/
Автор: Сливкин А.И. Селеменев В.Ф. Суховерхова Е.А.
Теги: фармакология общая терапия токсикология фармация физика лекарственные растения лекарственные средства издательство воронеж
ISBN: 5-7455-1094-3
Год: 1999
Текст
А. И. Сливкин, В. Ф. Селеменев,
Е. А. Суховерхова
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ
И БИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
КАЧЕСТВА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ
Учебное пособие
Под редакцией
В. Г. Артюхова, А. И. Сливкина
Рекомендовано Департаментом образователь-
ных медицинских учреждений и кадровой поли-
тики МИНЗДРАВА РФ о качестве учебнвго
пособия для студентов фармацевтических
ВУЗов (факультетов мед. ВУЗов) России.
Издательство
Воронежского государственного
университета
1999
УДК 615.07 (075.8)
ББК 52.8
С 47
Сливкин А. И., Селеменев В. Ф., Суховерхова Е. А.
С 47 Физико-химические и биологические методы оценки качества ле-
карственных средств: Учеб, пособие / Под ред. В. Г. Артюхова,
А. И. Сливкина. — Воронеж: Издательство Воронежского государ-
ственного университета, 1999. — 368 с.
ISBN 5-7455-1094-3
В учебном пособии рассматриваются документы, регламентирующие
работу аптечных учреждений, содержатся описания лабораторных работ
с использованием физических методов анализа, спектрофотометрии, эле-
ментного анализа, неводного титрования, бумажной, тонкослойной жид-
костной и газожидкостной хроматографии. Особое внимание уделяется
экспресс-анализу многокомпонентных лекарственных форм, изготовляе-
мых в аптеках. Приводятся методы биологической оценки активности
антибиотиков, сердечных гликозидов, инсулина, излагаются биологиче-
ские способы контроля качества лекарственных средств на пирогенность,
токсичность, стерильность, содержание веществ гистаминоподобного дей-
ствия. Вопросы статистической обработки результатов рассматриваются
по отношению к биологическим и химическим методам анализа.
Издание рассчитано на студентов химических, биологических, фар-
мацевтических факультетов высших учебных заведений, а также работ-
ников контрольных испытательных лабораторий при изучении и оценке
качества веществ, предназначенных для медицины и фармации.
Табл. 55. Ил. 35. Библиогр.: 62 назв.
Ецце.н а.енжж‘-
Д-риНЬл. наук, проф.'ТГ'Е. Сиплирая
Курского'госудмжадевнои) 'Мелиджжжвм^уицвйРСИтета),
д-рЛиол. вдук, ио№ Г. Н. Попове.
(зав. кафедтои’йнлля'сичвскии и яедвгютнской биохимии и
микробиолоши ДОДОЖВКСИЙК говуд1ф»Я|ршщго университета)
ISBN 5-7455-1)084*8.
© Сливкин А- И., Селеменев В. Ф.,
Суховерхова Е. А., 1999
© Издательство Воронежского
государственного университета, 1999
ОГЛАВЛЕНИЕ
?редисловие..................................................7
Контрольно-разрешительная система качества
Лекарственных средств........................................9
I. Оценка доброкачественности лекарственных средств
0 использованием физических констант........................81
2.1. Использование метода поляриметрии в фармацевтическом
анализе. Оценка доброкачественности лекарственных средств по
величине удельного вращения .............................82
2.2. Оценка доброкачественности лекарственных средств по их
растворимости............................................85
Работа 1. Определение степени чистоты лекарственных
препаратов по их растворимости и удельному вращению......85
Работа 2. Изучение возможностей использования поляриметрии
в количественном анализе лекарственных форм..............87
2.3. Оценка доброкачественности лекарственных средств
с использованием эталонных растворов ....................88
Работа 3. Определение содержания примесей в лекарственных
препаратах при помощи эталонных растворов................89
2.4. Оценка доброкачественности лекарственных средств
по содержанию в них воды.................................96
Работа 4. Определение содержания воды в лекарственных
препаратах...............................................96
2.5. Вязкость растворов полимеров...................... 101
Работа 5. Определение среднего значения молекулярной массы
и молекулярно-массовое распределение .................. 120
3. Анализ лекарственных средств с использованием методов
элементного анализа........................................126
3.1. Качественный элементный анализ ................... 126
3.2. Количественный элементный анализ.................. 128
Работа 1. Определение качественного и количественного состава
органических лекарственных средств методами элементного
анализа ............................................... 131
4. Анализ лекарственных средств с использованием метода
титрования в неводных средах...............................140
Работа 1. Титриметрическое определение лекарственных
препаратов в среде неводных растворителей ....;........ 143
5. Фармакопейный анализ готовых лекарственных форм.........146
5.1. Оценка качества однокомпонентных лекарственных форм ... 147
5.2. Особенности анализа многокомпонентных лекарственных
форм................................................... 147
5.2.1. Качественный авализ............................. 147
5.2.2. Количественный анализ........................... 149
3
6,2.3. Piw'wm' лодержииия компонентов в лекарственных
формах ............................................... 152
Работа 1. Имучониа оеобеииостай анализ»! многокомпонентных
лекарственных форм ................................... 155
6. Физико-химические методы анализа лекарстаенных
препаратов.................................................163
6.1. Фармацевтический анализ лекарственных средств
с использованием фотометрических методов .............. 163
6,1.1. Спектрофотометрия............................... 164
Работа 1. Определение лекарственного вещества в одноком-
понентной лекарственной форме методом УФ-спектроскопии. 169
Работа 2. Изучение возможностей применения спектрофото-
метрического метода в фармакопейном анализе лекарственных
средств и их лекарственных форм ....................... 170
Работа 3, Спектрофотометрическое определение лекарственных
веществ в двухкомпонентных лекарственных формах заводского
производства......................................... 171
6.1.2. Фотоколориметрия................................ 174
Работа 4. Фотоколориметрическое определение лекарственных
веществ в мазях...................................... 175
6.1.3. Спектрофотометрия в инфракрасной области света.. 175
6.1.4. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса в
фармацевтическом анализе............................... 197
6.2. Использование хроматографии в фармацевтическом
анализе ............................................. 208
6.2.1. Хроматография на бумаге ........................ 211
Работа 5. Определение доброкачественности лекарственного
средства методом бумажной хроматографии................ 212
6.2.2. Хроматография в тонком слое сорбента.............214
Работа 6. Изучение возможностей применения метода
тонкослойной хроматографии в фармакопейном анализе..... 215
6.2.3. Газовая и жидкостная хроматография.............. 223
Работа 7. Определение примеси салициловой кислоты в
ацетилсалициловой методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ)................................... 226
Работа 8. Определение подлинности, количественного состава
и содержания примесей в фармацевтических препаратах
методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ)............. 228
Работа 9. Изучение возможностей применения метода газовой
хроматографии в фармакопейном анализе лекарственных форм ... 230
Работа 10. Анализ лекарственной формы заводского
производства с применением различных физико-химических
методов анализа ....................................... 233
7. Использование физических и физико-химических методов
анализа для контроля содержания спирта этилового в фарма-
цевтических препаратах.....................................236
4
7.1. Определение содержания еширта ню плотности_____........ 237
7.2. Определение содержащая спирта в лекарственных
препаратах методом отгонки—......................———.—. 237
7.3. Определение содержания спирта ж лекарственных
препаратах по температуре кипения-------------------------- 239
7.4. Определение содержания спирта в лекарственных
препаратах методом рефрактометрии....................... 239
7.4.1. Рефрактометрия.................................. 241
7.4.2. Особенности рефрактометрического анализа водно-спирто-
вых растворов.............................................241
Работа 1. Рефрактометрическое определение спирта этилового
в лекарственных формах промышленного и аптечного
производства..............................................243
7.5. Определение спирта в лекарственных препаратах методом
газовой хроматографии..................................... 245
Работа 2. Газохроматографическое определение содержания
спирта этилового в экстракционных препаратах из раститель-
ного сырья................................................245
8. Экспресс-анализ лекарственных форм.......................247
8.1. Качественный экспресс-анализ лекарственных форм ... 247
8.2. Количественный экспресс-анализ лекарственных форм.. 249
Работа 1. Изучение физико-химических свойств, реакций
идентификации и количественного определения витаминов.... 254
Работа 2. Анализ глазных капель ......................... 260
9. Статистическая обработка результатов эксперимента........265
9.1. Классификация погрешностей химического анализа....... 266
9.2. Основные статистические характеристики однородной
выборки и их вычисление.................................. 268
9.3. Проверка однородности выборки ...................... 271
9.4. Доверительные интервалы и оценка их величины ...... 272
9.5. Метрологическая характеристика метода анализа....... 275
9.6. Метрологическая характеристика среднего результата.. 276
9.7. Интерпретация результатов анализа ..................276
9.8. Расчет и статистическая оценка параметров линейной
зависимости............................................. 279
10. Биологические методы анализа............................283
10.1. Биологический контроль качества лекарственных
средств................................................. 283
10.1.1. Принцип метода биологической оценки сердечных
гликозидов ............................................ 283
10.1.2. Определение биологической активности инсулина .. 296
10.1.3. Испытание на токсичность ....................... 304
10.1.4. Испытание на пирогенность....................... 305
10.1.5. Испытание на содержание веществ гистаминоподобного
действия................................................ 312
5
10,2. Методы микробиологического контроля лекарственных
средств................................................ 314
10.2.1. Испытание на стерильность...................... 325
10.2.2. Испытание на микробиологическую чистоту........ 332
10.2.3. Количественное определение микроорганизмов..... 335
10.2.4. Определение антимикробной активности антибиотиков
методом диффузии в агар................................ 347
10.3. Анализ лекарственных веществ и их метаболитов
в биологических жидкостях.............................. 356
Список литературы ........................................ 365
ПРЕДИСЛОВИЕ
В учебных программах подготовки специалистов-провизоров
рачительное внимание уделяется контролю качества лекарствен-
ных средств. Эффективность работы контрольно-разрешительной
системы является показателем качества потребляемых граждана-
ми лекарств, состояния и поступательного развития фармацевти-
ческой индустрии, уровня цивилизованности общества.
В данном учебном пособии материал изложен по схеме, отража-
ющей взаимосвязь практических задач с приведенными теорети-
ческими положениями, необходимыми для их решения. Анализ
студентами теоретической и справочной информации, охватываю-
щей общие принципы оценки качества лекарственных средств, со-
держащейся в большинстве предлагаемых лабораторных работ, дает
возможность использовать их для решения наиболее характерных
практических задач фармацевтического анализа.
Пособие состоит из четырех частей. В первой части приводят-
ся сведения из законодательных актов, касающихся контрольно-
разрешительной системы в фармации; содержатся данные о нор-
мативной документации, необходимой для открытия н функцио-
нирования контрольно-испытательных лабораторий; приводятся
методические материалы, инструкции, приказы, нормирующие
деятельность контрольно-аналитической службы; рассматриваются
все виды контроля качества лекарств в условиях химико-фарма-
цевтических предприятий, аптек, контрольных испытательных
лабораторий.
Во второй части содержатся общие методы анализа, нашедшие
широкое применение в практике, вошедшие в XI издание “Госу-
дарственной фармакопеи”. Значительное количество методик пе-
реработано и усовершенствовано. Материал представлен семью
разделами с предваряющей каждый раздел теоретической частью,
включающими оценку качества с использованием физических
констант, элементного анализа, титрования в неводных средах,
физико-химических методов анализа лекарств, экспресс-анализа
лекарственных форм, контроля содержания спирта в фармацев-
тических препаратах. Большое внимание уделяется возможностям
применения спектральных и хроматографических методов для
контроля качества лекарственных средств.
Материалы для написания третьей и четвертой частей взяты
из “Государственной фармакопеи” XI издания.
Третья часть книги представлена методами расчетов из стати-
стического анализа химических и биологических испытаний ле-
карств, без применения которых невозможно оценить достовер-
7
ность полученных экспериментальных результатов; рассматрива-
ются теоретические вопросы и прикладные аспекты статистики.
Четвертая часть пособия посвящена биологическим методам
анализа лекарственных средств и состоит из трех разделов. Био-
логические методы контроля качества лекарств включают спосо-
бы оценки активности лекарственного растительного сырья и пре-
паратов, получаемых из этого сырья, определение токсичности
веществ гистаминоподобного действия. Микробиологический кон-
троль лекарственных средств содержит испытание на стерильность,
на микробиологическую чистоту, определение антимикробной
активности, а также количественный анализ микроорганизмов. В
третьем разделе значительное внимание уделено биотестированию
активных клеток, стандартизации и использованию ферментных
препаратов в качестве аналитических реагентов.
Пособие подготовлено высококвалифицированными специали-
стами, имеющими большой опыт преподавания фармацевтичес-
кой и медицинской химии, дисциплин в смежных областях зна-
ний. Оно несомненно восполнит образовавшийся за последнее де-
сятилетие пробел в написании и издании учебно-методической
литературы в области вопросов оценки и контроля качества ле-
карственных средств. В 1995 г. было издано единственное со-
держательное “Руководство к лабораторным занятиям по фарма-
цевтической химии” под редакцией А. П. Арзамасцева.
Выход в свет учебного пособия А. И. Сливкина, В. Ф. Селеме-
нева и Е. А. Суховерховой является своевременным. Оно будет
полезно для студентов фармацевтических, химических, биологи-
ческих факультетов при выполнении лабораторных работ по фар-
мацевтической, аналитической, медицинской, биологической хи-
мии, а также для работников контрольных испытательных лабо-
раторий при изучении и оценке качества веществ медицинского и
фармацевтического назначения.
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор биологических наук,
профессор В. Г. Артюхов
1. КОНТРОЛЬНО-РАЗРЕШИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА
КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
В условиях рыночных отношений государство оставляет за
собой рычаги воздействия на ту часть деятельности социальной
сферы, от которой зависит здоровье нации. Это является одной из
основных функций контрольно-разрешительной системы Мини-
стерства здравоохранения Российской Федерации (М3 РФ), обес-
печивающей качество, эффективность и безопасность лекарствен-
ных средств.
Для обеспечения надежного качества лекарственных средств и
медицинской техники на всех ступенях необходима эффективная
государственная система контроля и надзора за производствен-
ной деятельностью всех аптечных учреждений и предприятий не-
зависимо от их форм собственности и ведомственной подчиненно-
сти.
Контрольно-аналитические лаборатории и центры контроля
качества лекарственных средств являются структурными подраз-
делениями контрольно-разрешительной системы М3 РФ и основ-
ным звеном территориальной службы контроля качества лекар-
ственных средств.
Приказ М3 РФ от 28.06.93 г. № 149 “О контрольно-разреши-
тельной системе обеспечения качества лекарственных средств,
медицинской техники и изделий медицинского назначения” про-
декларировал создание контрольно-разрешительной системы ка-
чества лекарственных средств. Контрольно-разрешительная сис-
тема М3 РФ представлена на рис. 1.1.
Приказ М3 РФ от 02.09.93 г. № 211 “О совершенствовании
контрольно-разрешительной системы обеспечения качества лекар-
ственных средств, медицинской техники и изделий медицинского
назначения” утвердил структуру контрольно-разрешительной си-
стемы обеспечения качества лекарственных средств, медицинской
техники и изделий медицинского назначения (рис. 1.2).
Сокращения, использованные на рис. 1.1 и 1.2:
ГНИИСКЛС — Государственный научно-исследовательский ин-
ститут по стандартизации и контролю качества лекарственных
средств М3 РФ;
РГЦЭЛ — Российский государственный центр экспертизы ле-
карств;
ВНИИИМТ — Всероссийский научно-исследовательский и ис-
пытательный институт медицинской техники;
ВНЦ БАВ — Всероссийский научный центр биологически ак-
тивных веществ.
9
Госстандарт Российской _________ Министерство здравоохранения Госкомитет санэпиднадзора
Федерации Российской Федерации Российской Федерации
1.1. Контрольно-разрешительная система М3 РФ
10
Рис. 1.2. Структура государственной системы контроля качества лекарствен-
ных средств, медицинской техники и изделия медицинского назначения
Система контроля качества серийно выпускаемых лекарств
действует в России на федеральном и территориальном уровнях.
На федеральном уровне эту систему представляют:
— Департамент государственного контроля лекарственных
средств и медицинской техники;
— ГНИИСКЛС в Центральной лаборатории государственного
контроля и изучения качества препаратов, кровезаменителей и
консервирующих растворов Гематологического научного центра
Российской академии медицинских иаук (РАМН).
На территориальном уровне система представлена органами по
сертификации лекарственных средств, контрольными испытатель-
ными лабораториями и центрами контроля качества.
В настоящее время работу по контролю качества и сертифика-
ции лекарственных Средств осуществляют 163 территориальных
лабораторий и центров контроля качества, аккредитованных Де-
партаментом на техническую компетентность. Все аккредитован-
11
ные территориальные лаборатории работают под методическим
руководством Департамента и направляют в его адрес оператив-
ную информацию о всех случаях выявленного брака.
Существующая контрольно-разрешительная система способна
обеспечить защиту населения страны от возможных негативных
последствий использования некачественной медицинской продук-
ции. Однако слабой стороной этой системы является ее разобщен-
ность, отсутствие вертикальной подчиненности, четкого разгра-
ничения полномочий и функций федеральных и региональных
органов, входящих в систему, отсутствие государственных орга-
нов контроля в ряде регионов России, а также постоянные пере-
бои в финансировании.
Основной проблемой в деятельности системы является недо-
статочный инспекторский контроль промышленных предприятий
и организаций, производящих, хранящих и реализующих лекар-
ственные средства, медицинскую технику и изделия медицинско-
го назначения. Причины этого — недостаточные численность и
финансирование контрольной службы.
Важную роль в обеспечении координации действий, исклю-
чении дублирования в работе учреждений, входящих в государ-
ственную систему контроля качества, эффективности и безопас-
ности лекарственных средств должна сыграть организация Го-
сударственного центра экспертизы и контроля лекарственных
средств на базе реорганизуемых государственных учреждений:
Государственного института доклинической и клинической экс-
пертизы лекарств, ГНИИСКЛС, Федерального центра по изуче-
нию побочных действий лекарств, научно-исследовательского ин-
ститута традиционных методов лечения (приказ М3 РФ от
22.02.99 г. № 58).
Создание территориальных органов контроля качества, эффек-
тивности и безопасности лекарственных средств, наряду с созда-
нием органов по сертификации лекарственных средств, аккреди-
тация которых в настоящее время проводится Департаментом,
позволит создать систему контроля на региональном уровне, строго
разграничить функции федеральных и территориальных органов,
обеспечить их вертикальную подчиненность Департаменту и вза-
имодействие с Государственным центром экспертизы и контроля
лекарственных средств.
Порядок проведения государственного контроля качества ле-
карственных средств, используемых на территории РФ, регламен-
тирован приказом М3 РФ от 25.03.94 г. № 53. Государственному
контролю подлежат все лекарственные средства, выпускаемые
отечественными предприятиями и поступающие по импорту.
12
Государственный контроль качества лекарственных средст i
Осуществляется в режимах:
— предварительного контроля;
— последующего выборочного контроля;
— арбитражного контроля.
Пробы лекарственных средств должны направляться в
ГНИИСКЛС, структура которого представлена на рис. 1.3.
Рис. 1.3. Структура ГНИИСКЛС
Пробы лекарственных средств должны направляться в инсти-
тут в упаковке, указанной в нормативной документации (НД) для
данного препарата или в таре из стекла (для субстанций) в коли-
честве, необходимом для проведения 4 полных анализов в соот-
ветствии с требованиями НД и с учетом испытаний на микробио-
логическую чистоту.
Образцы для испытаний на механические включения отбира-
ют в количестве, предусмотренном соответствующими действую-
щими инструкциями. В настоящее время утвержден Руководя-
щий документ (РД) 42-501-98 от 07.07.98 г. “Инструкция по кон-
тролю на механические включения инъекционных лекарствен-
ных средств”, согласно которому установлены требования на
механические включения всех видов инъекционных лекарствен-
ных средств: инфузионных и инъекционных растворов, препара-
тов крови, кровезаменителей, консервантов крови и применяе-
13
мых в виде растворов сухих лекарственных средств. Контролю
подлежат инъекционные лекарственные средства, выпускаемые
в ампулах, флаконах, бутылках, шприц-тюбиках и других емко-
стях из стекла или прозрачных полимерных материалов. Под ме-
ханическими включениями подразумеваются посторонние нера-
створимые частицы (кроме пузырьков газа), случайно присутству-
ющие в лекарственных средствах.
Выборка — это число ампул, флаконов, бутылок и других ем-
костей, которые необходимо отобрать для контроля от каждой
серии готовой продукции. При контроле на механические вклю-
чения учитывается объем инъекционного лекарственного средства.
Препараты малого объема — 100 мл и менее, большого объема —
более 100 мл независимо от того, являются ли они растворами
или получены при растворении сухих лекарственных средств.
Контроль и подсчет количества частиц может проводиться 3 ме-
тодами:
а) визуальным;
б) счетно-фотометрическим;
в) микроскопическим.
Визуальный контроль инъекционных препаратов на механи-
ческие включения проводится контролером невооруженным гла-
зом на черном и белом фонах. Зона контроля при просмотре осве-
щается электрической лампой накаливания или лампой дневного
света соответствующей мощности в зависимости от степени ок-
раски растворов (табл. 1.1). Освещенность зоны контроля должна
соответствовать не менее 2000 лк.
Таблица 1.1
Мощность источника при визуальном контроле
Окраска растворов Мощность источника света
Электрическая лампа накаливания, Вт Лампа дневного света, Вт
Бесцветные 60 20
Окрашенные 100 30
В группу “Окрашенные” включают бесцветные растворы в со-
судах из светозащитного стекла и окрашенные растворы в сосу-
дах из бесцветного стекла, а также растворы в емкостях из про-
зрачных полимерных материалов.
Для проведения визуального контроля инъекционных раство-
ров контролер должен Иметь зрение единицу. При необходимости
коррекция зрения производится очками. Состояние зрения конт-
14
ролера проверяется врачом-окулистом не реже одного раза в 6 ме-
сяцев, о чем делают отметку в медицинской книжке.
Количество образцов, отбираемых от каждой серии инъекци-
онного лекарственного средства, зависит от его агрегатного состо-
яния (раствор или сухое вещество), объема (малый или большой),
объема серии, а также от метода контроля (разрушающий или
неразрушающий).
Для проведения визуального контроля инъекционных препа-
ратов, не требующих вскрытия и растворения (неразрушающий
контроль), а также сухих лекарственных средств для инъекций
(разрушающий контроль) производят объем выборок продукции
и оценку результатов контроля с помощью усиленного двухсту-
пенчатого контроля в соответствии с ГОСТ 18242-72 (переизда-
ния 1983 г.).
1. Растворы малого объема (неразрушающий контроль)
От каждой серии произвольно отбирают выборку в два эта-
па — первая И вторая ступени в соответствии с табл. 1.2.
Таблица 1.2
Нормативы объемов выборок для контроля растворов малого объема
иа механические включения и параметры их оценки
Объем серии, шт. Ступень визуального контроля Объем выборки для визуального контроля, шт. Количество емкостей с растворами малого объема, имеющими включения, шт.
приемочное браковочное
1201—3200 Первая 80 2 5
суммарно (по 160 6 7
2 ступеням)
3201—10000 То же 200 6 10
400 15 16
Свыше 10 000 315 9 14
630 23 24
2. Растворы большого объема (неразрушающий контроль)
От каждой серии произвольно отбирают выборку в два эта-
па — первая и вторая ступени в соответствии с табл. 1.3.
На станциях переливания крови для просмотра инъекцион-
ных препаратов отделы контроля качества лекарств (ОККЛ) про-
изводят выборку 10 % емкостей от серии, но не менее 10 буты-
лок. При обнаружении хотя бы одной бутылки с механическими
включениями всю серию возвращают для повторного первичного
контроля.
15
Таблица 1.3
|||||1МЙТИНМ объемов выборок для контроля растворов большого
|ЙИ>*М* Н1 механические включения и параметры их оценки
Объем серии, шт. Ступень визуального контроля Объем выборки для визуального контроля, шт. Количество емкостей с растворами малого объема, имеющими включения, шт.
приемочное браковочное
151—280 Первая 20 0 2
суммарно (по 40 1 2
2 ступеням)
281—500 То же 32 0 2
64 1 2
501—1200 50 0 2
100 2 3
1201—3200 80 0 3
160 3 4
Свыше 3200 125 1 4
250 5 6
3. Сухие лекарственные средства, применяемые в виде
растворов (разрушающий контроль)
От каждой серии произвольно отбирают первую полную вы-
борку в соответствии с табл. 1.4.
Для растворения препаратов используют воду очищенную или
другой растворитель, указанный в частных фармакопейных ста-
тьях (ФС) или инструкции по применению препарата, предвари-
тельно профильтрованный через мембрану с диаметром пор не
более 1,2 мкм.
На предприятиях осуществляется трехкратный контроль чис-
тоты инъекционных препаратов: первичный — внутрицеховой
сплошной, вторичный — внутрицеховой выборочный и третий —
выборочный контроль, осуществляемый контролером отдела кон-
троля качества. Первичный и вторичный контроль осуществляет-
ся просмотрщиками цеха, участка.
Первичному контролю подлежат 100 % ампул, флаконов, бу-
тылок, шприц-тюбиков и других полимерных упаковок с инъек-
ционными препаратами, прошедшими стадию стерилизации или
приготовленными в асептических условиях, перед маркировкой
и упаковкой.
Для проведения вторичного контроля от каждой партии, про-
шедшей первичный контроль, отбирают среднюю пробу — 5 % от
партии до 2000 ампул, флаконов, бутылок, шприц-тюбиков и
250 шт. от всех других партий. При обнаружении более 2 % ам-
16
Таблица 1.4
Нормативы объема выборок для контроля сухих лекарственных
средств на механические включения и параметры их оценки
Группа препаратов Количество флаконов (ампул в серии)
до 35 000 включительно до 70 000 включительно до 105 000* включительно
число выборок коли- чество образцов число выборок коли- чество образцов число выборок коли- чество образцов
1. Препараты, предна- значенные для внут- ривенного введения, а также с указанием на этикетке “для инъек- ций”: 1 г включительно более 1 г (до 5 г включительно) 1 1 8 5 2 2 16 10 3 3 24 15
2. Препараты, предна- значенные для внутри- мышечного введения: 1 г включительно более 1 г (до 5 г включительно) 1 1 5 3 2 2 10 6 3 3 15 9
*От каждых последующих 35000 флаконов (ампул) отбирается одна выборка.
Примечания. 1. Для препаратов с дозировкой более 5 г число выборок,
количество образцов в выборке и норму содержания механических включений
указывают в частных фармакопейных статьях.
2. Для проведения контроля в ГНИИСКЛС, кбит рольных испытательных
лабораториях, Центрах контроля качества лекарственных средств и аптечных
складах М3 РФ и других ведомств отбирают удвоенное количество образцов од-
ной выборки независимо от группы, к которой отнесен препарат.
пул, флаконов, бутылок, шприц-тюбиков с механическими вклю-
чениями всю партию, от которой отобрана средняя проба, возвра-
щают для повторного первичного контроля.
Третий выборочный контроль осуществляется контролерами
ОТК. Для контроля отбирают среднюю пробу от каждой серии
изготовленной продукции перед маркировкой и упаковкой.
Счетно-фотометрический метод анализа осуществляется на при-
борах, основанных на принципе светоблокировки и позволяющих
автоматически определять размер частиц и число частиц соответ-
ствующего размера. Например, анализатары мехянических приме-
сей фотометрически-счетны з
Микроскопический мет< би-
нокулярного микроскопа типд, .^щи^ увеличением в
100 раз). ’ ' *
2. Заказ 3547
17
Просмотр глазных капель на отсутствие механических приме-
сей производится в соответствии с РД 64-076-89 “Инструкция.
Контроль готовых лекарственных средств в виде глазных капель
на отсутствие в них механических включений”. Настоящая инст-
рукция распространяется на готовые лекарственные средства в
виде глазных капель во флаконах или тюбик-капельницах и ус-
танавливает единые требования и порядок контроля препаратов
на отсутствие в них механических включений. Помещение для
контроля растворов глазных капель должно быть защищено от
прямого попадания солнечных лучей. Контроль чистоты глазных
капель во флаконах или тюбик-капельницах производится про-
смотрщиком невооруженным глазом на черном и белом фонах.
На предприятиях осуществляется двукратный контроль глаз-
ных капель на отсутствие в них механических включений. Конт-
ролю подвергаются флакойы или тюбик-капельницы с раствори-
телями глазных капель, прошедшие стадию стерилизации или
приготовленные в асептических условиях.
Первичный контроль проводится просмотрщиком цеха (участ-
ка). Этому контролю подвергаются 100 % флаконов или тюбик-
капельииц. Флаконы или тюбик-капельницы с растворами глаз-
ных капель, в которых обнаружены механические включения,
считаются забракованными.
Под видимыми механическими включениями подразумевают-
ся ворсинки. Другие твердые частицы в глазных каплях не до-
пускаются.
Глазные капли с опалесценцией не бракуют в том случае, если
опалесценция допускается действующей НД.
Просматривают флаконы “вверх донышком” на черном и бе-
лом фонах. Затем плавным движением без встряхивания перево-
дят “вниз донышками” и вторично просматривают на черном и
белом фонах.
Вторичный выборочный контроль осуществляется контроле-
рами отдела технического контроля (ОТК) в процессе полного
анализа качества предъявленной серии готовой продукции перед
сдачей на склад. Для этого из серии отбирают 1 % единиц про-
дукции, ноне менее 50 флаконов или тюбик-капельниц.
Освещенность зоны контроля должна соответствовать не менее
2500 лк. При обнаружении ворсинок фиксируется их число в каж-
дой единице контролируемой продукции.
В случае обнаружения в единице продукции хотя бы одной
твердой частицы или ворсинок более 5 производят повторный
контроль на удвоенном количестве флаконов или тюбик-капель-
ниц. При контроле на удвоенном количестве в случае обнаруже-
18
хотя бы одной твердой частицы или ворсинок более 5 серия
^Имкостью бракуется.
^^НКмчество продукции во флаконах определяется по коэффици-
-дефектности, который рассчитывается как средиеарифмети-
МПкое число ворсинок из взятых иа вторичный просмотр единиц
ИМВоДукции.
’ Серия глазных капель во флаконах считается годной, если ко-
эффициент дефектности ие превышает 3,5.
В* Из взятого иа просмотр количества тюбик-капельниц допуска-
ll вТСЯ не более 6 % единиц, содержащих механические включе-
Ж КНя, причем в каждой тюбик-капельнице не должно быть более
1 б Ворсинок.
Контроль на аптечных складах контрольно-аналитическими
f лабораториями, лабораториями, осуществляющими Государствен-
ный контроль в ГНИИСКЛС, проводится так же, как при вторич-
ном выборочном контроле.
Предварительному Государственному контролю подлежат оте-
чественные препараты:
— Впервые разрешенные к медицинскому применению М3 РФ,
а также впервые выпускаемые серийно на данном предприятии;
— серийно выпускаемые по измененной технологии;
— при получении лицензии на производство;
— переведенные на этот вид контроля Департаментом государ-
ственного контроля качества, эффективности, безопасности ле-
карственных средств и медицинской техники в связи с ухудше-
нием Их качества.
Предприятия направляют образцы первых очередных серий
(не менее 5) после проверки их в ОТК предприятия в ГНИИСКЛС
с протоколом анализа ОТК по всем показателям качества, соглас-
но НД, актом отбора средней пробы и сопроводительным пись-
мом. Для инъекционных растворов и глазных капель прилагает-
ся письменное заключение территориальной контрольной испы-
тательной лаборатории с результатами проверки по показателю
“Механические включения” в соответствии с действующими НД.
Образцы всех лекарственных форм направляются в институт
вместе с образцами лекарственных веществ (субстанций), из ко-
торых они приготовлены и которые ранее прошли предваритель-
ный контроль, и аналитическими паспортами, где указываются
номера их серий и изготовитель.
Лекарственные средства снимаются с предварительного конт-
роля, если их качество отвечает воем требованиям НД.
Последующему выборочному контролю подвергаются все се-
рии выпускаемых лекарственных средств. Номенклатура и перио-
2*
19
дичность их отбора устанавливаются планами-заданиями, утвер-
жденными Департаментом.
Для последующего государственного контроля образцы отби-
раются на складе готовой продукции предприятия-изготовителя,
на аптечных складах-базах, в аптеках и других учреждениях, ре-
ализующих лекарственные средства.
Отбор образцов на предприятиях-изготовителях проводит ОТК
предприятий с представителем территориальной контрольной ис-
пытательной лаборатории (центра). Отбор образцов на аптечных
базах (складах), в аптеках и других учреждениях, реализующих
и использующих лекарственные средства, осуществляет предста-
витель территориальной контрольной испытательной лаборатории.
Отбор образцов может также проводиться представителями
ГНИИСКЛС или других организаций, учреждений и предприя-
тий по заданию Департамента, а также при обследованиях пред-
приятий-изготовителей, аптечных и лечебных учреждений или
по сигналам учреждений здравоохранения и населения. Образцы
препаратов направляются в ГНИИСКЛС с сопроводительным пись-
мом и актом отбора средней пробы. Для инъекционных растворов
и глазных капель дополнительно прилагается результат провер-
ки по показателю “Механические включения” в соответствии с
действующими инструкциями.
Арбитражному контролю подвергают лекарственные средства
в случае возникновения споров об их качестве между поставщи-
ком и потребителем.
При разногласиях между поставщиком и потребителем (в спор-
ных случаях) по качеству лекарственных средств окончательное
решение принимает ГНИИСКЛС.
В спорных случаях для проведения контроля качества гото-
вых лекарственных средств по показателям: внешний вид, масса
или объем содержимого упаковки, подлинность, pH раствора ко-
личество упаковок, составляющих пробу, рассчитывают по фор-
муле: 0,4уп, где п — количество упаковок в одной серии, но не
более 30.
Зарубежные лекарственные средства подвергаются предвари-
тельному и последующему государственному контролю.
Предварительному контролю подлежат первые три серии впер-
вые закупаемых лекарственных средств. Образцы направляются
аптечной базой (складом) в 10-дневиый срок после их поступле-
ния.
Последующему контролю подвергаются:
— антибиотики, гормональные, ферментные и другие препа-
раты из животного сырья — по всем показателям НД;
20
— химико-фармацевтические препараты, требующие испыта-
ем на стерильность и пирогенность — по этим показателям вы-
Нврочно, по указанию Департамента;
ь. — другие препараты — выборочно, по планам ГНИИСКЛС,
утвержденным Департаментом.
Отбор образцов на этот вид контроля производится представи-
телями Департамента, соответствующих институтов или террито-
риальных контрольных испытательных лабораторий.
Контролю в ГНИИСКЛС подлежат все серии зарубежных ле-
карственных средств, в качестве которых потребителями выявле-
ны отклонения.
Претензии к качеству поставляемой зарубежной продукции мо-
гут быть предъявлены фирме-изготовителю только после подтвер-
ждения ГНИИСКЛС несоответствия качеству.
Образцы зарубежных лекарственных средств, направляемых
на госконтроль, должны сопровождаться письмом, в котором ука-
зывается вид контроля, актом отбора средней пробы, оригиналом
или заверенной копией сертификата фирмы-изготовителя.
АКТ
отбора средней пробы лекарственных средств
для последующего государственного контроля
от “______________________________” г.
Комиссия в составе:_______________________________________________
(ф.и.о., должность)
произвела изъятие образцов лекарственных средств со склада готовой
продукции предприятия (учреждения)
(полное наименование, ведомственная принадлежность)
№ п./п. Наименование препарата № серии Общее количество препарата Количество отобранного образца препарата Приме- чание
1 2 3 4 5 6
Подписи:
Начальник ОТК предприятия
Представитель контрольной
испытательной лаборатории
(представитель заказчика)
Акт составляется в двух экземплярах. Один направляется в
ГНИИСКЛС, второй остается на предприятии.
21
Заключение о кнчегтне лекарственных средств дается на осно-
вании анализа пробы (выборки), отобранной в соответствии с су-
ществующими положениями, если нет специальных указаний в
частных статьях. Пробы (выборки) отбирают от отдельных серий
(партий) лекарственного средства согласно требованиям ГФ XI,
вып. 2, только из неповрежденных, укупоренных и упакованных
согласно НД упаковочных единиц.
Для проведения испытаний лекарственных средств на соответ-
ствие требованиям НД проводят многоступенчатый отбор проб
(выборок).
Число ступеней определяется видом упаковки.
I ступень: отбор единиц упаковочной тары (ящиков, коробок,
мешков и др.)
II ступень: отбор упаковочных единиц, находящихся в упако-
вочной таре (коробок, флаконов, банок и др.)
III ступень: отбор продукции в первичной упаковке (ампул,
флаконов, туб, контурных упаковок и др.).
Для расчета отбора количества продукции на каждой ступени
используют формулу 0,4 Vn, где п — количество упаковочных еди-
ниц данной ступени одной серии (партии). Полученное в результате
подсчета по формуле дробное число округляют в сторону •увеличе-
ния до целого числа, которое должно быть не менее 3 и не более 30.
Из отобранных на последней ступени упаковочных единиц после
контроля по внешнему виду берут пробу (выборку) для исследова-
ния препарата на соответствие требованиям НД в количестве, не-
обходимом для 4 полных физико-химических анализов.
Отобранную пробу (выборку) упаковывают и хранят в соответ-
ствии с требованиями НД на лекарственное средство.
Проба лекарственных средств из расфасовки “Ангро” должна
представлять собой объединенные точечные пробы, взятые при-
мерно в равных количествах. Пробы отбирают из верхнего, сред-
него и нижнего слоев каждой упаковочной единицы, убеждаются
в однородности точечных проб и смешивают их.
Пробы отбирают пробоотборником, изготовленным из матери-
ала, не реагирующего с данным лекарственным средством.
Проба — это количество нештучной продукции, отобранной от
контролируемой серии, состоящей из нескольких точечных проб.
Выборка — количество штучной продукции, отобранной из кон-
тролируемой серии (партии).
Упаковочная единица — упаковка, содержащая установлен-
ное количество продукции.
Точечная проба — количество нештучной продукции, отобран-
ной одномоментно.
22
Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, раство-
1 ры, экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе
Лроизводства, могут быть контаминированы микроорганизмами
ж должны быть испытаны иа микробиологическую чистоту, кото-
рая включает количественное определение жизнеспособных бак-
терий и грибов, а также выявление определенных видов микроор-
ганизмов, наличие которых недопустимо в нестерильных лекар-
ственных средствах. От каждой серии лекарственного средства
(независимо от ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г
(мл), состоящую из равных разовых проб, взятых из минимум
10 разных упаковок. Для одного анализа лекарственного средства
используют отдельные образцы по 10 г (мл) для каждого раздела
исследования. Всего для проведения одного анализа используют
30 г (мл) лекарственного средства.
Для ряда лекарственных средств (антибиотиков, мягких ле-
карственных форм и др.) отбирают от каждой серии среднюю
пробу не менее 15 г, состоящую из равных разовых проб, взятых
из не менее чем 10 разовых упаковок. Для одного анализа ис-
пользуют образцы по 3 г (мл) для каждого раздела исследования.
Всего для проведения одного анализа используют по 9 г (мл) ле-
карственного средства.
Изъятие лекарственных форм на анализ оформляют актом от-
бора средней пробы.
На оптовых базах (складах) отбор проб на анализ проводят
провизоры-аналитики контрольных испытательных лабораторий
(отделов, центров) или контролеры по качеству аптечных баз. При
отборе проб на анализ составляется акт изъятия по форме:
АКТ от “_____”г.
изъятия образцов на анализ из
(наименование аптечных учреждений, отдела аптечной базы)
в контрольно-аналитическую лабораторию (Центр)
№ п/п Наименова- ние лекар- ственного средства № серии или партии Количество препаратов в партии, серии Изгото- витель Постав- щик Коли- чество, сданное на ана- лиз
1 2 3 4 5 6 7
СДАЛ:
М.П.
ПРИНЯЛ:
М.П.
Акт составляется в трех экземплярах. Первый экземпляр ос-
тается в организации, учрфжДенй*Г, сдавшем на ашицсзгцремарат,
, i а’ >•
i..-.- . i 23
i £> 11 > _
второй экземпляр — в лаборатории, третий экземпляр отдается
из лаборатории после таксировки поставщику.
Кдк правило, в штате приемного отдела аптечного склада (базы)
или при наличии контрольной испытательной лаборатории в штате
лаборатории в зависимости от объема работы выделяются два про-
визора: один — по отбору проб, другой занимается запросами не-
обходимых документов по качеству и контролирует судьбу забра-
кованной продукции (информирует сеть о браках, изымает забра-
кованную продукцию, возвращает поставщику и т. д.).
Все поступающие; акты изъятия в контрольной испытательной
лаборатории регистрируются в специальном журнале по форме:
№ п/п и № акта сдачи на анализ Дата по- ступления лекарств на анализ Наименова- ние постав- щика Количе- ство серий, сданных на анализ Количе- ство наи- менова- ний № доку- мента и дата воз- врата про- дукции
1 2 3 4 5 6
После поступления образцов иа анализ производится их иссле-
дование на соответствие требованиям НД. Образцы на анализ по-
ступают с паспортами качества заводов-изготовителей или серти-
фикатами зарубежных фирм.
Согласно требованиям приказа М3 СССР от 31.03.86 г. № 437
“О введении в действие инструкции “О порядке входного контроля
качества сырья, материалов, контроля за производством, приемки
готовой продукции и введения документации ОТК фармацевтичес-
ких фабрик (производств), аптечных управлений системы М3 СССР”
аналитический паспорт оформляется по установленной форме:
Название предприятия______________________________________
Аналитический паспорт №____
Наименование препарата (сырья)________________________________
Серия №_______________________________;_______________________
Масса, количество_____________________________________________
Поставщик (цех)_______________________________________________
Анализ выполнен по____________________________________________
(номер НД)
№ п/п Наименование показателей Норма по НД Результаты испытаний
1 2 3 4
Начальник ОТК или
Зав. контрольной испытательной лабораторией
24
Согласно указанному приказу предприятия должны использо-
вать в производстве сырье, обязательно проконтролированное по
всем показателям качества, предусмотренным требованиями НД
(ГФ, ФС-42, ВФС-42, ГОСТ).
Номер аналитического паспорта должен соответствовать поряд-
ковому номеру анализа по журналу.
В процессе производства ОТК проверяет соответствие требова-
ний технологического регламента и фактического ведения произ-
водства препарата.
Каждой серии изготавливаемой продукции в цехе (на участке)
присваивается номер. Нумерация серий начинается с января с
№ 1 для каждого наименования продукции. Номер серии образу-
ется из порядкового номера и цифры, обозначающих месяц изго-
товления продукции и двух последних цифр года изготовления.
Все цифры наносятся последовательно и слитно.
За одну серию настоек и жидких экстрактов считают продук-
цию, полученную из одного или нескольких перколяторов при
загрузке сырья одной серии, при этом объем продукции в серии
определяется по емкости отстойника. В случае изготовления про-
дукции в перколяторах небольшой емкости за одну серию счита-
ют продукцию массой не более 1000 кг.
За одну серию растворов считают продукцию, полученную из
одной емкости при одной загрузке сырья. В случае изготовления
растворов в небольших емкостях за одну серию считают продук-
цию массой не более 100 кг.
За одну серию мазей считают продукцию, полученную из од-
ной емкости при одной загрузке сырья. В случае изготовления
мазей в небольших емкостях за одну серию считают продукцию
массой не более 500 кг.
За одну серию таблеток принимают продукцию таблеточной
массы из одного смесителя. При наличии смесителей небольшой
емкости за одну серию считают продукцию массой не более 200 кг.
За одну серию растворов для инъекций считают количество
ампул (бутылок), раствор которых был приготовлен в одной ем-
кости при одной загрузке сырья. В случае поступления лекар-
ственного растительного сырья местной заготовки малыми парти-
ями разрешается объединять одноименное сырье до массы 200 кг
и под одной серией после его смешения.
Обеспечивая право граждан на медицинскую и лекарственную
помощь, государство обязано гарантировать соблюдение опреде-
ленных стандартов качества, приравненных к мировым. Выпол-
нять эту задачу призвана “контрольно-разрешительная система”.
25
Наряду с усилением контроля за качеством лекарственных
средств, поступающих в аптечную сеть всех регионов России, важ-
ное значение приобретает работа по обеспечению качества лекар-
ственных средств на промышленных предприятиях в процессе их
производства.
Во исполнение Федерального закона “О лекарственных сред-
ствах” разработан и утвержден стандарт отрасли ОСТ № 42-510-98
“Правила организации производства и контроля качества лекар-
ственных средств” (GMP), который по уровню требований не ус-
тупает аналогичным документам стран Европейского Союза, США,
ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения).
Введение и соблюдение на предприятиях фармацевтической
промышленности “Правил организации производства и контроля
качества лекарственных средств” (GMP) должно обеспечить про-
изводство лекарственных средств на современном уровне и гаран-
тировать высокое качество лекарств, что позволит России присо-
единиться к “Конвенции о взаимном признании инспекций в об-
ласти производства лекарственных средств”.
Предполагается, что для действующих в настоящее время фар-
мацевтических предприятий необходимо осуществлять поэтапное
введение Правил GMP с полным завершением работ к 2005 г.
GMP расшифровывается как Good Manuf acturind Practice (хоро-
шая [или надлежащая, или добротная] производственная практи-
ка) и означает правила, методические указания или официаль-
ные требования к организации фармацевтического производства,
нацеленные на обеспечение качества продукции с самого начала
производственного цикла. Правила GMP носят системный и про-
филактический характер, так как направлены на предотвраще-
ние ошибок и отклонений путем учета всех факторов, способных
отрицательно повлиять на качество готовой продукции.
В Директиве 89/34/ЕЕС Европейского сообщества отмечается,
что “качество лекарственных продуктов должно определяться с
соблюдением принципов GMP”.
В основе концепции GMP лежит понимание ограниченных воз-
можностей контроля качества лекарственных препаратов путем
лабораторного испытания образцов готовой продукции. Основным
недостатком контроля качества посредством анализа конечного
продукта является условность перенесения оценки испытанных
образцов на контролируемую серию продукции.
Основная идея GMP — “Не предполагай!” Иначе говоря, все
должно быть проверено, перепроверено и задокументировано.
Процессы должны быть “валидированы”, оборудование подверга-
ется “квалификации”, контрольно-измерительная аппаратура под-
26
лежит “калибровке”, к поставщикам все чаще направляются ауди-
торские проверки.
Содействуя выработке продукции, однородной внутри серий и
между сериями, правила GMP существенно повышают значи-
мость выборочного анализа готовой продукции при всех видах
контроля, — выходного (на предприятии-изготовителе), потреби-
тельского и государственного.
Понятия GMP “обеспечение качества” и “контроль качества”
тесно связаны, так что трудно определить одно из них, не затра-
гивая другого.
Качество фармацевтического порядка — это пригодность для
предназначенного применения и соответствие всем положениям
регистрационного досье и официальных стандартов.
Обеспечение качества — это совокупность организационных
механизмов, имеющих целью обеспечить такое положение, при
котором продукты по качеству отвечали бы предназначенному
применению.
Контроль качества — это часть обеспечения качества, включа-
ющая методы отбора проб, спецификации, методы испытаний,
организацию процесса, принятие решений относительно приемки
или браковки.
Правила GMP нацелены, прежде всего, на снижение риска,
присущего фармацевтическому производству, который нельзя пол-
ностью устранить посредством испытания готового продукта.
В сфере контроля качества действуют следующие принципы
правил GMP:
— на предприятии имеется отдел контроля качества, не зави-
симый от производственного отдела и располагающий всеми не-
обходимыми ресурсами для отбора образцов анализа сырья, ис-
ходных материалов и готовой продукции;
— все контрольные операции (отбор образцов, анализы и ис-
пытания) проводятся уполномоченными на то сотрудниками в со-
ответствии с утвержденными инструкциями и спецификациями;
— ни одна серия готовой продукции не может быть выпущена
в реализацию без удостоверения, выданного специально уполно-
моченным на то лицом, свидетельствующего о том, что она соот-
ветствует всем требованиям регистрационного досье;
— сохраняется достаточное для повторного контроля количе-
ство образцов сырья, исходных материалов и готовой продукции;
— предприятие регулярно подвергается самоинспектированию.
Обеспечение качества — это мера доказательства надежности
системы качества.
Концепция в GMP является гибкой и учитывает местные усло-
вия, особенности конкретного предприятия.
27
Внедрение правил GMP — это средство достижения устойчи-
вого высокого качества продукции.
В целях совершенствования порядка сертификации лекарствен-
ных средств, обеспечения полного его соответствия требованиям
законов РФ “О сертификации продукции и услуг” и “О защите
прав потребителей”, исключения дублирования и упрощения про-
цедуры сертификации во всех регионах России разработана “Сис-
тема сертификации ГОСТ Р”.
Система сертификации лекарственных средств и Правила сер-
тификации лекарственных средств утверждены М3 РФ, одобрены
Коллегией Госстандарта России, зарегистрированы Минюстом
России и введены в действие с 1 декабря 1998 г.
Система сертификации лекарственных средств является обя-
зательной и служит для защиты интересов потребителей, приме-
няющих лекарственные средства (рис. 1.4).
Положение о Системе сертификации лекарственных средств ус-
танавливает основные цели, принципы, состав, требования и пра-
вила Системы обязательной сертификации лекарственных средств,
Системы сертификации ГОСТ Р, разрешенных к медицинскому при-
менению и зарегистрированных в РФ (далее — Система).
Система применяется для сертификации лекарственных средств
(ЛС) отечественного и зарубежного производства, разрешенных к
применению в медицинской практике и имеющих регистрацион-
ное удостоверение М3 РФ. ЛС в контексте настоящего Положе-
ния — субстанция, готовое нерасфасованное лекарственное сред-
ство (“ангро”), готовая лекарственная форма, кроме медицинских
иммунобиологических препаратов.
Сертификации подлежат ЛС серийного производства:
— выпускаемые предприятиями различных форм собственно-
сти на территории РФ;
— ввозимые на территорию РФ из-за рубежа.
Орган управления Системой сертификации
лекарственных средств
--- Центральный орган по сертификации ------------
--- Орган по сертификации ---
--- Контрольная (испытательная) лаборатория ------
___ Заявитель (организация, производящая _________
или реализующая лекарственные средства)
Рис. 1.4. Структурная схема участников Системы сертификации лекарствен-
ных средств
28
Сертификация ЛС — процесс компетентного и авторитетного
подтверждения безопасности и соответствия качества ЛС требова-
ниям НД специально аккредитованными органами сертифика-
ции ЛС. Она состоит из двух взаимосвязанных частей: сертифи-
кации соответствия производства (систем качества) и сертифика-
ции соответствия ЛС.
Орган управления системой сертификации лекарственных
средств (ОУ) — М3 РФ. ОУ создает систему сертификации ЛС,
устанавливает правила процедуры и управления для проведения
сертификации соответствия производства (систем качества) ЛС и
сертификации соответствия ЛС, проводит аккредитацию й инс-
пекционный контроль органов (центров) по сертификации ЛС и
контрольных (испытательных) лабораторий (центров контроля).
Центральный орган по сертификации (ЦО) назначается ОУ и
функционирует на базе организации, имеющей статус юридичес-
кого лица и обладающей возможностями, обеспечивающими его
деятельность в системе.
Орган по сертификации (ОС) — аккредитованный орган, воз-
главляющий работы по сертификации ЛС; аккредитуется ОУ по
представлению федеральных или региональных органов испол-
нительной власти.
Система сертификации ЛС является обязательной и служит
для защиты интересов потребителей, применяющих ЛС по ме-
дицинским показаниям.
Сертификация ЛС проводится аккредитованными в системе ОС
на основании протоколов анализов, выданных аккредитованны-
ми испытательными лабораториями.
При сертификации ЛС применяются схемы сертификации, при-
нятые в “Порядке проведения сертификации продукции в РФ” и
в изменении № 1 к нему:
— схема 5 — испытания типа — сертификация системы каче-
ства, контроль сертифицированной системы качества (производ-
ства); испытания образцов, взятых у продавца и (или) изготови-
теля;
— схема 6 — рассмотрение декларации в соответствии с при-
лагаемыми документами — сертификация системы качества; кон-
троль сертифицированной системы качества;
— схема 7 — испытание партии;
— схема 8 — испытание каждого образца;
— схема 10 — рассмотрение декларации о соответствии с при-
лагаемыми документами плюс испытание образцов, взятых у из-
готовителя или продавца.
29
Выбор схемы сертификации в каждом конкретном случае оп-
ределяется в соответствии с инструкциями М3 РФ, регламенти-
рующими порядок проведения контроля качества и сертифика-
ции ЛС.
Для проведения сертификации лекарственных средств заяви-
тель подает заявку в орган по сертификации, к которой должны
быть приложены следующие документы:
— регистрационное удостоверение М3 РФ с разрешением на
применение ЛС в медицинской практике;
— лицензия на право производства (реализации) ЛС;
— акт отбора средней пробы (в соответствии с требованиями
ГФ XI, вып. 2);
— протокол анализа изготовителя (для отечественных ЛС) или
сертификат анализа фирмы и его перевод (для зарубежных ЛС) с
результатами проверки качества ЛС на соответствие требованиям
НД при выпуске.
ОС на основании заявки проводит работу по подготовке серти-
фикации ЛС, которая включает в себя:
— регистрацию заявки;
— определение количества, порядка отбора образцов, подле-
жащих испытаниям, и объема испытаний в соответствии с требо-
ваниями действующего приказа М3 РФ;
— определение схемы сертификации;
— определение контрольной (испытательной) лаборатории, ко-
торой поручается проведение испытаний.
Испытания (контроль качества) ЛС проводятся контрольной
(испытательной) лабораторией и включают следующие работы:
— проведение испытания ЛС;
— обработка результатов контроля.
По результатам испытаний лаборатория направляет в орган по
сертификации протокол анализа. Результаты анализа оформля-
ются на бланках, форма которых представлена на схемах 1—4.
Схема 1
Форма бланка результатов исследования химико-
фармацевтических лекарственных средств (субстанций)
(наименование испытательной лаборатории, адрес, телефон)
№ аттестата аккредитации ис-
пытательной лаборатории и
дата его выдачи М3 РФ
30
ИССЛЕДОВАНИЕ №_____________________________
(№ по журналу регистрации)
Наименование лекарственного
средства и его количество_____________________________________
Поставщик_____________________________________________________
Изготовитель__________________________________________________
Серия_________________________________________________________
Срок годности_________________________________________________
Описание, растворимость_______________________________________
Подлинность______________________________________________________
Прозрачность и цветность_________________________________________
Хлориды Сульфаты
Соли кальция Соли железа
Соли аммония Соли циика
Соли тяжелых металлов________________________________________
Испытание иа мышьяк__________________________________________
Числовые показатели Найдено Должно быть по НД
1. Температура кипения, плавления
2. Сульфатная зола
3. Потеря в массе при высушивании
4. Плотность
5. Показатель преломления
6. Удельное вращение
7. Кислотное число
8. pH раствора
9. Йодное число
10. Число омыления
11. Содержание спирта
12. Количественное содержание
Заключение по образцу:_______________________________________
отвечает требованиям ________________________________________
(№ НД)
м п
Зав. контрольной испытательной лабораторией
Провизор-аналитик
31
Схема 2
Форма бланка результатов анализа растворов
лекарственных средств в ампулах, флаконах,
тюбик-капельницах
(наименование испытательной лаборатории, адрес, телефон)
№ аттестата аккредитации ис-
пытательной лаборатории и
дата его выдачи М3 РФ
ИССЛЕДОВАНИЕ №_____________________________
(№ по журналу регистрации)
Наименование и количество ____________________________________
Поставщик ____________________________________________________
Изготовитель__________________________________________________
Серия Срок годности
Описание:_____________________________________________________
Подлинность:__________________________________________________
Цветность: окраска раствора превышает эталона №
Наполнение:_________________
Маркировка и упаковка:________________________________________
Просмотрено ампул, механических примесей
Должно быть_________________
В 1 мл содержится Найдено Должно быть
pH среды
Заключение по образцу______________________________________
Отвечает требованиям_______________________________________
(№НД)
и ,,
Зав. контрольной испытательной лабораторией
Провизор-аналитик
32
Схема'З
Форма бланка результатов исследования
лекарственного растительного сырья
(наименование испытательной лаборатории, адрес, телефон)
№ аттестата аккредитации ис-
пытательной лаборатории и
дата его выдачи М3 РФ
ИССЛЕДОВАНИЕ №______________________________
(№ по журналу регистрации)
Наименование лекарственного сырья
Поставщик ____________________________________________________
Заготовитель^_________________________________________________
Дата заготовки Срок годности.
Внешние признаки______________________________________________
Микроскопия_______________________________________________
Упаковка ___________________________________________________
Маркировка _________________________________________________
Числовые показатели Найдено Должно быть
1. Влага
2. Общая зола
3. Зола, не растворимая в соляной кислоте
4. Экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом
5. Измельченных частей, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий мм
6. Почерневших и побуревших частей
7. Других частей растения
8. Органических примесей
9. Минеральных примесей
10. Наличие амбарных вредителей
11. Эфирных масел
12. Радиоактивность
13. Количественное содержание действую- щего вещества
3. Заказ 3547
33
Заключение по образцу _________________________________________
Отвечает требованиям___________________________________________
(№НД)
Зав. контрольной испытательной лабораторией
Провизор-аналитик
Схема 4
Форма бланков исследований иа таблетки и капсулы
(наименование испытательной лаборатории, адрес, телефон)
№ аттестата аккредитации ис-
пытательной лаборатории и
дата его выдачи М3 РФ
ИССЛЕДОВАНИЕ №_____________________________
(№ по журналу регистрации)
Наименование и количество______________________________________
Поставщик______________________________________________________
Изготовитель___________________________________________________
Серия Срок годности
Физические свойства____________________________________________
Средняя масса таблетки_________________________________________
Отклонение от средней массы таблетки
Реакция идентичности___________________________________________
Реакция чистоты________________________________________________
Распадаемость должно быть
Количественное содержание Найдено Должно быть
Заключение по образцу_________________________________________
Отвечает требованиям__________________________________________
(№НД)
Зав. контрольной испытательной лабораторией
Провизор-аналитик
34
На территории РФ вводится сертификат соответствия ЛС еди-
ного образца, который выдается органами по сертификации, ак-
кредитованными федеральным органом исполнительной власти в
сфере здравоохранения.
Сертификат соответствия действует на территории, подведом-
ственной органу по сертификации, выдавшему сертификат, и вы-
дается сроком на 1 год; при необходимости он может быть продлен.
Органы по сертификации признают протоколы анализов, вы-
данные любой территориальной лабораторией, аккредитованной
федеральным органом исполнительской власти в сфере здравоох-
ранения, в том случае, если анализ выполнен по всем показате-
лям, предусмотренным НД.
ЛС, имеющие сертификаты соответствия, выданные любым
органом по сертификации, при поступлении по месту назначе-
ния подвергаются контролю только по показателям: “Описание”,
“Упаковка”, “Маркировка”, т.е. допускается взаимопризнание сер-
тификатов соответствия, выданных разными органами по серти-
фикации.
При отпуске ЛС непосредственно со склада заявителя допуска-
ется, по его ходатайству, переоформление сертификата соответствия
на организацию, являющуюся покупателем. Переоформление мо-
жет проводить только орган по сертификации, выдавший сертифи-
кат соответствия в течение
срока его действия.
При поставках в аптеч-
ные организации ЛС долж-
но сопровождаться серти-
фикатом соответствия или
его копией, заверенной
оригинальной печатью
фирмы, на имя которой
выдан сертификат.
Сертификат соответ-
ствия выдается по утвер-
жденной форме (см. при-
ложение 3 к Положению
о Системе сертификации
лекарственных средств).
ЛС, поставляемые оте-
чественными производите-
лями или зарубежными
фирмами, длительное вре-
мя работающими на рос-
Система серткфккацш ГОСТ Р
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
УПРАВЛЕНИЕ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ
ОРГАН ПО СЕРТИФИКАЦИИ
(НАЗВАНИЕ)
СЕРТИФИКАТ СООТВЕТСТВИЯ
РУКОВОДИТЕЛЬ ОРГАНА
ПО СЕРТИФИКАЦИИ
МД._______________________.
(маямъ)
ЭКСПЕРТ
(пн>кк)
3*
35
сийском рынке и не имеющими претензий к качеству выпускае-
мой ими продукции, & также фирмы, работающие с ними по пря-
мым контрактам, для реализации продукции через аптечную сеть
могут получить сертификат соответствия в органе по сертифика-
ции на основании протокола анализа ОТК (для отечественных про-
изводителей) или сертификата анализа (для зарубежных произ-
водителей) после проверки по показателям: “Описание”, “Упаков-
ка”, “Маркировка”.
В случае реализации этой продукции через посреднические
организации последние при поставке лекарственных препаратов
в аптечную сеть обязаны получить сертификат соответствия с
проведением анализа по всем показателям.
Продукция фирм и предприятий, освобожденных от посернй-
ного контроля, переводится ОУ на последующий выборочный кон-
троль в ГНИИСКЛС.
Лекарственные средства без сертификата соответствия не под-
лежат реализации на территории РФ.
Во всех случаях, когда территориальные контрольные лабора-
тории не могут оценить качество лекарственных средств в соот-
ветствии с требованиями НД, образцы этих ЛС с сопроводитель-
ными документами направляются в ГНИИСКЛС.
При одновременном поступлении иа сертификацию более.5 се-
рий ЛС одного наименования контроль качества по всем показа-
телям может проводиться выборочно (для каждой третьей, пятой
и т.д. серии) в зависимости от размера партии. При наличии по-
ложительных результатов оценка качества остальных серий мо-
жет быть проведена по показателям: “Описание”, “Подлинность”,
“Упаковка”, “Маркировка”. ЛС для инъекций и глазные капли
дополнительно подвергаются обязательному посерийному конт-
ролю по показателям: “pH” и “Механические включения”. Серти-
фикат соответствия при этом выдается на всю поступившую
партию. Обязательному контролю по всем показателям подле-
жат:
— лекарственные вещества, используемые для изготовления
ЛС в условиях аптек;
— наркотические ЛС (субстанции и лекарственные формы);
— ЛС для наркоза (в том числе и ингаляционного), за исклю-
чением кислорода и закиси азота;
— лекарственные формы для детей;
— препараты инсулина;
— рентгеноконтрастные средства.
Лекарственное растительное сырье независимо от формы его
выпуска должно проверяться на соответствие требованиям ГФ XI
36
И утвержденного НД по показателям ‘‘Подлинность’’', “Измель-
ченность”, “Содержание примесей”, “Степень зараженности ам-
барными вредителями” и на радиоактивность. Радиоактивность
проверяется согласно требованиям ВДУ-93 (“Временно допусти-
мый уровень содержания радионуклидов *Т(езия-134, -137, строп-
дня-90) Государственного комитета РФ санитарно-эпидемиологи-
ческого надзора. Норма радиоактивности — не более 6000 бекке-
релей на 1 кг лекарственного сырья.
На основании заключения контрольной лаборатории постав-
щику (изготовителю) может быть предъявлена претензия. ЛС долж-
ны реализовываться в сроки, указанные в НД. Продление сроков
годности для ЛС не допускается.
Орган по сертификации ЛС ведет учет выдаваемых им серти-
фикатов на основании правил учета и хранения бланков строгой
отчетности и направляет информацию о них в орган управления.
Образцы ЛС должны направляться в контрольную лаборато-
рию с протоколом анализа отдела технического контроля пред-
приятия-изготовителя (для отечественных), оригиналом или за-
веренной копией сертификата фирмы (для зарубежных) и актом
отбора средней пробы.
Результаты испытаний оформляются в виде протоколов анали-
за, который должен отражать фактические данные эксперименталь-
ной проверки, иметь заключение о соответствии требованиям НД и
должен быть подписан руководителем контрольной лаборатории.
Реестр — это книга (электронный журнал), содержащая сведе-
ния об объектах, участниках работ и документов в области серти-
фикации ЛС.
Ведение реестра осуществляет федеральный орган исполнитель-
ной власти в сфере здравоохранения. Он же является держателем
регистрационных номеров реестра.
Информация о сертификации ЛС на основании данных реест-
ра публикуется в периодических изданиях федерального органа
исполнительной власти в сфере здравоохранения и специальных
информационных сборниках.
В связи с введением в действие с 01.12.98 г. Системы серти-
фикации лекарственных средств (Системы сертификации ГОСТ Р)
Департамент государственного контроля качества, эффективнос-
ти, безопасности лекарственных средств и медицинской техники
(письмо № 29-4/2281 от 01.12.98 г.) информирует, что сертифи-
каты соответствия на ЛС, действующие на всей территории Рос-
сийской Федерации, оформляют следующие учреждения:
— Центр по сертификации лекарственных средств М3 РФ
(г. Москва);
37
— Центр сертификации и контроля качества лекарственных
средств (г. Москва);
— ГУЗ “Северо-Западный центр по контролю качества и серти-
фикации лекарственных средств” (г. Санкт-Петербург).
Сертификаты соответствия, действующие на территории опре-
деленного региона, оформляются органом по сертификации этого
региона.
Допускается взаимопризнание сертификатов соответствия, вы-
данных органами по сертификации других регионов.
Оформление сертификатов соответствия на ЛС (кроме иммуно-
биологических препаратов), поставляемые отечественными про-
изводителями (приложение 1) или зарубежными фирмами (при-
ложения 2 и 3), освобожденными от посерийного контроля Де-
партаментом государственного контроля ЛС и медицинской тех-
ники, осуществляется в соответствии с п. 7 Правил проведения
сертификации.
Выданные сертификаты соответствия на лекарственные сред-
ства действительны в течение срока, указанного в сертификате.
Приложение 1
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, освобожденных от посерийного контроля
№ п/п Наименование предприятия
1 2
1
2
3
4
5
6
ОАО «Нижфарм»
ОАО «Ай Си Эн Октябрь»
ОАО «Ай Си Эн Полифарм»
ОАО «Ай Си Эн Марбиофарм»
ОАО «Ай Си Эн Лексредства»
ОАО «Ай Си Эн Томский химфармзавод»
7 Экспериментальное производство медико-биологических пре-
паратов Российского кардиологического научно-производствен-
ного комплекса
8 ФГИ «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А. Семашко
9 ГУП «Иммунопрепарат»
10 НПО «Вирион»
11 НПО «Биомед»
12 ОАО «Уфа-Вита»
13 ЗАО «Брынцалов А»
14 ОАО «Московская фармацевтическая фабрика»
15 ОАО «Красногорсклексредства»
16 ОАО «Новосибхимфарм»
17 Московский эндокринный завод
18 ЗАО «Алтайвитамины»
38
J_J____________________________2___________________________
19 ГП «Нижегородская фармфабрика»
20 ОАО «ХФК Акрихин»
21 ОАО «Щелковский витаминный завод»
22 ПХФО «Татхимфармпрепараты»
23 Производственно-экпериментальный завод «ВИЛАР»
24 АООТ ХФП «Фармакон»
25 ЗАО «Верофарм» (ранее АО «Воронежхимфарм»)
26 ОАО «Красфарма»
27 Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и
изделий «Синтез»
28 АООТ «Тверская фармфабрика»
29 Тюменский химфармзавод
30 НПЦ «фармзащита»
31 АО «Лекформ»
32 Завод «Фармадон »
33 АООТ «Восток»
34 АО «Уралбиофарм»
35 ЗАО «Ставропольмедифарм»
36 АО «Асфарма»
37 Покровский завод биопрепаратов
38 АООТ «Новосибирский завод медпрепаратов»
39 ЗАО «Ярославская фармфабрика»
40 ГОП «Пермфармация»
41 Усолье-Сибирский химфармкомбинат
42 ГНЦ по антибиотикам (экспериментальный завод)
43 АОЗТ «Мелиген»
44 АО «Самсон»
45 Дочернее государственное унитарное производственное
предприятие «Вектор-Фарм» (ранее ГНЦ ВБ «Вектор»)
46 Ирбитский ХФЗ
47 АО «Самарская фармфабрика»
48 ЗАО «Ростовская фармфабрика»
49 ГП «Пятигорская фармфабрика»
50 Нижегородское предприятие по производству бактерийных
препаратов — фирма «ИМБИО»
51 Екатеринбургское предприятие по производству бактерийных
препаратов
52 ГУП «Аллерген»
53 АО «Биомед им. Мечникова
54 Лужский завод «Белкозин»
55 ТОО «Эколаб»
56 Казанское предприятие по производству бактерийных
препаратов
57 Иркутское предприятие по производству
иммунобиологический препаратов
39
58 Белебеевский мясо-молочный комбинат
59 Омское предприятие по производству бактерийных препаратов
60 ОАО «Фармфабрика», г. Краснодар
61 Фирма «Перфторан»
Приложение 2
ПЕРЕЧЕНЬ
зарубежных фирм, освобожденных от посерийного контроля
№ п/п Наименование фирмы Страна
1 2 3
1 Ай Си Эн Фармасьютикалс Инк, корпо- рация (Ай Си Эн Алкалоида, Ай Си Эн Галеника, Ай Си Эн Польфа Жешув) США, Польша, Венгрия, Югославия
2 Алкалоид Македония
3 Алкой (Алкон Куврер, Алкон Лабораториз) Бельгия, США
4 Альфа Вассерманы СПА Италия
5 Американ Драг Компаии США
6 Амун Фармасьютикалс Индастриес Ко Египет
7 Анжелини Франческо Италия
8 Анкерфарм ГмбХ Германия
9 Апджон Бельгия, США, Ита- лия, Великобритания
10 Алик США Корпорейши США
11 Апотекс Инк Канада
12 Арес-Сероно Групп Швейцария
13 Аста Медика Германия, Великобритан ия
14 Астра Швеция
15 Австралии Германия
16 Б. Браун Мельзунген АГ Германия
17 Байер Германия
18 Бакстер (Бакстер Хелскэйр Лимитед, Бакстер Корпорейшн, Бакстер) США, Великобрита- ния, Франция, Ирлан- дия
19 Белупо Хорватия
20 Берингер Ингельхайм Интернэшнл (Берингер Ингельхайм КГ, Берингер Ингельхайм Фарма КГ, Берингер Ин- гельхайм Италия С.п.а., Берингер Ингельхайм С.А.Р.Л., Берингер Ин- гельхайм Эллас А.Е., Фарматон С.А.) Германия, США, Италия, Греция, Франция, Швейцария
21 Берингер Майнхайм ГмбХ Австрия, Германия
22 Би Ди Ай Фармасьютикалс, филиал Боди дайиэмикс Инк Фармасьютикалс США
23 Бик Гульден Ломбере Чимини Фабрик Германия
40
1 1 2 1 §
24 Биогал Венгрия
25 Бионорика ГмбХ Германия
26 Биохеми ГмбХ Австрия
27 Бофур Ипсен Интернасионал Франция
28 Бристол Майерс Сквибб (Бристол Майерс Е.Р. Сквибб энд Санс Лтд, Бристол Майерс Сквибб, Бристол Майерс Барселонета Инк, Лаборатория Упса) США, Канада, Италия, Германия, Франция, Австрия, Греция, Испания
29 Бутс Хелскеар Интернейшнл (Герман Курт, Бутс Хелскеар-Интернейшнл) Великобритания, Германия
30 Ваймер Фарма Гмбх Германия
31 Вайтех Америка Корпорейшн США
32 Вайт-Ледерле Цианамид (Ледерле, Ледерле Лабораториз, Вайтхолл) США, Канада, Австрия
33 Вифор Интернэшнл Инк Швейцария
34 Галена, кроме препарата «Ново- Пассит, раствор» Чехия
35 Гедеон Рихтер Венгрия
36 Гексал АГ Германия
37 Генрих Мак Наследник Германия
38 Геифарм Канада
39 Глаксо Вэллком (Глаксо Вэллком, Глаксо, Глаксо Вэллком Оперэйшнс, Глаксо Вэллком Са., Глаксо Вэллком Лабораториз) Великобритания, Испания, Италия, Франция
40 Грюненталь Гмбх Германия
41 Дабур Индия
42 Даичи Фармасьютикал Ко. Лтд. Япония
43 Дева Холдинг АС Турция
44 Деч Гретер АГ Швейцария
45 Долоргит Германия
46 Домако Др, Ауфдемаур СА Швейцария
47 Д-р Каде Германия
48 Д-р Реддис Лабораторис Лтд Индия
49 Д-р Фальк Фарма Гмбх Германия
50 Др. Б. Шеффлер Гмбх Германия
51 Евро Цетус Нидерланды
52 Евродрат Лабораториз СА Бельгия
53 Замбон Групп Спа. Италия
54 Здравле Югославия
55 Зенека Лимитед Великобритания
56 Зорка-Фарма Югославия
57 Иннотек Интернасиональ Франция
58 Италфармако Италия
59 Квайзер Фарма Гмбх и Ко. Германия
41
1 1 2 1 з
60 Кернфарм интернэшнл Б. В. Нидерланды
61 Кийова Хакко Кош о Ко. Лтд. Япония
62 Кисеей Фармасьютикал Ко. Лтд. Япония
63 Клей-Парк Лабе Инк. США
64 Кнолль (Кнолль АГ, Васф Фарма, Германия, Великобри-
Кнолль Фармасьютикалс) тания
65 Ковекс С.а. Испания
66 Кревель Мойзельбах ГмбХ Германия
67 Кресслер Фарма Германия
68 КРКА Словения
69 Лаборатория Г Фор, кроме препарата ♦Вита Иодурол трифосфадеиии, капли Франция
глазные»
70 Лаборатория доктора Е. Бушара Франция
71 Лаборатория Домс Адриан Франция
72 Лаборатория Лафаль Франция
73 Лаборатория Ложэ Франция
74 Лаборатория Роза-Фитофарма Франция
75 Лаборатория Фурнье Франция
76 Лайф Фарма Италия
77 Лаинахер Хейльмиттель Гмбх Австрия
78 Лек Словения
79 Лемери Мексика
80 Лечива Чехия
81 Лизафарма СПА Италия
82 ЛНК Иитернейшнл Иик США
83 Мадаус АГ Германия
84 Маевска Фармасьютикалс США
85 МакНейл Коисьюмер Продакте Компани США
86 Манхеттен Драг Компани США
87 Медифарма Германия
88 Медокеми Лтд. Кипр
89 Бероии-Хеми АГ/Группа Менарини Италия, Германия
90 Мерк Германия, США
91 Мерк Шарп и Доум США, Нидерланды, Италия
92 Меркле Гмбх Германия, Австрия
93 Мерц+Ко. Гмбх и Ко. Германия
94 Мук ос Фарма Германия
95 Мундифарма Гмбх Австрия, Германия
96 Натур Продукт * Франция '
97 Натурварен Германия
98 Никомед (Никомед Дак, Никомед Дания, Бельгия,
Кристиане, Никомед Денмарк АС, Ни- Австрия, Норвегия,
комед Имаджинг, Никомед Фарма АГ) Ирландия
42
1 1 2 1 з
99 Ниппон Кайаку Ко. Лтд. Япония
100 Новартис АГ (Сиба-Гейги, Сандоз,Сан- доз Фарма, Зима СА, Новартис Фарма АГ, Новартис Продакт АГ) Швейцария, Канада
101 Ново Нордиск Дания
102 Новофарм Лтд. Канада
103 Нортон Хелскеар Великобритания
104 Олиго Фарма Нидерланды
105 Органон (Органон Текника, Органон Лтд, Органон Илаклари) Нидерланды, Турция, Ирландия
106 Орион корпорейшн (Нойра, Фармос групп, Эркофарм АС) Финляндия
107 Парке-Дейвис Гмбх Германия
108 Перрриго компани США Аптека Инк США
109 Плива Хорватия
110 Поли Индустриа Химика СПА Италия
111 Прайвет Формулейшн Инк США
112 Про Мед ЦС Чехия
ИЗ Продотти Форменти СРЛ Италия
114 Промедика Франция
115 Пфайзер Интернейшнл (Пфайзер Инк, Пфайзер ГмбХ, Пфайзер Италиано СПА, Пфайзер СА, Пфайзер Канада Инк, Пфайзер Илаклари АС, Пфайзер Амбуаз) США, Турция, Бель- гия, Германия, Кана- да, Франция, Велико- британия, Италия
116 Пьер Фабр Медикамент Франция
117 Ратиофарм Гмбх Германия
118 Реанал Венгрия
119 Рексал Сандаун США
120 Ривофарм СА Швейцария
121 Робафарм АГ Швейцария
122 Рон-Пуленк Рорер (Рон-Пуленк Рорер, Файсонс, Наттерманн) Франция, США, Гер- мания, Великобрита-
НИЯ
123 Роттафарм 124 Руссель Моришита Ко. 125 С.И.Ф.И. СПА 126 С.К.А.Т. 127 Сан Фармасьютикал 128 Санифи-Винтроп Хиноин (Санофи- Виитроп ГмбХ, Санофи-Винтроп Индустри, Санофи-Винтроп, Хиноин) 129 Снгмел Инк. 130 Сервье 131 Серл (Серл, подразделение Монсанта ПЛС; Серл, подразделение Монсанта СА; Хойман Фарма) Италия Япония Италия Франция Индия Франция, Великобри- тания, Германия, Венгрия США Франция США, Германия
43
1 1 2 1 з
132 Синтелабо группе Франция
133 Словакофарма СА Словакия
134 Солвей (Солвей Фармасьютикалс БВ, Солвей Фармасьютикалс Гмбх, Солвей Фарма) Германия, Франция
135 Солко Базель АГ (Солко АГ, Солко Базель СА) Швейцария, Польша
136 Сомако (Сомако,Тассони Сомако) Франция
137 Такеда Кемикал Индастриз Лтд. Япония
138 Тева Фармасьютикал Иидастриаз Лтд. Израиль, Великобри- тания
139 Терабель Фарма (Терабель Люсьен Фар- ма, Терабель Фарма Лаборатория Тис- сен) Бельгия, Франция
140 Терумо Кори. Япония
141 Токио Танабе Ко. Лтд. Япония
142 Торрент Фармасьютикал Индия
143 Уолш США
144 Ф. Джо Квизда ГмбХ Австрия
145 Ф.Хоффман—Ля Рош (Хоффман—Ля Рош, Рош Продакте Лтд.) Швейцария, Герма- ния, Великобритания, США
146 Фаран Лабораторией АС Греция
147 Фармасайнс Инк Канада
148 Фармация Швейцария, Италия
149 Ферринг Фармасьютикалз (Феррииг Арциаймиттель ГМбХ, Феррииг-Лечи- ва СА, Ферринг А/С) Германия, Чехия, Дания
150 Ферросан Иитериейшил А/С Дания
151 Фоур Вентуре Интерпрайзес США
152 Фрезениус Германия
153 ХемоФарм Д Ц Югославия
154 Хехст Мэрион Руссель (Хехст АГ, Хехст Мэрион Руссель ГмбХ, Руссель Уклаф, Лаборатория Руссель, Лабора- тория Кассен, Руссель Лабораториес Лтд, Мэрион Мэрол Лтд, Группа Лепе- тит С.п.а. Мэрион Мэрол Даум, Тюрк Хехст, Хехст-Руссель Фармацеутикал) Германия, США, Тур- ция, Франция, Италия
155 Хуман Венгрия
156 Хухтамяки Финляндия
157 Хэлсмарк Групп Л.Л.С. США
158 ЦТ АрцнеймиТтель Германия
159 Шварц Фарма АГ Германия
160 Шеринг АГ (Лейрас АО, Йенафарм Гмбхэид Ко.КГ, Шерииг АГ) Германия, Финляндия
161 Шерииг Плау Интернейшил (Эссекс Кеми АГ) США, Бельгия
44
1 1 2 1 з
162 Эббот (Эббот лабораториес, Эббот лабо- раториес Б.В. Эббот Ирландия Лтд) США, Нидерланды, Италия, Франция, Испания, Ирландия, Великобритания
163 Эбеве Австрия
164 Эгис Венгрия
165 Эджзаджибаши Турция
166 Эли Лилли США, Германия, Испания, Франция, Великобритания, Венгрия, Италия
167 Эспарма Германия
168 Юнифарм Инк США
169 ЮС. Куолити Драг США
170 ЮСБ Бельгия
171 Яманучи Юрол Б.В., кроме препарата Нидерланды
«Пимафуцин, свечи вагинальные 100 мг»
172 Янссен-Силаг (Янссен Фармасьютика, Бельгия, Швейцария
Силаг АГ)
Приложение 3
ПЕРЕЧЕНЬ
предприятий стран Балтии, освобожденных от посерийного контроля
№ п/п | Наименование предприятия | Страна
1 АО «Олайифарм» Латвия
2 ПАО «Гриидекс» Латвия
3 ЗАО «Илсанта» Литва
В дополнение к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281 Департамент
государственного контроля качества, эффективности, безопасности
ЛС направляет дополнение к перечню зарубежных фирм, освобож-
денных Департаментом от посерийного контроля качества ЛС по
всем показателям (письмо Департамента № 293-22/2 от 04.02.99 г.)
ДОПОЛНЕНИЕ
к перечню зарубежных фирм,
освобожденных от посерийного контроля
№ п/п | Наименование фирмы | Страна
1 ♦Аркофарма лабораториес фармацевтик» Франция
2 Кьези фармацеутици С.П.А. Италия
3 Лаборатори Балдаччи С.П.А. Италия
4 Лаборатория Буарон Франция
5 Лахема А/О Чешская республика
6 С.С. Терапия С.А. Румыния
7 Солвей Фармасьютикалс Б.В. Нидерланды
8 СПА — Сочьета Про дот и Антибиотичи Италия
9 Югоремедия Югославия
45
Во изменение п. 145 приложения 2 к письму от 01.12.98 г.
№ 29-4/2281 следует читать:
145 Ф. Хоффман-Ля Рош («Ф. Хоффман- Ля Рош Лтд», «Рош Фонтене», «Рош С.п.А», «Дженетек Инк.», «Синтекс ФармАГ», «Хоффманн-Ля Рош Инк.», ♦Хоффман-Ля Рош АГ», «Рош С.А., Фонтене-Сью-Буа», «Рош Николас Б.В.», «Лаборатория Рош Николас СА.», «А. Наттерманн унд СИ ГмбХ») Швейцария, Франция, Италия, США, Герма- ния, Нидерланды
В дополнение к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281 Департамент
разрешает органам по сертификации ЛС выдавать сертификаты со-
ответствия на ЛС, поставляемые в Россию по прямым контрактам с
польскими фирмами-изготовителями (приложение к письму) в со-
ответствии с п. 7 Правил сертификации лекарственных средств.
При оформлении сертификатов соответствия на ЛС производ-
ства польских предприятий-изготовителей следует обратить осо-
бое внимание на наличие:
— прямых договоров с польскими фирмами на поставку ЛС;
— оригиналов сертификатов качества фирм-производителей;
— маркировки и инструкции по применению ЛС на русском
языке.
Приложение
к письму от 08.02.99 г. № 293-22/3
№ п/п| Наименование фирмы-изготовителя | Страна
1 Ай Си Эн Польфа Жешув А.А. Польша
2 Варшавский завод лекарственных растений Гербаполь, Прушкув Польша
3 Варшавский фармацевтический завод ПОЛЬФА Польша
4 ГлаксоВэллком Познань А.О. (ранее Познаньский фармацевтический завод) Польша
5 Гродзинский фармацевтический завод ПОЛЬФА Польша
6 Краковский фармацевтический завод ПОЛЬФА А.О. Польша
7 Кутновский фармацевтический завод ПОЛЬФА Польша
8 Люблинский фармацевтический завод ПОЛЬФА Польша
9 Пабяницкий фармацевтический завод ПОЛЬФА Польша
10 Польфа-Лодзь А.О. Польша
11 Санофи-Биоком т..о.о Польша
12 Солко-Базель Польша Польша
13 Тархоминский фармацевтический завод Польша
14 Фармаком компания с о.о Польша
15 Фармацевтический завод Ельфа А.О. Польша
16 Фармацевтический завод ПОЛЬФАРМА АО Польша
17 Фармацевтический Институт Польша
18 Фармацевтическое предприятие ТЕРПОЛЬ А.О. Польша
46
В изменение к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281 Департамент
направляет дополнение к перечням зарубежных фирм стран Бал-
тии, освобожденных Департаментом от посерийного контроля ка-
чества ЛС по всем показателям. Сертификацию ЛС производства
указанных фирм следует проводить согласно п. 7 Правил сертифи-
кации ЛС (письмо Департамента № 293-22/18 от 07.04.99 г.)
Приложение
к письму от 07.04.99 г. № 293-22/18
Дополнение к перечню зарубежных фирм
№ п/п| Наименование фирмы-изготовителя | Страна
1 «L.D.P.» Лаборатория Торлан А.Ж.Ц. Фарма Лаборатория Леркен 2 Фармавит Франция Испания Франция Франция Венгрия
Во изменение приложения 2 к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281
Департамент государственного контроля качества, эффективнос-
ти, безопасности ЛС сообщает, что пп. 9, 12, 17, 161 перечня
зарубежных фирм, освобожденных Департаментом от посерийно-
го контроля, следует читать:
№ п/п| Наименование фирмы | Страна ~
п. 9 Фармация и Апджон:
Апджон 'i Бельгия, США
Фармация и Апджон НВ/СА Бельгия
Фармация и Апджон Компании США
Н.В. Апджои С .А. Бельгия
Апджон Компани США
Фармация и Апджон Бельгия, Великобрит- ания, Швеция, Ита- лия, Австралия
Дельта Вест Швеция
Каби Фармация Швеция
Фармиталия Карло Эрба Италия
Фармация и Апджон ГмбХ Германия
Фармация и Апджон CfII.A. Италия
Фармация и Апджон АС Швеция
Фармация Италия, Франция, Швеция
Фармация и Апджон Пти Лтд. п. 12 Арес-Сероио груп Австрия
Лаборатуар Серове С. А. Италия
Индустрия Фармасеутика Сероно С.п.А Италия
47
2 1 з
Серон о Фарма С.п.А Лабораториез Сероно С.А. п. 17 Байер: Италия Испания
Байер АГ Байер Корпорэйшн Майлз Лтд. Байер Групп п. 161 Шеринг Плау Шеринг Плау Германия США Великобритания Бельгия, Португалия, Италия, США, Испа- ния, Италия
С.И.Ф. И СПА ЮСБ Фарма Б.В. Италия Нидерланды
пп. 148, 125 из перечня исключаются.
Дополнение к перечню предприятий стран Балтии
№ п/п| Наименование предприятия | Страна
1 АО «Таллинский фармацевтический завод» Эстония
Письмом Департамента № 293-22/24 от 07.05.99 г. во измене-
ние приложения 2 к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281 Департа-
мент государственного контроля качества, эффективности, безо-
пасности ЛС и медицинской техники сообщает, что п. 159 переч-
ня зарубежных фирм, освобожденных Департаментом от посерий-
ного контроля, следует читать:
П. 64 Кнолль (Кнолль АГ, Басф Фарма, Кнолль Фармасьюти-
калс) — Германия,Великобритания, Индия.
Письмом Департамента № 293-22/9 от 11.03.99 г. во измене-
ние приложения 2 к письму от 01.12.98 г. № 29-4/2281 Департа-
мент государственного контроля качества, эффективности, безо-
пасности ЛС сообщает, что п. 159 перечня зарубежных фирм, ос-
вобожденных Департаментом от посерийного контроля, следует
читать:
П. 159 Шварц Фарма АГ (Шварц Фарма АГ, Изис Фарма
ГмбХ, РотексМедика ГмбХ) — Германия.
Согласно письму Департамента госконтроля ЛС № 29-4/2281
от 01.12.98 г. при сертификации кровезаменителей, выпускае-
мых производителями, освобожденными от посерийного контро-
ля, препараты дополнительно должны контролироваться по по-
казателям: “Подлинность”, “Прозрачность”, “pH”, “Механические
включения”, “Стерильность”; при сертификации препаратов кро-
ви — “Подлинность”, “Прозрачность”, “Общий белок”, “pH”, “Ме-
ханические включения”, “Пирогенность”, “Стерильность”.
48
Препараты крови
Раствор альбумина 5,10 и 20 %
Раствор альбумина плацентарного 5,
10 и 20 %
Раствор альбумина «Постаб» 5,10 и
20 %
Полибиолин
Протеин
Факторы свертывания крови
Глюиат
Фибриноген
Кровезаменители
Реополиглюкин
Полиглюкин
Реополиглюкин с глюкозой
Полифер
Реоглюкин
Гемодез
Гемодез-Н
Неогемодез
Глюконсодез
Изон и дез
Волекам
Полиглюсоль
Желатиноль
Полис» сидин
Сертификация медицинских иммунобиологических препаратов
в соответствии с “Системой сертификации медицинских иммуно-
биологических препаратов” осуществляется НИИ стандартизации
и контроля медико-биологических препаратов им. Л. А. Тарасе-
вича. Перечень основных групп медицинско-биологических пре-
паратов:
1. Вакцины бактерийные
2. Вакцины вирусные
3. Анатоксин
4. Иммуноглобулины нормальные
5. Иммуноглобулины специфические
6. Сыворотки антитоксические лечебные
7. Сыворотки диагностические
8. Бактериофаги лечебно-профилактические
9. Бактериофаги диагностические
10. Препараты иормофлоры (бифидумбактерин, споробактерни, бак-
тисубтил и др.)
11. Интерфероны, цитокины и другие биологические иммуномодуля-
торы для стимуляции аитиинфекционного иммунитета (рнбомунил,
ИРС-19, имуден и др.)
12. Аллергены бактериальные, грибковые, пищевые, бытовые, пыль-
цевые и др.
13. Диагностические тест-системы для ИФА, ПЦР, используемые для
диагностики инфекционных и паразитарных заболеваний.
14. Диагностикумы антигенные, антительные.
15. Питательные среды (бактериальные, вирусологические), за ис-
ключением сред для оценки микробной обсеменеииости лекарственных
средств.
Перечни фирм-производителей лекарств, освобожденных от
посерийного контроля, периодически меняются.
При реализации отечественных медицинских иммунобиологи-
ческих препаратов (МИБП) в лечебно-профилактические учреж-
4. Заказ 3547 49,
дения (ЛПУ) и аптечную сеть поставщиками должны предъяв-
ляться следующие документы:
1. Копия лицензии на право производства и реализации МИБП
или лицензия на право фармацевтической деятельности.
2. Копия сертификата производства на реализуемый препарат
установленного образца (за исключением станций переливания
крови).
3. Паспорт ОБТК организации-изготовителя на реализуемую
серию препарата.
При реализации зарубежных МИБП помимо лицензии на фар-
мацевтическую деятельность должны предъявляться следующие
документы:
1. Копия регистрационного удостоверения установленного об-
разца на препарат.
2. Копия сертификата соответствия на реализуемую серию пре-
парата, выданного ГИСК им. Л. А. Тарасевича.
Письмом М3 РФ от 01.04.99 г. № 2510/3609-99-32 введен но-
вый порядок сертификации лекарственных средств с 01.04.99 г.
В соответствии с п. 4.3 “Системы сертификации лекарствен-
ных средств Системы сертификации ГОСТ Р” Минздрав РФ сооб-
щает следующее. В связи с созданием в ряде субъектов Россий-
ской Федерации органов по сертификации лекарственных средств
с 01.04.99 г.:
1) отечественным предприятиям, указанным в приложении 1,
проводить сертификацию выпускаемых лекарственных средств в
следующих аккредитованных М3 РФ органах по сертификации
лекарственных средств:
— Федеральном государственном учреждении “Центр по сер-
тификации лекарственных средств” (г. Москва);
— Центре сертификации и контроля качества лекарственных
средств (г. Москва);
— Органе по сертификации лекарственных средств Медицин-
ского центра Управления Делами Президента Российской Феде-
рации (г. Москва);
2) отечественным предприятиям, указанным в приложении 2,
проводить сертификацию выпускаемых ЛС в Северо-Западном Цен-
тре по контролю качества и сертификации лекарственных средств
(г. Санкт-Петербург);
3) отечественным предприятиям, указанным в приложении 3,
проводить сертификацию выпускаемых Л С в Центре контроля ка-
чества и сертификации лекарственных средств Алтайского края
(г. Барнаул);
50
с 01.05.99 г:
1) отечественным предприятиям, указанным в приложении 4,
проводить сертификацию выпускаемых ЛС в органе по сертифи-
кации лекарственных средств Департамента по фармации при Ми-
нистерстве здравоохранения Республики Татарстан (г. Казань);
2) отечественным предприятиям, указанным в приложении 5,
проводить сертификацию выпускаемых ЛС в Свердловском Цент-
ре сертификации и контроля качества лекарственных средств
(г. Екатеринбург).
В период создания в субъектах Российской Федерации органов
по сертификации ЛС, предусмотренных “Системой сертификации
лекарственных средств Системы сертификации ГОСТ Р”, наряду
с порядком, предусмотренным новыми правилами сертификации
ЛС, соответствующим ведомством продлевается порядок контро-
ля и реализации отечественных ЛС (за исключением ЛС, произ-
водимых предприятиями, указанными в приложениях 1—5) в
соответствии с договорами, заключенными между Инспекцией (Уп-
равлением) государственного контроля ЛС и медицинской техни-
ки и российскими предприятиями (кроме предприятий, указан-
ных в приложениях 1—5), о разрешении реализации в аптечной
сети и лечебно-профилактических учреждениях Российской Фе-
дерации отечественных ЛС по паспортам ОТК предприятий. Для
предприятий, указанных в приложениях 4 и 5, данный порядок
продлевается до установленного соответствующим органом пери-
ода времени.
В связи с тем, что в ряде субъектов Российской Федерации не
завершен процесс создания органов по сертификации ЛС, преду-
смотренных “Системой сертификации лекарственных средств Си-
стемы сертификации ГОСТ Р” и “Правилами сертификации ле-
карственных средств”, до 01.07.99 г. оформление протоколов со-
ответствия на отечественные лекарственные средства в указан-
ных субъектах Российской Федерации может производиться
территориальными контрольными испытательными лаборатория-
ми (центрами контроля качества ЛС), аккредитованными М3 РФ
в соответствии с приказом Минздравмедпрома России от 14.06.94 г.
№ 118.
Руководителям органов исполнительной власти субъектов Рос-
сийской Федерации в сфере здравоохранения и фармацевтичес-
кой деятельности следует принять неотложные меры по созда-
нию органов по сертификации ЛС на подведомственной террито-
рии.
Для аккредитации органов по сертификации ЛС следует на-
править в Департамент государственного контроля качества, эф-
4*
51
фектнвности, безопасности ЛС и медицинской техники М3 РФ
комплект документов, предусмотренных Инструкцией “О поряд-
ке аккредитации органов по сертификации лекарственных
средств”, утвержденной Минздравом России 23.09.98г.
По мере аккредитации новых органов по сертификации ЛС в
субъектах Российской Федерации изложенный в настоящем до-
кументе порядок сертификации может изменяться.
Приложение 1
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, продукция которых подлежит
сертификации с 01.04.99 г. в Органах по сертификации лекарствен -
_____________________ных средств г. Москвы_____________________
1. АО “Биотехнология”, г. Москва
2. АОЗТ “НПК Эхо”, г. Москва
3. АОЗТ “Производственная фирма “Матерна Медика”, г. Москва
4. АОЗТ “Техноформ”, г. Москва
5. АООТ “Научно-производственное объединение “Экран”, г. Москва
6. Городская клиническая больница № 81 Департамента здравоохра-
нения Москвы
7. Государственный московский эндокринный завод
8. Государственный НИИ органической химии и технологии, г. Моск-
ва
9. ГП “ГосНИИ биологического приборостроения”, г. Москва
10. Государственное федеральное учреждение “Российский кардио-
логический научно-производственный комплекс” МЗРФ — Эксперимен-
тальное производство медико-биологических препаратов, г. Москва
11. ЗАО “Авентин-Экохелп”, г. Москва
12. ЗАО Аграрно-промышленной компании “Фито-Эм”, г. Москва
13. ЗАО “Бианон”, г. Москва
14. ЗАО “Бизнес Консалтинг Ивестмеит”, г. Москва
15. ЗАО “Время”, г. Москва
16. ЗАО “Институт молекулярной диагностики” Диафарм”, г. Москва
17. ЗАО “Инфамед”, г. Москва
18. ЗАО “Координационный технический центр “Гарарс”, г. Москва
19. ЗАО “Лекраспром”, г. Москва
20. ЗАО “Международный концерн” ЭДАС”, г. Москва
21. ЗАО “Пентек”, г. Москва
22. ЗАО “Производственно-фармацевтическая компания “Балтимор”,
г. Москва
23. ЗАО “Пульмомел”, г. Москва
24. ЗАО “Техмедсервис”, г. Москва
25. ЗАО “ФармаВид”, г. Москва
26. ЗАО “Фирма Внтафарма”, г. Москва
27. ЗАО фирма “Здоровье”, г. Москва
28. ЗАО “Экомед”, г. Москва
29. ИЧП “Градиент”, г. Москва
52
30. Корпорация “Олифен”, г. Москва
31. ФГП Московское ПХФО им. Н.А. Семашко
32. НИЦ ММА им.И.М. Сеченова, г. Москва
33. ОАО “Московская фармфабрика”
34. ОАО “Технопарк-Центр”, г. Москва
35. 000 Аграрно-промышленная фирма “Фито-Эм”, г. Москва
36. ООО “Биореактор**, г. Москва
37. ООО “Бристол-Манере Сквибб Мэнюфэкчуринг”, г. Москва
38. 000 НПП “Камелия**, г. Москва
39. ООО “Компания Деко”, г. Москва
40. ООО “Лаиафарм”, г. Москва
41. ООО “ Мт Маркет”, г. Москва
42. ООО “Панто-Витамии”, г. Москва
43. ООО “Репромед”, г. Москва
44. ООО “Талион-А”, г. Москва
45. ООО “Фермент”, г. Москва
46. Производственно-экспериментальный завод НПО ВИЛАР, г. Москва
47. СП “Веледа” ТОО, г. Москва
48. ТОО “Вега Лимитед”, г. Москва
49. ТОО “Диамед”, г. Москва
50. ТОО НПП “Мера”, г. Москва
51. ТОО “Олвуд”, г. Москва
52. ТОО “ОЛЛО”, г. Москва
53. ТОО ПКП “Вифитех”, г. Москва
54. ТОО “Производственно-коммерческая фирма АЗТ”, г. Москва
55. ТОО фирма “Био-Биз”, г. Москва
56. ЗАО “Ретиноиды”, г. Москва
57. Федеральное государственное предприятие “Центр по химии ле-
карственных средств”, г. Москва
58. ЗАО “Брынцалов А”, г. Москва
59. ЗАО “Хнмтех-МО”, г. Москва
60. ООО “Доктор Н”, г. Москва
61. ГНЦ РФ “НИОПИК”, г. Москва
62. Фармацевтическая фирма “КОНПО”, г. Москва
63. АО “Красногорсклексредства”, п. Опалиха Московской обл.
64. АОЗТ “Фармацевтическое предприятие “Оболенское”, п. Оболенск
Московской обл,
65. АООТ “Биомед” им. Мечникова, п/о Петрово-Дальнее Москов-
ской обл.
66. Государственный Краснозаводский химический завод, г. Красно-
заводск Московской обл.
67. ГП Научно-производственный центр “Фармзащита”, г. Химки Мос-
ковской обл.
68. ГП “Спецмолзавод” завод “Загорский”, г. Сергиев-Посад Москов-
ской обл.
69. ЗАО “Аграрно-промышленная фирма “Фито-М”, п. Мамонтовка
Московской обл.
70. ЗАО “Клинский пивокомбинат”, г. Клин Московской обл'.
53
71. ЗАО “ЛЭНС”, г. Одинцово Московской обл.
72. ЗАО “Производственное объединение “Тос”, г. Долгопрудный Мос-
ковской обл.
73. ОАО “Завод химреактивкомплект”, п. Старая Купавна Москов-
ской обл.
74. ОАО НПФ “Перфторан”, г. Пущино Московской обл.
75. ОАО “Промышленная химико-фармацевтическая компания “Мед-
химпром”, г. Железнодорожный Московской обл.
76. ОАО “Фармацевтическая фирма “КОНПО”, п. Оболенск Москов-
ской обл.
77. ОАО “Щелковский витаминный завод”, г. Щелково Московской
обл.
78. ООО “Биофабрика”, Раменский р-н Московской обл.
79. ТОО “Тибет”, п. Опалиха Московской обл.
80. Химфармкомбинат “Акрихин”, п. Старая Купавиа Московской
обл.
81. Федеральный центр двойных технологий “Союз”, п. Дзержин-
ский Московской обл.
Приложение 2
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, продукция которых подлежит
сертификации с 01.04.99 г. в Северо-Западном Центре по контролю
качества и сертификации лекарственных средств (г. Санкт-Петербург)
1. АОЗТ “Генезис”, г. Санкт-Петербург
2. АОЗТ “Сот”, г. Санкт-Петербург
3. АООТ “Фармацевтическая фабрика”, г. Санкт-Петербург
4. ЗАО “Антивирал”, г. Санкт-Петербург
5. ЗАО “ЛенВИТА”, г. Санкт-Петербург
6. НИИ гриппа РАМН, г. Санкт-Петербург
7. ООО “компания народной медицины “Биофабрика”, г. Санкт-Пе-
тербург
8. 000 НТФФ “Полисан”, г. Санкт-Петербург
9. ООО “Фармаплант”, г. Санкт-Петербург
10. СКТБ “Технолог”, г.Санкт-Петербург
11. ТОО Межрегиональный центр “Адаптоген”, г. Санкт-Петербург
12. ТОО “Фаркос”, г. Санкт-Петербург
13. ХФ ОАО “Ай Си Эн Октябрь”, г. Санкт-Петербург
14. ТОО “Хармс”, г. Санкт-Петербург
15. ЗАО “Мелигеи”, п. Щеглов Ленинградской обл.
16. ГП Киришский биохимический завод, г. Кириши Ленинградской
обл.
17. ЗАО “Фармаген” г. Всеволожск Ленинградской обл.
18. Лужский завод белковой колбасной оболочки “Белкозин”, г. Луга
Ленинградской обл.
19. ХПФ “Фармакон”, г. Санкт-Петербург
20. АО “Сайнтек”, г. Санкт-Петербург
54
Пр иложение 3
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, продукция которых подлежит
сертификации с 01.04.99 г. в Центре контроля качества и
сертификации лекарственных средств Алтайского края (г. Барнаул)
1. АОЗТ “Билтек”, г. Барнаул
2. Бийский филиал Новокузнецкого научно-исследовательского хим.
фарм. “института, г. Бийск
3. ГП “Фармацевтическая фабрика”, г. Барнаул
4. Государственное унитарное предприятие “Федеральный научно-
производственный центр “Алтай”, г. Бийск
5. ЗАО “Алтайвитамины”, г. Бийск
6. ЗАО “Бальзам”, г. Бийск
7. ЗАО “Бытхим”, Яровое
8. ЗАО “Эвалар”, г. Бийск
9. Муниципальное предприятие “Рубцовская городская станция пе-
реливания крови”, г. Рубцовск
10. ООО “Горчичник”, г. Барнаул
11. ООО “Янтарное”, с. Шульгинка
12. ООО “Катунь Олеум”, с. Советское
13. ТОО “Юнифарм”, г. Барнаул
14. ЗАО “Бахташ”, г. Бийск
Приложение 4
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, продукция которых подлежит
сертификации с 01.05.99 г. в Органе по сертификации
лекарственных средств Департамента по фармации
при Министерстве здравоохранения Республики Татарстан (г. Казань)
1. Казанское ПХФО “Татхимфармпрепараты”, г. Казань
2. Совет ВОИР КазНИИ техфотопроекта, г. Казань
3. Казанская фармфабрика
4. ОАО “ICN Марбиофарм”, г. Йошкар-Ола
Приложение 5
ПЕРЕЧЕНЬ
отечественных предприятий, продукция которых подлежит
сертификации с 01.05.99 г. в Свердловском Центре по сертификации
и контролю качества лекарственных средств (г. Екатеринбург)
1. АООТ “Екатеринбургская фармацевтическая фабрика”
2. АОЗТ “Лекформ”, г. Екатеринбург
3. ОАО “Ирбитский химико-фармацевтический завод”, г. Ирбит Сверд-
ловской обл.
4. АООТ “Уралбиофарм”, г. Екатеринбург
5. ООО “Завод медпрепаратов”, г. Екатеринбург
6. Свердловская областная станция переливания крови, г. Перво-
уральск Свердловской обл.
55
Сертификация изделий медицинского назначения проводится
органами по сертификации Госстандарта РФ. Форма сертифика-
та:
Сертификат соответствия
обязывает изготовителя
(продавца):
— обеспечить соответ-
ствие реализуемой продук-
ции требованиям норматив-
ных документов, на соответ-
ствие которым она была сер-
тифицирована, и маркирова-
ние ее знаком соответствия
в установленном порядке.
Продукция должна соответ-
ствовать испытуемому образ-
цу и данным испытаний;
— по требованию органа
по сертификации предъяв-
лять продукцию и создавать
условия для проведения ор-
ганом по сертификации ин-
спекционного контроля;
— применять знак соответствия по правилам, установленным
в системе сертификации;
— приостанавливать (прекращать) применение знака соответ-
ствия в случае приостановления (отмены) сертификата соответ-
ствия.
Сертификат соответствия обязывает изготовителя:
— следить за тем, чтобы изготовление продукции осуществля-
лась согласно установленным правилам ее производства в соот-
ветствии с образцом, следить за выполнением требований норма-
тивных документов;
— своевременна извещать орган по сертификации, выдавший
сертификат соответствия, об изменениях продукции и процесса
ее производства.
Сертификации подлежат:
1. Иглы хирургические, инъекционные однократного и многократ-
ного применения.
2. Шприцы однократного н многократного применения.
3. Зонды медицинские.
4. Вата медицинская.
5. Бинты марлевые и эластичные медицинские.
56
6. Повязки стерильные медицинские.
7. Марля медицинская.
8. Салфетки и отрезы марлевые.
9. Изделия ватно-марлевые медицинские.
10. Пакеты перевязочные медицинские.
11. Презервативы.
12. Соскн латексные детские.
13. Грелки резиновые.
14. Пузыри резиновые для льда.
15. Трубки медицинские резиновые.
16. Клей БФ.
17. Клеенка подкладная резинотканевая.
18. Перчатки хирургические.
19. Кислород, углерода диоксид, газообразные и жидкие.
20. Приборы для измерения артериального давления.
21. Линзы контактные и очковые.
22. Оправы очковые.
23. Крахмал картофельный.
24. Желатин.
25. Рыбий жир (кроме технического).
26. Тара стеклянная и полимерная для медицинской продукции.
27. Продукты для детского питания на молочной основе.
28. Сахар.
29. Перекись водорода медицинская.
30. Спирт этиловый.
31. Аптечки индивидуальные.
32. Трости.
33. Масло подсолнечное.
34. Дез. средства при реализации их населению.
35. Лейкопластыри.
36. Лейкопластырь простой.
37. Лейкопластырь бактерицидный.
38. Лейкопластырь перцовый.
39. Воды минеральные и другие.
Сертификат соответствия выдается сроком до 3 лет, 1 раз в
год проводится инспекционный контроль продукции, имеющей
сертификат. Существует 10 схем сертификации; чем сложнее схе-
ма сертификации, тем больше гарантий безопасности продукции.
До 01.06.97 г. действовал двухсторонний вид сертификата, кото-
рый заверялся печатями и подписями с обеих сторон. С 01.06.97 г.
введен новый вид сертификата — односторонний. Сертификат
имеет регистрационный и учетный номер.
В сертификате указывается вид сертификации:
А — на определенную партию продукции, который выдается
продавцу.
57
В — на производство продукции, который выдается произво-
дителю на изготовление определенного вида продукции. Серти-
фикат имеет срок действия.
Сертификаты соответствия гарантируют безопасность товара
для здоровья человека и окружающей среды. Согласно постанов-
лению Правительства РФ от 19.01.98 г. № 55 для реализации
товаров, подлежащих обязательной сертификации, в том числе
импортных, продавец должен иметь в подтверждение факта сер-
тификации один из следующих документов:
— подлинник сертификата;
— копию сертификата, заверенную держателем подлинника
сертификата или органом по сертификации, выдавшим сертифи-
кат, или нотариусом, или территориальным органом Госстандар-
та России;
— товарно-сопроводительные документы, оформленные изго-
товителем или поставщиком (продавцом) на основании подлин-
ника сертификата или его копии (заверенной держателем под-
линника или органом по сертификации, или территориальным
органом Госстандарта России), содержащие по каждому наимено-
ванию продукции сведения о наличии сертификата с указанием
его номера, срока действия, органа, выдавшего сертификат. Све-
дения о сертификате в товарно-сопроводительных документах
должны быть заверены печатью и подписью изготовителя или
продавца, с указанием адреса и телефона.
В соответствии с законами РФ, нормативными документами
М3 РФ проводится аккредитация контрольных лабораторий.
23.09.1998 г. М3 РФ утверждена “Инструкция о порядке аккре-
дитации контрольной лаборатории”.
Право на аккредитацию имеют региональные (территориаль-
ные) контрольные испытательные лаборатории, отделы (Цент-
ры) контроля качества ЛС и другие аналогичные подразделения
территориальных органов исполнительной власти в сфере здра-
воохранения и фармацевтической деятельности субъектов Феде-
рации, контрольные испытательные лаборатории при аптечных
складах (фармацевтических оптовых фирмах), а также аналити-
ческие лаборатории НИИ и высших учебных заведений фарма-
цевтического профиля (далее — контрольные лаборатории). До-
пускается аккредитация контрольных лабораторий ОТК пред-
приятий химико-фармацевтической промышленности при усло-
вии, что при проведении этого вида деятельности они не будут
осуществлять контроль качества продукции, выпускаемой дан-
ным предприятием.
58
Аккредитацию и инспекционный контроль за аккредитован-
ными лабораториями организует рабочий орган М3 РФ — Комис-
сия по аккредитации.
Аттестат аккредитации удостоверяет техническую компетент-
ность контрольной лаборатории и выдается Управлением на осно-
вании решения комиссии по аккредитации.
Аттестат аккредитации является основанием для выдачи ли-
цензии.
Аккредитация предусматривает следующие этапы:
— представление заявителем заявки на аккредитацию;
— экспертиза документов, представленных контрольной лабо-
раторией;
— аттестация (проверка) контрольной лаборатории комисси-
ей, включая экспериментальную проверку качества проведения
исследований в аккредитуемой лаборатории;
— принятие решения об аккредитации по результатам экспер-
тизы документов и проверки;
— оформление, регистрация и выдача аттестата аккредитации.
Одновременно с заявкой (приложение 3) представляются в трех
экземплярах следующие документы:
— проект области аккредитации (приложение 4);
— положение о контрольной лаборатории (приложение 5);
— паспорт контрольной лаборатории (приложение 6);
— заполненная анкета-вопросник (приложение 7);
— копия платежного поручения (с отметкой банка) об оплате
разового сбора за аккредитацию.
При соответствии контрольной лаборатории всем предъявляе-
мым требованиям:
— утверждается “Область аккредитации”;
— оформляется и выдается заявителю аттестат аккредитации
по установленной форме сроком на 3 года (приложение 9);
Аккредитованная лаборатория вносится в реестр Системы и ей
выдается аттестат аккредитации сроком на 3 года.
Аттестат аккредитации дает право на выдачу протоколов ана-
лизов, подтверждающих соответствие качества ЛС требованиям НД.
Приложение 1
ПЕРЕЧЕНЬ
оборудования и средств измерения, необходимых
для функционирования контрольной лаборатории
1. Аквадистиллятор ДЭ-25 или ДЭ-42.
2. Оборудование для тонкослойной хроматографии.
3. Аппарат Къельдаля.
4. Аппарат для флуоресцентного анализа витаминов в растворах.
59
5. Аппарат для экстрагирования Сокслета (на 100 мл).
6. Ареометры (набор).
7. Баня водяная.
8. Вакуумная сушилка.
9. Вискозиметр Гепплера с падающим шариком.
10. Встряхиватель с комплектом сит.
11. Встряхиватель лабораторный.
12. Муфельная печь электрическая.
13. Интерферометр для жидкостей.
14. Кимограф.
15. Облучатель бактерицидный.
16. Пикнометры (набор).
17. Прибор для определения спирта в настойках.
18. Прибор для испытания на мышьяк.
19. Прибор для определения эфирного масла.
20. Прибор для определения температуры затвердевания.
21. Прибор для определения температуры кипения.
22. Прибор для определения температуры плавления.
23. Прибор для определения веществ методом сжигания в кислоро-
де.
24. Прибор для определения времени полной деформации суппозито-
рий.
25. Стерилизатор паровой вертикальный.
26. Термостат водяной.
27. Термостат электрический суховоздушный.
28. Устройство для контролирования инъекционных растворов на
механические включения.
29. Центрифуга лабораторная.
30. Эксикаторы (набор).
31. Ваниа цементная эмалированная.
32. Ванна-сосуд четырехугольный вместимостью 3 л и 10 Л.
33. Весы лабораторные аналитические.
34. Весы лабораторные квадрантные 4 класса (ВКЛТ-2 кг-М,
ВКЛТ-500 г-М).
35. Секундомер.
36. Газовый хроматограф.
37. Жидкостный хроматограф.
38. pH-метр, милливольтметр.
39. Микроскоп биологический “Биолам”.
40. Потенциометр.
41. Поляриметр.
42. Полярограф.
43. Радиометр (РУВ-05П; РУБ-01 П6; РУБ-05ПМ) для проверки ле-
карственного растительного сырья на радионуклиды.
44. Рефрактометр.
45. Спектрофотометр.
46. Спектрофлуориметр.
60
47. Установка для амперометрического титрования.
48. Фотоэлектроколориметр.
49. Флуориметр.
50. Пламенный фотометр.
Приложение 2
ПЕРЕЧЕНЬ
документов, которыми должна располагать контрольная лаборатория
1. Правовые документы:
— положение о контрольной лаборатории (и копия устава, утверж-
денного в установленном порядке);
— копия ордера или договор об аренде помещения, подтверждающие
возможность законного пользования помещением.
2. Нормативные документы (НД) на лекарственные средства (ВФС,
ФС, на отечественные лекарственные средства, НД фирм-изготовителей
на зарубежные лекарственные средства, утвержденные в установленном
порядке); Государственная Фармакопея, зарубежные фармакопеи, Ин-
струкции, приказы Минздрава России, справочная литература, ГОСТы,
ОСТы и др.
3. Документы на испытательное и измерительное оборудование:
а ) регистрационные документы на оборудование (журнал, карты,
листы и др.), включающие следующие сведения:
— наименование и вид оборудования:
— предприятие-изготовитель, тип (марка), заводской и инвентарный
номер;
— дата изготовления, получения и ввода в эксплуатацию;
— состояние при покупке (новое, бывшее в употреблении, после ре-
монта и т.д.);
— данные об имеющихся неисправностях, ремонтах, техобслужива-
нии;
— данные об аттестации и поверках.
б) документы по эксплуатации и техническому обслуживанию испы-
тательного оборудования и средств измерений:
— паспорт на каждую единицу испытательного оборудования и сред-
ства измерений;
— документы по учету поверок средств измерений;
— графики поверок средств измерений.
4. Документы по персоналу лаборатории:
— личные дела сотрудников лаборатории;
— должностные инструкции;
— материалы аттестации сотрудников лаборатории.
5. Документы на контролируемые образцы лекарственных средств:
— журнал регистрации лекарственных средств, поступивших на кон-
троль;
— аналитический паспорт на отечественные и оригинал или заверен-
ная копия сертификата анализа на зарубежные лекарственные средства;
61
— акты отбора средних проб;
— инструкция о порядке обеспечения хранения образцов;
— инструкция о порядке возврата образцов, оставшихся от проведе-
ния контроля, заказчику;
— рабочие журналы с расчетными данными по результатам анализа;
— протоколы анализов.
6. Документы по поддержанию надлежащих условий в помещениях
баклабораторий:
— инструкции по обеспечению порядка в производственных помеще-
ниях;
— журнал контроля состояния помещений;
— эксплуатационная документация на оборудование, контролирую-
щее и поддерживающее необходимые условия окружающей среды в по-
мещениях.
7. Документы по архиву:
— инструкция по порядку ведения архива (журналов регистрации,
рабочих журналов, протоколов анализов, отчетов, сопроводительных
документов к образцам и т.д.).
Приложение 3
Руководителю Департамента
государственного контроля качества, эффек-
тивности, безопасности лекарственных средств
и медицинской техники Минздрава России
ЗАЯВКА
Прошу аккредитовать____________________________________________
(наименование контрольной лаборатории)
на_______________________________________________'_____________
(вид и область аккредитации)
Лаборатория обязуется:
а) отвечать требованиям аккредитованной лаборатории:
б) оплачивать все расходы, связанные с проведением оценки и реше-
нием административных вопросов на этапе, предшествующем аккреди-
тации, независимо от положительного решения по аккредитации или
отказа в ней.
Приложение: 1. Область аккредитации.
2. Положение о контрольной лаборатории.
3. Паспорт контрольной лаборатории.
4. Анкета-вопросник.
Руководитель
контрольной лаборатории________________________________
(подпись)
М.П. “___”г.
62
Приложение 4
“УТВЕРЖДАЮ”
Руководитель Департамента государственного Приложение
контроля качества, эффективности, безопас- к аттестату аккредитации
ности лекарственных средств и медицинской
техники Минздрава России
№__________________
“___” г. от “__”г.
ОБЛАСТЬ АККРЕДИТАЦИИ
(наименование и адрес контрольной лаборатории)
Наименова- ние контроли- руемой про- дукции Код окп Наименование анализов и определяемых характеристик (параметров) Обозначение НД на продукцию, содержащую значения опре- деляемых характеристи к (параметров) Обозначе- ние НД на методы анализов
1 2 3 4 5
Примечания: 1. Каждый лист приложения заверяется печатью Мин-
здрава России.
2. На этапе подачи заявки приложение подписывается
руководителем лаборатории.
Место
гербовой печати __________________________________________________
(подпись) (должность, фамилия, инициалы)
Приложение 5
“ УТВЕРЖДАЮ”
Руководитель контрольной лаборатории
(Руководитель_____________________________
(наименование организации,
в составе которой функционирует лаборатории
(подпись) (инициалы, фамилия)
“__” г
ПОЛОЖЕНИЕ
о контрольной лаборатории
(наименование контрольной лаборатории)
аккредитованной Минздравом России на
(вид и область аккредитации)
63
Приложение 6
(наименование предприятия, организации)
“УТВЕРЖДАЮ”
Руководитель ______________________
(наименование предприятия,
М.П. ______________________________
организации)
<4 » —
ПАСПОРТ
(наименование контрольной лаборатории)
аккредитованной Минздравом России иа техническую компетентность
(область аккредитации)
Приложение 6
Форма 1
Наименование и почтовый адрес аккредитуемой контрольной лабо-
ратории.
Наименование и почтовый адрес организации, в составе которой функ-
ционирует аккредитуемая контрольная лаборатория.
Фамилия, имя, отчество, должность, телефон руководителя выше-
стоящей организации.
Фамилия, имя, отчество, должность, телефон руководителя аккре-
дитуемой лаборатории.
Приложение 6
Форма 2
ПЕРЕЧЕНЬ
нормативных документов, устанавливающих
требования к методам анализов
Обозначение ВД Наимено- вание НД Кем и когда утвержден НД, дата введения Срок действия НД Примеча- ние
1 2 3 4 5
64
*
i
Приложение 6
Форма 3
ОСНАЩЕННОСТЬ ИСПЫТАТЕЛЬНЫМ ОБОРУДОВАНИЕМ (ИО)
Наиме- нова- ние анали- зируе- мой про- дук- ции Наиме- нование анализов и (или) опреде- ляемых характе- ристик (парамет- ров) про- дукции Наиме- нование ИО, тип (марка), завод- ской инвен- тарный номер Изгото- витель (страна, пред- прия- тие, фирма) Основ- ные техни- ческие харак- тери- стики Год ввода в эксп- луата- цию Сте- пень аморти- зации, % Приме- чание
1 2 3 4 5 6 7 8
Приложение 6
Форма 4
СВЕДЕНИЯ О СРЕДСТВАХ ИЗМЕРЕНИЯ (СИ)
Наимено- вание оп- ределяе- мых (изме- ряемых) характе- ристик (парамет- ров) про- дукции Наимено- вание СИ, тип (марка), заводской инвентар- ный номер Изгото- витель (страна, пред- прия- тие, фирма) Основные техниче- ские ха- рактери- стики (диапазон измере- ний, по- грешность) Год ввода в эксп- луата- цию Дата и номер прото- кола про- верки СИ, перио- дич- ность Сте- пень амор- тиза- ции, % При- меча- ние
1 2 3 4 5 6 7 8
Приложение 6
Форма 5
ОСНАЩЕННОСТЬ СТАНДАРТНЫМИ ОБРАЗЦАМИ
Наимено- вание приме- няемого стандарт- ного образца Наимено- вание и номер НД на стандарт- ный образец Наимено- вание и номер НД, кото- рыми преду- смотрено приме- нение стандарт- ного образца Кем утверж- ден, когда Аттесто- ванные харак- тери- стики Срок год- ности (годен) Нали- чие свиде- тель- ства При- меча- ние (изго- тови- тель
1 2 3 4 5 6 7 8
5. Заказ 3547
65
Приложение 6
Форма 6
СОСТОЯНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ПОМЕЩЕНИЙ
Назначение помещения (в том числе для прове- дения анализов, для хранения образцов и т.д.) Площадь, м2 Темпера- тура, °C, влажность, % Освещен- ность на рабочих местах Наличие специаль- ного обо- рудования При- меча- ние
1 2 3 4 5 6
Приложение 6
Форма 7
КАДРОВЫЙ СОСТАВ СОТРУДНИКОВ
КОНТРОЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ
№ п/п Фамилия, имя, отчество Долж- ность Образование (с указанием специально- сти, учебного заведения и года оконча- ния) Виды проводи- мых ана- лизов Дата и номер протоко- ла аттеста- ции, пе- риодич- ность При- меча- ние
1 2 3 4 5 6 7
Приложение 7
АНКЕТА-ВОПРОСНИК
с данными о состоянии контрольной лаборатории
1. Контрольная лаборатория, претендующая на аккредитацию:
Наименование:
Адрес:
Телефон: Телекс: Факс:
2. Организация или предприятие, которому подчинена контрольная ла-
боратория:
Наименование:
Адрес:
Телефон: Телекс: Факс:
3. Руководящий состав и структура:
3.1. Фамилии и должности ответственных руководителей конт-
рольной лаборатории и организации, которой она подчиняется.
3.2. Фамилия и должность лица, ответственного за связь с други-
ми организациями.
3.3. Подразделения контрольной лаборатории, представляемые на
аккредитацию.
4. Юридический статус и независимость:
4.1. Имеет ли аккредитуемая лаборатория статус юридического
лица?
Да/Нет
4.2. Могут ли административная подчиненность, система оплаты тру-
да сотрудников и источники финансирования оказывать влияние
на объективность результатов анализа?
Да/Нет
5. Кадры:
5.1. Общее количество сотрудников контрольной лаборатории, пред-
ставившей заявку на аккредитацию.
5.2. Общее количество квалифицированных сотрудников в заяв-
ленной области аккредитации.
5.3. Определены ли уровни профессиональной подготовки содруд-
ников?
Да/Нет
5.4. Имеются ли должностные инструкции?
Да/Нет
5.5. Проводится ли обучение кадров с целью поддержания и совер-
шенствования профессионального уровня?
Да/Нет
6. Нормативные документы:
6.1. Имеются ли в достаточном количестве НД, в соответствии с
которыми оценивается качество лекарственных средств?
Да/Нет
6.2. Своевременно ли изымаются устаревшие НД?
Да/Нет
6.3. Имеется ли система и условия учета, хранения и актуализа-
ции фонда НД?
Да/Нет
7. Оборудование и средства измерения:
7.1. Устанавливает ли система управления качеством совместимость
степени точности оборудования с проводимыми испытаниями?
Да/Нет
7.2. Регистрируется ли все испытательное оборудование?
Да/Нет
7.3. Имеются ли графики аттестации и поверок средств измере-
ния?
Да/Нет
8. Хранение образцов:
8.1. Установлен ли порядок хранения образцов, включая особые
условия окружающей среды?
Да/Нет
9. Архивы:
9.1. Существует ли порядок, устанавливающий сдачу в архив и
хранение документов с результатами проведенных анализов?
Да/Нет
Фамилия заявителя____________________________________________
Подпись лица, имеющего право подписи от имени заявителя
______________________________________________________________________________________(должность)
Дата заполнения________________________________
5*
67
Приложение 8
АКТ
Проверки__________________________________________________________
(наименование контрольной лаборатории)
(дата составления акта) (город)
В период с по г. на основании:
(название, номер и дата документа о проведении проверки)
комиссия в составе председателя:__________________________________
(должность, место работы, Ф.И.О)
и членов комиссии_________________________________________________
(должность, место работы, Ф.И.О)
провела проверку с целью
(наименование контрольной лаборатории и организации, в составе
которой она функционирует)
При проверке установлено:
Проверяемые характеристики состояния лаборатории Заключение комиссии
1. Статус, организационная структура, ад-
министративная подчиненность, финансо-
вое положение, система оплаты труда со-
трудников
2. Оснащенность и состояние испытатель-
ного оборудования и средств измерения
3. Обеспеченность нормативными и методи-
ческими документами
4. Квалификация и опыт работы персонала
в заявленной области испытаний, состояние
проводимой работы по повышению квали-
фикации
5. Условия размещения персонала, испыта-
тельного оборудования и средств измерения
6. Наличие и эффективность системы обес-
печения качества испытаний лекарствен-
ных средств
7. Дополнительные характеристики
Комиссия рекомендует__________________________________________
(замечания и рекомендации комиссии
по устранению недостатков и совершенствованию работы лаборатории)
Заключение:___________________________________________________
(рекомендации комиссии в отношении аккредитации
лаборатории с уточнением, при необходимости, области аккредитации)
68
Приложения. 1. Заявка на аккредитацию.
2. Область аккредитации.
3. Положение о контрольной лаборатории.
4. Паспорт контрольной лаборатории.
5. Анкета-вопросник.
Председатель комиссии ___________________________
(подпись)
Члены комиссии ___________________________
(подпись)
С актом ознакомлены:
Руководитель организации, в составе
которой функционирует лаборатория
(подпись)
Руководитель контрольной лаборатории
(подпись)
Дата
Приложение 9
Система сертификации ГОСТ Р
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
УПРАВЛЕНИЕ ГОСУДАРСТВЕННОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕН-
НЫХ СРЕДСТВ И МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНИКИ
АТТЕСТАТ АККРЕДИТАЦИИ
КОНТРОЛЬНОЙ ЛАБОРАТОРИИ
(ЦЕНТРА КОНТРОЛЯ)
Зарегистрирован в Минздраве России
“ ” г.
ИГК №
Действителен до “_”г
МИНЗДРАВ РОССИИ УДОСТОВЕРЯЕТ,
что ______________________________________________________
(наименование контрольной лаборатории (центра), адрес)
СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕБОВАНИЯМ МИНЗДРАВА РОССИИ,
ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫМ К КОНТРОЛЬНЫМ ЛАБОРАТОРИЯМ,
И АККРЕДИТОВАНА НА ТЕХНИЧЕСКУЮ КОМПЕТЕНТНОСТЬ.
Приложение: Область аккредитации
Начальник Управления _________________________________________
(подпись) (инициалы, фамилия)
Место печати
69
Приложение 10
ОТЧЕТ
О ПРОВЕДЕНИИ СЕРТИФИКАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
За период с по г.
(название контрольной лаборатории, центра контроля)
№ п/п Наимено- вание ле- карствен- ного средства Но- мер серии Предприя- тие (фирма), изготови- тель, страна Зая- витель Номер норматив- ного доку- мента, по которому проводил- ся конт- роль Заключение по результа- там контроля (при наличии брака — пока- затель брака), включая заме- чания к каче- ству
1 2 3 4 5 6 7
1. Лекарственные средства, изготовленные предприятиями России
Всего: * *
2. Лекарственные средства, поступившие по импорту
Всего: * *
Примечание. При подведении итогов заполняются графы, отмечен-
ные *
Руководитель контрольной лаборатории (центра)(подпись)
Создание надежного барьера, обеспечивающего отпуск населе-
нию и ЛПУ доброкачественных ЛС, является актуальной пробле-
мой. Сертификация — это важный механизм управления каче-
ством фармацевтической продукции, позволяющий объективно
оценивать и гарантировать больному ее безопасность и эффектив-
ность, обеспечивать соответствие продукции требованиям эколо-
гической чистоты.
До недавнего времени Россия оставалась одной из немногих
европейских стран, не имевших общегосударственной системы
сертификации, что отрицательно сказывалось как на безопаснос-
ти и техническом уровне товаров, так и на возможности их экс-
порта. За рубежом несертифицированная продукция либо запре-
щена к реализации вообще, либо реализуется По чрезвычайно низ-
ким ценам.
В силу необходимости требований нашего времени с 01.12.98 г.
в России введены правила проведения сертификации в Системе
сертификации ЛС, утвержденные Госстандартом РФ и Минюстом
России.
70
Конечная цель сертификации — гарантия безопасности лю-
дей, живущих сегодня, и сохранение здоровой среды обитания
для тех, кто будет жить завтра.
Контроль качества лекарств в аптеках осуществляется в соот-
ветствии с “Инструкцией по контролю качества лекарственных
средств, изготавливаемых в аптеках”, утвержденной приказом М3
РФ № 214 от 16.07.97 г., в которой перечислены все мероприя-
тия, предусматривающие повышение эффективности внутриап-
течного контроля изготовленных в условиях аптек ЛС, соответ-
ствующих по качеству необходимым требованиям НД. Внутриап-
течный контроль основан на строгом соблюдении фармацевтичес-
кого и санитарного режима в аптеке, включающего правильное
хранение лекарств. Основные требования, предъявляемые к са-
нитарному режиму аптечного производства и личной гигиене ра-
ботников аптек, определены специальной “Инструкцией по сани-
тарному режиму аптечных организаций”, утвержденной прика-
зом М3 РФ № 309 от 21.10.97 г. В данном документе изложены
санитарные требования к получению, транспортировке и хране-
нию воды очищенной и воды для инъекций, санитарные требова-
ния к помещениям и оборудованию асептического блока, сани-
тарные требования при изготовлении лекарств в асептических
условиях и при изготовлении нестерильных лекарственных форм.
Особые требования предъявляются к приготовлению и контролю
качества лекарств для новорожденных.
Все лекарства, изготовленные в аптечных учреждениях по ре-
цептам или по требованию лечебных учреждений, а также внут-
риаптечная заготовка, фасовка, концентраты и полуфабрикаты
подвергаются письменному контролю. Система внутриаптечного
контроля включает проведение приемочного контроля, предупре-
дительных мероприятий, органолептического контроля, письмен-
ного контроля, опросного контроля, физического контроля, хи-
мического контроля.
Для обеспечения внутриаптечного контроля в аптеках органи-
зуются аналитические кабинеты, аналитические столы, оснащен-
ные необходимыми приборами, реактивами, справочной и специ-
альной литературой. Внутриаптечный контроль в соответствии с
должностными обязанностями выполняют провизоры-аналитики,
провизоры-технологи. Всеми видами внутриаптечного контроля
качества лекарств обязаны владеть заведующий аптекой, его за-
местители.
Приемочный контроль проводится с целью предупреждения
поступления в аптеку некачественных лекарственных средств и
заключается в проверке поступающих лекарственных средств на
71
соответствие требованиям по показателям: “Описание”, “Упаков-
ка”, “Маркировка”, а также наличия сертификатов качества (пас-
портов) производителя.
Предупредительные мероприятия заключаются в следующем:
1) выполнение требований по соблюдению санитарных норм и
правил, противоэпидемического режима, фармацевтического по-
рядка в соответствии с действующим НД, инструкциями, прика-
зами;
2) соблюдение правил получения, сбора и хранения воды очи-
щенной, воды для инъекций;
3) обеспечение исправности и точности приборов, аппаратов и
весового хозяйства;
4) тщательный фармацевтический анализ поступающих в ап-
теку рецептов и требований ЛПУ;
5) соблюдение технологии изготовления ЛС;
6) обеспечение в аптеке условий и сроков хранения ЛС;
7) в помещениях хранения аптеки все штангласы с ЛС долж-
ны иметь: иомер серии завода-изготовителя, номер анализа конт-
рольной испытательной лаборатории, срок годности, дату запол-
нения и подпись заполнившего штанглас. На штангласах, содер-
жащих сердечные гликозиды, должно быть указано количество
единиц действия в одном грамме лекарственного растительного
сырья, или в одном миллилитре ЛС;
8) в ассистентской комнате на всех штангласах с лекарствен-
ными веществами должны быть указаны дата заполнения, под-
пись заполнивщего штанглас и проверившего подлинность лекар-
ственного вещества. Штангласы с ядовитыми и сильнодействую-
щими лекарственными веществами должны иметь указание о
высших разовых и суточных дозах;
9) штангласы с растворами, настойками жидкими полуфабри-
катами должны быть обеспечены нормальными каплемерами или
пипетками.
Контроль инъекционных и офтальмологических растворов и
глазных капель, изготовленных в аптеках, на механические вклю-
чения.
Настоящая инструкция устанавливает порядок визуального
контроля инъекционных и офтальмологических растворов и глаз-
ных капель, изготовленных в аптеках, на отсутствие механичес-
ких включений.
Под механическими включениями подразумеваются посторон-
ние подвижные нерастворимые вещества, кроме пузырьков газа,
случайно присутствующие в растворах. В процессе изготовления
растворы подвергаются первичному и вторичному контролю.
72
Первичный контроль осуществляется после фильтрования и
фасовки раствора. При этом просматривается каждая бутылка или
флакон с раствором. При обнаружении механических включений
раствор повторно фильтруют, вновь просматривают, укупорива-
ют, маркируют и стерилизуют. Растворы, изготовленные асепти-
чески, просматривают один раз после розлива или стерилизую-
щего фильтрования.
Вторичному контролю подлежат также 100 % бутылок и фла-
конов с растворами, прошедших стадию стерилизации, перед их
оформлением и упаковкой.
Контроль растворов на отсутствие механических включений
осуществляется провизором-технологом с соблюдением условий и
техники контроля.
Для просмотра бутылок (флаконов) должно быть специально
оборудованное рабочее место, защищенное от попадания солнеч-
ных лучей, где устанавливается “Устройство для контроля ра-
створов на отсутствие механических загрязнений” (УК-2) или др.
Допускается применение черно-белого экрана, освещенного таким
образом, чтобы исключить попадание света в глаза непосредствен-
но от его источника.
Контроль растворов осуществляется путем просмотра невоору-
женным глазом на черном и белом фонах, освещенных электри-
ческой матовой лампой в 60 Вт или лампой дневного света 20 Вт;
для окрашенных растворов — соответственно в 100 и 30 Вт.
Расстояние от глаза до просматриваемого объекта должно быть
25—30 см, а угол оптической оси просмотра к направлению све-
та — около 90°. Линия зрения должна быть направлена книзу
при вертикальном положении головы.
Провизор-технолог должен иметь остроту зрения, равную еди-
нице, которая при необходимости корректируется очками.
Поверхность просматриваемых бутылок и флаконов должна
быть снаружи чистой и сухой.
В зависимости от объема бутылки или флакона просматрива-
ют одновременно от одной до пяти штук. Бутылки или флаконы
берут в одну или обе руки за горловины, вносят в зону контроля,
плавным движением переворачивают в положение “вверх доныш-
ками” и просматривают на черном и белом фонах. Затем плавным
движением, без встряхивания переворачивают в первоначальное
положение “вниз донышками” и также просматривают на чер-
ном и белом фонах.
Время контроля соответственно составляет:
— одной бутылки (флакона) вместимость 100—500 мл — до 20 с.
73
— двух бутылок (флаконов) вместимостью 50—100 мл — 10 с.
— от двух до пяти бутылок (флаконов) вместимостью 5—50 мл
— 8—Юс.
Указанное время контроля не включает затраты времени иа
вспомогательные операции.
Забракованные по наличию механических включений бутыл-
ки (флаконы) выбирают и укладывают отдельно в специальную
тару.
Письменный контроль осуществляется при изготовлении ле-
карственных форм по индивидуальным прописям и требованиям
лечебно-профилактических учреждений. При этом заполняются
паспорта письменного контроля, в которых указываются дата,
номер рецепта (требования), взятые лекарственные вещества и их
количество, число доз. Паспорт подписывают лица, изготовив-
шие, расфасовавшие и проверившие лекарства. Все расчеты про-
изводятся до изготовления лекарственной формы и записывают-
ся на оборотной стороне паспорта. Названия лекарственных ве-
ществ записываются в паспорте на латинском языке по памяти
после изготовления лекарственной формы. При использовании по-
луфабрикатов и концентратов указываются их количества и кон-
центрация, а при изготовлении порошков (суппозиториев, пи-
люль) — масса отдельных доз и их количество. В паспорте отме-
чаются также формулы, используемые при расчетах, коэффици-
енты увеличения объема водных растворов при растворении
лекарственных веществ, величина суппозиторной (пилюльной)
массы, количество изотонирующих или стабилизирующих ве-
ществ, добавляемых в глазные капли или растворы для инъек-
ций.
Ведение паспортов письменного контроля является обязатель-
ным и в тех случаях, когда лекарство изготавливается и отпуска-
ется одним и тем же лицом. Паспорт при этом заполняется в
процессе изготовления лекарственной формы. Во всех остальных
случаях производит проверку рецепта и заполненного паспорта
провизор-технолог или лицо, его заменяющее. Контроль заклю-
чается в проверке соответствия записей в паспорте, прописи в
рецепте и правильности произведенных расчетов. Если лекарствен-
ная форма проверена провизором-аналитиком полным химичес-
ким контролем, то на паспорте ставятся номер анализа и подпись
провизора-аналитика. Паспорта письменного контроля хранятся
в аптеке в течение двух месяцев.
Опросный контроль производится выборочно после изготовле-
ния фармацевтом не более пяти лекарственных форм. При прове-
74
дении опросного контроля провизор-технолог называет первый
входящий в лекарственную форму ингредиент, а в сложных ле-
карственных формах указывает также его количество. После это-
го фармацевт перечисляет все взятые им ингредиенты и их коли-
чества. Если для приготовления лекарственной формы использо-
вались полуфабрикаты или концентраты, то фармацевт должен
назвать их состав и концентрацию.
Органолептический контроль заключается в проверке лекар-
ственной формы (в том числе и гомеопатической) по показате-
лям: внешний вид (“описание”)> запах, однородность, отсутствие
механических включений (в жидких лекарственных формах).
На вкус проверяются выборочно лекарственные формы для де-
тей.
Однородность порошков, гомеопатических тритураций, ма-
зей, пилюль, суппозиториев проверяется до разделения массы
на дозы.
Проверка осуществляется выборочно у каждого фармацевта в
течение рабочего дня с учетом видов лекарственных форм.
Физический контроль заключается в проверке общей массы
или объема лекарственной формы, а также количества и массы
отдельных доз, входящих в данную лекарственную форму. Конт-
ролируют массу 5—10 % от общего числа доз, входящих в состав
лекарственной формы, но не менее трех доз. Физическому конт-
ролю подвергаются каждая серия фасовки и внутриаптечной за-
готовки (не менее трех—пяти единиц от серии), все лекарствен-
ные формы, требующие стерилизации, до ее проведения и после
того, как проведена расфасовка. Лекарственные формы индиви-
дуального Изготовления контролируют выборочно, периодически
в течение рабочего дня в количестве не менее 3 % от общего коли-
чества всех видов лекарственных форм, изготовленных за день.
При выполнении физического контроля проверяется также каче-
ство укупорки.
Химический контроль основан на выполнении либо только ка-
чественного анализа (установление подлинности), либо полного
химического контроля, включающего качественный анализ и ко-
личественное определение содержания лекарственных веществ в
изготовленных в аптеке лекарственных формах.
Ежедневно качественному анализу в обязательном порядке под-
вергается вода очищенная из каждого баллона или из трубопро-
вода на каждом рабочем месте. Воду очищенную в соответствии с
требованиями ФС контролируют на отсутствие хлоридов, сульфа-
тов и солей кальция. Вода для приготовления инъекционных ра-
75
створов, а также лекарств для новорожденных и глазных капель
кроме указанных испытаний проверяется также на отсутствие
восстанавливающих веществ, аммиака и углекислого газа. Один
раз в квартал вода очищенная направляется из аптеки в конт-
рольную испытательную лабораторию для полного химического
анализа.
Качественному химическому анализу подлежат лекарствен-
ные средства, концентраты и полуфабрикаты, в том числе гомео-
патические настойки, тритурации, растворы, разведения, кото-
рые поступают из помещений хранения в ассистентскую. В слу-
чае возникающих сомнений аналогичным образом контролиру-
ют лекарственные средства, поступающие в аптеку со склада.
Ежедневно контролируют в ассистентской комнате концентра-
ты, полуфабрикаты и жидкие лекарственные формы, находящие-
ся в бюреточной установке и в штангласах с пипеткой, а также
каждую серию лекарств, расфасованных в аптеке. Лекарствен-
ные формы, изготовленные по индивидуальным рецептам и тре-
бованиям лечебно-профилактических учреждений, подвергают
качественному анализу выборочно в течение рабочего дня, но не
менее 10 % от общего количества изготовленных лекарственных
форм. Качественному анализу подвергаются все виды лекарствен-
ных форм, но особое внимание уделяется контролю детских ле-
карственных форм (особенно для новорожденных), а также ле-
карственных форм, применяемых в офтальмологии или содер-
жащих наркотические и ядовитые вещества. При отсутствии
методик количественного анализа лекарственных форм для но-
ворожденных они подвергаются проверке качественными реак-
циями.
Полному химическому контролю (качественному и количествен-
ному) подвергаются:
— все растворы для инъекций и инфузий до стерилизации,
включая определение величины pH, изотонирующих и стабили-
зирующих веществ. Растворы для инъекций и инфузий после сте-
рилизации проверяются на величину pH, подлинность и количе-
ственное содержание действующих веществ;
— стерильные растворы для наружного применения;
— глазные капли и мази, содержащие наркотические и ядови-
тые вещества;
— все лекарственные формы для новорожденных;
— растворы атропина сульфата и кислоты хлористо-водород-
ной (для внутреннего употребления), растворы ртути дихлорида и
серебра нитрата;
76
— все концентраты, полуфабрикаты, тритурации, в том числе
жидкие гомеопатические разведения неорганических и органи-
ческих лекарственных веществ и их тритурации, до третьего де-
сятичного разведения;
— вся внутриаптечная заготовка лекарственных средств (каж-
дая серия);
— стабилизаторы, применяемые при изготовлении растворов
для инъекций, и буферные растворы, применяемые при изготов-
лении глазных капель;
— концентрация спирта этилового при разведении в аптеке, а
в случае необходимости — при приеме со склада;
— концентрация спирта этилового в водно-спиртовых гомео-
патических растворах и каплях (каждая серия);
— гомеопатические гранулы на распадаемость (каждая серия)
в соответствии с требованиями действующих нормативных доку-
ментов.
Качественному и количественному анализу (полный химичес-
кий контроль) подвергаются выборочно лекарственные формы,
изготовленные в аптеке по индивидуальным рецептам или требо-
ваниям лечебных учреждений в количестве не менее трех при
работе в одну смену с учетом всех видов лекарственных форм.
Особое внимание обращается на лекарственные формы для детей;
применяемые в глазной практике; содержащие наркотические и
ядовитые вещества; растворы для лечебных клизм.
Результаты полного химического контроля регистрируются в
журнале.
Результаты органолептического, физического, качественного
и полного химического контроля регистрируются в соответствую-
щих журналах. Все случаи неудовлетворительного изготовления
лекарств, выявленные в аптеке, фиксируются в специальном жур-
нале. Брак устраняется, лекарственное средство вновь контроли-
руется, а если необходимо, готовится заново, проверяется и толь-
ко после этого отпускается.
Особые требования к контролю растворов для инъекций. Этот
контроль должен охватывать все стадии изготовления инъекци-
онных растворов. Результаты постадийного контроля вносятся в
специальный журнал, отдельно регистрируются результаты пол-
ного химического анализа растворов для инъекций.
Помимо полного химического контроля качество инъекцион-
ных растворов до стерилизации (включая определение pH, изото-
иирующих и стабилизирующих веществ) контролируется также
после стерилизации по внешнему виду, величине pH раствора,
77
установлению подлинности и количественному содержанию каж-
дого ингредиента. Для контроля отбирают один флакон с инъек-
ционным раствором от каждой серии. Осуществляется также кон-
троль качества упаковки флаконов, достаточности их заполнения,
отсутствие механических включений до и после стерилизации, а
также в случаях, предусмотренных инструкциями, на стериль-
ность и пирогенные вещества. Стерилизация растворов для инъ-
екций осуществляется ие позднее чем через три часа с начала
приготовления. Повторная стерилизация растворов для инъекций
не допускается. Параметры стерилизации регистрируются в жур-
нале.
Изготовление растворов для инъекций не допускается при от-
сутствии данных о химической совместимости в них ингредиен-
тов, технологии изготовления, режиме стерилизации, а также при
отсутствии методик их полного химического контроля. Категори-
чески запрещается одновременное изготовление нескольких инъ-
екционных растворов, содержащих лекарственные вещества с раз-
ными наименованиями или одни и те же лекарственные средства,
но в различных концентрациях. Растворы для инъекций счита-
ются забракованными, при несоответствии их физико-химических
показателей, наличии видимых механических включений, несте-
рильности, недостаточном объеме заполнения флакона, наруше-
нии фиксированности укупорки.
Хранят растворы для инъекций в строгом соответствии с фи-
зико-химическими свойствами входящих в их состав лекарствен-
ных веществ и установленными сроками годности.
Контроль при отпуске. Ему подвергаются все изготовленные
в аптеке лекарства. При этом контролируют соответствие упа-
ковки физико-химическим свойствам входящих в иих ингреди-
ентов, правильность оформления отпускаемых лекарств действу-
ющим требованиям НД, соответствие указанных в рецепте доз
лекарственных веществ списка А или Б возрасту больного, соот-
ветствие фамилии больного и номера на рецепте и этикетке, пра-
вильность содержания и оформления копии рецепта. Лицо, отпу-
стившее лекарственное средство, обязано поставить свою роспись
на оборотной стороне рецепта (требования).
Порядок оценки качества лекарств, изготовляемых в аптеках,
и нормы допустимых отклонений при их изготовлении установ-
лены приказом М3 РФ № 305 от 16 октября 1997 г. Для оценки
качества изготовленных лекарств используются термины “удов-
летворяет” или “ие удовлетворяет” требованиям ГФ, ФС, ВФС или
инструкциям М3 РФ.
78
1. Неудовлетворительность изготовленных лекарственных
средств устанавливается по следующим показателям их ка-
чества:
1.1. Несоответствие по описанию (внешний вид, цвет, запах).
1.2. Несоответствие по прозрачности или цветности.
1.3. Несоответствие по распадаемости.
1.4. Неоднородность по измельченности или смешиванию по-
рошков, мазей, суппозиториев, гомеопатических тритура-
ций.
1.5. Наличие видимых механических включений.
1.6. Несоответствие прописи по подлинности:
1.6.1. Ошибочная замена одного лекарственного вещества
другим, отсутствие прописанного или наличие непрописан-
ного вещества.
1.6.2. Замена лекарственных средств на аналогичные по фар-
макологическому действию без обозначения этой замены на
требовании, рецепте (копии рецепта, этикетке).
1.7. Отклонения от прописи по массе или объему:
1.7.1. Отклонения по общей массе (объему).
1.7.2. Отклонения по массе отдельных доз и их качеству.
1.7.3. Отклонения по массе навески (или по концентрации)
отдельных лекарственных веществ.
1.8. Несоответствие по величине pH.
1.9. Несоответствие по величине плотности.
1.10. Несоответствие по стерильности.
1.11. Несоответствие по микробиологической чистоте.
1.12. Нарушение фиксированности укупорки (для стерильных
лекарственных форм).
1.13. Нарушение действующих правил оформления лекарствен-
ных средств, предназначенных к отпуску.
Усложнение экстемпоральной рецептуры, разнообразие пропи-
санных компонентов и их дозировок нередко совершенно ничем
не оправданы. Необходимо проведение работы по унификации
часто повторяющихся прописей и разработке на них НД с вклю-
чением технологии и способов контроля качества. Эта огромная,
сложнейшая работа должна проводиться контрольными испыта-
тельными лабораториями, научно-исследовательскими и учебны-
ми фармацевтическими институтами и факультетами. Целесооб-
разность применения, терапевтическая эффективность, рациональ-
ная дозировка, фармакологическая совместимость должны под-
тверждаться соответствующими главными специалистами, уче-
ными, врачами. Затем в НИИ и вузах на соответствующих кафед-
79
pax разрабатываются технология и методики контроля качества,
рациональная упаковка, сроки годности для включения в НД.
Проекты НД должны апробироваться в базовых аптеках, конт-
рольных испытательных лабораториях, а затем рассматриваться
на комиссии по стандартизации НИИ Фармации М3 РФ. Конеч-
ной стадией является утверждение НД и издание сборников уни-
фицированных прописей для повседневной работы врачей и про-
визоров.
2. ОЦЕНКА ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФИЗИЧЕСКИХ
КОНСТАНТ
Одним из важных этапов фармацевтического анализа являет-
ся оценка степени чистоты ЛС. Все ЛС независимо от способов
получения испытывают на доброкачественность. При этом уста-
навливают содержание примесей. Примеси, встречающиеся в ЛС,
в зависимости от их характера и свойств могут оказывать влия-
ние на фармакологическое действие ЛС или могут не иметь спе-
цифического действия, а их присутствие указывает на степень
очистки лекарственного вещества (например, примеси хлоридов,
сульфатов).
Основными источниками примесей являются аппаратура, за-
грязненное сырье, растворители и другие вещества, которые ис-
пользуют при получении ЛС. В ЛС могут быть примеси, появле-
ние которых связано с изменением их физических и химических
свойств под действием влаги, света, кислорода, тары и других
факторов окружающей среды.
В отличие от химических веществ, которые классифицируют-
ся в зависимости от степени чистоты как “чистые”, “чистые для
анализа” и “химически чистые”, лекарственные вещества долж-
ны быть “фармакопейного качества”. В частной статье на каждое
лекарственное вещество приведен перечень показателей, по кото-
рым устанавливается его чистота (внешний вид, растворимость,
температура плавления или кипения, pH, цветность, примеси
других веществ и ионов, зола, влажность, удельный показатель
светопоглощения, показатель преломления, удельное вращение и
др.). Несоответствие лекарственного вещества одному из преду-
смотренных НД показателей указывает на изменение его каче-
ства, наличие примесей или появление их в процессе хранения.
Для установления чистоты лекарственных веществ использу-
ют различные физические, физико-химические, химические ме-
тоды анализа или их сочетание.
Важной физической константой, характеризующей подлинность
и степень чистоты ЛС, является температура плавления. Чис-
тое вещество имеет четкую температуру плавления. Незначитель-
ное количество примесей изменяет его температуру плавления.
Поскольку лекарственные вещества “фармакопейного качества”
содержат примеси, для них дается интервал температуры плавле-
ния (для большинства веществ в пределах 2 °C). По требованиям
государственной фармакопеи (ГФ) температура плавления лекар-
6. Заказ 3547
81
ственного вещества не должна выходить за указанные для него
пределы. Для веществ, которые плавятся с разложением, обычно
указывается температура, при которой вещество разлагается и
происходит резкое его изменение.
В некоторых частных статьях ГФ X рекомендует определять
температуру затвердевания или температуру кипения (по
ГФ XI — “температурные пределы перегонки”) для ряда жидких
ЛС. Температура кипения должна укладываться в интервал, при-
веденный в частной статье. Более растянутый интервал говорит о
наличии примесей.
Во многих частных статьях ГФ X приведены допустимые зна-
чения плотности, реже вязкости, подтверждающие подлинность
и доброкачественность ЛС.
Практически все частные статьи ГФ X нормируют такой показа-
тель качества ЛС, как растворимость в различных растворителях.
Наличие примесей в веществе может повлиять на его растворимость,
снижая или повышая ее в зависимости от природы примеси.
Определенным критерием чистоты ЛС могут служить такие
физические константы, как показатель преломления луча света
в растворе испытуемого вещества (рефрактометрия) и удельное
вращение, обусловленное способностью ряда веществ или их ра-
створов вращать плоскость поляризации при прохождении через
них плоскополяризованного света (поляриметрия). Методы опре-
деления этих констант относятся к оптическим методам анализа
и применяются также для установления подлинности и количе-
ственного анализа ЛС и их лекарственных форм.
Многие частные статьи ГФ X нормируют цветность и про-
зрачность ряда жидких ЛС, которые устанавливаются путем ви-
зуального сравнения их с эталонами цветности и мутности. Нали-
чие примесей может повлиять на каждый из этих показателей.
Важным критерием доброкачественности целого ряда ЛС яв-
ляется содержание в них воды. Изменение этого показателя (осо-
бенно при хранении) может изменить концентрацию действую-
щего вещества, а, следовательно, и фармакологическую актив-
ность и сделать ЛС не пригодным к применению [5].
2.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ПОЛЯРИМЕТРИИ В
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ. ОЦЕНКА
ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ПО ВЕЛИЧИНЕ УДЕЛЬНОГО ВРАЩЕНИЯ
Поляриметрический метод анализа основан на способности
веществ отклонять плоскость поляризации при прохождении че-
рез них пучка плоскополяризованного света и применяется для
82
качественной (подлинность, проверка на чистоту) и количествен-
ной оценки оптически активных лекарственных веществ.
В зависимости от природы оптически активного вещества вра-
щение плоскости поляризации может иметь различное направле-
ние и величину. Если от наблюдателя, к которому направлен свет,
проходящий через оптически активное вещество, плоскость по-
ляризации вращается по часовой стрелке, то вещество называют
правовращающим (D) и перед его названием ставят знак “+”, если
же плоскость поляризации вращается против часовой стрелки, то
вещество называют левовращающим (L) и перед его названием
ставят знак
Величину отклонения плоскости поляризации от начального
положения, выраженную в угловых градусах, называют углом
вращения и обозначают греческой буквой а. Величина угла вра-
щения зависит от природы оптически активного вещества, тол-
щины слоя вещества (длины пути света в оптически активном
веществе) и длины волны света. Для растворов величина угла вра-
щения зависит также от природы растворителя и концентрации
оптически активного вещества. Величина угла вращения прямо
пропорциональна толщине слоя оптически активного вещества
или его раствора. Влияние температуры в большинстве случаев
незначительно.
Для сравнительной оценки способности различных веществ
вращать плоскость поляризации света вычисляют величину удель-
ного вращения [а]. Удельное вращение — это константа оптичес-
ки активного вещества. Удельное вращение [а] определяют рас-
четным путем как угол поворота плоскости поляризации моно-
хроматического света на пути длиной в 1 дм в среде, содержащей
оптически активное вещество, при условном приведении концен-
трации этого вещества к значению, равному 1 г/мл.
Если нет специальных указаний, определение оптического вра-
щения проводят при температуре 20 °C и при длине волны D спек-
тра натрия (589,3 нм). Соответствующую величину удельного вра-
щения обозначают [а]р°. Иногда для измерения используют зеле-
ную линию спектра ртути с длиной волны 546,1 нм.
При определении [а] в растворах оптически активного ве-
щества необходимо иметь в виду, что найденная величина мо-
жет зависеть от природы растворителя и концентрации опти-
чески активного вещества. Замена растворителя может приве-
сти к изменению [а] не только по величине, но и по знаку.
Поэтому, приводя величину удельного вращения, необходимо
указывать растворитель и выбранную для измерения концент-
рацию раствора.
о*
83
Величину удельного вращения рассчитывают по одной из сле-
дующих формул:
для веществ, находящихся в растворе:
[а] = (а • 100)/Zc,
где а — измеренный угол вращения, град; I — толщина слоя,
дм; с — концентрация раствора, выраженная в граммах вещества
на 100 мл раствора;
для жидких веществ:
[а] = а / Zp,
где р — плотность жидкого вещества, г/мл.
Удельное вращение определяют либо в пересчете на сухое ве-
щество, либо из высушенной навески, о чем в частных статьях
должно быть соответствующее указание.
Измерение величины угла вращения проводят либо для каче-
ственной оценки ЛС, либо для его количественного определения
в растворе. Для оценки чистоты вещества по одному из приведен-
ных уравнений рассчитывают величину его удельного вращения
[а] и сравнивают с интервалом этой величины, который нормиру-
ется соответствующей частной статьей ГФ X. Таким способом ГФ X
нормирует качество около 60 ЛС, в молекулах которых имеется
асимметрический атом углерода (алкалоиды, гормоны, витами-
ны, антибиотики, терпены).
Концентрацию оптически активного вещества в растворе нахо-
дят по формуле:
а 100
с =-----.
[а]/
Поскольку величина [а] постоянна только в определенном ин-
тервале концентраций, использование формулы ограничено этим
интервалом.
Для измерения угла вращения применяют специальные при-
боры — поляриметры, позволяющие определить величину угла
вращения с точностью до ± 0,02°.
Работу на поляриметре начинают с установки нулевой точки
прибора: с пустой трубкой в случае, если исследуют чистое жид-
кое вещество, и с растворителем, если исследуют растворы ве-
ществ. При этом призмы анализатора приводят в положение,
при котором оба поля зрения имеют равное освещение. Эту опе-
рацию повторяют 3 раза и из полученных показаний берут сред-
нее значение, которое принимают за нулевое положение призм
(величина поправки). Далее также 3 раза проводят определение
с испытуемым образцом. Алгебраическая разность между вто-
84
рым и первым определением (поправкой) составляет угол вра-
щения (а) [1].
2.2. ОЦЕНКА ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПО ИХ РАСТВОРИМОСТИ
Практически все частные статьи ГФ X нормируют раствори-
мость ЛС в воде, спирте, хлороформе и некоторых других раство-
рителях. Под растворимостью в ГФ XI подразумевается не физи-
ческая константа, а свойство вещества, позволяющее дать ориен-
тировочную оценку подлинности и доброкачественности ЛС. На-
личие примесей выше установленного предела может заметно
сказаться на растворимости исследуемого вещества. Показатели
растворимости в разных растворителях приведены в частных ста-
тьях.
В ГФ XI предусмотрены условные термины растворимости.
Каждый из них соответствует определенному интервалу объемов
растворителя (мл), в пределах которого должно происходить пол-
ное растворение 1,0 г вещества. Оно считается полностью раство-
рившимся тогда, когда невооруженным глазом не будут обнару-
живаться частицы вещества.
Работа 1. Определение степени чистоты лекарственных
препаратов по их растворимости и удельному вращению
Задание 1. Установить растворимость левомицетина в различ-
ных растворителях и ее соответствие требованиям ГФ X.
ГФ X (с. 371) нормирует растворимость левомицетина в следу-
ющих растворителях: мало растворим в воде, легко растворим в
95 %-ном спирте, растворим в этилацетате, практически не ра-
створим в хлороформе.
Устанавливают растворимость левомицетина в разных раство-
рителях в соответствии с условными терминами (табл. 2.1).
Растворимость определяют следующим образом: навеску лево-
мицетина, предварительно растертого в порошок, вносят в отме-
ренный объем растворителя, соответствующий минимальному его
объему (см. табл. 2.1). Затем добавляют растворитель до макси-
мального его объема, при котором в растворе невооруженным гла-
зом не обнаруживаются частицы препарата. Процесс растворения
осуществляют в растворителях, имеющих температуру 20±2 °C,
путем непрерывного встряхивания в течение 10 мин. Массу пре-
парата взвешивают с точностью до 0,01 г с таким учетом, чтобы
на установление его растворимости расходовалось не более 100 мл
воды, а органических растворителей — не более 10—20 мл. Та-
ким образом, навеска левомицетина 0,10 г должна быть раство-
85
Табица 2.1
Раство- ритель Условный термин Минималь- ный объем растворителя на 1,0 г пре- парата, мл Максималь- ный объем растворителя на 1,0 г пре- парата, мл Соответ- ствие ГФ X, с. 371
Вода Мало раство- рим (м.р.) 100 1000
Спирт 95%-ный Легко раство- рим (л.р.) 1 10
Этилацетат Хлороформ Растворим (р.) Практически не растворим (пр.н.р.) 10 30 более 10 000
рима в 10—100 мл воды; 1,00 г — в 1—10 мл 95 %-ного этанола;
0,5 г — в 5—15 мл этилацетата; даже 0,001 г левомицетина не
должно растворяться в 10 мл хлороформа.
Делают вывод о соответствии ГФ X.
Полученные растворы левомицетина в 95 %-ном этаноле и этил-
ацетате сохраняют для определения подлинности поляриметри-
ческим методом.
Задание 2. Оценить качество левомицетина методом поляри-
метрии.
Определение подлинности левомицетина
Одним из способов, подтверждающих подлинность левомице-
тина, является определение направления вращения плоскости
поляризации его растворами. Для определения подлинности со-
гласно ГФ X (с. 371) готовят растворы левомицетина в 95 %-ном
спирте и этилацетате (можно воспользоваться растворами, приго-
товленными в предыдущем задании). Приготовленный раствор по-
мещают в кювету поляриметра, предварительно сполоснув ее этим
раствором, и отмечают направление вращения плоскости поляри-
зации раствором относительно воды. Раствор левомицетина в
95 % -ном спирте должен вращать плоскость поляризации впра-
во, в этилацетате — влево.
Для подтверждения подлинности используется и химический
метод, здесь не приводящийся.
Определение удельного вращения спиртового раствора левомицетина
ГФ X, с. 371 “Левомицетин” (раздел “числовые показатели”)
нормирует интервал, в который должно укладываться значение
86
удельного вращения 5 % -го раствора левомицетина в 95 % -ном
спирте. Удельное вращение должно составлять от +18 до +21°
(относительно 95 %-ного спирта).
Готовят 15—20 мл указанного раствора левомицетина и изме-
ряют величину угла вращения плоскости поляризации приготов-
ленным раствором на поляриметре. Измерение проводят относи-
тельно растворителя, 95 % -ного этанола. Рассчитывают удельное
вращение по формуле:
г л а-100
[а] = ——,
1с
где а — измеренный угол вращения, град; I — толщина слоя ра-
створа, дм (для используемой кюветы I = 1); с — концентрация
раствора левомицетина, выраженная в г на 100 мл раствора.
Сравнивают полученное значение с интервалом, указанным в
статье. Делают вывод о соответствии требованию ГФ.
Работа 2. Изучение возможностей использования
поляриметрии в количественном анализе лекарственных
форм
Задание. Выполнить количественный анализ раствора глюко-
зы для инъекций с использованием метода поляриметрии.
Лекарственная форма
Раствор глюкозы 5, 10, 25 или 40 % -ный для инъекций.
Состав:
Глюкозы безводной 50 г, 100 г, 250 г или 400 г
Раствора соляной кислоты 0,1 н. до pH 3,0—4,0
Натрия хлорида 0,26 г, 0,26 г, 0,26 г, 0,26 г
Воды для инъекций до 1 л
Полученными для испытания растворами глюкозы поочеред-
но заполняют кювету поляриметра и трижды проводят измерение
угла вращения каждого из испытуемых растворов. Берут среднее
из трех измерений и делают расчет содержания глюкозы в ра-
створе по формуле:
а-100
с =-----,
[а]-/
где с — концентрация раствора, %; а — определенный угол вра-
щения данного раствора, град.; I — толщина оптического пути
(толщина слоя), дм; [а] — удельное вращение водного раствора
глюкозы: [а] = 51,5—53° (справочные данные).
Содержание С6Н12О6 в 1 мл препарата соответственно долж-
но быть 0,0485—0,0515 г; 0,097—0,103 г; 0,242—0,258 г;
87
0,388—0,412 г (или 4,85—5,15 %; 9,7—10,3 %; 24,2—25,8 %;
38,8—41,2 %).
Делают вывод о соответствии требованиям ГФ.
2.3. ОЦЕНКА ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ЭТАЛОННЫХ РАСТВОРОВ
Определить содержание примесей в испытуемом лекарствен-
ном средстве можно двумя путями — эталонным и безэталонным.
Эталонный основан на наблюдении в одинаковых условиях ок-
раски или помутнения, возникающих под действием какого-либо
реактива на испытуемое вещество в сравнении с эталонным ра-
створом (стандартом). Система эталонов, рекомендуемая ГФ X и
XI, позволяет достигнуть одинаковой точности анализа, унифи-
цировать и значительно ускорить выполнение испытаний на чис-
тоту.
Эталон представляет собой образец, содержащий определенное
количество открываемой примеси. Установление наличия приме-
сей производят колориметрическим или нефелометрическим ме-
тодом, сравнивая результаты реакций в растворе эталона и в ра-
створе препарата после добавления одинаковых количеств соот-
ветствующих реактивов. Достигаемая при этом точность вполне
достаточна, чтобы установить, больше или меньше, чем допусти-
мо, содержится примесей в испытуемом препарате.
С использованием системы эталонов по ГФ X и XI выполняют
разнообразные испытания ЛС на чистоту. Основные из них при-
ведены:
1. Определение прозрачности; степени мутности и окраски
жидких ЛС или их растворов в указанных растворителях по срав-
нению с эталонами, номер которых указан в частных статьях ГФ.
2. Испытания на примеси неорганических ионов, являющие-
ся общими для большинства ЛС. В ходе испытания препарат
анализируют на предельное содержание хлоридов, сульфатов,
тяжелых металлов, солей кальция, железа, цинка и делают зак-
лючение о наличии допустимых количеств примесей рассмот-
ренных катионов и анионов, если интенсивность опалесценции
или окраски в испытуемом растворе не превышает таковую в
эталоне.
3. Испытание, рекомендованное во многих частных статьях
ГФ для определения примесей органических веществ, основанное
на их взаимодействии с серной кислотой. В результате дегидрата-
ции или окисления образуются окрашенные продукты. Интен-
88
сивность полученной окраски не должна превышать соответству-
ющего эталона цветности.
4. Испытание на содержание предполагаемой специфической
примеси, основанное на приготовлении эталонного раствора из
вещества, являющегося примесью к данному препарату. Готовят
испытуемый раствор препарата и эталонный раствор, содержа-
щий предельно допустимое количество химически чистой приме-
си. Затем к обоим растворам прибавляют соответствующий реак-
тив. Интенсивность окраски или опалесценции у раствора препа-
рата должна быть меньше, чем у эталона.
При выполнении испытаний на чистоту необходимо строго со-
блюдать общие указания, предусмотренные фармакопеей. Вода и
используемые реактивы не должны содержать ионов, наличие
которых устанавливают; пробирки должны быть одинакового диа-
метра и бесцветными; навески должны взвешиваться с точностью
до 0,001 г; реактивы следует добавлять одновременно и в одина-
ковых количествах как к эталонному, так и к испытуемому ра-
створу; образующуюся опалесценцию наблюдают в проходящем
свете на темном фоне, а окраску — в отраженном свете на белом
фоне. Если устанавливают отсутствие примеси, то к испытуемо-
му раствору прибавляют все реактивы, кроме основного; затем
полученный раствор делят на две равные части и к одной из них
прибавляют основной реактив. При растворении не должно быть
заметных различий между обеими частями раствора.
Следует иметь в виду, что последовательность и скорость при-
бавления реактива влияют на результаты испытаний на чисто-
ту. Иногда необходимо также соблюдать интервал времени, в
течение которого следует вести наблюдение за результатом реак-
ции.
Работа 3. Определение содержания примесей в лекар-
ственных препаратах при помощи эталонных растворов
Задание 1. Освоить способы определения прозрачности и сте-
пени мутности растворов лекарственных средств по методике
ГФ XI.
Прозрачность и степень мутности жидкостей определяют пу-
тем сравнения испытуемой жидкости с растворителем или этало-
нами.
Испытание проводят при освещении электрической лампой
матового стекла мощностью 40 Вт на черном фоне при вертикаль-
ном расположении пробирок.
Жидкость считают прозрачной, если при ее рассмотрении не-
вооруженным глазом не наблюдается присутствия нерастворимых
89
частиц, кроме единичных волокон. Сравнение проводят с раство-
рителем, взятым для приготовления жидкостей.
Приготовление эталонных растворов мутности
Эталонами для определения степени мутности служат взвеси
из гидразина сульфата и гексаметилентетрамина.
I. Приготовление раствора гидразина сульфата. 0,50 г гид-
разина сульфата (ГОСТ 5841-74, ч.д.а.) помещают в мерную кол-
бу вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл воды, перемешивают,
доводят объем раствора водой до метки и оставляют на 6 ч.
II. Приготовление раствора гексаметилентетрамина. 3,00 г
гексаметилентетрамина растворяют в 30 мл воды, отмеренных пи-
петкой или бюреткой.
III. Приготовление исходного эталона. К 25 мл раствора гид-
разина сульфата прибавляют 25 мл раствора гексаметилентетра-
мина, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч. Растворы
гидразина сульфата и гексаметилентетрамина отмеривают пипет-
кой или бюреткой.
Срок годности исходного эталона — 2 месяца в склянках с
притертыми пробками.
Примечание. Перед применением исходный эталон, основ-
ной эталон и эталонные растворы следует тщательно перемеши-
вать в течение 3 мин.
IV. Приготовление основного эталона. 15 мл исходного этало-
на, взятого пипеткой, помещают в мерную колбу вместимостью
1 л, доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.
Срок годности основного эталона — 24 ч.
V. Приготовление эталонных растворов. Для приготовления
эталонных растворов I, II, III, IV основной эталон берут пипеткой
или бюреткой в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят
объем жидкости водой до метки.
Эталонные растворы I, II, III, IV должны быть свежеприготов-
ленными (табл. 2.2).
Для сравнения берут равные объемы эталонного раствора и
испытуемой жидкости (5 или 10 мл). Сравнение проводят в про-
бирках бесцветного стекла или стекла одинакового оттенка, одно-
го и того же диаметра с притертыми пробками.
Таблица 2.2
Эталонные растворы
I II III IV
Основной эталон, мл 5 10 30 50
Вода, мл 95 90 70 50
90
Приготовление раствора испытуемого лекарственного средства
Для испытания подбирают одно из лекарственных средств,
приведенных в табл. 2.3. Готовят его раствор с соблюдением усло-
вий, указанных в частной статье.
Таблица 2.3
Условия проведения испытаний на прозрачность, степень мутности и
окраску растворов лекарственных препаратов по ГФ XI
Лекарственный препарат Условия приготовления раствора Прозрачность и степень мутности раствора Окраска раствора
Хлоралгидрат 1 г растворяют в 10 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды Прозрачный Бесцветный
Терпингидрат Темнсал 0,3 г растворяют в 3 мл кипящего этанола 1 г растворяют при нагре- вании до 40 °C в 20 мл све- жеприготовленной воды — « — Не превы- шает эталон № 3 — 4—
Фталазол 0,2 г растворяют в смеси из 1 мл 1 н. раствора гидроксида натрия и 4 мл воды Прозрачный Не интен- сивнее эта- лона № 4а
Натрия п-ами- носалицилат 1,0 г растворяют в 10 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды —4 — Не интен- сивнее эта- лона № 56
Определение прозрачности или степени мутности
приготовленных РАСТВОРОВ
Определение проводят так, как описано выше, сравнивая при-
готовление раствора с растворителем и эталонами.
Делают вывод о соответствии требованию ГФ.
Задание 2. Освоить способы определения окраски растворов
лекарственных средств по ГФ XI.
Окраску жидкостей определяют визуально путем сравнения с
соответствующими эталонами. Исследуемые жидкости и эталоны
берут для сравнения в равных количествах. Сравнение произво-
дят в пробирках одинакового стекла и диаметра при дневном от-
раженном свете на матово-белом фоне.
Окраска исследуемого образца должна быть идентична эта-
лону или только приближаться к отмеченной окраске, не пре-
вышая ее по интенсивности, ио несколько отличаясь от нее по
тону. Жидкость, которая должна быть бесцветной, рассматри-
вают сверху через весь слой жидкости на матово-белом фоне.
Бесцветными считают жидкости, которые по цвету не отлича-
91
ются от воды, а в случае растворов — от соответствующего ра-
створителя.
Приготовление эталонных растворов цветности
Раствор А. Около 6,00 г (точная навеска) растертого хлорида
кобальта (СоС12-6Н2О; ММ 237,93) растворяют в разбавленной сер-
ной кислоте (0,1 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл,
перемешивают и доводят объем раствором серной кислоты
(0,1 моль/л) до метки.
Содержание хлорида кобальта в растворе определяют следую-
щим образом: 6 мл раствора хлорида кобальта помещают в кони-
ческую колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибав-
ляют 5 мл 3 % -ного раствора перекиси водорода и 30 мл раствора
едкого натра, смесь кипятят с обратным холодильником в тече-
ние 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, при-
бавляют 2 г йодида калия и 15 мл 50 %-ного раствора серной
кислоты. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата нат-
рия — 0,1 моль/л (индикатор — крахмал).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02379 г хлорида кобальта (II).
Объем раствора хлорида кобальта (СоС12-6Н2О) разбавляют та-
ким образом, чтобы содержание хлорида кобальта в 1 мл состав-
ляло 0,060 г.
Раствор Б. 0,4900 г растертого бихромата калия (К2Сг2О7;
ММ 294,18) растворяют в разбавленной серной кислоте (0,1 моль/л)
в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствором
серной кислоты (0,1 моль/л) до метки. 1 мл полученного раствора
должен содержать 0,0049 г бихромата калия (К2Сг2О7).
Содержание бихромата калия в растворе определяют следую-
щим образом: 20 мл раствора бихромата калия помещают в кони-
ческую колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибав-
ляют 30 мл разведенной хлористоводородной кислоты, 1 г йодида
калия, оставляют на 5 мин в темном месте, затем прибавляют
80 мл воды и титруют выделившийся йод раствором тиосульфата
натрия — 0,1 моль/л (индикатор — крахмал) до изменения ок-
раски в зеленый цвет.
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,004903 г бихромата калия.
Раствор В. Около 6,00 г (точная навеска) растертого сульфата
меди (II) (CuSO4-5H2O; ММ 249,68) растворяют в разбавленной
серной кислоте (0,1 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл
и доводят объем раствором серной кислоты (0,1 моль/л) до метки.
92
Содержание сульфата меди в растворе определяют следующим
образом: 10 мл раствора сульфата меди помещают в коническую
колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют
40 мл воды, 4 мл разведенной уксусной кислоты, 3 г йодида ка-
лия, смесь перемешивают и выделившийся йод титруют раство-
ром тиосульфата натрия — 0,1 моль/л (индикатор — крахмал).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02497 г сульфата меди (II). Объем раствора сульфата меди
(CuSO4-5H2O) разбавляют таким образом, чтобы содержание суль-
фата меди в 1 мл составляло 0,060 г.
Раствор Г. Около 4,50 г (точная навеска) хлорида железа (III)
(FeCl3-6H2O; ММ 270,30) растворяют в мерной колбе вместимо-
стью 100 мл в разбавленной серной кислоте (0,1 моль/л) и дово-
дят объем раствором серной кислоты (0,1 моль/л) до метки.
Содержание железа (III) в растворе определяют следующим
образом: 10 мл раствора хлорида железа помещают в коническую
колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют
15 мл разведенной хлористоводородной кислоты, 4 г йодида ка-
лия и оставляют на 15 мин в темном месте. После прибавления
100 мл воды выделившийся йод титруют раствором тиосульфата
натрия — 0,1 моль/л (индикатор — крахмал).
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02703 г. хлорида железа (III).
Объем раствора хлорида железа (FeCl3-6H,O) разбавляют таким
образом, чтобы содержание хлорида железа в 1 мл составляло 0,045 г.
Срок годности исходных растворов — 1 год.
Приготовление основных растворов
Основные растворы получают смешением исходных растворов
хлорида кобальта (А), бихромата калия (Б), сульфата меди (В) и
хлорида железа (Г) с раствором серной кислоты (0,1 моль/л) в
следующих соотношениях (табл. 2.4).
Таблица 2.4
Основной раствор Раствор А, мл Раствор Б, мл Раствор В, мл Раствор Г, мл Раствор серной кислоты (0,1 моль/л), мл
I 35,00 8,00 17,00 40,00 —
II 9,50 10,70 1,90 4,00 73,90
III 40,50 6,30 6,10 12,00 35,10
IV 3,50 10,40 20,10 4,00 62,00
Срок годности основных растворов — 1 год.
93
Приготовление эталонов
Эталоны для сравнения приготавливают из основных раство-
ров путем разбавления их раствором серной кислоты (0,1 моль/л).
Эталоны следует хранить по 5 мл в бесцветных, герметически
укупоренных пробирках или запаянных ампулах вместимостью
5 мл в защищенном от света месте.
Срок годности эталонов № 1, 2, 3, 4 — 4 дня. Эталоны № 5, 6, 7
следует применять свежеприготовленными (табл. 2.5).
Таблица 2.5
№ эталона Эталоны коричневых оттенков Эталоны желтых оттенков
шкала а шкала б
Основной Раствор серной кислоты (0,1 моль/л), мл Основной Раствор серной кислоты (0,1 моль/л), мл
раствор I, мл раствор II, мл
1 100,00 — 100,00 —
2 50,00 50,00 50,00 50,00
3 25,00 75,00 25,00 75,00
4 12,50 87,50 12,50 87,50
5 6,30 93,70 6,30 93,70
6 3,10 96,90 3,10 96,90
7 1,60 98,40 1,60 98,40
Эталоны розовых оттенков Эталоны зеленых оттенков
шкала в шкала г
Основной раствор Ш, мл Раствор серной кислоты (0,1 моль/л), мл Основной раствор IV, мл Раствор серной кислоты (0,1 моль/л), мл
1 100,00 — 100,00 —
2 50,00 50,00 50,00 50,00
3 25,00 75,00 25,00 75,00
4 12,50 87,50 12,50 87,50
5 6,30 93,70 6,30 93,70
6 3,10 96,90 3,10 96,90
7 1,60 98,40 1,60 98,40
Примечание. Раствор серной кислоты (0,1 моль/л): медленно и осторож-
но, при постоянном перемешивании, вливают 6 мл концентрированной серной
кислоты в 1020 мл воды.
При сравнении окраски испытуемого раствора с эталонами
указывают, кроме номера эталона, букву шкалы. Например, ок-
раска раствора не должна превышать эталон № 56 [9, 10].
94
Приготовление раствора испытуемого лекарственного средства
Для испытания берут одно из ЛС, приведенных в табл. 2.3.
Раствор готовят с соблюдением условий частной статьи (см.
табл. 2.3)
Определение цветности приготовленных растворов
Определение проводят так, как описано выше, сравнивая при-
готовленные растворы со шкалой эталонов. Делают вывод о соот-
ветствии ГФ.
Определение содержания органических примесей в лекарственных
СРЕДСТВАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТАЛОННЫХ растворов
Испытание основано на взаимодействии органических приме-
сей с серной кислотой (дегидратации или окислении) с образова-
нием окрашенных продуктов. Окраску полученного раствора срав-
нивают с эталоном, приводимым в частной статье.
А. К 0,5 г кислоты ацетилсалициловой в пробирке прибавляют
5 мл концентрированной серной кислоты. Окраска полученного
раствора не должна быть интенсивнее эталона № 5а.
Б. К 0,5 г кислоты аскорбиновой в пробирке прибавляют 2 мл
концентрированной серной кислоты и оставляют на 30 мин. Ок-
раска раствора не должна превышать окраски эталона № 56, раз-
веденного в 2 раза.
В. К 0,5 г кислоты салициловой в пробирке прибавляют 6 мл
концентрированной серной кислоты. Окраска раствора не долж-
на быть интенсивнее эталона № 5а.
Делают заключение о соответствии требованиям ГФ.
Определение содержания специфической примеси в лекарственном
СРЕДСТВЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТАЛОННОГО РАСТВОРА ЭТОЙ ПРИМЕСИ
Испытание проводят путем сравнения окраски испытуемого
раствора лекарственного вещества с эталонным раствором, содер-
жащим предельно допустимое количество примеси после добав-
ления к обоим растворам соответствующего реактива.
Определяют содержание свободной салициловой кислоты (при-
меси) в кислоте ацетилсалициловой.
0,3 г препарата растворяют в 5 мл спирта и прибавляют 25 мл
воды (испытуемый раствор). В один цилиндр помещают 15 мл это-
го раствора, в другой — 5 мл того же раствора, 0,5 мл 0,01 %-ного
водного раствора салициловой кислоты, 2 мл спирта и доводят во-
дой до 15 мл (эталонный раствор, содержащий примесь). Затем в
оба цилиндра добавляют по 1 мл 0,2 % -ного раствора железоаммо-
ниевых квасцов. Окраска испытуемого раствора не должна быть
интенсивнее эталонного раствора (не более 0,05 % в препарате).
95
Аналогично могут быть проведены испытания таблеток кисло-
ты ацетилсалициловой. Навеска растертых таблеток должна со-
держать 0,3 г ацетилсалициловой кислоты. Салициловой кисло-
ты должно быть не более 0,00062 г или 0,00125 г, считая на сред-
нюю массу одной таблетки, содержащей 0,25 г или 0,5 г ацетил-
салициловой кислоты соответственно [10].
2.4. ОЦЕНКА ДОБРОКАЧЕСТВЕННОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
СРЕДСТВ ПО СОДЕРЖАНИЮ В НИХ ВОДЫ
Вода в ЛС может содержаться в виде капиллярной, абсорбцион-
но-связанной, химически связанной (гидратной и кристаллогид-
ратной) или свободной форме.
Сама по себе вода, конечно, не оказывает токсичного действия
на организм, но завышенное или заниженное ее содержание на-
рушает дозировку действующего вещества, а, следовательно, из-
меняет и фармакологическую активность препарата. Именно по-
этому для многих ЛС частные статьи нормируют содержание воды.
Содержание воды, не укладывающееся в указанный интервал,
делает ЛС недоброкачественным, а, значит, и не пригодным к
использованию.
В ГФ XI включены три метода определения воды в лекарствен-
ных средствах. Два из них можно отнести к физическим мето-
дам — это метод высушивания и метод дистилляции, а один — к
химическим — это метод акваметрии, который больше известен
как метод Фишера.
Для определения воды перспективным является также исполь-
зование метода газожидкостной хроматографии, ИК- и УФ- спек-
трофотометрии и некоторые другие.
Работа 4. Определение содержания воды в лекар-
ственных препаратах
Задание 1. Определить содержание воды в лекарственном сред-
стве методом высушивания.
Для испытания берут одно из лекарственных веществ, приве-
денных в табл. 2.6.
Высушивание проводят в сушильном шкафу, отрегулирован-
ном на необходимую температуру, указанную в соответствующей
частной статье ГФ X. В сушильный шкаф помещают предвари-
тельно доведенный до постоянной массы бюкс с навеской веще-
ства, взвешенной с точностью до 0,0002 г. Если в статье не указа-
на продолжительность высушивания, то препарат выдерживают
в шкафу в течение 2 ч. Для охлаждения бюкс и крышку помеща-
96
Таблица 2.6
Условия определения потери в массе при высушивании
Препарат Масса, г Температура и условия- высушивания Допустимая потеря в массе, %
Калия бромид 1,0 120 °C до постоянной массы 1
Калия йодид 1,0 110 °C в течение 4 ч 1
Натрия бромид 0,5 110 °C в течение 4 ч 4
Натрия хлорид 1,0 110 °C до постоянной массы 0,5
Натрия бензоат 0,5 100—105 °C до постоянной массы 3
Натрия цитрат для инъекций 0,5 195—200 °C до постоянной массы > 25 и < 28
Натрия сульфат 1,0 120 °C до постоянной массы > 52 и < 56
Кальция лактат 0,5 120 °C до постоянной массы 30
Глюкоза 0,5 100—105 °C до постоянной массы 10
Фталазол 0,5 100—105 °C до постоянной массы 1,6
Темисал 0,2 100—105 °C до постоянной массы 6
Анальгин 0,25 100—105 °C до постоянной массы 5,5
ют в эксикатор над концентрированной серной кислотой (или дру-
гим водоотнимающим веществом) на 50 мин. В период высушива-
ния и охлаждения бюкс должен быть открытым. Затем закрыва-
ют бюкс крышкой и взвешивают. Высушивание повторяют в те-
чение 1 ч. Если после вторичной сушки и охлаждения разница по
сравнению с первым взвешиванием не превышает 0,0005 г, высу-
шивание прекращают. При большем расхождении операцию вы-
сушивания повторяют, после этого вычисляют разность массы
вещества до и после высушивания.
Потерю массы препарата при высушивании рассчитывают по
формуле
х = [(m - mJlOO/m],
где ш — масса лекарственного вещества до высушивания, г; тг —
масса лекарственного вещества после высушивания, г.
По найденной потере массы вещества при высушивании оце-
нивают доброкачественность лекарственного препарата. Резуль-
таты оформляют в виде табл. 2.7.
Таблица 2.7
Результаты определения потери в массе при высушивании
лекарственного препарата
Препарат
ял Масса после Заключение о
высушива- высушивания, г Найдено влаги, % соответствии требованиям
Ц.ЦЯ, 1* | ГФХ
Т. Заказ 3647
97
Задание 2. Определить содержание воды в лекарственном рас-
тительном сырье методом дистилляции.
В качестве объектов для выполнения задания используют ле-
карственное сырье, приведенное в табл. 2.8.
Таблица 2.8
Допустимое содержание влаги в растительном лекарственном сырье
Объекты Допустимое содержание влаги, % Найдено эксперимен- тально, % Вывод о соответствии ГФ
Лист мяты перечной Лист мать и мачехи Лист крапивы Травы пустырника Трава водяного перца Корень одуванчика Корень солодки Не более 14 Не более 13 Не более 14 Не более 13 Не более 14 Не более 14 Не более 14
Метод определения основан на измерении объема воды, ото-
гнанной из испытуемого ЛС, к которому добавляют некоторый
объем органического растворителя. При совместном присутствии
органического растворителя и воды перегонка происходит при тем-
пературе более низкой, чем у каждой из этих жидкостей. Это
объясняется тем, что смесь паров воды и органического раствори-
теля имеет упругость, равную сумме упругости их паров при дан-
ной температуре. В качестве органических растворителей для вы-
полнения испытаний по ГФ XI рекомендуется использовать толу-
ол или ксилол (ГФ XI, с. 177). Погрешность метода возрастает
вследствие задержки капель воды на внутренних стенках холо-
дильника и приемника, а также за счет образования достаточно
больших масс вещества (10—20 г). Кипячение проводят так, что-
бы конденсирующийся растворитель не скапливался в холодиль-
нике, а полностью стекал в приемник.
Испытание выполняют в приборе для определения воды (ГФ XI,
с. 177). Сырье измельчают до размера частиц около 10 мм. В кол-
бу помещают массу сырья (около 20 г), взвешенную с погрешнос-
тью ± 0,01 г, приливают 100 мл толуола (ксилола) и прибавляют
несколько кусочков пемзы. Колбу соединяют с прибором и мед-
ленно нагревают так, чтобы конденсирующийся растворитель спо-
койно стекал со скоростью 2—4 капли в секунду. Когда основная
масса воды перегонится, нагревание постепенно усиливают и про-
должают его до просветления слоя толуола (ксилола). Увеличе-
ние объема воды в приемнике в этот период должно прекратить-
ся. После расслоения жидкостей отсчитывают объем перегнав-
98
шейся воды по градуировке на приемнике. Следует иметь в виду,
что приемник представляет собой цилиндрическую пробирку,
внизу конусообразно суженную. Поэтому йервый объем градуи-
рован по 0,05 мл, а последующие — по 0,2 мл.
Содержание влаги рассчитывают по формуле
X = V • 100/т,
где т — масса лекарственного растительного сырья, взятая для
анализа, г; V — объем воды, отсчитанный по градуированной про-
бирке, мл.
Делают заключение о соответствии препарата требованиям
ГФХ.
Задание 3. Определить содержание воды в лекарственном сред-
стве титрованием реактивом Фишера.
Метод включен в ГФ X и ГФ XI. Он основан на окислении
диоксида серы йодом в присутствии воды. Продукты реакции (сер-
ная и йодоводородная кислоты) связываются пиридином, что ко-
личественно сдвигает химическое равновесие вправо. Реактив
Фишера представляет собой раствор диоксида серы, йода и пири-
дина в безводном метаноле:
I, + SO, + 3C.H.N + Н,0 2C,H,N • HI + C.H.NSO..,
4 4 0 0 4 О О О О о
C.tLNSO, + СЩОН -» C.H.N • HSO.CH,.
о О о о О О *4 о
Реактив Фишера должен содержать избыток диоксида серы по
отношению к йоду и избыток пиридина по отношению к диокси-
ду серы и йоду. При этих условиях реакция прекратится, когда
свяжется вся вода или весь свободный йод. В ГФ XI (с. 178) в
метод титрования реактивом Фишера внесена дополнительно ме-
тодика определения конца титрования электрометрическим тит-
рованием “до полного прекращения тока”.
Проверка титра реактива Фишера
В связи с относительно малой устойчивостью реактива Фише-
ра при хранении возможно изменение титра. Поэтому перед ана-
лизом необходимо провести его проверку. Для этого точную мас-
су воды (около 0,04 г) помещают в сухую мерную колбу вмести-
мостью 100 мл, содержащую 5 мл метанола. Колбу герметично
соединяют с бюреткой, заполненной реактивом. Для исключения
возможности попадания влаги из воздуха бюретку герметизиру-
ют хлоркальциевой (или какой-либо другой осушительной) труб-
кой. Производят перемешивание электромагнитной мешалкой и
титруют реактивом Фишера. Вблизи точки эквивалентности ре-
актив добавляют по одной-две капли до изменения окраски ра-
створа от желтой до красновато-коричневой.
7*
99
"*л
Параллельно проводят контрольный опыт, титруя такой же
объем метанола. Рассчитывают титр Т по формуле
T = m/(V-V1),
где m — масса воды, г; V — объем реактива Фишера, израсходо-
ванный на титрование массы воды, мл; Vx — объем реактива Фи-
шера, израсходованный на титрование в контрольном опыте, мл.
Свежеприготовленный реактив объемом 1 мл эквивалентен
приблизительно 0,004 г воды.
Найденный титр используют при определении содержания воды
в препарате.
Определение содержания воды в препарате
Устанавливают содержание воды в кальция лактате или аналь-
гине. Если препарат не растворим в метаноле, то его мелко из-
мельчают и настаивают с определенным объемом метанола. За-
тем точную массу препарата, содержащую около 0,03—0,05 г воды,
помещают в сухую мерную колбу вместимостью 100 мл. Предва-
рительно в нее вносят 6 мл метанола, перемешивают 1 мин и
титруют реактивом Фишера до изменения окраски от желтой до
красновато-коричневой. Параллельно проводят контрольный опыт,
титруя такой же объем метанола. Рассчитывают содержание воды
по формуле
X = [(Vj - V2) Т • 100]/m,
где — объем реактива Фишера, затраченный на титрование
воды в испытуемом препарате, мл; V2 — объем реактива Фишера,
затраченный на титрование в контрольном опыте, мл; Т — титр
реактива Фишера; m — масса препарата, г.
По результатам титрования делают заключение о соответствии
данного показателя доброкачественности препарата требованиям
ГФ X. Результаты определения оформляют в виде табл. 2.9 [9, 10,
21, 22].
Таблица 2.9
Результаты определения алажиости лекарственного препарата
методом Фишера
Препарат Масса, г Объем титранта (основной опыт), мл Объем титранта (контрольный опыт), мл Содержа- ние влаги, %
100
2.5. ВЯЗКОСТЬ РАСТВОРОВ ПОЛИМЕРОВ
Определение среднего значения молекулярных масс (ММ)
полимеров и молекулярно-массового распределения (ММР)
с использованием вискозиметрии
Вязкость (внутреннее трение) — свойство текучих тел ока-
зывать сопротивление перемещению одной их части относитель-
но другой.
Реология жидкостей изучает их деформационные свойства,
способы исследования этих свойств, а также физико-химическую
природу жидкостей. Основными кинетическими переменными для
жидкостей служат деформация и ее скорость. Поэтому для изуче-
ния реологических характеристик жидких сред устанавливают
связь между приложенными внешними нагрузками и кинемати-
ческими параметрами.
Важнейшей характеристикой простых жидкостей и растворов
является вязкость Т|, которая определяется отношением напряже-
ния сдвига т к скорости сдвига G:
Жидкости, для которых Г| зависит только от концентрации и
температуры, называются ньютоновскими, а все другие жидко-
сти — неньютоновскими.
Различают динамическую, кинематическую, относительную,
удельную, приведенную и характеристическую вязкости.
Динамическую вязкость ц обычно выражают в пуазах (П) или
сантипуазах (1 сП = 0,01 П). Жидкость имеет вязкость 1 П, если
напряжение сдвига 1 дин/см2 создает скорость сдвига 1с-1. В си-
стеме СИ динамическая вязкость выражается в паскалях за 1 с
(Па-с), имеющих размерности (Н-с)/м2.
Когда плотность исследуемой жидкости о включена непосред-
ственно в измерение вязкости, то в этом случае получают кинема-
тическую вязкость v:
v = 3.
р
Выражается она в стоксах (Ст) или сантистоксах (1 сСт=0,01 Ст),
в системе СИ — в единицах м2 -с'1.
В ряде случаев требуется определить вязкость одной жидкости
относительно другой — относительную вязкость Т|отн-
Часто вязкость выражают как удельную вязкость Г|уд, которая
показывает, какая часть вязкости раствора обусловлена присут-
ствием в нем растворенного вещества:
101
Л-По П . .
" п п ~ ’
40 40
где г| — вязкость раствора; г|0 — вязкость растворителя.
Удельная вязкость, отнесенная к единице концентрации ра-
створа, называется приведенной вязкостью т|прив:
п =^-
Мирив ’
где с — концентрация раствора.
Для растворов полимеров вязкость является функцией моле-
кулярных масс, формы, размеров, гибкости макромолекул. Что-
бы определить структурные характеристики полимеров, приве-
денную вязкость экстраполируют к нулевой концентрации. В этом
случае вводится понятие характеристической вязкости [т|]:
[ц] = НтП =lim^L.
С_Ю с-Ю с
Характеристическая вязкость выражается в единицах, обратных
единицам концентрации.
Измерение вязкости ил капиллярных вискозиметрах
Для измерения кинематической вязкости применяются капил-
лярные вискозиметры типа Оствальда и Уббелоде с различными
модификациями. Если известна плотность исследуемой жидко-
сти р, то, зная V, можно вычислить динамическую вязкость т|.
Следует отметить, что капиллярные вискозиметры обычно исполь-
зуются для определения вязкости при одном значении скорости
сдвига. Поэтому такие вискозиметры применяются в основном
для исследования ньютоновских жидкостей. Капиллярные вис-
козиметры просты и удобны в обращении.
Стеклянные капиллярные вискозиметры, соответствующие
ГОСТ 10028—81, предназначены: 1) серии ВПЖ и ВПЖТ — для
определения вязкости прозрачных жидкостей, 2) серии ВПЖМ и
ВПЖТМ — для определения вязкости малых объемов прозрач-
ных жидкостей, 3) серии ВНЖ и ВНЖТ — для определения вяз-
кости непрозрачных жидкостей.
На рис. 2.1 представлен общий вид вискозиметра серии ВПЖ.
Вискозиметр состоит из капилляра с радиусом R и длиной L, че-
рез который под действием силы тяжести протекает жидкость
объемом V. Измерения проводят следующим образом. В колено 2
вискозиметра наливают измеренный объем жидкости и вискози-
метр помещают в термостат. Когда жидкость в вискозиметре при-
мет заданную температуру (с точностью ± 0,01 °C), производят под-
102
сасывание через отверстие 1 до тех пор,
пока жидкость не поднимется выше от-
метки Мг Тогда подсасывание прекра-
щают, жидкость опускается. Время t,
которое требуется, чтобы мениск прошел
расстояние между отметками Мх и М2,
замеряется. Если Н — средняя высота
жидкости, g — ускорение силы тяжести,
то
n = riVgH
р 8LV
nR4gH
8LV
где
— постоянная прибора,
обычно выражаемая в мм2 -с 2 (при этом
Рис. 2.1. Вискозиметр
стеклянный капиллярный се-
рии ВПЖ: 1 — трубка; 2 —
трубка; 3 — измерительный
резервуар; Mj , М2 — отмет-
ки измерительного резерву-
ара
поправками иа концевые эффекты и ки-
нетическую энергию пренебрегают).
Для определения вязкости в каждом
конкретном случае капиллярные виско-
зиметры выбирают в соответствии с таб-
лицей ГОСТ 10028—81 по известным зна-
чениям К и V в зависимости от характе-
ра изучаемой жидкости, ее объема и зна-
чения вязкости.
Измерения времени t проводят не менее 5—7 раз. При этом
разность между наибольшим и наименьшим временем истечения
жидкости между отметками не должна превышать 0,3 % средне-
го его значения.
Для определения относительной вязкости жидкости измеряют
время t^p истечения между верхней и нижней метками мениска
той жидкости, относительно которой проводят измерения 'Потн.
Затем в том же чистом и сухом вискозиметре при тех же услови-
ях определяют время истечения tcp исследуемой жидкости. Одно-
временно измеряют плотности изучаемых жидкостей р0 и р пик-
нометром ПЖ по ГОСТ 22524—77 и рассчитывают относитель-
ную вязкость по формуле
Поп,
tCPP
^ОсрРо
Для измерения характеристической вязкости готовят не менее
пяти различных концентраций исследуемого раствора. При этом
должно выполняться условие возможности линейной экстрапо-
103
ляции приведенной вязкости к нулевой концентрации, т.е. кон-
центрации раствора следует выбирать минимальными в пределах
чувствительности и точности метода измерения. Для каждой кон-
центрации раствора определяют t и рассчитывают приведенную
вязкость. Затем строят зависимость Г|прив. От концентрации с гра-
фически или линейным методом наименьших квадратов экстра-
полируют приведенную вязкость к нулевой концентрации, т.е.
находят характеристическую вязкость* [10]. Для вискозиметри-
ческого определения ММ полимера необходимы: вискозиметр;
термостат; приспособление для установки вискозиметра; градуи-
рованная пипетка на 5 мл с делениями на 0,2 мл; колбочки с
притертыми пробками емкостью 25 мл.
Вискозиметр. На рис. 2.2 изображен вискозиметр типа Бишо-
фа, видоизмененный в лаборатории полимеризационных процес-
сов Физико-химического института им. Л. Я. Карпова. Основны-
Рис. 2.2. Вискозиметр: 1 —
измерительный шарик; 2 — ка-
пилляр; 3 — шарик; 4 — резер-
вуар; 5, 6,7,8 — трубки; 9 —
перемычки
ми частями прибора являются: изме-
рительный шарик 1, капилляр 2, ша-
рик 3, резервуар 4 и трубки — 5,6,7
и 8. Нижняя часть капилляра 2 плав-
но изогнута в виде петли. Это позволя-
ет увеличить время истечения раство-
рителя t0 до 100 с при сравнительно
небольшой разности уровней (около
10 см) без существенного уменьшения
диаметра капилляра или увеличения
размеров прибора. Как и во всех вис-
козиметрах этого типа, положение
нижнего висячего уровня фиксирова-
но. Поэтому средняя величина гидро-
статического давления, под действием
которого происходит истечение жид-
кости из капилляра, не зависит от объе-
ма жидкости в резервуаре.
Раствор полимера можно разбавлять
непосредственно в вискозиметре и из-
мерять относительные вязкости при
нескольких концентрациях раствора
без промежуточных опорожнений, очи-
* Подробнее о зависимости [ц] от градиента скорости и об аномалии зависимо-
сти вязкости от концентрации при больших разбавлениях см., например: Ра-
фиков С. Р., Павлова С. А., Твердохлебова И. И. Методы определения
молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. М,
1963. С. 289—300.
104
стки и заполнения прибора, как это приходится делать при рабо-
те с вискозиметрами Оствальда.
Размер измерительного шарика 1 выбирают, исходя из того,
чтобы т0 ~ 100 с. Для работы с растворами полимера в бензоле и
толуоле объем измерительного шарика удобно выбрать равным
0,6 мл (dH ~ 12 мм).
Для работ с растворителями, различающимися по вязкости,
рекомендуется иметь несколько вискозиметров с измерительны-
ми шариками емкостью 0,4, 0,6, 1,0 и 1,5 мл при одном и том же
внутреннем диаметре капилляра (dB = 0,4 мм). Шарик 3, имею-
щий наружный диаметр dH = 10 мм, и трубка 7 служат для созда-
ния висячего уровня у нижнего конца капилляра. Трубку 7 при-
паивают к шарику 3 на несколько миллиметров ниже устья ка-
пилляра. Несоблюдение этого требования приводит к засасыва-
нию воздуха в капилляр и в измерительный шарик 1 при их
наполнении раствором. Объем шарика 3 должен быть минималь-
ным, чтобы измерения можно было начинать с возможно мень-
шим количеством исходного раствора, которое для каждого вис-
козиметра определяют экспериментально. К шарику 3 снизу при-
паяна стеклянная трубка 5 (dB= 1,2 мм), доходящая почти до дна
резервуара.
К верхней части трубки 7, снабженной оливкой, при помощи
короткого отрезка резиновой трубки присоединяют небольшой
стеклянный кран или припаивают шлиф с колпачком.
К грушевидному резервуару 4 емкостью 40—50 мл припаяна
трубка 6 (dH= 10 мм), через которую вводят раствор и добавляют
растворитель.
Через трубку 8 (dH= 7—8 мм) засасывают жидкость из резер-
вуара в капилляр и измерительный шарик.
Для прочности прибора трубки 6, 7 и 8 соединены припаянной
к ним стеклянной перемычкой 9.
Подготовка к измерениям
Подготовка вискозиметра. Новый вискозиметр тщательно моют
горячей хромовой смесью. Для этого трубку 8 (см. рис. 2.2) при-
соединяют к водоструйному насосу через чистую сухую стеклян-
ную емкость 0,5—1 л. В трубку 6 вставляют небольшую стеклян-
ную воронку с оттянутым концом таким образом, чтобы воронка
не закрывала плотно отверстие трубки 6. Затем закрывают кран
на трубке 7 (или надевают на нее колпачок) и, включив водо-
струйный насос, медленно, небольшими порциями наливают в
воронку горячую хромовую смесь (соблюдать осторожность!). По-
ступая в вискозиметр, хромовая смесь омывает трубку 6, резерву-
105
ар 4, шарик 3, нижнюю часть трубки 7, заполняет капилляр,
измерительный шарик 1 и частично трубку 8. Отсоединяют труб-
ку 8 от водоструйного насоса и через 1—2 ч сливают хромовую
смесь через трубку 6. Затем трубку 8 вновь присоединяют к водо-
струйному насосу и промывают вискозиметр большим количеством
горячей воды, ополаскивают дистиллированной водой, спиртом,
эфиром и сушат, протягивая водоструйным насосом воздух, кото-
рый предварительно пропускают через стеклянный фильтр, при-
соединенный к трубке 6.
Если исследуемый образец полимера заведомо содержит при-
меси, например мономер, пластификатор, ингибитор и др., то его
следует очистить фильтрацией или переосаждением.
Навеску полимера берут с таким расчетом, чтобы относитель-
ная вязкость исходного раствора при температуре измерений была
приблизительно равна 1,5. Для определения величины навески
полимердща 10 мл растворителя можно воспользоваться следую-
щими данными:
Ожидаемая ММ 1-106 5 105 1 105 1 104 1-14Я
Навеска, мг 14 40 70 370 600
Раствор не должен содержать взвешенных частиц, которые
могут засорить капилляр. Для их удаления раствор фильтруют
через стеклянный фильтр № 1 или 2. Чтобы исключить возмож-
ность изменения концентрации раствора*, первую, очень неболь-
шую, порцию фильтрата отбрасывают.
Проведение измерений
В вискозиметр (см. рис. 2.2) через трубку 6 наливают около
5 мл растворителя и устанавливают вискозиметр в термостате в
вертикальном положении. Термостатируют 10—15 мин при
25,00 ± 0,01 °C.
К трубке 8 присоединяют стеклянный фильтр № 1 и резино-
вую грушу, которую, как и соединительные каучуки, предвари-
тельно тщательно промывают горячим раствором соды, большим
количеством воды и высушивают.
Закрывают кран, присоединенный к трубке 7 (или надевают
на нее колпачок), и с помощью резиновой груши заполняют ра-
створителем шарик 3, нижнюю часть трубки 7, капилляр 2 и из-
мерительный шарик 1, всасывая жидкость на 1 см выше верхней
метки. (Следить за тем, чтобы растворитель не попал в резиновую
трубку и грушу!) Затем растворитель при помощи груши выдав-
ливают из измерительного шарика 1 и капилляра обратно в ре-
* О “хороших” и “плохих” растворителях см., например: Методы исследова-
ния полимеров/ Под ред. Аллена; Пер. с англ. М., 1961. С. 22—24.
106
зервуар 4. Описанную операцию повторяют три раза. Снова за-
полняют капилляр 2 и измерительный шарик 1 и открывают кран
(или снимают колпачок). Прцэтом жидкость из трубки 7 и из
шарика 3 стекает обратно в резервуар 4, а в шарике 3 образуется
висячий уровень.
По секундомеру отмечают время истечения растворителя от
верхней до нижней метки измерительного шарика. Секундомер
перед началом измерений заводят до отказа. Время истечения оп-
ределяют не менее пяти раз и берут среднее значение. Если пер-
вые отсчеты отличаются от последующих более чем на 0,2 с, то
их отбрасывают, соответственно увеличивая число измерений.
Определив время истечения растворителя t0, вискозиметр из-
влекают из термостата, сливают растворитель через трубку 6,
выдавливая его из капилляра при помощи груши. Пустой виско-
зиметр три раза прополаскивают чистым бензолом, втягивая его
при помощи груши через капилляр в измерительный шарик. Бен-
зол удаляют водоструйным насосом, который присоединяют к
трубке 6.
В сухой вискозиметр через трубку 6 вносят градуированной
пипеткой (с делениями 0,2 мл) 5 мл раствора полимера, и виско-
зиметр снова устанавливают в термостате в вертикальном поло-
жении. Кончик пипетки рекомендуется оттянуть на 1,5—2 см, но
так, чтобы толщина его стенок была около 1 мм.
Вискозиметр термостатируют в течение 15 мин, промывают
капилляр 2 и измерительный шарик 1 указанным выше спосо-
бом и измеряют не менее 5 раз время истечения раствора (t), не
забывая при этом открывать кран трубки 7 (или снимать колпа-
чок).
Если г|отн исходного раствора окажется значительно больше
1,5, то раствор разбавляют в вискозиметре, добавляя пипеткой
определенное количество растворителя. После добавления раство-
рителя раствор тщательно перемешивают нагнетанием воздуха
грушей через трубку 8 при закрытом кране трубки 7 (или при
надетом на нее колпачке). Каждый раз после разбавления раство-
ра капилляр и измерительный шарик трижды прополаскивают
раствором, как описано выше. Если г|отн < 1,5, то приготавливают
новый, более концентрированный исходный раствор.
Раствор с Г|отн, близкой к 1,5, разбавляют для последующих
измерений вязкости таким образом, чтобы интервалы получае-
мых концентраций были приблизительно одинаковы. Для этого к
5 мл такого раствора последовательно добавляют 0,75; 1,00; 1,25;
2,00 и 4,00 мл растворителя, причем Т|отн наиболее разбавленного
раствора не должна быть меньше 1,1. Время истечения растворов
107
с концентрациями ср с2, с3, с4, с5 обозначают tp t2, t3, t4, t5 (c —
концентрация исходного раствора).
По окончании измерений раствор из вискозиметра выливают,
и вискозиметр тщательно промывают 2—3 раза растворителем с
обязательным многократным прополаскиванием капилляра и из-
мерительного шарика, после чего проверяют время истечения
растворителя (t0). Среднее значение t0 после опыта должно вос-
производиться с точностью 0,2—0,3 с. В противном случае изме-
рения вязкости растворов полимера следует повторить после тща-
тельной очистки вискозиметра.
При измерениях вязкости растворов полимера в легколетучем
растворителе, например в ацетоне, рекомендуется:
1) термостатировать раствор в вискозиметре при закрытых труб-
ках 6 и 7;
2) прополаскивать и заполнять капилляр 2 и измерительный
шарик 1, нагнетая в вискозиметр воздух через трубку 6;
3) перемешивать раствор в вискозиметре вращательными дви-
жениями и осторожным встряхиванием вискозиметра, предвари-
тельно освобожденного из крепления.
Форма записи опытных данных приведена в табл. 2.10.
Таблица 2.10
Измерение вязкости
Дата___ Опыт №_____
Полимер: образец №
Навеска полимера 0,0340 г на 10 мл растворителя
Взято в вискозиметр 5 мл раствора
Температура Вискозиметр Секундомер
25,00±0,01 °C № 1 № 432
Время истечения, с
ч t, Ч (+0,75 мл) (+1,00 мл) ч (+1,25 мл) t. (+2,00 мл) to
97,6 134,6 129,8 124,6 120,4 115,6 97,8
97,4 135,0 129,6 124,6 120,4 115,2 97,4
97,4 134,8 129,8 124,6 120,0 115,0 97,8
97,8 135,0 129,8 124,4 120,2 115,2 97,6
97,8 135,0 129,8 124,4 120,0 115,0 97,4
97,8 135,0 124,4 120,0 115,0 97,8
Сред. 97,6 134,9 129,8 124,5 120,2 115,1 97,6
Обработка результатов измерений
Определение характеристической вязкости. Если раствор по-
лимера приготовлен при температуре Т4, отличающейся от темпе-
ратуры измерений Т2, то концентрацию раствора с, выраженную
в г/100 мл, вычисляют по формуле
108
рун 00
V(vf+y,)pi/р2 ’
где р — навеска полимера, г; V, Vj и V2 — объемы в мл, отмерен-
ные при температуре Tj соответственно растворителя, взятого для
приготовления раствора, исходного раствора, помещенного в вис-
козиметр, и растворителя, добавленного в вискозиметр для раз-
бавления раствора; pj/p2 — отношение плотностей растворителя
при температурах Тг и Т2.
Если Tj и Т2 различаются всего на несколько градусов, то можно
принять рг/р2 ~ 1. При этом допущении и вычислены концентра-
ции растворов, приведенные в табл. 2.11.
Таблица 2.11
Обработка результатов измерений
v,+v2 С t п 'отн % п /с 'уд' In п /с ’отп'
— 0 97,6 — — — —
5 0,340 134,9 1,382 0,382 1,124 0,952
5,75 0,296 129,8 1,330 0,330 1,116 0,965
6,75 0,252 124,5 1,276 0,276 1,096 0,968
8,0 0,212 120,2 1,231 0,231 1,087 0,978
10,0 0,170 115,1 1,180 0,180 1,059 0,974
Экстраполяция 1,01 1,00
0,0340-5-100 А..А ,.АА
с, = - -А-------= 0,340 г /100 мл;
с,
10-5,0
0,0340 5-100 ААОЛ ,.АА
с, =-------------= 0,296 г /100 мл;
2 10-5,75
0,0340-5-100 А.<. ....
-------------= 0,252 г /100 мл;
10-6,75
0,0340-5-100 А0)А ....
с, =-------------= 0,212 г /100 мл;
10-8,0
0,0340-5-100 А._. /|АА
с\ =-------------=0Д70г/100мл.
10-10,0
По уравнениям, приведенным выше, вычисляют Т|отн и т|уд и
рассчитывают значения Г|уд/с и In г|отн/с. Результаты этих вычис-
лений заносят в таблицу и строят график (рис. 2.3) в координатах
Т]уд/с — с и In Т)0Тц/с — с*. Через полученные точки проводят
* Таблицу значений натуральных логарифмов чисел см., например, в спра-
вочнике: Митропольский А.К. Краткие математические таблицы. М., 1962,
С. 56— 57. При отсутствии таких таблиц In г; вычисляют, умножая десятич-
ный логарифм величины г|отн на коэффициент, равный 2,3.
109
прямые и продолжают их до оси ординат, на которой они должны
пересечься. Отсекаемый отрезок оси ординат соответствует иско-
мой величине [г|]. Однако из-за ошибок измерений и экстраполя-
ции прямые могут пересечь ось ординат в двух точках, как пока-
зано на рис. 2.3. В этом случае величину [г]] определяют как сред-
нюю из двух полученных значений [г]]. В приведенном примере
[И] = 1,005.
На точность определений [г|] влияют:
а) чистота вискозиметра, измеряемого раствора и растворите-
ля;
б) точность измерений объема раствора и растворителя при
разбавлениях;
в) постоянство температуры во время измерений;
г) качество перемешивания раствора в вискозиметре и пропо-
ласкивания раствором капилляра и измерительного шарика пе-
ред измерениями времени истечения;
д) точность измерений времени истечения;
е) устойчивость полимера в процессе измерений (проверяют
для каждой системы полимер — растворитель по воспроизводи-
мости времени истечения наиболее концентрированного раствора
полимера в течение нескольких часов).
С учетом возможных погрешностей при определениях г|отн, Т]уд
и с точность определений значения [г]] не превышает 2 %.
Примерно такую величину составляет поправка на кинетичес-
кую энергию.
Описанный выше метод определения [г]] является точным, но
требует много времени, так как Т]отн приходится измерять при
нескольких концентрациях раствора. Для быстрой оценки вели-
чины ММ полимера можно вычислить [г|] из измерений вязкости
одного разбавленного раствора или, как это принято называть, по
одной точке.
Рис. 2.3. Определение характеристической вязкости’ 1 — зависимость Пуд/С
от с; 2 — зависимость In Поп,/0 от с
110
Вычисление молекулярной массы полимера. ММ полимера
вычисляют, подставляя полученное из опыта значение [ц] в урав-
нение Марка-Куна-Хаувинка: [т|] = КМ“. Для раствора полисти-
рола с ММ от 104 до 107 в толуоле при 25 °C рекомендуется
пользоваться следующими значениями констант: К = 1,34-Ю-4;
а ««6,71. Уравнение Марка-Куна-Хаувинка, прологарифмирован-
ное 1gК) для этой системы, имеет вид:
3
1g Ц, =1,408 lg[n] + 5,455.
В приведенном примере [т|] = 1,005. Следовательно,
lgMn = l,4081gl,005 + 5,455 = 5,458;
287 000 или-ЗЮ5.
Точность определения Мп зависит от точности вискозиметри-
ческих измерений и от того, в какой мере константы в уравнении
Марка-Куна-Хаувиика справедливы для данного полимера. Опре-
деленные числовые значения Киа применимы лишь для поли-
меров с одинаковым химическим и структурным составом и с
одинаковым ММР. Так как структура и ММР полимера зависят
от способа его приготовления, то для вычисления Mq следует
использовать значения Киа, для полимера, полученного в тех
же или, по крайней мере, в сходных условиях полимеризации.
Следует, кроме того, иметь в виду, что уравнение Марка-Куна-
Хаувинка справедливо для линейных макромолекул. При нали-
чии в полимерной цепи разветвлений значение а уменьшается и
при большой степени разветвленности [г]] перестает зависеть от
ММ:
1. Полученные значения Киа могут быть различны, если ММ
фракций, использованных для определения этих констант, нахо-
дили разными методами (М„ или Мж).
2. Вычисленная по уравнению Марка-Куна-Хаувинка ММ ис-
следуемого полимера наиболее близка к Мп , если ММ фракций
определяли методом светорассеяния.
Сказанное Поясняет, почему для одной и той же системы по-
лимер-растворитель существует много значений Киа.
Фракционирование полимеров
Как уже отмечалось выше, отдельные молекулы в образце по-
лимера имеют разные ММ и образец в целом характеризуется оп-
ределенной средней ММ. Однако образец можно разделить на не-
сколько меньших образцов, имеющих более узкие ММР и харак-
111
теризующихся своей собственной средней ММ. Каждый из таких
меньших образцов называют фракцией исходного нефракциони-
рованного образца. Процесс разделения исходного образца на не-
сколько фракций постепенно возрастающей (или уменьшающей-
ся) средней ММ называется фракционированием полимера. Зная
массы отдельных фракций и соответствующие средние ММ, мож-
но рассчитать кривую ММР исходного нефракционированного об-
разца. Пример таких кривых для нефракционированного поли-
мера и ряда его фракций приведен на рис. 2.4.
Однако прежде чем обсуждать процедуру расчета кривой ММР,
рассмотрим, как можно разделить исходный полимер на несколь-
ко фракций. Существует несколько экспериментальных методов,
дающих такую возможность. Из них наиболее важными являют-
ся дробное осаждение, дробное растворение, проявительная и гель-
проникающая хроматография.
Wh %
Рис. 2.4. Кривые ММР для нефракционированного образца (I) полимера, его
фракций (II—VIII). Пунктирные кривые соответствуют функциям распределе-
ния для полимера, остающегося в растворе после удаления каждой очередной
фракции
Дробное осаждение
Если небольшое количество осадителя (совместимого с раство-
рителем) добавить к раствору полимера в плохом растворителе*,
осадитель уменьшает растворяющую способность растворителя
настолько, что молекулярные фракции самых больших ММ уже
не могут оставаться в растворе и выпадают из него в виде набух-
* Плохой растворитель берут потому, что в этом случае осаждение полимера
удается провести, используя меньшее количество осадителя.
112
шего геля. Если удалить этот гель и снова добавить к раствору
некоторое количество осадителя, растворяющая способность ра-
створителя снова уменьшится и из раствора выпадает еще одна
порция полимера наибольшей ММ. Таким образом, при добавле-
нии каждой порции осадителя к раствору полимера происходит
его частичное осаждение. На этом принципе и основан метод дроб-
ного осаждения.
Основное различие между дробным осаждением и очисткой
методом осаждения заключается в относительных количествах
раствора полимера и осадителя. В первом случае к большому объе-
му раствора добавляют небольшие порции осадителя, тогда как
во втором случае небольшое количество раствора добавляют к
большому объему осадителя.
Методически дробное осаждение проводят следующим обра-
зом. 1 %-ный раствор полимера в плохом растворителе помеща-
ют в сосуд достаточно большой емкости с учетом необходимости
перемешивания и постепенного добавления осадителя. Этот со-
суд термостатируют, поддерживая температуру раствора посто-
янной с точностью ± 0,01 °C. Так как растворение и осаждение
— процессы обратимые, они чувствительны к небольшим изме-
нениям температуры. Поэтому для эффективного проведения
фракционирования необходим строгий температурный контроль.
После того как достигнута требуемая температура, начинают по
каплям добавлять осадитель при постоянном перемешивании.
По мере добавления осадителя раствор мутнеет, что свидетель-
ствует об осаждении фракций полимера наибольшей ММ. Когда
мутность становится значительной, добавление осадителя пре-
кращают и медленно подогревают содержимое сосуда до исчез-
новения мутиости. При нагревании выпавший в осадок полимер
снова растворяется. После этого перемешивание прекращают и
дают раствору медленно остыть до исходной температуры. Мут-
ность появляется снова. Такая процедура позволяет достичь ис-
тинного равновесия между растворенными низкомолекулярны-
ми фракциями и осажденными высокомолекулярными. Систему
выдерживают при постоянной температуре достаточно длитель-
ное время (8—10 чУдля того, чтобы высадившийся полимер об-
разовал желеобразный осадок, который осторожно отделяют, не
взбалтывая прозрачный раствор. После удаления геля к раство-
ру добавляют новую порцию осадителя до появления мутности,
и вся последовательность операций повторяется до получения
второй фракции. Повторив процедуру несколько раз, можно
выделить несколько фракций. Последнюю фракцию можно по-
лучить, просто выпарив полимер из раствора.
8. Заказ 3547 цз
Существует несколько модификаций методики дробного осаж-
дения. Один из методов заключается в охлаждении раствора по-
лимера (в одном растворителе). Этот метод очень прост. Раствор
приготавливают при повышенной температуре (например, 80 °C),
а затем медленно охлаждают, выдерживая его некоторое время
при более низкой температуре (например, 75 °C). При этом наибо-
лее высокомолекулярная фракция выпадает из раствора и ее ос-
торожно извлекают. Раствор продолжают медленно охлаждать и
выдерживают при следующей температуре (например, 70 °C), когда
выпадает в осадок вторая фракция. Процесс продолжают до полу-
чения нескольких фракций. Недостатком этого метода является
то, что для осаждения некоторых полимеров одного охлаждения
недостаточно.
Другой разновидностью дробного осаждения является метод
испарения растворителя. Полимер растворяют в бинарной смеси
растворитель-—осадитель, которую подбирают таким образом, что-
бы растворитель был более летуч, чем осадитель. Медленно пони-
жая давление пара иад раствором полимера, растворитель посте-
пенно испаряют. При этом раствор оказывается обогащен осади-
телем, полимер начинает высаживаться, первыми выпадают в
осадок высокомолекулярные фракции. Контролируя испарение
растворителя и отбирая порции осаждающегося полимера, мож-
но разделить его на фракции.
Дробное растворение (экстракция)
Метод дробного растворения основан на том, что растворимость
полимера в растворителе ограничена его ММ. Плохой раствори-
тель растворяет только низкомолекулярные фракции полимера,
хороший растворяет также и высокомолекулярные фракции. Если
есть серия растворителей с возрастающей растворяющей способ-
ностью, то, используя их по отдельности, начиная с растворителя
с минимальной растворяющей способностью, можно растворять
фракции с различными ММ одну за другой, начиная с самой низ-
комолекулярной.
Для проведения дробного растворения берется порошок или
маленький кусочек твердого полимера. В качестве серии раство-
рителей с возрастающей растворяющей способностью используют
смеси растворителя с осадителем, взятых в разных пропорциях.
Чем меньше относительное содержание растворителя в смеси, тем,
естественно, меньше ее растворяющая способность. К порошку
полимера добавляют смесь с наименьшей растворяющей способ-
ностью, дают ему набухнуть и затем хорошо перемешивают для
ускорения растворения фракции с наименьшей ММ. В зависимо-
114
ОГИ от природы полимера время перемешивания подбирают так,
чтобы достичь полного растворения всех растворимых компоиен-
TOS- После окончания перемешивания раствор фильтруют и вы-
варивают фильтрат. После полного испарения растворителя оста-
лся первая фракция. К набухшей массе, оставшейся не раство-
ренной после добавления первой порции бинарной смеси раство-
ритель-—осадитель (т.е. твердого остатка фильтрования), добавляют
следующую порцию бинарной смеси с большей растворяющей спо-
СОбностью, перемешивают и повторяют всю процедуру до получе-
ния второй фракции. Этим путем, применяя смеси со все возрас-
тающей растворяющей способностью, получают серии фракций
полимера с возрастающей ММ.
Фракционирование элюированием (проявительная хроматография)
Методика элюирования также
основана на принципе частичного
растворения, изложенном выше.
По этой методике полимер поме-
щают на стекловате в верхней час-
ти колонки, заполненной силика-
гелем или алюмогелем, как пока-
зано на рис. 2.5. Полимер после-
довательно элюируют смесью ра-
створитель—осадитель с постепен-
но возрастающей растворяющей
Способностью. Фракция наимень-
шей ММ элюируется первой, наи-
большей — последней. Эффектив-
ность метода возрастает при под-
держании градиента температуры
колонке. В верхней части колон-
ки температура несколько выше,
чем в нижней. Градиент темпера-
туры позволяет проводить серии
растворений и осаждений каждой
молекулярной фракции на различ-
ных уровнях колонки, что повы-
шает эффективность фракциониро-
Рис. 2.5. Схема лабораторной ус-
тановки фракционирования методом
элюирования: 1 — смесь раствори-
теля; 2 — стеклянная вата с порош-
ком полимера; 3 — силика- или алю-
могелевый наполнитель; 4 — кран
для регулирования протекания ра-
створителя; 5 — коллектор фракций
>анця.
Гельпроникающая хроматография
Гельпроникающая хроматография (ГПХ) является довольно
быстрым и эффективным методом фракционирования полимеров
е одновременным расчетом кривой ММР.
к* 115
Пршщип ТИХ заключается в следующем. В любой колоноч-
ной хроматографии при движении растворенного вещества от од-
ного конца колонки к другому оно переходит из одной фазы (не-
подвижной) в другую (подвижную). В жидкоадсорбционной хро-
матографии неподвижной фазой является твердое вещество (си-
ликагель, алюмогель или переплавленный стеклянный порошок,
которыми набита колонка), а в мобильной — жидкость (т.е. ра-
створитель, элюирующий растворенное вещество). В жидкостной
хроматографии обе фазы — жидкости, не смешивающиеся друг с
другом.
Однако в ГПХ простая жидкость, а именно сам растворитель,
действует и как неподвижная, и как подвижная фаза. Как это
может осуществляться? Колонка в ГПХ наполнена материалом,
который называется гелем, представляющим собой мельчайшие
сферические частицы (обычно диаметром 100 мкм) сшитого сопо-
лимера стирола с дивинилбензолом или стекла, содержащие мно-
жество микропор одинакового размера. Частицы геля являются
твердыми и несжимаемыми и обладают разной степенью пористо-
сти — размер пор меняется от 50 до 1000 А. Колонка может быть
наполнена частицами одной или разных степеней пористости.
Когда колонку наполняют подходящим растворителем, он запол-
няет не только объем, не занятый частицами геля (объем пустот),
но и объем пор внутри этих частиц. Фаза растворителя, занимаю-
щая объем пустот, выступает в роли подвижной фазы, тогда как
растворитель, занимающий поры, выступает в роли неподвижной
фазы (рис. 2.6).
Метод ГПХ основывается на предположении о том, что разде-
ление происходит только по размерам молекул полимера, без уча-
стия химических взаимодействии. Процесс осуществляется бла-
годаря различию гидродинамических объемов полимерных моле-
Рис. 2£. Схематическое изображе-
ние частиц геля (1), неподвижной —
объем пор (2) и подвижной — объем
пустот (3) фаз в колонке ГПХ
кул разных молекулярных масс
в растворенном состоянии. Ког-
да разбавленный раствор поли-
мера (например, 0,5 % -ной кон-
центрации) вводят в верхнюю
часть колонки, а затем элюиру-
ют растворителем, полимерный
раствор вместе с растворителем
начинает стекать по колонке
сверху вниз. Подвижная фаза,
находящаяся между частицами
геля, содержит молекулы поли-
мера, тогда как в неподвижной
116
фазе, внутри этих частиц, молекул полимера нет. Благодаря раз-
нице в концентрациях полимера между подвижной и неподвиж-
ной фазами молекулы полимера начинают диффундировать внутрь
частиц геля, стремясь выравнять концентрацию. Однако размер
пор ограничивает доступность частиц геля, позволяя проникать
туда лишь молекулам, не превышающим определенный гидроди-
намический размер. Молекулы большего размера оказываются
неспособными проникнуть внутрь геля и вымываются раствори-
телем из колонки. Таким образом, наиболее высокомолекулярная
фракция элюируется из колонки цервой.
Среди тех молекул, которые способны проникнуть в поры геля,
быстрее всего туда проникают молекулы наиболее низкомолеку-
лярных фракции, имеющих минимальные гидродинамические
размеры, они же занимают большую часть объема пор, тогда как
молекулы средних размеров проникают в поры медленнее и зани-
мают лишь часть объема пор. Если после этого еще раз промыть
колонку чистым растворителем, то подвижная фаза уже не будет
содержать молекул полимера, а неподвижная будет обогащена ими,
и градиент концентрации заставит молекулы полимера диффун-
дировать в противоположном направлении — из пор.
В таком диффузионном процессе (внутрь и из объема пор) мо-
лекулы, имеющие наименьшую ММ, удерживаются в колонке
дольше всего и элюируются последними. Молекулы промежуточ-
ных размеров занимают промежуточное положение и по времени
элюирования.
Если обозначить объем пор как Vn, а объем пустот между ними
как Vo, то самые большие молекулы, которые совсем не проника-
ют в поры, элюируются из колонки сразу после впрыскивания
образца, когда элюируется объем растворителя, равный Vo. Са-
мые маленькие молекулы, занимающие максимальный объем пор,
элюируются с объемом растворителя, равным Vo + Vn. Молекулы
промежуточных размеров элюируются в интервале от Vo до Vo + Vn.
Таким образом, объем элюата непосредственно дает оценку моле-
кулярных размеров. Однако на практике величины Vo и Vn не
рассчитывают, а строят калибровочные кривые в координатах
IgM—Vn, используя стандартные серии полимеров известных ММ
с узким ММР.
На хроматограммах таких стандартных образцов отмечают
объемы элюата, соответствующие пику, полученному для каждо-
го стандартного образца (рис. 2.7). Зная ММ стандартов и соот-
ветствующие им объемы элюата, строят калибровочную кривую
(рис. 2.8). Такой способ калибровки дает хорошие результаты при
условии, что ММР стандартов достаточно узкое ( Mw / Мп < 1,2) и
117
45 44 43 42 41 40 39 38 37 36 35 34 33 32 31
Объем элюата VE, мл
Рис. 2.7. ГПХ-хроматограммы для набора стандартных образцов поливииил-
пирродидоиа. Цифры над каждым пиком соответствуют объему элюата и моле-
кулярной массе ( скобках). Прибор: Waters ALC/GPC-244; колонка: ц стира-
тель 105, 104, 103 и 500 п 100 ; чувствительность: (Ш)2Х; давление — 70 пси;
концентрация — 0,5 %; введенный объем — 100 мл; температура — 25 °C
стандарты принадлежат к тому
Ve, мл
Рис. 2Я. Калибровочная кривая
ГПХ. связывающая 1g М и объем элю-
ата VE
же химическому классу, что и
исследуемый полимер.
Установка для ГПХ (рис. 2.9)
состоит из двух колонок: в одну
вводят образец полимера, дру-
гая — колонка сравнения. Ра-
створитель протекает через обе
колонки. Для измерения разно-
сти показателей преломления ра-
створа полимера и чистого ра-
створителя, вытекающих из двух
колонок, используют дифферен-
циальный рефрактометр. Эта
разность служит прямой мерой
концентрации полимера, элюи-
руемого с различными объема-
ми растворителя. Зная объем элюата и показатель преломления
и имея калибровочную кривую, можно непосредственно полу-
чить вес и ММ различных фракций полимера, элюируемых с
различными объемами растворителя. В полностью автоматизи-
рованной установке результаты получаются и фиксируются са-
мописцем в виде графика в координатах объем элюата — пока-
зания дифференциального рефрактометра. Объем элюата соот-
ветствует ММ, а показания самописца позволяют рассчитать
массовую концентрацию полимера. Такой график отображает
функцию ММР (рис. 2.10).
118
Рис. 2.9. Принципиальная схема установки ГПХ: 1 — отверствие для
нагретого образца; 2 — клапан; 3 — нагреватель; 4 — колонка для образца; 5 —
колонка сравнения; 6 — резервуар для растворителя; 7 — стеклянная измери-
тельная трубка; 8 — контрольный клапан; 9 — дегазатор; 10 — насос; 11 —
фильтр; 12 — контрольные клапаны; 13 — рефрактометр; 14 — источник света;
15 — сифон; 16 — фотокювета; 17 — слив; 18 — коллектор фракций
Рис. 2.10. ГПХ-хроматограмма для образца поливииилпирролидона
119
Работа 5. Определение среднего значения молекулярной
массы и молекулярно-массовое раснределение
Реополиглюкин (Rheopolyglucinum)
Применяется в качестве кровезаменителя
Состав: Декстрана с ММ
от 30000 до 40000 — 10 г
Натрия хлорида (ФС 42-2572-88) — 0,9 г
Воды для инъекций (ФС 42-2620-89) — до 100 мл
Относительная вязкость. Не более 5,5 при температуре
(2±0,1)°С. Определяют по отношению к 0,9 %-ному изотониче-
скому раствору натрия хлорида в капиллярном вискозиметре
(ГФ XI, вып 1, с. 87).
Декстран. От 9,5 до 10,5 % (поляриметрически; ГФ XI, вып 1,
с. 30) принимая удельное вращение декстрана [а]2д = + 199°.
Определение среднего значения молекулярной массы
Готовят 5 разведений, содержащих от 0,5 до 2,0 г декстрана в
100 мл в 0,9 %-ном изотоническом растворе натрия хлорида.
Растворы фильтруют через стеклянные фильтры № 4, измеряют
время истечения каждого раствора при температуре 25±0,1 °C в
капиллярном вискозиметре, имеющем время истечения воды от
80 до 120 с (ГФ XI, вып. 1, с. 89). Рассчитывают величину отно-
сительной вязкости раствора (т|отн) по отношению к вязкости
0,9 %-него изотонического раствора натрия хлорида. Уточняют
концентрацию каждого раствора поляриметрически (в процентах).
Величину приведенной вязкости (Т|прив) вычисляют по формуле
_ Па,н -1
Пприв >
где с — концентрация каждого разведения в процентах.
Строят график, на оси абсцисс которого откладывают концен-
трацию препарата в масштабе 1 % = 10 см, а на оси ординат —
Т|о,н -1
значение приведенной вязкости ~ в масштабе 0,1 = 10 см.
Точки должны находиться на прямой. Ее продолжение в месте
пересечения с осью ординат (с = 0) дает величину характеристи-
ческой вязкости, которая должна быть в пределах 0,168—0,193.
Среднее значение ММ (Мп) препарата рассчитывают из дан-
ных определения характеристической вязкости [г|] по формулам
[п]=9,бб10^ мп-°’5;
1gМ„ = 11g0,193 + 1g9,66 IO’4.
120
Среднее значение молекулярной массы должно быть от 30 000
до 40 000 (ФС 42-2011-93).
Молекулярно-массовое распределение
Средняя масса высокомолекулярной фракции должна быть не
более 80 000; средняя масса низкомолекулярной фракции — не
менее 10 000.
Для определения ММР из препарата выделяют высокомолеку-
лярную и низкомолекулярную фракции в количестве 5—10 % от
общего содержания декстрана в пробе.
Для выделения высокомолекулярной фракции к 120 мл препа-
рата прибавляют 80 мл воды. Уточняют концентрацию декстрана
поляриметрически. При постоянном перемешивании и темпера-
туре 20±0,1 °C прибавляют от 140 до 150 мл 95 %-ного спирта,
который обеспечивает выделение 5—10 %-ной высокомолекуляр-
ной фракции. Смесь нагревают примерно до 40 °C при перемеши-
вании до полного растворения высокомолекулярной фракции, а
затем охлаждают при перемешивании до температуры 20,0±0,1 °C.
Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения от
32,0 до 48,0 с'1 (от 2000 до 3000 об/мин) в течение 10 мин, декан-
тируют надосадочную жидкость и осадок высокомолекулярной
фракции растворяют в 50 мл воды. Спирт из раствора отгоняют.
Определяют концентрацию декстрана и вычисляют количество
высокомолекулярной фракции по отношению к содержанию дек-
страна в испытуемом растворе. Если количество выделенной вы-
сокомолекулярной фракции не составляет 5—10 %, анализ про-
водят повторно, изменяя количество 95 % -ного спирта.
Из раствора высокомолекулярной фракции готовят 5 разведе-
ний, содержащих от 0,5 до 1,6 г декстрана в 100 мл, и определя-
ют характеристическую вязкость прн температуре 20,0±0,1 °C.
Для приготовления разведений применяют воду и расчет относи-
тельной вязкости ведут по отношению к воде.
Для выделения низкомолекулярной фракции к 120 мл препа-
рата прибавляют 80 мл воды. Уточняют концентрации поляри-
метрически. Прн постоянном перемешивании при температуре
20,0±0,1 °C прибавляют от 200 до 220 мл 95 %-ного спирта, что-
бы удалить от 90 до 95 % высокомолекулярной и среднемолеку-
лярной фракций препарата. Смесь нагревают примерно до 40 °C
при перемешивании, а затем осадок охлаждают до 20,0±0,1 °C.
Осадок отделяют центрифугированием при частоте вращения от
32,0 до 48,0 с-1 (от 2000 до 3000 об/мин) в течение 10 мин.
Надосадочную жидкость, содержащую высокомолекулярную
фракцию, выливают в пятикратный объем 95 %-ного спирта и
121
отстаивают при температуре 4 °C в течение 16—18 ч или центри-
фугируют при частоте вращения от 32,0 до 48,0 с-1 (от 2000 до
3000 об/мин) в течение 10 мин при температуре 20 °C. Осадок
низкомолекулярной фракции растворяют в 50 мл воды (pH 6,5—
6,8 устанавливают 0,01 М раствором гидроксида натрия или 0,01 М
раствором кислоты хлористоводородной). Спирт отгоняют. Опре-
деляют концентрацию декстрана в растворе и вычисляют количе-
ство низкомолекулярной фракции по отношению к содержанию
препарата в исследуемом растворе.
Если количество выделенной низкомолекулярной фракции не
составляет 5—10 %, анализ проводят повторно. Для этого умень-
шают или увеличивают количество 95 % -ного спирта, прибавляе-
мого для удаления высокомолекулярной и среднемолекулярной
фракций, до получения 5—10 % низкомолекулярной фракции.
Из раствора низкомолекулярной фракции готовят 5 разведе-
ний, содержащих от 1,0 до 2,4 г декстрана в 100 мл, и определя-
ют характеристическую вязкость (для приготовления разведений
применяют воду). Расчет относительной вязкости ведут по отно-
шению к воде.
Характеристическая вязкость высокомолекулярной фракции
должна быть не более 0,273 (средняя ММ 80 000); характеристи-
ческая вязкость низкомолекулярной фракции должна быть не
менее 0,10 (средняя ММ 10 000) (ФС 42-211-93).
Контрольные вопросы и ситуационные задачи
1. Какие общие физические и физико-химические методы'установле-
ния доброкачественности лекарственных препаратов включены в ГФ X
и ГФ XI?
2. Что подразумевается под термином “растворимость” в ГФ X?
3. Какие условные термины приняты ГФ X и ГФ XI для обозначения
растворимости и для каких соотношений препарата и растворителя?
4. Как понимать термин “умеренно растворим” в ГФ XI?
5. В чем особенности определения растворимости лекарственных пре-
паратов в соответствии с требованиями ГФ X и чем они отличаются в
ГФ XI?
6. Как доказать, что 3%-иые спиртовые и водные растворы кислоты
борной прозрачны?
7. Какие жидкости по ГФ X и по ГФ XI считаются прозрачными и
какие бесцветными?
8. Сколько эталонов существует для определения степени мутности
жидкостей по ГФ X и по ГФ XI? Какова методика приготовления и
продолжительность пригодности этих эталонов?
9. Как готовят по ГФ XI исходные и основные растворы для опреде-
ления степени мутности?
10. Сколько эталонов окраски приведено в ГФ X и ГФ XI? Как они
готовятся?
122
11. В течение какого срока можно применять исходные, основные и
эталонные растворы, приготовленные по ГФ XI для определения окрас-
ки жидкостей?
12. Как подтвердить соответствие лекарственного препарата требова-
ниям ГФ X по растворимости, если в частной статье указано, что он
легко растворим в воде и очень мало растворим в хлороформе?
13. Лекарственными препаратами являются кислота салициловая,
ее эфир с уксусной кислотой и ее натриевая соль. С помощью каких
растворителей можно различить эти препараты?
14. В чем принципиальное отличие методик определения раствори-
мости анестезина и кислоты борной?
15. Кислота бензойная мало растворима в воде и легко растворима в
этаноле. Как это доказать?
16. Эталонами для определения прозрачности и степени мутности по
ГФ X служит взвесь, полученная из белой глины. Какими эталонами
определяется прозрачность, а какими — степень мутности лекарствен-
ных препаратов? Одинакова ли методика определения этих показате-
лей?
17. В ГФ XI изменен химический состав эталонов для определения
прозрачности и степени мутности жидкостей. Какие реактивы исполь-
зуются для их приготовления? Какие изменения внесены ГФ XI в мето-
дику определения прозрачности и степени мутности лекарственных пре-
паратов?
18. Водные растворы кислоты борной (3%-ные) должны быть про-
зрачными, а 5% -ные водные растворы натрия гидрокарбоната не долж-
ны по мутности превышать эталон № 4. Как это доказать?
19. Для определения окраски жидкостей были приготовлены исход-
ные растворы дихромата калия, хлорида кобальта и сульфата меди. В
течение какого срока из них можно готовить основные растворы и каков
срок их хранения?
20. В частной фармакопейной статье ГФ X на фталазол указано, что
-0,2 г препарата растворяют в смеси из 1 мл 1 н. раствора гидроксида
натрия и 4 мл воды. Полученный раствор должен быть прозрачным и
окраска не должна превышать эталона № 4а. Объясните, как проверить
соответствие препарата требованиям ГФ X по этим показателям.
21. Водный раствор хлоралгидрата (10%-ный) по ГФ X должен быть
бесцветным. Как это доказать?
22. Окраска 10%-ного водного раствора натрия п-аминосалицилата
по ГФ X не должна быть интенсивнее эталона № 56. Какой основной
раствор нужно использовать для приготовления эталона и какова мето-
дика определения окраски 10%-ного водного раствора натрия п-амино-
салицилата?
23. Какой основной раствор можно использовать для приготовления
эталона окраски при испытании растворов калия бромида, если 10% -ные
водные растворы его должны быть бесцветными? Какова методика опре-
деления?
24. Для приготовления эталонов окраски по ГФ XI используется че-
тыре основных раствора. Из каждого основного раствора можно приго-
123
товить семь эталонов. Изменилось ли число эталонов в ГФ XI по сравне-
нию с ГФ X? Как следует готовить, хранить эталоны и каковы сроки их
годности?
25. Водный раствор магния сульфата (10%-ный) должен быть бес-
цветным. В чем отличие методик установления бесцветности этого ра-
створа по ГФ X и ГФ XI?
26. В ГФ XI введена статья “Метод определения степени белизны
порошкообразных лекарственных средств”, позволяющая давать допол-
нительную характеристику доброкачественности лекарственных препа-
ратов. Чем можно объяснить изменение белизны при хранении таких
препаратов, как калия йодид и иатрия бромид?
27. Какие методы определения воды и летучих веществ включены в
ГФ XI? В чем сущность метода высушивания и метода дистилляции?
28. При каких условиях постоянную массу препарата считают дос-
тигнутой?
29. Какие химические соединения входят в состав реактива Фишера?
30. Какие химические реакции лежат в основе определения воды
методом Фишера?
31. Какие химические соединения ие могут быть определены титро-
ванием реактивом Фишера и почему?
32. Какова методика определения содержания воды титрованием ре-
активом Фишера?
33. Для чего проводят контрольный опыт при использовании реакти-
ва Фишера?
34. Какова методика установления титра реактива Фишера?
35. При испытании доброкачественности натрия бензоата устанавли-
вают потерю в массе при высушивании. С этой целью около 0,5 г препа-
рата (точная масса) сушат при 100—105 °C до постоянной массы, потеря
в массе не должна превышать 3 %. Как выполнить это испытание?
36. Разница в массе бюкса после повторного его высушивания была
равна 0,0004 г. Можно ли его использовать для определения воды и
летучих веществ в лекарственных препаратах? Что означает термин “по-
стоянная масса”?
37. Для определения потери в массе при высушивании эфедрина гид-
рохлорида его сушат при 100—105 °C до постоянной массы. Это же ис-
пытание адреналина гидротартрата проводят без нагревания высушива-
нием в вакуум-эксикаторе над серной кислотой в течение 3 ч. В хими-
ческой структуре препаратов много общего. Чем объяснить различия в
условиях выполнения испытаний?
38. Для всех ли препаратов при определении потери в массе требует-
ся высушивание до постоянной массы? Ответ подтвердите примерами и
обоснуйте причины изменения методики определения.
39. При количественном определении гексенала указано, что его со-
держание в препарате в пересчете на сухое вещество должно быть не
менее 98 %. Что означает выражение “в пересчете на сухое вещество” и
как осуществляют этот пересчет?
40. Для установления потери в массе путем высушивания препарата
при 100—105 °C взята навеска массой 0,5 г. Того же препарата при
124
проведении испытания в приборе для определения воды брали 10 г. В
чем сущность двух указанных методов? Чем объяснить столь большую
разницу в массах препаратов, необходимых для выполнения каждого из
этих испытаний?
41. При хранении реактива Фишера не был исключен доступ атмос-
ферной влаги. Как это может сказаться на качестве реактива? Какие
химические процессы могут при этом происходить?
42. Для приготовления реактива Фишера было взято заниженное
содержание пиридина. Отразится ли это на качестве реактива?
43. В препарате магния оксид проводят определение потери в массе
при прокаливании. Можно ли влажность этого препарата установить
реактивом Фишера?
3. АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ
ЭЛЕМЕНТНОГО АНАЛИЗА
Элементный анализ используют для количественного опреде-
ления органических и элементорганических соединений, содер-
жащих азот, галогены, серу, а также мышьяк, висмут, ртуть,
сурьму и другие элементы. Элементный анализ может быть так-
же применен для качественного подтверждения наличия этих
элементов в составе исследуемого соединения или для установле-
ния или подтверждения брутто-формулы вещества.
3.1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ЭЛЕМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Обнаружение азота
При прокаливании азотсодержащих веществ со смесью безвод-
ных карбоната натрия и тиосульфата натрия атомы азота органи-
ческих соединений превращаются в ионы тиоцианата, которые с
катионами трехвалентного железа образуют окрашенные в крас-
ный цвет комплексы:
FeCl3 + 3NaCNS -> Fe(CNS)3 + 3NaCl.
Методика проведения эксперимента
В сухую пробирку помещают 0,15 г анализируемого вещества
и 0,3 г смеси для спекания, состоящих из безводных карбоната
натрия и тиосульфата натрия, взятых в соотношении 9:1. После
тщательного перемешивания стеклянной палочкой содержимое
пробирки прокаливают 6—7 мин в пламени спиртовки до об-
угливания. В случае минерализации возгоняющихся веществ после
перемешивания насыпают сверху дополнительный слой смеси для
спекания. По окончании прокаливания пробирку охлаждают на
воздухе и к содержимому небольшими порциями при перемеши-
вании прибавляют 3—4 мл азотной кислоты до прекращения вы-
деления углекислого газа и создания pH 1—2. Раствор фильтру-
ют, фильтрат делят на 2 части. К первой части прибавляют
3 %-ный раствор хлорного железа (III). Вторая часть фильтрата
служит контролем. При наличии в испытуемом веществе азота
появляется красное или оранжевое окрашивание. Если окраши-
вание желто-оранжевое, опыт следует повторить, увеличив в 2 раза
массу вещества и количество реактивов.
Обнаружение серы
Метод пиролитического восстановления. При прокаливании
с формиатом натрия органического вещества, содержащего серу,
126
процесс деструкции при 250 °C сопровождается восстановлением,
в результате которого выделяется сероводород. Последний легко
обнаружить по реакции образования сульфида свинца.
Методика проведения эксперимента
В сухую пробирку помещают 0,05 г анализируемого вещества
и 0,05 г формиата натрия и тщательно перемешивают стеклян-
ной палочкой. Верхнюю часть пробирки плотно обертывают филь-
тровальной бумагой, на которую наносят 1—2 капли раствора аце-
тата свинца. Смесь прокаливают в пламени спиртовки в течение
5 мин. При наличии серы на внутренней поверхности бумаги по-
является пятно, окрашенное в черный цвет. В некоторых случаях
возможно ошибочное обнаружение серы вследствие высокой чув-
ствительности метода.
Окислительный метод. При минерализации смесью концент-
рированных азотной и хлористоводородной кислот (1:1) входя-
щая в органические вещества сера окисляется до сульфат-иона,
который обнаруживают с помощью хлорида бария.
Методика проведения эксперимента
К 0,1 г анализируемого вещества прибавляют по 2 мл концен-
трированной азотной и хлористоводородной кислот и выпарива-
ют в вытяжном шкафу на водяной бане досуха. Остаток смешива-
ют с 2 мл воды, фильтруют, к фильтрату прибавляют по 3 капли
разведенной хлористоводородной кислоты и 5 %-ного раствора
хлорида бария. Образование белого кристаллического осадка суль-
фата бария свидетельствует о наличии в исследуемом веществе
серы.
Обнаружение галогенов
Присутствие в молекуле лекарственного вещества ионогенно-
или ковалентно связанных атомов хлора, брома, йода легко под-
тверждается простой и доступной чувствительной пробой Бельш-
тейна. Для идентификации галогенов необходимо использовать
метод минерализации и соответствующие качественные реакции.
Проба Бельштейна. При сжигании галогенсодержащих ве-
ществ на медной проволоке или сетке в пламени спиртовки обра-
зуются летучие галогениды меди, которые окрашивают пламя в
зеленый или сине-зеленый цвет.
Методика проведения эксперимента
Медную проволоку длиной 10—12 см с загнутым в форме ушка
концом или медную сетку, предварительно обработанную разве-
денной азотной кислотой, промывают дистиллированной водой,
127
прокаливают в пламени спиртовки до исчезновения окраски пла-
мени. Если зеленое окрашивание пламени не исчезает в течение
1 мин, то это свидетельствует о наличии в спирте веществ, со-
держащих галогены, и такую спиртовку для проведения опыта
использовать нельзя. После охлаждения проволоки в ее ушко
помещают 3—5 мг вещества и снова вносят в пламя. Если пламя
спиртовки окрашивается в зеленый или сине-зеленый цвет, то
можно сделать вывод о наличии в испытуемом веществе галоге-
на. При его отсутствии характерной окраски пламени не наблю-
дается.
Идентификация галогенов
В случае положительного эффекта пробы Белыптейна для под-
тверждения наличия галогена в молекуле неизвестного вещества
и для идентификации хлора, брома или йода проводят дополни-
тельные испытания путем минерализации веществ в присутствии
безводного карбоната натрия. Образующиеся галогенид-ионы об-
наруживают и идентифицируют известными реакциями.
Методика проведения эксперимента
Смесь из 0,1 г анализируемого вещества и 0,5 г безводного
карбоната натрия сплавляют в тигле, нагревая его на плитке или
спиртовке. Плав охлаждают, добавляют порциями при переме-
шивании 5 мл азотной кислоты до прекращения выделения угле-
кислого газа. Жидкость фильтруют, фильтрат делят на 2 части. К
одной из них добавляют 2—5 капель 2 %-ного раствора нитрата
серебра. Образование в азотнокислой среде творожистого осадка
характерного цвета подтверждает наличие в испытуемом веще-
стве галогенов. Уже после проверки растворимости осадка в
5 % -ном растворе аммиака можно сделать вывод о наличии хлора
или других галогенидов — брома, йода.
Ко второй части фильтрата добавляют 5 мл разведенной сер-
ной кислоты, 1 мл хлороформа, а затем по каплям 1 %-ный ра-
створ калия перманганата до устойчивой розовой окраски водно-
го слоя и тщательно взбалтывают. При наличии брома слой хло-
роформа окрашивается в желто-бурый цвет, при наличии йода —
в розовый или фиолетовый.
3.2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ЭЛЕМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ
Методы количественного элементного анализа основаны на
предварительном разрушении органической части молекулы, ко-
торое осуществляется путем минерализации в присутствии окис-
лителей или восстановителей, с применением различных катали-
128
заторов или высокой температуры в зависимости от модифика-
ций метода. Образовавшиеся вследствие минерализации продук-
ты определяют различными физическими, химическими или фи-
зико-химическими методами.
Количественное определение углерода и водорода может быть
проведено окислением испытуемого соединения при повышенной
температуре (сжигание) с образованием диоксида углерода и воды.
В качестве окислителя, например, используют кислород в при-
сутствии катализаторов. Образовавшиеся С02 и Н20 улавливают
поглотителями, связывающими эти вещества. Анализ завершают
газометрическим, гравиметрическим или титриметрическим ме-
тодами.
Для определения азота в основном используют два химичес-
ких метода. Один из них — метод Дюма-Прегля — заключается в
термическом разложении веществ и газометрическом определе-
нии азота. Второй — метод Кьельдаля, широко применяемый в
фармацевтическом анализе азотсодержащих лекарственных ве-
ществ, основан на минерализации органического вещества сер-
ной кислотой с последующим титриметрическим определением
продуктов реакции.
Галогены и серу можно после сжигания навески вещества в
токе кислорода определять гравиметрическим или титриметри-
ческим методом.
Созданные в последние годы приборы для элементного анали-
за позволяют определить микрометодом не только углерод, водо-
род и азот в одной навеске, но и кислород, серу, фосфор, галогены
и другие элементы. Принцип действия этих методов заключается
в разложении пробы и последующей подаче продуктов распада на
хроматограф. Отчеты ведутся по пикам, полученным на хрома-
тограммах.
Существуют также способы, основанные на разложении и пос-
ледующем ИК-спектроскопическом определении элементов в орга-
нических веществах.
Определение азота в органических соединениях
Фармакопейный метод определения азота в органических со-
единениях известен также под названием метода Кьельдаля. Он
основан на сочетании минерализации органического вещества с
последующим применением кислотно-основного титрования. При-
меняют метод Кьельдаля для количественного анализа азотсодер-
жащих органических веществ, а также лекарственных препара-
тов, содержащих аминный, амидный и гетероциклический азот.
Метод включает несколько последовательно выполняемых стадий.
9. Заказ 3547
129
Вначале осуществляют минерализацию образца нагреванием с
концентрированной серной кислотой:
[О]
Амины, амиды —> СО,? + Н,О + NH.HSO..
НД
Затем действуют на гидросульфат аммония гидроксидом на-
трия и отгоняют выделяющийся аммиак в приемник, содержа-
щий раствор борной кислоты:
NH.HSO. + 2ОН- —> NH,? + 2Н,0 + SO/-.
4 4 о 2 4
Так как борная кислота реагирует с аммиаком с образованием
солей метаборной и тетраборной кислот, то в приемнике образу-
ются метаборат и тетраборат аммония:
NH3 + H3BO3 —> NH4BO2 + H2O;
2NH, + 4Н,В0, —> (NHXB.O. + 5Н„0.
Далее собранный отгон, содержащий весь образовавшийся амми-
ак в виде мета- и тетрабората аммония, титруют 0,1 М раствором
соляной кислоты:
NH4BO2 + НС1 + Н2О —> NH4C1 + Н3ВО3;
(NH4)2B4O7 + 5Н2О + 2НС1 —> 2NH4C1 + 4Н3ВО3.
Для повышения точности анализа параллельно выполняют
контрольный опыт. Разность между количеством миллилитров
титрованного раствора соляной кислоты в основном и контрольном
опытах, умноженная на 0,0014, соответствует количеству азота (г),
который содержится в испытуемом веществе.
Область применения метода Кьельдаля в фармацевтическом
анализе довольно широка. ГФ рекомендует его для определения
уретанов (мепротан), аминокислот (метионин, глутаминовая кис-
лота) и других азотсодержащих лекарственных веществ (бензо-
гексоний, оксафенамид, дипрофиллии). Самый существенный
недостаток метода — его трудоемкость.
Для определения некоторых лекарственных веществ, содержа-
щих легко гидролизующуюся в щелочной среде амидную группу
(салициламид, диэтиламид никотиновой кислоты, салюзид раство-
римый, прозерин), используют упрощенный вариант метода Кьель-
даля, исключающий стадию минерализации. Методика опреде-
ления сводится к разрушению препарата 30% -иым раствором гид-
роксида натрия в колбе Кьельдаля и отгонке выделяющегося ам-
миака (или диалкиламина) в приемник [10, 21].
130
Работа 1. Определение качественного и количественного
состава органических лекарственных средств методами
элементного анализа
Задание 1. Провести газометрическое определение азота в ле-
карственных средствах.
Азот определяют сжиганием навески вещества в кварцевой
трубке при помощи электропечи за счет кислорода твердых окис-
лителей оксида меди в атмосфере диоксида углерода. Продукты
сожжения вытесняют током диоксида углерода в азотометр со
щелочью. Оксиды азота, проходачерез слой восстановителя (обыч-
но нагретой металлической меди), восстанавливаются. Таким об-
разом, из трубки для сожжения в азотометр поступает смесь лишь
двух газов — диоксида углерода и азота. Диоксид углерода погло-
щается раствором щелочи, а азот собирается в азотометре. Изме-
ряют объем выделившегося азота и рассчитывают его содержание
в испытуемом веществе.
Сожжение. Установка для определения азота изображена на
рис. 3.1. Навеску вещества 5—7 мг, взятую с точностью до
0,00002 г на микровесах, берут в кварцевую лодочку или стек-
лянный капилляр (жидкое соединение) и помещают в трубку 11,
в которую предваритель-
но насыпают слой окси-
да меди длиной 10 мм.
Если навеска взята в ка-
пилляр, то его распола-
гают открытым концом
к заплавленной части
трубки 11. Затем навес-
ку засыпают оксидом
меди так, чтобы он за-
полнил всю трубку, но
немного не доходил до
отвода. При сожжении
легколетучих соедине-
ний трубка 11 должна
быть длиннее, чем при
сожжении нелетучих со-
единений. Трубку 11
закрывают резиновой
пробкой и присоединя-
ют к источнику диокси-
да углерода. В течение
1 мин ее продувают ди-
Рис. 3.1. Аппарат для определения азота моди-
фицированным методом: 1 — трубка с гидрокар-
бонатом натрия; 2 — уравнительная груша; 3 —
аппарат Киппа; 4 — трубка с постоянным напол-
нением; 5 — электрическая печь на 750—800 °C;
6 — кран с нарезкой; 7 — мнкроазотометр; 8 —
электрическая печь на 300 °C, нагревающая ок-
сид меди; 9 — горелка; 10 — кран; 11 — трубка с
переменным наполнением; 12 — электрическая
печь на 500—550 °C, нагревающая оксид меди
9*
131
оксидом углерода, затем присоединяют трубку 4 с постоянным
наполнением и пропускают ток диоксида углерода 2—3 мин. На
трубку 4 надвигают электропечи, присоединяют к трубке азото-
метр и продувают диоксидом углерода всю систему 1—2 мин.
Закрывают кран 6 соединительной трубки, поднимают грушу
азотометра вверх настолько, чтобы щелочь поднялась в воронку,
закрывают кран азотометра и кладут грушу на стол. Затем от-
крывают осторожно кран соединительной трубки и пропускают
диоксид углерода в азотометр. Микропузырьки должны очень
медленно подниматься вдоль стенок калиброванной части азото-
метра. Пока это не достигнуто, не имеет смысла начинать сожже-
ние. Если нет микропузырьков, то открывают кран азотометра,
спускают щелочь в грушу и снова полностью открывают кран
соединительной трубки, чтобы еще раз продуть систему. Для по-
лучения микропузырьков во многих случаях достаточно энергич-
но продуть установку. При работе с аппаратом Киппа для этого
надо вынуть кран 10, дать соляной кислоте подняться выше мра-
мора, снова вставить кран, дать соляной кислоте подняться в верх-
нем шаре до наивысшего уровня, опять приподнять кран, спус-
тить избыточное давление газа, снова- вставить кран, затем от-
крыть его и пропустить сильную струю диоксида углерода через
трубку для сожжения в течение 4—5 мин. При работе с автокла-
вом надо сильнее открыть вентиль. Если после вытеснения возду-
ха диоксидом углерода начинают выделяться микропузырьки, то
закрывают кран, через который поступает диоксид углерода, от-
крывают полностью кран соединительной трубки 6 и надвигают
печь на трубку 11 таким образом, чтобы навеска находилась вне
зоны этой печи. Затем начинают разложение навески с помощью
газовой горелки или печи, которую постепенно продвигают от
неподвижной печи в направлении навески до неподвижной печи,
нагревающей слой катализатора. По окончании сожжения, кото-
рое длится 10—15 мин, после прекращения выделения пузырь-
ков в азотометр начинают вытеснять газы. Для этого закрывают
кран соединительной трубки, открывают кран, через который
поступает диоксид углерода, и осторожно приоткрывают кран
соединительной трубки, следя за тем, чтобы вытеснение происхо-
дило не очень быстро. Как только поднимающиеся пузырьки сде-
лаются микропузырьками, прекращают пропускание диоксида
углерода. Печь с трубки 11 снимают лишь в конце вытеснения.
Электропечи с трубки 4 не снимают в течение всего рабочего дня.
При отсоединении трубки 11 от системы нужно быстро закрыть
трубку 4, так как при попадании в нее кислорода восстановлен-
ная медь будет быстро окисляться.
132
Чтобы закончить определение, грушу азотометра подвешива-
ют над воронкой. Если на мениске щелочи заметны пузырьки, то
их удаляют, сжимая и разжимая двумя пальцами резиновую труб-
ку. Через 15 мин берут отсчет.
Случается, что во время определения большие пузырьки заст-
ревают в суженной части азотометра и растут за счет следующих
пузырьков, образуя большой пузырь в нижней части азотометра.
Чтобы эту часть соединить с азотом, находящимся в градуирован-
ной части азотометра, поступают следующим образом. Наполня-
ют воронку азотометра 50%-иым раствором щелочи, опускают
грушу до уровня ртути и на короткое время открывают кран под
воронкой. Быстро опускающаяся щелочь увлекает газ из градуи-
рованной части вниз, в расширенную часть азотометра, где он
соединяется с остальной частью газа. Приподнимая снова грушу,
вытесняют газ в градуированную часть азотометра. Закрыв кран,
делают отсчет. Для этого опускают грушу, пока уровни щелочи в
азотометре и в груше не сравняются [20].
Расчет. Содержание азота (X) в процентах вычисляют по фор-
муле
X = [a(V-n)100]/g,
где а — масса 1 мл азота при данной температуре (t) и данном
исправленном давлении (р); V — объем азота, мл; п — поправка,
полученная для данного объема при калибровании азотометра,
мл; g — навеска, мг.
р = р1 -t/8-b,
где pj — атмосферное давление, мм рт. ст.; t/8 — поправка на
расширение ртутного столба, мл; b — поправка на давление насы-
щенных паров воды над 50%-ным раствором едкого кали.
Пример. Навеска — 4,572 мг.
Объем азота (V) по азотометру при температуре (t) 22,0 °C и
атмосферном давлении (р1) 754,0 мм рт. ст. был 0,352 мл. Азото-
метр имеет при этом объеме поправку 0,002 мл.
р = 754,0 - 22/8 - 12,2 =739,05.
Находим логарифм массы (1 мл) азота при t = 22 °C и р =
= 739 мм рт. ст. Он равен 0,05120.
Исправленный объем
V = 0,352 + 0,002 = 0,354 мл;
lg V = 1,54900;
1g х = 0,05120 + 1,54900 + 2,00000 - 0,66011 = 0,94009;
х = 8,71 (х — содержание азота в %).
133
Для испытания берут один из лекарственных препаратов, при-
веденных в табл. 3.1.
Таблица 3.1
Лекарственные препараты, рекомендуемые для определения азота
Лекарствен- ный препарат Химиче- ская формула Моляр- ная масса Содержание азота согласно частной статье ГФ, ФС, % Эксперимен- тально уста- новленное содержание азота в на- веске, % Заключение о соответст- вии требова- ниям ГФ
Глутаминовая кислота С5Н,ЫО4 147,13 9,4—9,55
Никотиновая кислота С,Н5ЫО2 123,11 не менее 11,3
Никотинамид C,H,N,0 122, 13 не менее 22,7
Салициламид C,H,NO, 137,14 не менее 10,1
Оксафенамид с..нло, 229,24 не менее 6,1
Изоплазид C,H;N3O 137,14 не менее 30,0
Проверив C,,H„N,O.S 334,39 не менее 8,3
Гексаметилен- тетрамин С.Н.А 140,19 не менее 39,6
Заполняют таблицу на основании результатов испытаний.
Определение углерода, водорода, серы и галогенов
Метод сжигания в колбе с кислородом является одним из перс-
пективных методов количественного элементного анализа. Он вклю-
чен во многие фармакопеи мира, в том числе Международную и
Европейскую, но пока ограниченно используется в отечественном
фармацевтическом анализе. Метод основан на разрушении органи-
ческого вещества сожжением в колбе, наполненной кислородом,
растворении образовавшихся продуктов в поглощающей жидкости
и последующем определении элементов, находящихся в растворе в
виде ионов или молекул. Определение выполняют различными хи-
мическими или физико-химическими методами. Метод может быть
использован для качественного и количественного определения орга-
нических лекарственных веществ, содержащих в молекуле галоге-
ны, серу, фосфор, азот и другие элементы. Преимущества метода
состоят в быстроте процесса минерализации, занимающего несколько
секунда исключении потерь элемента в процессе минерализации,
проходящем в герметически закрытой колбе; возможности унифи-
кации применительно к различным группам соединений; высокой
чувствительности анализа на заключительной его стадий и широ-
ком сочетании метода на этой стадии с физико-химическими мето-
дами. Большие перспективы открывает применение метода сжига-
134
кия в кислороде для определения примесей тяжелых металлов и
других элементов в лекарственных веществах при испытании их на
чистоту.
ГФ рекомендует этот метод для определения йода в йодорганн-
ческих лекарственных веществах. Однако проведенные в последние
годы исследования подтверждают возможность его использования
для элементного анализа сульфаниламидных препаратов и других
содержащих серу органических лекарственных препаратов. Весьма
широки перспективы применения метода для количественного ана-
лиза хлор- и бромсодержащих лекарственных препаратов с после-
дующим использованием меркуриметрического титрования. Важ-
ная особенность метода сжигания в кислороде — возможность при-
менения для анализа препаратов в таких лекарственных формах,
как таблетки, драже, мази, суппозитории.
Для определения углерода и водорода предложено несколько
модификаций метода сожжения в быстром токе кислорода с даль-
нейшим определением продуктов окисления (углекислого газа и
воды) после их поглощения специальными адсорбентами грави-
метрическим методом.
Наибольший интерес представляют методы, позволяющие из
одной навески определить сразу помимо углерода и водорода га-
логены, серу, фосфор и некоторые другие элементы, переходя-
щие при сожжении в устойчивые, нелетучие при высокой темпе-
ратуре оксиды, входящие в состав золы, являющейся побочным
продуктом сожжения [10].
Задание 2. Провести определение углерода, водорода, серы и
галогенов в лекарственном препарате методом сжигания в токе
кислорода.
Методом, который будет описан ниже, можно определить од-
новременно углерод, водород, серу (или галогены) из одной навес-
ки. Если препарат содержит серу и галогены или разные галоге-
ны, то в результате анализа будет получено их суммарное содер-
жание в навеске.
Определение проводят сожжением навески при помощи элект-
ропечи в кварцевой трубке в токе кислорода с дальнейшим погло-
щением продуктов окисления специальными поглотительными
аппаратами и последующим взвешиванием.
Установка для определения водорода, углерода,
серы (или галогенов) нз одной навески
Аппаратура состоит из трех основных частей: система подачи
н очистки кислорода, трубки для сожжения, системы для погло-
щения продуктов горения. Кислород подают в систему из газо-
135
метра или непосредственно из баллона. В связи с недостаточной
чистотой кислорода его предварительно очищают. Сначала прово-
дят грубую осушку пропусканием через колонки с осушителем
(концентрированная серная кислота, ангидрон, крупная фракция
аскарита), затем в катализаторной трубке окисляют примесь орга-
нических веществ до диоксида углерода и воды, которые в свою
очередь улавливаются аскаритом и ангидроном в U-образных труб-
ках. Очищенный кислород поступает в трубку для сожжения. В
кварцевой трубке в токе кислорода Проводят сожжение навески
при помощи электропечей (рис. 3.2).
Продукты сожжения поступают в систему, состоящую из
нескольких поглотительных аппаратов, заключительной труб-
ки и склянки Мариотта с водой. Поглотители располагают в
следующем порядке: 1) аппарат для поглощения галогенов и
серы, в который помещают электролитически осажденное, мел-
кодисперсное серебро, направляемое разъемной печью; 2) ап-
парат для поглощения воды наполняют ангидроном (безвод-
ный перхлорат магния); 3) аппарат для поглощения оксидов
Рис. 3.2. Прибор для определения углерода и водорода в веществах, содержа-
щих углерод, водород, галоид и серу: 1 — газометр с кислородом; 2 — осуши-
тельная склянка; 3 — кран с нарезкой; 4 — катализаторная трубка; 5 — сосуд
для охлаждения змеевика катализаторной трубки; 6, 7 — U-образные трубки;
8 — электрическая печь на 900 °C для сожжения вещества и нагревания зоны
разложения; 9 — дополнительная электрическая печь на 900 °C для нагревания
широкой части трубки; 10 — электрическая печь на 450—600 °C для нагревания
серебра; 11 — электрическая печь на 900 °C для нагревания зоны окисления;
12— узкая часть сжигательной трубки; 13 — аппарат для поглощения воды;
14 — аппарат для поглощения оксидов азота; 15 — аппарат для поглощения
диоксида углерода; 1'6'— заключительная трубка; 17 — склянка Мариотта; 18 —
клюв склянки Мариотта; 19 — цилиндр
136
азота, мешающих определению оксида углерода, наполненный
диоксидом марганца; 4) аппарат для поглощения диоксида уг-
лерода, наполненный аскаритом (сплав едкого натра с асбес-
том).
Поскольку точность определения зависит во многом от точно-
сти взвешивания и, в частности, от того, насколько правильно
будет взята навеска, на этом надо остановиться отдельно.
Навески твердых веществ берут в лодочку или кварцевую про-
бирку, жидких — в кварцевые капилляры. Навеску (обычно 5—
7 мг) берут с точностью до ± 0,0002 г на микровесах. Для взя-
тия навески жидкостей предварительно нагревают расширенную
часть капилляра и опускают его кончик в жидкость. После на-
полнения капилляр вынимают и протирают кончик замшей, взве-
шивают.
Следует помнить, что перед взятием навески вещество и тара
должны принять температуру весовой комнаты (20—30 мин).
При взвешивании протертый замшей поглотитель или капил-
ляр помещают на крючки, лодочку — непосредственно на чашки
весов, а кварцевую пробирку взвешивают на чашке весов вместе
со специальной подставкой.
При проведении анализа галогены или серу (если они присут-
ствуют) поглощают слоем серебра, помещенным в кварцевый по-
глотитель при температуре -600 °C. Поглотители с серебром взве-
шивают до и после определения по их охлаждении.
Поглощение галогенов серебром протекает по уравнению:
2Ag + С12 = 2AgCl,
поэтому процентное содержание галогена вычисляют простым
делением привеса серебра (Ь) на навеску (g) и умножением полу-
ченного результата на 100. Никакого коэффициента пересчета здесь
не требуется.
Пример. Навеска — 5,826 мг.
Масса лодочки с серебром до сожжения — М (тара) + 0,220 мг.
Масса лодочки с серебром после сожжения — М + 2,327 мг.
Привес лодочки с серебром — 2,107 мг.
Вычисляем содержание галогена:
х = b • ЮО/g - 2,107 • 100/5,826 + 36,16.
При определении серосодержащих препаратов поглотители с
серебром нагревают до и во время работы до 800 °C.
Поглощение оксидов серы протекает по схеме:
2Ag + О2 + SO2 = Ag^C^.
Следовательно, привес серебра будет соответствовать содержанию
so42-.
137
Расчет. Содержание серы (X) в процентах вычисляют по
формуле
Х = К^(Ь100)^,
где b — привес лодочки с серебром, мг; g — навеска, мг;
= 32,064/96,064 = 03338.
Пример. Навеска — 6,005 мг.
Масса лодочки с серебром до сожжения — М + 0,326 мг.
Масса лодочки с серебром после сожжения — М + 3,436 мг.
Привес лодочки с серебром — 3,110 мг.
Вычисляем содержание серы:
X - 0,333 (3,110 • 1ОО)/6,ОО5 - 17,28.
Водород определяют по привесу поглотителя с ангидроном,
поглощающим воду, который располагают сразу за поглотителем
с серебром; углерод — по привесу поглотителя с аскаритом и ан-
гидроном, поглощающими СО2.
Расчет проводят, как указано ниже, с учетом поправки, вы-
числяемой при сожжении контрольного вещества, масса и состав
которого точно известны (поправка учитывает возможные субъек-
тивные и объективные ошибки при проведении анализа на дан-
ной конкретной установке).
Поправку (п) в мг вычисляют по формулам:
“со, = а - A g/M; nH10 = b - В g/M,
где а — привес СО2, мг; А — масса СО2, рассчитанная по реакции
при окислении грамм-молекулы контрольного вещества, г; g —
навеска, мг; М — молекулярная масса контрольного вещества;
Ь — привес Н2О, мг; В — масса Н2О, рассчитанная по реакции
при окислении грамм-молекулы контрольного соединения, г.
Содержание углерода и водорода в % вычисляют по формулам:
. Хс = Код -100(а — nCQi)/g; Хн = К^о -100(b — n^oJ/N,
где
Код =МС/Мод = 12,01/44,01 = 0,2729;
Кн,о ZMHj0 =2,016 /18,016 =0Д119 .
Пример. Контрольное вещество — сахароза (С12Н22ОП),
м.в. 342,31. Навеска — 6,325 мг. Получено: СО2 — 9,802 мг,
HjO — 3,752 мг. Теоретически из 6,325 мг сахарозы должно по-
лучиться:
СО2 = (44,01-12)/342,31-6325 = 9,758 мг;
Н2О = (18,016 • 11) /34231 • 6325 = 3,662 мг.
138
Расчет поправка:
псо, =9,802 - 9,758 = 0,044, т. е. 45 мкг
пн,о = 3,752 - 3,662 = 0,090, т. е. 90 мкг.
Навеска — 5,280 мг. Получено: СО2 — 8,180 мг, HgO — 3,150 мг.
Содержание углерода и водорода в % с учетом поправки:
Хс = 0,2729-100(84 80 - 0,045)/5Д80 = 42,05;
Хн = ОД 119 -100(3450 - 0,09О)/5Д8О = 6,48.
Для испытаний берут одно из лекарственных веществ, приве-
денных в табл. 3.2. Пустые графы таблицы заполняются на осно-
вании результатов анализа.
Таблица 3.2
Лекарственное вещество Химическая формула Содержание элемен- тов по результатам анализа, % Содержание элемен- тов расчетное, %
С Н S Hal С Н S Hal
Левомицетин Проэернн Метионин с.ддао, c.^MW C1,H11NO^
Делают вывод о соответствии найденного состава истинной
формуле [20].
4. АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ТИТРОВАНИЯ
В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ
Титриметрические методы анализа — это наиболее распрост-
раненные в фармацевтическом анализе методы, отличающиеся ма-
лой трудоемкостью и достаточно высокой точностью. Количествен-
ную оценку с их помощью осуществляют путем определения от-
дельных элементов или функциональных групп, содержащихся в
молекуле лекарственного вещества. Многие органические веще-
ства не могут быть определены титрованием в водных растворах в
силу йх низкой растворимости или слабости проявляемых кис-
лотно-основных свойств. Задача их определения была успешно
разрешена заменой воды на органический (неводный) раствори-
тель.
Титрование в среде неводных растворителей (неводное титро-
вание) позволяет количественно определять органические веще-
ства, обладающие кислотными и основными свойствами, но труд-
но растворимые в воде. Можно осуществлять выбор органическо-
го растворителя, который способен изменять силу кислотных или
основных свойств анализируемого вещества. В качестве титран-
тов используют растворы сильных кислот или сильных основа-
ний.
Недостатком неводного титрования является необходимость
иметь герметизированную титровальную установку. Работа ведется
с весьма токсичными летучими растворителями.
Метод неводного титрования широко используется в фарма-
цевтическом анализе, поскольку многие синтетические и природ-
ные органические лекарственные вещества проявляют слабые ос-
новные или слабые кислотные свойства.
Неводное титрование органических оснований (и их солей)
выполняют, используя в качестве растворителя безводную уксус-
ную кислоту или уксусный ангидрид. Сочетают также уксусную
кислоту с уксусным ангидридом, который улучшает условия тит-
рования. Титрантом служит раствор хлорной кислоты, а индика-
тором — раствор кристаллического фиолетового, тропеолина 00
или метилового оранжевого. Растворы титранта и индикатора го-
товят в безводной уксусной кислоте.
Хлорной кислотой в неводной среде титруют соли сильных
оснований и слабых кислот (калия ацетат):
R-COOK + НС1О, -> КСЮ, + R-COOH.
Слабое органическое основание (R3N) при растворении в безвод-
ной уксусной кислоте становится сильной сопряженной кислотой:
140
R,N 4- СНЯСООН -> R,N-H+ 4- CH,COO~.
о о о о
При растворении хлорной кислоты в уксусной последняя про-
являет свойства сильного сопряженного основания, образуя пер-
хлорат- и ацетоний-ион:
СНдСООН 4- НС1О4 -> СЮ; 4- СН3СООН+.
Последний нейтрализует ацетат-ионы:
СНЯСОО" 4- СНЮООН + -> 2СНЮ00Н,
а перхлорат-ион взаимодействует с катионом основания:
R3N H+ 4- СЮ; -> [R3N H]+C10;.
Суммарно процесс нейтрализации слабого органического осно-
вания хлорной кислотой выглядит следующим образом:
R3N + НСЮ4 -> [R3N H]+C10;.
Данный процесс происходит при титровании лекарственных
веществ основного характера, относящихся к числу производных
пиразолона (амидопирин), пиридина (никотинамид, фтивазид),
алкалоидов, представляющих собой слабые основания (резерпин,
кофеин).
Химизм реакций при неводном титровании солей слабых орга-
нических оснований [R3N'HA], включающих анион (А-), можно в
общем виде представить следующим образом:
R3N-HA & R3N-H+ 4- А’;
А- + СНЮООН НА + СН,СОО_;
нею. + снясоон & сю; 4- СНЯСООН+;
4 О ' 4 О 4 1
СЩСОО- 4- СНЯСООН+ 2СЩС00Н.
Суммируя, получаем общее уравнение:
RgN-HA 4- НСЮ4 -> [R3N-H]+C1O4- 4- НА.
По этой схеме идет процесс титрования солей органических
оснований различной химической структуры (адреналина и нор-
адреналина гидротартраты, нитранол, хингамин, трихомонацид,
нафтизин, дитразина цитрат, нафтамон) и солей алкалоидов (ко-
деина фосфат, платифиллина гидротартрат, атропина сульфат,
сферофизина бензоат).
Исключение составляют галогениды четвертичных аммоние-
вых оснований и соли галогеноводородных кислот (гидрохлори-
ды, гидробромиды, гидроиодиды органических оснований). Эту
группу лекарственных веществ нельзя точно оттитровать в невод-
ной среде, так как галоген-ионы проявляют кислые свойства даже
в среде безводной уксусной кислоты. Поэтому галогеноводороды
141
(R3N-HA) титруют в присутствии ацетата ртути (II), который свя-
зывает галоген-ионы в малодиссоциированные соединения (ди-
хлорид, дибромид или дийодид ртути), не мешающие определе-
нию. Галоген-ионы (X-) замещаются эквивалентным количеством
ацетат-иона. Полученный ацетат органического основания от-
титровывают хлорной кислотой:
2 R3N HX + (CH3COO)2Hg -> HgX2 + 2[R3NH]+CH3C(Xr.
2[R3N H]+CH3COO~ + 2HC1O4 -> 2[R3NH]+C1O; + 2CH3COOH.
По НТД таким путем определяют гидрохлориды органичес-
ких оснований (димедрол, дибазол, амиказол, тропацин, проме-
дол, апрофен), в том числе производные фенотиазина (пропазин,
дипразин, аминазин, хлорацизин, трифтазин), галогеноводоро-
ды алкалоидов (пахикарпина гидройодид, гоматропина гидро-
бромид, кокаина гидрохлорид, скополамина гидробромид, гид-
рохлориды эфедрина, папаверина, апоморфина, морфина, этил-
морфина, пилокарпина) и витаминов (пиридоксина гидрохлорид),
соли четвертичных аммониевых оснований (оксазил, котарнина
хлорид).
Оттитровать в неводной среде соли галогеноводородных кис-
лот органических оснований можно и без помощи ацетата рту-
ти (II). Для этого в качестве растворителя используют смесь мура-
вьиной кислоты и уксусного ангидрида в соотношении 1:20. Та-
кое сочетание растворителей повышает основность растворов и
позволяет выполнить титрование с использованием в качестве тит-
ранта хлорной кислоты (индикатор — кристаллический фиолето-
вый), например, эфедрина гидрохлорида и дефедрина. В других
случаях к указанной смеси прибавляют бензол, например, при
определении этмозина и этацизина и др. Не требуется добавления
ацетата ртути и при определении некоторых солей органических
оснований (например, аминазина) с использованием в качестве
индикатора малахитового зеленого (растворитель уксусный ан-
гидрид, титрант — 0,1 М раствор хлорной кислоты).
Неводное титрование органических веществ, проявляющих
кислые свойства, выполняют обычно, используя в качестве ра-
створителя диметил формамид или его смесь с бензолом, а также
этилендиамин, бутиламин, пиридин. Титрантом служит раствор
гидроксида натрия в смеси метилового спирта и бензола или ра-
створ метилата натрия (метилата лития). В качестве индикатора
применяют тимоловый синий.
Фенолы (R-OH), растворенные в диметилформамиде, количе-
ственно взаимодействуют с метилатом натрия:
142
О СНз
Il ।
R-OH +C-N ->
I I
Н СНз
О СН3
_ * + /
R-0 +C-N
/ / \
Н Н СНз
R-O~ + CH3ONa -> R-ONa + СН3О~
0 СНз О СНз
W +/ II I
СНоО + C-N -> СН0ОН+ C-N
3 / / \ 3 it
Н Н СНз н СНз
Суммарная схема этого процесса:
R-OH + CH„ONa -> R-ONa + СНЯОН.
о о
В таких условиях можно количественно определять не только
фенолы, но и карбоновые кислоты, аминокислоты, сульфанила-
мидные препараты, барбитураты, производные тиоурацила, 4-ок-
сикумарина и др. Выбор растворителя и титранта зависит от сте-
пени ионизации титруемого объекта. Более сильные кислоты (бар-
битал, фенобарбитал, фталазол) по ГФ титруют в среде диметил-
формамида раствором гидроксида натрия, а вещества со слабо
выраженными кислотными свойствами (фенолы) — раствором ме-
тилата натрия [5, 30].
Работа 1. Титриметрическое определение лекарственных
препаратов в среде иеводиых растворителей
Задание 1. Освоить методику неводного титрования лекарствен-
ных веществ основного характера.
Количественное определение амидопирина
Около 0,25 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл
безводной уксусной кислоты, прибавляют 25 мл дихлорэтана и
титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до получения ярко-
фиолетового окрашивания (индикатор — раствор тропеолина 00 в
метиловом спирте). Параллельно проводят контрольный опыт. 1 мл
0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,02313 г препа-
рата (ГФ X, с. 45): Э = ММ.
Количественное определение никотинамида
Около 0,15 г предварительно высушенного препарата (точная
навеска) растворяют в 20 мл безводной уксусной кислоты и тит-
руют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до изумрудно-зеленого
окрашивания (индикатор — кристаллический фиолетовый). 1 мл
0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,01221 г C6H6N2O,
которого в высушенном препарате должно быть не менее 99 %.
143
Задание 2. Освоить методику неводного титрования солей орга-
нических оснований, содержащих галоген-ионы.
Количественное определение папаверина
Около 0,3 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл
безводной уксусной кислоты при слабом нагревании на водяной
бане. После охлаждения добавляют 5 мл ацетата окисной ртути и
титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до зеленого окраши-
вания (индикатор — кристаллический фиолетовый).
1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,03759 г
C20H21NO4-НС1, которого в препарате должно быть не менее 99 %.
При определении папаверина в лекарственной форме около
0,5 г (точная навеска) порошка растертых таблеток обрабатыва-
ют хлороформом 5 раз по 5 мл, фильтруют в сухую колбу через
фильтр, смоченный хлороформам, затем хлороформ отгоняют,
следы его удаляют продуванием воздуха. Остаток растворяют в
10 мл безводной уксусной кислоты и далее поступают, как опи-
сано выше.
Количественное определение дибазола
Около 0,15 г препарата (точная навеска), предварительно вы-
сушенного при 70—80 °C до постоянной массы, растворяют в 10 мл
безводной уксусной кислоты, прибавляют 5 мл ацетата окисной
ртути и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до голубова-
то-зеленого окрашивания (индикатор — кристаллический фиоле-
товый).
1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,02447 г
C14H12N2-HC1, которого в высушенном препарате должно быть не
менее 99 %.
При определении дибазола в лекарственной форме около 1 г
(точная навеска) порошка растертых таблеток обрабатывают хло-
роформом 1 раз в количестве 15 мл и 3 раза по 5 мл. Хлороформ-
ные извлечения фильтруют в сухую колбу через фильтр, смочен-
ный хлороформом. Хлороформ отгоняют до объема 1 мл, прибав-
ляют 10 мл безводной уксусной кислоты и далее проводят опреде-
ление, как в статье на лекарственное средство [9, 10].
Задание 3. Освоить методику неводного титрования лекарствен-
ных веществ, проявляющих кислые свойства.
Количественное определение варбитала
Около 0,15 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл
смеси диметилформамида и бензола (1:3), предварительно нейт-
рализованной по тимоловому синему в диметилформамиде, и тит-
руют с тем же индикатором из полумикробюретки 0,1 н. раство-
144
ром едкого натра в смеси метилового спирта и бензола до синего
окрашивания (ГФ X, с. 114).
1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 0,01842 г
C8H12N2O3, которого в препарате должно быть не менее 99,0 % и
не более 101,0 %.
Количественное определение феноварвитала
Около 0,2 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл
диметилформамида и титруют с тем же индикатором из полумик-
робюретки 0,1 и. раствором едкого натра в смеси метилового спирта
и бензола до синего окрашивания.
1 мл 0,1 н. раствора едкого иатра соответствует 0,02322 г
C12H12N2O3, которого в препарате должно быть не менее 99,0 % и
не более 101,0 % (ГФ X, с. 526).
Количественное определение фталазола
Около 0,1—0,2 г препарата (точная навеска) растворяют в 10—
20 мл диметилформамида, нейтрализованного непосредственно пе-
ред титрованием по тимоловому синему, и титруют 0,1 и. раство-
ром едкого натра в смеси метилового спирта и бензола до появле-
ния синего окрашивания (индикатор — тимоловый синий).
1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 0,02017 г
Из полученного процентного содержания фталазола вычитают
процентное содержание норсульфазола, умноженное на 1,58.
Содержание C17H13N3OsS2 в пересчете на сухое вещество долж-
но быть не менее 99,0 % (ГФ X, с. 534).
Количественное определение еензонала
Около 0,2 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл
диметилформамида, предварительно нейтрализованного по тимо-
ловому синему в диметилформамиде, и титруют с тем же индика-
тором из полумикробюретки 0,1 н. раствором едкого натра в сме-
си метилового спирта и бензола до появления синего окрашива-
ния.
1 мл 0,1 н. раствора едкого натра соответствует 0,03363 г
C19H16N2O4, которого в препарате должно быть не менее 99,0 %
(ГФ X, с. 534).
10. Заказ 3547
5. ФАРМАКОПЕЙНЫЙ АНАЛИЗ ГОТОВЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Для фармацевтического анализа важное значение имеет агре-
гатное состояние лекарственной формы. От него зависят отбор
пробы и подготовка ее к выполнению анализа. Лекарственные
формы по агрегатному состоянию классифицируют на твердые
(порошки, таблетки, драже, гранулы и др.); жидкие (истинные и
коллоидные растворы, суспензии, эмульсии, капли, линименты
и др.); мягкие (мази, суппозитории, пилюли, капсулы желатино-
вые и др.); газообразные (аэрозоли, газы).
Лекарственные формы могут содержать одно, два, три и более
лекарственных веществ. Поэтому различают одно-, двух-, трех-,
четырех- и т.д. компонентные лекарственные смеси. Используют
также термин “многокомпонентные смеси”, если в них содержит-
ся несколько лекарственных веществ.
При оценке качества лекарственных форм выполняют испыта-
ния на подлинность и количественное определение каждого из
лекарственных веществ, входящих в состав лекарственной фор-
мы.
При выполнении испытания подлинности препаратов, содер-
жащихся в однокомпонентных лекарственных формах, обычно
используют те же химические реакции, что и для соответствую-
щих субстанций.
При анализе таблеток, гранул, драже, линиментов, мазей, пи-
люль, капсул, включающих даже одно лекарственное вещество,
как правило, его предварительно отделяют от основы или напол-
нителя.
Сложность выполнения дальнейшего анализа увеличивается с
ростом числа компонентов, входящих в состав лекарственной
формы.
Характерная особенность анализа многокомпонентных лекар-
ственных форм заключается в том, что способы определения ин-
дивидуальных веществ не дают положительных результатов при
использовании их для анализа смесей. Поэтому вначале необхо-
димо выбрать условия, позволяющие анализировать одно лекар-
ственное вещество в присутствии другого или предварительно
отделить их друг от друга и от вспомогательных веществ. При
этом следует иметь в виду, что каждый из компонентов смеси
характеризуется определенными физическими и химическими
свойствами. Они могут вызывать различные процессы взаимодей-
ствия (например, явления адсорбции, гидролиза и т.д.). Все это
усложняет процесс количественного определения компонентов.
146
Сложной операцией является разделение ингредиентов, со-
держащихся в лекарственной форме, и выделение индивидуаль-
ных лекарственных веществ. Для этого необходимы различные
(нередко трудоемкие) методы экстракции и разделения. Поэтому
там, где это возможно; стремятся использовать методики, позво-
ляющие анализировать компоненты смеси при совместном при-
сутствии.
5.1. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ОДНОКОМПОНЕНТНЫХ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Испытания на подлинность выполняют, как правило, с помо-
щью химических реакций, указанных в фармакопейных статьях
на индивидуальные вещества, входящие в состав данной лекар-
ственной формы. Иногда эти вещества перед испытаниями извле-
кают органическими растворителями.
Перед проведением качественных и количественных определе-
ний твердые формы (таблетки, драже) растирают, жидкие пере-
мешивают — это необходимо для получения гомогенной массы, в
которой определяемое вещество было бы равномерно распределе-
но во всем объеме пробы. Берут навеску вещества и растворяют ее
в указанном в частной статье растворителе. Отделение лекарствен-
ного вещества от сопутствующих производят фильтрованием, цен-
трифугированием, экстракцией или отгонкой. Создают условия,
необходимые для выполнения определения прибавлением реак-
тивов, если это необходимо, и выполняют анализ одним из хими-
ческих или физико-химических методов. Расчет проводят с уче-
том исходной навески в пересчете на массу единицы дозирован-
ной лекарственной формы (таблетки, драже, капсулы), если это
необходимо.
5.2. ОСОБЕННОСТИ АНАЛИЗА
МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
5.2.1. Качественный анализ
Трудности в идентификации многокомпонентных лекарствен-
ных форм состоят в том, что один ингредиент может мешать об-
наружению другого или реактив одновременно реагирует с двумя
или несколькими компонентами смеси. Это происходит в случае
отсутствия специфических реакций на каждый из компонентов.
Вместе с тем одни компоненты смеси могут способствовать от-
крытию других. Поэтому в отличие от анализа однокомпонент-
ных лекарственных форм возможны следующие варианты иден-
тификации лекарственных веществ при совместном присутствии.
10*
147
1. Для идентификации подобраны специфические реакции (на
ионы или функциональные группы), при выполнении которых
обнаружению одного компонента не мешает присутствие другого.
2. Использован реактив, который последовательно реагирует
вначале с одним компонентом, затем с другим. Например, ра-
створ формальдегида в концентрированной серной кислоте при
обнаружении кодеина в смеси с кислотой ацетилсалициловой вна-
чале образует сине-фиолетовое (кодеин), а затем красное окраши-
вание (кислота ацетилсалициловая).
3. Реактив взаимодействует с обоими компонентами, но про-
дукты взаимодействия легко можно разделить. Примером может
служить анализ смеси натрия бензоата и натрия салицилата при
воздействии раствором сульфата меди в присутствии хлорофор-
ма. Хлороформный слой приобретает голубое окрашивание (бен-
зоат-ион), водный — зеленое (салицилат-ион).
4. Один из компонентов смеси в присутствии реактива дает
цветную реакцию на другой компонент. Так можно обнаружить
первичные ароматические амины реакцией азосочетания, если в
смеси присутствует резорцин (отпадает необходимость в добавле-
нии Р-нафтола).
5. При добавлении реактивов для обнаружения одного компо-
нента последовательно открывают остальные. Примером может
служить обнаружение анестезина в смеси с натрия гидрокарбона-
том н анальгином реакцией образования азокрасителя. После при-
бавления соляной кислоты выделяются пузырьки газа (гидрокар-
бонат-иои), при последующем добавлении раствора нитрата на-
трия появляется быстро исчезающее сине-фиолетовое окрашива-
ние (анальгин) и, наконец, от добавления щелочного раствора
Р-нафтола смесь приобретает красный цвет (анестезин).
6. Обнаружить один компонент в присутствии других не пред-
ставляется возможным без предварительного их разделения. Для
этой цели используют воду, растворы кислот или щелочей,' орга-
нические растворители (этанол, эфир, хлороформ). Затем в экст-
рактах идентифицируют каждый из компонентов.
7. Использование различных видов хроматографии (ВЭЖХ,
ГЖХ, ТСХ) для разделения и идентификации компонентов ле-
карственной формы. Например, в ТСХ-анализе применяют пла-
стинки “Силуфол УФ-254”. На них наносят раствор или хлоро-
формную вытяжку из лекарственной формы и раствор стандарт-
ного образца вещества-свидетеля. После хроматографирования в
предварительно подобранных условиях пятна на хроматограмме
проявляют с помощью цветных реакций или УФ-света. Такие
методики применимы в анализе мазей и аэрозолей, содержащих
148
несколько лекарственных веществ, а также суммарных препа-
ратов.
8. При анализе жидких лекарственных форм присутствие в
них галеновых препаратов (настоек, экстрактов), а также настоев
и отваров нередко мешает определению других ингредиентов.
Поэтому идентификации обычно должна предшествовать экстрак-
ция или разделение компонентов с помощью бумажной, тонко-
слойной или других видов хроматографии.
В некоторых случаях, например в присутствии настоя и на-
стойки валерианы или настоя пустырника, содержащиеся в них
малые количества алкалоидов, тритерпеиовых и прочих соедине-
ний не мешают идентификации других компонентов.
5.2.2. Количественный анализ
Применение титриметрических методов основано на особенно-
стях физических и химических свойств ингредиентов, входящих
в состав лекарственной формы, причем чем больше сходства в
этих свойствах, тем труднее осуществить определение какого-либо
из компонентов. При анализе лекарственных форм, содержащих
три ингредиента и более, редко удается найти единый метод, по-
зволяющий определить все компоненты. Поэтому используют со-
четание нескольких методов, основываясь на особенностях таких
физических и химических свойств ингредиентов, как раствори-
мость, кислотно-основные, окислительно-восстановительные свой-
ства, возможность взаимодействия с различными титрантами и
реактивами.
Количественный химический анализ лекарственных веществ
в многокомпонентных смесях может быть выполнен без разделе-
ния компонентов смеси или после предварительного разделения
смеси на отдельные компоненты.
Количественный анализ без разделения компонентов смеси
Титриметрический анализ лекарственной смеси, включающей
два ингредиента и более, можно выполнить без разделения ком-
понентов. Для этого подбирают условия, при которых определе-
ние одного компонента не мешает определению других. При этом
используют титриметрические методы, основанные на различии
свойств веществ, содержащихся в смеси (кислотно-основных
свойств, констант комплексообразования, произведений раство-
римости и др.).
Чаще всего применяют методы, основанные на одновременном
титровании суммы двух компонентов. Затем количественно опре-
деляют содержание одного из этих компонентов, используя мето-
ды, основанные на свойствах, присущих только данному веще-
149
ству. Расчет производят по разности между количеством милли-
литров титрантов (одинаковой молярности), затраченных на пер-
вое и второе титрование.
Один из компонентов может быть определен окислительно-вос-
становительным методом при отсутствии в смеси других окисля-
ющих компонентов.
Также возможно и применение комплексонометрического оп-
ределения одного из компонентов или сразу двух без разделения,
используя разные индикаторы и варьируя pH среды.
Кислотно-основное титрование смесей кислот, оснований или
их солей основано иа различии констант диссоциации компо-
нентов и становится возможным, если компоненты различают-
ся не менее чем в 1000 раз. При правильном подборе индикато-
ров в этих случаях удается избежать таких трудоемких опера-
ций, как разделение компонентов, фильтрование, выпаривание
и др.
При анализе смеси веществ, одно из которых мало растворимо
в воде, используют несмешивающиеся или смешанные раствори-
тели. Подобрав соответствующие индикаторы, можно последова-
тельно оттитровать такие вещества без разделения.
Последовательное титрование одной навески лекарственной
формы вначале в водной, а затем в неводной среде может быть
применено, когда в состав бинарной лекарственной формы вхо-
дят вещества со слабыми и сильными основными свойствами.
Многие двухкомпонентные лекарственные формы могут быть
проанализированы методом неводного титрования, титрованием
в разных растворителях, в каждом из которых титруется только
один ингредиент, или в одном растворителе при достаточно боль-
шой разнице констант ионизации определяемых веществ.
Количественный анализ после предварительного разделения
КОМПОНЕНТОВ СМЕСИ
Разделение смеси при помощи экстракции основано на разли-
чии растворимости компонентов в воде и в органических раство-
рителях или на различии кислотно-основных свойств.
Используя различие в растворимости лекарственных веществ,
можно осуществить разделение компонентов лекарственных сме-
сей следующими методами. г
1. При наличии в смеси веществ, хорошо растворимых в воде
и практически в ней не растворимых, разделение осуществляют
обработкой смеси водой с последующим фильтрованием. На филь-
тре остаются не растворимые в воде вещества. Так можно отде-
лять от других ингредиентов растворимые в воде неорганические
150
соли, соли органических кислот, соли азотсодержащих органи-
ческих оснований.
2. Лекарственные вещества, растворимые в органических ра-
створителях, не смешивающихся с водой (хлороформ, эфир), мож-
но отделять от веществ, не растворимых в этих растворителях.
Разделение выполняют путем экстракции хлороформом или эфи-
ром. Так можно отделять ароматические кислоты и органические
Основания от солей неорганических и органических кислот, а так-
же от солей органических оснований.
3. Вещества, растворимые в органических растворителях, мож-
но отделять от некоторых алифатических кислот и производных
фенолов. Последние необходимо предварительно действием щело-
чей превратить в водорастворимые феноксиды (феноляты). Затем
растворителем, не смешивающимся с водой (хлороформом или эфи-
ром), извлекают вещества, растворимые в этих растворителях.
4. Для отделения веществ, растворимых в хлороформе или
эфире, от органических оснований последние предварительно ней-
трализуют кислотами. Полученные соли оснований остаются в
водном растворе. Этот метод используют для отделения органи-
ческих кислот от органических соединений.
5. Соли органических оснований можно предварительно пре-
вратить в основания путем нейтрализации связанных кислот
щелочами. Образующиеся органические основания затем экстра-
гируют хлороформом или эфиром.
Если, пользуясь описанными методами, удается количествен-
но разделить компоненты смеси, то каждый из них затем опреде-
ляют тем или иным титриметрическим методом. При разделении
смесей, содержащих три компонента и более, нередко получают-
ся двухкомпонентные экстракты веществ с одинаковой раствори-
мостью. Их анализируют методами осаждения или кислотно-ос-
новного титрования, последовательно определяя каждый из ком-
понентов.
Следует учитывать, что лекарственные вещества, мало раство-
римые в воде или в органическом растворителе, частично извле-
каются вместе с отделяемым компонентом. Это нередко не дает
возможности выполнить количественное разделение смеси. Не-
обходимо также обращать внимание на отсутствие примеси воды
в органическом растворителе. Разделение сухих лекарственных
форм таким растворителем приводит к частичной экстракции ве-
ществ, растворимых в воде.
После извлечения лекарственного вещества органическим ра-
створителем последний обычно вначале удаляют, а затем прово-
дят титрование [26].
151
5.2.3. Расчет содержания компонентов
в лекарственных формах
Определение количественного содержания ингредиентов в мно-
гокомпонентных лекарственных формах осуществляют различны-
ми вариантами титриметрического анализа. Используют прямое,
обратное, заместительное, реверсивное титрование, определение
по разности. Нередко npjf этом проводят контрольные опыты,
чтобы учесть влияние индикатора или титрованного раствора на
результаты анализа.
Прямое титрование применяют для определения содержания
одного компонента порошка, мази, суппозитория, жидкой лекар-
ственной формы, когда другие компоненты не мешают определе-
нию. Расчеты при этом выполняют по формулам (5.1) или (5.2),
которые используют при количественном анализе однокомпонент-
ных лекарственных форм:
X = VKT100/a; (5.1)
X = VKTb/a, (5.2)
где X — содержание лекарственного вещества, % (5.1), или г (5.2);
V — объем титранта, израсходованный на титрование, мл; К —
коэффициент поправки титрованного раствора; Т — содержание
лекарственного вещества, г, соответствующее 1 мл титрованного
раствора; b — общая масса, г, или объем, мл, лекарственной фор-
мы; а — навеска, г, или объем, мл, лекарственной формы.
Если необходимо провести контрольный опыт, то расчет ведут
по формуле (5.3):
X = [(Vk - Vo)KT lOO]/a, (5.3)
где Vk и Vo — объемы титрантов, затраченные соответственно в
контрольном опыте и при титровании анализируемого лекарствен-
ного вещества, мл.
Контрольные опыты при алкалиметрическом титровании ста-
вят для установления количества титранта, необходимого для
нейтрализации используемых реактивов и растворителей или
мазевой основы. При нитритометрическом титровании с помощью
контрольного опыта устанавливают расход титранта на нитрози-
рование внутреннего индикатора. Чаще всего контрольные опы-
ты применяют при окислительно-восстановительном титровании.
При обратном титровании (по избытку титранта) расчеты вы-
полняют по формуле (5.4):
X = [(V,K1-V2K2)T 100]/а, (5.4)
где Vj и V2 — объемы титрантов, мл; Kj и К2 — их коэффициенты
поправок.
152
В случае постановки контрольного опыта расчет содержания
лекарственного вещества проводят по формуле (5.3), а в случае
титрования аликвотной части титруемой жидкости (после отделе-
ния осадка, образовавшегося от добавления титранта) — по фор-
муле (5.5):
X = [(Vk-V0)T100Wo6ui]/aW1, (5.5)
где — объем мерной колбы, мл; W1 — объем фильтрата,
взятый на титрование, мл.
Заместительное титрование — это титрование вещества, об-
разовавшегося в результате реакции в количестве, эквивалент-
ном определяемому веществу. Расчет содержания последнего вы-
полняют, как и при прямом титровании, но величину Т берут не
по титруемому заместителю, а по определяемому, компоненту сме-
си.
Реверсивное титрование предусматривает использование в ка-
честве титранта раствора анализируемого вещества, которым тит-
руют стандартный раствор. Расчет выполняют, как и при прямом
титровании, но в знаменатель ставят число миллилитров жидкой
лекарственной формы, пошедшей на титрование, а в числитель —
объем взятого титрованного раствора.
Когда определение содержания одного компонента в присут-
ствии других доступными методами невозможно, используют раз-
личные приемы анализа и варианты расчетов. Наиболее широко
применяют в анализе многокомпонентных лекарственных форм
варианты определений по разности.
Если один ингредиент титруют в сумме с другим, содержание
которого определено иным методом, количество анализируемого
компонента рассчитывают по формуле
X = [(V- V|)Tb]/a,
где V — объем титрованного раствора, мл, израсходованного на
титрование суммы ингредиентов; Vj — объем титранта, мл, из-
расходованного на титрование другого ингредиента иным мето-
дом в такой же навеске; b — общий объем (общая масса) лекар-
ственной формы, мл (г).
Если на определение одного компонента и на суммарное опре-
деление смеси взяты различные объемы (массы), то при расчете
второго ингредиента их необходимо привести к одному объему
(одной массе):
X = [(V-Vlal/a)Tb]/a„
где V — объем титрованного раствора, мл, израсходованного на
титрование обоих компонентов в объеме а^ Vj — объем титрован-
153
ного раствора, мл, израсходованного на титрование одного ком-
понента в объеме а.
Для суммарного и раздельного определения компонентов ле-
карственной формы можно использовать методики, при которых
эквиваленты препаратов различны. Так, если при определении
суммы ингредиентов эквивалент равен молекулярной массе, а в
другой методике при определении одного из компонентов эквива-
лент (Э) соответствует 1/4 молекулярной массы, то расчет выпол-
няют по формуле
X =[(V-V, /4)Т100]/а,
где V — объем титранта, мл, израсходованного на титрование сум-
мы ингредиентов в массе a; Vj — объем второго титранта, мл,
израсходованного на титрование одного компонента в массе а при
Э = М/4.
Если суммарное и раздельное титрование ингредиентов прово-
дят в разных объемах (массах) и при различии эквивалентов, то
при расчете необходимо приведение к одному эквиваленту и к
одной массе. Так, если при выполнении титрования суммы ком-
понентов было взято 5 мл жидкой лекарственной формы, а на
титрование одного компонента (Э = М/4) — 1 мл, то расчет вы-
полняют по формуле
X = [(V-V, 5/4-1)Т100]/5,
где V — объем титранта, мл, израсходованного на титрование сум-
мы ингредиентов в 5 мл лекарственной формы (Э = М); Vj —
объем второго титранта, мл, израсходованного на титрование од-
ного компонента (Э = М/4).
Если два компонента, входящие в состав лекарственной фор-
мы, можно оттитровать одним и тем же титрантом, а раздельное
определение их невозможно или затруднительно, то расчет коли-
чественного содержания можно провести по среднему ориенти-
ровочному титру Тср. Это масса смеси определяемых веществ (г),
соответствующая 1 мл титранта. Его величина рассчитывается по
значениям титров анализируемых компонентов и их соотноше-
ний в лекарственной форме. Упрощенный вариант расчета сред-
него ориентировочного титра выполняют по формуле
ТсР =(aiTi +а2Т2)/(а! +а2),
где Tj — титр первого компонента; aj — прописанная масса пер-
вого компонента, г; Т2 — титр второго компонента; — пропи-
санная масса второго компонента, г.
Однако если молекулярные массы компонентов, определяемых
суммарно, различны и ингредиенты в лекарственной форме про-
154
писаны в разных количествах, то средний ориентировочный титр
следует рассчитывать по формуле
Т = (а, + а2)/(а, /Т, +а2 /Т2).
Используют также расчеты по условным титрам (Т ). Они
применимы при определении в многокомпонентных лекарствен-
ных формах эквимолекулярных комплексных соединений, со-
стоящих из двух веществ (кофеин-бензоат натрия, эуфиллин и
др.). Определить их можно по условному Титру, рассчитанному
на одно из веществ, входящих в состав препарата. Так, например,
кофеин-бензоат натрия анализируют в лекарственных формах по
бензоату натрия. Условный титр кофеина-бензоата натрия опре-
деляют по формуле
Тус, =0,01441 100/а,
где 0,01441 — содержание натрия бензоата, соответствующее 1 мл
0,1 М раствора соляной кислоты; а — содержание натрия бензо-
ата в данной партии натрия кофеина-бензоата, %.
Содержание натрия бензоата в кофеине-бензоате натрия в со-
ответствии с требованиями ФС колеблется от 58 до 62 %. Поэто-
му условный титр находится в пределах 0,02484—0,02324. Вот
почему для определения условного титра и получения более точ-
ных результатов нужно знать содержание натрия бензоата в пре-
парате. Если таких данных нет, то расчеты ведут по средней ве-
личине содержания данного компонента в кофеине-бензоате на-
трия (т.е. 60 %) [26, 29].
Работа 1. Изучение особенностей анализа многокомпо-
нентных лекарственных форм
Задание 1. Провести анализ глазных капель.
Лекарственная форма
Кислоты аскорбиновой — 0,5 г
Калия йодид — 0,3 г
Раствора кислоты борной 2 %-ной — 10,0 мл
Установление подлинности лекарственных препаратов,
СОДЕРЖАЩИХСЯ В ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ
А. Кислота аскорбиновая и йодид-ион. Для последовательного
обнаружения йодид-иона и кислоты аскорбиновой используют в
качестве реактива нитрат серебра. К 2—3 каплям раствора лекар-
ственной формы добавляют 1 каплю раствора реактива. Образует-
ся желтый творожистый осадок йодида серебра (йодид-ион). При
дальнейшем прибавлении раствора нитрата серебра выделяется
серый осадок восстановленного серебра (кислота аскорбиновая).
155
Б. Ион калия. Обнаруживают, используя в качестве реактива
кобальтинитрит натрия. К 1—2 каплям лекарственной формы на
предметном стекле прибавляют 2—3 капли раствора реактива. Об-
разуется желтый кристаллический осадок.
В. Кислота борная. Выпаривают 5 капель лекарственной фор-
мы в фарфоровой чашке досуха, приливают 15—20 капель этано-
ла и поджигают. Пламя окрашивается в зеленый цвет (кислота
борная).
Количественное определение препаратов
А. Кислота аскорбиновая. К 1 мл лекарственной формы добав-
ляют 5 мл воды и титруют без индикатора 0,1 н. раствором йод-
монохлорида до желтого окрашивания (V).
1 мл 0,1 н. раствора йодмонохлорида соответствует 0,0088 г
кислоты аскорбиновой.
Б. Калия йодид. К оттитрованному раствору (см. А) прибавля-
ют 10 мл 0,1 н. раствора йодмонохлорида. Затем к реакционной
смеси добавляют 100 мл воды и 10 мл 2% -ного раствора салици-
лата натрия. Оставляют на 10 мин и титруют 0,1 н. раствором
тиосульфата натрия до обесцвечивания (индикатор — крахмал)
(Vx). Содержание калия йодида в лекарственной форме рассчиты-
вают по формуле
v_ (vi"v> 0 0088 10
л —----------------,
1
где V., — объем 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, израсходо-
ванного на титрование йода; V — объем йодмонохлорида, пошед-
ший на первоначальное титрование кислоты аскорбиновой.
В. Сумма кислоты борной и кислоты аскорбиновой. К 0,5 мл
лекарственной формы добавляют 10 мл нейтрализованного (по
фенолфталеину) глицерина и титруют 0,1 н. раствором гидрокси-
да натрия до розового окрашивания (индикатор — фенолфталеин)
(V2).
Содержание кислоты борной рассчитывается по формуле
Y_ (V2 - V/4) 0,006183 10
л —--------------------,
где V2 — объем 0,1 н. раствора гидроксида натрия, пошедший на
титрование суммы кислоты аскорбиновой и кислоты борной; V/4 —
объем 0,1 н. раствора йодмонохлорида, израсходованный на тит-
рование кислоты аскорбиновой (см. А), поделенный на 4, так как
на взаимодействие йодмонохлорида с кислотой аскорбиновой за-
трачивается 2 эквивалента, а щелочи — 1. Кроме того, кислоты
156
аскорбиновой в А взято на титрование 1,0 мл, а кислоты бор-
ной — 0,5 мл.
Задание 2. Провести анализ порошков.
Лекарственная форма
Кислоты ацетилсалициловой — 0,3 г
Кислоты аскорбиновой — 0,1 г
Кальция лактата — 0,2 г
Димедрола — 0,02 г
Рутина — 0,02 г
Определение подлинности лекарственных препаратов, содержащихся
В ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ
Аскорбиновая кислота. 0,01—0,02 г анализируемого порошка
помещают на часовое стекло и прибавляют 1—2 капли раствора
нитрата серебра. При стоянии появляется черное окрашивание.
Димедрол и ацетилсалициловая кислота. 0,01 г порошка по-
мещают на часовое стекло и прибавляют 1 каплю концентриро-
ванной серной кислоты. Появляется ярко-желтое окрашивание,
характерное для димедрола. Прибавляют 1 каплю воды. При этом
окраска исчезает — ощущается запах уксусной кислоты. При
добавлении раствора формальдегида и нагревании появляется ро-
зовое окрашивание.
Рутин. 0,05 г порошка помещают в пробирку и прибавляют
0,5 мл раствора гидроксида натрия. Появляется ярко-желтое ок-
рашивание.
Кальция лактат. 0,02 г порошка помещают в пробирку, при-
бавляют 2 мл воды и нагревают на водяной бане до растворения.
Раствор охлаждают, фильтруют и к фильтрату прибавляют 5—
6 капель раствора оксалата аммония. Наблюдают выпадение бе-
лого осадка, растворимого в минеральных кислотах и не раство-
римого в уксусной кислоте и растворе аммиака.
Количественное определение
Определение аскорбиновой кислоты. Навеску порошка 0,1 г,
взятую на ручных весочках, растворяют в 10 мл воды и титруют
0,1 н. раствором йода до синего окрашивания, не исчезающего в
течение 30 с (V2).
1 мл 0,1 н. раствора йода соответствует 0,0088 г кислоты ас-
корбиновой:
X = V^Tb/a.
Определение аскорбиновой кислоты, ацетилсалициловой кис-
лоты и димедрола в сумме. Навеску порошка 0,1 г растворяют в
10 мл спирта, прибавляют 5 мл воды и титруют 0,1 н. раствором
едкого натра до розового окрашивания, устойчивого в течение 30 с.
157
Содержание димедрола мало, поэтому считают, что затраченный
объем щелочи пошел на титрование аскорбиновой и ацетилсали-
циловой кислот (V2).
Определение димедрола и кислоты ацетилсалициловой. К на-
веске, равной массе одного порошка (0,64 г), прибавляют 5 мл
воды, 1 мл 30 % -ной уксусной кислоты, 2—3 капли раствора бром-
фенолового синего и при тщательном перемешивании титруют
0,1 н. раствором нитрата серебра до грязно-фиолетового окраши-
вания. Избыток уксусной кислоты дается для предотвращения
окислительно-восстановительной реакции между аскорбиновой
кислотой и нитратом серебра (V3).
Содержание димедрола вычисляют по формуле
X = V-K-0,02918 m/m..
Содержание кислоты ацетилсалициловой находят по выраже-
нию
X = [(V, - V, /2 - V3m /m,) 0,0182 0.64]/m,
где m — масса порошка, взятая на титрование суммы компонен-
тов (0,1 г); mj — масса порошка, взятая на титрование димедрола
(0,64 г).
Определение кальция лактата. 0,2 г порошка помещают в
пробирку, прибавляют 2 мл воды, раствор аммиака до нейтраль-
ной реакции (1 мл), 3 мл аммиачного буферного раствора, инди-
каторной смеси кислотного хром темно-синего и титруют 0,05 М
раствором трилона Б до зеленого окрашивания.
1 мл 0,05 М раствора трилона Б соответствует 0,01542 г каль-
ция лактата:
Х = VK -0,01542 0,64/0,2.
Определение рутина. Растворяют 0,05 г лекарственной формы
в 15 мл этанола в мерной колбе вместимостью 25 мл при нагрева-
нии на водяной бане. После охлаждения доводят раствор до мет-
ки этанолом.
К 1,6 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл 0,1 н.
раствора гидроксида натрия и доводят до 10 мл этанолом. Изме-
ряют оптическую плотность полученного раствора на фотоэлект-
роколориметре в цювете с рабочей длиной 10 мм при 400 нм (Aj).
Параллельно проводят реакцию с 0,5 мл 0,02 % -ного стандартно-
го раствора рутина и измеряют оптическую плотность (Аст). Со-
держание рутина вычисляют по формуле
X = А, • 0,0001 • 25 0,64/Ас, 1,6m,
где m — масса порошка, взятая на анализ, г.
158
Количественное определение каждого компонента проводят не
менее двух раз и рассчитывают содержание каждого компонента
в граммах в одном порошке. Сравнивают отклонение в массе каж-
дого компонента с допустимыми нормами [1, 26].
Контрольные вопросы по теоретической части
лабораторного занятия
1. Перечислите особенности экспресс-анализа порошков по сравне-
нию с фармакопейными методами.
2. Приведите состав порошков “антигриппин” для взрослых.
3. Напишите формулы, латинское и химическое названия кислоты
ацетилсалициловой, кислоты аскорбиновой, кальция лактата, димедро-
ла, рутина.
4. Приведите реакции подлинности ацетилсалициловой кислоты, ас-
корбиновой кислоты, кальция лактата, димедрола, рутина. Напишите
уравнения реакций.
5. Какими испытаниями можно доказать наличие в смеси кислоты
ацетилсалициловой, димедрола? Подтвердите уравнениями реакций.
6. Как доказать присутствие рутина в порошках “антигриппин”?
7. Приведите фармакопейные методы количественного определения
кислоты ацетилсалициловой, кислоты аскорбиновой, кальция лактата,
димедрола, рутина. Приведите уравнения реакций, грамм-эквиваленты
определяемых веществ.
8. В чем заключается принцип количественного определения аскор-
биновой кислоты в антигриппине? Приведите уравнения реакций, грамм-
эквивалент и расчетную формулу.
9. В чем заключается принцип количественного определения димед-
рола в антигриппине? Приведите уравнения реакций, грамм-эквивалент
и расчетную формулу.
10. В чем заключается принцип количественного определения кис-
лоты ацетилсалициловой в антигриппине? Приведите уравнения реак-
ций, грамм-эквивалент и расчетную формулу.
11. В чем заключается принцип количественного определения каль-
ция лактата в антигриппине? Приведите уравнения реакций, грамм-эк-
вивалент, расчетную формулу.
Задание 3. Провести анализ инъекционных растворов.
Лекарственная форма
Раствор новокаина изотонический 0,25 %-ный или 0,5 %-ный
(Новокаина — 0,25 г или 0,5 г
Раствора кислоты соляной 0,1 н. — 0,3 или 0,4 мл
Натрия хлорида — 0,85 или 0,817 г
Воды для инъекций — до 100 мл)
Описание
Бесцветная, прозрачная жидкость солоноватого вкуса, вызы-
вающая чувство онемения на языке, pH 3,8—4,5. Определение
pH проводят потенциометрически.
159
Определение подлинности
Новокаин:
а) на фильтровальную бумагу помещают по 1 капле анализи-
руемого раствора, разведенной соляной кислоты и раствора нит-
рита натрия. Рядом помещают 1—2 капли щелочного раствора
Р-нафтола, на границе слияния появляется оранжево-красное ок-
рашивание;
б) к 0,5 мл раствора прибавляют 1—2 капли разведенной сер-
ной кислоты и 0,3—0,5 мл 0,1 н. раствора перманганата калия,
фиолетовая окраска раствора тотчас исчезает.
Натрий — раствор окрашивает бесцветное пламя в желтый цвет.
Хлорид не определяют.
Количественное определение
Определение новокаина. К 2 мл 0,25 % -ного или 1 мл 0,5 % -но-
го раствора прибавляют 2—3 мл воды, 1 мл разведенной соляной
кислоты, 0,2 г бромида калия, 2 капли тропеолина 00 и 1 каплю
метиленового синего и титруют при 18—19 °C 0,02 М раствором
нитрита натрия, добавляя его в начале титрования со скоростью
0,2—0,3 мл через 1 мин, а в конце титрования (за 0,1—0,2 мл до
эквивалентной точки) по 1—2 капли через 1—2 минуты до пере-
хода красно-фиолетовой окраски в голубую (Vj). Параллельно про-
водят контрольный опыт (Vf).
1 мл 0,02 М раствора нитрита натрия соответствует 0,005456 г
новокаина.
X = VK-0,005456-100.
Определение соляной кислоты. Титруют 10 мл раствора 0,02 н.
раствором едкого натра до желтого окрашивания (индикатор 1 кап-
ля метилового красного) (V2). Расчет содержания 0,1 н. соляной
кислоты в лекарственной форме проводят, исходя из закона эк-
вивалентных объемов по формуле
V V2N2 УобЩ У2-0,02 100 _
ИСКмя) Nhc] v 0д0 10 2»
где V2 — объем раствора щелочи в мл, израсходованной на титро-
вание; N2 — нормальность раствора едкого натра; NHC1 — нор-
мальность соляной кислоты; — общий объем лекарственной
формы, мл; V — аликвота, взятая на анализ, мл.
Определение натрия хлорида. К 1 мл лекарственной формы
прибавляют 2 капли раствора бромфенолового синего, затем по
каплям разведенную уксусную кислоту до зеленовато-желтого
окрашивания и титруют 0,1 н. раствором нитрата серебра до фи-
олетового окрашивания осадка и раствора (V3). Содержание на-
160
трия хлорида в растворе новокаина 0,25 %-ного (Хх) и растворе
новокаина 0,5 %-ного (Х2) вычисляют по формулам
X, = [(V3 - V2 /10 • 5 - V, /10)Т • 100] /1;
Х2 =[(V3 - V2 /10-5-V,/5)Т-100]/1.
Так как объем V2 по абсолютной величине мал, то его можно
не учитывать. Т = 0,005844 г.
Контрольные вопросы по теоретической части
лабораторного занятия
1. Перечислите требования к инъекционным растворам.
2. Почему ГФ X предусматривает строгие пределы значений pH для
дистиллированной воды и растворов для инъекций?
3. Какими методами определяют pH по ГФ X?
4. По каким буферным растворам производят настройку и проверку
потенциометров для потенциометрического определения pH?
5. Что используют в качестве титранта при меркуриметрическом оп-
ределении галогенидов?
6. В какой среде проводят меркуриметрическое титрование? Поче-
му?
7. Какие индикаторы применяют при меркуриметрическом титрова-
нии, какой внешний эффект?
8. Напишите формулу дифенилкарбазона.
9. Напишите уравнения реакций при меркуриметрическом определе-
нии натрия хлорида и рассчитайте грамм-эквивалент.
10. Как действуют на организм соли ртути? Как обезвредить соли
двухвалентной ртути?
11. Напишите формулу, латинское и химическое названия новокаина.
12. Приведите реакции подлинности новокаина по аминогруппе.
13. Перечислите методы определения подлинности новокаина по ГФ X.
14. Приведите уравнения реакций определения количественного со-
держания новокаина различными методами, обусловленные наличием
функциональных групп.
15. Напишите уравнения реакций нитритометрического определения
новокаина.
16. Напишите уравнение реакции взаимодействия тропеолина 00 с
азотистой кислотой.
17. С какой целью при нитритометрическом титровании проводят
контрольный опыт?
Задание 4. Провести анализ лекарственной формы промыш-
ленного производства.
Таблетки “Асфен”
Состав на одну таблетку:
Ацетилсалициловой кислоты — 0,25 г
Фенацетина — 0,15 г
11. Заказ 3547
161
Вспомогательные вещества: крахмал, кислота лимонная, тальк,
кальция стеарат массой 0,48 г.
Свойства кислоты ацетилсалициловой и фенацетина и приме-
няемые методики анализа позволяют проводить реакции подлин-
ности и количественное определение без разделения.
Подлинность. 0,6 г порошка растертых таблеток кипятят в
течение 3 мин с 5 мл раствора гидроксида натрия, охлаждают,
фильтруют, фильтрат подкисляют разведенной серной кислотой;
выделяется белый кристаллический осадок (кислота ацетилсали-
циловая).
0,2 г препарата помещают в фарфоровую чашку, прибавляют
0,5 мл концентрированной серной кислоты, перемешивают и при-
бавляют 1—2 капли воды; ощущается запах уксусной кислоты.
Затем прибавляют 1—2 капли формалина; появляется розовое ок-
рашивание (кислота ацетилсалициловая).
0,1 г препарата встряхивают с 5 мл разведенной азотной кис-
лоты. Раствор постепенно окрашивается в желтый цвет. При даль-
нейшем встряхивании выпадает объемистый желтый осадок 3-нит-
ро-4-ацетаминофенетола (фенацетин).
Количественное определение. Около 0,5 г порошка растертых
таблеток (точная навеска) взбалтывают с 10 мл нейтрализованно-
го по фенолфталеину 95 % -ного спирта. Жидкость охлаждают до
8—10 °C и титруют 0,1 н. раствором гидроксида натрия до розово-
го окрашивания.
1 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия соответствует 0,018002 г
С9Н8О4 (кислоты ацетилсалициловой), которой должно быть
0,237—0,262 г, считая на среднюю массу одной таблетки.
Около 0,5 г (точная навеска) порошка растертых таблеток по-
мещают в колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл разве-
денной хлористоводородной кислоты и кипятят с обратным холо-
дильником в течение 30 мин. Раствор охлаждают до 15—20 °C и
фильтруют через бумажный фильтр. Фильтр и осадок промывают
5—6 раз 40 мл воды.
К фильтрату прибавляют 1 г бромида калия, 2 капли раствора
тропеолина 00, 2 капли раствора метиленового синего и при тем-
пературе не выше 18—20 °C титруют 0,1 М раствором нитрита
натрия, прибавляя его вначале со скоростью 1 мл в минуту, а в
конце титрования (за 1 мл до эквивалентного количества) — по
0,1 мл в минуту до исчезновения фиолетовой окраски и появле-
ния голубовато-зеленой, устойчивой в течение 2 мин.
1 мл 0,1 М раствора нитрита натрия соответствует 0,01792 г
C10HgNO2 (фенацетина), которого должно быть 0,143—0,158 г, счи-
тая на среднюю массу одной таблетки [1, 9, 26].
162
6. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Физико-химические методы анализа лекарственных форм име-
ют ряд преимуществ перед титриметрическими. Наряду с высо-
кой специфичностью, чувствительностью, экспрессностью очень
Важна возможность выполнения этими методами анализа двух- и
даже трехкомпонентных смесей веществ без предварительного
разделения с достаточной для фармацевтического анализа точно-
стью.
Применяемые физико-химические методы можно разделить на
8 основные группы: электрохимические (полярография, потенцио-
метрия), хроматографические и спектральные (прежде всего УФ-
И ИК-спектрофотометрия и фотоколориметрия).
6.1. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Фотометрические методы, основанные на избирательном по-
глощении электромагнитного излучения анализируемым веще-
ством, позволяют проводить определения без предварительного
разделения компонентов и служат для исследования строения,
идентификации и количественного анализа индивидуальных ве-
ществ и их смесей.
В зависимости от используемой аппаратуры в фотометричес-
ком анализе различают спектрофотометрические методы, осно-
ванные на поглощении веществом монохроматического излуче-
ния УФ- и ИК-диапазонов, колориметрические и фотоколоримет-
рические методы, основанные на поглощении веществом немо-
нохроматического излучения видимой части спектра. Определения,
связанные с измерением поглощения электромагнитного излуче-
ния, основаны на объединенном законе Бугера-Ламберта-Бера в
виде
А = %с/,
где А — оптическая плотность вещества; с — концентрация ра-
створа; I — толщина слоя вещества, см; X — показатель поглоще-
ния раствора, концентрация которого равна 1.
Величина х является специфической физической константой
для каждого вещества и может быть использована для целей иден-
тификации. Знание величины х позволяет определить содержа-
ние данного вещества в растворах неизвестной концентрации на
основе измерения оптической плотности А.
11*
163
6.1.1. Спектрофотометрия
Спектрофотометрия используется для идентификации соедине-
ний, исследования состава, строения и количественного анализа
индивидуальных веществ и многокомпонентных систем. Кривая
зависимости поглощения (функция поглощения) от длины волны
или волнового числа называется спектром поглощения вещества и
является специфической характеристикой данного вещества.
Разработано большое число способов качественного и количе-
ственного анализа лекарственных форм методом УФ-спектрофо-
тометрии. Для идентификации используют аналоги спектров ле-
карственных веществ, в которых помимо спектральных кривых
приведены значения удельных показателей поглощения. При ис-
пытаниях на подлинность идентифицируют лекарственные веще-
ства по положению механизма светопоглощения и соответствую-
щего ему значению оптической плотности или удельного показа-
теля поглощения. Часто используют метод, основанный на вы-
числении отношения оптических плотностей при двух длинах
волн, что снижает ошибку определения. Количественный спект-
рофотометрический анализ чаще всего комбинируют с установле-
нием подлинности по УФ-спектру. Определение содержания ком-
понентов в лекарственной форме проводят сравнением оптичес-
ких плотностей испытуемого ц стандартного растворов.
В спектрофотометрических методах применяют спектрофото-
метры — приборы, позволяющие проводить анализ как окрашен-
ных, так и бесцветных соединений по избирательному поглоще-
нию монохроматического излучения в видимой, ультрафиолето-
вой и инфракрасной областях спектра. Природа полос поглоще-
ния в ультрафиолетовой и видимой областях спектра связана с
различными электронными переходами в поглощающих молеку-
лах и ионах (электронные спектры); в инфракрасной области она
связана с колебательными переходами и изменением колебатель-
ных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего веще-
ства (колебательные спектры).
Распространенная в настоящее время аппаратура позволяет
получить ультрафиолетовые спектры в области от 190 до 380 нм,
видимые — от 380 до 780 нм, инфракрасные спектры — от 780 до
40 000 нм (40 мкм).
Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях
Спектрофотометрические измерения в ультрафиолетовой и ви-
димой областях чаще всего проводят для растворов, хотя такие
измерения могут быть проведены и для веществ, находящихся в
парообразном, жидком и твердом состояниях.
164
Образец анализируемого вещества при спектрофотометрических
определениях обычно растворяют в соответствующем растворите-
ле. Для этих областей пригодны многие растворители, в том чис-
ле вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры, раз-
веденные растворы аммиака, едкого натра, хлористоводородной
ХЛИ серной кислоты. Следует использовать растворители, не со-
держащие примесей, поглощающих в данной спектральной обла-
сти; для спектрофотометрии выпускаются специальные раство-
рители, гарантирующие отсутствие примесей.
Спектрофотометрический анализ по непосредственному изме-
рению оптической плотности может быть проведен для веществ,
обладающих лишь определенными особенностями строения (аро-
матические соединения, соединения с сопряженными кратными
связями, соединения ряда металлов и др.).
Некоторые анализируемые' вещества необходимо предваритель-
но перевести в соединение, поглощающее излучение.
Для определения концентрации растворов спектрофотометричес-
ким путем используется закон Бугера—Ламберта—Бера в форме
С = ^А- (6.1)
В ряде случаев даже при использовании монохроматического
излучения могут наблюдаться отклонения от закона Бугера—Лам-
берта—Бера, обусловленные процессами диссоциации, ассоциа-
ции и комплексообразования. При наличии таких отклонений сле-
дует пользоваться не формулой (6.1), а экспериментально найден-
ной зависимостью оптической плотности от концентрации.
Измерения оптической плотности А в ультрафиолетовой и ви-
димой областях проводятся на фотоэлектрических спектрофото-
метрах. Основными частями этих приборов являются: источник
излучения (лампа накаливания для видимой области, газоразряд-
ная водородная или дейтериевая лампа в ультрафиолетовой обла-
сти), монохроматор, диспергирующая система которого основана
на использовании кварцевой призмы или дифракционной решет-
ки, кюветное отделение, в котором располагаются кюветы с ис-
следуемыми веществами, приемное и фотометрическое устройства
для сравнительной оценки интенсивности световых потоков Jo и
J, основанные на использовании фотоэлементов.
Измерительная шкала спектрофотометра проградуирована в
процентах пропускания Т (т.е. Jo/J-lOO) и в величинах оптичес-
кой плотности А (т.е. 1g Jo/J ), а шкала длин волн или волновых
чисел — в нанометрах (нм) или в см-1, соответственно.
В процессе измерения на пути выходящего из монохроматора
пучка излучения определенной длины волны поочередно устанав-
165
ливается нулевой раствор (растворитель или раствор, содержа-
щий те же вещества, что и исследуемый, за исключением анали-
зируемого компонента), для которого Т=100 %, А = 0, и исследу-
емый раствор.
Для снижения величины ошибки при определении А концент-
рация раствора и толщина слоя его подбираются таким образом,
чтобы А в исследуемой спектральной области находилось в преде-
лах 0,2—0,7. В зависимости от способности вещества к поглоще-
нию это обычно достигается при использовании концентраций от
0,01 до 0,00001 % (кюветы с толщиной слоя 10 мм).
Показатель поглощения % вычисляют на основании измерен-
ной оптической плотности А для растворов с известной концент-
рацией по формуле
Х = ~А. (6.2)
VI
Концентрация с может быть выражена в молях на 1 л или в
граммах на 100 мл раствора. В зависимости от этого по формуле
(6.2) вычисляют молярный показатель поглощения или удельный
показатель поглощения.
Молярный показатель поглощения е представляет собой опти-
ческую плотность одномолярного раствора вещества при толщине
слоя 10 мм; удельный показатель поглощения (Е^) — оптиче-
скую плотность раствора, содержащего 1 г вещества в 100 мл ра-
створа при той же толщине слоя. Переход от удельного показате-
ля поглощения к молярному осуществляется по формуле
8 = е£М/10, (6.3)
где М — молекулярная масса.
Если известно значение £ (в форме £ или Е1см), определяют
концентрацию исследуемых растворов по величине оптической
плотности D, пользуясь формулой (6.1) (при условии подчинения
закону Бера).
Для идентификации веществ в ультрафиолетовой области спект-
ра рекомендуется применять регистрирующие спектрофотометры.
При измерениях на различных спектрофотометрах значения
характерных волн могут отличаться на ± 2 нм. Если отличие пре-
вышает указанный предел, то необходимо провести калибровку
шкалы длин волн.
При количественных определениях целесообразно использовать
такие полосы поглощения, которые отвечают следующим условиям:
1) данная полоса должна быть по возможности свободна от
наложения полос поглощения других компонентов анализируе-
мой системы;
166
2) выбранная полоса должна обладать достаточно высоким по-
казателем поглощения (X) для индивидуального соединения.
Такие полосы называются аналитическими.
При анализе используют максимум или минимум полосы по-
глощения и не следует производить измерения на участках кру-
того спада или подъема кривой.
Спектрофотометрический метод очень широко применяется в
анализе многокомпонентных систем, так как позволяет провести
количественное определение компонентов без их предварительно-
го разделения. Определение основано на аддитивности значений
оптической плотности всех компонентов смеси при одной длине
волны. Спектрофотометрическое определение двух- (и более) ком-
понентных лекарственных смесей может быть осуществлено раз-
личными способами в зависимости от характера светопоглоще-
ния каждого компонента.
1. Лекарственная форма содержит два вещества, одно из кото-
рых имеет максимум светопоглощения, а другое не поглощает
УФ-свет в данной области. Спектрофотометрический анализ вы-
полняют как и при анализе однокомпонентной лекарственной
формы.
2. Каждый из двух компонентов смеси имеет свой максимум
светопоглощения, в котором второй компонент оптически про-
зрачен. Это наиболее оптимальный вариант, позволяющий без
разделения определить концентрацию обоих компонентов, содер-
жащихся в лекарственной форме. Каждый из компонентов ана-
лизируют в соответствующем максимуме светопоглощения.
3. Лекарственная форма включает два вещества, причем в мак-
симуме поглощения одного из них имеет некоторое светопогло-
щение и второе вещество, а в максимуме поглощения второго ве-
щества первое оптически прозрачно. Такие смеси анализируют
методом изолированной абсорбции. Лекарственное вещество, в
максимуме светопоглощения которого другой компонент не по-
глощает, определяют как в однокомпонентной лекарственной
форме.
Расчет содержания (г) второго компонента (Х2), в максимуме
светопоглощения которого поглощает и первое вещество, выпол-
няют по формуле
Х2 = [(A2-A1E3/E1)Wb]/E2a-100,
где Aj — оптическая плотность раствора в максимуме поглоще-
ния первого компонента; А^ — оптическая плотность раствора в
максимуме поглощения второго компонента (сумма светопогло-
щения растворов обоих компонентов); Ех — удельный показатель
167
поглощения первого компонента в его максимуме поглощения;
Е2 — удельный показатель поглощения второго компонента в его
максимуме поглощения; Е3 — удельный показатель поглощения
первого компонента в максимуме поглощения второго компонен-
та; а — навеска или объем лекарственной формы, взятой для ана-
лиза; W — разведение; b — общая масса или объем прописанной
лекарственной формы.
Метод изолированной абсорбции используют для анализа па-
паверина и рибофлавина в смеси с другими препаратами, а также
ацетилсалициловой кислоты в присутствии салициловой.
4. Если двухкомпонентная лекарственная смесь содержит ле-
карственные вещества, полосы поглощения которых налагаются
друг на друга, то для количественного определения может быть
использован расчетный, метод Фирордта. Метод приемлем, если
при двух длинах волн наблюдается значительное различие в ин-
тенсивности поглощения обоих компонентов при каждой выбран-
ной для анализа длине волны. Затем для определения каждого
компонента устанавливают оптическую плотность анализируемо-
го раствора смеси при обеих длинах волн. Точность зависит от
того, насколько велико различие между светопоглощением ком-
понентов смеси. Она будет наибольшей, когда одна длина волны
является максимумом для второго компонента, а при второй дли-
не волны будет наблюдаться обратное явление.
При выполнении анализа методом Фирордта концентрацию (q
и с2) в двухкомпонентной смеси рассчитывают по формуле
С| = (Х|А| А,; с, = сс^ А2 Рз^г
Предварительно вычисляют значения коэффициентов ар а2,
Рр Р2:
а, = E'/(EfE'-E'2Ef);
Pi = ^2 /(EiE2 — Е2Е,);
а2 =е;/(е;е'-е',е^);
р2=е;/(е;е;-е'2е;),
где Е[ и Е'2 — удельные показатели поглощения одного и второго
компонентов при длине волны Х1; Ef и Е* — удельные показате-
ли одного и второго компонентов при длине волны Х2; Aj и А2 —
оптимальные плотности смесей соответственно при длинах волн
Xj и Х2.
На основе использования метода Фирордта разработаны спосо-
бы анализа лекарственных форм, содержащих резорцин и кисло-
ту салициловую; резорцин и новокаин; кислоты салициловую и
бензойную; салициламид и кислоту n-аминобейзойную; салицил-
168
амид и кофеин; амидопиридин, натрия бензоат и натрия салици-
лат; амидопирин, кофеин и натрия салицилат; папаверин и теоб-
ромин; смесь папаверина с анестезином и новокаином; смеси суль-
фаниламидов; анестезина и кислоты n-аминобейзойной; ами-
допирина и бутадиена и т.д.
Недостаток метода Фирордта заключается в том, что при ана-
лизе трех- и более компонентных смесей даже небольшие ошибки
в измерениях удельных показателей поглощения и оптических
плотностей приводят к значительному снижению точности ана-
лиза.
Существуют и другие способы определения, подробно описан-
ные в специальной литературе.
Относительная ошибка спектрофотометрических методов ана-
лиза 2—3 %.
Работа 1. Определение лекарственного вещества в
однокомпонентной лекарственной форме методом УФ-
спектроскопии
Задание. Освоить методику спектрофотометрического опреде-
ления кортизона ацетата в таблетках.
Количественное определение. Около 0,1 г (точная навеска)
порошка растертых таблеток помещают в мерную колбу ем-
костью 100 мл с притертой пробкой, прибавляют 60—70 мл
95 % -ного спирта и слегка нагревают на водяной бане при по-
мешивании в течение 10—15 мин. По охлаждении доводят
объем раствора 95 %-ным спиртом до метки, хорошо переме-
шивают и дают отстояться в течение 1 ч. Не взмучивая осадка,
5 мл раствора переносят в другую мерную колбу емкостью 100
мл и доводят объем раствора тем же спиртом до метки. Изме-
ряют оптическую плотность полученного раствора на спектро-
фотометре при длине волны 238 нм в кювете с толщиной слоя
1 см.
Содержание кортизона ацетата в граммах (X) вычисляют по
формуле
АЬ-20
390а ’
где А — оптическая плотность испытуемого раствора; 390 — удель-
ный показатель поглощения кортизона ацетата Е^ при длине
волны 238 нм; а — навеска, г; b — средняя масса таблетки, г.
Содержание С23Н30О6 соответственно должно быть 0,022—
0,028 г или 0,045—0,055 г, считая на среднюю массу одной таб-
летки.
169
Работа 2. Изучение возможностей применения спектро-
фотометрического метода в фармакопейном анализе лекар-
ственных средств и их лекарственных форм
Витамин В12
C^H^CoN. л0. .Р
63 оо 14 14
Задание 1. Установить подлинность цианокобаламина спект-
рофотометрическим методом.
Готовят 0,002 %-ный раствор препарата в воде (0,002 г ра-
створяют в 100 мл воды). Снимают спектр поглощения полу-
ченного раствора относительно воды от 260 до 560 нм через
10 нм. Вблизи предполагаемых максимумов спектр снимают
через 2 нм.
Подлинность. Полученный спектр должен иметь максимумы
поглощения при длинах волн 278±1 нм; 361±1 нм; 548±2 нм.
Задание 2. Определить чистоту препарата спектрофотометри-
ческим методом (установить отсутствие поглощающих примесей).
Определяют оптическую плотность (А) раствора, приготовлен-
ного для количественного определения в кювете с толщиной слоя
1 см при длинах волн 278 нм; 361 нм; 548 нм.
Отношение А при 361 нм/А при 548 нм должно быть от 3,0 до
3,4.
Отношение А при 361 нм/А при 278 нм должно быть от 1,7 до
1,88.
Задание 3. Определить количественное содержание цианоко-
баламина в препарате.
Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в
мерной колбе емкостью 500 мл и доводят объем раствора во-
дой до метки. 25 мл этого раствора переносят в мерную колбу
емкостью 250 мл и доводят объем раствора водой до метки.
Определяют оптическую плотность полученного раствора на
спектрометре при длине волны 361 нм в кювете с толщиной
слоя 1 см.
Содержание цианокобаламина в % (X) вычисляют по формуле
X = (А500 10)/207а,
где А — оптическая плотность испытуемого раствора; 207 — удель-
ный показатель поглощения Е]с^ чистого цианокобаламина (без-
водного) при длине волны 361 нм; а — навеска препарата, г.
Содержание C63H88CoN14O14P в пересчете на сухое вещество
должно быть не менее 95,0 %.
170
Задание 4. Провести спектрофотометрический анализ лекар-
ственной формы — раствора цианокобаламина для инъекций.
Раствор витамина В12 для инъекций
Состав: Цианокобаламина — 30, 100, 200 или 500 мг
Раствора натрия хлорида изотонического 0,9 %-ного — до 1 л
Описание. Прозрачная жидкость от слабо-розового до ярко-крас-
ного цвета.
Подлинность и примеси определяют так, как описано в зада-
ниях 1 и 2.
Определение. Препарат разводят водой до содержания около
0,02 мг цианокобаламина в 1 мл, измеряют оптическую плотность
полученного раствора на спектрофотометре при длине волны
361 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве контрольного
раствора применяют воду.
Содержание цианокобаламина, мг (X), в 1 мл препарата вы-
числяют по формуле
X = (A10V,)/207V,
где А — оптическая плотность испытуемого раствора; 207 — удель-
ный показатель поглощения Е]”* чистого цианокобаламина (без-
водного) при длине волны 362 нм; V — объем препарата, взятый
для разведения, мл; V4 — конечный объем раствора, мл.
Содержание C63H88CoN14O14P в 1 мл препарата соответственно
должно быть 0,027—0,033 мг, 0,09—0,11 мг, 0,18—0,22 мг или
0,45—0,55 мг.
Работа 3. Спектрофотометрическое определение
лекарственных веществ в двухкомпонентных лекар-
ственных формах заводского производства
Лекарственная форма
Папаверина гидрохлорида — 0,03 г
Дибазола — 0,03 г
(таблетки “Папазол”)
1. Ознакомиться с инструкцией к спектрофотометру СФ-26.
2. Снять спектры поглощения растворов. Приготовить 100 мл
0,0005 %-ного раствора папаверина гидрохлорида и 100 мл
0,002 % -ного раствора дибазола в 0,01 н. соляной кислоте. Для
этого точную массу папаверина гидрохлорида (0,05 г) и дибазо-
ла (0,1 г) помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл,
растворяют в 30—40 мл 0,01 н. соляной кислоты и доводят до
метки тем же растворителем. Переносят 1 мл раствора папаве-
рина гидрохлорида или 2 мл раствора дибазола в мерные кол-
бы вместимостью 100 мл и доводят до метки 0,01 н. соляной
кислотой.
171
Указанные растворы наливают в кюветы с рабочей длиной 1 см.
Кюветы поочередно помещают в кюветодержатель. Третью кюве-
ту заполняют 0,01 н. соляной кислотой (раствор сравнения). Из-
меряют значения оптической плотности растворов препаратов
относительно раствора сравнения вблизи 220—290 нм. Данные
оформляют в виде табл. 6.1 и по полученным значениям рассчи-
тывают удельный показатель поглощения каждого препарата по
формуле
Ei*=A/CZ,
где А — оптическая плотность; I — рабочая длина кюветы. —
удельный показатель поглощения.
Таблица 6.1
Спектрофотометрические характеристики
Препарат X, нм А
По полученным данным строят графики зависимости показа-
теля поглощения от длины волны (спектры поглощения папаве-
рина гидрохлорида и дибазола). Спектры поглощения позволяют
осуществить выбор длин волн для выполнения анализа лекарствен-
ной формы. Обычно при анализе смеси в качестве аналитических
выбирают такие длины волн, при которых наблюдаются макси-
мальные отношения величин поглощения растворов препаратов.
В данном случае они соответствуют максимуму поглощения ра-
створов препаратов, т.е. 250 нм для папаверина гидрохлорида и
270 нм для дибазола.
3. Установить удельный показатель поглощения папаверина
гидрохлорида и дибазола при 250 и 270 нм.
А. Папаверина гидрохлорид. Приготовить серию из 6 раство-
ров папаверина гидрохлорида с содержанием (С, %) в пределах
0,0001—0,0006 %. В качестве растворителя использовать 0,01 н.
раствор соляной кислоты. Произвести измерение оптической плот-
ности растворов (как указано в 2) при 250 и 270 нм. Данные офор-
мить в виде таблицы и рассчитать значения удельных показате-
лей поглощения.
Таблица 6.2
Удельные показатели поглощения папаверина гидрохлорида
С, % X = 250 нм X = 250 нм
А ^1см А Е1%
172
Провести статистическую обработку значений удельного пока-
зателя поглощения.
Б. Дибазол. Приготовить серию из 6 растворов дибазола с со-
держанием в пределах 0,0005—0,002 %. В качестве растворителя
использовать 0,01 н. раствор соляной кислоты. Измерить опти-
ческую плотность растворов (как указано в п. 2) при 250 и 270 нм.
Данные оформить в виде табл. 6.3 и рассчитать удельные показа-
тели поглощения.
Таблица 6.3
Удельные показатели поглощения дибазола
С, % 1 = 250 нм X = 250 нм
А Е^ А е;*
Статистически обработать значения удельных показателей по-
глощения. Полученные данные использовать для расчета содер-
жания препаратов в лекарственной форме.
4. Выполнить количественное спектрофотометрическое опре-
деление содержания папаверина гидрохлорида и дибазола в таб-
летках. Для этого около 0,05 г (точная масса) порошка растер-
тых таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл,
прибавляют 30—40 мл 0,01 н. соляной кислоты, взбалтывают в
течение 3—5 мин и доводят до метки 0,01 н. соляной кислотой.
Фильтруют, отбрасывая первые 15 мл фильтрата. Помещают 4 мл
фильтрата в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем
раствора до метки 0,01 н. соляной кислотой и перемешивают.
Измеряют оптическую плотность при 250 и 270 нм. Содержание
препаратов рассчитывают путем решения системы уравнений:
А1' =(Е?С, +Е^С2)1;
Ак’- =(£^0, +Е22С2)/,
где Сх и С2 — содержание папаверина гидрохлорида и дибазола
соответственно, %; Ех и Е2 — удельные показатели поглощения
компонентов при длинах волн и Х2; I — рабочая длина кюве-
ты, см.
Е^А*-1-Е2 А^
-(Ej-'E/’-E^E/1)/’
с Е^-А^-Е^А*-
2 (Е^Е^-Е^Е^)/'
173
Содержание папаверина гидрохлорида (Xi) и дибазола (Х2) в
таблетках рассчитывают по формуле
С, 100тср С2 100тср
4т 2 4т
где CjhC2 — рассчитанное содержание препаратов, %; тср —
средняя масса лекарственной формы, г; m — масса лекарствен-
ной формы, взятая на анализ, г.
Рассчитать отклонение от прописанных масс (г), сравнить с
допустимыми нормами отклонений и сделать заключение о соот-
ветствии содержания препаратов в лекарственной форме [1, 24].
6.1.2. Фотоколориметрия
Фотоколориметрический метод, как и спектрофотометрический,
относится к методам, основанным на поглощении веществами
электромагнитного излучения. В его основе также лежит закон
светопоглощения Бутера—Ламберта—Бера в виде
А = хс/,
где А — измеренная оптическая плотность вещества; с — концен-
трация растворов; I — толщина слоя вещества, см; х — показа-
тель поглощения раствора, концентрация которого равна 1.
Отличие фотоколориметрического метода от спектрофотомет-
рического заключается в использовании немонохроматического
излучения. Метод применяют для анализа окрашенных раство-
ров, т.е. требуется предварительный подбор специальных цвет-
ных реакций, позволяющих количественно перевести бесцветные
вещества в соединения, имеющие окраску. Метод применим для
определения, как правило, одного из веществ в сложных лекар-
ственных смесях, остальные определяются другими способами.
Величину хи/ определяют путем проведения серии предвари-
тельных измерений для растворов с известной концентрацией
исследуемого вещества.
При отсутствии линейной зависимости между с и D для опре-
деления следует пользоваться градуировочными графиками, по-
строенными для каждого определяемого вещества.
Определение проводят на специальных приборах — фотоколо-
риметрах. Принцип действия фотоколориметра основан на разни-
це фототоков двух фотоэлементов, на один из которых падает пу-
чок света, проходящий через определяемый раствор, на другой —
через растворитель. Величина разницы фототоков и определяет
оптическую плотность исследуемого вещества, которую отсчиты-
вают по шкале прибора.
174
В некоторых случаях определен ие интенсивности окраски (а
значит, и оптической плотности) проводят визуально. Такой ме-
тод носит название колориметрии.
Относительная ошибка фотоколориметрических методов обычно
не превышает 3 %, колориметрических — 5 % [1, 24].
Работа 4. Фотоколориметрическое определение лекар-
ственных веществ в мазях
Лекарственная форма
Мазь фурацилиновая 0,2 %-ная — 30,0
Задание 1. Установить подлинность фурацилина, содержаще-
гося в лекарственной форме.
К 0,05 г мази прибавляют 1 мл воды и нагревают до расплав-
ления основы. После охлаждения водное извлечение отделяют и
прибавляют 2—3 капли раствора гидроксида натрия. Появляется
оранжево-крас ное окрашивание.
Задание 2. Выполнить количественное определение фураци-
лина.
К 0,5 г мази прибавляют 10 мл воды и нагревают до расплав-
ления основы. После охлаждения водное извлечение отделяют и
переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Повторяют из-
влечение 3 раза, добавляя по 10 мл воды. Водные вытяжки объ-
единяют и доводят водой до метки (раствор I). К 5 мл раствора I
прибавляют 3 мл воды, 2 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия и
перемешивают. Через 20 мин измеряют оптическую плотность
полученного раствора (AJ на фотоколориметре в кюветах с дли-
ной рабочего слоя 3 мм при синем светофильтре. Параллельно
проводят аналогичное определение с 0,5 мл 0,02 % -ного стандарт-
ного раствора фурацилина и измеряют его оптическую плотность
(Аст). Содержание фурацилина рассчитывают по формуле
х _ А,-0,0001-50-100
“ Ас, -5-0,5 '
Стандартный раствор фурацилина готовят из препарата, соот-
ветствующего требованиям ГФ X. Точную массу около 0,02 г фу-
рацилина растворяют в 70—80 мл воды в мерной колбе вместимо-
стью 100 мл при нагревании на водяной бане. Затем охлаждают и
объем раствора доводят до метки.
6.1.3. Спектрофотометрия в инфракрасной области света
Инфракрасная (ИК) спектроскопия характеризуется широкой
информативностью, что создает возможность объективной оцен-
ки подлинности и количественного определения лекарственных
175
веществ. ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру
молекулы. Различия в химическом строении меняют характер
ИК-спектра. Важные преимущества ИК-спектрофотометрии — спе-
цифичность, быстрота выполнения анализа, высокая чувствитель-
ность, объективность получаемых результатов, возможность ана-
лиза вещества в кристаллическом состоянии.
В ГФ XI рекомендованы два способа установления подлиннос-
ти лекарственных веществ по ИК-спектрам. Один из них основан
на сравнении ИК-спектров испытуемого вещества и его стандарт-
ного образца. Спектры должны быть сняты в идентичных услови-
ях, т. е. образцы должны быть в одинаковом агрегатном состоя-
нии, в одной и той же концентрации, единой должна быть ско-
рость регистрации и т. д. Второй способ заключается в сравнении
ИК-спектра испытуемого вещества с его стандартным спектром.
В этом случае необходимо строго соблюдать условия, предусмот-
ренные для снятия стандартного спектра, приведенные в соответ-
ствующей НТД (ГФ, ВФС, ФС). Полное совпадение полос погло-
щения свидетельствует об идентичности веществ. Однако поли-
морфные модификации могут давать различные ИК-спектры. В
таком случае для подтверждения идентичности необходимо пере-
кристаллизовать испытуемые вещества из одного и того же ра-
створителя и вновь снять спектры.
Инфракрасная область спектра занимает диапазон от границы
видимой до микроволновой области — от 0,75 до 3405 мкм. Обычно
под инфракрасной областью подразумевают более узкий интер-
вал — от 2,5 до 20 мкм, соответствующий значениям волнового
числа 4000—500 см-1. Более коротковолновый и длинноволно-
вый участки спектра относят к областям ближней и дальней инф-
ракрасной спектроскопии.
С помощью ИК-спектроскопии возможно установление строе-
ния веществ, их идентификация и контроль чистоты. Методы
ИК-спектроскопии могут быть использованы также для количе-
ственного анализа и физико-химических исследований. Процес-
сы поглощения и испускания электромагнитной энергии имеют
дискретный, квантовый характер. Энергия кванта ДЕ определя-
ется разностью энергий квантовых состояний молекулы:
ДЕ = Е2 - Е, = hv = h— = hcv, (6.4)
X
где с — скорость света (3-1O10 см-с-1); Л, — длина волны (см); h —
постоянная Планка; v — частота электромагнитного излучения,
Гц; V — волновое число, см-1, т. е. число длин волн, укладываю-
щихся в 1 см.
176
Источниками инфракрасного излучения для получения спект-
ра служат тепловые источники, такие как глобар, штифт Нернста
и нихромовая лампа. Глобар представляет собою стержень, изго-
товленный из карбида кремния. Рабочая температура глобара
1300 К. Штифт Нернста — стержень, изготовленный из диоксида
циркония с примесью оксидов иттрия, тория, церия. Рабочая тем-
пература — 1700 К.
Для того чтобы выделить узкий интервал длин волн, пучок
света пропускают через дифракционные решетки или используют
призмы и решетки одновременно. Для работы в широком интер-
вале длин волн применяют сменные призмы из различных крис-
таллических материалов. Используют наиболее часто следующие
призмы:
— призма из кристаллов фтористого лития работает в интерва-
ле 10 000—1670 см-1 (1—6 мкм);
— призма из хлористого натрия — в интервале 2000—667 см-1
(5—15 мкм);
— призма из бромистого калия — в интервале 715—370 см-1
(14—27 мкм).
Кристаллы используемых веществ в призмах гигроскопичны,
они хранятся в защищенном от влаги воздуха эксикаторе. Наибо-
лее устойчивы призмы из хлористого серебра и кварца.
Условия съемки ИК-спектров
ИК-спёктры получают в любом агрегатном состоянии веще-
ства: жидком, твердом, газообразном. Для снятия спектра веще-
ство помещают в кюветы, в которых можно работать под давле-
нием и при высокой температуре и поддерживать толщину слоя
вещества в широком интервале — от 0,5 мм до 25 см. В качестве
растворителя при съемках ИК-спектров используют органичес-
кий растворитель, прозрачный в данной области спектра и не
вступающий в химическое взаимодействие с веществом. Обычно
применяют сухие четыреххлористый углерод, хлороформ или
сероуглерод: необходимо при подборе растворителей учитывать,
что кюветы готовятся из галоидных солей щелочных металлов и
могут растворяться в присутствии воды, водного спирта, диок-
сана и тетрагидрофурана. Чаще всего регистрируют ИК-спектры
веществ в твердом виде. Для этого существует несколько спосо-
бов:
1. Вещество растирают в агатовой ступке с вазелиновым, фто-
рированным или парафиновым маслами и наносят на пластинки
(окна) из NaCl или КВг. Пластинки зажимают специальным уст-
ройством. Частицы вещества не должны быть больше 2 мкм, только
12. Заказ 3547
177
в этом случае можно пренебречь потерями за счет преломления и
отражения светового потока от самого вещества.
2. Вещество запрессовывают в таблетку с бромистым калием.
Таблетка должна быть прозрачной, а таблетирование и растира-
ние должно производиться в отсутствие влаги воздуха. Недостат-
ком таблетирования является возможное перегревание вещества
и его необратимые изменения.
3. Готовят тонкую полимерную пленку веществ. Для этого ра-
створяют образцы и полимеры в легколетучих растворителях, и
раствор наносят пипеткой на пластинки из NaCl или КВг, раство-
ритель испаряется в вакууме, пластинку с тонким покрытием
помещают в спектрометр и снимают спектр.
Характеристические частоты
В ИК-спектрах органических соединений проявляются достаточ-
но интенсивные полосы поглощения, специфичные для определен-
ной функциональной группы атомов и относимые поэтому к харак-
теристическим (групповым) колебаниям. Они наблюдаются в основ-
ном в высокочастотной области спектра (от 4000 до 1500 см-1) и
проявляются в спектрах всех соединений, содержащих данную
функциональную группу. Так, характеристическими будут коле-
бания групп с легким атомом водорода — СН, ОН и NH, с крат-
ными связями — С=С, С=С, C=N, С=О, N=N и др. Различие в
значениях частот отдельных характеристических колебаний обус-
ловлено различием силовых постоянных или масс атомов. Чем
прочнее связь, т. е. чем больше величина силовой постоянной К,
и чем меньше масса атомов, тем в более длинноволновой области
находится характеристическая частота этой связи.
Область 4000—1500 см-1 соответствует, главным образом, валент-
ным колебаниям связей. ИК-спектроскопия в этой области исполь-
зуется преимущественно для определения строения вещества.
Длинноволновая область (v < 1500 см-1) содержит, наряду с ха-
рактеристическими частотами, полосы, присущие индивидуаль-
ным соединениям, и поэтому ее называют областью “отпечатков
пальцев”. Эта область ИК-спектра используется для идентифика-
ции веществ. В этой области находятся малоинтенсивные поло-
сы, соответствующие деформационным колебаниям атомов в свя-
зи, валентные колебания атомов в одинарных связях С—С, С—N,
С—О и скелетные колебания многоатомных молекул.
Отнесение полос поглощения отдельных функциональных групп
Определение структуры вещества методом ИК-спектроскопии
предполагает нахождение по данным ИК-спектров тех или иных
функциональных группировок атомов путем сравнения наблюда-
178
|мых частот с характеристическими, имеющимися в справочной
литературе. Эта операция носит название отнесение частот.
Установлена возможность использования ИК-спектроскопии для
Идентификации большой группы лекарственных веществ, содержа-
щих в молекуле карбонильные группы. Подлинность устанавлива-
ют по характеристическим полосам поглощения в следующих обла-
стях: 1760—1720, 1424—1418, 950—800 см'1 — для карбоновых
кислот; 1596—1582, 1430—1400, 1630—1612, 1528—1518 см'1 —
для аминокислот; 1690—1670, 1615—1580 см-1 — для амидов;
1770—1670 см-1 — для производных барбитуровой кислоты; 1384—
1370,1742—1740,1050 см-1 — для терпеноидов; 1680—1540,1380—
1278 см-1 — для антибиотиков тетрациклинового ряда; 3580—3100,
3050—2870, 1742—1630, 903—890 см'1 — для стероидов.
Таблицы основных характеристических частот в органических
соединениях приведены по источникам [25, 2, 6]. При отнесении
полос следует учитывать, что указанные в табл. 6.4—6.7 полосы
поглощения являются приближенными, поскольку не только обус-
ловлены характеристическими колебаниями атомов в данной свя-
зи, но и зависят от природы окружающих эту связь атомов, элек-
тронных заместителей, межмолекулярного взаимодействия, при-
роды растворителя, если запись спектра производилась в раство-
ре. Поэтому заключения о строении вещества, сделанные на
основании его ИК-спектра, желательно подтвердить другими фи-
зическими и, прежде всего, ЯМР-спектроскопией [15], или хими-
ческими методами. При отнесении полос поглощения необходимо
иметь в виду ряд обобщений, связывающих характеристические
частоты, наблюдаемые в ИК-спектрах, с природой связей и функ-
циональных групп. Наибольшие значения частот (v > 2500 см'1)
соответствуют частотам связей с легким атомом водорода — ОН,
NH, СН и др.
ОН-группа. На рис. 6.1 показана схема колебаний ОН-группы
в спиртах и указаны интервалы частот, соответствующие опреде-
ленным колебаниям. А Б в
Значение vOH 3700-е-3500 см'1 g)
соответствует свободной ОН-груп-
пе в парах вещества или в непо- v к с ) 5
лярных растворителях. Умень- | » (8-150-1200™ )
шение этих значений указыва- ▼ JL *
ет на взаимодействие ОН-груп- /'оЛаомоЛ-?)
пы, например, по типу водород- у J
ной связи ОН О. В последнем 1200-10000 см-1 '’о-н-звзо-з5оосм
случае наблюдается уширение рис д j Схема колебаний ОН-груп-
ПОЛОСЫ ОН. пы в спиртах
12*
179
NH-группа. Частоты валентных колебаний в аминах (vag и
vg) лежат в пределах 3500—3300 см'1, полосы vNH частично пере-
крываются с полосами vOH, но обычно полосы vNH уже, чем vOH.
Величина vNH зависит от природы заместителей в аминогруппе:
для первичных аминов характерно наличие двух интенсивных
полос (vas и vg) в области 3500—3100 см-1 и полос 6NH средней
интенсивности в интервале 1650—1590 см'1, во вторичных ами-
нах проявляется одна полоса vNH 3500—3300 см-1 и слабая поло-
са При переходе к солям аммония и к замещенным солям
аммония vNH уменьшается до 3200—2900 см-1.
СН-группа. Частоты валентных колебаний vCH укладываются
в пределы 3000—2850 см-1 (алифатические соединения) и 2100—
3000 см-1 (ненасыщенные и ароматические соединения). Значе-
ния частот валентных и деформационных колебаний метилено-
вой группы приведены в табл. 6.4. Изменение vCH для индивиду-
альных соединений данного класса не превышает 10—20 см-1.
Метильная группа имеет близкие значения частот валентных ко-
лебаний: vag = 2962±10 см-1, vg = 2872±10 см-1. В ненасыщенных
алифатических углеводородах vCH возрастает: в олефинах —
3020±30 см-1, в ацетиленовых — 3360±30 см-1. В ароматических
соединениях полоса колебаний vCH находится в области 3100—
3000 см-1, имеет мультиплетную структуру и среднюю интенсив-
ность, в области 1600—1450 см-1 проявляются валентные колеба-
ния кольца, в интервале 1100—1010 см-1 — ряд полос, соответ-
ствующих плоскостным, а в интервале 900—657 см-1 — неплоско-
стным деформационным колебаниям 5СН. Для подтверждения на-
личия в веществе группы R—Н часто прибегают к дейтерирова-
нию, заменяя Н на дейтерий. При этом, в соответствии с
уравнением (6.4), частоты колебаний этих связей уменьшаются в
>/2 = 1,4 раза.
СО-группа. Карбонильная группа С=О содержится в кетонах,
альдегидах, кислотах, солях, эфирах и др. и характеризуется ин-
тенсивной полосой поглощения vco в области 1740±40 см-1. Зна-
чения vco лежат в алифатических кетонах в пределах 1725—
1705 см-1, в альдегидах 1740—1720 см-1, в сложных эфирах 1730—
1710 см-1, в димерах кислот 1730—1680 см-1. В последнем случае
низкочастотный сдвиг объясняется образованием межмолекулярной
водородной связи. Ионизированной карбоксильной СОСГ-группе со-
ответствуют также меньшие значения vTO — 1610—1550 см'1 (v^) и
1420—1350 см'1 (vg) за счет делокализации электронов связи между
двумя атомами кислорода. ИК-спектры амидов кислот содержат два
сложных колебания: амид I, преимущественно v^, в области 1690—
1630 см’1 и амид 11, в основном 3N]I, в интервале 1650—1515 см'1.
180
Кратные связи >С=С<, >C=N. Для изолированной связи >С=С<
„лентные колебания наблюдаются в области 2240—1640 см"1, а
дд* сопряженной — 1650—1600 см"1; для v(;=c — в области 2240—
В100 см"1. Полосы, связанные с колебаниями vc=N, лежат в пре-
делах 1690—1630 см"1. Валентные колебания одинарных связей
(*|СсЛ слабые по интенсивности, расположены в области 1200—
воо см *. Таким образом, очевидно, что увеличение кратности
связи в соответствии с уравнением (6.4) приводит к росту силовой
Постоянной и частоты. Расшифровку ИК-спектров облегчает и
делает однозначной наличие сведений о составе соединений, мо-
лекулярной массе, физико-химических константах, способах син-
теза.
Процесс расшифровки ИК-спектра надо начинать с высокочас-
тотной области характеристических частот. Следует установить,
к производным какого класса углеводородов относится исследуе-
мое соединение, учитывая различие в частотах vCH алифатичес-
ких, ненасыщенных и ароматических соединений в области 3000—
2800 см"1. Затем перейти к поиску функциональных групп ОН,
NH в более высокочастотной области (v > 3000 см-1). Контур этих
полос (широкий или узкий) зависит от степени участия атомов в
водородных связях. В интервале 2000—1450 см-1 следует искать
соединения со связями С=О, C=N, N=N (валентные колебания). В
области 1500—1100 см*1 могут наблюдаться деформационные ко-
лебания связей ОН, NH и СН. В процессе отнесения следует ори-
ентироваться на табл. 6.4—6.7 или на справочную литературу [2,
6, 25]. Желательно знать элементный состав соединения (брут-
то-формулу) и его молекулярную массу.
Пример. На рис. 6.2 представлен ИК-спектр твердого веще-
ства, снятый в таблетках КВт. Брутто-формула — С^Н8О. По этим
данным необходимо идентифицировать неизвестное органическое
Т,%
100
80 -
0 --1—I--1-1—।—I—I—I—I—I—I------1—।—।—।—।—।-----1—।—।—
3200 3000 1500 1200 1000 700 v, см '
Рис. 6.2. ИК-спектр вещества брутто-формулы С8Н8О в КВг
181
соединение, определить его класс и функциональные группы.
Класс соединения: полоса поглощения v= 3180 см-1 может быть
отнесена к vc_H в олефинах или ароматических соединениях. По-
лоса при 1600 и 1450 см-1 свидетельствуют о наличии аромати-
ческого кольца.
Функциональные группы: вещество не содержит ОН-групп, так
как иет ни интенсивных, узких полос ОН-групп (v = 3500 см-1),
ни широкой полосы ОН-группы, участвующей в водородной свя-
зи.
Сильное поглощение при 1680 см-1 характерно для карбониль-
ной группы в кетонах. Полосы 1360 и 1265 см-1 типичны для
деформационных колебаний СН3-групп. Принимая во внимание
брутто-формулу соединения, определяем его как ацетофенон:
Идентификация вещества имеет целью установить, соответству-
ет ли образец эталону путем сравнения их ИК-спектров. В случае
идентичности обоих соединений их ИК-спектры совпадают. Мож-
но для этой цели сравнивать и табличные данные частот ИК-спек-
тров эталона и образца.
Метод ИК-спектроскопии может быть применен для установ-
ления чистоты образца и определения примеси. Если известен
характер примеси, то сравнивают ИК-спектр примеси со спект-
ром чистого вещества и находят характеристические полосы при-
меси, которые не перекрываются с полосами поглощения чистого
вещества. Если природа примеси неизвестна, то спектр чистого
вещества сравнивают со спектром исследуемого. В спектре веще-
ства, содержащего примеси, больше полос, чем в спектре этало-
на. По положению полос поглощения примеси можно установить
ее природу [38].
Внешние и внутренние факторы, влияющие на положение и
ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОЛОС ПОГЛОЩЕНИЯ
Факторы, влияющие на положение полос поглощения и их
интенсивность, можно разделить на внешние, зависящие от усло-
вий измерения, и внутренние, зависящие от структуры молекул.
Ввешвве факторы
Положение полос поглощения может изменяться в зависимос-
ти от условий проведения измерения. Взаимодействие полярных
групп вещества с полярным растворителем приводит к образова-
нию внутримолекулярных водородных связей и появлению в спек-
тре дополнительных полос поглощения, изменению их положе-
182
ния и интенсивности. В большей степени взаимодействие сказы-
вается на частотах валентных колебаний таких групп как карбо-
нильные, амидные, амино- и оксигруппы. Так, чем больше по-
лярность растворителя, тем ниже частота колебаний этих групп.
Понижение частоты карбонильной группы в ацетофеноне, свя-
занное с увеличением полярности растворителя, приводится ниже:
VC-O> см-* Растворитель
1709 В паровой фазе
1697 Гексан
1692 СС1
1682 СНС13
1665 СН3ОН
О
II
СбН5-С-СН3
Различие в полярности растворителей приводит к выявлению в
растворе таутомерных форм вещества, к сдвигу характеристичес-
ких полос поглощения и способствует изучению по ИК-спектрам
кето-енольного равновесия. В качестве примера, поясняющего воз-
можность существования различных таутомерных форм в зависи-
мости от условий (pH среды, полярности растворителей), можно
выбрать циклический р-дикетон, димедон, который способен су-
ществовать, в зависимости от условий, в различных формах:
а) В кетоформе О
II
СН
Vc_o — 1735—1708 см-1 (в СС14)
СН3 °
б) В енольной форме О
л , снзЛ I
vc_o-.H-1610c1M’1 Т^Аон
vc_c — 1575 см 1 СН3
в) В форме димерного енола
183
Проследим за изменением полосы vc_o, как наиболее инфор-
мативной. В твердом состоянии димедон находится в форме ди-
мерного енола с сильными водородными связями (в) vc=o..,H —
1610 см-1, vc_c — 1575 см-1 (рис. 6.3).
3600 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
v, см-1
Рис. 6.3. ИК-спектр димедона в КВг
В неполярном растворителе, например в СС14, димедон пре-
имущественно имеет форму кетона (а), хотя в равновесии присут-
ствует и енольная форма (б) — рис. 6.4.
Кетоформа:
vc3-o — 1735 см-1
vCj=<) — 1708 см'1
Димерный енол:
vc-o—н ~ 1607 см’’
0 ----1----1----1----1—
1700 1600 1500 1400 у Chr1
Рис. 6.4. ИК-спектр димедона в СС14 в обеих формах
Зафиксировать только кетонную форму становится возможным,
если в положении “2” димедона вместо водорода ввести метиль-
ные группы (рис. 6.5).
184
Рис. 6.5. Димедон в кетоформе
Натриевая соль димедона дает в ИК-спектре сильное смеще-
ние карбонильной полосы поглощения в низкочастотную область
вследствие образования аниона (г) — рис. 6.6.
Рис. 6.6. ИК-спектр димедона в 0,1 М NaOH
Внутренние факторы
Влияние структуры вещества
Внутренние факторы имеют решающее значение для определе-
ния природы вещества, для выяснения его структуры. Наличие в
молекуле групп атомов, обладающих мезомерным (М) и индук-
тивным (I) эффектами, влияет на порядок связи и, тем самым,
определяет положение и интенсивность полос инфракрасного спек-
тра. Кратные связи и атомы, содержащие неспаренные электро-
ны, вызывают мезомерный эффект. На мезомерный эффект мо-
жет накладываться и индуктивный эффект этих атомов. Если
кратных связей и атомов, содержащих неспаренные электроны,
нет в молекуле, то положение полос поглощения зависит только
от индуктивного эффекта. Например, на положение полос валент-
185
вых колебаний С=0 в ИК-спектре могут влиять суммарный мезо-
мерный и индуктивный эффекты. Рассмотрим положение полосы
vc-o в СЛОЖяых эфирах обычных спиртов (а) и тиолов (б) и срав-
ним их с положением этой же полосы в обычном кетоне (в)".
v,,„—1735 см1 —1690 см1 v,,„—1715 см"1
+М < - I для О +М > - I для S
Атомы серы и кислорода в соединениях а) и б) имеют положи-
тельный мезомерный эффект, связанный с участием неподелен-
ных электронов этих атомов в сопряжении с л-электронами двой-
ной С=О связи:
О. +м
a) R—С——0R1
— — — J
д') *м
б) R—С——SR1
Одновременно с мезомерным эффектом эти атомы проявляют
отрицательный индуктивный эффект, который, в противополож-
ность положительному мезомерному эффекту, связан с увеличени-
ем электронной плотности в направлении к атомам кислорода и
серы. Мезомерный эффект серы больше, чем ее индуктивный эф-
фект. У кислорода, наоборот, мезомерный эффект меньше, чем ин-
дуктивный. Следствием этого является уменьшение частоты vc=o в
тиоэфирах в сравнении со сложными эфирами. Таким образом, при
сопоставлении с эталоном, алифатическим кетоном (в), имеет мес-
то уменьшение (случай “б”) и увеличение (случай “а”) частотыvc=o.
Ввутрвмолекулярвая в межмолекуляриая водородная связь
Существенное влияние на положение и форму полосы погло-
щения оказывает наличие водородной связи. Это особенно сказы-
вается на колебаниях гидроксильной и аминогруппы, которые
легко образуют водородную связь с карбоксильной, амино-, нит-
ро- и другими группами. Водородная связь может быть как внут-
римолекулярной (например, салицилальдегид), так и межмоле-
кулярной (димеры карбоновых кислот):
Н
салицилальдегид
димер карбоновой кислоты
Для обоих соединений полоса валентных колебаний “связан-
ной” ОН-группы шире и сдвинута в область низких частот (боль-
ших длин волн) по сравнению с положением полосы “свободной”
ОН-группы. Одновременно уменьшается частота валентных коле-
166
баний другой группы vc_0, связанной с гидроксильной группой
водородной связью.
СТЕРИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
Напряжение кольца в циклических соединениях создает труд-
ности взаимодействия между группами, что приводит к пониже-
нию их частоты. Например,в соединении
при увеличении п от 5 до 9 частота vc_o амидной полосы снижает-
ся от 1710 до 1660 см-1, так как увеличение размеров кольца
затрудняет взаимодействие амидной группы и бензольного коль-
ца, в то же время увеличивается взаимодействие между группами
NH и СО, и значение частоты vc_0 приближается к частоте амида
с нормальной связью.
Интенсивность полос поглощения и применение
ИК-спектров в количественном анализе
Как правило, интенсивные полосы характерны для полярных
групп. Однако, как указывалось выше, интенсивность полос значи-
тельно зависит от расположения атомов и влияния их друг на друга,
т. е. от мезомерного и индуктивного эффектов. Уменьшение поляр-
ности групп, обычно связанное с влиянием заместителей, обладаю-
щих индуктивным эффектом, приводит к ослаблению интенсивнос-
ти полос поглощения. Это влияние Проявляется в алифатических
соединениях. Для ароматических систем, наряду с индуктивным
эффектом, имеет место и мезомерный эффект, вследствие чего ин-
тенсивность полос поглощения аналогичных групп, измеренная в
одинаковых условиях, больше, чем в алифатических.
Изменение концентрации вещества также приводит к измене-
нию интенсивности его характеристических полос поглощения.
Зависимость интенсивности поглощения от концентрации лежит
в основе количественного анализа по инфракрасным спектрам.
Этот метод анализа основан на применении закона Бугера—Лам-
берта—Бера А = ес/. Чаще всего здесь используют метод калибро-
вочного графика. В ИК-спектроскопии, в отличие от электронной
спектроскопии, затрудняется применение метода молярного ко-
эффициента поглощения из-за рассеяния, сплошного поглощения
и других эффектов. Из-за этих эффектов трудно определить поло-
жение линии 100 %-ного пропускания, т.е. интенсивность свето-
вого потока, прошедшего через образец без анализируемого ком-
понента. С этой целью с помощью метода базовой линии опреде-
ляют коэффициент пропускания как отношение
187
Тл = 1д ^0(Л|
для одной или нескольких полос поглощения исследуемого веще-
ства.
На рис. 6.7 приведен участок ИК-спектра с полосой поглоще-
ния, где при волновом числе vA данной полосы находят 1А и 1^.
Базовая линия проводится в основании полосы поглощения от
“горба к горбу” и на рисунке изображена пунктиром.
Рис. 6.7. Базовая линия полосы поглощения
По полученным данным вычерчивают калибровочный график
в координатах Т = f(C) и определяют концентрацию раствора ве-
щества.
Практические примеры
Пример 1. Отнесение полос поглощения в ИК-спектре веществ
к функциональным группам
Полосы поглощения в ИК-спектре соединения обусловлены
колебаниями определенной группы атомов, входящей в это веще-
ство. Зная частоту максимумов полос поглощения в спектре, по
таблицам характеристических частот устанавливают, какие груп-
пы входят в состав этого соединения.
На спектрограмме, которая выдается преподавателем, по оси
абсцисс отложены частоты (см'1), по оси ординат — процент про-
пускания инфракрасных лучей данным веществом. Зная струк-
турную формулу заданного соединения, записывают в таблицу
группы атомов и тип колебаний. Для каждой группы атомов с
помощью табл. 6.4—6.7 проводят отнесения характеристических
частот и сравнивают их с положением полос в спектре.
Например, имеется спектр о-толуидина, снятый в полимерной
пленке.В спектре наблюдается ряд интенсивных полос поглоще-
ния (рис. 6.8).
Пример 2. Определение структурной формулы вещества по его
ИК-спектру.
По выданному ИК-спектру и химическому составу вещества
необходимо установить его строение. Получив спектр соединения,
188
Частоты основных полос поглощения о-толуидина, см 1
Группировка атомов и тип колебаний Частоты максимумов полос поглощения в спектре, см1 Данные характеристических полос поглощения из таблиц, см'1
vnh2 3520, 3430 v 3500—3400
°NH2 1622 5 1640—1560
VC-N 1303,1268 v 1360—1250
V C-N (аром.) 3030 v 3000
V C-N (алиф.) 2925 v 3000
$сн3 1442, 1380 5 1450—1400
бензольное кольцо 1588, 1494, 1471 8 1600—1500
см
Т, %
4
см
ю
со
см
о>
см
тсо
осо
тем
100
0>
80
60
40
20
J__I__I__I__I__I__I-1—I___I___I_I__I___I__I__I_1—1__I__L
0
3600 2800 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 v, см ’
Рис. 6.8. ИК-спектр о-толуидина
следует сопоставить полосы наблюдаемых максимумов полос по-
глощения с характеристическими частотами с помощью табл. 6.4—
6.7 и определить группы атомов неизвестного соединения, прини-
мая во внимание его эмпирическую формулу. При расшифровке
спектра поглощения необходимо учитывать влияние на положе-
ние полос поглощения различных факторов: растворителя, суще-
ствования различных таутомерных форм в равновесии с основной
формой, наличие соседних групп атомов, обладающих мезомер-
ным и индуктивным эффектами.
Например, инфракрасный спектр жидкого вещества эмпири-
ческой формулы С8Н18О представлен на рис. 6.9. Определите его
строение.
В ИК-спектре наблюдается интенсивная полоса поглощения
при 3400 см*1, которая может быть v0H и vNH (см. табл. 6.5, 6.6).
Так как в приведенной брутто-формуле не содержится атомов азо-
та, то следует отнести эту полосу к v0H. Такое отнесение подтвер-
ждается также наличием интенсивной полосы при 1050 см-1 (80Н).
189
100
Q ---1---1--------1----1------L
3400 2400 1500 1300 1000
V, CM"1
Puc. 6.9. ИК-спектр октанола
В спектре также отсутствуют частоты, соответствующие vc=o
(1760 см-1). Следовательно, вещество не содержит СООН-групп.
Вещество может быть алифатическим спиртом, октанолом, так
как состав его соответствует формуле СпН2п+1ОН (С8Н17ОН).
Это заключение подтверждается также наличием частот, ха-
рактерных для СН3- и СН2-групп: vgCH3 — 2800 см-1, 8(СНз СНз) —
1480 см-1, vr„ — 1360 см-1.
Понижение частоты vOH до 3400 см 1 свидетельствует о том,
что гидроксильная группа участвует в межмолекулярной водо-
родной связи.
Задание 1 к примеру 1
190
Задание 2 к примеру 1
3600 2800
CH3(CH2)2NH2
___I I______I_____I____I
1600_____________________1400 1200 1000 800 V, CM-'
Задание 1 к примеру 2
191
Задание 2 к примеру 2
4000 3200 2400 1700 1500 1300 1100 900 v, см*1
Задание 3 к примеру 2
Т, %
100 -
80 -
60
40 -
20
1000 800 600 v, см-1
0
3500 3000 2500 2000 1800 1600 1400 1200
Задание 4 к примеру 2
192
Задание 5 к примеру 2
Таблица 6.4
Характеристические частоты поглощения алканов, алкенов и
ароматических соединений (бензол, нафталин, фенантрен и другие
аналогичные соединения)
Тип соединения Волновое число, см 1 (длина волны, мкм) Интенсив- ность Тип колебаний
Алканы сн3 2960 (3,38) с. v„(C-H)
2870 (3,48) с. v(C—Н)
1460 (6,85) 1375 (7,27) ср. 8„(С-Н) 8,(С—Н)
сн, 2920 (3,42) с. v„(C-H)
2850(3,51) с. v,(C—Н)
1465 (6,83) ср. 8„(С-Н)
Алкены =сн2 3080 (3,23) ср. v„(C-H)
2975 (3,36) ср. vs(C-H)
=СН— 3020 (3,31) ср. v8(C-H)
3020 (3,31) ср. v,(C-H)
Н/С=С\Н 1665—1652(6,02—6,05) ср. v,(C-H)
Н 3020 (3,31) сл. v(C—H)
R/C=C\H 1678—1668 (5,96—5,99) сл. v,(C=C)
980—965 (10,20—10,36) с. 8(C—H)
Ароматические 3070—3030 (3,26—3,30) сл. неплоские va(C—H)
ЦИКЛЫ 1600—1580(6,25—6,33) ср. v,(C=C) кольца
1500—1450(6,67—6,90) ср. v.(C=C) кольца
13. Заказ 3547
193
Таблица 6.5
Характеристические частоты поглощения гидроксильной группы в
спиртах, фенолах, кислотах
Тип соединения Волновое число, см'1 (длина волны, мкм) Интенсив- ность Тип колебаний
Алифатиче- ские спирты (мономеры) первичные 3630 (2,75) сл. va(O-H)
1045 (9,57) с. v,(O—Н)
1350—1250 (7,41—8,00) ср. 8(0—Н)
вторичные 3625 (2,75) сл. vs(O-H)
1100 (9,09) с. v(S-O)
1350—1250 (7,41—8,00) ср. 8(0—Н)
третичные 3615 (2,76) сл. v(O-H)
1150 (8,69) с. vs(C—О)
1410—1310 (7,09—7,63) ср. 8(0—H)
Ароматические спирты (Аг—ОН) 3600 (2,78) сл. v(O-H)
Димеры 1200 (8,33) с. v(C-O)
1410—1310 (7,09—7,63) ср. 8(0—H)
R—ОН О—R 3400—3200 (2,94—3,13) сл., ш. v(O-H)
Водородная связь 3400—320 (2,94—3,13) сл., ш. v(O—H)
Кристаллиза- ционная вода 3510 (2,69) сл. v(O—H)
1640—1615 (6,10—6,19) ср. 8(0—H)
Кислоты (мономеры) 3550 (2,82) сл. v(O— H)
920 (10,87) ср. 8(0—H)
Кислоты (димеры) 3000—250 (3,33—4,00) сл., ш. v(O—H)
194
Таблица 6.6
Характеристические частоты поглощения иминов, аминов и их солей
Тип соединения Волновое число, см1 (длина волны, мкм) Интенсив- ность Тип колебаний
Алифатиче- ские и арома- тические ами- ИЫ
~nh2 3500 (2,86) сл. v„(N-H)
3400 (2,94) сл. v,(N-H)
1230—1030 (8,13—9,71) ср. v(C—N)
1640—1560 (6,10—6,41) с. 8(N—H)
900—650 (11,11—15,38) ср. ш. 3(0—H) неплоские
NH 3350—3310 (2,99—3,02) сл. v(N—H)
1230—1030 (8,13—9,71) ср. v(C—N) две полосы
1580—1490(6,33—6,71) сл. S(N—Н)
-N—Н 3400—3300 (2,94—3,33) сл. v(N—H)
1590—1500 (6,29—6,67) ср. 6(N—H)
1670 (5,99) ср.ш. v(C=N) R-алкил
1640(6,10) ср. v(C=N) R-арил
Аммониевые
СОЛИ
R-NH/ 3000 (3,33) с.ш. v(N—H)
2500 (4,00), 2000 (5,00) ср. несколько полос
NH/ 1600—1575 (6,25—6,35) ср. 8.,(N-H)
3300—3030 (3,03—3,30) с.ш. v(N—H)
1430—1390 (7,00—7,20) с.ш. 5(N—H)
13*
195
Таблица 6.7
Хар и rrryriwf гг ис частоты ошгловцеижж карботивяых групп
Тип соединения Волновое число, см 1 (длина волны, мкм) Интен- сивность Тип колебаний
Кетоны
R—СО—R 1720 (5,82) с. v(C=O)
Аг-00—Аг Лактоны 1690 (5,90) с. v(C=O)
__со—СО— Ангидриды 1750(5,71) с. v(C«O)
(СН2СО)2О Кето-енольиая таутомерия ке- тонов 1830, 1760 (5,46), (5,68) с. v(C=O)
—СО—СН—СО— IT 1720 (5,81) с. v(C=O)
—С-С—СО— 1 он Альдегиды 1650,1615(6,06) (6,19) с. v(C=O)
—СНО Кислоты 1725 (5,80) с. v(C=O)
R—СООН 1760 (5,68) с. v(C=O), мономер
R—COON-О 1710 (5,85) с- v(C=O), димеры
R—СОО 1610—1550 (6,06—6,45) с. о /\ p О
—С*° "OR Амиды 1735(5,76) с.
—СО—NH, 3520, 3400 (2,84) (2,94) ср. v(N—H) свобод- ные формы
—со—nh2 о- 3200—3050 (3,12—3,28) ср. v(N—Н) ассоци- ированные формы
1690 (5,92) с. v(C=O) полоса амид 1, ассоци- ированная форма
1650 (6,06) с. v(C=O) полоса амид I, ассоци- ированная форма
1600(6,25) с. 8(N—Н) полоса амид 11, свобод- ная форма
1640(6,10) с. v(N—Н) полоса амид II, ассоци- ированная форма
196
6.1.4. Спектроскопия ядериого магнитного резонанса
в фармацевтическом анализе
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР, ПМР)
является методом, основанным на наблюдении индуцированных
радиочастотным полем переходов между ядерными магнитными
ВИергетическими уровнями молекул в постоянном магнитном поле.
Такие переходы возможны для ядер, имеющих спиновое кванто-
вое число I, не равное нулю (ядра 1Н, 13С, 19F, 31Р, у которых
I S, и др.). Спектр ЯМР состоит из совокупности сигналов ука-
занных переходов. Отдельный спектр ЯМР характерен для одно-
го типа ядер, специфичен для каждого вещества. В практике ис-
следовании органических лекарственных веществ используется
спектроскопия протонного магнитного резонанса (ПМР) и ЯМР*3С.
Основными направлениями использования спектроскопии ЯМР
в фармацевтическом анализе являются: идентификация лекар-
ственных средств и их комплексов с другими соединениями; ис-
следование стабильности и метаболизма; определение примесей и
оптической чистоты лекарственных средств; количественное оп-
ределение компонентного состава различных лекарственных форм
(15, 38].
Метод спектроскопии ЯМР используют для испытания под-
линности лекарственных веществ, которая может быть подтвер-
ждена либо по полному набору спектральных параметров, харак-
теризующих структуру данного соединения, либо по наиболее
характерным сигналам спектра. Подлинность можно также уста-
новить с помощью стандартного образца, добавляя определенное
его количество к анализируемому раствору. Полное совпадение
спектров анализируемого вещества и его смеси со стандартным
образцом указывает на их идентичность. Количественное опреде-
ление лекарственного вещества может быть также выполнено с
использованием спектров ЯМР. Относительная погрешность ко-
личественных определений методом ЯМР зависит от точности
измерений площади резонансных сигналов и составляет ±2—5 %.
При определении относительного содержания вещества или его
примеси измеряют площади сигналов резонанса испытуемого ве-
щества и стандартного образца. Затем вычисляют количество ис-
пытуемого вещества. Для определения абсолютного содержания
лекарственного вещества или примеси анализируемые образцы
готовят количественно и добавляют к навеске точно отвешенную
массу внутреннего стандарта. После этого выполняют регистра-
цию спектра, измеряют площади сигналов анализируемого веще-
ства (примеси) и внутреннего стандарта, затем вычисляют абсо-
лютное содержание.
197
Характеристика спектров
Главными показателями спектров ЯМР являются химический
сдвиг, мультиплетность, константа спин-спинового взаимодействия
и площадь сигнала резонанса. Их величины зависят от химичес-
кого окружения данного ядра или группы ядер, числа соседних
ядер, обладающих магнитным моментом, относительного распо-
ложения, а также от числа ядер в структурных фрагментах моле-
кулы.
Химический сдвиг (8), определяющий положение сигнала ре-
зонанса, зависит от окружения данного ядра или группы ядер,
выражается в миллионных долях (м.д.) и измеряется относитель-
но сигнала резонанса эталонного соединения, добавляемого к ана-
лизируемым растворам (1 %). Для растворов в органических ра-
створителях в качестве эталона используют тетраметилсилан
(ТМС), химические сдвиги сигналов ЯМР ХН и 13С которого при-
няты за начало отсчета, б^^Н, 13С) = 0,00 (5 — шкала химиче-
ских сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона измере-
ния химических сдвигов ЯМР 41 используют 2,2-диметил-2-си-
лапентан-5-сульфонат натрия (ДСС) с химическим сдвигом ме-
тильных протонов бдосСН) = 0,015; для измерения сдвигов ЯМР
13С — диоксан (ДО), 5ДО(13С) = 67,4. Химические сдвиги могут
быть измерены и пересчитаны в 5-шкалу по формуле
5 = 5Х+5СТ,
где 5 — химический сдвиг сигнала анализируемого вещества в
5-шкале; 5Х — химический сдвиг сигнала анализируемого веще-
ства относительно сигнала используемого эталона X; 5СТ — хими-
ческий сдвиг сигнала эталона в 5-шкале.
Сигналы ПМР регистрируются в диапазоне от 5 ~ 0,0 до
5 = 14,0. Значение химических сдвигов отсчитывают по оси абс-
цисс спектра справа налево.
Мультиплетность сигнала резонанса (М) зависит от числа ком-
понент сверхтонкой структуры сигнала, расщепляемого под вли-
янием соседних ядер, обладающих спиновым квантовым числом
I, не равным нулю. Мультиплетность сигнала ПМР (для протона
I = х/2) в спектрах первого порядка определяется по формуле:
. М = n + I,
где п — число протонов в соседней группе.
К спектрам первого порядка относятся спектры, для которых
разность химических сдвигов мультиплетных сигналов резонан-
са взаимодействующих ядер, выраженная в герцах, значительно
превышает константу спин-спинового взаимодействия, а каждая
из групп ядер магнитно эквивалентна (Дб-v/J > 10, где Д5 — раз-
198
ность химических сдвигов, м.д.; v — рабочая частота спектромет-
ра, МГц; J — константа спин-спинового взаимодействия, Гц).
В условиях магнитной неэквивалентности ядер соседних групп
мультиплетность сигнала определяется по формуле М = 2П. Ин-
тенсивности компонент в мультиплетах спектров первого поряд-
ка пропорциональны биноминальным коэффициентам. Для дуб-
летных сигналов отношение интенсивностей компонент состав-
ляет 1:1, для триплетных — 1:2:1, для квартетных — 1:3:3:1 и
т.д. В близко расположенных мультиплетах взаимодействующих
ядер наблюдается отклонение от указанной пропорциональнос-
ти, увеличение интенсивности компонент, ближайших к соседне-
му мультиплету, за счет уменьшения интенсивности более уда-
ленных компонент.
Константа спин-спинового взаимодействия (J) выражается
в герцах и зависит от расстояния между компонентами мульти-
плетов спектров первого порядка. В спектрах высших порядков
определение коистант спин-спинового взаимодействия требует спе-
циальных расчетов. Величины констант спин-спинового взаимо-
действия зависят от электроотрицательности заместителей, про-
странственного расположения групп взаимодействующих ядер, от
числа химических связей, отделяющих эти ядра, и угла между
химическими связями. Для большинства органических веществ
константы протон-протонного спин-спинового взаимодействия
имеют значения от 0 до 16 Гц.
Площадь сигнала резонанса (S) спектра ЯМР зависит от чис-
ла ядер, обусловливающих данный сигнал. Площади сигналов
спектров ПМР используются в расчетах числа протонов в соответ-
ствующих группах молекул, для измерения концентрации анали-
зируемых соединений или примесей.
Для исследования спектров ЯМР высокого разрешения ис-
пользуют легкоподвижные жидкости или растворы твердых ве-
ществ. Выбор растворителя определяется наиболее полным раз-
делением сигналов резонанса вещества и растворителя, содер-
жащего ядра, по которым проводится регистрация спектра ЯМР.
Уменьшение интенсивности сигналов растворителей спектров
ПМР достигается использованием дейтерированных или апро-
тонных растворителей. Химические сдвиги сигналов остаточных
протонов используемых дейтерированных растворителей: хло-
роформ — dx (5 = 7,26), бензол — d6 (5 = 7,16), вода — d2 (5 = 3,35;
4,8), диметил-сульфоксид — d6 (8 = 2,50; 3,7), уксусная кислота
— d4 (5 = 2,05; 8,5), ацетон — d6 (8 = 2,05).
Используются спектрометры с рабочими частотами 60 МГц и
более. Спектрометр ЯМР состоит из следующих узлов: магнита
199
системы стабилизации и коррекции магнитного поля, системы
генерации радиочастотного электромагнитного облучения образ-
ца и системы регистрации спектра. Необходим контроль чувстви-
тельности разрешающей способности и стабильности работы при-
бора соответственно технической документации. Раствор анали-
зируемого вещества готовят по частной статье, переносят спект-
ральную ампулу и проводят регистрацию заданной области спектра
на бланке, усиления подбирают. Высота наиболее интенсивного
сигнала анализируемого вещества должна достигать верхнего края
диаграммного бланка (90 % по высоте). Спектры ЯМР 1Н и 13С
представляют информацию о молекулярной структуре анализи-
руемого вещества.
Положение сигналов резонанса в спектре, их тонкая структу-
ра и площади позволяют определить число атомов водорода и уг-
лерода в отдельных группах, ближайшее химическое окружение,
сочленение отдельных структурных фрагментов молекулы, нали-
чие примесей. Многообразие структурной информации спектров
ЯМР исключает совпадения этих данных для разных соедине-
ний. Данный метод применяется для идентификации лекарствен-
ных веществ. Используют наиболее полный набор спектральных
параметров, характеризующих структуру вещества, или ограни-
чиваются характерными сигналами спектра анализируемого со-
единения, по которым судят о его составе или о наличии возмож-
ных примесей. При необходимости для подтверждения подлин-
ности лекарства (примеси) к анализируемому раствору после пер-
вичной регистрации спектра добавляют определенное количество
стандартного образца и проводят повторную запись спектров. Со-
впадение спектров указывает на идентичность анализируемого
вещества и стандартного образца.
Спектры ЯМР используют для количественного определения
относительного или абсолютного содержания лекарственного ве-
щества (примеси) в анализируемом лекарственном средстве. Для
определения относительного содержания вещества (примеси) из-
меряют площади сигналов резонанса анализируемого вещества
(примеси) и вещества, по отношению к которому нроводится ко-
личественное определение. Относительное мольное процентное (А)
или относительное процентное (Б) содержание отдельных веществ
(примеси) в анализируемых лекарственных средствах вычисляют
по формулам
. lOOSi/n; с lOOSjM./n,
А = Тл—1—Б = -------------L-
^(Si/nJ E(si/ni)
Ы i=l
200
где S; — площади сигналов резонанса веществ (примеси); i, п; —
число ядер в структурных фрагментах молекул веществ (приме-
си), которые обусловливают сигналы резонанса с площадями Sp
Mj — молекулярные массы вещества (примеси) i.
Для определения абсолютного содержания лекарственного ве-
щества (примеси) анализируемые образцы готовят количествен-
но. К навеске анализируемого вещества добавляют точно взве-
шенное количество вещества, играющего роль внутреннего стан-
дарта количественных измерений. Измеряют площади сигналов
анализируемого соединения (примеси) и стандарта. Абсолютное
содержание вещества в лекарственном средстве вычисляют по
формуле (процент)
В = 100(Sa /S„)[ManCTmc, /(MCTnama)],
где Sa/SCT — отношение площадей сигналов анализируемого ве-
щества (примеси) и стандарта; М — молекулярные массы; п —
число ядер в структурных фрагментах молекул веществ, обуслов-
ливающих сигналы резонанса с соответствующими площадями;
ш — навеска анализируемого вещества и стандарта.
Эталон количественных измерений должен растворяться в ис-
пользуемом растворителе при концентрациях, соответствующих
приблизительному равенству площадей сигналов Sa и SCT; не вза-
имодействовать с растворителем и анализируемым веществом,
иметь постоянный состав. Сигнал резонанса количественных из-
мерений должен регистрироваться в виде пика, не перекрываю-
щегося другими сигналами. Значения химических сдвигов харак-
терных сигналов веществ, используемых в качестве стандартов
количественных измерений по спектрам ПМР: малеиновая кис-
лота (2 СН, 5 = 6,60), бензилбензонат (СН2, 5 = 5,30), малоновая
кислота (СН2, 5 = 3,30), сукцинимид (2СН2, 5 = 2,77), ацетанилид
(СН3, 5 = 2,12), трет-бутанол (ЗСН3, 5 = 1,30), гексаметилцикло-
трисилоксан (6СН3, 5 = 0,15). Относительная точность количе-
ственных измерений методом ЯМР определяется точностью изме-
рений отношения площадей резонансных сигналов и в общем слу-
чае составляет ±(2—5 %) [10].
Спектроскопия ЯМР в течение последних 20 лет применяется
для изучения стероидных гормонов [7, 41]. В последние годы ис-
пользуются приборы с рабочими частотами 400—600 МГц, а так-
же двухмерная спектроскопия ЯМР [36, 50,61]. Проведено отне-
сение всех сигналов спектров ЯМР 1Н андрогенных гормонов тес-
тостерона и метилтестостерона, в том числе и сигналов, регистри-
руемых в области 5 1,5—2,5 м.д. [46].
Методом ЯМР 'Н-спектроскопии исследуют в унифицирован-
ных условиях идентификации: тестостерона пропионат, фенил-
201
пропионат, энантат, изокапронат и деканоат, метилтестостерона,
медротестрона, пропионаты, ретаболил, фениболин и силаболин.
Спектры ЯМР 1Н 2 %-ных растворов исследуемых веществ в дей-
терированном хлороформе регистрируют при 30 °C на спектро-
метре WH-90 с рабочей частотой 90 МГц. В качестве внутреннего
стандарта измерений химических сдвигов используют тетраме-
тилсилан (ТМС), Зтмс = 0,00 м.д.
Отнесение сигналов спектров ЯМР 41 к определенным груп-
пам протонов проводят на основании их химических сдвигов вида
мультиплетов и значений констант спин-спинового взаимодействия
путем сопоставления с известными данными или с помощью тех-
ники двойного резонанса. Величины химических сдвигов прото-
нов в спектрах, общих для лекарственных средств адрогенных и
анаболических гормонов, представлены в табл. 6.8. Сигналы про-
тонов Н-4 изученных гормонов, за исключением медротестрона
пропионата и метиландростендиола, регистрируются в виде уши-
ренных синглетов при 8 5,72—5,73 м.д., а анаболических гормо-
Таблица 6.8
Сигналы протонов в спектрах ЯМР *Н,
общие для лекарственных средств н анаболических гормонов
Соединение Химический сдвиг, 8 м.д.; мультиплетность; константа спин-спинового взаимодействия J, Гц
Н-4 (уш.с) Н-17 (дд) CH,-10(c) СН3-13(с)
8 8 ^1ва. 17 ^1вВ. 17 5 5
Тестостерона Андр 5,73 югенны 4,62 е гормо! 7,5 <ы 8,7 1,19 0,84
пропионат Тестостерона 5,72 4,61 7,4 8,9 1,18 0,78
фенилпропионат Тестостерона энантат 5,73 4,62 7,4 8,7 1,19 0,84
Тестостерона 5,73 4,62 7,1 9,0 1,19 0,84
изокапронат Тестостерона 5,73 4,62 7,4 9,0 1,19 0,84
деканоат Метилтестостерон 5,73 — — — 1,21 0,91
Медротестрона — 4,61 7,2 8,7 1,07 0,81
пропионат Метан дростенолон Анабо 6,07 лическ! не гормо ны 1,19 0,94
Метиландростендиол — — — — 1,03 0,87
Феноболин 5,82 4,62 7,0 8,9 — 0,79
Ретаболил 5,83 4,63 7,2 9,0 — 0,86
Силаболин 5,82 3,57 7,7 7,0 — 0,77
202
нов ретаболила, феноболина и силаболина — при 8 5,82—5,83 м.д.
Наличие двойной связи в положении 1—2 метандростенолона вы-
зывает смещение сигнала протона Н-4 в область слабого поля [17].
Характер заместителя гидроксильной группы в положении 17
практически не оказывает влияния на химические сдвиги прото-
нов Н-17 андрогенных гормонов: дублет-дублетные сигналы про-
тонов Н-17 тестостерона пропионата, фенилпропионата, энанта-
та, изокапроната, деканоатк, а также медротестрона пропионата
регистрируются при 8 4,61—4,62 м.д. У анаболических гормонов
влияние заместителя гидроксильной группы на положение в спек-
тре сигнала протона Н-17 более существенно. Вследствие поло-
жительного индуктивного эффекта триметилсилильной группы
сигнал протона Н-17 у силаболина смещен в область сильного
поля по сравнению с соответствующим сигналом ретаболила и
феноболина почти на 1,1 м.д.
Значения химических сдвигов синглетных сигналов протонов
метильных групп при С-10 изученных соединений, за исключе-
нием метиландростендиола и медротестрона пропионата, практи-
чески одинаковы, 8 0,81—0,8 м.д. Наименьшие значения хими-
ческих сдвигов сигналов протонов групп СНд-13 у фенилпропио-
нового и триметилсилильного производных гормонов — 8 0,77—
0,79 м.д. Наличие метильной группы в положении 17 и отсутствие
электроотрицательных заместителей у гидросильной группы в
метилтестостероне и метандростенолоне приводит к слабопольно-
му смещению протонов СН3-13 8 0,91 и 0,94 м.д. Для метандрос-
тендиола, также имеющего метильную группу в положении 17,
синглет протонов СН3-13 регистрируется при 8 0,87 м.д. за счет
экранирующего влияния двойной связи в положении 4—5.
В отношении гормонов, производных карбоновых кислот, в
области 8 2,2—2,4 м.д. наблюдаются сигналы протонов метилено-
вых групп, непосредственно связанных с карбоксильными груп-
пами. Во всех случаях они накладываются на сигналы протонов
стероидного цикла. У тестостерона пропионата можно выделить
квартет этих метиленовых протонов с константами спин-спино-
вого взаимодействия 7,6—7,7 Гц. Проведенное отнесение сигна-
лов метиленовых протонов этильной группы тестостерона и мед-
ротестрона пропионатов подтверждается методом двойного резо-
нанса. При облучении триплетного сигнала метильных протонов
этильной группы с химическим сдвигом 8 1,13 м.д. медротестро-
на пропионата и 8 1,14 м.д. тестрона пропионата квартетные сиг-
налы метиленовых протонов с химическими сдвигами соответ-
ственно 8 2,34 и 2,33 м.д. превращаются в синглетные.
203
Сигналы протонов метильных групп остатка декановой кисло-
ты у тестостерона деканоата и ретаболила проявляются в виде
мультиплетов при 5 0,88 м.д. Для тестостерона энантата сигнал
протонов метильной группы остатка гептановой кислоты наблю-
дается при 5 0,89 м.д. Дублетный сигнал метильных протонов
изопропильной группы тестостерона изокапроната с константой
спин-спинового взаимодействия 5,7 Гц регистрируется при
8 0,91 м.д. В спектре тестостерона фенилпропионата и феиоболи-
на в области 5 7,08—7,41 м.д. наблюдается мультиплетный сиг-
нал ароматических протонов. Для соединений, имеющих метиль-
ную группу в положении 17, характерно наличие дополнитель-
ных синглетных сигналов. В отношении метилтестостерона и ме-
тиландростендиола этими сигналами являются синглеты с
химическими сдвигами 8 1,21 м.д., а для метандростенола —
8 1,25 м.д. Сигнал протона Н-1 метандростеиолоиа наблюдается
при 8 7,06 м.д. в виде дублета с константой спин-спинового взаи-
модействия, равной 10,2 Гц, а протона Н-6 метиландростендиола
в виде уширенного дублета — при 8 5,35 м.д. с константой спин-
спинового взаимодействия 5,1 Гц. Мультиплетный сигнал прото-
на в положении 3 метиландростендиола регистрируется в области
8 3,35—3,76 м.д. Характерным сигналом силаболила является син-
глетный сигнал метильных протонов триметилсилильной группы
при 8 0,07 м.д. Спектр медротестроиа пропионата отличается от
спектров других гормонов наличием дублетного сигнала метиль-
ной группы в положении 2 при 8 1,00 м.д. с константой спин-
спинового взаимодействия, равной 6,4 Гц. [17].
Представлена возможность использования спектроскопии
ЯМР 13С для идентификации лекарственных средств андрогенных
и анаболических гормонов [16]. Спектры ЯМР 13С 10 %-ных ра-
створов соединений I—VII, IX, X в дейтерированном хлороформе
и соединения VIII (табл. 6.9) в смеси дейтерированных хлорофор-
ма и метанола (1:1) регистрируют на спектрометре WH-90 с рабо-
чей частотой 22,62 МГц при 30 °C в режиме полного подавления
спин-спинового взаимодействия протонов с углеродами и в режи-
ме спин-эхо-модуляции по 1JC>H- Химические сдвиги измеряют
по отношению сигнала хлороформа, 8„„ф 77,0 м.д.
Проводят отнесение сигналов ЯМР 13С тестостерона пропиона-
та (I), деканоата (II), фенилпропионата (Ш), нандролона деканоа-
та (IV) и фенилпропионата (V), силаболила (VI), метилтестостеро-
на (УП), метиландростендиола (УШ), метандростенолона (IX) и
медротестроиа пропионата (X) по спектрам с полным подавлени-
ем спин-спинового взаимодействия ядер углерода с протонами,
путем сопоставления с литературными данными, а также регист-
204
рацией спектров в режиме 1JC н- модуляции. Осуществлена иден-
тификация изученных соединений методом спектроскопии
ЯМР 13С. Значения химических сдвигов сигналов ЯМР 13С лекар-
ственных средств андрогенных и анаболических гормонов пред-
ставлены в табл. 6.9. На рис. 6.10—6.12 изображены диаграммы
химических сдвигов отдельных, наиболее характерных для про-
ведения идентификации сигналов ЯМР 13С данных стероидов.
Таблица 6.9
Химические сдвиги сигналов ЯМР 13С андрогенных
и анаболических гормонов 1-Х
Атом угле- рода Химические сдвиги, 8 м.д.
Г п* пг TV* V* VT vn VIII IX X
1 35,5 35,6 35,6 27,4 26,5 26,5 35,6 37,0 155,9 48,4
2 33,7 33,8 33,8 36,4 36,4 36,4 33,8 30,8 127,3 41,0
3 199,2 199,2 199,3 199,9 199,6 199,8 199,5 70,9 186,2 212,8
4 123,8 123,9 123,9 124,7 124,7 124,5 123,7 41,5 123,7 44
5 170,7 170,8 170,8 166,4 166,1 166,7 171,3 140,7 169,2 47,9
6 32,5 32,6 32,6 35,4 35,3 35,4 32,7* 120,9 33,1* 28,5
7 31,3 31,4 31,4 31,8 31,0 30,7 31,6* 31,3 32,6* 31,2
8 35,2 35,3 35,3 40,2 40,2 40,5 36,3 32,5 36,2 34,9
9 53,6 53,6 53,6 49,5 49,5 49,7 53,7 49,9 53,3 53,8
10 38,4 38,5 38,5 42,5 42,5 42,6 38,6 36,3 43,5 36,5
11 20,3 20,4 20,4 26,5 26,0 26,1 20,5 20,3 22,4 20,9
12 36,5 36,6 36,4 36,6 36,5 36,6 31,3 31,2 31,2 36,8
13 42,3 42,4 42,4 42,7 42,7 43,0 45,2 44,9 45,5 42,7
14 50,1 50,2 50,1 49,4 49,3 49,4 50,0 50,8 49,7 50,5
15 23,3 23,4 23,3 23,3 23,2 23,2 23,1 23,0 23,2 23,4
16 27,3 27,4 27,3 30,6 27,4 30,4 38,7 38,0 38,6 27,5
17 82,0 82,0 82,3 82,2 82,5 81,5 81,3 81,2 81,1 82,4
18 11,8 11,9 11,8 12,0 11,9 11,2 13,8 13,3 13,9 12,0
19 17,2 17,3 17,3 — — — 17,3 18,9 18,5 12,3
СН3-17 — — — — — — 25,7 25,1 25,7 —
СНя-2 — 14,5
“Химические сдвиги сигналов ЯМР 13С остатка пропионовой
кислоты: 5 174,3 м.д. (С=0), 5 27,6 м.д. (СН2), 5 9,1 м.д. (СН3).
6 Химические сдвиги сигналов ЯМР 13С остатка каприловой
кислоты: 5 173,8 м.д. (С=0), 5 34,4, 31,7, 29,3, 29,1, 29,0, 25,0,
22,5 м.д. (СН2), 5 14,0 м.д. (СН3).
“ Химические сдвиги сигналов ЯМР 13С фенилпропионовой кис-
лоты: 5 172,8 м.д. (С=0), 5 140,5 м.д. (С-1’), 5 128,4 и 128,2 м.д.
(С-2’, 6') и (С-3’, 5’), 5 35,9 м.д.(С-4'), 5 35,9 м.д. (С-22), 5 30,9 (С-21).
205
г Химические сдвиги сигналов ЯМР 13С группы (CH3)3Si:
5 0,1 м.д.
д Отнесение сигналов может быть попарно изменено.
213'^199'^17/*124^ 48^ ' 43 38 ' 36 34 ' 32 28^ 17 12
S, м.д
Рис. 6.10. Диаграмма химических сдвигов сигналов ЯМР 13С, наиболее харак-
терных для проведения идентификации гормонов I и X
Рис. 6.11. Диаграмма химических сдвигов отдельных сигналов ЯМР 13С, ис-
пользуемых для идентификации гормонов II—VI: а — диапазон химических
сдвигов 8 49—200 м.д.; б — диапазон химических сдвигов 8 11—43 м.д.
IX ЦО......... 8 1-... 61 Щ...
VIII 41 '"l“Q 10 ...A-’l... J 2 I б
VII юГ 8 1 Т1 2|"'|6 11|
44 ' 43 ' 40 38 36 34 ' 32 ' 22 ' 20 ‘ ‘ ~м.д
IJ£ 31...........Si,,,*.1 21 4 I 91.
VjH .-Al*.............. -1 3 а
VII |3.........5Т" 4| э(*
-'//У/1 '// ’ ‘ //' //# // //............
200 199 186 171 169 160 159 141 140 127 123 121 80 79 53 51 49
8. м.д
Рис. 6.12. Диаграмма химических сдвигов отдельных сигналов ЯМР 13С для
идентификации гормонов VII—IX: а — диапазон химических сдвигов 8 49—
200 м.д.; б — диапазон химических сдвигав 8 20—44 м.д.
Изученные гормоны, исходя из их структуры, можно условно
разделить на три группы.
К первой группе относятся сложные эфиры тестостерона I—III
и соединение X. Значения химических сдвигов сигналов ядер уг-
леродного скелета гормонов I—III практически одинаковы. Спек-
206
тры этих соединении различаются только по наличию сигналов
остатков пропионовой, фенилпропионовой и каприновой кислот
(см. табл. 6.9). Сравнение спектров соединений I и X показывает,
что близкими по значениям химических сдвигов сигналами яв-
ляются сигналы ядер С (7, 8, 9, 11—18), а также углеродов остат-
ка пропионовой кислоты. Отсутствие двойной связи в положении
4—5 и наличие метильной группы при С(2) у соединения X вызы-
вают смещение сигналов углеродов С(1, 2, 3) в слабое поле, а
сигналов углеродов С(4, 5, 6, 10, 19) — в сильное поле спектра по
сравнению с сигналами соответствующих углеродов соединения I
(см. рис. 6.10). Характерным сигналом в спектре стероида X, от-
сутствующим у стероида I, является сигнал 5 14,5 м.д. (СН3-2).
R2=(PI-VI).CH3(VII); R3=CH3CH2COO(I)
CH2(CH2)8CO(((.(V)
Ко второй группе относятся производные 19-нортестостерона
IV—VI. Основным отличием спектров этой группы соединений по
сравнению с производными тестостерона является отсутствие сиг-
нала метильной группы в положении 19. Значения химических
сдвигов сигналов ядер С(12)—С(15, 17, 18) гормонов IV—VI близ-
ки к значениям соответствующих сигналов этих же ядер соедине-
ний I—III (см. табл. 6.9). Отсутствие ангулярной метильной группы
вызывает смещение сигналов ядер С(2, 3, 4, 6, 8, 10, 11) в слабое
поле, а сигналов ядер С(1, 5, 9) — в сильное поле спектра по
сравнению с сигналами соответствующих ядер соединений I—III
207
(см. рис. 6.11, а, б). Дифференциация гормонов IV—VI может быть
проведена по наличию или отсутствию сигналов ядер углерода,
характерных для заместителя в положении 17 (см. табл. 6.9). На-
личие триметилсилильной группы у гормона VI обусловливает
незначительное смещение сигналов ядер С(17) и С(18) в сильное
поле спектра по сравнению с сигналами этих же ядер других про-
изводных 19-иортестостероиа. Влияние фенилпропионовой груп-
пировки сказывается на смещении сигнала углерода С(16) в силь-
ное поле спектра гормона V по сравнению с сигналом этого же
углерода гормонов IV и VI (см. рис. 6.11)
К третьей группе относятся гормоны VII—IX. Отличительной
особенностью спектров этих соединений является наличие сиг-
нала в области 5 25,1—25,7 м.д. (СН3-17). Строение соединений
VII—IX обусловливает близкие значения химических сдвигов
сигналов ядер С(12)—С(18) (см. табл. 6.5). Сигналы остальных
углеродов этих соединений смещены относительно друг друга в
зависимости от особенностей структуры (см. рис. 6.12, а, б). Вос-
становление кето-группы при С(3) и перемещение двойной связи
из положения 4—5 в положение 5—6 гормона VIII вызывает сме-
щение сигналов ядер С(2)—С(5), С(8)—С(10) в сильное поле спек-
тра, а сигналов С(1, 6) — в слабое поле по сравнению с сигнала-
ми соответствующих ядер соединения VII. У соединения IX зна-
чительное смещение испытывают сигналы ядер С(1, 2, 3, 10, 11)
по сравнению с сигналами этих же ядер соединения УП (см.
рис. 6.12, а, б). В данном случае сказывается появление двойной
связи в положении 1—2 [15—17].
6.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ В
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ*
Метод хроматографии находит все более широкое применение
в практике фармацевтического анализа, особенно в анализе мно-
гокомпонентных лекарственных форм, так как позволяет провес-
ти одновременно разделение сложных смесей веществ и количе-
ственно определить вещества, входящие в состав этих смесей. Боль-
шим его преимуществом является то, что он не требует примене-
ния других инструментальных методов анализа для выполнения
количественных определений, хотя сочетание с другими метода-
ми возможно и в ряде случаев позволяет еще более расширить
область применения хроматографии.
Под хроматографией обычно подразумевают процесс разделе-
ния смесей веществ, происходящий при их перемещении в пото-
ке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.
* В написании данного раздела принимала участие сотрудник химического
факультета Воронежского государственного университета Т. А. Брежнева.
208
Разделение происходит благодаря различию тех или иных
физико-химических свойств разделяемых веществ, приводящему
к неодинаковому взаимодействию их с веществом неподвижной
фазы, следовательно, к различию во времени удерживания слоя
сорбента.
По механизму, лежащему в основе разделения, различают ад-
сорбционную, распределительную, ионообменную и некоторые
другие виды хроматографии.
В основе адсорбционной хроматографии лежит непрерывный
обмен хроматографируемым веществом между неподвижной (чаще
всего твердой) и подвижной (газ, жидкость) фазами. Обмен осу-
ществляется за счет многократно повторяющихся актов адсорб-
ции-десорбции, происходящих в процессе перемещения хрома-
тографируемого вещества в токе подвижной фазы через слой не-
подвижного сорбента. Разделение осуществляется за счет разной
адсорбируемости хроматографируемых веществ. В зависимости от
агрегативного состояния подвижной фазы различают газоадсорб-
ционную и жидкостно-адсорбционную хроматографию. Последняя
включает в себя проточный колоночный и плоскостной (тонко-
слойная хроматография) варианты. Эффективность разделения
обусловлена правильным подбором комбинаций подвижной и не-
подвижной фаз. В качестве подвижной фазы применяют инерт-
ный газ, растворители с учетом их полярности или смеси несколь-
ких растворителей в различных пропорциях.
В основе распределительной хроматографии лежит обмен хро-
матографируемым веществом между двумя фазами — подвижной
и неподвижной, основанный на непрерывности в этих фазах. Раз-
деление смеси веществ достигается за счет различия в коэффици-
ентах распределения этих веществ между двумя иесмешивающи-
мися растворителями (жидкостно-жидкостная хроматография) или
газом и жидкостью (газожидкостная хроматография). Неподвиж-
ной фазой в этом варианте хроматографии является пленка жид-
кости, нанесенная на поверхность гранул сорбента. Использова-
ние этого варианта хроматографии позволяет значительно расши-
рить возможности разделения веществ, близких по строению и
свойствам, так как для каждой разделяемой смеси возможен под-
бор той неподвижной жидкой фазы, которая обеспечит наиболь-
шую полноту разделения в данном конкретном случае. Выбор под-
вижной фазы (элюента) тоже очень важен. Имено к этому вариан-
ту хроматографического разделения относится метод высокоэф-
фективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), все более широко
используемый в фармацевтическом анализе. ВЭЖХ применяют
для разделения и количественного определения близких по хи-
14. Заказ 3547
209
мической структуре веществ — производных фенотиазина, суль-
фаниламидов, антибиотиков тетрациклинового ряда. Метод при-
емлем для определения, например, трехкомпонентных смесей ал-
калоидов (гиосциамина, скополамина и эрготамина; кодеина, мор-
фина и этилморфина; кофеина, теофиллина и теобромина). ВЭЖХ
оказалась эффективной и при анализе современных мультивита-
минных лекарственных средств, содержащих до 13 витаминов и
18 микроэлементов в одной лекарственной форме.
Несколько более доступны и просты в эксплуатации газожид-
костные хроматографы, поэтому газохроматографические мето-
дики все более широко рекомендуются к применению частными
фаркопейными статьями последних лет. Метод газовой хромато-
графии используется в них как для количественного определения
лекарственных веществ, входящих в состав лекарственной фор-
мы, так и для подтверждения подлинности этих веществ. Много-
численны методики определения примесей в лекарственных сред-
ствах с применением различных вариантов газоадсорбционной и
газожидкостной хроматографии. Метод газовой хроматографии
перспективен для определения содержания воды и летучих при-
месей в лекарственных средствах, а также спирта и других лету-
чих растворителей в жидких лекарственных формах. Недостат-
ком метода, суживающим границы его применения в фармацев-
тическом анализе, является трудность переведения в газовую фазу
высококнпящих лекарственных веществ, хотя в публикациях
последних лет встречается все большее число методик, позволяю-
щих выполнить определения таких веществ по продуктам их раз-
ложения (пиролизная хроматография). Некоторые вещества мо-
гут быть определены путем перёвода в летучие производные (ре-
акционная хроматография).
Еще более просты и доступны в применении методы бумажной
и тонкослойной хроматографии (ТСХ). Несмотря на то, что оба
эти метода долгое время относили больше к качественным или
полуколичественным методам анализа, до сих пор они очень ши-
роко используются для разделения сложных смесей веществ бла-
годаря своей экспрессности и исключительной простоте выполне-
ния, не требующей практически никакой аппаратуры. Примене-
ние в последнее время для количественной оценки интенсивнос-
ти пятен на хроматограмме специальных сканирующих устройств
(денситометров) и сочетание их с другими, особенно спектрофото-
метрическими методами анализа, переводят ТСХ в разряд доста-
точно точных методов количественного анализа. Оба метода про-
должают широко использоваться в фармацевтическом анализе для
210
целей идентификации компонентов в многокомпонентных лекар-
ственных формах и для идентификации и установления предела
содержания примесей в лекарственных средствах [5, 19, 31].
6.2.1. Хроматография на бумаге
Метод бумажной хроматографии широко используется в фар-
мацевтическом анализе. Чаще всего его применяют для оценки
доброкачественности лекарственных средств при испытании их
начистоту и обнаружение примесей. Разработаны методики, поз-
воляющие определять подлинность и количественное содержание
лекарственного вещества в препарате сравнением бумажных хро-
матограмм его и стандартного образца (целанид, препараты, со-
держащие индивидуальные аминокислоты и смеси аминокис-
лот).
В основе хроматографии на бумаге лежит процесс, протекаю-
щий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее
капиллярам и поверхности подвижной жидкой фазы. При этом
неподвижной фазой является сама бумага или вещества, которы-
ми бумага предварительно обрабатывается. Перемещение подвиж-
ной фазы осуществляется либо под действием только каппилляр-
ных сил (восходящая хроматография), либо под действием ка-
пиллярных снл и силы тяжести (нисходящая хроматография).
Подвижность каждого из вариантов хроматографируемой сме-
си характеризуется величиной Rf, представляющей собой отно-
шение средних скоростей перемещения вещества и подвижной
фазы за время получения хроматограммы. Если неподвижная и
подвижная (элюент) фазы подобраны правильно, то смесь веществ
при хроматографировании разделится на несколько зон с разны-
ми Rf. На экспериментально определенные значения Rf значи-
тельно влияют условия хроматографирования. Более точной оцен-
кой хроматографической подвижности, мало чувствительной к
влиянию случайных отклонений в условиях проведения экспери-
мента, является величина Rs, представляющая собой отношение
величины Rf одного вещества к величине Rf другого вещества,
принятого за стандарт. Обычно выбор стандарта осуществляют
так, чтобы величины лежали в пределах 0,5—2,0. Величины Rf и
Rs используют для ориентировочной идентификации веществ.
Подлинность определяется при одновременном хроматографиро-
вании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного об-
разцов одного и того же вещества. Если образцы идентичны, то
должны иметь одинаковый вид пятен и равные значения Rf.
При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество в
условиях хроматографирования должны иметь разные значения
2Ц
14*
Rf. Причем по величине и интенсивности окраски обнаруживае-
мых на хроматограмме пятеи примесей можно судить о степени
чистоты лекарственного вещества. Сравнивая пятно примеси на
хроматограмме по совокупности величины и окраски с пятнами
стандартного образца примеси (свидетеля), полученными в тех
же условиях, можно оценить их содержание в образце полуколи-
чественно.
Количественное определение веществ после хроматографичес-
кого разделения проводится денситометрически непосредственно
на хроматограмме либо после элюирования. В последнем случае
пятна вырезают и после измельчения извлекают определяемое
вещество из бумаги каким-либо подходящим растворителем. Со-
держание анализируемого вещества в извлечении или сухом ос-
татке после отгонки растворителя находят любым методом, при-
годным для определения малых количеств (спектрофотометрия,
полярография и т. д.)
К достоинствам метода можно отнести его доступность и про-
стоту аппаратурного оформления. Недостатками можно считать
длительность развития хроматограммы, достигающая в ряде слу-
чаев десятков часов, и невозможность использования растворите-
лей, разрушающих бумажный слой [10].
Работа 5. Определение доброкачественности лекарствен-
ного средства методом бумажной хроматографии
Задание 1. Подготовить камеру, фазу и бумагу для хромато-
графирования.
Для проведения хроматографии на бумаге используют герме-
тизированные камеры, чаще стеклянные, с пришлифованной
крышкой. В нижней или верхней части камеры размещают сосуд
для подвижной фазы (лодочку). Внутренние стенки камеры об-
кладывают фильтровальной бумагой для более полного насыще-
ния пространства парами растворителей, применяемых для хро-
матографирования .
Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации “для
хроматографии” разрезают параллельно или перпендикулярно
волокнам на полосы, длина которых оговорена в частных статьях
ГФ. Ширину полос (А, см) определяют по формуле
А - 3(К + 1),
где К — количество хроматограмм на полосе. Длина полос долж-
на быть оговорена в частной статье.
На каждой полосе бумаги для обозначения места нанесения
хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят
♦линию старта» приблизительно в 1,5—2,0 см от края бумаги.
212
При погружении конца бумаги в элюеит нанесенные на линию
старта вещества должны быть выше уровня жидкости и непос-
редственно с ней не соприкасаться.
Если в частной статье указано, что бумага должна быть пропи-
тана неподвижной фазой, ее опускают в пропитывающий раствор
на 1—2 с, отжимают между листами фильтровальной бумаги и
сушат на воздухе в течение 15—20 мин.
Раствор веществ наносят на линию старта микропипеткой или
микрошприцем в несколько приемов так, чтобы диаметр образу-
ющихся пятен не превышал 10 мм. Расстояние между точками
нанесения отдельных проб — не менее 3 см. После нанесения
растворов анализируемых веществ и высыхания пятен бумагу за-
крепляют в камере так, чтобы она висела вертикально. Между
концом, погруженным в лодочку, и линией старта должен быть
один плавный перегиб. По окончании 1,5-часовой выдержки на-
ливают в лодочку элюент и начинают хроматографирование.
Элюент (смесь бензола и хлороформа 1:1) готовят смешивани-
ем равных объемов (20 и 20 мл) соответствующих растворителей.
Задание 2. Определить примеси посторонних стероидов в кор-
тизона ацетате.
Работу начинают с приготовления 2 % -ного хлороформного ра-
створа кортизона ацетата. 0,2 г препарата (точная навеска) ра-
створяют в мерной колбе емкостью 10 мл (можно воспользоваться
пикнометром).
На полоску быстрофильтрующей бумаги для хроматографии
(8x30 см), нропитанной 40 % -ным раствором формамида в мети-
ловом спирте, наносят 0,01 мл (200 мкг) 2 % -ного хлороформного
раствора препарата и на расстоянии 2—3 см — 0,02 мл (4 мкг)
0,02 %-ного спиртового раствора стандартного образца кортизо-
на. Хроматографируют нисходящим методом в камере со смесью
бензол—хлороформ (1:1) в течение 1,5—2 ч. Хроматограмму вы-
нимают из камеры, отметив графитовым карандашом конечное
положение фронта подвижной фазы, подсушивают на воздухе в
течение 5 мин, затем 30—40 мин в сушильном шкафу при 105—
110 °C и просматривают на ультрахимископе через люминесцент-
ную пластинку.
Посторонние пятна на хроматограмме должны отсутствовать.
Допускается пятно кортизона, расположенное на уровне пятна
стандартного образца и не превышающее его по совокупности ве-
личины и интенсивности (не более 2 % в препарате). Делают за-
ключение о доброкачественности лекарственного средства.
213
6.2.2. Хроматография в тонком слое сорбента
Хроматографический процесс, протекающий при движении
подвижной фазы в тонком слое сорбента (носителя), нанесенном
на инертную поверхность, называется хроматографией в тонком
слое сорбента. Неподвижной фазой в данном случае является сам
твердый сорбент либо вещества, предварительно на него нанесен-
ные. Механизм хроматографического разделения может быть раз-
личным, но чаще всего он является адсорбционным. Перемеще-
ние подвижной фазы в слое сорбента с целью упрощения аппара-
турного оформления процесса хроматографирования, как прави-
ло, осуществляется восходящим методом, т. е. под действием
капиллярных сил.
По сравнению с хроматографией на бумаге хроматография в
тонком слое сорбента имеет ряд преимуществ, основными из ко-
торых являются: высокая скорость процесса хроматографирова-
ния, возможность использования в качестве неподвижных фаз
(носителей) разнообразных сорбентов, а также сильнокислых,
щелочных или иных взаимодействующих с бумагой подвижных
фаз и жестких методов открытия пятен путем обработки хрома-
тограмм агрессивными веществами при повышенных температу-
рах.
Для хроматографирования могут использоваться готовые пла-
стинки с закрепленным слоем сорбента, выпускаемые промыш-
ленностью, и пластинки со специально приготовленным тонким
слоем сорбента.
Для разделения веществ методом хроматографии в тонком слое
сорбента используют хроматографические камеры подходящего
размера. На дно камеры наливают подвижную фазу в количестве,
достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру за-
крывают и выдерживают для насыщения парами растворителей
30—60 мин. Стенки камеры для полноты насыщения можно об-
кладывать фильтровальной бумагой. Анализируемый раствор на-
носят микропипеткой или микрошприцем на линию старта, про-
веденную на расстоянии 2—3 см от нижнего края пластинки, так,
чтобы пятна образцов отстояли друг от друга от краев слоя сор-
бента ие менее чем на 2 см. Нежелательное растекание пятен ана-
лизируемых проб при нанесении предотвращают путем периоди-
ческого подсушивания.
После окончательного высыхания нанесенных на линию стар-
та пятен пластинку вносят в камеру. Нижний край пластинки
при этом должен погрузиться в подвижную фазу на 0,5—1 см.
Лластинки с закрепленным слоем сорбента располагают под
углом 60—90°, а пластинки с незакрепленным слоем сорбента —
214
под углом 15—20° к поверхности жидкости. Когда фронт раство-
рителя пройдет 10—15 см, пластинку вынимают, отмечают поло-
жение фронта и открывают пятна хроматографировавшихся ве-
ществ, как указано в соответствующей частной статье. Опрыски-
вание незакрепленного слоя сорбента проводят немедленно после
завершения процесса хроматографирования, не допуская высы-
хания хроматограммы. Результаты хроматографирования оцени-
вают, как описано в разделе “Хроматография на бумаге” в ГФ XI.
При необходимости можно достигнуть лучшего разделения ана-
лизируемых смесей веществ методами хроматографии на бумаге
и в тонком слое сорбента, применив специальные приемы хрома-
тографирования — повторное и двухмерное.
Повторное хроматографирование заключается в том, что после
завершения первого хроматографирования пластинку или бумагу
высушивают и подвергают повторному пропусканию той же или
иной подвижной фазы в том же направлении. При двухмерном
хроматографировании повторное пропускание той же или иной
подвижной фазы осуществляют в направлении, перпендикуляр-
ном направлению первоначального движения. Двухмерное хро-
матографирование целесообразно осуществлять на квадратных
пластинках или листах бумаги. Анализируемая проба при этом
наносится на диагональ квадрата вблизи одного из его углов.
Двухмерную хроматографию с использованием одной и той же
подвижной фазы часто применяют для проверки устойчивости
веществ в условиях хроматографирования. Устойчивые вещества
образуют пятна, лежащие только на диагонали пластинки или
листа бумаги [9, 10, 19].
Работа 6. Изучение возможностей применения метода
тонкослойной хроматографии в фармакопейном анализе
Задание 1. Определить подлинность дэфедрина в таблетках
дэфедрина.
Подлинность. А. Ультрафиолетовые спектры поглощения ра-
створов препарата и стандарта, приготовленных для количествен-
ного определения, в области от 230 до 300 нм имеют максимумы,
минимумы и плечи при одних и тех же длинах волн.
Б. Навеску порошка растертых таблеток, эквивалентную 0,3 г
дэфедрина, взбалтывают с 30 мл спирта метилового и фильтруют.
0,01 мл фильтрата (100 мкг дэфедрина) наносят на пластинку со
слоем силикагеля F 254. Рядом в качестве свидетеля наносят
0,01мл (мкг) 1 %-ного раствора дэфедрина стандарта
(ФС 42-2685-89) в спирте метиловом. Пластинку подсушивают на
воздухе, помещают в камеру со смесью растворителей бутилаце-
215
тат—ацетон—спирт н-бутиловый—раствор аммиака—спирт мети-
ловый (4:2:2:1:1) и хроматографируют восходящим методом. Ког-
да фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее выни-
мают из камеры, сушат в токе теплого воздуха, опрыскивают ра-
створом, содержащим 0,3 г нингидрина в смеси 100 мл спирта
н-бутилового и 3 мл кислоты уксусной ледяной, и сушат в су-
шильном шкафу при температуре 120 °C в течение 20 мин. На
хроматограмме испытуемого препарата наблюдается пятно, нахо-
дящееся на одном уровне с пятном на хроматограмме стандарта.
Задание 2. Идентифицировать андрогены и анаболики мето-
дом ТСХ (тестостерона пропионат, метилтестостерон, метандрос-
тенолон, метиландростендиол).
Хроматографирование проводят на пластинках марки “Силу-
фол-254” размером 5x10 см. На линию старта наносят 0,01 мл
0,1 % -ного раствора препарата в этаноле и смесь веществ. Хрома-
тографируют восходящим методом в системе растворителей гек-
сан—ацетон (7:3). После разделения пластинку сушат на воздухе,
детекцию пятен проводят в УФ-свете или опрыскиванием
10 % -ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в ацетоне
(хроматограммы нагревают в сушильном шкафу при 110—120 °C
в течение 1—2 мин). Рассчитывают значения Rf.
Задание 3. Приготовить пластинки и системы для хроматогра-
фии.
Для хроматографии в тонком слое сорбента приготовить плас-
тинки в соответствии с методикой ГФ X и системы: 1) хлоро-
форм — метанол — 25% -ный раствор аммиака в отношении
100:25:1 и 2) ацетон — бензол — вода в отношении 65:30:5.
Задание 4, Определить посторонние примеси в лекарственных
препаратах методом ТСХ (Журнал “Фарматека”. 1998. № 1—5)
Подтверждение отсутствия посторонних примесей в ме-
тилурациле
METHYLURACILUM (Метилурацил)
2,4-Ди-окси-6-метил-1,2,3,4-тетрагидропиримидин (C6H6N2O2,
ММ 126,12)
Препарат содержит не менее 99,0 % C6H6N2O2 в пересчете на
сухое вещество.
Описание. Белый кристаллический порошок.
Посторонние примеси ТСХ. 0,05 г препарата растворяют в 5 мл
смеси вода—кислота уксусная ледяная (1:1). 0,02 мл полученно-
го раствора (200 мкг) наносят на пластинку со слоем силикагеля F.
Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе при темпе-
ратуре от 100 до 110 °C в течение 5 мин, помещают в камеру со
216
смесью растворителей хлороформ—спирт метиловый—кислота
уксусная ледяная (95:10:2) и хроматографируют восходящим ме-
тодом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки,
ее вынимают из камеры, сушат на воздухе при температуре от
100 до 110 °C в течение 10 мин, охлаждают, опрыскивают 1 % -ным
раствором п-диметиламинобензальдегида в смеси кислота хлори-
стоводородная концентрированная—спирт метиловый (1:3) и на-
гревают при температуре от 100 до 105 °C в течение 2 мин.
На хроматограмме должно появиться только одно пятно ос-
новного вещества. Наличие посторонних пятен недопустимо.
Определение посторонних примесей в салициламиде без-
эта лонным методом
SALICYLAMIDUM (Салициламид)
Амид кислоты салициловой (C7N7NO2, ММ 137,14).
Препарат содержит не менее 99,0 % C7N7NO2.
Описание. Белый кристаллический порошок без запаха. При
нагревании возгоняется.
Посторонние примеси. 0,1 г препарата растворяют в 5 мл спирта
метилового. 0,01 мл полученного раствора (200 мкг) наносят на
пластинку со слоем силикагеля F 254. Рядом в качестве свидетеля
наносят 0,01 мл (2 мкг) 0,02 % -ного раствора препарата в спирте
метиловом. Пластинку сушат на воздухе, помещают в камеру со
смесью растворителей н-бутилацетат—хлороформ—кислота мура-
вьиная (3:2:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда
фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают
из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете при 254 нм.
Пятно посторонней примеси на хроматограмме препарата по
совокупности величины и интенсивности окраски не должно пре-
вышать пятно на хроматограмме свидетеля.
Допускается пятно на линии старта.
Примечание. Испытание проводят в защищенном от света
месте. Растворы готовят непосредственно перед испытанием. Смесь
для хроматографирования используют только один раз.
Определение посторонних примесей в мезапаме безэталон-
ным методом
MEZAPAMUM (Мезапам)
7-Хлор-2,3-дигидро-1-метил-5-фенил-1Н-1,4-бензодиазепин
(C16H15C1N2, ММ 270,78)
Препарат содержит не менее 99,0 % C16H15C1N2 в перерасчете
на сухое вещество.
Описание. Светло-желтый или светло-желтый с зеленоватым
оттенком кристаллический порошок без запаха.
217
Посторонние примеси. 0,25 г препарата растворяют в 2,5 мл
ацетона. 0,005 мл полученного раствора (500 мкг) наносят на пла-
стинку со слоем силикагеля F 254. Рядом в качестве свидетеля
наносят 0,005 мл (0,5 мкг) 0,01 % -ного раствора препарата в аце-
тоне. Пластинку с нанесенными пробами сушат иа воздухе, поме-
щают в камеру со смесью растворителей гексаи—диэтиламин—
бензол (16:3:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда
фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают
из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете при
254 нм.
Любое пятно посторонней примеси на хроматограмме препара-
та по совокупности величины и интенсивности окраски не долж-
но превышать пятно на хроматограмме свидетеля. Суммарное со-
держание посторонних примесей не должно превышать 0,2 %.
Примечание. Используют свежеприготовленные растворы,
анализ проводят в защищенном от света месте.
Определение посторонних примесей в синзстрохе белэта-
лонным методом
SYNOESTROLUM (Синэстрол)
Мезо-3,4-бис(4-Гидроксифенил) гексан.
Hexestrol
Препарат содержит не менее 99,0 % С18Н22О2 в пересчете иа
сухое вещество.
Описание. Белый или белый со слегка желтоватым оттенком
порошок, без запаха.
Посторонние примеси. 0,05 г препарата растворяют в 5 мл
спирта 95 % -ного. 0,005 мл полученного раствора (50 мкг) нано-
сят на пластинку со слоем силикагеля F. Рядом в качестве свиде-
теля наносят 0,005 мл (0,25 мкг) 0,005 % -ного раствора препара-
та в спирте 95 % -ном. Пластинку с нанесенными пробами сушат
на воздухе, помещают в камеру со смесью растворителей бензол—
гексан—ацетон (5:2:2) и хроматографируют восходящим методом.
Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вы-
нимают из камеры, сушат на воздухе, опрыскивают 5 %-ным ра-
створом кислоты фосфорно-молибденовой в спирте 95 %-ном и
сушат в вытяжном шкафу в течение 1—2 мин при температуре от
95 до 100 °C.
На хроматограмме препарата должно появиться не более двух
посторонних примесей.
Пятно посторонней примеси на хроматограмме препарата по
совокупности величины и интенсивности окраски не должно пре-
вышать пятно на хроматограмме свидетеля.
218
Определение примеси гидразина в изониазиде
IZONIAZIDUM (Изониазид)
Гидразид кислоты изоникотиновой
Препарат содержит не менее 99,0 % C6H7N3O в пересчете на
сухое вещество.
Описание. Белый кристаллический порошок без запаха.
Определение гидразина. 1 г препарата растворяют в 10 мл сме-
си ацетон—вода (1:1). 0,01 мл полученного раствора (1000 мкг)
наносят на пластинку со слоем силикагеля F 254. Рядом в каче-
стве свидетеля наносят 0,002 мл 0,04 %-ного раствора гидразина
сульфата (эквивалент 0,2 мкг гидразина) в смеси ацетон—вода
(1:1). Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, поме-
щают в камеру со смесью растворителей ацетон—вода (49:1) и
хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвиж-
ной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры,
сушат на воздухе, опрыскивают 1 % -ным раствором п-диметил-
аминобензальдегида в спирте 95 %-ном и сушат при температуре
от 100 до 105 °C в течение 5 мин.
Пятно посторонней примеси на хроматограмме препарата, на-
ходящееся на уровне пятна свидетеля, по совокупности величи-
ны и интенсивности окраски не должно превышать пятно на хро-
матограмме свидетеля (не более 0,02 % в препарате).
Допускается пятно на линии старта.
Задание 5. Определить посторонние примеси в различных ле-
карственных формах методом ТСХ.
Оценка суммарного содержания посторонних примесей в
глазных каплях
Раствор сульфацил-натрия
(п-Аминобензолсульфонилацетамид-натрий)
Посторонние примеси. Препарат разбавляют водой до концен-
трации 4 %. 0,01 мл полученного раствора (400 мкг сульфацил-
натрия), наносят на пластинку со слоем силикагеля F 254. Рядом
в качестве свидетеля наносят 0,01 мл (20 мкг) 0,2 % -ного раство-
ра стрептоцида (ФС 42-2744-90).
Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помеща-
ют в камеру со смесью растворителей спирт н-бутиловый — спирт
95 % -ный — вода — аммиака раствор концентрированный (10:5:5:2)
и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвиж-
ной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры,
сушат при температуре 100—105 °C в течение 10 мин и опрыскива-
ют 2 % -ным раствором 4-диметиламинобензальдегида в смеси вода —
кислота хлористоводородная концентрированная (9:11).
219
Суммарное содержание посторонних примесей, оцененное по
совокупности величины и интенсивности окраски их пятен на
хроматограмме препарата в сравнении с пятном на хроматограм-
ме свидетеля, не должно превышать 5 %.
Подтверждение отсутствия посторонних примесей в суп-
позиториях
Свечи с метилурацилом
(6-метил-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-2,4-дионом)
Посторонние примеси. Навеску препарата, эквивалентную 0,5 г
метилурацила, нагревают на водяной бане с 50 мл смеси вода —
кислота уксусная ледяная (1:1) до расплавления основы, взбал-
тывают в течение 5 мин при периодическом нагревании, охлаж-
дают во льду и фильтруют. 0,02 мл полученного раствора (200 мкг
метилурацила) наносят на пластинку со слоем силикагеля F. Ря-
дом в качестве свидетеля наносят 0,02 мл (200 мкг) 1 %-ного
раствора метилурацила стандарта в той же смеси растворителей.
Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, выдержи-
вают в течение 5 мин при температуре 105 °C, помещают в камеру
со смесью растворителей хлороформ — спирт метиловый — кис-
лота уксусная ледяная (95:10:2) и хроматографируют восходящим
методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластин-
ки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе, выдерживают при
температуре 105 °C в течение 10 мин, охлаждают, опрыскивают
1 % -ным раствором n-диметиламинобензальдегида в смеси кис-
лота хлористоводородная концентрированная — спирт метиловый
(1:3) и выдерживают в течение 5 мин при температуре 105 °C.
На хроматограмме препарата должно появиться только одно
пятно.
Определение содержания примесей в таблетках
Таблетки бромгексина
[N-( 2-Амино-3,5-дибромбензил)-Ы-метил циклогекси ламина
гидрохлорида]
Посторонние примеси. Навеску порошка растертых таблеток,
эквивалентную 0,025 г бромгексина, встряхивают в течение 3 мин
с 5 мл хлороформа и фильтруют. 0,02 мл полученного раствора
(100 мкг бромгексина) наносят на пластинку со слоем силикагеля
F 254. Рядом в качестве свидетеля наносят 0,005 мл (0,25 мкг)
0,005 % -ного раствора бромгексина стандарта (ВФС 42-1002-80) в
хлороформе. Пластинку с нанесенными пробами сушат на возду-
хе, помещают в камеру со смесью растворителей гептан—этил-
ацетат (1:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда
220
фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из
камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете при 254 нм.
Пятно посторонней примеси на хроматограмме препарата по
совокупности величины и интенсивности окраски не должно пре-
вышать пятно на хроматограмме свидетеля.
Подтверждение подлинности (содержание триамциноло-
на ацетонида) в мази Триакорт
UNGUENTUM TRIACORTUM (мазь Триакорт)
Мазь Триакорт содержит триамцинолона ацетонид (ИР, 16а,
17а, 21а-тетрагидрокси-9а-фторпрегна-1,4-диен-3,20-дион-16,17-
ацетонид), димексид (диметилсульфоксид), 1,2-пропиленгликоль
и глицерин.
Описание. Мазь желтовато-белого цвета.
Подлинность. Триамцинолона ацетонид. Точную навеску пре-
парата, эквивалентную около 0,0005 г триамцинолона ацетонида,
нагревают на кипящей водяной бане при перемешивании с 30 мл
смеси спирт метиловый — гексан (1:1) в течение 2 мин, охлажда-
ют, переносят в делительную воронку, промывают колбу 35 мл
гексана и 10 мл спирта метилового, присоединяя растворители к
содержимому делительной воронки, прибавляют 2 мл воды и встря-
хивают в течение 2 мин. После отстаивания нижний слой перено-
сят в делительную воронку, содержащую раствор 1,5 г натрия хло-
рида в 70 мл воды, прибавляют 60 мл хлороформа и встряхивают в
течение 3 мин. После отстаивания нижний слой фильтруют через
бумажный фильтр с 3 г натрия сульфата безводного в мерную кол-
бу вместимостью 100 мл. Извлечение повторяют с 35 мл хлорофор-
ма, фильтруя хлороформ в ту же колбу, промывают фильтр 5 мл
хлороформа, присоединяя хлороформ к фильтрату, доводят объем
раствора хлороформом до метки и перемешивают (раствор А).
20 мл раствора А упаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл
хлороформа. 0,1 мл полученного раствора (10 мкг триамцинолона
ацетонида) наносят полосой около 1 см на пластинку со слоем
силикагеля F 254. Рядом в качестве свидетеля наносят такой же
полосой 0,02 мл (10 мкг) 0,05 %-ного раствора триамцинолона
ацетонида стандарта (ВФС 42-2036-91) в хлороформе. Пластинку
сушат на воздухе, помещают в камеру со смесью растворителей
хлороформ — спирт 95%-ный — вода (135:15:0,75) и хроматогра-
фируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дой-
дет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на возду-
хе и опрыскивают раствором тетразолиевого синего.
На хроматограмме препарата наблюдается пятно, находящее-
ся на одном уровне с пятном на хроматограмме стандарта.
221
Примечание. 0,05 г тетразолиевого синего растворяют при
нагревании в 25 мл спирта метилового, полученный раствор сме-
шивают с 30 % -ним раствором гидроксида натрия в соотношении 1:3.
Определение содержания примесей в инъекционном растворе
Кислая виннокаменная соль циклического диэфира
1 -метилпирролизидина
Препарат удовлетворяет требованиям ГФ XI для инъекцион-
ных лекарственных форм и имеет следующие показатели.
Описание. Бесцветная прозрачная жидкость.
Посторонние примеси. Препарат в объеме, эквивалентном
200 мкг платифиллина гидротартрата, наносят на пластинку со
слоем силикагеля F. Рядом в качестве свидетеля наносят 0,01 мл
(2 мкг) 0,02 %-ного раствора платифиллина гидротартрата стан-
дарта. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, по-
мещают в камеру со смесью растворителей хлороформ — спирт
метиловый — аммиака раствор концентрированный (85:14:1) и
хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвиж-
ной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры,
сушат на воздухе и опрыскивают модифицированным реактивом
Драгендорфа.
Пятно любой посторонней примеси на хроматограмме препа-
рата по совокупности величины и интенсивности окраски не долж-
но превышать пятно на хроматограмме свидетеля.
Задание 6. Освоить методику хроматоспектрофотометрическо-
го определения хлорпропамида.
Готовят пластинки с закрепленным слоем силикагеля марки
КСК. Около 0,Об г растертых таблеток (точная масса) помещают в
мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в небольшом
объеме этанола, доводят тем же растворителем до метки и фильт-
руют. На пластинку на линию старта наносят с помощью капил-
лярной пипетки 0,1 мл полученного раствора, а также два пятна
свидетеля (0,05 % -ного раствора хлорпропамида, приготовленно-
го из препарата, соответствующего требованиям ГФ X). Пятна
подсушивают на воздухе и хроматографируют в системе ацетон
— бензол — вода (65:30:5). После хроматографирования пластин-
ку высушивают в вытяжном шкафу. Проявляют часть пластин-
ки, соответствующую зоне одного свидетеля, о-толуидиновым ре-
активом. Часть пластинки, соответствующую второму свидетелю
и испытуемому раствору, закрывают предметным стеклом. Зоны,
содержащие свидетель и испытуемый образец, снимают, помеща-
ют в отдельные колбы, элюируют этанолом. Определяют значе-
ние оптической плотности растворов, полученных из зоны, соот-
222
ветствующей свидетелю (Ар и испытуемому образцу (А2) при
232 нм. Содержание хлорпропамида вычисляют по формуле
_ А, 0,0005тср
А,т
где 0,0005 г/мл — содержание хлорпропамида в эталонном ра-
створе; тср — средняя масса таблетки, г; m — масса навески,
взятая на анализ, г.
6.2.3. Газовая и жидкостная хроматография
Газовая хроматография в последние годы получила широкое
развитие в фармацевтическом анализе благодаря тому, что позво-
ляет одновременно разделить анализируемую смесь и определить
входящие в ее состав вещества количественно.
Газовая хроматография — это хроматография, в которой под-
вижная фаза, содержащая определяемые компоненты, находится
в состоянии газа или пара. В фармацевтическом анализе приме-
няется как газожидкостная (ГЖХ), так и газоадсорбционная (ГАХ)
хроматография. В ГЖХ неподвижной фазой служит жидкость,
нанесенная на твердый носитель, в ГАХ — твердый адсорбент.
Анализируемые вещества вводятся в поток газа-носителя, испа-
ряются в испарителе и в парообразном состоянии проходят через
колонку с сорбентом, разделяясь на отдельные компоненты. Раз-
деленные вещества элюируются из колонки газом-носителем, ре-
гистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде
пиков. Полученная хроматограмма служит основой для качествен-
ного и количественного анализа смеси веществ.
Метод газовой хроматографии применяется для оценки добро-
качественности лекарственных средств, так как позволяет выде-
лить и одновременно определить количественно содержание в них
примесей; для количественного определения индивидуальных ле-
карственных веществ в смеси; для определения подлинности и
количественного содержания лекарственных веществ, входящих
в состав сложных лекарственных форм; для определения содер-
жания воды и летучих веществ в лекарственных средствах; для
определения консервантов, входящих в состав лекарственных
форм; для определения этанола в спиртсодержащих лекарствен-
ных формах и т. д.
Определение проводят на газовых хроматографах, состоящих
из ряда систем: измерения и регулирования потока газа-носителя
и вспомогательных газов (для детектора); ввода пробы анализи-
руемого образца; газохроматографических колонок, а также сис-
тем детектирования, регистрации (и обработки) хроматографиче-
223
ской информации; термостатирования и контроля температуры
колонок, детектора и системы ввода проб, обеспечивающих необ-
ходимый температурный режим анализа. Наиболее часто приме-
няют детектор по теплопроводности (катарометр) и по ионизации
в пламени.
Действие детектора по теплопроводности основано на измене-
нии теплопроводности газа-носителя в присутствии других ве-
ществ. Он характеризуется большой универсальностью, так как
чувствителен практически ко всем летучим органическим соеди-
нениям. Действие более чувствительного пламенно-ионизацион-
ного детектора основано на измерении тока насыщения ионизи-
рованной газовой смеси в зависимости от ее состава. Детектор
чувствителен к органическим соединениям и не чувствителен к
парам воды. Кроме этих детекторов в газохроматографическом
анализе лекарственных веществ, особенно если требуется повы-
шенная чувствительность определения, можно использовать се-
лективные детекторы, такие, как термоионный и электронозах-
ватный.
Системы термостатирования и контроля температуры колонок,
детектора, узла ввода пробы предназначены для обеспечения не-
обходимых температурных режимов анализа.
Качественный анализ. Наиболее используемыми методами ка-
чественного анализа, применяемыми для идентификации лекар-
ственных веществ, являются метод веществ-свидетелей и метод
относительных удерживаний.
Метод веществ-свидетелей заключается в том, что непосред-
ственно после анализа исследуемого образца в идентичных усло-
виях проводят хроматографирование веществ, присутствие кото-
рых в исследуемой пробе вероятно. Совпадение времен удержива-
ния любого из компонентов анализируемой пробы и вещества-
свидетеля может служить доказательством идентичности обоих
веществ. Можно ввести вещество-свидетель прямо в анализируе-
мый образец. В этом случае критерием идентичности служит уве-
личение соответствующего пика на хроматограмме. Поскольку
соединения различной структуры могут иметь совпадающие вре-
мена удерживания (удерживаемые объемы), для большей досто-
верности проводимой идентификации хроматограммы анализи-
руемого образца и веществ-свидетелей должны быть сняты мини-
мум на двух колонках с неподвижными жидкими фазами, отли-
чающимися по полярности. Для идентификации веществ по методу
относительных удерживаний проводят анализ образца в услови-
ях, указанных в конкретной методике, причем предварительно к
224
пробе прибавляют определенное количество указанного в методи-
ке вещества сравнения. Относительное удерживание (г) определя-
ется по формуле
Г = *R ~ to /(tRq, — to),
где tR — время газохроматографического удерживания анализи-
руемого вещества; — время удерживания веществ сравнения;
t0 — время удерживания несорбирующего вещества.
Количественный анализ. Количественный анализ проводят с
учетом измерения параметров пиков веществ на хроматограммах.
Практически используют два параметра пиков: площадь или вы-
соту. Наиболее часто применяемым параметром является площадь
пика.
Площади пиков на хроматограмме определяют одним из сле-
дующих способов: умножением высоты пика (h) на его ширину
(Ц05), измеренную на половине его высоты; планиметрировани-
ем; с помощью интегратора. В связи с тем, что чувствительность
детекторов по отношению к разделяемым веществам, как прави-
ло, неодинакова, в необходимых случаях количественному опре-
делению предшествует градуировка прибора.
Существуют три основных метода количественного анализа:
метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации
и метод внутреннего стандарта.
Метод абсолютной градуировки основан на предварительном
определении зависимости между количеством введенного веще-
ства и площадью или высотой пика на хроматограммах. В хрома-
тограф вводят известное количество градуировочной смеси и оп-
ределяют площади или высоты полученных пиков. Строят гра-
фик зависимости площади или высоты пика от количества вве-
денного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют
площадь или высоту пика определяемого компонента и на осно-
вании градуировочного графика рассчитывают его количество.
Метод внутренней нормализации основан на приведении к
100 % суммы площадей пиков на хроматограмме.
Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного
определяющего параметра пика анализируемого вещества с тем же
параметром вещества сравнения, введенного в пробу в известном
количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество та-
кого вещества сравнения, пик которого достаточно хорошо разделя-
ется с компонентами исследуемой смеси. Проводят анализ пробы с
веществом и рассчитывают количество определяемого вещества.
Последние два метода требуют введения поправочных коэффи-
циентов, характеризующих чувствительность используемых ти-
15. Заказ 3547
225
пов детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов
детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности оп-
ределяется экспериментально [9, 10, 8, 31].
Работа 7. Определение примеси салициловой кислоты в
ацетилсалициловой методом высокоэффективной жидкост-
ной хроматографии (ВЭЖХ)
ВЭЖХ (жидкостная хроматография высокого давления) явля-
ется вариантом колоночной жидкостной хроматографии, в кото-
рой выдвижная фаза — элюент — проходит через заполняющий
колонку сорбент с большой скоростью за счет значительного дав-
ления на входе в хроматографическую колонку.
ВЭЖХ — удобный способ разделения, препаративного выделе-
ния и проведения количественного и качественного анализа неле-
тучих термолабильных соединений как с малой, так и с большой
молекулярной массой.
Объектом исследования является ацетилсалициловая кислота
(фармакопейная).
Работу проводят на жидкостном хроматографе “Милихром”.
Хроматографическая колонка из нержавеющей стали длиной 62 мм
с внутренним диаметром 2 мм заполнена сорбентом с обращенной
фазой С8 или С18 (силикагель с привитыми гидрофобными груп-
пами). Плотная упаковка частиц адсорбента малого размера (5 мкм)
в колонке позволяет получить высокоэффективное хроматогра-
фическое разделение компонентов смеси.
Насос высокого давления обеспечивает подачу элюента в ко-
лонку с заданной постоянной скоростью.
В качестве детектора используют микроспектрофотометр с пе-
ременной (190—900 нм) длиной волны.
Условия хроматографирования:
Элюент 40 %-ный этанол в 1 %-ной уксусной кислоте
Скорость потока элюента Длина волны 50 мкл/мин 280 нм (соответствует максимуму поглощения определяемых веществ)
Диапазон чувствительности Объем пробы Скорость диаграммной ленты Время измерения 0,8 о.е. 5 мкл 180 мм/ч 0,6 с
Работу начинают с приготовления раствора ацетилсалицило-
вой кислоты в этаноле с концентрацией 4 мг/мл и раствора сали-
циловой кислоты в этаноле с концентрацией 1 мг/мл. Задают
программу хроматографирования (длину волны, чувствительность,
226
время измерения, скорость диаграммной ленты). Заполняют на-
сос элюентом, для чего:
— открывают кран на 2—3 оборота резьбы;
— переключают тумблер в положение “набор”;
— устанавливают скорость набора элюента, переключив тумб-
лер скорости в положение “Промывка”;
— отсоединяют иглу от колонки и помещают в ее же гнездо;
— включают кнопку “Стоп” как только появится мениск, что
свидетельствует о полном заполнении колонки.
Ликвидируют люфт, для чего:
— переключают тумблер в положение “набор”;
— - устанавливают объем элюента — 14 мкл;
— устанавливают скорость набора элюента в интервале 50—
100 мкл/мин;
— включают команду “пуск”.
Отбирают пробу в иглу, для чего:
— набирают 5 %-ную уксусную кислоту (10 мкл) для создания
одинакового pH пробы и элюента;
— набирают раствор ацетилсалициловой кислоты в этаноле
(5 мкл);
— набирают вновь 5 %-ную уксусную кислоту (10 мкл);
— вводят иглу с пробой в колонку;
— закручивают колонку.
Хроматографирование раствора ацетилсалициловой кислоты
проводят не менее 3 раз, затем проводят хроматографирование
раствора салициловой кислоты, предварительно отобрав его иглу
так же, как ацетилсалициловую.
Полученные хроматограммы представлены на рис. 6.13.
Рис. 6.13. Хроматограммы: а) ацетилсалициловой кислоты; б) салициловой
кислоты: 1 — ацетилсалициловая кислота; 2 — салициловая кислота
15*
227
На хроматограмме идентифицируют пик (качественное опре-
деление), принадлежащий салициловой кислоте, используя дан-
ные хроматографирования индивидуального раствора салицило-
вой кислоты (по равенству объемов или времен удерживания пи-
ков).
Содержание примеси салициловой кислоты в ацетилсалицило-
вой рассчитывают по формуле
где Сх — содержание салициловой кислоты в ацетилсалицило-
вой, мг/мл; hx — высота соответствующего пика на хроматограм-
ме; сст — концентрация салициловой кислоты в стандартном ра-
створе; Ьст — высота стандартного пика на хроматограмме [10].
Работа 8. Определение подлинности, количественного
состава и содержания примесей в фармацевтических пре-
паратах методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ)
Задание 1. Провести фармакопейный анализ лекарственной
формы методом газожидкостной хроматографии.
Лекарственная форма
Камфоры рацемической для инъекций — 200 г
Масла персикового — до 1 л
Подтверждение подлинности камфоры
Подлинность подтверждают, снимая хроматограммы двух аце-
тоновых растворов. Один из них содержит испытуемый препарат,
а в другой прибавляют синтетической левовращающей или нату-
ральной правовращающей камфоры. О подлинности препарата
судят по значительному увеличению основного пика камфоры.
Колонка
Условия хроматографирования:
Температура колонки
Температура испарителя
Скорость газа-носителя
Детектор
300x0,3 см, заполненная сорбентом
10 % Апиезона L на полихроме
160 °C
200 °C
20 мл/мин
катарометр или пламенно-ионизацион-
ный
Готовят раствор инъекционного препарата камфоры в ацетоне
из расчета 1:5 (5 мл инъекционного раствора камфоры разбавля-
ют ацетоном в мерной колбе на 25 мл).
Приготовленный раствор делят на две части. Отбирают 1 мкл
приготовленного раствора микрошприцем и вводят в испаритель
хроматографа. Получают хроматограмму с двумя большими пи-
ками: первый — пик, соответствующий растворителю (ацетону);
228
второй — предположительно пик камфоры. Идентификацию вто-
рого пика проводят методом добавок. Для этого во вторую часть
приготовленного раствора добавляют кристаллик камфоры. Пос-
ле растворения в испаритель хроматографа вводят 1 мкл получен-
ного раствора с добавкой камфоры. Записывают хроматограмму,
на которой высота второго пика должна увеличиться. Наблюдае-
мое увеличение пика подтверждает подлинность камфоры.
Количественное определение камфоры
в растворе для инъекций
Для количественного определения может быть использована
первая часть приготовленного выше ацетонового раствора лекар-
ственной формы без добавки. Записывают не менее трех хрома-
тограмм, вводя в испаритель хроматогрофа по 1 мкл ацетонового
раствора лекарственной формы. Измеряют высоту (h) и ширину
по половине высоты (Цо 5) всех пиков на хроматограмме, кроме
пика растворителя (ацетона). Рассчитывают площадь каждого пика
по формуле S = ц0 5h. Расчет содержания камфоры проводят мето-
дом внутренней нормализации как отношение площади (высоты)
пика камфоры к сумме площадей (высот) пиков всех компонен-
тов (кроме ацетона). Ответ выражают в процентах:
X, =S,/jrs.100%, или X,=h,/£h, 100%.
i=i i=i
Содержание камфоры в лекарственной форме согласно требо-
ванию ФС должно быть не менее 97 %.
Делают вывод о соответствии лекарственной формы требова-
нию ФС.
Задание 2. Определить посторонние примеси в лекарственном
препарате методом газожидкостной хроматографии.
Исследуемый лекарственный препарат — бензилбензоат меди-
цинский. Для определения примесей в испаритель хроматографа
вводят 0,2 мкл препарата.
Посторонние примеси. 0,2 мкг препарата вводят в газовый
хроматограф.
Условия хроматографирования:
Колонка 300x0,3 см, заполненная сорбентом 5 % SE-30 на хроматоне N-AW (0,2—0,25 мм)
Температура колонки 150 °C
Температура детектора 200 °C
Температура испарителя 200 °C
Скорость газа-носителя (гелий) 30 мл/мин
Детектор пламенно-ионизационный
229
Определение содержания бензальдегида и спирта бензилового
проводят по калибровочным графикам, построенным при введе-
нии в хроматограф 0,2 мкл 0,02 %-, 0,05 %- и 0,08 %-ных ра-
створов бензальдегида в эфире и 0,2 %-, 0,5 %- и 0,8 %-ных
растворов спирта бензилового в эфире.
Содержание бензальдегида должно быть не более 0,05 %, а
спирта бензилового — не более 0,5 %.
Примечание. После ввода 4 анализируемых проб препарата
температуру колонки поднимают до 220 °C для вывода бензилбен-
зоата из колонки.
Работа 9. Изучение возможностей применения метода
газовой хроматографии в фармакопейном анализе
лекарственных форм
Лекарственная форма
Абисил — 200 г
Масла персикового — до 1 л
Задание 1. Установить подлинность лекарственных средств,
входящих в состав лекарственной формы, газохроматографичес-
ким методом.
Для получения, хроматограммы исследуемого препарата берут
0,5 г его (точная навеска) и растворяют в 100 мл диэтилового эфира
(точный объем). Микрошприцем отбирают 1 мкл приготовленного
раствора и вводят в испаритель хроматографа. Используют газовый
хроматограф любой марки. Детектор — катарометр или плазменно-
ионизационный. Колонка стальная длиной 3 м, диаметром 3 мм.
Сорбент — Апиезон L на полихроме в количестве 10 % от массы
носителя. Газ-иоситель —гелий, скорость газа-носителя —
20 мл/мин. Условия хроматографирования: температура испарите-
ля и детектора — 200 °C. Температурный режим колонки програм-
мируется. Начальная температура колонки — 12 5 °C выдерживает-
ся 30 мин, затем колонку нагревают до 180 °C со скоростью 20 °C в
минуту и 15 мин хроматографируют при 180 °C.
Для установления подлинности сравнивают полученную хро-
матограмму лекарственного препарата со стандартной хромато-
граммой, приведенной во временной фармакопейной статье
(ВФС 42-2594-95). Расположение и количество пиков на получен-
ной хроматограмме должно быть идентично стандартной. Если
есть лишние пики — это пнки примесей, которые подлежат коли-
чественной оценке.
Задание 2. Определить содержание примесей в препарате.
Для определения может быть использована хроматограмма
эфирного раствора препарата, полученная в предыдущем задании.
Задание выполняется только в том случае, если на полученной
230
хроматограмме присутствуют пики посторонних вещств, отсут-
ствующих на стандартной хроматограмме.
Если примеси есть, то проводят следующую обработку хрома-
тограммы. Измеряют высоты всех пиков, имеющихся на хрома-
тограмме. Процентное содержание примесей рассчитывают, ис-
пользуя метод внутренней нормализации, как отношение высоты
пика примеси (или суммы высот пиков примесей, если их не-
сколько) к сумме высот всех пиков, имеющихся на хроматограм-
ме. Для хроматограммы с п пиками
X = hx/^hi-lOO%,
1=1
где X — содержание примесей, выраженное в %; hx — высота
пика примеси (сумма высот пиков примесей), см; Ehj — сумма
высот всех пиков, имеющихся на хроматограмме, см.
Аналогичный расчет можно выполнить, используя не высоты,
а площади пиков:
X = Sx/£S, 100%.
1=1
В этом случае проводят дополнительное измерение ширины
пика (ширину пика измеряют на половине его высоты и обзнача-
ют Ц05). Измерения лучше производить, используя специальную
лупу со шкалой с ценой деления 0,01 см. Площадь пика выража-
ют в см2 и рассчитывают как произведение высоты пика на его
ширину, измеренную на 1/2 высоты этого пика:
S =
Согласно требованиям фармакопейной статьи общее процент-
ное содержание примесей не должно превышать 2,5%.
Задание 3. Провести идентификацию и определить количествен-
ное содержание действующего вещества в лекарственной форме
“Абисил” методом ГЖХ.
Если приготовление эфирного раствора препарата в задании 1
проводилось по точной навеске в точно отмеренном объеме эфира,
то полученная в задании 1 хроматограмма может быть использова-
на для дальнейших количественных расчетов. Чтобы осуществить
такие расчеты, производят хроматографирование стандартного об-
разца действующего вещества препарата — борнилацетата в тех же
условиях, что и исследуемого препарата. Стандартный образец го-
товят растворением 0,03 г борнилацетата (точная навеска) в 100 мл
диэтилового эфира (точный объем). 1 мкл полученного стандартно-
го раствора вводят в испаритель хроматографа и проводят хрома-
тографирование в том же температурном режиме, что и раствора
231
препарата. Время удерживания борнилацетата в данных условиях
должно составлять 1 мин. Проводят идентификацию по времени
удерживания (качественный анализ) борнилацетата на хроматог-
рамме раствора препарата. Пик на хроматограмме, время удержи-
вания которого совпадает с временем удерживания стандартного
образца, является пиком борнилацетата.
Измеряют высоты и ширину пиков борнил ацетата на хроматог-
рамме препарата и хроматограмме стандартного образца. Рассчи-
тывают площади пиков, используя вышеприведенную формулу.
Содержание действующего вещества (борнилацетата) в лекар-
ственной форме рассчитывают по формуле
C = Sx 100 100 Mc, /Sn 100Мх,
где С — содержание действующего вещества (борнилацетата) в ле-
карственной форме, %; Sx — площадь пика борнилацетата в препа-
рате, см2; SCT — площадь пика борнилацетата в стандартном образ-
це, см2; Мх — навеска препарата, г; Мст — навеска стандарта, г.
Согласно требованиям ВФС содержание борнилацетата долж-
но быть не менее 2 %.
Делают вывод о соответствии лекарственной формы требова-
ниям ВФС.
Задание 4. Провести фармакопейный анализ лекарственной
формы методом ГЖХ.
Лекарственная форма
Масло камфорное для наружного применения
Описание. Прозрачная маслянистая жидкость.
Определение подлинности масла камфорного
Подлинность. Время удерживания пика на хроматограмме ис-
пытуемого раствора относительно времени удерживания нафта-
лина (внутренний стандарт) должно соответствовать относитель-
ному времени удерживания пика камфоры на хроматограмме смеси
стандартов.
Определение поправочного коэффициента для камфоры
относительно внутреннего стандарта (нафталина)
Поправочный коэффициент для камфоры определяют, анали-
зируя в тех же условиях исскуственную смесь из точных навесок
около 0,1 г стандартов камфоры (ФС 42-2315-93) и нафталина,
растворенных в 100 мл хлороформа. Поправочный коэффициент
(к) вычисляют по формуле
k = (aS0)/(a0S),
где S, So — средние площади пика камфоры и нафталина, см2;
а, ад — навески камфоры и нафталина, г.
232
Определение плотности масла камфорного
Определение проводят при помощи ареометра. Плотность долж-
на составлять от 0,914 до 0,920. Точное значение р записывают и
используют ниже в формуле для количественного расчета.
Количественное определение камфоры в препарате
Плотность. От 0,914 до 0,928.
Количественное определение. К точной навеске препарата, эк-
вивалентной около 0,1 г камфоры, прибавляют около 0,1 г (точ-
ная навеска) нафталина (внутренний стандарт) и растворяют в
100 мл хлороформа.
Хроматографические условия:
300x0,3 см, заполненная сорбентом 5% ПЭГА
на хроматоне N-AW-DMCS (0,20—0,25 мм)
150 °C
220 °C
220 °C
60 мл/мин
пламенно-ионизационный
Колонка
Температура колонки
Температура испарителя
Температура детектора
Скорость газа-носителя
Детектор
Хроматографируют 1—2 мкл испытуемого раствора, регистри-
руя не менее трех хроматограмм.
Содержание камфоры в 1 мл препарата в граммах (X) вычис-
ляют по формуле
X = (a0kSp)/(a|S0),
где S — средняя площадь пика камфоры; So — средняя площадь
пика внутреннего стандарта; at — навеска препарата, г; а0 —
навеска внутреннего стандарта, г; к — поправочный коэффици-
ент для камфоры, определенный ранее; р — плотность препарата,
г/мл, определенная ранее.
Концентрация С10Н16О (камфоры) должна находиться в преде-
лах 95—105 % от концентрации, указанной на этикетке.
Работа 10. Анализ лекарственной формы заводского
производства с применением различных физико-хими-
ческих методов анализа
Лекарственная форма
Корвалол
Этилового эфира а-бромизовалериановой кислоты — 20 г
Фенобарбитала — 18,26 г
Натра едкого — 3,15 г
Масла мяты перечной — 1,42 г
Спирта этилового ректификованного — 580 мл
Воды очищенной — 420 мл
233
Задание 1. Провести количественное определение этилового
эфира а-бромизовалериановой кислоты в корвалоле методом газо-
жидкостной хроматографии.
К точному объему препарата, эквивалентному около 0,1 г эти-
лового эфира а-бромизовалериановой кислоты, прибавляют 1 мл
раствора внутреннего стандарта (камфоры) и перемешивают.
Хроматографические условия:
Колонка 300x0,3 см, заполненная сорбентом 5 %
ПЭГ-1500 на хроматоне N-AW (0,16—0,20 мм)
Температура колонки 120 °C
Температура испарителя 180 °C
Скорость газа-носителя 30 мл/мин
Детектор пламенно-ионизационный
Последовательно хроматографируют по 1 мкл полученного ра-
створа и раствора этилового эфира а-бромизовалериановой кисло-
ты. В 1 мл препарата в граммах (X) определяемое вещество вы-
числяют по формуле
X = Alao/(AolV),
где Aj — среднее значение отношения площадей пиков этилового
эфира а-бромизовалериановой кислоты и камфоры на хромато-
граммах испытуемого раствора; А^ — среднее значение отноше-
ния площадей пиков этилового эфира а-бромизовалериановой кис-
лоты и камфоры на хроматограммах раствора стандарта; а,, —
навеска этилового эфира а-бромизовалериановой кислоты стан-
дарта с учетом его фактического содержания, г; V — объем пре-
парата, взятый для определения, мл.
Примечания. 1. Раствор внутреннего стандарта готовят ра-
створением 1,5 г камфоры в 20 мл спирта 95%-ного.
2. Раствор стандарта готовят из точной навески около 0,1 г
этилового эфира кислоты а-бромизовалериановой. Навеску пре-
парата растворяют в 5 мл спирта 95 %-ного, прибавляют 1 мл
раствора внутреннего стандарта и перемешивают.
Содержание C7HlgBrO2 (этилового эфира кислоты а-бромизо-
валериановой ) в 1 мл препарата должно находиться в пределах
95—105 % от указанного на этикетке.
Задание 2. Провести количественное определение фенобарби-
тала в лекарственной форме “Корвалол” методом УФ-спектрофо-
тометрии.
Точно измеренный объем препарата, эквивалентный около
0,018 г фенобарбитала, помещают в мерную колбу вместимостью
100 мл, доводят объем раствора смесью аммиака раствор — вода
(1:5) до метки и перемешивают.
234
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спек-
трофотометре в максимуме поглощения при длине волны 240 нм
в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Одновременно в тех же условиях измеряют оптическую плот-
ность раствора фенобарбитала стандарта. Раствор стандарта в смеси
аммиака раствор — вода (1:5) с концентрацией фенобарбитала
около 0,000009 г/мл количественно готовят из точной навески
фенобарбитала (ФС 42-2424-93). Концентрацию рассчитывают с
учетом фактического содержания фенобарбитала в стандарте. Со-
держание фенобарбитала в 1 мл препарата в граммах (X) вычис-
ляют по формуле
X =(Alc-lOOlOO)/(AoV-5),
где Aj — оптическая плотность испытуемого раствора; Ау — оп-
тическая плотность раствора фенобарбитала стандарта; с — кон-
центрация фенобарбитала в растворе стандарта, г/мл; V — объем
препарата, взятый для определения, мл.
Содержание C12H12N2O3 (фенобарбитала) в 1 мл препарата долж-
но находиться в пределах 90—110 % от указанного на этикет-
ке [26].
7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ И
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА
ДЛЯ КОНТРОЛЯ СОДЕРЖАНИЯ СПИРТА
ЭТИЛОВОГО В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТАХ
Спирт этиловый является одним из наиболее широко употреб-
ляемых органических растворителей. Он используется для полу-
чения экстракционных препаратов из лекарственного раститель-
ного сырья (настоек и экстрактов). Широкое применение объяс-
няется доступностью и универсальностью этилового спирта как
растворителя, способного растворять лекарственные вещества са-
мых различных классов, обладающего бактериостатическим и
антисептическим действием, а также смешивающегося во всех
соотношениях с водой и большинством органических растворите-
лей.
При изготовлении лекарственных форм, в состав которых вхо-
дит этиловый спирт, содержание его всегда нормируется, а фар-
мацевтические предприятия, производящие такие лекарственные
формы, ведут строгий учет расхода этилового спирта в перерасче-
те на безводный этанол.
Помимо частных статей на спиртсодержащие лекарственные
препараты в ГФ X включены две фармакопейные статьи на спирт
этиловый: одна — на 95 %-ный, вторая — на 90, 70 и 40 %-ный
(ГФ X, с. 631 и 632).
Концентрацию спирта этилового по ГФ XI можно установить
тремя способами: по плотности, температуре кипения водно-спир-
товых смесей и методом отгонки. Для экспресс-контрол я содер-
жания спирта этилового в некоторых лекарственных формах при-
меняют метод рефрактометрии. Наиболее современным и перс-
пективным является газохроматографический метод определения
спирта в препаратах.
Концентрацию этанола выражают чаще всего в объемных про-
центах. Концентрация в объемных процентах показывает, какое
количество миллилитров безводного этанола содержится в 100 мл
водно-спиртового раствора или лекарственного препарата при 20 °C.
Иногда пользуются не зависящими от температуры массовы-
ми процентами (число г в 100 г раствора), в обозначении которых
должен быть индекс m (%m). Соотношения между объемными и
массовыми процентами содержания этанола в водно-спиртовых
растворах приведены в Алкоголеметрической таблице 1 (ГФ XI,
вып. 1, с. 303), составленной на основании зависимости
СуРб/в этаноле ^тРводно-спиртового раствора'
236
В таблице приведены также значения плотности водно-спир-
товых растворов различной концентрации при 20 °C.
7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СПИРТА
ПО ПЛОТНОСТИ
Плотность водно-спиртовых растворов напрямую связана с со-
держанием в них безводного этанола (табл. 1 ГФ XI, вып. 1, с. 303),
поэтому, определив плотность при помощи ареометра (денсимет-
ра) с точностью до 0,01 или пикнометрически с точностью до 0,001
при 20 °C, по таблице сразу находят содержание этанола в про-
центах в данном растворе. Если температура отлична от 20 °C, ее
или доводят до 20 °C, охлаждая или чуть подогревая раствор или
пользуются специальными “Таблицами для определения содер-
жания этилового спирта в водно-спиртовых растворах”, выпущен-
ными Издательством стандартов.
На принципе измерения плотности растворов основывается
определение содержания спирта спиртомерами (металлическими
и стеклянными). Спиртомер представляет собой ареометр, граду-
ированный сразу в объемных процентах содержания этанола; по-
казания его тоже зависят от температуры.
Определять содержание спирта этилового по плотности в лекар-
ственных препаратах можно с достаточной точностью только при
малом содержании остальных ингредиентов, так как их присут-
ствие меняет значение плотности и вносит искажение в получен-
ный результат. Часто лекарственные формы, содержащие спирт
(например, настойки, некоторые жидкие экстракты), стандартиру-
ют сразу по определенному значению плотности без табличного пе-
рехода к процентному содержанию спирта. Значения плотности в
этом случае подразумевают определенное содержание этанола в пре-
парате. Использование контроля содержания этанола в подобных
лекарственных препаратах по плотности все же является нестро-
гим и возможно тогда, когда требуемое содержание нормируется в
терминах “не более” или “не менее” стольких-то процентов.
Более точными являются фармакопейные методы количествен-
ного определения спирта в фармацевтических препаратах (ГФ XI,
вып. 1, с. 26—29), описанные ниже.
7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СПИРТА В
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ ОТГОНКИ
В круглодонную колбу вместимостью 200—250 мл отмеривают
точное количество жидкости. При содержании спирта в жидко-
сти до 20 % для определения берут 75 мл жидкости, если жид-
237
кость содержит от 20 до 50 % — 50 мл, от 50 % и выше — 25 мл;
жидкость перед перегонкой разбавляют водой до 75 мл.
Для равномерного кипения в колбу с жидкостью помещают
капилляры, пемзу или кусочки прокаленного фарфора. Если жид-
кость при перегонке сильно пенится, то добавляют фосфорную
нли серную кислоту (2—3 г), хлорид кальция, парафин или воск
(2-3 г).
Приемник (мерную колбу вместимостью 50 мл) помещают в
сосуд с холодной водой, собирают около 48 мл отгона, доводят его
температуру до 20 °C и добавляют воды до метки. Отгон должен
быть прозрачным или слегка мутным.
Плотность отгона определяют пикнометром и по алкоголемет-
рическим таблицам находят соответствующее содержание спирта
в процентах по объему.
Содержание спирта в препарате (X) в процентах по объему
вычисляют по формуле
X = 50а/Ь,
где 50 — объем отгона, мл; а — содержание спирта, % по объему;
b — объем исследуемого препарата, взятый для отгона, мл.
Если испытуемая жидкость содержит летучие вещества — эфир,
эфирные масла, хлороформ, камфору, летучие кислоты или осно-
вания, свободный йод и др., ее предварительно обрабатывают.
При содержании в жидкости эфира, эфирных масел, хлоро-
форма, камфоры к ней добавляют в делительной воронке рав-
ный объем насыщенного раствора натрия хлорида и такой же
объем петролейного эфира. Смесь взбалтывают в течение 3 мин.
После разделения слоев спирто-водный слой сливают в колбу
для отгона, а соединенные эфирные жидкости взбалтывают с
половинным количеством насыщенного раствора натрия хлори-
да, потом присоединяют к жидкости, находящейся в колбе для
отгона.
Если жидкость содержит менее 30 % спирта, то высаливание
производят не раствором, а 10 г сухого натрия хлорида.
При содержании летучих кислот их нейтрализуют раствором
щелочи; при содержании летучих оснований — фосфорной или
серной кислотой.
Жидкости, содержащие свободный йод, перед дистилляцией
обрабатывают цинковой пылью или рассчитанным количеством
сухого натрия тиосульфата до обесцвечивания. Для связывания
летучих сернистых соединений прибавляют несколько капель
раствора едкого натра.
238
7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СПИРТА
В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ ПО ТЕМПЕРАТУРЕ
КИПЕНИЯ
Прибор для количественного определения спирта по темпера-
туре кипения состоит из сосуда для кипения, трубки с боковым
отростком, холодильника и ртутного термометра с ценой деления
0,1 °C и пределом шкалы от 50 до 100 °C .
В сосуд для кипения наливают 40 мл настойки и для равно-
мерного кипения помещают капилляры, пемзу или кусочки про-
каленного фарфора. Термометр помещают в приборе таким об-
разом, чтобы ртутный шарик выступал над уровнем жидкости
на 2—3 мм. Сосуд нагревают на сетке с помощью электроплит-
ки с мощностью 200 Вт или газовой горелки. Когда жидкость в
колбе начнет закипать, с помощью реостата в 2 раза уменьша-
ют напряжение, подаваемое на плитку. Через 5 мин после на-
чала кипения, когда температура становится постоянной или
ее отклонение не превышает ±0,1 °C, снимают показания тер-
мометра. Полученный результат приводят к нормальному дав-
лению. Если показания барометра отличаются от 1011 ГПа
(760 мм рт. ст.), вносят поправку на разность между наблюдае-
мым и нормальным давлением 0,04 °C на 1,3 ГПа (1 мм рт. ст).
При давлении ниже 1011 ГПа поправку прибавляют к установ-
ленной температуре, при давлении выше 1011 ГПа поправку
вычитают.
Содержание спирта в настойке определяют при помощи
табл. 7.1.
Пример. Температура кипения раствора пустырника 80,9 °C,
атмосферное давление 1000 ГПа (732 мм рт. ст.), разность давле-
ний 1011 — 1000 = 11 ГПа (760—752=8 мм рт. ст). Поправка со-
ставляет: 0,04 °C х 8 = 0,32 °C. К найденной температуре кипения
прибавляют поправку: (80,9 + О,32)°С. По таблице этой темпера-
туре кипения соответствует 66 % спирта [10].
7.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СПИРТА В
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ
РЕФРАКТОМЕТРИИ
Рефрактометрия применяется для установления подлиннос-
ти и чистоты вещества, а также для определения концентрации
вещества в растворе, которую находят по графику зависимости
показателя преломления от концентрации. На графике выбира-
ют интервал концентраций, в котором соблюдается линейная за-
висимость между коэффициентом преломления и концентраци-
239
Таблица 7.1
Определение концентрации спирта в водно-спиртовых смесях
по температуре кипения при давлении 1011 ГПа (760 мм рт. ст.)
Температура кипения, °C % спирта по объему Температура кипения, °C % спирта по объему Температура кипения, °C % спирта по объему
99,0 1 85,4 32 81,5 63
98,3 2 85,2 33 81,4 64
97,4 3 85,0 34 81,3 65
96,6 4 84,9 35 81,2 66
96,0 5 84,6 36 81,1 67
95,1 6 84,4 37 81,0 68
94,3 7 84,3 38 80,9 69
93,7 8 84,2 39 80,8 70
93,0 9 84,1 40 80,7 71
92,5 10 83,9 41 80,6 72
92,0 11 83,8 42 80,5 73
91,5 12 83,7 43 80,4 74
91,1 13 83,5 44 80,3 75
90,7 14 83,3 45 80,2 76
90,5 15 83,2 46 80,1 77
90,0 16 83,1 47 80,0 78
89,5 17 83,0 48 79,9 79
89,1 18 82,9 49 79,8 80
88,8 19 82,8 50 79,7 81
88,5 20 82,7 51 79,6 82
88,1 21 82,6 52 79,5 83
87,8 22 82,5 53 79,45 84
87,5 23 82,4 54 79,4 85
87,2 24 82,3 55 79,3 86
87,1 25 82,2 56 79,2 87
86,8 26 82,1 57 79,1 88
86,6 27 82,0 58 79,0 89
86,4 28 81,9 59 78,85 90
86,1 29 81,8 60 78,8 91
85,9 30 81,7 61 78,7 92
85,6 31 81,6 62
ей. В этом интервале концентрацию можно вычислить по фор-
муле
сх= (n-n0)/F,
где сх — концентрация раствора; п — показатель преломления
раствора; п0 — показатель преломления растворителя при той же
температуре; F — фактор, равный величине прироста показателя
240
преломления при увеличении концентрации на 1 % (устанавли-
вается экспериментально).
Приборы, применяемые для определения показателя прелом-
ления, называются рефрактометрами. Определение проводится
при температуре 20±0,3 °C и длине волны линии D спектра на-
трия 589,3 нм. Показатель преломления, определенный при та-
ких условиях, обозначается индексом п£°.
Диапазон измеряемых показателей преломления при измере-
нии в проходящем свете 1,3—1,7. Точность измерения показате-
ля преломления должна быть не ниже ±2-10“4.
Рефрактометры тестируют по эталонным жидкостям, прилага-
емым к приборам, или дистиллированной воде, для которой
п 2° =1,3330.
Метод рефрактометрии относится к экспресс-методам анализа.
Простота и быстрота выполнения анализа, а также малые объемы
растворов, затрачиваемые на одно определение (несколько капель),
делают его незаменимым для внутриаптечного контроля приго-
товленных лекарственных препаратов. Этим методом в аптеках
определяют содержание некоторых лекарственных средств (бор-
ный.и салициловый спирт и др.).
7.4.1. Рефрактометрия
Рефрактометрический метод анализа основан на явлении из-
менения скорости света при прохождении его из одной среды в
другую. При этом луч света меняет свое первоначальное направ-
ление — преломляется. Отношение синуса угла падения луча (Р)
к синусу угла преломления (Р) для двух соприкасающихся сред
есть величина постоянная, которая носит название показателя
преломления (т)).
Показатель преломления зависит от температуры и длины вол-
ны света, при которой проводят определение. В растворах показа-
тель преломления зависит также от концентрации вещества и
природы растворителя.
7.4.2. Особенности рефрактометрического анализа
водно-спнртовых растворов
В водных растворах этилового спирта линейная зависимость
показателя преломления и концентрации наблюдается в преде-
лах 50—60 %. При установлении крепости спирта в более кон-
центрированных растворах следует их предварительно разбавить
и при расчетах концентрации учитывать разведение.
При определении показателя преломления спирто-водных ра-
створов следует на призму рефрактометра наносить не менее 5—7
16. Заказ 3547
241
капель и измерять величину п немедленно во избежание ошибки,
связанной с летучестью спирта. Исследование необходимо прово-
дить при температуре 20 °C. Если оно осуществляется не при 20 °C,
следует вносить поправку на температуру. Величины поправок
показателя преломления на 1 °C представлены в табл. 7.2. Если
определение проводится при температуре выше 20 °C, то поправ-
ку прибавляют к найденной величине показателя преломления;
если анализ проводится при температуре ниже 20 °C, поправку
вычитают.
Таблица 7.2
Показатели преломления спирто-водных растворов, концентрация
которых выражена в об. %
Концент- рация спирта п при 20 °C Поправка на 1 % спирта Темпера- турный коэф. Концент- рация спирта п при 20 °C Поправка на 1 % спирта Темпера- турный коэф.
0 1,33300 1-10* 18 1,34270 6,1-10* 1,510-*
1 1,33345 4,51О'* 1-10* 19 1,34330 6,0-Ю’4 1,5-10“*
2 1,33400 5,5-10* 110"4 20 1,34390 б,ою-4 1,610-*
3 1,33444 4,4-Ю'4 1,1-10* 21 1,34452 6,2-10'* 1,6-10-*
4 1,33493 4,9-Ю'4 1,110'* 22 1,34512 б,о-ю* 1,7-10~*
5 1,33535 4,210“* 1.2-10'4 23 1,34573 6,110-* 1,8-10'*
6 1,33587 5,2-Ю"4 1,2-10“* 24 1,34635 6,210* 1,9-10-*
7 1,33541 5,4-10'* 1,3-10“* 25 1,34697 6,2-10* 2,0-10-*
8 1,33700 5,9-10“* 1,3-10”* 30 1,35000 6,0-10'* 2,0-10-*
9 1,33760 6,0-Ю'4 1,8-10-* 35 1,35320 6,410* 2,1-10'*
10 1,33808 4,8-10“* 1,4-10'4 40 1,35500 4,010-* 2,4-10'*
11 1,33870 6,2-10'* 1,4-10“* 45 1,35700 4,0-10* 2,4-10*
12 1,33924 5,4-10“* 1,4-10'* 50 1,35900 4,010* 2,6-10'*
13 1,33977 5,3-10'* 1,4-10'* 55 1,36060 3,2-10* 2,6-10*
14 1,34043 6,6-10'* 1,4-10'* 60 1,36180 2,4-10 4 3,4-10'*
15 1,34096 5,3-Ю'4 1,5-10* 65 1,36300 2,4-10'* 3,6-10-*
16 1,34158 6,2-Ю'4 1,5-10* 70 1,36380 1,6-10'* 3,8-10'*
17 1,34204 5,110* 1,5-10* 75 1,36450 1,4-10'* 4,0-10'*
Пример. Анализу подвергался 40 % -ный раствор спирта. Оп-
ределение показателя преломления проводили при 23 °C. Пока-
зание рефрактометра — 1,3541. Согласно табл. 7.2 поправка на
1 °C для показателя преломления, близкого по величине к полу-
ченному (1,35500), равна 2,4-10“4 (т. е. 0,00024). Поскольку ис-
следование проводилось при 23 °C, то попрака будет составлять
0,00024 3 = 0,00072. Показатель преломления, приведенный к
20 °C, равен 1,3541 + 0,00072 = 1,35482.
По табл. 7.2 определяют соответствующую данному показателю
преломления концентрацию спирта. Найденной величины показа-
теля преломления (1,35482) в таблице нет; близкому по величине
242
показателю преломления 1,35500 соответствует 40 % спирта. Необ-
ходимо определить, какая концентрация спирта соответствует раз-
ности показателей преломления: 1,35500 - 1,35482 = 0,00018.
Поправка на 1 % спирта'равна 4,0-Ю-4. Следовательно,
0,00018/0,0004 = 0,45%. Таким образом, истинное содержа-
ние спирта в исследуемом растворе 39,55 % (40 - 0,45).
Для определения концентрации этилового спирта в спиртовых
растворах лекарственных препаратов, приготовленных на
70 %-ном спирте, разбавление проводят обычно 1:2, а приготов-
ленных на 95 %-ном спирте — 1:3. Исключение составляют ра-
створы салициловой кислоты, приготовленные на 70 % -ном спир-
те, которые разводят 2:1 вследствие ограниченной растворимости
салициловой кислоты в воде. При этом необходимо учитывать,
что при смешивании спирта с водой объем раствора несколько
уменьшается, в связи с чем следует вносить поправку к фактору
разведения: при смешивании 2 мл спирта с 1 мл воды — умножа-
ют на коэффициент 1,47 (вместо 1,5); при смешивании 1 мл спир-
та с 2 мл воды — на 2,98 (вместо 3); при смешивании 1 мл спирта
с 3 мл воды — на 3,93 (вместо 4). После соответствующего разве-
дения определяют показатель преломления полученного раство-
ра, вычитают величину показателя преломления, приходящуюся
на содержание растворенного препарата (или препаратов) в раз-
бавленном растворе. Если необходимо, вносят поправку на темпе-
ратуру и находят концентрацию спирта в приготовленном раство-
ре. Для установления крепости спирта в лекарственной форме най-
денное значение концентрации умножают на коэффициент разве-
дения.
Количественное определение лекарственных препаратов в спир-
товых растворах целесообразно проводить объемно-аналитическим
методом, так как рефрактометрические методы требуют приго-
товления в качестве контроля (п0) раствора спирта точно такой
же концентрации, как и в исследуемом растворе, что усложняет
анализ [29, 24].
Работа 1. Рефрактометрическое определение спирта
этилового в лекарственных формах промышленного и
аптечного производства
Задание 1. Определить содержание этанола в спирте салици-
ловом.
Лекарственная форма
Раствор салициловой кислоты (спирт салициловый) — 1—5 %
Состав: Кислоты салициловой — 10,0 г—50,0 г
Спирта 70 %-ного — до 1 л
16*
243
В сухую склянку (колбу или бюкс) вносят пипеткой 2 мл ра-
створа и 1 мл воды, перемешивают и устанавливают показатель
преломления полученного раствора (п). Затем из его значения вы-
читают поправку показателя на содержание салициловой кислоты
в разбавленном растворе (поправки приведены в табл. 7.3) и нахо-
дят показатель преломления спирта в разбавленном растворе. Если
температура в комнате при измерении показателя преломления
отличалась от 20 °C, то вносят поправку на температуру, исполь-
зуя температурные коэффициенты (поправки показателя прелом-
ления на 1 °C), приведенные в табл. 7.2. Если температура была
выше 20 °C, то поправка прибавляется к полученному значению п,
если ниже, то вычитается. При вычислениях не забывают умно-
жить коэффициент на число градусов, недостающее или превыша-
ющее 20 °C. По определенному таким образом с учетом всех попра-
вок показателю преломления спирта в разбавленном растворе на-
ходят концентрацию спирта в нем, используя табл. 7.2. По табли-
це находят самое близкое к найденному экспериментально значение
показателя преломления и соответствующую ему концентрацию
спирта в процентах. Вычитают поправку, приходящуюся на раз-
ницу между найденным и табличным значением показателя пре-
ломления, исходя из того, что поправка на 1% спирта составляет
4‘10-4 (0,0004). Установленное с учетом этой поправки процентное
содержание спирта в разбавленном 2:1 растворе умножают на ко-
эффициент разбавления (1,47) и получают окончательное значение
концентрации спирта в исходном растворе салициловой кислоты.
Таблица 7.3
Поправки показателя преломления на содержание салициловой
кислоты в разбавленном (2:1) водно-спиртовом растворе
Концентрация салициловой Поправка показателя
кислоты, массообъемный % преломления
1 0,00094
2 0,00188
3 0,00282
4 0,00376
5 0,00469
Задание 2. Определить содержание этанола в спирте борном.
Лекарственная форма
Раствор борной кислоты (спирт борный) — 1—4 %
Состав: Кислоты борной — 10,0—50,0 г
Спирта 70 %-ного — до 1 л
В сухую склянку вносят пипеткой 1 мл лекарственной формы
и 2 мл воды, перемешивают и измеряют показатель преломления
244
приготовленного разбавленного раствора. Далее вычисляют по-
правку на содержание борной кислоты (табл. 7.4). Если необходи-
мо, вносят поправку на температуру и устанавливают содержание
спирта, как было описано в задании 1, учитывая коэффициент
разведения 2,98.
Таблица 7.4
Поправки показателей преломления на содержание борной кислоты
в разбавленном (1:2) водно-спиртовом растворе
Концентрация борной кислоты, массообъемный % Поправка показателя преломления
1 0,00014
2 0,00028
3 0,00042
4 0,00056
7.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПИРТА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ
ПРЕПАРАТАХ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Метод газовой хроматографии является очень перспективным
в тех случаях, когда определению подлежат летучие вещества. В
случае спиртсодержащих препаратов таким веществом является
этанол. Причем определение может быть проведено как непосред-
ственным введением пробы препарата в испаритель хроматогра-
фа, так и введением разновесной паровой фазы над исследуемым
препаратом тогда, когда попадание в колонку сопутствующих ве-
ществ по каким-либо причинам нежелательно или невозможно.
Анализ паровой фазы может быть рекомендован для тех случаев,
когда растворенные в этаноле ингредиенты представляют собой
минеральные вещества или органические, но высококипящие, т. е.
трудно выводящиеся из хроматографической колонки. Использо-
вание метода ГЖХ особенно ценно, когда помимо этанола в ле-
карственной форме присутствует много разных компонентов и
применение других методов затруднено [21, 29, 31].
Работа 2. Газохроматографическое определение
содержания спирта этилового в экстракционных
препаратах из растительного сырья
Лекарственная форма
Настойка валерианы
Корневищ с корнями валерианы измельченных — 200 г
Спирта 70 % -ного до получения — 1л настойки
Содержание этанола в готовой настойке — не менее 65 %
245
Лекарственная форма
Настойка пустырника
Травы пустырника измельченной — 200 г
Спирта 70 %-ного до получения — 1л настойки
Содержание этанола в готовой настойке — не менее 64 %
Задание 1. Получить хроматограмму стандартного водно-спир-
тового раствора с известным содержанием спирта (70 %).
Условия хроматографирования:
Колонка 300x0,3 см, заполненная сорбентом
Температура колонки 90 °C
Температура испарителя 125 °C
Скорость газа-носителя (гелий) 20 мл/мин
Детектор катарометр или пламенно-ионизационный
Получают не менее трех хроматограмм стандартного образца с
известным содержанием спирта этилового, вводя его в испари-
тель хроматографа по 1 мкл. Измеряют высоту и площадь полу-
ченных пиков.
Задание 2. Получить хроматограмму настойки пустырника,
валерианы или какой-либо еще, вводя в испаритель хроматогра-
фа по 1 мкл исследуемого препарата. Условия хроматографирова-
ния выдерживают строго постоянными при хроматографирова-
нии препарата и стандартного образца. Пик этанола на хромато-
грамме идентифицируют по времени удерживания. Записывают
не менее трех хроматограмм исследуемого препарата. Измеряют
высоту и площадь пика этанола на хроматограмме настойки.
Содержание спирта этилового в препарате рассчитывают по
формуле
С = (S c )/S , % или С = (Ь.хс )/Ь. , %
X 'X СТ*' СТ' X 'X СТ" СТ ’
где Sx, SCT — площадь пиков этанола на хроматограммах препара-
та и стандартного образца соответственно (h*, hCT — высота этих
пиков); сст — концентрация этанола в стандартном образце, %.
Через каждые 10 определений температуру колонки поднима-
ют до 200 °C для удаления адсорбированных веществ (20—30 мин).
8. ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Необходимость внутриаптечного контроля обусловлена высо-
кими требованиями к качеству лекарственных форм, изготавли-
ваемых в аптеках. Поскольку изготовление лекарств в аптеках
ограничивается сжатыми сроками, оценку их качества осуществ-
ляют экспресс-методами. Основные требования, предъявляемые
к экспресс-анализу, — расход минимальных количеств лекарствен-
ных форм, простота и быстрота выполнения, достаточная точ-
ность и возможность проведения анализа без изъятия приготов-
ленного лекарства.
В настоящее время в аптеках широко используют различные
методы как качественного, так и количественного экспресс-ана-
лиза. Для этого применяют различные химические и физико-хи-
мические методы.
8.1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Качественный экспресс-анализ лекарственных форм отличает-
ся от макроанализа только тем, что на его выполнение расходует-
ся меньшее кольчество вещества и реактива. Анализ растворов и
порошков осуществляют без предварительного выделения лекар-
ственных веществ, когда наполнители не мешают выполнению
качественных реакций. Для выделения лекарственного вещества
из таблеток, драже, мазей, суппозиториев достаточно перемеши-
вания или растирания с растворителем.
Для выполнения качественного экспресс-анализа используют
цветные или осадочные химические реакции на соответствующие
катионы, анионы неорганических или функциональные группы
органических веществ. Анализ осуществляют капельным мето-
дом, при котором расходуется от 0,001 до 0,01 г порошка или 1—
5 капель жидкости.
Цветные реакции выполняют на фильтровальной бумаге или в
фарфоровых чашках, а осадочные — на часовых стеклах. Чув-
ствительность реакций на фильтровальной бумаге можно повы-
сить, используя такие физические явления, как поверхностное
натяжение, капиллярность, адсорбция, диффузия. Так, за счет
различия в скорости диффузии растворенных компонентов лекар-
ственной смеси можно одновременно идентифицировать без раз-
деления два и даже трн лекарственных вещества. Они образуют с
реактивом окрашенные кольца, отличающиеся по цвету и распо-
ложенные на различимом расстоянии от центра. Избирательность
247
цветных реакций можно также повысить обработкой полосок
фильтровальной бумаги парами летучих веществ.
Для экспресс-анализа многокомпонентных жидких и твердых
лекарственных форм представляют интерес и другие методы, по-
зволяющие идентифицировать компоненты смеси без их разделе-
ния. Иногда можно одним реактивом обнаружить два ингредиен-
та. Например, действуя окислителями, можно последовательно
открывать бромиды и йодиды, раствором хлорида железа (III) —
бензоаты и салицилаты и т. д. Можно подобрать реактив, кото-
рый с одним лекарственным веществом, содержащимся в смеси,
образует окрашенное соединение (растворимое или не раствори-
мое в воде), а с другим выделяет газообразный продукт. Такого
результата достигают, действуя концентрированной кислотой на
смесь, содержащую гидрокарбонаты и алкалоиды.
Если не удается выполнить анализ без разделения компонен-
тов, то используют те же принципы разделения, что и при макро-
анализе. Они основаны на различии в растворимости лекарствен-
ных веществ. С помощью воды, этилового спирта, ацетона, хло-
роформа можно разделять смесь, состоящую из веществ, раство-
римых и не растворимых в указанных растворителях. Растворы
кислот, щелочей, буферные растворы позволяют последовательно
извлекать из смеси вещества, различающиеся по кислотно-основ-
ным свойствам. Идентификацию выделенных индивидуальных
лекарственных веществ осуществляют теми же реакциями, кото-
рыми испытывают субстанции на подлинность.
Качественный экспресс-анализ лекарственных веществ, содер-
жащихся в мазях, суппозиториях и пастах, можно выполнять
смешиванием и растиранием на стеклянной пластинке с соответ-
ствующим реактивом. Если такой способ не дает положительных
результатов, то небольшую массу мази (пасты) предварительно
обрабатывают спиртом, бензолом, эфиром или хлороформом для
растворения основы (жиров, вазелина). Можно также извлекать
из мази (пасты) лекарственное вещество водой или растворами
кислот и щелочей при слабом подогревании. Иногда сочетают оба
эти способа, а затем отделяют полученное извлечение (декантаци-
ей, фильтрованием) от мазевой основы, растворенной в органи-
ческом растворителе. Если компоненты, содержащиеся в мазях,
не растворимы в воде (растворах кислот, щелочей, в органичес-
ких растворителях), то мазевую основу растворяют в эфире, бен-
зине или хлороформе, затем фильтруют и остаток на фильтре ра-
створяют, подбирая для этого соответствующий растворитель, в
котором растворяется компонент мази. Полученные экстракты ана-
248
лизируют соответствующими реактивами теми же методами, что
и сухие или жидкие лекарственные формы.
Качественный экспресс-анализ в условиях аптеки осуществля-
ют не только химическими, но физическими или физико-хими-
ческими методами.
Поляриметрия позволяет ^сделать заключение о подлинности
лекарственного вещества в растворе по значению удельного вра-
щения, рефрактометрия — по показателю преломления раство-
ра определенной концентрации.
Доступным для использования во внутриаптечном контроле
является метод флуориметрии. По характеру флуоресценции
кристаллов или растворов можно, например, осуществить иден-
тификацию препаратов некоторых алкалоидов, витаминов и др.
Для возбуждения флуоресценции на растворы испытуемых ве-
ществ воздействуют ультрафиолетовым излучением с длиной вол-
ны 365—366 нм. Некоторые лекарственные вещества сами не флу-
оресцируют, но при взаимодействии с рядом реактивов образуют
флуоресцирующие продукты.
Для выделения анализируемого лекарственного вещества из
многокомпонентной лекарственной формы используют хромато-
графию. Особенно перспективно применение для экспресс-анали-
за распределительной хроматографии на бумаге и тонкослойной
хроматографии. После выделения лекарственного вещества из ле-
карственной формы выполняют химические реакции на ионы или
функциональные группы, причем эти реакции могут быть выпол-
нены прямо на хроматограмме.
Для качественного экспресс-анализа настоек, экстрактов, на-
стоев и отваров может быть применено сочетание адсорбционной
хроматографии и люминесцентного анализа. Вначале использу-
ют различие в адсорбционной способности, компоненты лекар-
ственных форм разделяют на отдельные зоны в колонках из окси-
да алюминия. Полученные хроматограммы идентифицируют в уль-
трафиолетовом излучении или с помощью групповых реакций на
алкалоиды, гликозиды, сапонины, дубильные и другие вещества
[5, 10, 24].
8.2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ
Количественный экспресс-анализ может быть выполнен тит-
риметрическими или физико-химическими методами.
Титриметрический экспресс-анализ отличается от макроме-
тодов расходом меньших количеств анализируемых лекарствен-
ных форм (0,05—0,1 г порошка или 1—3 мл раствора). Это позво-
249
ляет анализировать лекарственную форму без изъятия, т.е. конт-
ролировать качество того лекарства, которое отпускается больно-
му. На выполнение количественного экспресс-анализа затрачива-
ется минимальное время, так как используются методики, как
правило, не требующие процессов извлечения, выпаривания, филь-
трования. Навеску порошка или объем жидкой лекарственной фор-
мы (растворы, глазные капли и др.) берут с таким расчетом, что-
бы на определение расходовалось не более 2 мл титрованного ра-
створа концентрацией 0,1 моль/л. Из твердых лекарственных форм
вначале получают раствор. При необходимости жидкие лекарствен-
ные формы предварительно разбавляют. Навеску мази, если осно-
ва не мешает определению, растворяют в 3—5 мл этанола или
эфира, а затем титруют. Для уменьшения расхода анализируемо-
го вещества и реактивов в количественном экспресс-анализе обычно
используют титрованные растворы концентрацией не только 0,1,
но и 0,02, 0,01 моль/л. Чтобы упростить расчеты, титрованные
растворы готовят точной нормальности (из фиксаяалов).
Из титриметрических методов для количественного экспресс-
анализа хлоридов, бромидов, йодидов используют аргентометрию
или меркуриметрию. Солн цинка, магния, кальция определяют
комплексонометрически. Кислоты и соли органических основа-
ний (гидрохлориды, гидробромиды, гидройодиды, сульфаты, фос-
фаты) титруют алкалиметрически. Растворы аммиака и щелочей,
органические основания (амидопирин, гексаметилентетрамин) оп-
ределяют ацидиметрически; йодометрию применяют для опреде-
ления растворов йода, хлорамина, формальдегида и др.
Для количественного экспресс-анализа двух- и трехкомпонент-
ных лекарственных форм сочетают несколько методов. При выбо-
ре методик анализа используют те же способы, что и при обыч-
ном анализе многокомпонентных смесей титриметрическими ме-
тодами.
Расчеты в количественном экспресс-анализе можно упростить,
пользуясь факторами титрования (Ф), значения которых вычис-
ляются в процентах по формуле
Ф “ ТВ/А100/а
и в граммах по выражению
Ф = Тв/АЬ/а.
Таким образом, фактор титрования включает навеску (а) и титр
исследуемого вещества (Т). Последующий расчет концентрации
или массы сводится к вычислению произведения ФУК (К — по-
правочный коэффициент, показывающий, во сколько раз титр
стандартного раствора больше или меньше расчетного).
250
Ответственным этапом внутриаптечного контроля является
оценка качества концентрированных растворов (концентратов).
Концентраты подвергаются обязательному количественному ана-
лизу во всех аптеках. Так как они содержат лекарственное ве-
щество в высоких концентрациях, то перед выполнением опре-
деления их разбавляют. Для облегчения расчетов результатов
титриметрического экспресс-анализа концентратов разработа-
ны специальные таблицы. Пользуясь этими таблицами, можно
по объему затраченного титранта судить о соответствии содер-
жания лекарственного вещества допустимым нормам отклоне-
ний.
Из физико-химических методов для количественного экспресс-
анализа лекарственных форм применяют рефрактометрию. Этот
метод пригоден для определения лекарственных веществ в кон-
центратах, жидких и растворимых в воде сухих лекарственных
формах, содержащих один или два ингредиента, а также для оп-
ределения концентрации этилового спирта в водно-спиртовых
растворах. Обязательным условием выполнения рефрактометри-
ческих определений является соблюдение температурного режи-
ма. Обычно определения выполняют при 20 °C. При небольших
отклонениях температуры (на 5—7 °C) можно вводить поправку с
помощью несложных расчетов.
Рефрактометрию применяют для количественного экспресс-
анализа глюкозы, кислот (борной, аскорбиновой, никотиновой);
солей неорганических и органических кислот (калия и натрия
бромиды, хлориды, йодиды; кальция хлорид и глюконат, калия
ацетат, натрия тетраборат, тиосульфат, гидрокарбонат, цитрат,
бензоат, салицилат); водорастворимых натриевых солей сульфа-
ниламидов (стрептоцида, норсульфазола, этазола, сульфацила).
Более точные результаты достигаются, если концентрация лекар-
ственного вещества выше 5 %. Иногда при анализе многокомпо-
нентных смесей рефрактометрию сочетают с титриметрическими
методами.
Расчет концентрации лекарственного вещества в лекарствен-
ной форме производят также с помощью фактора показателя
преломления F, который вычисляют по формуле
F = Fo + Кс,
где Fo — начальный фактор (прирост показателя преломления
при переходе от воды к раствору с бесконечно малой концентра-
цией); К — вторая производная (величина, соответствующая сред-
нему изменению фактора F при повышении концентрации препа-
рата на 1 %); с — концентрация раствора.
251
Значения показателей преломления и факторов для различ-
ных концентраций лекарственных веществ приведены в табли-
цах, которые имеются в руководствах по внутриаптечному конт-
ролю. Использование таблиц значительно упрощает расчеты.
Концентрацию веществ в однокомпонентных растворах (сх)
вычисляют по формуле
сх = (п - n„)/F.
где п — показатель преломления анализируемого раствора; —
показатель преломления растворителя при той же температуре.
В двух- и трехкомпонентных смесях одно или два лекарствен-
ных вещества определяют титриметрическим методом, а содер-
жание третьего компонента (сх) устанавливают измерением п ра-
створа смеси. Расчет проводят по формуле
Сх =[(n-n0)-cF-clFl]/F2,
где с и Cj — концентрации ингредиента смеси, установленные
титриметрически, %; Ей Fj — соответствующие им факторы;
F2 — фактор показателя преломления компонента, определяемо-
го рефрактометрически.
Для определения небольших (0,1—2 %) концентраций препа-
ратов в лекарственных формах используют интерферометриче-
ский метод, отличающийся от титриметрических небольшим рас-
ходом испытуемого объекта. Интерферометрия основана на изме-
рении показателей преломления растворов, но, в отличие от реф-
рактометрии, измеряется разность показателей преломления п
испытуемого вещества и эталона с известной величиной Пф.
Расчет концентраций Cjj в интерферометрическом анализе вы-
полняют по калибровочным графикам по формуле
сх =(п-р)/К,
где п — показатель интерферометра; р — поправка; К — удель-
ный коэффициент смещения интерференционной карты.
С помощью интерферометрии анализируют растворимые в воде
сухие двухкомпонентные лекарственные формы, а также раство-
ры каждого из двух компонентов, входящих в ее состав в равных
концентрациях. Затем измеряют величины смещения интерфе-
ренционной картины раствора смеси относительно раствора с мень-
шим значением показателя преломления (Дпх). После этого дела-
ют аналогичные измерения раствора второго компонента относи-
тельно раствора смеси (Дп2). Концентрацию первого (сХ1) и второ-
го (сХ2) компонентов вычисляют по формулам
Сх, = Дп2ссм /(Дп2 +Дп,); cXj = ДП|Ссм/(Дп2+ДП|).
252
Интерферометрию применяют для количественного экспресс -
анализа неорганических веществ (натрия хлорид, цинка сульфат,
борная кислота), гидрохлоридов алкалоидов (пилокарпина, эфед-
рина, папаверина) и органических оснований (новокаина, дикаи-
на, димедрола, дибазола) и др.
Для определения концентрации веществ, обладающих флуо-
ресценцией, используют количественное флуориметрическое оп-
ределение. Оно включает такие операции, как подготовка анали-
зируемой пробы и стандартного раствора; измерение интенсивно-
сти флуоресценции стандартного раствора, анализируемого раство-
ра и контрольной пробы (если она имеет флуоресценцию).
Флуориметрию применяют для количественного экспресс-ана-
лиза лекарственных форм, включающих витамины, алкалоиды,
антибиотики и др. Содержание (концентрацию) лекарственного
вещества в одном порошке или таблетке (с^) можно вычислить по
формуле
сх=[со(А-А|)Ь]/[(А2-А,)а1ОО],
где с0 — концентрация раствора стандартного образца, г/мл или
%; A, Aj, А2 — интенсивность флуоресценции соответственно ана-
лизируемого раствора, контрольной пробы, стандартного раство-
ра; а — навеска, г; b — средняя масса порошка (таблетки), г.
Для количественного экспресс-анализа могут быть использо-
ваны фотометрические методы.
Фотоколориметрию или визуальную колориметрию приме-
няют для количественного определения аптечных концентриро-
ванных растворов (концентратов). Фотоколориметрическое оп-
ределение раствора фурацилина 0,02 %-ного основано на цвет-
ной реакции с раствором гидроксида натрия, а раствора этакри-
дина лактата 0,1 %-ного — на образовании окрашенного
диазосоединения.
Особенно перспективен дифференциальный фотометрический
метод с использованием заменителей растворов сравнения. При
разработке методик дифференциального анализа вместо раствора
сравнения, содержащего стандартный образец, можно использо-
вать нейтральные светофильтры, матовые стекла, целлофановые
пленки, имеющие стабильную оптическую плотность. Предвари-
тельно по калибровочному графику, построенному с помощью
стандартного образца, необходимо установить, какой концентра-
ции анализируемого лекарственного вещества соответствует по
своей оптической плотности заменитель раствора сравнения. В
последующем, пользуясь этим заменителем как стандартным об-
разцом, можно экспресс-методом на том же приборе определять
253
концентрацию данного лекарственного вещества в различных ле-
карственных формах [5, 24].
Работа 1. Изучение физико-химических свойств, реакций
идентификации и количественного определения витаминов
При изучении физико-химических свойств витаминов опреде-
лить запах их субстанции, растворимость в воде, растворах едких
щелочей и минеральных кислот. Реакции на подлинность вита-
минов выполнить согласно нижеприведенным методикам.
Аскорбиновая кислота
1. Реакция с йодкрахмальным реактивом
При добавлении к 1 мл йодкрахмального реактива 10 мг ас-
корбиновой кислоты наблюдается обесцвечивание раствора.
2. Реакция с фосфорно-молибденовой кислотой
К 10 мг препарата в фарфоровой чашке или на часовом стекле
добавляют 2—3 капли воды, 2—3 капли фосфорно-молибденовой
кислоты. Наблюдается образование синего осадка молибденовой
сини.
3. Реакция образования берлинской лазури
К 5 мг препарата прибавляют 10 капель воды и 1 каплю фер-
рицианида калия, через 20—30 с прибавляют 1 каплю раствора
хлорида окисного железа. Наблюдается образование осадка сине-
го цвета (берлинская лазурь).
4. Реакция с нитратом серебра
50 мг препарата растворяют в 2 мл воды и приливают 0,5 мл
раствора нитрата серебра, выпадает темный осадок.
5. Реакция образования аскорбината железа
50 мг препарата растворяют в 0,5 мл раствора гидрокарбоната
натрия и добавляют 0,02 мг сульфата закисного железа. Наблю-
дается образование фиолетового осадка.
6. Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом
При. добавлении к раствору препарата (1:1000) по каплям ра-
створа 2,6-дихлорфенолиндофенола синяя окраска последнего ис-
чезает.
Тиамина бромид
1. Реакция образования тиохрома
10 мг препарата растворяют в 0,5 мл воды, добавляют 1 мл
раствора феррицианида калия, 1 мл раствора гидроксида натрия,
5 мл н-бутилового спирта. Смесь хорошо встряхивают и дают от-
стояться. В верхнем слое возникает наблюдаемая в УФ-свете си-
няя флуоресценция, исчезающая при подкислении и вновь воз-
никающая при подщелачивании раствора.
254
2. Образование осадков с общеалкалоидными осадочными ре-
активами
На двух часовых или предметных стеклах помещают по 5 мг
препарата, 1—2 капли воды и по 1—2 капли реактива Драгендор-
фа или фосфорно-молибденовой кислоты. Наблюдается образова-
ние окрашенного осадка оранжевого или желтого цвета.
Рибофлавин
1. Флуоресценция растворов рибофлавина
0,01 %-ный раствор препарата при просматривании в ультра-
фиолетовом свете обнаруживает интенсивную зеленую флуоресцен-
цию, исчезающую при добавлении соляной кислоты или щелочи.
2. Реакция образования лейкофлавина
К 2—3 мл 0,02 %-ного раствора рибофлавина добавляют 0,1 г
цинковой пыли и по каплям хлористо-водородную кислоту
(d = 1,12) до выделения пузырьков газа. Для ускорения реакции
пробирку подогревают на кипящей водяной бане. Наблюдается
обесцвечивание раствора препарата.
3. Капельная реакция с концентрированной серной кислотой
Несколько крупинок препарата (1—2 мг) помещают на сухое
часовое стекло, добавляют 1 каплю концентрированной серной
кислоты. Наблюдается красно-коричневое окрашивание, перехо-
дящее в желтое при добавлении 1 капли воды.
Никотиновая кислота
1. Образование медной соли
При добавлении к 3 мл теплого раствора препарата (1:100) 1 мл
раствора сульфата меди наблюдается выпадение осадка синего
цвета.
2. Образование комплексной соли никотиновой кислоты
При добавлении к 10 мл раствора препарата (1:100) 0,5 мл
раствора сульфата меди и 2 мл раствора роданида аммония на-
блюдается зеленое окрашивание.
3. Реакция с 2,3-динитрохлорбензолом
В фарфоровую чашку помещают 0,02 мг препарата, прибавля-
ют 2 мл 1 %-ного спиртового раствора 2,4-динитрохлорбензола и
выпаривают досуха на кипящей водяной бане. После охлаждения
к осадку прибавляют 10 капель 0,5 н. спиртового раствора гидрок-
сида калия. Наблюдается постепенное исчезновение малинового
окрашивания.
Пиридоксина гидрохлорид
1. Реакция с хлоридом окисного железа
При добавлении к 1 мл раствора препарата (10 мг в 10 мл
воды) 2 капель раствора хлорида окисного железа наблюдается
255
красное окрашивание, исчезающее при добавлении разведенной
хлористоводородной (или серной) кислоты.
2. Реакция с 2,6-дихлорхинонхлоримидом
При добавлении к 1 мл 0,01 % -ного раствора препарата 1 мл
0,04 %-ного раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида в абсолютном
этаноле и 1 капли аммиака наблюдается синее окрашивание.
3. Водный раствор препарата имеет фиолетовую флуоресцен-
цию в УФ-свете.
4. Реакция образования азокрасителя
0,1 г стрептоцида (или норсульфазола) растворяют в 2 мл воды
и 0,5 мл разведенной хлористо-водородной кислоты (d=l,04) и
прибавляют 0,5 мл 0,1 н. раствора нитрита натрия. Через 2 мин
1 мл полученного раствора приливают к раствору 0,02 г пиридок-
сина гидрохлорида в 1 мл воды, а затем прибавляют 5 капель
10 %-ного раствора гидроксида натрия. Наблюдается появление
красного окрашивания.
Рутин
1. 5 мл препарата растворяют в 5 мл 1н. раствора гидроксида
натрия. Наблюдается желто-оранжевое окрашивание.
2. 20 мг препарата растворяют в 5 мл 95%-ного спирта при
нагревании на кипящей бане, добавляют несколько капель кон-
центрированной хлористо-водородной кислоты и 50 мг порошка
цинковой пыли. Постепенно раствор окрашивается в красный цвет.
3. Реакция с реактивом Фелинга
50 мг препарата растворяют при нагревании в 5 мл 0,5%-ного
раствора хлористо-водородной кислоты. При добавлении 0,3 мл
раствора гидроксида натрия и 3 мл реактива Фелинга и последу-
ющем кипячении смеси образуется красный осадок.
4. 5 мг препарата помещают в сухую пробирку и добавляют
1—2 мл концентрированной серной кислоты. Наблюдается зеле-
ная флуоресценция в УФ-свете.
Фолиевая кислота
1. Реакция образования 6-птеридилкарбоновой кислоты
10 мг препарата растворяют в 5 мл 0,1 н. раствора гидроксида
натрия и добавляют 5 мл 0,1 н. раствора хлористо-водородной
кислоты и 1 мл раствора перманганата калия. Раствор помещают
на 3 мин в водяную баню с температурой 80—85 °C. К охлажден-
ному раствору прибавляют по каплям 0,2 мл раствора перекиси
водорода и смесь фильтруют. Фильтрат имеет голубую флуорес-
ценцию в УФ-свете.
256
Количественное определение витаминов
ПРОПИСЬ № 1. Рибофлавина — 0,001, раствора натрия хло-
рида — 0,9—1,0 %.
1. Определение подлинности
а) Раствор имеет зеленовато-желтый цвет и зеленое свечение в
УФ-свете.
б) К 3 каплям лекарственной формы прибавляют по 2 капли
разведенной азотной кислоты и раствора нитрата серебра. Обра-
зуется белый творожистый осадок, растворимый в растворе ам-
миака.
2. Количественное определение
а) Визуальная колориметрия
В 5 пробирок вносят соответственно 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 мл
0,02 % -ного стандартного раствора рибофлавина. Добавляют воду
дистиллированную до общего объема 10 мл. Содержимое проби-
рок перемешивают и сравнивают интенсивность окраски раство-
ров с окраской смеси, состоящей из 2,5 мл анализируемой лекар-
ственной формы и 7,5 мл дистиллированной воды. При сравне-
нии растворов необходимо соблюдать следующие условия:
• Пробирки должны быть изготовлены из одинакового стекла
и иметь одинаковый диаметр.
• Окраску жидкостей рассматривают в отраженном свете на
белом фоне.
Содержание рибофлавина в лекарственной форме в граммах
(Сх) вычисляют по формуле
с 0,0002У10
х 2,5
где V — объем. 0,02 % -ного стандартного раствора рибофлавина в
пробирке, сходной по окраске с анализируемым раствором, мл.
б) Фотоэлектроколориметрическое определение
Количественное определение рибофлавина фотоэлектроколори-
метрическим методом проводят на приборе марки ФЭК-56-Н в
кварцевых кюветах толщиной слоя 10 мм. Контроль — вода.
Вывор СВЕТОФИЛЬТРА
Раствор рибофлавина, полученный при смешивании 0,5 мл
0,02 %-ного стандартного раствора и 9,5 мл воды (см. визуаль-
ную колориметрию), переносят в кювету толщиной слоя 10 мм и
определяют оптическую плотность раствора при светофильтрах
№ 3—6. Результаты анализа приведены в табл. 8.1.
На основании проведенных исследований строят график зави-
симости оптической плотности (А) от длины волны (X, нм) и опре-
17. Заказ 3547
257
Таблица 8.1
№ светофильтра Максимум пропускания, нм Оптическая плотность (А)
3 400 0,245
4 440
5 490
6 540
деляют светофильтр, при котором наблюдается максимум опти-
ческой плотности раствора (рис. 8.1).
При светофильтре, обеспечивающем максимум оптической
плотности раствора рибофлавина, определяют поглощение раство-
ров приготовленных препаратов (см.визуальную колориметрию).
На основании полученных данных строят график зависимости
оптической плотности (А) от концентрации (с, г/мл) — рис. 8.2.
Измеряют оптическую плотность анализируемого раствора в
тех же условиях, что и при построении калибровочного графика.
По графику определяют концентрацию рибофлавина. Содержа-
ние препарата в лекарственной форме (Сх) вычисляют по формуле
cV^cJOUO
Y 2,5
где с — концентрация рибофлавина в анализируемом растворе по
калибровочному графику в 10-5 г/мл; Vj — объем лекарственной
формы, взятой для приготовления разведения, мл; V2 — общий
объем разведения, мл; V3 — общий объем лекарственной формы,
мл.
^тах НМ
Рис. 8.1. Построение калибровочного
графика
Рис 8.2. Определение концент-
рации рибофлавина в анализируе-
мой лекарственной форме
258
Расчет концентрации рибофлавина методом сравнения
оптической плотности испытуемого и стандартного
растворов
Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и стан-
дартного раствора препарата 0,005 %-ного (2,5 мл 0,02 %-ного ра-
створа рибофлавина и 7,5 мл воды) при вышеописанных условиях.
Содержание рибофлавина в лекарственной форме (Сх, г) вы-
числяют по следующей формуле:
С - АхсУ2У, - А,с1010_ А,с-40
х AXV| ~ А-2,5 А ’
где с — концентрация рибофлавина в стандартном растворе в
10-5 г/мл; А — оптическая плотность стандартного раствора; А* —
оптическая плотность исследуемого раствора; — объем
0,02 %-ного раствора рибофлавина, взятого для приготовления
раствора, мл; V2 — общий объем раствора сравнения, мл; V3 —
общий объем лекарственной формы, мл.
ПРОПИСЬ № 2. Рибофлавина — 0,003; кислоты аскорбиновой
— 0,1; сахара — 0,1.
1. Определение подлинности
а) К 0,01 г порошка прибавляют 2—3 капли концентрирован-
ной серной кислоты, проявляется красное окрашивание, перехо-
дящее в желтое при добавлении 1 капли воды.
б) К 0,005 г порошка прибавляют по 2 капли 5 %-ного раство-
ра феррицианида калия и хлорида окисного железа. Появляется
синее окрашивание.
в) К 0,001 г порошка прибавляют 3—5 капель воды и 3 капли
раствора нитрата серебра. Наблюдается образование серого осадка.
г) Промывают на фильтре 0,03 г порошка 1 мл воды. К фильт-
рату прибавляют 1 мл разведенной соляной кислоты, несколько
кристалликов резорцина и смесь кипятят в течение 1 мин. На-
блюдается красное окрашивание.
2. Количественное определение
а) Визуальная колориметрия
20 мг лекарственной формы помещают в пробирку, растворя-
ют в 10 мл воды и нагревают на кипящей водяной бане. Окраску
полученного раствора сравнивают с окраской стандартных раство-
ров, используемых в прописи № 1.
Содержимое препарата в анализируемой лекарственной форме
(Сх, г) вычисляют по формуле
С ^cVP_0,0002V 0,2_ 2V
а 0,02 1000’
17*
259
где V — объем 0,02 % -ного стандартного раствора рибофлавина,
взятого для приготовления раствора, интенсивность окраски ко-
торого сходна с окраской испытуемого раствора, мл; с — концен-
трация стандартного раствора рибофлавина, г/мл; а — навеска
лекарственной формы, г; Р — средняя масса порошка, г.
б) Фотоколориметрическое определение
Выбор светофильтра и построение калибровочного графика для
количественного определения рибофлавина производится по вы-
шеописанной методике (см. пропись № 1).
Для определения содержания препарата в лекарственной фор-
ме в 10 мл воды растворяют 50 мг порошка (см. визуальную коло-
риметрию, пропись № 2), определяют оптическую плотность по-
лученного раствора. По калибровочному графику находят содер-
жание препарата в анализируемой пробе в мг/мл.
Содержание препарата в лекарственной форме (Сх) вычисляют
по формуле
cVP=C40^ =
х а 0,05
где с — концентрация препарата согласно калибровочному гра-
фику в 10~5 г/мл; V — объем анализируемого раствора, мл; а —
навеска лекарственной формы, г; Р — средняя масса порошка, г.
Полученный результат количественного определения рибо-
флавина в порошке должен совпадать с результатом количествен-
ного определения методом сравнения оптических плотностей (про-
пись № 2) по формуле
_ AxcVP _ Ахс-102
х Аа “ А ’
где с — концентрация рибофлавина в стандартном растворе в
10-5 г/мл; А — оптическая плотность стандартного раствора; А* —
оптическая плотность анализируемого раствора; а — навеска ле-
карственной формы, г; V — общий объем анализируемого раство-
ра, мл; Р — средняя масса, г.
Работа 2. Анализ глазных капель
Лекарственная форма
Рибофлавина 0,02 % -ного — 50 мл
Кислоты аскорбиновой — 0,15 г
Глюкозы — 1,0 г
Калия йодида — 1,0 г
Определение подлинности
Рибофлавин. Раствор имеет зеленовато-желтый цвет и обнару-
живает зеленую флуоресценцию в УФ-свете.
260
Кислота аскорбиновая. К 5 каплям раствора прибавляют 5 ка-
пель раствора нитрата серебра. Выпадает осадок буровато-желто-
го цвета.
Калия йодид. Каплю испытуемого раствора наносят на фильт-
ровальную бумагу, предварительно обработанную ацетатом свин-
ца. Появляется желтое пятио.
К 1 мл раствора прибавляют 2 капли разведенной соляной
кислоты, несколько капель раствора хлорида окисного железа,
0,5 мл хлороформа. Хлороформ приобретает фиолетовое окраши-
вание.
Глюкоза. К 1 мл раствора прибавляют 10 капель пергидроля,
5 капель раствора аммиака и смесь нагревают до исчезновения
запаха аммиака. При последующем добавлении равных объемов
раствора Фелинга № 1 и № 2, взятых по 0,5 мл, выпадает осадок
кирпичного цвета.
Количественное определение
Определение кислоты аскорбиновой. К 2 мл раствора прибав-
ляют 3 мл воды, 5 капель раствора фенолфталеина и титруют
0,05 н. раствором гидроксида натрия.
1 мл 0,05 н. раствора гидроксида натрия соответствует 0,0088 г
аскорбиновой кислоты:
X = VK 0,0088 a/2.
Определение калия йодида. К 1 мл раствора прибавляют 10 мл
воды, 5 капель 30 % -ной уксусной кислоты, 5 капель раствора эози-
ната натрия и титруют 0,1 н. раствором азотнокислого серебра.
1 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра соответствует
0,0166 г йодида калия:
X = VK 0,0166 а/1.
Определение глюкозы. А. Производится рефрактометрически.
Для этой цели определяют показатель преломления испытуемого
раствора и воды. Содержание глюкозы рассчитывают с учетом
содержания и фактора показателей преломления ингредиентов,
входящих в состав исследуемого раствора (за исключением ри-
бофлавина).
Расчет содержания глюкозы проводят по формуле
X = [(n-n0)-c,Fl-c2F2]/F,
где п0 — показатель преломления воды; п — показатель прелом-
ления раствора; с2 — концентрация аскорбиновой кислоты, %;
с2 — концентрация калия йодида, %; Fp F2, F — факторы пока-
зателя преломления аскорбиновой кислоты, калия йодида и глю-
козы соответственно (справочные данные).
261
Б. Определение глюкозы йодометрическим методом. К 5 мл
анализируемого раствора прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора йода,
40 мл 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Смесь выдерживают
10 мин в темном месте, после чего добавляют 3 мл разведенной
серной кислоты и избыток йода оттитровывают 0,1 н. раствором
тиосульфата натрия (индикатор — крахмал).
Результаты количественного определения, полученные рефрак-
тометрическим и объемным методами, сравнивают с прописью.
1 мл 0,1 н. раствора йода соответствует 0,0099 г глюкозы. Со-
держание глюкозы (X) в лекарственной форме рассчитывают по
формуле
X = (25 - V1)-0,0099b/a,
где 25 мл — объем 0,1 н. раствора соли, взятый на титрование
глюкозы; V* — объем 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошед-
ший на титрование избытка 0,1 н. раствора йода; а — объем ра-
створа, взятый на анализ; b — объем лекарственной формы.
Определение рибофлавина
фотохолориметрическим методом
К 1 мл раствора прибавляют 9 мл воды и измеряют оптичес-
кую плотность полученного раствора на фотозлектроколориметре
с синим светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. В каче-
стве контрольного раствора используют воду. Параллельно изме-
ряют оптическую плотность эталонного раствора с концентраци-
ей рибофлавина 0,001 %. Рассчитывают содержание рибофлави-
на в граммах.
Контрольные вопросы
по теоретической части лабораторного занятия
1. Напишите структурную формулу рибофлавина, его химическое и
латинское названия.
2. Какие особенности химического строения рибофлавина обусловли-
вают его окислительно-восстановительные свойства и флуоресценцию
растворов?
3. Приведите уравнение реакции, подтверждающей окислительно-
восстановительные свойства рибофлавина. Что при этом наблюдается?
4. Что наблюдается при освещении растворов рибофлавина УФ-све-
том? Какие изменения происходят при последующем добавлении раство-
ров щелочей и кислот?
5. Можно ли для определения подлинности рибофлавина в данной
прописи использовать реакцию с азотнокислым серебром? Приведите
химическое обоснование.
6. Напишите уравнения реакций, доказывающие наличие йодид-иона
в данном растворе.
7. Напишите уравнения реакций, доказывающих наличие иона ка-
лия в данном растворе.
262
8. Каким методом может быть проведено количественное определе-
ние калия йодида в данной прописи? Напишите уравнения реакций,
значение грамм-эквивалента и формулу расчета содержания калия йо-
дида в %.
9. Какой вариант аргентометрического определения (прямой или об-
ратный) может быть использован для определения калия йодида в дан-
ной прописи? Йриведите химическое обоснование.
10. Приведите формулу и химическое название индикатора — эози-
ната натрия.
11. Напишите формулу аскорбиновой кислоты, латинское и хими-
ческое названия.
12. Какие химические свойства лежат в основе методов анализа ас-
корбиновой кислоты?
13. Какая функциональная группа обусловливает восстановительные
свойства аскорбиновой кислоты?
14. Чем обусловлены восстановительные свойства аскорбиновой кис-
лоты? Приведите уравнения реакций.
15. Перечислите возможные методы количественного определения
аскорбиновой кислоты. Напишите уравнения реакций.
16. Какие методы количественного определения аскорбиновой кис-
лоты могут быть использованы для анализа данной прописи глазных
капель? Приведите уравнения реакций.
17. Напишите уравнения реакций алкалиметрического (йодометри-
ческого) определения аскорбиновой кислоты, значение грамм-эквива-
лента, формулу расчета содержания аскорбиновой кислоты в %.
18. Напишите формулу и латинское название глюкозы.
19. Какая функциональная группа обусловливает восстановительные
свойства глюкозы? Приведите уравнения реакций.
20. Напишите уравнения реакций взаимодействия глюкозы с амми-
ачным раствором нитрата серебра и жидкостью Фелинга.
21. Как можно доказать наличие глюкозы в присутствии аскорбино-
вой кислоты?
22. Какой химический метод количественного определения глюкозы
может быть использован для ее анализа в данной прописи глазных ка-
пель? Приведите уравнения реакций, значение грамм-эквивалента, фор-
мулу расчета содержания глюкозы в %.
23. Приведите формулу расчета содержания глюкозы в % в данной
прописи глазных капель рефрактометрическим методом.
ЗАДАЧИ
Задание 1. Рассчитать энергию активации реакции
разложения
Энергию активации Е находят по уравнению Аррениуса
К2_ Е T2-Tt
К! 2303R ЦЪ ’
где Kj и К2 — константы скорости реакции при температурах
иТ2.
263
Из этого уравнения
Е = (lg^ .^RTjTj/fTj -TJ.
Задание 2. Рассчитать константу скорости реакции
разложения лекарственного препарата при 20 °C
В уравнение Аррениуса (см. задание 1) подставляют найденное
значение константы скорости реакции при одной температуре.
Проводят вычисления, используя поочередно значения констант
при трех температурах. Находят среднее значение константы ско-
рости реакции разложения.
9. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА
РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТА
Обозначения, использованные в настоящем разделе:
А — измеряемая величина;
а — свободный член линейной зависимости;
b — угловой коэффициент линейной зависимости;
F — критерий Фишера;
f — число степеней свободы;
i — порядковый номер варианты;
L — фактор, используемый при оценке сходимости результа-
тов параллельных определений;
ш, п — объемы выборки;
Р, Р — доверительная вероятность соответственно при дву- и
односторонней постановке задачи;
Qp Qn — контрольные критерии для идентификации грубых
ошибок;
R — размах варьирования;
г — коэффициент корреляции;
s — стандартное отклонение;
в2 — дисперсия;
Sjj— стандартное отклонение среднего результата;
Sj_ — логарифмическое стандартное отклонение;
S]~ -г- логарифмическая дисперсия;
S1r_ — логарифмическое стандартное отклонение среднего ре-
зультата;
Sq, s^, s2 — общая дисперсия и дисперсия коэффициентов ли-
нейной зависимости;
t — критерий Стьюдента;
U — коэффициент для расчета границ среднего результата га-
рантии качества анализируемого продукта;
W — весовой коэффициент пробита;
х, у — текущие координаты в уравнении линейной зависимо-
сти;
Хр — вычисленные, исходя из уравнения линейной зави-
симости, значения переменных х и у;
Y — пробит;
Y — активность препарата;
х, у — средние выборки (координаты центра линейной зависи-
мости);
хР у; — i-я варианта (i-я пара экспериментальных значений х
и у);
265
х ± Дх — граничные значения доверительного интервала сред-
него результата;
х. ± Дх — граничные значения доверительного интервала ре-
зультата отдельного определения;
Д — разность некоторых величин;
а — уровень значимости, степень надежности;
Дх — полуширина доверительного интервала величины;
5 — относительная величина систематической ошибки;
£, е — относительные ошибки соответственно среднего резуль-
тата и результата отдельного определения;
ц — истинное значение измеряемой величины;
Е — знак суммирования (сумма);
X2 — критерий хи-квадрат.
9.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ПОГРЕШНОСТЕЙ
ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Как в любом измерении, в результатах аналитического опреде-
ления йсегда содержится некоторая погрешность. Оценка погреш-
ности результата является частью анализа, а сама погрешность —
очень важной его характеристикой.
Погрешностью измерения называют отклонения результата из-
мерения от истинного значения измеряемой величины.
По способу вычисления погрешности можно подразделить на
абсолютные и относительные.
Абсолюная погрешность равна разности среднего измерения
величины х и истинного значения ц этой величины:
Дх = х-ц.
Иногда, если это необходимо, рассчитывают погрешность еди-
ничных определений:
Дх = х,-ц.
В зависимости от того, завышает или занижает погрешность ре-
зультат анализа, погрешности могут быть положительные и отри-
цательные.
Относительная погрешность вычисляется как отношение аб-
солютной погрешности измерения к истинному значению изме-
ряемой величины. Она может быть выражена в долях или про-
центах и обычно знака не имеет.
Относительную погрешность среднего результата вычисляют
по формуле
Ё = Дх/х-100%.
Относительная погрешность отдельного определения
Е = х,/х-100%.
266
Чаще всего погрешности классифицируют по характеру при-
чин, их вызывающих. При этом погрешности делят на системати-
ческие и случайные, а также промахи (или грубые погрешности).
К систематическим относят погрешности, которые вызваны
постоянно действующей причиной, они постоянны во всех изме-
рениях или меняются по постоянно действующему закону. Знак
систематической погрешности от эксперимента к эксперименту
не меняется, она или только завышает, или только занижает ре-
зультат. Систематические погрешности могут и должны быть
выявлены и устранены.
Случайные погрешности — это погрешности, причины появ-
ления которых неизвестны. Они не имеют постоянного знака, на-
звание “случайные” указывает на отсутствие какой-либо законо-
мерности в их появлении. Появление случайных погрешностей
обычно рассматривается как случайное событие и оценивается
методами математической статистики.
Промах — это погрешность, резко искажающая результат ана-
лиза и обычно легко обнаруживаемая, вызванная, как правило,
небрежностью или некомпетентностью аналитика.
На рис. 9.1 представлена схема, поясняющая понятия систе-
матических и случайных погрешностей и промахов. Прямая 1
отвечает тому идеальному случаю, когда во всех N определениях
отсутствуют систематические и случайные погрешности. Линии
2 и 3 — тоже идеализированные примеры химического анализа.
В одном случае (прямая 2) полностью отсутствуют случайные по-
грешности, но все N определений имеют постоянную отрицатель-
ную систематическую погрешность, Дх; в другом случае (линия 3)
полностью отсутствует система-
тическая погрешность. Реаль-
ную ситуацию отражает ли-
ния 4: имеются как случайные,
так и систематические погреш-
ности.
Деление погрешностей на
систематические и случайные
в известной степени условно.
Систематические погрешности
одной выборки результатов при
рассмотрении большего числа
данных могут переходить в слу-
чайные. Например, системати-
ческая погрешность, обуслов-
ленная неправильными показа-
Рис. 9.1. Систематические и случай-
ные погрешности химического анализа
267
ниями прибора, при измерении аналитического сигнала на раз-
ных приборах в разных лабораториях переходит в случайную. С
систематическими и случайными погрешностями связаны воспро-
изводимость и правильность.
Воспроизводимость характеризует степень близости друг к дру-
гу единичных определений, рассеяние единичных результатов от-
носительно среднего (рис. 9.2).
Воспроизводимость
Х1 х2х5 Х4Х3 Ц
•---•—• • > > »
у '----»---'
Правильность
Рис. 9.2. Воспроизводимость и правильность химического анализа
В отдельных случаях наряду с термином “воспроизводимость”
используют термин “сходимость”. При этом под сходимостью по-
нимают рассеяние результатов параллельных определений, а под
воспроизводимостью — рассеяние результатов, полученных раз-
ными методами, в разных лабораториях, в разное время, и т.п.
Правильность — это качество химического анализа, отражаю-
щее близость к нулю систематической погрешности. Правильность
характеризует отклонение полученного результата анализа от ис-
тинного значения измеряемой величины (см. рис. 9.2).
Иногда вводят понятие точность, характеризующее степень
близости результатов единичных определений к истинному зна-
чению измеряемой величины.
К началу обработки результатов химического анализа метода-
ми математической статистики систематические погрешности
должны быть выявлены и устранены или переведены в разряд
случайных. При этом данные анализа — случайные величины с
определенным распределением вероятности.
9.2. ОСНОВНЫЕ СТАТИСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ОДНОРОДНОЙ ВЫБОРКИ И ИХ ВЫЧИСЛЕНИЕ
Генеральная совокупность — гипотетическая совокупность всех
мыслимых результатов от - Z до + Z; выборочная совокупность
(выборка) — реальное число (п) результатов, которое имеет иссле-
дователь.
Под генеральной совокупностью результатов химического ана-
лиза понимают все мыслимые результаты, которые могли бы быть
получены при анализе одного и того же объекта различными ме-
тодами, на различных приборах, разными аналитиками. Обычно
же при проведении анализа одного и того же объекта имеем 3—
7 результатов (выборочная совокупность). Вопрос о близости па-
268
▼
I
t
раметров выборочной совокупности к параметрам генеральной со-
вокупности связан с объемом выборки и функцией распределе-
ния случайных величин. Как правило, для результатов химичес-
кого анализа при п > 20—30 с достаточной степенью надежности
и при п > 50—100 с хорошим приближением можно считать, что
имеем в своем распоряжении генеральную совокупность.
Одна из основных задач аналитика при оценке случайных по-
грешностей химического анализа — нахождение функции рас-
пределения, которой описываются экспериментальные данные. Из
математической статистики следует, что случайная величина счи-
тается заданной, если известна функция ее распределения. Эта
функция может быть представлена функциональной зависимос-
тью или графически. Данные большинства аналитических опре-
делений при наличии генеральной совокупности результатов хи-
мического анализа подчиняются закону нормального распределе-
ния (распределение Гаусса). Однако закон нормального распреде-
ления неприменим для обработки малого числа измерений
выборочной совокупности (п < 20). Для обработки таких выбо-
рок в химическом анализе используют распределение Стьюдента,
которое связывает между собой три основные характеристики:
ширину доверительного интервала, соответствующую ему веро-
ятность и объем выборки. Прежде чем рассматривать распределе-
ние Стьюдента и его применение для обработки данных химичес-
кого анализа, остановимся на некоторых основных характерис-
тиках выборочной совокупности.
Термином “выборка” обозначают, как уже говорилось, сово-
купность статистически эквивалентных результатов (вариант).
В качестве такой совокупности можно, например, рассматри-
вать ряд результатов, полученных при параллельных опреде-
лениях содержания какого-либо вещества в однородной по со-
ставу пробе.
Допустим, что отдельные значения вариант выборки объема п
обозначены через хД1 <i < п) и расположены в порядке возраста-
ния:
Хр х2; ... ... ; xn.i; хп. (9.1)
Результаты, полученные при статистической обработке выбор-
ки, будут достоверны только в том случае, если выборка однород-
на, т.е. если варианты, входящие в нее, не отягощены грубыми
ошибками, допущенными при измерении или расчете. Такие ва-
рианты должны быть исключены из выборки перед окончатель-
ным вычислением ее статистических характеристик. Как посту-
пают в этом случае, будет описано в разделе 9.3.
269
В большинстве случаев среднее выборки х является наилуч-
шей оценкой истинного значения измеряемой величины Ц, если
его вычисляют как среднее арифметическое всех вариант:
х = £х,/п. (9.2)
।
При этом разброс вариант х. вокруг среднего х характеризуется
величиной стандартного отклонения s. В количественном хими-
ческом анализе величина s часто рассматривается как оценка слу-
чайной ошибки, свойственной данному методу анализа. Квадрат
этой величины s2 называют дисперсией. Величина дисперсии мо-
жет рассматриваться как мера воспроизводимости результатов,
представленных в данной выборке. Вычисление величин s и s2
проводят по уравнениям 9.5 и 9.6. Иногда для этого предвари-
тельно определяют значения отклонений cL и число степеней сво-
боды (число независимых вариант) f:
d, = х,-х; (9.3)
f = n-l; (9.4)
s = Vs2. (9.6)
Число степеней свободы f — это число независимых перемен-
ных в выборочной совокупности за вычетом числа связей между
ними. В уравнении (9.4) f = п — 1, так как рассматривается рас-
сеяние данных относительно среднего, т.е. на результаты нало-
жена одна связь.
Стандартное отклонение среднего результата s- рассчитывают
по уравнению
s^s/Jn. (9.7)
Пример 9.1. При определении содержания стрептоцида в об-
разце линимента были получены следующие данные:
Номер опыта i 1 2 3 4 5
X, % L 9,52 9,55 9,83 10,12 10,38
n = 5;f = n- l = 5- l = 4
х = £ х, / п = (9,52 + 9,55 + 9,83 +10J 2 +10,33) / 5 = 9,87;
।
d, =|х,-х| = |х,-9,87), т.е. d, = |9,52-9,87| = 0,35 ит.д
270
s2 - v
= J,d2/f = £x;-nx2 /f =
1 11 7
= [(9,522 + 9,552 + 9,832 +10Д 22 +10,332)-5 - 9,872]/4 = 0Д252;
s = 7? = 703252 = 0,3538;
s. = s/7n =0,3538/75 = 03582.
9,3. ПРОВЕРКА ОДНОРОДНОСТИ ВЫБОРКИ
Как было указано, значения х, s2, s и s; могут быть признаны
достоверными, если ни одна из вариант выборки не отягощена
грубой ошибкой, т.е. если выборка однородна. Проверка однород-
ности выборок малого объема (п < 10) осуществляется без пред-
варительного вычисления статистических характеристик. С этой
целью после представления выборки в виде (9.1) для крайних
вариант Xj и хп рассчитывают значения контрольного критерия
Q, исходя из величины размаха варьирования R:
R = jx,-x„j; (9.8)
Q, = |x,-x,|/R; (9.9)
Q„ ~xn-il/R (9.10)
Выборка признается неоднородной, если хотя бы одно из вы-
численных значений Q превышает табличное значение Q (Р, п),
найденное для доверительной вероятности Р. Варианты Xj или
хп, для которых соответствующее значение Q > Q(P, п), отбрасы-
ваются, и для полученной выборки уменьшенного объема выпол-
няют новый цикл вычислений по уравнениям (9.8) и (9.9) с це-
лью проверки ее однородности. Полученная в конечном счете од-
нородная выборка используется для вычисления х, s2, s и .
Примечание 9.1. При |xj - х2| < ]х2 - х3| и |xn - xn_J <
< |xn_j — хп_2| уравнения (9.9) и (9.10) принимают соответственно
вид;
Qi =|х2 -хз|/^ Qn =1хп-1 - x„_2|/R-
Пример 9.2. При проведении девяти (п = 9) определений со-
держания общего азота в плазме крови крыс были получены сле-
дующие данные (в порядке возрастания):
i 1 2 3 4 5 6 7 8 9
X, % 0,62 0,81 0,83 0,86 0,87 0,90 0,94 0,98 0,99
271
По уравнениям (9.8) и (9.9) определяем
R = |Х) - Хп| = |0,62 - 0,99| = 0,37;
Q, = |х, - х2 |/R = |0,62 - 0,81|/0,37 = 0,51.
По табл. 1 приложения (ГФ XI, вып. 1, с. 248) находим:
0(9; 99%) = 0,46 < Q, = 0,51;
Q(9; 99%) = 0,55 > Q, = 0,51.
Следовательно, гипотеза о том, что значение хг = 0,62 должно
быть исключено из рассматриваемой совокупности результатов
измерений как отягощенное грубой ошибкой, может быть приня-
та с доверительной вероятностью 95 %, но должна быть отвергну-
та, если выбранное значение доверительной вероятности равно
99 % (табл. 9.1).
Для выборок большого объема (п > 10) проверку однородности
проводят после предварительного вычисления статистических
характеристик х, s2, s и s7. При этом выборка признается одно-
родной, если для всех вариант выполняется условие:
|d,|<|3s|. (9.11)
Таблица 9.1
Числовые значения контрольного критерия Q(P, п)
И Q
Р = 90 % Р = 95 % Р = 99 %
3 0,89 0,94 0,99
4 0,68 0,77 0,89
5 0,59 0,64 0,76
6 0,48 0,56 0,70
7 0,43 0,51 0,64
8 0,40 0,48 0,58
9 0,38 0,46 0,55
9.4. ДОВЕРИТЕЛЬНЫЕ ИНТЕРВАЛЫ
И ОЦЕНКА ИХ ВЕЛИЧИНЫ
При обработке данных нас интересует интервал, в который при
имеющейся выборке в п результатов с заданной вероятностью
попадают результаты химического анализа.
Если случайная однородная выборка конечного объема п полу-
чена в результате последовательных измерений некоторой вели-
чины А, имеющей истинное значение ц,то среднее этой выборки
х следует рассматривать лишь как приближенную оценку А. До-
272
стоверность этой оценки характеризуется величиной доверитель-
ного интервала х ± Дх, для которой с заданной доверительной
вероятностью Р выполняется условие:
(х-Дх)<ц< (х + Дх) (9.12)
Расчет граничных значений доверительного интервала прово-
дят по Стьюденту, предполагая, что варианты, входящие в вы-
борку, распределены нормально:
(x±Ax) = x±(t(P,f)s)/Vn, (9.13)
где t(P,f) — табличное значение критерия Стьюдента (табл. 9.2).
В таблице приведены значения t для различной доверительной
вероятности. Вероятность Р показания внутрь рассматриваемого
интервала чаще всего принимают равной 0,95 (95 %), хотя в за-
висимости от решаемых задач она связана также с числом степе-
ней свободы f (числа результатов или объема выборки п). Пользу-
ясь табличными значениями критерия Стьюдента, можно обраба-
Таблица 9.2
Числовые значения критерия Стьюдента и критерия £2
f Х2(Р, F) (Р = 95%) Критерий Стьюдента t (P,f ) и t (Р, f)
50 % 90 % 95 % 98 % 99 %
1 3,84 1,000 6,31 12,70 31,82 63,70
2 5,99 0,816 2,92 4,30 6,97 9,92
3 7,82 0,765 2,35 3,18 4,54 5,84
4 9,49 0,741 2,13 2,78 3,75 4,60
5 11,47 0,727 2,01 2,57 3,37 4,03
6 12,59 0,718 1,94 2,45 3,14 3,71
7 14,07 0,711 1,89 2,36 3,00 3,50
8 15,51 0,711 1,89 2,36 3,00 3,50
9 16,92 0,703 1,83 2,26 2,82 3,25
10 18,31 0,700 1,81 2,23 2,76 3,17
15 25,00 0,691 1,75 2,13 2,60 2,95
20 31,4 0,687 1,73 2,09 2,53 2,85
30 - 0,683 1,70 2,04 2,46 2,75
40 - 0,681 1,68 2,02 2,42 2,70
60 - 0,679 1,67 2,00 2,39 2,66
120 - 0,677 1,66 1,98 2,36 2,62
оо - 0,674 1,64 1,96 2,33 2,58
f Х2(Р, F) (Р - 95 % 75 % 95 % 97,5 % 99 % 99,5 %
Р
18. Заказ 3547
273
тывать результаты химического анализа при объемах выборки
п < 20.
Как видно из таблицы, наиболее эффективное влияние на ве-
личину t, а, следовательно, и на доверительный интервал оказы-
вает увеличение числа определений (п) до 4—5 параллельных;
дальнейшее увеличение числа параллельных проб оказывает уже
значительно меньшее влияние. Поэтому выполнение больше че-
тырех параллельных определений часто не имеет смысла (кроме
специальных случаев).
Доверительный интервал (см. уравнение (9.13)) характеризует
воспроизводимость и в определенной степени правильность ре-
зультатов химического анализа.
Подставив в уравнение (9.13) n = 1, получаем:
Xj ± Дх = X; ± t(P,f)s. (9.14)
Этот интервал является доверительным интервалом результата
отдельного определения. Для него с доверительной вероятностью
Р выполняются взаимосвязанные условия:
Х[-Дх<ц<Х[ + Дх; (9.15)
ц-Ах<Х| <ц+Дх. (9.16)
Значения Дх и Дх из выражений (9.13) и (9.14) используют
при вычислении относительных погрешностей отдельной вариан-
ты (е) и среднего результата (ё), выражая эти величины в %:
е = (Дх/х)-100 %; (9.17)
Ё = (Дх/х)-100 %. (9.18)
Пример 9.3. В результате определения содержания хинона в
стандартном образце хингидрона были получены следующие дан-
ные (п=10):
i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
x,. % 49,80 49,83 49,87 49,87 49,92 50,01 50,05 50,06 50,10 50,11
Расчеты по формулам 9.2, 9.4—9.7 дали следующие результа-
ты:
х = 49,96;
f = 9;
s2 = 0,01366; s = 0J169; sx= 0,03696.
Доверительные интервалы результата отдельного определения и
среднего результата при Р = 90 % получаем согласно (9.13) и (9.14):
х, ±Дх = х( ±t(P,f)-s = X| ±t(90%, 9)-s = Xj ±1^3-0Д169=Х) ±0,21;
х, ± Дх = х ± (t(P, f) • s)/ Vn = 49,96 ± (133 • 0Д169)/ Ло = 49,96 ± 0,07.
274
Тогда относительные погрешности е и е, согласно (9.17) и (9.18)
равны:
е = (Дх / х) • 100 % = (0,21 /49,96) -100% = 0,42 %;
ё = (Дх / х) • 100 % = (0,07/ 49,96) • 100% = ОД 4 %.
Обозначая истинное содержание хинона в хингидроне через ц,
можно считать, что с 90 % -ной доверительной вероятностью спра-
ведливы неравенства:
ц-0,21<Х| <ц + 0,21;
х, -0^1<p<Xj + 0,21;
ц-0,07< х<ц +0,07; х-0,07<ц < х + 0,07(прип = 10).
9.5. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
МЕТОДА АНАЛИЗА
С целью получения метрологической характеристики метода
проводят совместную статистическую обработку одной или не-
скольких выборок, полученных при анализе образцов с извест-
ным содержанием определяемого компонента ц. Результаты ста-
тистической обработки представляют в виде табл. 9.3.
Таблица 9.3
Метрологическая характеристика метода анализа
ц f X S2 S Р t(P, t) Дх е 8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10*
* Графа 10 заполняется в том случае, если реализуется неравенство (9.20).
Примечание 9.2. При проведении совместной статистичес-
кой обработки нескольких выборок, полученных при анализе об-
разцов с разным содержанием определяемого компонента ц, дан-
ные в графах 1, 2, 3, 4, 9, 10 приводят отдельно для каждой
выборки. При этом в графах 2, 4, 5, 7, 8 в последней строке под
чертой приводят обобщение значений f, s2, s, t, Дх.
Если для выборки объема m величина | ц - Я | > 0, следует ре-
шить вопрос о наличии или отсутствии систематической ошибки.
Для этого вычисляют критерий Стьюдента t:
t = |p-x|-Vm/s. (9.19)
Если, например, при Р = 95 % и f = m - 1 реализуется нера-
венство
t > t(P, f)8, (9.20)
полученные данным методом результаты отягощены системати-
ческой ошибкой, относительная величина которой 8 вычисляется
по формуле
18*
275
б=((х-ц)/И «»%•
(9.21)
9.9. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА
Если с помощью данного метода анализа (измерения) следует
определить значение некоторой величины А, то для полученной
экспериментально однородной выборки m рассчитывают величи-
ны, необходимые для заполнения табл. 9.4. Так поступают в том
случае, если применяемый метод анализа (измерения) не был ра-
нее аттестован метрологически. Если же этот метод уже имеет
метрологическую аттестацию, графы 2, 4, 5, 7, 8 и 9 табл. 9.4
заполняются на основании данных табл. 9.3, полученных при ат-
тестации.
Таблица 9.4
m f X s2 s Sx P t(P, t) Ax Ax или x± Ax £
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Таким образом, на основании выражения (9.12) для измеряе-
мой величины А в предположении отсутствия систематической
ошибки с вероятностью Р выполняется условие
х, - Дх < А < х +Дх, (9.22)
т. е.
А = х±Дх. (9.23)
9.7. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
Оценка сходимости результатов параллельных определений.
При рядовых исследованиях аналитик обычно проводит два-три,
реже четыре параллельных определения. Варианты полученной
при этом упорядоченной выборки объема т, как правило, доволь-
но значительно отличаются друг от друга. Если метод анализа
метрологически аттестован, то максимальная разность результа-
тов двух параллельных определений должна удовлетворять не-
равенству
|х,-xn| < L(P,m)s, (9.24)
где L(P, m) — фактор, вычисленный по Пирсону при Р = 95 %.
m 2 3 4
L 2,27 3,31 3,65
276
Если неравенство (9.24) не выполняется, необходимо провести
дополнительное определение и снова проверить, удовлетворяет ли
величина |ху - хп| указанному неравенству.
Если для результатов четырех параллельных определений не-
равенство (9.24) не выполняется, одна из вариант (х^ или хп) дол-
жна быть отброшена и заменена новой. При невозможности до-
биться выполнения неравенства (9.24) следует считать, что конк-
ретные условия анализа привели к снижению воспроизводимости
метода и принятая оценка величины s применительно к данному
случаю является заниженной. В этом случае поступают, как ука-
зано в разделах 9.2 и 9.3.
Определение необходимого числа параллельных определений.
Если необходимо получить средний результат х с относительной
погрешностью £ < ф, причем метод анализа метрологически атте-
стован, необходимое число параллельных определений m нахо-
дят, исходя из уравнений (9.12) и (9.13):
ш>[(Дх 100)/<рх]-\ (9.25)
Гарантия качества продукции. Предположим, что качество
продукции регламентируется предельными значениями а„йп и a„i>v
величины А, которую определяют на основании результатов ана-
лиза. Примем, что вероятность соответствия качества продукта
условию
am,n<A<amax (9.26)
должна составлять Р, %.
Пусть величину А находят экспериментально как среднее вы-
борки объема ш, а метод ее определения метрологически аттесто-
ван. Тогда условие (9.26) будет выполняться с вероятностью Р,
если значение х = А будет лежать в пределах
amm+ДА < А < amdX - ДА; (9.27)
ДА = [U(P)s]/-Ут. (9.28)
Значения коэффициента U для вероятности Р = 95 % и Р = 99 %
соответственно равны 1,65 и 2,33. Иными словами, для гарантии
качества наблюдаемые пределы изменения величины А на прак-
тике следует ограничить значениями
Атш =ат1„ + ДА = атш +[U(P)s]/V^; (9.29)
Атах =атлх-ДА = amdX-[U(P)s]/-Ут. (9.30)
Наоборот, если заданы значения Amin и Атах, то значения amin
и атах, входящие в неравенство (9.26), могут быть найдены путем
277
решения уравнений (9.29) и (9.30). Наконец, если заданы пары
значений А^, amin и Атах, атах, то уравнения (9.29) и (9.30)
могут быть решены относительно ш. Это может быть использова-
но для оценки необходимого числа параллельных определений
величины А.
Примечание 9.3. В уравнениях (9.28)—(9.30) величина
коэффициента U(P) должна быть заменена величиной t(P, f), если
значение f, определенное по уравнению (9.4), меньше 15.
Пример 9.4. Рассмотрим данные табл. 9.5 как метрологичес-
кую характеристику используемого метода анализа.
Таблица 9.5
№ М f X -> S” S Р, % t(P, f) табл. Дх € t выч F(P, f,> U табл. Р = 99 % F аыч 8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 100 20 100,13 0,215 0,464 95 2,09 0,97 0,97 1,28 3,36 17,92
а) Пусть amin = 98 %, am,v = 100,50 %. Тогда для испытуемого
образца продукта средний результат анализа А при проведении
трех параллельных определений (ш=3) должен находиться в пре-
делах
amin+[U(P)s]/Vin < A<amdX-[U(P)s]/Vm.
При P = 99 %
98 + [233 • 0,464] / Л < A < 100,5 - [2,33 • 0,464] IVJ;
98,62 < A <99,88.
При P = 95 %
98+[1,65 • 0,464] / Л < A < 100,5 - [1,65 0,464] IVJ;
98,44 < A < 100,06.
б) Реальный средний результат анализа образца испытуемого
продукта А = 99 % (при m = 3). Тогда определение пределов а^
и а,^, гарантированно характеризующих качество данного об-
разца с заданной доверительной вероятностью Р, проводим, исхо-
дя из уравнения (9.29) или (9.30), полагая Amin= Amax = А:
amm = A-[U(P)s]/Vm;
а max = A+[U(P)S]/V^.
При Р = 99 %
amm = 99 -[2,33 0,464]17з = 9838 %; *
а max = 99 + [2,33 • 0,464] / л/з = 99,62 %.
278
При Р = 95 %
amin = 99-[1,65 0,464]/ Л = 98,56%;
amax =99+[1,65-0,464]/Л = 99,44%.
Полученные оценки aniin и атах близки к границам доверитель-
ного интервала А± Ах = А ± Ах/7m =99±0,97/ Л = 99±0,56> что со-
ответствует примечанию 9.3.
9.8. РАСЧЕТ И СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ПАРАМЕТРОВ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ
При использовании ряда химических и физико-химических
методов количественного анализа непосредственному измерению
подвергается некоторая величина у, которая является линейной
функцией искомой концентрации (количества) х определяемого
вещества или элемента. Иными словами, в основе таких методов
анализа лежит существование линейной зависимости
у = Ьх + а, (9.31)
где у — измеряемая величина; х — концентрация (количество)
определяемого вещества или элемента; b — угловой коэффициент
линейной зависимости; а — свободный член линейной зависимо-
сти.
Для использования зависимости (9.31) в аналитических целях,
т.е. для определения конкретной величины х по измеренному зна-
чению у, необходимо заранее найти числовые значения констант
b и а, т.е. провести калибровку. Иногда константы функции (9.31)
имеют тот или иной физический смысл, и их значения должны
оцениваться с учетом соответствующего доверительного интерва-
ла. Если калибровка проведена и значения констант а и b опреде-
лены, величину Xj находят по измеренному значению у:
х, =(1/Ь)у,-а/Ь. (9.32)
При калибровке величину х рассматривают как аргумент, а
величину у — как функцию. Наличие линейной зависимости меж-
ду х и у не всегда является очевидным. По этой причине экспери-
ментальные данные, полученные при калибровке, в первую оче-
редь используют для оценки жесткости, т.е. степени неслучайно-
сти линейной связи между х и у, и лишь затем определяют значе-
ния констант а и b и их доверительные интервалы. В первом
приближении судить о жесткости линейной связи между пере-
менными х и у можно по величине коэффициента корреляции г,
который вычисляют по уравнению
279
(9.33)
исходя из экспериментальных данных, представленных в табл. 9.6.
Чем ближе |г| к единице, тем менее случайна наблюдаемая линей-
ная зависимость между переменными х и у. В аналитической
химии в большинстве случаев используют линейные зависимости
с коэффициентом корреляции |г| > 0,98 и только при анализе
следовых количеств рассматривают линейные зависимости с ко-
эффициентом корреляции |г| > 0,9. Применение уравнения (9.32)
оправдано только при |г| > 0,95.
Коэффициенты а и b и другие метрологические характеристи-
ки зависимости (9.31) рассчитывают с использованием метода наи-
меньших квадратов по экспериментально измеренным значениям
переменной у для заданных значений аргумента х.
Пусть в результате эксперимента найдены представленные в
табл. 9.6 пары значений аргумента х и функции у.
Таблица 9.6
i X У,
1 Х! У>
2 Х2 у2
• •• • ••
m х„, у„.
Тогда
а= £yj-b£xi /ш; (9.35)
I 1 1 J
f = m - 2. (9.36)
Если полученные значения коэффициентов а и b использовать
для вычисления значений у по заданным в табл. 9.6 значениям
аргумента х согласно зависимости (9.31), то вычисленные значе-
ния у обозначают через Yx, Y2, ..., YP ..., Yn. Разброс значений у;
относительно значений Yk характеризует величина дисперсии s^,
которую вычисляют по уравнению
280
so =
m
Z(y.-Y.
I
m m
Yi -а£У|~ь£х,У,
I I
/f- (9.37)
В свою очередь дисперсии констант b и а находят по уравнениям
mso
(9.38)
sl=------
m
m£x;
I
«2 m
(9.39)
mT
Стандартные отклонения s,, и sa и величины Ab и Да, необходи-
мые для оценки доверительных интервалов констант, рассчиты-
вают по выражениям
(9.40)
(9.41)
АЬ = t(P;F)sb;
Да = t(P;F)sa.
(9.42)
(9.43)
Уравнению (9.31) с константами а и b обязательно удовлетво-
ряет точка с координатами х и у, называемая центром калибро-
вочного графика:
m
x = Xx./m; (9.44)
i
У = £у./т. (9,45)
i
Наибольшие отклонения значений yi от значений Y; наблюда-
ются в окрестностях центра графика. Стандартные отклонения sy
и sx величин у и х, рассчитанных соответственно по уравнениям
(9.31) и (9.32) исходя из известных значений х и у, определяются
с учетом удаления последних от координат центра графика:
(9.46)
(9.47)
где У| — среднее значение; п. — число вариант, использованных
при определении у-.
281
При х = х и Yj = у
(9.48)
sy = Js^/m;
s
(9.49)
С учетом значений s„ и sv могут быть найдены значения вели-
У х
чин Ду и Дх:
(9.50)
Ay = syt(P;F);
Дх = sxt(P;F). (9.51)
Значения sx и Дх, вычисленные при = 1, являются характе-
ристиками воспроизводимости аналитического метода, если х —
концентрация, а у — функция х [10].
Обычно результаты статистической обработки по методу наи-
меньших квадратов сводят в таблицу (табл. 9.7).
Таблица 9.7
Результаты статистической обработки экспериментальных данных,
полученных при изучении линейной зависимости вида у = Ъх + а
f X У b а t(P, f) при Р - 95 % ДЬ Да S2 so Г sx при а = 1 У Дх Дх 100 X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Примечание 9.4. Если целью экспериментальной работы
являлось определение констант b и а, графы 11, 12 и 13 табл. 9.7
не заполняются.
Примеры вычислений, касающихся более сложных случаев
(наличие ряда из нескольких выборок, сравнение двух методов
анализа), а также случаи, когда при измерениях получают лога-
рифмы нескольких вариант, в настоящем разделе не рассматри-
ваются. С ними можно познакомиться в главе “Статистическая
обработка результатов химического эксперимента и биологичес-
ких испытаний” ГФ XI, вып. 1, с. 199.
10. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
10.1. БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Биологическую оценку качества лекарственных препаратов
обычно проводят по силе фармакологического эффекта или по
токсичности. Применяют биологические методы тогда, когда с
помощью физических, химических или физико-химических ме-
тодов не удается сделать заключение о чистоте или токсичности
лекарственного препарата или когда способ получения препарата
не гарантирует постоянства активности (например, антибиотики).
Биологические испытания проводят на животных (кошки, со-
баки, кролики, лягушки и др.), отдельных изолированных орга-
нах, отдельных группах клеток (форменные элементы крови), а
также на определенных штаммах микроорганизмов. Активность
препаратов выражают в единицах действия (ЕД).
10.1.1. Принцип метода биологической оценки
сердечных гликозидов
Биологическая оценка сердечных гликозидов основана на спо-
собности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах
систолическую остановку сердца животных.
Активность сердечных средств оценивают по сравнению с ак-
тивностью стандартных образцов и выражают в ЕД.
Испытания проводят на лягушках, кошках или голубях. Уста-
навливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемо-
го препарата, вызывающие систолическую остановку сердца по-
допытных животных. Затем рассчитывают содержание ЕД в 1 г
исследуемого средства, если испытываются лекарственные расте-
ния или сухие концентраты; в одной таблетке — при испытании
таблеток или в 1 мл, если испытываются жидкие лекарственные
формы.
Стандартные образцы и понятие единицы действия
Стандартными образцами при испытании листьев и препара-
тов наперстянки пурпуровой и крупноцветковой, травы, цветков,
листьев и препаратов ландыша служат специально изготовлен-
ные спиртовые экстракты из названных растений, содержащие
сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ.
Стандартными образцами при испытании других лекарствен-
ных растений и полученных из них препаратов служат индивиду-
альные кристаллические гликозиды: при испытании препаратов
наперстянки шерстистой — целанид-стандарт; при испытании тра-
вы, препаратов горицвета — цимарин-стандарт; при испытании
283
семян и препаратов строфанта — строфантин G-стандарт; при ис-
пытании травы и семян желтушника серого — эризимин-стан-
дарт.
Биологическую активность стандартных образцов устанавли-
вают на лягушках-самцах (Rana temporaria) массой 28—33 г при
подкожном введении в октябре—ноябре (таких лягушек условно
называют “стандартными” или “нормальными”), а также на кош-
ках или голубях в определенных условиях опыта.
При испытании на лягушках разведения стандартных образ-
цов подбирают с таким расчетом, чтобы одна лягушачья единица
действия (1 ЛЕД) соответствовала дозе стандартного Образца, вы-
зывающей в определенных условиях опыта систолическую оста-
новку сердца у большинства подопытных стандартных лягушек.
Под 1 ЛЕД наперстянки и ландыша подразумевают специфи-
ческую биологическую активность 0,3 мл стандартного образца,
разведенного в 4 раза водой. Неразведенные стандартные образцы
наперстянки и ландыша содержат в 1 мл 13,33 ЛЕД.
Под 1 ЛЕД цимарина, целанида подразумевают специфическую
биологическую активность 0,3 мл спиртоводного раствора крис-
таллического гликозида в следующей концентрации:
цимарина 1:13 333
целанида 1: 5 000.
Под 1 ЛЕД строфантина G, эризимина подразумевают специ-
фическую биологическую активность 0,4 мл спиртоводиого ра-
створа кристаллического гликозида в следующей концентрации:
строфантина 1:20 000
эризимина 1:25 000.
При испытании сердечных средств иа кошках и голубях ак-
тивность препарата выражают в кошачьих и голубиных ЕД.
Под одной кошачьей или голубиной единицей действия (1 КЕД,
1 ГЕД) подразумевают дозу стандартного образца или испытуемо-
го препарата из расчета на 1 кг массы животного или птицы,
вызывающую систолическую остановку сердца кошки или голу-
бя и устанавливаемую в определенных условиях опыта. Эта доза
является смертельной.
Разведения стандартного образца или испытуемого препарата
подбирают с таким расчетом, чтобы 1 КЕД или 1 ГЕД содержа-
лись примерно в 15 мл раствора [11].
А. Метод биологической оценки сердечных средств на лягушках
Отбор лягушек и их содержание
Для опытов пригодны лягушки-самцы вида травяная (Rana
temporaria) массой 28—40 г; водяная — озерная (Rana ridibunda)
и прудовая (Rana esculenta) массой 30—70 г.
284
I
Лягушек содержат в течение зимы в бассейне с проточной во-
дой в полутемном помещении при температуре от 3 до 8 °C.
Сохраняемые в бассейне лягушки зимой могут быть непосред-
ственно использованы для опыта. Весной и летом лягушки долж-
ны быть свежепойманнымн и выдерживаться до опытов в бассей-
нах с проточной водой в течение 2—3 суток. Температура воды в
бассейне в теплое время года не должна превышать 15 °C. Поме-
щение лаборатории, где проводят биологические испытания, долж-
но быть светлым, но защищенным от попадания прямых солнеч-
ных лучей, температура воздуха в нем 15—22 °C. В лаборатории
должна быть раковина для содержания подопытных лягушек, в
которую их помещают за 1—1,5 ч до проведения опыта.
Техника испытания и принцип расчета
Отбирают партию лягушек одного вида, возможно близких друг
к другу по массе. Взвешивание животных проводят непосредствен-
но перед опытом с точностью до 0,5 г с отклонениями от средней
массы в группе не более чем на ±2,5 г: 28—33, 30—35, 35—40, ...,
65—70 г.
Лягушек (5 или 10) укрепляют на досках брюшком кверху с
предельно вытянутыми конечностями, булавки вкалывают в вер-
хнюю часть морды и в суставы передних и задних конечностей.
Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней прямоу-
гольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сто-
рону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просве-
чивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей
по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой
части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже
места наложения пинцета так, что образуется узкое поперечное
оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким
(глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не
поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сер-
дечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими на-
давливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При
препарировании следят за тем, чтобы через образованное отвер-
стие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце сво-
бодно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к
наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное серд-
це каждые 15—20 мин смачивают 0,6 %-ным раствором натрия
хлорида (наносят пипеткой 2—3 капли).
Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя
растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу), в серд-
це (в полость желудочка), на водяных — в сердце (в полость же-
Й-
| 285
лудочка) или в вену; под кожу — только растворы, содержащие
гликозиды ландыша.
Лягушкам, относящимся к одной группе (5 шт.), вводят оди-
наковые дозы испытуемого раствора.
Препараты, подлежащие испытанию, предварительно разво-
дят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого
раствора соответствовали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество
единиц действия препарата умножают на количество миллилит-
ров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, в 1 мл раствора коргли-
кона 0,06 %-ного для инъекций содержится в среднем 13,3 ЛЕД
(13,3 • 0,3 = 3,99, т. е. разведение препарата 1:4).
а) Метод испытания при введении раствора под кожу. Ра-
створы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатичес-
кие мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в
одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят рав-
ными частями в обе конечности.
После введения раствора наблюдают за лягушками и опреде-
ляют наименьшую дозу, вызывающую систолическую остановку
сердца у большинства (3—4) из 5 лягушек данной группы в тече-
ние 1 ч, если испытывают сырье и препараты наперстянки, лан-
дыша, горицвета, или в течение 2 ч, если испытывают сырье и
препараты строфанта, желтушника. Если в течение этого време-
ни отчетливой остановки сердца не произошло, продолжают на-
блюдение еще 10 мин (при длительности наблюдения 1 ч) и учи-
тывают также количество лягушек, у которых остановка сердца
наступила в дополнительное время. Длительность систолической
остановки сердца должна быть не менее 15 мин. Лягушек, у кото-
рых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 15 мин
после остановки, в расчет не принимают.
В протоколах опытов отмечают время введения препарата и
результаты опытов для каждой лягушки в отдельности. Каждое
отдельное испытание начинают с определения чувствительности
данной партии лягушек к стандартному образцу. С этой целью
нескольким группам лягушек по 5 животных в каждой вводят
разные дозы стандартного образца: одной группе — дозу, соответ-
ствующую 1 ЛЕД (по 0,3 или 0,4 мл в зависимости от того, какой
применяется стандарт), другим — на 0,05—0,1 мл больше. Нахо-
дят наименьшую дозу стандартного образца, вызывающую оста-
новку сердца у большинства (3—4) из 5 лягушек, и устанавлива-
ют таким образом чувствительность опытной партии лягушек по
сравнению со стандартными лягушками. Затем в тех же услови-
ях опыта группе из 5 лягушек той же партии вводят раствор ис-
пытуемого препарата в дозе, соответствующей найденной наимень-
286
шей дозе стандартного образца, и наблюдают за животными в
течение 1 или 2 ч (в зависимости от того, какой препарат испыты-
вается). Если в результате наблюдений будет установлено, что
введенная доза недостаточна или слишком велика, дозу увеличи-
вают или уменьшают, причем разница между дозами должна быть
не более 0,1 мл. Опыты проводят до тех пор, пока не будет найде-
на наименьшая доза испытуемого препарата, вызывающая систо-
лическую остановку сердца у большинства (3—4) из 5 лягушек.
Далее рассчитывают содержание единиц действия в 1 мл, 1 г
или 1 таблетке испытуемого препарата.
Для сырья и препаратов наперстянки, ландыша, горицвета
расчет проводят по формуле
ВК
0,3 А ’
где В — наименьшая доза в мл, установленная для раствора стан-
дартного образца; К — число, обозначающее разведение испытуе-
мого препарата; 0,3 — доза в мл, соответствующая 1 ЛЕД; А —
наименьшая доза в мл, установленная для раствора испытуемого
препарата.
Для сырья и препаратов строфанта, желтушника расчет осу-
ществляют по выражению
ВК
ОДА ‘
б) Метод испытания при введении растворов в полость желу-
дочка сердца. Испытуемые растворы, предварительно освобожден-
ные от избытка спирта (не должен превышать 10 %) и летучих
веществ, в соответствующем разведении вводят лягушкам непо-
средственно в полость желудочка сердца со скоростью 0,1 мл в
5 с, проколов его в момент диастолы тонкой иглой, соединенной
со шприцем вместимостью 1 мл с двойной шкалой (деления 0,01—
0,02 мл). Иглу вынимают из полости желудочка во время систо-
лы, чтобы избежать кровотечения в месте укола.
Для определения наименьшей дозы раствора стандартного об-
разца и испытуемого препарата травяным лягушкам вводят при-
мерно 0,2 мл препарата наперстянки, ландыша, горицвета или
0,3 мл препарата строфанта, желтушника. Допустимое отклоне-
ние между вводимыми дозами — 0,02—0,03 мл.
При определении на водяных лягушках рассчитывают вводи-
мую дозу на 1 г массы тела. Для того чтобы не рассчитывать
каждый раз дозу на введение, предлагается таблица расчетных
доз (табл. 10.1). Допустимое отклонение между вводимыми доза-
ми должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки. Наи-
287
меньшими дозами обычно являются 0,004—0,006 мл раствора на
1 г массы лягушки.
Длительность наблюдения за лягушками — 15 мин, если ис-
пытывают сырье и препараты наперстянки, ландыша, горицвета;
для препаратов строфанта, желтушника — 20 мин. Если в тече-
ние этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, /’
наблюдение продолжают еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце
начинает вновь сокращаться ранее, чем через 5 мин после оста-
новки, в расчет ие принимают.
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, в 1 г, в 1 таблетке испы-
туемого образца по формулам, приведенным для подкожного вве-
дения, но обозначения А и В зависят от принципа расчета доз,
т.е. от вида применяемых лягушек:
А — наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или
1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора
испытуемого препарата;
В — наименьшая доза (1 мл на массу травяной лягушки или
1 мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора
стандартного образца.
в) Метод.испытания при введении растворов в вену- У лягу-
шек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем
по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо
и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На
внутренней поверхности отведенных в сторону лоскутов кожи с
Таблица 10.1
Дозы, рассчитанные для введения водяным лягушкам при оценке
препаратов, содержащих сердечные гликозиды, внутрисердечным и
внутривенным путем
Сред- няя масса лягуш- ки, г Дозы препарата на 1 г массы лягушки, мг
0,003 0,0035 0,004 0,0045 0,005 0,0055 0,006 0,0065 0,007 0,0075
Дозы препарата на массу лягушки
30 0,09 0,10 0,12 0,14 0,15 0,17 0,18 0,20 0,21 0,23
35 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,19 0,21 0,23 0,25 0,26
40 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0,30
45 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,25 0,27 0,29 0,32 0,34
50 0,15 0,18 0,20 0,22 0,25 0,28 0,30 0,33 0,35 0,38
55 0,17 0,19 0,22 0,25 0,28 0,30 0,33 0,36 0,39 0,41
60 0,18 0,21 0,24 0,27 0,30 0,33 0,36 0,39 0,42 0,45
65 0,20 0,23 0,26 0,28 0,33 0,36 0,39 0,42 0,45 0,49
70 0,21 0,25 0,38 0,32 0,35 0,39 0,42 0,46 0,49 0,52
75 0,23 0,26 0,30 0,34 0,38 0,41 0,45 0,49 0,52 0,56
288
каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, иду-
щей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины кни-
зу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену.
Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при
введении под кожу. Доску с группой препарированных живот-
ных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к
экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее ко-
лено петли вены лягушки.
При введении лягушкам внутривенным способом растворов
стандартных образцов и испытуемых препаратов в соответствую-
щем разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих
веществ, рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела (см.
табл. 10.1).
Лягушкам, относящимся к одной группе (5 шт.), вводят в вену
одинаковые дозы раствора стандартного образца или испытуемо-
го препарата тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимос-
тью 1 мл с двойной шкалой, со скоростью 0,1 мл в 5 с. После
каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы,
которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за оста-
новкой сердца лягушки — 15 мин, если испытывают сырье и пре-
параты наперстянки, ландыша, горицвета; для препаратов стро-
фанта, желтушника — 20 мин. Если в течение этого времени от-
четливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжа-
ют еще 5 мин; о результатах судят по изменениям, наступающим
в дополнительное время.
Определение наименьшей дозы стандартного образца и испы-
туемого препарата, вызывающей систолическую остановку серд-
ца у большинства лягушек (3—4 из 5), проводят так же, как при
введении под кожу. Допустимое отклонение между вводимыми
дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки.
Наименьшими дозами обычно являются 0,004—0,006 мл ра-
створа на 1 г массы лягушки.
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или 1 таблетке испы-
туемого препарата по формулам, приведенным для подкожного
введения, но с другими обозначениями А и В:
А — наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установ-
ленная для раствора испытуемого препарата;
В — наименьшая доза (1 мл на 1 г массы лягушки), установ-
ленная для раствора стандартного образца [11].
19. Заказ 3547
289
Б. Метод биологической оценки сердечных средств на койках
Отбор кошек и их содержание
Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беремен-
ных и не лактируюгцих, массой 2—3,5 кг, находившихся в усло-
виях лабораторного содержания в течение 2—3 сут. За 16—20 ч
до начала опыта животных лишают пищи, но ие воды.
Техника испытания и принцип расчета
Опыт проводят под легким эфириым или уретановым нарко-
зом (1,5—1,7 г/кг внутримышечно в затылочную часть головы).
В отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю
(затупленную инъекционную иглу № 19—22), соединенную тон-
кой каучуковой трубкой с градуированной бюреткой вместимос-
тью 50—100 мл, откуда поступает раствор испытуемого препара-
та, приготовленный на 0,9 %-ном растворе натрия хлорида. На
пути между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик,
помещенный в баню с подогреваемой водой (39 °C) для поддержа-
ния постоянной температуры вводимого раствора. В резиновую
трубку, соединяющую стеклянный змеевик с канюлей, вставля-
ют с помощью стеклянного тройника термометр, показывающий
температуру жидкости, поступающей к животному. Жидкость из
бюретки вытекает под постоянным давлением, что достигается
введением в бюретку стеклянного капилляра внешним диамет-
ром не более 1 мм, укрепленного при помощи каучуковой пробки
в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда Мариотта).
Длина капилляра должна быть такова, чтобы нижний его конец
доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость вытека-
ния жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима, нало-
женного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким
образом, чтобы в вену животного в 1 мин поступал 1 мл испыту-
емого раствора. Введение раствора проводят до наступления оста-
новки сердца; длительность опыта должна составлять не меиее 30
и не более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по ис-
чезновению сердечного толчка и контролируют последующим
вскрытием грудной клетки. При наличии патологических изме-
нений в органах опыт в расчет не принимают.
Оценку активности испытуемых препаратов можно проводить
2 способами: 1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в ко-
шачьих единицах действия (КЕД).
Оценка активности испытуемого препарата по сравнению со
стандартным образцом
В опыт берут не менее 12 кошек — по 6 кошек для испытуемо-
го препарата и стандартного образца. Данные, полученные при
290
биологическом испытании стандартного образца, могут быть ис-
пользованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут
без повторного испытания.
Из полученных в опыте данных вычисляют величину смер-
тельной дозы препарата для каждого животного в миллилитрах
на 1 кг массы. Находят величину средней смертельной дозы для
стандартного (Yc) и испытуемого (Y„) препаратов, а также стан-
дартную ошибку по формулам (1.1.2) и (1.1.9) главы “Статисти-
ческая обработка результатов химического эксперимента и био-
логических испытаний” (ГФ XI, вып. 1, с. 199).
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если от-
ношение стандартной ошибки к среднему значению не превышает
5,7 %. В противном случае необходимо увеличить число опытов.
Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требовани-
ям, если отношение средних смертельных доз испытуемого пре-
парата и стандартного образца составляет 90—110 %, а их раз-
ность не превышает величины sdt(P, f).
Стандартную ошибку разности sd вычисляют по формуле (1.4.4)
ГФ XI, вып. 1, с. 212. Критическое значение t(P, f) находят по
таблице значений t(P, f) из той же главы “Статистическая обра-
ботка результатов химического эксперимента и биологических ис-
пытаний” (с. 249) при уровне значимости 5 %, что соответствует
уровню достоверности 95 %. Значение величины t(P, f) зависит
от так называемого числа степеней свободы (f), которое равно об-
щему числу опытов, использованных для вычисления Yc и Y„,
уменьшенному на 2 (табл. 10.2).
Таблица 10.2
Результаты испытаний
№ п/п Стандартный образец Испытуемый препарат
мл/кг (Y.) Отклонения от средней (Yc-Yc) Квадрат отклонений (YC-YJ2 мл/кг (Y„) Отклонения от средней (Y„-Y„) Квадрат отклонений (Y„-Y„)2
1 15,0 2,0 4,0 16,0 2,5 6,25
2 16,3 0,7 0,49 17,1 1,4 1,96
3 18,2 1,2 1,44 20,0 1,5 2,25
4 17,8 0,8 0,64 19,5 1,0 1,0
5 17,0 0 0 20,0 1,5 2,25
6 17,7 0,7 0,49 18,4 0,1 0,01
Пример расчета:
Yc = 17,0 мл/кг; (Yc- Yc )2 = 7,06;
Y„ = 18,5 мл/кг; (Y„ - YH)2 = 13,72;
19*
291
I *1 _______
sYc=±------------= + J0,235 = ±0,48 мл/кг;
с у 6(6-1) V
sY„=±
— = ± JO,457 = ± 0,68 мл / кг.
6(6-1) *
Далее находят отношение стандартной ошибки к среднему зна-
чению для стандартного и испытуемого препаратов соответствен-
но:
S]U00 = +048400 =
Yc 17,0
sXd22=±Wioo=±
Y„ 18,5
Из расчетных данных видно, что эти величины меньше 5,7 %.
Следовательно, число проведенных опытов является достаточным
и можно вести расчет дальше.
Активность испытуемого препарата по отношению к стандарт-
ному образцу:
1^ = 91%.
18,5
Различие средних: 18,5 - 17,0 = 1,5 мл/кг.
Стандартную ошибку разности находят по формуле (1.4.4)
ГФ XI, с. 212:
sd = sY - Y,
7,06 + 13,72 12 ... .
-----------=±0,8 мл/кг.
12-2 36
Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений
t(P, f) в ГФ XI, вып. 1, с. 249].
Отсюда sdt = ± 2,23 • 0,8 = ± 1,78 мл/кг.
Поскольку разность средних (1,5 мл/кг) меньше величины sd t
(1,78 мл/кг), а активность испытуемого препарата отличается от
активности стандартного образца на 9 %, испытуемый препарат
следует считать удовлетворяющим по своей активности предъяв-
ляемым требованиям.
Определение активности испытуемого препарата в КЕД
Для выражения активности испытуемого препарата в КЕД рас-
чет проводят для каждого животного по формуле
. Кт
А =
а
292
где К — разведение испытуемого препарата; m — масса животно-
го, кг; а — доза разведенного препарата, мл.
Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД
и вычисляют (в КЕД и %) отклонения результатов отдельных
опытов от среднего числа КЕД.
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если
найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет мень-
ше максимально допустимого отклонения для данного числа опы-
тов, указанного в табл. 10.3.
Таблица 10.3
Максимально допуетнмое отклонение отдельных опытов от их средней
Число опытов Отклонение, % Число опытов Отклонение, %
3 9,4 7 16,3
4 11,5 8 17,6
5 13,3 9 18,9
6 14,9 10 20,0
Из табл. 10.3 следует, что испытания можно проводить на
3 кошках (минимальное число опытов), но только в том случае,
если полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4 %. В
противном случае число опытов надо увеличить [11].
Пример расчета. Определение числа КЕД для раствора стро-
фантина К 0,05 %-ного для инъекций (табл. 10.4).
Таблица 10.4
№ п/п Масса живот- ного, кг Разведение раствора для инъекций Доза, мл Число КЕД Отклонение от среднего
КЕД %
1 2,63 1:50 37 3,55 + 0,22 + 6,6
2 2,56 1:50 39 3,28 - 0,05 - 1,5
3 2,22 1:50 35 3,17 - 0,16 - 4,8
Среднее число КЕД = 3,33
В. Метод биологической оценки сердечных средств на голубях
Отбор голубей и их содержание
Для опытов отбирают беспородных здоровых голубей массой
280—400 г, находившихся в условиях лабораторного содержания
в течение 5—7 сут. За 18—24 ч до начала опыта птиц лишают
пищи, но не воды.
Техника испытания и принцип расчета
Опыт проводят под легким тиопентал-натриевым наркозом
(35 мг/кг внутримышечно в лапку). Наркотизированных голубей
привязывают к станку для мелких животных в положении на
293
спине таким образом, чтобы голова голубя находилась ниже ту-
ловища (во избежание попадания в дыхательные пути слизи и
рвотных масс). С внутренней стороны крыла удаляют перья, на-
ходят и отсепаровывают вену крыла. В вену вводят металличес-
кую канюлю, соединенную тонкой каучуковой трубкой с градуи-
рованной бюреткой вместимостью 5 мл, имеющей деления 0,05 мл.
Бюретку предварительно наполняют раствором испытуемого пре-
парата, приготовленным на 0,9 %-ном растворе натрия хлорида.
Испытуемый раствор вводят отдельными дозами по 0,3 мл через
каждые 5 мин до наступления остановки сердца голубя. Останов-
ку сердца определяют по характерному изменению положения
головы и шеи голубя и контролируют последующим вскрытием
грудной клетки. Длительность опыта должна составлять не менее
65 и не более 95 мин.
Голуби, смерть которых наступает в другие сроки, в расчет не
принимаются. В течение опыта голубю вводят не менее 13 и не
более 19 доз (0,3 мл) испытуемого раствора.
Испытание обычно проводят на 6 голубях.
Результаты опытов могут быть использованы для расчета био-
логической активности лишь в том случае, если в одной и той же
серии опытов расхождение между максимальными и минималь-
ными числами введенных доз не превышает 4, а общее число доз
не выходит за установленные пределы (13—19). В противном слу-
чае увеличивают количество подопытных голубей или повторяют
опыт с новой концентрацией испытуемого раствора. Оценку ак-
тивности испытуемых препаратов можно проводить 2 способами:
1) по сравнению со стандартным образцом; 2) в голубиных едини-
цах действия.
Оценка активности испытуемого препарата по сравнению со
стандартным образцом
В опыт берут не менее 12 голубей — по 6 голубей для стандарт-
ного образца и испытуемого препарата.
Данные, полученные при биологическом испытании стандарт-
ного образца, могут быть использованы для расчета и последую-
щих опытов в течение 30 сут без повторного испытания.
Из полученных в опыте со стандартным или испытуемым пре-
паратом данных вычисляют величину смертельной дозы препара-
та для каждого голубя в миллилитрах на 1 кг массы.
Результаты опытов подвергают статистической обработке ана-
логично результатам опытов на кошках.
Пример расчета при обработке данных см. в главе “Статисти-
ческая обработка результатов химического эксперимента и био-
логических испытаний” (ГФ XI, с. 199) — табл. 10.5.
294
Таблица 10.5
№ п/п Стандартный образец Испытуемый препарат
Число ДОЗ мл/кг (YJ Квадрат отклонений (Yc-Yc)2 Число ДОЗ мл/кг (Y„) Квадрат отклонений (\-Y„)2
1 16 14,9 0,81 16 13,4 1,44
2 17 17,4 2,56 15 15,0 0,16
3 16 15,4 0,00 .18 16,1 2,25
4 18 14,4 1,96 17 15,3 0,49
5 15 14,7 1,21 16 14,3 0,09
6 14 18,0 4,84 18 13,5 1,21
Активность испытуемого препарата по отношению к стандарт-
ному образцу:
Yc = 15,8 мл/кг; (Yc - Yc )2 = 11,38;
Y„ = 14,6 мл/кг; (YH - Y„)2 = 5,64;
= ± 11,38 = ± , = мл / кг;
V 6(6-1) v
__ I s64 ।----
sY„ = ± ’- = ± </0,188 = ± 0,43 мл / кг;
" \ 6(6-1) V
Щ°°= + 0/И100
Yc 15,8 ’ ’
sY^lOO 0,43100
Y„ 14,6 ’ °’
15,8 100
14,6
= 108%.
Различие средних: 15,8 - 14,6 = 1,2 мл/кг.
. /1138 + 5,64 12 .... .
sd=±.-------------=±0,75 мл/кг.
d V 12-2 36
Величина t при 12 - 2 = 10 равна 2,23 [см. таблицу значений
t(P, f) в ГФ XI, вып. 1, с. 249].
Отсюда sdt = ± 2,23 • 0,75 = ± 1,67 мл/кг.
Как видно из полученных данных, разность средних (1,2 мл/кг)
меньше величины sdt (1,67 мл/кг), а активность испытуемого
препарата отличается от активности стандартного лишь на 8 %.
Следовательно, испытуемый препарат по своей активности удов-
летворяет требованиям ГФ.
295
Определение активности испытуемого препарата в ГЕД
Для выражения активности испытуемого препарата в ГЕД рас-
чет проводят для каждого голубя по формуле
а Кт
а
где К — разведение испытуемого препарата; m — масса голубя,
кг; а — доза разведенного препарата, мл.
Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число ГЕД
и вычисляют в процентах отклонение отдельных опытов от сред-
него числа.
Пример расчета. Определение числа ГЕД для строфантина К
(табл. 10.6).
Таблица 10.6
№ п/п Масса голубя, кг Разведение гликозида Число введений (доз) Доза, мл Число ГЕД Отклонение от средней, %
1 0,335 1:60 000 15 4,5 4467 8,9
2 0,301 1:60 000 15 4,5 4013 2,1
3 0,335 1:60 000 18 5,4 3722 9,2
4 0,325 1:60 000 17 5,1 3823 6,8
5 0,332 1:60 000 16 4,8 4150 1,1
6 0,400 1:60 000 18 5,4 4445 8,3
Среднее число ГЕД = 4103.
Сведения о требуемом содержании ЛЕД, КЕД и ГЕД в отдель-
ных препаратах и растительном сырье, а также методики их оп-
ределения приведены в соответствующих фармакопейных стать-
ях.
- 10.1.2. Определение биологической активности инсулина
Активность испытуемого препарата инсулина определяют пу-
тем сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающе-
го) действия с гипогликемическим действием стандартного образ-
ца инсулина.
Стандартный образец н единица действия инсулина
Стандартный образец инсулина представляет собой препарат
высокоочищенного инсулина, активность которого определена
путем многократного сопоставления с активностью международ-
ного стандарта и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу
действия (ЕД) принимают специфическую активность количества
массы стандартного образца, эквивалентного по биологическому
действию 1 международной единице инсулина.
296
Приготовление растворов стандартного образца и испытуе
мого препарата инсулина. Точную навеску стандартного образца
инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты
(0,003 моль/л) с pH 2,7—3,0, содержащем консервант в такой же
концентрации, как испытуемый препарат.
Срок годности основного раствора стандартного образца инсу-
лина — 4 мес. при температуре 4 °C.
Перед опытом основной раствор стандартного образца инсули-
на разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л)
до концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина
разводят этим же раствором хлористоводородной кислоты до кон-
центрации 1 ЕД в 1 мл, исходя из его предполагаемой активно-
сти.
Метод определения биологической активности
Определение биологической активности инсулина проводят на
здоровых кроликах массой 2,5—3,5 кг. Животных массой 1,8—
2,3 кг предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вива-
рия, где они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды,
комбинированный корм и воду. По истечении этого срока опреде-
ляют чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроли-
кам дважды с интервалом 7—8 сут после 18 ч голодания вводят
подкожно раствор стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД
на 1 кг массы тела животного и определяют величину снижения
концентрации сахара в крови в процентах. Кровь для исследова-
ния берут из краевой вены уха животных до введения инсулина и
через 1,5 и 2,5 ч после его введения (для расчета берут среднюю
концентрацию сахара в крови из двух определений после введе-
ния инсулина). Кровь берут в условиях, не допускающих чрез-
мерного волнения кроликов. Из опытов исключают животных с
исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов,
установленных для используемого метода определения содержа-
ния сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для феррици-
анидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для глюкозоок-
сидазного метода), а также тех животных, которые реагируют на
введение инсулина судорогами или у которых снижение концен-
трации сахара в крови составляет менее 15 % по отношению к
исходной концентрации. Определение биологической активности
инсулина проводят не ранее, чем через 7—8 сут после испытания
на чувствительность.
Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды)
на 18 ч, предшествующих введению инсулина. Животных рас-
пределяют на две группы способом случайного выбора (в каждой
297
группе должно быть не менее 9 кроликов). Непосредственно пе-
ред введением инсулина кроликов взвешивают и определяют ис-
ходную концентрацию сахара в крови. Кроликам одной группы
вводят подкожно по 0,5 ЕД стандартного образца инсулина (S) на
1 кг массы тела, кроликам другой группы — такую же дозу испы-
туемого препарата инсулина (Т). Через 1,5 и 2,5 ч после введения
инсулина у животных снова определяют концентрацию сахара в
крови.
Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации
сахара (X) в крови в процентах по формуле
Х= —100,
а
где а — исходная концентрация сахара в крови, мг %; b — сред-
няя концентрация сахара в крови, мг % из двух определений,
проведенных через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулниа.
Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсули-
ну, при расчетах не учитывают животных с исходной концентра-
цией сахара в крови ниже и выше пределов, установленных для
используемого метода, а также реагирующих на указанную дозу
инсулина судорогами или дающих снижение концентрация саха-
ра в крови менее 15 % по отношению к исходной концентрации.
Через 3—5 сут на этих же кроликах проводят повторное испы-
тание с той разницей, что животным из группы, получавшей стан-
дартный образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат ин-
сулина (Т), а животным группы, получавшей (Т), вводят (S).
Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации са-
хара в крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый пре-
%Т
парат (%Т) по данным всего опыта. Отношение —- выражает
ТОО
относительную активность (R) испытуемого препарата (Т). Для
выражения активности испытуемого препарата (Т) в ЕД его пред-
полагаемую активность (А) умножают на R:
Т = RA.
Пример. При определении биологической активности инсули-
на для инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл
получили следующие величины снижения концентрации сахара
в крови в процентах (Y):
Первая часть Ys 49 61 35 55 39 28 53 38 50
испытания YT 48 50 48,5 65 46 22,5 15 48 63
Вторая часть YT 50 58 53 55 39 68 38 44 44
испытания Ys 50 51 41 55 45 60 43 60 56
298
YYs = 869; %S = 869 =48,28
18
_ %Т 45,83
К =----=------
%S
= 45,83.
= 0,949;
48,28
©75
УУт = 825; %Т = —
18
Активность T в ЕД, по данным этого опыта, равна:
Т = 0,949 • 40=37,96 ЕД в 1 мл.
Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым
образцом (Т). Среднюю величину при этом получают, объединяя
индивидуальные цифры снижения концентрации сахара в крови
в процентах в обоих опытах. При расчете окончательного резуль-
тата должны быть использованы данные, полученные не менее
чем на 30 кроликах. Если средняя величина R, по данным двух
или большего числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15,
испытание проводят заново, исходя из новой величины предпола-
гаемой активности испытуемого препарата.
Кролики могут быть использованы повторно для определения
биологической активности не ранее чем через 2 нед. после окон-
чания предшествующего опыта. Продолжительность использова-
ния кроликов в опытах по определению биологической активнос-
ти инсулина не должна превышать 5 мес [11].
Определение содержания сахара (глюкозы) в крови
Определение содержания сахара (глюкозы) в крови чаще всего
проводят феррицианидным (метод Хагедорна — Йенсена) или глю-
козооксидазным методом, однако возможно применение и других
методов. Рекомендуется использование готовых наборов реакти-
вов и автоматизированных приемов, в частности, автоматичес-
ких аппаратов для определения сахара (глюкозы) в крови.
Феррицианидный метод (метод Хагедорна — Йенсена). К 5 мл
0,45 %-ного раствора цинка сульфата в пробирке прибавляют 1 мл
раствора гидроксида натрия (0,1 моль/л) и затем 0,1 мл крови.
Пробирку помещают на 5 мин в кипящую водяную баню, после
чего смесь фильтруют в колбу для титрования через воронку с
ватой (специально приготовленную). Пробирку дважды промыва-
ют 3 мл воды. Промывные воды присоединяют к фильтрату. К
фильтрату прибавляют 2 мл раствора калия феррицианида (крас-
ной кровяной соли, 0,005 моль/л), смесь помещают в кипящую
водяную баню на 20 мин, затем охлаждают в холодной воде. К
299
смеси прибавляют 3 мл хлорцинкйодистого (“тройного”) раство-
ра, 3 мл 3 %-ной раствора уксусной кислоты и 2 капли 1 %-ного
раствора крахмала.
Освободившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата
(0,005 моль/л). Параллельно титруют контрольную пробу (не со-
держащую крови), обработанную теми же реактивами.
Количество натрия тиосульфата, пошедшего на титрование,
зависит от концентрации сахара в крови. Эту концентрацию рас-
считывают с помощью табл. 10.7, составленной для раствора нат-
рия тиосульфата (0,005 моль/л), пошедшего на титрование саха-
ра в пробе. В первом вертикальном столбце указаны целые и де-
сятые, а в верхнем горизонтальном ряду — сотые доли миллилит-
ра раствора натрия тиосульфата. На пересечении этих двух рядов
находят цифру, выражающую концентрацию сахара (мг %) в тит-
руемой пробе. Из опытной пробы вычитают контрольную пробу и
получают окончательную величину содержания сахара в крови
кролика.
Таблица 10.7
Расчет содержания сахара в миллиграммах в 0,1 мл крови при
использовании 0,005 моль/л раствора натрия тиосульфата
(феррицианидный метод)
Тиосуль- фат, мл Сотые доли миллилитра тиосульфата
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
0,0 0,385 0,382 0,379 0,376 0,373 0,370 0,366 0,364 0,361 0,358
0,1 0,355 0,352 0,350 0,348 0,345 0,343 0,341 0,338 0,336 0,333
0,2 0,331 0,329 0,327 0,325 0,323 0,321 0,318 0,316 0,314 0,312
0,3 0,310 0,308 0,306 0,304 0,302 0,300 0,298 0,296 0,294 0,292
0,4 0,290 0,288 0,286 0,284 0,282 0,280 0,278 0,276 0,274 0,272
0,5 0,270 0,268 0,266 0,264 0,262 0,260 0,259 0,257 0,255 0,253
0,6 0,251 0,249 0,247 0,245 0,243 0,241 0,240 0,238 0,236 0,234
0,7 0,232 0,230 0,228 0,226 0,224 0,222 0,221 0,219 0,217 0,215
0,8 0,213 0,211 0,209 0,208 0,206 0,204 0,202 0,200 0,199 0,197
0,9 0,195 0,193 0,191 0,190 0,188 0,186 0,184 0,182 0,181 0,179
1,0 0,177 0,175 0,173 0,172 0,170 0,168 0,166 0,164 0,163 0,161
1,1 0,159 0,157 0,155 0,154 0,152 0,150 0,148 0,146 0,145 0,143
1,2 0,141 0,139 0,138 0,136 0,134 0,132 0,131 0,129 0,127 0,125
1,3 0,124 0,122 0,120 0,119 0,117 0,115 0,113 0,111 0,110 0,108
1,4 0,106 0,104 0,102 0,101 0,099 0,097 0,095 0,093 0,092 0,090
1,5 0,088 0,086 0,084 0,083 0,081 0,079 0,077 0,075 0,074 0,072
1,6 0,070 0,068 0,066 0,065 0,063 0,061 0,059 0,057 0,056 0,054
1,7 0,052 0,050 0,048 0,047 0,045 0,043 0,041 0,039 0,038 0,036
1,8 0,034 0,032 0,031 0,029 0,027 0,025 0,024 0,022 0,020 0,019
1,9 0,017 0,015 0,014 0,012 0,010 0,008 0,007 0,005 0,003 0,002
300
Примечания . 1. Приготовление 0,45 %-ного раствора цин-
ка сульфата: 4,5 г цинка сульфата растворяют в воде в мерной
колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки.
Срок годности раствора — 7—10 сут.
2. Приготовление хлорцинкйодистого (“тройного”) раствора:
5 г цинка сульфата и 2,5 г калия йодида растворяют в 100 мл
насыщенного раствора натрия хлорида. Раствор должен быть све-
жеприготовленным.
3. Приготовление раствора натрия тиосульфата (0,005 моль/л):
25 г натрия тиосульфата помещают в мерную колбу вместимос-
тью 1 л и растворяют в свежепрокипяченной и охлажденной до
комнатной температуры воде. Объем раствора в колбе доводят
водой до метки. Выдерживают 10 сут в защищенном от света ме-
сте. Перед употреблением полученный раствор разводят водой в
20 раз, для чего 25 мл раствора помещают в мерную колбу вмес-
тимостью 0,5 л, доводят водой до метки и тщательно взбалтыва-
ют. Титр полученного раствора устанавливают с помощью раство-
ра калия йодата (0,005 моль/л). Если раствор натрия тиосульфа-
та оказывается менее концентрированным, чем 0,005 моль/л, то
по каплям прибавляют основной раствор тиосульфата. Если ра-
створ более концентрированный, то прибавляют воду и добивают-
ся, чтобы окончательный раствор был точно 0,005 моль/л (для
удобства подсчета).
4. Приготовление раствора калия йодата (0,005 моль/л): 0,1782 г
калия йодата, предварительно высушенного до постоянной мас-
сы, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л.
5. Приготовление раствора калия феррицианида (0,005 моль/л):
1,65 г калия феррицианида растворяют в небольшом количестве
воды в мерной колбе вместимостью 1 л, затем прибавляют 10,6 г
натрия карбоната безводного (ГОСТ 83—79, х.ч.), растворяют и
доводят объем раствора водой до метки. Срок годности раствора
2 мес при хранении в темном месте.
6. Приготовление 1 % -ного раствора крахмала: 1 г крахмала
растворимого по ГОСТ 10163—76 растворяют в 100 мл кипящего
насыщенного раствора натрия хлорида и фильтруют через вату.
Срок годности раствора 4 мес при хранении при комнатной тем-
пературе.
7. Приготовление ваты: вату (ГОСТ 5556—75) дважды кипя-
тят в воде, промывают холодной водой и сушат. Перед употребле-
нием смачивают водой.
Глюкозооксидазный метод. Кровь в количестве 0,1 мл смеши-
вается с 1,1 мл 0,9 %-ного изотонического раствора натрия хло-
рида в центрифужной пробирке. Прибавляют 0,4 мл 5 %-ного
301
раствора цинка сульфата и 0,4 мл раствора гидроксида натрия
(0,3 моль/л), перемешивают и через 10 мин центрифугируют при
2500 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл надосадочной жидкости при-
бавляют 3 мл энзимо-хромогенного реактива, перемешивают и точ-
но через 20 мин измеряют оптическую плотность раствора в кювете
с толщиной слоя 10 мм при длине волны 625 нм против контрольной
пробы, где вместо надосадочной жидкости взята вода. Время с мо-
мента прибавления энзимо-хромогенного реактива до измерения оп-
тической плотности должно быть одинаковым для всех проб. Па-
раллельно проводят определение оптической плотности раствора стан-
дартного образца глюкозы с концентрацией 100 мг%.
Содержание глюкозы в пробе (X) рассчитывают по формуле
где Dx — оптическая плотность испытуемой пробы; DCT — опти-
ческая плотность раствора стандартного образца глюкозы; с —
концентрация глюкозы в растворе стандартного образца.
Примечания. 1. Приготовление 5 %-ного раствора цинка
сульфата: 50 г цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе
вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки. Срок
годности раствора — 7—10 сут.
2. Приготовление энзимо-хромогенного реактива: в мерную
колбу вместимостью 100 мл помещают 80—90 мл ацетатного бу-
фера (0,25 моль/л, pH 4,8), в котором растворяют 2 мг глюкозо-
оксидазы (ТУ 6-09-10-1382—79), а затем 1 мг пероксидазы (фир-
мы “Реанал”, Венгрия), прибавляют 1 мл 1 %-ного раствора о-то-
луидина и доводят объем раствора ацетатным буфером до метки.
Срок годности реактива 3—4 нед. при хранении в защищенном от
света месте при температуре от 8 до 10 °C.
3. Приготовление раствора ацетатного буфера (0,25 моль/л,
pH 4,8): раствор натрия ацетата (0,25 моль/л) смешивают с раство-
ром уксусной кислоты (0,25 моль/л) в соотношении 6:4. Срок год-
ности раствора — 1 мес при хранении при температуре от 8 до
10 °C.
4. Приготовление раствора натрия ацетата (0,25 моль/л): 17 г
натрия ацетата растворяют в небольшом количестве воды в мер-
ной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой
до метки.
5. Приготовление раствора уксусной кислоты (0,25 моль/л): в
мерную колбу вместимостью 500 мл наливают небольшое количе-
ство воды, прибавляют 7,75 мл ледяной уксусной кислоты и до-
водят объем раствора водой до метки.
302
6- Приготовление раствора гидроксида натрия (0,3 моль/л):
12 г гидроксида натрия растворяют в воде в мерной колбе вмести-
мостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки.
7. Приготовление 1 %-ного раствора о-толуидина в абсолют-
ном спирте: 1 г о-толуидина (ТУ 60911-788—76), свежеперекрис-
т&ллиэованного из спирта, помещают в мерную колбу вместимос-
тью 100 мл и растворяют в небольшом количестве абсолютного
спирта при взбалтывании и подогревании на кипящей водяной
бане. После охлаждения доводят объем раствора абсолютным спир-
том до метки. Срок годности раствора — 4 мес при хранении в
защищенном от света месте при температуре от 8 до 10 °C.
8. Перекристаллизация о-толуидина: готовят насыщенный ра-
створ о-толуидина в горячем абсолютном спирте при нагревании
на кипящей водяной бане. Фильтруют раствор через складчатый
фильтр на воронке для горячего фильтрования. Фильтрат охлаж-
дают и приливают избыток охлажденной воды. Выпавшие крис-
таллы о-толуидина быстро отсасывают на воронке Бюхнера и вы-
сушивают в вакуум-эксикаторе над кальция хлоридом.
9. Приготовление раствора стандартного образца глюкозы
(5 мг/мл): 0,5 г глюкозы, предварительно высушенной до посто-
янной массы при температуре 37 °C, растворяют в насыщенном
растворе бензойной кислоты в мерной колбе вместимостью 100 мл
и доводят объем раствора до метки раствором бензойной кислоты.
Срок годности раствора — 3 мес при температуре от 8 до 10 °C.
10. Приготовление насыщенного раствора бензойной кислоты:
0,1 г бензойной кислоты (ГОСТ 10521—78) растворяют при нагре-
вании до 60—70 °C до полного растворения в воде в мерной колбе
вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.
Срок годности раствора — 1 год.
Испытание препаратов инсулина на пролонгированное (удлиненное)
f ДЕЙСТВИЕ
Испытание препаратов инсулина на пролонгированное действие
основано на сопоставлении длительности гипогликемического
эффекта испытуемого препарата и стандартного образца инсули-
на.
18 здоровых кроликов массой 3—4 кг распределяют на две
группы по 9 животных способом случайного выбора. Животных
содержат в отдельных клетках, за 18 ч до введения инсулина
лишают корма (но не воды). В начале опыта у кроликов определя-
ют исходное содержание сахара в крови и рассчитывают среднюю
концентрацию сахара в крови для каждой группы. Животным
первой группы вводят стандартный образец инсулина, а живот-
303
ным второй группы — испытуемый препарат инсулина. Навеску
стандартного образца инсулина растворяют в растворе хлористо-
водородной кислоты (0,003 моль/л, pH 2,7—3,0), содержащем кон-
сервант в такой же концентрации, как и препарат. Доза испыту-
емого препарата и стандартного образца составляет 0,8 ЕД на 1 кг
массы тела животного. Испытуемый препарат вводят в неразве-
денном виде. Концентрация (количество ЕД в 1 мл) стандартного
образца должна быть равна концентрации неразведенного испы-
туемого препарата. Через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после введения
препарата инсулина и стандартного образца определяют концент-
рацию сахара в крови у кроликов и подсчитывают среднее содер-
жание сахара для каждой группы.
Требования в отношении пролонгированного действия отдель-
ных препаратов инсулина изложены в соответствующих частных
статьях.
10.1.3. Испытание на токсичность
Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола мас-
сой 19—21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.
За 24 ч до испытания и во время его проведения животные
должны находиться в помещении с постоянной температурой. За
2 ч до взвешивания и отбора животных для проведения испыта-
ний у них отбирают корм и воду.
Каждую серию препарата испытывают на 5 мышах. Раствори-
тель, концентрация раствора (тест-доза) и способ введения указа-
ны в частных статьях.
Раствор препарата, подлежащего испытанию, подогревают до
37 °C и в объеме 0,5 мл вводят в хвостовую вену мыши со скоро-
стью 0,1 мл/с, если в частной статье нет других указаний.
Если в частной статье предусмотрен иной путь введения пре-
парата мышам, объем раствора, вводимого в брюшную полость,
под кожу или в желудок, может быть увеличен до 1 мл. Введение
в желудок производят шприцем посредством инъекционной иглы,
на конце которой имеется наплавленная олива, или при помощи
другого приспособления, обеспечивающего поступление раствора
или взвеси препарата в желудок.
Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч, если в част-
ной статье нет других указаний.
Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение
предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из по-
допытных мышей.
В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах
массой 20±0,5 г; в случае гибели при первоначальном испытании
304
двух мышей повторное испытание проводят на 15 животных. Если
при повторном испытании ни одна мышь не погибнет, т. е. сум-
марная гибель животных в двух опытах не превысит 10 %, пре-
парат считается выдержавшим испытание. В противном случае
препарат бракуют.
Для испытания на токсичность отбирают по 2 флакона или
ампулы от каждой серии, содержащей не более 10 000 флаконов
или ампул. При количестве в серии флаконов или ампул более
10 000 отбирают по 3 флакона или ампулы от каждой серии. Для
проведения испытания из отобранных флаконов или ампул гото-
вят общий раствор (смешанная проба). Общее количество отобран-
ного лекарственного средства должно быть достаточным для про-
ведения трех полных испытаний.
10.1.4. Испытание на пирогенность
Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола, не
альбиносах, массой 2—3,5 кг, содержавшихся на полноценном
рационе. Каждый кролик должен находиться в отдельной клетке
в помещении с постоянной температурой. Колебания температу-
ры не могут превышать 4—3 °C. При уборке клеток и взвешива-
нии животных их оберегают от возбуждения (избегать шума и
резких движений).
В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны
терять в массе. Взвешивание их проводят до дачи корма не менее
3 раз через день. Животные, теряющие в массе, для опыта не при-
годны. В течение 3 сут перед испытанием у каждого подопытного
кролика измеряют температуру. Измерения проводят ежедневно
утром до дачи корма при помощи медицинского ртутного или элек-
тротермометра, позволяющего определить температуру с точностью
до 0,1 °C. Датчик термометра вводят в прямую кишку на глубину
7—9 см (в зависимости от массы кролика) за внутренний сфинктер
на время, необходимое для достижения максимальной температу-
ры. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в
пределах 38,5—39,5 °C. Животные с более высокой или более низ-
кой температурой для опыта не пригодны. Кроме того, кроликов,
впервые предназначаемых для испытания лекарственных средств,
проверяют на реактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг
0,9 %-ного стерильного непирогенного раствора натрия хлорида,
соответствующего требованиям фармакопейной статьи. В случае из-
менения температуры у кроликов более чем на ±0,4 °C животные
считаются не пригодными для опыта.
Не позднее чем за 18 ч до опыта кроликов переводят в поме-
щение, в котором осуществляют испытание на пирогенность. Оно
20. Заказ 3547
305
должно проводиться в отдельной комнате с постоянной темпера-
турой, не отличающейся от температуры помещения, в котором
кролики постоянно содержались до опыта, более чем на ±2 °C, и
с колебаниями во время испытания, не превышающими 2 °C,
изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером нака-
нуне опыта у животных отбирают остаток корма. До и во время
опыта животные корма не получают (воду дают без ограниче-
ния).
Если нет других указаний в частной статье, для испытания
отбирают не меиее 2 флаконов или ампул от каждой серии, содер-
жащей от 1000 до 10 000 флаконов или ампул. При количестве в
серии флаконов или ампул более 10 000 отбирают по 3 флакона
или ампулы от каждой серии. Из отобранных флаконов или ам-
пул готовят общий раствор (смешанная проба). От серии, содер-
жащей до 1000 флаконов или ампул, для испытания отбирают по
1 флакону или ампуле.
Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а
также шприцы и иглы должны быть стерильными и непироген-
ными. Испытуемые лекарственные средства должны быть стериль-
ными. Их вводят кроликам в ушную вену. Другие пути введения
указывают в частной статье на лекарственное средство. Для каж-
дого кролика берут отдельную иглу. Растворы испытуемых ле-
карственных средств, подогретые до 37 °C (при отсутствии других
указаний в частных статьях), вводят в количествах и растворите-
лях, предусмотренных соответствующими частными статьями. Для
испытания на пирогенность воды для инъекций из нее предвари-
тельно готовят изотонический 0,9 % -ный раствор натрия хлори-
да. Натрия хлорид должен быть стерйльным и непирогенным,
что обеспечивается воздушным методом его стерилизации при тем-
пературе 180 или 200 °C в течение 30—60 мин в зависимости от
массы образца. Шприцы, иглы и необходимую стеклянную посу-
ду стерилизуют этим же методом при температуре 180 °C в тече-
ние 60 мин. Количество вводимого изотонического 0,9 %-ного
раствора натрия хлорида составляет 10 мл на 1 кг массы кроли-
ка. Все количество раствора, предварительно нагретого до 37 °C,
вводят в течение 2 мин.
Испытуемый раствор проверяют на 3 кроликах. Группа долж-
на состоять из животных, близких по массе (отличающихся не
более чем на 0,5 кг). Перед введением раствора у кролика дважды
с интервалом 30 мин измеряют температуру. Различия в показа-
телях температуры не должны превышать 0,2 °C. В противном
случае кролик для испытания не используется. Результат послед-
него измерения принимают за исходную температуру. Раствор
306
вводят не позднее, чем через 15—30 мин после последнего изме-
рения температуры.
Последующее измерение температуры при внутривенном вве-
дении испытуемого раствора проводят 3 раза с промежутками в
1 ч. При других путях введения — 5 раз с промежутками в 1 ч,
если в частной статье нет других указаний.
Воду для инъекций или раствор лекарственного средства счи-
тают непирогенными, если сумма повышений температуры у 3 кро-
ликов меньше или равна 1,4 °C. Если эта сумма превышает 2,2 °C,
то воду для инъекций или раствор лекарственного средства счи-
тают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений темпера-
туры у 3 кроликов находится в пределах 1,5—2,2 °C, испытание
повторяют дополнительно на 5 кроликах. Воду для инъекций или
раствор лекарственного средства считают непирогенными, если
сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает
3,7 °C. Если же эта сумма равна 3,8 °C или больше, воду для
инъекций или раствор лекарственного средства считают пироген-
ными.
В частной фармакопейной статье могут быть указаны другие
пределы отклонения температуры.
Если в частной статье на лекарственное средство нет других
указаний, случаи понижения температуры у кроликов принима-
ют за нуль.
Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для опреде-
ления пирогенности повторно, но не ранее, чем через 3 сут, если
введенный им до этого раствор лекарственного средства или вода
для инъекций были непирогенными. Если же введенный раствор
лекарственного средства или вода для инъекций оказались пироген-
ными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов
через 2 недели. При повышении температуры у кроликов в подоб-
ных случаях на 1,2 °C и более они используются через 3 недели.
Если исследуемые вещества обладают антигенными свойствами, то
одних и тех же кроликов нельзя использовать для испытания по-
вторно (если нет специальных указаний в частной статье) [11].
Примечания. На основании опыта контроля медицинских
иммунобиологических препаратов (МИБП) на пирогенность до-
пускаются следующие особенности при их испытании:
1. Испытание МИБП проводят на кроликах массой 1,5—2,5 кг.
2. Проверка реактивности кроликов является необязательной.
3. Термометр вводят в прямую кишку на глубину 5—7 см (в
зависимости от массы кролика).
4. Понижение температуры учитывают так же, как и ее повы-
шение.
20*
307
5. Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для
определения пирогенности повторно (но не более 3 раз) с интерва-
лом 2—3 сут, если ранее введенный препарат был непирогенным.
Если введенный препарат оказался пирогенным, кролики не мо-
гут быть использованы повторно.
Определение пирогенности ЛАЛ-тестом
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных пре-
паратов является активно развивающимся в настоящее время спо-
собом контроля качества лекарств, воды для инъекций. Он может
быть использован и в медицине для ранней диагностики заболе-
ваний, вызванных грамотрицательными бактериями, и в некото-
рых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грам-
отрицательных бактерий или их эндотоксинов.
В основе этого метода лежит способность лизата амебоцитов
(клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндоток-
синами грамотрицательных бактерий — липополисахаридами
(ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит
помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твер-
дого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция проста, и для ее реализации не требуется много времени,
ответ может быть получен через 30—60 мин. Тест высокоспеци-
фичен по отношению к эндотоксинам грамотрицательных бакте-
рий. Чувствительность его во много раз превышает чувствитель-
ность фармакопейного теста на кроликах.
Сырьем для производства ЛАЛ-реагента служит кровь мече-
хвостов — морских животных, обитающих у берегов Северной
Америки, Японии, Китая, Вьетнама, Индии. Готовый препарат
представляет собой сублимационно высушенный лизат клеток
крови (амебоцитов); после разведения его апирогенной водой го-
тов к использованию.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в
США в 1964 г., где и был налажен выпуск первых коммерческих
препаратов.
Поскольку первые исследования были проведены на мечехвос-
тах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их кро-
ви, был назван Лизат амебоцитов Лимулус (Limulus amebocyte
lysate) или сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
Преимущества этого теста — высокая чувствительность, простота
выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность полу-
чения количественного опыта. К несомненным преимуществам
ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок
(1—2 ч) большое количество образцов. При массовом использова-
308
нии ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Область
применения этого метода по сравнению с определением на кроли-
ках значительно шире: создается возможность для определения
пирогенности лекарств, которые нельзя было испытать на кроли-
ках — короткоживущих изотопов, препаратов седативного дей-
ствия и др.; проводится определение эндотоксинов в крови и дру-
гих биологических жидкостях организма, что расширяет возмож-
ности ранней диагностики инфекционных заболеваний, вызывае-
мых грамотрицательными микроорганизмами; анализируется
чистота медицинских аппаратов, соприкасающихся с кровью па-
циента, проводится постадийный контроль содержания ЛПС в
производстве инъекционных препаратов.
В настоящее время ЛАЛ-тест узаконен фармакопеями США, Ита-
лии, Китая, Европейской фармакопеи и др. В РФ 15.09.97 г. введе-
на временная фармакопейная статья ВФС 42-2960—97 “Определе-
ние содержания бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест)”, разрабо-
тан проект общей статьи для Фармакопеи XII “Испытание на пиро-
генность”. В основе метода определения по ВФС 42-2960—97 в
инъекционных препаратах содержания бактериальных эндоток-
синов лежит процесс физико-химического взаимодействия эндо-
токсинов с лизатом клеток (амебоцитов) крови мечехвостов, в ре-
зультате которого происходит образование геля.
Для определения содержания бактериальных эндотоксинов в
препаратах допускается использование различных модификаций
ЛАЛ-теста, если они приведены в частной фармакопейной статье.
ЛАЛ-тест — это наиболее современное средство оценки содер-
жания бактериальных эндотоксинов в инъекционных лекарствен-
ных средствах. Изучение механизма реакции гелирования, осо-
бенно взаимодействия эндотоксина с эндотоксинчувствительным
фактором ЛАЛ-реактива, поможет более глубокому пониманию
свойств эндотоксина, его биологической активности.
ЛАЛ-тест поднимет контроль качества лекарств на новую, бо-
лее высокую ступень.
Выполнение эксперимента по определению содержания
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ
Для проведения ЛАЛ-теста необходимы ЛАЛ-реактив, рабо-
чий стандартный образец (РСО) эндотоксина и вода для ЛАЛ-тес-
та.
Подготовка посуды. Посуда (пробирки, пипетки и др.), ис-
пользуемая для проведения ЛАЛ-теста, должна быть стерильна и
свободна от бактериальных эндотоксинов. Для этого стеклянную
посуду следует тщательно вымыть и обработать сухим жаром при
309
температуре 250 °C в течение 1 ч, при температуре 180 °C — 3 ч.
Стандарт эндотоксина. В качестве РСО эндотоксина исполь-
зуется препарат эндотоксина, оттитрованный фирмой-производи-
телем по Американскому национальному стандарту эндотоксина
RSE.
Содержание эндотоксина выражается в единицах эндотоксина
(ЕДэ).
Эндотоксин, включенный в набор для анализа по ЛАЛ-тесту,
может быть в виде раствора или в виде сублимационно высушен-
ного вещества. В последнем случае его разводят водой для ЛАЛ-
теста в соответствии с указаниями фирмы-производителя.
При хранении не допускается замораживание раствора эндо-
токсина. Рабочие разведения эндотоксина хранению не подлежат,
за исключением тех случаев, когда способ хранения описан фир-
мой-производителем .
Вода для ЛАЛ-теста. Вода, используемая для проведения ЛАЛ-
теста, должна быть свободна от бактериальных эндотоксинов.
Такого качества вода (содержание эндотоксинов < 0,001 ЕДэ/мл)
обычно входит в состав наборов для анализа по ЛАЛ-тесту.
ЛАЛ-реактив. Растворение, использование и хранение ЛАЛ-
реактива должно соответствовать инструкции фирмы-производи-
теля. ЛАЛ-тест должен проводиться тем методом, который пред-
писан для данного ЛАЛ-реактива.
Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ реакти-
ва. Для каждой серии используемого ЛАЛ-реактива следует под-
тверждать его заявленную чувствительность (X) по РСО эндоток-
сина. С этой целью готовят две параллельные серии последова-
тельных двукратных разведений эндотоксина водой для ЛАЛ-те-
ста. В анализе используется ряд из четырех концентраций, причем
нижняя граница диапазона концентраций должна быть ниже, а
верхняя — выше заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. За-
тем по методике, описанной в разделе “Проведение ЛАЛ-теста и
интерпретация результатов”, проводят реакцию с испытуемым
ЛАЛ-реактивом.
Если найденная чувствительность ЛАЛ-реактива отличается
от заявленной фирмой-производителем не более чем в 2 раза (от 2
до 0,5Х), то чувствительность этого ЛАЛ-реактива считается под-
твержденной и его можно использовать в дальнейшей работе.
Подтверждение возможности применения ЛАЛ-теста для оп-
ределения в испытуемом препарате содержания эндотоксинов.
Испытуемый препарат может усиливать или ингибировать реак-
цию между ЛАЛ-реактивом и эндотоксином. Поэтому при разра-
ботке частной фармакопейной статьи должна быть проведена ра-
310
бота по выявлению этих эффектов и определению методов их ус-
транения.
pH раствора испытуемого препарата должен находиться в пре-
делах 6,7—7,5. Для коррекции этого показателя в раствор препа-
рата следует добавлять стерильные, свободные от эндотоксинов
растворы NaOH, НС1 или подходящий буфер.
Проведение ЛАЛ-теста и интерпретация результатов
Качественный тест. Испытуемый препарат проверяют в од-
ном теоретически рассчитанном разведении, при котором реак-
ция должна быть отрицательной. Содержимое ампулы или фла-
кона с испытуемым препаратом разводят водой для ЛАЛ-теста.
Кратность предельного разведения (К) определяют по формуле
где А — максимально допустимое содержание эндотоксина в препа-
рате, указанное в частной фармакопейной статье; X — чувствитель-
ность ЛАЛ-реактива, указанная фирмой-производителем на этикетке
упаковки. Обе величины должны быть выражены в ЕДэ/мл.
Определение проводят в двух параллельных пробах. Получен-
ный раствор препарата по 0,1 мл помещают в две стеклянные
пробирки диаметром 10 мм и добавляют по 0,1 мл ЛАЛ-реактива.
В двух других пробирках проводят контроль ингибирования ис-
пытуемым препаратом реакции эндотоксина с ЛАЛ-реактивом.
Для этого к раствору испытуемого препарата добавляют стандарт-
ный эндотоксин в концентрации, вдвое превышающей чувстви-
тельность ЛАЛ-реактива.
Одновременно ставят положительный и отрицательный конт-
роль-опыт. Для проведения положительного контроля в две про-
бирки помещают по 0,1 мл ЛАЛ-реактива и по 0,1 мл раствора
РСО эндотоксина концентрации, в два раза превышающей чув-
ствительность ЛАЛ-реактива. Для отрицательного контроля в две
пробирки помещают по 0,1 мл ЛАЛ-реактива и по 0,1 мл воды
для ЛАЛ-теста.
Все реакционные смеси аккуратно перемешивают и одновре-
менно помещают на 60 мин в водяную баню или термостат с тем-
пературой 37 °C. Следует избегать вибрации и ударов во время
инкубации. По истечении указанного срока результаты регистри-
руются только как положительные или отрицательные. Положи-
тельная реакция характеризуется образованием плотного геля,
который не разрушается при переворачивании пробирки на 180°.
При отрицательной реакции такой гель не образуется.
311
Результаты испытания лекарственного препарата с помощью
ЛАЛ-теста можно оценивать лишь в том случае, когда в обеих
пробирках с отрицательным контролем реакция отрицательна, а
в обеих пробирках с положительным контролем — положитель-
на.
Препарат считают выдержавшим испытание, если реакция
отрицательна в обеих параллельных пробах. Если реакция поло-
жительна хотя бы в одной из проб, испытание повторяют с помо-
щью полуколичественного теста.
Если в контроле ингибирования испытуемым препаратом вза-
имодействия эндотоксина с ЛАЛ-реактивом реакция отрицатель-
на, это означает, что данный препарат способен препятствовать
указанной реакции. В этом случае результаты проведенного ЛАЛ-
теста признаются недействительными.
Полуколичественный тест. Испытуемый препарат проверя-
ют в ряде последовательных двукратных разведений водой для
ЛАЛ-теста. Определение проводят в двух повторностях. Контроль
ингибирования испытуемым препаратом реакции эндотоксина с
ЛАЛ-реактивом готовят для каждого разведения и также повто-
ряют дважды. Отрицательный и положительный контроль ста-
вится для всей серии разведений. Все пробирки инкубируются
одновременно.
Для расчета содержания эндотоксина в испытуемом препарате
отмечается наиболее высокое разведение, дающее плотный гель,
хотя бы в одной повторности. Содержание бактериальных эндо-
токсинов (С) определяется по формуле
С = ТХ,
где Т — титр наиболее высокого разведения препарата, дающего
плотный гель.
Препарат считается выдержавшим испытание, если получен-
ное при определении содержание эндотоксина в нем не превыша-
ет максимально допустимую величину, указанную в частной фар-
макопейной статье (ВФС 42-2960—97). „
10.1.5. Испытание на содержание веществ
гистаминоподобного действия
Настоящая фармакопейная статья является общей и касается
метода испытания на содержание веществ гистаминоподобного
действия лекарственных средств, предназначенных для паренте-
рального применения.
Испытание проводят на кошках обоего пола массой не менее
2 кг под уретановым наркозом. Уретан вводят внутрибрюшинно
из расчета 1 —1,2 г на 1 кг массы животного в 3—5 мл дистилли-
312
рованной воды. В случае недостаточной глубины наркоза вводят
дополнительно внутривенно уретан в количестве 1 г в 3 мл воды
на животное или этаминал-натрий в виде 2 %-ного раствора в
количестве 0,2 мл/кг внутривенно. Скорость введения указанных
растворов — 0,1 мл/с.
Допускается также применение гексенала в качестве наркоти-
ческого средства в дозе 350—400 мг/кг в 2—3 мл воды под кожу
или внутримышечно.
Для регистрации артериального давления в отпрепарированную
сонную артерию вставляют канюлю, заполненную раствором, пре-
дупреждающим свертывание крови (насыщенный раствор натрия
гидрокарбоната, 25 %-ный раствор магния сульфата, раствор гепа-
рина, содержащий 50 ЕД в 1 мл, и др.), и соединяют ее с ртутным
манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.
Испытуемые растворы вводят внутривенно.
Вначале проверяют чувствительность животного к гистамину.
Для приготовления основного раствора гистамина, содержа-
щего 1 мг гистамина-основания в 1 мл воды, около 138,1 мг (точ-
ная навеска) гистамина фосфата или около 82,8 мг (точная навес-
ка) гистамина дигидрохлорида растворяют в 50 мл дистиллиро-
ванной воды.
Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла с
притертой пробкой в защищенном от света месте при температуре
от 4 до 10 °C.
В качестве основного раствора гистамина можно использовать
также 0,1 %-ный раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах,
в 1 мл которого содержится 0,6038 мг гистамина-основания.
Из основного раствора гистамина непосредственно перед опы-
том путем последовательных разведений в воде или в растворе
натрия хлорида изотонического 0,9 %-ного для инъекций в зави-
симости от растворителя для испытуемого препарата, указанного
в соответствующей статье, готовят стандартные растворы, содер-
жащие 0,5 и 1 мкг/мл гистамина-основания.
Для проверки реакции животного на гистамин в вену последо-
вательно вводят указанные стандартные растворы с промежутка-
ми не менее 5 мин в дозах 0,1 и 0,2 мкг гистамина-основания в
0,2 мл на 1 кг Массы. Скорость введения раствора — 0,1 мл/с.
Животных, у которых при введении гистамина в дозе 0,2 мкг на
1 кг массы артериальное давление снизится менее чем на
20 мм рт. ст., из опыта исключают.
После проверки чувствительности животного к гистамину уточ-
няют величину гипотензивной реакции посредством повторного
введения стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2 мл
313
раствора) на 1 кг массы со скоростью 0,1 мл/с. Введение гистами-
на с интервалом 5 мин повторяют несколько раз, пока при двух
последовательных введениях не будет получено одинаковое сни-
жение артериального давления, которое принимается за стандарт-
ное в данных условиях опыта.
Затем с интервалом не менее 5 мин животному вводят испыту-
емый раствор лекарственного средства с той же скоростью, с ко-
торой вводили раствор гистамина.
Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест-доза)
указаны в соответствующей фармакопейной статье.
Препарат считают выдержавшим испытание, если снижение ар-
териального давления после введения тест-дозы не превышает реак-
ции на введение 0,1 мкг/кг гистамина в стандартном растворе.
При испытании в одном опыте разных лекарственных средств
необходимо проводить дополнительное определение реакции жи-
вотного на введение стандартного раствора гистамина в дозе
0,1 мкг/кг. Отмеченная при этом величина реакции принимается
как стандартная для последующего испытания препарата.
В случае значительного уменьшения величины реакции по срав-
нению с наблюдаемой в начале опыта необходимо вновь прове-
рить чувствительность животного к действию гистамина в дозе
0,2 мкг/кг. Если снижение артериального давления при этом бу-
дет не меиее 20 мм рт. ст., испытание препаратов продолжают в
соответствии с указанными выше требованиями.
Для испытания на содержание веществ гистаминоподобного
действия отбирают по 2 флакона или ампулы от каждой серии,
содержащей не более 10 000 флаконов или ампул. При количе-
стве в серии флаконов или ампул более 10 000 отбирают по 3 фла-
кона или ампулы от каждой серии. Из отобранных флаконов или
ампул готовят общий раствор (смешанная проба) для испытаний.
10.2. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
В последние годы на смену биотестам in vivo на лабораторных
животных приходят методы биотестирования in vitro с использо-
ванием антител, тканей-мишеней, иммобилизованных клеток-
мишеней.
Биотестирование
Качественное и количественное определение гормонов может
основываться как на структурных, так и на функциональных осо-
бенностях их молекул. В зависимости от этого выделяются две
основные группы методов.
314
К первой группе относят методы определения и распознавания
различных молекулярных форм гормонов. Их называют струк-
турно-специфическими, поскольку они основаны на специфично-
сти связывания с антителами, экспериментально индуцирован-
ными к определенной молекулярной конформации какого-либо
гормона. К методам, основанным на анализе взаимодействия гор-
мон — антитело, относят наиболее известный и широко распрос-
траненный метод радиоиммунологического анализа (РИА) и им-
муноферментный анализ (ИФА). Оба эти метода обеспечивают весь-
ма высокую специфичность и чувствительность.
Для проведения РИА гормонов, а также других лекарств или
токсических веществ (возможности метода весьма широкие) не-
обходимо иметь радиоактивно меченое исследуемое соединение и
смесь сывороточных гамма-глобулинов, содержащих антитела к
этому соединению. Идеальным случаем является использование
“чистых” моноклональных антител, полученных с помощью гиб-
ридомной методики.
Антитела — это белки, синтезируемые зрелыми формами В-лим-
фоцитов (В-клетками), которые возникают при дифференцировке
стволовых клеток в костном мозге. Взрослый человек обычно спо-
собен производить до 106—107 различных В-клеток. Каждая
В-клетка может синтезировать единичный вид антител против ка-
кого-нибудь чужеродного соединения, называемого антигеном.
Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки
крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов
иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобу-
линовой фракции до недавнего времени было труднодоступно.
Однако в 1975 г. Мильштейн и Коллер сделали важное открытие,
установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид анти-
тел, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клет-
ки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в
культуре растут и размножаются. Среди образующихся в резуль-
тате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, об-
наруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те
же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для полу-
чения гибридом. В то же время эти гибридомы сохраняют “бес-
смертный” характер миеломных клеток. Таким образом, было
осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на
основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид ан-
тител, что дало возможность получать неограниченное количе-
ство таких антител.
Чистые антитела гибридомных клеток называют моноклональ-
ными антителами. За последние годы получено большое количе-
315
ство таких антител. Помимо усовершенствования методов анали-
за, основанных на применении антител, моноклональные антите-
ла весьма перспективны для медицинского применения в целях
диагностики, профилактики, лечения (обеспечение направленно-
го введения лекарственного препарата, как антидоты при передо-
зировке лекарств).
Антитела обеспечивают высокую специфичность радиоимму-
нологического метода, высокая же чувствительность обеспечива-
ется использованием радиоактивного антигена.
Для описания сути метода обозначим антитело как АВр а со-
ответствующий антиген как лиганд L. Этим лигандом в нашем
случае является гормон, а в принципе это могут быть любые ле-
карственные соединения: пептиды, полипептиды, нуклеиновые
кислоты и другие вещества, к которым получены антитела.
Принцип РИА основан на конкурентном связывании идентич-
ных лигандов и антитела. В случае РИА оценивается конкурен-
ция с радиоактивномеченым лигандом (обозначим его как 1^).
Меченый и немеченый лиганды конкурируют друг с другом за
связывающий центр на лигандспецифичном антителе АВ^
свободные компоненты связанные компоненты
ABl+L + Lp # [Lp - ABl] + [L - ABJ
Количество L определяется по калибровочной кривой, полу-
ченной в контрольном опыте. Для этого добавляют небольшую
(аликвотную) часть образца к раствору, содержащему известное
количество ABL и Lp. L и Lp могут конкурентно связываться с
ABl, образуя комплексы [L — АВ] и [1^ — АВ].
Количество каждого из образующихся комплексов определя-
ется соотношением [L — ABJ/fL — ABL] = L/Lp, т.е. чем больше
L, тем меньше образуется [Lp — ABJ. После установления равно-
весия связанный материал отделяют от несвязанного. При этом
количество связанного 1^ можно определить непосредственно, из-
меряя радиощстивность осадка, либо косвенным путем, измеряя
радиоактивность свободного Lp, после установления равновесия и
вычитая его из первоначальной радиоактивности.
Сравнивая количество [Lp — ABJ, образующегося в стандарт-
ных условиях, с известными концентрациями L и Ц,, можно оп-
ределить количество L в испытуемом образце.
Иммуноферментные методы анализа имеют высокую чувстви-
тельность за счет использования не радиоактивности, а фермен-
тов. Специфичность также обусловлена применением антител.
Фермент используется для образования соединения, которое можно
определить в очень малых количествах, используя, например,
316
чувствительный метод флуоресцентного анализа. Существуют раз-
ные варианты ИФА, но общая методика такова:
1. К раствору, содержащему известное количество ABL и фер-
мента Е, добавляют образец L. В зависимости от количества L
образуется определенное количество комплекса [L — АВ — Е].
2. Комплекс [L — АВ — Е] отделяют от несвязанного матери-
ала.
3. Добавляют соединение S, которое в присутствии связанного
Е превращается в продукт Р:
g [L-ЛВ-Е]
4. Измеряют количество образовавшегося продукта Р.
5. В ходе анализа данных (путем сравнения со стандартной
контрольной системой, содержащей известное количество L) оп-
ределяют зависимость количества образующегося Р от величины
ферментативной активности в комплексе, которая, в свою оче-
редь, связана с количеством L в исходном образце:
В настоящее время зарубежные фирмы выпускают наборы ре-
активов для определения ряда гормонов и других лекарств имму-
ноферментным методом, так называемые контрольно-измеритель-
ные тесты (КИТы). Эти КИТы содержат стандартный раствор те-
стируемого лиганда, моноклональные антитела, фермент и необ-
ходимые реактивы для определения ферментативной активности.
Результаты РИА и ИФА коррелируют очень хорошо. Преиму-
щество ИФА заключается в том, что отсутствует необходимость
использования радиоактивных соединений, требующих специаль-
ных методов работы и лабораторной техники, а также более доро-
гостоящего оборудования и реагентов. Кроме того, метод ИФА
зачастую требует меньше времени.
Однако следует отметить, что такие структурно-специфичес-
кие методы, как РИА и ИФА, предназначены только для опреде-
ления количества гормонов, т. е. числа молекул данной структу-
317
ры в опытном образце по сравнению со стандартным, для которо-
го известно содержание исследуемого вещества. При определении
гормонов структурно-специфическими методами не учитывается
их биологическая эффективность, и, следовательно, невозможно
различить биологически активные формы гормонов.
Ко второй группе относят функционально-специфические ме-
тоды (или биотесты) определения биологической активности гор-
монов. Они основаны на сопоставлении действия гормонов на
физиологические функции органов или клеток-мишеней. Благо-
даря функциональной специфичности ответа ткани-мишени, она
будет “узнавать” только молекулы, обладающие по отношению к
ней определенной биологической активностью, в то время как
другие молекулы, даже с очень сходной структурой, никакого
ответа в клетках-мишенях не вызовут и, следовательно, не будут
определены с помощью данного биотеста. Необходимо отметить,
что величина специфического ответа клеточной культуры на дей-
ствие гормона пропорциональна количеству занятых рецепторов
клеточной поверхности и поэтому зависит от концентрации био-
логически активного вещества в пробе, действию которого под-
вергают ткань-мишень. На практике при биотестировании срав-
нивают величины ответа ткани-мишени после инкубации с тести-
руемым и контрольным (стандартным) растворами.
В последние годы, благодаря быстрому развитию биотехноло-
гии клеточных культур, стало возможным использовать иммоби-
лизованные монослои клеток-мишеней в биотестах — высокочув-
ствительных специфических системах, предназначенных для ко-
личественного определения ряда биологически активных веществ.
Основные принципы, лежащие в основе метода биотестирования,
иллюстрирует рис. 10.1.
В связи с разработкой биотестов стал возможным комплекс-
ный анализ ряда гормонов с помощью как структурно-специфи-
ческих, так и функционально-специфических методов, что позво-
Тестируемый препарат Стандартный препарат
монослой
клеток-мишеней
доза 1 доза 2
ингибируют до
установления
равновесия при
одинаковых
стандартных
условиях
Рис. 10.1. Основные принципы биотестирования
318
ляет получить полную информацию о количестве и биологичес-
кой активности гормонов. Биотесты с применением иммобилизо-
ванных клеток-мишеней пришли на смену биотестам, которые
ранее проводили на кратковременных культурах клеток-мише-
ней в суспензии, на культивируемых целых органах-мишенях, и
методам биотестирования in vivo на лабораторных животных.
Причем методики биотестирования с применением клеток-мише-
ней значительно усовершенствовались и упростились.
Примером практического применения метода является разра-
ботанный в лаборатории Стефана Бидея (США) метод биотестиро-
вания тиреотропного гормона (ТТГ) с помощью иммобилизован-
ных клеток щитовидной железы человека. Эти эксперименты по-
зволили получить стандартный препарат бычьего ТТГ в качестве
альтернативного “вторичного стандартного препарата” по отно-
шению к менее доступным препаратам ТТГ человека в рутинных
лабораторных биотестах.
Основные этапы биотестирования ТТГ
1. Выделение из ткани щитовидной железы, полученной при
тирэктомии, жизнеспособных фолликулярных клеток. Изоли-
рованные клетки получают, подвергая измельченные и промы-
тые образцы ткани ферментативному диспергированию с помо-
щью трипсина в специальной колбе. Клетки осаждают центрифу-
гированием, промывают солевым раствором и оценивают их жиз-
неспособность с помощью гемоцитомера под микроскопом.
2. Иммобилизация клеток в виде монослоев. С помощью сте-
рильной микропипетки с фиксированным объемом суспензию
клеток вносят в лунки специальных полистирольных плат, ис-
пользуемых для культивирования в монослое иммобилизованных
клеток-мишеней, добавляя гликопротеины сыворотки и факторы
связывания (рис. 10.2).
Предполагают, что клетки в суспензии распределены равно-
мерно, суспензии не содержат остатков тканей и клеточных агре-
гатов, что позволяет получать монослои
варьирующей в пределах 1—2 %.
с плотностью клеток,
♦
пни-;
Рис. 10.2. Иммобилизация клеток-мишеней на твердой подложке: ГС — гли-
копротеины сыворотки; ФС — факторы связывания
319
Иммобилизация клеток на твердой подложке в многолуноч-
ных полистирольных платах создает идеальные условия для вы-
полнения различных операций при биотестировании. Так, значи-
тельно упрощаются процедуры введения и удаления тестируемых
и стандартных препаратов. При этом клеточный монослой прак-
тически не нарушается. Уникальная пространственная конфигу-
рация клеток, организованных в монослои, способствует быстро-
му и одновременному действию гормона на все клетки, благодаря
чему достигается почти одинаковый “ответ” всех клеток. Так как
повторы культур во всех лунках структурно идентичны, то с по-
мощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чув-
ствительности и хорошей воспроизводимости результатов. Основ-
ное требование, предъявляемое к биотесту, заключается в том,
что каждая отдельная доза гормона должна быть проверена на
достаточном количестве “объектов” или повторов. Это требование
полностью удовлетворяется при использовании иммобилизован-
ных клеток единственного монослоя, поскольку в пределах одной
и той же платы все инкубационные лунки, а следовательно, и все
монослои находятся в одинаковых условиях с точки зрения тем-
пературы, влажности, концентрации СО2 в воздухе и состава пи-
тательной среды.
3. Оценка биологической активности тестируемых препара-
тов. Способность препаратов стимулировать накопление внутри-
клеточного ц-АМФ в первичных монослойных культурах фолли-
кулярных клеток щитовидной железы сравнивается со стандарт-
ным препаратом (стандарт — Fest International Reference Prepa-
ration № 68/38 с активностью 150 ЕД на ампулу). Измеряют
ц-АМФ методом, основанным на использовании антител, специ-
фичных к ц-АМФ.
По данным о накоплении внутриклеточного ц-АМФ при дей-
ствии стандартного и тестируемого препарата строят кривые за-
висимости “доза—ответ” и рассчитывают активность тестируемо-
го препарата.
Иммобилизованные ферменты нашли применение в автомати-
ческом анализе биологических субстратов и лекарственных
средств.
В настоящее время ряд зарубежных фирм выпускает комплек-
ты оборудования, одноразовых пластмассовых принадлежностей
и реактивов для культивирования клеток. Методы биотестирова-
ния гормонов с помощью иммобилизованных клеток-мишений
весьма перспективны, поскольку обладают рядом неоспоримых
преимуществ перед биоиспытаниями на лабораторных животных.
320
Методы стандартизации ферментных препаратов
В настоящее время препараты ферментов и их ингибиторов
находят широкое применение для лечения и профилактики раз-
личных заболеваний. Однако методы анализа этих аутобиоген-
ных препаратов не рассматривались в курсе фарманализа.
Внедрению энзимотерапии в клиническую медицину способ-
ствовали не только крупные достижения в области теоретической
энзимологии, но, в первую очередь, успехи в разработке совер-
шенных методов препаративного выделения высокоочищенных
препаратов ферментов и их ингибиторов, пригодных для меди-
цинских целей. В ближайшие годы с развитием методов генной
инженерии, позволяющей получать белковые препараты с задан-
ной видовой специфичностью, арсенал ферментных препаратов в
клинической медицине существенно расширится.
В энзимотерапии существует четыре основных направления:
1) Локальное использование ферментных препаратов в каче-
стве неспецифических лекарственных средств, преимущественно
для удаления нежизнеспособных тканей, сложных и неоднород-
ных по своему химическому составу. К этой группе ферментных
препаратов относят: во-первых, протеиназы как животного, так и
микробного, грибкового и растительного происхождения (трип-
син, хипотрипсин, эластаза, проназа, коллагеназа, папаин, бро-
мелин, фицин, дикиназа и др.), обладающие высокой способнос-
тью гидролизовать денатурированные массы белков, разжижать
вязкие и трудноотделяемые экссудаты, снижать антигенные свой-
ства ряда токсинов; во-вторых, деполимеразы нуклеиновых кис-
лот и нуклеопротеидов — ДНК-азы и РНК-азы, использующиеся
при лечении больных хроническими гнойными заболеваниями
легких и при других нагноительных процессах (конъюнктивиты,
кератиты и пр.); в-третьих, ферменты, деполимеризующие муко-
полисахариды (гиалуронидазы и лизоцим, или мурамидаза).
2) Парентеральное применение ферментов с целью тромболи-
тической терапии, а также при неспецифических противовоспа-
лительных процессах. С этой целью используются, как правило,
высокоочищенные препараты ферментов, обладающие низкой
антигенной активностью. Это плазмин (протеолитический фер-
мент крови) и его активаторы — стрептокиназа, урокиназа, ис-
пользующиеся для лечения артериальных тромбозов и тромбо-
флебитов. У нас в стране выпускается плазмин, активированный
трипсином, а также комплексный препарат трипсина с гепари-
ном (тромболитин). Среди протеолитических ферментов, нашед-
ших применение в клинике, следует отметить также калликреи-
21. Заказ 3547
321
ны. Эти ферменты, обладающие сходными ферментативными и
физиологическими функциями, содержатся в поджелудочной
железе, плазме крови, ликворе, слюне, моче. По специфичности
они близки к трипсину: расщепляют пептидные связи, образо-
ванные карбоксигруппами аргинина и лизина. Калликреины на-
ходятся в тканях в неактивном виде и активируются различными
факторами. Физиологическая активность калликреинов основы-
вается иа их способности катализировать в межтканевой жидко-
сти и плазме крови образование вазоактивных кининов из специ-
фического и а2-глобулина плазмы — кининогена. Кинины (бра-
дикинин и каллидин) участвуют в регуляции кровяного давле-
ния, проницаемости капилляров, скорости кровотока. С лечебной
целью применяют калликреины поджелудочной железы. Их пре-
параты — падутин и депопадутин благодаря сосудорасширяющим
свойствам используются для лечения функциональных и органи-
ческих поражений сосудов (облитерирующий эндоартериит, тром-
боангиит и др., глаукома).
В последние годы появились данные об успешном применении
в клинике при онкологических заболеваниях, воспалительных
процессах и радиационном поражении супероксидисмутазы
(СОД) — фермента, катализирующего реакцию дисмутации супер-
оксидных радикалов (07). возникающих в качестве побочных
продуктов биологического окисления. Более того, установлено,
что гранулоциты (тип белых кровяных клеток) выделяют боль-
шое количество 07 в период активизации дыхательных метабо-
лических процессов, способствующих развитию их в фагоциты.
Фагоциты, как известно, участвуют в захвате и переваривании
чужеродных частиц, бактерий и других клеток. Помимо уничто-
жения бактерий 07 повреждает другие ткани, вызывая воспали-
тельные процессы. Инъекции СОД, дисмутирующей О7> приво-
дят к противовоспалительному эффекту.
3) Применение ферментов и коферментов в заместительной
терапии, направленной на возмещение дефицита, возникающего
при некоторых заболеваниях. Это, в основном, ферменты, секре-
тируемые экзокринными клетками желудка, поджелудочной же-
лезы и кишечника.
4) Применение ингибиторов ферментов. Наиболее широкое
применение нашли тканевые ингибиторы протеаз (трасилол — из
околоушных желез, инипрол — из поджелудочной железы, кон-
трикал — из легких), так как они являются поливалентными ин-
гибиторами протеолитических ферментов: калликреинов, трип-
сина, химотрипсина, плазмина и др. Ингибиторы протеаз особен-
322
но эффективны при панкреатите, а также при фибринолитичес-
ких кровотечениях.
В фармации контроль качества ферментных препаратов осу-
ществляется путем определения единиц каталитической актив-
ности, содержащихся в единице массы ферментного препарата.
Об активности фермента судят по количеству превращенного суб-
страта или образовавшегося продукта реакции за определенный
промежуток времени. Во избежание ошибок при определении ка-
талитической активности ферментных препаратов следует по-
мнить, что:
— при относительно низких концентрациях субстрата реак-
ция имеет первый порядок по субстрату;
— по мере повышения концентрации субстрата порядок реак-
ции по субстрату постепенно снижается от единицы до нуля;
— скорость реакции пропорциональна общему количеству фер-
мента в реакционной смеси.
Поэтому определение активности следует вести в стандартных
условиях, т. е. при насыщающих концентрациях субстрата или
субстратов, оптимуме pH среды и постоянной температуре, кото-
рые должны поддерживаться в течение всего периода наблюде-
ния. Эти условия обеспечивают нулевой порядок реакции, при
котором ее скорость лимитируется только концентрацией иссле-
дуемого фермента. Измерять активность фермента нужно только
в начальный отрезок времени, когда реакция протекает линейно,
т. е. за единицу времени превращается одно и то же количество
субстрата (так называемая начальная скорость реакции).
Ферменты в качестве аналитических реагентов
В фармацевтической промышленности, фарманализе и меди-
цине ферменты часто применяют в качестве аналитических реа-
гентов. Для ферментативного анализа характерны безвредность и
высокая специфичность. Например, для определения глюкозы в
биологических жидкостях и тканях используется глюкозоокси-
даза. Глюкозооксидазный метод, в отличие от химических, обес-
печивает высокоселективное окисление глюкозы в биологических
растворах:
глюкозооксидааа
Глюкоза + О2 + Н>О ---------► Н2О2 + Глюконовая кислота.
Количество поглощенного кислорода измеряют с помощью
кислородного электрода, что обеспечивает высокую точность ана-
лиза.
Эффективность ферментативного анализа удалось увеличить с
помощью иммобилизации ферментов.
21*
323
Методам иммобилизации ферментов, физико-химическим и
каталитическим свойствам иммобилизованных ферментов посвя-
щены многочисленные публикации как научного, так и учебного
характера. Мы не будем останавливаться на этих вопросах, ибо
задачей в данный момент является общая характеристика мето-
дов применения иммобилизованных ферментов в аналитических
целях.
Иммобилизованные ферменты нашли применение в автомати-
ческом анализе биологических субстратов и лекарственных
средств. В этом случае иммобилизованные ферменты являются
рабочей частью автоматических проточных анализаторов. Анали-
зируемый раствор протекает по специальным трубкам, с внутрен-
ней поверхностью которых ковалентно связан фермент. Субстрат
количественно превращается ферментом, что регистрируется по
изменению оптической плотности или флуоресценции жидкости
(в зависимости от физико-химических свойств образующегося про-
дукта).
Для аналитических целей все шире применяются специаль-
ные ферментные электроды. Ферментный электрод — это комби-
нация датчика, в конструкции которого использован ионселек-
тивный электрод, с иммобилизованным ферментом. Такая ком-
бинация обеспечивает высокую специфичность, чувствительность
и быстроту анализа. Например, для контроля за содержанием пе-
нициллина в ростовых средах применяется пенициллиновый элек-
трод, действие которого основано на использовании рН-датчика,
покрытого иммобилизованной пенициллиназой, катализирующей
реакцию:
пенициллиназа
Пенициллановая кислота-----------► Пенициллин.
Отклик электрода очень быстрый (менее 30 с), диапазон изме-
ряемых концентраций 510-2—1-10 ‘4 М.
Для изготовления ферментного электрода сначала выбирают с
помощью справочников по энзимологии подходящую ферментную
систему. В идеальном случае действие электрода должно основы-
ваться на первичной функции фермента, т. е. на основной реак-
ции, которую он катализирует в природе. Например, в электроде
для определения глюкозы следует использовать глюкозооксида-
зу, в электроде для определения мочевины — уреазу. В некото-
рых случаях можно применять фермент, для которого определяе-
мое вещество служит вторичным субстратом.
В ферментном электроде обычно используют фермент в иммо-
билизованном состоянии, благодаря чему уменьшается количе-
324
ство фермента, требуемое для рутинного анализа, и для получе-
ния воспроизводимых результатов устраняется необходимость
частого определения активности ферментативного препарата. Кро-
ме того, при включении фермента в подходящий носитель зачас-
тую повышается стабильность фермента. Электродом, изготовлен-
ным с помощью растворимого фермента, можно провести около
50 измерений в течение 7 сут; с помощью фермента, включенного
в гель, — 100—200 измерений в течение 14—21 сут; с помощью
химически иммобилизованного фермента — 200—1000 измере-
ний в течение 6—14 мес. Так, электрод для определения глюко-
зы, изготовленный посредством ковалентного присоединения глю-
козооксидазы глутаровым альдегидом, стабильно работает более
300 сут.
Тип датчика следует выбирать в соответствии с природой фер-
ментативной реакции. Датчик должен реагировать на один из
продуктов или субстратов ферментативной реакции.
10.2.1. Испытание на стерильность
Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази,
пленки, другие лекарственные средства, в отношении которых
имеются соответствующие указания в нормативно-технической
документации (НТД), должны быть стерильными. Стерильность
лекарственных средств достигается соблюдением необходимых
санитарно-гигиенических условий их изготовления и режима сте-
рилизации.
Методы контроля стерильности, изложенные в данном разде-
ле, применяют для испытания всех лекарственных средств неза-
висимо от их природы и лекарственной формы, если нет других
указаний в частных фармакопейных статьях.
Отбор образцов для анализа. Образцы готовых лекарственных
средств отбирают для контроля от каждой серии в количествах,
зависящих от вида стерилизации и числа единиц (ампул, флако-
нов и т. д.) в серии.
В случае, если лекарственное средство стерилизуют насы-
щенным паром при избыточном давлении 0,11±0,02 МПа
(1,1±0,2 кгс/см2) и температуре 121±1 °C, образец состоит из
10 единиц. При других видах стерилизации минимальное ко-
личество образцов для анализа определяют по формуле n = Jn ,
где п — число единиц в образце, a N — число единиц в иссле-
дуемой серии препарата, при этом п должно быть не менее 3 и
не более 40.
Определение антимикробного действия лекарственного сред
ства. Во избежание неправильной оценки результатов анализа
325
необходимо определить однократно для каждого наименования
лекарственного средства, обладает ли оно антимикробным дей-
ствием. Для этого в две пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и
в две — с 10 мл среды Сабуро добавляют соответствующее коли-
чество исследуемого лекарственного средства (табл. 10.8) и вно-
сят в каждую пробирку по 0,1 мл микробной взвеси соответству-
ющего тест-штамма, содержащей 1000 клеток в 1 мл. Посевы в
тиогликолевой среде инкубируют при температуре от 30 до 35 °C
в течение 48 ч, а на среде Сабуро — при температуре от 20 до
25 °C в течение 72 ч.
Контролем служат пробирки с питательными средами, в кото-
рые вместо данного лекарственного средства вносят аналогичное
количество дистиллированной воды или соответствующего раство-
рителя.
Для проверки антибактериального действия лекарственных
средств используют тест-микроорганизмы: Staphylococcus aureus
АТСС 6538 Р, Bacillus subtilis АТСС 6633, Escherichia coli АТСС
25922, а противогрибкового действия — Candida albicans АТСС
885-653 (табл. 10.9).
При отсутствии антимикробного действия лекарственного сред-
ства в контрольных и опытных пробирках (колбах) должен на-
блюдаться рост перечисленных тест-микроорганизмов.
При наличии антимикробного действия лекарственных средств
используют соответствующие инактиваторы, указанные в част-
ных фармакопейных статьях (например: пара-аминобензойная
кислота — для сульфаниламидов, пенициллиназа — для пени-
циллинов и цефалоспоринов и т. д.). При отсутствии инактивато-
ра препарат разводят, изменяя соотношение объемов посевного
материала и питательной среды. Первоначально, не изменяя ко-
личества посевного материала, указанного в табл. 10.8, увеличи-
Таблица 10.8
Количество испытуемого препарата для посева в зависимости
от объема содержимого единиц (ампул, флаконов и др.),
составляющих серию
Объем содержимого одной единицы, мл Объем лекарственного средства для посева, мл Объем питательной среды
Менее 1 1—4 5-19 20—100 Более 100* Весь объем 1 2 2—4 10 В 10 раз больше объема образца для посева
‘Если объем содержимого единицы превышает 100 мл, предпочтительнее ис-
пользовать метод мембранной фильтрации.
326
Таблица 10.9
Тест-микроорганизмы, используемые для определения
антимикробного действия лекарственных средств
и ростовых свойств питательных сред
№ по Каталогу штаммов Всероссийского музея пато- генных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича Тест-штаммы Питательная среда №
010011 010014 240533 190155 201108 Bacillus subtilis АТСС 6633 Bacillus cereus АТСС 10702 Escherichia coli АТСС 25922 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 Staphylococcus aureus АТСС 6538-P 1 1 3 6 7 9 10 8
№ в коллекции патоген- ных грибов НИО глубоких микозов Ленинградского ГИДУВ
259 Candidaalbicans ATCC 885-653 2
вают объем питательной среды до 250 мл. Если при этом сохраня-
ется антимикробное действие лекарственного средства, уменьша-
ют объем посевного материала до 1 мл.
В случае неэффективности разведения лекарственного средства
используют метод мембранной фильтрации.
Посев лекарственных средств. Для контроля стерильности ле-
карственных средств применяют тиогликолевую среду и жидкую
среду Сабуро. При этом используют метод прямого посева на пи-
тательные среды или метод мембранной фильтрации.
Метод прямого посева. Испытуемый препарат, если необходи-
мо, растворяют в соответствующем растворителе и высевают в
количествах, указанных в табл. 10.8.
При испытании лекарственных средств посевы в тиогликоле-
вой среде инкубируют при температуре от 30 до 35 °C, а в среде
Сабуро — от 20 до 25 °C. Продолжительность инкубации посевов
в обеих питательных средах составляет 14 сут.
В случае помутнения питательной среды после внесения в нее
испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут после
посева сделать пересев на свежие аналогичные среды и инкубиро-
вать их при соответствующей температуре 14 сут от начала испы-
тания.
327
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в
маслах отбирают асептически по 0,1 г (мл) от каждой единицы и
вносят в стерильную колбу вместимостью 250 мл, содержащую
стеклянные бусы, 100 мл 1/15 моль/л фосфатного буферного ра-
створа (pH 6,8—7,0) и эмульгатор. Перед проведением испытания
содержимое колбы подогревают до температуры 41±1 °C. Колбу с
испытуемым образцом встряхивают не более 30 мин до получе-
ния однородной эмульсии. Полученную эмульсию в количестве
5 мл переносят в колбу с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл — в
колбу с 40 мл среды Сабуро. Посевы инкубируют 14 сут при соот-
ветствующей температуре для каждой питательной среды.
Примечания. 1. Выбор эмульгатора и его количество зави-
сят от природы мази и растворов лекарственных средств в мас-
лах. Наиболее часто применяют твин-80 в концентрации до 2,5 %,
не оказывающий антимикробного действия.
2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмуль-
гатор не вносят в буферный раствор.
3. При испытании мазей и растворов в маслах предпочтитель-
нее использовать метод мембранной фильтрации.
Метод мембранной фильтрации. При определении стериль-
ности лекарственных средств, обладающих выраженным антимик-
робным действием, и лекарственных средств, разлитых в емкости
более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации.
При испытании лекарственных средств с антимикробным дей-
ствием от каждой серии независимо от ее объема отбирают 30 ем-
костей (ампул, флаконов и др.), которые делят на 3 группы по
10 емкостей. Емкости двух групп (20 шт.) используют для испы-
тания на стерильность, третьей группы (10 шт.) — для контроля
полноты отмывания мембраны от лекарственного средства.
Испытание лекарственного средства на стерильность проводят
с использованием фильтрационной установки, включающей
фильтродержатель, соединенный с колбой-приемником. Фильт-
родержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пори-
стой пластины, на которую помещают мембрану: используют мем-
браны с размером пор 0,45±0,02 мкм, диаметром около 47 мм.
Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при
скорости вытекания воды 55—75 мл в 1 мин. Допускается ис-
пользование аппарата, представляющего собой стерильную замк-
нутую систему и работавшего также по принципу фильтрации
растворов.
Для фильтрации водных, масляных и спиртовых растворов
рекомендуют использовать фильтры из эфиров целлюлозы или
смесей эфиров целлюлозы. Фильтровальную установку в собран-
328
w*
ном виде стерилизуют насыщенным паром при избыточном дав-
лении 0,11±0,02 МПа (1,1±0,2 кгс/см2) и температуре 121±1 °C в
течение 20 мин (температура и время критические). Стерилиза-
цию можно осуществлять любым другим способом, обеспечиваю-
щим сохранность рабочих характеристик мембраны, а также сте-
рильность мембраны и всей установки (ионизирующее излучение,
оксид этилена и т. п.).
Испытуемое лекарственное средство растворяют или суспен-
дируют (если в этом есть необходимость) в соответствующей сте-
рильной жидкости и полученный раствор или суспензию пропус-
кают через стерильную мембрану. Для растворения лекарствен-
ных средств с антимикробным действием и отмывания мембраны
от них можно использовать любой растворитель, не подавляю-
щий роста микроорганизмов, например раствор натрия хлорида
изотонического 0,9 %-ного для инъекций. Используемый раство-
ритель перед стерилизацией необходимо профильтровать через
мембраны с порами размером 0,45±0,02 мкм для освобождения
от механических примесей.
Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических
условиях. Испытуемый раствор пропускают с помощью вакуума
через одну или несколько мембран. При испытании лекарствен-
ных средств с антимикробным действием или содержащих кон-
сервант после окончания фильтрации мембрану необходимо про-
мыть 3—5 порциями по 100 мл соответствующего растворителя,
например в растворах натрия хлорида изотонического 0,9 %-ного
для инъекций или жидкости № 1, при испытании мазей — жид-
кости № 2 (см. ГФ XI, вып. 2, с. 193). После отмывания мембра-
ны ее извлекают, разрезают стерильными ножницами пополам и
одну половину помещают в колбу со 100 мл тиогликолевой сре-
ды, вторую — в колбу со 100 мл среды Сабуро. Питательные сре-
ды с помещенными в них фильтрами выдерживают при темпера-
туре от 30 до 35 °C (тиогликолевая среда) и от 20 до 25 °C (среда
Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре.
Для контроля стерильности растворов лекарственных средств,
выпускаемых в виде порошков, лиофилизированных препаратов
и пр., содержимое каждой емкости предварительно растворяют в
стерильном растворителе. Затем из каждых 10 емкостей одной
группы отбирают полученный раствор в количестве, соответству-
ющем 200 мг лекарственного средства, и переносят в колбу, со-
держащую 100 мл аналогичного растворителя. Приготовленный
раствор немедленно фильтруют. После отмывания фильтра, как
указано выше, одну половину его помещают в колбу с тиоглико-
левой средой, другую — в колбу со средой Сабуро.
329
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в
маслах от каждой из 10 емкостей отбирают по 100 мг препарата в
колбу со 100 мл растворителя (изопропилмиристат и др.), кото-
рый предварительно подогревают до температуры не выше 45 °C
и стерилизуют фильтрованием через мембраны с размером пор
0,22±0,02 мкм. После фильтрации образца мембрану промывают
двумя-тремя порциями по 200 мл жидкости № 2 и затем одной-дву-
мя порциями жидкости № 1. Половину мембраны помещают в
тиогликолевую среду, другую — в среду Сабуро, в которые пред-
варительно вносят стерильный твин-80 из расчета 1 г на 1000 мл
среды.
При испытании лекарственных средств, разлитых в емкости
большого объема, через фильтры пропускают содержимое 5—10
емкостей, если объем каждой емкости составляет от 100 до 500 мл.
При наличии в емкости более 500 мл раствора на стерильность
испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5—10 емкостей
на 2—3 мембранах.
При испытании лекарственных средств, представляющих со-
бой вязкую жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии,
необходимо предварительно добавить растворитель, указанный в
частной статье для увеличения скорости фильтрации.
Контроль полноты отмывания фильтра (третья группа емко-
стей) проводят следующим образом: при испытании антибакте-
риального лекарственного средства в колбу с тиогликолевой сре-
дой и погруженной в нее половиной фильтра вносят суточную
культуру Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р, при испытании
противогрибкового лекарственного средства — в колбу со сре-
дой Сабуро и фильтром вносят 48-часовую культуру Candida
albicans АТСС 885-653 из расчета 100 микробных клеток на
весь объем среды. Инкубацию проводят при соответствующих
температурах. Наличие роста тест-микроорганизмов в конт-
рольных колбах через 48—72 ч свидетельствует о достаточной
полноте отмывания мембран от антимикробного лекарственно-
го средства.
Для контроля стерильности условий, в которых проводят ис-
пытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого
лекарственного средства с последующим воспроизведением всех
вышеописанных операций.
Учет и интерпретация результатов испытания на стериль
ность. Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по
окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов
в питательных средах оценивают визуально по появлению мутно-
сти, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Вы-
330
явленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микро-
скопированием мазков, окрашенных по Граму.
Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требовани-
ям испытания на стерильность при отсутствии роста микроорга-
низмов. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (кол-
бе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторя-
ют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый
раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном посе-
ве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованию
испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при
повторном посеве, морфологически сходных с микроорганизма-
ми, выявленными в первичном посеве, испытуемый препарат счи-
тают нестерильным. Если при повторном посеве наблюдается рост
микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально
выделенных, испытание повторяют в третий раз на удвоенном
количестве образцов. При отсутствии роста микроорганизмов после
инкубации посевов в третьем испытании испытуемый препарат
считают удовлетворяющим требованиям на стерильность. При
наличии роста хотя бы в одной пробирке испытуемый препарат
считают нестерильным [11].
Питательные среды
Для контроля стерильности применяют “Сухую питательную
среду для контроля стерильности” (тиогликолевую) отечествен-
ного производства (ТУ 42.14 № 161—79) и среду Сабуро (жид-
кую). Вместо коммерческой тиогликолевой среды может быть ис-
пользована тиогликолевая среда индивидуального приготовления.
Состав и приготовление питательных сред. Тиогликоле-
вая среда индивидуального приготовления:
Панкреатического гидролизата казеина — 15,0 г
Дрожжевого экстракта (10 %) — 5,0 г
Натрия хлорида — 2,5 г
Глюкозы — 5,0 г
Цистина (цистеина) — 0,75 г
Тиогликолевой кислоты или — 0,3 г
Тиогликолята натрия — 0,5 г
Раствора резазурина натрия 1:1000
(свежеприготовленного)4 — 1,0 мл
Агара — 0,75 г
Воды дистиллированной — до 1000 мл
pH после стерилизации — 7,0±0,2
Тиогликолевую среду можно хранить в течение 14 сут со дня
приготовления при температуре от 10 до 25 °C в защищенном от
света месте.
'Допускается приготовление среды без резазурина натрия
331
Если при хранении среды, содержащей резазурин, верхний ее
слой (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет, среду можно
регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в течение
10—15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим
быстрым охлаждением. Если окраска не исчезает после нагрева-
ния, среду считают не пригодной к употреблению. Регенерацию
среды можно проводить только один раз.
Среда Сабуро:
Пептона ферментативного
Глюкозы
Воды дистиллированной
pH после стерилизации
Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном
давлении 0,11±0,02 МПа (1,1±0,2 кгс/см2) и при температуре
121±1 °C в течение 15 мин.
—10 г
— 40 г
— до 1000 мл
— 5,6±0,2
Ж ид к ость № 1 :
Пептона ферментативного
Воды дистиллированной
pH после стерилизации
Жидкость №2:
Пептона ферментативного
Твина-80
Воды дистиллированной
pH после стерилизации
— 1г
— до 1000 мл
— 7,1± 0,2
— 5 г
— 10 г
— до 1000 мл
— 7,1±0,2
Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так
же, как и питательные среды.
Требования к ростовым свойствам питательных сред. Тио-
гликолевая среда и среда Сабуро должны обеспечивать визуально
обнаруживаемый рост соответствующих тест-штаммов аэробных
и анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД).
Используемые питательные среды должны обеспечивать рост
микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100 жизне-
способных клеток: для тиогликолевой среды — не позднее 48 ч
инкубации при температуре от 30 до 35 °C и для среды Сабуро —
не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 °C.
10.2.2. Испытание на микробиологическую чистоту
Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, раство-
ры, экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе
производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и
поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту.
Испытание иа микробиологическую чистоту включает количе-
ственное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а так-
332
же выявление определенных видов микроорганизмов, наличие
которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.
Испытание проводят в асептических условиях, применяя при-
веденные методы и питательные среды для контроля всех видов
нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используе-
мого в их производстве.
Лекарственные средства, обладающие антимикробным действи-
ем, и консерванты, входящие в состав некоторых нестерильных
лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов
микроорганизмов в условиях проведения испытания.
Во избежание неправильной оценки результатов испытания
определяют действие лекарственного средства в отношении сле-
дующих тест-микроорганизмов: Bacillus subtilis (Bacillus cereus),
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Candida albicans, указанных в табл. 10.9.
Определение антимикробного действия лекарственного сред-
ства. Пять образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый
разводят в соотношении 1:10 фосфатным буферным раствором
pH 7,0 (два образца), средой № 3 (один образец) и средой № 8 (два
образца) .
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на
жидкой среде № 1 при температуре от 30 до 35 °C в течение 18—
20 ч, культуру Candida albicans — на жидкой среде № 2 при тем-
пературе от 20 до 25 °C в течение 48 ч. Культуры разводят 1:1000
стерильным 0,9 %-ным раствором натрия хлорида изотоничес-
ким, вносят по 1 мл взвеси каждого тест-штамма (в отдельности)
в приготовленные образцы лекарственного средства в буферном
растворе (Bacillus subtilis, Candida albicans), в среде № 3 (Escheri-
chia coli) и в среде № 8 (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus). Для выявления микроорганизмов используют методы, при-
веденные в данной главе. В случае отсутствия роста тест-штам-
мов на соответствующих питательных средах отмечают антимик-
робное действие лекарственного средства.
Для устранения антимикробного действия лекарственного сред-
ства используют различные методы: 1) увеличивают разведение
лекарственного средства, взяв больший объем растворителя; 2) до-
бавляют необходимое количество соответствующего специфичес-
кого инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие
лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганиз-
мов (например, пенициллиназа — для пенициллинов и цефало-
споринов, пара-аминобензойную кислоту — для сульфанилами-
дов); 3) комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические
333
инактиваторы в питательные среды, нейтрализующие антимик-
робное действие лекарственного средства (например, 4 % твина-
80, 0,5 % соевого лецитина); 5) если все вышеперечисленные ме-
тоды неэффективны, а лекарственное средство растворимо, ис-
пользуют метод мембранной фильтрации; 6) если в связи с приро-
дой лекарственного средства нельзя использовать метод
мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы уст-
ранения его антимикробного действия в отношении данного тест-
штамма неэффективны, этот вид испытания не проводят.
Отбор и приготовление проб лекарственных средств для ис-
пытаний. От каждой серии лекарственного средства (независимо
от ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г ( мл), состо-
ящую из равных разовых проб, взятых из минимум 10 разных
упаковок. Для одного анализа лекарственного средства использу-
ют отдельные образцы по 10 г (мл) для каждого из описанных
далее методов исследования в последующих разделах. Всего для
проведения одного анализа используют 30 г (мл) лекарственного
средства. В том случае, когда возникает необходимость подтвер-
дить несомненность результатов, проводят повторное испытание
только по данному разделу исследования, используя образец в
количестве 10 г (мл).
Для ряда лекарственных средств (антибиотиков, мягких ле-
карственных форм и др.) отбирают от каждой серии среднюю пробу
не менее 15 г, состоящую из равных разовых проб, взятых из не
менее чем 10 разных упаковок. Для одного анализа используют
образцы по 3 г (мл) для каждого раздела исследования. Всего для
проведения одного анализа используют по 9 г (мл) лекарственно-
го средства. При повторении испытания по одному из разделов
исследования используют образец в количестве 3 г (мл).
Для лекарственных средств в аэрозольной упаковке, пленок
полимерных лекарственных и др. отбор и приготовление проб
проводят согласно указанию в частных статьях.
В зависимости от физических свойств лекарственной формы
образец для анализа готовят в виде раствора, суспензии или эмуль-
сии:
— твердые лекарственные формы, которые трудно растворя-
ются, измельчают с помощью соответствующего оборудования и
суспендируют в фосфатном буферном растворе с pH 7,0 или соот-
ветствующей жидкой питательной среде, рекомендованной для
определенного вида испытания;
— жидкие лекарственные формы, а также твердые формы,
которые быстро и практически полностью растворяются в фос-
фатном буферном растворе с pH 7,0 или соответствующей пита-
334
тельной среде в разведении 1:10, готовят в виде растворов или
суспензий;
— мягкие лекарственные формы, не растворимые в воде, эмуль-
гируют в фосфатном буферном растворе с pH 7,0 с помощью стек-
лянных бус и минимального количества подходящего стерильно-
го эмульгатора, указанного в соответствующей статье (например,
твин-80), применяя механическое встряхивание и нагревание до
температуры не более 45 °C в случае необходимости.
Приготовленные разведения образцов используют для опреде-
ления общего числа бактерий и грибов в 1 г (мл) лекарственного
средства и установления отсутствия бактерий семейств Entero-
bacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и Staphilococcus aureus [11].
10.2.3. Количественное определение микроорганизмов
Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чаш-
ках Петри диаметром 90—100 мм. Образец лекарственного сред-
ства в количестве 10 г (мл) растворяют, суспендируют или эмуль-
гируют в фосфатном буферном растворе с pH 7,0 так, чтобы ко-
нечный объем раствора (суспензии, эмульсии) был 100 мл. Посе-
вы просматривают ежедневно.
Определение общего числа бактерий. Приготовленный раствор
(суспензию, эмульсию) образца вносят по 1 мл в каждую из двух
пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры
от 45 до 50 °C среды № 1. Содержимое пробирок быстро переме-
шивают и переносят в чашку Петри, содержащие 15—20 мл за-
стывшей питательной среды № 1. Быстрым покачиванием чашек
Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После за-
стывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение
5 сут при температуре от 30 до 35 °C. Через 48 ч и окончательно
через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух
чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель
разведения, вычисляют число бактерий в 1 г (мл) образца.
Для получения достоверных результатов учитывают только те
чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний. Если при раз-
| ведении образца 1:10 нет роста, результаты отмечают следующим
образом: “В 1 г (мл) лекарственного средства (сырья) менее 10 бак-
~ терий”.
В Если число колоний на чашке превышает 300, делают ряд даль-
> нейших последовательных разведений образца (1: 100, 1:1000 и
т. д.), выбирая для посева разведение, наиболее соответствующее
указанному выше уровню [11].
Определение общего числа грибов. Испытание проводят дву-
слойным агаровым методом, описанным выше, используя сре-
> 335
ду № 2. Посевы инкубируют в течение 5 сут при температуре от
20 до 25 °C. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитыва-
ют общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на
двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на по-
казатель разведения, т. е. на 10, вычисляют число грибов в 1 г
(мл) образца. В случае, если число колоний грибов на чашке
превышает 300, делают ряд дальнейших разведений образца.
На чашке учитывают все колонии грибов, даже если их число
менее 30.
Выявление и идентификация семейства Enterobacteriaceae
Образец в количестве 10 г ( мл) вносят в 100 мл питательной
среды № 3, перемешивают и инкубируют при температуре от 30
до 35 °C в течение 24—48 ч. При наличии роста делают пересев
петлей на среды № 4 и № 5, разлитые в чашки Петри. Посевы
инкубируют при температуре от 30 до 35 °C в течение 24—48 ч.
Если после инкубации на средах № 4 и № 5 не будет колоний,
соответствующих морфологической характеристике, данной в
табл. 10.10, считают, что в образце нет бактерий семейства
Enterobacteriaceae.
Колонии, подозрительные по морфологии на принадлежность
к семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со
сред № 4 и № 5 на скошенную в пробирках среду № 1 и выращи-
вают при температуре от 30 до 35 °C в течение 18—20 ч. Из каж-
дой пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на
среды № 6 и № 7. После посева в половину пробирок со средой
№ 6 вносят по 0,5 мл стерильного вазелинового масла. Все посевы
инкубируют при температуре от 30 до 35 °C в течение 18—20 ч.
При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по из-
менению цвета среды № 6 из красного в желтый в пробирках с
Таблица 10.10
Морфологическая характеристика бактерий
семейства Enterobacteriaceae иа диагностических средах
Диагностическая среда Среда № 4 (агар Эндо) Среда № 5 (висмутсульфит агар)
Характерная морфология колоний Окраска по Граму Колонии круглые, ма- линовые с металли- ческим блеском или без него; розовые, бес- цветные, блестящие, выпуклые диаметром 2—4 мм Грамотрицательные пал Черные колонии с ха- рактерным металличе- ским блеском, участки среды под колониями окрашены в черный цвет; зеленовато-бу- рые колонии, светло- зеленые, бурые неспорообразующие очки
336
маслом и без него. О наличии нитритов в среде № 7 судят по
появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива
Грисса. Параллельно исследуют чистые культуры на наличие фер-
мента цитохром оксид азы.
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообра-
зующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реак-
цию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кисло-
ты и газа) и восстанавливают нитраты в нитриты, лекарственное
средство контаминировано бактериями семейства Enterobacteria-
ceae.
Выявление и идентификация
Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus
Образец в количестве 10 г (мл) вносят в 100 мл питательной
среды № 8, перемешивают и инкубируют при температуре от
30 до 35 °C в течение 24—48 ч. При наличии роста делают
пересев петлей на среды № 9 и № 10, разлитые в чашки Петри.
Посевы инкубируют при температуре от 30 до 35 °C в течение
24—48 ч.
Если после инкубации на средах № 9 и № 10 не обнаружены
колонии микроорганизмов, соответствующих морфологической
характеристике, данной в табл. 10.11 и 10.12, считают, что в
лекарственном средстве нет Pseudomonas aeruginosa и Staphylococ-
cus aureus. При наличии на среде № 9 характерных для Pseudomo-
nas aeruginosa колоний грамотрицательных неспорообразующих
палочек, обладающих специфическим запахом и выделяющих
сине-зеленый пигмент пиоцианин в питательный агар, культуру
исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы.
Таблица 10.11
Морфологическая характеристика Pseudomonas aeruginosa
иа диагностической среде № 9
Характерная морфология колоний Окраска по Граму
Зеленоватые, как правило, флуорес- цирующие колонии, голубые в ультра- фиолетовом свете Грамотрицательные неспорообразующие палочки
Таблица 10.12
Морфологическая характеристика Staphylococcus aureus
на диагностической среде № 10
Характерная морфология колоний
Золотисто-желтые колонии,
окруженные желтыми зонами
Окраска по Граму
Грамположительные кокки,
расположенные гроздьями
22. Заказ 3547
337
Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообра-
зующие палочки, которые дают положительную оксидазную ре-
акцию и образуют сине-зеленый пигмент, лекарственное средство
контаминировано Pseudomonas aeruginosa.
Наличие на среде № 10 золотисто-желтых колоний грамнело-
жительных кокков, окруженных желтыми эонами, свидетельству-
ет о ферментации маннита. Чистую культуру стафилококка ис-
следуют на наличие фермента плазмокоагулаэы.
Если в образце обнаружены грамположительные кокки, кото-
рые ферментируют маннит и дают положительную реакцию плаз-
мокоагуляции, лекарственное средство контаминировано Staphylo-
coccus aureus.
В нестерильных лекарственных средствах не допускается на-
личие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aerugi-
nosa и Staphylococcus aureus.
В 1 г (мл) лекарственного средства для приема внутрь допуска-
ется наличие не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесне-
вых грибов (суммарно).
В 1 г (мл) лекарственного средства для применения в полости
уха, носа, для интравагинального использования и для местного
употребления допускается наличие не более 100 микроорганиз-
мов, в том числе и грибов.
Тест на наличие нитритов. К суточной исследуемой культу-
ре бактерий на среде № 7 приливают 0,2—0,3 мл реактива Грис-
са, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного ок-
рашивания свидетельствует о наличии нитритов.
Тест на наличие цитохромоксидазы. Полоску фильтроваль-
ной бумаги смачивают реактивом н наносят платиновой петлей
или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуе-
мых бактерий со скошенной среды № 1. Синее окрашивание, по-
являющееся через 2—5 мин, свидетельствует о положительной
оксидазной реакции.
Тест на наличие плазмокоагулазы (реакция плазмокоагуля-
ции). Кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика,
помещают в 5 % -ный стерильный раствор натрия цитрата, отса-
сывают плазму, разводят 1:5 0,9 %-иым стерильным раствором
натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стериль-
ные пробирки. В каждую пробирку помещают 1 петлю суточной
культуры стафилококка и инкубируют при температуре от 30 до
35 °C в течение 4—6 ч. Если в течение этого времени не наблюда-
ют свертывание плазмы, реакцию плазмокоагуляции считают от-
рицательной. Обязательно наличие двух контролей: 1) контроль
338
раствора плазмы; 2) контроль культуры стафилококка, обладаю-
щего ферментом коагулазой.
Для удобства постановки реакции плазмокоагуляции можно
использовать сухую кроличью цитратную плазму промышленно-
го производства, которую разводят согласно наставлению по при-
менению.
Питательные среды
Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие оп-
ределенных микроорганизмов. Готовить питательные среды сле-
дует, строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компонен-
ты питательных сред должны соответствовать ГОСТу и ТУ
(табл. 10.13).
Состав и приготовление питательных сред
Среда № 1 — для выращивания бактерий:
Пептона ферментативного сухого — 10 г
Натрия хлорида — 5 г
Глюкозы — 1 г
Агара микробиологического* — 13 г
Мясной воды (1:2) — 1000 мл
pH после стерилизации 7,3±0,2.
К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворя-
ют при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают pH, кипятят
в течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее агар, нагрева-
ют до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марле-
вый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным
паром под давлением при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Среда №2 — для выращивания грибов (Сабуро):
Пептона ферментативного сухого — 10 г
Глюкозы — 40 г
Агара микробиологического* — 13 г
Воды дистиллированной — 1000 мл
pH после стерилизации 5,6±0,2.
Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный
заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилиза-
торе насыщенным паром под давлением при температуре 121 °C в
течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилиза-
ции насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бен-
зилпенициллина и 100 мг тетрациклина (либо перед стерилиза-
цией насыщенным паром под давлением — 50 мг левомицетина)
на 1000 мл среды.
* Жидкие среды № 1 и № 2 не содержат агара.
22*
339
Тест-микрооргаиизмы и условия для биологи
Антибиотик1 Тест-микроорга- низмы2 Среда для определения активности3-4 Количество среды на каж- дую чашку, мл5 Посевная доза6
Ниж- ний слой Верхний слой Ниж- ний слой Верх- ний слой
1 2 3 4 5 6 7
Ампициллин Staphylococcus № 11 № 7 +0.1 % 10 5 40 млн микробных
aureus 209 Р глюкозы клеток на 1 мл среды
Амфотерицин Б Candida u tills №11 № 16+0,1 % 15 2 мл рабочей взвеси на
ЛИА-01 глюкозы 100 мл среды
Вензилпеиицил- Staphylococcus № 17 № 7+0,1 % 10 5 40 млн микробных
ЛИН aureus 209 P9 глюкозы клеток на 1 мл среды
Гелиомицив Бас. subtilis № 17 15 100 млн спор на 1 мл
ATCC2 6633 среды
Гентамицин Вас. Pumilus №9 20 5 50 мли спор на 1 мл
NCTC 8241 среды
Грамицидин С Вас. cereus var. № 13 10 8 млн спор на 1 мл сре-
mycoides 537 ДЫ
Дактиномицин Вас. cereus var. № 14 10 20 млн спор на 1 мл
mycoides HB среды
Дигидрострепто- Вас. cereus var. № 9 10 20 млн спор на 1 мл
мицин mycoides 537 среды
Диклоксациллин Staphylococcus №11 № 7+0,1 % 10 5 40 млн микробных
aureus 209 P глюкозы клеток на 1 мл среды
Диоксициклин Вас. subtilis var. № 6 + 0,1 % 10 30 млн спор на 1 мл
л2 глюкозы среды
Каиамиции В10 Вас. subtilis № 12 №8 10 5 100 млн спор на 1 мл
ATCC 6633 среды
Канамицин Вас. Pumilus № 8 № 8 15 5 40 млн спор на 1 мл
NCTC 8241 среды
Карбени цил лии Pseudomonas aeru- № 7 15 10 мл бульонной куль-
ginosa NCTC 2134 туры на 100 мл среды
Карминомицин Вас. cereus var. № 5 15 100 млн спор на 1 мл
mycoides 537 среды
Левории Candida utilis № 16-0,1 % 15 2—2,5 мл рабочей
ЛИА-01 глюкозы взвеси на 100 мл сре-
ДЫ
Линкомицин Вас. subtilis №8 10 100 млн спор на 1 мл
ATCC 6633 среды
Метациклин Вас. subtilis var. №6 + 0,1 % 10 30 млн млн спор на
Л, глюкозы 1 мл среды
Метициллин Staphylococcus № 7+0,1 % 10 5 40 млн микробных
aureus 209 P глюкозы клеток на 1 мл среды
Микогептин Candida utilis № 16+1 % 15 2,5—3 мл рабочей
ЛИА-01 глюкозы взвеси на 100 мл
Мономицин Вас. cereus var. №9 10 20 млн млн спор иа
mycoides 537 1 мл среды
Неомицин To же №9 20 5 20 млн млн спор на
1 мл среды
Нистатин Candida utilis № 16+0,1 % 15 3~ 3,5 мл рабочей взве-
ЛИА-01 глюкозы си на 100 мл среды
Эксациллии Staphylococcus № 11 № 7+0,1 % 10 5 40 млн микробных
aureus 209 P глюкозы клеток на 1 мл среды
340
Таблица 10.13
ческого определения активности антибиотиков
Стандартный образец Растворитель для приготовления растворов стандартного и испытуемого растворов Срок годности основного рас- твора. стандарт- ного образца при температуре от 4 до 10 °C, сут Контрольная концентрация раствора стан- дартного образ- ца7,8, мкг/мл акт. вещества или ЕД/мл
Основной раствор Рабочий раствор
8 9 10 11 12
Ампициллина тригидрат Буфер № 1 Буфер № 1 3 1 мкг/мл
Амфотерицин В Диметилсуль- фоксид Буфер № I11 1 0,5 мкг/мл
Бензилпеницилли- на натриевая соль Буфер № 1 Буфер Mb I 3 1 ЕД/мл
Гелиомиции ОД н. раствор едкого натра13 0,1 в. раствор едкого натра 10 4 мкг/мл
Гентамицина сульфат Буфер № 4 Буфер № 4 14 2 мкг/мл
Грамицидин С Этиловый спирт 95 % Дистиллированная вода 30 100 мкг/мл
Дактиномицин Дистиллированная вода9 Буфер № 4 15 4 мкг/мл
Дигидрострепто- мицина сульфат Буфер № 3 Буфер № 4 30 2 мкг/мл
Диклоксаци длина натриевая соль Буфер № 1 Буфер № 1 6 8 мкг/мл
Доксициклина гидрохлорид 0,01 н. раствор хлористоводород- ной кислоты Буфер .V’ 2 7 0,5 мкг/мл
Канамицина моносульфат Дистиллированная вода Буфер № 4 30 1 мкг/мл
Каиамицина моносульфат Дистиллированная вода Вуфер № 4 30 10 мкг/мл
Карбеннциллииа динатриевая соль Вуфер № 1 Буфер № 2 3 10 мкг/мл
Карминомицина гидрохлорид Дистиллирован- ная вода Буфер № 4 10 15 мкг/мл
Леворни Диметил- сульфоксид Диметилсульфоксид до концентрации 100 мкг/мл, а затем в буфере № I11 3(10) 0,5 мкг/мл
Лннкомицина гидрохлорид Метациклина Дистиллированная вода 0,01 и. раствор Буфер .V* 4 30 100 мкг/мл
гидрохлорид хлористоводород- ной кислоты Буфер № 2 0,5 мкг/мл
Метициллина натривая соль Буфер № 1 Буфер № 1 3 20 мкг/мл
Микогептин Диметилсульфок- сид Диметилсульфок- сид до концентра- ции 50 мкг/мл, а затем буфер № 4*1 з12 1 мкг/мл
Мономицин Дистиллированная вода 3 % раствор хлорида калия 30 2 мкг/мл
Неомицина сульфат Буфер № 4 Буфер № 4 30 4 мкг/мл
Нистатин Диметил формам ид Буфер № 3 3 20 ЕД/мл
Оксациллина натриевая соль Буфер № 1 Буфер № 1 3 4 мкг/мл
341
1 2 3 4 5 6 7
Оксатетрациклин Вас. subtilis, var. Л, №6+1% глюкозы 10 30 млн спор на 1 мл среды
Олеаядомицин Оливомицин Вас. cereus, var. mycoides НВ Вас. subtilis, var. АТСС 6633 №11 №9 №18 10 10 5 20 млн спор на 1 мл среды 10 млн спор на 1 мл среды
Полимиксин В Полимиксин М Рифампицин Bordetella bronchi- septica АТСС 4617 Bordetella bronchi- septica ATCC 4617 Bae. subtilis, var. ATCC 6633 №15 №15 № 10+0,1% глюкозы 10 10 10 40—60 млн микроб- ных клеток на 1 мл среды 40—60 млн микроб- ных клеток на 1 мл среды 40 млн спор на 1 мл среды
Рубомицин Сизомицин Стрептомицин Тетрациклин Bae. cereus, var. mycoides 537 Bae. pumilus NCTC 8241 Вас. cereus var. mycoides 537 Bae. subtilis var. Л, №12 №5 №8 №9 № 6+1% глюкозы 20 15 5 10 10 10 млн спор на 1 мл среды 50 млн спор на 1 мл среды 20 млн спор на 1 мл среды 30 млн снор на 1 мл среды
Феноксиметилпе- нициллкн Флоримицин Фузидин Staphylococcus aureus 209 P Bae. subtilis ATCC 6633 Bae. cereus var. mycoides HB № 7+ 0,1% глюкозы №8 № 10+1% глюкозы 10 5 10 10 40 млн микробных клеток на 1 мл среды 20 млн спор на 1 мл среды 50 млн спор на 1 мл среды
Цефалексин Цефалотин Хлортетрациклии Вас. subtilis ATCC 6633 Вас. subtilis ATCC 6633 Вас. subtilis var Л, №11 №11 № 7+ 0,1% глюкозы № 7+ 0,1% глюкозы №6+1% глюкозы 10 10 5 5 10 100 млн спор на 1 мл среды 40 млн спор на 1 мл среды 30 млн спор на 1 мл среды
Эритромицин Bae. cereus var. mycoides HB №9 10 20 млн спор на 1 мл среды
1 Условия определения антимикробной активности антибиотиков указанных
наименований распространяются и на их лекарственные формы.
2 АТСС — Американская типовая коллекция культур, NCTC — Национальная
коллекция типовых культур.
342
Окончание табл. 10.13
8 9 10 11 12
Оксмтетрациклина ГНДрАХЛОрИД 0.01 н. раствор хлористоводород- ной кислоты Буфер № 2 7 1 мкг/мл
Оаеандомицша фосфат Буфер № 3 Буфер № 4 7 4 мкг/мл
Оливомнцин- квслота Стандартный обра- зец в этал(»ом спир те из расчета 5 мг в 1 мл, затем буфер № 1; испытуемый образец — в дистил- лированной воде Буфер № 1 14 2 мкг/мл
Полимиксин В сульфат Буфер № 3 Буфер № 5 14 100 ВД/мл
Полимиксин М сульфат Буфер № 3 Буфер № 5 14 100 ЕД/мл
Рмфамвмцш< 1 мл даметюаформ~ •меда на 10 мг навесим, затем дактеддшроваяная вода Буфер № 3 4 5 мкг/мл
Рубомицина НШЖСЖОвШ! Дистиллированная вода Буфер № 4 10 20 мкг/мл
Силомицина сульфат Буфер № 4 Буфер Ns 4 14 2 мкг/мл
Стуеятмапиша сульфат Буфер № 3 Буфер № 4 30 2 мкг/мл
Terpaomaiiaia гидрохлорид 0,01 и. раствор хлористоведород- ной кислоты Буфер № 2 7 2 мкг/мл
Фежжсиметялпе- НИЦМЛЛШ1 Буфер № 1 Буфер № 1 7 1 ВД/мл
Флоримицина сульфат Дистиллированная вода Буфер № 4 7 10 мкг/мл
Фузидиеновая кислота Стандартный обра- зец — в этиловом спирте из расчета 10 мг/мл, затем буфер № 4; испы- туемый образец — в буфере №4 Буфер № 3 7 5 мкг/мл
Цефалексин Буфер № 1 Буфер № 1 3 5 мкг/ мл
Цефалотина иатривая соль Буфер № 1 Буфер № 1 3 0,5 мкг/мл
Хлортетрацикл ина гидрохлорид 0,01 и. раствор хлористоводород- ной кислоты Буфер № 2 7 1 мкг/мл
Эритромицин 1 мл этилового спирта на 10 мг навески, затем буфер № 4 до 1000 ЕД/мл Буфер № 4 7 2 мкг/мл
3 Состав, приготовление сред и буферных смесей см. в ГФ XI, вып. 1, с. 221,
223.
4 Глюкозу добавляют в расплавленный агар в виде 40 %-ного стерильного
раствора.
343
5 Объемы сред указаны для чашек размером 20x100 мм. При использовании
лунок количество среды для нижнего или одного слоя удваивается.
8 Допускается уменьшение или увеличение посевной дозы тест-микроба в
зависимости от плотности получаемого газона и четкости очертания зон.
7 В таблице указана контрольная концентрация раствора стандартного образ-
ца для метода с использованием стандартной кривой.
8 Допускается при необходимости уменьшение или увеличение контрольной
концентрации раствора стандартного образца.
9 Для полного растворения препарата раствор помещают в холодильник при
температуре от 4 до .10 °C.
10 Активность каиамицина В определяется после гидролиза по стандартному
образцу каиамицина А.
11 Срок годности рабочих растворов в буфере при комнатной температуре —
не более 30 мни.
12 Срок годности основного раствора стандартного образца микогептииа при
комнатной температуре — не более 4—5 ч.
13 Основной раствор готовят в концентрации 1 мг в 5 мл раствора гидроксида
натрия (0,1 моль/л).
— 10 г
— 7,5 г
— 2,5 г
— 10,0 г
— 0,08 г
— 0,015 г
— 1000 мл
Среда №3 — среда обогащения для бактерий семейства
Enterobacteriaceae:
Пептона ферментативного сухого
Натрия фосфата двузамещенного
Калия фосфата однозамещенного
Глюкозы
Фенолового красного
Малахитового зеленого
Мясной воды (1:2)
pH после стерилизации 7,3±0,2.
Пептон и соли растворяют в мясной воде при нагревании, вно-
сят глюкозу, прибавляют 8 мл 1 % -ного раствора фенолового крас-
ного и 3 мл 0,5 %-ного раствора малахитового зеленого, устанав-
ливают pH, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр.
Стерилизуют насыщенным паром под давлением при температуре
121 °C в течение 15 мин в паровом стерилизаторе.
Среда № 4 (агар Эндо сухой) — для выделения бактерий
семейства Enterobacteriaceae — готовят согласно прописи на эти-
кетке.
Среда № 5 (висмутсульфит агар сухой) — для выделения
бактерий семейства Enterobacteriaceae — готовят согласно пропи-
си на этикетке.
Среда № 6 —для определения ферментации глюкозы:
Пептона ферментативного сухого
Натрия хлорида
Глюкозы
Фенолового красного
Мясной воды (1:2)
pH после стерилизации 7,2±0,2.
— 10,0 г
— 5,0 г
— 40,0 г
— 0,08 г
— 1000 мл
344
Пептон и натрия хлорид растворяют в мясной воде при нагре-
вании, вносят глюкозу, прибавляют 8 мл 1 %-ного раствора фено-
лового красного, устанавливают pH, кипятят 1 мин, фильтруют
через бумажный фильтр и разливают в пробирки с поплавками
по 4—5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным
паром под давлением при температуре 121 °C в течение 15 мин.
По окончании стерилизации следует как можно быстрее охла-
дить среду.
Среда № 7 — для определения восстановления нитратов в
нитриты:
Пептона ферментативного сухого — 5,0 г
Натрия хлорида — 5,0 г
Калия нитрата — 1,5 г
Воды дистиллированной — 1000 мл
pH после стерилизации 7,2±0,2.
Все компоненты растворяют в воде при нагревании, устанав-
ливают pH, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр,
разливают в пробирки по 4—5 мл. Стерилизуют в паровом стери-
лизаторе насыщенным паром под давлением при температуре
121 °C в течение 15 мин.
Среда № 8 — для выращивания Pseudomonas aeruginosa и
Staphylococcus ahreus:
Пептона ферментативного сухого — 10,0 г
Натрия хлорида — 5,0 г
Калия фосфата двузамещенного — 2,5 г
Глюкозы — 2,5 г
Воды дистиллированной — 1000 мл
pH после стерилизации 7,3±0,2.
Пептон и соли растворяют в воде при нагревании, вносят глю-
козу, устанавливают pH, кипятят 1 мин, фильтруют через бу-
мажный фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщен-
ным паром под давлением при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Среда № 9 — для выявления пигмента пиоцианина:
Пептона ферментативного сухого — 20,0 г
Магния хлорида безводного — 1,4 г
Калия сульфата безводного — 10,0 г
Глицерина — 10,0 мл
Агара микробиологического — 15,0 г
Воды дистиллированной — 1000 мл
pH после стерилизации 7,2±0,2.
Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде и остав-
ляют на 15 мин. Затем вносят глицерин, тщательно перемешива-
ют, растворяют при нагревании, устанавливают pH, кипятят 1 мин,
прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его
345
расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стери-
лизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давле-
нием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Среда №10 —для идентификации Staphylococcus aureus:
Пептона ферментативного сухого — 10,0 г
Натрия хлорида — 75,0 г
Маннита — 10,0 г
Фенолового красного — 0,025 г
Агара микробиологического — 15,0 г
Воды дистиллированной — 1000 мл
pH после стерилизации 7,4±0,2.
Все компоненты растворяют в воде, вносят 2,5 мл 1 %-ного
раствора фенолового красного, устанавливают pH, кипятят 1 мин,
прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его
расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стери-
лизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давле-
нием при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Требования к ростовым свойствам питательных сред. Ис-
пользуемые питательные среды должны обеспечивать рост соот-
ветствующих тест-штаммов бактерий и грибов, указанных в
табл. 10.13, при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособ-
ных клеток: для сред № 1, 3, 6—10 ие позднее 48 ч инкубации
при температуре от 30 до 35 °C и для среды № 2 — не позднее 72 ч
инкубации при температуре от 20 до 25 °C.
Растворы, реактивы
Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и
пептоном (1/15 мол):
pH — 7,0
Калия фосфата однозамещеииого — 3,56 г
Натрия фосфата двузамещенного — 7,23 г
Натрия хлорида — 4,3 г
Пептона ферментативного сухого — 1,0 г
Воды Дистилироваиной — до 1000 мл
Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под
давлением при температуре 121 °C в течение 15 мин. Раствор хра-
нят при температуре от 4 до 10 °C.
Феноловый красный — 1%-ный раствор:
Фенолового красного — 1,0 г
Раствора гидроксида натрия 0,1 (моль/л) — 28,2 мл
Воды дистиллированной — до 100 мл
Навеску индикатора растирают в ступке, прибавляя неболь-
шими порциями гидроксид натрия. Полученный раствор перено-
сят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раство-
346
ра водой до метки. Хранят во флаконе нейтрального светозащит-
ного стекла при температуре от 4 до 10 “С.
Малахитовый зеленый — 0,5 %-ный раствор:
Малахитового зеленого — 0,5 г
Воды дистиллированной — до 100 мл
Навеску красителя переносят в стеклянный флакон, прибав-
ляют стерильную горячую воду, помещают на сутки в термостат,
периодически встряхивая.
Реактив Грисса. Раствор № 1: 0,5 г сульфаниловой кис-
лоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты, прибавляют
100 мл воды, фильтруют. Раствор годен в течение месяца.
Раствор № 2: 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 мл кипя-
щей воды, охлаждают, прибавляют 30 мл ледяной уксусной кис-
лоты, фильтруют. Раствор годен в течение 7 сут.
Перед употреблением смешивают равные объемы растворов № 1
и №2.
Реактив на цитохромоксидазу. Раствор № 1:
1 %-ный спиртовой раствор нафтола-1.
Раствор № 2: 1 %-ный раствор Ы,Ы-диметил-р-фениленднами-
на дигидрохлорида.
Перед употреблением смешивают растворы № 1 и № 2 в соот-
ношении 2:3;
Растворы годны в течение 14 сут прн хранении при температу-
ре от 4 до 10 °C во флаконах нейтрального светозащитного стек-
ла.
10.2.4. Определение антимикробной активности
антибиотиков методом диффузии в агар
Определение антимикробной активности антибиотиков осно-
вано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Опреде-
ление проводят методом диффузии в агар на плотной питатель-
ной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-
микробов, образующихся при испытании растворов определенных
концентраций Государственного стандартного образца* и испыту-
емого препарата.
Антимикробная активность антибиотиков выражается в ЕД
или “мкг”. Для большинства антибиотиков 1 ЕД или “мкг” соот-
ветствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания);
для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение
единицы, соответствующие указания даются в частных статьях.
При определении антимикробной активности антибиотиков
используют стандартные образцы, активность которых, как пра-
* Далее — “стандартный образец”.
347
вило, устанавливают в соответствии с Международными биологи-
ческими стандартами. При отсутствии последних для указанных
целей могут быть использованы Международные химические стан-
дарты, антимикробную активность которых рассчитывают на ос-
новании показателей качества, установленных физико-химичес-
кими методами. Антимикробную активность стандартных образ-
цов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной кол-
лекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей
качества, установленных физико-химическими методами.
Стандартные образцы антибиотиков утверждаются и рассыла-
ются Государственным научно-исследовательским институтом по
стандартизации и контролю лекарственных средств Минздрава
РФ, хранятся и используются в соответствии с рекомендациями,
указанными на этикетке стандартного образца.
Метод определения. Тест-микробы, растворители, буферные
растворы, питательные среды и прочие условия проведения ис-
пытания указаны в табл. 10.14.
В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установлен-
ные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разли-
вают расплавленные питательные среды определенного состава в
один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные
среды, для верхнего или одного слоя — агаровую среду, предва-
рительно засеянную соответствующим тест-микробом. Если куль-
тура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то тем-
пература расплавленной среды, в которую вносят тест-микроб,
должна быть 49±1 °C: при использовании суспензии спор — 65—
70 °C. К среде следует добавить такое количество суспензии веге-
тативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный
рост тест-микроба и четкость зон угнетения его роста.
Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высо-
той 10,0±0,1 мм и внутренним диаметром 6,0±0,1 мм, из нержа-
веющей стали или алюминия расставляют на поверхности засе-
янной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чаш-
ки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диамет-
ром от 6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного
сверла либо другого соответствующего приспособления.
В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы
рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основ-
ные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в сте-
рильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из ос-
новных растворов в зависимости от применяемого варианта мето-
да диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной
кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций
348
испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций
стандартного образца.
Рабочие растворы испытуемых образцов готовят из основных
растворов таким образом, чтобы их концентрации не имели суще-
ственных отличий от концентраций раствора стандартного образца.
Для уменьшения влияния колебаний во времени между зака-
пыванием растворов, используемых в опыте, рекомендуется пос-
ле их внесения выдерживать чашки при комнатной температуре
в течение 1—2 ч. Затем чашки инкубируют при температуре
36±1 °C в течение 16—18 ч.
Диаметры зон угнетения роста тест-микроба при помощи соот-
ветствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.
Определение антимикробной активности антибиотиков с ис-
пользованием трехдозного варианта метода диффузии в агар.
Для проведения испытания готовят три раствора стандартного об-
разца (ср с2, с3) и три раствора испытуемого образца (Ир И2, И3).
Концентрации растворов, содержащих малую, среднюю и боль-
шую дозы, должны находиться между собой в кратном соотноше-
нии (1:2:4). При необходимости это соотношение может быть из-
менено. Концентрация раствора с2 должна быть близка к конт-
рольной концентрации раствора стандартного образца, указанной
в табл. 10.13.
Все растворы стандартного и испытуемого образцов вносят в
цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы
растворы с большими концентрациями не соприкасались между
собой. Предлагаемый вариант закапывания: с1И3с2И1с3И2.
Число чашек, используемых в каждом опыте, должно быть
достаточным для обеспечения статистической достоверности ре-
зультатов, но не менее 6 чашек.
Последовательность внесения растворов стандартного и испы-
туемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки должна
быть следующей: сначала вносят раствор с малой концентрацией
стандартного образца (ct) и соответствующий раствор испытуемо-
го образца (ИД затем — растворы со средней концентрацией (с2 и
И2), последними вносят растворы с большими концентрациями
(с3 и И3).
Расчет активности и дисперсионный анализ при использова-
нии трехдозного варианта метода диффузии в агар осуществляет-
ся в соответствии с главой “Статистическая обработка результа-
тов химического эксперимента и биологических испытаний»
(ГФ XI, вып. 1, с. 199). В данном разделе растворы определенных
концентраций стандартного (с) и испытуемого (И) образцов обо-
значены ds и du соответственно.
349
Таблица 10.14
Характеристика культуральных свойств тест-микроба
Название тест-микроба При росте иа плотной питательной среде При росте на жидкой питательной среде При микроскопическом изучении мазка агаровой культуры, окрашенной по Граму
Условия выращивания Описание культуры Условия выращивания Описание культуры
Staphylococcus Среда № 1, Гладкие с ровными Мясопептон- Равномерное по- Однородные по величине
aureus 209 Р t 36±1 «С, 18-20 ч, затем при ком- натной темпе- ратуре 24 ч краями колонии, с равномерной золо- тистой пигментацией ный бульон, pH 7,2—7,4, 18—20 ч мутнение бульона без пленки и сли- зистого осадка на дне и расположению в виде гроздьев кокки с хорошо выраженной грамположи- тельной окраской
Candida utilis Среда № 8, Круглые, кремового МПБ, Рост в виде равно- Овальные, иногда с от-
ЛИА-01 t 30±1 «С, 48 ч цвета с матовой по- верхностью колонии с равными краями pH 7,2—7,4, с 1 %-ной глю- козой, 18—20 ч мерной мути и осадка на дне ростками клетки; распо- ложены отдельно, цепоч- ками или группами
Вас. subtilis Среда № 1, Колонии желтоватого МПБ, Рост в виде пленкн Палочки с закругленными
var. Л2 t 36±1 °C, 18-“ 20 ч цвета, круглой фор- мы, влажно блестя- щие с шагреневой по- верхностью, слегка зазубренными края- ми и приподнятым центром pH 7,2—7,4, 18—20 ч с осадком иа дне краями, располагающиеся отдельно и цепочками с хорошо выраженной грамположительной окраской
Вас. subtilis, Среда № 1, Мелкие сероватые МПБ, Рост в виде пленки Тонкие палочки, распо-
АТСС 6633 t 36±1 «С, 18—20ч колонии с зубчатым краем pH 6,8—7,0, 18—20 ч с осадком на дне латающиеся отдельно или цепочками, с хорошо вы- раженной грамположи- тельной окраской
Вас. cereus, Среда № 2, Шероховатые коло- МПБ, Морщинистая Палочки е закругленными
var. mycoides t 36±1 «С, нии с краем, сформи- pH Т»8— 8,0, пленка; вся среда концами, располагающие-
537 18—20 ч рованным из пере- плетающихся воло- кон 18—204 прозрачная без осадков ся отдельно или цепочка- ми, с хорошо выраженной грамположительной ок- раской
Вас. cereus Среда № 1, Гладкие колонии с МПБ, Равномерное по- Тонкие с закругленными
var. mycoides t 36±1 °C, ровными краями и pH 6,8-7,0, мутнение бульона концами палочки, распо-
HB 18—20 ч сферической поверх- ностью 18—20 ч без образования пленки и осадка латающиеся отдельно или короткими цепочками, с хорошо выраженной грам- положительной окраской
Вас. pumilus Среда № 1, Мелкие серовато-го- МПБ, Равномерное по- Тонкие, мелкие палочки с
NCTC 8241 t 36±1 °C, 18—20 ч лубого цвета колонии с зазубренными края- ми и приподнятым центром pH 7,2-7,4, 18—20 ч мутнение бульона без образования пленки и осадка закругленными концами, располагающиеся отдель- но или короткими цепоч- ками, с хорошо выражен- ной грамположительной окраской
Bordetella МПА, Мелкие, мутные, бе- МПБ, Заметное помутне- Одиночные, короткие.
bronchiseptica ATCC 4617 pH 7,2—7,4 t 36±1 °C, 18—20 ч лые, слегка выпук- лые, фарфоровидные колонии pH 7,2-7,4 ние, серая пленка, тягучий осадок тонкие палочки с хорошо выраженной неотрица- тельной окраской
Pseudomonas МПА, Широкие, расплыв- МПБ, Заметное помутне- Одиночные палочки либо
aeruginosa NCTC 2134 pH 7,2—7,4 t 36±1 °C, 18—20 ч чатые, прозрачные с неровными краями колонии pH 7,2—7,4 ние, толстая плен- ка, среда может приобретать желто- вато-зеленую окрас- ку короткие цепочки с хоро- шо выраженной грамотри- цательной окраской
Определение антимикробной активности антибиотиков с ис-
пользованием стандартной кривой
Постановка опыта
В день постановки анализа из основного раствора готовят пять
рабочих растворов стандартного образца ср с2, с3, с4, с5 с концен-
трациями, увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z),
обычно в соотношении 1: 1,25. Средняя концентрация (с3) явля-
ется контрольной и должна быть близка к концентрации, указан-
ной в табл. 10.13: концентрация с4 — наименьшая, с5 — наиболь-
шая. Для исследования растворов каждой концентрации (кроме
контрольной) используют по три чашки. Раствор контрольной кон-
центрации с3 закапывают в три цилиндра (или лунки) каждой из
взятых в опыт чашек, в три другие цилиндра (лунки) закапывают
раствор одной из концентраций стандартного образца, чередуя его
с раствором контрольной концентрации. Таким образом, для по-
строения стандартной кривой используют 12 чашек.
После инкубации в термостате измеряют диаметры зон угнете-
ния роста тест-микробов. Далее вычисляют среднюю величину
диаметров зон для раствора контрольной концентрации стандарт-
ного образца в каждой группе из трех чашек, затем среднюю ве-
личину диаметров зон для раствора контрольной концентрации
стандартного образца из всех 12 чашек (общую среднюю из 36
зон). По разности между средней величиной зоны контрольной
концентрации, установленной из 12 чашек, и средней величиной
зоны контрольной концентрации, установленной из 3 чашек с
каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине
зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к
средней величине диаметра зоны данной концентрации, если она
положительная, и вычитают, если она отрицательная.
Пример. Общая средняя величина зоны для раствора конт-
рольной концентрации стандартного образца 1 мкг/мл, рассчи-
танная из 36 зон, равна 19,2 мм. Средняя величина зоны для
раствора той же концентрации, установленная из 3 чашек, на
которых испытывался раствор с концентрацией 0,83 мкг/мл стан-
дартного образца, равна 19 мм. Следовательно, величина поправ-
ки будет +0,2 мм. Средняя величина зоны для концентрации
0,83 мкг/мл равна 17,9 мм; прибавляя поправку +0,2 мм, полу-
чаем величину 18,1 мм. Таким образом, исправляют значение ве-
личины зон для растворов всех концентраций стандартного об-
разца и получают величины dp d2, d4, d5.
Для исследования активности испытуемого образца проводят
несколько определений, используя для каждого по 3 чашки, в
которые закапывают раствор контрольной концентрации стандарт-
352
ного образца и раствор испытуемого образца с концентрацией,
близкой к контрольной. Внесение растворов контрольной концен-
трации стандартного и испытуемого образцов в каждой группе из
трех чашек должно проводиться одномоментно. После инкуба-
ции измеряют зоны угнетения роста тест-микроба, образуемые
растворами контрольной концентрации стандартного и испытуе-
мого образцов. Находят среднее значение величин зон из 3 ча-
шек.
Расчет антимикробной активности испытуемых образцов по
стандартной кривой может быть проведен двумя способами: гра-
фическим методом или путем непосредственного расчета с исполь-
зованием соответствующих формул.
Расчет активности испытуемого образца графическим ме-
тодом. По исправленным значениям диаметров зон dp d2, d4, d5
для всех концентраций растворов стандартного образца ср с2, с4,
с5 и общей средней величине диаметров зон для контрольной кон-
центрации d3 вычисляют с использованием метода наименьших
квадратов размеры зон Dmin и Р,^ для низкой и высокой концен-
траций растворов стандартного образца:
Dmm =(3dj +2d2 +d3 -ds)/5;
Dmax =(3d5 +2d4 +d3-d,)/5,
по которым затем строят стандартную кривую на полулогариф-
мической сетке расчета биологической активности антибиотиков,
откладывая на оси абсцисс величины зон, на оси ординат — соот-
ветствующие им концентрации растворов стандартного образца.
Разность между найденными средними величинами зон угнете-
ния роста тест-микроба раствором испытуемого образца и раство-
ром контрольной концентрации стандартного образца из тех же
чашек прибавляют к значению величины зоны, соответствующей
контрольной концентрации на кривой (D3). Затем по кривой на-
ходят концентрацию, соответствующую найденной величине зоны.
Умножением полученной концентрации на степень разведения
получают активность в 1 мл основного раствора или в 1 мг испы-
туемого образца.
Пример. Средний размер зон для раствора испытуемого образ-
ца при разведении 1:300 составляет 18,7 мм, средний размер зон
для раствора стандартного образца, содержащего 2 мкг/мл (конт-
рольная концентрация), из тех же чашек — 18,5 мм. Следова-
тельно, разность составляет +0,2 мм. Эту разность прибавляют к
величине зоны для раствора в концентрации 2 мкг/мл по стан-
дартной кривой, которая равна D8= 18,6 мм, и получают величи-
ну 18,8 мм. Находят на кривой концентрацию, соответствующую
23. Заказ 3547
353
данному размеру зоны, — 2,36 мкг/мл. Эту величину умножают
на степень разведения и получают содержание активного вещества
в 1 мл основного раствора, т. е. 2,36 мкг/мл • 300 = 708 мкг/мл.
Так как концентрация основного раствора составляла 1 мг/мл,
то активность испытуемого образца равна 708 мкг/мл: 1 мг/мл =
= 708 мкг/мл.
Определение активности испытуемого образца расчетным пу-
тем. Кривая, отражающая зависимость между активностью ан-
тибиотика и размером зоны угнетения роста тест-микроба, после
перехода к координатам “логарифм концентрации (1g с) — диа-
метр зоны (D)” преобразуется в прямую, уравнение которой
D = a+blgc,
где а — свободный член; b — угловой коэффициент.
По исправленным значениям величин диаметров зон d1, d2, d4,
d5 для растворов стандартного образца с концентрациями ср с2,
с4, с5 и общей средней величине диаметра зоны d3, соответствую-
щей контрольной с3, рассчитывают величины а и b с применени-
ем метода наименьших квадратов. Так как концентрации сг с2,
с3, с4, с5 составляют геометрическую прогрессию, формулы для
вычисления коэффициентов а и b могут быть записаны в виде
b = (-2dj - d2 + d4 + 2ds) /101g Z;
a-d-blgcj,
где Z — знаменатель прогрессии разведения;
d = (dj + d2 + d3 + d4 + d5 )/5.
Пример. Пусть знаменатель прогрессии разведения Z = 1,25,
с3 - 5,0, а средние значения диаметров зон (в мм) равны: d4 = 17,64;
d2= 18,15; d3= 19,03; d4= 19,58; d5= 20,09. Тогда
b = (-2 • 17,64 -18Д 5+19,58 + 2 • 20,09) /(10 • 1g 1,25) = 6,3310,969 = 6,532;
d = (17,64+18Д 5 +19,03 +19,58 = 20,09)/ 5 = 18,90;
a=18,90 - 6,532 • 0,6990 = 14,33.
Если в опыте с одной стандартной кривой проведено п испыта-
ний образца, то логарифм среднего значения концентрации испы-
туемого образца в опыте рассчитывают по формуле
lgcu=lgc3+(du-ds)/b,
где си — среднее значение рабочей концентрации испытуемого
образца, полученное по п испытаниям; d"v — среднее значение
диаметра зон задержками роста, полученное по п параллельным
испытаниям (Зп чашкам); cTs — среднее значение соответствую-
354
щего диаметра для контрольной концннтрнции, полученное в тех
же испытаниях (по Зп чашки),
Величину концентрации с() вычисляют как антилогарифм:
Си = antilg (lgcu).
Для получения активности испытуемого образца неличипу с()
умножают на его разведение в опыте — ус.
Пример. Пусть n = 1; с3 = 5,0; ds = 18,61 и dy - 18,44 при
уи = 160. Тогда
dv =du=18,44;ds = ds = 18,61;
IgCu = 0,6990 + (18,44 -18,61) / 6,532 = 0,6730;
Си = antilg(Q,6730) = 4,710;
Аи =4,710 160 = 754.
Пример. Пусть п = 3; с3 = 5,0; dsl = 18,61; dS2 = 18,3;
dS3 = 18,12; dOT = 18,44; du2 = 18,1; dU3 = 18,3 при yc =160. Тогда
ds = (18,61 + 183+18Д2)/3 = 1834;
du =(18,44+18,1+183)73 =1828;
IgCy = 0,6990+(1828-18,34)76,532 = 0,6990-0,0092 = 0,6898;
Cy = antilg(0,6898) = 4,896;
Аи =4,896 160 = 783.
Поскольку микробиологическое исследование активности ан-
тибиотиков подвержено вариабельности, следует проводить не
менее 6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 дней),
так как средняя активность отдельных определений, проведен-
ных в разные дни, — более надежная величина, чем средняя ак-
тивность, полученная в результате такого же количества опреде-
лений, проведенных одновременно.
Расчет ошибки определения логарифма концентрации испы-
туемого образца в пределах одного опыта приведен в приложе-
нии 1 к настоящей главе из ГФ XI. Объединение результатов от-
дельных опытов осуществляют в соответствии с формулами, при-
веденными в приложении 2 к настоящей главе из ГФ XI.
Во всех сомнительных случаях и при определении активности
стандартных образцов должен использоваться только трехдозный
вариант метода диффузии в агар.
Для определения содержания активного вещества во флаконе
активность, найденную в 1 мг, умножают на массу содержимого
флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании ра-
23*
355
створа, ащригошижлешшйго ив юсяпо ©одержимого флаашява или ам-
пулы, активность, иайдеииую ® 1 мл этого ристворщ умножают
на его «йлывм. В случае необходимости «яиределешмя содержания
активного вещества ® 1 яг испытуемого образца следует величи-
ну, харажтефшаувииую содержание активного вещества во (флако-
не, разделить иа массу'Вадержимагофлакона, выраженную в мил-
лэщряммях.
При япредеаюииж ©одержания ааспжвииго вещества в таблетках
или капсулах их количеств®, а также подготовка для анализа
должны соответствовать требованиям -общих статей ГФ XI “Таб-
летки” (с. 154) и "“Капсулы” (с. 143). В дальнейшем основной ра-
створ испытуемого образца готовят из расчета 1 мг в 1 мл. После
перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют.
Рабочий раствор испытуемого образца готовят разведением иадо-
садочной жидкости (основного раствора. Для определения содер-
жания аигапвиого вещества в 1 таблетке или капсуле активность 1
мг порошка растертых таблеток или ©одержимого капсул умно-
жают на среднюю массу таблетки или содержимого капсулы, вы-
раженную в миллиграммах.
При исследовании таблеток, покрытых оболочкой, активность
определяют в нескольких растворенных таблетках, количество
которых я растворитель должны быть указаны в частных стать-
ях. Активность, найденную в 1 мл основного раствора, умножают
на его объем и делят на количество растворенных в этом объеме
таблеток (И].
10.3. АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И ИХ
МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
В фармацевтической и химиотерапевтической практиках, свя-
занных с различными методами лечения туберкулеза, необходи-
мо установление точной концентрации действующих лекарствен-
ных начал в препаратах, лекарственных формах, биологическом
материале. Важнейшими физическими методами количественной
оценки лекарств является фотометрия, флуориметрия, спектро-
фотометрия, интерферометрия.
Значительное внимание в новых разработках уделено спосо-
бам количественного определения важнейшего в лечебной прак-
тике туберкулостатика — изониазида (ГИНК). Используются раз-
личные методы определения ГИНК [27]. Для спектрофотометри-
ческой оценки концентрации ГИНК применяется способ, осно-
ванный на образовании окрашенного продукта при взаимодействии
лекарства с хлородоном. Расчет концентрации ГИНК осуществ-
356
ля ют по максимуму евет©пЕиглишц1ежийя шраа 598—60® ши. Методы,
предусматривающий» истоо:т1и,-жв»аа1И[ии>' окрадшвенных аналогов изожи-
азяда дал спектрофотометрического аяишиза, представлены на при-
мерах ковшплежссж ГИНК с дихладвим (1^^ 475 mi) или вариант
того же компшекеа в щрисутеткви гидроксида аммония (1шах 640
нм). Для той же цели используется продукт взаимодействия ГИНК
с 2,3,5-трифеяилпгетразслием и салями теллура. Предложены спо-
собы, основанные на применении окрашенных аналогов ГИНК с
гидроксиламином фенилсалицилата, диметиламинобензальдеги-
дом, тетрацианоэтиленом. Проводят спектрофотометрирование
ГИНК в 0,1 н. растворе хлористого водорода (300 нм) и других
растворителях. Для определения изониазида в моче используется
реакция образования окрашенного продукта с 2,4,6-трииитробен-
золсульфоновой кислотой. Известен способ определения ГИНК в
плазме и сыворотке крови, основанный на образовании окрашен-
ного продукта с транскоричным альдегидом [27]. Предложен ме-
тод оценки концентрации ГИНК в присутствии натрия пара-ами-
носалицилата (Na-ПАСК) и витамина В6 путем измерения макси-
мума поглощения (610 нм) для окрашенного соединения ГИНК с
2,3-дихлор-1,4-нафтохиноном [40].
Для определения концентрации ГИНК и ПАСК в таблетках с
погрешностью 0,1—0,2 % применяют спектрофотометрическое из-
мерение окрашенных комплексов — продуктов гидролиза этих
лекарств с н-Ы-метилбензохинонимином [57]. Для тех же лекарств
в составе различных лекарственных форм используют окрашен-
ные комплексы с окисленной формой нитропруссида Na (546 нм)
[54]. Отмечена высокая чувствительность метода измерения кон-
центрации ГИНК для красителя, образующегося при обработке
лекарства толиллитнйпиразолоном (550 нм) [18]. ГИНК, фтива-
зид и салюзид определяют спектрофотометрически в видимой об-
ласти соответствующих производных 2-нитроиндандиона-1,3 [14].
Находит применение модификационный метод определения ГИНК
в присутствии технологических примесей типа гидразина. Метод
основан на различном характере поглощения комплексов компо-
нентов смеси с 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном, полосы погло-
щения соответственно 510—540 нм [13].
Фотометрические методы также предусматривают использова-
ние окрашенных продуктов лекарств ГИНК с различными соеди-
нениями :1,4-нафтохиноном, 7-хлор-4-нитробензокса-2-диазолом-
1,3, пирокатехином, 9-хлоракридином, гидрокортизоном и дру-
гими. Известны способы, основанные на образовании окрашен-
ных продуктов с анионными комплексами хрома, хлорамином Т.
Для определения ГИНК в крови предложен метод фотометриче-
357
ской оценки концентрации комплекса лекарства с хлординитро-
бензолом. ГИНК в присутствии продуктов его обмена может быть
определен после его реакции с 2,4,6-тринитробензосульфокисло-
той или с 1-фтор-2,4-динитробензолом. Применяется микрометод
определения изониазида в крови, моче, мокроте [27]. Перспек-
тивными являются фотометрические методы определения ГИНК,
фтивазида путем предварительного образования на основе лекар-
ства полиметиновых красителей с применением ДМСО [3, 4, 49],
а также с использованием окрашенных комплексов с пикратами
никеля и меди [38].
Флуориметрия применяется для определения ГИНК в сыво-
ротке крови в виде цинкокомплексного соединения его гидра-
зона с пентан-2,4-дионом [27]. В практике находит примене-
ние разновидность методов с использованием салицилового аль-
дегида для связывания ГИНК. В числе электрохимических ме-
тодов, использующихся для определения концентрации ГИНК,
применяются переменнотоковая полярография, кондуктомет-
рическое, кулонометрическое и амперометрическое титрование
[27].
Эффективны хроматографические способы разделения и коли-
чественного определения лекарств. Тонкослойная хроматография
применена для совместного определения ГИНК и ПАСК: носите-
ли — оксид алюминия, силикагель, а также для количественного
обнаружения ГИНК в моче и других биологических средах. Бу-
мажная хроматография используется для оценки концентрации
ГИНК в лекарственных смесях и смесях с его метаболитами в
биологическом материале. Методы жидкостной хроматографии ре-
комендованы для определения ГИНК и его метаболитов в биоло-
гических объектах [27, 33, 39, 42, 52, 62].
Достаточно широко используются объемные методы анализа
лекарств в их формах. Количественная оценка содержания ГИНК
осуществляется броматометрическим, ванадатометрическим тит-
рованием, а также йодометрическим, йодхлорметрическим и це-
риметрическим способами. ГИНК в присутствии Na-ПАСК может
быть определен комплексиметрическим способом с помощью йод-
висмутата калия. Примером оксидиметрического способа опреде-
ления ГИНК является действие раствора бихромата калия на оп-
ределяемый объект с оттитровыванием избытка раствором соли
Мора. Гравиметрический метод определения ГИНК в виде его фос-
фовольфрамата описан и рекомендован для применения [27]. Окис-
лительный вариант при определении концентрации ГИНК в не-
которых случаях применяется с использованием N-бромсукцини-
мида [56].
358
Спектрофотометрические методы определения этамбутола ос-
нованы на способности образования окрашенных продуктов этого
препарата с Ni2+, Со2+, Си2+ в щелочной среде (Хшах 480 нм) [35,
45]. Для этой цели используются также комплексы этого лекар-
ства с дихлорфенолиндофеноном (640 нм) и пикриновой кислотой
(430 нм) [51].
Фотометрический метод применяется для определения концент-
рации этионамида в виде растворимого в воде комплекса с РЬг* [60].
Хроматографические способы анализа различных противотубер-
кулезных средств и их метаболитов предусматривают использова-
ние, в основном, методов высокоэффективной жидкостной хрома-
тографии [37, 43, 47, 48, 53, 55, 58]. Разработан способ количе-
ственного определения пиразинамида в сыворотке крови высоко-
эффективной жидкостной хроматографией с расчетом содержания
препарата по хроматограмме [28]. Широко применяется методика
для экспрессного метода определения концентрации пиразинами-
да в плазме крови, используемого в комбинации с рифампицином.
В качестве элюента применяют смесь бензол—спирт. Детектирова-
ние осуществляют по поглощению при 269 нм. Этот метод надежен
в диапазоне концентраций пиразинамида 1—50 мг/л [44].
Определение изониазида в моче проводилось модифицирован-
ными Л. И. Гребенником химическими методами Kelly и Poet для
количественного обнаружения гидразинсодержащих веществ и
Wollenberg — для исследования активной и ацетилированной
фракции изониазида (прямое определение в пробе).
В зависимости от количества активного изониазида, выделивше-
гося с мочой за 24 ч (среднее результатов двух определений) по отно-
шению к принятой дозе, все больные были разделены на три группы
по степени инактивации. К сильным инактиваторам препарата были
отнесены больные, выделившие с мочой от 0 до 10 % активного
изониазида, к средним — от 11 до 15 %, к слабым — свыше 16 %.
Как уже указывалось, ацетилированный изониазид в биологи-
ческих жидкостях очень часто определяют расчетным путем (по
разности между суммой всех гидразинсодержащих веществ и ко-
личеством свободного изониазида), получая при этом завышен-
ные цифры за счет гидразинсодержащих продуктов распада; в
данном случае количество выделенного ацетилированного изони-
азида определялось аналитическим путем.
Определение гидразинсодержащих веществ, активного (свободного) и
ацетилированного изониазида в моче
Техника обработки мочи в лаборатории. Поступившая для
исследования моча, которая при сборе консервируется в H2SO4,
измеряется и количество ее доводится дистиллированной водой
359
до 1000,0 или 2000,0 мл (в зависимости от диуреза). Разведенная
таким образом моча отливается в пробирки и может храниться в
холодильнике до проведения определения в течение недели.
Техника приготовления разведений мочи. По 5 мл разбавлен-
ной мочи наливают в 2 пробирки. В одну пробирку (а) добавляют
0,5 мл 10 н. H2S04 и помещают ее на 30 мин в кипящую водяную
баню для гидролиза, затем охлаждают и нейтрализуют содержи-
мое, добавляя Юн. NaOH с таким расчетом, чтобы реакция оста-
лась кислой, и доводят водой до 25 мл. К моче, не подвергавшей-
ся гидролизу — пробирка (б) — прибавляют 20 мл воды.
Разведенная гидролизованная моча из пробирки (а) использу-
ется для определения ацетилированного изониазида, а моча из
пробирки (б) — для определения активного изониазида и гидра-
зинсодержащих веществ.
А. Определение гидразинсодержащих веществ методом
Kelly я Poet в модификации Л. И. Гребенника
Принцип метода. Продукты превращения изониазида при на-
гревании в кислой среде дают с пара-диметиламинобензальдеги-
дом желтое окрашивание, интенсивность которого измеряется с
помощью спектрофотометра или универсального фотометра. Оп-
ределяется сумма продуктов превращения изониазида вместе с
фоном. Затем величина фона определяется расчетным путем.
Техника определения. Из пробирки (б), в которой содержится
разведенная моча, не подвергавшаяся гидролизу, берут 0,5 мл
раствора, добавляют 5,5 мл воды, 2 мл 50 %-ной НС1 и 2 мл
5 %-ного раствора пара-диметиламинобензальдегида (0,55 г пара-
диметиламииобензальдегида растворяют в 10 мл 95 % -ного спир-
та и прибавляют 1 мл концентрированной НС1), хорошо переме-
шивают и ставят в кипящую водяную баню на 1 ч. После охлаж-
дения доводят объем до 10 мл 0,1 н. НС1 и колориметрируют не
ранее чем через час в течение дня на спектрофотометре прн дли-
нах волн 430 нм и 470 нм — на универсальном фотометре при
светофильтрах № 7, 8 против контроля (пробы, приготовленной
аналогичным образом, но с использованием воды вместо мочи).
Стандарт готовится следующим образом: 1 мл стандартного ра-
створа изониазида (20 мкг) доводится в пробирке водой до 6 мл.
Дальнейшее определение в стандартной пробе проводится так же,
как и в моче.
Расчет ведут по расчетному коэффициенту с учетом всех разве-
дений- Величина фона определяется расчетным путем по разно-
сти показаний спектрофотометра при длинах волн 430 и 470 нм
или универсального фотометра при светофильтрах № 7, 8.
360
Изониазид и продукты ого рпсппда образуют и организме с пара
диметиламинобепиппьдегндом окрашенные соединения с одина-
ковым светоноглощвиием при длинах волн 430 и 470 нм. Пигмен-
ты и другие состапные части мочи дают при 430 нм (универсаль-
ный фотометр фильтр № 8) величины светоиоглощения в 5±1 раз
больше, чем при 470 нм (светофильтр № 7). Величину, получен-
ную после деления показаний спектрофотометра при 430 нм (све-
тофильтр № 8) на показатель при 470 нм (фильтр № 7), можно
принять за постоянную (К) и тогда фон рассчитывают по форму-
ле:
фон = (Et-E’)/(K-1),
где Ер Е2 — показания спектрофотометра при длине волны соот-
ветственно 430 и 470 нм при исследовании пробы.
Значение К устанавливается экспериментально для каждого
спектрофотометра путем выведения средней величины из 5—15
анализов мочи людей до получения препаратов; I — поправка на
величину светопоглощения за счет фона.
Сумму гидразинсодержащих веществ в пробе рассчитывают по
формуле:
[(Е2-Ф)-25 1000 С]/5 0,5-1000,
где Е2 — показатель спектрофотометра при длине волны 470 нм
при анализе испытуемой пробы; Ф — фон; С — цена деления
(скольким мкг изониазида равно 1 деление на шкале спектрофо-
тометра), 5 — количество мл мочи, взятое для разведения; 0,5 —
количество мл мочи, взятое для колориметрии; 25 — объем в мл,
до которого доведена моча при разведении; 1000 — объем, до ко-
торого доведено суточное или полусуточное количество мочи. Для
перевода мкг в мг полученное число делится на 1000.
Б. Определение активного изониазида методом Валленберга
в модификации Л. И. Гребенника
Принцип определения. Свободный изониазид и его активные про-
изводные (гидразоны ot-кетокислот) образуют в кислой среде с вана-
диевокислым аммонием цветное комплексное соединение, интенсив-
ность окраски которого измеряется на фотоэлектроколориметре.
Техника определения. Из пробирки (б), в которой содержится
разведенная моча, не подвергавшаяся гидролизу, берут в две про-
бирки по 2 мл раствора ванадиевокислого аммония, в другую про-
бирку — 6 мл воды и 2 мл 0,2 н. раствора H2SO4 (в этой пробе
определяют фон). Интенсивность полученного окрашивания из-
меряют на фотоэлектроколориметре при синем светофильтре; проба
с ванадиевокислым аммонием измеряется через 50—60 с.
361
Для приготовления стандарта в 2 пробирки берется по 2 мл
стандартного раствора, содержащего в 1 мл 20 мкг изониазида.
Дальнейшее определение в стандартной пробе проводится так же,
как и в моче.
В. Определение ацетилированного изониазида на основе
реакции Валленберга в модификации Л. И. Гребенника
Принцип метода. В исследуемом материале определяют коли-
чество свободного изониазида после гидролиза.
Количество ацетилированного изониазида вычисляют по раз-
ности между свободным изониазидом в гидролизованной и негид-
ролизованной моче (определение см. выше).
Техника определения. Из разведенной гидролизованной мочи
берут в две пробирки по 2 мл раствора. В одну пробирку добавля-
ют 6 мл воды и 2 мл раствора ванадиевокислого аммония, в дру-
гую пробирку — 6 мл воды и 2 мл 0,2 н. HgSC^ (в этой пробирке
определяют фон). Условия колориметрии те же, что и при опре-
делении активной фракции изониазида.
Стандарт. Из пробирки (а), в которой содержится гидролизо-
ванный стандартный раствор изониазида (в 1 мл 20 мкг), в две
пробирки отбирают по 2 мл. Дальнейшее определение в стандарт-
ной пробе проводится так же, как и в моче (см. выше).
Контроль на реактивы. В две пробирки наливают по 8 мл
воды, в одну из них добавляют 2 мл ванадиевокислого аммония, в
другую — 2 мл 0,2 н. раствора HgSO4. Условия колориметрии те
же, что и для опытной пробы. Контроль один и тот же для актив-
ного и ацетилированного изониазида.
Расчет активного изониазида. Контроль на реактивы (К) оп-
ределяют по формуле
контроль на реактивы = Ев - Ек,
где Ев — показатель колориметрии контроля с ванадиевым реакти-
вом; Ек — показатель колориметрии контроля с серной кислотой.
Экстинкцию пробы (Епр) рассчитывают по формуле
Еп₽ = Ев - Ек - К-
где Eg — экстинкция пробы с ванадием; Ед — экстинкция пробы
с серной кислотой, К — контроль на реактивы (расчет см. выше).
Количество активного изониазида в пробе рассчитывается сле-
дующим образом:
Хи = EIipKi 25 1000/2 5 100Q,
где К4 — цена деления; 25 — объем в мл, до которого доведена
моча при разведении; 1000 — объем в мл, до которого доведено
362
суточное или полусуточное количество мочи; 2 — количество ра-
створа в мл, взятого для колориметрии; 5 — количество мочи в
мл, взятое для разведения (для перевода мкг в мг полученное
число делится на 1000).
Нахождение цены деления (К4):
Ев - Ек - К = 40 мкг,
где Ев — экстинкция стандарта с ванадием; Ек — экстинкция
стандарта с H2SO4; К — контроль на реактивы:
К,=40/(Ев-Ек-К).
Расчет ацетилированного изониазида (проба после гидроли-
за). Контроль на реактивы тот же, что и при определении актив-
ного изониазида (расчет см. выше).
Экстинкция пробы (Епр)
Е,|р = Ев — Eh — К,
где Ев — экстинкция пробы с ванадием, Ек — экстинкция пробы
с серной кислотой, К — контроль на реактивы. Количество ак-
тивного изониазида в пробе после гидролиза:
X„ = (Е„р К, 25 1 000 Р) /2 5 1 000.
В связи с тем, что при кислотном гидролизе изониазид частич-
но расщепляется с образованием свободного гидразина и изони-
котиновой кислоты, полученные результаты необходимо умножить
на поправку, найденную экспериментальным путем (Р).
P = (EB-EJ/(E|B-E,J,
где Р — поправка, Ев — показатель преломления колориметрии
стандарта с ванадием без гидролиза; Ек — показатель преломле-
ния колориметрии стандарта с серной кислотой без гидролиза;
Е1в и Е1к — соответственно стандарт с ванадием и кислотой после
гидролиза.
В результате расчета по формуле получают количество свобод-
ного изониазида в гидролизованной моче. Вычитая из этой вели-
чины количество свободного изониазида в моче, не подвергавшейся
гидролизу, получают количество ацетилированного препарата.
Определение активного изониазида в сыворотке крови
методом Валленберга
К 2 мл сыворотки крови добавляют 1 мл 30 % -ного раствора
трихлоруксусной кислоты и 1 мл воды. Пробы центрифугируют и
2 мл центрифугата переносят в мерные пробирки, подщелачива-
ют по фенолфталеину 10 %-ным раствором гидроксида натрия, а
затем подкисляют 1 н. H2SO4 до исчезновения окрашивания. Объем
пробы снова доводят до 4 мл водой, прибавляют 2 мл ванадата
363
аммония и через 1 мин спектрофотометрируют при 400 им. Для
построения калибровочной кривой используют растворы кристал-
лического изониазида (от 1 до 40 мкг в пробе) в сыворотке здоро-
вых доноров. Оптическим контролем служат пробы, содержащие
только химические реактивы. На определение изониазида описы-
ваемым методам не влияет присутствие в кражи витаминов В,, В6,
В12> С, а также гепарина, АТФ, АКТГ в дозах, принимаемых в
клинике [32].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аксенова Э.К., Андрианова О.П., Арзамас-
цев А.П. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтичес-
кой химии/ Под ред. А.П. Арзамасцева. М., 1995. 318 с.
2. Бахшиев Н.Г. Введение в молекулярную спектроскопию. Л.,
1987. 214 с.
3. Бейсенбеков А.О. и др. // Актуальные проблемы фарма-
ции. Алма-Ата, 1991. С. 10—15.
4. Бейсенбеков А.С. н др. // Повышение качества лекар-
ственной помощи амбулаторным и стационарным больным на основе
ускорения научно-технического прогресса в свете решений 27-го съезда
КПСС: Тез. дайся. 4-го Веесоша. съезда фармацевтов, 18—20 ноября, 1986.
Казань, 1986. С. 326—327.
5. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия: В 2 ч. М., 1993. Ч. 1.
432 е.-, 4. 2. 608 с.
б. Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул/ Пер. с
англ. М., 1963. 286 с.
7. Бхакка Н., Уильямс Д. Применение ЯМР в органической
химии: Примеры из химии стероидов. М., 1966. 244 с.
8. Васильев В.П. Аналитическая химия: В 2 ч. М., 1989. Ч. 1.
319 с.; Ч. 2. 383 с.
9. Государственная фармакопея СССР. 10-е изд. М., 1968. 1079 с.
10. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1987. Вып. 1.
334 с.
11. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1990. Вып. 2.
397 с.
12. Гребенник Л.И. // Проблемы туберкулеза. 1965. № 7. С. 79.
13. Евгеньев М.И. и др.//Хим. фарм. журн. 1991. Т. 25, № 10.
С. 80—82.
14. Зоря Б.П. и др. Рук. Деп. в ВИНИТИ 07.09.90. №4928 —
В90. РЖФ. 1991. № 1—77.583 Деп.
15. Карташов В.С.// Хим. фарм. журн. 1996. № 5. С. 59.
16. Карташов В.С., Шоршнев С.В., Арзамасцев А.П.
// Хим. фарм. журн. 1992. Т. 26, № 5. С. 86.
17. Карташов В.С., Шоршнев С.В., Арзамасцев А. П.
и др. // Фармация. 1994. № 6. С. 35.
18. Келимханова С.Е., Анистратенко Н.А. // Совре-
менные проблемы фармации. Алма-Ата, 1989. С. 36—41.
19. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография: В 2 т. М., 1981.
Т. 1. 616 с.; Т. 2. 527 с.
20. Климова В. А. Основные микрометоды анализа органических
соединений. М., 1967. 208 с.
21. Кулешова М.И., Гусева Л.Н., Сив ицкая О. К. Анализ
лекарственных форм, изготовляемых в аптеках. М., 1989. 287 с.
22. Лабораторные работы по фармацевтической химии: В 2 ч./ В. Г. Бе-
ликов, Е. Н. Вергейчик, В. Е. Годецкий и др. М., 1993. Ч. 1. 432 с.;
Ч. 2. М., 1996. 608 с.
365
23. Листов С.А., Арзамасцев А.П., Сахатов Э.С. Эле-
ментный анализ лекарственных средств. Ашхабад, 1990. 145 с.
24. Методы анализа лекарств / Н. П. Максютина, Ф. Е. Каган,
Л. А. Кириченко и др. Киев, 1984. 222 с.
25. Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органичес-
ких соединений / Пер. с англ. М-, 1965. 216 с.
26. Погодина Л.И. Анализ многокомпонентных лекарственных
форм. Минск, 1985. 240 с.
27. Свинчук В. С. и др .//Фармация. 1990. Т. 39, № 2. С. 87—
90.
28. Способ определения пиразинамида в сыворотке крови.
А. с. 1767427 РФ. А. И. Сливкин, В. В. Онищенко // БИ. 1992. №37.
С. 164.
29. Справочник провизора-аналитика / Д. С. Волох, Н. П. Максюти-
на, Л. А. Кириченко и др. Киев, 1989. 198 с.
30. Титриметрические методы анализа неводных растворов /
В. Д. Безуглый, Т. А. Худякова, А. М. Шкодин и др. М., 1986. 382 с.
31. Хахенберг X., Шмидт А. Газохроматографический ана-
лиз равновесной паровой фазы. М., 1979. 160 с.
32. Шендерова Р.И.// Лабораторное дело. 1975. №2. С. 114.
33. Altomare Cosimo et al.//Farmaco, 1990. Vol. 45, № 11.
P. 1229—1236.
34. Bajaj R. et al. // J. Indian Chem. Soc. 1991. Vol. 68, №9.
P. 534—535.
35. Bhattacharyya R.G., Paul U.K.// Ind. Pharm. 1981.
Vol. 83, № 6. P. 219—221.
36. Bisnofberger K., Bull J.R., Chalmers A.A. //Magn.
Reson. Chem. 1987. Vol. 25, № 9. P. 780—783.
37. Blessington B. et al.//Chirality. 1991. Vol. 3, № 2. P. 139—
144.
38. Brittan H.G.//J. Pharm. Scienc. 1997. Vol. 86, № 4. P. 405.
39. Chiang Hung-Chen, Lin Long-Jun //J. Chem. Soc. 1978.
Vol. 25, № 3. P. 125—130.
40. Devani M.B. et al.// Indian J. Pharm. Sci. 1980. Vol. 42,
№6. P. 179—181.
41. Florey K. // Anal. Profil. Drug Subst. New York, 1975. Vol. 4.
P. 452—465.
42. Gaitonde Chandreshekhar D., Pathak Prita V.//Drug.
Dev. and Ind. Pharm. 1991. Vol. 17, № 19. P. 1201—1214.
43. Garberini G. et al.// Atti Soc. nature mat. Modena. 1984.
Vol. 115. P. 15—23.
44. Guermouche Moulay-Hassane //J. Planar. Chromatogr.
1991. Vol. 4, № 2. P. 166—167.
45. Hassan Saad S.M., Shalaby Abdalla // Microm. Acta.
1992. Vol. 4, № 5—6. P. 193—199.
46. Hayamizu K., Ishii T., Yanagisaswa M., KamoO. //
Magn. Reson. Chem. 1990. Vol. 28, № 3. P. 250—256.
366
47. Holdiness Mack R. // J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1!)85.
Vol. 340. P. 321—359.
48. HRLG Pharm. and Biochem. Heidelberg, 1990. P. 153 —154.
49. Issopoulos Prodromas В.//ActaPharm. Hung. 1991. Vol. 61,
№ 4. P. 198—204.
50. Kouadio L., Bernard P. Sabot J. F. et a I. //Sterohlu.
1988. Vol. 51, № 3—4. P. 363—384.
51. Mahrous Mohamed El-Sayed // Anal. Lett, 1992. Vol. 2b,
№ 2. P. 269—280.
52. Mandal P.S. et al. // Indian J. Pharm. Sri. 1986. Vol. 18,
№6. P. 183—185.
53. Orkirimil S. et al. //Sci. pharm. 1989. Vol. 57, .N" I. P. 15
51.
54. Prakash A. et al. //Acta chim. Hung. (ex. Acta clum. Acaml.
Sci. Hung.). 1983. Vol. 112, № 1. P. 21—25.
55. Rose U . et al. // J. pharm. belg. 1992. Vol. 47, .№ 3. P. 2 I к
56. Sa rwa r M . e t al. // Anal. Lett. 1989. Vol. 22, № 4. P. 853 -
860.
57. Sastry C.S. et al.//Indian J. Pharm. Sci. 1981. Vol. 43, № 3.
P. 118—120.
58. Sen A.K. et al. // J. Indian. Chem. Soc. 1990. Vol. 67, № 5.
P. 443—474.
59. Shan Yateen et al.// Drug. Der. and Ind. Pharm. 1992.
Vol. 18, № 14. P. 1589—1596.
60. Sikorska-Tomiska N . // Fresenius Z. and Chem. 1982. Vol. 312,
№ 4. P. 353.
61. Two-dimensional NMR Spectroscopy: Application for Chemists and
Biochemists II Ed. W.R. Croasmun, R.M.K. Carlson. New York, 1987.
P. 187—424.
62. Sassen W. von et al.//J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1985.
Vol. 338, № 1. P. 113—122.
Учебное издание
Слнвкин Алексей Иванович,
Селеменев Владимир Федорович,
Суховерхова Евгения Анатольевна
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Редактор В. В. Пушкаренко
Художественный редактор Л. А. Клочков
Электронная верстка К. П. Ленского
Корректор Г. И. Старухина
ИБ 2537
ЛР 040088 от 24.03.97. Подп. в печ. 10.12.99.
Форм. бум. 60x90/16. Бумага офсетная № 1.
Офсетная печать. Усл. п.л. 23,0. Уч.-изд. л. 23,6.
Тираж 1500. Заказ 3547.
Издательство Воронежского государственного университета
394000 Воронеж, ул. Ф. Энгельса, 8
Издательско-полиграфическая фирма “Воронеж”
394000 Воронеж, пр. Революции, 39