/
Текст
СОДЕРЖАНИЕ
От автора........................................... 7
Введение .............................................. 11
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света......12
1.1. Принципиальная схема построения микроскопа........12
1.2. Оптическая схема микроскопа.......................15
1.3. Механическая схема микроскопа.....................17
1.4. Оптика микроскопа.................................20
1.5. Электронная часть микроскопа......................21
Глава 2 Механические узлы микроскопа.....................24
2.1. Предметный столик.................................24
2.2. Фокусировочный механизм: грубая и точная фокусировка... 30
2.3. Узел крепления объективов: револьверное устройство.32
2.4. Узел крепления и перемещения конденсора...........34
Глава 3 Объективы микроскопадля медико-биологических
исследований.............................................36
3.1. Классификация объективов..........................38
3.2. Объективы для различных методов исследования
и контрастирования................................44
3.3. Иммерсионные объективы............................45
3.4. Маркировка на корпусе и ... стоимость объективов...47
Глава 4 Осветительные системы микроскопов.................50
4.1. Осветительная система микроскопа..................50
4.2. Типы осветительных систем.........................51
4.3. Классификация конденсоров.........................55
Глава 5 Системы визуализации........................... .62
5.1. Классификация визуальных насадок..................62
5.2. Классификация окуляров............................66
Глава 6 Как выбрать микроскоп............................69
6.1. Классификация микроскопов для медико-биологических
исследований......................................69
6.2. Классификация микроскопов по сложности конструкции
и соотношению «цена-качество».....................76
3
6.3. Основные требования к микроскопам для практической
медицины................................................84
6.4. Выбор микроскопа для решения медико-биологических
задач в КДЛ.............................................86
6.5. Основные признаки последнего поколения микроскопов .... 90
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света.
Методы исследования и контрастирования...................95
7.1. Метод светлого поля. Настройка освещения по Келеру.95
7.2. Метод темного поля. Настройка микроскопа для работы
по методу темного поля.............................. 100
7.3. Метод фазового контраста. Настройка микроскопа
для работы по методу фазового контраста...............103
7.4. Метод варел-контраста (VAREL-contrast)...........107
7.5. Поляризованный свет..............................108
7.6. Метод дифференциально-интерференционного контраста
(ДИК).................................................109
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света ... 110
8.1. Особенности конструкции инвертированных микроскопов
проходящего света.................................ПО
8.2. Методы контрастирования в инвертированных
микроскопах проходящего света....................116
8.3. Методы рельефного контраста......................121
8.4. Метод Cell Observer..............................129
8.5. Метод P.A.L.M.............'......................130
Глава 9 Люминесцентные микроскопы.................. 132
9.1. Основные принципы. Практика применения...........132
9.2. Особенность конструкции люминесцентных микроскопов.. 135
9.3. Внимание: люминесценция..........................143
9.4. Новые методики люминесцентной микроскопии........146
Глава 10 Поляризационные микроскопы
для медико-биологических исследований................. 151
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы
для медико-биологических исследований................. 155
11.1. Особенности систем АСМ..........................155
11.2. Классификация АСМ. Параметрический ряд..........160
Глава 12 Стереоскопические микроскопы ..................168
12.1. Особенности стереоскопических микроскопов.......168
12.2. Классификация стереоскопических микроскопов.....173
4
12.3. Методы исследований на стереоскопических микроскопах . 179
12.4. Стереомикроскопы нового поколения.
Цифровые стереомикроскопы.........................181
12.5. Особенность настройки и работы на стереомикроскопах... 185
Глава 13 Системы анализа изображения
для медико-биологических исследований................. 188
13.1. Классификация систем анализа изображения.........188
13.2. Основные элементы аппаратно-программного комплекса... 191
13.3. Сшивка изображения, расширенный фокус,
ЗВ-реконсрукция.......................................202
13.4. Телеконференция. Телемедицина (телепатология)....203
13.5. Внимание: анализаторы изображения................207
Глава 14 Стандарты микроскопии......................... 209
Глава 15 Уход за микроскопом........................... 220
15.1. Правила ухода за микроскопом.....................220
15.2. Чистка оптики микроскопа.........................222
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги ...........229
16.1. Вопросы о том, что и как мы видим................230
16.2. Вопросы об объективах............................245
16.3. Вопросы о методах исследования и контрастирования.248
16.4. Вопрос о визуальной насадке......................257
16.5. Вопрос об имерении и счете.......................260
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта.............. 267
17.1. Основные термины и определения...................267
17.2. Геометрия построения изображения линзовыми системами... 268
17.3. Зеркала и зеркальные поверхности.................269
17.4. Основные законы геометрической оптики............270
17.5. Теория образования изображения...................271
17.6. Микроскоп от «А» до «Я»..........................273
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности........322
18.1. Осветители.......................................322
18.2. Насадки..........................................326
18.3. Устройства для реализации методов контрастирования .... 327
18.4. Измерение и счет.................................329
18.5. Микроскопы.......................................330
Послесловие: Историческое эссе......................... 341
5
Приложения
Приложение 1. Использование флюоресцентной микроскопии
для выявления антинуклеарных аутоантител на перевиваемой
клеточной линии НЕр-2....................................359
Приложение 2. Изучение механизмов эволюции хромосом......363
Приложение 3. Практика применения микроскопов для определения
свойств и характеристик объектов. Люминесцентная микроскопия.... 365
Приложение 4. Практическое применение метода поляризационной
микроскопии при диагностике микрокристаллических артритов.... 368
Приложение 5. Конфокальная микроскопия: мифы и реальность.... 370
Приложение 6. Использование стереоскопического микроскопа
в косметологии..........................................376
Приложение 7. Применение стереоскопического микроскопа
в средней школе на уроках биологии. По результатам апробации
стереомикроскопа МБС 10.................................378
Приложение 8. Стандарты микроскопии: сводная таблица....380
Международные стандарты ISO, DIN........................384
Приложение 9. Основные формулы и таблицы микроскопии
для биологических микроскопов...........................387
Литература............................................ 403
6
Дорогим моим родителям,
детям и внукам посвящается
ОТ АВТОРА
Более 20 лет качество изображения в микроскопах, техно-
логия изготовления и сборки оптики микроскопа были для ме-
ня предметом изучения и практического исследования.
Последние 10 лет стали периодом осмысления понятия
«функционально-стоимостной анализ» микроскопов с точки
зрения значимости каждого функционального узла микро-
скопа для пользователя разного уровня знаний и его плате-
жеспособности.
Выявились сложности внедрения микроскопов нового по-
коления, связанные не только с естественно возросшей стои-
мостью, но и с психологией пользователя, а также с измене-
нием отношения пользователя к самому микроскопу.
Стало ясно, что переход к освоению нового поколения
микроскопов связан, прежде всего, со знанием основных
принципов микроскопии. Наибольшую сложность вызывают
новые методы исследования и контрастирования, что объ-
ясняется отсутствием методических разработок и опыта
внедрения в той или иной области. Кроме того, определен-
ные трудности вызывают объяснения, связанные с влиянием
на качество изображения конкретного объекта и вида иссле-
дования, а также психологическая зависимость от совершен-
но неправильных мнений, таких как: «Микроскоп — вечный
7
оптический прибор», «Какая разница, какой фирмы микро-
скоп? Он же все равно показывает».
Как сложно, порой, придти на помощь врачу-лаборанту
для создания доказательной базы при покупке микроскопов
по соотношению «цена — качество», зная сложнейшую задачу,
решаемую в лаборатории.
Как доказать тем, кто отвечает за закупку, что последнее
слово в каждой технологической цепочке лечения в больни-
це и клинике — за врачом-лаборантом, в течение 6 часов про-
сматривающим 200 и более предметных стекол во вред свое-
му здоровью? Результат этой работы неоценим, прежде всего,
для жизнедеятельности больного.
Значимость работы врача-лаборанта, сидящего за микро-
скопом, не уступает значимости врача-лаборанта, работающего
с дорогостоящими анализаторами. Следовательно, и микроскоп
должен требовать к себе подобного «трепетного» отношения.
Идет 2006год. Изменились мы, изменилось и время. Смес-
тились приоритеты, но неизменным остался микромир, и, со-
ответственно, желание, потребность и необходимость в мик-
роскопических исследованиях.
На российский рынок в настоящее время поставляется про-
дукция десятка зарубежных фирм, выпускающих микроскопы.
Сотни фирм-посредников (продавцов) участвуют в тендерах,
всеми правдами и неправдами предлагая продукцию, которая
не всегда соответствует требованию заказчика. В этой книге
мне бы хотелось показать границу допустимого...
Нельзя недооценивать огромного вклада в развитие отечес-
твенной микроскопии ученых, конструкторов, технологов и ра-
бочих ВНЦ ГОИ им. С. И. Вавилова1, ЛИТМО1 2, ЛенЗОС3, ОАО
ЛОМО им. Ленина4, ЛЗОС5, НПЗ6, КОМЗ7, ФОЗ8, БелОМО9.
1 Государственный оптический институт, Санкт-Петребург.
2 Ленинградский институт точной механики и оптики, ныне ИТМО, Санкт-
Петербург.
3 Ленинградский завод оптического стекла им. Ломоносова, Санкт-Пе-
тербург.
4 Ленинградское оптико-механическое объединение, Санкт-Петербург.
5 Лыткаринский завод оптического стекла, г. Лыткарино Московской обл.
6 Новосибирский приборостроительный завод, Новосибирск.
7 Казанский оптико-механический завод, Республика Татарстан, Казань.
8 Феодосийский оптический завод, Украина, Феодосия.
9 Белорусское оптико-механическое объединение, Белоруссия, Минск.
8
Можно без преувеличения сказать, что основатель опти-
ко-механического производства микроскопов механик Карл
Цейсс (1846 г.) и его соратники: Эрнст Аббе, Август Келер
и Отто Шотт, создавшие теорию образования изображения
в микроскопе и заложившие основные принципы построения
технологической цепочки разработки и изготовления опти-
ческих элементов и всего микроскопа в целом, на несколько
веков определили развитие этого направления в науке и тех-
нике. Поэтому законодателями в развитии микроскопии в те-
чение всего времени существования серийного производства
микроскопов являлась фирма Carl ZEISS (Германия).
Для того, чтобы оценить тенденции развития микроскопии
и изменения, происходящие в этом направлении, не будем от-
ступать от принятого в предыдущей книге правила. Однако,
если в первом издании книги «С микроскопом на «ты» боль-
ший акцент был сделан на отечественные микроскопы разра-
ботки 70-х годов, то произошедший за пять лет существенный
скачок в переоснащении медико-биологических лабораторий,
сместил основное внимание на современные микроскопы.
Особенность настоящего издания состоит в том, что здесь
в качестве примера микроскопических изображений приведе-
ны результаты исследований многих известных и неизвестных
миру микроскопистов из России и Украины, из Владивостока
и Иркутска, Вологды и Омска, Москвы и Санкт-Петербур-
га. И не удивляйтесь, если в последней главе «Историческое
эссе» на фотографиях вы увидите себя или своих знакомых.
Спасибо всем вам за желание учить и учиться. Многих
благодарю за информационную поддержку, без которой мне
было бы трудно говорить о новейших достижениях в совре-
менном мире микроскопических исследований, благодарю
за предоставленные фотографии реальных объектов, кото-
рые стали иллюстрациями для данной книги.
Спасибо вам — специалисты высочайшего класса из но-
восибирского Академгородка и мичуринского Наукограда,
представители киевского НАНУ, ученые и исследователи
из Владивостокского ДВО РАН, московские и питерские спе-
циалисты РАН и РАМН, а также увлеченные своей специаль-
ностью представители биофака МГУ.
Я благодарна учителям, определившим мой жизненный
путь. И, прежде всего, к.т.н. Лариной Раисе Михайловне
9
и к.т.н. Агроскину Льву Семеновичу (лаборатория мик-
роскопии оптического отдела ГОИ); благодарна родите-
лям — Владимиру Евгеньевичу и Татьяне Александровне
Алексеевым, отдавшим более 40 лет служению отечествен-
ной оптической промышленности на ЛЗОС и в ГОИ, подде-
ржавших меня на этом сложном пути; благодарна моим де-
тям — Михаилу и Елене, которые так или иначе продолжают
нашу семейную традицию.
Я благодарю специалистов компании Carl ZEISS в Гет-
тенгене, Оберкохоне и Йене, а также руководство фирмы
ООО «Карл Цейсс» в Москве и лично генерального директо-
ра к.п.н. М.С. Игельника и Катрин Штайгнер.
О. В. Егорова,
кандидат технических наук,
член Нью-Йоркской Академии,
Эксперт Гостстандарта РФ
Санкт-Петербург, Россия
10
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в мире существуют четыре ведущие фирмы, спо-
собные определять направление развития микроскопии и достойно
конкурировать друг с другом. Среди них: Carl Zeiss — немецкая фирма,
объединившая в 1990 г. западногерманскую фирму Opton и народное
предприятие Carl Zeiss, Jena, ГДР; Leica — немецкая фирма, включаю-
щая с 90-х годов прошлого века западногерманскую фирму Leitz, авс-
трийскую фирму Reichert, швейцарскую фирму Wild и др.;а также япон-
ские фирмы Nikon и Olympus.
Понятие «ведущая фирма» предполагает наличие следующих основ-
ных признаков:
• способность фирмы к выработке концепции построения нового
поколения микроскопов от расчетно-конструкторской прора-
ботки моделей до создания новой технологии изготовления;
• способность (научно-технологический потенциал) к разработке
новых методов исследования с соответствующей технологией
изготовления и контроля;
• организация производства и серийного выпуска нового поколения
микроскопов различных классов сложности с возможностью пос-
ледующей модернизации в течение жизненного цикла поколения.
Что касается остальных фирм, то они на базе технологий преды-
дущих поколений ведущих фирм только воспроизводят простые мо-
дели и модели среднего класса с частичной модернизацией, приспо-
сабливая их к собственным технологическим условиям. Сегодня это
ярко выражено в продукции китайских фирм. Обычно производство
ведется под контролем специалистов фирм-разработчиков. В этом
случае качество изготовления зависит от переданного оборудования
и «усвоения» технологических навыков.
В бывшем Советском Союзе предприятие ЛОМО являлось ведущей
фирмой с мощной расчетно-конструкторско-технологической базой.
К концу 80-х годов ЛЗОС также сделал попытку встать на путь веду-
щей фирмы, для чего на базе технологии ЛОМО приступил к развитию
конструкторско-расчетного отдела по созданию стереомикроскопов.
Однако времени на переходный период не хватило.
Так что же определяет уровень микроскопа и его класс?
Для того, чтобы ответить на поставленный вопрос, необходимо по-
нять конструкцию и отличительные особенности одного типа микро-
скопа от другого.
11
ГЛАВА 1
ИЗ ЧЕГО СОСТОИТ
МИКРОСКОП ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА
Правильное понимание функций и взаимодействие основных узлов микроскопа позволяют
предотвратить не только неправильный анализ микроскопического изображения и продлить
жизненный цикл микроскопа, но и сохранить свое собственное здоровье.
1.1. ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ СХЕМА ПОСТРОЕНИЯ МИКРОСКОПА
Нам хорошо известны как минимум четыре увеличительных опти-
ческих прибора — положительные очки, лупа, бинокль и микроскоп.
С очками все понятно — одна положительная линза с определенными
радиусами и из соответствующей марки стекла, расположенная на оп-
ределенном расстоянии от зрачка глаза.
С лупой немного сложнее. Расстояния от глаза до лупы и от лупы
до предмета — неопределенны (рис. 1.1). Увеличение меняется в зави-
симости от положения линзового элемента относительно фокуса.
Лупа имеет одноступенчатое увеличение при определенном рассто-
янии, которое рассчитывается по формуле:
Глупы = У7 250,
где ГЛупы — линейное увеличение лупы; (' — фокусное расстояние лупы,
мм; 250 — расстояние наилучшего видения, мм.
Увеличение лупы не бывает
выше 20х, да и это увеличение
является достаточно большим
_ .. для нее. Основными достоинс-
. А Г-Аё. твами лупы при малом увеличе-
. '"‘iZi- нии (ча1Че всего 2-Зх) являют-
ся ее большое поле и большое
рабочее расстояние. Однако
по мере повышения увеличения
Рис 1.1. Лупа на очки. эти параметры уменьшаются.
12
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Рис. 1.2.
Эволюция микроскопа:
а) век Х1Х-Й; 6) ХХ-й век; в) XXI-й век
Микроскоп — это оптический прибор, имеющий как минимум
двухступенчатое увеличение. И одно из них принадлежит окуляру,
который играет роль лупы. Только в отличие от бытовой лупы, оку-
ляр имеет постоянное увеличение, его положение в микроскопе оп-
ределено и жестко закреплено стандартом (высота окуляра).
Любой оптический микроскоп имеет базовые узлы, функцио-
нальное назначение которых не меняется от типа, класса прибо-
ра или страны производителя. Разница только в конструкторском
и технологическом решениях, предложенных специалистами фирм-
разработчиков, а также уровнем мирового научно-технического
прогресса (рис. 1.2). И как бы микроскоп не назывался — световой
микроскоп, видеомикроскоп, фотомикроскоп, цифровой микро-
скоп, лазерный сканирующий микроскоп, анализатор изображе-
ния — в его основе будет базовый световой микроскоп, принцип ко-
торого был разработан еще Левингуком, Ньютоном, Карл Цейссом,
Эрнстом Аббе.
Микроскоп можно представить как оптико-механо-электричес-
кий прибор (рис. 1.3), объединяющий в себе три функциональные
части: воспроизводящую, визуализирующую и осветительную.
13
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Основные задачи оптической части микроскопа связаны с вы-
** поднением следующих функций:
функция воспроизводящей системы — воспроизвести (создать,
сформировать) изображение объекта таким образом, чтобы оно
как можно точнее передавало детали объекта с соответствующим
разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей;
функция визуализирующей системы — передать изображение
объекта, созданное воспроизводящей системой микроскопа, таким
образом, чтобы оно с небольшим дополнительным увеличением
(или без него) было видно достаточно резко на сетчатке глаза, фо-
топленке или пластинке, на экране телевизора или монитора ком-
пьютера;
функция осветительной системы — создать световой поток, поз-
воляющий осветить объект таким образом, чтобы воспроизводящая
система микроскопа предельно точно могла выполнить свою основ-
ную функцию. При этом совместная работа обоих систем должна
обеспечивать визуализацию изображения с использованием физико-
химических свойств объекта.
Нормальную работу микроскопа обеспечивает единая технология
расчета, конструирования, изготовления и сборки оптико-механичес-
кой конструкции всех частей, выполненная в строгом соответствии
с требованиями геометрического (габаритного) и качественного (абер-
рационного) расчета оптической схемы микроскопа в целом и каждого
элемента в отдельности1.
Только в середине XIX века уровень развития математики, физики
и химии позволил механику Карлу Цейсу и его единомышленникам на-
ладить производство и серийный выпуск микроскопов. «Не интуиция,
а строгий расчет», — вот девиз микроскопостроения, который не изме-
нился с течением времени.
Каждый элемент и узел микроскопа решает определенную задачу,
связанную с конечной целью удовлетворения требованиям пользова-
теля. При этом немаловажным является соотношение «цена-качество»,
которое определяет в свою очередь класс прибора.
1 Первым отечественным микроскопом, у которого полностью от источника све-
та до окуляра была рассчитана оптическая схема, стал исследовательский микроскоп
МБИ-15. Расчет был выполнен в ГОИ им. Вавилова С. И. группой под руководством
д. т.н. А.П. Грамматина в 70-х годах XX века. Комплект планапохроматических объек-
тивов серии ОПА к нему был рассчитан д. т. н. Л. Н. Андреевым.
14
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Рис. 1.4.
Принципиальная оптическая
схема микроскопов последнего
поколения с длиной тубуса «бес-
конечность»:
А — микроскоп проходящего света;
Б — микроскоп люминесцентный
отраженного света.
1.2. ОПТИЧЕСКАЯ СХЕМА МИКРОСКОПА
Оптическая схема микроскопа реализует приведенные выше функ-
ции. Рассмотрим более подробно принципиальные оптические схемы
биологического микроскопа — микроскопа проходящего света и мик-
роскопа отраженного света с люминесцентным осветителем (рис. 1.4).
Осветительная система микроскопа проходящего света включает
следующие элементы:
♦ источник света — галогенную лампу с нитью накала определен-
ного габаритного размера1;
1 Размер нити входит в расчет осветительной системы, определяя максимальное линей-
ное поле, которое может быть равномерно освещено. Размер определяется мощностью лампы,
что в свою очередь связано с габаритными размерами основания и теплообмена в нем. Все пе-
речисленные параметры определяют класс микроскопа по соотношению «цена — качества».
15
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
♦ коллектор — оптический элемент, расположенный вблизи ис-
точника света и предназначенный для увеличения размера нити
(светящегося тела), что создает световой поток, «заполняющий»
осветительную апертуру конденсора1 или выходной зрачок объ-
ектива;
♦ конденсор — оптический узел, обеспечивающий необходимый
по размеру1 2 и качеству3 световой поток, а также настройку осве-
щения в соответствии с принципами Келера4.
Между осветительной системой, заканчивающейся конденсором,
и воспроизводящей оптической системой, начинающейся с объектива,
расположена плоскость предмета, на которую устанавливается препа-
рат (объект наблюдения и исследования). Заключительной в оптичес-
кой схеме микроскопа проходящего света является визуализирующая
система, состоящая из тубусной системы, дополнительных оптичес-
ких систем увеличения, так называемой «система Оптовар» (если та-
ковая есть) и окуляров.
Между объективом и окуляром находится плоскость изображе-
ния, расположенная на строго фиксированном расстоянии, определен-
ное понятием «длина тубуса» микроскопа.
Тубусная система — это промежуточная оптическая система, кото-
рая обеспечивает проекцию изображения, создаваемого объективом,
рассчитанным на «бесконечность», в плоскость изображения. Таким
образом, параллельный пучок света, выходящий из объектива, тубус-
ная система «превращает» в сходящийся пучок и обеспечивает форми-
рование изображения для последующей проекции его с помощью оку-
ляра (или адаптера фото-видеосистемы) на сетчатку глаза наблюдателя
(или на матрицу /фотопленку камеры).
В концепции поколения микроскопов 60-х-70-х годов, когда дли-
на тубуса была «конечной» и определенной (160 мм), тубусная система
выполняла роль дополнительной системы увеличения (системы Опто-
вар) и имела увеличение большее или меньшее 1х.
1 Изображение нити лампы проектируется, вписываясь в материальную диафрагму
осветительной системы, полностью открытую апертурную диафрагму конденсора, а также
в материальную диафрагму воспроизводящей системы — выходной зрачок объектива.
2 Световой поток, создаваемый конденсором, обеспечивает как равномерное освеще-
ние поля на предмете, так и световой конус, называемый осветительной числовой аперту-
рой, равный числовой апертуре объектива.
3 В данном случае речь идет об уровне исправления осевых и полевых аберраций осве-
тительной системы.
4 Конденсор как оптический элемент с помощью материальной осветительной апертур-
ной диафрагмы обеспечивает соосность осветительной системы и собственно микроскопа.
16
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Например, в отечественных микроскопах бинокулярная насадка
АУ-12 имела увеличение 1,5 х Ч В новых микроскопах, рассчитанных
на длину тубуса «бесконечность» (маркировка на бинокулярной насад-
ке «оо»), эта система имеет увеличение 1х.
Все, приведенное выше, касалось оптической схемы микроскопа
проходящего света. Чем же отличается оптическая схема люминесцен-
тного микроскопа?
В современных люминесцентных микроскопах происходит совме-
щение обеих оптических осветительных систем — проходящего света
и отраженного света. Последнее относится к оптической схеме люми-
несцентной осветительной системы (системе отраженного света), где
роль конденсора выполняет объектив. Через объектив проходит све-
товой поток, освещающий препарат, и с помощью того же объектива
строится изображение препарата.
13. МЕХАНИЧЕСКАЯ СХЕМА МИКРОСКОПА
Все механические части микроскопа должны обеспечивать точность
перемещения и позиционирования подвижных узлов, а также точность
центрировки и установки расстояний между оптическими элементами
микроскопа.
Современный микроскоп проходящего света, как и его собрат XVII
века, включает следующие составные механические части: штатив и ме-
ханические узлы, которые обеспечивают крепление и передвижение
оптических элементов.
На рис. 1.5. представлена конструкция современного микроскопа
проходящего света, а на рис. 1.6. — принципиальная схема расположе-
ния элементов механической части микроскопа.
Схема включает:
1. основание (1), на которое крепится весь микроскоп. При этом
в него может быть встроен осветитель проходящего света вместе с ис-
точника света и блоком питания;
2. тубусодержатель1 2 (2), на котором устанавливаются (сверху вниз):
• узел крепления визуальной насадки (3) с механизмом раздвиж-
ки по глазной базе наблюдателя вместе с окулярами;
1 Если «новый» микроскоп имеет конечную длину тубуса 160 мм итубусную систему
с увеличением большим или меньшим 1х, то это говорит о том, что микроскоп относится
к предыдущему поколению.
2 Основание и тубусодержатель в современной конструкции могут входить в единую
конструкцию — штатив.
17
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Рис. 1.5.
Конструкция микроскопа проходящего света:
1 — окуляры; 2 — бинокулярная насадка; 3 — штатив микроскопа со встроенной системой освещения и блоком питания;
4—конденсор; 5—центрировочные винты конденсора; 6—апертурная диафрагма конденсора (место, где располагаются
диафрагмы для темного поля и световые кольца фазового контраста); 7—объектив; 8—револьверное устройство для креп-
ления объективов; 9—предметный стол; 10—крепежный винт; 11 — узел крепления конденсора с фокусировочным
механизмом; 12—полевая регулируемая диафрагма; 13 — рукоятка передвижения препарата по оси X; 14 — рукоятка пере-
движения препарата по оси Y; 15 — рукоятка механизма грубой фокусировки; 16—рукоятка механизма точной фокусировки;
17—выключатель; 18—регулятор яркости источника света (галогенной лампы)
18
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Рис. 1.6. Принципиальная схема
положения механических узлов
прямого микроскопа проходяще-
го света:
1 — основание для встроенной
системы освещения; 2 — тубусо-
держатель; 3 — узел крепления
визуальной насадки; 4 — узел
крепления револьверного устройства
объективов; 5 — фокусировочный
механизм; 6 — узел крепления
предметного стола; 7 — узел креп-
ления конденсора с фокусировочным
и центрировочным механизмами.
♦ револьверное устройство (4) крепления объективов вместе
с объективами;
♦ фокусировочный механизм (5), включающий грубую и точную
настройку на резкое изображение;
• узел крепления предметного стола (6) вместе с предметным сто-
ликом;
• узел крепления и перемещения конденсора (7) вместе с конден-
сором.
Первые три позиции могут быть объединены в единый узел (мо-
дуль), называемый «оптическая головка». Фокусировочное пере-
мещение оптической головки может осуществляться как в рамках
штатива микроскопа, так и по отдельной стойке, которая крепится
к основанию1.
Основные задачи, которые решаются механической схемой мик-
роскопа:
♦ установка и поддержание расчетных расстояний между оптически-
ми элементами микроскопа с заданной точностью и центрировкой;
• обеспечение надежного крепления и точного движения оптичес-
кой части микроскопа;
• крепление и перемещение объекта.
1 Такая конструкция характерна для стереоскопических микроскопов.
19
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
1.4. ОПТИКА МИКРОСКОПА
Оптические узлы и принадлежности обеспечивают основную фун-
кцию микроскопа — создание увеличенного изображения рассмат-
риваемого объекта с достаточной степенью достоверности по форме
и цвету, контрасту и разрешению элементов, необходимых при наблю-
дении, анализе и измерении, и соответствующих требованиям методик
клинико-диагностической практики или медико-биологических иссле-
дований.
Все три основных функциональных системы микроскопа имеют
в своем составе оптические элементы, которые составляют оптичес-
кую базу микроскопа. Это объектив (воспроизводящая часть), окуляр
(визуализирующая часть) и конденсор (осветительная часть). Вспомо-
гательными элементами при этом являются: а) коллектор (осветитель-
ная система); б) линзово-призменный или зеркально-призменный блок
бинокулярной насадки, система Оптовар, оптический адаптер и фото-
проектив (визуальная система).
Качество изображения, создаваемое воспроизводящей частью мик-
* роскопа, обеспечивается не только точностью расчета, конструиро-
ванием и изготовлением самого объектива, но конструкцией и тех-
нологией изготовления механических узлов микроскопа1.
Например.
1) Четкость изображения в микроскопе обеспечивается точностью
совмещения просматриваемого слоя препарата с расчетной плоскос-
тью предмета объектива (которая, кстати, не всегда совпадает с фо-
кусом объектива в физическом его понимании). Данное условие, пре-
жде всего, связано с точностью изготовления механических деталей
узла фокусировочного механизма, величиной вертикального пере-
мещения предметного столика или объектива, геометрическими раз-
мерами рукояток управления (диаметром и шириной), а также плав-
ностью хода фокусировочного механизма.
2) Качество изображения в пределах всего поля видения связано с ка-
чеством изготовления поверхности предметного стола, перпендикуляр-
ностью плоскости предметного стола к оптической оси микроскопа.
3) Разрешение, а также точность геометрического воспроизведе-
ния объекта в изображении в центре поля и по краям связано с из-
готовлением объектива и точностью изготовления револьверно-
го устройства. Точность фиксации объектива в рабочем положении
1 Здесь мы не рассматриваем условия приготовления препарата.
20
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
обеспечивается технологией изготовления револьверной головки —
точностью изготовления присоединительной резьбы в объективе
и в гнезде револьверной головки, а также точностью центрировки
элементов в объективе, центрировкой собственно объектива отно-
сительно оптической оси микроскопа.
4) Разрешение по осям XYZ, точность геометрического воспроизведе-
ния объекта в изображении в центре поля и по краям, свето — и цве-
топередача связана с расчетным качеством осветительной системы
и ее конструкторско-технологическим исполнением, а также с точнос-
тью настройки осветительной системы по принципу Келера.
1.5. ЭЛЕКТРОННАЯ ЧАСТЬ МИКРОСКОПА
Существуют три группы микроскопов, в которых можно наблюдать
различную степень сложности формирования электрической и элект-
ронной части.
Первая группа — это учебные и простейшие рабочие микроскопы,
в которых осветительная часть состоит или только из осветительного
зеркала, или она имеет отдельный осветитель аналогичный осветите-
лям ОИ 19, ОИ 32 или ОИ 35.
Вторая группа представляет собой микроскопы с ручным управ-
лением, имеющие встроенные осветительные системы со встроенным
или вынесенным блоком питания мощных источников света (12В 100
Вт). В некоторых простых моделях микроскопов (например, Primostar)
подключение источника света к сети происходит через адаптер, что уп-
рощает ремонт электрической части.
К таким микроскопам относятся отечественные модели МИКМЕД
1 (6-20), МИКМЕД 2,5,6, а также рабоче-лабораторные и универсально-
исследовательские микроскопы с ручным управлением серий «Axio»,
«DM», «ВХ».
Третья группа представляет собой микроскопы с кодированны-
ми системами и системами, управляемыми с помощью компьютера.
В настоящий момент отечественное микроскопостроение не обладает
подобными системами. Это универсально-исследовательские микро-
скопы зарубежных фирм, например, такие как микроскопы Axio Imager
M1/Z1 фирмы Carl ZEISS. Эти микроскопы получили название «цифро-
вые микроскопы» (Digital Microscope) (рис. 1.7).
Кодированные системы предполагают настройку установочных
параметров на заводе. Например, с помощью запоминающихся уст-
ройств кодируется местоположение объективов, то есть первое гнез-
21
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
Рис. 1.7. Цифровые микроскопы: a) DN'aOOO (ф/.рмь Leica;, 5) Ахю !mage'Z' (ф.'.рмы Са' Ze:ss)
до в револьверном устройстве соответствует объективу 5х, второе —
1Ох ит.д. В современных моторизованных микроскопах управление
производится как с жидкокристаллического дисплея, установленного
на штативе микроскопа (рис. 1.8), так и с помощью персонального
компьютера (ПК).
При управлении микроскопом с помощью компьютера путем на-
жатия на соответствующую цифру на панели управления или на эк-
ране монитора происходит поворот револьверной головки (креп-
ления объектива или светоделительного элемента) в кодированное
положение, соответствующее цифре. Эта цифра означает или по-
зицию светоделителя (светофильтра), или конкретное увеличение.
Если речь идет об объективе, то в процессе этой операции происхо-
дит автоматическая фокусировка объектива, позволяющая получить
четкое изображение препарата, а также настройка освещения по Ке-
леру, то есть установка диафрагм полевой и апертурной, а также
фронтального компонента конденсора в соответствии с числовой
апертурой объектива.
Программное обеспечение микроскопа1 дает возможность управ-
лять с помощью компьютера следующими функциями:
• фокусировкой объективов;
• поднятием/опусканием предметного стола;
• поворотом моторизованного револьверного устройства с объек-
тивами;
• поворотом моторизованной турели светоделительных люминес-
центных блоков;
1 В микроскопах фирмы Carl ZEISS управление моторизованными микроскопами про-
изводится с помощью стандартной программы AxioVisionControl.
22
Глава 1 Из чего состоит микроскоп проходящего света
♦ установкой моторизованного устройст-
ва промежуточной системы дополни-
тельного увеличения Оптовар;
♦ переключением затвора отраженного/
проходящего света (в т. ч. в люминес-
центном осветителе);
♦ регулировкой яркости галогенного ос-
ветителя;
♦ установкой моторизованного конден-
сора (путем откидывания фронтально-
го компонента для работы объективов
малого увеличения, включением гнезда
с элементами различных методов конт-
растирования);
♦ вращением моторизованного револь-
верного устройства, установленного
в основании, для крепления цветных
и ослабляющих светофильтров;
♦ регулировкой открытием/закрытием
апертурной диафрагмы проходящего /
отраженного света в соответствии с ус-
танавливаемым в ход лучей объективом;
♦ управлением и настройкой моторизо-
ванной фото/видео системы;
♦ управлением моторизованным столом
по осям XYZ.
Рис. 1.8. Жидкокристаллический
дисплей управления функциями
микроскопа Axio Imager Ml/Z1,
установленный на штативе
микроскопа
Рис. 1.9. Объектив с блоком ACR
В новых микроскопах Axio Imager Ml и Z1 впервые применен спо-
соб определения элемента по метке на корпусе объектива и светодели-
тельных блоков — ACR (Automatic Component Recognition — автома-
тическое определение компонента, рис. 1.9).
23
ГЛАВА 2
МЕХАНИЧЕСКИЕ УЗЛЫ МИКРОСКОПА
В первой главе отмечалось, что механические части микроскопа поддерживают основные
оптические узлы в рабочем состоянии и обеспечивают управление подвижными элементами
с требуемой точностью. Рассмотрим классификацию и особенности наиболее важных
механических узлов, значительно влияющих на стоимость микроскопа.
К таким узлам относятся:
• предметный столик;
• фокусировочный механизм;
• револьверные устройства крепления объективов и светоделительных элементов;
• узел крепления и перемещения конденсора.
2.1. ПРЕДМЕТНЫЙ СТОЛИК
Предметный столик микроскопа предназначен для крепления и ус-
тановки в определенное положение препарата. Основные требования
к столикам связаны как с технологией изготовления, так и с функцио-
нальными особенностями узла.
Основные требования к конструкции предметных столиков:
а) необходимо соблюдать параллельность между рабочей поверх-
ностью стола (1), на которую устанавливается препарат, и базовой
поверхностью кронштейна (2), на которую стол «опирается» и кре-
пится; при этом сам кронштейн крепится к штативу микроскопа
(рис. 2.1);
б) необходимо обеспечивать перпендикулярность рабочей поверх-
ности стола (1) к оптической оси микроскопа (2) (рис. 2.2).
Для выполнения этих условий поверхность современного пред-
метного стола имеет специальное керамическое покрытие. Ранее,
например, в микроскопах фирмы Leica поколения 70-х годов про-
шлого века, на металлическую поверхность стола прикреплялась
достаточно толстая пленка, которая, однако, со временем отставала
от стола и коробилась, что мешало перемещению препарата.
24
Глава 2 Механические узлы микроскопа
Номенклатура предметных столов свя-
зана как с методиками микроскопирования
и наблюдения, так и с экономической целе-
сообразностью.
Конструктивно предметные столики могут
быть неподвижными и подвижными.
Неподвижные столики обычно приме-
Рис. 2.1. Схема, базировки пред-
метного стола:
1 - рабочая поверхность стола;
2 - базовая поверхность стола
и кронштйна
няются в самых простых моделях прямых
биологических микроскопов: в микроско-
пах-игрушках, школьных и учебных моделях.
Движение объекта при этом осуществляется
пользователем вручную, и объект может быть
закреплен с помощью двух подпружиненных
лапок с клеммами. На столах могут быть ус-
тановлены примитивные препаратоводите-
ли. Неподвижные столы, как правило, имеют
небольшие допуски на перпендикулярность
и параллельность рабочей поверхности,
что приводит к некачественному наблюде-
нию объекта1. В то же время они недороги,
что важно для такого класса приборов, где
препараты грубы, а наблюдения не требуют
анализа. Подобные предметные столы ис-
Рис. 2.2. Схема центрировки
предметного стола:
1 - рабочая поверхность стола;
пользовались в самых популярных отечест- 2 - оптическая ось микроскопа
венных монокулярных моделях середины XX
века серии БИОЛАМ Р11 и СИ.
В то же время для инвертированных биологических микроскопов
неподвижные столики являются основными, и это связано с особен-
ностью работы, прежде всего, из-за применения специальной посуды
нестандартных габаритов, а также для ускорения процесса наблюде-
ния, требующего ручного перемещения этой посуды.
Обычно эти столы имеют нестандартные габариты и приспособ-
лены для крепления микроманипуляторов, а также препаратоводите-
лей со специальными вкладышами для перемещения чашек, планшет
или обычных предметных стекол.
1 Изображение имеет следующий вид:
а) резкость в какой-либо краевой зоне поля видения, нерезкость — в противоположной
части (изображение как бы наклонено по отношению к центру поля). При любом движении
препарата картина не меняется;
б) изображение резкое по всему полю, однако такое впечатление, что одна часть поля
видения выше, а другая — ниже. При любом движении препарата картина не меняется.
25
Глава 2 Механические узлы микроскопа
и
-Y,
яти-
ия;
эвка
Петри
Обозначения по-
добных столов обычно
выглядит следующим
образом:
130x85 R/L,
где первые две цифры
указывают на коорди-
натное перемещение по
осям XY; буквы — гово-
рят о том, что рукоят-
ки управления имеют
как правостороннее
(R), так и левосторон-
нее (£) расположение
без специальной рамки
для крепления посуды \
Подвижный
стол — это сложный
механический узел, со-
стоящий, как минимум, из двух взаимно перемещающихся частей.
В табл. 2.1 представлена классификация предметных столов совре-
менных биологических микроскопов.
Как видно из таблицы по способу движения предметные столы мо-
гут быть координатными, поворотными и вращающимися.
Координатные предметные столики (рис. 2.3) осуществляют ко-
ординатное перемещение объекта по двум осям X-Y с помощью единой
рукоятки (сдвоенной — коаксиальной) вручную или от электродви-
гателя (обычно шагового). Последние носят название «сканирующие
столики». Управление ими может осуществляться с помощью джойс-
тика от стационарного устройства управления (контроллера) или с по-
мощью специальной программы от компьютера.
Столы этого типа обязательно имеют координатную шкалу и нони-
ус, указывающие точность перемещения в горизонтальной плоскости
по осям X и Y. Обозначения сканирующих столов обычно не содержат
требований по точности позиционирования, поэтому целесообразно
уточнять эти сведения при покупке. Например, обозначение может вы-
глядеть следующим образом1 2:
1 Приведены данные предметного стола микроскопа Axiovert 200, Carl Zeiss.
2 Приведены данные сканирующих столов фирмы Carl Zeiss для комплектации лазерно-
го сканирующего микроскопа LSM 510.
26
Глава 2 Механические узлы микроскопа
Таблица 2.1
Классификация предметных столов
№ п/ п Признак Под- группа Группа
I Тип стола 1 предметный стол для проходящего света
2 предметный стол для отраженного света
II Габаритные размеры 1 малые
2 средние
3 крупные
III Форма 1 прямоугольная
2 круглая
3 нестандартная
IV Основное движение стола 1 координатное перемещение (по осям X и Y)
2 поворотное движение (на определенный угол, например 240°)
3 вращательное движение (на 360°)
V Принцип перемещения 1 ручное управление
2 моторизованное управление (джойстиком, с помощью компьютерной программы)
VI Крепление объектов 1 без крепления
2 клеммы («лапки»)
3 препаратодержатель одного—двух стандар- тных предметных стекол (24x76)
4 препаратодержатель чашек Петри разных диаметров, плашек разных размеров
5 универсальные препаратодержатели
6 специализированный препаратово дитель для поляризационных микроскопов
VII Нониусы 1 без нониусов
2 механические
3 электронные
4 с фиксацией через определенный промежуток
VIII Материал 1 металлизированная пластмасса
2 металлический
3 стекло
1 Вращающиеся поляризационные предметные столы с фиксацией положения через 45°
27
Глава 2 Механические узлы микроскопа
Рис. 2.4. Типичный набор вращающихся предметных столиков для поляризационных исследований
1. Обычный сканирующий стол DC 120x100 со специальной встав-
кой типа «К» для крепления предметных стекол 76 х 26 мм. Стол имеет
перемещение 120x100 мм; поворот оси соответствует перемещению в 1
мм, минимальный шаг перемещения — 0.25 цт.
2. Пьезосканирующий стол 130 х 85 PIEZO с линейным кодировани-
ем и пьезодвижением. Координатное перемещение 130 х 85 мм; макси-
мальная скорость сканирования: 100 mm/s; разрешение: 0.2 цт; вос-
производимость (повторяемость): < 1 цт; абсолютная точность: ± 5 цт;
габариты стола 160 х 116 мм.
Поворотные предметные столики обеспечивают поворот коор-
динатного стола на некий угол (обычно не более 240°) при этом при-
нцип координатного перемещения препарата не меняется.
Поворотные столы применяются в трех случаях:
1) работа осуществляется как с правосторонним, так и с левосторон-
ним расположением рукояток управления препаратоводителя;
2) при наблюдении требуется установить, имеет ли место двулучеп-
реломление объекта, для чего в скрещенных николях1 достаточ-
но повернуть объект на 90°;
3) при работе с системами анализа изображения или при наблю-
дении требуется установка объекта не только по осям X-Y,
но и с небольшим разворотом.
Обозначение подобного стола обычно выглядит следующим об-
разом:
75x50/240°,
1 Скрещенные николи — это положение, при котором анализатор и поляризатор раз-
вернуты друг относительно друга на 90°, что обеспечивает полное гашение света (темный
фон). Если препарат имеет элементы с двулучепреломлением, то при повороте стола эти
элементы будут меняться: светлеть или темнеть.
28
Глава 2 Механические узлы микроскопа
। Рис 2.5.
\ Микроскоп Axioskop 40 Tetrad™,
) (США)
где первые две цифры обозначают координатное перемещение по осям
XY, третья — угол поворота, а общий габаритный размер стола может
быть, например, 240 х 170 мм1.
Вращающиеся предметные столики (рис. 2.4) предназначены
для специальных поляризационных микроскопов и снабжены враща-
ющимся диском. Диск имеет маркировку по окружности через 1°. Два
нониуса, закрепленные на неподвижной части столика, обеспечивают
отсчет углов поворота с определенной точностью. Специальный сто-
порный винт обеспечивает фиксацию вращающегося диска предметно-
го столика из любого установленного положения через каждые 30° —
45° (для разных фирм угол фиксации свой). На вращающийся столик
в поляризационных микроскопах проходящего света устанавливается
специальный препаратоводитель с раздельными рукоятками управле-
ниями, однако крепление объектов может осуществляться и с помо-
щью пружинящих лапок.
Обозначения подобных столов обычно имеет маркировку «Ро1»,
что означает — для поляризационных исследований.
В последнее время появились технологии микроскопических ис-
следований, предполагающие применение 72 и96-луночных планше-
тов, а также чашек Петри не только на инвертированных микроскопах,
но и на прямых биологических микроскопах. В зависимости от этого
меняются габаритные размеры столов, что связано с установкой соот-
ветствующих держателей посуды.
В последнее время все чаще прямые микроскопы используются
для наблюдения и небольших манипуляций с объектами, находящимся
в плашках или чашках Петри. Например, в России нашел применение
микроскоп Axioskop 40 Tetrad™ (рис. 2.5), разработанный американс-
1 Приведены данные поворотного стола микроскопа Axio Imager, Carl Zeiss.
29
Глава 2 Механические узлы микроскопа
кими специалистами на базе лабораторного цейссовского микроскопа.
Оригинальные механические микроманипуляторы высокой точности
крепятся на обычный координатный стол и позволяют проводить ра-
боты в области генетического анализа.
2.2. ФОКУСИ РОВОЧ НЫ Й МЕХАНИЗМ:
ГРУБАЯ И ТОЧНАЯ ФОКУСИРОВКА
Фокусировочный механизм обеспечивает движение стола или объ-
ектива1 для установки определенного расстояния между объектом
наблюдения и оптической частью микроскопа. Это расстояние гаран-
тирует резкое изображение объекта. «Наводка на резкость» осущест-
вляется двумя регулировками — грубой и точной. Каждая регулиров-
ка — это свой механизм и своя рукоятка. Рукоятки управления могут
быть разнесены или совмещены, но обязательно располагаются справа
и слева от микроскопа попарно.
Разнесенные рукоятки управления обычно присущи учебным мик-
роскопам как менее точные и более дешевые.
Грубая фокусировка (регулировка) осуществляется большой
по диаметру рукояткой. Минимальная величина перемещения со-
ставляет 1 мм за один оборот. При этом грубая фокусировка явля-
ется рабочей для увеличения микроскопа не более 400х (увеличение
объектива не более 40х), что связано с глубиной резкости объектива,
для остальных увеличений — это «черновое» движение. Обычно гру-
бая фокусировка предназначена для установки стандартизованной
величины, постоянной для всех увеличений объективов, так называ-
емой высоты объектива.
Точная фокусировка (регулировка) осуществляется парой не-
больших рукояток, которые обычно за один оборот придвигают стол
или объектив к объекту на 0,01-0,05 мм. Величина перемещения
за один оборот зависит от конструктивных особенностей микроскопов
различных фирм. Точная фокусировка является рабочей для объекти-
вов с увеличением от 40х и больше.
Как правило, на одну из рукояток точной фокусировки наносится
шкала, которая позволяет контролировать вертикальное перемещение
микроскопа.
1 В современных микроскопах фокусировочное движение объектива осуществляется
в специальных микроскопах для физиологов, где требуется крепление на столе микромани-
пуляторов.
30
Глава 2 Механические узлы микроскопа
Отечественный микроскоп модели Микмед 2 имеет грубое фокусиро-
вочное перемещение на длине до 30 мм. При этом один оборот рукоятки
обеспечивает перемещение на 2,5 мм, точная фокусировка осуществля-
ется в пределах 2,5 мм (при одном обороте — на 0,25 мм) и на одну из ру-
кояток точной фокусировки нанесена шкала с ценой деления 0,002 мм.
Функциональное назначение фокусировочного перемещения
значительно важнее, чем принято полагать.
Без точной фокусировки не обойтись в следующих случаях:
♦ если увеличение объектива более 40х;
• при работе с иммерсионными объективами1;
• при работе с объективами, которые не дают резкого изображения
по всему полю видения;
• если на всем видимом поле объект имеет различную толщину
или объем, превышающий глубину резкости объектива.
Совмещение (коаксиальное расположение) обеих рукояток значи-
тельно упрощает работу, одновременно усложняя конструкцию и по-
вышая стоимость микроскопа.
Современный уровень технологий позволяет совмещать функции
как грубой, так и точной наводки на резкость с помощью одной рукоятки.
Это достигается путем использования реверсного механизма, позволяю-
щего вначале осуществить грубую настройку — до обеспечения стандар-
тной высоты объектива, а затем точную — в пределах глубины резкости
объектива. В основном, этот прием используется в учебных микроскопах.
Современные исследовательские и универсальные микроскопы име-
ют устройство «автоматической настройки на резкость» — автофокус.
В этом случае при переключении револьверной головки и установки
объектива в рабочее положение вначале происходит автоматический
подвод объектива к объекту, затем реверсное движение1 2 в пределах
глубины резкости объектива и, наконец, установка его в плоскости на-
илучшего видения.
Следует отметить, что «точность» плоскости наводки определяется
оператором. Микроскоп «запоминает» это положение и дальше проис-
1 Опытные микроскописты пользуются грубой фокусировкой при работе с объектива-
ми больших увеличений и иммерсионными объективами. Однако, рабочее расстояние этих
объективов меньше 0,3 мм, а глубина резкости так мала, что увеличивается риск поврежде-
ния препарата или фронтального компонента объектива.
2 Реверсное движение состоит из трех этапов: движение к предмету (через «фокус»),
движение от предмета (обратный ход через «фокус») и точная фиксация положения объек-
тива в «фокусе».
31
Глава2 Mexai -ies зди " .poc.ona
ходит воспроизведение при каждой установке
именно этого объектива в ход лучей. При этом
нельзя забывать, что каждый оператор облада-
ет собственной плоскостью резкого видения,
поскольку и острота зрения, и чувствитель-
ность глаз к свету строго индивидуальны.
Модели микроскопов Axio Imager Ml/Zl
Рис. 2.6.
Кнопки управления микроско-
пом, расположенные на фокуси-
ровочном механизме
лйиМхХ - ; ।
’ • ' ... I
Рис. 2.7.
Сенсорное устройство контроля
Z- положения
имеют моторизованное устройство для вра-
щения револьверной головки с объектива-
ми и автофокусировочное устройство с за-
поминающим блоком и пакетом программ
(AxioVision Control). После «обучения», даль-
нейший переход от одного увеличения к дру-
гому осуществляется простым нажатием
на кнопки поворотного устройства, которые
расположены или на основании микроскопа
или на рукоятке фокусировочного механизма
(рис. 2.6) и обеспечивают вращение объекти-
ва вправо или влево от центра. При этом га-
рантировано получение резкого изображения
с любым увеличением.
На рукоятках фокусировочного механизма
(справа и слева) расположено в общей слож-
ности 6 кнопок управления настроечными
функциями в ручном режиме, в том числе яр-
костью источника света, установкой светофильтров и т.д., и 10 кнопок
при моторизованном режиме работы микроскопа.
Еще одно новшество появилось в моделях Axio Imager — это конт-
рольное сенсорное устройство перемещения по оси Z (рис. 2.7), кото-
рое устанавливается сбоку на предметный столик. Точность переме-
щения фокусировочного механизма при этом составляет 25 нм.
Одним из основных условий работы микроскопа с автофокусиров-
кой является соблюдение требований государственных стандартов
и стандарта ИСО 9000 по толщине предметного и покровного стекла.
2.3. УЗЕЛ КРЕПЛЕНИЯ ОБЪЕКТИВОВ:
РЕВОЛЬВЕРНОЕ УСТРОЙСТВО
Существует несколько типов крепления объективов в микроскопе:
♦ ввинчивание объектива непосредственно в штатив;
32
Глава 2 Механические узлы микроскопа
♦ крепление объективов с помощью специального безрезьбового
устройства (направляющей), так называемые «салазки»;
♦ использование револьверного устройства с несколькими гнездами.
В настоящее время самым распространенным типом крепления объ-
ективов является револьверное устройство (револьверная головка).
Узел крепления объективов в виде револьверного устройства
выполняет следующие функции:
♦ смену увеличения в микроскопе за счет вращения головки, в каж-
дое гнездо которой ввинчивается объектив определенного увели-
чения;
• фиксированную установку объектива в рабочее положение;
• гарантированное центрирование оптической оси объектива отно-
сительно оптической оси микроскопа в целом, включая освети-
тельную систему.
Последняя функция осуществляется в поляризационных микроско-
пах (где это очень важно) с помощью специальных центрируемых
гнезд. Около гнезда в револьверном устройстве имеются отверстия,
в которые устанавливаются винты для центрировки объектива не-
посредственно в гнезде.
Рис. 2.8. Револьверное устройство
крепления объективов с призма-
ми ДИК
В отечественных поляризационных мик-
роскопах такие револьверные головки имеют
все центрируемые гнезда. В револьверных
головках микроскопов фирмы Цейсс одно
гнездо всегда остается не центрируемым.
Револьверное устройство может быть 3-х,
4-х, 5-ти, 6-ти или 7-ми гнездным в зависи-
мости от класса сложности микроскопа и ре-
шаемых им задач.
В микроскопах, где применяется диффе-
ренциально-интерференционный контраст,
в револьверной головке над гнездом имеется один или несколько па-
зов для установки направляющей с призмой (рис. 2.8).
В учебных микроскопах объективы обычно делаются несъемными,
то есть крепятся таким образом, чтобы замена их была затруднена.
Порядок следования объективов должен строго соблюдаться
по принципу: от меньшего увеличения к большему, при этом движение
револьверной головки осуществляется по часовой стрелке.
33
Глава 2 Механические узлы микроскопа
Как правило, при сборке микроскопов производится операция
подбора объективов — комплектация. Это позволяет не терять изоб-
ражение объекта из поля зрения при переходе от одного увеличения
к другому.
И еще одно условие должно обеспечивать револьверное устройство —
парфокальность. Это условие сохранения единой плоскости резкого
видения («фокуса») для всех объективов. Это связано со стандартной
величиной объектива — «высотой». Резьбовое отверстие, вернее его
внешняя поверхность, является материальной базовой поверхностью
для отсчета высоты объектива. Объектив должен быть ввинчен в гнез-
до таким образом, чтобы между ним и револьверной головкой не было
зазора. Это условие для точного позиционирования объектива в рабо-
чем положении по оптической оси микроскопа.
Парфокальность в комплекте объективов обеспечивается конструк-
цией микроскопа и технологией его изготовления. При отсутствии
этого условия, в процессе перехода от одного объектива к другому,
для получения резкого изображения требуется значительная подфо-
кусировка.
Как было сказано выше, моторизованные исследовательские и уни-
версальные модели имеют моторизованные револьверные устройства.
Такие устройства требуют строгого соблюдения порядка установки
объективов. Обычно на револьверном устройстве над гнездом, куда
ввинчивается объектив, имеется метка с порядковым номером или уве-
личением. Хотя с внедрением технологии ASR, о которой говорилось
ранее, микроскоп «научился» самостоятельно определять объектив,
«занося» его параметры в программу управления.
2.4. УЗЕЛ КРЕПЛЕНИЯ И ПЕРЕМЕЩЕНИЯ КОНДЕНСОРА
Узел крепления конденсора расположен под предметным столиком
и имеет вид кронштейна с гнездом. Узел предназначен для установки
конденсора, его фиксации и центрировки, то есть перемещения в гори-
зонтальной плоскости перпендикулярно оптической оси микроскопа.
Узел имеет направляющую для фокусировочного движения (перемеще-
ния) конденсора по вертикали вдоль оптической оси.
Как самостоятельный узел, отделенный от осветительной системы
(источника света и коллектора), конденсор является основным элемен-
том для центрировки осветительной системы относительно оптичес-
кой оси микроскопа. Его задачей является четкая проекция (фокуси-
34
Глава 2 Механические узлы микроскопа
ровка) полевой диафрагмы в плоскость предмета при осуществлении
принципа Келера.
Конденсор жестко крепится с помощью стопорного винта, который
предотвращает выпадение конденсора и обеспечивает его центриро-
ванное положение в процессе работы.
Центрировочные винты при конденсоре обеспечивают совмещение
осветительного пучка от источника света и оптической оси микроско-
па (настройка освещения по Келеру).
Еще раз отмечаем, что это очень важный этап настройки освещения
в микроскопе, влияющий на равномерность освещения и точность вос-
произведения объекта, а также на контраст и разрешение элементов
в изображении объекта.
Фокусировка (настройка по высоте) конденсора осуществляется
с помощью ручки на кронштейне и, также как центрировка, влияет
на работу всего микроскопа.
Конденсор может быть неподвижным и не центрироваться поль-
зователем. Обычно подобная конструкция принадлежит учебным
микроскопам, как более дешевая. Со временем происходит самопро-
извольная децентрировка, требующая настройки. При этом не обес-
печивается точность воспроизведения, которая требуется, например,
при медико-биологических исследованиях. Именно по этой причине
отечественные микроскопы серии БИОЛАМ (МИКМЕД 1), а также
другие, разработанные в 60-х годах XX века, не рекомендуются в прак-
тической медицине, где требуется проведение исследований или пос-
тановка диагноза.
До этого мы говорили о прямых микроскопах.
Если же рассматривать инвертированные («перевернутые») микро-
скопы, то узел крепления конденсора и его функция аналогичны, толь-
ко узел расположен сверху предметного стола.
35
ГЛАВА 3
ОБЪЕКТИВЫ МИКРОСКОПА
ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектив — это визитная карточка микроскопа, его сердце, его глаза. Взглянув на корпус
объектива, можно получить полную (или почти полную) информацию о микроскопе, фирме-
производителе (и даже о продавце!), а главное о том человеке, который работает с ним.
Разработка объектива начинается с осмысления задачи пользовате-
ля — увеличение, разрешение, условия работы и, конечно, требуемое
качество изображения. Все это формирует оптическую схему и конс-
трукцию объектива.
Разработчики оптических систем:
♦ выбирают оптическую схему и оптические композиции1, удов-
летворяющие требованиям технического задания;
• по влиянию параметров1 2 (радиусом, толщиной линз, расстоя-
ниями между компонентами) задаются точность изготовления,
сборки элементов и всего объектива, соответствующие расчет-
ному качеству;
♦ конструкторы разрабатывают оптико-механическую конструк-
цию, а также определяют технологические требования к изго-
товлению оптических, механических деталей, отдельных сборок
и всего в целом объектива. Назначаются допуски, центрировки,
просветляющие покрытия, оптические клеи, определяются спо-
собы сборки.
1 Обычно объективы состоят из стекол групп крона, флинта, фторфосфатных стекол, а
также флюорита. Стекла, использующиеся для объективов микроскопа, имеют повышенные
требования по пузырности и бессвильности. В СССР оптические стекла выпускали на Лен-
ЗОС (Ленинград), АЗОС (г. Лыткарино Московской обл.), ИОЗ (г. Изюм). Широко известны
заводы Отто ШОТТ, входящие в фонд Carl ZEISS (Германия); заводы Хойя (Япония).
2 В процессе габаритного расчета определяются основные параметры оптической сис-
темы. Затем производится аберрационный расчет и, на основании влияния изменения пара-
метров на качество изображения, определяется точность изготовления и сборки (техноло-
гические параметры).
36
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Технологи1 оптического, механического и
сборочного производства составляют техно-
логический процесс изготовления и сборки
узлов, а также всего объектива. После экспе-
риментального изготовления объектива про-
водится ряд исследований на соответствие
расчетной и конструкторской документации1 2.
И только после этого начинается жизненный
цикл объектива.
Объективы имеют сложную оптико-ме-
ханическую конструкцию, которая включает
несколько одиночных линз и компонентов,
склеенных из 2-х или 3-х линз. Количество
линз обусловлено кругом решаемых объек-
тивом задач. В прямой зависимости от этого
находится и экономический аспект — соотно-
шение «цена-качество».
Существует определенная связь между
** поставленной задачей и ее решением —
нельзя требовать от объектива того, что
вступает в противоречие с законами фи-
зики и технологией изготовления. Нужно
иметь в виду, что:
Рис 3.1 Оптико-механическая
конструкция объектива для мик-
роэлектроники (DUV150х/0.90
для УФ области 248 нм, фирмы
Leica). Наличие 17 линз из спе-
циального стекла и флюорита
делает конструкцию сложной
и «тяжелой» для пропускания
в видимой области спектра.
♦ чем выше качество изображения и увеличение, создаваемые объек-
тивом, тем сложнее его оптическая схема;
• чем сложнее оптическая схема, тем «тяжелее» конструкция, а зна-
чит сложнее технология изготовления и сборки (рис. 3.1), и тем
выше стоимость объектива.
При этом возможно уменьшение светопропускания в широком спек-
тральном диапазоне, снижение разрешения и контраста по полю.
Есть определенная связь между параметрами объектива:
♦ чем больше рабочее расстояние, тем меньше числовая апертура
объектива, тем меньше разрешение микроскопа;
1 Специфика технологии микроскопостроения связана с процессом изготовления и
сборки, в результате которых должен получиться прибор с дифракционным качеством изоб-
ражения, поэтому на всех этапах производства присутствуют высоко квалифицированные
технологи.
2 Объектив микроскопа имеет дифракционное качество изображения, поэтому оценка
качества изготовления ведется с помощью тонких тест-объектов и высокоточных методов.
37
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
♦ чем больше числовая апертура объектива, тем больше его светоси-
ла, однако при этом становится меньше глубина резкого видения.
3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ОБЪЕКТИВОВ
Классификация объективов сложна. Она связана как с физико-хи-
мическими свойствами объекта, так и с конструктивными особеннос-
тями, основными параметрами и расчетным качеством собственно
объектива.
Классификация учитывает:
♦ требования к точности воспроизведения объекта в изображении,
учитывающие разрешающую способность и цветопередачу в цент-
ре и по полю видения, что определяется таким понятием, как «тип
оптической коррекции»;
• условия наблюдения, которые связаны с наличием иммерсионной
среды между объектом и объективом, работой объектива с покров-
ным стеклом;
• расчетные параметры объектива: рабочее (свободное) расстояние
между объективом и объектом, числовая апертура объектива;
• особенности конструкции объектива, связанные с обеспечением
методов контрастирования.
А. Выходные параметры
• Увеличение
• Числовая апертура
• Рабочее расстояние
• Линейное поле
• Рабочая область спектра
Г. Конструктивные
особенностиы
• Пружинящая оправа
• Коррекционные кольца
• Ирисовая диафрагма
Б. Качество изображения
(тип оптической коррекции)
• Ахроматизация
• Кривизна поля
• Хроматические аберрации
В. Конструктивные
параметры
• Длина тубуса
• Высота
• Коррекция на толщину
покровного стекла
• Отношение к иммерсии
Д. Конструкторско-
технологические особенности
• Методы исследования и
контрастирования
. Оптические среды
• Формообразование
оптических поверхностей
Рис. 3.2.
Классификация сов-
ременных объек-
тивов по основным
признакам.
38
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Объективы микроскопа представляют собой оптические системы,
предназначенные для построения микроскопического изображения в
плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешени-
ем элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта
исследования.
Объективы имеют четкую классификацию, которая характеризует
их как с технической, так и с экономической точки зрения. В ее основе
лежат такие признаки как: выходные параметры, качество изображе-
ния (тип оптической коррекции), конструктивные параметры, конс-
труктивные особенности и конструкторско-технологические особен-
ности (рис.3.2).
Рассмотрим классификацию более подробно.
ГРУППА А. ВЫХОДНЫЕ ПАРАМЕТРЫ
1. Увеличение. В зависимости от степени увеличения объективы де-
лятся на четыре группы:
• объективы малого увеличения1 — от 1 х до 20х;
• объективы среднего увеличения — от 20х до 50х;
• объективы большого увеличения — от 50х до 100х;
• объективы сверхбольшого увеличения — свыше 100х.
Увеличение маркируется на корпусе объектива, например «10х».
Классификационный признак не уточняется1 2.
2. Числовая апертура. В зависимости от величины числовой апер-
туры объективы также делятся на четыре группы:
1. объективы малых числовых апертур — до 0,2;
2. объективы средних числовых апертур — от 0,2 до 0,65;
3. объективы высоких числовых апертур — от 0,65;
4. объективы повышенных числовых апертур3 — с числовыми
апертурами выше традиционных для соответствующего увеличе-
ния (например, 10х/0,40; 40х/0,75; 100х/1,30МИ).
Числовая апертура маркируется на корпусе объектива после
увеличения, например, «0,65». Классификационный признак не
уточняется.
1 Объективы увеличения от 1х до 5х в обиходе называют: объективы лупного увеличе-
ния, поисковые объективы, обзорные объективы
2 Ранее в микроскопах, имеющих длину тубуса «•=», на корпус вместо увеличения нано-
силась маркировка фокусного расстояния.
3 Разработкой этого класса объективов в разное время занимались группы под руко-
водством д.т.н. Грамматика А.П. (ГОИ им. Вавилова), д.т.н. Ивановой Т.А. и Фролова Д.Н.
(ЛОМО им. Ленина).
39
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
3. Рабочее расстояние. По величине рабочего расстояния объекти-
вы подразделяются на:
• объективы с обычным рабочим расстоянием;
• объективы с большим рабочим расстоянием1 (LD — long distance);
• объективы со сверхбольшим рабочим расстоянием (LLD — large
long distance).
На корпус зарубежных объективов наносится маркировка LD и LLD.
Числовое значение рабочего расстояния не маркируется и обычно ука-
зывается в описании, прилагаемом к микроскопу.
4. Рабочая область спектра. Данный признак классифицирует объ-
ективы по светопропусканию в различной области спектра:
• объективы для видимой области спектра — пропускание от 400
до 700 нм;
• объективы для ультрафиолетовой области спектра — от 250 до
400 нм (кроме специальных);
• объективы для инфракрасной области спектра — от 700 до
900 нм (кроме специальных).
На корпус наносится маркировка принадлежности объективов к
группам для ультрафиолетовой (УФ, UV) и инфракрасной (ИК, IR) об-
ластей спектра.
5. Линейное поле. По этому параметру современные объективы де-
лятся на две группы:
1. обычные — с линейным полем в плоскости предмета до 20 мм;
2. широкопольные1 2- — с линейным полем выше 20 мм.
Обычно величина линейного поля на корпусе объектива не маркиру-
ется. Однако, на корпусе высококачественных объективов UPlanSApo
нового поколения 1П82-оптики ф. Olympus, например, указана вели-
чина линейного поля окуляра 10х — «FN 26,5».
ГРУППА Б. КАЧЕСТВО ИЗОБРАЖЕНИЯ (ТИП ОПТИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ)
1. Ахроматизация. По этому параметру можно оценить класс объ-
ектива, связанный с качеством изображения и, следовательно, разде-
лить по соотношению «цена-качество».
1 Этот класс объективов в нашей стране был разработан под руководством д.т.н. Грам-
матика А.П. — для биотехнологии и микроэлектроники и д.т.н. Андреева А.Н. — для поля-
ризационной микроскопии (ГОИ им. Вавилова), а также Фроловым Д.Н. — для биотехноло-
гии (завод АОМО им. Ленина).
2 Этот класс объективов был разработан д.т.н. Андреевым (для МБИ15), а эксперимен-
тальные образцы отработаны и внедрены на АОМО группой микроскопии под руководс-
твом к.т.н. Соколовой Т.И.
40
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Объективы делятся на 4 группы:
1. ахроматы — объективы, в которых аберрации исправлены для
одной основной длины волны — зеленой и не исправлены для
двух других — красной и синей, при этом полевые аберрации не
исправлены1;
2. апохроматы1 2 — объективы, в которых аберрации исправлены
для трех основных длин волн (зеленой, красной, синей), при этом
полевые аберрации не исправлены;
3. полуапохроматы3 — объективы, в которых аберрации исправле-
ны для одной основной длины волны (зеленой) и не доисправле-
ны для двух других (красной и синей)-,
4. монохроматы — объективы, в которых аберрации исправлены
только для одной длины волны, которая указывается.
На корпусе объектива маркируется апохроматическая (АПО, АРО),
полуапохроматическая (МИКРОФЛЮАР, FLUAR, FLUOTAR) и моно-
хроматическая коррекция (указывается длина волны, в которой рассчи-
таны все аберрации и объектив имеет наибольшее светопропускание).
2. Кривизна поля. По этому параметру, также как и по ахромати-
зации, можно оценить класс объектива по соотношению «цена-качест-
во», связанному с качеством изображения.
По указанному признаку современные объективы делятся всего на
две группы: на объективы с кривизной (с улучшенным качеством изоб-
ражения по полю) и объективы с плоским полем.
На корпусе объектива маркируется только вторая группа при
этом, объектив ахроматической коррекции маркируется — ПЛАН,
PL, А-Plan, Achroplan, апохроматической коррекции — План-АПО,
Plan-АРО; а полуапохроматической— Plan-Neofluar.
1 Тип оптической коррекции касается исправления неких волновых аберраций, но не каса-
ется понятия «план», т.е. плоского поля. Такие объективы всегда имеют значительную «кривиз-
ну» и требуют постоянной перефокусировки для получения резкого изображения для центра и
края поля. К ним относятся объективы микроскопов моделей Биолам Р,С,Д и Микмед 1.
2 Этот тип объективов по соотношению «цена-качество» относится к объективам вы-
сшей оптической коррекции и предназначен для выполнения наиболее ответственных ра-
бот, требующих точной цветопередачи. Объективы имеют высокую стоимость, поэтому в
мировой практике для научно-исследовательских работ часто применяются объективы про-
межуточной коррекции — полуапохроматы.
3 Объективы, содержащие оптические элементы из кристалла флюорита или стекол типа
фторфосфатных. По своим техническим параметрам и качеству изображения они близки к
апохроматам, но за счет неполной исправности волновых аберраций в широком спектраль-
ном диапазоне, а значит и более простой оптической схеме и менее жестким требованиям к
технологии изготовления и сборки, их стоимость менее высокая. Такие объективы называ-
ются флюотарами (Fluotar), флюарами (Fluar) и т.п.
41
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
3. Хроматические аберрации. По этому параметру объективы де-
лятся на две группы:
1. объективы с хроматической разностью увеличения (ХРУ) — ве-
личина более 0,3%, требующая дополнительной компенсации при
наблюдении (компенсационные окуляры);
2. объективы без хроматической разности увеличения — ХРУ = 0%;
система не требует дополнительной компенсации при наблю-
дении.
Этот параметр на корпусе объективов не маркируется, поскольку
является признаком всего поколения и, как правило, рекламируется
или представляется фирмами в начале описания или основного ката-
лога. Новое поколение оптики без хроматической разности различные
фирмы маркируют по-разному, например:
ICS-оптика и ICPS-onmuKa (Carl Zeiss);
HCS-оптика (Leica);
UIS-оптика и Ш82-оптика (Olympus);
CFIeo-оптика (Nikon).
ГРУППА В. КОНСТРУКТИВНЫЕ ПАРАМЕТРЫ
1. Длина тубуса. По длине тубуса объективы делятся на три группы:
♦ конечная длина тубуса стандартная1 — 160 мм;
♦ стандартная длина тубуса — «бесконечность» (°°)1 2;
• нестандартная длина тубуса3 — не определена ГОСТом или ISO.
Длина тубуса маркируется на корпусе объектива4.
2. Высота объектива. По этому параметру объективы делятся на
две группы: нестандартная и стандартная высота. Международным
стандартом принята высота, равная 45 мм5. Параметр на корпусе объ-
ектива не указывается.
3. Коррекция на толщину покровного стекла. По этому параметру
объективы делятся на три группы:
1 По соотношению «цена-качество» стоимость данных объективов ниже, чем в совре-
менных микроскопах с длиной тубуса «бесконечность». Особенности и влияние этой длины
тубуса на качество изображения буде рассмотрено далее.
2 Тубусная система, определяющая увеличение объектива, имеет разное фокусное рас-
стояние. Оптимальным считается фокусное расстояние 160 мм (фирма Carl Zeiss). Однако
эта же фирма для удешевления объективов в простейших микроскопах Primostar использует
фокусное расстояние 180 мм.
3 Обычно это микроскопы-игрушки.
4 Маркировка была введена стандартами 80-х годов XX в.
5 В СССР ГОСТом 70-х годов были определены две величины высоты — 33 мм (микроско-
пы серии БИОЛАМ, МИКМЕД 1) и 45 мм. Новая оптика фирмы Nikon имеет высоту 60 мм.
42
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
< без покровного стекла (d=О);
• с корректировкой на стандартную толщину покровного стекла
(d=0,17 мм);
• с корректировкой на определенную толщину покровного стекла1
(например, 0-2,0; 1,5-2,5).
На корпусе объектива обязательно указывается корректировка
на толщину покровного стекла1 2. Если объектив работает в диапазоне
стандартной толщины, то есть от 0 до 0,17 мм, то маркировка имеет
знак «-».
4. Отношение к иммерсии. По этому параметру объективы делятся
на сухие и иммерсионные.
На корпусе объектива указывается тип иммерсии, с которой работа-
ет объектив. Кроме этого обязательной является маркировка цветным
кольцом.
ГРУППА Г. КОНСТРУКТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
1. Пружинящая оправа. По этому конструктивному параметру
объективы делятся на две группы:
• без пружинящей оправы — по международному стандарту это
могут быть объективы с числовой апертурой до 0,50;
♦ с пружинящей оправой — по международному стандарту это
должны быть объективы с числовой апертурой более 0,50.
На корпусе объектива не указывается. Может упоминаться в описа-
нии на микроскоп.
2. Коррекционные кольца. По этому конструктивному параметру
объективы делятся на две группы:
♦ без коррекционной оправы;
♦ с коррекционной оправой.
Коррекционная оправа позволяет корректировать качество изобра-
жения объектива (переход на другую толщину покровного стекла или
иммерсионную среду) за счет подвижного элемента внутри объектива.
На корпусе объектива с коррекционным кольцом есть указание Когг.
3. Ирисовая диафрагма. По этому параметру объективы делятся на
объективы без ирисовой диафрагмы и с ирисовой диафрагмой. На кор-
пусе объектива с ирисовой диафрагмой есть указание Iris.
1 Это специализированные объективы для инвертированных микроскопов.
2 На объективах прежних стандартов (принятых до 80-х годов) стандартная величина
0,17 мм не указывалась.
43
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
ГРУППА Д. КОНСТРУКТОРСКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
1. Оптические среды. По этому параметру объективы делятся на
следующие:
• линзовые объективы;
♦ зеркально-линзовые объективы;
• зеркальные объективы;
* граданные объективы1 — объективы из стекла с переменным по-
казателем преломления.
Указания на корпусе объектива отсутствуют.
2. Формообразование оптических поверхностей. По этому пара-
метру объективы делятся на следующие:
♦ сферические — стандартные объективы;
♦ асферические;
• кино формные1 2.
Указания на корпусе объектива отсутствуют.
Последним признаком в классификации объективов является их раз-
деление в зависимости от методов исследования и контрастирования. Так
как это достаточно серьезная группа объективов рассмотрим ее отдельно.
3.2. ОБЪЕКТИВЫ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
И КОНТРАСТИРОВАНИЯ
Конструкция объектива, методика расчета и технологические осо-
бенности изготовления оптических деталей зависят как от типа микро-
скопа (проходящего или отраженного света), так и от методов исследо-
вания или контрастирования, которые применяются при использовании
этих объективов. В последнем случае — это либо обычные объективы
светлого поля без отступлений от расчетов и технологии изготовления
основного варианта, либо специальные объективы. На корпусе объек-
тивов специальных указаний на этот счет не предусматривается.
Для микроскопов отраженного света рассчитываются и произво-
дятся специальные объективы — безрефлексные. Об этом можно уз-
нать по приставке Эпи- (или Epi-) перед маркировкой типа оптической
коррекции (например, Epiplan-Neofluar).
1 Разработкой этих объективов в 1985-1988 гг. занимались параллельно в ГОИ им. Вави-
лова и на АенЗОСе. Расчеты велись под руководством д.т.н. Грамматика А.П.; НИР группы
к.т.н. Лариной Р.М.
2 Разработка киноформных объективов для целей биотехнологии в 1985-1990 гг. была
связана со специальным расчетом и технологией изготовления поверхности (виде линзы
Френеля). Расчеты велись под руководством д.т.н. Грамматика А.П.; НИР группы к.т.н. Ла-
риной Р.М.
44
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Для люминесцентных микроскопов выпускаются специальные объек-
тивы — люминесцентные, обладающие минимальным количеством собс-
твенной люминесценции, то есть способности оптических сред светиться
без объекта. Чаще всего числовая апертура этих микроскопов больше, чем
для обычных объективов. Имеется буквенная маркировка Л, F, FL1.
Поляризационные микроскопы комплектуются специальными по-
ляризационными объективами, обладающими минимумом натяже-
ния в оптических деталях, что обычно связано с технологией изготов-
ления и сборки объективов. Маркировка объективов цветная (красная)
и имеется дополнительная буквенная маркировка П, Pol.
Особенность конструкции объектива может быть вызвана требова-
ниями методов контрастирования. Для реализации метода фазового
контраста требуется применение специальных фазовых объективов,
имеющих оптический элемент с нанесенным специальным способом
кольцом, которое имеет определенный размер, положение и светопро-
пускание. Объективы имеют цветную маркировку всех надписей (зеле-
ного цвета) и буквенное обозначение — Ф1, Ph 1 и т.д.
Разработанный фирмой Carl Zeiss новый метод контрастирования
VAREL-контраст по своим свойствам относится к фазовым объективам,
однако конструктивно имеет дополнительное кольцо, расположенное в
том же месте, что и в основном фазовом варианте. Объектив, работаю-
щий по методу VAREL-контраста, имеет цветную маркировку надписей
(зеленого цвета) и буквенное обозначение, например, Phi Vari.
Объективы, применяемые при исследованиях по методу темного
поля в проходящем свете, в конструкции могут иметь ирисовую диа-
фрагму. Для применения объективов по методу дифференциально-
интерференционного контраста в проходящем свете1 2 не требуется
специальных конструктивных изменений в варианте объектива светло-
го поля. Однако для работы требуется специально рассчитанная при-
зма (клин), которая устанавливается в револьверное устройство над
объективом (в инвертированных микроскопах — под объективом).
3.3. ИММЕРСИОННЫЕ ОБЪЕКТИВЫ
Редкие исследования в практике лабораторной диагностики и при
проведении научных изысканий обходятся без объективов масляной
иммерсии. Применение иммерсии позволяет получить такое разреше-
1 Все объективы фирмы Carl Zeiss являются не люминесцирующими.
2 Объективы дифференциально-интегрального контраста отраженного света имеют
маркировку ДИК (DIC).
45
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
ние, которое позволяет различать мелкие детали в структуре или тон-
кие цветовые оттенки.
Для медико-биологических исследований традиционными являют-
ся три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil),
водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glys). Послед-
няя, в основном, используется в исследованиях с помощью ультрафио-
летовой микроскопии.
Применение иммерсии требуется в случаях:
• повышения разрешающей способности микроскопа за счет увели-
чения числовой апертуры;
• применения в соответствии с технологическим процессом микро-
скопирования;
♦ повышения видимости за счет увеличения разности показателя
преломления среды и объекта;
• увеличения глубины просматриваемого слоя, который зависит от
показателя преломления среды.
Кроме того, иммерсионная жидкость может служить для уменьше-
ния количества рассеянного света за счет устранения бликов от объек-
та. При этом исключаются неизбежные потери света при попадании его
в объектив.
Особенность иммерсионных объективов связана с тем, что фрон-
* тальный компонент (первая линза) должен быть выполнен из опти-
ческого стекла близкого по показателю преломления к иммерсии.
Рис. 3.3. Комплект объективов водной иммерсии (фирмы Carl Zeiss)
46
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Интересны последние разработки фирм Carl Zeiss и Olympus для
физиологов.
Например, модель AXIOSKOP 2FS (Carl Zeiss), укомплектована спе-
циальными объективами Ахропланами (рис. 3.3), которые помещаются
в водный (физиологический) раствор на %-% корпуса объектива. При
этом корпус фронтального компонента выполнен из специального про-
тивокоррозийного материала, стойкого к работе в водной среде с элек-
тродами. Объективы имеют еще одну особенность — большие рабо-
чие расстояния и узкую фронтальную часть, что позволяет работать с
микроманипуляторами непосредственно под микроскопом. Характер-
но, что при исследовании по методу дифференциально-интерферен-
ционного контраста объективы могут работать по новой технологии
"infrapatch” в световом диапазоне 750-780 нм. В комплект входят объ-
ективы следующих увеличений, числовых апертур и рабочих рассто-
яний: 10х/0,30 W (3,1 мм); 20х/0,50 W (2,0 мм); 40х /0,75 W (1,98 мм);
63х/0,90 W (1,45 мм). Объективы могут быть выполнены и в фазовом
варианте.
3.4. МАРКИРОВКА НА КОРПУСЕ И ... СТОИМОСТЬ ОБЪЕКТИВОВ
Все основные сведения об объективе и, следовательно, данные для
работы с микроскопом можно найти на корпусе объективов. Они про-
сты и понятны, если объектив имеет принятую в соответствии с ISO
систему надписей. Важно уметь ее «читать».
Надпись в общей сложности делится на три части:
1. расчетное качество изображения — тип оптической коррекции,
исправление кривизны по полю;
2. основные технические параметры объектива — увеличение и
числовая апертура, отношение к иммерсии, отношение к мето-
дам исследования и контрастирования;
3. условия работы объектива — длина тубуса объектива, коррекция
объектива при работе с соответствующим покровным стеклом.
Объектив имеет номенклатурный номер, по которому возможен его
заказ на заводе-изготовителе. Иногда на этой же строчке маркируется
и фирменный знак завода.
Для удобства работы стандартом.15О предусмотрена цветовая мар-
кировка надписи и цветной круговой полосы:
» по методам исследования и контрастирования — надпись;
» по увеличениям — полоса;
» по иммерсионным средам — полоса.
47
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
♦ Цветная маркировка всей надписи на корпусе означает:
черный цвет — базовый светлопольный вариант;
зеленый цвет — фазовые и Varel-объективы;
красный цвет — поляризационные объективы.
Цветное кольцо, расположенное ближе к основной надписи означа-
ет увеличение объектива, а именно:
черное 1х-1,25х;
серое 1,6х-2х;
коричневое 2,5х-3,2х;
красное 4х-5х;
оранжевое 6,3х-8х;
желтое 10х-12,5х;
светло-зеленое 16х-20х;
темно-зеленое 25х-32х;
голубое 40х-50х;
синее 63х-80х;
белое 100х - 125х - 160х.
Цветное кольцо, расположенное ближе к фронтальному компонен-
ту, означает тип иммерсии-.
без цвета — сухая система;
черное — масляная иммерсия;
белое — водная иммерсия;
оранжевое — глицериновая иммерсия;
красное — другой тип иммерсии.
На рис. 3.4. приведен классический пример надписей на корпусе
объективов последнего поколения.
Рис. 3.4. Маркировка современ-
ных объективов
Как ни странно, стоимость объектива мо-
жет быть определена .... по маркировке, если
понятна классификация объективов. Можно
сказать, что стоимость объектива включает
в себя стоимость используемых материалов
(стекла, клея, металла, просветляющих пок-
рытий и пр.), стоимость и качество изготов-
ления оптических и механических деталей,
а также точность сборки. Следует отметить,
что при сравнении однотипных объективов
ведущих фирм эта величина отличается не
более чем на + 5%. Все остальное — коммер-
ческая политика.
48
Глава 3 Объективы микроскопа для медико-биологических исследований
Рис. 3.5. Стоимостное сравнение однотипных ЮОх объективов разных по типу оптической коррекции и мето-
дам контрастирования:
1 - СP-"Achromat" 100x71.25 Oil (СП); 2 - CP-"Achromat" 100х/1.25 Oil Ph 3 (ФК); 3 - "А-Plan" 10Ох/1,25 Oil (СП); 4 - "А-Plan"
100x71,25 Oil Ph 3 (ФК); 5 - "Achroplan" 100x71.25 Oil (СПЛ 6 - "Achroplan" IOOx/1.25 Oil Ph 3 (ФК); 7- "Fluar" 100x7130 Oil
UV (СП, ультрафиолетовый); 8 - "Plan-Neofluar" 100x71.30 Oil (СП); 9 - EC "PIan-Neofluar" 100x71.30 СШ M27 (IC S-on-
тика, СП); 10-"Plan-Neofluar" 100x71.30 Oil Ph 3 (ФК); 11 - EC'Plan-Neofluar" 100x71.30 Oil Ph 3 M27(IC S-оптика, ФК);
12 - "Plan-Neofluar" 100x71.30-0.7 Oil kis (с ирисовой диафрагмой); 13 - "Plan-Apochromat" 100x/1.40 Oil (СП); 14 - "Plan-
Apochromat" 100x71.40 Oil DIC M27 (IC S-оптика; СП; ДИК); 15 - "alpha Plan-Fluar" 100x71.45 Oil (для метода TIRF).
Обозначения: СП - светлое поле; ФК - фазовый контраст; ДИК - дифференциально-интерференционный контраст.
На рис. 3.5 представлены графики стоимости объективов фирмы
Carl Zeiss по представленной выше классификации. Отметим, что срав-
нение идет в относительных, а не в абсолютных или условных едини-
цах. Важно понять, каково именно соотношение «цена-качество» в от-
работанных технологически объективах.
Казалось бы, объективы одинаковой оптической коррекции СР-
Achromat, А-Plan и Achroplan являются ахроматическими объекти-
вами плоского поля, однако стоимость их отличается один от дру-
гого почти в полтора раза. Это связано с тем, что объектив с одними
и теми же выходными параметрами (увеличение, числовая апертура,
тип оптической коррекции) можно выполнить из разных сортов сте-
кол, которые значительно отличаются по стоимости. При этом, если
стекло химически нестойкое1, то оно требует применения просвет-
ляющих покрытий с защитой и особого технологического процесса
обработки и центрировки. Отсюда и повышение стоимости при явно
улучшенном качестве изображения и светопропускания.
1 Обычно такие стекла обладают хорошими оптическими параметрами и светопропус-
канием.
49
IJI ABA 4
ОСВЕТИТЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ МИКРОСКОПОВ
Большой ошибкой при работе с микроскопом является недооценка значимости
осветительной системы: мощности источника света, типа лампы, конструкции и расчетного
качества осветительной системы, выходных параметров, применения различных методов
контрастирования, возможности проведения настроечных операций. Подобный подход
ведет к неправильному подбору не только класса сложности микроскопа, но и его типа для
разрешения проблем наблюдения, оценки и анализа объекта наблюдения.
4.1. ОСВЕТИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА МИКРОСКОПА
Осветительная система — это система линз, диафрагм и зеркал (при
необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и
полное заполнение апертуры объектива.
Как мы уже выяснили в состав осветительной системы входят:
• источник света;
• коллектор;
• конденсор.
Конструктивно систему можно разделить на две части.
Первая часть осветительной системы — источник света вместе с
коллектором. При этом, чем выше класс микроскопа, тем совершеннее
система.
Как оптический элемент коллектор может быть:
• однолинзовым элементом с асферической поверхностью;
• многолинзовой системой с качеством изображения близким к
дифракционному, то есть к качеству объектива1.
Многолинзовый коллектор может быть подвижным и осуществлять
перемещение вдоль оптической оси, увеличивая или уменьшая, таким
образом, размер изображения светящегося тела нити лампы. Коллектор
и источник света являются принадлежностью нижней (или верхней в ос-
ветителе отраженного света) частью штатива.
1 Исследовательские и универсальные модели последнего поколения серии «Axio»
50
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Современные коллекторы имеют как минимум одну линзу с асфери-
ческой поверхностью для уменьшения габаритного размера. Кроме того,
коллектор имеет поверхность с тонким матированием, что позволяет по-
высить равномерность освещенности в плоскости апертурной диафраг-
мы конденсора.
Коллектор люминесцентного осветителя выполнен из дорогостоя-
щего кварцевого стекла с целью повышения светопропускания в широ-
ком спектральном диапазоне.
С увеличением линейного поля в лабораторных и исследователь-
ско-универсальных моделях микроскопов появилась проблема уве-
личения светящегося тела накала. Возникло противоречие с мини-
мизацией габаритных размеров микроскопа в целом и осветительной
системой — в частности. В связи с этим были разработаны конструк-
ции с зеркалами как самих ламп, например, галогенной лампы 12В
35Вт, так и зеркал в узле крепления за лампой. Это позволило увели-
чивать, при необходимости, как размер нити, так и мощность свето-
вого потока за счет вписывания витков прямого и зеркального изоб-
ражения нити (12В 100Вт) или сдвоенного изображения светящегося
тела ртутной лампы.
Вторая часть осветительной системы — конденсор.1 Роль кон-
денсора в микроскопе проходящего света очень важна, поэтому, явля-
ясь комплектующей частью микроскопа, конденсор имеет собствен-
ную классификацию и параметры.
Конденсор — это оптическая система, предназначенная для увели-
чения количества света, поступающего в микроскоп. В микроскопах
проходящего света конденсор расположен между объектом (предмет-
ным столиком) и источником света (коллектором, зеркалом). В микро-
скопах отраженного света роль конденсора выполняет объектив.
Конденсоры различаются по типу оптической коррекции, число-
вой апертуре, рабочему расстоянию и назначению (для реализации
различных методов контрастирования).
4.2. ТИПЫ ОСВЕТИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ
Осветительные системы делятся на группы в зависимости от типа
источника света, а также конструкторского решения и принципа рас-
положения источника света относительно оптической оси собственно
микроскопа.
1 Положение конденсора в микроскопе проходящего света конструктивно было предло-
жено Карл Цейсу русским патологоанатомом Бабухиным Н.Н. в конце XIX в.
51
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Развитие световых микроскопов прошло несколько этапов, причем
немаловажную роль в этом сыграли источники света и осветительные
системы.
Источник света, будь то солнце, лампа накаливания, галогенная,
ртутная или ксеноновая, выполняет основную функцию — это освеще-
ние объекта микроскопического исследования таким образом, чтобы
точность его воспроизведения оптическими элементами микроскопа
в изображении по форме, разрешению и цвету была максимальной.
Условия выполнения этой функции связаны как с оптическими пара-
метрами осветительной системы, так и с электрическими параметрами
искусственного источника.
Габаритный размер и увеличения осветительной системы (оптики
коллекторной части и конденсора) связаны с формой и размером нити.
Это же можно сказать и собственно об источнике, мощность и габа-
ритные размеры которого влияют на параметры и габаритные размеры
блока питания лампы. При этом следует отметить, что все это оказыва-
ет влияние на габариты и дизайн самого микроскопа.
Равномерность освещенности и яркость в поле зрения микроскопа
(в плоскости изображения) определяется равномерностью освещения
объекта в плоскости предмета и равномерностью и полнотой заполне-
ния плоскости выходного зрачка микрообъектива изображением нити
лампы (источника света).
К учитываемым геометрическим параметрам ламп, применяемых в
микроскопах, относятся высота светового центра (точка, относительно
которой строится светораспределение лампы) и размер источника све-
та (длина светящейся части, диаметр спирали, площадь, заполненная
светящейся частью).
Для получения достаточно яркого и равномерно освещенного поля
микроскопа осветительная система и источник света должны обеспе-
чивать следующие электрические параметры:
• световой поток в плоскости предмета;
» световой поток, попадающий на сетчатку глаза или фотопленку;
• освещенность;
• максимальную силу света;
• яркость изображения;
• спектральную составляющую, то есть те линии спектра, которые
источник света выделяет.
В табл. 4.1 представлены типы осветительных систем.
Для обеспечения приведенных световых параметров в современных
микроскопах отечественного и зарубежного производства применяют-
52
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
ся, в основном, галогенные лампы и, чаще всего, производства фирмы
OSRAM (Германия) — б В 20 Вт, 6В 30 Вт; в лабораторных микроско-
пах — более мощные источники — 12 В 35 Вт — 50 Вт; в исследователь-
ских — 12 В 100 Вт. Срок службы долгосрочной галогенной лампы (6 В
20 Вт) составляет 1000 ч.; ртутной лампы (НВО 50) — 150 ч.; ртутной
лампы (НВОЮЗ) — 300 ч.
В настоящее время все больше входит в практику применение ди-
одных источников. Их использование в рабочих моделях, например,
Axiostar Plus, Carl Zeiss, DM LED, Leica, получило распространение в
конце 90-х годов (рис.4.1). Фирма HUND (Германия) на основе диодно-
го осветителя для дерматологии предложила свой вариант упрощен-
ного люминесцентного микроскопа мод. Medicus AFL (Fluorescence
dye Mykoval). В отечественной практике применяются осветители
полукустарных производств (типа ПО-01М). К сожалению, незнание
законов оптики и, в частности, положения осветительной системы
относительно конденсора приводит к искажениям цветопередачи и
формы объекта.
Диодный осветитель, которым комплектуется микроскоп Axio-
Imager, имеет следующие параметры: срок службы >10000 час, мощ-
ность — около 50W. Принцип Келера обеспечивает работу микроско-
па по методам светлого, темного поля и поляризации.
Основными критериями при выборе источника света обычно яв-
ляются:
♦ световой поток, излучаемый лампой при ее включении на номи-
нальное напряжение;
♦ максимальная сила света или яркость тела накала;
♦ стабильность светового потока лампы;
♦ цветовая температура лампы;
♦ пропускаемое оптическое излучение.
Для выравнивания света, как правило, применяются светофильтры.
В микроскопах, начиная с лабораторной модели (например, Axioskop),
Рис. 4.1.
Диодный осветитель:
а) к рабочему микроскопу
Axiostar, б) к исследова-
тельскому микроскопу
Axiolmager
53
Таблица 4.1
Типы осветительных систем
Группа с краткой качественной характеристикой Состав группы Характерные признаки
яркость ПОЛЯ в плоскости исследуемого объекта размер источника света
Группа 1 Естественный свет — неопределенность ус- ловий наблюдения Непосредственно солнечные лучи — солнечный «зай- чик» Достаточная яркость в ограни- ченный промежуток времени, одна- ко при неправильной настройке со- здаются блики Имеет случайные размеры
Дневной свет Неопределенная и обычно недоста- точная яркость, особенно при работе с объективами больших увеличений, однако обеспечивается достаточно высокая равномерность освещения Отсутствует
Группа 2 Искусственное осве- щение — постоянство условий наблюдения Потолочная лам- па накаливания или дневного ос- вещения Яркость недостаточная особенно при работе с объективами больших увеличений Определенность размеров не обеспечивает условий, требу- емых для нормального функ- ционирования микроскопа
Настольная лампа накаливания Яркость и освещенность доста- точные, много направленного вредного света, не участвующего в построении изображения То же
Специальный на- стольный освети- тель для микро- скопа (типа ОИ 19, 9М, 24.28, 32,35) Мощность источника света и его яркость подобраны в соответствии с требованиями оптики микроско- па 50-70х годов Габаритные размеры нити лампы являются основой га- баритного расчета освети- тельной системы микроскопа (коллектора и конденсора)
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
конструктивно в основании устанавлива-
ется система нейтральных фильтров с раз-
личными коэффициентами светопропуска-
ния. Последнее особенно важно, так как в
этом случае в микроскопе поддерживается
цветовая температура 3200°К, что позволя-
ет, не уменьшая яркости лампы, сохранять
цветопередачу.
Все современные микроскопы имеют
реостаты для изменения мощности напря-
жения или яркости свечения источника
света. В исследовательских и универсаль-
ных моделях прямых и инвертированных
микроскопов серии «Axio» имеется так на-
зываемый «менеджер света», который поз-
воляет фиксировать мощность источника
света не только по яркости освещаемого
поля, но и с помощью 10 диодных малога-
баритных ламп1.
4.3. КЛАССИФИКАЦИЯ КОНДЕНСОРОВ
Оптическая система конденсора пред-
назначена для увеличения количества све-
та, поступающего в микроскоп. Конденсор
располагается между объектом (предмет-
ным столиком) и осветителем (источником
света). Чаще всего в учебных и простых
микроскопах конденсор может быть выпол-
нен несъемным и неподвижным. В осталь-
ных случаях конденсор является съемной
частью и при настройке освещения имеет
фокусировочное перемещение вдоль опти-
ческой оси и центрировочное перемещение
перпендикулярное оптической оси. При
конденсоре всегда находится осветительная
апертурная ирисовая диафрагма.
1 Оригинальным решением дизайна менеджера све-
та в микроскопе Primostar (Carl Zeiss) является размеще-
ние диодных ламп по контуру штатива.
55
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Выходные параметры
• числовая апертура
• рабочее расстояние
• фокусное расстояние
• освещаемое линейное поле на предмете
• отношение к иммерсии
Конденсор |
Конструктивные особенности
• конструкция конденсора
• функциональна принадлежность
Тип конденсора
• принцип построения оптической схемы
• ахроматизация
• кривизна поля
• принцип конечной проекции
Рис. 4.2. Схема классификации параметров конденсора как основной части осветительной системы
Конденсор как основная часть осветительной системы имеет свою
классификацию (рис.4.2). Так же как и объектив, конденсор должен
быть рассчитан на применение его с различной толщиной предметно-
го стекла (дна посуды), с определенной расчетной корректировкой и
выходными техническими и конструктивными параметрами.
Выходные параметры конденсора
1. Числовая апертура:
малая числовая апертура, до 0,3;
средняя числовая апертура, до 0,6;
высокая числовая апертура, до 0,9 (1,25 с масляной иммерсией);
сверхбольшая числовая апертура, до 1,4 (с масляной иммерсией).
2. Рабочее расстояние, мм:
нормальное рабочее расстояние (0,5-7,0);
большое рабочее расстояние (7,0-35 мм);
сверхбольшое рабочее расстояние (35 мм и больше).
3. Фокусное расстояние1.
4. Освещаемое линейное поле на предмете1:
среднее линейное поле, до 20 мм;
большое линейное поле, до 25 мм;
сверхбольшое линейное поле, более 25 мм. 1 2
1 Ранее этот параметр маркировался на корпусе конденсора, а затем был внесен в
описание.
2 Освещаемое линейное поле определяется комплектом объективов, с которым рабо-
тает тот или иной конденсор и максимальным полем окуляра 10х. Например, если указано,
что конденсор работает с объективами увеличения начиная с 1х, то освещаемое поле будет
соответствовать линейному полю окуляра; если начиная с 10х — то освещаемое поле, со-
ответствующее расчету конденсора, будет равно (=) линейному полю окуляра деленному
(:) на увеличение объектива 10х.
56
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
5. Отношение к иммерсии:
сухие системы;
иммерсионные системы.
На корпусе конденсора маркируется числовая апертура конденсора
А 0,9/1,25. Дополнительно в инвертированных микроскопах может быть
нанесено рабочее расстояние и указание иммерсии, например, Oil.
По типу оптической конструкции конденсоры в зависимости от
таких составляющих как принцип построения оптической схемы, ах-
роматизация, кривизна поля, принцип конечной проекции, делятся на
следующие:
• простые конденсоры;
• конденсоры Аббе;
• ахроматические конденсоры;
• апланатические конденсоры;
• ахроматические апланатические конденсоры.
Расчет конденсора и его качество изображения напрямую связано со
* * стандартом толщины предметного стекла1.
На корпусе конденсоров зарубежных фирм может быть сделана мар-
кировка Ach, Apl. ach.
По конструктивным особенностям конденсоры могут быть клас-
сифицированы по нескольким параметрам.
1. Конструкция конденсора:
• единая конструкция;
• с подвижной фронтальной частью1 2: навинчивающейся, откиды-
вающейся или съемной;
• с откидывающейся линзой большого поля3;
• с регулируемой апертурной диафрагмой4;
• с плавной сменой увеличения5;
• со сменными элементами методов контрастирования: вставкой
с одним модуляционным элементом, вставкой горизонтального
1 Толщина покровного стекла является важной величиной для прямых микроскопов с
конденсорами числовой апертуры 0,9 и более.
2 Фронтальная часть конденсора обеспечивает числовую апертуру конденсора и осве-
щаемое поле на предмете.
3 Большое освещаемое поле может быть реализовано либо с помощью линзы большого
диаметра, расположенной снизу конденсора (например, ОИ 14), либо за счет съемной фрон-
тальной части конденсора.
4 Для изменения осветительной числовой апертуры.
5 Устаревшая конструкция конденсоров (до 70-х годов XX века), когда освещаемое поле
регулировалось за счет изменения увеличения конденсора.
57
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
перемещения, револьверным устройством с несколькими моду-
ляционными элементами1;
♦ с различным креплением (посадочным диаметром).
2. Функциональная принадлежность-.
♦ светлопольный конденсор — применяется только для светлого
поля или обеспечивает работу с различными методами контрас-
тирования с помощью вставок с модулирующими элементами;
♦ темнопольный конденсор — применяется только для работы по
методу темного поля с сухими и иммерсионными средами;
• универсальный конденсор — обеспечивает работу с различными
методами контрастирования с помощью револьверного устройс-
тва для крепления модулирующих элементов;
♦ поляризационный конденсор1 2.
Обозначения, в основном, относятся к конденсорам для различных
методов контрастирования:
СП (Н) — светлое поле;
ТП (D) — темное поле;
Ф/ФК/1,2,3 (Phi, Ph 2, Ph 3) — фазовый контраст;
ДИК (DIC/ I, II, III) — дифференциально-интерференционный
контраст;
П (Pol) — для исследований в поляризованном свете. Поляризаци-
онный конденсор дополнительно имеет красный цвет маркировки.
Конструктивно конденсор для прямого микроскопа проходящего
света может быть выполнен: с откидной или со свинчиваемой фрон-
тальной линзой (для увеличения числовой апертуры) или откидной
линзой большого поля. Максимальная числовая апертура — 1,4.
Конденсор является одним из основных элементов, обеспечиваю-
щих работу микроскопа по различным методам освещения и контрас-
тирования. Например:
♦ косое освещение связано с диафрагмированием света от края к
центру и смещением осветительной апертурой диафрагмы отно-
сительно оптической оси микроскопа;
♦ темное поле связано с максимальным диафрагмированием от
центра к краю осветительной апертуры;
• фазовый контраст связан с кольцевым освещением объекта, при
этом изображение светового кольца должно вписывается в фазо-
вое кольцо объектива.
1 Под модуляционным элементом понимается элемент, изменяющий форму светового
потока.
2 Конденсор для поляризационных измерений имеет линзы без натяжения.
58
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Рис. 4.3. Принципиальная схема конструкции конденсора проходящего света прямого микроскопа
Существует разница между конденсорами прямых и инвертирован-
ных микроскопов проходящего света. Связано это, естественно, со спе-
цификой работы с микроскопом. Для прямых микроскопов функция кон-
денсора сводится к освещению объекта, расположенного на предметном
стекле определенной толщины (1,1 мм) в соответствии с принятыми при-
нципами освещения. Объект является только предметом освещения и
наблюдения. Расстояние от фронтальной линзы конденсора до предмет-
ного стекла может составлять от 0,5 до 1,2 мм с накинутой фронтальной
линзой. При откинутой фронтальной линзе это расстояние может увели-
читься на порядок. Числовая апертура находится в пределах от 0,3 (без
фронтальной части) до 1,4 при работе с иммерсией (рис.4.3 и рис. 4.4).
В инвертированном микроскопе конденсор должен выполнять не-
сколько функций — обеспечивать не только освещение объекта в со-
ответствии с принятыми принципами и методами контрастирования,
но и работу пользователя с объектом, расположенным в пространстве
между фронтальной частью конденсора и предметным стеклом. Это
Рис. 4.4.
Универсальный конденсор:
а) рабочего и лабораторного
микроскопов светлого/тем-
ного поля и фазового конт-
раста; б)исследовательского
микроскопа светлого/темно-
го поля (Axiolmager)
59
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Рис. 4.5. Принципиальная схема конструкции конденсора проходящего света инвертированного микроскопа
возможно при сверхбольшом рабочем расстоянии конденсора. Рассто-
яние от предмета до фронтального компонента может находиться в
пределах: 50-200 мм, при числовой апертуре от 0,3 до 0,55 (максималь-
но возможная апертура при расстоянии около 5 мм — 0,70).
Конденсоры инвертированных микроскопов (рис.4.5 и 4.6) имеют
особую конструкцию, связанную с большим диаметром линз (40-
50 мм).
В современных микроскопах применяются различные материалы и
оптические элементы — конфигурации линз. В качестве рассеивающих
элементов, обеспечивающих равномерность освещенности больших
полей, могут применяться растровые линзы или типа линз Френеля.
Обычно для этих целей применяется матовое стекло, устанавливаемое
под конденсором. Единственным недостатком этого рассеивающего
элемента является то, что он задерживает 50% света. Если для мощно-
го источника света это незначительная величина, то для маломощных
ламп, устанавливаемых в рабочие модели, она существенна. Обычно
светофильтры устанавливаются, если свет «бликует». Но это происхо-
дит, по большей мере, из-за неправильной настройки освещения.
Рис. 4.6.
Универсальный конденсор:
а) светлого поля, фазового контраста,
варел-контраста - от рабоче-лабо-
раторного микроскопа Axiovert 40С;
6) светлого поля, фазового контраста,
ДИК - от исследовательского микро-
скопа Axiovert 200.
60
Глава 4 Осветительные системы микроскопов
Для бесперебойного функционирования современного микроскопа,
вернее его осветительной системы, очень важно, чтобы подключе-
ние к сети и состояние помещения соответствовали международным
стандартам, см. табл. 4.2.
Таблица 4.2
Требования к помещению и сети для двух типов микроскопов различных типов
и классов сложности
Характеристики Микроскопы
Axiovert 40С рабоче-лабораторный инвертированный мик- роскоп Axiolmager исследовательско-уни- версальный прямой мик- роскоп
Класс защиты I
Тип защиты IP 20
Электрическая безопасность по DIN EN 61010-1 (IEC 61010) с учетом предписаний CSA и UL no DIN EN 61010-1 (IEC 1010-1) c CSA и предписаний UL
Категория перенапряжения II
Подавление радиопомех по EN 55011 Класс В
Помехозащищенность по DIN EN 61326 /А 1
Сетевое напряжение от 100 до 240 V АС (±10%) от 100 до 127, от 200 до 240 V АС (±10%)
Сетевая частота от 50 до 60 Гц
Потребляемая мощность внут- реннего сетевого блока макс.10 VА макс.260 VA
Блок поджига ртутной лампы для НВО 50
Класс защиты I
Тип защиты IP 20
Диапазон сетевого напряжения 100, ПО, 120,127, 230, 240 V АС
Диапазон сетевой частоты 50 и 60 Гц
Потребляемая мощность при работе НВО 50 макс. 350 VA
Блок поджига ртутной лампы для НВО 100
Класс защиты I
Тип защиты IP 20
Сетевое напряжение 100 VAC ...240 VAC
Сетевая частота 50 / 60 Hz
Потребляемая мощность при работе с НВО 100 155 VA
Предохранители по IEC 127
Штатив микроскопа Т1 A/H,5x20 мм Т 5 А/Н/250 V; 5 х 20 мм
Блок поджига ртутной лампы mbq 52 ac-z для НВО 50 100 V, 127 V:2xT4A Т 6,3 А/Н/ 250 V; 5 х 20 мм
61
ГЛАВА 5
СИСТЕМЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
Мало создать изображение, важно его увидеть, визуализировать. При этом восприятие не должно
вызывать болезненных ощущений, а также обеспечивать нормальное документирование на
фотопленке или экране монитора. К сожалению, почему-то некоторые пользователи считают
нормальным самостоятельно выводить изображение из микроскопа на камеры. Да, действитель-
но, можно взять втулку с установленной на одном конце камерой и присоединить ее к любому
выходу микроскопа: окулярной трубке, как с окуляром, так и без него, или к нормальному фото-
видеовыходу. Но тогда не стоит удивляться тому, что край поля искажен, да и цвет не соответству-
ет действительности.
В микроскопе все оптические элементы имеют жестко определенное и выставленное
местоположение. Для визуализации наиболее важным является тот факт, что выходной
зрачок микроскопа должен совпадать с входным зрачком глаза, если речь идет о глазе, или
плоскость изображения микроскопа должна совпадать с плоскостью чувствительного элемента
(фотопленки или матрицы камеры).
5.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ВИЗУАЛЬНЫХ НАСАДОК
Системы визуализации можно классифицировать по принципу фик-
сирования изображения с помощью различных носителей: оптическо-
го, бумажного (пленочного) и электронного.
С помощью оптического носителя передача изображения осущест-
вляется через оптический элемент — окуляр. При этом приемник изоб-
ражения — выходной зрачок микроскопа, а визуализация — через глаз.
С помощью бумажного (пленочного) носителя передача изобра-
жения осуществляется через фотоаппарат/киноаппарат с объективом
или без, при этом приемник изображения — фото- и кинопленка; визу-
ализация — фотография/кино/телеэкран.
С помощью электронного носителя передача изображения осу-
ществляется через цифровую/аналоговую систему, при этом приемник
изображения — матрица, визуализация — через экран (монитор).
Классическим модулем, с помощью которого происходит визуали-
зация, является визуальная насадка.
62
Рис. 5.1.
Визуальные насадки:
а) монокулярная и биноку-
лярная насадки с диоптрий-
ной наводкой на резкость
на окулярной трубке; б) би-
нокулярная насадка сдвумя
фото- видеовыходами
По выходным параметрам визуальные насадки можно отнести
к трем типам.
Первый тип. В зависимости от количества выходов визуальные на-
садки подразделяются на: монокулярные, бинокулярные и бинокуляр-
ные с фото- и видеовыхо^ом. (тринокулярные1, т.е. с одним или двумя
дополнительными выходами) (рис. 5.1).
В свою очередь бинокулярные насадки с фото- видеовыходом в за-
висимости от количества переключений делятся на:
♦ одноступенчатые — с постоянным со-
стоянием визуального наблюдения и
документирования (обычное деление:
30% — визуальное наблюдение и 70% —
документирование);
♦ двухступенчатые — с одним переклю-
чением и двумя положениями (100% —
визуальное и 0% — документирование;
0% — визуальное и 100% — документи-
рованное);
♦ трехступенчатые — с двумя переклю-
чениями и тремя положениями (100% :
0%; 50% : 50%; 0% : 100%.
В отличие от старой классификации в сов-
ременной есть еще один признак, связанный с
тем, что фото- видеовыход может быть орга-
низован не на визуальной насадке, а в штативе
микроскопа. В ходе лучей визуального канала
Рис. 5.2.
Штатив микроскопа Axiovert 200
с пятью фото- видеовыходами
1 Тринокулярные насадки (тринокуляры) — устаревший термин, т.к. раньше для про-
екции изображения на фотопленку использовались окуляры, в том числе и отрицательные
(гамалы). В связи с переходом на цифровые фотоаппараты окуляры заменили адаптерами,
поэтому правильнее говорить о дополнительном фото- видеовыходе (порте), который тех-
нологически выполняется на визуальной насадке (бинокулярной или монокулярной).
63
Глава 5 Системы визуализации
устанавливается отклоняющее зеркало, что |
позволяет уменьшить стоимость микро-
скопа.
Таким образом, фото- видеовыходы
можно подразделить на расположенные: в '-iJB1' /
бинокулярной насадке, на штативе микро- __у
скопа (фронтальный, правосторонний и/
или левосторонний) и выход снизу основа- Рис 5.3. Визуальная насадка с пере-
ния (рис. 5.2). мещением окулярных трубок
Второй тип. В зависимости от высоты
взора1 визуальные насадки могут иметь:
♦ постоянную высоту, при этом по наклону окулярных трубок на-
садки делятся на прямые насадки (0°; 90°) и имеющие постоянный
угол наклона (45°; 30°);
• переменную высоту, при этом насадки делятся на насадки с пере-
менным углом наклона окулярных трубок и с переменной высотой
окулярных трубок1 2 (рис. 5.3).
Третий тип. По максимальному линейному полю окуляров визуальные
насадки делятся на следующие:
♦ обычные (линейное поле окуляров 10х до 20 мм);
♦ широкопольные (линейное поле окуляров 10х до 23 мм);
♦ сверхширокополъные насадки (линейное поле окуляров 10х —
25 мм и выше).
По типу оптической конструкции визуальные насадки делятся на:
зеркальные, зеркально-призменные и призменные насадки. При этом
насадки могут быть как с прямым изображением, так и перевернутым.
По типу механической конструкции установки глазной базы насад-
ки могут быть: с горизонтальным перемещением окулярных трубок и с
разворотом окулярных трубок.
При этом они могут делиться на насадки с подвижными и неподвиж-
ными окулярными трубками3.
В качестве корпусных материалов для уменьшения стоимости наса-
док все чаще применяется пластмасса или металлизированная пласт-
масса, что приводит к уменьшению срока службы насадок. На рис. 5.4
1 Положение окулярных трубок относительно глаз наблюдателя.
2 За счет перемещения всей насадки по вертикали или за счет разворота окулярных тру-
бок вокруг оси.
3 Перемещения каждой окулярной трубки связаны: 1) с компенсацией оптического хода
лучей в процессе установки глазной базы (обычно в насадках с горизонтальным перемеще-
нием); 2) с диоптрийной наводкой на резкость при компенсации зрения наблюдателя (в ус-
таревших моделях микроскопов конструкции до 80-х годов прошлого века).
64
Глава 5 Системы визуализации
Рис 5.4. График функционально-стоимостного анализа визуальных насадок (данные указаны в табл. 5.1)
Таблица 5.1
Цифровые данные функционально-стоимостного анализа визуальных насадок
Позиция Угол наклона окулярной трубки / макси- мальное линейное поле окуляра, которое может пропустить оптика бинокулярной насадки визуального канала Наличие фото- виде- овыхода и дополни- тельных конструктив- ных особенностей
1 45720 нет
2 30723 нет
3 45720 100:0 / 0:100
4 30720 нет
5 30720 30:70
6 30720 100:0 / 0:100
7 30723 30:70
8 20723 нет
9 20723 100:0 / 0:100
10 20723 100:0/0:100 Ergo Горизонт.
11 6-25723 100:0 / 0:100
12 30725 100:0 / 50:50 / 0:100
13 30725 100:0 / 50:50 / 0:100 2 выхода
65
Глава 5 Системы визуализации
Рис 5.5.
Двойная насадка для обучения
специалистов
в относительных единицах приведена тенденция изменения стоимости
насадок в зависимости от классификации и сложности конструкции1.
В таблице 1. приведены значения позиций графика.
Насадки обеспечивают возможность наблюдения:
♦ одним пользователем;
♦ двумя наблюдателями1 2 при помощи двойных насадок (рис.5.5);
♦ несколькими наблюдателями (от 3-х до 9) при помощи насадок с
дополнительными визуальными выходами (вправо и/или влево)
для установки удаленных на расстоянии визуальных насадок.
Не редко малоквалифицированные менеджеры по продажам зарубежных
микроскопов, не зная особенностей оптической схемы микроскопа, но, же-
лая удовлетворить требования заказчика, за меньшую стоимость комплекту-
ют микроскопы насадками, например, пропускающими линейное поле 20 мм,
и окулярами 10х с линейным полем большим, например, 22 мм. В этом случае
наблюдается по краям поля зрения затемнение (виньетирование), что повы-
шает утомляемость глаз.
5.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ОКУЛЯРОВ
Окуляры предназначены для построения микроскопического изоб-
ражения на сетчатке глаза наблюдателя (рис. 5.6). Окуляры выполняют
1 Тенденция рассматривается на примере насадок фирмы Карл Цейсс, хотя при рассмот-
рении классификаций это не играет роли, т.к. при усложнении конструкции любого модуля
тенденция к росту цены одинакова для всех фирм.
2 Обучающие насадки по качеству изображения (разрешению и цветопередаче) значи-
тельно лучше, чем проекция на экран монитора компьютера или телевизора. Двойная на-
садка или основная насадка для обучающего центра обычно имеет светящуюся подвижную
стрелку для показа.
бб
Глава 5 Системы визуализации
Рис. 5.6.
Конструкция окуляра:
1 - плоскость изображения
(плоскость сетки); 2 - полевая
диафрагма; 3 - линзы; 4 - плос-
кость входного зрачка глаза
наблюдателя и выходного зрачка
микроскопа; 5 - корпус окуляра.
функцию лупы, то есть увеличивают изображение без внесения допол-
нительного разрешения.
Окуляры состоят из двух групп линз: глазной — ближайшей к глазу
наблюдателя, и полевой — ближайшей к плоскости изображения, в ко-
торой объектив строит изображение рассматриваемого объекта.
Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и
объективы (рис. 5.7).
По отношению к хроматическим аберрациям окуляры делятся на:
♦ компенсационные, т.е. окуляры, имеющие оптическую коррек-
цию, которая при совместной работе с объективами, имеющими
ХРУ свыше 0,3%, обеспечивают изображение без цветной каймы
вокруг объектов;
♦ без компенсационного действия (ХРУ=0%).
Оптическая коррекция окуляров связана с необходимостью работы
с объективами плоского поля. Корректировка окуляра по полю отмеча-
ется маркировкой «РЬ» или «ПЛАН».
По линейным полям окуляры делятся на:
♦ обычные (с окулярным числом1 до 180 мм);
♦ широкоугольные (с окулярным числом до 200);
♦ сверх широкоугольные (с окулярным числом более 200).
Окуляры могут быть с небольшим выносом выходного зрачка (5-
7 мм от поверхности глазной линзы) и с вынесенным зрачком для рабо-
ты в очках и без них (более 15 мм от поверхности глазной линзы).
Функционально окуляры могут быть предназначены для наблюде-
ния и проекции (фото-окуляры, гамалы).
1 Окулярное число равно произведению увеличения окуляра на его линейное поле.
67
Глава 5 Системы визуализации
Рис.5.8. Схема классификации окуляров по групповым признакам
Рис. 5.7. Схема классификации окуляров по группам признаков
Конструктивно окуляры могут быть выполнены с жестко закреп-
ленными элементами и с подвижными элементами. Подвижные линзо-
вые элементы предназначены как для получения резкого изображения
для глаза (диоптрийная наводка на плоскость изображения), так и для
создания дополнительного плавного изменения увеличения (zoom-оку-
ляры1). Диоптрийная наводка может осуществляться при настройке на
резкое изображение сетки (микрометра).
Поляризационные окуляры, предназначенные для поляризацион-
ных измерений, имеют конструктивный элемент на корпусе, фиксиру-
ющий положение окуляра в окулярной трубке насадки.
Современная маркировка окуляров предусматривает, кроме ука-
зания линейного увеличения окуляра, размер видимого поля изобра-
жения (линейное поле в мм), например, 10х/18, 16х/16. Маркировка
наносится на фронтальную (переднюю часть) окуляра или по верхней
образующей корпуса окуляра.
Там же маркируются дополнительные сведения: работа в очках
(символом в виде очков) или «foe.» — фокусировочный (передвижной)
элемент внутри окуляра для наводки на резкость изображения сетки
окуляра, а также тип оптической коррекции (PL, WPL) или компенса-
ция хроматической разности увеличения (К).
1 В 90-х годах 20 века проф. Л.Н. Андреевым (ГОИ им. Вавилова С.И. — ЛИТМО, СПб)
были рассчитаны zoom-окуляры 10х - 16х для школьных микроскопов. Окуляры были внед-
рены на Феодосийском оптическом заводе (ФОЗ), мод. УШМ.
68
ГЛАВА б
Ш жШШЩЖШШЖШ
’ЛАЙ; ж??
КАК ВЫБРАТЬ МИКРОСКОП
Понятие «парк микроскопов», близко понятию «парк автомобилей»: и тот и другой вид
продукции тесно связан с человеком, с его потребностями, психологией, понятием
«комфортности» и... консерватизмом. Огромное разнообразие личных желаний и требований
профессии, стилей и моды, психологии и логики породили широкий выбор автомобилей и...
микроскопов.
6.1. КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРОСКОПОВ ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Классификация микроскопов неразрывно связана с классификаци-
ей объекта, способом его освещения, а также с принципом построения
изображения и требованиями комфортности наблюдений (табл. 6.1).
Попробуем разобраться в огромном разнообразии микроскопов,
при этом будем рассматривать каждый вид, отмечая его отличитель-
ные признаки.
Первый признак: объект исследования.
По этому признаку микроскопы можно разделить на следующие ос-
новные виды'.
микроскопы плоского поля — это микроскопы, оптическая схема
которых обеспечивает воспроизведение объекта в двумерном про-
странстве — двумерное изображение (по координатам Х-У/пло-
щадь). Объекты исследования — тонкие, в среднем, толщиной от
10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих
микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в
пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освеще-
ния (эффекты косого освещения, фазового контраста, дифферен-
циально-интерференционного контраста);
стереоскопические микроскопы — это микроскопы, оптическая
схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмер-
ном пространстве — объемное, трехмерное изображение (по коор-
динатам X-Y-Z/объем). Объекты исследования — габаритные, в
69
Таблица 6.1
Классификация световых микроскопов
Микроскопы Характеристика объекта
Тип Подтип Вид
А) Микроско- пы ПЛОСКОГО поля (двухмер- ное изображе- ние объекта) Микроскопы прохо- дящего света «биоло- гические микроско- пы» Микроскопы прохо- дящего и отражен- ного света (прямые и инвертированные Прямые биологичес- кие микроскопы Прозрачные и полу- прозрачные объекты
Инвертированные (пе- ревернутые) биологи- ческие микроскопы
Микроскопы отра- женного света «ме- таллографические микроскопы»
Прямые металлогра- фические микроскопы Полупрозрачные объ- екты и непрозрачные объекты с различными коэффициентами отра- жения
Инвертированные (пе- ревернутые) металло- графические микро- скопы
Б) Стереоско- пические мик- роскопы (объ- емное ИЛИ трехмерное изображение объекта) Микроскопы прохо- дящего и падающе- го света (для медико- биологических целей) Микроскопы про- ходящего, отражен- ного и падающего света Прямые микроскопы Полупрозрачные объ- екты и непрозрачные объекты с различными коэффициентами отра- жения
Микроскопы отра- женного и падающего света (для техничес- ких целей)
Глава б Как выбрать микроскоп
Глава 6 Как выбрать микроскоп
среднем, толщиной от 100 мм до 1 мм, просматриваемый слой по
высоте/глубине — от 50 мм до 0,5 мм. В этих микроскопах можно
наблюдать и плоские объекты.
Для удобства работы с объектами или в зависимости от условия
их размещения (специальная посуда, термокамера) микроскопы конс-
труктивно могут быть выполнены в двух вариантах:
прямые микроскопы (классическое построение схемы микроско-
па) сконструированы таким образом, что наблюдательная часть
микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) расположена свер-
ху объекта. Это относится как к микроскопам плоского поля, так и
к стереомикроскопам;
инвертированные микроскопы (перевернутое построение схемы
микроскопа) — сконструированы таким образом, что наблюдатель-
ная часть микроскопа (бинокулярная насадка с окулярами) располо-
жена снизу объекта. Этот конструктивный признак относится толь-
ко к микроскопам плоского поля.
Второй признак: конструкция осветительной системы микроскопа.
В зависимости от способа освещения все рассмотренные выше типы
микроскопов можно разделить следующим образом:
микроскопы проходящего света (классические микроскопы для
биолого-медицинских исследований), основной принцип освеще-
ния в которых связан с тем, что свет проходит через объект. С
помощью микроскопов проходящего света плоского поля, которые
могут быть как прямыми, так и инвертированными, а также сте-
реоскопическими, можно рассматривать прозрачные и полупро-
зрачные объекты;
микроскопы отраженного света (металлографические микро-
скопы), основной принцип освещения в которых связан с тем, что
свет падает на объект и отражается от него. На микроскопах
отраженного света плоского поля, которые могут быть как прямы-
ми, так и инвертированными, а также стереоскопическими, иссле-
дуются объекты непрозрачные, с различной степенью отражающей
способности, и полупрозрачные. Существуют два вида микроско-
пов отраженного света, связанные с освещением объекта с помо-
щью объектива и вне него;
собственно микроскопы отраженного света, в которых свет про-
ходит через оптическую систему микроскопа (в том числе, и объ-
ектив, как часть осветительной системы), отражается от объекта, и
вновь проходит через оптическую систему микроскопа (объектив,
71
Глава 6 Как выбрать микроскоп
как основной элемент, воспроизводящий увеличенное изображение
объекта);
микроскопы падающего света, в которых свет «падает» на объ-
ект, минуя оптическую систему микроскопа (объектив), отражает-
ся от объекта и проходит через оптическую систему микроскопа
(объектив).
В основном микроскопы падающего света — это стереоскопические
микроскопы. Правда, иногда в отечественной практике люминесцент-
ные микроскопы плоского поля с осветителем отраженного света от-
носят к микроскопам, работающим в падающем свете. Дело в том, что
мы рассматриваем изображение, построенное не совсем тем световым
потоком, который прошел через оптическую систему микроскопа от
источника света и отразился от объекта. А вторичным, который поя-
вился в результате воздействия на объект. Строго говоря, речь идет об
одном и том же световом потоке, только объект освещается одной дли-
ной волны, а изображение строится другой.
Обе основные осветительные системы могут быть конструктивно
объединены, тогда микроскоп становится микроскопом проходящего
и отраженного света. Обычно это исследовательские или универсаль-
ные микроскопы.
Третий признак: принцип построения изображения.
В основном, это связано с физико-химическими явлениями, кото-
рые возникают при воздействии светового потока на объект или препа-
рат, приготовленный специальным способом. При этом световой поток
также может быть подвержен изменению, как по форме, так и по своим
физическим свойствам. В таком случае микроскопы можно разделить
следующим образом.
Микроскопы светлого поля обеспечивают следующую картину —
на светлом фоне более темное изображение объекта.
Основные условия освещения: это обычный прямо проходящий
свет, изменения в котором могут быть связаны только с длиной
волны светового потока, определяемой применением в освети-
тельной системе широкополосных светофильтров из обычного
цветного стекла. Редко используются узкополосные специаль-
ные светофильтры (интерференционные).
Классическая схема подобного микроскопа делает его базовым для
обеспечения условий получения различных методов контрастирования.
Еще лет 25 тому назад (в 70-е годы) можно было увидеть целую гамму
специальных микроскопов, которая выглядела следующим образом.
72
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Микроскопы с методом косого освещения обеспечивают следую-
щую картину — на сером фоне можно наблюдать контрастное изоб-
ражение объекта с неровным по толщине контуром.
Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет
частично перекрывается до того, как попадает на объект.
Микроскопы с методом темного поля1 гарантируют такое изобра-
жение — на темном фоне можно наблюдать более светлое изображе-
ние объекта или ярко блестящий контур объекта.
Основные условия освещения: а) в микроскопах проходящего све-
та — обычный прямо проходящий свет полностью перекрывает-
ся до того, как попадает на объект; б) в микроскопах отраженно-
го света — обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму
с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной
зрачок объектива.
Микроскопы с методом фазового контраста1 2 (самый популярный
микроскоп для биолого-медицинских исследований прозрачных
слабоконтрастных объектов) дают возможность с максимальной
степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне
более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по
контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом
контрасте картина обратная.
Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет
перекрывается, но в два этапа — часть света до объекта, а затем
после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослабле-
нием. При этом свет в виде светового кольца определенной пло-
щади проходит через объект, а затем после объекта — через по-
лупрозрачное кольцо в объективе.
Однако для практической работы не всегда требуются такие узко-
специализированные микроскопы. Тем более что реализация указан-
ных методов контрастирования изображения объекта реализуется
достаточно просто и, практически, только в пределах изменений в од-
ном узле — конденсоре. Проще выпускать один конкретный съемный
узел или дополнительное устройство (если изменения касаются еще,
например и объективов, как в фазовом контрасте). Проблемы стали
решаться еще проще, когда появился новый принцип конструирова-
ния — модульный, который обеспечивает полную взаимозаменяе-
мость узлов, как кубиков-модулей. Применение различных модулей
1 Термин «темнопольный микроскоп».
2 Термин «фазовый микроскоп». Кстати, термин «иммерсионный микроскоп» относил-
ся к микроскопу с иммерсионным объективом.
73
Глава б Как выбрать микроскоп
для методов контрастирования расширяют функциональные возмож-
ности базовой модели проходящего или отраженного света, позволяя
создавать именно ту модель, которая наилучшим способом удовлет-
воряет требованиям пользователя.
И все же в парке микроскопов есть место для специализирован-
ных микроскопов, которые, несмотря на модульность конструкций,
все же имеют собственное название и определяют свою группу. Ме-
тоды исследования в этих микроскопах реализуются значительно
большим количеством узлов и деталей (кроме объективов и конден-
соров).
Люминесцентные микроскопы обеспечивают возможность на-
блюдения на темном фоне свечения объектов.
Основные условия освещения: обычный прямо падающий свет
определенной длины волны попадает на объект, изображение
объекта строится в другой длине волны; выделение соответс-
твующих областей спектра происходит с помощью сложной
системы блоков интерференционных светофильтров.
Поляризационные микроскопы в общем случае обеспечивают на-
блюдение на сером или темном фоне разноцветного, четкого или
контрастного изображения.
Основные условия освещения: обычный прямо проходящий свет
с помощью поляризатора в осветительной системе превращается
в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью ана-
лизатора происходит выделение из структуры изображения тех
элементов, которые связаны с анизотропией объекта.
Микроскопы этого типа имеют вариант, который в последнее время
формируется на базе микроскопа светлого поля.
Микроскопы дифференциально-интерференционного конт-
раста или интерференционного контраста, обеспечивающие на-
блюдение на однотонном цветном фоне яркого цветного «объем-
ного» изображения или изображения того же цвета, что и фон, но
с окантовкой из другого цвета.
Основные условия освещения: обычный прямо проходящий
свет с помощью поляризатора в осветительной системе пре-
вращается в линейно-поляризованный свет, после объекта
с помощью специальной призмы (или другого специального
элемента) и анализатора происходит создание объемного (в
пределах глубины резкости объектива) цветного контрастного
изображения независимо от того, является ли объект анизот-
ропным или нет.
74
Глава б Как выбрать микроскоп
Эта группа микроскопов существует как самостоятельно, так и
в виде модуля (дополнительных принадлежностей — специальных
призм, которые устанавливаются для объективов и конденсоров)
Ультрафиолетовые микроскопы и инфракрасные микроскопы —
освещение и наблюдение изображения объекта с помощью элект-
ронно-оптических преобразователей (ЭОПов) вне видимого спект-
рального диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.
Рассмотренное разделение в одинаковой степени относится как к мик-
роскопам плоского поля прямым и инвертированным, так и к стереомик-
роскопам, а также к микроскопам проходящего и отраженного света.
Четвертый признак: способ наблюдения, документирования и
анализа изображения:
Обычные микроскопы, в которых изображение фиксируется и
анализируется глазами человека; с помощью дополнительных съем-
ных приспособлений можно выводить изображение на телеэкран и
монитор, на фотопленку.
Фотомикроскопы — это сложная фотосистема, она встроена в схе-
му микроскопа (причем не одна, а две-три), работает с помощью
полностью автоматизированной системы настройки, в микроскопе
может быть осуществлена передача изображения на ТВ-зкран, и мо-
жет производиться видеозапись.
Анализаторы изображения (аппаратно-програмные комплексы) —
это комплекс оборудования, в котором изображение фиксируется,
передается с помощью аналоговых или цифровых камер и анализи-
руется в системе компьютера, обрабатывающего изображение по
определенной программе.
Микроскопы проекционные, в которых проекция изображения
осуществляется непосредственно на специальный большой экран
(система обычного наблюдения с помощью окуляров отсутствует),
при этом разработки конструкций и технологий изготовления экра-
на направлены на получение такого разрешения элементов изобра-
жения объекта, которое было бы приближено к разрешению обыч-
ного микроскопа.
Микроскопы сравнения, оптические системы, в которых обеспе-
чивают объединение в одном поле видения двух изображений, полу-
ченных с помощью двух разных микроскопов, при этом два изобра-
жения могут накладываться друг на друга или располагаться рядом,
занимая какую-либо часть поля.
75
Глава б Как выбрать микроскоп
Микроскопы-спектрофотометры, в которых производится измерение
оптической плотности, светопропускания или светоотражения участка
объекта в спектральном диапазоне обычно от 300 нм до 700 нм. Это
происходит с помощью фотометрических насадок, включающих ФЭУ
(фотоэлектрические умножители) и системы диафрагм, ограничиваю-
щих фотометрируемый (изучаемый) участок на объекте, а также специ-
ального монохроматора, выделяющего необходимую длину волны.
Развитие современной науки, техники и технологии ведет к усовер-
шенствованию световых микроскопов, приближая их по разрешению и
созданию изображения к электронным микроскопам. Все чаще встре-
чаются такое словосочетание: лазерный сканирующий микроскоп, кон-
фокальный микроскоп и туннельный микроскоп. В них используется
принцип послойного сканирования изображения с различным шагом
по глубине и площади с помощью лазерного луча или обычного пучка
света минимального (точечного) размера. Шаг сканирования объекта
по глубине может составлять доли микрона: чем он меньше, тем точ-
нее воспроизводится объемный рельеф объекта. Оптико-механическая
конструкция и электронная схема микроскопов, формирующая скани-
рующий пучок, достаточно сложные и точные в изготовлении.
6.2. КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРОСКОПОВ ПО СЛОЖНОСТИ КОНСТРУКЦИИ
И СООТНОШЕНИЮ «ЦЕНА-КАЧЕСТВО»
Классификация микроскопов была бы неполной, если бы мы забы-
ли об экономическом аспекте. Естественно, что микроскопы, как лю-
бой наукоемкий прибор, имеют свой класс точности, который связан с
уровнем сложности конструкции, качеством изображения и управле-
ния микроскопом, что тесным образом связано с их потребительским
функционально-стоимостным назначением. Что в свою очередь оказы-
вает влияние на серийность и цену.
Микроскопы могут быть разделены на следующие группы по клас-
сам сложности в зависимости от функции (табл. 6.2).
ГРУППА 1. МИКРОСКОПЫ-ИГРУШКИ
<Д. Основная функция, которую должны выполнять микроскопы этой груп-
пы, проста — занять ребенка, правда, в эти микроскопы с большим удо-
вольствием «играют» и взрослые. В этих микроскопах интересно то, что:
• они легкие, миниатюрное повторение настоящих микроскопов;
♦ качество изображение в них порой на уровне обычных;
76
Таблица 6.2
Классификация прямых микроскопов по сложности конструкции
Признаки Учебные Рабочие Лабораторные Исследовательские 1 Универсальные
Длина тубуса микроскопа (а- т.) Группа А (разработки до 80-х годов XX в) Конечная длина тубуса — 160 мм
Группа Б (раз- работки 90-х годов XX в) «бесконечность» Специальная оп- тика Длина тубуса — «бесконечность» (“) Единый комплект
Хроматичес- кая разность увеличения — ХРУ (отсутс- твие повыша- ет контраст и разрешение) Группа А (разработки до 80-х годов ХХв) наличие ХРУ (компенсационные окуляры)
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) ХРУ=0 Специальная оп- тика ХРУ=0 Единый комплект
Мощность источника света (тип лампы) Группа А (разработки до 80-х годов ХХв) Накаливания до 12 - 30Вт Галогенные 6В 20 - 30 Вт Галогенные 12В 35-50 Вт Галогенные — 12В 100Вт
Ртутные — 50Вт, (отечественные — 250 Вт) Ртутные — 50Вт, 100Вт Ксеноновые — 75 Вт Ртутные — 50Вт, 100Вт Ксеноновые — 75-100 Вт
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Галогенные — 6 В 30 Вт Галогенные — 6В 20 — 30 Вт Диодные — 30 Вт Галогенные — 12В 35-50 Вт Галогенные — 12В 100Вт Диодные — 100 Вт С волоконным световодом — 100 Вт (галогенная лампа)
Глава б Как выбрать микроскоп
Таблица 6.2 (Продолжение)
Признаки Учебные Рабочие Лабораторные Исследовательские | Универсальные
Диодные — 30 Вт Ртутные — 50Вт Ртутные — 50Вт, 100Вт; Ксеноновые — 75 Вт Ртутные — 50Вт, 100Вт С волоконным световодом — 100Вт (ртутная лампа) Ксеноновые — 75-100 Вт
Система ос- вещения Группа А (разработки до 80-х годов XX в.) Зеркало, Наклад- ной осветитель. Встроенный уп- рощенный осве- титель с мало- мощным источ- ником света(без реостата) Встроенный укоро- ченный осветитель с реостатом Встроенный ос- ветитель с ре- остатом для из- менения ярко- сти источника света Встроенный осветитель с реостатом для изменения яркости источника света
Встроенный осветитель с реостатом для изменения яркости источника света Автоматическая система настройки ос- вещения
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Зеркало.Встро- енный упрощен- ный осветитель с маломощным ис- точником света (без реостата)
Реализация принципа Ке- лера (точнос- ти воспро- изведения изображения объекта по форме, цвету, оптической плотности) Группа А (разработки до 80-х гг. XX в.) нет Предустановлен- ное освещение по Келеру Настраиваемое освещение по Келеру
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Предустановлен- ное Настраиваемое Настраиваемое освещение по Келеру Настраиваемое освещение по Келеру (ручное) Автоматическая настройка по Келеру
Глава б Как выбрать микроскоп
Таблица 6.2 (Продолжение)
Признаки Учебные Рабочие Лабораторные Исследовательские | Универсальные
Исправление искажений осветитель- ной системы по качеству изображения Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) не исправлено не исправлено улучшено по качеству изображения
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) улучшено по ка- честву изобра- жения улучшено по качест- ву изображения частично ис- правлено (ахро- матизована) Исправлено (ахроматизована)
Линейное поле окуля- ра 10х Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) До 15 мм 18-20 мм 20-23 мм 23-25 мм
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) 18-20 мм
Визуальная насадка Монокулярная Бинокулярная Бинокулярная насадка, бинокулярная насадка с фотовидеовыходом (триноку- лярная)
Угол накло- на окулярной трубки Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) 45’ 45’ 30’ Не более 30’ 30’-20’, 0°-20° (переменный угол наклона)
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) 45’, 30’
Диоптрийная наводка(для выравнивания изображения одного Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) Конструктивно установлено в левой окулярной трубке бинокулярной насадки
Глава б Как выбрать микроскоп
о
Таблица 6.2 (Продолжение)
00
Признаки Учебные Рабочие Лабораторные Исследовательские | Универсальные
глаза относи- тельно дру- гого) Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Конструктивно установлено в окуляре
Револьвер- ное устройс- тво для креп- ления объек- тивов Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) на 3-4 объектива на 4-5 объективов на 5-6 объективов
на 4—5 объективов на 5-6 объек- тивов на 6-7 объективов (ручное); на 6-7 объективов (кодированное или автоматическое);
Методы ис- следования и контрастиро- вания Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) Светлое поле Светлое поле Темное поле Фазовый контраст Люминесценция Поляризация Светлое поле Темное поле Фазовый контраст Люминесценция Поляризация
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Светлое поле Для одного объ- ектива: - темное поле - фазовый контраст Светлое поле Темное поле Фазовый контраст Люминесценция Поляризация Светлое поле Темное поле Фазовый кон- траст Переменный контраст (varel) Люминесцен- ция Поляризация Светлое поле Темное поле Фазовый контраст Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) Люминесценция Поляризация
Предметный стол Группа А (разработки до 80-х годов ХХв.) Простой с клем- мами для крепле- ния препарата Координатный ме- ханический с препа- ратоводителем Координатный механический с препаратоводителем Поворотный (на 210°-270°) механический с препаратово- дителем Вращающийся (на 360°) механический с препаратоводи- телем
Глава б Как выбрать микроскоп
Таблица 6.2 (Окончание)
00
Признаки Учебные Рабочие Лабораторные Исследовательские Универсальные
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Координатный механический с препаратоводи- телем Координатный механический с препаратоводителем Координатный моторизованный с препаратоводителем Поворотный (на 210°-240°) механический с препаратово- дителем Вращающийся (на 360°) механический с препаратоводи- телем
Тип оптичес- кий коррек- ции объек- тива Группа А (разработки до 80-х годов XX в.) Ахромат Ахромат с улучшенным по полю изоб- ражением; Планахроматы Планахроматы; План-неофлюары; Планапохроматы
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Планахромат Планахроматы Планахроматы; План-неофлю- ары;
Материа- лы основных корпусных деталей Группа А (разработки до 80-х годов XX в.) Металл; Металлизиро- ванная пласт- масса; Пластмасса Металлизированная пластмасса (корпус) — бинокулярная насадка Металлизированная пластмасса (корпус) — окуляра
Группа Б (раз- работки с 90-х годов XX в) Металлизированная пластмасса (корпус) — бинокулярная насадка, конденсор, окуляр, осветительная система Металлизированная пластмасса (корпус) — бинокулярная насадка Металлизированная пластмасса (корпус) — окуляра
Модульность / вариантность конструкции нет Модульные конструкции
Глава 6 Как вы!
Глава 6 Как выбрать микроскоп
• конструктивно и функционально микроскопы могут быть выпол-
нены значительно «интереснее»: плавное изменение окулярного
увеличения, проекция изображения на малогабаритный экран, за-
крепленный на микроскопе, или на стену1;
• массовое производство и очень низкие цены подобных микроско-
пов диктуют простоту конструкции;
• не соблюдаются требования международных технических стандартов;
• часто оптика и механика выполняются из пластмассы и металлизи-
рованной пластмассы;
• микроскопы рассчитаны на минимальный срок службы.
Микроскопы-игрушки имитируют микроскопы светлого поля про-
ходящего света и падающего, могут быть плоского поля, за рубежом
встречаются стереомикроскопы.
ГРУППА 2. ШКОЛЬНЫЕ ИЛИ УЧЕБНЫЕ МИКРОСКОПЫ
<& Основная функция — обучение с помощью микроскопов, в основ-
** ном, естественным наукам в школах, гимназиях и колледжах. Не-
смотря на то, что эти микроскопы также относятся к разряду мас-
совых по производству:
♦ цена их на порядок, а то и больше, превышает стоимость предыду-
щей группы микроскопов; выходные и технологические параметры
микроскопов соответствуют принятым стандартам;
♦ оптика стеклянная, механика частично металлическая;
♦ специфичность применяемости этой группы микроскопов, обязы-
вает разрабатывать такие конструкции, которые имеют минимум
съемных элементов. Несъемными обычно бывают зеркало, объек-
тивы и окуляры;
♦ микроскопы рассчитаны на достаточно короткий срок службы до 5
лет с учетом того, что на них учатся работать, а значит, могут час-
то выводить из строя.
Школьные микроскопы практически обеспечивают только один ме-
тод исследования (светлое поле) в проходящем свете на микроскопе
плоского поля.
1 Хорошо известны микроскопы АНААИТ, выпускаемые ОАО ЛОМО. Расчет оптики
был выполнен д.т.н. Ивановой Г.А. В отличие от тайваньского аналога микроскоп имеет диф-
ракционное (высокое) качество изображения
82
Глава 6 Как выбрать микроскоп
ГРУППА 3. СТУДЕНЧЕСКИЕ ИЛИ РУТИННЫЕ1 МИКРОСКОПЫ
Функции микроскопов этой группы сводятся либо к профессио-
** нальной подготовке специалистов, либо к обеспечению рутинных,
постоянных, однообразных работ в соответствующих областях
науки и техники.
Крупносерийное производство подобного вида микроскопов, а,
главное, разнообразие решаемых ими задач, заставляет периодически
пересматривать конструкции, усовершенствуя и упрощая при этом тех-
нологию их изготовления.
Следует отметить особенность, которая связана с современным
уровнем обучения (скорее, это больше относится к дальнему зару-
бежью): улучшается качество изображения, даваемое микроскопами, за
счет применения оптики с улучшенной коррекцией аберраций по полю,
что и ведет к постепенному удорожанию этого класса микроскопов.
Кроме того, микроскопы позволяют пользователю иметь наивысшую
производительность труда.
Группа рутинных микроскопов включает в себя микроскопы прохо-
дящего света с обеспечением методов фазового контраста и темного
поля для биологии и медицины.
ГРУППА 4. РАБОЧИЕ МИКРОСКОПЫ
Функционально это особая группа микроскопов, которая несет всю
** тяжесть ответственности повседневной работы. С помощью рабочих
микроскопов ставится диагноз и выдается окончательный резуль-
тат, который можно при необходимости задокументировать — это
промежуточная группа между предыдущей (рутинными) и последу-
ющей (лабораторными микроскопами). Стоимость йх увеличивается
за счет повышения качества изображения всей оптической системы
микроскопа и точности механических узлов. Они должны быть про-
сты настолько, чтобы оптико-механическая конструкция обеспечи-
вала наименьшее количество настроечных операций, особенно свя-
занных с освещением и методами исследования, при этом должно
быть отличное качество изображения по полю.
1 Название «Рутинные микроскопы» (routine) в зарубежных каталогах несут несколько
другую смысловую нагрузку, чем в России. У нас — это упрощенные микроскопы, постоянно
находящиеся в работе. За рубежом — это микроскопы любого класса сложности, выполняю-
щие повседневную работу. Эта путаница приводит к тому, что пользователь хочет купить ру-
тинный микроскоп (подразумевая рабочий за 2,5-5 тыс. Евро, например, и удивляется, когда
не очень квалифицированные менеджеры предлагают микроскопы по стоимости 10-15 тыс.
Евро или наоборот.
83
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Группа рабочих микроскопов включает практически все типы: плос-
кого поля и стереоскопические, проходящего и отраженного света
светлого и темного поля, фазового и дифференциально-интерферен-
ционного контраста, люминесцентные и поляризационные, прямые и
инвертированные, анализаторы изображения.
ГРУППА б. ЛАБОРАТОРНЫЕ МИКРОСКОПЫ
Функция группы микроскопов достаточно расплывчата на данный мо-
* мент развития микроскопии. Пожалуй, их можно охарактеризовать
следующим образом — последняя по сложности модель, которая мо-
жет быть использована в практической медицине на стадии повсед-
невных исследований и простая модель для научно-исследовательских
работ. Это обычно средние по габаритам модели, по качеству изобра-
жения близкие как к рабочим, так и к исследовательским моделям (все
зависит от желания пользователя и его финансовых возможностей).
Отличительным признаком можно назвать и наличие нескольких мо-
дулей для контрастирования и обязательно модуля для документиро-
вания. Серийность подобных микроскопов обычно невысока по срав-
нению с исследовательскими микроскопами.
ГРУППЫ 7 И 8. ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЕ И УНИВЕРСАЛЬНЫЕ МИКРОСКОПЫ
Основная функция этой группы микроскопов — обеспечение проведе-
* ния научно-исследовательских работ по «полной» программе с макси-
мально возможным количеством перестраиваемых модулей, обеспече-
ние работы с набором высококлассной оптики предельных параметров
широчайшего выбора. Естественно, что стоимость подобных наукоем-
ких приборов значительна. И, конечно, бессмысленно работать на по-
добных штативах простой оптикой или только одним методом.
Группы микроскопов с 3 по 8 входят в основные товарные группы
для медико-биологических работ в практической и научно-исследова-
тельской потребительской области.
6.3. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К МИКРОСКОПАМ
ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
Для решения биолого-медицинских задач в процессе проведения
микробиологических исследований микроскоп должен обладать следу-
ющими основными требованиями:
84
Глава 6 Как выбрать микроскоп
1. Тип микроскопа должен обеспечивать проведение качественной
настройки освещения объекта с соответствующими требования-
ми реализации принципа Келера.
Точность воспроизведения результатов исследования в значитель-
ной степени связана с решением проблем освещения. Фирма Карл Цейсс
единственная фирма, использующая традиционные материалы для
корпусных деталей осветителя, что позволяет при естественном повы-
шенном температурном режиме не вносить искажений в световой по-
ток за счет изменения формы деталей. Укороченная форма осветителя
в моделей АКСИОСТАР экономична и эргономично решает проблему
освещения по Келеру, а также обеспечивает свободный доступ к лампе и
простоту ее замены. Кроме того, принцип размещения стабилизирован-
ного блока питания в пирамидальном штативе микроскопа гарантирует
надежность работы блока питания при перепадах напряжения.
2. Качество объективов микроскопа должно обеспечивать работу
таким образом, чтобы увеличивать производительность труда и
уменьшать усилия, связанные с распознаванием объекта и его об-
наружением, при этом резкость изображения должна сохраняться
по всему полю видения, а цветопередача в изображении объекта
должна поддерживаться осветительной системой микроскопа.
Микроскопы МИКМЕД 1, 2 (АОМО), ВМЕ/СМЕ (Аейка) и
СН20/30/40 (Олимпус) являются экономичными микроскопами по ка-
честву изображения, относящиеся к микроскопам третьего/четвертого
поколения. Имеют длину тубуса 160 мм, при этом оптика осветитель-
ной системы и объективов не исправлены по хроматическим аберра-
циям (не компенсированы цветовые искажения). Это явление хорошо
заметно при правильно настроенном освещении во время наблюдения
нативных (неокрашенных) препаратов и при исследовании по методам
фазового контраста и темного поля, и сказывается на разрешающей
способности всего микроскопа.
Параметры (увеличение окуляров и всего микроскопа в целом) не
соответствуют стандартам ИСО 9001.
Пользователи бывшего СССР привыкли к таким окулярам, как
5х, 15х, что обеспечивало наблюдение объектов при общем увеличе-
нии микроскопа 450х и 1350х (с масляной иммерсией) и бООх (сухие
системы) в монокулярных микроскопах, а также 675х (с масляной
иммерсией) в бинокулярных микроскопах. Однако современный уро-
вень оптики микроскопа пятого поколения обеспечивает качественное
изображение не за счет применения дополнительных окуляров указан-
ных выше увеличений, а за счет совместной работы окуляра 10х и всех
85
Глава 6 Как выбрать микроскоп
типов объективов (400х, бЗОх и 1000х) в сочетании с высоким качест-
вом осветительной системы.
Сложность комплектации рутинных лабораторий связана, прежде
всего, с финансовым положением медицинских учреждений. И как не
хотелось бы иметь микроскопы высокого класса в обычных лаборато-
риях, однако условие покупки диктует класс микроскопа.
В среднем стоимости биологических микроскопов светлого поля
на сегодняшний день (на дворе 2006 год) находятся на уровне:
• учебные микроскопы (для школ) — $ 200-500 (не всегда по качес-
тву изготовления подходят даже для простого просмотра);
• студенческие микроскопы1 — $ 500-900 (могут подойти для
фельдшеров);
• рабочие микроскопы — $1,0-3,5 тыс. (могут быть базовыми для
основных исследований в КДЛ, для врачей-лаборантов);
• лабораторные микроскопы — $5,0-10,0 тыс. (для ответственных
исследований; для врачей-лаборантов и зав. лабораторий);
• исследовательские микроскопы — $6,0-15,0тыс. и универсаль-
ные микроскопы — $6,0-25,0 тыс. (для методических и научно-
исследовательских работ).
Примером самых распространенных групп микроскопов (учебных
и рабочих микроскопов), чаще всего встречающихся в тендерных заяв-
ках, а также предметом сомнений «покупать — не покупать» являются
перечисленные ниже модели (табл. 6.3).
6.4. ВЫБОР МИКРОСКОПА ДЛЯ РЕШЕНИЯ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ЗАДАЧ В КДЛ
Для того чтобы микроскоп удовлетворял двум основным требова-
ниям «цена/качество», которые постоянно вступают в противоречие,
целесообразно ответить на несколько вопросов, связанных с выбором.
Выбор микроскопа обычно ассоциируется:
• с технологическим процессом того, кто на нем работает,
• со способностью завода-изготовителя технически обеспечить
этот процесс, выдерживая соответствующую планку соотноше-
ния «качество-цена».
Отсюда и следует та основная задача, которую предстоит решать
вам, оставшись наедине с огромным парком микроскопов мирового
уровня.
1 Группа студенческих микроскопов по качеству изображения выше, чем учебные (для
школ).
86
Таблица б.З
Основные модели современных микроскопов (учебные и рабочие модели)
Класс слож- ности ЛОМО, Санкт- Петербург Карл Цейсс, Германия Фирма-прода- вец SMT GmbH Micros, Австрия Leica, Германия Nikon, Япония Olympus Япония
Учебные и студенчес- кие МИКМЕД 1 класс оптики 70-х годов PrimoStar последнее поколение, серия с 2006 г. МахМопо MaxBino класс оптики 80-х годов МС ЮМ МС 20М МС 20 МС 50 класс оптики 70-х годов CM Е2 ВМ Е2 DM Е2 класс оптики 80-х годов YS 50 класс оптики 80-х го- дов СН20 класс оптики 80-х го- дов
S200 класс оптики 80-х годов
Рабочие МИКМЕД 51 класс оптики 90-х годов Triton класс оптики 70-х годов МС 100 МС 200 МС 300 МС 400 класс оптики 70-х годов DM LS2 DM LB2 последнее поколение YS 100 класс оп- тики 80-х годов СХ21 СХ31 послед- нее поко- ление
Topic в,т,с (класс оптики 80-х годов) МСХ 300 МСХ 400 класс оптики 80-х годов 50i послед- нее по- коление, нестан дартная оптика
МИКМЕД 2 класс оптики 80-х годов Axiostar plus последнее поколение Medicut класс оптики 80-х годов MCD 500 класс оптики 80-х годов
Vb365 Wilocyt послед- нее поколение —
Н 600 послед- нее поколение —
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Глава 6 Как выбрать микроскоп
йЕД Попробуйте воспользоваться предлагаемыми житейскими подхода-
• • ми и практическими советами:
• прочитайте внимательно эту книгу;
♦ четко представьте себе, какого рода работу выполняете Вы и Ваш
микроскоп;
• четко поймите цель покупки микроскопов;
♦ оцените финансовые возможности.
В таблице 6.4 представлен небольшой тест для покупателя, продавца
или менеджера. Ответив положительно на один из вариантов ответов
каждой группы, вы сможете подобрать нужный класс микроскопа по
соотношению «цена-качество».
Микроскоп проходящего света для медицины и биологии предна-
значен для наблюдения в проходящем свете светлом поле окрашенных
и неокрашенных мазков крови, препаратов костного мозга, осадков
мочи, клеточных концентратов, тканевых биотитов, гистологических
срезов, водорослей, воды и так далее, и так далее.
При гематологическом исследовании с помощью микроскопа про-
водится ряд операций, например:
• обзорный просмотр препаратов;
• дифференцирование клеток по форме, структуре ядра и цитоп-
лазме;
• обнаружение нормальных и патологических структур эритро-
цитов,
• выявление малодифференцированных и атипичных клеток;
• подсчет форменных элементов крови;
• определение лейкоцитарной формулы.
В табл. 6.5 представлены типы работ, которые могут наблюдаться в
практической медицине при микроскопических исследованиях.
Для каждого типа работ в мировой практике микроскопостро-
ения предусмотрены свои конструкции микроскопов и концепции
построения параметрического ряда. В настоящее время в отечест-
венной практике наблюдается некое несоответствие в комплектации
и использовании парка микроскопов. Если в 70-х годах наши лабо-
ратории клиник и больниц, а также научных институтов были уком-
плектованы современным по тем временам отечественным обору-
дованием, то в настоящее время наблюдается явное отставание от
мировых тенденций.
88
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Таблица 6.4
Принцип подбора микроскопа
Группа Основной при- знак Подгруппа Параметр подгруппы
Группа 1 Производи- тельность тру- да рутинная работа каждый день не менее 5 часов
постоянная работа каждый день 2-3 часа
периодическая работа 1-2 дня в неделю
разовая работа не более 3-5 раз в месяц
Группа 2 Технология ра- боты с микро- скопом просмотр материала по принципу «да-нет»
анализ отобранного ма- териала определение диагноза
экспресс-анализ в экс- тренных ситуациях выдача рекомендации и определение диагноза
научный анализ и ис- следования методические решения
Группа 3 Квалификация начинающий, студент
фельдшер, лаборант
врач-лаборант
зав. лабораторией, кандидат медицинских наук и т.д.
Группа 4 Уровень работы традиционные методики
разработка новых методик, апробация новых расходных материалов, экспертная оценка
то же с учетом возможности дооснащения мик- роскопа (модули методов контрастирования, ана- лизатор изображения, документирование)
Группа 5 Экономика дооснащение лаборатории
переоснащение лаборатории в рамках существу- ющих объемов и методик
оснащение лаборатории с целью соответствия мировому уровню, высшей категории или для проведения работ по контролю качества/серти- фикации (референц-лаборатория).
оснащение новой лаборатории традиционного направления
оснащение лаборатории нового направления
89
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Таблица 6.5
Типы работ при микроскопических исследованиях в практической медицине
Рутинные работы 1-го рода Рутинные работы 2-го рода Лабораторные ра- боты Исследователь- ские работы
Занятость 6-8 ч. в сутки Занятость 6 ч. в сутки Занятость не ме- нее 10 ч. в неделю Занятость не бо- лее 10 ч. в неделю
Работа максимум в двух диапазонах увеличения (2-мя объективами) Работа не менее чем в двух диапа- зонах увеличения Работа не более чем в четырех диапазонах уве- личения Диапазон увели- чений не ограни- чен
Исследование од- ним методом ис- следования Исследование не менее чем двумя методами исследо- вания, один из ко- торых может быть специальным Исследования не менее чем дву- мя методами ис- следования, в том числе и специаль- ными Количество ме- тодов исследова- ния не ограни- чено
Нет документи- рования Возможность фотографирова- ния (камера руч- ная или полуавто- матическая) Фотографирова- ние (полуавто- матические и ав- томатические камеры) Фотографирова- ние (автоматичес- кая камера)
Нет необходи- мости в анализе изображения Возможен анализ изображения Анализ изобра- жения
6.5. ОСНОВНЫЕ ПРИЗНАКИ ПОСЛЕДНЕГО ПОКОЛЕНИЯ МИКРОСКОПОВ
В 1846 году Карл Цейсс впервые в мире приступил к серийному
выпуску микроскопов, стремясь создать такое производство, которое
позволило бы врачу или биологу в любом месте земного шара поста-
вить диагноз и идентифицировать с одинаковой точностью и высокой
степенью повторяемости.
За свои 160 лет существования серийного производства микроско-
построение пережило пять поколений. Естественно, что достижения
разработок предыдущего поколения переходили составляющими эле-
ментами в следующее. В табл. 6.6 выделены те признаки, которые со-
хранились в последнем поколении из предыдущих.
В отечественной практике трудно назвать конкретную законченную
модель соответствующую определенному поколению. Практически все
микроскопы имеют элементы предыдущего поколения или по дизайну,
или по стандартизованным параметрам, или по конструкции.
90
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Таблица б.б
Поколение Основные задачи, решаемые поколением Основные признаки поколения
До начала серийного производс- тва достижение 100% повторя- емости получаемого в мик- роскопе изображения в результате совершенного тех- нологического процесса рас- чета и изготовления удовлетворение требований современной науки и техники конструкция качество изображения качество освещения методы исследования
1-е разработка теории образова- ния изображения разработка принципов матема- тического расчета оптических систем разработка комплекта стекол разработка технологического процесса изготовления оптико- механических узлов реализация основных методов исследования для биолого-ме- дицинских исследований единый технологический про- цесс производства единый дизайн основных узлов и штатива определенной серии микроскопов примитивная модульность конс- трукции осветительная система с ис- кусственным источником осве- щения методы исследования: темное поле, косое освещение, фазо- вый контраст
П-е стандартизация выходных параметров конечная длина тубуса 160 мм, высота объектива 33 мм высота окуляра 13 мм планоптика флюоритовые системы микрофотография поляризационная микроско- пия изменение дизайна приборов
Ш-е увеличение выходных пара- метров микроскопа унификация приборов повышение качества изображе- ния за счет выравнивание хро- матической разности увеличе- ния в комплекте объективов с применением компенсацион- ных окуляров повышение качества изображе- ния за счет совершенствования осветительных систем высота объектива 45 мм ХРУ объективов 2% линейное поле окуляров 18-20 мм вынесенная плоскость выходно- го зрачка микроскопа для обес- печения работы в очках увеличенные числовые аперту- ры объективов фотометрия люминесцентный метод иссле- дования встроенные системы освещения системы анализа изображения
91
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Таблица б.б (окончание)
Поколение Основные задачи, решаемые поколением Основные признаки поколения
автофокусировка автоматизация процессов уп- равления освещением галогенные и ртутные лампы зеркальные рефлекторы в осве- тителе большие рабочие расстояния в объективах коаксиальные рукоятки управ- ления изменение дизайна приборов
IV-e повышение качества изображе- ния за счет исключения хрома- тической разности увеличения в комплекте объективов с при- менением окуляров Гюйгенса повышение разрешающей спо- собности ХРУ объективов 0% только бинокулярные системы наблюдения сверхбольшие линейные поля (более 20 мм) длина тубуса «бесконечность» высота окуляров 10 мм диоптрийная настройка с по- мощью подвижного элемента в окуляре дифференциально-интерфе- ренционный метод исследова- ния в проходящем свете модульность конструкций системы обработки изображе- ния сканирующие столы лазерная сканирующая микро- скопия изменение дизайна приборов
V-e расширение зоны общения ахроматизация осветительной системы единый принцип построения конструкции всего ряда микро- скопов всех классов сложности (от простой до универсальной), единый стандарт телемедицина
92
Глава 6 Как выбрать микроскоп
Например, микроскоп МБИ15 является переходной между 2-м и 3-м
поколениями: длина тубуса 160 мм, двойная высота объективов (33 мм
и 45 мм), малая величина линейного поля окуляров (15 мм для окуляра
10х), сдвоенные комплекты окуляров (компенсационные и Гюйгенса),
планоптика и оптика с большой кривизной поля, люминесценция, по-
ляризация, фотография.
Микроскоп МИКМЕД 2 является переходной моделью между 3-м
и 4-м поколениями. Его признаки: длина тубуса 160 мм, высота объ-
ективов 45 мм, встроенная система освещения, коаксиальные рукоят-
ки управления, бинокулярные системы, улучшенные по полю ахрома-
ты, линейное поле 18 мм для окуляров 10х, высота окуляров 13 мм, но
объективы имеют хроматизм увеличения 0,8 % и требуют применения
компенсационного окуляра. Это единственная модель отечественного
биологического микроскопа, наиболее отвечающая требованиям 4-го
поколения.
Микроскоп ЛЮМАМ РПО является переходной моделью между 4-м
и 5-м поколениями: длина тубуса «бесконечность», высота объективов
45 мм и окуляров — 13 мм, линейное поле окуляров 18 мм, встроенная
система освещения, ХРУ объективов — 0 %, люминесценция, вариант
с объективами больших числовых апертур. Это единственная модель,
близкая к 5-ому поколению среди отечественных биологических мик-
роскопов.
Таким образом, признаками поколения микроскопов, входящих
в XXI век являются:
1. Технологический процесс завода-изготовителя соответствует
международному стандарту качества ISO 9001.
2. Основные технические характеристики микроскопа соответс-
твуют пакету международных стандартов качества ISO 9000,
стандартизуют такие основные параметры, как:
• длина тубуса микроскопа — «бесконечность»;
• оптика микроскопа (объективы, окуляры, промежуточная
система) — свободная от хроматической разности увеличе-
ния (отсутствуют цветные искажения);
• высота объективов — 45 мм;
• стандартный ряд увеличений (например, для объективов:
1,25х-2,5х-5х (4х)х-10х-25х (20х)-50хх(40х)-63х-100х).
Кроме того, в стандарте определены основные требования к тех-
нологии изготовления и параметрам:
• покровного стекла (номинал 0,17 мм);
• предметного стекла (номинал 1,1 мм);
93
Глава 6 Как выбрать микроскоп
• иммерсионного масла;
• требования к присоединительным размерам, в том числе, в
узлах крепления объективов и окуляров;
• маркировка на корпусе объектива и окуляра;
• требования к технологии изготовления предметных столов,
элементов поляризационного и люминесцентного микро-
скопов.
3. Микроскопы всей линейки подчинены единому принципу конс-
труирования и дизайна.
4. Модульность конструкций.
5. Осветительная система обеспечивает реализацию принципа
Келера (наличие в конструкции микроскопа регулируемых диа-
фрагм — полевой и апертурной регулируемого конденсора).
6. Рукоятки управления фокусировкой (точная и грубая) или пред-
метным столом (по направлениям X-Y) — коаксиальные, т. е.
расположенные на одной оси.
7. Диоптрийная наводка на резкое изображение в бинокулярной
насадке осуществляется с помощью подвижного элемента в оку-
ляре, а не с помощью механизма, расположенного на окулярной
трубке насадки (например, в моделях АУ 12, или МИКМЕД 2).
8. Линейные поля окуляров 10х — от 18 мм до 25 мм.
94
ГЛАВА 7
ПРЯМЫЕ МИКРОСКОПЫ
ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И КОНТРАСТИРОВАНИЯ
Основным методом наблюдения для всех типов микроскопов является метод светлого поля:
в поле зрения на светлом фоне наблюдается контрастное однотонное или естественное цветное
изображение объекта.
Современные микроскопы всегда можно доукомплектовать модулями традиционных методов
контрастирования, связанных с изменением интенсивности света различными способами.
Это относится к таким методам исследования, как:
• косое освещение,
• темное поле,
• фазовый контраст,
• дифференцитально-интерференционный контраст ДИК (сочетание эффекта фазового
контраста и исследования в поляризованном свете),
• варел-контраст, переменный контраст (плавный переход от метода темного поля к методу
фазового контраста), а также:
• к исследованиям в поляризованных лучах;
• к исследованиям в свете люминесценции.
В названиях современных микроскопов отсутствуют ссылки на применяемые в них модули,
реализующие традиционные методы контрастирования. О люминесцентной микроскопии мы
будем говорить отдельно.
7.1. МЕТОД СВЕТЛОГО ПОЛЯ.
НАСТРОЙКА ОСВЕЩЕНИЯ ПО КЕЛЕРУ
Этот метод является основным — все остальные методы исследова-
ния и контрастирования настраиваются после получения качественно-
го изображения объекта с помощью реализации принципа Келера.
95
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исслед
|трастирования
Рис 7.1.
Обучение на микроскопах:
а) Аксиоскоп 40 с двойной насадкой; б) комплекс с 9-ю наблюдателями
(базовый микроскоп Аксископ 40); в) маркер для обозначения места
на предмете; г) светящаяся стрелка на изображении люминесцирую-
щего объекта
Обнаруженный в светлом поле объект может в дальнейшем марки-
роваться, а затем демонстрироваться с помощью другого метода конт-
растирования (рис. 7.1).
Все методы контрастирования настраиваются только после того,
* как микроскоп изначально будет настроен по принципу Келера!
Настройка микроскопа связана с правильным освещением плос-
кости предмета, с необходимостью установки (центрирования) нити
лампы (источник света) и всех оптических элементов микроскопа по
единой оптической оси.
Принцип Келера заключается в том, что осветительная система
микроскопа (источник света, коллектор, конденсор) устанавливается
на одну оптическую ось с собственно оптикой микроскопа (объекти-
вом, окуляром). Для этого имеются две материальные диафрагмы, ко-
торые физически видимы — в отличие от оптической оси, которая не
видна. Это полевая диафрагма, установленная на штативе микроскопа
вблизи осветителя (источника света и коллектора), и апертурная диа-
фрагма, смонтированная внутри конденсора.
96
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис. 7.2.
Примеры влияния неправильной
настройки на изображение:
а) засветка в изображении;
а, б) хроматическая аберрация
и засветка
Рис. 7.3. Неправильная настройка освещения. При отцентрированной осветительной системе, но опущенном
конденсоре, происходит исчезновение элементов объекта и появление бликов (б, в):
а) конденсор находится в поднятом положении; б) апертурная диафрагма зажата, конденсор опущен;
в) апертурная диафрагма открыта, введен цветной светофильтр, кондесор опущен
При неправильной настройке освещения наблюдаются явления,
связанные с искажением объекта по форме, цвету. Неправильная на-
стройка освещения по-разному влияет на качество изображения (см.
рис. 7.2 и рис. 7.3).
Настройка освещения по Келеру должна проводиться в начале рабо-
чего дня и перед ответственными исследованиями.
Порядок проведения настройки (рис. 7.4)
1. Получить резкое изображение препарата с помощью объектива
среднего увеличения 10х-20х.
2. Прикрыть полевую диафрагму.
3. С помощью фокусировочного механизма конденсора («) полу-
чить резкое изображение полевой диафрагмы1 (б).
1 Если при фокусировке полевая диафрагма выходит из поля видения, то следует ее приотк-
рыть и с помощью центрировочных винтов привести в центр, получить ее резкое изображение.
Операция повторяется до тех пор, пока резкое изображение прикрытой полевой диафрагмы не
окажется в центре поля видения.
97
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис. 7.4. Порядок настройки освещения по Келеру
98
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
4. С помощью центрировочных винтов конденсора (в) привести
изображение полевой диафрагмы в центр поля видения (г).
5. Раскрыть полевую диафрагму на основании до размера поля зре-
ния микроскопа (Э).
6. Открыть апертурную диафрагму конденсора по выходному зрач-
ку объектива, для чего вместо окуляра поставить точечную диа-
фрагму (или дополнительный микроскоп МИР-4) и, наблюдая за
ярким пятном в микроскопе, открыть апертурную диафрагму в
размер этого пятна (е).
7. Для улучшения контраста изображения рекомендуется открыть
апертурную диафрагму конденсора на 80% относительно вы-
ходного зрачка объектива, для чего вместо окуляра поставить
точечную диафрагму (или дополнительный микроскоп МИР-4)
и, наблюдая за ярким пятном в микроскопе, прикрыть апертур-
ную диафрагму на величину не более, чем Уз от размера этого
пятна (ж, з).
рекоменАации
* * 1. При появлении бликов, рефлексов, блесткости, снижении конт-
раста — проверьте правильность настройки освещения в поряд-
ке, указанном выше.
2. Все операции проводятся при сфокусированном на объект мик-
роскопе. При настройке плотный объект должен быть выведен из
поля зрения, т. е. после получения резкого изображения объекта,
предметное стекло смещается препаратоводителем таким обра-
зом, чтобы поле зрения под объективом было прозрачным.
3. При работе с объективами больших увеличений (от 20х и выше)
рекомендуется применять конденсор с числовой апертурой
А = 0,9/1,25 (1,4); а с объективами 10х и меньше— конденсор с
числовой апертурой А = 0,3.
Новое поколение отечественных и зарубежных микроскопов во
встроенных осветительных системах имеют самоцентрирующиеся га-
логенные лампы. Кроме того, настройка (фокусировка) нити лампы
в апертурную диафрагму конденсора производится на заводе-изгото-
вителе.
Гарантом получения изображения, максимально приближенного по
форме, цвету и разрешению к объекту наблюдения, является правиль-
но настроенное освещение. Свет должен проходить через объект, если
не требуется дополнительного его контрастирования.
99
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Основным правилом, которое должно быть усвоено, является цент-
** ральное положение апертурной диафрагмы конденсора, если на шта-
тиве микроскопа отсутствует полевая диафрагма.
& Для этого необходимо сделать следующую контрольную проверку:
1. вынуть из окулярной трубки окуляр;
2. закрыть апертурную диафрагму на Уг видимого поля;
3. установить дополнительный микроскоп, например, МИР4 в оку-
лярную трубку или положить на верхний срез окулярной трубки
лист белой бумаги с точечной диафрагмой1;
4. если апертурная диафрагма при ее медленном раскрытии оказа-
лась в центре (т. е. края диафрагмы равномерно раскрываются), то
осветительная система может считаться отцентрированной;
5. если при этом источник света (нить лампы накаливания) находит-
ся в центре светящегося видимого поля, следовательно, и источ-
ник света отцентрирован. В противном случае необходимо пере-
мещением лампы привести нить в центр поля.
Если источником света является протяженная лампа дневного света
или просто настольная лампа, а осветитель состоит из осветительного
зеркала и конденсора, то действия должны быть аналогичными — вы-
нуть окуляр, проверить центрировку апертурной диафрагмы и поло-
жение источника света. Центрировка источника света в этом случае
осуществляется с помощью зеркала. С конденсором сложнее, так как
обычно в этих конденсорах отсутствуют центрировочные винты и тре-
буются специальные ключи для проведения операции центрировки.
7.2. МЕТОД ТЕМНОГО ПОЛЯ. НАСТРОЙКА МИКРОСКОПА
ДЛЯ РАБОТЫ ПО МЕТОДУ ТЕМНОГО ПОЛЯ
Метод основан на эффекте, который достигается освещением объ-
** екта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна
превосходить числовую апертуру применяемого объектива.
Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив: при
отсутствии объекта видимое поле в микроскопе будет темным, а при
его наличии будет наблюдаться следующая картина — на темном фоне
1 Точечная диафрагма может быть выполнена с помощью иголки.
100
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис. 7.5. Оптическая схема получения эффекта темного
поля:
а - с помощью диафрагмы, расположенной в плоскости
апертурной диафрагмы, при этом создается световой поток,
который не попадает в объектив; 6-с помощью диафрагмы,
расположенной в плоскости апертурной диафрагмы конденсора
и ирисовой диафрагмы, расположенной в объективе;
1 - диафрагма темного поля (плоскость апертурной диафрагмы
конденсора); 2 - оптика конденсора; 3 - плоскость предмета;
4 - объектив; 5 - ирисовая диафрагма внутри объектива
в отраженном или рассеянном (диф-
фузно отраженном) свете присутству-
ет яркое блестящее свечение контура
вокруг объекта.
Метод применяется для наблю-
дения живых бактерий и других
объектов, где достаточно наблюдать
контур.
Для создания темного поля в мик-
роскопе проходящего света применя-
ются:
1. щелевой метод;
2. метод реализуется (рис. 7.5) за
счет перекрытия осветитель-
ной апетруры конденсора (материальной диафрагмой) и выход-
ного зрачка объектива (проекцией изображения материальной
диафрагмы). Конденсор должен иметь непрозрачный диск, рас-
положенный в плоскости апертурной диафрагмы, закрывающий
центральный пучок света. Объектив может иметь регулируемую
ирисовую диафрагму или вкладыш. И то, и другое должно быть
расположено внутри в определенном месте — в выходном зрачке
объектива. Эти устройства позволяют уменьшать выходное от-
верстие объектива (выходную числовую апертуру объектива);
3. получение темного поля с помощью специального конденсора
темного поля (рис. 7.6).
Если внутри объектива имеется ирисовая диафрагма1, то, вращая
кольцо, можно достичь необходимого перекрытия непрозрачным дис-
ком выходного зрачка (рис. 7.5 б).
1 Объектив имеет кольцо с накаткой и маркировка на корпусе объектива (например,
объектив 90x1,25 — 0,60 МИ, шифр 06М-90).
101
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Эффект темного поля можно по-
лучить с помощью обычного кон-
денсора. Для этого необходимо в
плоскость апертурной диафрагмы
конденсора (или в откидное гнездо
под конденсором) установить плас-
тину с непрозрачным диском. Одна-
ко следует помнить, что для каждого
объектива этот диск может быть раз-
ным из-за величины выходного зрач-
ка объектива.
Специальный конденсор фазо-
во-контрастного устройства имеет
в одном из гнезд диафрагму темного
поля (для объективов 10х-40х).
Рис. 7.6. Новый темнопольный конденсор
ф.Саг! Zeiss для объективов со сменными
фронтальными линзами (для объективов от
2,5х до ЮОх)
Конденсор темного поля — конденсор, предназначенный для по-
лучения эффекта темного поля с помощью специальной конструкции
оптической фронтальной части. На рис. 7.6 представлен специальный
конденсор для работ всего комплекта объективов от 2,5х до ЮОх (с чис-
ловой апертурой конденсора А= 1,4) по методу темного поля.
Отечественная промышленность выпускает кардиоид-конденсор
темного поля мод. ОИ-13/ОИ13М с апертурой А =1,2, который состо-
ит из сферического зеркала и линзы-кардиоида. Он применяется как
с объективами сухих систем, так и с иммерсионными объективами.
Для получения темного поля с иммерсионными объективами внутрь
объектива устанавливается специальная диафрагма, уменьшающая
числовую апертуру. Диафрагма входит в комплект конденсора.
Подготовка к работе
1. Использовать в качестве источников света для микроскопа с кон-
денсором темного поля осветители, например, ОИ-32, ОИ-351.
2. Приготовить препарат на нормальном предметном стекле тол-
щиной 0,8-ъ 1,2 мм.
3. Установить препарат («раздавленная капля») на предметном сто-
лике микроскопа и закрепить.
4. Настроить освещение по методу светлого поля по принципу Ке-
лера с помощью светлопольного конденсора.
5. Заменить обычный конденсор темнопольным и закрепить1 2.
1 Если работа ведется на микроскопах Биолан Р, С, D/
2 Конденсор (рис. 7.6) не требует замены. В нем есть светлополный элемент. Меняются
только оптические головки.
102
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Порядок работы
1. Опустить конденсор и нанести на верхнюю линзу конденсора
каплю иммерсионной жидкости (кедровое масло, дистиллиро-
ванную воду).
2. Сфокусировать микроскоп на объект вращением рукоятки гру-
бой и точной фокусировки. При этом в поле зрения должно по-
явиться светлое кольцо с темным пятном посредине или только
светлое пятно.
3. Поднять конденсор до появления светлого пятна (если форма
светлого пятна или кольца неправильная, значит, капля иммер-
сионной жидкости мала).
4. Вывести пятно в центр поля зрения с помощью винтов конденсора.
5. Проверить правильность настройки конденсора для чего:
• вынуть окуляр;
• вставить диафрагму-точку или дополнительный микроскоп
МИР-4, который предварительно настроен на изображение
выходного зрачка объектива.
6. Поднять конденсор до такого положения, при котором капля им-
мерсионной жидкости соприкоснется с предметным стеклом и
распространится по нему.
При правильно настроенном микроскопе будет наблюдаться следу-
ющая картина:
темный диск, заполняющий все поле зрения и тонкая полоска
света по диаметру выходного зрачка объектива (при этом долж-
но быть перекрыто —9/10 зрачка).
7.3. МЕТОД ФАЗОВОГО КОНТРАСТА. НАСТРОЙКА МИКРОСКОПА
ДЛЯ РАБОТЫ ПО МЕТОДУ ФАЗОВОГО КОНТРАСТА
<£ Метод связан с изменением условий освещения при наблюдении сла-
** боконтрастных биологических объектов (микроорганизмов, расти-
тельных клеток) в неокрашенном состоянии с целью их визуализа-
ции (контрастирования).
Конденсор фазово-контрастный — это конденсор, предназначен-
ный для получения эффекта фазового контраста. Может быть специ-
альным, или превращен из обычного светлопольного конденсора путем
установки в плоскости апертурной диафрагмы конденсора кольцевой
диафрагмы определенного размера, которая соответствует размеру фа-
зового кольца в объективе.
103
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
" '• ' :- . Рис. 7.7. Эффект темного поля
В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры
объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы
внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Фа-
зово-контрастное устройство дает возможность преобразовывать
фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в ам-
плитудные. В результате этого прозрачные микроорганизмы стано-
вятся видимыми (рис. 7.7).
В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения
различают положительный и отрицательный фазовые контрасты. Рас-
смотрим их подробнее.
Положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объ-
ективе технологически получается путем травления, что вносит «опе-
режение» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с
показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на
более светлом фоне (КФ-4, КФ-4М).
Отрицательный фазовый контраст (аноптральный или тем-
нопольный фазовый контраст), когда фазовое кольцо в объективе
технологически получается путем нанесения на поверхность стек-
ла тонкой пленки, что вносит «запаздывание» в прямо прошедший
свет. При этом изображение объекта с показателем преломления
большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона
(МФА-2).
Фазовые объективы имеют внутри фазовый элемент (линзу или
пластину) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьша-
ет амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет
% - % от выходного зрачка объектива при этом светопропускание коль-
ца 10-30% в зависимости от типа фазового контраста (рис. 7.8).
104
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис 7.8. Оптическая схема получения фазового контраста:
1 - световое кольцо в конденсоре; 2 - конденсор; 3 - препарат; 4 - объ-
ектив; 5 - фазовое кольцо в выходном зрачке объектива; 6 - прямой свет,
прошедший через объектив из конденсора; 7 - световой поток, получен-
ный в результате отклонения света объектом в препарате; 8 - тубусная
линза микроскопа
Таким образом, фазовое кольцо, нанесенное
внутри объектива, выполняет две функции: га-
сит как серый светофильтр сильный прямой
кольцевой свет из конденсора, и придает этому
свету постоянное фазовое смещение.
Отличительной особенностью в изображе-
нии является наличие гала-эффекта по кон-
туру объекта (небольшое просветленное поле
вокруг объекта).
Для исследования методом фазового кон-
траста готовят влажные препараты типа «раз-
давленная капля».
/т|Т| Желательно для этой цели отбирать тон-
кие стекла. Для длительного наблюдения
покровное стекло по краям закрепляют
вазелином.
Порядок работы
(отечественные устройства КФ4/КФ4М)
• Заменить конденсор микроскопа специальным фазово-конт-
растным конденсором и установить его таким образом, чтобы
при подъеме фронтальная линза находилась на уровне предмет-
ного столика.
♦ Включить диафрагму с маркировкой «О» («Н» — в зарубежном).
• Обычные объективы заменить фазовыми.
• Поместить препарат на предметный столик микроскопа.
• Сфокусироваться на резкое изображение объекта.
• Установить освещение в светлом поле по принципу Келера, пос-
ле чего в положении осветительной лампы, зеркала и конденсора
никаких изменений не допускается.
• Вместо окуляра вставить вспомогательный микроскоп (диоптр).
Перемещая окуляр вспомогательного микроскопа внутри тубуса,
получить четкое изображение фазового кольца объектива.
• В этом положении окуляр зафиксировать винтом.
105
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис. 7.9.
Изображение препарата (/) и вид вы-
ходного зрачка объектива (//) при вы-
нутом окуляре:
а - изображение препарата - неконтраст-
ное, т.к. световое кольцо конденсора децен-
трировано относительно фазового кольца
объектива; 6- изображение препарата
контрастное с гала эффектом по контуру,
световое кольцо конденсора вписано в
фазовое кольцо объектива
• Вращая револьверное устройство конденсора, включить нужную
кольцевую диафрагму, в результате чего в окуляре, помимо фа-
зового темно-серого кольца объектива, появится изображение
светлого кольца диафрагмы конденсора (рис. 7.9 а).
• Вращая центрировочные винты при конденсоре, совместить
изображение светового кольца конденсора с темным кольцом
объектива (рис. 7.96).
При правильной установке освещения изображение объектов в пре-
парате должно получиться очень контрастным (рис. 7.10). При смене
объективов или препарата необходимо проверить совмещение кольце-
вой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива.
Проверка правильности настройки микроскопа
При вынутом окуляре на темном фоне наблюдается совмещение по-
лупрозрачного фазового кольца объектива и светящегося светового
кольца конденсора.
При наличии окуляра на сером фоне наблюдается более светлое
изображение объекта с четким контуром, различимыми элемента-
ми внутри и гала-эффектом — светлой внешней каймой вокруг объ-
екта. При этом изображение имеет слабо выраженный объемный
эффект.
106
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
Рис 7.10. Фотография объекта:
а - в светлом поле; 6- фазовом контрасте.
(Пущино, ИТЭБ РАН, Н.Р.Тирас, 2005)
7.4. МЕТОД ВАРЕЛ-КОНТРАСТА (VAREL-CONTRAST)
Идея метода варел-контраста первоначально родилась в конструк-
ции инвертированных микроскопов фирмы Carl Zeiss и воплощена на
базе лабораторного микроскопа Аксиоскоп 40 в 2003 г.
Основным элементом метода является объектив с двумя фазовыми
кольцами. Одно кольцо для реализации метода фазового контраста, рас-
положено на расстоянии Уз выходного зрачка объектива. Второе кольцо
для реализации метода варел-контраста расположено ближе к краю и
толще первого. В конденсоре располагается модулятор света в виде све-
тового сектора составляющего приблизительно % - Уз от диаметра (рис.
7.11). Фазовый контраст отличается наличием гала — эффекта вокруг
Рис. 7.11. Варел-контраст:
а - эффект рельефного контраста (изображение препарата); 6- основной элемент конденсора (диа-
фрагма в виде сектора, устанавливаемого в конденсор) и специальный объектив
107
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
контура объекта. Чем больше толщина объекта, тем эффект становит-
ся более выраженным, что приводит к потери информации об объекте.
Изображение с варел-контрастом объемное без дополнительных свето-
вых эффектов (рис. 7.10«). Этот метод дополняет фазовый контраст.
Метод реализуется с помощью двух объективов: «А-Plan» 10х/0.25
Ph 1 Var 1 и «А-Plan» 40х/0.65 Ph 2 Var 2.
Конструктивно в конденсоре используется подвижная вставка с тре-
мя отверстиями. Центральное отверстие используется для светлого поля,
а два крайних — для фазового и варел-контрастов, что очень удобно.
7.5. ПОЛЯРИЗОВАННЫЙ СВЕТ
Метод связан с визуализацией объекта или
его элементов в поляризованном свете в ре-
зультате изменения направления поляризации
света и проявления анизотропных свойств
объекта. Особенностью микроскопа является
наличие в оптической схеме поляфильтров:
в осветительной части— поляризатора, а в
промежутке между объективом и окуляром —
анализатора. Наблюдение производится тогда,
когда оба поляфильтра развернуты друг отно-
сительно друга на 90° (рис. 7.12). При этом в
поле зрения наблюдается максимальное затем-
нение. Если объект обладает поляризующими
свойствами, то на темном фоне появляется
светлый или разноцветный объект с четким
изображением по контуру (рис. 7.13).
Рис. 7.12. Оптическая схема создания поляризованного света в микро-
скопе проходящего света:
Д - анализатор; Р - поляризатор;
1 - поляризатор; 2 - конденсор; 3 - предмет; 4 - объектив; 5 - анализатор;
5а - компенсатор X; 6 - тубусная линза
Рис. 7.13.
Неокрашенное волокно:
а - в светлом поле; 6 - в поля-
ризованном свете; в-в поля-
ризованном свете с введенной
в ход лучей компенсационной
пластинкой X
108
Глава 7 Прямые микроскопы проходящего света. Методы исследования и контрастирования
7.6. МЕТОД ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ИНТЕРФЕРЕНЦИОННОГО
КОНТРАСТА (ДИК)
Метод основывается на поляризационных свойствах света. В со-
* зданный с помощью скрещенных поляроидов поляризованный свет
вводятся две двулучепреломляющие призмы (призмы Воллостона):
одна — в конденсор, вторая — вблизи выходного зрачка объектива.
Рис. 7.14. Оптическая схема
создания дифференциально-
интерференционного контраста
в микроскопе проходящего света:
1 - поляризатор; 2 - двулучепре-
ломляющая призма конденсора;
3 - конденсор; 4 - предмет; 5 - объ-
ектив; 6 - двулучепрел омляющая
призма объектива; 7- анализатор;
7а - компенсаторная пластинка А;
3—тубусная линза
Призма конденсора осуществляет разде-
ление одного пучка лучей на два. После про-
хождения пучков через объект вторая призма
вновь соединяет пучки. При прохождении
через объект оба частичных пучка либо не
приобретают дополнительной разности хода
(одинаковые структуры), либо, при наличии
разных структур, пучки получают различные
разности хода. Так как свет поляризованный,
то анализатор выбирает из смещенных по
фазе волновых компонентов те, которые ле-
жат в направлении его колебаний (рис. 7.14).
Рис. 7.15. Метод показывает «поперечные» и «продольные» (по высоте)
параметры объекта, поэтому возникает рельеф (объем) в изображении:
о - объект в светлом поле; 6 - объект в ДИК
Рис. 7.76. Различные препараты, визуализированные с помощью метода ДИК:
а - диатомовые водоросли; 6- клетки
109
ГЛАВА 8
ИНВЕРТИРОВАННЫЕ МИКРОСКОПЫ
ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА
Инвертированные (перевернутые) микроскопы, по сравнению с прямыми, были разработаны
сравнительно недавно. В номенклатуре фирмы Carl Zeiss1 в 1924 году впервые в мире
появился инвертированный металлографический микроскоп с первым в мире объективом,
рассчитанным на «бесконечность». Прошло около десяти лет, и в 1935 году вышла модель
Lu, где использовался первый прямой базовый штатив биологического микроскопа, который
можно было переделать в инвертированный. 1976 год был годом начала выпуска мод. IM и
IM 35 — первых инвертированных микроскопов проходящего света, обеспечивающих все
методы контрастирования, в том числе люминесценцию в отраженном свете. А в 1987 г. фирма
Opton (западная фирма Carl Zeiss) разработала и предложила пользователю первое поколение
микроскопов «Axiovert», полностью укомплектованных ICS-оптикой (оптической системой,
рассчитанной на «бесконечность», и с цветокоррекцией без хроматической разности увеличения).
8.1. ОСОБЕННОСТИ КОНСТРУКЦИИ ИНВЕРТИРОВАННЫХ МИКРОСКО-
ПОВ ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА
Применение микроскопов настолько разнообразно, что требует
использования не только микроскопов плоского поля и трехмерного,
объемного изображения, но и микроскопов перевернутой (инвертиро-
ванной) конструкции.
Область применения инвертированных микроскопов — бактерио-
логия, вирусология, репродукция, молекулярная биология и т.д. Они
1 Приоритет в этом виде микроскопов, как, впрочем, и других, принадлежит
именно этой фирме. Фонд Carl Zeiss имеет определенные преимущества перед други-
ми фирмами. Ни при каких обстоятельствах фирма не изменит своего названия и не
откажется от направления «микроскопия», т. к. это определено Уставом Фонда, разра-
ботанным Эрнстом Аббе. Я приношу извинение приверженцам микроскопов других
фирм, однако, поскольку современные микроскопы наиболее широко и разнообразно
всегда были представлены именно на фирме Carl Zeiss, то и речь, в основном, пойдет
о микроскопах этой фирмы. В то же время не могу не отметить, что в разработке ин-
вертированных микроскопов участвовали многие фирмы-разработчики внедрением
своих технологических новшеств.
110
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
используются в биологии и в медицине в т. ч. в фармокологии для ис-
следования растительных и животных клеток и/ или образцов ткани.
Сосудами для наблюдения и культивирования являются, например,
пробирки для культур, чашки Петри и плашки для микротитрования.
Бурный рост биотехнологии в 80-е годы потребовал создания простых
инвертированных микроскопов. На территории России были широко
известны микроскопы TELEVAL, Карл Цейсс, Йена (ГДР).
В последнее время репродукция и клонирование стали настолько
популярны, что необходимо рассмотреть варианты комплектации ла-
боратории.
В табл. 8.1 представлены основные этапы работ по ЭКО и типы мик-
роскопов, применяемых на этих этапах.
Основными признаками необходимости применения микроскопов
перевернутой конструкции являются:
• работа с нестандартным образцом, т. е. системой «препарат —
предметное стекло», где роль предметного стекла выполняют
чашка Петри, планшета, специальная посуда в виде бутылок или
пробирок, требующих применения специальных объективов и
конденсоров с большим рабочим расстоянием;
• манипуляция с препаратом, т. е. выполнение определенных опе-
раций с помощью микроманипуляторов или других инструмен-
тов, требующих большого свободного расстояния между препа-
ратом и осветителем, а также неподвижности предметного стола
при фокусировочном движении микроскопа;
• относительно небольшие увеличения (до 200х, максимум — 400х
при рутинных работах) по сравнению с обычным микроскопом,
но с большим разрешением, чем в стереомикроскопе (напри-
мер, при увеличении 100х в обычном микроскопе разрешение
1,34 мкм, в стереомикроскопе — 6,71 мкм).
Таким образом, основные отличия инвертированных микроскопов
сводятся к следующему:
• конструкция штатива обеспечивает расположение осветителя
(источника света, коллектора и конденсора) сверху препарата,
расположенного на предметном столе, а револьверное устройс-
тво крепления объективов, устанавливается под предметным
столом;
♦ оптика микроскопа (конденсор и объектив) должна быть ориен-
тирована на большие рабочие расстояния;
• микроскоп должен быть ориентирован на работу с живым неок-
рашенным объектом.
111
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Таблица 8.1
Микроскопы для проведения исследований по направлениям
ЭКО, ПЭ (пункция фолликулов и яйцеклеток)
и И КСИ (введение единичного сперматозоида внутрь зрелой яйцеклетки)
Вид исследо- вания Типы микроскопов Основные требования
1. Общие клинические исследова- ния Биологический микроскоп прямой рабочий Микроскоп должен обеспечивать контрастное наблюдение окра- шенный (кровь) и неокрашенных (моча) препаратов в светлом поле (кровь) и в фазовом контрасте (моча) с увеличением 200х ФК — 400х-1000хМИ и линейным по- лем окуляра10х:18-20 мм
2. Оценка состояния спермы (подвиж- ность и мор- фология ис- следования) а) Биологический прямой рабочий микроскоп б) Комплекс аппаратно- программный ВидеоТесТ- Сперм на базе микроскопа, системы ввода, компьюте- ра и программного обеспе- чения ВидеоТесТ-Сперм 2.1 (с целью стандартизации исследований ВОЗ и ESHRE с 90-хгг. ХХв. проводят ме- роприятия по развитию и внедрению компьютерно- го анализа в практику) Микроскоп должен обеспечивать наблюдение нативного препарата с увеличением 400х-630х, с линейным полем окуляра 10х 18-20 мм: а) методом фазового контраста; б) методом светлого поля и/или фазового контраста с использо- ванием объектива 20х для анали- за подвижности сперматозоидов и по методу светлого поля с исполь- зованием объектива 100х с масля- ной иммерсией для анализа мор- фологии сперматозоидов
3. Получе- ние эмбри- онов Стереоскопический мик- роскоп проходящего света Стереоскопический микроскоп должен обеспечивать объемное изображение объектов в диапа- зоне увеличений 6,5х-50х с плав- ным измененим увеличения и с нагревательным столиком
Инвертированный рабо- чий или лабораторный микроскоп проходяще- го света Микроскоп должен обеспечивать увеличение 50х-100х-200х-320х (400х) при наблюдении нативных препаратов с помощью рельеф- ных контрастов: фазовый контраста, варел-конт- раста, дифференциально-интер- ференционного контраста (ДИК / ПласДИК / Хоффман-контраста)
112
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
В истории отечественного микроскопос-
троения был опыт разработок инвертиро-
ванных микроскопов. Первые появились в
70-х годах (МБИ-13), в 80-х годах была вто-
рая волна разработок БИОЛАМ П (рис. 8.1).
К сожалению, уровень разработок на сегод-
няшний день остался на том же уровне, что и
все разработки 70-80-х годов. Правда, к чес-
ти наших конструкторов следует отметить
попытку реализации фазового контраста и
рельефного контраста (на щели) для объек-
тива 10х.
Современные инвертированные микро-
скопы имеют два уровня сложности (рис. 8.2):
Рис. 8.1. Отечественный инверти-
рованный микроскоп БИОЛАМ ПЗ
это рутинные микроско-
пы — лабораторные и
исследовательские.
Класс сложности ин-
вертированных микро-
скопов связан с мощ-
ностью источника света
и с наличием методов
контрастирования, с
простотой настроек и
сложностью работы с
препаратом1.
В табл. 8.2 представ-
лены различия между
группами микроскопов.
Рис. 8.2. Инвертированные микроскопы проходящего света фирмы
Carl ZEISS, Германия:
а - рабоче-лабораторная мод. Axiovert 40C/40CFL; б-исследовательско-
универсальная мод. Axiovert 200/200М
1 Хочется отметить, что «класс микроскопа», равно как и соотношение «цена-качество»,
у нас в стране не совсем выдерживаются с точки зрения технико-технологических и эконо-
мических понятий. Скорее здесь берется во внимание торговое представление — кто может
дать большую скидку и снизить цену (за счет или ухудшения потребительских параметров,
или предложения вторичного рынка приборов). Это не всегда соответствует возможности
модели, на которую возлагаются вполне определенные надежды. В данном случае, т. е. в этой
книге, рассматриваются пользовательские понятия, принятые в расчетной и конструктор-
ско-технологической практике. А при покупке следует помнить, что ниже себестоимости
приборов (затрат на материалы, производство и т. п.) продавать заводу-изготовителю в сов-
ременных рыночных условиях не выгодно. Здесь бы хотелось заметить, что понятие «лабо-
раторный» в соотношении «цена-качество» не одно и то же, что «лабораторный» в понятии
места использования. В лаборатории могут применяться рабочие, лабораторные и исследова-
тельские микроскопы, стоимость и качество которых значительно отличаются между собой.
113
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Таблица 8.2
Основные отличительные особенности групп сложности
инвертированных микроскопов
Признаки Параметры Рабоче-лабора- торная модель Исследовательско- универсальная модель
Проходящий свет
Методы иссле- дования и кон- трастирования а) традицион- ные методы б) контрастиру- ющий метод в) современный рельефный кон- траст а) светлое поле; б) фазовый кон- траст; в) Varel-контраст (Варел-контраст); PlasDIC (Плас- ДИК); а) светлое поле; б) фазовый контраст; в) Varel-контраст (ва- рел-контраст; Хоф- фман-контраст; дифференциально- интерференцион- ный контраст (ДИК); PlasDIC (ПласДИК); поляризация
Отраженный свет (люминесценция)
Источник све- та а) галогенная лампа б) ртутная лам- па а) не более12В 35 Вт; б) не более 50 Вт а) не менее 12В 100 Вт б) 50 Вт и 100 Вт
Тип оптичес- кой коррекции объективов ICS (без хро- матической разности уве- личения) 1. ахроматы и планахроматы 2. объекты вы- сокой оптичес- кой коррекции 3. объективы с большим рабо- чим расстоя- нием 1. CP-Achromat; А-Plan; Achroplan; 2. Plan-Neofluar; Fluar; Plan-Apochromat) 3. LD А-Plan; LD Plan-Neofluar4 1. А-Р1ап; Achroplan; 2. Plan-Neofluar; Fluar; Plan- Apochromat 3. LD A-Plan; LD Plan-Neofluar4
Ряд увеличений объективов 2,5x—5x—10x— 20x-32x-40x- (63х-100хМИ) 2,5 x—5x—lOx—20x— 32х-40х-63хМИ- бЗх-ЮОхМИ
Система до- полнительно- го увеличения («Optovar») l,25x-l,6x - 2,5x (проходящего света) l,25x-l,6x-2,5x
Линейное поле окуляра (базовое) окуляр 10 X (базовый) 18-20 мм 22-23 мм
114
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Универсальные модели выпускаются в двух вариантах — ручном
и моторизованном, что делает возможным применение микроскопов
в технологических цепочках или в условиях, связанных с работой в
особо чистых условиях, например, в специальных боксах или инку-
баторах. Эти модели являются базовыми для лазерных сканирующих
микроскопов.
Документирование. Одним из требований работы с микроскопом
может быть документирование или, по крайней мере, вывод на экран
монитора. Существует несколько вариантов выполнения этого тре-
бования. Традиционный вариант с помощью тринокуляра (биноку-
лярной насадки с фото — видеовыходом) для инвертированных мик-
роскопов несколько неудобен из-за того, что является помехой при
работе с препаратом. Конструкции современных микроскопов обес-
печивают большое разнообразие решения этой проблемы. Например,
новые рабочие микроскопы, типа Аксиоверт 40, имеют самый эконо-
мичный вариант — фронтальный фото — видеовыход (рис. 8.3), в то
время как исследовательская модель может
иметь большее количество выходов. Напри-
мер, у Аксиоверт 200 их уже 5. Предполагая
работать с различными по габаритам инку-
баторами и микроманипуляторами, поль-
зователь сам выбирает способ крепления
фото — видеосистемы.
Предметные столы. Предметные столы
инвертированных микроскопов имеют свою
особенность, связанную с габаритными раз-
Рис 83. Фронтальный фото- ви-
мерами и возможностью размещения допол-
нительных элементов для крепления контей-
неров стандартной формы, таких
как плашки, чашки Петри или
предметные стекла (рис. 8.4).
Для тех случаев, когда обра-
зец требует подогрева или ох-
лаждения имеются специальные
предметные столы с подогревом
и контролем температуры. Кроме
того, существуют специальные
крепежные рамки с подогревом
и контролем температуры, пред-
деовыход в микроскопах эконом
класса
назначенные для модернизации Рис 8.4. Стеклянный предметный стол
115
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Рис 8.5. Рамки для крепления
различной посуды и подогревае-
мые рамки
стандартных и механических предметных
столов (рис. 8.5).
В предметном столе с подогревом тепло
выделяется транзисторами без создания элек-
тромагнитных помех, что важно для электро-
физиологических исследований. Кроме того, в
предметном столе имеются воздуховоды, через
которые поток подогретого воздуха поступает
под образец — именно туда, где он нужен.
Другой способ контроля температуры —-
нагрев образца с помощью инкубатора. Этот
способ отличается тем, что при его исполь-
зовании не формируется температурный
градиент. Дополнительный нагрев обеспе-
чивается нагревателями, устанавливаемыми
на иммерсионные объективы. Тепло передается через иммерсионное
масло непосредственно на образец. Для оптимального наблюдения за
клетками необходима не только правильная температура, но и пос-
тоянное значение pH. Для поддержки этого значения при инкубации
используется СОг.
8.2. МЕТОДЫ КОНТРАСТИРОВАНИЯ
В ИНВЕРТИРОВАННЫХ МИКРОСКОПАХ ПРОХОДЯЩЕГО СВЕТА
С помощью инвертированных микроскопов можно осуществлять
следующие методы исследования и контрстирования:
в проходящем свете — освещение по методу светлого поля, фазо-
вый контраст, VAREL-контраст (косое освещение по методу светлого
поля, одностороннее освещение по методу темного поля) PlasDIC-
контраст, DIC-контраст, Hoffman-контраст, поляризация;
в отраженном свете — люминесценция.
Реализация методов, как мы уже знаем, связана с объективом и кон-
денсором.
Объективы инвертированных микроскопов должны иметь большое
рабочее расстояние, при этом, с точки зрения технологического про-
цесса конструирования и изготовления, подобные объективы имеют
пониженную по сравнению с обычными объективами числовую апер-
туру, а, значит, и разрешение.
LD-объективы — объективы с большими рабочими расстояниями.
При исследованиях с помощью инвертированных микроскопов прохо-
116
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
дящего света обычно используются сосуды, толщина дна которых зна-
чительно отличается от привычной толщины покровного стекла 0,17
мм. Объективы малого увеличения (до 10х) за счет небольших число-
вых апертур (до 0,25), увеличивающих глубину резкого видения, обыч-
но без ухудшения качества изображения работают с посудой большой
толщины. Например, СР-Achromat 5х /0,12 имеет рабочее расстояние в
воздухе 10,9 мм, СР-Achromat 10х /0,25 — 5,3 мм.
Однако уже в среднем диапазоне увеличения эти рабочие рас-
стояния уменьшаются чаще всего до значений около или ниже 1 мм.
Такие объективы уже больше нельзя применять для большой тол-
щины дна.
Специальные LD-объективы (.Long Distance — большое расстоя-
ние) устраняют этот недостаток; они имеют относительно большое
рабочее расстояние и в то же время обычную для всех других объек-
тивов высоту — 45 мм. В объективах LD А-Plan уже имеется коррек-
тировка оптики по качеству изображения на стандартную толщину
1 мм (± 0,4 мм), что обеспечивает четкую картину и контраст, а также
отсутствие искажений в полученных изображениях.
Для настройки на используемую толщину дна посуды объективов
с большим увеличением 32х или 40х следует надевать на объектив со-
ответствующий стеклянный колпачок, компенсирующий толщину дна
посуды. В табл. 8.3 приведен комплект объективов инвертированных
микроскопов с указанием рабочих расстояний и при применении раз-
личных методов контрастирования1. Данный комплект имеет оптику,
которая не вносит собственную люминесценцию. Поэтому при работе
в варианте люминесцентного микроскопа наблюдается яркое свечение
объекта без фоновой засветки.
Рабочие расстояния объективов для двойного контраста (фазового
и варел-контраста Ph Var) аналогичны фазовым объективам Ph.
При работе с обычными объективами, что не исключается, важно
иметь такую форму предметного стола, которая обеспечивала бы бес-
препятственную смену объективов в соответствии с парфокальностью
оптики (при смене объективов резкость изображения сохраняется).
Разнотолщинность посуды требует применения объективов, корректи-
рующих качество изображение при работе с покровным стеклом пере-
менной толщины1 2.
1 В этом издании приведен полный комплект оптики для инвертированных микроско-
пов одной фирмы с тем, чтобы получить «точку отсчета» для оценки дальнейшего развития
микроскопии.
2 Особенно это актуально для объективов с большими числовыми апертурами.
117
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Таблица 8.3
Типичный комплект объективов инвертированных микроскопов
Обозначение объектива Свободное рабочее расстояние
без стеклянного колпачка для кор- рекции толщины дна включая стеклянный колпачок для коррекции толщины дна 0,17-0,6
D=0,17 мм D=1 мм D=l,2- 1,8 мм
CP-Achromat 5х/0,12 10,9 10,4 10,2... 9,8 —
CP-Achromat 10х/0,25 А- 5,3 4,8 4,6... 4,2 —
Plan 2,5х/0,0б 9,4 8,9 8,7... 8,3 —
А-Plan 5х/0,12 9,8 9,2 9,1... 8,7 —
А-Plan 10х/0,25 4,4 3,9 3,7... 3,3 —
LD А-Plan 20х/0,30 Ph 1 4,8 4,3 4,2... 3,8 —
LD А-Plan 32х/0,40 Ph 1 — 3,2 3,1... 2,7 3,1... 2,8
LD А-Plan 40х/0,50 Ph 2 — 2,0 1,9... 1,5 1,9... 1,6
Pan-Neofluar 2,5х/0,075 9,55 9,0 8,9... 8,5 —
Pan-Neofluar 5х/0,15 13,6 13,1 12,9... 12,5 —
Pan-Neofluar 10х/0,30 5,58 5,0 4,9... 4,5 —
Объективы с коррекцией на толщину дна посуды D = 0,17 — 1,5
LD Pan-Neofluar 20х/0,40 Korr Ph2 LD Pan-Neofluar 40х/0,60 Korr Ph2 LD Pan-Neofluar 63x/0,75 Korr Ph2 8,34... 7,46 3,27... 2,57 2,11... 1,24
Объективы с корректирующей оправой (Когг). Для получения
очень хорошего изображения важно соблюдать точную толщину пок-
ровного стекла. С помощью корректирующей оправы Когг-объективы
можно настраивать на различную толщину покровных стекол. Для этого
следует выбрать место на образце и определить, при каком положении
корректирующей оправы будет наблюдаться наилучшая резкость и конт-
раст изображения (при этом настройка на резкость необходима всегда).
В процессе работы с живыми объектами на инвертированном мик-
роскопе возможно использование воды. Для защиты от пролитых
жидкостей и попадания воды в объектив, револьверное устройство,
а также внутрь микроскопа разработана система защиты Aqua Stop1
1 Разработка фирмы Carl Zeiss.
118
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
(рис. 8.6). Для этого используется тройная
защита: силиконовая герметизация самого
объектива, силиконовое покрытие всего ре-
вольверного устройства крепления объекти-
вов, а также применение контейнера, распо-
ложенного под револьверным устройством
крепления объективов. Две трубки, подклю-
ченные к контейнеру, отводят жидкость от
микроскопа. В то же время Aqua Stop не ог-
раничивает свободу вращения револьверно-
го устройства объективов.
Конденсоры. Получение качественного
изображения связано с осветительной систе-
Рис. 8.6. Aqua Stop
мой. Так же как и объективы, параметры конденсора — рабочее рас-
стояние и числовая апертура — имеют свою зависимость. Обычный
конденсор имеет рабочее расстояние порядка 1 мм, при этом число-
вая апертура соответствует 0,9 или 1,25 (1,4) в иммерсионном вариан-
те. Для инвертированных микроскопов рабочее расстояние конденсо-
ра должно быть не менее 30 мм, поэтому числовая апертура будет не
более 0,55 (рис. 8.7).
В табл. 8.4 приведены данные по комплекту конденсоров.
Следует отметить, что при работе с конденсором А = 0,2, чтобы пол-
ностью осветить поле на предмете для работы со слабыми объективами
(< 5х), конденсор приходится выдвигать из своего рабочего положения.
То же самое необходимо в случае применения особенно высокой посу-
ды для культур, когда требуется увеличить свободное рабочее расстоя-
ние примерно до 190 мм.
Рис. 8.7. LD-конденсоры разных
числовых апертур:
0 — А = 0,4; 0 — А = 1,4.
119
120
Таблица 8.4
Типичный комплект конденсоров
Характеристика Конденсоры
1. Рабоче-лабораторная модель микроскопа
Числовая апертура А = 0,2 A = 0,4 A = 0,55
Свободное расстоя- ние (первая поверхность фронтального компонента конденсора — верхняя по- верхность столика >90 мм >53 мм >31 мм доп. регулировка высоты 6 мм
Комплект объективов (по увеличению) 5х-20х 5x-40x VAREL: 5x-32x PlasDIC: 5x-40x 5х-40х PlasDIC: 5х-40х
Метод исследования и контрастирования СП, ФК СП, ФК VAREL PlasDIC СП, ФК PlasDIC
2. Исследовательско-универсальная модель микроскопа
Числовая апертура LD А = 0,35 LD A = 0,55 LD А = 0,6 А = 0,8 А =1,4
Управление Ручной ручной, моторизованный Ручной
Тип оптической коррек- ции конденсора Ахромати- ческий Ахроматический апланатический
Свободное расстояние >70 мм >26 мм >40 мм > 6,8 мм > 0,5 мм
Комплект объективов (по увеличению) 2,5х-100х 4x-100x 10х-40х 5х-100х 20х-100х
Метод исследования и контрастирования позиций — 5 и 6: СП; ДИК; ФК (Ph 0, Ph 1, Ph 2); VAREL (Var 1) PlasDIC позиций — 5 и 6/6 МОТ: СП; ДИК; ФК (Ph 1, Ph 2, Ph 3); VAREL (Var 1/2 для 5 поз.) PlasDIC СП, Хоффман СП, ДИК СП, ТП, ФК, ДИК, СП, ТП, ФК, ДИК,
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Таблица 8.5
Пример подбора комплекта оптики для реализации фазового контраста
(лабораторная модель)
Объектив Кольцевые диафрагмы конденсора
A=0,55 A= 0,4 A=0,2
А-Plan 5х/0,12 PhO — Ph 0/0,4 Ph 0/0,2
СР-Achromat 10х/0,25 Phi А-Plan 10x/0,25 Phi LD А-Plan 30x/0,30 Phi LD А-Plan 32x/0,40 Phi Plan-Neofluar 5x/0,15 Phi Plan-Neofluar 10x/0,30 Phi Phl/0,55 Ph 1/0,4 Ph 1/0,2
LD Achrostigmat 20x/0,45 Ph2 LD А-Plan 40x/0,50 Ph2 LD Plan-Neofluar 20x/0,40 Korr Ph2 LD Plan-Neofluar 40x/0,60 Korr Ph2 LD Plan-Neofluar 63x/0,75 Korr Ph2 Ph2/0,55 Ph 2/0,4 —
Высота конденсора А = 0,55 и его числовая апертура могут регули-
роваться для получения лучшей освещенности поля и максимальной
интенсивности при всех установках объективов.
При применении разных фазовых объективов с Ph 0, Ph 1, Ph 2, Ph
** 2 необходимо контролировать правильное использование конденсо-
ров, позволяющее получать фазовый контраст именно с теми свето-
выми кольцевыми диафрагмами, которые есть в конденсоре. Пример
подбора приведен в табл. 8.5.
8.3. МЕТОДЫ РЕЛЬЕФНОГО КОНТРАСТА
В табл. 8.6 представлена реализация различных методов контрасти-
рования в моделях инвертированных микроскопов ведущих фирм.
На рис. 8.8 представлено изображение, полученное с помощью фазово-
го контраста (левое) и Плас ДИК (правое). Можно видеть, что чем больше
объект по высоте, тем присущий фазовому контрасту гала-эффект значи-
тельнее, что мешает наблюдению и документированию. Методы так назы-
ваемого «рельефного» контрастирования связаны с тем, что изображение
объекта формируется за счет как минимум двух пучков лучей или зади-
афрагмированного специальным образом светового потока, выходящего
из осветительной системы и проходящего через объект. Так называемые
121
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Таблица 8.6
Реализация различных методов контрастирования в моделях различных фирм-изго-
товителей
Методы исследования и конт- растирования Фирма-изготовитель
Carl Zeiss Leica Olympus Nikon
Светлое поле ® ® ® ®
Фазовый контраст ® ® ® ®
Варел-контраст ®
Рельефный фазовый контраст ®
Хоффман-контраст ® ®
Интегрально-модуляционный контраст ®
Дифференциально-интрефе- ренционный контраст ® ®
ПласДИК ®
«модуляционные» элементы располагаются обычно в плоскости апертур-
ной диафрагмы конденсора и в плоскости выходного зрачка объектива. В
конденсоре — это или кольцо (фазовый контраст), или щель (ПласДИК),
или круговой сегмент (варел-контраст), или прямоугольный элемент с
поляризатором (Хоффман-контраст), или поляризатор с призмой Вол-
лостона (ДИК). В объективах обычно — это кольца (фазовый контраст,
варел-контраст) или прямоугольник (Хоффман-контраст). Эти элементы
объектива имеют пропускание порядка 25 %. Таким образом, имеющий по
отношению к среде небольшую толщину объект «ощупывается» светом, а
затем свет, избирательно участвующий в построении изображения, созда-
ет рельефное, объемное изображение поверхности препарата.
Рис. 8.8.
Изображение объекта:
а) в фазовом контрасте; б) ПласДИК
122
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Рис. 8.9. ICSI-инъекция с помощью метода PlasDIC
Большую роль играет правильность подборки всех элементов микро-
** скопа, создающих «модулированный» пучок света и обеспечивающих
контраст за счет изменения интенсивности света прошедшего через
среду и через прозрачный неокрашенный объект.
«Участниками» этого процесса являются: конденсор с определенной
числовой апертурой с модуляционным элементом; объектив со своим
элементом, обязательно сочетающийся с числовой апертурой конден-
сора, и дополнительные принадлежности типа анализатора при исполь-
зовании поляризованного света в ПласДИК или ДИК (рис. 8.9).
Именно перечисленные особенности, а главное — правильная на-
стройка микроскопа при использовании тех или иных методов конт-
растирования, позволяют получить комфортное наблюдение с правиль-
ной передачей морфологии объекта. В табл. 8.7 представлены основные
элементы микроскопа, принимающие участие в создании «рельефных»
контрастов, реализуемых различными фирмами.
VAREL-контраст (ВАРЕЛ-контаст). VAREL-контраст (перемен-
ный рельефный контраст) дает рельефное изображение образцов и
может применяться как альтернатива фазовому контрасту (рис. 8.10).
VAREL-контраст можно применять также на изогнутых поверхнос-
тях, например, на 96-луночных плашках для микротитрования, для
которых невозможно настроить
фазовый контраст, поскольку
нельзя совместить кольца (из-за
неровности).
Настройка метода со специ-
альной посудой сводиться к тому,
что важно выбрать положение
сектора и фазовое кольцо внутри
объектива. При работе, напри-
мер, с плашками для микротит-
Рис. 8.10. Изображение объекта при исследовании
в Varel-контрасте по мере перемещения варел-
элемента
123
Таблица 8.7
Реализация методов контрастирования
Метод контрастирования Конденсор, (числовая апертура, рабочее расстояние) Объективы (увеличение) Дополнительные принадлежности Фирма
Фазовый контраст* А=0,20 (а=90 мм) А=0,30 (а=72 мм) А=0,55 (а=31 мм) 5х-10х-20х- 32х-40х Кольцевая диафрагма кон- денсора Carl Zeiss, Leica, Olympus, Nikon
Рельефный фазовый контраст А=0,30 (а=72 мм) 4х-10х-20х- 40х Щель конденсора в виде сек- тора Olympus, Leica
Варел-контраст А=0,40 (а= 53 мм) А=0,55 (а=31 мм) 10х-20х- 32х-40х Щель конденсора в виде сек- тора Carl Zeiss
Хоффман-контраст А=0,60 (а= 40 мм) 10х-20х- 40х Элементы модуляции (пря- моугольные), поляризатор и анализатор встроены в кон- денсор и объектив Carl Zeiss, Olympus
Дифференциально — интреференционный контраст (ДИК) ** А=0,35 А=0,55 А=0,80 А=1,40 10х-20х- 40х-63х- 100хМИ Призма ДИК конденсора, анализатор, призма ДИК объектива Carl Zeiss, Leica, Olympus, Nikon
ПласДИК А=0,55 (а=31 мм) 10х-20х- 32х-40х . Щель конденсора 5 (3,5) мм, анализатор, призмы ДИК для объективов Carl Zeiss
* Комплект для рабочего и лабораторного вариантов микроскопа.
*• Комплект для исследовательского микроскопа.
Инвертированные микроскопы проходящего света
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
рования на краю кавитации
для освещения следует вы-
брать положение диафраг-
мы кольца VAREL-конт-
раста, напротив, в центре
кавитации возможно пра-
вое или левое положение
кольца VAREL-контраста
(рис. 8.11).
Перемещение VAREL-
освещения за пределы зрач-
ка объектива (наблюдается
при вынутом окуляре) со-
ответствует односторон-
нему освещению по методу
темного поля.
Перемещение VAREL-
диафрагмы между Ph — и
VAREL-кольцом объекти-
Рис. 8.11. Положения .варел-элемента конденсора при дви-
жении его в радиальном направлении
ва соответствует косому
освещению по методу светлого поля. Сегмент VAREL-контраста рас-
полагается в подвижной пластине с тремя отверстиями Ph, Н, Var,
в которой можно закрепить и световое кольцо для фазового конт-
раста. Таким образом, левое положение подвижного узла крепления
диафрагм позволяет быстро переключиться с VAREL-контраста на
Ph-контраст.
PlasDIC-контраст (ПласДИК-контраст). PlasDIC-контраст — это
новый интерференционный контраст. Реализация метода1 (рис. 8.12)
требует штатива микроскопа со следующими компонентами: револь-
верное устройство для установки 5 объективов с прорезью для уста-
новки подвижной призмы PlasDIC; узла крепления диафрагмы Ph, Н,
PlasDIC; щелевой диафрагмы 5 мм для PlasDIC-контраста; подвижного
узла для крепления 3-х светоделительных модулей Р&С с модулем ана-
лизатора D Р&С.
PlasDIC-контраст дает рельефное представление поверхности
препарата и рекомендуется для особенно толстых образцов. Конт-
раст можно настраивать переменно. Контрастирование плашек для
микротитрования возможно до края (рис. 8.13). При работе по ме-
1 В данном случае речь идет о реализации метода в рабоче-лабораторной модели мик-
роскопа.
125
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
пространство
без поляризации
плоскость предмета
б
1
пространство
с поляризацией
Рис. 8.12. Принципиальная оптическая
схема и элементы метода PlasDIC (пат.
DE10219804):
1 - узел крепления поляризатора; 2 - блок
поляризатора; 3 - щелевая диафрагма
конденсора; 4 - крепление анализатора;
5 - комплект призм ДИК для объективов; 6 -
комплект объективов с большими рабочими
расстояниями; 7 - конденсор; 8 - галерея
изображения диатомовой водоросли
тоду ПласДИК сосуды для культивирования не обязательно должны
иметь стеклянное дно. Этот метод предназначен для использования
пластиковой одноразовой посуды.
DIC-контраст (ДИК-контраст). Наилучших результатов при ис-
пользовании метода дифференциально-интерференционного кон-
траста (ДИК) можно добиться лишь при наличии компонентов,
полностью соответствующих друг другу. В связи с этим существует
оптимально подходящая для каждого объектива ДИК-призма (клин),
которая устанавливается в паз, расположенный в револьверном ус-
тройстве под конкретным объективом. Кроме того, в револьверном
устройстве конденсоров находится соответствующая призма.
126
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Рис. 8.13. Изображение лунки с помощью трех рельефных методов:
а - Hoffman, 6- PlasDIC, в - DIC.
Вверху - фокусировка на край; внизу - фокусировка на центр
При реализации метода ДИК по Номарскому поляризатор и анали-
затор скрещены (под прямым углом друг к другу), а контраст дости-
гается путем перемещения ДИК-призмы перпендикулярно оптической
оси микроскопа.
При реализации метода ДИК по Сенармону (рис. 8.14) вместо ДИК-
призмы используется вращающийся анализатор с Х/4— пластинкой.
Второй метод обеспечивает гораздо большее удобство доступа к руко-
ятке управления движением призмы, что становится наиболее очевид-
но при использовании сложных конфигураций микроскопа, включаю-
щих в себя камеры и микроманипуляторы.
Hoffman-контраст (Хоффман-контраст). Этот рельефный кон-
траст является одним из популярных методов, применяемых в тех-
нологии ЭКО. Преимущество, которое
отмечается пользователями, связано с от-
сутствием окраски препарата при работе
с пластиковой (одноразовой) посудой.
В отличие от метода ДИК, где основ-
ной является поляризация светового по-
тока, в Хоффман-контрасте, несмотря на
то, что используется элемент, поляризую-
щий свет в секторе, он скорее выполняет рис g. н Элементы для реализации
роль элемента косого освещения. В связи метода ДИК по Сенармону
127
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
Рис 8.15. Изображение препарата и основные элементы Хоффман-контраста:
а - изображение; 6- конденсор и револьверное устройство модулятора для различных объективов; в - вид модулятора
в объективе
а
с этим качество изображения в микроскопе очень зависит от настрой-
ки метода.
На рис. 8.15 представлен основной элемент — конденсор с модуля-
тором, представляющий собой револьверное устройство, в котором
закреплены модулирующие устройства для объективов с различной
числовой апертурой.
Внутри конденсора есть поляризатор (рис 8.15 в). Для каждого объ-
ектива имеется соответствующий подвижный элемент (рис. 8.16 а), ко-
торый является контрольным при настройке метода. При вращении
поляризатора серая часть модулятора остается постоянной — изменя-
ется по интенсивности проходящего света часть Р2 контрольного эле-
мента. Подвижный элемент должен быть установлен таким образом,
чтобы светлая часть контрольного элемента была полностью наложена
на серый элемент модулятора. На рис. 8.16 показана последователь-
ность настройки.
Рис. 8.16. Схема настройки Хоффман-контраста:
а - вид выходного зрачка объектива через линзу Бертране, видны элементы объектива и конденсора; 6- не выровнен-
ное положение модулятора и контрольного элемента; в - выровненное положение модулятора и контрольного элемента;
г, д - минимум контраста; е - максимум контраста.
/- непеременная часть; II - часть, контролирующая изменение света при вращении поляризатора
128
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
жЙЗ Изображение при правильно настроенном контрасте должно быть:
на серОМ фоне объемное изображение объектов, с одного края ко-
торого — темный контур, с другого — ярко светлый без теневых и
гала — эффектов.
8.4. МЕТОД Cell Observer
Система Cell Observer интересна тем, что является примером со-
четания новых типов инвертированных микроскопов и аппаратно-
программного решения сложной биологической задачи исследова-
ния живых клеток.
В данную систему входят следующие компоненты: инвертиро-
ванный исследовательский микроскоп, цифровая камера, програм-
мный пакет AxioVision, а также различные принадлежности, такие
как, например, предметные столы с перемещением по осям X и Y,
сменные светофильтры, затворы, инкубаторы и культуральные ка-
меры.
Программный пакет Cell Observer состоит из документирования
динамических процессов с задержкой по времени, поддержкой не-
скольких каналов, Z-стек и модуля Mark&Find в произвольных соче-
таниях. В этой системе имеются различные функции, которые могут
потребоваться при современных методах визуализации живых кле-
ток. Например, возможность изменения любых параметров даже во
время записи с помощью команд «Пауза» и «Продолжение», изме-
рение расстояния между точками А и В, расчет угла по точкам А, В
и С, статистические вычисления и многое другое.
Выйдя за пределы второго и третьего измерений, можно увидеть
новые измерения в предлагаемых системой Cell Observer функциях.
Информацию, полученную из четвертого измерения (длины волны)
можно сохранять в 8 различных каналах изображения и в любой мо-
мент произвольно комбинировать. Пятое измерение (время) служит
для описания регистрации клеток за определенный период време-
ни. В шестом измерении происходит автоматическая фокусировка
на различных положениях на культуральном планшете. Программа
Cell Observer обеспечивает наблюдение живых клеток при работе
как с двумерными, так и со сложными шестимерными изображени-
ями вне зависимости от их количества (и для шести изображений,
и для шестисот).
129
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
8.5. МЕТОД PALM.
В 2005 году две немецкие фирмы Р. A.L.M. Microlaser Technologies и
Carl Zeiss объединились и представили на рынок новую технологию с
использованием лазера.
Микролазерная система Р. A. L. М. относится к бесконтактному ла-
зерному микроманипулированию с живыми клетками (Non-Contact
Live Cell Laser Micromanipulation Using PALM MicroLaser Systems).
Наилучшим образом описание метода РА. L.M. и его технологичес-
кие особенности представлены в статье «Лазерная катапульта» Тать-
яны Зиминой (корр. ж-ла «Наука и жизнь»), в которой она — с точки
зрения специалиста-биолога, а я — микроскописта, рассказываем об
этом методе.
Одна из важнейших и сложнейших задач при проведении микроопе-
раций с биообъектами — выделение интересующего элемента (напри-
мер, живой клетки, хромосомы, макромолекулы определенного вида) из
имеющегося биологического материала без его загрязнения и поврежде-
ния. Лазерная микросистема позволяет успешно решать эту задачу.
Сфокусированный через объектив с высокой числовой апертурой
УФ-лазерный пучок (рабочая длина волны — 337 нм; размер фокуси-
ровочной области — 1 цт) длительностью порядка 3 наносекунд, пе-
ремещаясь по препарату, не только вырезает нужный микрообъект, не
повреждая его, но и «катапультирует» в улавливающий микроконтей-
нер, отделяя, таким образом, от остального материала (рис. 8.17). Мощ-
ность лазерного пучка и фокусировка автоматически регулируются с
большой точностью. Этим же лазерным лучом можно предварительно
разрушить в исследуемом образце те элемен-
ты, которые могут мешать выделению (иссече-
нию и катапультированию) нужного объекта.
Принцип лазерного иссечения с помо-
щью УФ-лазера, заложенный в микросисте-
ме PALM Microbeam, основан на явлении так
называемого «абляционного фоторазложе-
ния» — фотохимического процесса отделе-
ния массы с поверхности твердого тела без
теплообмена с окружающей средой. Узкий
лазерный пучок фокусируется чуть ниже био-
логического объекта на подложке, на которой
он расположен. В фокусе пучка достигается
экстремально высокая плотность фотонов
Рис. 8.17. Схема работы лазерной
микросистемы P.A.L.M.
130
Глава 8 Инвертированные микроскопы проходящего света
(плотность энергии более 1012 Вт/см2), которая достаточна для разрыва
молекулярных связей биомолекул на ионы, электроны и другие части-
цы, т. е. для образования плазмы. Формирование и разрушение микро-
плазмы вблизи фокальной точки лазера происходит в течение наносе-
кунд, то есть настолько быстро, что не происходит теплопереноса за
границы сфокусированного лазерного пятна.
Этот же процесс является движущей силой катапультирования. Все
происходящее визуализируется с помощью видеокамеры и записыва-
ется на управляющий компьютер, где хранится подробная информация
обо всех манипуляциях и экспериментах. Компьютер регулирует ско-
рость вырезания объекта, интенсивность лазерного луча, а также пози-
ционирует луч в интересующем месте и т. д.
Использование дополнительного ИК-лазерного луча позволяет при
необходимости точно удерживать биологические объекты в растворе в
определенном положении, сближать их (например, клетки) для после-
дующих манипуляций.
Система может использоваться для огромного числа манипуляций
с биологическими и медицинскими объектами: выделения и анали-
за ДНК, РНК, хромосом и изучения экспрессии генов, клонирования,
культивирования клеток, исследования раковых тканей, искусственно-
го оплодотворения и т. д. Все эти манипуляции и исследования исполь-
зуются в биологии, медицине, биохимии, криминалистике1.
К приведенной информации целесообразно добавить несколько
слов о микроскопе.
Система Р. A.L.M. базируется на ручном и моторизованном вариан-
те биологического инвертированного микроскопа Axiovert 200/200М.
Микроскоп помещается в специальный инкубатор, позволяющий рабо-
тать с живыми клетками или клеточной культурой. При работе исполь-
зуются объективы — LD Plan-Neofluar. Толщина предметного стекла,
на котором располагается объект — 0,17 мм.
Новое сообщение поступило из Германии: фирма Carl Zeiss с 2007
года выводит на рынок новый микроскоп — универсальный инверти-
рованный микроскоп Axio Observer (Аксио Обсёрвер). Три варианта
штатива — два ручных (Al, DI) и один моторизированный (ZI) с управ-
лением со штатива (аналогично Axio Imager ZI). Микроскоп придет на
смену Axiovert 200/200М.
1 В популярном фильме «CSI — место преступления» криминалисты воспользовались
технологией P.A.L.M. на базе микроскопа Axiovert 200 для выделения единичного объекта
(спермы) для доказательства преступления. Объект был иссечен и перенесен в соответству-
ющую среду для дальнейшего исследования.
131
ЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ МИКРОСКОПЫ
Люминесцентная микроскопия обладает рядом преимуществ качественного и количественно-
го характера:
• цветное свечение,
• высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне,
• возможность исследования прозрачных и непрозрачных живых объектов, а также наблю-
дения за различными жизненными процессами в динамике их развития,
• обнаружение и установление локализации отдельных микробов и вирусов.
Современный парк люминесцентных микроскопов включает в себя все типы микроскопов
(рис. 9.1), что говорит о популярности метода, а главное, о его важности и высокой информа-
тивности ’. В 2004 году фирма Carl Zeiss представила новый ряд микроскопов под девизом:
«Carl ZEISS: FluoresScience», определив, таким образом, основное направление в световой
микроскопии. Однако, как и все другие методы контрастирования, он может быть как помощ-
ником, так и источником ошибок и ложных выводов.
9.1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ. ПРАКТИКА ПРИМЕНЕНИЯ
В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцент-
ной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител.
Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвест-
ных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требует
меньше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применя-
ется как метод люминесцентного выявления возбудителя туберкулеза
для диагностики таких инфекционных форм как: дифтерия, гонорея,
возвратный тиф и др.
На люминесцентном микроскопе производят фенотипический ана-
лиз клеток периферической крови, костного мозга и тканей по нали-
чию поверхностных антигенов с помощью моноклинальных антител
1 Благодарю всех, кто помог мне в написании этой главы своими работами, в которых я
тоже принимала участие, пусть и косвенное. Это специалисты в области микологии, иммуно-
логии, генетики и, прежде всего, проф. Блинова Н.П., канд. мед. наук Назарову Е.К., канд. мед.
наук Лапина С., докт. биол. наук Рубцова Н.Б. Сообщения представлены в Приложении.
132
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис.9.1. Группа люминесцентных микроскопов:
а) прямой микроскоп; б) инвертированный микроскоп; в) стереоскопический микроскоп
Таблица 1
Спектры поглощения и эмиссии объектов
Объект поглощает Объект светится
синий свет зеленый свет
зеленый свет желтый свет
желтый свет красно-оранжевый свет
(диагностика пер-
вичных и вторичных
иммунодефицитов,
лейкозов и т.д.), а
также оценку функ-
циональной актив-
ности фагоцитирую-
щих клеток крови.
Для люминесцен-
тных методов иссле-
дования большую
роль играет обработ-
ка препарата специ-
альными реактивами.
Отдельные молекулы
вещества обладают
способностью на ко-
роткое время погло-
щать свет, а затем испускать его, правда, в другой длине волны, как пра-
вило, в сторону красного света (закон Стокса1), превышая длину волны
поглощаемого света возбуждения на 20-50 нм.
1 Правило Стокса (закон Стокса) установлено Дж. Г. Стоксом в 1852 г. Правило ут-
верждает, что длина волны фотолюминесценции больше, чем длина волны возбуждающего
света. Согласно этому энергия фотонов люминесценции меньше энергии фотонов возбуж-
дающего света. Правило Стокса выполняется не всегда, во многих случаях в спектре фото-
люминесценции наблюдаются антистоксовы линии, длины волн которых короче возбужда-
ющей. Правило широко известно в формулировке немецкого физика Э. Ломмеля: максимум
спектра люминесценции сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону
более длинных волн.
133
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 93. Контрольный препарат ф. Биомерье. Элементар-
ные и ретикулярные тельца.
Axsiostar plus: ртутная лампа НВО 50; люм. блок 09; обл.
возбуждения - EX ВР 450-490; обл. запирания -BSFT510;
обл. змиссии -EMLP515. (Е.К.Назарова, РМАПО, кафедра
КЛД, Москва)
Различные флуорохромы
(маркеры) обладают в зави-
симости от вида совершено
определенными спектрами
поглощения, зависящими от
внутреннего строения флуо-
ресцирующих молекул, а иног-
да и от их окружения. Пог-
лощается не каждый фотон
облучающего света, а лишь
некоторая его часть. Кроме
того, не все захваченные фо-
тоны снова излучают свет.
Хорошие маркирующие ве-
щества имеют высокий «кван-
товый выход», характеризу-
ющий соотношение между
испущенными и поглощенны-
ми фотонами. Этот эффект
является очень полезным для
микроскопии. Маркированный таким образом препарат освещается
возбуждающим отфильтрованным, например, синим светом, и наблю-
дается уже в свете сформированным, например, с помощью запираю-
щего фильтра, полностью не пропускающего синий и длинноволно-
вый желтый и красный свет.
Таким образом, маркированные структуры, например, части кле-
точной структуры, высвечиваются зеленым светом на темном фоне.
К диагностическим, методам исследования хламидий относится
метод иммунофлуоресценции1. Наружная оболочка хламидий содержит
родоспецифический ЛПС-антиген, видоспецифический ОМР-1-анти-
ген и типоспецифический ОМР-2 белковый антиген. Их обнаружение
используется при диагностике хламидиоза иммунофлуоресцентным
методом (рис. 9.3). К достоинствам этого метода относится относитель-
ная быстрота постановки диагноза (около 60 мин), простота работы с
тест-системой и возможность оценки клеточного состава полученного
для исследования материала. Специфичность метода высокая — около
95 %. Однако при использовании метода ПИФ возможно получение как
ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов1 2.
1 Авторы: Назарова Е. К., Зенина М. Н.
2 Примеры применения приведены в приложении.
134
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
9.2. ОСОБЕННОСТЬ КОНСТРУКЦИИ ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ МИКРОСКОПОВ
Интересно, что появление модульного принципа конструирования
изменило статус люминесцентного микроскопа как некого экзотичес-
кого прибора. Эта модель стала рутинной и входит в модельный ряд
всех групп микроскопов. Если раньше люминесцентные микроскопы
очень отличались от обычных, по крайней мере — за счет комплекта-
ции их специальными люминесцентными объективами, то есть обла-
дающими минимумом собственной люминесценции, то в настоящее
время все больше фирм переходит на единый комплект объективов.
Люминесцентные микроскопы разделяются на группы сложнос-
ти, так же как и биологические микроскопы. В зависимости от группы
сложности микроскопа изменяются основные модули:
♦ источник света становится мощнее;
• линейные поля окуляров увеличиваются;
» усложняется конструкция устройства установки и управления све-
тофильтрами — от ручного переходит к автоматическому режиму;
• увеличивается количество люминесцентных блоков светофиль-
тров.
Рис. 9.4.
Схема конструкции люминес-
центного микроскопа:
1 - галогенная лампа с
коллектором; 2-полевая
диафрагма проходящего света;
3 - апертурная диафрагма;
4 - конденсор; 5 - плоскость
предмета; 6 - объектив; 7- све-
товой поток проходящего света
и люминесценции; 8 - тубусная
линза;9-окуляр; /0-блок
ртутной лампы с коллектором;
11 - задвижка; 12 - теплоза-
щитный светофильтр; 13 - апер-
турная диафрагма; 14 - блок
люминесцентных светофильтров;
15 -фото-видеовыход
135
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
£'t3 Конструкция люминесцентного микроскопа отличается от биологи-
’е"®’ ческого (проходящего света) наличием осветителя отраженного све-
та, расположенного над объективами, и дополнительных узлов, в том
числе специальных блоков со светофильтрами и светоделительной
полупрозрачной пластинкой, которые расположены между осветите-
лем отраженного света и объективами (рис. 9.4).
Осветительная система. В современных люминесцентных микро-
скопах освещение объекта происходит по схеме осветителя отражен-
ного света:
• световой поток от источника света попадает на полупрозрачное
зеркало, которое отражает 100%-световой поток и направляет
его в объектив;
• объектив, работая как конденсор, освещает объект;
• свет, отраженный от объекта, попадает обратно в объектив, про-
ходит через него, затем через полупрозрачное зеркало, которое
пропускает 100% отраженного света, и создает изображение в
плоскости изображения.
В обычных микроскопах отраженного света оптика разрабатывается
ч»™®’ таким образом, чтобы обеспечивать возможность освещения и созда-
ния изображения непрозрачных и полупрозрачных объектов с помо-
щью одного многолинзового узла — объектива. То есть изображение
строится только за счет отраженных от объекта лучей. Таким обра-
зом, чем меньше света поглощается и больше отражается, тем контрас-
тнее изображение. Если объект биологический (прозрачный или полу-
прозрачный) и покрыт покровным стеклом, то блики отраженных от
поверхности покровного стекла лучей снижают контраст, или «заби-
вают» и без того неконтрастное изображение. Поэтому для работы в
отраженном свете применяются объективы, во-первых, рассчитанные
на работу без покровного стекла, во-вторых, безрефлексные, работа-
ющие с высокоотражающими и малопоглощающими поверхностями.
По этой причине микроскопы проходящего и отраженного света име-
ют два комплекта объективов, а обычный метод микроскопии светлое
поле отраженного света применяется в специальных методиках.
В люминесцентных микроскопах отраженного света оптика обычная,
используются объективы проходящего света, рассчитанные на рабо-
ту с покровным стеклом. И связано это с тем, что задача состоит в
наблюдении изображения, сформированного световым потоком све-
чения: свет проходит через покровное стекло и через объект, происхо-
136
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
дит реакция возбуждения и испускания света, который и «собирается»
затем объективом. И это не прямое отражение от поверхности объек-
та, а именно захват светового потока «испускания», то есть «глубинно-
го» свечения. Заметим, что мы не видим те элементы объекта, которые
не светятся под воздействием светового потока определенной длины
волны, и, даже если они светятся, но их светящееся изображение не
проходит через запирающий светофильтр («отрезается»).
Люминесцентный осветитель отраженного света включает в себя:
• узел крепления источника света, который обеспечивает уста-
новку ртутной лампы (в отечественных моделях — ДРШ — 250,
ДРШ-250-3, ДРШ100, НВО 100 W/2; в зарубежных - НВО 50W,
НВО 100 W, НВО 150 W) или ксеноновой лампы, а также увели-
чение светящегося тела за счет применения специального сфери-
ческого зеркала-отражателя;
• коллектор, который может быть неподвижным или подвижным
с узлом фокусировочного перемещения вдоль оптической оси и
шторкой для перекрытия света;
• блок поджига ртутной (или ксеноновой) лампы;
• тубус микроскопа отраженного света с узлом полевой и апертур-
ной диафрагм;
• устройство крепления блока люминесцентных светофильтров.
В качестве источника света используются как обычные галогенные
лампы (например, в простых накладных осветителях типа отечествен-
ного ОИ 28), так и ртутные и ксеноновые лампы высокого и сверхвы-
сокого давления. Сейчас на рынок фирмой Hunda (Германия) представ-
лен рабочий люминесцентный микроскоп для дерматологии с диодным
осветителем. Специфическое свечение диода, упрощенная и дешевая
конструкция микроскопа позволяет использовать его в простейших
случаях применения широкой спектральной полосы пропускания за-
пирающего светофильтра1.
Однако лампы накаливания в качестве источников света не пригод-
ны для люминесцентной микроскопии из-за того, что металлическая
нить накаливания преобразует большую часть потребленной элект-
роэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом
лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном
диапазоне, который не всегда пригоден для возбуждения и наблюдения
особенно слабосветящихся объектов. Для работы в свете люминесцен-
ции необходимо иметь источник света с линейчатым спектром интен-
1 Для иммунолюминесцентных реакций микроскоп не пригоден.
137
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
сивным в коротковолновой час-
ти, в той части, которая наиболее
приемлема для биологических
объектов.
В отличие от лампы накали-
вания ртутные лампы работают
по принципу газового разряда и
обладают линейчатым спектром
излучения (рис. 9.5).
Лампы имеют специфичное
светящееся тело. В кварцевую
колбу вплавлены два электро-
да. В зоне горения содержится
небольшое количество ртути.
Рис. 9.5. Спектр ртутной лампы За счет разрядов определенной
мощности высокого напряжения
между электродами возникает электрическая световая дуга, которая и
поддерживается в «горящем» состоянии.
Лампа излучает чрезвычайно интенсивный свет, содержащий значи-
тельную долю УФ — излучения. Излучаемая световая энергия концентри-
руется при определенных длинах волн, так называемых «линиях ртути».
Большим преимуществом таких линейчатых излучателей является
чередование интенсивных линий и мало интенсивных спектральных по-
лос, которые необходимы при создании условий для наблюдения в свете
люминесценции. Важно, что возбуждение осуществляется с помощью
одной «линии», а свечение в силу смещения Стокса наблюдается при
длине волны, в которой лампа испускает мало интенсивный свет.
Система светофильтров. В схеме люминесцентного микроскопа
одним из основных узлов является полупрозрачная светоделитель-
Рис. 9.6.
Схема работы люминесцентного блока свето-
фильтров:
7 - световой поток от источника света; 2 - выделенный
световой поток возбуждения; 3 — световой поток эмис-
сии (свечения объектов, меток);
Л - возбуждающий светофильтр; В - полупрозрачная
пластина (полупрозрачное зеркало, дихроичное зерка-
ло); 6— запирающий светофильтр.
138
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.7. Графики пропускания разных блоков люминес-
центных светофильтров:
а - с широкополосным запирающим светофильтром (ЕХ
ВР 450-490, BS FT 510, ЕМ Р 515); 6-с узкополосным за-
пирающим светофильтром (EX ВР 450-490, BS ГТ 510, ЕМ Р
515-565); в - стремя светофильтрами возбуждения и запи-
рания (DAPI+FITS+Texas Red + EX TBP 400+495+570, BS FT
410+505 +565, EMTBP 450+530+610).
Обозначения: EX - возбуждающий светофильтр; BS - запирающий
светофильтр; EM - свет эмиссии (припускание света эмиссии)
ная пластина (полупрозрачное зеркало), выполненная на высоком
технологическом уровне. Иногда подобная пластина может иметь
до 40 слоев пленки-покрытия для выделения необходимой длины
волны.
Светоделительная полупрозрачная пластина обладает следующими
свойствами:
• как зеркало служит для излома и направления светового потока
от источника света через конденсор-объектив на объект;
• как пластинка служит для пропускания света от объекта, про-
шедшего через объектив, для формирования изображения.
Кроме того, полупрозрачная пластина (полупрозрачное зеркало)
осуществляет разделение светового потока по спектру (рис. 9.6).
йЕД Аля пРимеРа возьмем блок светофильтров: 09 — ЕХ ВР 450-490, BS
"“в ртр ем Ер gig, представленных на рис. 9.7а:
♦ световой поток с длиной волны Xi = 450-490* нм (ЕХ ВР), выделен-
ный с помощью возбуждающего светофильтра А из всего спект-
рального диапазона ртутной лампы, на 100% отклоняется зеркалом
и заставляет объект светиться (люминесцировать);
1 Принято указывать максимумы спектра поглощения и спектра люминесценции
(по Э. Ломмелю).
139
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.8. Изображение битума (Axsiostar plus: ртутная лампа НВО 50, объектив 10х):
а - люминесцентный блок 10 — EX ВР 450-490; BS FT 510; ЕМ ВР 515-565; б- люминесцентный блок 09 - EX ВР 450-
490; BS FT510; ЕМ ВР 515
♦ от объекта отражаются два световых потока Xi =450-490 нм
и Хг = 515 нм (ЕМ LP) и, пройдя через объектив, попадают на полу-
прозрачную пластинку;
• полупрозрачная пластинка пропускает 90% светового потока с дли-
ной волны Хг = 515 нм, и отражает 90% светового потока с длиной
волны Xi = 450 - 490 нм;
• через запирающий светофильтр С проходит весь световой поток с
длиной волны больше, чем 510 нм (BS FT), и именно этот свет яв-
ляется основным для построения изображения на черном фоне. Бу-
дут видны все элементы объекта, отразившие свет в спектральном
диапазоне 510-7001 нм и в тех цветах, которые характерны для это-
го диапазона — ярче виден тот цвет, который отразился в большем
количестве.
На рис. 9.7 приведены графики спектрального пропускания свето-
фильтров и полупрозрачной пластины для разных блоков1 2.
Влияние запирающего светофильтра на качество свечения можно оце-
нить по тестовому объекту (рис. 9.8). Разницу между двумя, казалось
бы, такими одинаковыми блоками 10 («) и 09 (6), которые отличаются
только характеристиками запирающего светофильтра (ЕМ ВР 515-565
и ЕМ LP 515, соответственно) можно наблюдать на абсолютно черном
тестовом объекте — битуме (рис. 9.8). Как видно на фото, узкополос-
ный запирающий светофильтр («) создает ярко зеленый цвет, в то вре-
мя как широкополосный (6) — зеленовато-желтоватый.
1 Видимый глазом спектральный диапазон.
2 Блоки от микроскопов фирмы Carl Zeiss.
140
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.9.
Способы крепления блоков люминесцент-
ных светофильтров:
а - установка в микроскопе; 6- 3-х позици-
онное устройство с горизонтальным переме-
щением; в - револьверное устройство с 8-ю
блоками, г - блок с устройством ACR
В моделях 70-х годов светофильтры выполнялись в виде отдельных
элементов, которые можно было комбинировать. Однако это требова-
ло сложных конструкций микроскопа, дополнительных механических
деталей, а главное — отсутствия стандартизации процесса исследова-
ния.
Современный блок конструктивно представляет собой куб, в кото-
ром закреплены:
• со стороны источника света — возбуждающий светофильтр;
• под углом 45° — светоделительная полупрозрачная пластина;
• со стороны наблюдательной системы — запирающий свето-
фильтр (рис. 9.9 д).
Все три элемента блока являются сменными. Свойство пластины
и светофильтров определяется применяемым флуорохромом и ожи-
даемым цветом видимой люминесценции. Крепление блоков разно-
образное: от двух-трех позиционных подвижных вставок до 10-ти по-
зиционных револьверных устройств1 (рис. 9.9). Связано это с тем, что
в медицинской практике требуется работа, как в проходящем свете, так
и в свете люминесценции.
Револьверное устройство может быть ручным и моторизованным,
управляемым от компьютера. В последних моделях AxioImager исполь-
зуется кодирующее устройство ACR. В новых моделях появился новый
1 В отечественном микроскопе БИМАМ Р 11/12 (АЮМАМ РПО) до сих пор использу-
ется один блок, который жестко встроен в конструкцию микроскопа.
141
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
тип светоделительных люминесцентных блоков — «НЕ», обладающих
высоким контрастом и спектральными характеристиками.
Использование многоцветной люминесценции, когда необходимо
последовательно возбуждать объект несколькими длинами волн с по-
мощью мощных ртутных ламп на быстро выгорающих объектах, требу-
ет применения быстродействующих шторок, открывающихся и закры-
вающихся в течение 2-х секунд. В подобных условиях целесообразно
применять моторизованные микроскопы со скоростными шторками.
Люминесцентные объективы. Люминесцентные объективы техно-
логически выполняются из оптических сред (стекла и клея), не внося-
щих собственной люминесценции в изображение. В противном случае
они вносят в изображение дополнительную фоновую засветку, умень-
шая тем самым интенсивность свечения объекта и превращая фон,
вместо черного, например, в зеленоватый или коричневатый. Ясно, что
в таком случае вместо яркого зеленого свечения объекта будет видно
слабое свечение или свечение с желтоватым оттенком. Для получе-
ния большего выхода люминесценции объективы стараются сделать с
большими числовыми апертурами (10x0,40; 40x0,75, 100x1,40) с упро-
щением оптических схем. Возбужденное в препарате флуоресцентное
излучение распространяется по всем направлениям. Задачей объекти-
ва является «собрать» как можно больше такого излучения, однако при
низкой числовой апертуре подобный эффект незначителен.
Гораздо эффективнее оказывается большой угол открытия (апер-
тура). При удвоенной апертуре объектива удается «захватить» почти в
четыре раза больше флуоресцентного излучения. Посредством иммер-
сии, в частности, масляной или водной иммерсии, можно дополнитель-
но устранить световые потери, возникающие вследствие рефлексов на
поверхностях. Изображение становится более светлым.
Иммерсионное мало должно быть специальным, не люминесцирую-
щим. Разработать единое иммерсионное масло (и = 1,52) пока не уда-
лось. Поэтому часто в практической медицине применяют объекти-
вы водной иммерсии с дистиллированной водой (и = 1,33), которая не
обладает люминесцирующими свойствами.
В инвертированных люминесцентных микроскопах задача услож-
няется тем, что, чем больше рабочее расстояние и потребность в кор-
ректировке на толщину дна посуды, тем меньше числовая апертура
объектива. Так же как и в прямых микроскопах, в них объединяют мик-
роскопию проходящего и отраженного света, что вполне естественно
при исследовании биологических объектов. Однако для проходяще-
142
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
го света работа с конденсорами небольшой числовой апертуры (до
А = 0,55) большого рабочего расстояния и объективами с большой чис-
ловой апертурой приводит к снижению света и разрешения. Именно
по этой причине на инвертированных микроскопах есть возможность
установки конденсоров с большими числовыми апертурами (более
А = 0,55), правда, с небольшим рабочим расстоянием. Это обеспечивает
работу с обычными объективами больших числовых апертур, но уже со
стандартным покровным стеклом 0,17 мм.
93. ВНИМАНИЕ: ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ
Как ни при каком другом методе исследования наблюдение в свете
люминесценции требует серьезного отношения, начиная от научно-те-
оретического обоснования до технологии, подготовки, проведения и
собственно процесса наблюдения и анализа.
©Например, в процессе исследования хломедийных инфекций получе-
ние ложноположительных результатов может быть обусловлено:
• низким качеством диагностических наборов;
• погрешностями при пробоподготовке;
• наличием в исследуемых образцах нежизнеспособных возбуди-
телей, а также других бактерий, имеющих перекрестно реагиру-
ющие антигены с антигенами хламидий, которые дают такое же
ярко-зеленое свечение;
• субъективным характером трактовки получаемых результатов
свечения;
♦ неправильной техникой взятия соскоба со слизистой;
♦ особенностью хронических форм инфекции: например, наличием
в исследуемом материале L-подобных форм хламидий, утратив-
ших наружную оболочку и, таким образом, неспособных распоз-
наваться в ПИФ обычными тест-системами.
Однако стоит добавить, что ложное представление об объекте в зна-
чительной степени обеспечивает именно микроскоп. С этой точки зре-
ния на качество люминесцентного изображения влияют:
» класс микроскопа и тип оптической коррекции объективов;
» мощность источника света;
» правильность подбора флуорохромов и системы запирающих и
возбуждающих светофильтров:
» настройка осветительной системы микроскопа.
На рис. 9.10 представлены результаты экспериментов по влиянию раз-
личных факторов настройки осветителя на люминесцентное изображение.
143
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
а о в
г
д
Рис. 9.10. Влияние настройки
люминесцентного осветителя
на свечение изображения:
а - изображение препарата при пра-
вильно настроенном люминесцен-
тном осветителе; 6и в - - крайнее
левое и крайнее правое положения
коллектора; г и д - крайнее левое
и крайнее правое положения светя-
щегося тела ртутной лампы
Для исключения влияния неправильной настройки осветительной
системы только в люминесцентном осветителе современного микро-
скопа устанавливаются специальные контрольные окна (рис. 9.11), ко-
торые установлены в осветителе и при контроле вводятся в ход лучей,
а при исследовании выводятся из него.
Для настройки люминесцентного осветителя необходимо:
* ♦ из револьверного устройства вывинтить объектив;
♦ на предметный стол положить лист белой бумаги;
• ввести блок светофильтров;
• опустить светозащитный экран;
• включить блок поджига лампы, дать
ей разгореться в течение 10 мин.;
♦ наблюдать светящийся диск, в ко-
тором видны два изображения —
собственно светящееся тело между
электродами и его зеркальное изоб-
ражение (рис. 9.12 в).
Задача настройки: совместить оба изоб-
ражения (собственно светящегося тела
ртутной лампы и его зеркального отображе-
ния) в центре (выходном зрачке объектива):
Рис. 9.11. Контрольное окно в люминес-
центном осветителе отраженного света
144
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.12. Настройка изображения
светящегося тела ртутной лампы
и его зеркального отображения:
а - изображения децентрированы;
6-изображения параллельны друг
другу; в - изображения приближены
друг к другу.
» с помощью коллектора получить резкое изображение первично-
го изображения светящегося тела;
» произвести настройку в соответствии с рис. 9.12;
♦ проконтролировать положение сдвоенного изображения с помо-
щью контрольного окна, для чего ввести его в ход лучей (изобра-
жение должно быть в центре контрольного круга);
• установить объект;
» ввинтить объектив.
Как было доказано на рис. 9.10, настройка осветителя очень важ-
на, поэтому новое поколение универсально-исследовательских микро-
скопов фирмы Carl Zeiss имеет самонастраивающийся узел крепления
ртутной лампы НВО 100 (рис. 9.13). Сенсорное устройство контроли-
рует положение светящегося тела лампы относительно оптической оси
осветителя. Оператор может определить осуществляемый контроль по
трехкратному щелчку: Y-Z-коллектор. Подобный контроль позволяет
исключить ошибки настройки.
Люминесцентный осветитель настраивается по принципу Келера
* и так же, как и в обычных осветителях отраженного и проходяще-
го света, имеет апертурную и полевую диафрагмы. В отличие от ос-
ветителя проходящего света, где первой после источника света идет
полевая диафрагма, а затем апертурная (в конденсоре), в осветите-
лях отраженного света первой после источника света идет апертур-
ная диафрагма, а затем — полевая.
Рис. 9.13.
Самоцентрирующийся узел крепления
ртутной лампы НВ0100:
а - внешний вид;
6-схема управления: 1 - коллектор; 2 - спе-
циальное зеркало; 3 - z-мотор; 4 - у-мотор;
5 - электроника; 6 - 4х-позиционный сенсор.
145
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
9.4. НОВЫЕ МЕТОДИКИ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
Современное развитие биологических направлений на основе лю-
минесцентного метода исследования и технические возможности поз-
воляют обеспечить направления исследований в области биологии
клетки. К ним относятся цитобиология и молекулярная биология.
Цитобиология (клеточная физиология / нейробиология / нейрофи-
зиология):
• мембранные поверхности: интерактивная поверхность клетки —
окружающая среда;
♦ Exocytosis-Endocytosis;
• клетка — основание — контакты, трансмембранный ионный об-
мен;
• локализация и обмен скоплений молекул на мембранах;
» проникновение вирусных частиц через мембрану клетки;
♦ перенос вакуолей через клеточную мембрану;
• белки мембраны клетки;
♦ взаимодействие цитоскелета с мембраной клетки.
Молекулярная биология / биология развития / биохимия:
♦ мономолекула, то есть взаимодействие миозина-АТФ, белково-
мембранное взаимодействие;
♦ взаимодействие белок-белок, анализ выделенного гена;
» обмен белка.
Достижения в указанных направлениях стали возможны с появле-
нием таких методов исследования как TIRF (Total Internal Reflection
Fluorescence Microscopy— микроскопия полного внутреннего лю-
минесцентного отражения) (рис. 9.14) и SIRF (Simple Internal Reflec-
tion Fluorescence Microscopy —- микроскопия простого внутреннего
люминесцентного отражения). В первом методе используется лазер,
во втором — ртутная лампа. Методы были впервые предложены на
фирме Carl Zeiss и 70-х годах, когда появились объективы с йод-ме-
тилленовой иммерсией и со сверхбольшими числовыми апертурами
А=1,61.
Целью разработки данных методов являлось уменьшение флуорес-
цирующего фона и улучшение отношения «сигнал-шум» (уменьшение
фоновой засветки).
1 В России приблизительно в это же время были разработаны аналогичные объективы.
Группа микрооптики ГОИ им. Вавилова С. И.(23 лаб.) занималась отработкой эксперимен-
тальных образцов. Но йод-метилленовая иммерсия очень токсична и агрессивна, поэтому
объективы не прижились.
146
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.14.
Принципиальная схема мик-
роскопии полного внутреннего
люминесцентного отражения
Рис. 9.15.
Схема хода лучей в процессе
работы при обычной люминес-
ценции (слева) и при полном
внутреннем отражении (справа):
1 - объектив; 2 - иммерсионный
слой; 3 - покровное стекло; 4 - мо-
нослой (недолговечная область)
Рис. 9.16. Объектив a Plan-Neofluar
Результатами применения методов стали: исследования возбужден-
ных флуорохромов в недолговечной области; наблюдение отдельных
флуоресцирующих молекул; большое секционирование (рис. 9.15).
Преимущества достаточно ощутимы — высокое пространствен-
ное разрешение, вдоль оптической оси, отсутствие вторичной флуо-
ресценции, наблюдение деталей в сложных
изображениях.
Основными элементами для реализации
данного способа решения вопросов исследо-
вания являются — объектив со сверхбольшой
числовой апертурой (рис. 9.16) и элементы-
слайдеры (рис. 9.17), которые устанавлива-
ются в плоскость полевой (TIRF) или апер-
турной (SIRF) диафрагм инвертированного
микроскопа Axiovert 200.
При этом SIRF — «удобный» элемент для
усиления контраста ртутной лампы без ла-
зера. TIRF — это лазерное освещение через
слайдер, при котором возможна нормальная
флуоресценция.
147
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис.9.17.
Варианты установки
конструктивных элементов
(слайдов) для реализации
методов SIRF и TIRF:
...... в плоскость апер-
турной диафрагмы
(SIRF);
-------в плоскость поле-
вой диафрагмы
(TIRF)
Критический угол для полного внутреннего отражения определяет-
ся по формуле:
1/и = и2/«1 = since,,/sin 90° = sina^.
Например:
1) при показателях преломления «2 = 1,38 и «1 = 1,515, критический
угол будет равен
1,38/1,515 = sinoCgVsin 90° = sina^, то есть ag=65,63°.
2) при показателях преломления «2 = 1,45 и «1 = 1,515, критический
угол будет равен
1,45/1,515 = sina^/sin 90° = since,,, то есть се,, =73,15°.
TIRF—объектив для того, чтобы «захватить» свечение объектов, по-
падающих под полное внутреннее отражение, должен иметь числовую
апертуру А> 1,38 (угол приблизительно 66°).
Рис. 9.18.
При полном внутрен-
нем отражении на-
блюдаются только те
светящиеся элементы,
которые расположены
в слое 200 нм:
а -обычная люми-
несценция;6-Т1ЙГ
148
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.19.
Сравнительные изображения
объектов, полученные с приме-
нением:
а, в - обычной люминесценции;
б-метода TIRF; г - метода НВО
SIRF
План-Fluar 1ООх /1,45 Oil имеет угол 73.4°, то есть угол в 7,5°, доступ-
ный для TIRF—метода.
А вот объектив Plan-Apochromat 100х /1,4 Oil имеет угол 67°, что для
реализации TIRF затруднено.
На рис. 9.18 и 9.19 приведены результаты применения методов в
биологических исследованиях.
Однако существуют и ограничения при работе с методом TIRF:
• работа может проводиться только в маленьком объеме образца
близко к толщине покровного стекла;
• работы возможны только с образцами, которые находятся в вод-
ной среде;
♦ требуется компьютерный контроль (прицеливание, лазерное ос-
вещение, лазерная безопасность).
Устройство ApoTome, разработанное на фирме Carl Zeiss в июле
2003 года, получило престижную американскую награду «R&D 100», ко-
торая дается за достижения в технической и технологической области.
Управление блоком происходит с помощью программы. Он может
быть установлен на универсальных прямых и инвертированных микро-
скопах Axiolmager Z1 и Axiovert 200М.
149
Глава 9 Люминесцентные микроскопы
Рис. 9.20. Устройство AproTome:
а - собственно блок; б-принцип действия (выделения монослоя); в - сравнение изображений, полученных
в обычной люминесценции (верхнего) и с блоком AproTome (нижнего).
Технология получения метода связана с установкой подвижной сет-
ки (решетки) в световой поток люминесцентного осветителя. В резуль-
тате этого происходит: оптическое секционирование светового потока
через объект, увеличение разрешения в осевом направлении ~ в 2 раза,
а также улучшение отношения «сигнал-шум», что ведет к повышению
разрешающей способности. Таким образом, происходит «удаление»
лишнего света из плоскости фокусировки, что обеспечивает хорошую
предпосылку для создания 3D изображения и 3D реконструкций.
150
ГЛАВА 10
ПОЛЯРИЗАЦИОННЫЕ МИКРОСКОПЫ
ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
В зарубежных моделях рабочих микроскопов довольно часто встречаются варианты с
принадлежностями для получения упрощенного поляризованного света. В отечественных
микроскопах это реализуется только в микроскопе БИОЛАМ Р-17 и соответствующем варианте
микроскопа МИКМЕД1. Однако настоящий поляризационный микроскоп имеет несколько
особенностей, которые позволяют производить определенные наблюдения и измерения, в
которых качество оптики является определяющим.
Одним из методов изучения веществ и объектов является иссле-
дование в поляризованных лучах. Правда, желательно, чтобы объекты
обладали свойством анизотропии. С помощью поляризованного света
можно:
» сконтрастировать изображение объекта за счет проявления ани-
зотропных свойств объекта;
» измерить степень анизотропности объекта.
Поляризованный свет представляет собой «упорядоченные» с по-
мощью поляфильтров световые волны, которые имеют одно преиму-
щественное направление (линейно-поляризованный свет).
Основным условием формирования
поляризованного света в микроскопе
является изменение ориентации света
в пространстве путем введения в ход
лучей как минимум двух поляфильтров
(анализатора и поляризатора). В све-
товом потоке поляфильтры специаль-
но ориентируются друг относительно
друга — разворачиваются на 90°, что
обеспечивает непропускание света в
определенном направлении колебания
(рис. 10.1).
151
Глава 10 Поляризационные микроскопы для медико-биологических исследований
Схематично это можно представить следующим образом (рис.
10.2). Световой поток от лампы проходит через апертурную диафраг-
му в конденсоре, вблизи которой расположен первый поляфильтр.
Направление колебания света становится линейно-поляризован-
ным. Таким свет проходит через плоскость предмета и попадает в
объектив.
За объективом располагается второй поляфильтр (анализатор), ко-
торый разворачивается таким образом, чтобы не пропустить установ-
ленное направление колебания — происходит «гашение» света.
Теперь следует положить на предметный столик объект. В том мес-
те, где объект обладает анизотропным свойством (двойным лучепре-
ломлением), происходит «проявление» изображения (или просветле-
ние) в поле видения.
Объясняется это тем, что показатель преломления подобных мате-
риалов зависит от скорости распространения света в направлении ко-
лебания. Поэтому, когда линейно поляризованный свет проходит через
подобный объект, то происходит изменение (поворот) колебаний све-
та относительно плоскости, сформированной ранее поляризатором, а
значит, и частичное пропускание света анализатором.
Вращением анализатора можно контролировать предпочтительное
направление поляризации, а дополнительно введенные компенсаты
известной величины позволяют оценить степень анизотропности объ-
екта, измерение угла поворота поляризации при прохождении света
через объект.
Поляризационная микроскопия обычно характеризуется:
♦ высокой степенью контрастности изображения объектов в поля-
ризованных лучах;
♦ четкостью цветного изображения без дополнительного рассеян-
ного света, ухудшающего качество изображения;
• визуализацией объектов, невидимых в обычном свете и обладаю-
щих свойством двулучепреломления.
В медицинской практике поляризационные микроскопы применя-
ются при анализе состава почечных и желчных камней, желчи, различ-
ных гистологических срезов мышечных тканей при инфаркте миокар-
да, а в фармакологии — при анализе лекарственных смесей.
В комплект поляризационного модуля максимально должны
входить: анализатор, поляризатор и вращающийся центрируемый
столик.
152
Глава 10 Поляризационные микроскопы для медико-биологических исследований
Рис. 10.2.
Схема установки анали-
затора и поляризатора в
рабочем микроскопе:
1 -откидной поляризатор, ус-
тановленный под конденсором,
2 - анализатор,устанавливае-
мый в бинокулярной насадке;
При проведении исследований с целью обнаружения кристаллов и
их свойств применяются специальные поляризационные микроскопы,
которые включают:
• окуляр с сеткой для центрировки микроскопа и проведения не-
обходимых измерений;
• визуальный тубус, в котором обеспечена возможность установки
анализатора линзы Бертрана (для наблюдения коноскопии);
• конденсор с откидной свободной рамкой для установки поляри-
затора, или специальный поляризационный конденсор с откид-
ной фронтальной линзой;
• центрировочная пластина с перекрестием для совмещения оп-
тической оси микроскопа с механической осью вращения пред-
153
Глава 10 Поляризационные микроскопы для медико-биологических исследований
метного столика. На ярлыке пластины указываются координа-
ты положения центра перекрестия.
В лабораторных биологических и поляризационных, а также бо-
лее сложных микроскопах, например, типа Аксиоскоп 40, может
использоваться специальный блок, который наравне с люминес-
центными блоками устанавливается в револьверное устройство над
объективами.
К основным требованиям, предъявляемые к поляризационным
микроскопам, следует отнести применение специальных объекти-
вов и конденсоров, которые имеют отличительную маркировку «Ро1»
или «П», а также по стандарту имеют надпись красного цвета.
Пример практического применения метода поляризационной
микроскопии при диагностике микрокристаллических артритов
приведен в Приложении 4.
154
ГЛАВА 11
ЛАЗЕРНЫЕ СКАНИРУЮЩИЕ МИКРОСКОПЫ
ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Для исследователей, занимающихся микроскопическими методами, главным является
возможность в передаваемом изображении реального объекта увидеть как можно больше
с высоким разрешением и с высокой степенью достоверности. Для достижения этой цели
идеальным может быть сочетание разрешающей способности электронной микроскопии с
методами световой. При этом наиболее ответственная роль отводится подготовке образца,
сохраняющего свойства объекта. На современном этапе развития науки и техники такой выход
был найден. Это метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ)1.
Физиологи могут регистрировать ионные концентрационные зависимости при различных
биологических процессах и получать количественные характеристики (константы).
Клеточные биологи широко используют метод восстановления флуоресценции после
фотоотбеливания (FRAP), позволяющий качественно и количественно описывать кинетику
внутриклеточного транспорта в микрокомпартментах клеток, а также метод флуоресцентно-
го резонансного переноса энергии (FRET), незаменимый при исследованиях межмолекуляр-
ных и белок-белковых взаимодействиях.
Новые технологии и подходы также используются в фармакологии (транспорт и внутриклеточ-
ная локализация лекарственных средств) и в молекулярной биологии (детекция единичных
ДНК-мишеней)1 2.
11.1. ОСОБЕННОСТИ СИСТЕМ ЛСМ
Из теории образования изображения, разработанной Эрнстом
Аббе, известно, что плоскость предмета, где находится объект, и
плоскость изображения, где формируется изображение, сопряжены
1 Начало отечественных разработок в ГОИ им. Вавилова С. И. относятся к началу 90-х
годов прошлого века. Наша группа занималась подбором и разработкой основного элемента
(конфигурацией и размером) точечной системы. К сожалению, мы не успели довести работу
до экспериментального образца.
2 В главе использованы материалы, подготовленные канд. биол. наук Ячменевым С. В.
для газеты «Zeiss сегодня», 2005 г.
155
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
Рис. 11.1. Первые точечные
элементы конфокальной
микроскопии:
о - оригинальные Nipkow—от-
верстия; 6-схема спиннинг-
осветителя
между собой. Оптическая система имеет два фокуса: передний фокус,
который расположен на объекте, то есть в пространстве предмета,
и задний фокус, который расположен в пространстве изображения.
Фокус — это некое пространство, в пределах которого каждый объек-
тив (в зависимости от своей числовой апертуры) обеспечивает резкое
изображение объекта без дополнительной перефокусировки (глуби-
ны резкости объектива). Такое же пространство, только увеличенное
в квадрат увеличения объектива, есть и в сопряженной плоскости —
плоскости изображения.
Для получения резкого изображения с высокой точностью передачи
контура, формы и цвета объекта необходимо анализировать очень тон-
кие слои — плоскости, то есть «собирать» эти изображения, как «слое-
ный пирог» в пределах глубины резкости объектива. Выделить единую
плоскость можно с помощью диафрагмирования в плоскости изобра-
жения — диафрагма отсекает «лишний» свет в изображении. Для полу-
чения объемного изображения необходимо «сканирование» объекта. В
начале 60-х годов эту задачу пытались решить с помощью специальных
точечных диафрагм, расположенных в определенном порядке и враща-
ющихся с определенной скоростью, как в плоскости изображения, так
и в осветительной системе (рис. 11.1) *. В то время не было малогаба-
ритных и не вредных лазеров, обеспечивающих высококогерентный
осветительный поток.
Проблема получения резкого (четкого) и контрастного изобра-
жения без так называемых засветок, снижающих контраст, наиболее
актуальна при работе с флуоресцирующими объектами. Картина флу-
оресцирующего объекта представляет собой темный фон, на котором
видно яркое, или не очень, свечение либо меток, либо структур (рис.
11.2). Биологические структуры достаточно объемны, и при наблюде-
нии в световой микроскоп можно видеть ореолы, наложения одной
1 Технологическая проблема получения точечных диафрагм, расположенных в оп-
ределенном порядке, была одной из причин остановки отечественных разработок в 80-х
годах.
156
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
зображение янтарной окаменелости
поя 300 pm):
флуоресценция z-разрешения, ограни-
ктивом; 6-конфокальное изображение
укции; в - одиночный конфокальный
доения, ограниченный размером
афрагмой; г - галерея послойного
структуры на другую. Положение усугубляется, когда нам нужно про-
анализировать изображение, полученное с помощью многоцветной
флуоресценции.
Серийный выпуск специальных конфокальных сканирующих мик-
роскопов, предназначенных для исследования объектов в биологии и
медицине, осуществляется рядом компаний, в то же время, получени-
ем трехмерного изображения на уровне разрешения, приближенного к
электронной микроскопии, много лет занимается компания Carl Zeiss
Пять поколений микроскопов нашли свое место в научных центрах
всего мира. Разработаны теории и методики для медико-биологичес-
ких целей, усовершенствованы программы и микроскопы.
Напомним, что при работе со светящимися объектами важными
являются длина волны возбуждения и длина волны запирающего све-
тофильтра, который пропускает флуоресцирующий свет и не пропус-
кает свет возбуждающей.
Основной принцип конфокальной (совпадение фокусов) микроско-
пии представлен на рис. 11.3. В качестве когерентного источника света
для создания спектра возбуждения используются лазеры с соответс-
твующим излучением в видимой области. Это исключает применение
1 ЛСМ-модули выпускаются, практически, всеми фирмами-разработчиками оптико-
электронных систем.
157
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
Рис. 11.3. Принципиальная схема
конфокальной микроскопии:
1 - детектор; 2 - точечная кон-
фокальная диафрагма (pinhole);
3 - главный дихроичный делитель;
4—образец; 5 -лазер
достаточно сложной осветительной системы, ртутной или ксеноновой
ламп, а также технологически сложных интерференционных возбужда-
ющих светофильтров.
Точечная материальная (конфокальная) диафрагма (pinhole), рас-
положенная в некой плоскости пространства изображения объектива,
сопряжена (оптически спроектирована) с единой фокальной плоскос-
тью объектива в пространстве предметов, освещенного объекта. Пучок
света от лазера с длиной волны возбуждения генерирует в образце флу-
оресцентный свет, который, пройдя через объектив и полупрозрачную
пластину (главный дихроичный делитель), попадает в плоскость изоб-
ражения, где расположена pinhole.
Созданное изображение регистрируется высокочувствительной
(включая эмиссионные светофильтры) системой детекции.
Как видно на рис. 11.3, диаметр точечной конфокальной диа-
фрагмы контролирует толщину оптического среза, так как отсекает
свет, исходящий от объекта вне фокальной плоскости (пунктирных
линий). Таким образом, формируется некий «пространственный
фильтр» позволяющий снимать информацию только с отдельной тон-
кой оптической плоскости образца. Следует отметить, что в обычной
световой, в том числе и люминесцентной микроскопии изображение
регистрируется в пределах всего освещаемого пространства части
образца, в том числе и вне фокуса, что создает неконтрастное (по
глубине) изображение.
158
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
Рис. 11.4. Принцип трехмерного
лазерного сканирования:
о - по осям X-Y; 6-по оси Z; в - га-
лерея послойного сканирования;
г-различия в люминесцентных
изображениях обычной (?) и конфо-
кальной (2) микроскопии.
С помощью системы лазерного ска-
нирования по осям X-Y-Z достигается
высокое разрешение в многоцветной
флуоресценции объекта, что обес-
печивает максимальную информа-
тивность
Специальная система независимых сканирующих зеркал, располо-
женных во взаимно перпендикулярных плоскостях, позволяет пере-
мещать сфокусированный лазерный пучок в плоскости по осям XY.
Измеренная таким образом в каждой точке (пикселе) интенсивность,
в том числе и флуоресценции, позволяет сформировать тонкий XY
срез изображения (рис. 11.4д).
Благодаря прецизионному перемещению образца вдоль оси Z, по-
является возможность подобно томографии проводить шаг за шагом
послойное Z—оптическое секционирование (рис. 11.46). Дальнейшая
компьютерная трехмерная организация полученных срезов и их пос-
ледующая реконструкция позволяют получать контрастное по всему
объему трехмерное флуоресцентное изображение исследуемого объ-
екта. Именно сканирование в пределах глубины резкости объектива
(ось Z) позволяет создать пошаговую галерею изображений, что обес-
печивает возможность воспроизведения любого оптического среза в
159
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
изображении (рис 11.4 в), что совершенно невозможно для обычной
световой микроскопии. Данный подход позволяет послойно просмат-
ривать живые биологические объекты с уровнем разрешения до 100—
150 нм. В то же время этот метод позволяет получить четкую картину
при многоцветной флуоресненции (рис. 11.4г).
11.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ЛСМ. ПАРАМЕТРИЧЕСКИЙ РЯД
Лазерный сканирующий микроскоп (ЛСМ) представляет собой
единый системный комплекс, состоящий из трех частей — электрон-
ной части с лазерным блоком, оптического модуля со сканирующей
системой и светового микроскопа. Электронная часть включает ком-
пьютерную систему высокого класса, электронный модуль управления,
лазерный модуль с лазерами различной мощности и длины волны (UV,
VIS, NIR) и корректирующими блоками к ним. Оптический сканирую-
щий модуль (ЛС-модуль), включает в себя несколько регистрирующих
каналов (детекторов) с системой светофильтров различных длин волн,
конфокальные точечные диафрагмы, сканирующее зеркало. Модуль вы-
полнен в виде отдельного блока, который устанавливается на световой
микроскоп. При этом расположение АС-модуля для прямого микро-
скопа — сверху, положение для инвертированного микроскопа — сбо-
ку или снизу.
Лазерная сканирующая система представляет собой два самостоя-
тельных модуля: современный универсальный моторизованный люми-
несцентный микроскоп и исследовательский лазерный сканирующий
модуль на базе например, двух лазеров — HeNe-laser (543 нм, 1 mW —
встроенный) и Ar-Laser (458,477, 488, 514 нм, 30 mW).
Для получения высокого качества изображения тонких структур в
микроскопе применяются объективы высокой оптической коррекции
Plan-Neofluar— объективы плоского поля с полуапохроматической
коррекцией. Таким образом достигается исправление оптической сис-
темы микроскопа для 3-х основных длин волн — зеленого, красного
и синего спектров, и, следовательно, создание такого цветного изоб-
ражения, на которое не влияют хроматические (цветовые) искажения
оптики, связанные с технологией изготовления оптических деталей. В
комплекте используется уникальный объектив планапохроматической
коррекции 63х /1,40 МИ большой светосилы, что обеспечивает регист-
рацию слабого свечения флуоресцирующих объектов и их элементов.
Объективы имеют повышенную числовую апертуру, которая опре-
деляет разрешающую способность микроскопа, что позволяет разли-
160
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
чить более мелкие детали, чем в микроско-
пе с обычными объективами (табл. 11.1).
Получение высокого качества изображе-
ния и результатов тесно связано с возможнос-
тью моторизированной модели, работающей
в автоматическом режиме при переходе от
одного увеличения к другому и обеспечива-
ющей правильную (классическую) настройку
освещения по принципу Келера.
Сам модуль разделяется на классы слож-
ности по соотношению «цена-качество»,
в которых понятие «качество» связано с
количеством и мощностью лазерных сис-
тем, количеством каналов с детекторами и
их параметрами, принципами управления
и контроля за процессом сканирования,
а также полнотой пакета компьютерных
программ. Есть упрощенные системы фирм
Олимпус и Лейка1, однако для научно-ис-
следовательских задач интерес представля-
ют АСМ фирмы Carl Zeiss (Рис. 11.5). Две
модели этой фирмы перекрывают диапазон
Рис. 11.5. Семейство LSM фирмы
Carl Zeiss
научных исследований. Рассмотрим более
подробно каждую модель с точки зрения
полноты решаемых задач.1 2
Модель LSM 5 PASCAL представляет собой конфокальный мик-
роскоп начального уровня — мощную и при этом недорогую систе-
му, ставшую новым стандартом в своем классе. Упрощенный модуль
АСМ подходит для применения в различных областях люминес-
центной визуализации, в том числе и для получения изображений с
ДИК-контрастом.
Модуль имеет:
• один или два конфокальных канала, каждый из которых оснащен
высокочувствительным детектором;
1 АСМ системы фирм Лейка и Carl Zeiss иногда можно встретить в одном и том же
учреждении и даже в одной комнате, как и микроскопы. Задачи, которые можно решать с
помощью этих систем, настолько разнообразны и новы для наших пользователей, что при-
оритеты отдаются скорее с финансовой точки зрения, нежели с точки зрения необходимости
и достаточности.
2 Данная книга предполагает ознакомление с тенденциями развития, а не конкурентос-
пособности продукции той или иной фирмы.
161
162
Таблица 11.1
Разрешающая способность, выходная апертура и интенсивность люминесцентного свечения в зависимости от числовой
апертуры объектива
Параметры объектива Оценка эксплуатационных свойств объектива
Тип оптической коррекции Увеличение/ числовая апертура Разрешающая способность, мкм (лин/мм) Выход- ная аперту- ра Интенсивность люминесцент- ного свечения
Plan-Neofluar 10x/0,30 1,42 (704) 0,03 0,81-Ю’6 Объектив высокого разрешения и плоского поля
C-Apochromat 10x/0,45 ВИ 0,95 (1052) 0,045 4,10-Ю-6 Объектив высшей оптической кор- рекции, водной иммерсии, имеет большую кривизну по полю (нерез- кость), «работает» практически точ- кой (малой площадью в центре поля);
LD Plan-Neofluar 20x/0,40 1,07 (934) 0,02 0,1б-106 Объектив высокого разрешения и плоского поля с большим рабочим расстоянием, что необходимо при работе с чашками Петри
Plan-Apochromat 20x/0,75 0,57 (1754) 0,0375 1,9-10'6 Объектив высшей оптической кор- рекции и плоского поля
LD Plan-Neofluar 40x/0,60 0,71 (1408) 0,015 0,05-10’6 Объектив высокого разрешения и плоского поля с большим рабочим расстоянием, что необходимо при работе с чашками Петри
Achroplan IR 40x/0,80 ВИ 0,53 (1886) 0,02 0,16-Ю6 Объектив ахроматический плоского поля, имеет просветляющее покры- тие, позволяющее работать в инф- ракрасной области спектра; водной иммерсии
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
163
Plan-Neofluar 40x/l,30 МИ 0,17 (5882) 0,0325 i,ii-io-6 Объектив высокого разрешения и плоского поля; масляной иммерсии
C-Apochromat 40x/l,20 ВИ 0,184 (5434) 0,03 0,81-10'6 Объектив высшей оптической кор- рекции, имеет большую кривизну по полю (иерезкость), «работает», прак- тически, точкой (малой площадью в центре поля); водной иммерсии
Achroplan 50x/0,90 МИ 0,47 (2127) 0,018 о,ю-ю-6 Объектив ахроматической коррекции и плоского поля; масляной иммерсии
Plan-Apochromat 63x/l,40 МИ 0,158 (6329) 0,022 0,23-10'6 Объектив высшей оптической кор- рекции плоского поля; масляной иммерсии
Achroplan 63x/0,95 ВИ 0,45 (2222) 0,015 0,050-IO'6 Объектив ахроматической коррекции и плоского поля; водной иммерсии
Achroplan IR 63x/0,90 ВИ 0,47 (2127) 0,014 0,027-10'6 Объектив ахроматический плоского поля, имеет просветляющее покры- тие, позволяющее работать в инф- ракрасной области спектра; водной иммерсии
Plan-Neofluar 100х/1,30МИ 0,17 (5882) 0,0130 0,029-Ю'6 Объектив высокого разрешения и плоского поля; масляной иммерсии
Plan-Apochromat 100х/1,40МИ 0,158 (6329) 0,0140 0,038-10'6 Объектив высшей оптической кор- рекции плоский по полю; масляной иммерсии
a-Plan-Fluar 100х/1,45МИ 0,152 (6578) 0,0145 0,044-10-6 Специальный объектив для работы по методу TIRF (наблюдение свече- ния клеток, находящихся на дне посу- ды, «скользящим» лазерным пучком под углом полного внутреннего отра- жения); масляной иммерсии
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для мед и ко-би ол огических исследований
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
• одну точечную конфокальную диафрагму (pinhole), общую для
обоих каналов.
Лазерная система может включать в себя максимально до 3-х лазер-
ных источников в различной конфигурации. Это могут быть лазеры —-
аргоновый (458, 488, 514 нм), аргон-криптоновый (488, 568 нм), гелий-
неоновый (543 нм), гелий-неоновый (633 нм) или диодный (405 нм).
Индивидуальное изменение интенсивности каждой лазерной линии
контролируется оптико-механическим плавно регулируемым филь-
тром (MOTF). В случае мультитрекинга (последовательного лазерного
сканирования), а также для чистого по канального разделения муль-
тифлуоресцентных (более одного флуорохрома) изображений, фильтр
позволяет сканировать образец только в режиме «рамка за рамкой».
Это происходит довольно медленно, что существенно затрудняет ре-
гистрацию кратковременных процессов.
Модель LSM 5101 представляет собой исследовательский модуль
АСМ, дает возможность использовать до четырех каналов люминес-
ценции одновременно и позволяет работать с различными типами
лазеров для возбуждения красителей в ультрафиолетовом и видимом
диапазоне.
В случае исследовательского модуля проблема упрощенного ста-
новиться решаемой. Исследовательский модуль оснащен акустоопти-
ческим, плавно регулируемым фильтром (AOTF), который способен
мгновенно, в пределах микросекундного интервала, изменять и конт-
ролировать интенсивность одновременно на 6-ти различных лазерных
линиях. Это позволяет:
• сканировать образец, в случае мультитрекинга, в режиме «линия
за линией», что не лимитирует скорость сканирования;
• выбирать произвольной геометрической линией область фото-
отбеливания или сканирования образца (функция ROI).
• Методы сканирования (рис. 11.6):
• сканирование по нарисованной произвольной линии;
• полное вращение изображения на угол 360°;
• масштабирование и смещение.
В дополнение к этому поддерживаются стандартные и специальные
режимы, например, сканирование сплайна или сканирование реальной
области интереса (ROI).
Электронная система обеспечивает тринадцать различных скоро-
стей сканирования для каждого из двух режимов: сканирующее увели-
1 Развитие этого типа микроскопов идет очень интенсивно и возможно, что часть све-
дений уже устарело.
164
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
чение (zoom) до 40х, которое свободно вращается на 360°, и максималь-
ное разрешение при сканировании до 2048x2048 пикселей.
Все процессы можно записывать и сохранять в виде видеоклипов.
Благодаря функции многодорожечной записи возможно получение
многоканальных люминесцентных изображений без перекрестных по-
мех между каналами.
Исследовательский модуль может иметь до четырех конфокальных
каналов с индивидуальными высокочувствительными детекторами,
при этом каждый канал оснащен собственной точечной конфокальной
диафрагмой (концепция «multiple pinhole»). Данное конструкторское
решение обусловлено собственно объектом и принципом конфокаль-
ного изображения. Толщина оптического среза зависит от длины вол-
ны флуоресцентного красителя и размера точечной диафрагмы. Сле-
довательно, для получения одинаковых по толщине оптических срезов
мультифлуоресцентного изображения необходима автоматическая
подгонка размера pinhole перед каждым каналом. Этот подход сущес-
твенно оптимизирует детекцию и позволяет получать предельное про-
странственное разрешение при максимальной интенсивности сигнала.
Исследовательский модуль позволяет максимально использовать до
4-х лазерных источников одновременно и обеспечивает возможность
выделения следующих спектральных линий: 458 нм, 477 нм, 488 нм, 514
нм, 543 нм.
Рис. 11.6.
Сканирующие движения луча по объекту, которые мо-
гут быть произвольно выбраны с помощью программ:
1 - однонаправленное сканирование, при возврате - гаше-
ние луча; 2 - двойное скоростное сканирование, линейное
сканирование до 1300 Hz (DDS - двойное детекторное скани-
рование); 3 - поворотное сканирование, разные углы (Г, 0-
360°); 4 - двойное скоростное поворотное сканирование DDS;
5- произвольное сканирование для реально существующей
области интереса (rROIs); 6 - произвольное сканирование
локализации возбуждения.
Стратегия сканирования - 1D, 2D, 3D, время - 4D. Абсолютно
линейное сканирующее движение: некоторая задержка
времени для каждого пикселя в изображении (основное
для количественных измерений).
165
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
Помимо вышеперечисленных лазеров, дополнительно можно ис-
пользовать ультрафиолетовый (UV) аргоновый лазер (351, 364 нм), ар-
гоновый лазер (458, 477, 488, 514 нм) и мультифотонный импульсный
(NIR) лазер (700 - 950 нм).
Модуль обеспечивает возможность локализации помеченных мо-
лекул. Система ConfoCor 2 фирмы Carl Zeiss с помощью люминесцен-
тной корреляционной спектроскопии (FCS) помогает понять взаимо-
действие между этими молекулами. Объем измерения — меньше, чем
бактерия Е. coli, — легко помещается внутрь любой клетки. Благодаря
этому, биохимические процессы можно исследовать в их естественной
среде. Эту систему можно использовать и для измерений в растворах.
Модуль АСМ использует устройство AOTF, позволяющее линейно
контролировать интенсивность лазера от 0 до 100% с шагом 0,1 %.
Модель LSM 510 NLO предназначена для длительного наблюдения
клеток, тканей и эмбрионов. Многофотонная технология, используемая
в этом микроскопе, гарантирует высокое качество изображений даже
при работе с образцами большой толщины, а высокая избирательность
в трех измерениях не только обеспечивает гибкость при визуализации,
но и дает возможность проводить эксперименты с обесцвечиванием,
например, FRAP (восстановление люминесценции после обесцвечива-
ния) и локальное высвобождение.
Одной из последних мировых разработок семейства АСМ является
LSM 510 МЕТА фирмы Carl Zeiss. Главной отличительной особеннос-
тью этой модели является замена двух (из четырех) конфокальных од-
ноканальных детекторов на один полихроматический 32-х канальный
МЕТА-детектор.
Задача разделения близь лежащих спектров возбуждения и спектров
эмиссии является одной из основных при исследованиях в многоцвет-
ной флуоресценции. Эта задача в данной модели решается следующим
образом.
Пройдя через конфокальную диафрагму, флуоресцентный свет пред-
варительно линейно раскладывается на спектральные составляющие,
которые далее детектируется в 32-х независимых высокочувствитель-
ных каналах. Таким образом, каждый сканируемый попиксельно опти-
ческий срез имеет, помимо трехмерных координат, еще и информацию
о спектральном распределении интенсивности {Lambda Stack), то есть
происходит сканирование полного суммарного эмиссионного спектра.
Далее функция не смешиваемого линейного разделения {Linear Un-
mixing) позволяет смешанный сигнал пиксель за пикселем прецизион-
но разделять на составляющие и идентифицировать спектр каждого
166
Глава 11 Лазерные сканирующие микроскопы для медико-биологических исследований
флуоресцентного красителя в отдельности. В качестве спектров срав-
нения можно использовать получаемые в режиме on-line индивидуаль-
ные эмиссионные спектры для каждого маркера. Данная технология,
которая получила название «Эмиссионная дактилоскопия», безоши-
бочно регистрирует, несмотря на широко перекрывающиеся между
собой эмиссионные спектры, каждый флуоресцентный компонент как
отдельный канал, поэтому обеспечивается возможность наблюдения
реального, чисто разделенного на составляющие, трехмерного мульти-
флуоресцентного изображения объекта.
Программное обеспечение для КАСМ решает довольно широкий
круг задач и позволяет использовать целую серию современных техно-
логий:
♦ возможность снимать множественные временные серии муль-
тифлуоресцентных изображений с изменениями специфических
конфигураций;
♦ трехмерную и четырехмерную (временную) реконструкцию объ-
ектов с элементами анимации;
♦ колокализационный анализ, позволяющий, в случае совпадения
различных сигналов в одной точке (пикселе), получать не смеши-
ваемые изображения;
♦ количественные трехмерные измерения объемных параметров
и топографический пакет (материаловедение) для визуализации
трехмерных поверхностей с различными измерительными фун-
кциями.
ЛСМ рекомендуется использовать для следующих исследований
(см. Приложение 5):
♦ получение двойных (редких, тройных) immunolabelin фикси-
рованных и живых клеток, при этом главным образом два ка-
нала назначаются для использования зеленой (FITC) и красной
(TRITC) флуоресценции;
♦ проведение фото отбеливающих экспериментов;
• анализ поведения флуоресцентных датчиков в живых клетках;
• трехмерная реконструкция и анимация изображения;
♦ измерение интенсивности флуоресценции в определенных зонах
клеток.
167
ГЛАВА 12
СТЕРЕОСКОПИЧЕСКИЕ МИКРОСКОПЫ
Одним из основных преимуществ объемного 3-х мерного изображения является его
естественность при наблюдении. Мы видим предмет таким, какой он есть — неперевернутое
изображение на большом поле, увеличенное и естественное. И как ни странно, разрешение
элементов более выражено, чем в обычной плоской микроскопии. Известно, что разрешающая
способность восприятия повышается в б раз, если мы видим предмет в объеме.
12.1. ОСОБЕННОСТИ СТЕРЕОСКОПИЧЕСКИХ МИКРОСКОПОВ
Особенность стереоскопического микроскопа связана с его задачами:
• возможность увидеть как можно больше в глубину;
• необходимость наблюдения трехмерного (объемного) изобра-
жения;
• возможность наблюдать при небольшом увеличении достаточно
большие по меркам микроскопии предметы (от сотни мкм до не-
скольких см);
• получение прямого (неперевернутого) изображения предмета.
Если микроскоп имеет визуальную насадку с одним окуляром, то
он — монокулярный, двумя — бинокулярный. Часто в разговорной
речи стереоскопический микроскоп называют еще и «бинокуляром»
или «бинокулярным микроскопом». По внешним признакам, к которым
относится бинокулярная визуальная насадка, это правильно. Но по ре-
зультату наблюдения и по конструкции — это совершенно разные оп-
тические приборы (рис. 12.1).
С конца XIX—начала ХХ-го века бытует название стереоскопическо-
го микроскопа как «бинокулярной лупы». Но на дворе XXI век.
Лупа — оптический прибор с одноступенчатым увеличением (один
оптический увеличивающий компонент). Максимальное увеличение
обычной лупы составляет 15х-20х. Увеличение в стереомикроскопе —
как минимум двух ступенчатое (объективы, окуляр), а современные
стереомикроскопы имеют и трех — (плюс система сменного увеличе-
ния) и четырех — (еще плюс дополнительные насадочные линзы с раз-
168
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Щ Рис 72.7.
Изображения объектов,
полученные с помощью:
того микроскопа,
омикроскопа;
менением метода
электронного мик-
ными увеличениями) ступенчатое увеличение и оно достигает величи-
ны 400х-420х. Другое дело, что для работы иногда достаточно иметь
лунное увеличение (до 20х).
Последнее требование можно выполнить как стереомикроскопом,
так и обычным бинокулярным микроскопом (с объективом 1,25 х или
2,5х и окуляром 10х). Поэтому необходимо более четко представить
себе, что нужно получить от микроскопа: плоское или объемное (!)
изображение объекта, а также, каким должно быть максимальное (!)
увеличение и рабочее расстояние.
Основные отличия стереоскопических микроскопов от обычных
микроскопов связаны с принципом построения оптической схемы
микроскопа для наблюдения объекта двумя глазами.
Схема обычного микроскопа с бинокулярной насадкой обеспечи-
вает это наблюдение двумя глазами, исходя из условия комфортности
наблюдения (плоского изображения). При этом изображение не изме-
нится ни по форме, ни по цвету1, и остается полностью идентичным как
для правого, так и для левого глаза.
Схема стереоскопического микроскопа также обеспечивает на-
блюдение двумя глазами, однако формирование изображения (объем-
1 Правда, существует небольшое снижение светопропускания в одной ветви относи-
тельно другой, что связано с необходимостью компенсации оптического хода лучей. Осо-
бенно это отмечается в микроскопах учебных и старых моделях микроскопов.
169
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
ного) связано, по сути самого бинокулярного зрения, с рассматрива-
нием объекта под углом. При этом изображение для правого и левого
глаза — разное, поскольку каждый из глаз «рассматривает» свой учас-
ток объекта под определенным углом.
Обычный микроскоп с плоским полем изображения имеет один
объектив, который расположен перпендикулярно к плоскости объек-
та. В построении изображения участвует свет, который прошел через
объект или отразился от него и полностью заполнил входную апертуру
объектива.
В световом потоке участвуют следующие составляющие «плоского»
двухмерного изображения:
• по горизонтали — все элементы объекта, попадающие в «поле
зрения» объектива;
• по вертикали (глубине) — все элементы объекта, попадающие в
«поле зрения» объектива в пределах той глубины, которая обра-
зована полным апертурным углом объектива.
С помощью разделительных призм бинокулярной насадки происхо-
дит равнозначное разделение светового потока, участвующего в пост-
роении изображения. При использовании фотовыхода и наличии спе-
циальной светоделительной призмы или зеркала световой поток может
быть разделен на три части, но и при этом изображение по-прежнему
будет плоским.
Другое дело в стереоскопическом микроскопе.
Человек воспринимает объект в трехмерном пространстве — по
горизонтали, по вертикали и под углом. Убедиться в этом можно до-
статочно просто: необходимо закрыть сначала один глаз, затем другой.
Сразу становится ясно, что происходит как бы «ощупывание» взглядом
объекта под разными углами — то с одной стороны, то с другой. Иными
словами, происходит мысленная реконструкция объекта в трехмерном
пространстве по осям XYZ под разными углами.
Основная задача стерео прибора — не менять физиологического вос-
приятия. Решение этой задачи связано с той частью микроскопа, ко-
торая участвует в построении изображения объекта. А именно, с
объективом или объективами. На одном и том же поле видения объ-
ект «рассматривается» под двумя разными углами на соответствую-
щую глубину. Иными словами, каждый угол формирует свой поток
света, свою ветвь наблюдения в одном и том же поле.
йЁД Зная различия в физико-конструктивных особенностях микроско-
щи® пов, КОрректно говорить:
170
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Таблица 12.1
Сравнение обычного и стереоскопического микроскопов
Параметр Обычный микроскоп Стереоскопический микроскоп
Увеличение, max-min 12х-1600х 2,5х -400х
Поле на предмете, шах 20,8 мм 40 мм*
Рабочее расстояние, max 10 мм 92 мм®
Числовая апертура, max-min 0,05-1,4 0,05 (для одной ветви — 0,025) — 0,3 (для одной ветви — 0,15)
* Параметры базового варианта
• обычный микроскоп с плоским изображением объекта может быть
монокулярным, бинокулярным, или тринокулярным в зависи-
мости от применяемой визуальной насадки;
♦ специальный микроскоп с трехмерным изображением объекта яв-
ляется стереоскопическим микроскопом.
На рис. 12.2. представлены оптические
каналы микроскопов обычного и стерео-
скопического, если снять бинокулярную
насадку. Конструктивно расчет и построе-
ние оптической схемы стереоскопического
микроскопа ведется при условии наклона
каждого монокулярного микроскопа (при
схеме Грену), или разделения входного апер-
турного пучка на две ветви (при схеме Аббе)
под углом не более 7° от вертикали.
В табл. 12.1 приведены основные пара-
метрические отличия микроскопов плоско-
го поля от стереомикроскопов.
И последняя особенность. В стерео
микроскопах, повторяющих бинокулярное
наблюдение, изображение должно быть
прямым1. Поэтому в схему микроскопа
включены оборачивающие системы: при-
зменные или линзовые.
Стереоэффект и псевдо стереоэффект
(рельефный контраст). Говоря о псевдо
Рис 12.2.
Если снять бинокулярную насадку:
а - обычный микроскоп; б-стереоско-
пический микроскоп
1 В обычных микроскопах есть насадки с прямым и перевернутым изображением.
171
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
стереоэффекте, необходимо четко представлять, что в данном случае
речь идет о получении трехмерного изображения объекта в условиях
обычного микроскопа плоского поля.
Псевдо стереоэффект нередко называют обратным стереоэффек-
том. Теоретически это можно объяснить тем, что левое изображение
объекта попадает в правый глаз, а правое — в левый. Иными словами,
точки предмета, расположенные перед предметной плоскостью, вос-
принимаются нами как расположенные за нею.
Различаются два рода псевдо стереоэффекта: естественный и искус-
ственный.
Естественный псевдо стереоэффект получается в том случае, если
апертура объектива мала (до А = 0,10). Глубина резкости такого объек-
тива достаточно большая. Значит, четко можно различить элементы
объекта на глубине порядка 0,5 мм.
В искусственно созданном псевдо стереоэффекте объемность воз-
никает не за счет естественного повторения нашего бинокулярного
видения и раздвоения апертурного пучка на два самостоятельных ка-
нала, а благодаря искусственно созданному разделению или раздвое-
нию апертурного пучка в плоскости выходного зрачка объектива, то
есть в некой промежуточной плоскости внутри объектива. Изобра-
жение объекта при псевдо стереоэффекте будет перевернутым, так же
как и в микроскопах с плоском полем, в то время как в стереомик-
роскопах оно всегда прямое.
Искусственное разделение апертурного пучка тем сложнее сделать,
чем больше апертура объектива. Величина глубины резкости объекти-
ва с апертурой А = 0,30, например, незначительная и уменьшается по
мере увеличения числовой апертуры объектива. Следовательно, и вы-
сота объемного изображения также будет уменьшаться.
С другой стороны, появление псевдо стереоэффекта связано с
изменением светового потока (интенсивности) в зрачке объектива,
а именно с созданием разности фаз — опережением или запазды-
ванием. Поэтому искусственный псевдо стереоэффект можно на-
блюдать при следующих методах контрастирования, относящихся к
так называемым «рельефным» контрастам: косое освещение, темное
поле, фазовый контраст, дифференциально-интерференционный
контраст.
Кстати, при неправильно настроенном освещении или при очень
сильно «зажатой» числовой апертурой также наблюдается псевдо
стереоэффект.
172
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
12.2. КЛАССИФИКАЦИЯ СТЕРЕОСКОПИЧЕСКИХ МИКРОСКОПОВ
Как и обычные микроскопы, стереомикроскопы различаются по
классу сложности: учебные, рабочие, лабораторные и исследова-
тельские.
Опорными точками при оценке класса сложности микроскопа служат:
♦ коэффициент панкратики, т. е. отношение в zoom (зуум) — сис-
теме1;
♦ номенклатура сменных объективов по увеличениям и типам оп-
тической коррекции;
♦ номенклатура осветительных систем для разных методов иссле-
дования и контрастирования, а также в зависимости от мощнос-
ти источника света;
♦ номенклатура принадлежностей — оснований, столов.
Есть определенная закономерность в параметрах стереоскопическо-
го микроскопа, не отличающаяся от обычных микроскопов:
• чем больше увеличение, тем меньше линейное поле;
♦ чем больше увеличение, тем меньше рабочее расстояние.
Однако есть и особенность — при смене
увеличения с помощью дополнитель-
ной системы (Галилея или плавной/
zoom) рабочее расстояние остает-
ся постоянным. Смена увеличения
дополнительной системы происходит
внутри за счет изменения расстояний
между оптическими элементами систе-
мы, когда при постоянном рабочем рас-
стоянии происходит изменение увели-
чения и линейного поля (рис. 12.3).
Рис. 12.3.
Изменение линейного поля и уве-
личения при работе плавной смены
увеличения (zoom): слева - мини-
мальное увеличение максималь-
ное поле; справа - максимальное
увеличение минимальное поле на
предмете
Для того чтобы при смене увеличения
предмет оставался резким на всем диа-
пазоне работы zoom, необходимо сфо-
кусироваться на предмет при макси-
мальном увеличении (при меньшей
глубине резкого видения), тогда при пе-
реходе на меньшее увеличение «фокус»
не будет выходить из некой усреднен-
1 Зуум система — это система плавности смены увеличения. Сменная система увеличе-
ния, расположенная между объективом и окуляром иногда называется «системой Галилея»,
т. к. расположена в параллельном ходе лучей.
173
174
Таблица 12.2
Параметры микроскопов Stemi 2000 и StereoLumar. VI2
Объективы (тип оптической кор- рекции, увели- чение дополни- тельной линзы, крат) Рабочее расстоя- ние, мм Окуляры
WPL 10х/23 мм PL 16х/16 мм W25x/10 мм
Увеличение общее, крат Поле на предмете, мм Увеличение общее, крат Поле на предмете, мм Увеличение общее, крат Поле на предмете, мм
Stemi 2000 (zoom 1:7,7), схема Грену
0,Зх 285 1,95-15,0 118,0-15,3 3,1-24,0 82,1-10,7 4,9-37,5 51,3-6,7
0,4х 210 2,60-20,0 88,5-11,5 4,2-32,0 61,5-8,0 6,5-50,0 38,5-5,0
0,3...0,5 234...91 1,95-25,0 118,0 - 9,2 3,1-40,0 82,1-6,4 4,9-68,8 51,3-4,0
0,63х 130 4,10-31,5 56,2-7,3 6,6-50,4 39,1-5,1 10,2-78,8 24,4-3,2
Без дополнитель- ной системы 92 6,5-50,0 35,4-4,6 10,4-80,0 24,6-3,2 16,3-125,0 15,4-2,0
1,25х 60 8,1-62,5 28,3-3,7 13,0-100,0 19,7-2,6 20,3-156,3 2,3-1,6
1,6х 48 10,4-80 22,1-2,9 16,6-128,0 15,4-2,0 26,0-200,0 9,6-1,3
2х 31 13-100 17,7-2,3 20,8-160,0 12,3-1,6 32,5-250,0 7,7-1,0
StereoLumar. V12 (zoom 1:12,5), схема Аббе
0,8х (NeoLumar) 80 6,4...80 35,9...2,9 10,2...128 25...2,5 16...200 15,6...1,3
1,5х (NeoLumar) 30 12...150 19,2...1,5 19,2...240 13,3...1,1 30...375 8,3...0,7
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
ной плоскости (с уменьшением увеличения глубина резкости стерео-
микроскопа увеличивается).
Для примера в табл. 12.2 представлены полные параметры микро-
скопа Stemi 2000 и StereoLumar. V12.
Документирование осуществляется через один канал или через оку-
ляр, или через дополнительный фото — видеовыход.
©Помните, что угол наклона к предмету одной ветви составляет 6-
7°, что затрудняет использование программы анализа изображения:
«длинный фокус» для создания изображения.
<Л Основные требования при создании и выпуске стереоскопических
микроскопов сводятся к следующему:
♦ с помощью воспроизводящей части оптической системы микро-
скопа (объектива/объективов и системы Галилея) должно обеспе-
чиваться раздвоение светового потока на два самостоятельных
световых пучка, разнесенных на определенное расстояние (стерео
базу) или наклоненных под определенным углом (углом стерео-
скопичности), при этом оба пучка должны участвовать в построе-
нии единого (объемного) изображения;
♦ каждая из двух самостоятельных частей микроскопа должна быть
абсолютно идентична по отношению к другой (увеличение, качес-
тво изображения, числовая апертура, видимое поле на предмете).
Не соблюдение этих правил ведет как к отсутствию собственно сте-
реоэффекта, так и к дискомфортному состоянию при работе на микро-
скопе. Последнее ведет к ухудшению зрения пользователя и вызывает у
него головную боль.
Существует два типа стереоскопических микроскопов — по схеме
Грену и по схеме Аббе. С 1896 г. на предприятии Карла Цейса ведется
отсчет серийного выпуска стереоскопических микроскопов. В первых
моделях была реализована схема Грену.
Стереомикроскопы по схеме Грену. Схема Грену (рис. 12.4) — это
схема, при которой объект наблюдается под разными углами с помо-
щью двух монокулярных микроскопов наклоненных под углом 12-17°
друг к другу.
Самым простым решением при создании микроскопа со. стерео-
скопическим эффектом явилось объединение двух монокулярных
микроскопов. Расположенные под углом друг к другу, они в совокуп-
ности составляют единый сдвоенный апертурный угол. Иными сло-
вами, внешние образующие апертурного конуса каждого объектива
175
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис. 12.4.
Принципиальная оптическая схема
по Грену:
/ - пара объективов; 2 - панкратическая
система;
Ф, о? - апертурный угол 1-ой и 2-ой ветви
микроскопа; о - общий апертурный угол
стереомикроскопа.
составляют единый апертурный угол,
который и участвует согласно волновой
теории образования изображения в со-
здании единого изображения объекта.
Внутренние образующие апертурного
угла при этом перекрываются.
После прохождения света через
объектив монокулярного микроскопа
идет обычное построение увеличенно-
го изображения. Для каждого из двух
микроскопов — свое изображение, но
общими являются: входной апертурный
угол йь аг, единое поле и одинаковое
увеличение.
Каждый монокулярный микроскоп
строит двухмерное изображение объ-
екта. Третья составляющая формиру-
ется за счет той области резкого ви-
дения, которая образуется в пределах
пересечения глубин резкости одного
и другого объективов, расположенных
под углом друг к другу. Все это фор-
мирует в нашем сознании увеличенное
трехмерное изображение объекта.
Эта схема известна как схема Грену. Она была создана первой и
до сих пор пользуется популярностью там, где необходимо хорошее
качество изображения и высокое разрешение по глубине.
Стереомикроскопы по схеме Аббе. Существует еще одна схема
создания микроскопа со стереоскопическим эффектом — схема Аббе
(рис. 12.5). Стереомикроскопы по схеме Аббе могут еще называть мик-
роскопами телескопического (telescope) принципа, т. к. схема обеспе-
чивает разделение на две самостоятельные ветви основного параллель-
ного пучка, идущего после основного объектива.
Схема Аббе реализуется с помощью объектива большого диаметра,
далее идет разделение на два канала со стерео базой, обеспечивающей
наклон основной оси апертурного пучка каждого канала под углом 12-
17°. В каждую ветвь входит линзовая система (система Галилея), обес-
печивающая дополнительно сменные увеличения.
В построении изображения участвует свет, прошедший через объ-
ект (или отразившийся от него), и полностью заполнивший входную
176
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
апертуру объектива. При выходе из
объектива сразу происходит разделе-
ние светового потока по двум парал-
лельно расположенным каналам. Таким
образом, входная апертура объекти-
ва — одна, а выходная — разделена на
две равные.
Если пойти обратным ходом, то оп-
тическая ось (центр оптической сис-
темы) каждого канала пройдет через
свой участок основного объектива и
будет являться образующей конуса,
угол которого составляет % от аперту-
ры основного объектива. Таким обра-
зом, в нашем сознании в построении
увеличенного изображения объекта
принимают участие два разных микро-
скопа — правый и левый.
В той и другой схеме обязательным
условием является наличие или двух
микроскопов, или двух оптических ка-
налов, расположенных под определен-
ным углом друг к другу (наклоненных),
как наши глаза. Естественно, что при
Рис. 12.5.
Принципиальная оптическая схема стете-
ромикроскопа по схеме Аббе:
1 - основной объектив; 2 - панкратическая
система;
Оъ 0; - апертурный угол 1-ой и 2-ой ветви
микроскопа; о - общий апертурный угол
стереомикроскопа
этом визуальная насадка всегда должна быть бинокулярной.
Обе схемы реализуют основные принципы получения трехмерного
изображения:
• раздельное наблюдение объекта под определенным углом;
• получение правильного стереоскопического восприятия наблю-
даемого пространства за счет прямого изображения предмета,
которое обеспечивается оборачивающей призменной или линзо-
вой системами;
♦ обеспечение углового стереоскопического параллакса за счет уст-
ройств раздвижки по глазной базе наблюдателя обычно с помощью
призменных систем и шарнирных механизмов раздвижки по базе.
Практически все ведущие фирмы в мире выпускают стереоскопи-
ческие микроскопы. Наибольшего совершенства в технологии и в со-
здании широкой номенклатуры достигли две фирмы — Вильд (Швей-
177
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис. 12.6. Документирование
через окуляр. Стереоскопический
микроскоп по схеме Аббе МБС-10
цария)1, в настоящее время это Лейка-Вильд,
и Бауш & Ломб1 2 (США).
В России стереомикроскопы ранее выпус-
кались на трех заводах: ЛОМО, Лыткаринском
заводе оптического стекла (ЛЗОС) и Казанс-
ком оптико-механическом заводе (КОМЗ).
ЛОМО являлось головным предприятием,
на котором серийно производились стерео-
микроскопы по схеме Аббе и велись в 80-х го-
дах разработки микроскопов по схеме Грену.
Однако потребителям хорошо известны толь-
ко самые первые микроскопы по схеме Аббе:
МБС-1 и МБС-2 (в конце 60-х они были пере-
даны для серийного производства на ЛЗОС)
и микроскопы разработок 70-х годов — МБС-
200 (отраженного света) и МССО (проходящего и отраженного света).
ЛОМО по своей технологической оснащенности должно было вы-
пускать микроскопы исследовательского плана высшего класса по
качеству изображения. К сожалению, первый отечественный стерео-
скопический микроскоп с панкратической системой 1:5 (МСПЭ-1),
разработанный в конце 80-х годов, сошел с рынка, практически на нем
не побывав. Микроскоп был снабжен волоконным осветителем. В нем
были реализованы методы темного поля и косого освещения в прохо-
дящем свете. Большой стеклянный стол обеспечивал надежную работу
микроскопа с фотошаблонами (микроэлектроника).
Надо сказать, что бурное развитие отечественной микроскопии 70-х
годов позволило выпустить на рынок несколько вариантов микроско-
пов среднего класса по качеству изображения серии МБС-200 (МССО).
Среди них были поляризационные микроскопы (типа МПС и МПСУ) и
микроскопы с самостоятельным люминесцентным осветителем.
В настоящее время стереомикроскопия на ЛОМО нашла свое воп-
лощение в операционных микроскопах и микроскопах-тренажерах.
На Лыткаринском заводе оптического стекла с середины 80-х годов
ведутся работы по созданию ряда стереомикроскопов — МБ С-9, затем
МБС-10 (рис. 12.6). Микроскопы принадлежат к группе рабочих и к на-
стоящему времени имеют достаточно большую номенклатуру прина-
длежностей (фото, осветители, предметные столы).
1 Стереомикроскопы по схеме Аббе.
2 Стереомикроскопы по схеме Грену. В настоящее время о фирме практически не слыш-
но. В 90-х годах прошлого века входила в состав фирмы Лейка.
178
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Казанский оптико-механический завод выпускает стереомикроско-
пы по схеме Грену на основе бинокля. Маленький, легкий этот микро-
скоп, в основном, экспортировался, так как подходил для использова-
ния в общеобразовательных школах. В 80-х годах были начаты работы
по созданию ряда стереомикроскопов по схеме Грену с набором сдво-
енных объективов. К сожалению, в настоящее время на отечественном
рынке продукция этого завода не видна.
12.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НА СТЕРЕОСКОПИЧЕСКИХ
МИКРОСКОПАХ
Стереоскопические микроскопы по реализуемым методам контрас-
тирования отличаются от обычных микроскопов. Связано это с тем, что
чаще всего в стереоскопические биологические микроскопы наблюда-
ются объемные непрозрачные или мало прозрачные объекты. Правда, в
последнее время круг препаратов расширился (рис. 12.7).
Основные методы проходящего света: светлое и темное поле, косое
освещения — по-прежнему являются базовыми. Современные стерео-
микроскопы снабжаются люминесцентными осветителями, что значи-
тельно расширяет область их применения.
Основные методы исследования в стереомикроскопах, как и в мик-
роскопах плоского поля, связаны со способом освещения. Специфика
Рис. 12.7.
Биологические объ-
екты в проходящем
и падающем свете.
Съемка произведена на
микроскопе Stemi 2000С
(a-е) Stereo. Discovery
V12 (г,5)
179
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис. 12.8. Гибкие световоды освети-
телей KL200 и KL1500, Carl Zeiss
оптической схемы стереомикроскопов обес-
печивает в любом случае косо-направленное
освещение — будь то круговое освещение
(через оба канала, расположенных под уг-
лом), или коаксиальное (через один объек-
тив — одну ветвь). Осветители, в основном,
состоят из источника света (галогенной
лампы) и волоконных световодов. Светово-
ды обеспечивают так называемое «холод-
ное» освещение (удаленный источник света
не нагревает плоскость предмета) и могут
быть мягкими (крепиться на микроскопе
или штативе) и гибкими типа «гусиная шея»
световод (устанавливаться в блоке питания
и иметь возможность менять свое положение за счет фиксации в жест-
кой пружинящей оболочке).
В зависимости от мощности источника света создается разный по
площади световой поток (рис. 12.8).
Проходящий и падающий свет позволяют наблюдать объекты в
светлом поле и темном поле, в поляризованном свете и свете люми-
несценции.
Поляризованный свет в проходящем свете строится классичес-
ким способом — с анализатором и поляризатором, с вращающимся
предметным столиком и компенсатором Лямбда. А вот падающий
свет неоднозначен. Поляризатор навинчивается на одну из ветвей
осветителя, в то время как анализатор устанавливается на объектив.
Качество поляризованного света очень сильно зависит не только от
свойств объекта, сколько от ориентации поляризаторов относитель-
но друг друга.
Способ получения света «на полное гашение» (как это должно быть
при скрещенных поляроидах) может быть один, как, кстати, и любая
настройка в стереомикроскопе — все начальные настройки произво-
дятся на плоских объектах с соответствующими отражающими по-
верхностями и толщиной.
Люминесцентный метод реализуется двумя способами: с помощью
люминесцентного осветителя падающего света и с помощью полноцен-
ного люминесцентного стереоскопического микроскопа.
Падающий люминесцентный свет формируется ртутным источни-
ком света (или мощной галогенной лампой). На рис. 12.9 представлены
180
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис 12.9. Люминесцентный осветитель и его элементы (Stemi 2000):
а - общий вид стереомикроскопа с люминесцентным осветителем НВО 50 падающего света; 6-запирающий свето-
фильтр; в - крепление запирающего светофильтра в микроскопе; г - возбуждающий светофильтр для осветителя.
элементы для создания люминесцентного освещения: система возбуж-
дающего светофильтра и двойного запирающего светофильтра.
Данный способ реализации не совсем подходит для биологических
объектов, так как процессы, происходящие в них, носят глубинный ха-
рактер, в то время как данный осветитель решает проблемы поверх-
ности предмета. В крайнем случае объект «просвечивается» сбоку, а
рассматривается сверху.
Переходя к современным моделям, следует отметить, что существует
еще одна группа микроскопов, являющаяся промежуточной между сте-
реоскопическими микроскопами и микроскопами плоского поля — это
макроскопы1. Обладая параметрами стереоскопических микроскопов,
такими как поле, увеличение и рабочее расстояние, эта группа реализует
плоское поле. В конце 80-х годов эти микроскопы пользовались большим
спросом, правда, в микроэлектронике, то есть для технических целей.
12.4. СТЕРЕОМИКРОСКОПЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ.
ЦИФРОВЫЕ СТЕРЕОМИКРОСКОПЫ
В 2004 г. фирма Carl Zeiss вывела на рынок стерео микроскопов со-
вершенно новый класс микроскопов, который можно было бы отнес-
ти к цифровым.
Новые стереоскопические микроскопы серии «SteREO» по схеме
Аббе включают в себя две модели — SteREO. Discovery и SteREO. Lumar
1 Макроскопы выпускала фирма Wild, Швейцария, сейчас Лейке-Вильд.
181
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис. 12.10.
Новое школение с сереем/, к-
роско 'ов ю схеме Аббе:
< iic-1LC,DiSCO'/c'yVI2;о-Sie-liO,
Lumar.V12; в - установка основного
объектива; г - процесс регулировки
светлого-темного поля и косого осве-
щения в проходящем свете
(рис. 12.10). Области применения в биологии и медицине: онкогенетика,
микробиология, анатомия. В модели биологического стереомикроско-
па SteREO. Discovery. V12 сразу бросается в глаза необычность конс-
трукции — массивный штатив и стойка с устройством регулировки
по высоте (фокусировка), оптическая головка с регулировкой плавной
смены увеличения и новое револьверное устройство для крепления 3-
х основных объективов (рис. 12.10 в).
Новые стереоскопические микроскопы имеют плавную смену уве-
личения zoom с коэффициентом 1:12,5. Разрешение объектива 1,5х со-
ставляет 0,6 мм. Бинокулярная насадка с плавным изменением угла на-
клона окулярных трубок от 5° до 45° комплектуется окулярами 10х/23,
16х/16 и 25х/10. Предметный стол проходящего света позволяет ис-
пользовать новый осветитель с диодами VisiLED в светлом поле. Рав-
номерное освещение больших полей обеспечивает высокое качество
наблюдения. Новый двойной адаптер 60N-2x 60N 1,0х1 обеспечивает
работу с двумя камерами, при этом устойчивый штатив гарантирует
стабильность получаемых изображений.
Управление движением оптической головки и сменой увеличения про-
изводится с помощью дисплеев H.I.P или системы SY.CO.P (рис. 12.11).
Источники питания «холодного света» — KL 1500 и KL 2500, ртут-
ная лампа — НВО ЮО.с.
Люминесцентный осветитель (рис. 12.12) имеет ахроматический —
апланатический коллектор, улучшающий качество светового потока,
1 Один выход обеспечивает увеличение адаптера 2х, второй - 1х
182
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис 12.11.
Устройство управления микро-
скопом:
а - процесс управления с устройства
SY.CO.P; 6- интерфейс устройства SY.CO.P;
в - процесс управления с устройства
H.I.R; г—интерфейс устройства H.I.R
равномерность освещенности и пропускание в УФ и ИК диапазонах
возбуждения. Установка светофильтров возбуждения в револьверном
устройстве позволяет одновременно проводить исследования как ми-
нимум с двумя красителями.
Базовые конфигурации стереомикроскопов отличаются достаточно
небольшим общим увеличением (в диапазоне примерно от 5х до 60х),
большим линейным полем на предмете (примерно до 30 мм) и большим
Рис 12.12.
Основные комплектующие люминесцентного стереоскопического микроскопа:
о - узел крепления ртутной лампы НВ0100; d — револьверное устройство для крепления люминесцентнх фильтров;
в - узел крепления светофильтров возбуждения и запирающих светофильтров; г и д - объекты в свете люминесценции
183
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
рабочим расстоянием (около 80 мм) между предметом и фронтальной
линзой микроскопа. Обозначение V12 показывает, что плавная смена
дополнительного увеличения зумм — системы (zoom) изменяется в
12,5 раз (zoom 1:12,5), что обеспечивает диапазон увеличения от 0,8х
до 10х. Панкратическая система смены увеличения обеспечивает вы-
сокий контраст и точную фокусировку изображений во всем диапазоне
увеличения. После базовой настройки стереомикроскопа на резкость
при смене увеличения с помощью зуум-системы изображение остается
точно в фокусе.
Системная панель управления (SY. СО. Р) представляет собой соче-
тание трех отдельных элементов:
♦ сенсорного экрана, чувствительного к прикосновениям;
♦ четырех кнопок управления интенсивностью освещения;
♦ джойстика для управления моторизованными механизмами уве-
личения и фокусировки.
Системная панель управления SY. СО. Р рассчитана на работу одной
рукой, при этом с джойстиком и четырьмя кнопками можно работать,
не отводя взгляда от образца.
Сенсорный экран обеспечивает одновременный вывод основных
оптических параметров, а также позволяет активизировать и сохранять
различные настройки микроскопа. Сенсорный экран представляет со-
бой панель, чувствительную к прикосновениям. Чтобы активизировать
определенную функцию, необходимо коснуться пальцем соответству-
ющей кнопки на экране.
После включения в основном окне отображаются следующие пара-
метры:
♦ время и дата;
♦ общее увеличение при наблюдении (Mag), выбранный объектив
(Obj) / окуляр (Буер);
♦ размер рассматриваемого поля (Field), разрешающая способ-
ность (Resol) и глубина резкого видения (Depth);
♦ интенсивность освещения — в виде полоски с текущим значени-
ем в процентах и цветовой температурой по Кельвину для пада-
ющего света (RL) и проходящего света (TL).
Отображаемые значения разрешающей способности (Resol) и глу-
бины резкости (Depth) достигаются только при оптимальных услови-
ях, то есть при оптимальном освещении и открытой апертурной диа-
фрагме.
Блок H.I.P устанавливается на оптическую головку и фокуси-
ровочный механизм. С помощью вращения ругулировочного кольца
184
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
происходит смена параметров. С помощью кнопок происходит запо-
минание 2-х положений.
Микроскоп позволяет проводить исследования с возможностью
возврата к исходным или эталонным параметрам.
12.5. ОСОБЕННОСТЬ НАСТРОЙКИ И РАБОТЫ НА СТЕРЕОМИКРОСКОПАХ
Особенность стереоскопической микроскопии в первую очередь
связана с теорией образования объемного (трехмерного) изображения
в сознании человека.
Стереоскопический микроскоп состоит из двух самостоятельных
ветвей. Каждая ветвь является промежуточной системой, формирую-
щей увеличенное изображение своей части объекта на сетчатке соот-
ветствующего глаза. Далее происходит обычный физико-психологи-
ческий процесс в мозгу человека, связанный с формированием общего
изображения объекта.
/ГЛ Существует несколько правил конструирования и эксплуатации стерео-
скопических микроскопов, при несоблюдении которых наблюдается:
♦ нарушение стереоскопического эффекта;
♦ дискомфорт, связанный с ухудшением состояния здоровья поль-
зователя;
♦ повышенная утомляемость глаз;
• снижение разрешающей способности глаз;
♦ появление головной боли;
♦ общая повышенная раздражимость.
л£Я В частности, правила эксплуатации стереоскопического микроскопа
IgiS® можно сформулировать следующим образом:
1. Выходной зрачок каждой ветви микроскопа должен быть точно
совмещен с соответствующим зрачком глаза наблюдателя.
2. При наблюдении голова пользователя должна быть зафиксирова-
на, а направление наблюдения по возможности должно быть го-
ризонтальным. Наблюдатель не должен испытывать напряжения,
связанного с опусканием глаз (наблюдение «вниз») или подняти-
ем (наблюдение «вверх»).
3. Руки в рабочем состоянии по возможности должны иметь упор,
чтобы не создавать дополнительного напряжения в теле, в том
числе и голове.
185
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
Рис 12.13.
Области применения
стереомикроскопов:
о - обучение; 6 - иссле-
дования в лаборатории;
в-в зоологическом музее
4. Нельзя работать на разъюстированном стереомикроскопе. При
обнаружении децентрировки1 бинокулярной насадки необходимо
срочно менять микроскоп.
Указанные условия связаны с высотой микроскопа — расстоянием
от плоскости стола до выходного зрачка микроскопа и параметрами
тела пользователя.
Общая высота складывается из следующих составляющих:
♦ высоты основания микроскопа;
♦ габаритной высоты объекта, зависящей от его оптических ха-
рактеристик (типа оптической коррекции объектива, фокусного
расстояния, числовой апертуры, линейного поля);
♦ фокусного расстояния объектива и рабочего расстояния всей
системы микроскопа;
1 Положите на стол белый лист бумаги с нарисованным крестом. Закройте один глаз,
затем другой. Смещение изображения может наблюдаться только в горизонтальном на-
правлении. При смещении креста в вертикальном направлении на величину большую, чем в
горизонтальном, микроскоп считается негодным к эксплуатации, поскольку допуск на вер-
тикальное смещение — в два раза меньше, чем на горизонтальное.
186
Глава 12 Стереоскопические микроскопы
♦ габаритных размеров микроскопа (объектив + промежуточная
система увеличения + визуальная насадка);
• угла наклона окулярных трубок визуальной насадки;
♦ высоты стула пользователя;
♦ параметров тела пользователя.
Естественно, что при заказе микроскопа все параметры берутся ус-
редненными.
Для регулировки в стереомикроскопах предусмотрено:
1. перемещение оптической головки вместе с фокусировочным ме-
ханизмом по круглой стойке;
2. применение насадок с переменным углом наклона.
На рис. 12.13 отражены сферы применения стереомикроскопов в
биологии и медицине. Пример использования стереоскопического
микроскопа в косметологии приведен в Приложении 6.
187
ГЛАВА 13
СИСТЕМЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ
ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИМ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Бурный рост цифровой техники приводит к тому, что все большее и большее число микроскопистов
не удовлетворяются только наблюдением объектов в микроскоп, но и стараются запечатлеть их изоб-
ражения с помощью установленной на микроскоп системы документирования, а также сохранить
или проанализировать полученное изображение с помощью специализированных программ.
В настоящее время на территории России достаточно много фирм занимается обеспечением
потребителей аппаратурой для документирования и анализа изображения. Однако немногие
разработчики понимают, что конечное качество изображения и точность результата анализа
во многом зависит от качества каждого элемента входящего в систему. Нельзя, имея учебный
микроскоп, ставить и решать исследовательские высокоточные задачи, так же как нельзя решать
серьезные задачи, используя «охранную» камеру, то есть камеру, применяемую для визуального
контроля помещений в охранных целях.
Зачастую, не являясь специалистами в области микроскопии и не консультируясь у тех, кто понимает
всю сложность сохранения истинного качества изображения, покупатель тратит средства, а подчас
идет ложным путем. «Скупой платит дважды» в данном случае очень актуальное высказывание.
Как пример разработок систем анализа изображений, отвечающих высоким требованиям
современного качества и серьезного отношения к используемому оборудованию, в данной
главе будут рассмотрены подходы и программное обеспечение фирм Carl Zeiss1 и ВидеоТесТ1 2
(Санкт-Петербург).
13.1. КЛАССИФИКАЦИЯ СИСТЕМ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ
Началом массового развития систем анализа изображений может
считаться конец 80-х гг. XX века, когда применение компьютерной тех-
ники стало все больше и больше входить в жизнь. Тогда же стали широ-
1 Благодарю А. В. Зацепина, специалиста по системам анализа изображения фирмы Carl
Zeiss, Москва за консультации и предоставленный материал.
2 Благодарю В. Г. Пантелеева, генерального директора, и М.Ю. Егорова, начальника от-
дела маркетинга и продаж. Валерия Георгиевича я знаю еще по работе на АОМО, когда в КБ
микроскопии предполагалось создание систем анализа изображения (в конце 80-х — начале
90-хгг.). Совместно с Пантелеевым В. Г. мы написали книгу «Компьютерная микроскопия»
(2005 г. изд. Техносфера).
188
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
ко использоваться такие термины, как «документирование», «система
анализа изображения», «анализатор изображений», «телеконферен-
ция», «телемедицина». При всей их кажущейся разности это звенья
одной цепочки, подразумевающие под собой определенный набор обо-
рудования или, как сейчас это принято называть, аппаратно-програм-
мный комплекс (АПК). В зависимости от сложности решаемых задач
может изменяться, как аппаратная, так и программная составляющие
системы.
В общем случае в состав аппаратно-программного комплекса входят:
микроскоп, система ввода, компьютер с периферийными устройствами
и специализированное программное обеспечение. По мере усложнения
системы может увеличиваться степень автоматизации входящих в ее
состав устройств, так например микроскоп может быть оснащен мото-
ризованным столом, а в некоторых случаях и вся система может иметь
возможность удаленного управления. В табл. 13.1 описаны основные
функции оборудования, входящего в состав АПК.
В общем случае механизм работы довольно прост:
♦ изображение, созданное в плоскости изображения микроскопа
через видеовыход и ТВ-адаптер, проецируется на ПЗС-матрицу
камеры;
♦ снятый с матрицы камеры сигнал в цифровом виде передается
в компьютер (при наличии аналоговой камеры, аналоговый сиг-
Таблица 13.1
Основные функции оборудования, входящего в состав АПК
Основные компо- ненты системы Назначение компонентов
Микроскоп Создание изображения объекта
Система ввода (камера) Оцифровка изображения объекта, получаемого с помо- щью микроскопа, и передача его в компьютер. Примечание. Если для получения изображения применяется аналоговая камера, то для преобразования аналогового сигна- ла в понятный для компьютера цифровой, необходимо наличие качественной платы захвата (frame grabber).
Компьютер Вычислительный блок
Программное обеспечение Управление аппаратной частью (камерой и/или микро- скопом). Обработка изображения с получением статистики и отчета. Хранение полученных изображений и результатов изме- рений и анализа.
189
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Рис. 13.1. Системы документирования с помощью:
а - фотоаппарата; б-цифрового фотоаппарата в т. ч. установленного на окуляр; в - цифровой видеокамеры; г и д - сис-
темы телемедицины с аналоговой камерой
нал поступает на АЦП платы захват, где преобразуется в циф-
ровой вид);
♦ программное обеспечение получает изображение и позволяет
обрабатывать его в «свободном» режиме либо по заранее уста-
новленной программе (методике).
По устройству системы ввода все комплексы можно разделить на
три группы (рис. 13.1).
Первая группа — на микроскоп устанавливается цифровой фото-
аппарат (в окуляр или в видеовыход).
Вторая группа — на микроскоп установлена специализированная
система ввода, частный случай камера с внешним управлением для «те-
лемедицины».
Третья группа — микроскоп и система ввода объединены в один
корпус (иногда такую систему называют «цифровой микроскоп», что в
принципе не верно).
Необходимо помнить, что есть несколько подходов к созданию сис-
темы анализа изображений (САИ) в лаборатории.
1. Имеющийся микроскоп приспосабливается к САИ. Это не са-
мый лучший вариант, так как обычно для этих целей используется
старый микроскоп с ухудшенным качеством изображения из-за ес-
тественного старения оптики. Если микроскоп более или менее хо-
190
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
рошего качества, то при заказе системы ввода необходимо акцен-
тировать внимание на марке микроскопа, типе осветителя, рабочих
объективах (при этом главное — увеличение объективов, числовая
апертура, тип оптической коррекции).
2. Известна конкретная задача, под которую создается САИ, но
ограниченно финансирование. При разработке программ обра-
ботки изображений, созданных для решения конкретных задач, оп-
ределяются минимально достаточные требования к оборудованию,
которое должно использоваться в составе анализатора, то есть ука-
зывается тип и класс микроскопа, а также системы ввода.
Очень важно прислушиваться к специалистам-разработчикам, уточняя
все «за» и «против» применения той или иной модели микроскопа.
3. Есть финансирование и очень хочется иметь современную ап-
паратуру с САИ. Это самый лучший, если не сказать идеальный вари-
ант. Прежде чем что-то предложить, специалисты фирмы-разработ-
чика обсудят с Вами возможности предлагаемых систем и подберут
оптимальный вариант. Отсюда вывод: в данном случае обязательно
обращайтесь к специалистам, и вы не прогадаете. Однако избыточ-
ность приводит к нерациональному использованию аппаратуры.
13.2. ОСНОВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ АППАРАТНО-ПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА
Базовым микроскопом для систем визуализации и документирова-
ния, в принципе, может служить любой микроскоп, имеющий допол-
нительный вывод изображения в плоскость, сопряженную с сенсором
ТВ-камеры или цифрового фотоаппарата. В практике отечественной
микроскопии такими микроскопами являются модели: Микмед-2 — ва-
риант 2 с насадкой МФН-11, Микмед 2 — вариант 11 (ЕС Аюмам РПО)
с насадкой МФН-11-1 и другие.
Микроскоп. Базовым элементом в анализаторах изображения яв-
ляется микроскоп.
Основные требования, которым должен обладать микроскоп, входя-
** щий в систему анализа изображения:
• осветительная система должна обеспечивать настраеваемый прин-
цип Келера;
• кривизна поля в изображении, которое создает объектив, не долж-
на превышать % в плоскости матрицы камеры (лучше всего для
любых систем анализа изображений использовать только объек-
тивы с плоским полем);
191
192
Таблица 13.2
Анализ оборудования системы ввода
«За» «Против» Вывод
ЦИФРОВОЙ ФОТОАППАРАТ
Низкая стоимость. Съемка макрообъектов. Возможность использовать вне лаборатории. 1. Затруднена цветокоррекция изображения. 2. Низкое соотношение сигнал/шум (цифровые фотоаппараты разработаны для съемки в быто- вых условиях). 3. Неудобная настройка по небольшому экрану дисплея с малым разрешением, что зачастую при- водит к получению изображения не совсем в фо- кусе или использованию нескольких «пристре- лочных» кадров (при использовании некоторых специализированных программ по управлению цифровым фотоаппаратом удается получить на экране компьютера более крупное изображение, что позволяет немного облегчить настройку). 4. Первоначальная запись изображений проис- ходит на карточку фотоаппарата (CF, SD, ММС и т.д.), соответственно для последующей обра- ботки необходимо будет передать изображе- ния с носителя в компьютер, что занимает оп- ределенное время. 5. Обычно при съемке с микроскопа во избежа- ние получения на изображении темных углов рекомендуется использовать максимальный zoom фотоаппарата. Так как в системе появля- ется некий неградуированный элемент (опти- ческий zoom фотоаппарата), то возможен не- который разброс в значениях при измерении элементов изображения. Цифровой фотоаппарат можно ре- комендовать для применения в сис- темах анализа изображений в том случае, если есть острая нехватка средств на более качественную сис- тему, не поставлено серьезных за- дач по провидению анализа полу- ченных изображений, а необходимо только документирование.
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
193
Таблица 13.2 (окончание)
«За» «Против» Вывод
АНАЛОГОВАЯ СИСТЕМА ВВОДА
Запись видеороликов. Настройка в режиме реального времени. Относительная дешевизна. 1. Различная разрешающая способность по вер- тикали и горизонтали. 2. Ограничение разрешающей способности ис- пользованием телевизионного стандарта (PAL или NTSC). 3. Требуется хорошая плата захвата изображе- ний, позволяющая проводить оцифровку полу- ченных изображений без сжатия. 4. Двойная потеря качества при оцифровке (сначала цифровой сигнал с матрицы преоб- разуется в аналоговый, передаваемый по ка- белю в плату захвата изображения, а в плате он преобразуется в цифровой вид, понятный компьютеру). Аналоговую систему ввода мож- но рекомендовать для применения в системах анализа изображений в том случае, если стоит задача ана- лиза динамики процессов, проте- кающих с достаточно высокой ско- ростью, например анализ скорости кровотока или анализ подвижности сперматозоидов. Примечание: в последнее время для решения задач, связанных с подвижностью объектов, стали использоваться CMOS-камеры, кото- рые позволяют записывать ролики со скоро- стью 50-100 полных кадров в секунду.
ЦИФРОВАЯ СИСТЕМА ВВОДА
Настройка в режиме реального времени. Большая разрешающая способ- ность. Одинаковая разрешающая спо- собность по вертикали и горизон- тали (квадратный пиксель). Большое время накопление слабо- го сигнала (в системах с примене- нием охлаждения Пельтье). Большой динамический диапазон. Хорошее соотношение сигнал/ шум (получение «чистого» изоб- ражения). 1. Относительно высокая стоимость. 2. Нет возможности записывать видеоролики с большой скоростью. Цифровую систему ввода можно рекомендовать для применения в системах анализа изображений для получения высококлассных изобра- жений (при условии наличия хоро- шего микроскопа) и для проведения точного автоматического анализа изображений
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
♦ обеспечение в микроскопе системы нейтральных светофильтров,
а также конверсионного светофильтра для поддержания цветовой
температуры осветителя не более 3200°К и обеспечение для каме-
ры благоприятного по мощности светового потока;
♦ применение только стабилизированных источников питания ос-
ветителя.
Перед началом работы с САИ исследователь должен уделить внима-
ние правильной настройке микроскопа и освещения, а так же:
• центрировке камеры относительно отцентрированной в соот-
ветствии с принципом Келера полевой диафрагмы;
• равномерное заполнение светом выходного зрачка объектива.
Кроме того, оптические поверхности конденсора, объектива,
коллектора должны быть чистыми.
Система ввода. Следующим элементом анализатора изображений,
после микроскопа, является система ввода. Это может быть цифровой
фотоаппарат, аналоговая или цифровая камера (CCD или CMOS).
В табл. 13.2 представлен небольшой анализ этого оборудования с
точки зрения использования его вместе с микроскопом, а также поло-
жительные («за») и отрицательные («против») стороны применения
тех или иных устройств.
При работе с камерами необходимо помнить, что:
• промежуточное изображение микроскопа составляет 18-25 мм;
♦ диагональ сенсора камеры находится в диапазоне от И" до 1".
ТВ-адаптер (переходник для крепления камеры к микроскопу) из-
меняет размер поля изображения в соответствии с размером сенсора
путем изменения увеличения изображения. Так, например, чтобы впи-
сать матрицу камеры с диагональю Уг" в поле изображения, необхо-
димо использовать адаптер с коэффициентом 0,5 х. С другой стороны,
используя ТВ-адаптер 1х, мы получим изображение в 2 раза крупнее,
чем в предыдущем случае, и, соответственно, с вдвое меньшим полем
изображения. Такой вариант стыковки может использоваться в тех
случаях, когда:
• объекты достаточно мелкие, даже при максимальном увеличе-
нии микроскопа, и находятся в центре изображения (например,
хромосомы);
• присутствуют сильные искажения по краям изображения, от ко-
торых требуется избавиться (неравномерность фона, геометри-
ческие искажения по краям).
194
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Таблица 13.3
Размеры матриц камер
Параметры камер Тип матрицы
Уз" %" %"
Размер матрицы, мм х мм 4,8 х 3,6 6,4 х 4,8 8x6,4
Размер диагонали матрицы, мм 6 8 10,2
В табл. 13.3 приведены реальные размеры матриц камер в соответс-
твии с их диагональю.
йСД ^Ри использовании цифрового фотоаппарата необходимо помнить,
что прежде чем фотоаппарат будет установлен на микроскоп, для по-
лучения приемлемого качества необходимо «собрать» систему адап-
теров (или сборный адаптер). При этом:
• первый адаптер обеспечивает крепление с микроскопом;
♦ второй (промежуточный) адаптер обеспечивает пространство для
перемещения объектива (зуум — системы) фотоаппарата;
♦ третий адаптер обеспечивает крепление фотоаппарата со вторым
адаптером.
Первый и второй адаптеры могут предлагаться заводами-произво-
дителями микроскопов, а третий — заводом-производителем фото-
аппарата.
Немаловажным критерием для выбора камеры является разреша-
ющая способность. Для цифровых систем ввода принято определять
разрешающую способность в пикселях (единичных элементах изобра-
жения Picture's Element).
На рис. 13.2. наглядно представлена разность между камерами с раз-
ным разрешением. Разрешение связано со способностью к различению
Рис. 13.2.
Распределение интенсивности
света в двух близ лежащих точках
при использовании камер разно-
го разрешения:
а - график интенсивности двух
близлежащих точек; 6-вид и график
интенсивности при разрешении
752x572; в - вид и график интенсив-
ности при разрешении 1280x1024
Plan-Neofluar 10х 1.3мм
195
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
близко расположенных друг к другу элементов. Как видно из рисунков,
крайний левый характеризует разрешение двух объектов близкое к те-
оретической величине; средний показывает, что при малом разрешении
камеры элементы сливаются; правый — что при большом разрешении
камеры наблюдается раздельное распознавание объектов. На среднем
рисунке можно увидеть, что изображение составлено из квадратов —
это говорит о том, что для различения объектов изображение было
электронным способом увеличено, поэтому говорить о форме объекта
уже не приходится. На крайнем правом при меньшем увеличении вид-
но раздельное изображение, и квадраты практически не видны. Здесь
уже можно рассмотреть форму объекта.
Программы. Сердцем любой системы анализа изображений явля-
ется программное обеспечение. Именно оно решает основные задачи,
связанные с обработкой изображений. В общем случае перечень задач,
решаемых программным обеспечением, выглядит так:
• управление аппаратной частью, в частности системой ввода;
• улучшение качества полученных изображений, выделение иссле-
дуемых образцов;
• проведение измерений и статистическая обработка результатов
измерений;
• классификация измеренных объектов;
• генерация отчета о проделанной работе;
• хранение изображений, результатов измерений и сопутствующей
информации с возможностью быстрого поиска и сортировки.
Управление камерой осуществляется путем использования в соста-
ве программного обеспечения специальной подпрограммы — драйвера
камеры. Изображение объекта выводится на экран монитора компью-
тера в режиме реального времени, проводится фокусировка и выбор
оптимальных условий съемки: баланс белого, установка оптимальных
времени экспозиции и усиления сигнала. Настроенные значения со-
храняются и позволяют работать с серией изображений в одинаковых
условиях.
Качество полученного изображения можно улучшить за счет приме-
нения набора фильтров. Это фильтры: «яркость-контраст-гамма», вы-
равнивание фона, вычитание фона, усиление резкости и сглаживание
шумов, а также применение морфологических операций к изображе-
нию. Используя определенную последовательность применения филь-
тров, во многих случаях можно добиться улучшения качества первона-
чального изображения и подчеркивания на изображении объектов, с
которыми в дальнейшем предстоит работать.
196
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
На полученном изображении можно проводить измерительные
процедуры с автоматическим занесением результатов в таблицу и
последующей статистической обработкой. Перед началом измерений
обязательно производится калибровка системы для того, чтобы все ре-
зультаты измерений выражались в реальных величинах (сантиметрах,
миллиметрах, микрометрах и т.д.). Рекомендуется периодически про-
верять точность калибровки с помощью объект-микрометра и всякий
раз проводить калибровку заново при изменении аппаратной части, так
как даже при незначительном изменении в увеличении системы при ис-
пользовании старой калибровки может появиться погрешность.
Измерения на изображении объекта могут проводиться вручную.
Обычно это измерения линейных величин, таких как:
• расстояния от точки до точки;
• расстояния между прямыми линиями;
• длина ломаной линии;
• радиус дуги или угол между двумя лучами;
• яркость в отдельной точке и на разрезе.
Измерять можно объекты, как в полуавтоматическом, так и в ав-
томатическом режимах. В полуавтоматическом режиме пользователь
выбирает из списка параметров те, которые ему интересны, и вруч-
ную обводит объекты на изображении. Все выбранные параметры к
выделенным объектам измеряются автоматически и заносятся в таб-
лицу. Вариант автоматических измерений объектов подразумевает
автоматическое выделение объектов на изображении, отличающихся
от фона, или других изображений по некоторым параметрам, напри-
мер, яркости или цвету. После чего проводится измерение выбран-
ных параметров в автоматическом режиме, а данные представляются
в табличном виде.
Во многих случаях операцию измерения продолжает классифика-
ция объектов по одному или нескольким из измеренных параметров.
В соответствии с заданным критерием все объекты делятся на классы
или группы, после чего вычисляется статистика по каждому классу с
представлением полученных данных в наглядном (графическом) виде.
Интересный круг задач представляет исследование движения объ-
ектов, когда с помощью соответствующей системы ввода с достаточной
скоростью записывается видеоролик (обычно в формате avi). С помо-
щью специализированного программного обеспечения на таком роли-
ке можно проследить за траекториями движения объектов, вычислить
скорость их движения, а также оценить изменение параметров объекта
во времени (например, изменение оптической плотности).
197
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Работа с типовыми объектами изо дня в день может быть облегчена,
если программное обеспечение позволяет автоматизировать рутин-
ные операции, когда вся последовательность действий записывается в
качестве подпрограммы или методики. В наиболее современном про-
граммном обеспечении процесс составления собственной методики
Рис 133.
Интерфейсы различных программ фирмы Видео-
Тест (Россия, Санкт-Петербург):
а - ВидеоТесТ-Карио; 6 - ВидеоТесТ-FISH; в - ВидеоТесТ-
Сперм; г - ВидеоТесТ-Гем; д - ВидеоТесТ-Морфология
198
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
максимально нагляден и прост. В алгоритме могут быть предусмотрены
специальные остановки для вмешательства пользователя в процесс.
Наиболее полно рассмотреть разнообразие аппаратно-программных
комплексов, представленных на отечественном рынке, можно на при-
мере продукции санкт-петербургской фирмы ВидеоТесТ (рис. 13.3).
Комплексы, выпускаемые фирмой ВидеоТесТ, можно разделить на
следующие:
• комплексы для документирования;
• специализированные комплексы для решения определенных
конкретных задач;
• универсальные комплексы для решения широкого спектра задач.
Комплекс для документирования основан на использовании про-
граммного обеспечения ВидеоТесТ-Альбом 4.0 \ Эта система пред-
назначена для решения задач по вводу полученного изображений,
небольшой их корректировке и созданию на основе полученных изоб-
ражений баз. Применение специальных методик сжатия позволяют
хранить информацию компактно и в то же время без потери качест-
ва. Расширенные возможности по поиску, фильтрации и сортировке
данных позволяют быстро находить нужную информацию. Наряду с
персональной, доступна и сетевая версия программы, позволяющая
работать с одной базой данных изображений пользователям с разных
рабочих мест.
Специализированные комплексы представлены такими анализато-
рами как:
• ВидеоТесТ-Карио 3.1 — аппаратно-программный комплекс для
автоматического кариотипирования хромосом (рис. 13.3 я);
• ВидеоТесТ-FISH 2.0 — комплекс для проведения анализов по ме-
тоду FISH (рис. 13.3 б);
• ВидеоТесТ-Сперм 2.1 — комплекс для оценки параметров под-
вижности, концентрации и морфологических особенностей
сперматозоидов; (рис. 13.3 в)
• ВидеоТесТ-Гем 1.0 — автоматизированный комплекс для работы
с клетками крови (рис. 13.3 г).
Все эти АПК могут быть оснащены моторизованными столами, что
позволяет отнести их к полностью автоматическим системам, роль
оператора в которых сводится к следующим задачам — положить один
или несколько образцов на предметный столик, запустить методику и
после окончания обработки проконтролировать результат.
1 Представленные программы постепенно совершенствуются, что отражается в номере
версии.
199
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
ning System)
Универсальные анализаторы изображений представлены АПК Ви-
деоТесТ-Морфология (рис. 13.3 Э). Назначение универсальных комп-
лексов — помощь в решении исследовательских задач по определению
морфологических и фотометрических свойств различных медицинс-
ких и биологических объектов, определение зависимостей между оп-
ределенными показателями объектов и их клинической значимостью.
В основе такого комплекса лежит одноименное программное обеспе-
чение, основной задачей которого является помощь в создании поль-
зовательских методик. Так как предустановленные методики, а также
те методики, которые пользователи составляют самостоятельно, могут
быть с успехом применены в практической деятельности, то это обус-
лавливает широкое использование анализатора не только в научно-ис-
следовательских лабораториях, но и в практических медицинских уч-
реждениях.
Естественно, что поскольку разработка анализаторов изображений
ведется не только у нас в стране, то на отечественном рынке широко
представлены анализаторы и программное обеспечение ряда зарубеж-
200
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
ных фирм, например: AxioVision, фирмы Carl Zeiss, а также генетичес-
кие программные продукты фирмы Metasystems GmbH.
Фирма Metasystems GmbH была организована в 1986 г. частью со-
трудников Института Прикладной Физики Хайдельбергского Универ-
ситета, Германия. В самом начале своего развития фирма специали-
зировалась на разработке программного обеспечения для управления
моторизованными столами, устанавливаемыми на микроскоп для авто-
матического поиска и распознавания специфических объектов. Первой
их системой была сканирующая система на базе микроскопа Карл Цейс
для автоматического поиска метафазных пластинок. Система тогда по-
лучила название Metafer. В дальнейшем была создана программа Ikaros
для проведения автоматического кариотипирования. Затем стали со-
здаваться различные программы и приложения для работы с флуорес-
центными изображениями, такие как: ISIS CGH, ISIS mFISH/ mBAND,
Comet Assay и другие.
Продукцию, которую сейчас предлагает фирма Metasystems, по
своим функциональным возможностям можно разделить на несколь-
ко групп.
1. Ikaros (Karyotyping system) (рис. 13.4 а) — система для проведения
кариотипирования хромосом человека, животных и растений.
2. Isis (In Situ Imaging system) — система для проведения съемки, ар-
хивации и анализа флуоресцентных изображений. К этой систе-
ме существуют дополнительные модули Color Karyotyping — для
кариотипирования флуоресцентно меченых хромосом, для про-
ведения CGH (Comparative Genome Hybridization) метода, для
Mfish / Mband (многоцветного ФИШ и многоцветного БЭНД)
анализов (рис. 13.4 6).
3. Telomere Analysis — система для анализа сигналов из теломерных
участков хромосом.
4. Comet Assay — система для проведения съемки и анализа комет,
размеров их головной части и хвоста, интенсивности свечения и
т. д (рис. 13.4 в).
5. Metafer (Slide Scanning System) — система автоматического поис-
ка объектов, например, метафаз, ядер, специфических клеточных
структур. Поиск может производиться как в проходящем свете
(метафазные пластинки), так и в свете люминесценции — поиск
специально меченых клеток, поиск и автоматический подсчет
ФИШ сигналов (рис. 13.4 г);
6. DNA Probe Kits — специфические наборы ДНК проб (зондов) для
работы с mFISH, mBAND методами.
201
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
13.3. СШИВКА ИЗОБРАЖЕНИЯ, РАСШИРЕННЫЙ ФОКУС,
ЗО-РЕКОНСРУКЦИЯ
Интерес представляют программы, которые позволяют производить
технологические операции с изображением. Рассматриваем три про-
граммы: сшивка изображения, расширенный фокус, 3D реконструкция.
Программа ВидеоТесТ-Размер 5.0 обеспечивает возможность авто-
матической сшивки изображений. Можно последовательно ввести в
компьютер смежные участки образца, а затем объединить их в соста-
Рис. 13.5.
Сшивка изображений:
а - смежные участки изображения снимаются после-
довательно; 6-суммарное изображение получено с
помощью функции «сшивка изображений»; в - объект
гистологический.
ВидеоТест (Россия, Санкт-Петербург)
б
Рис. 13.6.
Расширенный фокус:
а - один и тот же участок изображения снимается несколько раз с измене
глубины резкости таким образом, чтобы области, находящиеся не в фокус
них изображениях, выглядели резкими на других; 6- резкое суммарное i
жение нейрона Гиппокампа получено с помощью функции «расширенный
ВидеоТест (Россия, Санкт-Петербург)
202
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Рис 13.7.
ЗО-реконструкция, Axiovision
(Carl Zeiss)
ве одного изображения, получив полное изображение интересующего
объекта. Для патологоанатомов важным является просмотр всего пре-
парата (рис. 13.5).
С помощью программ ВидеоТесТ-Морфология 4.0 и ВидеоТесТ-
Размер 5.0 можно получить резкое суммарное изображение из серии
изображений, снятых с разной глубиной фокуса. Эта функция полезна
при съемке и анализе толстых образцов или образцов, имеющих нерав-
номерную толщину (рис. 13.6).
Указанные выше программы разработаны отечественной фирмой
ВидеоТесТ. Эти программы существуют и в других фирмах. Входят, на-
пример, в программу Axiovision. 4, как опции1.
В тот же пакет входит программа ЗЭ-реконструкция, которая позво-
ляет создавать объемные, реконструкции объектов. Эта опция приме-
няется в лазерных сканирующих микроскопах (рис. 13.7).
13.4. ТЕЛЕКОНФЕРЕНЦИЯ. ТЕЛЕМЕДИЦИНА (ТЕЛЕПАТОЛОГИЯ)
Новый термин «телемедицина» появился в нашей стране около десяти
лет тому назад. На основе новейших достижений компьютерной техно-
логии и техники связи возникла возможность обеспечения информаци-
ей, как с точки зрения наблюдения за процессом лечения и работой своих
коллег, так и в части получения квалифицированной консультации.
1 Опции Axiovision: “Panorama” и “Z-stok”
203
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
Рис. 13.8.
Принцип связи по системе «Теле-
патология» через спутник связи
Возможны различные варианты построения систем передачи изоб-
ражений:
♦ передача одиночных изображений;
♦ дистанционная работа с препаратами, в том числе посредством
спутниковой связи (рис. 13.8);
♦ телеконференции.
При анализе сложных препаратов во время гистологических, цито-
логических исследований возникает необходимость проконсультиро-
ваться с другим врачом или специалистом. С помощью системы для
телемедицины есть возможность послать изображение препарата для
анализа в любую страну и через некоторое время получить ответ. Для
телепатологии важным моментом является то, что можно не только по-
лучить изображение препарата, но и, находясь в другом городе, управ-
лять микроскопом для выбора того места в изображении, которое, по
мнению консультанта, является наиболее информативным. Для этого в
качестве микроскопа, с которого идет информация, необходимо иметь
специальный моторизованный микроскоп типа исследовательского
или универсального класса сложности.
Моторизованная система микроскопа призвана обеспечивать управ-
** ление микроскопом на расстоянии. Важно отметить такие функци-
ональные возможности дистанционного управления микроскопом
через компьютер, как передвижение препарата с помощью сканиру-
ющего предметного столика, автофокусировка на объект, смена уве-
личения за счет вращения револьверного устройства с объективами
и соответствующая поднастройка осветительной системы.
204
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
В апреле 2000 г. произошел телемост между Ревенсбургским универ-
ситетом (Германия) и ЦКБ при Управлении делами Президента (Мос-
ква, Россия). В реальном масштабе времени, «в живую», врачи-специа-
листы обоих стран проводили пробную консультацию по системе связи
телемедицины. Управляя из Германии микроскопом, который находил-
ся в России, врач-консультант мог определить по изображению на мо-
ниторе гистологического препарата, и по «громкой связи» поставить
свой диагноз. То же самое смогли проделать и наши специалисты с мик-
роскопом немецкой стороны.
В Москве в Онкоинституте им. Герцена, в Центральной Больнице
МПС, в Центральной Клинической Больнице при Управлении делами
Президента РФ существует внутренняя телекоммуникационная связь
между предоперационной и кабинетом заведующего отделением.
Представьте себе, что происходит срочная операция и требуется про-
ведение экспресс-диагностики по гистологическому препарату. Врач-
лаборант устанавливает препарат под микроскопом, а заведующий от-
делением со своего рабочего места, управляя с помощью компьютера
микроскопом (выбор места сканирующим столом, смена увеличения и
т. д.), делает вывод и дает рекомендации. И это реально уже сегодня.
Другой вид телемедицины известен уже давно и связан с хирургией.
Система позволяет при хорошем качестве линий проводить передачу
видеоизображения операций с операционного микроскопа в аудито-
рию для демонстрации студентам. Аудитория может находиться в дру-
гом здании, другом городе, другой стране. Кроме изображения, могут
передаваться и комментарии о том, что происходит в данный момент
на операционном столе. С помощью системы можно читать лекции сту-
дентам, находящимся в другом городе, при этом лекция может сопро-
вождаться демонстрацией изображений и видеороликов.
Большое значение применение систем телемедицины имеет не толь-
ко для обучения студентов, но и для повышения квалификации уже
работающих врачей и специалистов. Возможна организация оператив-
ного обмена опытом, результатами новых исследований с наглядным
иллюстративным материалом.
Системы телемедицины могут быть использованы в сетях связи раз-
личного уровня.
1 Локальные сети связи в рамках одного учреждения или фирмы.
Диагностические изображения могут передаваться с различных диа-
гностических комплексов в единый информационный центр учреж-
дения, в единую базу данных. В этом случае для обмена информацией
чаще всего используются локальные компьютерные сети типа Internet.
205
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
2 Сети в рамках одного города. В пределах одного города, напри-
мер, Москвы, различные диагностические центры могут быть связаны
высокоскоростными оптоволоконными линями связи. Эти сети служат
для обмена видеоинформацией, проведения видеоконференций.
3 Сети связи в рамках одной страны. В этом случае для России
единственными линями связи остаются обычные телефонные линии.
4 Сети связи в рамках всего мира. В этом случае самым простым
вариантом являются так же обычные телефонные линии. Но для связи
с Европейскими странами более актуальным является связь по прото-
колу ISDN, так как большинство пользователей в Европе уже имеют не
обычные телефоны, а телефоны ISDN. В настоящее время разрабатыва-
ется версия программы телекоммуникации, которая будет поддержи-
вать протокол ISDN.
Для организации связи в мировом масштабе все большую роль и
популярность приобретает сеть INTERNET. В этой сети использует-
ся протокол TCP/IP. В настоящее время разрабатывается версия про-
граммы, поддерживающая этот протокол. Необходимо отметить, что
связь с зарубежным партнером с помощью сети INTERNET стоит в
100 раз меньше, чем при использовании междугородного телефонно-
го разговора.
Рассмотрим виды передаваемой информации более подробно.
1. Передача «живого» (наблюдаемого в реальном времени) видео-
изображения обеспечивается в обе стороны, то есть каждый из
собеседников может видеть другого. Система позволяет менять
качество изображения и скорость передачи кадров в зависимос-
ти от реальной пропускной способности канала связи.
2. Передача изображения высокого качества с микроскопа произ-
водится с помощью обычной телевизионной камеры или с помо-
щью специальных цифровых видеокамер. Максимальное разре-
шение, получаемое с помощью обычных телевизионных камер,
составляет 768x576.
Для задач, в которых требуется более высокое разрешение, на-
пример, телепатология, используют специальные цифровые видео-
камеры, которые имеют разрешение 2650x1740 элементов. При этом
гарантируется, что качество переданного изображения не уступает
качеству изображения, наблюдаемому глазом в окуляр микроскопа.
Передача медицинских изображений может осуществляться в обе
стороны. Это обеспечивает возможность возврата изображения или
его информативных фрагментов обратно от консультанта с указани-
ем результатов анализа (графических или текстовых).
206
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
3. Передача звука (речевое общение), при этом звук передается в
обе стороны.
4. Передача текста также является одним из общения между собесед-
никами. Для общения с помощью текста открывается окно, состо-
ящее из двух частей: в первой части пользователь печатает свои
сообщения, а во второй части получает ответы. Весь протокол се-
анса связи при необходимости может быть сохранен. Текстовое
общение возможно на русском, английском или немецком языке.
5. Передача файлов ранее полученных изображений. Кроме того,
возможна передача текстовых файлов, например, истории болез-
ни или заключения специалиста.
В системе для передачи изображений используется линия связи, ос-
нованная на стандартной аналоговой коммутируемой телефонной ли-
нии. При необходимости можно воспользоваться выделенными линия-
ми связи для поддержания высокого качества связи или после доработки
системы использовать радиорелейные и спутниковые линии связи.
В качестве устройства ввода изображений могут быть использова-
ны следующие устройства:
♦ микроскоп с видеокамерой;
♦ операционный микроскоп с телевизионной/видеокамерой;
♦ рентгенотелевизионная установка;
♦ ультразвуковой аппарат;
» эндоскопический аппарат;
♦ сканер для сканирования рентгеновских снимков;
♦ видеомагнитофон.
13.5. ВНИМАНИЕ: АНАЛИЗАТОРЫ ИЗОБРАЖЕНИЯ
лЙГЯ Главное требование — высокое качество изображения самого микро-
скопа р[и одна система анализа изображений не сможет скорректиро-
вать дефекты микроскопа (геометрию объекта, неравномерность ос-
вещенности, провалы в освещенности, отсутствие резкости, кривизну
поля, дисторсию). Чаще всего подобные искажения возникают из-за
неправильности настройки освещения по Келеру. Они в большинстве
случаев искажают морфологическую картину, что влияет на качество
автоматического анализа и достоверность окончательного результата.
©Ярким примером является рис 13.9. Полученное изображение в мик-
роскопе (а) явно имеет дефекты настройки осветительной системы.
Однако была сделана попытка улучшения качества изображения за
207
Глава 13 Системы анализа изображения для медико-биологических исследований
• Рис. 13.9.
' ~ ' Пример обработки изображения:
а) изображение с микроскопа (до обработки); б) фон
..! f , у' > после операции «вычитание фона»; в) изображение
-«*. .... ' . * после проведения операции «вычитание фона».
счет программы и действия «вычитание фона» (6). В результате была
получена картина (в), которая не подходит для анализа, то есть расче-
та площади, периметра или оптической плотности. Косое освещение
создало условие, при котором неравномерный контур объекта созда-
ет неравнозначность определения границ. А ведь на глаз, качество
изображение вполне подходит для анализа..., может быть, только ви-
зуального, но не с помощью программы
Будьте внимательны при работе с системами анализа изображения.
Золотое правило:
• хороший микроскоп,
♦ камера, соответствующая требованиям исследований,
• правильная настройка освещения.
208
ГЛАВА 14
СТАНДАРТЫ МИКРОСКОПИИ
Наше время связано со стандартизацией, или попыткой упорядочить определенные действия
и привести к единой системе понимания в жизни и работе. Говорить на одном языке в разных
концах страны и земного шара можно лишь в том случае, если мы понимаем, что и приборы,
и методики имеют единые базовые (стандартные) параметры.
В этой части книги рассмотрены основные стандарты микроскопии, а также во многом
зависящие от нас, микроскопистов, причины, по которым качество изображения, заложенное
в микроскопе, сохранялось бы в течение всего жизненного цикла микроскопа.
Микроскоп является одним из сложнейших оптико-механических
приборов, качество изображения которого напрямую связано с соблю-
дением правил эксплуатации.
Эти правила можно разделить на 3 группы.
Группа 1 — обеспечивает аберрационный и геометрический (габа-
ритный) расчет оптической системы соответствующего качества изоб-
ражения.
Группа 2 — обеспечивает четкое испол-
нение конструкции оптико-механических и
электрических параметров.
Группа 3 — обеспечивает технологический
процесс изготовления и сборки, а также реа-
лизацию методов контрастирования.
Перечисленные параметры являются вне-
шними и контролируются сторонними орга-
низациями органов стандартизации.
К стандартизованным деталям и парамет-
рам относятся:
♦ покровные и предметные стекла (тол-
щина, ширина, длина — размеры и до-
пуски);
♦ иммерсионное масло (показатель пре-
ломления, частная дисперсия, пропус-
кание в спектральном диапазоне);
Рис. 14.1. Основные элементы
стандарта микроскопии, влия-
ющие на качество изображения
(рабочее положение микро-
скопа): толщины и размеры
предметных и покровных стекол;
увеличение, допуск на высоту и
высота, длина тубуса объектива
209
Глава 14 Стандарты микроскопии
Таблица 14.1
Параметры покровных стекол (ГОСТ 6672-75), мм
Ширина, мм* Длина, мм* Толщина, мм**
9 9 0,17 мм — номинальная, 0,19 мм — максимальная, 0,13 мм — минимальная.
18 18
20 20
24 24
24 48
30 40
40 40
40 60
60 80
80 100
* Предельные отклонения ± 1 мм.
** Предельные отклонения — от (+ 0,02) мм до (—0,04) мм.
Таблица 14.2
Стандартные параметры покровных стекол (DIN 58884)
Марка Толщина, мм Примечание
Номинальная Максимальная Минимальная
N1 0,17 0,17 0,13 Общего назначе- ния (основной)
Nl —Н 0,17 0,17 0,15 Высокого назначе- ния (основной)
Nl/2 0,17 0,19 0,16 —
N2 0,17 0,25 0,17 —
♦ параметрический ряд увеличение основных оптических элемен-
тов микроскопа (собственно микроскоп, объектив, окуляр, до-
полнительная система «Оптовар», адаптеры для камер);
» высота объективов и окуляров (размер, допуски);
» присоединительные размеры (насадок, объективов, окуляров
и т.д.);
» технология получения поляризованного света;
» технология исследований в свете люминесценции.
Рассмотрим более подробно те стандартизованные элементы, с ко-
торыми чаще всего сталкиваются в биолого-медицинской практике.
Покровное стекло — это оптический элемент, расположенный между
объектом наблюдения и объективом, закрепляемый на предметном стекле.
Покровное стекло является одним из основных оптических компонентов
210
Глава 14 Стандарты микроскопии
Таблица 14.3
Стандартные параметры предметных стекол (по ГОСТ 9284-75)
Ширина, мм Длина, мм Толщина, мм
Номиналь- ное значе- ние Предель- ное откло- нение Номиналь- ное значе- ние Предель- ное откло- нение Номиналь- ное значе- ние Предель- ное откло- нение
26 + 1,0 46 ± 1,0 1,0 ±0,1
26 76
60 80
80 100
90 120
при расчете качественных, параметрических и габаритных характеристик
воспроизводящей части микроскопа и, в первую очередь, объектива.
Покровное стекло предохраняет и фиксирует препарат. Толщина стек-
ла учитывается при расчете объектива и маркируется на его корпусе.
ГОСТ 6672-75 «Стекла покровные для микропрепаратов. Тех-
нические условия». Стандарт регламентирует показатель прелом-
ления стекла 1,515 ± 0,002 и коэффициент дисперсии 60 ± 0,2, а также
другие параметры (табл. 14.1).
Что касается зарубежных стандартов на ПС, то основной показатель
преломления стекла по DIN 588841 «Покровные стекла для микро-
скопов» соответствует: пе= 1,5255+0,0015, основная дисперсия 56±2
для длины волны Хе = 546,07 нм (табл. 14.2).
Предметное стекло — это оптический элемент, расположенный меж-
ду осветителем и объективом, устанавливаемый на предметном столике.
Предметное стекло является одним из основных оптических компонентов
при расчете качественных, параметрических и габаритных характеристик
осветительной системы микроскопа, в первую очередь конденсора.
Стекло предназначено для размещения на нем препарата в естест-
венном состоянии или после предварительной химической обработки.
йЁЗ ГОСТ 9284-75 «Стекла предметные для микропрепаратов. Тех-
нические условия» регламентирует материал — стекло с показате-
лем преломления 1,51 ± 0,01 и частной дисперсии п = 60 ± 2. При этом
указывается параллельность рабочих поверхностей не более 0,03 мм,
1 Соответствие международным стандартам ISO 8036-1 (1986-09), NEQ*ISO 8036-1
(1998-03), NEQ*ISO/DIS 8036-1 (1996-04), NEQ-ISO/FDIS 8036-1 (1997-11), NEQ‘ISO 8037-1
(1986-09), NEQ*ISO 8255-1 (1986-09), NEQ. Все стандарты микроскопии разработаны фир-
мой Carl ZEISS, Германия.
211
Глава 14 Стандарты микроскопии
Таблица 14.4
Стандартные параметры предметных стекол (DIN 58884), мм
Длина Ширина Толщина Примечание
45...44 76...75 26...25 номинальная 1,1 максимальная 1,2 минимальная 0, 9 нормальные предметные стекла
крупные предметные стекла
76...75 39...38 52... 51
допуск плоскостности рабочих поверхностей составляет 0,1мм при
длине 100 мм (табл. 14.3).
По международному стандарту DIN 58884 «Микроскопы. Предмет-
ные стекла»1 (табл. 14.4) указываются параметры стекла пе= 1,53 ± 0,02
и диапазоны размеров (выделенная цифра — номинальное значение).
-cfTI Показатель преломления иммерсионной жидкости. Показатель
преломления иммерсии, которая применяется в микроскопе, бли-
зок к показателю преломления стекла фронтального компонента
объектива:
кедровое масло — 1,515;
вазелиновое масло — 1,48162;
глицерин, 100% — 1,4739;
физиологический раствор — 1,3346;
вода дистиллированная — 1,3329.
Основные параметры иммерсионного масла установлены в соот-
ветствии с ГОСТ 13739-78 «Масло иммерсионное для микроскопов.
Технические требования. Методы испытания»1 2. Показатель прелом-
ления пл= 1,515±0,001. Коэффициент пропускания в слое толщиной
1мм в спектральном диапазоне: 500-720 нм соответствует 95%; 400-
480 нм соответствует 92%.
В соответствии с международным стандартом ISO 8036-1:1998 «Оп-
тика и оптические инструменты — микроскопы — Часть 1: Иммер-
сионное масло для общего применения в световой микроскопии3»
1 Современные зарубежные микроскопы, начиная с класса рабочих микроскопов, конструк-
тивно обеспечивают крепление в препаратоводителях, стандартную толщину, ширину и длину
предметного стекла. В противном случае происходит выпадение стекол или отсутствует возмож-
ность их закрепления. В моторизованных моделях при автофокусе возможно повреждение фрон-
тального компонента объектива и выхода из строя автоматической системы наводки на резкость.
2 Несоблюдение стандарта ведет к ухудшению качества изображения: снижению конт-
раста и разрешения.
3 Соответствие международным стандартам ISO 8036-1 (1998-03), EQV.
212
Глава 14 Стандарты микроскопии
Таблица 14.5
Ряд R10 значений для увеличения компонентов световых микроскопов
0,32 0,40 0,50 0,63 0,80
1 1,25 1,6 2 2,5 3,2 4 5 6,3 8
10 12,5 16 20 25 32 40 50 63 80
100 125 160 200 250 320 400 500 630 800
1000 1250 1600 ит.д.
показатель преломления пе-1,518 + 0,0005. Коэффициент пропускания
в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне следующий: 500—760
нм соответствует 95 %, 400 нм соответствует 60 %.
По международному стандарту «Иммерсионное масло для лю-
минесценции» коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в
спектральном диапазоне следующий: 500-700 нм соответствует 95%,
365-400 нм соответствует 60 %.
Обращаем внимание, что в международных стандартах указывается
** светопропускание в толщине слоя равном 10 мм, а не 1 мм, как в оте-
чественном стандарте.
jdKjl Параметрический ряд увеличений в соответствии с международным
стандартом din iso 8039 «Оптика и оптические инструменты:
Микроскопы. Увеличения1» представлен математическим рядом
R10. Эти величины предназначены для конечных значений увеличе-
ний компонентов световых микроскопов, участвующих в создании
изображения. В этом же документе дается определение увеличитель-
ных систем.
В табл. 14.5 приведен стандартный ряд увеличений. Кроме того, в
современных микроскопах есть приоритетный ряд увеличений объек-
тивов и окуляров, который в таблице выделен. Например, имеют следу-
ющие увеличения:
• окуляры: 10х - 16х - (20х) — (25х)1 2;
• адаптеры: 0,4х -0,5х -0,63х - 1,6х -2х -2,5х;
• система Оптовар: 0,63х - 1,25х - 1,6х - 2х - 2,5х - 4х;
• объективы: 0,5х-1х-1,25х-2,5х-4х-5х-10х-20х-40х-50х
-63х-100х-(150х)3-(200х)
1 Соответствие международным стандартам ISO 8039 (1997-11), EQV.
2 Это увеличение осталось только в стереомикроскопах.
3 Это увеличение относится к микроскопам отраженного света.
213
Глава 14 Стандарты микроскопии
йблица 14.6
Технологические размеры объектива и окуляра, формирующие длину тубуса микро-
скопа (ISO 9345-1)
Отрезок Обозна- чение Номиналь- ное значе- ние, мм Числовая апертура Допуск, мм
Высота объектива L1 45,0 <0,1 + 0,2
>0,1+ <0,25 ±0,06
>0,25-<0,45 + 0,03
>0,45 + 0,01
Задний рабочий отрезок объектива L2 150,0 — ±0,5
Высота окуляра L3 10,0 — + 0,3
Механическая длина ту- буса L4 160,0 — ±0,5
• дополнительные насадочные линзы для стереомикроскопов:
(0,Зх) -0,4х — 0,5х — 0,63х — 2х.
Этим же стандартом определены допуски на увеличения объектива,
окуляра (±5%) и тубусных систем, в том числе, системы Оптовара и
адаптера (±2%).
Следует отметить, что в стандартах ISO по микроскопии наряду с
численным значением дается пояснение, относящееся к параметру,
буквенные обозначения и примеры выражения.
г’чЗ Стандарт ISO 9345-1 дает понятие длины тубуса микроскопа1, здесь
° же приводятся понятия установочных плоскостей, базовых плоскос-
тей и оптических присоединительных размеров (рис. 14.2).
Принципиальные размеры и их допуски приведены в табл. 14.6.
1 Стандарт дает все основные понятия, опираясь на микроскоп с конечной длиной ту-
буса 160 мм, в то время как все современные микроскопы рассчитаны на длину тубуса «бес-
конечность». Это связано с упрощенным толкованием основных параметров (высоты объ-
ективов, окуляров), что является более важным, чем задний рабочий отрезок объектива (в
объективах последнего поколения он равен «бесконечности»), и механическая длина тубуса.
Последняя в современных микроскопах связана не с объективом, а с тубусной линзой, так
как параллельный пучок света, выходящий из объектива, тубусной системой превращается в
сходящийся пучок, позволяющий получить первичное изображение в плоскости изображе-
ния микроскопа. Какой бы не была тубусная линза, это первичное изображение находится
на расстоянии 10 мм ниже опорной плоскости окуляра (т.е. на величину высоты окуляра,
определенную данным стандартом).
214
Глава 14 Стандарты микроскопии
Рис. 14.2.
Опорные плоскости, базовые
плоскости и оптические присо-
единительные размеры
(по стандарту ISO 9345-1)
Рис. 14.3.
Высота объектива
(по стандарту ISO 9345-1):
а - работа без покровного стекла;
б-работа с толщиной покровного
стекла 0,17 мм; в - работа с толщи-
ной покровного стекла 1,5 мм.
Высота объектива1 45 мм — это не габаритный размер объектива. Эта
** величина постоянна для всех объективов независимо от их габаритов,
увеличений и типа оптической коррекции, только числовая апертура
влияет на величину допуска (табл. 14.6). Небольшие изменения в
высоте объективов определяет только их корректировка на толщину
1 Основные определения приведены в «Словаре микроскописта». Нестандартная высота
объективов относилась к ранним стадиям развития микроскопов. Они присутствовали в ком-
плектах микроскопов, практически, до 60-х годов ХХв. (высота 25-30 мм, не выровненная для
полного комплекта объективов). В 70-х годах в период развития микроэлектроники срочно
потребовались объективы с большими рабочими расстояниями, тогда и появились специаль-
ные объективы, которые больше нигде не нашли применения (высота объективов 90-95 мм).
Стандартная высота объектива до настоящего времени имеет две величины. Первая — высота
33 мм (по стандарту 60-х годов). До настоящего времени объективами с такой высотой ком-
плектуются микроскопы МИКМЕД 1 (БИОЛАМ Р. С.Д.), они входят и в другие комплекты
отечественных микроскопов, серийный выпуск которых относится к 70-м годам. Объективы
компактны и дешевы, поэтому ими комплектуются учебные модели микроскопов. Вторая ве-
личина — высота 45 мм, которая появилась в период развития планоптики и потребностях
в высококачественной оптике. Эти объективы — из разряда дорогостоящих и «элитных», в
конце XX века стали составлять основу комплектации рабочих микроскопов.
215
Глава 14 Стандарты микроскопии
покровного стекла (рис. 14.3). Это связано с тем, что объективы,
используемые с объектами, закрытыми покровным стеклом, должны
иметь высоту 45 мм, увеличенную для компенсации мнимого смещения
объекта за счет толщины покровного стекла на величину оптического
удаления хода луча:
£(и-1)
п
где t — толщина покровного стекла, п — показатель преломления
стекла.
Высота объективов нового поколения микроскопов фирмы Никон
(Япония) стала больше и составляет 60 мм.
Переход мировых оптических производителей микроскопов с высо-
ты объектива 33 мм (отечественный ГОСТ 50-х годов) на высоту 45 мм
были связаны с необходимостью увеличения габаритных размеров объ-
ектива. Улучшение качества изображения объектива на большом линей-
ном поле (с 18 мм до 25 мм) и выравнивание хроматических аберраций
увеличения для единого комплекта потребовали применения большего
количества линз и изменения их оптических параметров. Высота 60 мм
связана с введением объектива увеличения 0,5х. Пока необходимость в
данном шаге другими фирмами не воспринята.
В новом поколении универсально-йсследовательских микроскопов
фирм Карл Цейсс и Лейка есть еще один стандартизованный параметр,
который отличает одну фирму от другой. Это присоединительная резьба.
Наш отечественный стандарт ГОСТ 3469-83 и международный
стандарт ISO 8038 определяют два размера для резьбы объектива:
малая объективная резьба OB(W)0,8" и большая метрическая резьба
М27х0,751. Аналогичные параметры используются в комплектах объ-
ективов фирмы Карл Цейс. Объективы фирмы Лейка имеют метричес-
кую резьбу М25.
Переход на метрическую резьбу связан с тем, что требуется переход
на единое револьверное устройство для микроскопов проходящего и
отраженного света (как в отечественных микроскопах МБИ 15 и Вио-
лам И), и объективы проходящего света раньше устанавливались на эти
микроскопы через переходное кольцо. Сегодня фирмы приняли новую
политику, связанную с тем, что, улучшив качество изображения в мик-
роскопе и объективах, они перевели объективы проходящего света на
метрическую резьбу М27 (фирма Карл Цейсс, мод. Axiolmager) или М
1 Метрическая резьба традиционно применяется в объективах отраженного света свет-
лого и темного поля. Для обеспечения темного поля требовался дополнительный канал для
света, проходящего вне объекта.
216
Глава 14 Стандарты микроскопии
25 (фирма Лейка, мод. DM 2500-6000). При этом, в комплектах по-пре-
жнему остались объективы с малой объективной резьбой, как эконо-
мичный вариант.
©Еще одно важное упоминание в стандарте, которое необходимо знать.
Определенная комбинация объектива и окуляра часто используются
для исправления аберраций. Поэтому применение объектива одного
изготовителя с окуляром другого, хотя бы и удовлетворяющим тре-
бованиям указанного стандарта, может привести к потери качества
изображения.
гб^З Примером технологического стандарта может служить международ-
ный стандарТ isq 8576.2 «Система координат в поляризованной
световой микроскопии». Этот стандарт устанавливает систему ко-
ординат для всех градуированных вращательных и поступательных
перемещений в микроскопах и его принадлежностях, с тем, чтобы
привести к единообразию методики измерения. Особое внимание в
стандарте уделяется поляриметрическим параметрам и таким изме-
рительным приспособлениям, как вращающиеся предметные столи-
ки, поляризаторы, анализаторы и компенсаторы.
Современная лаборатория, использующая микроскопический метод
исследования, все чаще обращается к системам анализа изображе-
ния. Комплекс должен отвечать требованиям определенных стандар-
тов и, прежде всего, по достоверности и точности воспроизведения.
За точность работы электронной части и программного продукта от-
вечает предприятие-разработчик.
В настоящее время в М3 РФ зарегистрирован только один комплекс,
отвечающий указанным требованиям и закрепляющий за производи-
телем ответственность за работу микроскопа, камеры, компьютера и
программы. Это «Аппаратно-программный комплекс визуализации
морфологических препаратов, анализа и регистрации оптических и
морфологических показателей «ВидеоТесТ» (регистрационное удос-
товерение № 29/20010702/6102-04 от 16.02.2004, Изделие медицинской
техники, Код ОКП: 94 4350, ТУ 9443-001-52154675-2003), включающий:
1. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и морфо-
логических показателей дли исследования компонентов осадка
мочи (типа «ВидеоТесТ»);
2. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и морфо-
логических показателей дли исследования фертильности спермы
217
Глава 14 Стандарты микроскопии
по оценке концентрации, подвижности, морфологии головки
(типа «ВидеоТесТ-Сперм 2.1»);
3. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и морфо-
логических показателей дли исследования клеток крови (типа
«ВидеоТесТ-Гем»);
4. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и мор-
фологических показателей дли морфологических исследований
клеток и тканей (типа «ВидеоТесТ-Морфология»);
5. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и мор-
фологических показателей дли морфологических исследований
клеток (типа «ВидеоТесТ-Морфология»);
6. Аппаратно-программный комплекс визуализации морфологи-
ческих препаратов, анализа и регистрации оптических и мор-
фологических показателей дли морфологических исследований
колоний бактерий (типа «ВидеоТесТ»).
Регламентация срока службы приборов связана с материалами, при-
гдцд© меняемыми в изделии, методиками и критериями расчета вероят-
ности безотказности работы, а также предельного состояния. Основ-
ными документами для оптико-механического прибора (светового
микроскопа) являются государственные стандарты и технические ус-
ловия.
Основные ТУ для проверки качества изображения объективов и
окуляров в отечественных микроскопах — ТУ 3-3.870-83. В документе
регламентированы условия качества оптико-механического изделия.
При этом основными являются требования к условиям эксплуатации:
«...п. 1.2.15.1. Установленная календарная продолжительность без-
отказной эксплуатации должна быть не менее 2,5 лет.
п. 1.2.15.2. Установленный полный срок службы должен быть не ме-
нее 7 лет.
п. 2.4. Основными документами при проведении испытаний и при-
емки являются настоящие ТУ, комплект конструкторской документа-
ции и контрольный образец, утвержденный установленным порядком
по ГОСТ 26964-86».
В ТУ на изготовление любого микроскопа указан срок службы мик-
роскопа 10 лет с момента расконсервации, при этом максимальный
срок хранения на складе — 1 год.
218
Глава 14 Стандарты микроскопии
Однако в связи с изменением состава материалов (применения плас-
тмассы в фокусировочном механизме конденсора, в осветительной
системе), срок службы отечественных микроскопов снижен до 7 лет
(сведения службы надежности ОАО ЛОМО от 19.01.04г.). Срок службы
указывается в паспорте изделия.
При условиях повышения процента узлов и деталей из менее про-
чных материалов, чем сталь, алюминий и их производные, происходит
снижение срока службы микроскопа как любого оптико-механического
прибора, механического прибора, а также прибора с источниками элек-
трического освещения. Расчет надежности ведется с учетом эксплуата-
ции в течение определенного времени (ГОСТ 25.001-78, ГОСТ 27.002-
89, ГОСТ 27.003-90, ГОСТ 27.004-85, ГОСТ 27.202-83, ГОСТ 27.203-83,
ГОСТ 27-204-83, ГОСТ 27.410-87, РД50-650-87).
Для микроскопа расчет ведется из условий эксплуатации в среднем
100 ч. в месяц. При этом учитывается количество элементов, подвер-
женных движению (качения, вращения и т.д.) и связанных с нагрева-
тельными элементами (источниками света).
Для микроскопов наиболее значимыми с точки зрения надежности
являются бинокулярная насадка (включая корпусные детали), освети-
тельная система (включая материалы для полевой диафрагмы, корпу-
са узла крепления лампы), фокусировочные механизмы конденсора и
собственно микроскопа1.
Основные действующие в настоящее время государственные и меж-
дународные стандарты микроскопии приведены в Приложении 8.
1 Чем больше в изделии дешевых (непрочных) материалов, тем ниже себестоимость
прибора, тем меньше срок службы микроскопа и тем быстрее происходит замена изделия.
Стоимость микроскопа является показателем жизненного цикла прибора: чем ниже стои-
мость эквивалентных изделий, тем меньше их жизненный цикл.
219
ГЛАВА 15
УХОД ЗА МИКРОСКОПОМ
В настоящее время лаборатории оснащены самыми разнообразными моделями
биологических микроскопов как отечественного, так и зарубежного производства. Все еще
широко используются старые отечественные модели 50-х годов такие как: М-9, МБИ-1, МБР-1,
МБИ-3, МБР-3 и другие, срок службы которых значительно превышает определенный ТУ срок,
составляющий 10 лет. Для охраны здоровья при работе с микроскопами вне зависимости
от их марки, конструкции и места изготовления, выработаны определенные общие правила
обращения, настройки и ухода за ними, которых необходимо придерживаться.
15.1. ПРАВИЛА УХОДА ЗА МИКРОСКОПОМ
Как любой оптический прибор микроскоп требует бережного обра-
щения. А с учетом того, что он является основным рабочим инструмен-
том, влияющим как на принятие решения, так и ца состояние здоровья
тех, кто с ним работает, рассмотренные ниже правила являются жиз-
ненно важными.
©Дефекты в изображении, возникающие в результате загрязнения оп-
тических поверхностей (рис. 15.1):
• снижение общего контраста (серый объект на сером фоне);
♦ невозможность получить резкое изображение препарата;
• неравномерность освещенности в изображении;
♦ «неспокойное» изображение, т. е. частичное исчезновение резко-
го изображения;
• цветная кайма или фон.
Основные правила хранения микроскопа и ухода за ним
1. Микроскоп от проникновения внутрь пыли должен быть пок-
рыт чехлом, лучше полиэтиленовым (или стеклянным колпаком).
Микроскоп может храниться в ящике или шкафу.
2. Вынимая прибор из ящика, снимая с полки, а также при переносе
с места на место микроскоп необходимо одной рукой держать за
штатив, а другой придерживать за основание.
3. Необходимо оберегать микроскоп от механических ударов.
220
Глава 15 Уход за микроскопом
ИвМИИ
Рис 15.1. Характер изображения, полученного с помощью одного и того же объектива:
а, б, в - при загрязненной оптической поверхности фронтального компонента; г, д, е - после чистки поверхности.
Как видно загрязнение фронтального компонента приводит к снижению контраста, разрешения, цветопередачи, яркости
и освещенности в плоскости изображения.
4. Каждый объектив должен быть ввинчен до конца в гнездо револь-
верного устройства, и четко зафиксировать в ходе лучей в рабо-
чем состоянии микроскопа.
5. Необходимо предохранять фронтальные линзы объективов и
конденсора, а также глазные линзы окуляров от соприкосновения
с различными реактивами.
6. Нельзя без необходимости снимать бинокулярную насадку и при-
касаться к поверхности тубусной линзы.
7. Нельзя касаться любой стеклянной поверхности пальцами рук,
поскольку на поверхности остаются жирные следы. Это потребу-
ет проведения внеплановой чистки оптики, которая может пов-
лечь за собой повреждение просветляющих поверхностей.
8. Категорически запрещается снимать «рубашку» (металлический
корпус) объектива и заниматься его разборкой.
9. Во внерабочем состоянии микроскопа объективы должны быть
опущены (при чем в ход лучей должен быть установлен объектив
малого увеличения). При этом объектив не должен касаться пред-
метного столика.
10. Для предохранения попадания пыли внутрь микроскопа (если от-
сутствует чехол) окуляры должны быть вставлены в окулярные труб-
ки, а объективы ввинчены в гнезда револьверного устройства. Если
окуляры отсутствуют, то на окулярные трубки необходимо сделать
221
Глава 15 Уход за микроскопом
бумажный чехол, а там где нет объективов — необходимо в оставше-
еся гнездо вставить заглушку или заклеить его широким скотчем.
11. Рекомендуется перед началом или в конце работы оценить чис-
тоту основных оптических поверхностей объектива, окуляров и
конденсора микроскопа и в случае загрязнения немедленно под-
вергнуть их чистке.
12. Для продления срока службы ламп в осветителях рекомендует-
ся не подвергать их резким перепадам напряжения и перед вклю-
чением и выключением переводить регулятор накала нити лампы
(реостат) в минимальное положение. Осветители, в которых от-
сутствует регулятор накала (реостат), для продления срока служ-
бы лампы рекомендуется реже выключать.
13. Раз в полгода необходимо проводить профилактическую чистку
и смазку микроскопа представителями сервисной технической
службы.
15.2. ЧИСТКА ОПТИКИ МИКРОСКОПА
В табл. 15.1 приведен перечень оптических узлов микроскопа и тех-
нология их чистки.
Объектив является основной частью микроскопа — воспроизводя-
щей, создающей увеличенное изображение с дифракционным расчет-
ным качеством. Одной из причин отсутс-
твия этого качества, в том числе, контраста,
разрешения и цветопередачи, является
грязь в объективе и, в первую очередь — на
передней поверхности первой линзы.
После использования в течение всего
рабочего дня, иммерсионный объектив
обязательно должен быть вычищен с по-
мощью набора для чистки (рис. 15.2).
Как было показано в табл. 1, чистить
объективы можно тремя способами. Если
иммерсионное масло соответствует стан-
дарту, то его вязкость такова, что позволяет
производить чистку фронтального компо-
нента с помощью бумажной салфетки или
фланелевой тряпочки. Однако, если иммер-
сионная жидкость старая и загустела, если
слой иммерсии застыл (давно не чистили),
то объектив необходимо вывернуть и под-
Рис 15.2. «Джентльменский» набор
микроскописта: смесь для протирки
(спиртовая), груша № 1, вата медицинс-
кая и деревянная палочка
222
Таблица 15.1
Перечень оптических узлов и технологию их чистки
Деталь, узел, модуль Что подвергается чистке Средство чистки Способ чистки
ОБЪЕКТИВ Нельзя разбирать! Объективы сухой системы (не иммерсионные) имеют нестойкое просветляющее покрытие на фронтальных линзах! Фронтальная (первая) лин- за — поверхность линзы и металлическая часть оп- равы. Специальная салфетка, пропитан- ная спиртом. Чистая фланелевая тряпочка. При сильном загрязнении — дере- вянная палочка (длина — 15 см; диаметр — 5 мм) с острым кон- цом, обернутым ватой и слегка смоченным в спирт-эфирной сме- си (1:3), или ксилоле, или авиа- ционном бензине (чистом), или спирте (96%). й Протирка
Внутренняя часть и пос- ледняя оптическая поверх- ность объектива со сторо- ны резьбы. Резиновая груша № 1 Is Выдувание
Наружная поверхность корпуса. Вата, слегка смоченная в спирте. «Ъ Протирка
КОНДЕНСОР При чистке нельзя силь- но давить на фронтальную линзу (ближайшую к препа- рату): может выпасть! Фронтальная (первая) лин- за — поверхность линзы и часть оправы. Деревянная палочка (длина — 15 см; диаметр — 5 мм) с острым кон- цом, обернутым ватой и слегка смо- ченным в спирт-эфирной смеси (1:3), или ксилоле; или авиационном бензине (чистом); или спирте 96%. й Протирка
Внутренняя часть — со сто- роны осветителя Резиновая груша № 1 Выдувание
Глава 15 Уход за микроскопом
223
Таблица 15.1 (продолжение)
224
Деталь, узел, модуль Что подвергается чистке Средство чистки Способ чистки
Откидная линза (нижняя, ближайшая к источнику света) Чистая фланелевая тряпочка й Протирка
ОКУЛЯР При чистке: 1. поверхности глазной лин- зы —- сильно не тереть: можно испортить просвет- ляющее покрытие! 2. окулярной сетки (толщи- на 0,17-0,5 мм) — сильно не тереть: можно разбить или стереть сетку! Глазная (первая) линза — поверхность линзы и часть оправы. Специальная салфетка, пропитан- ная спиртом Чистая фланелевая тряпочка или тряпочка для протирки очков Протирка Подышать на поверхность!
Внутренняя часть и пос- ледняя оптическая повер- хность. Резиновая груша № 1 Выдувание
Окулярная сетка — стек- лянная поверхность с двух сторон. Чистая фланелевая тряпочка или тряпочка для протирки очков Протирка Подышать на поверхность!
ВИЗУАЛЬНАЯ НАСАДКА Желательно не снимать с микроскопа! Чистить при необходимости! При чистке поверхность ту- бусной линзы сильно не те- реть: можно испортить про- светляющее покрытие! Первая поверхность тубус- ной системы (внутри на- садки). Чистая фланелевая тряпочка или тряпочка для протирки очков Резиновая груша. й Протирка Подышать на поверхность! Выдувание
Внутренняя поверхность призм в окулярных труб- ках — оптическая повер- хность при вынутых оку- лярах. Резиновая груша № 1 Выдувание
Глава 15 Уход за микроскопом
Таблица 15.1 (окончание)
Деталь, узел, модуль Что подвергается чистке Средство чистки Способ чистки
ПРЕДМЕТНЫЙ СТОЛ Верхняя поверхность пред- метного стола. Вата, смоченная спиртом «Ь Протирка
Нижняя часть стола, часть между столом и конденсо- ром, подвижные части стола. Резиновая груша № 1; Вватный тампон и спирт. Выдувание Протирка
СВЕТОФИЛЬТРЫ, мато- вые стекла Стеклянная поверхность с двух сторон. Чистая фланелевая тряпочка или тряпочка для протирки очков й Протирка Подышать на поверхность!
Светофильтры для люми- несцентной микроскопии Не прикасаться к стеклян- ной поверхности рукой! Чистить при необходимости! Просветляющее покрытие нестойкое! Не тереть! Внешняя стеклянная повер- хность. Чистая фланелевая тряпочка или мягкая тряпочка для протирки оч- ков й Протирка Подышать на поверхность!
ПОЛЯФИЛЬТРЫ и КОМ- ПЕНСАТОРЫ для поляри- зационной микроскопии; ДИК призмы Не прикасаться к стеклян- ной поверхности руками! Чистить при необходимости! Просветляющее покрытие нестойкое! Не тереть! Внешняя стеклянная повер- хность или обе стеклянные стороны. Чистая фланелевая тряпочка или мягкая тряпочка для протирки оч- ков (подышать на поверхность!) й Протирка
Глава 15 Уход за микроскопом
225
Глава 15 Уход за микроскопом
вергнуть тщательной чистке. То же относится к сухим объективам, опу-
щенным в слой иммерсии.
Процесс чистки следующий (рис. 15.3):
1. вывернуть объектив из микроскопа (или устанавливить в поло-
жение удобное для чистки с большим свободным расстоянием);
2. сделать тампон из ваты, для чего:
2.1. слегка смочить заостренный кончик палочки в спирте,
2.2. наматывая вату на кончик палочки, вытянуть небольшой
кусочек;
2.3. положив на ладонь, скатать вату на палочке в «тампон»;
3. сухим тампоном одним движением руки снять иммерсию с пер-
вой линзы объектива, убрать грязный тампон;
4. сделать новый тампон из ваты;
5. смочить тампон в смеси следующим образом:
5.1. осторожно обмакнуть тампон во флакон со смесью, едва
погружая палочку;
5.2. вынуть палочку с тампоном и промокнуть на сгибе руки
около ладони;
Лишняя влага не должна попасть на фронтальную часть объектива, так
как в противном случае линза объектива может выпасть из оправы.
6. кругообразным движением, без вдавливания линзы внутрь объ-
ектива аккуратно протереть поверхность линзы и металличес-
кую оправу;
7. сделать следующий «тампон»;
8. подышать на поверхность;
9. протереть стеклянную поверхность палочкой с сухим тампоном;
10. проверить чистоту поверхности, наклонив объектив;.
В противном случае операцию придется повторить.
Но чистить следует не только иммерсионные объективы. Вы сами
можете почувствовать, когда следует посмотреть все первые поверх-
ности объективов.
Технология достаточно простая:
• свет направляется на первую поверхность объектива и оценива-
ется ее чистота, если поверхность грязная — следует продолжить
чистку;
• необходимо посмотреть на свет со стороны резьбовой части
объектива (со стороны последней поверхности);
• со стороны последней поверхности объектива следует «грушей»
выдуть грязь, при этом струю воздуха направив от центра к краю.
226
Глава 15 Уход за микроскопом
Рис. 15.3. ' - -
Процесс «активной» чистки оптики:
1-йman - получить ватный тампон (7, 2,5); 2-йэтап - слегка смочить ватный тампон в спирте или любой другой
смеси и проверить влажность на запястье - тампон должен быть чуть влажным (4,5); 3-йэтап - сначала снять слой
масла, затем новым тампоном протереть поверхность фронтальной линзы объектива - круговым движением от центра
линзы к краю и вывести тампон через край оправы (6,7,8,9); 4-йэтап - подышать на линзу (Ю); 5-йэтап - после
повторной протирки сухим тампоном проверить чистоту поверхности (11).
©При плохо вычищенном объективе может произойти следующее:
резкое снижение контраста изображения, потеря четкости, резкости
и разрешающей способности объектива, появление дополнительного
рассеянного света.
227
Глава 15 Уход за микроскопом
Помните, что микроскоп с иммерсионным объективом плохо рабо-
тает в помещении, где температура ниже + 10°С.
Чистка фронтального компонента конденсора аналогична чистке
объектива. Только со всеми конденсорами, кроме конденсора от моделей
МИКМЕД-2 и ЛЮМАМ РПО, надо быть вдвойне аккуратным. Ни в коем
случае при чистке не надавливать на линзу и не смачивать обильно спир-
товой смесью. Оба случая ведут к выдавливанию фронтального компо-
нента, то есть к выходу из строя осветительной системы микроскопа.
Плохо вычищенный фронтальный компонент конденсора снижа-
ет освещенность поля на предмете, при этом возможно появление
дополнительной окраски и провалов в освещенности изображения
мелких элементов.
Иными словами, чистка влияет на точность воспроизведения объек-
та, окраску фона в поле изображения, снижает разрешающую способ-
ность микроскопа.
Чистка окуляра. В окуляре обычно чистится глазная линза — пер-
вая к глазу наблюдателя.
Чаще всего на первой поверхности линзы остаются отпечатки паль-
цев, пыль, грязь, цветные разводы, что ведет к рассеянному свету, сни-
жению четкости и контраста картины.
Однако бывает и осыпка внутри окуляра, которая создает ощущение
грязи на изображении объекта. Эта грязь может вносить ложное пред-
ставление об объекте.
йЙД рекомендуется самому пользователю разбирать окуляр. Однако
при смене сетки можно рекомендовать аккуратно вывинтить глазную
линзу в оправе и с помощью груши «выдуть» попавшую грязь.
Если на окулярной сетке Вы обнаружите грязь, то поверхность ее не
рекомендует протирать спиртом (это можно делать только в крайнем
случае). Лучше взять чистую фланелевую тряпочку, подышать на стек-
лянные поверхности с двух сторон, а затем ею протереть поверхности.
Желательно не касаться сетки пальцами рук, а аккуратно брать ее за
кромку по диаметру.
228
ГЛАВА 16
МАСТЕР-КЛАСС СТРАНЫ СОВЕТОВ.
ДИАЛОГИ
Эта глава посвящена вопросам и ответам, советам и рекомендациям не только
моим, как специалиста и практика, но и моих, а также ваших коллег. Диалоги
с пользователями - это наиболее интересная и важная часть общения, позволяющая
не только поделиться опытом практического применения микроскопа, но и разобраться
в теоретических вопросах с минимумом формул или совсем без них. Оставим это для
другой главы, а теоретические рассуждения - теоретикам - физикам и математикам.
Телефонные звонки, вопросы по электронной почте, вопросы на сайтах, конференциях...
Их много и они разные. Может быть, именно в этой главе вы найдете ответ и на свои
вопросы.
в Почему микроскопы одной группы имеют разную стоимость?
гй Микроскопы одной группы могут иметь разную стоимость, ко-
торая зависит в первую очередь от комплектации. Практически все
составные части микроскопа, рассмотренные нами в первой части,
имеют варианты. Они позволяют составлять модели простой или
сложной комплектации, обеспечивая переход от менее точного — к
высокоточному, от менее качественного — к высококачественному
изображению в микроскопе. Естественно, что подобные переходы
сопровождаются изменением как количественного состава (увеличе-
нием числа деталей), так и качественного свойства (изменением тех-
нологии изготовления и применения материалов). Например, микро-
скоп для получения фазового контраста на одном объективе может
быть укомплектован универсальным конденсором, а может — свето-
вой вставкой в конденсор, при этом стоимость уменьшается в полто-
ра раза. Для создания поляризованного света можно воспользоваться
откидным поляфильтром, установленным под конденсором, а можно
установить вращающийся поляфильтр с компенсатором Лямбда. Сто-
имость возрастет в 3 раза, но это дает качественный эффект при реа-
лизации метода.
229
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
16.1. ВОПРОСЫ О ТОМ, ЧТО И КАК мы видим
К С чем связана усталость глаз, снижение чувствительности к воспри-
ятию света и цвета при работе с микроскопом?
ЙЯ На микроскопе профессионалам приходится работать по 6-8 часов
с огромным напряжением, связанным не только с ответственностью
за результат исследования, но и с необходимостью компенсации недо-
статка настройки микроскопа.
При утомлении глаз наблюдается снижение контрастной чувствитель-
ности остроты зрения и скорости зрительного восприятия. Сильнее всего
подвержена влиянию утомляемости устойчивость ясного видения.
Основной причиной, вызывающей утомление зрения при искусст-
венном освещении в микроскопе, является недостаточная или нерав-
номерно распределенная яркость по рабочей поверхности.
Неравномерное распределение освещения в поле зрения при перево-
де взгляда от одной яркости (ярко освещенной части объекта) к другой
ведет к частому изменению адаптации, что сопровождается зрачковым
рефлексом (сужением или расширением зрачка) и образованием после-
довательных образов, аккомодации. Особенно сильно это проявляется
при больших полях в микроскопе.
Недостаточная яркость обычно является следствием малой осве-
щенности, при которой приходится прищуривать глаза, придвигаясь
ближе к окуляру микроскопа или наклоняя голову. Таким образом, вы
пытаетесь рассмотреть деталь под большим углом.
Естественно, что чрезмерная яркость в поле зрения ведет к болез-
ненному нарушению и расстройству зрения, вызывая ослепление не-
которых мест сетчатки (слепые пятна), потерю способности видеть в
мало освещенном месте (куриная слепота) и т. д. Яркий свет способс-
твует появлению слез или эффекту «плывущего изображения».
Полезные советы
1. Необходимо правильно настраивать бинокулярную насадку по
глазам. Заметим, что это относится не только к установке оку-
лярных трубок на межзрачковое расстояние (по глазной базе) и
выравниванию резкости в плоскости изображения одного глаза
относительно другого, но и к совмещению выходного зрачка мик-
роскопа со зрачком глаза.
2. При работе на старых отечественных микроскопах серии Био-
лам Р, С, Д, Микмед 1, Люмам Р8 проверьте правильность комп-
лектации бинокулярной насадки однотипными окулярами. К со-
жалению, мало кто знает, что окуляры с монокулярных насадок
230
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
являются не центрированными, а бинокулярные насадки ком-
плектуются только центрированными окулярами. Хуже всего,
если в бинокулярной насадке установлены один — центрирован-
ный, а в другой — не центрированный окуляры1.
3. Правильно настраивайте осветительную систему микроскопа, пери-
одически проверяя центрировку полевой диафрагмы и ее резкое ви-
дение в плоскости предмета, а также положение нити лампы относи-
тельно выходного зрачка объектива, если осветитель невстроенный.
4. Следите за тем, чтобы освещение поля на объекте не было слиш-
ком ярким (слепящим).
5. Избегайте резкого перехода от яркого света в микроскопе к тем-
ноте в комнате и наоборот.
6. Не работайте на микроскопе безотрывно, после 30-40 минут ра-
боты сделайте небольшой перерыв. При этом старайтесь не на-
прягать зрение, не двигать глазами в разные стороны (например,
вверх, вниз, вправо, влево, что еще больше приводит к усталости),
долго не смотреть в одну точку. Желательно, чтобы стены в лабо-
ратории были спокойных тонов с неяркими картинами.
в Почему один и тот же объект в одном и тот же микроскопе раз-
ные люди видят по-разному?
ЙЯ Натренированный глаз видит любые отступления в цвете и разре-
шении. Цветовые ощущения у непрофессионалов, особенно при оцен-
ке оттенков красного и синего цветов, разные. То же относится и к
разрешающей способности системы «глаз + микроскоп». Поэтому не
спорьте, если один говорит, что видит серый фон, а другой наблюдатель
видит голубой, один видит тонкую перемычку в диатомовых водорос-
лях, а другой утверждает, что ее нет. Пусть в данном случае арбитром
выступит современная сложная техника — анализатор изображения.
® Почему изображение выходит из поля видения (зрения)?
=ЙС помощью объектива малого увеличения вы обнаружили заинтере-
совавший вас элемент. Переходите на объектив большего увеличения
и... объект наблюдения потерян из-за того, что «вышел» из поля зре-
ния. Причина — в технологии изготовления револьверного устройства
и объектива, вернее в точности центрировки каждого элемента в отде-
льности и совместной центрировки. Если это невозможно выполнить
самостоятельно, то на ряде фирм осуществляется операция по комп-
лектации (подбору) на револьверном устройстве объективов соответс-
1 Центрируемые окуляры технологически обеспечивают жесткие допуски для центри-
ровки по горизонтальной и вертикальной оси.
231
Глава 1 б Мастер-класс Страны советов. Диалоги
твующего диапазона увеличений, которые при последовательном пере-
ключении обеспечивают наличие изображения объекта в поле зрения.
В микроскопах моделей БИОЛАМ Р, С, Д и МИКМЕД 1 фирмы
ЛОМО на револьверном устройстве у гнезда, куда ввинчивается объ-
ектив малого увеличения, есть красная точка. Объективы устанавлива-
ются в револьверном устройстве в порядке возрастания увеличения.
При соблюдении этого правила вам гарантируется условие: при пе-
реключении объективов (т. е. переходе от одного увеличения к другому)
изображение объекта, установленного в центр, не будет выходить из
поля зрения окуляра.
В этом случае можно порекомендовать:
Если у вас имеются микроскопы Биолам Р, С, Д или Микмед 1, и вы
еще ни разу не переставляли объективы, то посмотрите правильную
их установку как было сказано выше.
Если у вас имеется микроскоп нового поколения, а проблема — ста-
рая, значит, произошли нарушения в центрировке и вряд ли вам удас-
тся ее решить.
Если вы постоянно меняете объективы с одного микроскопа на дру-
гой, то в этом случае и не чему удивляться.
К С чем чаще всего связаны искажения и снижение качества изобра-
жения при наблюдении, фотографировании или «захвате» изобра-
жения видеокамерой с микроскопа, и каковы способы их устранения?
ЙЯ Ответ представлен в табл. 16.1.
® Что приводит к искажению в изображении?
ЙЯ Искажения могут произойти из-за технологических отступлений
при изготовлении систем микроскопа, нарушения технологии микро-
скопирования (например, приготовление препарата или проведение
наблюдений), некорректной настройки микроскопа. Иными словами,
аберрации могут появиться на всех этапах от расчета микроскопа до
получения изображения объекта на сетчатке глаза.
©На искажения в изображении влияют следующие нарушения техно-
логии производства микроскопа, в частности, объектива:
• отступления от расчетных радиусов кривизны поверхностей линз;
• не соблюдение расчетных толщин линз, пластинок, призм;
• несоответствие качества изготовления оптических поверхностей
требованиям расчета;
232
Таблица 16.1
Примеры дефектов и способы их устранения
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
1. Нерезкое изобра- жение на негативе (мониторе) 1. Нарушение номинальной величины длины тубуса микро- скопа в фотоканале. 2. Нарушение расчетного условия работы объектива: а) объектив, рассчитанный на работу с покровным стеклом, используется не в расчетных условиях: • на препарате отсутствует покровное стекло; • толщина покровного стекла не соответствует номи- нальной величине; б) объектив, рассчитанный на работу без покровного стекла, используется не в расчетных условиях: ♦ препарат с покровным стеклом; в) объектив, рассчитанный на работу с иммерсией: • используется без иммерсии; • применяется иммерсия, которая имеет показатель преломления, не соответствующий номинальному значению по стандарту; • температура в помещении значительно выше или ниже рекомендуемой по инструкции. 3. Искажения (сферическая аберрация) в передающей опти- ческой системе. 4. Нарушение резкого изображения из-за перемещения меха- низма грубой или точной фокусировки: • самопроизвольное опускание стола с препаратом или револьверной головки с объективом ♦ неосторожное обращение с фотокамерой (взвод за- твора) или видеокамерой (разворот камеры, подна- ладка камеры); ♦ Проверить и привести в соответствие условия работы объектива и микро- скопа • Привести в рабочее состояние механи- ческие узлы микроскопа • Закрепить узлы и детали, установить микроскоп на стол, имеющий антивиб- рационные устройства (амортизаторы)
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
233
234
Таблица 16.1 (Продолжение)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
5. Несовпадение плоскости изображения в визуальном кана- ле (в плоскости форматной окулярной сетки) и в плоскости фотоэмульсии (видикона камеры). б. Не совпадение условий работы в визуальном и фото-ка- налах: • применение различных по светопропусканию и длине волны светофильтров, например, одного общего све- тофильтра в осветительной системе, а другого — отде- льно в фотоканале. 7. Нарушение условий эксплуатации микроскопа или фото- видеокамер: • внешняя вибрация от неустойчивости местоположе- ния микроскопа (стол, этаж) • вибрация от неправильной работы с фотонасадкой (при работе затвора).
2. Изображение низ- коконтрастное, име- ется так называемая вуаль 1. Наличие рассеянного света в микроскопе. 2. Наличие грязных компонентов. 3. Фотоматериал засвечен и имеет собственную вуаль. 4. См. п.1-7 дефекта 1 • Произвести чистку оптики микроско- па • Заменить фотоматериал
3. Изображение име- ет раздвоение 1. Нарушение настройки микроскопа или фотокамеры: во время экспозиции скачкообразно сместился какой-либо эле- мент — препарат, объектив, окуляр, фотокамера. 2. Искажения (децентрировка, астигматизм) в передающей оптической системе. • Произвести перенастройку прибора ♦ Заменить оптику микроскопа
4. Односторонняя нерезкость изобра- жения 1. Нарушение условия работы микроскопа: ♦ неперпендикулярность плоскости предметного стола или фотопленки, или видикона камеры к оптической оси микроскопа ♦ Исправить микроскоп ♦ Правильно зарядить пластинку или ус- тановить кассету
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Таблица 16.1 (Продолжение)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
♦ клиновидность предметного стекла, или препарат имеет разнотолщинность в виде клина. Заменить предметное стекло
5. Круговая нерез- кость изображения 1. Неправильный подбор оптики (окуляра). 2. Большая кривизна изображения оптической системы. ♦ Применить планоптику • Заменить окуляр гомалыо
б. Частичная нерез- кость изображения структуры по глубине 1. Неправильный подбор оптики (глубина резкости объек- тива мала). ♦ Заменить объективом того же увеличе- ния, но с меньшей числовой апертурой
7. Наложение резкого изображения одно- го слоя структуры на Другой 1. Неправильный подбор оптики (глубина резкости объек- тива велика). ♦ Заменить объективом того же увеличе- ния, но с большей числовой апертурой
8. Артефакты 1. Несоблюдение условий чистоты: • грязь на препарате; • грязь на поверхности оптических деталей, проектиру- ющих изображение; ♦ черные полосы на негативе, так называемая фрикци- онная вуаль (дефект пленки); • пузырьки воздуха при фотографировании иммерси- онного объектива, следы; • пальцев на оптической поверхности проектирующих деталей • Произвести чистку оптики и препарата. • Сменить пленку. • Аккуратно произвести зарядку и обра- ботку фотоматериала.
9. Изображение не перекрывает кадр 1. Несоответствие размеров: • угловых размеров кадра и изображения; • изображения полевой диафрагмы и поля зрения мик- роскопа. ♦ Удлинить камеру или сменить окуляр. • Раскрыть полевую диафрагму. ♦ При малых увеличениях уменьшить чис- ловую апертуру конденсора с помощью апертурной диафрагмы конденсора.
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
235
236
Таблица 16.1 (Продолжение)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
10. Односторон- нее виньетирование изображения в кадре 1. Нарушение условий работы: ♦ децентрировка всей оптической системы микроскопа; ♦ частичное перекрытие света механической деталью (оправой, вкладышем). ♦ Отъюстировать оптическую систему. ♦ Убрать из хода лучей мешающие детали.
11. Неравномерность почернения негатива 1. Нарушение работы осветительной системы. 2. Неправильный подбор источника света (плотность спира- ли лампы не соответствует параметрам оптической системы осветителя и объектива). 3. Нарушение работы микроскопа (рефлексы от оправы, по- верхности линзы или внутренней поверхности микроскопа или фототубуса). • Правильно настроить осветитель. • Установить в осветительной системе матовое стекло.
12. Изображение смещено относитель- но кадрового окна визирной трубки Нарушена конструкция микроскопа: ♦ неправильное положение светоделительной призмы. • Настроить прибор. • Можно ввести коррекцию при съемке.
13. Дифракционные явления на структу- рах объекта Нарушены условия освещения: • закрыта апертурная диафрагма, • конденсор в неправильном положении. • Открыть апертурную диафрагму кон- денсора. ♦ Настроить освещение.
14. Недостаточное почернение фона: а. при методе темно- го поля Нарушение условий получения метода: • апертура объектива не перекрывается апертурой кон- денсора (Аоб»А№„); • неправильно установлен конденсор; ♦ большая толщина предметного стекла. ♦ Устранить перечисленные причины ис- кажений.
б. при методе фазо- вого контраста ♦ плохо отъюстирована система «фазовый объектив + световое кольцо конденсора», • параметры фазового кольца не соответствуют свойс- твам объекта. • Отцентрировать изображение светово- го и фазового колец • неустранимый дефект.
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Таблица 16.1 (Продолжение)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
в. при поляризаци- онном методе • недостаточно точно произведена настройка на «гаше- ние» для выявления свойств объекта; • Устранить недостаток юстировки.
г. при методе люми- несценции • нарушено условие освещения объекта, • неправильный подбор комплектов светоделительной пластины и системы возбуждающего и запирающего светофильтров • источник света не обеспечивает необходимую мощ- ность излучения в соответствующем спектральном диапазоне; ♦ Проверить подбор оптики
д. при методе ДИК • недостаточно точно произведена настройка на «гаше- ние» для выявления свойств объекта, • нарушено условие освещения объекта, ♦ неправильно подобраны и установлены призмы в конденсоре и над объективом. • Настроить освещение. • Проверить соответствие оптических элементов.
15. Кадр прозрачный; изображение отсутс- твует • Нарушена технология фотографирования и печати: • не произведена экспозиция (не сработал затвор, не введена светоделительная призма, погасла лампа); • при печати выбранная выдержка недостаточна; • перепутан фиксаж и проявитель. ♦ Повторить съемку. • Правильно выполнить технологический процесс съемки и проявки.
16. Плотность почер- нения велика; изоб- ражение отсутствует Фотоматериал засвечен. • Заменить фотоматериал.
17. Плотность почер- нения мала Нарушена технология печати: ♦ мала выдержка; ♦ мало время проявления; • низка температура проявления; • истощен проявитель; ♦ проявитель давно приготовлен. • Повторить съемку. ♦ Правильно выполнить технологический процесс съемки и проявки.
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
237
238
Таблица 16.1 (Продолжение)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
18. Плотность почер- нения велика Нарушена технология печати: ♦ большая выдержка; ♦ велико время проявления; • велика температура проявления. • Повторить съемку. • Правильно выполнить технологический процесс съемки и проявки.
19. Недодержка или передержка при ра- боте с экспономет- ром Нарушена технология фотографирования: ♦ неправильно определена выдержка. • Ввести корректировку.
20. Беловатый налет или желтые пятна Нарушена технология печати: • недостаточная промывка перед фиксированием, • проявитель загрязнен фиксажем, • истощен фиксаж или проявитель. ♦ Повторить съемку. ♦ Правильно выполнить технологичес- кий процесс проявки (желтые пятна устраняются кислым раствором мар- ганцовокислого калия и хлористого натрия).
21. Дихроичная ву- аль желтоватого или коричневатого цвета при рассматривании в отраженном свете Нарушена технология печати: ♦ недостаточная промывка перед фиксированием, • проявитель загрязнен фиксажем. • Повторить съемку. ♦ Правильно выполнить технологический процесс проявки. • Применить кислый фиксаж (удаляется кислым фиксажем или тиомочевинной).
22. Вертикальные бе- лые полосы на не- гативе Нарушена технология печати: • при проявлении не производилось вращение улитки с пленкой. • Правильно выполнить технологический процесс проявки.
23. Полосы на фото- пластинке Нарушена технология печати: ♦ при проявлении пластина помещена в кювету эмуль- сионным слоем вниз. ♦ Правильно выполнить технологический процесс проявки.
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Таблица 16.1 (Окончание)
Дефекты на негати- ве или экране мо- нитора Причины возникновения дефекта Способы устранения дефекта
24. Повышенный или пониженный контраст Нарушение условия работы системы «микроскоп-фотока- мера»: ♦ неправильно выбран светофильтр, • неправильно выбран размер апертурной диафрагмы. Нарушена технология фотографирования и печати: • неправильно выбран фотоматериал, • применены несоответствующие проявитель и режим обработки. ♦ Правильно выполнить технологический процесс проявки. • Настроить освещение.
25. Вуаль цветного изображения Нарушена технология печати: • не выдержан режим обработки, • истощенные растворы. • Правильно выполнить технологический процесс проявки
26. Рыжеватая ву- аль цветного изоб- ражения Нарушена технология печати: • плохо проведено отбеливание. • Правильно выполнить технологический процесс проявки (удаляется повторным отбеливанием и фиксированием).
27. Частичное спол- зание цветных эмульсионных слоев Нарушена технология печати: высокая температура воды при промывке. ♦ Правильно выполнить технологический процесс проявки
28. Неправильная пе- редача цвета Нарушены условия работы системы «микроскоп-фотока- мера»: • несоответствие применяемой пленки цветовой тем- пературе источника света. • Применить конверсионный свето- фильтр
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
239
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
• не соблюдение при сборке расчетных расстояний (воздушных
промежутков) между линзами;
• «старение» оптических деталей (расклейки, «сползание» просвет-
ляющих покрытий, осыпка внутри объективов);
• отступление физико-химических констант в используемых опти-
ческих материалах от требований расчета;
♦ некачественная сборка или выход из строя микроскопа в целом
или оптических узлов (децентрировка, неперпендикулярность
или непараллельность оптической оси микроскопа оптико-меха-
нических элементов);
• неперпендикулярность предметного столика оптической оси
микроскопа.
©При нарушении технологии микроскопирования искажения в микро-
скопе появляются в следующих случаях:
• несоответствие толщины покровного стекла требованиям ГОСТа
или той величины, на которую рассчитан объектив;
• несоответствие констант иммерсионной жидкости (применяемой
в работе и заложенной в расчет объектива);
• нарушение технологии приготовления препарата по толщине (срезы);
• неравномерность (разнотолщинность) размещения на предмет-
ном стекле приготовленного препарата.
Искажения могут появиться и при нарушении технологии наблюдения:
• неправильная настройка освещения;
• неправильный подбор оптики — выходящей за пределы полезно-
го увеличения;
• несоответствие хроматической разности увеличений объектива и
окуляра;
• работа с объективами, длина тубуса которых не соответствует
длине тубуса, заложенной в конструкции микроскопа;
• установка в бинокулярной насадке окуляров разных хроматичес-
ких аберраций (чаще всего, это сочетание включает окуляры Гюй-
генса и компенсационные) и положений выходных зрачков (рас-
стояние от глазной линзы до глаз наблюдателя, например один
обычный с расстоянием 5-7 мм, другой — с вынесенным зрач-
ком — 10-17 мм).
Нестандартные условия работы оптики микроскопа, связанные с оп-
тическими элементами (покровные стекла, предметные стекла, им-
мерсионная жидкость), расположенными между конденсором и объ-
ективом, влияют на следующее:
• окраску поля на объекте, что ведет к окраске поля, где находится
изображение объекта;
240
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
• неравномерность освещенности в плоскости предмета (объек-
та) и, соответственно, в плоскости, где формируется изображе-
ние объекта;
• нерезкость по полю в плоскости изображения объекта.
Если Вы обнаружите указанные искажения, то есть смысл провести
следующие тестовые операции:
• вынуть окуляр и проверить настройку освещения; настроить ос-
вещение;
♦ убрать из хода лучей мешающие детали путем проверки фиксации
положения узлов (фиксация положения объектива в револьвер-
ной головке, фиксация и крепление визуальной насадки, правиль-
ность установки конденсора в узле крепления, фиксация положе-
ния откидной оправы конденсора, устойчивое и зафиксированное
положение предметного столика);
• снять объектив и вычистить фронтальную линзу объектива, а заод-
но — фронтальную линзу конденсора и глазную линзу окуляров;
• проверить условия эксплуатации объектива (толщину покровного
стекла и длину тубуса микроскопа в соответствии с маркировкой
на корпусе; иммерсионное масло; температуру в помещении).
Если это не помогло — вызывайте сервисного мастера.
в Как строится изображение в микроскопе?
|Й Представим, что каждый оптический элемент имеет предмет перед
собой, тогда изображение этого предмета будет располагаться после
него. При этом предмет находится в так называемой плоскости предме-
та, а изображение, соответственно — в плоскости изображения. Мик-
роскоп — это последовательность расположения оптических элемен-
тов и узлов, поэтому для каждого следующего элемента объектом будет
являться предыдущее изображение. Таким образом, предмет, вернее,
его изображение после объектива как эстафета передается другими оп-
тическими элементами микроскопа до тех пор, пока мы это изображе-
ние не увидим.
Однако есть еще один предмет, который мы не видим вместе с изоб-
ражением нашего предмета — это нить лампы. Но его построение в
микроскопе аналогично, и увеличенное изображение нити можно уви-
деть, вынув окуляр.
ОБЪЕКТ. Для объекта оптическими системами, которые строят
изображения, являются объектив и окуляр.
По законам геометрической оптики, изображение объекта (предме-
та для объектива) строится в плоскости изображения объектива или
241
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Рис. 16.1. Схема прохождения лучей
в микроскопе:
а - часть визуализирующей системы
микроскопа; 6-часть воспроиз-
водящей системы микроскопа;
в - часть осветительной системы
микроскопа.
в подобных ПЛОСКОСТЯХ,
которые называются со-
пряженными и форми-
руются другими опти-
ческими системами.
Плоскость изображе-
ния объектива для окуля-
ра является плоскостью
предмета, т.е. изображе-
ние объекта, построен-
ное объективом, является
предметом для окуляра.
Далее изображение про-
ектируется на сетчатку
глаза, что для микроско-
па является последним
этапом геометрического
построения изображения.
Построение осуществля-
ют так называемые полевые пучки. Они как бы выходят из центра источ-
ника света и, формируясь в плоскости предмета объектива (микроскопа),
охватывают и ощупывают весь объект и «несут» его через весь микроскоп
на сетчатку глаза (рис. 16.1)
НИТЬ ЛАМПЫ. Для оценки правильности участия света в форми-
ровании изображения объекта рассмотрим геометрическое построение
нити лампы (источника света) в ее промежуточных плоскостях.
В построении изображения участвуют апертурные лучи (пучки). Про-
межуточными плоскостями для построения изображения источника све-
та служат плоскость апертурной диафрагмы конденсора и плоскость вы-
ходного зрачка объектива.
Световой конус сформирован конденсором таким образом, что верши-
на конуса (острый конец) направлена в плоскость предмета, где распо-
242
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Световой конус сформирован конденсором,
причем вершина конуса (острый конец) на-
правлена в плоскость предмета, где распо-
ложен объект. Основанием конуса является
плоскость линзы конденсора, ограниченная
оправой.
Затем этот конус как бы переворачивается, острым
концом оставаясь в плоскости предмета. При этом
основанием становится плоскость первой (фрон-
тальной) линзы, ограниченная ее оправой. Это и
есть входной световой конус микроскопа или апер-
турный конус объектива (апертура объектива).
Рис. 16.2. Схема апертурных пучков
ложен объект, при этом основанием конуса является плоскость линзы
конденсора, ограниченная оправой. Затем этот конус как бы перевора-
чивается, острым концом оставаясь в плоскости предмета, а основани-
ем становится плоскость первой (фронтальной) линзы, ограниченная ее
оправой. Это и есть входной световой конус микроскопа или апертур-
ный конус объектива (апертура объектива).
Апертурные пучки как бы «берут» всю нить накала (светящееся
тело) и проходят через объект световым конусом (апертура конденсо-
ра) (рис. 16.2).
В окуляре вы не увидите изображения нити лампы, так как в это вре-
мя окуляр «рассматривает» изображение объекта.
Увидеть нить лампы можно, только вынув окуляр и заменив его для
наблюдения на дополнительный микроскоп МИР-4, точечную диафраг-
му, или лист черной бумаги с точкой.
В данном случае изображение нити формируется в «бесконечнос-
ти», а для нас — на зрачке нашего глаза, а не на сетчатке, поэтому мы
его не видим.
Желательно, чтобы изображения нити и объекта на длинном пути в
микроскопе не совпадали друг с другом.
® Как определить, что мешает в изображении, грязь или арте-
факты? Если грязь, то, как определить ее местонахождение?
<3 Местонахождение загрязнения или наличие грязи можно опреде-
лить, если понять характер загрязнения:
1. Если вы хорошо видите «инородное» тело вместе с препаратом,
то необходимо повернуть окуляр. Если грязь так же движется, то
она находится в плоскости последней линзы окуляра. При нали-
чии шкалы грязь может осесть на поверхности пластинки (обыч-
но со стороны последней линзы окуляра).
2. Если «инородное» тело неявно появляется тогда, когда Вы чуть
отодвинетесь от глазной линзы окуляра, значит, необходимо по-
чистить первую линзу окуляра.
243
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
3. Если «инородное» тело резко видно, но не движется вместе с
окуляром, необходимо подвинуть предметное стекло. Если «ино-
родное» тело сдвинулось, значит, надо почистить поверхность
покровного стекла.
4. Если в плоскости предмета на объекте видны серые тени, раз-
ноцветные ореолы, неяркая грязь, то это, скорее всего, дефект
настройки освещения. Подвигайте конденсор вверх-вниз, про-
верьте, в каком положении у вас находится апертурная диа-
фрагма, в центре ли расположен источник света. Если Ваша
осветительная система позволяет проводить настройку по Ке-
леру — выполните ее.
5. Если при движении конденсора грязь будет «размываться», а за-
тем исчезнет, необходимо чистить фронтальный компонент кон-
денсора, а заодно и выходное защитное стекло, если осветитель-
ная система встроена в основание.
6. Если вы не можете получить резкое изображение, снижен кон-
траст и разрешение, изображение «неспокойное», тогда необ-
ходимо снять объектив и произвести чистку его фронтального
компонента.
7. Снижение контраста (серое изображение с большим количес-
твом рассеянного света) может быть связано с отпечатками
пальцев на тубусной линзе бинокулярной насадки. Надо вынуть
окуляр и сбоку посмотреть в окулярную трубку микроскопа так,
чтобы увидеть поверхность призмы и чуть дальше. Если отпе-
чаток виден, необходимо снять бинокулярную насадку и очень
осторожно протереть фланелевой тряпкой, не забывая при этом
предварительно подышать на поверхность. Тубусную линзу не ре-
комендуется чистить спиртовыми смесями, так как на нее обыч-
но наносится нестойкое просветляющее покрытие (в отличие от
фронтальных компонентов объективов, конденсоров и глазных
линз окуляров).
Обеспечение такого качества изображения, которое способствует
идентификации объекта в его изображении, является основной задачей
оптики всего микроскопа.
Качество изображения зависит как от расчета, так и технологии из-
готовления оптико-механических элементов микроскопа.
Представим себе, что микроскоп изготовлен строго в соответствии
с расчетной и конструкторской документацией. Что же в этом случае
будет влиять на качество изображения в микроскопе? Какие визуаль-
ные искажения мешают нам различить тонкие структуры?
244
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
К факторам влияния относятся следующие:
• чистота оптических частей микроскопа;
• подбор оптики, соответствующий требованиям пределов полез-
ного увеличения; настройка осветительной системы микроскопа
в соответствии с основными требованиями принципа Келера;
• обеспечение требований по разрешающей способности.
16.2. ВОПРОСЫ ОБ ОБЪЕКТИВАХ
® Что нельзя делать с объективом?
<3 При обращении с объективами нельзя:
• мыть объектив под струей воды;
• заливать иммерсионное масло со стороны резьбовой части, т.е.
капать на поверхность последней линзы;
• ронять, трясти, нагревать, охлаждать объектив (если на то нет
особого указания);
• разбирать объектив.
S Почему часто с объективом 40х плохо видны мазки? А вот ког-
да опускаешь его в иммерсионное масло — становится видно хоро-
шо, но объектив быстро портится?
«Q Объектив 40х/0,65 для биологических микроскопов рассчитан на
работу с покровным стеклом 0,17 мм. Толщина покровного стекла (ПС)
и показатель преломления стекла, из которого оно сделано, входит в
расчет объектива и участвует как составляющая оптическая часть объ-
ектива в исправлении аберраций (искажений) в центре и по полю.
Толщина покровного стекла не сказывается на работе с объекти-
вами, имеющими числовую апертуру до 0,30, — апертура маленькая,
глубина резкости большая. А далее, с увеличением числовой аперту-
ры объектива значение толщины ПС возрастает в арифметической
прогрессии. В сухих объективах, начиная с А = 0,60, толщина приме-
няемого ПС должна быть строго в пределах, определенных ГОСТ. В
противном случае наблюдается вуалирование изображения (сниже-
ние контраста).
Иными словами, отдельные точки объекта при изменении ПС вы-
глядит не резко, т. е. световые лучи, преломляющиеся на внешней по-
верхности стекла, соединяются не в одной точке, а на протяжении не-
которой линии вдоль оптической оси микроскопа — так называемая
«аберрация на покровном стекле», которая тем больше, чем толще ПС.
Отклонение толщины ПС даже на сотую долю миллиметра вызывает
245
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
неблагоприятный эффект. Слой среды, в которую закреплен препарат,
также действует как увеличение толщины ПС.
Иммерсионная жидкость имеет тот же показатель преломления
1,52, что и покровное стекло из К8. Таким образом, за счет иммерсион-
ной жидкости получается условие, которого требует расчет объектива.
Однако фронтальная линза (первая поверхность) покрыта нестойким
просветляющим покрытием, которое при соприкосновении с иммер-
сионным маслом, а затем — с чистящей жидкостью портится, ухудшая
качество изображения.
Полезные советы
Если препарат в виде мазка традиционно не покрывается ПС, а на-
блюдения проводятся с сухим объективом увеличения 40х и выше, то
целесообразно иметь рядом стандартное покровное стекло, которое
при необходимости можно просто положить на препарат.
При особо важных исследованиях целесообразно пользоваться зару-
бежными покровными стеклами, которые имеют жесткий технологи-
ческий допуск на толщину.
® Какую иммерсионную жидкость лучше всего применять? Как
работать с иммерсионными объективами?
<3 Мы уже говорили о роли иммерсии при проведении исследований. Од-
нако «жидкая» линза между объективом и препаратом имеет способность
к изменению в толщине, т.е. к изменению рабочего расстояния объектива.
Это может быть связано с компенсацией толщины покровного стекла, что
влияет на качество изображения, как в лучшую, так и в худшую сторону:
• при работе объектива с масляной иммерсией покровное стекло
может не применяться, так как показатели преломления покров-
ного стекла, фронтальной линзы объектива и масла — близки;
• при работе объектива с водной иммерсией и отсутствии покров-
ного стекла могут возникнуть такие искажения, как снижение
контраста, поскольку показатели преломления фронтального
компонента и водной иммерсии одинаковы, но значительно от-
личаются от показателя преломления стекла.
Кстати, физико-химические параметры и свойства зарубежных им-
мерсионных жидкостей несколько отличаются от отечественных. По-
этому, если отечественные объективы могут работать с зарубежным
иммерсионным маслом, то отечественное масло может значительно
ухудшить работу зарубежных объективов (снижение контраста из-за
появления сферической аберрации).
246
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
При этом компенсации за счет рабочего расстояния объектива мо-
жет не произойти.
Ухудшение качества изображения может быть связано с тем, что:
• срок гарантированной надежности и стойкости к внешней среде,
а также работоспособности оптикомеханоэлектрических частей
микроскопа закончился, и произошло ухудшение физико-хими-
ческих свойств иммерсии (например, увеличение вязкости);
• иммерсионное масло должно применяться при определенных
температурных условиях;
• преломление света меняется в зависимости от температуры, с ее
повышением показатель преломления падает и наоборот.
В случае ухудшения качества изображения из-за применяемой им-
мерсионной жидкости можно порекомендовать:
♦ проверить срок годности или соответствие применяемой жид-
кости, на которую рассчитан объектив;
♦ сменить иммерсию;
• если нет возможности заменить, то придется согласиться с ухуд-
шением качества изображения;
♦ вычистить фронтальную линзу объектива.
Квалифицированный врач-лаборант очень умело и быстро умеет на-
страивать микроскоп для работы с иммерсией. Поэтому приведенный
здесь порядок работы предназначен для молодых специалистов.
Порядок работы
1. Выводим из хода лучей сухой объектив.
2. На препарат капаем иммерсионное масло (желательно иммерси-
онным маслом немного смазать фронтальную линзу объектива).
3. Вводим в ход лучей иммерсионный объектив (90x1,25МИ,
50x1,ОМИ, 100x1,25МИ и т. д.) и фиксируем его.
4. Опускаем объектив до соприкосновения с каплей иммерсионной
жидкости, затем, наблюдая в микроскоп, с помощью рукояток гру-
бой и точной фокусировки производим настройку на резкость.
Микроскоп готов к работе!
1. При появлении в поле зрения пузырьков операцию настройки (со-
прикосновение фронтальной линзы с иммерсией) необходимо пов-
торить.
2. При ощущении нехватки света открыть апертурную диафрагму
конденсора полностью и движением зеркала найти положение на-
247
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
илучшей освещенности, после этого апертурную диафрагму целе-
сообразно немного прикрыть.
Некоторые методики исследования и диагностики предусматривают
нанесение иммерсионного масла на фронтальный компонент конденсора.
Применение вместо кедрового масла других масляных жидкостей
не рекомендуется, так как если показатель преломления используемой
иммерсии (например, вазелинового масла с показателем 1,48162) отли-
чается от показателя преломления кедрового масла (показатель 1,515),
возможно снижение контраста, отсутствие резкости изображения,
уменьшение разрешающей способности.
обратите внимание, если у вас есть объектив с белым кольцом на
d корпусе, то это объектив водной иммерсии (40хВИ, 70хВИ, 63xW,
ЮОхВИ). Эти объективы можно применять тогда, когда предметное
стекло с препаратом предварительно были смочены в воде. Этого
вполне достаточно, чтобы получить качественное изображение, пос-
кольку капля воды является той иммерсионной жидкостью, которая
располагается между фронтальной линзой и препаратом.
Обычно объективы водной иммерсии применяются для экспресс-
диагностики.
16.3. ВОПРОСЫ О МЕТОДАХ ИССЛЕДОВАНИЯ И КОНТРАСТИРОВАНИЯ
® Как лучше исследовать неокрашенный препарат методом
светлого поля?
<3 Обычно при исследовании мочи пользуются приемом, суть которого
заключается в том, чтобы направить световой поток в сторону от объ-
екта и наблюдать дифракционные явления от края объекта. Движения
просты и заучены: конденсор — вниз, зеркало — в сторону. Казалось
бы все правильно.
Высококвалифицированный врач-лаборант достаточно быстро об-
наруживает неокрашенные объекты. Но конденсор и зеркало заранее
выводятся из нормального состояния. Зеркало «уводит» световой по-
ток вместе с яркой нитью лампы в сторону от объекта, оставляя для его
освещения краевые пучки света, искаженные предыдущей оптической
системой осветителя (например, коллектором).
Если посмотреть в выходной зрачок объектива, сняв окуляр, то мы
увидим смещенный куда-то неявно выраженный световой поток. Изоб-
ражение объекта визуализируется, хотя не совсем отчетливо и, возмож-
но, не очень точно воспроизводя объект.
248
Глава 1 б Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Теоретически это объясняется достаточно просто:
• происходит смещение источника света (нити лампы) с центра
оптической оси микроскопа, что в теории образования изобра-
жения отмечается как аберрация децентрировки, которая вносит
искажение в изображение;
• апертура конденсора не соответствует апертуре объектива, так
как конденсор выведен из своего рабочего положения.
Но вот произошла очередная смена поколения микроскопов, ис-
чезли осветительные зеркала, и основным стало правило: все оптичес-
кие элементы, участвующие в построении изображения, должны быть
расположены на одной оптической оси и апертура конденсора должна
соответствовать апертуре объектива. Для выполнения этих условий и
существует конденсор косого освещения. В нем установлена апертур-
ная диафрагма, которая смещается перпендикулярно оптической оси,
и при этом настроенный конденсор (четкая проекция апертурной диа-
фрагмы конденсора в выходной зрачок объектива) гарантирует совпа-
дение осветительной и воспринимающей апертур.
В подобном случае можно порекомендовать следующее: для отечес-
* * твенных микроскопов серии Биолам Р, С, Д и Микмед 1 есть смысл
установить конденсоры косого освещения ОИ 14, которые наверняка
имеются в архивах.
В современных микроскопах со встроенной системой освещения це-
лесообразно воспользоваться любым из следующих способов:
• прикрыть апертурную диафрагму в конденсоре;
• уменьшить яркость освещения с помощью регулятора яркости;
♦ установить в откидную оправу конденсора или поместить на вы-
ходное отверстие на основании нейтральный, голубой или зеле-
ный светофильтр.
В Какова роль ирисовой диафрагмы в осветителе?
<3 Наличие в осветительной системе ирисовых (апертурной и полевой)
диафрагм позволяет раздельно регулировать величину числовой аперту-
ры и диаметр освещенного поля зрения. Уменьшение светового диамет-
ра апертурной диафрагмы конденсора приводит к уменьшению апертур-
ного угла и совершенно не влияет на величину освещенного поля зрения.
Это может привести только к усилению влияния осветительной систе-
мы на контраст и освещенность изображения объекта в целом.
Уменьшение диаметра полевой диафрагмы, расположенной у
коллектора, вызывает уменьшение диаметра освещаемого участка
249
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
предмета. Это позволяет ограничивать поле рассматриваемого объек-
та, концентрируя внимание на определенном участке.
S Почему блестит изображение?
<3 Наша привычка не настраивать освещение для каждого объектива
(т.е. не согласовывать числовые апертуры конденсора и объектива) и
опускать конденсор, забывая его поднимать, в микроскопах со встроен-
ной системой освещения оборачивается ухудшением качества наблю-
дения. В частности, появляются блики. И вместо того, чтобы настроить
освещение, мы устанавливаем матовые стекла. Одно, второе и... света
становится мало, лампа работает на полном накале, глаза болят от пе-
ренапряжения...
При опускании конденсора изображение полевой диафрагмы выхо-
дит за пределы плоскости объекта, и она исчезает из поля зрения. Ос-
вещение становится слабее, поле зрения темнее.
Границы пучка света и явления дифракции на объекте меняются.
Возникают оптические искажения. Иными словами, края поля зрения
часто бывают освещены ярче, чем центр поля.
Если исследуются окрашенные препараты, видимость которых обус-
ловлена не разницей в преломлении, а явлениями поглощения, то, чем
ниже опускается конденсор, тем быстрее возникает искажение в изоб-
ражении.
©1. При появлении бликов, рефлексов, блескости, снижении контрас-
та проверьте правильность настройки освещения в порядке.
2. Все операции настройки освещения проводятся при сфокуси-
рованном на объект микроскопе. Не забудьте, что при настрой-
ке объект должен быть выведен из поля зрения, иными словами,
после получения резкого изображения объекта, предметное стек-
ло смещается таким образом, чтобы поле зрения под объективом
было прозрачным.
В данном случае рекомендация только одна:
• закройте полевую диафрагму, и сразу все станет ясно;
• настройте освещение по Келеру, как уже было рассказано выше.
В Микроскоп МИКМЕД 2 не стабилен в работе: не хватает све-
та, появляются блестки ит.д.С чем это может быть связано?
Л Микроскоп МИКМЕД 2 представляет собой конструкцию со встро-
енной системой освещения, при этом маломощная лампа 6В 20 Вт выне-
сена относительно плоскости предметного стола на значительное рас-
250
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
стояние. Микроскоп имеет классическую схему реализации принципа
Келера: ирисовые полевая и апертурная диафрагмы, фокусируемый и
центрированный конденсор. Конденсор имеет откидную фронтальную
линзу. Практически во всех лабораториях, которые используют этот
микроскоп, фронтальный компонент скинут, с каким бы объекти-
вом не велась работа.
Обращаю внимание. При скинутой фронтальной линзе следу-
** ет работать с объективами 4х и 10х и проводить настройку по
Келеру. С объективами 20х, 40х и ЮОх необходимо фронталь-
ную линзу конденсора накидывать и проверить настройку ос-
вещения по Келеру (центрировку прикрытой полевой диафрагмы).
В противном случае наблюдается дефицит света и неполное запол-
нение числовой апертуры объектива, а также неравномерность ос-
вещенности.
В В чем разница между новыми и старыми люминесцентными
микроскопами ?
<3 Обращаю внимание на то, что отечественные люминесцентные
микроскопы серии Люмам РПО рассчитаны на длину тубуса «бес-
конечность». Все предыдущие модели серий Люмам и МЛД были
рассчитаны на конечную длину тубуса 160 мм. «Бесконечность» дает
определенные расчетно-конструктивные преимущества, особенно,
по качеству изображения. К сожалению, «любимый» объектив со
старого микроскопа проблематично установить на новый микро-
скоп без использования дополнительной тубусной линзы. Кстати,
установка объективов с нового микроскопа на старый тоже не даст
хорошего качества изображения. Если Вам все-таки каким-то обра-
зом удастся получить резкое изображение объекта без дополнитель-
ной линзы, то контраст будет низок, да и увеличение микроскопа
будет отличаться.
В подобном случае, кстати, относящемся и к биологическим мик-
роскопам зарубежного производства, можно рекомендовать только
одно:
• при установке нового объектива на микроскоп необходимо
внимательно посмотреть на маркировку нового и «родного»
объективов на самую нижнюю строчку, на которой обычно ука-
зывается длина тубуса и толщина покровного стекла. При сов-
падении маркировок смело устанавливайте новый объектив на
микроскоп, при несовпадении — не рекомендую этого делать.
251
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
® В люминесцентных микроскопах фирмы Цейсс часто рекомен-
дуют фильтр 09 в качестве базового. Можно ли его использовать
при работе с красителем FITC?
<3 Набор фильтров № 09 производства компании Карл Цейс (Германия)
действительно может быть использован для работы с красителями
типа FITC (Fluoresceinisothiocyanat), Fluoresceindiacetat, Fluorescein di-
B-D-glucopyranoside и др. Краситель FITC обладает следующими харак-
теристиками: длина волны возбуждения — 490 нм, длина волны излу-
чения (эмиссии) — 525 нм.
Набор фильтров № 9 обладает полосой пропускания на уровне 80 % в
диапазоне от 450 нм до 490 нм (возбуждающий фильтр), что позволяет
получить необходимую волну света возбуждения (490 нм). Также этот
набор обладает срезом характеристики пропускания, характерным для
длинноволнового фильтра 515 нм с уровнем пропускающей способ-
ности 96%. То есть все излучения с длинами волн более 515 нм будут
пропущены на выход фильтра, в том числе необходимая для данного
красителя длина волны 525 нм. С другой стороны все длины волн менее
515 нм будут ослаблены на 100%, что обеспечивает помехозащиту от
более коротковолнового света возбуждения. Разница между показате-
лем длины волны среза отсекающего фильтра 515 нм и длиной волны
возбуждаемого света 525 нм мала, что не может быть причиной пара-
зитных засветок в области более коротковолнового света (сине-зеле-
ного). Паразитные метки могут возникать в желтой и красной области
спектра при условии применения других красителей, загрязнении пок-
ровного стекла или неправильной подготовки образца. Но, как прави-
ло, такие случаи очень редки.
® От чего зависит качество изображения при люминесцентном
исследовании?
<3 Чаще всего можно услышать, что при исследовании в свете люми-
несценции не хватает света, наблюдается слабое свечение на светлом
фоне.
Причины возникновения подобных эффектов различны:
• со временем при длительной работе качество светоделительной
пластины и светофильтров начинает подвергаться физическому
разрушению, что ведет к расширению спектральной полосы све-
топропускания;
• источник света должен обеспечивать высокую энергию возбуж-
дения в узких спектральных диапазонах, то есть обладать линей-
чатым спектром излучения в большом спектральном диапазоне
252
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Рис. 16.3. Графики светопропускания комплекта
объективов для прямых и инвертированных микро-
скопов проходящего света:
а - планахромат A-Plan 5х/0,12; 6-планахромат
Achroplan 10х/0,25; в - планахромат с большим рабочим
расстоянием и корректировкой на толщину покровного
стекла 0-2 мм LD Achroplan 20х/0,40 Когг; г - планахро-
мат с большим рабочим расстоянием и корректировкой
на толщину покровного стекла 0,3-1,6 мм LD Achroplan
40х/0,60 Когг; д - пла н полуапохромат Plan-Neofluar
100х/1,30 ОН (данные 2004 г.)
(от ультрафиолета до инфракрасного излучения) с шириной по-
лосы в определенных длинах волн от 10 до 50 нм (как, например,
в ртутной лампе, что отличает ее от других типов ламп, имеющих
непрерывный спектр излучения);
♦ срок службы ртутной лампы незначителен, по мере его истече-
ния яркость лампы и само тело накала уменьшается;
♦ применение в качестве иммерсии обычного масла в силу отсутс-
твия специального нелюминесцирующего масла, ведет к появле-
нию засветки и снижению контраста.
♦ применение объективов, которые обладают вредной засветкой
или в составе своих стекол имеют такие, которые не пропускают
свет в диапазоне 300-2000 нм, т.е. в диапазоне возбуждения и
эмиссии.
253
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
В связи с последним замечанием на рис. 16.3., как пример, приведе-
ны графики светопропускания различных объективов фирмы Carl Zeiss,
применяемых в комплектах прямых и инвертированных микроскопов
проходящего света всех классов сложности. Так как эти микроскопы как
опцию имеют люминесцентный модуль, то объективы одинаково хорошо
работают как в проходящем свете, так и в свете люминесценции с различ-
ными люминесцентными блоками. Как видно из графиков, все объективы
(разной оптической коррекции и параметров) обладают высоким свето-
пропусканием в УФ-области спектра, видимой и ближней ИК-области.
Несколько полезных советов
• Нелюминесцирующее масло обладает минимумом собственной лю-
минесценции и высоким коэффициентом светопропускания в широ-
ком спектральном диапазоне, в том числе и в УФ области спектра.
• Водная иммерсия является нелюминесцирующей.
• При исследовании слабосветящихся объектов помещение долж-
но быть затемнено. В процессе работы желательно беречь глаза от
яркого света — не следует смотреть на зажженные лампы, выхо-
дить в светлую комнату.
• Не забывайте перекрывать свет от ртутной лампы, если вы не ра-
ботаете со светящимся объектом, чтобы предотвратить выцвета-
ние объекта.
♦ Помните, что в осветительной ветви люминесцентного микроско-
па обязательно должны находиться либо кювета с дистиллирован-
ной водой (ЛЮМАМ Р8), либо теплозащитный светофильтр (сов-
ременные микроскопы). В отечественном микроскопе теплофильтр
является съемным, в зарубежных микроскопах он встроен в осве-
тительную систему. Теплофильтр предотвращает выход из строя
интерференционных светофильтров.
• Не забывайте периодически контролировать настройку люминес-
центного осветителя. От этого зависит интенсивность свечения и
равномерность освещения препарата в пределах всего поля зрения.
• При приготовлении препарата не связанные флуорохромы долж-
ны тщательно удаляться из препарата путем вымывания. Наличие
излишних флуорохромов снижает контраст, осветляя фон.
Я Почему трудно видеть стереоэффект в стереоскопических
микроскопах?
Наблюдение стереоэффекта требует определенной тренировки. На-
пример, предмет имеет вид горного хребта, проходящего как раз по се-
254
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
редине поля зрения снизу вверх. Микроскоп настроен: сфокусирован на
определенный участок предмета, и бинокулярная насадка установлена
по глазам. Если закрыть левый глаз, то правый глаз четко видит правый
склон хребта от внешнего края поля зрения к внутреннему, а также часть
левого склона. Если закрыть правый, то левый глаз четко увидит левый
склон также от внешнего края поля к внутреннему и часть правого скло-
на. Когда открыты оба глаза и голова зафиксирована в одном положении,
то видна вся картина горного хребта в трехмерном (объемном) виде.
в С чем связаны болезненные ощущения при работе на стерео-
микроскопах?
При длительной работе на стереомикроскопах возникают болезненные
ощущения, как, впрочем, и при работе на бинокулярных микроскопах.
(gj Причинами этого явления может быть ряд нарушений.
1. Не выполнены обязательные условия работы микроскопа, то есть на-
блюдается несовпадение по положению и размеру зрачков микроско-
па и наблюдателя, неравномерное освещение обоих полей зрения на
объекте; неравенство увеличения в обеих ветвях микроскопа.
2. Скрытые дефекты зрения (косоглазие, астигматизм).
3. Неисправен микроскоп:
• разъюстирована бинокулярная насадка (децентрирован при-
зменный блок);
• плохо фиксируется или настроен осветитель (нарушение осве-
щенности, яркости в ветвях);
• нарушено подобие изображения в ветвях (центрировка, де-
фекты в виде расклеек, сколов в оптических элементах отде-
льно взятой ветви).
Полезные советы в отношении стереомикроскопов, равно как и би-
нокулярных микроскопов, могут сводиться к следующему:
• необходимо обязательно научиться настраивать бинокулярную
насадку по своим глазам;
• серьезно относиться к освещению объекта;
♦ ни при каких условиях не работать на испорченном микроскопе
или бинокулярной насадке.
Я Что нужно делать, если вращающийся предметный столик для
поляризационных исследований не отцентрирован?
При сильно расцентрированном столике механическая ось мо-
жет находиться на большом расстоянии от оптической оси, поэтому
255
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
при вращении изображение объекта может выходить из поля зрения
окуляра.
В процессе настройки необходимо воспользоваться центрировоч-
ными винтами и запастись терпением.
Для простоты описания будем называть изображение центрировоч-
ной пластины «объектом».
Порядок проведения предварительной центрировки:
1. Повернуть предметный стол на некоторый угол по часовой стрел-
ке и против нее.
2. По форме дуги, которую описывает любая выбранная точка
объекта, находящаяся в поле зрения, определить, в каком на-
правлении от центра расположена механическая ось вращения
стола.
3. Смещать в противоположном направлении с помощью центри-
ровочных винтов выбранную точку объекта до появления ее в
поле зрения окуляра, постоянно вращая при этом предметный
стол.
Далее порядок настройки аналогичен порядку проведения точной
центрировки, описанной ниже.
Порядок проведения точной центрировки:
1. Совместить перекрестия центрировочной пластины (объекта) и
окуляра.
2. Повернуть предметный столик на 180°:
• если объект останется на месте, то можно считать, что меха-
ническая и оптическая оси микроскопа совмещены;
♦ если изображение объекта опишет полукруг, то механичес-
кая ось вращения столика находится на % расстояния между
новым положением объекта и перекрестием окуляра, в этом
случае продолжаем юстировку.
3. С помощью центрировочных винтов передвинуть объект к цент-
ру перекрестия в окуляре на Vi радиуса, полученного при враще-
нии полукруга.
4. Совместить центр изображения объекта и перекрестия в окуляре
с помощью координатного препаратоводителя.
5. Проверить центрировку, повернув предметный столик на 180°.
Следует отметить, что центрировка может осуществляться и с по-
мощью объектива при наличии в микроскопе специального револьвер-
ного устройства с центрируемыми гнездами под объектив. Центриров-
ка объективов проводится аналогичным способом.
256
Глава 1 б Мастер-класс Страны советов. Диалоги
16.4. ВОПРОС О ВИЗУАЛЬНОЙ НАСАДКЕ
Я Наличие очков у врачей-лаборантов — нормальное явление. Как
избежать этого?
£9 Присмотритесь к врачам-лаборантам и тем, кто работает с микро-
скопами — девяносто процентов из них носят очки. Опрос отечест-
венных пользователей микроскопов показал, что очки появляются, как
минимум, на второй год интенсивной работы. В результате опроса вра-
чей-лаборантов КДЛ установлено, что 62 % пользователей работают за
микроскопом от 4 до 6 часов; 40 % отмечали болевые ощущения при ра-
боте на микроскопах со встроенным освещением, а 35 % — при работе с
бинокулярными микроскопами; у 40 % — болевые ощущения связаны с
глазами и головой, 36 % — с глазами.
Ясно, что влияние настройки освещения и бинокулярной насадки —
это основные причины плохого настроения и самочувствия, а также
резкого падения зрения.
б! С удобством работы на микроскопе, имеющим бинокулярную насад-
** ку или... экран монитора связаны следующие факторы:
• осанка человека, сидящего за микроскопом (изгиб спины, поло-
жение головы, глаз и рук на столе при работе);
• угол взора, являющийся продолжением естественного взгляда;
♦ совмещение выходного зрачка микроскопа с входным зрачком
глаза наблюдателя;
• физиология и состояние зрения наблюдателя.
Большое значение имеет высота прибора и наклон окулярных тру-
бок бинокулярной насадки. Обычным явлением в отечественных ла-
бораториях являлось наличие толстых книг или на стульях пользова-
телей, или под микроскопами, как правило, моделей Биолам Р, С, Д.
Появились новые модели микроскопов с оптикой, рассчитанной на
«бесконечность», но опять — и книги, и не совсем довольные мнения:
слишком высоко. Даже наш первый из нового поколения микроскоп
Микмед 2 вызывал подобные нарекания.
Возможно, мы были не готовы к новому поколению микроскопов не
только по качеству изображения, но и по дизайну. Не задумывались о
том, что микроскоп не только подключается к электрической сети че-
рез евро розетки с заземлением, но и мебель для него должна быть на
соответствующем уровне.
Как часто можно слышать, что в новые микроскопы тяжело смот-
реть, видно то полполя, то ресницы. При этом устают плечи и голова,
257
Глава 1 б Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Рис. 16.4. Рабочая поза
наблюдателя (а) и мо-
дель с рекомендуемыми
угловыми положениями
тела в соответствии со
стандартом DIN 33408 (б)
изображение «течет», а угол наклона окулярных трубок бинокулярной
насадки то слишком крут (45°), то слишком мал (15°). В то же время по
мнению менеджеров по продажам микроскопов угол наклона в 30° яв-
ляется базовым... Стоп.
Ведущие фирмы-производители всегда думают о пользователе. На-
пример, насадки могут иметь разные углы наклона, что связано с ли-
нейным полем окуляра, габаритами насадки и с ценой. Высота и взора,
и микроскопа изменяются за счет разных постоянных и переменных
углов наклона окулярных насадок или высоты самой насадки. Кроме
этого, есть специальные эргономичные подставки, изменяющие угол
наклона и высоту прибора. Например, микроскоп Axiostar plus имеет
такую подставку, которая позволяет получать 6 положений (рис. 16.5).
Однако редко кто пользуется этими возможностями в рамках государс-
твенного финансирования, что, естественно, связано с повышением
цены (лучше книгу подложить или производителя поругать), да и места
на столе не так уж много...
И все же основным является не это.
Правильная настройка визуальной насад-
ки сводится к соблюдению двух правил:
1. совпадению выходного зрачка мик-
роскопа с входным зрачком гла-
за, что обеспечивается правильной
установкой окулярных трубок по
глазной базе наблюдателя и распо-
ложением глаза на расстоянии выне-
сенного зрачка окуляра;
2. резкому видению изображения объ-
екта обоими глазами, независимо от
их амитропии
Рис. 16.5. Эргономичная подставка для
рабочего микроскопа Axiostar plus
258
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
На рис. 16.6 представлена схема совре-
менных окулярных трубок изменяющих
высоту прибора за счет разворота. Вос-
пользуемся этим рисунком для иллюстра-
ции настройки бинокулярной насадки.
Для установки бинокулярной насадки
по глазной базе необходимо придерживать-
ся приведенного ниже порядка.
1. Вставить окуляры и выставить оку-
лярные трубки горизонтально (рис. 16.7).
2. Правым глазом рассмотреть резкое
изображение объекта в правом окуляре, за-
тем — левым глазом в левом окуляре.
3. Взять лист бумаги и приблизить его
к окуляру. На бумаге будет виден четко
очерченный светящийся круг. Медленно
отвести лист от окуляра вверх, при этом
будет наблюдаться постепенное уменьше-
ние диаметра светящегося круга до тех пор,
пока он не превратиться в яркую точку. С
движением бумажного листа дальше от
окуляра диаметр светящегося круга начнет
увеличиваться до определенного размера,
затем его кромка станет нечеткой и круг
размоется1.
Выходной зрачок микроскопа — это све-
тящаяся яркая точка, именно здесь должен
быть расположен зрачок глаза наблюдате-
ля. Если наблюдать сбоку за тем, кто сидит
за микроскопом, то очень хорошо видно,
какой именно свет попадает в глаз. Пусть
кто-нибудь проконтролирует правильность
попадания света в ваши глаза!
4. Медленно свести окулярные трубки к
Рис. 16.6. Схема, демонстрирующая воз-
можность изменения высоты микроско-
па за счет разворота окулярных трубок
Рис. 16.7. Настройка бинокулярной
насадки:
а - по глазной базе; б - с совме-
щением зрачка глаза со зрачком
микроскопа
носу. Сначала наблюдаются два изображения, которые постепенно сли-
ваются. Когда будет видно одно изображение, движение целесообразно
продолжить до повторного получения двух изображений. Затем обрат-
1 Если в зрачок глаза попадет светящийся круг до яркой точки или после нее, а не сама
яркая точка, то наблюдатель будет видеть полполя, свои ресницы, «проплывающее» изобра-
жение, лампу на потолке и т. д.
259
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
ным движением вернуться к положению одного изображения. Заметить,
где расположена неподвижная риска относительно шкалы механизма
раздвижки глазной базы.
5. Поочередно посмотреть правым глазом в правый окуляр, ле-
вым — в левый. Если окулярные трубки разведены точно по глазной
базе, а зрачки расположены на соответствующем расстоянии, то вы уже
никогда не сможете неправильно настроить насадку — обоим глазам
будет комфортно.
Для того чтобы не болели глаза, необходимо выровнять условия на-
** блюдения одного глаза относительно другого. Для этого существу-
ет диоптрийная настройка или на окулярной трубке, или в окуляре.
Плоскость изображения в микроскопе находится на вполне опре-
деленном расстоянии1 — 13-10 мм ниже кромки окулярных трубок
(опорной плоскости окуляра). При изготовлении это положение
контролируется, поэтому подвижные элементы одного из каналов
уравновешивают разность в глазах наблюдателя.
Для выравнивания условий наблюдения необходимо выполнить сле-
дующие действия:
1. Выставить на окуляре или окулярной трубке неподвижную риску
напротив маркировки «0».
2. Ввести в ход лучей объектив 20х-40х.
3. Закрыть тот глаз, который расположен со стороны диоптрийной
наводки, и с помощью механизма точной фокусировки получить
резкое изображение объекта для другого глаза.
4. Теперь закрыть второй глаз и открыть первый. Несмотря на то, что
изображение может остаться резким, целесообразно, взявшись за
окуляр или окулярную трубку, с помощью подвижной части (вра-
щая ее вправо и влево относительно «0») получить резкое изобра-
жение для второго глаза2.
16.5. ВОПРОС ОБ ИМЕРЕНИИ И СЧЕТЕ
Я Несмотря на то, что все больше в жизнь входят системы ана-
лиза изображения, производящие измерения с помощью компью-
терных программ, экономические возможности не позволяют по-
1 У разных фирм по-разному, несмотря на то, что это величина стандартизована и назы-
вается «высота окуляра».
2 Нельзя для второго глаза получить резкое изображение с помощью повторного обра-
щения к фокусировочному механизму. В противном случае настройка собьется.
260
Глава 1 б Мастер-класс Страны советов. Диалоги
рой произвести закупку подобной аппаратуры. Как произвести
измерения и счет с помощью окулярной сети или окулярного мик-
рометра?
В практической работе приходится (а иногда и требуется) проводить
гисто — стереометрические исследования1 с определением линейных и
объемных размеров микроскопических объектов, например, толщину
злокачественной меланомы кожи (по Бреслау) или площадь просвета
сосуда, частично закрытого атеросклеротической бляшкой и т. д.
Измерения и счет в микроскопе достаточно частое явление. Изме-
ряют линейные размеры, площадь, ведут подсчет элементов в объекте
или на определенной площади. Окулярные микрометры используются
для измерения микроскопических объектов, а также для определения
увеличения объективов.
Для микроскопических измерений и счета требуются объект-мик-
рометр и окулярные штриховые сетки, некоторые из которых пред-
ставлены в табл. 16.2.
Таблица 16.2
Примеры объект-микрометров, применяемых для микроскопических измерений
Изображение Наименование Технические характеристики
Объект — микро- метр для проходя- щего света 5+ 100/100 у D = 0,17 мм. Деление на +У-оси — 5 мм 5 ин- тервалов; Деление на -Y-оси — 1 мм 100 интервалов с двумя встречны- ми шкалами = 10 мкм, точность ±1 мкм.
/ | ПП!1 И01 6 Si / Микрометр с пере- крестием 14:140 / d = 26 мм Длина деления = 14 мм Цена деления = 0,1мм Погрешность деления < 0,001 мм
1 Эта глава написана совместно со знаменитым патологоанатомом докт. мед. наук Беля-
ниным В. Л. по его просьбе (незадолго до его смерти).
261
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Таблица 16.2 (окончание)
Изображение Наименование Технические характеристики
J Окулярная пласти- на с перекрестием / d = 26 мм
Микрометр с пере- крестием 10:100/d = 26 mm Длина деления = 10 мм Цена деления = 0,1 мм Погрешность деления < 0,001 мм
Микрометр — сетка 1235х12,5/5;10 / d = 26 мм Площадь 12,5 х 12,5 мм, поделен- ная на 5 х 5 или 10 х 10 полей
т
-Г-
/ С 1 \ Форматная штри- ховая пластина МС 2,5х / d = 26 мм Для малоформатной фото- съемки с дополнительным увеличением 2,5х или круп- ноформатной фотосъемки с дополнительным увеличени- ем 10х
При использовании окулярной пластины бинокулярная насадка или
бинокулярная насадка с фотовыходом должны быть оснащены двумя
окулярами «foe» с регулируемой глазной линзой. При этом в один из
них устанавливается окулярная пластина.
262
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Для определения линейных разме-
ров необходимо пользоваться изме-
рительными приборами. Это либо из- 'л. - • ’ -
мерительный окулярный микрометр Bit
(цифровой микрометр с неподвижной
шкалой (рис. 16.8) и подвижным пере- С_ —
крестием или электронный цифровой
микрометр), либо стеклянная пластин- Рис 16.8. Цифровой микрометр
ка с нанесенной на нее шкалой (10 мм
с ценой деления 0,01 мм), которая устанавливается в окуляр. Плас-
тинка располагается в плоскости полевой диафрагмы с помощью
зажимного кольца. Плоскость изображения, ограниченная полевой
диафрагмой, может располагаться как внутри оптической системы
окуляра — между глазной и задней линзами, так и вне оптической
системы окуляра — непосредственно за задней линзой. Необходимо
помнить, что для установки шкалы (сетки) используется окуляр, кото-
рый имеет подвижный компонент (обычно заднюю линзу) для диопт-
рийной наводки на плоскость полевой диафрагмы.
йЁЗ ^ри Установке шкалы требуется выполнить следующие дейс-
’•®г® твия (рис. 16.9):
• окуляр на стол ставится глазной лин-
зой вниз;
♦ отвинчивается задняя линза окуляра
в оправе или механическая часть оку-
ляра;
• на диафрагму, ограничивающую поле
зрения, шкалой вниз кладется плас-
тина;
♦ пластина закрепляется вывинченными
ранее частями окуляра.
Рис. 16.9. Установка пластины
со шкалой в окуляр:
1 - окулярная штриховая сетка;
2-узел диафрагмы;
/? - часть окуляра с глазной линзой
При этом плоскость, на которую нане-
сены деления, должна всегда находиться
снизу. Именно в этом месте формируется
изображение препарата, которое создается
объективом, поэтому одновременно видно и шкалу, и изображение
объекта.
Окулярную сетку необходимо брать за кромку. Сетка (шкала) нано-
сится фотолитографическим способом, потому она нестойкая к чистя-
щим средствам (стирается).
263
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Резкое изображение шкалы получается при движении подвижного
компонента окуляра1. Затем с помощью фокусировочного механизма
микроскопа добиваемся резкого изображения препарата на шкале1 2.
Перед проведением измерений с помощью окулярного микрометра
необходимо определить цену деления шкалы для конкретного объекти-
ва. Величина этих делений меняется в зависимости от увеличения взя-
того объектива. Для этого используют объект-микрометр проходящего
света (ОМП), представляющий собой предметное стекло с нанесенной
на него шкалой, каждое деление которой равно 0,01 мм (либо 0,005 мм)
и покровным стеклом 0,17 мм.
Подготовка и настройка
«•—о перед измерением длины следует определить цену деления мик-
рометра или шкалы в соответствии с используемой комбинацией
объектива и окулярной сетки. Цена деления шкалы — это отрезок
препарата, который соответствует расстоянию между делениями ис-
пользуемого окулярного микрометра с перекрестием.
Для калибровки необходимо, вращая окуляр, расположить шкалы объ-
ект-микрометра и микрометра с перекрестием параллельно друг дру-
гу, а нулевые штрихи обеих шкал точно совместить друг с другом.
Если при этом произойдет совпадение двух штрихов шкал таким об-
разом, что 99 расстояний между делениями (по 10 мкм каждое) объ-
ект-микрометра точно соответствуют 100 расстояниям между деле-
ниями микрометра, то для используемой комбинации объектива и
окулярной пластины (10х/0,25 и микрометр с перекрестием 10:100)
цена деления к’ составит:
99
к’ = х 10 мкм = 9,9 мкм. ---
100
После замены объект-микрометра на измеряемый препарат получа-
ют нужный измеряемый отрезок L как число расстояний между де-
лениями окулярного микрометра с перекрестием (примерно десятые
доли), помноженное на цену деления шкалы к.
Например:
L = 35,5 • 9,9 мкм = 351,5 мкм.
1 Вынуть окуляр со шкалой из окулярной трубки насадки, наблюдая через него окно
или стену, с помощью диоптрийной наводки получить резкое изображение сетки. Вставить
окуляр в ту окулярную трубку, по глазу которой производилась настройка. Диоптрийную
наводку данного окуляра больше не трогать!
2 Установить, если она есть, диоптрийную наводку второго окуляра на «0». Наблюдая
в оба окуляра, с помощью фокусировочного механизма получить резкое изображение пре-
парата.
264
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Особенно крупные структуры препаратов могут измеряться и путем
использования нониусных делений (0,1 мм) на координатном пред-
метном столе. При этом может возникнуть необходимость определе-
ния отрезка путем математического расчета по результатам комби-
нированного измерения по осям X и Y.
Измеряемый отрезок на промежуточном изображении в окуляре
должен быть > 5 мм, чтобы влияние случайных погрешностей было
как можно меньше.
Ошибки могут возникать также в том случае, если окуляр вставлен в
тубус бинокулярной насадки не до упора.
Для грубой морфометрической оценки можно измерить микроскопи-
ческие объекты величиной диаметра данного поля зрения, предвари-
тельно отметив, сколько делений объект-микрометра помещается в
поле зрения окуляра при том или ином объективе, Например, в мик-
роскопе МБИ-3 для объектива 40х, окуляра 7х (линейное поле окуляра
18 мм) и бинокулярной насадки 1,5х диаметр поля зрения составит:
18:40:1,5 = 0,3 мм.
Следовательно, любой микроскопический объект, закрывающий все
поле зрения при данной комбинации оптических систем, будет иметь
длину (или ширину) около 0,3 мм, а по формуле п.К2 (где тт = 3,14, а
R составляет величину, равную половине диаметра, то есть 0,15 мм)
можно вычислить площадь объекта. В данном случае она составит:
3,14-0,152 = 0,07 мм2.
При отсутствии объект-микрометра в самом крайнем случае в качес-
тве измерительной линейки можно воспользоваться имеющейся в
любой клинической лаборатории для подсчета ферментных элемен-
тов крови счетной камерой Бюркера с сеткой Горяева, принимая во
внимание, что сторона каждого большого пустого квадрата сетки со-
ставляет 0,2 мм.
Для стерео морфометрических
и планиметрических исследований
следует использовать разнообразные
окулярные вставки, например, квад-
ратно-сетчатую вставку с 289 точка-
ми, окулярную вставку Яблучанско-
го, Невзорова и другие. Простой в
использовании является окулярная
измерительная сетка Г. Г. Автандило-
ва для цитогистостереометрических
исследований со 100 и 25 точками. Рис 16.10. Измерения с помощью микрометра.
265
Глава 16 Мастер-класс Страны советов. Диалоги
Принцип использования разных окулярных вставок примерно оди-
наков. По соотношению количества точек (или линий), накладываю-
щихся и не накладывающихся на исследуемое изображение, определя-
ют площадь (и объем) интересующих структур. Например, используя
сетку Г. Г. Автандилова, по количеству точек, попавших на изображение
атеросклеротической бляшки в артерии сердца, в сравнении с количес-
твом точек, не попавших на изображение бляшки и пришедшихся на
изображение просвета артерии, можно судить о площади поражения
атеросклерозом коронарной артерии и степени стеноза. Подробные
сведения о морфометрии микроскопических объектов содержатся в
соответствующих руководствах.
л-гд] При определении размера сфотографированного объекта, необходи-
мо предварительно сфотографировать объект-микрометр.
При этом:
• шкала микрометра фотографируется при тех же условиях, что и
препарат;
• фотографическая печать с полученных негативов производят при
одном и том же увеличении.
К снимку ОМП прикладывается миллиметровая шкала так, чтобы
деление линейки совпало с одним из штрихов на снимке. Затем опре-
деляется другое деление линейки, которое точно совпадает со штри-
хом на снимке.
лйдЯ Не забывайте о толщине штрихов! За базу (отсчет) необходимо при-
’о‘-го' нять край линии.
Для повышения точности берите как можно большее число делений.
Если между этими делениями линейки М интервалов, а между штри-
хами снимка N интервалов шкалы, то масштаб изображения равен
100 M/N.
Например. 30 делений миллиметровой линейки соответствуют 10 де-
лениям изображения ОМП; следовательно, масштаб изображения на
этой фотографии равен 100 30/10 = 300.
При определении масштаба изображения на экране монитора (теле-
визора или компьютера) прием может быть аналогичным, что и при фо-
тографировании, однако не следует забывать, что увеличение при этом
будет «электронным». Истинный размер объекта зависит от калибровки
электронной системы (соответствия между линейным размером в мкм и
размером между элементами воспринимающей камеры в пикселях).
266
ГЛАВА 1 7
ВАРЬ-СПРАВОЧНИК МИКРОСКОПИСТА
Это не совсем обычная глава. Здесь представлены не только определения, объяснения,
но и справочные данные по тем или иным явлениям, свойствам, конструкциям. Принцип
построения, взятый за основу словаря-справочника, это опорное (ключевое) слово, вокруг
которого происходит объяснение термина.
17.1. ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В начале целесообразно привести формулировки некоторых основ-
ных понятий геометрической оптики в соответствии с ГОСТ 7427-76,
которые могут встречаться в специальной литературе.
Пространство предметов — совокупность точек пространства.
Иными словами — это пространство, в котором находятся предметы,
то есть излучающие свет точки, линии и поверхности, как самосветя-
щиеся, так и освещаемые каким-либо источником света.
Обозначение: нем. Objektraum; англ. Object space.
Пространство изображений — совокупность изображений точек
пространства предметов, определенных по законам параксиальной оп-
тики. Иными словами, это пространство, в котором возникают опти-
ческие изображения предметов из пространства предметов.
Обозначение: нем. Bildraum; англ. Image space.
Сопряженные плоскости (точки, лучи) — соответствие пространс-
тва изображения пространству предметов, иными словами, любому
лучу (точке, плоскости) в плоскости предметов после прохождения че-
рез оптическую систему соответствует только один луч (точка, плос-
кость) в пространстве изображения.
Фокус focus — очаг] — точка, в которой собирается прошедший че-
рез оптическую систему параллельный пучок световых лучей.
Передний фокус — точка на оптической оси в пространстве пред-
метов, сопряженная с бесконечно удаленной точкой, расположенной на
оптической оси в пространстве изображений.
Обозначение: F; нем. Objektbrennpunkt; англ. Front focus.
267
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Задний фокус — точка на оптической оси в пространстве изобра-
жений, сопряженная с бесконечно удаленной точкой, расположенной
на оптической оси в пространстве предметов.
Обозначение: Fy; нем. Bildbrennpunkt; англ. Back focus.
Переднее фокусное расстояние — расстояние от передней главной
точки до переднего фокуса.
Обозначение: f; нем. Objektbrennweite; англ. Front focal length.
Заднее фокусное расстояние — расстояние от задней главной точ-
ки до заднего фокуса.
Обозначение: fy; нем. Bildbrennweite; англ. Back focal length.
Осевая точка предмета (изображения) — точка пересечения плос-
кости предмета (изображения) с оптической осью.
Обозначение: А (Ау); нем. Objektpunkt (Bildpunkt); англ. Object (im-
age) point.
Центрированная оптическая система, состоящая из сферических
преломляющих (и отражающих) поверхностей — система, в которой
все центры ее поверхностей располагаются на одной прямой, называе-
мой оптической осью системы.
Параксиальный луч — луч, идущий бесконечно близко к оптичес-
кой оси.
Нулевой луч — условный луч, используемый при расчете оптических
систем.
17.2. ГЕОМЕТРИЯ ПОСТРОЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ
ЛИНЗОВЫМИ СИСТЕМАМИ
С помощью обычного микроскопа мы видим изображение объекта
перевернутым. В принципе, это обстоятельство не мешает, потому что
рассматриваемые структуры хаотичны, да и работать непосредствен-
но с обычным микроскопом не приходится. При большом увеличении
микроскоп имеет малое видимое поле и рабочее расстояние. Другое
дело — лупа и стереоскопические микроскопы. Лупа имеет небольшое
увеличение, большое видимое поле и рабочее расстояние, это же отно-
сится и к стереомикроскопам. В этих приборах необходимо иметь пря-
мое изображение: в первом случае — мы читаем, ремонтируем часы,
препарируем, во втором случае — оперируем, рассматриваем колонии
в чашках Петри и при этом в поле зрения видим свои руки, инструмент
и стол с объектом одновременно.
Действительное изображение объекта формируется оптической
системой в определенной плоскости (плоскости изображения). Это
268
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
а собирающая л»нза Если расстояние до предмета больше фокусного
Рис. 17.1.
Схемы получения изоб-
ражения:
а) собирающая линза;
б) рассеивающая линза
расстояния линзы, то изображение действи-
тельное перевернутое.
Изображение расположено по другую сторону
линзы.
Изображение уменьшенное, если расстояние
до предмета (а) и фо^сное расстояние линзы (f)
находятся в соотношении а > 2f.
Изображение увеличенное, если расстояние
до предмета находится в диапазоне 2f> a>f.
изображение существует помимо нас. Оно может быть и в воздухе, и
мы в этом убедимся, когда будем настраивать микроскоп. Для примера
можно рассмотреть вариант построения изображения в микроскопе в
соответствии с законами геометрической оптики. Объектив микроско-
па строит действительное перевернутое и увеличенное изображение в
плоскости полевой диафрагмы окуляра. В свою очередь, выходящий из
окуляра пучок лучей, попадая в глаз, собирается на его сетчатке, где об-
разуется окончательное изображение предмета.
Классическим примером мнимого изображения является ваше
собственное отражение в зеркале.
Получение того или иного изображения зависит от геометрического
построения изображения (геометрическая оптика), то есть от положе-
ния объекта относительно фокуса оптической системы, которая стро-
ит изображение. При этом важно: какова сама система — собирающая
или рассеивающая. Рассмотрим, как влияет положение предмета отно-
сительно линзы на тип изображения.
Если расстояние до предмета меньше фокусного расстояния, то
изображение мнимое, прямое, увеличенное.
Изображение расположено с той же стороны, что и объект.
Изображение, образуемое рассеивающей линзой, при любом поло-
жении объекта — мнимое, прямое, уменьшенное.
Изображение расположено с той же стороны, что и объект.
173. ЗЕРКАЛА И ЗЕРКАЛЬНЫЕ ПОВЕРХНОСТИ
В микроскопе кроме линзовых систем применяются зеркальные по-
верхности и зеркала.
При отражении в плоском зеркале лучи только изменяют направле-
ние. Об увеличении речи нет. Работа плоских зеркал сводится к откло-
269
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
нению пучков лучей, их поступательному смещению и к оборачиванию
изображения.
Плоские зеркала в микроскопах применяются:
♦ в качестве собственно осветительных зеркал;
• в осветительных системах при изломе оптической оси освети-
теля;
• в общей системе микроскопа для излома оптической оси системы
с целью уменьшения габарита микроскопа (сферические зеркала
применяются для увеличения или уменьшения изображения);
• в бинокулярных, рисовальных и фото-насадках.
Рассмотрим влияние положения зеркальных сферических поверх-
ностей по отношению к предмету на получаемое изображение.
1. Расстояние от предмета до вершины сферического зеркала
> радиуса сферы.
2. Изображение — уменьшенное, обратное, действительное, рас-
положено между центром сферы и фокусом.
3. Расстояние от предмета до вершины сферического зерка-
ла =радиус сферы.
4. Изображение равное, обратное, действительное, расположено в
центре сферы.
5. Фокусное расстояние < расстояния от предмета до верши-
ны сферического зеркала < радиусу сферы.
Изображение — увеличенное, обратное, действительное, располо-
жено на расстоянии > радиуса сферы.
В микроскопах зеркальные сферические поверхности, в основном,
применяются:
• в качестве самостоятельных осветительных зеркал,
• в осветителях в виде рефлекторов для удвоения изображения
нити накала (ЛЮМАМ РПО, АКСИОСКОП и др.),
• в эпи-системах объективов отраженного света, работающих по
методу темного поля,
• в зеркальных и зеркально-линзовых объективах.
17.4. ОСНОВНЫЕ ЗАКОНЫ ГЕОМЕТРИЧЕСКОЙ ОПТИКИ
Три основных физических закона построения изображения в опти-
чески прозрачных средах при прохождении через них луча или пучка
лучей света (рис. 17.2).
1. Закон прямолинейного распространения света: в однородной сре-
де световые лучи прямолинейны.
270
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Рис. 17.2.
Схемы прохождения света через
объекты с разными показателя-
ми преломления
2. Закон отражения света: на границе двух сред возникает отражен-
ный луч, лежащий в плоскости, образуемой падающим лучом и норма-
лью к границе (в плоскости падения), причем угол отражения ф1 равен
углу падения ф.
3. Закон преломления света (Закон Снеллиуса) гласит: преломлен-
ный луч лежит в плоскости падения (при падении света на границу
изотропной среды) и образует с нормалью к границе угол фг (угол
преломления). Он определяется соотношением:
при переходе света в оптически более плотную среду («2>«i) луч
приближается к нормали (фг < фт);
при переходе света в оптически менее плотную среду («2 < нт) угол
падения не может превышать предельного значения фпр., так как угол
преломления ф1 не может превышать п/2.
17.5. ТЕОРИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ
Теория образования изображения в микроскопе как сложном оп-
тико-механическом приборе является объяснением механизма, пос-
редством которого формируется изображение в микроскопе. При этом
подразумевается когерентное освещение и двухступенчатый процесс
дифракции.
Двухступенчатый процесс дифракции означает:
первое — объект представляет собой решетку, которая дифрагиру-
ет при взаимодействии со световым потоком. «Первичная дифракци-
онная картина», характеризующая объект, отображается в выходном
зрачке объектива в его задней фокальной плоскости;
271
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
второе — свет от «первичной дифракционной картины» дифраги-
рует дальше, до плоскости изображения. Здесь, в результате интерфе-
ренции всех лучей, присутствующих в выходном зрачке, образуется не-
посредственно изображение. Этим объясняется необходимость того,
чтобы лучи, дифрагированные объектом, собирались объективом в
одной плоскости и могли участвовать в формировании изображения.
Если дифрагированные лучи второй ступени не участвуют в образова-
нии изображения, то мелкие детали изображения не будут различаться
глазом (уровень разрешения будет низкий).
Десять законов из теории образования изображения Аббе
1. Каждый объект вызывает в промежуточной плоскости микро-
скопа характерное изображение источника света. Эта про-
межуточная плоскость, как правило, совпадает с выходным
зрачком объектива микроскопа или с плоскостью, ему сопря-
женной.
2. Существенным действием объекта является его дифракцион-
ное действие.
3. Изображение объекта, даваемое прибором, возникает как ре-
зультат интерференции элементарных волн, выходящих из от-
дельных точек всего дифракционного изображения источника
света.
4. Изображение объекта следует представлять себе как вторичное
интерференционное изображение в отличие от первичного,
соответствующего дифракционному изображению источни-
ка света (или вторичное изображение освещенных объектов
в отличие от первичного изображения источника света и са-
мосветящихся объектов).
5. Вид вторичной дифракционной картины, то есть вид оконча-
тельного изображения, полностью определяется характером
первичного интерференционного изображения.
6. Если первичное интерференционное изображение во всей
своей полноте принимает участие в образовании вторично-
го изображения, то последнее выглядит полностью подобным
объекту.
7. Если при каких-либо условиях выпадает часть первичного
изображения, то вторичное изображение, в зависимости от
соотношения между действующей и выпавшей частями, стано-
вится в большей или меньшей степени не сходным с объектом.
8. Если структурные элементы объектов имеют геометричес-
кие размеры меньшие определенного предела, то выходной
272
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
зрачок объектива значительно ограничивает действующую
часть первичного дифракционного изображения. Возника-
ющее вследствие этого несходство изображения с объектом
может быть столь большим, что изображение не будет воспро-
изводить деталей структуры. Структура объекта уже не раз-
решается.
9. Для разрешающей способности — этой наиболее важной ха-
рактеристики объектива, определяющим фактором является
его апертура.
Ю.Увеличение микроскопа может служить лишь целям создания
условий, при которых глаз в состоянии видеть все детали,
разрешенные объективом. Давать микроскопу увеличение
больше, чем это необходимо для указанной цели, бессмыслен-
но, так как оно не может сделать доступным глазу большее чис-
ло подробностей структуры объекта. Самое большее, что может
вызвать завышение увеличения— это усиление видимости
вторичных максимумов дифракционного изображения, что, в
свою очередь, может вызвать ложное представление о строе-
нии объекта.
17.6. МИКРОСКОП ОТ «А» ДО «Я»
А
Аберрация [aberratio/aberrare — отклоняться] — искажение или
отступление в изображении объекта от идеального. Современные
оптические приборы должны отвечать высоким требованиям в
отношении качества изображения, что выражается в резкости по всему
полю зрения, отсутствием цветных каемок и искажений по форме.
Иными словами, аберрация — это нарушение в идеальности пост-
роения изображения в единой плоскости, расположенной перпендику-
лярно оптической оси (невидимой линии, которая проходит через все
оптические элементы и является осью вращения их образующих повер-
хностей).
Различаются два вида искажений:
• для одной длины волны — монохроматические;
• для трех основных длин волн — хроматические.
Монохроматические аберрации включают в себя: сферическую
аберрацию, кому, астигматизм, кривизну поля, дисторсию.
273
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Рис 17.3. Графики волновой аберрации:
/-30-реконструкция и //-фотографии
дифракционных точек различных типов
аберраций:
а - идеальная дифракционная точка
(график развернутый в двух плоскостях);
б- дифракционная точка в процессе
фокусировки;в - сферическая аберрация;
г - астигматизм; д - кома
Хроматические аберрации включают в себя: хроматизм положения,
хроматизм увеличения.
Аберрация — астигматизм (рис. 17.3 г) характеризуется тем, что
лучи от объекта собираются в двух взаимно перпендикулярных плос-
костях изображения, которые разнесены друг от друга на некоторое
расстояние. Астигматизм — полевая аберрация (обнаруживается по
полю и редко в центре).
Дифракционная картина
Яркое ядро неправильной формы (квадрат, треугольник, мно-
гоугольник, овал), светлое кольцо разорвано в нескольких
местах, при перефокусировке дифракционная картина «пля-
шет» (то увеличивается в размере, то уменьшается). Обычно
количество астигматичных точек увеличивается к краю поля
зрения.
А<?фр«г$ия-дисторсия (рис. 17.4) вызывает искажение изображе-
ния объекта, проявляющееся в нарушении геометрии. Эта аберрация
полевая и является расчетной. Дисторсия возникает из-за несоблюде-
ния условий, связанных с постоянством линейного увеличения, кото-
274
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Рис 17.4. Дисторсия. Виды искажения в изображении:
а - подушкообразное; 6 - бочкообразное; в - ровное,
прямое и ортоскопическое; г - наклонное; д - трапеци-
евидное
рое создает оптическая систе-
ма в плоскости изображения.
Искажения обнаруживаются и
усиливаются от центра к краю.
Дисторсия может быть:
1) подушкообразной (по-
ложительной) с вогнутыми
сторонами квадрата; при этом
линейное увеличение по мере
удаления от оптической оси
возрастает;
2) бочкообразной (отрица-
тельной) с выпуклыми сто-
ронами квадрата; при этом
линейное увеличение уменьша-
ется по мере удаления от оп-
тической оси.
Это аберрация окуляров, которая достаточно трудно исправляет-
ся путем усложнения оптической схемы. Окуляры для биологических
микроскопов обычно имеют дисторсию на краю порядка 3-10%.
Для сравнения — измерительные окуляры, которые применяются в
микроскопах для микроэлектроники или в других измерительных при-
борах, имеют дисторсию в пределах 0,1-0,05%.
Оценка этого искажения обычно производится на сетках или по
системе полос, проходящих по всему полю.
Объективы обычно не имеют дисторсии.
Аберрация — кома (рис. 17.3 д) характеризует нарушение симмет-
рии (децентрировка) в изображении.
Вспомним, что для потока лучей существует так называемое условие
синусов. Суть его в том, что лучи, прошедшие через оптическую систе-
му, пересекаются в одной точке (гомоцентричность), если выполняется
следующее условие:
п • sin<f> / и' • sin ф' = const,
где и, п' — соответственно показатели преломления сред, откуда луч
света пришел, и где он распространяется после преломления; ф, ф' —
соответственно, угол падения и угол отражения.
Дифракционная картина
Яркое ядро, разорванное первое светлое кольцо (первый максимум),
а за ним — система разорванных колец, образующих как бы хвост
275
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
0,05м»,
Рис. 17.5. Тест-сетка для определения в изображе-
нии дисторсии на краю поля и кривизны по полю
кометы. Чем больше расцентриро-
вана система, тем больше количест-
во разорванных колец. Хвост комы
может быть направлен от центра
поля зрения к краю и наоборот.
Аберрация — кривизна изоб-
ражения (поля) характеризуется
тем, что изображение плоского
объекта располагается на неплос-
кой поверхности. Для наблюдения
подобного изображения по полю
требуется постоянная перефоку-
сировка для получения резкого
изображения рассматриваемого
участка на поле.
Кривизна поля чаще всего задается при расчете оптической сис-
темы: чем меньше расчетная кривизна поля, тем сложнее оптическая
схема. Исправленные расчетным путем оптические системы являются
системой плоского поля или планоптикой.
Аберрация сферическая (рис. 17.3 в, 17.6) характеризуется тем, что
лучи света, вышедшие из точки объекта, расположенной на оптической
оси, после преломления (отражения) всеми элементами оптической
системы, не собираются в одну точку. Каждый луч пересекает оптичес-
кую ось в различных ее точках.
Сферическую аберрацию можно наблюдать, если сфокусировать
микроскоп на дифракционный препарат, а затем расфокусировать
изображение, удаляясь от места, где должно находиться четкое изобра-
жение. В этом случае получится равномерно освещенное световое пят-
но, которое по мере приближения к четкому изображению уменьша-
ется. При определенном положении внутри пятна появляется светлый
диск. При дальнейшем приближении светлое пятно вокруг диска все
более и более уменьшается. При этом оно становится светлее и приоб-
ретает особенно яркий край. Однако, ни в каком месте при движении
пятно не стягивается в точку. Наоборот, начиная с определенного поло-
жения, при дальнейшем движении оно снова становится больше. Цен-
тральный светлый диск исчезает, остается лишь светлое пятно с ярким
краем, который тоже постепенно исчезает.
Иными словами, существует не единая плоскость, где формирует-
ся изображение объекта, а создается некая область (объем), где трудно
найти резкое изображение объекта.
276
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Рис. 17.6. Кружки рассеяния (дифракционная точка).
Вблизи изображения и каустика при наличии сфери-
ческой аберрации,
Схема появления сферической аберрации:
/ - дифракционная точка в плоскости фокусировки,
видна яркая точка и светлое кольцо, при этом реальное
изображение объекта исследования четкое, позволяющее
различить близ лежащие светлые и темные элементы;
2 - появление сферической аберрации при выходе из
плоскости фокусировки, при этом происходит перерас-
пределение энергии из ядра в кольцо - кольцо стано-
вится «набухшим»; в реальном изображении появляется
нечеткость контура, снижение контраста и разрешения;
3 и 4 - сферическая аберрация, в реальном изображении -
расфокусировка (нет возможности сфокусироваться); серое
изображение без контрастных элементов
Дифракционная картина
Отличается от идеальной
тем, что происходит пере-
распределение интенсив-
ности света между ядром
и светлым кольцом (пер-
вым максимумом), делая
их практически равными
по яркости. Иными слова-
ми, ядро становится «на-
бухшим» (увеличивается
в размере); темное кольцо
(первый минимум) — бо-
лее тонким (уменьшается
в размере); светлое коль-
цо — более широким (уве-
личивается в размере); по
полю появляется легкая
дымка («облака») в темном
фоне между дифракцион-
ными картинами. Контраст
и разрешение в изображе-
нии — уменьшаются.
Аберрации хроматические —
эти аберрации связаны с тем, что при прохождении пучка лучей через
среду (стекло) происходит разложение света в спектр.
Скорость распространения света различных длин волн различна.
При наличии дефектов в стекле можно наблюдать два типа хромати-
ческих аберраций:
1) хроматическая аберрация положения — пересечение лучей с
различной длиной волны в разных плоскостях вдоль оптической оси
(вблизи плоскости изображения), при этом изображения будут разного
цвета, но одного увеличения;
2) хроматическая разность увеличения — пересечение лучей с раз-
личной длиной волны в плоскости изображения, но с разным увеличе-
нием, при этом изображение объекта имеет вид «слоеного пирога», так
как разноцветные изображения разного увеличения накладываются друг
на друга.
Кроме того, исправление волновых аберраций в одной, двух или
трех длинах волн приводит к такому понятию, как «тип оптической
277
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Рис. 17.7. График волновой
аберрации различных типов
объективов:
коррекции» (ахроматы, апохроматы). Степень
исправления аберрации, или оптическая кор-
рекция, характеризует цветопередачу фона и
изображения объекта соответствующей опти-
ческой системой (рис. 17.7).
Дифракционная картина
Яркое ядро правильной формы, равномерно
освещенное кольцо, цвет которого говорит
о типе оптической коррекции соответствую-
щей оптической системы. Если в оптической
системе присутствует сферическая аберрация,
неизбежно появление вуали фона. Если вуаль
имеет цвет, говорят о присутствии сферохро-
матической аберрации.
Хроматизм увеличения обычно оценивается
по другому тестовому препарату, который но-
сит название тест-платте (рис. 17.8).
Хроматическая разность увеличения в
микроскопе является базовым понятием при
1 - ахроматы; 2 - апохроматы оценке современного поколения микроскопов.
На рис. 17.7 представлена разность в оптичес-
ких схемах и распределения расчетных хроматических аберраций в оп-
тической схеме микроскопа.
Абсорбция [absorptio — поглощение] — поглощение вещества из
раствора твердым телом или жидкостью, поглощение происходит во
всем объеме поглотителя. Абсорбция света — это поглощение света
при прохождении через вещество.
Адаптация [adaptatio<adaptare — приспособлять] — приспособ-
ление строения и функций организма к изменяющимся условиям су-
ществования. Глаза способны продолжать действовать при изменении
интенсивности света в огромных пределах, что связано с адаптацией
зрения к условиям освещения, возможность настраиваться на данный
уровень яркости.
Адсорбция [ad — на, к + sorbere — поглощать, всасывать] — пог-
лощение вещества из раствора поверхностным слоем жидкости или
твердого тела. Широко применяется в технике, в том числе в биологии,
для разделения и очистки вещества.
Аккомодация [accomodatio] — приспособление к чему-либо.
Аккомодация глаза — приспособление глаза к ясному видению
предметов, находящихся на различных расстояниях от него, путем из-
278
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
менения преломляющей силы его оптических
сред за счет сжатия и растяжения мышц вокруг
хрусталика. Если мышца ослабляется, то хрус-
талик растягивается, и его фокусное расстоя-
ние увеличивается. Если мышца сжимается, то
хрусталик ею сдавливается, становится более
выпуклым, и его фокусное расстояние делает-
ся короче. Если мы смотрим вдаль, то мышца
ослабляется и на ретину проектируется резкое
изображение далеких предметов. Если близкий
предмет — мышца сжимается и при умень-
шенном фокусе хрусталика получается резкое
изображение предмета. Благодаря аккомода-
Рис. 17.8. Тест-платте. Неровные
края, а также чередование черных
и светлых полос позволяют про-
контролировать как цветные иска-
жения оптической системы, так и
наличие сферической аберрации
ции здоровый глаз может с полной резкостью
видеть предметы с расстояния в 10-20 см и до бесконечности.
Анизотропия [anisos — неравный + tropos — свойства, вращения] —
неодинаковость физического свойства тела по различным направлени-
ям внутри этого тела.
Апертура [apertus — открытый] — действующее отверстие, опре-
деляемое размерами линз или диафрагмами.
Апертура угловая — максимальный плоский угол, стягиваемый
линзой в центр поля объекта или изображения двумя противополож-
ными крайними лучами, когда объектив работает в нормальном рабо-
чем положении.
Апертура числовая — безразмерная величина, соответствующая
следующему условию:
A = He-sina,
где пе — показатель преломления среды между объективом и объектом
наблюдения; а — % полного угла, попадающего в объектив света.
Обозначение: А — нем. Numerische Apertur; англ. Numerical aperture.
Световой поток проходит через конденсор и выходит из него в виде
двух типов световых пучков:
а) светового конуса, проходящего через объект и участвующего в
построении «геометрического» изображения объекта (рис. 17.10);
б) параллельного пучка, проходящего через объект и участвующего
в создании «фонового» изображения.
Основным является световой конус, апертурный пучок. Световой
апертурный угол — разный в зависимости от того, какая среда (показа-
тель преломления) между объективом и объектом (рис. 17.11).
279
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
окуляр
(ХРУ=О%)
плоскость
изображения
(ХРУ=0%)
тубусная линза
корректор
(ХРУ=-1,2%)
объектив
(ХРУ=+1,2%)
плоскость предмета
окуляр
(ХРУ= 0%)
плоскость скорректированная
изображения по цвету
(ХРУ=О%)
тубусная линза
(ХРУот-1,1%до-1,9%)
система
объектив
(ХРУ от+1,1 % до+1,9%)
Рис. 17.9. Принципиальные оптические схемы микроскопов двух поколений:
а - длина тубуса 160 мм с хроматической разностью увеличения (разработка микроскопов до 70-х годов XX века);
6- длина тубуса «бесконечность» без хроматической разности увеличения (первые разработки 80-е гг. XX в.); в - ICS-оптика
фирмы Carl Zeiss (90-е годы XX века)
Рис. 17.10.
Апертурный пучок сформированный конденсором:
1 - плоскость предмета (препарат); 2 - световой поток, после
источника света и коллектора; 3 - фронтальная (первая) линза
объектива (оптической системы); 4 - фронтальная (первая)
линза конденсора (осветительной оптической системы);
о - 71 светового конуса (апертурный угол).
Разрешающая способность связана с числовой апертурой кон-
денсора и объектива. При равенстве апертур создается условие
гомогенности системы и увеличение силы света
Рис. 17.11.
Изменение размера апертурного пучка в зависимости от
среды между объективом и предметом:
1 - предметное стекло; 2 - покровное стекло; 3 - объект (точка
фокуса конденсора и объектива); 4 - фронтальный компонент
. (первая линза) объектива; 5-воздух (п=1); 6 - иммерсия
(масляная иммерсия п= 1,52); 7 - отраженные от поверхности
покровного стекла пучки света.
0) - апертурный угол сухого объектива; Ог- апертурный угол
иммерсионного объектива. При использовании иммерсии по-
вышается разрешающая способность (о; > щ) и уменьшаются
потери света на отражение
280
Глава '7 Ciicsspb-справсчн.'.г'.^крсс«г,:гг
Существует связь между апертурой
и рабочим расстоянием. Чем больше
числовая апертура объектива, тем
меньше рабочее расстояние.
Апертурный пучок — световой ко-
нус, попавший в объектив после про-
хождения через объект (рис. 17.12).
Апертурный угол в пространстве
предметов — угол между оптической
осью и лучом, выходящим из осевой
точки предмета и идущим на край
апертурной диафрагмы.
Обозначение: Sa; нем. Offnungs-
winkel; англ. Angular aperture.
Апертурный угол в пространстве
изображений — угол между оптичес-
кой осью и лучом, проходящим через
осевую точку изображения и край апертурной диафрагмы.
Обозначение: sa; нем. Bildseitiger Offnungswinkel; англ. Angular
aperture.
Рис. 17.12. Апертурный пучок и рабочее рас-
стояние в зависимости от числовой апертуры
объектива; ограничивается диаметром фрон-
тальной линзы объектива
Б
Блескость — свойство светящейся поверхности, находящейся в по-
ле зрения, нарушать нормальные зрительные функции.
В
Визировать [visieren — целиться] — наводиться на какую-либо
точку.
Видность относительная дневного зрения — относительная вид-
ность или относительная чувствительность глаза — это отношение
мощности света с длиной волны 550 нм к мощности излучения с дли-
ной волны X, которое вызывает такое же зрительное ощущение, что и
излучение с длиной волны 555 нм. Обычно при дневном освещении глаз
человека наиболее чувствителен к свету с длиной волны 555 нм. В сов-
ременной литературе принято название: относительная спектральная
световая эффективность или чувствительность глаза.
Например: для излучения с длиной волны 700 нм относительная
чувствительность глаза почти в 250 раз ниже, чем для света с длиной
281
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
волны 560 нм. Значения относительной видности различны для разных
людей. Однако эти значения не очень сильно отличаются для людей с
нормальным зрением.
Высота объектива — расстояние между передней фокальной плос-
костью объектива и его опорной плоскостью.
Высота окуляра — расстояние между передней фокальной плос-
костью окуляра и опорной плоскостью окуляра.
Передняя фокальная плоскость окуляра и плоскость первичного
изображения объектива совпадают, когда окуляр установлен в окуляр-
ную часть тубуса. Это один из оптических присоединительных разме-
ров, который в настоящее время принимается равным 10 мм. В отечес-
твенной практике эта высота пока остается старой — 13 мм.
Г
Глаз — орган зрения, воспринимающий световые раздражения, это
оптический элемент зрительного восприятия изображения.
Глаз получает зрительное впечатление только от лучей с длинами
волн примерно от 400 нм до 750 нм. Отверстие радужной оболочки
глаза (зрачок) автоматически, в зависимости от яркости света может
сужаться до 2 мм или расширяться до 8 мм. Площадь зрачка глаза, сле-
довательно, изменяется в 16 раз. (См. Адаптация, Блескостъ, Визиро-
вать, Зрения угол, Слепимость).
Глаз переносит расхождение расстояний аккомодации и конверген-
ции в 3 дптр, однако при проектировании стереоскопических и бино-
кулярных приборов рекомендуют удерживать это расхождение в зоне
комфорта +1,0 дптр.
Глаз как оптический прибор имеет свое разрешение, числовую апер-
туру, ощущение цвета и интенсивности света. Предел разрешения
глаза принимают равным е = 1' при наблюдении точечных объектов с
контрастом /<= 1 и освещенностью 50—200 лк. С понижением конт-
раста разрешающая способность уменьшается. Так: при контрасте 0,5
разрешающая способность становится е = 2-3', а в сумерках снижает-
ся до 5'.
Острота зрения составляет 10'. Двоение изображения тонких ли-
ний величиной в 30" уже заметно глазом. Глазом можно заметить также
следующие величины искажений и аберраций, вносимых оптическими
системами в изображение:
• параллакс и астигматизм лучей — от 0,25 до 0,5 дптр.;
• пирамидальность — 0,5 призменных дптр (приблизительно 18');
282
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
♦ хроматизм (контурную и фоновую окраску) изображения — 1-3’;
♦ угол резкого поля видения — 2°;
♦ ширина аккомодации глаза — от 5 до 6 дптр.;
♦ разность наклонов изображения в бинокуляре — более 30';
♦ разность увеличений в обеих трубках бинокуляра — более 5 %.
Глазная база — расстояние между центрами вращения глазных яб-
лок человека.
Колеблется в пределах 48-82 мм. В отечественных бинокулярных
микроскопах берется в расчет диапазон 52-76 мм. В зарубежных мик-
роскопах пределы могут быть иными.
Глубина резкости — расстояние вдоль оптической оси, измеренное
между точками пространства изображений. Глубина резкого изображе-
ния, оцениваемая в плоскости изображения объектива, в квадрат увели-
чения объектива больше глубины объекта, которую можно наблюдать
невооруженным глазом (в плоскости объекта). Каждый объектив имеет
свою глубину резкости. Путем тонких перемещений тубуса микроскопа
вверх или вниз объектив наводят поочередно на плоскости препарата,
расположенные на различной глубине. Таким образом, можно возмес-
тить недостаток коррекции объектива — его кривизну изображения по
полю или небольшую глубину резкости самого объектива из-за, пред-
положим, большой числовой апертуры.
Глубина резкого изображения (глубина резкого видения) — рассто-
яние вдоль оси зрения, на протяжении которого изображение объекта при
сфокусированной системе микроскопа будет выглядеть резко и четко при
соответствующем увеличении и разрешении элементов объекта.
Глубина резкости изображаемого пространства без перефокуси-
ровки микроскопа (полная) определяется как сумма геометрической,
волновой и аккомодационной глубины.
Объем аккомодации для нормального глаза (эмметропа) при рас-
стоянии 250 мм составляет 4 дптр:
Та = 250/Гм2 = 0,004/'2
где/' — фокусное расстояние.
Геометрическая глубина резкого изображения в микроскопе:
Тг = 250ие/АГм,
где е — разрешающая способность глаза.
Дифракционная, или волновая глубина резкости:
ТВ = «Х/2А2,
283
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
где и — показатель преломления среды, X — длина волны, А — число-
вая апертура объектива.
Соответственно,
Т= Та + Tr + Тв = 250/1$ + 250ие / АГМ + иХ/2А2.
д
Диафрагма [diaphragma — перегородка] — устройство, ограничива-
ющее световой поток по диаметру.
Диафрагма апертурная — диафрагма, ограничивающая световой
поток, проходящий через оптическую систему. В материальном смыс-
ле является оправой наименьшей по диаметру линзы или специальной
диафрагмой (иногда регулируемой — ирисовой).
Обозначение: нем. Offnungsblende; англ. Aperture stop.
Диафрагма полевая— диафрагма, расположенная в плоскости
предмета и ограничивающая размер линейного поля оптической сис-
темы в пространстве изображений.
Обозначение: нем. Feldblende; англ. Field stop.
Диафрагма виньетирующая — любая диафрагма, кроме апертур-
ной и полевой, которая ограничивает пучки лучей, выходящих из точек
предмета и лежащих вне оптической оси.
Обозначение: нем. Abschattblende.
Диафрагма ирисовая — регулируемая по диаметру диафрагма, вы-
полненная в виде нескольких лепестков из тонкого металла, черненная
для устранения бликов.
Обычно регулируемая диафрагма устанавливается в оптической
схеме микроскопа в двух местах — в плоскости полевой и апертурной
диафрагм.
Применение ирисовых диафрагм в объективах связано с исполь-
зованием последних при работе по методу темного поля. Ирисовые
диафрагмы объектива позволяют уменьшать их выходную числовую
апертуру и, как правило, расположены в плоскости выходного зрачка
объектива. Это позволяет повысить контраст изображения без учас-
тия конденсора (апертуры осветительного пучка), т. е. убрать ненужную
засветку, которая может возникнуть из-за применения иммерсионной
жидкости.
В поляризационной микроскопии диафрагма позволяет ограничить
участок в зрачке при коноскопическом исследовании образца. В тем-
нопольной микроскопии регулируемая ирисовая диафрагма позволяет
284
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
применить в плоскости апертурной диафрагмы конденсора диафрагми-
рующий диск меньшего диаметра и не очень точного технологического
исполнения (изображение диска должно закрывать выходной зрачок
объектива).
Диафрагмное число — величина, обратная относительному от-
верстию: fy/D.
Обозначение: К; нем. Offnungszahl; англ. F-number.
Диоптрия [dioptes — видящий насквозь] — единица оптической
силы линзы. 1 диоптрия (1 дптр) равна оптической силе линзы с фокус-
ным расстоянием 1 м (1000 мм). Оптическая сила линзы в 1 дптр равна
1/ф', где ф' в метрах.
Диоптрийная наводка на резкость (механизм диоптрийной навод-
ки на резкость) — коррекционная подвижка внутреннего компонента
окуляра или механическая подвижка окулярной трубки визуальной на-
садки вместе с окуляром, связанная с компенсацией недостатков зре-
ния одного из глаз при точной наводке на плоскость, в которой форми-
руется изображение предмета после объектива.
Диоптр [dioptra < dia — сквозь +opsomal —увижу] — устройство в виде
круглой диафрагмы («точка»), которое устанавливается вместо окуляра и
обеспечивает визирование, наблюдение плоскости выходного зрачка объ-
ектива, находящейся в микроскопе со стороны окуляра в бесконечности.
Как и дополнительный микроскоп предназначено для настройки таких
методов исследования как темное поле, фазовый контраст, косое освеще-
ние, дифференциально-интерференционный контраст.
Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК/DIC) —
метод рельефного контрастирования объектов с помощью поляризо-
ванного света и псевдо объемного изображения в пределах глубины
резкости объектива.
Дифракция [diffractus — разломанный] (загибание волн, огибание
волн препятствий) — явление, связанное со свойством отклонения
волн от их прямолинейного распространения, огибание препятствий с
частичным проникновением в область геометрической тени.
Дифракция на проволоке. При внесении в узкий пучок лучей тон-
кой проволоки в изображении щели появится тень — тень и щель не
резкие. В середине тени появляется светлая полоска, окруженная свет-
лыми и темными полосками, которые к краям располагаются теснее
(дифракционные линии). При освещении белым светом — полосы ок-
рашены.
Дифракция на щели. При прохождении света через узкую щель за
нею получаются дифракционные полосы. Кроме того, происходит ин-
285
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
терференция отдельных лучей. В зависимости от наклона лучей к оси
симметрии системы получаются неодинаковые разности хода — чере-
дование светлых и темных полос.
Дифракция на малом отверстии. При прохождении света через
отверстие возникает дифракционная фигура — результат дифракции и
интерференции света. Различные элементарные волны проходят путь
разной длины — существуют различия по фазе. Это выражается в том,
что появляется система светлых и темных колец вокруг светящейся яр-
кой точки (ядра).
Дифракционная картина в микроскопе — результат прохожде-
ния световой волны через объект, который может быть представлен
как система круглых отверстий, которые ограничивают сферическую
волну. Дифракционная фигура представляет собой распределение ос-
вещенности в виде пятна. Это система дифракционных изображений,
каждое из которых представляет собой следующее изображение:
♦ на темном контрастном фоне яркое ядро, в котором сконцентри-
рован максимум энергии,
♦ далее следует темное кольцо (первый минимум энергии) и
♦ одно светлое кольцо (первый максимум после ядра — энергии в
кольце меньше, чем в ядре).
Эта картина характеризует условие образования изображения, а
также искажения в пределах Vt X или 0,25Х (где X — длина волны в нм),
что гарантирует точность воспроизведения объекта.
В отличие от других оптических систем нормальный объектив мик-
роскопа имеет именно такую картину, как описано выше. Остальные
оптические системы имеют дифракционную картину с большим коли-
чеством колец — каждое новое светлое кольцо говорит о том, что вол-
новая аберрация увеличивается на 0,25Х (разрешение и качество систе-
мы в целом начинает падать). Объектив записи и воспроизведения для
видеомагнитофона имеет одно ядро без колец, что говорит о высокой
степени исправления волновых аберраций.
По теории образования изображения, объект представляет собой
решетку, т. е. систему точечных отверстий, дифракцию на которых мы
и воспринимаем как изображение. Для того чтобы оценить качество
изображения, создаваемое оптической системой микроскопа, ее разре-
шение и точность воспроизведения по цвету, геометрическим размерам
и форме, необходимо выделить одно отверстие или систему отверстий
в центре поля и по всему полю зрения.
О качестве изображения оптической системы микроскопа в целом и
объектива в частности судят по изменению в дифракционной картине,
286
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
которую наблюдают с помощью специального препарата — «звездное
небо».
Дисперсия [dispersus — рассеянный, рассыпанный] — зависимость
фазовой скорости распространения волн в среде от их длины.
Длина волны [X] — расстояние между соседними пиками или впади-
нами, или, вообще, между ближайшими точками, колебания в которых
происходят в одинаковой фазе. Длина волны в микроскопии обычно
выражается в нанометрах (нм) или миллиметрах (мм): 1 мм = 1000 нм,
1 нм = 0,001 мм.
3
Зрачок входной — параксиальное изображение апертурной диа-
фрагмы в пространстве предметов или апертурная диафрагма, распо-
ложенная в пространстве предметов.
Обозначение: D нем. Eintrittspupille; англ. Entrance pupil.
Зрачок выходной — параксиальное изображение апертурной диа-
фрагмы в пространстве изображений или апертурная диафрагма, рас-
положенная в пространстве изображений.
Обозначение: D' нем. Austrittspupille; англ Exit pupil.
Зрения угол — угол, под которым глаз видит край объекта. Если
объект находится на границе видимости, то угол, под которым он ви-
ден, равен 1'.
Зрение бинокулярное — наблюдение двумя глазами. Глаз легко
вращается в отверстии черепа (глазнице). Вращение глазного яблока
позволяет, не поворачивая головы, менять направление взгляда в ши-
роких пределах. Каждый глаз воспринимает и передает в мозг свою
независимую картину, которая в сознании точно совмещается. Каж-
дая точка картины от каждого глаза должна попасть на так называе-
мые соответственные, т. е. соединенные с одной и той же точкой мозга,
участки ретины. Таким образом, наблюдается единое, а не раздвоенное
изображение предмета. Оба глаза должны двигаться в строгой коорди-
нации друг с другом.
Зрение стереоскопическое заключается в способности видеть пред-
меты объемными при наблюдении их двумя глазами. Так как каждый
глаз смотрит на один и тот же предмет под несколько отличным углом, то
изображение в одном глазу несколько отличается от изображения в дру-
гом. Психологическое восприятие этого факта вызывает объемное пред-
ставление о предмете. Многочисленные опыты, связанные с испытани-
ем способности стереоскопического восприятия у лиц, обслуживающих
287
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
стереоскопические приборы, показали высокую чувствительность глаз
человека к стереоскопическому эффекту Установлено, что стереоско-
пическая разрешающая способность глаз человека, равная 10" (угловым
секундам), в шесть раз превосходит его обычную разрешающую способ-
ность, предельный угол которой составляет в среднем 60".
И
Изотропия [z'sos — разный, одинаковый, подобный + tropos — свойс-
тво] — одинаковость свойств объектов и по всем направлениям.
Изогиры — черные полосы, соответствующие тем направлениям,
для которых колебания лучей параллельны плоскостям поляризации
поляризаторов.
Изохромы [isos — равный; chroma — цвет] — это полосы различ-
ной интерференционной окраски. Каждой полосе соответствует со-
вокупность направлений, вдоль которых лучи, образовавшиеся за счет
двойного лучепреломления, имеют одинаковую разность хода.
Изображение — воспринимаемый органами зрения объект. При
изучении процесса образования изображения в микроскопе свет рас-
сматривается как волновое движение. Здесь основное значение имеют
явления преломления, дифракции и интерференции. Изображение, ко-
торое получается с помощью любого оптического прибора (в том числе
и глаза), может быть действительным и мнимым, прямым и переверну-
тым.
Изображение объекта. По законам геометрической оптики, изоб-
ражение объекта (предмета для объектива) строится в плоскости изоб-
ражения объектива или в подобных плоскостях, которые называются
сопряженными и формируются другими оптическими системами.
Для окуляра плоскость изображения объектива является плоскос-
тью предмета, т.е. изображение объекта, построенное объективом,
является предметом для окуляра. Далее изображение проектируется
на сетчатку глаза, что для микроскопа и является последним этапом
геометрического построения изображения. Построение осуществляют
так называемые полевые пучки. Они как бы выходят из центра источ-
ника света и, формируясь в плоскости предмета объектива (микроско-
па), охватывают, ощупывают весь объект и «несут» его через весь мик-
роскоп на сетчатку глаза.
Изображение нити лампы. Для оценки правильности участия света
в формировании изображения объекта рассмотрим геометрическое пос-
троение нити лампы (источника света) в ее промежуточных плоскостях.
288
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
В построении изображения участвуют апертурные лучи (пучки).
Промежуточными плоскостями для построения изображения источ-
ника света служат:
♦ плоскость апертурной диафрагмы конденсора и
♦ плоскость выходного зрачка объектива.
Световой конус сформирован конденсором, причем вершина конуса
(острый конец) направлена в плоскость предмета, где расположен объ-
ект. Основанием конуса является плоскость линзы конденсора, огра-
ниченная оправой. Затем этот конус как бы переворачивается, острым
концом оставаясь в плоскости предмета. При этом основанием стано-
вится плоскость первой (фронтальной) линзы, ограниченная ее опра-
вой. Это и есть входной световой конус микроскопа или апертурный
конус объектива (апертура объектива).
В окуляре вы не увидите изображения нити лампы, так как с по-
мощью окуляра мы «рассматриваем» изображение объекта. Увидеть
нить лампы можно, только вынув окуляр и заменив его на дополни-
тельный микроскоп МИР-4, точечную диафрагму {диоптр), или лист
черной бумаги с точкой для наблюдения объекта, который находится
в «бесконечности». В данном случае изображение нити формируется
в «бесконечности», а для нас — на зрачке нашего глаза, а не на сетчат-
ке, поэтому мы его не видим. Желательно, чтобы изображения нити и
объекта на длинном оптическом пути в микроскопе не совпадали друг
с другом.
Иммерсия, иммерсионная жидкость [immersio — погружение] —
любая жидкость, которая находится между объектом и объективом
микроскопа. Показатель преломления иммерсии, которая применяется
в микроскопе, близок к показателю преломления стекла фронтального
компонента объектива.
Основные параметры иммерсионного масла стандартизованы.
Интерференция [inter-между + ferens (ferentis) — несущий, пере-
носящий] — явление, связанное с наложением двух или, в нашем слу-
чае, нескольких световых волн. Наглядно это видно на примере воды.
Вспомните, как волны спешат друг за другом на берег, а затем откаты-
ваются обратно. Вот здесь и происходит их столкновение — они или
становятся больше и выше, или совершенно «затухают» и «гасятся».
Так и со светом — то яркая полоса (всплеск, максимум света), то темная
полоса (гашение, минимум света).
Интерференция белого света. Шкала интерференционных
цветов. При движении призмы Номарского в поляризованном свете
(скрещенные анализатор и поляризатор-николи) в плоскости выходно-
289
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
го зрачка объектива происходит смена цветов локализованной интер-
ференционной картины.
Белый свет — это сумма световых потоков различной длины волны
от 380 до 750 нм. Получающаяся в кристалле (объекте) разность хода
для одних длин волн будет равна четному, для других— нечетному
числу полуволн. Поэтому волны одной длины (один цвет), входящие в
состав белого цвета, при интерференции будут уничтожаться. В резуль-
тате отношение интенсивностей различных цветов будет иным, чем в
белом свете, и объект будет казаться окрашенным.
Каждой разности хода (Д) соответствует некоторая интерференцион-
ная окраска-смесь в различных пропорциях всех цветов, входящих в состав
белого, кроме тех, которые уничтожаются при данной разнице хода. В скре-
щенных николях при Д = 0 объект будет темным. Очень малые разности
хода (Д < 100 нм) для всех лучей составляют небольшую часть длины све-
товой волны, поэтому ни один цвет не будет погашен полностью, все они
будут иметь весьма малую интенсивность, и объект будет казаться серым.
При Д~ 100-150 нм в сером цвете появится слабый синеватый от-
тенок, так как эта разность хода уже приближается к 0,5Х фиолетовых
и синих лучей. При дальнейшем возрастании разности хода 200-250
нм в аналогичных условиях оказываются длины волн зеленых, желтых
и отчасти красных лучей; цвет объекта будет приближаться к белому.
При этом фиолетовые и синие лучи (X = 400-500 нм) находятся в усло-
виях наибольшего усиления, так как для них Д ~ 0,5Х, но это не скажет-
ся на окраске вследствие малой чувствительности глаза.
При Д~300 нм максимально усилены желтые лучи (Х = 600 нм). Ин-
терференционная окраска будет желтой. Д= 530 нм приблизительно
равна (%) X фиолетового цвета; IX зеленого и (%) X красного. Условия
интерференции наиболее благоприятны для фиолетовых лучей, не-
сколько менее — для красных, и неблагоприятны — для зеленых и жел-
тых. Глаз более чувствителен к красным, чем к фиолетовым лучам. Бу-
дет видна красная окраска с фиолетовым оттенком и т. д.
Цвета, при повышении разности хода периодически повторяются.
Шкала разбивается на порядки, граница между которыми проводится
по фиолетовому цвету. В табл. 17.1 представлены цвета, входящие в 1-
ый и 2-ой порядок.
В 1-ом порядке имеются отсутствующие в других порядках серый и
белый цвета; но в нем нет синего и зеленого. Лучи, для которых Д = иХ,
в скрещенных николях уничтожаются, а в параллельных — интерфе-
рируются с усилением. Те же лучи, для которых Д = иХ + 0,5Х, в скре-
щенных николях усиливаются, в параллельных — ослабляются.
290
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Таблица 17.1
Цвета, входящие в 1-ый порядок Цвета, входящие во 2-ой и каждый последующий порядок
Серый Синий
Белый Зеленый
Желтый Желтый
Красный Красный
Фиолетовый Фиолетовый
Для каждой разности хода (Д) цвета интерференции в скрещенных и
параллельных николях являются дополнительными друг к другу до бе-
лого цвета. Последовательность цветов в параллельных николях та же,
что и в скрещенных. Отличия состоят лишь в том, что шкала цветов в
параллельных николях сдвинута на % порядка по сравнению со шкалой
в скрещенных николях.
Фиолетовый цвет появляется в середине 1-го порядка. Серые и бе-
лые окраски заменены желтыми и бурыми. Все порядки, кроме 1-го, со-
стоят из желтого, красного, фиолетового, синего и зеленого цветов.
Чтобы наблюдать цвета интерференции в параллельных николях не-
обходимо:
♦ поставить кристалл на погасание (в скрещенных николях);
♦ повернуть его ровно на 45°;
♦ повернуть один из николей на 90°.
Другой способ: медленно поворачивая столик при параллельных
николях, найти положение кристалла, в котором его интерференцион-
ная окраска кажется наиболее сочной.
Параллельными николями пользуются, когда исследуемое вещест-
во является слабо двулучепреломляющим. В скрещенных николях все
кристаллы кажутся однообразно окрашенными в белые и серые цвета.
В дифференциально-интерференционном контрасте поляризацион-
ный модуль имеет жестко установленные скрещенные николи. ДИК —
призма объектива при перемещении перпендикулярно оптической оси
микроскопа обеспечивает появление различной окраски в изображе-
нии, соответствующей первому или второму порядку.
К
Компенсаторы. Компенсаторы в поляризационном микроскопе
могут выполнять роль, как вспомогательного элемента для проведения
291
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
измерений, так и роль элемента, улучшающего качество изображения и
работу собственно микроскопа. Например, кристаллическая пластин-
ка высших порядков применяется для устранения деполяризующего
действия светоделительной системы насадки. Располагается пластина
между отклоняющей призмой насадки и тубусной линзой.
Обычно компенсаторы изготавливаются из оптически анизотроп-
ных материалов. Они служат для постепенного увеличения или умень-
шения разности хода поляризованных световых волн и имеют извест-
ную разность хода. Таким образом, поляфильтры обнаруживают знак
разности хода в исследуемом объекте, а компенсаторы показывают их
абсолютную величину.
Суть их применения сводится к следующему: если объект, облада-
ющий слабым лучепреломлением, исследуется между скрещенными
поляризующими элементами, то он будет слегка светиться на темном
фоне. Яркость достигает максимума, если ось объекта составляет 45° с
осями поляризатора и анализатора. Теперь введем в ход лучей пластин-
ку компенсатора. При вращении анализатора можно найти такое поло-
жение, при котором объект становится светлее, если его вращать в одну
сторону, и темнее, если его вращать в другую. Это позволяет отличить
истинное двойное лучепреломление от явления рассеяния.
Кварцевый клин и слюдяные пластинки применяются для по-
вышения контраста в проходящем поляризованном свете. В отражен-
ном свете применяется ряд компенсаторов. Наиболее часто встречают-
ся в комплектах поляризационных микроскопов интерференционные
светофильтры и кварцевая компенсационная пластинка. Интерфе-
ренционные светофильтры крепятся, например, в салазках и устанав-
ливаются в промежуточном тубусе, между анализатором и тубусной
линзой. Светофильтры применяются для определения дисперсии вра-
щательных свойств минералов. Кварцевая компенсационная пластинка
1-го порядка крепится в оправе и устанавливается туда же. Пластинка
применяется для качественного определения знака разности фаз.
Для количественных измерений вращательных свойств минералов
по методу Хеллимода (анализ эллиптически отраженных лучей) в отра-
женном свете используется пластинка Накамуры. Она представляет
собой бикварцевую тонкую пластинку, состоящую из двух половинок,
сделанных соответственно из право — и левовращающего кварца, вы-
резанного перпендикулярно к оптической оси.
При наблюдении объектов с рефрактометрической кюветой с
помощью фотоэлектрического окуляра АОМО (ФОМ 2-6, 3) можно
провести:
292
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
♦ определение показателя преломления иммерсионных жидкостей
стандартного иммерсионного набора или определение показате-
ля преломления любой другой жидкости в диапазоне от 1,4 до 1,8
с точностью до 0,001;
♦ определение показателя преломления иммерсионной среды, ок-
ружающей анализируемый объект, при исследовании иммерси-
онных объектов при работе по методам «фокального экраниро-
вания» с последующим определением показателя преломления
объекта.
Конвергенция — сведение зрительных осей глаз при рассматривании
близких предметов за счет поворота глазных яблок навстречу друг другу.
Конденсор [condensare — сгущать] — оптическая система для кон-
центрации светового потока и равномерного освещения объекта.
Конденсор Аббе — неисправленный по качеству изображения кон-
денсор, состоящий из 2-х неахроматизованных линз: одной двояковы-
пуклой, другой — плосковыпуклой, обращенной к объекту наблюдения
(плоская сторона этой линзы направлена вверх). Апертура конденсора:
А = 1,20. Имеет ирисовую диафрагму.
Конденсор апланатический — конденсор, состоящий из трех линз,
расположенных следующим образом: верхняя линза плоско-выпуклая
(плоская сторона направлена к объективу), далее следуют вогнуто-вы-
пуклая и двояковыпуклая линзы. Апертура конденсора: А = 1,40. Имеет
ирисовую диафрагму.
Конденсор ахроматический — конденсор, полностью исправлен-
ный в отношении хроматической и сферической аберрации.
Конденсор ахроматический апланатический — конденсор высо-
кого качества изображения.
Отечественный апланатический конденсор прямого и косого освеще-
ния ОИ-14. Классическая конструкция. Числовая апертура фронтальной
части —-1,4; числовая апертура большого поля — 0,3; пределы перемеще-
ния ирисовой апертурной диафрагмы перпендикулярно оптической оси
микроскопа для получения косого освещения — +10 мм; пределы угла
разворота ирисовой апертурной диафрагмы — от 0 до 150°. Использует-
ся в микроскопах серии БИОЛАМ и МИКМЕД1.
Коноскопия — наблюдение между скрещенными поляризационны-
ми фильтрами в сильно сходящемся пучке поляризованного света.
Коноскопическое наблюдение позволяет:
• определить, является ли объект одно — или двухосным;
• определить знак двойного лучепреломления (т.е. оптический
знак кристалла);
293
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
• определить ориентацию оптических осей объекта и величины
угла между ними;
• диагностировать изучаемые объекты и элементы их структур.
Коноскопическая картина (интерференционная фигура) представ-
ляет собой систему интерференционных полос — изогир и изохром.
Коноскопическое изображение одноосных кристаллов (оптическая ось
параллельна направлению наблюдения) выглядит как темный крест, ок-
руженный концентрической интерференционной бахромой или изох-
ромами. Крест сохраняется при повороте столика.
Коноскопический ход лучей. В плоскости выходного зрачка объектива
(в задней фокальной плоскости объектива) возникает интерференцион-
ная картина поляризованных лучей. Наблюдение производится с помо-
щью специальной линзы — линзы Бертрана, которая позволяет наблюдать
изображение обычным способом с помощью окуляра. Для получения ка-
чественной картины рекомендуется объект освещать сильно сходящими-
ся пучками лучей (апертурная диафрагма конденсора открыта).
Кювета рефрактометрическая представляет собой предметное
стекло с наклеенным на него клином под углом 45° и пластиной, при
этом наклонная грань и вертикальная грань образуют канал, в который
помещается иммерсионная жидкость с зернами минерала; канал на-
крывается покровным стеклом. На предметном стекле каждой кюветы
нанесена гравировка номера; каждая из кювет отличается маркой стек-
ла (показателем преломления) клина, численное значение показателя
преломления выгравировано на предметном стекле.
Л
Люминесценция — способность вещества испускать излучение при
воздействии на него внешней энергии (энергии возбуждения). Излуче-
ние люминесценции — это избыток излучения, превышающий тепло-
вое излучение вещества, которое возникает при данной температуре.
Длительность излучения люминесценции значительно превышает пе-
риод световых волн.
Излучение люминесценции зависит от природы вещества (объекта)
и характеризуется:
• спектральным распределением плотности лучистого потока, т. е.
шириной спектральной полосы пропускания, величинами коэф-
фициента излучения и максимальной длиной волны, при которой
происходит излучение;
• степенью поляризации;
294
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
• выходом люминесценции, т. е. отношением излучаемой энергии
к поглощенной, на которую влияет степень тушения излучения,
зависящая от структуры вещества и от внешних условий;
• временем затухания.
Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает
большей длиной волны, чем поглощенный (См. Правило Стокса, Фо-
толюминесценция, Флуорохромы). Поэтому люминесценцию выгодно
возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (300-400 нм), либо сине-
фиолетовыми. В обоих случаях (люминесценции и фотолюминесцен-
ции) возникает свечение в цветовой гамме всего или большей части
видимого спектра. Спектр флуоресценции остается неизменным при
любой длине волны возбуждающего излучения.
Этот вид люминесценции носит название наведенной (вторичной)
в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко про-
являемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми
веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах,
некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.
Луч обыкновенный — луч, электрический вектор которого перпен-
дикулярен главному сечению, имеет для всех направлений один и тот
же показатель преломления и подчиняется закону преломления (для
одноосного объекта).
Таблица 17.2
Основные спектральные линии ртутных ламп или фраунгоферовых линий
Обозначение Длина волны, нм Цвет
i 365,00 темно-фиолетовый
h 404,36 фиолетовый
g 435,83 сине-фиолетовый
Г 479,99 синий
f 486,13 синий
F 486,00 зеленый
e 546,07 зеленый
d 587,56 желто-оранжевый
D 589,29 желто-оранжевый
c' 643,85 красный
c 656,27 красный
c 656,00 красный
r 706,52 темно-красный
295
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Луч необыкновенный — луч, у которого электрический вектор, ле-
жащий в плоскости главного сечения, показатель преломления зависит
от направления, при этом луч не подчиняется закону преломления и
может выйти из плоскости падения. Величина двойного лучепрелом-
ления, угол между оптическими осями и их положение в пространстве
имеют дисперсию (изменяются с длиной волны света).
М
Маркировать [marquer — отмечать] — ставить на какое-либо из-
делие клеймо, марку.
Маркировка — нанесение надписи или рисунков на изделие для
того, чтобы его можно было отличить среди изделий аналогичного
вида.
Микроскоп [micros — малый + scopein — рассматривать, наблю-
дать] — оптический прибор, имеющий как минимум две ступени уве-
личения изображения объекта.
Микроскопия световая основывается на законах геометрической
оптики и волновой теории образования изображения, при этом в ка-
честве источника света используются естественные и искусственные
источники. Изучение морфологии большинства патогенных микро-
организмов, имеющих размеры не более 2-10 мкм, возможно только с
помощью световых микроскопов. Современные световые микроскопы
позволяют получать раздельное увеличенное изображение объектов и
структур размером до 0,5 мкм с разрешением до 0,1 мкм в видимой об-
ласти спектра.
Микроскопия электронная. В основу положен метод получения
электронно-оптического изображения с помощью потока электронов.
Электронная микроскопия базируется на законах геометрической и
волновой оптики, а также электромагнитных полей. С помощью элек-
тронного микроскопа можно изучать объекты, размеры которых лежат
за пределами разрешения светового микроскопа (0,2 мкм). Обычно их
применяют для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения
клеток микроорганизмов и других субмикроскопических объектов,
а также макромолекулярных структур.
Н
Николь [по имени англ, физика У. Николя (W. Nicol), 1768-1851] —
призма из исландского шпата; служит для поляризации света.
296
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Нит [лат. nitere блестеть] — устарелое название единицы яркости
светящейся поверхности.
Нониус, иначе «верньер» — дополнительная шкала измерительно-
го инструмента, позволяющая повысить точность отсчета по основной
шкале в несколько раз (10,20, больше).
0
Объект [objectum — предмет] — предмет, явление, на который
направлена какая-либо деятельность.
Объект микроскопического исследования— в общем случае
представляет собой сильно структурированный коллоид, который су-
ществует в реальном времени и может быть обнаружен органами ося-
зания и обоняния (срез, мазок, моча, водоросль, мышь). Объект — это
то, что существует помимо нас, и мы можем его потрогать, а, главное,
взять и сделать с ним то, что поможет оценить его состояние, размеры,
свойства. Сделать так, чтобы объект и его элементы (структуру) мож-
но было рассмотреть более детально с помощью очков, под лупой или
микроскопом.
Объекты непрозрачные — объекты, которые максимально отража-
ют световую волну (например зеркальная поверхность), или полностью
поглощают ее (например «абсолютно черное тело», дерево, камень).
Если световая волна распространяется в среде с одним показателем
преломления и попадает на границу раздела со средой, показатель пре-
ломления которой больше, чем первый, то энергия переносимой волны
максимально отразится от поверхности раздела.
Объекты полностью прозрачные или полупрозрачные. Объекты
можно отнести к прозрачным, если меньшая часть энергии световой
волны отражается от их поверхности (граница раздела двух сред), а
большая часть проникнет во вторую среду с минимальным поглощени-
ем. В зависимости от соотношения прошедшей и отразившейся части
световой энергии, говорят о полностью прозрачных или полупрозрач-
ных объектах.
Объекты амплитудные — объекты, которые поглощают свет, в
физическом смысле меняют амплитуду и интенсивность световой
волны, проходящей через этот объект. Такие объекты носят название
амплитудных. Однако в «чистом виде» они встречаются крайне редко.
В качестве примера можно назвать «абсолютно черное тело».
Объекты фазовые — объекты, которые могут иметь определенное
светопоглощение на разных участках и при этом отличаться по опти-
297
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
ческой плотности. При прохождении света через такие объекты амп-
литуда его не меняется, а изменяется фаза колебания, что не фиксиру-
ется глазом. Причем величина этого изменения зависит от показателя
преломления объекта и его толщины. К фазовым объектам относятся
живые неокрашенные микроорганизмы, изображение которых в обыч-
ном микроскопе отличается малой контрастностью.
Объект фазово-амплитудный — любой объект, который пропус-
кает хоть немного света, имеет показатель преломления и, следова-
тельно, вызывает фазовые изменения в световой волне. Это приводит
к одновременному изменению световой волны по фазе и амплитуде
после взаимодействия с объектом.
Объекты люминесцирующие — объекты, основное свойство ко-
торых связано с особой способностью некоторых их частиц к самосве-
чению. При поглощении света одной длины волны объект начинает
испускать свет другой длины волны. Иными словами, возбуждаясь
под действием света определенной длины волны, частицы объекта при
исследовании их в другой длине волны, начинают светиться. При этом
частицы испускают свет с длиной волны обычно большей, чем длина
волны возбуждающего света.
Объекты анизотропные— объекты, скорость распространения
света в которых различна по различным направлениям, или же это объ-
екты, показатели преломления которых изменяются в зависимости от
направления распространения световой волны и плоскости ее колеба-
ний. Иными словами, это объекты, у которых оптические свойства не
одинаковы по различным направлениям.
Если плоскополяризованный свет попадет на подобный объект, то,
упрощенно говоря, он может разделиться на два луча, поляризованных
во взаимно перпендикулярных направлениях. Эти лучи имеют разные
показатели преломления, а значит и разные скорости распространения.
Как мы уже выяснили, это приводит к разности фаз колебаний свето-
вой волны. Разность фаз пропорциональна показателю преломления и
толщине объекта. Величина поворота плоскости поляризации зависит
от длины волны, что говорит о способности поляризованного света
к разложению по спектру (дисперсионное свойство). Поляризующее
свойство объекта наиболее характерно выражено, когда речь идет об
обыкновенном и необыкновенном лучах (см. Плеохроизм).
К анизотропным объектам можно отнести кристаллы и волокна.
Объект изотропный — это объект, который не поляризует свет,
прошедший через него. Однако, при отражении от изотропного объ-
298
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
екта, свет может поляризоваться (когда он падает под углом полного
внутреннего отражения — закон Брюстера).
Объектив [objectivus — предметный] — часть оптического прибо-
ра, создающая перевернутое действительное изображение объекта с
определенным увеличением.
Объективы микроскопа предназначены для построения микроско-
пического изображения в некой плоскости (плоскости изображения) с
соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью
воспроизведения по форме и цвету объекта исследования. Объективы
имеют сложную конструкцию, которая включает несколько одиночных
и склеенных компонентов из 2-х и 3-х линз. Количество линз в объек-
тиве может доходить до 13-14.
Объективы иммерсионные [от лат. immersio — погружение] —
пространство между предметом и объективом заполнено прозрачной
средой с показателем преломления п = 1,3-1,7. Иммерсионные объекти-
вы больших увеличений имеют короткое фокусное расстояние — 1,5-
2,5мм при свободном рабочем расстоянии 0,1-0,Змм (расстояние от
плоскости препарата до оправы фронтальной линзы объектива).
Объективы монохроматические рассчитаны для применения в
узком спектральном диапазоне, практически они хорошо работают в
одной длине волны. Аберрации исправлены в узком спектральном диа-
пазоне. Монохроматы были широко распространены в 60-х годах в пе-
риод развития фотометрических методов исследования и создания ап-
паратуры для исследований в ультрафиолетовой (УФ) и инфракрасной
(ИК) областях спектра.
Объективы ахроматические рассчитаны для применения в спект-
ральном диапазоне 486-656 нм. В этом типе объективов ахроматизация
(исправление любой аберрации, искажения) выполнена для двух длин
волн. Волновые аберрации для точки на оси составляют не более ОДА.
В этих объективах устранены сферическая аберрация, хроматичес-
кая аберрация положения, кома, астигматизм и частично сферохро-
матическая аберрация. Изображение объекта имеет несколько сине-
вато-красноватый оттенок. В связи с простотой конструкции ахроматы
имеют следующие достоинства:
• высокий коэффициент светопропускания, что необходимо при
проведении фотометрических измерений и люминесцентных ис-
следованиях;
♦ обеспечение трудносочетаемых (при расчете) условий — боль-
шого рабочего расстояния при работе объектива с покровным
стеклом, явно превышающим стандартную толщину, и при этом
299
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
возможность сохранения разрешающей способности, что необ-
ходимо при работе на инвертированных микроскопах.
Полевые аберрации в чистых ахроматах исправлены чаще всего на
%-% поля, т.е. без перефокусировки возможно наблюдение в пределах
% - % по центру видения. Это увеличивает время наблюдения, так как
требует постоянной перефокусировки на край поля.
Объективы апохроматические — объективы, имеющие расши-
ренную рабочую спектральную область; ахроматизация выполняется
для трех длин волн. Волновые аберрации для точки на оси составляют
не более О, IX. Кроме хроматизма положения, сферической аберрации,
комы и астигматизма достаточно хорошо исправляются также вто-
ричный спектр и сферохроматическая аберрация. Полевые аберрации
в чистых апохроматах исправлены чаще всего на % поля, т.е. без пере-
фокусировки возможно наблюдение в пределах % по центру видения.
Это увеличивает время наблюдения, так как требует постоянной пе-
рефокусировки на край поля. Апохроматы обычно применяются при
особо тонких и важных исследованиях и особенно там, где требуется
качественная микрофотография.
Объективы полуапохроматические — объективы, в которых абер-
рации для одной из трех длин волн исправлены в пределах 0,25Х. В совре-
менных микроскопах такие объективы носят название «микрофлюар».
Объективы план (планахроматы, планапохроматы, планполуапох-
роматы) — объективы, в которых наравне с исправлением в спектраль-
ном диапазоне исправлены кривизна по полю изображения, астигма-
тизм и кома, что обеспечивает резкое изображение по всему полю
наблюдения.
Объективы полуплан (объективы с улучшенным качеством по
полю) — объективы, в которых полевые аберрации исправлены на ве-
личину Уз поля.
Объективы контактные — во время работы объективы приво-
дятся в соприкосновение с исследуемым объектом. В результате кон-
такта поверхность объектива принимает форму первой поверхности
фронтальной линзы, что обеспечивает плоскостность изображения.
Освещение объекта осуществляется через объектив. Фирма ЛОМО
выпускала люминесцентные контактные микроскопы. С помощью этих
микроскопов проводилось исследование ткани организмов в прижиз-
ненном состоянии.
В контактных объективах исправлен астигматизм.
Объективы Эпи — объективы отраженного света с дополнитель-
ной осветительной системой темного поля в виде светового кольца,
300
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
расположенной вокруг основного корпуса светлопольного объектива.
Размер светового кольца или осветительного пучка зависит от аперту-
ры объектива и линейного поля на предмете. В современных объекти-
вах конструкции эпи-системы имеют растровые элементы, зеркала —
асферические поверхности высших порядков.
Объективы поляризационные — объективы свободные от натя-
жения. При изготовлении к этим объективам предъявляются повышен-
ные требования:
• отсутствие расчетного астигматизма;
• высшие категории стекла по бессвильности;
• отсутствие натяжения в линзах, в склеенных компонентах, в ком-
понентах в оправе, в собранном объективе;
• отсутствие в оптической схеме кристаллов, обладающих двулу-
чепреломлением.
Объективы люминесцентные — объективы, не вносящие в изоб-
ражение собственное свечение в исследуемой области люминесценции,
т. е. обладающие минимумом собственной люминесценции. При изго-
товлении предъявляются требования:
• отсутствие в оптической схеме объектива материалов, обладаю-
щих собственной
• люминесценцией, при этом оптические среды должны обладать
максимумом пропускания в широкой области спектра (от 300 нм
до 800 нм);
♦ сохранение при изготовлении тех же требований по отношению
к клею и просветляющим покрытиям;
• иммерсионная жидкость не должна вносить дополнительное
свечение.
Объективы безрефлексные — объективы отраженного света свет-
лого и темного поля, а также поляризационные отраженного света. При
изготовлении предъявляются требования:
• расчет объективов на рефлексы;
• применение покрытий, рифлений, чернений и прочих антиреф-
лексных методов.
Окуляр [okularis — глазной] — обращенная к глазу часть оптическо-
го прибора, предназначенная для рассматривания с некоторым увели-
чением изображения, созданного объективом прибора. При маркиров-
ке надпись, связанная с основными параметрами окуляра, наносится на
корпус окуляра со стороны глазной линзы (ближайшей к наблюдателю)
или по направляющей. На корпусе указываются:
• линейное увеличение (в кратах);
301
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
• линейное поле в плоскости изображения, в которой объектив со-
здает изображение объекта (или другими словами, размер поле-
вой диафрагмы окуляра, ограничивающей поле как в плоскости
изображения, так и на предмете);
• тип коррекции (ПЛАН / PLAN — окуляры плоского поля; К —
компенсационные, для компенсации хроматических аберраций
объектива, WF — широкопольные);
• вынос выходного зрачка или обеспечение работы в очках (выход-
ной зрачок вынесен на 14-20 мм);
• может маркироваться центрированное и отъюстированное пере-
крестие.
Окуляр Гюйгенса — простейший окуляр, состоящий, как минимум,
из 2-х линз. Термин, применялся первоначально для окуляра, состоя-
щего из 2-х плосковыпуклых линз (коллективной линзы и глазной лин-
зы с диафрагмой в промежутке), установленных так, что их выпуклые
поверхности обращены к объективу. Оптическая схема окуляра рас-
считывается таким образом, что в них практически отсутствует хро-
матическая разность увеличения (ХРУ). Такие окуляры применяются
с объективами, в которых также отсутствует ХРУ. Применение сеток в
окуляре возможно, но располагаются они внутри между линзами. Угло-
вое поле окуляров доходит до 45°.
В настоящее время термин применяется к любому окуляру с диа-
фрагмой внутри.
Окуляр Кельнера — состоит из простой линзы и склеенной из двух
линз глазной линзы. Угловое поле увеличено до 50°.
Окуляр компенсационный — окуляр, который совместно с объ-
ективом исправляет хроматическую разность увеличения (ХРУ). Ве-
личина ХРУ в компенсационных окулярах колеблется от 0,5 % до 2 %.
Применяется совместно с ахроматическими и планапохроматическими
объективами, входящими в комплект БИОЛАМ Р, С, Д (МИКМЕД-1),
МБИ-15, БИОЛАМ П, И
Окуляр ортоскопический — состоит из плосковыпуклой глазной
линзы и трехсклеенного компонента. Угловое поле до 40°.
Окуляр симметричный — состоит из двух одинаковых компонен-
тов, расположенных симметрично друг относительно друга. Окуляр
имеет большой вынос зрачка, что позволяет на его основе получать
окуляры для работы с очками. Угловое поле окуляров не превышает
40°-42°.
Окуляр широкоугольный — окуляры классифицируются по углу
поля видения, т. е. по угловому полю. Это высококачественный окуляр
302
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
сложной оптической конструкции. Нередко в них применяются линзы
с асферическими поверхностями. Угловое поле может быть 80°-100°.
Окуляр широкопольный — окуляры классифицируются по линей-
ному полю видения и связаны с окулярным числом. Новые современ-
ные окуляры с линейным полем 18-20 мм являются широкопольными,
а с полем 25-30 мм — сверхширокопольными.
Окуляр Эрфле — состоит из трех компонентов. Обеспечивает боль-
шой вынос зрачка. Имеет большое расстояние до сетки, и данная схема
обычно используется, когда требуется перемещение окуляра. Угловое
поле увеличено до 60°.
Окулярная сетка— оптическая деталь, устанавливаемая в плос-
кость полевой диафрагмы. Сетка может быть выполнена в виде шка-
лы окулярного микрометра, сетки с различными размерами квадратов,
кругов правильной формы или логарифмической сетки, на стекло мо-
гут быть нанесены фигуры стандартной формы (для сравнения). Сетка
предназначена для измерения линейных размеров, вычисления площа-
ди объекта, для количественного подсчета.
Окулярное число — это произведение линейного поля окуляра (раз-
мер полевой диафрагмы окуляра) на его увеличение. Полезное видимое
поле обычно оценивается по окулярному числу, максимальная полез-
ная величина которого составляет 250 мм, минимальная — 180 мм. Чем
выше технологический уровень фирмы-производителя, тем больше
окулярное число в широкопольных (WF) окулярах.
Оправы коррекционные (кольца) — тип подвижной оправы, пред-
назначенной для изменения расстояния между оптическими элемента-
ми внутри объектива. Оправы конструктивно устанавливаются в место,
определенное в соответствии с требованиями расчета для коррекции
сферической аберрации за счет перемещения линзовых компонентов
объектива. Сферическая аберрация может возникнуть, а значит, быть
скомпенсирована в следующих случаях:
• толщина покровного стекла, отличная от стандартной, может ме-
няться в определенных пределах и часто используется в объекти-
вах инвертированных микроскопов;
• работа объективов с различными иммерсионными жидкостями;
чаще всего, это или «водная» «масляная» - «глицериновая», или
две иммерсионные системы в разных сочетаниях;
• работа объектива в двух системах «сухая» — «иммерсионная».
В этом случае в конструкции объектива предусмотрено подвижное
кольцо. На корпусе обычно маркируются или пределы толщины пок-
ровного стекла (положение линз в системе объектива, при котором
303
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
именно эта толщина покровного стекла скомпенсирована), например,
«1,0» - «1,5» - «2,0», или условное обозначение иммерсионной жидкос-
ти, например, «OIL» - «GLYC» - «DRY»
Оправы пружинящие — оправы объектива, имеющие пружину,
обеспечивающие ее подвижность.
Механическая конструкция объектива выполнена таким образом, что
фронтальный компонент под действием пружины совершает плавное
возвратно-поступательное движение. Применение подобного механиз-
ма связано с числовой апертурой объектива: чем больше числовая апер-
тура, тем меньше рабочее расстояние и глубина резкости объектива, тем
больше вероятность при настройке (фокусировке) испортить фронталь-
ную линзу объектива или раздавить покровное стекло. Независимо от
увеличения международным стандартом ISO рекомендовано примене-
ние пружинящей оправы, начиная с числовой апертуры объектива 0,50.
Ортоскопический ход лучей — обычный ход лучей в микроскопе.
Он имеет следующий путь: в плоскость полевой диафрагмы окуляра
(другими словами, в плоскость изображения объектива или фокаль-
ную плоскость окуляра) проектируется изображение объекта. Наблю-
даемая при этом интерференция (наложение) поляризованных лучей
локализована (собрана) в плоскости объекта.
Для получения качественной картины рекомендуется уменьшать
(прикрывать) апертурную диафрагму конденсора.
Осветительные системы — система линз, диафрагм и зеркала (при
необходимости), обеспечивающая равномерное освещение объекта и
полное заполнение апертуры объектива.
Осветительная система состоит из следующих элементов:
• источник света — источник электромагнитных колебаний, естес-
твенный (солнце) или искусственный (потолочный светильник,
настольная лампа, специальные осветители для микроскопа);
• коллектор — оптическая система, с помощью которой светяще-
еся тело источника света (солнечный зайчик, нить лампы) про-
ектируется в плоскость апертурной диафрагмы конденсора, при
этом светящееся тело (нить лампы) может быть увеличено до
размера диафрагмы,
• конденсор — оптическая система, которая проектирует полевую
диафрагму коллектора в плоскость предмета.
Освещение, принципы — последовательность построения эле-
ментов осветительной системы, позволяющие получить качественное
освещение плоскости предмета. Различаются два принципа построе-
ния — критическое освещение и освещение по Келеру.
304
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Освещение критическое — равномерно яркий источник света
располагается непосредственно за полевой диафрагмой и с помощью
конденсора изображается на плоскости предмета. Размер полевой диа-
фрагмы подбирается так, чтобы ее изображение, точно было ограниче-
но полем зрения окуляра (при малом увеличении объектива1).
Освещение по Келеру — собирающая линза (коллектор) располага-
ется рядом с полевой диафрагмой и образует изображение источника
света в фокальной плоскости конденсора (где расположена апертурная
диафрагма конденсора). В этом случае лучи, исходящие из каждой точ-
ки источника света, после прохождения конденсора образуют парал-
лельные пучки. Преимущество такого принципа заключается в том, что
неравномерность в распределении яркости по источнику света (нити
накала галогенной лампы или светящегося тела ламп высокого на-
пряжения) не вызывает неравномерности освещенности в плоскостях
предмета и изображения микроскопа.
Относительное отверстие — абсолютное значение отношения
удвоенного расстояния от оптической оси до точки преломления или
отражения меридионального луча, параллельного оптической оси в
пространстве предметов и проходящего через край апертурной диа-
фрагмы, к заднему фокусному расстоянию системы.
Относительный показатель преломления двух сред — отноше-
ние И1/И2 = «1-2.
Отражение полное внутреннее — вся энергия падающего света
возвращается в первую, оптически более плотную среду, при этом угол
падения ф>фпр. Для границы «стекло — воздух» (и1/иг= 1,5) угол пол-
ного внутреннего отражения равен 4Г50'.
Осцилляция [oscillum — колебание]. С введением компенсационных
пластин Л, Л/4 или кварцевого клина возможно определение оптичес-
ких характеристик кристаллов и направления осцилляции.
П
Параллакс \<гр. parallaxis — уклонение] — это видимое измене-
ние положения предмета вследствие перемещения глаза наблюдателя.
Стереоскопическое зрение позволяет получить объемное восприятие
пространственного изображения, которое построено на разности мо-
нокулярных изображений правого и левого глаза. Если спроецировать
1 Как правило, это микроскопы-игрушки или учебные микроскопы, в которых использу-
ются объективы с увеличением не более 4х.
305
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
с обеих точек зрения на некую плоскость два изображения какой-либо
точки, не лежащей в плоскости предмета, то можно измерить стерео-
скопический параллакс — расстояние между этими двумя точками.
Наименьший угловой стереоскопический параллакс, еще ощуща-
емый глазом, равен 10». В случае возникновения очень больших уг-
ловых параллаксов утрачивается возможность ощущения слитного
объемного изображения. Возникает двоение изображения. Предель-
ный угловой стереоскопический параллакс ограничен углом около
30-40’. Поле линейное на объекте представляет собой тот его учас-
ток, изображение которого заполняет поле зрения окуляра. Поле на
объекте рассчитывается с учетом линейного поля окуляра и увели-
чения объектива.
Поле линейное оптической системы в пространстве предметов —
наибольший размер изображаемой части плоскости предмета, лежаще-
го на конечном расстоянии в пространстве предметов (до объектива).
Обозначение — 2у; нем. Eintrittsfeid; англ. Linear field in the object
space.
Поле линейное оптической системы в пространстве изображе-
ний — наибольший размер изображения, лежащего на конечном рас-
стоянии (после объектива или окуляра).
Обозначение — 2у; нем. Austrittsfeid; англ. Linearfield in the image
space.
Поле угловое оптической системы в пространстве предметов —
абсолютное значение удвоенного угла между оптической осью и лучом
в пространстве предметов, проходящего через центр апертурной диа-
фрагмы и край полевой диафрагмы.
Обозначение — 2v; нем Objektwinkel; англ. Angular field in the ob-
ject space.
Поле угловое оптической системы в пространстве изображе-
ния — абсолютное значение удвоенного угла между оптической осью и
лучом в пространстве изображения, проходящем через центр апертур-
ной диафрагмы и край полевой диафрагмы. Обычно этот термин отно-
сят к окулярному угловому полю.
Обозначение — 2v'; нем Bildwinkel; англ. Angular field in the image
space.
Покровное стекло— стекло, расположенное между объектом и
объективом.
Покровное стекло предохраняет и фиксирует препарат. Толщина
стекла учитывается при расчете объектива и маркируется на его кор-
пусе.
306
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Предметное стекло — стекло, которое находится между осветите-
лем и объективом, располагается на предметном столике. Стекло пред-
назначено для размещения на нем препарата в естественном состоянии
или после предварительной химической обработки.
Препарат \praeparatus — приготовленный] — искусственно приго-
товленный по специальной технологии объект исследования. Препа-
рат может быть химическим и фармацевтическим продуктом ла-
бораторного или фабричного изготовления. По-видимому, корректно
говорить: «устанавливаем препарат», но «рассматриваем объект» и
«изображение объекта». Препарат помещается на предметное стек-
ло и может быть закрыт покровным стеклом.
Препараты тестовые контрольно-юстировочные для оценки ка-
чества изображения оптики микроскопа — препараты, выполненные
на предметном стекле с покровным стеклом и без такового, размеры
элементов на котором позволяют оценить волновые аберрации оптики
(дифракционное качество) и геометрические искажения. Используются
на операциях окончательной сборки объективов и микроскопа в целом.
Основным препаратом является дифракционный препарат «Звездное
небо».
Препарат дифракционный «Звездное небо» — препарат для
оценки сферической аберрации, комы (децентрировки оптической сис-
темы), астигматизма. Препарат представляет собой предметное стекло
с маленькими отверстиями правильной формы, которые находятся в
плотном слое алюминия. Они располагаются по всей площади в преде-
лах линейного поля объектива. Диаметр отверстия соответствует так
называемому кружку Эри и находится на пределе разрешения объек-
тива, когда начинают проявляться волновые свойства света — явление
дифракции на отверстии. Для микроскопа препарат имеет вид пред-
метного стекла, на котором нанесен слой алюминия с отверстиями.
Если оценивается качество изображения объектива, рассчитанное
на определенную толщину покровного стекла, то предметное стекло
покрывается покровным стеклом соответствующей толщины. Если
объектив работает без покровного стекла — предметное стекло диф-
ракционного препарата его также не имеет.
Отверстия получают двумя способами:
• пылевым способом, когда препарат после нанесения слоя алюми-
ния остается на ночь в пыльном помещении, затем пыль смыва-
ют и вместо нее остаются отверстия разных размеров,
• с помощью латексных препаратов, когда роль случайных пыли-
нок выполняют латексные шарики определенного размера. При
307
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
этом возможно получение любой концентрации отверстий (ко-
личества отверстий на единицу площади).
Таким образом, при пылевом препарате размер отверстий и их кон-
центрация носят случайный характер, в латексном препарате — задан-
ный.
По препарату «звездное небо» определяется:
• сферическая аберрация в центре поля — по дифракции на одном
отверстии;
• астигматизм в центре поля и по полю в целом — по дифракции
на одном отверстии;
♦ кома по полю — по дифракции на одном отверстии;
• хроматические аберрации по полю — по дифракции на одном от-
верстии;
• кривизна поля — по дифракционной картине на группе отверс-
тий.
Качество изображения оценивается по форме и интенсивности
свечения в ядре и кольце, общему фону в пределах поля зрения, цвету
светлых колец и фона, а также изображению и искажению всей карти-
ны в целом по полю. При оценке качества изображения прежде всего
обращается внимание на контраст, разрешение и цвет.
Препарат контрольно-юстировочный «Тест-платте» — для
оценки хроматических аберраций, астигматизма, сферической аберра-
ции и кривизны по полю. Так же как и препарат «звездное небо», вы-
полнен на предметном стекле и представляет собой систему чередую-
щихся черных и белых полос. Полосы получены путем механического
нанесения в слое алюминированного покрытия полос равной ширины
через равные промежутки. И полосы, и промежутки равны между со-
бой, хотя на одной пластине могут присутствовать несколько типов
размеров (табл. 17.3). Обязательным условием нанесения полос являет-
ся специфичность их краев. Края полосы должны иметь острые неров-
ности, как горы, по цвету «вершин» и «склонов» которых определяется
наличие в оптической системе хроматической разности увеличения
или сферохроматической аберрации. По тест-платте оценивается и мо-
нохроматическая сферическая аберрация. При этом изображение тест-
объекта будет с «вялыми» размытыми краями и разного контраста от
края полосы к центру.
Препарат «Пластинка Аббе» — клинообразная узкая полоска,
толщина которой меняется от 0,09 до 0,24 мм. Нижняя поверхность
клина покрыта непрозрачным слоем серебра, на котором процарапаны
полосы, т. о., получается чередование темных и светлых полос. Рваные
308
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Таблица <17-3
Расстояние меж- ду полосками на объекте, мкм Требуемая для разрешения апертура объектива
Прямое освещение при апертуре конденсора Максимально ко- сое освещение
Ак = 0,1 Ак = 0,34
1,90 0,19 0,15 - -
1,33 0,30 0,20 л 717 ч;—
0,83 0,56 0,35 —
0,70 0,70 0,45 0,40
0,62 0,80 0,55 0,45
0,52 0,95 0,70 0,55
0,48 1,05 0,80 0,60
0,41 1,25 1,00 0,70
0,33 — 1,30 0,90
0,25 — — 1,15
0,24 — — 1,25
при большом увеличении края полос являются контрастным предме-
том для оценки качества изображения. Препарат наклеен на предмет-
ное стекло.
Полярзация \polarisation< polos — ось, полюс] — явление, которое
происходит с лучом света при его отражении и преломлении, особенно,
если среда обладает двойным лучепреломлением (анизотропией). Дан-
ное явление связано с тем, что колебательное движение во всех точках
луча происходит в одной плоскости, которая проходит через направле-
ние луча, тогда как в неполяризованном свете колебания происходят по
всем направлениям, перпендикулярным к лучу (См. Изотропия, Изоги-
ры, Изохромы, Анизотропия, Плеохроизм, Луч обыкновенный, Луч не-
обыкновенный, Дисперсия, Изохромы, Показатель преломления, Конос-
копия, Экстинкция, Ортоскопический ход лучей, Осцилляция, Фактор
гашения, Компенсаторы).
Плеохроизм — анизотропия поглощения. Это явление связано с тем,
что свет, проходя через среду, поглощается по-разному в зависимости от
ориентации плоскости поляризации и от направления распространения.
Плеохроичный объект обладает способностью к изменению окраски при
изменении направления света (дисперсией), что связано с тем, что свет
различных длин волн поглощается средой в разной степени.
В двуосных объектах показатель преломления для обоих лучей зависит
от направления распространения. Характеристикой двойного лучепре-
309
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
ломления может служить разность показателей преломления необыкно-
венного и обыкновенного лучей. Из центра излучения движение световой
волны распространяется во все стороны с одинаковой скоростью (3-1010
см/сек). Направление распространения нормально к поверхности волны.
Если распространение света рассматривается лишь в одном определен-
ном направлении, то его можно представить, как световой луч.
Показатель преломления — это отношение скорости света в пус-
тоте к его скорости в веществе (прозрачном или полупрозрачном).
Р
Разрешающая способность — способность глаза или оптического
прибора различать мелкие детали. Иными словами — это наименьшее
расстояние между изображением двух соседних точек (линий), которые
различаются как два отдельных изображения. Понятие разрешающей
способности было введено Аббе (рис. 17.10). Аббе показал, что для
возникновения изображения подобного объекту, необходимо, чтобы
в фокальной плоскости F объектива имелось не менее двух соседних
максимумов. При прямом освещении разрешающая способность будет
rf=X/A06- При использовании конденсора возникает условие, что в
фокальной плоскости возникает два спектральных максимума при
числовой апертуре объектива Аоб/2, т. е. уменьшить вдвое наименьшее
разрешаемое расстояние d.
Нижний предел разрешения объектов, наблюдаемых в микроскоп,
равен 0,18 мкм (при Аоб = 1,6; X = 0,560 мкм; Zi (размер кружка Эри) = 3,3),
при УФ излучении можно довести предел разрешения до 0,1 мкм.
Практически установлено, что при благоприятных условиях глаз
еще способен различать два изображения, если падение освещенности
Рис. 17.13.
рафик разрешающей способности, представ-
ленный в виде кружка Эри (кружок рассеяния):
справа - дифракционная картина одной точки;
слева - дифракционная картина двух близ ле-
жащих точек, уже различимых глазом. ’
310
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
между двумя максимумами будет составлять не менее 5 %, что соответс-
твует размеру кружка Эри zi = 3,3. Первое темное кольцо соответствует
значению первого максимума, для которого zi = 3,83.
Расстояние рабочее — расстояние от плоскости предмета, на кото-
рой расположен объект, до первой выступающей части объектива или
конденсора (это может быть оправа или первая поверхность фронталь-
ной линзы) в положении, когда в микроскоп четко видно изображение
объекта (термин для пользователя микроскопа).
Расстояние свободное — расстояние от первой поверхности фрон-
тальной линзы до плоскости предмета (термин, употребляемый при
расчете объектива, конденсора).
С
Свет — поток лучистой энергии различной длины волны (область
видимых лучей), который воспринимается сетчаткой глаза. При этом
ощущение света — это яркость, воздействующая на орган зрения, или
результат взаимодействия лучистой энергии с органом зрения и вос-
приятие этого взаимодействия сознанием человека. С другой стороны,
свет — это электромагнитное излучение, которое проявляется как вол-
новое движение или ведет себя аналогично потоку частиц. Мы будем
пользоваться и тем, и другим объяснением. Как волновое явление, свет
имеет те же характеристики, что и механическая волна — амплитуда,
фаза, период.
Светофильтр — фильтр, пропускающий определенные световые лучи
в широком спектральном диапазоне. Каждый источник света имеет свой
спектр длин волн. При этом существует зависимость между распределе-
нием световой энергии ламп по спектру и их электрической нагрузкой.
Свет для освещения и фотографирования рассматриваемого объекта
может быть изменен по своему спектральному составу с помощью свето-
фильтров и подобран в соответствии с конкретными требованиями.
Обычно светофильтры изготовляются из однородного оптического
стекла. При одинаковой толщине они обладают различными, строго оп-
ределенными для каждого светофильтра коэффициентами поглощения,
зависящими от длины волны проходящего света. Светофильтрам приня-
то давать характеристику, указывая коэффициент чистого пропускания
??? [мм] для толщины стекла в 1 мм и определенной длины волны.
Коэффициент пропускания определяется отношением выходяще-
го потока света [Фх] к входящему [Фо] без учета потерь на отражение:
d=Ф1/Ф0.
311
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Светофильтры могут быть составными для того, чтобы выделить
определенную длину волны. В этом случае потери на отражение могут
быть уменьшены, если оба комбинируемых фильтра соединить с помо-
щью иммерсионной жидкости, показатель преломления которой дол-
жен быть близок по величине к показателю преломления обоих свето-
фильтров. В большинстве случаев достаточно внести между фильтрами
одну каплю иммерсионного масла, применяемого для работы иммерси-
онных объективов.
Вопрос о потере интенсивности, вызванной применением све-
тофильтров, представляет особый интерес для микрофотографии.
В практике зарубежной микроскопии принято, что эта потеря учиты-
вается коэффициентом фильтра, который указывает, насколько следу-
ет продлить выдержку в случае применения того или иного фильтра.
Значение кратности зависит от спектра излучения источника света,
спектрального поглощения фильтра и спектральной чувствительности
используемого фотоматериала.
По свойствам и областям применения светофильтры можно подраз-
делить на несколько групп.
1. Каждый светофильтр, максимум пропускания которого находится
в видимой части спектра, может в микроскопии и в микрофотографии
повышать контрастность окрашенных или цветных объектов.
2. Для того чтобы ослабить силу светового потока и его спектраль-
ный состав в соответствии с чувствительностью используемого устройс-
тва, применяются так называемые компенсационные светофильтры. К
ним относятся все светоослабляющие фильтры, конверсионные свето-
фильтры, теплозащитные светофильтры и некоторые специальные
цветные желто-зеленые светофильтры. Заводы-изготовители обычно
поставляют ослабляющие светофильтры различной плотности. Они от-
личаются нейтральным поглощением и могут применяться при съемке
цветных снимков. В практике зарубежной микроскопии используются
для микрофотографии так называемые конверсионные фильтры.
3. Для того чтобы в различных областях спектра получить изучение,
близкое к монохроматическому, служат избирательные интерференци-
онные светофильтры.
4. Зеленые фильтры с относительно строгой шириной полосы час-
тот находят применение в качестве корректирующих светофильтров.
Светофильтры контрастирующие используются как контрас-
тирующие элементы и устанавливаются в осветительной ветви мик-
роскопа. В общем виде синий матовый светофильтр применяется при
компенсации желтизны, вносимой лампой, так как минералы в поли-
312
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
рованных шлифах имеют слабые собственные оттенки. Желтый свето-
фильтр применяется при визуальной оценке отражательной способнос-
ти минералов. При этом цвет минерала не принимается во внимание.
Светофильтр поляризационный — фильтр, пропускающий ли-
нейно-поляризованный свет с одним направлением колебаний. Поля-
ризационные светофильтры (поляризаторы, николи) выполняются
из поливиниловой пленки, предназначенные для работы в видимой
области спектра. Диаметр поляризаторов от 15 до 50 мм (См. Анализа-
тор, Поляризатор).
Светофильтры теплозащитные— фильтры для задерживания
тепловых лучей источника света. Применяются, в основном, в осве-
тителях с ртутными и ксеноновыми лампами. Защищают от теплового
воздействия источника света, влияющего на прочность и светопропус-
кание интерференционного покрытия возбуждающего светофильтра,
наиболее близко расположенного к нему.
Светофильтр интерференционный— фильтр, пропускающий
определенные световые лучи в узком спектральном диапазоне. Узко-
полосные интерференционные светофильтры с высокой механичес-
кой прочностью в диапазоне длин волн 1,5-8 мкм, FWHM = 30-60 нм,
Гшах = 50 %, Т фона не более 1 % для обычных и 0,01 % для контрастных
фильтров. Зеленый интерференционный светофильтр улучшает ка-
чество изображения неокрашенных объектов и увеличивает контраст
цветных, особенно при черно-белой фотографии. Отрезающие интер-
ференционные светофильтры с высокой механической прочностью в
диапазоне длин волн 2-16 мкм.
Светофильтры конверсионные — это такие фильтры, с помощью
которых можно перемещать цветовую температуру источника света на
более высокую или низкую величину. Конверсионный фильтр преобра-
зует искусственный свет (3200 К) в дневной свет (5500 К) для наблюде-
ния и цветной фотосъемки на пленку дневного света.
Светофильтры коррекционные (компенсационные) служат для
устранения еще имеющихся хроматических погрешностей изображе-
ния, а также, прежде всего, устраняют встречающиеся по краям карти-
ны изображения цветные кромки в структуре объекта.
Светофильтры возбуждения служат для выделения из общего из-
лучения источника света лучей, возбуждающих видимую люминесцен-
цию объектов. Устанавливается в ветви осветителя.
Светофильтр запирающий предназначен для срезания света воз-
буждения и пропускания света люминесценции. Устанавливается в на-
блюдательной ветви.
313
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Светофильтры сменные, например, теплозащитные применяют-
ся для исключения попадания в глаза наблюдателя красных и инфра-
красных лучей. А, например, светофильтр БС8 применяется для пре-
дохранения объектов от выцветания, прозрачен для видимой области
спектра и срезает его ультрафиолетовую часть. Устанавливаются там
же, где и возбуждающий фильтр.
Стерео [stereos — пространственный] — первая составная часть
сложного слова.
Стереоскопическая база — это понятие чаще относится к прибор-
ной части и характеризует неизменность расстояния между оптически-
ми осями двух ветвей прибора, обеспечивающих получение объемного
изображения (стереоэффекта).
Стереоскопический эффект — эффект, связанный со зрительным
восприятием. Особенность зрительного восприятия человека заклю-
чается в способности чувствовать глубину воспринимаемого зрением
пространства. Эта способность связана как с различным напряжением
мышц, так и с обработкой изображений, полученных каждым глазом,
на нервно-химическом уровне.
Слепимость — слепящее действие блеских поверхностей. Обычно
слепимость создается прямыми лучами нити накаливания лампы, час-
тями поверхности осветительных приборов, имеющих значительную
яркость, а иногда чрезмерной яркостью самих рабочих поверхностей
объекта. Слепимость зависит от угла, образованного направлением лу-
чей источника света к глазу, с горизонтальной линией зрения. Прибли-
зительно можно считать, что действие блескости обратно пропорцио-
нально квадрату этого угла.
Т
Турель [фр. tourelle] — приспособление для установки и кругового
вращения чего-либо.
У
Увеличение — кажущаяся величина предмета определяется его
изображением на сетчатке. В случае невооруженного глаза кажущийся
размер зависит от угла, под которым предмет виден. Для нормально-
го глаза наименьшее расстояние отчетливого зрения примерно равно
250 мм. Это расстояние наиболее удобно для рассматривания деталей
предмета. Если перед глазами поместить собирательную линзу, то рас-
314
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
сматриваемый предмет можно значительно приблизить к глазу. Такая
линза образует увеличенное изображение предмета, которое позволя-
ет рассматривать мелкий предмет. Увеличение служит для того, чтобы
расширить угол зрения, позволяющий глазу яснее различать детали.
Увеличение линейное — увеличение в сопряженных плоскостях,
перпендикулярных оптической оси, определяемое отношением разме-
ра параксиального изображения к размеру предмета.
Обозначение: Ь; нем. Abbildungsmafistab; англ. Linear magnification.
Увеличение угловое — увеличение в сопряженных точках на оп-
тической оси, определяемое отношением углов параксиальных лу-
чей с оптической осью в пространстве изображений и пространстве
предметов.
Обозначение: g; нем. Winkelverhaltnis; англ. Angular magnification.
Увеличение объектива. При конечной длине тубуса (например, 160
мм) увеличение объектива определяется по формуле:
|Зо6 = Д.Т./Гоб = 1бО/Гоб,
где Д.Т. — механическая длина тубуса, F06 — фокусное расстояние объ-
ектива. При длине тубуса «бесконечность» определяющим для расчета
увеличения объектива является фокусное расстояние тубусной линзы
или системы
Роб = Гт.л./Д>6,
где Ft.a. — фокусное расстояние тубусной линзы.
Увеличение окуляра. Увеличение окуляра ведется с учетом рассто-
яния наилучшего видения — 250 мм:
Гок=250/Гок,
где Fok — фокусное расстояние окуляра, мм.
Увеличение микроскопа общее является произведением увеличе-
ний объектива и окуляра. Если между объективом и окуляром есть до-
полнительная увеличивающая система, то общее увеличение микроско-
па равно произведению значений увеличений всех оптических систем,
включая промежуточные: объектива, окуляра, бинокулярной насадки,
оптовара или проекционных систем.
Гм = Роб• Гок-?1 • <^2’ ••. >
где Гм — общее увеличение микроскопа, роб — увеличение объекти-
ва, Гок — увеличение окуляра, qi, qi... — увеличение дополнительных
систем.
315
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Увеличение полезное — увеличение, удовлетворяющее требова-
нию: общее увеличение микроскопа должно быть настолько большим,
чтобы угловая величина изображения (наименьшее разрешаемое мик-
роскопом расстояние) не была меньше предельного угла разрешающей
способности глаза наблюдателя.
Гм = (500 =1000) -Лоб,
где А0б — числовая апертура объектива, Гм — общее увеличение мик-
роскопа.
Если между объективом и окуляром есть дополнительные оптичес-
кие элементы, которые имеют собственное увеличение (бинокулярная
насадка, система Оптовара), то это увеличение также учитывается.
Ф
Фаза [phasis — появление] — величина, которая характеризует
состояние колебательного процесса в каждый момент времени.
Фазовое превращение — изменение свойства вещества, приводя-
щее к переходу его из одной фазы в другую.
Фазовая скорость — скорость перемещения монохроматической
волны (любой ее фазы) в пространстве.
Фазовый контраст — контраст изображения, обусловленный раз-
ностью фаз между лучами, образующими светлый фон в поле зрения, и
лучами, испытавшими рассеяние на исследуемом объекте.
Фактор гашения. Эффективность поляризатора и анализатора ха-
рактеризуется фактором гашения, который определяется как отноше-
ние интенсивности света, прошедшего при параллельном расположе-
нии поляризатора и анализатора, к интенсивности света, прошедшего
при их скрещенном положении. В одноосном кристалле обыкновенный
луч имеет постоянный по направлениям колебания показатель прелом-
ления и подчиняется законам преломления (преломленный луч лежит
в плоскости падения). Необыкновенный луч имеет показатель прелом-
ления, зависящий от направления. Этот луч не подчиняется закону
преломления и может выйти из плоскости падения, т.е. находиться в
другой плоскости пространства. Максимальная разность показателей
преломления необыкновенного и обыкновенного лучей характеризует
величину двойного лучепреломления.
Фильтр \filtre, filtrum — войлок] — устройство, пропускающее или
задерживающее определенные токи, колебания, лучи или частицы.
316
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Фотометрия \phos (photos) — свет+metron мера, metreo — изме-
ряю] — раздел оптики, занимающийся измерением световых величин
(освещенности, яркости, силы света, светового потока) и энергети-
ческих характеристик электромагнитного излучения. Цитофото-
метрия применяется в медико-биологической практике при изучении
различных аспектов внутриклеточной химии. В основе метода лежат
основные принципы фотометрического анализа и абсорбционной спек-
трофотометрии растворов, связанных с явлением поглощения света
исследуемым веществом (См. Абсорбция, Адсорбция). Цитофотометрия
вошла в практику с 30-40-х годов прошлого столетия. Первый отечест-
венный промышленный прибор МУФ-4 был выпущен в 1958 г. на ГОМЗ
(ныне ЛОМО) совместно с ГОИ им. С. И. Вавилова.
Фотолюминесценция — свечение объектов, возникающее в резуль-
тате поглощенной ими лучистой энергии. Фотолюминесценцию услов-
но подразделяют на:
• флуоресценцию, т. е. свечение со временем затухания, не превы-
шающим НУ8 сек;
• фосфоресценцию, которая продолжается более длительное время
после прекращения возбуждения.
Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объ-
ектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультра-
фиолетовыми лучами. Из синтетических флуорохромов наилучшие ре-
зультаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин,
ФИТЦ (флюоресцеинизо-тиоцианат), которые обычно применяют в
виде слабых водных растворов.
В настоящее время наиболее распространенным считается метод
ФИТЦ. Для изучения различных препаратов, окрашенных ФИТЦ,
применяется пластина «ЗЕЛЕНАЯ-2» со светофильтром возбуждения
«Х450-480» и отрезающим светофильтром «ОС11-2» или «Х520-560».
Если применяется светофильтр «Х520-560», то он из общего излучения
люминесцирующего объекта пропускает только зеленую часть спек-
тра, характерную для специфической люминесценции ФИТЦ. Если в
препарате есть желтая или оранжевая люминесценция, то такая часть
спектра светофильтром «Х520-560» срезается. В случае, когда необхо-
димо увидеть как зеленую, так и желтую люминесценцию, то в качестве
отрезающего светофильтра применяется «ОС11-2». Для уменьшения
собственной люминесценции оптики со всеми пластинками, кроме ГО-
ЛУБОЙ, применяется светофильтр БС8-3.
Надписи на оправах светофильтров соответствуют маркам стекол,
из которых сделаны светофильтры, и их толщине. Например, ФС1-8,
317
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
означает, что светофильтр сделан из стекла ФС1 толщиной 8 мм. Разная
толщина позволяет методом подбора выбрать такой фильтр, который
обеспечит при имеющейся окраске и интенсивности свечения объекта,
наиболее удобное для анализа изображение.
ц
Цвет объекта определяется цветом тех лучей, которые пропускает
объект. Известно, соединение всех цветов — белый цвет. Значит, можно
предположить, что если лучи белого света падают на объект, то часть
лучей поглощается, а часть — отражается. При этом глаз воспринимает
такой цвет, который является дополнительным к цвету поглощенных
лучей. Вместе эти части составляют опять белый цвет. Смена цветов,
которая соответствует смещению полосы поглощения от фиолетового
до красного, в химии красителей носит название углубление цвета, об-
ратная последовательность носит название повышение цвета. Погло-
щающий объект (вещество) характеризуется как спектральной полосой
поглощения, так и ее интенсивностью. Интенсивность воспринимается
глазом как насыщенность окраски.
Таблица 17.4
Цвета соединений
Область поглощения, нм Цвет поглощенного света Цвет объекта (вещества) Изменение цвета
Углубление цвета Повышение цвета
400-435 фиолетовый желто-зеленый А т
435-480 голубой желтый
480-490 зеленовато- голубой оранжевый
490-500 голубовато- зеленый красный
500-560 зеленый пурпурный
560-580 желто-зеленый фиолетовый
580-595 желтый голубой
595-605 оранжевый зеленовато- голубой
605-750 красный голубовато- зеленый
318
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Таблица 17.5
Цветовые зоны видимого спектра
Цвет Пределы X, нм Ширина участка, нм
Фиолетовый 390-450 60
Синий 450-480 30
Голубой 480-510 30
Зеленый 510-550 40
Желто-зеленый 550-585 25
Желтый 575-585 10
Оранжевый 585-620 35
Красный 620-800 100
Таблица 17.6
Функция видимости дневного зрения для различных длин волн
Длина волны, нм 400 440 480 520 560 600 640 700
Видимость излучения 0,0004 0,023 0,139 0,710 0,995 0,631 0,175 0,004
В табл. 17.4 представлены цвета соединений, каждый из которых
имеет одну полосу поглощения в видимой части спектра.
Поглощение обычно имеет максимум при определенной длине вол-
ны (Хтах) и снижается по обе стороны от него. Спектр поглощения ха-
рактеризуется полушириной ДХ в нм (нанометр) — ширина полосы
поглощения на уровне 0,5 от максимального. Спектр поглощения орга-
нических красителей представляет собой наложение нескольких полос
поглощения. В солнечном спектре глаз различает 7 радужных цветов
и оттенков. При длине волны около 445 нм находится граница между
фиолетовым и синим цветом; около 460 нм — между синим и голубым;
около 500 нм — голубым и зеленым; около 540 нм — зеленым и желтым;
около 600 нм — желтым и оранжевым (табл. 17.5).
Предполагается, что в сетчатке имеется три различных вида свето-
чувствительных элементов, каждый со своей особенно широкой поло-
сой возбуждения. Если, например, на сетчатку падает красный цвет, то
затрагиваются все 3 элемента, все они поглощают красный цвет, но в
разной степени (табл. 17.6).
Глаз чувствует эту разницу, что и сопровождается ощущением крас-
ного цвета. Зеленый цвет также возбуждает все три элемента, но в иных
319
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
Таблица 17.7
Основные спектральные линии
Обозначения Длина волны, нм Цвет
i 365,00 темно-фиолетовый
h 404,36 фиолетовый
g 435,83 сине-фиолетовый
f 479,99 СИНИЙ
f 486,13
F 486,00 зеленый
e 546,07
d 587,56 желто-оранжевый
D 589,29
c’ 643,85 красный
c 656,27
c 656,00
R 706,52 темно-красный
отношениях, чем красный. Ощущение суммы возбуждений во всех трех
элементах соответствует яркости падающего света. Ощущение отно-
шений возбуждений во всех трех элементах соответствует ощущению
цвета. Если бы оставался только один элемент, то об отношениях не
было бы смысла говорить, т. е. не было бы ощущения цвета, хотя впе-
чатление яркости оставалось бы по-прежнему. Такое представление хо-
рошо объясняет возможность сложения любого цвета из трех других;
или случай цветовой слепоты, когда глаз теряет ощущение цветности в
некоторых участках спектра и т. д. (табл. 17.7).
Ш
Штатив [нем. Stativ, лат. Statuvus — стоящий} — 1) вертикальная
подставка (стойка) для крепления; 2) устройство для установки и за-
крепления.
Э
Эксцентрик [фр. excentrique;лат. ех — из, вне + centrum — центр] —
вращающаяся часть машины или механизма в форме диска (цилиндра),
320
Глава 17 Словарь-справочник микроскописта
ось вращения которой не совпадает с центром диска; служит обычно
для преобразования вращательного движения в поступательное.
Экстинкция [extinctio — гашение] — ослабление световых потоков,
проходящих сквозь какую-либо среду, результат комбинированного
действия рассеяния и поглощения.
Эмиссия [лат. Emission — испускание, излучение] испускание фото-
нов, электронов, ионов и др. частиц нагретыми телами или телами, на
которые действуют внешние электрические и электромагнитные поля
или потоки быстрых частиц.
Эпи... [гр. Epi] — предлог: на, над, сверх, после.
Эри кружок — безаберрационная система изображает светящуюся
точку в монохроматическом свете в виде дифракционной фигуры, со-
стоящей из центрального яркого пятна (кружка Эри) диаметром 2x3,83
оптических единиц, в котором освещенность быстро убывает от центра
к периферии, и ряда светлых концентрических колец, разделенных тем-
ными промежутками, в которых освещенность падает до нуля.
321
ПЕЧЕСТВЕННЫЕ МИКРОСКОПЫ
И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ
Световые микроскопы являются одними из основных приборов при исследовании
биологических объектов от макро — до микромира. Наверное, справедливо будет сказать,
что микроскоп в данном случае является основным вспомогательным прибором, работающим
как на благо развития, познания нашего мира, так и для защиты и предупреждения болезней
и биологических катастроф. Нельзя допускать исчезновения технологии производства и
теоретических разработок наших ученых в области оптического приборостроения.
Эта глава посвящена отечественным приборам, в основном, разработкам 70-х и 80-х годов
прошлого столетия, микроскопам, которые находятся в обращении до сих пор.
То, что появилось в начале XXI века, уже не совсем наше...
18.1. ОСВЕТИТЕЛИ
До сих пор в нашей огромной стране можно увидеть все типы осве-
тителей, которые применялись в XIX-XX веках: зеркало, автономный и
накладной осветители. Но ими так же надо уметь пользоваться, как и
современными встроенными осветителями.
Для микроскопов со встроенным освещением проблемы комфорт-
ности наблюдения и соблюдения основных законов оптики не сущест-
вует. Но если микроскоп имеет осветительное зеркало, то для работы,
особенно с различными методами контрастирования, необходимо при-
менять специальный осветитель для микроскопа, а не настольную или
потолочную лампу. А если в процессе работы требуется фотографиро-
вание, то микроскоп должен быть снабжен накладным осветителем, ра-
ботающим по принципу Келера.
Ранее у нас выпускались автономные осветители типа ОИ-9М, ОИ-
19, ОИ-24, которые можно найти в учебных институтах и старых лабо-
раториях. В настоящее время отечественная промышленность выпус-
кает накладные осветители ОИ-32 и ОИ-35. Все они устанавливаются
на микроскопах серии ВИОЛАМ Р, С и МИКМЕД 1.
322
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Настройка освещения с помощью автономных осветителей
0 0 Применение осветителей типа ОИ-19 или настольных ламп, ко-
торые устанавливаются на расстоянии около 250 мм от зеркала,
не обеспечивает точного совмещения центра нити и оптической
оси микроскопа. В этом случае все зависит от умения пользова-
теля настраивать освещение. Подобные осветители сняты с про-
изводства.
При работе с осветителями типа ОИ-9, ОИ-19, ОИ-24 или другой
аналогичной конструкции после установки их на расстоянии 250 мм
следует выполнять несколько правил:
• чтобы добиться резкого изображения нити лампы на зеркале мик-
роскопа, необходимо двигать лампу вдоль патрона;
♦ чтобы световой поток попал на зеркало, корпус осветителя необ-
ходимо разместить на стойке соответствующим образом по вы-
соте и наклонить;
• чтобы добиться размещения изображения нити по середине вы-
ходного зрачка объектива (большая сторона прямоугольника
должна быть горизонтальна), следует развернуть патрон лампы в
корпусе;
♦ увеличенное изображение нити может быть вписано в зрачок.
Характеристики отечественных серийных накладных осветителей
Накладные осветители ОИ-32 и ОИ-35 — это малогабаритные ис-
точники искусственного света, обеспечивающие оптимальное осве-
щение. Они устанавливаются на основании микроскопа и в опреде-
ленной степени гарантируют, что центр нити лампы находится на
оптической оси самого микроскопа.
В малогабаритном осветителе ОИ-32 в качестве источника света при-
меняется лампа накаливания 220V, 15W (110V, 15W).
Осветитель ОИ-35 предназначен для освещения объектов в прохо-
дящем свете по методу Келера. В качестве источника света использу-
ется галогенная лампа 6V 20W, в вынесенном блоке питания предус-
мотрена регулировка интенсивности света. Нить лампы имеет вид
прямоугольника, и одной из основных задач, которую надо решить,
является заполнение выходного зрачка микрообъектива изображе-
нием нити лампы. При этом большая сторона прямоугольника рас-
полагается горизонтально.
f Наблюдение настройки освещения проводится при вынутом окуляре.
323
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Технология настройки освещения при работе
с накладными осветителями типа ОИ-32, ОИ-35
Осветитель ОИ-32:
1. снять зеркало с микроскопа;
2. установить в отверстие на основании накладной осветитель та-
ким образом, чтобы он был устойчив;
3. обязательно положить на коллекторную линзу матовое стекло, так
как нить лампы имеет «М» -образный вид, что создает сильную
неравномерность освещенности в поле наблюдения объекта.
Микроскоп готов к работе!
Осветитель ОИ-35 (настройка осветителя производится вне мик-
роскопа):
1. поставить осветитель на стол так, чтобы положение его было ус-
тойчивым;
2. включить осветитель;
3. положить на выходное отверстие осветителя белый лист бумаги;
4. спроектировать четкое изображение нити лампы при полностью
открытой полевой диафрагме: движением лампы вдоль патрона,
вращая рукоятку подвижного коллектора;
5. расположить длинную сторону прямоугольника изображения нити
вдоль длинной части осветителя с помощью винтов при патроне;
6. привести изображение нити с помощью 2-х винтов при наклон-
ном зеркале в центр выходного отверстия;
7. прикрыть полевую диафрагму для даль-
нейшей настройки;
8. аккуратно поставить осветитель на ос-
нование микроскопа типа БИОЛАМ Р,
С, Д или МИКМЕД 1;
9. добиться резкого изображения объекта
с помощью рукояток грубой и тонкой
фокусировки;
10. убрать из хода лучей нижнюю линзу
конденсора (линзу большого поля);
11. добиться резкого изображения полевой
диафрагмы осветителя движением кон-
денсора вверх-вниз;
12. открыть полевую диафрагму до размера
Рис. 18.1. Микроскоп Микмед 1 с
осветителем ОИ 35
поля видения;
324
Глава 18 Оте»- с-с~чен ,3:е -лгхс-агь1 г принадие;-
13. вынуть один из окуляров;
14. проверить заполнение светящегося
отверстия (выходной зрачок объек-
тива) изображением нити (оно долж-
но быть четким и центрированным
относительно отверстия);
15. продолжая наблюдать, с помощью
рукоятки прикрыть апертурную диа-
фрагму конденсора на ¥з от светяще-
гося отверстия;
16. вставить окуляр на место.
Рис. 18.2. Люминесцентный освети-
тель ОИ 28 с галогенной лампой, на-
бором светофильтров и специальных
объективов
Микроскоп готов к работе!
Помните, если в конденсоре установлено матовое стекло, то нить
5“# лампы не будет видна при вынутом окуляре. Если нить лампы нахо-
дится в центре, то светящееся отверстие при этом будет равномерно
освещено. Если нить не отцентрирована, то будет наблюдаться яркое
пятно и снижение освещенности при удалении от него.
f Вывести из хода лучей матовое стекло. Проверить заполнение выход-
♦ ного зрачка объектива изображением нити.
Конструкции крепления накладных осветителей зарубежных моде-
лей имеют стопорные винты или конструктивные элементы, которые
позволяют жестко устанавливать осветитель на основание.
Характеристики отечественного съемного люминесцентного ос-
** ветителя ОИ-28
В комплект осветителя входят: 4 ахроматических люминесцентных
объектива, светофильтры, собственно осветитель и блок питания.
Комплект люминесцентных объективов-ахроматов рассчитан на дли-
ну тубуса 160 мм и работает с покровным стеклом толщиной 0,17 мм.
Высота объективов — 33 мм. В комплект входят два сухих «объекти-
ва» и два иммерсионных — водной и масляной иммерсии.
Состав светофильтров осветителя:
♦ светофильтр возбуждения ФС-1 (толщиной 0,5; 1,0; 2,0 мм) для
выделения из общего излучения источника света сине-фиолето-
вых лучей, возбуждающих видимую люминесценцию объектов;
♦ сменные фильтры — теплозащитные СЗС24 и СЗС21, а также
светофильтр БС8, которые устанавливаются там же, где и возбуж-
дающий фильтр;
325
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
♦ запирающий светофильтр ЖС18, склеенный со светофильтром
ЖЗС19, который крепится на оправе ахроматической линзы ос-
ветителя. Линза является частью тубусной системы микроско-
па (т. е., увеличивает оптический ход лучей для получения общей
длины тубуса 160 мм), она расположена между объективом и на-
садкой и имеет собственное увеличение 1,8х.
Комплект светофильтров осветителя отличается по составу от ком-
плекта светофильтров люминесцентного микроскопа. Это связано
с использованием менее мощного источника света — галогенной
лампы, которая имеет значительно меньший спектральный диапа-
зон длин волн, чем ртутная лампа, и в основном, в видимой части
спектра.
Источник света — малогабаритная кварцевая лампа накаливания КГМ9-
70В. В сочетании со светофильтрами осветитель обеспечивает спект-
ральный диапазон возбуждения люминесценции от 400 до 440 нм, спек-
тральный диапазон исследуемой люминесценции от 500 до 700 нм.
18.2. НАСАДКИ
До сих пор специалисты в поликлиниках и больницах пользуются
монокулярными насадками. Отечественные микроскопы могут быть
укомплектованы бинокулярными насадками типа АУ-12 и тринокуляр-
ной микрофотонасадкой МНФ 11 (бинокуляр — для наблюдения и тре-
тий выход — для фото). Кроме того, можно использовать специальные
насадки для учебного процесса и демонстрации.
Характеристики отечественных серийных насадок
Бинокулярная насадка АУ-12 предназначена для наблюдения обо-
ими глазами, имеет собственное увеличение 1,5х и устанавливает-
ся на микроскопах, в которых собственная насадка — монокулярная
(БИОЛАМ Р-11, С-11, вариант МИКМЕД 1).
Микрофотонасадки обеспечивают наблюдение и фотографиро-
вание микроскопических объектов с помощью микроскопов, вы-
пускаемых фирмой ЛОМО. Это микроскопы различных классов
сложности серии БИОЛАМ, БИМАМ, ЛЮМАМ (для ЛЮМАМ
РПО — вариант МФН-11М), ПОЛАМ, МЕТАМ. Фотографирова-
ние производится с помощью пленочной фотокамеры, размер кад-
ра 24x36 мм (рис. 18.3).
Камеры ручные типа ЗЕНИТ:
а) МФН-12 — монокулярная насадка с выходом на 35-мм фотока-
меру, увеличение сменных окуляров — 7х и 10х.
326
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
б) МФН-11 — бинокулярная насадка
с выходом на 35-мм фотокамеру, име-
ет дополнительную сменную систему
увеличения 1,1х-1,6х-2,5х; увеличение
проектива — 2,4х.
В микро фото-насадке обеспечиваются
следующие варианты светоделения:
1 20% света попадает в визуальный канал,
80% — поступает в фотоканал;
2 100% света попадает в визуальный ка-
нал.
Рис. 18.3. Микрофотонасадки:
а-бинокулярная МФН11;6-моно-
кулярная МФН12 со светофильтрами
и фотоокулярами
18.3. УСТРОЙСТВА ДЛЯ РЕАЛИЗАЦИИ МЕТОДОВ КОНТРАСТИРОВАНИЯ
Также как осветительные системы, элементы микроскопа для получе-
ния различных методов контрастирования тесно связаны с конструкци-
ей микроскопов, в частности с объективами и конденсорами (рис. 18.4).
Характеристики отечественного конденсора косого освещения
(рис. 18.4 в)
До сих пор в микроскопах Биолам Р, С, Д в качестве конденсора
используется апланатический конденсор прямого и косого осве-
щения ОИ-14. Правда, мало кто об этом догадывается. Конден-
сор ОИ-14 как часть осветительной системы применяется для
увеличения контраста изображения малоконтрастного объекта
за счет изменения угла падения света от отдельно стоящих ос-
ветителей при использовании зеркала (вместо смещения или на-
клона зеркала), а также при работе с накладными и встроенными
осветителями для микроскопов серии БИОЛАМ Р, С, Д и МИК-
МЕД-1.
Апертура конденсора с двумя лин-
зами (фронтальной и параболичес-
кой) — 1,4; с одной линзой (большого
поля) — 0,3. Пределы перемещения
ирисовой апертурной диафрагмы
перпендикулярно оптической оси
микроскопа для получения косого ос-
вещения — ± 10 мм. Угол разворота
ирисовой апертурной диафрагмы —
от 0 до 150°.
: a lilifill J IfillfJJ| в IIS»
Рис. 18.4. Комплект конденсоров к микроско-
пу Виолам ВС,Д/Микмед 1:
а - темнопольный ОИ13; 6-светлопольный Аббе;
в - светлопольный и косого освещения ОИ 14
327
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Характеристики отечественного кон-
денсора темного поля (рис. 18.4 а)
Темнопольный кардиоид-конденсор ОИ-
13 для микроскопов серии БИОЛАМ Р, С,
Д имеет числовую апертуру А=1,2 и состо-
ит из сферического зеркала и линзы-кар-
диоида. Применяется темнопольный кон-
денсор, как с объективами сухих систем,
так и с иммерсионными объективами.
Рис. 18.5. Фазово-контрастное уст-
ройство КФ 4:
а - фазовый конденсор; 6-набор фа-
зовых объективов; в - дополнительный
микроскоп МИР 4 т -
Отечественные фазово-контрастные
устройства (рис. 18.5)
Для микроскопов БИОЛАМ Р, С, Д, МИК-
МЕД-1, МБИ-15, ЛЮМАМ Р-8 применя-
ется фазово-контрастное устройство КФ-4, для микроскопов нового
поколения ЕС БИМАМ Р, МИКМЕД-2 выпущено устройство КФ-4М.
В новом люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ РПО-11 фазово-
контрастное устройство имеет фазовые объективы с длиной тубуса
«бесконечность» и специальный конденсор, аналогичный специаль-
ному конденсору от КФ-4М. При работе с фазово-контрастным ус-
тройством на микроскопе серии БИОЛАМ Р, С, Д или МИКМЕД-1
применяют осветитель ОИ-35.
В отечественные фазово-контрастные устройства КФ-4 (с объек-
тивами высотой 33 мм), КФ-4М (с объективами высотой 45 мм) входят:
• специальный конденсор с числовой апертурой А=0,8 и набор
световых колец, соответствующих фазовым кольцам в объек-
тивах;
• комплект фазовых объективов-ахроматов, работающих с покров-
ным стеклом толщиной 0,17 мм, с фазовыми элементами внутри
и длиной тубуса 160 мм;
• дополнительный микроскоп МИР-4 для настройки микроскопа.
При исследовании в светлом поле можно применить желто-зеленый
светофильтр, который входит в комплект фазово-контрастного уст-
ройства.
f При правильной установке освещения изображение элементов объ-
* ектов в препарате должно получиться очень контрастным. При смене
объективов или препарата необходимо проверить совмещение коль-
цевой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива. Для
исследования методом фазового контраста предлагается готовить
влажные препараты типа «раздавленная капля».
328
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
18.4. ИЗМЕРЕНИЕ И СЧЕТ
Характеристики отечественных устройств для измерения и счета
Винтовой окулярный микрометр МОВ-1-16 состоит из окуляра,
неподвижной пластины со шкалой и подвижной пластины с пере-
крестием и биштрихом, которая перемещается в поле зрения окуляра
с помощью барабана микрометрического винта. Увеличение окуля-
ра — 16х, диапазон измерений от 0 до 8 мм, поле зрения окуляра —
11 мм, цена деления неподвижной шкалы — 1 мм, цена деления шка-
лы барабана — 0,01 мм.
Неподвижная шкала в поле зрения окуляра служит для отсчета пол-
ных оборотов барабана винта (целых миллиметров). Отсчет по не-
подвижной шкале определяется положением подвижного биштри-
ха, то есть количеством делений, на которые переместился биштрих,
считая от нулевого деления шкалы. Барабан по окружности разделен
на 100 частей, поворот барабана на одно деление соответствует пере-
мещению перекрестия на 0,01 мм. Барабан служит для отсчета со-
тых долей миллиметра.
Фотоэлектрический окулярный микрометр ФОМ-2
Это современный окулярный микрометр с микропроцессорным ус-
тройством и термопечатью результатов измерений и вычислений.
Микропроцессорное устройство позволяет производить сложные
вычисления по измеренным данным. В настоящее время ФОМ-2 вы-
пускается в упрощенном варианте без термопечати и с простым мик-
ропроцессором. Диапазон измерений — от 0 до 14 мм, увеличение —
6,3х; 12,5х; 16х.
Объект-микрометры
Объект-микрометры выполняют две функции — в качестве вспомо-
гательного инструмента для аттестации окулярного микрометра или
элементов микроскопа (например, определения увеличения объекти-
ва) и как контрольная пластина для оценки качества настройки осве-
щения (например, темного поля). Существует два типа объект-мик-
рометров — для проходящего и для отраженного света.
Объект — микрометр проходящего света (ОМП) предназначен
для аттестации микроскопа проходящего света при проведении из-
мерений. ОМП представляет собой прозрачную стеклянную пласти-
ну (предметное стекло), в центре которой расположен объект в виде
черного круга. В центре этого круга — черная шкала длиной 10 мм, на
которой нанесены 100 делений.
Объект-микрометр отраженного света (ОМО) предназначен для
аттестации микроскопа отраженного при проведении измерений.
329
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
ОМО представляет собой металлическую пластину по размерам со-
ответствующую предметному стеклу. В центральное отверстие вкле-
ен объект в виде несколько выступающего непрозрачного диска, с на-
несенным на него алюминиевым (высокоотражающим) покрытием. В
центре диска расположена прозрачная шкала длиной 10 мм со 100 де-
лениями. Препарат без покровного стекла. Объект-микрометр мо-
жет выполнять роль тестового объекта при настройке темного поля
в отраженном свете.
Рис. 18.6. Биологический мик-
роскоп Микмед б (ОАО ЛОМО,
Россия)
18.5. МИКРОСКОПЫ
Парк микроскопов ОАО АОМО для медико-биологических иссле-
дований включает в себя следующие приборы:
• серия МИКМЕД-1 (в четырех вариантах исполнения, хотя на
рынке предлагают 6) — это самые простые и недорогие модели,
широко применяемые в медицине, биологии, в средних и высших
учебных заведениях;
• серия МИКМЕД-2 представлена тремя
моделями профессиональных микро-
скопов (в том числе двумя люминесцен-
тными);
• новые микроскопы МИКМЕД-5 и
МИКМЕД-6 (рис. 18.6) предназначе-
ны для проведения биохимических,
патологоанатомических, цитологичес-
ких, гематологических, урологических,
дерматологических, биологических и
общеклинических исследований в ла-
бораториях медицинских учреждений
любого уровня;
• серия БИОЛАМ П представлена двумя специализированными
моделями инвертированных микроскопов для исследования кле-
точных культур,
• поляризационный микроскоп ПОЛАМ Р-211М и ПОЛАМ Л-213 М.
Рассматривается возможность выпуска микроскопа МИКМЕД 61 и
микроскопа с проекционной насадкой МИКРОВИЗОР™.
В табл. 18.1 представлены основные параметры биологических пря-
мых микроскопов.
1 Микроскопы имеют небольшое отличие по качеству изображения. Пожалуй, основ-
ным отличием можно назвать комплектацию мод. МИКМЕД б отечественными объектива-
ми от микроскопа МИКМЕД 2.
330
IaJ
IaJ
Таблица 18.1
Основные параметры биологических прямых микроскопов
Модель МИКМЕД 1 (вар. 6) МИКМЕД 1 (вар. 2-20) МИКМЕД 2 МИКМЕД 2 (ЛЮМАМ РПО 11) МИКМЕД 2 (ЛЮМАМ РПО 12 МИКМЕД 5
Общее уве- личение 50х-1800х 150х-1500х 40-1500 63-1500х 40-1000х
Визуальная насадка Бино —- АУ 12 и моно — верти- кальная с выдвиж- ным тубусом Бино — АУ12 Бино — (1х) Бино — (1х) Бино — (1х) Бино — (1х)
Револьверное устройство 4-х гнездное 4-х гнездное 4-х гнездное 4-х гнездное 5-ти гнездное 4-х гнездное
Объективы Апохромат: 10x0,30; 20x0,65; 90x1,3 МИ 60x1,0 ВИ Ахромат: 10x0,20; 40x0,65; 100x1,25 МИ 4x0,12; 10x0,30; 40x0,65; 100x1,25 МИ Микрофлюар Стигмахро- мат 10х/0,50; ЮОх/1,ЗОМИ 20х/0,45; 40х/0,65; 40х/0,65* Микрофлюар Стигмахро- мат 10х/0,50; 20х/0,70; 40х/0,85; 100х/1,30МИ; 100х/1,20ВИ 40х/0,65; 40х/0,75ВИ* Ахромат: 4х/0,10 10х/0,25 40х/0,65 100х/1,25МИ
Окуляр 7х/18; 7х/18 со шкалой; 5х/22 10х/18 10х/18; 15х/11 6,Зх/18; 10х/18; 15х/12; 15/10 с сеткой 10х/18
Глава 18 Отечественные микроскопы и
332
Таблица 18.1 (Окончание)
Модель МИКМЕД1 (вар. 6) МИКМЕД 1 (вар. 2-20) МИКМЕД 2 МИКМЕД 2 (ЛЮМАМ РПО 11) МИКМЕД 2 (ЛЮМАМ РПО 12 МИКМЕД 5
Предметный стол Круглый вращаю- щийся с коорди- натным перемеще- нием Прямоуголь- ный с коорди- натным пере- мещением Прямоуголь- ный, двухко- ординатный Двухкоординатный с препа- ратоводителем Двухкоор- динатный с препарато- водителем; диапазон пе- ремещения 70x30 мм
Конденсор А =1,25 А = 1,25 А = 0,9/0,3 А = 0,9 (вар. 12 —для ФК) Аббе, А =1,25
Источник света Зеркало Встроенная лампа 20Вт Встроенная галогенная, 6В 25Вт Встроенная галогенная, 6В 25Вт Ртутная лампа ДРШ100. Ртут- ная лампа HB-100W/2. Галогенная лампа нака- ливания 6V, 20W
Спектраль- ный диапазон возбуждения люминесцен- ции, нм — — — 400 - 550 360 - 550
Спектраль- ный диапазон исследуемой люминесцен- ции, нм —- — 500 — 700 400 - 700
без покровного стекла
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
18.5.1. ОТ СТАРОГО МИКРОСКОПА К НОВОМУ
Подберем оптику для двух объективов: сухого объектива (40x0,65)
и иммерсионного объектива большого увеличения с разными пара-
метрами (90x1,25МИ и 100x1,25МИ), которые входят в комплект трех
микроскопов БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15 и МИКМЕД-2.
Расчет оптики для сухого объектива
1. Микроскоп БИОЛАМ Р-15 с бинокулярной насадкой АУ-12, кото-
рая имеет собственное увеличение 1,5х.
Числовая апертура объектива — АОб= 0,65:
♦ нижний предел увеличения микроскопа — 500 х 0,65= 325х;
♦ верхний предел увеличения микроскопа — 1000 х 0,65 = 650х;
♦ общее увеличение объектива и бинокулярной насадки — 40 х 1,5
= 60х;
♦ минимальное рабочее полезное увеличение — 325: 60 = 5,4х;
♦ максимальное рабочее полезное увеличение — 650:60 = 10,8 х.
Общий вывод: для работы с объективом 40х в условиях микроско-
па БИОЛАМ Р-15 можно использовать окуляры увеличением от 5х до
10х. Серийно АОМО выпускает окуляры компенсационные 5х (АМ-
24), 6,3х (АКШ-6,3 — из нового поколения), 7х (AM-13), 8х (АКШ-8) и
10х (АМ-14 или АКШ10/18 из нового поколения). В комплектах зару-
бежных микроскопов вы найдете только окуляры 6,3 х и 10 х.
2. Для микроскопа БИОЛАМ Р-11 расчет будет несколько другим.
Собственное увеличение монокулярной насадки 1х, значит, в расчет
будем брать только увеличение объектива 40х. Из диапазона полезно-
го увеличения микроскопа от 325 х до 650х увеличение окуляра нахо-
дится в диапазоне 8х-16,2х. Из серийных компенсационных окуляров
подойдут 8х (АКШ-8), 10х (АМ-14 или АКШ10/18), 12,5х (АМ-18), 15х
(АМ-27), 16х (АКШ-16 из нового поколения); из комплектов зарубеж-
ных микроскопов — 10х, 12,5х и 16х. Те же результаты будут и при
подборе окуляров для работы с микроскопом МИКМЕД-2 и для всех
современных зарубежных микроскопов.
Иначе обстоит дело с объективами масляной иммерсии.
Здесь при равенстве числовых апертур есть разница в увеличениях
объективов: 90х и 100х. Как мы выяснили выше, полезное увеличение
объективов одинаковое и лежит в пределах 625х-1250х.
Вот как будет выглядеть подбор окуляров (табл. 2).
В скобках указаны окуляры, которые соответствуют расчету, однако
не соответствуют современной комплектации микроскопов.
Ниже приведена таблица, которая поможет вам подобрать:
333
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Таблица 18.2
Подбор окуляров
БИОЛАМ Р-11 БИОЛАМ Р-15 МИКМЕД-2
Увеличение объектива 90х 90х 100х
Числовая апертура 1,25 1,25 1,25
Увеличение насадки 1х 1,5х 1х
Нижний предел увели- чения 625х 625х 625 х
Верхний предел увели- чения 1250х 1250х 1250х
Минимальное увеличе- ние окуляра2 (7х) 10х (5х) 10х (6,3х) 10х
Максимальное увеличе- ние окуляра (12,5х) 10х 10х (12,5х) 10х
♦ окуляр в зависимости от объектива,
♦ объектив и окуляр в зависимости от требуемого увеличения,
♦ объектив и окуляр в зависимости от требуемого разрешения
(речь идет о числовой апертуре объектива — она является опре-
деляющей).
В табл. 18.2 выделены два комплекта объективов — старый, кото-
рым комплектуются микроскопы БИОЛАМ Р, С, Д (МИКМЕД-1), и
новый (он указан со звездочкой), относящийся к микроскопам БИ-
МАМ Р и МИКМЕД-2. В таблице указаны окуляры, которыми следует
пользоваться при работе с тем или иным объективом, без ущерба для
качества изображения. При этом комплект окуляров, используемый в
микроскопах с бинокулярной насадкой АУ-12 (собственное увеличе-
ние 1,5х), несколько отличается от комплекта окуляра, работающего с
монокулярной и бинокулярной насадкой нового поколения, у которой
собственное увеличение — 1х.
Обратите внимание, в новом комплекте, который отвечает меж-
дународным стандартам, чаще всего встречается окуляр 10 х. Это
действительно наиболее применяемый окуляр, а главное, он создает
комфортные условия наблюдения для глаз. Принято считать, что по-
лезное поле видения (поле на расстоянии 250 мм от объекта) состав-
ляет 180-250 мм.
В табл. 18.3 приведены значения линейного поля отечественных
серийных окуляров, которые входят в комплекты БИОЛАМ Р, С, Д и
МИКМЕД-1, а также в ЛЮМАМ.
334
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Таблица 18.3
Значения линейного поля отечественных серийных окуляров
Тип Шифр Увеличение Линейное поле, мм
Компенсационный АМ-12 5х 22
АМ-13 7х 18
AM-14 10х 13
АМ-27 15х 11
Широкоугольный* АКШ-10/18 ’ 10х 18
Гюйгенса АМ-10 10х 14
М-10 10х 14
М-7 7х 18
Измерительный АТ-38 15х 13
Окуляр с указателем АТ-34 10х 15
Рассчитаем линейное поле на объекте, которое мы реально наблю-
даем в конкретный окуляр.
Линейное поле широкоугольного окуляра 10х составляет 18 мм.
При работе с монокулярной насадкой и объективом 40х линейное поле
на объекте составит:
18:40 = 0,45 (мм).
При работе с бинокулярной насадкой АУ-12, увеличение которой
1,5х, с тем же объективом поле на объекте будет равно:
18:40-1,5 = 0,21 (мм).
18.5.2. НАБОР СВЕТОФИЛЬТРОВ НОВОГО ОТЕЧЕСТВЕННОГО МИКРОСКОПА
МИКМЕД 2, ВАР. 11 (ЛЮМАМ РПО-11)
Набор светофильтров для люминесцентного микроскопа второго
поколения ЛЮМАМ Р-8 представляет собой более технологически
усовершенствованные системы. Часть светофильтров вошла в новый
микроскоп. О них мы и будем говорить.
На рукоятке направляющей с пластиной обычно нанесено условное
наименование, соответствующее спектральной области пропускаемо-
го в систему наблюдения света, то есть цвету люминесценции объек-
та. Три направляющие с пластинами «ЗЕЛЕНАЯ» — «ЗЕЛЕНАЯ-2» —
«КРАСНАЯ» обеспечивают оптимальные условия для возбуждения
люминесценции наиболее распространенных в практической работе
335
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Таблица 18.4
Параметры светофильтров от микроскопа ЛЮМАМ Р8
Элементы Параметры Исследуемая люминесценция
ультрафи- олетовая Сине- голубая желто- зелено- красная красная
Возбуждающий светофильтр марка стекла УФС6 УФС 6 ФС 1 (СС 15) ЗС11
толщина 3 мм; 5 мм 3 мм; 5 мм 2 мм, 4 мм, 6 мм (2-4 мм) 3 мм
Запирающий светофильтр марка стекла УФС 2+ БС4 же 3+ БС8 ЖС 18+ ЖЗС 19 КСИ
цвет Черный бесцветный желтый красный
Светоделитель- ная пластина (полупрозрачное зеркало) область отражения 250- 290 нм 300-360 нм 360-440 нм (450-440 нм) 530- 570 нм
область пропускания 320- 400 нм 420-500 нм 480-700 нм (520-560 нм) 600- 700 нм
маркировка Ультрафи- олетовая голубая зеленая (зеленая 2) красная
флуорохромов: АКРИДИНОВОГО ОРАНЖЕВОГО, ФЛУОРЕСЦЕ-
ИНИЗОТИОЦИАНАТА (ФИТЦ), РОДАМИНА и др., которые возбуж-
даются ФИОЛЕТОВЫМ, СИНИМ, ГОЛУБЫМ или ЗЕЛЕНЫМ светом.
Направляющая с пластиной «ГОЛУБАЯ» обеспечивает наблюдение го-
лубой люминесценции при возбуждении длинноволновым ультрафио-
летовым излучением с Хмах = 365 нм.
В табл. 18.4 и 18.5 приведены параметры светофильтров от микроско-
па ЛЮМАМ Р8, а также рекомендуемые сочетания светофильтров и по-
лупрозрачной пластины при использовании различных флуорохромов1.
18.5.3 НОВОЕ ЦИФРОВОЕ КАЧЕСТВО — ВСЕ ЕЩЕ ВПЕРЕДИ
Новый тип микроскопа — МИКРОВИЗОР (рис. 18.7) представляет со-
бой микроскоп с видеоголовкой и цифровой видеокамерой, а также пол-
ноцветным VGA-монитором. Видеоголовка имеет разъем для флэш-карты
и позволяет сохранять наблюдаемое изображение объектов. Управление
всеми функциями видеоголовки производится с помощью стандартного
манипулятора — «мышки». Встроенный порт USB позволяет передавать
данные в «реальном времени» внешней IBM-совместимой ЭВМ.
1 Эти рекомендации были даны к. т. н. Барским И. Я.
336
Таблица 18.5
Рекомендуемые сочетания светофильтров и полупрозрачной пластины при использовании различных флуорохромов1
Направляющая Спектральная характеристика светодели- тельной пластины, нм Рекомендуемые светофильтры Пример
область отражения >90% область пропускания >90% для возбуждения люминесценции отрезающий (запирающий) флуорохромов
Зеленая от 400 до 440 от 500 до 700 ФС1-5 ФС1-2 ФС1-4 ФС1-6 ФС1-8 ЖС18-2 и ЖЗС 19 ЖС18-3 и ЖЗС 19 Акридиновый оранжевый, Оливомицин, Аурамин-502, Quinacrine mustard (QM)
Зеленая 2 от 450 до 480 от 520 до 700 Х450-480 СС15-3 СС15-5 СС15-6 ОС 11-2 Х520-560 ФИТЦ
Красная от 520 до 550 от 610 до 700 Х546 ЗС11-2 ЗСП-З КС 11-2 КС 13-1 КС 13-2 ОС 14-2 ОС 14-4 Родамин, Генатопорфи- рин хлорофил- ла, Texas Red
Голубая От 340 до 370 От 425 до 500 УФС 6-5 УФС 6-3 УФС 6-8 ЖСЗ БС8 DAPI, Hoechst, Натехоламин
Эти рекомендации были даны к. т. н. Барским И. Я.
Глава 18 Отечественные микроскопы и
UJ
UJ
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Таблица 18.6
Характеристика микроскопа МИКМЕД б
Основной режим работы В проходящем свете
Методы наблюдения Светлое поле, темное поле
Револьверное устройство Четырехгнездное
Объективы-ахроматы 4x0.10; 10x0.25; 40x0.65; 60х0.858;100х1.25 МИ
Увеличение 40-1000/1600*
Визуальная насадка Бинокулярная с фотовидеовыходом
Окуляры 10х/18; 16х/15
Конденсор А=1,25
Предметный столик, диапа- зон перемещения, мм Двухкоординатный с препаратоводителем, 76x50 мм
Источник света — галоген- ная лампа 6В, 20Вт
Видеоматрица 1.3 мегапиксела, цветная
ЖК монитор 6,4», цветной, разрешение 640 х 480
Флэш-карта Стандарта SD или MMS
Управление Манипулятор «мышь»
Функции управления Экспозиция, яркость, усиление, баланс белого (ручной, автоматический)
Цифровое увеличение 2-х кратное
Виртуальная клавиатура QWERTY, рус. /лат.
Связь с внешней ЭВМ USB 2.0
Питание Сетевой адаптер ~ 220 V =12 V
Для МИКРОВИЗОРа базой является новый микроскоп МИКМЕД 61
(табл. 18.6).
МИКРОВИЗОР1 2 (рис. 18.7) может быть отнесен как к техническим
микроскопам, так и к биологическим. Насадка может быть установлена
на любой микроскоп и способна заменить как бинокулярное наблюде-
ние, так и цифровой фотоаппарат. Именно такими мы видим объекты на
экране монитора компьютера. Простота обращения и настройки гото-
вой к работе системы упрощена до состояния, позволяющего работать
с ней непрофессионалу в области цифровой обработки изображения.
1 Микроскоп китайского производства, сборка ОАО ЛОМО, прошел сертификацию
М3 РФ.
2 Разработка прибора и насадки принадлежит группе сотрудников «ЛОМО-Фотоник»
во главе с канд. физ.-мат. наук Лопатиным А. И. Микроскопы выпускает ОАО ЛОМО
338
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Рис. 18.7. Новый цифровой мик-
роскоп с насадкой МИКРОВИЗОР
(ЛОМО-ФОТОНИК, Россия)
растное изображение с
Сохранение изображения в процессе работы
на флэш-карту, перенос его в компьютер для
дальнейшего сохранения, обработки или пе-
редачи по E-mail является привлекательным и
удобным.
Качество изображения биологических объ-
ектов (насекомых, рыб, растений) удовлетвори-
тельное, при этом отмечается достаточно высо-
кая четкость и контраст, а также цветопередача
однотонных объектов.
На рис. 18.8 представлен небольшой экспе-
римент, проделанный с фрагментом насекомо-
го. Сначала было снято реальное изображение
(я), затем была произведена цифровая обра-
ботка (доли секунды) и было получено конт-
соответствующим разрешением (б). Введение
цифрового увеличения в 2 раза дает дополнительный эффект от наблю-
дения. При этом процесс обработки и дополнительного увеличения не
требует больших усилий со стороны оператора (работа с мышкой в два
перехода). В изображении наблюдаются засветки и неравномерность,
связанные с некачественной настройкой осветительной системы мик-
роскопа. После того, как микроскоп был настроен с одним объективом,
переход на другой не изменил картины, которая по-прежнему оста-
валась высокого контраста и разрешения. Интересно, что с помощью
Рис. 18.8. Эффект контрастирова-
ния на микроскопе МИКРОВИЗОР:
а - изображение объекта с помощью
микроскопа проходящего света;
6 - изображение объекта с помо-
щью цифровой обработки програм-
мы насадки - объективы 10х и 40х
(слева -1х; справа - 2х)
339
Глава 18 Отечественные микроскопы и принадлежности
Рис. 18.9. Наблюдение;биомеди-
цинского препарата:О«||й
а - изображение объекта с микро-
скопа проходящего света; (жуйфро-
вая обработка изображения .й? ей?
«мышки» возможно создание эффекта псевдообъемности, что пред-
ставляет интерес при работе с неокрашенными препаратами.
После цифровой обработки биомедицинского препарата происходит
усиление контраста (рис. 18.9) с достаточно точной цветопередачей.
Следует обратить внимание на то, что качество изображения еди-
ной системы «микроскоп — цифровая насадка» во многом зависит от
качества изображения и настройки микроскопа.
Так как насадка представляет собой автономный узел, то установка
ее на микроскопы класса не выше лабораторного различной конструк-
ции и конфигурации посредством соответствующих переходников поз-
воляет надеяться на значительное улучшение в качестве изображения
по полю.
340
ПОСЛЕСЛОВИЕ:
ИСТОРИЧЕСКОЕ ЭССЕ1
Вместо за кл ючен ия хотелось бы: оста но виться и оглянутйя назад; длятодо, чтобы идти вперед.
За достаточно непродолжительный исторический срок вобластиадикросШостроения наща|т
страна многое приобрела и многое пртерялодНельзя забЬ1вОРвлЯ^ принесло нашему';|
Отечеству славу, к чему; конечно;относится оптическая-наукаИройшленнК^
ЧТО БЫЛО ДО НАС...
Получение прозрачного стекла было извес-
тно древним египтянам и жителям Месопота-
мии за 1600 лет до н. э. В древнем Риме стек-
лянная утварь и украшения достигли высокого рц(_ ?
совершенства. Науке античной древности не Монокулярный
были известны оптические свойства линз, а микроскоп
ее представления о световых явлениях и про- фирмы
цессе зрения были противоречивы и наивны. Carl Zeiss,
Только в начале эпохи Возрождения (XIII век конец XIX в.
н.э.) человечество получило первые оптичес-
кие приборы: очки и увеличительное стекло. В начале XVII столетия
были изобретены микроскоп и зрительная труба. Более 300 лет тому
назад Левенгук впервые применил микроскоп для изучения биологи-
ческих объектов.
Научная проработка задач оптического приборостроения нача-
лась с конца XVII столетия, благодаря трудам: Р. Декарта (1596-1650),
П. Ферма (1601-1665), И. Ньютона (1643-1727), Л. Эйлера (1707-1783),
М.В. Ломоносова (1711-1765) и К. Гаусса (1777-1855). Однако форми-
рование теории оптических приборов в самостоятельную дисциплину
1 Эссе (франц, essai — попытка, проба, очерк, от лат. exagium — взвешивание) — про-
заическое сочинение небольшого объема и свободной композиции, выражающее индивиду-
альные впечатления и отображения.
341
Рис 2. Оптические мастерские и торговый дом фирмы Carl Zeiss, откры-
тый в 1903 г. в Санкт-Петербурге (Казанская ул., д.2)
ZEISS
— МЦКРОСКопь1 =
. . ъ V
гис. 3. Реклама начала века
на биологический микроскоп,
штатив V,
фирмы Carl Zeiss
произошло только в последней
5 четверти XIX в., когда начался
быстрый рост оптической про-
мышленности.
В 1867 году на завод Карла
Цейса в г. Йене (Германия) при-
шел молодой ученый Эрнст Аббе.
За время работы он создал диф-
гас. < Карл Пенсе Рис 5. Эрнст Аббе ракционную теорию образова-
___ (1840-1905) ния изображения, показал роль
апертуры объектива и определил
предел разрешения светового микроскопа. В 1872 г. Аббе рассчитывает
ахроматические, а позднее сухие и иммерсионные апохроматические
объективы1.
Благодаря трудам М. В. Аомоносова и Л. Эйлера, в России еще в XVIII в.
были заложены важнейшие основы создания оптического приборостро-
ения. Однако в XIX в. и позднее оптическая промышленность долге годы
не получала надлежащего развития. В1903 году в Санкт-Петербурге были
1 В Йене, в музее Карл Цейс, созданном Эрнстом Аббе, меня поразила мастерская — ма-
ленькая, со шлифовальными и полировальными станками под окнами, со свечками на каждом
рабочем месте. По сравнению с огромными светлыми цехами в Геттенгене и на АОМО — это
темный чулан, но сколько великих идей воплощено именно здесь, чтобы сегодня можно было
раскрывать тайны микромира, лечить, учить, заглядывать в прошлое и будущее.
342
Послесловие: историческое эссе
открыты оптические мастерские с магазином
по продаже очков и микроскопов фирмы Carl
ZEISS, просуществовавшие до 1914 г.
После революции 1917 г. Советский
Союз пошел по пути создания мощной
научной базы, располагающей хорошо ос-
нащенными лабораториями и высоко ква-
лифицированными научно-техническими
кадрами. Основной технологией создания
нового являлся опыт зарубежных фирм.
НАША НАУЧНАЯ БАЗА...
15 декабря 1918 г. был создан Государс-
твенный оптический институт (ГОИ), воз-
главляемый первым директором академи-
ком Д.С. Рождественским (1876-1940).
Народный комиссар просвещения А. В.
Луначарский и заведующий Петроградс-
ким отделом науки М. П. Кристи подписали
постановление об учреждении ГОИ, состо-
Рис 6. Российские врачи по достоинс-
тву оценили труд ученых, инженеров,
мастеров и рабочих фирмы Carl Zeiss.
Грамота, выданная Карлу Цейсу и
скрепленная 300 подписей.)887 г.
ящего из двух отделов: научного и техни-
ческого. Кроме того, в ведении ГОИ находился Государственный за-
вод оптического стекла.
В институте работал ряд выдающихся советских ученых: академи-
ки С.И. Вавилов (1891-1951), А.А. Лебедев (1893-1969), И.В. Гребен-
щиков (1887-1953), В.П. Линник (1889-1984) и член-корреспонденты
АН СССР- Н.Н. Качалов (1883-1961), Д.Д. Максутов (1896-1964),
А. И. Тудоровский (1875-1963) и др.
Первым достижением этой группы ученых было создание произ-
водственной базы оптического стекла в Советском Союзе. И одним из
основных достижений было создание единого каталога оптического
стекла1. Вычислительное бюро ГОИ, руководимое А. И. Тудоровским,
освоило методику расчета совершенных оптических систем. Уже в 1929 г.
развитие советской оптической промышленности достигло такого
уровня, что для руководства ею потребовалось создание специального
1 В разработке каталога принимала участие и моя мама — Алексеева Татьяна Александров-
на (1924-2001), измеритель лаборатории 1Ф. Уроженка волжского города Вольска, она начала
трудовой путь на Лыткаринском заводе оптического стекла в 1943г. В 1949г. с переездом в Ле-
нинград поступила в ГОИ, и всю свою сорокалетнюю трудовую деятельность посвятив стеклу.
343
Послесловие: историческоезссе
технического и административного центра. Этим центром стало
Всесоюзное объединение оптико-механической промышленности
(ВООМП), куда вошли такие заводы как ГОМЗ, КИНАП и ПРОГРЕСС.
ПЕРВЫЕ ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ...
Работы по микроскопостроению начались в ГОИ примерно с 1924г.
Первые отечественные микроскопы увидели свет в 30-х годах ХХв. В
1932 г. в институте были рассчитаны и изготовлены первые советские
объективы для микроскопа, в том числе, и иммерсионные больших уве-
личений. Небольшое количество серийных микроскопов было выпуще-
но в опытных мастерских ГОИ.
Кроме этого, для подготовки высококвалифицированных инже-
неров — оптотехников в 1930г. был создан Ленинградский институт
точной механики и оптики (ЛИТМО) на базе ранее существовавшего
техникума. К этому времени за рубежом не было втузов, готовящих ин-
женеров для оптической промышленности.
В 1936г. в Ленинграде начался выпуск серийных микроскопов М-9 с
тремя объективами, включая иммерсионный 90x1,25. С 1939 г. наша про-
мышленность начала выпуск прямых металлографических микроскопов.
К 1940 г. отечественная промышленность выпускала уже 10 типов микро-
Рис. 1. Такими в 1950 г. были мои родители Алексее-
вы Владимир Евгеньевич и Татьяна Александровна.
Впереди у них было 40 лет честной работы в ГОИ,
свойственной поколению, прошедшему через Вели-
кую Отечественную войну, тем, кто к 1975 г. вывел
нашу отечественную оптическую промышленность
на высокий научно-технический уровень
скопов. Были разработаны и ос-
воены в производстве несколько
моделей поляризационных микро-
скопов и большой горизонтальный
металлографический микроскоп
МИМ-3.
Даже в годы войны группа уче-
ных, эвакуированных из Ленинг-
рада в Йошкар-Олу, продолжала
работу над созданием отечест-
венной технологии сборки объек-
тивов микроскопа.
После Великой Отечествен-
ной войны в ГОИ пришло моло-
дое поколение, прошедшее войну,
эвакуацию и работу на заводах в
тылу. Такими были мои учителя,
такими были мои родители. Тру-
довая биография моих родителей
344
Послесловие: историческое эссе
мало отличается от биографии молодежи тех лет. В июне 1941г. после
окончания в Ленинграде 10-го класса мой отец ушел добровольцем на
фронт, был тяжело ранен на Синявинских болотах, а закончил войну в
Манчжурии. После демобилизации в 1948 г. пришел во второй научный
отдел на должность лаборанта, начал учиться дальше. Закончил вечер-
ний оптический факультет ЛИТМО. Более 40 лет свой трудовой де-
ятельности посвятил разработкам оптических приборов, имел десятки
научных статей и авторских свидетельств. Ушел на пенсию в должнос-
ти зам. начальника лаборатории и прожил без своей любимой работы
только год. В 1943 году моя мама после окончания техникума приехала
работать на Лыткаринский завод оптического стекла. Всю войну про-
работала в оптическом цеху, была начальником смены. Там они с папой
и встретились. С конца 1949 года мама начала работать измерителем в
лаборатории 1Ф, где проработала более 40 лет. Не раз ей присуждали
звание лучшего измерителя. Она была одним из тех, кто составлял Оте-
чественный каталог оптического стекла. Благодаря таким целеустрем-
ленным, ответственным и честным людям наша страна достигла опре-
деленных высот в науке и технике, в космосе и в микроскопии... 50-е
годы можно считать началом подъема отечественного микроскопост-
роения. Разработка и серийный выпуск российских микроскопов — это
результат решения целого комплекса задач. Прежде всего, создания
технологической линии, технического оснащения и подготовки специа-
листов высочайшего уровня на государственном оптико-механическом
заводе (ГОМЗ) и на экспериментальном заводе ГОИ им. Вавилова в
Ленинграде. Базовым являлось точное оборудование для изготовления
оптических и механических деталей, а также и сборки. В этом помощь
оказали специалисты фирмы Carl Zeiss, приехавшие из послевоенной
Германии в 1946 г.
2-ОЙ НАУЧНЫЙ ОТДЕЛ,
23 ЛАБОРАТОРИЯ ГОИ ИМ. ВАВИЛОВА С. И....
В 1953 г. в ГОИ им. С. И. Вавилова (это имя было присвоено институ-
ту 26 января 1951г.) на базе оптотехнического отдела была образована
лаборатория световой микроскопии, которую возглавил проф. д.т.н.
Захарьевский А. Н.(1893-1965). В последующие годы начальниками
этой лаборатории были к. т. н. Поляков Н. И. и к. т. н. Папаян Г. В.
Лаборатория входила в состав 2-го научного отдела. Кроме микро-
скопии, в отделе велись разработки контрольно-измерительной техни-
345
Послесловие: историческое эссе
it
в’
Рис 8. Группа микрооптики 2-го научного отдела в 1980 г.:
в центре - наш руководитель к.т.н. Ларина Раиса Михайлов-
на; слева - Белякова Галина Ильинична; справа - Горбунова
Валентина и я в процессе испытания новых объективов
ки, пирометрических приборов,
офтальмологических и интер-
ферометрических приборов.
Работы по созданию и внед-
рению новых, более совершен-
ных объективов микроско-
пов, окуляров, конденсоров и
промежуточных систем для
обеспечения фазового и интер-
ференционного контрастов, а
также методов и приборов для
их контроля, проводились в
группе под руководством к. т.н.
Соколовой Т. И. Позднее рабо-
ты были продолжены ее учени-
ками — к. т. н. Лариной Р. М. и Беляковой Г. И.
С 1975 г. я работала в этой группе под руководством Раисы Михай-
ловны Лариной, но очень хорошо помню и Татьяну Ивановну Соколо-
ву. Благодаря этим ученым, я научилась анализировать, сопоставлять
и думать, а также следовать основному правилу, которому они придер-
живались всегда: мало знать самому, необходимо передать эти знания
другому, и, конечно же, принципу — «зри в корень».
Во время работы в этой группе мне пригодились все знания по тех-
нологии стекла, металла, приборостроения, полученные в ЛИТМО1, а
также опыт работы в СНО1 2.
Анализ расчетной и конструкторской документации, а затем ис-
следование экспериментальных образцов объективов и микроскопов
различными методами качественной и количественной оценки на со-
ответствие документации — это кропотливая и увлекательная работа.
Мы занимались контрольно-юстировочной аппаратурой. Опыт раз-
работки интерферометра3, автоколлимационного метода мир, а также
установки для измерения частотно-контрастных характеристик4 — вот
1 Ректором института в то время был проф. д. т.н. Митрофанов С.П.
2 СНО — студенческое научное общество. Первый опыт конструкторской и исследова-
тельской работы мы с моей подругой Светой Варфоломеевой (ныне нач. лаб. Красногорско-
го завода им. С. А. Зверева) получили на кафедре Спецприборов. Руководил нами молодой
начинающий ученый Святослав Михайлович Латыев, ныне декан факультета оптико-инфор-
мационных систем и технологий, д. т.н., профессор ИТМО.
3 Работа велась в разные времена, и мне довелось работать с Королевым В. И. и Духопе-
лом И.И.(ГОИ).
4 Установка ЧКХ для исследования объективов микроскопа разработана в т. ч.
и к. т. н. Лариной Р. М.
346
Послесловие: историческое эссе
небольшой перечень работ, которые позволили нам выпустить в свет
первые объективы больших числовых апертур и рабочих расстоя-
ний нового поколения. Это были объективы с киноформными1 эле-
ментами и с градановой1 2 оптикой, первые отечественные объективы
записи и воспроизведения для видеопроигрывателей. Теоретические
расчеты оптики микроскопа выполнялись профессорами д. т.н.
Грамматиным А. П. и д. т. н. Андреевым Л. Н.. В 80-х годах мы работали
с расчетами д. т.н. Ивановой Т.А.(ЛОМО), разработавшей большой
комплект оптики нового поколения для микроскопов серии БИМАМ.
Кроме того, у нас были и совместные работы по разработке тест-
объектов с группой микрооптики народного предприятия Carl ZEISS,
Jena (ГДР).
Расцвет отечественной микроскопии пришелся на 70-е годы про-
шлого века, когда объединенное предприятие ЛОМО выпускало в год
более 25 тыс. микроскопов практически 50 наименований. Именно в
этот период фирма ЛОМО совместно с научной базой ГОИ им. С. И. Ва-
вилова и ЛИТМО стала одной из ведущих фирм в мире.
На территории СССР существовали еще оптические производства
микроскопов в городах:
Новосибирск — Новосибирский приборостроительный завод, выпус-
кавший упрощенные микроскопы для сельского хозяйства серии МБУ;
Лыткарино Московской области — Лыткаринский завод оптичес-
кого стекла, выпускающего до сих пор стереоскопические микроскопы
серии МБС;
Казань — Казанский оптико-механический завод, выпускавший
стереоскопические микроскопы серии БМ;
Феодосия — Феодосийский оптический завод, выпускающего учеб-
ные микроскопы серии УШМ/УМ.
Наша группа курировала все оптико-механические заводы, выпус-
кающие лупы и микроскопы. Особое внимание мы уделяли ЛОМО,
ФОЗ и ЛЗОС. Учебные микроскопы ФОЗ и стереоскопические мик-
роскопы ЛОМО и ЛЗОС были моим полем деятельности. Именно
работа в этой многопрофильной группе на стыке расчета, конструи-
рования и технологии производства подвела к одному вопросу, кото-
1 Оптический линзовый элемент (типа линзы Френеля) с нанесенными по диаметру
кольцами определенной глубины, радиуса и на определенном расстоянии друг от друга. Этот
элемент позволял уменьшить количество линз в оптической схеме объектива и увеличить
рабочее расстояние в объективах для биотехнологии.
2 Оптический линзовый элемент с переменным показателем преломления по радиусу.
Этот элемент позволял уменьшить количество линз в оптической схеме объектива. Предпо-
лагалось использование в объективах для записи и воспроизведения.
347
Послесловие: историческое эссе
рый звучал просто: «Почему наши высокотехнологичные разработки,
соответствующие современному уровню, уровню 80-90-х годов, не
внедрялись в производство?». Но ответ оказался не простым. Поиски
его привели к созданию методики, позволяющей еще на стадии расче-
та дать ответ на вопрос о реальной возможности серийного выпуска
любого объектива на базе того или иного производства1.
Результатом деятельности многих отечественных специалистов
явилось:
« создание первых отечественных объективов микроскопов с
плоской поверхностью изображения и увеличенными полями —
планахроматов и планапохроматов, которые были использованы
для комплектации таких моделей микроскопов как: БИОЛАМ И;
МБИ-15; ПОЛАМ Р и Л; МИМ 9 и 10; МЕТАМ Р и др.
• разработка объективов для УФ-области спектра и проекционных
окуляров к ним для микроскопов МУФ-б и МУФ-5;
« создание специализированных объективов с большими и сверх-
большими рабочими расстояниями для инвертированных мик-
роскопов и микроскопов для целей микроэлектроники МКД;
« разработка объективов с увеличенными числовыми апертурами
и контактных объективов на основе слаболюминесцирующих оп-
тических сред для микроскопов ЛЮМАМ и контактных прибо-
ров ОИ-ЗО, ОЛК-2, МАК-2.
Группу фазово-контрастной и интерференционной микроскопии
возглавлял А. Н. Захарьевский, а затем дело было продолжено его уче-
никами А. Ф. Кузнецовой, Л. А. Фединым и Г. Н. Забродиной. Результа-
том работы этой группы стал промышленный выпуск первых отечес-
твенных интерференционных микроскопов МБИН-4 и устройства с
переменным фазовым контрастом КФ-5.
Именно Галина Николаевна Забродина учила меня азам фазового
и дифференциально-интерференционного контраста. А Леонид Анд-
реевич Федин (к. т.н., зам. начальника нашей лаборатории), умный и
талантливый человек, в далеком 1975 году преподал мне, стажеру-ис-
1 Моя диссертация называлась «Методы оценки технологичности и контроля качества
оптических систем нового поколения объективов микроскопа» (1995 г.). Научным руково-
дителем был д. т.н. Андреев Л.Н., теоретик и практик, с которым мы тесно сотрудничали
в ГОИ. Он рассчитал много серийных объективов, в т.ч. и для МБИ15. В основном, работа
выполнена в ГОИ, базовыми были материалы ГОИ, ЛОМО, АЗОС, ЛенЗОС, ФОЗ и ЛИТ-
МО, а защитила я ее — на Оптическом факультете, на кафедре, возглавляемой в то время д.
т.н., профессором Зверевым В.А., заслуженным деятелем науки РФ, лауреатом Ленинской
премии и премии Совмина СССР, которого я хорошо знала по работе на ЛОМО. Сколько
интересных, умных, интеллигентных, талантливых специалистов нашей оптической науки
мне посчастливилось встретить и вместе работать!
348
Послесловие: историческое эссе
следователю, курс маркетинга, показав необходимость постоянного
исследования рынка, анализа потребности и конкурентоспособности
микроскопов, тогда уже он был очень болен.
Первые работы по созданию отечественных ультрафиолетовых и люми-
несцентных микроскопов выполнялись под руководством д. т.н. Брумбер-
га Е.М.(1907-1977), но наибольший вклад в развитие этого направления
внес к. т.н. Барский И.Я. Под его непосредственным руководством были
разработаны методики и выпущены первые отечественные люминесцент-
ные микроскопы: МЛ-3, МЛ-2, МАИ-1, семейство микроскопов ЛЮМАМ
и также фотометрическая насадка ФМЭЛ-1. При участии к. т.н. Якубена-
са В. А. В. были разработаны и выпущены промышленностью контактные
микроскопы для прижизненных исследований ОЛК-2 и МАК-1.
Исаак Яковлевич Барский постоянно оказывал консультативную
помощь нашей группе при работе над новыми люминесцентными объ-
ективами и нелюминесцирующими средами, а также при разработке
светофильтров для люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ РПО.
Начиная с 60-х годов прошлого века, широкое развитие получают
количественные методы исследования в микроскопии. Здесь, прежде
всего, необходимо отметить работы к. т. н. Агроскина Л. С., а затем его
ученика Папаяна Г. В. по созданию отечественной цитофотометричес-
кой аппаратуры и промышленному выпуску приборов МЦФВ-1 и мик-
родекситометра М-85. Кроме того, эта группа занималась вопросами
поляризационной и металлографической микроскопии.
Также как и Р. М. Ларина, Л. С. Агроскин всегда поддерживал меня в
моих исканиях, учил жизни и уважению к своей профессии. Наблюде-
ния за его работой на первом анализаторе изображении и микроспек-
трофотометре IBAS фирмы Opton (ФРГ), явились толчком для разра-
ботки методики по светопр опусканию и, благодаря Льву Семеновичу,
на базе IBAS была создана установка для измерения светопропускания
объективов микроскопа.
Результаты анализа измерений — около 200 объективов разных лет
выпуска и фирм-производителей — позволили сделать выводы о вли-
янии на качество изображения в микроскопе, а также на работу сис-
тем анализа изображения следующих моментов: срока эксплуатации,
загрязнений на фронтальном компоненте, осыпки и расклейки внутри
объектива, типа оптической конструкции и увеличения числовой апер-
туры. Этот опыт придает мне уверенности при проведении лекций о
сроке службы объективов и микроскопов, а также о влиянии техноло-
гических процессов на качество изображения.
349
Рис. 9. Биологический микроскоп
БИОЛАМ Р,С,Д, разработка веду-
щего конструктора ЛОМО к.т.н.
РМ. Рагузина, 70-е годы XX века
Послесловие: историческое эссе
Для меня и Лев Семенович, и Раиса Ми-
хайловна всегда были и остаются эталоном
настоящего ученого, требовательного к себе и
другим...
... Решением Международного жюри Все-
мирной выставки, в г. Брюсселе (1958г.) ГОИ
им. С. И. Вавилова были присуждены три вы-
сшие награды выставки — ГРАН-ПРИ за сов-
местные разработки с промышленностью, в
числе которых:
« группа интерференционных прибо-
ров - ИЗК-40, ИЗК-56, ИЗК-58, МИИ-4;
« микроскопы — микрокиноустановка
МКУ-1, большой биологический микро-
скоп МБИ-6, люминесцентный микро-
скоп МЛ-1, телевизионный микроскоп
МТ-1, поляризационные микроскопы
МИН-7 и МИН-8, микроскопы для ядерной физики МБИ-8М и
МБИ-9, микроскоп ультрафиолетовый МУФ-4;
« продукция заводов оптического стекловарения, созданная сов-
местно с ГОИ.
Кроме того, ЗОЛОТАЯ МЕДАЛЬ была присуждена за металлогра-
фический микроскоп и установку для испытания металлов при высо-
кой температуре.
Однако ГОИ — это научно-исследовательский институт, тогда как
основной производственной базой микроскопостроения в России всег-
да был завод.
ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ БАЗА.
В 1905 г. профессору Санкт-Петербургского университета А. Л. Гер-
шуну было поручено организовать оптико-механическую мастерскую
на базе Обуховского сталелитейного завода. 23 августа 1913 г. было
утверждено «Российское акционерное общество оптических и меха-
нических производств» (РАООМП). 4 февраля 1914г. был построен и
открыт завод на Чугунной, 8 (20), национализированный 28 июня 1918 г.
В сентябре 1921г. предприятие получило название «Государственный
оптический завод» (ГОЗ), а ко дню открытия XVI съезда ВКП (б) — 25
июня 1930 г. завод был переименован в «Государственный оптико-меха-
нический завод» (ГОМЗ). Основной продукцией завода была фото — и
350
Послесловие: историческое эссе
киноаппаратура, а также астроприборы, в том числе, оптический ком-
плекс для Ленинградского планетария (1939 г) и телескоп для Пулковс-
кой обсерватории (1940г.).
КБ МИКРОСКОПИИ.
ЛАБОРАТОРИЯ ПЕРСПЕКТИВНЫХ РАЗРАБОТОК...
Ленинградское оптико-механическое объединение (ЛОМО) как
объединение трех заводов ГОМЗ, КИНАП и ПРОГРЕСС появилось в
октябре 1962 г. В течение 25 лет его генеральным директором был Ми-
хаил Панфилович Панфилов (1913-1991). Именно в это время ЛОМО
стал ведущим в оптической промышленности России. С 1986 по 1992 гг.
завод возглавлял Д. В. Сергеев.
В1990 г. предполагалось на базе КБ микроскопии, которым тогда ру-
ководила О. Н. Немкова, создать центр перспективных разработок. Мы
уже занимались новым поколением микроскопов, первенцем которого
был хорошо известный БИМАМ Р 11-13. Именно для этой цели я пе-
решла из ГОИ на ЛОМО. Но Перестройка спутала все планы. Однако
мы продолжали работать над новыми приборами — поляризационным
микроскопом ПОЛАМ РПО, так и оставшимся экспериментальным
(группа исследователей под руководством Аллы Ильиничны Фрез и
Ирмы Андреевны Дружининой) и люминесцентным микроскопом ЛЮ-
МАМ РПО — 11 (группа Бодровой Л. Н.) и МЕТАМ АВ 31-33 (группа Е.
Лобачевой). При мне Рэм Михайлович Рагузин1 — создатель микроско-
пов серии БИОЛАМ, БИМАМ, ПОЛАМ работал над новым рабочим
микроскопом с длиной тубуса «бесконечность», носившим рабочее на-
звание БИМ. Разработкой объективов для микроскопов после неожи-
данной смерти д. т.н. Ивановой Т. А. стал заниматься Д.Н. Фролов.
Настоящими кудесниками сборки объективов любого уровня слож-
ности были и остаются Фрейдберг Николай Львович и Ольга Ивановна
Лютинская, в далекие сороковые обученная немецкими специалиста-
ми, которой не было равных на протяжении 50-ти лет существования
КБ микроскопии и микрооптики.
14 июня 1993 г. ЛОМО вновь становится Акционерным обществом с
генеральным директором И. И. Клебановым (1992-1997).
1 Р.М. Рагузин, к. т.н., месяца на три раньше меня был приглашен в Нью-Йоркскую Ака-
демию наук. Для нас обоих это было почетное приглашение, знак уважения перед нашей оте-
чественной наукой и производством. На сколько мне известно, больше членов Нью-Йоркской
Академии наук среди специалистов нашего направления (микроскопостроения) в России нет.
351
Послесловие: историческое эссе
От КБ микроскопии в 1993 г. я принимала участие в маркетинговых
исследованиях американской фирмы «МакКензи», возглавляя группу,
отправленную в г. Екатеринбург. Для меня это был огромный опыт ре-
ального исследования рынка, его потребностей и платежеспособности
в новых экономических и политических условиях. После этой поездки
для себя я сделала, пожалуй, основные выводы, перевернувшие созна-
ние — требуется переоснащение парка оборудования современными
микроскопами, большие производственные мощности и капиталовло-
жения для их выпуска, но, прежде всего, необходима просветительская
работа по работе с микроскопами. И еще — для продажи продукции
важным является маркетинг, продвижение товара на рынок и продви-
жение фирмы на рынок.
После разрыва связей «ГОИ — ЛОМО — Министерство — пользова-
тель» наш конечный пользователь оказался перед пропастью незнания:
где взять микроскопы? кто их выпускает? какие микроскопы лучше?
Последний вопрос до сих пор остается открытым...
БЮРО ИССЛЕДОВАНИЯ РЫНКА И ИНФОРМАЦИОННО-РЕКЛАМНОЙ
ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОАО ЛОМО ИМ. В. И. ЛЕНИНА...
Я перевелась из КБ в отдел маркетинга в 1995 г. и по 1998 г. возглавля-
ла Бюро исследования рынка и информационно-рекламной деятельнос-
ти ОАО ЛОМО. Это был важный период моей жизни. Мы создавали но-
вое, мало кому понятное направление — маркетинг. Конечно, сам отдел
существовал уже несколько лет, но что он должен делать и как — никто
не знал. Моим руководителем был молодой и энергичный человек новой
формации — Александр Викторович Шахорко. У него я научилась много-
му — и, прежде всего, логике действий в новой экономической ситуации,
ответственности за принятие решения, работе в стрессовых ситуациях.
Ему, а также директору по маркетингу С. В. Шнурову, наше бюро было
обязано свободой в организации, а также созданием концепции, при-
нципов и механизма принятия решения в маркетинге на промышленном
предприятии. Это было очень интересное время.
Неожиданным для меня стало сообщение из Америки с предложени-
ем стать членом Нью-йоркской Академии наук1. Это событие сыграло
главную роль в дальнейшей моей жизни. Надо было соответствовать
присвоенному званию и нести груз ответственности... не перед
1 За полгода до этого этим званием был удостоен Р.М. Рагузин. На сколько я знаю, нас
только двое в области микроскопии, кто носит это почетное звание.
См. предыдущую сноску!
352
Послесловие: историческое эссе
Америкой, а перед Россией
и нашими пользователями.
В этот же год я защитила
диссертацию, которую начала
делать с первых дней работы
в ГОИ...
Наше бюро состояло из
сильных маркетологов. Ко-
ролев Владимир Гаврилович,
бывший военпред, стал для
меня эталоном настоящего
менеджера по маркетингу.
Не по специальному обра-
Рис 7Д:Сгёнд 0А0710М0 на выставке «Здравоохранение-
1997», Экспоцентр, Москва
зованию, а по своему внут-
реннему состоянию, преданности предприятию и... России. Знание
технологии промышленного производства и своей специальности,
спроецированное на знание психологии покупателя и экономической
тенденции внутри страны, позволяли ему и нам ориентироваться в то
сложное время. Мы верили в возрождение машиностроения и пере-
оснащение медицинских учреждений, в развитие товаров народного
потребления и в то, что наше нисколько не хуже зарубежного. Ясно
было, что необходимость технологического переоснащения произ-
водства — это одна из главных задач в конкурентной борьбе на рос-
сийском рынке. У микроскопов ЛОМО была вполне определенная
ниша, где наше производство и КБ, имея огромный опыт и научно-
технический потенциал, могли бы развиваться...
Анализ ситуации, техно-
логии, продукта, рынка, кон-
курентов, продаж, производс-
тва— не ради анализа, а в
качестве инструмента процве-
тания предприятия и привле-
чения покупателей — вот такой
была наша задача. Мы отстаи-
вали свои позиции, предлагали
пути усовершенствования, рек-
ламировали и продвигали то-
вар и фирму на рынок. Именно
тогда родилась идея создания
дилерской сети для продаж.
Рис. 1Р Мастер-класс для патологоанатомов на базе ЦПАЛ,
Москва, 2002 г т» '
353
Послесловие: историческое эссе
ч®' PUC.12.
На конференции главных врачей
и районных специалистов
г. Новосибирска, 2003 г.
: Слева направо: Варфоломеева
О.В., Майер А.Д., Ходова Р.Р.,
Штейнля И.Е., Косяков Н.С,
Егорова О.В., Винокурова ЕВ./
Попкова О.В., Обухов А.В
Рис 13.
0 новом в области микроскопии.
Студенты кафедры
«Оптические приборы»
Московского Технического
университета, 2003 г
птШс-ое тж 143
Продавать тоже надо уметь.
Обучение дилеров фирмы
ООО Карл Цейсс. 2004 г
354
Послесловие: историческое эссе
Участие в выставках стало не скучным мероприятием, а целенап-
равленной акцией, в которой принимали участия все, включая дирек-
тора выставок Лебедева Евгения.
К сожалению, тогда нас мало принимали всерьез. Однако мы сумели
организовать структуру, которая в дальнейшем могла бы объединить
маркетинг, КБ, производство, экономические и финансовые структуры
и продажу. С нынешним генеральным директором (а в то время финан-
совым директором) профессором, доктором экономических наук Алек-
сандром Михайловичем Ароновым мы пытались встроить маркетинг в
структуру предприятия. Но, по-видимому, это было преждевременно...
И в 1998 году я ушла с ЛОМО.
Сейчас с позиции 2006 года я вижу, что мы были правы во многом,
хотя дальнейший ход истории развития, как ГОИ, так и ЛОМО, оказал-
ся иным, не таким, каким виделся всем нам в начале 90-х.
ЭКСПЕРТ ГОССТАНДАРТА РФ. ООО «CARL ZEISS»
При ВНЦ ГОИ им. С. И. Вавилова на базе отдела стандартизации
был организован некоммерческий орган по сертификации «ТКС-опти-
ка, Санкт-Петербург», где с 2000 г. я и работаю экспертом Госстандарта
РФ по оптическим приборам.
Однако сделанный в 1993 году вывод стал для меня определяющим.
Результатом работы последних лет является эта книга и кочевая жизнь
по городам России, Средней Азии, Украины и Беларуссии с лекциями,
консультациями, оценкой состояния лабораторий.
Задача осталась прежней: просвещение пользователей через лекции
и статьи, проведение разъяснительной работы по рациональному под-
ходу к комплектации лабораторий, а также пропаганда современных
методов исследования и контрастирования. Другими словами — че-
рез научные круги и методические центры продвигать новые методы
контрастирования, появившиеся за последние 20 лет в микроскопии,
во избежание отставания в этой области нашей страны от зарубежных.
И в этом помогает возможность, связанная с демонстрацией новых
микроскопов фирмы Carl Zeiss с современными методами исследова-
ния и контрастирования1.
Несмотря на сложности экономического плана, все больше специ-
алистов понимает необходимость не только работать на современных
1 Зная продукцию фирмы Карл Цейс еще с 1975 года, мне интересно наблюдать за тен-
денциями развития оптического приборостроения, анализировать и разъяснять нашим спе-
циалистам — врачам и биологам
355
Послесловие: историческое эссе
Рис. 15. Конференции 2004 года:
о - Тюмень, мастер-класс, 6-Новосибирский Академгородок, экскурсия по демонстрационному залу.
микроскопах, но и получать зна-
ния по практике работы с ними.
Еще года два тому назад приходи-
лось доказывать необходимость
введения двух часового практи-
ческого занятия на курсах после-
дипломного образования. Но уже
сегодня на кафедре КДЛ РМАПО
(зав. кафедры д. м. н. проф. Долгов
В. В.) практически на всех курсах,
кураторами которых являются
Луговская С.А., Шабалова И.П.,
Назарова Е.К., Почтарь М.Е. и
Миронова И. И., я читаю курс по
практике работы с микроскопом.
Рис. 15. С профессором РМАПО, д. мед. наук Пугов-
ской С. А. во время курса, проводимого по каналу
телеконференции Москва-Чита, 2004 г
При этом сами преподаватели по-
нимают, что необходимо и обучать, и работать на уровне XXI века, не
только опираясь на свой опыт и свои знания, но и благодаря современ-
ной технике. Постепенно становится ясно, что дешевый микроскоп не-
известных фирм решает минимум задач при минимальном сроке служ-
бы. Скупой платит дважды, а знание уменьшает степень риска.
Круг замкнулся...
Если Вы читаете эти строки, значит, у нас есть будущее.
356
ПРИЛОЖЕНИЯ
Закончить книгу можно по-разному, одна-
ко мне бы хотелось, чтобы последнее слово ос-
талось за специалистами — микроскопистами
различных областей биологии и медицины. В
настоящее время внедрилась определенная
практика, связанная с тем, что в книгах в ка-
честве Приложения публикуются материалы,
которые автор считает важными, но сам он
не является их автором. В последние 3 года я
печаталась во многих издаваемых Атласах и
книгах (см. список литературы) в подобных
приложениях.
Мне бы хотелось привести разные приме-
ры применения микроскопов в биологии и
медицине, которые являются результатами
экспериментов, исследований, апробаций.
Практически все статьи сделаны были по моей
просьбе (кроме Приложения 3). Некоторые из
них, такие как применение стереомикроскопа
в школе и в косметологии, были инициирова-
ны мною.
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ!
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ
ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИНУКЛЕАРНЫХ АУТОАНТИТЕЛ
НА ПЕРЕВИВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ НЕР-2
Лапин С. В., Мазинг А. В., Тотолян А. А.
Научно-методический центр по молекулярной медицине М3 РФ
на базе СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова, г. Санкт-Петербург.
Основным методом иммунологической диагностики системных за-
болеваний соединительной ткани, является обнаружение антинуклеар-
ных антител. Тесты по определению антинуклеарных антител стоят в
ряду наиболее часто используемых серологических тестов и, без сом-
нения, являются самым часто выполняемым клиническим анализом в
практических иммунологических лабораториях во всем мире.
Антинуклеарные антитела (АНА) представляют собой семейство
аутоантител, взаимодействующих с рибонуклеиновыми кислотами и
белками ядра. К настоящему времени описано более 100 разновиднос-
тей АНА, направленных против нуклеиновых кислот, гистонов, белков
ядерной мембраны, компонентов сплайсосомы, рибонуклеоротеинов,
белков ядрышек и центромер.
Основным скрининговым методом выявления АНА является не-
прямая иммунофлюоресценция. Этот метод традиционно обознача-
ется как «антинуклеарный фактор» (АНФ). С его помощью можно
установить наличие у больного антител, принадлежащих к семейству
АНА, после чего конкретная разновидность антител устанавливает-
ся с помощью дальнейшего тестирования. В 1982 году Tan предложил
использовать в качестве субстрата непрямой иммунофлюоресценции
человеческую перевиваемую эпителиоидной клеточную линию НЕр-2.
Применение перевиваемых клеток человека, в отличие от традицион-
но используемых для выявления АНФ тканей лабораторных живот-
ных, позволяет значительно увеличить чувствительность метода и
достоверно описать тип свечения ядра. Благодаря своей превосход-
ной чувствительности и информативности этот метод стал «золотым
стандартом» выявления АНФ.
359
Приложения
Рис 1.1. Типы свечения клеток: '
о - гомогенный; 6 - гранулярный; в - центромерный; г - цитоплазматический
Для клинических целей достаточно описывать 6 основных типов
свечения клеток: периферический, гомогенный, гранулярный, ядрыш-
ковый, центромерный и цитоплазматический.
Гомогенный тип свечения ядра клетки предполагает наличие анти-
тел против хроматина ядра или антител к гистонам. Он встречается у
больных с СКВ и лекарственной волчанкой, а также у больных с сис-
темным склерозом и склеродермией. Часто связан с наличием антител
к двуспиральной ДНК.
Гранулярный тип является наиболее часто встречающимся и, одно-
временно, наиболее неспецифическим. Окрашиваются крупные надмо-
лекулярные рибопротеиновые комплексы, что придает свечению харак-
терный гранулярный вид. Он встречается в сыворотке крови больных с
различными аутоиммунными заболеваниями, содержащей множество
разновидностей АНА, таких как Sm, nRNP, La/SSB, PCNA. Кроме того,
гранулярный тип преобладает в сыворотках крови у клинически здоро-
вых лиц с АНА.
360
Приложения
Рис. 1.2. Результаты иммунологических исследований:
о - антитела и цитоплазма нейтрофилов при аутоиммунных поражениях сосудов. Свечение локализуется в цитоплазме
клетки рядом с ядром; б - антитела к слизистой желудка (обкладочным клеткам), встречаются при атрофическом гастрите
и В12-дефицитной анемии; в - антитела к миоарду при дилятационной кардиомиопатии; г - биопсия кожи больного
с пузырчаткой, окраска антисывороткой к C1q и родамином. Отложения комплемента в базальном слое кожи; д—антиан-
доиезиальные антитела при целиакии — непереносимости клетчатки; е - антитела к островковым клеткам поджелудочной
железы при инсулин-зависимом сахарном диабете.
Axioscop-40 FL: ртутная лампа НВО 50;люм. блок 09, обл. возбуждения - EX ВР 450-490;обл. запирания -BS FT 510; обл.
эмиссии-ЕМ LP 515
361
Приложения
Центромерный тип флюоресценции отмечается при появлении
антител к центромерам хромосом и обнаруживается только в де-
лящихся клетках. Его присутствие характерно для CREST варианта
склеродермии.
Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-
синтетазам, в частности Jo-1. Кроме того, он отмечается у больных с
АНА, направленным против других компонентов цитоплазмы клетки:
антител к актину — при аутоиммунном гепатите, или антител к мито-
хондриям — при первичном биллиарном циррозе.
В Научно-методическом центре по молекулярной медицине М3 РФ
на базе Санкт-Петербургского Государственного медицинского универ-
ситета им. акад. И. П. Павлова разработан и опробован метод культиви-
рования клеток линии НЕр-2 на предметных стеклах и серологический
тест для выявления АНФ с описанием типа свечения. Особенностью
выполнения метода являются высокие требования к люминесцентной
микроскопии, которым удовлетворяют микроскопы Axiostar и Ах-
ioscop-40 фирмы Carl Zeiss. При сопоставлении разработанного теста
с традиционным методом выявления АНФ с использованием тканей
лабораторных животных в качестве субстрата было установлено, что
разработанный метод позволяет увеличить чувствительность обследо-
вания на 40 %.
Другие исследования этого Центра представлены на рис. 1.2.
362
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЭВОЛЮЦИИ ХРОМОСОМ
Рубцова Н. В., Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б.
Центр коллективного пользования микроскопического анализа :
биологических объектов СО РАН (ЦКП),
г. Новосибирск ;
Изучение механизмов эволюции хромосом млекопитающих сегодня
невозможно представить без использования современных методов мо-
лекулярно-цитогенетического анализа. В исследованиях Новосибирс-
кого Центра коллективного пользования микроскопического анализа
биологических объектов СО РАН (ЦКП) широко используется полу-
чение районо— и хромосомоспецифичных ДНК-проб, как при разра-
ботке новых методов анализа хромосомных патологий человека,
так и для уточнения и верификации выявленных случаев реорганиза-
ции хромосом при сравнительном кариотипировании различных так-
сонов. В ряде случаев особенно эффективным является использование
метода многоцветного бэндинга хромосом, разработанного Институ-
том генетики человека Йенского университета и фирмой MetaSystems
GmbH (Германия).
Примером таких работ может служить анализ реорганизации хро-
мосом в группе «arvalis» рода Microtus. Многоцветный бэндинг, осно-
ванный на флуоресцентной in situ гибридизации микродиссекционных
ДНК-проб, окрашивает районы хромосом в соответствии с составом
их ДНК, что позволяет получить в одном эксперименте с использова-
нием небольшого числа ДНК-проб детальное описание протяженных
хромосомных районов.
На рис. 2.1. приведены результаты использования многоцветного
бэндинга для сравнительного анализа районов гомеологичных хро-
мосом у пяти видов полевок группы «arvalis», один из них (Microtus
arvalis) представлен двумя хромосомными формами. Использование
многоцветного бэндинга надежно показало отсутствие инверсии в го-
мологичных хромосомах разных хромосомных форм Microtus arvalis
и наглядно продемонстрировало инверсию проксимального района
в гомеологичных хромосомах Microtus rossiaemeridionalis.
363
Приложения
Обозначения
* положение центромеры
] дополнительный С-блок
R
хромосомы 5
Рис. 2.1. CISS-гибридизация ДНК проб 5-1 (зеленый) и 5.2 (красный) и многоцветный бэндинг хромосом 5 М.
arvalis «arvalis» (о) и М. arvalis «obscuras» (б), хромосомой 5R (в), и гомеологичными хромосомами М. kirgiso-
rum (г), М. transcaspicus (й), М. kermanensis (е) и М. rossiaemeridionalis (ж, з).
Представлены результаты CISS-гибридизации ДНК проб 5-1 (слева), многоцветный бэндинг (в центре) и про-
фили относительных интенсивностей свечения DAPI и FISH ДНК проб (справа)
364
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
ПРАКТИКА ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОСКОПОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОЙСТВ
И ХАРАКТЕРИСТИК ОБЪЕКТОВ. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
ОБ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ПОЛИФОСФАТОВ
А.С. Агроскин, Н.В. Королев, И.С. Кулаев и др.
(Доклады АН СССР. I960, т. 131, №6, 1440-1443)
Длины волн, соответствующих максимумам флуоресценции
исследованных препаратов
Вещество Максимум излучения, нм Вещество Максимум излучения, нм
Возбуждение Возбуждение
260-280 296-313 260-280 296-313
Аденин 335 355 Урацил 355 430
Аденозин 375 375 Уридин-5-моно- фосфат 320 430
Аденозин-5-мо- нофосфат 360 350 Уридин-5-три- фосфат 330 340
Гуанин 370 370 Тимин 310 395
Гуанозин-5-мо- нофосфат 370 360 Тимидин-5-мо- нофосфат 335 375
Гуанозин 325 355 РНК 350-360 380-400
Цитозин 400 400 ДНК 340-360 350-380
Цитидин-5-мо- нофосфат 330 340 Различные по- лифосфаты 320-350 350-360
УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ КРИСТАЛЛОВ И АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ
И.Я. Барский, И.Е. Брумберг.
(Биохимия. 1958, т. 23, в.5, 791-792)
Положение максимумов при исследовании аминокислот
Название DL-трипто- фан L-трипто- фан DL-тирозин L-тирозин Фенил- аланин
Максимум излучения 345-344 нм 336-335 нм 303-304 нм 303-304 нм 301-300 нм
365
Приложения
УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ КРИСТАЛЛОВ И АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ
И.Я. Барский, И.Е. Брумберг
(Биохимия. 1958, т. 23, в.5, 791-792)
Флуоресценция возбуждения УФ лучами с длиной волны 275-250 нм
Объект ^maxj НМ Объект ^тах, НМ
Ароматические соединения Одревесиневшие элементы коллусов моркови на среде Геллера
L-Фенилаланин 298 с сахарозой на свету 440-442
D-Фенилаланин 298 с сахарозой в темноте 440-442
п-Оксибензойная кислота 300; 400 с сахарозой и конифери- ном (15 мг/л) в темноте 440-442
Кониферин 351-352 с сахарозой и фенилалани- ном (36 мг/л) в темноте 440-442
Вератровая кислота 355 Корень кукурузы: зона 2-3 мм от кончика 340
Протокатеховая кислота 400
зона 15-20 мм от кончика 438-442
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ МИКРОСКОПИИ
К ИЗУЧЕНИЮ ЛИГНИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК
И.Я. Барский, М.С. Бардинская
(Доклады АН СССР. Биохимия. 1959, т. 129,№2, 443-446)
Флуоресценция форменных элементов костного мозга, лимфатических узлов и пери-
ферической крови крысы
Тип клеток Интенсивность УФ флуоресцен- ции (отн. ед.) Тип клеток Интенсивность УФ флуоресцен- ции (отн. ед.)
Костный мозг Лимфатические узлы
Миэлобласты и МИЭЛОЦИТЫ 7,8 Большие и средние лимфоциты 3,3
Юные лейкоциты 6,2 Малые лимфоциты 1,8
Сегментоядерные и палочкоядерные нейтрофилы 5,0 Лимфоциты зобной железы 1,7
Эритробласты 1,0 Периферическая кровь
Метакариоциты, ядерная цитоплаз- матическая часть 1,3 Сегментоядерные нейтрофилы 4,8
14,7 Лимфоциты 1,7
Збб
Приложения
ФОТОГРАФИЧЕСКИЙ СПОСОБ МИКРОФЛУОРИМЕТРИИ ПРИ ИММУНОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ
И.Я. Барский, Т.Н.Хавкин
(Доклады АН СССР. Цитология. 1968, т. X, 1501-1504)
Микрофлуориментрия препаратов, обработанных флуоресцирующими
гамма-глобулинами
Объект исследования Средние показате- ли интенсивности флуоресценции, М±м
Наименование объекта Образования, подвергнутые флуориметрии
Культура возбудителя сибирской язвы Периферия микробного тела 22,3 ±0,37
Центр микробного тела 12,8 + 0,23
Таксиколлазмы, оди- ночная и делящиеся Периферия тела паразита 200,0 + 4,0
Внутренние участки тела пара- зита 113,0 + 2,0
Срез селезенки мыши, зараженной риккетсиями Бернета Микроорганизмы в просвете вакуоли в макрофаге 21,7 ±1,0
Цитоплазма клеток, не содер- жащих риккетсий 16,4+1,0
Срез селезенки белой МЫШИ Скопление гамма-глобулина в клетке 14,05 ±0,05
Цитоплазма клетки, не содер- жащей гамма- глобулина 10,0 ±0,15
367
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ
ПРИ ДИАГНОСТИКЕ МИКРОКРИСТАЛЛИЧЕСКИХ АРТРИТОВ
Лапин С. В., Шемеровская Т. Г.
Городской ревматологический центр,
Городская больница № 25, г. Санкт-Петербург.
Подагра представляет собой тяжелое нарушение метаболизма пури-
новых нуклеотидных оснований в организме, которое приводит к отло-
жению скоплений кристаллов мочекислого натрия (моноурата натрия)
в тканях. Отложения кристаллов приводит к развитию артрита, обра-
зованию тофусов в мягких тканях и подагрической нефропатии. Подаг-
ра является основной причиной воспалительных артритов у мужчин
старше 40 лет.
Обнаружение у пациента гиперурикемии (повышенное содержание
мочевой кислоты в крови) является лабораторным признаком, указы-
вающим на риск развития подагрического артрита. Однако для под-
тверждения причины поражения сустава и постановки диагноза подаг-
рического артрита необходимо обследование синовиальной жидкости
из пораженного сустава с помощью поляризационной микроскопии.
После получения синовиальной жидкости в результате диагности-
ческой пункции сустава, в исследуемом материале оценивается общий
цитоз и осуществляется дифференциальный подсчет клеток. Анализ
цитоза должен быть проведен в течение ближайших 2-х часов, так как
при анализе на поздних сроках наблюдаются изменения клеточности.
Далее жидкость центрифугируется при 1500 g в течение 20 мин. Из по-
лученного осадка по стандартной методике на обезжиренных предмет-
ных стеклах готовятся толстые мазки. Мазки фиксируются высушива-
нием под бытовым феном в течение 1 часа.
Для обнаружения кристаллов используется поляризационный мик-
роскоп Axiolab Pol фирмы Карл Цейсс, оснащенный поляризационны-
ми объективами 10х - 20х - 40х - 100х, поляризационным конденсором
А=0,24/0,90 Pol, поворотным анализатором и вращающимся столом.
Микроскопическое исследование мазка синовиальной жидкости осу-
368
Приложения
Рис. 4.1. Мазок синовиальной жидкости:
а - в светлом поле; 6-в поляризованном свете
ществляется при увеличении 200х со скрещенными осями поляриза-
тора и анализатора. Это позволяет обнаружить яркие кристаллы на
темном фоне, что значительно облегчает их поиск и морфологическую
оценку (рис. 4.1). Необходимо отметить, что в большинстве случаев об-
наружить кристаллы с помощью световой микроскопии не представля-
ется возможным.
Кристаллы моноурата натрия крупные, имеют характерную игловид-
ную форму и могут быть расположены как внутриклеточно, так и сво-
бодно. Кристаллы дигидропирофосфата кальция, которые встречают-
ся при пирофосфатной арторопатии мельче и обладают ромбовидной
формой. Более точная дифференцировка вида кристаллов может быть
осуществлена с помощью «лямбда» — компенсатора, который позво-
ляет оценить вид лучепреломления кристаллов. Кристаллы моноурата
натрия обладают выраженным отрицательным двойным лучепрелом-
лением, в то время как кристаллы дигидропирофосфата кальция имеют
слабое положительное двойное лучепреломление.
Использование данного метода с большой специфичностью позво-
ляет диагностировать микрокристаллические артропатии и проводить
дифференциальный диагноз с другими причинами поражений сус-
тавов. Поляризационная микроскопия должна быть интегрирована в
комплекс лабораторного обследования синовиальной жидкости, наря-
ду с оценкой клеточного состава и бактериоскопией.
369
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 5
КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ: МИФЫ И РЕАЛЬНОСТЬ
Г. И. Штейн,, канд.. биол. наук
Руководитель группы конфокальной микроскопии
и анализа изображений Института цитологии РАН,
г. Санкт-Петербург
Первый патент на конфокальный микроскоп был получен Марвином
Мински в 1957 г. С появлением надежных лазеров, мощных малогаба-
ритных компьютеров и другой элементной базы в середине 80-х годов
начался серийный выпуск этих приборов такими фирмами как Zeiss,
BioRad, Leica, Nikon, Olympus и другими.
В настоящее время конфокальная микроскопия широко использует-
ся в клеточной биологии. Наиболее часто встречающейся задачей для
конфокальной микроскопии является изучение структуры клеток и их
органоидов благодаря своему высокому разрешению и контрасту, напри-
мер, структуры ядра, хромосом, или даже локализации в них отдельных
генов, используя методику FISH (Fluorescence in situ hybridization).
Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ,
например белков. Такое изучение помогает понять: существует ли при-
чинно-следственная связь между ними. Предварительно белки метятся
антителами с разными флуорохромами. В обычный микроскоп трудно
разобрать, находятся ли белки рядом или один под другим. Конфокаль-
ная микроскопия позволяет это сделать.
Еще одна задача — исследования динамических процессов, происхо-
дящих в клетках. Например, движение ионов кальция и других веществ
через клеточные мембраны. Правда, для этого нужен высокоскорост-
ной конфокальный микроскоп.
Новыми перспективными направлениями являются методики
FRAP — Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление
флуоресценции после фотовыжигания) и FRET — Fluorescence Reso-
nanse Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцент-
ного резонанса). FRAP применяется для исследования подвижности
биоорганических молекул посредством инициации фотохимического
разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассо-
370
Приложения
единения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом
из необлученной зоны движутся, вследствие диффузии, в облученную
зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно су-
дить о подвижности молекул.
FRET применяется для определения расстояния между молекула-
ми разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся
двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрываю-
щимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцеп-
тору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате ре-
зонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит
от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию
в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным
микроскопом.
® «Недавно в нашем институте появился конфокальный микро-
скоп, а у меня давно приготовлены интересные препараты. Надо
бы посмотреть их на этом приборе, а вдруг я увижу что-нибудь
интересное?».
йЗ Прежде всего, надо осознавать, что большинство современных кон-
фокальных микроскопов построено на базе люминесцентного (прямого
или инвертированного) микроскопа. Следовательно, объекты исследо-
ваний должны быть предварительно окрашены соответствующим лю-
минесцентным красителем или обладать собственной люминесценци-
ей. 1 Иногда микроскоп имеет так назывемый «детектор проходящего
света», который позволяет наблюдать и неокрашенные объекты в ре-
жиме интерференционного контраста. Поэтому необходимо предвари-
тельно выяснить параметры конфокального микроскопа, и особенно,
какие имеются в комплекте лазеры, если хотите использовать режим
люминесценции. В частности, существует ли для вашего красителя не-
обходимая возбуждающая лазерная линия или соответствующий набор
фильтров и дихроичных зеркал.
Например, для выявления ДНК очень часто используются кра-
сители типа DAPI и Hoechst, имеющие люминесценцию в диапазоне
400-500 нм. В соответствии с правилом Стокса возбуждающий свет
должен иметь более короткую длину волны, то есть 300-400 нм. Это
ультрафиолетовый диапазон. Лазеры с такими длинами волн, конеч-
но, созданы, но они стоят очень дорого и имеют довольно громоздкую
конструкцию, поэтому, скорее всего, они отсутствуют в вашем конфо-
1 В зарубежной литературе обычно используется термин «флуоресценция», являющая-
ся частным случаем люминесценции (прим. авт.).
371
Приложения
кальном микроскопе. А для того, чтобы посмотреть ДНК, придется ис-
пользовать другие красители, которые сейчас специально разработаны
для конфокальной микроскопии и которые позволяют обходиться без
дорогостоящей аппаратуры.
И, наконец, длительное хранение препаратов не улучшает их качес-
тва, особенно с точки зрения интенсивности люминесценции. Поэтому
для исследований на конфокальном микроскопе приготовлением пре-
паратов следует заниматься особенно тщательно, предварительно про-
консультировавшись со специалистами.
® «В обычном люминесцентном микроскопе мои объекты светят-
ся очень слабо, трубно что-либо разобрать. Надо бы попробовать
их на конфокальном микроскопе. Там ведь имеется лазерный осве-
титель, высокочувствительные фотоприемники, компьютерная
обработка изображений».
Лазер обладает большой спектральной плотностью излучения в
очень узкой полосе, в то время как полоса поглощения флуорохрома
достаточно широкая. С помощью специально подобранных фильтров
из излучения ртутной лампы, применяемой в качестве источника све-
та в люминесцентном микроскопе, можно «вырезать» нужный участок
спектра с мощностью излучения, иногда даже большей, чем у лазера.
Кроме того, в процессе сканирования объекта лазерный луч освеща-
ет каждую точку объекта очень непродолжительное время. Например,
если поле сканирования имеет размер 1024x1024 точек, а общее время
сканирования составляет 1с, то время позиционирования луча равно
1 мкс, то есть 1/1000000 часть общего времени! Так что фотоприем-
ники работают в очень напряженном режиме, и для них интенсивнос-
ти света хватает далеко не всегда. Не надо также забывать о том, что
люминесценция в конфокальном микроскопе регистрируется с очень
тонкого слоя объекта в отличие от обычного микроскопа.
Глаз человека воспринимает изображение по-другому, не по точкам,
а целиком. Он обладает чрезвычайно высокой чувствительностью, ко-
торую способны превзойти только уникальные приборы.
Конечно, в конфокальном микроскопе с помощью электронных сис-
тем можно усилить сигнал и довести яркость изображения на экране мо-
нитора до требуемого уровня. Но тут появляется серьезная проблема.
Как и в любом электронно-оптическом приборе, в конфокальном микро-
скопе существуют случайные флуктуации сигнала или шумы, имеющие
разнообразную физическую природу (квантовую, тепловую и т.д.). Чем
меньше уровень шумов (т.е. чем больше отношение сигнал/шум), тем
372
Приложения
более качественным будет изображение. Высокочастотные шумы прояв-
ляются на изображении как яркие или темные точки, и их источниками
являются лазеры, фотоприемники, электронные блоки, волоконно-оп-
тические кабели. Низкочастотные шумы видны как горизонтальные по-
лосы. Эти шумы могут возникать из-за наводок по электрической сети,
вибраций и других причин. Шумы будут засорять изображение и снижать
его информативность. Увеличение чувствительности фотоприемников и
усиление полезного сигнала приводит и к усилению шумов.
Для увеличения яркости изображения можно попытаться увеличить
мощность лазера, но при этом происходит «выцветание» препарата за
счет фотохимического разложения флуорохрома, а также повреждение
живых клеток. Еще один способ — это приоткрыть конфокальную диа-
фрагму. На фотоприемники будет попадать больше света, но зато ухуд-
шится разрешающая способность конфокального микроскопа.
Конфокальный микроскоп предназначен, в частности, для усиления
контраста изображения, а не его яркости. Для слабосветящихся объ-
ектов необходимо использовать специальные высокочувствительные
видеокамеры с большим временем накопления сигнала.
® «Сейчас на конфокальном микроскопе я поставлю объектив с
максимальным увеличением, установлю минимальное поле сканиро-
вания с максимальным форматом, получу размер элемента изобра-
жения (пиксела), отнесенный к плоскости объекта, 2-3 нм и увижу
там такие детали, что ни в сказке сказать, ни пером описать!».
о£Э Разрешающая способность (resolution) конфокального микроско-
па — его важнейший параметр (впрочем, как и других оптических при-
боров). Это минимальное расстояние между двумя точками объекта,
при котором прибор может различать их как отдельные структуры.
Теоретически разрешающая способность конфокального микроскопа
всего в 1,4 раза лучше обычного. Она зависит, прежде всего, от длины
волны излучения. А так как и тот, и другой микроскопы — это опти-
ческие приборы видимого диапазона., то существует предел, наклады-
ваемый волновыми свойствами света. Существенное значение имеет
также апертура объектива (а не его увеличение!), но и здесь существует
предел, который уже конструктивно достигнут. Разрешающая способ-
ность микроскопа подразделяется на латеральную (т.е. в плоскости,
перпендикулярной оптической оси системы) и аксиальную (т.е. в на-
правлении оптической оси), причем аксиальное разрешение, как пра-
вило, в 2-3 раза хуже латерального. Диаметр конфокальной диафраг-
мы также имеет важное значение, поскольку от него напрямую зависит
373
Приложения
толщина слоя, с которого снимается оптический сигнал, т. е. аксиальное
разрешение. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем тоньше «оптический
срез». Однако, как уже указывалось, при этом уменьшается световой
поток, попадающий на фотоприемник.
Поскольку конфокальный микроскоп — прибор оптико-электронный,
то его разрешающая способность зависит не только от оптических узлов,
но и от электронных систем преобразования оптического сигнала в ана-
логовый электрический, а затем и в цифровой. Эти преобразования мо-
гут ухудшить разрешение. Например, такие параметры как формат кадра
(т. е. число пикселей — элементов изображения на кадр) и электронное
увеличение (zoom) влияют на разрешающую способность. Чем больше
формат кадра и zoom, тем меньше размеры пикселей и расстояние между
ними, то есть с большей точностью отслеживаются детали изображения.
Максимальный размер пикселей, при которых еще не происходит поте-
ри оптического разрешения, определяется теоремой Найквиста. Исходя
из нее, размеры пикселей (и расстояние между ними) должны быть по
крайней мере в 2.3 раза меньше оптической разрешающей способности
микроскопа. При увеличении размеров пикселей происходит потеря в
разрешении конфокального микроскопа (undersampling), при умень-
шении их размеров разрешение не увеличивается, но могут появиться
структуры на изображении, которых на самом деле нет (oversampling).
Кроме того, в этом случае возрастает плотность энергии лазерного излу-
чения на препарате, что может привести к его выцветанию.
Поэтому для достижения максимально возможного разрешения
необходимо стремиться не к максимальному увеличению прибора, а к
использованию высокоапертурного объектива. Параметры сканирую-
щей системы должны ему соответствовать. Для правильной настройки
конфокального микроскопа для этого существуют специальные таблицы
и графики. Кроме того, необходимо бороться с шумами, ухудшающими
качество изображения. Если же вам необходимо рассмотреть (не просто
обнаружить) детали изображения менее 0,2 мкм, то для этого придется
применять другие методы, например, электронную микроскопию.
® «На серии конфокальных срезов я не увидел интересующих меня
структур, все очень расплывчато. Я сделаю трехмерную реконс-
трукцию и посмотрю на мой объект как бы сбоку. Тогда увижу
что-нибудь интересное».
оОЕсли ваш объект не структурирован или, по крайней мере, четких
деталей не видно ни на одном срезе, реконструкция ничего не даст.
Снежный ком, как ни поворачивай, как ни режь, останется снежным
374
Приложения
комом. Возможно, что вы сделали слишком мало срезов, или они идут с
большим интервалом, превышающим аксиальное разрешение. Реконс-
трукцию наиболее эффективно применять для объектов, имеющих
четкие контуры для того, чтобы посмотреть его форму во всех проек-
циях. Хорошие результаты получаются тогда, когда внутри объекта, ок-
рашенного одним красителем, расположены структуры другого цвета.
Проблемы колокализации (т. е. взаиморасположения разных веществ)
можно решить и без трехмерной реконструкции, путем просмотра ор-
тогональных проекций.
Фирмы-производители постоянно создают новые более совершен-
ные приборы. Вот только небольшой перечень инноваций за последние
несколько лет. В 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический
светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазер-
ный луч возбуждения и люминесценцию. Светоделитель управляется
от компьютера, и его спектральные свойства могут быстро перестраи-
ваться, в том числе на несколько лазерных линий. В этом же году фирма
Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 МЕТА
с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновре-
менно в 32-х спектральных каналах! В 2004 г. Zeiss создает высокоско-
ростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше
обычного конфокала.
375
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ б
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СТЕРЕОСКОПИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА В КОСМЕТОЛОГИИ
С. Г. Акбаш,
эстетист-косметолог, эксперт Госстандарта по косметологии
Задача: точно отделить эпонихиум от кутикулярной пластинки, не
повреждая ни одной живой клетки, так как подобные повреждения
приводят к усилению защитных функций кожи. Выражается это уси-
ление сверхбыстрой эпитализацией околоногтевого валика, а выгля-
дит просто как давно не ухоженные ногти. Причем, кутикула, нарастая
столь стремительным регенеративным амитозом, становится раз от
раза грубее и массивнее.
Обычно косметолог использовал лупу с подсветкой 8х, с которой
лучше видно рабочее поле, но работа с эпонихиумом проводилась ин-
туитивно.
В микроскоп Stemi 2000С видно четко границу живых клеток и зер-
нистого и шиповатого слоев по характерному признаку — тургору, при-
сущему всем живым клеткам. Стало возможным отделить достаточно
точно наслоения мембран поверхностных слоев, которые не имеют ни
метаболизма, ни митотического деления. Удаление тонкого слоя этих
фрагментов клеточных структур не приведет к чрезмерному разраста-
нию кутикулы, ее последующему воспалению при минимальной трав-
ме. Более того, при точности подобных манипуляций именно в месте
начала роста эпонихиальной пластины даже поврежденная пластина
приходит в первоначальное состояние. Но без микроскопа эта точ-
ность, как было сказано ранее, интуитивна, наработана годами тонкого
ручного навыка и очень субъективна, то есть зависит только от умения
доктора, а не от точного видения рабочего поля.
Для проведенной выше работы врача-косметолога мы предложили
недорогой малогабаритный стереоскопический микроскоп Stemi 2000-С
с увеличением 50хх и волоконным осветителем KL 200.
Микроскоп был оснащен цветной аналоговой камерой типа МС-
3249R/MFG (%" 3-CCD). В качестве программного обеспечения пере-
дачи изображения на мони-тор («захват изображение» и перевод его
376
Приложения
в цифровой формат), а также создание галереи изображений была ис-
пользована программа AxioVision.
В процессе работы пациент мог наблюдать проводимые действия на
экране. Наиболее интересные моменты были зафиксированы, а затем
скомпонованы.
Если требуется произвести дополнительное исследование крови или
ткани пациента, то для этих целей можно использовать биологический
микроскоп Axiostar с фотовыходом и той же камерой и системой ана-
лиза изображения; зафиксировать результат исследования и также ус-
тановить в галерею. При необходимости все видеоизображения могут
быть включены в карточку пациента.
Для проведения подобных работ может быть рекомендован либо
медицинский, либо универсальный штатив с удлиненной горизонталь-
ной штангой. Все зависит от габаритов рабочего места работы врача-
косметолога.
377
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ?
ПРИМЕНЕНИЕ СТЕРЕОСКОПИЧЕСКОГО МИКРОСКОПА В СРЕДНЕЙ ШКОЛЕ
НА УРОКАХ БИОЛОГИИ
По результатам апробации стереомикроскопа МБС10.
Протопопова Т.Г.,
преподаватель биологии, школа № 393, г. Санкт-Петербург
Класс Тема урока Что рассматриваем Увеличение микроско- па, крат
Шестой Строение клетки Форма растительных кле- ток, местоположение ядра. Пластиды 8х; 16х
Жизнедеятельность клетки Движение цитоплазмы в листьях элодеи 16х; 32х
Строение корня Рассмотреть корневые во- лоски и чехлик 16х; 32х
Строение почки Чешуйки, зачаточные лис- тья, цветы, конус роста 8х; 16х; 32х
Развитие побега из почки Несколько почек по мере развития 16х; 32х; 56х
Особенности микро- скопического стро- ения листа в связи с его функциями Покровная ткань, основная, проводящая, механическая 32х; 56х
Внутреннее строение стебля в связи с его функциями Особенности строения кле- ток каждого слоя стебля: Ткани 16х; 32х
Образование годич- ных колец Особенности строения кле- ток древесины в зависимос- ти от времени года и сторо- ны света 16х
Строение семени 1 и 2-х дольных растений Зародыш 8х; 16х
Строение цветка Строение тычинки, пестика (рыльце) 8х; 16х
378
Приложения
Класс Тема урока Что рассматриваем Увеличение микроско- па, крат
Седьмой Водоросли однокле- точные Водоросли со стенок аква- риума 16х; 32х
Строение сфагнума Типы клеток сфагнума в связи с их функциями 16х; 32х
Голосеменные строе- ния хвои Поперечный разрез хвои 16х; 32х
Грибы, плесневые грибы Белая плесень 16х; 32х
Одноклеточные Особенности строения аме- бы, эвглена зеленая, инфузо- рия-туфелька. Передвижение 8х; 16х; 32х
Восьмой Тип: членистоногий
Отряд: чешуекрылые Чешуйки на крыльях, их формы, окраска 16х; 32х
Отряд: двукрылые Ноги мухи 8х; 16х
Отряд: жесткокрылые Усики майского жука. Ноги скарабея, медведки, пла- вунца. Окраска хитина бронзовок 8х; 16х
Класс: рыбы Определение возраста рыбы по чешуе 8х; 16х
Приспособление птиц к полету во вне- шнем строении Строение опахало контур- ного и пухового пера 8х; 16х; 32х
Девятый Микроскопическое строение ткани Микропрепараты эпители- альной, соединение 16х; 32х
Одиннад- цатый Изучение строения растительной, живот- ной, грибной клетки Растительная, животная, грибная клетка 16х; 32х
Примечание. Возможно, в новом веке и в российской средней школе или колледже по-
явятся стереоскопические микроскопы. За рубежом этот тип микроскопа применяется так
же, как и обычные биологические микроскопы.
379
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 8
СТАНДАРТЫ МИКРОСКОПИИ: СВОДНАЯ ТАБЛИЦА1
Номер стандарта Название стандарта Номер старого стандарта
ГОСТ 2.412-81 ЕСКД. Правила выполнения чертежей и схем оптических изделий ГОСТ 2.412-68
ГОСТ 1807-75 Радиусы сферических поверхностей оп- тических деталей. Ряды числовых зна- чений. ГОСТ 1807-57
ГОСТ 3178-75 Приборы оптические настольные. Вы- сота расположения оптических осей и выходного зрачка ГОСТ 3178-64
ГОСТ 3361-75 Окуляры и тубусы микроскопов. При- соединительные размеры ГОСТ 3361-69
ГОСТ 3469-91 (ИСО 8038-85) Микроскопы. Резьба для объективов. Размеры ГОСТ 3469-83
ГОСТ 3514-94 Стекло оптическое бесцветное. Техни- ческие условия ГОСТ 3514-76, кроме раздела 2
ГОСТ 5359-77 Резьба окулярная для оптических при- боров. Профиль и размеры ГОСТ 5359-50
ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепара- тов. Технические условия ГОСТ 6672-59
ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Техни- ческие требования ГОСТ 8074-71
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепара- тов. Технические условия ГОСТ 9284-59
ГОСТ 9411-91 Стекло оптическое цветное. Техничес- кие условия ГОСТ 9411-81
ГОСТ 11141-84 Детали оптические. Классы чистоты по- верхностей. Методы контроля ГОСТ 11141-76
ГОСТ 11200-75 Объективы и тубусы микроскопов. Присоединительные размеры ГОСТ 11200-65
ГОСТ 13240-78 Заготовки из оптического стекла. Тех- нические условия ГОСТ 13240-67
1 Государственные стандарты. Указатель 2003 г.
380
Приложения
Номер стандарта Название стандарта Номер старого стандарта
ГОСТ 13659-78 Стекло оптическое бесцветное. Физи- ко-химические характеристики. Основ- ные параметры ГОСТ 13659-68
ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопов. Технические требования. Методы ис- пытания ГОСТ 13739-68
ГОСТ 15130-86 Стекло кварцевое оптическое. Техни- ческие условия ГОСТ 15130-79
ГОСТ 23136-93 Материалы оптические. Параметры ГОСТ 23136-78
ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Об- щие технические требования ГОСТ 7594-75, ГОСТ 8307-72, ГОСТ 8309-75, ГОСТ 9461-74, ГОСТ 18504-73, ГОСТ 10513-73
ГОСТ 28489-90 Микроскопы световые. Термины и оп- ределения
ГОСТ 28869-90 Материалы оптические. Методы изме- рений показателя преломления ГОСТ 3516-74, ГОСТ 5421-73, ГОСТ 5723-75, ГОСТ 8201-74
ГОСТ 29214-91 (ИСО 8040-86) Оптика и оптические приборы. Мик- роскопы. Присоединительные размеры тубусных вставок и пазов для них
ГОСТ Р 50701-94 Приборы наблюдательные телескопи- ческие. Термины и определения
ГОСТ Р 50909-96 Приборы визуальные наблюдательные. Требования безопасности и методы ис- пытаний
ГОСТР ИСО 8374-93 Фотография. Определение условий не- активного освещения по ИСО
РСТ РСФСР 791-91 Фотоизображения. Общие технические требования
ГОСТ 4.460-86 СПКП. Объективы. Номенклатура по- казателей
ГОСТ 4.462-86 СПКП. Фотоувеличители. Номенклату- ра показателей
ГОСТ 4.464-86 СПКП. Фотоаппараты. Номенклатура показателей
381
Приложения
Номер стандарта Название стандарта Номер старого стандарта
ГОСТ 13095-82 Объективы. Методы измерения фокус- ных расстояний ГОСТ 13095-67
ГОСТ 13096-82 Объективы. Методы измерения рабоче- го и заднего отрезков ГОСТ 13096-67
ГОСТ 24604-81 Объективы. Методы определения коэф- фициентов пропускания
ГОСТ 24724-81 Объективы для кино- и фотоаппаратов . Метод определения коэффициентов рассеяния
ГОСТ 24775-81 Объективы. Методы измерения винье- тирования
ГОСТ 25502-82 Объективы. Методы определения фо- тографической разрешающей способ- ности
ГОСТ Р МЭК 60335-2-56-99 Безопасность бытовых и аналогичных электрических приборов. Дополнитель- ные требования к проекторам и анало- гичной аппаратуры ГОСТ Р 50805-95
ГОСТ 4.446-86 СПКП. Средства измерения и контроля линейных и угловых размеров в маши- ностроении. Номенклатура показателей.
ГОСТ 4.447-86 СПКП. Приборы контрольно-измери- тельные оптико-механические для из- мерения линейных размеров. Номенк- латура показателей
ГОСТ 4.448-86 СПКП. Приборы контрольно-измери- тельные оптико-механические для из- мерения углов. Номенклатура показа- телей
ГОСТ 4.449-86 СПКП. Приборы контрольно-измери- тельные контроля шероховатости и ка- чества поверхности. Номенклатура по- казателей
ГОСТ 4.451-86 СПКП. Микроскопы световые. Номенк- латура показателей
ГОСТ 4.450-86 СПКП. Приборы и аппаратура для спектрального анализа. Номенклатура показателей
ГОСТ 30479-97 Обеспечение износостойкости изделий. Методы установления предельного из- носа, обеспечивающего требуемый уро- вень безопасности. Общие требования.
382
Приложения
Номер стандарта Название стандарта Номер старого стандарта
ГОСТ Р 40.002- 2000 Система сертификации ГОСТ Р. Регис- трация систем качества. Основные по- ложения ГОСТ Р 40.002-96
ГОСТ Р 40.003- 2000 Система сертификации ГОСТ Р. Регист- рация систем качества. Порядок прове- дения сертификации систем качества и сертификации производств ГОСТ Р 40.003-96, ГОСТ Р 40.004-96
ГОСТ Р 40.005- 2000 Система сертификации ГОСТ Р. Регист- рация систем качества. Инспекционный контроль сертификационных систем ка- чества и сертификации производств ГОСТ Р 40.005-96
ГОСТ 2.116-84 Карта технического уровня и качества продукции ГОСТ 2.116-71
ГОСТ 27.002-89 Надежность в технике. Основные поня- тия. Термины и определения
ГОСТ 27.004-85 Надежность в технике. Системы техно- логические. Термины и определения ГОСТ 2.2954-78
ГОСТ 27.202-83 Надежность в технике. Системы техно- логические. Методы оценки надежнос- ти по параметрам качества изготовлен- ной продукции ГОСТ 16.467-70, ГОСТ 16.304-74 - ГОСТ 16.306-74, ГОСТ 23.641-79
ГОСТ 27.204-83 Надежность в технике. Системы техно- логические. Технические требования к методам оценки надежности по пара- метрам производительности
ГОСТ Р 51672- 2000 Метрологическое обеспечение испы- таний продукции для целей подтверж- дения соответствия. Основные поло- жения ’
ГОСТ 28.496-90 Система оценки качества и сертифика- ции взаимопоставляемой продукции. Знак соответствия. Форма, размеры и порядок применения
ГОСТ Р 50.267.0- 92 (МЭК 601-1-88) Изделия медицинские электрические. Часть 1. Общие требования безопас- ности
ГОСТ 3519-91 Материалы оптические. Методы опре- деления бессвильности ГОСТ 3521-69
ГОСТ 3522-81 Материалы оптические. Методы опре- деления пузырности ГОСТ 3522-69
383
Приложения
МЕЖДУНАРОДНЫЕ СТАНДАРТЫ ISO, DIN
ISO/ТС 172/SC5. ISO 8036. ISO 8037. ISO 8577. ISO 9344. ISO 10934. ISO 8576. Информация, передаваемая потребителю. Микроскопы. Иммерсионное масло. Предметные стекла. Микроскопы. Спектральные фильтры. Микроскопы. Окулярные сетки. Микроскопия. Термины. Микроскопы. Система координат в поляризацион- ной световой микроскопии.
ISO 8036-1:1998. Optics and optical instruments. Microscopes. Part 1:
ISO 8576:1996. Immersion oil for general use in light microscopy. Optics and optical instruments. Microscopes. Reference
ISO 8672:1993. system of polarized light microscopy. Air quality. Determination of the number concentration
ISO 10312:1995. of airborne inorganic fibres by phase contrast optical mi- croscopy. Membrane filter method. Ambient air. Determination of asbestos fibres. Direct
transfer transmission electron microscopy method.
ISO 10934-l:2002.0ptics and optical instruments. Vocabulary for micros-
ISO 13794:1999. copy. Part 1: Light microscopy. Ambient air. Determination of asbestos fibres. Indi-
ISO 14966:2002. rect-transfer transmission electron microscopy method (available in English only). Ambient air. Determination of numerical concentration of inorganic fibrous particles. Scanning electron micros- copy method
384
Номер документа Дата вы- пуска Тип доку- мента Акту- али- зация Соответствие международным стандартам Название
DIN 58884 1970-08-00 ST*N C(RX) ISO 8036-1 (1986-09), NEQ’ISO 8036-1 (1998-03), NEQ’ISO/DIS 8036-1 (1996-04), NEQ'ISO/FDIS 8036-1 (1997-11), NEQ4SO 8037-1 (1986-09), NEQ*ISO 8255-1 (1986-09), NEQ Препаратодержатели, покровные стекла, иммерсионные средства для микроскопов
DIN 58888 1979-07-00 STN и ISO 8038-1 (1997-12), NEQ’ISO/ DIS 8038-1 (1996-05), EQVISO/ FDIS 8038-1 (1997-08), EQV Резьбовое соединение для объекти- вов микроскопа; RMS-резьба
DIN ISO 8036-1 2002-03-00 DCN-E и ISO 8036-1 (1998-03), EQV Оптика и оптические инструменты - микроскопы - Часть 1: Иммерсион- ное масло для общего применения в световой микроскопии (ISO 8036-1:1998). В документе излагаются требования к иммерсионному маслу для общего применения в световой микроско- пии в видимом спектральном диапа- зоне. Благодаря своему оптическому эффекту иммерсионное масло явля- ется составной частью оптики мик- роскопов. Выполнение требований согласно данному документу гаран- тирует качество изображения.
Приложения
385
386
Номер документа Дата вы- пуска Тип Доку- мента Акту- али- зация Соответствие международным стандартам Название
DIN ISO 8039 2001-12-00 ST*N и ISO 8039 (1997-11), EQV Оптика и оптические инструменты - микроскопы - увеличения (ISO 8039:1997). В документе представлен ряд значе- ний для увеличения компонентов све- товых микроскопов, участвующих в создании изображения, и дается оп- ределение увеличительных систем, в которых они используются.
Приложения
ПРИЛОЖЕНИЕ 9
ОСНОВНЫЕ ФОРМУЛЫ И ТАБЛИЦЫ МИКРОСКОПИИ
ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОСКОПОВ
Во время повседневной работы с микроскопом подчас требуется
проводить расчеты, которые вызывают определенные затруднения у
врачей-лаборантов и биологов, являющихся специалистами высокого
класса в своей области.
Ниже приведены формулы и расчетные таблицы, которые выручат
в трудный час.
Небольшое замечание — в таблицах приведены значения увеличе-
ний, соответствующие стандартному ряду увеличений ряда Ra 10. Из
произведения двух и более стандартных чисел округлением снова по-
лучается стандартное число (рекомендовано специалистами фирмы
Carl Zeiss).
3.1. Формулы и таблицы микроскопии
Для удобства работы или подбора оптики целесообразно пользо-
ваться уже готовыми таблицами. Ниже приведены формулы, по кото-
рым производились расчеты и комментарии.
387
388
Приложения
Таблица 1
Таблица общего увеличения микроскопа
Система дополнительного увеличения (тубусная система или система «Оптовар») [адс]
[роб] 1х 1,25х 1,6х 2,5х 4х
Увеличение окуляра [Гок]
10х 16х 20 х 10х 16х 20 х 10х 16х 20 х 10х 16х 20х 10х 16х 20 х
1х 10х 16х 20х 12,5х 20х 25х 16х 25х 32х 25х 40 х 50х 40х 64х 80х
1,25х 12,5 20х 25х 16х 25х 32х 20х 32х 40 х 32х 50х 63х 50х 80х ЮОх
2,5х 25х 40х 50х 32х 50х 63х 40х 63х 80х 63х ЮОх 125х ЮОх ЮбОх 200х
4х 40х 63х 80х 50х 80х ЮОх 63х ЮОх 125х ЮОх 160х 200х ЮОх 250х 320х
5х 50х 80х ЮОх 63х ЮОх 125х 80х 125х 160х 125х 200х 240х 200х 320х 400х
10х ЮОх ЮОх 200х 125х 200х 250х ЮОх 250х 320х 250х 400х 500х 400х 640х 800х
20х 200х 320х 400х 250х 400х 500х 320х 500х бЗОх 500х 800х ЮООх 800х 1250х ЮООх
40х 400х бЗОх 800х 500х 800х ЮООх бЗОх ЮООх 1250х ЮООх ЮООх 2000х ЮООх 2500х 3200х
50х 500х 800х ЮООх бЗОх ЮООх 1250х 800х 1250х 1600х 1250х 2000х 2500х 2000х 3200х 4000х
63х бЗОх ЮООх 1250х 800х 1250х ЮООх ЮООх ЮООх 2000х 1600х 2500х 3200х 2500х 4000х 5000х
ЮОх ЮООх ЮООх 2000х 1250х 2000х 2500х ЮООх 2500х 3200х 2500х 4000х 5000х 4000х 6400х 8000х
Примечание. Выделенное увеличение 5000х является бесполезным из-за низкого качества воспроизведения объекта по разрешению.
* Расчет производится по формуле:
Ум — [ Роб] ’ [Гок] [оСдс ] ,
где Ум — общее увеличение микроскопа, роб — увеличение объектива, Гок — увеличение окуляра, адс —
увеличение дополнительной системы.
Таблица 2
Диапазон полезного увеличения (по теории Эрнста Аббе)*
Числовая апертура объектива Аоб Нижний предел по- лезного увеличения 500 А„б Верхний предел по- лезного увеличения 1000 Ао6 Числовая апер- тура объектива Аоб Нижний предел по- лезного увеличения 500 А0б Верхний предел по- лезного увеличения 1000 Аоб
0,025 12,5х 25х 0,45 200х 400х
0,03 12,5х 32х 0,50 250х 500х
0,04 20х 40 х 0,60 320х бЗОх
0,06 32х 63х 0,65 320х бЗОх
0,075 40х 80х 0,75 400х 800х
0,10 50х ЮОх 0,80 400х 800х
0,12 63х 125х 0,85 400х 800х
0,13 63х 125х 0,90 400х ЮООх
0,15 63х ЮОх 0,95 500х ЮООх
0,16 80х ЮОх 1,0 500х ЮООх
0,22 ЮОх 200х 1,20 бЗОх 1250х
0,25 125х 250х 1,25 бЗОх 1250х
0,30 125х 320х 1,30 бЗОх 1250х
0,35 ЮОх 320х 1,40 бЗОх 1250х
0,40 200х 400х 1,45 бЗОх 1250х
* Расчет производится по формуле:
Ум = (500-1000) Аоб,
где Ум — общее увеличение микроскопа, АОб — числовая апертура объектива.
389
390
Таблица 3
Подбор оптики микроскопа в соответствии с пределами полезного увеличения
Объектив Пределы полез- ного увеличения Максимальное увеличение последующей после объ- ектива системы в пределах полезного увеличения Рекомендуемые увеличения окуляров при тубус-факторе
500А 1000А Г500А Г1000А 1х 1,5х
lx/0,025 12,5х 25х 12,5х 25х (Юх)15х-20х (28х) (7х)10х-15х(16х)
2,5х/0,05 25х 50х Юх 20х 10х-15х-20х 6,Зх-7х-10х-12,5х (15х)
2,5х/0,08 40х 80х 16х 32х 15х-20х-25-28 Юх-15х-20х
4х/0,12 60х 120х 15х ЗОх 15х-20х-25-28 10х-20х
5х/0,Ю 50х ЮОх Юх 20х Юх-15х-20х 6,Зх-7х-10х-12,5х
5х/0,12 60х 120х 12х 24х (10х)15х-20х (7х)-10х-12,5х-15х-16х
8х/0,20* ЮОх 200х 12,5х 25 х 12,5х—15х-20х—25х (7х)-10х-12,5х-15х-16х
9х/0,20* ЮОх 200х Их 22х 10х-12,5х-15х-16х-20х 7х-10х-12,5х-15х
Юх/0,25 125х 250х 12,5х 25х (10х)15х-20х 8х-10х-12,5х-15х-16х
Юх/0,30 150х ЗООх 15х ЗОх 15х-20х-25х-28х 10х-12,5х-15х-16х-20х
Юх/0,40 200х 400х 20х 40х 20х-25х-28х (12,5х)-15х-20х-25х-(28х)
Юх/0,50 250х 500х 25х 50х (20х) -25х-28х 16х-20х-25х-28х
20х/0,40* 200х 400х Юх 20х Юх-15х-20х (5х)-6,Зх-7х-10х-12,5х- (15х)
25х/0,50 250х 500х Юх 20х Юх-12,5х-15х-20х 6,Зх-7х-10х-12,5х
25х/0,55 275х 550х 12х 22х (Юх)15х-20х 7х-10х-12,5х-15х
20х/0,65 325х 650х 16х 32х 15х-20х-25х-28х 10х-15х-20х
20х/0,85 425х 850х 21х 42х 20х-25х-28х 15х-20х-25х-28х
40х/0,50 250х 500х 6х 12,5х (5х)6,Зх-7х-10х 4х-5х-7х
40х/0,60 ЗООх бООх 7,5х 15х (7х)10х-15х 5х-7х-10х
40х/0,65 325х 650х 8х 16х (7х)10х-15х 5х-7х-10х
40х/0,75 375х 750х 9х 18,7х Юх-15х (20х) 6,Зх-7х-10х-12,5х
40х/0,85 425х 850х 10,6х 21х 10х-15х-20х 7х-10х-12,5х-15х
40х/0,95 475х 950х 11,8х 22,5х (Юх)15х-20х 7х-10х-12,5х-15х
Таблица 3 (окончание)
Объектив Пределы полез- ного увеличения Максимальное увеличение последующей после объ- ектива системы в пределах полезного увеличения Рекомендуемые увеличения окуляров при тубус-факторе
500A 1000A Г500А Г1000А 1х 1,5х
40х/1,35 675x 1325x 16х ЗЗх 15х-20х-28 10х-15х-20х
50х/0,55 275x 550x 5,5х Их 5х-6,Зх-7х-10х 4х-5х-7х
50х/0,85 425x 850x 8,5х 17х (7х)10х-15х 5х-7х-10х
50х/1,00 500x ЮООх 10х 20х 10х-15х-20х 6,Зх-7х-10х-12,5х (15х)
63х/0,85 425x 850x 7х 13х 7х-10х (15х) 4х-5х-6,3х -7х (10х)
63х/1,20 600x 1200x 10х 20х 10х-15х-20х 6,Зх-7х-10х-12,5х (15х)
63х/1,40 700x 1400x Их 22х 10х-15х-20х 7х-10х-12,5х-15х
70х/1,23 615 1230 8,7х 17,6х (7х)10х-15х(20х) 5х-6,Зх-7х-10х-(12,5х)
85х/1,0 500 1000 5,8х 11,8х (5х)7х-10х (12,5х) 4х-5х-6,3х-7х
90х/1,25 625 1250 6,9х 13,8х 6,Зх-7х-10х-12,5х (15х) (4х)5х-6,Зх-7х-(10х)
90х/1,30 700 1300 7,7х 14,4х 7х-10х-12.5х (15х) 5х-6,Зх-7х-10х
100х/0,70 350x 700x 3,5х 7х 5х-6,3х-7х 4х-5х
ЮОх/0,80 400x 800x 4х 8х 5х-6,3х -7х(10х) 4х-5х
100х/0,90 450x 900x 4,5х 9х 5х-6,Зх-7х-10х 4х-5х-6,3х
100х/0,95 475x 550x 4,7 х 9,5х 5х-6,Зх-7х-10х 4х-5х-6,3х
ЮОх/1,25 625x 1250x 6,2х 12,5х (5х) 6,Зх-7х-10х (15х) 4х-5х-6,3х-7х (10х)
lOOx/1,35 675x 1325x 6,7х 13,5х 6,Зх-7х-10х-12,5х-15х 4х-5х-7х-10х
100x/l,40 700x 1400x 7х 14х 7х-10х-12,5х-15х 4х-5х-7х-10х
СО
kO
392
Таблица 4
Наименьшее разрешаемое расстояние между элементами структуры и глубина резкости объектива*
Аоб Х=400 им Х=550нм Х=700 им Глубина резкости объек- тива, мкм
У1 У1 У1 У> У2 У1
0,03 6,67 8,13 9,2 14,23 11,18 11,67 444,4
0,05 4,00 4,88 5,50 6,71 7,00 8,54 160,00
0,10 2,0 2,44 2,75 4,27 3,36 3,5 40,00
0,15 1,33 1,63 1,84 2,85 2,24 2,33 17,80
0,20 1,00 1,22 1,37 1,68 1,75 2,14 10,00
0,25 0,8 0,98 1,10 1,71 1,34 1,4 6,40
0,30 0,67 0,81 0,92 1,42 1,12 1,17 4,40
0,35 0,57 0,69 0,70 1,22 0,96 1,0 3,30
0,40 0,5 0,61 0,66 1,07 0,84 0,87 2,50
0,45 0,44 0,54 0,62 0,95 0,74 0,78 1,98
0,50 0,4 0,49 0,55 0,85 0,67 0,7 1,60
0,55 0,36 0,44 0,50 0,61 0,64 0,78 1,30
0,60 0,33 0,41 0,46 0,71 0,56 0,58 1,10
0,65 0,31 0,37 0,42 0,66 0,52 0,54 0,95
0,75 0,27 0,32 0,36 0,57 0,45 0,47 0,71
0,80 0,25 0,305 0,34 0,53 0.42 0,44. 0,63
0,85 0,23 0,29 0,32 0,5 0,39 0,41 0,55
0,90 0,22 0,27 0,31 0,47 0,37 0,39 0,49
0,95 0,21 0,26 0,29 0,45 0,35 0,37 0,44
1,0 0,126 0,126 0,174 0,221 0,174 0,221 0,40
1,20 0,105 0,105 0,145 0,184 0,145 0,184 0,28
1,25 0,101 0,101 0,139 0,177 0,139 0,177 0,26
1,30 0,097 0,097 0,134 0,17 0,134 0,17 0,24
1,40 0,09 0,09 0,124 0,158 0,124 0,158 0,20
1,45 0,087 0,087 0,120 0,152 0,120 0,152 0,18
Приложения
* Расчет производится по формуле:
У1 = Х/2Аоб; У2 = 0,61Х/Аоб,
где У1, У2 — наименьшее разрешаемое расстояние, мкм; АОб — числовая апертура объектива; X — длина
волны, при которой происходит исследование, нм; цифра «2» — коэффициент при равенстве числовых
апертур осветителя и объектива; 0,61 — коэффициент при уменьшенной числовой апертуре объектива
на Уз по отношению к осветительной апертуре1.
Иммерсионные системы, начиная с числовой апертуры 1,0, рассчитываются с учетом того, что осве-
тительная числовая апертура соотносится с числовой апертурой объектива1 2 как 1:3.
Числовая апертура объектива маркируется на корпусе объектива (например, 40х/0,65); числовая
апертура конденсора определяется по маркировке на корпусе конденсора и определяется по положению
рукоятки регулируемой апертурной диафрагмы3.
Глубина резкости объектива - это дифракционная, или волновая глубина и вычисляется по формуле:
Тв = иХ/2А2,
где п — показатель преломления среды, X — длина волны, А — числовая апертура объектива.
1 Апертурная диафрагма конденсора прикрыта на % числовой апертуры объектива.
2 Апертурная диафрагма конденсора прикрыта на % числовой апертуры объектива.
3 На практике размер числовой апертуры конденсора определяется при вынутом окуляре по размеру задиафрагмированного апер-
турной диафрагмой конденсора освещенного диска (выходного зрачка объектива). Если диафрагма полностью вписана в диск, то чис-
ловая апертура конденсора равна числовой апертуре объектива.
Приложения
393
394
Таблица 5
Наименьшее разрешаемое расстояние между элементами структуры, лин/мм*
А,,6 X = 400 им Х=550нм Х = 700 нм
У1 Уг У1 Уг Уг У1
0,03 150 123 109 70 89 86
0,05 250 205 182 149 143 117
0,10 500 410 364 234 298 286
0,15 752 613 543 351 446 429
0,20 1000 820 730 595 571 467
0,25 1250 1042 910 585 746 714
0,30 1493 1235 1087 704 893 855
0,35 1754 1450 1429 820 1042 1000
0,40 2000 1639 1515 935 1190 1149
0,45 2273 1852 1613 1053 1351 1282
0,50 2500 2041 1818 1176 1492 1429
0,55 2778 2273 2000 1639 1562 1282
0,60 3030 2439 2174 1408 1786 1724
0,65 3226 2703 2381 1515 1923 1852
0,75 3704 3125 2778 1754 2222 2128
0,80 4000 3280 2941 1887 2381 2273
0,85 4348 3448 3125 2000 2564 2439
0,90 4545 3704 3226 2128 2703 2564
0,95 4762 3846 3448 2222 2857 2703
1,0 7936 7936 5747-1 4525 5747 4525
Приложения
* Расчет производится по формуле:
1000/с/,
где 1000 — const; d — разрешающая способность, мкм (см. табл. 3).
Таблица б
Размеры линейного поля на предмете
[Аоб] Система дополнительного увеличения (тубусная система или система «Оптовар») [а„]
1х 1,25х 1,6х 2,5х 4х
Линейное поле окуляра, мм
18 20 23 25 18 20 23 25 18 20 23 25 18 20 23 25 18 20 23 25
1х 18,0 20,0 23,0 25,0 14,4 16,0 18,4 20,0 11,25 12,5 14,37 15,62 7,2 8,0 9,2 10,0 4,5 5,0 5,75 6,25
1,25х 14,4 16,0 18,4 20,0 11,5 12,8 14,78 16,0 9,0 10,0 11,49 12,49 5,76 6,4 7,36 8,0 3,6 4,0 4,6 5,0
2,5х 7,20 8,0 9,2 10,0 5,76 6,4 7,36 8,0 4,5 5,0 5,74 6,25 2,88 3,2 3,68 4,0 1,8 2,0 2,3 2,5
4х 4,50 5,0 5,75 6,25 3,6 4,0 4,6 5,0 2,81 3,12 3,59 3,9 1,8 2,0 2,3 2,5 1,12 1,25 1,43 1,56
5х 3,60 4,0 4,6 5,0 2,88 3,2 4,6 4,0 2,25 2,5 2,87 3,12 1,44 1,6 1,84 2,0 0,9 1,0 1,15 1,25
10х 1,80 2,0 2,3 2,50 1,44. 1,6 1,84 2,0 1,12 1,25 1,43 1,56 0,72 0,8 0,92 1,0 0,45 0,5 0,57 0,62
20х 0,90 1,0 1,15 1,25 0,72 0,8 0,92 1,0 0,56 0,62 0,72 0,78 0,36 0,4 0,46 0,5 0,22 0,25 0,28 0,31
40х 0,45 0,5 0,57 0,62 0,36 0,4 0,46 0,5 0,28 0,31 0,36 0,39 0,18 0,2 0,23 0,25 0,11 0,12 0,14 0,15
50х 0,36 0,4 0,46 0,50 0,29 0,32 0,37 0,4 0,22 0,25 0,28 0,31 0,14 0,16 0,18 0,2 0,09 0,1 0,11 0,12
бЗх 0,28 0,32 0,36 0,40 0,22 0,26 0,29 0,32 0,18 0,19 0,23 0,25 0,11 0,12 0,14 0,16 0,07 0,08 0,09 0,1
ЮОх 0,18 0,20 0,23 0,25 0,14 0,16 0,18 0,2 0,11 0,12 0,14 0,15 0,07 0,08 0,09 0,1 0,04 0,05 0,05 0,06
’"Расчет производится по формуле:
2у~ 2yoi<: ([Роб] • [о£дс])>
где 2у — линейное поле на предмете, мм; 2уок — линейное поле окуляра1, мм; [30б — увеличение объектива;
«дс — увеличение дополнительной системы увеличения «Оптовар».
395
1 Диаметр линейного поля окуляра маркируется на корпусе окуляра (например, 10х/18).
Приложения
396
Приложения
Таблица 7
Размеры линейного поля на предмете (без окуляров и с видеоадаптерами)
Увеличение видеоадаптеров для аналоговых и цифровых камер [адс/яА]
[АОб] 1х 0,63х 0,5 х 0,4х 0,33...1,6х 0,5...2,4х
Линейное поле, проп’ ^скаемое бинокулярной насадкой, мм
20 23 25 20 23 25 20 23 25 20 23 25 20 23 25 20 23 25
1х 20 23 25 31,74 36,5 39,68 40,0 46,0 50,0 50,0 57,5 62,5 60,б... 12,5 69,7... 14,37 75,7... 15,6 40,0... 8,33 46,0... 9,58 50,0... 10,41
1,25х 16,0 18,4 20,0 25,39 29,2 31,74 32,0 36,8 40,0 40,0 46,0 50,0 48,48... 10,0 55,76... 11,49 60,56... 12,48 32,0... 6,66 36,8... 7,66 40,0... 8,33
2,5х 8,0 9,2 10,0 12,69 14,6 15,87 16,0 14,4 20,0 20,0 23,0 25,0 24,24... 5,0 27,88... 5,75 30,28... 6,24 16,0... 3,33 14,4... 3,83 20,0... 4,16
4х 5,0 5,75 6,25 7,93 9,12 9,92 10,0 11,5 12,5 12,5 14,37 15,62 15,15... 3,12 17,42... 3,59 18,92... 3,9 10,0... 2,08 11,5... 2,39 12,5... 2,6
5х 4,0 4,6 5,0 6,35 7,3 7,93 8,0 9,2 10,0 10,0 11,5 12,5 12,12... 2,5 13,94... 2,87 15,14... 3,12 8,0... 1,66 9,2... 1,91 10,0... 2,08
Юх 2,0 2,3 2,5 3,17 3,65 3,97 4,0 4,6 5,0 5,0 5,75 6,25 б,Об... 1,25 6,97... 1,43 7,57... 1,56 4,0... 0,83 4,6... 0,96 5,0... 1,04
20х 1,0 1,15 1,25 1,58 1,82 1,98 2,0 2,3 2,5 2,5 2,87 3,12 3,03... 0,62 3,48... 0,72 3,78... 0,78 2,0... 0,41 2,3... 0,48 2,5... 0,52
40х 0,5 0,57 0,62 0,79 0,91 0,99 1,0 1,15 1,25 1,25 1,43 1,56 1,51... 0,31 1,74... 0,36 1,89... 0,39 1,0... 0,21 1,15... 0,24 1,25... 0,26
50х 0,4 0,46 0,5 0,63 0,73 0,79 0,8 0,92 1,0 1,0 1,15 1,25 1,21... 0,25 1,39... 0,28 1,51... 0,31 0,8... 0,16 0,92... 0,19 1,0... 0,21
бЗх 0,31 0,36 0,39 0,5 0,58 0,63 0,63 0,73 0,79 0,79 0,91 0,99 0,96... 0,2 1,10... 0,23 1,2... 0,24 0,63... 0,13 0,73... 0,15 0,79... 0,16
ЮОх 0,2 0,23 0,25 0,31 0,36 0,39 0,4 0,46 0,5 0,5 0,57 0,62 0,60... 0,12 0,69... 0,14 0,75... 0,15 0,4... 0,08 0,46... 0,09 0,5... 0,1
* Расчет производится по формуле:
2у = 2убн: ([роб] • [Идс/<2д]),
КО
где 2у — линейное поле на предмете, мм; 2убн — линейное поле, пропускаемое бинокулярной насадкой,
мм; |3об — увеличение объектива; адс/дд — увеличение видеоадаптера.
При использовании дополнительной системы увеличения «Оптовар» формула расчета выглядит сле-
дующим образом:
2у = 2уби • ([Роб] • [ПдС/йд] • [йдс]),
где (ХдС/<2д — увеличение дополнительной системы увеличения «Оптовар».
Таблица 8
Размеры линейного поля на предмете (видеокамеры с матрицами %"; И" и %"; без дополнительной системы увеличения)
[АОб] Размер диагонали видеоадаптера для аналоговых и цифровых камер (размер матрицы в дюймах) [удс/ад]
8 мм (’Л") 6 мм (%") 10,2 мм (%")
Увеличения видеоадаптера для аналоговых и цифровых камер («дс/ад]
О.БЗх 0,5...2,4х 0,4х 0,33...1,6х 0,5х 0,63х 1х
1х 12,7 16,0...3,33 15,0 18,18...3,75 24,4 16,19 10,2
1,25х 10,16 12,8...2,69 12,0 14,54...3,0 16,32 12,95 8,16
2,5х 5,08 6,4...1,35 6,0 7,27...1,5 8,16 6,47 4,08
4х 3,17 4,0...6,67 3,75 4,5...0,93 5,1 4,04 2,55
5х 2,54 3,2...0,67 3,0 3,63...0,75 4,08 3,24 2,04
10х 1,27 1,6...0,33 1,5 1,82...0,37 2,04 1,62 1,02
20 х 0,63 0,8...0,17 0,75 0,91...0,18 1,02 0,81 0,51
40х * 0,32 0,4...0,08 0,37 0,45...0,09 0,51 0,40 0,25
50х 0,25 0,32...0,06 0,3 0,36...0,07 0,41 0,32 0,2
63х 0,2 0,25...0,05 0,24 0,29...0,06 0,38 0,25 0,16
ЮОх 0,12 0,16...0,03 0,15 0,18...0,03 0,20 0,16 0,10
Приложен!
Приложения
Таблица 9
Взаимосвязь основных параметров микроскопа
Параметр Разрешающая спо- собность S Полезное увеличение микро- скопа ₽ПОЛ Масштаб изображения Р
Формула 0,61Х А 500А-1000А УГ — ' х ОК р
обозначение изменение параметра X — длина вол- нысвета А — числовая апертура объек- тива А — числовая апер- тура объектива V — увеличение объ- ектива Гок — увеличение оку- ляра К — длина камеры р — расстояние на- илучшего видения (250 мм)
изменение (Д) длины волны света X а с увеличением X 8 увеличивается Д6 с увеличением X |3пол уменьшается Рпол ▼ “Г не влияет
изменение (А) числовой апер- туры объекти- ва А с увеличением А 6 уменьшается 6 т Д . с увеличением А ' рпол увеличива- ется Д Рпол не влияет
изменение (Д) увеличения объектива V А с увеличением V 8 увеличивается Д6 не влияет 11 с увеличением V р увеличивается др
изменение (А) увеличения окуляра Гок » с увеличением Гок 8 увеличивается Д6 не влияет 1 с увеличением Гок Р увеличивается др
изменение (А) увеличения длины каме- ры К k с увеличением К 8 увеличивается Д6 не влияет А с увеличением К Р увеличивается др
398
Приложения
Глубина резкого изображения (гео- метрическая) Тг Глубина резко- го изображения (волновая) Тв Освещенность изображения Е Линейное поле в микроскопе d
Е/? Ар* X 2АА тгсВАА РР | ах
£ — острота зрения р — расстояние наилучшего виде- ния (250 мм) А — числовая апертура объек- тива |3 — масштаб изоб- ражения X — длина волны света А — числовая апертура объек- тива п — 3,14 т — коэффициент свето' пропускания оптичес- кой системы прибора В — яркость источни- ка света А — числовая аперту- ра объектива |3 — масштаб изобра- жения L — диагональ фо- токадра |3 — масштаб изоб- ражения
не влияет л с увеличением X Тв увеличива- ется дтв не влияет не влияет
с увеличением А Тг уменьшается тг у д с увеличением А Тв уменьшается Т х в У дд с увеличением А Е увеличивается ДД£ не влияет
с увеличением V Тг уменьшается тг ▼ д не влияет с увеличением V Тв уменьшается Е у ДД с увеличением V d уменьшается У Д
с увеличением Гок Тг уменьшается тг у Д не влияет с увеличением Гок Тв уменьшается Е ) г ДД с увеличением Гок d уменьшается d v Д
с увеличением К Тг уменьшается тг ▼ д не влияет с увеличением К Тв уменьшается Е у ДД с увеличением К d уменьшается d " Д
Таблица является итоговой и показывает связь основных параметров
элементов микроскопа между собой.
399
Приложения
3.2. Примеры применения таблиц микроскопии
Рассмотрим примеры применения таблиц в практической работе.
♦ Задача 1. Необходимо рассмотреть объект, имеющий минималь-
ное расстояние между элементами 0,14 мкм.
ЛЗ В табл. 3 находим параметр числовой апертуры объектива, позволя-
ющий при обычном освещении рассмотреть элементы с наименьшим
расстоянием 0,14 мкм. Это числовая апертура 1,25.
По табл. 2 определяем, что при числовой апертуре микроскопа 1,25
пределы полезного увеличения в микроскопе должны находиться в
диапазоне 630-1250х.
Традиционно этой числовой апертуре соответствует увеличение
объектива ЮОх.
По табл. 1 находим, что с современным комплектом объективов,
окуляров, тубусных систем и систем с дополнительным увеличением
эту задачу можно решить двумя способами:
а) увеличение 1000х: объектив 100х/1,25МИ + окуляр Юх + тубус-
ная система 1х — любой биологический микроскоп нового поколения
(отечественный — МИКМЕД 2; зарубежный — Axiostar plus);
б) увеличение 1250х: объектив 100х/1,25 МИ + окуляр Юх + тубус-
ная система (или дополнительная система увеличения) 1,25х (отечест-
венный — отсутствует; зарубежный — Axioskop 40).
♦ Задача 2. По методике исследований биологических объектов тре-
буется применение увеличения 630*. Объект имеет минимальное
расстояние между элементами 0,36-0,42 мкм.
ЛЗ По табл. 2 определяем, что увеличение бЗОх входит в пределы полез-
ного увеличения объективов с числовыми апертурами 0,60-0,65-1,20-
1,25-1,30-1,40-1,45.
По табл. 3 определяем, что размер 0,36-0,42 мкм обеспечивается
числовыми апертурами 0,65-0,75-0,80.
Таким образом, увеличение бЗОх для различения объекта с мини-
мальными структурами 0,36-0,42 мкм может быть получено с объек-
тивом числовой апертуры 0,65. Традиционно эту числовую апертуру
имеет объектив с увеличение 40 х.
По табл. 1 определяем, что задачу можно решить двумя способами:
а) увеличение бЗОх : объектив 40х/0,65 + окуляр 16х + тубусная
система 1х — любой биологический микроскоп нового поколения
(отечественный — МИКМЕД 2 комплектуется окуляром 15х, при
400
Приложения
этом увеличение будет несколько меньше — 600х ; зарубежный —
Axiostar plus);
б) увеличение бЗОх: объектив 40х/0,65 + окуляр 10х + тубусная сис-
тема (или дополнительная система увеличения) 1,6х (отечественный —
отсутствует; зарубежный — Axioskop 40).
Эта задача имеет и другое решение.
Увеличение бЗОх может быть получено с объективом, имеющим
большую числовую апертуру 0,80-0,85. Такой апертурой обладает как
объектив 40х (его мы уже рассмотрели), так и объектив 63х.
В таком случае комплект упрощается: 63х/0,80 + окуляр 10х + тубусная
система 1х (отечественный — отсутствует; зарубежный — Axiostar plus).
♦ Задача 3. Определить линейное поле на предмете при использова-
нии окуляра 10х/18 и адаптера 0,63* (объектив 40х/0,65).
ЛЗ Окуляр 10х с линейным полем 18 мм. Увеличения всех систем, вхо-
дящих в микроскоп, аналогичны примеру 1; тип камеры %".
Линейное поле на предмете при наблюдении: 18:40:1:2,5 = 0,18 мм
Размер диагонали камеры %" — 10,2 мм
Линейное поле при документировании (по диагонали):
10,2:40:2,5: 0,63 = 0,16 мм
♦ Задача 4. На какие параметры влияет изменение числовой апер-
туры объектива?
ЛЗ По табл. 7 в левом крайнем столбце находим «изменение (Д) число-
вой апертуры объектива А» и вдоль горизонтальной строки смотрим,
как влияет изменение числовой апертуры на разрешение, полезное уве-
личение, масштаб изображения, глубину резкого изображения (геомет-
рическую), глубину резкого изображения (волновую), освещенность
изображения, линейное поле в микроскопе.
♦ Задача 5. Как рассчитать количество пикселей камеры для оп-
тимальной съемки?
ЛЗ Необходимое количество пикселей для оптимальной съемки =
= YLCCD • 6000 • Аоб / фо6 • йад),
yLCCD — размер CCD-элемента камеры по X и Y осям соответс-
твенно;
Аоб — числовая апертура объектива;
Роб — увеличение объектива;
аад — увеличение адаптера.
401
Приложения
Пример 1: Объектив — 63х/1,4 Oil; увеличение адаптера камеры —
1,0х;
камера %" CCD с матрицей CCD - 8,7 мм х 6,7 мм
(8,7 • 6000 • 1,40)/(63 х 1) = 1160 и (6,7 • 6000 • 1,40)/(63 х 1) = 894.
Результат: 1160/.894 Pixel.
Пример 2: Объектив— 10х /0,50; увеличение адаптера камеры —
0,63х;
камера %" CCD с матрицей CCD — 8,7 мм х 6,7 мм
(8,7 • 6000 • 0,50)/(10 х 0,63) = 4142 и (6,7 • 6000 • 0,50)/(10 х 0,63) - 3190
Результат: 4142x3190 Pixel.
402
ЛИТЕРАТУРА
1. Franz Muchel «ICS» — A New Principle in Optics// Zeiss Infom., 30, 20-27
(1988), No 100E. - s. 20-26.
2. Абдулкадыров К. M. и др. Цитогенетические исследования в гематологии
при помощи современных компьютерных технологий: Пособие для вра-
чей. — СПб., 2003. — 30 с.
3. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. — М.: Медицина, 1990. — 384 с.
4. Агроскин А. С., Папаян Г. В. Цитофотометрия. А.: Наука, 1977. — 295 с.
5. Андреев А. Н., Ларин Р. М., Окишев С. Г., Егорова О. В., Хмеличек А. . И.
Новые ахроматические объективы для учебных микроскопов // Ж. —
ОМП. - 1990. - № 3. - С. 35.
6. Арсеньев А. А., Ларина Р. М., Егорова О. В. Приборы для измерения часто-
тно-контрастных характеристик объективов микроскопа //Ж. — ОМП. —
1981. — № 1. — с. 18.
7. Барский И.Я. и др. Контактная микроскопия//М.: Наука, 1976. — 160 с.
8. Грамматин А. П., Румянцева Л. Е„ Ларина Р. М., Егорова О. В. Планахрома-
тический объектив микроскопа // А. с. № 1652955. — кл. G02 В 21/02. —
заяв. 14.06.89. — опуб. 30.05.91. — Бюл. № 20.
9. Духопел И. И., Ларина Р. М., Егорова О. В., Агапова Л. И. Интерферометри-
ческие методы оценки качества изображения объективов микроскопа И
Ж. — Труды ГОИ им. С. И. Вавилова. — Т. 74. (1987). — 208 с.
10. Дюков В. Г. и др. Растровая оптическая микроскопия. М.: Наука, 1992. —
207 с.
11. Егорова О. В. Анализ конструкций микрообъективов на стадии выполне-
ния научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ // Ж. —
ОМП. - 1990. - № 12. - С. 64.
12. Егорова О. В. Влияние качества оптики микроскопа на формирование ви-
деосигнала системы ввода анализатора изображения: Приложение к атласу
«Цитологическая диагностика заболеваний легких» / Шапиро Н. А. — М„
2005. - С. 193-198.
13. Егорова О. В. Гибкая эндоскопия сегодня // Ж. — Медитех. — 1997. — №
8. - С. 16.
14. Егорова О. В. Комплектация современных лабораторий медико-биологи-
ческой направленности // Ж. — Клинико-лабораторный консилиум. —
2004. - № 2. - С. 43 - 44.
15. Егорова О. В. Контроль качества. Актуальные проблемы техники и техно-
логии // Ж. — Медитех, 1998. — № 17. — С. 4.
16. Егорова О. В. Медицинские выставки — взгляд по ту сторону стенда //
Ж. — Мир медицины. — 1997. — № 5. — С. 37.
17. Егорова О. В. Методы контрастирования в микроскопах для общеклини-
ческих исследований: Приложение к атласу Общеклинические исследова-
403
ния (моча, кал, ликвор, эякулят) / Миронова И. И., Романова Л. А., Дол-
гов В. В. - М„ 2005. - С. 201-204.
18. Егорова О. В. Методы оценки технологичности и контроля качества оп-
тических систем нового поколения объективов микроскопа // Диссерта-
ция. — 1995.
19. Егорова О. В. Микроскоп от «А» до «Я» // Ж. — Новости клинической ци-
тологии России. — Т. 3-4. (т. 3-4) — 1999 (2000).
20. Егорова О. В. Операционные микроскопы ЛОМО //Ж. — Вестник хирур-
гии. — 1996. - № 3. - С. 108.
21. Егорова О. В. Особенности микроскопических исследований гистологи-
ческих препаратов: Приложение к атласу «Цитологическая диагностика
метастазов рака» / Ершов В. А. — СПб., 2005. — С. 59-61.
22. Егорова О. В. Практика работы с микроскопом: Пособие для врачей / Под
ред. проф. Белянина В. Л. — Из серии: В библиотеку врача-патологоанато-
ма Санкт-Петербурга. — СПб., 2003. — С. 51.
23. Егорова О. В. Проблемы современной микроскопической диагностики
//Ж. — Лабораторная диагностика. Terra medica. — 2003. — № 2. — С.
31-32.
24. Егорова О. В. Разрешающая способность в биологических микроско-
пах: Приложение к Цитологическому атласу / Шабалова И. П. и др. — М:
2005. - С. 116-119.
25. Егорова О. В. С микроскопом на «ТЫ» // СПб.: Интермедика, 2000. — 328
с.
26. Егорова О. В. Световой микроскоп // Газета «Интерлаб медика» — 1997. —
март/апрель. — С. 8.
27. Егорова О. В. Современные биологические микроскопы: Приложение к Ге-
матологическому атласу / Луговской С. А., Почтарь М.Е. — М., 2004. — С.
229-234.
28. Егорова О. В. Современные биологические микроскопы // Ж. — Меди-
тех. — 1996. — № 4 (с. 5); 1997. — № 1 (с. 4); № 3 (с. 5); № 5 (с. 5); № 8 (с. 5).
29. Егорова О. В. Современные операционные микроскопы // Ж. — Terra med-
ica. — 1998. — № 3. — С. 39.
30. Егорова О. В. Спектрофотометры нового поколения // Ж. — Медитех,
1997. - № 8. - С. 16.
31. Егорова О. В. Стереомикроскопы-тренажеры — путь к успешной операции
//Ж. — Terra medica. — 1997. — № 2. — С. 41.
32. Егорова О. В. Тенденции развития световой микроскопии для практичес-
кой и научной медицины //Ж. — Медицинская картотека. — 2004. — №
З.-С. 11.
33. Егорова О.В. Экология плюс здоровье — ключ к жизни //Ж. — Жизнь и
безопасность. — 1996. — № 3. — С. 338.
34. Егорова О. В., Лабецкая Т. 3., Тарутин А. В. Анализ макроэкономических
тенденций — основа маркетинга в условиях кризиса //Ж. — Маркетинг и
маркетинговые исследования в России. — 1997. — № 2. — С. 24.
404
35. Егорова О. В., Лабецкая Т. 3., Тарутин А. В. Проблемы маркетинга на про-
мышленных предприятиях в условиях кризиса // Ж. — Маркетинг и мар-
кетинговые исследования в России. — 1997. — № 3. — С. 16.
36. Егорова О. В., Ларина Р. М. Анализ технологических требований к новым
объективам для световых микроскопов // Ж. — ОПТНП. — 1989. — №
3. - С. 3.
37. Егорова О. В., Ларина Р.М., Агроскин Л. С. Измерение светопропускания
микрообъективов // Ж. — ОМП. — 1991. — № 10. — С. 75.
38. Егорова О. В., Маликов И. В. Проблемы оценки конкурентоспособности
торговой организации // Ж. Маркетинг и маркетинговые исследования. —
2006. - № 4. - С. 324.
39. Егорова О. В., Мандельштам Н. Э., Лизунова О. Л. Стереоскопические мик-
роскопы МБ С-10 И ОМП. - 1988. - № 8. - С. 16.
40. Егорова О. В., Фролов Д.Н. Безрефлексные планахроматические объекти-
вы для поляризационных исследований // Ж. — Оптический. — 1994. — №
10. - С. 43.
41. Егорова О. В., Ячменев С. В., Зацепин А. В. Новые горизонты науки: Сбор-
ник научно-практических статей специалистов МГУ им. М. В. Ломоносо-
ва, 2004. — С. 67 — 80.
42. Зенина М.Н., Клыкова Е.И., Карнилова Т.А., Андреева Н.Е. Морфомет-
рические исследования эритроцитов в диагностике анемий: Науч, -практ.
журн. «Клинико-лабораторный Консилиум». — 2004. — №3. — С. 23-27.
43. Иванова Т.А., Кирилловский В. К. Проектирование и контроль оптики
микроскопов // Л.: Наука, 1984. — 230 с.
44. Кто есть кто в ГОИ: Библиографический справочник / Под ред. Мирошни-
кова М.М. // - Т. 1, СПб., 1998. - 108 с.
45. Коваленко И. Ф., Ларина Р. М., Егорова О. В., Хмеличек А. И. Новый учеб-
ный микроскоп УМ-301. И Ж. — ОМП. — 1988. — № 2. — С. 59.
46. Ларина Р. М., Егорова О. В., Хмеличек А. И. Тенденции развития учебных
микроскопов для школ. И Ж. — ОМП. — 1990. — № 2. — С. 3.
47. Лизунова О. Л., Ларина Р.М., Полтырева Е.С., Егорова О. В. Стереоскопи-
ческий микроскоп МБС-9. // Ж. — ОМП. — 1976. — № 10. — С. 62.
48. Луизов А. В. Инерция зрения. — М.: Оборонгиз, 1961. — 248 с.
49. Маринец О. В., Егорова О. В. Микроскопы ЕС БИМАМ Р в клинической
лаборатории // Ж. — Морфологи. — 1996. — №2. — С. 117.
50. Маришаль Ф., Франсон М. Структура оптического изображения. — М.:
Наука, 1964. — 167 с.
51. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Ме-
дицинские лабораторные технологии / Под ред. Проф. А. И. Карпищен-
ко. — СПб.: Интермедика, 2002.
52. Медицинские лабораторные технологии: Справочник. / Под ред. Карпи-
щенко А. И.. //. СПб.: Интермедика, 1998. — С. 30-60.
53. Меллорс Р. Методы цитологического анализа — М.: Иностранная литера-
тура, 1957. — 363 с.
405
54, Мессарош В. Г., Сапрыкина Н.В., Егорова О. В. Преимущество применения
люминесцентной микроскопии при диагностике урогенитальных форм хла-
мидиозов. // Ж, — Вопросы онкологии. — 1996. — Т. 42, — № 3. — С. 109.
55. Михель К. Основы теории микроскопа. — М.: Госиздат технико-теорети-
ческой литературы, 1955. — 276 с.
56. Назарова Е. К., Егорова О. В., Зенина М. В. Возможности применения сис-
тем анализа изображения для обнаружения и регистрации хламидийной
инфекции при использовании метода иммунофлуоресценции И Ж. — Ла-
боратория. — 2002. — № 4. — С. 8-9.
57. Назарова Е.К., Зенина М.Н. Хламидийная инфекция. Цитология. Имму-
нофлуоресценция: Атлас. — СПб., 2004. — С. 73.
58. Панов В. А., Андреев Л. Н. Оптика микроскопов. — Л.: Машиностроение,
1976. — 427 с.
59. Пантелеев В., Егорова О., Клыкова Е. Компьютерная микроскопия. — М.:
Техносфера, 2005. — 304 с.
60. Полонская Н.Ю., Егорова О. В. Основы цитологической диагностики и
микроскопическая техника: Учеб, пособие для студ. высш. уч. заведе-
ний. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 160 с.
61, Сквозь призму времени. — СПб.: ЛИК, 2002. — 194 с.
62. Скворцов Г.Е. и др. Микроскопы, — Л.: Машиностроение, 1969. — 511 с.
63. Соколенко Д.В., Егорова О. В. Средства и методы микроскопии в миколо-
гии. Общие аспекты работы микологической лаборатории. Микроскопы.
Настройка микроскопа. Методы контрастирования. Уход за микроскопом:
Пособие для врача — лабораторного миколога / Под ред. проф. Блинова
Н.П.-СПб., 2004.-47 с.
64. Справочник технолога-оптика. — Л.: Машиностроение. — 1983. — 400 с.
65. Тотолян А. А, Зуева Е. Е., Лапин С. В. Возможности иммунологической ла-
боратории в диагностике аллергических, аутоиммунных и онкогематоло-
гических заболеваний: Ежегодный справочник «Лабораторная диагности-
ка России». — 2004/2005. — С. 76-96.
66. Фролов Д.Н., Егорова О. В. Микрообъектив с увеличенным рабочим рас-
стоянием // Патент № 2075771. — заяв. 26.04.93, — per. 20.03.97.
67. Фролов Д. Н„ Егорова О. В. Планапохроматический светосильный микро-
объектив большого увеличения // Патент № 2079155. — заяв. 13.01.94. —
per, 10.05.97.
68. Фролов Д.Н., Егорова О. В. Планапохроматический светосильный объек-
тив // Патент № 2082196. — заяв. 13.01.94. — per. 20.06.97.
69. Фролов Д. Н., Егорова О, В. Планахроматический микрообъектив большо-
го увеличения // Патент № 2073264. — заяв. 03.03.93. — per. 10.02.97.
70. Фролов Д.Н., Егорова О. В. Планахроматический объектив с большим ра-
бочим расстоянием для инвертированного микроскопа // Ж. - Оптичес-
кий. - 1994. - № 10. - С. 76.
71. Фролов Д. Н., Жидкова Н. А., Егорова О. В. О конденсорах микроскопов
проходящего света. // Ж. - Оптический. - 1994. - № 4. - С, 169.
406