х SSC-буфер: 0,3 Μ
цитрат Na, 3 Μ NaCl, pH 7,0); буфер для ДНК/РНК гибридизации —
250 мМ Na2HPO4, рН 7,2, 7% SDS, 2,5 мМ ЭДТА; пленка типа
Saran Wrap; мираклос (Miracloth, «Calbiochem-Behring», La Jolla, CA
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 149
92037); рентгеновская пленка HyperfilmTM («Amersham Bioscience»)
или аналоги в случае отсутствия фосфоимеджера.
Гомогенизатор Komet RG5, Германия или другая модель; цент-
рифуга среднескоростная с охлаждением и объемом стаканов до
100 мл; микроцентрифуга желательно с охлаждением («Eppendorf»,
«Heraus» или других фирм); световой микроскоп и камера Розен-
таля—Фукса; ДНК-амплификатор; прибор для фракционирова-
ния ДНК в агарозном геле с источником питания; прибор, приме-
няемый для дот-гибридизации, например Bio-Dot™, «Bio-Rad»,
США; ультрафиолетовый облучатель (например, VL-6LC фирмы
«Vilber Lourmat», Франция); гибридизационная печь (например,
Hybridization Shaker; «Amersham Bioscience»); фосфоимиджер (на-
пример, Typhoon Trio «GE Healthcare», США) — крайне желателен,
но не является абсолютно необходимым, шейкеры, текмоблоки, хо-
лодильные шкафы на +4, -20 и -70 °С.
Выделение хлоропластов
Первым этапом проведения run-on транскрипции является выделе-
ние органелл (в нашем случае хлоропластов), которое необходимо
проводить при температуре от 0 до 4 °С. При такой температуре
транскрипция, как и большинство биохимических процессов в
клетке, практически останавливается, но при повышении темпера-
туры до 20-30 °С синтез РНК в органеллах возобновляется.
Для выделения пластид растительную ткань гомогенизируют с
помощью миксера (Komet RG5, Германия или другого гомогениза-
тора) в специальном буфере для гомогенизации (см. «Реактивы и
оборудование»), осмотическая сила которого обеспечивает интак-
тность выделяемых органелл. На 10-15 г растительной ткани берет-
ся 80 мл буфера. Гомогенат фильтруют через 1 слой марли и 2 слоя
мираклоса (Miracloth, «Calbiochem-Behring», La Jolla, CA 92037).
Полученный фильтрат центрифугируют 5 мин при 3500 g. Осадок
осторожно ресуспендируют (кисточкой или мягко встряхивая про-
бирки) в небольшом объеме буфера для гомогенизации (на 10 г ис-
ходного растительного материала берется 1 мл буфера). Полученную
суспензию наслаивают на ступенчатый градиент перкола (40/70%) и
центрифугируют 30 мин при 6000 g. После центрифугирования, на-
чиная с верхней части градиента, полностью удаляют слой буфера
для гомогенизации, буфер с частично разрушенными хлороплас-
тами и часть 40%-го перкола (рис. 2.4.1). Далее вместе с остатком
40% -го перкола отбирают интактные хлоропласты. Для удаления
перкола к суспензии хлоропластов добавляют не менее 50 мл буфера
для гомогенизации и центрифугируют 5 мин при 3500 g. Затем оса-
150
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Гомогенизирующий
буфер
Слой 40%
Слой 70%
Митохондрии
Разрушенные
хлоропласты
Интактные
хлоропласты
Ядра
Рис. 2.4.1. Разделение клеточных органелл в ступенчатом градиенте пер-
кола (40/70%). Пунктирными линиями показана часть градиента, кото-
рая обычно отбирается для получения интактных хлоропластов
док хлоропластов ресуспендируют в 1 мл буфера для гомогениза-
ции, и производят подсчет выделенных хлоропластов, используя
световой микроскоп и камеру Розенталя—Фукса [5].
Примечание 1
Метод выделения интактных хлоропластов основан на разделении
различных клеточных органелл при центрифугировании в сту-
пенчатом градиенте перкола. Ядра, как самые тяжелые органел-
лы, проходят оба слоя перкола и образуют вместе с фрагментами
клеточных стенок осадок на дне пробирки (рис. 2.4.1). Интактные
хлоропласты проходят сквозь 40%-й перкол и скапливаются на
границе между слоями 40%- и 70%) -го перкола. Частично разру-
шенные хлоропласты не входят в 40%-й перкол и образуют слой
между буфером для гомогенизации и 40%)-м перколом. Митохон-
дрии остаются в буфере для гомогенизации. Таким способом можно
не только очистить хлоропласты от других типов органелл, но и от-
делить интактные пластиды от частично разрушенных. Вполне воз-
можно применение и других буферных систем для гомогенизации
ткани при выделении хлоропластов и даже других типов градиентов
для очистки пластид [6]. При выделении мелких хлоропластов или
этиопластов из молодых активно растущих зеленых или этиолиро-
ванных тканей необходимо предварительно определить концентра-
ции перкола для ступенчатого градиента, который позволит наибо-
лее эффективного отделить интактные органеллы.
В реакцию транскрипции следует всегда брать только интакт-
ные хлоропласты, поскольку они имеют наиболее высокую транс-
крипционную активность [7]. После выделения органелл необходи-
мо выравнивать их количество в разных вариантах опыта. Оценить
количество хлоропластов можно несколькими способами: подсче-
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 151
том с использованием микроскопа и камеры Розенталя—Фукса [5],
измерением количества хлоропластной ДНК или измерением коли-
чества хлорофилла. В настоящее время применяются все три вида
расчета [8-10], однако следует иметь в виду, что каждый из них
имеет недостатки и может привести к некоторому искажению полу-
ченных результатов. При анализе равного количества хлоропластов
в каждом варианте опыта хотя бы часть транскрипционной актив-
ности в хлоропластах средней части листа злаков (в сравнении с ба-
зальной частью) будет вызвана не увеличением скорости транскрип-
ции, а увеличением количества копий пластидной ДНК в каждом
хлоропласте [11]. Аналогичным образом результат может не совсем
правильно отражать влияние фактора на скорость транскрипции
при равном количестве ДНК в каждом варианте опыта, поэтому
крайне важно проводить изучение влияния какого-либо фактора на
скорость транскрипции на максимально однородном биологическом
материале.
Транскрипция in vitro. Выделение 32Р-меченых
вновь синтезированных транскриптов
Интактные органеллы являются основой транскрипционной системы.
Они содержат ДНК, РНК-полимеразы и белковые факторы регуля-
ции транскрипции. После замены буфера для выделения органелл
на буфер для ресуспендирования хлоропласты частично лизируются
из-за резкого падения осмотической силы раствора. Это позволяет
ионам Mg2+, нуклеотидтрифосфатам (НТФ) и другим компонентам
транскрипционной системы беспрепятственно проникать в органел-
лы. Реакцию хлоропластной транскрипции обычно проводят при
25 °С и начинают ее добавлением в среду хлоропластов или НТФ.
Для реакции run-on транскрипции обычно берут около
107-108 хлоропластов в буфере для гомогенизации, центрифугиру-
ют 2 мин при 3500 g, тщательно удаляют супернатант и добавляют
45 мкл буфера для ресуспендирования хлоропластов (см. «Реактивы
и оборудование») и 50 мкл транскрипционного буфера (см. «Реакти-
вы и оборудование»), тщательно ресуспендируют пипетированием
и инкубируют транскрипционную смесь 10 мин при температуре
25 °С. Переносят пробирки в лед, немедленно добавляют равный
объем стоп-буфера (см. «Реактивы и оборудование») и тщательно
перемешивают. Проводят одну депротеинизацию кислым фено-
лом (рН 4,5-5,0), к оставшейся фенольной фазе добавляют 150 мкл
стоп-буфера для более полной экстракции РНК. Далее проводят
депротеиницацию хлороформом. Нуклеиновые кислоты осаждают
из водной фазы этанолом (2,5 объема водной фазы) или изопропано-
лом (0,7 объема), предварительно добавив к водной фазе 0,1 объема
152 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
3 Μ ацетата натрия, рН 5,2. Осаждение происходит в течение 60 мин
при -20 °С. После этого РНК осаждают центрифугированием в тече-
ние 30 мин при 15 000 g. Осадок РНК промывают 75%-м этанолом
(500-1000 мкл). После удаления спирта осадок подсушивают, раст-
воряют в 100 мкл свободной от РНКаз деионизованной воды или в
гибридизационном буфере и переносят раствор 32Р-меченой РНК в
пробирку с подготовленной мембраной и гибридизационным буфе-
ром или хранят при -70 °С до использования.
Примечание 2
Прежде всего важно убедиться в том, что в ходе реакции транс-
крипции метка включается именно в РНК. Состав компонентов ре-
акционной среды для транскрипции в лизатах разных органелл или
для изучения транскрипции какой-либо одной РНК-полимеразой
будет отличаться. При использовании метода run-on транскрипции
в зависимости от объекта, типа органелл и эффективности экспрес-
сии изучаемых генов бывает необходимо экспериментально опреде-
лить продолжительность реакции транскрипции in vitro. Практи-
чески всегда, применяя метод run-on транскрипции, стараются про-
водить реакцию в течение наиболее короткого периода времени,
чтобы максимально исключить влияние на результат распада вновь
синтезированных транскриптов.
По нашим данным [7], при построении временной кривой транс-
крипции в хлоропластных лизатах ячменя для psbA, rrnl6, atpB и
rbcL генов наиболее интенсивно РНК синтезируется в первые 15 мин
(самой интенсивной транскрипция была от 7 до 15 мин).
Между 15 и 30 мин реакции интенсивность транскрипции резко
падает. После 30 мин реакции накопление радиоактивно-меченной
РНК снижается для всех изученных генов.
Это может быть вызвано недостатком какого-либо компонента
транскрипционной смеси. Лимитирующим может являться УТФ,
поскольку его содержание в меченом препарате незначительно. Для
предотвращения возможного торможения транскрипции из-за не-
достатка УТФ в большинстве работ в реакционную смесь добавляют
немеченый УТФ в концентрации 0,01 мМ (другие НТФ добавляют
до концентрации 0,2 мМ).
Теоретически ингибировать транскрипцию могут компоненты
среды, использованной при выделении хлоропластов. Можно было
ожидать негативное влияние примеси сорбита на транскрипцию
хлоропластных генов. Однако результаты показали, что добавление
в среду для транскрипции сорбита в концентрации 0,33 Μ приводи-
ло лишь к незначительному ингибированию скорости транскрип-
ции хлоропластных генов [7].
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 153
Подготовка мембран с фрагментами изучаемых генов
В настоящее время практически всегда получают необходимое ко-
личество фрагментов ДНК исследуемых генов с помощью ПЦР, ис-
ходя из расчета, что в одну точку обычно наносится 1 мкг ДНК.
Очистка ПЦР фрагментов от ПЦР смеси на колонках или другим
способом повышает качество нанесения фрагментов на мембрану, но
не является необходимой процедурой. ДНК перед нанесением на
мембрану должна быть денатурирована. Для этого к 100 мкл раство-
ра ДНК (содержащего 1 мкг ДНК) добавляют NaOH до конечной
концентрации 0,5 N. Денатурацию проводят при 95-100 °С в тече-
ние 10 мин, после чего пробирки немедленно переносят в лед. Для
нанесения образцов ДНК на мембрану в точки или узкие продолго-
ватые пятна удобно использовать специальные аппараты, применяе-
мые для дот-гибридизации, например Bio-Dot™, «Bio-Rad», США
или другие аналогичные приборы. ДНК наносят на нейлоновую
мембрану, обладающую высокой связывающей способностью (на-
пример, Hybond N+ размер пор 0,45 мкм, «Amersham Bioscience»),
согласно предварительно составленной схеме (рис. 2.4.2.В). Фраг-
менты каждого гена наносятся в 2-3-кратной повторности. Прибор
для дот-гибридизации позволяет создать слабый вакуум, который
способствует равномерному нанесению ДНК на мембрану. После на-
несения ДНК мембрану высушивают. После этого для нейтрализа-
ции на мембране щелочи и удаления каких-либо примесей ее про-
мывают в течение 5 мин при комнатной температуре в 2х SSC бу-
фере (20х SSC-буфер: 0,3 Μ цитрат Na, 3 Μ NaCl, pH 7,0). ДНК
«пришивают» к мембране при помощи ультрафиолетового облуче-
ния (например, VL-6LC фирмы «Vilber Lourmat», Франция; длина
волны 254 нм; облучение 5 мин с расстояния 5-7см). Приготовлен-
ные таким способом мембраны могут сразу использоваться для гиб-
ридизации с 32Р-РНК или храниться при комнатной температуре.
Примечание 3
Размер наносимого фрагмента ДНК на мембрану может быть от
150-200 до несколько тысяч пар нуклеотидов. При размере фраг-
мента ДНК 100 и менее пар нуклеотидов создаются значительные
трудности на разных этапах работы. Использование фрагментов
ДНК разной длины незначительно влияет на результат гибридиза-
ции. Было показано, что если фрагменты ДНК различались в 3 раза
(330 и 967 п.н.), то разница интенсивности сигналов гибридизации
не превышала 10% [4]. Оптимальный размер гибридизационной
пробы, по нашему мнению, составляет от 300 до 1000 п.н. Фрагмент
ДНК такой длины легко амплифицировать ПЦР и идентифициро-
вать с помощью рестрикционного анализа и электрофореза в агароз-
ном геле.
154
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
A
rbcL
rbcL
rrn16
rrn16
rpl16
rpl16
rpl23-2
rpl23-2
В
atpB
atpB
matK
matK
trnEY
trnEY
rpslo
rpslo
С
psbA
psbA
ndhA
ndhA
rpoB
rpoB
ndhF
ndhF
Рис. 2.4.2. Определение интенсивности транскрипции пластидных генов
с помощью метода run-on транскрипции. Радиоавтографы эксперимента с
этиопластами (А) и хлоропластами (Б) листьев ячменя. (В) Схема нанесе-
ния фрагментов ДНК исследованных генов на мембрану. (Г) Гистограмма,
полученная в результате обработки данных радиоавтографов (А и Б). На
оси ординат показана интенсивность транскрипции в условных едини-
цах. Светлые столбики — транскрипционная активность этиопластов,
темные столбики — транскрипционная активность хлоропластов
ДНК—РНК-гибридизация, анализ полученных данных
Непосредственно перед гибридизацией фрагментов ДНК, нанесен-
ных на нейлоновую мембрану, с молекулами 32Р-РНК проводят
предгибридизацию мембраны в буфере следующего состава: 250 мМ
Na2HPO4, pH 7,2, 7% SDS, 2,5 мМ ЭДТА. Для этого мембрану поме-
щают в пробирку для гибридизации, добавляют от 5 до 50 мл (в зави-
симости от объема пробирки и размера мембраны) гибридизацион-
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 155
ного буфера и инкубируют в гибридизационной печи (Hybridization
Shaker; «Amersham Bioscience») при постоянном вращении в тече-
ние как минимум 1 ч при температуре примерно 58 °С в случае ана-
лиза хлоропластных генов. Такая относительно невысокая темпера-
тура предгибридизации и гибридизации объясняется тем, что при
run-on транскрипции идет гибридизация одновременно с фрагмен-
тами многих генов, которые отличаются по размеру, нуклеотидно-
му составу и, как следствие, по оптимальной температуре гибриди-
зации. После такой предобработки мембрана с нанесенными на нее
фрагментами ДНК готова к гибридизации с молекулами 32Р-РНК,
полученными в ходе реакции транскрипции in vitro.
Гибридизацию проводят в тех же условиях, что и пред гибридиза-
цию. Гибридизацию проводят в новой порции гибридизационного бу-
фера (объем 1-5 мл). Нагревают пробирку до температуры гибриди-
зации (58 °С в случае постановки run-on транскрипции с хлороплас-
тами). В пробирку с буфером и мембраной добавляют 32Р-меченую
РНК, полученную в ходе реакции транскрипции in vitro. Гибриди-
зацию проводят 12-18 ч, после чего мембраны вынимают из проби-
рок и промывают дважды в буфере, содержащем 0,5х SSC и 0,2%
SDS, при 58 °С. После этого отмывку мембраны проводят в буфере,
содержащем 0,2х SSC и 0,2% SDS. При необходимости возможна от-
мывка мембраны при более высокой температуре и/или при более
низкой концентрации соли. Длительность каждой отмывки состав-
ляет около 10 мин, объем буфера для каждой отмывки — не менее
250 мл. Отмытые мембраны оборачивают пленкой (типа Saran
Wrap) и закладывают в кассеты для экспозиции с рентгеновской
пленкой Hyperfilm™ («Amersham Bioscience»). Пленку проявляют
и сканируют. Для перевода данных в числовые значения и последу-
ющего их анализа используют программы Quantity One («Bio Rad»)
и Microsoft Excel. Результаты гибридизации нанесенных на мембра-
ну фрагментов пластидных генов с 32Р-меченой РНК, полученной в
ходе транскрипции in vitro (рис. 2.4.2.А и 2.4.2.Б), представлены в
виде гистограммы (рис. 2.4.2.Г). Из результатов видно, что в хло-
ропластах первого листа ячменя наибольшей скоростью транскрип-
ции отличаются psbA, rrnl6 и trnEY гены, в то время как другие
гены (rpsl6, rpoB, ndhA) имеют значительно более низкую скорость
транскрипции.
Примечание 4
В run-on эксперименте обычно исследуют транскрипцию, по край-
ней мере, нескольких генов. Они могут иметь сильно различающие-
ся значения интенсивности транскрипции, и, соответственно, точки
156
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
на мембране для таких генов будут отличаться по размеру и интен-
сивности засвечивания пленки. В такой ситуации желательно про-
вести несколько различных по длительности экспозиций мембраны
с рентгеновской пленкой, что позволит выбрать наиболее удачную
радиограмму для дальнейшего анализа.
При наличии фосфоимиджера (например, Typhoon Trio «GE
Healthcare», США) и соответствующих компьютерных программ
есть возможность определить активность гибридизационных сигна-
лов непосредственно с мембраны без применения рентгеновских
пленок, что повышает чувствительность метода и значительно упро-
щает процесс анализа результатов.
Возможные проблемы, оценка метода
1. Известно, что обе нити хлоропластной ДНК являются кодирую-
щими. Практически все исследователи в качестве гибридизаци-
онных проб на мембрану наносят двунитевые фрагменты ДНК,
полученные амплификацией фрагментов ДНК. Это может быть
причиной завышенных значений интенсивности транскрипции
изучаемого гена, поскольку в ходе run-on транскрипции может
происходить транскрипция с обеих нитей ДНК, и антисмысло-
вая РНК, получаемая с противоположной нити ДНК, может
гибридизоваться с нанесенной на мембрану одной из нитей гиб-
ридизационной пробы. Чтобы исключить такую возможность,
желательно в качестве гибридизационной пробы использовать
фрагмент не двунитевой ДНК, а антисмысловую РНК [4] или
химически синтезированный одноцепочечный ДНК олигонук-
леотид.
2. Причиной искажения результатов, получаемых методом run-on
транскрипции, может быть также «сквозная» транскрипция,
т. е. транскрипция нескольких генов, не принадлежащих одно-
му оперону. Причиной такого явления может быть не полное
терминирование синтеза РНК.
3. Нельзя также полностью исключить возможность некоторой
неспецифичной транскрипции изучаемой зоны ДНК в системе
изолированных хлоропластов.
Однако, несмотря на отмеченные недостатки, метод run-on
транскрипции является очень важным современным инструментом
изучения интенсивности транскрипции индивидуальных генов. Он
сравнительно прост и относительно дешев. Данный метод практи-
чески не ограничен количеством анализируемых генов. Его приме-
нение имеет большие перспективы для изучения самых разных сто-
Раздел 2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов 157
рон регуляции биогенеза прежде всего пластид и митохондрий, а
также для изучения регуляции транскрипции активно экспресси-
рующихся ядерных генов.
Литература
1. Marzluff W. F. Transcription of RNA in isolated nuclei // Methods
Cell Biol. 1978. V. 19. P. 317-331.
2. Deng X. W., Stern D. В., Tonkyn J. C, Grissem W. Plastid run-on
tanscription application to determine the transcriptional regulation
of plastid genes // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 9641-9648.
3. Binder S., Hatzack F., Brennickle A. A novel pea mitochondrial in
vitro transcription system recognizes homologous and heterologous
mRNA and tRNA promoters // J. Biol. Chem. 1995. V. 270.
P. 22 182-22 189.
4. Legen J., Kemp S., Krause K., Profanter В., Herrmann R. G.,
Maier R. M. Comparative analysis of plastid transcription profiles
of enter plastid chromosomes from tobacco attributed to wild-type
and PEP-deficient transcription machineries // Plant J. 2002.
V. 31. P. 171-188.
5. Brown i?., Rickless P. A New method for study cell division and cell
extension with some preliminary effect of temperature and
nutrient // Proc. R. Soc. London. B. 1949. V. 136. P. 110-125.
6. Юрина Η. П., Белкина Г. Г., Полежаева Е. В., Турищева М. С,
Одинцова М. С. ДНК-белковый комплекс из хлоропластов го-
роха: выделение и свойства // Мол. биология. 1988. Т. 22.
С. 117-124.
7. Зубо Я. О., Кузнецов В. В. Применение метода run-on транс-
крипции для изучения регуляции экспрессии пластидного гено-
ма. Физиология растений 2008. Т. 55. С. 114-122.
8. Rapp J. С, Baumgartner В. J., Mullet J. Quntitative analysis of
transcription and RNA levels of 15 barley chloroplast genes // J.
Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 21 404-21 411.
9. Tullberg Α., Alexciev K., Pfannschmidt Th., Allen J. F.
Photosynthetic electron flow regulates transcription of the psaB
gene in pea (Pisum sativum L.) chloroplasts through the redox
state of the plastoquinone pool // Plant Cell Physiol. 2000. V. 41.
P. 1045-1054.
10. Зубо Я. О., Селиванкина С. Ю., Ямбуренко М. В., Зубкова Н. К.,
Кулаева О. Н., Кузнецов В. В. Цитокинины активируют транс-
крипцию хлоропластных генов // Докл. АН. 2005. Т. 400.
С. 396-399.
158 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
11. Baumgartner В. J., Rapp J. С, Mullet J. E. Plastid transcription
activity and DNA copy number increase early in barley chloroplast
development // Plant Physiol. 1989. V. 89. P. 1011-1018.
2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ
ТРАНСКРИПТОВ ГЕНОВ РАСТЕНИЙ
С ПОМОЩЬЮ ОТ-ПЦР
А. К. Кравцов, В. В. Кузнецов
Введение
Для количественной оценки транскрипции генов растений в настоя-
щее время используют пять основных методов: нозерн-анализ (от
англ. northern blotting), in situ гибридизация [1], метод RNAse
protection [2, 3], run-on транскрипция [см. раздел 2.4] и полиме-
разная цепная реакция после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).
Довольно часто для изучения экспрессии генов используют несколь-
ко из перечисленных методов, что связано прежде всего с различ-
ной чувствительностью и ограничениями методов. В частности,
нозерн-анализ является единственным методом, который дает ин-
формацию о размере мРНК, показывает наличие/отсутствие альтер-
нативного сплайсинга, а также целостность нативной РНК. Метод
RNAse protection используют главным образом для картирования
генов и определения сайтов инициации и терминации транскрип-
тов. Гибридизация in situ позволяет определять уровень мРНК изу-
чаемых генов в конкретной клетке, без предварительной стадий
лизиса клеток и выделения РНК [4]. С помощью метода run-on
транскрипции можно изучать интенсивность транскрипции генов.
Основное ограничение перечисленных методов заключается в их
сравнительно низкой чувствительности. ОТ-ПЦР, напротив, явля-
ется самым чувствительным из методов, предназначенных для изу-
чения относительного содержания транскриптов генов.
В данном разделе рассматривается применение метода ОТ-ПЦР
только для изучения относительного содержания мРНК генов расте-
ний.
Принцип метода
В основе методики полимеразнои цепной реакции после обратной
транскрипции (ОТ-ПЦР) лежат два самостоятельных метода: обрат-
ная транскрипция (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР) [7,
см. раздел 1.6]. Без стадии ОТ невозможно изучение транскриптома
Раздел 2.5. Определение содержания транскриптов генов 159
(совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой,
группой клеток, тканью или целым органом, включая мРНК и не
кодирующие РНК), характера экспрессии генов под влиянием раз-
личных факторов и т. д. Молекула мРНК крайне неудобна для ис-
следования. Нативная мРНК подвергается быстрой деградации, ее
невозможно копировать, и, как следствие, обнаруживать единич-
ные копии, как это возможно для ДНК с помощью ПЦР. На основе
РНК-матрицы необходимо синтезировать комплементарную ей ДНК
(кДНК, англ. cDNA) для дальнейшего использования ее в ПЦР.
Следовательно, основной принцип метода заключается в следую-
щем: в ходе реакции ОТ на основе одноцепочечной молекулы РНК
по принципу комплементарности, используя фермент РНК-зави-
симую ДНК-полимеразу [5, 6], синтезируется кДНК. В результа-
те образуется гетеродуплекс — двунитевая молекула, состоящая
из РНК и комплементарной ей ДНК (кДНК). Затем определенный
участок первой нити кДНК амплифицируется в ПЦР, при этом про-
исходит увеличение ампликонов в геометрической прогрессии. Вы-
вод об относительном содержании транскриптов (мРНК) изучаемых
генов делается на основе накопления продуктов ПЦР (ампликонов)
в ходе ПЦР. Предполагается, что чем больше ампликонов накапли-
вается в ходе реакции, тем больше транскриптов (мРНК) было в про-
бе в момент выделения РНК, в то время как отсутствие ампликонов
после окончания ПЦР свидетельствует об отсутствии в пробе мРНК
изучаемого гена. Результаты представляют в условных единицах.
Электрофореграммы ПЦР-продуктов обрабатывают с помощью ком-
пьютерной программы, и чем интенсивнее сигнал, тем большее от-
носительное значение ему присваивается компьютерной програм-
мой.
Реактивы и оборудование
Выделение РНК. Trizol (38% фенол; 0,8 Μ гуанидинтиоционат;
0,4 Μ аммоний тиоционат; 0,1 Μ ацетат натрия, рН 5,0; 5% глице-
рин), хлороформ, изопропанол, 80% этанол, стерильная вода, ДНКа-
за I и 10х реакционный буфер с MgCl2 («Fermentas», Латвия).
Реакция ОТ и ПЦР. ДТТ; РНКазин («Fermentas»); 0,1 Μ NaOH;
1 мМ ЭДТА; 0,1 Μ ацетат натрия; стерильная вода; набор праймеров
для синтеза кДНК и ПЦР; 1 ед. активности M-MuLV обратная транс-
криптаза с 10х реакционным буфером («Fermentas»); Taq-полиме-
раза с 10х реакционным буфером; 10 мМ и 0,2 мМ смеси дНТФ
(дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ).
Для доказательства амплификации фрагмента изучаемого гена
в ходе ПЦР может потребоваться набор ферментов рестрикции
и/или секвенирование амплифицируемых фрагментов.
160 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Электрофорез в агарозном геле. Агароза, стерильная вода,
0,5 Μ фосфатный буфер, рН 7,0 для РНК-электрофореза; ТАЕ буфер
для ДНК-электрофореза (0,4 мМ Трис НС1, рН 7,5; 0,2 мМ ацетат нат-
рия; 0,01 мМ ЭДТА); 0,5 мкг/мл бромистый этидий; 20% формаль-
дегид; 0,05% бромфеноловый синий; 0,05% ксиленцианол.
Оборудование. Набор пластиковой посуды (желательно однора-
зовой); набор автоматических пипеток переменного объема со сте-
рильными одноразовыми наконечниками (желательно с барьерным
аэрозольным фильтром) от 0,5 до 1000 мкл; шейкеры; термоблоки;
холодильные шкафы на +4 °С, -20 °С и -70 °С; микроцентрифуга с
охлаждением («Eppendorf», или других фирм); Амплификатор
(«Терцик», «ДНК-технология», Россия или «Mastercycler Personal»
(«Eppendorf», США) или других фирм); камера для электрофореза с
набором гребенок («Bio-Rad», США или других фирм); источник
тока типа «Эльф-4» («ДНК-Технология», Россия или других фирм);
сканер — фосфоимиджер Typhoon TRIO+ Variable Mode Imager со
светофильтром 610 ВР 30 Deep purple, SYPRO Rudy, и программным
обеспечением Typhoon Scaner Control («GE Healthcare», США), а
также ImagerQuant TL Control Centre или гель-документирующая
станция с программным обеспечением («Bio-Rad», США). Спектро-
фотометр Genesys 10UV scanning («Thermo scientific», США).
Ход определения
Для успешного определения уровня мРНК методом ОТ-ПЦР на пер-
вом этапе необходимо получить качественный препарат нативной
РНК, не содержащей примеси ДНК. Чтобы избежать деградации
РНК, свежие образцы растительной ткани замораживают в жидком
азоте и хранят до выделения РНК при температуре -70 °С. Все раст-
воры для выделения необходимо готовить на воде, не имеющей
РНКазной активности. В состав растворов должны входить препара-
ты, которые ингибируют РНКазы (ДТТ, РНКазин «RiboLock RNase
Inhibitor», гуанидинтиоционат и др.). Основными источниками
загрязнения РНКазами являются руки, бактерии, распространя-
ющиеся, в том числе, и с пылью. Вот почему все работы, связанные
с выделением РНК, нужно проводить в одноразовых перчатках, а
используемые реактивы открывать на минимальное время. Предва-
рительное автоклавирование посуды и растворов не может гаранти-
ровать отсутствие загрязнения РНКазами и ампликонами. Доста-
точно, чтобы лабораторная посуда и наконечники для пипеток были
одноразовыми и свободными от РНКаз и ДНКаз. Обычно такая
пластиковая посуда и одноразовые наконечники на упаковке имеют
маркировку «RNase and DNase Free». В случае когда избежать ис-
Раздел 2.5. Определение содержания транскриптов генов 161
пользования стеклянной посуды и многоразового пластика не удает-
ся, стекло «прожаривают» при температуре 180-200 °С в течение
1 ч, а пластик промывают раствором 0,1 Μ NaOH и 1 мМ ЭДТА («Си-
лекс»). Для упрощения процедуры выделения РНК мы рекоменду-
ем воспользоваться методикой выделения РНК с реактивом Trizol
[см. раздел 2.3]. После выделения РНК рекомендуется проверить
чистоту препарата и определить концентрацию РНК с помощью
спектрофотометра и гель-электрофореза. Если в результате измере-
ния выясняется, что концентрация РНК в различных вариантах
эксперимента отличается, то их выравнивание проводят с помощью
разбавления наиболее концентрированных проб или переосаждени-
ем РНК (1/10 объема 0,1 Μ ацетата натрия и равный объем изопро-
панола) с последующим растворением РНК в нужном объеме воды.
Концентрацию РНК определяют при длине волны 260 нм. 1 о. е.
соответствует 40 мкг мРНК в 1 мл. Кроме того, проверку чистоты
выделенной РНК определяют отношением значений поглощения
раствора РНК при следующих длинах волн: 260 нм (максимум по-
глощения нуклеиновых кислот), 280 нм (максимум поглощения бел-
ков) и 230 (максимальное поглощение полисахаридов). Если отно-
шения А260/А280 и А2б0/А2зо равны или больше 1,8, то полученный
препарат РНК достаточно чист и при спектрофотометрическом
определении его концентрации можно использовать приведенное
выше соотношений (А2б0 =1 о. е. соответствует 40 мкг РНК на мл).
Качество мРНК (степень деградации) оценивают с помощью де-
натурирующего электрофореза в агарозном геле. Используемый для
этого 1,5% агарозный гель готовится на основе 0,5 Μ фосфатного бу-
фера рН 7,0 с добавлением 0,5 мкг/мл этидиума бромида. В образец
РНК (0,5-3 мкг) необходимо добавить 2,2 Μ формальдегида, 0,05%
бромфенолового синего и 0,05% ксиленцианола, тщательно переме-
шать и прогреть при температуре 60-65 °С в течение 3-5 мин, затем
денатурированную РНК необходимо поставить в лед на 5-10 мин.
После прохождения денатурирующего гель-электрофореза, мРНК
выглядит как «шмер» размером от 200 до 9000 оснований. 18S
рРНК выглядит наиболее яркой полосой расположенной в районе
2000 оснований, 28S рРНК расположена в районе 5000 оснований,
при высокой концентрации и хорошем качестве РНК на гель-элек-
трофорезе в районе 100 оснований можно отличить менее яркую по-
лосу 5S РНК.
Полученный препарат РНК необходимо проверить на наличие
ДНК, так как даже следовые количества ДНК в пробе способны значи-
тельно исказить полученные результаты ОТ-ПЦР. Это связано с тем,
что эффективность амплификации ДНК намного выше, чем кДНК.
Именно по этой причине рекомендуется провести первую реакцию
162 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
амплификации с препаратом выделенной РНК без синтеза кДНК.
При этом количество циклов амплификации должно быть макси-
мальным (38-45) для выявления единичных фрагментов ДНК. Если
после проведения ПЦР и электрофореза в геле не детектируется фраг-
мент ДНК, значит, данная проба РНК свободна от примеси ДНК. Про-
тивоположный результат — наличие полосы продукта ПЦР в геле
после электрофореза указывает на то, что в пробе обнаружена ДНК,
и данный образец необходимо обработать ДНКазой I из расчета: на
1 мкг РНК берется 1 е. а. ДНКазы I и 1мкл 10х реакционного буфе-
ра с MgCl2 («Fermentas»). Реакцию следует проводить в течение 1 ч
при температуре 37 °С, инактивацию фермента проводят с помощью
прогревания проб при температуре 60-65 °С в течение 10 мин и по-
следующим охлаждением во льду. После обработки РНК ДНКазой
рекомендуется повторное проведение амплификации перед синте-
зом к ДНК.
Синтез кДНК осуществляется с помощью ОТ. В зависимости от
целей эксперимента ОТ можно проводить с использованием различ-
ных праймеров. Наиболее универсальны гексануклеотидные прай-
меры со случайными нуклеотидными последовательностями, одна-
ко избыточное увеличение концентрации таких праймеров будет
приводить к преимущественному синтезу коротких (около 600 нук-
леотидов) кДНК, и наоборот, уменьшение концентрации праймеров
по отношению к РНК будет способствовать синтезу более длинных
кДНК («Силекс»). Использование (oligo — dT) праймеров, в отличие
от гексануклеотидных праймеров, позволяет исследовать 3' район
РНК. Для определения относительного содержания уровня мРНК
мы рекомендуем также использовать oligo(dT) праймер (ttt ttt ttt ttt
ttt ttt ttt (v) (n)), где t — тимин, v — аденин или цитозин или гуанин,
n - любой нуклеотид. Довольно часто для синтеза кДНК применяют
специфичный праймер (обратный, антисмысловой к кодирующей
последовательности гена специфичный праймер). Преимущество
такого специфичного праймера перед (oligo — dT) праймером за-
ключается в том, что с его помощью можно синтезировать кДНК с
использованием РНК, не содержащей поли-А терминирующую об-
ласть (например, мРНК пластидных и митохондриальных генов).
Для проведения ОТ необходимо поместить пробирку в ледяную
баню и смешать в ней: 2 мкл РНК-пробы (3-5 мкг тотальной РНК),
1 мкл праймеров (15-20 пмолей специфичного, 0,5 мкг гексанукле-
отидного или 0,5 мкг oligo — dT праймеров. Реакционную смесь до-
водят водой свободной от РНКаз до 18 мкл и перемешивают. Для де-
натурации РНК полученную смесь инкубируют при температуре
65 °С в течение 5 мин, затем вновь переносят в ледяную баню. Обра-
зовавшийся конденсат на стенках пробирок собирают кратковре-
Раздел 2.5. Определение содержания транскриптов генов 163
менным центрифугированием (5-10 с). После этого в пробирку до-
бавляют 2,5 мкл 10х реакционного буфера для M-MuLV обратной
транскриптазы («Fermentas»), 2,3 мкл 10 мМ смеси дНТФ (дАТФ,
дГТФ, дТТФ, дЦТФ), 5 е. a. M-MuLV обратной транскриптазы и ин-
кубируют 1 ч при 42 °С (при использовании случайных гексанукле-
отидных праймеров перед инкубацией при температуре 37 °С смесь
необходимо прогреть при температуре 25 °С в течении 10 мин («Си-
лекс»).
Для остановки реакции ОТ реакционную смесь прогревают при
температуре 65 °С в течение 10 мин. После охлаждения в ледяной
бане полученная кДНК может быть сразу же использована для про-
ведения ПЦР. При необходимости к ДНК можно хранить при темпе-
ратуре -20 °С в течение 2-3 недель или до 1 года при температуре
-70 °С.
Проведение ПЦР после синтеза кДНК практически ничем не от-
личается от обычной ПЦР. Мы приводим протокол, оптимизирован-
ный для проведения ПЦР с к ДНК. В пробирке для проведения ПЦР
необходимо смешать 2 мкл 10-кратного буфера для Taq-ДНК-поли-
меразы, 2 мкл 2,5 мМ смеси дНТФ (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ),
0,2 мкл (1 е. а) Taq-полимеразы, по 1 мкл (50 пмолей) прямого и об-
ратного праймеров, 13,5 мкл воды свободной от ДНКаз и РНКаз,
2 мкл кДНК полученной в ходе реакции ОТ. Программу амплифи-
кации и температуру «отжига» праймеров подбирают в зависимости
от размера и нуклеотидного состава праймеров и амплифицируемо-
го фрагмента. В начале работы необходимо построить кривую зави-
симости образования ампликонов от количества циклов амплифи-
кации. Первая ПЦР с вновь синтезированной к ДНК должна вклю-
чать в себя 35-40 циклов амплификации. В последующих ПЦР
количество циклов амплификации постепенно должно уменьшать-
ся до того момента, пока амплифицируемый фрагмент практически
не будет обнаруживаться на гель электрофорезе (обычно это возни-
кает при амплификации до 23-28 цикла, с хлоропластной РНК
вплоть до 15-20 циклов). Это необходимо для определения такого
количества циклов амплификации, при котором возможно обнару-
жить вероятные различия в количестве накопленных ампликонов в
разных вариантах опыта. Различия в количестве амплифицируе-
мых фрагментов (интенсивности свечения полосы в геле) между ва-
риантами указывают на различия содержания кДНК в пробирке пе-
ред ПЦР, а следовательно, и в уровне мРНК изучаемого гена.
На рис. 2.5.1 видно, как количество ампликонов увеличивается
до определенного максимального значения. Различия между вари-
антами опыта хорошо видны после 25 циклов амплификации и пол-
ностью нивелируются после 40 циклов ПЦР. В варианте «В» содер-
164
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Рис. 2.5.1. Оптимизация количества циклов амплификации при ОТ-ПЦР.
РНК — тотальная РНК, выделенная из листьев, отделенных от 6-дневных
этиолированных проростков ячменя, инкубированных на свету на раство-
рах (А) АБК, (Б) БАП или воде (В) в течение 6 ч. 25, 30 и 40 — циклы амп-
лификации, после которых проводился электрофорез
жание кДНК и, следовательно, мРНК в пробе было наибольшим,
(количество ампликонов в пробирке в ходе ПЦР достигло макси-
мальных значений уже после 30 циклов), по сравнению с варианта-
ми «А» и «Б», где уровень транскриптов был существенно ниже,
максимум накопления ампликонов детектировали после 40 циклов.
Таким образом, рекомендуемая программа амплификации в об-
щем виде выглядит следующим образом:
I цикл: 94 °С, 4 мин,
II цикл: 94 °С, 15-40 с,
(температура отжига праймера) 15-40 с,
72 °С, 15-40 с,
77 цикл повторяют (22-45раз)
III цикл: 4 °С (хранение).
Для того чтобы доказать, что в ОТ-ПЦР взято одинаковое коли-
чество РНК, служат контрольные гены, экспрессия которых не
регулируется изучаемым фактором в условиях эксперимента (наи-
более часто используют гены β-Tubulin (β-тубулин), Actin (актин),
Ubiquitin-II (убиквитин-П).
Применяя метод ОТ-ПЦР для определения относительного со-
держания транскриптов изучаемых генов, важно помнить, что ПЦР
имеет очень высокий риск контаминации. Все манипуляции с
кДНК и ампликонами рекомендуется проводить одноразовыми на-
Раздел 2.5. Определение содержания транскриптов генов 165
конечниками с аэрозольными фильтрами. Синтез кДНК, амплифи-
кацию и электрофорез осуществляют в разных комнатах, снабжен-
ных независимой приточно-вытяжной вентиляцией. Кроме того, для
снижения риска контаминации после проведения электрофореза
новый синтез кДНК и ПЦР разрешается проводить только на следую-
щий день, при этом исследователь должен иметь несколько ком-
плектов лабораторной одежды.
Процедура проведения ДНК электрофореза в агарозном геле до-
вольно универсальна и обычно не вызывает трудностей. Важным до-
полнением служит наличие в распоряжении исследователя совре-
менной станции гель-документирования и программного обеспече-
ния для количественной оценки интенсивности свечения пятен ДНК
(или в крайнем случае для детекции ДНК на геле можно обойтись
обычным ультафиолетовым облучателем и цифровым фотоаппара-
том). В качестве сканера нуклеиновых кислот в агарозных гелях,
окрашенных бромистым этидием, можно использовать Typhoon
TRIO+ Variable Mode Imager со светофильтром 610 ВР 30 Deep
purple, SYPRO Rudy, EtBr и программным обеспечением Typhoon
Scaner Control («GE Healthcare», США), а также ImagerQuant TL
Control Centre или аналоги. Методика сканирования и обсчета изо-
бражений электрофореграмм достаточно уникальна для большин-
ства компьютерных программ, поэтому здесь она не приводится.
Интерпретация результатов
Несмотря на то что ОТ-ПЦР является высокочувствительным мето-
дом, необходимо внимательно подходить к вопросу интерпретации
полученных результатов. Используя метод ОТ-ПЦР, исследователь
сможет определить относительный уровень транскриптов на момент
выделения РНК (рис. 2.5.1). ОТ-ПЦР не позволяет судить об интен-
сивности транскрипции, а также о скорости деградации мРНК и о
размере транскриптов. На содержание транскриптов изучаемого
гена влияют скорость транскрипции гена, деградация мРНК, сплай-
синг и др. Предположим, что в одном из вариантов опыта наблюда-
ется высокая интенсивность транскрипции и низкая скорость дегра-
дации мРНК, а в другом — высокая интенсивность транскрипции и
высокая скорость деградации мРНК. В такой ситуации с высокой
долей вероятности можно сказать, что в первом случае уровень
транскриптов будет больше, чем во втором. Нельзя проводить пря-
мую зависимость между содержанием транскриптов и уровнем ко-
дируемого ими белка. Для изучения экспрессии генов результаты,
полученные данным методом, крайне полезно сопоставлять с ре-
зультатами run-on транскрипции и нозерн-гибридизации.
166 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Оценка метода, возможные проблемы
Высокая воспроизводимость результатов данного метода обеспечи-
вается строгим соблюдением всех указаний и требований, которые
даны в разделе «Ход определения», однако существуют дополни-
тельные приемы и рекомендации, направленные на снижение рис-
ков получения артефактных результатов. Неверный подбор прайме-
ров или температурный режим амплификации могут привести к
тому, что исследователь будет изучать уровень мРНК совершенно
иного гена, не предусмотренного планом работы. Перед началом ам-
плификации с кДНК крайне желательно определить все основные
параметры проведения ПЦР с ДНК, используя праймеры, предназ-
наченные для кДНК амплификации изучаемого фрагмента. Размер
ампликона не всегда доказывает, что прошла амплификация ожи-
даемого фрагмента гена. В связи с этим для доказательства правиль-
ности амплификации изучаемого гена или кДНК рекомендуется ис-
пользовать рестрикционный анализ или определение нуклеотидной
последовательности методом секвенирования.
Кроме того, значительно исказить результаты, как уже отмеча-
лось, может примесь фрагментов ДНК в препарате кДНК. Необхо-
димо помнить, что ДНК обладает большей, по сравнению с кДНК,
эффективностью амплификации, и это может сильно повлиять на
конечный результат и привести к неверному выводу. Чтобы избе-
жать подобного рода ошибки, необходимо перед синтезом кДНК
провести ПЦР с препаратом РНК, обработанной ДНКазой. Если пос-
ле ПЦР с РНК не обнаруживаются ампликоны, значит препарат не
содержит примеси ДНК. В некоторых случаях отличить ампликон
полученный от кДНК и ДНК позволяет структура гена и выбранный
для амплификации фрагмент гена. В тех случаях, когда ген содер-
жит небольшой интрон (100-400 п.н.), рекомендуется подобрать
праймеры так, чтобы по краям ампликона оказались фрагменты эк-
зонов, а в центре интрон, и тогда после ОТ-ПЦР полученный ампли-
кон можно будет отличить по размеру от ампликона, синтезирован-
ного на ДНК.
Исказить результаты опыта может загрязнение проб РНК и
кДНК, РНКазами и ДНКазами, соответственно. Кроме того, если
после обработки препарата РНК ферментом ДНКазой, не провести
инактивацию фермента, то вся вновь синтезированная кДНК будет
разрушена ДНКазой.
На чувствительность метода в значительной степени влияет спо-
соб детекции ампликонов и разрешающая способность приборов. В
своих исследованиях мы используем один из самых распространен-
ных методов детекции — электрофорез в агарозном геле. В качестве
сканера гелей, окрашенных бромистым этидием, используем ска-
Раздел 2.6. Исследование транскрипции генов
167
нер Typhoon TRIO+ Variable Mode Imager со светофильтром 610 ВР
30 Deep purple, SYPRO Rudy. Другой метод детекции ампликонов,
который в ряде случаев можно считать модификацией ОТ-ПЦР, —
детекция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [Real-time PCR,
см. раздел 2.7] существенно упрощает и ускоряет процесс получе-
ния воспроизводимых результатов. Используя ПЦР-РВ, при помо-
щи стандартных образцов с известной концентрацией ДНК, можно
в абсолютных величинах рассчитать количество транскриптов из-
учаемого гена.
Литература
1. Parker R.M., Barnes Ν. Μ. mRNA: detection by in situ and
northern hybridization // Methods in Molecular Biology. 1999.
V. 106. P. 247-283.
2. Hod Y. A simplified ribonuclease protection assay // Biotechniques.
1992. V. 13. P. 852-854.
3. Saccomanno C.F., Bordonaro M., Chen J.S., Nordstrom J.L.
A faster ribonuclease protection assay // Biotechniques. 1992. V. 13.
P.846-850.
4. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time
reverse transcription polymerase chain reaction assays // Journal
of Molecular Endocrinology. 2000. V. 25. P. 169-193.
5. Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA
tumour viruses // Nature. 1970. V. 226. P. 1209-1211.
6. Mizutani S., Boettiger D., Temin H.M. A DNA-depenent DNA
polymerase and a DNA endonuclease in virions of Rous sarcoma
virus // Nature. 1970. V. 228. P. 424-427.
7. ЗАО «Силекс». Методические указания «Обратная транскрип-
ция (ОТ) и обратная транскрипция совмещенная с полимераз-
ной цепной реакцией (ОТ-ПЦР)». www.sileks.com/main/descr/
pdf/RTMMLV.
2.6. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ
С ПОМОЩЬЮ ДНК МИКРОЧИПОВ
Д. А. Лось
Введение
В течение многих лет исследования экспрессии генов на уровне
транскрипции проводились помощью РНК—ДНК-гибридизации или,
как часто пишут, — нозерн-блоттинга. Это достаточно эффектив-
168 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
ный и в меру чувствительный метод позволяет изучать экспрессию
ограниченного числа генов, в основном — известной функции. Даль-
нейшее развитие методологии анализа генной экспрессии привело к
появлению метода полимеразной цепной реакции (ПЦР или PCR, от
англ. Polymerase Chain Reaction), проводимой на матрицах ДНК, по-
лученных в результате обратной транскрипции, — RT-PCR (от англ.
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) с изначально вы-
деленной РНК (см. раздел 2.5). Этот метод несколько расширил
спектр изучаемых генов. Однако анализ экспрессии всего генома
бактерий1 вообще и Synechocystis в частности оказался возможным
только после определения полной нуклеотидной последовательнос-
ти и изобретения технологии изготовления ДНК-микрочипов.
Цианочипы с генами (или фрагментами генов) Synechocystis
представляют собой стеклянные пластинки размером со стандар-
тное предметное стекло, используемое для световой и/или флуорес-
центной микроскопии (рис. 2.6.1). Каждая точка на стекле — это
молекулы ДНК, представляющие индивидуальные гены или фраг-
менты генов. Как видно из рисунка, каждый ген нанесен на стек-
лянную подложку в двух повторностях. Такие микрочипы позволя-
ют проводить анализ изменения транскрипции в ответ на опреде-
ленное внешнее воздействие или в ответ на ту или иную мутацию.
Компания «TaKaRa Bio» организовала в Японии настоящий
консорциум из пользователей опытных образцов микрочипов, в ко-
торый помимо самого производителя вошли еще ряд крупных ис-
следовательских институтов и университетов. Среди учредителей
консорциума значились такие крупные центры, как Kazusa
Research Institute, National Institute for Basic Biology, Токийский,
Нагойский, Киотский университеты и некоторые другие. В течение
трех лет микрочипы не продавались, а активно использовались
только в Японии и только участниками консорциума. Такое поло-
жение дел, конечно же, совсем не понравилось американским кол-
легам, оказавшимся в данном случае отстающими. Японцы на са-
мом деле предоставляли возможность использовать микрочипы
практически всем желающим. Но только в Японии и, как следствие,
только в соавторстве с собою. Американцы вышли из положения лет
через пять, начав производить свои «цианочипы». Однако амери-
канские микрочипы были сделаны на основе маломерных синтети-
ческих олигонуклеотидов, в то время как японцы делали (и продол-
Полные аннотированные геномы цианобактерий представлены в базе данных по
их геномам «Cyanobase» по адресу http://bacteria-classic.kazusa.or.jp/
cyanobase/. Практически полную информацию (за редким исключением еще
неоконченных или не аннотированных проектов) можно найти на странице
http: //www. ncbi.nlm.nih. gov/genornes/lproks . cgi
1
Раздел 2.6. Исследование транскрипции генов 169
А Б
Амплификация
отдельных генов
из геномной ДНК
Нанесение ДНК
всех генов
на твердый
носитель
Синтез
меченой кДНК
на РНК-матрице
(ОТ)
Гибридизация кДНК
с микрочипом
Лазерная детекция
сигналов контроля
и эксперимента
Сравнение
интенсивности
сигнала каждого
гена в контроле
и в эксперименте
Рис. 2.6.1. Анализ транскрипции генов с помощью ДНК-микрочипов.
(А) Условия эксперимента. Для изготовления микрочипа используются
амплифицированные фрагменты ДНК или синтетические олигонуклео-
тиды, каждый из которых представляет на микрочипе индивидуальный
ген. ДНК наносится на стеклянную подложку и ковалентно пришивается
к ней. Пробы для гибридизации представляют собой кДНК, полученные с
помощью обратной транскрипции (ОТ) с использованием флуоресцент-
ных нуклеотидов. Для получения к ДНК из контрольных и опытных об-
разцов используются разные флуоресцентные метки. После стандартной
гибридизации меченой кДНК (опыт + контроль) с ДНК-микрочипом и от-
мывки проводится сканирование по двум длинам волн, характерным для
использовавшихся флуоресцентных нуклеотидов. Сигналы сравнивают-
ся между собой. (Б) Типичный вид ДНК-микрочипа для Synechocystis
(TaKaRa IntelliGene™ Cyanochip version 1.0) при сравнении экспрессии
генов в нормальных и стрессовых условиях. Каждая точка представляет
собой индивидуальный ген. Все гены сгруппированы в 4 блока в двух пов-
торностях. Яркие точки свидетельствуют об усилении транскрипции в
стрессовых условиях; темные точки показывают репрессированные стрес-
сом гены. Интенсивность сигналов сравнивается компьютерной программой
жают) чипы на основе фрагментов ПЦР со средним размером в 1 т.
п.н. Соответственно и качество результатов, полученных на япон-
ских «цианочипах» TaKaRa Cyanochip™, которые теперь имеются в
свободной продаже, до сих пор несравнимо выше, чем на американс-
ких. Кстати, в каталоге TaKaRa Bio Inc. в разделе IntelliGene™
170 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Cyanochip до сих пор присутствует надпись «This product is not
available in US, Europe, Taiwan and Korea».
Использование ДНК-микрочипов позволяет оценить изменения
в транскрипции (точнее, в количестве мРНК) всех генов, даже если
функции этих генов до сих пор неизвестны1.
Исследование транскрипции с помощью ДНК-микрочипов в со-
четании с направленным мутагенезом позволяет идентифицировать
не только гены, вовлеченные в ответы организмов на изменения в
окружающей среде, но и сенсорные системы, вовлеченные в воспри-
ятие и передачу стрессовых сигналов (рис. 2.6.1).
Для того чтобы применить ДНК-микрочипы, следует сначала
выделить общую клеточную РНК, провести синтез кДНК, исполь-
зуя выделенную РНК в качестве матрицы для синтеза к ДНК. Затем
с помощью флуоресцентно-меченных дезоксинуклеотидов необхо-
димо получить «цветные» зонды двуцепочечной ДНК, которые и бу-
дут использованы для гибридизации с ДНК-микрочипами.
Выделение РНК
1. 50 мл суспензии клеток Synechocystis (ОП750 = 0,3-0,4) фикси-
руют добавлением равного объема охлажденного этанола (0-4 °С),
содержащего 5% фенола, и оставляют во льду до центрифугиро-
вания.
Это удобно делать в 50-мл пластиковых пробирках Falcon
или Corning. Образец разливается по 25 мл в каждую пробирку
и добавляется по 25 мл холодного фиксирующего раствора
этанола.
2. Клетки осаждают центрифугированием при 3-4 тыс. g в тече-
ние 10 мин при 4 °С. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл буфера ТЕ
50/100 (50 тМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 тМ ЭДТА), переносят в
пробирки типа эппендорф, осаждают центрифугированием, за-
мораживают в жидком азоте и хранят при -70 °С до выделения
РНК.
Таким образом, можно собрать и хранить множество об-
разцов. Фиксация этанолом в присутствии фенола помогает
зафиксировать клетки и их содержимое, включая РНК, в том
состоянии, в котором они находились в момент отбора пробы.
Дальнейшие манипуляции, например центрифугирование при
К оригиналам опубликованных результатов, полученных с использованием
ДНК-микрочипов цианобактерий, имеется свободный доступ через базу данных
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) по адресу: http://
www.genome.jp/kegg/expression/.
1
Раздел 2.6. Исследование транскрипции генов
171
различных температурах, уже никак не повлияют на синтез
РНК. Клетки, ресуспендированные в ТЕ50/100, удобно объеди-
нить из двух пробирок по 0,5 мл в один эппендорф объемом
2 мл. Начиная с этого этапа все дальнейшие операции реко-
мендуется производить в перчатках. Желательно использо-
вать одноразовые перчатки без талька.
3. Перед выделением нуклеиновых кислот осадок ресуспендируют
в 0,5 мл STE (50 тМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 тМ ЭДТА, 50 mM NaCl,
0,5% SDS) буфера и инкубируют с 0,5 мл фенола, насыщенного
ТЕ, 10 мин при 65 °С.
Крышки микропробирок следует зафиксировать пласти-
ковыми держателями, либо использовать пробирки с замком.
Если этого не сделать, нагревание обязательно вызовет от-
крытие крышек пробирок с вероятной потерей образцов. В
этих и дальнейших операциях рекомендуется использовать
пробирки объемом 1,5 мл. Используйте только перегнанный
фенол: его можно приобрести под маркой «для молекулярной
биологии». Фенол фирмы «Sigma» (США) перегонять не следу-
ет. Его следует нагреть на водяной бане при 65 °С до полного
растворения и насытить автоклавированным буфером ТЕ
рН7,5—8,0). В некоторых протоколах применяется так назы-
ваемый кислый фенол, насыщенный водой. В данном случае —
это необязательно.
4. Смесь центрифугируют в течение 5 мин, супернатант отбирают
и дважды обрабатывают смесью фенола с хлороформом (1:1).
5. Нуклеиновые кислоты (РНК + ДНК) осаждают двойным объе-
мом холодного (-20 °С) этанола (обычно — 1 мл).
Выпадение нуклеиновых кислот в осадок можно увидеть
невооруженным глазом сразу же в пробирке при достаточной
их концентрации. При малой концентрации нуклеиновых
кислот в растворе для их визуализации требуется инкубация
под спиртом при -20 °С в течение 6-12 ч.
6. После центифугирования в центрифуге Эппендорф при 4 °С в те-
чение 10-15 мин на максимальной скорости осадок нуклеино-
вых кислот следует промыть 2 раза 70% этанолом и растворить
в воде.
Воду качества MilliQ следует автоклавировать и хра-
нить специально для растворения РНК при +4 °С. Можно ис-
пользовать воду, автоклавированную в присутствии DEPC —
диэтилпирокарбоната — ингибитора рибонуклеаз, хотя это
и не является абсолютно необходимым условием. Можно так-
172 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
же хранить аликвоты воды, замороженными при -20 °С в про-
бирках эппендорф.
7. Раствор нуклеиновых кислот обрабатывают свободной от РНКазы
ДНКазой I, согласно рекомендациям производителя, для осво-
бождения от геномной ДНК, после чего дважды обрабатывают
смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1).
РНК осаждают из раствора двойным объемом этанола при -20 °С
в течение 8-12 ч.
Изоамиловый спирт используется для лучшего разделения
водной и фенолъной фаз и для предотвращения пенообразова-
ния при встряхивании, однако он является необязательным.
Можно использовать смесь фенол:хлороформ 1:1.
Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов
(DNA microarray)
1. Для реакции обратной транскрипции используют следующую
реакционную смесь: 100 ед. активности обратной транскрипта-
зы (например, AMV Reverse Transcriptase XL фирмы «TaKaRa»,
Япония), однократный реакционный буфер (10х буфер всегда
прилагается к ферменту), смесь дезоксирибонуклеотидилтри-
фосфатов dCTP (2 mM dCTP, 5 тМ dTTP, 5 тМ dGTP, 5 тМ
АТР), 3 тМ СуЗ-dCTP (или Cy5-dCTP) (флуоресцентно-меченные
флуорофорами СуЗ и Су5 дезоксинуклеотиды можно приобрести у
фирмы «GE Healthcare», Великобритания), 300 пМ случайного
гексамерного праймера, 100 ед. активности ингибитора РНКаз
(типа RNasin I), 20 мкг общей РНК. РНК, выделенная из кон-
трольного образца, метится Cy5-dCTP, а выделенная из экспе-
риментального образца (например, после стрессового воздей-
ствия) — СуЗ-dCTP. Реакцию обратной транскрипции проводят
в объеме 50-100 мкл при 42 °С в течение 2 ч.
2. Не включившиеся в цепь к ДНК нуклеотиды удаляют путем
гель-фильтрации центрифугированием на колонках Centri-Sep
(«Princeston Separations», США).
3. Полученную меченую кДНК освобождают от РНК щелочным
гидролизом (200 mM NaOH 40 мин при 65 °С) с последующей ней-
трализацией щелочи 3 Μ ацетатом натрия (рН 5,5) и переосаж-
дением этанолом. Весь полученный материал используется для
гибридизации с 1 ДНК микрочипом.
4. Для гибридизации ДНК-микрочипов можно использовать запаян-
ные полиэтиленовые пакеты или специальные камеры для гибри-
дизации фирмы «Arraylt» (США, http://www.arrayit.com).
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени
173
В последнем (предпочтительном) случае рекомендуется следо-
вать инструкции к кассете, в которой указано — как правильно
сориентировать микрочип, в какую лунку и сколько залить бу-
фера и куда закапать смесь флуоресцентных зондов. ДНК-мик-
рочипы (CyanoCHIP компании «TaKaRa») прегибридизуют в бу-
фере, содержащем 4х SSC, 0,2% SDS, 5х раствор Денхардта,
100 нг мл-1 ДНК спермы лосося, при температуре 65 °С в тече-
ние 1 ч.
5. Гибридизацию проводят при тех же условиях в течение 12 ч с
добавлением полученных флуоресцентных зондов.
6. Гибридизованные микрочипы отмывают в 2х SSC (lx SSC содер-
жит 150 mM NaCl и 15 тМ цитрата натрия, рН 7,4) при комнат-
ной температуре, 2х SSC 10 мин при 60 °С, затем в 0,2х SSC и
0,1% SDS 10 мин при 60 °С и в 0,2х SSC 2 мин при комнатной
температуре.
7. Микрочипы сканируют на сканере GMS418 («Affimetrix»,
США) с последующим анализом интенсивности сигналов инди-
видуальных генов при помощи программы AutoGene software
(«BioDiscovery», США). Интенсивность сигнала каждого гена
нормализуют по сумме интенсивностей сигналов всех генов за
исключением генов рРНК. Затем рассчитывают изменения в ко-
личестве транскриптов каждого гена по отношению к общему
уровню мРНК. Обычно это делается специальной, но несложной
программой, написанной в MS-Excel. Программное обеспечение
обычно прилагается к сканеру микрочипов.
2.7. ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ НА
АППАРАТАХ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА
Г. А. Романов, Л. И. Патрушев
Введение
ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ, от англ. qRT PCR) яв-
ляется дальнейшим развитием метода полимеразной цепной реак-
ции ПЦР in vitro. ПЦР-РВ позволяет наблюдать и документально
фиксировать ход процесса избирательной амплификации последо-
вательностей ДНК в зависимости от числа температурных циклов.
Это, в свою очередь, дает возможность применить строгий матема-
тический аппарат к описанию процесса амплификации и количест-
венно определять важные характеристики данного процесса в пер-
вую очередь исходное число молекул нуклеиновых кислот, которые
174 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
служили матрицами для избирательного синтеза ДНК. Разумеется,
метод ПЦР-РВ может быть также использован и для качественного
анализа наличия/отсутствия искомых последовательной ДНК, на-
пример, при проведении анализов, направленных на выявление му-
таций, инфекций или ГМО. Однако главное достоинство метода —
это возможность осуществления именно количественного анализа.
В этой связи ПЦР-РВ активно применяется при исследованиях
транскрипционной активности (точнее — содержания транскрип-
тов) генов в биологических образцах, а также при анализе пищевых
продуктов на наличие трансгенных добавок, относительное содер-
жание которых важно оценить количественно. ПЦР-РВ может ис-
пользоваться и при судебно-медицинской экспертизе, а также для
санитарного и экологического контроля. Важным преимуществом
метода ПЦР-РВ является изолированность реакционных проб от
внешней среды на всех этапах анализа, при этом для получения
окончательного результата не требуется разделения продуктов ПЦР
электрофорезом или гибридизации на микрочипе. Это позволяет из-
бежать контаминации помещений ДНК-ампликонами, приводящей
к ложноположительным результатам, особенно в условиях проведе-
ния массовых анализов.
Принцип метода
Принцип метода ПЦР-РВ основан на непрерывном количественном
выявлении продуктов ПЦР в реакционной смеси на протяжении
всей реакции с помощью флуоресцентных меток. Детали метода за-
висят от варианта ПЦР-РВ. Ниже будут рассмотрены два часто ис-
пользуемых варианта: с реагентом SYBR Green в качестве флуорес-
центной метки или с флуоресцентно-мечеными зондами, получив-
шими название TaqMan. Описание других эффективных вариантов
метода, основанных, в частности, на применении молекулярных би-
конов и резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET), мож-
но найти в обзорах [1-7].
SYBR Green (N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-l,3-benzothiazol-
2-ylidene)methyl]-l-phenylquinolin-l-ium-2-yl]-N-propylpropane-l,3-
diamine) — это интеркалирующий реагент с большим сродством к
двухцепочечной ДНК. В образующемся комплексе ДНК—SYBR
Green краситель флуоресцирует в зеленой области спектра (λmax =
= 522 nm) при поглощении голубого света (λmax = 488 nm) в -1000 раз
более интенсивно, чем в свободном состоянии. Так как в процессе
амплификации ДНК увеличивается число двухцепочечных моле-
кул, флуоресценция комплекса ДНК—SYBR Green пропорциональ-
но возрастает, при условии, что SYBR Green добавлен в большом
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени
175
избытке по отношению к синтезируемой ДНК. Соответственно,
измерение уровня флуоресценции следует проводить только на тех
ступенях цикла, когда амплифицированная ДНК присутствует в виде
двухцепочечных молекул (обычно на ступени гибридизации или
элонгации цепей ДНК), что необходимо учитывать при программи-
ровании прибора. Вариант с использованием SYBR Green в целом
более экономичен и универсален по сравнению с другими варианта-
ми, хотя этот флуорофор окрашивает и неспецифические продукты
ПЦР.
Вариант метода ПЦР-РВ с использованием зондов TaqMan более
специфичен в отношении амплифицируемой последовательности.
Зонд TaqMan представляет собой короткий ДНК-олигонуклеотид,
комплементарный целевой последовательности. Этот олигонуклео-
тид мечен с обоих концов флуоресцентными красителями (флуоро-
форами), которые взаимодействуют между собой по типу FRET, в
результате чего флуоресценция одного из красителей, служащего
маркером реакции, гасится. Спектр поглощения гасителя флуорес-
ценции и спектр испускания флуорофора должны перекрываться.
Тушение флуоресценции происходит благодаря безызлучательному
переносу энергии от возбужденной молекулы флуорофора к молеку-
ле гасителя и рассеиванию энергии в диапазоне более длинных волн
или без излучения. Таким образом, в начале амплификации флуо-
ресценция маркерного флуорофора подавлена, однако в процессе
специфичной амплификации зонд TaqMan присоединяется к ком-
плементарной цепи синтезируемой ДНК и в результате расщепляет-
ся на отдельные нуклеотиды благодаря 5'-3'-экзонуклеазной актив-
ности Taq-ДНК-полимеразы. Концевые красители при этом прост-
ранственно разобщаются, что приводит к прекращению FRET и
активации сигнала флуоресценции маркерного флуорофора. По
мере прохождения ПЦР и увеличения числа копий целевой амп-
лифицируемой последовательности число расщепленных зондов
TaqMan пропорционально возрастает, и уровень флуоресценции ре-
акционной смеси закономерно повышается. Таким образом, избира-
тельность амплификации при варианте TaqMan определяется не
двумя, как в варианте с SYBR Green, а тремя уникальными олиго-
нуклеотидами. Преимуществом системы TaqMan перед системами с
интеркалирующими красителями является не только ее более высо-
кая специфичность, но и предоставляемая ею возможность следить
за амплификацией двух или нескольких целевых последователь-
ностей в одной пробе (так называемая мультиплексная реакция),
при использовании соответствующего числа зондов с различными
красителями.
176 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Оборудование, материалы и реактивы
ПЦР-РВ проводится на специальном оборудовании (детектирующих
амплификаторах, или термоцикл ерах), разработанном рядом извест-
ных биотехнологических фирм. Функционирование оборудования и
анализ полученных результатов обеспечивается поставляемым вместе
с приборами программным обеспечением. Среди зарубежных фирм
наиболее известны своими амплификаторами в режиме реального
времени «Applied Biosystems», «BioRad» (США), «Eppendorf» (Гер-
мания) и др. Российские специалисты также смогли создать соответ-
ствующее оборудование, которое широко используется во многих
медицинских и научных учреждениях страны и в испытательных
лабораториях. Это приборы АНК4, АНК16 и АНК32, разработан-
ные Институтом аналитического приборостроения РАН (С.-Петер-
бург) и МГТУ им. Баумана при участии компании «Синтол» (Москва),
и приборы марки ДТ (ДТ-322 и ДТ-96) компании «НПО ДНК-техно-
логия» (Москва). Основные характеристики детектирующих ампли-
фикаторов отечественных фирм рассмотрены ниже.
Приборы АНК32 (рис. 2.7.1) и ДТ-322 во многом близки по сво-
им рабочим характеристикам. Они позволяют проводить исследова-
ние до 32 образцов одновременно с использованием пробирок (от-
дельных или объединенных в стрипы) емкостью 0,2 мл; диапазон
рабочих температур термоблока составляет 4-99 °С. Оба прибора
специализированы как в отношении варианта с красителем SYBR
Green, так и вариантов с флуоресцентно-меченными олигонуклеоти-
дами. Оптическая система АНК32 позволяет проводить в одной про-
бирке до 4 реакций варианта TaqMan одновременно при использо-
вании 4 видов флуорофоров с разными спектрами испускания
флуоресценции (таких как 6-FAM, R6G, HEX, JOE, ROX, TxRed,
TAMRA, Cy5 и др.). Источником света при этом является галоге-
Рис. 2.7.1. Амплификатор АНК32
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени 177
новая лампа, а диапазоны излучений, возбуждающих флуорофо-
ры, регулируются светофильтрами (возможна установка до 5 пар
фильтров). У прибора ДТ-322 число каналов измерения флуорес-
ценции только два (длины волн возбуждения/детекции 470/514,5 и
532/570 нм), однако источником света являются светодиоды, даю-
щие стабильное излучение в узком диапазоне длин волн. Возможно
использование для одного из каналов реагентов SYBR Green или
6-FAM, а для другого — флуорофоров R6G, HEX, CAL Fluor 560,
TAMRA или СуЗ. Достоинством амплификатора ДТ-322 является
также высокая скорость нагрева/охлаждения термоблока, состав-
ляющая 3 и 2,5 °С в секунду соответственно. Это позволяет прово-
дить анализ быстрее, чем на амплификаторе АНК32, у которого ско-
рость нагрева/охлаждения составляет 1,2 °С/с. Кроме того, прибор
ДТ-322 более компактен и легок (11 кг) по сравнению с прибором
АНК32 (26 кг).
Амплификатор АНК16 отличается от АНК32 в основном только
уменьшенным вдвое числом лунок для проб в нагревательном бло-
ке. Прибор АНК4 того же производителя является портативным ам-
плификатором, предназначенным для экспресс-анализа малого чис-
ла проб (всего 4), в том числе в полевых условиях (вес прибора всего
5,5 кг). Недавно выпущенный фирмой «ДНК-технология» прибор
ДТ-96 (рис. 2.7.2) сочетает в себе лучшие качества предшествующих
разработок и не уступает по совокупности характеристик регистри-
рующим амплификаторам ведущих западных производителей. Этот
амплификатор позволяет анализировать до 96 проб одновременно, с
Рис. 2.7.2. Амплификатор ДТ-96
178 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
использованием как пробирок на 0,2 мл, так и стандартных планше-
тов. Источниками излучений являются 4 фотодиода, дающие воз-
можность проводить детекцию флуоресценции по 4 каналам одно-
временно, при длинах волн возбуждения/детекции 470/520, 530/570,
590/630 и 630/670. Эти каналы настроены на флуорофоры 6-FAM,
HEX, ROX и Су5 соответственно. При этом по желанию заказчика
возможна установка оборудования для дополнительного 5-го кана-
ла измерений. Технические характеристики амплификатора ДТ-96
(диапазон и точность температур, скорость нагрева/охлаждения,
возможность создания температурных градиентов) остаются таки-
ми же высокими, как и у более раннего прибора ДТ-322. Как и пред-
шественник, прибор ДТ-96 сохраняет все данные при отключении
электропитания и/или остановке компьютера благодаря встроенным
микроконтроллеру и дисплею, и способен продолжить выполнение
программы после ликвидации аварии. Надо отметить, что разработ-
чики отечественных детектирующих амплификаторов создали для
них удобное русскоязычное программное обеспечение, ориентиро-
ванное на пользователей различного уровня подготовки. Это создает
благоприятные условия для проведения как скрининговых, так и
научно-исследовательских работ.
Для проведения ПЦР-РВ требуются те же стандартные реакти-
вы, что и для обычной ПЦР (см. раздел 1.6), за исключением флуо-
ресцентных маркеров. Стандартными реактивами являются: смесь
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер, соль магния (обычно
MgCl2) и термостабильная ДНК-полимераза. Для минимизации
случайных флуктуации между пробами добавляют второй флуоро-
фор (обычно ROX) в качестве пассивного эталона. Все отечественные
устройства для ПЦР-РВ — это открытые системы, не привязанные
жестко к производителям определенных реактивов или тест-систем.
При этом российские фирмы-разработчики («Синтол», «ДНК-тех-
нология») выпускают реактивы и материалы, подобранные для
оптимальной работы соответствующих амплификаторов. Фирма
«Синтол», в частности, синтезирует по заказу олигонуклеотидные
зонды, меченные разными флуорофорами. Среди продуктов этой
фирмы имеются полные комплекты реактивов для ПЦР-РВ, при-
чем Taq-ДНК-полимераза поставляется совместно с ингибирую-
щими антителами, что обеспечивает ее активацию только в услови-
ях высокой температуры, вызывающей денатурацию антител (так
называемая Hot Start Polymerase). Обе компании выпускают ком-
плекты реактивов для качественного и количественного анализа со-
держания ГМИ в пищевых продуктах, сырье и кормах; для выявле-
ния бактериальных и вирусных инфекций, а также генетических
полиморфизмов человека. Обе компании предоставляют при этом
пробы для соответствующих положительных контролей. Следует
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени 179
упомянуть и фирму «ДНК-синтез» (Москва), производящую меченные
флуорофорами олигонуклеотидные зонды и праймеры.
Подготовка и ход определения
Подготовка к проведению ПЦР-РВ включает: 1) подготовку матри-
цы ДНК для амплификации; 2) выбор варианта ПЦР; 3) дизайн и за-
каз необходимых праймеров и зондов; 4) введение программы в ам-
плификатор, т. е. обозначение рабочих лунок, подбор температур и
времени для термоциклов, а также необходимого числа этих цик-
лов.
Подготовка матрицы
Матрицей для амплификации может служить только ДНК. РНК,
хотя и близка по структуре, не способна заменить ДНК в этом про-
цессе. Поэтому при изучении транскриптов необходимо предвари-
тельно на их основе синтезировать молекулы комплементарной ДНК
(кДНК) с помощью обратной транскриптазы. Проблем с выделением
ДНК для ПЦР-РВ из живых тканей и клеток обычно не бывает,
однако важно следить за тем, чтобы в препарате ДНК не оставалось
примесей, ингибирующих ДНК-полимеразу, таких как фенол, хло-
роформ, спирты, детергенты, гепарин и др. Проблемы могут возник-
нуть при использовании ДНК из таких объектов, как продукты пи-
тания и корма, где ДНК обычно существенно деградирована. Однако
именно ПЦР-РВ позволяет успешно анализировать деградирован-
ную ДНК, так как в этом методе обычно амплифицируют короткие
фрагменты ДНК длиной ~100 нуклеотидов. При работе с геномной
ДНК объектов типа арабидопсиса или риса количество ДНК в пробе
должно быть в пределах 0,1-5 мкг; при использовании кДНК ее ко-
личество в пробе может быть меньше на 1-2 порядка величин. При
этом желательно выровнять все пробы по содержанию ДНК (для по-
ложительного и отрицательного контролей это необязательно). Осо-
бенно важно стандартизовать испытуемые пробы по содержанию
ДНК при использовании варианта с SYBR Green.
Выбор варианта ПЦР
Выбор варианта ПЦР зависит от поставленной задачи. При неболь-
шом числе проб или в начале нового исследования предпочтитель-
ным может быть метод с SYBR Green, который более прост в подго-
товке и интерпретации, а также дешевле системы TaqMan. В случае
активно проводимой работы с большим числом образцов более пред-
почтительным является метод TaqMan (и ему подобные), как более
специфичный и (при использовании мультиплексной ПЦР) произ-
водительный.
180 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Дизайн и заказ праймеров
Дизайн и заказ праймеров и зондов удобно осуществлять через
Интернет с помощью доступных программ, таких как Primer3 (ад-
реса в Интернете: http: //f rodo.wi .mit .edu/primer3/ или http: //
biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi), а также сай-
та NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)
(см. также раздел 1.6). Последняя из программ не только облегчает
подбор праймеров и зондов, но и проверяет их на абсолютную специ-
фичность в отношении целевой последовательности среди всего ге-
нома объекта исследований (для известных геномов). При наличии
в остальной части генома дополнительных мест посадки праймеров,
фланкирующих потенциально амплифицируемый участок ДНК,
эта пара отбрасывается, а поиск праймеров продолжается до тех
пор, пока не будет найдена подходящая специфическая пара. Темпе-
ратура отжига зонда TaqMan должна быть на 5-10 °С выше темпе-
ратуры отжига праймеров. Характерной особенностью ампликонов
в ПЦР-РВ является их малый размер: при использования вариан-
та SYBR Green оптимальный размер ампликона — в пределах
100-200 нуклеотидных остатков, в случае TaqMan может быть еще
меньше. При этом все праймеры и зонды должны обладать близки-
ми термодинамическими характеристиками, определяющими тем-
пературу плавления ДНК-дуплексов (разница не более 1-2 °С), а
также сходной эффективностью (90-100%). Последняя определяет-
ся путем ПЦР-РВ с серией разбавлений матриц ДНК. При работе с
системой, основанной на SYBR Green (но не TaqMan), для более прос-
той интерпретации результатов желательно, чтобы амплифицируе-
мые участки сравниваемых генов были близки по размеру, посколь-
ку интенсивность флуоресценции в этом случае зависит от размера
ампликона. При этом важно следить, чтобы выбранные флуорофо-
ры соответствовали оптическим характеристикам используемого
детектирующего амплификатора.
Программирование амплификатора
Программирование амплификатора проводят на основе известных
характеристик праймеров и рекомендаций фирмы-изготовителя
прибора. В ПЦР температурный цикл обычно состоит из трех сту-
пеней: денатурации ДНК (94-95 °С), гибридизации с праймерами
(и зондами) — здесь температура устанавливается в зависимости от
температуры плавления праймеров (Тпл минус 0-5 °С), и синтеза
ДНК Taq-ДНК-полимеразой (72 °С). Однако в случае именно ПЦР-РВ
трехступенчатый цикл может быть сокращен до двухступенчатого:
денатурации и гибридизации—элонгации праймеров. Дело в том,
что для синтеза коротких фрагментов ДНК (длиной до сотни нуклео-
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени
181
тидных остатков) требуется настолько мало времени, что Taq-ДНК-по-
лимераза вполне успевает провести этот синтез при минимальной
температуре и в ходе ее подъема. При этом время эксперимента со-
кращается настолько, что результаты ПЦР-РВ могут быть получе-
ны уже через 30-40 мин после запуска программы амплификации.
Для варианта с интеркалирующим флуорофором (SYBR Green) по-
сле завершения заданного числа циклов важно провести плавление
синтезированных ампликонов, для проверки специфичности ампли-
фикации. Эта возможность предусмотрена программой приборов.
Так как метод является высокочувствительным, при приготов-
лении смесей для амплификации необходимо избегать возможных
загрязнений посторонними ДНК или ампликонами. Поэтому сме-
шивание растворов для ПЦР-РВ необходимо проводить в резиновых
перчатках предпочтительно в отдельном помещении, в закрытых
контролируемых пространствах, регулярно обрабатываемых ультра-
фиолетом — так называемых ПЦР-боксах. Реакционные смеси, со-
держащие все компоненты (кроме праймеров и исследуемой нукле-
иновой кислоты), необходимо готовить одновременно для всех проб
(с превышением объема на 15%), а не отдельно в каждой пробирке,
т. к. в последнем случае увеличиваются временные затраты на про-
боподготовку и снижается степень их стандартизации, а значит и
достоверность результатов. Во избежание изменения объема проб
из-за испарения воды, приготовление большого числа проб рекомен-
дуется проводить на ледяной бане или в охлаждающем термостате.
В этой работе очень важны чистота и качество исходных растворов,
правильность расчетов и точность и аккуратность разнесения мно-
жества аликвот. Число параллельных проб для каждого анализиру-
емого образца ДНК или РНК должно быть не менее трех. После под-
готовки проб, объем которых обычно составляет 20-25 мкл, их сле-
дует поместить в амплификатор согласно инструкции для этого
прибора. Приготовленные пробы со стабилизированной ДНК-поли-
меразой можно оставлять в холодильнике на ночь. В каждом опыте
обязательно наличие положительных (с известной ДНК-матрицей)
и отрицательных (без добавления ДНК-матрицы) контрольных проб.
В случае системы TaqMan положительный контроль (на прохожде-
ние ПЦР) может находиться и внутри испытуемых образцов, что яв-
ляется ее важным преимуществом перед системой SYBR Green.
Лишние контроли в эксперименте не так страшны, как отсутствие
нужных. Далее, пользуясь инструкцией для прибора, обозначают
рабочие ячейки, устанавливают выбранный температурный режим
с заданным числом циклов и запускают программу. Число циклов
амплификации чаще всего находится в пределах 25-50. Уже после
25 циклов количество целевой ДНК теоретически должно возрасти
182 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
в 33 554 432 (225) раз. Конечно, идеальных условий при ПЦР никог-
да не бывает, и удвоение ампликонов ни в одном цикле не проходит
на 100%. Тем не менее количества новообразованной ДНК после
25-30 циклов обычно достаточно для определения искомых пара-
метров ее амплификации.
Интерпретация результатов
Интерпретация результатов ПЦР-РВ основана, в первую очередь, на
анализе зафиксированных прибором кривых увеличения интенсив-
ности флуоресценции, отражающих накопление амплифицируе-
мых ДНК. В координатах, где по оси абсцисс отложено число темпе-
ратурных циклов, а по оси ординат — нормированная интенсив-
ность флуоресценции, эта кривая имеет интегральную S-образную
форму (рис. 2.7.3). Рост кривой на начальном этапе связан с экспо-
ненциальным процессом копирования ДНК, а снижение скорости
роста и выход на плато — с истощением тех или иных компонентов
исходной реакционной смеси (праймеров, дезоксирибонуклеозид-
трифосфатов, ДНК-полимеразы). Чем больше исходная концентра-
ция матриц для амплификации целевой последовательности ДНК,
тем на более раннем цикле начнется рост кривой флуоресценции,
т. е. кривая расположится в более левой части графика. И наоборот,
чем меньше исходная концентрация матриц, тем правее будет эта
кривая. Прилагаемая к прибору программа автоматически рассчи-
Рис. 2.7.3. Типичная кривая роста флуоресценции в ходе амплифика-
ции ДНК
Раздел 2.7. ПЦР в режиме реального времени
183
тывает так называемый пороговый цикл (Ct) для каждой кривой,
что позволяет проводить их сравнение на качественном уровне. По-
роговый цикл (отмечен стрелкой на рис. 3) — это номер цикла
ПЦР-РВ, при котором значение флуоресценции ПЦР-продукта на-
чинает достоверно превышать уровень фоновой флуоресценции. Ct
обратно коррелирует с log исходного количества матриц ДНК. Дос-
товерность результатов оценивается с учетом контролей как внеш-
них (в отдельных пробирках), так и внутренних при использовании
варианта TaqMan. Например, если та или иная проба показала отсут-
ствие амплификации целевой последовательности, но при этом по-
следовательность контрольной ДНК, присутствующей в той же про-
бе (внутренний контроль), также не амплифицировалась, то это ука-
зывает на общее ингибирование процесса синтеза ДНК в пробе, т. е.
на недостоверность данного отрицательного результата.
Для количественного определения необходимо включить в чис-
ло амплифицируемых образцов еще и стандартные калибровочные
пробы с известным содержанием целевой последовательности. Такие
стандарты также поставляются фирмами, выпускающими комплек-
ты для количественной ПЦР-РВ. После завершения амплификации
интегрированная с прибором программа автоматически выполняет
расчет содержания целевой последовательности, например транс-
генного 358-промотора.
Более сложным случаем является количественный анализ со-
держания транскриптов. Здесь первичные данные должны быть нор-
мированы на аналогичные значения, полученные для генов сравне-
ния (так называемых референтных генов), т. е. тех генов, экспрес-
сия которых конститутивна и близка к постоянной. В качестве
референтных генов у арабидопсиса часто используются гены «до-
машнего хозяйства» (housekeeping genes), например, ген актина 2
(At3gl8780) и/или ген полиубиквитина 10 (At4g05320). Однако эти
гены активно экспрессируются, поэтому для более точного расчета
количества слабо экспрессируемых генов желательно подбирать ре-
ферентные гены с относительно слабой экспрессией [8, 9]. Современ-
ные требования к проведению количественного анализа содержания
транскриптов таковы, что для каждой серии (планшета) требуется
присутствие не менее 2-х референтных генов. Более подробные све-
дения о количественном анализе данных, получаемых с помощью
ПЦР-РВ, можно найти в приводимых обзорах [5-11].
Оценка метода, возможные проблемы
На сегодняшний день метод ПЦР-РВ является одним из лучших ме-
тодов для проведения массовых тестов на основе ДНК, к тому же
пригодным для количественного анализа. Он существенно ускоряет
184 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
процесс получения результата, делает его более воспроизводимым и
достоверным, позволяет избежать не только использования опас-
ных для здоровья соединений (радиоактивных изотопов, акрилами-
да и др.), но и контаминации лабораторий ДНК-ампликонами. Ко-
нечно, этот метод пока весьма затратен, причем дорого стоит не
только сам амплификатор, но и выпускаемые для него материалы и
комплекты реактивов.
Однако не все варианты ПЦР-РВ одинаково хорошо справляются
с задачей избирательной амплификации целевой последовательнос-
ти, особенно при осуществлении мультиплексной амплификации
TaqMan в одной пробе. Отмечены случаи, когда при ПЦР-РВ ампли-
фикация одной последовательности ДНК по пока неясной причине
блокирует амплификацию других. Впрочем, такие проблемы возни-
кают и при обычных ПЦР в ходе мультиплексных реакций и реша-
ются обычно путем замены праймеров и/или варьирования прог-
раммы амплификации. Основная литература по ПЦР-РВ приведена
ниже.
Литература
1. Espy Μ. J., Uhl J. Я, Sloan L. M. et al. Real-Time PCR in Clinical
Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing //
Clin. Microbiol. Rev. 2006. V. 19. P. 165-256.
2. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М.,
2004, Наука, 526 с.
3. РебриковД. В. ПЦР в реальном времени. М., 2008. Бином, 216 с.
4. Трофимов Д. Ю. и др. Метод повышения точности ПЦР в реаль-
ном времени // Доклады АН. 2008. Т. 419. С. 421-424.
5. Logan J., Edwards К., Saunders N. (Eds) Real-Time PCR: Current
Technology and Applications. Caister Academic Press. London.
2009. ISBN: 978-1-904455-39-4.
6. Edwards K. Real-Time PCR: An Essential Guide. Publ. Horizon
Bioscience, UK, 2004. ISBN: 0-9545232-7-X.
7. Tevfik Borah M. (ed.) Real Time PCR (BIOS Advanced Methods),
Taylor & Francis Group, N. Y., Abingdon. 2006. ISBN:
0-4153-7734-X.
8. A-Z of Quantitative PCR / Ed S.A. Bustin. IUL Biotechnol. Series
5. Intern. Univ. Line, 2004. ISBN 0-9636817-8-8.
9. Czechowski Т., Stitt M., Altmann Т., Udvardi Μ. Κ.,
Scheible W.-R. Genome-Wide Identification and Testing of
Superior References Genes for Transcript Normalization in
Arabidopsis // Plant Physiol. 2005. V. 139. P. 5-17.
Раздел 2.8. QTL-анализ
185
10. Gutierrez S., Mauriat Μ., Pelloux J., Bellini C, van
Wuytswinkel O. Towards a Systemic Validation of References in
Real-Time RT PCR // Plant Cell. 2008. V. 20. P. 1734-1735.
11. Cikos §., Koppel J. Transformation of Real-Time PCR Fluorescence
Data to Target Gene Quantity // Anal. Biochem. 2009. V. 384.
P. 1-10.
2.8. QTL-АНАЛИЗ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Л. И. Сергеева
Введение
Последние десятилетия стали свидетелями значительных успехов в
выяснении функции генов в растениях. Эти успехи отчасти опреде-
ляются идентификацией генов, стоящих за конкретными мутант-
ными фенотипами. В других подходах для установления функции и
характера регуляции гена используют экспрессию клонированного
гена in vivo при создании трансгенного организма, или in vitro в бес-
клеточной системе. В последние годы в основном пользуются вы-
ключением отдельных генов за счет инсерций или RNAi, а также in
silico путем установления гомологии и нахождения функциональ-
ных доменов методами биоинформатики. Все вышеперечисленные
подходы особенно эффективны при анализе признаков, обнаружи-
вающих дискретную изменчивость, когда мутант и растение дикого
типа различаются по одному гену. Однако во многих случаях, на-
пример при анализе скорости роста, непрерывная изменчивость
признаков заставляет предполагать, что они контролируются мно-
гими генами или определяются взаимодействием гена с окружаю-
щей средой. Выяснение природы генов, контролирующих полиген-
ные признаки, успешно начато в последнее десятилетие. Анализ ло-
кусов количественных признаков (QTL, от англ. Quantitative Trait
Locus) позволяет эффективно картировать и идентифицировать гены,
определяющие сложные (полигенные) признаки. QTL-анализ — это
статистический метод, который связывает два типа информации —
фенотипические данные (измерения признака) и генотипические
данные (обычно молекулярные маркеры) — в попытке объяснить
генетическую основу изменчивости сложных признаков, контроли-
руемых несколькими генами. Метод устанавливает точную локали-
зацию, количество, эффект и взаимодействие QTLs. В ближайшем
будущем использованию метода QTL будут способствовать значи-
тельное расширение генетических ресурсов, совершенствование ме-
186 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
тодов молекулярной биологии, геномики, протеомики и быстрое на-
копление экспериментальных данных в области функциональной
генетики, полученных на модельных видах (арабидопсис) и куль-
турных растениях.
Принцип метода
QTL-анализ основан на природной внутривидовой аллельной измен-
чивости, которая приводит к небольшим или значительным коли-
чественным изменениям исследуемого признака. Природная аллель-
ная изменчивость отличается от индуцированной изменчивости (у
мутантов) тем, что аллели присутствуют в природных популяциях
и предположительно в определенных условиях дают растениям
селективные преимущества или по меньшей мере остаются ней-
тральными по отношению к отбору. Для картирования QTL нужна
сегрегированная популяция, полученная путем скрещивания двух
родительских форм. Желательно, чтобы эти родительские формы
различались по признаку, интересующему исследователя. Для при-
знаков, контролируемых десятками или сотнями генов, родитель-
ские линии не должны обязательно различаться фенотипически по
исследуемому признаку; скорее, они должны просто содержать раз-
личные аллели, которые в результате рекомбинационных событий
мейоза дадут в поколении потомков целый спектр фенотипических
проявлений признака. Поскольку родителями являются растения
из природных популяций (образцы или экотипы дикорастущих ви-
дов), сорта, селекционные линии или расы культурных растений,
они обычно различаются по многим локусам. QTL-анализ устанав-
ливает связь между количественным значением признака и аллель-
ным составом локусов для всех индивидуальных растений в сегреги-
рованной популяции.
QTL-анализ выявляет участки хромосом, где расположены гены
или группы тесно сцепленных генов, обнаруживающих значитель-
ное количественное влияние на признак, и позволяет количествен-
но оценить такое влияние. Отсюда следует, что QTL — это не ген, а
только участок хромосомы, и для идентификации генов, ответствен-
ных за количественные изменения признака, связанного с данным
QTL, необходимо использование других методов [1-3].
Для проведения QTL-анализа исследователю нужны два или бо-
лее сорта (экотипа, линии) организмов одного вида, которые разли-
чаются генетически по отношению к интересующему признаку.
Например, можно выбрать линии, несущие разные аллели, влияющие
на длину корня (длинный корень — короткий корень). Во-вторых,
требуются генетические маркеры, которые отличают эти родитель-
ские линии между собой. Сегодня аллельный состав индивидуаль-
Раздел 2.8. QTL-анализ
187
ных растений (линий) легко определить с помощью генетических
маркеров [2, 4].
Генетические маркеры
Генетические маркеры отражают генетические различия между ин-
дивидуальными организмами или видами. Генетические маркеры,
которые расположены в непосредственной близости к генам (то есть
тесно сцеплены с ними), могут быть названы генными «метками».
Такие маркеры сами по себе не влияют на фенотип изучаемого приз-
нака, поскольку они лишь расположены близко к генам, контроли-
рующим признак. Все генетические маркеры занимают, подобно
генам, определенные положения в геноме в пределах хромосом. Су-
ществует три основных вида генетических маркеров: (1) морфологи-
ческие (также «классические» или «видимые») маркеры, которые
сами по себе представляют фенотипические признаки или характе-
ристики; (2) биохимические маркеры, которые включают аллель-
ные варианты ферментов (изозимы), и (3) ДНК (или молекулярные)
маркеры, которые показывают места различий нуклеотидной по-
следовательности ДНК. Морфологические маркеры обычно визу-
ально характеризуют такие фенотипические признаки, как, напри-
мер, окраска цветков, форма семян. Изозимные маркеры — разли-
чия в ферментах, которые выявляют с помощью электрофореза
(см. раздел 3.2) или специального окрашивания (см. раздел 3.5).
Главный недостаток морфологических и биохимических маркеров —
это то, что их число ограничено, и они зависят от условий окружаю-
щей среды или этапа развития растения. Однако, несмотря на эти
ограничения, морфологические и биохимические маркеры чрезвы-
чайно полезны для селекционеров. ДНК-маркеры — наиболее ши-
роко используемый тип маркеров вследствие их многочисленности.
Они возникают из различных типов мутаций ДНК, таких как замес-
тительные (точечные) мутации, перестановочные (вставки или уда-
ления (делеции)) или ошибки воспроизведения. В отличие от мор-
фологических и биохимических маркеров, число молекулярных
маркеров практически неограничено, они не зависят от факторов
окружающей среды или этапа онтогенеза. ДНК-маркеры могут быть
поделены на 3 класса, согласно методу их определения на основа-
нии: (1) гибридизации; (2) полимеразной цепной реакции (см. раз-
дел 1.6) и (3) по последовательности ДНК [2-4].
Необходимым условием проведения QTL-анализа является кон-
струирование карты сцепления. Карты сцепления (молекулярно-ге-
нетические карты, linkage-карты) указывают позицию маркеров и
относительные генетические расстояния между маркерами вдоль
хромосом. С помощью карт сцепления устанавливают местоположе-
188 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
ние генов и QTLs, связанных с интересующим признаком, поэтому
такие карты называют еще QTL-картами. QTL-картирование осно-
вано на принципе, что гены и маркеры сегрегируют (разделяются)
при рекомбинации хромосом, что позволяет анализировать их в по-
томстве (F2) и сравнивать с родительскими формами. Расположен-
ные близко гены и маркеры будут чаще совместно (сцепленно) пе-
редаваться от родителя к потомству, чем гены и маркеры, располо-
женные дальше друг от друга. В сегрегирующей популяции (F2)
имеется смесь рекомбинантных генотипов. Частота рекомбинант-
ных генотипов может быть использована для расчета генетического
расстояния между маркерами. Анализируя сегрегацию маркеров,
можно установить относительное положение и расстояние между
маркерами: чем ниже частота рекомбинации между двумя маркера-
ми, тем ближе они расположены на хромосоме, и наоборот. Карти-
рование используется для преобразования частоты рекомбинации в
единицы генетических расстояний, называемые сантиморганами
(сМ). Так, 1 сМ соответствует частоте рекомбинации 1% . Маркеры,
которые имеют частоту рекомбинации 50% и более, считаются не
сцепленными, т. е. расположенными на разных хромосомах или да-
леко друг от друга на одной хромосоме. Карты сцепления строятся
на основе анализа множества сегрегирующих маркеров. Конструи-
рование карты включает три основных этапа: (1) получение карти-
рующей популяции; (2) идентификация полиморфизма и (3) анализ
сцепления маркеров.
Картирующие популяции
Для конструирования карты сцепления требуется сегрегированная
популяция растений (т. е. популяция, полученная при половом раз-
множении). Родительские формы, отобранные для получения попу-
ляции F2, обычно различаются по одному-двум или нескольким инте-
ресующим признакам. Величина популяции F2 колеблется в среднем
от 50 до 250 индивидов, однако для высокоразрешающего карти-
рования требуется популяция с большим числом индивидов.
В большинстве случаев у самоопыляющихся видов (таких, как
арабидопсис) картирующую популяцию получают от родителей, ко-
торые оба (практически по абсолютному большинству генов) гомо-
зиготны. Существуют разные типы популяций: F2-популяции, по-
лученные самоопылением F1-гибридов, или популяции обратного
скрещивания (ВС, от англ. back-cross), полученные в результате
скрещивания Fl-гибридов с одним из родителей. F2 и ВС — наибо-
лее простые виды популяций, разработанные для самоопыляющих-
ся видов растений. Основными преимуществами этих популяций
является легкое конструирование и короткое время получения.
Раздел 2.8. QTL-анализ
189
Последующее самоопыление (inbreeding) индивидуальных рас-
тений F2 в течение нескольких поколений (до F8) приводит к пере-
воду в гомозиготное состояние большинство локусов и позволяет по-
лучить популяцию рекомбинантных близкородственных линий
(RIL, Recombinant Inbred Lines), состоящую из серии гомозиготных
линий, каждая из которых включает уникальную комбинацию сег-
ментов хромосом от исходных родителей. Основной недостаток RIL —
длительное время получения, так как обычно лишь к 7-8-му поко-
лению достигается необходимый уровень гомозиготности [2-4].
Другой тип популяции — популяции дигаплоидов (DH, от англ.
Doubled Haploid) — могут быть получены при регенерации растений
путем индукции удвоения хромосом из пыльцевых зерен. Однако
конструирование DH-популяций возможно только для видов, ко-
торые способны к культивированию in vitro (например, злаковые
виды, такие как рис, ячмень, пшеница). Главное преимущество
RIL- и DH-популяций — это то, что они воспроизводят гомозиготные
линии, которые могут быть размножены без генетических измене-
ний. Это позволяет работать с такими «бессмертными» популяциями
в разных местах и в разное время. Более того, семенами индивиду-
альных RI- и DH-линий можно обмениваться между лабораториями
для дальнейшего анализа сцепления и добавления новых маркеров
на существующие карты. Для арабидопсиса уже созданы коллекции
RIL, пригодные для анализа разнообразных признаков [1, 5].
Второй шаг в конструировании карты сцепления — это подбор
ДНК-маркеров, которые показывают различия между родительски-
ми формами (т. е. полиморфные маркеры). Для построения карты
сцепления важно, чтобы между родительскими формами существо-
вал достаточный полиморфизм. Как только полиморфные маркеры
подобраны, они должны быть найдены и обозначены («расставле-
ны» по хромосомам) во всей картируемой популяции, включая ро-
дителей, — так называемое маркерное «генотипирование» популя-
ции. Для этого ДНК должна быть экстрагирована из каждого инди-
вида популяции, после чего проводят ПЦР и изучают сегрегацию
маркеров. Значимые отклонения от ожидаемой сегрегации могут
быть проанализированы с помощью Chi-square (Хи-квадрат) теста.
В основном, сегрегация не сцепленных маркеров происходит по за-
конам Менделя, хотя бывают и нарушения [2].
Заключительный этап конструирования карты сцепления вклю-
чает введение данных для каждого ДНК-маркера на каждого индиви-
да популяции в общую базу и проведение анализа сцепления с исполь-
зованием специальных компьютерных программ (Map-maker/EXP;
MapManager QTX; JoinMap), которые доступны через Интернет.
190 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Сила сцепления между маркерами (или между маркером и QTL)
определяется как отношение вероятности наличия этой связи к ве-
роятности отсутствия связи. Это отношение обычно выражают в ло-
гарифмической форме и называют LOD (от англ. Logarithm of Odds).
Значения LOD > 3 обычно используют для построения карты сцепле-
ния. Величина LOD, равная 3, означает, что сцепление между мар-
керами в 1000 раз более вероятно, чем его отсутствие. Сцепленные
между собой маркеры сгруппированы вместе в группы сцепления,
которые представляют собой сегменты хромосом или цельные хро-
мосомы. Аккуратность измерения генетических расстояний и опре-
деления порядка маркеров напрямую зависит от числа индивидуу-
мов (RI-линий) в картирующей популяции. В идеале, такая популя-
ция должна состоять как минимум из 50 индивидов.
Расстояние вдоль карты сцепления измеряется согласно частоте
рекомбинаций между генетическими маркерами. Нужен специаль-
ный расчет для превращения частоты рекомбинации в сантиморга-
ны. Когда расстояния на карте малы (<10 сМ), дистанция на ней со-
ответствует частоте рекомбинаций. Однако при больших расстояни-
ях (>10 сМ) нужно вводить специальные поправки, учитывающие,
что рекомбинационные события влияют на соседние рекомбинации
и т. д. Следует отметить, что расстояния на генетической карте не
связаны напрямую с физическим расстоянием на ДНК между гене-
тическими маркерами, но зависят от размера генома растительных
видов. Кроме того, отношение между генетическим и физическим
расстоянием меняется вдоль хромосомы. Например, существуют ре-
комбинационные «горячие точки» и «холодные точки», которые яв-
ляются участками хромосом, где рекомбинации случаются, соответ-
ственно, с повышенной или пониженной частотой.
Если картирующая популяция используется для QTL-анализа,
то следующим важным этапом должно быть получение фенотипи-
ческих данных по интересующему признаку, т. е. представители
всех Ш-линий, составляющих популяцию, должны быть количест-
венно охарактеризованы (например, по длине корня) для последую-
щего QTL-картирования.
После того как выполнены измерения интересующего феноти-
пического признака у большого числа особей F2-поколения или их
RIL-потомков, а также проведено генотипирование каждого расте-
ния той же популяции, можно приступать собственно к QTL-анали-
зу. QTL-анализ основан на принципе определения ассоциаций меж-
ду фенотипическими измерениями признака и генотипом маркеров.
Принцип картирования QTL с помощью RIL схематически показан
на рис. 2.8.1 [3].
Раздел 2.8. QTL-анализ
191
Родительская Родительская
линия 1 линия 2
F1
Рекомбинантные
имбредные линии
Количественные
значения признака
Рис. 2.8.1. Схема получения набора рекомбинантных линий (RIL) и их
использования для QTL анализа. Для простоты в каждой линии показана
только одна хромосома и представлены только шесть RIL. Скрещивали
два экотипа растений (родительские линии 1 и 2, хромосомы которых об-
означены черным и серым цветом), далее в поколении F1 проводили само-
опыление гибридов, чтобы получить F2 линии. RIL получали многократ-
ным самоопылением F2 линий до практически полного гомозиготного
состояния (поколение F8 обеспечивает 99,2% -й уровень гомозиготности).
Черные и серые штриховые линии указывают положение молекулярных
маркеров. В этом примере приведенные внизу количественные характе-
ристики признака указывают на QTL в нижней части хромосомы; присут-
ствие аллелей родительской формы 2 соответствует высокому уровню
проявления признака, а аллели родительской формы 1 соответствуют
низкому уровню проявления признака
Маркеры используют для разделения картирующей популяции
на различные генотипические группы на основании присутствия
или отсутствия того или иного маркерного локуса и определения,
имеются ли существенные различия между этими группами по от-
ношению к измеряемому признаку. Возможность связи между тем
или иным маркером и QTL определяют по величине критерия LOD.
Значительное отличие некоторых групп от средних значений попу-
ляции (LOD = 2 или 3, в зависимости от системы маркеров и типа по-
пуляции) означает, что локус определенных маркеров сцеплен с QTL,
контролирующим исследуемый признак. Несцепленные маркеры,
расположенные далеко от QTL или на других хромосомах, будут на-
следоваться независимо от этого QTL, поэтому не будет выявлено
значительной разницы между средними показателями генотипи-
ческих групп.
192 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Для нахождения QTL применяют три основных метода: анализ
по одному маркеру, простое интервальное картирование и сложное
интервальное картирование.
Анализ по одному маркеру — простейший метод для нахожде-
ния QTLs, сцепленных с конкретным маркером. Статистические ме-
тоды для этого анализа включают ί-тест, алгоритм ANOVA и линей-
ную регрессию. Основным недостатком этого метода является то,
что чем дальше QTL находится от маркера, тем меньше вероятность
его обнаружить, т. к. существует вероятность, что между маркером
и QTL может случиться рекомбинация. Использование большого
числа ДНК-маркеров, покрывающих весь геном с интервалами ме-
нее 15 сМ, может уменьшить остроту этой проблемы.
Простое интервальное картирование (SIM, от англ. simple interval
mapping) анализирует наличие QTL в интервалах между соседними
парами связанных между собой маркеров вдоль всех хромосом. Этот
метод компенсирует возможные рекомбинации между маркером и
QTL и является более продвинутым по сравнению с анализом по од-
ному маркеру.
В настоящее время для обнаружения QTLs чаще всего использу-
ют сложное интервальное картирование (CIM, от англ. composite
interval mapping). Оно соединяет интервальное картирование с ли-
нейной регрессией и включает добавочные генетические маркеры в
статистическую модель в дополнение к паре соседних связанных
между собой маркеров. Этот метод более точен и эффективен по
сравнению с первыми двумя, особенно для обнаружения связанных
между собой QTLs. Для проведения CIM используют программы
QTL Cartographer, MapManager QTX, PLABQTL, MapQTL.
С помощью методов интервального картирования получают про-
фили возможных мест нахождения QTL между соседними связан-
ными маркерами. Результаты SIM- и CIM- статистических тестов
обычно представляют в виде графика с LOD-значениями, где марке-
ры, включенные в группу сцепления, отмечены на оси х, а значения
LOD — на оси у. В таких LOD-профилях находят позиции наивыс-
ших значений LOD, которые используют для определения наиболее
вероятного положения QTLs по отношению к карте сцепления. Эти
пики максимумов должны превышать заданный уровень достовер-
ности, который чаще всего определяют с помощью теста перестано-
вок (англ. permutation test) [6]. Обычно порогом достоверности QTL
является значение LOD между 2 и 3.
Индивидуальные QTLs могут быть описаны как главные и вто-
ростепенные. Это определение основано на соотношении фенотипи-
ческих изменений, обусловленных QTLs: главные QTLs отвечают за
> 10%, а второстепенные — за < 10% фенотипических изменений
Раздел 2.8. QTL-анализ
193
признака. Иногда на главные QTLs ссылаются как на стабильные к
условиям окружающей среды, тогда как второстепенные QTLs яв-
ляются чувствительными к условиям окружающей среды (напри-
мер, это относится к QTLs, влияющим на устойчивость к болезням).
Хотя наиболее вероятная позиция QTL — это та позиция на карте,
где определена наибольшая LOD величина, QTLs фактически распо-
ложены в пределах «доверительных интервалов» (англ. confidence
intervals). Эти интервалы рассчитываются несколькими способами.
Простейший: «один LOD-поддерживающий интервал», который
определяют, находя область по обеим сторонам от пика QTL, кото-
рая соответствует уменьшению величины LOD на единицу.
Не существует абсолютного значения для числа ДНК-маркеров,
требуемых для построения генетической карты, так как эта величина
зависит от числа и длины хромосом растительного вида. Для нахож-
дения QTL обычно достаточна относительно «редкая сеть» равно-
мерно расположенных маркеров на карте, содержащая, в среднем,
от 100 до 200 маркеров. Для геномов большего размера требуется
большее число маркеров.
Все карты сцепления уникальны, так как созданы на основе кар-
тированной популяции, полученной от двух определенных родителей
и с использованием определенного типа маркеров. Даже если тот же
набор маркеров применяют для создания другой карты сцепления,
нет гарантии, что все маркеры будут полиморфными между разны-
ми популяциями. Поэтому для корректировки информации, пере-
носимой от одной карты на другую, требуются общие маркеры, ко-
торые чрезвычайно полиморфны и называются «якорными» (или
основными) маркерами. Особые группы таких маркеров, которые
расположены в тесной близости друг к другу в определенных облас-
тях генома, были названы «bins». Такие «bins» используют для объ-
единения карт сцепления; они представляют собой 10-20 сМ участ-
ки вдоль хромосом, границы которых определяются набором якор-
ных маркеров. Если такие общие якорные маркеры включены в
различные карты, последние могут быть объединены для создания
консенсусных («consensus») карт. Такие карты могут быть чрезвы-
чайно полезны при создании новых карт или для особого типа кар-
тирования. Например, такая карта может показать, какие еще мар-
керы присутствуют в том участке хромосомы, где находится QTL,
и, таким образом, могут быть использованы для более точной лока-
лизации QTL.
Возможные проблемы
Существует много факторов, которые могут повлиять на процесс об-
наружения QTLs. Главными из них являются генетические свойства
194 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
QTLs, контролирующих признак, факторы окружающей среды,
размер популяции и экспериментальные ошибки.
Генетические свойства QTLs, контролирующих признак, вклю-
чают величину эффекта индивидуальных QTLs. Только QTLs, ока-
зывающие достаточно большой фенотипический эффект, могут быть
обнаружены. QTLs с малым эффектом могут оказаться ниже порога
обнаружения. Другой генетический признак — расстояние между
QTLs на хромосоме. QTLs, которые тесно связаны между собой (т. е.
находятся на расстоянии примерно 20 сМ или меньше), чаще опре-
деляются как один QTL в популяциях обычного размера (< 500 ли-
ний).
Факторы окружающей среды могут оказывать значительное
влияние на экспрессию генов, контролирующих количественные
признаки. Эксперименты, проводимые, например, в разное время
года или в разные годы, могут позволить исследователю изучать
влияние факторов окружающей среды на QTLs. Поэтому «бессмерт-
ные» популяции — RIL или DH — идеально подходят для этих це-
лей. Большое значение в процессе обнаружения QTLs играет размер
популяции. Чем больше популяция, тем аккуратнее картирование,
позволяющее определять QTLs с малым эффектом.
Главными источниками экспериментальных ошибок являются
ошибки при генотипировании маркеров или фенотипическом изме-
рении признака. Ошибки генотипирования маркеров или недоста-
ток маркеров могут повлиять на порядок расположения маркеров и
расстояния между ними на карте сцепления. Трудность заключает-
ся в том, что полиморфные маркеры не всегда равномерно распреде-
лены вдоль хромосомы, но сгруппированы в одних местах и отсут-
ствуют в других. В дополнение к неравномерному распределению
маркеров, частота рекомбинаций неодинакова вдоль хромосом. Точ-
ность фенотипического измерения исследуемого признака имеет
наибольшее значение для аккуратного картирования QTLs. Надеж-
ное картирование QTLs может быть осуществлено только на основа-
нии надежных фенотипических данных. Повторные фенотипические
измерения могут улучшить аккуратность картирования, уменьшая
«фоновый шум».
В целом, точность картирования данного признака определяет-
ся тремя показателями: плотностью маркеров (т. е. числом марке-
ров на единицу длины хромосомы), размером популяции и точностью
оценки количественного проявления признака. Чем больше попу-
ляция, тем больше число рекомбинационных событий и, соответ-
ственно, точность картирования. Число маркеров следует соразме-
рять с размерами популяции или, скорее, числом рекомбинаций.
Увеличение числа маркеров до бесконечности не поможет при не-
Раздел 2.8. QTL-анализ
195
достаточном числе рекомбинационных событий. Однако карта дол-
жна содержать достаточное число маркеров, чтобы точно выявить
сайты рекомбинации. В случае арабидопсиса исследователи ис-
пользуют популяции RIL, включающие от 30 до 420 и в среднем
80-200 линий при среднем количестве маркеров 100-150.
В идеале, обнаруженные QTLs должны быть подтверждены неза-
висимым способом. Подобные исследования могут включать QTL-ана-
лиз на других независимых популяциях, полученных от тех же ро-
дительских генотипов или близко связанных генотипов, а также
использование популяций большего размера. Другой подход под-
твердить QTLs состоит в использовании особой популяции, называе-
мой близко изогенные линии (NILs, от англ. near isogenic lines).
NILs получают, скрещивая родителя-донора (т. е. родителя, который
обладает интересующим исследователя признаком) с рекуррентным
(повторно используемым) родителем. Гибрид F1 опять скрещивают
с рекуррентным родителем для получения первого поколения воз-
вратного скрещивания {англ. back cross, BC1). ВС1 затем повторно
скрещивают с рекуррентным родителем, и т. д. до получения, на-
пример, ВС7. Многократные возвратные скрещивания полученных
гибридов с рекуррентным родителем позволяют в значительной сте-
пени вытеснить геном родителя-донора интересующего признака.
Конечный ВС7 будет содержать весь геном рекуррентного родителя,
за исключением небольшого участка хромосомы от второго родите-
ля, включающего интересующий ген или QTL. Гомозиготные F2 ли-
нии могут быть получены путем самовоспроизведения ВС 7. Следует
отметить, что для получения NIL, содержащую искомый ген, расте-
ния с соответствующим признаком нужно отбирать в каждом цикле
обратного скрещивания. Генотипируя NILs с помощью якорных
маркеров и сравнивая средние значения признака у них с рекуррент-
ным родителем, можно подтвердить исходный QTL и картировать
его с большой точностью.
Высокоразрешающее картирование QTLs в сочетании с иденти-
фикацией генов-кандидатов, анализом экспрессии и поиском му-
тантов, фенотипы которых сходны с фенотипами QTLs, — вот те сред-
ства, которые сегодня используют для идентификации QTL. Пос-
кольку некоторые из этих методов наиболее подробно разработаны
на примере арабидопсиса и риса (первых растений, у которых были
секвенированы геномы) — наиболее впечатляющие успехи в клони-
ровании QTL достигнуты именно у этих видов. В целом, картирова-
ние QTLs является достаточно точным методом: соответствующие
гены-кандидаты были обнаружены на расстоянии, не превышаю-
щем 2 сМ от исходного положения QTL (позиции, для которой полу-
чено наивысшее значение LOD) на генетической карте (см. обзор [3]).
196 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Использование метода
в физиологических исследованиях
Чаще всего QTL-анализ используют для локализации и в конечном
счете идентификации генов, вовлеченных в контроль сложных фи-
зиологических признаков. Арабидопсис — длиннодневное растение,
цветение которого стимулирует световой день продолжительностью
более 12 ч. Этот признак, несомненно, носит количественный харак-
тер: в зависимости от экотипа растений и внешних условий, продол-
жительность периода от посева до цветения составляет от трех не-
дель до девяти месяцев. QTL-анализ обнаружил большое число ге-
нов, в большей или меньшей степени влияющих на время перехода
к цветению (см. обзор [3]). Некоторые из этих локусов уже были из-
вестны благодаря анализу мутаций, кроме того, с помощью QTL-ана-
лиза были обнаружены новые гены. Два таких гена, FRIGIDA (FRI)
и FLOWERING LOCUS С (FLC) клонированы и подробно исследова-
ны методами формальной и популяционной генетики.
Использование бессмертных картирующих популяций для
QTL-анализа имеет то преимущество, что в одной и той же популя-
ции можно исследовать неограниченное число признаков, выявляя
при этом совместную локализацию QTLs для, на первый взгляд, никак
не связанных признаков. Так, скорость роста растений, наглядный
пример полигенного признака, также изучали с помощью QTL-анали-
за, порой обнаруживая при этом совместную локализацию неожи-
данных признаков (см. обзор [5]). Хотя за подобной совместной ло-
кализацией QTLs может стоять один общий ген, причиной ее могут
быть и различные, но тесно сцепленные гены. Поэтому для того,
чтобы отличить плейотропный эффект единственного гена, влияю-
щего на разные признаки, от действия сцепленных генов, когда ря-
дом оказываются QTLs для нескольких различных признаков, необ-
ходимо высокоразрешающее картирование и клонирование QTLs.
Далее следует подтвердить или опровергнуть неожиданную совмест-
ную локализацию QTLs для разных по своей природе признаков.
Картирование QTL использовали для идентификации генов, от-
вечающих за метаболические пути. Очевидно, что в случае аллель-
ного разнообразия генов, кодирующих ферменты биосинтеза, ана-
лиз активности ферментов как количественного признака в сегре-
гированной популяции должен помочь выявить соответствующие
гены. В этом случае проявляются преимущества арабидопсиса как
модельного растения, у которого отсеквенирован геном и предполо-
жительно аннотированы многие гены. Примером может служить
фермент фосфоглюкомутаза (ФГМ), превращающая глюкозо-1-фос-
фат в глюкозо-6-фосфат [7]. Примечательно, что QTL-анализ обна-
руживает не только структурные и часто уже аннотированные гены:
Раздел 2.8. QTL-анализ
197
в том же исследовании были найдены локусы, которые существенно
влияли на активность ФГМ, хотя кодирующий ФГМ ген отсутство-
вал в исследуемом участке хромосомы. Эти данные позволяют пред-
полагать, что такой QTL отвечает за регуляцию активности фермен-
та. Природу подобных регуляторов (это могут быть факторы транс-
крипции, аллостерические регуляторы и т. п.) нельзя напрямую
выяснить в ходе QTL-анализа, для этого требуются дополнительные
исследования.
Другой пример QTL-анализа ферментной активности иллюстри-
рует рис. 2.8.2: это фермент сахарозосинтаза (Susy), участвующий в
расщеплении сахарозы на УДФ-глюкозу и фруктозу. Активность
Susy определяли гистохимически в проростках RIL популяции араби-
допсиса Landsberg erecta x Cape Verde Islands (Ler x Cvi). Описанный
метод позволяет полуколичественно оценить тканеспецифичную
активность фермента (см раздел 3.5), и эти данные можно использо-
вать для QTL-анализа [7, 8]. Оказалось, что на активность Susy вли-
яет несколько QTLs, причем некоторые из них контролируют актив-
ность Susy лишь в некоторых органах растения.
Так, например, QTL, расположенный на нижнем конце хромосо-
мы 1, контролирует экспрессию Susy в гипокотиле, корневой шейке
и нижней части корней, но не в верхней части корней. Другие QTL
контролируют экспрессию фермента только в одном или небольшом
числе органов, например, QTL, локализованный в верхней части
хромосомы 4, влиял на активность Susy только в одном участке кор-
ня (рис. 2.8.2). У арабидопсиса на основании гомологии последова-
тельностей аннотированы шесть генов Susy. Все эти гены располо-
жены на расстоянии, не превышающем интервал в 2 LOD от обнару-
женных QTLs, так что их можно считать вероятными кандидатами
на роль генов, определяющих изменчивость этого признака. Вместе
с тем, во многих QTLs ген Susy не был найден в пределах интервала в
2 LOD; из этого следует, что QTL определяется другим геном, кото-
рый еще предстоит идентифицировать в процессе высокоразрешаю-
щего картирования.
QTL-анализ также использовали для того, чтобы связать резуль-
тирующий фенотипический признак со стоящим за ним метаболи-
ческим путем и соответствующим ферментом. Sergeeva и др. [9] из-
мерили длину корней и гипокотилей проростков RIL популяции
Ler x Cvi и выявили по несколько QTLs для обоих признаков, а за-
тем определили в той же популяции растений активности раствори-
мой и связанной с клеточной стенкой инвертазы. Оказалось, что
QTL с максимальным действием на длину корня (в верхней части
хромосомы 1) также влиял на растворимую (вакуолярную) инверта-
зу, но не влиял на длину гипокотиля. Поскольку этот QTL содержит
198
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Рис. 2.8.2. Генетическая карта арабидопсиса, на которой показаны QTLs
для активности сахарозосинтазы (Susy), рассчитанной по результатам
гистохимического анализа различных органов проростков. Семидневные
проростки окрашивали на активность Susy методом [8]. Длина стрелок со-
ответствует интервалам в 2 LOD, а направление стрелок указывает дей-
ствие аллелей: вверх — увеличение активности под влиянием аллелей Ler
и вниз — увеличение активности под влиянием аллелей Cvi. Черными и
серыми стрелками показаны статистически значимые QTLs (соответ-
ственно при Ρ < 0,05 и Ρ < 0,10). Горизонтальными стрелками показано
приблизительное положение аннотированных генов Susy
аннотированный ген инвертазы, предположили, что этот ген явля-
ется очевидным геном-кандидатом, отвечающим за данный QTL.
Дальнейшее картирование и использование нокаут-мутантов по
гену вакуолярной инвертазы, расположенному в пределах найден-
ной QTL в верхней части хромосомы 1, подтвердили роль раствори-
мой инвертазы в удлинении корня.
Возможность обнаружить QTLs для множественных признаков
была успешно показана в исследовании, объединившем широкомас-
штабные работы по метаболомике с QTL-анализом: с помощью хро-
матографии высокого разрешения в сочетании с масс-спектрометри-
ей. Keurentjes и др. [10] определили содержание свыше 1000 метабо-
литов у всех линий одной из RIL популяций. Для более чем 75%
исследованных метаболитов обнаружен один или несколько локу-
сов, существенно влиявших на уровень метаболита. Это исследова-
ние показало, что корреляция между QTLs, контролирующими раз-
личные метаболиты, позволяет идентифицировать метаболические
пути и судить об их взаимосвязи. Такой подход все чаще использует-
ся для анализа экспрессии генов и синтеза соответствующих белков
в масштабах всего генома.
Раздел 2.8. QTL-анализ
199
Сходная молекулярная организация ряда процессов в растениях
делает очевидным, что многие из генов, охарактеризованных у ара-
бидопсиса, определяют генетическую изменчивость, используемую
селекционерами для создания новых сортов культурных растений.
Вместе с тем у систематически отдаленных растений за аналогич-
ные процессы могут отвечать совсем другие гены. Наиболее хорошо
известным примером является переход к цветению. Клонирование
QTL у риса выявило множество генов, которые ранее были иденти-
фицированы с помощью анализа мутантов как регуляторы перехода
к цветению у арабидопсиса [5]. Однако два важнейших гена, ответ-
ственные за природную изменчивость этого признака у арабидопси-
са, FRI и FLC, не были найдены у однодольных растений. Анализ
фенотипов и физиологии растений пшеницы предсказывал сущест-
вование гена, подобного FLC, но вместо него был найден совершенно
иной регуляторный ген.
Таким образом, картирование QTL — это высокоразрешающая
технология для идентификации генов, определяющих сложные по-
лигенные признаки. Генетические ресурсы, созданные благодаря ана-
лизу геномов арабидопсиса и риса, стали важным условием даль-
нейших генетических исследований этих видов, а также ускорили
работы с другими видами растений. QTL-анализ уже продемонстри-
ровал свои возможности при создании новых селекционно-ценных
маркеров, особенно в тех случаях, когда известны гены, которые яв-
ляются предметом селекции.
Литература
1. Koornneef Μ., Alonso-Blanco С, Vreugdenhil D. Naturally
Occurring Genetic Variation in Arabidopsis thaliana // Annu.
Rev. Plant Biol. 2004. V. 55. P. 141-172.
2. Collard В. С Y., Jahufer M. Z. Z., Brouwer J. В., Pang E. С. К. An
Introduction to Markers, Quantitative Trait Loci (QTL) Mapping
and Marker-assisted Selection for Crop Improvement: The Basic
Concepts // Euphytica. 2005. V. 142. P. 169-196.
3. Вреугденхил Д., Коорнэф М., Сергеева Л. И. Применение
QTL-анализа в физиологических исследованиях // Физиология
растений. 2007. Т. 54. С. 15-21.
4. Ежова Т. Α., Лебедева О. В., Огаркова О. Α., Пеннин Α. Α., Сол-
датова О. П., Шестаков С. В. Arabidopsis thaliana — модель-
ный объект генетики растений. Учебно-методическое пособие
по генетике растений. Москва: МАКС Пресс, 2003. 220 с.
5. Alonso-Blanco С, Aarts Μ. G. M., Bentsink L., Keurentjes J. J. В.,
Reymond M., Vreugdenhil D., Koornneef M. What Has Natural
200 ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА И ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Variation Taught Us about Plant Development, Physiology, and
Adaptation? // The Plant Cell. 2009. V. 21. P. 1877-1896.
6. Churchill G. Α., Doerge R.W. Empirical Threshold Values for
Quantitative Trait Mapping // Genetics. V. 138. P. 963-971.
7. Sergeeva L. I., Vonk J., Keurentjes J. J. В., van der Plas L. H. W.,
Koornneef M., Vreugdenhil D. Histochemical Analysis Reveals
Organ-Specific Quantitative Trait Loci for Enzyme Activities in
Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 237-245.
8. Sergeeva L. I., Vreugdenhil D. In situ Staining of Activities of
Enzymes Involved in Carbohydrate Metabolism in Plant Tissues //
Journal of Experimental Botany. 2002. V. 53. P. 361-370.
9. Sergeeva L.I., Keurentjes J.J.B., Bentsink L., Vonk J., van der
Plas L. H. W., Koornneef M., Vreugdenhil D. Vacuolar Invertase
Regulates Elongation of Arabidopsis thaliana Roots as Revealed by
QTL and Mutant Analysis // PNAS. 2006. V. 103. P. 2994-2999.
10. Keurentjes J. J. В., Fu J., de Vos С Η. R., Lommen Α., Hall R. D.,
Bino R. J., van der Plas L. H. W., Jansen R. C, Vreugdenhil D.,
Koornneef M. The Genetics of Plant Metabolism // Nature
Genetics. 2006. V. 38. P. 842-849.
Глава 3
МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ
И ГИСТОХИМИИ
3.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА
И. Е. Мошков, Н. С. Степанченко, Г. В. Новикова
Введение
У всех живых организмов белки — главнейшие работники, отвечаю-
щие за протекающие в клетках биохимические процессы, которые
могут меняться при изменениях условий окружающей среды, пато-
логических состояниях, а также как результат проявления мутаций
и многих других ситуациях. С ранних этапов развития биохимии и
по сей день, по мере того, как исследователи научились выделять
индивидуальные белки; определять их состав и структуру; выяс-
нять, когда и как они синтезируются в клетках; устанавливать, ка-
кие белки функционируют при различных условиях; сравнивать
одинаковые белки из разных организмов, а также белки организмов
дикого типа и мутантов и т. д., значение количественного определе-
ния содержания белка в изучаемом образце все возрастает.
Любой метод, используемый для определения белка в бескле-
точных экстрактах, показывает лишь общее содержание белка в об-
разце. Чтобы получить представления о составе белков и их свойствах
и функциях, необходимо фракционирование сложных белковых сме-
сей путем их хроматографического или электрофоретического раз-
деления с целью последующего анализа индивидуальных белков.
Понятно, что при всех перечисленных ситуациях необходимо опре-
делять содержание белка.
Едва ли не основным требованием, предъявляемым к методу
количественного определения белка, является возможность его
применения в присутствии разнообразных внутриклеточных компо-
нентов и нечувствительность к компонентам буферных смесей, ис-
пользованных для экстракции белков из клеток. Таким образом,
«золотой стандарт» — это метод, характеризующийся специфич-
202 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
ностью, чувствительностью, воспроизводимостью, быстротой и прос-
тотой проведения, а также отсутствием влияния небелковых компо-
нентов. Сразу оговоримся, что пока не существует какого-то одного
метода определения белка, который удовлетворял бы всем перечис-
ленным требованиям. У каждого метода есть свои преимущества и
недостатки.
В связи с этим наша основная цель состоит в том, чтобы помочь в
выборе наиболее приемлемого метода определения белка для кон-
кретного исследования. Очевидно, что знание точной концентрации
белка абсолютно необходимо для расчета, например, ферментатив-
ной активности. Ошибки в измерении концентрации белка приво-
дят к накоплению общих ошибок в этих расчетах. Более того, в на-
стоящее время все чаще исследователи используют коммерческие
наборы для определения содержания белков (киты), что вполне
оправдано, поскольку позволяет до определенной степени стандар-
тизировать процедуру. Но пользователи коммерческих китов, к со-
жалению, не всегда представляют себе лежащие в их основе хими-
ческие реакции, об этом также целесообразно рассказать.
В данном разделе будут рассмотрены наиболее часто и широко
используемые методы определения белка: метод Lowry с соавт. [1],
метод Bradford [2], ВСА (bicinchoninic acid, бицинхониновая кисло-
та) метод [3], а также УФ-спектрофотометрия, причем в их ориги-
нальных вариантах. Кроме того, включена информация о некото-
рых приемах, которые помогают преодолеть ограничения, вызванные
либо несовместимостью буферов с выбранным методом определения
белка, либо низким содержанием белка в исследуемом образце.
Выбор метода определения белка
Самые распространенные исследования, для которых требуется
предварительное определение содержания белка, — это изучение
свойств и функций белков, различные варианты хроматографичес-
кого и электрофоретического разделения белков (нативный и «го-
лубой нативный» электрофорез, электрофорез в денатурирующих
условиях, двумерный и диагональный электрофорез и др.). Подчерк-
нем, что для всех перечисленных выше анализов значение имеет не
только точность определения, но и возможность нормализовать не-
редко большое число образцов, различающихся как по составу бел-
ков, так и по составу буферов, для их корректного сравнения.
Один из наиболее ответственных моментов при определении
концентрации белка — выбор совместимого с анализируемым об-
разцом метода. Поскольку все описанные ниже методы основаны на
специфических свойствах белков, то и состав белкового образца, и
состав буфера являются главными критериями пригодности метода.
Раздел 3.1. Количественное определение содержания белка 203
Состав белкового образца является решающим при выборе ме-
тода. Если в пробе преобладают белки, обогащенные аминокислот-
ными остатками аргинина, то при определении по Bradford резуль-
таты будут завышены, тогда как при использовании метода Lowry
или ВСА они будут точнее. Напротив, пробы с цистеин-богатыми
белками будут давать завышенные результаты с ВСА, а применение
методов Lowry или Bradford даст значения ближе к истинным. В це-
лом, если необходимо определить содержание белка в сложных бел-
ковых смесях, то предпочтительнее методы Lowry и ВСА.
Состав буфера также очень важен. Метод Lowry высокочув-
ствителен к такому часто используемому компоненту буферной сме-
си как ЭДТА, которая мешает образованию хромофора. Метод ВСА
совместим с широким спектром детергентов, включая додецилсуль-
фат натрия (ДДС-Na), но не допускает восстановителей, например
дитиотреитола (ДТТ). Метод Bradford не подходит для высоких кон-
центраций детергентов, но вполне употребим для использования в
присутствии восстановителей, таких как ДТТ или 2-меркаптоэта-
нол. В табл. 3.1.1 приведены наиболее распространенные соедине-
ния и их предельно допустимые концентрации, которые могут ме-
шать определению белка тем или иным методом. Если подобрать
подходящий метод для конкретной буферной системы не удалось, то
необходимо избавиться от мешающих определению соединений, на-
пример, осаждением белка, после чего белок можно растворять в со-
ответствующем буфере.
Калибровочный график (кривая)
В отличие от бытующих представлений, опыт показывает, что ка-
либровочный график не обязательно должен быть линейным. Диа-
пазон концентраций белка для калибровки зависит от выбранного
метода. Например, метод Bradford довольно чувствительный, но ка-
либровочный график имеет линейный участок в весьма узком ин-
тервале концентраций белка. В идеале калибровочный график нуж-
но строить в каждом опыте, что позволяет добиться более точных ре-
зультатов. Особенно это касается методов Lowry и ВСА, развитие
окраски в которых не терминируется. В методе Bradford могут наб-
людаться значительные сдвиги калибровочных кривых, поэтому ре-
комендуется хотя бы периодически строить калибровочные графи-
ки. Практика показывает, что при использовании коммерческих
наборов и стандартизации процедуры (время, температура) воспро-
изводимость калибровочных графиков достаточно высока.
Как правило, для построения калибровочного графика служит
один стандартный белок, и очень важно выбрать его правильно.
204 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Если стандартный белок выбран неудачно, то это может привести к
значительным ошибкам (как в сторону завышения, так и заниже-
ния) в расчетах абсолютного содержания белка. Однако это не поме-
шает проводить сравнительные исследования содержания белков в
различных образцах. Наиболее распространенными стандартами
являются бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин, хотя
у них есть некоторые ограничения, что необходимо учитывать при
проведении исследований. Если для определения используется кит,
в составе которого имеется раствор стандартного белка (чаще всего,
БСА) с известной концентрацией, именно его и следует брать для по-
строения калибровочного графика.
Метод Lowry
Этот метод основан на двух различных реакциях. Первая реакция
состоит в образовании комплекса катионов меди с амидными связя-
ми, с последующим восстановлением меди в щелочных условиях.
Получаемый продукт называется биуретовым хромофором, кото-
рый необходимо стабилизировать добавлением тартрата [4]. Вторая
реакция — восстановление реагента Folin-Ciocalteu комплексом
восстановленной меди с амидными связями, а также аминокислот-
ными остатками тирозина и триптофана. Реагент Folin-Ciocalteu в
восстановленном виде синего цвета, поэтому детектируется спект-
рофотометрически в диапазоне длин волн 500-750 нм. Сама по себе
биуретова реакция не очень чувствительна. Использование реагента
Folin-Ciocalteu повышает чувствительность метода почти в 100 раз.
Метод относительно чувствительный, но требует больше времени,
чем другие, и чувствителен ко многим соединениям (табл. 3.1.1 в кон-
це раздела). Корректному определению мешают: детергенты, угле-
воды, глицерин, трицин, ЭДТА, трис, соли калия, сульфгидриль-
ные соединения, дисульфиды, фенолы, гуанин, ксантин, магний и
кальций. Многие из этих веществ используются в буферах для гомо-
генизации или подготовки белковых проб, что является одним из
основных ограничений данного метода. Помимо этого, метод мало
пригоден для измерения содержания гидрофобных белков или со-
держания белка в мембранных фракциях. Также метод Lowry чув-
ствителен к изменениям в содержании аминокислотных остатков
тирозина и триптофана. Линейность калибровочного графика с
БСА в качестве стандарта наблюдается по концентрации белка до
1500-2000 мкг/мл. Хотя спектр поглощения окрашенного продук-
та реакции приходится на 500-750 нм, обычно используют длину
волны 660 нм. Другие длины волн также могут использоваться, и
это позволяет уменьшить эффект от «загрязнения» пробы посторонни-
ми веществами. Например, в образцах, выделенных из растительных
Раздел 3.1. Количественное определение содержания белка 205
объектов, хлорофилл будет мешать измерению при 660 нм, но не
при 750 нм. Если при 660 нм значения оптической плотности оказа-
лись низкими, то измерение поглощения при 750 нм может повы-
сить чувствительность.
Метод Bradford
Это простой, быстрый, недорогой и чувствительный метод определе-
ния содержания белка, вследствие чего он является одним из наибо-
лее популярных. Его основное достоинство — чувствительность; ме-
тод позволяет надежно определять от 10 до 100 мкг/мл белка.
Метод основан на прямом связывании Кумасси G-250 с амино-
кислотными остатками аргинина, триптофана, тирозина, гистиди-
на и фенилаланина в белке, причем с аргинином он связывается в
восемь раз чаще, чем с другими аминокислотными остатками. Поэ-
тому, если известно, что белок обогащен остатками аргинина (на-
пример, гистон), то в качестве стандарта необходимо также исполь-
зовать аргинин-богатый белок. Комплекс Кумасси—аргинин имеет
максимум поглощения при 595 нм, тогда как сам краситель в раст-
воре — при 470 нм.
Спектры поглощения комплекса и чистого красителя перекры-
ваются, поэтому очень важно следить за соотношением объемов
красителя и белка, так как их неконтролируемое изменение будет
приводить к ошибкам измерения. Если по какой-то причине ме-
тод Bradford используется для определения белка в широком диапа-
зоне концентраций (до 1500 мкг/мл), то очевидно, что калибровоч-
ный график не будет линейным. Однако им можно пользоваться,
если «разбить» его на линейные отрезки с целью получения линей-
ного уравнения для каждого линейного участка. Далее полученные
уравнения можно будет применять при расчетах.
Другой, вероятно наиболее важный, аспект, возникающий при
использовании метода, — это возможное взаимодействие компонентов
буфера образца с красителем (табл. 3.1.1). Необходимо проверять
реакцию буферной смеси, в которой находится белок, на взаимодей-
ствие с красителем. В случае взаимодействия, необходимо удалить
взаимодействующие с красителем компоненты при помощи одного
из методов, описанных ниже.
Следует отметить, что для измерения лучше использовать стек-
лянные кюветы, так как на стенках кварцевых и, тем более, пласти-
ковых кювет адсорбируется значительное количество красителя.
Определение белка с ВСА реагентом
Этот метод основан на взаимодействии ионов Cu2+ с белками в ще-
лочных условиях, что приводит к переходу катионов Cu2+ в Cu1+,
206 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
которые детектируются с высокой чувствительностью бицинхони-
новой кислотой. При этом зеленый цвет реагента меняется на пур-
пурный, причем интенсивность окрашивания пропорциональна
концентрации белка в растворе. Долгое время считалось, что меха-
низм, лежащий в основе этого метода, похож на механизм метода
Lowry, но сейчас известно, что это две разные реакции с ионами
меди, уникальные для ВСА метода [5]. Первая реакция протекает
при низких температурах и является результатом взаимодействия
меди и ВСА с аминокислотными остатками цистеина, цистина,
триптофана и тирозина. При повышении температуры пептидная
связь также ответственна за развитие окраски. Таким образом, про-
ведение реакции при 37 °С, а не при комнатной температуре повы-
шает чувствительность и уменьшает колебания измерений в зависи-
мости от аминокислотного состава белков. Следует помнить, что по-
сле 37 °С оптическая плотность контрольной пробы увеличивается
примерно на 2% за каждые 10 мин, поэтому после охлаждения про-
бы до комнатной температуры следует сразу же приступать к изме-
рению. Чувствительность этого метода можно повысить, если инку-
бировать пробы при 60 °С.
Бицинхониновая кислота заменяет реагент Folin-Ciocalteu, ис-
пользуемый в методе Lowry. ВСА образует комплекс с Си+, который
имеет максимум поглощения при 562 нм. Преимущество этого реа-
гента в том, что он не взаимодействует со многими компонентами
буферных смесей, особенно с детергентами. Вещества, которые мо-
гут мешать определению, — это либо восстановители Cu2+ (напри-
мер, ДТТ), либо хелаторы (ЭДТА). Тем не менее, эти компоненты бу-
феров не являются критическими, поэтому от них довольно легко
можно избавиться.
Этот метод можно использовать для измерения белка в широком
диапазоне (до 2000 мкг/мл), причем линейность калибровочного гра-
фика наблюдается практически во всем диапазоне концентраций.
Достоинство метода состоит и в том, что он нечувствителен как к
ионным, так и неионным детергентам. В связи с этим метод может
успешно применяться для определения содержания мембранных и
гидрофобных белков.
УФ-метод
Измерение спектра поглощения в УФ-диапазоне — наиболее быст-
рый и простой метод определения белка, но и наименее точный.
Определение концентрации путем измерения УФ-поглощения, обыч-
но при 280 нм, зависит от присутствия ароматических аминокислот
в белках. Тирозин и триптофан поглощают при 280 нм, тогда как
максимум поглощения фенилаланина — при 260 нм. Метод чув-
Раздел 3.1. Количественное определение содержания белка 207
ствителен к значениям рН и ионной силы, которые определяют прост-
ранственную организацию белков и их комплексов.
Если белковый образец загрязнен и неизвестен коэффициент
молярной экстинкции белка, определение концентрации белка
УФ-методом приведет к неправильным результатам. Этот метод рас-
смотрен только потому, что он может быть использован для быстрой
оценки концентрации белка, предшествующей более точным изме-
рениям, описанным выше. Для расчета приблизительной концен-
трации используется следующее уравнение [6].
Концентрация белка, мг/мл = 1,55А280 — 0,76А260.
Этот метод хорошо подходит для сравнения различных раство-
ров одного белка. Если взять раствор чистого белка с известным ко-
эффициентом молярной экстинкции, то можно точно определить
концентрацию, измерив оптическую плотность при 280 нм. Для
многих индивидуальных белков коэффициенты экстинкции извест-
ны [7].
Но этот метод не подходит для измерений без предварительной
очистки смеси белков от УФ-поглощающих компонентов, напри-
мер, нуклеиновых кислот. Кроме того, различные белки отличают-
ся по аминокислотному составу и поэтому имеют разные молярные
коэффициенты поглощения, что следует учитывать при расчетах.
Кюветы из стекла и полистерола также поглощают УФ, поэтому
для этого метода используют кварцевые кюветы. Метакрилатные
пластиковые кюветы пропускают ~60% при УФ 280 нм, и их также
можно использовать. УФ-метод наименее чувствительный из всех,
представленных выше. Но и его чувствительность может быть повы-
шена при изменении длины волны от 210 до 225 нм [7]. Однако при
таких длинах волн повышается вероятность ошибки измерения,
так как в этом диапазоне поглощают практически все органические
вещества.
Подготовка белкового образца
Наиболее простой путь избавления от небелковых компонентов, ме-
шающих определению белка, — это осаждение белка. В этом случае
потребуется строить два калибровочных графика: первый — на
основании разведений стандарта, осажденного таким же образом,
что и опытная проба, а второй — используя те же разведения стан-
дарта, но без осаждения, чтобы определить, сколько белка было по-
теряно в ходе осаждения.
Осаждение ацетоном является самым простым и совместимым
с описанными выше методами определения белка. К раствору белка
208 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
добавляют холодный (-20 °С) 100% ацетон до конечной концентра-
ции 80% . После инкубации не менее 1 ч при -20 °С белок осаждают
центрифугированием (20 мин, 15 000 g, 4 °С). Как правило, этих
условий достаточно для осаждения белка, но если содержание белка
в исходном растворе низкое, то могут потребоваться более высокие
скорости центрифугирования. Затем следует осторожно отобрать
надосадочную жидкость. После этого необходимо высушить осадок
при комнатной температуре или при -20 °С. Очень важно не пересу-
шить осадок белка, в противном случае могут появиться сложности
с растворением осадка в буфере/растворе, совместимом с выбран-
ным методом определения белка. Хотя способ осаждения белка аце-
тоном прост, могут потребоваться большие объемы ацетона, вслед-
ствие чего нужно проводить несколько повторных центрифугирова-
ний, что удлиняет процедуру. В этом случае можно осаждать белок
трихлоруксусной кислотой (ТХУ).
При осаждении белка ТХУ нужно знать, кислота какой концен-
трации необходима для осаждения белков, присутствующих в ис-
следуемом образце. Другой очень важный момент, возникающий
при использовании ТХУ, — удаление избытка кислоты перед раст-
ворением белкового осадка. К белковой пробе добавляют ТХУ до
выбранной конечной концентрации, тщательно перемешивают и
инкубируют не менее 30 мин во льду. Затем белок осаждают центри-
фугированием, как описано выше. После удаления надосадочной
жидкости осадок белка промывают холодным (-20 °С) 80% ацето-
ном. Для удаления ТХУ потребуется, по крайней мере, 3-4 отмыв-
ки. Отмытый от ТХУ осадок белка высушивают при комнатной тем-
пературе или при -20 °С, не пересушивая. Затем растворяют осадок
в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения
белка.
Кроме ацетона и ТХУ, белок можно осадить смесью хлороформа
с метанолом, которые берут в разных соотношениях в зависимости
от природы белков, находящихся в исследуемом препарате. При
этом образуются две фазы, разделенные белком. После тщательного
удаления фаз осадок белка промывают метанолом, затем высушива-
ют и растворяют в выбранном буфере.
Чтобы снизить концентрацию веществ, мешающих использова-
нию выбранного метода определения белка, белковый препарат
можно разбавить, но этот прием подходит только для образцов с вы-
сокой концентрацией белка.
можно избавиться или существенно снизить концентра-
цию несовместимых веществ путем перевода белков в другой буфер
при помощи гель-фильтрации в мини-колонках, например PD-10
Раздел 3.1. Количественное определение содержания белка 209
или NAC-5 и NAC-10 («GE Health Care») в соответствии с прилагае-
мыми инструкциям. Гель-фильтрация приведет к разбавлению бел-
кового раствора, который можно концентрировать при помощи
специальных концентрирующих фильтров.
Сейчас для определения содержания белка используют коммер-
ческие наборы реактивов. Фирмы «Sigma», «Bio-Rad», «Pierce» и
многие другие продают киты, которые давно и успешно применяются.
Для тех читателей, которые хотят самостоятельно готовить реаген-
ты, используемые в описанных выше методах, в Приложении при-
ведем их «рецепты», а также соответствующие протоколы (микро-
формат) для каждого из рассмотренных выше методов определения
содержания белка.
Литература
1. Lowry О. Н., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein
Measurement with the Folin Phenol Reagent// J. Biol. Chem.
1951. V. 193. P. 265-275.
2. Bradford Μ. M. A Rapid and Sensitive Method for the
Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the
Principle of Protein-Dye Binding// Anal. Biochem. 1976. V. 72.
P. 248-254.
3. Smith P. K., Krohn R. I., Hermanson G. Т., Mallia A. K.,
Gartner F.H., Provenzano M. D., Fujimoto E. K., Goeke N. M.,
Olson B. J., Klenk D. C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic
Acid// Anal. Biochem. 1985. V. 150. P. 76-85.
4. Gornall A. G., Bardawill C. S., David Μ. Μ. Determination of
Serum Proteins by Means of the Biuret Method// J. Biol Chem.
1949. V. 177. P. 751-766.
5. Wiechelman K. J., Braun R. £>., Fitzpatrick J. D. Investigation of
the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups
Responsible for Color Formation// Anal. Biochem. 1988. V. 175.
P. 231-237.
6. Layne E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for
Measuring Proteins// Methods Enzymol 1957.V. 3. P. 447-455.
7. Fasman G. D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular
Biology. CRC Press, Boca Raton, Florida, 1989. 601 p.
8. Stoscheck С. М. Quantitation of Protein// Methods Enzymol.
1990. V. 182. P. 50-68.
210 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Таблица 3.1.1. Допустимые концентрации наиболее часто используемых
химических веществ, совместимые с различными методами определения
белка
Метод
Вещество
Lowry
Πредельн
ВСА
ая концентрация
Bradford
280 нм
УФ
205 нм
Кислоты и основания
HCI
NaOH
ТХУ
0,1 Μ
< 1,25%
0,1 Μ
0,1 Μ
< 1%
0,1 Μ > 1 Μ
> 1 Μ
10%
0,5 Μ
> 1 Μ
< 1%
Буферы
Ацетат
Сульфат
аммония
Борат
Цитрат
Глицин
HEPES
Фосфат
Трис
> 28 мМ
2,5 мМ
2,5 мМ
2,5 мкМ
250 мМ
250 мМ
0,2 Μ
20%
10 мМ
< 1 мм
1 Μ
100 мкМ
250 мМ
0,1 Μ
0,6 Μ 0,1 Μ
1 Μ > 50%
50 μ Μ 5%
0,1 Μ 1 Μ
100 мМ
2Μ 1 Μ
2 Μ 0,5 Μ
10 мМ
9%
> 100 мМ
< 10 мМ
5 мМ
< 20 мМ
50 мМ
40 мМ
Детергенты
CHAPS
ДДС-Na
Тритон Х-100
Твин 20
Октилгликозид
Дезоксихолат
1,25%
0,25%
0,10%
625 μκγ/мл
2%
2%
2%
2%
2%
10%
0,1% 0,1%
0,1% 0,02%
0,3%
10%
0,25% 0,3%
<0,1%
0,1%
< 0,01%
0,1%
0,1%
Восстановители
ДТТ
2-Меркапто-
этанол
50 мкМ
1,8 мкМ
< 1 мМ
< 1%
1 Μ 3 мМ
1 Μ 10 мМ
0,1 мМ
< 10 мМ
Разное
Нуклеиновые 0,2 мг 0,1мг 0,25 мг 1 мкг
кислоты
Раздел 3.1. Количественное определение содержания белка 211
Таблица 3.1.1. Допустимые концентрации наиболее часто используемых
химических веществ, совместимые с различными методами определения
белка (окончание)
Метод
Вещество
дмсо
ЭДТА
Глицерин
KCI
Lowry
> 6,2%
125 мкМ
25%
30 мМ
Предельн
ВСА
5%
10 мМ
10%
< 10 мМ
ая концентрация
Bradford
0,1 Μ
100%
1 Μ
280 нм
20%
30 мМ
40%
100мМ
УФ
205 нм
< 10%
0,2 мМ
5%
50 мМ
Приложение
Метод Lowry
Реактив Folin-Ciocalteu. 100 г вольфрамата натрия, 25 мг молибда-
та натрия, 700 мл воды, 50 мл 85%-й фосфорной кислоты и 100 мл
соляной кислоты кипятить 10 ч с обратным холодильником. Доба-
вить 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 3-4 капли бромной воды,
кипятить 15 мин. После охлаждения разбавить воду до 1 л, профиль-
тровать. Как видно, готовить реактив самим очень трудоемко. Де-
шевле и надежней купить готовый реактиву фирмы «Sigma» (кат. но-
мер F9252).
Реактив Lowry. 2% Na2C03 (раствор 1), 2% K-Na тартрат (или
2% Na цитрат) (раствор 2), 1% CuSO4 (раствор 3). Все эти растворы
можно хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед
определением приготовить рабочий раствор, для чего смешать 98 мл
раствора 1, 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3.
Протокол (время проведения 1,5-2 ч). К 100 мкл раствора бел-
ка в 0,5 Μ NaOH добавить 500 мкл свежеприготовленного реактива
Lowry, инкубировать 10 мин, затем добавить 100 мкл разбавленного
реактива Folin-Ciocalteu (разбавить исходный реактив дистиллиро-
ванной водой в соотношении 1:1), инкубировать 1 ч в темноте. Изме-
рить оптическую плотность полученного раствора при 750 нм.
Поскольку при этом методе определения реакция никак не оста-
навливается, то следует помнить, что каждые 10 мин оптическая
плотность будет увеличиваться. Поэтому необходимо контролиро-
вать время, прошедшее до спектрофотометрии.
Метод Bradford
Реагент: 0,5мг/мл Coomassie Blue Brilliant G-250, 25% метанол (эта-
нол) и 42,5% H3PO4. Реагент стабилен в темноте при 4 °С. Для приго-
212 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
товления рабочего раствора реагент разбавить в пять раз. Разбавлен-
ный рабочий раствор стабилен в течение недели в темноте при 4 °С.
Хотя приготовить рабочий раствор не составляет большого тру-
да, но его можно купить у фирмы «Sigma», кат. номер В6916.
Протокол. К 50 мкл раствора белка добавить 450 мкл рабочего
раствора, перемешать, инкубировать при комнатной температуре
5 мин, измерить оптическую плотность полученного раствора при
595 нм.
Определение белка с ВСА реагентом
Реагент А: 1% Na бицинхонинат (ВСА), 2% Na2CO3, 0,95%
NaHCO3, 0,16% Матартрат, 0,4% NaOH, pH 11,25.
Реагент В: 4% CuSO4.
Для приготовления рабочего раствора смешать 50 мл реагента А
и 1 мл реагента В.
Протокол (время проведения 35-45 мин при инкубации 37 °С).
К 25 мкл раствора белка добавить 500 мкл рабочего раствора и инку-
бировать 30 мин при 37 °С (или 2 ч при комнатной температуре).
Охладить до комнатной температуры и измерить оптическую плот-
ность полученного раствора при 562 нм.
3.2. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ
ПРИ ПОМОЩИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА НАТРИЯ
И ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Г. В. Новикова, И. С. Степанченко, И. Е. Мошков
Введение
Современная физиология растений, задачи которой связаны с разде-
лением макромолекул, не могла остаться невооруженной таким вы-
сокоразрешающим и высокочувствительным методом, каким явля-
ется электрофоретическое разделение белков. Сейчас этот метод за-
нимает одно из центральных мест среди методов анализа, в том числе
белков. Он настолько популярен, что используется практически в
каждой статье, публикуемой в научной литературе, на той или иной
стадии фракционирования или характеристики белков. При помо-
щи электрофореза можно разделять белки, различающиеся по та-
ким важнейшим параметрам как размеры (молекулярная масса),
пространственная конфигурация, вторичная структура и электри-
ческий заряд. Причем эти параметры могут «работать» как отдель-
но, так и в совокупности.
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 213
Принцип метода
Физический принцип метода заключается в том, что находящиеся в
буферном растворе молекулы белков обладают некоторым суммар-
ным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от
рН среды. Если через этот раствор пропускать электрический ток,
то формируется электрическое поле. Под его действием белки миг-
рируют в направлении анода или катода в соответствии с их суммар-
ным зарядом, а возникающее при движении трение ограничивает
скорость миграции; причем в зависимости от размера, конфигура-
ции, жесткости и заряда белковых молекул, они приобретают раз-
ные скорости. В ходе электрофореза препарат, состоящий из раз-
личных белков, разделяется на зоны одинаковых молекул, переме-
щающихся с одинаковой скоростью.
Для электрофоретического разделения белков в настоящее время
почти исключительно применяются полиакриламидные гели (ПААГ),
причем, изменяя концентрацию полимера, можно получать гели с
широким диапазоном размеров пор. Можно менять и электричес-
кий заряд белков, варьируя рН буферов, а также влиять на конфигу-
рацию белка при помощи введения в буфер денатурирующих аген-
тов или детергентов. Очевидно, что все это позволяет использовать
электрофорез для анализа практически всего разнообразия белков.
В настоящее время существуют несколько вариантов электрофо-
реза в ПААГ, при помощи которых можно получить различную ин-
формацию о белках. Электрофорез в отсутствие денатурирующих
агентов или детергентов называют нативным. При этом варианте
белки разделяются в соответствии с отношением масса/заряд. Элек-
трофорез в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия
(ДДС-Na) называется электрофорезом в денатурирующих условиях
или ДДС-Na-ПААГ электрофорез. При этом варианте электрофоре-
за подвижность каждого белка зависит только от одного парамет-
ра — его молекулярной массы (см. ниже). Наиболее информатив-
ным можно считать двумерный электрофорез (2D электрофорез),
когда в первом направлении используется изоэлектрическое фоку-
сирование (ИЭФ), а во втором — диск-электрофорез в присутствии
ДДС-Na.
Далее мы подробно рассмотрим два варианта электрофоретичес-
кого разделения белков, а именно: ДДС-Na-ПААГ электрофорез и
2D электрофорез. Оба названные варианта электрофоретического
разделения белков широко применяются в настоящее время для ре-
шения многих традиционных физиологических задач, а также для
протеомного анализа, который становится важнейшим элементом
современной физиологии растений.
214 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Одномерный (1D) электрофорез в присутствии ДДС-Na
(ДДС-Na-ПААГ электрофорез)
Этот вариант электрофореза, разработанный в 1970 г. U. К. Laemmli
[1], — модификация диск-электрофореза (disc-electrophoresis,
discontinuous, прерывистый) L. Ornstein [2] и B.J. Davis [3]. И в
наши дни ДДС-Na-ПААГ электрофорез не потерял своей популяр-
ности и используется чрезвычайно широко. При этом варианте
электрофореза разделение белков по их электрофоретической под-
вижности сочетается с использованием эффекта концентрирования
и эффекта молекулярного сита. Этот метод особенно ценен тем, что
позволяет разделять любые полиэлектролиты с молекулярной мас-
сой от 10 000 Да и менее до 1 000 000 Да и более.
В отличие от электрофореза, где применяется однородная бу-
ферная система с постоянным значением рН, при диск-электрофоре-
зе используются пары буферов различного состава и с разными зна-
чениями рН, а носитель в простейшем варианте состоит из двух сло-
ев ПААГ, отличающихся друг от друга по размерам пор. Верхняя
зона, которую называют концентрирующим гелем, обычно занима-
ет 1-3 см, в ней концентрирования белков не происходит. Назначе-
ние концентрирующего геля — создать условия, необходимые для
концентрирования образца на границе с разделяющим гелем. Для
разделяющего геля — это исходная зона фракционирования.
Основа создания гелей для разделения белков по размеру — ак-
риламид. Акриламид, смешанный с метиленбисакриламидом, при
добавлении инициатора реакции полимеризации персульфата ам-
мония (ПСА) образует полимерную сетку с поперечными сшивками.
Катализирует реакцию полимеризации ТЕМЕД (Ν, Ν, Ν, N-тетра-
метилендиамин).
Размеры пор в геле обратно пропорциональны количеству акри-
ламида. Гели с низким процентом акриламида используются для
разделения крупных белков и их комплексов, а гели с высоким про-
центом акриламида — для разделения небольших белков. Применя-
ют также и градиентные гели, которые приготавливают так, чтобы в
верхней части разделяющего геля (начало пути образца) был низ-
кий процент акриламида, тогда как высокий процент — в нижней
(конец пути образца). Такие гели позволяют разделять белки в ши-
роком диапазоне молекулярных масс, что увеличивает разрешающую
способность метода. Полимеризация разделяющих градиентных ге-
лей должна происходить сверху вниз, что достигается подбором со-
отношения ПСА и ТЕМЕД.
Чтобы выбрать концентрацию мономеров для приготовления
ПААГ, при помощи которого можно наилучшим образом провести
разделение белков, необходимо знать величину Τ — процентное от-
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 215
ношение суммарной массы обоих мономеров к объему их раствора, и
величину С — процентное отношение массы метиленбисакриламида
к общей массе обоих мономеров.
Величина Τ обычно варьирует в пределах 3-30% , а С составляет
1-5% . Выбор значений С и Τ определяется диапазоном фракциони-
рования белков и ограничивается механическими и адсорбционны-
ми свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увели-
чивать степень сшивки (повышать С до 3—5%), для мелкопористых
гелей величина С не должна превышать 1-2% .
Поскольку в концентрирующем геле белки не разделяются, его
концентрацию делают минимальной (обычно Τ = 4%). Этот гель по-
лимеризуют в таком же по составу буфере, что и разделяющий гель,
но по концентрации и значению рН эти буферы не одинаковы. Бу-
фер концентрирующего геля, как правило, почти нейтральный, бу-
фер разделяющего геля — щелочной или кислый: в щелочной бу-
ферной системе удобно фракционировать кислые белки, тогда как в
кислой — щелочные.
В качестве разделяющего геля при ДДС-Na-ПААГ электрофо-
резе по Laemmli чаще всего используют 10-12,5%-й ПААГ, кон-
центрирующего — 3-5%-й; для обоих гелей С = 2,67%. Буфером
разделяющего геля служит 0,375 Μ Трис-HCl (рН 8,8) с добавлением
ДДС-Na до 0,1%. Для концентрирующего геля используется 0,125 Μ
Трис-HCl (рН 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Для полимеризации в оба геля
вносят 0,025% ПСА и ТЕМЕД (0,0625%). Концентрации ПСА и
ТЕМЕД должны быть подобраны так, чтобы при комнатной темпе-
ратуре время полимеризации геля составляло 30-40 мин.
Для приготовления гелей смесь мономеров заливают в простран-
ство между двумя стеклянными или пластиковыми пластинами так
называемой «кассеты». Кассеты располагают вертикально на вы-
ровненной (по уровню) горизонтальной поверхности. Понятно, что
дно кассеты необходимо герметизировать, чтобы избежать вытека-
ния акриламида во время приготовления гелей. В широко использу-
емом в настоящее время оборудовании для электрофореза фирмы
«Bio-Rad», а также в оборудовании других фирм для герметизации
служат резиновые прокладки. Расстояние между пластинами (тол-
щина геля) задается при помощи прокладок (спейсеров), которые
располагают вдоль боковых краев пластин. Спейсеры могут быть вы-
полнены из стекла («Bio-Rad»), а также из тефлона («GE Healthcare»).
В аналитических целях используют гели (и соответственно спейсе-
ры) толщиной 0,5, 0,75 и 1 мм. На каждой пластине геля ведут элек-
трофорез нескольких препаратов, так как в этом случае их состав
можно сопоставлять, поскольку они разделялись в идентичных
условиях при фракционировании в параллельных «треках». Во вре-
216 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
мя полимеризации на верхнем крае концентрирующего геля форми-
руют карманы для внесения образцов. Для этого в еще не заполиме-
ризовавшийся гель вставляют «гребенку» из тефлона или плексигла-
са, прямоугольные зубцы которой формируют карманы.
Белковый препарат вносят в 0,0625 Μ Трис-HCl (рН 6,8), содер-
жащий 10% глицерина и 0,001% бромфенолового синего. В препа-
рат добавляют ДДС-Na до 2% и 2-меркоптоэтанол до 5% (или ДТТ
до 100 мМ), затем препарат кипятят в течение 3-5 мин на водяной
бане. Если исходный белковый препарат имеется в виде осадка, то
его следует сначала растворить в буфере, а потом добавлять ДДС-Na
из концентрированного раствора. Если этот шаг опущен, то ком-
плекс белка с ДДС-Na не удастся растворить полностью. Отмечено,
что некоторые, особенно высокомолекулярные белки, после перво-
начального их восстановления обработкой хаотропными агентами
(2-мераптоэтанолом или ДТТ) в ходе электрофореза могут окислять-
ся, что приводит к размытости полос и невоспроизводимости ре-
зультатов разделения. Чтобы избежать этого негативного эффекта,
можно провести алкилирование SH-групп белка при помощи обра-
ботки йодацетамидом, от избытка которого нет необходимости из-
бавляться перед нанесением препарата белка на гель. Образец вно-
сят в карман геля после окончательной сборки прибора для электро-
фореза, как правило, подслаивая его под электродный буфер.
Решая вопрос о загрузке геля, необходимо помнить, что чем
меньше загрузка, тем лучше разделение близких по молекулярной
массе белков. Как ориентировочный максимум можно применять
нагрузку порядка 1 мг суммарного препарата белка на 1 кв. см сече-
ния геля. Вносить препарат в карман желательно в минимальном
объеме, чтобы высота слоя препарата составляла не более половины
высоты кармана. Понятно, что иногда следовать этой рекомендации
трудно ввиду недостаточной концентрации белка в исходном препа-
рате.
Рабочее напряжение, сила тока и продолжительность разделе-
ния, как правило, подбираются экспериментально, но так, чтобы
достичь наилучшего разделения. В качестве электродного буфера в
ДДС-Na-ПААГ электрофорезе по Laemmli используют 0,025 Μ Трис,
титрованный глицином до рН 8,3, чему соответствует концентрация
глицина 0,192 М, а также 0,1% ДДС-Na. Вкладом последнего в
электропроводность рабочего буфера можно пренебречь. Для сокра-
щения времени разделения и уменьшения диффузии зон электрофо-
рез желательно вести при максимально возможном напряжении.
Однако при увеличении напряжения возрастает сила тока и выделя-
ется тепло, что ведет к неравномерному нагреванию геля и, как ре-
зультат, к ухудшению качества разделения. Хотя при снижении
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 217
температуры диффузия уменьшается, но падает и электрофорети-
ческая подвижность белков, а, следовательно, увеличивается про-
должительность электрофореза. Кроме того, если вести электрофо-
рез на холоду, то ДДС-Na может выпадать в осадок, поскольку его
растворимость сильно зависит от температуры. Опыт показывает,
что разумной продолжительности электрофореза соответствует на-
пряженность поля 10-12 В/см.
Мы уже говорили о том, что при ДДС-Na-ПААГ электрофорезе
белки разделяются исключительно по их молекулярной массе, точ-
нее, по их кажущейся массе. Действительно, принимается, что пос-
ле обработки ДДС-Na белки оказываются полностью денатуриро-
ванными; количество молекул ДДС-Na, связанных с полипептидом,
пропорционально молекулярной массе полипептида; наконец, соб-
ственный заряд полипептида, «покрытого» ДДС-Na, несущественен
в сравнении с зарядом связанного с полипептидом ДДС-Na. Отсюда
очевидно, что в рассматриваемом варианте электрофореза все поли-
пептиды имеют одинаковый удельный заряд. Электрофоретическая
подвижность полипептида в комплексе с ДДС-Na описывается про-
стейшей зависимостью, а именно: она прямо пропорциональна лога-
рифму молекулярной массы полипептида. Величину электрофоре-
тической подвижности (Rf) представляют в относительных едини-
цах, выражающих отношение пути, пройденного полипептидом, и
лидирующим красителем бромфеноловым синим, за время проведе-
ния электрофореза. Напомним, что значение Rf зависит от порис-
тости геля, температуры и времени.
Чтобы определить молекулярную массу каждого полипептида,
разделенного при помощи ДДС-Na-ПААГ электрофореза, использу-
ют наборы белков с известными молекулярными массами (маркеры
или стандарты). Они имеются в продаже в нескольких форматах:
неокрашенные, окрашенные, низко- и высокомолекулярные. По
окончании электрофореза, измерив пути миграции лидирующего
красителя и каждого из маркеров, можно рассчитать значение Rf и,
зная молекулярные массы маркеров, построить график зависимос-
ти логарифма молекулярной массы (lg Μ) от Rf для данного опыта.
Если пористость геля выбрана удачно, то такая зависимость будет
линейной. Определив Rf экспериментально полученного полипеп-
тида, из графика можно найти для него величину lg M и вычислить
молекулярную массу. График зависимости lg Μ и Rf необходимо
строить в каждом опыте, поскольку наклон кривой зависит от усло-
вий эксперимента.
С методом диск-электрофореза по Laemmli совместимы гели с
градиентом пористости разделяющего геля, что еще больше повы-
шает разрешающую способность метода. Однако следует помнить,
218 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
что объем мини (8x10 см) разделяющих гелей, которые сейчас наи-
более популярны, слишком мал для формирования градиента. Но
если есть необходимость, можно приготовить гели с линейным гради-
ентом концентрации ПААГ. Заметим, что использование градиент-
ных гелей при ДДС-Na-ПААГ электрофорезе имеет ряд преимуществ:
самоограничение миграции белков в геле, а также непрерывное суже-
ние зон разделяемых белков. Действительно, при движении в элек-
трическом поле белки попадают в области с более мелкими порами,
трение усиливается, движение зон замедляется, а в какой-то момент
миграция может практически прекратиться. К моменту окончания
фракционирования все белковые зоны займут свои положения и
останутся в них до тех пор, пока будет подаваться электрическое на-
пряжение. Сужение белковых зон происходит из-за того, что впере-
ди идущие белки тормозятся гелем сильнее, а идущие сзади их пос-
тоянно догоняют, вследствие чего существенно снижается диффузия
белков из зоны. В целом, картина разделения белков при электро-
форезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соотноше-
ния размеров белков в препарате и характера градиента пористости,
который подбирают экспериментально. Выбор буфера и электричес-
кого режима играют второстепенную роль. Но следует отметить, что
для приготовления градиентных гелей необходимо обзавестись до-
полнительным оборудованием, а именно: смесителем градиента и
перистальтическим насосом, — а также приобрести опыт использо-
вания этого оборудования. Для получения пластины с градиентом
пористости геля смесь подают на дно кассеты, причем в смесителе
градиентного устройства должна находиться смесь мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре — более концентрированная
смесь.
Следует коротко сказать об источниках ошибок при неудовлет-
ворительном разделении. Хорошее разделение удается достичь только
в гелях, приготовленных из высокоочищенных исходных соедине-
ний. Однако помимо этого причиной неудовлетворительных ре-
зультатов могут служить следующие факторы: «старение» раство-
ров, применяемых для приготовления гелей; неподходящие разме-
ры пор (концентрация геля); неудачно выбранная буферная система
(тип ионов, область рН, ионная сила); слишком короткий путь раз-
деления (разделяющий гель); недостаточное концентрирование ве-
щества перед разделением (слишком короткий концентрирующий
гель); неравномерная полимеризация геля (пузырьки воздуха в
геле); влияние взаимодействия белков при их слишком высокой
концентрации; выпадение в осадок исследуемых веществ (прежде
всего на границе концентрирующего и разделяющего гелей) и их по-
степенное растворение, приводящее к образованию хвостов; недос-
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 219
таточно плотное прилегание геля к стеклянным пластинкам, вслед-
ствие чего раствор вещества проникает в эту щель; диффузия и не-
эффективное отведение тепла; артефакты, вызываемые действием
ПСА. Подчеркнем, что необходимо тщательно готовить образцы для
ДДС-Na-ПААГ электрофореза. Если препараты белка содержат гуа-
нидингидрохлорид, детергенты, соли в высоких концентрациях,
которые отрицательно влияют на миграцию белковых полос в геле и
могут привести к размытости или волнистости белковых полос, то
необходимо освободить образец от этих веществ при помощи диали-
за, ультрафильтрации или осадить белок одним из способов, описан-
ных в предыдущем разделе. Можно использовать также специаль-
ные киты для очистки белковых препаратов, например, фирма
«Pierce» предлагает Thermo Scientific Pierce SDS-PAGE Sample Prep
Kit (кат. номер 89888).
Двумерный электрофорез (2D электрофорез) белков
Далее рассмотрим применение двумерного электрофореза белков в
формате, предложенном Р.Н. O'Farrell в 1975 г. [4]. Это уточнение,
на наш взгляд, сделать необходимо, поскольку нельзя смешивать
2D электрофорез по O'Farrell с двумерным электрофорезом белков,
при котором в обоих направлениях происходит их электрофорети-
ческое разделение. Следует помнить, что при одномерном разделе-
нии белков в выбранной системе электрофореза различные белки
могут мигрировать в одной зоне из-за близости их размеров, совпа-
дения электрофоретических подвижностей при выбранном значе-
нии рН, либо в результате неблагоприятной для разделения комби-
нации названных параметров. Поэтому каждую полосу после перво-
го раунда электрофоретического фракционирования смеси белков
следует проверить на гомогенность в других условиях. Это можно
сделать одновременно для всех полос первого разделения (первого
направления). Для этого вырезанную из геля первого направления
полоску располагают на поверхности концентрирующего геля вто-
рого направления. Для электрофореза, который ведут в направле-
нии перпендикулярном длине полоски, используют другую буферную
систему. После окрашивания геля второго направления выявляют-
ся пятна, расположенные по всей поверхности геля. В настоящее
время один из вариантов этого метода фракционирования белков
широко распространен под названием «голубой нативный электро-
форез» (blue native electrophoresis).
Принципиальное отличие 2D электрофореза по O'Farrell состоит
в том, что в первом направлении проводят изоэлектрическое фоку-
сирование (ИЭФ) белков, а во втором — ДДС-Na-ПААГ электрофо-
220 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
рез по Laemmli. Подчеркнем, что ИЭФ — один из наиболее эффек-
тивных методов фракционирования и очистки белков, который в
аналитических целях используется на завершающих стадиях выде-
ления и очистки белков, а в препаративном варианте — для обработ-
ки фракций белков, полученных в результате гомогенизации расти-
тельного материала.
Важнейшее различие между электрофорезом и ИЭФ состоит в
том, что при ИЭФ параметром фракционирования служит только
значение изоэлектрической точки (рI) белка. Когда белок попадает
в гель с градиентом рН, к которому приложено электрическое поле,
то белок начинает двигаться к электроду с зарядом, противополож-
ным его собственному: положительно заряженные белки перемеща-
ются к катоду, а отрицательно заряженные — к аноду. Во время
миграции белки либо приобретают, либо теряют протоны, в резуль-
тате чего их заряд и подвижность снижаются. Заряд белка становится
нулевым при достижении точки на градиенте рН, равной рI белка.
Как создается градиент рН? Он создается самим электрическим
полем в растворе, который содержит смесь синтетических амфо-
терных молекул (амфолитов) небольшой молекулярной массы,
отличающихся друг от друга по значению рI. Все коммерчески
доступные смеси таких веществ имеют фирменные названия: фирма
«Bio-Rad» продает биолиты, фирмы «Sigma» и «GE Healthcare» —
фармалиты. Особенность амфолитов состоит в том, что при раство-
рении в воде каждое вещество стремится изменить рН раствора так,
чтобы приблизиться к своему значению рI. Для того чтобы ИЭФ
происходило, амфолиты не только должны задавать каждой точке
градиента определенное значение рН, но и обеспечивать в этой точке
буферную емкость, достаточную для того, чтобы это значение не за-
висело от присутствия белка в растворе. Для проведения ИЭФ в
геле, как правило, крупнопористом, акриламид полимеризуют в
1-2% (не ниже) растворе амфолитов. В электрическом поле амфоли-
ты выстраиваются в порядке возрастания значений их рI. Подчерк-
нем, что чем более пологий градиент, то есть чем меньше интервал
изменений рН, тем дальше будут отстоять друг от друга полосы бел-
ков, незначительно отличающихся по величине рI, тем лучшее раз-
решение будет достигнуто. Амфолиты, обеспечивающие широкий
интервал рН, удобны для изучения сложных смесей белков с неиз-
вестными значениями рI, а амфолиты с узким интервалом — для
фракционирования белков с близкими или заранее известными зна-
чениями рI.
Смеси мономеров акриламида для ИЭФ готовят так же, как для
ДДС-Na электрофореза. Но не следует вносить избыток ПСА, кото-
рый может окислять амфолиты, что «искривляет» градиент рН.
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 221
Особые требования предъявляются к чистоте акриламида: он не
должен содержать акриловую кислоту, освободиться от которой
можно путем перекристаллизации или при помощи подходящей
ионообменной смолы.
Поскольку вблизи изоэлектрической точки растворимость бел-
ков снижается, что может вызвать их осаждение, ИЭФ-гели полиме-
ризуют в присутствии высокой концентрации мочевины. Кроме
того, для надежного растворения белков необходимо присутствие в
гелях неионных детергентов, таких как Тритон Х-100 и Nonidet
Р-40 (NP-40). Перед тем как приступить к полимеризации ИЭФ-ге-
лей, то есть до добавления ПСА и ТЕМЕД, надо деаэрировать раст-
вор. Это один из важнейших моментов, так как оставшиеся в геле
пузырьки воздуха не позволят ИЭФ начаться. Это особенно важно,
когда ИЭФ проводят в стеклянных трубках, поскольку раствор мо-
номеров акриламида с амфолитами, детегрентами и мочевиной до-
вольно вязкий, а диаметр трубок, как правило, мал. Например, при
ИЭФ с использованием Mini-Protean 2-D Electrophoresis Cell фирмы
«Bio-Rad», 7,5-см стеклянные трубки имеют внутренний диаметр
1 мм.
Для приготовления всех растворов для ИЭФ необходима бидис-
тиллированная или μΩ вода. Гели для проведения ИЭФ в трубках
готовят из акриламида с Τ = 30% и С = 5,4% . Следует помнить, что
после полного растворения мономеров необходимо профильтровать
полученный раствор и хранить при 4 °С в темноте. Буфер образцов
для ИЭФ в трубках включает 7,5 Μ мочевину, 2 Μ тиомочевину, 1%
Тритон Х-100, 4% CHAPS, 20 мМ ДТТ, 0,2% амфолиты с рН 3-10.
Так как белки при ИЭФ надо оберегать от контакта с католитом
(20 мМ NaOH), то на поверхность внесенного в трубку образца на-
слаивают разведенный в два раза буфер (overlay buffer), по составу
аналогичный используемому для приготовления образцов, но в этот
буфер вносят также 0,1% бромфенолового синего.
Изоэлектрическое фокусирование в трубках проводят в 4%
ПААГ (С = 5,4%), содержащем 9,2 Μ мочевину, 2% Nonidet NP-40,
0,5% амфолиты с рН 3-10, 2% амфолиты с рН 5-7, 0,05% ТЕМЕД и
0,05% ПСА. Опыт показывает, что предфокусирование в трубках
целесообразно проводить 10 мин при 200 В, 15 мин при 300 В и
15 мин при 400 В. А для ИЭФ в трубках мы используем следующие
условия: 15 мин при 500 В, затем 4 час при 750 В.
В последнее время необходимость самостоятельно «строить»
градиент рН отпала, поскольку появилась возможность покупать
уже готовые полоски геля (IPG strips, стрипы) с иммобилизованными
амфолитами (иммобилинами). Фирмы «Bio-Rad» и «GE Healthcare»
под названиями ReadyStrip IPG Strip и Immobiline Dry Strip, соответ-
222 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
ственно, предлагают уже готовые стрипы с градиентом рН. Принци-
пиальное отличие иммобилиновых стрипов от гелей с амфолитами
состоит в том, что градиент рН на стрипах формируется уже при их
производстве. Стрипы имеют разную длину, а диапазоны рН на-
столько разнообразны, что могут удовлетворить самого взыскатель-
ного экспериментатора. Для того чтобы безошибочно выбрать стри-
пы с градиентом рН, подходящим для решения конкретной задачи,
необходимо сначала провести ИЭФ в стеклянных трубках, посколь-
ку в них можно построить практически любой градиент рН, смеши-
вая амфолиты с различными значениями рН в разных соотношени-
ях. Но в любом случае начинать работу необходимо с использования
амфолитов с самым широким диапазоном значений рН, а именно: от
3,0 до 10,0. Подчеркнем, что отличительной особенностью ИЭФ по
O'Farrell является то, что при этом способе ИЭФ белков используют-
ся гели, которые полимеризуют в растворе амфолитов с суммарной
концентрацией 2% (масса/объем), но 1,6% составляли амфолиты
диапазона рН 5-7 и 0,4% — рН 3-10. Использование цилиндричес-
ких гелей с такой смесью амфолитов привело к существенному
улучшению качества фракционирования белков.
Если ИЭФ проводят в стрипах, то белок растворяют в буфере, со-
держащем б Μ мочевину, 1,5 Μ тиомочевину, 3% CHAPS, 66 мМ
ДТТ, 0,5% амфолиты с рН 3-10. Условия проведения ИЭФ в стри-
пах подбирают экспериментально, ориентируясь на рекомендации
производителей. При использовании 7-см стрипов ИЭФ, как прави-
ло, ведут до 10-12 кВчас.
Одно из главных условий успешного ИЭФ — «качество» препа-
ратов белков, предназначенных для 2D электрофореза. Так, в препа-
ратах белков недопустимо присутствие нерастворенных частиц бел-
ка, а также сильно полярных молекул, искажающих картину ИЭФ.
Обычная загрузка белка при аналитическом варианте ИЭФ, напри-
мер в трубках длиной до 10 см и с внутренним диаметром 1 мм, не
должна превышать 50 мкг белка. Другое дело IPG стрипы: если пос-
ле второго направления планируется окрашивание гелей коллоид-
ным Кумасси ярко голубым (СВВ) G-250, то на стрипы длиной 7 см
можно нагрузить 50-100 мкг белка, а на 18-см — 200-400 мкг белка.
Способы внесения белкового образца при ИЭФ в трубках и на
стрипах существенно различаются. При использовании цилиндри-
ческих гелей препарат в мкл-объеме наслаивают на торец геля в не-
посредственной близости с электродными электролитами, тогда как
стрипы регидрируют в белковом препарате, поскольку их продают в
высушенном виде.
В качестве католита при ИЭФ по O'Farrell в трубках используют
20 мМ NaOH, анолита — 10 мМ H3РO4. Оба раствора перед проведе-
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 223
нием ИЭФ тщательно деаэрируют, их хранение возможно только в
вакууме. При этом варианте ИЭФ вверху располагается катод, а
анод — внизу. Выбор знака верхнего электрода связан с тем, что бел-
ковый образец вносят на цилиндрический гель сверху. Перед тем
как начать ИЭФ, проводят предфокусировку, которая необходима
для очистки геля от радикалов, а также для того, чтобы амфоли-
ты, находящиеся в геле, «выстроились» в соответствии с значения-
ми их рI.
Как и при электрофорезе, для ИЭФ фракционирования белков
оправдано использование максимально допустимых напряженнос-
тей электрического поля. Ее ограничивает лишь возможность эф-
фективного отведения выделяемого в ходе ИЭФ тепла. Плотность
тока в ходе ИЭФ изменяется намного сильнее, чем при электрофоре-
зе. Отсюда очевидно, что необходимо тщательно подбирать условия,
которые обеспечат наилучшее разрешение, поскольку качество вто-
рого направления в полной мере зависит от того, насколько акку-
ратно проведено ИЭФ. Рекомендуемые для предфокусировки и ИЭФ
условия можно найти в буклетах, которые прилагаются к комплек-
там аппаратуры для 2D электрофореза.
Для сопоставления результатов фракционирования белков, их
идентификации и определения значений рI после окончания ИЭФ
полезно вдоль градиента в нескольких точках при помощи специ-
альных поверхностных (торцевых) электродов измерить значение
рН. Если ИЭФ проводили в стрипах, то этой процедуры можно избе-
жать, так как амфолиты химически сшиты с нанесенным на стрип
гелем, вследствие чего в ходе ИЭФ миграция амфолитов не происхо-
дит. Измерение величины рН вдоль цилиндрических гелей — про-
цедура трудоемкая и достаточно продолжительная. Чтобы не прибе-
гать к ней, предпочтительно применять рI-маркеры — белки с зара-
нее известными значениями рI. Уже знакомые нашим читателям
фирмы «Bio-Rad» и «GE Healthcare» выпускают наборы таких мар-
керных белков. Эти белки можно вносить отдельно или вместе с об-
разцом. В каждом наборе один из маркеров представлен окрашен-
ным белком, по перемещению которого можно следить за ходом
ИЭФ.
Для проведения ИЭФ в трубках используется Mini-Protean 2-D
Electrophoresis Cell («Bio-Rad», кат. номер 165-2960), в котором од-
новременно можно фокусировать 16 образцов. Имеются специаль-
ные требования к источнику питания для проведения ИЭФ в труб-
ках: он должен обеспечивать высокое напряжение (не ниже 1000 В)
и очень низкий ток. PowerPac HV High-Voltage Power Supply фирмы
«Bio-Rad» (кат. номер 164-5056) отвечает указанным требованиям.
Для ИЭФ в стрипах в настоящее время практически повсеместно
224 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
применяется специальное оборудование Protean IEF Cell («Bio-Rad»,
кат. номер 165-400), позволяющее интегрировать напряжение и
время, чтобы получить необходимое количество вольт-час. При ис-
пользовании очень популярных 7-см стрипов в указанном аппарате
одновременно можно проводить ИЭФ 20 образцов.
По окончании ИЭФ во втором направлении белки разделяют при
помощи ДДС-Na-ПААГ электрофореза по Laemmli. Если ИЭФ про-
водили в трубках с внутренним диаметром 1 мм, то толщина гелей
второго направления должна быть не менее 1 мм. Если для ИЭФ ис-
пользовали стрипы, то гели второго направления могут быть мень-
шей толщины, поскольку толщина стрипа с нанесенным на него ге-
лем составляет 0,5 мм. Полость над концентрирующим гелем, в ко-
торую помещают цилиндрический гель или стрип, формируется
также при помощи «гребенок», предназначенных для 2D электро-
фореза. Перед тем как поместить ИЭФ-гель/стрип на поверхность
концентрирующего геля второго направления, их необходимо урав-
новесить в буферах образцов для проведения ДДС-Na-ПААГ элек-
трофореза по Laemmli. Аккуратно извлеченные из стеклянных тру-
бок гели или стрипы инкубируют в течение 15 мин в буфере, содер-
жащем 0,5 Трис-HCl, рН 6,8, 6 Μ мочевину, 2% ДДС-Na, 30%
глицерин, 10 мг/мл ДТТ и небольшое количество бромфенолового
синего. Затем еще 15 мин в буфере, содержащем 0,5 Трис-HCl,
рН 6,8, 6 Μ мочевину, 2% ДДС-Na, 30% глицерин, 25 мг/мл йодаце-
тамида и бромфеноловый синий.
Подготовленные гели/стрипы следует закладывать на поверх-
ность концентрирующего геля. Перед тем как начать электрофорез,
цилиндрический гель/стрип необходимо «заплавить» в полости при
помощи 1% агарозы (с низкой температурой плавления), которую
готовят в том же буфере, что концентрирующий гель. Теперь все гото-
во для проведения ДДС-Na-nAAr электрофореза по Laemmli. Для вто-
рого направления удобно использовать Mini-Protean 3 Electrophoresis
Cell для 1-2 гелей (кат. номер 165-3301), Mini-PROTEAN Tetra Cell
для 1-4 гелей (кат. номер 165-8004), а также Mini-Protean 3 Dodeca
Cell для 1-12 гелей (кат. номер 165-4100). Все приборы фирмы
«Bio-Rad». Но можно проводить разделение белков во втором на-
правлении в любом аппарате, предназначенном для одномерного
электрофореза. Для второго направления необходим источник пита-
ния, дающий высокий ток (50-100 мА) и низкое напряжение (500 В),
например, PowerPac НС High-Current Power Supply («Bio-Rad», кат.
номер 164-5052).
Выше мы уже говорили о причинах, приводящих к неудовлетво-
рительному разделению белков при ДДС-Na-nAAr электрофорезе.
Все сказанное ранее в полной мере относится и к 2D электрофорезу.
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 225
Следует специально подчеркнуть следующее. При 2D электрофорезе
используются растворы с высокой концентрацией мочевины, что
необходимо для устранения угрозы агрегации белков. Отсюда по-
нятны повышенные требования к качеству мочевины. Препараты
мочевины, которые должны быть наивысшей чистоты, следует не
только обязательно деионизировать на ионообменных смолах, но и
помнить о том, что они должны быть свежеприготовленными. Заме-
чено, что даже хранение препаратов, подготовленных для ИЭФ, и
при -70 °С, и при -20 °С, может влиять на качество 2D электрофо-
реза.
Окраска белков после электрофореза
Обнаружение и локализацию белков после электрофоретического
разделения в ПААГ осуществляют путем их окрашивания различ-
ными красителями. Зоны белков после ДДС-Na-ПААГ электрофоре-
за или пятна после 2D электрофореза имеют разную интенсивность,
которая зависит от концентрации белка. Для окраски гели помеща-
ют в раствор красителя. Краситель диффундирует внутрь геля и
прочно связывается с белками. Поскольку процесс диффузии зани-
мает несколько часов, то для предотвращения размывания полос
или пятен белки в геле предварительно фиксируют. Для этого гели
сначала помещают в фиксирующий раствор, который, как правило,
содержит смесь уксусной кислоты (реже трихлоруксусной кисло-
ты, ТХУ) и метанола (этанола). Для окрашивания гелей после
ДДС-Na-nAAr электрофореза или стрипов после 2D электрофореза
фиксацию совмещают с окрашиванием, используя красители, раст-
воренные в смеси, состав которой аналогичен фиксатору. Если ИЭФ
проводили в цилиндрических гелях, то перед окрашиванием гелей
второго направления необходимо удалить амфолиты, так как со
многими белковыми красителями они образуют нерастворимые
комплексы. Для этого гель обычно вымачивают в водном растворе,
содержащем 3,5% сульфосалициловой кислоты, 12% ТХУ и 30%
метанола (этанола).
Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам гель,
поскольку происходит замещение буфера геля на раствор красителя
и небольшая сорбция красителя на геле. Но связывание красителя с
гелем несоизмеримо ниже, чем с белками, поэтому от «фона» доста-
точно легко удается избавиться, отмыв гель несколькими объемами
смеси, в которой приготовлен краситель. Отметим, что время окра-
шивания и «отмывки» подбираются опытным путем.
Чаще всего для окрашивания гелей используют Кумасси ярко
голубой, а именно: СВВ R-250 и СВВ G-250. Приставки R и G — со-
кращение от Red и Green, соответственно, так как водные растворы
226 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
названных красителей имеют красноватый или зеленоватый оттенок.
Цифра 250 относится к чистоте красителя. В кислой среде СВВ свя-
зывается с основными и гидрофобными аминокислотными остатка-
ми белков, изменяясь от унылого красновато-коричневого цвета до
интенсивного синего. Краситель СВВ связывается с некоторыми
белками лучше, чем с другими, из-за различий в аминокислотном
составе белков. После окрашивания СВВ R-250 можно вполне надеж-
но обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На порядок более
высокую чувствительность окраски можно получить при помощи
СВВ G-250. Амфолиты, которые используются при 2D электрофоре-
зе, реагируют с СВВ R-250, поэтому для окраски гелей второго на-
правления рекомендуются коллоидные суспензии СВВ G-250 [5].
Другой популярный метод окрашивания гелей — азотнокислым
серебром, при котором металлическое серебро осаждается на поверх-
ности геля в месте расположения белковых полос/пятен. При этом
можно обнаружить менее 0,5 нг белка. Заметим, что при некоторых
способах окрашивания серебром не соблюдается стехиометричность.
Этого недостатка лишен метод окрашивания серебром, предложенный
в 1985 г. W. Ansorge [6]. Однако он не получил широкого распрос-
транения по ряду причин, выходящих за рамки нашего рассмотре-
ния. Скажем лишь, что окрашивание этим методом нельзя использо-
вать, если в дальнейшем предполагается применять масс-спектро-
метрический анализ белков. По этой причине в последнее время
разделенные при помощи электрофореза белковые полосы/пятна
окрашивают серебром в соответствии с другим протоколом [7]. Пос-
ле такого варианта окрашивания полипептиды можно идентифици-
ровать при помощи масс-спектрометрии. Дополнительное преиму-
щество этого метода — его относительная простота и непродолжи-
тельность процедуры окрашивания, которая занимает не более 1,5 ч.
В последние годы увеличился спрос на флуоресцентные красите-
ли, использование которых в десятки раз расширило пределы детек-
тирования белков. Доступнее стали и приборы, позволяющие обна-
руживать окрашенные флуоресцентными красителями белки. Сре-
ди флуоресцентных красителей наиболее популярными являются
SYPRO Ruby, SYPRO Orange, Coomassie Fluor Orange, Cy-3 и Cy-5.
Максимумы возбуждения и эмиссии перечисленных флуоресцент-
ных красителей таковы, что для обнаружения окрашенных ими
белков можно использовать технические средства, снабженные со-
ответствующими наборами фильтров и лазеров, которыми оснаще-
но большинство приборов для измерения флуоресценции. Появи-
лась также возможность окрашивать в гелях белки определенных
классов. Например, коммерчески доступны наборы реактивов для
обнаружения гликопротеинов (при помощи Pro-Q Emerald 300), а
также фосфобелков (при помощи Pro-Q Diamond).
Раздел 3.2. Разделение белков при помощи электрофореза 227
Окрашенные гели можно хранить в высушенном состоянии. Их
сушат, как правило, между двумя листами целлофана или между
листом Whatman 3MM и листом целлофана. Существуют специаль-
ные устройства для сушки гелей, например, фирма «Bio-Rad» про-
дает линейку аппаратов для сушки гелей (Gel Drying Systems), в ко-
торых гель высушивают за счет подогрева и вакуума. Температура
подогрева может варьировать в зависимости от плотности геля, но в
большинстве случаев она составляет -80 °С. В таких вакуумных
сушках гель толщиной 0,75-1 мм высыхает за 1-2 ч. Более удобным
способом хранения результатов электрофореза является сканирова-
ние гелей. Сканировать гели лучше в проходящем свете, что точнее
отражает плотность белковой полосы/пятна. Для сканирования
предпочтительнее использовать модифицированные сканеры (ден-
ситометры) со встроенной внутренней калибровкой и снабженные
фильтрами для повышения чувствительности сканирования гелей,
окрашенных разными красителями. Один из самых распространен-
ных приборов для сканирования гелей — прибор фирмы «Bio-Rad»
Molecular Imager GS-800 Calibrated Densitometer (кат. номера
170-7980, 170-7981).
Полученные изображения гелей можно подвергать количест-
венной и качественной оценке, с помощью соответствующего прог-
раммного обеспечения. Подобное программное обеспечение постав-
ляется многими фирмами, например, «Bio-Rad», «GE Healthcare»,
«Phoretix» и др.
Итак, насколько позволил объем этой главы, мы рассмотрели
проблему разделения белков при помощи электрофореза в присут-
ствии ДДС-Na и 2D электрофореза. Для тех из наших читателей, ко-
торые хотят узнать больше деталей, касающихся этих нестареющих
методов анализа белков, мы рекомендуем для начала обратиться к
практическому пособию [8].
Литература
1. Laemmli U. К. (1970) Cleavage of Structural Proteins during the
Assembly of the Head of Bacteriophage T4// Nature. 1970. V. 227.
P. 680-685.
2. Ornstein L. Disc Electrophoresis, 1, Background and Theory//
Ann New York Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 321-349.
3. Davis B. J. Disc Electrophoresis. 2, Method and Application to
Human Serum Proteins// Ann. New York Acad. Sci. 1964. V. 121.
P. 404-427.
4. O'Farrell P. H. (1975) High Resolution Two-Dimensional
Electrophoresis of Proteins// J. Biol. Chem. 1975. V. 250.
P. 4007-4021.
228 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
5. Neuhoff V., Stamm Я, Eibl Я. (1985) Clear Background and Highly
Sensitive Protein Staining with Coomassie Blue Dyes in
Polyacrylamide Gels. A Systematic Analysis// Electrophoresis.
1985. V. 6. P. 427-448.
6. Ansorge W. (1985) Fast and Sensitive Detection of Protein and
DNA Bands by Treatment with Potassium Permanganate// J.
Biochem.Biophys. Meth. 1985. V. 11. P. 13-20.
7. Shevchenko Α., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass Spectrometric
Sequencing of Proteins Silver-Stained Polyacrylamide Gels//
Anal. Chem. 1996. V. 68. P. 850-858.
8. Остерман Л. А. (1981) Методы исследования белков и нуклеи-
новых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование
(практическое пособие) // М., Наука, 288 с.
3.3. ВЕСТЕРН-БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ
Е. С. Пожидаева
Введение и принцип метода
Метод Вестерн-блот-гибридизации (или western blotting, иммуно-
блоттинг) позволяет качественно и количественно исследовать бел-
ки с помощью специфических антител [1]. Принцип Вестерн-блот-гиб-
ридизации заключается в: а) способности антитела узнавать уни-
кальные области антигена, называемые эпитопами, и связываться с
ними; б) способности белка к иммобилизации на носителе с сохране-
нием его антигенных свойств и в) возможности визуализации ком-
плекса антиген-антитело. Это высокочувствительный метод, с по-
мощью которого можно обнаружить в анализируемом образце ин-
дивидуальный белок в количестве менее 1 нг. При этом белки
предварительно разделяют в полиакриламидном геле (ПААГ), что
позволяет определить молекулярный вес изучаемого белка, затем
их переносят на носитель (мембрану) и проводят идентификацию
целевых белков с использованием антител. Таким образом, стандарт-
ная постановка Вестерн-блот-гибридизации включает в себя три эта-
па: 1) разделение белков с помощью гель-электрофореза; 2) перенос
белков на мембрану и 3) иммунохимический анализ. В данной
статье рассматриваются вопросы переноса белков на мембрану и им-
мунохимический анализ.
Антитела вырабатываются в организме животных В-лимфоци-
тами (или В-клетками), как правило, в ответ на чужеродные антиге-
ны. Сыворотку крови, содержащую специфические к данному анти-
гену антитела, называют антисывороткой. Существует пять глав-
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
229
ных видов антител: IgG, IgD, IgA, IgE и IgM, называемых изотипами.
Изотип антитела определяется его консервативным участком [1-3].
В фундаментальных исследованиях обычно используют антитела
двух типов: поликлональные и моноклональные [2, 3]. После попа-
дания антигена в организм различные линии В-лимфоцитов начи-
нают выделять в кровь антитела, которые специфично узнают раз-
ные эпитопы исходного антигена. Такие антитела, выделенные из
сыворотки крови, называют поликлональными (или гетерогенны-
ми) антителами. Способность поликлональных антител связывать
не одну, а практически все имеющиеся на белковой молекуле анти-
генные детерминанты позволяет идентифицировать эволюционно
близкие белки разных организмов.
Моноклональные (или гомогенные) антитела получают из гиб-
ридом, образованных путем слияния В-лимфоцитов иммунизиро-
ванного животного с миеломными клетками. Каждая линия В-лим-
фоцитов производит идентичные антитела к одному конкретному
эпитопу. Такие антитела являются гомогенными по своей специ-
фичности и по физико-химическим свойствам [1—3]. Гибридомы
способны размножаться in vitro и продуцировать антитела [4]. Раз-
работаны специальные методы, позволяющие выделить одну гиб-
ридную клетку, которая, размножаясь, секретирует антитела толь-
ко одного вида. Моноклональные антитела имеют ряд преимуществ
перед поликлональными, в том числе из-за их специфичности к
определенной антигенной детерминанте и возможности подбора ан-
тигенных детерминант, к которым образуются антитела. Однако не-
достатком этого типа антител является высокая стоимость их произ-
водства.
Существуют так называемые антиидиотипические антитела [5],
относящиеся к группе, выделяемой при классификации антител по
антигенам. Они вырабатываются организмом против эпитопов, на-
зываемых еще идиотипами, локализованных в антигенсвязываю-
щей области или вариабельной области молекулы другого антитела.
Проще говоря, это антитела против антител, вырабатываемых са-
мим же организмом. По своей структуре антиидиотипические анти-
тела зеркально повторяют пространственную конфигурацию анти-
тела, против которого был выработан иммунный ответ.
При постановке Вестерн-блот-гибридизации нужно точно знать,
в каком животном, и против какого антигена данная сыворотка
была выработана. Антигенами обычно являются белки (полипепти-
ды) или углеводы, реже липиды или нуклеиновые кислоты, все
чаще используют синтетические полипептиды как аналоги белко-
вых антигенов [1-3]. В первом и последнем случаях антитела взаи-
модействуют с короткой областью антигена, около 5-8 аминокис-
230 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
лотных остатков. Данные аминокислоты могут располагаться не-
прерывно или находиться в различных областях полипептидной
цепи первичной структуры, объединяясь во вторичной или третич-
ной структуре антигена. В случае углеводов область антигена состо-
ит от одной до шести молекул моносахаридов. Липиды и нуклеино-
вые кислоты в чистом виде не являются иммуногенами. Однако в со-
единении с другими веществами, например в виде липопротеинов
или нуклеопротеидов, они становятся сильными иммуногенами. При
использовании синтетических полипептидов следует внимательно
подходить к выбору иммунодоминантного участка (т. е. той облас-
ти, которая будет использована для производства антител) изучае-
мого белка, образованного несколькими эпитопами. Эпитопы могут
располагаться как на удаленном расстоянии друг от друга, образуя
зависимый от конформации иммунодоминантный район, так и об-
разовывать линейную антигенную детерминанту. Более подробно о
природе, свойствах и структуре антител и антигенов можно прочи-
тать в [1-5].
Реактивы, материалы и оборудование
Буфер для переноса (10х): 25 мМ трис, 192 мМ глицин, рН 8,3. Не
рекомендуется использовать кислоту или щелочь для доведения
уровня рН.
Перед переносом в 1х буфер добавляют 100%-й метанол до ко-
нечной концентрации 20% и ДДС-Na (додецилсульфат натрия) до
конечной концентрации 0,1%.
Растворы для окрашивания гелей до переноса: раствор 1 —
200 мМ имидазол; раствор 2 — 300 мМ ZnSO4.
Раствор для окрашивания гелей после переноса: 0,1% раствор
Coomassie blue R-250 («Pierce», кат. № 20278) в 50%-м метаноле.
Раствор для окрашивания мембран после переноса: 1% раствор
Ponceau S («Sigma», кат. № Р7170) в 1%-й уксусной кислоте.
Калийно-фосфатный буфер для иммуноблоттинга PBS (10х):
750 мМ NaCl, 30 мМ КС1, 45 мМ Na2HPO4, 15 мМ КН2PO4, рН 7,5.
Трис-солевой буфер TBS (10х): 100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1500 мМ
NaCl; Tween-20 («Sigma», кат. № Р1379).
Блокирующие реагенты: сухое обезжиренное молоко; казеин
(«Merck», кат. № 1.02241) или BSA («Sigma», кат. № А7906).
Растворы для субстрата пероксидазы хрена: раствор 1 —
0,5 мМ люминол в ДМСО, 0,4 мМ р-кумаровая кислота в ДМСО,
0,1 Μ трис-HCl, рН 8,5; раствор 2 — 5,4 мМ H2O2, 0,1 Μ трис-HCl,
рН 8,5. Растворы хранят в темных сосудах при 4 °С не более двух не-
дель. Перед использованием растворы смешивают в равных объемах.
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
231
Прибор Mini Trans-Blot® Cell (кат. № 170-3930, «Bio-Rad») или
прибор типа Trans-Blot® SD Semi-dry transfer cell (кат. № 170-3940,
«Bio-Rad»); нитроцеллюлозные мембраны (Hybond ECL, Hybond™
C-extra, Hybond C-super, «GE Healthcare») и PVDF мембраны
(Immobilion membrane, Millipore) с размером пор 0,45 мкм и 0,20 мкм;
бумага Whatman 3 MM («GE Healthcare», кат. № 3030-153).
Проведение анализа
Разделение белков в ПААГ
Для идентификации индивидуальных белков образцы предваритель-
но подвергают гель-электрофорезу. Разделение белков может проис-
ходить по молекулярному весу, изоэлектрической точке и (или)
электрическому заряду. Характер разделения зависит от обработки
образца и типа геля. Универсальным методом разделения белков,
который используется наиболее часто, является электрофорез в
ПААГ в присутствии ДДС-Na по методу Лэммли [6] (рис. 3.3.1).
Подробно этот метод описан в разделе 3.2.
Для переноса используют гели неокрашенные или отмытые по-
сле обратимого окрашивания с использованием имидазола и суль-
Рис. 3.3.1. Выявление белков фотосинтетических комплексов в клетках
цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 с применением специфических
антител. (А) Электрофореграмма бактериального экстракта (12%-й ПААГ
в присутствии ДДС-Na). (Б) Блоты на нитроцеллюлозе, обработанные по-
ликлональными антителами кролика к белкам 1 — βATPase (β субъеди-
ница АТФ синтазы), 2 — PC и АРС (фикоцианин и аллофикоцианин фико-
билисом), 3 — D1 (ФСII) и 4 — PsaA (ФСI) соответственно и конъюгатом
антикроличьих антител с пероксидазой. Слева указана позиция бел-
ков-маркеров, кДа. Рисунок адаптирован из [8]
232 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
фата цинка. Предварительная визуализация белков после электро-
фореза перед переносом их на мембрану позволяет убедиться в качест-
ве разделения образцов, количестве белков, определить позицию
маркерных белков, а также точную область геля, которая будет ис-
пользоваться для переноса. Для окрашивания гель после электро-
фореза помещают в кювету и промывают дистиллированной водой
1 мин. Затем гель инкубируют 10 мин в растворе 0,2 Μ имидазола
при постоянном качании, снова промывают водой и инкубируют в
растворе 0,3 Μ сульфата цинка до полной визуализации прозрачных
белковых полос на молочно-белом фоне геля. Для остановки реак-
ции гель промывают водой несколько раз для полного удаления
сульфата цинка. До переноса гель можно хранить в небольшом ко-
личестве воды при 4 °С не более 12 ч. Перед переносом гель отмыва-
ют 1х буфером для переноса, не содержащим ДДС-Na или метанол.
Перенос белков на мембрану
Мембраны. Для проведения иммунной реакции белки предварительно
переносят на мембраны, которые могут быть двух типов: из нитроцел-
люлозы (например, Hybond ECL, GE Healthcare, кат. № RPN303D)
или поливинилиденфторида (PVDF; например, Immobilion membrane,
Millipore, кат. № IPVH00010). Коммерчески доступны мембраны со
стандартным размером пор 0,45 мкм и 0,20 мкм. Мембраны с порами
размером 0,45 мкм часто используют для белков с молекулярным
весом выше 20 к Да, т.к. белки меньше 20 к Да могут быть утеряны
при следующих после переноса отмывках мембран. Для низкомоле-
кулярных белков рекомендуют использовать мембраны с более мел-
кими порами (0,20 мкм), что позволяет уменьшить потери. Также
потери можно снизить за счет уменьшения времени переноса белков
на мембрану и добавлением в буфер для переноса метанол в стандарт-
ных концентрациях 10 или 20% , так как метанол уменьшает порис-
тость самого геля и мембраны. Высокомолекулярные белки (более
100 кДа) обладают ограниченной растворимостью, поэтому в этом
случае, наоборот, отсутствие метанола в буфере существенно повысит
эффективность их переноса. Кроме того, рекомендуется добавлять в
буфер для переноса ДДС-Na в низких концентрациях 0,05-0,1% для
усиления высвобождения белков из геля. При этом не рекомендует-
ся превышать концентрацию ДДС-Na более 0,1%, т. к. снижается
коэффициент связывания белков с нитроцеллюлозой, а, кроме того,
ДДС-Na может денатурировать антигены.
Нитроцеллюлозные мембраны — наиболее дешевый и часто ис-
пользуемый тип мембран. Иммобилизованные на них белки четко
окрашиваются различными красителями (Ponceau S, Coomassie
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
233
R-250 и др.). После переноса белков нитроцеллюлозные мембраны
можно высушивать и сохранять при комнатной температуре. Нит-
роцеллюлоза обладает относительно высокой связывающей (адсорб-
ционной) емкостью, 80-100 мкг белка/см2. Недостатком нитроцел-
люлозных мембран является их повышенная ломкость, поэтому пов-
торное использование может быть затруднено из-за возможных
механических повреждений. В настоящее время предлагаются аль-
тернативные типы нитроцеллюлозных мембран с внутренним мат-
риксом, повышающим их прочность (Hybond™ C-extra, Hybond
C-super, «GE Healthcare»). Кроме того, рекомендованы нитроцеллю-
лозные мембраны (Hybond ECL, «GE Healthcare»), оптимизирован-
ные для хемилюминесценции. Следует отметить, что данный тип
мембран требует тщательного увлажнения перед переносом белков в
течение 5-10 мин в буфере для переноса.
PVDF-мембраны обладают более высокой адсорбционной спо-
собностью (170-200 мкг/см2). Это позволяет наносить на мембрану
и анализировать белки с большей концентрацией, чем в случае нит-
роцеллюлозных мембран, что особенно важно при секвенировании
белков. Кроме того, использование PVDF-мембран в случае перено-
са высокомолекулярных белков более 100 к Да позволяет увеличить
эффективность их связывания с мембраной в присутствии ДДС-Na и
отсутствии метанола. Механические свойства (устойчивость к раз-
рывам) PVDF-мембран позволяют легко ими манипулировать даже
при повторном исследовании образцов. Благодаря своей гидрофоб-
ности PVDF-мембраны сорбируют меньше заряженных примесей,
что значительно уменьшает вероятность неспецифических взаимо-
действий при иммунных реакциях. Отметим, что PVDF-мембраны
требуют обработки 100% метанолом перед электроблоттингом, и
данный тип мембран нежелательно высушивать.
Оба типа мембран совместимы с колориметрическим, флуорес-
центным и хемилюминесцентным методами обнаружения сигналов.
Однако следует иметь в виду, что некоторые марки PVDF-мембран
обладают собственной флуоресценцией, что ограничивает их приме-
нение. Поэтому перед использованием мембраны следует протести-
ровать для выявления возможного фона.
Тип переноса
Известно несколько способов электрофоретического переноса бел-
ков из ПААГ с иммобилизацией на мембранах (белковый электро-
блоттинг). Перенос осуществляется с помощью электрического тока
в направлении от катода (минус) к аноду (плюс) при погружении в
раствор (влажный перенос, wet transfer) или в небольшом его объе-
ме (полусухой перенос, semy-dry transfer). Для этой цели коммер-
234 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
чески доступны и удобны для использования, в частности приборы
фирмы «Bio-Rad» (США) [7]. Для влажного переноса рекомендуется
прибор Mini Trans-Blot® Cell (кат. № 170-3930, «Bio-Rad»), в случае
полусухого переноса — прибор типа Trans-Blot® SD Semi-dry
transfer cell (кат. № 170-3940, «Bio-Rad»). Как правило, электро-
блоттинг осуществляют согласно методике фирмы-производителя,
к примеру, для приборов фирмы «Bio-Rad» перенос проводят в буфе-
ре Таубина (трис-глициновый буфер с добавлением 0,1% ДДС-Na и
10% или 20% -го метанола).
Процедура электроблоттинга
Перед переносом нитроцеллюлозные мембраны и гели увлажняют в
буфере для переноса. PVDF-мембраны замачивают на 1-2 мин в
100%-м метаноле, а затем промывают в буфере для переноса без
метанола. Неравномерное увлажнение мембран может привести к
появлению пузырей и блокировке переноса белков. Размер мембран
должен точно соответствовать размеру геля. Для каждого геля необ-
ходимо приготовить 8 листов бумаги Whatman 3 ММ, которые тща-
тельно смачивают в буфере для переноса. Увлажненные четыре лис-
та последовательно помещают на анодную пластину. Затем на бума-
гу помещают мембрану, сверху кладут гель, который накрывают
оставшимися четырьмя листами бумаги Whatman, смоченными в
том же буфере и закрывают катодной пластиной. Для удаления пу-
зырьков воздуха каждый слой аккуратно разглаживают роликом
или стеклянной пробиркой, смоченными в буфере для переноса. Та-
кая структура «сэндвича» используется для обоих типов электропе-
реноса. Необходимо всю работу проводить в перчатках, а мембраны
брать только пинцетом.
Стандартный электроблоттинг белков с «wet»-системой прово-
дят в течение 2 ч при 0,8-1 мА/см2 при комнатной температуре.
Однако рекомендуется использовать охлажденные растворы. Пере-
нос высокомолекулярных белков (или белковых комплексов) прово-
дят при минимальном токе в течение ночи при 4 °С. При использо-
вании системы «semi-dry» фирма «Bio-Rad» предлагает выполнять
перенос с мини-гелей (размером 8x8 см) в течение 15-30 мин при
10-15 В, а с больших гелей (размером 20x20 см) — в течение
30 мин - 1 ч при 15-25 В. Порог по току для больших гелей составля-
ет 3 мА/см2, а для мини-гелей 5,5 мА/см2. Во всех случаях напря-
жение не должно превышать 25 В. Необходимо отметить, что цели и
задачи исследования определяют условия и тип электроблоттинга,
которые во многих случаях подбираются индивидуально.
Если возникла необходимость сохранить нитроцеллюлозную
мембрану после переноса белков на длительное время, то ее можно
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
235
высушить при 80 °С в течение 10 мин или при комнатной температу-
ре в течение часа, а в дальнейшем использовать для иммунохими-
ческого анализа. PVDF-мембраны сохраняют увлажненными в кю-
ветах с дистиллированной водой в холодильнике при 4 °С или запе-
чатывают в полиэтиленовые конверты с небольшим количеством
воды. В этом случае не рекомендуется сохранять мембраны более
2 недель.
Для контроля полноты переноса белков, после электроблоттин-
га гели окрашивают Coomassie R-250 (раствор 0,025% Coomassie
R-250 в 10% уксусной кислоте, 45% метаноле). Для визуализации
окрашенных белков гели отмывают от несвязанного красителя раст-
вором для окрашивания (без красителя). Окраску белков, сорбиро-
ванных на нитроцеллюлозной мембране или PVDF-мембране, про-
водят в 0,05-1% растворе Ponceau С в 1%-й уксусной кислоте в тече-
ние 30 мин. Затем мембраны отмывают дистиллированной водой до
визуализации окрашенных полос. На мембране карандашом отмеча-
ют позицию маркерных белков, а также порядок нанесения образцов.
Коммерчески доступны окрашенные белковые маркеры (Prestained
ДДС-Na-PAGE Standards, «BioRad», кат. № 161-0318EDU), которые
хорошо видны на геле и мембранах без дополнительного окрашива-
ния.
Проведение и регистрация Вестерн-блот-гибридизации
Процедура гибридизации
При стандартной постановке Вестерн-блот-гибридизации мембраны
с иммобилизованными белками предварительно инкубируют в тече-
ние 1 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе, содер-
жащем буфер lx PBS или lx TBS, блокирующий реагент (5% (в/о)
сухое обезжиренное молоко или 1% (в/о) казеин или 3% (в/о) BSA))
и детергент (1% Tween-20). Первичные антитела разводят в блоки-
рующем растворе до необходимой концентрации и далее инкубируют
с мембранами в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого
для удаления первичных несвязавшихся антител мембраны промы-
вают блокирующим буфером (4 раза по 10 мин) при комнатной тем-
пературе; затем инкубируют в течение часа в блокирующем буфере с
вторичными антителами (например, кроличьи IgG-антитела, конъ-
югированные с пероксидазой, Sigma, кат. № 15006-10MG). Несвя-
завшиеся вторичные антитела удаляют повторным промыванием в
блокирующем буфере без блокирующего реагента (4 раза по 10 мин).
Затем, проводят визуализацию вторичных антител, связавшихся с
белками. В случае иммуноглобулинов, конъюгированных с перок-
сидазой, детекцию сигнала проводят с помощью реакции хемилю-
236 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
минесценции. С этой целью мембраны инкубируют в течение 1 мин
в реакционной смеси, приготовленной из растворов 1 (0,5 мМ люми-
нол, 0,4 мМ р-кумаровая кислота в ДМСО, 0,1 Μ трис-HCl, рН 8,5) и
2 (5,4 мМ H2O2, 0,1 Μ трис-HCl, рН 8,5), смешанных в равных про-
порциях. При инкубации мембраны в растворе конъюгированная с
вторичными IgG-антителами пероксидаза в присутствии перекиси
водорода окисляет люминол в 3-аминофталат через серию промежу-
точных реакций. Данная реакция сопровождается люминесценцией
в месте локализации конъюгата, которая усиливается за счет присут-
ствия в растворе кумаровой кислоты. Через 1 мин мембрану акку-
ратно пинцетом извлекают из кюветы, удаляют излишки раствора
прикосновением уголка мембраны к фильтровальной бумаге и мем-
брану запечатывают в прозрачную пищевую пленку. Регистрацию
хемилюминесцентного сигнала проводят незамедлительно, напри-
мер, на пленке X-ray (Hyperfilm, «GE Healthcare») или на приборе
фосфоимиджер (например, Typhoon Trio+, «GE Healthcare») при
длине волны 428 нм.
В качестве примера на рис. 3.3.1 представлены результаты Вес-
терн-блот-гибридизации белков цианобактерии Synechocystis sp.
РСС 6803 с антителами против белков фотосинтетических комплек-
сов — белков PsaA (ФС1), pATPase (β субъединица АТФ-синтазы),
D1 (ФСП), Rieske (цитохромный b6/f комплекс), а также PC и АРС
(белки фикоцианин и аллофикоцианин фикобилисом, соответствен-
но) [8]. Выделенные клеточные белки разделяли с помощью 12%
ПААГ в присутствии ДДС-Na (А). После разделения в геле белки пе-
реносили на нитроцеллюлозную мембрану описанным методом и ис-
пользовали для Вестерн-блот-гибридизации с антителами против
белков фотосинтетических комплексов (Б).
Блокирующий буфер
Инкубацию мембран в блокирующем растворе проводят для умень-
шения фона неспецифического связывания антител. Блокировка
мембран может проходить как при комнатной температуре, так и
при более низких температурах, однако время инкубации в этом
случае существенно возрастает (например, при 4 °С блокировку про-
водят в течение ночи). В качестве блокирующих реагентов исполь-
зуют обезжиренное сухое молоко (менее 2% жира), очищенный бы-
чий сывороточный альбумин (BSA), казеин или желатин, а также
готовые наборы для иммунологического анализа с собственным бло-
кирующим реагентом. Блокирующие реагенты разводят либо в фос-
фатно-солевом буфере (PBS), либо трис-солевом буфере (TBS) до не-
обходимой концентрации, которая варьирует от 1 до 5%. Также в
состав блокирующего буфера входит детергент Tween-20 в концен-
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
237
трации от 0,05% до 1% . Tween-20 блокирует гидрофобные взаимо-
действия, уменьшая неспецифическое связывание антител. Нужно
отметить, что казеин трудно растворим в TBS буфере, поэтому реко-
мендуется вначале растворить казеин и NaCl в 10 мМ Трис, а затем
довести рН до 7,5 соляной кислотой.
Выбор блокирующего реагента и его концентрации является
важным этапом и зависит от типа используемых первичных и вто-
ричных антител. Например, блокирующие реагенты, полученные
из сухого обезжиренного молока, могут значительно снизить эффек-
тивность связывания первичных анти-HiS6 антител [9], узнающих
полигистидиновый эпитоп. Часто антитела содержат азид натрия,
который добавляют для их длительного хранения. Однако его при-
сутствие может подавлять действие пероксидазы, необходимой при
хемилюминесцентном методе детекции сигнала. Выбор блокирую-
щего реагента особенно существенен при использовании фосфо-спе-
цифичных антител (phospho-specific antibodies), позволяющих выя-
вить фосфорилированные белки. Например, блокирующие реаген-
ты на основе сухого обезжиренного молока могут содержать белки,
усиливающие фон или способные дефосфорилировать белки. Кроме
того, при выборе фосфо-специфичных антител рекомендуют исполь-
зовать TBS, а не PBS буфер, так как последний также будет усили-
вать неспецифическое связывание и развитие окраски фона. При
начальных этапах исследования для выявления оптимальных усло-
вий иммунохимической реакции следует протестировать различные
блокирующие реагенты в разных буферах.
Первичные и вторичные антитела
Первичные антитела специфически связываются с целевым белком,
а затем вторичные антитела обнаруживают первичные. Как уже
было отмечено, первичные антитела являются специфическими по
отношению к изучаемому антигену. Коммерческие первичные анти-
тела от фирм-производителей (например, «Agrisera», Швеция) по-
ставляются в стандартной концентрации 1 мг/мл. Однако условия
эффективного связывания, включающие концентрацию антител,
концентрацию детергента, используемого при отмывке антител,
время инкубации с антителами и температуру гибридизации необ-
ходимо подбирать индивидуально для каждого антитела. Определе-
ние титра антител, т.е. предельного разведения исходных антител,
при котором происходит наиболее эффективное выявление первич-
ных антител вторичными, проводят титрованием. Для этого готовят
последовательные двукратные разведения антитела, равные объе-
мы (от 0,1 до 3 мкл) каждого разведения наносят на мембрану и
оставляют до полного впитывания. В данном случае предпочтитель-
238 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
нее использовать мембраны с малым диаметром пор. Мембраны ин-
кубируют с вторичными иммуноглобулинами в течение часа при
комнатной температуре. Затем мембраны отмывают и проводят де-
текцию сигнала вторичных антител для установления нужного тит-
ра по интенсивности иммунной реакции. При стандартной поста-
новке Вестерн-блот-гибридизации первичные антитела разводят в
соотношении 1:1000 в случае поликлональных антител и 1:5000 —
для моноклональных антител в блокирующем буфере, содержащем
блокирующий реагент и детергент. Реакцию проводят, как прави-
ло, при комнатной температуре, однако часто применяют гибриди-
зацию при 4 °С в течение ночи. Это особенно предпочтительно, если
антитела обладают пониженным сродством к белку или двух часов
при комнатной температуре недостаточно для эффективного взаи-
модействия антитело-антиген. Однако нужно помнить, что продол-
жительная инкубация может усиливать неспецифическое связы-
вание.
Вторичные антитела вырабатываются при иммунизации одного
животного иммуноглобулинами другого и являются поликлональ-
ными антителами. Например, при иммунизации козы иммуногло-
булинами кролика вырабатываются кроличьи IgG-антитела, кото-
рые специфически узнают антигенные участки антител, вырабо-
танных в кроликах. Вторичные антитела разводят до стандартной
концентрации согласно рекомендациям их фирм-производителей,
как правило, в соотношении 1:20 000 или 1:40 000. До и после ин-
кубации с вторичными антителами рекомендуется тщательно про-
мывать мембраны 3-4 раза по 10 мин в PBS или TBS буферах, с до-
бавлением Tween-20. Концентрацию детергента в отмывочном бу-
фере можно повышать, что позволяет удалить неспецифически
связанные антитела и тем самым уменьшить возможный фон гибри-
дизации. Если фон достаточно высокий, то концентрацию Tween-20
можно увеличить до 2% и выше.
Хранить антитела рекомендуют в 50% глицерине при -20 °С,
причем концентрация антител не должна быть ниже 0,5 мг/мл.
Типы регистрации сигнала и оценка результатов
Метод регистрации сигнала зависит как от типа антител, так и от
способа проведения иммунной реакции. Существуют флуориметри-
ческий, колориметрический и хемилюминесцентный методы визуа-
лизации взаимодействия антитела с антигеном.
При выборе IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, ис-
пользуют хемилюминесценцию. Пероксидаза хрена представляет
собой фермент, который катализирует окисление люминола в при-
сутствии перекиси водорода [10]. Данная реакция сопровождается
Раздел 3.3. Вестерн-блот-гибридизация
239
свечением, регистрируемым либо с помощью рентгеновской пленки
(например, X-ray Hyperfilm, «GE Healthcare»), либо на приборе фос-
фоимиджер (например, Typhoon Trio+, «GE Healthcare») при длине
волны 428 нм.
В настоящее время предпочтение отдают вторичным антителам,
конъюгированным с флуоресцентным красителем FITC (флуоресце-
инизотиоцианат), что позволяет использовать его в качестве флуо-
ресцентной метки антител [11]. Данный тип красителя практически
не выцветает, поэтому при правильном хранении мембран (сухое
место и темнота) регистрацию сигнала можно повторить даже через
месяц. Сигнал сканируют на приборе фосфоимиджер (например,
Typhoon Trio, «GE Healthcare») с настройками для лазера — 488 нм,
фильтра — 526 нм.
Молекулярный вес белковых зон, выявленных на мембране с по-
мощью антител, оценивают путем сопоставления с позицией мар-
керных белков с известными молекулярными весами. Для полуко-
личественной оценки целевого белка в различных сериях опытов в
качестве контроля сравнения используют сигналы, полученные пос-
ле Вестерн-блот-гибридизации с антителами против структурных
белков, таких как актин или тубулин, которые наносят на мембрану
в одной и той же дозе в разных экспериментах. Это позволяет кор-
ректировать полученные сигналы по отношению к сигналам рефе-
рентного белка, в случае количественной ошибки при нанесении об-
разцов на гель или неполного переноса. Числовые данные, получен-
ные при флуориметрическом или хемилюминесцентном методах
анализа с помощью прибора фосфоимиджер, возможно анализиро-
вать при помощи компьютерных программ (например, программы
ImaGene, AIDA32).
Особенности метода
Метод Вестерн-блот-гибридизации — это высокочувствительный и
специфичный метод идентификации белков, который имеет ряд
преимуществ перед методами иммуноферментного анализа в раст-
ворах [3, 12]. Предварительное разделение белков с помощью ПААГ
позволяет анализировать связывание антител с несколькими анти-
генами, каждый из которых может быть качественно и количест-
венно охарактеризован. Вестерн-блот-гибридизация позволяет выя-
вить и определить содержание антигенов даже при крайне низкой
концентрации (менее 1 нг белка). Однако необходимо отметить, что
нарушения на любом из этапов этого метода могут исказить весь
процесс и привести к ошибочной интерпретации данных. Напри-
мер, при электрофоретическом разделении белков вероятна денату-
рация и разрушение определенных конформационных эпитопов,
240 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
что ведет к снижению чувствительности метода. Также существует
вероятность неспецифического взаимодействия вторичных антител
с белками, не являющимися мишенью исследования, что может
приводить к окрашиванию нецелевых белков и появлению фона.
При наличии фонового окрашивания следует уменьшить концен-
трацию вторичных антител, а также увеличить время отмывки мем-
браны и концентрацию детергента в отмывочном буфере. В процессе
приготовления образцов спонтанное (де)фосфорилирование или
окисление белков могут привести к появлению артефактных сигна-
лов на мембране, что особенно важно при анализе белков, получен-
ных после изоэлектрического фокусирования. Перенос белков на
мембрану также требует тщательности: появление пузырьков воз-
духа между мембраной и гелем может привести к потере образцов в
этой зоне, а неправильный расчет времени переноса или концентра-
ции метанола в буфере станут причиной меньшей эффективности
переноса. Таким образом, несмотря на то что иммуноблоттинг явля-
ется высокочувствительным методом и широко практикуется, он
также имеет ряд ограничений, которые могут потребовать от иссле-
дователя проведения дополнительных экспериментов.
Литература
1. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Ε. Μ.
Теория и практика иммуноферментного анализа. Под ред. Его-
рова Α. Μ. Μ.: Высш. школа, 1991. 288 с.
2. Глинн Л., Стъюард М. Структура и функции антител, изд-во
Мир, Москва, 1983. 200 с.
3. Кэтти Д. Антитела: Методы, изд-во Мир, Москва, 1991. 287 с.
4. Алътшулер Е. П., Серебряная Д. Б., Катруха А. Г. Получение
рекомбинантных антител и способы увеличения их аффиннос-
ти. Успехи биологической химии. Т. 50, 2010, с. 203-220.
5. Rico Μ. J., Hall R. P. Idiotypes, anti-idiotypes, and autoimmunity //
J Am Acad Dermatol. 1988. V. 19. P. 579-585.
6. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
7. Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual
(PDF). Bio-Rad Laboratories, http://www.bio-rad.com/
cmc_upload/0/000/013/280/Μ1703930E.pdf.
8. Pojidaeva E., Zinchenko V. V., Shestakov S. V., Sokolenko A.
Involvement of the SppAl peptidase in acclimation to saturating
light intensities in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol.
2004. V. 186. P. 3991-3999.
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 241
9. QIAexpress Detection and Assay Handbook — English (PDF).
http://www.qiagen.com/literature/render.aspx?id=129.
10. Veitch N. C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic
enzyme. Phytochemistry // 2004. V. 65. P. 249-259.
11. Szewczyk В., Summers D. F. Fluorescent staining of proteins
transferred to nitrocellulose allowing for subsequent probing with
antisera // Anal. Biochem. 1987. V. 164. P. 303-306.
12. Тертон M., Бангхем Д. P., Колкотт К. Α., под редакцией Кол-
линз У. П. Новые методы иммуноанализа, изд-во Мир, Москва,
1991. 280 с.
3.4. ЭКСПРЕССИЯ ЦЕЛЕВЫХ (РЕКОМБИНАНТНЫХ)
БЕЛКОВ В БАКТЕРИЯХ
Е. С. Пожидаева
Введение
В настоящее время активно используются различные технологии
(химический синтез, бесклеточные системы или продуценты), поз-
воляющие получать очищенные (рекомбинантные) белки, сохраня-
ющие свою физиологическую активность [1]. Это связано не только
со структурно-функциональным анализом исследуемых белков, но
и с потребностью создания противовирусных вакцин, производства
антител и человеческих белков, применяемых при терапии различ-
ных заболеваний. В качестве основного продуцента целевых белков
служат бактерии Escherichia coli (далее Ε. coli) и Bacillus subtilis,
дрожжи Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, линии клеток
млекопитающих (СНО, BHK, А-293), а также трансгенные растения
(см. разделы 1.1 и 1.2). Среди перечисленных организмов, способ-
ных к гетерологичной экспрессии белков, наиболее часто использу-
ются грамотрицательные бактерии Е. coli, так как они обладают ря-
дом преимуществ перед другими продуцентами. Быстрый рост клеток
Е. coli, относительно высокий выход чужеродного белка, низкая
стоимость реактивов для экспрессии и очистки белка делают про-
цесс наработки целевых белков наиболее эффективным, недорогим
и простым. Кроме того, детально изучены особенности генома Е. coli
и разработаны молекулярно-генетические методы манипуляции с
бактериями. Однако нужно отметить, что гетерологичная экспрес-
сия эукариотических белков в бактериях имеет некоторые ограни-
чения. При выборе микробиологического синтеза целевых белков
эукариот необходимо учитывать отсутствие у бактерий ферментатив-
ных систем, обеспечивающих такие посттрансляционные модифи-
242 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
кации белков, как гликозилирование, фарнезилирование и т. п.,
а также возможную токсичность чужеродных белков для бактериаль-
ной клетки, препятствующую получению устойчивых штаммов-про-
дуцентов [2]. В настоящее время созданы коммерческие бактериаль-
ные системы экспрессии, позволяющие получать высокий уровень
целевых белков, в том числе и эукариотических.
Принцип метода
В основе метода экспрессии целевых белков в бактериях (Е. coli) ле-
жит использование систем векторов экспрессии для продуцирова-
ния больших количеств белка [1]. Метод включает в себя несколько
этапов, часть из которых рассматривается в других разделах данного
сборника: 1) выбор систем векторов экспрессии Е. coli, анализ после-
довательности ДНК, кодирующей целевой белок, подбор коротких
олигонуклеотидов (праймеров) к выбранному участку гена; 2) созда-
ние плазмидных конструкций с целевым геном и трансформация дан-
ными конструкциями штаммов-продуцентов Е. coli; 3) оптимизация
условий экспрессии целевого белка и анализ его экспрессии с по-
мощью Вестерн-блот-гибридизации; 4) очистка целевого белка и оцен-
ка его пригодности для решения поставленных задач.
Реактивы и оборудование
Для каждой коммерческой экспрессионной системы подобраны бак-
териальные штаммы, среды и условия, обеспечивающие максималь-
ный выход целевого белка. Список экспрессирующих векторов и со-
ответствующих штаммов Е. coli представлен в табл. 3.4.1.
Таблица 3.4.1. Наиболее часто используемые системы экспрессирующих
векторов Е. coli
№
Вектор
Штамм Устойчи- Промо-
вость тор
N-/C-TAG
Кат. №
Векторы семейства рЕТ
1
рЕТ-11,
15b, 21,
22b,
25b
BL21(DE3) Amp T7lac
PLysS Cm
N-HisTag
Novagen1,
кат.
№ 69257
ι
http://www.meгсk-chemicals.ru
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 243
Таблица 3.4.1. Наиболее часто используемые системы экспрессирующих
векторов Е. coli (окончание)
№
Вектор
Штамм
Устойчи-
вость
Промо-
тор
N-/C-TAG
Кат. №
Векторы семейства pQE
2
3
4
5
6
7
8
рЕТ-28b
(+)
рЕТ-З0b
рЕТ-32
(а-с)
pQE-16,
pQE-60,
pQE-70
pQE-9,
pQE-30,
pQE-31,
pQE-32,
pQE-40
PQE-80L,
PQE-81L,
PQE-82L
pQE-Tri
System
BL21(DE3)
BL21(DE3)
pLysS,
BL21
(Rossetta)
BL21(DE3)
M15(pREP4)
SG13009
[pREP4]
M14(pREP4)
SG 13009
[pREP4]
He требует
наличия
плазмиды
pREP4
M15(pREP4)
SG13009
[pREP4]
Km
Km
Cm
Amp
Amp
Km
Amp
Km
Amp
Km
T7/ac
T7/ac
T7/ac
T5
T5
T5
T7
His-Tag,
T7-Tag
His-Tag,
T7-Tag
Trx-Tag,
His-Tag,
S-Tag
C-HisTag
N-HisTag
N-HisTag
C-HisTag
Novagen,
кат.
№ 69258
Novagen,
кат.
№ 69554
Novagen,
кат.
№ 69030
Qiagen1,
кат.
№ 32903
Qiagen,
кат.
№32915
Qiagen,
кат.
№ 32923
Qiagen,
кат.
№ 33903
Векторы семейства pIVEX
9
pIVEX
Бесклеточ-
ный лизат
Amp
T7
His-tag,
MBP-tag,
HA-tag
Roche, 2
кат. №№
3269019,
3268985,
3268993
1
2
http://www.qiagen.com
http://www.roche.com
244 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Реактивы
Клетки E.coli выращивают в жидкой LB или ТВ среде при 37 °С при
аэрации. Среда LB — в 1 л воды растворяют 10 г бактотриптона, 5 г
дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, доводят рН до 7,5 раствором 1 N
NaOH и автоклавируют. Среда ТВ — 12 г бактотриптона, 24 г дрож-
жевого экстракта, 4 мл глицерина, 900 мл воды; автоклавируют,
охлаждают и добавляют 100 мл калий-фосфатного буфера. Раствор
калий-фосфатного буфера — на 1 л вносят 23,1 г КН2PO4, 125,4 г
К2НPO4, автоклавируют. Для приготовления агаризованнои среды
(1,5% агара) 15 г агара добавляют на литр раствора. После стерилиза-
ции в среду, охлажденную до 50 °С, вносят антибиотики. Ампицил-
лин готовят в концентрации 100 мг/мл в деионизованной воде, ис-
пользуют конечную концентрацию 50 мкг/мл. Карбенициллин го-
товят в концентрации 50 мг/мл в деионизованной воде, используют
конечную концентрацию 50 мкг/мл. Хлорамфеникол готовят в кон-
центрации 34 мг/мл в этаноле, используют конечную концентра-
цию 34 мкг/мл. Канамицин (сульфат) — исходная концентрация
30 мг/мл в деионизованной воде, используют конечную концентра-
цию 30 мкг/мл для штаммов-продуцентов, содержащих ген устой-
чивости к канамицину на плазмиде, и 15 мкг/мл — если ген встроен
в хромосому (штаммы AD494, BL21trxB, Novagen). Все растворы со-
храняют при -20 °С.
Индуктор ИПТГ (синтетический аналог лактозы, IPTG) —
100 мМ раствор изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозида; 2,38 г
ИПТГ растворяют в 100 мл деионизованной воды, стерилизуют че-
рез фильтр с размером пор 0,22 мкм, хранят при -20 °С.
Буфер для ресуспендирования бактериальных клеток: 20 мМ
трис-HCl, рН 8,0.
Буфер для образцов: 100 мМ DTT, 2% ДДС-Na, 80 мМ трис-HCl,
рН 6,8, 0,006% бромфенолового синего, 15% глицерина (2х).
Буферы для очистки целевого белка в нативных условиях
Буфер для лизиса: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол,
рН 8,0 (рН доводят раствором NaOH).
Буфер для отмывки: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 20 мМ ими-
дазол, рН 8,0 (рН доводят раствором NaOH).
Буфер для элюции: 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 250 мМ ими-
дазол, рН 8,0 (рН доводят раствором NaOH).
Буферы для очистки целевого белка в денатурирующих условиях
Буфер для лизиса клеток: Буфер А: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ
трис-HCl, 6 Μ GuHCl (гуанидин хлорид), рН 8,0 (рН доводят раство-
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 245
ром NaOH). Буфер Б: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ трис-НС1, 8 М мочеви-
на, рН 8,0 (рН доводят раствором NaOH).
Буфер для промывки. Буфер В: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ трис-НС1,
8 Μ мочевина, рН 6,3 (рН доводят раствором НС1).
Буфер для элюции. Буфер Г: 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ трис-НС1,
8 Μ мочевина, рН 5,9 (рН доводят раствором НС1). Буфер Д: 100 мМ
NaH2PO4, 10 мМ трис-НС1, 8 М мочевина, рН 4,5 (рН доводят раство-
ром НС1). Растворы, содержащие мочевину, нельзя автоклавиро-
вать и нагревать выше 60 °С.
Ввиду быстрого разложения мочевины, рН используемых при
очистке буферов доводят непосредственно перед использованием.
Оборудование
ДНК полимеразы, применяемые для ПЦР. Рекомендуется исполь-
зовать «proofreading» ДНК-полимеразы, способные вносить исправ-
ления ошибок при репликации (например, Encyclo- или Tersus-no-
лимеразы, «Евроген»).
ДНК-амплификатор; прибор для электрофореза ДНК в агароз-
ном геле с источником питания; ультрафиолетовый облучатель (на-
пример, VL-6LC фирмы «Vilber Lourmat», Франция); настольная
центрифуга с охлаждением (например, центрифуга «Eppendorf»
5415 R), шейкеры, термоблоки, ледяная баня, холодильные шкафы
на +4 °С, -20 °С и -70 °С, стеклянные пробирки, пластиковые стакан-
чики («фальконы») с завинчивающимися крышками на 15 и 50 мл.
Этапы метода
Выбор систем векторов экспрессии Е. coli,
анализ последовательности ДНК,
кодирующей целевой белок,
подбор праймеров к выбранному участку гена
Выбор векторов определяется задачами, стоящими перед исследова-
телем. В настоящее время известны и коммерчески доступны разно-
образные прокариотические системы экспрессии, часть из которых
представлена в табл. 3.4.1. При выборе вектора следует обращать
внимание на тип промотора, с которого транскрибируется клониро-
ванный ген, кодирующий целевой белок, а также на следующую за
ним последовательность, включающую инициирующий ATG-кодон
и уникальные сайты рестрикции (полилинкер), по которым прово-
дят встраивание кодирующей части клонируемого гена. Не менее
важным является наличие или отсутствие дополнительных конце-
вых фрагментов (tag), благодаря которым становится возможным
проводить одноступенчатую хроматографическую очистку реком-
бинантных белков от белков Е. coli [1].
246 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
При экспрессии эукариотических белков необходимо помнить,
что регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуля-
торных сигналов бактерий и обычно не узнаются бактериальными
РНК-полимеразами и рибосомами. Поскольку в бактериальной
клетке отсутствует система сплайсинга интронов [2], то в экспресси-
рующих векторах клонируют не участки геномной ДНК эукариоти-
ческой клетки, а комплементарную ДНК (кДНК) целевого гена,
синтез которой осуществляют на матрице мРНК методом RT-ПЦР
(см. раздел 2.5).
Промоторы
Тип промотора определяется экспрессионной системой (см.
табл. 3.4.1). Различают индуцибельные и репрессибельные промо-
торы [2]. В частности, промоторы лактозного, галактозного и араби-
нозного оперонов являются индуцибельными, т. е. максимальная
интенсивность транскрипции таких оперонов достигается при до-
бавлении в питательную среду внешних индукторов — низкомоле-
кулярных углеводов: лактозы, галактозы или арабинозы [2]. К при-
меру, все векторы семейства pQE (Qiagen, кат. № 32915) обладают
сильным модифицированным промотором фага Т5, содержащим
два /ас-операторных локуса (табл. 3.4.1). Регуляция такого промо-
тора осуществляется под контролем Zac-penpeccopa, который коди-
руется на отдельной мультикопийной плазмиде pREP4, находящейся
в клетках штамма М15 Е. coli («Qiagen», кат. № 34210). Добавление
индуктора ИПТГ снимает репрессию lac-репрессора с Т5-промотора
и запускает синтез целевого белка [3].
Также известны промоторы, созданные на основе фага лямбда,
чья индукция происходит при повышении температуры роста до
42 °С [2]. Когда клетки растут при температуре 30-32 °С, чувстви-
тельный к температуре репрессор фага лямбда связывается с опера-
тором и блокирует экспрессию. При повышении температуры реп-
рессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связаться с
промотором и начать транскрипцию.
Репрессибельные промоторы входят в состав оперонов, управля-
ющих синтезом аргинина, гистидина или триптофана [2]. В этом
случае максимальная интенсивность транскрипции достигается
при отсутствии или концентрации ниже порогового уровня в клетке
соответствующих низкомолекулярных индукторов — аргинина,
гистидина и триптофана.
В качестве примера рассмотрим наиболее часто используемую сис-
тему экспрессионных векторов рЕТ Е. coli («Novagen», кат. № 69076)
[4, 5]. Транскрипция клонированных в векторе рЕТ-генов, коди-
рующих целевой белок, находится под контролем сильного про-
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 247
мотора, выделенного из фага Т7 (табл. 3.4.1). Транскрипция с дан-
ного промотора инициируется Т7 РНК полимеразой, которая от-
сутствует в бактериях. Поэтому при разработке данной системы
был создан штамм-продуцент BL21(DE3) Ε. coli («Merck Biosciences»,
кат. № 69450), содержащий ген РНК-полимеразы фага Т7, встроен-
ный в бактериальную хромосому. Генетическая конструкция, ис-
пользуемая при внедрении гена Т7 РНК полимеразы в хромосому,
также содержит lac-регулируемый промотор и lac-оператор. Актива-
ция транскрипции гена Т7 РНК-полимеразы происходит при добав-
лении в среду выращивания бактерий лактозы или ее синтетическо-
го аналога ИПТГ. Для экспрессии токсичных белков был получен
штамм-продуцент BL21(DE3) pLysS E. coli («Merck Biosciences»,
кат. № 69388), который дополнительно содержит плазмиду pLysS с
геном лизоцима фага Т7. Вследствие того что лизоцим эффективно
ингибирует Т7 РНК-полимеразу, базальный уровень индукции
целевого белка в клетках данного штамма существенно снижен,
что является важным фактором при экспрессии генов токсичных
белков. В настоящее время фирма «Novagen» предлагает более
10 различных штаммов-продуцентов и более 40 типов рЕТ-векторов
для экспрессии целевых белков различного типа (http://www.
merck-chemicals.com), что облегчает работу исследователя [5].
Сайты узнавания рестриктазами
На первом этапе клонирования проводят подбор праймеров длиной
не менее 20 п.н., комплементарных 5'- и З'-концам кодирующей об-
ласти исследуемого гена (см. раздел 1.6). Как правило, к ДНК-по-
следовательности праймеров присоединяют сайты узнавания рес-
триктазами, позволяющие клонировать ген таким образом, что ко-
дирующая часть целевого гена присоединяется к кодирующей части
бактериального гена с сохранением «рамки» считывания. Очень
удобным вариантом являются серии векторов со сдвигом рамки счи-
тывания, сконструированные для облегчения работы исследователя.
Это позволяет не задумываться о необходимости попадания в «рам-
ку считывания» при клонировании целевых генов в конкретном
векторе, а выбрать один из трех векторов серии, который подходит
под конкретную целевую последовательность. К сайтам рестрикции
на 5'-концы праймеров рекомендуется добавлять дополнительные
нуклеотиды. Это необходимо для эффективного связывания с ДНК
рестриктазы и ее активности. Например, нужно учитывать, что для
повышения активности рестриктаз Nde I или Not I количество до-
полнительных нуклеотидов в праймерах должно быть 8 или 10 со-
ответственно, хотя для большинства рестриктаз достаточно трех-че-
тырех нуклеотидов. Более подробную информацию можно получить
248 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
на сайте фирмы-производителя рестриктаз «Fermentas» (www.
f ermentas . com). Кроме того, к последовательности обратного прай-
мера рекомендуется присоединить терминирующие кодоны.
Тад-последовательности
Для удобства очистки экспрессированных рекомбинантных белков
современные векторы экспрессии содержат fag-последовательнос-
ти, кодирующие специальные пептиды или короткие белки. С по-
мощью данных последовательностей проводят одноступенчатую
хроматографическую очистку рекомбинантных белков от белков
Е. coli. Чаще всего используют (His)6-tag — это короткая концевая
последовательность, состоящая из шести остатков гистидина (His).
Также применяют GST-tag (глутатион-S-трансфераза), Trx-tag (ти-
реоредоксин), S-tag (S-белок рибонуклеазы) [3-5]. Tag-последова-
тельности могут располагаться как на N-, так и на C-конце целевого
белка, что обычно стабилизирует экспрессированные белки в бакте-
риальных клетках.
Создание плазмидных конструкций с геном,
кодирующим целевой белок,
и трансформация данными конструкциями
штаммов-продуцентов Е. coli
Получение рекомбинантных плазмид с клонированными в них гена-
ми, кодирующими целевой белок, а также трансформацию данны-
ми конструкциями клеток Е. coli проводят по стандартным методи-
кам [6] либо по протоколам, представленным фирмами, поставляю-
щими экспрессионные векторы и штаммы. Необходимо учитывать
то, что многие штаммы-продуценты Е. coli содержат дополнительные
плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотику. Поэтому для
отбора колоний после проведения трансформации бактериальную
суспензию рассевают на агаризованную среду LB, содержащую два
селективных антибиотика. Например, клетки штамма-продуцента
BL21(DE3) pLysS E. coli, трансформированные векторами семейства
рЕТ, высевают на среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина и
34 мкг/мл хлорамфеникола (табл. 3.4.1), т. к. векторы рЕТ (за неко-
торым исключением) включают ген устойчивости к ампициллину,
а плазмида pLysS содержит ген устойчивости к хлорамфениколу [5].
Оптимизация условий экспрессии целевого белка
и анализ его содержания
с помощью Вестерн-блот-гибридизации
Для коммерчески доступных систем экспрессии целевых (рекомби-
нантных) белков оптимизированные протоколы присутствуют на
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 249
сайтах фирм-производителей [3-7]. В остальных случаях оптимиза-
цию условий экспрессии необходимо проводить самостоятельно,
принимая во внимание природу целевого белка и его дальнейшее
применение.
Процедура
Полученные после трансформации единичные колонии, содержа-
щие рекомбинантную плазмиду с клонированным геном целевого
белка, инокулируют в 1,5 мл жидкой LB среды с соответствующими
антибиотиками и подращивают в течение ночи при 37 °С без кача-
ния. На следующий день культуру клеток разводят свежим раство-
ром LB в соотношении 1:100, также содержащим соответствующие
антибиотики. Клетки выращивают при 37 °С при постоянной аэра-
ции до достижения оптической плотности ОП600~0,6. Отбирают
1 мл контрольной пробы (без индукции), центрифугируют при
12 000 об/мин в течение 1 мин, надосадочную жидкость удаляют, а
осадок ресуспендируют в равном объеме 2х буфера для образцов и
сохраняют при 4 °С до конца эксперимента. Затем для индукции
lac-промотора в клеточную суспензию добавляют индуктор ИПТГ до
конечной концентрации 0,4-1 мМ и выращивание культуры про-
должают в течение следующих 4 ч [5]. Для оптимизации условий
экспрессии рекомендуется построить временную кривую индукции,
отбирая контрольные пробы (после индукции) клеточной суспензии
для анализа через 1, 2, 3 и 4 ч после добавления ИПТГ. Отобранные
пробы центрифугируют при 12 000 об./мин в течение 1 мин, надоса-
дочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в равном объеме
2х буфера для образцов и сохраняют при 4 °С до конца эксперимен-
та. Экспрессию целевых белков анализируют в тотальном клеточ-
ном экстракте электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) в
присутствии 1% ДДС-Na по методу Лэммли (см. раздел 3.2). Перед
внесением в лунки ДДС-Na-ПААГ образцы выдерживают в кипя-
щей воде в течение 10 мин и центрифугируют для осаждения кле-
точного дебриса. Анализируют присутствие белковых полос ожида-
емого мол. веса в сравнении с контрольными пробами (см. рис. 3.4.1).
После окончания индукции всю клеточную суспензию собирают
центрифугированием (5000 об./мин, при 4 °С в течение 20 мин),
надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в буфе-
ре, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 8,0 и сохраняют при -70 °С или
используют для дальнейших манипуляций (например, для очистки
целевого белка). Важно иметь в виду, что тельца включения, кото-
рые могут сформироваться в ходе экспрессии целевого гена, трудно
растворимы после замораживания.
250 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Рис. 3.4.1. Экспрессия целевых белков размером 21 и 23 кДа в клетках
М15 Е. coli. Уровень экспрессии оценивали через 4 ч после добавления
ИПТГ (+ ИПТГ). В качестве контроля служили пробы, отобранные до ин-
дукции (- ИПТГ). Пробы после индукции использовали для очистки целе-
вых белков методом ионно-аффинной хроматографии с использованием
Ni-агарозы (Ni). Справа стрелками указана позиция экпрессированных
белков, слева (М) — позиция маркера, кДа
На рис. 3.4.1 представлены результаты экспрессии белков с мо-
лекулярным весом 21 и 23 кДа в клетках Е. coli, которые кодируют-
ся генами, входящими в один оперон, а также результат очистки
этих белков. Гены были клонированы в плазмиде pQE30, содержа-
щей полинуклеотидный «довесок» для кодирования (His)б-последо-
вательности в TV-концевой части рекомбинантного белка (рис. 3.4.1).
Уровень экспрессии целевых белков проверяли через 4 ч после до-
бавления ИПТГ (+ ИПТГ). В качестве контроля брали пробы, ото-
бранные до индукции (- ИПТГ). Положительные (+)-пробы приме-
няли для очистки целевых белков методом ионно-аффинной хрома-
тографии с использованием никелевой Ni-агарозы («Qiagen», кат.
№ 30210) (рис. 3.4.1).
Экспрессия токсичных белков
Как правило, стандартной ростовой средой выращивания бактерий
является среда LB. Однако для экспрессии генов токсичных белков
фирма «Novagen» рекомендует использовать вектор рЕТ-22b(+) и
ростовую среду ТВ [5]. При использовании вектора рЕТ-22b(+) ре-
комбинантные белки достраиваются сигнальным пептидом, направ-
ляющим их в периплазматическое пространство, где этот пептид от-
щепляется пептидазой. При этом снижается степень токсичности
белка и вероятность формирования телец включения. ТВ-среда счи-
тается более питательной, чем LB. Глицерин в ее составе является
дополнительным источником углерода. Кроме того, при росте на
среде ТВ клетки меньше закисляют среду, что положительно сказы-
вается на их пролиферации и белковом синтезе. Для культивации
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 251
бактерий единичную колонию инокулируют в 2 мл жидкой ТВ сре-
ды, содержащей антибиотик, и клетки выращивают при 37 °С до
ОП600 = 0,2-0,6. После этого клетки осаждают коротким центрифу-
гированием, надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспенди-
руют в 2 мл среды ТВ. Затем 100 мкл клеток переносят в 8 мл среды
ТВ, содержащей 50 мкг/мл карбенициллина и снова подращивают
до ОП600 = 0,2-0,6. Клетки опять собирают центрифугированием
(2500 об./мин, 5 мин), ресуспендируют в свежей среде ТВ, содержа-
щей 50 мкг/мл карбенициллина, добавляют ИПТГ в концентрации
1 мМ и индукцию проводят при 30 °С в течение двух часов при пос-
тоянной аэрации. После окончания индукции клетки собирают
центрифугированием (12 000 об./мин при 4 °С в течение 15 мин), ре-
суспендируют в буфере 20 мМ трис-HCl рН 8,0 и используют для
дальнейшего анализа. После индукции все образцы (включая кон-
трольные) сохраняют при -70 °С.
Для экспрессии токсичных и мембранных белков фирма «Roche»
(Швейцария) предлагает систему Rapid Translation System, позво-
ляющую проводить экспрессию белков в лизате Е. coli in vitro [7].
Специально для этого разработан прибор, содержащий два отделе-
ния, разделенные полупроницаемой мембраной: реакционное отде-
ление, в котором происходит экспрессия белка, и «фидинг»-отделе-
ние, в которое поступает вновь синтезированный белок. Удаление
синтезируемых полипептидов из реакционного отделения сквозь
полупроницаемую мембрану в 10-мл «фидинг»-отделение позволяет
предотвратить подавление трансляции накоплением уже экспресси-
рованного белка, а также его возможную деградацию. Экспрессию
белков проводят при 30 °С в течение 24 ч, объем реакции в обоих
случаях составляет 1 мл.
Оптимизация условий экспрессии
При оптимизации условий экспрессии необходимо подбирать тем-
пературный режим и концентрацию ИПТГ. Как правило, стандарт-
ную экспрессию целевого белка проводят при 37 °С и концентрации
ИПТГ 1 мМ. Однако не всегда количественный выход нужного про-
дукта достигает максимального уровня. Агрегация экспрессирован-
ного белка в тельца включения также снижает выход нативного бел-
ка. Поэтому для получения растворимой формы целевого белка
культивирование клеток проводят при пониженных температурах в
диапазоне 16-26 °С. Также известно, что высокая скорость роста до
индукции не всегда приводит к накоплению целевого белка даже
при последующем понижении температуры.
252 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Очистка рекомбинантных белков
Как уже отмечалось выше, для очистки экспрессированного белка
чаще всего используют «довесок» (His)6-tag, который может нахо-
диться на его N- или С-конце. Хроматографическую очистку реком-
бинатных белков, содержащих (His)6-tag, проводят методом ион-
но-аффинной хроматографии с использованием Ni-агарозы («Qiagen»,
кат. № 30210), в нативных или денатурирующих условиях в соответ-
ствии с протоколом фирмы «Qiagen» [3]. (His)б-последовательность
связывается с никель-хелатным сорбентом, при этом имидазольные
кольца соседних гистидинов занимают два свободных координаци-
онных места в комплексе никеля с иммобилизованным нитролотри-
ацетатом. Связывание (His)6-белка с сорбентом осуществляется в
щелочной области рН, когда имидазольные кольца гистидинов депро-
тонированы. При понижении рН комплекс разрушается, и рекомби-
нантный белок элюируется с колонки. Таким образом, становится
возможным, предварительно отмыв при высоких рН не связавшие-
ся с сорбентом белки Е. coli, после понижения рН избирательно элю-
ировать целевой белок. Очистку гибридных белков из лизатов Е. coli,
содержащих GST-tag, проводят путем инкубации с глутатион-сефа-
розой, так как белок GST взаимодействует с глутатионом.
Процедура очистки (His)6-белка
Для очистки целевого белка в нативных условиях осадок клеток
после индукции ресуспендируют в буфере для лизиса (в нативных
условиях) из расчета 2-5 мл буфера на грамм сырого веса клеток,
затем добавляют лизоцим до конечной концентрации в пределах
1 мг/мл и инкубируют 30 мин на льду. Затем клеточную суспензию
обрабатывают ультразвуком по 10 с при 200-300 W с интервалом
10 с для охлаждения. Если лизат достаточно вязкий, то рекоменду-
ется добавить РНКазу А (10 мкг/мл) и ДНКазу I (5 мкг/мл) и инку-
бировать на льду в течение 10-15 мин.
Для очистки целевого белка в денатурирующих условиях осадок
клеток после индукции ресуспендируют в буфере для лизиса А или
Б, содержащих денатурирующие реагенты, 6 Μ гуанидигидрохло-
рид или 8 Μ мочевину соответственно. Клеточную суспензию инку-
бируют при комнатной температуре в течение 15-60 мин, периоди-
чески аккуратно помешивая.
После лизиса клеточную суспензию центрифугируют 30 мин
при 10 000 об/мин и 4 °С. Надосадочная жидкость (лизат) должна
быть прозрачной, без примесей клеточного дебриса. При необходи-
мости процедуру центрифугирования повторяют. Полученный ли-
зат незамедлительно используют для очистки целевого белка или
замораживают в жидком азоте и сохраняют при -70 °С.
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 253
4 мл лизата наносят на колонку объемом 1 мл, содержащую
Ni-NTA агарозу («Qiagen», кат. № 30624), предварительно уравно-
вешенную 10 объемами буфера для лизиса. Агарозу аккуратно пере-
мешивают с лизатом и инкубируют при постоянном помешивании
на круговом роторе (скорость вращения 200 об./мин) при 4 °С в тече-
ние 15-30 мин. Затем открывают нижний выход колонки и собира-
ют фракцию, содержащую не связавшиеся с агарозой белки. Колон-
ку промывают 10 объемами буфера для лизиса и последовательно
4 объемами промывочного буфера. При этом собирают фракции для
анализа. Целевой белок элюируют буфером для элюции 4 раза по
0,5 мл. Аликвоты по 5-10 мкл из каждой фракции анализируют с
помощью ДДС-Na-ПААГ. Пример такой очистки проиллюстриро-
ван на рис. 3.4.1.
Колонку с Ni-NTA агарозой можно сохранять и использовать по-
вторно, для чего сразу после использования необходимо провести ее
очистку и при необходимости регенерацию [3]. С этой целью колон-
ку объемом 1 мл промывают 4 мл буфера для регенерации (4 объема
колонки), содержащего раствор 6 Μ GuHCl и 0,2 Μ уксусной кис-
лоты. Затем последовательно промывают 5 мл дистиллированной
воды, 3 мл 2% ДСН, 1 мл 25% этанола, 1 мл 50% этанола, 1 мл
75% этанола, 5 мл 100% этанола, 1 мл 75% этанола, 50% этанола,
25% этанола и 1 мл дистиллированной воды. После этого колонку
промывают 5 мл 100 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 20 мл дистиллированной
воды. При наличии остатков этанола в колонке промывку дистил-
лированной водой повторяют еще раз. Затем колонку насыщают ни-
келем добавлением 2 мл 100 мМ NiSO4, промывают 2 мл дистилли-
рованной воды и 2 мл буфера для регенерации. После этого колонку
уравновешивают в подходящем буфере для лизиса. Для длительно-
го хранения колонку промывают дистиллированной водой, затем
2 мл 25% этанола. После этого колонку закрывают снизу, и уровень
25% этанола доводят до половины колонки. Хранят при +4 °С.
Возможные проблемы
Основной проблемой при получении целевых белков в бактериаль-
ных клетках является их низкая экспрессия, что может быть связано
с различными факторами, включая неподходящий бактериальный
штамм, вектора экспрессии или условия культивирования клеток.
В табл. 3.4.2 описаны некоторые примеры возможных проблем, воз-
никающих при экспрессии белков, а также варианты их разрешения.
Таким образом, в настоящем разделе рассмотрен метод экспрес-
сии целевых (рекомбинантных) белков в бактериальных клетках.
Это лишь один из многочисленных подходов, позволяющих полу-
чать нужные белки. Другие системы экспрессии рассмотрены в моно-
254 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
графии [8]. Необходимо еще раз отметить, что выбор организма,
метода и условий экспрессии, а также способов очистки целевого
(рекомбинантного) белка в первую очередь зависит от цели исследо-
вания и природы получаемого белка и требует тщательного предва-
рительного анализа.
Литература
1. Hardin С, Edwards J., Riell Α., Presutti D., Miller W.,
Robertson D. Cloning, Gene Expression, and Protein Purification.
Publisher// Oxford University Press, USA, 2001. Edited by
Charles Hardin, Jennifer Edwards. 424 с
2. Альберте Б., Брей Д. и др. Молекулярная биология клетки. М.,
Мир. 1994. Т. 1-3. 1558 стр.
3. QIAgenes Ε. coli Handbook — English (PDF)
http://www.qiagen.com/literature/render.aspx?id=103714
4. Furlong J., Meighan M,, Conner J., Murray J. and BarklieJ.
Clements. Methods for improved protein expression using Pet
vectors. Nucleic Acids Research, Vol. 20. № 17. 1992.
5. Novagen. 2001. Protein Expression: Prokaryotic Expression: pET
System Overview. 2001. Novagen Catalog. P. 68-72.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической ин-
женерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984. 479 стр.
7. Roche Diagnostics GmbH. Rapid Translation System RTS pIVEX
His-tag Vector Set// кат. № 3253538
http://wolfson.huj i.ac.il/ expression/pivex-his .pdf
8. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М., Нау-
ка, 2004. С. 168-191.
Таблица 3.4.2. Возможные проблемы и их решения при экспрессии белков
Пути решения
Проблема
Вектор
Штамм
Условия культи-
вирования
Белок не ин-
дуцируется
Уменьшить дис-
танцию между
инициирующим
кодоном ATG и
рибосома-связы-
вающим сайтом
до 2-8 п.н.
Заменить вектор
Раздел 3.4. Экспрессия целевых белков в бактериях 255
Таблица 3.4.2. Возможные проблемы и их решения при экспрессии бел-
ков (окончание)
Пути решения
Проблема
Вектор
Штамм
Условия культи-
вирования
Деградация
РНК
Наличие
редких ко-
донов
Целевой ген
обусловли-
вает потерю
или инакти-
вацию гена
DE3 lys
Экспрессия
токсичных
белков
Использовать
векторы, структу-
рирующие РНК
Заменить кодоны
для оптимизации
с помощью мута-
генеза
Использовать
мало-копийные
плазмиды
Использовать
векторы с полным
подавлением экс-
прессии целевого
гена до его ин-
дукции
Применять векто-
ры, где экспрес-
сия целевого бел-
ка находится под
контролем
Т7-промотора;
Применять векто-
ры, в которых
экспрессия целе-
вого белка строго
регулируется
lас-оператором
Использовать
штаммы, дефект-
ные по гену РНКа-
зы (BL21Star)
Использовать
штаммы, способ-
ные считывать
редкие кодоны
(штаммы Rosetta,
Codon +)
Использовать
штаммы гесА-
(HMS174; BLR)
Использовать
штаммы,
BL21AI или
BL21(DE3)pLysS/E,
также штаммы
С41 и С43
Выращивать бак-
терии при низких
температурах
Выращивать бак-
терии на мини-
мальной среде
или при низких
температурах для
снижения скорос-
ти трансляции
Уменьшить кон-
центрацию индук-
тора
Использовать
недавно транс-
формированные
бактерии
Для подавления
фоновой экспрес-
сии клетки выра-
щивать на глю-
козе
Проводить индук-
цию при высокой
плотности клеток
Уменьшить время
индукции
Для подавления
фоновой экспрес-
сии клетки выра-
щивать на глю-
козе
256 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
3.5. ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ (IN SITU) ЛОКАЛИЗАЦИЯ
АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ УГЛЕВОДНОГО
МЕТАБОЛИЗМА В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ
Л. И. Сергеева
Введение
Для локализации экспрессии генов используют in situ гибридиза-
цию и репортерные гены, присоединенные к промотору исследуемо-
го гена. Однако определение мРНК или активности репортерного
гена не гарантирует полного соответствия активности гена и коди-
руемого им белка, так как может происходить пост-транскрипцион-
ная регуляция. Для нахождения и локализации белка часто приме-
няют иммунологические методы. Но и наличие белка не гарантирует
его активности in situ: он может быть активирован/инактивирован
в процессе протеолиза, энзиматической модификации или с помощью
другого регуляторного механизма. Активности ферментов традици-
онно определяют в экстрактах, но этот метод также не дает информа-
цию о точной локализации активного фермента в растении. Таким об-
разом, даже демонстрация экспрессии гена с помощью нозерн-блот
анализа или in situ гибридизации наряду с иммунологическим опре-
делением белка и измерением активности в экстрактах не показыва-
ет активного фермента в определенной ткани или типе клеток.
Для целого ряда ферментов разработаны методы определения
активности in situ, например активность фосфатаз может быть ви-
зуализирована с помощью солей разных металлов; азокрасителей;
соединений, содержащих броминдольную группу [1]. Другой воз-
можный метод — это сопряжение окисления НАДН с восстановле-
нием нитросинего тетразолия (НСТ), приводящее к образованию си-
него преципитата — формазана. Этот метод в основном применим
к различным редуктазам: тетразол-редуктазе, глюкозо-6-фосфат де-
гидрогеназе (Гл-6Ф-ДГ), изоцитрат дегидрогеназе и уридин-5-ди-
фосфоглюкоза дегидрогеназе [1-3]. На животных тканях он также
применялся для обнаружения некоторых других ферментов, напри-
мер гексокиназы (ГК) и фосфоглюкомутазы (ФГМ). В 1988 г. описа-
на модификация НСТ-метода, которая включала сопряжение серии
энзиматических реакций [4]. Согласно этой модификации, актив-
ность сахарозосинтазы (СС) в развивающихся зерновках кукурузы
была визуализирована путем ее сопряжения через серию реакций со
«вспомогательными» ферментами с восстановлением НСТ. Сходные
протоколы были разработаны уже несколько десятков лет назад, но
никогда не находили широкого применения в исследовании расте-
ний, в частности в силу недоступности необходимых промежуточ-
Раздел 3.5. Гистохимическая локализация активности ферментов 257
ных ферментов [2]. Текси и др. также локализовали активности не-
скольких ферментов с помощью вспомогательных энзимов [5], но
эти авторы использовали отпечатки тканей (tissue-print), что имеет
недостаток — низкое пространственное разрешение.
В 2002 г. мы показали, что подобный гистохимический метод
может найти применение для локализации активности ферментов
на срезах тканей самых различных растений [6]. Метод был успеш-
но апробирован на ряде ферментов углеводного метаболизма, среди
которых уридин-5'-дифосфоглюкозопирофосфорилаза (УДФГ-ПФ),
аденозин-5'-дифосфоглюкозопирофосфорилаза (АДФГ-ПФ) и фос-
фоглюкозоизомераза (ФГИ), локализация которых, насколько нам
известно, в растительных тканях ранее не проводилась. В последние
годы метод нашел дальнейшее применение при изучении смены
программ развития растений [7, 8]; при установлении связи между
активностью ферментов первичной метаболизации сахарозы и рос-
товыми процессами [9]; для локализации активностей в интактных
проростках [10] и интактных зародышах семян [11]; как полуколи-
чественный метод в сочетании с другими методиками, например с
QTL-анализом, для нахождения локусов генов [10, 12] (см. раз-
дел 2.8).
Принцип метода
Принципом визуализации активности ферментов в настоящей ра-
боте является сопряжение окисления НАДН с восстановлением
НСТ, приводящее к преципитации синих кристаллов формазана.
Для всех ферментов, описанных в настоящей работе, этот метод яв-
ляется опосредованным: продукт ферментативной реакции, кото-
рую необходимо обнаружить, используется как субстрат для серии
последовательных реакций, в итоге приводящих к восстановлению
НАД. Схема этих реакций приведена на рис. 3.5.1.
До окрашивания и визуализации активностей ферментов ткань
должна пройти процедуру фиксации, так как все исследованные
ферменты, за исключением инвертазы клеточных стенок, являются
растворимыми белками. Важно, чтобы исследуемый фермент был
зафиксирован («заякорен») в том месте, где он присутствует в орга-
не/ткани, без существенной потери его активности. Удачным явля-
ется сочетание мягкого фиксатора и незамедлительной фиксации
уже во время приготовления среза. При этом только исследуемый
фермент зафиксирован внутри ткани, тогда как субстраты и «сопря-
женные ферменты», добавленные в среду инкубации, находятся в
растворимой форме. Следовательно, преципитация НСТ будет пока-
зывать локализацию фермента только в том случае, если вся цепь
258 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
(^Инвертаза)
Сахароза
УДФ4
СС
глюкоза
АТФ
~АДФ
(Гексокиназа^ \ ф-6-Ф
фруктоза УДФГл
(ФК ) Пф V (УДФГ-ПФ )
^ф ( АДФГ-Пф)
Гл-1-Ф
(ФГИ
Гл-6-Ф
фгм)
НАД
АТФ ПФ
АДФГл
( Гл-6-Ф-дГ)
НСТвосст.
Формазан
НСТокисл.
НАДН
6-фосфо-глюконат
Рис. 3.5.1. Схема реакций для гистохимического определения фермен-
тов. Условные обозначения: АДФГл — аденозин-5'-дифосфоглюкоза;
АДФГ-ПФ — аденозин-5'-дифосфоглюкоза-пирофосфорилаза; Гл-1-Ф —
глюкозо-1-фосфат; Гл-6-Ф — глюкозо-6-фосфат; Гл-6Ф-ДГ — глюко-
зо-6-фосфат дегидрогеназа; ПФ — пирофосфат; СС — сахарозосинтаза;
УДФГл — уридин-5'-дифосфоглюкоза; УДФГ-ПФ — уридин-5'-дифос-
фоглюкоза-пирофосфорилаза; ФГМ — фосфоглюкомутаза; ФГИ — фос-
фоглюкоизомераза; ФК — фруктокиназа; Ф-6-Ф — фруктозо-6-фосфат;
НСТ — нитросиний тетразолий. См. цвет, вклейку, рис. 5
реакций, следующих за начальным этапом, который катализирует
изучаемый фермент, будет протекать намного быстрее, чем проис-
ходит диффузия промежуточных продуктов.
Протокол локализации для всех исследованных ферментов (за
исключением инвертазы) основан на превращении глюкозо-6-фос-
фата в фосфоглюконат и сопутствующее восстановление НАД. Тип
субстрата и «сопряженных» ферментов определяет специфичность
метода для каждого индивидуального фермента. Локализация ин-
вертазы не может быть осуществлена при сопряжении окисления
НАД с восстановлением НСТ, так как гидролиз сахарозы с помощью
кислой инвертазы осуществляется при рН 6,0, тогда как все другие
описанные в настоящей статье ферметативные реакции протекают в
более щелочной среде, при рН 7,4-8,0. В наших исследованиях для
локализации инвертазы мы использовали метод [13], согласно кото-
рому восстановление и преципитация НСТ происходят при участии
глюкозооксидазы и феназинметосульфата в процессе окисления
глюкозы (образовавшейся в результате распада сахарозы под воздей-
ствием инвертазы) до глюконовой кислоты.
Раздел 3.5. Гистохимическая локализация активности ферментов 259
Материалы и протоколы
Растительный материал и условия выращивания
Эксперименты проводили на листьях гастерии (Gasteria verrucosa
Η. Duval); листьях кукурузы (Zea mays L.); листьях банана (Musa sp.);
стеблях петунии (Petunia hybrid); стеблях, черешках листьев, корнях,
клубнях картофеля (Solarium tuberosum L. cv «Bintje»); плодах земля-
ники (Fragaria χ ananassa), проростках арабидопсиса (Arabidopsis
thaliana L. Heynh); развивающихся плодах и семенах и прорастаю-
щих семенах томата (Lycopersicon exculentum Mill, cv Moneymaker).
Растения выращивали в фитотроне или теплицах в стандартных
условиях для каждого вида растений. 7-8-дневные проростки ара-
бидопсиса выращивали в чашках Петри на влажной фильтроваль-
ной бумаге.
Получение срезов и фиксация
Срезы толщиной 120 или 200 мкм получали на салазочном микрото-
ме. Срезы толщиной 200 мкм использовали только для локализации
инвертазной активности, поскольку кислая инвертаза является
апопластным ферментом, и при меньшей толщине среза наблюдали
диффузное окрашивание вследствие вытекания содержимого из по-
врежденных микротомным ножом слоев клеток. Срезы немедленно
фиксировали (первые капли фиксатора наносили кисточкой на рас-
тительный объект и нож микротома уже при получении среза) в
растворе 0,01 Μ дитиотреитола (ДТТ) с 2% параформальдегидом и
2% растворимым поливинилпирролидоном 40 (рН 7,0) в течение 1 ч
при 4 °С. После фиксации срезы промывали дистиллированной во-
дой и оставляли на ночь при 4 °С, после чего промывали еще не менее
5 раз (для удаления растворимых Сахаров) с интервалом не менее
30 мин. Срезы могли храниться при 4 °С до 5 дней без значительно-
го снижения активности локализуемых ферментов. Интактные про-
ростки арабидопсиса фиксировали и промывали согласно протоко-
лу для срезов растений.
Локализация
Основной протокол для исследуемых ферментов
Для определения активности ферментов срезы инкубировали в 1 мл
инкубационной среды в пластиковых пробирках на 2 мл или в стек-
лянных пузырьках на 7 мл в водяной бане при 30 °С в течение
30 мин. В ряде опытов период инкубации составлял 2-3 ч. Продол-
жительность инкубации зависела в большей степени от типа иссле-
дуемой ткани и этапа развития растения, чем от типа испытуемого
260 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
фермента. В случае сравнения активностей между тканями или об-
работками срезы всегда инкубировали равное время. После инкуба-
ции ферментные реакции останавливали, промывая срезы в дистил-
лированной воде. Срезы хранили в дистиллированной воде при 4 °С,
так как они могли храниться, по крайней мере, месяц без потери
окрашивания.
Специальные протоколы для изучаемых ферментов
Активность УДФГ-ПФ визуализировали, инкубируя срезы в реак-
ционной среде, используемой для определения активности в экс-
трактах (модификация метода [14]). Реакционная смесь содержала
100 мМ HEPES-NaOH буфер (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 2 мМ ацетата Mg,
1 мМ НАД, 1 Ε ФГМ из мышцы кролика («Roche», Германия), 1 Ε
Гл-бФ-ДГ из Leuconostoc («Roche», Германия), 20 мМ глюко-
зо-1,6-бисфосфата, 0,9 мМ пирофосфата (PPi) и 0,03% НСТ. Реак-
цию начинали, добавляя субстрат — 5 мМ УДФГ. В контрольных ре-
акциях в инкубационную смесь не вносили УДФГ, или УДФГ и PPi,
или PPi, или НАД.
Активность АДФГ-ПФ была визуализирована при инкубации
срезов в реакционной среде, используемой для определения актив-
ности в экстрактах (модификация метода [14]). Реакционная смесь
содержала 75 мМ HEPES-NaOH буфер (рН 8,0), 0,44 мМ ЭДТА, 1 мМ
ЭГТА, 5 мМ MgCl2, 0,1% БСА, 1 мМ НАД, 20 мМ глюко-
зо-1,6-бисфосфат, 2 Ε ФГМ, 6 Ε Гл-бФ-ДГ, 2 мМ фосфоглицерат,
10 мМ NaF, 1,4 мМ PPi и 0,03% НСТ. Реакцию запускали, добавляя
2 мМ АДФГ. В контрольных реакциях в инкубационную смесь не
вносили АДФГ, или АДФГ и PPi, или PPi, или НАД.
Активность СС визуализировали, инкубируя срезы в реакцион-
ной среде, как описано ранее [4] с некоторыми модификациями.
Инкубационная смесь содержала 50 мМ HEPES-NaOH буфер (рН 7,4),
1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2, 0,1% БСА, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ НАД, 1 Ε
ФГМ, 1 Ε Гл-бФ-ДГ, 20 мМ глюкозо-1,6-бисфосфат и 0,03% НСТ.
Реакцию инициировали, добавляя раствор субстратов, включаю-
щий сахарозу, УДФ и PPi, в конечной концентрации в инкубацион-
ной среде 3,6 мМ, 71 мкМ и 71 мкМ, соответственно. Контрольные
срезы инкубировали без сахарозы, или без ФГМ, глюкозо-1,6-бисфос-
фата и PPi, или без НАД.
Инвертазную активность определяли, следуя протоколу [13]. Ин-
кубационная среда включала 38 мМ Na3PO4 буфер (рН 6,0), 25 Е
глюкозо-оксидазы (ГО, «Roche», Германия), 0,024% НСТ, 0,014% фе-
назин-метосульфат и 1% сахарозы. В контрольных препаратах от-
сутствовали сахароза, или ГО, или феназин-метосульфат.
Раздел 3.5. Гистохимичесская локализация активности ферментов 261
Активности ГК и фруктокиназы (ФК) визуализировали, инку-
бируя срезы в реакционной (среде, используемой для определения
активности в экстрактах (модификация метода [14]). Инкубацион-
ная среда включала 50 мМ 2-(бис(2-гидроксиэтил)амино-2-(гид-
роксиметил)-1,3-пропанодиол (Bis-Tris) буфер (рН 8.0), 6,25 мМ
MgCl2 , 2,5 мМ АТФ, 1 мМ НАД, 1 Ε Гл-6Ф-ДГ, 1 Ε ФГИ («Roche»,
Германия, только для определения ФК), 12,5 мМ HEPES-NaOH бу-
фер (рН 7,4), 0,25 мМ ЭГТА, 0,25 мМ ЭДТА, 0,025% БСА, 0,3%
НСТ. Реакцию запускали, добавляя 0,5 мМ глюкозы (или 0,5 мМ
фруктозы в случае определения ФК). В контрольных реакциях в
инкубационную смесь не внюсили глюкозу (или, соответственно,
фруктозу), или АТФ, или Гл-6Ф-ДГ, или НАД.
Микроскопия и фотографирование
Срезы исследовали под бинокуляром (Leica) или микроскопом (Nicon
Optiphot). Фотографии получены с помощью цифровой цветной ви-
деокамеры Panasonic или Sony CCD DKR 700.
Оценка влияния фиксации на активности ферментов
Срезы тканей фиксировали и промывали согласно стандартному
протоколу. Контрольные срезы инкубировали в буфере (подобному
буферу для экстракции, [14]) вместо фиксатора. Затем из тканей
экстрагировали растворимые белки и определяли в растворимой
фракции активности ферментов по методу [14, 15]. Активности
определяли в экстрактах из срезов растущих клубней картофеля
(АДФГ-ПФ, УДФГ-ПФ, ФГМ, ФГИ, ГК, ФК) или из выращенных in
vitro растений картофеля (ОС, кислая растворимая инвертаза, ин-
вертаза клеточных стенок).
Результаты. Примеры локализации
Влияние фиксации на общую активность фермента изучали, сравни-
вая активность ферментов в экстрактах из фиксированных и нефикси-
рованных тканей. Фиксация и последующее промывание тканей при-
водили к потере от 31% до 69% активности для разных ферментов,
среднее снижение составило 54% . Потеря активности происходила
преимущественно за счет фиксации, а не последующей промывки.
Ферменты, включенные в схему на рис. 3.5.1, участвуют в угле-
водном метаболизме. Поэтому развивающиеся клубни картофеля, у
которых происходит активный углеводный метаболизм, могут слу-
жить в качестве показательного модельного объекта [14, 15]. Все изу-
чаемые ферменты были локализованы в растущих клубнях или
стеблях картофеля [6]. На рис. 3.5.2 показан общий вид локализа-
ции АДФГ-ПФ, ФК, ГК и ФГИ в клубнях картофеля. В контроль-
262 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Рис. 3.5.2. Локализация ферментов в развивающихся клубнях картофе-
ля. (А) Активность АДФГ-ПФ в 12-дневных клубнях: (А1) общий вид про-
дольного среза клубня, показывающий активность фермента в большин-
стве тканей (бар = 2 мм); (А2) отсутствие активности в контрольном инку-
бировании без АДФГл (бар = 2 мм); (A3) деталь (А1), показывающая
интенсивную локализацию в запасающих крахмал паренхимных клет-
ках (бар = 30 μ). (Б) Активность ФК в развивающихся клубнях картофеля:
(Б1) общий вид продольного среза клубня, показывающий высокую ак-
тивность ФК в большинстве тканей, особенно в сосудистых пучках (бар =
= 2 мм); (Б2) деталь (Б1), показывающая локализацию активности в апи-
кальной почке клубня (бар = 150 μ); (БЗ) высокая активность ФК в клет-
ках, окружающих сосуд в 7-дневном клубне (бар = 30 μ). (В) Активность
ФГИ в прорастающем 5-месячном клубне. Сильное окрашивание вокруг
ростка и в сосудистой ткани (бар = 500 μ). (Γ) ГК-активность в развиваю-
щихся клубнях: (Г1) апикальная почка 5-дневного клубня. Интенсивное
окрашивание в листовых примордиях, центральной и латеральных зонах
апекса (бар = 100 μ); (Γ2) ГК-активность вокруг ядер в клетках субапи-
кальной зоны 5-дневного клубня (бар = 30 μ). См. цвет. вклейку, рис. 6
ных вариантах, в которых непосредственный субстрат исследуемого
фермента не был включен в инкубационную смесь, никогда не наб-
людали синего окрашивания ни для одного из ферментов (см., на-
пример, рис 3.5.2.А2). Другие контрольные реакции, в которых не
добавляли НАД или один из «вспомогательных» энзимов, также не
Раздел 3.5. Гистохимическая локализация активности ферментов 263
давали окрашивания (данные не показаны). В целом, в сосудистых
тканях окрашивание было сильнее, чем в других тканях, которые в
клубнях картофеля главным образом состоят из запасающих па-
ренхимных клеток. Подобная локализация активности не может
быть объяснена просто как общая более высокая активность обмена
веществ в клетках сосудистых тканей или прилегающих к ним,
так как отдельные ферменты показали иную картину локализации
(сравните АДФГ-ПФ и ФК активности, рис. 3.5.2., А1, Б1). Метод
является достаточно чувствительным для получения информации
об уровне активности в индивидуальных клетках, как, например,
показано для ФГМ: в паренхимных клетках, непосредственно при-
легающих к сосудистым тяжам и не содержащих крахмала, обнару-
жена намного более высокая активность, чем в соседних с ними па-
ренхимных клетках, содержащих крахмал [6].
Из рис. 3.5.2.Г2 видно, что возможна даже субклеточная локали-
зация, по крайней мере для активности ГК. Кристаллы НСТ преципи-
тированы вокруг ядер клеток. Подобная локализация навряд ли явля-
ется артефактом, так как наблюдалась в случае ГК, СС и АДФГ-ПФ,
но не ФК, ФГИ или ФГМ (данные не показаны).
Помимо клубней картофеля, у ряда растительных видов были
проанализированы различные органы: корни, стебли, гипокотили,
листовые пластинки и черешки листьев, плоды. Небольшая часть
полученных результатов приведена на рис. 3.5.3. В развивающихся
плодах томатов наблюдали отчетливую картину локализации ак-
тивности УДФГ-ПФ и АДФГ-ПФ (рис. 3.5.3., ΑΙ, Α2). Оба фермента
проявляли высокую активность в молодых семенах, сосудистой тка-
ни плодов и субэпидермальных слоях и более низкую — в паренхи-
ме перикарпа.
О специфичности метода можно судить по различной картине
локализации ферментов внутри семян. УДФГ-ПФ проявляла высо-
кую активность в различных частях развивающихся семян, тогда
как АДФГ-ПФ активность была обнаружена только в одной части
семени — зародышевом мешке. ФГМ была также активна в плодах
томатов, с преимущественной локализацией в сосудистых пучках, и
намного менее активна в семенах. Окрашивание в эпидермальных
слоях наблюдали главным образом вследствие наличия эндоген-
ных пигментов, как можно заключить из контрольного варианта
[6]. На поперечных срезах стеблей петунии активность УДФГ-ПФ
выявлена в большинстве тканей (рис. 3.5.3.Б1). Наибольшая актив-
ность отмечалась во внутренней и наружной флоэме сосудистого ци-
линдра и в хлорофилл-содержащих наружных слоях коры.
В волосках стеблей также локализована высокая активность
УДФГ-ПФ, особенно в апикальных клетках (рис. 3.5.3.Б2). Эта ак-
264 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Рис. 3.5.3. Локализация активности ферментов в различных органах и
тканях растений. (А) Развивающийся плод томата: (А1) высокая ак-
тивность УДФГ-ПФ в большинстве тканей (бар = 2 мм); (А2) активность
АДФГ-ПФ, значительно меньшая в семени, по сравнению с УДФГ-ПФ
(бар = 2 мм). (Б) Стебель петунии: (Б1) высокая активность УДФГ-ПФ
во внутренней и наружной флоэме и в содержащих хлорофилл наруж-
ных слоях коры на поперечном срезе (бар = 500 μм); (Б2) УДФГ-ПФ и
(БЗ) АДФГ-ПФ активности в волосках стебля петунии (бар = 30 μм).
(В) Стебель картофеля: (В1) локализация гексокиназы в устьицах в стеб-
ле (бар = 30 μ); (Β2) активность инвертазы в стебле ipt-трансгенного карто-
феля (бар =150 μ); (ВЗ) Активность СС в стебле ipt-трансгенного картофе-
ля (бар = 150 μ). (Γ) Локализация УДФГ-ПФ в 7-дневном интактном про-
ростке Arabidopsis (бар = 1,5 мм). См. цвет, вклейку, рис. 7
тивность была специфична для УДФГ-ПФ, т. к. при локализации
тесно связанного с УДФГ-ПФ фермента — АДФГ-ПФ — никакой ак-
тивности, даже при продолжительной инкубации, обнаружено не
было (рис. 3.5.3.БЗ). В других тканях стеблей петунии активность
АДФГ-ПФ также присутствовала (данные не показаны). В зеленых
листьях также было возможно локализовать активности фермен-
тов, несмотря на наличие хлорофилла. В суккулентных листьях
Gasteria verrucosa обнаружена высокая активность УДФГ-ПФ в па-
лисадной и губчатой паренхиме, тогда как активность практически
отсутствовала в эпидермальных клетках и в центральной паренхи-
Раздел 3.5. Гистохимическая локализация активности ферментов 265
ме, не содержащей хлорофилл. В листьях кукурузы высокая актив-
ность СС была локализована во флоэме, прилегающей к сосудистым
пучкам, но отсутствовала в окружающих тканях [6].
Высокое разрешение метода, предоставляющего информацию
на клеточном уровне, показано на рис. 3.5.3.В1. В запирающих клет-
ках устьиц у картофеля была обнаружена достаточно высокая ак-
тивность ГК, но в остальной части эпидермиса и паренхимных клет-
ках эта активность была намного ниже. Небольшие гранулы соли
тетразолия, присутствующие в эпидермальных клетках, предпола-
гают локализацию ГК в специфическом типе органелл, по-видимо-
му, в митохондриях.
Оценка метода. Возможные проблемы
Представленный метод описывает основной протокол для локализа-
ции in situ активности различных ферментов, с тем условием, что
активность исследуемого фермента должна быть сопряжена с вос-
становлением НАД, окисление которого, в свою очередь, сопряжено
с восстановлением и преципитацией НСТ. Возможности метода по-
казаны на ряде ферментов углеводного метаболизма и для различ-
ных тканей. В течение ряда лет метод применяли для локализации
ферментов, которые сами восстанавливают НАД. Однако в настоя-
щей работе мы показали, что ферменты, которые не восстанавлива-
ют НАД непосредственно, могут быть обнаружены при использова-
нии одной или более вспомогательных ферментных реакций, в ито-
ге приводящих к восстановлению НАД. Высокое пространственное
разрешение и четкая картина локализации во всех исследуемых
тканях показывают, что преципитация НСТ действительно отража-
ет местонахождение активно работающего in situ фермента.
Возможные артефакты
Фиксация ткани должна быть достаточно мягкой (щадящей), чтобы
сохранить активность изучаемого фермента. Из литературных дан-
ных известно, что при потере активности вплоть до 75% можно про-
водить достоверную локализацию ферментов. Данные по остаточ-
ной активности не означают непременно, что ферменты были ин-
активированы; активность может частично быть восстановлена из
нерастворимой в буфере фракции путем экстракции из осадков при
добавлении содержащего тритон буфера. Таким образом, фиксация
обычно приводит к иммобилизации белков (как и ожидается), делая
их менее растворимыми, но не неактивными.
Побочные ферментативные реакции, вследствие нежелательных
или неспецифических активностей, приводящие к восстановлению
НАД, могли бы давать ошибочную картину локализации. Для конт-
266 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
роля отсутствия подобных артефактов мы каждый раз проводили
отдельную инкубацию, в которой в инкубационную среду не добав-
ляли субстрат исследуемой реакции. Эти контроли всегда были от-
рицательны [6]. Кроме этого, в других контрольных реакциях, в ко-
торых не вносили в инкубационную среду один из вспомогательных
ферментов и/или НАД (или другой кофактор), также не происходи-
ла преципитация НСТ.
На основании интенсивного окрашивания в сосудистой ткани
можно было предположить, что окрашивание коррелирует с содер-
жанием белка в различных тканях. Однако сравнение нетрансфор-
мированных растений картофеля с ipt-трансформантами делает это
предположение маловероятным, т. к. картина локализации в сосу-
дистой ткани этих растений очень различна, тогда как содержание
белка у них было сходным [6]. Таким образом, можно заключить,
что локализация, наблюдаемая после фиксации, адекватно отража-
ет ситуацию in planta.
Специфичность метода
Для каждого исследуемого фермента наблюдали специфическую и
стабильную картину локализации. Например, последовательности
реакций, использованные для обнаружения активностей АДФГ-ПФ
и УДФГ-ПФ, были сходны, за исключением первого шага, когда в
качестве субстрата использовали АДФ-глюкозу или УДФ-глюкозу
соответственно. В результате наблюдали абсолютно различную ло-
кализацию, что говорит о специфичности протокола (рис. 3.5.3., Б2,
БЗ). Более того, реакции, катализируемые ФК и ГК, сходны, но кар-
тина локализации для каждого исследуемого фермента была специ-
фична в различных тканях (не показано).
Чувствительность метода
Представленный метод не может быть использован для абсолютного
количественного определения активностей. Гахан [3] использовал
НСТ-преципитацию на срезах для количественного измерения ак-
тивности. Однако это требует непосредственного определения пре-
ципитации НСТ в каждом исследуемом срезе, что делает анализ бо-
лее сложным и неподходящим для большого числа срезов.
Строго говоря, невозможно определить количественно границы
метода. Однако сравнение гистохимической локализации in situ с
количественными данными, полученными в анализах с использова-
нием экстрактов, дает представление об относительной чувствитель-
ности. По крайней мере, для ФК настоящий протокол является на-
столько же чувствительным, что и традиционные методы экстракции.
В том случае, когда фермент активен только в нескольких клетках,
Раздел 3.5. Гистохимическая локализация активности ферментов 267
гистохимический метод может быть даже более чувствителен, так
как не происходит «разведения» неактивными клетками или тканя-
ми в процессе экстракции. Высокое пространственное разрешение
было получено с помощью гистохимической локализации, и во мно-
гих случаях преципитацию красителя наблюдали в отдельных клет-
ках, например во флоэме, в клетках-спутниках клубней картофеля
или в запирающих клетках устьиц.
В целом представленный в статье гистохимический метод может
быть использован при изучении углеводного метаболизма у различ-
ных растений, предоставляя информацию, недоступную при при-
менении других методов локализации, таких как гибридизации in
situ или иммунолокализации.
Литература
1. Gahan Р. В. Plant histochemistry and cytochemistry: an
introduction. New York: Academic Press, 1984.
2. Altman F. P. Tetrazolium salts and formazans // Progress in
Histochemistry and Cytochemistry. 1976. V. 9 P. 1-56.
3. Gahan P. B. Quantitative enzyme cytochemistry in plant
biotechnology //Phytochemical Analysis. 1991. V. 2. P. 97-106.
4. Wittich P. E., Vreugdenhil D. Localization of sucrose synthase
activity in developing maize kernels by in situ enzyme
histochemistry // Journal of Experimental Botany. 1998. V. 49.
P. 1163-1171.
5. Tecsi L. 7., Smith A. M., Maule A. J., Leegood R. C. A spatial
analysis of physiological changes associated with infection of
cotyledons of marrow plants with cucumber mosaic virus // Plant
Physiology. 1996. V. 111. P. 975-985.
6. Sergeeva L. /., Vreugdenhil D. In situ staining of activities of
enzymes involved in carbohydrate metabolism in plant tissues //
Journal of Experimental Botany. 2002. V. 53. P. 361-370.
7. Appeldoorn N. J. G., Sergeeva L., Vreugdenhil D.,
van der Plas L. H. W., Visser R. G. F. In situ analysis of enzymes
involved in sucrose to hexose-phosphate conversion during
stolon-to-tuber transition of potato // Physiologia Plantarum.
2002. V. 115. P. 303-310.
8. Гришу нина Е. В. Влияние го/-генов на углеводный метаболизм в
процессе клубнеобразования у картофеля // Дис. канд. биол.
наук. Москва, 2006. 160 с. РГБ ОД, 61:06-3/1087.
9. Фещенко Η. Φ. Локализация расщепляющих сахарозу фермен-
тов в апексе корня : Дис. канд. биол. наук. Москва, 2006. 168 с.
РГБ ОД, 61:06-3/520.
268 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
10. Sergeeva L. I., Vonk J., Keurentjes J. J. В., van der Plas L. H. W.,
Koornneef M., Vreugdenhil D. Histochemical analysis reveals
organ-specific quantitative trait loci for enzyme activities in
Arabidopsis // Plant Physiology. 2004. V. 134. P. 237-245.
11. Baud S., Graham A. A spatiotemporal analysis of enzymatic
activities associated with carbon metabolism in wild-type and
mutant embryos of Arabidopsis using in situ histochemistry // The
Plant Journal. 2006. V. 46. P. 155-169.
12. Sergeeva L. I., Keurentjes J. J. В., Bentsink L., Vonk J.,
van der Plas L. H. W., Koorneef M., Vreugdenhil D. Vacuolar
invertase regulates elongation of Arabidopsis thaliana roots as
revealed by QTL and mutant analysis // PNAS. 2006. V. 103.
P. 2994-2999.
13. Doehlert D. C, Felker F. C. Characterization and distribution of
invertase activity in developing maize (Zea mays) kernels //
Physiologia Plantarum. 1987. V. 70. P. 51-57.
14. Appeldoorn N. J. G., de Bruijn S. M., Koot-Gronsveld E.A. M.,
VisserR. G. F.y Vreugdenhil D., van der Plas L. H. W. Developmental
changes of enzymes involved in conversion of sucrose to
hexose-phosphate during early tuberization of potato // Planta.
1997. V. 202. P. 220-226.
15. Appeldoorn N. J. G., de Bruijn S. M., Koot-Gronsveld E. A. M.t
VisserR. G. F., Vreugdenhil D., van der Plas L. H. W. Developmental
changes in enzymes involved in the conversion of hexose-phosphate
and its subsequent metabolites during early tuberization of potato //
Plant, Cell and Environment. 1999. V. 22. P. 1085-1096.
3.6. ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЛОКАЛИЗАЦИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И СТРОНЦИЯ
В ТКАНЯХ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
И. В. Серегин, А. Д. Кожевникова
Введение
Одной из важнейших проблем экологической физиологии растений
является изучение ответной реакции растений на ионы тяжелых ме-
таллов, которые при повышенных концентрациях оказывают ток-
сическое действие на самые разнообразные физиологические про-
цессы. Данная проблема имеет как очевидное практическое значение,
которое определяется возрастающим загрязнением окружающей
среды тяжелыми металлами, так и важное фундаментальное значе-
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 269
ние, которое связано с исследованием механизмов адаптации и
устойчивости растений к тяжелым металлам.
По ряду причин растения не могут не поглощать большинство
тяжелых металлов и, в отличие от животных, способны накапли-
вать их в больших количествах. Именно поэтому проблема компарт-
ментации металлов в растении является определяющей при изуче-
нии их токсического действия и механизмов устойчивости.
Способность растений накапливать тяжелые металлы реализу-
ется на разных уровнях организации: клеточном, тканевом и орган-
ном, что связано, прежде всего, со способностью растений накапли-
вать металлы в клеточных оболочках и вакуолях клеток разных
тканей и органов, а также с существованием барьерных тканей,
ограничивающих передвижение ряда тяжелых металлов.
Распределение и накопление металлов в тканях растений, а в
ряде случаев и в различных клетках одной и той же ткани может
быть крайне неравномерным. При количественном анализе содержа-
ния металла на единицу массы, который часто проводят с помощью,
например, атомно-абсорбционной спектрофотометрии, усредняют-
ся не только различия в его содержании в различных зонах и участ-
ках корня и побега, но и различия в содержании металла в различ-
ных тканях растений. В конечном итоге это может привести к не-
достаточно корректной интерпретации полученных результатов.
Неоценимую помощь в изучении распределения и накопления ме-
таллов по тканям растений могут оказать простые в использовании
гистохимические методы. Полученные с их помощью данные допол-
няют результаты количественного анализа. Это позволяет полнее
понять основные закономерности распределения, накопления, а
также пути передвижения металлов по растению, что является на-
сущной проблемой современной иономики.
В ранних работах для определения Pb использовали сульфид-
ный метод [1]. Позднее с целью гистохимического определения
металлов стали применяться органические нефлуоресцентные и
флуоресцентные индикаторы. В 1972 г. впервые был разработан
гистохимический метод определения Pb с использованием родизона-
та натрия [2]. Гистохимический метод определения Ni появился не-
сколько позже [3]. В настоящее время он модифицирован, что позво-
лило повысить его чувствительность [4]. Кроме того, разработаны
гистохимические методы определения других тяжелых металлов, а
также стронция [5-7].
Для выявления Zn существует ряд методик с использованием
флуоресцентных индикаторов Zinquin, RhodZin-3, FluoZin-1,
FluoZin-2, FluoZin-3, IndoZin-1, FuraZin-1, TSQ, Newport Green PDX
и Newport Green DCF, различающихся по своей специфичности и
270 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
чувствительности к ионам Zn, а также по способности проникать че-
рез плазматическую мембрану [8, 9]. Для определения Си и Fe, a
также Hg, Ni, Cd и Pb используют малоспецифичные флуоресцент-
ные красители Phen Green SK и Phen Green FL [8, 9]. Вышеперечис-
ленные флуоресцентные индикаторы применяются главным обра-
зом в физиологии животных, а в физиологии растений используются
с целью изучения транспорта металлов через клеточные мембраны.
Остановимся более подробно на гистохимических методах опре-
деления Cd, Pb, Ni, Zn и Sr в тканях высших растений.
Принцип методов
Гистохимические методы определения металлов основаны на обра-
зовании окрашенных или флуоресцирующих комплексов аналити-
ческих реагентов с изучаемыми металлами. При разработке гисто-
химических методов для выявления металлов в тканях растений
учитываются следующие основные принципы:
• аналитический реагент должен образовывать окрашенный
или флуоресцирующий комплекс с изучаемым металлом, ко-
торый будет отчетливо виден под микроскопом, так как именно
по его распределению можно судить о распределении металла
по тканям;
• используемый реагент должен обладать высокой чувствитель-
ностью и селективностью к изучаемому металлу;
• реагент должен проникать в неповрежденные клетки;
• возможность перераспределения металла во время проведения
анализа должна быть незначительной, что особенно важно для
ионов, поступающих внутрь клетки;
• при разработке метода данные гистохимического анализа дол-
жны быть подтверждены результатами, полученными с по-
мощью альтернативных методов.
Материалы и реактивы
Оборудование
Световой микроскоп (определение Cd, Pb, Ni и Sr, а также выявле-
ние Zn с помощью цинкона), флуоресцентный микроскоп или кон-
фокальный сканирующий флуоресцентный микроскоп (определе-
ние Zn с помощью флуоресцентного индикатора Zinpyr-1). Мик-
роскопы должны быть оснащены системой анализа изображения.
Реактивы
Определение Cd, Pb: дитизон, ацетон, ледяная уксусная кислота.
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 271
Определение Ni: диметилглиоксим, гидроксид натрия, бура
(Na2B407 x 10Н2О).
Определение Sr: родизонат натрия.
Определение Zn с помощью цинкона: цинкон, гидроксид нат-
рия, бура (Na2B407 x 10Η2Ο).
Определение Zn с помощью Zinpyr-1: Zinpyr-1, диметилсульфоксид.
Для приготовления реактивов используют супердеионизован-
ную воду.
Ход определения
Протоколы подготовки индикаторов для проведения гистохимичес-
кого анализа и результаты анализа приведены в табл. 3.6.1 и на
рис. 3.6.1.
Серии срезов изучаемого материала, выполненные с помощью
безопасной бритвы, помещают на предметное стекло, на которое на-
носят 3-4 капли аналитического реагента, осторожно накрывают
покровным стеклом и через несколько минут рассматривают под
микроскопом. При подсыхании реагента на предметном стекле его
необходимо подслаивать под стекло, а избыток удалять фильтро-
вальной бумагой. Для протекания реакций необходимо несколько
минут. Препараты не хранятся. Локализацию металлов определяют
по соответствующему окрашиванию тканей или по флуоресценции.
Для анализа распределения Cd, Pb, Ni и Sr, а также Zn с помощью
цинкона используют световую микроскопию, а для изучения рас-
пределения Zn с помощью флуоресцентного сенсора Zinpyr-Ι ис-
пользуют конфокальную сканирующую флуоресцентную световую
микроскопию или флуоресцентную световую микроскопию.
Таблица 3.6.1. Гистохимические методы определения Cd, Pb, Ni, Sr и Zn
в тканях растений
Реагент
Металл
Протокол приготовления
реагента. Цвет образую-
щегося комплекса/
флуоресценции
Мешающие
ионы
Дитизон
C13H12N4S
(Mr =256,3)
(металло-
хромный
индикатор)
Cd, Раствор дитизона (0,5 мг/мл)
Pb в смеси ацетон : дистиллиро-
ванная вода (3 : 1), к 6 мл кото-
рого добавляют 1-2 капли
ледяной уксусной кислоты для
повышения чувствительности
реакции. Хранению не подле-
жит. Цвет комплекса Cd и Pb
с дитизоном — красный [5]
Zn, Cu, Cr, Fe
272 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
Таблица 3.6.1. Гистохимические методы определения Cd, Pb, Ni, Sr и Zn
в тканях растений (окончание)
Реагент
Металл
Протокол приготовления
реагента. Цвет образую-
щегося комплекса/
флуоресценции
Мешающие
ионы
Диметил-
глиоксим
C4H8N202
(Мг = 116,1)
(металло-
хромный
индикатор)
Родизонат
натрия
C6Na206
(Mr =214,0)
(металло-
хромный
индикатор)
Цинкон
C20H15N4NaO6S
(Mr = 462,4)
(металло-
хромный
индикатор)
Ni
Zinpyr-1
C46H36CI2N6O5
(Mr =823,2)
(флуорес-
центный
индикатор)
Максимумы
возбуждения
и эмиссии
Zinpyr-1 нахо-
дятся в види-
мой области
спектра: 490
и 525 нм соот-
ветственно
Sr
Zn
Zn
1%-й раствор диметилглио- Си, Со, Pd
ксима в 1,5%-м растворе
NaOH, приготовленный на
0,05 Μ растворе буры
(Na2B407 x 10Н2О) (рН 9,8 -
10,4). Хранится в течение
недели. Цвет комплекса Ni
с диметилглиоксимом —
малиновый [4]
0,2 %-й раствор родизоната Pb
натрия в дистиллированной
воде. Хранится в течение неде-
ли. Цвет комплекса Sr с роди-
зонатом натрия — бурый [6]
0,0065 г цинкона растворяют Са — неспе-
в 0,2 мл 1 Μ NaOH в растворе цифическое
буры (Na2B4O7 χ 10Н2О) красно-бу-
(рН 9,8-10,4) и доводят дистил- рое окраши-
лированной водой до 10 мл так, вание
чтобы концентрация буры в раст-
воре составляла 0,05 М; затем
полученный раствор нагревают
до 80 °С и охлаждают до ком-
натной температуры. Хранится в
течение недели. Цвет комплекса
Zn с цинконом — синий [7]
Для приготовления сток-раст- Нет мешаю-
вора (5 мМ) навеску реагента щих ионов
растворяют в диметилсульфок-
сиде. Сток-раствор хранится
при -20 °С в защищенном от
света месте. Непосредственно
перед анализом реагент раз-
мораживают и разводят до
концентрации 10 мкМ суперде-
ионизованной водой. Цвет
флуоресценции Zinpyr 1 в при-
сутствии Zn — зеленый [7, 10]
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 273
Интерпретация результатов
Описанные гистохимические методы выявления металлов в тканях
растений являются полуколичественными или в ряде случаев — ка-
чественными. По интенсивности окрашивания можно судить о на-
коплении металла в клетках и тканях. Можно также провести срав-
нительный анализ накопления металла в клеточных оболочках и в
протопластах клеток разных тканей. Для идентификации метал-
лов, связанных с материалом клеточных оболочек, а также находя-
щихся в периплазматическом пространстве и на поверхности про-
топласта можно использовать плазмолиз перед проведением гисто-
химического анализа (рис. 3.6.1.Д)[13, 14].
Следует, однако, сразу отметить, что при изучении окрашенных
срезов, по интенсивности окрашивания мы можем полуколичествен-
но оценивать и сравнивать содержание металла в разных участках
среза на единицу площади, в то время как сравнение содержания
металла в клетках разных тканей возможно лишь при сходном раз-
мере клеток этих тканей на срезах.
Анализируя распределение металлов в растущих частях расте-
ний, необходимо учитывать, что уменьшение интенсивности окра-
шивания растягивающихся клеток по сравнению с меристематичес-
кими свидетельствует лишь об уменьшении содержания металла в
растягивающихся клетках на единицу объема клетки. Содержание
металла в перерасчете на клетку может и не уменьшаться или даже
увеличиваться в результате его поглощения, например, в зоне рас-
тяжения корня.
Оценка методов, возможные проблемы
Гистохимические методы являются незаменимыми для анализа пе-
редвижения и распределения металлов в живых тканях растений.
Однако, как и любой другой метод, они обладают рядом недостат-
ков.
1. Можно предположить, что этими методами выявляются не все
ионы изучаемого металла. Кроме того, большая часть металла
находится в клетке в связанном состоянии в виде комплексов с
белками, пептидами, углеводами, органическими кислотами и
аминокислотами. Чтобы повысить чувствительность методов,
нами были отобраны реагенты, обладающие наибольшим срод-
ством к изучаемым металлам, и подобрана среда, в которой реа-
гент наиболее чувствителен к изучаемым ионам.
2. Большинство аналитических реагентов недостаточно селектив-
ны. Поэтому для определения Ni и Sr нами были выбраны диме-
тилглиоксим и родизонат натрия соответственно, которые обла-
274 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
дают не только наибольшей чувствительностью к этим ионам, но
и наибольшей избирательностью, т. е. применение этих реагентов
позволяет определять Ni и Sr в присутствии других ионов. Родизо-
нат натрия применялся также для определения Pb в тканях расте-
ний, однако, как показали результаты экспериментов, сродство
этого реагента к Pb много меньше, чем к Sr. Поэтому этот метод
может использоваться при отсутствии в среде избытка Pb.
Рис. 3.6.1. Распределение РЬ (А, Б), Ni (В, Г), Sr (Д, Е) и Zn (Ж-И) по тка-
ням растений (ниже см. пояснения к рис.). Обозначения: ВК — внутрен-
няя кора; К — кора; КП — ксилемная паренхима; Мк — метаксилема;
Π — перицикл; ОКл — основные клетки эпидермы; Ρ — ризодерма; С —-
сердцевина; Φ —флоэма; Э — эндодерма. См. цвет, вклейку, рис. 8
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 275
Пояснения к рис. 3.6.1: для выявления Pb использовали раствор дити-
зона (комплекс дитизона со Pb окрашен в красный цвет) (А, Б), Ni
выявляли с помощью диметилглиоксима (малиновое окрашивание)
(В, Г), Sr — с помощью родизоната натрия (бурое окрашивание) (Д, Е),
а при изучении распределения Zn использовали цинкон (синее окраши-
вание) (Ж) и флуоресцентный индикатор Zinpyr-Ι (зеленая флуоресцен-
ция) (3, И). А, В, Д, Ε — проростки Zea mays; Б — проростки Lupinus
rubrum; Г, Ж, И — растения Noccaea caerulescens (ранее Thlaspi
caerulescens), 3 — растения Thlaspi arvense после 24 ч (А, В, Д), 7 суток
(Е, Б), 7 недель (Г, Ж-И) инкубации в присутствии солей металлов. Zea
mays, Lupinus rubrum, Thlaspi arvense относятся к растениям исклю-
чателям, накапливающим тяжелые металлы преимущественно в под-
земных органах, a Noccaea caerulescens — гипераккумулятор Ni, Cd и
Zn, накапливающий эти металлы в надземных органах и устойчивый к
их токсическому действию. Растения выращивали на растворах 10 мкм
(Б), 100 мкМ (A) Pb(N03)2, 35 мкМ (В), 200 мкМ (Г) Ni(N03)2, З мМ
Sr(N03)2 (Д, Е), 70 мкМ (3), 800 мкМ (И), 1000 мкМ (Ж) Ζη(ΝO3)2· А, Б,
Д, Е, 3 — показано накопление металлов преимущественно в апоплас-
те. В, Г, Ж — показано накопление металлов в симпласте. Д — показа-
ны плазмолизированные корни. Плазмолиз проводили 0,7 Μ раствором
сахарозы в течение 1 ч, после чего были приготовлены серии попереч-
ных срезов корня и проведен гистохимический анализ распределения
Sr. Показано накопление Sr в клеточных оболочках, в периплазмати-
ческом пространстве и на поверхности протопласта. Отсутствие окраши-
вания на рисунках свидетельствует о содержании металлов ниже предела
определения гистохимического метода. И — показан корневой волосок
и распределение Zn в нем. При определении Cd с помощью дитизона
окрашивание сходно со Pb. А — [11, 12]; Б, В, Д — [12, 13]; Е-И — [12].
Для определения Cd, к сожалению, пока не существует
столь селективного аналитического реагента, и поэтому при
проведении анализа обязательно нужно учитывать наличие в
среде мешающих ионов в высоких концентрациях.
Для анализа распределения Zn нами были использованы два
реагента, каждый из которых имеет свои преимущества и не-
достатки. Так, применение флуоресцентного сенсора Zinpyr-1
позволяет изучить распределение Zn даже при очень низком его
содержании в тканях, что является результатом очень высокой
чувствительности и селективности данного метода. Однако этот
метод лишь в ограниченной степени может быть применен для
анализа распределения Zn в надземных органах из-за автофлуо-
ресценции хлорофилла при используемой длине волны (488 нм).
В этом случае целесообразно проводить анализ распределения
276 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
цинка с помощью металлохромного индикатора цинкона, кото-
рый образует с Zn окрашенный комплекс и обладает высокой се-
лективностью к этому металлу.
3. При проведении гистохимического анализа важно учитывать
чувствительность метода. Чувствительность гистохимических
методов нельзя определить непосредственно на срезах, т. к. со-
держание металла в тканях растений очень часто превышает их
содержание в питательной среде за счет эффекта концентриро-
вания. Поэтому чувствительность методов следует оценивать
капельным методом, когда на предметное стекло наносят раст-
воры солей изучаемых металлов в различных концентрациях и
растворы соответствующих аналитических реагентов. В нашем
случае окрашивание было визуально заметно при концентрации
солей металлов 10 мкМ (дитизон, диметилглиоксим, цинкон) и
0,1 мМ (родизонат натрия). Чувствительность флуоресцентного
метода (Zinpyr-Ι), полученная при анализе спектров эмиссии
Zinpyr-Ι и различных концентраций Zn, составляла 1 нМ.
При проведении гистохимического анализа необходимо
принимать во внимание, что отсутствие окрашивания тех или
иных тканей или органов при инкубации растений на растворах
солей тяжелых металлов свидетельствует лишь о том, что содер-
жание металлов в тканях ниже предела определения гистохи-
мического метода. Однако при изучении распределения метал-
лов по тканям растений следует учитывать, что растения спо-
собны накапливать металлы в концентрациях, в десятки и даже
сотни раз превышающих их содержание в растворе или почве.
Следовательно, даже при концентрации металлов в среде на гра-
нице или даже ниже предела определения гистохимических ме-
тодов содержание металлов в растениях, скорее всего, будет дос-
таточным для изучения их распределения с помощью этих мето-
дов.
4. Применительно к гистохимическим реагентам очень часто воз-
никает вопрос, проникают ли сами реагенты в неповрежденные
клетки. Относительно приведенных здесь методов утвердительно
ответить на этот вопрос нам позволяет тот факт, что с помощью
данных методов удается определить локализацию металлов в
эпидерме листа, большинство клеток которой не повреждаются
при приготовлении препаратов эпидермы, а металлы (Cd, Ni,
Sr, Zn) выявляются, в том числе, и в протопластах (рис. 3.6.1,
Г, Ж). Аналогичные результаты были получены на неповреж-
денных клетках корневого чехлика. Для Zinpyr-Ι его способ-
ность проникать через биологические мембраны известна также
из литературы [10]. Косвенным доказательством этого является
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 277
также выявление Zn данным методом в неповрежденных корне-
вых волосках (рис 3.6.1.И).
5. При использовании гистохимических методов, особенно осно-
ванных на применении органических растворителей (как в слу-
чае дитизона), не исключено перераспределение металлов во
время приготовления препаратов. Поэтому существенно, что
срезы обрабатываются смесью ацетона и воды, в которой диффу-
зия ионов Cd и Pb идет с малой скоростью. Это показали наши
эксперименты с предварительной промывкой срезов водой или
смесью ацетона и воды. В первом случае реакция заметно ослабля-
лась, тогда как во втором она практически не менялась. Следова-
тельно, вымывания Cd и Pb из срезов практически не происходи-
ло. Предварительное промывание срезов водой было проведено
также в случае Ni и Sr. После этого интенсивность окрашивания
тканей диметилглиоксимом или родизонатом натрия соответ-
ственно существенно не менялась. Кристаллы аналитических
реагентов с металлами также практически не были обнаружены
рядом со срезами. Все эти факты еще раз свидетельствуют об от-
сутствии сколько-нибудь значимого вымывания и перераспре-
деления ионов во время приготовления препаратов и проведения
гистохимического анализа. Однако возможность этого явления
необходимо всегда учитывать и оценивать при проведении ана-
лиза.
6. При приготовлении срезов необходимо учитывать, что, по край-
ней мере, некоторое количество клеток перерезается, и их со-
держимое может вытекать из среза. В этой связи надо заметить,
что срезы монтируются на предметное стекло сразу же после
приготовления. Однако даже в этом случае мы не можем быть
уверены, что часть содержимого клеток не теряется, но мы мо-
жем оценить вероятность этого процесса. Особенно это важно
для ионов, поступающих в симпласт, таких как Ni и Zn. Если
предположить, что протопласты клеток, разрушаясь при приго-
товлении срезов, вытекают из клеток, то при высоких концен-
трациях металлов, когда окрашивание всех тканей происходит
очень интенсивно, мы должны наблюдать также окрашивание
вокруг срезов, что свидетельствовало бы о частичном вытека-
нии содержимого клеток. В наших исследованиях подобного яв-
ления не наблюдалось, что указывает на отсутствие заметного
«вытекания протопластов» при данной методике анализа. Ана-
логичные результаты были получены и для других ионов и реа-
гентов. Однако на это явление следует обращать внимание.
Применение флуоресцентного сенсора Zinpyr-Ι и сканирую-
щей световой конфокальной микроскопии для анализа распре-
278 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
деления Zn позволяет изучать распределение металла в клет-
ках, целостность которых не нарушена, так как изучаемые клет-
ки находятся на некотором расстоянии от поверхности среза.
7. При использовании флуоресцентных красителей, у которых
имеется определенный уровень автофлуоресценции и не проис-
ходит сдвига в спектрах эмиссии при образовании комплекса с
металлом, необходимо проверять уровень автофлуоресценции в
тканях. В нашем случае для этой цели был выбран хелатор Zn —
Ν, Ν, Ν', М'-тетракис(2-пиридилметил)-этилендиамин (ΤΡΕΝ),
который способен проникать через мембраны клеток и обладает
высоким сродством к ионам Zn [10]. Инкубация корней растений
Thlaspi arvense, выращенных в присутствии 50 мкМ Zn(N03)2,
в растворе TPEN (1 мМ) в течение 2 ч с последующей обработкой
срезов флуоресцентным сенсором Zinpyr-Ι привела к практически
полному отсутствию флуоресценции в тканях корня (рис. 3.6.2),
что свидетельствует о незначительном вкладе автофлуоресцен-
ции при идентификации Zn в тканях, а также косвенно подтвер-
ждает высокую избирательность реагента к Zn.
Гистохимические методы были использованы для выявления
распределения, накопления и передвижения тяжелых металлов у
целого ряда видов растений, относящихся как к исключателям, на-
капливающим тяжелые металлы преимущественно в подземных
органах, так и к гипераккумуляторам, накапливающим тяжелые
металлы в больших количествах преимущественно в надземных
органах без видимого нарушения метаболизма [2-7; 11—14]. Полу-
ченные с применением этих методов данные внесли значительный
вклад в выяснение роли разных тканей корня и побега растений в
передвижении и накоплении тяжелых металлов, что важно для ре-
шения проблемы избирательного накопления тяжелых металлов в
подземных органах исключателей и надземных органах гиперакку-
муляторов. Проведенное картирование передвижения и накопления
тяжелых металлов у исключателей и гипераккумуляторов позволи-
ло заключить, что роль тканей растений в поступлении, передвиже-
нии и накоплении тяжелых металлов неодинакова не только для
разных металлов, но и для растений исключателей и гипераккуму-
ляторов, что, в свою очередь, определяет металло- и тканеспецифич-
ность токсического действия металлов [12, 13].
Важно отметить, что результаты гистохимических анализов
всегда должны сравниваться с результатами, полученными дру-
гими методами (электронная микроскопия, сканирующая электро-
нная микроскопия, рентгеноструктурный микроанализ, атомно-аб-
сорбционная спектроскопия и др.), нацеленными на исследование
распределения металла на внутриклеточном и органном уровнях.
Раздел 3.6. Гистохимические методы определения тяжелых металлов 279
Zinpyr-1 +Zn
Zinpyr-1
Zinpyr-1 +TPEN
Zinpyr-1 +TPEN + Zn
Рис. 3.6.2. Анализ уровня автофлуоресценции индикатора Zinpyr-Ι и
флуоресценции комплекса Zinpyr-Ι с Zn. (А) Отсутствие флуоресценции
тканей корня Thlaspi arvense после 7 недель инкубации на питательной
среде в присутствии 50 мкМ Zn(NO3)2 и последующей инкубации корней в
течение 1 ч в присутствии хелатораZn — Ν, Ν, Ν', №-тетракис(2-пиридил-
метил)-этилендиамина (ΤΡΕΝ) с последующей обработкой срезов флуо-
ресцентным индикатором Zinpyr-Ι (фильтр GFP, 488нм). (Б) Показан срез
корня, представленный на рис. (А), для визуализации использован крас-
ный фильтр (543нм). (В) Спектры эмиссии флуоресцентного сенсора
Zinpyr-1, его комплекса с Zn в присутствии или отсутствие TPEN. Кривые
для Zinpyr-1 + TPEN и Zinpyr-1 + TPEN + Zn совпадают [13]. См. цвет,
вклейку, рис. 9
Поэтому при изучении распределения и накопления металлов в расте-
ниях важно использовать совокупность этих методов для получения
более целостной картины транспортных потоков изучаемого металла.
Литература
1. Пирс Э. Гистохимия. М.: ИЛ, 1962. 962 с.
2. Glater R. Α., Hernandez L. Lead detection in living plant tissue
using a new histochemical method // J. Air Pollut. Control
Association. 1972. V. 22. P. 463-467.
280 ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ И ГИСТОХИМИИ
3. Severne В. С. Nickel accumulation by Hybanthus floribundus //
Nature. 1974. V. 248. P. 807-808.
4. Серегин И. В., Кожевникова А. Д., Казюмина Ε. Μ., Иванов В. Б.
Токсическое действие и распределение никеля в корнях кукуру-
зы // Физиология растений. 2003. Т. 50. С. 793-800.
5. Серегин И. В., Иванов В. Б. Гистохимические методы изучения
распределения кадмия и свинца в растениях // Физиология рас-
тений. 1997. Т. 44. С. 915-921.
6. Серегин И. В., Кожевникова А. Д. Транспорт, распределение и
токсическое действие стронция на рост проростков кукурузы //
Физиология растений. 2004. Т. 51. С. 241-248.
7. Серегин И. В., Кожевникова А. Д., Грачева В. В., Быстрова Е. И.,
Иванов В. Б. Распределение цинка по тканям корня проростков
кукурузы и его действие на рост // Физиология растений. 2011.
Т. 58. С. 85-94.
8. Haugland R. P. Handbook of fluorescent probes and research
products. Eugene, OR: Molecular Probes, Inc., 2002. 950 p.
9. Sabnis R. W. Handbook of biological dyes and stains: synthesis and
industrial applications. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons,
Inc., 2010. 521 p.
10. Sinclair S. Α., Sherson S. M., Jarvis R., Camakaris J., Cobbet C. S.
The use of the zinc-fluorophore Zinpyr-1, in the study of zinc
homeostasis in Arabidopsis roots // New Phytol. 2007. V. 174.
P. 39-45.
11. Серегин И. В., Шпигун Л. К., Иванов В. Б. Распределение и ток-
сическое действие кадмия и свинца на корни кукурузы // Физио-
логия растений. 2004. Т. 51. С. 582-591.
12. Серегин И. В., Кожевникова А. Д. Роль тканей корня и побега в
транспорте и накоплении кадмия, свинца, никеля и стронция //
Физиология растений. 2008. Т. 55. С. 3-26.
13. Серегин И. В. Распределение тяжелых металлов в растениях и
их действие на рост: Дис. ...д-ра биол. наук. М.: ИФР РАН, 2009.
423 с.
14. Серегин И. В., Пехов В. М., Иванов В. Б. Использование плазмо-
лиза для выяснения локализации свинца в корневых клетках //
Физиология растений. 2002. Т. 49. С. 317-319.
Глава 4
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
И ТРАНСДУКЦИИ СИГНАЛОВ
4.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАСТЕНИЯХ
ИУК, ЦИТОКИНИНОВ, АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ
И ГИББЕРЕЛЛИНОВ
ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ (ELISA)
Л. М. Котова, А. А. Котов
Введение
ELISA (от англ. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) — иммуно-
ферментный твердофазный анализ, также известный как EIA (от
англ. Enzyme Immunoassay, ИФА), появился как концепция нового
метода и как термин после двух независимых публикаций Perlmann
и Engvall из Швеции и Schuurs и van Weemen из Нидерландов в
1971. Приблизительно в это же время были впервые получены по-
ликлональные антитела на ИУК, гибереллины (ГК3) и абсцизовую
кислоту (АБК) [1, 2] и положено начало иммунологического подхо-
да в определении фитогормонов (ФГ). Несколько позже другими ис-
следователями был разработан первый радиоиммунологический
анализ ИУК [3] и, наконец, первый анализ ИУК методом ИФА —
сначала с использованием прямого конкурентного ИФА, в котором
применяется меченный ферментом гормон [4], а позднее непрямым
вариантом ИФА с использованием меченных ферментом антител
[5]. Большой вклад в разработку иммунологического метода опреде-
ления ФГ был сделан Элмаром Вайлером, им впервые были получе-
ны поликлональные антитела на цитокинины [6], и с его участием
созданы моноклоналъные антитела к ИУК, АБК и цитокининам [7].
Достоинства ИФА: поскольку метод основан на использовании
антител, обладающих высокой селективностью к определенному ве-
ществу, подготовка проб перед анализом может быть ограничена
несложной процедурой очистки от возможных иммунореактивных
загрязнителей, а применение 96-луночных планшет позволяет еди-
282 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
новременно анализировать большое количество образцов. ИФА явля-
ется высокочувствительным тестом: при измерении ФГ обычно не-
обходимо 0,5-1мл его раствора с концентрацией 1-10 нМ, для чего
требуется -100 мг сырой растительной ткани. Диагностические ан-
тисыворотки используются в ИФА в разведении 1:10000 — 1:100000
и могут храниться при -20 °С десятки лет, что кратно окупает за-
траты на их получение.
Принцип метода
ИФА в современном виде основан на способности полистирола или
поливинилхлорида благодаря гидрофобному взаимодействию проч-
но адсорбировать белковые молекулы, что дает возможность ис-
пользовать лунки планшет из этих материалов в качестве твердой
фазы (матрицы), несущей на своей поверхности или белки-антиге-
ны (АГ), или антитела (иммуноглобулины). Для количественного
определения низкомолекулярных веществ, к которым относятся
фитогормоны (ФГ), используют метод конкурентного ИФА, прове-
дение которого возможно двумя вариантами. В первом варианте [4]
специфичные антитела (AT) сорбируют на твердую фазу, и конку-
ренция за связывание с ними происходит между определяемым ФГ
и ФГ, ковалентно конъюгированным с ферментом (ФГ-фермент) —
чем больше ФГ содержится в тестируемой пробе, тем меньше конъю-
гата ФГ-фермент свяжется с AT и будет иммобилизовано на поверх-
ности лунок планшета. Поскольку после взаимодействия AT — АГ
нет дополнительных стадий амплификации сигнала, данный вариант
относится к прямому ИФА. В большинстве случаев в качестве фер-
мента для создания конъюгатов с ФГ используется щелочная фосфата-
за из кишечника теленка, типичным хромогенным субстратом кото-
рой является p-нитрофенил фосфат (p-nitrophenyl phosphate, /?NPP),
дающий растворимый желтый продукт с максимумом поглощения
450 нм. Во втором варианте [5, 8, 9, 10] на твердую фазу сорбируют
конкурентный антиген — ковалентный конъюгат ФГ с белком
(ФГ-белок), обычно альбумином, и в этом случае конкуренция за
связывание со специфичными AT происходит между определяемым
ФГ и ФГ в составе иммобилизованного на твердой фазе планшета
белкового конъюгата. Таким образом, количество антител, способ-
ных в результате иммунологической реакции иммобилизоваться на
поверхности лунок, находится в обратной зависимости от количест-
ва ФГ в анализируемой пробе (рис. 4.1.1.В). Во втором варианте, в
отличие от первого, для учета результата конкуренции требуется
добавочный этап выявления иммобилизованных первичных AT вто-
ричными AT, иммунными к первичным и снабженными ферментной
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК... 283
меткой. Дополнительная стадия со вторичными AT ведет к ампли-
фикации иммунного сигнала, и данный вариант ИФА относится к
непрямому. В некоторых непрямых вариантах используют двухста-
дийную авидин-биотиновую амплификацию: после первичных AT
следует их реакция со вторичными биотинилированными AT, а за-
тем иммобилизованные биотиновые остатки выявляют конъюгатом
авидина с ферментом (щелочной фосфатазой) [11]. Наиболее часто
употребляемой ферментной меткой для вторичных AT является
щелочная фосфатаза или пероксидаза из хрена. Хромогенным суб-
стратом для пероксидазы являются ароматические фенолы или ами-
ны: 2,2-азино-ди (3-этил-бензотиазолин) сульфоновая кислота (ABTS)
и 3,5,3',5'-тетраметилбензидин (ТМВ). В меньшей степени применя-
ют о-фенилендиамин (OPD), о-дианизидин (ODIA) и 5-аминосалици-
ловую кислоту (5AS).
К одной из отличительных особенностей вариантов ИФА отно-
сится стабильность ферментной метки: щелочная фосфатаза, ис-
пользуемая в первом варианте, является нестабильным ферментом,
и конъюгаты на ее основе не подлежат длительному хранению, тог-
да как конъюгаты пероксидазы со вторичными AT во втором вари-
анте можно хранить без изменения активности в течение длительно-
го времени (до 20 лет, данные авторов). Другое отличие касается
требований, предъявляемых к препарату первичных AT: поскольку
в первом варианте они используются для сенсибилизации планшет,
необходимо предварительное выделение из антисыворотки свобод-
ной от альбуминов иммуноглобулиновой фракции, тогда как во вто-
ром варианте можно использовать неочищенную антисыворотку.
В дальнейшем мы ограничимся подробным описанием второго ва-
рианта конкурентного ИФА, в котором применены кроличьи пер-
вичные поликлональные AT к ФГ и вторичные антикроличьи AT с
пероксидазной меткой (см. рис. 4.1.1.В).
ФГ являются гаптенами — низкомолекулярными веществами,
не обладающими иммуногенной активностью, поэтому для выработ-
ки AT к ним (рис. 4.1.1 .А) их ковалентно конъюгируют с белком-но-
сителем, получая иммуноген. Для избежания перекрестной реак-
тивности AT с белком конкурентного антигена для его синтеза и
синтеза иммуногена берут разные белки — в первом случае это обычно
овальбумин (Ов), во втором — бычий сывороточный альбумин (БСА)
[9, 10, 11] или используют другие сочетания: Ов — человеческий сы-
вороточный альбумин [5], БСА — кроличий сывороточный альбу-
мин [8], кроличьи иммуноглобулины — БСА [11]. При создании тех
и других конъюгатов способ химической фиксации ФГ, как правило,
одинаков, но для каждого ФГ зависит от химической природы групп,
284
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
для иммунизации
животных и получения
антител
Синтез конъюгатов
гормон-белок
для сенсибилизации
планшет
Синтез конюгатов с образованием пептидной связи
между NH2-rpynnou белка (БСА или овальбумина) и — СООН группой гормона:
/ — активация дициклогексилкарбодиимидом (ДЦКД) (по Fuchs etal., 1971; 1972),
// — метод смешанных ангидридов (по Welter, 1981).
Конъюгация ИУК с белком (БСА или овальбумина) через
азот индольнго кольца ИУК с помощью формальдегида
(по Pengelly & Meins, 1977)
Синтез конъюгатов рибоэидов цитокининов (зеатинрибоэида
и изопентениладенозина) с использованием перидатного окисления
их рибоэнова остатка и конъюгация полученных альдегидов
с NH2-группой белка (БСА или овальбумина) (по Weiler, 1980).
Рис. 4.1.1.А. Подготовка реагентов для ИФА: синтез конъюгатов гор-
мон-белок
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
285
Иммунизация кроликов и получение антисыворотки
1 -я схема иммунизации 2-я схема иммунизации
Преиммуниэация (priming): 2 мл смеси конъюгата гормон-БСА в ФСБ (1 мг/мл)
с полным адъювантом Фрейнда (1:)
Еженедельные (т.е. 4 раза в течение месяца)
подкожные инъекции по 0,5 мл смеси
(распределяемых на 5-7 точек) Инекция 1,5 мл внутрикожно в 20—30 мест
(пуговка по 0.05 мл) в холку и вдоль спины
1-я ж В холку ^ 2-я ж по обе стороны позвоночника и 0,5 мл смеси
вводят подкожно между лопаток
Через
7 дней
4-я
Через
месяц
1 -я поддерживающая инъекция
Через
7-10 дней
дополнительная инъекция в каждую
заднюю лапку по 0,5 раствора
гормон-БСА в ФСБ (2-3 мг/мл) —
Забор крови из краевой
вены уха по 20-50 мл
Через
2 недели
Через
2 недели
2-я поддерживающая инъекция
Через
месяц
Через
7-10 дней
Через
7-10 дней
Забор крови из краевой вены уха по 20-50 мл
Процедуры аналогично продолжаются до 5-7 поддерживающих ежемесячных инъекций,
через 7-10 дней после каждой делая заборы крови.
Рис. 4.1.1 .Б. Подготовка реагентов для ИФА: иммунизация кроликов
и получение антисыворотки
286
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
ИФАФГ
Сенсибилизация лунок конкурентным антигеном: адсорбция коньюгата
ФГ-овальбумин на полистироловом 96-луночном плоскодонном планшете
3-кратная промывка ФСБ-Т
ФГ-Ов в 0.05 Μ NaHC03/ Na2C03 буфере,
рН 9.7(150 мкл на лунку). Инкубация Зч
при +37 'С или в течение ночи при +4 "С
временное хранение
при -20 'С
Конкурентное связывание первичных антител: ФГ анализируемой пробы
конкурирует с адсорбированным коньюгатом ФГ-овальбумин за связывание
с вносимыми в пробу первичными кроличьими анти-ФГ антителами
Стандарт ФГ или проба
в ФСБ-Т (75 мкл на
лунку)
анти-ФГ IgG
3-кратная
промывка ФСБ-Т
Добавление анти-ФГ IgG в ФСБ-Т
с 1% Ов(75 мкл на лунку) и
инкубация 2 ч при +4 'С
Инкубация с вторичными бараньими антителами против
иммуноглобулинов кролика lgG(H+L), мечеными пероксидазой хрена
бараньи IgG, меченые
пероксидазой
3-кратная промывка ФСБ-Т
и 3-кратная промывка диет, водой
Бараньи IgG, меченые
пероксидазой в ФСБ-Т с 0,5 % Ов
(150 мкл на лунку).
Инкубация 1 ч при +37 *С
Определение иммобилизованной ферментной метки (пероксидазы)
по цветной реакции с хромогенным субстратом: свежеприготовленный раствор
орто-фенилендиамина (0,4 мг/мл) с 0,03 % H2O2 в 0,06 Μ NaH2PC>4/ Na2HPO4
буфере, рН 5,0 вносят по 150 мкл в лунки и после 30 мин инкубации при 37 'С
реакцию останавливают добавлением 40 мкл 6 N H2SO4· Измерение оптической
плотности проводят на спектрофотометре для планшет при 492 нм
Рис. 4.1.1 .В. Схема проведения ИФА
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
287
Учет результатов ИФА
Концентрационную калибровочную прямую для ФГ получают с помощью
logit-преобразования данных оптической плотности лунок по формуле:
logit (В/В0) = In [(В/В0)/(1 - В/В0)] = a lg Сфг + Ъ;
где В = А - Атах, В0 = Ац - Атах, А — оптическая плотность лунок, в которых инкубировали стандарты ФГ,
Ао — лунки без внесения ФГ (контроль), Атак — фоновая оптическая плотность, определяемая
при инкубации стандарта ФГ с насыщающе высокой концентрацией (~10~4—10~3 М), Сфг — молярная
концентрация фитогормона в объеме вносимой в лунки пробы,
а и b — коэффициенты линейной регрессии
Рис. 4.1.1.Г. Учет результатов ИФА с построением калибровочных гра-
фиков. На рисунке подчеркнута антисыворотка, а в квадратных скобках
указан конкурентный конъюгат
288
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
способных образовывать ковалентную связь с аминокислотными
остатками пептидов, в основном с наиболее удобной для конъюгирова-
ния и реакционноспособной ε — NH2-группой лизина (рис. 4.1.1.А).
При создании конкурентных конъюгатов используют более низкое,
чем в иммуногене, соотношение гормон/белок, чтобы избежать
«гормон-перегруженных» антигены, способные к многоточечному
связыванию с AT, тем самым снижая реактивность последних к сво-
бодным гормонам [8]. Например, если для получения ИУК-N-ECA
используют молярную пропорцию 257:1, то для ИУК-N-Лиз-Ов она
составляет 3:1 (табл. 4.1.1.Б).
Для повышения чувствительности ИФА и снижения неспеци-
фического фона химическую фиксацию ФГ в конкурентном конъю-
гате часто проводят с использованием дополнительного спейсера [11],
для чего белок предварительно модифицируют лизином (Лиз—Ов).
Наличие лизинового мостика между ФГ и белком удаляет гормон от
поверхности белка, понижая вероятность многоточечного связыва-
ния иммуноглобулинов с остатками ФГ, а также их дополнительного
связывания с Ов при контакте АГ-АТ [12]. Также для повышения
чувствительности к анализируемому ФГ в конкурентном конъю-
гате можно использовать его структурно близкий и менее иммуно-
реактивный аналог (гетерологический ИФА). Применение гетеро-
логического варианта для анализа ИУК, т. е. использование в кон-
курентном антигене индолмасляной кислоты (ИМК) вместо ИУК в
сочетании с AT против ИУК-БСА повысило чувствительность ана-
лиза метиловых эфиров ИУК практически в 2 раза. Замена ИУК-С-Ов
на ИМК-С-Ов сопровождалась снижением специфичности ИФА
(табл. 4.1.2.А), что в литературе отмечается и в отношении гетеро-
логического ИФА других веществ [8]. Применение гетерологичес-
кого варианта в отношении ИФА гиббереллинов (ГК) дает возмож-
ность использования AT против ГК3-БСА в качестве группового
реагента на другие ГК. Так, использование их в сочетании конъю-
гатом ГК1-Лиз-Ов значительно снижает специфичность ИФА в от-
ношении метилового эфира ГК1, соответственно увеличивая чувстви-
тельность к нему в -1000 раз (табл. 4.1.2.Б), что делает возможным
анализ последнего в растительных тканях [10, 13].
ИУК, абсцизовая кислота (АБК) и ГК являются органическими
кислотами, и их карбоксильные группы используются для реакции
конденсации с NH2- группами белка с образованием пептидных свя-
зей для создания конъюгатов (рис. 4.1.1.А). Основными методами
получения пептидов являются: метод смешанных ангидридов с ис-
пользованием эфиров хлоругольной кислоты, в основном изобутил-
хлорформиата [14], который активирует карбоксильную группу
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК... 289
гормона, образуя с ним смешанный ангидрид (рис. 4.1.1. А), и карбо-
диимидный метод с образованием промежуточной активной О-ацили-
зомочевины и активного побочного ангидрида ФГ (реакция послед-
него с белком на рис 4.1.1.А показана пунктирной стрелкой). В
карбодиимидном методе используют водонерастворимый дицик-
логексилкарбодиимид (ДЦКД) [Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimide, DCC]
[1, 2, 5, 10] или водорастворимые карбодиимиды: N-диметилами-
нопропил-N'-этилкарбодиимид [l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimide, EDC, EDAC, EDCI] [4] или N-циклогексил-N-(2-мор-
фолиноэтил)-карбодиимид-мето-р-толуолсульфонат [N-cyclohexyl-N-
(2-morpholinoethyl)-carbodiimide-metho-p-toluolsulphonate, CMC] [11].
Замена карбоксила на пептидную связь модифицирует химическую
структуру ФГ в составе иммуногена и делает вырабатываемые на
него AT слабореактивными в отношении свободных кислотных
форм ФГ. Такая особенность в наибольшей степени характерна для
ИУК и ГК, и в наименьшей — для АБК. Поэтому создают метиловые
или этиловые эфиры ФГ при обработке проб с ФГ раствором диазо-
метана или диазоэтана в диэтиловом эфире, т. к. эфирная структура
иммунохимически близка к пептидной и иммунореактивнее свобод-
ных форм ФГ на 3-4 порядка (табл. 4.1.2, А и Б).
Необходимость метилирования ИУК перед анализом может быть
устранена другим способом ее конъюгации на белке-носителе при
синтезе иммуногена/антигена [15, 8]. Для этого используют вместо
карбоксильной группы С1 азот индольного кольца N, который конъю-
гируют с NH2-группой белка (ИУК-N-белок) формальдегидным мето-
дом с образованием метиленового мостика -СН2- (рис. 4.1.1.А).
Чувствительность к ИУК получаемых AT сопоставима с чувстви-
тельностью к метиловому эфиру ИУК для AT против ИУК-С-БСА
(табл. 4.1.2.А). Изменение ориентации гаптена на иммуногене
также изменяет специфичность AT — по сравнению с AT против
ИУК-С-БСА, AT против ИУК-N-BCA более специфичны к участку
СЗ — С1, т. е. месту, по которому в основном идут изменения при
метаболизме ИУК, связанном с ее синтезом, распадом и образовани-
ем пептидных и эфирных конъюгатов (табл. 4.1.2.А).
Для ИФА цитокининов конъюгаты с белком синтезируют на
основе их рибозидов, поскольку рибоза содержит вициальные гид-
роксильные группы, легко окисляемые периодатом в альдегидные,
которые способны образовывать прочную ковалентную связь с
NH2-группами белка после стабилизации продукта реакции боро-
гидридом (рис. 4.1.1. А). Таким образом, AT, получаемые на данные
конъюгаты, более иммунореактивны в отношении цитокининовых
нуклеозидов и нуклеотидов, чем оснований, для которых степень пе-
рекреста относительно рибозидов составляет 40-70% (табл. 4.1.2.В).
290 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Высокая специфичность AT предполагает проведение ИФА не-
очищенных проб (водного остатка после экстрагирования органи-
ческими растворителями), однако в тестах «добавлено/выявлено»,
проводимых на грубых растительных экстрактах, обнаружилось ис-
кажение количественных данных. К веществам, способным оказы-
вать неспецифическую интерференцию, можно отнести раститель-
ные фенольные метаболиты (таннины и проч.), связывающиеся с
белками, а также сахара. Другой сложностью количественного ИФА
ФГ является наличие их иммунореактивных гомологов (для ИУК
это индолмасляная и индолпропионовая кислота, а также хлорсо-
держащая ИУК), серии структурно-близких ФГ (семейство ГК) и
иммунореактивных метаболитов, главным образом «запасных» конъ-
югатов (глюкозные эфиры ИУК и АБК, аминокислотные пептиды
ИУК, N-глюкозиды, рибозиды и фосфорибозиды цитокининов). Та-
ким образом, для определения ФГ методом ИФА необходимым усло-
вием является предварительная очистка проб с выделением фрак-
ции анализируемого гормона, которая не содержит интерферирую-
щих и посторонних иммунореактивных веществ. Для учета всех
форм ФГ перед очисткой и фракционированием пробы в ее аликво-
тах конъюгаты ФГ расщепляют методом щелочно-кислотного или
ферментативного гидролиза. Для получения фракций гормонов,
чистых для ИФА, в настоящее время используют хроматографию
низкого разрешения на мини-колонках, которую называют твердо-
фазной экстракцией (ТЭ) или SPE (solid phase extraction), применяя
в основном обращенно-фазовую экстракцию (ОФЭ) на гидрофобных
силикагелях с привитым октадецилсиланом С18 или на стирол-диви-
нилбензольных смолах (например, Поролас ТМ), а также ионообмен-
ную экстракцию (ИОЭ) на анионо- и катионообменных сорбентах. Для
очистки ФГ от фенольных веществ, особенно кислых, которые кохро-
матографируются с ФГ при ИОЭ и ОФЭ используют хроматографию на
мини-колонках с поливинилполипирралидоном (ПВПП), на котором
также возможно получить чистую фракцию ИУК (рис. 4.1.2.Б1), а
для фракционирования других ФГ дополнительно используют ОФЭ
на мини-колонках с С18 (рис. 4.1.2.В). Разделение рибозидов и осно-
ваний цитокининов проводят колоночной хроматографией на гид-
рофильных (нормально-фазовых) сорбентах, например Toyopearl
HW 40F и Polyclar AT (рис. 4.1.2Г).
1
Сокращения (к рис. 4.1.2, Б-Г): АБК — абсцизовая кислота, Зеа — зеатин,
ЗР — зеатинрибозид, ИП — изопентениладенин, ИПА — изопентениладено-
зин, ГКз— гиббереллин 3, ΓΚ1 — гиббереллин 1, ИАА — индолилацетальдегид,
ИАМ — индолацетамид, ИАН — индолилацетонитрил, ИА-Асп — индолилацети-
ласпарагиновая кислота, ИМК — индолилмасляная кислота, ИУК — индолилук-
сусная кислота, ТР — триптофол, Три —триптофан, Кум — кумаровая кислота.
A
2 мл водного остатка после упаривания метанольного экстракта,
подкисленного до рН 3.0 добавлением 0.5 мл 0.2 Μ КН2PO4/H3PO4 буфера с рН 2.88
+ 6 мл 0.05 Μ КН2PO4/H3PO4 буфера с рН 3.0
Рис. 4.1.2.А. Схема этапов колоночного выделения фитогормонов из рас-
тительных проб для ИФА: этап I и На — начало хроматографического раз-
деления на колонке ПВПП-1 (1 мл сорбента); этап Пб и Пв — продолжение
разделения после добавления колонки ПВПП-2 (2,5 мл сорбента); этапы
Ша-Шв — хроматография на С18 Amprep (300 мг сорбента) элюцией воз-
растающего метанола с 0,2 Μ уксусной кислотой; дополнительная хрома-
тография цитокинин-содержащих фракций на колонках Toyopearl HW
40F и Polyclar AT элюцией ФСБ. На рисунке символом «x» обозначен не со-
держащий гормонов отбрасываемый элюат
292
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Рис. 4.1.2., Б. Профили элюции стандартов ФГ. (Б1) Начало хроматог-
рафического разделения на колонке ПВПП-1 (1 мл сорбента), этап I и
Па. (Б2) Продолжение разделения после добавления колонки ПВПП-2
(2,5 мл сорбента), этап IIб и IIв. Примечание: количества стандартов, на-
носимых в колонки перед началом элюции, составляют: для индолсо-
держащих веществ — 0,2 мкмоль, цитокининов и АБК — 0,05 мкмоль,
пара-кумаровой кислоты — 0,12 мкмоль. Оптическая плотность фрак-
ций измерена на спектрофотометре VSU2-P (Karl Zeiss, Jena, Германия)
в кварцевых кюветах толщиной 0,5 см. Для ИУК и индолсодержащих
веществ при 280 нм, пара-кумаровой кислоты — 300 нм, цитокининов
и АТФ — 268 нм, АБК — 245 нм
в
с
О
Рис. 4.1.2., В и Г. (В) Хроматография на С18 Amprep (300 мг сорбента)
элюцией возрастающего метанола с 0,2 Μ уксусной кислотой, этапы
IIIа-IIIв (на рис. 4.1.2.А). (Г) Дополнительная хроматография цитоки-
нин-содержащих фракций на колонках 6x0,6 см с 1,5 мл сорбента Toyopearl
HW 40F элюцией ФСБ (после 7,5 мл элюция 0,005 Μ уксусной кислотой) и
Polyclar AT элюцией ФСБ. Примечание: количества стандартов, наносимых
в колонки перед началом элюции, составляют: для цитокининов и АБК —
0,05 мкмоль, ГК3 и ΓΚ1 — 0,002 мкмоль. Оптическая плотность фракций из-
мерена на спектрофотометре для цитокининов и АТФ при 268 нм, АБК при
245 нм. Выходы стандартов ГК3 и ΓΚ1 определены с помощью ИФА
294
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Материалы и реактивы
Реактивы, растворы и материалы
для получения антител и проведения ИФА
Фитогормоны для приготовления конъюгатов с белком
и стандартов для калибровки
АБК (рацемат), ГК3, ГК1, ИУК, индолил-3-масляная кислота
(ИМК) — «Serva» (Германия); транс-зеатин, транс-зеатинрибо-
зид, изопентениладенин (ИП), изопентениладенозин (ИПА),
(+)цис,транс-АБК — «Sigma» (США).
Растворы и материалы для синтеза конъюгатов ФГ-белок
БСА («Serva»), овальбумин («Serva»).
0,1 Μ боратно-карбонатный буфер, рН 8,5 (готовят из раствора
0,1 Μ H3ВO3, доводя его рН до 8,5 под рН-метром добавлением 0,1 Μ
Na2CO3).
Колонка для гель-фильтрации (1,6x20 см, 40 мл) с Sephadex
G-25 F («Pharmacia», Швеция).
Трубка для диализа Visking, type36/32 («Serva», #44120). Пе-
ред использование кипятят 30 мин в 0,01 Μ Na2EDTA, после промы-
вают водой и при необходимости хранят при 4 °С в 50% глицерине.
Концентрирующая ячейка на 50 мл Amicon 8050 («Amicon»,
США) с мембраной РМ-10 для диафильтрации под давлением
(2,5 кгс/см2).
Консервант для белковых растворов
0,1-0,02% азид натрия (NaN3), используют 20% маточный раствор.
Буферы для ИФА:
Карбонатный буфер для сенсибилизации планшет конкурентным
антигеном (конъюгатом ФГ-Ов): 0,05 Μ NaHCO3/Na2CO3, pH 9,7 (го-
товят из раствора 0,05 Μ NaHCO3, доводя его рН до 9,7 под рН-мет-
ром добавлением 0,05 Μ Na2CO3) и хранят при 4 °С.
Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 0,01 Μ Na-фосфатный буфер
(0,01 Μ NaH2PO4/Na2HPO4) с 0,15 М NaCl, pH 7,5-7,4 (ФСБ). Гото-
вят в 20 раз более концентрированный раствор с рН 6,55 (при раз-
бавлении рН увеличивается до 7,5). Концентрированный раствор
хранят при температуре не ниже 18 °С для предотвращения выпаде-
ния солевого осадка. ФСБ-Т — ФСБ с 0,05% Triton X-100 («Sigma»,
США) для разведения проб и стандартов ФГ и промывки планшет,
хранят при 4 °С. Для разведения вторичных AT в ФСБ-Т добавляют
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК... 295
0,5% (для первичных антител 1%) овальбумина, растворяя непосред-
ственно перед использованием.
Раствор для проведения цветной реакции с пероксидазой
Свежеприготовленный орто-фенилендиамин (0,4 мг/мл) в 0,06 Μ
NaH2PO4/Na2HPO4 буфере, рН 5,0 с 0,03% H2O2 (1 мл аптечной 3%
H2O2 добавляют в 100 мл раствора непосредственно перед внесением
в лунки). Opmo-фенилендиамин перед использованием следует пере-
кристаллизовать: в 100 мл хлороформа при температуре -40-50 °С
растворяют 10 г орто-фенилендиамина, раствор фильтруют и остав-
ляют на ночь при -20 °С. Выпавшие кристаллы фильтруют через по-
ристый стеклянный фильтр № 3, промывают холодным хлорофор-
мом, сушат в токе N2 и хранят при 4 °С в темноте.
Останавливающий раствор
6 N H2SO4 готовят, вливая при перемешивании 16 мл концентриро-
ванной H2SO4 в 84 мл H2O.
Спектрофотометр для планшет
Titertek Multiskan MCC-340 («Flow Laboratories-Labsystems», Ни-
дерланды—Финляндия).
Полистироловые планшеты для ИФА (EIA/ELISA) на 96 лунок
с плоским дном
Dynatech microtiter (Μ 129В, В 71 9112М), ELISA F-plate Immulon,
(Dynatech Laboratories, Inc., США); Dynatech microELISA (Μ 129Α,
В 71 9112), ELISA F-plate Immulon, (Dynatech Laboratories, Inc.,
США); Costar EIA/RIA Plate, flatt bottom, high binding HB, #3590;
Nunc (Immuno Plate) Plate I with certificate Immuno Maxi Sorp
#43 94 54.
Синтез иммуногенных конъюгатов для производства антисывороток
Для синтеза иммуногенов используют бычий сывороточный альбумин
(БСА) («Serva»), пептидные конъюгаты которого с АБК (АБК-БСА),
ГК3 (ГК3-БСА) и ИУК (ИУК-С-БСА) получают либо карбодиимид-
ным методом, либо методом смешанных ангидридов (рис. 4.1.1.А).
В первом методе, проводимом с использованием водонерастворимо-
го дициклогексилкарбодиимида (ДЦКД) по Фуксу [1,2], АБК (раце-
мат), ГК3, или ИУК (табл. 4.1.1.А) растворяют в освобожденном от
перекисей диоксане (перегоняется после суток настаивания с грану-
лами NaOH) и добавляют ДЦКД («Serva», Германия). Смесь встря-
хивают на шейкере типа Sumal S 411 (Германия) в течение 30 мин
296
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
при 20-22 °С, после чего центрифугируют при 12 000 g на микро-
центрифуге Labimex 320а (Польша) в течение 15 мин для осаждения
образующейся дициклогексилмочевины. Супернатант вносят по кап-
лям при перемешивании в раствор БСА в 0,1 Μ боратно-карбонат-
ном буфере, рН 8,5, в течение 30 мин при +4 °С и полученную реак-
ционную смесь оставляют на ночь на магнитной мешалке ММ-5
(Россия) при +4 °С. Далее реакционную смесь доводят до 5 мл ФСБ,
центрифугируют при 25 000 об./мин (62 800 g, VAC 602, ротор
SW-40, «Janetzki MLW», Германия) в течение 1 ч и супернатант с
полученным гормон-белковым конъюгатом подвергают гель-фильтра-
ции на колонке (1,6x20 см, V=40 мл) с Sephadex G-25 F («Pharmacia»,
Швеция), уравновешенным ФСБ. Очищенный конъюгат доводят
раствором ФСБ до концентрации 2 мг/мл по белку, стерилизуют,
пропуская через мембранный фильтр с порами диаметром 0,2 мкм
(«Synpor 8», Чехия), и хранят до использования при -20 °С.
Синтез пептидного конъюгата ИУК-С-БСА методом смешанных
ангидридов [14]: 10,5 мг ИУК растворяют в 0.4 мл диметилформа-
мида («Fluka»), прибавляют 9 мкл три-л-этиламина (или 15 мкл
три-п-бутиламина), после чего раствор охлаждают до -15 °С, вносят
в него 8 мкл изобутилхлорформиата и инкубируют 8 мин при -15 °С.
Предварительно 84,2 мг БСА растворяют при 0 °С для предотвраще-
ния выпадения осадка белка в 4,4 мл 50% диметилформамида, до-
бавляют 84 мкл 1 N NaOH и далее вносят ранее полученную реакци-
онную смесь. Раствор инкубируют при 0 °С в темноте под N2 при пе-
ремешивании 1 ч, после добавляют 40 мкл 1 N NaOH и при тех же
условиях продолжают инкубировать еще 5 ч. Полученный конъю-
гат очищают диализом при 4 °С в целлофановых трубках Visking
[type 36/32] («Serva», #44120) 3 дня против 10% диметилформами-
да (5 смен по 2 л) и 3 дня против ФСБ (5 смен по 2 л). После диализа
раствор конъюгата доводят стерильным ФСБ до концентрации
3,5 мг/мл использованного для реакции БСА и хранят при-20 °С.
Для конъюгации БСА с ИУК через азот индольного кольца
(ИУК-М-БСА) используют формальдегидный метод [3, рис. 4.1.1.А].
Количества реагентов для синтеза указаны в табл. 4.1.1.Б. В раствор
БСА последовательно при перемешивании добавляют раствор 3 Μ
Na ацетата, раствор формалина, смесь выдерживают 1 мин и затем
вносят раствор ИУК. Реакционную смесь инкубируют при переме-
шивании под N2 в течение 16-18 ч при 20-22 °С. Полученный конъ-
югат очищают гель-фильтрацией на колонке (1,6x20 см, V=40 мл) с
Sephadex G-25, стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр
(диаметр пор 0,2 мкм) и хранят до использования, как описано выше.
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
297
Синтез конъюгатов цитокининовых рибозидов с БСА (на приме-
ре ЗР-БСА) ведут методом периодатного окисления рибозного остат-
ка [6, рис. 4.1.1. А]. Количества использованных реактивов приведе-
ны в табл. 4.1.1.В. Все операции проводят при перемешивании реак-
ционной среды магнитной мешалкой в сосудах из темного стекла
при 20-22 °С. Диальдегид ЗР получают добавлением в течение
7 мин раствора 0,01 Μ NaIO4 («Serva», Германия) к раствору ЗР
(«Serva», Германия) в метаноле. Через 13 мин избыток NaI04 ней-
трализуют добавлением 0,1 Μ этиленгликоля («Serva», Германия) и
после 5 мин полученный раствор по каплям вносят в раствор БСА в
H2O, доведенный 5% К2CO3 до рН 9,3. По мере добавления ЗР-альде-
гида поддерживают данный рН 5% К2CO3 (рН определяют по инди-
каторной бумаге «Рифан»). Через час два раза с часовым перерывом
между ними добавляют по 1 мг NaBH4 («Serva», Германия) и, через
40 мин после внесения последней порции, рН доводят до 6,5 1 N
уксусной кислотой и выдерживают смесь еще 2 ч. Полученный
ЗР-БСА диализуют при 4 °С в трубках Visking («Serva», Германия)
в течение трех суток против 2 л ФСБ с его 5-кратной сменой. Затем
стерильным ФСБ доводят раствор конъюгата до концентрации
2 мг/мл по белку и хранят при —20 °С.
Поскольку поглощение света свободным и связанным с белком
гаптеном не отличается, молярное соотношение гормон/белок мож-
но определить на спектрофотометре VSU2-P («Karl Zeiss», Герма-
ния) при двух длинах волн, одна из которых является максимумом
поглощения белка, другая — максимумом поглощения гаптена по
формуле: моль ФГ/моль БСА = (БСАεх χ А280/Ах - ΒCΑε280)/(ΦΓε280 -
- ΦΓεx x Α280/Αx), где А280 — оптическая плотность раствора конъю-
гата при 280 нм (максимум поглощения БСА), Ах — оптическая
плотность раствора конъюгата при длине волны максимума погло-
щения гаптена (для ИУК χ = 288 нм, для ЗР χ = 268 нм); ε — коэффи-
циенты молярного поглощения (М_1см-1) χ 104 раствора белка или
ФГ при разных длинах волн (БСАε268 = 3,60, БСАε280 = 4,28 и БСАε288 =
= 2,96; иукε280 = 0,550 и иукε288 = 0,468; 3Ρε268 = 1,72 и 3Ρε280 = 1,09).
Молярные соотношения гормон/белок для синтезированных конъю-
гатов составляли: 29:1 для ИУК-С-БСА (синтез с помощью ДЦКД) и
9:1 (синтез методом смешанных ангидридов); 54:1 для ИУК-N-BCA;
4:1 для ЗР-БСА.
Синтез конкурентных конъюгатов для сенсибилизации планшет
Конъюгаты синтезируют на основе овальбумина (Ов) («Serva», Гер-
мания) или овальбумина, модифицированного лизином (Лиз-Ов),
298
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
который получают по Мальдини с сотр. [11]. В раствор 40 мг Ов в
20 мл ФСБ в сосуде из темного стекла при 20-22 °С по каплям при
перемешивании магнитной мешалкой добавляют 800 мкл 1% глю-
таральдегида («Serva», Германия), через 3 ч вносят 1 мл 2 Μ раство-
ра лизин-HCl и оставляют еще на 1 ч. Полученный Лиз-Ов очищают
диафильтрацией через мембрану РМ-10 в концентрирующей ячейке
Amicon 8050 («Amicon», США) пятью циклами концентрирования
раствора до 1-2 мл с последующим доливом H2O до 20-30 мл, после
чего фильтруют через капроновый мембранный фильтр с порами
диаметром 0,45 мкм («Диа-М», Россия) и хранят концентриро-
ванным (10 мг/мл в H2O или в 0,1 Μ боратно-карбонатном буфере,
рН 8,5) при -20 °С.
Синтез конъюгатов ФГ с Ов или с Лиз-Ов проводят методами,
аналогичными конъюгированию с БСА (см выше), но с некоторыми
модификациями количеств используемых реагентов, которые при-
ведены в табл. 4.1.1. Синтезированные конъюгаты очищают от низ-
комолекулярных компонентов реакционной смеси и переводят в
ФСБ методом диафильтрации в концентрирующей ячейке Amicon
8050 (для ЗР-Лиз-Ов и ИПА-Лиз-Ов) или гель-фильтрацией, либо
на миниколонке (V = 5 мл) с Acrylex P6 F («Reanal», Венгрия)
(HyK-N-Лиз-Ов, ГК1-Лиз-Ов, ГК3-Лиз-Ов, (+)АБК-Лиз-Ов), или на
колонке (1,6x20 см, V=40 мл) с Sephadex G 25 F (для ИУК-С-Ов и
ИМК-С-Ов) аналогично описанному выше. Раствор очищенных
конъюгатов доводят ФСБ до концентрации 1 мг/мл по белку, добав-
ляют NaN3 до 0,1-0,02 % и хранят порциями по 100 мкл при -20 °С.
Процедура иммунизации и получение антисыворотки
Для получения поликлональных AT к одному ФГ обычно использу-
ют 1-2 кроликов, проводя иммунизацию по одной из схем, показан-
ных на рис 4.1.1.Б [см. также 16, с. 6]. Для усиления иммунного от-
вета раствор конъюгата ФГ-БСА в ФСБ смешивают 1:1с неполным
(содержит только легкое минеральное масло с эмульгатором) или
полным (содержит дополнительно 0,1% убитых сухих клеток
Mycobacterium butyticum) адъювантом Фрейнда («Calbiochem»,
Швеция), непосредственно перед инъекциями гомогенизируя смесь
набором-опорожнением шприца через иглу большого диаметра и из-
бегая попадания в нее пузырьков воздуха. Иммунизация включает в
себя преиммунизацию и 5-7 поддерживающих ежемесячных инъ-
екций, после каждой из которых через 7-10 дней производят забор
крови для получения антисывороток. Преиммунизацию проводят
2 мл вышеописанной смеси раствора конъюгата 1 мг/мл в ФСБ с пол-
ным адъювантом Фрейнда 1:1. Если в первой схеме преиммуниза-
ция состоит из 4 еженедельных подкожных инъекций (разовая
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
299
доза смеси на 1 кролика — 0,5 мл, 5-7 подкожных введений по
~0,1 мл): 1-я инъекция — в холку, 2-я — в брюшко, 3-я и 4-я — в
спинку вдоль позвоночника, то во второй преиммунизацию прово-
дят в один этап, делая множественные внутрикожные инъекции.
Через месяц после последней инъекции делают первую поддержива-
ющую инъекцию. Поддерживающие уколы ставят внутримышечно
в бедренную часть задних лапок, в каждую по 0,5 мл смеси раствора
конъюгата 2 мг/мл в ФСБ с адъювантом Фрейнда 1:1, полным для
первой схемы и неполным для второй. В отличие от первой схемы
во второй схеме иммунизации между первой и второй поддержива-
ющими инъекциями проводят дополнительную внутримышечную
инъекцию, вводя в каждую бедренную часть задних лапок по 0,5 мл
раствора конъюгата гормон-БСА в ФСБ (2-3 мг/мл), но без адъю-
ванта.
Забор крови (20—50 мл с 1 кролика) производят из краевой вены
уха, которое последовательно протирают ксилолом (для набухания
вен), спиртом и ФСБ, и после надреза вены безопасной бритвой
кровь собирают в стеклянный цилиндр на 50 мл, предварительно
смоченный ФСБ для предотвращения ее преждевременного сверты-
вания и прилипания фибринового сгустка к стеклу. Перед надрезом
вены край уха, по которому стекает кровь, обычно смазывают вазе-
лином, что предотвращает тромбообразование. Фибриноген из крови
удаляют, выдерживая ее 30 мин при +37 °С, а затем 1 сутки при 4 °С
для полной ретракции (сжатия) образовавшегося фибринового сгуст-
ка и получения большего объема сыворотки (~1/2-3/4 от объема
крови). Далее сыворотку освобождают от форменных элементов
крови центрифугированием при 2-4 тыс. об./мин 30 мин при 4 °С
(центрифуга К24 D, «VEB MLW Medizintechnik», Германия), добав-
ляют NaN3 до 0,1-0,02% и хранят при +4 °С или при -20 °С (дли-
тельное хранение). Антисыворотка с высокой чувствительностью к
ФГ и высоким содержанием специфичных AT (высокий титр) может
быть получена после 3-5 поддерживающих инъекций.
Аффинная очистка антител
Для повышения чувствительности ИФА (см. график калибровки
АБК на рис. 4.1.1.Г) из грубой антисыворотки выделяют фракцию
гормон-специфичных AT, проводя иммуноаффинную хроматогра-
фию. Сорбент для анти-ИУК-С-БСА или анти-АБК-БСА AT синте-
зируют ковалентной иммобилизацией ИУК или АБК на амино-се-
фарозе типа AH-Sepharose-4B с помощью водорастворимого карбо-
диимида (N-диметиламинопропил-N'-этилкарбодиимид, EDC) [15].
К 2 мл сыворотки добавляют 2 мл 0,01 Μ КН2PO4/К2НPO4 буфера,
рН 7,5, доводят рН до 7,8, используя 120 мкл 0,1 Μ КОН/К2НPO4
300
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
буфера с рН 11,6, полученные 4 мл загружают в колонку с 5 мл сор-
бента и инкубируют в ней 30 мин. Далее сорбент последовательно
промывают 10 мл 0,01 Μ К-фосфата рН 7,2 и 20 мл ФСБ при скорос-
ти 0,4 мл/мин. Антитела элюируют 10 мл 0,1 Μ КОН/К2НРO4 буфе-
ра рН 11,6. Элюат нейтрализуют равным объемом 1М Tris-HCl с рН
7,0 до рН 7,5 и добавляют NaN3 до 0,1-0,02%. Полученную фрак-
цию AT хранят при 4 °С.
Конъюгат вторичных (антивидовых) антител с ферментом
В качестве ферментного конъюгата используют препарат лиофи-
лизированных бараньих AT против иммуноглобулинов кролика
IgG(H+L), меченных пероксидазой хрена («Предприятие по произ-
водству бактерийных препаратов — НИИЭиМ им. Η. Φ. Гамалеи»,
РАМН, Москва, Россия). Препарат сухих AT из ампулы с указан-
ным объемом растворяют в 2 объемах Н2O и добавляют 2 объема гли-
церина. Полученный раствор препарата AT с ферментом 1:4 в 50%
глицерине хранят до использования при -20 °С (можно хранить до
15 лет!) и готовят в рабочем разведении (1:500) в ФСБ-Т с 0,5% Ов
непосредственно перед нанесением в лунки планшета.
Реактивы и материалы для выделения фитогормонов
из растительных проб для ИФА
Сорбенты и колонки для разделения и очистки ФГ
Патрон с Поролас ТМ — полипропиленовая мини-колонка для твер-
дофазной экстракции Диапак на 1 мл («БиоХимМак СТ», Россия),
заполненная 50 мг гидрофобного сорбента Поролас ТМ (гранули-
рованный стирол-дивинилбензольный сополимер, диаметр зерен
100-200 мкм, размер пор 42,4 А («ОмскХимПром», Россия)).
С18 Amprep (300 мг) — колонка для твердофазной экстракции с
фазой С18 (модифицированный октадецилсиланом силикагель), взя-
той из 3 серийных мини-колонок С18 Amprep 100 mg («Amersham»,
Англия). Колонки перед использованием для активации максималь-
ной сорбционной емкости последовательно промывают метанолом и
Н2O по 5 раз и хранят до использования в метаноле.
ПВПП1 и ПВПП 2 — колонки (6,0x0,8 см) с 1 мл и 2,5 мл соот-
ветственно, ПВПП («Sigma», США), набухшего в Н20 и промытого
от мелких частиц 5-кратной декантацией. После использования
ПВПП регенерируют 10 объемами 6 Μ мочевины с последующей
промывкой Н20, в которой хранят при комнатной температуре в
темноте до повторного использования.
Колонки на 1,25 мл (6,0x0,6 см) с 1,5 мл фазы ToyopearlHW 40F
(«TSK», Япония) или ПВПП Polyclar AT («Serva», Германия), на-
бухшего в Н2O и промытого, как указано выше.
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК... 301
Получение раствора диазометана
и синтез метиловых эфиров (метилирование)
карбоксил-содержащих ФГ
Нитрозометилмочевину для получения диазометана синтезируют
по методике, описанной в Органикуме, т. 2 [17, с. 268], и хранят по-
рциями в стеклянных пробирках на 2 мл при -20 °С. Так как нитро-
зометилмочевина и диазометан очень сильные мутагены, все мани-
пуляции с ними надо проводить в вытяжном шкафу. Перед генера-
цией диазометана пробирку закрывают полиэтиленовой крышкой с
двумя сквозными отверстиями: для иглы шприца и для трубочки.
Газообразный диазометан получают разложением нитрозометилмо-
чевины, для чего на водно-ледяной бане к ней после предваритель-
ного смачивания водой добавляют по каплям из шприца раствор
40% КОН. Образующиеся пары желтого цвета отводят с помощью
полиэтиленовой трубочки в сосуд, где пропускают через охлажден-
ный до -20 °С смесью льда с поваренной солью эфир, до приобрете-
ния последним ярко-желтого цвета. Для метилирования проб ис-
пользуют свежеприготовленный эфирный раствор диазометана.
Серный эфир (очистка от перекисей)
Наличие в эфире перекисей можно определить по пожелтению до-
бавленных в его аликвоту нескольких капель свежеприготовленно-
го раствора 2% KJ, подкисленного 1 Μ НС1. Для очистки 1 л серного
эфира в стеклянной делительной воронке встряхивают 5 мин с
100 мл 20% метабисульфита Na, отделенный эфир снова встряхива-
ют 5 мин с 100 мл 20% NaOH, эфир после отделения 5-кратно про-
мывают в делительной воронке бидистиллированной водой. Далее в
эфир (1л) добавляют 10 мл 2% НС1 и перегоняют на водяной бане
при 40 °С.
Ход определения
Подготовка проб растительного материала для ИФА
Пробу растительного материала (0,1-0,3 г сырого веса) растирают
стеклянным пестиком (диаметром 8,5 мм) в жидком азоте в фарфоро-
вом тигле с матированным дном до порошкообразного состояния, до-
бавляют 80% метанол с антиоксидантами (200 мг/л ВНТ и 100 мг/л
аскорбиновой кислоты), переносят суспензию в мерные полипропи-
леновые пробирки на 10 мл («Sarstadt», Германия) и доводят объем
до 5 мл. Затем под током газообразного N2 пробирки закрывают герме-
тичной крышкой и инкубируют -20 ч при +4 °С при постоянном
встряхивании на шейкере. Далее экстракты фильтруют через по-
302
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
липропиленовый шприц-наконечник с 1 слоем бумажного фильтра
на дне, и одновременно для очистки от липидов и хлорофиллов про-
пускают через присоединенный к нему патрон с Поролас ТМ (50 мг
сорбента), предварительно промытый метанолом и H2O по 6 мл и
продутый воздухом. Затем патрон с Поролас ТМ дополнительно про-
мывают 1 мл 80% метанола и объединенные 6 мл экстракта упари-
вают в темноте (при красном свете) в пенициллиновых флаконах на
5 мл на водяной бане при +40 °С под током N2 в течение -40 мин до
-0,5 мл водного остатка, который до разделения ФГ хранят при
-20 °С 1-4 дня. Использованный патрон с Поролас ТМ очищают
6 мл ацетона, промывают 4 мл H2O и хранят до следующего употреб-
ления.
Для определения связанных форм ФГ перед очисткой и фрак-
ционированием пробы в аликвоте ее водного остатка производят
разрушение конъюгатов. Гидролиз эфиров ИУК (глюкозидов) про-
водят в 1 N NaOH 1 ч при 23 °С, пептидов ИУК (аминокислотных
конъюгатов) — в 7 N NaOH 3 ч при 100 °С. После гидролиза раство-
ры NaOH на льду нейтрализуют 5 N H3PO4. Глюкозные эфиры АБК
гидролизуют 2 Ν ΝΗ4ΟΗ 2 ч при 60 °С. Расщепление фосфорных
эфиров цитокининовых нуклеотидов с переводом их в нуклеозиды
проводят щелочной фосфатазой: в пробу вносят фермент в 0,01 Μ
Tris с 0,001 Μ MgCl2 из расчета 25 единиц активности фермента на
мл раствора и инкубируют 2 ч при 37 °С. Для получения свободных
оснований цитокининов из их рибозидов, N-глюкозидов и 0-глюко-
зидов (для зеатина и дигидрозеатина) применяют β-глюкозидазу
(2,5 единиц на мл раствора), с которой пробу в 0,01 Μ Tris-HCl pH 5
инкубируют 1 ч при 37 °С.
Разделение фитогормонов на колонках ПВПП и С18
Дальнейшую очистку ФГ с их разделением на отдельные фракции
ведут тремя основными этапами (рис. 4.1.2.А) на колонках с ПВПП
и силикагелем С18. Перед этапом I колонку С18 промывают метано-
лом и H2O по 6 мл. Далее в нее сверху вставляют колонку ПВПП-1
(1 мл сорбента), а выход для поддержания скорости элюции 1 мл/мин
соединяют силиконовым шлангом с перистальтическим насосом и
собранную систему колонок ПВПП-1 — С18 (рис. 4.1.2.А, I) уравно-
вешивают 3 мл 0,05 Μ ΚΗ2ΡO4/Η3ΡO4 буфера, рН 3,0. На этапе I
(рис. 4.1.2.А) водный остаток метанольного экстракта проб дово-
дят до 1,5 мл H2O, подкисляют до рН 3,0 добавлением 0,5 мл 0,2 Μ
КН2PO4/H3PO4 буфера, рН 2,88, и пропускают через систему
ПВПП-1 — С18, которую затем промывают 6 мл 0,05 Μ КН2PO4/
H3PO4 буфера, рН 3,0, и потом колонки разъединяют. ИУК и ряд ин-
дольных и фенольных соединений остаются на ПВПП-1, а АБК, гиб-
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
303
береллины и цитокинины свободно элюируются (рис. 4.1.2.Б1) и
концентрируются на С18.
Промывка колонки ПВПП-1 на этапе I и последующая дополни-
тельная промывка H2O и 0,06 Μ NaH2PO4/Na2HPO4 буфера, ρΗ 5,0,
по 1 мл на этапе Па (рис 4.1.2. А) элюируют с нее большинство амфо-
терных и нейтральных индольных производных (триптофан, индо-
лилацетамид, индолилацетальдегид), в то время как некоторые ней-
тральные и кислые производные либо полностью (индолилацето-
нитрил, индолацетамид, индолилмасляная кислота), либо частично
(триптофол, индолилацетиласпарагиновая кислота) задерживают-
ся вместе с ИУК (см. рис. 4.1.2.Б1, Б2). Для отделения их, а также
фенолкарбоновых кислот (кумаровой, коричной, феруловой и т. д.)
от ИУК проводят этап очистки Пб-в (рис 4.1.2.А), перед которым к
ПВПП-1 снизу присоединяют дополнительную колонку ПВПП-2 с
2,5 мл фазы для увеличения длины хроматографического пробега в
3,5 раза, что улучшает эффективность разделения в л]3,5= 1,8 раза.
Получение на этапе Пб-в фракции ИУК, свободной от малоподвиж-
ных на ПВПП нейтральных индолов (триптофол, индолилацетонит-
рил), происходит за счет увеличения рН элюента до 7,4, при кото-
ром подвижность кислых индолов значительно возрастает, остава-
ясь неизменной у нейтральных. Для лучшего разделения ИУК от
других кислых индолов (индолилацетиласпарагиновой кислоты,
индолилмасляной кислоты) повышение рН проводят ступенями рН
5-7.4 (см. рис. 4.1.2.Б). Таким образом, на этапе Пб (рис. 4.1.2.А)
систему колонок ПВПП-1-2 последовательно промывают 4 мл
NaH2PO4/Na2HPO4 буфера с рН 5,0 и З мл ФСБ. Перед этапом Пв
снизу к системе колонок ПВПП-1-2 присоединяют патрон с Поро-
лас ТМ, предварительно промытый последовательно по 5 мл метано-
ла, H2O и 0,05 Μ ΚΗ2ΡO4/Η3ΡO4 буфера с рН 3,0. Полученную систе-
му колонок промывают 3 мл ФСБ (рис. 4.1.2.А), и свободная от при-
месей ИУК элюируется с колонок ПВПП-1-2 (см. рис. 4.1.2.Б),
сорбируясь на Поролас ТМ. Данный материал обладает высокой
гидрофобностью и при высокой ионной силе элюента (0,15 Μ NaCl)
способен удерживать ИУК даже при нейтральном рН раствора.
После этапа Пв Поролас ТМ отсоединяют от ПВПП-1-2, промывают
0,5 мл H2O и 0,5 мл метанола, и ИУК элюируют 3,5 мл метанола
(рис. 4.1.2.А) в 5-мл пенициллиновый флакон с 20 мкл раствора
ВНТ (butylated hydrixytoluene, 2,6-di-tert-butyl-p-cresol, «Serva»,
Германия) в 96% этаноле (1 мг/мл). Метанольный элюат упаривают
досуха в темноте (при красном свете) под током азота при +40 °С.
Далее ИУК метилируют, для чего сухой остаток растворяют в 100 мкл
метанола, добавляют на льду при перемешивании раствор диазомета-
на в диэтиловом эфире (см. «Материалы и реактивы») до появле-
ния устойчивой слабо-желтой окраски (-300-400 мкл на пробу),
304
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
инкубируют 15-20 мин в темноте, растворитель выпаривают под
током N2 и хранят до анализа при -20 °С. Для ИФА с использовани-
ем AT против конъюгата, в котором ИУК ковалентно закреплена на
белке через азот индольного кольца, метилирование не производят.
Для проверки чистоты полученной фракции ИУК применяют
тонкослойную хроматографию (ТСХ) ее аликвоты, которую прово-
дят на пластинах Silufol («Kavalier», Чехия) в смеси растворителей
бензол/гексан/ацетон (3/4/3 объемные части) для метилированных
проб или бензол/ацетон/пиридин (60/39/1 объемные части) для не-
метил ированных. Пробы на старт наносят полосой 1 см в 10 мкл
метанола, и пробег растворителя от старта до финиша составляет
10 см. Хроматограмму просушивают 2-3 мин, вырезают из нее вер-
тикальную полосу с пробегом одной пробы (2 см χ 10 см), которую
делят на 20 равных участков, и каждый экстрагируют в 2 мл мета-
нола в течение суток при +4 °С. Метанол выпаривают под током Ν2
при +40 °С и фракции до ИФА хранят при -20 °С. Часть хроматогра-
фической пластины используют для стандартов индольных веществ
(по 5-10 мкл 10-2 Μ раствора в метаноле на стартовое пятно), поло-
жение которых после ТСХ выявляется цветной реакцией с реакти-
вом Ван-Урка: 1 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в
смеси 50 мл 25% НС1 и 50 мл 96% этанола. Пластины после опрыс-
кивания реактивом прогревают 5 мин при 90 °С, и индолсодержащие
вещества окрашиваются в синий цвет. Подвижности стандартов в пер-
вой системе растворителей (бензол/гексан/ацетон): индолилацетамид
(Rf 0,1), триптофол (Rf 0,35), метиловый эфир индолилацетиласпара-
гиновой кислоты (Rf 0,45), метиловый эфир ИУК (Rf 0,65) и метило-
вый эфир индолилмасляной кислоты (Rf 0,75). Во второй системе
растворителей (бензол/ацетон/пиридин): индолилацетиласпараги-
новая кислота (Rf 0,02), индолилацетамид (Rf 0,3), индолилпирови-
ноградная кислота (Rf 0,32), ИУК (Rf 0,58), триптофол (Rf 0,65), ин-
долилмасляная кислота (Rf 0,7) и индолилацетонитрил (Rf 0,87).
Гормоны пробы, сконцентрированные после этапа I на колонке
С18 (рис. 4.1.2.А), далее на этапах Ша-в элюируют кислыми вод-
но-метанольными растворами с возрастающей концентрацией спир-
та: пошагово 5,5 мл 20% (фракция Зеа/ЗР), 4 мл 25% (фракция
ГК3/ГК1) и 4мл 40% метанола в 0,2 Μ уксусной кислоте (фракция
АБК- и ИП/ИПА; этапы IIIа, IIIб, IIIв соответственно, рис. 4.1.2.А).
На рис. 4.1.2.В показана хроматограмма стандартов этих ФГ. Элю-
цию проводят при помощи шприца на 5 мл со скоростью 1 мл/мин
(1-2 капли/с). Перед каждым этапом фракционирования к колонке
С18 снизу присоединяют патрон с Поролас ТМ (рис. 4.1.2.А) для
концентрирования соответствующих ФГ из выходящего водно-ме-
танольного раствора, которые потом элюируют с Поролас ТМ 5 мл
метанола (первые 0,5 мл отбрасывают) в 10-мл силилированные
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК... 305
(«Силикон ДС-1», «Диа-М», Россия) пенициллиновые флаконы с
добавлением 20 мкл ВНТ в 96% этаноле (1 мг/мл). Элюат упаривают
при пониженном давлении (0,8 кгс/см2), создаваемом водоструй-
ным насосом, с одновременным выдуванием паров растворителя то-
ком N2 при +35 °С; ГК3/ГК1-содержащие фракции метилируют, как
ранее описано для ИУК, и до ИФА пробы хранят при -20 °С. Коли-
чественный выход стандартов ИУК, ЗР, Зеа, ИПА, ГΚ1 и АБК при
данной системе разделения, оцененный с помощью ИФА, составля-
ет 88, 85, 95, 84, 85 и 99% соответственно.
Как видно из рис. 4.1.2.В, фракционирование на колонке С18 не
позволяет разделить рибозиды и основания цитокининов и измере-
ния ИФА в данном случае представляют собой общую иммунореак-
тивность пробы, которую количественно выражают либо в эквива-
лентах основания, либо рибозида (ЗР-экв. и ИПА-экв.). Кроме того,
фракции могут содержать иммунореактивные N-глюкозиды и нук-
леотиды цитокининов. Для дополнительной очистки и измерения
по отдельности каждой формы цитокинина полученные фракции
Зеа/ЗР и АБК-ИП/ИПА дополнительно разделяют либо тонкослой-
ной хроматографией на пластинах Silufol, либо жидкостной коло-
ночной хроматографией.
Хроматография цитокининов
ТСХ цитокининов на пластинах Silufol ведут в смеси растворителей
n-бутанол/14 Μ ΝΗ4ΟΗ/Η2O (6/1/2 объемные части), используя для
хроматографии бутанольную (верхнюю) фазу смеси. После хрома-
тографии пластины просушивают 15-20 мин в эксикаторе, создавая
в нем вакуум с помощью водоструйного насоса, вырезают из них
вертикальные полосы с пробегом одной пробы (2 см χ 10 см), разме-
чают скальпелем на 20 равных участков, силикагель слегка опрыс-
кивают водой и размеченные зоны тефлоновым шпателем снимают,
перенося их для экстракции в 1 мл смеси метанол/H2O/уксусная
кислота (10:10:1) с 50 мкг ВНТ. Цитокинины экстрагируют 1 ч при
комнатной температуре со встряхиванием, затем центрифугируют
при 15 000 g 7 мин с охлаждением, 800 мкл супернатанта переносят
в пенициллиновые флаконы на 10 мл и либо хранят при -20 °С,
либо сразу упаривают в вакууме водоструйного насоса при +30 °С
досуха за -15 мин и хранят до ИФА при -20 °С. Положение стандар-
тов цитокининов (по 10-20 мкл 10-2 Μ раствора в метаноле на старто-
вое пятно) выявляют, опрыскивая хроматограмму раствором KMnO4
и прогревая 5 мин при 37 °С (неспецифическое побурение органи-
ческих соединений). В качестве стандартов используют зеатин (Зеа)
(Rf 0,48), зеатинрибозид (ЗР) (Rf 0,25), изопентениладенин (Rf 0,67),
изопентениладенозин (Rf 0,37) и краситель Congo red (Rf 0,18), κοχρο-
306
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
матографируемый в данной системе растворителей с N- и 0-глюко-
зидами зеатина.
Жидкостную хроматографию цитокининов проводят на колонках
Toyopearl HW 40F для разделения Зеа/ЗР и Polyclar AT (см. «Матери-
алы и реактивы») для разделения ИП/ИПА/АБК. В колонки вводят
0,5 мл раствора пробы в ФСБ и далее элюируют ФСБ самотеком со
скоростью ~3 мл/ч. Для дополнительного разделения на Toyopearl
HW ИП и ИПА после 7,5 мл ФСБ используют 0,005 Μ уксусную
кислоту. Хроматография стандартов цитокининов приведена на
рис. 4.1.2.Г Стандарт АТФ используют для определения места вы-
хода нуклеотидных форм цитокининов.
Иммуноферментный твердофазный анализ
ИФА проводят в основном на полистироловых 96-луночных плоско-
донных планшетах, например Dynatech microtiter, ELISA F-plate
Immulon (Германия). Краевые лунки в анализе не используют. Лун-
ку А1 выбирают в качестве контрольной при измерении оптической
плотности остальных и используют только для заполнения хромо-
генным субстратом в конце ИФА (этап 4). Общая процедура ИФА
схематично показана на рис 4.1.1 .В.
1-й этап. Сенсибилизация лунок конкурентным АГ. Сорбцию
конкурентного антигена (конъюгата ФГ с Ов или с Лиз-Ов) на по-
верхность лунок планшета (сенсибилизация) проводят его раство-
ром (-0,1 мкг/мл) в 0,05 Μ NaHCO3/Na2CO3 буфере, рН 9,7, внося по
150 мкл на лунку, и далее планшет инкубируют 3 ч при +37 °С или,
для ИУK-N-Лиз-Ов, в течение ночи при +4 °С. Лунки освобождают
стряхиванием планшета и трижды промывают ФСБ-Т, подавая его с
помощью многоканального дозатора (рис. 4.1.2.В), инкубируя пос-
ле каждого заполнения по ~5 мин и удаляя раствор стряхиванием.
После сенсибилизации промытую планшету либо сразу используют
для проведения ИФА, либо хранят до использования при -20 °С.
Концентрацию конъюгата для сенсибилизации подбирают в
предварительных тестах, руководствуясь несколькими критерия-
ми: окончательная оптическая плотность лунок после проведения
хромофорной реакции должна лежать в достоверном диапазоне из-
мерений используемого фотометра (обычно относительная оптическая
плотность не выше 1,0-1,2 единиц), и данное разведение должно обес-
печивать максимальную чувствительность ИФА. Последнее опре-
деляется тестированием серии различных сочетаний разведений
конъюгата и антисыворотки, по мере ее разбавления чувствительность
анализа увеличивается. Оптимальная концентрация конъюгата дол-
жна быть наименьшей из тех, при которых по мере понижения разве-
дения антисыворотки наблюдается насыщение связывания AT (плато
хромофорного ответа). Для данной концентрации конъюгата под-
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
307
бирают разведение антисыворотки, дающее -70% от максималь-
ного связывания AT (максимального хромофорного ответа).
2-й этап. Конкурентное связывание первичных AT. Перед про-
ведением этапа готовят растворы анализируемой пробы и растворы
стандартов ФГ для построения калибровочного графика. Сухой
упаренный остаток очищенной фракции пробы растворяют, до-
бавляя 10 мкл 80% этанола и затем 600-1000 мкл ФСБ-Т. Стан-
дарты ФГ в ФСБ-Т готовят в диапазоне концентраций 10~7-10~10,5М
(см. рис. 4.1.1.Г) из маточного раствора 5 10-3 Μ или 2·ΙΟ-5 Μ в 80%
этаноле, который хранят при -20 °С. Для построения калибровочного
графика обычно используют 4 концентрации стандарта, делая десяти-
кратные разведения с промежуточными, кратными sqrt 10 = 3,16 (напри-
мер, 316 мкл стандарта доводят до 1 мл, прибавляя 684 мкл ФСБ-Т).
Контроль (ФСБ-Т), стандарты и анализируемую пробу тестиру-
ют в 4-6 аналитических повторностях, внося в сенсибилизирован-
ные лунки по 75 мкл, после чего планшет охлаждают -15 мин при
+4 °С. Затем в каждую лунку вносят по 75 мкл охлажденной кро-
личьей антисыворотки, разведенной в ФСБ-Т с 1% Ов (табл. 4.1.3) и
планшет инкубируют 2 ч при +4 °С. Поскольку между анализируе-
мым ФГ и его сорбированным гормон-белковым конъюгатом идет
конкуренция за связывание с AT (анти-ФГ IgG, рис. 4.1.2.В), то им-
мобилизация последних на планшете обратно пропорциональна ко-
личеству ФГ в пробе. По окончании этапа конкуренции лунки план-
шет трижды промывают ФСБ-Т.
3-й этап. Инкубация с вторичными AT. В лунки вносят по
150 мкл раствора меченных пероксидазой хрена вторичных бараньих
AT против иммуноглобулинов кролика в разведении 1:500 в ФСБ-Т
с 0,5% Ов, инкубируют 1 ч при +37 °С, после чего лунки 3 раза про-
мывают ФСБ-Т и 3 раза дистиллированной H2O.
4-й этап. Цветная реакция. Для определения активности иммо-
билизованной пероксидазы в лунки вносят по 150 мкл хромогенного
субстрата — свежеприготовленного раствора орто-фенилендиами-
на (0,4 мг/мл) в 0,06 Μ NaH2PO4/Na2HPO4 буфере, pΗ 5,0 с 0,03%
H2O2 (1 мл аптечной 3% H2O2 добавляют в 100 мл раствора непосред-
ственно перед внесением в лунки). Планшеты инкубируют 30 мин
при 37 °С, затем реакцию останавливают добавлением 40 мкл 6 N
H2SO4. Интенсивность хромофорного ответа измеряют при λ = 492 нм
на планшетном спектрофотометре типа Titertek Multiskan МСС-340
(«Flow Laboratories — Labsystems», Нидерланды — Финляндия).
Интерпретация результатов
Концентрационную калибровочную прямую для ФГ получают с по-
мощью logit-преобразования данных оптической плотности лунок
308
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
по формуле: logit (В/В0) = In [(В/В0)/(1 — В/В0)] = а-\&Сфг + Ь, где
В = А-Аmах, В0 = А0-Аmах, где А — оптическая плотность лунок, в
которых инкубировали стандарты ФГ; А0 — лунки без внесения ФГ
(контроль); Атах — фоновая оптическая плотность за счет неспеци-
фического связывания первичных и вторичных AT с планшетом,
определяемая при инкубации стандарта с насыщающе высокой кон-
центрацией ФГ (~10-4-10_3 М); СфГ — молярная концентрация ФГ в
объеме вносимой в лунку пробы; а и b — коэффициенты линейной
регрессии калибровочной прямой [4]. В низкофоновых системах
ИФА Аmах обычно очень мала (менее 2% от безгормонального кон-
троля А0), и постоянное измерение ее величины может не прово-
диться, принимая В = А и В0 = А0. Так как контроль, стандарты и
анализируемую пробу тестируют в 4-6 аналитических повторнос-
тях (лунках), то для расчетов В или В0 берут их средние арифмети-
ческие. Аналогичное logit-преобразование проводят и для лунок с
анализируемой пробой, следовательно, lgСфг(проба) = (ln[(Впроба/В0)/
(1-Впроба/В0)]-b)/а.
Коэффициент калибровки а отражает восприимчивость ИФА к
концентрационным изменениям, что определяет точность анали-
за — чем ниже коэффициент, тем в более узком диапазоне проходят
измерения. Количество ФГ, необходимое для 50% ингибирования
связывания AT с планшетом (СфГ50%), при котором logit (B/B0) = 0,
является показателем чувствительности тест-системы к ФГ.
СфГ50% используется при оценке специфичности ИФА — процент
перекреста основного ФГ с другими веществами вычисляется как
СфГ50% /Сх50% x 100% , где Сх50% — чувствительность к веществу-пе-
рекрестнику. Типичные калибровочные графики ИФА для ФГ по-
казаны на рис. 4.1.1.Г, а специфичность различных тест-систем
ИФА приведена в табл. 4.1.2.
Оценка метода, возможные проблемы
Количественные результаты, получаемые методом ИФА, зависят от
предварительной подготовки проб для анализа: чем тщательнее про-
ведена очистка от интерферирующих примесей и веществ с высоким
процентом иммунного перекреста, тем достовернее результат. Спе-
цифичность антисывороток на порядок снижает требования к нали-
чию посторонних веществ в выделяемой из пробы фракции анализи-
руемого гормона, позволяя заменять ВЭЖХ (тысячи теоретичес-
ких тарелок) твердофазной экстракцией на мини-колонках, сочетая
обращенно-фазовое разделение с ионообменным, и использовать
мини-колонки низкого разрешения (~5 теоретических тарелок при
нормальном давлении, как, например, упоминаемые здесь колонки
с Toyopearl HW 40F и Polyclar AT). Несмотря на вышеупомянутое
преимущество ИФА, при работе с конкретным материалом требуется
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
309
предварительная проверка получаемой фракции на адекватность
количественного анализа: или тестом с добавлением известного ко-
личества ФГ и проведением измерения до и после добавления, или
кратным разбавлением пробы. В последнем случае должна соблю-
даться параллельность графика logit (B/B0) (рис 4.1.1.Г) между крат-
ным разбавлением пробы и кратным (калибровочным) разбавлением
стандарта гормона [15]. Адекватность ИФА достаточно просто дости-
гается очисткой от наиболее явных растительных интерферентов —
фенольных метаболитов с помощью поливинилпирролидона; одна-
ко вторая проблема, связанная с иммунореактивными загрязните-
лями, требует более сложного подхода и зависит от конкретного
гормона. Описанный способ пробоподготовки наиболее надежен в
отношении АБК, в отношении гиббереллинов он применим для
растений, у которых основным представителем является ГКХ, на-
пример горох [10, 13].
Для ИУК значение степени очистки ее фракции от конъюгиро-
ванных форм зависит от типа используемой антисыворотки, кото-
рая может быть против ИУК, закрепленной на белке ковалентно
либо по С1, либо по N индольного кольца. В последнем случае фрак-
ционирование на поливинилпирролидоне может быть достаточно
из-за нечувствительности AT к связанной ИУК (табл. 4.1.2.А). При
применении анти-С1-ИУК AT необходима проверка фракций с по-
мощью ТСХ (см. Ход определения и [4]), по результатам которой
можно принять решение о целесообразности введения дополнитель-
ной очистки, используя или фракционирование на С18 Amprep —
место выхода ИУК совпадает с ГК1/ГК3 (рис. 4.1.2.В), или фракцио-
нирование на катионообменниках типа Диапак Амин или ДЕАЕ
(нейтральные эфиры ИУК не задерживаются).
Наибольшую сложность для анализа представляют цитокини-
ны. Выделяемая на С18 Amprep фракция ИП/ИПА (см. «Ход опре-
деления») свободна от нуклеотодов ИП, которые более подвижны,
однако для раздельной оценки ИП и ИПА требуется дополнитель-
ная колоночная хроматография (рис. 4.1.2.Г). Фракция Зеаи ЗР мо-
жет содержать дополнительно как иммунореактивные нуклеотиды
зеатина, так и его иммунореактивные N-гликозиды, что делает
дополнительную хроматографию (например, на Polyclar AT,
рис. 4.1.2.Г) необходимой не только для разделения Зеа и ЗР. В за-
висимости от целей исследования можно использовать полуколи-
чественную оценку цитокининов, определяя основания и рибозиды
в одной пробе и выражая их как псевдосумму (например Зеа/ЗР, по-
скольку они имеют разную молярную иммунореактивность) и давая
количество в эквиваленте одной из форм [10, 11, 13].
Многоэтапные стадии подготовки проб, особенно при проведе-
нии колоночного фракционирования, связаны с потерями изучае-
мого вещества и могут варьировать от пробы к пробе. Общепринятым
310
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
решением данной проблемы является введение в пробу радиоактивно
меченного гормона с С14 (Т1/2 5 730 лет) или H3 (Т1/2 12,4 года), потери
которого будут проверены на заключительном этапе. Отчасти флук-
туацию потерь можно преодолеть, избегая промежуточных опера-
ций концентрирования проб перед следующим этапом, используя
метод элюции из колонки в колонку, а фракционирование вести при
эффективном разделении веществ по специально подобранной схе-
ме элюции, захватывая нужную фракцию с «запасом», что учтено в
приводимом методе подготовки проб для ИФА.
При разработке тест-системы ИФА могут возникать некоторые
проблемы с ее чувствительностью и характером детекции, связан-
ным с крутизной наклона получаемого калибровочного графика
(чем круче, тем достовернее количественная оценка). Если данные
характеристики не удается значительно улучшить подбором разве-
дения иммуногена и антисыворотки (см. Ход определения), необхо-
димо обратить внимание на неспецифическую сорбцию первичных
и вторичных AT на планшете, обусловливающую фоновую иммуно-
реактивность. Устранение данного фона можно достичь добавлением
в ФСБ-Т вместо овальбумина другого белка (1% БСА или 5% обез-
жиренное сухое молоко (NFDM)), блокирующего остаточные места
сорбции на планшете. Также необходимо проверить иммунореак-
тивность полученной антисыворотки на белок, используемый для
синтеза конкурентного иммуногена — в случае высокого показате-
ля конъюгат следует сделать с другим белком. Для снижения фона и
увеличения чувствительности AT используют аффинную очистку
антисывороток [15], однако данная процедура в отношении поли-
клональных AT, как ни парадоксально, может снизить их специ-
фичность (табл. 4.1.2. А). Детекция ФГ может быть также увеличена
с помощью гетерологического ИФА (см. выше), однако данный
подход может также негативно повлиять на специфичность теста
(табл. 4.1.2.А). На чувствительность анализа может оказать влия-
ние температура — при повышенной температуре (37 °С) может на-
блюдаться эффект положительной кооперативности — усиление свя-
зывания AT с высокомолекулярным АГ в присутствии мини-коли-
честв гаптена, поэтому для повышения чувствительности ИФА этап
конкурентного связывания лучше проводить при 4 °С. Выбор план-
шет для проведения ИФА также важен для получения достоверных
результатов. Помимо высоких сорбционных способностей, одним из
требований, предъявляемых к качеству планшет для ИФА (для
обеспечения точности анализа), является равномерность сорбци-
онных свойств по всей поверхности (по всем лункам), что определя-
ется в основном технологией формовки и зависит от фирмы произво-
дителя. Таким образом, перед приобретением планшет необходимо
протестировать несколько экземпляров, оценив их пригодность.
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
311
Литература
1. Fuchs S., Haimovich J., Fuchs Υ. Immunological Studies of Plant
Hormones. Detection and Estimation by Immunological Assays //
Eur. J. Biochem. 1971. V. 18. № 3. P. 384-390.
2. Fuchs Y., Mayak S., Fuchs S. Detection and Quantitative
Determination of Abscisic Acid by Immunological Assays // Planta.
1972. V. 103. № 2. P. 117-125.
3. Pengelly W., Meins F. A Specific Radioimmunoassay for
Nanogram Quantities of the Auxin, Indole-3-Acetic Acid // Planta.
1977. V. 136. № 2. P. 173-180.
4. Weiler E. W., Jourdan P. S., Conrad W. Levels of Indole-3-Acetic
Acid in Intact and Decapitated Coleoptiles as Determined by a
Specific and Highly Sensitive Solid-Phase Enzyme Immunoassay //
Planta. 1981. V. 153. № 6. P. 561-571.
5. Кудоярова Г. Р., Веселое С. Ю., Еркеев Μ. И., Гюли-Заде В. 3.,
Гимаева Р. М., Загидуллин Н. В., Шакирова Φ. М. Иммунофер-
ментное определение содержания индолилуксусной кислоты в
семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физи-
ология растений. 1986. Т. 33. № 6. С. 1221-1227.
6 Weiler Ε. W. Radioimmunoassays for Trans-Zeatin and Related
Cytokinins // Planta. 1980. V. 149. № 2. P. 155-162.
7. Weiler E.W., Eberle J., Mertens R., Atzorn R., Feyerabend M.,
Jourdan P. S., Arnscheidt Α., Wieczorek U. Monoclonal- and
Polyclonal Antibody Based Immunoassay of Plant Hormones //
Immunology in Plant Science. Ed. by T. L. Wang. Cambridge:
Cambridge Univ. Press, 1985. P. 27-58.
8. Manning K. Heterologous Enzyme Immunoassay for the
Determination of Free Indole-3-Acetic Acid (IAA) using antibodies
against ring-linked IAA // J. Immunol. Meth. 1991. V. 136. № 1.
P. 61-68.
9. Kara A.N., Kotov Α.Α., Bukhov N.G. Specific Distributions of
Gibberellins, Cytokinins, Indole-3-Acetic Acid, and Abscisic Acid
within Radish Plants Closely Correlate with Photomorphogenetic
Responses to Blue or Red Light // J. Plant Physiol. 1997. V.151.
№ 1. P. 51-59.
10. Kotov Α. Α., Kotova L. M. The Contens of Auxins and Cytokinins in
Pea Internodes as Related to the Growth of Lateral Buds // J. Plant
Physiol. 2000. V. 156. № 4. P. 438-448.
11. Maldiney Ft., Leroux В., Sabbagh I., Sotta В., Sossountzov L.,
Miginiac E. A Biotin-Avidin-Based Enzyme Immunoassay to Quantify
Three Phytohormones: Auxin, Abscisic Acid and Zeatin-Riboside //
J. Immunol. Meth. 1986. V. 90. № 2. P. 151-158.
312
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
12. Еремин С. А. Иммунохимический анализ лекарств и органи-
ческих соединений // Журнал Всесоюзного химического об-ва
им. Д. И. Менделеева. 1988. Т. 33. № 5. С. 46-51.
13. КотоваЛ.М., Котов Α. Α., Кара Α. Η. Изменение баланса фито-
гормонов в стеблях и корнях гороха после декапитации пророст-
ков // Физиол. раст. 2004. Т. 51. Вып. 1. С. 121-125.
14. Weiler Ε. W. Radioimmunoassays for pmol-Quantities of
Indole-3-Acetic Acid for Use with Highly Stable [125I]- and [3H]IAA
Derivaties as Radiotracers // Planta. 1981. 1981. V. 153. № 6.
P. 319-325.
15. Pence V. C, Caruso J. L. ELISA Determination of IAA Using
Antibodies Against Ring-Linked IAA // Phytochem. 1987. V. 26.
№ 5. P. 1251-1256.
16. Galfre' G., Butcher G. W. Making Antibodies // Immunology in
Plant Science. Soc. for Exp. Biol. Seminar Ser., 29. Ed. by
T. L. Wang. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1986. P. 1-25.
ISBN 0-521-30746-5.
17. Беккер X., Домшке Г., Фангхенелъ Э. Органикум. В 2 т. Т. 2.
Пер. с нем. М.: Мир, 1992. 474 с.
Таблица 4.1.1 .А. Реагенты для синтеза конъюгатов ФГ-белок карбоди-
имидным методом
Конъюгаты: гормон-белок
Гормон (мг)
ДКЦЦ (мг)
Диоксан (мкл)
БСА (мг)
Ов (мг)
Лиз-Ов (мг)
0,1 Μ боратно-карбо-
натный буфер рН 8,5
(мл)
20
13,2
300
30
—
—
2
65
15
750
30
—
—
3,5
50
27
1000
30
—
—
3
58,5
33,0
750
—
50
—
5
0,125
0,04
2
—
—
3
0,3
0,5
0,12
6
—
—
5
0,5
13
3
150
—
—
10
1
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
313
Таблица 4.1.1 .Б. Реагенты для синтеза конъюгатов ИУК-Ы-белок с ис-
пользованием химической пришивки ИУК по азоту индольного кольца
с помощью формальдегида
Реагенты
Конъюгаты: гормон-белок
ИУК-N-BCA
ИУК-N-Лиз-Ов
Р-р ИУК (мг) в 0,1 Μ борат-
но-карбонатном буфере,
рН 8,5 (мкл)
7,5% формалин
30% формалин
Р-р БСА (мг) в H2O (мкл)
Р-р Лиз-Ов (мг) в 0,1 Μ
боратно-карбонатном буфере,
рН 8,5 (мкл)
3 Μ Na ацетат
3 мг в 600 мкл 0,015 мг в 100 мкл
240 мкл
30 мг в180 мкл
180 мкл
50 мкл
1 мг в 100 мкл
250 мкл
Таблица 4.1.1 .В. Реагенты для синтеза конъюгатов цитокинин-белок
Реагенты
Гормон (мг) + метанол (мкл)
0,01 Μ NаIO4(мл)
0,1 Μ этиленгликоль (мкл)
Р-р БСА(мг) в Н2O(мл),
рН до 9,3
Р-р Лиз-Ов (мг) в Н2O (мл),
рН до 9,3
NaBH4
Р-р NaBH4 в Н2O (2 мг/мл)
Конъюгаты:
ЗР-БСА
2 мг +
200 мкл
1
60
22 мг
в 1 мл
—
2 раза
по 1 мг
—
: гормон-
белок
ЗР-Лиз-Ов
1 мг +
100 мкл
0,5
30
—
35 мг
в 15 мл
—
630 мкл
ИПА-Лиз-Ов
1 мг+ 100
мкл
0,5
30
—
32 мг
в 9,5 мл
—
630 мкл
314
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Таблица 4.1.2.А. Процент перекрестных реакций антисывороток против
ИУК-С-БСА (1), ИУК-N-BCA (2) и аффинно-очищенных антител против
ИУК-С-БСА (3) с использованием различных конкурентных конъюгатов
с овальбумином (Ов)
Кросс-реагенты
ИУК (неметилированная)
Метиловый эфир ИУК
Этиловый эфир ИУК
Индолилацетиласпарагиновая
к-та*
Индолил-3-масляная к-та*
Индолил-3-пропионовая к-та*
Индолил-3-молочная к-та*
Индолил-3-карбоновая к-та*
Индолил-3-пировиноградная
к-та*
Индолилацетальдегид
Индолилацетонитрил
Индолилкарбинол
Триптофол
Триптамин HCI
L-Триптофан*
Индолилацетамид
1-Нафталинуксусная к-та*
2,4-Дихлорофеноксиуксусная
к-та*
2,3,5-Трииодобензойная к-та*
4-Хлорофеноксиуксусная к-та*
Кросс-реактивность(%)
ИУК-С-
Ов
0,01
100
(31,9**)
590
200
0,17
0,54
0,06
0,02
0,09
0,32
0,58
0,02
0,47
0,51
1,18
116
6,89
< 0,01
—
0,02
1
имк-с-
Ов
0,05
100
(14,5**)
263
74,7
45,9
8,58
0,55
0,11
0,11
2,34
10,21
0,45
7,75
0,42
1,13
160,2
1,31
< 0,01
—
< 0,01
2
ИУК-N-
Лиз-Ов
100
(26**)
0,9
—
0,04
0,03
2,2
0,05
< 0,001
2,3
0,4
0,002
< 0,001
< 0,001
0,002
0,002
0,1
75,9
0,003
< 0,001
0,05
3
ИУК-С-
Ов
0,09
100
(18,68**)
187
94,44
55,33
6,63
1,06
0,06
0,17
2,87
6,40
0,39
7,96
0,57
1,16
39,96
1,36
< 0,01
—
< 0,01
Раздел 4.1. Количественное определение ИУК...
315
Таблица 4.1.2.А. Процент перекрестных реакций антисывороток против
ИУК-С-БСА (1), ИУК-N-BCA (2) и аффинно-очищенных AT против
ИУК-С-БСА (3) с использованием различных конкурентных конъюгатов
с овальбумином (Ов) (окончание)
Кросс-реактивность(%)
1 2 3
Кросс-реагенты
ИУК-С- ИМК-С- ИУК-N- ИУК-С-
Ов Ов Лиз-Ов Ов
Фенилуксусная к-та* < 0,01 0 0,3 < 0,01
5-Оксииндолил-З-уксусная к-та — — 1,0 —
а-(р-Хлорфенокси)изомасляная — — < 0,001 —
к-та*
N-1-Нафтилфталаминовая к-та* — — < 0,001 —
* Для антисывороток против ИУК-С-БСА (1 и 3) кросс-реагенты подвергали
метилированию.
** Концентрация вещества (нМ) для 50% ингибирования связывания AT
(logit(B/B0) = 0).
Таблица 4.1.2.Б. Процент перекрестных реакций антисыворотки против
ГК3-БСА с использованием различных конкурентных конъюгатов с оваль-
бумином (Ов)
Кросс-реагенты
Метиловый эфир ГК3
Этиловый эфир ГК3
ГК3
Метиловый эфир ΓΚ1
Этиловый эфир ΓΚ1
гк1
Кросс-реактивность(%)
ГК3-Лиз-Ов
100(1,78*)
—
—
0,15(1200*)
—
—
ΓΚ1 -Лиз-Ов
100(0,080*)
39,00
8,70
10,70(0,794*)
10,70
0,89
* Концентрация вещества (нМ) для 50% ингибирования связывания AT
(logit (B/B0) = 0).
316
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Таблица 4.1.2.В. Процент перекрестных реакций антисывороток на
ЗР-БСА (1) и ИПА-БСА (2)
Кросс-реактивность(%)
Кросс-реагенты 1 2
транс-Зеатинрибозид
транс-Зеатин
цис-Зеатин
Дигидрозеатин
Дигидрозеатинрибозид
Изопентениладенин
Изопентениладенозин
Аденин
Бензиламинопурин
Кинетин
ЗР-Лиз-Ов
100(0,398*)
39,87(1,12*)
2,24
6,30
3,97
0,13
0,56
0
0,13
0,03
ИПА-Лиз-Ов
0,28
0,30
—
0,13
1,36
75,00 (0,668*)
100(0,355*)
0,003
11,21
4,56
* Концентрация вещества (нМ) для 50% ингибирования связывания AT
(logit(B/B0) = 0)
4.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ,
АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ И
ГАЛОИДФЕНОКСИКИСЛОТ В ОДНОМ ОБРАЗЦЕ
РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
В. В. Карягин, В. Ю. Ракитин, В. Л. Садовская
Введение
Для количественного анализа фитогормонов и синтетических регу-
ляторов роста необходимо проведение экстракции анализируемых
веществ из растительной ткани с последующей очисткой экстракта
от сопутствующих примесей. На каждом из этих этапов в силу раз-
личных причин возможны значительные потери анализируемых ве-
ществ; использование внутренних стандартов позволяет их учиты-
вать. Однако при работе с ограниченным количеством растительной
ткани и с учетом чрезвычайно низких концентраций фитогормонов
и их химической нестабильности большое значение приобретает
Раздел 4.2. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты... 317
уменьшение потерь определяемых веществ. Твердофазная очистка
и концентрирование экстрактов на маленьких колонках различных
фаз для жидкостной хроматографии позволяют повысить выход
анализируемых соединений, а также сократить время подготовки
образцов для анализа [1].
Принцип метода
Метанольный экстракт растительной ткани (0,1-1 г) последователь-
но очищают на колонках с анионообмеником DEAE и обращенной
фазой (С18) и далее разделяют на колонке Sephasorb HP на три фрак-
ции, содержащие абсцизовую кислоту (АБК), галоидфеноксикисло-
ты и индолил-3-уксусную кислоту (ИУК). Предложенный метод
позволяет исключить такие критические в смысле потерь анализи-
руемых веществ стадии, как традиционная очистка образца путем
переэкстракции между двумя несмешивающимися жидкостями и
концентрирование в вакууме. Количественное определение АБК в
виде метилового эфира, а ИУК и галоидфеноксикислот в виде пен-
тафторбензиловых (ПФБ) эфиров проводят методом газовой хрома-
тографии (ГХ) с детектором электронного захвата (ГХ-ДЭЗ) или
масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС) в режиме масс-се-
лективного детектирования (МСД). Чувствительность ГХ определе-
ния с ДЭЗ составляет 1 пг или несколько фемтограммов с МСД при
соотношении сигнала к шуму 2/1.
Материалы и реактивы
Реактивы и аппаратура
ИУК («Sigma», США), АБК («Aldrich», США), индолил-3-пропио-
новая кислота(ИПК) («Serva», ФРГ), 4-ХФУ и 2,4-Д («Sigma», США),
2М-4Х и 4-бромфеноксиуксусную кислоту (4-БФУ) синтезировали
из соответствующих хлорфенолов [2].
Насосы для жидкостной хроматографии МС-300 («Microtechna»,
Чехия), проточный спектрофотометр Holochrome («Gilson»,Франция),
6-ходовые краны TF-6 («Gasukuro Kogio», Япония). Газовый хрома-
тограф Газохром 1109 (Россия), снабженный ДЭЗ с 63Ni источником
β-излучения. Газовый хроматограф HP 5890А с масс-спектрометри-
ческим детектором HP 5970B (США). Сцинтилляционный счетчик
1219 Rackbeta («Wallac LKB», Швеция).
Растительный материал
В качестве примера содержание ИУК, АБК и галоидфеноксикислот
определяли в плодах томата (Lycopersicon esculentum Mill.) сорта
318
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Сливовидный и семенах подсолнечника (Helianthus annuus L.) сорта
Передовик. На чашечки цветков томата наносили по 1 мкг водного
раствора (10 мкл на чашечку) натриевой соли 4-хлорфеноксиуксус-
ной кислоты (4-ХФУ) для стимуляции искусственной партенокар-
пии. Для демонстрации возможности одновременного определения
фитогормонов и галоидфеноксикислот (помимо 4-ХФУ) к образцам
плодов томата и семян подсолнечника перед гомогенизацией были
добавлены также 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) и
2-метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота (2М-4Х) по 50 нг/г ткани.
Последние соединения часто используют в физиологических опы-
тах в качестве синтетических аналогов ауксина.
Ход определения
Экстракция определяемых веществ
из растительного материала и очистка экстракта
Анализируемый материал (плоды томата и семена подсолнечника) в
количестве 1-2 г фиксировали жидким азотом и гомогенизировали
в охлажденной жидким азотом фарфоровой ступке в 10-кратном по
отношению к навеске объеме охлажденного до -20 °С 80% метано-
ла, содержавшего антиоксидант — 2,б-ди-трет-бутил-4-метилфе-
нол (ВНТ) («Serva», ФРГ) — 10 мг/л. Метанольные растворы внут-
ренних стандартов (по 50 нг на г образца плодов томата и по 500 нг
на 1 г образца семян подсолнечника) добавляли непосредственно пе-
ред гомогенизацией. В качестве внутренних стандартов использова-
ли: ИПК для ИУК [3], 4-БФУ для 4-ХФУ [2]. Внутренним стандар-
том для АБК служила 3Н АБК (2,55 ТБк/моль, «Amersham», Вели-
кобритания), которую добавляли в количестве 1 пг/г ткани [4].
Полученный гомогенат помещали на 10 мин при комнатной тем-
пературе в ультразвуковую ванну UM-4 («Techpan», Польша) для
ускорения и улучшения экстракции. Увеличение времени экстрак-
ции не приводило к увеличению выхода анализируемых веществ.
Экстракт фильтровали через стеклянный микроволоконный фильтр
GF/C («Whatman», Великобритания) диаметром 25 мм. Осадок на
фильтре промывали 3-кратным по отношению к навеске ткани объе-
мом 70 % метанола, содержавшего антиоксидант ВНТ (10 мг/л).
Соответствующее 1 г растительной ткани количество объеди-
ненного фильтрата вносили при помощи насоса HI (рис. 4.2.1) со
скоростью 1,5 мл/мин в колонку С1 (слабый анионообменник на
основе силикагеля с химически привитыми диэтиламиноэтильны-
ми группами) — 30x9мм DEAE Si 100, 0,03 мм («Serva», ФРГ), кото-
рая была предварительно промыта последовательно: 0,25 Μ раство-
ром ацетата калия (10 мл), 0,2 N уксусной кислотой (10 мл) и 70 %
Раздел 4.2. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты... 319
Рис. 4.2.1. Схема твердофазной очистки экстракта. Сплошной линией по-
казано положение 6-ходовых кранов (Κ1 и К2), при котором производится
ввод образца насосом H1 в колонку C1 (DEAE Si 100) и перевод образца при
помощи насоса H3 из колонки С2 (С - 18) в колонку С3 (Sephasorb HP). Пун-
ктирной линией показано соединение кранов при переводе образца насо-
сом H2 из колонки C1 в колонку С2. Стрелками показано направление дви-
жения образца в системе. СФ — проточный спектрофотометр. Подробнос-
ти см. в тексте
метанолом (10 мл). Переключением 6-ходового крана К1 подсоеди-
няли колонку С1 к колонке С2 (обращенная фаза С-18 на основе си-
ликагеля с химически привитыми октадецилсилановыми группа-
ми) — 30x6 мм Chromosorb LC-7, 0,005 мм («Sigma», США), предва-
рительно промытой деионизированной (на колонке, наполненной
смесью анионо- и катионообменников 300x30 мм Serdolit MB
(«Serva», ФРГ)), водой (10 мл) и, используя насос Н2, элюировали
образец со скоростью 2 мл/мин 0,3 Μ раствором формиата калия рН 3
(10 мл), содержавшим 1% этилацетата. Добавление этилацетата
уменьшает адсорбцию примесей на колонке С2. Анализируемые ве-
щества концентрировались в колонке С2, которую затем промывали
0,004 N водным раствором муравьиной кислоты рН 3 (10 мл). После
этого колонку С2 переключением 6-ходового крана К2 подсоединяли
к колонке С3 (гидроксипропилированный химически сшитый декс-
тран с высокой плотностью матрикса) — 250x4,6 мм Sephasorb HP
Ultrafine 0,010-0,015 мм («Pharmacia», Швеция). Элюирование с
колонки С2 проводили 0,003 N муравьиной кислотой в 98 % метано-
ле со скоростью 0,4 мл/мин, используя для этой цели насос H3. Для
элюирования образца с колонки С2 на С3 требовалось 5 мин, после
чего краны К1 и К2 переключали в положение, при котором на ко-
лонку С1 можно было наносить следующий образец, а на колонке С3
320
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
с тем же элюентом происходил завершающий этап очистки и разде-
ление анализируемых веществ на 3 фракции: АБК, галоидфенокси-
кислоты и ИУК. Время удерживания составляло: АБК — 9 мин, га-
лоидфеноксикислоты — 15,5 мин, ИУК и ИПК — 21 мин. Неболь-
шие объемы фракций (АБК — 0,8 мл, галоидфеноксикислоты —
1,2 мл, ИУК и ИПК — 1,6 мл) позволяли проводить их концентри-
рование в токе азота при температуре 40 °С, избегая критического в
смысле потерь высушивания в вакууме [5].
Важно правильно оценить емкость колонок, особенно анионооб-
менной, на которую поступает растительный экстракт. Поэтому в
предварительных опытах следует определить максимальную ем-
кость этой колонки по отношению к анализируемой ткани и учиты-
вать этот показатель при расчете объема наносимого образца [6].
Поскольку из всех испытанных в настоящей работе веществ на ани-
онообменной колонке слабее всего удерживалась АБК, она может
служить метчиком при определении емкости колонки. Для опреде-
ления емкости ионообменной колонки к экстрактам из различных
навесок исследуемой ткани (например, 1, 2, 3, 4 г и т. д.) добавляют
известное количество АБК, заведомо большее ее эндогенного содер-
жания в данной ткани. Далее определяют количественный выход
добавленной АБК. Резкое снижение доли выхода будет свидетельство-
вать о перегрузке колонки. Использованная в нашей системе колон-
ка DEAE Si 100 размером 30x9 мм позволяет без перегрузки очи-
щать объем экстракта, эквивалентный 2 г плодов томата или семян
подсолнечника, при совместном выделении АБК, ИУК и галоидфе-
ноксикислот, и эквивалентный 4 г этих же тканей — при выделении
ИУК и галоидфеноксикислот без АБК. В случае недостаточной ем-
кости анионообменной колонки следует или увеличить объем ко-
лонки, или уменьшить образец. Емкость последующих колонок не
имеет столь решающего значения, т. к. в них поступает уже частич-
но очищенный экстракт.
Приготовление летучих производных
для газохроматографического анализа
Метиловый эфир АБК получали, добавляя 200 мкл раствора диазо-
метана в ацетоне, полученного из нитрозометилмочевины в генера-
торе диазометана «Wheaton Scientific» (США) [7], к очищенной и
высушенной фракции, содержащей АБК. Реакцию метилирования
вели при 0 °С в течение 10 мин. После ее завершения образец высу-
шивали в токе азота при 35 °С, растворяли в 20-100 мкл гексана, от-
бирали шприцем 1-5 мкл и анализировали методом ГХ-ДЭЗ. Остав-
шийся образец использовали для учета потерь АБК [4].
Раздел 4.2. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты... 321
Для проведения ГХ анализа из ИУК и галоидфеноксикислот го-
товили их ПФБ-эфиры. Описанный в литературе метод приготовле-
ния ПФБ-производных [8] был нами модифицирован. Сухой оста-
ток, содержавший ИУК или галоидфеноксикислоты, растворяли в
100 мкл 2% раствора пентафторбензилбромида в 0,025 N КОН в ме-
таноле. Реакцию проводили 50 мин при 60 °С. После окончания ре-
акции смесь высушивали в токе азота при 40 °С. Сухой остаток раст-
воряли в 20-100 мкл гексана и анализировали методом ГХ-ДЭЗ.
Условия газохроматографического анализа
В работе был использован газовый хроматограф Газохром 1109 (Рос-
сия), снабженный ДЭЗ с 63Ni источником β-излучения. Использова-
ние ДЭЗ было обусловлено его значительной селективностью и чу-
вствительностью к АБК, имеющей в своей структуре карбонильную
группу с высоким сродством к электронам. Введение в ИУК и ИПК
при приготовлении летучих производных пентафторбензильной
группы также позволяет повысить чувствительность анализа на
ДЭЗ в 1000 раз по сравнению с их определением на пламенно-иони-
зационном детекторе. 4-ХФУ и 2М-4Х имеют в своих молекулах
только по одному атому хлора, из-за этого их электронно-акцептор-
ные свойства невысоки, и для их определения на ДЭЗ в эти вещества
также приходится вводить мощную электронно-акцепторную пен-
тафторбензильную группу. 2,4-Д имеет в своей структуре 2 хлора и
поэтому может быть определена на ДЭЗ в виде метилового или бути-
лового эфиров. Поскольку 2,4-Д присутствует в одной фракции с
2М-4Х, 4-ХФУ и 4-БФУ, она подвергается пентафторбензилирова-
нию вместе с ними. ГХ анализ проводили при следующих условиях:
колонка 10 м x 0,53 мм НР-17 («Hewlett-Packard», США). Газ-но-
ситель — азот: подача на колонку со скоростью 1 мл/мин, на поддув
детектора — 40 мл/мин. Температурный режим — изотермический.
Температура инжектора — 260 °С, детектора — 260 °С, колонки —
250 °С при анализе Ме-АБК, ПФБ-ИУК и ИПК, — 235 °С при ана-
лизе ПФБ-эфиров галоидфеноксикислот. Времена удерживания:
Ме-АБК — 6 мин, ПФБ-эфиров ИУК и ИПК — 11,5 и 14 мин, соот-
ветственно, ПФБ-эфиров 4-ХФУ, 4-БФУ, 2,4-Д и 2М-4Х — 5, 6, 7 и
8 мин, соответственно.
Использование масс-спектрометрического детектора дает воз-
можность количественно определять с высокой чувствительностью
анализируемые соединения и идентифицировать их по масс-спектру,
что позволяет получать более достоверную информацию по сравне-
нию с ДЭЗ, где идентификация происходит в основном по времени
удерживания веществ на колонке и по наличию в их структуре элек-
тронно-акцепторных групп. ГХ-МС анализ проводили с использова-
322
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
нием газового хроматографа HP 5890A с масс-спектрометрическим
детектором HP 5970В («Hewlett-Packard», США) в режиме МСД.
Колонка 25м x 0,32мм HP — 5 («Hewlett-Packard», США). Расход
газа-носителя — гелия 1 мл/мин. Ввод образца (1 мкл) на колонку
без сброса. Температурный режим: инжектор — 250 °С, колонка —
2 мин 60 °С, затем программирование температуры от 60 до 150 °С —
40°/мин, от 150 до 250 °С — 10°/мин. Ионизация — электронным
ударом 70 эВ. Анализируемые вещества детектировали по основно-
му и молекулярному ионам.
Расчет количеств анализируемых веществ проводили с учетом
потерь, определенных по внутренним стандартам [2].
При помощи приведенного выше метода определено содержание
эндогенных ИУК и АБК в плодах томата и семенах подсолнечника,
а также продемонстрирована возможность определения галоидфе-
ноксикислот в данных объектах (табл. 4.2.1).
Таблица 4.2.1. Содержание АБК, ИУК и галоидфеноксикислот в плодах
томата сорта Сливовидный и семенах подсолнечника сорта Передовик
Объект Содержание, нг/г сырой массы
АБК ИУК 4-ХФУ* 2,4-Д** 2М-4Х**
Томат, 660+22 92+3 124+5 47+3 47+2
20-дневные
плоды
Подсолнечник 685+24 945+37 — 46+2 47+2
15-дневные
семена
* Цветки томата были обработаны Na-солью 4-ХФУ. В плодах томата опре-
деляли и количество свободной 4-ХФУ.
** 2,4-Д и 2М-4Х по 50 нг/г образца добавляли к плодам томата и семенам
подсолнечника непосредственно перед гомогенизацией.
Примечание. Представлены средние арифметические из 5 био-
логических повторностей и их стандартные отклонения.
Выход анализируемых соединений при использованном способе
очистки составил: 95% для галоидфеноксикислот, 93% для АБК и
91% для ИУК. По нашему мнению, высокий выход обусловлен тем,
что в процессе очистки удалось избежать концентрирования образ-
ца в вакууме, а также жидкостно-жидкостной переэкстракции, т. е.
стадий, на которых наиболее высока вероятность потерь исследо-
ванных веществ.
Раздел 4.3. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты... 323
Литература
1. Torres СМ., Pico Y., Manes J. Determination of Pesticide
Residues in Fruit and Vegetables // J. Chrom. 1996. V. 754 A.
P. 301-331.
2. Ракитин В. Ю., Карягин В. В. Газохроматографическое опреде-
ление 4-хлорфеноксиуксусной кислоты — стимулятора плодо-
образования у томата // Физиология растений. 1984. Т. 31.
С. 1191-1196.
3. Akiyama Μ., Sakurai Ν., Kuraishi S. A Simplified Method for the
Quantitative Determination of Indoleacetic Acid by High
Performance Liquid Chromatography with Fluorometric
Detector // Plant and Cell Physiol. 1983. V. 24. P. 1431-1439.
4. Ракитина Т. Я., Власов П. В., Ракитин В.Ю. Гормональные
аспекты различной устойчивости мутантов Arabidopsis thaliana
к ультрафиолетовой радиации // Физиология растений. 2001.
Т. 48. С. 414-420.
5. Mann J.D., Jaworski Ε. G. Minimizing Loss of Indoleacetic Acid
During Purification of Plant Extracts // Planta 1970. V. 92.
P. 285-291.
6. Chen K.H., Miller A. N., Patterson G. W., Cohen J. D. A Rapid and
Simple Procedure for Purification of Indole-3-Acetic Acid prior to
GC-SIM-MS Analysis // Plant Physiol. 1988. V. 86. P. 822-824.
7. Pierce. Handbook and General Catalog. Netherlands: Pierce
Chemical Company. 1987. P. 199-201.
S.Epstein E., Cohen J.D. Microscale Preparation of
Pentafluorobenzyl Esters for Electron Capture Gas
Chromatographic Detection of Indole-3-Acetic Acid from Plants //
J. Chrom. 1981. V. 209. P. 413-420.
4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫДЕЛЕНИЯ И СОДЕРЖАНИЯ
ЭТИЛЕНА В РАСТЕНИЯХ
В. Ю. Ракитин, Т. Я. Ракитина
Введение
Этилен наряду с другими фитогормонами принимает участие прак-
тически во всех физиологических процессах — от прорастания се-
мян до созревания плодов, а также в реакциях на стрессоры — экс-
тремальные температуры, затопление, засуху, механические воздей-
ствия, ионизирующую радиацию и т. д. Интерес к исследованиям
324
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
по физиологии, биохимии и молекулярной биологии этилена обу-
словлен в первую очередь потребностями сельского хозяйства и био-
технологии, уже сейчас использующих весьма успешные приемы
управления физиологическими процессами растений. Этиленпро-
дуценты (вещества, выделяющие этилен при попадании в растения)
применяют для ускорения и синхронизации созревания и опадения
плодов, при механической уборке урожая яблок, оливок и томатов.
Ингибиторы действия этилена, например 1-метилциклопропен, ис-
пользуют для продления жизни срезанных цветов и торможения со-
зревания при хранении плодов. Выяснение механизмов действия
этилена позволит усовершенствовать уже существующие техноло-
гии получения, транспортировки, хранения и переработки сельско-
хозяйственной и биотехнологической продукции, в которых необ-
ходимо контролировать уровни этилена в растениях и окружающей
их среде.
Свойства этилена и его открытие как фитогормона
Этилен представляет собой ненасыщенный углеводород с молеку-
лярной массой 28,05 и имеет формулу Н2С=СН2. Температура кипе-
ния этилена — минус 103,71 °С. Газообразный этилен бесцветен, об-
ладает эфирным запахом, его плотность при 0 °С и атмосферном дав-
лении 1 кг/см2 составляет 1,26 г/л. Диффузионное равновесие
этилена между водой и воздухом при его концентрации в воздухе
1 часть на 1 миллион и температуре 25 °С составляет 1:10000. Эти-
лен образует галоидзамещенные углеводороды в реакциях с галоге-
нами и координационные соединения, взаимодействуя с некоторыми
ионами металлов. Связывание газообразного этилена растворами пер-
хлората ртути широко применяли в экспериментах по изучению об-
разования этилена растениями из его меченых предшественников, а
также для уменьшения концентрации этилена в камерах с растени-
ями. Этилен высвобождается из этого комплекса при добавлении
ионов хлора, что легло в основу многих ранних работ по определе-
нию образования этилена. Перманганат калия окисляет этилен до
этиленгликоля (НОСН2-СН2ОН) [1, 2]. Этот прием служит для уда-
ления этилена из атмосферы контейнеров, в которых транспортиру-
ют цветы или хранят фрукты, чтобы предотвратить их преждевре-
менное старение и перезревание. В качестве носителя перманганата
калия в таких случаях используют окись алюминия, силикагель,
цеолиты, т. е. любые гидрофильные носители с большой удельной
поверхностью. Этилен можно удалять из воздуха окислением на ка-
тализаторах, при помощи генераторов озона или ультрафиолетовых
ламп [3].
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 325
Одной из первых научных публикаций о том, что каменноуголь-
ный газ оказывает сильное действие на растения: вызывает опаде-
ние листьев у деревьев, потерю геотропической реакции у проростков,
ускоренное старение и увядание цветов — было сообщение Girardin в
1864 г. [1]. В 1901 г. Д. Н. Нелюбов, работавший в Санкт-Петербур-
ге, показал, что физиологически активным компонентом каменно-
угольного газа является этилен [1, 2, 4]. На этиолированных расте-
ниях гороха он продемонстрировал так называемую «тройную реак-
цию» : торможение роста стеблей в длину при концентрации этилена
в воздухе 0,1 мкл/л; изодиаметрический рост стеблей и потерю геотро-
пической реакции (1 мкл/л). В 1912 г. Sievers и True [1, 2] сообщи-
ли, что после окуривания дымом керосиновых печей зеленые плоды
лимона быстро созревали, а в 1924 г. Denny [2] обнаружил, что эти-
лен является активным компонентом этого дыма. В 1910 г. Botjies
[2] показал, что газообразные выделения спелых яблок, вызываю-
щие потерю геотропической реакции проростков томатов, можно
удалить из воздуха абсорбентами этилена. В 1934 г. Gane [1,2] дока-
зал, что этилен образуется в созревающих яблоках. В конце 30-х го-
дов XX века, главным образом работами Denny и его коллег [2],
было показано, что этилен может синтезироваться не только плода-
ми, но и другими органами растений: цветами, листьями, корнями
и семенами. На основании полученных к тому времени данных по
действию этилена на растения было высказано предположение, что
этилен можно рассматривать как эндогенный регулятор роста [2].
Действие эндогенного этилена на созревание плодов было первым из
его многочисленных физиологических эффектов, обнаруженных в
растениях [5]. Однако дальнейшие исследования этилена как эндо-
генного регулятора физиологических процессов тормозились из-за
отсутствия надежных высокочувствительных методов его определе-
ния. Использование газовой хроматографии позволило обнаружить
этилен в болыпинстве растительных объектов, а также исследовать
интенсивность его образования при различных физиологических
процессах, в том числе и при созревании плодов [3].
Поскольку образование этилена и чувствительность к нему за-
висят от парциального давления кислорода и двуокиси углерода,
при изучении образования и определении количества этилена в тка-
нях растений также необходимо учитывать газообмен и содержание
СO2 и O2 [6].
Методы определения этилена
Известно большое количество методов определения этилена. Био-
тесты, использующие реакции растений на экзогенный этилен, не-
смотря на высокую чувствительность, далеко не всегда позволяют
326
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
получать количественные данные [1]. Химические методы, основан-
ные на способности олефинов образовывать аддукты с солями ртути
с последующим определением этилена на аппарате Варбурга или ме-
тодом титрования, оказались малопригодными при определении
низких концентраций этилена (менее 2,2x10-8 моль/л или 0,5мкл/л)
[7]. Поглощение радиоактивного этилена солями ртути и его после-
дующее количественное определение с помощью сцинтилляцион-
ных счетчиков были использованы для изучения образования этилена
из меченых предшественников [1]. Возможно также прямое опреде-
ление этилена масс-спектрометрическим методом. Однако массы
этилена, окиси углерода и азота весьма близки, и для такого анали-
за нужны масс-спектрометры с очень высокой степенью разрешения
или хромато-масс-спектрометры [1]. Лазерный фотоакустический
анализатор с чувствительностью 6 пкл этилена на 1 л воздуха при-
меняют для изучения выделения этилена растениями в открытых
системах (постоянно продуваемых чистым воздухом) [8]. Газохро-
матографические методы благодаря высокой чувствительности и
быстроте анализа позволили значительно упростить определение эти-
лена, сыграв исключительную роль в развитии исследований по био-
химии и физиологии этилена.
Газохроматографическое определение этилена
Выбор детектора
Газовый хроматограф с газопроточным счетчиком радиоактивности
в качестве детектора используют при изучении биосинтеза этилена
из меченых предшественников [9].
Гелиевый ионизационный детектор применяют для анализа сле-
довых примесей легких углеводородов и, в частности, этилена в кис-
лороде, используемом для терапевтических целей, и в жидком кис-
лороде, употребляемом для дыхания пилотов в авиации и космонав-
тике. Этот детектор позволяет определять без концентрирования
образцов до нескольких частей углеводородов на миллиард частей
исследуемого газа [10].
Фотоионизационный детектор обеспечивает определение кон-
центраций этилена порядка одной части на миллиард в 1 мл воздуха
и применяется для изучения выделения этилена растениями в от-
крытых системах [11]. Недостатками гелиевого ионизационного и
фотоионизационного детекторов являются очень высокие требова-
ния к чистоте газа-носителя. Пламенно-ионизационный детектор
на 2-3 порядка менее чувствителен к углеводородам, чем вышеупо-
мянутые детекторы, но благодаря своей доступности и применению
устройств, концентрирующих углеводороды из образцов воздуха,
весьма перспективен для определения этилена [7, 12, 13].
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 327
Выбор колонки
Для отделения этилена от других летучих выделений растений и
компонентов атмосферы обычно применяют колонки с окисью алю-
миния длиной 0,5-1,5 м при температурах 60-150 °С [1]. Несмотря
на то что данные сорбенты хорошо и быстро разделяют низшие
углеводороды, их использование при определении микропримесей
углеводородов в воздухе нецелесообразно, так как окись алюминия
и силикагель обладает «памятью», т. е. адсорбирует часть этилена
из образцов газа, а затем частично десорбирует его при введении в
хроматограф образцов, не содержащих этилен. Кроме того, эти адсор-
бенты отличаются высокой каталитической активностью, что может
приводить к образованию этилена из других летучих выделений
растений. Еще один недостаток окиси алюминия и силикагеля со-
стоит в том, что они поглощают воду из образцов воздуха и поэтому
требуют частого активирования. Указанные недостатки отсутству-
ют у колонок полимерных сорбентов — хромосорбов 107 и 108 или
порапаков Q, S, R, N и Τ длиной 1,5-3 м при температуре 40-50 °С.
Поскольку разные партии одного и того же сорбента могут значи-
тельно отличаться друг от друга, одним из основных критериев их
пригодности служит способность отделять этилен от этана. Послед-
ний также содержится в воздухе, образуется в растениях и имеет
близкие с этиленом хроматографические характеристики [13].
Концентрирование этилена
Газовые хроматографы с пламенно-ионизационными детекторами
при объеме образцов воздуха 1-2 мл позволяют получить воспроиз-
водимые количественные результаты вплоть до концентрации эти-
лена 4,5·10-9 моль/л (0,1 мкл/л) [7, 12, 13]. Для многих раститель-
ных объектов эта концентрация значительно превышает физиоло-
гическую пороговую концентрацию [14]. Накопление этилена выше
пороговой концентрации в камере с растениями может повлиять на
интенсивность его образования, изменить скорость роста, вызвать
образование отделительных зон, ускорить созревание плодов. Для
того чтобы избежать указанных явлений, определение этилена не-
обходимо проводить при его возможно более низкой концентрации в
камере. Продолжительное выдерживание растений в камерах или
уменьшение соотношения объема камеры к весу объекта для увели-
чения концентрации накапливающегося этилена (позволяющей
проводить его измерение без концентрирования) в большинстве слу-
чаев не оправдано. Концентрация этилена в атмосфере межклетни-
ков многих растительных объектов не достигает 4,5 · 10-9 моль/л,
(0,1 мкл/л), что также делает невозможным его определение с пла-
328
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
менно-ионизационным детектором без предварительного концент-
рирования.
Концентрирующие системы понижают концентрационный предел
определения на несколько порядков, что в значительной степени
позволяет избавиться от ошибок при определении выделения этиле-
на. За счет сокращения экспозиции, увеличения соотношения объ-
ем камеры/вес объекта и проветривания камеры в промежутках
между измерениями удается избежать чрезмерного изменения со-
держания СO2 и O2 и накопления этилена выше пороговой концен-
трации. Большие возможности открывает применение концентри-
рующих устройств для измерения кинетики образования этилена в
открытых системах [7], где камеры с объектами постоянно продува-
ют воздухом необходимого состава, а отбор образцов газа, выходя-
щего из камеры с объектом, может быть осуществлен в любой мо-
мент эксперимента практически неограниченное число раз.
Наиболее доступным способом концентрирования углеводоро-
дов из воздуха является их адсорбция на колонках, наполненных
порапаком N, S, Q и хромосорбом 107 и 108 при температуре -30 °С.
Использование в качестве сорбента силикагеля нецелесообразно,
поскольку было обнаружено, что при температуре выше 100 °С на
нем образуется дополнительный этилен из органических компонен-
тов, присутствующих в образцах газов из растений. Полную десор-
бцию этилена с силикагеля удавалось получить только при 130 °С.
С колонок порапака N и хромосорба 108 (70 x 4 мм) этилен может
быть количественно десорбирован при 50 °С, но при температуре
выше 80 °С эти сорбенты выделяют метан, этан и этилен [12, 13].
Температура адсорбции и количество адсорбента имеют ис-
ключительно большое значение, поскольку они определяют объ-
ем удерживания этилена на колонке. Так на колонке порапака N
(70 χ 4 мм) при температуре -78 °С (сухой лед — ацетон) объем
удерживания составляет около 1л, а при -30 °С — около 150 мл.
Поскольку образца объемом 10-100 мл вполне достаточно для опреде-
ления 2,2 · 10-10 моль/л (0,005 мкл/л) этилена (обычная концентрация
в чистом воздухе), применение криотермостата или другого холодиль-
ника на -30 °С вполне заменяет использование сухого льда.
Удаление двуокиси углерода и влаги из образцов газа
Двуокись углерода и вода, которые часто содержатся в больших ко-
личествах в образцах воздуха, могут быть причиной перегрузки
концентрирующей и основной колонок хроматографа, что приводит
к невозможности получения количественных результатов. Пары
воды также могут блокировать соединительные трубки адсорбера,
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 329
Рис. 4.3.1. Схема установки для концентрирования и ввода в хроматог-
раф углеводородов из образцов воздуха, 1a — гелий 0,1 атм, 1б — гелий
2 атм; 2 — регулятор расхода газа для продувки концентрирующей систе-
мы; 3 — колонка с молекулярными ситами (5 А) для очистки газа-носите-
ля; краны для введения образцов воздуха 4а — из шприцев, 4б — из инку-
бационных сосудиков или 4в — с дозирующей петлей из камер открытого
типа; 5а — инжектор для калибровки хроматографа; 56 — инжектор хро-
матографа; 6 — колонка для удаления СО2; 7 — U-образная трубка для вы-
мораживания воды; 8 — шестиходовой кран; 9 — концентрирующая ко-
лонка; 10 — расходомер; 11 — пузырьковый индикатор прекращения
тока газа-носителя из концентрирующей системы; 12 — выход газа-носи-
теля из концентрирующей системы; 13 — хроматографическая колонка
(3 м χ 2 мм, Порапак N, 80-100 меш)
вымерзая на них при отрицательной температуре. Поэтому удале-
ние влаги и двуокиси углерода является гарантией стабильной рабо-
ты газового хроматографа с концентрирующей системой. Вполне
удовлетворительным для указанных целей оказалось поглощение
двуокиси углерода в стеклянной колонке (100x6 мм) с целлитом
545, 30-60 меш, пропитанным насыщенным раствором КОН (20%
от веса целита) и вымораживание воды в U-образной стеклянной
трубке 30 x 4 мм, охлаждаемой до -78 или -30 °С (рис. 4.3.1).
Определение этилена
с использованием концентрирующей системы
Всю систему (рис. 4.3.1) продувают гелием 30 с со скоростью
60 мл/мин, при этом концентрирующая колонка 9 отключена от
330
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
хроматографа краном 8 и находится в термостате при температуре
60 °С. Использование гелия в качестве газа-носителя и для продув-
ки концентрирующей системы вполне оправдано, поскольку он со-
держит меньше этилена, чем азот или аргон. Концентрирующую ко-
лонку 9 помещают минимум на 1 мин в криотермостат (-30 °С) и сразу
прекращают продувку системы. Через кран 4а в систему вводят иссле-
дуемый образец газа со скоростью не более 60 мл/мин. Систему проду-
вают гелием 30 с. Затем концентрирующую колонку 9 помещают в
термостат на 60 °С и через 30 с подключают ее краном 8 к хроматогра-
фу на 30 с. После отключения краном 8 колонки 9 от хроматографа
можно начинать концентрирование следующего образца.
Получение этилена для калибровки хроматографа
Этилен можно получать дегидрированием этилового спирта или раз-
ложением щелочью этиленпродуцентов, созданных на основе 2-хло-
рэтилфосфоновой кислоты [15]. Второй способ значительно проще и
дает более чистый (практически 100%) этилен. При получении эти-
лена этим способом в сосуд объемом 6 мл к 2 г КОН или NaOH шпри-
цем добавляют по каплям 3 мл водного раствора (1:1) препарата эти-
ленпродуцента (рис. 4.3.2) (осторожно: происходит вспенивание и
нагрев). Этиленом, образовавшимся из первого миллилитра раство-
ра, промывают сосуд от воздуха, затем, проткнув колпачок из само-
уплотняющейся резины, собирают этилен в газометр, вытесняя из
него насыщенный раствор NaCl. Для того чтобы игла не забилась ре-
зиной, в ней выпиливают боковое отверстие для выхода газа. Из
1 мл этиленпродуцента этрела образуется приблизительно 70 мл эти-
Рис. 4.3.2. Устройства для получения и хранения этилена. 1 — сосуд для
получения этилена; 2 — колпачок из самоуплотняющейся резины; 3 —
игла с боковым отверстием; 4 — газометры
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 331
лена. Самый простой способ получения газовых смесей для калиб-
ровки хроматографа с концентрацией этилена 4,510_8-910-7 мол/л
(1-20 мкл/л) заключается в последовательном разбавлении этилена
в сосудах известного объема при атмосферном давлении.
Расчет газообмена
Выделение или поглощение газов растениями обычно выражают в
объемных, молярных или весовых единицах, отнесенных к массе,
площади или количеству объектов. Газообмен по этилену, двуокиси
углерода и кислороду может быть вычислен в случае использования
камеры закрытого типа по формуле (1), а для камеры открытого
типа по формуле (2):
S = (Ct- С0) <Vk - Vp) / tM, (l)
S = (Ct- C0) A / M, (2)
где S — интенсивность газообмена; Ct — концентрация определяе-
мого газа в момент отбора пробы; С0 — исходная концентрация газа
в камере; Vk — объем камеры; Vp — объем растительного объекта;
Μ — масса, площадь или количество объектов; t — время экспози-
ции; А — скорость продувки камеры воздухом.
Определение содержания этилена, двуокиси углерода,
и кислорода в тканях растений
Газообмен у растений подчиняется закону диффузии Фика [14]:
dm/dt = KF(Cм - Cв) / l или См = dml/dtKF + Cв. (3)
Из этого уравнения следует, что концентрация газа в атмосфере
межклетников См зависит от скорости и направленности его транс-
порта dm/dt, который определяется образованием или потреблени-
ем газа в растении, а также от диффузионного сопротивления 1/KF,
характеризующего свойства барьера, через который идет диффузия
(К — коэффициент диффузии, а l и F — толщина и площадь барье-
ра), и внешней концентрации газа Св.
Определение концентрации газа в атмосфере межклетников рас-
четным путем без повреждения растения весьма заманчиво. Однако
если определение внешней концентрации газа и скорости диффузии
не представляет особых трудностей, то прямое измерение диффузи-
онного сопротивления для такой сложной, непрерывно меняющейся
системы, как живое растение, практически невозможно. Для опреде-
ления внутритканевых газов были предложены методы, основанные
на их извлечении при разрежении.
332 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Рис. 4.3.3. Прибор для откачки внутритканевых газов вакуумным насо-
сом. 1 — вакуумный эксикатор; 2 — колокол; 3 — колпачок из самоуплот-
няющейся резины; 4 — растительный объект; 5 — затворная жидкость;
6 — регулятор вакуума; 7 — к вакуумному насосу
Извлечение внутритканевых газов
У растений, имеющих внутренние полости или крупные межклет-
ники, внутритканевые газы извлекают шприцем. Этим же шприцем
полученный образец газа вводят в хроматограф. Во время откачки
растения погружают в воду, чтобы исключить попадание воздуха в
образец газа, в частности через отверстие, проделанное иглой шпри-
ца. К недостаткам этого метода можно отнести то, что извлечение га-
зов происходит при неконтролируемом разрежении, и также то, что
для большинства растительных объектов он непригоден из-за отсут-
ствия полостей, в которые можно вводить иглу шприца (например,
у листьев), или из-за малых размеров объектов. Более универ-
сальный способ, с небольшими модификациями использованный во
многих работах, состоит в том, что растение помещают под колокол,
находящийся в вакуумном эксикаторе, наполненном насыщенным
раствором NaCl или (NH4)2SO4. Затем при помощи вакуумного насо-
са в течение 1-5 мин создают разрежение в 10-100 мм рт. ст, экси-
катор открывают и шприцем через пробку в колоколе отбирают об-
разец газа [16] (рис. 4.3.3). Образцы, полученные этим способом,
представляют собой сумму растворенных в клетках и содержащих-
ся в межклетниках газов. К сожалению, особенности данного и ряда
аналогичных устройств для извлечения внутритканевых газов не
позволяют в одной навеске растительной ткани одновременно опре-
делять концентрацию газов в атмосфере межклетников и их общее
содержание, так как эти устройства дают возможность извлекать
внутритканевые газы только 1 раз: при слабом или при сильном раз-
режении.
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 333
Определение количества газов,
находящихся в межклетниках и растворенных в тканях
Ртутный насос, изображенный на рис. 4.3.4, выгодно отличается от
других известных устройств для извлечения внутритканевых газов
тем, что позволяет проводить последовательные откачки при любом
необходимом разрежении, причем можно отдельно собирать газ, по-
лученный при каждой откачке [12, 13]. Кроме того, конструкция со-
суда для откачки позволяет после извлечения газов по весу инфиль-
трированной затворной жидкости определять объем межклетников,
что необходимо для расчета количества растворенных в тканях га-
зов. При работе с этим насосом растения сначала погружают в раст-
вор неионного детергента (0,01% ОП-7, ОП-10, тритон Х-100) для
предотвращения прилипания пузырьков воздуха, затем надрезают
в нескольких местах скальпелем под слоем затворной жидкости в
сосуде для откачки, что увеличивает выход газа при слабом разре-
жении и ускоряет инфильтрацию затворной жидкости в межклет-
ники. Сосуд закрывают пришлифованной крышкой, смазанной для
Рис. 4.3.4. Ртутный насос для извлечения внутритканевых газов. 1 — со-
суд для откачки внутритканевых газов; 2 — штуцер; 3 — затворная жид-
кость; 4 — растительный объект; 5а и 5б — распределительные краны;
6 — газоприемник емкостью 0,5 л, 7 — ртуть; 8 — подвижный сосуд насо-
са емкостью 1 л; 9 — вакуумный шланг; 10 — шприцы для отбора образ-
цов газа
334
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
уплотнения вазелином, шприцем доливают затворную жидкость до
верхнего края штуцера, сосуд взвешивают и присоединяют к насо-
су. В качестве затворной жидкости применяют насыщенный проки-
пяченный раствор NaCl, в который добавляют 2 мл/л концентриро-
ванной НС1 (для уменьшения растворения двуокиси углерода). Для
каждого образца растительной ткани используют свежую затвор-
ную жидкость, из которой предварительно при сильном разрежении
удаляют растворенный в ней воздух.
При определении концентрации газов в атмосфере межклетни-
ков откачку проводят при разрежении около 650 мм рт. ст. в течение
10-20 с. Разрежение получают, опуская подвижный сосуд насоса на
необходимую высоту. Распределительным краном 5а (рис. 4.3.4)
соединяют сосуд для откачки с газоприемником. После того как
выделившиеся из растительного объекта газы перейдут в газопри-
емник, распределительный кран закрывают, а подвижный сосуд
поднимают на высоту, необходимую для получения избыточного
давления в газоприемнике. Затем распределительными кранами 5а
и 5б соединяют газоприемник со шприцем, в который переводят
извлеченный образец межклеточной атмосферы. После этого при
сильном разрежении (около 5 мм рт. ст.) за три-четыре последо-
вательные откачки (1—2 мин каждая) извлекают практически все
оставшиеся в тканях газы. Образец, полученный при сильном раз-
режении, представляет собой сумму газов, оставшихся в межклет-
никах после откачки, проведенной при слабом разрежении, и газов,
растворенных в клетках. Из насоса газы, полученные при слабом и
сильном разрежении, переводят в отдельные стеклянные шприцы
объемом соответственно 10 и 50 мл, смазанные глицерином. Шпри-
цы соединяют с насосом при помощи отрезков вакуумного шланга
(30x6x2 мм). После отсоединения шприца от насоса отверстие ва-
куумного шланга закрывают стеклянной палочкой. Образцы газов
объемом 1-2 мл отбирают для анализа из 10 и 50 мл шприцев, про-
калывая вакуумный шланг тонкой иглой. При определении низких
концентраций этилена образцы газов вводят непосредственно из
шприцев в концентрирующую систему хроматографа (рис. 4.3.1).
После извлечения внутритканевых газов распределительный кран
5а (рис. 4.3.4) и подвижный сосуд насоса помещают в такое положе-
ние, чтобы затворная жидкость могла поступать в сосуд для откачки
при атмосферном давлении, под действием которого она будет инфи-
льтроваться в межклетники растительной ткани. Затем сосуд отсое-
диняют от насоса, доводят уровень затворной жидкости до верхнего
края штуцера и взвешивают.
Объем межклетников рассчитывают по формуле (4), а содержа-
ние растворенных газов — по формуле (5):
Раздел 4.3. Определение выделения и содержания этилена 335
Vm = (М2 - М1) / Mpd, (4)
СР = (C1V1 + C2V2) / Mp - C1Vm, (5)
где Vm — удельный объем межклетников; Μ — масса растительной
ткани; М1 — масса сосуда до извлечения внутритканевых газов;
М2— масса сосуда после инфильтрации растительной ткани; d —
удельный вес затворной жидкости; С — содержание растворенного
газа в растительной ткани; С1 и С2 — концентрации; V1 и V2 — объе-
мы образцов внутритканевых газов, полученных при слабом и силь-
ном разрежении соответственно.
Определение выделения этилена, газообмена CO2 и O2, содержа-
ния этих газов в атмосфере межклетников и в клетках дает полную
информацию о газовом режиме растения, необходимую при иссле-
довании механизма действия этилена [12, 17].
Оценка метода, возможные проблемы
Следует отметить, что физиологическое действие этилена в первую
очередь зависит от его концентрации в растении. Принято считать,
что выделение этилена прямо пропорционально его синтезу и содер-
жанию, что во многих случаях справедливо. Однако по скорости вы-
деления этилена не всегда можно судить о его содержании в расте-
нии. Так при одной и той же скорости синтеза и выделения этилена,
изменение диффузионного барьера при устьичных движениях, утол-
щении кутикулы или затоплении вызывает изменение содержания
(см. формулу 3), а следовательно, и действия этилена. После восста-
новления диффузионного равновесия скорость выделения этилена
остается прежней.
Еще одна часто встречающаяся ошибка при измерении выделе-
ния этилена — это длительное выдерживание растений в герметич-
ных камерах для накопления определяемой концентрации этилена.
Накапливающийся в камере этилен может вызвать автокаталити-
ческое образование или ингибирование его синтеза, а у поврежден-
ных при отделении органов растений будет наблюдаться так называ-
емая раневая реакция, которая сопровождается многократным уси-
лением образования этилена. При длительной экспозиции растений
в герметичных камерах изменяется содержание CO2 и O2, от кото-
рых зависит как действие, так и образование этилена.
Определение выделения этилена на газовом хроматографе с пла-
менно-ионизационным детектором и устройством для концентри-
рования углеводородов позволяет в десятки раз повысить чувст-
вительность прибора за счет использования для анализа образцов
воздуха большого объема. Высокая чувствительность дает возмож-
336
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
ность в десятки раз сократить время пребывания растений или их
органов в камерах перед анализом и проводить определение эти-
лена до накопления его физиологически активной концентрации
и при незначительном изменении содержания CO2 и O2 в атмосфе-
ре камеры.
Использование предложенного метода позволяет избежать пере-
численных ошибок при определении выделения этилена растения-
ми в обычных и стрессовых условиях [17, 18].
Литература
1. Ward Т. М., Wright Μ., Roberts J. Α., Self R., Osborn D.J.,
Analytical procedures for the assay and identification of ethylene //
Isolation of plant growth substances/ Ed. Hillman J. R., Cambrige:
Cambrige Univ. Press, 1978, P. 135-152.
2. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир.
1986. Т. 2. 312 с.
3. Roberts J. Α., TuckerG. A. Eds., Ethylene and plant development//
London: Butter worths, 1985, 416 p.
4. Osborne D. J. The control role of ethylene in plant growth and
development// Biochemical and physiological aspects of ethylene
production in lower and higher plants/ Eds. Clijsters H.,
De Proft M., Marcelle R., Van Poucke M. Dordrecht, Boston,
London: Kluwer Acad. Publ. 1989. P. 1-11.
5. Ракитин Ю.В. Ускорение созревания плодов. М.: АНСССР,
1955, 167с.
6. Ракитин В. Ю., Ракитин Л. Ю. Определение СО2, О2 и N2 газо-
хроматографическим методом// Физиология растений. 1974.
Т. 21. С. 1293-1296.
7. De Greef J. Α., De Proft M. Kinetic measurements of small ethylene
changes in an open system designed for plant physiological studies//
Physiology Plantarum. 1978. V. 42. P. 79-84.
8. Harren F. J. M., Bijnen F. G. C, Reuss J., Voesenek L. A. C. J.,
Blom C. W. P. M., Intracavity photoacoustic measurements with a
CO2 waveguide laser; detection of C2H4 as trace gas at the ppt
level// Appl. Phys. 1990. B. 50. № 1. 137-144.
9. Jerie P. H., Hall M. A. The identification of ethylene oxide as a
major metabolite of ethylene in Vicia faba L// Proc. Roy Soc/
London. 1978. B. 200. P. 84-94.
10. Castello G. Analysis of traces of contaminants in breathing oxygen
with a helium detector and an electron capture detector//
J. Chromatogr. 1971. V. 58. P. 117-125.
Раздел 4.4. Определение свободных и связанных полиаминов 337
11. Bassi Р. К., Spenser Μ. S. Comparative evaluation of photoionization
and flame ionization detectors for ethylene analysis // Plant, and Cell
Environment. 1985. V. 8. № 2. P. 161-165.
12. Ракитин В. Ю. Газохроматографическое определение этилена в
растительных объектах// Методы определения фитогормонов,
ингибиторов роста, дефолиантов и гербицидов/ Под ред. Раки-
тина Ю. В. М. Наука. 1973. С. 84-90.
13. Ракитин В. Ю., Ракитин Л. Ю. Определение газообмена и со-
держание этилена, двуокоси углерода и кислорода в тканях рас-
тений// Физиология растений. 1986. Т. 33. С. 403-413.
14. Burg S. P. Ethylene, plant senescence and abscission// Plant Physiol.
1968. V. 43. P. 1503-1511.
15. Ракитин Ю. В., Ракитин В. Ю. Природа действия 2-хлорэтил-
фосфоновой кислоты и других этиленвыделяющих регуляторов
роста и развития растений// Агрохимия. 1979. № 5. С. 126-149.
16. Beyer Ε. Μ., Morgan P. W. A method for dertermining the
concentration of ethylene in the gas phase of vegetative plant
tissues // Plant Physiol. 1970.V. 46. № 2. P. 352-354.
17. Ракитин В. Ю. Активация этиленом цианидрезистентного ды-
хания при созревании плодов лимона// Физиология растений.
1988. Т. 35. С. 717-725.
18. Ракитина Т. Я.у Ракитин В. Ю., Власов П. В., Пруднико-
ва О. Н. Влияние АБК на индуцированное УФ-Б выделение эти-
лена у etr и ctr мутантов Arabidopsis thaliana// Физиология рас-
тений. 2004. Т.51. С.737-741.
4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ
И СВЯЗАННЫХ ПОЛИАМИНОВ В РАСТЕНИЯХ
МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ
ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
В. Ю. Ракитин, О. Н. Прудникова, Л. А. Стеценко,
Н. И. Шевякова
Введение
Природные алифатические полиамины (ПА) — универсальные орга-
нические поликатионы, участвующие во многих фундаментальных
процессах жизнедеятельности растений: от процессов восприятия и
передачи сигналов, экспрессии генома, роста и развития до адапта-
ции к абиотическим стрессам [1, 2, 3].
338
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
В растениях ПА представлены в основном диаминами: путрес-
цином (Пут) и кадаверином (Кад), а также триамином спермидином
(Спд) и тетрамином спермином (Спм).
У некоторых водорослей и архебактерий, устойчивых к экстре-
мальным факторам внешней среды (термофильные и галофильные
экотипы), обнаружены так называемые необычные ПА (норсперми-
дин, норспермин, кальдопентамин и др.) — производные Спд и Спм
(табл. 4.4.1).
Таблица 4.4.1. Обычные и необычные природные полиамины [4]
Общепринятое
название
Систематическое
название
Химическая структура
1,3-Диаминопропан
Путресцин
Кадаверин
Спермидин
Норспермидин
сим-Норспермидин
Термин
Спермин
Термоспермин
Гомоспермин
Кальдопентамин
Гомокальдопентамин
Гомокальдогексамин
N4-Аминопропил-
норспермидин
1,3-Диаминопропан
1,4-Диаминобутан
1,4-Диаминопентан
1,8-Диамино-4-азоок-
тан
1,7-Диамино-4-азогеп-
тан
1,9-Диамино-5-азоно-
нан
1,11 -Диамино-4,8-диа-
зоундекан
1,12-Диамино-4,9-диа-
зододекан
1,12-Диамино-4,8-диа-
зододекан
1,13-Диамино-4,9-диа-
зотридекан
1,15-Диамино-4,8-триа-
зопентадекан
1,16-Диамино-4,8,12-
триазогексадекан
1,20-Диамино-4,8,12,
16-тетраазоэйкозан
NH2(CH2)3NH2
NH2(CH2)4NH2
NH2(CH2)5NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH2
NH2(CH2)4NH(CH2)4NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH
(CH2)3NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)4
NH(CH2)3NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH
(CH2)3NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)4NH
(CH2)4NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH
(CH2)3NH(CH2)3NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH
(CH2)3NH(CH2)4NH2
NH2(CH2)3NH(CH2)3NH
(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)4
NH2
[NH2(CH2)3]3N
N4-Аминопропил-
спермидин
[NH2(CH2)3]N[NH2(CH2)4]
Раздел 4.4. Определение свободных и связанных полиаминов 339
У некоторых растений (люцерна) такие необычные ПА найдены
в условиях гипертермии.
Благодаря наличию двух и более аминогрупп ПА при физиоло-
гических рН ведут себя как основания (рКс = 9-10). По этой причине
их называют органическими катионами (Спм4+, Спд3+, Пут2+, Кад2+).
Именно с катионной природой чаще всего связывают их биологичес-
кую активность. ПА присутствуют во всех компартментах раститель-
ной клетки, включая ядро, что указывает на их участие в различных
фундаментальных процессах. В растениях ПА содержатся в концен-
трациях от 10-9 до 10-5 Μ и способны легко и прочно связываться с от-
рицательно заряженными группами биополимеров: нуклеиновыми
кислотами, фосфолипидами, анионными группами мембран и клеточ-
ных стенок, а также образовывать стереоспецифические комплексы
вокруг белковой молекулы. Эти ионные взаимодействия весьма важ-
ны для регуляции структуры и функции макромолекул в нормальных
условиях и особенно для защиты их от деградации при стрессах.
Основное отличие от таких катионов, как Mg2+ и Са2+, заключает-
ся в поливалентности ПА и их способности к многоточечному связы-
ванию с различными биополимерами, вследствие чего они способны
стабилизировать вторичную и трехмерную структуру биополимеров
и таким образом воздействовать на их биологическую активность.
Имеются данные о стимуляции ПА многих реакций, связанных с
синтезом ДНК, РНК и белков и, напротив, повышенные концентра-
ции ПА ингибируют протеолиз белков, активность РНКаз и других
энзимов.
Начиная со времени обнаружения ПА у растений, изучение их
метаболизма и физиологической роли ведется в двух основных на-
правлениях: как регуляторов роста и развития растений в норме и
как низкомолекулярных биологически активных метаболитов, участ-
вующих в адаптации растений к действию экстремальных для жиз-
недеятельности факторов внешней среды.
Давно обсуждается вопрос о причастности ПА к классу гормо-
нальных веществ. Американская школа исследователей во главе с
Артуром Галстоном в 90-х годах XX века [5] настаивала на такой
классификации ПА.
В процессе онтогенеза растений внутриклеточный уровень ПА
изменяется, что регулируется не без участия фитогормонов (гиббе-
релины, ауксины, цитокинины, этилен).
Пути биосинтеза ПА в растениях хорошо изучены, клонирована
большая часть генов для ферментов, получены трансгенные и му-
тантные растения с измененным метаболизмом ПА. Родоначальни-
ком главных ПА путресциновой семьи (Спд, Спм и ряда необычных
ПА) является диамин Пут. Он может образоваться непрямым путем
через серию промежуточных продуктов, включая агматин, при де-
340
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
карбоксилировании аргинина аргининдекарбоксилазой или пря-
мым путем через декарбоксилирование орнитина орнитиндекарбок-
силазой и цитруллина цитруллиндекарбоксилазой. Далее наращива-
ние алифатической цепи Пут с образованием Спд, катализируемое
спермидинсинтазой, и Спм, катализируемое сперминсинтазой, идет
путем последовательного присоединения пропиламина, который об-
разуется с помощью S-аденозилметионин декарбоксилазы. Диамин
Кад близок по структуре молекулы к Пут, содержит на одну СН2
группу больше (пентадиамин). Кад образуется при прямом декар-
боксилировании лизина, катализируемом лизиндекарбоксилазой.
Регуляция активности ферментов биосинтеза ПА осуществляет-
ся как на транскрипционном, так и посттранскрипционном уровне.
Считается, что большинство ферментов биосинтеза проходят пост-
транляционную модификацию, образуясь сначала как профермен-
ты (неактивные предшественники).
Клеточный гомеостаз ПА контролируется как на уровне анабо-
лизма, так и катаболизма, включающего окислительную деградацию.
В процессе катаболизма терминальные аминогруппы ПА подвергают-
ся окислительному дезаминированию медьсодержащими диаминок-
сидазами с образованием первичных продуктов, перекиси водорода
и аммиака, и синтезом в последующих реакциях метаболитов, имею-
щих физиологическое значение (таких как алкалоиды и др.).
ПА в растениях присутствуют как в свободной форме, так и свя-
занной с белками, оксикоричными и фенольными кислотами в фор-
ме коньюгатов. Коньюгированные формы ПА найдены во многих се-
мействах растений и вызывают большой интерес вследствие их мно-
гочисленных полезных функций, особенно в стрессорных условиях.
Одним из важных защитных свойств ПА и их коньюгатов при
формировании стресс-адаптаций является их антиоксидантная ак-
тивность. ПА связывают свободные радикалы, активные формы
кислорода (АФК), предотвращая их токсическое действие и пере-
кисное окисление липидов в мембранах. Увеличение содержания
ПА и особенно Пут в тилакоидных мембранах при повышенном
уровне УФ-В, засолении и других абиотических стрессах представ-
ляет собой один из первичных механизмов защиты фотосинтетичес-
кого аппарата. При этом эффективность защитного действия ПА
прямо пропорциональна количеству аминогрупп в его молекуле.
Следует отметить, что свободные ПА имеют более низкие кон-
станты связывания со всеми типами АФК, чем их коньюгаты с ко-
фейной, кумаровой или феруловой кислотой [6].
Коньюгаты ПА с низкомолекулярными соединениями представ-
ляют особый интерес, поскольку обладают способностью к дальнему
транспорту, возможно, выполняя сигнальную роль, а также важны
для регуляции эндогенного пула свободных ПА [6, 7]. Спектр конъ-
Раздел 4.4. Определение свободных и связанных полиаминов 341
югированных ПА органоспецифичен, зависит от вида и фазы разви-
тия растения.
Определение содержания свободных,
НСlO4-растворимых и нерастворимых
конъюгированных ПА
Исследование механизмов действия свободных и связанных ПА в
первую очередь требует детального анализа изменения их содержа-
ния при различных биохимических и физиологических процессах в
органах и тканях растений. Широкое применение нашло наиболее
чувствительное определение ПА, основанное на их экстракции 5%
НСlO4, дансилировании аминогрупп, разделении и регистрации по-
лученных производных методом высокоэффективной жидкостной
хроматогафии (ВЭЖХ) с флюорометрическим детектором. Однако
дансилированию подвергаются углеводы и фенольные соединения,
присутствующие в растениях в относительно больших количествах,
что может значительно затруднить количественное определение ПА.
Анализ ПА в виде бензоильных производных с использованием
УФ-детектора лишен указанных недостатков [8, 9].
В настоящем разделе приведено определение свободных, раство-
римых и нерастворимых связанных ПА после их гидролиза в виде
бензоильных производных методом ВЭЖХ.
Экстракция 5% НСlO4 свободных,
растворимых конъюгированных ПА
и получение фракции нерастворимых связанных ПА
Образцы тканей растений (0,3-0,7 г) помещали в пакетики из алю-
миниевой фольги, фиксировали в жидком азоте и хранили до анали-
за при температуре -70 °С. Замороженные образцы гомогенизиро-
вали в фарфоровой ступке с 5 мл 5% хлорной кислоты при темпе-
ратуре 0 °С. Для учета потерь при гомогенизации, экстракции,
приготовлении бензоильных производных ПА и их очистке в качест-
ве внутреннего стандарта в ступку добавляли 25 мкл 1 мМ раствора
1,6-диаминогексана («Sigma», США) в 0,1Ν НСlO4. Экстракция ПА
5% хлорной кислотой из гомогенизированных тканей проходила
при 0 °С в течение часа, затем экстракт фильтровали под вакуумом
через микроволоконный стеклянный фильтр GF/C диаметром 25 мм
(«Whatman», Великобритания). Половину объема фильтрата ис-
пользовали для определения свободных ПА, а вторую — для опреде-
ления НСlO4-растворимых конъюгатов ПА. В осадке, полученном
при фильтровании гомогената, определяли НСlO4-нерастворимые
конъюгаты ПА.
342
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Гидролиз конъюгатов ПА
Для определения нерастворимых и растворимых конъюгированных
ПА осадок (вместе с фильтром) и фильтрат подвергали кислотному
гидролизу в б N НСl в течение 24 ч при температуре 95 + 1 °С в запа-
янных стеклянных ампулах. Внутренний стандарт после фильтра-
ции гомогената содержался только в экстракте. Поэтому в осадок на
фильтрах к НСlO4-нерастворимым ПА добавляли перед гидролизом
25 мкл 1 мМ 1,6-диаминогексана.
Полисахариды, содержащиеся в листьях, могут мешать опреде-
лению НСlO4 — растворимых конъюгатов ПА. Так в М. crystallinum
после кислотного гидролиза не удавалось обнаружить не только ПА,
входившие в состав конъюгатов, но также и добавленный к образцу
внутренний стандарт — 1,6-диаминогексан [10].
Для удаления полисахаридов из листовых экстрактов использо-
вали метод, применяемый для осаждения полисахаридов при выде-
лении нуклеиновых кислот из растений [11]. С этой целью фильтрат
экстракта из листьев перед гидролизом доводили до рН 4,5, добав-
ляли 2-бутоксиэтанол («Sigma», США) до его концентрации в среде
28,5 объемных % и выдерживали 30 мин при 0 °С для формирова-
ния осадка. Гелеподобный осадок удаляли фильтрованием под ваку-
умом на фильтре GF/C. Фильтрат высушивали в фарфоровых чаш-
ках на водяной бане при 70 °С, растворяли в 5 мл 6 N НСl и подверга-
ли гидролизу по описанному выше методу.
Гидролизаты высушивали в фарфоровых чашках на водяной
бане при температуре 70 °С, затем растворяли в 5 мл 5% НСlO4. Гид-
ролизаты экстрактов содержали сумму свободных ПА и ПА, освобо-
дившихся из НСlO4-растворимых конъюгатов. Количество ПА, вхо-
дивших в состав НСlO4-растворимых конъюгатов, рассчитывали по
разнице значений суммарного содержания ПА в гидролизатах экс-
трактов и свободных ПА, которые определяли в экстрактах, не под-
вергавшихся гидролизу. Гидролизаты НСlO4-нерастворимых конъ-
югатов ПА содержали только ПА, освободившиеся в результате гид-
ролиза осадков, образовавшихся при фильтровании гомогената на
микроволоконном стеклянном фильтре GF/C.
Приготовление бензоильных производных ПА
Профильтрованный экстракт и гидролизаты переносили в стеклян-
ные пробирки объемом 20 мл с притертой пробкой и добавляли 4 мл
2 N NaOH, 35 мкл бензоилхлорида («Sigma», США) и интенсивно
перемешивали в течение 60 с. Реакцию бензоилирования ПА прово-
дили в течение 20 мин при комнатной температуре, время от време-
Раздел 4.4. Определение свободных и связанных полиаминов 343
ни перемешивая раствор. Затем для лучшего расслоения фаз в реак-
ционную среду добавляли 3 мл насыщенного раствора NaCl и обра-
зовавшиеся бензоильные производные ПА экстрагировали 2 мл
диэтилового эфира. Отделившийся слой эфира переносили стеклян-
ной пипеткой в другую пробирку и промывали 6 мл дистиллирован-
ной воды для удаления следов щелочи и соли. Затем эфирную фазу
переносили в полипропиленовую пробирку («Eppendorf») и выпари-
вали досуха под струей воздуха при температуре 35 °С на приборе
Silli Term. Heating Module («Piers», Швеция). Приготовленные об-
разцы бензоильных производных хранили в холодильнике при тем-
пературе -8 °С.
Разделение и количественное определение
бензоильных производных ПА
Приготовленные вышеописанным способом образцы бензоильных
производных ПА растворяли в 100 мкл метанола и вводили 20 мкл в
жидкостный хроматограф HP 1090 (фирмы «Hewlett-Packard»,
США) с колонкой Separon SGX С 18, размер частиц 5 мкм, длиной
150 мм и диаметром 3,3мм («Tessek», Прага).
Разделение бензоильных производных ПА проводили в режиме
градиентного элюирования смесью воды и метанола со скоростью
потока 0,6 мл/мин (табл. 4.4.2).
Таблица 4.4.2. Режим градиентного элюирования бензоильных произ-
водных полиаминов
Время, мин Концентрация метанола в элюенте, %
0 10
1,3 50
17,0 80
19,0 100
21,0 100
23,0 10
Последовательность выхода бензоильных производных ПА из
колонки была следующей: Пут, Кад, диаминопропан, 1,6-диамино-
гексан, Спд, Спм.
Количественное определение бензоильных производных ПА осу-
ществляли на фильтровом детекторе при λ = 254 нм и чувствительнос-
ти 0,125 Е. Потери учитывали с помощью внутреннего стандарта.
344
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Содержание ПА в тканях растений рассчитывали по формуле:
Ρ = (Sp x Is)/ (Sis x Μ x Кр),
где Ρ — содержание данного ПА (нмоль/г сырой массы или
нмоль/растение), Sp — площадь пика данного ПА (мм2), Is — коли-
чество внутреннего стандарта, добавленного к пробе растительного
материала (нмоль), Sis — площадь пика внутреннего стандарта
(мм2), Μ — масса пробы (г) или количество растений (шт), Кр — со-
отношение площадей пиков эквимолярных количеств внутреннего
стандарта и данного ПА (Кр = Sis cm / Sp cm).
Площадь Sis cm и Sp cm определяли по хроматограмме калибро-
вочного раствора. Для приготовления калибровочного раствора к
2 мл 5% НСlO4 добавляли по 25 мкл 1 мМ растворов Пут, Кад, Спм,
Спд и 1,6-диаминогексана в 0,1 N НСlO4. Калибровочный раствор
для 1,3-диаминопропана и 1,6-диаминогексана готовили отдельно,
поскольку бензоильные производные 1,3-диаминопропана и Пут
разделяются не полностью.
На рис. 4.4.1 и 4.4.2 представлены полученные описанным ме-
тодом данные по влиянию УФ-В радиации на содержание свободных
ПА в розетках Arabidopsis thaliana [12] и действию засоления NaCl
на динамику содержания свободных и НСlO4-растворимых и не-
растворимых конъюгатов ПА в корнях Mesembryanthemum
crystallinum [10].
Рис. 4.4.1. Влияние УФ-В радиации на содержание свободных полиами-
нов в розетках растений A. thaliana. Интенсивность облучения —
5±0,5 Вт/м2. Содержание путресцина (1), спермидина (2) и спермина (3)
определяли через 24 ч после облучения
Раздел 4.4. Определение свободных и связанных полиаминов 345
Рис. 4.4.2. Изменение содержания свободных и конъюгированных поли-
аминов в корнях М. crystallinum L. при действии солевого стресса 400 мМ
NaCl (6-48 ч). (А) Спермидин. (Б) Спермин. (В) Кадаверин. (Г) Путресцин.
(Д) Диаминопропан. 1 — свободные ПА; 2 — НСlO4-растворимые конъю-
гаты ПА; 3 — НСlO4 -нерастворимые конъюгаты ПА. На оси абсцисс пока-
зана продолжительность действия солевого стресса в часах
346
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Литература
1. Кузнецов Вл. В., Радюкина Н. «77., Шевякова Н. И. Полиамины и
стресс: биологическая роль, метаболизм и регуляция // Физио-
логия растений. 2006. Т. 53. С. 658-683.
2. Kuznetsov VI. V., Shevyakova N. I. Polyamines and stress tolerance
of plants invited review // Plant Stress. 2007. V. 1. P. 50-71.
3. Kuznetsov VI. V., Shevyakova N. I. Polyamines and plant
adaptation to saline environments // desert plants. Ed.
K. A. Ramawat. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 2010.
P. 261-298.
4. Bagni N., Tassoni A. Biosinthesis, Oxidation and conjugation of
aliphatic polyamines in higher plants // Amino Acids. 2001. V. 20.
P. 301-317.
5. Galston A. W., Kaur-Sawhney R., Atabella T., and Tiburcio A.F.
Plant polyamines in reproductive activity and response to abiotic
stress // Bot. Acta, 1997. V. 110. P. 197-207.
6. Bors W., Langebartels C, Michel C, Sandermann H. Polyamines
as radical scavengers and protectants against ozone damage //
Phytochemistry. 1989. V. 28. P. 1589-1595.
7. Shevyakova N. I., Rakitin V. Yu, Stetsenko L. Α., Aronova Ε. Ε.,
Kuznetsov Vl. V. Oxidative stress and fluctuations of free and
conjugated polyamines in the halophyte Mesembryanthemum
crystallinum under NaCl salinity // Plant Growth Regul. 2006.
V. 50. P. 69-78.
8. Flores Η. Ε., Galston A. W. Analysis of polyamines in higher plants
by high performance liquid chromatography // Plant Physiol.
1982. V. 69. P.701-706.
9. Smith Μ. Α., Davies P. J. Monitoring polyamines in plant tissues
by high performance liquid chromatography // High performance
liquid chromatography in plant sciences // Ed. Linskens H. F.,
Jackson J. F. Springer-Verlag, 1987. P. 209-227.
10. Стеценко Л. Α., Ракитин В. Ю., Шевякова Н. И., Кузне-
цов Вл. В. Органоспецифическое содержание свободных и конъ-
югированных полиаминов в растениях Mesembryanthemum
crystallinum при засолении // Физиология растений. 2009.
Т. 56. С. 893-898.
11. Manning К. Isolation of nucleic acids from plants by differential
solvent precipitation // Anal. Biochem. 1991. V. 195. P. 45-50.
12. Ракитин В. Ю., Прудникова О. Η., Карягин В. В., Ракити-
на Т. Я., Власов П. В., Борисова Т. Α., Новикова Г. В., Мош-
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 347
ков И. Е. Выделение этилена, содержание АБК и полиаминов в
Arabidopsis thaliana при УФ-В стрессе// Физиология растений.
2008. Т. 55. № 3. С. 355-361.
4.5. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ
АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА,
НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ
И АКТИВНОСТЕЙ ОСНОВНЫХ
АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ
И. Л. Радюкина, Ю. В. Иванов, Н. И. Шевякова
Введение
Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в клет-
ках растений в процессе нормальной жизнедеятельности организма
как промежуточные продукты в процессах фотосинтеза, дыхания
и др. Их избыточное накопление в клетках является ранним событи-
ем, сопровождающим действие на растения практически всех абио-
тических и биотических стрессов. К АФК относят химически ак-
тивные молекулы, полученные в результате неполного восстановле-
ния кислорода: синглетный кислород (1O2), супероксид-радикал
(O2*_), пероксид водорода (H2O2), гидроксил-радикал (ОН*) [1]. К
АФК также относят озон [2]. В повышенных концентрациях АФК
оказывают токсическое действие на важнейшие составные элемен-
ты клеток (белки, ДНК и др.). В низких концентрациях они могут
выступать как сигнальные молекулы, включающие многие меха-
низмы защиты от стрессов. Основными источниками внутриклеточ-
ных АФК являются хлоропласты, митохондрии, пероксисомы. Су-
ществует и энзиматический путь образования АФК, связанный с ра-
ботой ферментов (липоксигеназы, пероксидазы, НАДФН-оксидазы,
ксантиноксидазы) [3]. Конститутивный уровень АФК необходим
для лигнификации клеточных стенок, передачи стрессорного сигна-
ла и формирования иммунного ответа, для процессов старения и
программируемой гибели клеток.
Растения постоянно поддерживают определенный баланс обра-
зования и разрушения АФК. Ухудшение условий существования
сдвигает этот баланс в сторону повышенного образования активных
радикалов и накопления перекисных соединений. В ходе эволюции
растения сформировали систему антиоксидантной защиты, направ-
ленную на предотвращение избыточного образования АФК. Анти-
оксидантная система защиты клетки включает в себя ферменты
первой линии защиты от АФК: супероксиддисмутазу (СОД) и фер-
348 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
менты детоксикации перекиси водорода (каталазу, различные пе-
роксидазы и др.); ряд ферментов, необходимых для регенерации ак-
тивных форм антиоксидантных соединений (монодегидроаскорбат-
редуктаза, дегидроаскорбатредуктаза, глутатионредуктаза) [1, 3] и
низкомолекулярные соединения (α-токоферол, каротиноиды, ас-
корбиновая кислота, глутатион, маннит, сорбит, пролин, соедине-
ния фенольной природы, полиамины), многие из которых функцио-
нируют как «тушители» АФК. Наиболее общим индикатором раз-
вития окислительного стресса (ОС), вызванного аккумуляцией в
клетках АФК, является состояние перекисного окисления липидов
мембран (ПОЛ), о чем судят по количеству образованного малоново-
го диальдегида (МДА) (рис. 4.5.1). Исследования содержания АФК,
низкомолекулярных антиоксидантов и функционирования антиок-
сидантных ферментов важны при изучении процессов адаптации
растений к действию абиотических и биотических стрессоров, по-
скольку позволяют определить степень устойчивости растений раз-
личных таксономических групп и экотипов.
Рис. 4.5.1. Малоновый диальдегид
При изучении степени развития окислительного стресса и функ-
ционирования антиоксидантной защиты растения используются раз-
личные биохимические методы. Мы выбрали наиболее распространен-
ные, воспроизводимые и относительно недорогие и доступные.
Методы, характеризующие степень развития
окислительного стресса в растениях
Определение содержания малонового диальдегида
Малоновый диальдегид (МДА) образуется в клетках при деградации
полиненасыщенных жирных кислот АФК и служит тестом перокси-
дирования жирных кислот. МДА способен повреждать мембраны,
ДНК. Повышенное образование МДА служит маркером развития
окислительного стресса и, как следствие, является показателем сте-
пени повреждающего действия того или иного стрессора. При ис-
пользовании каких-либо приемов, позволяющих улучшать устой-
чивость растений к действию стрессоров, МДА может служить тестом
на эффективность выбранного способа. В биохимических исследова-
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 349
ниях преимущественно пользуются методом, основанным на спо-
собности МДА реагировать с тиобарбитуровой кислотой, образуя
окрашенный комплекс, количество которого можно определить по
оптической плотности при 532 нм [4].
Протокол анализа
100 мг растительного материала гомогенизируют в 1,5 мл 20% трих-
лоруксусной кислоты, центрифугируют при 10 000 g течение 15 мин
при 4 °С. К отобранным 0,3 мл супернатанта добавляют 1,2 мл 0,5%
тиобарбитуровой кислоты в 20% трихлоруксусной кислоте. Реак-
ционную смесь инкубируют 30 мин при 95 °С, охлаждают, центри-
фугируют 15 мин при 10 000 g. Оптическую плотность супернатанта
определяют при 532 нм и 600 нм. В качестве контроля используют
раствор тиобарбитуровой кислоты в трихлоруксусной кислоте. Рас-
чет содержания МДА проводят по формуле:
C =(Е532-Е600)хVех2
k x ms x Va
где Сх — содержание МДА, мкмоль/г сырой массы; Ε — оптическая
плотность раствора; Ve — объем экстракта, мл; Va — объем экстрак-
та взятый для анализа, мл; k — коэффициент молярной экстинкции
МДА: 156 мМ-1 x см-1; ms — масса образца для экстракции, г.
Определение содержания активных форм кислорода
Определение концентрации перекиси водорода
Содержание перекиси водорода является важным показателем сте-
пени развития окислительного стресса в растении при действии стрес-
соров различной природы. Сравнительный анализ количества пере-
киси водорода у различных растений в нормальных и стрессорных
условиях может служить признаком устойчивости того или иного
вида или сорта, а также демонстрировать эффективности применяе-
мых способов улучшения устойчивости.
В литературе описано несколько методов определения содержа-
ния перекиси в растениях. В основном они различаются пороговой
чувствительностью, т. е. минимальным содержанием перекиси во-
дорода, достоверно определяемым конкретным методом. В этом от-
ношении наиболее чувствительным, а также наиболее дорогим, яв-
ляется флуоресцентный метод (1-10 мкм перекиси водорода). Для
получения воспроизводимых результатов флуоресцентный метод
требует наличия флуориметра последнего поколения с возможнос-
тью использования микропланшетов (96 луночных) вместо кювет.
350
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Наиболее доступным является определение количества перекиси
водорода, основанное на образовании окрашенного продукта — пе-
роксида титана [5].
Протокол анализа
Растительный материал гомогенизируют в холодном 100% ацетоне
в соотношении 1:2 (масса навески/объем ацетона), центрифугируют
при 10 000 g течение 10 мин. К полученному супернатанту добавля-
ют 20% TiCl4 в концентрированной соляной кислоте до конечной
концентрации соли титана в растворе — 4%, затем добавляют кон-
центрированный гидроксил аммония (NH4OH) в количестве 0,2 мл
на 1 мл образца. Образующийся осадок пероксида титана отделяют
центрифугированием 10 000 g течение 5 мин, осадок ресуспендиру-
ют в 2 N H2SO4. Оптическую плотность измеряют при 415 нм, кон-
тролем служит дистиллированная вода. Содержание перекиси водо-
рода рассчитывают, используя стандартную кривую, построенную
по растворам перекиси водорода с известной концентрацией от 0,1
до 1 мМ. Расчет проводят по формуле:
Cх = CH2O2 x Ve / Ms
где Сх — содержание H2O2, мМ/г сырой массы; СH2O2 — концентра-
ция H2O2 по калибровочной кривой, мМ; Ve — объем экстракта, мл;
ms — масса образца для экстракции, г.
Еще одним из наиболее известных способов определения содер-
жания перекиси водорода в растительных тканях является метод
Okuda [6]. В этом методе используется З-(диметиламино) бензойная
кислота и З-метил-2-бензотиазолин гидразон и коммерческий пре-
парат пероксидазы хрена.
Протокол анализа
Растительный материал (0,2 г) растирают в ступке при 0 °С в тече-
ние 1 мин в присутствии 2 мл 0,2 N НСlO4 и 0,1 г кварцевого песка.
После центрифугирования при 20 000 g 5 мин супернатант отбира-
ют и нейтрализуют 4 N КОН и вновь центрифугируют при 1000 g
1 мин. Аликвоту (200 мкл) очищают на колонке AG-1 (0,8x2 см),
элюируют 800 мкл дистиллированной воды. К реакционной смеси
(1 мл) добавляют 400 мкл 12,5 ммоля З-(диметиламино) бензойной
кислоты в 0,375 Μ фосфатном буфере (рН 6,5), 80 мкл З-метил-2-бен-
зотиазолин гидразона. Реакцию начинают добавлением 20 мкл перок-
сидазы (0,25 единиц) при 25 °С. Увеличение оптической плотности
(появление окраски) измеряют при 590 нм на двулучевом спектрофо-
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 351
тометре, определяемый диапазон составляет 2-200 нмоль перекиси
водорода.
Для проверки специфичности окраски только для перекиси во-
дорода используют несколько контрольных образцов: 1) к элюату
добавляют 10 ед. каталазы, инкубируют 15 мин при 20 °С, а затем
останавливают реакцию кипячением (1 мин) и проводят определе-
ние по указанному протоколу, добавляя перекись водорода; 2) про-
водят реакцию в отсутствии пероксидазы; 3) проводят реакцию с
коммерческим препаратом пероксидазы и добавлением перекиси.
Определение содержания супероксид-радикала
Так же как и первые два метода, определение содержания супер-
оксидрадикала служит характеристикой степени развития окисли-
тельного стресса в растениях в неблагоприятных условиях.
Содержание супероксидрадикала определяют по методу Beckett
et al. [7], основанному на восстановлении адреналина (эпинефрина)
до адренохрома под действием супероксид-радикала.
Протокол анализа
Замороженные образцы массой 300 мг гомогенизируют в жидком
азоте, переносят в полипропиленовые пробирки (эппендорф) с до-
бавлением 1,5 мл дистиллированной воды и центрифугируют 15 мин
при 5000 g. 300 мкл супернатанта переносят в стеклянные пробир-
ки, доводят объем до 10 мл и добавляют 100 мкл 10 мМ раствора
адреналина. Смесь инкубируют на свету в течение 30 мин при ком-
натной температуре, после чего на спектрофотометре измеряют
оптическую плотность раствора при 490 нм, контроль — дистилли-
рованная вода. Для проверки специфичности метода обычно ис-
пользуют в качестве контроля реакцию in vitro, проведенную в при-
сутствии коммерческого препарата СОД (например, Cu/Zn СОД),
подбирая количество фермента так, чтобы добиться 75% ингибиро-
вания образования супероксид-радикала. Следует также отметить,
что для более строгого доказательства специфичности описываемо-
го метода используют ЭПР метод. При этом также применяют ком-
мерческий препарат фермента в количестве, вызывающем 75% ин-
гибирование образования супероксид-радикала.
Содержание супероксид-радикала оценивали по количеству об-
разовавшегося адренохрома по формуле:
= Е490 x k
Сх l
где Сх — концентрация адренохрома; k — коэффициент молекуляр-
ной экстинкции вещества, 4020 мкМ-1 x см-1; l — длина оптическо-
го пути луча света, см.
352
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Определение эффективности
антиоксидантного защитного ответа растений
на действие стрессоров различной природы
Определение активностей антиоксидантных ферментов
Антиоксидантные ферменты являются обязательными участника-
ми защитного ответа растения при действии стрессоров. Эффектив-
ность их функционирования определяет степень устойчивости видов
растении, это может быть интегральным показателем сортовой
устойчивости растений. Следует, однако, учитывать, что активность
антиоксидантных ферментов в стрессорных условиях может изме-
няться разнонаправленно, и не всегда она коррелирует с устойчи-
востью растения к действию стрессоров. Более того, в ряде случаев
может наблюдаться ингибирование активности фермента. Поэтому
анализ функционирования антиоксидантной защитной системы яв-
ляется многофакторным и включает множество параметров: актив-
ность различных ферментов, их изоформ, содержание низкомоле-
кулярных метаболитов, сопоставление содержания низкомолеку-
лярных метаболитов и активностей ферментов их метаболизма.
Определение активности супероксиддисмутазы
В настоящее время принято считать, что первой линией защиты
клеток от образования супероксид радикала являются Cu/Zn — СОД,
Fe — СОД, Μn — СОД. Механизм действия заключается в последова-
тельном восстановлении и окислении супероксидными анион-ради-
калами металла (Me) активного центра фермента.
СОД-Меn+ + 02- = СОД-Ме(n-1)+ + O2,
СОД-Ме(n-1)+ + O2.- + 2Н+ = СОД-Меn+ + H2O2.
Реакция может протекать спонтанно, но в присутствии фермен-
та скорость повышается в 10 000 раз.
СОД в клетке присутствует в виде нескольких изоформ. Изофор-
мы СОД различаются между собой по типу металла, встроенного в
активный центр фермента (Cu/Zn — СОД, Fe — СОД, Μn — СОД), по
молекулярной массе, локализации в клетке, чувствительностью к
ингибиторам [1, 3, 8-9].
Cu/Zn — СОД обнаружена в клетках как прокариотических, так
и эукариотических организмов. Cu/Zn — СОД является наиболее
распространенной в клетках растений: она обнаружена во всех внут-
риклеточных компартментах — в цитозоле, хлоропластах, митохон-
дриях, пероксисомах, а также в апопласте. Цитозольная Cu/Zn —
СОД растительного и животного происхождения является гомоди-
мером, состоящим из двух равного размера субъединиц, связанных
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 353
нековалентно (масса изоформы колеблется в пределах 32-34 кДа),
хлоропластная изоформа растений является гомотетрамером. Крис-
таллическая структура растительной Cu/Zn — СОД гомологична та-
ковой из клеток животных: каждая субъединица фермента имеет
структуру бочонка (бета-барреля) [9]. Марганецсодержащая изо-
форма обнаружена как у эукариот, так и у прокариот. У эукариот
эта изоформа локализована в матриксе митохондрий и пероксисом,
но в печени человека и павиана фермент присутствует в значитель-
ном количестве и в цитозоле. Молекулярная масса фермента 46 или
92 кДа, и он состоит соответственно из 2 или 4 субъединиц одинако-
вого размера [3, 9]. Железосодержащая изоформа не обнаружена в
клетках животных, у растений локализована в хлоропластах — как
в строме, так и на мембранах тилакоидов. Кроме хлоропластов фер-
мент обнаружен в нефотосинтезирующих органеллах и тканях: в пе-
роксисомах листьев Lycopersicon esculentum, пероксисомах лепест-
ков гвоздики, а также в цитозоле клубеньков некоторых бобовых —
клевера, сои, фасоли. Молекула Fe — СОД работает в форме гомоди-
мера, имеет молекулярную массу 36-46 кДа в хлоропластах и
54 кДа — в цитозоле клубеньков бобовых [9]. Изоформы СОД отли-
чаются разной чувствительностью к ингибиторам CN- и H2O2. Так,
Cu/Zn — СОД ингибируется CN- и H2O2, Fe — СОД только H2O2, а
Μn — СОД не подвержена ингибированию указанными вещества-
ми. Характерной особенностью клеток растений, отличающих их от
клеток других организмов, является наличие всех трех изоформ и
множественность изозимов форм СОД. Так, в клетках листьев куку-
рузы обнаружено 9 изозимов СОД: 4 Cu/Zn — СОД в цитоплазме,
1 Cu/Zn — СОД в хлоропластах и 4 Μn — СОД в митохондриях. Ко-
личество изоформ изозимов различается у разных видов растений.
Одним из наиболее распространенных методов определения об-
щей активности СОД является метод Beauchamp [10]. В этом методе
используется фотохимическое восстановление нитросинего тетразо-
лия, в результате которого образуется формазан — вещество синего
цвета. В качестве источника супероксид радикала служит система
метионин/рибофлавин. В присутствии СОД данный процесс ингиби-
руется, так как СОД диспропорционирует часть супероксид радика-
лов. В результате такого ингибироваиия количество образующегося
формазана уменьшается. Оптическая плотность формазана измеря-
ется при 560 нм и служит основой для расчета активности фермен-
та (рис. 4.5.2).
Протокол анализа
0,1-0,3 г растительного материала растирают в жидком азоте.
Экстракцию растворимых белков проводят 0,066 Μ K/Na-фосфат-
354
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Контроль КСН H2O2
Мn-СОД
Fe-СОД
Cu/Zn-СОД
Рис. 4.5.2. Ингибиторный анализ изоформ СОД
ным буфером, рН 7,4, содержащим 1 мМ дитиотриитола (DTT),
0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в DMSO (диметил
сульфоксид), 1-3 мг поливинилпирролидона (ПВП). Все используе-
мые вещества необходимы для стабилизации белков в растительном
экстракте, стабилизации рН, предотвращения окислительно-вос-
становительных реакций, возникающих в результате разрушения
клеточных органелл и выхода их содержимого в гомогенат. После
центрифугирования гомогената при 10 000 g в течение 20 мин при
4 °С полученный супернатант используют как ферментный препа-
рат для определения активности СОД.
Реакционная смесь объемом 2 мл содержит 40 мкл ферментного
препарата; 40 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,8; 10 мМ L-метионина;
54 мкМ нитросинего тетразолия; 0,025% Тритон Х-100 и 3 мкМ ри-
бофлавина. Реакцию проводят при освещении люминесцентными
лампами модели F36W/54 («Philips», Венгрия) в течение 30 мин.
Необходимо очень тщательно располагать пробирки с реакционной
смесью для достижения равномерной и одинаковой освещенности. В
качестве контроля используют реакционную смесь без ферментного
препарата. Оптическую плотность раствора измеряют при 560 нм на
спектрофотометре. Расчет активности фермента проводят по формуле:
log
А =
(Ε
контр.
E обр.
log2 x m6eJl
где А — активность СОД, усл. ед. активности/мг белка; Еконтр. —
оптическая плотность контрольного образца; Еобр. — оптическая
плотность опытного образца; mбел. — масса белка в объеме препара-
та, используемого для анализа, мг.
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 355
Активность СОД выражается в условных единицах активности
на мг белка в препарате. Использование log в расчетах обусловлено
логарифмической зависимостью оптической плотности от количес-
тва фермента, кроме того, достоверным считаются значения опти-
ческой плотности, соответствующие 50% ингибированию реакции с
нитросиним тетразолием. В связи с этим используется log2 как ко-
эффициент.
Вторым по распространенности методом определения активнос-
ти СОД является восстановления цитохрома С с использованием в
качестве источника супероксид радикала системы ксантин/ксанти-
ноксидаза.
В каждом из приведенных методов имеются свои ограничения.
Восстановление нитросинего тетразолия может ингибироваться не
только СОД.
Для метода с использованием цитохрома необходимо для каж-
дого эксперимента подбирать концентрацию ксантиноксидазы (ко-
личество единиц активности), поскольку неправильно подобранное
соотношение приводит к большому разбросу данных.
Определение активности гваякол-зависимых пероксидаз
Внутриклеточное содержание перекиси водорода регулируется ря-
дом ферментов, основными из которых являются каталаза и перок-
сидаза. Пероксидазы — это суперсемейство гемсодержащих белков,
содержащее три класса. Растительные пероксидазы в разных изо-
формах присутствуют практически во всех компартментах клетки:
хлоропластах (в строме и в мембранах тилакоидов), в мембранах
глиоксисом, пероксисом, митохондрий, в цитозоле, клеточной стен-
ке и участвуют в процессах образования клеточной стенки (лигни-
фикации, суберизации, образования полимеров), в защите от пато-
генов, в биосинтезе этилена, в фенольном катаболизме. Пероксидазы
разделяют на катионные, анионные и нейтральные по их изоэлек-
трической точке, определяемой методом изофокусирования. В усло-
виях ОС пероксидаза, наряду с другими компонентами антиокси-
дантной защитной системы, играет важную роль; и определение ее
активности в условиях стресса служит одним из маркеров функцио-
нирования антиоксидантной защитной системы.
Пероксидазы восстанавливают перекись в окислительно-восста-
новительной реакции с использованием различных субстратов: фе-
нолов (пирокатехин, гваякол, гидрохинон), аскорбиновой кислоты,
глутатиона, ароматических кислот, адреналина.
Определение активности свободной, ион- и ковалентносвязан-
ной форм пероксидазы проводят по методу, предложенному Ridge I
и модифицированному Шевяковой с соавт. [11-12]. В качестве суб-
356 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
страта используют гваякол. Этот метод является наиболее воспро-
изводимым, доступным и недорогим. Активность свободной пе-
роксидазы, измеряемая этим методом, считается общей активностью.
Для анализа вклада изоформ в общую активность следует использо-
вать метод изофокусирования, нативного электрофореза.
Протокол анализа
0,1-0,3 г растительного материала растирают в жидком азоте.
Экстракцию растворимых белков проводят 0,066 Μ K/Na-фосфат-
ным буфером, рН 7,4, содержащим 1 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF в
DMSO, 1-3 мг ПВП. После центрифугирования при 10 000 g в тече-
ние 20 мин при 4 °С полученный супернатант содержит фракцию
растворимых белков, в том числе первую фракцию растворимой пе-
роксидазы (ПО).
Для получения второй фракции ПО — ион-связанной — осадок
после первой фракции 2-3 раза промывают 0,066 Μ K/Na-фосфатным
буфером, рН 7,4, с центрифугированием каждый раз при 7000 g
20 мин. К промытому осадку добавляют 1 Μ NaCl, соотношение
ткань: NaCl — 1:1, и пробы оставляют на 30 мин при комнатной темпе-
ратуре. После центрифугирования при 7000 g 20 мин при 4 °С полу-
ченный супернатант содержит фракцию ион-связанной пероксидазы.
Для получения третьей фракции ПО — ковалентносвязанной —
осадок после второй фракции 2-3 раза промывают 0,066 Μ
K/Na-фосфатным буфером, рН 7,4, с центрифугированием каждый
раз при 7 000 g 20 мин. К промытому осадку добавляют 0,1% Triton
Х-100 в 1 Μ NaCl, соотношение ткань: Triton X-100 — 1:1, и пробы
инкубируют 30 мин на качалке при комнатной температуре. После
центрифугирования при 7000 g 20 мин при 4 °С полученный су-
пернатант содержит фракцию ковалентносвязанной ПО.
Реакционная смесь объемом 2 мл содержит 0,066 Μ K/Na-фос-
фатный буфер, рН 7,4; 40 мкл супернатанта и гваякол (7 мМ). Не-
посредственно перед измерением в реакционную смесь добавляют
0,25 мл 0,01 Μ перекиси водорода. Динамику изменения оптичес-
кой плотности регистрируют на спектрофотометре в течение 3 мин
при длине волны 470 нм. Показания снимают каждые 2 с. В качест-
ве контроля используют исходный буфер. Активность пероксидазы
рассчитывают по формуле:
где Δ Emin — среднее изменение оптической плотности за 1 мин;
Voбщ. — общий объем реакционной среды, мл; k — коэффициент мо-
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 357
лярной экстинкции, 5,6 мкМ-1 х см-1; mбелка — масса белка в объеме
препарата, используемого для анализа, мг.
Определение активности каталазы
Каталаза также является гемсодержащим тетрамерным белком,
осуществляющим реакцию разложения перекиси с образованием
молекулярного кислорода и воды. Филогенетические исследования
показали, что растительные каталазы можно разделить на три боль-
ших класса. К классу I принадлежат ферменты, обнаруженные как
у однодольных, так и у двудольных растений. Ферменты этого клас-
са вовлечены в детоксикацию перекиси, образующейся в пероксисо-
мах и глиоксисомах в условиях нормальной жизнедеятельности
растений. Каталазы класса II чаще встречаются среди двудольных
растений и играют заметную роль при адаптации к стрессовым усло-
виям. Класс III специфичен для однодольных [3]. Определение ак-
тивности каталазы проводили по методу Vitoria et al. [13].
Протокол анализа
Растительный материал (0,1-0,3 г) гомогенизируют в фарфоровой
ступке с жидким азотом. Экстракцию растворимых белков проводят
0,05 Μ K/Na-фосфатным буфером, рН 7,8, содержащим 1 мМ DTT,
0,5 мМ PMSF в DMSO, 1-3 мг ПВП. Суспензию центрифугируют при
10 000 g в течение 20 мин при 4 °С.
Реакционная смесь объемом 2 мл содержит 0,05 Μ K/Na-фос-
фатный буфер, рН 7,8; 50 мкл супернатанта. Непосредственно перед
измерением в реакционную смесь добавляют 0,1 мл 0,1 Μ перекиси
водорода. Динамику изменения оптической плотности регистриру-
ют на спектрофотометре в течение 3 мин при длине волны 240 нм.
Показания снимают каждые 2 с. В качестве контроля используют
исходный буфер.
Расчет активности каталазы проведен с помощью калибровоч-
ной кривой, построенной по известным концентрациям H2O2:
1000 x ΔEmin хVобщ.
A=
k x m
белка
где А — количество вещества израсходованной H2O2 в минуту 1 мг
белка препарата; ΔEmin — среднее изменение оптической плотности
за 1 мин; Vo6щ — общий объем реакционной среды, мл; k — коэффи-
циент молярной экстинкции, 32,57; тбелка — масса белка в объеме
препарата, используемого для анализа, мг.
358
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Определение активности аскорбатпероксидазы
Аскорбатпероксидаза — это один из важнейших ферментов, поддер-
живающих уровень восстановленных соединений в аскорбат-глута-
тионовом цикле. Соотношение восстановленного и окисленного глу-
татиона является показателем редокс-баланса в клетке, степени раз-
вития ОС; уровень активности аскорбатпероксидазы у растений в
нормальных и стрессорных условиях демонстрирует эффективность
защитного ответа.
Активность аскорбатпероксидазы определяют по методу Nakano
and Asada [14] по уменьшению количества содержания аскорбата
при 290 нм (аскорбат окисляется в этой реакции).
Протокол анализа
0,5 г растительного материала растирается с 1 мл охлажденного
0,1 Μ фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 1 мМ DTT, 0,5 мМ
PMSF в DMSO в охлажденной ступке. Суспензию центрифугируют
при 10 000 g в течение 20 мин при 4 °С. Реакционная смесь (3 мл) со-
держит: 50 мМ фосфатный буфер (рН 7,0), 0,5 мМ аскорбиновую
кислоту, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ H2O2 и 0,05-0,1 мл ферментного пре-
парата (растительного экстракта). Реакция начинается добавлени-
ем перекиси водорода, изменение оптической плотности измеряется
при 290 нм в течение 3 мин. Активность фермента рассчитывают по
формуле:
где А — активность фермента, ммоль/мг белка; ΔEmin — среднее из-
менение оптической плотности за 1 мин; VH — объем образца, мкл;
Vбуф. — объем буфера, мл; VН2O2 — объем перекиси водорода, мл; k —
коэффициент молярной экстинкции 2,8 нмоль/см; тбелка — масса
белка в объеме образца, мг.
Метод проведения нативного электрофореза
супероксиддисмутазы и пероксидаз
Поскольку определение активности СОД или ПО служит интеграль-
ным показателем, для анализа вклада изоформ СОД и ПО в функцио-
нирование защитного ответа необходимо проводить изоферментный
анализ методом нативного фореза или Вестерн-блот-гибридизации,
а также изофокусирования (для ПО). Метод Вестерн-блот-гибриди-
зации требует дорогостоящих антител (лучше моноклональных) и
не всегда доступен, особенно для изоформ ПО. В связи с этим метод
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 359
нативного электрофореза может быть в какой-то степени альтерна-
тивным. Он позволяет проанализировать вклад изоформ у растений
различных видов или установить различия в спектре изоформ меж-
ду устойчивым и чувствительным сортами. Дополнительная инфор-
мация может быть получена с применением изофокусирования и
Вестерн-блот гибридизации.
Электрофорез белковой фракции (ферментные препараты СОД и
ПО) в неденатурирующих условиях проводят в полиакриламидном
геле по стандартной методике [15] на приборе Bio-Rad «Mini protein
3», США. Состав геля указан в табл. 4.5.1.
Таблица 4.5.1. Приготовление геля
Реактивы
Разделяющий Концентрирующий
гель 12% (нижний) гель 5% (верхний)
H2O
1,5 МТрис-HCI, рН8,8
Акриламид, 30%
0,1 МЭДТА
Персульфат аммония, 10%
ТЕМЕД
0,25 МТрис-HCI, рН6,8
3,3 мл
2,5 мл
4 мл
200 мкл
100 мкл
4 мкл
—
3,1 мл
—
1,7 мл
200 мкл
40 мкл
10 мкл
5 мл
После полимеризации геля в лунки наносят по 15 мкл фермент-
ного препарата, смешанного с 10 мкл утяжеляющего раствора
(1,25 мл 0,5 Μ Трис-HCl рН 6,8; 0,2 мл 0,5% бромфенолового сине-
го; 3 мл глицерина; 5,5 мл воды). Образцы выравнивают по концен-
трации белка по методу Бредфорд (Bradford Μ. Μ., 1976). 50 мкл
ферментного препарата смешивают с 0,5 мл реактива Брэдфорда
(10 мг Кумасси R-250, 5 мл 95% этанола, 10 мл 85% H3PO4 доводят
дистиллированной водой до 100 мл) и 2,5 мл разбавителя (5 мл 95%
этанола, 10 мл 85% H3PO4 доводят дистиллированной водой до
100 мл). Измерение оптической плотности проводят при 595 нм. В
контрольный образец вместо ферментного препарата добавляют та-
кой же объем воды. Концентрацию белка рассчитывают, используя
калибровочную кривую, построенную по БСА. Электрофорез прово-
дят при +4 °С при силе тока, равной 0,01 А в концентрирующем геле
и 0,03 А в разделяющем геле. Средняя продолжительность электро-
фореза составляет 3-4 ч (до тех пор, пока бромфеноловый синий не
выйдет из геля). Для проведения электрофореза используют элек-
360
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
тродный буфер по Laemmli (0,025 Μ Трис- НС1; 0,192 Μ глицин;
рН 8,4).
После завершения электрофореза гель снимают со стекол и за-
ливают окрашивающим раствором. Для визуализации активности
СОД гель в чашке Петри заливают 50 мМ Трис-HCl буфером рН 7,8 с
добавлением 30 мкм рибофлавина и 245 мкм нитросинего тетразо-
лия. В течение 30 минут гель инкубируют в темноте на качалке, пос-
ле чего сливают окрашивающий раствор, гель промывают несколь-
ко раз дистиллированной водой и переносят на свет, где он приобре-
тает фиолетовую окраску, а его полосы с изоформами СОД остаются
прозрачными [16].
Для определения активности пероксидазы гель в чашке Петри
заливают K/Na-фосфатный буфером, рН 7,4 с добавлением 2 мМ
раствора бензидина в DMSO и 3 мМ раствора перекиси водорода.
Гель оставляют на 30 мин на качалке. Активность пероксидазы
определяют по интенсивности окрашивания полос [12,17].
Проведение ингибиторного анализа
для идентификации изоформ СОД
Для определения типа изоформ СОД проводят ингибиторный ана-
лиз. Перед окрашиванием геля его выдерживают в течение 30 мин в
растворе 3 мМ KCN или 5 мМ H2O2. Далее окрашивание геля прово-
дят по методике, описанной выше [16].
Определение содержания низкомолекулярных
антиоксидантов
Определение эндогенного содержания пролина
Для растений пролин является широко распространенным метабо-
литом, обладающим протекторными свойствами. Аккумуляция про-
лина показана в растениях, подвергшихся засолению, засухе, дей-
ствию тяжелых металлов, УФ-облучению. Пролин обладает не только
осмопротекторными, но и антиоксидантными свойствами. Сравни-
тельный анализ содержания пролина у растений в нормальных и
стрессовых условиях вместе с активностью антиоксидантных фер-
ментов служит показателем эффективности защитного ответа.
Один из самых старых, но до настоящего времени используемый
метод определения содержания пролина — это реакция с нингидри-
ном в кислой среде с образованием окрашенного в красный цвет про-
дукта. Несмотря на столь почтенный «возраст» (более 50 лет), этот ме-
тод является простым, быстрым, дешевым и легковоспроизводимым.
Далее изложены экстракция и определение содержания свобод-
ного пролина по методу Bates [18].
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 361
Протокол анализа
Навеску растительного материала массой 100 мг растирают в жид-
ком азоте. Растертый материал переносят в химический стакан и за-
ливают 4 мл дистиллированной воды. Стакан с навеской трехкратно
доводят до кипения и охлаждают. Образовавшуюся вытяжку фи-
льтруют в мерные пробирки. Полученный экстракт доводят до нуж-
ного объема (6-7 мл) и в дальнейшем используют для анализа. Про-
бирки с 1 мл экстракта, 1 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл ни-
нгидринового реактива (1,25 г нингидрина, 20 мл 6 Μ H3PO4, 30 мл
ледяной уксусной кислоты) инкубируют в течение 1 ч на кипящей
водяной бане. В контрольный образец вместо экстракта добавляют
1 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность полученных
окрашенных растворов измеряют на спектрофотометре против кон-
троля при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывают
с использованием калибровочной кривой по формуле:
Exk xV
Сx = общ.
VH x m
где Сх — концентрация пролина, мкмоль/г сырой массы; Ε — опти-
ческая плотность раствора; k — коэффициент, рассчитанный по ка-
либровочной кривой; Vобщ — общий объем экстракта, мл; VH — объ-
ем экстракта взятый для анализа, мл; m — масса навески, г.
Недостатком данного метода является возможность образова-
ния в минорных количествах нингидриновых производных других
аминокислот в этих условиях, что приводит к некоторому завыше-
нию полученных значений. Определение свободного пролина в рас-
тительных тканях можно проводить и на аминокислотном анализа-
торе. Во всех случаях пролин, как и другие аминокислоты опреде-
ляется в качестве нингидриновых производных. Проведенное нами
сравнение значений для содержания пролина, полученных этим ме-
тодом и с помощью аминокислотного анализатора, позволяет утвер-
ждать, что различия не влияют на обнаруживаемую тенденцию. Наи-
более точный метод определения содержания пролина и других ами-
нокислот — это метод флуоресцентных производных. Однако он
требует прибора для высокоэффективной жидкостной хроматографии
с флуоресцентным детектором. Этот дорогостоящий прибор досту-
пен далеко не каждому институту. Кроме того, и сами флуоресцен-
тные реактивы являются достаточно дорогими расходными матери-
алами.
Благодаря использованию хроматографической колонки проис-
ходит разделение индивидуальных аминокислот, что повышает
точность определения. В последнее десятилетие стал находить ши-
362
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
рокое применение метод высокоэффективной жидкостной хрома-
тографии низкомолекулярных соединений. Однако стоимость та-
кого оборудования высока. Кроме того, более высокая разрепгающая
способность метода высокоэффективной жидкостной хроматогра-
фии требует очень тщательной подготовки образцов для анализа,
поскольку растительный экстракт содержит большое количество
низкомолекулярных соединений, близких по химической структу-
ре, что снижает точность определения и удлиняет время анализа.
Поэтому даже в иностранных публикациях указывается на исполь-
зование старого метода Bates.
Определение активности пролиндегидрогеназы
Содержание пролина в растениях находится под строгой регуляци-
ей, включающей функционирование как ферментов его синтеза, так
и распада. В последнее время показано, что процесс деградации про-
лина является одним из компонентов защитного ответа растения.
Пролиндегидрогеназа (ПДГ) — ключевой фермент деградации про-
лина, локализованный в митохондриях. В результате реакции дегра-
дации пролина ПДГ образуется пирролин-5-карбоксилат и супер-
оксидрадикал. Образующийся супероксидрадикал может быть при-
чиной вторичного ОС. В связи с этим определение активности ПДГ
является важным показателем при изучении ОС у растений. Актив-
ность ПДГ оценивают по скорости использования НАД+ на окисление
пролина, измеряя увеличение концентрации образующегося НАДН в
единицу времени с помощью метода, предложенного Mattioni et al.
[19]. Активность выражают в мкмоль НАД+, восстановленного в те-
чение 1 мин в расчете на 1 мг белка растительного материала.
Протокол анализа
Растительный материал (100 мг) растирают в предварительно охлаж-
денной ступке с ПВП и экстракционным буфером (250-300 мМ).
Центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Супернатант ис-
пользуют для определения активности фермента. Состав экстракци-
онного буфера: 0,05 Μ Трис-HCl, рН=7,8; 1 мМ ЭДТА; 0,5% (ν/ν)
Triton Х-100.
Реакционная смесь объемом 2 мл содержит карбонатный буфер
0,1 М, рН 10,3; 100-200 мкл супернатанта, 0,02 Μ L-пролина. Не-
посредственно перед измерением в реакционную смесь добавляют
100 мМ НАД. Динамику изменения оптической плотности регис-
трируют на спектрофотометре в течение 2 мин при длине волны
340 нм. Показания снимают каждые 2 с. В качестве контроля ис-
пользуют исходный буфер. Активность ПДГ рассчитывают по фор-
муле:
Раздел 4.5. Методы оценки содержания активных форм кислорода... 363
где А — активность фермента, мкмоль НАД/мг белка*мин; ΔEmin —
среднее изменение оптической плотности за 1 минуту; Vo6щ. — об-
щий объем реакционной среды, мл; k — коэффициент молярной
экстинкции, 6,22 мкмоль-1 x см-1; тбелка — масса белка в объеме об-
разца, мг.
Для поддержания достаточно высокого уровня восстановленных
глутатиона и аскорбиновой кислоты действуют ферменты аскор-
бат-глутатионового цикла. Соотношение восстановленного и окис-
ленного глутатиона является важным показателем развития ОС в
растительной клетке.
Определение содержания восстановленного глутатиона
Как указывалось выше, содержание восстановленного глутатиона
является показателем редокс-баланса растительной клетки и степени
развития ОС. Определение его содержания, так же как и все вышепе-
речисленные параметры, позволяет охарактеризовать степень устой-
чивости растения.
Для определения количества восстановленного глутатиона ис-
пользуется реагент Эллмана [20].
Протокол анализа
Растительная ткань (1 г) гомогенизируется в 5 мл 100 мМ Na-фос-
фатного буфера (рН 7,4), центрифугируется при 20 000 g 15 мин при
4 °С. К супернатанту добавляют 5% трихлоруксусную кислоту, цен-
трифугируют при 20 000 g 15 мин при 4 °С. Реакционная смесь со-
держит 0,2 Μ фосфатный буфер (рН 8,0), 5% трихлоруксусную кис-
лоту и реактив Эллмана, аликвоту растительного экстракта (общий
объем 2 мл). Реактив Эллмана содержит: 19,8 мг 5-5'-дитио-бис-
(2-нитробензойной кислоты) в 100 мл 0,1% цитрата натрия. Оптичес-
кую плотность полученного желтого раствора измеряют при 412 нм.
Количество восстановленного глутатиона рассчитывают, используя
стандартную кривую (коммерческий препарат восстановленного
глутатиона).
Литература
1. Jithesh Μ. Ν., Prashanth S. R., Sivaprakash K. R., Parida A.K.
Antioxidative response mechanisms in halophytes: their role in
stress defense // Journal of Genetics. 2006. V. 85.P. 237-254.
364
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
2. Halliwell В. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a
fundamental theme of aerobic life // Plant Physiol. 2006. V. 141.
P. 312-322.
3. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. V. Antioxidants, oxidative
damage and oxygen deprivation stress: a review // Annals of Botany.
2003. V. 91. P.179-194.
4. Heath R. L., Packer L. Photoperoxidation in isolated cloroplasts.
Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Archives
of Biochem. and Biophys. 1968. V. 125. P. 189-198.
5. Brennan Т., Frenkel C. Involvement of hydrogen peroxide in the
regulation of senescence in pear // Plant Physiol. 1997. V. 59.
P. 411-416.
6. Okuda Т., Matsuda Yu.y Yamanaka Α., Sagisaka Sh. Abrupt
increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter
wheat is caused by cold treatment // Plant Physiol. 1991. V. 97.
P. 1265-1267.
7. Beckett R. P., Minibayeva F. V., Luthje S., Bottger M. Reactive
oxygen species metabolism in desiccation-stressed thalli of liverwort
Dumortiera // Physiol. Plantarum. 2004. V. 122. P. 3-10.
8. Kliebenstein D. J., Monde R.A., Last R. L. Superoxide dismutase in
Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation
and protein localization // Plant Physiology. 1998. V. 118.
P. 637-650.
9. Бараненко В. В. Супероксиддисмутаза в клетках растений //
Цитология. 2006. Т. 48. С. 465-474 .
10. Beauchamp Ch., Fridovich I. Superoxide dismutase improved
assays and an assay applicable to acrylamide gels // Analytical
Biochemistry. 1971. V. 44. P. 276-287.
11. Шевякова Η. И., Стеценко Л. Α., Мещеряков А. Б., Кузне-
цов Вл. В. Изменение активности пероксидазной системы в про-
цессе стресс-индуцируемого формирования САМ // Физиология
растений. 2002. Т. 49. С. 670-677.
12. Ridge /., Osborne D. J. Role of peroxidase when hydroxyproline-rich
protein in plant cell wall is increased by ethylene // Nature. New biol.
1971. V. 229. P. 205-208.
13. Vitoria A. P., Lea P. J., Azevedo R. A. Antioxidant enzymes
responses to cadmium in radish tissues // Phytochemistry. 2001.
V. 57. P. 701-710.
14. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavendged by
ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts // Plant Cell
Physiol. 1981. V. 22. P. 867-880.
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 365
15. Laemmli U. К. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227.
P. 680-685.
16. Miszalski Z., Slesak E., Niewiadomska R., Baczek-Kwinta R.y
Luttge U., Ratajczak R. Subcellular localization and stress responses
of superoxide dismutase isoforms from leaves in the C3 — CAM
intermediate halophyte Mesembryanthemum crystallinum L. //
Plant, Cell and Envir. 1998. V. 21. P. 169-179.
17. Rao V. M., Paliyath G., Ormrod P. D. Ultraviolet-B- and
ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of
Arabidopsis thaliana//Plant Physiology. 1996. V. 110. P. 125-136.
18. Bates L. S., Waldren R. P., Teare I. D. Rapid determination of free
proline for water stress studies // Plant Soil. 1973. V. 39.
P. 205-207.
19. Mattioni C, Lacerenza N. G., Troccoli Α., De Leonardis A.M.,
Di Fonzo N. Water and salt stress-induced alterations in proline
metabolism of Triticum durum L. seedling // Plant.Physiol. 1997.
V. 101. P. 787-792.
20. Ellman G. L. Tissue sulhydryl groups // Arch.Biochem.Biophys.
1959. V. 82. P. 70-77.
4.6. АНАЛИЗ
ГОРМОН-РЕЦЕПТОРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
РАДИОЛИГАНДНЫМ МЕТОДОМ
С. Н. Ломин
Введение
Первым этапом восприятия гормонального сигнала клеткой являет-
ся его рецепция специальными белками-рецепторами. Рецептор [R]
состоит из функциональных частей (доменов), из которых особую
значимость имеет лиганд-связывающий домен, а также эффектор-
ный домен, ответственный за включение/выключение сигнальной
трансдукции. Ассоциация гормона с лиганд-связывающим доменом
приводит к изменению конформации и функционального состояния
эффекторного участка. От режима работы рецептора во многом за-
висит характер передачи сигнала и, соответственно, клеточный от-
вет. Рецепторы могут как находиться внутри клетки, так и ассоции-
роваться с плазмалеммой. Отличительной чертой рецептора являет-
ся его способность избирательно связывать конкретные химические
лиганды, в том числе гормоны. В отличие, например, от белков ме-
таболизма рецептор связывает гормон с высоким сродством, прак-
366
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
тически всегда обратимо, не производя его химического изменения.
Сродство гормона к рецептору характеризуется равновесной кон-
стантой диссоциации (ΚD). По сравнению с другими гормон-связы-
вающими белками рецепторы обладают наивысшим сродством к
своим лигандам, диапазон ΚD от 10-7 до 10-12 Μ [1]. Еще одной важ-
ной характеристикой рецептора является его лигандная специфич-
ность. Параметры гормон-рецепторного взаимодействия могут быть
определены количественно с помощью широко используемого ради-
олигандного метода. Также возможно на физико-химическом уров-
не исследовать механизм взаимодействия гормона с рецептором.
Принцип метода
Метод основан на использовании радиоактивно-меченного гормона,
что позволяет следить за количеством лиганд-рецепторных комп-
лексов [LR] по количеству связанной метки. Зная количество поме-
щенного в пробу меченого гормона, можно, если потребуется, без
труда рассчитать и концентрацию свободного лиганда [L]. Незави-
симо от системы вычислений, для корректного определения равно-
весных характеристик гормон-рецепторного взаимодействия необ-
ходимо выполнение ряда условий:
1) концентрация лиганда во много раз больше концентрации ре-
цепторов;
2) стабильное равновесие в пробах, где концентрация всех компо-
нентов (связанного и свободного лиганда и рецептора) остается
неизменной;
3) одинаковая доступность всех рецепторов для лиганда.
Экспериментальная практика показывает, что в опытах по свя-
зыванию меченые гормоны самой разной структуры связываются не
только с рецепторами (специфическое связывание), но, с некоторой
вероятностью, и с другими компонентами системы: белками, мем-
бранами, фрагментами клеток, другими высокополимерными суб-
станциями, стенками пробирок (так называемое неспецифическое
связывание). В реальных условиях количественно оценить вклад
неспецифического связывания возможно, если смешать радиоак-
тивный гормон с большим избытком (100-10 000-кратным) его не-
меченого аналога. Так как количество высокоаффинных рецептор-
ных сайтов сравнительно мало, избыток немеченого гормона вытеснит
практически весь меченый гормон из этих сайтов. С другой сторо-
ны, количество неспецифических сайтов очень велико, и добавлен-
ный в указанных пределах избыток немеченого гормона практичес-
ки не скажется на величине неспецифического связывания меченого
лиганда. Поэтому экспериментальные пробы, где к меченому гормо-
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 367
ну добавлен большой избыток того же, но немеченого гормона, бу-
дут измерять уровень именно неспецифического связывания. Чтобы
определить величину специфического связывания (Bs), достаточно
вычесть из общего связывания (Т) неспецифическое (NS):
BS = T - NS. (1)
На практике для большей точности определения параметров
гормон-рецепторного взаимодействия надо стараться минимизиро-
вать неспецифическое связывание. Желательно, чтобы его уровень
не превышал 20-30% от тотального.
Для расчета характеристик взаимодействия гормон-рецептор
необходимо знание концентрации в пробе лиганд-рецепторных ком-
плексов [LR] и соотношения концентраций LR и свободного лиганда
L ([LR]/[L]).
Оборудование, материалы и реактивы
В радиолигандных исследованиях используют лиганды, которые,
как правило, мечены тритием или 125I и должны удовлетворять
ряду требований, в частности они должны обладать:
1) высокой удельной радиоактивностью, желательно не ниже
750 ГБк/ммоль или 20 Ки/ммоль;
2) высоким сродством к рецептору, с константой диссоциации на
уровне нМ или ниже;
3) высокой специфичностью связывания в отношении изучаемого
рецептора;
4) высокой степенью чистоты (особенно радиохимической), при-
чем метка не должна диссоциировать от лиганда в ходе экспери-
мента.
Следующим необходимым компонентом является препарат ре-
цептора, полученный тем или иным путем в зависимости от харак-
тера и задач исследования. Чаще всего рецепторный препарат пред-
ставляет собой суспензию в подходящем для исследования буферном
растворе. В большинстве случаев в ходе эксперимента поддержива-
ется определенная температура, что предполагает использование
термостатов или, при условии проведения эксперимента при 4 °С,
ледяной бани. Для разделения связанного и несвязанного гормонов
требуются специальные устройства: центрифуги, если разделение
осуществляется центрифугированием, специальные фильтры и ва-
куумные установки в случае разделения фильтрованием. В случае
диализа используется диализная камера. Для отбора супернатанта
используется вакуумный насос. Гормон из осадка лучше элюиро-
368
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
вать. В случае транс-зеатина и ряда других гормонов подходящим
элюентом является 96% этанол. Для измерения радиоактивности
препаратов чаще всего используют сцинтилляционные счетчики.
При этом элюат помещается во флакон для радиоактивного счета и
смешивается со сцинтилляционной жидкостью, в которой должен
равномерно распределиться для оптимального счета. В случае эта-
нольного элюата радиоактивности в качестве сцинтиллятора можно
использовать ЖС-8 («Реахим») или ACS2 («Amerscham») на основе
диоксана. Фильтры с радиоактивностью можно просчитывать как в
диоксановом, так и в толуольном сцинцилляторах.
Ход определения
Типичный радиолигандный эксперимент состоит из 4 основных ста-
дий:
I. Инкубация образца с радиоактивным лигандом до достижения
равновесия.
П. Разделение свободной и связанной радиоактивности.
III. Измерение количества связанной радиоактивности.
IV. Математический, графический или компьютерный анализ ре-
зультатов.
Стадия I. Инкубация образца с радиоактивным лигандом до
достижения равновесия. Растворимые ядерно-цитоплазматические
рецепторы в составе цитозоля или очищенные инкубируют с гормоном
в составе гомогенного раствора. Для мембранных требуется предва-
рительное выделение соответствующих мембран. Далее с гормоном
инкубируют суспензию выделенных мембран. Иногда для анализа
берут живые объекты, например интактные клетки или срезы
тканей. В случае использования живого материала иногда бывает
сложно добиться гомогенности системы и исключить метаболизм
и транспорт лиганда, рецептора или гормон-рецепторного комплек-
са. К тому же корректному анализу могут мешать эндогенные гор-
моны. Решением проблемы может стать экспрессия гена исследуе-
мого рецептора в организме, заведомо не имеющем ни рецепторов,
ни систем транспорта и метаболизма изучаемого гормона [2, 3].
Чаще всего для этого используют Е. coli и дрожжи. В большинстве
случаев рецептор сохраняет при этом свою функциональную актив-
ность. Кроме того, в этом случае можно изучать свойства индивиду-
альных рецепторов и нарабатывать их в количестве, достаточном
для количественного анализа (см. раздел 4.7).
После идентификации наличия сайтов специфического связы-
вания необходимо определить время наступления равновесия в сис-
теме, когда процесс выходит на безусловное плато. При изучении
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 369
дозовой зависимости важно, чтобы уровень максимального связы-
вания радиоактивности лежал в пределах от 1000 до 10 000 распа-
дов в мин (dpm). Меньшие значения не обеспечивают точность изме-
рений, а большие приводят к перерасходу меченого гормона и пре-
парата рецептора. Достоверное определение параметров связывания
требует испытания не менее 5-7 различных концентраций гормона.
Для каждой концентрации рекомендуется ставить 4 параллели: 2
для тотального и 2 для неспецифического связывания. В связи с
тем что неспецифическое связывание имеет линейную зависимость
от концентрации метки, можно сократить количество неспецифи-
ческих проб до 3-4. Одна из концентраций должна быть близка к
ΚD. Достаточно, чтобы крайние концентрации меченого лиганда от-
личались от ΚD на 1-1,5 порядка. Чувствительность метода возрас-
тает с (а) уменьшением ошибки определения радиоактивности;
(б) уменьшением величины [L*]/KD, следовательно, лучше прово-
дить исследования при низкой концентрации меченого лиганда;
(в) уменьшением уровня неспецифического связывания; (г) увели-
чением объема реакционной смеси, что ограничивает постановку
эксперимента в микрообъемах. Также важно проводить экспери-
мент в оптимальных для связывания гормона условиях.
Стадия II. Разделение свободной и связанной радиоактивностей.
Количественное определение связанного гормона является важней-
шей частью эксперимента. Это определение можно проводить с по-
мощью как равновесного диализа, так и физического разделения
связанного и свободного гормона. Физическое разделение, как пра-
вило, более доступно. Чаще всего его осуществляют с помощью цен-
трифугирования или фильтрации. Суспензию микросом и клеток
можно осадить быстрым центрифугированием. Растворимые рецеп-
торы могут быть осаждены с раствором сульфата аммония высокой
концентрации. Альтернативно несвязанный гормон может быть ад-
сорбирован суспензией активированного угля. В этом случае гор-
мон-рецепторный комплекс остается в супернатанте после центри-
фугирования. Также гормон-рецепторные комплексы могут быть
задержаны на специальных фильтрах (например, с помощью ваку-
умной установки). Разумеется, такие фильтры не должны сами свя-
зывать гормон. В случае модификации рецептора присоединением к
нему короткого полипептида, распознаваемого специальным сор-
бентом или антителом, гормон-рецепторный комплекс можно иммо-
билизовать с помощью аффинного матрикса или антител.
Стадия III. Измерение количества связанной радиоактивности.
Измерение радиоактивности связанного гормона проводят с по-
мощью сцинтилляционного счетчика при добавлении соответствую-
щей образцу сцинтилляционной жидкости, или, в случае 125I, ис-
370
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
пользуют гамма-счетчик. Эффективность счета трития во много раз
выше в гомогенном сцинтилляционном растворе, чем при анализе
нерастворимых осадков. В этой связи рекомендуется экстрагиро-
вать радиоактивный гормон из осадков каким-либо элюентом, хоро-
шо растворимым в сцинтилляционной жидкости и мало влияющим
на эффективность счета (например, этанолом). Также могут приме-
няться солюбилизаторы осадков. Для достижения большей точнос-
ти необходимо подбирать длительность счета в зависимости от сред-
него уровня радиоактивности проб и соотношения радиоактивности
в пробе и фоновой радиоактивности сцинтилляционной жидкости.
В связи с тем что важнейшие параметры гормон-рецепторного взаи-
модействия (Κd, [RT]) выражаются в единицах концентраций, же-
лательно получать результаты в единицах dpm (распады в мин).
Зная удельную радиоактивность лиганда, результаты легко пере-
считать в единицы концентрации. В случае счета в единицах cpm
(импульсы в мин) необходимо определить эффективность счета в
данных конкретных условиях.
Стадия IV. Интерпретация результатов. Описываемый подход
основывается на физико-химическом представлении о лиганд-ре-
цепторном взаимодействии. В 1926 г. Кларк предложил описывать
его как обратимую реакцию:
L + R < k-1 > LR,
где L — лиганд; R — рецептор; LR — комплекс лиганда с рецепто-
ром, a k+1 и k-1 — константы скоростей ассоциации и диссоциации
лиганд-рецепторных комплексов. В условиях равновесия по закону
действующих масс равновесная константа диссоциации (ΚD) для
этой системы определяется как:
КА k+1 [LR]
Исходя из простых уравнений (2) и (3), можно построить теоре-
тические кривые дозовой зависимости связывания гормона с рецеп-
тором. В условиях равновесия в присутствии постоянной концен-
трации рецептора связывание гормона в линейных координатах
описывается гиперболической функцией с асимптотой, определяе-
мой общим количеством рецептора (рис. 4.6.1. А). Сколько бы мы ни
прибавляли гормона к фиксированному пулу рецептора, специфи-
ческое связывание гормона будет ограничено числом имеющихся
гормон-связывающих сайтов (RT). Чаще всего на одну молекулу ре-
цепторного белка приходится один гормон-связывающий участок,
поэтому положение асимптоты связывания обычно показывает об-
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 371
Рис. 4.6.1. Способы представления результатов анализа связывания гор-
мона (лиганда) с рецептором. (А) Концентрационная зависимость образо-
вания гормон-рецепторных комплексов в простых линейных координатах.
(Б) Обработка результатов в координатах Скэтчарда [12]. Концентра-
ция лиганд-рецепторных комплексов [LR] зависит от КD: для кривых 1, 2
и 3 КD равны соответственно 0,1, 1 и 10 нМ. Концентрация сайтов связы-
вания лиганда принята за 1 пМ. [LT] — общая концентрация лиганда (гор-
щее количество рецепторов в пробе. Задачу точного определения
основных характеристик гормон-рецепторных взаимодействий на
основе дозовых зависимостей связывания гормона теоретически ре-
шил в 1949 г. Дж. Скэтчард (Scatchard, 1949). На основе простых
преобразований уравнения (3) Скэтчард вывел следующее уравне-
ние:
(4)
Уравнение (4) является линейным типа у = ах + b, если за «y»
принять соотношение [LR] / [L], а за «х» — [LR\. Зависимость в этих
координатах (обычно называемых координатами Скэтчарда) имеет
вид прямой с тангенсом угла наклона, равным -1/Κd, а место пере-
сечения этой прямой с осью абсцисс соответствует общей концентра-
ции рецепторов (занятых + свободных) [RT] (рис. 4.6.1.Б). Скэтчар-
довские координаты до сих пор широко используются для расчета
параметров связывания и представления результатов эксперимен-
тов, хотя для той же цели в настоящее время имеется больпюе число
специализированных компьютерных программ.
Тест-система может содержать два лиганда, один из которых ме-
ченый, а второй — нет. Если эти лиганды конкурируют за один и тот
же сайт связывания и количество лигандов больше, чем рецепторов,
то в присутствии второго лиганда уровень связывания меченого ли-
ганда будет ниже, так как второй лиганд замещает первый в комплек-
се с рецептором. Можно охарактеризовать дозовую зависимость
372
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
вытеснения метки, если провести эксперимент по связыванию при
фиксированной концентрации первого лиганда в присутствии раз-
личных концентраций немеченого лиганда. Очевидно, что чем боль-
ше сродство к рецепторам немеченого лиганда (гормона), тем при
более низких его концентрациях будет наблюдаться вытеснение.
Следовательно, кривые вытеснения для более аффинных лигандов
будут смещены в область меньших концентраций конкурента по
сравнению с аналогичными кривыми для низкоаффинных лигандов
(рис. 4.6.2.А). Эксперименты этого типа называются конкурентны-
ми и позволяют оценивать сродство к рецепторам различных неме-
ченых лигандов по концентрационной зависимости вытеснения ими
меченого гормона. Для количественной оценки сродства проводят
Рис. 4.6.2. (А) Кривые вытеснения фиксированной концентрации мече-
ного гормона различными концентрациями немеченых гормонов, разли-
чающихся по сродству к рецептору. Величины КD для кривых 1-3 соответ-
ствуют 0,1, 1 и 10 нМ. Концентрация лиганд-связывающих сайтов —
0,01 пМ, концентрация меченого гормона 0,1 нМ. (Б) Концентрационная
зависимость связывания меченного тритием транс-зеатина рецептором
цитокининов АНК4, представленная в двойных обратных координатах.
1 — в отсутствие, и 2 — в присутствии 26 нМ тидиазурона. (В) Данные по
связыванию меченного тритием транс-зеатина рецептором цитокининов
АНК4 в координатах Хилла. [L*R] — концентрация связанного рецепто-
ром меченого гормона; [L] — концентрация немеченого гормона, [Rt] —
концентрация гормон-связывающих сайтов, [L*T] — общая концентра-
ция гормона. Мелким пунктиром обозначены 1С 50
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 373
анализ кривых вытеснения меченого лиганда немечеными. На осно-
ве этих кривых определяют концентрацию немеченого гормона, при
которой вытесняется ровно половина меченого гормона (IС50). Кон-
центрацию радиоактивного лиганда подбирают таким образом, что-
бы она примерно соответствовала или была меньше его ΚD с рецепто-
ром, но при этом обеспечивала достоверный счет метки. В конкурент-
ных опытах обязательно включают пробы для неспецифического
связывания, чтобы отсечь фон связанной радиоактивности, не отно-
сящийся к взаимодействию с рецептором. Все операции экспери-
мента (инкубация до достижения равновесия, разделение связанного
и свободного гормонов, счет радиоактивности связанного гормона)
проводят так же, как в опытах по насыщению. Константа ингибиро-
вания ΚI немеченого лиганда, соответствующая его ΚD взаимодей-
ствия с рецептором, определяется по формуле [5]:
ТС
Κ1=ΚD= 50 . (5)
1 + [L*]0
*
Здесь [L*]0 и ΚD* характеризуют соответственно фиксированную
концентрацию меченого лиганда и его сродство к рецептору. Если
[L*]0 много меньше ΚD*, то ΚI становится примерно равной IС50 и
часто называется кажущейся константой ингибирования или дис-
социации (от англ. apparent binding constant). Если [L*]0 в точности
равен ΚD*, то КI равна половине значения IС50. Для корректности
расчетов КI по формуле (5) важно, чтобы конкурентный анализ про-
водили в тех же условиях (состав среды, температура, время), в ка-
ких была определена ΚD*. Эту ΚD* можно вычислить непосредствен-
но по кривой вытеснения меченого гормона немеченым гомологом.
Для этого анализ связывания проводят в координатах Скэтчарда.
Значения LR/L по оси ординат определяют исходя из соотношений
для меченого лиганда, за вычетом неспецифического связывания.
Брать в расчет при этом суммарное количество лиганда в инкуба-
ционной смеси необязательно, так как соотношение LR/L по метке
равно соотношению LR/L для общего количества того же лиганда.
Но для значений концентрации связанного лиганда LR (ось абсцисс)
необходимо вычислить именно суммарное его количество, т. е. сумму
меченого и немеченого. Ориентиром служит количество специфичес-
ки связанной метки, которое умножается на коэффициент, равный
соотношению в пробе немеченого гормона к меченому. Условием кор-
ректности расчета констант по соотношению значений IС50 являет-
ся относительно низкий уровень связанной радиоактивности (не бо-
лее 20% в отсутствие конкурента) по отношению к тотальной метке
374
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
[5]. При правильной постановке опыта и адекватных вычислениях,
в координатах Скэтчарда получается прямая с параметрами, близ-
кими к тем, какие могут быть установлены в опытах по насыщению
радиолигандом.
Рассмотренный выше случай наиболее типичен, однако в реаль-
ности разные лиганды могут взаимодействовать с различными участ-
ками рецептора. Поэтому выделяют три возможных типа связыва-
ния пары лигандов [1]:
1) конкурентное связывание, когда оба лиганда связываются с
одним и тем же сайтом на рецепторе;
2) неконкурентное связывание, когда связывание лигандов проис-
ходит с различными сайтами на одном и том же белке;
3) бесконкурентное связывание, когда лиганд второго типа взаи-
модействует не с рецепторами, а с комплексами, образованны-
ми лигандом первого типа с рецептором (наиболее редкий тип).
Чтобы дифференцировать типы связывания разных лигандов и
доказать, например, именно конкурентный характер связывания в
изучаемой тест-системе, проводят равновесные опыты с меченым и
немечеными лигандами. Получают несколько кривых насыщения
для меченого лиганда, одна из которых — обычная кривая насыще-
ния, в остальных случаях опыты ставят аналогично с той лишь раз-
ницей, что в растворе присутствует определенная постоянная кон-
центрация немеченого лиганда. Используемые постоянные концен-
трации должны заметно (на 25-80%), но не полностью вытеснять
меченый лиганд. Связывание анализируют в двойных обратных ко-
ординатах, 1/[LR] и 1/L. В этих координатах зависимость представ-
ляет собой прямую. Принцип анализа описан в [1, 6]. Если прямые,
полученные в экспериментах в присутствии и в отсутствие немече-
ного лиганда, пересекаются на оси ординат, то взаимодействие яв-
ляется конкурентным (рис. 4.6.2.Б). Если прямые не пересекаются
на оси ординат, общее число доступных сайтов для меченого лиган-
да в присутствии немеченого как бы уменьшается, и, следовательно,
связывание конкурентным не является. При этом могут наблюдать-
ся три различных типа поведения прямых. Если связывание являет-
ся неконкурентным, то связывание одного лиганда может все же
влиять на сродство другого к рецептору. Следовательно, если второй
лиганд влияет на аффинность первого, то прямые пересекают ось аб-
сцисс в разных местах, если же нет, то они пересекаются в одной
точке этой оси. В случае бесконкурентного связывания прямые идут
параллельно друг другу. В принципе, в обратных координатах можно
также определять аффинность рецептора и количество сайтов связы-
вания гормона, однако для этих целей они применяются редко в свя-
зи с более высокой ошибкой среднего при расчете обратных величин.
Раздел 4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия 375
Если график Скэтчарда выгибается вниз, это может означать на-
личие двух или более сайтов связывания гормона с различной аф-
финностью на одном рецепторе, либо наличие двух или более рецеп-
торов. Через эту кривую можно теоретически провести несколько
условных асимптот, соответственно количеству различных сайтов
связывания. Если в системе имеются два сайта связывания, то через
кривую в координатах Скэтчарда можно провести две асимптоты.
Тангенс угла наклона асимптоты левой части кривой равен
-1/ΚD1-1/ΚD2, а точка пересечения с осью абсцисс соответствует
[RT1]. Тангенс угла наклона асимптоты правой части кривой соответ-
ствует -1/KD2, а точка пересечения с осью абсцисс соответствует
[RT1]+[RT2]. Однако подобного рода явление может вызываться и
другими причинами. Представим себе, что поливалентный рецеп-
тор последовательно присоединяет лиганды по схеме:
L + R <=> LR; L + LR <=> L2R и т. д.
Начальное связывание лигандов с рецептором может увеличи-
вать (положительная кооперативность) либо снижать (отрицатель-
ная кооперативность) аффинность взаимодействия с ним последую-
щих лигандов. В случае отрицательной кооперативности скэтчар-
довская кривая выгнута вниз (как и в случае наличия двух сайтов
связывания), а в случае положительной кооперативности — вверх.
Возникает проблема дискриминации случаев отрицательной коопе-
ративности и наличия несколько типов связывающих мест. Для это-
го существуют специальные методы анализа. Для выявления и дис-
криминации случаев кооперативного связывания результаты экс-
прериментов по связыванию обрабатывают в координатах Хилла
lg ([LnR] / [RT] - [LnR]), lg[L]. График представляет собой прямую
линию с тангенсом угла наклона (п), отражающим степень кажу-
щейся кооперативности (γ). Значения γ > 1 свидетельствуют о поло-
жительной кооперативности, а γ < 1 — об отрицательной. Если γ ~= 1,
то заметная кооперативность отсутствует (рис. 4.6.2.В). Точка пере-
сечения прямой с осью абсцисс соответствует lgKD. При этэм для
случая двухсайтового связывания прямая образует некоторый пере-
гиб у оси абсцисс. Однозначно доказать наличие нескольких сайтов
с различным сродством можно с помощью преобразования коорди-
нат методом Бьеррума [1, 6, 7].
Оценка метода, возможные проблемы
Описанный метод позволяет количественно исследовать свойства
рецепторов. При этом использование радиоактивно-меченнсго гор-
мона повышает чувствительность метода, а меченый гормон с хими-
376 ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
ческой точки зрения практически идентичен немеченому (природ-
ному). Однако в ходе работы могут возникать некоторые проблемы.
Так, очень важно тщательно разделять связанный и несвязанный
гормоны. Концентрация несвязанного гормона всегда выше связанно-
го, и присутствие примеси несвязанного гормона может существен-
но влиять на результат измерений. Гормон должен иметь достаточно
свободный доступ к рецептору. В противном случае результат может
существенно отличаться от реальности. Так как работа проводится с
радиоактивно-меченным веществом, то возникает проблема защиты
исследователя и окружающей среды от радиоактивного загрязне-
ния. Это требует специальных навыков в работе с такими соедине-
ниями (см. также [8]). В последнее время активно развиваются но-
вые методы изучения взаимодействия макро- и микромолекул, та-
кие как позитронная томография, высокоэффективный анализ с
использованием микрочипов, поверхностный плазмонный резонанс
и др. Надо надеяться, что в ближайшие годы эти методы послужат
хорошим дополнением или более безопасной и удобной заменой
типа эксперимента, представленного в настоящем обзоре. Однако,
как бы ни развивалась техника анализа, описанные здесь на приме-
ре радиолигандного метода закономерности взаимодействия гормо-
на с рецептором сохранят свое значение и в будущих исследованиях.
Литература
1. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический
курс. Μ.: Φ АИР-ПРЕСС, 1999. 716 с.
2. Romanov G. Α., Spichal L., Lomin S. N., Strnad M., Schmulling T.
A live cell hormone-binding assay on transgenic bacteria expressing
a eukaryotic receptor protein // Analytical Biochemistry. 2005.
V. 347. P. 129-134.
3. Romanov G.A., Lomin S. N. Hormone-binding assay using living
bacteria expressing eukaryotic receptors. In Cutler S., Bonetta D.,
eds. Plant Hormones: Methods and Protocols, Second Edition.
Series «Methods in Molecular Biology». Humana Press, USA,
2009. V. 495. Ch. 10. P. 111-120.
4. Cheng Y. C, Prusoff W. H. Relationship between the inhibitor
constant (Kj) and the concentration of inhibitor which causes
50% inhibition of enzymatic reaction // Biochem. Pharmacol.
Med. 1973. V. 22. P. 3099-3108.
5. Blondeau J.P., Rocher P., Robel P. Competitive inhibition of
specific steroid-protein binding: practical ratios for the
derivation of equilibrium inhibition constants // Steroids. 1978.
V. 32. P. 563-575.
Раздел 4.7. Применение трансгенных бактерий
377
6. Ломин С. Н., Романов Г. А. Анализ гормон-рецепторного взаи-
модействия. Теоретические и практические аспекты // Физио-
логия растений. 2008. Т. 55. С. 283-299.
7. Tallarida R. J. Interactions between drugs and occupied
receptors // Pharmacol. Ther. 2007. V. 113. P. 197-209.
8. Hulme E. C, Trevethick M. A. Ligand binding assays at equilibrium:
validation and interpretation // British Journal Pharmacol. 2010.
V. 161. P. 1219-1237.
4.7. ПРИМЕНЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Г. А. Романов
Введение
Одним из важнейших методических приемов для выявления и ха-
рактеристики гормонального рецептора является анализ его взаи-
модействия с гормоном [1]. Чаще всего такой анализ основан на ис-
пользовании радиоактивного гормона, который является меченым
двойником его природного аналога, а сам метод получил название
радиолигандного (или радиорецепторного). Как известно, рецепто-
ры связывают «свой» гормон избирательно и с высоким сродством и
тем самым отличаются от всех других белков данного организма. Ре-
зультат радиолигандного анализа выражается в измеренном коли-
честве связанной радиоактивности препаратом, содержащим функ-
ционально активный белок-рецептор (см. раздел 4.6). Основная
сложность при выполнении данной задачи заключается в том, что
рецепторы содержатся в эукариотических клетках в низких кон-
центрациях, и выделение и очистка индивидуальных рецепторных
белков представляют собой непростую задачу. Очистка конкретного
белка — это, как правило, длительный процесс, требующий значи-
тельных материальных затрат. При этом сохранность биологичес-
ких свойств белка на конечном этапе очистки вовсе не гарантирует-
ся. Это относится в первую очередь к сложным мультидоменным
мембранным белкам, к которым принадлежат многие рецепторы
гормонов. Если же использовать не индивидуальные белки, а суб-
клеточные органеллы или микросегменты живых тканей [2], то до-
бавляются проблемы, связанные с возможным присутствием не од-
ного, а нескольких различных рецепторов для данного гормона, а
также ферментов метаболизма как рецептора, так и гормона, плюс
эндогенных гормонов, свободных и ассоциированных с рецептора-
ми. Кроме того, низкие концентрации рецепторов в живой клетке
378
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
часто затрудняют использование таких препаратов для проведения
количественных анализов. Предлагаемый здесь способ изучения ре-
цепторов на основе трансформированных бактерий позволяет облег-
чить задачу анализа гормон-рецепторных взаимодействий и избе-
жать многих методических проблем.
Принцип метода
Одним из путей решения методических проблем, возникающих при
необходимости изучения гормон-связывающих свойств индивиду-
ального рецепторного белка, является его экспрессия в бактериаль-
ной клетке. Для осуществления биосинтеза рецептора в бактериях
получают клоны, трансформированные экспрессирующим вектором,
содержащим кДНК рецепторного белка. Рассмотрим основы подго-
товки и проведения такого анализа на примере рецепторов цитоки-
нинов, экспрессированных в клетках кишечной палочки Е. coli.
Как известно, рецепторы цитокининов представляют собой
трансмембранные сенсорные гистидинкиназы [3]. Клоны Е. coli,
экспрессирующие рецепторы цитокининов, были получены на осно-
ве мутантных бактерий линии KMI001 [4], у которых была инак-
тивирована сходная по структуре сенсорная гистидинкиназа RcsC
(рис. 4.7.1). Экспрессированные гистидинкиназы растений (CRE1/
Рис. 4.7.1. Схематическое изображение трансгенной бактериальной
клетки Е. coli, экспрессирующей рецепторы цитокининов и чувствитель-
ной к цитокининам. YojN — фосфотрансмиттер; RcsB — транскрипци-
онный фактор, регулятор cps-промотора. RcsC — гибридная гистидинки-
наза бактерии, аналог АНК-рецепторов
Раздел 4.7. Применение трансгенных бактерий
379
АНК4, АНКЗ и другие рецепторы цитокининов) оказались способ-
ны заместить бактериальную гистидинкиназу RcsC и использовать
бактериальную систему передачи сигнала. Это позволило придать
трансформированным бактериям новое свойство, а именно чувстви-
тельность к цитокининам, что в естественных условиях у Е. coli от-
сутствует. Дополнительно в бактериальную хромосому этих клонов
встроен репортерный ген LacZ (кодирует β-галактозидазу) под конт-
ролем cps-промотора. Этот промотор в норме активируется сигналом,
поступающим от бактериальной гистидинкиназы RcsC. При замене
RcsC на аналогичный растительный белок-рецептор репортерный ген
LacZ становился чувствительным к цитокининам, добавленным в
среду выращивания бактерий [4]. Эти результаты подтвердили ре-
цепторную роль клонированной гистидинкиназы и в то же время по-
казали, что в бактерии растительный белок-рецептор находится в
функционально активном состоянии: он способен как воспринимать
добавленные в среду цитокинины, так и передавать их сигнал на чув-
ствительный промотор.
Этот важный результат дал основу для разработки количествен-
ного метода исследования гормон-рецепторных взаимодействий с
использованием интактных трансгенных бактерий, экспрессирую-
щих эукариотический рецептор [5, 6]. Было показано, что гомоген-
ную суспензию бактерий можно аликвотировать и смешивать с дру-
гими компонентами точно так же, как обычный раствор. При этом
все реакции с бактериями можно проводить в широком диапазоне
условий среды (рН, температура, концентрация солей) без потери
целостности бактерий и функциональной активности рецептора.
Особенно важно то, что исследования можно проводить при низких
(0-4 °С) температурах, что предотвращает действие случайных эн-
зиматических активностей на рецепторы и/или гормоны. Еще одно
удобное свойство бактериальной суспензии, выгодно отличающее ее
от очищенных белков-рецепторов, — это возможность быстрого
разделения связанного и свободного гормона, что достигается либо
пульсовым низкотемпературным центрифугированием, либо ваку-
ум-фильтрацией через подходящую мембрану. При таких скорос-
тях разделения фаз равновесие в системе гормон-рецептор практи-
чески не смещается, и результаты анализа не искажаются процесса-
ми диссоциации гормона из комплекса с рецептором, что нередко
происходит в других системах. Таким образом, типичный опыт по
изучению гормон-рецепторного взаимодействия с использованием
трансгенных бактерий включает следующие основные стадии: а) вы-
ращивание и последующее аликвотирование бактерий; б) инкуба-
ция полученных аликвот с меченым гормоном; в) осаждение бакте-
рий центрифугированием и удаление супернатанта; г) измерение ра-
380
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
диоактивности связанного осадком гормона. Часть меченого гормона
попадает в осадок механически (так называемое неспецифическое
связывание), поэтому, чтобы доказать наличие специфического свя-
зывания высокого сродства, к части бактериальных аликвот добав-
ляют смесь меченого гормона с избытком немеченого двойника.
Только достоверная разница между общим (только меченый гормон)
и неспецифическим (смесь меченого и немеченого гормона) связыва-
нием позволяет констатировать наличие высокоаффинного связы-
вания гормона с рецептором (см. раздел 4.6).
Материалы и реактивы
• Клоны Е. coli линии KMI001, несущие экспрессирующие век-
торы pINIII или pSTV28 с генами отдельных рецепторов цито-
кининов; эти клоны можно хранить в течение месяца в виде
колоний на агаризованной среде LB с антибиотиком или при
-70 °С для длительного хранения.
• Стандартная среда М9 (рН 7) с добавлением 0,1% касамино-
вых кислот («Difco», США).
• Стоковые растворы антибиотиков и активаторов: карбеницил-
лин (или ампициллин), 50 мг/мл в воде; хлорамфеникол,
30 мг/мл в этаноле; IPTG, усилитель транскрипции вектора,
200 мМ в воде. Эти растворы хранят при -20 °С.
• Высокомеченный гормон, в нашем случае транс-[2-3Н]зеатин
с удельной радиоактивностью 600-900 ГБк/моль (Прага,
Чехия), раствор в 20% этаноле. Немеченый транс-зеатин
(«OlChemim», Чехия), стоковый раствор 0,1 Μ в 40-50% DMSO.
Препараты гормонов хранятся при -20 °С.
• Все необходимое для сцинтилляционного счета радиоактив-
ности (сцинтиллятор, флаконы).
• Вакуумный отсос с ловушкой для быстрого удаления радиоак-
тивных супернатантов из эппендорфовских пробирок.
• Перчатки, халаты и другие защитные средства для работы с
радиоактивностью.
Ход определения
I. Трансформированные клоны Е. coli выращивают на качалке в
темноте при 22-25 °С на среде М9 (рН 7) с добавлением антибио-
тиков (карбенициллина, 25-50 мкг/мл, или хлорамфеникола,
30 мкг/мл), а для отдельных клонов также IPTG, в концентра-
ции от 25 до 250 мкМ, в зависимости от клона. Используют ноч-
Раздел 4.7. Применение трансгенных бактерий
381
ную культуру с оптической плотностью около единицы при
λ = 600 нм (при превышении указанной плотности суспензию
разбавить средой М9). Перед постановкой опыта по связыванию
культуру следует охладить до температуры 0-4 °С, можно хра-
нить несколько часов в холодильнике или на ледяной бане.
П. Высокомеченный транс-[2- Н]зеатин разносят точным микро:
дозатором в серию эппендорфовских пробирок, примерно по
2 пикомоля на пробу. К тест-пробам на неспецифическое связыва-
ние добавляют 100-1000-кратный избыток немеченого транс-зе-
атина, к остальным пробам — равный объем жидкости, в которой
растворен транс-зеатин (раствор DMSO). Общий объем внесенных
растворов гормонов не должен превышать 5 мкл, повторность
проб должна быть 2-3-кратная. Пробы с гормонами помещают
на ледяную баню и к ним добавляют охлажденную гомогенную
суспензию бактерий, из расчета 0,75 мл на пробу. Пробирки
плотно закрывают, коротко (несколько секунд) встряхивают на
вортексе для полного перемешивания и оставляют при низкой
температуре в темноте заданное время, обычно от 20 до 40 мин.
В ходе инкубации желательно периодическое (раз в 10 мин) пе-
ремешивание суспензии коротким встряхиванием или 3-крат-
ным переворачиванием пробирок. В ходе этих и последующих
операций необходимо тщательно соблюдать все меры предосто-
рожности, применяемые при работах с радиоактивными соеди-
нениями.
III. После инкубации проводят центрифугирование проб в охлаж-
денном роторе 2-3 мин на максимальной скорости (обычно
13 000 об./мин). Пробы переносят на ледяную баню и быстро
удаляют супернатанты с помощью вакуумного отсасывания.
При этом тщательно удаляют все капли со стенок пробирок.
При необходимости проводят дополнительное пульсовое (3-4 с)
центрифугирование для полного сбора оставшейся жидкости на
дне пробирок с последующим ее тщательным удалением. Далее
пробирки помещают в штатив при комнатной температуре, к
осадкам добавляют этанол в количестве 0,2 (0,24) мл, пробир-
ки тщательно закрывают и оставляют на встряхивателе
(1400 об./мин) по крайней мере 1 ч при комнатной температуре.
IV. По 0,2 мл этанола переносят из пробирок во флаконы для сцин-
тилляционного счета (возможно предварительное пульсовое
центрифугирование экстрактов). К флаконам добавляют сцин-
тилляционную жидкость, обычно достаточно 5 мл на флакон.
Флаконы выдерживают 1-2 ч при комнатной температуре для
равномерного распределения радиоактивности и просчитывают
5-10 мин на пробу в зависимости от дозы радиоактивности. Ре-
382
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
зультаты счета статистически обрабатывают вручную или с при-
менением соответствующих компьютерных программ, например
SigmaPlot, опции Simple Ligand Binding.
Интерпретация результатов
Как уже отмечалось выше, вначале необходимо определить разницу
между пробами с общим и неспецифическим (с добавлением немече-
ного гормона) связыванием. Только достоверная разница свидетель-
ствует о наличии высокоаффинного связывания рецептора с гормо-
ном [1]. Однако при этом важны как абсолютная величина общего
связывания гормона, так и соотношение специфического и неспеци-
фического связывания. Чем выше удельная доля специфического
связывания от общего, тем более надежно и достоверно присутствие
сайтов высокоаффинного связывания в препарате. Для точного опре-
деления параметров (ΚD и др.) гормон-рецепторного взаимодейст-
вия важно, чтобы уровень неспецифического связывания не превы-
шал 20-30% от тотального. Этого можно достичь подбором опти-
мальных условий для взаимодействия гормона с рецептором, часто
также уменьшением количества бактерий в пробах для снижения
уровня неспецифического связывания в осадках. Примеры выявле-
Рис. 4.7.2. Связывание Н-траyс-зеатина интактными трансгенными
бактериями (Е. coli), экспрессирующими рецепторы цитокининов араби-
допсиса АНКЗ и CRE1/AHK4.1 — общее связывание; 2 — неспецифичес-
кое связывание; 3 — специфическое связывание
Раздел 4.7. Применение трансгенных бактерий
383
ния специфического связывания, расчета констант взаимодействия
гормон-рецептор, а также лигандной специфичности связывания
представлены на рис. 4.7.2-4.7.4. Более детальную информацию о
способах постановки количественных опытов по связыванию с раз-
ными задачами можно почерпнуть из [1] и раздела 4.6.
Оценка метода, возможные проблемы
Использование живых интактных бактерий, экспрессирующих ин-
дивидуальный эукариотический рецептор, для анализа гормон-ре-
цепторного взаимодействия имеет ряд преимуществ. Во-первых, от-
падает необходимость в процедурах очистки рецепторного белка
или содержащих его субклеточных органелл. Во-вторых, облегчает-
Рис. 4.7.3. Дозовая зависимость связывания Н-транс-зеатина с цитоки-
ниновыми рецепторами АНКЗ и CRE1/AHK4 и ее анализ в координатах
Скетчарда
384
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ
Рис. 4.7.4. Конкурентные кривые вытеснения H-транс-зеатина из ком-
плекса с рецептором немечеными лигандами. 1 — транс-зеатин; 2 — ли-
гидрозеатин; 3 — изопентениладенин
ся задача отделения связанного гормона от свободного. В-третьих,
не возникает проблема метаболизации рецептора и/или гормона в
ходе инкубации, а также присутствия других аналогичных рецепто-
ров и эндогенных гормонов. Кроме того, в описанном примере с ци-
токининовым рецептором стало возможным испытать функцио-
нальные свойства рецептора непосредственно в бактерии и убедить-
ся в его биологической активности. В искусственной бактериальной
системе транскрипции гена рецептора можно модулировать концен-
трацию этого белка с помощью подбора промотора и состава среды.
Это позволяет достигать концентраций рецептора существенно боль-
ших, чем в растительной клетке, что делает возможным проведение
разнообразных количественных анализов. Однако описанный метод
имеет и некоторые ограничения, которые необходимо принимать во
внимание. Е. coli относятся к грамотрицательным бактериям и покры-
ты дополнительной внешней оболочкой с порами, хорошо проницае-
мыми лишь для относительно небольших соединений с молекулярны-
ми массами до 600-900 Да [6]. Поэтому для анализа взаимодействия
рецепторов с высокомолекулярными лигандами нативные Е. coli не-
пригодны, но эту сложность можно обойти, удалив внешнюю обо-
лочку бактерий с получением так называемых сферопластов. Еще
одна проблема заключается в том, что различные клоны бактерий
по-разному экспрессируют рецепторы, а в некоторых случаях не ис-
ключена экспрессия мутантных форм. Поэтому необходим отбор
клонов, наиболее пригодных для анализа связывания гормона, их
хранение при -70 °С для сохранности основных свойств, а также
стандартизация условий экспериментов. Еще одним ограничением
метода может быть необходимость некоей энзиматической модифи-
Раздел 4.7. Применение трансгенных бактерий
385
кации (глюкозилирование, фосфорилирование, др.) рецептора для
придания ему полноценной биологической активности. Этот про-
цесс, осуществляемый в эукариотической клетке специализирован-
ными ферментами, может не происходить в бактериальной клетке.
Решением вопроса в таком случае может быть совместное клониро-
вание в бактерии не только гена самого рецептора, но и генов его мо-
дификации, хотя это, безусловно, потребует дополнительных усилий.
Однако опыт соответствующих работ показывает, что эукариотичес-
кие рецепторы в целом сохраняют свою активность при экспрессии
в бактериальной клетке.
Литература
1. Ломин С. Н.у Романов Г. А. Анализ гормон-рецепторного взаи-
модействия. Теоретические и практические аспекты // Физио-
логия растений. 2008. Т. 55. С. 283-299.
2. Muramatsu I., Tanaka Т., Suzuki F., Li Z., Hiraizumi-Hiraoka Υ.,
Anisuzzaman A. S. Μ., Yamamoto Η., Horinouchi 7Λ, Morishima S.
Quantifying Receptor Properties: the Tissue Segment Binding
Method — a Powerful Tool for the Pharmacome Analysis of Native
Receptors // J. Pharmacol. 2005. V. 98. P. 331-339.
3. Романов Г. А. Как цитокинины действуют на клетку // Физио-
логия растений. 2009. Т. 56. С. 295-319.
4. Suzuki Т., Miwa К., Ishikawa К., Yamada Η., Aiba Η., Mizuno Т.
The Arabidopsis Sensor His-kinase, AHK4, Can Respond to
Cytokinins // Plant and Cell Physiology 2001. V. 42. P. 107-113.
5. Romanov G. Α., Spichal L., Lomin S., Strnad M., Schmiilling T.
A Live Cell Hormone-Binding Assay on Transgenic Bacteria
Expressing a Eukaryotic Receptor Protein // Analytical Biochem.
2005. V. 347. P. 129-134.
6. Romanov G. Α., Lomin S. N. Hormone-Binding Assay Using Living
Bacteria Expressing Eukaryotic Receptors // In: Cutler S.,
Bonetta D., eds. Plant Hormones: Methods and Protocols, Second
Edition. Series «Methods in Molecular Biology», vol. 495, Chapter 10.
2009. Humana Press, USA. P. 111-120.
Глава 5
МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ
И АНАЛИЗА СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР
5.1. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ И ХАРАКТЕРИСТИКИ
РОСТА КУЛЬТУР КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
А. М. Носов
Введение
Культура клеток высших растений широко используется в качестве
объекта для решения разнообразных задач физиологии и биохимии
растений. Кроме того, она является основой для создания многих
растительных биотехнологий. Для корректной интерпретации по-
лучаемых результатов необходима адекватная оценка используемой
культуры клеток, прежде всего характеристика ее роста и физиоло-
гического состояния. Для некоторых задач бывает достаточно ка-
чественной характеристики роста культуры, однако для подавляю-
щего большинства случаев необходима строгая количественная
оценка этого процесса. В частности, многие процессы (поглощение
клетками минеральных элементов, интенсивность и специфика ды-
хания клеток, особенности первичного и вторичного метаболизма
и др.) существенно различны в разных фазах роста культуры. Пос-
кольку интенсивность роста культур клеток может сильно разли-
чаться, «привязка» исследуемых характеристик к возрасту культу-
ры (сутки после пересева) может приводить к серьезным ошибкам в
интерпретации полученных результатов. Более верно с физиологи-
ческой точки зрения сопоставлять процессы по фазам роста культу-
ры, что требует их четкого разграничения. Достаточно эффективно
для этого использовать принципы и методы, принятые в микробио-
логии. Результаты количественного изучения роста могут быть дос-
таточно информативны и точны, если для анализа брать различные
параметры: индекс роста, удельную скорость роста (или время удво-
ения биомассы), экономический коэффициент.
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 387
Полное и достаточно точное определение ростовых характерис-
тик возможно лишь для суспензионной культуры клеток, то есть
для системы, состоящей из хорошо перемешиваемой гомогенной
взвеси клеток. Предполагается, что интенсивность перемешивания
достаточна для диспергирования клеток и что в среде нет перепада
концентраций.
Характеристика роста культур, растущих на поверхности среды
(каллусных культур клеток), представляет собой более сложную и
трудоемкую задачу.
Основные принципы
характеристики ростовых процессов
и используемые параметры
Индекс роста
Индекс роста является простейшей характеристикой роста и опре-
деляется как
I = (Xmax - X0) / X0, (1)
где Х0 и Xmax — количество биомассы (или другого измеряемого
критерия роста — например, числа клеток) в начале цикла выращи-
вания и максимальное ее значение соответственно.
Следует отметить, что некоторые исследователи предпочитают
вычислять индекс роста без учета начального содержания биомас-
сы, т. е. по формуле
I = Xmax / x0. (2)
При хорошем росте культуры значения индекса роста, вычисля-
емые по обеим формулам, близки.
Основным недостатком использования индекса роста для харак-
теристики роста культур является его зависимость от уровня на-
чальной плотности культуры. Известно, что максимальный уровень
накопления биомассы Xmax определяется в основном количеством
углеводного субстрата в среде, но не начальной плотностью культу-
ры, которая в основном влияет на длительность лаг-фазы роста. Та-
ким образом, при высокой начальной плотности клеток можно по-
лучить очень низкий индекс роста, несмотря на то что другие рос-
товые характеристики (например, удельная скорость роста) будут
весьма высокими. Следовательно, индекс роста является объектив-
ным критерием роста только при выровненной начальной плотнос-
ти культур.
388 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Скорость роста
Удельная скорость роста
В простейшей модели роста предполагается, что в течение бесконеч-
но малого промежутка времени dt увеличение биомассы dx должно
быть пропорционально количеству биомассы χ и интервалу време-
ни, т. е.
dx = μxdt, (3)
откуда
dx/dt = μx. (4)
Дифференциальное отношение dx/dt выражает скорость роста
популяции клеток. Параметр μ, обозначающий скорость роста еди-
ницы биомассы (1/х) (dx/dt), называется удельной скоростью рос-
та и измеряется в единицах, обратных времени (l/t)· Этот параметр
аналогичен сложным процентам. Например, удельная скорость рос-
та 0,1 сут-1 означает прирост биомассы на 10% за сутки.
Если μ постоянна, то интегрирование уравнения (4) дает
lпх = lnχ0 + μt, (5)
где х0 — биомасса в начальный момент времени t = 0.
График зависимости lпх от времени будет иметь вид прямой ли-
нии с наклоном μ (μ = tg α).
Из уравнения (5) следует, что
ln(x/x0) = μt. (6)
График зависимости 1п(л:/л:0) от времени будет иметь вид прямой
линии, исходящей из начала координат, с наклоном μ. Из уравне-
ния (6) следует:
x = х0еμt. (7)
Рост, подчиняющийся этому закону, называется экспоненци-
альным, или логарифмическим.
Удельная скорость роста μ является основным параметром, ха-
рактеризующим скорость роста.
Время удвоения биомассы
Зависимость между удельной скоростью роста и временем удвоения
(td или τ) биомассы можно получить, подставив в уравнение (4) x =
= 2х0 и t = τ.
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 389
Тогда
τ = ln2/μ или τ ~= 0,692/μ. (8)
Таким образом, время удвоения биомассы однозначно определя-
ется удельной скоростью роста. Например, при удельной скорости
роста, равной 0,1 сут-1, время удвоения биомассы составляет около
7 суток.
Экономический коэффициент
Экономический коэффициент (или выход биомассы) определяют из
уравнения
Δх/Δs = Y, (9)
где Ах — увеличение биомассы, соответствующее потреблению суб-
страта в количестве As.
Более строго экономический коэффициент определяется преде-
лом, к которому стремится отношение Ах/As при As —» 0, т. е.
Y = - Δх/Δs. (10)
Знак «минус» вводится потому, что значения x и s изменяются в
противоположные стороны.
Важность экономического коэффициента и его физиологичес-
кий смысл состоят в том, что он выражает соотношение энергетичес-
кого и конструктивного метаболизма клеток в популяции, иными
словами — эффективность использования субстрата среды для по-
строения биомассы клеток.
Если х0 и s0 — начальные концентрации биомассы и субстрата
соответственно, а х и s — соответствующие концентрации во время
роста в культуре, то
x - х0 = Y(s0 - s). (11)
Когда концентрация биомассы достигает своего максимума,
хтах, обычно субстрат среды (сахароза или другой источник углеро-
да) поглощается клетками полностью, в этом случае экономический
коэффициент можно с достаточной точностью определить как
Υ = (xmax - x0)/s0· (12)
Например, при начальной концентрации сахарозы в среде 3%
(30 г/л среды) и начальном содержании биомассы в культуре 1,0 г/л
(по сухой биомассе) в конце выращивания получили 11,0 г сухой био-
массы, тогда экономический коэффициент У составляет (11 - 1) / 30 =
390 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
= 1/3 = 0,33. Это означает, что треть субстрата клетки используют
на конструктивный обмен (построение биомассы), а две трети — на
энергетический (дыхание).
Кривая роста и определение длительности фаз роста
Рост культур клеток описывается S-образной кривой роста, типич-
ная форма которой представлена на рис. 5.1.1. В процессе роста
культура проходит ряд фаз, каждая из которых соответствует опре-
деленному физиологическому состоянию популяции клеток. Дли-
тельность каждой из фаз роста является важной характеристикой
роста культуры клеток. Кривые роста часто изображают в обычной
системе координат, когда по оси абсцисс откладывают время куль-
тивирования (для культур клеток высших растений — сутки), по
оси ординат — критерии роста (сухая или сырая биомасса, число
клеток, упакованный объем). Такое представление роста культур
носит преимущественно иллюстративный характер, поскольку не
позволяет определить границы фаз ростового цикла. Для детально-
го анализа роста культур необходимо построение графика ростовой
кривой в полулогарифмической системе координат, то есть по оси
ординат необходимо откладывать не фактическое значение крите-
рия роста, а его натуральный логарифм (lnx). Более удобным явля-
ется использование нормированного значения ростового критерия,
то есть значение ln x/x0. В этом случае кривые роста для любого
критерия будут идти из начала координат, что значительно облегча-
ет их сопоставление.
Обычно на ростовой кривой выделяют шесть фаз роста. Латент-
ная, или лаг-фаза, роста — период, в который видимый рост не на-
блюдается ни по одному из ростовых критериев. После нее идет фаза
Рис. 5.1.1. Типичная S-образная кривая роста с шестью фазами роста.
1 —лаг-фаза; 2 — фаза ускорения роста; 3 — фаза экспоненциального
роста; 4 — фаза замедления роста; 5 — стационарная фаза; 6 — фаза
деградации
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 391
ускорения роста, за которой следует фаза экспоненциального роста
культуры, в которой удельная скорость роста постоянна и имеет
максимальное значение (μтах)· После экспоненциальной фазы роста
или из-за недостатка источников питания, и/или из-за накопления
ингибирующих продуктов наступает фаза замедления роста. После
того как биомасса (или другой критерий роста) достигнет макси-
мума, наступает стационарная фаза, в которой рост прекращается,
то есть не происходит видимого изменения значения исследуемого
ростового критерия. Заключительной фазой роста принято считать
фазу деградации, в которой биомасса (или другой критерий роста)
уменьшается в результате метаболических процессов, связанных с
поддержанием жизнедеятельности клеток, или их автолиза.
Следует особо отметить, что линейная фаза роста, часто упоми-
наемая в литературе по культурам клеток растений, в которой уве-
личение биомассы происходит по линейному закону в нормальной
системе координат, для суспензионных культур отсутствует (точ-
нее, ее можно выделить в фазе ускорения роста, но ее длительность
крайне мала). Линейную фазу роста можно зафиксировать для кал-
лусных культур клеток, выращиваемых поверхностным способом.
При таком способе культивирования наличие линейной фазы роста
обусловлено особенностью поглощения клетками субстрата из пита-
тельной среды — не из всего объема среды, а с определенной поверх-
ности путем диффузии.
Преимущество построения кривой роста в полулогарифмичес-
ких координатах состоит в том, что в этом случае экспоненциальная
фаза роста будет выражена в виде прямой линии, тангенс угла на-
клона которой к оси t равен максимальной удельной скорости роста
μτηαχ. Границы фазы экспоненциального роста определяют по точ-
кам расхождения проведенной прямой от графика S-образной кри-
вой роста (рис 5.1.2). Длительность лаг-фазы определяют методом
Лоджа и Хиншельвуда [1]. Для этого на графике зависимости ло-
гарифма биомассы от времени необходимо экстраполировать пря-
мую линию, соответствующую экспоненциальной фазе роста, до
уровня начальной биомассы. В случае построения графика зависи-
мости в нормированных координатах (ln х/х0 от времени) — до пе-
ресечения с осью абсцисс. Отрезок, отсекаемый при этом на оси
абсцисс, будет соответствовать длительности лаг-фазы (фаза 1 на
рис. 5.1.2).
Для определения длительности стационарной фазы роста через
точку максимального накопления биомассы проводят прямую, па-
раллельную оси абсцисс. Границы стационарной фазы роста опреде-
ляют по точкам расхождения проведенной прямой от графика S-об-
разной кривой роста. Фаза ускорения роста будет находиться между
392 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
ΙηΧΑ
Рис. 5.1.2. Графическое определение длительности фаз роста. Обозначе-
ния фаз роста — аналогично рис. 5.1.1. Границы фазы роста соответству-
ют пунктирным линиям
лаг-фазой и экспоненциальной фазой роста; фаза замедления —
между экспоненциальной фазой и стационарной фазой, фаза дегра-
дации — после стационарной фазы роста. Этим методом можно кор-
ректно определить длительность фаз роста с точностью до суток.
Для полной и надежной характеристики роста культур клеток
растений используют разные критерии: сухую массу клеток т, сы-
рую массу клеток ms, количество клеток в миллилитре суспензии
(концентрацию клеток) п. В качестве ориентировочных и быстро
определяемых критериев — осажденный объем клеток (SCV —
settled cell volume) и упакованный объем клеток (PCV — packed cell
volume). Достоинство этих критериев — возможность возврата кле-
ток в колбу для последующего культивирования, что в ряде случаев
важно.
Для культур клеток растений характерно явление несбаланси-
рованности роста по различным ростовым критериям. Это выража-
ется в различной длительности фаз ростовой кривой при построении
ее по сухой массе клеток, сырой массе клеток или концентрации
клеток. В частности, по сырой массе клеток фаза стационара насту-
пает, как правило, существенно позже, что связано с ростом клеток
растяжением (за счет формирования и увеличения центральной ва-
куоли).
Особенности характеристики роста каллусных культур
Каллусные культуры клеток выращивают на поверхности среды, и
отбор проб для анализа роста невозможен. Поэтому методика опре-
деления ростовых характеристик более трудоемка и существенно
отличается от анализа суспензионных культур клеток.
В качестве основной характеристики роста каллусов обычно
применяют индекс роста. Построение кривой роста и определение
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 393
основных ростовых характеристик используют реже, однако для
корректного определения индекса роста и оптимального срока пере-
садки культуры это необходимо.
Для исследования роста каллусных культур приходится для
каждого определения брать индивидуальный каллус. Поскольку
цикл выращивания каллусных культур составляет не менее 30 су-
ток, с учетом аналитических повторностей, для анализа необходимо
одновременное культивирование минимум 50-60 каллусов. Кал-
лусы можно выращивать в чашках Петри (по 5-6 каллусов в чашке)
либо по одному в широких пробирках. Начальный вес каллусов дол-
жен быть одинаковым (0,5-0,7 г сырой массы с точностью не менее
±5%). Для анализа на каждую точку ростовой кривой используют не
менее трех каллусов.
Следует отметить, что в качестве критериев роста для каллус-
ных культур используют лишь сухую и сырую массу клеток, а кри-
вая роста в нормальных системах координат часто имеет линейный
участок (см. «Экономический коэффициент»).
Протоколы методик
Для получения достоверных и воспроизводимых результатов на
культурах клеток в качестве объекта исследования весьма важно
оптимизировать выращивание культуры по основным факторам
культивирования.
В зависимости от задач, для выращивания культур можно ис-
пользовать колбы объемом от 0,25 до 2,0 л. Степень заполнения
колб суспензией не должна превышать 10-15% от общего объема
колбы. Важно оптимизировать объем инокулюма и начальную плот-
ность культуры. Обычно начальная плотность культуры находится
в пределах 1-2 г/л по сухой массе клеток и подбирается таким обра-
зом, чтобы лаг-фаза находилась в пределах 1-3 суток. Для пересад-
ки в качестве инокулюма используют культуру клеток в фазе замед-
ления роста. Выращивание проводят в темноте при температуре
26 °С, и влажности 60-70%, на качалке с круговым вращением,
скорость вращения качалки — около 100 об./мин (95-105 об./мин).
В процессе культивирования из колб отбирают пробы для анали-
за. Для точного определения ростовых характеристик желательно
отбирать пробы ежедневно (это особенно важно в начальных фазах
роста) в одно и то же время. Однако для большинства случаев прием-
лемо отбирать пробы через день.
При определении ростовых характеристик желательно парал-
лельно в каждой отобранной пробе определять жизнеспособность
клеток в популяции.
394 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Протокол определения жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток обычно определяют по их прокрашива-
нию витальными красителями (обычно 0,025% синькой Эванса или
0,1% раствором феносафранина) и выражают как процент непрокра-
шенных («жизнеспособных») клеток. Доля жизнеспособных клеток
в культуре должна быть не менее 60% , для хорошо растущих куль-
тур — 80-90%. Жизнеспособность клеток обычно несколько изменя-
ется в цикле выращивания, существенно снижаясь к началу фазы де-
градации. При жизнеспособности клеток в популяции менее 50% ис-
следовать ростовые характеристики культуры и использовать ее
для физиологических экспериментов нецелесообразно. В этом слу-
чае необходимо проводить работы по оптимизации физиологическо-
го состояния данной культуры клеток.
Поскольку суспензионные культуры клеток состоят из агрега-
тов клеток различного размера, применяют два способа определе-
ния жизнеспособности культур — по подсчету клеток или по подсчету
культивируемых единиц. Последний способ более предпочтителен,
для крупноагрегированных суспензий он единственно возможен.
Протокол определения жизнеспособности культуры
по количеству жизнеспособных клеток
1. Готовят 10 мл водного раствора витального красителя: 0,025%
синьки Эванса или 0,1% раствор феносафранина. Раствор мож-
но хранить длительное время при комнатной температуре. Сле-
дует иметь в виду, что для разных культур результаты, полу-
ченные с различными красителями, могут несколько разли-
чаться.
2. В ламинар-боксе стерильно отбирают пробу, используя пипетку
объемом 1 мл с обрезанным «носиком» (это необходимо для по-
падания в пробу всех клеточных агрегатов, размер которых мо-
жет достигать для крупноагрегированных суспензий 2-3 мм).
При отборе пробы необходимо вращать колбу, чтобы не образо-
валось осадка клеток, от этого в большой степени зависит точ-
ность и воспроизводимость результатов.
3. На предметное стекло наносят пипеткой каплю суспензии кле-
ток, рядом наносят капилляром небольшую каплю красителя
(объем красителя должен быть в 8-10 раз меньше объема сус-
пензии). Капли смешивают и накрывают покровным стеклом.
4. Через минуту после смешивания стекло просматривают под
микроскопом и подсчитывают количество прокрашенных кле-
ток (при просмотре не менее 500 клеток). Для подсчета удобны
счетчики клеток, используемые в гематологических исследова-
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 395
ниях. Жизнеспособность культуры выражают как процент не-
прокрашенных клеток к общему числу просмотренных клеток.
Для более точного определения жизнеспособности культуры
желательно провести для каждой пробы 2-3 независимых анали-
за (пп. 2-4).
Протокол определения жизнеспособности культуры
по количеству жизнеспособных культивируемых единиц
Выполнить пп. 1—3 Протокола определения жизнеспособности куль-
туры по количеству жизнеспособных клеток.
5. Через минуту после смешивания стекло просматривают под
микроскопом и подсчитывают количество жизнеспособных аг-
регатов клеток (при просмотре не менее 200 агрегатов). Жиз-
неспособным считается агрегат, в котором количество непро-
крашенных клеток больше половины (определяется визуально).
Жизнеспособность культуры выражают как отношение коли-
чества жизнеспособных агрегатов к общему числу просчитан-
ных агрегатов в процентах. Необходимо провести минимум два
независимых анализа на каждую пробу.
Протокол определения сухой и сырой биомассы клеток
1. В ламинар-боксе стерильно отбирают пробы, используя пипетку
объемом 10 мл с обрезанным «носиком». При отборе пробы необ-
ходимо вращать колбу, чтобы не образовалось осадка клеток
(см. п. 2 Протокола определения жизнеспособности культур по
количеству жизнеспособных клеток).
2. Отобранную пробу суспензии клеток объемом 10 мл отфильтро-
вывают на воронке Бюхнера через бумажный или нейлоновый
фильтр под вакуумом. Для этого по каплям суспензию из пипетки
наносят в центр фильтра и выдерживают 15-20 с (время фильтра-
ции должно быть одинаковым для всех проб). В некоторых слу-
чаях (например, большое количество экзометаболитов в среде, не-
обходимость использования высушенной биомассы для дальней-
ших анализов) можно промыть клетки на фильтре по каплям
дистиллированной водой или соответствующим буфером. Одна-
ко для большинства случаев это не требуется.
3. Получившуюся в центре фильтра «горку» клеток шпателем пе-
реносят в стеклянный бюкс, доведенный до постоянного веса;
бюкс закрывают крышкой для предотвращения испарения воды.
4. Закрытый бюкс с клетками взвешивают на аналитических ве-
сах и, после вычитания веса бюкса (с крышкой), получают зна-
чение сырой массы клеток в 10 мл суспензии.
396
ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ...
5. Открывают крышку бюкса и помещают его на сутки в термостат,
установленный на температуру 60 °С.
6. После высушивания бюкс с клетками закрывают крышкой, пе-
реносят в эксикатор и охлаждают до комнатной температуры
(1,5-2 ч).
7. Бюкс взвешивают на аналитических весах и после вычитания
веса бюкса получают значение сухой массы клеток в 10 мл сус-
пензии.
8. Для контроля полноты высушивания клеток желательно повто-
рить процедуры пп. 5-7, повторно выдерживая клетки в тер-
мостате в течение 2-3 ч. При этом сухая масса клеток должна
изменяться не более чем на 5-6% . Однако для большинства
культур клеток 18-24 ч вполне достаточно для полного высуши-
вания.
Высушенную биомассу можно использовать для химического
анализа или иных целей.
Описанный протокол определения сухой и сырой массы клеток
дает более точные результаты по сравнению с распространенным ва-
риантом без использования бюксов, когда биомассу взвешивают
вместе с фильтром или на алюминиевой фольге.
Протокол определения концентрации клеток (числа клеток)
Для определения концентрации клеток (числа клеток в мл суспен-
зии) используют подсчет клеток. Для этого служит гемоцитометр,
используемый для подсчета форменных элементов крови — камеру
Фукса—Розенталя. Следует особо отметить, что из-за значительных
размеров растительных клеток камеру Горяева, предназначенную
для подсчета эритроцитов, использовать нельзя.
Перед подсчетом числа клеток необходимо провести дезинтегра-
цию (мацерирование) клеточных агрегатов, из которых состоит сус-
пензионная культура клеток растений. Для этого обычно использу-
ют два подхода — мацерирование в растворе хромовой кислоты или
действие ферментов (пектиназ и целлюлаз). Метод с хромовой кис-
лотой более быстрый и менее сложный, однако требует подбора
оптимального времени мацерации.
Протокол определения концентрации клеток
с использованием хромовой кислоты
1. Готовят 20% раствор хромовой кислоты (20 г хромового ангид-
рида CrO3 растворяют в 100 мл дистиллированной воды, раствор
можно хранить под тягой при комнатной температуре длитель-
ное время).
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 397
2. В ламинар-боксе стерильно отбирают 1 мл пробы пипеткой с об-
резанным «носиком» (см. п. 2 Протокола определения жизнеспо-
собности культуры по количеству жизнеспособных клеток).
3. К 1 мл отобранной суспензии добавляют 4 мл 20% раствора хро-
мовой кислоты, флакон укупоривают фольгой и помещают в
термостат с температурой 60 °С на время от 5 до 30 мин в зависи-
мости от типа суспензии (см. примечание 1).
4. После инкубации суспезию клеток в хромовой кислоте шприцу-
ют (набирают и выпускают из шприца) 3-4 раза. Для этого берут
стеклянный шприц объемом не менее 5 мл с иглой большого диа-
метра.
5. Гемоцитометр Фукса-Розенталя готовят для измерений, для
чего покровное стекло притирают к камере до появления интер-
ференционных колец. Заполняют камеру мацерированной сус-
пензией с помощью стеклянного капилляра диаметром не менее
1 мм.
6. Производят подсчет клеток в камере в соответствии с инструк-
цией, прилагаемой к камере. Для этого под микроскопом под-
считывают число клеток в 5 больших квадратах камеры (эти
квадраты разделены двойными линиями, каждый большой
квадрат состоит из 4 маленьких квадратов). В результате полу-
чают количество клеток в 5 квадратах, обозначаемое N. Подсчет
производят не менее чем в 6 камерах.
7. Производят расчет концентрации клеток по формуле
С = 1000 x k x Ncp (кл/мл),
где k — разведение исходной суспензии. Для данного способа
k = 5, так как к 1 мл суспензии добавляют 4 мл хромовой кисло-
ты; Ncp — среднее значение N (количества клеток в 5 больших
квадратах камеры). При просчете 6 камер Ncp = ΣΝ/6.
Примечание 1. Для каждой культуры необходимо произвести опти-
мизацию условий мацерации. Для этого одновременно необходимо про-
вести манипуляции пп. 1-4 протокола с использованием различного
времени инкубирования клеток в термостате — 5, 10, 15, 20, 25 и
30 мин. Затем под микроскопом определить степень мацерации клеток,
при этом необходимо просматривать клетки как до шприцевания, так и
после него. Оптимальным временем следует считать то время, когда
уже не остается клеточных агрегатов, но еще нет разрушения клеток.
С оптимальным временем инкубирования, а также с двумя ближайши-
ми вариантами (время инкубирования ±5 мин от оптимального) следует
провести всю процедуру определения числа клеток. Если различия в
398 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
полученных результатах не превышают 5-10% или в оптимальном ва-
рианте число клеток оказывается достоверно выше, чем в «соседних»,
процедуру оптимизации можно считать завершенной. В противном
случае следует повторить оптимизацию, используя другое разведение
клеток (меньшее или большее количество добавленной кислоты, либо
кислоту с меньшей концентрацией — 8-10%).
Протокол определения концентрации клеток
с использованием ферментов
1. Готовят по 5 мл водных растворов 10% целлюлазы и 5% пекти-
назы.
2. В ламинар-боксе стерильно отбирают 1 мл пробы, используя пи-
петку с обрезанным «носиком» (см. Протокол определения жиз-
неспособности культуры по количеству жизнеспособных кле-
ток).
3. К 1 мл отобранной суспензии добавляют 0,5 мл 10% целлюлазы
и 0,5 мл 5% пектиназы. Флакон плотно закрывают фольгой и
инкубируют на ротационном шейкере при температурой 25 °С
от 5 до 30 мин в зависимости от типа суспензии (см. примеча-
ние 1 Протокола определения концентрации клеток с использо-
ванием хромовой кислоты).
Далее выполняют пункты 5-7 Протокола определения жизнеспо-
собности культуры по количеству жизнеспособных клеток. В фор-
муле используют k = 2.
Протокол определения осажденного объема клеток (SCV)
и упакованного объем клеток (PCV)
Достоинством этих критериев роста является быстрота определе-
ния, а также возможность характеристики роста в отдельной колбе.
Недостатком — низкая точность метода (так как объем осадка кле-
ток определяется визуально) и, как следствие, невысокая воспроиз-
водимость. Критерии можно использовать лишь для ориентировоч-
ного исследования или мониторинга.
Протокол определения осажденного объема клеток (SCV)
1. В ламинар-боксе стерильно отбирают 5 или 10 мл пробы (одина-
ково для всех определений), используя пипетку с обрезанным
«носиком» (см. Протокол определения жизнеспособности куль-
туры по количеству жизнеспособных клеток).
2. Переносят пробу стерильно в градуированную пробирку соответ-
ствующего объема (10 мл — в случае объем пробы 5 мл и 15 мл —
при объеме пробы 10 мл).
Раздел 5.1. Методы оценки и характеристики роста культур клеток 399
3. Отстаивают клетки в течение 5-30 мин (одинаково для всех опре-
делений). Оптимальное время отстаивания определяют в зависи-
мости от типа культуры клеток и задач исследования (см. Приме-
чание 2).
4. Определяют объем осадка клеток по градуировке пробирки.
Протокол определения упакованного объема клеток (PCV)
Определение проводят аналогично определению SCV, за исключе-
нием пункта 3. Вместо отстаивания клеток используют центрифуги-
рование в градуированных центрифужных пробирках при 200 g в
течение 1-5 мин (одинаково для всех определений).
Примечание 2. Время осаждения или время центрифугирования
следует оптимизировать для конкретной культуры и в зависимости от
задач исследования. С этой целью для 2—3 точек в цикле выращивания
следует определить SCV или PCV с использованием различного времени
отстаивания (5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин) или центрифугирования (1, 2, 3,
4, 5 мин) соответственно. Оптимальным будет минимальное время от-
стаивания (центрифугирования), после которого увеличение времени
соответствующей процедуры не приведет к уменьшению объема осадка
клеток более чем на 5-10% .
Если после определения SCV или PCV необходим возврат клеток в
колбу для последующего выращивания, следует выбрать минимальное
время отстаивания или центрифугирования, которое дает воспроизво-
димые результаты. Надо учесть, что в целом использование клеток после
определения SCV или PCV для дальнейшего выращивания нежелатель-
но, поскольку отстаивание или центрифугирование может снижать их
жизнеспособность.
Анализ роста культуры
По измеренным критериям — сухая и сырая масса клеток, число
клеток — строят кривую роста, при этом полезно построить кривую
как в обычных координатах, так и в полулогарифмических — для
определения длительности фаз ростового цикла. Для построения в
полулогарифмических координатах целесообразно использовать по
оси ординат значение lп х/х0 (уравнение 6), поскольку в этом случае
график будет идти из начала координат, и можно наглядно сопостав-
лять графики, построенные для различных критериев роста. По
графику определяют длительность фаз роста (см. «Кривая роста и
определения длительности фаз роста»), при этом важно, чтобы
линейный участок графика, соответствующий экспоненциальной
фазе роста, был определен как минимум по трем эксперименталь-
ным точкам.
400 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
По полученным результатам измерений рассчитывают ростовые
характеристики: индекс роста культуры / по различным критериям
(Im, Ims, In), используя формулу (1) или (2), удельную скорость роста
в экспоненте μ по различным критериям (μm, μms, μn), время удвое-
ния клеток или биомассы τ — по формуле (8), экономический коэф-
фициент Y, используя формулу (12).
Для расчета удельной скорости μ можно использовать два спосо-
ба — графический и аналитический. Графический способ позволяет
определить удельную скорость роста культуры в экспоненциальной
фазе роста, когда ее значение постоянно и максимально для данного
цикла выращивания (μηιαχ)· Для определения μπιαχ достаточно изме-
рить по графику кривой роста в полулогарифмических координатах
тангенс угла наклона прямой, соответствующей экспоненциальной
фазе роста.
Аналитическим способом можно определить удельную скорость
роста в любой фазе роста по формуле:
μx = (ln xi - ln xi_1)/(ti - ti-1),
где xi и xi_1 — значения критерия роста (сухая масса клеток т, сы-
рая масса клеток ms, концентрация клеток N) в момент времени ti и
ii-1 соответственно.
При этом во всех фазах роста μx будет ниже μmax, в стационарной
фазе μx будет равна нулю, а в фазе деградации — иметь отрицатель-
ное значение.
При проведении биотехнологических исследований бывает по-
лезным определение такого параметра, как продуктивность по био-
массе Р, имеющего размерность г/л за сутки
Ρ = максимальное значение Pi = (xi - x0)/(ti - t0),
где х0 и xi — количество сухой биомассы в начале культивирования
и в момент времени ti соответственно (г/л).
По полученным параметрам роста можно корректно оценить ис-
пользуемую культуру клеток и сопоставить ее с другими культура-
ми, причем даже в тех случаях, когда их характеристики известны
лишь по данным литературы и представлены неполно (во многих ра-
ботах описание роста культур клеток сводится лишь к изображению
кривой роста в нормальных системах координат).
Наиболее информативным показателям роста является удель-
ная скорость роста культуры в экспоненциальной фазе роста μmax.
Для большинства культур значение μmax находится в пределах
Раздел 5.1 ■ Методы оценки и характеристики роста культур клеток 401
0,1-0,4 сут-1. Если μтах меньше 0,1 сут-1, то необходимо проводить
работу по оптимизации роста культуры клеток, до этого использо-
вать данную культуру для проведения экспериментов вряд ли целе-
сообразно. При удельной скорости роста выше 0,4 сут-1 (максималь-
ное значение, известное по данным литературы, находится в райо-
не -0,5-0,6 сут-1, время удвоения биомассы τ при этом чуть более
суток), культуру клеток можно считать очень хорошо растущей.
Следует учесть, что μmax обычно бывает различной для разных рос-
товых критериев.
Индекс роста культур клеток обычно лежит в пределах 5-15. Он
также бывает различным в зависимости от используемого критерия
роста и сильно зависит от начальной плотности культуры и количест-
ва субстрата (источника углерода) в среде.
Экономический коэффициент Υ обычно находится в пределах от
0,2 до 0,5. Более низкие значения экономического коэффициента
свидетельствуют о менее эффективном использовании культурой
субстрата, и при значении Υ менее 0,15-0,20 следует оптимизиро-
вать условия выращивания культуры.
Длительность фаз ростового цикла существенно зависит от типа
культуры и условий эксперимента. Лаг-фазу можно регулировать
количеством инокулюма (начальной плотностью клеток). Считает-
ся оптимальным, если лаг-фаза составляет 1-3 суток. Более дли-
тельная лаг-фаза увеличивает длительность цикла выращивания,
отсутствие лаг-фазы (использование высокой начальной плотности
культуры) при длительном выращивании культуры (более года) мо-
жет привести к снижению ростового потенциала культуры. В то же
время выращивание клеток без лаг-фазы может быть эффективным
способом повышения продуктивности культуры для биотехнологи-
ческих целей (для наработки биомассы клеток в биореакторах).
Длительность экспоненциальной фазы роста обычно составляет
4-9 суток, длительность стационарной фазы роста сильно зависит
от конкретной культуры клеток — для некоторых культур она может
отсутствовать (например, для культур клеток диоскореи Dioscorea
deltoidea Wall), для других ее продолжительность может превы-
шать 10-12 суток (культуры клеток Nicotiana spp.).
При анализе ростовых кривых следует обращать внимание на
отличия реальных кривых роста от теоретических, что может да-
вать ценную информацию об используемой культуре клеток. Напри-
мер, достаточно часто на кривой роста отмечается «ступенька» в се-
редине экспоненциальной фазы роста. Это может быть вызвано дву-
мя причинами — сменой используемого субстрата (например, для
некоторых культур гидролиз сахарозы происходит вне клеток за
счет ферментов, выделяемых культурой в среду, затем клетки по-
402 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
глощают фруктозу, и лишь потом — глюкозу) либо наличием в
культуре клеток двух стабильных субпопуляций.
Параллельно с характеристикой роста культуры клеток полезно
оценивать физиологическое состояние входящих в нее клеток, для
чего обычно используют такие критерии, как соотношение в попу-
ляции клеток различных типов, агрегированность клеток, митоти-
ческий индекс, пролиферативный пул популяции.
Митотический индекс определяют, подсчитывая долю делящихся
клеток, («метафазные пластинки») на давленных препаратах при
окрашивании насыщенным ацетокармином. Обычно в цикле выра-
щивания можно зафиксировать два пика митотической активнос-
ти — для суспензионных культур клеток в районе 2-4 и 5-7 суток.
Максимальное значение митотического индекса при периодическом
выращивании культуры редко превышает 2-4% .
Состав популяции определяют как процентное соотношение раз-
личных типов клеток (меристемоподобных, паренхимоподобных,
аномальных) в популяции, агрегированность — как соотношение
числа отдельных клеток и агрегатов клеток различного размера.
Состав популяции существенно изменяется в цикле выращивания.
Обычно в начальных фазах культивирования (фаза ускорения роста,
экспоненциальная фаза) в популяции преобладают клетки меристе-
моподобного типа, в заключительных фазах — паренхимоподобно-
го, при этом увеличивается доля аномальных клеток. Агрегиро-
ванность культуры также может изменяться в цикле культивирова-
ния.
Пул пролиферирующих клеток в популяции определяют по
включению 3Н-тимидина в ДНК клеток. Пролиферативный пул по-
пуляции вычисляется как доля клеток, включивших меченый ти-
мидин. Для хорошо растущих культур клеток он может достигать
80-90%.
Литература
1. С.Дж. Перт. Основы культивирования микроорганизмов и кле-
ток. Из-во «Мир», 1978. 331 с.
2. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология
морфогенеза растений. М., Наука, 1964. 272 с.
3. Plant Cell Culture. A practical approach. Edited by R. A. Dixon
and R. A. Gonzales. 2nd. ed. Oxford University Press, 1994.
156 pp.
4. Plant Cell Culture Protocols. Edited by V. M. Loyola-Vargas and F.
Vazquez-Flota, 2nd. ed., — Humana Press, — Totowa, New Jersey,
2006. 393 pp.
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
403
5.2. ПРОТОПЛАСТЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ
КАК ОБЪЕКТ ДЛЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ,
БИОХИМИЧЕСКИХ, МОЛЕКУЛЯРНЫХ
И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
А. В. Носов, Т. А. Шевырёва, М. С. Трофимова, О. И. Соколов,
Е. Б. Глоба, А. А. Фоменков, И. Н. Смоленская
Введение
Организм высших растений на протяжении большинства стадий
онтогенеза представлен тканями, индивидуальные клетки которых
механически связаны через общую клеточную стенку, а функцио-
нально — надклеточной симпластной сетью. Наблюдать за индиви-
дуальными клетками в составе целого организма — задача непрос-
тая, тем более исследовать их физиологические и биохимические
особенности. Однако получение лишенных клеточных стенок про-
топластов представляет собой эффективный подход преобразования
организованных тканей растений в суспензии клеток, работать с ко-
торыми гораздо проще. Изолированные протопласты можно опре-
делить как «голые» клетки растений (рис. 5.2.1.А), поскольку
клеточная стенка экспериментально удаляется механическим либо
ферментативным способом. Можно дать более информативное опре-
деление: протопласт — лишенная клеточной стенки изолирован-
ная клетка растений, находящаяся в состоянии осмотического
стресса. Если мы примем последнее определение как более отвеча-
ющее действительности, нам будет легче анализировать причины
успехов и неудач в работе с протопластами.
В данном разделе представлены: (1) принципы получения изо-
лированных протопластов клеток растений; (2) основные направле-
ния их использования; (3) перечень необходимых в работе материа-
лов и оборудования; (4) лабораторные протоколы.
Методические принципы получения протопластов
Надо отметить, что протопласты не всегда получают искусственно.
Например, из сока зрелых плодов томатов [XXX]1, заполняющего
лакуны вокруг семян, можно выделить (отжать) много протопластов.
Популяция их будет очень пестрой — здесь протопласты с ядром и без
ядра; протопласты, заполненные ликопином или содержащие хлоро-
филл; вакуопласты (вакуоли, окруженные ободком плазмалеммы).
1
Римскими цифрами даны ссылки на библиографию из табл. 5.2.1 в конце раздела.
404 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Рис. 5.2.1. Протопласты, первые деления, регенерация растений и иссле-
дование поверхности протопластов в сканирующем электронном микрос-
копе (СЭМ). (Представлены оригинальные результаты авторов, если не
указано иное.) (А) Протопласт из мезофилла табака. (Б) Многоядерный
протопласт — результат спонтанного слияния, окраска карболовым фук-
сином. (В) Первые деления клеток, образованных из протопластов. (Г) Ми-
тозы в клетках, окраска карболовым фуксином (для А-Г масштабная ли-
нейка — 15 мкм). (Д) Регенерация растений из каллуса, сформированного
из протопластов мезофилла табака. (Е) Электрофоретическое разделение
белков в ДДС-Na-ПААГ: протопласты мезофилла табака помещали в бу-
фер для образцов, прогревали и наносили на гель. (Ж) протопласт из
культивируемой клетки табака, интерференционный контраст (мас-
штаб — 10 мкм) [XIII]. (3) Поверхность протопласта мезофилла Nicotiana
rustica, СЭМ, постфиксация 1% OsO4 (масштаб — 1,5 мкм) [12]. (И, К) Про-
топласты клеток каллусной ткани Daucus carota, без постфиксации OsO4
(масштаб — 1,5 мкм (И), 1,1 мкм (К)) [12]. η — ядро; * — вакуоль
Поскольку таких объектов немного, в целом ряде лабораторий
были успешно разработаны методы изолирования протопластов.
Существуют два основных метода. Один состоит в механическом
удалении клеточной стенки в среде, содержащей осмотический ста-
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
405
билизатор. Технически — это мелкое шинкование определенных
тканей растений острыми лезвиями или скальпелями в растворе
осмотика. В этом случае на выходе, как правило, незначительное
число протопластов, и в основном источником их служат вакуоли-
зированные клетки паренхимного типа. Этот метод сейчас исполь-
зуется редко.
Другой метод связан с энзиматическим удалением клеточной
стенки. В 1960 г. Cocking [1] удачно применил ферментный препа-
рат из культуральной жидкости гриба Myrothecium verrucaria для
получения больших количеств изолированных протопластов из
кончиков корней томатов. Именно этот метод является общеприня-
тым в настоящее время. При правильно подобранных условиях изо-
лирования и культивирования можно получить большое число про-
топластов, которые длительное время сохраняют жизнеспособность.
Хороший выход изолированных протопластов составляет до 10 млн
из грамма ткани или клеток.
Сущность данного метода состоит в удалении клеточной стенки
таким образом, чтобы клетки не разрушались, и не наблюдалось ли-
зиса протопластов. Для этого наружное и внутреннее осмотическое
давление на плазмалемму должно быть равным (см. раздел 5.3).
Подбор осмотически активных соединений
Подбор конкретных осмотически активных соединений и их кон-
центраций зависит от вида ткани и условий выращивания растений.
Одним из методов определения концентраций этих агентов служит
прямое наблюдение за плазмолизом клеток под микроскопом, при
инкубации в растворах с повышающимся уровнем осмолярности —
суммарной концентрации всех имеющихся в растворе осмотически
активных частиц (молекул и ионов). Плазмолиз может быть пол-
ным, когда клеточная оболочка целиком отошла от протопласта и
под микроскопом видно, что округленный протопласт лежит в цент-
ре полости, ограниченной оболочкой. Возможен частичный и при-
стеночный плазмолиз, когда клеточная стенка отошла от протоп-
ласта с одной стороны, но на значительном ее протяжении, или
лишь в некоторых местах. Осмолярность клеточного сока мезофитов
в среднем составляет 0,3 моль/л. В качестве осмотически активных ве-
ществ обычно используют различные углеводы: глюкозу, сахарозу,
маннит, сорбит, глицерин и др. Маннит и сорбит применяют чаще,
так как они плохо проникают в клетки. Отметим, что успешное ис-
пользование в качестве осмотика того или иного шестиатомного
циклического спирта — дело эмпирическое. Нельзя определенно
сказать, что это прямо связано с вовлеченностью указанных соеди-
406 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
нений в метаболизм клеток конкретных видов растений. Однако сор-
бит, по опыту, дает выход более «чистых» и жизнеспособных про-
топластов [2]. Применяют также смесь маннита и сорбита. Можно
использовать глюкозу и сахарозу, особенно при выделении про-
топластов из суспензионных культур клеток; несмотря на активное
проникновение этих Сахаров через плазмалемму, получается раст-
вор, близкий по углеводному составу к питательной среде клеток.
Для некоторых тканей применение углеводных осмотиков не
дает хороших результатов. В этом случае используют солевые раст-
воры, хотя известно, что соли обладают большей проникающей спо-
собностью, чем сахара, и снижают активность отдельных карбогид-
раз. На практике применяют в качестве осмотиков 0,21 Μ СаС12 или
0,23 Μ КС1 и смеси этих солевых растворов с маннитом или сорби-
том [3-5]. Часто используют смеси растворов указанных солей и
углеводных осмотиков для «отмывки» протопластов от гидролити-
ческих ферментов (если отмывка необходима для дальнейшей рабо-
ты с протопластами). Такие высокие концентрации ионов К+, Са2+ и
Cl-, очевидно, быстро приводят к блокированию их транспорта
внутрь клеток, и они работают как осмотики в соответствии с произ-
ведением растворимости солей. В случаях, когда источником про-
топластов служат клетки, растущие в культуре in vitro, часто берут
за основу макро- и микросоли конкретных питательных сред, к ко-
торым добавляют другие осмотически активные вещества (до нуж-
ного уровня осмолярности) [2]. Это смягчает процесс выделения
протопластов, особенно если он длителен. Неправильный выбор
осмотика и его концентрации может привести к разрыву плазма-
леммы либо вызвать спонтанное слияние и образование многоядер-
ных протопластов (рис. 5.2.1.Б). Частота появления таких структур
зависит от разных причин [4]. Она повышается с ростом температу-
ры, на нее положительно влияет продолжительность инкубации в
растворах ферментов и их концентрация («переферментированность
клеток»), излишне высокие скорости центрифугирования, наличие
в среде двухвалентных катионов при щелочных значениях рН.
Оптимальны для выделения протопластов растворы с суммарной
осмолярностью от 0,3 до 0,7 моль/л, но всегда лучше использовать
концентрации немного выше, чем изотонические — это облегчает
манипулирование с изолированными протопластами (пипетирова-
ние, центрифугирование и т. п.). Далее в тексте, если говорится о
растворе ферментов, то подразумевается, что он приготовлен на раст-
воре осмотически активного вещества.
Выделение протопластов и подготовка растений
Теперь о том, из чего можно выделить протопласты и как подгото-
вить растения, отделенные от них части, ткани и клетки. Уже доста-
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
407
точно давно протопласты умеют получать из разных тканей одно-
дольных и двудольных растений [6, 7]. Используют листья, про-
ростки, клубни, лепестки, плоды, клубеньки бобовых растений,
опухолевые клетки различного происхождения, ткани и клетки,
культивируемые in vitro. Протопласты могут быть получены из
микроспор, взятых на стадии тетрады, или одноклеточной пыльцы.
Для выделения протопластов обычно берут молодые растения,
еще не начавшие цветение. Имеют значение условия их выращива-
ния: интенсивность освещения, фотопериод, влажность и темпера-
тура. Общее правило — из здорового, полностью тургесцентного
растения легче получить много целых, жизнеспособных и функцио-
нально активных протопластов (из подсохшего материала их полу-
чить невозможно). В некоторых случаях необходима предваритель-
ная подготовка материала. Иногда перед выделением протопластов
растение помещают в темноту либо на короткое время на яркий
свет. Если планируется дальнейшее культивирование протопластов
или инкубация в каких-либо средах, содержащих исследуемый эф-
фектор, в течение суток и дольше, то все работы по изолированию
протопластов проводятся в стерильных условиях (и все растворы
должны быть стерильными). Для этого ткани, взятые от целого рас-
тения, выращенного в поле или теплице, тщательно моют в слабом
растворе мягкого детергента, промывают проточной водой, а затем в
ламинар-боксе проводят стерилизацию поверхности растительного
материала в одном из дезинфицирующих растворов (см. «Материалы
и оборудование»). Время стерилизации зависит от объекта и хими-
ческой природы стерилизующего вещества. Затем материал не-
сколько раз промывают стерильной водой. Обычно ткани мелко на-
резают и помещают в растворы осмотиков, содержащие гидролити-
ческие ферменты. Иногда полезно выдержать ткань на растворе
осмотиков без ферментов, чтобы вызвать предварительный плазмо-
лиз и сократить время инкубации в ферменте. Например, чтобы по-
лучить жизнеспособные протопласты из листьев гаплоидных рас-
тений табака, выращенных в стерильных условиях in vitro, ткань
(разрезанную на кусочки) выдерживают в темноте в течение не-
скольких часов в растворе 0,4 Μ сахарозы. Листья кормовых бобов
помещают на 1 ч в смесь 0,5 Μ сорбита и 5 мМ СаСl2. Некоторые ав-
торы рекомендуют подогревать раствор осмотика, в котором инку-
бируется ткань, до 28 °С для более быстрого достижения осмотичес-
кого равновесия. С листьев, если возможно, снимают эпидерму (чаще
нижнюю). Обычно скальпелем надрезают центральную или боко-
вую жилку листа недалеко от основания и тянущим движением
пинцета от основания к кончику жилки пытаются ее извлечь, при
этом удаляются и фрагменты эпидермы. Далее «открытые» участки
408 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
быстро разрезают на небольшие кусочки и помещают на раствор
ферментов, поверхностью лишенной эпидермы, стараясь, чтобы
ткань оставалась наплаву. Дело в том, что из эпидермальной ткани
сложно выделить протопласты из-за очень плотной упаковки и проч-
ного соединения клеток между собой, а также модификации клеточ-
ных стенок, например за счет кутикулярного слоя. Эпидерма не
всегда легко снимается, даже если листья или другие ткани не под-
сохли. Плохо снимается эпидерма с листьев растений, выращенных
in vitro. Маленькие листья, такие как у арабидопсиса, — также труд-
ный объект для этой процедуры. Поэтому их, как правило, мелко
нарезают бритвой (или специальными приспособлениями) и ин-
фильтрируют раствором фермента под небольшим вакуумом [8].
Следует отметить, что всегда, когда материал нарезают, получается
гораздо больше «грязи» — остатков тканей и обломков клеток. Не-
давно был предложен оригинальный метод выделения протопластов
из листьев арабидопсиса [9] — метод «сэндвича». Он предполагает
фиксирование верхней эпидермы листьев на кусочках липкой лен-
ты «Time tape», затем на нижнюю эпидерму наклеивают полоски
«Magic tape», которые потом удаляют вместе с нижней эпидермой, а
подготовленные таким образом листья помещают на раствор фер-
мента. Безусловно, такой прием можно распространить и на листья
других видов растений.
Протопласты выделяют и из культивируемых тканей, которые
растут, как правило, быстрее, чем целые растения, и могут быть ис-
пользованы круглогодично. При этом культура растет в стерильных
условиях и не требует специальной асептической обработки. Успеш-
ное получение протопластов в этом случае также зависит от ряда
факторов. Во-первых, от возраста исходной ткани в цикле выращи-
вания: по данным многих авторов, лучше брать ткань, находящую-
ся на стадии раннего экспоненциального роста, когда в популяции
имеется значительное число клеток, способных начать деление
(если этот процесс необходим для дальнейшего успеха эксперимен-
та) [2, 5]. Во-вторых, от особенностей роста ткани: каллусы многих
видов растений растут в виде плотной массы, состоящей в основном
из клеток паренхимного типа, небольших меристемоидных участ-
ков и, часто, обильно представленных трахеальных элементов. Все
это приводит к небольшому выходу протопластов и требует допол-
нительных методов их очистки. Оптимально для изолирования про-
топластов использовать суспензионные культуры клеток, весьма
удобные для разных манипуляций: фракционирования клеток, вве-
дения изотопов и других соединений, синхронизации клеточных
популяций и т. п. Иногда лучший результат получают после предва-
рительной подготовки суспензий, например после 2-3-суточного
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
409
культивирования клеток на среде без сахарозы [2, 3], что очевидно
влияет на состав и толщину клеточной стенки. В некоторых случаях
каллусные и суспензионные культуры предынкубируют в растворе
осмотиков.
Состав, концентрация и время действия ферментов
Эти параметры во многом определяют возможность протопласта
освободиться от своей жесткой оболочки. Клеточная стенка пред-
ставлена в основном полисахаридами, в ней присутствуют также не-
которые белки, липиды и ароматические вещества. Существует три
основных полисахаридных компонента клеточной стенки. Целлю-
лоза — неразветвленный полимер, состоящий из β-D-глюкопира-
нозных единиц, соединенных 1,4-связями, и собранный в пучки
микрофибрилл. Связующие гликаны или гемицеллюлозы — раз-
ветвленные полимеры, сшивающие микрофибриллы целлюлозы.
В основном, к линейным участкам β-( 1-4)-D-глюкана через О-6-поло-
жение присоединены остатки D-ксилозы, с которыми, в свою оче-
редь, связаны остатки L-арабинозы или D-галактозы. У некоторых
видов растений линейная часть гликанов сформирована β-(1-4)-D-кси-
ланом. Пектиновый матрикс, в который заключен целлюлозно-ге-
мицеллюлозный каркас клеточной стенки — это полигалактуроно-
вая кислота, неупорядоченно модифицированная метильными и
ацетильными группами. Поэтому основными компонентами фер-
ментной смеси для выделения протопластов должны быть целлю-
лазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Этой цели удовлетворяют фер-
ментные препараты, полученные из микроорганизмов и грибов. Как
правило, целлюлазные препараты представлены смесью ферментов
с высокой целлюлазной и ощутимой гемицеллюлазной активнос-
тью. Целлюлазный препарат Onozuka R10 («Kinki Yakult», Япония),
выделенный из Trichoderma viride, является сложным комплексом
целлюлаз, гидролизующих сначала нативную и кристаллическую
целлюлозу, а затем и аморфную. В основном этот препарат представ-
лен несколькими формами эндо-1,4-β-глюканаз с оптимумом дей-
ствия при рН 4-5. В его составе присутствуют целлобиаза, ксила-
наза, пектиназа, а также примеси липаз и различных нуклеаз.
Целлюлазной активностью обладает ферментный комплекс Cellulysin
(«Calbiochem», Швейцария); целлюлазной и выраженной геми-
целлюлазной активностью — Driselase («Kyowa, Hakko, Kogyo»,
Япония), полученная из Basidiomycetes sp. Отметим целлюлазу из
Aspergillus niger («Sigma-Aldrich», США), а также отечественные
препараты ксиланазу, полученную из того же гриба, и ксиланигрин
(Московский завод ферментных препаратов). Применяют различ-
ные пектиназы — Macerozyme R10 из Rhizopus sp. («Kinki Yakult») и
410 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Macerase («Calbiochem»). Если ферменты не разрушают полностью
компоненты клеточной стенки, то к ним можно добавить пищевари-
тельный сок улитки Helix pomatia. Коммерческий препарат Helicase
(«Ind. Biol. Fran3aise», Франция) содержит более 30 индивидуаль-
ных карбогидраз. Подбор ферментов проводят на основании сведе-
ний об особенностях тканей и данных, имеющихся в литературе для
тканей подобного типа.
Время выделения протопластов зависит от концентрации фер-
ментов и температуры. При высоких концентрациях и температуре
(25-30 °С) для выделения протопластов достаточно 1-4 ч, при не-
высоких — 12-20 ч. Оптимальные условия: рН 5-6, температура
23-26 °С; иногда требуется слабое постоянное или периодическое
покачивание в течение периода инкубации с ферментом (опти-
мально — 50-80 об./мин). Некоторые исследователи предпочита-
ют выделять протопласты более длительное время при температу-
ре 10-18 °С, считая, что в таких условиях плазмалемма не так уяз-
вима для механических воздействий и активности сопутствующих
ферментов — липаз и протеаз, при этом метаболизм протопластов
снижен, что положительно сказывается на их жизнеспособности.
В результате обработки ткани ферментными препаратами получа-
ется смесь, содержащая протопласты, «обломки» тканей, разру-
шенные и целые клетки, трахеальные элементы. Чтобы отделить
протопласты от этих примесей (если это необходимо), суспензию
фильтруют через нейлоновые или металлические фильтры (сетки),
а затем центрифугируют в мягких условиях. Далее обычно про-
топласты «отмывают» от ферментов растворами осмотиков и при не-
обходимости проводят очистку, используя низкоскоростное диффе-
ренциальное или изопикническое центрифугирование.
Протопласты в генетических, физиолого-биохимических
и молекулярных исследованиях
В данном разделе в очень сжатой форме представлены сведения о не-
которых основных направлениях и преимуществах использования
протопластов в разных областях экспериментальной биологии рас-
тений. Материал суммирован в табл. 5.2.1, где указаны особенности
работы с протопластами и приведена дополнительная библиогра-
фия. Чтобы избежать повторов, приводим только описание направ-
лений, согласно их номерам в таблице.
1. В течение двух десятилетий с момента пионерской работы
Cocking [1] внимание исследователей притягивали протопласты
per se. Они были предметом десятков международных симпо-
зиумов, монографий, сборников и томов в продолжающихся
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
411
сериях Springer, CRC Press, Academic Press и др. Ранние экс-
перименты фокусировались на создании условий, способству-
ющих получению большого числа жизнеспособных протоплас-
тов из разных тканей и видов растений. Затем разрабатывались
протоколы, необходимые для восстановления клеточной стен-
ки, возобновления делений (рис. 5.2.1.В и 5.2.1.Г), формирова-
ния клеточных колоний и каллусов, в которых можно индуци-
ровать процессы морфогенеза и регенерацию целых растений
(рис. 5.2.1.Д) [I, II и обзоры III, IV]. На протопластах изучали
закономерности синтеза РНК, ДНК и белков [V, VI] при дедиф-
ференцировке клеток и реактивации клеточного цикла, роль
фитогормонов в делении [VII] и т. д. Деления клеток, сформи-
рованных протопластами, проходят достаточно синхронно. Это
касается не только вновь вступающих в клеточный цикл про-
топластов из клеток мезофилла. Синхронизирующее влияние
отчасти связано с процессами разрушения и восстановления
клеточной стенки, поскольку протопласты, выделенные из про-
лиферирующих, но асинхронных по фазам клеточного цикла
популяций клеток, таких как суспензионные культуры, также
синхронизируют свои клеточные деления. Возможно, опреде-
ленную сигнальную роль играют олигосахариды, получаемые
во время гидролиза компонентов клеточной стенки. Современ-
ные исследования в этих направлениях должны шире вовлекать
протопласты вместе с тонкими подходами анализа индиви-
дуальных макромолекул и возможностями их визуализации
(флуоресцентная и конфокальная микроскопия, проточная ци-
тометрия и др.).
2. Любая гибридизация, будь то половая, при которой объединя-
ются гаметы, или гибридизация культивируемых in vitro сома-
тических клеток животных, предполагает взаимодействие мем-
бран и слияние клеток. Жесткая целлюлозно-пектиновая обо-
лочка клеток растений полностью исключает возможность их
слияния. Поэтому исторически значительный интерес был при-
кован к использованию протопластов для соматической гибри-
дизации [6, 7]. Слияние протопластов, выделенных механичес-
ким путем, наблюдали еще более 100 лет назад [VIII]. Как уже
отмечалось, при обработке ткани ферментами возможно спон-
танное слияние протопластов [4] (рис. 5.2.1.Б), но явление это
не слишком частое, поэтому для его стимуляции был предложен
ряд методов [7]. Часто в качестве индуктора слияния использу-
ют растворы с рН 9-11 и концентрацией Са2+ 100-300 мМ, при
этом протопласты предварительно агглютинируют с помощью
концентрированных растворов ПЭГ (М. в. 1500-6000 Да) [IX].
412 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Первое в мире растение — соматический гибрид Nicotiana
glauca x N. langsdorfii — получил в 1972 г. Carlson [X], а в
1975 г. впервые в нашей стране, в лаборатории Р. Г. Бутенко
были получены соматические гибриды N. tabacum при слиянии
протопластов клеток пластомного мутанта и геномного мутан-
та, гомозиготного по гену Su («сульфур») [10]. Дополнительная
интрига методологии клеточной инженерии заключается в воз-
можности гибридизации между отдаленными видами, что оста-
ется привлекательным и в наше время [XI].
3. Постепенно интерес исследователей сместился от соматической
гибридизации к использованию протопластов в качестве реци-
пиентов генетического материала с целью трансформации [IV].
Были разработаны методы, облегчающие проникновение ДНК в
протопласт с помощью химических медиаторов или электро-
пробоя. В итоге ДНК (например, плазмидная) захватывается
значительной популяцией протопластов и транспортируется в
ядро, где исследуемый ген в составе плазмиды может транскри-
бироваться в течение нескольких дней [8, XII]. Этот феномен по-
лучил название временной экспрессии (или в английском вари-
анте — transient expression). Первые результаты такой экспрес-
сии хорошо заметны уже через сутки (рис. 5.2.2.Г) [XIII]. Но
лишь в небольшой фракции клеток (около 1%) чужеродная
ДНК интегрируется с геномом клетки хозяина и передается по
наследству вместе с другими его генами, что квалифицируют
как стабильную трансформацию [XIV].
4. Нередко физиологам и биохимикам растений необходимо пред-
ставить какой-либо параметр в расчете на клетку. Но тут возни-
кает проблема: подсчитать клетки в составе ткани — дело не-
простое. Существующие методы мацерации тканей, как прави-
ло, предполагают жесткую обработку кислотами, щелочами и
хелатирующими агентами, и часто при высокой температуре.
Освобожденные из ткани клетки, безусловно, будут мертвыми
(дальше их использовать нельзя), да и многие из них разрушат-
ся при мацерации. Альтернатива — выделить протопласты из
ткани и подсчитать в камере гемоцитометра (для клеток расте-
ний оптимальна камера Фукса—Розенталя, более глубокая, чем
камера Горяева). Этот метод очень полезен при изучении при-
роста числа клеток в суспензионных культурах. Сферическая
форма протопласта позволяет легко измерить его диаметр и вы-
числить объем. При изменении осмолярности среды протоплас-
ты ведут себя, почти как идеальные осмометры за счет большой
вакуоли (рис. 5.2.1.Ж), такое их свойство помогло, например,
обнаружить на плазмалемме дополнительные сайты связыва-
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
413
Рис. 5.2.2. Флуоресцентная и конфокальная флуоресцентная микроско-
пия протопластов. (Представлены оригинальные результаты авторов,
если не указано иное.) (А, Б) Конфокальная флуоресцентная микроско-
пия протопластов культивируемых клеток клена (клетки 24 ч инкубиро-
вали без сахарозы, затем с 50 мМ сахарозы и 1 мМ красителя lucifer
yellow-CH); распределение красителя через (А) 1 ч и (Б) 24 ч (краситель
локализован в вакуоли) культивирования с сахарозой (масштаб — 4 мкм
(А) и 20 мкм (Б)) [XXXI]. (В) Фрагмент протопласта клетки сокового ме-
шочка Citrus limettioides, выделенного после 2-часовой инкубации кле-
ток с 250 мМ сахарозы и 100 мкМ А1еха-488 (маркер эндоцитоза); конфо-
кальная микроскопия эндоцитозных везикул содержащих А1еха-488 (на
периферии темного фона вакуоли, масштаб — 8 мкм) [XXXI]. (Г) Конфо-
кальная микроскопия протопласта спустя 20 ч после электропорации в
присутствии плазмиды кодирующей BobTIP26-l::GFP; видна красная
флуоресценция хлорофилла и зеленая флуоресценция GFP (масштаб —
10 мкм) [XIII]. (Д-Ж) Изменение локализации окрашенного FM 1-43
мембранного материала в протопластах миксотрофной суспензии клеток
сахарной свеклы при осмотическом стрессе. Протопласты инкубировали
в изотонической среде (0,4 Μ сорбит), содержащей 15 мкМ FM 1-43
(15 мин), затем на предметном стекле концентрацию сорбита доводили до
0,4 Μ (Д), 0,25 Μ (Ε) или 0,6 Μ (Ж) (красная флуоресценция хлоропластов,
масштаб — 12 мкм). (3, И) Разное фокусирование изображений протопласта
миксотрофной клетки суспензии сахарной свеклы после 5 мин инкубирова-
ния с филипином (масштаб — 12 мкм). n — ядро; * — вакуоль; окончание
стрелки — оболочка ядра; хл — хлоропласты. См. цвет, вклейку, рис. 10
414 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
ния фузикокцина [11]. Непрерывное наблюдение за размерами
индивидуальных протопластов выявило транзиентное умень-
шение их объема в ответ на облучение синим светом [XV]. При
культивировании свежевыделенных протопластов они вначале
«подрастают в размерах», и лишь затем приступают к делению,
что позволяет подойти к изучению возможных механизмов,
контролирующих растяжение клеток. В частности, было показа-
но, что временная экспрессия пептида ENOD40 в протопластах
Arabidopsis или его экзогенное введение приводили к быстрому
ингибированию растяжения клеток [XVI]. Безусловно, ведущую
роль в регулировании клеточного объема играет вакуоль. Напри-
мер, протопласты трансгенных клеток табака со сверхэкспрес-
сией тонопластного аквапорина цветной капусты BobTIP26-1
увеличили свой объем в четыре раза [XIII].
5. Увлечение генетическими аспектами использования протоплас-
тов не затенило их достоинств как физиологических моделей.
Изолированные протопласты, поборовшись с осмотическим шо-
ком и не начав регенерировать стенку и дедифференцироваться,
в физиологическом отношении, как и морфологически, напоми-
нают исходную клетку. Можно получить протопласты из мезо-
филла с высоким уровнем фотосинтеза [XVII] и с сохранением
специфических особенностей C3- и C4-растений [XVIII], из кле-
ток клубеньков с нитрогеназной активностью [XIX]. Затем мож-
но сразу перейти к электрофоретическому методу анализа про-
топластных белков (рис. 5.2.1.Е) без их экстракции и очистки.
Протопласты оказались незаменимым объектом для монито-
ринга внутриклеточного рН, что способствовало выявлению эф-
фекта быстрого рН-статирования цитозоля, в основном за счет
трех механизмов, локализованных в плазмалемме: Н+-АТФазы,
НСO3-/Cl и К+/Н+ антипортеров [XX, XXI].
6. Один из важных моментов в жизни растений — формирование и
увеличение поверхности клеточной стенки при делении и растя-
жении клеток. Протопласты позволяют сравнить обычные за-
программированные процессы «текущего ремонта» с репараци-
ей клеточной стенки после ее разрушения. Сигналом, вероятно,
служит утрата связи плазмалеммы с клеточной стенкой, так как
регенерация происходит не только на поверхности изолиро-
ванных протопластов, но и протопластов плазмолизированной
клетки, сохранившей интактную стенку. Наблюдать процесс
формирования клеточной стенки «с нуля» можно только на изо-
лированных протопластах. Топография поверхности свежевы-
деленных протопластов из разных тканей разных видов расте-
ний сходна (рис. 5.2.1.3) [4, 12, XXII] — без фибрилл и складок,
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
415
незначительно шероховатая с равномерно распределенными по-
рами. Существенно иная поверхность открывается без дополни-
тельной фиксации OsO4 — складчатая (рис. 5.2.1.И), с порами
до 1,5 мкм, часть которых окаймлена глобулами, и сетчатая
(рис. 5.2.1.К), с разнообразными конусовидными ячейками.
(Вероятно, липидсодержащие структуры утрачиваются при про-
водке через органические растворители, и экспонируется бел-
ковый остов плазмалеммы, «сшитый» альдегидной фиксацией
с подлежащим субкортикальным слоем цитоплазмы.) На поверх-
ности протопластов в адекватных условиях через 10-20 мин появ-
ляются первые фибриллы целлюлозы [XXIII], а сеть из них на-
чинает формироваться спустя 3 ч [4].
7. Изолированные протопласты более доступны действию экзоген-
ных факторов и позволяют изучать ответы непосредственно на
клеточном уровне. В 1962 г. Cocking [XXIV] впервые обнару-
жил, что ауксин вызывает увеличение объема протопластов, на-
ходящихся в среде непроникающего осмотика. Дальнейшее изу-
чение этого эффекта [XXV], а также исследования изменений
мембранного потенциала в ответ на экзогенный ауксин, вкупе с
применением специфичных антител, позволили доказать нали-
чие ауксинового рецептора на плазмалемме протопластов таба-
ка [XXVI]. Применяя проточную цитометрию к протопластам
из алейронового слоя ячменя, с помощью флуоресцентно-мечен-
ного авидина удалось показать связывание биотинилированной
АБК с плазмалеммой [XXVII]. Протопласты также активно ис-
пользуют, например, при изучении влияния грибных токсинов
на содержание внутриклеточного АТФ [XXVIII] или действия
элиситоров на генерацию АФК [XXIX].
8. Многочисленные ранние работы, в которых изучалось поступ-
ление меченых молекул (аминокислот, Сахаров, нуклеозидов
и т. д.), предполагали сравнение протопласта с исходной клет-
кой, а не выяснение механизмов транспорта веществ через мем-
брану. Однако изолированные протопласты, лишенные «кажу-
щегося свободного пространства», сформированного апопластом,
сохраняют уникальность модели для прямых исследований
мембранного транспорта.
Вещества и частицы могут попадать в протопласт или вы-
гружаться из него и в мембранных везикулах, которые форми-
руют плазмалемма (в первом случае) или специализированные
эндомембраны (во втором случае). В первых работах с протоп-
ластами методами световой и электронной микроскопии был
обнаружен везикулярный транспорт ферритина и частиц виру-
са табачной мозаики [XXV, XXX]. Развитие флуоресцентной и
416 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
конфокальной микроскопии, а также широкое использование
флуоресцентных красителей и зондов позволило активно изу-
чать динамичную структуру плазмалеммы. Например, вполне
убедительно был показан с помощью непроникающего зонда
lucifer yellow-CH эндоцитоз растворенной сахарозы и даль-
нейший ее транспорт в вакуоли клеток запасающих тканей
(рис. 5.2.2.А-В) [XXXI]. Недавно использование заряженных
золотых наночастиц позволило различить клатрин-зависимый
и независимый путь эндоцитоза в протопластах табака [XXXII].
Для исследования структуры и состава мембран и возможности
их перераспределения между плазмалеммой и внутриклеточ-
ными компартментами применяют красители, резко изменяю-
щие интенсивность флуоресценции при взаимодействии с фос-
фолипидами (полиметиновые красители FM 4-64, FM 1-43 и его
производное FM 2-10) или стеринами (полиеновый макролид —
филипин III). Молекула FM 1-43 легко встраивается в липид-
ный бислой, имея липофильный «хвост», а положительно заря-
женная «голова» препятствует дальнейшему проникновению
через мембрану. Поэтому единственным путем поступления это-
го красителя внутрь клетки является эндоцитоз. Инкубация
протопластов с FM 1-43 приводит к яркому окрашиванию плаз-
малеммы в виде тонкой сплошной линии желто-зеленого цвета,
как в изо-, так и в гипоосмотических условиях (рис. 5.2.2.Д и
5.2.2.Е). После гипертонического стресса отчетливо заметно на-
копление окрашенного FM 1-43 материала в примембранной об-
ласти протопласта (рис. 5.2.2.Ж). Этот материал был «изъят»
из плазмалеммы эндоцитозом, что привело к сокращению пло-
щади поверхности протопласта в гипертонических условиях.
Филипин маркирует также только плазмалемму, но она приоб-
ретает вид пунктирной линии голубого цвета, что может сви-
детельствовать о неравномерном распределении в ней стеринов
(рис. 5.2.2.3 и 5.2.2.И). В настоящее время не вызывает сомне-
ния факт существования в мембранах эукариот специальных
доменов — липидных «рафтов», обогащенных стеринами, сфин-
голипидами и фосфолипидами с преимущественно насыщенны-
ми жирными кислотами [XXXIII].
9. Если удается массово получать протопласты из какой-либо тка-
ни и при этом сохранять их физиологическую активность и
жизнеспособность, то такие протопласты — прекрасный мате-
риал для изолирования клеточных органелл. Уже давно из про-
топластов выделяют ядра деплазмолизом в гипотоническом бу-
фере с последующим механическим разрушением и инкубацией
с низкими концентрациями неионных детергентов [XXXIV].
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
417
Аналогичные принципы подходят для выделения хлоропластов
и митохондрий. Протопласты — хороший источник вакуолей
[XIII, XXXV], цитопластов (протопласты без вакуолей), карио-
пластов и мини-протопластов (ядра с ободком цитоплазмы или
порции только цитоплазмы, окруженные плазмалеммой соответ-
ственно) [XXXVI].
Наконец, концептуально-новые инструментальные подходы,
такие как проточная цитометрия, значительно расширяют возмож-
ности использования протопластов для одновременного решения за-
дач физиологии растений, молекулярной биологии и генетики. Ме-
тод позволяет изучать на миллионах индивидуальных протопластов
морфометрические параметры, анализировать собственную флуо-
ресценцию (хлорофилла, лигнина, вторичных соединений и т. п.) и
ответы специализированных флуоресцентных зондов (на ДНК, РНК,
белки, антигены и т. п.), а также сортировать протопласты по выб-
ранным параметрам [13].
Материалы и оборудование
В настоящее время процедуры изолирования и культивирования
протопластов клеток растений описаны в ряде руководств и обзоров,
но всегда лучше найти конкретные протоколы, соответствующие
определенным тканям и типам клеток. Работа с протопластами, как
правило, проводится в стерильных условиях и требует несложного
оборудования.
Оборудование
1) бокс или ламинар-бокс;
2) инвертированный микроскоп;
3) центрифуга для низкоскоростного центрифугирования;
4) фильтрующие насадки для стерилизации растворов с размера-
ми пор 0,22-0,45 мкм (Millex или др.);
5) автоклав;
6) термостат;
7) спиртовая горелка;
8) пинцеты и скальпели;
9) пипетки на 1, 2 и 5 мл;
10) чашки Петри разных диаметров;
11) стерильные колбы Эрленмейера;
12) центрифужные пробирки;
13) центрифужные стаканы со вкладышами;
418 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
14) «матрасик» из крафта с вложенными в него листами фильтро-
вальной бумаги или кафельная плитка;
15) стеклянные воронки с вложенными в них нейлоновыми сетка-
ми с размером пор 100, 60, 40, иногда 25 мкм;
16) качалка с контролируемыми параметрами;
17) колбы на 1 л для стерильной воды;
18) стаканы (5 шт) на 500-800 мл для стерилизации и промывания
листьев растений водой;
19) штатив для пробирок;
20) камера Фукса—Розенталя для подсчета элементов крови (в стра-
нах Западной Европы популярна камера Neubauer);
21) шприцы с замком Люэра для фильтрующих насадок.
Основные материалы
1) гидролитические ферменты, о которых говорилось выше, вы-
пускаются многими фирмами. Некоторые «японские гомологи»
предлагает, например, компания «Sigma-Aldrich» (Driselase,
D9515; Onozuka RS, C0615; Macerozyme R10, P2401). Следует
иметь в виду, растворы ферментов лучше готовить заранее. Пос-
ле растворения ферментов нужно удалить нерастворимый оса-
док (обычно это целит, препятствующий слеживанию порошка)
центрифугированием, разделить раствор на аликвоты и заморо-
зить при -20 °С. Замораживать рекомендуется обязательно, если
используется ферментный комплекс Driselase, поскольку при-
меси липаз и протеаз менее устойчивы к замораживанию-отта-
иванию;
2) соли, сахароза, маннит, сорбит;
3) Parafilm или адгезивная лента для заклеивания краев чашек
Петри;
4) алюминиевая фольга;
5) этанол 70- и 96% -й;
6) дезинфицирующие вещества (рекомендуемое время обработки):
гипохлорит натрия, например в виде разбавленного в 10-20 раз
бытового отбеливателя (5-20 мин); этанол 70% (0,2-1 мин);
перекись водорода 3% (5-15 мин); хлорид бензалкония 0,05%
(5-20 мин) и др.;
7) растворы красителей (0,1-0,01%) на осмотиках, для определе-
ния жизнеспособности протопластов (окрашиваются протопласты
с поврежденной мембраной): Eosin Y (Colour Index, CI 45380),
Erythrosin В (CI 45430); Evans blue (CI 23860); Phenosafranine В
(CI 50200).
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
419
Протоколы
Растворы ферментов стерилизуют фильтрованием, а посуду — су-
хим жаром при 180 °С в течение 1 ч. Бумажные «матрасики» авто-
клавируют при 2 атм в течение 1 ч, также стерилизуют и дистилли-
рованную воду. Инструменты можно стерилизовать при 120 °С или
прожигать несколько раз над горелкой, предварительно опуская их
в 96% -й спирт. Стол ламинар-бокса и всю стеклянную посуду пред-
варительно протирают 70% -м спиртом. Другие растворы стерили-
зуют в автоклаве при 0,7-0,8 атм в течение двух 15-минутных цик-
лов.
Протопласты из мезофилла табака
1. Листья табака промывают проточной водой, затем ополаскива-
ют дистиллированной.
2. Помещают их в стакан с 70%-м спиртом на 0,5-1 мин.
3. Затем переносят на 3-5 мин в раствор 0,1%-го «Диацида»
(666 мг цетилпиридиний хлорида, 333 мг этанолмеркурий хло-
рида в 1 л дистиллированной воды + 0,2% Tween-20).
4. Трижды по 10 мин промывают стерильной дистиллированной
водой, разлитой в стаканы емкостью 500-800 мл.
5. Помещают в матрасик на фильтровальную бумагу или на сте-
рильную кафельную плитку нижней эпидермой вверх; осторож-
но с помощью скальпеля и глазного пинцета снимают эпидерму,
разрезают на небольшие кусочки шириной 5-10 мм и помеща-
ют на раствор фермента (0,5 Μ манит + 0,5%-я целлюлаза
(Onozuka R10), рН 5,5-5,7), разлитый по 10 мл в 100-мл колбы
Эрленмейера (стерильные) так, чтобы ткань плавала на поверх-
ности.
6. Колбы закрывают фольгой и ставят в темноту при 22 °С на
13-15 ч.
7. Под инвертированным микроскопом оценивают качество и об-
щее количество выделившихся протопластов.
8. Начинают отмывать от фермента, если выделилось достаточное
число протопластов, и они имеют правильную сферическую
форму с равномерно расположенными в них хлоропластами.
9. С помощью пипетки пропускают суспензию через нейлоновые
фильтры (сначала 100 мкм, затем 60 и 40 мкм) в стеклянные
колбы или сразу в центрифужные пробирки.
10. Закрывают пробирки (если нужно, то стерильно) и центрифуги-
руют при 100 g в течение 3 мин.
420 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
11. Осторожно отбирают надосадочную жидкость и добавляют
7-8 мл 0,4 Μ маннита.
12. Затем центрифугируют в тех же условиях, отмывку повторяют
дважды.
13. Пипеткой удаляют раствор маннита и добавляют 1-2 мл среды
культивирования.
14. В чистую стерильную пробирку наливают 0,9 мл среды и 0,1 мл
суспензии протопластов.
15. В камере Фукса—Розенталя определяют число протопластов в
1 мл.
16. На предметном стекле с помощью 0,01% -го раствора Evans blue
или 0,1%-го Eosin Y, приготовленных на соответствующем
осмотике, определяют процент живых протопластов.
17. Исходную суспензию протопластов разводят средой так, чтобы
их конечное число составляло 1-410 в 1 мл (плотность для
культивирования), и по 2 мл разливают в чашки Петри диамет-
ром 50-60 мм.
18. Заклеивают края чашек парафилмом и культивируют в темноте
при 25 °С, наблюдая под инвертированным микроскопом за раз-
витием протопластов.
Протопласты из суспензионной культуры клеток
1. В 250-мл круглодонные колбы помещают 10 мл суспензии кле-
ток и добавляют 10 мл двукратного раствора фермента (макро- и
микросоли среды культивирования + 0,8 Μ сорбит, 0.4%
Onozuka R-10, 0,2% Cellulysin, 0,2% Macerozyme R10, 0,8%
Driselase, pH 5,5-5,7). Эта смесь ферментов дает хорошие ре-
зультаты для многих суспензионных культур клеток.
2. Колбы стерильно закрывают фольгой и ставят на качалку
(60-70 качаний/мин) на 15-18 ч в темноту при 20-22 °С или на
4-6 ч при 25-26 °С.
3. Дальнейшие операции с суспензией протопластов проводят так
лее, как и с протопластами из мезофилла табака (раствор для от-
мывания фермента: макро- и микросоли + 0,36 Μ сорбит).
4. Подсчитывают число протопластов, определяют процент жи-
вых и высевают в чашки Петри с плотностью 5104-105 в 1 мл.
5. Протопласты помещают в темноту при 25 °С.
Цитологические наблюдения
Протопласты, изолированные из мезофилла табака или суспензион-
ной культуры клеток, на соответствующих средах (среда MS для та-
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
421
бака, SH для протопластов из суспензии клеток сахарной свеклы
и т. п.) через 24 ч образуют клеточную стенку, а на 2-3-е сутки наб-
людаются первые деления. Через 20-25 суток культивирования
формируются многоклеточные колонии.
Литература
1. Cocking Ε. С. A method for the isolation of plant protoplasts and
vacuoles // Nature. 1960. V. 187. P. 962-963.
2. Смоленская И. Η., Ралдугина Г. Η. Культура протопластов из
суспензии клеток сахарной свеклы // Физиология растений.
1981. Т. 28. С. 1022-1029.
3. Смоленская И. Н., Носов А. В., Ралдугина Г. Н. Суспензионная
культура клеток кормовых бобов // Физиология растений. 1988.
Т. 35. С. 1229-1237.
4. Jasik J., Smolenskaya I. N., Zorinyants S. Ε., Nosov A. V.,
Baulina O. I., Kristin J. Cytological study on wheat {Triticum
timopheevi Zhuk.) protoplasts // Biol. Plant. 1992. V. 34.
P. 193-201.
5. Зоринянц С. Э., Смоленская И. Η., Носов А. В. Быстрорастущая
суспензионная культура клеток и протопласты пшеницы Тимо-
феева // Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 300-306.
6. Butenko R. G. Cultivation of isolated protoplasts and hybridization
of somatic plant cells // Int. Rev. Cytol. 1979. V. 59. P. 323-373.
7. Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Клеточная инженерия растений.
Киев: Наук, думка, 1984. 160 с.
8. Υоо S. D., Cho Υ. Η., Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a
versatile cell system for transient gene expression analysis // Nat.
Protoc. 2007. V. 2. P. 1565-1572.
9. Wu F.H., Shen S.C., Lee L.Y., Lee S.H., Chan M.T., Lin C.-S.
Tape-Arabidopsis sandwich — a simpler Arabidopsis protoplast
isolation method // Plant Methods. 2009. 5:16 doi:10.1186/
1746-4811-5-16.
10. Глеба Ю. Ю., Бутенко Р. Г., Сытник К. М. Слияние протоплас-
тов и парасексуальная гибридизация у Nicotiana tabacum L. //
ДАН СССР. 1975. Т. 221. С. 1196-1198.
11. Трофимова М. С, Клычников О. И., Носов А. В., Бабаков А. В.
Активация дополнительных сайтов связывания фузикокцина
на плазматической мембране при осмотическом стрессе // Фи-
зиология растений. 1999. Т. 46. С. 9-15.
422 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
12. Соколов О. И., Кривопалов Ю. В., Соколова М. К.у Илъчуков В. В.,
Носов А. В. Топография поверхности и элементы цитоматрикса
протопластов растительных клеток // Физиология растений.
2001. Т. 48. С. 447-454.
13. Galbraith D. W. Protoplast analysis using flow cytometry and
sorting // Flow Cytometry with Plant Cells / Eds Dolezel J.,
Greilhuber J., Suda J. Weinheim: Wiley-VCH Verlag, 2007.
P. 231-250.
Таблица 5.2.1. Основные направления использования изолированных
протопластов клеток растений
Направление использования
и особенности работы
с протопластами
Дополнительная библиография
1. Получение протопластов для
дальнейшего восстановления
клеток, с их последующими делени-
ями и регенерацией растений.
Важно: стерильность; иногда
необходима подготовка исходного
материала; подбор питательных
сред для всех этапов
2. Соматическая гибридизация и
клеточная инженерия растений.
Важно: умение получать расте-
ния-регенеранты хотя бы для про-
топластов одного из партнеров;
хорошее качество протопластов;
стерильность
3. Протопласты — объект для вре-
менной экспрессии генов и генети-
ческой трансформации. Важно: сте-
рильность; специальные растворы
для трансфекции; наличие приемов
культивирования протопластов
и регенерации растений
4. Выделение протопластов для
подсчета числа клеток и определе-
ния их размеров. Важно: объем
протопластов следует измерять
при изоосмотических условиях;
подсчитывать протопласты можно
не отмывая от ферментов
[I] Nagata &Takebe, 1970. Planta. 92:
301-308; [ll]Takebeetal., 1971.
Naturwissenschaften. 58: 318-320;
[III] Galbraith, 1989. Int. Rev. Cytol.
116: 165-227; [IV] Daveyetal.,
2005. Biotechnol. Adv. 23: 131-171;
[V] Kulikowski & Mascarenhas, 1978.
Plant Physiol. 61: 575-580; [VI]
Zelcer & Galun, 1976. Plant Sci. Lett.
7: 331-336; [VII] Meyer & Cooke,
1979. Planta. 147: 181-185
[III, IV]; [VIM] Kuster, 1909. Ber.
Dtsch. bot. Ges. 27: 589-598; [IX]
Kao, 1977. Mol. Gen. Genet. 150:
225-230; [X] Carlson etal., 1972.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69:
2292-2294; [XI] Xia, 2009. J. Gen.
Genom. 39: 547-556
[IV]; [XII] Abel & Theologis, 1998.
Methods Mol. Biol. 82: 209-217;
[XIII] Reisen et al., 2003. Plant Mol.
Biol. 52: 387-400. [XIV] Wang et al.,
2000. Plant Cell Rep. 19: 654-660
[XIII]; [XV] Wang & lino, 1997. Plant
Physiol. 114: 1009-1020; [XVI] Guzzo
et al., 2005. J. Exp. Bot. 56: 507-513
Раздел 5.2. Протопласты клеток растений
423
Таблица 5.2.1. Основные направления использования изолированных
протопластов клеток растений (окончание)
Направление использования
и особенности работы
с протопластами
Дополнительная библиография
5. Протопласты — модель для изу-
чения особенностей метаболизма
клеток различных тканей. Важно:
адекватная оценка выхода из состо-
яния осмотического шока; щадящие
условия выделения; условия культи-
вирования, соответствующие экспе-
риментальной задаче
6. Топография поверхности протоп-
ластов и процессы образования
клеточной стенки. Важно: сочетание
условий, определяющих сохран-
ность протопластов, с требования-
ми подготовки образцов для элек-
тронной микроскопии
7. Исследование ответа протоплас-
тов растений на фитогормоны и
другие стимулы. Важно: при иссле-
довании эффектов регуляторов рос-
та необходимо использовать среды
для протопластов без соответствую-
щих фитогормонов или регуляторов;
истощение по фитогормонам исход-
ного материала;стерильность
8. Изучение структуры плазма-
леммы, трафика мембранного
материала, поглощения веществ и
частиц. Важно: необходимо исполь-
зовать среды пригодные для иссле-
дования транспорта и эндоцитоза
9. Выделение клеточных органелл.
Важно: подобрать буферные систе-
мы, с оптимальным рН, осмотичнос-
тью, солевым составом, концентра-
цией детергентов и стабилизаторов
мембран органелл; стерильность
[XVII] Riazunnisaetal., 2007. Physiol.
Plant. 129: 879-886; [XVIII] Edwards
& Huber, 1978. Proc. IV Int. Cong.
Photosynth.: 29-34; [XIX] Broughton
etal., 1976. Nature. 262: 208-209;
[XX] Трофимова и Молотковский,
1988. Физиология растений. 35:
629-640; [XXI] -"-, 1993. -"-. 40:
94-100
[XXII] Caneko, 1990. J. Electron
Microsc. 39: 426-428; [XXIII]
Williamson etal., 1977. Protoplasma.
91:213-219
[XXIV] Cocking, 1962. Nature. 193:
998-999; [XXV] Power & Cocking,
1970. J. Exp. Bot. 21: 64-70; [XXVI]
Barbier-Brygoo et al., 1989. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 86: 891-895;
[XXVII] Yamazaki et al., 2003. Plant J.
35: 129-139; [XXVIII] Walton et al.,
1979. Plant Physiol. 63: 806-810;
[XXIX] Papadakis &
Roubelakis-Angelakis, 1999. Plant
Physiol. 121: 197-205
[XXV]; [XXX] Cocking, 1965.
Biochem J. 95: 28-29; [XXXI]
Etxeberria et al., 2005. Plant Cell
Physiol. 46: 474-481; [XXXII] Onelli
etal., 2008. J. Exp. Bot. 59:
3051-3068; [XXXIII] Laloi etal.,
2007. Plant Physiol. 143: 461-472
[XIII]; [XXXIV] Saxena et al., 1985. J.
Plant Physiol. 121: 193-197; [XXXV]
Wagner, 1987. Methods Enzymol.
119: 55-62; [XXXVI] Lorz et al.,
1981. Physiol. Plant. 53: 385-391
424 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
5.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ВОДНОГО СТАТУСА
РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ
ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ЗОНДА ДАВЛЕНИЯ
А. Б. Мещеряков, В. П. Холодова
Введение
Многие абиотические стрессоры вызывают сильное нарушение фи-
зиологических функций растений, а их восстановление и стабили-
зация являются важнейшим условием выживания растений при
стрессе и последующей адаптации к существованию в изменивших-
ся условиях, ранее, возможно, непригодных для жизни. Известно,
что основную массу растений составляет вода — 80-96%. Водный
статус растения определяется главным образом величинами водно-
го, осмотического и матричного потенциалов, тургорного давления,
гидравлической проводимостью и объемным эластическим модулем
клеточной стенки. Внутриклеточный зонд давления позволяет опреде-
лить на уровне клетки тургорное давление (Р), объемный эластичес-
кий модуль клеточной стенки (ε) и гидравлическую проводимость
клеточной мембраны (Lp). Градиент водного потенциала в системе
почва — растение — воздушная среда определяет как направление,
так и величину потока воды в растении, основная часть которого
протекает через ксилему и частично апопласт. Необходимость точ-
ного количественного измерения параметров водного статуса расте-
ний очевидна при изучении многих разделов физиологии растений.
Попытки измерения указанных параметров предпринимались дав-
но, уже с начала прошлого века. Несмотря на несомненные успехи в
этой области, надо все же отменить, что такие измерения проводи-
лись либо на целых растениях, либо на довольно больших тканевых
фрагментах с использованием недостаточно точных механических
датчиков давления-растяжения.
Внутриклеточный зонд давления
Только сравнительно недавно профессором У. Циммерманом (Гер-
мания, Институт биофизической химии, г. Юлих) был разработан
метод прямого измерения тургорного давления и ряда других па-
раметров водного обмена индивидуальных клеток растений, по-
лучивший название «pressure probe technique» [1, 2]. Первоначально
измерения можно было проводить только на крупных клетках водо-
рослей, но постепенное совершенствование, автоматизация, стан-
дартизация метода обеспечила ему широкое использование в иссле-
дованиях водного статуса растений. Суть «pressure probe technique»
(в русской литературе — «техника зонда давления», или «внутрикле-
Раздел 5.3. Определение параметров водного статуса клеток 425
точный зонд давления») заключается в том, что в растительную
клетку вводится стеклянный микрокапилляр, заполненный гид-
рофобной жидкостью (силиконовым маслом). Он передает тургор-
ное давление клетки микрозонду, преобразующему механическое
давление в электрическое напряжение, регистрируемое в цифровом
или аналоговом виде, которое после соответствующей калибровки
пересчитывается в единицы давления (Па).
В установке зонда давления используют капилляр диаметром
около 1 мм, оттягиваемый с одного конца до 3-6 мм, кончик при
этом оставляют открытым; длина капилляра 4-5 см. (Для оттягива-
ния кончика капилляра подходит прибор для вытяжки стеклянных
микроэлектродов.) С другого, «толстого», конца капилляр с помощью
специальной тонкой стальной микроиглы диаметром 2,4 мкм и
шприца полностью заполняется дегазированным силиконовым мас-
лом с низкой вязкостью AS 4 («Wacker», Германия). Подготовлен-
ный микрокапилляр (1) (рис. 5.3.1) с помощью специального рези-
нового уплотнителя (4) на резьбе соединяется с прозрачной плекси-
гласовой камерой (5) прямоугольной формы, имеющей несколько
высверленных ходов диаметром не более 1 мм, заполненных сили-
коновым маслом. Ход, к одному концу которого крепится микрока-
пилляр, является сквозным. По нему, частично входя в капилляр,
проходит тонкая серебряная проволока (9), которая на выходе из из-
мерительной камеры уплотняется с помощью специальной эласти-
ческой прокладки на резьбе. С ее помощью можно изменять чув-
ствительность измерительной камеры, продвигая ее вперед-назад
и, таким образом, уменьшая или увеличивая объем силиконового
масла, заполняющего ходы камеры. Один из них идет к металли-
ческому микрозонду давления CQS-140-200D («Kulite», США) —
(6), преобразующему давление в камере в пропорциональное электри-
ческое напряжение. Напряжение поступает на милливольтметр (мы
использовали электрометр модель 602, фирмы «Keithley Inst.»,
США), и самописец со шкалой от 1 мВ (либо компьютер). В другой
ход (7) диаметром 0,17 мм вводится металлический поршень, спо-
собный поступательно передвигаться в двух направлениях (впе-
ред-назад) с помощью электрического микросервомотора со скорос-
тью вращения 2500 об./мин — (8) (вход микропоршня в канал каме-
ры также герметизирован резиновой прокладкой и плексиглазовой
«пробкой»).
Измерение тургорного давления
Измерение тургорного давления Ρ производится следующим спо-
собом. Фрагмент листа (2) крепят клеммой на столике микрома-
нипулятора в кювете (3) из плексигласа (рис. 5.3.1), покрытой фильт-
426 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Рис. 5.3.1. Принципиальная схема измерительного зонда внутриклеточ-
ного давления растений. 1 — стеклянный микрокапилляр, 2 — расти-
тельная клетка, 3 — среда измерения, 4 — резиновый уплотнитель, 5 —
измерительная камера, 6 — зонд давления (микротрансдуктор), 7 — ме-
таллический стержень, 8 — электрический микросервомотор, 9 — сереб-
ряная проволока, 10 — мениск на месте раздела клеточный сок/силико-
новое масло. Описание работы установки см. в тексте
ровальной бумагой, смоченной раствором 0,25 мМ CaSO4; и с по-
мощью микроманипулятора Leitz (Германия) (10) вводят в клетку
заполненный силиконовым маслом микрокапилляр. Поскольку дав-
ление масла в капилляре примерно равно атмосферному, клеточный
сок входит в микрокапилляр с отчетливо видимой границей разде-
ла, или мениском (1). При включении движения металлического
стержня (7), мениск можно возвратить в исходное положение. При
этом давление в измерительной системе становится равным внут-
риклеточному тургорному давлению. Зонд давления (микротранс-
дуктор 6) преобразовывает его в пропорциональное напряжение и
через измерительный прибор передает на самописец. При удачной
попытке измерения на самописце можно было проследить прямую
линию (соответствующую постоянной величине тургора в клетке)
вплоть до 1 ч и более. Область измерений нашей системы — электро-
метр + самописец равнялась от 0 до 1,8 МПа, что превышает макси-
мально возможные значения тургорного давления у подавляющего
большинства растений. Измерения тургора в одной клетке статисти-
чески достаточно повторить 3-5 раз, поскольку, если все воспроиз-
водится аккуратно, без повреждения клетки, величина тургора
практически не изменяется. Для наблюдения за мениском на гра-
нице клеточный сок/масло необходим бинокулярный микроскоп с
Раздел 5.3. Определение параметров водного статуса клеток 427
большим фокусным расстоянием, чтобы можно было вводить доста-
точно крупные фрагменты растений и целые листья. Нами был ис-
пользован микроскоп М420 («Wild», Германия) с фокусным расстоя-
нием 7 см и окулярной микрометрической линейкой, которая при
максимальном увеличении позволяла измерять объекты длиной
от 2-3 мкм. Для освещения объектов служил источник холодного
света KL 1500 («Schott», Германия) с 2 световодами, чтобы избежать
увеличения объема силиконового масла при нагреве.
Методика внутриклеточного зонда давления позволяет также
измерять некоторые параметры внутри- и межклеточного транспор-
та воды, что зачастую необходимо знать при изучении многих про-
цессов физиологии. Наиболее распространены подобные измерения,
например, в области экологии, а также для изучения механизмов
роста и стрессустойчивости.
С помощью зонда давления можно провести измерения, которые
позволяют рассчитать такой важный параметр, как объемный элас-
тический модуль (ε), характеризующий степень эластической рас-
тяжимости клеточной стенки.
Измерение объемного эластического модуля
Принцип метода состоит в том, чтобы количественно оценить изме-
нение Ρ в ответ на дозированное изменение объема клетки. Для это-
го, проведя надежное измерение исходной величины Ρ клетки, не
прерывая регистрации, нужно дозированно изменить объем клетки.
Вначале на микрокапилляре нужно отметить (маркером) положе-
ние мениска, затем поставить на микрокапилляре 1-3 точки на рас-
стоянии 1-2 см ближе к его кончику. Затем с помощью микросерве-
ра нужно произвести быстрый отбор нескольких пиколитров кле-
точного сока (объем определяется расстоянием между выбранными
для данного измерения точками на микрокапилляре), с последую-
щим возвратом к исходному положению. Таким же образом можно
произвести вспрыск дозированного объема содержимого капилляра
(и возврат его в клетку). Эту процедуру, выполняемую с максималь-
ной скоростью, следует повторить несколько раз. Надежными изме-
рениями будут те, при которых возврат Ρ к исходному значению
достаточно точен.
Для расчета величины объемного эластического модуля по
формуле
ε = Vкл x DР / DV,
помимо рассчитанного из произведенных измерений DР, нужно так-
же вычислить:
428 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
1) Vкл — объем исследованной клетки под микроскопом с учетом
геометрических очертаний с помощью микрометрической ли-
нейки (практически два наиболее частых варианта — это шар
или цилиндр);
2) DV— объем введенного либо отобранного клеточного сока, изме-
ренный с помощью микрометрической линейки под микроско-
пом и рассчитанный для кончика капилляра по формуле усе-
ченного конуса (рис. 5.3.2):
DV = ph (R2 + r2 + Rr) / 3,
где π = 3,14; h — расстояние между точками на микрокапилляре
при каждом конкретном изменении объема клетки; R и r — радиусы
капилляра, соответствующие двум концам h.
Рис. 5.3.2. Релаксационная кривая изменения тургорного давления, по-
лученная в результате отбора или инъекции через микрокапилляр микро-
количеств клеточного сока (А), и схема движения мениска клеточный
сок/силиконовое масло в микрокапилляре (Б). 1 — растительная клетка,
2 — микрокапилляр, 3,4 — положения мениска при релаксации внут-
риклеточного давления, по которым рассчитывается величина впрыски-
ваемого в клетку либо отобранного из клетки объема жидкости DV
Раздел 5.3. Определение параметров водного статуса клеток 429
Измерение гидравлической проводимости
клеточных мембран
Техника зонда давления позволяет измерять гидравлическую прово-
димость клеточных мембран, которая рассчитывается по формуле:
Lp = τ1/2 x A/V x (ε - Ρ) x ln 2.
Если измерения и расчеты Ρ, ε и V уже выполнены, а рассчитать
поверхность А клетки не представляет труда, в качестве экспери-
ментальной задачи необходимо записать кривую релаксации дав-
ления и рассчитать из нее полупериод процесса — τ1/2 . Для этого,
как и при измерении е, нужно увеличить либо уменьшить Ρ путем
подачи внутрь клетки или отбора из нее содержимого микрока-
пилляра. Затем с помощью микросервомотора необходимо удержи-
вать мениск строго в определенном положении; тогда, чтобы вернуть
тургор в исходное положение, клетка будет вынуждена либо транс-
портировать воду из апопласта (соседних клеток), либо сбрасывать
ее в апопласт. При этом на самописце регистрируется двухфазная
кривая релаксации давления, основной характеристикой которой
является полупериод процесса τ1/2.
τ1/2, или полупериод релаксации давления, можно вычислить
либо вручную (графически, на ленте самописца), либо с помощью
оцифровки релаксационной кривой на планшете компьютера и
дальнейшего ее преобразования. Второй метод более точен и быстр.
Надо отметить, что уравнение, используемое для расчета гидравли-
ческой проводимости Lp, хорошо работает в области водного потен-
циала, близкого к нулю, то есть в идеальном случае все измерения
для расчета Lp нужно проводить либо в условиях влажной камеры,
либо помещая фрагменты растительной ткани в раствор 0,2-0,5 mМ
CaSO4.
Ниже приведены некоторые опубликованные нами данные по
водным параметрам, полученные методом внутриклеточного зонда
давления на различных растительных объектах и в работах, име-
ющих разную тематику.
Из табл. 5.3.1 в работе, посвященной изучению градиента турго-
ра в клетках зоны роста проростков клещевины, в зависимости от
глубины их залегания [2], четко показано, что величина тургора
возрастает от 0,37 МПа в 4 поверхностном слое клеток до 1,04 МПа
в 12 слое, вплотную прилегающем к центральному проводящему
пучку, где происходит интенсивная разгрузка флоэмных элементов
и активный транспорт в зону роста (наружные слои клеток). Гра-
диент тургора на расстоянии всего 470 мкм составляет 0,7 МПа.
Таблица 5.3.1. Водные параметры кортикальных клеток в зоне роста гипокотиля проростков Ricinus communis L.,
детерминированные глубиной залегания от поверхностных слоев до центрального проводящего пучка
Слои клеток
4,n = 9 5,n = 22 6,n=17 7, n = 9 8,n=11 9,n=10 10,n = 8 12,n=10
Параметры
Ρ, Μ Pa
t1/2, S
ε, МРа
0,37±0,10
5,2±2,1
6,8+2,5
0,58+0,03
4,6±0,9
9,0±3,8
0,64±0,10
4,2±1,5
9,9±4,5
0,73+0,04
4,1±1,9
12,1+3,8
0,83+0,30
3,7±1,2
8,7±3,2
0,87+0,22
2,8+1,1
9,2±4,2
0,86+0,23
2,5±1,2
10,1±2,6
1,04+0,1
2,8+0,4
11,5+3,8
Lp, 10-8(ms-1MPa_1) 1,3±0,6 2,5±0,7 2,9+1,3 3,1 + 1,6 7,3±2,8 6,5±2,9 4,9+2,5 5,3±1,3
Таблица 5.3.2. Параметры водного обмена запасающей паренхимы корня сахарной свеклы сорта Ялтушков-
ская 030 и кормовой Rote Walz
Сорт
Измерение
Ρ, МПа
(η)8-54
τι/2> с
(η)12-106
ε, MPa(n)8-12
Lp, 10"8(ms"1MPa"1)
(n)6-10
Я-030
Я-030
RW
Влаж. камера
1 мМ CaS04
_"_
0,44±0,13
1,98±0,11
1,27±0,15
11±5
13±4
11±5
11,7+7,3
16,1 ±6,6
7,0±2,5
11,6±7,9
5,9±1,7
30,3±12,5
Раздел 5.3. Определение параметров водного статуса клеток 431
Эластический модуль также возрастает от 6,8 до 11,5 МПа, что
вполне объяснимо максимальным растяжением клеточных мембран
и прилегающих к ним клеточных стенок, благодаря низкому осмоти-
ческому потенциалу. Полупериод релаксации и гидравлическая
проводимость клеток, прилегающих к центральному проводяще-
му пучку, выше, чем у поверхностных клеток. Это, по-видимому,
объясняется так: вода поступает в зону роста главным образом по
центральному проводящему пучку, и скорость ее выхода из него в при-
легающие паренхимные клетки значительно выше, чем транспорт
по периферическим слоям.
Табл. 5.3.2 взята из работы, посвященной особенностям водного
обмена запасающей паренхимы сахарной и кормовой свеклы в связи
с проблемами сахаронакопления. Известно, что сахарная свекла яв-
ляется одним из немногих растений, способных накапливать саха-
розу до 20% свежей массы тканей в зрелых корнеплодах. Значение
тургора в клетках таких корнеплодов, измеренное в стандартных
условиях — в растворе с водным потенциалом близким к 0 (1 мМ
CaSO4) — составляет 1,8-2,0 МПа, что значительно превышает тур-
гор известных высших растений (в том числе и для кормовой свек-
лы — 1,3 МПа). Столь высокое тургорное давление и соответствую-
щий ему осмотический потенциал (800-900 мОсммольхкг-1) долж-
ны сочетаться с особыми свойствами клеточных оболочек, ε сорта
сахарной свеклы более чем в 2 раза выше, чем кормовой. Обращает
на себя внимание также «заторможенность» водного транспорта —
это достаточно высокие цифры полупериода релаксации, причем
практически равные у кормовой и сахарной свеклы, а также отсут-
ствие различий при измерении полупериода релаксации при нуле-
вом водном потенциале и во влажной камере. Кроме того, отмечено
особенно низкое значение гидравлической проводимости там, где
она должна бы быть высокой (при измерении клеток сахарной свек-
лы в растворе с нулевым водным потенциалом).
Таблица 5.3.3. Параметры водного режима у листьев Сз и САМ растений
Mesembryanthemum crystallinum L.
Вариант
Растение 1,
3-й лист
Растение 2,
3-й лист
Р,
MПа±SD
(n=6-12)
0,41±0,11
0,39±0,12
ε,
MПа±SD
Cз растения,
3,1±1,5
2,8±2,1
t1/2
s ± SD
0 мМ NaCl
201±101
315±112
Lp, 10-6 x m-1х
xMПа-1±SD
3,33±0,21
3,67±0,54
432 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Таблица 5.3.3. Параметры водного режима у листьев Сз и САМ растений
Mesembryanthemum crystallinum L. {окончание)
р, ε τ.1/2 Lp, 10-6 x m-1 x
Вариант MПа±SD
(n=6-12) МПа±SD s±SD xMna-1±SD
CAM растения, 400 мМ NaCI
Растение 1, 0,58±0,21 6,3±2,2 524±211 0,98±0,05
3-й лист
Растение 2, 0,60±0,19 7,1 ±2,9 677±52 0,84±0,08
3-й лист
Хрустальная травка (М. crystallinum) является идеальным объ-
ектом, который на действие ряда абиотических факторов отвечает
переключением с С3-фотосинтеза на высокоэффективный водосбе-
регающий механизм фотосинтеза САМ-типа Это позволяет хрус-
тальной травке обеспечить 5-10-кратное повышение эффективнос-
ти использования воды и выживание в условиях жесткого водного
дефицита. Растения, выращиваемые в нормальных условиях на вод-
ной культуре и взятые на измерение водных параметров внутрикле-
точным зондом давления, показали в клетках листа обычное значе-
ние тургора: 0,39-0,41 МПа. После внесения в питательный раствор
400 мМ хлористого натрия, стресса и адаптации с переключением на
САМ-фотосинтез растение смогло продолжать вегетацию, однако
приобретя при этом несколько ксероморфную структуру. Тургор по-
высился до 0,58-0,60 МПа, объемный эластический модуль — в
2-2,5 раза, полупериод релаксации также возрос более чем в 2 раза,
гидравлическая проводимость снизилась более чем в 4 раза. Расте-
ние «замкнуло» в себе воду путем изменения описанных выше пара-
метров.
Заключение
Приведенные экспериментальные данные свидетельствуют о том,
что изучение водных параметров клеток может оказаться полезным
в самых разных областях физиологии растений. Метод может пока-
заться достаточно трудоемким, но для определенных целей весьма
продуктивным. Говоря о внутриклеточном зонде давления, необхо-
димо отметить, что, работая на кусочках ткани, мы должны учиты-
вать возможные взаимодействия измеряемой клетки с соседними.
Однако благодаря высокой скорости измерения таких параметров,
как тургорное давление, объемный эластический модуль, видимо,
получаемые значения могут считаться близкими к истинным для них.
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 433
Кроме того, небольшая модификация прибора позволяет изме-
рять водные параметры в клеточных культурах или даже в единич-
ных клетках.
Литература
1. Zimmermann U., Steudle E. The pressure dependence of the
hydraulic conductivity, the membrane resistance and membrane
potential during turgor pressure regulation in Valonia
utricularis // J. Membr. Biology 1974. V. 16. P. 331-352.
2. Huesken D., Steudle E., Zimmermann U. Pressure probe technique
for measuring water relations in higher plants // Plant Physiol.
1978. V. 61. P. 158-163.
3. Meshcheryakov Α., Steudle E., Komor E. Gradients of turgor,
osmotic pressure, and water potential in the cortex of the hypocotyl
of growing Ricinus seedlings // Plant Physiol. 1992. V. 98.
P. 840-852.
4. Мещеряков А. Б., Лукьянова Ο. Α., Холодова В. П. Особенности
водного обмена запасающей паренхимы корня сахарной свеклы
Beta vulgaris L. в связи с сахаронакоплением //Физиология рас-
тений. 1992. Т. 39. С. 1116-1125.
5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК
ВОДНОГО БАЛАНСА РАСТЕНИЙ - ВОДНОГО
И ОСМОТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА И ТУРГОРА -
МЕТОДОМ ТЕРМОПАРНОЙ ИЗОПИЕСТИЧЕСКОЙ
ПСИХРОМЕТРИИ
А. А. Котов, Л. М. Котова
Введение
Водный потенциал растительных клеток и тканей (ψw)1 представля-
ет собой сумму двух основных потенциалов — осмотического потен-
циала клеточного содержимого (ψ8) и потенциала внутриклеточного
1
Сокращения: термоэдс — термоэлектродвижущая сила; Tel и Тс2 — первый и
второй растворы, наносимые на сенсорный спай термопары с разными осмоти-
ческими потенциалами ψs Tc1 и ψsTc2; U dry — термоэдс «сухой» термопары без
раствора; U Tc — термоэдс, генерируемая термопарой с раствором, имеющим осмо-
тический потенциал ψs Tc; ψs Tc — осмотический потенциал наносимого на термопа-
Tc(iso)
ру раствора; ψs — осмотический потенциал изопиестическои точки; ψp —
тургорное давление; ψs — осмотический потенциал; ψs+m — комбинированный
осмотический и матричный потенциал; ψw — водный потенциал.
434 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
давления (ψp), каждый из которых может быть определен отдель-
ным методом. Наиболее прост в определении ψs, его величина кор-
ректно измеряется с использованием как криоскопического, так и
термопарно-психрометрического методов [1] и не требует большого
количества материала. Для измерения ψp необходима более слож-
ная техника pressure-probe [2], которая применима для тканей с
крупными клетками (более 100 мкм), что ограничивает возможность
отдельной оценки данного параметра. Для определения ψw ранее ис-
пользовался метод подбора раствора осмотика с ψs, изопиестичным
ψw, при котором, после кратковременной инкубации в нем пробы,
раствор не меняет концентрацию, или, наоборот, проба не меняет
своих размеров (метод Рихтера). Наибольшее распространение по-
лучил метод струек В. С. Шардакова, основанный на оценке измене-
ния плотности серии растворов маннитола или сахарозы с разным ψs
до и после инкубации с ним растительной пробы [1, 3]. Недостатком
такого определения ψw является невысокая точность и необходи-
мость большого количества материала. Попытка измерения ψw рас-
тительных проб термопарно-психрометрическими осмометрами ко-
нструкции Spanner и Richards & Ogata выявила некорректность по-
лучаемых результатов, связанную с их значительным искажением
из-за вариабильности коэффициента сопротивления диффузии во-
дяного пара кутикулярного покрова разных проб [4, 5]. Несмотря на
такой принципиальный недостаток, метод может быть применен
при предварительной скарификации объекта, однако это не всегда
приемлемо. Данная проблема была преодолена с помощью изопиес-
тического подхода, который Воуег применил, используя конструк-
цию психрометра Richards & Ogata [6, 5]. Последний способ приго-
ден для оценки как ψs, так и ψw, обладает высокой точностью, не
требует большого количества материала, и практически для любого
объекта дает возможность непрямого измерения ψ = ψw - ψs [2, 7, 8, 9].
Принцип метода
Определение водного потенциала (ψw) объекта с помощью термопар-
ного психрометра основано на измерении термоэлектродвижущей
силы (термоэдс), возникающей в результате охлаждения или нагре-
ва капли воды или растворов с различными значениями ψw на сен-
сорном контакте (спае) термопары при испарении водных паров с
нее или конденсации водных паров на нее из расположенного вбли-
зи тестируемого образца. Стационарное значение температуры сен-
сорного контакта, а значит, и выходное термоэдс, является результа-
том установления динамического равновесия между интенсивнос-
тью притока/оттока тепла за счет переносимых к датчику водяных
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 435
паров и скоростью диссипации этого тепла на самом датчике в силу
его теплопроводности [5]. Поскольку поток паров между объектом и
раствором на термопаре находится в прямой зависимости от разни-
цы их ψw и в обратной — от сопротивления диффузии водяного пара
поверхности объекта, в случае калибровки психрометра по свободно
испаряющим растворам результаты оценки ψw растительных орга-
нов, обладающих кутикулой, могут быть некорректны. Для устра-
нения влияния кутикулярного сопротивления применяют изопиес-
тический подход [5]. Для одного и того же образца проводят как
минимум два последовательных измерения термоэдс термопарами,
несущими на сенсорном спае растворы с разными осмотическими
потенциалами (ψs), что позволяет вычислить ψs «изопиестической
точки» [5], численно равный ψw пробы, в которой не происходит об-
мена водными парами между образцом и каплей в термопаре, т. е.
термоэдс равен нулю.
Технической особеностью изопиестического метода является
быстрая смена термопар (за 2-3 с). Психрометры, выпускаемые про-
мышленностью, не позволяют проводить измерения в данном режи-
ме; используют термопарные психрометры, которые можно изгото-
вить самостоятельно. Одним из вариантов таких приборов является
усовершенствованный нами [8] вариант психрометра Boyer [5]. Мо-
дифицированная конструкция отличается наличием защитного
колпачка на термопаре, что делает процесс ее смены простым и быст-
рым. Внесенные модификации также исключают необходимость
извлечения пробы из камеры после измерения ψw для ее заморажи-
вания в жидком азоте и оттаивания перед измерением комбиниро-
ванного осмотического и матричного потенциала ψs+m. Данная осо-
бенность увеличивает точность определения ψ , вычисляемого как
ψw — ψs+m> а. также позволяет использовать минимальные количест-
ва растительного материала, проводя измерения всех трех компо-
нентов ψw, ψs+m, ψp в одной пробе [8, 9].
Материалы и оборудование
Термопарный психрометр
Измерительный комплекс состоит из 4 блоков (рис. 5.4.1): несколь-
ко (до восьми) измерительных ячеек с тестируемыми образцами и
погруженными в них на время измерения сменными термопарами
(Блок А) расположены в термоизолированном боксе (Блок Б), вы-
ходные электрические кабели термопар вложены в специальные
узкие прорези в стенке термобокса и далее через кнопочный пере-
ключатель (Блок В) соединены с измерительным прибором (Блок Г).
436 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Рис. 5.4.1. Функциональная схема термопарного психрометра (ниже см.
пояснения к рис.). См. цвет, вклейку, рис. 11
Пояснения к рис. 5.4.1: блок А — измерительная ячейка для размеще-
ния термопары и тестируемого образца (слева представлена в сборе):
1 — баррель: латунная часть (1a), полипропиленовая часть, экраниро-
ванная с внутренней поверхности алюминиевой фольгой (1б), провод, сое-
диняющий алюминиевый экран внутри барреля с внешней водной средой
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 437
термобокса (1в); 2 — латунная тер;мопарная камера; 3 — латунная крыш-
ка термопарной камеры с фторопластовой прокладкой (За) и силиконо-
вым кольцом (36); 4 — проба растительного материала; 5 — плунжер:
латунная часть (5а), полипропиленовая часть, экранированная алю-
миниевой фольгой (56), скользящий пластиковый защитный колпачок
(5в), ручка для переноса (5г); 6 — термопара: ветви (6а), сенсорный кон-
такт (спай) в форме серебряного кольца (66), опорные контакты (спаи)
(6в), провода (6г), экранированный провод (6д), стержни штекера про-
вода (6е), заземления экранов проводов (6ж). Блок Б — термостатирую-
щий бокс для размещения 8 измерительных ячеек (на схеме в качестве
примера изображена одна измерительная ячейка): 7 — пенопластовая
коробка с крышкой (7а), пенопропиленовыми вкладышами (76), снаб-
женными прорезями для проводов, и платформой из плексигласа (7в) и
пенопропилена (7г) с отверстиями для баррелей и минимешалки; 8 —
сосуд с водой; 9 — минимешалка; 10 — заземляющий провод сосуда с
водой. Блок В — блок коммутаций и переключателя. Для удобства на
схеме полностью показана электроизмерительная цепь только для од-
ной термопары: 11 — алюминиевая панель штекеродержателя с клем-
мой заземления (На); 12 — кнопка переключателя; 13 — внутренние
контактные клеммы переключателя; 14 — «нулевой» короткозамк-
нутый штекер; 15 — заземление экрана кабеля, соединяющего пере-
ключатель с нановольтамперметром. Блок Г — измерительный блок
(нановольтамперметр Р341 с усилителем Ф127/1 схематично показан
общим рисунком): 16 — клеммы нановольтамперметра.
Минимальный используемый измерительный диапазон нановоль-
тамперметра Р341 составляет ±1мкВ с ценой деления 20 нВ.
Измерительная ячейка (рис. 5.4.1., блок А) состоит из барреля
(1) с привинченной к нему термопарной камерой (2) с крышкой (3), в
которой размещен растительный материал (4), и вставленного в бар-
рель плунжера (5) с термопарой (6), погруженной в камеру. Латун-
но-пластиковый баррель представляет собой полый цилиндр, к ни-
жней латунной части (1а) которого прикреплена латунная камера
(2) с тестируемыми образцами (4). Камера надежно защищена от
проникновения термостатирующей воды благодаря крепежному
распорному силиконовому кольцу крышек (3б), а гидрогерметич-
ность внутренней полости барреля обеспечена резьбовым соедине-
нием между баррелем (1) и крышкой (3), плотно зажимающим фто-
ропластовую прокладку (За) между торцевой стороной стенки бар-
реля и фланцем крышки. В зависимости от величины и количества
тестируемого растительного материала использовали термопарную
камеру меньшего или большего размера — диаметром 10 мм и высо-
той 12 мм или диаметром 14 мм и высотой 14 мм, привинчивая к
438 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
баррелю крышки соответствующего типа. В баррель погружен плун-
жер (5) — латунно-пластиковый стержень, на его нижней латунной
части (5а) находится хромель-копелевая термопара (6а), сенсорный
(66) и опорные (6в) спаи которой проникают внутрь камеры с тести-
руемым материалом через узкое сквозное отверстие (диаметр 3 мм) в
ее крышке (3). Латунная часть плунжера (5а) при этом герметично
закрывает отверстие крышки камеры. Обе латунные части плунже-
ра (5а) и барреля (1а) выполняют роль проводника тепла для термо-
стабилизации опорных спаев термопары (6в) — мест крепления ее
хромелевой и копелевой частей к медным проводам (6г). Хромеле-
вая и копелевая части термопары (6а) представляют собой две про-
волоки длиной 10 мм и диаметром 50 мкм, место контакта их друг с
другом является термочувствительной точкой (сенсорный спай, 66)
с DU/DT равным 69 мкВ/°С [10, с. 403], выполненным в форме сереб-
ряного кольца (диаметр 1,5 мм, высота 0,5 мм, толщина 80 мкм), к
которому с обеих сторон припаяны ветви термопары. Кольцо слу-
жит местом размещения раствора с известным ψs, испарение или
конденсация водных паров которого изменяют температуру сенсор-
ного спая относительно опорных, создавая тем самым термоэдс в
цепи термопары, измеряемую нановольтамперметром [10, с. 339].
Верхние полипропиленовые половины барреля (16) и плунже-
ра (56) дополнительно термоизолируют латунные части, позволяя
опускать их до середины водяного бокса. Плунжер наполовину за-
крыт внешним подвижным полипропиленовым колпачком (5в),
способным скользить вдоль него. Он предохраняет термопару во вре-
мя ее движения в барреле, центрируя ход плунжера. Для снятия эф-
фекта электризации при движении колпачка внешние и внутренние
полипропиленовые поверхности плунжера и барреля, соответствен-
но, экранированы тонкой алюминиевой фольгой, соединенной с об-
щей системой заземления. Экран барреля соединен с водной средой
заземленного термобокса (1в), а экран плунжера — с заземленным
экраном проводов термопары (6ж). Изолированные медные провода
(диаметр 0,15 мм) присоединены к опорным спаям термопары и про-
ходят внутри плунжера, попарно перевиты и заключены на всем
протяжении до штекера (6е) в заземленную экранирующую оболоч-
ку (6ж), что защищает сигнал термопары от наведенных и статичес-
ких электропомех. С целью избегания образования паразитных тер-
моэдс провода термопары плотно соединены со стержнями штекера
без припаивания. Для предотвращения окисления контактные кон-
цы медных стержней штекеров (6е) имеют гальваническое серебря-
ное покрытие.
Местом проведения психрометрического измерения проб явля-
ется термоизолирующий пенополистироловый бокс с внешними
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 439
габаритами 330x330x330 мм (рис. 5.4.1, Блок Б, 7), защищающий
измерительные ячейки от температурных флуктуации окружаю-
щей среды, которые должны быть снижены до ±5х10-4 °С [6]. Кон-
тейнер заполнен на 2/3 водой, налитой в металлический эмалиро-
ванный сосуд (8), и снабжен минимешалкой (9) для устранения вер-
тикального температурного градиента, характерного для водных
сред. Установки рассчитана на одновременное использование 8 из-
мерительных ячеек, размещаемых в общем термобоксе.
Экранированные провода термопары соединены с измеритель-
ным блоком через переключатель (рис. 5.4.1, Блок В). Штекеры
термопар фиксируют в гнездах штекеродержателя (на рисунке не
показан), изготовленного из оргстекла и закрепленного на внешней
алюминиевой панели переключателя (11). Для удобной многока-
нальной коммутации с фиксацией включенной кнопки (12) при вза-
имном выключении других, использована механическая система
модульного переключателя (тип ПКнбЗ), управляющая соединени-
ем неподвижных стержней штекеров с серебряными контактами
гибких медных пластин (13). Для снижения возникновения пара-
зитных термоэдс переключатель с измерительным прибором соеди-
нен медными нелужеными проводами. К алюминиевой панели пере-
ключателя подключены провода заземления термобокса (рис. 5.4.1,
Блок Б, 10), экранов термопарных кабелей (рис. 5.4.1, Блок А, 6ж)
и экрана кабеля переключателя (рис. 5.4.1, Блок В, 15), соединяю-
щего его с измерительным прибором — нановольтамперметром Р341
с блоком фотоусилителя Φ 127/1 (Россия, рис. 5.4.1, Блок Г), клем-
ма заземления которого уже непосредственно была связана с медной
пластиной, врытой в землю.
Латунные заглушки (рис. 5.4.2.В) погружаются в баррель до и
после ввода в них термопар и служат для герметизации термопар-
ных камер. К нижней площадке заглушек приклеены мягкие поли-
эфирные прокладки (рис. 5.4.2.В, 12), на которых наносят тонкий
слой вазелина для плотного закрывания отверстий крышек камер.
Временные алюминиевые крышки для термопарных камер с от-
верстием для сбора материала (конкретный диаметр зависит от тес-
тируемого материала) (рис 5.4.2.А, 2).
Вазелин — высокоочищенный бескислотный медицинский ва-
зелин с концентрацией зольных элементов менее 0,002% (глазной;
ОДО «АКСО», Беларусь) или Apiezon «N» («Serva», Германия).
Влажный бокс для сбора растительного материала. Бокс с при-
мерными габаритами: длина — 90 см, ширина — 53 см, высота —
65,5 см, выполнен в виде каркаса из плексигласовых брусьев, стенки
которого, кроме передней фронтальной, затянуты полиэтиленом. К
открытой части бокса крепится съемная панель — полиэтиленовый
440 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Рис. 5.4.2. Элементы и аксессуары термопарного психрометра (стрелка-
ми показана последовательность их использования) (ниже см. пояснения
к рис.). См. цвет. вклейку, рис. 12
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 441
Пояснения к рис. 5.4.2: (А) Подготовка термопарной камеры перед сбо-
ром проб. (Б) Подготовка барреля. (В) Латунная заглушка для термо-
парной камеры. (Г) Монтаж термопарной камеры к баррелю и гермети-
зация ее латунной заглушкой. (Д) Плунжер с термопарой. (Е) Плунжер
с термопарой, погруженный в баррель с термопарной камерой во время
измерения пробы. (Ж) Герметизация и перемещение камеры в крио-
держатель перед замораживанием пробы в жидком азоте. 1 — термо-
парная камера, покрытая изнутри вазелином; 2 — временная алюми-
ниевая крышка камеры с отверстием для сбора материала; 3 — герме-
тизирующий полистироловый контейнер для хранения термопарной
камеры перед взятием проб (два донышка чашек Петри диаметром 4 см,
скрепленные лентой Parafilm); 4 — баррель; 5 — провод, соединяющий
алюминиевый экран внутри барреля с внешней водной средой термо-
бокса; 6 — тефлоновая лента, герметизирующая место соединения верх-
ней полипропиленовой части барреля с нижней латунной; 7 — крышка
термопарной камеры, покрытая изнутри вазелином и привинчивающа-
яся к латунной части барреля; 8 — полипропиленовый колпачок; 9 —
стеклянная пробирка; 10 — латунная часть заглушки; 11 — скользя-
щий полипропиленовый защитно-направляющий колпачок; 12 — по-
лиэфирная прокладка (скотч), наклеенная на тонкий поролон, для гер-
метизации отверстия крышки камеры; 13 — термопара; 14 — латунная
часть плунжера; 15 — полипропиленовая часть плунжера, экраниро-
ванная алюминиевой фольгой; 16 — экранированные провода термопа-
ры; 17 — штекер термопары; 18 — ручка для переноса плунжера; 19 —
полипропиленовая заглушка для герметизации отверстия :крышки тер-
мопарной камеры при криообработке в жидком азоте; 20 —- наконечник
полипропиленовой заглушки; 21 — криодержатель термогдарной каме-
ры; 22 — нижнее кольцо криодержателя с резьбой; 23 — втулка, фик-
сирующая полипропиленовую заглушку в криодержателе; 24 — направ-
ляющие стержни криодержателя; 25 — пружинные фиксаторы; 26 —
проволока дополнительного закрепления термопарной камеры в крио-
держателе.
лист на прямоугольном алюминиевом каркасе, в который вмонтиро-
ваны рукава из тонкого полиэтилена и мини-рукава для выхода оку-
ляров микроскопа.
Стереомикроскоп МБС-10, размещаемый в камере на время сбора
проб, герметично закрыт мягким полиэтиленовым мешком с отвер-
стиями для окуляров и объектива, что не мешает работе с его фокуси-
рующими винтами; линза объектива снабжена герметичнс закреплен-
ным стеклянным окошком из чашки Петри соответствующего размера.
Растворы с известным осмотическим потенциалом по 3 мл
в 10-мл пенициллиновых флаконах для нанесения на термочувстви-
442 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
тельный спай (петлю) термопары: дистиллированная вода (ψ3 = 0) и
три раствора сахарозы с ψs = 0,295 МПа (0,11 М), 0,594 МПа (0,22 М)
и 0,912 МПа (0,33 М).
Полипропиленовые заглушки (рис. 5.4.2.Ж, 19) для герметиза-
ции крышек термопарных камер во время криообработки находя-
щихся в них проб.
Криодержатель для термопарных камер (рис. 5.4.2.Ж, 22) с
пластиковой втулкой (рис. 5.4.2.Ж, 23), скользящей по направляю-
щим стержням держателя (рис. 5.4.2.Ж, 24) и фиксирующий по-
липропиленовую заглушку крышек камер с помощью пружинных
фиксаторов (рис. 5.4.2.Ж, 25).
Термос с жидким азотом.
Ход определения
Подготовка материалов перед определением
За один или более дней до сбора проб наносят вазелиновое покрытие
на внутреннюю поверхность термопарных камер, их латунные крыш-
ки, нижние части латунных заглушек и торцевые части термопар-
ных плунжеров вокруг места прикрепления термопары. Для нанесе-
ния используют шприц на 5 мл, подающий вазелин через надетый
на него наконечник от автоматической варипипетки на 200 мкл.
Термопарные камеры перед нанесением нового вазелинового
покрытия предварительно промывают хлороформом для удаления
остатков прежнего. Тонкий равномерный слой покрытия формиру-
ют переворачиванием нагретой до ~80 °С камеры с небольшим коли-
чеством расплавленного вазелина, давая стечь его излишкам на
фильтровальную бумагу. После остывания камеру переворачива-
ют, вновь нагревают, тонким полиэтиленовым капилляром уда-
ляют из краев дна камеры излишки вазелина, вновь переворачи-
вают вверх дном и дают остыть до комнатной температуры. Каме-
ры (рис. 5.4.2.А, 1) далее накрывают временными алюминиевыми
крышками с отверстием для сбора материала и до взятия проб хра-
нят в индивидуальном герметичном контейнере, представляющем
два донышка от полистироловых чашек Петри диаметром 4 см,
скрепляемых вместе пленкой Parafilm (рис. 5.4.2.А, 3).
Латунные крышки камер покрывают изнутри вазелином также
при нагревании до ~80 °С, удаляя его излишки тонким полиэтиле-
новым капилляром. Остывшие крышки ввинчивают снизу в латун-
ную часть баррелей (рис. 5.4.2.Б), сверху баррели закрывают полип-
ропиленовыми колпачками (рис. 5.4.2.Б, 8) и комплексы крыш-
ка-баррель-колпачок хранят вертикально подвешенными внутри
стеклянных пробирок (рис. 5.4.2.Б, 9) в штативе. Аналогичным
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 443
способом в пробирках хранят плунжеры с термопарами и латунные
заглушки (рис. 5.4.2.В).
Влажный бокс подготавливают за день до сбора проб, покрывая
изнутри его стенки на половину высоты листами влажной фильтро-
вальной бумаги. При снятой передней панели в нем размещают не-
обходимые инструменты и оборудование: стереомикроскоп МБС-10,
термопарные камеры в герметичных контейнерах (рис. 5.4.2.А, 3),
баррели с привинченными к ним крышками камер (рис. 5.4.2.Б),
латунные заглушки (рис. 5.4.2.В), матерчатые салфетки для про-
тирки окошка объектива микроскопа, инструменты для иссекания
и переноса в термопарные камеры растительного материала (скаль-
пель, ножницы, пинцет), стеклянную палочку для разравнивания
материала в термопарных камерах, а также чашку Петри для скла-
дывания временных крышек камер. Далее бокс закрывают пере-
дней панелью и оставляют на ночь для насыщения водными парами.
Сбор проб и проведение измерений
В день сбора проб, за 1-2 ч до начала работы в камеру через рука-
ва вносят требуемое количество опытных растений. Термопарные
камеры по мере необходимости освобождают из их контейнеров
(рис. 5.4.2. А, 3) и помещают в них высекаемые из растений кусочки
органов в количестве, достаточном для покрытия их дна. Заполне-
ние производят через отверстие в центре временной алюминиевой
крышки камеры (рис. 5.4.2.А, 2), что позволяет аккуратно разме-
щать материал на дне, не допуская его прилипания к боковым стен-
кам камеры. После крышку снимают, равномерно распределяют
материал стеклянной палочкой по дну и камеру закрывают латунной
крышкой, держа ее за привинченный к крышке баррель (рис. 5.4.2,
Б и Г). Затем у барреля сверху снимают полипропиленовый колпа-
чок и вводят в него латунную заглушку (рис. 5.4.2, В и Г), закрыва-
ющую отверстие в крышке камеры. После окончания сбора проб
всей опытной партии их переносят в водный термобокс (рис. 5.4.1,
блок Б). Время инкубации камер в термобоксе, которое необходимо
для их термостабилизации и насыщения водными парами пробы,
оценено на модельной системе. Тест-объектом являлся смоченной
водой диск фильтровальной бумаги, и выход на плато термоэдс по-
груженной в камеру с диском термопары, несущей на чувствитель-
ном спае дистиллированную воду, происходил через 5 ч инкубации.
Перед проведением основных измерений вклад тепла, исходя-
щего от живого объекта и нагревающего сенсорный спай термопа-
ры, определяют по термоэдс «сухой» термопары без раствора (Udry Tc).
Для этого за 1,5 ч до начала определения ψw латунные заглушки за-
меняют «сухими» термопарами, через 30 мин измеряют UdryTc, пос-
444 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
ле чего термопары вновь заменяют заглушками. После 5 ч инкуба-
ции проб в термобоксе проводят измерения, необходимые для опре-
деления ψw. Для этого при открытой крышке термобокса (рис. 5.4.1,
66) латунные заглушки заменяют термопарами, несущими на сен-
сорном спае один из растворов Tc1 с известным ψsTcl. Раствор вводят
в петлю сенсорного спая, осторожно погрузив конец термопары в
жидкость, затем сосуд с раствором резко опускают, в результате
чего внутри серебряного кольца на сенсорном спае (рис. 5.4.1, 7а)
остается сферическая капля, объем которой (1,8 мкл) определен диа-
метром окружающего ее кольца и одинаков для всех термопар. Бла-
годаря наличию на плунжере с термопарой защитного колпачка
процедура замены им латунной заглушки в одном барреле составля-
ет 2-3 с. После ввода термопар во все тестируемые камеры с пробами
крышку термобокса закрывают, пропустив аккуратно экранирован-
ные провода термопар (рис. 5.4.1, 6д) через прорези в пенопропиле-
новом вкладыше термобокса (рис. 5.4.1, 76), и оставляют систему для
уравновешивания. Установку нулевого значения нановольтампер-
метра в режиме измерения напряжения U (термоэдс) проводят
включением в измерительную цепь короткозамкнутого штекера «О»
(рис. 5.4.1, 14). В конце 20-мин пребывания термопар в камерах
измеряют их термоэдс (UTc1), последовательно подключая кно-
почным переключателем (рис. 5.4.1, Блок В, 13) выходы с термо-
пар (рис. 5.4.1, бе) к измерительной цепи нановольамперметра
(рис. 5.4.1, Блок Г, 16). Среднее время измерения термоэдс 8 проб
составляет 10 мин. Далее термопары в баррелях вновь быстро заме-
няют на заглушки и через 1 ч аналогично измеряют термоэдс UTc2
с термопарами, несущими на сенсорных спаях раствор Тс2 с другим
известным ψsTc2. Измерения каждой пробы проводят индивидуаль-
ной термопарой, сенсорный спай которой между измерениями про-
мывают дистиллированной водой, и кольцо на спае просушивают
осторожным промоканием острым уголком фильтровальной бума-
ги. После проведения второй серии измерений термопары с Тс2 в
баррелях заменяют на криоустойчивую полипропиленовую заглуш-
ку (рис. 5.4.2.Ж, 19), наконечник которой (рис. 5.4.2.ж, 20) плотно
герметизирует отверстие крышки термопарной камеры. Далее про-
бы подготавливают к определению их ψs+m.
Баррели с камерами извлекают из водного термобокса, промо-
кают снаружи фильтровальной бумагой и камеры с материалом
без разгерметизации переносят в держатель для криообработки
(рис. 5.4.2.Ж, 21). Для этого крышку с камерой и полипропилено-
вой заглушкой вывинчивают из барреля (рис. 5.4.2.Ж) и ввинчива-
ют в нижнее кольцо криодержателя (рис. 5.4.2.Ж, 22). Для полной
герметичности при погружении в жидкий азот место вхождения на-
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 445
конечника заглушки в отверстие крышки смазывают вазелином.
Полипропиленовую заглушку закрепляют на держателе пластико-
вой втулкой (рис. 5.4.2.Ж, 23) с помощью пружинных фиксаторов
(рис. 5.4.2.Ж, 25). Герметичность соединения камеры с крышкой в
жидком азоте обеспечивает криостойкая О-образная силиконовая
прокладка крышки (рис. 5.4.1, Блок А, 36), используемая в плун-
жерах медицинских шприцов типа Record на 1 мл («Chirana», Вен-
грия). Для надежности удержания крышки на камере при криообра-
ботке дно камеры дополнительно фиксируют проводами, закрепляя
их на нижней части держателя (рис. 5.4.2.Ж, 26). Криообработку
проб ведут, погрузив термопарную камеру до уровня крышки на
2 мин в жидкий азот (до прекращения кипения азота вокруг), и до
измерения ψs+m при необходимости хранят при -20 °С.
Перед измерениями ψs+m камеры с пробами уравновешивают
при комнатной температуре ~1 ч. Камеры вывинчивают из криодер-
жателей и привинчивают к баррелям, быстро заменяют полипропи-
леновые заглушки крышек камер на латунные и переносят в термо-
бокс. Аналогично процедуре измерения ψw после 5 ч инкубации про-
водят измерение ψs+m убитого замораживанием материала, но без
оценки его фоновой теплоотдачи «сухой» термопарой, приняв
UdryTc = 0.
Интерпретация результатов
Расчеты значения ψw (МПа) по результатам измерений термоэдс
(мкВ) проводят нахождением изопиестической точки с ψsТс(iso) = ψw
условием которой является равенство Udry Tc = aψsTc(iso) + b, где а и
b — коэффициенты линейной зависимости между ψ8Το раствора на
термопаре и термоэдс UTc = aψsTc + b [5]. Значения а и b для каждой
пробы находят решением системы двух уравнений с использовани-
ем измеренных UTc1 и UTc2 и известных ψsTc1 и ψsTc2:
UtTcl = aψsTc1 + b,
UtTc2 = aψTc2 + b,
где
a = (UtTc1 - UtTc2)/(ψsTc1 _ ψsTc2),
b = UtTcl - ψsTc1 [(UtTc1 - - UtTc2)/(ψsTc1 _ ψTc2)]
и, окончательно, ψw = ψsTc(iso) = (Udry Tc/a) - b/a.
446 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Аналогично процедуре измерения ψw, проводят измерение ψs+m
убитого замораживанием материала, для которого Udry Tc = 0. По
разнице потенциалов, полученных для «живой» и «убитой» пробы,
вычисляют величину клеточного тургора ψp = ψ/w - ψs+m.
Оценка метода, возможные проблемы
В данной методике анализ параметров водного статуса проводится
на изолированных частях растений, лишенных постоянного прито-
ка воды. Вследствие этого для молодых растущих органов, в отли-
чие от зрелых, результатом определения ψ является не его реаль-
ная, а более низкая величина, называемая пороговым тургором Y [7,
11, 9]. Снижение (релаксация) ψ до Y происходит за счет пластичес-
ких свойств (текучести) молодых клеточных стенок и играет роль
механизма, благодаря которому ψw растущего органа постоянно ре-
лаксирует, поддерживая свой уровень ниже ψ0 окружающего апо-
пластного раствора (ксилемного содержимого), что обеспечивает при-
ток воды в клетки по градиенту водного потенциала, вызывая их
рост. У, наряду со скоростью деформации т, является реологичес-
кой характеристикой клеточных стенок, определяя предельное дав-
ление, выше которого начинается пластическая деформация кле-
точных стенок. В зрелых клетках У выше, чем в молодых, и либо
равен ψ , либо превышается [7, 11, 9]. Изопиестическая термопар-
ная психрометрия применима не только для изолированных орга-
нов, а также может быть проведена и на целых растениях in situ.
С помощью гильотинного психрометра конструкции Boyer с сотр.
[11] возможно измерение ростоиндуцирующего давления Δψp = ψ —
- Y, производя измерение ψw до и после изоляции участка стебля
специальным режущим устройством — гильотиной.
Для корректного определения «изопиестической точки» важное
значение имеет качество гидрофобного покрытия камеры, которое
экранирует возможные паразитные водоадсорбирующие центры на
поверхности металла камеры и не должно содержать гидрофильных
примесей [5]. Из тестированных нами смазок наиболее подходящим
являлся высокоочищенный бескислотный медицинский вазелин с
концентрацией зольных элементов менее 0,002% (глазной; ОДО
«АКСО», Беларусь) и Apiezon «N» («Serva», Германия).
Одним из самых вероятных источников ошибок при работе тер-
мопарного психрометра является статическое электричество. Проб-
лема статического заряда, образующегося вследствии скольжения
пластиковых колпачков на плунжере с термопарой, решена благо-
даря использованию покрытия контактных поверхностей тонкой
Раздел 5.4. Определение характеристик водного баланса растений 447
заземленной металлической фольгой (рис. 5.4.1., 1в, 56). Измерение
термопотенциалов на уровне нановольт высокочувствительным при-
бором делает необходимым при монтаже установки тщательно зазем-
лять ее части, как показано на рис. 5.4.1, и иметь надежное общее за-
земление. Также серебряные контакты штекеров термопар следует пе-
риодически очищать меловой бумагой от образующегося темного
налета сульфида серебра, однако золотое или родиевое гальваническое
покрытие менее предпочтительно из-за возникновения более высокого
паразитного контактного термоэдс этих металлов с медью [10].
При проведении психрометрических измерений используемая в
термобоксе водная среда (рис. 5.4.1, Блок А, 8) представляет собой
наилучший теплопоглотитель и теплостабилизатор, однако относи-
тельно слабая теплопроводность воды и способность к образованию
температурного градиента может быть источником артефактов.
Применение во время проведения серийных измерений перемеши-
вающего минимотора (рис. 5.4.1, Блок А, 9) способно снять данное
негативное явление и предотвратить дрейф нулевой точки термо-
парного выхода.
Литература
1. Milburn J. A. Water Flow in Plants. Integrated themes in biology.
New York: Longman Group Inc., 1979. 256 p.
2. Nonami H., Boyer J. S., Steudle E. S. Pressure probe and isopiestic
psychrometer measure similar turgor // Plant Physiol. 1987. V. 83.
P. 592-595.
3. Cottignies Α., Jennane A. Water content, water potential, and
transition from the non-cycling to the cycling state in the pea
cotiledonary bud // J. Plant Physiol. 1988. V. 132 P. 1-4.
4. Barrs H. D. Comparison of water potentials in leaves as measured
by two types of thermocouple psychrometer // Aust. J. Biol. Sci.
1965. V. 18. P. 36-52.
5. Boyer J. S., Knipling E. D. Isopiestic technique for leaf water
potentials with a thermocouple psychrometer // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1965. V. 54. P. 1044-1051.
6. Richards L. Α., Ogata G. Thermocouple for vapor pressure
measurement in biological and soil systems at high humidity //
Science. 1958. V. 128. P. 1089-1090.
7. Cosgrove D. J., Van Volkenburgh E.y Cleland R. E. Stress relaxation of
cell walls and the yield threshold for growth: demonstration and
measurement by micropressure probe and psychrometer
techniques // Planta. 1984. V.162. P. 46-54.
448 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
8. Котов Α. Α., Котова Л. М. Термопарный психрометр для измере-
ния водного потенциала растительных тканей изопиестическим
методом // Физиология растений. 2010. Т. 57. № 5. С. 783-790.
9. Котов Α. Α., Котова Л. М. Изменение водных и реологических
характеристик пазушных почек гороха при переходах рост-по-
кой-рост в апикальном доминировании // Физиология расте-
ний. 2010. Т. 57. № 6. С. 898-910.
10. Эберт Г. Краткий справочник по физике. М.: Физматгиз, 1963.
553 с. ^
11. BoyerJ. S., Cavalieri A. J., Schulze E.-D. Control of cell enlargement:
effects of excision, wall relaxation, and growth-induced water
potentials // Planta. 1985. V. 163. P. 527-543.
5.5. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ
И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ ИНТАКТНОСТИ
А. Г. Шугаев, Д. А. Лаштабега, Н. С. Белозерова,
И. П. Генерозова
Введение
Выделение митохондрий является необходимым этапом в изучении
энергетических процессов, происходящих в различных раститель-
ных объектах. Это существенно для понимания, например, особен-
ностей дыхательного метаболизма донорных и запасающих орга-
нов, прорастающих семян и созревающих плодов, изучения ответной
реакции митохондрий на действие абиотического и биотического
стресса и многих других актуальных проблем современной физио-
логии, биохимии и молекулярной биологии растений. Несмотря на
то что с момента получения первых препаратов митохондрий расте-
ний Миллердом и др., [1] прошло уже около 60 лет, до настоящего
времени исследователи продолжают испытывать трудности в при-
менении описанных методов выделения органелл к ряду раститель-
ных объектов, а также сталкиваются с необходимостью модифика-
ции известных методик под новый объект исследования. Это обу-
словлено в основном спецификой растительного материала. Как
известно, клетки растений имеют прочную клеточную стенку, при
разрушении которой повреждаются и митохондрии. Кроме того,
клетки растений содержат вакуоли, в которых накапливаются мно-
гие вещества, например хиноны, фенолы, ионы металлов, органи-
ческие или жирные кислоты и т. д., потенциально повреждающие
мембраны митохондрий или ингибирующие активность ферментов.
Раздел 5.5. Методы выделения митохондрий растений 449
Поэтому исследователи вынуждены вести поиск методов, которые
позволили бы обойти или хотя бы свести к минимуму действие
этих факторов. Оказалось, что создать универсальную методику,
пригодную для получения интактных митохондрий из любого рас-
тения или его органа, практически невозможно. Те или иные осо-
бенности многих растительных тканей, например высокое содер-
жание растительных масел или фенолов, крахмала или хлорофилла,
требовали соответствующим образом изменять условия выделения
митохондрий. Этим можно объяснить тот факт, что исследователи,
приступающие к изучению митохондрий новых растительных объ-
ектов или отрабатывающие новые методы исследования митохон-
дрий, вынуждены каждый раз заново, эмпирическим путем, подби-
рать оптимальные условия их выделения: тоничность и рН среды,
концентрации хелатирующего соединения, восстановителя, буфер-
ную систему, способы гомогенизации ткани и дополнительной очист-
ки органелл [2-8].
В данной работе приведены довольно простые методики получе-
ния митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы и этиолирован-
ных проростков гороха, которые являются модификациями ранее
описанных методов [2,3,6]. Следует отметить, что выделение и изу-
чение метаболической активности митохондрий предполагают на-
личие в лаборатории минимального набора необходимых приборов
и оборудования, включая рефрижераторные центрифуги, кислород-
ный электрод и полярограф. Необходимо также отметить, что нема-
ловажную, а подчас определяющую роль в получении интактных,
функционально активных препаратов митохондрий играет исполь-
зование высококачественных реактивов.
Методика
Выделение митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы
Митохондрии выделяли из запасающей паренхимы корнеплода са-
харной свеклы (Beta vulgaris L., сорта Верхнячская 031,
ряда других сортов), выращенной в полевых условиях.
Отмытые водопроводной водой корнеплоды помещали на 30 мин
в холодную комнату. После охлаждения ткани корнеплода (30-90 г)
ее измельчали в блендере (при этом лучше не использовать скорости
вращения более 1000 об./мин) в течение 40-80 с, в среде гомогениза-
ции (соотношение вес ткани/объем среды = 1:2), содержащей: 0,6 Μ
сахарозу, 0,1 Μ Трис-НСl-буфер (рН 7,6), 0,04 Μ ЭДТА, 0,015 Μ глу-
татион и 0,1% бычий сывороточный альбумин (БСА). Следует отме-
тить, что во все среды, кроме среды гомогенизации, вносился очи-
щенный от жирных кислот препарат БСА. Гомогенат фильтровали
450 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
через однослойную бязь и центрифугировали при 3200 g в течение
4,5 мин, осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при
25 000 g в течение 4 мин. Полученный осадок (митохондрии) ресус-
пендировали в среде отмывания, содержащей: 0,5 Μ сахарозу,
0,02 Μ Трис-НС1-буфер (рН 7,2), 0,04 Μ ЭДТА, 0,1% БСА, и центри-
фугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Отмытые митохондрии
помещали в среду следующего состава: 0,4 Μ сахароза, 0,02 Μ
Трис-НС1-буфер (рН 7,2), 0,1% БСА. Она же является реакционной
средой после добавления 0,005 Μ MgCl2, 0,01 Μ КН2PO4, субстрата
окисления и АДФ.
Работу лучше проводить в холодной комнате или на холодном
столе при температуре 2-4 °С. Если температура поднималась выше
5-6 °С, лучше не проводить опыт с этим препаратом. Существенные
повреждения органелл могут возникнуть на последней стадии при
ресуспендировании конечного осадка митохондрий. Эту процедуру
следует выполнять, используя кисточку или стеклянный гомогени-
затор. Хранить суспензию митохондрий лучше на льду или в снегу в
достаточно глубоких пробирках, чтобы наружный воздух не согре-
вал препарат. Особое внимание обращалось также на строгое выдер-
живание времени выделения, которое составляло 35-45 мин. Через
30 мин после получения фракции митохондрии использовали в опыте.
Митохондрии могут храниться при 0 °С в течение 8 ч (позже этого
срока препарат не анализировали) в пробирке, закрытой пробкой,
без существенного изменения обсуждаемых ниже свойств нативнос-
ти. Аликвота митохондрий отбирается в опыт охлажденной пипет-
кой со дна пробирки, при этом верхний слой суспензии, толщиной
до 1 мм, не используется.
Дополнительная очистка митохондрий корнеплода сахарной
свеклы проводилась с помощью ступенчатого градиента сахарозы.
Для этого отмытые митохондрии наслаивали на заранее приготов-
ленный в пробирках объемом 35 мл градиент, содержащий по 7 мл
60%-, 47%-, 35%- и 25%-й сахарозы, а также 20 мМ Трис-НС1-бу-
фер (рН 7,2) и 0,1%-ный БСА и центрифугировали при 113 000 g в
течение 90 мин. Фракцию очищенных митохондрий (содержащую
50-60% белка исходной фракции митохондрий), находящуюся между
слоями 35%- и 47%-й сахарозы, собирали с помощью шприца,
медленно разбавляли в несколько раз средой ресуспендирования,
содержащей: 0,4 Μ сахарозу, 20 мМ Трис-НСl-буфер (рН 7,2),
0,1%-й БСА и осаждали при 11 000 g в течение 15 мин. Осадок мито-
хондрий ресуспендировали в той же среде и хранили на льду.
Следует отметить, что, несмотря на широкое распространение
сахарозного градиента, этот метод очистки имеет ряд существенных
Раздел 5.5. Методы выделения митохондрий растений 451
недостатков, в частности с его помощью трудно добиться хорошего
разделения митохондрий и хлоропластов. Поэтому для очистки ми-
тохондрий из зеленых тканей применяется градиент плотности пер-
кола [5].
Выделение митохондрий
из этиолированных проростков гороха
Семена гороха (Pisum sativum L., сорт Флора-2) перед замачиванием
промывали 0,01% раствором KMnO4. Проростки гороха выращива-
ли в темноте при температуре 22-24 °С на влажной фильтровальной
бумаге.
5-дневные эпикотили помещали в стакан гомогенизатора и за-
ливали средой выделения (соотношение вес ткани/объем буфера =
= 1:2), быстро измельчали ножницами и гомогенизировали с по-
мощью пресса [2]. Среда гомогенизации содержала: 0,4 Μ сахарозу,
5 мМ ЭДТА, 20 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8,0), 10 мМ КС1,
2 мМ дитиотреитол и 0,1% БСА, свободный от жирных кислот. Го-
могенат фильтровали через однослойную бязь и центрифугировали
при 25 000 g в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспендировали
в 8 мл среды промывания и центрифугировали при 3000 g в течение
3 мин. Среда промывания содержала: 0,4 Μ сахарозу, 20 мМ ка-
лий-фосфатный буфер (рН 7,4), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ КС1 и 0,2% БСА.
Надосадочную жидкость центрифугировали при 11 000 g в течение
10 мин, осаждая митохондрии. Осадок ресуспендировали в 2-3 мл
среды, содержащей: 0,4 Μ сахарозу, 20 мМ калий-фосфатный буфер
(рН 7,4), 0,1% БСА, и вновь осаждали митохондрии центрифу-
гированием при 11 000 g в течение 10 мин. Суспензию митохонд-
рий, содержащую около 6 мг белка на 1 мл, хранили на льду. При
изучении метаболической активности митохондрий гороха реак-
ционная среда содержала: 0,4 Μ сахарозу, 20 мМ калий-фосфатный
буфер (рН 7,4), 0,1% БСА и 5 мМ ЭДТА. Остальные добавления при-
ведены в подписях к рис. 5.5.2.
Поглощение кислорода митохондриями измеряли полярографи-
чески, используя кислородный электрод типа Кларка, конструкции
Шольца и Островского [9]. Скорость окислении субстратов, величи-
ну коэффициента дыхательного контроля (ДК), отношения АДФ/О
и скорости фосфорилирования (СКФ) рассчитывали по методу Чан-
са и Вильямса [10]. Количество митохондриального белка определя-
ли по Лоури с БСА в качестве стандарта.
Результаты
Полученные митохондрии отвечают известным критериям интакт-
ности, в частности они обладают целостными мембранами, способ-
452 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Рис. 5.5.1. Аскорбат-цитохром с-зависимое поглощение кислорода
(нмоль/(мин мг белка) митохондриями корнеплода сахарной свеклы (А,
В) и этиолированных проростков гороха (Б). Митохондрии вносили в ре-
акционную среду, содержащую 0,4 Μ сахарозу (А, Б) в присутствии
10 мМ Трис-буфера (рН 7,2). Гипотоническая среда содержала только
10 мМ Трис-буфер (В). Реакционная среда содержала 10 мМ аскорбат и
0,2 мг белка митохондрий. Поглощение кислорода митохондриями ини-
циировали добавлением 25 мкМ цитохрома с и ингибировали 1 мМ KCN
ны окислять большинство субстратов цикла Кребса, обнаруживая
при этом достаточно высокий ДК и близкие к теоретическим вели-
чины отношения АДФ/О.
Универсальным критерием интактности митохондрий является
целостность их мембран. При этом чаще всего определяется целос-
тность наружной мембраны органелл как наиболее легко поврежда-
емой в ходе выделения. С этой целью анализируют ее проницае-
мость для экзогенного цитохрома с. Одним из биохимических тестов
является определение скорости KCN-чувствительного аскорбат-ци-
тохром с-зависимого поглощения кислорода, которая очень низка в
интактных митохондриях и быстро нарастает, если органеллы под-
вергнуть осмотическому шоку [5]. На основании этого теста было
показано, что 85-90% наружных мембран выделенных нами мито-
хондрий сахарной свеклы и гороха оставались неповрежденными
(рис. 5.5.1).
Принципиально важным качеством для большинства интакт-
ных митохондрий растений является их высокая функциональная
(окислительная и фосфорилирующая) активность, а также отчетли-
Раздел 5.5. Методы выделения митохондрий растений 453
Рис. 5.5.2. Полярографические кривые поглощения кислорода при окис-
лении малата митохондриями, выделенными из корнеплода сахарной
свеклы (А) и этиолированных проростков гороха (Б). Состав реакционной
среды см. раздел «Методика». Дополнительно вносили: 10 мМ малат,
18 мМ глутамат, 220 мкМ АДФ и около 1мг/мл митохондрии. Цифры у
кривых — скорость поглощения кислорода (нмоль/(мин мг белка))
вый (жесткий, прочный) контроль скорости окисления субстратов
со стороны аденилатов — ДК по Чансу. В присутствии субстрата до-
бавление АДФ приводит к резкому возрастанию скорости поглоще-
ния кислорода митохондриями с последующим возвращением ее к
исходному уровню после фосфорилирования всей добавленной АДФ
и превращения ее в АТФ (рис. 5.5.2). ДК численно равен отношению
скорости окисления субстрата митохондриями в присутствии АДФ
(состояние 3) к скорости поглощения кислорода после исчерпания
АДФ (состояние 4); а отношение между числом молей добавленного
АДФ к числу атомов избыточно поглощенного кислорода равно от-
ношению АДФ/О [10]. При этом, судя по литературным данным,
для интактных митохондрий растений величина коэффициента ДК
редко превышает 3-4 при окислении НАД-зависимых субстратов и
2-3 при окислении сукцината. На рис. 5.5.2 видно, что при окисле-
нии малата митохондриями корнеплода сахарной свеклы величина
ДК превышала 4, а для митохондрий проростков гороха она достига-
ла 10, что свидетельствует о хорошем (прочном) сопряжении про-
цессов окисления и фосфорилирования в выделенных органеллах.
С этим согласуются близкие к теоретическим значения отношения
454 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
АДФ/О, которое является показателем КПД процесса окислительного
фосфорилирования. Выделенные митохондрии, в частности митохон-
дрии корнеплода сахарной свеклы, способны окислять большинство
субстратов цикла Кребса, а также экзогенный НАДН, демонстрируя
при этом высокую окислительную и фосфорилирующую активность
(табл. 5.5.1).
Таблица 5.5.1. Характеристика окислительной и фосфорилирующей
активности митохондрий корнеплода
Реакционная среда (см. раздел « Методика ») в присутствии около 1 мг
митохондриального белка. Скорость окисления субстратов в состоянии 3
(Vз) рассчитана после добавления 250 мкМ АДФ. Дополнительно вноси-
ли: малат, пируват, цитрат, изоцитрат, α-кетоглутарат, сукцинат —
ЮмМ, глутамат — 18 мМ, экзогенный НАДН — 1 мМ. Окисление пиру-
вата проводили в присутствии 0,6 мМ тиаминпирофосфата (ТПФ) и
0,5 мМ малата; кетоглутарата — в присутствии 0,6 мМ ТПФ и 10 мМ
малоната.
Субстраты
цитрат
изоцитрат
а-кетоглутарат
сукцинат
малат + глутамат
пируват
НАДН
v3
нмольО2/
(мин
мг белка)
75 ± 15
65 ± 10
85 ±26
250 ± 50
160 ±35
110 ± 20
90 ±40
ДК
2,9 ±0,4
2,3 ±0,3
3,1 ±0,5
2,7 ±0,8
4,5 ± 1,2
3,2 ± 1,3
1,8 ±0,5
АДФ/О
2,1 ±0,3
1,9 ±0,2
3,3 ±0,4
1,4 ± 0,15
2,5 ±0,4
2,2 ±0,3
1,4 ±0,2
СКФ
мкмольФн
/(мин
мг белка)
0,3 ±0,1
0,25
0,55 ±0,1
0,7 ±0,1
0,8 ±0,2
0,4 ±0,1
0,25 ±0,1
Выделенные препараты митохондрий соответствуют и другим
критериям нативности. Среди них можно отметить отсутствие оста-
точного дыхания, т. е. полное подавление окисления субстратов
ингибиторами цитохромного (цианид) и альтернативного (салицил-
гидроксамовая кислота) пути окисления; высокую стабильность
митохондрий, т. е. сохранение рассматриваемых свойств в течение
более 8 ч хранения препаратов при 0-2 °С; низкую степень загряз-
ненности фракции пластидами, микросомами и другими немито-
хондриальными компонентами, что определялось по активности со-
ответствующих ферментов-маркеров (6-фосфоглюконат-дегидроге-
назы, антимицин Α-нечувствительной цитохром c-редуктазы и др.),
а также путем электронномикроскопического исследования (дан-
ные не приведены).
Раздел 5.5. Методы выделения митохондрий растений 455
Заключение
Таким образом, предложенная нами модифицированная методика
выделения митохондрий из растительных тканей позволяет полу-
чить фракцию митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы, а так-
же из этиолированных проростков гороха. По перечисленным выше
критериям, выделенные митохондрии характеризуются высокой
степенью интактности, не уступая в качестве органеллам, получен-
ным из других растительных объектов [4-6]. В этой короткой статье
мы не могли подробно разобрать все факторы (их довольно много)
процедуры выделения митохондрий, влияющие на качество полу-
чаемой фракции. Анализ всех факторов читатели могут найти в бо-
лее подробных методических руководствах и статьях, часть из кото-
рых приведена в списке литературы. Цель данной работы заклю-
чалась в том, чтобы дать специалистам наиболее простые, и, при
соблюдении указанных условий, безотказно работающие методики
выделения интакных митохондрий из двух широко распространен-
ных растительных объектов. Вместе с тем надо четко понимать, что
эти методики могут и должны быть модифицированы в соответ-
ствии с различными специальными задачами исследований. При-
мер такой задачи, судя по литературным данным, — это изучение
активности аскорбатпероксидазы, одного из важных антиоксидант-
ных ферментов митохондрий растений, для сохранения его актив-
ности рекомендуется добавление в состав всех сред выделения орга-
нелл 1-10 мМ аскорбиновой кислоты [7]. С другой стороны, в ряде
случаев процедуру выделения митохондрий можно значительно
упростить, исключив дополнительную очистку их в градиенте плот-
ности сахарозы или перкола.
Литература
1. Millerd Α., Bonner J., Axelrod В., Bandurski R. Oxidative and
phosphorylative activity of plant mitochondria // Proc. Natl. Acad.
Sci. 1951. V. 37. P. 855-862.
2. Войников В. К. К вопросу о выделении интактных растительных
митохондрий // Известия Сибирского Отделения Академии наук
СССР. Серия биологических наук. 1980. Вып. 2. С. 121-126.
3. Шугаев А. Г., Выскребенцева Э. И. Выделение интактных мито-
хондрий из корнеплода сахарной свеклы // Физиология расте-
ний. 1982. Т. 29. С. 799-803.
4. Ikuma H. Necessay conditions for isolation of tightly coupled higher
plant mitochondria // Plant Physiol. 1970. V. 45. P. 773-781.
5. Neuburger M. Preparation of plant mitochondria, criteria for
assessment of mitochondrial integrity and purity, survival in vitro //
456 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Higher plant cell respiration. Encyclopedia of plant physiology.
V. 18 / Eds. Douce R., Day D. A. Berlin: Springer-Verlag, 1985.
P. 7-24.
6. Vianello Α., Macri F., Braidot E.t Mokhova E. N. Effect of
cyclosporin A on energy coupling in pea stem mitochondria //
FEBS Lett. 1995. V. 371. P. 258-260.
7. Jimenez Α., Hernandez J. Α., del Rio L. Α., Sevilla F. Evidence for
the presence of ascorbate-glutatione cycle in mitochondria and
peroxisomes of pea leaves // Plant Physiol. 1997. V. 114.
P. 275-284.
8. Hajek Т., Honys D., Capkova V. New method of plant mitochondria
isolation and sub-fractionation for proteomic analyses // Plant Sci.
2004. V. 167. P. 389-395.
9. Шолъц К. Φ., Островский Д. Н. Ячейка для амперометрическо-
го определения кислорода // Методы современной биохимии /
Под. ред. Кретовича В. Л., Шольца К. Φ. Μ.: Наука, 1975.
С. 52-58.
10. Chance В., Williams G. R. The Respiratory Chain and Oxidative
Phosphorylation // Adv. Enzymol. 1956. V. 17. P. 65-134.
5.6. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛАЗМАЛЕММЫ
МЕТОДОМ РАЗДЕЛЕНИЯ МИКРОСОМАЛЬНЫХ
МЕМБРАН В ВОДНОЙ ДВУХФАЗНОЙ
ПОЛИМЕРНОЙ СИСТЕМЕ
М. С. Трофимова, Т. А. Шевырева, И. М. Жесткова, С. Н. Ломин
Введение
Плазматическая мембрана (плазмалемма) — барьер между клеточ-
ным содержимым и внешней средой. Через плазмалемму происхо-
дит основной обмен веществ, ее белки воспринимают сигналы и пе-
редают их в клетку, на ее поверхности синтезируется клеточная
стенка. Прогресс в получении очищенных везикулярных препаратов
плазмалеммы и функциональной идентификации транспортных и
сигнальных макромолекул был достигнут в 90-е годы прошлого сто-
летия, когда для выделения плазматических мембран фракцию
микросом разделили в водной двухфазной полимерной системе [1].
С этих пор данный метод стал приоритетным в арсенале экспери-
ментаторов, в настоящее время он также широко востребован в свя-
зи с задачами, решаемыми протеомикой.
Раздел 5.6. Получение плазмалеммы методом разделения мембран 457
Принцип метода
При смешивании водных растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ) и декс-
трана в определенном диапазоне концентраций образуется двухфаз-
ная смесь, верхняя и нижняя фазы которой обогащены ПЭГ и де-
кстраном соответственно. Биологические мембраны обладают изби-
рательностью по отношению к полимерам этой водной системы. Из
всей совокупности внутриклеточных мембран и мембран органелл
плазмалемма обладает самым высоким сродством к гидрофобной и
менее плотной по сравнению с декстраном верхней фазе, представ-
ленной ПЭГ. Такая избирательность плазмалеммы обусловлена от-
личиями свойств ее наружной поверхности от других мембран.
Метод получения плазмалеммы включает ряд этапов, в том чис-
ле гомогенизацию ткани, фильтрацию гомогената для удаления не-
разрушенных клеток и обломков клеточных стенок (клеточного деб-
риса), дифференциальное центрифугирование для получения фрак-
ции микросом, разделение микросом в двухфазной полимерной
системе, переосаждение фракции плазмалеммы, оценку количества
и чистоты препарата.
Материалы и оборудование
Среда гомогенизации: 300 мМ сахароза, 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0),
10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиоэритритол
(или дитиотреитол), 1 мМ фенилметилсульфонил фторид и 0,6%-й
(в/о) поливинилпирролидон.
Фазовый буфер: 300 мМ сахароза, 5 мМ калий-фосфатный буфер
(рН 7,8), 3 мМ КС1, 1 мМ дитиоэритритол (или дитиотреитол) и
0,1 мМ ЭДТА.
Фазовая смесь: возможно приготовление как непосредственно,
так и из стоковых растворов (см. ниже).
Среда суспендирования: 300 мМ сахароза, 10 мМ бис-трис-про-
пан-Mes (рН 7,2), 0,5 мМ ЭДТА и 5 мМ дитиоэритритол (или дитиот-
реитол). Состав среды суспендирования подбирается в зависимости
от конкретных задач эксперимента. Для протеомного анализа среду
следует дополнить ингибиторами известных типов протеаз. Можно
воспользоваться коммерчески доступными наборами или составить
смесь самостоятельно.
Материалы и приборы: ткани для фильтрации гомогената,
стеклянный гомогенизатор, центрифужные пробирки, точные весы
для взвешивания центрифужных пробирок с жидкостью, блендер,
низкоскоростная центрифуга с охлаждением и набором роторов,
ультрацентрифуга.
458 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Приготовление основных растворов
Среда гомогенизации
30,78 г сахарозы, 3,63 г Трис, 877 мг ЭДТА, 1,8 г поливинилпирро-
лидона, 333 мг метабисульфита калия, 231 мг дитиоэритритола раст-
ворить приблизительно в 200 мл дистиллированной воды, довести
рН до 8,0 раствором 1 N НС1 и привести объем к 300 мл. Отдельно
взвесить 52 мг фенилметилсульфонил фторида, растворить в 1 мл
этилового спирта и непосредственно перед гомогенизацией внести в
среду.
Фазовый буфер
22,4 г сахарозы, 30 мг дитиоэритритола, б мг ЭДТА растворить в
дистиллированной воде, внести 5 мл 0,2 Μ калий-фосфатного буфе-
ра и 0,3 мл 2 Μ КС1, довести объем до 200 мл.
Заранее приготовить стоковые растворы 0,2 Μ калий-фосфатно-
го буфера с рН=7,8 и 2 Μ КС1. Приготовленные растворы можно хра-
нить при 4 °С.
Фазовая смесь
2,24 г декстрана Т500 (Pharmacia) или декстрана 500000 (Sigma) и
ПЭГ 3500 или 4000 (Sigma) поместить в 50 мл центрифужную про-
бирку, пробирку поставить на весы и добавить в нее 22,52 г фазового
буфера. Содержимое пробирки растворить. Аналогично приготовить
еще одну (три) пробирки с фазовой смесью.
При внесении в каждую пробирку 9 г суспензии микросом в фа-
зовом буфере или 9 г фазового буфера получаем 36 г фазовой систе-
мы, которую после тщательного перемешивания подвергаем разде-
лению центрифугированием.
Среда суспендирования
30,78 г сахарозы, 846 мг бис-трис-пропана, 231 мг дитиоэритрито-
ла, 44 мг ЭДТА; растворить в дистиллированной воде, довести до
рН 7,2 сухим Mes и привести объем к 300 мл.
Этапы получения препарата плазмалеммы
Выделение микросомальных мембран
Для выделения микросомальных мембран 100 г растительного мате-
риала промывают дистиллированной водой, обсушивают фильтро-
вальной бумагой и смешивают в соотношении 1:3 (в/о) со средой
гомогенизации, содержащей 300 мМ сахарозу, 100 мМ Трис-НС1
(рН 8,0), 10 мМ ЭДТА, 5 мМ метабисульфит калия, 5 мМ дитиоэрит-
Раздел 5.6. Получение плазмалеммы методом разделения мембран 459
ритол (или дитиотреитол), 1 мМ фенилметилсульфонил фторид и
0,6%-й (в/о) поливинилпирролидон. Гомогенизация производится
три раза по 30 с при максимальных оборотах бытового блендера
типа Уоринга (например, MPW-302, Польша, 14 000 об./мин) или
блендера другого типа. В зависимости от механических свойств рас-
тительного материала время гомогенизации можно сокращать до
5 с. Гомогенат фильтруют через 3 слоя батистовой ткани или не-
сколько слоев ткани типа Miracloth и центрифугируют при 10 000 g
10 мин в угловом роторе. Осадок отбрасывают, а из супернатанта
осаждают фракцию микросомальных мембран центрифугировани-
ем при 100 000 g 30 мин в угловом роторе. Все процедуры проводят
при 4 °С в холодной комнате. Осадок микросом ресуспендируют в
18 мл фазового буфера, содержащего 300 мМ сахарозу, 5 мМ ка-
лий-фосфатный буфер (рН 7,8), 3 мМ КС1, 1 мМ дитиоэритритол и
0,1 мМ ЭДТА, используя стеклянный гомогенизатор.
Получение плазмалеммы
Для получения препаратов плазмалеммы фракцию микросомаль-
ных мембран после центрифугирования при 100 000 g разделяют на
субфракции с использованием водной двухфазной полимерной систе-
мы декстран Т500—ПЭГ 3500 (4000). Обычно концентрация полиме-
ров составляет 6,2% (в/в), но в некоторых случаях она может варьиро-
вать от 5,6 до 6,5% (в/в), и это устанавливается в предварительных
экспериментах. Для непосредственного разделения микросомаль-
ной фракции к 27 г охлажденной фазовой смеси, содержащей поли-
меры в фазовом буфере, добавляют по 9 г микросомальных мембран,
ресуспендированных в той же среде, чтобы конечная концентрация
декстрана и ПЭГ составляла по 6,2% (в/в). В результате получают
по 36 г фазовой системы в двух 50 мл пробирках. Содержимое про-
бирок необходимо тщательно перемешать переворачиванием не ме-
нее 20 раз. Далее смесь разделяют на две фазы центрифугированием
в бакет-роторе при 2500 g и 4 °С в течение 5 мин. Отбирают верхнюю
фазу, содержащую ПЭГ и обогащенную плазмалеммой. При отборе
верхней фазы важно не захватить интерфазу. Отобранную верхнюю
фазу разбавляют в 10 или более раз средой суспендирования, содер-
жащей 300 мМ сахарозу, 10 мМ бис/трис-пропан-Mes (рН 7,2),
0,5 мМ ЭДТА и 5 мМ дитиоэритритол, тщательно перемешивают и
после этого центрифугируют при 100 000 g в течение 30 мин в угло-
вом роторе. К полученному осадку плазматических мембран добав-
ляют среду суспендирования до объема 0,5-1 мл, ресуспендируют
фракцию пипетированием, аликвоты помещают в пробирки и хра-
нят при -70 °С до использования. Схема получения плазмалеммы
показана на рис. 5.6.1.
460 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Растительный материал
Гомогенизация
и фильтрование
Гомогенат
Центрифугирование
(10000 д, 10 мин)
Супернатант
Центрифугирование
(100000 д, 30 мин)
Осадок (клетки, клеточные
стенки, ядра, митохондрии,
пластиды)
Супернатант
(белки цитозоля,рибосомы,
мелкие везикулы)
Осадок
(микросомальные мембраны, МС)
Разделение МС в водной полимерной системе
Фазовая смесь Фазовая система
о плазмалемма
о другие мембраны
Ресуспендирование
МС в фазовом
буфере и
перемешивание
с фазовой смесью
Центрифугирование
(1500д, 5 мин)
для разделения фаз
Ресуспендирование осадков,
определение содержания белка,
анализ маркерных активностей
Отбор фаз, разбавление средой
суспендирования и центрифугирование
(100000 д, 30 мин)
Рис. 5.6.1. Схема получения плазмалеммы методом разделения микросо-
мальных мембран в водной двухфазной полимерной системе. Другие мем-
браны — внутриклеточные мембраны (эндоплазматический ретикулум,
аппарат Гольджи, тонопласт) и мембраны органелл (субмитохондриаль-
ные частицы, тилакоиды); ПЭГ — верхняя фаза, содержащая полиэти-
ленгликоль 3500 (4000); Т500 — нижняя фаза, содержащая декстран
500000
Одним из преимуществ метода является возможность получения
правильно ориентированных везикул плазмалеммы. После цикла
замораживания—размораживания суспензии почти половина вези-
кул приобретает противоположную ориентацию, и, таким образом,
суспензия содержит равные доли везикул, ориентированных цитоп-
лазматической стороной внутрь и наружу. Типичная картина сус-
пензии плазмалеммы и распределение ее везикул по размерам пока-
заны на рис. 5.6.2. Чтобы получить суспензию, полностью состоящую
из «вывернутых» везикул, существует прием обработки свежевыде-
ленной суспензии неионным детергентом Brij 58 в конечной концен-
трации 0,05%, который «выворачивает» везикулы цитоплазмати-
Раздел 5.6. Получение плазмалеммы методом разделения мембран 461
Рис. 5.6.2. Электронная микрофотография (слева) и кривая распределе-
ния везикул плазмалеммы, изолированной из корней 7-дневных этиоли-
рованных проростков кукурузы, по размерам (справа). Приведено из [2]
ческой стороной наружу. Размеры везикул при такой обработке
уменьшаются. Поэтому при необходимости их переосаждения сле-
дует увеличить время ультрацентрифугирования фракции до 2 ч.
Этот прием также способствует очистке внутреннего содержимого
везикул, «захваченного» в процессе гомогенизации [3].
Определение содержания мембранного белка
в препаратах методом Bradford
Метод основан на взаимодействии красителя Coomassie G250 с
основными аминокислотами белков [4] (см. также раздел 3.1). Реак-
тив Bradford содержит: 0,005% (в/о) Coomassie G250, 5% (о/о) эти-
ловый спирт, 10% (о/о) ортофосфорную кислоту и дистиллирован-
ную воду. Полученные мембранные препараты солюбилизируют
0,1% -ным Тритоном Х-100 (в/в) в соотношении 1:1 в течение
1-2 мин. Если концентрация белка в препаратах превышает допус-
тимый диапазон измерения, предварительно разводят суспензию
мембран средой суспендирования. К солюбилизированным мембра-
нам добавляют реактив Bradford в соотношении 1:29, перемешива-
ют и инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре. За-
тем измеряют оптическую плотность образцов при 595 нм. В кювету
сравнения вносят среду суспендирования, Тритон Х-100 и реактив
Bradford в соответствующих пропорциях. Содержание белка опре-
деляют по калибровочной кривой, построенной с использованием в
качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина. Для получе-
ния калибровочной кривой стандартный белок растворяют в среде
суспендирования с 0,05%-м Тритоном Х-100.
462 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Оценка степени обогащения мембранной фракции
плазмалеммой
Для оценки степени чистоты полученной фракции плазмалеммы ис-
пользуют два метода. Один из них основан на измерении активности
маркерных ферментов, типичных для плазмалеммы и других мем-
бранных фракций. В другом случае для этой цели используют Вес-
терн-блот-анализ мембранных белков с набором специфических ан-
тител против белков-маркеров, сравнивая интенсивность иммуно-
окрашивания в препаратах плазмалеммы и других фракциях.
Определение активности маркерных ферментов
Для определения степени обогащенности полученных препаратов
плазматической мембраной измеряют и сравнивают активности
маркерных ферментов во фракциях плазмалеммы и исходных микро-
сомальных мембранах. Такими ферментами чаще всего являются
ортованадат-ингибируемая Н+-АТФаза плазмалеммы (Р-типа), нит-
рат-ингибируемая Н+-АТФаза тонопласта (V-типа), цитохром с-окси-
даза внутренней мембраны митохондрий и цианид-нечувствитель-
ная НАДН-цитохром с-редуктаза для мембран эндоплазматическо-
го ретикулума [5].
Активность Н+-АТФаз удобно оценивать по количеству окис-
ленного НАДН в сопряженной АТФ-регенерирующей системе [6].
Для этого в 1-см кювету спектрофотометра вносят 1,9 мл основной сре-
ды, содержащей 100 мМ KCl, 10 мМ Mes бис-mpuc-пропан, рН 7,8 (для
Н+-АТФазы V-типа) или рН 6,5 (для Н+-АТФазы Р-типа), суспен-
зию везикул (содержание белка 20-50 мкг), 50 мкл 10 мМ НАДН,
20 мкл 100 мМ фосфоенолпирувата, 40 мкл 50 мМ АТФ и 5 мкл смеси
ферментов пируваткиназы и лактатдегидрогеназы («Sigma», США).
Реакцию гидролиза АТФ запускают внесением 8 мкл 1 Μ MgSO4 и
сразу же регистрируют кинетику окисления НАДН на спектрофото-
метре при 340 нм. Коэффициент молярной экстинкции НАДН при
расчетах 6,2 мМ-1 х см-1. Для расчета специфической активности ре-
акцию проводят в присутствии и в отсутствие ингибиторов: 100 мкМ
ортованадата натрия и 10 мМ ΚΝO3 для Н+-АТФаз Р- и V-типов со-
ответственно.
Скорость окисления цитохрома с регистрируют по изменению
абсорбции при 550 нм в среде, содержащей 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4),
0,025% -й (в/о) Тритон Х-100 и 0,05 мМ цитохром с, восстановлен-
ный добавлением дитионита натрия. Скорость восстановления ци-
тохрома с измеряют в той же среде, дополненной 1 мМ NaCN и 0,1 мМ
НАДН. В каждую пробу вносят приблизительно 50 мкг мембранного
белка. Для расчета активности используют коэффициент молярной
экстинкции для цитохрома с при 550 нм, равный 18,5 мМ-1 х см-1.
Раздел 5.6. Получение плазмалеммы методом разделения мембран 463
Типичные данные анализа приведены в табл. 5.6.1.
Таблица 5.6.1. Активности маркерных ферментов в микросомальных
мембранах (МС), полученных из корней этиолированных проростков
гороха, и в плазмалемме (ПМ), собранной в верхней фазе
Маркерные ферменты
NaVO4-чувствительная
Н+-АТФаза
КNO3-чувствительная
Н+-АТФаза
CN-резистентная НАДН-цит
с редуктаза
Цит с оксидаза
Удельная активность,
мкмоль субстрата/(мг белка
МС ПМ
0,03
0,05
0,6
0,012
0,22
0,01
0,15
н. о.
мин)
Обогаще-
ние
7,3
0,2
0,25
н. о.
Примечание: обогащение — отношение активности в ПМ к активности в
МС; н. о. — не определяется.
Иммуноблотинг с использованием антител
против маркерных белков мембран
и растворимых белков клеточных компартментов
Сначала проводят денатурирующий электрофорез мембранных бел-
ков по Laemmli [7] (см. раздел 3.2). На каждую дорожку геля вносят
равное количество мембранного белка. После электрофоретическо-
го разделения белки из геля переносят на PVDF- или нитроцеллю-
лозную мембрану и проводят Вестерн-блот гибридизацию с первич-
ными антителами против белков-маркеров. Интенсивность иммуно-
окрашивания полос белков-маркеров указывает на присутствие и
содержание данного типа мембран во фракции. Подробный прото-
кол проведения Вестерн-блот анализа дан в разделе 3.3.
В настоящее время ряд фирм предлагают антитела к маркерным
белкам мембран и компартментов растительной клетки. Информа-
ция о таких антителах доступна, например, на Интернет-сайте фир-
мы «Agrisera» (Швеция) http://www. agrisera. com/.
На рис. 5.6.3 приведен пример такого анализа. Показан резуль-
тат тестирования мембранных фракций, полученных после трех-
кратного разделения микросомальных мембран в водной полимер-
ной двухфазной системе. Можно видеть, что иммуноокрашивание
полос, соответствующих маркеру плазмалеммы Н+-АТФазе Р-типа,
значительно интенсивнее в мембранах верхней фазы (ВФ), в то время
464 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
ВФ НФ ВФ НФ
Н+-АТФаза
BiP2
Рис. 5.6.3. Иммунодетекция маркерных белков в мембранах, собранных
из верхней (ВФ) и нижней (НФ) фаз водной полимерной системы. Слева
представлены результаты Вестерн-блот анализа фракций, полученных
разделением микросомальных мембран из корней 6-дневных этиолиро-
ванных проростков кукурузы, справа — из 6-дневных проростков араби-
допсиса. Трехкратное разделение мембран кукурузы и арабидопсиса в фа-
зовой системе проводили при концентрации полимеров 6,2% и 5,8% (в/в)
соответственно. Переосажденные мембраны, отобранные из верхней и
нижней фаз водной двухфазной системы, солюбилизировали в буфере
для образцов по Laemmli в течение 1 ч при 37 °С. Для анализа использова-
ли антитела фирмы «Agrisera» против Н+-АТФазы плазмалеммы (кат.
№ AS07 260) и против белка люмена ЭПР BiP2 (кат. № AS09 481)
как интенсивность иммуноокрашивания маркера люмена ЭПР раст-
воримого белка-шаперонина BiP2 выше в нижней фазе (НФ).
Особенности метода, дополнительные рекомендации
Для полного ознакомления читателей с терминологией и принципами
исследования биологических мембран можно рекомендовать книгу
«Биологические мембраны. Методы», переведенную и опубликован-
ную издательством «Мир» (1990 г.) [8].
Обычно процедура выделения плазмалеммы от момента гомоге-
низации растительного материала до замораживания полученного
препарата занимает 4 ч. Из 100 г ткани в среднем можно получить до
50-100 мг микросомальных мембран и до 5-10 мг плазмалеммы.
Эти числа приблизительны, и выход зависит от механических свойств
клеточных стенок, биохимических и морфологических особеннос-
тей объекта, режима высокоскоростного центрифугирования. В за-
висимости от специфики объекта концентрация полимеров может
меняться от 5,6 до 6,5%, а КС1 — от 1 до 5 мМ [1].
Для повышения чистоты плазмалеммы следует провести повторно
процедуру разделения фаз. Для этого одновременно центрифугиру-
ют при 1500 g 5 мин равное количество пробирок с фазовой систе-
мой, содержащей мембранный материал или чистый фазовый бу-
фер. После разделения фаз верхние фазы с мембранами соединяют с
чистыми нижними фазами, тщательно перемешивают и снова цент-
рифугируют в том же режиме. После этого отбирают верхние фазы и
действуют согласно протоколу. Эту процедуру можно повторять не-
однократно.
Раздел 5.6. Получение плазмалеммы методом разделения мембран 465
Наиболее оптимальным следует считать механическое разруше-
ние растительного материала в блендере, при котором происходит
везикуляция мембранного материала. Отношение объем среды го-
могенизации/навеска критично как для полного разрушения тка-
ни, так и для чистоты внутреннего объема везикул. Чем оно выше,
тем чище люмен везикул, однако при этом снижается выход матери-
ала. Обычно используют отношение, лежащее в диапазоне от 1,5:1
до 5:1, что зависит от плотности исходного материала. Увеличение
ускорения и времени ультрацентрифугирования приводит к увели-
чению доли мелких везикул в препарате плазмалеммы [9].
При получении плазмалеммы из суспензионных клеточных
культур следует предварительно отмыть клетки, перевести в среду
гомогенизации и разрушить их в гомогенизаторе типа Polytron или
Ultra-Turrax, а затем гомогенизировать в блендере Уоринга, как
описано выше.
Гомогенизация растительного материала приводит к высвобож-
дению из клеточных компартментов гидролитических ферментов и
физиологически активных веществ. Для блокирования нежела-
тельных активностей в среду гомогенизации вводятся протекторы и
ингибиторы, и при этом очень важно выполнять все процедуры в хо-
лодной комнате на льду, чтобы снизить активность гидролаз. Все
растворы и посуда также должны быть охлаждены до 4 °С. Охлаж-
дение в значительной степени препятствует деградации мембранно-
го материала. Все растворы должны быть свежеприготовленными,
поскольку от этого зависит эффективность восстановителей и инги-
биторов в средах. Кроме того, это позволяет предотвратить бактери-
альное загрязнение в осадке плазмалеммы.
Идентификация мембран в выделенной фракции и оценка сте-
пени их чистоты являются одним их важнейших этапов при изоли-
ровании плазмалеммы. Выбор для этой цели метода из описанных
выше (по измерению активности маркерных ферментов или при по-
мощи антител против белков-маркеров) определяется конкретными
задачами эксперимента, зависит от количества исходного расти-
тельного материала и выхода плазмалеммы соответственно. Незави-
симо от применяемого метода, степень обогащения плазмалеммои
верхней фазы водной полимерной системы следует оценивать по от-
ношению к исходной микросомальной фракции.
Литература
1. Larsson С, Sommarin Μ., Widell S. Isolation of highly purified
plasma membranes and separation of inside-out and right-side-out
vesicles // Methods Enzymol. 1994. V. 228. P. 451-469.
466 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Трофимова М. С, Жесткова И. М., Андреев И. М., Свиное Μ. М.,
Бобылев Ю. С, Сорокин Ε. Μ. Осмотическая водная проницае-
мость вакуолярных и плазматических мембран, изолирован-
ных из корней кукурузы // Физиология растений. 2001. Т. 48.
С. 341-348.
Johansson F., Olbe M., Sommarin M., Larsson С. Brij 58, a
Polyoxyethylene Acyl Ether, Creates Membrane Vesicles of Uniform
Sidedness. A New Tool to Obtain Inside-Out (Cytoplasmic Side-Out)
Plasma Membrane Vesicles // Plant J. 1995. V. 7. P. 165-173.
Bradford Μ. Μ. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation
of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of
Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1975. V. 72. P. 248-254.
Briskin D. P., Leonard R. Т., Hodges Т. К. Isolation of the Plasma
Membrane: Membrane Markers and General Principles // Methods
Enzymol. 1987. V. 148. P. 542-558.
Palmgren M. An H+-ATPase assay: Proton pumping and ATPase
activity determined simultaneously in the same sample // Plant
Physiol. 1990. V. 94. P. 882-826.
Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.
Биологические мембраны. Методы: Перевод с англ./ Под ред.
Дж. Б. Финдлея, У. Г. Эванса. М.: Мир, 1990. 424 с.
Гайворонская Л. М., Тимонина В. Н., Трофимова М. С, Дзюбен-
ко В. С. Получение и характеристика везикул плазматической
мембраны с низкой протонной проницаемостью из клеток сус-
пензионной культуры сахарной свеклы // Физиология расте-
ний. 1987. Т. 34. С. 13-27.
5.7. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ПОЛЯРНЫХ
ЛИПИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА
В. Д. Цыдендамбаев, А. Г. Верещагин
Введение
В настоящее время не существует общепризнанного определения
понятия «липиды», как не существует и единой их классификации
[1, 2]. Обычно этим понятием обозначают различные классы соеди-
нений, как правило, слаборастворимых или вовсе не растворимых в
воде, но хорошо растворимых в органических растворителях. В
большинстве случаев это различные производные жирных кислот
(ЖК), называемые ацилсодержащими липидами, а также вещества,
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 467
не содержащие ЖК — высшие алифатические углеводороды, спирты,
альдегиды и кетоны, называемые неомыляемыми. Одну из групп
ацилсодержащих липидов составляют простые (нейтральные) липи-
ды, дающие в результате гидролиза два типа первичных продуктов.
Примерами простых липидов могут служить три-, ди- и моноацилгли-
церины, восковые эфиры и эфиры стеринов. К другой группе этих
липидов принадлежат сложные (полярные) липиды, содержащие
гидрофильные, в частности заряженные, функциональные группы.
К полярным липидам относят глицерофосфолипиды (фосфатидил-
холины, фосфатидилэтаноламины, фосфатидилглицерины и др.),
глицерогликолипиды (моногалактозил-, дигалактозил- и сульфо-
хиновозил-диацилглицерины), а также фосфо- и гликосфинголипи-
ды; при гидролизе полярных липидов образуются три первичных
продукта или более [1, 2]. Наконец, в течение последних десятиле-
тий было показано, что в растительных тканях широко распростра-
нены оксилипины, которые представляют собой продукты перекис-
ного окисления ди- и триненасыщенных ЖК и их ацильных остат-
ков в полярных и нейтральных липидах под действием реактивных
форм кислорода или липоксигеназных ферментов [3].
Преобладающие среди нейтральных липидов растений триацил-
глицерины (ТАГ) локализованы в олеосомах цитозоля, а восковые
эфиры содержатся на поверхности кутикулы. В то же время поляр-
ные липиды представляют собой интегральные компоненты внут-
риклеточных мембран и определяют вместе с белками и другими
соединениями их структуру и функцию. Получить готовый для
анализа препарат ТАГ нетрудно — достаточно лишь проэкстрагиро-
вать сухую измельченную растительную ткань в аппарате Сокслета
чистым н-гексаном. Сходным образом поверхностные воска можно
легко извлечь кратковременным погружением изолированного рас-
тительного объекта в хлороформ. Напротив, препаративное получе-
ние полярных липидов является достаточно сложной технической
задачей, не решенной полностью и до настоящего времени [4, 5].
Цель настоящего обзора состоит в том, чтобы кратко изложить
основные результаты аналитических работ по экстракции, очистке
и предварительному фракционированию полярных липидов кле-
точных мембран высших растений.
Эти три главных начальных этапа исследования липидов факти-
чески определяют успех всего анализа. Они должны обеспечить ко-
личественный выход липидной смеси, содержащейся в изучаемом
материале, полную очистку липидов от нелипидных примесей и со-
хранение нативности липидов, т. е. целостности ковалентных свя-
зей в их молекулах. В противном случае применение даже самых со-
вершенных методов на дальнейших этапах такого исследования не
468 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
приведет к получению данных, сколько-нибудь достоверно отража-
ющих действительный состав полярных липидов в живой ткани.
Очевидно, что для полного извлечения липидов все их связи с
нелипидными компонентами клетки — белками, полисахаридами
и т. д. — должны быть разрушены. Однако жесткость применяе-
мых для такого разрушения воздействий должна быть несколько
ниже того предела, за которым нативность выделяемых липидов
уже не сохраняется. Следовательно, при разработке метода экстрак-
ции необходимо находить некоторый компромисс между разрушаю-
щим воздействием условий экстракции на комплексы липидов с био-
полимерами клетки и отсутствием такого воздействия на молекулы
самих липидов. Для достижения такого компромисса необходимо,
прежде всего, знать, какие именно силы взаимодействия удержива-
ют полярные липиды в клетке.
Обычно считают, что, за немногими исключениями, фосфо- и
гликолипиды растительных мембран не соединены с нелипидными
веществами клетки ковалентными связями, а главную роль в их
связывании играют слабые гидрофобные и ван-дер-ваальсовы взаи-
модействия, водородные и ионные связи. Слабые взаимодействия
устанавливаются, например, между гидрофобными алифатически-
ми цепями липидов и неполярными радикалами протеиногенных
аминокислот — валина, лейцина, изолейцина и др. Энергия таких
взаимодействий никогда не превышает ~2 ккал/моль, и потому для
их нарушения достаточно воздействия неполярными и малопо-
лярными органическими растворителями — н-гексаном, хлоро-
формом и др.
Важное место в образовании комплексов липидов с другими кле-
точными компонентами принадлежит водородным связям, возни-
кающим между гидроксильными, карбоксильными и аминогруппа-
ми липидов, с одной стороны, и полярными функциональными
группами биополимеров — с другой. Энергия этих связей составля-
ет 0,5-12 ккал/моль, что значительно выше соответствующей вели-
чины для слабых взаимодействий. Поэтому разорвать водородные
связи можно лишь с помощью полярных органических растворите-
лей, например метанола, этанола и других низших спиртов, а также
воды, т. е. веществ с высокой диэлектрической постоянной.
Наконец, наибольшей прочностью характеризуются ионные
связи, образующиеся между липидами и веществами неэкстрагиру-
емого остатка. Так, известны взаимодействия типа «ион — диполь»
с фосфатными группами липидов, а также комплексы фосфолипи-
дов с ионами щелочноземельных металлов. В свою очередь, эти ком-
плексы могут быть связаны с биополимерами клетки. Именно ион-
ные связи, вероятно, являются причиной трудной экстрагируемости
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 469
некоторых липидов, например трифосфоинозитидов, которые мож-
но извлечь лишь после некоторого смещения величины рН экстра-
гента в кислую или щелочную сторону.
В то же время липиды могут удерживаться в растительном мате-
риале не только различными химическими связями, но и механи-
ческими факторами. Так, в семенах злаков спиральные молекулы
амилозы крахмала образуют комплексы с лизофосфатидилхолином
по типу соединений включения, которые можно разрушить только
водонасыщенным н-бутанолом, способным замещать липиды в по-
лости спирали. Еще одним таким фактором может служить недоста-
точная проницаемость клеточных оболочек для растворителей. В
данном случае выход липидного материала можно увеличить путем
добавления к экстрагенту небольшого количества воды, которая вы-
зывает набухание полисахаридных структур этих оболочек, увели-
чивая тем самым дисперсность живой системы и облегчая доступ
экстрагента к липидам. Таким образом, количественной экстрак-
ции полярных липидов можно достичь лишь в присутствии воды.
Проницаемость оболочек можно также повысить слабым (1:300)
подкислением экстрагента соляной кислотой, которое, кроме того,
вызывает разрыв ионных связей (см. выше) [5, 6].
Гомогенаты водонасыщенных растительных тканей обычно ха-
рактеризуются высокой активностью липолитических и липоксиге-
назных ферментов, приводящей к быстрому разрушению полярных
липидов. Для его предотвращения свежий материал следует фикси-
ровать кипящим изопропанолом или кипящей водой и, при необхо-
димости, хранить полученную смесь до момента гомогенизации на
холоду. Вопреки широко распространенному мнению, замораживание
свежей ткани не гарантирует сохранения липидов в нативном состоя-
нии; в действительности такой прием может даже ускорить разруше-
ние липидов — в особенности при последующем оттаивании [6].
Очевидно, что на всех этапах препаративного выделения липи-
дов (см. выше), начиная с фиксации материала, остатки содержа-
щихся в них полиненасыщенных ЖК следует защищать от нефер-
ментативного аутоокисления под действием кислорода внешней
среды. Для достижения этой цели все применяемые органические
растворители должны содержать ионол (бутил-окситолуол, ВНТ,
25 мг/л) в качестве антиоксиданта, а в ходе экстракции через экс-
трагент необходимо пропускать поток инертного газа. Ясно также,
что должны быть обеспечены чистота растворителей и посуды, а
также техника безопасности при работе с такими весьма токсичны-
ми и недостаточно химически устойчивыми веществами, как хлоро-
форм и метанол [6, 7].
470 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
В настоящей работе мы рассмотрели лишь наиболее принципи-
альные данные, касающиеся техники получения препаратов по-
лярных липидов растений. Более подробные сведения об экспери-
ментальных деталях тех или иных методик можно найти в обзорах
и статьях, приведенных в списке литературы.
Выделение липидов
Большинство существующих методов экстракции полярных липи-
дов из растительных тканей, в том числе и применяемый в нашей
лаборатории, основаны на впервые предложенном в работе Folch
et al. [8] использовании эквимолярной смеси хлороформа и метано-
ла (2:1, об/об). Высокая эффективность этой смеси, где на каждую
молекулу хлороформа приходится одна молекула метанола, обу-
словлена способностью активного протона хлороформа ассоцииро-
ваться с молекулами воды под действием слабых водородных свя-
зей. В результате данная смесь способна сольватировать до 5,5% со-
держащейся в ткани воды без образования двухфазной системы [6].
В нашей лаборатории для извлечения липидов из растительного
материала уже в течение многих лет используется созданный нами
специальный прибор (рис. 5.7.1). Его действие основано на принци-
пе исчерпывающей ступенчатой экстракции. Растворитель удержи-
вается в камере экстрактора давлением газа на нижнюю поверхность
фильтра 12 или же герметизацией пространства под фильтром. В то
же время жидкость можно полностью удалить из камеры фильтро-
ванием в вакууме. Постоянное перемешивание суспензии обеспечи-
вает исчерпывающую экстракцию липидов из материала. Такое пе-
ремешивание достигается как с помощью магнитной мешалки 4,
так и непрерывным пропусканием аргона (5 мл/мин), который од-
новременно вытесняет из камеры экстрактора 8 воздух; даже техни-
ческий аргон обычно содержит меньше воздуха, чем азот, и, буду-
чи тяжелее воздуха, эффективно замещает последний в экстрак-
торе [7].
Воздушно-сухой растительный материал (семена и др.) измель-
чают до образования ~0,25-мм частиц, что способствует количес-
твенному выходу липидов из клеток; применение более мелких час-
тиц может затруднить последующее фильтрование их суспензий.
Полученную муку сразу же переносят в камеру экстрактора 8 и за-
ливают содержащим метанол экстрагентом для предотвращения фер-
ментативного гидролиза липидов.
При планировании эксперимента со свежими водонасыщен-
ными вегетативными тканями (листья, побеги, корни, мякоть пло-
дов и т. п.) следует исходить из того, что они обычно содержат не ме-
нее 7-8% этерифицированных ЖК на сухую массу, и что количест-
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 471
Рис. 5.7.1. Прибор для экстракции липидов. (А) Пузырьковый измери-
тель скорости газа. (Б) Экстрактор с головкой и приемной колбой. (В) Тру-
бопровод с источником инертного газа. (Г) Различные положения треххо-
дового крана 22.1 — бюретка пузырькового измерителя с делениями на О,
5 и 10 мл, 2 — резиновая груша для мыльного раствора, 3 — шланг пу-
зырькового измерителя, 4 — плита магнитной мешалки, 5 — переключа-
тель скорости мешалки, 6 — отводная трубка головки экстрактора, 7 —
головка экстрактора НШ-29, 8 — камера экстрактора НШ-29, 9 — ниж-
ний уровень трубки химической воронки, 10 — исходный уровень раство-
рителя 1 в экстракторе (13 мл), 11 — магнит в стеклянной ампуле, 12 —
фильтр из пористого стекла № 3, 13 — трубка для оттока жидкости из ка-
меры экстрактора, 14 — выступы для крепления колбы при помощи рези-
нового кольца, 15 — мерная 200-мл приемная колба НШ-14, 5,16 — отвод-
ная трубка экстрактора для соединения с трубопроводом В, 17 — шланг
для соединения отводной трубки капилляра 18 с отводной трубкой реду-
цирующего вентиля баллона с инертным газом (аргоном); капилляр слу-
жит для дросселирования потока газа, 19 — вакуумные шланги, 20 — от-
водная трубка трехходового крана 22 для соединения с экстрактором,
21 — отводная трубка трехходового крана для соединения с отводной
трубкой капилляра, 22 — трехходовой кран, 23 — отводная трубка трех-
ходового крана для соединения с водоструйным насосом (на рисунке не
показан), 24 — отводная трубка редуцирующего вентиля баллона, 25 —
рукоятка вентиля. Стрелка указывает направление наклона экстрактора
(см. раздел 2)
472 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
во этих ЖК в пробе материала для экстракции не должно быть ниже
10-20 мг. Для извлечения липидов свежие ткани измельчают скаль-
пелем, немедленно фиксируют 30-минутным кипячением в изо-
пропаноле, тщательно растирают в ступке, добавляя в случае необ-
ходимости ацетон, образовавшуюся суспензию переносят в камеру 8
и растворители удаляют фильтрованием [6, 9]. Экстракцию липи-
дов в приборе (рис. 5.7.1) и определение полноты их извлечения
можно, как правило, выполнить за 1-2 рабочих дня.
Для экстракции материала, находящегося на фильтре 12, осаж-
дения суспензии и отфильтровывания надосадочной жидкости трех-
ходовой кран устанавливают в положениях I, II и III соответственно.
Работу проводят при комнатной температуре и в присутствии ионо-
ла (см. выше). Растительный материал сначала трижды обрабатыва-
ют в течение 40, 3 и 3 мин смесью 1 — СНСl3:СH3ОН:H2O (3:2:0,17),
а затем 3 раза по 30 мин смесью 2 — CHCl3:CH3OH:HNO3 (2:1:0,01).
После экстракции кислоту в приемной колбе 15 немедленно ней-
трализуют небольшим избытком водного аммиака. Объем экстракта
доводят до метки изопропанолом и отбирают аликвоту для ГЖХ-ана-
лиза ЖК (см. ниже), а растворители из оставшейся части экстракта,
предназначенной для очистки и фракционирования (см. «Очистка
липидов»), удаляют на вакуумном роторном испарителе при комнат-
ной температуре. Выдерживать экстрагированные липиды в тече-
ние сколько-нибудь продолжительного времени в «сухом» виде
(без растворителя) недопустимо. Поэтому если их немедленное даль-
нейшее исследование почему-либо невозможно, то после удале-
ния растворителей липиды части экстракта, оставшейся после от-
бора аликвоты, сразу же растворяют в смеси изопропанола с бензолом
(1:19 — 1:4) и полученный раствор переносят в специальную ам-
пулу (рис. 5.7.2) через шлиф 4. Шлифы 4 смазывают вакуумной
смазкой и присоединяют к ним краны со шлифами 5. Ампулу поме-
щают в ледяную баню и через кран 6 пропускают поток аргона до мо-
мента замерзания раствора. Затем ампулу запаивают и хранят при
-5 °С [5, 7].
Чтобы установить, какова степень полноты извлечения липидов
(recovery, R) в %, достигнутая в результате экстракции, проводят,
во-первых, количественное ГЖХ-определение массы этерифициро-
ванных ЖК в остатке растительного материала с применением внут-
реннего стандарта. Для этого содержащий остаток растительного
материала экстрактор, соединенный с приемной колбой малого объ-
ема, отделяют от головки 7 и трубки 16. В камеру 8 добавляют 10 мл
этанола, ~100 мг металлического натрия, перемешивают и вносят
определенную аликвоту (см. ниже) изопропанольного раствора
внутреннего ГЖХ-стандарта — метилового эфира (МЭ) маргарино-
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 473
Рис. 5.7.2. Ампула для хранения препаратов полярных липидов. 1 — ам-
пула, 2 — трубка для подачи инертного газа, 3 — места запаивания, 4 —
шлиф-керн, 5 — шлиф-муфта, 6 — кран подачи газа, 7 — кран отвода газа
вой (н-гептадекановой, С17:0) кислоты. К НШ-29 камеры 8 присое-
диняют обратный холодильник и экстрактор устанавливают над ис-
точником нагрева (трубка 13 приподнята в направлении, указанном
стрелкой). Суспензию материала в экстракторе нагревают до кипе-
ния в течение часа для полного омыления всех этерифицированных
ЖК. Надосадочную жидкость отфильтровывают через трубку 13 в
приемную колбу, растворители выпаривают, остаток растворяют в
воде и добавляют небольшой избыток 10%-го раствора H2SO4. Вы-
павшие ЖК, включающие ЖК пробы проэкстрагированного остат-
ка и ЖК стандарта (С17:0), извлекают гексаном (4x2 мл) и превра-
щают в МЭЖК, которые затем разделяют методом ГЖХ.
Кроме того, для достижения указанной выше цели выполняют
еще одно аналогичное ГЖХ-определение массы ЖК, но в качестве
исходного материала используют аликвоту раствора экстрагирован-
ных липидов (см. выше). В обоих случаях для получения достовер-
ных данных такого определения соотношение по массе между сум-
мой МЭЖК пробы и стандартом (метилмаргаратом) должно быть
близко к 20, т. е. по площади ГЖХ-пик стандарта должен состав-
474 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
лять 5+1% от всех пиков МЭЖК данной хроматограммы. Таким об-
разом, при работе с каждым новым растительным объектом необхо-
димую величину массы добавляемой С17:0-ЖК следует каждый раз
устанавливать заново, опытным путем.
Степень полноты извлечения липидов из растительного матери-
ала (R, %) рассчитывают по уравнению:
R = 100Р x (Р+р)-1,
где Ρ = (ΣSi x Pst/Sst) x (V/υ) и р = ΣSi x pst/sst, мкг — величины массы
этерифицированных ЖК в экстракте и в остатке после экстракции,
соответственно; ΣSi и Σsi — суммарные площади всех пиков хрома-
тограммы, за исключением пика стандарта (С17:0); Sst и sst — пло-
щади пиков стандарта; Pst и рst, мкг — величины массы стандарта,
добавленного для определения количественного состава этерифици-
рованных ЖК в экстракте и в остатке после экстракции, соответ-
ственно; V и υ, мл — соответственно, общий объем экстракта и объем
аликвоты экстракта, отобранной для этого определения. Для прове-
дения серийных расчетов величины R в нашей лаборатории была
разработана компьютерная программа. В опытах с целым рядом как
воздушно-сухих, так и обводненных растительных объектов мы по-
казали, что при использовании данного метода величина R обычно
достигает 98-99% [5, 7, 9].
Внутренний стандарт можно использовать и для предваритель-
ной оценки концентрации и количественного ЖК-состава суммы
липидов в том или ином объекте еще до проведения их экстракции.
С этой целью аликвоту стандарта добавляют к определенной навеске
растительного материала, полученную смесь омыляют, ЖК превра-
щают в МЭЖК и после ГЖХ-разделения рассчитывают массу по-
следних (см. выше).
Следует еще раз подчеркнуть, что полное выделение полярных
липидов из растительной ткани совершенно необходимо, поскольку
их более растворимые компоненты могут значительно отличаться
по составу от прочно связанных. Так, в наших опытах с соей индекс
ненасыщенности ЖК-остатков в этих группах липидов составил
1,61 и 1,37, а содержание насыщенных ЖК в сумме ЖК — 12,3 и
29,0% соответственно [5]. Недавно из вегетативных органов и се-
мян сорго были экстрагированы ТАГ, диацилглицерины, жирные
спирты, стерины, токоферолы и другие липиды, которые были
идентифицированы методами ВЭЖХ, ГЖХ и ТСХ [10].
Оценка нативности полярных липидов в экстракте
Мы уже отмечали, что в процессах подготовки ткани и самой экс-
тракции полярные липиды могут подвергаться сравнительно жест-
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 475
кому воздействию. Поэтому необходимо контролировать степень на-
тивности полученных липидов, т. е. концентрацию их неразрушен-
ных компонентов в выделенном препарате. Такой контроль состоит в
определении в нем веществ, наличие которых в липидах нативной тка-
ни данного растительного объекта исключено или маловероятно [6].
Прежде всего, в этом препарате могут содержаться МЭЖК —
продукты переэтерификации липидов с метанолом, который пред-
ставляет собой первичный спирт с наиболее активной ОН-группой.
Его присутствие в экстрагенте, наряду со следами минеральной кис-
лоты, может вызывать алкоголиз сложноэфирных групп этих сое-
динений [5]. Для определения концентрации МЭЖК в липидном
препарате его смешивают с внутренним стандартом, МЭЖК выделя-
ют с помощью адсорбционной ТСХ на окиси алюминия (Аl2O3) или
на силикагеле и их количество устанавливают методом ГЖХ. Уро-
вень МЭЖК природного происхождения, исходно присутствующих
в ткани, устанавливают экстракцией растительного материала без
применения метанола. Наши опыты с семенами сои показали, что
выделенный препарат липидов включал ~0,41% МЭЖК, из которых
-0,34% МЭЖК возникали в результате метанолиза липидов в ходе
их извлечения, а ~0,07% МЭЖК были природного происхождения.
После хранения метанол-содержащего экстракта в течение 48 ч при
+5 °С общее количество МЭЖК возрастало в 3-5 раз.
Наряду с метанолом экстрагент неизбежно содержит то или
иное количество воды из растительной ткани, и потому в выделен-
ных липидах часто находят продукты их гидролиза — свободные
ЖК (СЖК). Как известно, они оказывают токсическое действие на
клеточные мембраны. Поэтому СЖК не могут содержаться в полно-
ценной живой ткани, и наличие этих артефактов в липидном препа-
рате наиболее убедительно указывает на то, что при обработке рас-
тительного материала нативность липидов была нарушена. Опреде-
ление СЖК в экстрагированных липидах включает их разделение
методом препаративной ТСХ, выделение зоны СЖК и установление
их количественного содержания методом ГЖХ с внутренним стан-
дартом (см. выше). Уже упоминавшиеся эксперименты с соей позво-
лили установить, что в липидном препарате уровень СЖК составлял
~0,09%. Следовательно, при экстракции гидролиз липидов проте-
кал значительно медленнее, чем их метанолиз.
Можно видеть, что в липидах экстракта сои суммарная концен-
трация СЖК и МЭЖК не превышала 0,5%; степень нативности
липидов в выделенном препарате достигала 99,6% . Мы приходим
к выводу, что при строгом соблюдении рассмотренных выше усло-
вий опыта липиды почти целиком предохраняются от разруше-
ния [5, 11].
476 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
Если же эти условия не соблюдались, то в экстрактах, наряду с
МЭЖК и СЖК, нередко обнаруживаются артефактные продукты
ферментативного разрушения полярных липидов фосфолипазами:
фосфолипазой А2 — лизофосфолипиды; фосфолипазой С — sn-1,2-ди-
ацилглицерины; фосфолипазой D — фосфатидные кислоты или фос-
фатидилметанолы, и т. д., а также продукты липоксигеназного и
аутоокисления (см. выше). Все эти продукты разрушения в той или
иной степени поверхностно-активны, оказывают мембранолитичес-
кий эффект и потому в норме не свойственны живой растительной
ткани, хотя некоторые из них иногда встречаются в липидных экс-
трактах в качестве минорных компонентов. Поэтому утверждения
об их присутствии в сколько-нибудь значительном количестве в том
или ином объекте нельзя признавать достоверными, если не будет
доказано, что эти продукты не возникали в результате нарушения
нативности липидов при хранении и/или экстракции растительного
материала [6].
Таким образом, методика экстракции, видоизмененная для
какого-либо нового биологического объекта, может применяться
к нему только после того, как в отношении этого объекта будет
достигнуто полное извлечение липидов при сохранении их натив-
ности.
Очистка липидов экстракта от нелипидных примесей
Как правило, содержание нелипидных примесей в экстрактах рас-
тительного материала намного превышает концентрацию в этих
экстрактах самих полярных липидов. Так, исходный экстракт се-
мян сои включал (в %) водорастворимые вещества (42,3), ТАГ
(41,3), гидрофобные белки (11,6) и только 4,8% полярных липидов;
всего растворялось до 56% сухой массы семени [5]. Солюбилизация
этих загрязнений вызывается, во-первых, тем, что применяемые
экстрагенты наряду со слабополярным растворителем — хлорофор-
мом — всегда содержат и полярные жидкости — метанол, воду и т. д.
(см. «Выделение липидов»), а во-вторых — солюбилизирующим дей-
ствием самих полярных липидов экстракта на водорастворимые
вещества экстрагируемого материала. Неочищенные экстракты, как
правило, невозможно прямо использовать для достоверного ТСХ-опре-
деления состава полярных липидов в данной ткани, поскольку при
разделении таких смесей на пластинке образуются «хвосты», а боль-
шое количество липидов остается в стартовой зоне в абсорбирован-
ном состоянии.
Как и проблема экстракции липидов, проблема их количествен-
ной очистки от загрязнений включает, прежде всего, достижение
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 477
полного возврата липидов в результате очистки, а также получение
препарата, лишенного нелипидных примесей и липидных артефак-
тов. По-видимому, здесь наиболее перспективна адсорбция на Аl2O3.
Можно считать, что активность этого адсорбента достаточна для ко-
личественного отделения липидов от сопутствующих загрязнений
и в то же время не столь сильна, чтобы вызвать в них необратимые
химические изменения. В этом отношении Аl2O3 выгодно отличает-
ся от кремнекислоты (силикагеля, SiO2), которая, будучи наиболее
сильным из существующих адсорбентов, может необратимо связы-
вать как разнообразные загрязнения из внешней среды, так и неко-
торые полярные липиды, вызывая их частичное разрушение; к тому
же количество ЖК в неэлюируемых липидах в данном случае невоз-
можно определить с помощью щелочного гидролиза содержимого
колонки.
В нашей работе применение пластинок, содержавших лишен-
ную каталитически-активных ОН-групп Аl2O3 наименьшей, V сте-
пени активности, а также силанизированный кизельгур позволило
практически целиком очистить экстракт семян сои (см. выше) от
ТАГ и нелипидных соединений фосфора. Затем при использовании
избирательной молекулярной адсорбции на широкой (3x5 см) ко-
лонке с Al2O3 нам удалось получить три фракции полярных липи-
дов, одна из которых, не содержавшая фосфолипидов, была почти
полностью очищена от белка. По общей концентрации полярных
липидов сумма этих фракций более чем в 10 раз превосходила ис-
ходный экстракт (52% против 4,8%). Во всех этих опытах возврат
липидов после их очистки превышал 99% [5].
В дальнейшем для очистки исходного экстракта нами была со-
здана полуавтоматическая жидкостно-хроматографическая установ-
ка, состоящая из колонки (1x33 см) с Аl2O3 III степени активности,
ультратермостата, микронасоса и коллектора фракций. После раз-
деления на этой установке в сочетании с жидко-жидкостным рас-
пределением уровень полярных липидов в сумме выделенных фрак-
ций достигал 95%, а их возврат - ~99% [12].
На принципе жидко-жидкостного распределения основан и дру-
гой современный способ очистки полярных липидов, выделенных
из биологических объектов — методика Folch et al. [8]. Согласно
этой методике, к хлороформ-метанольному (2:1, об/об) экстракту
липидов добавляют в количестве 1/4 от его объема воду (или 0,88%
КС1) так, чтобы объемное соотношение между этими компонентами
всегда равнялось 8:4:3. После встряхивания и отстаивания получен-
ной смеси образуются нижняя и верхняя фазы, в которых это соот-
ношение равно 86:14:1 и 3:48:47 соответственно. Очищенные липи-
ды должны содержаться в нижней фазе, составляющей 60% общего
478 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
объема, а нелипидные примеси — в верхней. Если необходимо более
полно удалить эти примеси из нижней фазы, к ней приливают смесь
метанола и воды (1:1), сходную по составу с верхней фазой, и снова
встряхивают; количество добавляемой при этом смеси должно быть
таким, чтобы соблюдалось исходное соотношение 8:4:3 (см. выше).
В применении к объектам с высоким содержанием воды метод Folch
et al. [8] был успешно модифицирован в работе Bligh, Dyer [13], ко-
торые предложили учитывать ее объем при составлении исходного
экстрагента с соотношением 8:4:3 (см. выше).
В настоящее время этот модифицированный метод наиболее рас-
пространен в лабораторной практике. В то же время его использова-
ние многими авторами позволило выявить и целый ряд присущих
ему недостатков.
Так, было показано, что полного разделения веществ между фа-
зами не происходит, и каждая из них в той или иной степени содер-
жит соединения, преобладающие в другой фазе. С одной стороны,
при каждом промывании в верхнюю фазу может переходить от 2 до
10% экстрагированных липидов благодаря способности некоторых
из них, например гликолипидов или лизофосфолипидов, образовы-
вать с водой истинные растворы ниже их критической мицеллярной
концентрации, а также вследствие легкости эмульгирования в воде
липопротеидов, протеолипидов и т. д.
С другой стороны, такое промывание не всегда полностью удаля-
ет нелипидные примеси, уровень которых в нижней фазе по Folch
et al. [8] может составлять до 8% от массы ее сухого остатка. Кроме
того, на границе между фазами почти всегда возникает промежуточ-
ный слой в виде весьма устойчивой водной эмульсии липидов и гид-
рофобных мембранных белков, которая при распределении вклю-
чается в нижнюю фазу. Наконец, метод Folch et al., по-видимому,
неприменим для очистки липидов, выделенных, как в наших иссле-
дованиях (см. «Выделение липидов»), с использованием исчерпыва-
ющей экстракции, поскольку в таком случае содержание нелипид-
ных примесей, легко переходящих в нижнюю фазу, бывает особенно
велико. Отмеченные ограничения, безусловно, следует учитывать
при планировании соответствующих экспериментов [5, 6].
К современным методам очистки изолированных полярных ли-
пидов от примесей принадлежит также жидко-жидкостная распре-
делительная хроматография [14]. Колонку заполняют суспензией
гидрофильного полидекстранового геля Sephadex G-25 в верхней
фазе по Folch et al., раствор «сырых» липидов в минимальном объе-
ме нижней фазы вносят в колонку, липиды элюируют этой фазой
для полного отделения примесей, поглощаемых гелем, и колонку
регенерируют для дальнейшего использования пропусканием верх-
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 479
ней фазы. В результате очистки животных липидов этим методом
возврат липидного фосфора, достигал 94-100%, а уровень нелипид-
ных примесей в очищенных препаратах не превышал 1% . Успехи в
работах с животными липидами, полученные с помощью данной ме-
тодики, позволили применить ее и в исследовании растительных
тканей. При этом возврат липидного фосфора, выход липидов из ко-
лонки и содержание водорастворимых примесей в выделенном пре-
парате липидов составили 94, 97 и 2% соответственно. Недостаток
данного метода — значительная затрата времени, требуемая для его
выполнения [5, 6].
Можно сделать вывод, что, несмотря на бесспорные успехи, проб-
лема очистки липидов экстракта от нелипидных загрязнений еще
не решена и ни один из существующих сейчас методов не обеспечи-
вает полного соблюдения тех условий, которые были сформулирова-
ны в начале этого раздела. Это обстоятельство следует непременно
учитывать при планировании новых работ с липидами растений.
Предварительное фракционирование
суммы полярных липидов
Чтобы достоверно определить качественный и количественный со-
став индивидуальных компонентов полярных липидов в очищенном
экстракте из данного растительного объекта, необходимо иденти-
фицировать такие компоненты в каждом классе этих липидов и
установить их молярную концентрацию. Между тем отдельные ли-
пидные классы в их смеси обычно значительно различаются между
собой по величине полярности, растворимости, электрического за-
ряда и другим физико-химическим свойствам [1, 2, 4]. Очевидно, что
непосредственное использование такого экстракта для анализа ин-
дивидуальных липидных компонентов, без предварительного раз-
деления липидов этого экстракта на отдельные классы или хотя бы
их группы, не может привести к получению сколько-нибудь успеш-
ных результатов.
Поэтому уже в течение многих лет проводятся работы по предва-
рительному фракционированию смеси липидов экстракта. Цель
этих работ состоит в получении фракций, более простых по составу,
более однородных по физико-химическим свойствам, чем исходная
смесь, и потому пригодных для последующего ВЭЖХ- или ТСХ-раз-
деления в сочетании с ГЖХ-анализом ЖК, масс-спектрометрией
и т. д. Существующие методы такого фракционирования включают
адсорбционную и ионообменную хроматографию на колонках, про-
тивоточное распределение, диализ и др.
В нашей работе фракционирование смеси полярных липидов
сои выполнялось одновременно с их очисткой (см. «Очистка липи-
480 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
дов...»). Эти липиды, свободные от ТАГ, выделили с пластинки
Аl2O3 смесью хлороформа, изопропанола и воды (20:10:10), а также
водонасыщенным бутанолом; выход суммы полярных липидов и
фосфолипидов составил 99,1 и 98,6% соответственно. Избиратель-
ная молекулярная адсорбция на Аl2O3 с элюированием ацетоном,
хлороформ-метанолом и бутанолом позволила получить фракции
бесфосфорных полярных липидов, фосфолипидов и высокополяр-
ных липидов, соответственно, с суммарным выходом > 99% . Нако-
нец, при работе на полуавтоматической хроматографической уста-
новке эту смесь разделили на пять очищенных фракций (23,5, 17,6,
5,9, 33,3 и 19,6% от суммы), которые затем были использованы для
ТСХ-анализа [12].
Ранее, при фракционировании полярных липидов на Аl2O3 с
применением смесей хлороформа, метанола и воды; хлороформа,
этанола и 70 мМ ΝΗ4ΝO3 (pΗ 5,1) и хлороформа, этанола и 70 мМ
ацетата ΝΗ4 (pΗ 7,8) получили пять фракций: 1) простых липидов +
фосфатидилхолинов, 2) сфингомиелинов + лизофосфатидилхоли-
нов, 3) фосфатидилэтаноламинов, 4) фосфатидилинозитов + кар-
диолипинов и 5) фосфатидилсеринов. Использование нейтрального
адсорбента и растворителей с реакцией среды, близкой к нейтраль-
ной, позволило в значительной степени сохранить нативность этих
липидов.
Иногда адсорбентом при фракционировании полярных липидов
служит флорисил (Florisil®), обработанный для снижения содержа-
ния окиси магния соляной кислотой. Этот материал дает результа-
ты, сходные с теми, которые достигаются с Аl2O3. Его применение
наиболее оправдано в том случае, когда разделяемая смесь богата
кислыми фосфолипидами. Благодаря своему повышенному срод-
ству к следам магния, оставшимся в адсорбенте, эти липиды могут
селективно отделяться от других компонентов смеси. Если бы фло-
рисил был легче доступен, он мог бы служить одним из наиболее
перспективных адсорбентов для предварительного фракционирова-
ния суммы липидов.
При работе на колонке с кремнекислотой (SiO2) одни авторы об-
наружили, что ацетон совершенно не десорбирует фосфолипиды с
этой колонки, обеспечивая тем самым селективное элюирование
гликолипидов; последующий возврат фосфолипидов из колонки
хлороформ-метанолом составляет в среднем 95%. В то же время в
других работах было показано, что абсолютно четкое разделение по-
лярных липидов на фракции в этих условиях обычно не достигает-
ся, а степень полноты выхода липидов и сохранения их нативности
также оказывается недостаточной. Эти обстоятельства следует осо-
бенно принимать во внимание, если для фракционирования исполь-
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 481
зуются смеси липидов, полученные путем исчерпывающей экстрак-
ции (см. «Выделение липидов»). Тем не менее следует признать,
что, несмотря на имеющиеся недостатки, методы адсорбционной
хроматографии, по сравнению с другими, пока наиболее пригодны
для предварительного фракционирования липидов — как для отде-
ления неполярных липидов от полярных, так и для разделения по-
следних на отдельные группы.
Другой разновидностью колоночной хроматографии, используе-
мой для фракционирования полярных липидов, служит ионообмен-
ная хроматография. В данном случае их разделение базируется в
основном на различии между классами липидов по знаку или вели-
чине их электрического заряда и, в меньшей степени, — на разли-
чии в полярности, обусловленном присутствием гидроксильных и
других неионогенных групп. Ионообменным материалом в колонке
при этом обычно служит диэтиламиноэтил-(ДЭАЭ-)целлюлоза, ко-
торую для создания заряда на ее поверхности последовательно про-
мывают НС1, водой, КОН, вновь водой до рН 7, СH3СООН и СH3ОН.
Неионогенные полярные липиды (гликолипиды и др.) элюируют
смесью хлороформа с метанолом при рН 7; амфотерные (фосфати-
дилхолины и др.) — той же смесью, но содержащей ацетат аммония,
кислые (фосфатидилглицерины и др.) — хлороформом с добавлени-
ем СH3СООН; а основные (фосфатидилэтаноламины, липоаминокис-
лоты и др.) — смесью хлороформа с водным аммиаком. Таким обра-
зом, состав липидов в каждой фракции определяется составом об-
менных ионов в соответствующей подвижной фазе. На этой колонке
из липидных экстрактов растений выделили фракции сульфолипи-
дов, галактолипидов и т. д., пригодные для дальнейшего ТСХ-ана-
лиза. Нативность липидов при фракционировании сохранялась, но
достаточная селективность их разделения при этом не обеспечива-
лась, поскольку в каждой фракции можно было обнаружить значи-
тельную примесь как предыдущей, так и последующей фракций.
Кроме того, некоторые классы фосфолипидов (фосфатидилинозиты
и др.) могли прочно адсорбироваться ДЭАЭ-целлюлозой [2, 5, 6].
В одном из недавних исследований непрерывное многоэтапное
градиентное микрофракционирование мембранных глицеролипидов
листьев и корней риса с использованием сочетания анионообмен-
ных аминопропиловых колонок и колонок SiO2 позволило получить
препараты фосфолипидов (фосфатидилэтаноламинов, -холинов, -ино-
зитов и -глицеринов) и гликолипидов (моногалактозил-, дигалакто-
зил- и сульфохиновозилдиацилглицеринов) с выходом 87-95% и
стандартным отклонением 3-7% [15].
Иногда для фракционирования полярных липидов используют
гель-хроматографию на высокополимерном полисахариде Sephadex
482 ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ И АНАЛИЗА СТРУКТУР
LH-20. На этом носителе фосфолипиды селективно отделяются от
протеолипидов, а сами фосфолипиды разделяются на сфингомиели-
ны + фосфатидилхолины, фосфатидилэтаноламины и фосфатидил-
серины + монофосфоинозитиды с выходом, близким к 100%. В то
же время можно считать, что область применения Sephadex LH-20
будет ограниченной, поскольку получаемые с его помощью фрак-
ции часто объединяют липиды, весьма разнородные по величине
ТСХ-подвижности.
Наконец, использование жидко-жидкостного разделения, кото-
рое включает методы противоточного распределения и диализа,
основанные на различии между отдельными группами липидов по
их сродству к тому или иному растворителю, обеспечивает эффек-
тивное отделение полярных липидов от нейтральных с высокой се-
лективностью и сохранением нативности. Однако для предвари-
тельного фракционирования самих полярных липидов между собой
эти методы непригодны [2, 5, 6].
Заключение
Материалы настоящей статьи позволяют сделать вывод, что созда-
ние универсального метода экстракции, очистки и фракционирова-
ния полярных липидов, который был бы пригоден для любого рас-
тительного объекта, представляет собой, по-видимому, неосуществи-
мую задачу. Следовательно, в настоящее время при выполнении
исследований, касающихся липидной тематики, следует макси-
мально учитывать и принимать во внимание многообразные резуль-
таты, уже достигнутые в этой области. По мере появления новых ме-
тодик такого рода, отвечающих всем необходимым требованиям в
применении к отдельным объектам, задача получения достоверных
данных состава и содержания полярных липидов в каждом новом
растительном материале будет становиться все более реальной.
Литература
1. Васъковский В. Е. Липиды // Соросовский образоват. журнал,
1997. № 3. С. 32-39.
2. Christie WW. http: //lipidlibrary.aocs . org/Lipids /what lip/
index.htm
3. Goebel C, Feussner I. Methods for the Analysis of Oxylipins in
Plants // Phytochemistry. 2009. V. 70. P. 1485-1503.
4. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и иденти-
фикация липидов. М.: Мир, 1975. 323 с.
5. Zhukov A. V., Vereshchagin A. G. Current Techniques of Extraction,
Purification, and Preliminary Fractionation of Polar Lipids of
Раздел 5.7. Количественная экстракция полярных липидов 483
Natural Origin // Advances in Lipid Research. 1981. V. 18.
P. 247-282.
6. Christie W. W. Preparation of Lipid Extracts from Tissues //
Advances in Lipid Methodology — Two / Ed. Christie W.W. Dundee:
The Oily Press, 1993. P. 195-213.
7. Жуков А. В., Верещагин А. Г. Прибор для количественной экс-
тракции липидов из растительного материала // Физиология
растений. 1974. Т. 21. С. 659-663.
8. Folch J., Lees Μ., Stanley G. H. S. A Simple Method for the
Isolation and Purification of Total Lipids from Animal Tissues //
J. Biol. Chem. 1957. V. 226. P. 497-509.
9. Цыдендамбаев В. Д., Верещагин А. Г. Исследование липидов
корня сахарной свеклы в связи с функцией сахаронакопле-
ния. 2. Экстрагируемость ацилсодержащих липидов паренхи-
мы покоящегося корня // Физиология растений. 1980. Т. 27.
С. 778-784.
10. Christiansen К. L., Weller С. L., Schlegel V. L., Cuppett S.L.,
Carr Т. P. Extraction and Characterization of Lipids from the
Kernels, Leaves, and Stalks of Nine Grain Sorghum Parent
Lines // Cereal Chemistry. 2007. V. 84. P. 463-470.
11. Жуков А. В., Верещагин А. Г. Об экстрагируемости липидов из
семян сои // Физиология растений. 1974. Т. 21. С. 1083-1089.
12. Жуков А. В., Верещагин А. Г. Фракционная очистка полярных
липидов семян сои методом хроматографии на колонке с окисью
алюминия // Физиология растений. 1982. Т. 29. С. 212-218.
13. Bligh Ε. G., Dyer W. J. A Rapid Method for Total Lipid Extraction
and Purification // Canad. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37.
P. 911-917.
14. Wuthier R. E. Purification of Lipids from Nonlipid Contamination
on Sephadex Bead Columns // J. Lipid Research. 1966. V. 7.
P. 558-561.
15. Rizov /., Doulis A. Separation of Plant Membrane Lipids by
Multiple Solid-phase Extraction // J. Chromatogr. A. 2001.
V. 922. P. 347-354.
Оглавление
Предисловие 3
ГЛАВА 1. МЕТОДЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И БИОИНФОРМАТИКИ 5
1.1. Получение трансгенных растений
методом агробактериальной трансформации
Г. Н. Ралдугина, С. А. Данилова, Н. О. Юрьева 5
1.2. Получение транспластомных растений табака
методом баллистической трансформации
С. А. Данилова 26
1.3. Генетически трансформированные корни
как модельная система для изучения физиологических
и биохимических процессов корневой системы
целого растения
И.Н. Кузовкина, М.Ю. Вдовитченко 37
1.4. Применение конструкций ДНК
с репортерными генами
в физиологии растений
Г. А. Романов 53
1.5. Инсерционные мутанты Arabidopsis thaliana
и их использование
для изучения функции гена
А. В. Демиденко 66
1.6. Полимеразная цепная реакция.
Стратегия подбора праймеров
для анализа экспрессии генов
Е. А. Лысенко 75
1.7. Сравнение последовательностей ДНК и белков
Е. А. Лысенко 96
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМА
И ЕГО ЭКСПРЕССИИ 109
2.1. Саузерн-блот-гибридизация
Д. В. Беляев 109
2.2. Применение гидрогелевых биочипов для идентификации
генно-модифицированных источников
Д. А. Гряду нов, И. А. Гетман, Г. А. Романов 120
ОГЛАВЛЕНИЕ
485
2.3. Определение относительного количества
транскриптов растительных генов
методом нозерн-блот-гибридизации
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко 136
2.4. Изучение регуляции экспрессии растительных генов
с использованием метода run-on транскрипции
Я. О. Зубо, М. В. Ямбуренко, В. В. Кузнецов 147
2.5. Определение относительного содержания транскриптов
генов растений с помощью ОТ-ПЦР
А. К. Кравцов, В. В. Кузнецов 158
2.6. Исследование транскрипции генов
с помощью ДНК микрочипов
Д. А. Лось 167
2.7. ПЦР в режиме реального времени
на аппаратах отечественного производства
Г. А. Романов, Л. И. Патрушев 173
2.8. QTL-анализ и его применение
в физиологических исследованиях
Л. И. Сергеева 185
ГЛАВА 3. МЕТОДЫ БЕЛКОВОЙ ХИМИИ
И ГИСТОХИМИИ 201
3.1. Количественное определение содержания белка
И. Е. Мошков, Н. С. Степанченко, Г. В. Новикова 201
3.2. Разделение белков при помощи электрофореза
в присутствии додецилсульфата натрия
и двумерный электрофорез
Г. В. Новикова, Н. С. Степанченко, И. Е. Мошков 212
3.3. Вестерн-блот-гибридизация
Е. С. Пожидаева 228
3.4. Экспрессия целевых (рекомбинантных) белков
в бактериях
Е. С. Пожидаева 241
3.5. Гистохимическая (in situ) локализация активности
ферментов углеводного метаболизма
в растительных тканях
Л. И. Сергеева 256
3.6. Гистохимические методы определения локализации
тяжелых металлов и стронция
в тканях высших растений
И. В. Серегин, А. Д. Кожевникова 268
486
ОГЛАВЛЕНИЕ
ГЛАВА 4. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
И ТРАНСДУКЦИИ СИГНАЛОВ 281
4.1. Количественное определение в растениях ИУК, цитокини-
нов, абсцизовой кислоты и гиббереллинов
иммуноферментным методом (ELISA)
Л. М. Котова, А. А. Котов 281
4.2. Количественное определение индолил-3-уксусной кислоты,
абсцизовой кислоты и галоидфеноксикислот
в одном образце растительной ткани
В. В. Карягин, В.Ю. Ракитин, В. Л. Садовская 316
4.3. Определение выделения и содержания этилена
в растениях
В.Ю. Ракитин, Т.Я. Ракитина 323
4.4. Определение свободных и связанных полиаминов
в растениях методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии
B. Ю. Ракитин, О. Н. Прудникова,
Л. А. Стеценко, Н. И. Шевякова 337
4.5. Методы оценки содержания
активных форм кислорода,
низкомолекулярных антиоксидантов
и активностей основных антиоксидантных ферментов
Н.Л. Радюкина, Ю.В. Иванов, Н.И. Шевякова 347
4.6. Анализ гормон-рецепторного взаимодействия
радиолигандным методом
C. Н. Ломин 365
4.7. Применение трансгенных бактерий
для изучения мембранных рецепторов
Г. А. Романов 377
ГЛАВА 5. МЕТОДЫ БИОЛОГИИ КЛЕТКИ
И АНАЛИЗА СУБКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР 386
5.1. Методы оценки и характеристики
роста культур клеток высших растений
А. М. Носов 386
5.2. Протопласты клеток растений
как объект для физиологических, биохимических,
молекулярных и генетических исследований
А. В. Носов, Т. А. Шевырёва, М. С. Трофимова,
О. И. Соколов, Е. Б. Глоба, А. А. Фоменков,
И. Н. Смоленская 403
ОГЛАВЛЕНИЕ
487
5.3. Определение параметров водного статуса
растительных клеток
с помощью внутриклеточного зонда давления
А. Б. Мещеряков, В. П. Холодова 424
5.4. Определение основных характеристик
водного баланса растений —
водного и осмотического потенциала и тургора —
методом термопарной изопиестическои психрометрии
А. А. Котов, Л. М. Котова 433
5.5. Методы выделения митохондрий растений
и определения их интактности
A. Г. Шугаев, Д. А. Лаштабега, Н. С. Белозерова,
И. П. Генерозова 448
5.6. Получение плазма леммы
методом разделения микросомальных мембран
в водной двухфазной полимерной системе
М. С. Трофимова, Т. А. Шевырева, И. М. Жесткова,
С. Н. Ломин 456
5.7. Количественная экстракция полярных липидов
из растительного материала
B. Д. Цыдендамбаев, А. Г. Верещагин 466
Структура
хлоропласта
Рис. 1. Хлоропласты в клетках растений
Рис. 2. Модель ЗБ-структуры GFP
Рис. 3. Примеры окраски растительных тканей. (А) Выявление активнос-
ти GUS у проростков ARR5::GUS арабидопсиса после индукции цитоки-
нином (слева) и в контроле (справа). (Б) Флуоресценция EGFP в клетке
эпидермиса табака при транзиентнои экспрессии конструкта с EGFP,
слитого с рецептором цитокининов арабидопсиса АНКЗ
(363) 363 370 380 390 400 410 420 430 .440
AtSig1(272)
OsSigl (269)
AtSig4[1S2)
AtSig2(345)
OsSig2A(336)
OsSig2Bpi2)
AtSig3(345)
OsSig3-MP32)
AtSig5(292)
OsSig5(276)
AJtSig6P20)
OsSigSP46)
Consensus(363)
Рис. 4. Фрагмент множественного выравнивания последовательностей
программой Clustal W в пакете Vector NTI. Слева указаны названия вы-
равниваемых белков, за ними цифры, обозначающие порядковый номер
представленной рядом аминокислоты в этой последовательности; циф-
ры сверху нумеруют положения в выравнивании в целом; им соответ-
ствует нумерация в консенсусной последовательности, приведенной в ниж-
ней строке. Разрывы последовательности обозначены знаком « - ». Цвето-
вые обозначения: красные буквы на желтом фоне — идентичные во всех
последовательностях; синие буквы на голубом фоне — идентичные в боль-
шинстве последовательностей; черные буквы на зеленом фоне — амино-
кислоты с высоким сходством; зеленые буквы на белом фоне — аминокис-
лоты со слабым сходством; черные буквы на белом фоне — аминокислоты,
не имеющие сходства
Рис. 5. Схема реакций для гистохимического определения ферментов
(подробнее см. рис. 3.5.1 на с. 258)
Рис. 6. Локализация ферментов в развивающихся клубнях картофеля
(подробнее см.рис. 3.5.2 на с. 262)
Рис. 7. Локализация активности ферментов в различных органах и тка-
нях растений (подробнее см.рис. 3.5.3 на с. 264)
Рис. 8. Распределение Pb (А, Б), Ni (В, Г), Sr (Д, Е) и Zn (Ж-И) по тканям
растений (см. пояснения к рис. 3.6.1 на с. 275)
Рис. 9. Анализ уровня автофлуоресценции индикатора Zinpyr-Ι и флуо-
ресценции комплекса Zinpyr-1 с Zn. (А) Отсутствие флуоресценции тка-
ней корня Thlaspi arvense после 7 недель инкубации на питательной среде
в присутствии 50 мкМ Zn(NO3)2 и последующей инкубации корней в тече-
ние 1 ч в присутствии хелатора Zn — Ν, Ν, Ν', N'-тетракис(2-пиридилме-
тил)-этилендиамина (ΤΡΕΝ) с последующей обработкой срезов флуорес-
центным индикатором Zinpyr-1 (фильтр GFP, 488нм). (Б) Показан срез
корня, представленный на рис. (А), для визуализации использован крас-
ный фильтр (543нм). (В) Спектры эмиссии флуоресцентного сенсора
Zinpyr-1, его комплекса с Zn в присутствии или отсутствие ΤΡΕΝ. Кривые
для Zinpyr-1 + ΤΡΕΝ и Zinpyr-1 + ΤΡΕΝ + Zn совпадают [13]
Рис. 10. Флуоресцентная и конфокальная флуоресцентная микроско-
пия протопластов. (Представлены оригинальные результаты авторов,
если не указано иное). (А, Б) Конфокальная флуоресцентная микроско-
пия протопластов культивируемых клеток клена (клетки 24 ч инкубиро-
вали без сахарозы, затем с 50 мМ сахарозы и 1 мМ красителя lucifer
yellow-CH); распределение красителя через (А) 1 ч и (Б) 24 ч (краситель
локализован в вакуоли) культивирования с сахарозой (масштаб — 4 мкм
(А) и 20 мкм (Б)) [XXXI]. (В) Фрагмент протопласта клетки сокового ме-
шочка Citrus limettioides, выделенного после 2-часовой инкубации кле-
ток с 250 мМ сахарозы и 100 мкМ А1еха-488 (маркер эндоцитоза); конфо-
кальная микроскопия эндоцитозных везикул содержащих А1еха-488 (на
периферии темного фона вакуоли, масштаб — 8 мкм) [XXXI]. (Г) Конфо-
кальная микроскопия протопласта спустя 20 ч после электропорации в
присутствии плазмиды кодирующей BobTIP26-l::GFP; видна красная
флуоресценция хлорофилла и зеленая флуоресценция GFP (масштаб —
10 мкм) [XIII]. (Д-Ж) Изменение локализации окрашенного FM 1-43
мембранного материала в протопластах миксотрофной суспензии клеток
сахарной свеклы при осмотическом стрессе. Протопласты инкубировали
в изотонической среде (0,4 Μ сорбит), содержащей 15 мкМ FM 1-43
(15 мин), затем на предметном стекле концентрацию сорбита доводили до
0,4 Μ (Д), 0,25 Μ (Ε) или 0,6 Μ (Ж) (красная флуоресценция хлороплас-
тов, масштаб — 12 мкм). (3, И) Разное фокусирование изображений про-
топласта миксотрофной клетки суспензии сахарной свеклы после 5 мин
инкубирования с филипином (масштаб — 12 мкм). η — ядро; * — вакуоль;
окончание стрелки — оболочка ядра; хл — хлоропласты
Рис. 11. Функциональная схема термопарного психрометра (см. поясне-
ния к рис. 5.4.1 на с. 436)
Рис. 12. Элементы и аксессуары термопарного психрометра (стрелками по-
казана последовательность их использования) (см. пояснения к рис. 5.4.1 на
с. 441)
МОЛЕКУЛЯРНО-
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
И БИОХИМИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ
В СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ
РАСТЕНИЙ
Под редакцией
д-ра биол. наук, профессора, члена-корр. РАН Вл.В. Кузнецова,
д-ра биол. наук, профессора, В. В. Кузнецова,
д-ра биол. наук, профессора, Г.А. Романова.
Москва
БИНОМ. Лаборатория знаний
2012