/
Автор: Ротмистров М.Н.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология микробиология очистка воды
Год: 1978
Текст
АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ КОЛЛОИДНОЙ химии и химии воды М. Н. РОТМИСТРОВ, П.И.ГВОЗДЯК, С.С.СТАВСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ очистки воды КИЕВ «НАУКОВА ДУМКА» 1978
УДК 576.8 : 575.2 Микробиология очистки воды. Ротмистров М. Н„ Гвоздяк П. И.. Став- ская С. С. К., «Наук, думка», 1978. 268 с Монография посвящена проблеме очистки воды от синтетических и трудно разлагаемых природных органических соединений, а также освобо- ждения воды от микроорганизмов. Приведены общие сведения о микроорга- низмах. Дано описание известных в литературе микробов, участвующих в разложении и обезвреживании синтетических и устойчивых природных ор- ганических соединений. Проанализированы пути биохимической деструкции этих веществ. Описаны методы отделения микробных клеток от воды. Рассчитана на микробиологов и биохимиков, а также па инженерно- технических работников, занятых биологической очисткой промышленных стоков. Может быть полезна аспирантам и студентам вузов б иологического профиля. Ил. 66. Табл. 12. Список лит. 553 назв. Ответственный редактор Е. И. КВАСНИКОВ Рецензенты Б. Е. АИЗЕНМЛН, М. А. ШЕВЧЕНКО 51 41 7 Научно- техчич. ВашИИИ НП Редакция физиологической, биохимической и медицинской литературы Р 20503-391 М221(04)-78 396-78 © Издательство «Наукова думка», 1978
ПРЕДИСЛОВИЕ Перед обществом стоит весьма важная и ответственная задача: сохранить природу, в том числе и водные ресурсы, для нормальной жизни будущих по- колений. О важности этой проблемы свидетельствует ряд решений Комму- нистической Партии и Советского Правительства по данному вопросу. Цель и задача представленной книги — внести посильный вклад в создание основ микробиологий очистки воды и этим содействовать защите окружающей среды от загрязнения. Расположение и подбор материала в монографии диктовались, с одной стороны, стремлением создать первое пособие по микробиологии для инженер- но-технических работников — микробиологов и биохимиков, обслуживающих сооружения по биологической очистке промышленных сточных вод. С другой стороны, авторам казалось целесообразным построить эту книгу так, чтобы она могла быть использована в вузах для преподавания основ экологической микробиологии, направленной на охрану природы от индустриальных химиче- ских выбросов в промышленные стоки и почву, а также от загрязнения окру- жающей среды пестицидами и детергентами в результате народнохозяйствен- ной деятельности. Поэтому мы считаем необходимым предпослать специаль- ной части изложение общих сведений о микроорганизмах (глава I). Наряду с этим авторы не имели возможности собрать в книге все необходимые указа- ния для организации микробиологического контроля в условиях работы лабо- раторий при промышленных очистных сооружениях н тем более для органи- зации исследований по микробиологии очистки воды в отраслевых институтах или на вузовских кафедрах. Для этого необходимо иметь руководства по микробиологической технике. В большинстве учебных пособий и в монографиях, прямо относящихся к микробиологии очистки воды, рассматриваются лишь биохимические процес- сы, возбуждаемые активным илом, т. е. комплексными биоценозами, динамика очистки во времени и методы контроля работы по химическим показателям; демонстрируются технологические схемы и их инженерное оформление. В предлагаемой книге приведены общие сведения о микроорганизмах и проанализированы данные литературы, а также результаты собственных исследований относительно таксономии, биохимических деструктивных воз- можностей, экологических и общебиологическнх особенностей микроорганизмов, участвующих в разрушении трудно разлагаемых загрязнителей промышленных 3
стоков, а также показаны, где это возможно, пути биохимической деструкции. Приведены (глава II) краткие сведения по конструкции аэротенков и техно- логии биологической очистки. В отделе микробиологии очистки воды Института коллоидной химии и химии воды АН УССР открыто новое явление, названное электроудержива- нием частиц различной степени дисперсности. Оно уже используется для осво- бождения воды от микроорганизмов и их метаболитов при получении апиро- генной воды в производстве ампулированных инъекционных растворов; изучается применение его для иммобилизации ферментов. Есть основания полагать, что электроудерживание найдет в недалеком будущем более широ- кое применение при очистке воды от микробных клеток. Этот вопрос освещен в главе IV, где излагаются также реагентные методы очистки воды, разраба- тываемые в институте. М. Н Ротмистровым написаны предисловие, введение, глава I и заключе- ние, П И Гвоздяком — глава IV, С. С. Ставской — глава II; глава III написа- на совместно П. И. Гвоздяком и С. С. Ставской.
ВВЕДЕНИЕ В индустриальных странах с высоким уровнем развития произ- водительных сил очистка промышленных сточных вод как одно из мероприятий охраны природы приобрела значение проблемы государственной важности. Среди применяемых методов очист- ки промышленных стоков биологическая очистка является наи- более дешевой и самой доступной, а на практике нередко един- ственно возможной. В основе технологии биологической очистки сточных вод ле- жит использование активного ила или биопленки, представляю- щих собой скопление множества живых и мертвых организмов, имеющих микроскопически малые размеры. Так как в природе между организмами, живущими в тесном контакте вследствие общности экологических процессов, устанавливаются сложные взаимоотношения — от симбиотических до антагонистических, то и активный ил или биопленка не могут рассматриваться как простые скопления организмов. Их видовой состав регулируется экологическими условиями. Состав активного ила или биопленки пока еще не изучен для всех отраслей промышленности, имеющих сточные воды и био- логические очистные сооружения. Бесспорным можно лишь считать, что в каждом активном иле и в каждой биопленке действующим началом, первопричиной деструктивных биохими- ческих процессов служат микроорганизмы, преимущественно бактерии. Для активного ила, независимо от характера про- мышленного производства или отрасли промышленности, это в первую очередь гетеротрофные бактерии, а для биопленок, наря- ду с бактериями, существенную роль могут играть и грибы ми- кромицеты. Научные представления о биологической очистке воды на первом этапе своего зарождения были чисто технологические. Разумеется, их полезность и в виде биотехнологии не вызывает сомнений. В большинстве изданий, посвященных биологической очистке воды, не рассматривались лежащие в ее основе микро- организмы — возбудители биохимических процессов. До извест- 5
ной степени это оправдано, если учесть, что издававшиеся руко- водства предназначены для инженеров. В микробиологии, так же как и в других биологических науках, непрерывно отпочковы- ваются новые отрасли, новые ответвления. Так, на протяжении нескольких десятилетий зародились: техническая микология, учение об антибиотиках, генетика и селекция микроорганизмов, молекулярная биология, геологическая микробиология. Навис- шая над человечеством угроза загрязнения всех водных бассей- нов континентов и Мирового океана, а также обусловленный научно-техническим прогрессом дефицит пресной воды побужда- ют ученых сосредоточить внимание на биологической очистке промышленных сточных вод, в основе которой лежат микробио- логические процессы. Назрела необходимость систематизировать и упорядочить ли- тературные данные периодической печати об отдельных микро- бах-деструкторах, применявшихся для очистки промышленных стоков или потенциально пригодных для этого, а также дать сводку собственных исследований по очистке воды от синтетиче- ских органических соединений и микроорганизмов. При очистке сточных вод чистыми культурами бактерий или их комплексами возникает потребность в освобождении воды от микробных кле- ток, поскольку в чистых культурах они не оседают подобно ак- тивному илу. При этом мы считали целесообразным привести таксономическую и биохимическую характеристику не только микробов, способных вызывать разложение и трансформацию органических веществ непосредственно в водной среде, т. е. функционирующих в очистных сооружениях, но также собрать сведения о микробах-деструкторах, функционирующих в почвах либо в условиях лабораторного эксперимента. Подобная характеристика физиолого-биохимических возмож- ностей микробных таксонов, во-первых, позволит составить кол- лекции чистых культур микробов-деструкторов для снабжения ими заводских лабораторий или отраслевых научно-исследова- тельских институтов, а затем и промышленности, во-вторых, по- служит фундаментом для микробиологических основ биологиче- ской очистки промышленных сточных вод, которые в том и со- стоят, чтобы показать, какие таксоны способны выполнять ту или иную деструктивную функцию. Необходимо установить связь между микробным таксоном и биохимическими реакция- ми, на которые он способен. Это позволило бы давать конкрет- ные рекомендации отдельным отраслям промышленности. В слу- чаях построения технологических схем биологической очистки на чистых культурах бактерий или их комплексах можно бы- ло бы высылать эти культуры или же рекомендовать выделить их из заводских очистных сооружений. В случаях очистки сто- ков на существующих очистных сооружениях посредством ак- тивного ила можно было бы рекомендовать определенные куль- туры бактерий для обогащения ими активного ила. 6
Авторами сделаны попытки обобщить литературные данные и результаты собственных исследований относительно микро- организмов, активно участвующих во внешней среде или в ла- бораторной практике в деструкции пестицидов, поверхностно-ак- тивных веществ (ПАВ) и отбросов различных отраслей про- мышленности , загрязняющих природу трудно разлагаемыми органическими веществами. В очистных сооружениях и бытовых сточных водах встреча- ется бесчисленное множество живых существ. Микромир актив- ного ила, биопленки и сточных вод нельзя рассматривать ис- ключительно как мир микроорганизмов. Понятие микроорганизм имеет в микробиологии конкретное содержание. К микробам относят: бактерии, грибы — гифообразующие микромицеты и дрожжи — и, условно, вирусы. Однако в некоторых руководствах по общей и почвенной микробиологии простейшие (Protozoa) и альгофлора (отделы Cyanophyta, Chlorophyta, Вacillariophyta, Diatomeae) рассматриваются наряду с типичными микроорга- низмами, хотя, разумеется, простейшие — объект зоологии, а водоросли — альгологии. Особенности микробиологии очистки промышленных сточных вод требуют и от нас того, чтобы водо- росли и простейшие рассматривались в этой книге, поскольку водоросли широко используются при очистке промышленных сто- ков сахарных и крахмалопаточных заводов, а также прямо или косвенно оказывают влияние на очистку воды в прудах и других водоемах, разрушая некоторые соединения и обогащая воду кис- лородом. Простейшие в процессы обмена веществ не вовлекают синтетические органические вещества, загрязняющие сточные во- ды, но участвуют в работе активного ила как звено трофической цепи, поглощая клетки бактерий. В активном иле и биопленках встречаются и другие представители фауны: черви, коленчатоно- гие, личинки мух, им мы не уделяем внимания, так как они не имеют никакого отношения ни к микробиологии, ни к очистке воды. Главную роль в очистке воды, по сравнению с другими груп- пами микроорганизмов, играют бактерии. Поэтому им уделено основное внимание в главе 1. Представленная книга поможет ми- кробиологам, работающим в промышленности, и другим заинте- ресованным лицам, например гидрохимикам и технологам, озна- комиться с данными, характеризующими роль и видовой состав микроорганизмов-санитаров, помощников человека в борьбе за охрану водоемов; она сможет помочь в решении тех вопросов, которые выдвигает перед человечеством научно-технический про- гресс и неизбежно связанное с ними потребление огромного ко- личества пресной воды, приобретающей значение технического сырья. Поэтому рациональное ведение водного хозяйства и раз- работка всех областей наук, призванных помочь в обеспечении коммунального хозяйства и промышленности доброкачественной водой, являются насущной потребностью нашего времени. 7
ГЛАВА I ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МИКРООРГАНИЗМАХ СТРОЕНИЕ, СОСТАВ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ (ПРОКАРИОТОВ) В промышленных сточных водах обитает бесчисленное мно- жество микроорганизмов, среди которых преобладают бактерии. А если учесть, что очень часто для более эффективной биологи- ческой очистки промышленные стоки смешивают с бытовыми, богатыми природными органическими веществами (водораство- римыми белками и углеводами), то станет ясно, что в таких сточных водах могут развиваться почти все ныне известные ге- теротрофные бактерии, а также некоторые (возможно и все) бак- терии, способные к хемоавтотрофному метаболизму. Помимо истинных бактерий — эубактерий — в промышленных сточных водах находятся миксобактерии, актиномицеты, синезеленые во- доросли, микоплазмы и другие микроорганизмы: вирусы, грибы, зеленые водоросли и представители животного мира — простей- шие. Бактериальная клетка отличается наиболее универсальным набором ферментных систем, способных охватить множество разнообразных химических реакций, часто очень полезных для народного хозяйства и необходимых для охраны окружающей среды от угрозы гибели или частичного отравления ее химиче- скими веществами, которые накапливаются в результате про- мышленной деятельности. Микроорганизмы — лучшие санитары Земли! Многие микроорганизмы используются в промышлен- ности и сельском хозяйстве как продуценты спиртов, кислот, биологически активных веществ и антибиотиков. В сельском хо- зяйстве используются азотфиксаторы и энтомопатогенные ми- кробы. Однако наряду с этим множество микробов не только бесполезны, но и весьма вредны, образуя токсины либо пара- зитируя в организме человека, животных и растений; это пато- генные (болезнетворные) или фитопатогенные микроорганиз- мы, вызывающие болезни человека, домашних животных, сель- скохозяйственных растений и лесов. Большой ущерб народному хозяйству наносят и обычные сапрофитные микробы, поселяясь на пищевых продуктах, кормах, промышленных товарах, по- вреждая их и понижая товарные качества. В роли недругов человека могут выступать представители всех перечисленных 8
групп микроорганизмов, а также вирусы и риккетсии, принад- лежащие к абсолютным паразитам и неспособные к сапрофит- ному образу жизни — к жизни вне живых клеток высших орга- низмов. Морфология бактерий. Строение бактериальной клетки приближается к строению клетки других, более высоко организованных существ (эукариотов). Большинство бактерий относятся к организмам одноклеточным, поэтому возможности для морфологического разнообразия у них очень ограничены, особенно если учесть, что размер их часто меньше одного ми- крона. Преобладающее большинство бактерий, описанных до a S Рис. 1. Сферические формы бактерий: а — микрококки; б — диплококки; в — стрептококки; г — сарцины. 40-х годов текущего столетия, т. е. до внедрения в лабораторную практику электронных микроскопов, по форме клетки прибли- жается к трем геометрическим фигурам — шару, цилиндру и спирали. Разумеется, живые бактерии не могут точно отражать геометрические фигуры и имеется немало отклонений от этих форм. Существуют бактерии, представляющие собой переход от одной фигуры к другой либо комбинации из сцепленных между собой шаровидных или цилиндрических клеток. Бактерии шаровидные, овоидные или иногда не совсем пра- вильной формы, но приближающиеся к сферической — это кок- ки (coccus — греч. зерно) (рис. 1). Если после деления они рас- падаются на одиночные клетки, то называются микрококками. Оставшиеся после деления объединенными попарно — именуют- ся диплококками (diplos—греч. двойной). Диплококки иногда состоят из бобовидных клеток либо удлиненных, как пламя све- чи или лезвие ланцета. При делении в одном направлении кокки могут оставаться соединенными в длинные цепочки. Они назы- ваются стрептококками (греч. streptos — цепь, лента). При де- лении в двух взаимно перпендикулярных направлениях образу- ются фигуры из четырех клеток, именуемые тетракокками. Ро- довым признаком некоторых кокков является их способность размножаться делением в трех взаимно перпендикулярных на- правлениях, в результате чего образуются пакеты или тюки, со- стоящие из множества соединенных слизью тетракокков; они на- зываются сарцинами (от латинского sarcina—связка, тюк). Сарцины встречаются повсеместно в воздухе, воде и почве. Группы кокков, напоминающие виноградные грозди, называют- 9
ся стафилококками (от грея, staphylos — виноградная гроздь); эти бактерии всегда находятся на коже человека и животных и являются возбудителями гнойных процессов. Микрококки, ди- плококки, стрептококки, сарцины и стафилококки — все это определенные роды бактерий. Среди бактерий различной морфо- Рис. 2. Палочковидные формы бактерий. логии кокки наиболее однотипны по размерам. Диаметр клетки кокков равен 0,5—1,0 мкм, иногда — до 2,5 мкм. Бактерии, имеющие палочковидную или цилиндрическую форму клетки, бывают разной длины: от совсем коротких, почти кокков и коккобактерпй (1—1,5 мкм), до длинных, иногда пря- мых, а иногда изогнутых или искривленных палочек и даже ни- тей (10—18 мкм и больше). Палочковидные формы бактерий ши- роко распространены в природе. Их примерно в три раза больше, чем сферических. Это объясняется более выгодным соотноше- нием массы и поверхности у цилиндра, чем у шара. Многие па- лочковидные формы подвижны. Органами движения служат так называемые жгутики. Среди палочковидных форм встреча- ется довольно много видов, способных к образованию спор. Спо- ры всегда образуются внутри клетки — эндоспоры. Спорообра- зующие палочковидные грамположительные аэробные формы на- зываются бациллами и объединяются в род Bacillus. Споровые грамположительные анаэробные формы, живущие без воздуха, 10
объединяются в род Clostridium. Бесспоровые грамотрицательные па- лочковидные — повсеместно распро- страненные формы составляют род Bacterium. Преимущественно вод- ные и почвенные грамотрицательные палочковидные формы, образующие желтый или зеленовато-желтый пигмент, объединяют в род Pseudo- monas. Клетки рода Pseudomonas отличаются от клеток рода Bacte- rium расположением органов дви- жения — жгутиков на полюсах (мо- нополярное или биполярное распо- ложение). Рис. 3. Клетки Bacillus subtilis. Бактерии с цилиндрической формой клеток, так же как и кокки, могут оставаться после деления объединенными попар- но— диплобактерии и диплобациллы — и быть объединенными в длинные цепочки — стрептобактерии или стрептобациллы, на- поминающие елочные бусы (рис. 2). Длина палочковидных бак- терий от 1—2 до 10—20 мкм. Палочковидная форма клетки Pseudomonas, Bacterium, Ba- cillus и Clostridium обусловливает большое разнообразие мор- фологии: у одних видов клетка равномерной толщины по всей длине, у других она утолщена в центре, напоминая стекло керо- синовой лампы (род Clostridium в стадии спорообразования), у третьих — перед образованием спор появляется утолщение на конце палочки, и клетка напоминает барабанную палочку или ракетку для игры в теннис. Наконец, клетки могут напоминать ткацкий челнок, будучи заостренными на концах. У палочкооб- разных бактерий, родственных актиномицетам — микобактерий и коринебактерий — форма клетки бывает настолько непра- вильна из-за утолщений, изгибов и искривлений, что даже оп- ределение «палочкообразная форма» к ним уже почти непри- менимо. Некоторые палочковидные молочнокислые и маслянокислые бактерии в жидких средах с бродящими углеводами имеют непра- вильную и часто нитевидную форму. Нитевидные образования, состоящие из многих десятков палочкообразных клеток, свой- ственны сенной палочке при образовании пленок на жидких пи- тательных средах, а также другим видам палочкообразных бак- терий (рис. 3). Существует самостоятельная систематическая группа нитча- тых бактерий, или хламидобактерий, состоящих из длинных нитей, образуемых множеством палочковидных бактерий, распо- ложенных в виде цепочки и покрытых трубчатым чехлом или футляром (рис. 4). Длина нитей достигает 1000 мкм, а иногда нескольких миллиметров при толщине 1—2 мкм. Нитчатые 11
бактерии всегда присутствуют в очистных сооружениях — аэро- тенках, отстойниках, прудах, а также в пресноводных водоемах. Спиралеобразные или извитые формы бактерий не являются однородной группой микроорганизмов, родственных между со- бой. Они многообразны, различаясь по длине, толщине клетки, числу и диаметру завитков — оборотов спирали — и многим био- логическим признакам. По совокупности свойств различают три группы спиральных или извитых бактерий: вибрионы, спириллы и спирохеты (рис. 5). Вибрионы представляют собой изогнутую Рис. 4. Нитчатые бактерии Crenothrix polyspora; а — дерновинка из сидячих нитей; б — фрагмент нити с макрокони- диями; в — нить с микроконидиями; г — молодая быстрорастущая нить. палочку, составляющую около ’/д оборота спирали, иногда не- сколько клеток вибрионов образуют спираль. Название получи- ли от латинского vibrare — трепетать. Есть вибрионы с закручен- ными концами, имеющие форму почки или фасоли, например хищнически паразитирующий на грамотрицательных бакте- риях— Bdellovibrio (рис. 6), размеры его 1,0 X 0,5 мкм. Спирил- лы — это бактерии, тело которых имеет полный оборот спирали, а иногда и два оборота. Это типичные сапрофитные водные ор- ганизмы, например Spirillum volutans — гигантская бактерия 30—70 X 1—2 мкм. Вибрионы и спириллы относятся к истинным бактериям — эубактериям. Строение их клетки типичное для прокариотов — она покрыта достаточно жесткой — ригидной оболочкой, позволяющей клетке сохранять присущую ей форму. Ранее вибрионы и спириллы считались близкими в системати- ческом отношении и объединялись в одно семейство — Spi- rillaceae. В 8-м издании Берги спириллы входят в часть 6, где рассматриваются строгие микроаэрофилы, а вибрионы, объеди- няемые в семейство Vibrionaceae, отнесены в часть 8 и рассмат- риваются как факультативно анаэробные бактерии вместе с ки- шечной группой бактерий. Таким образом, вибрионы и спирил- 12
Рис. 5. Спиральные формы бакте- рий: 1 — вибрионы; 2 — спириллы; 3 — спиро- хеты (а — Spirochaeta; 6 — Cristispira; в — Treponema; г — Leptospira; д — Вог- reiia). лы, рассматриваемые в одной группе по форме клетки, т. е. по морфологическим признакам, в систематическом отношении рас- положены в различных таксономических категориях, в группах далеко отстоящих одна от другой. Спирохеты имеют вид тонких спиралей с многими оборота- ми. Размеры клеток: от 5,0 до 300 мкм длины и 0,2—0,75 мкм ширины. У спирохет нет ригидной оболочки; оболочка клетки эластичная, вследствие чего спирохеты не только изгибаются, но и закручиваются в кольца. Концы клеток суживаются (рис. 5, 3). В последние два десятилетия исследователи много внимания уделяли изучению бактерий, лишенных оболочки — микоплаз- 13
Рис. 6. Клетка Bdellovibrio (общий вид). мам. Форма клетки у микоплазм сферическая либо мицели- альная — в виде тончайших нитей. Размеры могут колебаться, наряду с крупными обычно шаровидными или округлыми фор- мами, достигающими 10 мкм, есть мелкие микроформы — менее 200 нм. Одна и та же культура в одном возрасте может иметь нитевидные образования с диаметром нитей 0,02—0,5 мкм. Ина- че говоря, микоплазмы полиморфны. Размеры бактерий, особенно длина палочковидных форм, зависят от условий обитания. Изменения pH, консистен- ции среды, концентрации солей и многих питательных ве- ществ, а также состав питательной среды оказывают прямое влияние на размеры клеток. Сказываются на размерах и эко- логические условия. Поэтому длина палочковидных форм без учета совокупности условий имеет лишь относительное диагно- стическое значение. В промышленных сточных водах и синтети- ческих средах, содержащих в качестве единственного источника углерода синтетические соединения, такие как лара-нитроанилин, толуидины, дихлорбензол, пикриновая кислота, капролактам и поверхностно-активные вещества (ПАВ), мы постоянно наблю- дали измельчание палочковидных бактерий родов Pseudomonas, Bacillus и Citrobacter по сравнению с культурами на универсаль- ных питательных средах. Этот факт не должен игнорироваться микробиологами в практической работе по микробиологии про- мышленных стоков. Образование фильтрующихся форм нами не проверялось *. * У многих видов бактерий есть фильтрующиеся формы, размеры ко- торых лежат на грани разрешающей способности оптических микроскопов — 0,2 мкм или видны только в электронные микроскопы. 14
Бактерии, принадлежа- щие к различным классам или семействам, по-разному относятся к питательным средам или субстратам. На универсальных питательных средах: мясопептонном буль- оне (МПБ), сладком пивном сусле, картофельном отваре, либо на этих средах, уплот- ненных агар-агаром,— мясо- пептонный агар (МПА), хорошо размножается боль- шинство бактерий. При ро- сте на поверхности плотных питательных сред (МПА, сусло-агар) преобладающее Рис. 7. Колонии Bacillus mesentericus на большинство изученных бак- агаризованном сусле. терий образуют скопления клеток — колонии, видимые невооруженным глазом в 1—2-су- точном возрасте (рис. 7). Однако не все бактерии способны раз- множаться на универсальных питательных средах. Многие виды нитчатых бактерий на МПА или МПБ не размножаются и по- этому на поверхности универсальных плотных сред не образуют колоний. В специальных средах нуждаются микоплазмы и спи- рохеты. Строение и размножение а к т и н о м и ц ето в. Ак- тиномицеты получили свое название за радиальное лучеобраз- ное (actinos — луч, mycos — греч. гриб.) расположение мице- лия, образующегося при прорастании спор или разрастании об- рывка мицелия. Это особенно характерно для рода Streptomyces (рис. 8). В изложении вопросов, касающихся таксономии и система- тики прокариотов, мы придерживаемся интерпретации, принятой в 8-м издании «Определителя бактерий» Берги. Все актиноми- цеты входят в порядок Actinomycetales. К этому порядку отне- сены организмы, образующие либо настоящий мицелий, либо ветвящиеся нити и обладающие иными общими признаками. Вместе с актиномицетами рассматриваются и родственные им микроорганизмы: коринебактерии, бревибактерии, пропионовые бактерии и роды Arthrobacter и Cellulomonas. Эти бактерии не образуют мицелия, имеют вид палочек неправильной формы — искривленных или булавовидно-вздутых, иногда коккообразных. Большинство родственных актиномицетам бактерий проявляют тенденцию к полиморфизму и образованию клеток с незначи- тельным ветвлением. У представителей рода Streptomyces мицелий и органы раз- множения — конидиеносцы — напоминают микроскопические 15
грибы — микромицеты, но по ряду признаков отличаются от них. Для мицелия актиномицетов характерна толщина 0,3— 0,8 мкм, реже 0,1 или 1,0 мкм, т. е. толщина, характерная для бактериальных клеток. Мицелий грибов значительно толще — 2—5 мкм, часто 7—9 мкм и до 40 мкм. Некоторые виды стреп- Рис. 8. Общий вид мицелия актиномицетов: а —тонкие почти прямые гифы; б — толстые искривленные. томицетов имеют отдельные нити или гифы прямые неразвет- вленные, для других типичны искривленные ветвящиеся гифы. У микробиологов Советского Союза представление об акти- номицетах формировалось на основании взглядов, развитых крупнейшим советским микробиологом Н. А. Красильниковым, который не считал актиномицеты бактериями и выделял их в самостоятельную таксономическую категорию — класс актино- мицетов. Красильников все лучистые грибы разделял на высшие и низшие. Организмы с хорошо развитым мицелием, имеющие органы размножения, отнесены к высшим. Организмы, не обра- зующие мицелия, с клетками палочковидной или кокковидной формы были отнесены им к низшим. Приведенные здесь харак- терные черты актиномицетов являются по Красильникову при- знаками высших форм. Низшие — очень близки к грамположи- тельным бактериям. В 8-м издании определителя Берги все без исключения актиномицеты безоговорочно отнесены к бактериям. В жидких средах актиномицеты растут на поверхности и в глубине среды; на плотных средах они образуют колонии, иног- да сливающиеся в дерновинки. Мицелий актиномицетов у раз- ных родов и семейств септированный и несептированный — без поперечных перегородок. Все представители этого порядка грам- положительные. При росте актиномицетов рода Streptomyces на плотных агаризованных средах у них различают три типа мице- лия: субстратный, надсубстратный, или собственно колонии, и воздушный. Субстратный мицелий проникает вглубь агара и 16
служит для всасывания питательных веществ, надсубстрат- ный — составляет плотную часть колонии, а на воздушном ми- целии расположены органы размножения — конидиеносцы со спорами (рис. 9). У разных видов рода Streptomyces конидие- носцы различной формы: прямые, волнообразные, спиралевид- ные с одним или многими завитками, с плотной или растянутой спиралью (рис. 10). Размножение всех изученных представителей порядка актн- номицетов происходит бесполым способом. Споры на конидие- носцах образуются лишь путем обособления участков плазмы Рис. 9. Колония актиномицета в разрезе (схематически) (по [146]): d — гифы субстратного мицелия; б — колония на поверхности агаризован- ного субстрата; в — воздушный мицелий и спороносны. вокруг ядерного вещества в округлые тельца — фрагментация либо путем образования поперечных перегородок в конидиенос- цах и отчленения цилиндрических клеток — сегментация. В пос- леднее время описано целое семейство актиномицетов — Strepto- sporangiaceae, у которых споры образуются в специальных меш- ковидных вместилищах — спорангиях. У рода Streptosporangi- um споры неподвижны, спорангиоспоры рода Actinoplanes подвижны, передвигаются посредством жгутиков. Кроме спор размножение происходит почками и обрывками мицелия. Клетки актиномицетов покрыты плотной клеточной оболоч- кой, имеют протоплазму и ядерное вещество, или нуклеоиды, которые, как и у других бактерий, не покрыты ядерной оболоч- кой. Клеточная оболочка 10—30 нм толщиной, многослойная или двух-трехслойная. По химическому составу весьма близка к оболочкам грамположительных бактерий. Гексозамины и мукопротеиды — компоненты мукополисахаридов — входят в состав оболочек актиномицетов и прочих грамположительных бактерий. Особенностью оболочки мицелия актиномицетов яв- ляется мелкопористое строение с диаметром пор около 5 нм. Оболочка воздушного мицелия и спор актиномицетов имеет фибриллярное строение, которое исчезает после обработки ли- зоцимом, смесью этанола, хлороформа и этилового эфира либо другими растворителями липидов; это свидетельствует о том, что фибриллярность обусловлена липоидами. По химическому соста- ву клеточной стенки различаются между собой не только 2 8-616 51417
Рис. 10. Спороносны актиномицета Streptoniyces albus. спирального строения: а — микрофото 5-суточной культуры (агар), спирали растянутые, X 1 : 150; б — отдельная ветка, X 1 : 1000. семейства, но и роды актиномицетов. Распространение и значе- ние актиномицетов в природе велико. Среди них встречаются виды, образующие биологически активные вещества — витамины, аминокислоты и антибиотики; некоторые виды рода Streptomy- ces являются продуцентами широко применяемых антибиотиков: стрептомицина, тетрациклина, хлорамфеникола, эритромицина, олеандомицина и многих других. Актиномицеты всегда присутствуют в очистных сооружениях. Однако в качестве деструкторов указываются чаще представи- тели низших актиномицетов — нокардии или родственные акти- номицетам коринебактерии и Arthrobacter. К роду Corynebacte- rium (от латинского согупе—булава) относятся возбудитель дифтерии, а также некоторые фитопатогенные бактерии и Согу- nebacterium mediolanum — вид, вызывающий трансформацию стероидов. Представители рода Arthrobacter встречаются в ак- тивном иле очистных сооружений, являясь деструкторами орга- нических соединений. Некоторые виды этого рода используются в промышленности как продуценты глутаминовой кислоты. По морфологии это палочковидная бактерия, нередко образующая кокковидные формы, особенно в старых культурах или при не- благоприятных условиях. 18
Микобактерии (сем. Mycobacteriaceae) неподвижны, грампо- ложительны, кислотоустойчивы. После окраски карболовым фук- сином в препаратах при нагревании микобактерии и проактино- мицеты (нокардии) не обесцвечиваются 5%-ным раствором со- ляной кислоты (кислотоустойчивость), что обусловлено боль- шим содержанием в оболочке и клетке воскообразных ве- ществ — эфиров миколевой кислоты. К микобактериям относит- ся туберкулезная палочка; описаны микобактерии, разрушаю- щие фенол: Mycobacterium flavum, М. hyalinum, М. lacticolum, М. vadosum. Нокардии в молодых культурах образуют субстратный и воз- душный мицелий. Позже мицелий по мере старения колоний распадается на палочковидные клетки. Конидиеносцев и кони- диеспор проактиномицеты не образуют. Лешевалье [412] выде- лено из активного ила 107 штаммов нокардии. Из этого числа 35 штаммов отнесены к новому виду Nocardia amarae sp. nova (Leshevalje). В отделе микробиологии очистки воды Института коллоидной химии и химии воды АН УССР из почвы Северодо- нецкого химкомбината, загрязненной нитроанилином, выделена Nocardia rubra, потребляющая пара-нитроанилин. Строение бактериальной клетки. Раздел микро- биологии, рассматривающий тонкое строение бактериальной клетки, т. е. внутреннюю структуру, одни исследователи назы- вают цитологией бактерий, другие — анатомией бактерий. Зада- ча цитологии бактерий — изучение составных частей, органоидов клетки. Общее строение бактериальной клетки представлено на рис. 11. Клеточная оболочка. Бактериальная клетка в стандартных условиях и определенном возрасте имеет постоянную форму, присущую каждому роду, а иногда и виду бактерий. Форма клетки обусловливается оболочкой, так как содержимое клет- ки — протопласт, освобожденный от оболочки обработкой фер- ментом лизоцимом в изотоническом растворе сахарозы, приоб- ретает округлую форму. Следовательно, оболочка служит как бы внешним каркасом бактериальной клетки. По данным Гизена и Холловей [363, 382], клеточная оболоч- ка составляет 20—30% сухого веса бактериальной клетки. Все бактерии, за исключением микоплазм, миксобактерий и спиро- хет, имеют плотную и достаточно жесткую ригидную клеточную оболочку подобно растительным клеткам. Однако клеточные оболочки бактерий по своему химическому составу и структуре резко отличаются от клеточных стенок растений, которые, как известно, состоят из целлюлозы. У бактерий целлюлозы в обо- лочках нет, исключением являются уксусные бактерии Aceto- bacter xylinum и A. acetigenum, образующие толстую кожистую пленку из целлюлозных фибрилл. Показать наличие клеточной оболочки у бактерий можно, ис- пользуя явление плазмолиза. Для этого готовят суспензию из 2* 19
Рис. 11. Комбинированное схе- матическое изображение про- кариотической клетки. В верхней части — основные струк- туры подвижной бактериальной клетки со жгутиками; в средней ле- вой части показаны мембранные структуры фотосинтезирующего ми- кроба, справа — гетеротрофной бак- терии, в нижней части — резерв- ные вещества или включения; / — базальные тельца; 2 — жгутики*, 3 — капсула; 4—клеточная оболочка; 5— цитоплазматическая мембрана; 6 — цитоплазма; 7 —рибосомы; 8 — мезосома; 9— нуклеоид; 10 — поли- фосфаты; 1J — полисахаридные гра- нулы; 12 — включения серы; 13 — липидные капли; 14 — пластинчатые тилакоиды; 15 — хроматофоры. ром фуксина, после чего крупных палочковидных бактерий в гипертоническом растворе. А. А. Им- шенецкий [И2] получал наиболее яркие картины плазмолиза у Вас. mycoides в 4М растворе хлористого натрия. При этом, вследствие потери водц цитоплазма вместе с цито- плазматической мембраной сжима- ется и отделяется от клеточной стен- ки у боковых поверхностей клетки. Бактериальная клеточная оболочка обладает и эластичностью; вслед- ствие этого подвижные палочковид- ные и извилистые бактерии способ- ны изгибаться в разные стороны. Толщина клеточных оболочек 10— 25нм [363] Тинкториальные свойства клеток, т. е способность окрашиваться ани- линовыми красками, широко приме- няемыми в микробиологии, также зависят от свойства клеточных сте - нок. В 1884 г. датским ученым Гра- мом был предложен метод окраски бактерий основными анилиновыми фиолетовыми красками (генциан- виолет или кристаллвиолет) с после- дующей обработкой раствором Лю- голя, представляющим собой раст- вор йода в йодистом калии. При погружении окрашенных препара- тов в этиловый спирт одни бактерии обесцвечиваются — грамотрицатель- ные, другие остаются фиолето- выми — грамположительные. Для удобства наблюдения препараты с грамотрицательными бактериями докрашиваются нейтральротом, са- фронином или очень слабым раство- они приобретают красный цвет. Не- смотря на пользование этим методом на протяжении 90 лет, химический смысл реакции до сих пор не вполне выяснен. И тем не менее эмпирический критерий окрашиваемости по Граму стал таксономическим признаком для бактерий, а разделение всех бактерий на грамположительные и грамотрицательные ста- ло классическим и представляет собой одну из первых ступеней в идентификации бактериальных культур. Окраска по Граму связана с химическим составом бактери- 20
альной стенки. У грам- Таблица 1 положительных бактерий в клеточных оболочках образуются комплексные Химический состав бактериальной клеточной оболочки, % сухого веса изолированных оболочек соединения из йода и основных фиолетовых кра- сок. Взаимодействуя с некоторыми химическими структурами клеточной стенки, эти комплексные соединения прочно связы- плштся Пл vtiMUiwmvn.’ Бактерии Липиды Полисаха- риды Аминоса- хара Грамположи- тельные Грамотрица- тельные 0—2 10—20 30—60 1—50 10—20 0—5 составу и физическим свойствам клеточные оболочки грамположительных бактерий значительно отличаются от оболочек грамотрицательных. Кле- точные оболочки грамположительных бактерий толще, чем грамотрицательных; так, например, их толщина у золотистого стафилококка составляет 15—20 нм, у Е. coli— 10—15 нм. У грамположительных кокков — Micrococcus lysodeihticus и Stre- ptococcus albus в оболочках мало липидов и много аминосахаров; в оболочках Е. coli наоборот — много липидов и мало аминосаха- ров. Эти данные для большей наглядности сопоставлены в табл. 1. Осмотическое давление в живой бактериальной клетке колеблется от 3 — до 30 атм и обусловливается высокой кон- центрацией метаболитов [363]. Чтобы противостоять такому давлению при попадании бактерий в гипотоническую среду, их оболочка должна быть очень прочной. Такая прочность клеточ- ной стенки зависит от прочного каркаса из гетерополимера — полисахаридпептида, именуемого пептидгликаном, или муреином (от латинского murus — стенка). Каркас, или решетка, состав- ляющая основу клеточной стенки, имеет замечательное строение: параллельно лежащие полисахаридные цепочки укреплены по- перечными пептидными, содержащими ковалентные связи между звеньями полисахарида и пептида; это придает ему большую прочность. Еще одна особенность бактериальной клеточной стен- ки состоит в том, что муреиновая решетка, или каркас, пред- ставляет собой сплошную замкнутую фигуру, напоминающую камеру футбольного мяча у бактерий, имеющих сферическую форму клетки, или оболочку дирижабля у бактерий продолго- ватой формы. Решетчатая структура каркаса бактериальной оболочки не имеет разрывов. Этот каркас получил название муреинового мешка. В полисахаридных цепях повторяющимся звеном является муропептид-дпсахарид, у которого N-ацетил- глюкозамин соединяется р (1—4)-связью с N-ацетилмурамовой кислотой. Мурамовая кислота представляет собой глюкозамин в эфирной связи с молочной кислотой. Как видно из рис. 12, через гидроксильную группу молочной кислоты, входящей в состав ацетилмурамовой кислоты, присоединена тетрапептидная цепь, в 21
-о Нчщешлглююянм нчщеюмураноВая кислот сн,он с»2он L-amm ын нс-сн3 о нлс-сн-с=о J I D-глутншоВая кислот L-лизин D-аюкин ЫН QHC-CQOH СНг NH = £,=0 NH нс-сн} соон Рис. 12. Муропептид бактериальных кле- точных стенок. Представляет собой дисахарид, к которому присоединена тетрапептидная боковая цепь. Моносахаридные единицы соединены 1—4 свя- зями. которую входят остатки L- аланина, £)-глутаминовой кислоты, L-лизина и О-ала- нина. В каркасе поперечные пептидные цепи ковалентно связываются с терминаль- ным остатком О-аланина каждого муреинового звена продольной цепи (рис. 13). У грамотрицательных бактерий муреиновая решет- ка более рыхлая. Кроме му- реина оболочка содержит и другие компоненты, не свя- занные ковалентно с муреи- ном. Грамположительные бактерии содержат тейхое- вые кислоты, полипептиды и полисахариды. Тейхоевые кислоты состоят из остатков глицерина и рибита. Поли- сахариды непостоянного со- става иногда содержат остатки сахаров —глюкозы, галактозы, рамнозы и ман- нозы. Антигенные свойства грамположительных бактерий обусловливаются тейхоевыми кислотами и полисахарида- ми клеточной оболочки. Оболочки грамотрицательных бактерий содержат в качестве дополнительных компонентов липопротеи- ды, сложные липополисахариды и полипептиды; от них зависит антигенная специфичность грамотрицательных бактерий и спо- собность акцептировать вирусы [167]. Химический состав обо- лочек бактерий резко отличен от состава оболочек растений и животных. Этим и обусловлена чувствительность бактерий к та- ким лекарственным веществам, как антибиотики, не действую- щим на животные клетки. В состав оболочки входят простети- ческие группы ферментов — коэнзимы, обусловливающие первый этап обмена веществ при контакте бактерий с питательными ве- ществами. В этом слое происходит дробление макромолекул. Типичным компонентом бактериальной оболочки является диа- минопимелиновая кислота. Наряду с прочностью оболочка должна быть рыхлой и обла- дать дифференцированной избирательной проницаемостью, что- бы питательные вещества могли проникнуть в клетку. У кисло- тоустойчивых бактерий, например у туберкулезной палочки, в оболочках очень много липоидов, жироподобных веществ, а так- же содержатся специфические жирные кислоты—туберкулосте- ариновая и фтионовая. Большое влияние на свойства оболочек 22
грамположительных бакте- рий оказывает магний. Ин- тересным методом доказа- тельства этого является культивирование грамполо- жительных бактерий на сре- де, лишенной магния. При условии магниевого голода- ния S-формы грамположи- тельных бактерий превраща- ются в /?-формы, красящиеся грамотрицательно. Капсула. У многих кокко- вых, палочковидных и неко- торых нитчатых бактерий клетка как бы обволакивает- Рис. 13. Параллельные цепи муреина (пептидогликана). Тесно связаны друг с другом в единую структуру благодаря большому числу по- перечных связей. Каждая цепь содержит в среднем 12 дисахаридных единиц. Верти- кальными линиями представлены тетрапеп- тидные боковые цепи, а горизонтальны- ми — пептапептидные поперечные мостики. ся сверху слизистой желеобразной массой коллоидального ве- щества — капсулой. Капсула тесно примыкает к клеточной обо- лочке и расположена снаружи. Иногда граница между капсулой и клеточной оболочкой плохо видна. Толщина бактериальных капсул колеблется от долей микрометра до 10 мкм и более, т. е. может намного превышать размеры бактерий (рис. 14). У неко- торых бактерий капсула представляет собой просто утолщенную клеточную оболочку, у иных — коллоидный метаболит прото- пласта бактерий. Не всегда легко провести грань между оболоч- кой бактериальной клетки и капсулой. Обычные анилиновые краски капсул не окрашивают. Един- ственная краска, способная окрашивать капсулу без протрав- ливания,— это алциановая голубая. Долго полагали, что все бактериальные капсулы полисахаридной природы. Затем было доказано, что они бывают двух типов: полисахаридной и поли- пептидной природы. У возбудителя сибирской язвы капсула состоит из полипептида — глутаминовой кислоты. Аналогичный глутамин-полипептид найден в слизи сенной палочки. Белково- углеводный комплекс выделен из капсул чумной палочки (Pas- terella pestis). Полисахаридные капсулы, состоящие из углевода декстрана, характерны для вредителя сахарного производства — лейконостока, молочнокислых стрептококков и других бактерий. Некоторые капсулы содержат глюкозамин, азот и фосфор, дру- гие состоят из остатков глюкозы и глюкуроновой кислоты. Если капсула имеет полипептидную или так называемую муциновую природу, она состоит из нитевидных полипептидных мицелл. В капсулах до 98% воды. В активном иле аэротенков всегда встречается капсульная гетеротрофная бактерия, названная Zoogleae ramigera. Этому виду некоторые исследователи приписывали исключительно важ- ную роль в очистке сточных вод благодаря его способности к формированию капсул и образованию хлопьев в активном иле. 23
Рис. 14. Капсула пневмококка (по [165]). Капсульный полимер обладает большой адсорбционной способ- ностью в отношении органических веществ у нехлопьеобразую- щпх бактерий. По мнению Ясухико [532], капсульный полимер зооглеи представляет собой мукополисахарид, включающий два аминосахара: N-ацетилглюкозамин и N-ацетилфруктозамин. Клетки Z. ramigera палочковидные с закругленными концами, до 3,0 мкм длиной, имеют один полярный жгутик. Капсулы в 1,5—2 раза превышают размер клеток. Капсулы хорошо выявляются при суспендировании бактерий в туши или черной краске (нигрозине) — на темном фоне бак- терии и их капсулы светлые, поскольку тушь и нигрозин не проникают в капсулы. Значение капсул для бактерий объяснить трудно, так как они не характерны для определенных родов или видов. В пределах вида одни штаммы образуют капсулы, дру- гие в тех же условиях не образуют. Слизь капсул непрочно за- держивается на клеточной оболочке бактерий. Встряхиванием или энергичным перемешиванием культуры капсульных бакте- рий можно частично или полностью удалить капсулы. В угле- водных капсулах обнаружены глюкоза, галактоза, рамноза, манноза, абеквоза, фукоза, колитоза, гептоза и другие сахара. У нескольких штаммов одного и того же вида в состав капсул могут входить различные сахара. На этом основаны серологиче- ские реакции типизации штаммов пневмококков (по так назы- ваемому соматическому О-антигену). Полисахарид декстрсан, из 24
которого состоят бактериальные капсулы, широко используется в аналитической химии, биохимии и вирусологии в виде препа- рата, именуемого сефадексом. Сефадекс обладает адсорбцион- ными свойствами и применяется при фильтрационном разделении или очистке различных веществ, в частности белков, а также вирусов. Мембраны бактерий. Протопласт снаружи окружает цито- плазматическая мембрана — плазмалемма, прилегающая непо- средственно к оболочке. Мембраны составляют 40—90% всей массы клетки. Длительно существовало ошибочное представле- ние, что периферическая плазмалемма бактериального прото- пласта является единственной мембранной структурой бактери- альной клетки. Сейчас известно, что периферическая мембрана образует инвагинации, составляющие внутриклеточные мембран- ные структуры. Различными методами показано, что мембраны трехслойные и достигают 8,5 нм в толщину. У всех исследован- ных бактерий мембраны могут быть причислены к обязатель- ным компонентам бактериальной клетки [63, 126]. В. И. Бирю- зовой [23] собрана большая литература о молекулярной орга- низации плазмалеммы. Ее наружная поверхность, обращенная к клеточной оболочке, состоит из субъединиц грибовидной фор- мы с размером головки 8—12 нм. Часть этих субъединиц, по-ви- димому, является ферментативными белками, другая часть — белково-липидными структурами. Белки мембран представляют собой ферменты. В мембранах обнаружена АТФаза, пенициллиназа, НАДН-дегидрогеназа, лак- татдегидрогеназа и ряд цитохромов: a, alt а2, а3, Ь\, Ь, с. Выявле- ны также транслоказы, фосфатазы и другие ферменты. Липид- ные компоненты мембран представлены в основном фосфолипи- дами— N-фосфатидилглицерином и фосфатидилэтаноламином. Реже встречаются другие фосфолипиды — фосфатидилинозит и фосфатидилхолин. Кроме того, в мембранах содержатся липо- аминокислоты. Особенностью бактериальных липидов по сравне- нению с липидами других организмов является отсутствие сте- роидов. Количество насыщенных и ненасыщенных жирных кис- лот в липидах разных бактерий различно. Общее содержание липидов в мембранах достигает 30%. В мембранах бактерий вы- явлены каротиноиды, хиноны, гликолипиды, полисахариды и даже нуклеиновые кислоты. На первых этапах развития цитологии бактерий бактериаль- ную мембрану представляли как периферическую плазмалемму, пленку, играющую роль лишь регулятора поступающих в бакте- риальную клетку веществ в виде растворов. Электронно-микро- скопические исследования показали, что мембранные структуры образуют в протопласте различной формы впячивания. Сосредо- точение ферментной активности, особенно окислительно-восста- новительных процессов, в мембранных структурах позволяют бактериям широко использовать «мембранную биохимическую 25
лабораторию». Н. С. Гельман, Н. А. Лукоянова и Д. Н. Остров- ский [63] ввели в своей монографии целую главу «Бактериаль- ные мембраны — полифункциональные системы», где рассмат- ривают участие мембраны в переносе электронов, в биосинтезе многочисленных химических клеточных компонентов, в делении и формировании спор и, наконец, в транспорте различных ве- ществ из среды в клетку и наоборот — из клетки в окружаю- щую среду. При этом возможен пассивный перенос — по гради- енту концентрации, т. е. в сторону более низкой концентрации, и активный перенос — против градиента концентрации. Сложное строение бактериальных мембран обусловливает их высоко диф- ференцированную проницаемость и этим создает совершенней- шую систему метаболизма микроскопически малого организма бактерий. Протопласт. Содержимое бактериальной клетки без клеточ- ной оболочки получило название протопласта. Протопласт со- стоит из цитоплазмы, покрытой мембраной. Разработан метод освобождения протопласта грамположительных бактерий по- средством обработки клеток ферментом лизоцимом. Оболочки клеток при этом растворяются, а протопласты сохраняются жи- выми, способными к росту, делению, синтезу протеинов и нукле- иновых кислот [363]. Цитоплазма представляет собой водяни- стую или слегка вязкую массу—сложную композицию белков, жиров, углеводов и многочисленных других органических со- единений, минеральных веществ и воды. Цитоплазма не гомо- генная коллоидная жидкость, она содержит множество субми- кроскопических мембранных структур, выявленных электронной микроскопией. В цитоплазматических белках найдено 20 раз- личных аминокислот, обусловливающих различные свойства бел- ков. Например, аминокислота тирозин имеет спиртовые группы (ОН) в боковой цепи и этим обусловливает гидрофильность ци- топлазмы. Липоиды, наоборот, обусловливают гидрофобность цитоплазмы. Важными компонентами цитоплазмы являются рибосомы, ферменты, рибонуклеиновые кислоты (РНК). Рибосомы пред- ставляют собой мембранные структуры 16 X 18 нм, состоящие на 40% из белка и на 60% из РНК. Они являются центрами синтеза белка. Одним из доказательств этого служит концент- рация антибиотика хлорамфеникола на рибосомах. Механизм действия хлорамфеникола на бактерии состоит в подавлении синтеза белка в бактериальных клетках, чувствительных к это- му антибиотику. Бактериальная клетка содержит около 10 000 рибосомальных частиц. Матричная и транспортная РНК участвуют в синтезе белков. Ферменты катализируют реакции синтеза и распада. При обработке лизоцимом бактериальных клеток протопласт приобретает сферическую форму и сохраняет жизнеспособность. В протопластах происходят важнейшие био- химические процессы: биосинтез белка и нуклеиновых кислот, 26
синтез ферментов и, так как мезосомы находятся в протопласте, то и все окислительно-восстановительные экзоэнергетические ре- акции происходят в протопласте. Включения. В цитоплазме бактериальной клетки встречают- ся разные включения, играющие роль запасных питательных веществ: гранулеза, гликоген и другие полисахариды, жир, гра- нулы полифосфатов, или волютиновые гранулы, сера. Количе- ство жира может достигать у некоторых микробов 50% к сухой массе. Содержащиеся в клеточном соке соли обусловливают осмотическое давление, достигающее у бактерий обычно 3—6, а в некоторых случаях до 30 атм. Ядерные элементы, или нуклеоиды бактерий. Бактерии отно- сятся к прокариотам, т. е. организмам, не содержащим морфо- логически обособленных ядер. У бактерий есть тельца, именуе- мые нуклеоидами, или хроматиновыми тельцами. Они содержат дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и выполняют функции ядра. Делению клетки предшествует деление дискретных те- лец— нуклеоидов, которые можно выявить специфическими ре- акциями и методами окраски, особенно после предварительной специальной обработки препаратов. Функции ядерного аппарата бактерий соответствуют функциям ядер у эукариотов, т. е. слу- жат носителями наследственных признаков вида и передают их потомству. Основным компонентом нуклеоидов являются нуклеопротеи- ды. Нуклеопротеиды состоят из белка и нуклеиновых кислот. Поскольку нуклеиновые кислоты вначале выделялись из расти- тельных и животных клеток, содержащих ядра (nucleus — яд- ро), предполагалось, что они находятся только в ядрах. Позже с помощью цитохимических методов нуклеиновые кислоты бы- ли выявлены, кроме хромосом, в митохондриях, рибосомах, в независимых генетических элементах — плазмидах и гиало- плазме. Белки, входящие в состав нуклеопротеидов, бывают чаще всего гистонами и протаминами. Эти щелочные белки образуют с нуклеиновыми кислотами солеобразные соединения. При гид- ролизе нуклеиновых кислот образуются пуриновые и пиримиди- новые основания а также сахара: рибоза — из РНК или дезо- ксирибоза из ДНК и фосфорная кислота. Состав ДНК и РНК следующий: днк Аденин Гуанин Цитозин Тимин Фосфорная кисло- та d- Дезоксирибоза РНК Аденин Гуанин Цитозин Урацил Фосфорная кисло- та d-Рибоза 27
Эти вещества имеют следующее химическое строение: Пуриновые основания Пиримидиновые основания Основным структурным элементом нуклеиновых кислот яв- ляются соединения, именуемые нуклеотидами. В состав нуклео- тида входят: азотистое основание, углевод (рибоза или дезо- ксирибоза) и фосфорная кислота. Азотистые основания, соеди- няясь по типу гликозидов с альдегидным атомом сахара рибозы или дезоксирибозы, образуют нуклеозиды. После присоединения к гидроксилу углеводного компонента в 3- или 5-положении фос- форной кислоты образуются фосфорные эфиры нуклеозидов — нуклеотиды. В состав нуклеиновой кислоты может входить раз- личное число нуклеотидов — от нескольких до сотен и даже тысяч. Бактериальные ДНК — это высокополимерные соединения, состоящие из большого числа нуклеотидов — полинуклеотиды с молекулярным весом около 4 млн. Молекула ДНК представляет собой цепь нуклеотидов, где расположение их имеет определен- ную последовательность. В последовательности расположения азотистых оснований закодирована генетическая информация каждого вида. Нарушение этой последовательности возмож- но при естественных мутациях или же под влиянием мутаген- ных факторов. При этом микроорганизм приобретает или утра- чивает какое-либо свойство. У него наследственно изменяются признаки, т. е. появляется новая форма микроорганизма. У всех микроорганизмов — прокариотов и эукариотов — носителями ге- нетической информации являются нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК. Лишь некоторые вирусы представляют собой исключе- ние: у них ДНК отсутствует, а наследственная информация за- писана или отражена только в РНК. ДНК эукариотов сосредоточена в хромосомах. Прокариоты лишены типичных хромосом. Исключение представляют много- клеточные бактерии порядка Caryophanales, описанного 28
М. А. Пешковым [201]. Нуклеоиды этих бактерий имеют вид хромосом. У бакте- рий актиномицетов и бактериальных ви- русов — бактериофагов — при электрон- ной микроскопии ДНК имеет вид тонкой нити с линейным расположением нуклео- тидов. Нить ДНК аналогична хромосоме. Фрагменты нити ДНК из нескольких ну- клеотидов представляют собой ген, обу- словливающий один или несколько при- знаков. Молекула ДНК состоит из двух цепочек полинуклеотидов, образующих двойную спираль (модель ДНК Уотсона и Крика, рис. 15). Азотистые основания, входящие в со- став нуклеотидов цепочки ДНК, объеди- нены водородными связями так, что аде- нин всегда спарен с тимином, гуанин с цитозином; содержание аденина с тими- ном, а гуанина с цитозином — эквимоле- кулярны, иначе говоря А = Т и Г = Ц. От- ношение пуриновых оснований к пирими- диновым, т. е. у и ц равно 1. Отноше- А 4- Т л о ние г ц- колеблется в пределах 0,2— 2 у различных видов микробов, но имеет постоянное значение для бактерий определенного вида, что поз- воляет говорить возможности генетической систематики. Движение бактерий. Многим бактериям свойственно самопроизвольное движение. Так, спиралевидные бактерии все подвижны, есть подвижные палочковидные и шаровидные бак- терии, однако многие эубактерии неподвижны. На отдельных стадиях развития подвижные бактерии могут утрачивать спо- собность к движению; она реализуется только в жидкой среде. Некоторые спиральные формы бактерий имеют большую ско- рость передвижения за одну секунду, в 20—30 раз превышающую их длину, это скорее, чем бежит любой рекордсмен по ско- ростному бегу — 45—50 м/сек. Автомобилю нужно было бы раз- вить скорость 200 — 250 км/ч, чтобы достичь относительной ско- рости вибриона. Нельзя смешивать активное движение бактерий с броуновским движением, которое является беспорядочным ко- лебанием бактерий и мелких органических и неорганических частиц. Активное движение возможно реактивным путем, скользящее — вследствие вращательного движения клетки, со- кращения ее (у спирохет) и движения при помощи жгутиков. Жгутики — пучки очень тонких нитевидных образований, или фибрилл, белковой природы. Сами жгутики способны к интен- 29
Рис. 16. Формы жгутиковых бак- терий: а — монотрихи; б —амфитрихи; в и г — лофотрихн; д — перитрихи. Бактерия с одним жгутиком сивному сокращению и мерца- тельному движению. Каждый жгутик состоит из очень тонких фибрилл; жгутики отходят от гра- нул, расположенных под цито- плазматической мембраной и на- зываемых блефаропластами. Жгу- тики — это органеллы бактерий, их толщина 0,02—0,05 мкм. В оп- тическом микроскопе их можно видеть только после специальной обработки фиксированных бакте- рий, в электронном — жгутики видны хорошо. Расположение жгутиков — наследственный при- знак, который используется в клас- сификации бактерий. У палочко- видных бактерий жгутики могут быть либо только на полюсах, ли- бо располагаться по всей клетке, на полюсе называется монотрих, с двумя жгутиками, расположенными на противоположных по- люсах,— амфитрихи, с полярно расположенными пучками — ло- фотрихи и с разбросанными жгутиками по всей поверхности — перитрихи (рис. 16, 17). Расположению жгутиков соответствует характер движения клетки. Вращательные движения жгутиков могут достигать очень большой скорости — до 3000 об/мин, т. е. скорость вра- щения ротора электромотора. Подвижность миксобактерий осу- ществляется реактивно, путем выделения слизи в окружающее пространство и путем изгибания клетки. Движение медленное — фронтальное, в жидкой среде иногда незаметное. На плотных агаризованных средах с большой влажностью образуют, вслед- ствие движения, пленку. Фимбрии. Поверхность некоторых бактерий покрыта очень тонкими прямыми волосками — фимбриями. Они встречаются как у подвижных, так и у неподвижных форм бактерий. Их ко- личество велико и может исчисляться тысячами. Назначение фимбрий неизвестно, однако есть указание на активное участие фимбрий в процессах адсорбции бактерий частицами минералов. У некоторых бактерий, например Escherichia coli штамм К-12, имеются на поверхности клетки тонкие трубчатые отростки — Е-пили, участвующие в половом процессе — конъюгации. Пили выявлены у клеток-доноров (один-два на клетку). Споры. Бактериальные эндоспоры. Лишь немногие бактерии образуют споры. К спорообразующим относятся палочковидные бактерии сем. Bacillaceae, куда принадлежат роды Bacillus и 30
Рис. 17. Жгутиковые бактерии: а — Pseudomonas; б — Spirillum; в — Proteus vulgaris. Clostridium. Споры образуют все виды рода Streptomyces и дру- гие актиномицеты (см. раздел «Систематика...»). Кроме того, спо- ры встречаются как исключение у некоторых кокковидных, ви- брионов и спирилл: Sarcina сегеа, Vibrio desulfuricans, Spirillum amyloferum. По форме эндоспоры овальные, эллипсоидальные или сферические. Эндоспоры гораздо выносливее к действию неблагоприятных условий, чем вегетативные клетки того же ви- да бактерий. Известны бактерии, споры которых обладают высо- кой устойчивостью к действию супрамаксимальных градаций температуры для данного вида. Так, если вегетативные клетки погибают при нагревании до 70—80° в течение 10 мин, то споры многих бактерий выдерживают нагревание до 90—100° в течение 10 мин. А термотолерантные споры некоторых термофилов, например анаэробных целлюлозных бактерий, выдерживают кипячение на протяжении 2—3 ч. Для получения обогащенной культуры термофильных анаэробных целлюлозных бактерий суб- страт, из которого выделяют бактерии (навоз либо почва), 31
кипятят 2 ч, а затем высевают на питательную среду с целлю- лозой. В оптическом микроскопе споры резко отличаются от веге- тативных клеток как ярко блестящие тельца вследствие более высокого показателя преломления света. Это можно видеть в неокрашенных и окрашенных препаратах. Объясняется повы- шенное светопреломление как бы повышением плотности цито- плазмы в споре; при спорообразовании большая часть цито- плазмы переходит в спору. На споре формируется оболочка. Клетка, образующая спору, называется спорангием. При отми- рании спорангиальной клетки спора получает вторую оболоч- ку — экзоспориум. При изучении сверхтонких срезов спор эубактерий удалось установить, что центральная часть заполнена спороплазмой, со- держащей несколько нуклеоидов. Спороплазма покрыта оболоч- j кой, составляющей внутренний покров, называемый интиной; наружный слой — оболочка споры, придающая ей высокую ре- зистентность к воздействию реактивов, благодаря чему споры трудно окрашиваются. Во время спорообразования клетка син- тезирует специфическое для спор соединение — дипиколиновую кислоту (пиридин-2,6-дикарбоновая кислота). В вегетативных клетках бактерий ее не бывает. Однако некоторые авторы руко- водств по микробиологии без основания считают, что стенки спор не содержат соединений, характерных для стенок вегета- тивных клеток, и состоят из других веществ. Тимен [491] сооб- щает, что последние работы Солтона и Маршала показали, что стенки спор Вас. subtilis содержат глюкозамин, диаминопимели- новую и мурамовую кислоты и рибитолфосфат, как и вегетатив- ные клетки, но в меньшем количестве. Высказывается предпо- ложение, что входящая в состав оболочки устойчивых к высокой температуре спор кальциевая соль диаминопимелиновой кисло- ты частично обусловливает терморезистентность спор. Споры бактерий, за исключением актиномицетов, нельзя счи- тать неизбежной стадией онтогенеза. Они формируются лишь при неблагоприятных условиях — истощении питательных сред и накоплении в среде продуктов метаболизма. Поместив споро- образующие бактерии в дистиллированную воду, можно инду- цировать спорообразование. Бактериальные споры эубактерий сохраняют жизнеспособность многие годы. В нашей лаборато- рии хранятся без пересевов в аэробных условиях чистые куль- туры споровых бактерий: маслянокислых, пектинразлагающих и анаэробных целлюлозных, более 35 лет сохраняя жизнеспо- собность. Шлегель [271] приводит случаи сохранения жизне- способности спор в образцах почвы от 50 до 100 лет, а на кор- нях гербарных растений от 200 до 320 лет. В оптимальных усло- виях споры прорастают, и бактерии начинают свой жизненный цикл. В одной вегетативной клетке всегда содержится одна спора. Поэтому спорообразование эубактерий не имеет отноше- 32
ния к размножению. Многие актиномицеты обычно размножа- ются спорами. Размножение и рост бактерий. Бактерии, относя- щиеся к различным порядкам, имеют характерные особенности размножения. Преобладающее большинство бактерий размножа- ется простым поперечным делением клетки на две равные части (изоморфное деление). Причем это деление может происходить и путем вростания (образования) оболочки от периферии к центру, и путем перетяжки. Все миксобактерии размножаются путем перетяжки. Клетка суживается в месте деления, затем это место утончается и, наконец, клетка делится. Некоторые представители порядка Cytophagales при спиральной форме клетки имеют поперечное деление, например род Saprospira. Встречающиеся в воде и кишечнике моллюсков представители 3 рода Cristispira размножаются продольным делением клетки. Патогенные спирохеты рода Borrelia — возбудители европейско- го возвратного тифа — размножаются поперечным делением. У другого представителя этого рода — возбудителя африканско- го возвратного тифа — наблюдалось и поперечное и продольное деление. Делению клеток предшествует деление нуклеоидов, вы- полняющих функцию ядра. У различных эубактерий, кроме деления на равновеликие части, встречается гетероморфное деление, при котором у па- лочковидных клеток могут отделяться маленькие шарообразные или серповидные образования, обладающие жизнеспособностью. Иногда эти части клеток так малы, что проходят сквозь бак- териологические фильтры (фильтрующиеся формы бактерий из- вестны у многих видов). Известно размножение бактерий путем почкования. Условия среды предопределяют скорость размножения бак- терий. Состав питательной среды, pH, гН2, температура и влажность оказывают большое влияние на скорость размноже- ния. При оптимальных условиях деление клеток наблюдается через 20—30 мин. У разных видов скорость деления различна. В полноценных средах и при оптимальных условиях скорость размножения возрастает; ускоряет размножение смена пита- тельной среды — проточное культивирование. В полноценной и свежей питательной среде наблюдается цикл развития бактериальной популяции, изображаемый в фор- ме кривой, разделяемой на 5 фаз: 1 — фаза задержки размноже- ния— лаг-фаза; 2 — фаза логарифмического роста; 3 — фаза замедленного роста; 4 — стационарная фаза; 5 — фаза ускорен- ного отмирания клеток. Типичная кривая роста бактериальной популяции имеет S-образную форму. В литературе встречается разделение кривой роста на большее число фаз. Так, Стефенсон [246] различает их восемь; есть тенденция к уменьшению числа фаз до четырех [271]: начальная лаг-фаза — 1; фаза ло- гарифмического роста или экспоненциальная — 2; стационарная 3 8—Glti 33
фаза — 3; фаза отмирания — 4 (рис. 18). В этих фазах рост представляет функцию време- ни. Мерой роста может слу- жить число клеток, подсчиты- ваемых в единице объема раз- личными методами. Для этой цели применяют счетные каме- ры, фильтрацию через мем- бранные фильтры, затем под- сушивание фильтра, окрас- ку, просветление и счет под микроскопом, высев на чаш- ки Петри и подсчет коло- ний после инкубации. Число Рис. 18. Логарифмическая кривая роста бактериальной культуры: I — лаг-фаза; 2 — фаза логарифмического роста; 3 — стационарная фаза максималь- ного числа бактерий; 4 — фаза логарифми- ческого отмирания бактерий. клеток не точно соответствует бактериальной массе из-за того, что размеры их неодинаковы. Бактериальную массу определяют путем учета «урожая» сы- рых или сухих клеток. Сырую массу определяют взвешиванием после центрифугирования и высушивания осадка при темпера- туре 100°. Еще более точные результаты можно получить путем количественного определения углерода и азота. Простым, хотя и не очень точным, методом является нефелометрическое опре- деление концентрации бактериальных клеток по мутности жид- кой среды. У начинающих микробиологов наименее ясное представление бывает о начальной (лаг) фазе. Название ее произошло от английского слова lag — отставать, тащиться. По ряду причин бактерии после пересева в свежую питательную среду не раз- множаются или по скорости размножения отстают от обычного, свойственного данному виду или штамму темпа размножения. Чем старее была культура, взятая для размножения, тем длин- нее лаг-фаза. Поэтому для пересевов рекомендуется брать куль- туру в логарифмической (экспоненциальной) фазе роста. Разу- меется, эта начальная фаза — от посева до достижения макси- мальной скорости роста, как впрочем и другие фазы,— не может быть одинаковой для разных родов и видов бактерий и зависит от состава среды. У бактерий, быстро размножающихся (мно- гие гетеротрофы), лаг-фаза короче — 2—3 ч, у хемоавтотрофов (нитрифицирующие, водородные и др.) лаг-фаза затягивается до 10 ч. Во второй — экспоненциальной, или логарифмической, фазе роста — культурам свойственна максимально возможная для дан- ного вида скорость деления, если все факторы роста оптималь- ны. В этой фазе ритм воспроизведения остается постоянным, количество бактерий должно увеличиваться в геометрической прогрессии. В результате постоянного истощения среды (при стационарной культуре) и накопления метаболитов скорость де- 34
ления падает и наступает 3-я — фаза замедленного роста, или отрицательного ускорения. Наконец, наступает время, при ко- тором скорость отмирания клеток равна скорости размножения и число живых клеток держится на одном уровне,— это стацио- нарная фаза или 4-я фаза в используемом нами обозначении. Затем развитие каждой культуры завершается фазой ускоренной гибели или отмирания клеток. Продолжительность фаз может быть различной даже в стационарной культуре на МПА и на синтетических средах. При проточном или непрерывном культи- вировании характер роста и размножения бактерий изменяется. Актиномицеты по размножению отличаются от всех прочих бактерий. Низшие формы — нокардии, микробактерии — размно- жаются простым делением, высшие — спорообразованием. Спо- ры образуются на конидиеносцах либо в спорангиях. Размноже- ние актиномицетов возможно также почками и обрывками ми- целия (см. с. 15—17). Химический состав бактерий. Одноклеточное строение преобладающего большинства бактерий и микроскопи- ческие размеры, обитание в водных растворах органических и минеральных веществ либо в других жидкостях в погруженном состоянии ставит бактериальную клетку в тесную зависимость от окружающей среды. Одни и те же роды и виды бактерий, вегетирующие в резко различающихся по химическому составу и физико-химическим свойствам естественных субстратах или искусственных питательных средах, отличаются рядом биохими- ческих признаков. При этом формируются различия не только в динамической или функциональной биохимии бактериальной клетки, возникающей в результате изменений метаболизма, но и, как следствие, в статической биохимии — в химическом составе бактериальной клетки. Так, например, в среде, богатой сахаром, вредитель сахарного производства стрептококк (Leu- conostoc mesenteroides), благодаря образованию крупных капсул, превращает сахарозу в слизистую декстрановую массу; в среде, богатой углеводами, особенно в картофельных и зерновых за- торах, клетки маслянокислых бактерий, имеющие клостридиаль- ную форму, ярко окрашиваются йодом в сине-фиолетовый цве! за счет содержания крахмалоподобного полисахарида грану- лезы. На средах, содержащих достаточно углеводов, красные дрожжи Rhodotorula способны накапливать до 50—60% жира по отношению к сухому веществу клеток. На средах, не содержа- щих углеводов, бактерии рода Clostridium не образуют грану- лезы, красные дрожжи не отлагают жира, лейконосток не об- разует слизистых капсул. Нитчатые железобактерии, образую- щие охряного цвета чехлы в железистых водах, на плотных питательных средах с лимоннокислым железом прекрасно раз- виваются, не образуя железосодержащих чехлов (собственные наблюдения). Таких примеров можно привести много. Химиче- ский состав микробной клетки в известной мере зависит от 3 * 35
состава среды. Что касается функционально-биохимических осо- бенностей штамма или вида, то они еще более тесно сопряжены с химическим составом субстрата и динамикой органических и минеральных соединений в питательной среде и могут варьи- ровать в очень широких пределах. Так, образование лимонной кислоты грибом-микромицетом Aspergillus niger зависит от на- следственной биохимической активности штамма, от солевого состава среды, на которой проводится окислительное брожение, и ряда других условий [124]. При культивировании микро- организмов на синтетических средах солевой состав сред ока- зывает большое влияние во всех случаях. В качестве примера можно указать на лабораторное получение или промышленное производство антибиотиков. Солевой состав сред и источник углерода в среде имеют решающее значение для образования микробом антибиотика. В наших исследованиях по деструкции синтетических органических соединений [221] опыты проводились только-на синтетических средах постоянного солевого состава. Большое разнообразие географических и экологических усло- вий, в пределах которых возможно расселение и существование в природе отдельных видов микроорганизмов, также накладыва- ет свой отпечаток на химический состав клеток и отражается на биохимических функциях микробной популяции. Современ- ные методы лабораторного эксперимента позволяют расчленить микробную клетку на ее органеллы и изучать в отдельности химический состав жгутиков, оболочек, протопласта, мембран, рибосом, нуклеоидов, а также содержимого протопласта: раз- личные запасные питательные вещества — гликоген, волютин, жиры, пигменты, витамины и другие метаболиты. Химический состав прокариотических клеток резко не отли- чается от химического состава клеток даже высших эукарио- тов —• животных или растений. В них можно найти почти все соединения, встречающиеся у растений и животных. Клетки бактерий, за исключением Azotobacter chroococcum, в отличие от других живых клеток, не содержат только стеролов [180]. В бактериальных клетках можно обнаружить следующие орга- нические вещества: протеины и протеиды, нуклепротеиды, ну- клеиновые (рибонуклеиновые и дезоксирибонуклеиновые) ки- слоты, пуриновые и пиримидиновые основания, липиды, углево- ды, органические кислоты и аминокислоты, витамины, спирты, альдегиды, кетоны, пигменты, токсины, ферменты, антибиотики и другие классы органических веществ; кроме того, в них всегда содержатся вода и минеральные соли. Замечательной особенностью бактерий, как и большинства живых клеток, является высокое содержание воды: вегетатив- ные клетки содержат 75—98% воды к общему весу микробной массы. На количество воды в клетках большое влияние оказы- вают окружающие условия. В субстратах с низким содержанием влаги, например в супесчаных почвах в засушливых районах, 36
количество воды в микробных клетках понижается, а в водной среде, наоборот,— повышается. Водная фаза среды представ- ляет собой оптимальные условия для нормального метаболизма, а следовательно, и размножения бактерий при соответствующей температуре и других благоприятных условиях. С позиций коллоидной химии микробная клетка представляет собой коллоидную систему, где дисперсионной средой является вода, а дисперсной фазой биополимеры, в состав которых вхо- дят перечисленные выше органические вещества клетки. Лишь часть воды, содержащейся в живой бактериальной клетке, на- ходится в свободном состоянии. Остальная вода во всех компо- нентах клетки имеет форму связанной воды. Гипертонические растворы солей или сахаров во внешней среде приводят к по- тере бактериальной клеткой не только свободной, но и части связанной воды. Органическое вещество бактерий содержит те же элементы, что и любое другое органическое вещество клеток. В него вхо- дят следующие элементы: С, Н, О, N, S, Р и, кроме того, в мень- ших количествах элементы, поступающие в бактериальную клет- ку главным образом в виде неорганических солей — Na, К, Са, Mg, Fe, Cl. О потребности бактерий в некоторых элементах судят по тому, какие соли, будучи внесенными в питательную среду, оказывают хотя бы незначительное стимулирующее дей- ствие на рост либо на некоторые физиологические или биохими- ческие функции микробной популяции определенного рода или вида микроорганизмов. Ссылки на выявление в микробной золе того или иного элемента не могут служить достаточной аргумен- тацией потребности данного вида микроба в этом элементе. В микробную клетку, наряду с необходимыми, могут поступать также и случайные элементы, в которых клетки не нуждаются. Так, например, Махер и Маннингер (цит. по [180]) нашли в золе Sarcina citrea и Azotomonas: Ag, Al, В, Са, Си, Fe, К, Mg, Na, Ni, Si, Sn. В питательную среду авторы вводили; В, Fe, К, Mg, Na, Sn, т. е. 6 элементов из 12 обнаруженных в золе при. анализе; следовательно, остальные присутствовали в среде в качестве загрязнителей солей, других питательных компонентов среды или воды. А. М. Кузин [156], рассматривая минеральный состав патогенных бактерий, указывает, что для сальмонелл, например, необходимы только шесть ионов: Na, К, Mg, Cl, РО4 и SO4. Для Ebertella typhosa необходимы, кроме шести пере- численных, еще Са и Fe. Nielsen и Hartelius утверждают, что В, Be, Hg, Са, Cd, Си, Сг, Со, Zn, Si и Мп стимулируют рост целого ряда микроорганизмов, присутствуя в средах в виде ультраследов хлоридов этих элементов. В литературе встречают- ся данные о том, что азотобактер не фиксирует молекулярного азота в отсутствие молибдена или ванадия [180], а следы меди и цинка стимулируют рост Corynebacterium diphtheriae [246]. В перечисленных литературных источниках говорится о замет- 37
ном действии ультраследов элементов на рост микроорганизмов. Следовательно, речь идет уже не о зольных элементах, а о микро- элементах. В некоторых руководствах по микробиологии цинк, марганец, никель, йод, бром называются микроэлементами микроорганизмов [165], однако прочного основания для этого нет. Так, Стефенсон [246] считает, что соли, необходимые для всех бактерий, неизвестны. Отсутствие точных сведений о по- требностях отдельных видов или родов микробов побуждает исследователей вносить во все синтетические среды К, Na, Mg, Fe, SO4, РО4 и Cl. Значение отдельных элементов для микробной клетки еще недостаточно выяснено, однако С, N, S и Р вносят в среду для всех гетеротрофов. Они входят в состав белков. Углерод состав- ляет 45—55% сухого вещества клеток. Содержание азота ко- леблется от 2,8% у азотбактера до 15,5% у холерного вибриона. Азот входит в состав аминокислот. Содержание фосфора, уча- ствующего в важнейших процессах фосфорилирования углево- дов, колеблется от 1,6% у Вас. cereus до 3,1 у Вас. subtilis и может достигать 74% веса неорганического остатка у тубер- кулезной палочки. Калий участвует в переносе фосфатов при образовании гексозодифосфатов из гексозомонофосфатов. Каль- цию отводится роль катализатора, он обнаруживается в связан- ном состоянии (с углеводами, липидами и протеинами) и сво- бодной форме. Магний способен активировать почти все ферменты, нуждающиеся в двухвалентных катионах. Действие магния может быть частично заменено кобальтом, цинком и никелем. Сера входит в состав весьма важных аминокислот — метионина и цистеина. Железо играет важную роль в окисли- тельных реакциях. Медь является компонентом ферментов — оксидазы аскорбиновой кислоты и фенолоксидазы. Кобальт представляет собой структурный компонент витамина Bi2. Се- ребро обладает способностью действовать на бактерии в таких ничтожно малых количествах, что выходит далеко за рамки представлений о микроэлементах. Оно обладает так называемым олигодинамическим действием, проявляющимся в воде при по- гружении в нее серебряных пластин, монет, любых изделий из серебра, либо при пропускании воды через посеребренный пе- сок. Олигодинамическое действие серебра широко используется; гак, Л. А. Кульский рекомендует его для освобождения питье- вой воды от микроорганизмов [157]. Содержание неорганических веществ в микробной массе, как указывалось, изменяется в широких пределах — от 2 до 30% к сухому весу. Оно связано с возрастом культуры, составом пи- тательной среды и, разумеется, зависит от вида микроорганиз- ма. Органическое вещество суммарно составляет 40—90% к сухому весу. В последние годы накопилось много данных о хи- мическом составе клеточных оболочек. Исследования в этой области привели к установлению новых закономерностей и от- 38
о I —одноклеточные (а — Chroococcus; б — Gloeocapsa pelurocapsoides); II — нитчатые (a —Nodularla spctmigena; б — Anabaenopsisdes arnoldii; в — Nostoc spbericum; a —Anabaena oscillarioides). крытию новых органических соединений, входящих в состав оболочек бактериальной клетки конкретных видов, о чем гово- рилось выше. Строение и биология синезеленых водорос- лей. Цианофицеи, или синезеленые водоросли, характеризуются своеобразным цветом клетки с оттенками от оливково-зеленого до голубовато-зеленого, голубого, коричневого, а иногда почти черного цвета. Окраска обусловлена специфическими для этой группы организмов пигментами — фпкоцианом и фикоэритрином, а также обычными для фотосинтетиков хлорофиллом а и каротиноидами. Строение этих пигментов рассматривается в соответствующем разделе этой главы. Фотосинтез цианофицеи сопровождается выделением кислорода. Синезеленые водорос- ли — Cyanophyta весьма сходны по строению клетки, таллома и ряду биологических признаков с бактериями. Систематическое положение их в связи с этим неоднократно пересматривалось. В 8-м издании определителя бактерий Берги 1974 г. [299] они названы цианобактериями, однако выделены в самостоятельный отдел Division Cyanobacteria. Все остальные прокариотические организмы составляют отдел II, Division II — Bacteria. В опре- делителе Станиера даны краткие сведения о цианобактериях всего на полстраницы, но ни описания известных таксонов, ни систематики не приводится. Среди синезелепых водорослей различают: 1) одноклеточные (Chroococcales), живущие либо в виде одиночных и парных 39
Рис. 20. Lyngbya с гормого- ниями, а — трихом; б — гормогонии. клеток, либо значительно чаще в виде колоний (рис. 19); 2) много- клеточные нитевидные формы, обра- зующие трихом (от греч. trichos — волосок). У нитевидных форм три- хом может быть прямым, изогну- тым, почти кольцеобразным или спиралевидным, у некоторых родов толщина трихома неравномерна за счет неравновеликих клеток. Три- хом чаще состоит из одного ряда клеток, но бывает и из двух, а ино- гда из нескольких. Диаметр трихо- ма от 1 мкм и меньше (некоторые виды рода Lyngbia) до 20 мкм у других родов (рис. 20). У нитчатых форм различают ветвление двух типов: ложное вет- вление, аналогичное имеющемуся у некоторых нитчатых бактерий, и истинное ветвление, которое бывает боковым, в результате роста интер - калярных клеток. У некоторых представителей ветвление дихотоми- ческое, в результате продольного де- ления терминальной, верхушечной клетки. Ветвь служит продолжени- ем трихома, от которого она возникает. Строение клеток цианофицей. У хроококковых водорослей клетки шарообразной или овальной формы; форма клеток нитчатых (гормогониевых) разнообразна. Бывают клет- ки удлиненные, когда длина превышает ширину, укороченные, дискообразные, где длина в несколько раз меньше ширины, и такие, когда длина и ширина равны,— изодиаметрические. В се- редине трихома интеркалярные клетки бывают цилиндрически- ми, бочечкообразными, овальными, шарообразными, шарообраз- носплюснутыми и даже угловатыми. Терминальные клетки в конце нити чаще куполообразные или полушаровидные. Вегетативные клетки имеют всегда многослойную жесткую (ригидную) оболочку. Так, у Oscillatoria rubescens при увели- чении 110 000 обнаружена четырехслойная оболочка [355]. Вну- тренний слой оболочки плотно прилегает к протопласту со всех сторон и состоит из пептидогликана. Наружный слой оболочки более плотный и значительно более толстый, на границе смеж- ных клеток трихома не смыкающийся. Фогг и др. [355] назы- вают этот наружный слой клеточным чехлом. Стенки, разгра- ничивающие смежные клетки, называются поперечными перего- родками; они состоят только из внутреннего тонкого слоя и 40
имеют поры. По каналам, соединяющим через поры соседние клетки, проходят тяжи цитоплазмы — плазмодесмы, по кото- рым возможен обмен веществ между клетками трихома. Три- хом в целом, состоящий из одного, двух или нескольких рядов клеток, покрыт еще одной общей трубчатой оболочкой, именуе- мой влагалищем (например, сем. схизотриксовые или плекто- немовые) [140]. Эта наружная оболочка бывает слизистая или фиброзная, состоящая из тончайших переплетенных между со- бой волоконец. Протопласт цианофицей не имеет ядра, как и протопласт бактерий. В протопласте различают более прозрачную неокра- шенную часть — центроплазму—и периферическую, содержа- щую пигменты — хроматоплазму. В центроплазме имеются бо- лее уплотненные участки, или нуклеоиды, представляющие собой ядерные эквиваленты, в которых обнаружены ДНК и РНК- В клетках цианофицей есть полости, заполненные газом — газовые вакуоли. Под микроскопом они выглядят черными тель- цами; закономерны для планктонных родов, так как способству- ют их пребыванию во взвешенном состоянии. Структур, содер- жащих пигменты, в центроплазме нет. Нуклеоиды синезеленых водорослей не отделены от цитоплазмы ядерной оболочкой так же, как и у бактерий. В хроматоплазме содержатся все пигменты, свойственные синезеленым водорослям. В периферической зоне клеток обна- ружены ламеллярные структуры, содержащие фотосинтетиче- ские пигменты. В виде тонких пластинок они располагаются параллельно клеточной оболочке, что видно на схематическом рисунке клетки прокариотов (см. рис. 11); группы пигмент- содержащих пластинок называются тилакоидами. М. А. Пеш- ков [203] предлагает всю периферическую часть плазмы — хроматоплазму, пронизанную пигментсодержащими пластинка- ми, назвать «парахроматофором». Среди вегетативных клеток нитчатых цианофицей встре- чаются клетки более прозрачные и более крупные, названные гетероцистами. Оболочки гетероцист толще, чем у смежных пигментированных клеток. С соседними клетками гетероцисты соединяются порами с проходящими через них плазмодесмами. В оптический микроскоп гетероциста кажется пустой. Под элек- тронным микроскопом (X 14 000) гетероциста Anabaena cylin- drica [355] вся заполнена мембранными структурами. Гетеро- цисты обнаружены у многих представителей порядков Nosto- cales (за исключением сем. Oscillatoriaceae) и Stigonematales. Расположение гетероцист в трихоме возможно интеркалярное и терминальное. Гетероцисты не содержат основных пигментов цианофицей — фикоциана и фикохрома. Они окрашены в жел- тый или чуть зеленоватый цвет каротиноидами и малым коли- чеством хлорофилла а. Биологическое значение гетероцист 41
окончательно не выяснено, поэтому им приписываются различ- ные функции. Размножение. Полового размножения у синезеленых водо- рослей (бактерий) не обнаружено. Размножаются они исклю- чительно вегетативным путем, часто простым равнополовинным делением клетки. Возможно размножение спорами, которых однако в каждой клетке не бывает больше одной. Споры спо- собствуют переживанию в неблагоприятных условиях, посколь- ку они более устойчивы к ним, чем вегетативные клетки. Спо- ры обычно крупнее, чем вегетативные клетки, оболочка у них более толстая и содержимое представляется более сгущенным. Нитчатые формы размножаются также подвижными многокле- точными участками нитей, которые называются гормогониями (рис. 20). Гормогонии способны к самостоятельному движению путем скольжения. Подвижные гормогонии образуются как у трихомов, которым свойственно активное движение, так и у видов с неподвижными трихомами. Гормогонии многоклеточ- ные, однако могут состоять из нескольких или только одной клетки. Один организм способен образовывать несколько и даже много гормогониев по всей длине трихома. У гормогониев нет обверток, как у трихома; они покрыты лишь выделяемой клетками слизью. Различают одноклеточные образования ни- тевидных цианофицей, служащие организму тоже для размно- жения: гонидии — единичные клетки, покрытые слизистой обо- лочкой; кокки — одноклеточные фрагменты без индивидуальной оболочки; планококки— голые клетки, способные к активному движению [355] (они, собственно, не имеют отличий от одно- клеточных гормогониев). В неблагоприятных условиях некото- рые вегетативные клетки цианофицей покрываются более тол- стой оболочкой, превращаясь в покоящиеся споры, или акине- ты. Наблюдается также образование покоящихся гормоспор, состоящих из 7—9 клеток, покрытых обверткой. Наконец, сле- дует отметить, что иногда в нескольких клетках трихома обра- зуется по нескольку десятков мелких спор (эндоспор). Заканчивая краткое описание строения и биологии синезе- леных водорослей, нельзя не упомянуть о том, что М. А. Пеш- ковым [204] представлен анализ литературы, касающейся микроорганизмов, занимающих промежуточное положение меж- ду бактериями и синезелеными водорослями. Среди них роды Oscillospira и Simonsiella — бесцветные микроорганизмы, имею- щие строение, идентичное водоросли Oscillatoria и весьма близкое к бактерии Beggiatoa, но способные к паразитическо- му образу жизни в организме насекомых, человека и млеко- питающих. Значение синезеленых водорослей в природе и народном хозяйстве очень велико. Они широко распространены в пресно- водных водоемах, особенно с непроточной водой, или при за- медленном течении в искусственных водохранилищах. Встре- 42
чаются они на различных географических широтах в разных климатических зонах во все времена года. Но особенно боль- шой ущерб приносят в летние месяцы во время «цветения» во- доемов. Пигменты. Среди химических компонентов микробных клеток большое значение имеют пигменты. Это слово — «пиг- мент»— произошло от латинского pigmentum — краска. Раз- личные химические соединения, характеризующиеся цветностью (окраской), присущи животным, растениям и микроорганизмам. Пигменты микроорганизмов весьма разнообразны по цвету и оттенкам. Еще со времени исследований Ньютона известно, что белый свет состоит из семи первичных цветов: красного, оранжевого, желтого, зеленого, голубого, синего и фиолетового, составляю- щих спектр. Пигменты микробов представлены всеми цветами спектра, а также оттенками, которые являются комбинациями из первичных цветов. Так, кроме семи цветов спектра, пигмен- ты бывают палевые, бежевые, сомон, охряные, каштановые, бурые, коричневые, черные, серые, терракотовые, грюн, сепия и многих других оттенков, названия которых отсутствуют в обычном лексиконе. Поэтому при определении микроорганиз- мов, особенно грибов и актиномицетов, необходимо цвет и от- тенок пигментации колоний или штрихов устанавливать по шкале цветов А. С. Бондарцева [28]. Пигментация микроорга- низмов широко используется при их классификации, особенно актиномицетов, грибов-микромицетов и пурпурных бактерий. Пигментацию микробов причисляют к признакам, генетически закрепленным [271]. Тем не менее признак этот весьма измен- чив, зависит от условий и варьирует у некоторых видов от яр- кой окраски до бледных тонов или полной потери пигмента, наступающей в результате модификационной или мутационной изменчивости. А. Е. Крисс, Н. А. Красильников, М. X. Шигаева [143, 149, 268] наблюдали ее у актиномицетов, Е. С. Татарен- ко [248] — у грибов-микромицетов, Месробяну и Пеунеску [180] —у стафилококков. Нами выделены из гнойного отделяе- мого ран и из крови септических больных стафилококки ярко- оранжевой окраски, приобретавшие при последующем длитель- ном культивировании на МПА светло-желтую пигментацию. Один штамм полностью утратил пигмент. На кафедре микро- биологии КГУ при адаптации стафилококков к пенициллину, нами получен апигментный вариант стафилококка из междуна- родного штамма St. aureus № 209. Цвет колоний пигментных бактерий зависит от pH среды, состава среды, возраста куль- туры и условий предшествующего культивирования. На плот- ных агаризованных средах пигментация более резко выражена, чем на жидких универсальных и синтетических средах. В пре- делах вида возможно существование пигментированных и бес- цветных вариантов, а следовательно, и популяций. 43
Вопрос о пигментах бактерий рассматривается нами по- дробно в связи с тем, что среди водной микрофлоры процент пигментированных родов и видов бактерий значительно выше, чем среди патогенных, бродильных и, по-видимому, даже выше, чем среди почвенных бактерий. При этом именно пигментные микроорганизмы играют важную роль в очистке промышлен- ных сточных вод. Количество изученных микробных пигментов значительно превысило число известных растительных пигмен- тов. Возникла потребность данные о них привести в систему— классифицировать пигменты. Андерсон [286] предложил в осно- ву классификации микробных пигментов положить два свойства: 1) растворимость в различных растворителях; 2) химический состав. Наиболее совершенной является классификация пигментов по химическому составу. Е. П. Феофилова [264] в монографии «Пигменты микроорганизмов» также придержи- вается классификации пигментов по химическому составу. В аспекте химического строения излагаются сведения о микроб- ных пигментах и в этой книге. Чтобы яснее представить, почему большинство синтезируе- мых в биохимической лаборатории живой клетки веществ бес- цветные и лишь некоторые соединения (пигменты) имеют окраску, нужно обратиться к некоторым свойствам органиче- ских соединений. Рассмотрим химические и физико-химические закономерности строения органических соединений, обусловли- вающих цветность вещества, т. е. оказывающих физиологиче- ское воздействие на человеческий глаз и вызывающих зритель- ное восприятие первичного цвета. Электромагнитные излучения с диапазоном волн 365—750 нм (а в специальных условиях 302—950 нм) воспринимаются человеком с ощущением цвета. Цветность микробных пигментов, как и цветность любого орга- нического соединения, зависит от ненасыщенности и поляри- зуемости, т. е. наличия двойных и тройных связей или же свободных радикалов. Все микробные пигменты имеют в моле- куле двойные связи. Существует взаимосвязь между ненасы- щенностью соединения и поглощением света в видимой области спектра. Ненасыщенные группы с областью поглощения 180— 800 нм названы «хромофорами». Введение хромофоров в бес- цветные (прозрачные) соединения превращают их в вещества, поглощающие свет в видимой области, т. е. обладающие цвет- ностью; они названы хромогенами. Имеются данные о строении хромофорных радикалов. Гиллем и Штерн [64] приводят пере- чень следующих хромофорных групп: Хромофорная группа Карбонильная Карбоксильная Система RRXC=O —СООН Хромофорная группа Нитрозо Нитро Система 44
Хромофорная группа Система Хромофорная группа Система Амидная —conh2 Нитратная —ONO3 Этиленовая RCH=CHR Нитритная Тиокарбо- —ONO Ацетиленовая RCsCR нил иная >C=S Сульфо- Азометиновая >C=N— ксильная >s—О Нитрильная —Ca=N Сульфоновая >0 >s/ Азо —N=N— Некоторые группы, не являясь хромофорными, вызывают уси- ление цветности хромогенов; они названы «ауксохромами». Амино- и окси-группы представляют собой типичные ауксохро- мы. Галогены и некоторые другие заместители также характе- ризуются ауксохромными свойствами. Например, диметилами- но-, диэтиламино-, метокси-, этокси-группы. Иллюстрацией к существующей связи между строением и цветом соединения могут служить следующие примеры: бен- зол (I) бесцветный, введение нитрогруппы, являющейся хро- мофорной, дает нитробензол (II)—хромоген светло-желтого цвета; введение в кольцо нитробензола метоксильной группы (-ОСНз) ауксохрома в орто-положение дает о-метоксинитро- бензол (III) желтого цвета; введение в нитробензол в орто-по- ложение гидроксила ауксохрома дает о-нитрофенол (IV) ярко- желтого цвета. I и III IV Из приведенного примера видно, что наличие в соединении одной лишь хромофорной группы (II, —NO2), без ауксохромов (III, —ОСНз и IV, —ОН) также обусловливает цветность со- единения, хотя и менее интенсивную. Пигментные микроорганизмы играют важную роль в осво- бождении пресноводных водоемов от органических веществ, а также в деструкции синтетических органических соединений в сооружениях по биологической очистке промышленных сточ- ных вод. Пигменты, близкие по строению или идентичные пиг- ментам зеленых растений, содержат бактерии, способные к фо- тосинтезу,— синезеленые бактерии, а также фототрофные, пур- пурные и зеленые серобактерии. Еще Бючли в 1890 г. обнаружил, что у пурпурных серо- бактерий, кроме красного пигмента — бактериопурпурина, есть зеленый пигмент, подобный хлорофиллу. В настоящее время многочисленными исследованиями подтверждено, что фототроф- 45
Хлоро/рим а(1) Бактериохтроирилл (II) Продавивши (VI) 4 у-каротин (IV) Рис. 21. Пигменты, образуемые прокариотами (истинными бактериями и синезелеиыми водорослями) эукариотами (протококковыми водорослями). ные серобактерии содержат зеленый пигмент — бактериохлоро- филл. Как известно, высшие растения содержат два хлорофил- ла, незначительно различающихся между собой. Хлорофилл а — CssHyaOsN^Mg и b — CS5H70O6N4Mg. Бактериохлорофилл — C55H74O6N4Mg ближе структурно к хлорофиллу а, но отлича- ется от него наличием в первом пиррольном кольце ацетильной группы вместо винильной (рис. 21). Бактериохлорофилл содер- жат пурпурные и зеленые серобактерии. Хлорофилл а (иден- тичный хлорофиллу высших растений) содержат синезеленые водоросли, а также протококковые водоросли, относящиеся к эукариотам. Синезеленые водоросли (Cyanophyta) содержат также спе- цифические пигменты — билихромоиротеиды, относящиеся к растворимым белкам, представляющим собой двухкомпонент- ные системы, состоящие из белка типа глобулинов и хромо- форных групп — фикобилинов, обусловливающих голубой или красный цвет пигмента. Фикобилины представляют собой про- изводные тетрапиррола, при этом четыре пиррольные кольца 46
не замкнуты, как у хлорофиллов (рис. 21, I и II), а вытянуты в развернутую цепь. Билихромопротеиды наряду с хлорофиллом участвуют в фотосинтетических процессах. Синезеленые водо- росли, именуемые по предложению редакционной коллегии 8-го издания «Определителя бактерий» Берги также цианобак- териями, содержат и желтые пигменты — каротиноиды. У них выявлены а- и p-каротин (рис. 21), характерные и для высших растений. Мы приводим структурную формулу лишь у-кароти- на потому, что он, помимо цианофицей, встречается также и у других прокариотических микроорганизмов, в частности у зе- леных серобактерий. Все пигменты цианофицей расположены в периферической части клетки, называвшейся прежде хроматоплазмой, причем пигменты не находятся непосредственно в периферическом слое цитоплазмы клетки водорослей, а расположены в ламеллярном фотосинтетическом аппарате — парахроматофоре. Под электрон- ным микроскопом парахроматофор цианофицей имеет вид тон- ких пластин, идущих параллельно клеточной оболочке. Фотосинтетические пигменты микроорганизмов характери- зуются по спектрам поглощения света. Максимум поглощения раствора бактериовиридина в этиловом спирте отмечен при 670—660 нм и второй максимальный пик около 430 нм. У сине- зеленых водорослей встречается несколько типов хлорофилла а с различными максимумами в красной области — 660; 663; 672; 694; 698 и 702 нм [82]. Положением максимумов в спект- рах поглощения различаются также и пигменты белковой при- роды — билихромопротеиды цианофицей. Так, С-фикоцианин имеет максимум 615 нм, С-фикоэритрин — 560 нм. Оба эти пигмента присутствуют постоянно только у рода Nodularia. У распространенного вида Anacystis nidulans постоянно при- сутствует С-фикоцианин и никогда не обнаруживается С-фико- эритрин. У Phormidium ectocarpii, наоборот, всегда обнаружи- вается С-фикоэритрин и отсутствует С-фикоцианин. Наконец, есть и такая группа водорослей [81, 82], как различные пред- ставители рода Anabaena и Tolypothrix tenuis, которые всегда содержат С-фикоцианин, а С-фикоэритрин появляется у них лишь при слабом освещении или при наличии других источни- ков углерода в дополнение к СО2. При исследовании различных родов цианофицей [82] выяв- лены каротиноидные пигменты — у-каротин и миксоксанто- филл — с максимумами поглощения в ацетоне 450 и 480 нм. Из них мнксоксантофилл присущ исключительно цианофицеям. Все перечисленные выше пигменты Cyanophyta принимают прямое или косвенное участие в фотосинтезе. Имеются указа- ния на то, что билихромопротеиды непосредственно в реакции фотосинтеза не участвуют, но являются переносчиками свето- вой энергии на хлорофилл а, обеспечивающий фотосинтез. 47
Желтые и оранжевые пигменты микроорганизмов — кароти- ноиды — принадлежат к наиболее распространенным и весьма часто встречающимся в микробном мире. Они представляют собой соединения с открытой цепью углеродных атомов и от- носятся к ненасыщенным углеводородам терпенового типа [264]. М. С. Цвет предложил их назвать каротиноидами по названию пигмента моркови каротина с эмпирической формулой С40Н56. Позже было установлено, что каротин существует в виде трех изомеров: а, 0 и у-каротинов, и что они характерны для растений, животных и микробов. Из них у цианофицей об- наруживается у-каротин (рис. 21, 71/). Его функция — защита клетки от окисления; в фотосинтезе он, по-видимому, не уча- ствует [82]. Е. Н. Кондратьева [139] показала, что у всех видов зеленых серобактерий рода Chlorobium обнаружен у-каротин, составляющий 80—85% всех каротиноидов, найденных у пред- ставителей этого рода. Роль у-каротина у зеленых серобактерий окончательно не выяснена. Кроме того, они содержат и другие каротиноиды, но в меньшем количестве. У других пигментных бактерий каротиноиды очень распространены. У многих бакте- рий, имеющих желтые, оранжевые и красные оттенки колоний, цвет колоний обусловлен наличием каротиноидов. У желтых сар- цин колонии пигментированы свойственным этим бактериям ка- ротиноидом — сарцина-ксантином. У нефотосинтезирующих бактерий распространены высшие Сбо-каротиноиды. Они обнаружены у Sarcina flava, Sarcina lutea, Micrococcus lysodeikticus и Corynebacterium poinsettiae. Некоторые каротиноиды связаны с остатками сахаров, образуя гликозидные каротиноиды, присущие миксобактериям. При свя- зи с жирными кислотами образуются эфиры каротиноидов и жирных кислот (Myxococcus fulvus) [82]; другой пигмент, ана- логичного строения, выделен у миксобактерий Sorangium сош- positum. В связи с тем что [1-каротин является провитами- ном А, потребность в котором в медицине и в народном хозяй- стве велика, способность микроорганизмов к сверхсинтезу некоторых метаболитов используется у микромицета Blakeslea trispora для промышленного производства каротина [231]. Образование каротиноидов присуще многим актиномицетам. Высшие каротиноиды с 12 и более двойными связями, содер- жащие альдегидные и метоксильные группы, являющиеся ауксохромами, т. е. усиливающими цветность, имеют оранже- вый, а иногда красный цвет. Так, у пурпурных бактерий крас- ная окраска обусловлена высшими каротиноидами. Однако наиболее ярко-красное окрашивание колоний, свойственное Serratia marcescens — чудесной палочке *, прежде называвшей- * Чудесной палочкой Bact. prodigiosum названа в связи с образованием кроваво-красных пятен на хлебе, в том числе и на просфоре, хранившейся в костелах и церквях и применявшейся для причащения. Эти красные пятна принимали за кровь. 48
ся Bacterium prodigiosum, обусловлено специфическим пигмен- том— продигиозином (рис. 21, IV), состоящим из трех, раз- вернутых в цепочку пиррольных колец. Реже, чем желтые, оранжевые и красные, встречаются в микробном мире синие или фиолетовые пигменты. Один из видов распространенного в воде рода Pseudomonas содержит синий пигмент — индиго- идин, относящийся к хинонам (рис. 21, У)- Этот пигмент обра- зуют Pseudomonas indigofora, Arthrobacter polychromogenes, C. insidiosum. Синий пигмент хиноидного строения выделен из Act. coelicolor Тоноло с соавт. (цит. по [144]). Н. А. Кра- сильников [146] приводит девять видов актиномицетов, обра- зующих синие пигменты различные по химическому строению. Кроме того, есть актиномицеты с фиолетовыми пигментами. Так, первый актиномицетный антибиотик — мицетин, описанный Красильниковым и Кореняко еще в 1939 г., представляет собой фиолетовый пигмент. Фиолетовый оттенок имеют также коло- нии бактерии Chromobacterium violaceum, легко выделяемой из торфяников. Около 70—80% всех актиномицетов образуют пиг- менты; у разных представителей этого порядка бактерий име- ются пигменты всех оттенков спектра. Некоторые микробные пигменты являются антибиотиками. К пигментам-антибиотикам относится пиоцианин (рис. 24, VII), принадлежащий к гетеро- циклическим соединениям — производным феназина. Пиоциа- нин выделяется в питательную среду бактерией Pseudomonas aeruginosa, до недавнего прошлого называвшейся Pseudomonas руосуапеа; видовое название бактерии и послужило основанием для названия пигмента. Пигмент окрашивает питательные сре- ды в красивый зеленовато-голубой цвет, ибо он относится к экзопигментам, выделяемым из клетки. В противоположность ему хлорофилл, фикоциан и каротиноиды относятся к эндо- пигментам, они не выделяются в субстрат, оставаясь постоянно связанными с микробной клеткой, что легко проследить на красных дрожжах. Пигментация красных дрожжей Rhodotorula обусловлена также каротиноидами, но они никогда не окра- шивают агаризованных сред вокруг колоний. Пигменты микро- бов, за исключением хлорофилла, относятся к вторичным ме- таболитам. Отсюда и возможность существования многих пигментных форм в виде беспигментных (бесцветных) вариантов. 4 8-616
СИСТЕМАТИКА БАКТЕРИЙ (ПРОКАРИОТОВ) «Вида, как категории, строго опре- деленной, всегда себе равной и неиз- менной, в природе не существует...» (К. А. Тимирязев, Исторический метод в биологии). По мере познания человеком природы число известных живых существ непрерывно увеличивается. В каждой из биологических наук на известном этапе развития возникала потребность в си- стематизации накопившегося материала, иначе говоря, в клас- сификации уже известных изученных живых организмов. На- зревала необходимость точно различать сходные между собой организмы. В средине XVIII ст. знаменитый шведский натура- лист Карл Линней (1707—1773) предложил двойную, или би- нарную, номенклатуру для обозначения каждого вида живых существ. Согласно этому принципу каждое живое существо — растение, животное и микроорганизм обозначается двумя ла- тинскими словами: в название каждого вида входит и наиме- нование рода. Род—обычно существительное, вид — прилага- тельное. Например, Sarcina — пакет (скопление шарообразных бактерий в форме пакета), lutea — желтая (от латинского lu- teus — желтый). В наименование вида или рода вводится иногда физиологический или общебиологический признак, по которому микроорганизм стал известен, например, Acetobacter aceti — бактерия, образующая уксусную кислоту, или Vibrio cholerae — вибрион, вызывающий холеру. В медицинской микробиологии было принято роды бактерий называть именами крупных ми- кробиологов, имеющих приоритет в исследовании данного микроорганизма. Например, кишечная палочка — бактерия, ко- торую принято считать показателем санитарного состояния воды, в честь микробиолога Эшериха названа Escherichia coli. Важные биохимические или физиологические функции также стали отражать в родовых названиях бактерий. Так возникли ро- ды Sulfomonas — организмы, окисляющие сернистые соединения, сульфиты, гипосульфиты или элементарную серу; Lactobacte- rium — молочнокислые бактерии; Methanobacterium и Methano- coccus — бактерии, превращающие органические кислоты и спир- ты в метан. Отсюда в микробиологии получилась пестрая карти- на в названиях родов бактерий, чего нет, например, в ботанике. Разнообразие микроорганизмов в природе велико. Если большинство из широко известных микробов однообразны по форме клетки, т. е. по своей морфологии, то они весьма разно- образны по совокупности физиологических и биохимических признаков. А их полезность или вред обусловливается именно биохимическими функциями. Чтобы ориентироваться в накап- ливающейся информации о микробах, в частности о помощни- ках человека, играющих роль санитаров при очистке промыш- 50
ленных сточных вод в биологических очистных сооружениях, необходимо познакомиться с их систематикой, таксономией, номенклатурой и определителями, по которым можно устано- вить — идентифицировать систематическое положение — род и вид микроорганизма. Все весьма близкие по морфо-физиологическим признакам прокариотические организмы относятся к одному виду (Spe- cies). Виды объединяются в роды (Genus), роды в семейства (Familia), семейства группируются в порядки (Ordo), поряд- ки— в классы (Classis) и классы — в отделы (Divisio). Часть систематики, изучающая связи между отдельными группами организмов, систематическими единицами, соподчиненность и пределы систематических категорий, таксонов, называется так- сономией. Правила наименования организмов и таксонов, принятых в данной области биологии, и их перечень называются номен- клатурой. Принятая в микробиологии латинская номенклатура интернациональна. Таксономия и номенклатура помогают упо- рядочению системы микробов-прокариотов, помогают классифи- цировать их. Наука о принципах и методах построения системы и связях или отношениях между таксонами называется систе- матикой. Г. А. Заварзин [99] дает следующее определение систематике как науке: «Систематика есть теория многообра- зия организмов, изучающая отношения между их группами». В. И. Кудрявцев [155] считает, что... «Систематика... наука о классификации организмов и опознавании установленных групп...». Существует два вида классификаций: естественные, или филогенетические, и искусственные. Естественную систематику спорообразующих дрожжей, основанную на генеалогии и фило- генетическом сродстве, разработал и предложил известный со- ветский микробиолог В. И. Кудрявцев [155]. Филогенетическую систематику истинных бактерий и актиномицетов разрабатывал крупнейший советский микробиолог-флорист Н. А. Красильни- ков [143, 144]. Свой определитель бактерий и актиномицетов [145] он также строил на принципах филогении, однако во многих таксонах для этого было недостаточно материала. Номенклатура, принятая в определителе Н. А. Красильникова, тоже отличалась от номенклатуры других определителей, изда- вавшихся в последние 30—40 лет как в СССР, так и за рубе- жом. Наша отечественная школа микробиологов широко поль- зовалась и систематикой, и номенклатурой Красильникова, считая, например, актиномицеты близкой к бактериям, но са- мостоятельной прокариотической группой микроорганизмов. Это нашло свое отражение не только в определителях и моно- графиях самого Красильникова, но также во многих отече- ственных руководствах по микробиологии и в специальной периодической печати. Не имея возможности анализировать 4 51
здесь литературу, касающуюся систематики прокариотов, отме- тим лишь, что филогенетическая систематика бактерий пока не построена. Создание ее дело не такого уж близкого будущего. По-видимому, потребуется продолжительный период изучения химического состава нуклеотидов, хотя бы у более крупных таксономических категорий, и подробная характеристика мета- болических диапазонов, а также границ изменчивости система- тических единиц (таксонов). Среди прокариотов в наиболее выгодном положении ока- зались синезеленые водоросли. Их изучение и построение си- стематики развивались альгологами, а не микробиологами. В альгологии, как и в других разделах ботаники, систематика строилась на филогенетических принципах. Этому, несомненно, благоприятствовало значительно большее число морфологиче- ских признаков и большее разнообразие биологических особен- ностей, в частности размножения и образования покоящихся (переживающих) форм, чем у бактерий. В лучшем положении, чем другие бактерии, находятся также и высшие формы акти- номицетов, имеющие мицелий и специализированные органы спороношения. Морфологические признаки для построения фи- логенетической систематики, несомненно, более надежны, чем некоторые физиологические и многие биохимические. Искусственные классификации бактерий проще и задачи их менее сложны. Они создавались с целью ускоренной каталоги- зации микробов и ускоренного распознавания или идентифика- ции практически важных полезных или вредных организмов. Искусственная, или номенклатурная, классификация положена и в основу систематики бактерий, использованной в большин- стве определителей бактерий, в том числе и в изданных в СССР: Л. М. Горовиц-Власовой [69], В. Д. Штибена и И. К. Бабич [273], Цион [265] и Берги [18]. Из них для опре- деления бактерий, выделенных из очистных сооружений, от- стойников, лагун, водоемов, сборников промстоков, очиститель- ных прудов, карт на полях орошения и различных водоемов, загрязненных сточными водами, можно рекомендовать лишь определители: Берги [18]—русский перевод 4-го издания; И. А. Красильникова [145] и 7—8-е издания Берги [298, 299]. Классификация бактерий служит постоянно предметом дис- куссий и разногласий. Это обусловлено простотой и однообра- зием строения и развития и недостаточностью опознавательных признаков у прокариотов. Широко используемые в микробио- логической классификации биохимические признаки не ста- бильны в различных естественных условиях существования микробной популяции или в различных искусственных усло- виях поддержания штамма. Эта биохимическая нестабильность особенно часто наблюдается у гетеротрофных бактерий. В основу разделения бактерий на семейства и порядки, т. е. на более крупные таксономические категории, положены мор- 52
фологические признаки, но более низкие систематические еди- ницы— роды и виды — различать по морфологическим призна- кам невозможно. Лишь некоторые роды бактерий имеют на- столько характерную морфологию, что даже при простом микроскопировании можно сказать, к какому порядку, семей- ству и роду принадлежит та или иная чистая культура бакте- рий. Для группировки бактерий в самые низкие таксоны — виды — привлекаются культуральные признаки, т. е. характер роста на плотных агаризованных питательных средах; размеры и формы колоний, блестящая либо тусклая, матовая, гладкая или морщинистая, радиально или концентрически складчатая поверхность; форма края и цвет колонии; степень ее прозрач- ности; рост на средах, уплотненных добавлением желатина. Среды, уплотненные агар-агаром, при культивировании бак- терий не изменяют своей консистенции: лишь очень немногие бактерии заметно разрушают агар-агар. Среды с желатином разжижаются очень многими бактериями с резко выраженны- ми протеолитическими свойствами. Этот признак всегда ис- пользуется для характеристики и определения вида бактерий. Определяется гидролиз крахмала. По характеру роста на жидких питательных средах также судят о некоторых свойствах изучаемой культуры. Образование пленки или кольца на стен- ках пробирки, равномерное помутнение или выпадение хлопье- видных или пылевидных осадков составляют дополнительную характеристику вида. Учитываются максимально физиологиче- ские и биохимические признаки: окислительно-восстановитель- ные функции, в частности редукция метиленовой сини и нитра- тов, образование индола, сероводорода, аммиака, свертывание молока, пептоннзация казеинового сгустка, сбраживание сахаров с образованием кислот и газов либо с образованием только кис- лот. Чем подробнее будет дана характеристика культуры, тем надежнее результаты ее идентификации. Определение вида бактерий остается в микробиологии одной из самых трудных задач. Род бактерий в большинстве случаев четко очерчен, но самый малый таксон — вид — иногда очень трудно различим даже при учете множества биохимических свойств и при самом тщательном изучении и анализе всех осо- бенностей определяемого штамма. Исходным материалом в определении вида бактерий всегда служит штамм—лабора- торная культура, полученная микробиологом из одной колонии, выросшей на агаризованной среде в чашке Петри. В связи с тем что на протяжении последнего десятилетия появились в литературе предложения использовать для клас- сификации бактерий соотношение нуклеотидов в составе ДНК отдельных видов микробов [12—15], следует кратко остановить- ся на этом вопросе. Нуклеотидный состав ДНК в значительной степени зависит от систематического положения организма. В лаборатории Чаргаффа установлена видовая специфичность 53
ДНК, доказано, что Пур — Пир, или =1, а также уста- новлены закономерности нуклеотидных отношений, подтвер- жденные А. С. Белозерским и А. Н. Спириным [12—15]. Они по- казали, что содержание аденина равняется содержанию тимина д (А = Т, у = 1) и что содержание гуанина —содержанию цито- зина (Г = Ц или - = 1)> а также Г + Т = А + Ц, что то же = 1. Для животных характерно А + Т>Г + Ц; такой тип ДНК называется АТ-типом. У бактерий Г + Ц>А + Т, и тогда ДНК называется ГЦ-типом. У актиномицетов ДНК относится к самому высокому ГЦ-типу. Было выяснено, что нуклеотидный состав ДНК настолько типичен для каждого вида бактерий, что при изменчивости бак- терий по типу расщепления на S- и R-варианты, они имеют идентичный состав ДНК. Установлено также, что бактерии, отно- сящиеся к разным систематическим группам, имеют сходный нуклеотидный состав ДНК (кишечная палочка и некоторые ко- ринебактерии 50—52% ГЦ; псевдомонасы и микобактерии 57— 70% ГЦ). Культуры бактерий с одинаковым составом ДНК не обязательно родственны. Существует известная корреляционная связь между нуклеотидным составом и антигенной структурой [12]. Пока не удалось установить связи между составом ДНК и принадлежностью бактерий к грамположительной груп- пе. Близкородственные бактерии патогенного и сапрофитного видов, гемолитические и негемолитические оказались показа- телями специфичности ДНК. В обзорной статье И. Н. Блохиной и Г. Ф. Левановой [24] приведено более 600 таксонов микробов, у которых определя- лось содержание ГЦ. Авторы приводят значительное число ис- следований, в которых определение соотношения нуклеотидов позволило уточнить или изменить систематическое положение отдельных видов бактерий. Резюмируя критический анализ ли- тературы, авторы заключают, что данные о составе ДНК ши- роко и с успехом применяются для выяснения таксономическо- го положения родов и видов бактерий. Работа по изучению нуклеотидного состава бактерий ведет- ся во многих лабораториях и институтах разных стран. Однако накопленных данных пока недостаточно для характеристики всех, даже наиболее крупных систематических единиц — по- рядков и семейств. Неуверенность в результатах видовой иденти- фикации вызвала сомнения в целесообразности определения вида у бактерий. В связи с этим австралийский микробиолог Скермен предложил ограничиться определением бактерий толь- ко до рода и разработал ключ (определитель) для определения рода бактерий [473]. К Пятому всесоюзному съезду Всесоюзно- 54
го микробиологического общества в г. Ереване в 1975 г. был издан русский перевод определителя родов бактерий Скермена вместе с кратким описанием 19 частей 8-го издания определите- ля Берги. Высказывание К. А. Тимирязева, приведенное нами перед разделом «Систематика» в качестве эпиграфа, разумеется, взято не потому, что авторы отрицают реальное существование вида у бактерий. Но часто определение вида сопряжено с большими трудностями, а длительные наблюдения при лабо- раторном культивировании над видами родов Pseudomonas или Bacillus показывают, что проявление изменчивости за счет из- менившихся условий — консистенции или состава среды, влаж- ности, температуры, стационарного или непрерывного культи- вирования, pH и гНг приводит к стушевыванию границ между видами в пределах рода бактерий. Недостатки существующих классификаций приводили часто к тому, что близкородственные бактерии попадали в различные систематические группы, а далеко отстоящие друг от друга сводились в одну группу. В различных определителях одни и те же бактерии относились к разным систематическим груп- пам. Все это стимулировало к поискам новых путей классифи- кации бактерий. Так появилась числовая таксономия. Во вто- рой половине XVIII ст. французский ботаник Адансон впервые высказал мысль о возможности классифицировать животных и растения по совершенно новому принципу. Он предложил все признаки организмов считать равноценными. При этом учиты- вается возможно большее число признаков, не менее 50. Орга- низмы должны группироваться на основе максимального коли- чества совпадающих признаков. При изучении группы организ- мов или большого их числа, как это бывает необходимо в микробиологических исследованиях, числовая или нумерическая таксономия очень трудоемка. Поэтому идея Адансона не только в XVIII, но и в XIX и в первой половине XX ст. не нашла под- держки. Лишь с появлением электронно-вычислительных ма- шин, в 1957 г. числовая таксономия предложена для использо- вания в микробиологии. Отдельный признак каждого штамма сравнивают с отдельным признаком всех других штаммов. По- добие или сходство между штаммами тем больше, чем больше будет отношение всех совпадающих признаков к количеству учтенных. Организмы группируются на основании сходства. Не- которые микробиологи видят преимущества числовой таксо- номии перед другими в том, что равноценность признаков устраняет элемент предвзятости. Некоторые авторы сомневают- ся в том, что можно так подобрать признаки, чтобы они ха- рактеризовали филогенетические связи между таксонами бак- терий. Для обработки большого числа признаков используются электронно-вычислительные машины, как в других случаях статистических исследований. Низшую изучаемую таксономиче- скую единицу называют операционной таксономической едини- 55
цей (ОТЕ). Обычно это штамм. Но ОТЕ может служить и вид или род бактерий. Изучаемая ОТЕ сравнивается со штаммом, имеющим определенные номенклатурные обозначения — «номе- ниферы». Рядом исследователей проведено изучение некоторых микробных таксонов с помощью нумерической, или адансонов- ской систематики. Полученные данные совпадают с данными общепринятых систематик. Из изложенного можно заключить, что нумерическая, или адансоновская, систематика не внесла чего-то нового в система- тику бактерий, что позволило бы ее достоинства поставить выше традиционных систематик. И если сравнивать нумериче- скую систематику с генетической, основанной на изучении ну- клеотидного состава, то приходится признать, что биохимиче- ское изучение нуклеотидного состава формирует новый фун- дамент для систематики бактерий, чего нельзя сказать о нумерической (цифровой) систематике. Однако в настоящее время «...ни нумерические методы, ни химические определения генетической близости организмов не могут быть положены в основу построения системы» (Г. А. Заварзин, [99]). Приводим в очень сокращенном виде классификацию бакте- рий по 8-му изданию определителя Берги. Некоторые система- тические группы вами описаны в начале главы I, им уделяется меньше внимания. Прокариоты разделены на следующие части: Часть 1. Фототрофные прокариоты. Синезеленые водоросли или цианофицеи (их строение подробно описано на с. 39—43). Раньше эти организмы рассматривались только в ру- ководствах по альгологии, сейчас некоторые исследователи от- носят их к бактериям. Систематика их, как мы уже указывали выше, разработана лучше, чем собственно бактерий (эубакте- рий), и подробно приводится в литературе [68, 93]. Основана она исключительно на морфологических признаках. Синезеленые водоросли объединены в тип Cyanophyta, кото- рый подразделяется на 3 класса: 1) хроококковые (Chroococca- les); 2) хамеснфоновые (Chamasiphoneales); 3) гормогоние- вые (Hormogoneales). Хроококковые включают 5 порядков, 1 подпорядок и 14 семейств, в числе которых такие широко из- вестные, как Mycrocystidaceae и Gloeocapsaceae. Представители класса Chroococcales — это одноклеточные и колониальные фор- мы, не образующие эндоспор, экзоспор и гетероцист. Класс Chamaesiphonales делится на 4 порядка и 5 семейств. К нему относят одноклеточные и колониальные прикрепленные к субстрату синезеленые водоросли. Хамеснфоновые размно- жаются при помощи эндоспор и экзоспор. Они не образуют гетероцист, плазмодесм, гормогониев и влагалищ. Нити в слое- вищах могут срастаться и образовывать ложную паренхиму. У одноклеточных различаются основание и вершина. Класс Hormogoneales объединяет 6 порядков, I подпорядок и 31 семейство. К гормогониевым относятся широко известные 56
сем. Mastigocladaceae, Oscillatoriaceae, Nostocaceae, Anabena- ceae, Rivulariaceae. Это наиболее высоко организованные фор- мы Cyanophyta. Организмы многоклеточные, нитевидные. Клет- ки в нитях соединены плазмодесмами. Размножаются главным образом с помощью гормогониев, некоторые — посредством спор. Отдельные представители образуют гетероцисты. Высокая приспособляемость синезеленых водорослей к усло- виям окружающей среды обусловливает их широчайшее рас- пространение в природе. Развиваясь в водоемах зачастую в огромных количествах («цветение» воды) эти организмы причи- няют значительный ущерб народному хозяйству, ухудшают качество воды. Изменение вкуса и запаха воды при развитии синезеленых водорослей связано с выделением ряда специфи- ческих летучих веществ, таких как пзопропилмеркаптаи, ди- метилсульфид и др. Именно диметилсульфид, а не амины, как считалось ранее, придают воде неприятный рыбный запах [70]. Синезеленые водоросли образуют ряд высокотоксичных для теплокровных соединении, вызывая массовые отравления сель- скохозяйственных животных при водопое и водоплавающих птиц [71]. Токсины действуют губительно также на рыб и дру- гих гидробионтов. Кроме прямого воздействия, наблюдается их угнетение и даже гибель в связи со значительным понижением концентрации растворенного кислорода за счет процессов рас- пада и окисления продуктов разложения водорослевых клеток. Фототрофные бактерии. Порядок Rhodospiri 11 ales. Клетки со- держат бактериохлорофилл и каротиноиды. Сюда относится сем. Rhodospirillaceae. Клетки способны расти с серой или суль- фидом в качестве единственных доноров электронов при фото- синтезе. Род Rhodospirillum имеет спиралевидные клетки; род Rhodopseudomonas — клетки овальные, сферические пли па- лочковидные. Сем. Chromatiaceae. Клетки содержат бактериохлорофилл и различные каротиноиды. Капли серы откладываются внутри клеток. У рода Thiocystis клетки от овальных до палочковид- ных с полярными жгутиками. Род Thiosarsina имеет вид сфе- рических диплококков. Род Thiosarsina представляет округлые клетки, сгруппированные в пакеты. Thiospirillem имеет спи- риллообразные клетки. Сем. Chlorobiaceae — зеленые фотобактерии. Имеют свобод- ноживущие палочковидные клетки, передвигающиеся посред- ством полярных жгутиков — род Chloropseudomonas. Клетки неподвижные, от овальных до палочковидных или вибрионо- видных— род Chlorobium. Клетки от сферических или не- правильных до звездообразных, покрытых выростами, просте- ками,— род Prosthecochloris. Все представители этого порядка встречаются в различных водоемах. Часть 2. Скользящие бактерии. Эта часть содержит два порядка: 1) миксобактерии — Myxobacteriales способны к 57
образованию плодовых тел; 2) Cytophagales — плодовых тел не образуют. Миксобактерии. Играют большую роль в деструкции труд- иоразрушаемых органических веществ, таких как целлюлоза. Клетки миксобактерии по форме бывают палочковидные, вере- тенообразные, эллипсоидальные или шаровидные. Причем в пределах одного вида встречаются все эти формы клеток на разных стадиях развития. Примером может служить целлюло- зоразрушающая бажтерия Myxococcus Hutchinsoni, у которой в молодой культуре вегетативные клетки удлиненные с заост- ренными концами, часто имеют S-образную форму. Со време- нем эта форма клеток изменяется в палочковидную. Палочки уже не имеют заостренных концов, у них концы округлые. По- степенно палочки укорачиваются, уплотняются, превращаясь в шарообразные формы, которые называются цистами. У Myxo- coccus Hutchinsoni цисты одноклеточные, но у других миксо- бактерий встречаются цисты, состоящие из нескольких вегета- тивных клеток. Цисты миксобактерий объединяются в довольно крупные «плодовые тела» овальной или грушевидной формы; иногда они приобретают настолько причудливую форму, что напоминают скорее маленькое растение, чем бактерию. Однако встречаются и такие миксобактерии, которые не образуют пло- довых тел. Их принадлежность к миксобактериям устанавли- вается по другим признакам. Характерные признаки миксобактерий: клетки не имеют плотной оболочки, присущей преобладающе- му большинству бактерий, оболочка эластичная, не ригидная, бла- годаря чему форма клеток меняется при движении (отсутствие ригидной оболочки подтверждается тем, что при погружении в ги- пертонические растворы клетки не плазмолизируются, наблю- дается сокращение объема всей клетки — плазморриз [112]); подвижны, однако отсутствуют органы движения — жгутики; имеют ясно видимые при окраске нуклеоиды, напоминаю- щие у некоторых родов морфологически обособленное ядро эукариотов; плазма однородна, эндоспор не образуют, вся клетка при образовании цист может рассматриваться как спора. Часть 3. Хламидобактерии. Порядок Chlamydobacte- riales. Нитчатые бактерии пресноводных водоемов изучены лучше, чем соленых, среди них есть свободно плавающие и при- крепленные к субстратам, подвижные и неподвижные. У по- движных жгутики полярные. Размеры нитчатых бактерий труд- но установить, так как нити при самом малом увеличении не помещаются по длине в поле зрения микроскопа. Во всяком случае, длина некоторых видов нитчатых бактерий измеряется миллиметрами и даже сантиметрами, т. е. составляет несколь- ко тысяч микрометров при толщине нити от 1,5 до 9,0 мкм. Нити многоклеточны. Размножаются путем распада на отдель- 58
ные клетки или путем образования на концах нитей многочис- ленных гонидий, мелких репродуктивных телец, которые, рас- пространяясь в воде, дают начало новым организмам. У неко- торых видов нитчатых бактерий гонидии имеют жгутики, с помощью которых они интенсивно передвигаются. Одни виды этих бактерий питаются готовыми органическими веществами — гетеротрофы, другие (железобактерии) способны самостоятельно строить органические соединения из углерода углекислоты за счет использования энергии окисления неорга- нических веществ (железо) — автотрофы (хемоавтотрофы). Примером нитчатых бактерий может служить железобакте- рия Leptothrix oehraceae (см. рис. 4). Нити толстые, 2—9 мкм в диаметре, длина достигает нескольких миллиметров, непо- движно прикрепленные. Размножаются неподвижными кони- диями или отдельными клетками. Нити окружены толстой сли- зистой капсулой, насыщенной гидроокисью железа, благодаря чему нити в нижней части имеют желто-охряный цвет или цвет ржавого железа. Иногда отдельные клетки нити как бы со- скальзывают в сторону от главной нити, образуя подобие боко- вых ветвей, однако это псевдоветвление. Нитчатые бактерии Sphaerotilus играют отрицательную роль в очистке сточных вод при обильном развитии в аэротенках. Часть 4. П о ч к у ю щ и е с я и стебельковые бакте- рии. При делении образуются неэквивалентные части. Одна группа родов имеет простеки (выросты), другая их не имеет. Простеки могут выполнять репродуктивную функцию, образуя почки (роды Hyphomierobium, Pedomicrobium). У родов Caulo- bacter, Prosthecomicrobium простеки такой функции не выпол- няют. Почки могут образовываться и на клетке, и на стебельке (простеке). Обитают в почве и в воде. В очистке вод, по-внди- мому, не участвуют. Часть 5. Спирохеты. Порядок Spirochaetales. Спирохеты напоминают спираль с небольшим (см. рис. 6, а) диаметром оборотов. Некоторые роды (см. рис. 6, а) характеризуются боль- шим числом мелких завитков, другие формы — крупными оборо- тами всей клетки, идущими как бы вокруг более плотной осевой нити (см. рис. 6, б). Название бактерий этого порядка происхо- дит от латинских корней spira — изгиб и chaete — грива. Подобно тому как термин «бактерия», помимо обозначения рода бакте- рий, т. е. бесспоровых палочек, применяется для обозначения бактерий как микроорганизмов вообще, так и термин «спирохе- та» применяется к определенному роду спирохет и в более ши- роком понимании —для обозначения всего порядка бактерий, ха- рактеризующихся длинным телом, состоящим из множества спи- ральных завитков, способных сокращаться и изгибаться. Спирохеты имеют черты сходства с бактериями и про- стейшими. Размеры спирохет варьируют в широких пределах — от нескольких до 500 мкм, при толщине 0,25—1,5 мкм. Содержи- 59
мое клеток однородно, они не имеют отчетливо видимого ядра. Оболочки, типичной для бактерий, у спирохет нет. Если она есть, то чрезвычайно тонка, эластична и гибка, подобно оболоч- кам животных клеток; она скорее приближается к цитоплазмати- ческим мембранам бактерий, чем к клеточным стенкам. Поэтому ее именуют перипластом. У многих спирохет оболочка не окра- шивается. Сами спирохеты вообще окрашиваются плохо при употреблении обычных анилиновых красок, используемых для бактерий. Их можно окрасить по методу, применяемому для окрашивания мазков крови (по Романовскому—Гимза), или наблюдать по методу негативного окрашивания в черной туши (белые спирохеты видны па темном фоне). Спирохеты не образуют спор. Наличие органов движений — жгутиков не выяснено, так как для передвижения они не нужны вследствие гибкости и сокращаемости клеток. Характерной чер- той спирохет является наличие осевой эластичной нити, проходя- щей вдоль клетки и выполняющей скелетную функцию. Во- круг осевой нити спирально завивается цитоплазма, образуя первичные завитки. В клетках спирохет путем электронной мик- роскопии выявлены фибриллярные структуры. Клетка как бы содержит тонкие нити фибрилл, сплетенных в пучки. У сапро- фитного рода Cristispira по поверхности клетки тянется килевид- ная мембрана, называемая кристой. Эта криста тоже имеет фибриллярную структуру. Итак, какие же признаки сближают спирохеты с бактериями и какие с Protozoa? У спирохет нет морфологически обособлен- ного ряда, они одноклеточные, не ветвятся, половой процесс отсутствует. Этим они сходны с бактериями. У спирохет нет жесткой клеточной оболочки, они способны активно сокращать свое тело, патогенные спирохеты вызывают инфекции, протекаю- щие циклично (возвратный тиф), спирохеты чувствительны к тем же химиотерапевтическим веществам, что и простейшие; болезни, вызываемые некоторыми Protozoa (малярия, сонная болезнь) протекают тоже циклично. Все это признаки, сближаю- щие спирохеты с Protozoa. Часть 6. Спиральные и изогнутые бактерии. Сем. Spirillaceae. Клетки 0,25—1,2 мкм ширины, до 2,6 мкм длины. Обычно биполярные лофотрихи, т. е. жгутики на обоих полюсах. К этому семейству относятся роды: Spirillum, Campy- lobacter и роды неясного систематического положения: Bdello- vibrio, Microcyclus и Pelosigma. Спиралевидные или извитые формы бактерий весьма много- образны, они отличаются по длине, толщине, числу завитков, диаметру завитков, наконец, по волнообразному и штопорооб- разному движению в жидкой среде. В зависимости от формы клетки различают вибрионы и спириллы. Вибрионами называются бактерии, тело которых не превышает 1/г обо* рота спирали (от латинского — vibrare — трепетать). К вибрио- 60
нам относится Vibrio desulfuricans, культуры которого ьисиа- навливают сульфаты с образованием черного осадка сернистого железа в жидких средах и вызывают почернение агаризованных питательных сред вокруг колоний на чашках Петри. Этот виб- рион выделяется из воды рек, озер, болот и морей, встречается в грязях лиманов, в торфах, почвах, сапропелях и на рисовых полях. Это типичный водный организм. Возбудитель азиатской холеры — Vibrio cholerae — тоже водный организм. Во время эпидемий холеры холерный вибрион выделяется из рек и экс- крементов больных холерой. Если клетка бактерии имеет один полный оборот спирали пли несколько оборотов, она называется спириллой. Примером может служить спирилла, постоянно обитающая в воде, Spiril- lum volutans—крупная бактерия 1,5—2 мкм толщиной при длине 30—70 мкм. Спириллы и вибрионы объединяются в сем. Spirillaceae. Одним из наиболее интересных, недавно открытых микроор- ганизмов является вибрион, ведущий хищнический паразитиче- ский! образ жизни Bdellovibrio bacteriovorus (Stolp et Petzold) (см. pric. 6). Бактерия открыта в 1962 г. [221] в опытах по выявлению бактериофагов, возбудителей бактериозов растений, и подробно описана Штольпом в обзорной статье (цит. по [221]). Название бактерии происходит от греческого слова bdello — пьявка и латинского voro — пожирать. Bdellovibrio bacteriovorus в переводе — вибрион-пьявка, пожиратель бакте- рий. Форма клетки — типичный вибрион, подобный изображен- ному на рис. 6, но меньше размером. Длина его 1 мкм, ширина 0,3 мкм, на полюсе один толстый жгутик, шириной 28 нм и по длине многократно превышающий длину клетки. Мощный жгутик обусловливает большую подвижность вибриона-паразита. Он относится к совершенно новому типу бактерий с паразити- ческим, хищническим образом жизни подобно бактериофагу, вирусу бактерий. Но по природе ядерного вещества, химическо- му составу клеючной оболочки, строению жгутика и другим признакам является бактерией. По способу питания Bdellovibrio облигатный паразит, на питательных средах в отсутствие живых бактерий не растет, он развивается только внутри клеток бакте- рий-хозяев, т. е. поражаемых им бактерий. Если чувствительные к вибриону бактерии поместить в жид- кую среду вместе с бделловибрио, то через несколько секунд хищник их атакует, наносит удар в стенку бактериальной клет- ки, и после этого быстро вращается вокруг своей продольной оси при помощи жгутика; в результате этого сверлящего враще- ния проникает внутрь клетки и вызывает лизис ее содержимого. Внутри клеток пораженных бактерий вибрионы размножаются и после их литического распада выходят в среду и начинают новую атаку при наличии клеток хозяина. Вибрион-хищник мо- жет быть отделен от клеток бактерии-хозяина путем фильтрации 61
через фарфоровые свечи (Пастера — Шамберлана) с величиной пор 0,2—0,45 мкм. Посевы фильтрата — чистой культуры Bdel- lovibrio на плотные среды в чашки Петри вместе с бактерией- хозяином дает рост паразита на газоне бактерий в виде прозрач- ных пятен лизиса. Посевы в жидкую среду, где уже размно- жались бактерии-хозяева, дает просветление жидкой среды в результате полной гибели клеток хозяина. У паразита-хищника нет узкой специализации: штамм вибриона, поражающий один из видов кишечной группы бактерий, может поражать и другие виды энтеробактерий или легко к ним адаптируется. Чувстви- тельными к вибриону-хищнику оказались фитопатогенные Pseu- domonas и Xanthomonas, представители родов Salmonella, Аего- bacter, Proteus, Serratia, Escherichia и Erwinia. Выделенные и изученные штаммы Bdellovibrio различаются по спектру хозяев и бактериологической активности: некоторые действуют только на определенные штаммы одного вида, иные — на виды одного рода; большинство штаммов охватывает широкий спектр хозяев. К настоящему времени многочисленные исследования пока- зали повсеместное распространение вибриона-паразита в прес- ных и соленых водоемах, в почве, и особенно в сточных водах; он оказался интегральным компонентом природной микрофлоры ряда европейских стран, Южной и Средней Америки, Африки, Австралии, Японии, Индии и Цейлона. Если заражение бакте- риальной культуры вести большим числом клеток вибриона-па- разита, эквивалентным числу клеток хозяина, то лизис наступает быстро — через несколько часов он может быть завершен. Учи- тывая, что Bdellovibrio консервируется лиофилизацией и под- дается адаптивной изменчивости, можно предполагать возмож- ность использования этого агента при микробной очистке про- мышленных сточных вод в качестве средства освобождения от бактериальных клеток производственной культуры путем их ли- зиса. Это лишь возможный перспективный путь исследований для практического использования хищника, паразита бактерий. Часть 7. Грамотрицательные аэробные палоч- ки и кокки. Сем. Pseudomonadaceae. Род Pseudomonas — играет важную роль в природе и в очистке воды. У бактерий клетки чаще палочковидные, реже кокковидные или изогнутые; чаще одиночные. Оболочки не эластичны, ригидны, вследствие чего форма клетки постоянная. Морфологически обособленных ядер нет, но есть нуклеоиды. Клетки неветвящиеся, подвиж- ные, движение осуществляется посредством жгутиков. Большей частью монотрихи. Грамотрицательные, бесспоровые. Размно- жаются клетки простым делением пополам. Часто наблюдается гетероморфное деление с образованием неравновеликих клеток, реже размножение идет перешнуровыванием или почкованием. При почковании или в результате лизиса возможно образование субмпкроскопических гранул, проходящих сквозь бактериальные фильтры (образование фильтрующейся стадии клеточных бак- 62
терпй). По физиологическим и биологическим признакам бакте- рии очень разнообразны. Есть среди них с автотрофным типом питания, но большинство гетеротрофы. Преобладающее боль- шинство— сапрофиты, однако есть симбиотрофы (Rhizobium). Е природе они широко распространены. В водоемах и очистных сооружениях эубактерий составляют преобладающую массу микроорганизмов. Практическое значение для разрушения синтетических соеди- нений в очистных сооружениях имеют представители сем. Pseu- domonadaceae. Что касается видового состава биохимически высокоактивных бактерий — деструктов синтетических соедине- ний, то в литературе, проанализированной в этой книге, а так- же имеющейся в нашем распоряжении, первое место по частоте встречаемости, числу видов и количеству разрушаемых соеди- нений занимают виды рода Pseudomonas. Они способны вызывать трансформации хлорорганических пестицидов и дегалогениро- вать другие галогенорганические соединения. Бактерии рода Pseudomonas способны восстанавливать нитрогруппу нитроаро- матических соединений, используя их в качестве источника угле- рода и азота. По данным Р. П. Наумовой [189], Pseudomonas dacunhea может использовать капролактам в качестве един- ственного источника углерода и азота. Несколько видов рода Pseudomonas способны разрушать серусодержащие соединения, в частности ПАВ — алкилсульфаты и алкилсульфонаты. По дан- ным Ц. И. Роговской [218], в деструкции органических соеди- нений участвуют: Ps. sinuosa, Ps. caudatus, Ps. coadunata, Ps. li- quida— при разрушении винилацетата; Ps. liquefaciens — при очистке сточных вод производства триметилолпропана (этрио- ла); Ps. mycofaga — в сточных водах, содержащих ацетальде- гид; Ps. radiatus — в сточных водах, содержащих ацетат каль- ция, формальдегид, масляный альдегид, метиловый и бутиловый спирты; Ps. oleovorans — в сточных водах, образующихся при синтезе жирных кислот. Имеются данные о разрушении полиакрилата культурой Pseudomonas aeruginosa, выделенной с зубного протеза. Эта культура была способна использовать синтетический полиакри- лат в качестве единственного источника углерода. Чтобы составить полное представление о широчайших фер- ментативных возможностях в области деструкции органических соединений представителями рода Pseudomonas, нельзя не упо- мянуть хотя бы кратко некоторые классы природных органиче- ских соединений, непригодных для использования животным и растительным миром. Некоторые из этих природных соединений даже могут служить антисептиками или дезинфектантами для болезнетворных микроорганизмов. Так, штамм Pseudomonas pu- tida, выращенный на среде с толуолом в качестве единственного источника углерода, окислял бензол, толуол и этилбензол. Е. И. Квасников и соавт. [130, 252] из почв западноукраинских 63
нефтяных промыслов выделили несколько культур рода Pseudo- monas, активно окисляющих нафталин. Нафталинокисляющие Pseudomonas centrifugans и Ps. boreopolis выделены из подзем- ных вод нефтегазоносных районов Урала и Поволжья, Северно- го Предкавказья, Грузии, Литвы и Украины. Л. Д. Штурм [274] приводит данные об окислении метана Ps. fluorescens и усвоении гептана шестью видами Pseudomonas, нафтенов — Ps. aeruginosa. Есть данные о разрушении псевдомонадами каучу- ка, резины и смазочных масел [25]. Из сказанного видно, что на земле, по-видимому, нет орга- нических соединений (синтетических и природных), не разла- гаемых каким-либо из видов бактерий рода Pseudomonas. К части 7-й отнесены сем. Azotobacteriaceae, Rhizobiaceae, Methylomonadaceae, Halobacteriaceae и роды неясного система- тического положения Alcaligenes, Acetobacter и Brucella. Часть 8. Грам отрицательные, факультативно анаэробные бактерии, включающие Enterobacteriaceae и Vibrionaceae. Часть 9. Грамотрицательные анаэробные бак- терии— сем. Bacteroidaceae и роды с неясным систематиче- ским положением — Desulfovibrio, Butyrivibrio и др. Часть 10. Грамотрицательные кокки и кокко- бациллы. Сюда относят еемейство патогенных кокков Neis- seriaceae. Часть 11. Грамотрицательные анаэробные кокки. Роды. Veillonella, Acidaminococcus, Megaspliera. Часть 12. Грамотрицательные хемолитотроф- ные бактерии, включающие сем. Nitrobacteriaceae, Sidero- capsaceae и организмы, вовлекающие в обмен серу и ее соедине- ния (род Thiobacillus и др.). Часть 13. Метанообразующие бактерии — сем. Methanobacteriaceae. Роды: Methanobacterium, Methanosarcina, Methanococcus. Часть 14. Грамположительные кокки — сем. Mic- гососсасеае, Streptococcacea, Peptococcaceae. Многие представи- тели патогенны. Часть 15. Палочки и кокки, образующие эндо- споры — сем. Bacillaceae. Описаны выше. Часть 16. Грамположительные аспорогенные палочковидные бактерии, к которым относятся молоч- нокислые бактерии — сем. Lactobacillaceae и несколько родов неопределенного систематического положения. Систематика, эко- логия и биология молочнокислых бактерий в Советском Союзе детально разработана Е. И. Квасниковым и О. А. Нестеренко [128]. Часть 17. Актиномицеты и родственные орга- низмы. Эта группа включает коринебактерии с родами Согу- nebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Cel- 64
lulomonas, Kurthia сем. Propionibacteriaceae, а также порядок Actinomycetales c 8 семействами. Часть 18. Риккетсии — патогенные организмы, строгие внутриклеточные паразиты, возбудители инфекционных заболе- ваний. Часть 19. Микоплазмы. Класс Mollicutes. Порядок My- coplasmatales. Порядок состоит из двух семейств: Mycoplasma- taceae и Acholeplasmataceae. Представители сем. Mycoplasmata- сеае требуют для роста наличия стеринов в среде. Семейство содержит один род Mycoplasma, насчитывающий 36 видов. Все виды паразитируют в организме животных либо человека. Вто- рое семейство порядка Mycoplasmatales — Acholeplsmataceae — содержит также один род Acholeplasma; все виды этого рода не требуют для своего роста наличия в среде стеринов и являются сапрофитными представителями микоплазм. Болезнетворные ми- коплазмы изучаются с 1898 г. и о них накоплен огромный лите- ратурный материал. В монографии В. Д. Тимакова, Г. Я- Каган [250] собрано более 1000 литературных источников о патоген- ных микоплазмах. Литература по сапрофитным микоплазмам (около 100 источников) обобщена в монографии В. В. Балашо- вой «Микоплазмы и железобактерии» [8]. Микоплазмы представляют собой полиморфные микроорга- низмы, прокариоты, отличающиеся от всех описанных выше бактерий отсутствием клеточной стенки и большим разнообра- зием форм: в пределах не только одного вида, но и одного штамма встречаются одновременно шарообразные, эллипсовид- ные, дискообразные, чашевидные, булавовидные искривленные, нитевидные длинные до нескольких (2—5) мкм при толщине 150—200 нм (рис. 22). Тонкие нитевидные структуры могут образовывать формы ветвления. Наиболее крупные шарообраз- ные формы достигают 10 мкм. Мельчайшие формы микоплазм получили название «элементарных телец», размеры которых 125—220 нм, т. е. близки к размерам крупных вирусов. Для сравнения укажем, что палочкообразный вирус табачной мозаи- ки имеет длину 350 нм [236], длина бактериофага молочнокислого стрептококка (Streptococcus lactis) 630—690 нм [241], Х-виру- са картофеля—1500—4290 нм. Вирус чумы рогатого скота 300—750 нм [241]. Из этого видно, что «элементарные тельца» микоплазм'по размерам намного меньше перечисленных ви- русов. Жизнеспособность «элементарных телец» микоплазм до- казана. Поэтому и считается, что микоплазмы относятся к мель- чайшим свободноживущим микроорганизмам. Микоплазмы не нуждаются в культивировании на живых клетках микроорганиз- мов подобно вирусам. Отсутствие клеточной оболочки делает их нечувствительными к пенициллину, подавляющему, как известно, синтез клеточных оболочек у бактерий. Изучение морфологии и цитологии этих бактерий показало, что их протопласт покрыт трехслойной мембраной, различимой 5 8—616 65
Рис. 22. Полиморфный рост Acholeplasma laidlawii (по [8]): а — округлые тела различного диаметра, связанные плазма- тическими нитями; 6—дихотомическое ветвление нити,- д г — округлые тела с отходящими нитями; д, е — срезы ахо- леплазмы. ЦМ. — цитоплазматическая мембрана; округлое тело и отходящая от него нить имеют общую ЦМ. под электронным микроскопом; они неподвижны, грамотрица- тельны. Микоплазмы требовательны к составу и свойствам питательных сред. Растут лишь на изотонических средах, содер- жащих сыворотку крови. На поверхности плотных сред образуют колонии, напоминающие яичницу-глазунью. Сыворотка крови человека, богатая холестерином, обеспечивает наиболее интен- сивный рост колоний микоплазм. В возрасте 3—5 дней колонии микоплазм иногда достигают 1,5—2 мм в диаметре, но чаще они неразличимы невооруженным глазом. Добавление в бульон ненасыщенных жирных кислот (олеиновой, линолевой) способ- ствует росту длинных ветвистых форм. Внеклеточный рост микоплазм на питательных средах слу- жит принципиальным отличием их от вирусов. Клетки мико- плазм сохраняют форму благодаря окутывающим протопласт 66
мембранам, легко разрушаемым при обработке ультразвуком. При этом наступает дезинтеграция клеток, и мембраны могут быть отделены от них центрифугированием. Оказалось, что мем- браны паразитических микоплазм богаты холестерином [250]. Из сыворотки млекопитающих, добавляемой в питательные сре- ды, микоплазмы используют также белки, фосфолипиды и вы- сокомолекулярные жирные кислоты. Микоплазмы содержат от 31 до 59% белков и около 10% галактана. В составе микоплазм обнаружено 17 аминокислот (в это число не входит диамино- пимелиновая). Это объясняется тем, что диаминопимелиновая кислота является компонентом клеточной стенки, отсутствую- щей у микоплазм. Отсутствие оболочек и служит причиной по- лиморфизма микоплазм, свойственного патогенным и сапрофит- ным представителям порядка Mycoplasmatales. Микоплазмы имеют фильтрующиеся формы, проходящие подобно вирусам че- рез бактериальные фильтры. Размножаются микоплазмы почко- ванием, образованием мицелиальных форм, в которых формиру- ются сферические тельца, в дальнейшем освобождающиеся при распаде нитей и дающие начало новым нитевидным структурам. От образования мицелиеиодобных нитей и происходит название «микоплазма» — мицелиеподобная плазма. В. Д. Тимаков и Г. Я. Каган [250] классифицировали мико- плазмы в зависимости от локализации патологических процес- сов на такие группы: 1) возбудители респираторных заболева- ний человека, животных и птиц; 2) выделяемые при заболева- ниях мочеполового тракта человека и животных; 3) связанные с заболеваниями суставов и сердца человека, животных и птиц. Были выделены еще три группы патогенных микоплазм и 7-я группа — условные комменсалы человека, животных и птиц, а также сапрофитные микоплазмы почв и сточных вод. Назовем виды лишь некоторых микоплазм. Mycoplasma ho- minis 1 — возбудитель заболевания верхних дыхательных путей, ангин и фарингитов человека. Mycoplasma hominis 2 вызывает ревматоидные артриты. Mycoplasma pneumonic — возбудитель атипичных пневмоний и бронхитов человека. Mycoplasma my- coides вызывает плевропневмонию рогатого скота. Mycoplasma gallisepticum — возбудитель респираторного заболевания кур и индеек. Микоплазма-инфекции распространяются контагиозно. В 1936 г. выделена из сточных вод Лондона первая са- профитная микоплазма, не нуждающаяся в стеринах. Она на- звана по имени исследователя, получившего культуру на обога- щенном МПБ, Acholeplasma laidlavii. Установлено также, что микоплазмы причастны к 70 различным заболеваниям растений. Иначе говоря, установлено, что существуют фитопатогенные микоплазмы. При этом обнаружена спиралевидной формы мико- плазма [228], названная Spiroplasma. К сапрофитным микоплаз- мам причисляют [8] железобактерии (Gallionella) и окисляю- щие марганец бактерии (Metallogenium). В. В. Балашова и 5 * 67
Г. А. Заварзин [8,98] показали, что музейный штамм сапрофит- ной микоплазмы — Acholeplasma laidlavii— способен достаточ- но энергично окислять железо при условиях культивирования, принятых для железобактерий. Роль сапрофитных микоплазм в сточных водах пока не выяснена. СТРОЕНИЕ, РАЗМНОЖЕНИЕ И СИСТЕМАТИКА ГРИБОВ, ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И ПРОСТЕЙШИХ В процессах очистки воды от загрязнений наряду с бактериями (прокариоты) принимают участие эукариотные организмы — грибы, водоросли и простейшие животные. Зачастую это участие бывает непрямым и выражается в потреблении продуктов жизне- деятельности бактерий или поедании самих бактериальных кле- ток. Тем не менее грибы и водоросли в изобилии развиваются в биофильтрах, водоросли — в окислительных прудах, а прото- зоа — во всех типах очистных сооружений. Все это побудило нас при описании организмов, играющих роль в очистке воды, оста- новиться также на этих представителях эукариотов. Грибы (Mycota). По строению и биологии размножения грибы разделяют на слизистые грибы — миксомицеты (Мухоту- cota) и настоящие грибы (Eumycota). Миксомицеты нами в этой книге не рассматриваются, так как они не встречаются в очист- ных сооружениях и никаких данных о разрушении этими гри- бами органических соединений при очистке воды в литературе не обнаружено. По внешним признакам они не похожи на истин- ные грибы. Их вегетативное тело — многоядерный плазмодий — имеет вид голой плазмы. У истинных грибов (Eumycota) вегетативное тело (таллом) представляет собой скопление множества нитей или гиф, часто сильно разветвленных и переплетенных, именуемых мицелием. Мицелий бывает бесцветным или пигментированным в различ- ные цвета, чаще зеленоватых или сине-зеленых тонов, что хоро- шо видно при росте грибов на поверхности плотных питатель- ных сред, где они образуют колонии или довольно прочные дер- новинки. Мицелий в колониях и дерновинках бывает воздушный и субстратный. У грибов нет фотосинтетических пигментов. По типу питания они гетеротрофы. Поглощение питательных ве- ществ возможно лишь из растворов (осмотрофия). Мицелиаль- ные грибы для роста и развития требуют аэробных условий; энергию они добывают в окислительных реакциях, используя для этого органические соединения. Грибы все без исключения принадлежат к растительному миру. Наука о грибах — мико- логия—представляет собой часть (отдельную главу) ботаники. Число известных видов грибов очень велико. По численности грибы превосходят число видов всех вместе взятых растений, 68
кроме покрытосеменных. В грандиозном труде Саккардо «Syllo- ge Fungorum», состоящем из 25 томов, опубликованных с 1882 по 1928 г., собрано описание всех известных к тому времени гри- бов нашей планеты — 74 323 вида. Среди них множество видов ведет паразитический образ жизни (фитопатогенные и зоопато- генные, в частности, энтомопатогенные). Многие грибы съедоб- ны, однако существуют токсинообразующие, продуценты орга- нических кислот, антибиотиков и других биологически активных веществ. Их описание можно найти в курсах общей микологии, в руководствах по фитопатологии, медицинской микологии и в специальных монографиях по технической микологии, антибио- тикам и т. п. Здесь будут кратко изложены сведения лишь о сапрофитных грибах — микромицетах, культивируемых с при- менением микробиологических методов. Некоторые из таких типичных сапрофитных микромицетов выделяются из очистных сооружений, особенно из биофильтров. Нередко эти грибы из- вестны как плесневые грибы, портящие пищевые продукты и некоторые промышленные товары (ткани, кожевенные изделия), или как продуценты органических кислот и биологически актив- ных веществ. Все они способны потреблять органические соеди- нения растительного и животного происхождения. Строение мицелия. Гифы грибов могут быть одноклеточны- ми, несептированными (большинство низших грибов) или много- клеточными, разделенными на клетки поперечными перегород- ками (септами), имеющими в центре пору, через которую цитоплазма соседних клеток сообщается (ценоцитоз). Многокле- точный (септированный) мицелий имеют все высшие грибы. Гифа представляет собой трубчатую нить, диаметр которой за- висит от вида гриба и условий культивирования; он колеблется от 3 до 10—12 мкм. Клетки грибов (гифы) покрыты оболочкой, по составу отли- чающейся от бактериальных и растительных оболочек; компо- нентами грибных оболочек являются полисахариды и хитин. Принадлежность к определенному классу по В. И. Билай [21] до некоторой степени предопределяет химический состав клеточ- ных оболочек. Так, в классе фикомицетов (подкласс зигоми- цетов) у многих видов оболочка состоит из целлюлозно-хити- нового комплекса; у некоторых видов из классов сумчатых и несовершенных — хитино-глюканового, у дрожжей — маннано- глюканового. Итак, в состав клеточных оболочек грибов входят в качестве основных компонентов: глюканы, хитин, белки и жиры. Хитин — вещество, свойственное животному миру. Из хи- тина состоят жесткие покровы насекомых. Однако в оболочках некоторых грибов содержание хитина достигает 60%. Для гриб- ных оболочек целлюлоза не характерна, но в оболочках, напри- мер фитофторы, она обнаружена. Молодые оболочки гиф бесцветны, с возрастом у некоторых видов пигментируются в различные цвета: зеленый, синий, желтый, оранжевый, красный, 69
коричневый. Некоторые компоненты оболочек располагаются так, что образуют фибриллы. Оболочки бывают двухслойные и многослойные. Под оболочками расположена цитоплазмати- ческая мембрана (плазмалемма), обусловливающая регуляцию проникновения растворов в клетку или выход метаболитов из клетки. Мембрана состоит из белков (около 38%) и липидов (около 40%). Это обеспечивает ее проницаемость для водо- растворимых и жирорастворимых веществ. Способствует этому локализация ферментов в цитоплазматической мембране. Фер- менты мембраны принимают участие в метаболизме, гидролизе, синтезе, переносе различных веществ, утилизируемых грибной клеткой либо удаляемых в окружающую среду. Содержимое клетки представлено цитоплазмой, имеющей од- но или несколько ядер, вакуоли, митохондрии, рибосомы и вклю- чения, состоящие из запасных питательных веществ. У молодых клеток цитоплазма в оптическом микроскопе ка- жется гомогенной. В более старых клетках появляются вакуоли, заполненные клеточным соком. У некоторых грибов имеются пульсирующие вакуоли. Из грибов, встречающихся в очистных сооружениях, такие ритмично сокращающиеся вакуоли есть у сапролегниевых грибов. Нередко в вегетативных гифах или орга- нах спороношения можно наблюдать движение цитоплазмы вместе со всеми органоидами клетки. Наиболее выражено оно у фикомицетов. А. А. Ячевский [277] приводит 8 видов муко- ровых, у которых наблюдалось движение цитоплазмы. В клетках гиф содержится по одному или несколько ядер. У некоторых фикомицетов в клетке спорангиеносца может со- держаться много десятков и даже сотни ядер. Многоядерность наблюдается и в конидиеносцах аскомицетов, у базидиомицетов она менее выражена. Строение ядра у грибов типично для эука- риотов растительных организмов. Размеры ядра 2—3 мкм, у мукоровых мелкие ядра—1 —1,5 мкм, форма округлая. Ядро покрыто оболочкой — нуклеолеммой — и имеет ядрышко и хро- матиновое вещество или хроматиновую нить, распадающуюся на определенной возрастной стадии клетки на присущее каждому роду постоянное число хромосом. Наличие ядерной оболочки у ядер эукариотных микроорганизмов (грибы и водоросли) — отличительный признак структуры их клеток. Нуклеоиды про- кариотных микроорганизмов лишены оболочек, а хроматиновые нити не распадаются на хромосомы. Ядра размножаются либо прямым делением — амитозом, ли- бо косвенным — кариокинетическим путем, иначе митозом. Ми- тотическое деление ядра наблюдается тогда, когда за ним следу- ет деление клетки. Число хромосом у сумчатых грибов 4, у базидиальных 4—8. При митозе (кариокинезе) хромосомы рас- щепляются вдоль, и число их накануне деления клетки удва- ивается. В митозе различают четыре фазы: 1) профазу; 2) мета- фазу; 3) анафазу и 4) телофазу. Описание этих фаз дается во 70
всех руководствах по общей биологии или цитологии, где разби- рается биология растительной или животной клетки, и поэтому здесь опускается. Хромосомы грибов состоят из цепочек ДНК и РНК- В предыдущих разделах строение ДНК и РНК изложе- но при характеристике нуклеоидов у прокариотов. В ДНК и РНК содержится основной генофонд грибной клетки. Однако стремительное развитие молекулярной биологии непрерывно вносит поправки и дополнения к представлениям, которые ка- зались незыблемыми еще несколько лет тому назад. Это осо- бенно относится к молекулярной генетике. Так, в последнее время, как уже упоминалось, у многих микроорганизмов откры- ты носители наследственных признаков, находящиеся за преде- лами нуклеоидов или ядер. Они названы плазмидами. Плазми- ды локализованы в мембранах на периферии клетки либо в мембранных структурах всего протопласта. Митохондриями, или хондриосомами, называются органоиды клетки эукариотов, представляющие собой мембранные внутри- клеточные образования. Форма и размеры их различны — от овальных и грушевидных телец до нитевидных или ветвистых. Наиболее полно митохондрии изучены у дрожжей и дрожже- подобных грибов в работах М. Н. Мейселя с сотр. [175, 176], в которых показано, что они не отличаются от митохондрий выс- ших организмов. По своему назначению митохондрии представ- ляют собой центры сосредоточения ферментов энергетического обмена. М. Н. Мейсель обнаружил [175], что клетки дрожжей при брожении содержат меньшее число митохондрий, которые гипертрофированы (бродильный тип клеток). Аналогичная кар- тина наблюдается и в аэробных условиях при избытке углеводов в среде, особенно сахарозы и глюкозы. Цитологически наблюда- ется бродильная перестройка митохондриального аппарата. Сведения по цитологии грибов связаны в основном с исследо- ванием строения клетки дрожжевых и дрожжеподобных грибов. В дрожжевой клетке обнаружен эндоплазматический ретикулум (ЭР), представляющий собой систему пузырьков или цистерн и канальцев, соединяющихся с нуклеолеммой и цитоплазмати- ческой мембраной. Мембраны эндоплазматического ретикулума обеспечивают продвижение различных веществ по грибной клет- ке, представляют собой активные поверхности для локализации ферментов, а следовательно, и метаболических процессов. Есть предположение об участии ЭР в синтезе липидов и углеводов. Рибосомы — мелкие, в пределах 15—20 нм, тельца, диффуз- но расположенные в цитоплазме. В них содержится около 50% всей РНК дрожжевой клетки. Они представляют собой нуклео- протеид, состоящий из 42% РНК и 50% протеина. Рибосомы являются центрами синтеза белковых веществ клетки. Они от- носятся к мембранным структурам грибной клетки. Из всех мембранных структур наименее устойчивой является аппарат Гольджи. Это мембраны, расположенные в виде пу- 71
зырьков, быстро реагирующих на повреждающие воздействия химических или физических факторов. М. Н. Мейсель и сотр. [176] показали, что в результате облучения дрожжей продукты нарушенного патологического обмена поврежденных клеток уда- ляются экскреторными пузырьками аппарата Гольджи. Все описанные выше клеточные структуры являются органоидами грибных клеток. Рис. 23. Mucor racemosus: «’—разветвленные спорангиеносцы; б — спорангий со столбиком внут- ри; в — столбик; г — хламидоспоры; д — псевдодрожжи. Клетки многих грибов содержат различные включения. Ос- новным запасным веществом является гликоген, который обыч- но в виде мелких гранул равномерно распределяется в цито- плазме грибной клетки. В вакуолях накапливаются полифосфа- ты (метахроматин, волютин). В клетках грибов можно обнару- жить липиды в виде капелек, которые называют липосомами (микросомами, сферосомами). Грибы размножаются вегетативным, т. е. бесполым путем, но у них есть и половое размножение. Бесполое размножение возможно- спорами, почкованием клеток, фрагментацией гиф с образованием оидий или артроспор, а также в результате механического разрыва мицелия. Грибам свойственна высокая регенеративная способность: любой обрывок мицелия в благо- приятных условиях дает рост, превращаясь в организм следую- щего поколения. Половое размножение грибов происходит в результате слияния двух клеток — гамет (плазмогамия), сопро- 72
вождаемого слиянием ядер (кариогамия). Между копуляцией гамет и кариогамией может проходить время, в течение которо- го образовавшаяся дочерняя клетка — зигота представляет со- бой дикарион — клетку с двумя ядрами. При морфологической однородности гамет они именуются изогаметами, а мицелий, на котором они образуются, называется гомоталлическим. Ес- ли же клетки, образующие гаметы — гаметангии, различаются морфологически, то женские гаметы называются оогониями, мужские — антеридиями. Тогда образующий их мицелий назы- вается гетероталлическим. При лабораторном культивировании грибов, с применением микробиологических методов, половое размножение не играет существенной роли. Систематика грибов. В микологии все грибы разделяют по ряду морфолого-биологических признаков на низшие и высшие. К низшим принадлежат два класса: а) архимицеты, не имеющие мицелия и живущие в водной среде, и б) фикомицеты, часть из которых еще ведет водный образ жизни и часть в процессе филогенеза уже перешла к сухопутному существованию. Размно- жаются фикомицеты спорами бесполым и половым путем. При бесполом размножении споры образуются в специальных шаро- образных органах — спорангиях, расположенных на длинных отростках мицелия — спорангиеносцах, имеющих длину от де- сятков до сотен микрон. Каждый спорангий содержит от не- скольких десятков до 300—500 спор. У фикомицетов типичный нитчатый мицелий, однако он не имеет клеточного строения, не септированный. К высшим грибам относят классы сумчатых грибов и бази- диальных. Их вегетативное тело представляет собой хорошо раз- витый нитчатый многоклеточный мицелий, они обладают мор- фологически четко дифференцированными органами размноже- ния. У сумчатых грибов бесполое вегетативное и половое размножение. Названы они так за то, что при половом размно- жении споры образуются в небольших овальной или продолго- ватой формы органах, названных сумками. Сумки заключены в плодовые тела — аскокарпы. Вегетативные споры, или кони- дии, формируются на дифференцированных отростках мице- лия— конидиеносцах (рис. 24). Базидиальные грибы также размножаются половым и бесполым, или вегетативным, путем. В результате полового процесса образуются специальные орга- ны — базидии, каждая из которых несет на себе четыре споры. Отсюда и название — базидиальные. К базидиальным принадлежат грибы, плодовые тела которых общеизвестны как съедобные и ядовитые. Они, как и другие базидиомицеты и архимицеты, не входят в сферу интересов мик- робиологии. Высшие грибы имеют гаплоидную и диплоидную стадии. На- конец, существует большая группа грибов, у которых не выявле- но половое размножение. Они названы несовершенными гриба- 73
Рис. 24. Aspergillus niger: a — конидиеносцы с головками из пузырьков со стеригмами и спорами; б — двухъярусные стеригмы; в — конидиеносцы при большем увеличении; г — споры (конидии). ми, или Fungi imperfects. Эта группа несовершенных грибов тяготеет по всем признакам к высшим грибам. Приводим схему классификации грибов: Класс 1. Archimycetes (архимицеты — примитивные грибы, не имеющие мицелия) Класс 2. Phycomycetes (грибы-водоросли) Класс 3. Ascomycetes (сумчатые грибы) Класс 4. Basidiomycetes базидиальные грибы) Группа Fungi imper- fecti (несовершенные грибы) В очистных сооружениях, особенно на биофильтрах, встре- чаются представители классов Phycomycetes (грибы-водоросли), Ascomycetes (сумчатые) и Fungi imperfecti (несовершенные грибы). Из класса фикомицетов чаще других встречаются гри- бы сем. мукоровых, относящиеся к родам Mucor и Rhizopus. Мицелий этих грибов не септированный, представляет собой как бы одну многоядерную клетку. Органами вегетативного раз- множения служат споры, образующиеся в шарообразных или грушевидных спорангиях. Оболочка зрелых спорангиев всегда пигментирована в коричневый или черный цвет. Для микроско- пического изучения препараты мукоровых грибов необходимо го- товить в молочной кислоте или глицерине, так как в воде оболоч- ки спорангиев растворяются, освобождая споры. Количество спор в одном спорангии непостоянно и колеблется от нескольких штук или десятков до нескольких сот. Спорангии образуются на специальных утолщенных отрост- ках мицелия, именуемых спорангиеносцами или спорангиофора- ми. При толщине вегетативного мицелия около 4—7 мкм тол- щина спорангиеносцев колеблется от 5 до 22 мкм, при этом 74
у мукоров длина их составляет 120—250 мкм, иногда до 1000 мкм, у ризопуса — до 2—4 мм. Спорангиеносцы могут быть прямыми или разветвленными. От вегетативного .мицелия и спорангия спорангиеносец отделен поперечной перегородкой (рис. 26). Размеры спорангиев у разных видов различны: от 27 до 220 мкм. Для рода Rhizopus характерно, что кроме обыч- ных извилистых гиф образуются ровные, толстые гифы, назы- ваемые столонами, длина их достигает 2—3 см. Столоны начи- наются от узлов, где образуются ризоиды — корнеобразные от- ростки, прикрепляющие мицелий к субстрату. От этих же узлов берут начало спорангиеносцы, располагающиеся по три — пять штук расходящимися прутиками. Столоны и спорангиеносцы этого гриба бывают слегка пигментированы в коричневатый тон. Фикомицеты были изолированы из проб биопленки биологи- ческих фильтров, проб отстойников и у выхода воды из очист- ных сооружений г. Харькова (Безлюдовка) [168]. Всего выделе- но 27 видов фикомицетов, среди которых преобладают сапро- легниевые грибы (особенно виды рода Pythium). Pythium deba- ryanum и Phytium monospermum выделялись в течение всего го- да. Автор дает морфолого-систематическое описание фикомице- тов, выделенных из очистных сооружений, но не определяет их роли в деструкции органических веществ. К отдельной группе грибов-микромицетов, встречающихся в биопленках очистных сооружений, относятся роды Aspergillus и Penicillins сем. аспергиллиевых, в одних источниках [162] отнесенного к классу сумчатых грибов (Ascomycetes), в других [21, 205]—к несовершенным грибам (Fungi imperfecti). Эти роды весьма широко распространены в природе и особенно в почвах. Оба рода известны как плесени, повреждающие пище- вые продукты. Размножаются они очень скоро: один индиви- дуум способен образовать много десятков или сотен тысяч спор, каждая из которых может дать начало новой колонии. Грибы при росте на поверхности плотных питательных сред ха- рактеризуются способностью давать колонии, легко сливающие- ся между собой в так называемые дерновинки, покрывающие субстрат сплошной чаще зеленовато-голубоватой, серой или бе- лой бархатистой пленкой. Цвет колоний или дерновинок являет- ся постоянным для каждого вида и служит диагностическим признаком при определении вида. Мицелий у грибов семейства аспергиллиевых многоклеточный, бесцветный, иногда по краю колонии белый, бежевый или желтый, в стареющих культурах буреющий. На поверхности мицелия образуются отростки — конпдиеносцы. Конидиеносцы аспергиллов крупные, несептиро- ванные, длиною от нескольких десятков до 350—800 мкм при толщине от 3—4 до 18—20 мкм. На конце образуется вздутие или пузырек булавовидной или шаровидной формы. На пузырь- ках расположено множество отростков кеглевидной формы — стеригм (рис. 25, а). Стеригмы бывают простые и сложные — 75
двухъярусные (рис. 25, б, в). На верхушке каждой стеригмы образуются споры. Споры в цепочках либо рассыпаются. Раз- меры конидиеносцев, форма пузырька, размеры стеригм и спор имеют диагностическое значение, т. е. служат видовыми при- знаками. Конидиеносцы пенициллов отличаются по размерам и строению от конидиеносцев аспергиллов. Длина их от 70—100 до 300, редко 600 мкм, толщина 3—4, реже 5—6 мкм, они септи- Рис. 25. Penicillijm chrysogenum: а — конидиеносец с метулями и стеригмами; б — метули со стеригмами и спорами; в — конидии (споры); г — клейстокарпий с сумками. рованы, на верхнем конце вздутия нет, но есть метули (рис. 25), на которых расположены стеригмы, несущие споры. Некоторые виды пенициллов, как и аспергиллы, имеют сумчатую стадию. Сумки расположены в аскокарпах, называемых клейстокарпия- ми (рис. 25, г). К аскомицетам относятся также дрожжи, или дрожжевые грибы. Это одноклеточные организмы, размножающиеся вегета- тивно — почкованием (например, сахаромицеты) и делением (шизосахаромицеты) или половым путем с образованием внутри клетки аскоспор. Форма клетки круглая, овальная или палоч- ковидная (рис. 26). Клетки крупные — до 10 мкм. При выра- щивании в жидкой среде дрожжи могут образовывать пленку на поверхности или расти в глубине среды, вызывая в последнем случае брожение углеводов. На твердой среде дрожжи образуют колонии характерной для каждого вида формы, структуры, цве- та и консистенции. Кроме истинных дрожжей, или аскомицетов, есть также ложные или аспорогенные дрожжи, не образующие спор. Дрожжи и дрожжеподобные грибы широко распростране- ны в природе и встречаются в почве, на поверхности растений и насекомых. Следует полагать, что после дальнейшего анализа литера- туры и экспериментальной доработки вопроса определенные 76
Рис. 26. Дрожжи, или дрожжевые грибы (клет- ки, образующие почки). виды, а может быть и штаммы грибов могут быть рекомендованы для обезвре- живания токсических синтетических со- единений. Форма использования грибов, ио-видимому, может быть различной. В очистных сооружениях типа био- фильтров и в прудах могут в изобилии развиваться водоросли. Это, большей частью, зеленые водоросли подкласса Protococcine. Зеленые водоросли (Chloro- phyta) получили свое название благодаря зеленой окраске клеток, которой они обя- заны наличию хлорофилла. Наряду с хло- рофиллом у этих водорослей обнаружены желтые пигменты — каротин и ксантофил. Пигменты находятся в особых тельцах хроматофорах, часто имеющих пиреноиды — более плотные образования, возле которых обычно отклады- ваются запасные вещества. По химическому составу зеленые водоросли близки к высшим растениям. Среднее содержание (в % к сухому весу): углеводов 30—35, азотсодержащих 4— 45, липидов 10, золы и других веществ 10—20. Содержание раз- ных веществ колеблется в зависимости от вида водорослей, усло- вий произрастания, физиологического состояния клеток и других факторов [6]. Зеленые водоросли широко распространены в при- роде и довольно хорошо изучены. Однако пристальное внимание исследователей эти организмы, в частности представители про- тококковых водорослей, привлекли лишь в последнее время, благодаря своей способности быстро размножаться в лаборатор- ных условиях и давать огромную биомассу, содержащую разно- образные органические вещества. К протококковым (Protococcales) относятся одноклеточные и колониальные формы. Клетки чаще всего шаровидные или овальные с одним ядром в центре и хроматофором с пиренои- дом. Оболочка содержит целлюлозу. Более высокоорганизован- ные представители протококковых водорослей, например водя- ная сеточка (Hydrodiction), имеют много ядерных клеток с рас- сеченным пристеночным хроматофором и большим числом пиреноидов. Размножение бывает бесполое, половое и вегетативное. При бесполом в вегетативной клетке образуется значительное коли- чество двужгутиковых голых зооспор. У ряда представителей вместо зооспор образуются аплано- или автоспоры. Они, как и зооспоры, развиваются в результате деления клеточного со- держимого на ряд одноядерных участков, но не дают жгутиков и покрываются целлюлозной оболочкой еще внутри материнской клетки. У одноклеточных форм зооспоры или автоспоры после 77
выхода из материнской клетки разъ- единяются, а у колониальных оста- ются соединенными в колонию, число клеток которой уже не увеличивается, поскольку отсутствует вегетативное деление. Вегетативное деление наблю- дается у очень немногих протококко- вых водорослей. Исключением являют- ся представители сем. плеврококковых, размножающиеся только вегетативным путем. У многих протококковых изве- стен половой процесс, при котором происходит копуляция гамет, напоми- нающих строением зооспоры. Образо- вавшаяся в результате слияния гамет зигота или вырастает в новую особь, или превращается в покоящуюся спору. Систематическое деление протококковых водорослей осу- ществляется разными авторами неодинаково. Чаще всего их делят на четыре семейства: 1) хлорококковые (Chlorococca- сеае); 2) гидродикциевые (Hydrodictyaceae); 3) сценедесмовые (Scenedesmaceae); 4) плеврококковые (Pleurococcaceae). К сце- недесмовым относятся широко известные Chloreila и Scenedes- mus (рис. 27). Протококковые за некоторыми исключениями пресноводные организмы. Многие живут во влажной почве, на стволах де- ревьев. В воде они распространены в планктонных условиях, особенно сценедесмовые. Они нередко являются миксотрофами, развиваясь в большом количестве в присутствии органических веществ, что, например, выражено у хлореллы. Это свойство и обусловливает способность протококковых водорослей разви- ваться в биофильтрах, где они участвуют в утилизации органи- ческих загрязнений стоков. Но важная роль зеленых водорослей в очистке воды состоит не в потреблении органических веществ, а в фотосинтетической аэрации окислительных прудов. Простейшие (Protozoa) до недавнего прошлого входи- ли в круг интересов только почвенной и медицинской микро- биологии. Почва и вода богаты органическими веществами и являются естественными средами обитания этих организмов. Патогенные простейшие вызывают инфекционные заболевания человека и животных и обитают в больном организме. Роль простейших в почве сводится в основном к пожиранию бакте- рий; по мнению некоторых авторов, это имеет положительное значение [190], так как способствует ускоренному размноже- нию молодых поколений бактерий, биохимически более актив- ных. В связи с бурным ростом городов и промышленности, а также распространением биологического метода очистки сточ- 78
a — Euglypha alveclata; 6 — Aspidisca costata; в — Paramecium caudatum 1; a —Euplo- tes charon; d — Vorticella microstoma. ных вод простейшие привлекают к себе внимание как компонен- ты биоценозов активного ила и биопленки. В очистных сооружениях постоянно размножаются обитате- ли почв и водоемов, представители животного микромира — простейшие, которые в зоологии относятся к I типу Pro- tozoa (рис. 28). В активном иле очистных сооружений можно встретить и других животных — представителей IV типа — червей, представителей VI типа — членистоногих. Разумеется, черви и членистоногие даже в виде своих самых мелких пред- ставителей имеют довольно сложное строение тела, не могут быть отнесены к объектам микробиологии и нами не рассмат- риваются. Внимание будет уделено лишь одноклеточным пред- ставителям микрофауны. Среди простейших можно встретить организмы с различным типом питания: сапрозойным, голозойным и голофитным. По- ступление растворенных в воде органических веществ путем диффузии через всю поверхность клетки — характерная черта сапрозойного питания. Такое питание свойственно саркодовым, у которых клетка не покрыта ригидной оболочкой, и проме- жуточным формам между жгутиковыми и саркодовыми, которые имеют одновременно ложноножки (псевдоподии) и жгутики от одного до многих. В условиях работы очистных сооружений в биоценозах активного ила и биопленки скопляется огромное количество живых организмов, часть из них отмирает либо унич- тожается другими существами, при этом белковая масса их тел гидролизуется и переходит в водорастворимое состояние, т. е. превращается в субстрат для сапрозойного питания соответ- ствующих видов простейших. 79
Голозойное питание состоит в поглощении бактерий, одно- клеточных мелких водорослей и твердых частиц, представляю- щих собой продукт распада живых существ, их органов, тканей и клеток (детрит). Большинству инфузорий присущ этот тип питания. Есть голозойные амебы, питающиеся другими прото- зоа, более мелкими амебами либо инфузориями. Третий тип питания — голофитный присущ очень немногим простейшим, в клетках которых есть хлорофилл. Автотрофное питание этих протозоа полностью соответствует автотрофному питанию зеленых растений. Они усваивают углекислоту посред- ством своего хлорофилла либо живут в симбиозе с зеленой одноклеточной водорослью, которая посредством фотосинтеза снабжает органическими соединениями простейших симбионтов. Протозоа располагают ферментами, способными гидролизо- вать белковые вещества. В литературе нет данных о том, чтобы протозоа могли использовать синтетические органические сое- динения. В биоценозах очистных сооружений встречаются представи- тели четырех классов простейших: 1) саркодовые (Sarcodina); 2) жгутиковые (Mastigophora; 3) ресничные инфузории; (Ci- liata); 4) сосущие инфузории (Suctoria). Саркодовые (Sarcodina). Клетки состоят из протоплазмы и ядра. У отряда амеб тело не покрыто жесткой оболочкой, поэтому термин клетка к ним в обычном смысле не применим. Форма тела амеб легко изменяется, так как они выпускают на своей поверхности выросты — псевдоподии, или ложноножки. Псевдоподии служат амебам для передвижения и захвата пи- щи. Есть отряд саркодовых — фораминифера, тело которых по- крыто известковой раковиной. Отряды солнечников и радиоля- рий имеют более сложное строение тела, чем амебы. Тело их шарообразное, а нитевидные псевдоподии имеют постоянную длину и расположены в виде лучей, радиально расходящихся от уплотненной центральной части. Некоторые солнечники име- ют раковину, тогда радиальные иголочки бывают известковые или, возможно, кремниевые. Саркодовые питаются бактериями, исключением являются еолнечники, питающиеся другими вида- ми простейших. Роль саркодовых в жизни биоценозов активно- го ила и биопленки мало заметна. Жгутиковые (Mastigophora). Тело имеет большей частью овальную, эллиптическую, продолговатую или округлую форму. Размеры 10—20 мкм, на концах один или несколько жгутиков — эластичных органоидов, обеспечивающих быстрое движение клеток. Некоторые жгутиковые образуют как бы связующее звено между саркодовыми и жгутиковыми, так как способны выпускать псевдоподии. Размножаются делением, питаются бактериями. Благоприятными условиями размножения является высокое содержание органических веществ и бактерий. У не- которых жгутиковых в клетках содержится хлорофилл. Обычно 80
в лужах встречается Euglena viridis, ее организм способен к фотосинтезу (галофит). В биоценозах очистных сооружений встречаются бесцветные жгутиковые — Bodo caudatus и Oico- monas socialis (колониальный организм, подобный шарообраз- ному вольвоксу, но неправильной формы). Считается, что жгу- тиковые играют подчиненную роль по сравнению с инфузориями в очистных сооружениях. Ресничные инфузории (Ciliata). Имеют более сложное строе- ние, чем два предыдущих класса. Тело их покрыто тонкими волосками, или ресничками. Реснички у инфузорий могут рас- полагаться различно и в зависимости от этого они носят сле- дующие названия: 1) равноресничные, у которых вся поверх- ность равномерно покрыта ресничками; 2) брюхоресничные — на брюшной поверхности ресничек больше, чем на других ча- стях; 3) разноресничные, имеющие реснички различной длины, обычно более длинные у ротового отверстия; 4) круглореснич- ные— при круговом расположении ресничек вокруг тела. У ин- фузорий два ядра: макронуклеус — большое ядро и микрону- клеус— значительно меньшее по размеру. Различается на- ружный слой — эктоплазма, и внутренний — эндоплазма; в эндоплазме переваривается пища. Колебания ресничек способ- ствуют движению всей инфузории. Роды этого класса могут быть сходны по контурам и строению тела, например Euplotes charon и Stylomchia pustulata, и могут резко различаться, например Aspedisca (овальное тело), Vorticella (воронка на длинной нож- ке) и Opercularia glomerata (напоминает ветку, покрытую пло- дами) . Представители этого класса значительно различаются меж- ду собой по образу жизни, размерам и другим биологическим признакам. Aspedisca и Euplotes — овальные клетки. Очень подвижны, они быстро передвигаются по поверхности активного ила или плавают в воде. Вторую группу составляют быстро плавающие, но часто останавливающиеся и стоящие подолгу неподвижно на месте (Paramecium caudatum, Colpoda steinii). Третью группу представляют роды простейших, наиболее слож- ные по строению, которые прикрепляются к субстрату посред- ством стебельков, прямых или разветвленных, иногда очень эластичных и способных к сокращению (Vorticella, Opercularia, Carchesium, Epistilis). Простейшие последней группы по форме напоминают колокольчики или веретенообразные тела. Перед- няя часть тела имеет околоротовой диск с углублением, в этой части расположены реснички. Ресничная инфузория Epistilis играет очень важную роль в образовании хлопьев активного ила, превосходя в этом отношении всех простейших [332]. Для рек мало загрязненных описаны роды простейших, называемые группой олигосапробного типа. Для рек сильно загрязненных описаны роды простейших, называемые группой простейших по- лисапробного типа. Делались попытки оценивать состояние 6 8-616 81
активного ила в зависимости от преобладания в нем простейших олигосапробного или полисапробного типа. Преобладание про- стейших олигосапробного типа, очевидно, указывает на здоровое состояние ила, в случае преобладания полисапробного типа протозоа ил находится в неблагополучном состоянии для рабо- ты. Так как есть еще индикаторы мезосапробных водоемов, то нам этот тест представляется не очень точным. Сосущие инфузории (Suctoria). Инфузории этого класса при- крепляются к субстратам несокращающимися стебельками. В активном иле они малочисленны. Питаются более крупными инфузориями с помощью сосательных щупалец. Значение их для очистных сооружений не выяснено. Данные о селективном поглощении некоторыми инфузориями определенных видов бак- терий, по-видимому, требуют дополнительной проверки. НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИИ МИКРОБОВ ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ Ферменты, или энзимы, играют важную роль в жизни микроор- ганизмов. По характеру действия они подобны катализаторам, так как ускоряют реакции, не входя в состав конечных продук- тов, заметно не расходуясь и не изменяя первичных свойств. Все проявления жизнедеятельности микроорганизмов — это ре- зультат действия органических катализаторов — ферментов. Характерной особенностью ферментов является специфич- ность их действия. Каждый фермент действует на строго опре- деленный субстрат. Специфичность бывает абсолютная, когда фермент действует на один субстрат (уреаза), групповая— когда фермент действует на ряд соединений с определенными атомными группировками (липаза), а также стереохими- ческая — когда фермент действует на определенные стереоизо- меры (р-глюкозооксидаза). Активность ферментов в клетке строго регулируется. Процесс биосинтеза ферментов находится под генетическим контролем. Активность ферментов регулирует- ся концентрацией конечных и промежуточных продуктов пре- вращения субстрата, а также условиями окружающей среды. Начиная с 1926 г. многие ферменты были получены в чи- стом виде в форме кристаллов. В кристаллическом виде была получена уреаза, фермент, расщепляющий мочевину на NH3 и СО2. Затем были получены кристаллические препараты фермен- тов пепсина и трипсина, которые при изучении оказались бел- ками. Позже удалось выяснить, что многие ферменты имеют, кроме белка, небелковый компонент. Так, из бактерий и дрож- жей был выделен фермент, активирующий водород при окисли- тельно-восстановительных процессах. Оказалось, что в его со- 82
став входит витамин Bj — рибофлавин и специфический белок — носитель рибофлавина. Рибофлавин без белка-носителя был неактивен. Сейчас все ферменты по составу разделяются на две группы: 1) простые ферменты, представляющие собой кристаллические белки; 2) сложные ферменты, имеющие в своем составе актив- ную или простетическую группировку небелковой природы (ко- фермент) и белковый носитель (апофермент). Простетическими группами ферментов могут быть витамины, нуклеотиды и т. д. Часто ферменты прочно связаны с микробной клеткой (напри- мер, многие окислительно-восстановительные ферменты) и вы- деляются наружу лишь после ее разрушения. Такие ферменты Называются эндоферментами. Ферменты, которые легко выде- ляются из клетки в окружающую среду (например, гидролазы), называются экзоферментами. Согласно современной классификации и номенклатуре фер- менты подразделяются на шесть классов на основании химизма вызываемых ими реакций. Каждый класс делится на подклассы и подподклассы в зависимости от природы индивидуальных превращений. Учитывается также структура коферментов, тип гидролизуемой связи и т. п. Таким образом, каждый фермент имеет шифр из четырех чисел. Первое число указывает, к како- му из шести классов принадлежит фермент, второе и третье, соответственно, подкласс и подподкласс, четвертое число пред- ставляет собой порядковый номер фермента в подиодклассе. Например, алкоголь: НАД-оксиредуктаза (старое название — алкогольдегидрогеназа) зашифровывается как 1.1.1.1. Названия ферментов обычно происходят от названия преобразуемого суб- страта или типа катализируемой реакции. Для некоторых фер- ментов сохраняются традиционные названия, например пепсин, папаин. Классы ферментов. Оксиредуктазы, или окислитель- но-восстановительные ферменты. К ним принадлежат дегидро- геназы НАД (никотинамидадениндинуклеотид), НАДФ, (нико- тинамидадениндинуклеотидфосфат), цитохромы а, Ь, с, цито- хромоксидаза. Все эти ферменты участвуют в переносе водорода, электронов и кислорода. Они имеют большое значение для процессов дыхания и брожения микроорганизмов. Ферменты переноса — трансферазы. Ферменты этой группы катализируют перенос атомных группировок одного соединения на другое, например, аминоферазы производят переаминирова- ние; фосфоферазы катализируют перенос остатков фосфорной кислоты. Гидролазы, или гидролитические ферменты, катализирую- щие реакции гидролитического расщепления внутримолекуляр- ных связей. Эти ферменты участвуют в расщеплении и синтезе углеводов, жиров и белков, причем компонентом реакции яв- ляется вода. К этому классу относятся карбогидразы, расщеп- 6’ 83
ляющие углеводы и глюкозиды (а- и (3-амилазы, целлюлаза и целлобиаза, пектиназа, а-глюкозидаза и др.); эстеразы, расщеп- ляющие эфирные связи с образованием спиртов и кислот; ли- пазы, катализирующие гидролиз и синтез жиров; фосфатазы, вызывающие превращение эфиров фосфорной кислоты; протео- литические ферменты, катализирующие гидролиз и синтез бел- ков (протеиназы) и превращения пептидов (пептидазы). Пеп- тидазы катализируют отщепление и присоединение терминаль- ных аминокислотных остатков в пептидных цепях. Гидролитические ферменты имеют большое практическое значение. В СССР и во многих других развитых странах орга- низовано промышленное производство гидролитических ферментов, в основном амилолитических и протеолитических. Амилолитические и протеолитические ферментные препараты из микробов производятся в СССР на специальных заводах для пивоваренной, винокуренной и кожевенной промышленности. Среди гидролаз есть действующие на галоидные связи С-га- лоидных соединений. Лиазы катализируют реакции присоединения групп к двой- ным связям и реакции противоположного направления — от- щепление каких-либо групп по месту двойных связей. Альдолаза расщепляет фруктозо-1-6-дифосфат на трехуглеродные соедине- ния, пируватдекарбоксилаза отщепляет СО2 от пировиноградной кислоты. Углерод-сера-лиазы и углерод-галоген-лиазы могут использоваться при трансформации микробами синтетических соединений. Изомеразы катализируют превращение некоторых органи- ческих соединений в их изомеры. При этом происходит внутри- молекулярная перестановка радикалов или группировок. Изо- меризации могут подвергаться аминокислоты, органические кислоты и углеводы. Ферменты этой группы участвуют в неко- торых метаболических процессах. Лигазы (синтетазы) катализируют синтез сложных органи- ческих соединений из более простых. Глутаминсинтетаза, напри- мер, синтезирует глутамин из глутаминовой кислоты и аммиака с обязательным участием аденозннтрифосфорной кислоты (АТФ), дающей энергию для реакции. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ При росте, размножении и других проявлениях жизнедеятель- ности микробы нуждаются в непрерывном поступлении стро- ительных материалов, или питательных веществ и энергии. Эти потребности удовлетворяются в процессе обмена веществ. По характеру питания микроорганизмы близки к растениям. Твер- дые вещества не пригодны для их питания. Поэтому любой пи- тательный субстрат, любое органическое вещество животного, растительного или синтетического происхождения, прежде чем 84
стать продуктом питания для микроорганизма, подвергается воздействию микробных ферментов во внешней среде и должно быть переведено в состояние, усвояемое из водных растворов. Крупные молекулы веществ, нерастворимых в воде (целлю- лоза, крахмал, белки), превращаются вне клетки под влиянием гидролитических ферментов в низкомолекулярные соединения, хорошо растворимые в воде. Например, целлюлоза и крахмал превращаются в глюкозу, белки — в аминокислоты, пластмассы и смолы — в их мономерные компоненты, иначе говоря, полиме- ры, природные н синтетические, превращаются в мономеры. Водорастворимые питательные вещества адсорбируются на клеточных оболочках микробов, а затем диффундируют в клетку микроорганизма. Диффузия, или проникновение веществ через клеточную оболочку, возможна в связи с мозаичным строением микробной плазменной оболочки — мембраны. Внешний слой плазмы — цитоплазматическая мембрана — трехслойна; толщина ее 6—8,5 нм. Структурные субъединицы мембраны представля- ют собой сочетание липоидных и протеиновых молекул — липо- идно-протеиновую мозаику. Часть субъединиц является белково- липидными комплексами, другая часть — ферменты. Липоидные ячейки пропускают жирорастворимые вещества (глицерин, жир- ные кислоты), а протеиновые ячейки—воду и водорастворимые вещества (углеводы, сахара и водные растворы аминокислот и минеральных солей). До 75% всех липидов бактерий сосредо- точено в мембранах. Ферменты мембраны или плазмалеммы участвуют в глубокой деструкции сложных органических ве- ществ, поступающих в клетку, либо в трансформации некоторых органических соединений, без чего их потребление или энерге- тическое использование невозможно. Большую роль при поступлении питательных веществ внутрь клетки играют, по современным представлениям, ферменты пер- меазы или транслоказы. В настоящее время считают, что пе- редвижение веществ из внешней среды в бактериальную клетку обеспечивается, по крайней мере, четырьмя группами механиз- мов: пассивной и активной диффузиями, стереоспецифически- ми пассивной и активной диффузиями. Из них только пассивная диффузия не требует затраты энергии, так как диффундирую- щее вещество в этом случае, последовательно растворяясь в веществе клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, переходит внутрь клетки, причем устанавливается равенство внутренней и внешней концентраций. Остальные три механизма требуют затраты энергии, причем стереоспецифические пассив- ная и активная диффузии происходят при участии специфи- ческих белков — переносчиков пермеаз. Сейчас сравнительно хорошо изучены пермеазы, осуществляющие транспорт внутрь клетки углеводов, аминокислот и некоторых ионов. Установлена связь между химическим строением различных веществ и их способностью проникать в микробную клетку. 85
Углеводороды и другие соединения, не распадающиеся на ионы, очень скоро проникают в клетку микробов. Но если органические соединения содержат -СН2, -ОН или -СООН груп- пы, то скорость проникновения замедляется. Этиловый спирт с одним гидроксилом (С2Н5ОН) проникает легче, чем этиленгли- коль с двумя ОН-группами (СН2ОН СН2ОН) или глицерин с тремя ОН-группами (СН2ОН-СНОН-СН2ОН). Еще труднее проникает 6-атомный спирт маннит (СН2ОН-(СНОН)4СН2ОН), а также сахара, имеющие оксигруппы, альдегидные или кетон- ные группировки. То же касается кислот. Жирные кислоты с одной карбоксильной группой — уксусная (СН3СООН), пропио- новая (СНз-СН2-СООН) проникают в. клетку легче, чем имею- щие оксигруппу — оксипропионовая или молочная (СН3СНОН • • СООН). Одноосновные кислоты, например масляная (СН3- •СН2-СН2-СООН), легче проникают в клетку, чем двухоснов- ные— янтарная (СООН СН2 СН2 • СООН) или малоновая (СООН-СН2-СООН). Одним словом, питание микроорганизмов тесно связано с физико-химическими свойствами микробных кле- ток. Эти свойства микробов непостоянны, они динамичны. Одна- ко их можно кратко охарактеризовать. Удельный вес бактерий в среднем равен 1,055. Плазма бак- териальной клетки обладает известной вязкостью, которая в 800 раз превышает вязкость воды, что соответствует примерно вязкости глицерина. Иногда вязкость у старых клеток может в 8000 раз превышать вязкость воды. Это соответствует вязко- сти густого сахарного сиропа. У юных бактериальных клеток вязкость низкая, с возрастом она повышается. То же наблю- дается по направлению от центра клетки к периферии Основ- ная масса цитоплазмы — это жидкий золь. Периферическая часть клетки пребывает в состоянии геля. Полупроницаемость клеточной стенки и цитоплазматической мембраны обусловливают осмотические свойства клеток микро- организмов. Все микроорганизмы обладают внутриклеточным осмотическим давлением. При внесении бактерий, дрожжей и актиномицетов в концентрированные растворы солей или саха- ров у них наблюдается явление плазмолиза. При этом внешнее осмотическое давление намного превышает внутреннее. Плаз- молиз у грамотрицательных бактерий воспроизводится легче, чем у грамположительных, которые не плазмолизируются или с трудом плазмолизируются. Внутреннее осмотическое давление бактерий равно 3—6 атм, оно вдвое ниже, чем в клетках живот- ных. Это связано с большей проницаемостью оболочки бакте- рий по сравнению с оболочками клеток высших животных. Осмотические явления играют важную роль в питании ми- кробов. Если клетку поместить в гипотонический раствор, наблю- дается ее набухание и даже разрыв в результате явления, назы- ваемого плазмоптизом. В микробиологической практике в ка- честве физиологического раствора используется 0,5%-ный 86
раствор NaCl; 0,85%-ный физиологический раствор, изотонич- ный для клеток высших животных, непригоден для бактерий — он для них гипертоничен и вызывает плазмолиз. Большое значение для микроорганизмов имеет реакция сре- ды, которая зависит от концентрации водородных ионов. Для обозначения концентрации водородных ионов Зеренсен пред- ложил употреблять термин pH, представляющий собой отри- цательный логарифм концентрации водородных ионов: pH = — log (Н+) = log ; pH = — log (ОН)~. Для чистой воды pH 7,07. Чем выше кислотность, тем ниже чис- ловое значение pH, чем выше щелочность, тем больше числовое значение pH. Нижний предел pH — 0, верхний — 14,0. Среды, используемые для культивирования бактерий, должны иметь pH 7,2—7,4; для дрожжей — 6,0—6,5; для микроскопических грибов — 5,0—6,0. Изменение концентрации водородных ионов резко сказывается на развитии всех физиологических функций микроорганизмов. С изменением pH меняется проницаемость клеточной оболочки, а следовательно, и условия питания. Уско- ряется или тормозится деятельность микробных ферментов. У бактериальных клеток имеется электрический заряд, кото- рый всегда имеет отрицательный знак. Если в сосуд с бактерия- ми, находящимися во взвешенном состоянии в нейтральной водной среде, погрузить два электрода и пропустить ток, то бактерии передвигаются к аноду. Это явление называется электрофорезом и свидетельствует о наличии у бактерий отри- цательного электрокинетического потенциала. Отрицательный заряд бактерий обусловлен большим количеством кислых фос- фолипидов и небольшого количества основных белков в мембра- нах бактериальной клетки. У разных бактерий потенциал неоди- наков, он зависит от электрохимических свойств веществ, входящих в поверхностный слой бактериальной клетки. Ионоген- ный распад поверхностно расположенных веществ увеличивает электрический потенциал, что, например, происходит под влия- нием антибиотиков либо лизоцима. Величина электрокинети- ческого потенциала зависит от характера среды, окружающей клетку (концентрация электролитов и pH). Поэтому для элек- трохимической характеристики поверхности бактерий более ти- пична изоэлектрическая точка, чем электрокинетический по- тенциал. Если в среду добавить катионы или ее подкислить, отрица- тельный заряд поверхности бактерий постепенно уменьшается, а затем исчезает и снижается электрофоретическая подвиж- ность. Реакция среды, при которой отсутствует всякое движение бактерий при прохождении тока и электрокинетический потен- циал равен нулю, называется изоэлектрической точкой. Для большинства бактерий изоэлектрическая точка лежит в зоне 87
pH 3,0—4,0. Реакция среды влияет на величину и знак заряда. При реакции среды, когда pH ниже изоэлектрической точки клетки, заряд поверхности клетки положительный, а если pH выше изоэлектрической точки, то заряд отрицательный. Установ- лено, что электрический заряд поверхности клетки обусловли- вает адсорбцию из среды ионов с противоположным зарядом. При определенном pH субстрата между клеткой микроба и средой начинается обменная адсорбция, которая приводит к по- ступлению питательных веществ в клетку. Потребности микроорганизмов в питательных веществах весьма разнообразны. Микробы, как и другие живые организ- мы, нуждаются в различных химических элементах. Микроор- ганизмам необходимы органогены: С, Н, О, N, зольные элемен- ты: S, Р, К, Na, Mg, Са и микроэлементы: Мп, Zn, Си, Cd, Со, С1, В, Si. Отношение микроорганизмов к разным источникам углеро- да различно и специфично. Одни ассимилируют СО2, другие требуют сложных органических соединений. Весь мир микро- организмов можно разделить на следующие физиологические группы: 1) гетеротрофы, которые усваивают углерод из готовых орга- нических соединений; а) автотрофы, которые ассимилируют СО2 из воздуха; 3) промежуточные гетеротрофы., усваивающие углерод из го- товых органических соединений, но способные включать в об- мен СО2. Гетеротрофные микроорганизмы ассимилируют углерод только из готовых органических соединений, но так как орга- нических соединений в природе бесчисленное множество, то среди гетеротрофов есть виды и даже иногда штаммы или груп- пы бактерий, усваивающие углерод из определенных классов веществ. Питательная ценность источников углерода зависит от физио- логических особенностей микроорганизма, химического состава и физических свойств вещества. Легкость усвоения углеродсо- держащих соединений предопределяется степенью окислен- ности углерода. Карбоксилы — СООН имеют малую питатель- ную ценность, радикалы с восстановленным углеродом — СН3, СН2 и СН — более питательны. Но легче всего усваиваются полуокисленные атомы углерода — СН2ОН, СНОН, СОН. Вы- сокую питательную ценность имеют соединения, богатые спиртовыми группами. Наиболее доступными источниками угле- рода для большинства гетеротрофных микроорганизмов являют- ся: сахара, глицерин, маннит, молочная, винная и лимонная кислоты. Многие бактерии успешно осуществляют гидролиз углеводов, жиров, белков, используя их в качестве источника углерода. Весьма распространенный растительный полисахарид крахмал часто служит источником углерода для бактерий и гри- 88
бов. При этом он проходит стадию ферментативного гидролиза и превращается в глюкозу: (СвН10О6)„ + пН2О -> пС6Н12Ов. У многих микроорганизмов в наборе ферментов содержатся целлюлоза, способная гидролизовать целлюлозу до целлобио- зы, и целлобиаза, расщепляющая целлобиозу до глюкозы. Это аэробные и анаэробные целлюлозные бактерии (Bacillus cellu- losae hydrogenicus, Clostridium Omelianskii) и миксобактерия Sorangium cellulosum. целлюлаза (C„H10O5)„ + Va/iHjO 1/2nC12H22Ou целлюлоза целлобиоза целлобиаза С12Нг2Оп 4- H2O -> 2C6H12Oe • целлобиоза глюкоза Оба процесса протекают внеклеточно, их схематически можно представить себе так: Пальмитиновая (С13Н32О2) и стеариновая (С|3Н36О2) кисло- ты входят в состав жиров: С3Н6 (С1вН31О2)3 + ЗН2О С3Н5 (ОН)3 + ЗС1(!Н3]О2Н. трипальмитин глицерин пальмитиновая кислота Тристеарин — C3H5(Ci8H35O2)3, как и трипальмитин, не прони- кает сквозь бактериальную оболочку, а продукты его гидролиза уже делаются доступными бактериям. Полимерная молекула белка непригодна для питания бакте- рий. Ферменты протеазы расщепляют пептидную связь белков. Полученные в результате этого органические кислоты и амино- кислоты служат питательными веществами для микроорганиз- мов. RCO - NHR + Н2О -> RCOOH + H2NR. органические амино- кислоты кислоты Автотрофные микроорганизмы делятся на две группы: фото- автотрофные бактерии, которые в качестве источника углерода ассимилируют СО2 воздуха за счет солнечной энергии, и хе- моавтотрофные, использующие энергию, получаемую в резуль- тате окисления некоторых минеральных веществ. К фотоавто- трофным бактериям относятся зеленые и пурпурные серобакте- 89
рии, а также пурпурные несерные бактерии. В процессе фотоассимиляции принимают участие пигменты. Фотоавтотрофные бактерии рода Chlorobium — Chlor, thio- sulf atophilum — это зеленые серобактерии. О пигментах зеленых бактерий уже говорилось. Зеленые серобактерии нуждаются для развития в свете и H2S. У зеленых растений донатором водорода является вода, а у зеленых серобактерий — сероводо- род. Поэтому в результате реакции у зеленых растений выде- ляется кислород, а у серобактерий — сера: 1. СО2 4-Н2О + солн. энергия -> 1/6С6Н12Ов 4-О2 (растения) 2. СО2 4- 2Н254-солн. энергия —> 1/6C(iH]2Oe4-H2O4-S2 (бактерии). У пурпурных бактерий бактериохлорофилл маскируется красно-коричневыми пигментами типа каротиноидов и фикоби- линов. Все три группы фотосинтезирующих бактерий характе- ризуются различной степенью автотрофности — от облигатной (зеленые серобактерии) до факультативной (пурпурные неСер- ные бактерии). Пурпурные серобактерии являются промежуточ- ной группой. Хемосинтез осуществляется бесцветными бактериями. Про- цесс хемосинтеза был открыт в 1888 г. знаменитым микробио- логом С. Н. Виноградским у нитрифицирующих бактерий. Нит- рифицирующая бактерия Nitrosomonas окисляет NH3 в азоти- стую кислоту. 2NH, 4- ЗО2 -+ 2HNO2 4- 2Н2О 4- 158 кал. Далее другая бактерия Nitrobacter окисляет азотистую кислоту в азотную: 2HNO2 4- 02 -> 2HNOa 4- 48 кал. Исследования Виноградского показали, что сопряженно проис- ходят следующие два процесса: 1) окисление NH3 в азотистую кислоту и 2) восстановление С02 до органического соединения типа гексозы. Это можно выразить суммарным уравнением: 1. 2NH3 4- 2О2 = 2HNO2 4- 4Н 4- энергия 2. С02 4- 4Н 4- энергия = 1/вСвН12Ов4- Н20. На окисление одного моля аммиака должно было бы затрачи- ваться два атома кислорода, но расчеты показывают, что в дей- ствительности затрачивается 2,89 атома кислорода. Для пол- ного же окисления NH3 до азотистой кислоты и воды нужны были бы три атома кислорода. Однако, поскольку на этот окис- лительный процесс затрачивается меньше чем три атома кисло- рода, предполагают, что параллельное восстановление С02 осуществляется водородом аммиака; это п указывает на сопря- женность указанных процессов. Механизм передачи химической энергии окисления на восстановление С02 до сих пор изучен недостаточно. 90
К хемоавтотрофным бактериям, кроме нитрифицирующих, относятся также серобактерии, тионовые, водородные и желе- зобактерии. Таким образом, в мире микроорганизмов существу- ет специализация в углеродном питании, что имеет большое зна- чение для превращений углерода в природе. Источниками азота для микроорганизмов могут служить различные вещества. Наряду со строго паратрофным питанием за счет живых белков (паразитизм) существуют микроорганиз- мы, усваивающие пептоны, аминокислоты, азот нитро- и амино- групп неорганических солей и молекулярный азот атмосферы. Приведенные в этой книге литературные данные и собственные наблюдения позволяют считать, что среди бактерий, актиноми- цетов и грибов есть много видов, способных усваивать азот синтетических соединений: капролактама, нитроанилина, нитро- бензола, пикриновой кислоты и цианистых соединений. По отношению к азоту все бактерии разделяются на две группы: 1) аминоавтотрофные, синтезирующие белковые веще- ства за счет неорганических источников азота, и 2) аминоге- теротрофные, способные синтезировать ряд аминокислот из про- стейших источников, но не способные построить одну или не- сколько аминокислот и требующие их в готовом виде. Есть среди них такие, которые могут расти только на белках (пато- генные бактерии) или на пептонах (молочнокислые бактерии). К аминоавтотрофам относятся микроорганизмы, использую- щие азот аммиачных солей, азотнокислых солей и мочевину. К этой группе принадлежат плесневые грибы, многие актино- мицеты, уксуснокислые бактерии, свободноживущие азотфикса- торы — Azotobacter chroococcum и Clostridium pasteurianum, клубеньковые бактерии Rhizobium phaseoli и другие азотфикса- торы. Аминоавтотрофы при использовании азота минеральных соединений предварительно переводят его в аммиачный азот, а затем потребляют для построения аминокислот, из которых синтезируют белки. Предварительный перевод азота в аммиак объясняется тем, что в составе микробной клетки азот нахо- дится в восстановленном состоянии в форме амино- (NH2) и иминогрупп (NH). Роль азота в белковых веществах протоплаз- мы бактерий состоит в том, что он придает белкам реактив- ность. Азот трудно входит в состав соединений из-за инертности, но легко из них выходит. К аминогетеротрофам принадлежит большинство патогенных бактерий, молочнокислые бактерии, риккетсии и т. д. Эти мик- роорганизмы нуждаются в готовых аминокислотах. Многие из них имеют активные протеолитические ферменты, при помощи которых осуществляют расщепление белков до аминокислот, используемых затем для построения клеточных белков. Роль зольных элементов и микроэлементов в жизни микро- организмов сводится к следующему: сера входит в состав белко- вых веществ, встречается только в восстановленном виде —SH— 91
и —S—S— и играет видную роль в регуляции окислительно* восстановительного потенциала микробных клеток, ассимили- руется в виде сульфатов, и только паразитические формы бакте- рии требуют серу в виде SH-групп, входящих в белки. Фосфор в виде фосфорной кислоты входит в состав важней- ших органических соединений, нуклеиновых кислот и фосфоли- пидов. В отличие от азота и серы фосфор встречается в бак- териальных клетках только в окисленном состоянии (Р2О5). Фосфор вступает в связи с углеродом только через кислород или азот. Эти связи образуются с затратой энергии. Поэтому органические соединения фосфора являются аккумуляторами энергии в микробных клетках. Соединениями, аккумулирующи- ми энергию, являются аденозиндифосфорная (АДФ) и адено- зинтрифосфорная (АТФ) кислоты. Фосфор входит в состав фер- ментов, используется микроорганизмами в виде солей ортофос- форной кислоты. Калий играет существенную роль в превращениях углеводов. Лучший источник калия — соли ортофосфорной кислоты. Маг- ний необходим для зеленых и пурпурных серобактерий, у ко- торых входит в состав хлорофилла. У других бактерий магний является активатором ферментов и находится в ионном состоя- нии. Источником магния могут служить сернокислые и другие его соли. Кальций усваивается из растворимых солей. Роль его в клетке, как и роль натрия, не выяснена. Железо входит в состав простетических групп цитохромных ферментов. Без же- леза резко падает окислительная активность аэробных организ- мов. Микроэлементы Zn, Мп, Со, Cd, J, Вг, В участвуют в син- тезе ферментных белков. Поэтому микроэлементы резко стиму- лируют жизнедеятельность микроорганизмов Многие микроорганизмы нуждаются в дополнительных росто- вых факторах. Это могут быть витамины (главным образом, группы В), аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основа- ния, а также некоторые другие вещества. Количественная по- требность в таких соединениях очень незначительна. Это свидетельствует о том, что факторы роста не используются ми- кроорганизмами в качестве пластического или энергетического материала, а играют роль в обмене веществ. Известно, что мно- гие витамины и другие ростовые факторы входят в состав про- стетических групп жизненно важных ферментов. Так, пирофос- фат тиамина (Bi) является коферментом карбоксилазы, которая осуществляет в клетке расщепление кетокислот, в частности пировиноградной кислоты. Рибофлавин (В2) входит в качестве простетической группы в состав дыхательных ферментов фла- виновых дегидрогеназ. Пантотеновая кислота (В3) является составной частью коэнзима А, участвующего в процессах ацети- лирования. Никотинамид (В5) представляет собой простети- ческую группу пиридиннуклеотидных дегидрогеназ. Пиридоксин 92
(В6) входит в состав ферментов, участвующих в декарбоксили- ровании и переаминировании аминокислот. Фолиевая (В9) и па- ра- аминобензойная (В10) кислоты участвуют в синтезе пуриновых и пиримидиновых оснований и т. д. Таким образом, роль дополнительных факторов роста для микроорганизмов очень велика. Как уже указывалось, многие микробы не способны синтезировать ростовые факторы само- стоятельно и нуждаются в предоставлении готовых соединений, однако многие другие синтезируют ростовые вещества и часто в большом количестве. Это явление называется сверхсинтезом и используется человеком для получения необходимых веществ промышленным путем. Например, получение очень важного витамина В12 возможно только посредством микроорганизмов. В заключение следует отметить, что разнообразие потребностей микроорганизмов в питательных веществах играет исключи- тельную роль в природе, так как обеспечивает разложение раз- личных соединений и включение входящих в их состав хими- ческих элементов в общий круговорот веществ. Для осуществления ряда обменных реакций микробные клетки нуждаются в постоянном притоке энергии. Эту энергию микроорганизмы получают в процессах окислительного метабо- лизма или дыхания. Термин дыхание равнозначен понятию био- логическое окисление, но окисление понятие более конкретное, чем дыхание. Под дыханием нередко понимают приспособления для осуществления дыхания (легкие, жабры). Биологическое окисление составляет сущность дыхания — реакцию, идущую с выделением энергии. Биологическое окисление может быть пря- мым, т. е. происходить за счет присоединения кислорода. Пря- мое окисление в микробной клетке происходит с помощью фер- ментов оксидаз. Наблюдается у почвенных сапрофитных бакте- рий или у водных хемоавтотрофов серобактерий: 2S + 2Н2О + 30.. -> 2H2SO4 + 237 кал, а также у нитрификаторов и некоторых других хемосинтези- рующих бактерий. Непрямое окисление происходит за счет дегидрогенирования субстрата (отнятия водорода) или за счет отдачи субстратом электронов. Примером переноса электронов, который представ- ляет собой окисление, является: окисление Fe++ "• ~ Fe+++ + е“. ьосстановление Отдача электронов ведет к окислению, присоединение элек- тронов — к восстановлению. Но электроны не могут оставаться в свободном состоянии, поэтому каждая отдача электрона — окисление сопровождается присоединением электрона к другому 93
субстрату — акцептору, т. е. восстановлением. Непрямое окисле- ние путем дегидрогенирования происходит под влиянием фер- ментов дегидрогеназ (без участия кислорода у анаэробов). По типу дыхания все бактерии можно разделить на три группы: 1) строгие анаэробы — маслянокислые бактерии, воз- будители ботулизма; 2) строгие аэробы — уксуснокислые бакте- рии, палочки инфлуэнцы, псевдомонасы; 3) факультативные анаэробы — кишечная палочка, молочнокислые бактерии, по- давляющее большинство патогенных бактерий и дрожжи. У представителей всех этих трех групп возможно дыхание путем непрямого окисления — дегидрогенирования. С отщеплением водорода освобождается электрон, а энергия поступает на нуж- ды микробной клетки. Например, некоторые водные микроорга- низмы осуществляют реакцию: H2S — 2Н —>- S + 2Н (акцептор) + 2е~. Уксуснокислые бактерии вызывают реакцию: СН3СН2ОН — 2Н -> СН3СОН + 2Н (акцептор) + 2е~. Первичные, или пиридиннуклеотидные, дегидрогеназы от- щепляют водород непосредственно от субстрата. К этой группе ферментов относятся никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ). Активной группировкой в этих ферментах является никотинамид (вита- мин В5). НАД имеет следующее строение: n=c-nh2 НС С —N I II N-C-N НС н2с-о—P-о—Р—о // // о о но-сн | I 9 но-сн НС сн2 Присоединяя водород, НАД превращается в НАД-Н2. Вос- становленная дегидрогеназа передает свой водород другому акцептору и при этом окисляется в НАД. Вторичные, или фла- виновые, дегидрогеназы переносят водород от первичных на сле- дующий промежуточный переносчик в дыхательной цепи. Таким образом, в клетке водород непрерывно переносится с одного ак- цептора на другой и в конце концов передается конечному, или терминальному, акцептору, находящемуся вне клетки, например 94
кислороду воздуха с образованием Н2О или Н2О2, углекислоте СО2 с образованием СН4, на серу с образованием H2S. Дегидрогенирование всегда сопровождается переносом элект- рона, т. е. происходит окисление. Передача водорода соответ- ствует передаче электрона. Из субстрата освобождается энергия, получаемая микробной клеткой. Полученная энергия исполь- зуется микробной клеткой посредством системы ферментов аде- нозиндифосфат — аденозинтрифосфат (АДФ — АТФ). Энергия кумулируется в макроэргических связях АТФ и затем служит клетке для удовлетворения ее энергетических нужд. Итак, в результате дегидрогенирования наблюдается деструкция суб- страта с утилизацией заключенной в нем энергии микробной клеткой. Аэробное дегидрогенирование. Аэробные бакте- рии имеют систему цитохромов — пигментированных окисли- тельно-восстановительных ферментов. Благодаря цитохромам аэробные бактерии могут в качестве конечного акцептора водо- рода использовать кислород воздуха. Цитохромы — это желтые пигменты, имеющиеся у всех аэробных микроорганизмов. Цито- хромы подобны гемоглобину крови, содержат железо. Водород субстрата переносится на простетическую группу дегидрогеназы НАД, в результате образуется восстановленная форма НАД-Н2, которая передает водород флавинадениндипу- клеотиду (ФАД). Последний превращается в ФАД-Н2, который передает водород цитохрому. Энергия освобождается в виде АТФ. Последовательно три цитохрома передают друг другу во- дород, и третий цитохром передает его цитохромоксидазе: Обычно при доступе воздуха наблюдается полное окисление. Чаще всего окисляется глюкоза или другие сахара. Конечными продуктами являются Н2О и СО2. Сапрофитные бактерии или дрожжи в аэробных условиях окисляют глюкозу до воды и углекислоты: СвН12О. + 6О2 -> 6СО2 4- 6Н2О + 688 500 кал. 95
Полное окисление, как сгорание, приводит к освобождению всей энергии, имеющейся в субстрате. Но окисление может быть не- полным, и тогда освобождается лишь небольшая часть энергии, заключенной в субстрате дыхания. Анаэробное дегидрогенирование. В анаэробных условиях многие виды микроорганизмов вызывают лишь частич- ное окисление субстрата. Конечные продукты этого неполного окисления несут в себе часть энергии, содержащейся в субстра- те. Такими конечными продуктами могут быть у анаэробов эти- ловый и бутиловый спирты, молочная и уксусная кислоты, ацетон. Примером может служить спиртовое брожение, вызываемое дрожжами: СвН1гО6 -> 2С2Н5ОН + 2СО2 + 31 200 кал. При анаэробном окислении освобождается в 22 раза меньше энергии, чем при полном аэробном окислении глюкозы. Ка- лории образовавшейся энергии — это условный символ. Тепло- вая энергия потеряна для клетки, она не может ее утилизиро- вать. При брожении обязательно происходит фосфорилирование глюкозы, образование фосфорных эфиров глюкозы, а затем расщепление глюкозы на соединения с тремя атомами углерода, из которых после дальнейших превращений образуется пиро- виноградная кислота. Этот путь разложения гексоз носит назва- ние анаэробный гликолиз или гексозодифосфатный путь. Разли- чия между типами брожений начинаются с пировиноградной кислоты. В зависимости от набора ферментов в клетках микро- организмов пировиноградная кислота превращается в молоч- ную кислоту (молочнокислые бактерии), этиловый спирт (дрожжи) и т. д. У микроорганизмов также описан другой способ окисления гексоз — гексозомонофосфатный путь. Этот путь характерен для ряда аэробных микроорганизмов, в частности грибов сем. As- pergill асеае, и существует наряду с анаэробным гликолизом. У многих микроорганизмов пировиноградная кислота, обра- зующаяся при расщеплении глюкозы, превращается при участии кофакторов и пируватдегидрогеназы в «активированную уксус- ную кислоту» или ацетилкоэнзим А, который включается затем в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса). В цикле Кребса происходит окисление органических кислот, при котором вы- деляется энергия, запасаемая в макроэргических фосфатных связях АТФ. Кроме того, этот цикл обеспечивает также процес- сы биосинтеза многочисленными предшественниками, такими как а-кетоглутаровая, щавелевоуксусная кислоты, из которых в результате аминирования образуются аминокислоты. 96
Цикл трикарбоновых кислот, или цикл Кребса; Пировиноградная кислота I 4 j----> Щавелевоуксусная кислота ----1 Яблочная кислота t Фумаровая кислота t I Янтарная кислота t а-Кетоглутаровая кислота 4 Лимонная кислота I 4 Цисаконитовая кислота I 4 Изолимонная кислота I 4 Щавелево-янтарная кислота СО2 В последнее время у микроорганизмов были обнаружены специфические соединения полифосфаты, в которых энергия за- пасается впрок и может быть по мере необходимости использо- вана клеткой. ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ Проблема изменчивости микробов стала предметом для дискус- сий со времени возникновения микробиологии как науки. С 70-х годов XIX ст. до наших дней изменчивость представляет одну из ярких и увлекательных глав микробиологии. Изучение изменчивости бактерий принесло много ценного материала для создания картины онтогенетического развития многих видов. Экспериментальная изменчивость по мнению крупнейших спе- циалистов по систематике бактерий может служить одним из плодотворнейших методов выяснения места организма в системе при попытке установления филогенетического родства. Лабора- торная изменчивость в эксперименте помогает определить гра- ницы вида и рода бактерий. Изменчивость прокариотов и эукариотов должна рассматри- ваться раздельно, так как прокариотам не свойствен тот ха- рактер изменчивости, который сопряжен с половым процессом. В то же время для грибов и водорослей (кроме синезеленых) как эукариотических организмов характерно множество воз- можностей, вытекающих из комбинации признаков родитель- ских организмов при образовании диплоидных клеток в резуль- тате слияния гомозиготных и гетерозиготных гамет. Учитывая, что в микробиологии очистки воды разные группы микроорганизмов занимают неравноценное положение, мы огра- ничиваемся изложением изменчивости лишь прокариотов как 7 8-616 97
организмов, играющих значительно более важную роль в очист- ке воды, чем эукариоты. Особенно если оставить в стороне естественные процессы самоочищения водоемов. В нашу задачу входит, в первую очередь, активная очистка промышленных стоков посредством чистых культур бактерий или их комплек- сов в очистных сооружениях. Поэтому остановимся на измен- чивости бактерий. Г. А. Надсон [188] различал несколько категорий изменчи- вости. Изменчивость, проявляющаяся при смене стадий жизни, т. е. по мере развития и старения культур меняются размеры, а иногда и форма клеток, у некоторых видов появляются нераз- личимые в оптическом микроскопе образования — фильтрую- щиеся формы (онтогенетическая изменчивость). Цикл развития, или онтогенез, культуры у некоторых видов бактерий довольно сложный. У бактерий, как и у высших орга- низмов, нет двух абсолютно одинаковых организмов. Предста- вители одного вида могут различаться по форме, величине клет- ки и по биохимическим свойствам. Это индивидуальная изменчивость. Третья категория изменчивости — груп- повая изменчивость. Целые микробные популяции, развивающиеся в различных изолированных пространствах, мо- гут приобретать или утрачивать какие-то признаки Образуются варианты различной степени устойчивости, т. е. они могут быть временными или же относительно долгое время сохраняющими- ся. Это формы изменчивости, именуемые модификациями. Далее Г. А. Надсон отмечает, что в 1920 г. им была обна- ружена изменчивость микробов под влиянием радиевых и рент- геновых лучей, происходящая скачкообразно. Эти скачкообраз- ные изменения наследственны, и для отличия от мутаций у растений и животных автор предложил называть их сальтация- ми (от латинского saltus — скачок). Этот термин не удержался в литературе, и явление внезапной наследственной изменчиво- сти микроорганизмов считается мутационной изменчи- востью. Мутанты, возникшие под влиянием обработки куль- туры радиацией или химическими реагентами, относятся к ка- тегории индуцированных мутантов в отличие от возникающих естественно при неучитываемом действии среды. Учение об изменчивости прошло длинный путь и сопровож- далось появлением самых фантастических представлений о не- обычайно широких пределах изменчивости, когда допускалась легкая превращаемость одних видов и родов в другие. Затем появилась другая противоположная точка зрения о высокой стабильности бактериального вида и постоянстве морфологии и физиолого-биохимических свойств. Однако большая скорость размножения и смена поколений за время меньшее, чем один час, позволяет использовать бактерии для изучения многих за- кономерностей изменчивости. Бактерии стали в наши дни излюбленным объектом генетиков. На изучении бактерий, их 98
изменчивости и наследственности открыты и обоснованы неко- торые положения молекулярной биологии и молекулярной ге- нетики. Изучение изменчивости патогенных бактерий привело к открытию вакцин и созданию современных методов диагностики инфекционных заболеваний. Использование экспериментального мутагенеза позволило создать высокоактивные расы и мутанты продуцентов антибиотиков. Литература по изменчивости кишеч- ных бактерий (Г. П. Калина [116] и Д. Г. Кудлай [152]), дрожжей (В. И. Кудрявцев [154, 155]), анаэробных целлюлозных бактерий (М. Н. Ротмистров [220]) позволяет считать исследования в этой области очень важными. Нельзя сомневаться, что исследования по изменчивости и селекции микробов, разрушающих синтетиче- ские загрязнители промышленных стоков, окажутся не менее плодотворными. По мере развития промышленности число новых химических соединений, применяемых в быту, в промышленной и сельско- хозяйственной деятельности человека, резко увеличилось. Мно- жество химических соединений различных классов самого раз- нообразного назначения или просто представляющих собой отбросы и побочные продукты химических производств попа- дают в сточные воды, в почву, а затем уносятся в естественные водоемы. К таким соединениям относятся: альдегиды, кетоны, эфиры, карбоновые кислоты и их соли или эфиры, спирты, как алифатические, так и ароматические, нитро- и галоидпроиз- водные ароматических соединений и множество различных по строению детергентов или поверхностно-активных веществ (ПАВ). Среди продуктов органического синтеза выявляется все больше соединений, обладающих резко выраженным ингибирую- щим, цитотоксическим и биоцидным действием на клетки многих живых организмов. Такие соединения все шире применяются для борьбы с разными вредоносными организмами. Планомер- но ведутся изыскания дезинфицирующих средств, инсектицидов, фунгицидов, дефолиантов, средств дератизации и прочих хими- ческих веществ, применяемых для девастации (истребление возбудителей инфекционных и инвазионных заболеваний чело- века, животных и растений). Химизация народного хозяйства и, в частности, сельского хозяйства привела к тому, что множество галоидорганических, фосфорорганических и других соединений, объединяемых в понятие пестициды, производятся в огромных количествах, в процессе практического применения эти соедине- ния попадают в почву, а затем в водоемы. Нельзя не упомянуть о том, что многочисленные, относительно безвредные для живой природы синтетические соединения в виде разного рода упако- вочных материалов и пластмасс бытового и промышленного назначения также накопляются в почве, в свалочных местах и на дне водоемов. 7* 99
Известно, что многие химические вещества, получаемые пу- тем органического синтеза, разрушаются микроорганизмами в почве и водоемах или очистных сооружениях, т. е. в природе есть микроорганизмы, способные адаптироваться к этим соеди- нениям. Имеющиеся наблюдения нашли отражение в научной периодической печати. Некоторые синтетические вещества воз- можно подвержены микробному разложению, но пока не попали в поле зрения микробиологов и биохимиков. Несомненно, что уже создано и продолжает создаваться химической промыш- ленностью много таких веществ, которые трудно разрушаются микроорганизмами, причем это зависит либо от химического строения вещества, либо от того, что оно имеет трудно атакуе- мую микробами форму в результате вторичной промышленной обработки — прессование под большим давлением, полировка поверхности и покрытие ее антикоррозионными материалами. Остановимся кратко на анализе причин и условий проявле- ния биохимической активности микроорганизмов в естественных условиях обитания. Трансформация органических веществ или их микробная деструкция, используемая человеком в процессе народнохозяй- ственной деятельности, становится возможной потому, что мно- гие микроорганизмы способны удовлетворять свои пищевые потребности за счет углерода и азота разнообразнейших орга- нических соединений, в том числе и синтетических, а энергети- ческие за счет утилизации химической энергии, освобождаемой при трансформации либо расщеплении этих органических ве- ществ на более простые. В очистке промышленных сточных вод принимает участие большинство микроорганизмов, способных к гетеротрофному биосинтезу, ибо только они могут разрушать органические ве- щества. Известно, что гетеротрофы в процессе эволюции при- способились к использованию в природе тех естественных орга- нических веществ, с которыми они встречаются в нормальных экологических условиях. Это вещества растительного и живот- ного происхождения разной сложности: углеводы от гексоз и пентоз до целлюлозы, пентозанов, лигнина и хитина; азотистые вещества от аминокислот до полипептидов и прочных фибрил- лярных белков — кератина и коллагена, нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды; липиды и их компоненты от глицерина и жирных кислот до сложных растительных и животных масел, жиров и жироподобных веществ — фосфолипидов, липопротеи- дов и т. д. У значительно меньшего числа микроорганизмов су- ществует приспособленность к потреблению углеводородов нефти, озокерита, битуминозных сланцев, сапропелитов и фено- лов. Они в течение длительного периода времени, охватываю- щего жизнь многочисленных поколений микробов, в нормальных экологических условиях вступали в контакт с этими веществами, совершенно непригодными для всего органического мира ни в 100
качестве источников питания, ни в качестве энергетического ма- териала. Микробы же в процессе эволюции приспособились утилизировать и эти инертные в биохимическом отношении ве- щества. Наиболее широко распространенные в природе органические вещества и предопределяли направление эволюции биохими- ческих процессов в микробном мире. Однако следует указать, что не все приспособительные реакции микроорганизмов, а осо- бенно бактерий, наследственно закреплены и являются след- ствием эволюции. Многочисленные изменения биохимических свойств и даже некоторых физиологических особенностей яв- ляются обратимыми и, по-видимому, представляют собой моди- фикации. Адаптивная изменчивость микрофлоры, так широко известная при очистке промышленных сточных вод, представ- ляется явлением сложным, где безусловно приходится сталки- ваться с проявлением различных категорий изменчивости микро- организмов. Те формы адаптации, где приобретенное свойство закреплено наследственно, образуются в результате мутацион- ной изменчивости и отбора мутантов средой. Часто встречаемая, легко обратимая изменчивость представляет собой модифи- кации. Хотя среди микроорганизмов промышленных стоков постоян- но встречаются эубактерии, низшие формы актиномицетов, микроскопические грибы, или микромицеты, и водоросли, одна- ко в трансформации и деструкции большинства органических ве- ществ и, особенно, синтетических соединений, ведущая роль принадлежит бактериям. Они занимают первое место в ценозах активного ила и биопленки по численности таксонов и штаммов, а возможно и по скорости размножения в специфической вод- ной среде, изобилующей различными токсически действующими химическими соединениями или ингибиторами роста микроорга- низмов. Высшие формы актиномицетов и микромицеты зани- мают подчиненное положение. В этой книге обсуждение вопроса о природе и характере изменчивости микроорганизмов, выполняющих роль санитаров в борьбе с загрязнением воды, касается в основном бактерий. Преобладающее большинство бактерий имеет замкнутую ге- нетическую систему. Кроме того, в онтогенезе бактерий нет диплоидной фазы. Иначе говоря, формы изменчивости бакте- рий, связанные со скрещиванием наследственного материала, у преобладающего большинства гетеротрофных бактерий отсут- ствуют. Исключение составляет кишечная палочка, у которой известна копуляция или парасексуальный процесс, ведущий к необычному скрещиванию с рекомбинацией генетического мате- риала — меромиксису. Следовательно, все рассуждения об изменчивости бактерий относятся к организмам, пребывающим в гаплоидной фазе. Им присуща адаптивная изменчивость — физиолого-биохимические модификации и мутационная измен- 101
чивость. Адаптивную изменчивость бактерий большинство иссле- дователей рассматривает как фенотипическую, не затрагиваю- щую генома, а мутационную — как бесспорно генотипическую. Представление об изменчивости и наследственности бакте- рий нельзя составить без знания некоторых положений молеку- лярной генетики прокариотической клетки. В основе процессов приспособления микробных культур к изменяющимся экологи- ческим условиям лежат изменчивость и наследственность, яв- ляющиеся разделами генетики бактерий. При изложении ци- тологии бактериальной клетки уже рассматривалась структура ДНК и РНК и их роль в жизни клетки. Характерное строение ДНК сохраняется у каждого вида и передается потомству из поколения в поколение, как и другие признаки. ДНК бактерий представляет собой двунитчатую спираль, замыкающуюся в кольцо. Кольчатая нить ДНК бактерий, расположенная в ну- клеоиде, не содержит белка. Такое кольцо ДНК соответствует хромосоме эукариотической клетки. Известно, что в хромосоме эукариотических клеток, кроме ДНК, всегда содержится белко- вый компонент. Отсюда следует, что понятие хромосомы у эукариотов несколько отлично от понятия хромосомы бактерий. Нить ДНК, представляющая собой хромосому бактерий, разу- меется, у разных видов различается. Сахарофосфатный компо- нент ДНК У всех видов бактерий одинаков; расположение азо- тистых оснований и их комбинация, напротив, различаются у разных видов. Наследственные свойства бактерий или отдельные признаки закодированы в единицах наследственности — генах, линейно расположенных в хромосоме вдоль нити ДНК. Следовательно, ген является фрагментом нити ДНК- Каждому признаку соот- ветствует определенный ген, а часто еще меньший отрезок ДНК — кодон. Иначе говоря, в нити ДНК в линейном порядке расположена информация обо всех свойствах бактерий. При этом у бактерий есть еще одна особенность. В ядрах эукариотов содержится обычно несколько хромосом, число их в ядре по- стоянно у каждого вида. Нуклеоид бактерий содержит лишь одно кольцо из нити ДНК, т. е. одну хромосому. Однако запа- сом информации, заключенным в одной хромосоме или в коль- цеобразно сомкнувшейся двунитчатой спирали ДНК, сумма наследственных признаков бактериальной клетки не исчерпы- вается. У многих видов бактерий открыты плазмиды — внехро- мосомные факторы наследственности. Плазмиды содержат ДНК, также несущую генетическую информацию, передаваемую от материнской клетки к дочерней. Репликация. Уже упоминалось, что расположение ну- клеотидов и их комбинация в цепочке ДНК различны у разных видов, но постоянны для каждого вида бактерий. Как же вос- производится постоянство ДНК в пределах вида? Дочерняя клетка должна получить ДНК точно такого же строения, какое 102
имела материнская бактериальная клетка, иначе говоря, ДНК дочерней клетки должна быть точной копией ДНК, принадле- жавшей материнской клетке. Этот процесс аналогичен печата- нию в типографии рисунков с имеющегося цинкового клише или получению фотографического изображения на фотобумаге с го- тового негатива. Процесс воспроизведения нуклеиновой кислоты именуется репликацией ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК комплементарны. На каждой из цепочек спирали может синте- зироваться новая цепочка. Любая из двух новых цепочек ока- зывается комплементарной родительской цепочке. Вновь синте- зированные двойные спирали содержат каждая одну родитель- скую и одну заново образовавшуюся цепочку. Такая репликация ДНК обеспечивает сохранение генетической информации вида. Нуклеиновые кислоты, участвующие в сохранении наследствен- ных свойств клетки и вида микроорганизма, а следовательно, и в передаче этих свойств потомству, принято называть генетиче- скими нуклеиновыми кислотами (ГНК). В отличие от них име- ются нуклеиновые кислоты, не выполняющие генетических функ- ций, но участвующие в других процессах жизнедеятельности. Генетический код. ДНК как носитель наследственно- сти предопределяет и свойства белков, синтезируемых в клетке. Иначе говоря, в ДНК закодированы свойства белков каждого вида микроорганизмов, т. е. присущая им специфичность. Осо- бенности белков, их индивидуальные свойства находятся в за- висимости от последовательности расположения аминокислот, входящих в состав пептидной цепи, которая в свою очередь предопределяется конкретным участком ДНК, состоящим из нескольких пар азотистых оснований, точнее — из нескольких нуклеотидов. То число нуклеотидов, от которых зависит вклю- чение при биосинтезе белка одной аминокислоты, получило название кодона. Один кодон содержит, как правило, три азо- тистых основания. Отсюда термин триплетный кодон, или трип- лет. Аденин, тимин, гуанин и цитозин — это азотистые основа- ния, компоненты ДНК, из которых и состоят кодоны. Например, аденин, тимин, тимин (АТТ); аденин, цитозин, цитозин (АЦЦ) или — гуанин, аденин, цитозин (ГАЦ) и т. п. Кодоны, состоящие из трех азотистых оснований, способны обусловить включение всех 20 аминокислот, входящих в состав белков, в синтезируе- мый полипептид. Последовательный порядок триплетов ГНК предопределяет последовательный порядок аминокислот поли- пептидной цепочки. Если один триплет (кодон) обусловливает включение одной аминокислоты, тогда код называют невырож- денным. Если же включение одной аминокислоты детерминиро- вано несколькими кодонами, код называется вырожденным. Изучены физико-химические свойства ДНК, полученные под влиянием тепловой или щелочной обработки и названные де- натурацией. Двунитчатая спираль ДНК, прогретая при 80—90° и быстро охлажденная, остается разобщенной на две комп- 103
лементарные нити в результате разрушения водородных свя- зей. ДНК остается в денатурированном виде. Если же охлажде- ние ведется медленно в смеси 0,03 М лимоннокислого и 0,3 М хлористого натрия, то разобщенные температурной денатураци- ей (плавлением) две нити ДНК снова объединяются в двунит- чатую спираль (ренатурация), приобретая свойства исходной ДНК вплоть до передачи наследственных свойств по типу транс- формации у бактерий. Опыты по ренатурации ДНК имеют прямое отношение к представлению о механизме изменчивости на молекулярном уровне. При ренатурации цепочки денатурированной (разоб- щенной спирали) ДНК должны быть комплементарными (до- полнительными) друг другу, однако не обязательно, чтобы они были половинками двунитчатой спирали, разделившимися при денатурации молекулы ДНК. Опыты были проведены на двух культурах одного и того же вида, выращенных на различных средах. Одна из культур инкубировалась на среде, содержащей тяжелый изотоп азота 15N. Весь азот этой культуры, включая азот ДНК, был тяжелым изотопом 15N. ДНК обеих культур бы- ла денатурирована и смешана. В ренатурированной ДНК при медленном охлаждении получены «гибридные» молекулы ДНК, у которых одна нить содержит тяжелый изотоп азота. Иссле- дования показали, что подобные гибридные спирали ДНК могут быть получены лишь при ренатурации близкородственных видов бактерий. Удалось получить в процессе ренатурации ДНК, спи- раль которой состояла из одной нити, принадлежавшей кишеч- ной палочке, и комплементарной ей нити дизентерийной бакте- рии. Такие «гибридные» ДНК имеют огромное значение для экспериментального получения новых форм бактерий с нужны- ми свойствами. Итак, функции нуклеиновых кислот в микробной клетке диф- ференцированы. Даже ДНК клетки не все принадлежат к ГНК. Не говоря о том, что у вирусов роль ГНК выполняют двухце- почечные РНК и одноцепочечные ДНК и РНК. Двухцепочные ДНК по своим свойствам и структуре принадлежат к соединениям более устойчивым и консервативным, поэтому отобраны эволю- цией для хранения наследственной информации. Клетка как бы экономит ДНК, привлекая для выполнения различных функций более подвижные, динамичные нуклеиновые кислоты —РНК. Транскрипция. ДНК служит шаблоном, с которого ко- пируются синтезируемые соединения. Но синтез белков про- исходит без непосредственного участия ДНК- Белки синтези- руются в клеточных рибосомах, а ДНК в рибосомах не содер- жится. Информация передается от ДНК к рибосомам — центрам синтеза белков — посредством информационной рибонуклеино- вой кислоты или матричной РНК, обозначаемой мРНК. Копи- рование (считывание информации с ДНК) представляется в следующем виде. На ДНК строится мРНК- Переписывание ин- 104
формации с ДНК на мРНК называется транскрипцией. Разу- меется, процесс копирования, построения мРНК относится к метаболическим процессам, идущим с участием ферментов, в данном случае с участием РНК-полимеразы. мРНК синтези- руется на одной из цепочек ДНК и комплементарна ей, однако отличается тем, что вместо тимина ДНК в цепи РНК стоит ура- цил. Расположение нуклеотидов в мРНК (их последователь- ность) предопределяется порядком расположения их в ДНК. Итак, в комплементарной мРНК против аденина расположен урацил, против тимина — аденин, против цитозина — гуанин, против гуанина — цитозин. В переносе информации от ДНК к рибосомам принимает участие особая рибонуклеиновая кисло- та— транспортная РНК (тРНК), характеризующаяся большой подвижностью. тРНК обладает относительно небольшим моле- кулярным весом, растворимостью и в связи с этим большей подвижностью, чем мРНК- Третий тип РНК, имеющийся в бак- териальных клетках — рибосомальная (рРНК), концентрирую- щаяся в местах синтеза белков — рибосомах. Помимо трех ти- пов РНК насчитывают несколько тысяч молекулярных видов мРНК и до 60 видов тРНК. Это все РНК с различающейся молекулярной массой. Общее количество РНК в бактериальных клетках значительно больше, чем ДНК. При этом ДНК кон- центрируется в нуклеоидах, РНК — в цитоплазме. У бактерий, имеющих плазмиды, плазмидная ДНК находится в цитоплазме. Биологический синтез белка представляет собой сложный, многофазный или многоступенчатый процесс. Помимо РНК в синтезе белков принимают участие многочисленные ферменты. На первой ступени активируются аминокислоты, соединяющие- ся потом в пептидные цепочки. Вторая ступень — транспорт ак- тивированных аминокислот к рибосомам. Третья ступень пред- ставляет собой упорядочение и сочетание инициированных ами- нокислот и расположение их в необходимой последовательности на матричной РНК с последующим замыканием пептидных свя- зей. Четвертая ступень — формирование из линейной молекулы объемной структуры, свойственной данному белку. Повышение реакционной способности, активация аминокислот увеличивает возможности взаимодействия их друг с другом; осуществляется этот процесс при взаимодействии аминокислот с аденозинтри- фосфорной кислотой (АТФ). При этом происходит передача энергии одной макроэргической связи АТФ на аминокислоту, переходящую на более высокий энергетический уровень. Реак- ция активации аминокислот протекает с участием фермента аминоацил-РНК-синтетазы. Для активации различных амино- кислот необходимы разные ферменты — синтетазы. Аминоки- слотная последовательность при синтезе осуществляется кодона- ми (фрагментами цепи ДНК). Таким образом, тРНК переносит активированную амино- кислоту с повышенным запасом энергии к рибосоме на рРНК, 105
где идет конструирование молекул белка, но а нем участвует и иРНК, являющаяся посредником между ДНК нуклеотида и рибосомой, в которой идет синтез белка; иРНК, построенная на ДНК, полностью отражает в своем расположении нуклеоти- дов порядок нуклеотидов в ДНК- Академиком А. С Спириным установлено, что РНК из нуклеоида поступает в рибосомы в ви- де соединения с белком. Эти частицы названы информасомами. В такой форме мРНК и служит матрицей для синтеза белка. Итак, мРНК как бы проходит через рибосому, одним фрагмен- том своей молекулы она расположена на рибосоме Предполо- жим, что в центре рибосомы находится кодон мРНК УГУ. К центру рибосомы подходит тРНК с аминокислотой цистеи- ном. В цепочке тРНК есть фрагмент нуклеотидов АЦА, комп- лементарный последовательности УГУ цепочки мРНК- При комплементарном взаимодействии образуются водородные связи между кодоном УГУ мРНК и антикодоном АЦА тРНК. При этом тРНК, присоединяясь к мРНК, ориентирует доставленную аминокислоту так, что она посредством полимеризующего фер- мента присоединяется к формирующейся белковой цепи В при- веденном примере цистеин присоединяется к пролину, прежде доставленному на соседний кодон ЦЦЦ в мРНК посредством тРНК, содержащей в своей цепочке комплементарный антико- дон ГГГ. Если представить себе движение РНК через рибосому слева направо, то тРНК, отдав аминокислоту пролин, выйдет из рибосомы вправо, чтобы начать снова процесс доставки про- лина в рибосому для передачи на мРНК. Если следующий сле- ва кодон ГУУ, то к нему может присоединиться только тРНК, доставляющая валин. Каждому кодону (триплету) соответ- ствует своя аминокислота Из сказанного можно заключить, что основным регулятором построения белка является ДНК, поскольку она в соответствии со своей структурой синтезирует мРНК, на которой формирует- ся белок. Самые незначительные изменения в структуре ДНК, возникающие в результате спонтанной или индуцированной му- тации, неизбежно скажутся на строении мРНК, а матричная (информационная) РНК передаст эти изменения формирую- щейся на ней цепочке белковой молекулы. Таким образом, вы- ясняется механизм корреляционной связи между изменением (заменой или выпадением) нуклеотидов в составе кодонов или триплетов ДНК и изменениями в структуре белков, а следова- тельно и в свойствах клетки, в ее наследственности. Изменения в структуре отдельных фрагментов ДНК генов могут про- исходить в результате различных воздействий внешних факто- ров— мутагенов (см. «Мутации и мутагенез»). Выяснено, что иногда наблюдаются в «работе» триплетов «ошибки». Трип- лет (кодон) вместо свойственной ему аминокислоты, включает в белковую цепь несвойственную ему аминокислоту, что при- водит к изменению свойства белка, а следовательно, и свой- 106
ства клетки. Структурные гены ДНК, формирующие мРНК, переходящую из нуклеоидов в цитоплазму и взаимодействую- щую с рибосомой и тРНК, служат матрицей для синте- за белков; в той же цепи ДНК есть фрагменты, именуемые «ген-регулятор» и «ген-оператор». Они сами не образуют иРНК, но влияют на ее образование «структурными генами». Эти сведения о биосинтезе белка и об интимном механизме измен- чивости на молекулярном уровне позволяют яснее видеть на- следственную генотипическую изменчивость и возможные ре- зультаты фенотипической изменчивости бактерий. Трансформация. Явление трансформации — изменения наследственных признаков у бактерий под влиянием чужерод- ной ДНК — впервые наблюдал Гриффитс в 1928 г. Он заражал мышей Streptococcus pneumoniae или пневмококком. Пневмокок- ки вызывают воспаление легких и патогенны как для человека, так и для мышей. Вирулентные, т. е. способные вызвать забо- левание, пневмококки образуют капсулу и являются S-вариан- тами, дающими на питательной среде гладкие колонии. Авиру- лентные, безвредные, пневмококки не имеют капсулы и отно- сятся к R-типу, образующему шероховатые колонии. Гриффитс вводил мышам культуру живых авирулентных пневмококков в смеси с убитыми нагреванием вирулентными, в результате чего большинство животных погибало. Из крови погибших мышей были выделены вирулентные капсульные пневмококки. В даль- нейшем было показано, что процесс трансформации возможен не только в опытах in vivo (в живом организме), но и in vitro (в пробирке), получены существенные доказательства того, что трансформирующим фактором является высокополимерная ДНК- Оказалось, что единственным ферментом, прекращаю- щим процесс трансформации, является ДНКаза, расщепляющая ДНК. Для осуществления трансформации необходимо соблюде- ние ряда условий. Так, клетки-реципиенты, т. е. клетки, кото- рые воспринимают трансформирующую ДНК, могут включить в геном двухнитевую молекулу ДНК с молекулярным весом не менее 3—5Х 10s. Таким образом процесс восприятия ДНК вы- сокоспецифичен. Трансформируемость не зависит от характера трансформируемого признака, а лишь от способности клеток- реципиентов к восприятию ДНК, которую называют компетент- ностью. Компетентность связана с повышенной проницаемостью клеточной стенки для молекул ДНК, а также синтезом специ- фических рецепторов на поверхности клетки. Через некоторое время после так называемого эклипс-периода проникшая в клет- ку ДНК спаривается с гомологичным участком ДНК клетки- реципиента и происходит обмен участками цепей донорской и реципиентной ДНК с включением трансформирующей ДНК в геном клетки-реципиента (интеграция). Известен перенос путем трансформации как одного, так и двух признаков, причем он может осуществляться разными фрагментами ДНК. ". рансфор- 107
мация бывает внутри- и межвидовая. В последнем случае она наблюдается у близкородственных видов. В настоящее время с помощью ДНК У бактерий трансфор- мированы следующие признаки: капсульные и поверхностно-со- матические антигены, резистентность к антибиотикам и некото- рым другим веществам, способность синтезировать различные аминокислоты и другие факторы роста, способность использо- вать углеводы. Полагают также, что трансформация бактерий может происходить в природе, приводя к формированию попу- ляций с атипичными признаками. Трансдукция. Трансдукция — это перенос генетическо- го материала от бактерии-донора к бактерии-реципиенту с по- мощью фага. Впервые явление трансдукции было открыто в 1951 г. Ледербергом с сотрудниками у Salmonella typhimurium. Сейчас различают неспецифическую и специфическую трансдук- ции. При неспецифической трансдукции возможен перенос фагом любого признака от бактерии-донора к бактерии-реципиенту. Перенос осуществляется только умеренными (невирулентными) фагами. Умеренные фаги способны заражать бактерии, однако не размножаются в них и не вызывают лизиса, а включаются в ДНК бактериальной клетки и в таком неинфекционном со- стоянии в виде так называемого профага передаются от клетки к клетке при размножении. Культуры бактерий, содержащие профаг, называются лизогенными. В этих культурах с неболь- шой частотой (в одной из 102 — 105 клеток) наблюдается спон- танное размножение фага и происходит лизис клетки с осво- бождением фаговых частиц, обнаруживаемых с помощью бакте- рий-индикаторов, для которых такой фаг вирулентен. Явление неспецифической трансдукции можно представить на следующем примере. Если инфицировать фагом Р-22 штамм- донор S. typhimurium, обладающий определенными признаками, а затем подействовать полученным лизатом на лизогенный для этого фага штамм-реципиент той же бактерии, не имеющий этих признаков, то среди клеток реципиента обнаруживаются особи, обладающие одним из признаков донора. При этом к раз- ным клеткам могут переноситься различные признаки. Считают, что отдельные частицы фага Р-22, вирулентного для донора, размножаясь в клетке, захватывают фрагменты бактериальной ДНК- Попадая в клетки лизогенного для фага Р-22 штамма-ре- ципиента, эти частицы, включаясь в ДНК, переносят призна- ки, закодированные на таких фрагментах. Включение (интегра- ция) трансдуцируемого участка ДНК в хромосому реципиента происходит по типу «разрыв-воссоединение». Обычно перено- симые фрагменты довольно короткие из-за небольших размеров частицы фага. Поэтому, как правило, в клетку-реципиент пере- носится, в отличие от процесса трансформации, только один признак. Попадание двух частиц фага, несущих различные ге- ны, в одну и ту же клетку мало вероятно. Если же при транс- 108
дукции переносятся два признака, это свидетельствует о том, что гены, ответственные за данные признаки, расположены в близком соседстве на хромосоме, что используют для опреде- ления локализации генов при составлении хромосомных карт. Фаги, несущие участки бактериальной ДНК, дефектны, так как фаговая частица не может содержать и ДНК бактерии, и свою собственную. Наряду с неспецифической существует специфическая транс- дукция. Например, фаг X всегда располагается на хромосоме бактерии-донора по соседству с геном, ответственным за синтез р-галактозидазы, и специфически переносит этот ген в клетки реципиента, неспособные синтезировать данный фермент. Выде- ляют еще абортивную трансдукцию, когда трансдуцированный участок ДНК не интегрируется в клетке и не реплицируется. Наличие его устанавливают, благодаря обнаружению продукта, за образование которого отвечает данный ген. При размножении культуры наблюдается разбавление этого продукта, поскольку клетки не передают трансдуцированный ген друг другу. По этому признаку и определяют характер происшедшей транс- дукции. С помощью трансдукции переносятся способность сбражи- вать различные углеводы, резистентность к антибиотикам, пе- нициллиназная активность, спорообразование и другие призна- ки. Процесс трансдукции, по-видимому, играет важную роль в природе, приводя к появлению штаммов бактерий с атипичны- ми свойствами. В пользу этого предположения говорит частое выделение из природных источников умеренных фагов, способ- ных вызывать трансдукцию. Конъюгация — представляет перенос генетического ма- териала от клетки к клетке при их контакте. Это явление было открыто Ледербергом и Татумом в 1946 г. Они смешали два ауксотрофных мутанта Е. coli К 12, каждый из которых был не- способен к синтезу разных аминокислот и витаминов. Смесь вы- сеяли на питательную среду, не содержащую этих веществ. На среде выросли прототрофные колонии, способные самостоятель- но синтезировать все витамины и аминокислоты, по которым были ауксотрофны взятые в опыт мутанты. Эти колонии появи- лись в результате рекомбинации генов между родительскими штаммами. Частота появления прототрофных рекомбинантов была 10-е. Необходимым условием рекомбинации является осу- ществление непосредственного контакта между клетками роди- тельских штаммов. В дальнейшем получены электронные мик- рофотографии спаривающихся клеток, между которыми обра- зовался цитоплазматический мостик. Показано, что в процессе конъюгации оба штамма неравноценны, и генетический мате- риал переносится односторонне, т. е. всегда от одного штамма, который условно обозначили F+ (от англ, fertility — плодови- тость), к другому, обозначенному F-. Штаммы-доноры стали 109
считать мужскими, штаммы-реципиенты — женскими. Оказа- лось, что доноры бывают двух типов. Наряду с обычными F+, обеспечивающими рекомбинации с низкой частотой, существуют штаммы-доноры, дающие высокую частоту рекомбинаций — по- рядка 10~' — 10~3. Эти штаммы называют Hfr (от англ, high frequency of recombination). Полагают, что фактор F представляет собой фрагмент ДНК и является плазмидой, причем в клетках F эта плазмида авто- номна, в то время как в клетках Hfr она включена в хромосому. Это предположение подтверждается тем, что при обработке кле- ток F акридиновым оранжевым плазмида F утрачивается, но тот же краситель не оказывает действия на клетки Hfr. Особен- ностью донорных клеток является наличие на их поверхности выростов, которые называют F-пилями, играющих роль в конъюгации, в процессе которой происходит спаривание клеток при помощи F-иилей. В свою очередь ДНК плазмиды F внед- ряется в хромосому клетки-донора и разрывает ее кольцевую структуру. Затем линейный участок ДНК, оканчивающийся отрезком, соответствующим ДНК плазмиды F, внедряется в клетку-реципиент. При этом участок ДНК плазмиды F редко попадает в реципиентную бактерию. В результате конъюгации образуется зигота. Донорская ДНК в зиготе может интегри- роваться в хромосому реципиента, а также реплицироваться независимо от генома реципиентной клетки. Полагают, что ме- ханизм интеграции представляет собой «разрыв — воссоедине- ние». Процесс конъюгации очевидно распространен в природе. В результате обмена генетическим материалом вследствие конъюгации появляются штаммы бактерий, обладающие ати- пичными признаками. Мутации и мутагенез. Исследования по изменчиво- сти и селекции микроорганизмов в связи с развитием учения об антибиотиках стимулировало развитие работ по мутагенезу про- дуцентов витаминов, антибиотиков, ферментов и других био- логически активных веществ. Микробиологи-селекционеры привлекали все известные методы изыскания новых форм микроорганизмов с повышенной биохимической активностью. Приспособление бактерий к разрушению нового синтетического органического соединения, не встречавшегося ранее в природе, требует от бактериальных клеток синтеза новых ферментов, т. е. изменения в генотипе. Генотипическая изменчивость наслед- ственна. Под генотипом бактерий подразумевают всю совокупность генов бактериальной клетки, тогда как совокупность опре- деляемых этими генами внешних морфолого-культуральных при- знаков бактерий (вида) в строго определенных условиях суще- ствования называется фенотипом С изменением условий фено- типические признаки могут значительно изменяться Это осо- 110
бенно заметно у бактерий-деструкторов, которым посвящена настоящая книга, при пересевах с универсальных питательных сред МПБ, МПА, сусло-агара на синтетические среды, где единственным источником углерода служат ПАВ, капролактам, ГМД и другие синтетические соединения. Фенотипическая из- менчивость по наследству не передается. Мутации — это изменения в генном аппарате клетки, которые сопровождаются изменениями контролируемых этими генами признаков. Различают макро- и микроповреждения ДНК, веду- щие к изменению свойств клетки. Макроизменения, а именно: выпадение участка ДНК (деления), перемещение отдельного участка (транслокация) или поворот определенного участка молекулы на 180° (инверсия) —у бактерий наблюдаются срав- нительно редко Гораздо более характерны для них микропов- реждения, или точечные мутации, т. е. качественные изменения в отдельных генах, например замена пары азотистых основа- ний. Мутации бывают прямые и обратные, или реверсивные. Прямые — это мутации организмов дикого типа, например утра- та способности самостоятельно синтезировать факторы роста, т. е. переход от прото- к ауксотрофности. Обратные мутации представляют собой возвращение, или реверсию, к дикому типу. Способность к реверсии характерна для точечных мутаций. В результате мутаций изменяются такие важнейшие признаки, как способность самостоятельно синтезировать аминокислоты и витамины (ауксотрофные мутанты), способность к образова- нию ферментов. Эти мутации называют биохимическими. Хо- рошо известны также мутации, ведущие к изменению чувстви- тельности к антибиотикам и другим антимикробным веществам. По происхождению мутации разделяют на спонтанные и инду- цированные. Спонтанные возникают самопроизвольно без вме- шательства человека и носят случайный характер. Частота та- ких мутаций очень низка и составляет от 1 X Ю~4 до 1 X 10_|°. Индуцированные возникают при воздействии на микроорганиз- мы физических или химических мутагенных факторов. К физи- ческим факторам, обладающим мутагенным действием, относят- ся ультрафиолетовое и ионизирующие излучения, а также тем- пература. Химическими мутагенами являются ряд соединений и среди них наиболее активны так называемые супермутагены. В природных условиях и эксперименте изменения в составе бактериальных популяций могут возникать в результате дей- ствия двух факторов — мутаций и автоселекции, происходящей в результате адаптации некоторых мутантов к условиям среды обитания. Такой процесс, очевидно, наблюдается в среде, где преобладающим источником питания является синтетическое ве- щество, например, ПАВ или капролактам. Автор химических супермутагенов И. А. Рапопорт предлага- ет использовать мутагенную селекцию для получения штаммов микроорганизмов, способных разлагать синтетические соединения 111
в сточных водах химических предприятий [214]. Для реше- ния этой задачи работу следует проводить в трех направлениях: 1) сообщать известному виду или видам микроорганизмов способность разрушать химическое вещество отдельно либо с его естественными аналогами; 2) повышать уже присущее микроорганизму свойство разла- гать некоторые вещества; 3) повышать способность к очистке смешанной популяции, состоящей из небольшого числа видов. Автор рекомендует проверять полученные активные штаммы и смешанные культуры в природных условиях и считает наи- более перспективным использование супермутагенов — N-нитро- зоалкилмочевин, этилениминов и диалкилсульфатов. Плазмиды бактерий. Генетическая информация бак- терий не ограничивается ДНК, расположенной в нуклеоиде бак- териальной клетки. Как уже отмечалось в предыдущих разде- лах книги, носителями наследственных свойств служат также внехромосомные элементы, получившие общее название плаз- мид. В отличие от ДНК ядерных эквивалентов-нуклеоидов, яв- ляющихся органоидами бактериальной клетки, плазмиды пред- ставляют собой независимые генетические элементы. Потеря плазмид или их приобретение не отражается на биологии клет- ки (приобретение плазмид оказывает положительное влияние лишь на популяцию в целом, повышая жизнеспособность вида). Свойство плазмид передаваться от одной клетки к другой по- ложено в основу деления плазмид на группы: 1) трансмиссив- ные, или конъюгативные (инфекциозные), и 2) нетрансмиссив- ные, или неконъюгативные (неинфекциозные). К трансмиссив- ным относят плазмиды, инициирующие свойства доноров у клеток-хозяев. При этом последние получают новое качество — возможность конъюгировать с клетками-реципиентами и отда- вать им свои плазмиды. Клетки-реципиенты, приобретая во вре- мя конъюгации плазмиды, сами превращаются в доноров. Учение о внехромосомной наследственности бактерий имеет возраст уже более четверти столетия, однако сам термин «плаз- миды» получил распространение лишь в 60—70-х годах, хотя был предложен Ледербергом еще в 1952 г. До этого плазмиды фигурировали в литературе под названиями, присвоенными группам плазмид, обладающих идентичными функциями, либо под общим названием «эписомы». В предыдущем разделе упоминались F-факторы, которые называются еще конъюгативными плазмидами за то, что они способны, попадая в бактериальную клетку, передавать ей свой- ства донора. Этим они как бы обеспечивают собственный перенос из клетки, уже «инфицированной» секс-фактором, в другую клетку — реципиент, еще не имеющую этой плазмиды. Конъюга- тивные плазмиды принадлежат к группе наиболее полно изу- ченных. Плазмидная ДНК представляет собой ковалентно П2
замкнутую кольцеобразную цепь нуклеотидов. Выяснено суще- ствование плазмид, ингибирующих F-фактор, а также несовме- стимых с другими, введенными в одну и ту же клетку. Дока- зано удвоение числа плазмид репликацией, а также возможность присутствия в одной бактериальной клетке не только двух, но и большего числа плазмид. При исследовании полового фактора были получены плазмидные мутанты, известные теперь также и у R-факторов. По-видимому, мутации возможны у всех плаз- мид. Колициногенные факторы. Они называются так в связи с их свойством детерминировать образование культурами Escherichia coli особого рода антагонистических веществ — колицинов, способных поддерживать или выявлять антагонизм между родственными бактериями. Колицинами эти агенты на- зывались до тех пор, пока в качестве их продуцентов была из- вестна только Escherichia coli. Позже, когда обнаружили, что аналогичные белковые вещества продуцируются и многими дру- гими видами бактерий (Shigella sonnei, Salmonella typhimu- rium, S. typhi, параколи, клебсиеллами), термин колицины был заменен термином бактериоцины, а плазмиды, обусловливаю- щие их образование, получили название бактериоцинов. Коли- циногенные факторы сокращенно обозначаются как колфакторы (Col-факторы). В связи с тем, что они вызывают синтез раз- личающихся между собой колицинов, помечаемых заглавными буквами — А, В, D, I, К — идентичные обозначения введены и для колициногенных факторов: col A, col В, col К и т. п. R-факторы. Первоначально возникающую у бактерий устойчивость к антибиотикам и другим лекарственным вещест- вам называли «привыканием». Затем выяснилось, что появление резистентности бактерий к лекарственным препаратам связано с изменением в геноме и представляет собой наследственное яв- ление. Обнаружена устойчивость одной и той же культуры бак- терий к нескольким лекарственным веществам — множественная устойчивость — и показано наличие у резистентных к антибио- тикам бактерий фактора резистентности, обладающего транс- миссивностью. Для обозначения этого фактора в начале 60-х годов был предложен символ R (англ. Resistance). Позже дока- зано, что R-фактор представляет собой плазмиду, передающую- ся при конъюгации от одного поколения к другому. R-фдкто- ры — комплексное образование, состоящее из секс-фактора, отвечающего за перенос, и генома, детерминирующего лекар- ственную устойчивость. В этом случае он называется «фактором переноса резистентности» или RTF — (от англ, resistance trans- fer factor). Вместе с колициногенными факторами генетические элемен- ты — F- и R-факторы с 30-х и до конца 60-х годов назывались эписомами (от греч. epi — над, сверх; soma — тело). Исследо- вания бактериальных эписом в СССР получили широкое 8 8—616 113
развитие в медицинской микробиологии [153]. В настоящее вре- мя самостоятельные генетические элементы бактериальной клет- ки, существующие независимо от хромосомы, называются плаз- мидами. Часть известных плазмид остаются свободными в клет- ке, часть может встраиваться в хромосому и существует в интег- рированном состоянии с хромосомой бактерии. Эти последние сохранили за собой название эписом. К эписомам относятся и умеренные фаги, генетические элементы которых встраиваются в хромосому бактерии-хозяина; в таком, интегрированном с хро- мосомой, виде геном умеренного фага именуется профагом [153]. Известны плазмиды, контролирующие патогенные свой- ства кишечных палочек [Ent] и гемолитические свойства [Н1у]. Наибольший интерес в аспекте использования бактерий для охраны окружающей среды представляют сведения о наличии у бактерий родов Pseudomonas и Bacillus плазмид, кодирующих разрушение различных органических веществ; они названы плазмидами деградации. Известны плазмиды культуры Ps. pu- tida, метаболирующей камфору, октанол и нафталин; они обоз- начены в литературе индексами Cam, ОСТ и NAH. Род Pseudomonas принадлежит к наиболее высокоактивным бактериям-деструкторам. Назрела необходимость изучения его плазмид. Методами генной инженерии, возможно, удастся про- извести реконструкцию этих культур с целью получения штам- мов, объединяющих в клетках популяции плазмиды, кодирую- щие одновременно разрушение красителей и поверхностно-актив- ных веществ (ПАВ); интересно было бы получить культуру Bacillus subtilis с плазмидами, детерминирующими разрушение капролактама и ПАВ, либо гексаметилендиамина, весьма ток- сичного отхода амидного производства, и ПАВ. Проблема полу- чения бактериальных штаммов-деструкторов целых комплексов загрязнителей воды имеет огромное народнохозяйственное зна- чение. Заканчивая раздел изменчивости и генетики бактерий, мы подчеркиваем, что отнюдь не считаем возможным все формы изменчивости бактерий в интересующем нас аспекте свести к мутационной изменчивости в геноме. Синтетические соединения могут служить факторами адаптации [123] и привести культуру бактерий к фенотипической изменчивости, сопровождаемой пе- рестройкой ферментного аппарата, дающей микробной попу- ляции возможность использовать новое синтетическое соедине- ние, несмотря на то, что свойство это наследственно и не за- креплено.
ГЛАВА II МИКРООРГАНИЗМЫ В ОЧИСТКЕ СТОЧНЫХ вод ОЧИСТНЫЕ СООРУЖЕНИЯ И МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ИХ РАБОТЫ Биологические методы очистки вод, загрязненных бытовыми и промышленными отходами, применяются уже около 70 лет. Преимуществом биологических методов перед многими хими- ческими и физико-химическими является полная минерализация органического материала. Наиболее простой способ очистки сточных вод состоит в использовании почвенных методов очист- ки на полях фильтрации и полях орошения. Поля фильтрации представляют собой хорошо дренирован- ные участки, желательно с легкими песчаными почвами. Отве- денная на такие поля сточная жидкость медленно фильтруется через грунт. При этом от воды отделяются взвешенные веще- ства и происходит разложение органических соединений за счет жизнедеятельности микробов. В деструкции органических сое- динений принимают участие почвенная микрофлора и микро- организмы, попавшие в почву вместе со сточной водой. В на- стоящее время этот метод становится весьма неэкономичным, так как поля фильтрации занимают значительные земельные площади, которые могли бы использоваться для выращивания сельскохозяйственных растений. В этом отношении более вы- годны поля орошения, отличающиеся тем, что определенную часть года они фильтруют загрязненную воду и накапливают удобряющие вещества, а затем засеваются полевыми, овощны- ми и другими культурами. Их пропускная способность для сточной жидкости ниже, однако с таких удобренных участков удается получать большие урожаи. Кроме органических ве- ществ, поля фильтрации и орошения отделяют от очищаемой воды взвешенные в ней микроорганизмы. Количество адсорби- рованных почвой микробов достигает 99,8% первоначального их числа в сточной жидкости [36]. Наряду с сапрофитами в почву при очистке стоков могут попадать болезнетворные и факультативно патогенные формы. Раньше считалось, что эти организмы, не находя благоприятных условий для существова- ния, вскоре погибают. Однако сейчас взгляды на строгую 8* 115
специализацию патогенных бактерий изменились — из почвы вы- деляют сапрофитные и фитопатогенные бактерии сем. Ente- robacteriaceae [37], вирулентность обнаружена у микроорганиз- мов, которые ранее считались безвредными [100]. С этой точки зрения поля фильтрации, очищающие сточную воду с высоким содержанием микроорганизмов, в особенности бытовые стоки, представляют эпидемиологическую угрозу для населения. По- видимому, опасно также использовать поля орошения для вы- ращивания овощей, которые загрязняются почвой, возможно содержащей болезнетворные бактерии и вирусы. Это — сущест- венный недостаток данного метода очистки. Еще одним недо- статком является неприятный гнилостный запах в районе очист- ных сооружений при микробном разложении белковых веществ, содержащихся в хозяйственно-фекальных и многих промышлен- ных стоках. Поля орошения и фильтрации используют чаще всего для очистки сточных вод предприятий пищевой промыш- ленности. Для очистки сточных вод служат также окислительные пру- ды. Это естественные или искусственные неглубокие водоемы, в которых осуществляется деструкция органических веществ ана- логично процессам самоочищения в природных водах. Очистные пруды могут быть обычными и с искусственной аэрацией. В не- аэрируемых прудах окисление органических загрязнений мик- роорганизмами происходит за счет растворенного в воде кисло- рода. Их малая глубина способствует хорошему прогреванию и освещенности воды солнечными лучами, в результате чего интенсивно развиваются планктонные водоросли и донные выс- шие растения. Растительные организмы питаются неоргани- ческими продуктами микробного метаболизма и, в свою очередь, снабжают микроорганизмы кислородом, образующимся в про- цессе фотосинтеза. В последние годы водорослям отводится важная роль в процессах самоочищения водоемов, а в ряде стран проводятся исследования по выращиванию на сточных во- дах водорослей родов Clorella и Scenedesmus с целью получе- ния кормового белка и биологически активных веществ [35]. Аэрируемые пруды в 5— 10 раз эффективнее обычных. Повыше- ние количества растворенного в воде кислорода достигается с помощью механических аэрирующих устройств. Поля фильтрации, орошения и окислительные пруды отли- чаются сравнительно небольшой производительностью. Поэто- му в больших городах и на крупных промышленных предприя- тиях используются специальные очистные сооружения. Суще- ствуют аэробные и анаэробные методы очистки. К аэробным относится очистка с помощью активного ила и биофильтро- вание. Активный ил, представляющий собой сложный биоценоз, на- ращивается и используется для очистки сточной воды в искус- ственных железобетонных бассейнах, называемых аэротенками. 116
В аэротенки подается сточная жидкость, прошедшая предвари- тельную обработку — тяжелые частицы удаляются в песколов- ках, дальнейшее отделение взвешенных веществ осуществляется в первичных отстойниках. Активный ил получают, аэрируя без протока бытовую сточную жидкость до появления хлопьев, ко- торые обычно образуются через двое-трое суток. Затем включа- ют проток. Достаточное для работы количество активного ила накапливается за период от двух недель до нескольких месяцев в зависимости от времени года. В отсутствие хозяйственно-бы- товых стоков при пуске очистных станций на предприятиях в качестве источника микроорганизмов для получения активного ила можно использовать почву или донный ил естественных во- доемов. Хорошие результаты дает наращивание специфическо- го, приспособленного к характеру загрязнений активного ила при продувании воздухом промышленных сточных вод [408]. Процесс окисления органических веществ стока происходит в две стадии. Первая — сорбция загрязнений — осуществляется в момент смешивания сточной жидкости с активным илом. Одно- временно начинается вторая — процесс окисления сорбирован- ного материала. Первую стадию можно проводить в отдельных резервуарах — камерах биокоагуляции, куда добавляют актив- ный ил из вторичных отстойников. После продувания воздухом в таких камерах сточная жидкость подается в первичные отстой- ники. Эффективность работы первичных отстойников повышает- ся также при использовании предварительной аэрации сточной воды в специальных сооружениях — преаэраторах. Если очистке подлежат промышленные сточные воды, высоко концентриро- ванные или содержащие токсические компоненты, то перед аэро- тенками строят бассейны-усреднители, чтобы избежать губи- тельного действия резких колебаний состава промышленных стоков на активный ил. Аэротенки могут быть различной конструкции [85, 86, 135]. Обычно это длинные 2 — 4-коридорные проточные резервуары глубиной 3 — 6 м, снабженные механическим или пневматиче- ским устройством для аэрации — пористыми керамическими пластинами, металлическими трубами с отверстиями, через кото- 117
рые подается воздух, или механическими мешалками разного типа (рис. 29). Сточная вода, смешанная с активным илом, так называемая иловая смесь, протекает через аэротенк. В это время и происходит окисление большей части органических загрязне- ний, в результате чего вода очищается. После аэротенка смесь поступает во вторичный отстойник, где ил оседает и отделяется от воды, которая после обеззараживания может быть сброшена в водоем. Избыток активного ила удаляется, а часть его после регенерации снова возвращается в аэротенк. Регенерация про- исходит в одном из коридоров аэротенка и состоит в усиленной аэрации ила для завершения процесса окисления сорбирован- ных органических веществ и восстановления его сорбционной способности. Наряду с сооружениями, в которых сточная вода не смеши- вается сразу с жидкостью, находящейся в аэротенке, существуют аэротенки со ступенчатым впуском сточных вод, аэротенки- смесители. Разработаны аэротенки-отстойники, аэротенки-освет- лители и другие. Аэротенк-осветлитель оригинальной конст- рукции, обеспечивающий хорошее отделение ила от очищенной воды, независимо от его физико-химических свойств, предложен сотрудниками Научно-исследовательского конструкторско-техно- логического института городского хозяйства МКХ УССР [107]. Биофильтры по своей производительности уступают аэротен- кам. Они представляют собой сооружения, заполненные круп- нозернистой загрузкой, на которой и развиваются микроорга- низмы, образуя биопленку. В качестве наполнителя используют различные материалы, которые должны быть устойчивыми к разрушению и безвредными для микроорганизмов. Различают биофильтры высоконагружаемые и слабонагружаемые, или ка- пельные. Высоконагружаемые предусматривают очистку боль- ших объемов сточных вод с достаточно высокой концентрацией загрязнений. Они в 10—15 раз более производительны, но не обеспечивают полной очистки сточной жидкости. В слабона- гружаемых достигается полная очистка, но производительность их низка. Эти сооружения рекомендуется использовать для очистки небольших объемов сточных вод с невысокой концентра- цией загрязнений. В капельных биофильтрах применяется ес- тественная вентиляция, которая осуществляется за счет перепа- да температур сточной воды и внешнего воздуха. Если темпе- ратура внутри фильтра выше, чем снаружи, поток воздуха поступает снизу вверх. При более высокой внешней температуре происходит обратное движение. Высота капельных биофильтров обычно не превышает двух метров, отношение диаметра к вы- соте больше единицы. Подача сточной жидкости на эти фильтры осуществляется с такой скоростью, при которой частицы био- пленки не смываются, поэтому минерализация отмерших клеток происходит здесь же, на фильтре. Очищенная вода прозрачна и может сразу сбрасываться в водоем. 118
Высоконагружаемые биофильтры достигают 4 м высоты. В них применяется как естественная, так и искусственная вен- тиляция. Сточная вода подается со значительной скоростью, при которой смываются и выносятся верхние слои биопленки, поэтому выходящая из сооружения вода непрозрачна и требует отстаивания во вторичных отстойниках. Конструктивно высоко- нагружаемые и капельные биофильтры практически не отли- чаются. Схема такого сооружения представлена на рис. 30. Помимо высоконагружаемых и капельных иногда применяются башенные фильтры, у которых высота в несколько раз больше диаметра. Время контакта сточной воды с биопленкой зависит от состава стока, его концентрации, температуры и других фак- торов, а также конструкции сооружения. Биофильтры имеют ряд недостатков по сравнению с аэротен- ками. Кроме более низкой производительности, это так назы- ваемое заиливание, которое происходит в результате чрезмер- ного разрастания биопленки и уменьшения пространства между частицами загрузки. Такое явление наблюдается при повыше- нии концентрации подаваемых на очистку стоков и делает не- обходимым их предварительное разбавление. Биопленка не пе- реносит перерывов в орошении и требует постоянного увлажне- ния. Поэтому биофильтры должны использоваться непрерывно, иначе сооружение выходит из строя и пленку приходится на- ращивать заново. Обычно ее получают, орошая загрузку сточ- ной жидкостью. Время, необходимое для образования пленки, т. е. период созревания фильтра, составляет 30 — 50 дней. Иног- да, если пленка чрезмерно разрослась, в работе фильтра спе- циально делают перерыв для частичного ее отмирания, для этого можно применять и другие меры. Заиливание наблюдается также при подаче на фильтры стоков, содержащих большое 119
Рис. 31. Схема установ- ки для биологической очистки сточных вод, со- держащих чегколетучие примеси: 1 — аэротенк; 2 — аэро- фильтр; 3 — подача воды с питательными солями; 4 — подача сточной жидкости; 5 — отвод очищенной воды; 6 — отстойник; 7 — подача воздуха. количество взвешенных частиц, поэтому воду перед очисткой необходимо тщатель- но подготавливать. Иногда биофильтры соединяют с аэро- тенками. Для очистки сточных вод от ле- тучих органических соединений может быть с успехом использована установка, представляющая собой комбинацию аэро- тенка и аэрофильтра, предложенная со- трудниками отдела биологической очи- стки промышленных стоков Института коллоидной химии и химии воды АН УССР (рис. 31) [57]. Верхняя часть со- оружения работает как биофильтр. Очи- щаемая жидкость подается ниже верхне- го края загрузки, а разбавляющая вода с минеральными солями — сверху. При этом летучие вещества, находящиеся в стоке, не попадают в окружающую атмо- сферу, а разлагаются микроорганизмами биопленки при прохождении через филь- трующий слой. В то же время остальные компоненты сточной воды разрушаются в нижней части установки, являющейся аэротенком. В аэротенках и биофильтрах можно успешно очищать как хозяйственно-быто- вые, так и промышленные сточные воды, в том числе и стоки химических пред- приятий [177]. Органические отходы могут быть обезврежены и частично минерализованы также анаэробным методом. Сбраживанию под- вергают избыток активного ила, образующегося в аэротенках, осадки из первичных отстойников, а также некоторые промыш- ленные сточные воды, содержащие органические вещества в очень высокой концентрации. При очистке промышленных сто- ков анаэробный метод часто предшествует аэробным. Разложе- ние отходов осуществляется в специальных сооружениях — метантенках. Если требуется одновременно осадить взвешенные вещества и подвергнуть их сбраживанию, пользуются септиктен- ками и эмшерами. Септиктенки, или гнилостные отстойники, представляют собой резервуары, через которые медленно (в те- чение 1—4 суток) протекает сточная жидкость. Выпадающий при этом осадок затем анаэробно разлагается в течение дли- тельного времени (6—12 месяцев). Одновременно происходит его обеззараживание и уплотнение. При брожении выделяются дурно пахнущие газы. Содержимое септиктенка покрывается коркой, состоящей из вынесенных пузырьков газа, иловых час- 120
тиц и развившихся в них ми- кроорганизмов — большей ча- стью плесневых грибов. Вода под коркой насыщается раз- личными продуктами анаэроб- ного распада органических со- единений. Ее дальнейшая очи- стка затруднительна. Именно поэтому септиктенки имеют очень ограниченное применение и используются при очистке сточных вод, поступающих от отдельной группы зданий или временных поселений там, где есть возможность расположить их вдали от жилого массива. Разновидностью септиктенков можно считать анаэробные ла- гуны, которые представляют Рис. 32. Схема конструкции метан- тенка. собой глубокие земляные канавы, обычно предназначенные для очистки стоков животноводческих ферм и птицефабрик. Эмшер- ские бассейны, в отличие от септиктенков, являются двухъярус- ными отстойниками. Переработанный в них осадок может быть удален в любое время, для чего не требуется полной выгрузки сооружения, как в случае септиктенков. При выпуске сброжен- ного ила содержимое эмшера перемешивается, что способствует биоразложению органических веществ в сточной жидкости. Вода в двухъярусных отстойниках, благодаря особенностям их кон- струкции, не загрязняется вторично продуктами анаэробного распада и легче доочищается. Эмшерские бассейны используют- ся на небольших станциях биологической очистки. Метантенки — это закрытые резервуары глубиной 3—5 м. Схема конструкции сооружения представлена на рис. 32. Они снабжены устройствами для перемешивания, ввода несброжен- ного и вывода перебродившего осадка, а также подогрева со- держимого. Метантенки работают в режиме мезофильного (30— 35°) или термофильного (50—53°) брожения. Повышение тем- пературы способствует интенсификации процесса анаэробного распада органических отходов. При термофильном сбраживании быстрее происходит обеззараживание осадков — погибают па- тогенные бактерии и яйца гельминтов. Для поднятия и поддер- живания температуры используют тепло, получаемое при сжи- гании метана, который выделяется из жидкости. Термофильны?; процесс приводит к более глубокому распаду вещества и полу- чению большего количества газа. Однако подогрев до 50—53° особенно в зимнее время требует значительных затрат топлива, и выделяющегося газа часто не хватает. Перебродивший ил перекачивается на иловые площадки, где подвергается естест- 121
венному высушиванию или обезвоживанию фильтрованием и искусственным подогревом. Высушенный ил используется в ка- честве удобрения или брикетируется и служит топливом. Можно вывозить на поля и необезвоженный ил. Нормальная эксплуатация очистных сооружений в значи- тельной степени зависит от правильного выбора методов кон- троля их работы. Эти методы можно разделить на биологические, химические и физико-химические. Наиболее чувствительны био- логические, заключающиеся в наблюдении за живыми организ- мами, населяющими активный ил и биопленку [405— 407]. Реакция их на изменение условий внешней среды прояв- ляется значительно раньше, чем эти изменения могут быть установлены с помощью химических анализов. В качестве инди- каторных организмов выступают простейшие, которые в зооло- гии относятся к 1 типу Protozoa (см. главу I). В биоценозах очистных сооружений встречаются представи- тели четырех классов простейших: 1) саркодовые (Sarcodina); 2) жгутиковые (Mastigophora); 3) ресничные инфузории (Cilia- ta); 4) сосущие инфузории (Suctoria). Единой точки зрения в оценке роли простейших нет. Некоторые авторы считают, что простейшие никакого влияния на очистку сточных вод не ока- зывают. Другие полагают, что их роль сводится к улучшению хлопьеобразования ила и осветлению воды. Мы уже упоминали о том, что простейшие не вызывают заметной трансформации или деструкции органических веществ. Однако наблюдения за ними имеют несомненное значение при оценке работы очистных сооружений. Так, общеизвестно, что при хорошем состоянии активного ила в нем развиваются в значительном числе пред- ставители ресничных инфузорий Ciliata, главным образом при- крепленные к субстрату сувойки Vorticella convallaria, коло- ниальные формы Opercularia glomerata и Epistylis plicatilis. При достаточном количестве растворенного в воде кислорода реснички у этих организмов подвижны. В иловой смеси обна- руживаются также активно передвигающиеся свободноплаваю- щие инфузории. При пониженной аэрации и перегрузке активно- го ила органическими веществами реснитчатый аппарат сувоек утрачивает подвижность, сжимается. В дальнейшем эти орга- низмы вообще исчезают и замещаются бесцветными жгутиковы- ми, амебами и сосущими инфузориями. В небольших количе- ствах появляются сувойки Vorticella microstoma, способные переносить недостаток кислорода и избыточную концентрацию органических загрязнений. Видовой состав простейших в иле становится менее разнообразным. При наблюдении за работой биофильтров также пользуются простейшими как индикаторны- ми организмами. Наряду с Protozoa часто контролируют нали- чие и жизнедеятельность коловраток сем. Bdelloidea и некото- рых червей. 122
Полезно также микроскопическое наблюдение за составом микроорганизмов активного ила и биопленки. Так, чрезмерное развитие грибов и нитчатых бактерий в активном иле, хотя и ускоряет процесс окисления органических веществ стока, од- нако нарушает работу аэротенка, поскольку такой ил не обра- зует хлопьев, плохо оседает в отстойниках и вызывает вторичное загрязнение воды. Это явление носит название «вспухания» ила. Вспухание наблюдается при изменении условий очистки. Ему способствует перегрузка очистных сооружений сточными водами, недостаточная аэрация, наличие в стоке углеводов, изменение реакции среды в кислую сторону. Бурное развитие грибов в био- фильтрах приводит к закупориванию отверстий между загрузоч- ными камнями и ухудшению аэрации, в результате чего очистка становится затруднительной, а в теле фильтра начинаются анаэробные процессы разложения пленки, сопровождающиеся скверным запахом. В таком случае сооружение требует полной очистки и наращивания биопленки заново. Лаборатории, контролирующие работу очистных установок, широко используют, наряду с биологическими тестами, пока- затели химической потребности в кислороде (ХПК) и биохими- ческого потребления кислорода (БПК). ХПК — величина, ха- рактеризующая общее содержание в воде органических и неор- ганических веществ, реагирующих с сильными окислителями, и выраженная в единицах количества кислорода, расходуемого на окисление. Сейчас для определения ХПК сточных вод применяют ис- ключительно бихроматный метод. Перманганатный метод ис- пользуется только при анализе органических компонентов при- родных вод, так как при большом количестве зачастую трудно- окисляемых органических соединений в стоках данный способ непригоден. В то же время бихромат калия в 18 н. серной кислоте в присутствии катализатора — сульфата серебра — спо- собен окислять практически все органические вещества на 95— 100%. Суть метода заключается в обработке предварительно отфильтрованной через бумажный или мембранный фильтр сточной воды раствором бихромата калия и концентрированной серной кислотой с подогревом или без него в присутствии суль- фата серебра. Непрореагировавший бихромат после окончания реакции оттитровывают раствором соли Мора, используя в ка- честве индикатора ферроин или N-фенилантраниловую кислоту. ХПК в миллиграммах кислорода на 1 л сточной воды определя- ют путем простого расчета. Биохимическим потреблением кислорода (БПК) называется количество кислорода в миллиграммах, требующееся для окис- ления органических веществ в 1 л сточной воды в результате аэробных биологических процессов. Для определения БПК сточ- ную жидкость разбавляют чистой водой и помещают в за- крытую склянку. Микроорганизмы, находящиеся в сточной 123
жидкости, окисляют органические загрязнения, расходуя при этом кислород, растворенный в разбавляющей воде. Через 2, 3, 5, 10 и более суток устанавливают количество использованного кислорода и относят его к 1 л сточной воды. В зависимости от числа суток получают БПКг, БПКз, БПКэ, БПКы и т. д. БПКполн определяют через 15—20 суток, до начала нитрификации. Наи- более принято определение БПК5 и БПКполн- Содержание раст- воренного кислорода в жидкости обычно определяют йодометри- ческим методом Винклера [170, 171]. БПК всегда меньше ХПК, так как в воде могут присутствовать соединения, недоступные для микроорганизмов, но окисляемые химически. Кроме того, часть органических веществ используется для построения тела микробных клеток без окисления молекулярным кислородом. Подробно методы определения ХПК и БПК приведены Ю. Ю. Лурье и А. И. Рыбниковой [171]. Наряду с ХПК и БПК пользуются определением дегидроге- назной активности ила при помощи 2, 3, 5-трифенилтетразолий- хлорида. Дегидрогеназы восстанавливают это соединение в фор- мазан ярко-красного цвета. По степени окраски судят об окис- лительной способности ила [83]. Поскольку успешная очистка сточных вод активным илом заключается не только в разрушении органических загрязнений, но и в отделении ила от очищенной воды, в практике аэробной очистки пользуются также показателями илового индекса. Объемный индекс ила — это объем, который занимает 1 г актив- ного ила после 30-минутного отстаивания [35]. Этот показатель растет при вспухании активного ила. Описанные методы биологической очистки в течение долгого времени достаточно успешно использовались для обработки сточных вод. В настоящее время в связи с неуклонным ростом количества трудноразлагаемых синтетических органических за- грязнений, а также общим увеличением объема бытовых и про- мышленных органических отходов традиционная биологическая очистка не дает уже удовлетворительных результатов. Для решения этой проблемы должны быть использованы принци- пиально новые методы, основанные на использовании селекцио- нированных высокоактивных микробных культур. В связи с этим большой интерес представляют работы, направленные на выяснение роли различных таксономических групп микроорга- низмов в очистке загрязненных вод. микрофлора сточных вод ПРИ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКЕ В различных типах очистных сооружений создаются неодинако- вые физико-химические условия, в результате чего в них разви- ваются разные группы микроорганизмов. Поэтому наиболее 124
удобно рассматривать микрофлору активного ила, биопленки и сбраживаемых отходов отдельно. В активном иле аэротенков преобладающей группой микро- организмов являются бактерии. Уже в ранних работах [313, 378] как доминирующие в активном иле описываются капсуль- ные бактерии Zoogloea ramigera. Это грамотрицательные неспо- ровые палочковидные монотрихи, способные минерализовать органические соединения и образовывать хлопья на жидкой питательной среде. В работах последних лет особое внимание уделяется зооглейным бактериям. Установлено, что Z. ramigera утилизирует фенол, о-, м- и n-крезолы, бензол, м- и п-толуолы [504]. Среда с л«-толуолом предложена в качестве элективной для выделения штаммов Z. ramigera из сточных вод. Существен- ное значение имеет способность этих бактерий к хлопьеобразо- ванию, так как именно это явление обусловливает хорошее осе- дание активного ила и отделение его от очищенной воды. Так, из 54 штаммов бактерий, изолированных из активного ила аэро- тенка, только пять культур могли формировать хлопья на жид- кой питательной среде с пептоном и дрожжевым экстрактом [501]. Три культуры были представителями Zoogloea sp. Среди 207 штаммов, выделенных Андерсоном [288], только 11 были способны к хлопьеобразованию. Из них 9 принадлежали к роду Zoogloea, по одному — к родам Mycobacterium и Nocardia. Унц и Дондеро [502, 503] разработали метод выделения и изолировали из активных илов 65 штаммов Z. ramigera. Авторы детально изучили их физиолого-биохимические свойства и по- казали, что эти культуры растут в широком диапазоне темпера- тур от 9 до 37° С. Оптимальными являются температура 28° и pH 7,0. Бактерии не растут в анаэробных условиях, но хорошо переносят их в течение 24 дней. При исследовании отношения выделенных штаммов к различным источникам углерода уста- новлено, что крахмал, амигдалин, инулин, некоторые первичные спирты, насыщенные жирные кислоты и интермедиаты цикла Кребса поддерживают рост большинства изолятов. Аспарагин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты пригодны для большей части культур как единственный источник углерода и азота. Авторы считают, что штаммы рода Zoogloea доминируют в при- родных хлопьевидных зооглейных колониях. Z. ramigera коли- чественно преобладает также в слизистой пене, образующейся на поверхности сточной жидкости после отстаивания [358]. Из 38 штаммов, выделенных из пены, 22 изолята принадлежали к роду Zoogloea. Особый интерес вызывает синтез внеклеточного полимера культурами Z. ramigera. По мнению некоторых авторов [356, 357], капсульный полимер напоминает целлюлозу. Тезука Ясу- хико [533] считает его мукополисахаридом, состоящим из двух аминосахаров: N-ацетилглюкозамина и N-ацетилфукозамина (в соотношении 1 :2). Полимер образуется из глюкозы, фрукто- 125
зы, галактозы, лактозы, сахарозы или растворимого крахмала, добавленных к солевой среде [432]. При этом синтезируется та- кое количество полимера, что культура превращается в гель. Капсульное вещество Z. ramigera, по-видимому, играет значи- тельную роль в очистке, адсорбируя органические соединения, а также неорганические ионы, включая радиоактивные. Гелеобраз- ный капсульный полимер адсорбирует также нехлопьеобразую- щие бактерии активного ила, способные разлагать органические загрязнения [288]. Клетки Z. ramigera могут накапливать в большом количестве гранулы волютина, состоящие из длинно- цепочечных полифосфатов [462]. Эта способность бактерий извлекать из среды фосфор интересна в связи с необходимостью очистки воды, загрязненной фосфорсодержащими вещества- ми — пестицидами, детергентами и т. д. По мнению Крэбтри и Маккоя [330], Z. ramigera является самостоятельным видом, а не формой роста других микроорганизмов в хлопке [376]. Одна- ко в настоящее время эту бактерию многие авторы относят к псевдомонадам, так как, кроме способности образовывать зо- оглейные колонии, других таксономических критериев, отли- чающих Z. ramigera от нефлуоресцирующих видов рода Pseudo- monas, не установлено [356, 357, 533]. Помимо Z. ramigera способностью разрушать органические соединения в сточных водах и образовывать хлопья обладают также и другие бактерии. В начале 50-х годов Маккинней с соавт. [421, 423] изолировал из активного ила 72 штамма раз- личных видов бактерий, которые образуют хлопья и разлагают органические вещества в питательной среде при аэрации. Кроме Z. ramigera были выделены представители родов Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Escherichia и др. Способность бактерий к хлопьеобразованию зависит от характера питательных веществ среды [398]. Механизм флокуляции еще не выяснен окончательно. Счита- ют, что соединение бактерий в хлопья является физико-химиче- ским процессом [83, 398]. При образовании хлопьев отрицатель- но заряженные поверхности смежных клеток штаммов рода Flavobacterium соединяются ионными мостиками через катионы [532]. Полагают также [317], что в склеивании клеток Fla- vobact. dormistator основную роль играет полимер преиму- щественно полипептидной природы, клеток представителей ос- тальных родов — гетерополисахаридные полимеры. Микробные полимерные вещества ведут себя как полиэлектролиты. Они взаимодействуют между собой, в результате чего происходит агрегирование бактерий в хлопья. Продукцию внеклеточного гелеобразного полимера бактериальных капсул и флокуляцию связывают с накоплением внутри клеток поли-р-оксимасляной кислоты (ПОМ) [331, 432]. Однако в опытах Дейнема [339] у наиболее активных хлопьеобразователей содержание в клетках ПОМ было незначительным. Высказано предположение, 126
что соединение бактерий в хлопья обусловливается образовани- ем целлюлозных фибрилл [340]. Видовой и родовой состав бактерий активного ила весьма разнообразен. Важной задачей при его изучении является пра- вильный подбор питательных сред, из которых каждая в от- дельности не может обеспечить рост всех обитателей активного ила. В связи с этим были предприняты попытки изучить пище- вые потребности микроорганизмов. Дайэс и Бхэт [342] нашли, что только 24% из ПО изолятов, полученных из необработанных сточных вод, и 8% из 150 штаммов, выделенных из активного ила, не нуждаются ни в витаминах, ни в аминокислотах при росте на среде, содержащей глицерин, сукцинат натрия и нитрат аммония. Прекесэм и Дондеро [450] показали, что на агаризо- ванной среде с экстрактом активного ила в качестве единствен- ного источника питания общее число изолированных бактерий выше, чем на других питательных средах. Эффективность экст- ракта зависит от источника и образца активного ила. Более половины из 127 штаммов, выделенных на среде с экстрактом активного ила, не росли на синтетических средах с глюкозой, аминокислотами, витаминами, дрожжевым экстрактом и ми- неральными солями. На агаризованном экстракте активного ила число выросших бактериальных колоний составляло 175,6 X Юб в пересчете на 1 г сухого вещества. Близкие результаты при использовании илового экстракта получили Гэйфорд и Ричард [362]. В то же время другие исследователи [481] для выделе- ния бактерий из сточной и речной воды как наиболее пригодную среду рекомендуют казеино-пептоно-крахмальный агар. Однако на других семи средах, использованных в опытах, в том числе приготовленных на основе загрязненных вод, получены сходные результаты. Для количественного учета микрофлоры большое значение имеет гомогенизация активного ила перед посевом на питательные среды. Так, например, использование с этой целью ультразвука привело к 20-кратному увеличению количества кле- ток бактерий рода Thiobacillus и общего числа гетеротрофных бактерий [526]. Большинство бактерий, принимающих участие в очистке,— гетеротрофы. Это, в основном, представители водной флоры, а также, по-видимому, некоторые обитатели кишечного тракта человека и животных, поступающие с фекальными стоками. О выделении из сточных вод и активного ила большого коли- чества бактерий кишечной группы сообщает ряд авторов [421, 531]. Однако еще Аллен [285], используя метод предваритель- ной гомогенизации хлопьев ила, показал, что относительное число кишечных бактерий незначительно, а доминирующими ро- дами в активном иле являются Achromobacterium, Chromobac- terium (Flavobacterium) и Pseudomonas. Полагают, что бакте- рии кишечной группы составляют только малую часть бакте- риальной популяции сточных вод, так как температура, при 127
которой ведется процесс очистки, больше подходит для водной микрофлоры, чем для кишечных бактерий [376]. Интересно, что Аллен вообще не включает в число доминирующих таксонов Z. ramigera. Другие исследования показали, что в активном иле аэротенка превалируют роды Achromobacter, Flavobacterium и Alcaligenes [289]. На преобладание в сточных водах Pseudo- monas указывают Канска [394] и Йэлл с соавт. [531]. Послед- ние показали, что из 85 чистых культур бактерий, выделенных из городских стоков, 78 штаммов были грамотрицательные па- лочки. 38% общего числа грамотрицательных бактерий со- ставляли представители группы Pseudomonas — Xanthomonas, 17%—Escherichia-Aerobacter, 12%—Flavobacterium и 12% — Achromobacter. К основным родам, приведенным Алленом в качестве преобладающих по численности в активном иле, дру- гие авторы добавляют Bacillus и Corynebacterium [358, 398]. Коринеформные бактерии составляют доминирующую группу в активных илах, очищающих стоки молочных заводов. Так, Эйдемс [278] изучал образование и состав бактериальной флоры активного ила, окисляющего молочные отходы. Подсчет и изоляция колоний производились на питательном агаре, со- держащем пептон, глюкозу, мясной экстракт и снятое молоко. Всего было выделено и идентифицировано 1200 организмов. Характерно, что через 9 дней после начала аэрации в молодых хлопьях ила преобладали псевдомонады и ахромобактерии. К концу четвертой недели их число уменьшилось, но значи- тельно увеличилось количество клеток коринебактерий. То же самое отмечалось и на 56-й день. Таким образом, коринеформ- ные бактерии, в основном представители рода Arthrobacter, ста- ли доминирующей группой и составили 60—70% изолятов. Эйдемс отмечает несовпадение полученных данных с результа- тами Ясевич и Порджес [390, 449], так как в его опытах прак- тически не обнаруживались виды рода Bacillus. Большое коли- чество Arthrobacter-подобных бактерий автор сравнивает со значительным числом изолятов Bacterium (Brevibacterium) li- nens у Ясевич и Порджес. Brevibact. linens, по Мюльдеру с соавт. [424], является коринеформной бактерией типа Arthro- bacter. Таким образом, численность этой группы бактерий высока, что свидетельствует о важной роли коринеформных организмов в утилизации отходов молочной промышленности. Четыре штамма ранее неизвестной бактерии, которая по основ- ным характеристикам оказалась ближе всего к представителям рода Arthrobacter и была выделена в новый вид Arthrobacter luteus sp. nov., изолировали из сточных вод пивоваренного за- вода Канеко Татсухико и сотр. [393]. Штаммы этого вида имели ряд общих черт с некоторыми видами родов Nocardia, Cellulo- monas, Microbacterium, Mycobacterium, Corynebacterium. Авто- ры полагают, что описанный ими вид занимает промежуточное 128
положение между семействами Corynebacteriaceae и Actinomy- cetaceae. Лайтхарт с сотр. [413, 414] предлагает при изучении байте рий, доминирующих в биологических очистных сооружениях, использовать метод нумерической таксономии. Авторы отмеча- ют, что знание основных групп микроорганизмов, участвую- щих в процессах разложения органических загрязнений, необхо- димо так же, как информация о возбудителе болезни для по- становки правильного диагноза. Только имея эти сведения, оператор может изменить условия в очистном сооружении та- ким образом, чтобы увеличить число желаемых форм и уменьшить — нежелаемых, например вызывающих вспуха- ние. Исследователи, определив 109 различных признаков у вы- деленных ими 450 культур бактерий, разделили изоляты на 9 групп: 1) Alcaligenes — Achromobacter; 2) Pseudomonas; 3) Enterobacteriaceae; 4) Arthrobacter — Bacillus; 5) Cytopha- ga — Flavobacterium; 6) Pseudomonas — Vibrio — Aeromonas; 7) Achromobacter и (8, 9) смешанные. Та или иная группа пре- обладает в популяции в зависимости от времени года, состава сточных вод, места отбора проб. Использовать компьютер для анализа структуры микробных популяций очистных установок предлагают Прекесэм, Дондеро [451] Дайэс и Бхэт [341] из 21 образца сточных вод и 9 образцов активного ила выделили 24 культуры азотобактера. Из них только три штамма относились к типично почвенному виду Azotobacter chroococcum. Остальные 21 оказались Az. agilis. Авторы считают, что в сточных водах и активном иле создаются благоприятные условия для развития этого вида. В активном иле обнаруживаются также нитрифицирующие бактерии. Вино- градская [527] выделила из активного ила зооглееобразующие нитрифицирующие бактерии рода Nitrosocystis, присутствующие там в значительном количестве. Лавлесс и Пейнтер [415] мето- дом обогащения изолировали из активного ила Nitrosomonas sp. Нитрифицирующие бактерии развиваются в иле после удаления легкоусвояемых органических загрязнений [226]. Из активного ила изолированы также нитчатые организмы. Преобладание нитчатых форм связывают с явлением вспухания активного ила. Главным виновником вспухания большинство исследователей считают бактерию Sphaerotilus natans [254, 333, 438, 439, 441]. Интересны работы по определению таксономиче- ского положения S. natans. Бриф еще в 1936 г. [29] провел сравнительное изучение родов Sphaerotilus и Cladothrix, на осно- вании которого пришел к выводу, что это — различные организ- мы. Однако исследования Разумова [211, 212] показали, что род Sphaerotilus с типичным видом S. natans Ktz. (1833) иден- тичен роду Cladothrix с типичным видом С. dichotoma Cohn (1875). Это позволило объединить их в один род Sphaerotilus с видами S. natans и S. dichotomus (Migula). По мнению 9 8-616 129
Разумова, оба эти вида идентичны и являются экологическими вариантами одного организма. Более того, при снижении в воде концентрации органических веществ и наличии железа они ста- новятся неотличимыми от Leptothrix ochracea. Нити Sphaerotilus, а также, по-видимому, и других организ- мов, влияя отрицательно на процесс осаждения активного ила, одновременно отличаются высокой окислительной способностью. Вспухший ил работает гораздо интенсивнее, чем обычный. Нит- чатые организмы могут использовать как источник углерода различные субстраты, в том числе анионные и неионные детер- генты [443]. Как отмечает Разумов [212], они «способны усваи- вать и такие органические соединения, которые в природе прак- тически не встречаются, по крайней мере в значительных кон- центрациях». По данным автора, Cladothrix может развиваться в сточных водах заводов сахарной, крахмало-паточной, спирто- вой промышленности, производства синтетического каучука, бу- мажных и текстильных фабрик, на отходах лесохимических предприятий, а также за счет углерода нефти и даже аллиловых масел. Немалую роль Sphaerotilus играет в процессах самоочи- щения водоемов [29]. Наряду со S. natans Пайпс [442] выделял из вспухшего ила нитчатые формы бацилл. Автор наблюдал случаи вспухания ила, где доминировали представители рода Beggiatoa. При очистке сточных вод, содержащих сульфиды, вспухание ила могут вызывать серобактерии Thiothrix sp. [350]. В очистном сооружении с больничным стоком обнаружены ните- образующие кишечные палочки [433]. Вин [506] разделил нит- чатые бактерии активного ила на 5 групп: 1) капсулообразую- щие нитчатые бактерии; 2) оранжевые и желтые неподвижные грамотрицательные формы, по-видимому, близкие к флавобак- териям; 3) грамположительные бактерии, напоминающие Micro- scilla и Flexibacter; 4) неподвижные грамотрицательные бакте- рии, сходные с Cyanophyceae, но не содержащие пигментов. Пятая группа представлена впервые описанными неподвижными грамположительными бактериями. Вин с сотр. [507] изолировал из ила новую группу нитчатых грамотрицательных бактерий Haliscomenobacter hydrossis gen. n., sp. п. Рост этих бактерий стимулируется при наличии белковых и полисахаридных суб- стратов. При вспухании в иле обнаруживаются также нитчатые Geotrichum [448, 466] и хищные грибы Zoophagus insidians [325] и Arthrobotrys [441]. Размножение в активном иле фила- метирующих микроорганизмов, ведущее к его вспуханию, объяс- няют понижением концентрации растворенного кислорода в сточной жидкости [454], наличием в очищаемой воде углеводов [348], а также недостатком азота и фосфора [442]. Развитию грибов благоприятствует кислая реакция среды [326]. Сообще- ния о находках грибов в активном иле немногочисленны. Кук и др. [327] изолировали из активного ила 136 штаммов 30 ви- дов дрожжей и дрожжеподобных грибов, среди которых домини- 130
руют Trichosporon cutaneum, Rhodotorula glutinis, R. mucilagi- ncsa, Candida parapsilosis, C. tropicalis. Источниками попадания этих организмов в сточную воду исследователи считают воздух, почву и бытовые стоки. Наличие большого числа дрожжевых клеток свидетельствует, по мнению авторов, о том, что, по крайней мере, некоторые дрожжевые грибы используют пита- тельные вещества в сточных водах и таким образом принимают участие в очистке. Мицелиальные грибы изучал Кук (цит. по [440]), который продемонстрировал наличие в активном иле и за- грязненных водах Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Fu- sarium, Myrothecium, Gliocladium, Phialophora, Cladosporium, Margarinomyces, Aureobasidium, Geotrichum, Trichoderma. Пред- ставители первых восьми родов присутствовали в незначитель- ном количестве, что позволило автору считать их случайными. Виды последних пяти родов обнаруживались в большем числе, что может свидетельствовать об их участии в процессах разло- жения органического вещества. В то же время Пайк и Кэрдс [440] утверждают, что грибы нельзя считать нормальной фло- рой активного ила. Роль актиномицетов в сточных водах и активном иле, к со- жалению, практически не изучена. Из активного ила выделены проактиномицеты Nocardia actinomorpha [421] и Nocardia sp. [288]. Лешевалье и др. [412] выделили 107 штаммов нокардий из активного ила и пены десяти различных очистных установок. 35 культур отнесены к новому виду N. amarae sp. nov., который по целому ряду признаков отличается от близких к нему N. rhodochrous и N. ucrainica. В некоторых активных илах акти- номицеты обнаружены в значительном количестве [218, 410]. Таким образом, как видно из приведенных литературных данных, большинство бактерий, выделенных из активного ила, очищающего бытовые стоки, представляют грамотрицательные палочки, среди которых доминирующим родом является Pseu- domonas. Часто выделяются представители родов Flavobacteri- um, Achromobacter и Zoogloea. Из грамположительных бактерий ведущее место занимает род Bacillus. Некоторые авторы изоли- ровали в значительных количествах коринеформные бактерии. Относительное число и роль грибов в активном иле оценивается противоречиво. Тем не менее, учитывая данные, полученные Куком с сотр. [326], можно предположить, что эти организмы также в какой-то мере участвуют в процессах очистки сточных вод. Другим распространенным способом аэробной биологической очистки сточных вод является биофильтрование. Изучению мик- робного населения биопленки биологических фильтров, в осо- бенности бактериальной флоры, уделялось сравнительно мало внимания. Так, Калабина и Мудрецова-Висс [115] сообщили о наличии в биопленке зооглейных скоплений бактерий, нитчатых бактерий и грибов. Состав микроорганизмов зависит от количе- 9* 131
ства поступающей на фильтр сточной воды. Баттерфилд и Уотти [314, 516] также обнаружили в биопленке зооглейные бактерии, близкие к бактериям активного ила. В опытах этих авторов чистые культуры бактерий развивались на загрузочных камнях биофильтра и давали такую же степень очистки, как производ- ственная установка. Смесь девяти чистых культур зооглееобра- зующих бактерий оказалась более эффективной, чем каждый штамм в отдельности. Все изолированные бактерии при культи- вировании в жидкой среде в условиях аэрации образовывали хлопья, напоминающие активный ил. Таким образом, авторы установили тождественность зооглейных бактерий биопленке биологических фильтров и активного ила. Кейлевей с соавт. [316] показал, что состав микрофлоры биопленки изменяется в зависимости от глубины фильтра. На глубине 30 см наблюдается наибольшее количество и разнооб- разие видов. Автором изолированы 14 видов гетеротрофных бактерий, среди которых доминируют представители родов Fla- vobacterium и Bacillus. Зооглееобразующие бактерии преобла- дают в верхней части биофильтра. Интересные результаты приведены в работе Холлса и Боарда [373]. Авторы выделили из биопленки биологических фильтров следующие группы бактерий: Acinetobacter, Alcaligenes, Pseudo- monas, Bacillus, энтеробактерии, желтые грамотрицательные па- лочки, коринеформные бактерии и микрококки. Число клеток представителей каждой группы неодинаково в молодой (2-днев- ной) и зрелой (21-дневной) пленке. В зрелой пленке преобла- дают бактерии рода Acinetobacter и желтые грамотрицательные палочки, которые, по мнению исследователей, близки к флаво- бактериям. Анализируя литературу по микрофлоре активного ила и биопленки, Холле и Боард пришли к заключению о суще- ствовании двух типов микробных ассоциаций, принимающих участие в аэробных процессах обработки отходов,— в первом доминируют псевдомонады, во втором — флавобактерии и Aci- netobacter, ранее определяемый как Achromobacter или Alcali- genes. Значительно больше данных о грибах, обитающих в биоплен- ке. Как сообщают Томлинсон и Холл [498], около 30% пленки на биофильтре — грибного происхождения. Преобладающими формами являются Fus. aquaeductuum, Geotrichum (Oospora), Sepedonium sp., Ascoidea rubescens, Subbaromyces splendens, Sporotrichum sp., Penicillium sp., Dictyuchus sp., Pythium sp. Фэлдмэн [352], кроме приведенных родов и видов, изолировал также представителей Cephalosporium, Epicoccum, Cladosporium, Trichoderma, Aspergillus, Phoma, Rhodotorula. Л. И. Логвиненко [168] на всех этапах очистки хозяйственных и промышленных стоков на биофильтрах изолированы водные фикомицеты из порядков Saprolegniales, Leptomytales, Peronosporales. Наиболее разнообразной является группа сапролегниевых грибов, которые 132
включают 14 видов пяти родов. Количественно преобладают виды рода Pythium, которые составляют почти половину всех изолятов. По данным Бекера и Шоу [296], при сравнитель- ном изучении микрофлоры сточных вод в процессе их очистки на биофильтрах преобладающей группой грибов оказались дрожжи, главным образом беспигментные. Родовой состав грибов в биофильтре зависит от места отбо- ра исследуемого образца. Томлинсон [497] нашел, что Fusarium доминирует в верхней части биофильтра, a Geotrichum — в глу- бине. По мнению авторов, это связано с тем, что Fusarium хорошо сосуществует с водорослями — такими как Stigeoclonium и Chlorella, a Geotrichum к такому сосуществованию неспособен. В развитии микроорганизмов на биофильтрах наблюдается се- зонность: летом преобладают зооглейные бактерии, осенью они частично вытесняются фузариями, позже развиваются Geotri- chum и, наконец, Sepedonium [376]. В холодное время весны и зимой встречается Leptomitus lacteus [324]. Видовой состав грибов в биопленке зависит также от скорости протока очища- емой воды [324]. В обычных условиях доминируют Coniothyrium fuckelii, Fus. aquaeductuum и Geotrichum candidum. При повы- шенной скорости — Fus. aquaeductuum, G. candidum и Pullu- laria pullulans. Кук с соавт. [326] изучал роль грибов в процессе очистки загрязненных вод. С этой целью автором были отобраны 8 обще- распространенных видов, а именно: Fus. aquaeductuum, Fus. oxysporum, G. candidum, Margarinomyces heteromorphum, Pen. lilacinum, Pen. melinii, Pen. ochrochloron, Trich. viride. В сточ- ную воду вносили указанные культуры и наблюдали динамику БПК. Было установлено, что изучаемые грибы могут успешно соперничать с другими микроорганизмами за органические вещества и кислород. Более активно процесс очистки происхо- дит при кислой реакции среды. При чрезмерном развитии грибов в биофильтрах отверстия между загрузочными камнями могут забиваться, ухудшая усло- вия аэрации и прохождения через фильтр сточной воды. С целью возможного регулирования роста грибов в биопленке Пэйнтер [431] изучал пищевые потребности четырех обычных ее обита- телей. Автор показал, что эти грибы нуждаются в различных источниках азота: Sepedonium n. sp. может использовать азот только из органических его соединений, в то время как Fus. aquaeductuum, Geotrichum sp. и T. cutaneum способны утилизи- ровать аммонийный азот, a Fus. aquaeductuum — также азот нитратов. Все исследованные штаммы нуждались в витаминах. Оптимальное значение pH для Sepedonium n. sp. было 7—8,5, для остальных грибов интервал pH, при которых они хорошо развивались, был значительно шире — от 3 до 9. Интересные результаты получены автором при воздействии на грибы раз- личных ионов. Показано, что Zn2+ подавляет развитие грибов 133
при использовании концентрации, превышающей оптимальную. Очевидно, растворы, содержащие ионы цинка, могут применять- ся для ингибирования роста грибов при слишком бурном их развитии в биопленке. Таким образом, приведенные данные позволяют сделать вы- вод о том, что видовой состав биоценозов, составляющих плен- ку биологических фильтров, отличается от состава ценозов активного ила. Основным отличием является развитие в биофиль- трах большого количества грибов, которые принимают активное участие в процессах очистки сточной жидкости от органического вещества. Наряду с аэробной очисткой широко применяется анаэробное сбраживание отходов. Этот способ имеет ряд преимуществ пе- ред аэробными методами. При анаэробных процессах достигает- ся значительная минерализация органических веществ и образу- ется сравнительно небольшая биомасса микроорганизмов. Нет необходимости в аэрации отходов. Конечным продуктом фер- ментации является метан, который в силу очень низкой раство- римости быстро выделяется из системы, может быть собран и использован. К недостаткам метода относится необходимость поддержания определенной температуры в метантенках. Процесс очень чувствителен к внезапным изменениям концентрации и состава питательных веществ, колебаниям температуры и pH. Кроме того, установлено, что анаэробные бактерии не способны разлагать целый ряд органических соединений, это препятствует использованию метода для очистки стоков ряда отраслей хими- ческой промышленности. Анаэробная ферментация органического материала применя- ется при обработке бытовых и промышленных стоков, а также отходов животноводческих и птицеферм [381, 404]. Хотя ана- эробное сбраживание органического материала в метантенках используется уже давно, бактериология и биохимия этого про- цесса изучены недостаточно. Одной из причин этого, по-видимо- му, являются трудности, с которыми встречаются исследователи при культивировании анаэробных бактерий [381]. Успехи в изу- чении микрофлоры, участвующей в анаэробном разложении от- ходов, были достигнуты после получения новых сведений о мик- роорганизмах рубца жвачных животных. Процессы, протекаю- щие в рубце, имеют много общего с реакциями превращения органических веществ в метантенках. Вот почему исследования, которые ведутся в этих двух направлениях, взаимосвязаны [380]. Известно, что анаэробное разложение органического веще- ства в этих условиях протекает в две стадии. На первой — не- метаногенной—происходит сбраживание субстрата. Во время этой стадии белки, углеводы и липиды превращаются главным образом в жирные кислоты. В процессах биодеградации при- нимают участие различные физиологические группы микроорга- низмов; целлюлозные, протеолитические и другие. Вторая стадия 134
носит название метаногенной. На этой стадии специфические метановые бактерии разлагают конечные продукты биохимиче- ских реакций первой стадии до метана и углекислоты [495]. В ряде работ, посвященных изучению микроорганизмов неме- таногенной стадии [404, 496], приводятся сведения о числен- ности аэробных и факультативно анаэробных бактерий в раз- лагающемся иле. Количество их составляет около 2 X 10е кле- ток/мл. Позже при помощи анаэробной техники, используемой при культивировании организмов рубца, было установлено, что число облигатно анаэробных бактерий на 1—3 порядка выше, чем аэробных и факультативно анаэробных [484, 496]. Сравни- тельный подсчет показал, что в неметаногенной фазе число облигатных анаэробов составляет 3,9 X Ю8—1,5 X 1010 кле- ток/мл, аэробов и факультативных анаэробов — 8 ХЮ5 — 1 X 108 клеток/мл [496]. При сбраживании отходов свиноферм количественного преобладания строгих анаэробов над другими группами не наблюдается [380]. Общее число облигатно ана- эробных бактерий в этих опытах колеблется от 6,4 X Ю5 до 8,4 X Ю6 клеток/мл. В установках же, где сбраживались быто- вые стоки, количество анаэробов составляет 2 X Ю7 клеток/мл. Интересны попытки ряда исследователей качественно и коли- чественно охарактеризовать различные физиологические типы бактерий, которые участвуют в неметаногенной ферментации. При этом авторы использовали метод селективных питательных сред, содержащих в качестве единственного источника углерода и энергии определенные органические субстраты. Недостатком данного метода является то, что на таких средах при подсчете могут быть пропущены бактерии, способные разлагать и исполь- зовать внесенный в среду субстрат в конструктивном обмене, но не способные получать из него энергию, и наоборот. Тем не менее таким образом были получены сведения о физиологи- ческих группах бактерий, обладающих целлюлолитической, протеолитической и липолитической активностью, а также о сульфатредуцирующих и денитрифицирующих бактериях. К со- жалению, большая часть этих работ выполнена без применения анаэробной техники культивирования и касается аэробных и факультативно анаэробных бактерий, роль которых в процессах ферментации органических веществ, очевидно, менее значи- тельна, чем анаэробных организмов. Лишь в последние годы появились некоторые данные о фи- зиологических типах анаэробных обитателей метантенков [472]. Анаэробные бактерии, обладающие протеолитической активно- стью, выделяли и изучали на среде, содержащей молоко, мясной бульон, супернатант содержимого метантенка, витамины, соли и следы органических кислот. Общее число бактерий составляет 6,5 X Ю7 клеток/мл. Всего изолировано 43 штамма бактерий. 28 штаммов относятся к роду Clostridium, а именно: CL bifer- mentans, Cl. lituseburense, Cl. mangenotii, Cl. perenne, Cl. perfrin- 135
gens, CI. sphenoides, Cl. filiforme. Кроме того, выделены 8 штам- мов Peptococcus anaerobicus, 3 штамма грамотрицательных не- спорообразующнх бактерий родов Bacteroides и Eubacterium и 3 штамма, близких к Bifidobacterium. Число бактерий с протео- литическими свойствами, сообщенное Хобсоном [380], несколько меньше— 105 клеток/мл. В разлагающихся отходах обнаружены целлюлозоразрушаю- щие анаэробные бактерии в количествах 0,8—2,0 Х103 клеток/мл [389] и 103 клеток/мл [380]. По мнению Кирша и Сайкса [404], численность их невелика, если учесть, что около 10% сухого вещества разлагающегося ила составляют целлюлоза и гемицел- люлоза. Целлюлолитические бактерии, выделяемые из содержи- мого метантенков, очень близки по видовому составу и физио- лого-биохимическим характеристикам к бактериям рубца жвач- ных животных. В связи с этим большой интерес представляют данные о физиологии питания и метаболической активности целлюлозоразрушающих бактерий рубца. Показано [309], что основные виды используют аммонийный азот и не способны ути- лизировать аминокислоты. Эти бактерии нуждаются в Na+, ви- таминах группы В и жирных кислотах, необходимых для про- цессов биосинтеза. Появились совершенно новые представления о механизме деградации целлюлозы [411] и подробно изучены условия, влияющие на этот процесс [478, 479]. Установлено, что в биоразложении гемицеллюлозы участвуют главным обра- зом штаммы Bacteroides ruminicola, Butyrivibrio fibrisolvens и, по-видимому, некоторые руминококкн. Эти же виды характери- зуются пектинолитической активностью [338]. Сходные данные приводятся Хобсоном [380] для анаэробных целлюлолитических бактерий, принимающих участие в анаэробном сбраживании от- ходов. Способность ферментировать гемицеллюлозу присуща в основном Bacteroides ruminicola. Эти бактерии дезаминируют аминокислоты, в результате чего выделяется аммиак. Большин- ство культур, изолированных из разлагающихся отходов, усваи- вают аммонийный азот. Характер доминирующих при анаэробной очистке таксонов в большой степени зависит от состава микрофлоры поступающих в сооружение отходов, а также от химической природы разла- гаемых органических веществ. Так, при заполнении очистной установки бытовыми отходами или стоками свиноферм энтеро- бактерии, главным образом Е. coli, и анаэробные стрептококки составляют около 50% популяции [380]. В сооружении, где очищались стоки свиноферм, обнаружены также Cl. butyricum, Bacteroides и грамотрицательные коккобациллы. Первыми раз- виваются Bacteroides с амилолитическими свойствами, затем целлюлолитические и протеолитические бактерии. Терин [494] выделял из содержимого метантенка культуры накопления бак- терий, разлагающих крахмал, целлюлозу, казеин, пептон, под- солнечное масло. Каждый источник углерода стимулировал 136
развитие определенной типичной бактериальной популяции. Ав- тор высказывает предположение, что факультативно анаэробные Bacillus spp. первыми разрушают макромолекулы, а псевдомо- нады, колиформные бактерии и грамположительные кокки ис- пользуют продукты разложения субстратов. Первичное разложе- ние целлюлозы и крахмала, по-видимому, осуществляют строгие анаэробы. Протеолитическими свойствами обладают в основном споровые бактерии. Микроскопия культур, утилизирующих рас- тительное масло, показала наличие вибрионов, которые количе- ственно преобладали в препаратах. Изучая аэробные и факуль- тативно анаэробные бактерии метантенков. Терин [493] разделил их на три группы: грамположительные кокки, грамположи- тельные спорообразующие палочки и грамотрицательные палоч- ки с полярным жгутиком. В первой группе идентифицированы Micrococcus varians, М. ureae, М. candidus, во второй — Bacillus cereus, В. cereus var. mycoides, В. circulans. К третьей группе отнесены представители рода Pseudomonas. Хэттинг с сотруд- никами [375] выделил аналогичные культуры из метантенка, адаптированного к синтетическому субстрату, содержащему (в г/л): декстрина — 25; сахарозы — 35; питательного бульона — 10; гидролизата казеина — 6; янтарной кислоты — 0,45; уксус- ной кислоты — 0,3; пропионовой кислоты—0,2; масляной кисло- ты — 0,05; молочной кислоты — 0,75; тартаровой кислоты — 0,375; валериановой кислоты — 0,025. Это были Bacillus cereus, В. cereus var. mycoides, В. megaterium, В. puntothenticus, В. pumilis и Pseudomonas spp. 16 культур выделены на среде для денитрифицирующих бактерий. Из них только 4 штамма отнесены к роду Pseudomonas. Изолированы также фотосинте- зирующие несерные пурпурные бактерии Rhodopseudomonas sp. Культуры денитрифицирующих бактерий Alcaligenes spp., Ach- romobacter spp., Pseudomonas spp. и Bacillus sp. получены так- же методом обогащения на среде с метанолом [337]. Они спо- собны расти и осуществлять денитрификацию, используя СН4 в качестве единственного источника углерода. Метан служит также донором водорода при процессе денитрификации. Наряду с метаном бактерии могут использовать метанол, этанол, малат и лактат. При разложении отходов мясо-консервной промыш- ленности выделяются Ps. denitrificans, Serratia indicans, Klebsi- ella и некоторые другие бактерии [312]. 3 штамма облигатно анаэробных бактерий, идентифицированных как Bacteroides ru- minicola, подгруппа brevis, изолировала из разлагающегося ила Суссман [484]. Выделенные культуры обладают значительной сахаролитической и некоторой протеолитической активностью, образуют из глюкозы янтарную, уксусную и муравьиную кисло- ты и требуют для роста неизвестный дополнительный фактор. Из разлагающегося ила изолирован возбудитель анаэробного брожения, названный Streptococcus diploidus. Этот микроорга- низм превращает спирт (при концентрации не больше 8%), жи- 137
ры и углеводы в кислоты. Оптимальная температура процесса 35° С, pH — 7,6. При инокуляции ила данной культурой про- цесс первичной деструкции органических веществ происходит быстрее, чем в контроле [399, 400]. Эти же авторы [311, 401] выделили факультативно анаэробные споровые бактерии, уча- ствующие в ферментации ила, которые они предложили назвать Bacillus endorhythmos. Терин [493] выделил из содержимого метантенков и охаракте- ризовал 92 культуры. Все бактерии были анаэробами или микро- аэрофилами. Около 50% изолятов были спорообразующими. Па- лочковидные микроорганизмы напоминали по морфологии Согу- nebacterium, Lactobacillus, Ramibacterium, Actinomyces и Bifido- bacterium. Автор считает, что классическое определение до вида бактерий, осуществляющих анаэробное разложение органиче- ских отходов, меньше дает для характеристики бактериологии процесса, чем выделение крупных микробных групп на основании морфологического и биохимического сходства. Приведенные результаты позволяют заключить, что ведущую роль в процессах анаэробного разложения органического ма- териала играют облигатные анаэробные бактерии. Однако сис- тематическое выявление в содержимом метантенков аэробов и факультативных анаэробов свидетельствуют о том, что эти микроорганизмы также участвуют в деструкции органических веществ, и при определенных условиях численность их может существенно возрастать. Так, при добавлении к ферментируемой жидкости глюкозы количество аэробных и факультативно ана- эробных бактерий повышается от 1 X 106 до 3,2 X 109 клеток/мл (цит. по [404]). Наряду с бактериями в содержимом метантенков обнаружи- ваются грибы. Кук (цит. по [495]) добавлял к разлагающемуся содержимому лабораторных моделей метантенков мицелиальные и дрожжевые грибы и обнаружил, что внесенные клетки не гиб- нут, а у отдельных видов их число даже увеличивается. Автор заключил, что грибы принимают участие в процессах разложе- ния органического материала в метантенках, а не присутствуют там в виде покоящихся клеток. Вторая стадия анаэробной ферментации органических отхо- дов осуществляется метанообразующими бактериями. Эти орга- низмы довольно широко распространены в природе и обнаружи- ваются в почве, органических осадках озер и прудов, рубце травоядных животных, сточных водах и содержимом метантен- ков. Биохимии метаногенной фазы уделялось много внимания, однако сравнительно мало сведений о бактериях, ее осуществ- ляющих. Изучение метанообразующих бактерий затруднено из- за высокой чувствительности их к кислороду, а также очень не- значительной скорости роста. Морфологически метаноген- ные бактерии очень разнообразны. Баркер [293] разделил их 138
на три группы в зависимости от формы клеток и указал суб- страты, из которых вероятнее всего образуется метан: Палочковидные клетки Неспорообразующие: Methanobacterium 1. Mbact. formicicum — муравьиная кислота, СО, Н2 2. Mbact. propionicum — пропионовая кислота 3. Mbact. sohngenii — уксусная кислота масляная кислота Спорообразующие: Methanobacillus 1. Mbac. omelianskii — первичные и вторичные спирты* Сферические клетки Клетки, не имеющие расположения сарцин: Methanococcus 1. Me. mazei — уксусная кислота, масляная кислота, 2. Me. vannielii — муравьиная кислота, Н2 Клетки, расположенные как сарцины: . Methanosarcina 1. Ms. barkerii — метиловый спирт, уксусная кислота, СО, Н2 2. Ms. methanica — уксусная кислота Дополнительно к перечисленным нужно отметить изолиро- ванный из рубца новый, не описанный ранее организм Mbact. ги- minantium [478], способный окислять Нг или муравьиную кисло- ту с одновременным восстановлением СО2 до метана. В даль- нейшем исследования Брайанта с сотр. [310] показали, что Methanobac. omelianskii не отдельный вид, а симбиотическая ассоциация двух видов бактерий. Число метаногенных бактерий в разлагающемся иле доволь- но значительно. Хьюкелекьен и Хэйнемэн [цит. по 495] выдели- ли из 1 мл содержимого метантенков 25 X 102—25 X 106 бак- терий, способных ферментировать уксусную кислоту, 6 X 102— 25 Х106 бактерий, ферментирующих масляную кислоту, и 25 X X 102—25 X Ю8 бактерий, ферментирующих этиловый спирт. Близкие результаты (105—108 клеток/мл) получены другими авторами [427]. Смис (цит. ио [495]) из разлагающегося ила бытовых сточных вод выделил чистые культуры метанообразую- щих бактерий: Mbact. formicicum — 1 ХЮ7, Mbact. sp.— 1 Х108, Mbact. ruminantium — 1 X 107, Mcoc. sp.— 1 X 106, Msarc. bar- kerii — 1 X 106. Автор показал, что ацетатферментирующие ме- таногенные бактерии обнаруживаются в меньшем числе, чем водородокисляющие, хотя еще недавно считалось, что 70% ме- тана выделяется при ферментации ацетата. Многие авторы [404, 471] указывают на зависимость резуль- татов количественной и качественной оценки метаногенных бак- 139
герий от состава использованной питательной среды и методики культивирования. На солевой среде, содержащей 1% муравьино- кислого натрия, а также цистеин и тиогликолят в качестве восстанавливающих агентов, через 8—10 дней выделяли мак- симальное число метанообразующих бактерий [404]. По мнению Зиберта и Хэттинга [471], муравьинокислый натрий обеспечи- вает рост бактерий, ферментирующих уксусную, пропионовую и масляную кислоты. В отличие от муравьинокислого натрия, метанол, смесь СО2—Н2 и ацетат не поддерживают каждый в отдельности рост метаногенных бактерий до тех пор, пока не добавлен другой источник энергии — муравьинокислый натрий. Брайент с сотр. [310] приводит следующий перечень метаноген- ных субстратов: Н2, СОз, СО, метанол, муравьиная и уксусная кислоты. Анализируя данные о ферментации метанообразующи- ми бактериями жирных кислот, содержащих в цепочке до шести атомов углерода, автор подвергает сомнению чистоту бакте- риальных культур, использованных другими исследователями. При сравнительном подсчете метаногенных бактерий показа- но, что в жидкой среде вырастает в 10 раз больше клеток, чем на твердой [495]. Наиболее многочисленными были водород- окисляющие бактерии. Число бактерий, ферментирующих уксус- ную кислоту, всегда на 1—3 порядка меньше. Зиберт с сотр. (цит. по [495]) также изучали влияние состава питательной среды на результаты определения числа клеток метаноген- ных бактерий. Были испытаны 22 варианта среды и подобран оптимальный состав питательных веществ. На предложенной авторами среде обнаружено от 1 X 108 до 1,9 X 1010 клеток/мл. Однако эти данные получены для экспериментальной установки, перерабатывающей «синтетический» сток. Аналогичных данных с использованием этой среды для исследования бактерий в про- изводственных сооружениях нет. Механизм образования метана до настоящего времени пол- ностью не выяснен. Учитывая различные точки зрения, Баркер (цит. по [404]) предложил следующую унифицированную концеп- цию продукции метана, которая включает как теорию восста- новления СО2, так и теорию прямого восстановления субстрата: СО2 нсоон СН3СН2СООН СН3СН2ОН1 сн3сн2соон] ------хСООН СО2 + хН----1 СН3ОН 4- хН--, 4 I I -Н2о СН3СООН + хН ---хН+ I + 2H+ I —Н2О ХСНО | + 2Н+ хСН2ОН I + 2Н+ I — Н2О I хСН3 I + 2Н+ сн4 140
В этой схеме СО2 соединяется с неидентифицированным но- сителем и образуется карбоксильное производное вещества х. Далее следует восстановление этого карбоксильного производ- ного с освобождением метана и регенерацией вещества х. хН может также соединяться с метанолом, в результате чего после дегидрирования образуется хСН3, из которого затем выде- ляется метан. После соединения уксусной кислоты с хН также в конечном итоге получается хСН3, а затем образуется метан. Ферментативные системы, принимающие участие в образовании метана, изучались Панцхавой с сотр. [195]. Таким образом, превращение органического вещества в ме- тантенках происходит в две стадии: сбраживание субстрата до жирных кислот (неметаногенная) и образование из жирных кислот СН4 и СО2 (метаногенная). Во время первой стадии главную роль играют анаэробные бактерии родов Clostridium, Bacteroides и др. Вторую стадию осуществляет уникальная груп- па облигатных анаэробов — метановые бактерии родов Methano- bacterium, Methanobacillus, Methanococcus, Methanosarcina. Своеобразная микрофлора развивается в открытых искус- ственных водоемах различной глубины — лагунах. Интерес к таким гидротехническим очистным бассейнам особенно возрос в конце 40-х годов, когда было показано, что в лагунах можно очищать воды с высокими концентрациями загрязнений, и стои- мость такой очистки значительно ниже, чем при использовании других методов [305, 306]. Перегрузка некоторых лагун кон- центрированными сточными водами приводит к тому, что рас- творенного кислорода в них становится мало, условия прибли- жаются к анаэробным, тем не менее очистка сточных вод происходит удовлетворительно. Со временем анаэробным, глу- боким лагунам стали отдавать предпочтение. Интересной особенностью анаэробных лагун является то, что жидкость во многих из них приобретает красную пигмента- цию. Это явление обусловливается присутствием фотосинтези- рующих серобактерий, относящихся к семейству Thiorhodaceae, которые развиваются в анаэробных условиях при наличии в среде сероводорода и освещении. Очевидная польза этих орга- низмов состоит в том, что они потребляют сероводород и умень- шают неприятный запах лагун. Купер [328] относит красную окраску воды в лагунах на счет Thiopedia rosea и в меньшей степени — на счет бактерий рода Chromatium. Последние описаны как одноклеточные сфе- рические или палочковидные организмы со жгутиками, способ- ные образовывать капсулы, но не зооглеи; имеют характерный красный пигмент. В отличие от других представителей семей- ства Thiorhodaceae они достаточно легко культивируются. Бак- терии рода Chromatium найдены Купером в пруду близ Рич- монда (Калифорния), куда сбрасывались воды нефтеперераба- тывающего завода. Характерно, что там не наблюдается 141
обычного для анаэробных лагун газовыделения. Внесение в ана- эробную лагуну, принимающую сточные воды шерстомойки, метановых бактерий Thiopedia rosea вскоре привело к ярко-ро- зовой окраске воды [329]. Слеттен и Зингер [475] впервые обнаружили в красноватой воде анаэробной лагуны, очищающей сточные воды сельскохо- зяйственной фермы, бактерии рода Rhodothece (сем. Thiorhoda- сеае) — одноклеточные, пигментированные, шарообразные орга- низмы диаметром около 3,5 мк, без жгутиков, часто объединен- ные в пары или короткие цепочки. Пигмент клеток представляет собой в основном бактериальные хлорофиллы и ксантофиллы; обнаружены только следы каротиноидов. Пигмент в воду не выделяется, а окраска лагун достигается благодаря очень вы- сокой — до полумиллиарда клеток в 1 мл — концентрации бак- терий в воде. Авторы считают фотосинтезирующие серобактерии полезными для очистки сточных вод организмами, разрушающи- ми восстановленные соединения серы и предотвращающими таким образом отвратительный запах анаэробных лагун. Ре- комендуется вносить эти бактерии в больших количествах в те лагуны, где их нет. Из окислительного пруда были выделены пурпурные серобак- терии Chromatium vinosum и Thiocapsa floridana, интенсивно размножающиеся в естественных условиях при температуре около 16° и pH 7,7—8,2 [383]. Известно, что пурпурные серо- бактерии могут использовать некоторые органические вещества в качестве источников углерода или доноров электронов [226, 267]. Эту способность они проявляют и в случае очистки сточ- ных вод: серобактерии разрушают некоторые углеводы, амино- кислоты, соли летучих органических кислот, в частности ацета- ты, и другие вещества, способствуя снижению загрязненности воды [383]. Thiocapsa floridana интенсивно потребляет биотин, синтезируемый в лагунах Aerobacter aerogenes и другими бак- териями [353]. Важную роль в очистке сточных вод в лагунах играют ме- тановые бактерии. Так, например, Methanobacterium formicicum встречается и развивается в лагунах при температуре 15° и выше и pH 7,02—8,0 [383]. Метановые бактерии используют для роста муравьиную кислоту, метанол и другие вещества, имею- щиеся в лагунах. Анализ работ, посвященных исследованию микрофлоры, уча- ствующей в процессах аэробного и анаэробного разложения органических отходов, показывает, что при очистке сточных вод в различного типа сооружениях получают преимущество и более интенсивно развиваются определенные таксоны микро- организмов. В условиях аэротенков — это грамотрицательные палочковидные бактерии, среди которых преобладают псевдо- монады, в биофильтрах — это грамотрицательные бактерии и грибы, в метантенках — анаэробные гетеротрофные и метановые 142
бактерии. Состав микробных ценозов очистных установок зави- сит также от характера разлагаемых веществ. Как указывает Маккинней [420], «природа органических соединений в отходах, подлежащих стабилизации, определяет, какие бактерии будут доминировать. На белковых отходах преобладают Alcaligenes, Flavobacterium, Bacillus, в то время как на углеводных или угловодородных — Pseudomonas». Такая зависимость тем более должна проявляться при очистке промышленных сточных вод, содержащих специфические, часто токсичные для большинства микроорганизмов вещества, которые и определяют состав ми- кробной популяции, способной к их разложению.
ГЛАВА III МИКРОБНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ НЕКОТОРЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Природные органические вещества принимают участие в посто- янном процессе круговорота элементов в биосфере Земли. Воз- можность деструкции всех природных органических веществ микроорганизмами ни у кого не вызывает сомнения. Сто лет назад Луи Пастер писал: «...роль бесконечно малых казалась мне бесконечно большой... благодаря участию их в разложении и возвращению в воздух всего, что жило!» [197]. Очень яркая, образная картина огромного кладбища, каким предстала бы перед нами природа в отсутствие микроорганизмов, представле- на в известном учебнике академика В. Л. Омелянского [193]. Видный советский микробиолог А. Е. Крисс [150] указывает: «По доступности для бактериальных ферментов органическое вещество разделяется на нестойкое и стойкое органическое ве- щество. Эти термины означают, что всякое органическое веще- ство в подходящих условиях подвергается превращениям энзи- мами бактерий, но не с одинаковой легкостью». Автор здесь имеет в виду «органическое вещество», продуцируемое в Миро- вом океане. Но эти слова можно в полной мере отнести ко всем природным органическим соединениям биосферы, особенно если учесть деятельность не только бактерий, но актиномице- тов и микроскопических грибов. И то, что органика сохраняет- ся на протяжении веков в древних мощах, мумиях египетских фараонов и т. п., отнюдь не означает, что она стойка к микроб- ной атаке, а означает лишь отсутствие «подходящих условий» для проявления разрушительной способности микроорганизмов. То же самое можно сказать и об углеводородах нефти, которые залегают в недрах Земли практически без изменений миллио- ны лет — будучи извлеченными на поверхность, в аэробных условиях они сразу же находят для себя потребителей среди разнообразнейших представителей микробного мира. Сложнее обстоит дело с синтетическими органическими ве- ществами. Именно для них, для man-made substances, существу- ют термины «nonbiodegradable», «recalcitrant molecules», «xenobi- 144
otics» и др. Вначале считалось, что многие из синтетических органических соединений не поддаются никаким превращениям [281]. Потом список таких «недоступных» веществ стал сокра- щаться в связи с появлением новых данных о микроорганизмах и осуществляемых ими реакциях. Сейчас преобладает мнение о том, что все без исключения синтетические органические со- единения могут подвергаться деструктурирующему влиянию микроорганизмов [230]. Ассортимент синтетических веществ, которые попадают в окружающую среду, сравнительно невелик, хотя исчисляется уже десятками тысяч наименований. Количество таких соеди- нений, в отличие от природных, неудержимо растет. Круговорот элементов в современной биосфере включает также и эти орга- нические вещества. На рис. 33 представлена схема основных превращений природных и синтетических соединений [43]. Син- тетические процессы, осуществляемые в результате автотрофного и гетеротрофного биосинтеза, дополняются сейчас химическим синтезом, реализуемым человеком. Полное биохимическое разложение органических соединений, их минерализация с образованием неорганических веществ (углекислоты, воды, аммиака, нитратов, фосфатов, сульфатов, окислов металлов и т. д.) достигается в результате целого ряда последовательных реакций — микробных превращений или трансформаций. Такие превращения приводят к изменению структуры органических веществ, а иногда и к усложнению его строения. Трансформации, которые существенно изменяют, глав- Рис. 33. Схема превращений природных и синтетических веществ в биосфере: 1 ~~ неорганические вещества; 3 — природные органические вещества, в том числе ключевые соединения, (2); 4— синтетические органические вещества. ным образом упрощают, структуру органического вещества, при- нято называть деструкцией. Трансформации органических со- единений могут сопровождаться частичной их минерализацией (рис. 33), например, в результате реакций дезаминирования, декарбоксилирования и т. д. Ю 8—610 145
Микроорганизмы путем ряда трансформаций переводят все природные и синтетические вещества в так называемые ключе- вые соединения — несколько десятков веществ (аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, субстраты основных метаболических циклов клетки и др.), из которых синтезируют все необходимые компоненты и получают основную часть энер- гии. Превращения, в результате которых образуются ключевые соединения, называют реакциями подготовительного метаболиз- ма, реакции основных метаболических циклов — ключевого (ос- новного) метаболизма, а синтез биополимеров и других необ- ходимых клетке соединений — реакциями конструктивного мета- болизма [122, 123]. Ферменты, которые осуществляют реакции основного и кон- структивного метаболизма, высокоспецифичны и, как правило, конститутивны. Ферменты подготовительного метаболизма отно- сятся в основном к индуктивным ферментам и намного менее специфичны. Это способствует вовлечению в микробные реак- ции самых разнообразных соединений, в частности и таких, ко- торые ранее в природе не встречались. Однако синтетические вещества обычно очень медленно раз- лагаются в окружающей среде, они склонны накапливаться в живых организмах, причем степень кумуляции увеличивается по трофической цепи. Так, например, степень кумуляции хлор- органических пестицидов (в том числе ДДТ) водорослями до- стигает двух порядков [505], а концентрация ДДТ в теле рыб может в десятки тысяч раз превышать его концентрацию в воде, в которой эта рыба живет [395]. Синтетические органиче- ские вещества в природе подвергаются атаке главным образом со стороны микроорганизмов. Изучение этого процесса, позна- ние физиологических, биохимических и генетических механизмов микробной деструкции синтетических соединений представляет собой один из интереснейших, важнейших и наименее изучен- ных разделов современной теоретической микробиологии [113, 114, 122, 123]. Наиболее важный, нуждающийся в разрешении практиче- ский вопрос состоит в подборе соответствующих культур микро- организмов и нахождении подходящих условий для разрушения синтетических органических веществ. Но уже сейчас в сточных водах встречается более 55 тысяч разнообразных синтетических соединений [178] и найти для каждого из них оптимальный режим биодеградации и самый подходящий микроорганизм- деструктор представляется нереальной задачей. Существует несколько подходов к решению проблемы био- логической очистки промышленных сточных вод. Простейший из них сводится к определению основных технологических па- раметров обработки сточной жидкости (чаще всего смеси про- мышленных и бытовых стоков) активным илом, биопленкой или другим комплексом микроорганизмов. Работы по очистке сто- 146
ков отдельных предприятий с помощью активного ила представ- ляют большой практический интерес для каждого конкретного завода или комбината, однако они не имеют научной ценности, поскольку включают два неизвестных — неопределенный хими- ческий состав стока и неопределенный биологический состав ценоза. Иногда достаточно незначительного изменения техноло- гии получения какого-нибудь вещества и связанного с ним из- менения сточных вод, как всю работу по биоочистке такого стока по сути необходимо начинать сначала. Значительно большую научную информацию несут исследо- вания по разрушению активным илом или биопленкой опреде- ленного синтетического вещества. Однако в большинстве этих работ преобладают инженерно-технологические аспекты и мало внимания акцентируется на «главных действующих лицах» — бактериях, актиномицетах или грибах, которые осуществляют весь процесс деструкции. И только в последнее время к реше- нию острой проблемы очистки биосферы от синтезированных человеком органических веществ подключаются микробиологи и биохимики, которые изучают пути деструкции определенных, наиболее важных (токсических или широко распространенных) синтетических загрязнителей, ищут микроорганизмы-деструкто- ры, выделяют ферментные системы, обеспечивающие данный процесс. Наиболее распространенный метод поиска микроорганизмов- деструкторов органических соединений сводится к тому, что определенную экологическую систему (ил, почву) обрабатывают некоторое время водой, содержащей в возрастающей концентра- ции вещество, которое необходимо разрушить, а затем из такой культуры накопления выделяют микроорганизмы, способные ис- пользовать это соединение как единственный источник энергии, углерода, азота и т. д. Такой метод нельзя считать целесообраз- ным. И не только потому, что он чисто эмпирический. Его использование не гарантирует отбора действительно наилучшего микроба-деструктора, хотя выбор производится из чрезвычайно широкого круга организмов: при этом выделяется микроорга- низм, который именно в данных условиях скрининга разрушает то или иное вещество. Даже при незначительных изменениях реакции среды, аэрации, температуры и т. п. может доминиро- вать и выделиться другой микроорганизм. Научный подход к выбору микроорганизмов-деструкторов должен базироваться на детальном изучении физиологии и биохимии микробных культур, а также путей деструкции органических веществ в живой клетке. Только на основании таких знаний можно сознательно подби- рать микробы, способные обезвреживать определенные соеди- нения, или установить наличие органических веществ, которые могут быть разрушены отдельной группой микроорганизмов. Важное значение имеет анализ конечных продуктов деструк- ции того или иного вещества [41]. Так, полная минс^ализвция 10* 147
соединений, содержащих металлы (особенно щелочные) или относительно большое количество азота, обязательно сопровож- дается повышением pH среды, и поэтому наиболее вероятных деструкторов таких соединений необходимо искать среди микро- организмов, которые предпочитают щелочную среду. Наоборот, при деструкции фосфорорганических и галогензамещенных ве- ществ среда подкисляется, и поэтому для полной минерализации этих соединений следует выбирать микроорганизмы, предпочи- тающие кислую среду. Конечно, нельзя не принимать в расчет весь путь биологического разложения органического вещества, и особенно начальных этапов метаболизма. Синтетические соединения имеют самое разнообразное хи- мическое строение, физиологические свойства, назначение и при- менение. Исследования, связанные с изучением деструкции этих веществ с помощью микроорганизмов, постоянно расширяются. Необходимо обобщить весь накопленный экспериментальный материал, найти правильные подходы к классификации загряз- нений с точки зрения их возможной биодеструкции. Вопрос этот очень сложный. Настоятельная необходимость разделить синтетические вещества на определенное число групп диктуется потребностью практики, желанием на каждое изменение соста- ва загрязнителей адекватно реагировать сознательным измене- нием биоценоза, способного их обезвреживать. Видный американский микробиолог Мартин Александер от- мечает в одной из своих работ [282]: «Таким образом, на основании имеющейся литературы можно выделить следующие категории загрязняющих веществ, которые должны изучаться биологами, занимающимися бактериями, грибами, актиномице- тами, водорослями и протозоа в природе: а) пестициды, особен- но инсектициды, гербициды и фунгициды; б) поверхностно-актив- ные вещества; в) хелатообразующие агенты; г) тяжелые метал- лы, в частности ртуть и мышьяк; д) полихлорированные бифенолы, более широко известные как ПХФ-лы; е) многочис- ленные органические соединения, попадающие в воду как побоч- ные продукты производства или отходы промышленности; ж) синтетические полимеры; з) углеводороды нефти или при- родного газа; и) нитраты; к) другие питательные ионы, которые поддерживают рост нежелательных водорослей; л) нитрозамины; м) серная кислота и н) загрязнители воздуха». В другой работе Александер [283] относит к трудноразру- шаемым синтетическим соединениям такие группы веществ: пе- стициды, полихлорированные бифенолы, синтетические полимеры, поверхностно-активные вещества (ПАВ), азотсодержащие со- единения и другие вещества, которые попадают в промышлен- ные сточные воды. Совершенно очевидно, что автор выделяет группы синтетических загрязнителей, не придерживаясь какого бы то ни было принципа классификации: и по физиологическим свойствам (пестициды), и по химическому строению (полихлор- 148
фенолы, азотсодержащие вещества), и по физико-химической характеристике (ПАВ, полимеры) и т. д., а все оставшиеся соединения, «не вписавшиеся» в эти разнородные группы, отно- сит к «другим веществам промышленных сточных вод» или «загрязнителям воздуха». Мы считаем, что рациональное ис- пользование микроорганизмов для разрушения синтетических органических веществ возможно только на основе установления общих закономерностей биодеструкции. По-видимому, макси- мальную пользу принесло бы определение взаимосвязи между химическим строением органических соединений и таксономи- ческим положением микроорганизмов, способных их эффективно разрушать [42]. Всем известна субстратная специфичность микроорганизмов по отношению к природным источникам питания. Так, напри- мер, разложение белковых веществ осуществляется гнилостны- ми бактериями, которые, однако, не способны конкурировать с дрожжами в ассимиляции углеводов. Многие микробы харак- теризуются особенной приверженностью к определенному суб- страту, и некоторые из них даже получили соответствующие названия, как то — целлюлозоразлагающие бактерии. Это свой- ство микроорганизмов издавна используется на практике. Даже одно и то же органическое вещество атакуется различными груп- пами микроорганизмов по-разному. Это особенно четко было показано в связи с микробной трансформацией стероидов. Г. К. Скрябин с сотрудниками приводит множество примеров высокой химической специализации микроорганизмов и даже использует это свойство как таксономический признак [229]. Нами на примере сердечных гликозидов отмечено, что грибы рода Aspergillus вводят гидроксильную группу преимуществен- но в 7р-положение стероидного ядра, в то время как фузарии предпочитают окислять 12р-углеродный атом [39, 40, 49]. При микробной деструкции синтетических органических веществ на- блюдается аналогичное явление [392]. Установлено, что обра- ботка такой разнородной популяции, как почва или активный ил, например, нитро- и динитрофенолами приводит к заметному обогащению ее видами Achromobacter, Alcaligenes и Flavobac- terium, тогда как прибавление тиогликолана увеличивает отно- сительное содержание Aeromonas и Vibrio [391]. Совершенно очевидно, что для успешного разрушения тех или иных синте- тических органических веществ необходимо подбирать соответ- ствующие микроорганизмы. Все синтезированные человеком органические вещества име- ют аналоги среди природных, и необычность их строения со- стоит в своеобразном размещении атомов в молекуле, а отнюдь не в наличии каких-то новых, неизвестных природе типов связи между ними. Исходя из этого, при рассмотрении микробной деструкции синтетических органических соединений мы придер- живаемся традиционного для классической микробиологии де- 149
ления веществ в соответствии с их химическим строением, с уче- том того, какая часть молекулы вовлекается в биохимическую реакцию и источником какого элемента является это вещество. Такой подход позволяет объединить все синтетические органи- ческие вещества в несколько групп: источники углерода; со- единения азота; серу-, фосфор- и галогенсодержащие вещества; элементорганические соединения [221]. Химический принцип классификации прост и, как оказалось, достаточно эффективен, однако нельзя не отметить тех трудно- стей, которые могут встретиться при отнесении того или иного соединения к определенной группе. Так, например, широко при- меняемый пестицид паратион имеет следующее строение: S СаН6О, || ,---х \p-O-S 4-NO2, C2H6OZ я поэтому в равной степени может рассматриваться и как азот-, и серу-, и фосфор-, и конечно, как углеродсодержащее веще- ство. Как быть в подобных случаях? Если бы в биохимическую реакцию вовлекался сначала атом серы, то такая трансформа- ция изучалась бы наряду с другими микробными превращения- ми серусодержащих соединений. Но микроорганизмы донных отложений [368] и гриб Penicillium waksmani Zaleski [453] начинают разрушение паратиона атакой МО2-группы: S S С2Н6О || ,--х С2Н5О || ,--х /Р—О—\ NO2 -* )Р—О—%—NH2, с2нвох c2H5oz поэтому его нужно вначале рассматривать в разделе «деструк- ция соединений азота». Известно также [468], что разложение паратиона культурой Flavobacterium sp. протекает в результате гидролиза эфирной связи между фосфором и бензольным кольцом с образованием диэтил-орто-тиофосфорной кислоты и и-нитрофенола: С2Н5О || ---х С2Н5О || ,--х >Р—О—" у—NO2 ->• \р—он + НО—^>-no2. С2Н5ОХ \=/ C2H5OZ \=/ В этом случае целесообразно изучать его разрушение как деструк- цию фосфорорганического вещества. Превращение образовав- шегося n-нитрофенола можно найти в разделе разрушения азотсодержащих соединений, а отщепление серы от диэтил-орто- тиофосфорной кислоты — в анализе трансформаций серусодер- жащих веществ. Это создает некоторые неудобства, особенно, если нужно проследить за полной минерализацией какого-то сложного син- тетического соединения. Однако такой подход представляется нам более правильным, чем деление вещества на группы, исходя 150
из их назначения. Для микроорганизма, по-видимому, не столь важно, используем ли мы синтетическое нитросоединение в ка- честве красителя (нитроанилин), взрывчатого (тринитротолуол) или лекарственного (нитроглицерин) вещества — все три соеди- нения могут послужить ему источником азота, если он обладает свойством трансформировать нитрогруппу. Несомненное преимущество химической классификации син- тетических загрязнителей заключается еще и в том, что она позволяет рассматривать микробное разрушение целых групп веществ в соответствии с их строением, что дает возможность после накопления и систематизации экспериментальных фактов вывести определенные закономерности процесса минерализации самых разнообразных веществ, предвидеть пути их деструкции, предсказать с большой степенью вероятности наиболее подходя- щие таксономические группы микроорганизмов, способные бы- стро и эффективно их разрушать, т. е. наметить действительно научный, а не чисто эмпирический, подход к решению сложной проблемы микробной очистки воды от синтетических веществ. Биохимическая очистка сточных вод базируется либо на ис- пользовании широкого круга водных микроорганизмов, которые входят в состав разнообразных ценозов — илов, биопленки и т. п., либо на применении адаптированных, высокоактивных микроорганизмов, особенно их ассоциаций, или, наконец, на внедрении в технику очистки иммобилизованных (адсорбирован- ных или химически закрепленных на твердых поверхностях) биологических катализаторов — ферментов. Первый процесс включает традиционную очистку бытовых сточных вод в аэротенках, биофильтрах, лагунах и других очистных сооружениях, а также самоочищение водоемов. Это наиболее распространенный, надежный биологический метод очистки воды, хотя он и имеет ряд недостатков: требует огром- ных очистных сооружений, значительных земельных площадей, а в случае очистки промышленных стоков — часто и дополни- тельного количества воды для разведения сточных вод с целью уменьшения концентрации того или иного токсического вещества в них. Существует тенденция очищать сточные воды химических предприятий совместно с бытовыми стоками. Однако такой спо- соб не всегда достаточно эффективен. П. Е. Шкодич и сотр. [270] отмечают, что многие трудноокисляющиеся синтетические органические вещества, в том числе, например, бенз (а) пирен, проходят через биологические сооружения без изменений; это обстоятельство привело авторов к выводу, что решающим усло- вием для эффективной очистки сточных вод предприятий орга- нического синтеза является их предварительная подготовка на локальных внутрицеховых установках. Все более широкое применение, особенно для очистки про- мышленных высококонцентрированных стоков, находит [409, 430] микробный метод, предложенный Н. Т. Путилиной [207]. 151
Распространению этого безусловно перспективного и более эф- фективного по сравнению с предыдущим метода препятствует в основном отсутствие рационального способа отделения микро- организмов от очищенной ими воды. Третий метод — ферментативный — предусматривает пропус- кание воды через специальную загрузку, удерживающую в ак- тивном состоянии ферменты, которые катализируют соответ- ствующие превращения соединений-загрязнителей. Известны только отдельные случаи ферментного обезвреживания стоков, превращения токсических или биорезистентных примесей воды в нетоксические вещества, которые легко усваиваются водными организмами. Иммобилизованные ферменты имеют большую перспективу при локальном обезвреживании промышленных сточных вод, однако их применение связано со значительными трудностями, которые заключаются как в получении специаль- ных ферментов, так и в их закреплении на поверхности загруз- ки. Несмотря на это, ферментативный метод, безусловно, займет надлежащее место в системе очистки воды. ДЕСТРУКЦИЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Поверхностно-активные вещества (ПАВ) представляют собой разнородную по химической структуре группу соединений, кото- рые обладают одинаковой способностью снижать поверхностное натяжение жидкостей. Несмотря на стремление рассматривать микробную деструкцию синтетических веществ в связи с их хи- мическим строением, в данном случае нам представляется более удобным использовать чисто утилитарную классификацию для того, чтобы привлечь внимание лиц, интересующихся проблемой биоразложения ПАВ, опасных загрязнителей воды. Внутри этой группы мы анализируем имеющиеся в литературе и полученные нами данные с точки зрения выяснения корреляции между ми- кробными таксонами и химической структурой разрушаемых веществ. Поверхностно-активные вещества принято делить на ионо- генные, диссоциирующие на ионы в водной среде, и недиссоци- ирующие—неионогенные. К ионогенным относятся анионактив- ные (АПАВ), которые при диссоциации образуют макроанион, обладающий поверхностной активностью, катионные (КПАВ), образующие поверхностно-активный макрокатион, и амфотерные или амфолитные, диссоциирующие как АПАВ или как КПАВ в зависимости от реакции среды. Большую угрозу загрязнения воды представляют анионные и неионогенные поверхностно-активные вещества, широко ис- пользуемые в качестве компонентов моющих средств или детер- гентов (от английского «deterge» — очищать). Мировое произ- водство синтетических детергентов с 30 тыс. т в 1949 г. возросло 152
до 900 тыс. т в 1973 г. и продолжает ежегодно увеличиваться. Только в СССР сейчас выпускают около 700 тыс. т моющих средств в год, а к 1980 г. предполагают довести выпуск до 1 млн. т в год. Наряду с моющим действием ПАВ характери- зуются эмульгирующими, диспергирующими, солюбилизирующи- ми и другими полезными свойствами, в связи с чем находят самое разнообразное применение в промышленности, сельском хозяйстве, строительстве, быту, медицине и т. д. Целевое назначение ПАВ как моющих средств обусловлива- ет попадание почти всего объема их продукции в сточную воду, которая, в свою очередь, может загрязнять поверхностные водоемы, грунтовые воды, почву. Химические и физико-химиче- ские методы очистки стоков не решают проблемы борьбы с загрязнением воды поверхностно-активными веществами, так как при использовании этих методов ПАВ, как правило, только концентрируются или разрушаются частично, но не разлагаются полностью до СО2, Н2О и других простейших продуктов. Полная деструкция детергентов осуществляется микроорганизмами, на использовании которых основаны все биологические методы очи- стки воды. Однако очистка стоков от ПАВ общепринятыми био- логическими методами затруднена, поскольку многие из этих веществ сравнительно устойчивы к микробному разложению и проходят через очистные сооружения, не изменяясь. При этом ПАВ из-за высокой способности к пенообразованию нарушают их работу, снижая скорость оседания активного ила. Разнесе- ние пены ветром создает эпидемиологическую опасность, так как вместе с пеной распространяются болезнетворные бактерии, в частности возбудители кишечных инфекций. Число бактерий в водоемах при пенообразовании очень возрастает из-за того, что в пене создаются чрезвычайно благоприятные трофические условия [200]. Незначительное количество (0,2—0,4 мг/л ПАВ) придает неприятный вкус и запах питьевой воде. Образование пены на поверхности водоемов нарушает кислородный режим и вызывает массовую гибель населяющей их флоры и фауны. Изучению санитарно-гигиенических аспектов загрязнения воды ПАВ посвящена монография Е. А. Можаева [185], в которой приведены данные о их влиянии на качество воды, самоочи- щающую способность водоемов, организм человека и животных. Таким образом, совершенно очевидна необходимость интен- сификации и поиска новых эффективных биологических методов очистки сточных вод от ПАВ. Наряду с этим направлением важ- ное значение имеет изучение биоразлагаемости рекомендуемых для практики Ъштетических ПАВ, целью которого является выбор наиболее легко биохимически окисляемых веществ. В СССР, США, ФРГ и других странах запрещено производство биологически трудно разлагаемых соединений. Способность ПАВ биодеградировать зависит от их химической структуры. Строе- ние молекулы вещества, с одной стороны, предопределяет его 153
пригодность в качестве субстрата соответствующих ферментов, а с другой — сказывается на антимикробных свойствах соеди- нения. Известно, что анионактивные ПАВ обладают микробо- цидным и микробостатическим действием. При этом показано, что вещества, характеризующиеся высокой антимикробной ак- тивностью, одновременно наиболее стойки к микробному разло- жению. В связи с этим вполне вероятно, что первым этапом взаимодействия микроорганизма с ПАВ является приобретение им резистентности к данному веществу. Именно среди резистент- ных особей в дальнейшем селекционируются клетки, способные разрушать ПАВ, используя их в качестве источника питания. Вопрос о влиянии синтетических ПАВ на микроорганизмы в связи с очисткой от них сточных вод обсуждался нами ранее [224]. Биодеградацию ПАВ определяют как в природной, так и в сточной воде. В последнем случае, как правило, источником микроорганизмов служит активный ил. Наблюдаемая при этом вариабельность результатов обусловлена следующими фактора- ми: 1) разным происхождением образцов воды и ила, а также временем адаптации ила к изучаемому веществу; 2) температу- рой, при которой проводится опыт; 3) концентрацией испытуемо- го соединения; 4) временем инкубации; 5) природой дополни- тельного органического материала в образце воды; 6) различным составом технических препаратов исследуемых ПАВ. Результаты зависят не только от типа теста, но и от метода анализа. Биодеградация должна пройти настолько глубоко, что- бы образовались продукты, приемлемые для окружающей сре- ды (environmentally acceptable). Изучают как первичную, так и полную деградацию ПАВ. Под первичной подразумевают поте- рю веществом поверхностной активности, которую определяют, измеряя специфическими методами поверхностное натяжение или устанавливая концентрацию веществ, способных соеди- няться с метиленовой синью (metylen blue active substances — MBAS),— для АПАВ, и веществ, способных соединяться с вис- мутом (Bi-active substances — BiAS),— для НПАВ. Весьма приблизительные представления о первичном разложении ПАВ дают наблюдения за потерей ими способности к пенообразова- нию [302]. О частичном разложении ПАВ до безвредных про- дуктов судят по поведению живых организмов (дафний, рыб) в исследуемой очищенной воде. Полное разложение поверхно- стно-активных соединений до неорганических веществ оценивают неспецифическими методами, определяя БПК, ХПК, общий ор- ганический углерод, выделение СОг. Некоторые авторы [452] предлагают судить о разрушении ПАВ по интенсивности роста бактерий-деструкторов на средах с этими веществами. В зависимости от способности к биодеградации моющие средства, по предложению Богена и Сойер [302], делят на «мягкие» и «жесткие». «Мягкие» детергенты сравнительно легко 154
разрушаются микроорганизмами. К этой группе относятся ве- щества, которые на 85% удаляются активным илом в аэротен- ке, разлагаясь при этом до СО2 и Н2О [294]. «Жесткие» удаля- ются лишь на 40—45%. Остальные вещества составляют проме- жуточную группу. Это деление детергентов весьма условно, так как «мягкость» или «жесткость» соединения в большой степени зависят от условий постановки эксперимента. В практике в настоящее время наиболее широко используют- ся анионные ПАВ, а именно: алкилсульфаты общей формулы R—OSO3Na, алкилсульфонаты — R—SO3Na, и алкилбензолсуль- фонаты — R [OjSOaNaj где R — неразветвленная (линейная) или разветвленная углеводородная цепь, чаще всего из 10—18 угле- родных атомов. Первые исследования разлагаемости анионных ПАВ микроорганизмами проводились с активным илом и речной водой. В этих опытах было показано, что скорость биодеграда- ции АПАВ зависит прежде всего от строения алкильной цепи. Вещества с неразветвленной (линейной) цепью сравнительно легко разрушаются микроорганизмами активного ила. Развет- вления в цепи задерживают разложение ПАВ. Медленно разла- гается, например, тетрапропиленбензолсульфонат [303, 465, 470], в прошлом широко используемый в промышленности и быту. Биодеградация осуществляется легче при большей длине ал- кильной цепи, а у сульфонатов — при большем расстоянии меж- ду концом цепи и гидрофильной группой [374, 486]. Однако с увеличением длины алкильной цепи свыше См—С[3 активность деструкции алкилсульфатов уменьшается, что объясняется сни- жением растворимости [528]. Для алкилбензолсульфонатов (АБС) установлено [486], что одиночная боковая метильная группа на ближнем или отдаленном конце цепи только незна- чительно замедляет процесс биодеградации. Наличие терминаль- ной четвертичной группы не имеет большого значения, если есть открытый конец цепи. Если же такого открытого конца нет, наблюдается заметное торможение процесса. Деградация происходит, по не обычным метаболическим путем, и облегчает- ся при увеличении длины цепи. Существенное значение для биоразложения АБС может иметь положение сульфофенильной группы в алкильной цепи [377]. Терминальные изомеры мягче соединений, у которых сульфофенильная группа присоединена в середине цепи. Большой интерес представляют исследования разложения ПАВ чистыми культурами микроорганизмов. Первые работы на эту тему появились в 50-х годах. Так, Ризен [457] показал, что Ps. aeruginosa, Serratia niarcescens, Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Salmonella enteritidis, Paracolobactrum aerogenoides при выращивании на синтетической среде могут использовать различные анионные ПАВ в качестве единственного источника 155
углерода. Обнаружено, что на скорость биоразложения влияет минеральный состав питательной среды. Из почвы, сточных вод и активного ила были выделены бактерии, способные расти на среде с АБС в качестве единственного источника углерода: Alcaligenes faecalis (7 культур), A. viscosus (2), A. bookeri (1), Ps. putrefaciens (2), Ps. denitrificans (1), Ps. convexa (1), Pseu- domonas sp. (11), Flavobacterium suaveolans (1), Escherichia coli (1), Aerobacter aerogenes (3), Paracolobactrum aerogenoides (3), Bacillus sp. (1) [422]. 15 штаммов из 34 прекрасно росли на АБС. Для 7 культур не была токсичной даже такая высо- кая концентрация вещества, как 1000 мг/л. Штаммы Ps. fluores- cens, Ps. putida, Achromobacter sp., способные расти за счет l-n-додецилсульфоната, изолированы Кардини с сотр. [318]. Авторам не удалось выделить бактерии, способные расти на l-n-гексадецилсульфонате, однако культуры, адаптированные к l-n-додецилсульфонату, разрушали также, хотя и медленнее, 1 -n-гексадецил сульфонат. Интересные работы выполнены Пейном с сотр. [435—437]. Из почвы, взятой в районе очистного сооружения, методом на- копления были выделены два штамма Pseudomonas — С12 и С12В. Первый штамм разрушал только додецилсульфат (ДДС), второй — еще и додецилбензолсульфонат. Необходимо отметить, что представители рода Pseudomonas особенно часто выделяются из культур накопления на средах с анионными ПАВ. Так, на селективной среде с АБС из активного ила были изолированы 16 штаммов Pseudomonas, а именно: Ps. striata (1), Ps. pavonaceae (2), Ps. dacunhae (2), Ps. membranoformis (1), Ps. arvilla (1), Ps. cruciviae (1), Pseudomonas sp. (6), Pseudomonas sp., сходный c Ps. effusa (1), Pseudomonas sp., сходный c Ps. rathonis (1) [461]. Все выделенные культуры разрушают линейный алкилбензолсульфонат. Методом накопле- ния получены один штамм Ps. fluorescens и два штамма Nocar- dia sp., способные использовать в качестве единственного источ- ника углерода линейные АБС — n-сульфонатные производные 2- фенилбутана, 3-фенилпентана и 7-фенилтетрадекана [499]. При изучении 45 штаммов бактерий, принадлежащих к 34 видам 19 родов, установлено, что способность разрушать ПАВ широко варьирует у микроорганизмов, даже среди представителей од- ного рода [366]. Так, Acetobacter suboxydans разлагает все ис- пользуемые соединения за 24 ч, a A. peroxydans за 72 ч совсем не разрушает алкилсульфат и на 42% разлагает алкилбензол- сульфонат. Активными деструкторами ПАВ оказались все виды Azotobacter, кроме Az. bejerinkii. Авторы высказывают пред- положение о том, что выращивание Azotobacter на детергент- содержащих сточных водах может иметь в будущем большое значение, так как благодаря фиксации атмосферного азота во- да обогащается азотными соединениями, а это в свою очередь способствует развитию других микроорганизмов — деструкторов. 156
Рис. 34. Прозрачные зоны вокруг колоний бактерий, разлагающих додецил- сульфат натрия на среде с кристаллами: а — чашка Петри с агаризованной средой, содержащей кристаллы додецнлсульфата натрия; б — прозрачные зоны вокруг колоний бактерий-деструкторов, выросших на этой среде. Бальо с сотр. [291, 292] выделил из сточной воды и изучил активность деструкции лаурилсульфоната и тетрапропилбензол- сульфоната у 40 штаммов бактерий, отнесенных к разным ро- дам. Большинство культур довольно быстро разрушало лаурил- сульфонат. Тетрапропилбензолсульфонат оказался более стойким к биодеградации. Разложение этого соединения вызывали Bact. imperiale и смесь Corynebacterium annamensis и Flavobact. dif- fusum. Способность разрушать додецилбензолсульфонат показа- на для Е. coli [387, 447], предварительно адаптированных му- зейных культур S. marcescens, Proteus vulgaris, Ps. fluorescens [366]. Кук обнаружила [323] в сточных водах Klebsiella (Аего- bacter), Achromobacter, Flavobacterium и Micrococcus, которые окисляют синтетические анионные детергенты; наиболее актив- ным оказался штамм Klebsiella. Десять культур бактерий, способных утилизировать АБС, в числе которых были штаммы Alcaligenes faecalis, A. metalcaligenes, Aer. aerogenes, E. coli н E. freundii, выделил Андерсон [286], однако деструкторов ПАВ среди них не обнаружено. Как свидетельствует Виллетс [520], в метаболизме АБС принимают участие и представители рода Bacillus. Bacillus sp., изолированный из хозяйственно-бытовых стоков на солевой среде с 0,05% ундецилбензол-п-сульфоната, рос на всех гомологах этого соединения с длиной алкильного радикала от Ci до Си, на бензолсульфонате, п-оксибензоате, 157
Таблица 2 Основные свойства бактерий, разрушающих ДДС Показатели Pseudomonas Achromo- bacter Flavo- bacte- rium Энте- робак- терии флюоресци- рующая груп- па нефлюорес- цирующая группа Окраска по Граму — Подвижность + + + + + Оксидаза -н + — + Анаэробное разложение — + + ГЛЮКОЗЫ Восстановление нитратов Гидролиз: V + — + + желатины V — — + — крахмала V — — + — Каталаза + — — + + Лецитиназа V — — + V Образование: индола — —• — — V сероводорода — — — + + ацетона X —- — + V Рост на углеводородах V V — — V (4-) — положительная реакция; (—) — отрицательная реакция; (V) — вариабельное свойство; (X) — здесь и в табл. 3 и 5 исследования не проводились. Таблица 3 Разрушение бактериями алкилсульфатов, % ДДС Первичный алкилсульфат Вторичный алкил- сульфат Микроорганизмы Время, сутки 7 1 4 4 7 Pseudomonas aerugino- 100 100 0 0 0 sa 1 С Ps. lluorescens 80 15 100 ► 100 — X X X Ps. aurantiaca 106 38 100 0 98 0 0 0 Pseudomonas sp. 41 69 100 — 88 100 0 0 100 Pseudomonas sp. 34 100 — 100 — 0 0 100 Achromobacter sp. 16 M 100 .— 100 0 0 0 Flavobacterium sp. 33 13 70 100 84 100 X X X Citrobacter sp. 26 0 0 45 0 0 0 0 0 Enterobacter sp. 58 0 20 45 0 65 0 0 0 Примечание. Исходная концентрация (в мг/л): ДДС — 500; алкилсульфатов — 200. 158
3,4-диоксибензоате. Нами из различных субстратов (речная и морская вода, бытовые стоки, сточные воды предприятий по про- изводству анионных ПАВ, активные илы городских и заводских очистных установок, почва, песок, ризосфера растений, на- стой сена) на синтетиче- ских средах, содержащих алкилсульфаты (АС) в качестве единственного источника углерода и энергии, изолированы бактерии, активно разла- гающие эти соединения. Для выделения микро- организмов были исполь- зованы метод накопитель- Таблица 4 Способность разрушать алкилсульфаты у коллекционных микроорганизмов Микроорганизмы Количест- во иссле- дованных штаммов Количест- во штам- мов, раз- рушающих ДДС Pseudomonas 88 20 Coli-подобные 11 2 Micrococcus 50 0 Streptococcus 2 0 Sarcina 3 0 Serratia marcescens 2 0 Bacillus 31 0 Arthrobacter 7 0 Nocardia 22 3 Дрожжи и дрожже- подобные грибы * 41 0 * Роды Candida, Torula, Rhodotorula, Trichospo- ron, Torulopsis, Metschnikowia, Cryptococcus, Saccha- romyces, Hansenula, Shizosaccharomyces. ных культур и разработанный нами метод обнаружения микро- бов-деструкторов АС [222]. Этот метод заключается в посеве исследуемого материала на агаризованную синтетическую среду определенного солевого состава, содержащую 0,7— 1,0 г/л ДДС. В такой среде додецилсульфат образует в толще агара кристаллы. Метод основан на способности микро- бов, разрушающих АС, образовывать вокруг колоний прозрач- ные зоны в результате использования вещества клетками (рис. 34). Величина зон тем больше, чем выше деструктивная актив- ность штамма. С помощью указанных методов нами выделено свыше 100 бактериальных культур, способных метаболизиро- вать ДДС в солевой среде [223]. Детально изучены 42 штамма. Бактерии идентифицированы по 7 и 8-му изданиям определителя Берги [298] на основании 36 признаков. Основные свойства этих бактерий приведены в табл. 2. Преобладающее большин- ство выделенных культур (33 штамма) отнесены к роду Pseu- domonas. Среди флюоресцирующих псевдомонад, выделенных из почв, ризосферы и сточных вод, идентифицированы различ- ные биотипы Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. aurantiaca, Ps. aeru- ginosa. Нефлюоресцирующие представители Pseudomonas, a также бактерии родов Flavobacterium, Achromobacter и coli-подоб- ные культуры родов Citrobacter, Enterobacter и Shigella, изоли- рованы главным образом из активного ила. Все выделенные штаммы активно разлагают ДДС, а часть из них — и техниче- ские препараты АС, содержащие смесь гомологов с различной длиной угловодородной цепи (табл. 3). Технические препараты алкилсульфонатов и алкилбензолсульфонатов данными бактерия- 159
время, я Рис. 35. Рост культуры Citrobacter freundii на средах с различной кон- центрацией (ДДС): / —1 г/л: 2 — 0,6 г/л; 3—0,1 г/л. ми не разрушались. Попытки изолировать споровые бакте- рии или дрожжи оказались безуспешными. Для расширения таксоно- мической характеристики бак- терий — деструкторов алкил- сульфатов мы изучили 257 кол- лекционных штаммов микро- организмов. Культуры высева- ли на среду с кристаллами ДДС и определяли их способ- ность использовать данное ве- щество как единственный ис- точник углерода и энергии. Из табл. 4 видно, что чаще всего эта способность обнаруживает- ся у бактерий рода Pseudomo- nas (20 штаммов из 88). Де- структивной активностью обла- дают также 2 музейных coli- подобных бактерии и 3 штамма нокардий. Все проверенные культуры бацилл, микрококков и других грамположительных бактерий, а также дрожжей и дрожжеподобных грибов не разрушают додецилсульфата. Проведенные нами опыты позволяют заключить, что способ- ность использовать алкилсульфаты в качестве единственного источника углерода и энергии присуща главным образом ге- теротрофным грамотрицательным палочковидным бактериям и, в первую очередь, представителям рода Pseudomonas. У отдельных культур изучали деструктивную активность в зависимости от условий выращивания. Показано [243—245], что при исходном pH 7,2 Citrobacter freundii 2Т и Pseudomonas sp. 2Т/1 разрушают в жидкой солевой среде не более 0,5—0,6 г/л додецилсульфата натрия (рис. 35). pH среды при этом пони- жается до 4,5—5,0. В забуференной среде бактерии могут раз- рушать до 10—15 г/л ДДС. Деструкция додецилсульфата бы- стрее происходит при выращивании бактерий на качалке, чем в стационарных условиях. Определенное влияние на скорость разрушения вещества оказывает плотность бактериального ино- кулюма. Оптимальной для разложения додецилсульфата в на- ших опытах была температура 28—32° (рис. 36). Добавление в среду глюкозы снижает скорость деструкции. Манометриче- ским методом Варбурга показано [225], что бактерии, выращен- ные на среде с додецилсульфатом, способны окислять другие соединения гомологического ряда алкилсульфатов. При этом активность окисления гексил-, октил- и децилсульфатов нахо- дится практически на одном уровне с активностью окисления 160
Рис. 36. Влияние температуры на рост и потребление ДДС Citrobacter freundii. 1 — 28—32°; 2 - 37°; 3 — 22°. додецилсульфата, в то время как гомологи с более длинной пенью — тетрадецил- и иентадецилсульфаты окисляются значи- тельно активнее (рис. 37). Культура растет также на техниче- ских препаратах алкилсульфатов, содержащих смесь гомологов с длиной цени Сю—С18. Исследовали способность разрушать алкилсульфаты так- же у зеленых водорослей рода Chlorella *. О роли водорослей в биоразложении ПАВ данных в литературе мало. В то же время вопрос взаимодействия водорослей и ПАВ чрезвычайно важен, поскольку водоросли в большом количестве развиваются в биофильтрах и окислительных прудах, которые используются для биологической очистки сточных вод. Кроме того, значитель- ный интерес представляет изучение роли водорослей в процессах самоочищения водоемов от ПАВ. В работе Девиса и Глойне [336] сделана попытка изучить деструктивную способность во- дорослей и показано, что все взятые в опыт водорослевые куль- туры слабо разлагают некоторые анионактивные и неионогенные ПАВ. Однако отсутствие контроля бактериального загрязнения ставит иод сомнение полученные авторами результаты. В наших опытах [242] исследовались три бактериально чистые культуры зеленых водорослей рода Chlorella: Chi. vulgaris, штаммы 62 и М, и Chi. pyrenoidosa. Chi. vulgaris M выделена из сточных вод Магнитогорского металлургического комбината, две другие культуры получены в отделе регуляторных механизмов клетки Института молекулярной биологии и генетики АН УССР. Куль- туры Chi. vulgaris 62 и Chi. vulgaris М выращивали в люмино- * Работа проводилась в Институте ботаники АН УССР канд. биол. наук Л. И. Леповой. И 8-Й16 161
стате при температуре 22—24° и освещенности 3000 лк на модифицированной жидкой и агаризованной среде Тамия [141]. Адаптированный к гетеротрофному способу питания штамм Chi. pyrenoidosa выращивали в темноте в термостате при темпе- Рис. 37. Динамика поглощения кислорода культурой Citrobacter freundii при окислении алкилсульфатов: /— эндогенное дыхание; 2 — субстратное дыхание за счет гексилсульфата; 3 — октилсульфата; 4 — децилсульфата; 5 — додецилсульфата; б — тетраде- цилсульфата; 7 — пентадецилсульфата. ратуре 26—28° на жидкой и агаризованной среде ФДГА [131]. При изучении влияния ДДС на водоросли к агаризованным средам Тамия и ФДГА добавляли от 1 до 200 мг/л соединения. Через 5—6 суток отмечали наличие или отсутствие роста во- дорослевых культур. Способность водорослей разрушать ДДС изучали на аналогичных жидких средах с ПАВ. О влиянии ДДС на водоросли в жидких средах судили ио приросту биомассы, подсчитывая общее число клеток хлореллы в камере Горяева, и по соотношению живых и мертвых клеток [142]. С целью выявления возможного бактериального загрязнения водорослей культуральную жидкость при каждом отборе проб высевали на М.ПА и агаризованные среды Тамия и ФДГА с ДДС. 162
При выращивании водорослевых культур на агаризованных средах 1—50 мг/л вещества не оказывают неблагоприятного влияния на их рост. В присутствии 100 мг/л ПАВ отмечено угнетение роста, особенно у автотрофных штаммов. При выра- щивании на соответствующей жидкой среде с 50 мг/л ДДС автотрофные штаммы Chi. vulgaris 62 и Chi. vulgaris М дают значительно меньший прирост биомассы и более высокий про- цент мертвых клеток по сравнению с контролем без ПАВ. Кон- центрация ДДС в культуральной среде этих водорослей не из- меняется. В отличие от двух других штаммов Chi. pyrenoido- sa дает практически одинаковый прирост биомассы в контроле и опытном варианте, где вместо глюкозы в среду вносили 50 мг/л ПАВ. При этом в среде с ДДС существенно повышает- ся число мертвых клеток. В то же время добавление к полно- ценной среде ФДГА додецилсульфата натрия в концентрациях 50 и 100 мг/л несколько стимулирует рост культуры ChL руге- noidosa. Количество мертвых клеток также превышает их чис- ло в контроле, однако их меньше, чем на среде с ПАВ без глю- козы. Во всех опытных вариантах отмечено снижение кон- центрации ДДС. Убыль большей части ДДС в культураль- ной жидкости Chi. pyrenoidosa происходит за 8 суток. После этого в среде еще определяются остаточные количества вещества, которое не разрушается при дальнейшем культиви- ровании водорослей. Полное исчезновение ПАВ наблюдается лишь в одном случае — при наличии в среде 50 мг/л вещества и глюкозы. Контроль загрязнения показал, что на протяжении всех опытов культуры водорослей были бактериально чистыми. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что некоторые штаммы водорослей рода Chlo- rella способны разрушать алкилсульфаты. Активность водо- рослей значительно ниже активности бактерий. Однако деструк- ция алкилсульфатов водорослями, по-видимому, может играть определенную роль в водоемах, загрязненных ПАВ. В последние годы много внимания уделяется изучению пу- тей микробного метаболизма анионных ПАВ, а также выделе- нию и исследованию ферментов, ответственных за их разруше- ние [487, 517, 523]. Показано, что углеводородные радикалы алкилсульфатов, алкилсульфонатов и алкилбензолсульфонатов окисляются в тех же биохимических реакциях, что и углеводо- роды, жирные кислоты и спирты. Пути микробной деструкции алкилбензолсульфонатов включают также реакции расщепления бензольного кольца. АБС более устойчивы к разложению и, поскольку они ко- личественно преобладают в общем объеме продукции ПАВ, их метаболизм изучен детальнее. Основными биохимическими ре- акциями, ведущими к разрыву связей С—С, в результате чего 11 163
разрушается молекула АБС, являются со-окисление, т. е. окисле- ние терминальной метильной группы в алкильной цепи, «-окис- ление, р-окисление и деструкция бензольного кольца при помо- щи механизмов орто- или лшта-расщеплсния. «-Окисление алкильного радикала происходит аналогично разложению пря- моцепочечных углеводородов через образование спирта и альде- гида до карбоксикислоты: -СН„—СН3 -> —СН2—СН2ОН —СН2—СНО _> —СН2-СООН. При а-окислении алкильная цепь прогрессивно укорачивает- ся на один атом углерода, который выделяется в виде СОг- р-Окисление ведет к последовательному уменьшению алкильной цепи на два атома углерода сразу. Хейман и Молоф исследовали способность выделенной Пей- ном с сотр. [379] культуры Pseudomonas С 12 В метаболизи- ровать линейные первичные и вторичные алкилбензолсульфона- ты с различной длиной углеводородной цепи. Культура разру- шала АБС с короткими 1- и 2-углеродными алкильными цепями. АБС с длинной (С3—С12) цепью начинали разлагаться только после предварительной инкубации бактерий со спиртами, аль- дегидами или кислотами, как с соответствующим числом атомов углерода, так и с более длинной цепью. Авторы предполагают, что для разложения АБС с длинной алкильной цепью необхо- дима предварительная индукция соответствующих ферментов соединениями, близкими по структуре к изучаемым АБС, но не содержащими кольца. Бактериальная деструкция АБС происхо- дит в результате ряда биохимических реакций; «-окисления, р-окисления, вторичного «-окисления, а-окисления, неполного ^ окисления и декарбоксилирования, которые приводят к об- разованию бензойной или фенилуксусной кислоты. Причем АБС с нечетным числом углеродных атомов в алкильной цепи мета- болизируется через бензойную, а с четным — через фенилуксус- ную кислоту. Вещества с четным числом атомов углерода инду- цируют путь бензойной кислоты, с нечетным — оба пути. Даль- нейшее разрушение бензойной и фенилуксусной кислот происходит с разрывом кольца. Блестящие исследования путей бактериальной деструкции АБС и осуществляющих ее ферментов провел Виллетс с сотр. [520—524]. Автор обнаружил у бактерий, способных к р-окисле- нию, зависимую от НАД оксигеназу смешанной функции. Это конститутивный фермент, который окисляет АБС благодаря довольно широкой субстратной специфичности. В клетках бакте- рий— деструкторов АБС — содержатся также ключевые фер- менты классического пути р-окисления, а именно: ацил-СоА- синтетаза, ацил-СоА-дегидрогеназа и р-оксиацил-СоА-дегидро- 164
геназа. Весь комплекс ферментов 0-окисления характеризуется широкой субстратной специфичностью и действует на жирные кислоты, все прямоцепочечные АБС и некоторые изомеры АБС с разветвленной цепью. р-Окисление не происходит, если метиль- ная группа в разветвленной цепи находится возле р-атома угле- рода. Но есть микроорганизмы, такие, как изолированные Вил- летсом [521] представители рода Micrococcus, которые могут разрушать р-метилзамещенные изомеры АВС путем комбинации а- и Р-окисления. Эти бактерии выделяются сравнительно ред- ко, что свидетельствует о незначительном распространении в природе способности комбинировать механизмы а- и р-окисле- ния; именно этим объясняется стойкость к биодеградации изоме- ров с метильной группой в p-положении. К микробной деструк- ции устойчивы также изомеры с двумя метильными группами возле концевого атома углерода. Некоторые микроорганизмы разрушают эти вещества с помощью фермента, идентичного 3-оксиизобутил-СоА-гидролазе, принимающей участие в катабо- лизме валина, молекула которого также содержит диметил- замещенный терминальный атом углерода. Установлено, что дан- ный фермент индуцируется при выращивании бактерий как на валине, так и на соответствующих изомерах АБС. Сравнительно стойкими к биодеградации являются изомеры, содержащие четвертичный атом углерода. Все изоляты бакте- рий, выделенные на среде с этими веществами в качестве един- ственного источника углерода, имеют дегидрогеназу, принимаю- щую участие в метаболизме пантотеновой кислоты, в молекуле которой есть аналогичная структура [521]. Деградация бензоль- ного кольца в АБС происходит с помощью механизмов, хорошо известных из работ по микробной деструкции фенолов [22]. Установлено [523], что при разрушении бензольной части моле- кулы АБС чистыми культурами бактерий происходит орто-рас- щепление ароматического ядра. В то же время показано [351], что ароматическое кольцо бензол-сульфоната и толуол-п-суль- фоната может метаболизироваться двумя путями. Бесклеточные экстракты изолированных из сточной и речной воды штаммов Ps. aeruginosa сначала окисляют эти соединения до пирокатехи- на, после чего штамм А метаболизирует его по мета-пути, пре- вращая последовательно в полуальдегид 2-оксимуконовой кис- лоты, 4-окси-2-кетовалериановую кислоту, ацетальдегид и пировиноградную кислоту. Штамм В осуществляет орто-рас- щепление бензольного кольца и трансформирует его в цис, цнс-муконовую кислоту, муконолактон, энололактон 0-кетоади- пиновой кислоты и в 0-кетоадииат. Авторы считают, что бепзол- сульфонат и толуол-п-сульфонат индуцируют у Ps. aeruginosa 2,3-катехолоксигеназу. Интересно, что выделенные из сточной воды штаммы Ps. fluorescens, способные расти на бензолсуль- фонате и толуол-п-сульфонате как единственных источниках 165
углерода, не растут на этилбензолсульфонате и соответствующих производных с 4—18 С в боковой цепи [458]. Ps. testosteroni Н-8, наряду с бензолсульфонатом и толуол-п-сульфонатом, ути- лизирует этилбензолсульфонат, но не использует высшие гомо- логи [379]. В то же время бактерии, адаптированные к АБС, способны метаболизировать бензолсульфонат, но после длитель- ной лаг-фазы [435]. Представляют интерес исследования биоразложения АБС в присутствии дополнительных источников углерода. Хорват и Кофт [384] показали, что Pseudomonas sp. НК-1 не растет на среде с АБС. Рост и разрушение алкилбензолсульфонатов на- блюдаются при добавлении 0,01 % глюкозы. При метаболизме бо- ковой цепи АБС в качестве промежуточных продуктов обнару- живаются изопропанол и четвертичный бутиловый спирт. В ре- зультате превращений бензольного кольца образуются фенол, пирокатехин, миндальная кислота, бензиловый спирт и бензой- ная кислота. Авторы считают, что фенол играет важную роль в десульфонировании АБС, и предполагают следующий соокисли- тельный механизм их разрушения в среде с фенолом: I ОН додеци лбен зол- фенол сульфонат + NaHSO3 + ОН додецил- пирокатехин бензол Полученные результаты позволили авторам сделать важный вывод о том, что прежняя концепция об устойчивости к биораз- ложению веществ такого типа несостоятельна. Несмотря на то, что эти соединения не поддерживают рост микроорганизмов, будучи единственным источником углерода в среде, они могут разрушаться по типу кометаболизма в комплексных средах, со- держащих и другие источники углерода. Из литературы также известно, что серусодержащие ПАВ могут разрушаться микро- организмами путем разрыва связи С—S или сульфатно-эфирной связи. На возможность гидролиза этих связей в молекулах ани- онных ПАВ еще в 1958 г. указал Богэн [301]. Сульфатная или сульфонатная группа гидролитически отщепляется и замещает- ся гидроксилом, в результате чего образуются оксиалканы и оксифенилалканы. Сульфит внутриклеточно окисляется до сульфата, а затем восстанавливается до сульфида, который используется клетками при биосинтезе серусодержащих амино- кислот и других веществ [520, 522]. Например, при десульфо- нировании АБС метаболизм сульфитного иона может быть пред- ставлен следующим образом: 166
^\/он II 1 сульфит-------> [сера]2+----> [сера]0 I----* сульфат * J е сульфид I I цистеин аденозинфоа юсульфат | гомоцистеин фенолы стероиды * 1 г метионин I производные гексозамина Доказательством возможности такого пути деструкции является образование значительного количества ионов сульфата и суль- фита в начале микробного разложения этих ПАВ. Для биоде- градации алкилбензолсульфонатов существенное значение имеет ьзаимное расположение сульфонатной группы и алкильной цепи в бензольном кольце: пара-соединения разрушаются быстрее, чем орто- или лета-производные. Грамотрицательную бактерию рода Pseudomonas, способную расти на додецилсульфате натрия как источнике углерода и серы, изолировал Хсу [386]. Полученные из нее бесклеточные препараты гидролизуют сульфо-эфирную связь, вследствие чего освобождается ион сульфата и образуется додециловый спирт. Ферментный препарат отщепляет сульфатный ион также от децил- и тетрадецилсульфатов. Автор считает фермент адап- тивным, так как при выращивании бактерий на среде с цитра- том деструкции детергентов приготовленными из них бесклеточ- ными экстрактами не происходит. Тийссе и Вандере [489] изо- лировали из речной воды штаммы бактерий рода Pseudomonas, которые хорошо росли на н-бутил- и н-пентилсульфонатах. В бес- клеточных экстрактах Pseudomonas АЛ и AJ2 обнаружен фермент, гидроксилирующий в молекулах С4—С7 и С8—С12-н- алкил-1-сульфонатов углеродные атомы, непосредственно связан- ные с сульфонатной группой [490]. Образовавшиеся в резуль- тате реакции 1-оксиалкил-1-сульфонаты неустойчивы и быстро распадаются с выделением альдегидов и бисульфита. Альдегиды в дальнейшем окисляются до жирных кислот. Фермент, иден- тифицированный как н-алкил-1-сульфонатгидроксилаза, не 167
отличается строгой субстратной специфичностью и действует на большинство первичных и вторичных алкилсульфонатов. Он активен только в аэробных условиях. В присутствии НАД-Н2 активность повышается. По своим свойствам обнаруженный фермент, по-видимому, может быть отнесен к моноокси- геназам. Ps. fluorescens, Ps. putida, Achromobacter sp. разлагают 1-н-додецилсульфонат с освобождением сульфита и образова- нием лауринового альдегида и лауриновой кислоты [318]. Раз- рушение серусодержащих анионных ПАВ путем гидролиза суль- фо-эфирной или С—S связи, по некоторым данным, происхо- дит быстрее в присутствии дополнительных источников углерода и энергии. Ризен [457] показал, что Ps. aeruginosa на среде с пептоном отщепляет сульфогруппу алкилсульфата с образо- ванием спирта, а затем жирной кислоты. Бенард с сотр [297] выдвинул интересную концепцию относительно подходов к био- деградации трудно разлагаемых детергентов, в том числе соеди- нений, у которых р-окисление затруднено из-за наличия развет- влений в алкильной цепи. Авторы предложили исследовать возможность микробной деструкции гидрофильной серусодержа- щей группы. В таких опытах АБС использовался только как источник серы. Для получения накопительных культур брали питательные среды следующего состава: АБС — 0,5 г; глюко- за—1,5 г; NH4C1 — 1 г; Na2HPO4—1 г; КС1 - - 0,5 г; MgCl2— 0,1 г; дистиллированная вода — до 1 л. Для выделения чистых культур служила эта же среда с добавлением 12 г агар-агара и 0,2 г FeCl2-4H2O. Особый интерес представляют колонии, во- круг которых среда изменяла окраску в результате образования сульфида железа. Четыре изолята особенно активно разлагали АБС. Степень деструкции детергента определяли как с помощью колориметрического метода с метиленовой синью, так и путем титрования освободившихся сульфатных ионов. При выращива- нии бактерий на качалке при комнатной температуре за 7 дней разрушается около 70% АБС, что значительно превышает ре- зультаты, достигнутые другими исследователями — 30—40% за 1—2 месяца [422, 518]. В контрольных колбах, не содержащих глюкозы, за это время разрушается менее 20% вещества. Глю- коза стимулирует также биоразложение АБС бактериями в аквариуме с речной водой. У Pseudomonas С12В изучена содержащаяся в бесклеточных экстрактах алкилсульфатаза, индуцированная при выращивании бактерий на питательном бульоне с добавлением додецилсуль- фата [525]. Фермент не индуцируется в присутствии арилсуль- фоната. Во фракции, осажденной сульфатом аммония, его ак- тивность в 4 раза выше. Оптимальными для проявления фермен- тативной активности оказались pH 7,5 и температура 70° С. Фосфат, арсенат и ионы некоторых тяжелых металлов подавляю" десульфатирование, а ионы магния и марганца — стимулируют. 168
В качестве продукта реакции обнаружен додеканол. Арилсуль- фонаты, сульфаты вторичных спиртов и феноксиэтилсульфонат не являются субстратами для этого фермента. Интересно, что выращивание культуры на додецилсульфате как единственном источнике углерода индуцирует активность других ферментов, а именно: ферментов глиоксалатного пути, изоцитратлиазы п малатсинтетазы. В литературе есть указания на возможность биодеградации серусодержащих детергентов путем гидролиза в анаэробных ус- ловиях [459], однако биохимическая сторона этого процесса не изучена. Установлено только, что синтетические ПАВ с раз- ветвленной алкильной цепью практически не разлагаются, в то время как прямоцепочечные за 3—6 ч разрушаются на 20%. В ряде случаев гидролиз С—S связи наступает после частич- ного или полного отщепления боковой алкильной цепи. Изве- стно, что наличие в бензольном кольце 5О3Н-заместителя за- метно повышает устойчивость ароматических соединений к биологическому воздействию [284]. В опытах Райпина и сотр. [458] культуру Ps. testosteroni Н-8 выращивали на среде с арилсульфонатами, которые служили единственным источником углерода, серы и энергии. Бактерии утилизируют бензолсульфо- нат, n-толуолсульфонат и этилбензолсульфонат. При этом клет- ки ассимилируют небольшую часть серы. Остальная выделяется в среду в виде сульфата, существенно увеличивая ее кислот- ность. Чтобы избежать этого, среду делали буферной, добавляя значительные количества одно- и двузамещенных фосфорно- кислых солей калия (3,0 и 7,0 г в литре соответственно). Окисление бензолсульфоната отмытой клеточной суспензией ин- гибируется цианидом калия, йодацетатом, хлористой ртутью, мышьяковистым калием и азидом натрия. Фтористый натрий, 2,4-динитрофенол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ), гидроксиламин и бисульфит натрия не оказывают существенно- го влияния. Культура Ps. testosteroni Н-8 обладает, по-видимо- му, активной сульфитоксидазой, благодаря чему при расщепле- нии бензолсульфоната сульфит в среде не накапливается. В опы- тах Кейна и Фарра [315] изолированные из очистных сооружений и речной воды 12 культур бактерий рода Pseudo- monas, среди которых преобладали Ps. aeruginosa, выращивали на среде без минерального источника серы, но с арилсульфона- том. Все культуры гидролизовали бензол- и толуолсульфона- ты с образованием сульфита, который сразу же превращался в сульфат. Располагая значительной коллекцией бактерий-деструкторов, принадлежащих к различным таксонам, мы анализировали ин- термедиаты, образующиеся в процессе разложения алкилсуль- фатов, с целью расшифровки механизма первичной деградации АС. Оказалось, что все изолированные нами бактерии прежде всего осуществляют гидролиз сульфо-эфирпой связи, в ре- зультате чего в среде обнаруживаются сульфат-ион (рис. 38) 169
и додециловый спирт. По- давляющее большинство ис- пытанных бактерий не на- капливает при этом додека- нол, а сопряженно окисляет его, превращая в додекано- вую кислоту, которая, по-ви- димому, в свою очередь под- вергается разложению с по= мощью механизмов а- и 0- окисления. Рис 38. Динамика сульфат-иона при по- Неионогенные ПАВ еще треблении ДДС культурой Citrobacter , , Н freundii- более разнообразны- по своей /-pH; 2-сульфат-ион; з- ддс. химической структуре, чем анионные. Они представля- ют собой продукты присо- единения окиси этилена к веществам, содержащим активный во- дород, например, к алкилфенолам, жирным спиртам, меркапта- нам и др. Практически любое соединение, молекула которого наряду с гидрофобным радикалом содержит карбоксильную, гидроксильную, амидную или аминную группу с подвижным атомом водорода, может реагировать с окисью этилена, образуя неионогенное ПАВ. Схематически на примере алкилфенолов это можно представить следующим образом: R—ОН + /1СН2—СН2 -> R—(СН2СН2О)пОН, где R — гидрофобный остаток. Гидрофильную группу в молекуле НПАВ могут образовы- вать, помимо окиси этилена, и другие соединения. Так, довольно широко применяются НПАВ — сложные эфиры маннита и сор- бита, которые называют соответственно маннитаны и сорбита- ны или спаны. Оксиэтилированные эфиры сорбита и маннита нашли распространение под названием «твины». Хорошо из- вестны НПАВ, в состав которых, наряду с окисью этилена, входят остатки окиси пропилена — так называемые блок-сопо- лимеры. Разнообразие химического строения НПАВ, как уже указывалось ранее, создает трудности при анализе этих веществ и приводит к получению весьма противоречивых результатов при изучении биоразлагаемости. Сведения о биодеградации НПАВ получены в основном в опытах с комплексными биоценозами — водными микроорга- низмами, активным илом, биопленками. Так, Каплин и соавт. [120] изучали скорость распада в природной воде оксиэтилиро- ванных синтетических жирных спиртов, алкилфенолов, блок-со- полимера окисей этилена и пропилена в концентрациях 1 — 10 мг/л. Оксиэтилированные жирные спирты в водоемах рас- 170
падаются быстро, медленнее распадается блок-сополимер и еще медленнее — оксиэтилированные алкилфенолы. Скорость распа- да изучаемых веществ зависит от их исходной концентрации и количества оксиэтильных групп. Оксиэтилированный алкилфе- нол с десятью оксиэтильными группами в концентрации 1 мг/л разрушается полностью на 49-е сутки, а при концентрации 10 мг/л на 174-е сутки остается еще 37% неразрушенного веще- ства. Оксиэтилированный алкилфенол (семь оксиэтильных групп) в концентрации 1 мг/л деградирует на 139-е сутки, к тому же времени распад 10 мг/л происходит на 72%. Биологи- ческое разложение нонилфенолэтоксилатов, содержащих от 8 до 30 групп оксиэтилена, было изучено на лабораторной уста- новке в условиях, аналогичных промышленным [463]. Оказалось, что разложение вещества происходит на 80% и не требует пред- варительной адаптации микроорганизмов активного ила. В работах Т. В. Трифоновой с сотр. [259] приводятся данные о биоразложении продуктов присоединения смеси окиси этиле- на и окиси пропилена к первичным жирным спиртам. Иссле- дователи изучали продукт оксиалкилирования синтетических первичных спиртов фракции Сю — Сю (около 10% спиртов изо- строения), содержащий в среднем 8 оксиалкиленовых групп, а также продукт оксиалкилирования н-додецилового спирта, со- держащий в среднем 10 оксиалкиленовых групп. Разрушение с помощью активного ила происходит на 92—99%. Степень уда- ления НПАВ из сточных вод зависит от степени адаптации активного ила. Так, вещество почти полностью разлагается адаптированным активным илом за 6 ч, в то время как неадап- тированный ил за это же время удаляет из стока лишь 43% НПАВ. Шгифф и соавт. [483] сравнивали биоразложение оксиэти- лированного линейного алкилфенола с разрушением двух оксп- этилированных алкилфенолов с разветвленной цепью. Быстрее распадается линейный алкилфенолэтоксилат. По данным Ольдхэма [429], оксиэтилированный алкилфенол (Lissapol) в концентрации до 100 мг/л на 30% сорбируется, но не разру- шается микроорганизмами биопленки. При использовании микроорганизмами активного ила окси- этилированного алкилфенола (Triton-x-ЮО) в концентрации 5— 10 мг/л вещество разрушается на 95—100%. Активный ил пред- варительно подвергается адаптации, длительность которой за- висит от ряда факторов и колеблется от 4 дней до 3 месяцев [304]. В других исследованиях [444] показано, что продукты кон- денсации алкилфенолов с окисью этилена в концентрации до 100 мг/л являются почти безвредными и не влияют на дегидро- геназную активность ила. Наименьшая биоразлагаемость в ряду алкилфенолов отмечается у соединений, имеющих разветвлен- ный алкильный радикал. Так, биоразлагаемость оксиэтилиро- 171
ванного алкилфенола с разветвленным алкильным радикалом — 3%, нормальным алкильным радикалом — 63%, в то время как для оксиэтилированных спиртов она составляет 100%. О медлен- ной деградации алкилфенолов, содержащих 9 оксиэтильных групп, сообщает Пэттерсон с соавт. [434]. При исходной кон- центрации веществ 5 мг/л разложение на 50% наступает через 6 недель. В работе Хаддлстона и Оллреда [388] отмечается, что раз- рушение оксиэтилированных прямоцепочечных спиртов фракции Сю — С12 происходит полностью, а оксиэтилированные алкил- фенолы даже после длительного выдерживания в очистном со- оружении содержат еще много оксиэтильных групп. Другими авторами [417] показано, что этоксилаты синтетических спир- тов легко разлагаются в биофильтрах, а этоксилаты изооктил- фенола трудно биодеградируют, так как вытекающая жидкость имеет тенденцию к пенообразованию. О биоразлагаемости не- ионогенных ПАВ, применяемых в качестве деэмульгаторов эмульсий нефти с водой есть сведения в работе В. В. Булатни- кова с соавт. [30]. Большинство этих соединений плохо подда- ется биохимическому окислению. Авторы показывают, что деэмульгаторы — блок-сополимеры окиси этилена и пропилена относятся к «биологически жестким». Легко и быстро разру- шаются НПАВ, полученные на основе первичных жирных спир- тов и сахаров [517]. Вейман и Робертсон [518] предлагают заменить трудноразлагаемые ПАВ «сахарными детергентами», что приведет, по их мнению, к улучшению процесса очистки сточных вод. Работы по изучению деструкции НПАВ чистыми культурами микроорганизмов немногочисленны. Показано, что твины могут служить питательным субстратом для бактерий, а также спо- собствовать использованию других соединений, облегчая их транспорт в клетку. Поэтому твины часто используют в каче- стве компонентов при приготовлении питательных сред [4, 5, 151, 183, 308, 334, 385, 456, 476]. Эти вещества применяются также при проведении микробной трансформации стероидных субстратов. Нерастворимые в воде стероиды, суспендированные в растворе твина 80, значительно быстрее превращаются под влиянием микробных ферментов [151]. Ps. aeruginosa, Aspergil- lus niger и Penicillium notatum способны расти в растворах сложных эфиров жирных кислот [295]. Образуя эстеразы, эти микроорганизмы расщепляют эфирные связи с освобождением жирных кислот. Способностью разлагать полиоксиэтиленолеат обладают некоторые штаммы непатогенных микобактерий, кото- рые окисляют его до углекислоты и воды. Микобактерии ис- пользуют данное соединение в качестве единственного источника углерода. Работами, проводимыми в Институте коллоидной химии и химии воды АН УССР канд. биол. наук В. М. Удодом, показано, 172
что додециловый эфир полиэтиленгликоля в концентрации 50— 100 мг/л полностью разрушается микроорганизмами родов Pseu- domonas, Bacillus и Candida в течение 18 ч. Увеличение концент- рации до 100—250 мг/л приводит к замедлению деструкции, и разложение наступает на 2—7-е сутки. Таким образом, из приведенной литературы можно заклю- чить, что скорость окисления НПАВ зависит от их химического строения, т. е. от длины и степени разветвленности алкильной цепи и от длины полиэтиленгликолевой цепи. Наиболее полно и быстро разрушаются соединения, полученные на основе нор- мальных первичных и вторичных спиртов, алкильная цепь ко- торых содержит более 7 атомов углерода, а полиоксиэтилено- вая— не более 10—12 молей окиси этилена. Недостаточно полно окисляются прямоцепочечные алкилфенолы, так как на ско- рость деструкции влияет ароматическое кольцо. Наиболее устойчивыми к биоразрушению являются оксиэтилированные алкилфенолы, имеющие разветвленную алкильную цепь, с коли- чеством оксиэтильных групп более 10. Положение фенольного кольца в прямой алкильной цепи оказывает большое влияние на скорость деградации. Первичное прикрепление дает большую скорость, чем вторичное. Препараты, полученные на основе ли- нейных олефинов, почти полностью деградируют под влиянием микроорганизмов активного ила. Деструкция неионогенных поверхностно-активных веществ происходит в два этапа [169, 517]: 1) карбоксилирование конечной метильной группы с по- следующим 0-окислением и 2) гидролиз полиэтиленгликолевой цепи. При этом образуются следующие типы молекул: 1) с не- поврежденной гидрофобной и деградированной полиэтиленгли- колевой цепями; 2) с карбоксилированной гидрофобной и нена- рушенной полиоксиэтиленовой цепями; 3) с карбоксилированной гидрофобной и деградированной полиоксиэтиленовой цепями. Деградация полиэтиленгликолевой цепи легче происходит в том случае, когда цепь содержит 10 или меньше оксиэтильных групп, и осуществляется путем гидролиза. При разрушении гидрофильной цепи образуются этиленгли- коли, которые в свою очередь разлагаются микроорганизмами до углекислоты и воды. О деградации моно-, ди-, триэтиленгли- колей в речной воде сообщается в работе Эванса и Дэвида [349]. Если первые два соединения были токсичными для мик- роорганизмов, то триэтиленгликоль не был. Моноэтиленгликоль в концентрации 0,2—10 мг/л полностью разрушается в течение трех дней. Скорость биодеградации ди- и триэтиленгликолей бы- ла одинаковой и происходила за 7 дней. Другие авторы отме- чают расщепление полиэтиленгликолей в концентрации 1% штаммом Ps. aeruginosa [372]. Этиленгликоль может разлагаться уксусными бактериями Gluconobacter melanogenus, Acetobacter ascedens, A. aceti, A. pa- steurianum, использующими его в качестве источника углерода 173
[307]. При окислении гликолей уксусными бактериями обра- зуется гликолевый альдегид, а затем гликолевая кислота. Бак- терии рода Aerobacter способны разлагать этиленгликоль в кон- центрации 1 % в полноценной питательной среде [359]. Показа- но [492], что штаммы из группы Pseudomonas — Achromobacter разрушают этиленгликоли в концентрации 5 мкМ, и лаг-фаза продолжается 32 ч. Этиленгликоль, содержащийся в стоках в концентрации 10 мг/л, может разлагаться бактериями после лаг-фазы 96 ч [387]. Разложение этиленгликоля в концентрации 0,5% в анаэробных условиях может осуществлять Cl. glycolicum в присутствии цистина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и серина [359]. При анаэробном разложении пропи- ленгликоля образуется пропиленовый альдегид. Среди выделен- ных Грабиньской-Лоневской [367] бактерий, разрушающих эти- ленгликоли, доминируют микроорганизмы рода Pseudomonas. Таким образом, накопившиеся в последние годы данные о биоразлагаемости ПАВ свидетельствуют о необходимости, с одной стороны, синтеза и внедрения в производство легко био- разрушаемых соединений, а с другой — разработки новых ин- тенсивных методов очистки воды от ПАВ. Эти методы должны основываться на использовании специально полученных высо- коактивных чистых культур микроорганизмов, деструкторов ПАВ. Применение таких культур в микробном методе очистки будет способствовать защите водоемов от загрязнения синтети- ческими соединениями и сохранению окружающей человека при- роды. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЗАКРЕПЛЕННЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК И ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ В ОЧИСТКЕ СТОЧНЫХ ВОД Многие исследователи не удовлетворяются только селекцией высокоактивных микробных культур-деструкторов и определе- нием основных промежуточных продуктов метаболизма, они вы- деляют и изучают ферменты, ответственные за осуществление тех или иных трансформаций резистентных соединений. При этом существует перспектива не только изучения механизма действия и возникновения специфических, новых ферментных систем, но и использования этих ферментов при очистке биосфе- ры. И если предложения Райта [530] о применении фермент- ных препаратов путем внесения их в почву для ускорения биологической детоксикации гербицидов вряд ли осуществимы и несколько преждевременны, то энзиматическая очистка сточ- ных вод уже сейчас имеет под собой надежную основу — прин- цип иммобилизации ферментов и ферментных систем. Закрепление микробных клеток на поверхности различных материалов осуществлено давно — достаточно вспомнить микро- 174
биологический метод получения уксуса путем пропускания вод но-спиртовой смеси через буковую или березовую стружку, кокс или другую насадку, населенную уксуснокислыми бактериями Bacterium aceti, Bacterium Schutzenbachii (так называемый ге- нераторный, или немецкий способ, применяемый с 1832 г. до настоящего времени). В 1864 г. Луи Пастер проделал простой и убедительный опыт с адсорбированными (закрепленными) на веревке уксуснокислыми бактериями [196]. Очистка питьевой воды с помощью медленных фильтров, используемых еще и те- перь на некоторых водопроводах, основана на биохимической деятельности населяющих эти фильтры микробов. Биологиче- ские фильтры для очистки сточных вод также представляют со- бой не что иное, как адсорбированные, закрепленные культуры и ассоциации микроорганизмов, как правило, разнообразные по высоте загрузки и образующие своего рода биохимическую цепь последовательных трансформаций органических веществ до конечных продуктов разрушения. Мы использовали возможность закрепления микроорганиз- мов на загрузках при создании установки для биологической очистки воды, содержащей вещества с повышенной упругостью паров [56]. Ранее считалось невозможным производить аэра- ционную биологическую очистку сточных вод, загрязненных лег- колетучими токсическими соединениями, так как отработанный воздух увлекает их за собой, загрязняя атмосферу [7]. Во избе- жание этого мы предложили направить воздух после аэротен- ка 1 (см. рис. 34) в аэрофильтр 2, верхняя часть которого оро- шается разбавляющей водой 3 с минеральными питательными солями, в то время как сточная вода 4, содержащая легколету- чие органические соединения, подается ниже верхнего края загрузки установки. Поднимающийся навстречу сточной жидко- сти воздух увлекает за собой летучие вещества в верхнюю часть аэрофильтра, где они ассимилируются адсорбированными на загрузке, адаптированными к загрязнению микроорганизмами. В зависимости от количества и степени летучести загрязне- ний высота верхней части аэрофильтра должна быть разной Опыты, проведенные на лабораторной модели установки, пока- зали, например, что однометрового слоя загрузки над местом подачи стока достаточно, чтобы уменьшить содержание п-нитро- анилина в отработанном воздухе в 10—15 раз [57]. В настоящее время отдельные высокоактивные чистые куль- туры закрепляют в насадке, например, в полиакриламидном геле, коллагене и т. д., и через нее пропускают раствор пре- вращаемого вещества [230, 232]. Киношита и Окада [403] включали в полиакриламидный гель культуру Achromobacter guttatus KF 71, которая сохраняла при этом способность гид- ролизовать капролактам. Авторы определили некоторые опти- мальные параметры процесса — pH 7,5 и температура 35°. Пред- принималась также попытка в лабораторных условиях исполь- 175
зовать мембранные фильтры для фиксирования на них бакте- рий, разрушающих гербицид изопропилфенилкарбамат, с целью моделирования процесса очистки сточной жидкости [419]. Очень перспективным методом очистки воды от всевозмож- ных загрязняющих ее веществ, особенно синтетических, являет- ся использование иммобилизованных (закрепленных, нераство- римых) ферментов — «ферментов второго поколения». Идея закрепления ферментов на нерастворимом в воде носителе и применения таких мощных катализаторов в технологических процессах и медицине возникла давно. Еще в 1916 г. осу- ществлена адсорбция инвертазы на активированном угле в свежевыделенной гидроокиси алюминия. С 1951 г. для фракцио- нирования антител и выделения антигенов используют конъюга- цию белков с целлюлозой. До недавнего времени существовал единственный метод закрепления ферментов — обыкновенная физическая адсорбция. Однако адсорбционная емкость извест- ных материалов относительно белков явно недостаточна, а силы адгезии невелики, и разрыв связи между ферментом и поверх- ностью адсорбента может наступать от малейших изменений условий процесса. Поэтому такой метод иммобилизации не нашел широкого применения, но, поскольку он прост и может, по-видимому, способствовать выяснению механизма действия ферментов в живых системах, илах и почве, а в некоторых слу- чаях применяться на практике, некоторые исследователи зани- маются изучением адсорбции ферментов, поиском новых, эффек- тивных носителей и т. д. [104, 206]. В последние 10—15 лет были разработаны различные хими- ческие и физико-химические методы иммобилизации ферментов, что открыло широкие возможности использования их во многих технологических процессах. Многочисленные работы по этому вопросу опубликованы в самых разнообразных изданиях — от специальных академических журналов до массовых газет [19, 20, ПО, 111, 133, 239, 240, 397]. Иммобилизация ферментов является важнейшим научно-техническим достижением совре- менной биологической науки. Закрепление ферментов позволяет многократно их использовать, не загрязняя продуктов реакции, приводит к увеличению стабильности по отношению к условиям внешней среды, а иногда и к повышению активности. Нерастворимые закрепленные ферменты могут найти приме- нение в создании новых, уникальных технологических процессов, пригодных к использованию в пищевой промышленности (полу- чение глюкозы и фруктозы из полисахаридов, стабилизация пи- ва и молока, осветление вина и соков, стерилизация жидкостей); в области тонкого органического синтеза (разделение рацеми- ческих смесей, получение аминокислот, трансформация стероид- ных соединений, синтез лекарственных веществ); в тяжелом (основном) органическом синтезе (замена углеводородного сырья углеводным, получение спиртов, кислот, кетонов) и мик- 176
робном синтезе белка; в медицине как лекарственные средства (уреаза, Л-аспарагиназа и др); в аналитической химии (опре- деление глюкозы, мочевины, антител — в этих случаях чувстви- тельность метода увеличивается почти на 10 (!) порядков и со- здаются условия для определения 1000 молекул антитела в 1 мл раствора). Иммобилизованными ферментами можно детектиро- вать слабые световые, звуковые и механические воздействия, создавать неисчерпаемые источники энергии путем разложения воды видимым светом с помощью фотосинтетической системы хлоропластов и гидрогеназы и т д. Широкие перспективы ис- пользования иммобилизованных ферментов, важность этого на- правления привлекают многих исследователей. Только в СССР насчитываются десятки научных учреждений, где изучается процесс закрепления ферментов и их работы в таком состоянии. Бесспорны возможности иммобилизованных ферментных систем в очистке сточных вод [19, 319, 320, 508]. В некоторых странах закрепленные ферменты используются для очистки сточных вод пищевой и целлюлозно-бумажной промышленности. Уже в тече- ние ряда лет большая группа исследователей Пенсильванского университета под руководством Артура Хампфри ведет интен- сивные исследования по получению фенолоксидазы, иммобили- зации и применению ее в очистке сточных вод металлургической промышленности [320, 515]. Используются внутриклеточные ферменты дрожжей Trichosporon cntanenm, неидентифицирован- ных дрожжей, выделенных из активного ила, очищающего фе- нолсодержащие сточные воды металлургического завода, и бак- терий Pseudomonas sp. Фенолоксидаза — адаптивный фермент и продуцируется микроорганизмами только при наличии фенола в среде. Поэтому дрожжи выращивали на среде, содержащей 0,1% (по весу) фенола, в полунепрерывной культуре, затем выделяли и хроматографически очищали фермент и, наконец, с помощью реакции диазотирования закрепляли на стеклянных шариках с 90%-ным выходом исходной активности. Иммобили- зованная фенолоксидаза используется для определения содер- жания фенола в жидкости. Несмотря на то, что ферменты можно извлекать из живот- ных и растительных тканей, а также осуществлен химический синтез некоторых из них, непревзойденным по дешевизне и до- ступности источником ферментов являются микроорганизмы. Поэтому и в случае применения наиболее эффективной биохими- ческой очистки воды — ферментативного катализа — остается проблема подбора микроорганизмов, способных осуществлять необходимые реакции с синтетическими или трудноразрушае- мыми веществами. Перед исследователями, занимающимися вопросами исполь- зования иммобилизованных ферментов в очистке сточных вод, стоят следующие основные задачи: 1) селекция и выращивание микроорганизмов, содержащих значительное количество необхо- 12 8-616 177
димых ферментов; 2) получение ферментов, их очистка до со- стояния, в котором они могут быть использованы для закреп- ления; 3) разработка приемлемых методов иммобилизации ферментов, способных работать достаточно долго (месяцы — годы); 4) использование кинетики процессов превращения ве- ществ с помощью закрепленных ферментов; 5) создание много- ступенчатых схем полного обезвреживания стоков системой по- следовательных энзиматических реакций. Очень важное значение имеют способы иммобилизации. Они должны быть простыми, эффективными, не снижать каталити- ческой активности белка и давать возможность закреплять фер- менты из сложных биологических комплексов без особой предва- рительной очистки, что значительно удешевило и упростило бы процесс. В нашей лаборатории изучается энзиматическая очистка во- ды от некоторых органических соединений с помощью фермент- ных комплексов, удерживаемых в неоднородном электрическом поле. Нами было показано, что высокомолекулярные соедине- ния природного происхождения — белки, нуклеиновые кисло- ты — могут концентрироваться из растворов при пропускании их через поляризованные электрическим полем зернистые, волок- нистые или пористые загрузки проводников второго рода и ди- электриков [50, 52, 53, 54]. Опыты проводили на трехкамерной ячейке, состоящей из центральной рабочей и двух электродных камер. В рабочую камеру размером 25 X 7 X 37 мм (длина X ширина X высота), отделенную от электродных целлофановыми мембранами, поме- щали 750 мг ваты. Через нее снизу вверх подавали с постоянной скоростью исходный раствор исследуемых веществ. За содержа- нием соединений в исходных, подаваемых в рабочую камеру растворах (Со), и в растворах, выходящих из камеры (Ci), следили по максимумам поглощения белков и нуклеиновых ки- слот в диапазоне волновых чисел (35,5—38) X Ю3 см-1 с по- мощью УФ-спектрофотометра Specord UV-VIS. Электродные камеры заполняли гранулированным активированным углем и через них отдельным протоком пропускали дистиллированную воду. На электроды подавали выпрямленный диодовым мостом ток напряженностью 0—225 В/см. В опытах использовали в виде водных растворов в концентрациях, не превышающих 0,02%, следующие кристаллические белки и нуклеиновые ки- слоты: бычий альбумин (фирма «Biomed», Польша), бактери- альную амилазу и термофильную протеиназу (японская фирма «Daiwa Kasei КК»), глюкозооксидазу, выделенную из Penicilli- um vitale Pidopl. et Bilai (УкрНИИ спиртовой промышленности, Киев), лизоцим из яичного белка (фирма «Reanal», Венгрия), РНК, выделенную из дрожжей рода Torula (фирма «Sigma», США) и низкомолекулярную ДНК (фирма Fluka A. G., Buchs S. G., Швейцария). 178
Рис. 39. Удерживание белка поля- ризованной ватой: а — включение тока: б — выключение тока. Адсорбционная емкость есте- ственного целлюлозного волокна (ваты) по отношению к белкам и нуклеиновым кислотам незначи- тельна. Поэтому при обычном пропускании растворов изучае- мых высокомолекулярных органи- ческих соединений через слой ваты в рабочей камере концен- трация испытуемого вещества на выходе (Ci) быстро выравнива- ется и соответствует исходной концентрации раствора на входе в камеру (Со). Полное насыщение загрузки раствором биополимера и выравнивание концентраций на входе и выходе из камеры проис- ходит в течение 5—10 мин (рис. 39). При подаче на электро- ды постоянного электрического тока (стрелка а, рис. 39) концен- трация используемого соединения в выходящей из камеры жидкости резко снижается. Изменяя ско- рость протока раствора вещества в средней камере и напряжен- ность электрического поля, достигали такого уровня содержания вещества в выходящей из камеры жидкости, который не улавли- вается с помощью спектрофотометра. В этом случае белок или нуклеиновая кислота практически полностью удерживаются в рабочей камере. Таким образом, создание в камере, заполнен- ной целлюлозным волокнистым материалом, электрического по- ля постоянного тока приводит к концентрированию в ней изучае- мых биополимеров в количествах, в сотни и тысячи раз превы- шающих концентрации, способные удерживаться благодаря естественным адсорбционным свойствам загрузки. Отключение электрического поля (стрелка б, рис. 39) приводит к быстрому освобождению из камеры удерживаемого соединения. При этом в вытекающей жидкости содержится биополимер в количествах, значительно превышающих концентрацию исходного раствора. Установлено, что эффективность удерживания белков и ну- клеиновых кислот целлюлозным волокном, помещенным в постоянное электрическое поле, прямо пропорциональна напря- женности этого поля и обратно пропорциональна скорости про- тока испытуемого раствора в рабочей камере. На рис. 40 пред- ставлены экспериментальные кривые изменения концентрации некоторых белков и нуклеиновых кислот вытекающей из рабо- чей камеры жидкости в зависимости от напряженности поля и скорости протока растворов. 12* 179
С, мкг/мл Рис. 40. Влияние напряженности элект- рического поля и начальной концентра- ции веществ на удерживание биополиме- ров поляризованной ватой. 1—4 — растворы РНК; 5 — ДНК; 6 — амилазы, 7— глюкозооксидазы; 8 — лизоцима. Скорость протекания растворов: / и 8 — 1,6 мл/мин; 2, 4—7 — 0,9 хмл/мин; 3~ 0,6 мл/мнн. нимальной скорости протока Следует отметить, что при одинаковом режиме ра- боты установки (напряжен- ность и проточность — const.) степень удерживания веществ зависит от исходных концентраций раствора и для различных соединений неодинакова. Так, при ис- пользовании растворов био- полимеров с разной началь- ной концентрацией было по- казано, что для полного и эффективного удерживания соединений при одинаковой и постоянной проточности раствора в камере необхо- димо увеличивать напря- женность электрического поля пропорционально со- держанию вещества в исход- ном растворе (рис. 40, кри- вые 2 и 4). При использова- нии же в опыте оптималь- ной для удерживания ма- кромолекул постоянной на- пряженности поля (200 В/см) необходимо сводить к мини- муму проточность раствора с максимальным содержани- ем биополимера (рис. 40, кривые 1, 2, 3 и 4). При ми- в камере можно умень- раствора шить напряженность электрического поля, при которой происхо- дит полное удерживание высокомолекулярных органических сое- динений из растворов с одинаковой исходной концентрацией. Проведенные опыты показали, что белковые вещества удер- живаются целлюлозной загрузкой, помещенной в постоянное электрическое поле, значительно лучше, чем нуклеиновые кисло- ты: так, например, при проточности 1,6 мл/мин не удается пол- ностью извлечь из раствора РНК, используя в опыте максималь- ные напряженности поля — 200—225 В/см (рис. 40, кривая /), а лизоцим (рис. 40, кривая 8) при этой проточности концентри- руется в камере при напряженности 150 В/см и полностью удер- живается в ней при 175—200 В/см, хотя исходная концентрация его в 3 раза превышает концентрацию РНК. Аналогичная кар- тина наблюдается при удержании амилазы (рис. 40, кри- вая 6). Опыты показали, что эффективно сконцентрировать в ISO
камере белок из раствора, даже в десятки раз превышающего по концентрации раствор РНК, можно, используя оптимальную напряженность поля и минимальную проточность раствора в установке (рис. 40, кривая 7). При сравнении эффективности удерживания нуклеиновых кислот необходимо отметить, что РНК концентрируется в каме- ре под действием постоянного электрического поля лучше, чем ДНК- Так, при концентрации исходного раствора 37 мкг/мл и проточности 0,9 мл/мин РНК полностью удерживается в камере уже при 125 В/см (рис. 40, кривая Д; извлечь же из раствора ДНК при этих условиях удается лишь при напряженности поля 200—225 В/см (рис. 40, кривая 5). Таким образом, проведенные исследования позволили устано- вить основные закономерности, которым подчиняется явление удерживания высокомолекулярных соединений целлюлозной за- грузкой, помещенной в поле постоянного электрического тока. Степень удерживания веществ загрузкой прямо пропорциональ- на напряженности электрического поля и обратно пропорцио- нальна скорости протока раствора в рабочей камере. При оди- наковых исходных параметрах работы установки (концентрация исходного раствора вещества, напряженность поля, проточность в рабочей камере) степень удерживания различных соединений неодинакова. Это может иметь существенное значение при раз- делении смеси веществ. Как оказалось, белки легко удерживаются не только из водных растворов, но и из сложных биологических смесей, на- пример надосадочной жидкости после гомогенизации клеток и центрифугирования. Следует подчеркнуть особо, что при этом не теряются каталитические свойства ферментов, что, безуслов- но, можно и нужно использовать в биохимической технологии и в частности при очистке сточных вод. Так как сточные воды анидного производства содержат прак- тически только гексаметилендиамин (ГМД), а его дезаминиро- вание, как уже упоминалось ранее, привело бы к полному обез- вреживанию этой «мертвой» воды, мы попытались разрушить ГМД с помощью иммобилизованных ферментов. В качестве ис- точника дезаминаз избрали штамм споровых бактерий Вас. sub- tilis 21. Культуру выращивали на ,ЦПА в течение 24 ч при температуре 37°. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором (0,56%) и центрифугировали при 6000 об/мин в тече- ние 20 мин. 10 г сырой биомассы разрушали с помощью гомо- генизатора Л-17 [187] в рефрижераторной центрифуге при тем- пературе 4° в фосфатном буфере (pH 7,0). Бесклеточный экст- ракт, представляющий собой надосадочную жидкость, после центрифугирования гомогената клеток, активно дезаминирует ГМД: 5-минутного контакта бесклеточного экстракта с 1%-ным раствором ГМД в соотношении 1 : 1 достаточно для полного разрушения токсического вещества. При этом наблюдается 181
заметное выделение аммиака. Непосредственно из бесклеточного экстракта осуществлено закрепление ферментного комплекса на загрузках (вате, обезжиренной шерсти) в электрическом поле [52]. Удерживаемые полем ферментные системы успешно раз- рушают ГМД при пропускании через коллектор 0,1%-ного раст- вора вещества в течение двух недель. Скорость протока раство- ра субстрата через ячейку составляет 50 мл/ч. Вытекающая из камеры жидкость лишена ГМД либо содержит его в концентра- ции не более 70—100 мкг/л. Таким образом, удерживаемые в электрическом поле фер- менты осуществляют соответствующие превращения субстратов. Следует отметить, что при отключении поля ферменты вымы- ваются потоком жидкости из объема загрузки; при этом они не теряют своих каталитических свойств и могут быть повторно иммобилизованы. Опыты показывают, что с помощью электри- ческого поля можно иммобилизовать ферменты любой степени очистки — от кристаллических до находящихся в сложных био- логических смесях, в том числе в бесклеточных экстрактах [52, 53]. Сохранение активности ферментов при их электроудержива- нии может использоваться для локальной ферментной очистки воды в биотехнологии при иммобилизации ферментов, а также при разработке способов очистки и выделения ферментов из биологических смесей. Закрепление ферментов по типу электро- удерживания имеет преимущества по сравнению с другими ти- пами иммобилизации. Так, для его осуществления не требуется специально подготовленных коллекторов и каких-либо реакти- вов; источниками пригодных к закреплению ферментов могут служить как чистые кристаллические, так и технические препа- раты, даже бесклеточные экстракты; ферменты можно легко снять с коллектора (для этого достаточно отключить электри- ческое поле и промыть систему водой), а затем использовать его для закрепления других ферментов. Существует возмож- ность иммобилизации комплекса ферментов или смеси различ- ных микробных культур и ферментов; электроудерживание сво- дит к минимуму опасность микробной порчи иммобилизованных ферментов. Существенным ограничением и недостатком электро- иммобилизации ферментов является то, что систему нужно не- прерывно держать под напряжением, а это затрудняет работу в случаях, когда субстрат или продукт реакции обладает боль- шой подвижностью в электрическом поле, или для осуществле- ния ферментной реакции необходима среда с высокой ионной силой. Описанная иммобилизация ферментов аналогична, по-види- мому, электроудерживанию микроорганизмов [58, 59] и осу- ществляется благодаря электростатическому и диполь-диполь- ному воздействиям между поляризованными частицами коллек- тора и молекулами белка, несущими определенный заряд и 182
имеющими в электрическом поле большой дипольный момент. Поскольку материал коллектора обладает отличной от жидко- сти диэлектрической проницаемостью и поляризуется, электри- ческое поле в рабочей камере неоднородно, с многочисленными градиентами потенциала. Это создает условия для диэлектрофо- ретического [445, 446] перемещения белков-диполей в зоны большей напряженности поля, и доставка ферментов к поверх- ности коллектора происходит за счет электро- и диэлектрофоре- за. При отключении электрического поля диполь-дипольное взаи- модействие исчезает, и белок покидает коллектор. Мы полагаем, что иммобилизация ферментов с помощью электроудерживания наиболее близка к закреплению и органи- зации работы ферментов в клетке. Перемещающиеся ионы и электроны создают на биологических мембранах резко неодно- родное электрическое поле. Неоднородность его усугубляется сложным строением поверхности мембраны, которая образуется различающимися по своим геометрическим и электрическим па- раметрам липидными и белковыми молекулами. Расположенные на мембране, способные к перемещению белки под воздействи- ем такого поля устремляются в зоны большей напряженности и взаимодействуют по типу электроудерживания с встречающи- мися на их пути «вмонтированными» в мембрану белками и меж- ду собой. Так как перенос ионов и электронов по мембране — процесс дискретный, то и генерируемое ими электрическое поле имеет импульсный характер, что приводит к чередованию сбли- жения и отталкивания молекул белка, к их колебательному, пульсирующему движению, необходимому для нормальной ра- боты цепи ферментов. Таким образом, электроудерживание ферментов представ- ляет определенный практический интерес и имеет, по-видимому, существенное значение в биологии.
ГЛАВА IV ОСВОБОЖДЕНИЕ ВОДЫ ОТ МИКРООРГАНИЗМОВ Важное место в микробиологии очистки воды занимает вопрос освобождения ее от микроорганизмов. Биологическая очистка сточных вод заключается, как известно, в разрушении раство- ренных органических веществ микроорганизмами активного ила и биопленки или доминирующими культурами бактерий, актино- мицетов и грибов. При этом некоторая часть загрязнений мине- рализуется, т. е. превращается в углекислоту, воду, аммиак, нитраты, сульфаты и пр., другая часть используется микроорга- низмами в конструктивном метаболизме, в результате чего микроорганизмы размножаются и их концентрация в очищаемой воде значительно возрастает. Происходит вторичное загрязнение воды, которое зачастую не так опасно, как исходное, особенно обусловленное синтетическими, токсическими, канцерогенными веществами и т. и., но тем не менее недопустимо. Живые мик- роорганизмы — возможные источники заражения , и даже в том случае, если они совершенно непатогенны для животных и ра- стений или предприняты меры к их уничтожению (например, хлорированием, озонированием), то и тогда они как органиче- ское вещество разлагаются, способствуя евтрофикации водоемов, развитию водорослей и т. д. Спуск загрязненных микробными клетками вод в открытые водоемы недопустим. Поэтому после биологической очистки сточных вод предусматривается отделе- ние микроорганизмов от жидкости. Активный ил имеет одно су- щественное достоинство — при нормальных условиях он довольна быстро оседает, оставляя прозрачную надосадочную жидкость, которая содержит сравнительно небольшое количество микро- организмов и после дополнительного обеззараживания может быть направлена в водоем. Не случайно важнейшим показате лем активного ила, характеризующим его качество, является так называемый объемный индекс, представляющий собой объем, который занимает 1 г активного ила после 30-минутного отстаи- вания в мерном цилиндре на 1000 мл [135, 218. 238] При нарушениях технологического режима биологической очистки, связанных в основном с подачей в аэротенк слишком 184
концентрированных сточных вод или изменением других пара- метров (аэрации, pH и т. д.), может наступать «вспухание» активного ила, развитие нитчатых форм микроорганизмов, в частности Sphaerotilus (Cladothrix), грибов и бактерий [218], т. е. происходит резкое увеличение количества отдельных, сво- бодно живущих, не входящих в состав хлопка активного ила клеток микроорганизмов. В этих случаях наблюдается значи- тельная интенсификация процесса разрушения растворенных в воде органических соединений, однако воспользоваться этим фактом не представляется возможным, поскольку такой ак- тивный ил не оседает в отстойниках, и прошедшая биологи- ческую очистку, освобожденная от растворенных органических веществ вода очень загрязнена микроорганизмами. Аналогичная ситуация возникает при использовании для очистки воды бак- териальных или других доминирующих культур. Затруднения, связанные с отделением микроорганизмов от больших объемов воды, являются одними из главных и пока непреодолимых препятствий к широкому внедрению в практику очистки промышленных сточных вод микробного метода [230], безусловно более прогрессивного и более производительного по сравнению с использованием активного ила. В микробиологической промышленности накоплен значи- тельный опыт по отделению микроорганизмов от жидкостей. При производстве вина и пива дрожжи отделяют на протяжении тысяч лет простым отстаиванием. Кроме того, используют фильт- рование через слой различных материалов — асбест, целлюлозу, инфузорную землю и др. [3, 27, 261]. В производстве пекарских дрожжей суспензию пропускают через сепараторы и фильтр- прессы [3, 27]. При получении ферментов (так же. как и других биологически активных веществ) путем выращивания микро- организмов в глубинных условиях отделение биомассы от куль- туральной жидкости осуществляется на фильтрпрессах, барабан- ных вакуумфильтрах, различного типа центрифугах и сепарато- рах [118]. В последние 10—15 лет вопрос отделения биологических ча- стиц от жидкостей и газов приобретает особую остроту и акту- альность. Это связано главным образом с технологическими нуждами микробиологической промышленности и особенно той ее области, которая занимается выращиванием бактерий и дрожжеподобных грибов на различных углеводородах с целью получения «белка из нефти» Однако вода, в той или иной сте- пени освобожденная от микроорганизмов, все шире использует- ся и в других отраслях промышленности. Например, если до недавнего времени особое внимание на содержание микробных клеток в жидкости обращали только в случаях приготовления растворов лекарственных препаратов, питательных сред в мик- робиологическом производстве, водоподготовке и очистке сточ- ных вод, то сейчас определенные требования к микробному 185
качеству воды предъявляются и пищевой индустрией, электрон- ной и радиопромышленностью. Для многих технологических процессов необходимо большое количество обессоленной и хо- рошо очищенной воды, лишенной любых клеток микроорганиз- мов. Даже в таких отраслях промышленности, как целлюлозно- бумажная, текстильная, химическая, нефтехимическая, атомная и др., где используется большое количество воды, как правило, уже побывавшей в технологических процессах и загрязненной органическими веществами, возникают осложнения, связанные с развитием в такой воде значительного количества микроорга- низмов, которые прикрепляются к трубопроводам, оборудова- нию, изделиям и тем самым затрудняют осуществление процес- сов теплообмена, нарушают технологический режим и ухудшают качество выпускаемой продукции. В дальнейшем проблема, связанная с необходимостью отде- ления микроорганизмов, будет становиться все более актуаль- ной; это связано не только с развитием биологической техно- логии и расширением применения микробов в промышленности, сельском хозяйстве, очистке биосферы, а также увеличением потребностей в свободной от биологических частиц воде, но и с микробным загрязнением окружающей среды. Дело в том, что возрастающее загрязнение воды, почвы и воздуха органически- ми и неорганическими веществами стимулирует развитие разно- образных микроорганизмов. В ревультате этого количество ми- кробов в биосфере, видимо, неуклонно увеличивается. Туманы и дымы, испаряющиеся легколетучие органические вещества способствуют более интенсивному размножению микроорганиз- мов в воздухе. Бесперебойными поставщиками огромных ко- личеств микробов в атмосферу являются, как уже указывалось, аэротенки и другие аэрируемые очистные сооружения [26, 364, 370, 402, 455, 460, 464, 514], а также пыльные бури. Использова- ние воды для технических, сельскохозяйственных, бытовых и транспортных целей, а также эрозия почвы, заиливание, затоп- ление больших территорий при строительстве гидротехнических сооружений, развитие водных растений и фотосинтезирующих организмов и т. д. существенно повышают минеральную и орга- ническую компоненты природных вод, а это не может не отра- зиться на содержании в них микроорганизмов. Учитывая большую роль микробов в качестве главных сани- таров Земли, необходимо способствовать развитию микроорга- низмов, особенно гетеротрофов, и тем самым усиливать само- очищающую способность биосферы. С другой стороны, бурный рост численности микроорганизмов в воздухе и воде может принести ощутимый вред человеку. Общеизвестно, какой ущерб наносит чрезмерное развитие синезеленых водорослей некото- рым водным бассейнам (особенно искусственным). Осложняется в связи с этим и подготовка воды для технических и бытовых целей. «Демографический взрыв», «атака» водорослей привлека- 186
ет внимание не только ученых, но и неспециалистов. Таким образом, наряду с проблемой защиты биосферы от загрязнения химическими веществами и электромагнитными волнами, перед человечеством возникает задача очистки некоторых компонентов окружающей среды от микроорганизмов. Это актуально не толь- ко для промышленности (из-за биообрастаний и сложности подготовки воды для питьевого и оборотного водоснабжения), но и для сельского хозяйства и медицины, в особенности, если учесть, что в последнее время трудно определить границу меж- ду патогенными, условнопатогенными и сапрофитными микро- организмами. Установлено, что при определенных условиях растения могут поражаться типичными сапрофитными ризо- сферными бактериями [37], а некоторые фитопатогенные мик- роорганизмы вызывают заболевания животных, в частности, на- секомых [61, 482]. Все существующие методы отделения микроорганизмов мож- но разделить на две группы: 1) реагентные и 2) безреагентные. Реагентные методы включают: коагуляцию и флокуля- цию; адсорбцию; флотацию и пенное фракционирование; экстракцию жидкость — жидкость. Безреагентные — гравитационное осаждение; фильтро- вание и электрофорез. Часто в одном технологическом процессе используются два и более различных методов, например, коагу- ляция с последующим гравитационным осаждением, флокуля- ция и фильтрование и т. д. РЕАГЕНТНЫЕ МЕТОДЫ Общим недостатком реагентных методов отделения микро- организмов от жидкостей является необходимость применения специальных материалов и реактивов. Эти реагенты должны отвечать соответствующим требованиям. Они должны быть нетоксичны; не менять существенно pH среды; не влиять на хи- мический состав клеток; реагировать в незначительных коли- чествах; иметь высокую активность и низкую стоимость; по воз- можности отделяться от клеток и повторно использоваться. Несмотря на такие ограничения, некоторые из реагентных методов получили значительное распространение в водоподго- товке, микробиологической промышленности и др. Широко используются методы очистки воды, основанные на коагуляции и флокуляции [158, 343—346]. При этом происходит нейтрализация заряда клеток, что ведет к их слипанию и оседанию. Поэтому флокуляция зависит от природы поверхности микробной клетки, ионного состава среды, pH и используемых флокулянтов. Процесс флокуляции микроорганизмов изучен недоста- точно. Предполагают, что при коагуляции дрожжевых клеток 187
образуются солевые мостики между атомами кальция и карбок- сильными группами поверхности клеток. К. А. Калунянц с соавт. [119] с целью отделения бактерий при производстве ферментов использовал хлористый кальций при наличии в среде солей фосфорной кислоты для образования геля фосфорнокислого кальция. Однако этот процесс требует добавления к суспензии значительного количества СаСЬ (0,8—4%) и фосфорнокислых солей (до 4%), что неприемлемо в условиях очистки сточных вод. Катионные ПАВ — алкилпиридиновые и четвертичные ам- мониевые соли, а также алкиламины — проявляют активность в концентрациях 0,01—0,1%. Синтетические анионные и неани- онные полиэлектролиты (полиакриламид, полистиролсульфонат, полиглутаминовая кислота, декстран) тоже приводят к флоку- ляции бактерий, причем агломерация в этом случае происходит скорее благодаря специфической адсорбции полимеров и созда- нию полимерных мостиков между клетками, чем в результате понижения заряда бактериальных частиц. Возможно, что в свя- зи с расширением ассортимента синтетических полиэлектроли- тов и их промышленным производством, эти вещества найдут широкое применение и в процессах отделения микроорганизмов. Коагуляция включает в себя также и электрокоагу- ляцию — интересный и перспективный метод очистки воды с помощью гидроокисей алюминия, железа и др., образующихся при электрохимическом растворении изготовленного из этих металлов анода [160]. Естественно, во время электрокоагуля- ции происходят также окисление, флотация, электрофорез и т. п. При электрохимической коагуляции отпадает необходимость транспортировки и хранения коагулянта, приготовления его растворов, дозирования, смешивания с водой и т. д., но процесс фильтрования осадка при этом остается. При осаждении скоа- гулированных взвешенных частиц на электродах происходит увеличение сопротивления и расхода электроэнергии, а также возникают трудности, связанные с периодической чисткой элек- тродов. Экспериментально установлено, что агрегирование и коагу- ляция дисперсных частиц могут наступать в результате их по- ляризационного взаимодействия в электрическом поле. Заря- женные и незаряженные частицы образуют цепочечные агрегаты различной степени устойчивости как в однородном электриче- ском поле [164], так и под воздействием электрического заряда малой мощности [136]. Своеобразный механизм агрегирования клеток водорослей под влиянием электрического тока в при- сутствии солей многозарядных неорганических катионов посту- лируют Мацкевич и соавт. [96, 173]. Исследователи считают, что такие катионы взаимодействуют с отрицательными заряда- ми поверхности частиц, при этом происходит локальная переза- рядка этой поверхности, и при достаточно высоком градиенте напряженности наступает расщепление клетки водоросли на 188
составные части (макромолекулы) «в результате растягивания разноименных зарядов, прочно связанных с макромолекулами, в разные стороны» [173]. Такой разрыв клеток под действием то- ка, названный авторами «электролизис биодисперсий», приводит, по их мнению, к выделению из их периферического слоя слизи, что и обусловливает компактную агрегацию водорослей, способ- ных отделяться от воды обыкновенным фильтрованием через бумажный фильтр. Вероятность столкновения клеток микроорганизмов друг с другом (а значит и их адгезии, слипания) тем больше, чем вы- ше концентрация частиц в среде. На этом основании в нашем отделе разрабатываются методы очистки воды от микроорга- низмов с использованием тонкодисперсных замутнителей, в частности глинистых минералов [65, 66, 158, 159]. При этом большое внимание уделяется тому обстоятельству, что глинистыс- минералы, как и многие другие тела с развитой поверхностью, активно адсорбируют различные микроорганизмы. Это способ- ствует адгезии клеток и, кроме того, может иметь самостоятель- ное значение для отделения микроорганизмов от жидкости. Адсорбция микроорганизмов на поверхности твердых тел изучается еще с прошлого столетия. Данные по этому вопросу подытожены профессором МГУ Д. Г. Звягинцевым [103]. Уста- новлены некоторые основные закономерности процесса. Адсорб- ция зависит от свойств микроорганизмов и адсорбентов, состава и физико-химических свойств среды и условий, обеспечивающих контакт между клетками и поверхностью твердого тела. «Адсорбция установлена для самых различных групп микро- организмов: споровых и неспоровых, грамположительных и грам- отрицательных бактерий, проактиномицетов, актиномицетов, грибов, дрожжей, водорослей, простейших животных, мико- плазм, вирусов и фагов» [103]. Однако различные микроорга- низмы неодинаково адсорбируются твердой поверхностью. На степень адсорбции влияет и систематическое положение микро- ба, в том числе видовые и даже штаммовые особенности, и та- кие факторы, как возраст культуры, фазы ее развития, физио- логическое состояние. Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Sac- charomyces cerevisiae и Saccharomyces vini почти полностью адсорбируются на всех видах сорбентов; хорошо сорбируются Pseudomonas pyocyanea, Bacillus brevis, хуже — Вас. mycoides, Вас. megatherium, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas vulga- ris, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum и др. Старые и мертвые клетки не прикрепляются к стеклу [477]; убитые нагре- ванием дрожжи не адсорбируются глинистыми минералами [464]. Д. Г. Звягинцев [103] считает, что в большинстве случаев микроорганизмы после их умерщвления нагреванием все же сохраняют способность к адсорбции. Величина и форма клеток не играют существенной роли в процессе адсорбции, однако есть сведения о том, что мелкие клетки, например, Micrococcus, 189
Pseudomonas, Agrobacterium сорбируются сильнее крупных Bacillus [425]; подвижные бактерии адсорбируются хуже не- подвижных, а бескапсульные — лучше слизистых. Степень адсорбции микробов зависит также от природы адсорбента. Д. Г. Звягинцев [102, 103] на основании микроско- пических исследований расположил адсорбенты в следующий ряд по убывающей способности адсорбировать бактерии: Дауэкс 1 > Дауэкс 50 > гумбрин > бентонит > кил > нон- тронит > монотермит > каолинит >асбест. Мюллер и Хикиш [425] изучали адсорбцию 12 штаммов бактерий 9 родов на раз- личных адсорбентах и приводят аналогичный ряд используемых ими адсорбентов (в скобках указан процент адсорбированных клеток): монтмориллонит (92) > Вофатит EZ (90) > Вофатит EW и бентонит (87) > лесс (82) > анионит Вофатит N (79) > каолинит (75) > катионит Вофатит СР (45) > кварц (44). Исследования Д. Г. Звягинцева по адсорбции микроорга- низмов на модифицированной поверхности стекла, содержащей преимущественно либо гидрофильные (NH+2, COO-, ОН-), либо гидрофобные — (СН3) — группы, еще раз продемонстрировали роль природы поверхности адсорбента во взаимодействии между микробными клетками и твердыми материалами, а также всю сложность этого процесса [101, 103, 198]. Определенную селек- тивность по отношению к вирусам проявляют некоторые син- тетические полиэлектролиты. Например, сополимер стирола и малеинового ангидрида, сшитый дивинилбензолом, способен адсорбировать из воды вирус табачной мозаики (палочки дли- ной 3000 А и диаметром 160 А) на 100% и вирус полиомиелита (шарообразные, диаметром 350 А с большим содержанием РНК.) —на 99,99%, в то время как ионообменная смола Амбер- лайт ХЕ-119 поглощает только 9% вируса табачной мозаики. Поперечносшитый сополимер азобутилена и малеинового ангид- рида РЕ 60 в виде порошка с размером частиц 100 меш адсор- бирует вирусы в присутствии других микроорганизмов и орга- нических веществ, что позволяет обходиться без дополнитель- ного фильтрования или обработки жидкости ионообменными смолами при концентрировании вирусов и выделении их из различного рода сточных и природных вод [509, 511]. В ионо- обменных смолах аниониты, поверхность которых заряжена положительно, адсорбируют микроорганизмы значительно луч- ше, чем отрицательно заряженная поверхность катионитов. В последнем случае определенное значение имеет природа ка- тионов, насыщающих смолу: сравнительно хорошо сорбируются отдельные микроорганизмы (например, Вас. mycoides, Sarcina sp.) водородной формой смолы, хуже — катионитами, насыщен- ными Cu2+, Fe3+ и А13+, и еще хуже при насыщении ионами кальция, магния и бария. Формы смолы, содержащие однова- лентные катионы (К+, Na+, NH+4), практически не сорбируют 190
бактерий. Еще Пил (цит. по [103]) нашел, что по степени влияния на адсорбцию Azotobacter chroococcum почвой вводимые в нее катионы можно расположить в следующий ряд: Na+ < Li+ < < NH+4 < К+ < Mg2+ < Са2+ < Ва2+ < Мл2+ < А13+ < < Fe3+. В дальнейшем эти результаты были подтверждены, расширены и обоснованы [102, 464]. Не только наличие опреде- ленных катионов, особенно ионов водорода в среде, но и их кон- центрация оказывает влияние на адсорбцию микроорганизмов. В отсутствие катионов многие культуры не поддаются адсорб- ции. Адсорбция спорообразующих микроорганизмов подчиняет- ся правилу Шульце—Гарди: для того, чтобы вызвать адсорб- цию бацилл, трехвалентного катиона нужно в 10—100 раз меньше, чем двухвалентного, которого достаточно в 10—100 раз меньше, чем одновалентного, за исключением иона водорода, которого требуется примерно столько же, сколько трехвалент- ного. Д. Г. Звягинцев [103] на основании данных литературы и собственных исследований пришел к выводу, что влияние pH и катионов на адсорбцию коррелирует с их влиянием на вели- чину электрокинетического потенциала, на агрегативную устой- чивость бактериальной суспензии — при приближении к изо- электрической точке дзета-потенциал уменьшается и адсорбция увеличивается. Следует, однако, учитывать возможность обра- зования координационных связей через ионы металлов, уста- новление химических связей и т. д. Природа адсорбционного взаимодействия микроорганизмов с твердыми материалами окончательно не выяснена. Предпола- гается, что основную роль в этом процессе играет электроста- тическое притяжение (и даже ионный обмен), которое зависит от природы поверхности твердого тела, величины и характера ее заряда, а также от электрокинетических свойств клетки. Д. Г. Звягинцев [103, с. 53] приводит целый список сил, воз- можно принимающих участие в процессе адгезии клеток: «1. Химические связи между взаимодействующими поверх- ностями, например, водородные связи, тиоловые, амидные и эфирные связи. 2. Образование ионных пар и ионных триплетов, например, — NH3...— COO — и — COO —...Са...— ООС —. Этот тип взаимо действия включает энергию десольватации. 3. Силы, вызванные флуктуацией зарядов взаимодействую- щих тел. 4. Мозаичный заряд на поверхностях подобного или противо- положного общего заряда, специфически возникающий из элек- тростатического притяжения геометрически упорядоченных за- рядов. 5. Силы, обусловленные притягательным взаимодействием противоположно заряженных тел. 6. Электростатическое притяжение между поверхностями, несущими одинаковый заряд. 191
7. Электростатическое притяжение, обусловленное отражен- ными силами. Эти силы можно рассматривать как обусловлен- ные десольватацией внутримембранных ионов при объединении мембран. 8. Силы поверхностного натяжения и поверхностной энергии. 9. Силы Ван-дер-Ваальса. Помимо сил притяжения при адсорбции клеток могут дей- ствовать силы отталкивания. 10. Силы отталкивания одноименно заряженных поверхно- стей. И. Препятствие притяжению, обусловленное пространствен- ными барьерами, такими как капсулы и сольватные слои». Даже самые лучшие адсорбенты обладают небольшой ад- сорбционной емкостью по отношению к микроорганизмам. Бо- лее того, десорбция — освобождение микробных клеток и реге- нерация адсорбента — затруднительна и связана с необходи- мостью обработки его растворами кислот, солей, щелочей, ПАВ или других органических соединений [103, 105, 335]. Следует отметить, что практического применения при отделении микро- организмов от воды адсорбция, по-видимому, не нашла главным образом из-за малой поглотительной емкости и сложности реге- нерации адсорбентов [103, 194, 215, 512]. Пенное фракционирование, флотация, в том числе и электрофлотация, основаны на способности пузырьков газа (воздуха, водорода, кислорода и др.) в присутствии ПАВ поднимать клетки микроорганизмов на поверхность жидкости; при этом образуется пена, которую отделяют и разрушают, получая концентрированную суспензию микроорганизмов и очи- щенную воду. Для описания процесса пенного фракционирования микро- организмов пользуются уравнением адсорбции Гиббса [148]: г_______1 dy RT ~d\nCi ' где Г—поверхностное концентрирование; R—газовая постоян- ная; Т—абсолютная температура; у—поверхностное натяже- ние; Ci — исходная концентрация суспензии. Известно несколько разновидностей флотации, различаю- щихся главным образом способами генерации газа и его сме- шения с водой [208]: 1) флотация с подачей воздуха (газа) через пористые мате- риалы; 2) флотация с механическим диспергированием воздуха; 3) флотация с выделением воздуха из раствора; 4) электрофлотация; 5) биологическая флотация. Существенную роль в процессе флотации микроорганизмов играют форма и размеры сосудов, значение pH и ионная сила 192
суспензии, диаметр пузырьков газа, скорость их подачи, доза и природа ПАВ, наличие других водорастворимых веществ в суспензии и т. д. Большое, иногда решающее, значение имеет видовая принадлежность микробной клетки, ее состояние и воз- раст культуры. Так, известно, например, что вначале в пену переходят споры Bacillus anthracis, а затем только вегетативные клетки и их обломки. Аналогичным образом можно отделить клетки Serratia marcescens и споры Вас. subtilis var. niger от автолизированных остатков клеток: при использовании в каче- стве пенообразующих факторов жирных кислот сначала уносят- ся обломки и вегетативные клетки, а в присутствии диоктила- мина в качестве ПАВ — удаляются практически одни только споры Вас. subtilis var. niger [360, 361]. Более того, оказалось, что клетки Brucella suis, образующие шероховатый и мукоид- ный типы колоний, хорошо отделяются и концентрируются пен- ным флотированием, а гладкого типа такой способностью не обладают. Споровые бактерии, образующие бугорчатые коло- нии (tubercle bacilli), легко отделяются от суспензии при фло- тировании, a Escherichia coli, Staphylococcus albus, Schizosaccha- romyces sp.— с трудом. Исследования Година с сотр. [360, 361] показали, что гидро- фобные организмы, такие как Е. coli, быстрее концентрируются пенной флотацией в присутствии NaCl. Фосфат и карбонат тоже способствуют отделению клеток, но не в такой степени, как хлорид натрия. Бикарбонат, сульфат, нитрат, бромид и йо- дид не влияют на этот процесс; ионы аммония, по-видимому, угнетают флотацию. Пенным фракционированием с использова- нием катионного ПАВ — этилгексадецилдиметиламмонийбро- мида —в концентрации 0,015—0,04 мг/мл удалось достичь очень большого (до 1 000 000 раз) концентрирования клеток. Флотация используется как для очистки воды от грубо- дисперсных примесей и растворенных веществ, так и для отде- ления микроорганизмов от жидкостей. Были предприняты попытки применить этот метод для отделения дрожжей и бакте- рий при производстве БВК- Электрофлотация известна с начала XX века и осно- вана на использовании тонкодиспергированных пузырьков га- зов, выделяющихся при электролизе. Для осуществления про- цесса применяют вертикальные пластинчатые или горизонталь- ные решетчатые электроды, расположенные на расстоянии 0,5—2 см друг от друга, либо один электрод на поверхности жидкости, а другой — на дне сосуда. Часто анод изготавливают из электрохимически растворимых материалов (железо, медь, цинк, алюминий), образующих коагулирующие соединения, или добавляют обыкновенные флотореагенты, коагулянты и фло- кулянты [262, 263]. Возможно, электрофлотация, в частности, ее модификация, успешно разрабатываемая в Институте кол- лоидной химии и химии воды АН УССР Л. А. Кульским, 13 8—616 193
Е. С. Мацкевичем и В. И. Журавлевой [172], будет полезна при освобождении воды от синезеленых водорослей. О естественной флотации микроорганизмов и роли этого явления в формировании бактерионейстона, распределении мик- роорганизмов в толще жидкости и переносе их в воздух было сказано выше. Пенная флотация — это довольно слож- ный, «капризный», малоэффективный процесс и вряд ли смо- жет быть использован для полного удаления микроорганизмов из воды. Экстракция жидкость — жидкость основана на том, что при интенсивной обработке водной суспензии несмешивающимися с ней органическими растворителями — бензином, диэтилкетоном, н-пропанолом, бутанолом и др.— происходит адгезия клеток, и они располагаются между указанными двумя слоями жидкости. Эти три слоя нужно разделить, клетки микроорганизмов и во- ду — освободить от остатков органического растворителя. Не- смотря на эти сложности, метод экстракции жидкость — жид- кость считается одним из самых перспективных для отделения микроорганизмов, особенно бактерий при производстве белка из нефти. Шведский ученый Пер-Оке Альбертсон предложил исполь- зовать для разделения бактерий, вирусов, фрагментов клеток, мембран, ядер, белков, нуклеиновых кислот и любых других частиц биологического происхождения двухфазные водные ра- створы полимеров — полиэтиленгликоля, декстрана и их произ- водных [2, 279, 280]. Фракционирование в двухфазной водной системе основывается на избирательном распределении частиц между этими фазами, аналогичном распределению растворимых веществ. Метод Альбертсона получил широкое распространение и используется во многих биохимических и микробиологических лабораториях, так как позволяет в «мягких» условиях, без на- рушения структурной целостности и изменения нативных свойств осуществлять выделение и очистку лабильных биологических объектов, а также дать определенную информацию о их строе- нии. Реализация этого метода в промышленном масштабе, на- пример, для выделения вирусов или получения чистых фермен- тов, не встречает, по мнению автора, принципиальных трудно- стей, однако в очистке воды он не может быть использован. Очевидно, и любая другая модификация экстракции жидкость — жидкость неприменима при микробной очистке промышленных сточных вод и, конечно, такой метод совершенно непригоден для водоподготовки. Поэтому, несмотря на многочисленность литературных, осо- бенно патентных сведений по жидкостной экстракции микроор- ганизмов, эти данные здесь не представлены. 194
БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ МЕТОДЫ Безреагентные методы ценны тем, что они не требуют приме- нения дополнительных реактивов, материалов и т. д.; это спо- собствует чистоте как жидкости, так и отделенных микробных клеток. Издавна применяющиеся и наиболее распространенные до настоящего времени способы основаны на гравитацион- ном разделении. На помещенное в жидкость шарообразное тело (клетку мик- роорганизма) действует сила тяжести Р, определяемая с учетом закона Архимеда: Р= -^-лг2 3 * * б(б —б0) g, где г — радиус частицы, см; S — плотность клетки, г/см3; б0— плотность жидкости, г/см3; g — ускорение силы тяжести, см/сек2. Клетка оседает со скоростью v, испытывая сопротивление среды F, определяемое по закону Стокса: F = бллр, где т] — вязкость жидкости, г/см/сек. Р = F, т. е. лг3 (б — б0) g = блгтр, 2 г2 (6 — б0) е 1 отсюда v = -т---2----, 9 т) т ’ где I — необходимая длина осаждения, см; т — время осажде- ния, сек. Нетрудно показать, что при искусственном увеличении гра- витационной силы с помощью центрифуги скорость оседания частиц 2 г*(6-60)&-гр 9 т] ’ где со — ангулярная скорость вращения центрифуги, об/сек; гр — расстояние от частицы до оси вращения ротора центрифу- ги, см. Скорость оседания частиц тем больше, чем выше скорость вращения ротора и больше его диаметр. Если плотность микроб- ной клетки приближается к плотности среды (воды, в которой находится эта клетка, или питательной среды), то б — б0—»-0 и v—>-0, т. е. микробная клетка не оседает. Как показали исследования Д. Г. Звягинцева [106, 217], средняя плотность бактериальных клеток составляет 1,080 г/см3, и таким образом б — б0 представляет собой довольно незначительную величину. 13* 195
Для ускорения процесса осаждения можно использовать и некоторое уменьшение вязкости (г|), например, нагревая культу- ральную жидкость. Размер клетки имеет большое значение, так как скорость оседания пропорциональна квадрату радиуса микроорганизма. Если дрожжевая клетка оседает в центрифуге в течение 10 мин, то бактериальная, размер которой в 5 раз меньше, будет оседать в тех же условиях в течение 250 мин, т. е. более 4 ч. Однако многие бактерии имеют неоспоримые преимущества перед более крупными микроорганизмами в очистке промышленных сточных вод. Малая скорость осаждения бактериальных клеток в гра- витационном поле и сравнительно большие затраты энергии при использовании центрифуг служат основным препятствием к использованию этого метода в очистке воды от микроорга- низмов. Фильтрационные методы отделения микроорганиз- мов основаны: 1) на механическом задерживании микроорганизмов по типу сита, когда размеры пор фильтров меньше размеров бактерий — мембранные фильтры (из коллодия, ацетата целлюлозы и др.), фильтрующие пластины типа «миллипор»; 2) на электростати- ческом (адсорбционном) задерживании, когда поры фильтра больше размера бактерий, но бактериальные клетки не проходят сквозь него, так как положительно заряженные стенки фильтра из неглазированного фарфора, бумаги, асбеста и др. притягива- ют и удерживают отрицательно заряженные клетки микроорга- низмов. Масло, белок, электроотрицательные частицы какого- либо красителя снимают эффект задерживания клеток такими фильтрами. Количественно охарактеризовать фильтрование трудно, по- скольку на этот процесс оказывает сильное влияние состав среды, pH, концентрация солей, температура, размер и природа клеток микроорганизмов, давление фильтрования и т. д. [513]. По этим же причинам перенесение результатов фильтрования одних биологических объектов на другие тоже не представляет- ся возможным, и для каждого отдельного случая приходится экспериментально подбирать режим работы. Подробное описание типов фильтров (путчи, вакуумные, ба- рабанные, тарельчатые, дисковые, роторные, рамные, патронные и т. д.) и материалов фильтровальных перегородок (хлопок, асбест, полиэфиры, стекло, найлон, нитрон, полиэтилен, поливи- нилхлорид, тефлон, целлюлоза и ее производные и пр.) можно найти в работах В. А. Жужикова [95], Уэбба [261] и других [354, 513]. В области отделения микроорганизмов с использованием фильтрования плодотворно работает в Институте микробиологии и вирусологии АН УССР В. Ф. Семенов. Руководимая им ла- боратория предложила ряд новых, оригинальных установок для 196
концентрирования, например синезеленых водорослей, отделе- ния дрожжей и бактерий [129, 227]. Фильтрование используют для промышленного отделения микроорганизмов, в частности дрожжей и актиномицетов, от культуральной жидкости или готового продукта, а также для холодной стерилизации жидкостей (инъекционных лекарствен- ных препаратов, питательных сред и т. д.). Стерилизующее фильтрование нашло широкое применение в лабораторной мик- робиологической практике [33, 117, 174, 192, 426]. Особенно часто используются мембранные фильтры. Их получают главным образом из эфиров целлюлозы — нитро-, ацетил- или ацетата целлюлозы [186, 210, 253, 347, 529], а также синтетических полимеров [529]. Эти вещества растворяют в соответствующих органических растворителях (ацетоне, хлороформе, спиртах и др.), разливают тонкой пленкой и высушивают. Основным поставщиком мембранных фильтров является фирма Millipore Corp. Bedford, USA, изготовляющая пластины высокой пористо- сти (80—85%), самого различного назначения и диаметра пор — от 0,005 до 5 мкм; скорость фильтрования через такие фильтры составляет 0,005—560 мл/см2 в минуту соответственно. Различ- ные мембранные фильтры выпускаются также отечественной промышленностью — Мытищинской фабрикой мембранных филь- тров. Характеристика фильтров приводится в обзоре Эриха [347] и монографии Т. И. Тихоненко [253]. В практику бактериологического анализа воды мембранные фильтры были внедрены впервые в СССР и Германии перед второй мировой войной. Н. Г. Холодный еще в 1929 г. использо- вал их для фильтрования образцов воды. К. К. Барсов [10] прямо на фильтрах выращивал и наблюдал бактерии. Извест- ный метод прямого счета микроорганизмов «по Разумову» был предложен в том же (1933) году, что и окраска бактерий на мембранных фильтрах 5%-ным раствором фенолэритрозина [209]. Мембранные фильтры используют для анализа воды и очист- ки ее от микроорганизмов, выделения и концентрирования специ- фической микрофлоры, в том числе и вирусов, медицинских и клинических анализов, анализа воздуха и др. Исследования по- следних лет [369] показали, что метод ультрафильтрования непригоден для концентрирования бактерий из воды с целью последующего изучения их физиологических и биохимических свойств, так как последние изменяются в процессе фильтрова- ния. Кроме того, значительное количество микроорганизмов свя- зывается с мембранами. Следовательно, после концентрирования с помощью ультрафильтрования микроорганизмы ни количест- венно, ни функционально не эквивалентны тем, которые обитают в воде. Мембранные фильтры применяются также в промышлен- ности, где существует острая необходимость бактериально чи- стой воды, главным образом в медицинской и пищевой [365, 197
485, 510, 513]. Совершенствуются старые, проводится поиск новых способов получения мембран с заданной и регулируемой величиной пор. Тем не менее еще не устранены следующие их недостатки: сложность и трудность изготовления строго калиброванных пор; малая производительность фильтров; необходимость использо- вания больших перепадов давления; очень ограниченная кон- центрация микроорганизмов в жидкости (не более 100 клеток в 1 л), поскольку в противном случае фильтры быстро забива- ются, так как весь задерживаемый материал собирается на верхней поверхности, а не в объеме фильтров, и их регенерация практически невозможна. Для увеличения срока службы фильт- ров осуществляют предфильтрацию, во время которой пытаются отделить возможно большее количество грубодисперсных при- месей, что, хотя и несколько увеличивает срок службы мембран фильтра, усложняет процесс фильтрования. В США разработана такая конструкция фильтра (так называемый Fulflo-Filter), ко- торая позволяет одновременно осуществлять предфильтрование через намотанные на полый цилиндр нитки из природного либо синтетического волокна (целлюлозного, вискозного, полиэфир- ного, найлонового, полипропиленового и др.), а затем и полное освобождение воды от бактерий и вирусов с помощью мембран- ных фильтров фирмы Миллипор, изготовленных из эфира цел- люлозы [510]. Производительность фильтра составляет 1000 л/ч, и его используют для концентрирования вирусов из значитель- ных объемов воды. В то же время недостаточно широко применяется известный еще со времен Л. Пастера другой способ отделения микроорга- низмов от жидкости путем фильтрования. По предложению Л. Пастера его соотечественник Шамберлен создал пористые фильтрующие устройства, получившие всеобщее признание — так называемые свечи Шамберлена. Общеизвестно, что такой фильтр работает не на «ситовом эффекте», а на основе электро- статического взаимодействия между отрицательно заряженной клеткой микроорганизма и положительно заряженным телом фильтра, и удивительно, что за 100 лет бурного развития науки и техники не было предпринято попыток увеличить «электро- отрицательность» клеток микроорганизмов и «электроположи- тельность» фильтрующего слоя с тем, чтобы повысить электро- статическое взаимодействие между ними, а вместе с ним и эффективность фильтрования жидкостей. Тем более, что элект- ростатическое осаждение и электрофильтры давно применяются для очистки газов, в том числе и биологической очистки воздуха. Известно, что микроорганизмы несут на себе определенный заряд, в обычных условиях, как правило, отрицательный. Кроме того, бактерии обладают огромным дипольным моментом. Н. А. Толстой с соавт. [255, 257, 258] с помощью разработан- ных ими электрооптических методов выяснили происхождение 198
и определили величины жестких дипольных моментов коллоид- ных частиц различной физико-химической природы, в том числе некоторых микроорганизмов и белков в воде. Оказалось, что дипольные моменты Е. coli, Bact. fluorescens, Serratia marcescens и других бактерий в 2,5—3 млн. раз больше дипольных момен- тов воды; белки — миоглобин, лошадиные сывороточные псев- доглобин и альбумин, яичный альбумин и др.— обладают не столь большим дипольным моментом, но все же превышающим водный на 2—2,5 порядка [258]. Экспериментально доказана также поверхностная природа жесткого электрического диполя такого рода частиц в воде и показано, что для удлиненных частиц он направлен вдоль их длинной геометрической оси [257]. Авторы считают, что вокруг находящейся в воде коллоид- ной частицы образуется мономолекулярная пленка воды, плот- но заполняющая поверхность и обращенная одним знаком ди- поля к поверхности частицы. Создается как бы двойной электри- ческий (однако отнюдь не ионный) слой, причем оказывается, что наклонное (~80°) расположение диполей воды к поверх- ности частицы более устойчиво в нем, даже без наложения внеш- него электрического поля, чем перпендикулярное [256, 258]. Однако с некоторыми объяснениями авторов, особенно в тех случаях, когда они распространяются на биологические частицы, не всегда можно согласиться. В частности, не учтена мозаич- ная — гидрофильно-гидрофобная — структура поверхности бак- териальной клетки, не обосновано предположение о том, что все молекулы монослоя воды обращены одним знаком диполя к поверхности бактерий (сейчас доказана электрическая неод- нородность такой поверхности, показано, что на ней имеются как отрицательно заряженные группы — карбоксильные, фос- фатные,— так и группы с положительным зарядом, например аммонийные). Однако это обстоятельство, очевидно, не может существенно влиять на указанный процесс и будет только спо- собствовать неустойчивости равномерного и перпендикулярного расположения диполей воды вокруг клетки, т. е. в конечном счете, неустойчивости такого состояния клетки, когда она не имела бы дипольного момента. Данные относительно увеличения дипольного момента клетки в постоянном электрическом поле, т. е. наведенного электрического дипольного момента, в литера- туре отсутствуют, однако некоторые исследователи считают, что дипольный момент коллоидных частиц, в том числе и микроор- ганизмов, может возрастать в электрическом поле на несколько порядков. Такая дополнительная поляризация, возможно, проис- ходит как за счет изменений электрического состояния внутри клетки, так и вследствие деформации наружного двойного элект- рического слоя — на этот раз ионного [321]. Взгляды Н. А. Толстого с сотр. [256, 258] и тщательные экспериментальные исследования, связанные с изучением на- личия у бактерий жесткого дипольного момента, создаваемого 199
монослоем ориентированных диполей воды на поверхности клет- ки, не меняют наших представлений о двойном электрическом слое вокруг клетки микроорганизма как коллоидной частицы. Водная «шуба» на поверхности клетки не сказывается ни на величине, ни на знаке заряда этой клетки. Такой монослой молекул воды является как бы составной частью клетки, пред- ставляет с ней одно неразрывное целое. Рис. 41. Двойной электрический слой (а) потенциал (б). и электрокинетический Вокруг отрицательно заряженной клетки микроорганизма имеется слой противоионов — катионов, компенсирующих этот заряд (рис. 41). Такая система зарядов и представляет собой двойной электрический слой (ДЭС). Часть из противоионов ДЭС находится на значительном расстоянии от поверхности клетки — это так называемый диффузный слой, другая часть непосред- ственно примыкает к этой поверхности и связана с нею настоль- ко прочно, что не покидает ее при перемещении клетки в сре- де — это «плотный» или «гельмгольцевский» слой. В зависимости от условий внешней среды (pH, количество и природа солей и др.) ДЭС может быть «размытым» или «уплотненным», т. е. противоионы плотного слоя могут покидать его и переходить в диффузный, или наоборот. Сумма зарядов плотного и диффуз- ного слоев внешней обкладки двойного электрического слоя равна заряду внутренней обкладки ДЭС, т. е. истинному заряду клетки. При движении частицы относительно жидкости, в которой она находится, непрочно связанные противоионы диффузного слоя отстают, а вместе с частицей передвигаются только про- тивоионы близко прилегающего адсорбционного (плотного) слоя. Разность между абсолютными значениями истинного заряда клетки и количеством противоионов адсорбционного слоя пред- ставляет собой видимый заряд движущейся частицы — ее элек- трокинетический или дзета-потенциал. 200
Дзета-потенциал предопределяет подвижность микробных клеток при наложении внешнего электрического поля — электро- форез. Электрофорез — это движение заряженной частицы в любом электрическом поле. В микробиологии для изучения электрокинетических свойств микроорганизмов принято исполь- зовать однородное электрическое поле постоянного тока, однако Рис. 42. Взаимодействие с электрическим полем клеток микроорга- низмов, заряженных отрицательно (а) и положительно (б). поле, в котором обычно изучается электрофоретическая подвиж- ность микроорганизмов, не совсем однородно. Его искажает и поляризация электродов, и некоторая ионная проводимость, воды, и само наличие в ней заряженных и имеющих значитель- ный дипольный момент частиц •— клеток микроорганизмов. Одна- ко такое возмущение поля несущественно, и при изучении электрокинетического потенциала микроорганизмов им пренебре- гают. Обладающая Диполем отрицательно заряженная клетка мик- роорганизма, попав в однородное поле, испытывает действие двух противоположно направленных, но неравных по абсолют- ному значению электрических сил. Под влиянием результирую- щей этих сил Fe клетка движется в сторону анода (рис. 42, а). Изменение направления знака электрического поля приведет к изменению направления движения клетки микроорганизма, и, если в случае, представленном на рис. 42, I, а, она двигалась справа налево, то в случае, изображенном на рис. 42, II, а — слева направо, и наоборот. Если такую переполюсовку на элект- родах осуществлять очень быстро (порядка тысяч раз в секунду), 201
Рис. 43. Поведение микробной клетки в неоднородном электрическом поле. т. е. использовать высокочастотное переменное однородное поле, то клетка вовсе перестает двигаться в одном направлении, а колеблется в пространстве относительно какой-то точки с ча- стотой поля. Снижая pH среды или увеличивая в ней количе- ство многозарядных катионов, можно изменить заряд клетки на противоположный — положительный, и такая клетка будет дви- гаться к катоду (рис. 42, б). Если уплотнить ДЭС клетки, перевести противоионы диффузного слоя в «гельмгольцевский» слой и таким образом уменьшить до нуля дзета-потенциал клет- ки — довести ее до изоэлектрической точки, то она, обладая только электрическим дипольным моментом, не будет двигаться в однородном электрическом поле постоянного тока, так как на разные по знаку, но одинаковые по величине заряды диполя действуют разные по направлению, но равновеликие электриче- ские силы (рис. 42, а). Однако, если клетку микроорганизма, не обладающую зарядом, но имеющую постоянный или наведен- ный электрический дипольный момент, поместить в неоднород- ное (дивергентное) электрическое поле, то она начнет передви- гаться к одному из электродов. Движение, вызванное взаимо- действием нейтральной частицы с неоднородным электрическим полем, называется диэлектрофорезом [446]. Герберт Поль сле- дующим образом объясняет действие диэлектрофоретической силы (рис. 43, а): так как электрическое поле неоднородно, то один заряд диполя оказывается в более сильном поле, чем другой. На частицу будут действовать электрические силы, раз- ные не только по направлению, но и по абсолютной величине, и клетка станет передвигаться в зону большей напряженности электрического поля, поскольку поляризуемость клетки в поле больше поляризуемости воды. Изменение знака поля не сказы- вается на направлении движения клетки (рис. 46, б), следо- вательно, и в неоднородном электрическом поле переменного тока клетка-диполь будет двигаться в одном и том же направ- лении, т.е. будет проявляться диэлектрофорез. 202
Движение заряженных и обладающих диполем частиц в неоднородном переменном электрическом поле называют диполофорезом [199, 269, 445, 446]. Диэлектрофорез изучает- ся с 1951 г. применительно к ча- стицам, находящимся в непро- водящих жидкостях типа угле- водородов. Исследования ди- полофореза в проводящих жидкостях, например, водных растворах, связаны со значи- тельными трудностями из-за невозможности создания в та- ких средах электрического по- ля достаточно большой напря- Рис. 44. Ячейки для изучения движе- ния клеток микроорганизмов в неод- нородном электрическом поле. женности. Основные экспериментальные исследования диэлектрофоре- тического эффекта выполнены Полем [446] с помощью цилин- дрической ячейки: внешний электрод представлял собой цилиндр диаметром 10 см с оловянным покрытием, а внутренний — тща- тельно центрированная проволока из вольфрама диаметром 2,24-10~2 см. Поль наблюдал, что в такой ячейке частицы с большей поляризуемостью, чем жидкая фаза, двигались к цент- ральному электроду, менее полярные — к стенке цилиндра. Так отделялись суспензии, например, полихлорвинила от раствора тетрахлорметана в бензоле. Поль, по-видимому, первым попытался использовать диэлект- рофорез применительно к микробиологическим объектам. При- менив высокочастотное электрическое поле (2,55 МГц), умерен- ный вольтаж (десятки вольт) и среду с незначительным содер- жанием ионов (глубокообессоленную воду), Поль наблюдал отделение живых клеток дрожжей от мертвых. При этом он воспользовался тем обстоятельством, что, как показал Шван [467], поляризуемость воды и клеток микроорганизмов в зна- чительной степени различается. Диэлектрическая постоянная воды и очень разбавленных водных растворов равна ~ 80, а жи- вых клеток— 102—104; удельная электропроводность колеблется соответственно в пределах 3 X 10-6 — 2 ом-1 см-1 для воды и 10~2— 10 ом-1 см-1 для микроорганизмов. Поль сконструировал ячейку (рис. 44) из оргстекла, которую можно было помещать под микроскоп и таким образом наблюдать за поведением кле- ток микроорганизмов в неоднородном электрическом поле. Не- однородность поля достигалась тем, что один электрод пред- ставлял собой тщательно заостренную иглу толщиной 0,66 мм, а другой — пластину, размещенную на удалении 1 мм от конца иглы. В отсутствие электрического поля клетки дрожжей были 203
равномерно распределены во всем объеме ячейки. При нало- жении напряжения 30 В и более они быстро (в течение 15— 30 сек) собирались на кончике игольчатого электрода. Убитые (окрашиванием кристалл-виолетом при температуре 60—70° в течение 3 мин) дрожжевые клетки имели тенденцию оставаться в жидкости, и таким образом достигалось отделение живых кле- ток от мертвых. Основными факторами, обеспечивающими разделение живых и мертвых клеток дрожжей с яомощью диэлектрофореза, по мнению авторов [446], являются: 1) использование высокочастотного переменного поля; 2) осуществление процесса в среде с очень низкой электро- проводностью; 3) создание неоднородного электрического поля. И, конечно, залогом успешного перемещения клеток в результа- те диэлектрофореза является, как об этом свидетельствует само название явления, заметная разница в диэлектрической прони- цаемости микроорганизмов и среды. Диэлектрофоретическое (диполофоретическое) движение сфе- рических — полистирол — и палочковидных — палыгорскит — коллоидных частиц в воде изучали под микроскопом болгарские исследователи во главе со Ст. Стойловым [199]. С этой целью они изготовили ячейки сферической и цилиндрической формы, аналогичные описанным выше, но более точно воспроизводящие неоднородное поле, создаваемое системами «точечный заряд — сфера» и «цилиндр — струна». Строгой количественной теории, описывающей поведение дисперсных частиц в неоднородном электрическом поле, еще не создано. Расчеты силы, действующей на незаряженную части- цу в проводящей среде в таком поле, и скорости движения заряженной частицы в нем выполнены В. Н. Шиловым и В. Р. Эстрела-Льописом [269] с учетом всех мировых достиже- ний в этой области, но пока выводы этих работ не полностью согласуются с результатами прямого эксперимента [199]. Рас- смотрим некоторые общие закономерности. Из классической теории электричества известно, что во внеш- нем электрическом поле на сферическую частицу действует сила: Fe=E-q + P- grad Е, где Е — напряженность внешнего поля; q — заряд частицы; Р — электрический момент частицы. Если поле однородное (как в случае электрофореза), то его градиент напряженности равен нулю и Fe = E-q. Под влиянием этой силы частица движется к одному из электродов. При этом возникает сила сопротивления среды, определяемая по закону Стокса-. F = бллр, 204
причем Fe=F. Если учесть, что <7 = £-е-г, то g-e-r-E = =6лТ]ГП и где £ — электрокинетический потенциал (дзета-потенциал); е — диэлектрическая постоянная среды; v — скорость движения клетки микроорганизма под воздействием электрического поля (скорость электрофореза). , Из сопоставления этого уравнения с уравнением для скорости осаждения частиц в гравитационном поле видно, что скорость движения частиц в электрическом поле, в отличие от гравита- ционного, не зависит от плотности частицы и среды и от разме- ра частицы, а прямо пропорциональна дзета-потенциалу и на- пряженности электрического поля. Известно, что при наложении однородного электрического по- ля между дисперсными частицами происходит диполь-дипольное взаимодействие, которое приводит к образованию устойчивых или распадающихся цепочечных агрегатов. Если энергия диполь- дипольного взаимодействия частиц в поле превосходит энергию электрического отталкивания, то частицы сблизятся на такие расстояния, где молекулярные силы притяжения преобладают и цепочечные агрегаты после снятия поля будут устойчивы [164]. Однородное электрическое поле постоянного тока использует- ся для обессоливания воды электродиализом через ионитовые мембраны. При этом на поверхности мембран, и особенно ани- онитовых, со стороны камеры обессоливания, образуются пленки из присутствующих в воде коллоидов и органических веществ [31, 32], интенсивно накапливаются на поверхности мембран краски [75]. Находящиеся в воде микроорганизмы тоже испы- тывают на себе электрофоретическую силу, которая доставляет их к поверхности анионитовых мембран в камере обессолива- ния, где они могут задерживаться. Однако, как показывают исследования Танака [448], на ионообменных мембранах не задерживается много клеток, видимо, из-за высокой скорости протока жидкости. Об этом свидетельствует также наличие зна- чительного количества живых микроорганизмов в воде, прошед- шей электродиализную деминерализацию [179, 215], хотя мно- гие бактериальные клетки гибнут в результате действия на них электрического поля [446]. Электродиализные установки даже с близко расположенными мембранами («струнного» типа) [73] не обеспечивают отделения от воды вирусов [67, 275]. Электрофорез микроорганизмов используют сейчас при исследовании природы поверхности клеток, а также как лабо- раторный метод концентрирования и разделения микроорганиз- мов [76, 77,79,80,90—92,182]. Однако, по всеобщему призна- нию специалистов, электрофорез не может стать промышленным способом отделения микроорганизмов от жидкостей [513]. 205
В неоднородном поле существует определенный градиент потенциала и поэтому следует учитывать второй член уравне- ния I. Электрический момент Р зависит от электрических свойств материала частицы и среды и для диэлектрической частицы определяется: Р = 8Х Г^Е 6s + где г—радиус частицы; ei и ег— диэлектрические проницаемо- сти среды и частицы. В рассматриваемых нами случаях (микробная клетка в во- де) e2>ei, и на поверхности частицы возникает избыток поляри- зационных зарядов, которые приводят к притяжению и агреги- рованию частиц друг с другом. Это явление используется при очистке сточных вод [136]. И. С. Лавров, В. И. Барабанов и др. [9, 72, 163] обрабатыва- ли воду неоднородным электрическим полем, созданным си- стемой «цилиндр — струна». Частички дисперсной фазы переме- щаются в нем в зону большей напряженности, взаимодействуют между собой электростатически, что приводит к их коагуляции, образованию крупных мицелл, которые при определенных усло- виях не распадаются даже после отключения электрического поля и могут быть отделены от жидкости. Последующее фильт- рование такой воды значительно улучшает ее физико-химиче- ские и органолептические показатели, но обеззараживающего эффекта добиться при этом не удается: при плотности исходного заражения 107 — 1010 микробных клеток Е. coli в 1 л воды устра- няется 99,6% микроорганизмов. Сами авторы отмечают, что «этот результат нельзя считать достаточным» [163, с. 58]. Дей- ствительно, элементарный подсчет показывает, что в обработан- ной таким образом воде остается 4-104 — 4-107 клеток кишечной палочки в литре. Как видно из приведенных выше данных, теоретические и экспериментальные исследования в области диэлектро (диполо)- фореза были направлены на изучение взаимодействия дисперс- ных частиц в неоднородном поле с целью уменьшения агрега- тивной устойчивости суспензии, создания условий для успешного протекания коагуляционных и флокуляционных процессов, кото- рые приводят к образованию конгломератов, не распадающихся после отключения поля и способных поэтому в дальнейшем к ускоренной седиментации или отделению путем фильтрования [72, 136, 163]. Такое направление исследований по очистке воды, видимо, характерно для специалистов в области коллоидной хи- мии. Туролла [500], например, в своей обзорной статье, посвя- щенной роли дзета-потенциала в процессе коагуляции примесей воды, указывает, что диспергированные коллоидные частицы можно устранить из воды только путем коагуляции и флокуля- 206
ции. Поэтому И. С. Лавров и сотр. [163] подвергали питьевую; воду, самые разнообразные сточные воды, содержащие нефть, коллоидные частицы полистирола, красящие вещества и другие примеси, электрообработке в течение нескольких минут в ста- тических условиях, добивались коагуляции фазы, а затем от- стаивали или фильтровали выпавшие в осадок конгломераты. Такая обработка, хотя и ведет к определенному улучшению ка- чества воды, но не может обеспечить достаточного обеззаражи- вающего эффекта, создает трудности, связанные с тем, что оса- док после электрокоагуляции имеет большую влажность, очень рыхлый и текучий. Тем не менее, комплексная электрохимиче- ская обработка воды достаточно перспективна, и в некоторых странах (ФРГ, Япония) уже работают промышленные установ- ки, очищающие 120—350 м3 воды в час [428]. УДЕРЖИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОЛЯРИЗОВАННЫМИ МАТЕРИАЛАМИ В начале 1972 г. мы впервые наблюдали, как ведет себя суспен- зия микроорганизмов при протекании через зернистую загруз- ку, помещенную в электрическое поле, направленное перпенди- кулярно потоку жидкости [46, .48, 59]. В результате многочис- ленных опытов нами было обнаружено новое явление, которое в общем виде можно сформулировать так: «удерживание частиц различной степени дисперсности (в том числе и некоторых обра- зующих истинные растворы веществ) поляризованными мате- риалами». Внешне суть явления сводится к тому, что слой зер- нистого, волокнистого или пористого материала, который не представляет собой никакой реальной фильтрующей перегородки для частиц малого размера, будучи помещенным в электриче- ское поле, превращается в высокоэффективный фильтр, задер- живающий всякие коллоидные частицы и многие вещества, образующие истинные растворы. Так как это явление новое и несомненно представляет определенный практический интерес как для отделения микроорганизмов от воды, так и для очистки жидкостей, концентрирования примесей, растворимых в жидко- сти или находящихся в ней в коллоидно-дисперсном состоянии, разделения частиц биологического и небиологического проис- хождения и т. п., мы считаем целесообразным несколько более подробно изложить его основные закономерности. Установка, с помощью которой изучали процесс удержива- ния микроорганизмов, гидравлическая и электрическая схемы ее питания предельно просты (рис. 45). Аппарат для очистки жидкости выполнен из токонепроводящего материала (оргстек- ло, резина, эбонит, тефлон и т. п.) и состоит из трех камер: двух электродных и средней — рабочей (рис. 46). С целью предотвра- щения попадания в рабочую камеру продуктов электродных.. 207
реакций и исключения их влияния на процесс удерживания мик- роорганизмов электродные камеры отделены от рабочей мем- бранами и промываются отдельными потоками жидкости. Электродами служат пластины из нержавеющей стали, покры- тые окисью марганца, титана, графита и др. Для обеспечения надежного уплотнения материала в средней камере и снижения падения напряжения в электродных камерах использовались Рис. 45. Электрическая (а) и гидравлическая (б) схемы питания ячейки для изучения электроудерживания микроорганизмов. также насыпные электроды из гранул активированного угля. В качестве мембран служил целлофан или выпускаемые про- мышленностью ионитовые мембраны — МК-40 и МА-40. Значи- тельная часть исследований проведена с аппаратом следующих размеров: средняя камера — 25 X 20 X 40 мм (длина X шири- на X высота), электродные камеры — 25 X 5 X 40 мм, площадь электродов — 10 см2. Использовали также аппараты больших размеров и других конструкций. Среднюю камеру заполняли зернистой, волокнистой или пористой загрузкой проводников II рода или диэлектриков — ионообменными смолами, кварце- вым песком, силикагелем, кусочками обожженной глины, цел- люлозным или синтетическим волокном, шерстью, шелком, ба- зальтовой и стеклянной ватой, полиуретаном, различного рода тканью и т. д., и через нее пропускали содержащую микроорга- низмы жидкость — биологически очищенную сточную воду, фи- зиологический раствор, водопроводную, дистиллированную и глубокообессоленную воду, содержащую от 10 до 109 клеток/мл. В качестве тест-объектов, дополнительно вводимых в жидкость, использовали микроорганизмы различной формы и размеров, в том числе и бактериофаги, живые и мертвые, грамположитель- ные и грамотрицательные, образующие капсулы, споровые и неспороносные, обладающие жгутиками и неподвижные, в воз- 208
расте от нескольких часов до 20 су- ток, принадлежащие к различным так- сономическим группам (табл. 5). Культуры микроорганизмов выра- щивали в чашках Петри на соответ- ствующих средах (СА, МПА, среды Сабуро, Эндо), клетки снимали шпа- телем, промывали несколько раз су- спендированием в дистиллированной или обессоленной воде и центрифуги- рованием. Концентрацию микроорга- низмов в исходной и очищенной жид- кости измеряли общепринятыми мето- дами: с помощью фотоэлектроколори- метра (ФЭК-56), высевом на агаризо- ванную среду, фильтрованием через мембранные фильтры с последующим проращиванием задержавшихся на них клеток на соответствующей твер- дой питательной среде, методом пря- мого счета в камере Горяева или по Разумову, а также по методу Грасиа (для вирусов). При необходимости [235] прошедшую через установку во- ду отдавали в специализированные уч- реждения для проверки ее на апиро- генность в соответствии с требования- ми Государственной фармакопеи X из- дания (1968 г.). Если пропускать достаточно густую суспензию микроорганизмов через не бывшую в употреблении загрузку, на- пример, из ионообменных смол или Рис. 46 Схема ячейки для электроудерживания микро организмов: 1 — средняя камера; '2 — устрой- ство для отвода жидкости; 3 — штуцер для отвода раствора электролита; 4 — катодная ка- мера; 5 — катод; 6—мембрана; 7 — штуцер для подвода раство- ра электролита; 8 — устройство для подачи жидкости; 9 — анод; 10— анодная камера; 11— мем- брана. других материалов, то часть клеток задержится этой загрузкой, так как поверхность твердых тел в той или иной степени адсорбирует микроорганиз- мы [103]. Однако, как уже отмечалось выше, адсорбционная емкость даже самых лучших адсорбентов микроорганизмов сравнительно невелика, а небольшой (несколько сантиметров) слой крупнозернистого (0,5—3 мм) или неспрессованного волок- нистого материала не представляет собой фильтрующей пере- городки для частиц столь малого размера, поэтому уже через считанные минуты концентрация микробных клеток на выходе из камеры сравняется с их концентрацией в исходной жидкости (рис. 47). При попытке повторного (после простой промывки водой) использования загрузки эффекта отделения микроорга- низмов не наблюдается, так как материал исчерпал все свои адсорбционные возможности и нуждается в специальной реге- нерации. 14 8—616 209
Таблица 5 Характеристика культур, используемых в опытах по отделению микроорганизмов от жидкости Культура Размеры, мкм Подвиж- ность Окраска по Граму клеток спор Aspergillus niger 10—300 2,5—4 Peniciliium purpurogenum 3,5—200 2,5—4.5 — Candida albicans 9,0—10 0 — + Candida tropicalis 6,0—7,0 0 — + Saccharomyces cerevisiae 5,0-10 0 — + Rhodotorula utilis 3,0—7,5 0 — -1- Bacillus cereus 1,3—4,0 0,9—1,3 + + Bacillus polymyxa 1,3—4,5 1,7—2,6 + + Bacillus mesentericus 0,6—6,0 0,5—0,9 4- + Bacillus subtilis 0,6—4,0 0,6—0,9 + + Escherichia coli 0,5—1,3 0 + Proteus vulgaris 0,5—2,0 0 + — Pseudomonas aeruginosa 0,5—1,2 0 + — Serratia marcescens 0,5—0,8 0 + — Staphylococcus aureus 0,5—0,8 0 + Фаг Escherichia coli 0,12—0,2 0 X X Фаг Pseudomonas phasedicola 0,07—0,15 0 X Chlorella vulgaris 4,2—10 0 X X Anacystis nidulans 0,8—5,5 0 X X Если же на такую загрузку наложить электрическое поле (рис. 47, а), то она приобретает способность удерживать не- сравненно большие количества микроорганизмов, на десятки порядков превышающие адсорбционную емкость материала за- грузки. При длительном пропускании суспензии через установ- ку в загрузке удерживается настолько большое количество кле- ток, что они превращаются в пастообразную массу, забивают каналы и поры, а гидравлическое сопротивление системы воз- растает до такой степени, что препятствует протеканию суспен- зии. Отключение электрического поля (рис. 47, б) освобождает микробные клетки, и они легко вымываются потоком жидкости в виде густой массы, концентрация клеток в которой может в десятки раз превышать концентрацию исходной суспензии. Повторное включение тока (рис. 47, а2) приводит к немедлен- ному удерживанию клеток и отделению их от жидкости. Таким образом, одну и ту же загрузку можно успешно, без какой бы то ни было специальной регенерации реактивами использовать многократно — практически бесконечно долго. Для изучения основных закономерностей процесса удержи- вания микроорганизмов поляризованными материалами опыты проводили с загрузкой из силикагеля, среднюю камеру отде- ляли от электродных мембранами из целлофана, а в качестве объекта исследования использовали пекарские дрожжи Sa- ccharomyces cerevisiae. Силикагель в обычных условиях почти 210
не адсорбирует микроорганизмов, обладает незначительными ионообменными свойствами; для опытов отбирали зерна пра- вильной шарообразной формы определенного диаметра. Целло- Рис. 47. Адсорбция (/) и электроудерживание (2) микроорганиз- мов: а — включение электрического поля; б — отключение поля. фановые мембраны, в отличие от ионитовых, одинаково хорошо проницаемы как для анионов, так и для катионов, не пред- ставляют собой в воде существенного электрического сопротив- ления и не сорбируют микроорганизмов. Дрожжи легко про- мываются, хорошо оседают при центрифугировании, отлично видны в оптическом микроскопе, культивируются на доступных питательных средах. Процесс удерживания микроорганизмов в неравномерном неоднородном электрическом поле существенно зависит от ве- личины напряженности внешнего поля. На рис. 48 приведена типичная кривая этой зависимости. В данном опыте через за- грузку зернистого (d = 2 мм) силикагеля в описанной выше камере пропускали суспензию дрожжей, содержащую 108 кле- ток в 1 мл дистиллированной воды. С увеличением напряжения от 10 до НО В/см сила тока возрастает от 7 до 25 мА*. * При определении напряженности электрического ноля не учитывалось падение напряжения на электродах и мембранах, что лишь в незначительной степени может сказаться на характере кривой. 14* 211
Рис. 48. Влияние напряженности элек- трического поля на степень удер жиьання дрожжевых клеток поляри- зованным силикагелем (скорость про- тока — 2,2 мл/минj. Рис. 49. Влияние скорости прото- ка суспензии через загрузку из поляризованного силикагеля на степень удерживания дрожжевых клеток (Е — 20 В/см). Увеличение скорости протока суспензии через камеру с за- грузкой приводит к уменьшению степени удерживания микроб- ных клеток (рис. 49). Напряженность поля и скорость протока жидкости—это два параметра, тесно связанные между собой, и, увеличивая один из них или уменьшая другой, можно до- биться освобождения воды от микробных клеток [55, 58—60]. Нам не удалось пока четко установить [233, 234], как зави- сит степень удерживания микроорганизмов от размера и формы их клеток, окраски по Граму, подвижности и физиологического состояния. Все микроорганизмы хорошо отделяются от жидко- сти, но живые клетки, очевидно, удерживаются несколько луч- ше, мертвых, убитых автоклавированием, подвижные — лучше неподвижных, палочковидные — лучше шарообразных, а шеро- ховатые — лучше капсульных. Однако этот вопрос нуждается в дополнительных, более широких и тщательных исследованиях. Степень удерживания микроорганизмов поляри- зованными материалами обратно пропорциональна концентрации солей в очищаемой жидкости (рис. 50) и несколько уменьшается с увеличе- нием концентрации ми- кроорганизмов в суспен- зии (рис. 51). При прочих равных условиях отделе- 0 0,001 0,002 0,000 ОШ 0,005 0.006 0007 Концентраций сот, н Рис. 50. Влияние концентрации хлористого калия в суспензии на степень удерживания дрожжей поляризованным зернистым сили- кагелем. 212
25\______'_______. _______________, 5 5,6g 6 6,69 IqC, м/м Рис. 51. Влияние концентрации кле- ток в суспензии на степень удержи- вания дрожжей. (Е — 90 В/см; про- точность 5,5 мл/мин; загрузка — сили- кагель) . Рис. 52. Влияние величины зерна за грузки на удерживание Saccharomyc- es cerevisiae поляризованным сили кагелем: / — 1 мм; 2 — 1—2 мм; 3 — 2—3 мм. иие микробных клеток улучша- ется с уменьшением размера зерен силикагеля (рис. 52). Интересно отметить, что основ- ная масса клеток удержива- ется первыми слоями поля- ризованного материала. Это можно наблюдать визуально, если осторожно открыть среднюю рабочую камеру после пропускания через нее значительного количества концентрированной суспен- зии, особенно окрашенных клеток, например, Serratia marcescens. Об этом свидетельствуют также специальные опыты, проведен- ные в высоких (до 60 см) камерах, заполняемых как зернистыми, так и волокнистыми материалами и оборудованных устройства- ми для отбора проб на различных уровнях. Распределение коли- чества удержанных силикагелем клеток по высоте показано на рис. 53. Таким образом, достаточно нескольких сантиметров (~10 см) слоя крупнозернистой загрузки для практически пол- ного отделения микроорганизмов от жидкости. В случае волок- нистых материалов этот слой еще меньше —не превышает 3— 4 см. С целью получения стерильной апнрогенной воды для при готовления инъекционных растворов была создана фильтровали ная установка по типу известного в производстве готовых ле царственных средств «фильтра ХНИХФИ» [55, 138], используе мого сейчас для отделения от воды грубодисперсных примесей Установка снабжена электродами и различными схемами элек пропитания; толщина фильтрующего слоя — 3,5 см. При загрузке из волокнистых материалов имеется возмож- ность упаковывать их с различной плотностью. Показано, что с увеличением плотности зарядки электрического фильтра мар- лей от 0,1 г/см3 до 0,4 г/см3 эффективность удерживания микро- организмов увеличивается; однако слишком плотная упаковка создает дополнительное гидравлическое сопротивление. Иссле- 213
кроорганизмов на такого ти- па установке, Т. П. Скубко (опытный завод ХНИХФИ, Харьков) экспериментально установила границы зон сте- рильности воды в зависимо- сти от напряженности элек- трического поля и плотности зарядки фильтра для ряда Рис. 54. Микробиологическая диаграм- ма воды, полученной путем пропускания через поляризованный электрическим полем слой марли определенной плот- ности упаковки (Р) при скоростях фильтрования: I — 30; 2 — 40, 3 — 60, 4 — 80, 5 — 100, мл/мин. Н — зона нестерильной воды; С — эона сте- рильной апирогенной воды. микроорганизмов при различных скоростях фильтрования (рис. 54). При соблюдении определенных условий (скорость фильтрования равна или меньше обозначенной на соответствую- щей кривой, а точки пересечения значений напряженности внеш- него электрического поля и плотности упаковки фильтра нахо- дятся справа от кривой) получается вода, безусловно лишенная микробных клеток. Природа электрического поля также сказывается на степени удерживания микроорганизмов материалами, помещенными в это поле. Лучше всего процесс очистки воды происходит при использовании электрического поля постоянного тока без пуль- саций по схеме, изображенной на рис. 55, а, и с характеристи- кой, приведенной справа на том же рисунке. Хорошие резуль- таты получаются при наложении на электроды выпрямленного тока с характеристикой, показанной на рис. 55, б; несколько хуже — при использовании импульсного тока (рис. 55, в) и зна- чительно хуже, если применять переменный ток промышленной частоты (50 Гц). Результаты многочисленных опытов сведены на рис. 56, где справа от каждой кривой, обозначенной в соот- ветствии с вариантами схемы электрического питания, распо- ложена зона стерильной апирогенной воды. Существенное влияние на процесс электроудерживания ока- зывает природа материала загрузки. Так, например, шерсть значительно превосходит в этом отношении хлопок, и тем более стекловату, а помещенный в электрическое поле кварцевый 214
Рис. 55. Схема электрического питания фильтра для получения стерильной апи- рогенной воды: а — ток без пульсации: б — выпрямленный ток; в — импульсный ток. песок хуже отделяет микроорга- низмы, чем силикагель или ионо- обменные смолы. В отношении Рис. 56. Микробиологическая диа- грамма воды, профильтрованной через слой марли, помещенной в электрическое поле: а —* без пульсаций; б — выпрямленного двухполупериодного тока без сглажива- ния; в — выпрямленного однополупе- риодного тока без сглаживания. последних показано, что наилуч- шие результаты получаются при использовании смешанного слоя ионообменных смол (КУ-2 и АВ-17), хорошо удерживает ми- кробные клетки анионит АВ-17 и хуже — катионит КУ-2. При этом важна также форма катионита, природа противоионов, ко- торыми он насыщен: лучше всего проявляются его удерживаю- щие свойства, когда он насыщен ионами водорода или трехва- лентных металлов, хуже — при насыщении двухвалентными и еще хуже, когда в качестве противоионов он содержит однова- лентные катионы. Как же происходит удерживание микробных клеток поляри- зованными материалами? Каковы основные силы, обеспечиваю- щие это явление? Для непосредственного наблюдения за поведением клеток микроорганизмов при протоке суспензии в неоднородном элек- трическом поле, направленном перпендикулярно движению су- спензии, была изготовлена специальная камера (рис. 57) [44]. Основанием камеры служит пластинка 1 из оргстекла разме- рами 75 X 28 X 4 мм. В боковых стенках пластинки с противо- положных сторон высверлены каналы 2 и 3, достигающие 3/< ее ширины, с выходом в виде тонких отверстий 4 на верхнюю плоскость. Эти каналы с отверстиями предназначены для под- вода и отвода суспензии. В отверстия 5 и 6, тоже выходящие на поверхность пластинки, продеты проволочки 7 и 8, которые служат электродами. Сверху на пластинке помещается рамка 9 из тонкой (0,6 мм) эластичной листовой резины. Образовав- 215
Рис. 57. Камера для наблюдения за поведением микробных клеток r не- однородном неравномерном электрическом поле: / — пластинка из оргстекла, 2, 3 —каналы для суспензии; 4 — отверстия; 5, 6 — каналы для электродов; 7, 8 — электроды; 9 — резиновая рамка; /0—шарики силикагеля; //— покровное стекло; 12—шпильки; 13 — рамка из оргстекла. шуюся камеру размерами 15 X 15X0,6 мм заполняли слоем ша- рообразных зерен силикагеля 10, диаметром 0,5 мм и накры- вали покровным стеклом 11, которое прижимали с помощью шурупов 12 к резине 9 рамкой 13 из оргстекла. Камеру поме- щали на предметный столик микроскопа, обеспечивали проток суспензии и наблюдали за поведением клеток микроорганизмов при различной напряженности электрического поля, создаваемо- го на электродах. Опыты проводили с суспензиями клеток различных микро- организмов на дистиллированной воде; в качестве заполнителя использовали необработанный силикагель. Для большей чет- кости изображения брали окрашенные фуксином п метилено- вым синим силикагель и дрожжи, а наблюдение вели в плос- кости, проходящей через диаметр шариков заполнителя. При протекании суспензии через камеру без наложения электрического поля только отдельные клетки адсорбируются на поверхности силикагеля, а основное количество микроорга- низмов увлекается потоком жидкости (рис. 58, а). Включение тока приводит микробные клетки в движение, отличное от на- правления течения суспензии. При малой общей напряжен- ности электрического поля (примерно до 5 В/см) это движение не очень интенсивное, более пли менее упорядоченное и на- правлено в сторону анода. Клетки притягиваются к поверх- ности силикагеля, и особенно большое количество их скаплп- 216
вается в местах соприкосновения зерен между собой. На обра- щенной к катоду стороне поверхности силикагеля возникают многочисленные цепочки пз микробных клеток, и если, напри- мер, у Saccharomyces cerevisiae количество клеток в цепочке составляет 3—7 (рис. 58, б), то у Bacillus subtilis достигает 20 и более особей в каждой. В пространстве между зернами наблюдается едва заметное круговое движение клеток, которое усиливается по мере увеличения напряженности электрического поля (рис. 58, е). В больших полостях, образуемых 4—5 зер- нами силикагеля, можно наблюдать по два-три центра, вокруг которых вращаются клетки микроорганизмов (рис. 59, а, б). Характерно, что, если вокруг одного центра микроорганизмы движутся по часовой стрелке, то вокруг соседнего — против. Прекращение протока суспензии или плавное изменение его на обратный не сказывается на направлении вращения микроор- ганизмов, но перемена полярности на электродах приводит к немедленному изменению направления вращения клеток на противоположное. При дальнейшем увеличении напряженности электрического поля (порядка 70—200 В/см) клетки микроор- ганизмов скапливаются в основном на стыках зерен силикаге- ля (рис. 58, г), их круговое движение подавляется, и в меж- зерновом пространстве преобладает интенсивное поступатель- ное движение клеток в направлении анода. После отключения тока микроорганизмы, принимавшие уча- стие во вращательном движении, и основная масса клеток, скопившихся на поверхности силикагеля, увлекаются потоком жидкости (рис. 58, д). При этом цепочечные агрегаты и конгло- мераты клеток тут же распадаются. Каковы причины описан- ного явления? Важную роль в обеспечении эффекта электроудерживания микроорганизмов играет, по-видимому, электростатическое вза- имодействие микробных клеток с поляризованными полем мате- риалами. С целью подтверждения существования такого взаимо- действия было проведено непосредственное наблюдение за поведением клеток в присутствии частиц различных материалов в электрическом поле [46]. Для этого можно использовать либо описанную выше камеру (рис. 57), либо обыкновенную ячейку для изучения электрофореза микроорганизмов [76, 78], либо предельно простую установку, представленную на рпс. 60. Плоскопараллельный капилляр Перфильева 1 соединяют ре- зиновыми трубками 2 со стеклянными сосудами 3; после поме- щения в ячейку частиц материала и заполнения ее суспензией клеток микроорганизмов установку крепят к микроскопу, встав- ляют электроды и микроскопируют препарат при различных режимах электрического питания. Иследовали поведение кле- ток— представителей бактерий, грибов, водорослей: Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula в присутствии частиц глинистых минералов (монтмориллонита, палыгорскита, 217
Рис. 58. Поведение клеток дрожжей при движении суспензии а — 0; 6 — 5; в — 20; г — 150 В/см;
между зернами силикагеля различной напряженности поля; о после отключения тока.
Рис 59. Круговое движение дрожжевых клеток в полостях, образованных четырьмя (и) и пятью (б) поляризованными зернами силикагеля.
Рис. 60. Камера для изучения ново дения клеток микроорганизмов в электрическом поле в присутствии отдельных частиц различных мате- риалов: / — капилляр Перфильева; 2 — стеклянные трубки; <3 — соединительные шланги; 4— 5 — электроды. бентонита), помпы, песка, сили- кагеля (марки КСМ-2,5 и КСМ-5), стекла (в том числе кварцевого), асбеста, активи- рованного угля, ионообменных смол (АВ-17 и КУ-2), полиуре- тана, тефлона, а также воло- кон — хлопка, шерсти, шелка, капрона, найлона и некоторых других под влиянием постоян- ного, импульсного и перемен- ного тока. На рис. 61 приводятся фо- тографии, иллюстрирующие поведение клеток вегетирую- щей односуточной культуры Bacillus subtilis в присутствии частиц глинистого минерала монтмориллонита. В обычных условиях (без наложения элек- трического поля) лишь немно- гие клетки контактируют с поверхностью глины — частица ми- нерала имеет одноименный с клеткой, отрицательный заряд, а суспензия приготовлена на дистиллированной воде, не содер- жащей достаточного количества катионов, которые способство- вали бы адсорбции. Отдельная частица минерала в капилляре не представляет собой барьера для микробных клеток, и они ее легко огибают при движении суспензии относительно части- цы (что можно достичь изменением уровня жидкости в одном из стеклянных сосудов). Однако достаточно наложить на си- стему электрическое поле постоянного тока, как клетки собира- ются в больших количествах на обращенной к катоду стороне поверхности глинистого минерала, а после отключения тока по- кидают ее, снова образуя со временем равномерную суспензию. Повторное наложение электрического ноля опять приводит к на- коплению клеток на частице; смена полярности на электродах моментально резко отбрасывает все микробные клетки от данной поверхности этой частицы, но способствует притяжению других клеток к противоположной ее стороне. Аналогично ведут себя и другие микроорганизмы при кон- такте с частицами всех исследуемых нами материалов в поле импульсного и особенно сглаженного постоянного тока. В поле переменного тока промышленной частоты (50 Гц) накопления клеток на частицах не происходит. Различия во взаимодействии микроорганизмов с поверхно- стью разнообразных материалов в электрическом поле обуслов- лены не только природой этих материалов, но и их состоянием, в частности, гидрофильностью. Это можно продемонстрировать 221
Рис. 61. Поведение клеток Bacillus subtilis в присутствии глинистого минера- ла монтмориллонита без наложения поля (at), в электрическом поле постоян- ного тока (б) и при смене полярности на электродах (в).
на примере глинистых минералов, гидрофильность которых ме- няется в зависимости от температуры обжига. Способность некоторых термически обработанных глин ад- сорбировать микробные клетки была известна еще со времен Луи Пастера. Предложенные одним из его учеников в 1884 г. фильтры — «свечи Пастера — Шамберлена», которые до сих пор широко используются для стерилизации жидкостей, изготавли- ваются из обожженной смеси кварцевого песка и каолина, при- чем температура обжига должна быть достаточно высокой, чтобы минерал не набухал и не диспергировался в воде, но и не должна превышать определенной границы, иначе фильтр не будет работать [117, 192]. Как же влияет температура обжига глины на ее взаимодей- ствие с микробными клетками в электрическом поле? Для выяснения этого вопроса проводили исследования с природным монтмориллонитом Черкасского месторожде- ния [21]. Монтмориллонит принадлежит к классу минералов со структурным мотивом 2:1, т. е. его элементарная частица состоит из двух внешних кремнекислородных тетраэдрических сеток и одного промежуточного алюмокислородного октаэд- рического шара и соответствует теоретической формуле (OHjiSigAKChonl-LO. С повышением температуры термиче- ской обработки монтмориллонита его гидрофильность снижается [191]. На термограммах черкасского монтмориллонита на- блюдаются два эндо- и один экзотермические эффекты; эндо- эффект при температуре 130—140° соответствует удалению сорбционно связанной воды (обратимый процесс); при 550— 575° происходит необратимый процесс дегидроксилизации ми- нерала — удаление кристаллизационной (структурной) влаги; экзоэффект при 850° связан с изменением кристаллического строения минерала, что подтверждено исследованиями электри- ческих, реологических и рентгеноструктурных свойств монтмо- риллонита [184]. При 800° в системе появляется альбит, при бо- лее высокой температуре — шпинель. Таким образом, в области температур 800° и выше дисперсную систему следует рассматри- вать как смесь дегидроксилированного минерала, альбита, шпи- нели и других высокотемпературных кристаллических фаз. В этой серии опытов применяли минерал, нагретый до темпе- ратуры 100—1000° и охлажденный вместе с муфелем. Спек- шийся монтмориллонит дробили, отбирали фракции с размером частиц 30—40 мкм и смешивали с суспензией микроорганизмов в дистиллированной воде. Использовали интактные односуточ- ные культуры Saccharomyces cerevisiae, полученные на СА (клетки овальной формы, размер 4,0X11,0 мкм), и Вас. sub- tilis, выращенные на МПА (палочки 1,5—3,0x0,5—0,8 мкм). Концентрация микроорганизмов в суспензии составляла 106— 10s клеток/мл. Для сравнения интенсивности взаимодействия микробных клеток с отдельными частицами глины, которые 223
подвергались различной температурной обработке, в каждой серии опытов пользовались одной и той же суспензией микро- организмов, а для наблюдения выбирали примерно одинаковые по размеру частицы монтмориллонита. На электроды в течение одинакового промежутка времени подавали выпрямленный дио- дами ток. Картину фиксировали на фотопленке, осуществляли смену полярности и снова через определенное время фотогра- фировали поле зрения. В камере создавали напряженность электрического поля порядка 15—25 В/см. Относительно большие и массивные частицы монтморилло- нита при такой напряженности поля не движутся, а клетки микроорганизмов интенсивно перемещаются в направлении к аноду. Однако как только они приближаются к поляризован- ной частице глины, то немедленно притягиваются обращенной к катоду стороной поверхности, накапливаются и образуют многочисленные цепочечные агрегаты и скопления. Проведенные исследования показывают, что частицы необра- ботанного глинистого минерала и образцы, обожженные при температуре ниже 500—600°, под воздействием электрического поля постоянного тока интенсивно накапливают на обращен- ной к катоду поверхности микробные клетки. Смена поляр- ности на электродах приводит к резкому взаимному отталки- ванию частиц глины и клеток микроорганизмов. В этот момент при значительном скоплении микробных клеток на поверхности минерала, что может быть достигнуто увеличением^ времени подачи напряжения или использованием более густой суспен- зии, наблюдается резкий сдвиг частицы глины в сторону, про- тивоположную направлению движения клеток. По-видимому, такого же рода сила отталкивания действует и между отдель- ными клетками микроорганизмов во время смены полярности. Во всяком случае после выключения тока клетки со временем снова распределяются по всему объему камеры, не образуя конгломератов или скоплений. 7акое поведение частиц глины и клеток микроорганизмов свидетельствует о существенной роли двойного электрического слоя (ДЭС) в их поляризации. Если бы поляризация частиц обеспечивалась каким-то другим, например, ориентационным механизмом, то при смене поляр- ности на электродах внезапного сдвига глины и рассредоточе- ния клеток микроорганизмов не наблюдалось бы. Частицы глинистого минерала и микробные клетки имеют в воде определенные двойные электрические слои, внешняя об- кладка которых представлена положительно заряженными ионами. Это обстоятельство мешает клеткам микроорганизмов интенсивно адсорбироваться на поверхности монтмориллонита. Наложение электрического поля постоянного тока приводит к смещению ДЭС, поляризации частиц, в результате чего клет- ки подходят к частице на близкое расстояние. При смене по- лярности наступает момент, когда внешнее поле в системе 224
отсутствует, и ДЭС частицы минерала и микроорганизмов воз- вращаются в исходное, «нормальное» положение. Двойные электрические слои перекрываются и, будучи одноименно заря- женными, вызывают резкое отталкивание частиц и клеток друг от друга. Интенсивность накапливания микробных клеток на частицах монтмориллонита, который подвергался обжигу при температуре выше 600°, значительно меньше, а после термиче- ской обработки при 800—900° минерал почти не взаимодей- ствует с организмами. Полученные результаты свидетельствуют о значительном влиянии изменений в структуре монтмориллонита при его тер- мической обработке на взаимодействие этого минерала с клет- ками микроорганизмов в электрическом поле. Следует отметить также, что применение импульсного тока вместо постоянного приводит к несколько худшим резуль- татам, а на переменный ток промышленной частоты суспензия не реагирует, и картина под микроскопом остается такой же, как и до включения тока. Таким образом, наблюдаемый эффект связан, по-видимому, с поляризацией веществ в электрическом поле, перераспреде- лением зарядов, электростатическим, диполь-дипольным взаи- модействием материалов и микробных клеток, которые, как известно, обладают в водной среде значительным дипольным моментом [255, 256, 258]. Это взаимодействие в определенной степени обеспечивает удерживание дисперсных частиц различ- ными зернистыми и волокнистыми материалами в электриче- ском поле. Каковы же основные причины обнаруженного нами явле- ния «удерживания частиц различной степени дисперсности по- ляризованными материалами»? Известно [181], что помещен- ные в электрическое поле частицы материала, способного поля- ризоваться и имеющего отличную от среды диэлектрическую проницаемость, искажают это поле, создают так называемые локальные микрополя, напряженности которых больше, чем напряженность макроскопического внешнего поля: А Е, = Е + , а f EdS = U, 1 За0 J г\ где Е] — напряженность локального микрополя; Е — напряжен- ность внешнего электрического поля; Р — поляризуемость ча- стицы; ео — диэлектрическая проницаемость; S — расстояние между электродами (катодом К и анодом A); U — напряжение на электродах. Таким образом, в заполненной загрузкой камере, на кото- рую наложено внешнее электрическое поле постоянного тока, существует очень сложное неоднородное электрическое поле. В отличие от используемого ранее другими авторами «класси- 15 8—616 225
микробную клетку в неравномерном не- однородном поле при движении суспен- зии перпендикулярно общей напряжен- ности электрического поля. ческого» равномерно неодно- родного электрического по- ля, создаваемого системами электродов «точечный за- ряд — сфера» или «ци- линдр — струна», такое поле резко неравномерно неодно- родное, с многочисленными градиентами потенциала, и в нем проявляются электро-, диэлектро- и диполофорети- ческие силы, поляризацион- ные, электростатические и другие взаимодействия. По-видимому, электрофо- рез и электростатическое взаимодействие служат ос- новной причиной прикрепле- ния микроорганизмов к по- верхности заполнителя и образования цепочечных агрегатов, а диполофорез способствует концентриро- ванию клеток микроорганиз- мов в местах контакта зерен силикагеля между собой. Враще- ние микробных клеток в объеме между зернами обусловлено, очевидно, электрогидродинамическими потоками, природа кото- рых не вполне ясна. Снятие электрического поля приводит к ис- чезновению всех вызываемых им сил, и клетки микроорганизмов уносятся из камеры потоком жидкости. Создание математической модели неравномерного неодно- родного поля, теоретический расчет поведения частиц в нем — чрезвычайно трудная задача, которая, по мнению специалистов, вряд ли будет решена в ближайшее десятилетие. Поэтому по- пытаемся дать хотя бы грубую качественную оценку происхо- дящих в таком поле событий. На движущуюся с суспензией микробную клетку, как на отрицательно заряженную частицу, в сложном неоднородном электрическом поле (рис. 62) дей- ствует электрофоретическая сила Fe, направленная в сторону анода по касательной к силовым линиям поля и определяемая по уравнению: _ _ _ Fe = qE = turE; микробная клетка как частица, имеющая значительный диполь- ный момент, ощущает диэлектрофоретическую силу Fg, направ- ленную в зону большей напряженности поля и определяемую [269]: S 1 ^Ё— 2 81 *1~ *2 х2+ 2xj r3V£f; 226
кроме того, на клетку действует сила потока жидкости Fc, определяемая по закону Стокса: Fc = блгг]^, где q — заряд клетки; £— дзета-потенциал клетки; е, ei— ди- электрическая постоянная клетки и среды; хг, —проводи- мость клетки и среды; г — радиус клетки; V Е]— градиент на- пряженности неоднородного локального микрополя; т]1 — вяз- кость жидкости; v — скорость протока жидкости. Результирующая этих сил либо затянет клетку в зону мак- симальной напряженности локального микрополя — к месту соприкосновения зерен между собой (если Fg > Fe + Fc), либо доставит к положительно заряженной стороне поляризованной поверхности загрузки (если Fe> Fg + Fc), либо унесет пото- ком жидкости (если Fc > Fe + Fg). В этом последнем случае не происходит освобождения воды от микробных тел. Следова- тельно, для успешного отделения микроорганизмов необходимо соблюдать неравенство: Fc < Ft 4- Fgl или блгг]^ < 1ггЕ + 4" ei ~r J-~9rX т- е‘ и < —— (еН£ + 4- 8j -Хдг^ ~ r2V^i 6л гц \ 2 1 и Д- 2Х] / Из приведенной формулы следует, что чем жидкость более вязкая, тем труднее отделить от нее микробные клетки; для обеспечения сохранения качества фильтруемой жидкости уве- личение скорости протока (производительность установки) должно сопровождаться увеличением общей напряженности внешнего электрического поля; снижение дзета-потенциала клетки снижает эффективность процесса фильтрования. Удер- живание зависит также от размера отделяемых частиц (клеток микроорганизмов), электропроводности среды и клетки, ди- электрической постоянной среды и градиента напряженности неоднородного электрического поля, который предопределяется, в свою очередь, природой (в частности, поляризуемостью, ди- электрической проницаемостью и т. д.), а также размерами и формой материала загрузки. Эти данные подтверждаются и экспериментально. Удерживание микроорганизмов — это частный случай обна- руженного явления. Проведенные опыты показали, что таким образом можно отделять от жидкости (и не только водной) находящиеся в ней в коллоидном состоянии глинистые мине- ралы и другие высокодисперсные частицы [48, 74, 89, 161, 237], а такжё многие вещества, образующие истинные растворы — белки [51, 52, 54], нуклеиновые кислоты [50], полисахариды, 15* 227
гуминовые вещества [48] и даже сравнительно низкомоле- кулярные органические соединения, в частности красители [47, 75]. В связи с этим представляется вполне реальным использо- вать явление электроудерживания для разнообразных целей, а именно: 1) отделения микроорганизмов; 2) концентрирования микробов, в частности вирусов; 3) стерилизации жидкостей; 4) получения не только стерильной, но и апирогенной воды (инъекционные растворы); 5) разделения биологических частиц; 6) иммобилизации ферментов и проведения энзиматических реакций; 7) очистки жидкостей (в том числе сточных и питьевых вод) от коллоидных частиц различной природы, красящих и других органических веществ. Удерживание в неоднородном электрическом поле белков и нуклеиновых кислот с сохранением их биологической актив- ности свидетельствует о возможной роли этого явления в жи- вой клетке. Общеизвестно, что клеточная стенка неоднородна по своему составу, а следовательно, и по диэлектрической про- ницаемости и имеет довольно высокий электрический потенци- ал [16, 17, 474]. Мембраны клеточных органелл (митохондрий, хлоропластов) и бактерий «содержат молекулярные электри- ческие генераторы» [87], причем величина генерируемой трансмембранной разности электрических потенциалов дости- гает существенных значений — 100 —300 мВ. Поэтому вполне резонно допустить существование в клеточных структурах не- равномерного неоднородного электрического поля, аналогично- го создаваемому нами в эксперименте, с высокой напряжен- ностью и градиентом потенциала, и предположить его влияние на процесс удерживания, локализацию и работу биологически активных соединений, особенно высокомолекулярных. Таким образом, возможности использования явления элек- троудерживания частиц поляризованными материалами очень широки, разнообразны и еще не полностью раскрыты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ На протяжении 9 лет авторы книги, работая в отделе микро- биологии очистки воды в Институте коллоидной химии и химии воды АН УССР, выступают на специальных конференциях, съездах и симпозиумах, а также в научной печати, пропаган- дируя идею создания микробиологических основ биологической очистки промышленных сточных вод. До тех пор, пока очистка сточных вод представляла собой заботу инженеров коммуналь- ного хозяйства, пока относительно немногочисленные заводы и фабрики, к тому же и небольшие, сбрасывали свои во- ды недостаточно очищенными либо вовсе без очистки на общегородские коммунальные очистные сооружения, можно было мириться с тем, что активный ил использовался, как нечто подобное «черному ящику». Стоки городов и промыш- ленности направлялись в коммунальные очистные сооружения по биологической очистке воды. За счет городских сточных вод происходило сильное разбавление промышленных стоков, и в таких условиях активный ил коммунальных сооружений адап- тировался к деструкции различных химических соединений и очищал таким образом промышленные сточные воды от хими- ческих загрязнителей. Но по мере индустриализации и особен- но с развитием химической, целлюлозно-бумажной, лако-кра- сочной и текстильной промышленности перечисленные отрасли производства стали строить собственные очистные сооруже- ния. Коммунальных стоков и воды не хватает для разбав- ления сильно загрязненных промышленных стоков. Наступили новые условия для биологической очистки промышленных сточ- ных вод. При высокой концентрации загрязнителей либо при наличии в стоках высокотоксичных соединений (при недостат- ке воды для разбавления) участились случаи инактивации, а иногда отравления и гибели активного ила. Для новых завод- ских сооружений, которые еще не работали, активный ил берут на другом близлежащем заводе, если даже химический состав этих стоков отличен от химического состава стоков вновь пус- каемого предприятия. В худшем случае ил набирается в какой- либо реке, озере или болоте и запускается вместе со стоком 229
вновь построенного предприятия в аэротенк. После пуска био- логических очистных сооружений начинается процесс адапта- ции активного ила, недостаточно поддающийся управлению. Известен случай, когда на одном из химических заводов очист- ные сооружения, после их пуска, на протяжении 7 месяцев «работали» вхолостую. Промышленный сток на входе в аэро- тенки и на выходе из них имел идентичные показатели БПК и ХПК. Адаптации ила в данном случае не произошло. Микробиолог-исследователь при близком соприкосновении с технологией биологической очистки промышленных сточных вод не может не задуматься над тем, что же представляют собой биоценозы, именуемые активным илом или биопленкой? Какие компоненты этих ценозов главные и какие второстепен- ные? Результаты наших исследований и литературные данные свидетельствуют о том, что чистые культуры некоторых видов бактерий, выделенные из активных илов или почвы и селекцио- нированные методом ступенчатого улучшающего отбора, зна- чительно превосходят активный ил по деструктивной биохими- ческой активности, следовательно, для очистки промышленных сточных вод должны привлекаться чистые культуры деструк- торов. Они могут быть использованы в биологической очистке для обогащения ими активного ила при работе на обычных очистных сооружениях — аэротенках, либо на локальных уста- новках типа биофильтр-аэротенк, конструкция которых разрабо- тана в отделе микробиологии очистки воды нашего института. Предлагаемый метод очистки промышленных сточных вод посредством чистых культур бактерий уже не будет биологи- ческой очисткой в современном представлении, это будет ми- кробный метод или микробиологическая очистка с изменением отдельных этапов технологического процесса. В частности, микробиологическая очистка требует изменения технологии от- деления от воды микробной массы. При биологической очистке отработанный активный ил сам оседает в отстойниках, куда поступает из аэротенков очищенная вода. После микробиологи- ческой очистки бактериальная масса не оседает, ее необходи- мо отделять от воды путем адсорбции на глинистых минералах с последующей коагуляцией либо безреагентным методом — электроудерживания. Выдвигая вопрос о микробиологической очистке промыш- ленных стоков, авторы книги, разумеется, считают вполне целе- сообразным по-прежнему широко применять обычную биологи- ческую очистку сточных вод в промышленности. Применение микробиологического метода и его разработку нужно рекомен- довать первоначально только для отдельных химических про- изводств или отраслей промышленности, где стоки содержат весьма токсичные соединения либо являются высококонцентри- рованными, требующими большого количества воды для раз- бавления, что часто невыполнимо из-за ограниченности водных 230
ресурсов. Примером может служить производство анидного во- локна, где стоки содержат высокотоксичное соединение — гек- саметилендиамин (ГМД), вызывающий отравление активного ила, что заставляет в настоящее время сжигать сточные воды, содержащие ГМД. В отделе микробиологии очистки воды наше- го института уже разработан микробиологический метод очистки промышленной сточной воды от ГМД, гораздо более эффектив- ный, чем сжигание. Микробиологический метод эффективнее био- логической очистки также при загрязнении стоков ПАВ и капро- лактамом. Вместо чистых монокультур при микробиологическом мето- де очистки промышленных сточных вод можно применять и комплексы чистых культур, состоящие из нескольких штаммов одного и того же вида или из нескольких культур различных видов и даже родов. Однако все они будут не случайными компонентами биоценозов, как это имеет место в активном иле, где наряду с «отобранными» автоселекцией культурами деструкторов, находится множество спутников, комменсалов и представителей мира животных, попросту паразитирующих на смесях бактериальных популяций. Необходимость интенсификации биологической очистки общепризнана. К мысли о целесообразности замены активного ила частично или полностью селекционированными чистыми культурами высокоактивных бактерий-деструкторов, т. е. к пе- реходу на микробиологическую очистку, мы пришли в резуль- тате экспериментальной работы по разрушению чистыми куль- турами следующих синтетических органических соединений: мара-нитроанилина, 2,4,6-тринитрофенола (пикриновой кисло- ты), капролактама, гексаметилендиамина (ГМД), анионных поверхностно-активных веществ — додецилсульфата натрия. Все перечисленные соединения активным илом либо не разрушаются, либо разрушаются лишь в малых концентрациях, тогда как чистые культуры бактерий или их комплексы вызы- вают деструкцию этих веществ при значительно более высоких концентрациях в среде. В заключение приводим таблицы со списками родов и видов бактерий-деструкторов, способных разрушать или трансформи- ровать различные органические вещества, встречающиеся в промышленных сточных водах (см. приложение). Приведенные в списках культуры в первую очередь рекомендуется приме- нять для очистки воды от конкретных химических соединений. Однако нужно отметить, что в микробиологии очистки воды вопрос о биохимической активности штаммов, принадлежащих к одному и тому же виду, имеет такое же значение, как и в технической микробиологии: не все штаммы, принадлежащие к одному виду, идентичны по главному хозяйственно ценному показателю. В данном случае по интенсивности и глубине де- струкции загрязнителей промышленных стоков. Несмотря на 231
это, мы полагаем, что именно указанные виды, а лучше изучен- ные штаммы этих видов, пригодность которых для обезвре- живания определенных соединений доказана, должны приме- няться и для обогащения «слабых» илов, и для локальной очистки промышленных стоков посредством монокультур либо комплексных чистых культур, т. е. для внедрения микробиоло- гического метода очистки промышленных сточных вод. При самом беглом просмотре таблиц со списками микробов, выделенных и использованных различными исследователями для разрушения пли трансформации определенных групп со- единений (см. приложение, табл. 1—6), отчетливо видно преобла- дание бактерий над грибами; преобладание грамотрицательных бесспоровых бактерий над грамположительными; первое место среди грамотрицательных бактерий занимают представители ро- да Pseudomonas. Фенолы (табл. 1) разрушаются представителями 67 таксо- нов микробов — бактерий и грибов — обитателей воды, почвы и воздуха. Среди деструкторов фенолов по численности видов первое место занимают грамотрицательные палочки рода Ba- cterium (18 видов, 21%), второе место принадлежит роду Pseudomonas (10 видов, 15%), третье место — видам рода Mycobacterium. Галоидорганические соединения (табл. 2) лучше всего раз- рушают актиномицеты рода Streptomyces. Для нитроорганиче- ских соединений (табл. 3) на первом месте стоят роды Pseudo- monas и Bacterium, т. е. грамотрицательные палочковидные формы. В разрушении СПАВ (табл. 4) первое место занимают представители рода Pseudomonas (44%). Высокоактивными деструкторами ПАВ являются также бактерии кишечной груп- пы. Потребность в очистке воды от металлорганических соеди- нений (табл. 5) возникает редко. 50% бактерий — деструкторов формальдегида составляют виды рода Pseudomonas (табл. 6). В табл. 12 приводится список 71 культуры бактерий и грибов, выделенных из аэротенка, метантенка и биофильтра. Рассмотрим средние цифры по всем таблицам: Pseudomonas Bacterium Bacillus Актиномицеты Дрожжеподобные грибы и дрожжи Грибы мицелиальные около 31% » 41% » 15% » 11% » 4% » 8% Данные по а