/
Автор: Громов Б.В.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология биология микробиология биологические науки учебное пособие
Год: 1985
Текст
Б.В.ГРОМОВ
СТРОЕНИЕ
БАКТЕРИЙ
ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА
И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени А. А. ЖДАНОВА
Б. В. ГРОМОВ
СТРОЕНИЕ БАКТЕРИЙ
Учебное пособие
ЛЕНИНГРАД
ИЗДАТЕЛЬСТВО ЛЕНИНГРАДСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1985
Печатается по постановлению
Редакционно-издательского совета
Ленинградского университета
УДК 576.8.094
Громов Б. В. Строение бактерий: Учеб, пособие. — Л.: Изд-во Ле-
нингр. ун-та, 1985.— 192 с.
В первом учебном пособии подобного рода изложены современные пред-
ставления об особенностях строения и химического состава различных струк-
тур бактериальной клетки и о функциональном назначении этих структур.
Подробно описаны оболочки грамположительных и грамотрицательных бакте-
рий, транспортные и рецепторные функции ^компонентов внешней мембраны,
строение и функции цитоплазматической мембраны и внутрицитоплазматиче-
ских мембранных структур, а также функции элементов цитоплазмы, нуклео-
ида, рибосом, включений, жгутикцв и фимбрий.
Для студентов биологических факультетов. Может быть полезно также
специалистам — микробиологам, цитологам, биохимикам и генетикам.
Библиогр. 85 назв. Ил. 79. Табл. 1.
Рецензенты: д-р биол. наук Л. Н. Серавин (Биол.
НИИ ЛГУ), д-р техн, наук В, И. Яковлев (Технол. ин-т
им. Ленсовета).
2003000000—135
Г 076(02)—85 89—85
© Издательство
Ленинградского
университета, 1985 г.
ПРЕДИСЛОВИЕ
Настоящее учебное пособие написано на основе оригиналь-
ного курса, осуществляемого на кафедре микробиологии Ленин-
градского университета для студентов — микробиологов и моле-
кулярных биологов. Книга рассчитана на читателя, знакомого
с основами микробиологии, биохимии, цитологии и генетики
в объеме университетских курсов этих дисциплин.
В соответствии с тенденциями развития современной цитоло-
гии бактерий большое внимание уделено вопросам макромоле-
кулярной организации клеточных структур и их функциональ-
ному значению. Бурное развитие этих разделов бактериологий
в последние годы пока не нашло достаточно полного отражения
в учебной литературе. В то же время очевидно, что круг вопро-
сов, требующих рассмотрения в подобном руководстве, должен
быть весьма широк и разнороден. Не имея возможности рабо-
тать во всех затрагиваемых в книге областях науки, автор, есте-
ственно, мог допустить просчеты и ошибки, за указания на ко-
торые он заранее благодарит читателей. С другой стороны, на
наш взгляд, неизбежен и оправдан определенный субъективизм
в выборе материала, оценке имеющихся данных и в подборе
примеров и рекомендуемой литературы. Автор приносит изви-
нения тем микробиологам, материалы которых вполне заслужи-
вают упоминания в подобном руководстве, но из-за ограничен-
ности его объема не упомянуты.
ВВЕДЕНИЕ
Бактерии относятся к организмам с прокариотическим ти-
пом организации клетки (по мнению большинства бактериоло-
гов понятия прокариота и бактерии идентичны), что опреде-
ляется особенностями ультраструктуры этих организмов,
а также строения и функций ряда макромолекул.
К прокариотам принадлежат два царства живых организ-
мов: собственно бактерии или царство эубактерий и царство
архебактерий. Открытие царства архебактерий, происшедшее
недавно, явилось одним из крупнейших достижений современ-
ного естествознания.
Основные отличия прокариот от эвкариот состоят в следую-
щем:
— В клетках прокариот отсутствуют компартменты или ор-
ганеллы, ограниченные специализированными липопротеидными
мембранами, нет и ядерной оболочки с поровым комплексом.
Они лишены также митохондрий и хлоропластов', эндоплазма-
тического ретикулюма, цистерн аппарата Гольджи, микротелец,
лизосом. Бактерии неспособны к фагоцитозу и пиноцитозу, у них
отсутствует также направленный внутриклеточный транспорт
различных типов везикул. Возможно, что это одна из причин,
ограничивающих размеры бактериальной клетки, так как с уве-
личением ее объема эффективность внутриклеточного транс-
порта за счет диффузии резко падает.
— У прокариот отсутствуют актиновые микрофиламенты и
тубулиновые микротрубочки, митотический аппарат. Бактерии
неспособны к амебоидному движению, в них не наблюдается
токов цитоплазмы и перемещения внутриклеточных элементов.
Имеющиеся в литературе отдельные сообщения о наличии у не-
которых бактерий сократимых белков нуждаются в подтверж-
дении.
— Геном прокариотической клетки организован в одну коль-
цевую хромосому (в клетке может быть несколько ее копий),
которая представляет собой единый репликон. Дополнительные
4
репликоны могут быть представлены относительно маленькими
молекулами плазмидных ДНК. Зато при быстром росте бакте-
рий в клеточных циклах синтез ДНК идет непрерывно, при этом
последовательные раунды ее репликации перекрываются, что
никогда не наблюдается в эвкариотных клетках. Все же, по-
скольку скорость синтеза ДНК не может превысить определен-
ный предел, время, необходимое для удвоения генома клетки
у бактерий, будет неизбежно возрастать с увеличением разме-
ров хромосомы. У эвкариот периоды репликации ДНК чере-
дуются с периодами, в которые синтез ДНК не идет, но много-
численность репликонов в их геномах обеспечивает практиче-
скую независимость времени удвоения ДНК клетки от ее коли-
чества. По мнению некоторых ученых, отсутствие множества
репликонов резко ограничивает возможности увеличения объема
генома клеток прокариот, а следовательно, и возможности их
прогрессивной эволюции.
В прокариотической хромосоме ДНК не связана с гисто-
нами, хотя здесь имеются определенные белки, играющие ре-
гуляторную и защитную роль. Для прокариотической хромо-
сомы не характерна интрон-экзонная структура, соответственно
отсутствует сплайсинг считываемых РНК. Зато у прокариот
имеются опероны, с которых считывается полигенная иРНК.
Для инициации белкового синтеза у прокариот (в отличие от
эвкариот) не является необходимым присутствие на 5'-конце
иРНК 7-метилгуанозина (кэп); в отличие от эвкариот у них
нет отдельных РНК-полимераз для синтеза информационной,
транспортной и рибосомальной РНК*.
— Прокариотическая клетка содержит только один тип. ри-
босом с константой седиментации 70 S, причем часть рибосом
ассоциирована с цитоплазматической мембраной, что никогда
не наблюдается у эвкариот. Процессы транскрипции и трансля-
ции в прокариотической клетке обычно идут одновременно' т. е.
с частично синтезированной молекулой иРНК уже связываются
рибосомы и начинается синтез белковой молекулы (трансля-
ция).
— Некоторые прокариоты обладают структурами, отсутст-
вующими у эвкариот, — это бактериальные жгутики, эндоспоры,
газовые пузырьки и другие включения, окруженные белковыми
мембранами, полимеры.
Таким образом, прокариотическая клетка обладает рядом
качественных отличий от эвкариотической, в том числе на
уровне организации генома, механизмов транскрипции и транс-
ляции. Следует иметь в виду, что представления об особенно-
стях прокариотической клетки сформировались в результате
* Особенности организации геномов прокариот и эвкариот подробно рас-
смотрены в книге: Инге-Вечтомов С. Г Введение в молекулярную генетику.
М., 1983.
5
исследований преимущественно клеток эубактерий. Изучение
архебактерий уже вносит в эти представления некоторые кор-
рективы. Так, в геноме некоторых архебактерий обнаружены
несвойственные прокариотам интроны.
Клеточное строение четко отграничивает прокариот от виру-
сов. Общепринято, что бактериальная клетка неделима, хотя
отдельные исследователи считают, что клетки некоторых бак-
терий распадаются на субклеточные элементы, из которых за-
тем вновь могут быть собраны бактериальные клетки. Подоб-
ные клеточные циклы приписывают, например, внутриклеточ-
ным облигатным паразитам — риккетсиям.
Размеры бактериальных клеток довольно сильно варьируют,
однако несомненно существуют пределы этому варьированию.
Наиболее крупные бактерии, например Achromatium oxaliferuin,
представляют собой овальные клетки до 125 мкм длиной, Beg-
giatoa gigantea имеет толщину до 55 мкм. Однако столь круп-
ные бактерии очень редки. Видимо, в прокариотической клетке,
лишенной специализированных мембранных систем, координа-
ция внутриклеточных процессов с увеличением ее размеров ста-
новится затруднительной.
Зато прокариотическая клетка может быть значительно
мельче эвкариотической. Ее величина достигает нижнего тео-
ретически возможного предела, который определяется тем, что
клетка должна быть окружена, по крайней мере, мембраной
толщиной около'8 нм, содержать рибосомы диаметром около
20 нм. Наименьшее наблюдаемое количество ДНК у некоторых
микоплазм порядка 5- 108, и едва ли клетка может иметь на-
много меньше ДНК. Такое количество ДНК укладывается в шар
диаметром около 120 нм. Таким образом, диаметр округлой
клетки не может быть меньше 170—200 нм. Размеры таких
клеток лежат на пределе разрешающей способности светового
микроскопа. Диаметр порядка 0,2 мкм имеют клетки мико-
плазмы Acholeplasma laidlawii. Очевидно, что подобная вытя-
нутая в нить клетка может иметь толщину всего в несколько
десятков нанометров и невидима в световом микроскопе. Неко-
торые исследователи считают, что своеобразные бактерии, на-
капливающие окисли железа и марганца — Gallionella и Metal-
logenium, представляют собой микоплазмы, образованные преи-
мущественно субмикроскопическими нитями. В культурах ми-
коплазм среди более крупных элементов обычно присутствуют
тела размером около 150 нм и меньше, т. е. невидимые в све-
товом микроскопе. Однако пока не получено обоснованных
доказательств жизнеспособности подобных тел.
Большинство бактерий одноклеточны, однако существует
немало форм, состоящих из многих клеток. Можно ли их счи-
тать многоклеточными, будет зависеть от содержания, вклады-
ваемого в это понятие. Существует мнение, что у истинно мно-
гоклеточного организма должна наблюдаться функциональная
6
дифференцировка клеток в процессе вегетативного роста. В та-
ком случае многоклеточными можно считать только азотфик-
сирующих цианобактерий, у которых фиксация азота осущест-
вляется специализированными неделящимися клетками — гете-
роцистами.
Для многих бактерий характерен трихомный тип организа-
ции, при котором многочисленные клетки собраны в нить —
трихом. Нередко в процессе роста трихома образование новых
перегородок, разделяющих его клетки, начинается еще до завер-
шения образования предшествующих. Снаружи трихом обычно
одевают дополнительные слои оболочки, не участвующие в об-
разовании перегородок между клетками (рис. 1). Трихомы, под-
вижные за счет работы много-
численных жгутиков, образу-
ют виды рода Caryophanon,
описанного советским ученым
М. А. Пешковым. Трихомную
организацию имеют также
многие ползающие бактерии,
в том числе относящиеся к ро-
ДУ Beggiatoa. Трихом В. alba
состоит из многочисленных
клеток, разграниченных ци-
топлазматической мембраной
и одним муреиновым слоем,
тогда как вся нить окружена
пятислойной оболочной. Деле-
ние трихома обычно происхо-
Рис. 1. Срез трихома нитчатой бак-
терии. Ув. X 20 000.
а — оболочка, одевающая трихом; б —
перегородка; в — нуклеоид.
дит в результате отмирания
некоторых клеток, так называемых некридий, которые как бы
приносятся в жертву ради нужд всего организма. Недавно В. И.
Дудой были описаны бактерии, в трихомах которых клетки раз-
делены лишь цитоплазматической мембраной, тогда как оболоч-
ка одевает весь трихом. У цианобактерий обнаружена интерес-
ная закономерность, определяющая форму клеток в трихомах. У
видов, имеющих тонкие нити, клетки цилиндрические, но с уве-
личением толщины нитей появляются дисковидные клетки,
у которых ширина больше длины. У видов с очень толстыми
нитями все клетки дисковидные. Предполагают, что эта зако-
номерность объясняется тем, что у прокариот иРНК обычно ко-
роткоживущие, и для клетки сложно было бы осуществлять ре-
гуляцию синтетических процессов в участках, удаленных от
центрально расположенной ДНК. Как уже отмечалось, несом-
ненно существуют причины, ограничивающие размер прокарио-
тической клетки. Закономерность, отмеченная для цианобакте-
рий, вероятно, справедлива и для других трихомных форм.
Многоклеточные комплексы, клетки которых расположены
более или менее беспорядочно, характерны для метанобразую-
7
щей архебактерии Methanosarcina, клетки которой находятся
под общей внешней оболочкой. Разделение комплекса за счет
инвагинаций этой оболочки происходит только время от вре-
мени. Колонии метаносарцины имеют полости, заполненные
газом, что способствует их плавучести. Кроме того, в полостях
обнаружены клетки бактерий-спутников, возможно способствую-
щих развитию метаносарцины. В этом случае образование мно-
гоклеточного комплекса имеет определенное приспособительное
значение. Сходные комплексы характерны для микококкой,
бактерий, систематическое положение которых не вполне ясно.
Грамположительные кокки, деление которых происходит
в разных плоскостях, образуют многоклеточные комплексы, если
расщепление клеточных перегородок не следует сразу за их об-
разованием. В таких комплексах клетки более или менее тесно
ассоциированы. Агрегаты стафилококков могут служить приме-
ром таких комплексов, хотя клетки здесь легко разъединяются,
и комплексы, видимо, не имеют определенного функциональ-
ного значения. При развитии в естественной среде некоторые
бактерии образуют колонии, клетки в которых расположены
в определенном порядке. Это так называемые организованные
колонии. Они характерны для рода Larnpopedia, некоторых фо-
тосинтезирующих бактерий, например Pelodictyon.
Форма бактерий весьма разнообразна, хотя наиболее обычны
палочки и шарики — кокки, и соответствует разным типам сим-
метрии (рис. 2, 3). Так, кокки имеют шаровую симметрию, па-
лочки — осевую, некоторые простекобактерии радиальную,
а спириллы и спирохеты спиральны. Подобное соответствие
однако формально и иногда неверно по сути. Так, большинство
кокков шарообразны только сразу после деления, рост их обычно
идет не во все стороны, но вдоль определенной оси. В связи
с этим интересно отметить, что по некоторым данным многие
кокки произошли от палочек. Только некоторые цианобакте-
рии— представители Pleurocapsales являются настоящими ша-
риками, они растут, как шары, и, вырастая, дробятся с образо-
ванием многочисленных дочерних клеток — шариков. Звездча-
тые простекобактерии, обладающие радиальной симметрией,
либо образуют почки, либо растут в одном направлении, а затем
делятся на две дочерние клетки подобно палочкам. Для боль-
шинства бактерий характерна осевая симметрия. Уникальной
организацией обладает ползающая бактерия, обитающая в ро-
товой полости человека, — Simonsiella. У трихомов этой бакте-
рии различают брюшную и спинную стороны, она может ползти,
только контактируя брюшной стороной с субстратом. В то же
время она зеркально симметрична, т. е. имеет билатеральное
строение тела.
Можно отметить нередкую у бактерий тенденцию к спира-
лизации. Такая организация способствует движению спирилл и
спирохет, но у других закрученных в спираль бактерий, напри-
8
мер у Seliberia и Nitrosospira, спираль так тесно сжата, что не
может нести подобную функцию. У некоторых бактерий могут
быть получены закрученные в спираль мутанты. Грамположи-
тельные палочки при некоторых воздействиях растут в виде
спирально закрученных нитей. Считают, что подобные тенденции
отражают спиральное расположение синтезируемых компонен-
тов оболочки.
Рис. 2. Морфологическое разнообразие бактерий.
/ — палочки и кокки; 2 — Нyphomicrobium; 3 — Caulobacter; 4 — Vibrio; 5 — Spirillum;
6 — Saprospira; 7 — Spirochaeta; 8 — Nitrosospira; 9 — Seliberia; 10 — Nitrobacter; 11 —
Planctomyces; 12 — Cytophaga; 13 — Spiroplasma; 14 — Selenomonas; 15 — Microcyclus;
16—бактерии с шипами; 17—Prosthecomicrobium; 18—Caryophanon; 19 — Stella hu-
mosa; 20 — Simonsiella; 21 — Serpens flexibilis; 22 — Pseudomonas rhodos; 23 — Nitrosolo-
bus; 24 — Methanoplanus limicola; 25 — Haloarcula.
На заре развития систематики бактерий типу их симметрий
придавали большое значение, форма клетки часто рассматри-
валась как родовой признак. В настоящее время очевидно, что
у бактерий нет определенного соответствия между формой и
другими свойствами организма.
У большинства бактерий отсутствует дифференциация на
передний и задний концы, т. е. полюса клетки равноценны или
их различия очень незначительны. Полярность иногда прояв-
ляется при образовании спор бациллами, клетки которых обра-
зуют цепочки. Около некоторых перегородок споры располо-
жены с обеих сторон, тогда как около других спор нет. Для не-
9
Рис. 3. Различные бактерии (фотографии в световом микроскопе).
Ув. Х2000.
/ — клетки миксобактерни; 2 —нитевидная ползущая флексибактерия; 3 — полиморфные
клетки микобактерии; 4 — кокки, делящиеся в трех плоскостях и образующие пакеты-
сарцины; 5 — плеврокапсовая цианобактерия, шаровидные клетки которой растут, как
шары, а затем дробятся; 6 — клетки вибриона; 7 — спиральные клетки неподвижной
бактерии Flectobacillus; 8 — спирилла.
10
которых бактерий характерна четко выраженная полярность
клеток, связанная с различием функций, которые несут ее
концы. Это прежде всего бактерии с диморфным клеточным
циклом, дочерние клетки которых отличаются от родительских.
Сюда относятся стебельковая бактерия Caulobacter (рис. 4),
почкующаяся бактерия Hyphomicrobium и некоторые другие.
Клетки упомянутых бактерий, Caulobacter и Hyphomicro-
bium, имеют выросты — простеки. По определению Стейли, про-
стеками называют выросты клеток, содержащие цитоплазму и
окруженные хотя бы некоторыми элементами клеточной обо-
лочки. Простеки могут быть короткими или длинными, их мо-
жет быть много или только одна (рис. 4, 5), они могут разли-
чаться по функциям. У Caulobacter стебельки служат для при-
крепления клетки к субстрату, у Hyphomicrobium на гифах
образуются почки (рис. 6), у Ancalomicrobium, Prosthecobacter
и других простекобактерий эти выросты, видимо, не несут спе-
циализированных функций. Считают, что у всех бактерий они
облегчают поглощение пищи за счет увеличения поверхности
клетки.
Обычно подчеркивают примитивность организации бактери-
альных клеток, несомненно, однако, что они эволюционировали
в своем направлении в течение гораздо большего времени, чем
эвкариотические. Хотя эволюционные возможности прокариоти-
ческой клетки, по всей видимости, ограничены, в процессе эво-
люции происходили изменения их клеточной организации, что
привело постепенно к ее усложнению.
В соответствии с современными представлениями об эволю-
ции бактерий эубактерии и архебактерии произошли от общего
предка, однако обособление этих линий эволюции произошло
очень давно. В отношении своеобразия биохимических, физиоло-
гических и структурных свойств представителей царства эубак-
терий наука располагает обширной информацией. Архебакте-
рии пока изучены хуже.
Клетки архебактерий структурно относятся к прокариотному
типу, но многие макромолекулы, входящие в их состав, — ли-
пиды, полисахариды, белки, в том числе некоторые ферменты
и т. д., являются уникальными и не обнаруживаются ни у эу-
бактерий, ни у эвкариот? Архебактериям свойственны биохими-
ческие реакции, отсутствующие у других организмов.
Кроме фенотипических отличий своеобразное эволюционное
положение эубактерий и архебактерий подтверждено анализом
нуклеотидных последовательностей их рибосомальных РНК.
Известно, что рРНК очень медленно изменяется в процессе эво-
люции. Определение накопившихся в результате мутаций изме-
нений в нуклеотидном составе рРНК позволяет оценивать сте-
пень различий как между близкородственными формами —
штаммами, видами, так и между представителями высших так-
сонов, в том числе царств. С другой стороны, наличие опреде-
11
ленных сходных участков в последовательностях оснований
рРНК свидетельствует об общем происхождении организмов,
фенотипически иногда весьма различных, и об их принадлеж-
ности к определенным линиям эволюции. По составу и после-
довательностям нуклеотидов в 16S и 5 S рРНК архебактерий
настолько же далеки от эубактерий, как и от эвкариот.
К 1984 г. было известно 25 родов и около 40 видов архебак-
терий. Наиболее многочисленная по количеству известных форм
Рис. 5. Простекобактерия с много-
численными простеками. Ув. X10 000.
Рис. 4. Делящаяся клетка сте-
бельковой бактерии Caulobac-
ter. Ув. X10 000.
Рис. 6. Клетка Нyphomicrobium с ги-
фами, на которых образуются почки.
У в. Х8000.
группа — метанобразующие бактерии, а также анаэробные бак-
терии, восстанавливающие элементарную серу. К архебакте-
риям относятся также некоторые аэробные серобактерии, гало-
бактерии и термоацидофильные микоплазмы. По морфологиче-
ским признакам и размерам клетки эубактерий и архебактерий
сходны, однако среди архебактерий пока неизвестны трихомные
и мицелиальные формы, зато обнаружены квадратные и пла-
стинчатые: Haloarcula и Methanoplanus. Неизвестны архебак-
терий, вызывающие заболевания животных или растений.
Гипотетический общий родоначальник эу- и архебактерий,
видимо, не обладал плотной клеточной оболочкой. У термоаци-
12
дофильных архебактерий плотная оболочка в эволюции так и
не возникла, у других групп архебактерий она появлялась мно-
гократно и независимо. Поэтому оболочки архебактерий обна-
руживают разнообразие химического строения и свойств. У при-
митивной формы, родоначальницы эубактерий, уже появилась
оболочка, содержащая пептидогликан, характеризующийся на-
личием мурамовой кислоты и пептидов с чередующимися L- и
D-аминокислотами. Эволюция таких форм привела к формиро-
ванию двух групп бактерий, в настоящее время господствующих
на Земле, — грамположительных и грамотрицательных. Они раз-
граничены достаточно четко благодаря такому легко определяе-
мому критерию, как строение клеточной оболочки. Различия
в ее строении обычно проявляются в отношении к окраске по
методу Грама, однако могут быть бактерии, окрашивающиеся
как грамотрицательные, но имеющие грамположительную обо-
лочку. Кроме того, они могут иметь и другие признаки, харак-
терные скорее для грамположительных бактерий. Например,
все бактерии, образующие эндоспоры, обладают грамположи-
тельной оболочкой, но некоторые из них окрашиваются как
грамотрицательные. Поэтому характер организации оболочки
рассматривается в качестве признака более важного, чем сама
по себе окраска по Граму. В 1978 г. Гиббонс и Муррей предло-
жили грамотрицательные эубактерии выделить в отдел Граци-
ликутных (Gracilicutes), а грамположительные — в отдел Фир-
макутных (Firtnacutes).
Вершин морфологической эволюции в группе Фирмакутных
достигли актиномицеты, в группе Грациликутных — цианобак-
терии (синезеленые водоросли). Морфология, цитология и циклы
развития этих довольно сложно организованных организмов
рассмотрены в специальных монографиях: актиномицеты —
в книге Калакуцкого и Агре [1977], цианобактерии — в моногра-
фиях Фогга с соавторами [Fogg, е. а., 1973], Гусева и Никити-
ной (1979] и в работах автора [Громов, 1976].
Глава I
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ОБОЛОЧКИ
§ 1. Строение и синтез муреина
В состав оболочек фирмакутных и грациликутных входит
структурный полимер, обозначаемый как мукопептид, глюкоз-
аминопептид, гликопептид, пептидогликан или муреин (лат. ши-
rus — стенка). В настоящее время общеприняты два последних
наименования.
Муреин состоит из линейных молекул гликана, образован-
ного «кирпичиками», включающими остатки N-ацетил-М-глю-
козамина (I) и N-ацетилмурамовой кислоты (З-О-лактил-Ы-аце-
тил-М'-глюкозамин) (II), соединенные р-1,4 связями:
Мурамовая кислота в качестве структурного компонента об-
наружена только в клетках фирмакутных и грациликутных, и
ее присутствие может служить доказательством принадлежно-
сти организма к одной из этих групп прокариот. Вместе с тем
«кирпичики», образующие бактериальный гли-кан, весьма сходны
с «кирпичиками», из которых состоят структурные соединения
оболочек некоторых эвкариот, именно дисахаридом целлобио-
зой, лежащей в основе целлюлозы растительных клеток, и ди-
сахаридом, образованным остатками глюкозамина и входящим
в состав хитина — компонента оболочек грибов и кутикулы бес-
позвоночных животных.
Благодаря карбоксильным группам мурамовой кислоты бак-
териальный гликан, в отличие от целлюлозы и хитина, обладает
кислотными свойствами, что определяет ряд важных свойств
бактериальной оболочки.
14
Сходство структур бактериального гликана, хитина и клет-
чатки, вполне возможно, определяется сходством выполняемых
этими соединениями функций и не имеет исторических причин.
Однако, по мнению некоторых исследователей, структура ске-
летных полимеров эволюционировала от более сложной у прока-
риот, к более простой у эвкариот. В пользу подобной точки
зрения говорит тот факт, что у грибов при синтезе хитина обо-
лочки, так же как у бактерий при синтезе муреина, в качестве
предшественника выступает УДФ-Ы-ацетил-О-глюкозамин.
Длина молекул гликана оболочек, например у Bacillus sub-
tills, варьирует от 30 до 590 единиц дисахарида, хотя ее опре-
деление методически сложно, так как в процессе очистки проис-
ходит частичный гидролиз молекул за счет активирования ли-
тических ферментов, всегда присутствующих в оболочках бак-
терий.
Пептид, входящий в состав муреина, включает 3—6 различ-
ных аминокислот. Аминокислоты с разветвленной цепью, аро-
матические и серосодержащие, а также гистидин, аргинин и
пролин никогда не встречаются в составе муреина.
Основу пептидной части муреина составляют тетрапептиды,
образованные чередующимися L- и D-аминокислотами. В состав
тетрапептида часто входит также необычная аминокислота —
диаминопимелиновая (ДАП), находящаяся в мезоформе:
НООСк ХООН
Vh-ch2—сн2-сн2-сн<^
h2nz xnh2
В составе пептида ДАП обычно связана своим L-асимметрич-
ным центром.
С карбоксильной группой мурамовой кислоты соединена
аминогруппа крайней аминокислоты пептида. Обычно это L-
аланин, но иногда — глицин или L-серин. За L-аланином следует
D-глутаминовая кислота, которая связана у-карбоксильной груп-
пой (иногда а-карбоксильной группой) с диаминокислотой, на-
ходящейся в 3-м положении. Вторая карбоксильная группа
глутаминовой кислоты остается свободной. Она может, быть
амидирована или к ней могут быть присоединены дополнитель-
ные аминокислоты.
У всех грациликутных и многих фирмакутных в 3-м положе-
нии находится ДАП, свободная карбоксильная группа которой
иногда амидирована. У некоторых бактерий вместо мезо-ДАП
обнаруживается Ь,Ь-ДАП или другая аминокислота. Часто это
L-лизин, реже L- или D-орнитин, мезо-2,6-диамино-З-гидрокси-р-
пимелиновая или 2,4-диаминомасляная кислоты, гидроксилизин
или гомосерин.
Вторая аминогруппа диаминокислоты служит местом попе-
речных сшивок соседних пептидов, она связана с терминальным
карбоксилом D-аланина прилежащего пептида.
15
Четвертой аминокислотой тетрапептида является D-аланин,
карбоксильная группа которого свободна или участвует в об-
разовании межпептидной связи. Некоторые пептидные цепочки
содержат два терминальных D-аланина, другие — только три
аминокислоты или менее.
Аминокислотный состав и строение пептидной части муреина
грациликутных стабильны. У фирмакутных, напротив, аминокис-
лоты, входящие в состав тетрапептида, могут различаться, так
же, как строение и состав аминокислотных мостиков, соединяю-
щих соседние тетрапептиды. У фирмакутных особенности строе-
ния пептидной части муреина характеризуют определенные так-
соны бактерий, в некоторых случаях этот признак бывает ре-
шающим. У фирмакутных известно более 100 разновидностей,
или хемотипов, муреина. В соответствии со схемой, предложен-
ной в 1972 г. Шлайфером и Кандлером, различные хемотипы
муреина подразделяются на группы А и В в зависимости от
положения сшивки пептидов — у третьего или второго амино-
кислотного остатка тетрапептида и на подгруппы — в зависи-
мости от аминокислотного состава пептидов и соединяющих их
мостиков.
В группе А пептиды соединены через аминокислоты в 3-м и
4-м положениях, причем связь пептидов обеспечивается со-ами-
ногруппой ДАП одного пептида и карбоксилом D-аланина дру-
гого.
Подгруппа А-1 характеризуется прямой связью ДАП одного
пептида с D-аланином другого и является наиболее обычной:
L-ала
D-глу
мезо-ДАП
D-ала
Гликан
I
NH
I
Н—С-СНз
I
с-о
~ NH
I
Н-С-(СН2)2-СООН
I
с-о
I
” NH NH2- D-ала
I I
Н—С—(СН2)з—СН-СООН
I
С-0
I
- NH
I
Н-С-СНз
I
соон
16
Подобный тип муреина свойствен грациликутным и многим
фирмакутным.
Муреин подгруппы А-2 содержит дополнительный пептидный
мостик, соединяющий тетрапептиды, причем он имеет ту же
аминокислотную последовательность, что и тетрапептид, соеди-
ненный с гликаном. Например, муреин Micrococcus luteus имеет
строение:*
—АГ—AM—АГ—
I
L-ала
I
D—глу—гли гли
L-лиз —D-ала—L-лиз—D-глу—L-ала—D-ала
I I
D-ала L-лиз
I
D—глу—гли
I
L-ала
I
—АГ—AM—АГ—.
Подгруппа А-3 также характеризуется наличием дополни-
тельных аминокислотных мостиков, соединяющих тетрапептиды.
Здесь мостики состоят из глицина или монокарбоновых L-ами-
нокислот или из их сочетаний. Этот тип муреина свойствен боль-
шинству фирмакутных. Количество аминокислотных остатков
в мостике, образованном одной и той же кислотой, варьирует
от 1 до 6. Кроме глицина это могут быть L-аланин или L-серин.
Если мостик состоит из гетеропептида, то кроме упомянутых
аминокислот в нем может содержаться L-треонин, а число ами-
нокислотных остатков варьирует от 2 до 7. В некоторых слу-
чаях разные бактерии содержат одни и те же аминокислоты
в одинаковом количестве, но последовательности аминокислот-
ных остатков в мостике при этом различаются. К этой подгруппе
относится муреин Staphylococcus aureus, имеющий следующее
строение:
—АГ—AM—АГ—
I
L-ала
I
D-глу—NH2
I
L-лиз —гли—гли—гли—гли—гли—D-ала
I I
D-ала L-лиз
I
D-глу—NH2
I
L-ала
__________ —АГ—AM—АГ—.
* Здесь и далее: АГ — N-ацетилглюкозамин, AM — N-ацетилмурамовая
кислота.
2 Б. В. Громов
17
В муреинах подгруппы А-4 аминокислотные мостики содер-
жат дикарбоновую аминокислоту, ее а-карбоксильная группа
остается свободной или амидирована. Это может быть D-аспа-
рагиновая, D- или L-глутаминовая кислоты. Например, муреин
Streptococcus faecium имеет следующее строение:
—АГ—AM—АГ—
I
L-ала
I
D-глу—NH3
i т
L-лиз—D-acn—D-ала
I I
D-ала L-лиз
I
D—глу—NH3
I
L-ала
I
-АГ— АМ-АГ—.
В состав аминокислотного мостика в муреине этого типа может
входить еще одна аминокислота — глицин, D- или L-серин, L-
аланин.
Группа В включает муреины, в которых соединение тетра-
пептидов происходит между аминокислотами в положениях 2
и 4, причем а-карбоксильная группа D-глутаминовой кислоты
одного пептида связана с карбоксильной группой D-аланина
прилегающего. Соединяющий мостик, очевидно, должен содер-
жать диаминокислоту. В подгруппе В-1 это L-диаминокислота,
в подгруппе В-2 — D-диаминокислота. Муреин В-2 типа Eubao
terium limosum имеет следующее строение:
—АГ—AM—АГ—
I
L-cep
I
D-глу—D-л из—D-ала
I I
L-орн L-орн
I I
D-ала D-глу
I
L-cep
I
—АГ—AM—АГ— .
Детали строения пептидов в муреинах группы В значительно
варьируют. Их характерной особенностью является также за-
мена L-аланина в первом положении на глицин или серин. Гли-
цин встречается у некоторых коринеподобных фитопатогенных
бактерий, а серин характерен для анаэробных неспорообразую-
18
щих фирмакутных. Муреины группы В встречаются значительно
реже муреинов группы А.
По мнению авторов приведенной классификации муреинов,
наиболее эволюционно примитивным является химически слож-
ный муреин с межпептидными мостиками, а наиболее прогрес-
сивным— муреин с прямой связью пептидов, характерный,
в частности, для грациликутных.
Аминокислотный состав пептидов и строение муреина—до-
вольно консервативный признак. Это связано с тем, что входя-
щие в его состав пептиды не синтезируются непосредственно на
информационной РНК, но их состав и строение контролируется
полигенно через ряд ферментов, участвующих в их синтезе.
Поэтому точечные мутации не могут непосредственно прояв-
ляться в структуре пептидов, для изменения которой необхо-
димы существенные нарушения строения соответствующих фер-
ментов.
Из вышеизложенного очевидно, что некоторое варьирование
строения муреина все же может иметь место. В некоторых слу-
чаях наблюдаются модификации не только пептидной, но и гли-
кановой частей. Примеры такого рода будут приведены в даль-
нейшем.
Муреин придает оболочке бактерий определенную механи-
ческую прочность, упругость или ригидность. Он содержит
отрицательно и положительно заряженные группы, т. е. влияет
на характер поверхностного заряда клетки.
Бактериальная оболочка обладает определенной биологиче-
ской активностью, проявляющейся в ходе взаимодействия бак-
териальной клетки с иммунной системой человека или живот-
ного. За специфику подобных взаимодействий ответственны
различные компоненты оболочек, а элементы муреина обнару-
живают неспецифический адыовантный эффект. Адьювантом
называют вещество, усиливающее иммунный ответ на введение
неродственного антигена. Как оказалось, адьювантной актив-
ностью обладают сравнительно небольшие части молекулы му-
реина, наименьшим активным фрагментом оказался трипептид,
соединенный с мурамовой кислотой:
AM
I
L—ала—D-глу—мезо-ДАП.
Если свободная карбоксильная группа глутаминовой кислоты
амидирована или метилирована, адьювантную активность про-
являет даже мурамилдипептид, усиливающий, кроме того, не-
специфическую устойчивость организма к инфекции. Защитное
значение подобных реакций животного на муреин клеточной
оболочки бактерий очевидно.
Литические ферменты. Ферменты, разрушающие структуру
муреина, после их открытия Александром Флемингом долгое
время были известны как лизоцимы. Активность литических
2*
19
ферментов необходима для нормального роста и деления бакте-
риальных оболочек, она строго контролируется, и присутствие
таких ферментов в клетках бактерий не всегда легко обнару-
жить. Они могут находиться в неактивном состоянии будучи
связаны с элементами оболочки. Некоторые бактерии, например
бактериолитические миксобактерии и актиномицеты, исполь-
зуют литические ферменты в качестве средства нападения и за-
щиты в борьбе за существование с другими бактериями. Лизо-
цимы участвуют в проникновении вирусной нуклеиновой кис-
лоты в бактериальную клетку и в лизисе бактерий в результате
вирусной инфекции.
Лизоцимы являются фактором неспецифического иммунитета
организма человека и животных. Они содержатся в слезной
жидкости, мокроте, слюне, крови, молоке, в тканях тела живот-
ного. Известно, что недостаток лизоцима в слезной жидкости
может привести к болезням роговицы. Большое количество ли-
зоцима имеется в белке куриного яйца.
Точки приложения литических ферментов различны. Фер-
менты подразделяются на гликозидазы, амидазы и эндопепти-
дазы, направленность их действия следующая:
эндо-Ы-ацетилглюкозамил-Ь1-ацетил мурамидаза
(глюкозидаза)
эндо-Ы-ацетилмурамил-М-ацетилглюкозиламидаза
| (глюкозидаза)
—AM—АГ—AM—АГ—
| <------ N-ацетилмурамил-М-аланинамидаза.
эндопептидазы
Степень чувствительности муреина к литическому действию
ферментов уменьшается при увеличении числа свободных ами-
ногрупп пептида, числа сшивок полисахаридных молекул и
особенно при соединении муреина с другими макромолекулами
оболочки или модификациях его полисахаридной части.
Синтез муреина проходит ряд стадий, осуществляемых
в цитоплазме, на уровне цитоплазматической мембраны и в обо-
лочке (рис. 7). В цитоплазме проходят первые этапы синтеза
муреина, при этом функцию переносчика синтезируемой моле-
кулы выполняет уридиндифосфат (УДФ). N-ацетилмурамовая
кислота синтезируется из УДФ-М-ацетилглюкозамина и фосфо-
энолпирувата, затем происходит последовательное присоедине-
ние аминокислот пептидного мостика. Присоединение каждой
аминокислоты катализируется специальным ферментом, причем
для D-аминокислот — это специфические ферменты. Для про-
хождения этих реакций необходима энергия АТФ и микроэле-
20
менты, в частности Мп2+. Синтез муреина может происходить,
когда трансляция полностью ингибирована. В этих условиях
клетки приобретают более массивные оболочки, чем в норме.
Таким образом, продукт синтеза в цитоплазме — УДФ-Ы-аце-
тилмурамилпептид, следующие этапы синтеза связаны с цито-
плазматической мембраной и ассоциированными с ней фер-
ментами. Здесь происходит трансгликозилирование, в котором
N- аиетилглюкозанин
У ДФ-N- ацетилглюкозамин
У ДФ-N- ацетил мура новая кислота
У ДФ-N- ацетилмурамилпентапеп гид
N- ацетилмурамилпен тапептид
дифосфолипид
N - ацетилглюкозамил -
-N- ацетилмурамилпентапептид-
-дифосфолипид
N- ацетилглюкозаминил -
N- ацетипмуранилпентаи цил -
- (С1 п) - пентапептидил -
- дифосфолипид
Трансгликозилирование
Рис. 7. Стадии синтеза муреина.
1 — в цитоплазме; 2 — в цитоплазматической мембране;
3 — в оболочке.
предшественниками являются УДФ-Ы-ацетилмурамилпептид и
УДФ-Н-ацетилглюкозамин (рис. 8).
В роли гидрофобного переносчика на мембранном уровне
выступает фосфолипид, у некоторых бактерий идентифицирован-
ный как ундекапренилфосфат, имеющий следующее строение:
сн3 сн3 сн3 ОН
Il II
сн3—с=сн—сн3—(сна—с=сн—сн2)9—сн2—с=сн-сн2—о—р—он-
I
о
На первом этапе на ундекапренилфосфат переносится N-аце-
тилмурамилпентапептидмонофосфат с образованием соответст-
21
вующего замещенного фосфолипида и УМФ. Затем на образо-
вавшееся соединение переносится остаток N-ацетилглюкозамина
с освобождением УДФ. Таким образом, образуется фосфорили-
рованный «кирпичик» будущего муреина. В этот момент к пеп-
тиду могут присоединяться аминокислоты пептидных мостиков.
Существенно, что синтезированный пептид содержит два терми-
нальных D-аланина, являясь, таким образом, пентапептидом.
У стафилококка, например, в это время к е-аминогруппе лизина
последовательно присоединяются глицины (см. с. 17). Глицин
может акцептироваться только дисахаридпентапептидом, свя-
занным с липидом. В это же время D-глутаминовая кислота
амидируется аммонием, и после этого мономер переносится на
растущий муреин. В этих реакциях, так же как в реакциях,
УМФ
он он
ЭДФ-м-ацетилгмкозамн
УДСр - N-ацет иг
- мурамиллептид
ОН
I
липид — Р-ОН
\\
О
N - ацет илмурамил - Р - О -Р- липид
II
О
пептид
УДФ
ОН ОН
Н3Р0
ОН
I о
N-ацетилглюкозаиил -N - ацетилмурамил-Р-0-Р-липид
ОН
липид — Р-О-Р-ОН
пептид
пептидогликан
2
О
О
О о
Рис. 8. Этапы синтеза муреина,
идущие в цитоплазматической
мембране.
проходящих в цитоплазме, принимают участие транспортные
РНК, причем они специфичны для D-аминокислот. Кирпичик-
предшественник переносится на растущую цепь муреина и вклю-
чается в нее путем трансгликозилирования (удлинение) итранс-
пептидирования (сшивки). При транспептидировании второй
терминальный' D-аланин отщепляется. В этих процессах участ-
вуют трансгликозидазы и транспептидазы. При трансгликозили-
ровании освобождается переносчик — ундекапренилпирофосфат,
который отдает одну молекулу фосфата под влиянием специ-
фической фосфатазы, таким образом завершается цикл унде-
капренила.
Синтез муреина завершается либо непосредственным соеди-
нением пептидов отдельных кирпичиков, либо с помощью пеп-
тидных мостиков в зависимости от типа муреина. Участки вновь
синтезированного муреина отличаются относительно незначи-
тельным числом пептидных сшивок, а также присутствием пен-
тапептидов. В процессе его созревания число пептидных сшивок
возрастает, причем процесс первичного встраивания мономеров
и созревание муреина обусловлены различными ферментами.
Синтез муреина может быть подавлен рядом антибиотиков,
инактивирующих определенные ферменты, участвующие в син-
тезе или связывающиеся с липидным переносчиком в мембране
22
или образующие комплекс с точкой роста цепи муреина. К анти-
биотикам — ингибиторам ферментов относятся D-циклосерин,
О-карбамид-ЕХ-серин, подавляющие активность аланинрацемазы,
катализирующей превращение L-аланина в D-аланин, и присое-
динение последнего к пептиду. С молекулами переносчика взаи-
модействуют бацитрацин, ванкомицин и ристоцетины А и В,
они угнетают стадию переноса на растущую цепь муреина ди-
сахаридпентапептидфосфолипида. Активность транспептидазы
подавляет цефалоспорин. Различные пенициллины связывают
те или иные ферменты, участвующие в синтезе муреина, хотя
детально механизмы их действия не установлены. Синтез му-
реина подавляют высокие концентрации глицина, способного
включаться в пептидные цепи вместо L-аланина.
§ 2. Оболочка фирмакутных
Строение оболочки у разных грамположительных бакте-
рий— фирмакутных довольно различно, но она всегда массивна.
У многих видов оболочка образована муреином, с которым ко-
валентно связаны вторичные полимеры — тейхоевые и тейхуро-
новые кислоты или нейтральные полисахариды, такая оболочка
может быть однородной. Другие формы имеют дополнительные
Рис. 9. Поверхностная структура фирмакутных, выявляемая электронно-
микроскопическими методами [Steytr, 1978].
/ — на срезах; 2, 3 — на репликах со сколов замороженного материала: с поперечного
скола (2), с продольного скола (3); цм — цитоплазматическая мембрана; о — оболочка;
s — белковый поверхностный слой, образованный регулярно уложенными белковыми
субъединицами.
к этому основному слою структуры. Нередко поверхность основ-
ного слоя оболочки покрыта упорядоченно расположенными
белковыми субъединицами (рис. 9).
Простые оболочки на срезах имеют толщину 20—100 нм и
более, однако при приготовлении срезов они сильно спадаются,
так, толщина оболочки на срезах составляет всего 31—35% от
обнаруживаемой на сколах замороженных бактерий. До сих пор
остается неясным, распределены ли в таких оболочках все ком-
поненты равномерно, или отдельные участки обогащены опре-
деленными полимерами. На срезах и сколах оболочки никакой
ее структуры часто не выявляется (рис. 9). После экстракции
23
дополнительных полимеров (например, трихлоруксусной кисло-
той) толщина оболочки уменьшается примерно на 7з, однако ее
структура не изменяется. Однако иногда оболочка на срезе вы-
глядит не вполне однородной, но как бы состоящей из двух
электронноплотных слоев, заключающих менее плотную для
электронов центральную зону. Повышенная электронная плот-
ность периферических частей оболочки может объясняться боль-
шой концентрацией здесь полианионных компонентов, хотя
экспериментальных подтверждений этому пока не получено.
У некоторых бактерий, например у Streptococcus faecalis, на
сколах удалось обнаружить организованную структуру обо-
лочки, напоминающую два ряда булыжников, разделенных цен-
тральным каналом, где плотность вещества, видимо, ниже, чем
в периферических частях оболочки. Выявляемые здесь глобулы,
вероятно, представляют собой поперечные сколы пучков микро-
фибрилл, наличие которых свидетельствует об упорядоченной
укладке макромолекул в оболочке.
У фирмакутных оболочка обычно тесно прилегает к цито-
плазматической мембране, хотя иногда на сколах, и особенно
на срезах между ними, видно некоторое пространство, несмотря
на то, что оболочка и мембрана соединены многочисленными
фибриллярными мостиками. У Bacillus licheniformis между обо-
лочкой и цитоплазматической мембраной находится тонкий
слой, окрашивающийся рутениевым красным — специфическим
красителем кислых мукополисахаридов. Пространство между
оболочкой и цитоплазматической мембраной называют пери-
плазматическим пространством или периплазмой.
У фирмакутных с гомогенной оболочкой муреин обычно со-
ставляет 40—60% от ее сухого веса, а у некоторых бактерий,
например у Micrococcus lyzodeikticus, 80—90%. Муреин обра-
зует здесь трехмерную губчатую структуру. Обычная для обо-
лочек многих бацилл, например Bacillus subtilis, толщина 30—
40 нм приблизительно соответствует толщине 40 молекул му-
реина. Как уже говорилось, у фирмакутных обнаружено более
100 различных хемотипов муреина, но упомянутые различия
относятся только к пептидной части его молекулы. У некоторых
штаммов фирмакутных, кроме того, обнаружены аномалии в по-
лисахаридной части молекулы. Так, у некоторых видов Bacillus
70—80% глюкозамина не имеют N-ацетильных групп, а у Mi-
crococcus lyzodeikticus эти группы отсутствуют у мурамовой
кислоты. Существенно, что муреин с частично отсутствующими
ацетильными группами у глюкозамина (но не у мурамовой кис-
лоты) приобретает устойчивость к лизоциму.
Тейхоевые кислоты (от греч. «тейхос» — стенка) — полимеры,
образованные остатками спирта рибита (рибиттейхоевые) (I)
или глицерина (глицеринтейхоевые) (II), связанными фосфо-
диэфирными мостиками. Одна молекула тейхоевой кислоты
обычно включает 7—15, иногда до 50 спиртовых остатков. Неко-
24
торые свободные гидроксильные группы спиртов заняты остат-
ками D-аланина, глюкозы, N-ацетилглюкозамина или N-ацетил-
галактозамина (R — на схеме). Остающиеся свободными гидро-
ксилы фосфорной кислоты придают тейхоевой кислоте свойства
полианиона. У глицеринтейхоевых кислот фосфатные остатки
расположены сравнительно близко друг к другу и могут захва-
тывать двухвалентные катионы. Рибиттейхоевые кислоты имеют
к двухвалентным катионам несколько меньшее сродство, так
как фосфатные группы у них находятся на большем расстоянии
одна от другой, чем у глицеринтейхоевых. Аминогруппы D-ала-
нинов придают тейхоевым кислотам амфотерные свойства и
могут нейтрализовать их внутренний заряд.
В некоторых тейхоевых кислотах глюкоза может быть вклю-
чена непосредственно в цепь полимера — это глюкозилтейхоевые
кислоты (III):
ш
п
В цепь тейхоевой кислоты, может входить также глюкозамин,
обычно ацетилированный. Молекулы тейхоевых кислот могут
быть ковалентно связаны с муреином:
25
Он
I
Снг-0-Р-О-
Н NH Он NH
I i ।
О = О н - c - CH 3 c = О
Сн3 С — О — сала Ch3
У разных штаммов Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus
в рибиттейхоевых кислотах глюкозил и D-аланин находятся
у каждого спиртового остатка или только у некоторых, а иногда
эти компоненты вообще отсутствуют. Характер чередования
остатков также бывает различен. Это делает возможным широ-
кое варьирование строения молекул тейхоевых кислот у разных
бактерий.
Липотейхоевые кислоты, обычно это глицеринтейхоевые кис-
лоты, связаны с липидом, который находится в цитоплазмати-
ческой мембране, являясь ее компонентом, тогда как гидрофиль-
ная часть молекулы находится в оболочке и может даже час-
тично выходить на поверхность бактерии.
Тейхоевые кислоты служат не только дополнительными эле-
ментами пространственной структуры оболочки, но и выполняют
ряд жизненно важных для бактериальной клетки функций. Как
полианионы они влияют на катионный обмен клетки. Считается,
что они осуществляют захват из окружающей среды и связыва-
ние Mg2+, причем большим сродством к Mg2+ обладают глице-
ринтейхоевые кислоты. Липотейхоевые кислоты, вероятно, обес-
печивают необходимое ионное окружение цитоплазматической
мембраны.
По крайней мере, у некоторых бактерий тейхоевые кислоты
участвуют в регуляции активности автолитических ферментов-
гидролаз, способных разрушать собственный муреин. Например,
у пневмококков и Вас. subtilis они необходимы для проявления
активности L-аланинамидазы, у Вас. subtilis, кроме того, при
отсутствии тейхоевых кислот фермент не локализуется в обо-
лочке и полностью выделяется в окружающую среду. У пнев-
мококков и других бактерий связанные с мембраной липотейхое-
вые кислоты выступают в роли ингибиторов собственных лити-
ческих ферментов, связывая их. Нарушение этой связи приводит
к лизису клетки. Взаимодействия подобного рода крайне специ-
26
фичны и наблюдаются только между определенными фермен-
тами и тейхоевыми кислотами.
Тейхоевые и липотейхоевые кислоты обладают антигенными
свойствами и в определенной степени обусловливают антиген-
ную специфичность клеточной поверхности.
Тейхоевые кислоты, точнее их сахарные компоненты, входят
в состав рецепторов для некоторых бактериофагов и, таким об-
разом, определяют возможность адсорбции фага на клеточной
поверхности. Если по каким-либо причинам молекула тейхоевой
кислоты теряет гликозильные остатки, клетка обычно приобре-
тает устойчивость к тому или иному бактериофагу. Как поли-
анионы тейхоевые кислоты определяют поверхностный заряд
клетки.
Кроме тейхоевых кислот в оболочках фирмакутных могут
присутствовать тейхуроновые кислоты, образованные остатками
уроновых кислот и N-ацетилглюкодамина:
Синтез тейхуроновых кислот активируется при недостатке
фосфора в среде, при этом тейхуроновые кислоты замещают
тейхоевые, хотя сйнтез липотейхоевых кислот продолжается.
В процессе синтеза тейхоевых кислот глицерофосфат посту-
пает из цепи метаболитов гликолиза, рибитфосфат образуется
за счет энзиматического восстановления при участии НАДН-D-
рибулезо-5-фосфата. В синтезе полимера переносчиком и по-
ставщиком фосфора выступает цитидинфосфат. Ферменты син-
теза тейхоевых кислот тёсно связаны с цитоплазматической
мембраной, их активность зависит от двухвалентных катионов
Mg2+ и Са2+. УДФ-глюкоЗа или УДФ-М-ацетилглюкозамин слу-
жат донором гликозилов, присоединяющихся к свободным гид-
роксильным группам полимера в реакции трансгликозилиро-
вания.
Синтезы тейхоевых кислот и муреина в клетке взаимосвя-
заны и идут одновременно. При этом у некоторых бактерий
довольно строго выдерживается соотношение молекул муреина
и тейхоевых кислот 1:1.
В синтезе тейхоевых кислот принимает участие фосфолипид,
тот же, что и в синтезе муреина — ундекапренилфосфат. Через
него осуществляется взаимодействие и регуляция этих синтезов
27
и, в конечном счете, регуляция синтеза клеточной оболочки.
Количество ундекапренила в мембране клетки определяется ак-
тивностью двух ферментов — киназы, катализирующей фосфо-
рилирование ундекапренила, и фосфатазы, гидролизующей этот
фосфолипид. Изменение активности этих ферментов служит ос-
новным механизмом, регулирующим синтез оболочки.
Оболочка фирмакутных представляет собой губчатую струк-
туру с. порами диаметром порядка 1—6 нм. Возможность про-
хождения молекул через оболочку определяется размерами этих
пор, а также зарядом оболочки. Характер структуры оболочки
и особенно ее объем в значительной степени зависят от ионной
силы и значения pH окружающего раствора. Степень «сшито-
сти» молекул муреина пептидными мостиками сильно влияет на
заряд, объем и обводненность муреина.
Отрицательно заряженные карбоксилы или фосфатные
группы полимеров оболочки не нейтрализованные аминогруп-
пами ее аминокислот создают силы отталкивания, в результате
чего объем, занимаемый оболочкой, увеличивается и обводнен-
ность ее возрастает. Отрицательно заряженные группы могут
быть нейтрализованы катионами, поступающими из окружаю-
щей среды, тогда оболочка уменьшается в объеме и становится
менее обводненной. Оболочка фирмакутных — эффективный
ионнообменник с высокой поглотительной способностью и может
содержать больше катионов, чем цитоплазма. Оболочка ряда
фирмакутных характеризуется следующей степенью сродства
к катионам:
Н+ > La3+ > Cd2+ > Sr2+ > Са2+ > Mg2+ > К+ > Na+ > Li\
Поглотительная способность оболочки фирмакутных вполне
сопоставима с аналогичной способностью лучших катионитов,
выпускаемых современной промышленностью. Например, погло-
тительная способность оболочки Micrococcus lyzodeikticus соот-
ветствует 3,5 meg на г сухого веса.
Степень насыщенности оболочки катионами у бактерий
сильно варьирует, а состав катионов непосредственно зависит
от их относительного содержания в среде. Хотя сродство обо-
лочки к двухвалентным катионам примерно в 10 раз выше, чем
к одновалентным, последние обычно преобладают в оболочке,
поскольку они в большем количестве содержатся в питательных
средах. Оболочка может служить депо необходимых клетке ка-
тионов при перенесении бактерий из концентрированной среды
в разведенную.
У большинства фирмакутных в составе оболочки кроме ее
основного слоя обычно присутствуют дополнительные струк-
туры, образованные полисахаридами, белками или гликопро-
теидами, их наличие, видимо, является правилом, особенно для
бактерий, обитающих в условиях естественной среды, поскольку
дополнительные компоненты оболочки могут нести важные
28
функции, связанные с рецепцией окружающих условий, защи-
той клетки от различных воздействий и т. п. Дополнительные
компоненты оболочки могут быть оформлены в определенные
структуры, например у многих бактерий на поверхности имеется
слой белковых молекул, уложенных в определенном порядке
(см. рис. 9). Этот белок синтезируется на рибосомах, связанных
с цитоплазматической мембраной, выделяется из клетки и
в процессе самосборки формирует на поверхности оболочки
белковый слой, который, видимо, несет защитную функцию.
Подобные структурированные белковые слои оболочки описаны
у многих фирмакутных, в том числе у Bacillus alvei, Вас. anth-
racis, Вас. brevis, Вас. cereus, Clostridium botulinum, Cl. sporo-
genes, Lactobacillus casei, Sporosarcina urea.
Иногда на поверхности оболочки фирмакутных присутствуют
белковые молекулы, не образующие структур определенной
Рис. 10. Конформация белковых мо-
лекул, образующих ворсинки на по-
верхности оболочки фирмакутных
[Cohen, Phillips, 1981].
1 — расположение молекул протеина «А»
на поверхности оболочки Staphylococcus
aureus; 2 — расположение спаренных мо-
лекул протеина «М» стрептококков груп-
пы «А»; кс — поверхностный слой обо-
лочки.
формы. Характерная особенность таких белковых молекул за-
ключается в образовании ими а-спирали, определенным образом
ориентированной на поверхности клетки. Например, молекулы
белка «А» стафилококков формируют одномолекулярную анти-
параллельную структуру, причем на конце молекулы находится
участок, определяющий рецепторные свойства белка (рис. 10).
Молекула укреплена в оболочке концом, несущим свободную
карбоксильную группу. Белок «А» расположен по всей поверх-
ности бактериальной клетки, он обладает высокой биологиче-
ской активностью, вызывает агглютинацию эритроцитов, яв-
ляется иммунодепрессантом, угнетает фагоцитоз, комплемент,
препятствует трансформации лимфоцитов.
У стрептококков группы «А» на поверхности клеток распо-
ложены ворсинки длиной около 50 нм, образованные так назы-
ваемым «М»-протеином. Каждая ворсинка состоит из двух спа-
ренных молекул «М»-белка, которые также связаны с муреином
оболочки своими терминальными карбоксильными группами
(рис. 10). Конечные участки молекул «М»-белка определяют его
способность склеивать клетки стрептококка друг с другом.
Клетки, снабженные ворсинками «М»-белка, способны прикреп-
29
ляться к клеткам эпителия. «М»-белок обладает антифагоцитар-
ной активностью. По своему строению он очень близок тропо-
миозину— регуляторному мышечному белку позвоночных. Воз-
можно «М»-белок определяет иммунологическую мимикрию
клеток стрептококка, поскольку против собственных белков
макроорганизм антител не вырабатывает.
Особенности строения оболочки микобактерий. Для мико-
бактерий, близких к ним форм и для некоторых актиномицетов
характерна усложненная структура оболочки. Все эти орга-
низмы являются грамположительными и относятся к фирмакут-
D-глуталлиновая
к-та
NH ,
C-(CH2)2-C0NH,,
I
с=о
мезо-ДАП
D-аланин
I
NH NH?
I I
Н-С-(СН2)3 — CH-CONH?
I
с=о
I
NH
I
Н-С-СЩ
I
СООн
Рис. 11. Строение муреина микобактерий.
ным. Лучше всего изуче-
ны оболочки Mycobacte-
rium tuberculosis и BCG,
непатогенного штамма
Mycobacterium bovis.
В микобактериальной
оболочке можно выделить
4 компонента:
1. Так называемый
скелет оболочки, образо-
ванный муреином, кова-
лентно связанным с мико-
латом арабиногалактана.
2. «Свободные липи-
ды», т. е. липиды, кото-
рые могут быть удалены
нейтральными раствори-
телями.
3. Пептиды, которые
могут быть удалены при
обработке оболочек про-
теазами. Сюда относится
частично амидированная
поли-Ь-глутаминовая кис-
лота.
4. Глюкан, присутст-
вующий в оболочке неко-
торых штаммов.
Муреин микобактерий относится к А-1 подтипу, но имеет
ряд особенностей (рис. 11). Во-первых, вместо обычной N-аце-
тилмурамовой кислоты здесь содержится N-гликолилмурамовая
кислота, во-вторых, свободные карбоксильные группы D-глута-
миновой и мезо-ДАП кислот амидированы, в-третьих, межпеп-
тидные связи могут быть двух типов: обычные —D-ала-мезо-ДАП
и необычные —мезо-ДАП-мезо-ДАП. Последний тип связи об-
наружен пока только у микобактерий. Гликолилмурамовая кис-
лота кроме микобактерий характерна для Nocardia и Micromo-
nospora.
30
Характерными компонентами оболочки микобактерий яв-
ляются миколовые кислоты, представляющие собой «-развет-
вленные p-гидроксикислоты с общей формулой
^-СН-СН-СООН
I ।
он r2
а-Субъединица обычно содержит 21—22 углеродных атома,
р включает ненасыщенные связи, циклопропановые кольца, ме-
тильные или метоксильные группы, кетогруппы или дополни-
тельные карбоксильные группы. У данного штамма обычно об-
наруживается от 2 до 5 различных миколовых кислот. Наличие
определенных миколовых кислот является систематическим при-
знаком, хотя их состав может более или менее сильно варьиро-
вать при изменении условий культуры. Иногда различают сле-
дующие миколовые кислоты: коринеформные — с 28—36 ато-
мами углерода, нокардиальные — с 40—60 атомами и микобак-
териальные— с 60—90 атомами углерода.
Длина молекулы миколовых кислот у Mycobacterium увели-
чивается при повышении температуры, присутствие в среде
углеводородов существенно влияет на их состав. Некоторые
сапрофитные микобактерии при их выращивании на мясопеп-
тонном агаре утрачивают миколовые кислоты, но накапливают
их, если растут на средах с парафинами.
Строение молекулы миколовой кислоты может быть весьма
сложным, например для Af. tuberculosis человеческого типа ха-
рактерна миколовая кислота следующего строения:
О ОН
СН3-(СН2)17-СН-С—(СН2)17-СН-СН-(СН2)19-с!н-СН-СООН.
I \ / I
сн3 СН2 (СН2)21
сн3
Миколовые кислоты придают клеточной поверхности гидро-
фобность. Клетки некоторых микобактерий почти совершенно
не смачиваются водой, и это имеет немаловажное значение.
Гидрофобность, с одной стороны, придает клетке устойчивость
к действию различных растворенных в воде токсических ве-
ществ, что особенно существенно для патогенных форм. С дру-
гой стороны, она затрудняет обмен клетки с окружающей средой
и замедляет ее рост. Поэтому в питательные среды для выра-
щивания туберкулезных микобактерий обычно добавляют по-
верхностно-активные вещества.
Миколовые кислоты играют решающую роль в определении
так называемой кислотоустойчивости клеток микобактерий. Ки-
слотоустойчивость заключается в способности клетки удержи-
вать краску при обработке кислотой. Метод соответствующей
31
окраски предполагает использование красок,- обладающих до-
статочным сродством к липидам. При использовании фуксина
и ряда других основных красителей в раствор добавляют фе-
нол, придающий краске гидрофобность. Некоторые красители,
например Виктория голубая В или Виктория R, не требуют
добавления фенола. Клетки теряют кислотоустойчивость после
обработки горячей разведенной НС1.
Кислотоустойчивость (иногда говорят кислотоупорность) —
важный диагностический признак. По современной' классифи-
кации бактерий кислотоустойчивость является родовым призна-
ком Mycobacterium, т. е. среди них не может быть некислото-
устойчивых форм, но с этим согласны не все исследователи.
У сапрофитных микобактерий наличие миколовых кислот
определяет их способность к использованию гидрофобных суб-
стратов, прежде всего парафинов нефти. Так, Mycobacterium
mucosum, распространенная в загрязненных нефтепродуктами
водах Арктики, способна использовать углеводороды нефти при
10° С. Среди миколовых кислот у нее доминируют Сз4:0, Сзвю,
С34:1, Сзб:г. Ненасыщенные кислоты, составляющие около 50%'
от всего количества миколовых кислот, остаются жидкими при
низких температурах и обеспечивают эластичность оболочки,
необходимую для солюбилизации и транспорта гидрофобного
субстрата. Таким образом, в данном случае синтез определен-
ных миколовых кислот определяет механизм биологически важ-
ного адаптационного процесса.
Кислотоустойчивость сапрофитных микобактерий изменяется
в зависимости от возраста культуры, состава питательной среды
и других факторов. Некоторые сапрофитные микобактерии те-
ряют кислотоустойчивость, если их выращивают на средах
с углеводами или мясопептонном агаре. Степень кислотоустой-
чивое™ повышается при выращивании культур на средах с па-
рафинами, маслами, углеводородами, что связано с увеличе-
нием в этих условиях содержания в оболочках миколовых кис-
лот.
В составе оболочки микобактерий миколовые кислоты могут
обнаруживаться как компоненты различных макромолекул. Как
было указано, важным элементом оболочки микобактерий явг
ляется миколат арабиногалактана. Арабиногалактан представ-
ляет собой сильно разветвленный полимер, образованный остат-
ками D-арабинозы и D-галактозы в отношении 5 :2. Терминаль-
ные ветви линейных олигосахаридов, состоящих из арабинозы,
определяют иммунные свойства этого полимера. Молекулярная
масса арабиногалактана BCG около 30 000. Молекула кова-
лентно связана фосфодиэфирной связью с С-6 атомом каждого
десятого остатка мурамовой кислоты муреина, поэтому иногда
говорят о существовании в оболочке микобактерий декамеров,
где и4-т = 8—10 и х~Н/=8—10.
32
МИК МИК МИК
I I I
(ара5, гал2)п - ара5, гал2- (ара5, гал2)т
I
О
О=Р—ОН
I
о
I
(AM—АГ)Х—AM—(АГ—АМ)У
I
L-ала
I
D-глу
I
мезо-DAP
I
D-ала
Один из 10 арабинозных остатков арабиногалактана эстери-
фицирован молекулой миколовой кислоты:
О
I I
он н
Арабиногалактан содержится также в оболочках С or у neb act е-
rium и Nocardia.
Гликолипидные компоненты извлекаются из оболочек мико-
бактерий, склонных к образованию клеточных тяжей, так назы-
ваемых «кордов», при росте на поверхности жидкой среды.
В состав этих соединений входит «корд-фактор», представляю-
щий собой 6,6’-димиколат трегалозы:
3 Б. В. Громов
33
«Корд-фактор» обладает высокой биологической активностью
и характерен для патогенных форм. Образование бактериями
«кордов» можно обнаружить в микроскопических препаратах
клеток, что имеет известное диагностическое значение.
10—15% массы оболочек микобактерий составляют пептиды,
не входящие в состав муреина и образованные обычными ами-
нокислотами. Они, видимо, ковалентно связаны с муреином и
могут быть разрушены протеолитическими ферментами. У виру-
лентных штаммов микобактерий в оболочке присутствует поли-
L-глутаминовая кислота, составляющая несколько процентов от
массы оболочки.
Оболочка микобактерий имеет толщину 20—40 нм и состоит
из 3 или более слоев, выявляемых на срезах клеток. Распреде-
ление различных компонентов оболочки в этих слоях не уста-
новлено, но поверхность клеток гидрофобна, т. е. богата липи-
дами.
Оболочка микобактерий обладает высокой биологической
активностью, в том числе адъювантной. Широко известен и
используется полный адъювант Freund’a, состоящий из убитых
клеток микобактерий (обычно BCG), добавленных к неполному
адъюванту. Последний представляет собой эмульсию минераль-
ного масла в воде, содержащей антиген. Добавление клеток
микобактерий значительно усиливает эффект адъюванта.
Введение животным клеток BCG в масляной эмульсии при-
дает им неспецифическую устойчивость к инфекции, в том числе
к заражению бактериями, неродственными микобактериям. Этот
эффект отчасти зависит от присутствия корд-фактора, подобной
активностью обладает и один корд-фактор. Клетки микобакте-
рий, а также корд-фактор обнаруживают также антиопухоле-
вую активность, что связано с цитотоксичностью последнего,
проявляющейся на уровне митохондрий.
§ 3. Оболочка грациликутных
Оболочка грамотрицательных бактерий — грациликутных
отличается структурной и функциональной сложностью. Именно
строение оболочки позволяет очертить группы форм, представ-
ляющих определенные прогрессивные пути эволюционного раз-
вития бактерий. Детали строения оболочки в различных группах
грациликутных могут варьировать, но общий план ее строения
сохраняется у таких, казалось бы, различных форм, как кишеч-
ные бактерии и цианобактерии. Изменение строения оболочки
в результате мутаций ограничено, так как мутанты с глубокими
изменениями оболочки, видимо, нежизнеспособны. Клетку гра-
циликутных помимо цитоплазматической окружает внешняя
мембрана, что является отличительной особенностью оболочки
этой группы бактерий. Между мембранами заключено пери-
4
плазматическое пространство, или периплазма, включающая
тонкий слой муреина (рис. 12, 13).
Основой внешней мембраны оболочки грациликутных, также
как цитоплазматической, служит липидный бислой. За счет при-
сутствия в ней сложного полимера — липополисахарида (ЛПС)
внешняя мембрана плотнее цитоплазматической и может быть
отделена при разделительном центрифугировании. Она обычно
выглядит более электронноплотной на срезах. При скалывании
замороженных клеток она часто не расщепляется, а если рас-
щепляется, то на репликах сколов ее структура выявляется
плохо. Текучесть внешней мембраны меньше, чем цитоплазма-
Рис. 12. Поверхностные структуры гра-
циликутных, выявляемые электронно-
микроскопическими методами [Sleyfr,
1978].
1 — на срезах; 2—4 — на репликах со сколов
замороженного материала: 2 — на поперечном
сколе, 3 — «выпуклая», т. е. обращенная
к внешней среде поверхность, 4 — «вогну-
тая», т. е. обращенная к цитоплазме по-
верхность; вм — внешняя мембрана; цм — ци-
топлазматическая мембрана; пп — периплаз-
матическое пространство; м — муреиновый
слой; ц — цитоплазма; s—белковый слой.
4
тической, видимо, тоже за счет присутствия липополисахарида.
Однако при температурах, приводящих к кристаллизации липи-
дов внешней мембраны, функции оболочки нарушаются. Для
нормальной жизнедеятельности бактерий необходимо, чтобы
липиды внешней мембраны находились преимущественно в жид-
костно-кристаллическом состоянии. Пределы роста некоторых
штаммов Е. coll определяются именно влиянием температуры
на состояние липидов внешней мембраны.
Внешняя мембрана состоит из фосфолипидов, липополисаха-
рида (ЛПС), липопротеина (ЛП) и белков. В мембране Е. coli
на 1 мкм2 поверхности приходится порядка 105 молекул ЛПС,
106 — ЛП, 105 — белков, 106—фосфолипидов, при этом количе-
ство остатков жирных кислот ЛПС и фосфолипидов примерно
одинаково. ЛПС занимает около 30—40% поверхности мем-
браны и локализован только во внешнем ее лепестке, тогда как
3* 35
фосфолипиды, видимо, находятся только во внутреннем лепестке
.мембраны.
Константа латеральной диффузии ЛПС на 5 порядков ниже,
чем фосфолипидов, однако подвижность фосфолипидов внут-
реннего лепестка мембраны ниже, чем у фосфолипидов цито-
плазматической мембраны. Это определяется взаимодействием
фосфолипидов с липидной частью молекулы ЛП, входящего
также во внутренний лепесток внешней мембраны, а своей бел-
ковой частью фиксированного на муреиновом слое- оболочки.
Рис. 13. Клетка Vampirovibrio — типичной
грациликутной бактерии на срезе. Ув.
Х60 ООО.
во — вырост оболочки; м ~~ мезосома. Остальные
обозначения как на рис. 12.
Таким образом, для вне-
шней мембраны харак-
терна более жесткая и
упорядоченная структура,
чем для цитоплазматиче-
ской.
Внешняя мембрана,
являясь первым барьером
между клеткой и средой,
препятствует проникнове-
нию в клетку крупных
молекул и тем самым
определяет устойчивость
бактерий ко многим воз-
действиям, в том числе к
антибиотикам, в частнос-
ти актиномицину Д, фер-
ментам, например лизо-
циму, красителям, детер-
гентам, жирным кисло-
там. Целостность внеш-
ней мембраны может
быть нарушена при воз-
действии ЭДТА-хелати-
рующего агента, «вытяги-
вающего» из мембраны двухвалентные катионы, необходимые
для ее стабильности. Целостность мембраны нарушается и при
холодовом осмотическом шоке, т. е. при перенесении бактерий
при охлаждении в раствор меньшей ионной силы. При низкой
температуре замерзают липиды мембраны, она теряет эластич-
ность и разрушается под влиянием внутреннего давления.
ЛПС расположен во внешнем лепестке мембраны и обращен
к окружающей среде полисахаридной частью молекулы. Особен-
ности строения этой части молекулы ЛПС в значительной сте-
пени определяют индивидуальность данной бактерии в ее взаи-
модействиях с иммунной системой макроорганизма, вызывая
выработку специфических антител. ЛПС определяют как сома-
тический бактериальный антиген или, что более принято, как
36
0-антиген (от нем. Ohne Hauch — не образующие налета на
агаре, неподвижные, не имеющие жгутиков и соответственно их
Н-антигена, у подвижных форм маскирующего О-антиген). Эта
терминология первоначально относилась к бактериям рода Pro-
teus, у которых гигантские клетки — швермеры, снабженные
сотнями жгутиков, легко распространяются по поверхности
среды, образуя налет — Hauch. О-антиген имеют все грацили-
кутные. В деталях строения ЛПС у разных бактерий может
значительно различаться, однако общий план его строения
у всех бактерий одинаков. Лучше всего изучен ЛПС бактерий
рода Salmonella; его обычно принимают за стандарт, с которым
сравнивают ЛПС других бактерий.
Рис. 14. Структура молекулы липополисахарида Salmonella [Luderitz е. а.,
1982].
1, 2 — моносахариды: О-цепей (1) и внешней части ядра (2); 3 — гептозы ядра; 4 —
КДО; 5 — глюкоз а мин липида А; 6 — 4-амино-4-дезокси-Ь-арабиноза; 7 — фосфат; 8 —
этаиоламин; 9 — жирная кислота.
Липополисахарид сальмонелл состоит из липида А и гетеро-
полисахаридной части молекулы, в которой выделяют области
ядра и О-епецифические цепи, различающиеся как структурно,
так и функционально (рис. 14). О-специфические цепи ЛПС
образованы повторяющимися идентичными олигосахаридными
последовательностями. Только в редких случаях последователь-
ности представляют собой олигомер сахара одного типа, напри-
мер у Е. coli 09 это маннан, обычно же это — гетерополисаха-
рид. Характер строения О-специфических цепей определяет се-
ротип данного штамма бактерий. Каждому серотипу соответ-
ствует ЛПС с уникальной структурой О-цепей, к которым при
иммунизации образуются специфические антитела. Среди Sal-
monella известно более 1200 типов О-антигена.
У Salmonella typhimurium серогруппы «В» О-цепи образо-
ваны пентасахаридными остатками, основные цепи которых по-
строены маннозой, рамнозой и галактозой, а ветви — ацетили-
рованным остатком абеквозы и остатком глюкозы:
—Абек—Ац Глюк
I I
—Манн—Рамн—Г ала—
Не все участки молекулы полисахарида имеют одинаковое
значение в определении его антигенной специфичности. Остатки
37
некоторых сахаров играют иммунодоминантную роль, в частно-
сти у кишечных бактерий, это 3,6-дезоксигексозы, к которым
относится уже упомянутая абеквоза, представляющая собой
3,6-дезокси-В-галактозу. У представителей других серогрупп
могут присутствовать: паратоза — 3,6-дидезокси-В-глюкоза; ти-
велоза — 3,6-дидезокси-В-манноза; колитоза — 3,6-дидезокси-Ь-
галактоза и др.
Остатки сахаров, входящих в О-специфические цепи, иногда
ацетилированы. У представителей некоторых родов кишечных
бактерий в состав О-цепей входят гексозамины и уроновые кис-
лоты, у других грамотрицательных бактерий в образовании О-
специфических цепей кроме разнообразных сахаров и их произ-
водных участвуют многоатомные спирты, органические и амино-
кислоты.
Состав основной полисахаридной последовательности О-цепи
у данной бактерии весьма стабилен, но такие модификаторы,
как ацетильные группы, остатки сахаров, образующие ветви,
присутствуя не у всех молекул полисахарида, определяют ми-
крогетерогенность ЛПС даже у одной бактериальной клетки.
Число олигосахаридных последовательностей в разных моле-
кулах ЛПС может значительно варьировать. У Salmonella typhi-
murium некоторые цепи состоят из 30—35 повторов, тогда как
некоторые молекулы ЛПС совсем лишены О-цепей. Длина О-це-
пей зависит от свойств штамма и условий культивирования.
О-антигенные цепи выступают над поверхностью внешней
мембраны бактериальной клетки, образуя ворсинки до 150 нм
длиной.
Синтез О-антигенных цепей происходит независимо от син-
теза остальной части молекулы ЛПС и определяется активно-
стью комплекса специфических ферментов. В качестве перенос-
чика гликозильных остатков на уровне мембраны выступает
полиизопреноид. При синтезе ЛПС, так же как и других компо-
нентов оболочки, соблюдается принцип «один фермент — одна
связь», т. е. структура цепи определяется специфичностью фер-
ментов, участвующих в ее синтезе, при котором каждый фермент
ответствен за синтез определенной связи между двумя мономе-
рами. Примером реализации этого принципа может служить
механизм изменения структуры О-антигенного олигосахарида
сальмонелл группы Е при их лизогенизации умеренным фагом.
Структура полисахарида группы Ег переходит в структуру по-
лисахарида группы Е2 под влиянием фага в15, привносящего
в геном бактерии информацию, необходимую для синтеза инги-
битора а-1,6-полимеразы хозяина и, синтеза новой полимеразы,
катализирующей образование р-1,6-связи и репрессора фермента
хозяина, катализирующего ацетилирование полисахарида. Даль-
нейшее превращение полисахарида группы Е2 в полисахарид
группы Е3 под действием фага в34 — результат приобретения
38
микроорганизмом ферментов, катализирующих образование по-
липренилмонофосфатглюкозы и глюкозилирование полимера.
Гены, определяющие синтез гликозилтрансфераз, ответствен-
ных за сборку определенной углеводной цепи, локализованы
в одном и том же участке хромосомы. Это rfb-гены для синтеза
последовательности ядра, и rfa — для синтеза повторяющегося
звена О-антигенной цепи.
Ферменты, катализирующие синтез углеводной цепи ЛПС,
локализованы в цитоплазматической мембране, и образующиеся
полимеры переносятся во внешнюю мембрану через специализи-
рованные участки оболочки. У клетки Salmonella таких участ-
ков около 200, а у Е. coll почему-то меньше— 10—50.
Присутствие О-цепей на поверхности бактерии делает ее
относительно устойчивой к захвату фагоцитами, хотя эта устой-
чивость теряется в присутствии специфических для О-цепей
антител. Поэтому антигенное разнообразие, обусловленное раз-
личиями структуры О-цепей, дает патогенным бактериям опре-
деленные селективные преимущества.
О-антигенные цепи не только очень разнообразны по своему
строению, но и легко изменяются в результате фаговой конвер-
сии или мутаций. В результате мутаций изменения в О-специ-
фических цепях происходят гораздо чаще, чем в базальной
части молекулы полисахарида. Это тоже можно рассматривать
как полезное приспособление патогенных бактерий, но уже на
уровне генома. При мутациях появляются клетки, не реагирую-
щие с антителами, специфичными к исходным бактериям.
Ядро ЛПС обладает более стабильной структурой, чем О-
цепи. У всех Salmonella его строение одинаково. В ядре иногда
выделяют внешнюю и внутреннюю части (см. рис. 14). Внеш-
няя часть ядра ЛПС Salmonella образована цепочкой гексоз,
D-глюкозой и D-галактозой, N-ацетилглюкозамин и галактоза
образуют ветви:
АГ Г ал
I I
О-цепи—Г люк —Г ал—Глюк—
Внутренняя часть ядра состоит из специфических для ЛПС
сахаров гептоз; именно из Ь-глицеро-О-манно-гептозы (I), и
2-кето-3-дезокси-Э-манно-октоната (КДО) (II):
39
Гептозы и КДО образуют трисахариды. К гептозам присоеди-
нены фосфатные остатки, а к дистальному остатку гептозы че-
рез два фосфатных остатка — этаноламин, этаноламин присое-
динен и к третьему остатку КДО:
ф—о—сн2—сн2—nh2
I
Гепт—Ф Ф КДО-Ф—O-CH2-CH2-NH2
I I I
— Гепт —Гепт — КДО —КДО — липидА
I
Ф
Ядро ЛПС несет отрицательные заряды, видимо, имеющие су-
щественное функциональное значение, так как они могут спо-
собствовать интеграции ЛПС с другими компонентами внешней
мембраны через двухвалентные катионы.
У других кишечных бактерий наблюдаются некоторые моди-
фикации описанной структуры ядра ЛПС, однако его основа,
образованная трисахаридами, состоящими из гептоз и КДО,
обычно сохраняется. В ЛПС других грациликутных гептозы и
КДО в составе ядра ЛПС могут не обнаруживаться, зато здесь
могут присутствовать различные другие вещества, в том числе
уроновые и аминокислоты.
Бактерии, синтезирующие полную структуру ЛПС, имеют
S-фенотип (от Smooth — гладкий) и на агаре образуют колонии
с ровной блестящей слизистой поверхностью. Легко получить
мутанты, образующие колонии с матовой неровной поверхно-
стью, — R-мутанты (от Rough — неровный). Хорошо изучены
R-мутанты кишечных бактерий. Они синтезируют полное или
неполное ядро ЛПС, соединенное с липидом А, но у них отсут-
ствуют О-специфические цепи. Ra-мутанты образуют нормаль-
ное ядро ЛПС, группа мутантов от Rb до Re имеют дефекты
в ядре ЛПС, наиболее редуцировано ядро у Re-мутантов, у ко-
торых оно состоит только из КДО и липида А. Очевидно, что
молекулы такого ЛПС значительно меньше нормальных, и Re-
мутанты содержат в несколько раз больше молекул ЛПС, чем
бактерии дикого типа. Во внешней мембране таких мутантов
также больше фосфолипидов, причем они обнаруживаются и
во внешнем лепестке мембраны, но меньше белковых молекул
по сравнению с их количеством в мембране бактерий дикого
типа. При криоскалывании таких клеток внешняя мембрана
часто разделяется на два лепестка. Бактерии с еще более реду-
цированным ЛПС нежизнеспособны.
Внешняя мембрана может быть реконструирована in vitro.
При этом образуются пузырьки, мембраны которых структурно
и функционально сходны с внешней мембраной бактериальной
клетки. Для реконструкции необходимы белки, фосфолипиды,
ионы Mg2+ и обязательно молекулы ЛПС.
40
Бактерии с нарушенной структурой ЛПС, особенно в обла-
сти ядра, являются плейотропными мутантами с многочислен-
ными дефектами внешней мембраны. Наблюдаются изменения
ее проницаемости, например выход в среду периплазматических
белков, т. е. они являются Leaky-мутантами «с течью». У таких
бактерий изменяется чувствительность к фагам и колицинам и
нарушается адсорбция антител из-за потери соответствующих
рецепторов, а также утрачивается способность к конъюгации.
Потеря рецепторных свойств мембраной связана с тем, что
именно ЛПС служит рецептором для многих бактериофагов, но,
кроме того, нарушения в ЛПС приводят к потере ряда рецеп-
торных белков внешней мембраны, в частности рецептора
фага К.
R-мутанты хорошо растут в лабораторных условиях, нередко
даже вытесняя S-форму, т. е. имеют селективное преимущество.
Однако R-мутанты обычно менее приспособлены к существова-
нию в естественной среде, у них повышена чувствительность
к различным токсическим агентам, они легко фагоцитируются
и теряют вирулентность. Из этого правила, правда, имеются
исключения. Так, ЛПС в R-форме содержат природные виру-
лентные штаммы возбудителя чумы Yersinia pestis. У этой бак-
терии имеется капсула, полисахарид которой, видимо, выпол-
няет функции О-антигенных цепей других кишечных бактерий.
В связи с этим интересно привести мнение о происхождении
в процессе эволюции О-аитигенных цепей ЛПС от капсульного
полисахарида.
Синтез ядра ЛПС происходит независимо от синтеза О-спе-
цифических цепей. При синтезе ядра мембранным носителем
выступает липид А, который затем остается тз составе ЛПС.
Липид A Salmonella представляет собой фосфолипид, обра-
зованный центральным дисахаридом («позвоночник» липида),
состоящим из двух D-глюкозаминовых остатков, соединенных
р-1,6 связью:
Il II
KDO ОО Р С=0
I I
CHZ сн?
н-С-О-П H-C-0-R
I . I
(снДо (сн2)ю
сн5 сн3
41
Оба глюкозамина фосфорилированы. В молекуле ЛПС терми-
нальный остаток КДО ядра полисахарида присоединен к С-3
второго глюкозамина (левый глюкозамин). Фосфорилированные
глюкозамины составляют полярную головку липида А, которая
ацилирована жирнокислотными остатками (R).
У Salmonella молекула липида А содержит 7 молекул жир-
ных кислот, в том числе 4 молекулы D-3-гидрокситетрадекано-
вой кислоты (3—ОН—14:0; р-гидроксимиристиновая) и по од-
ной молекуле додекановой (12:0, лауриновая), тетрадекановой
(14:0, миристиновая), гексадекановой (16:0, пальмитиновая).
Кроме того, в состав липида А входит 2-гидрокситетрадекановая
(2—ОН—14:0, а-гидроксимиристиновая) и 3-гидроксидодекано-
вая (3—ОН—12:0, р-гидроксилауриновая).
Две молекулы р-гидроксимиристиновой кислоты связаны
амидной связью с аминогруппами дисахарида, две другие —
эфирной с его гидроксилами. Остальные молекулы жирных кис-
лот присоединены эфирной связью через гидрокислы дисахарида
или гидроксимиристиновой кислоты.
Наблюдается некоторая гетерогенность липида А в молеку-
лах ЛПС одного организма за счет наличия или отсутствия
аминосоединений, присоединенных к некоторым фосфатным груп-
пам. Примерно к 50% молекул липида A Salmonella у фосфат-
ной группы первого глюкозамина (правый глюкозамин) присое-
динен фосфорилэтаноламин, у части молекул фосфатный остаток
второго глюкозамина соединен с 4-амино-4-дезокси-Ь-арабино-
зой. В этих случаях аминогруппы заместителей остаются сво-
бодными, т. е. изменяется заряд липида А. Степень замещения
фосфатных групп зависит от условий среды и может иметь для
бактерий адаптивное значение.
Выращивание кишечных бактерий при относительно низкой
температуре (например 12° С) приводит к появлению в составе
липида А ненасыщенных жирных кислот, что, очевидно, повы-
шает точку замерзания внешней мембраны и увеличивает ее
текучесть.
Приведенная схема строения липида А справедлива не
только для кишечных бактерий, но и для многих других граци-
ликутных. Липид сходной структуры имеют, например, некото-
рые виды Chromobacterium, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas.
В некоторых случаях через фосфатные группы к дисахариду
присоединяются D-глюкозамины, D-арабиноза. Некоторые бак-
терии, однако, обладают существенно иным липидом А. Так,
в липиде A Rhodopseudomonas viridis и Rhodopseudomonas ра-
lustris отсутствует глюкозамин и фосфат, а его основу образует
42
производное глюкозамина 2,3-диамино-2,3-дидезокси-П-глюкоза:
-о
сн2
NH NH
I I
0=0 с=о
I I
сн2 сн2
I I
н — с — он н— с — он
I I
(СНз^о (-нг)ю
I I
сн з сн3
У аэробных ползающих бактерий, в том числе Myxococcus,
Cystobacter, Cytophaga, Flexibacter, в ЛПС гептоза отсутствует
или содержится в малом количестве, встречается необычный
сахар З-О-метилксилоза, в составе липида А преобладают нечет-
ные изожирные кислоты с числом атомов 17 и более.
Как уже было отмечено, синтез ЛПС происходит на уровне
цитоплазматической мембраны, молекулы вновь синтезирован-
ного ЛПС перемещаются во внешнюю мембрану в местах сое-
динения этих мембран. В процессе синтеза О-специфические
цепи, очевидно, должны быть направлены внутрь цитоплазмы.
При внедрении ЛПС во внешнюю мембрану происходит «флип-
флоп» перенос. При этом транслоцироваться могут только цепи,
включающие три молекулы КДО. Транслоцированные молекулы
ЛПС перемещаются от мест контакта мембран и распреде-
ляются по всей поверхности внешней мембраны. При этом му-
тантные R-молекулы более подвижны, чем S-молекулы ЛПС,
частично фиксированные в определенных участках мембраны.
Липид А, входящий в состав полноценных, не мутантных
молекул ЛПС, не обладает антигенностью и не определяет
образования специфических антител. Однако в реакциях с R-
мутантами или при использовании очищенных препаратов
липида А антитела к нему образуются. Очевидно, что эти анти-
тела не обладают ни штаммовой, ни даже видовой специфич-
ностью. Антитела к липиду А наряду с антителами к О-специ-
фическим цепям обнаруживаются в сыворотке животных и
человека, т. е. их образование происходит в естественных усло-
виях.
ЛПС большинства бактерий токсичен для животного орга-
низма и обозначается как эндотоксин, поскольку освобождается
43
из клеток только после их разрушения. Токсичность ЛПС опре-
деляется липидом А, ЛПС R-мутантов столь же токсичен, как
и ЛПС диких бактерий данного типа. В организме животного
ЛПС вызывает эндотоксическую реакцию, лихорадку, лейкоци-
тоз, токсический шок, а при высоких дозах ЛПС — смерть.
ЛПС некоторых бактерий, например упомянутых видов Rho-
dopseudomonas, имеющих необычную структуру липида А, не
обладает токсичностью.
Существуют ферменты, разрушающие ЛПС. Так, частицы
некоторых фагов содержат фермент с гликозидазной актив-
ностью, разрушающий О-антигенные цепи, которые служат ре-
цепторами для этих фагов. Такие ферменты обнаружены у не-
которых бактерий, миксомицетов.-
ЛПС взаимодействует с системой комплемента, оказывает
пирогенный эффект, т. е. вызывает повышение температуры
тела животных, стимулирует внутрисосудистое свертывание
крови. В дозах, составляющих сотые доли микрограмма, он вы-
зывает гибель куриных эмбрионов, что позволило использовать
этот эффект в качестве биотеста на эндотоксин.
Однако ЛПС не только токсичен, он вызывает неспецифи<
ческое повышение резистентности организма, оказывает адъю-
вантный эффект, стимулирует выработку интерферона, обладает
антиопухолевой активностью, обнаруживает митогенную актив-
ность в отношении лимфоцитов.
Имеются отдельные наблюдения, свидетельствующие о био-
логической активности бактериальных ЛПС в отношении орга-
низма растения. Так, наблюдали повышение резистентности
растений табака к бактериальной инфекции под воздействием
ЛПС фитопатогенных псевдомонад или кишечных бактерий.
Этот эффект ЛПС связан только с комплексом ядро — липидА
(О-антигенные цепи не существенны).
О-антигенные цепи ЛПС клубеньковых бактерий, очевидно,
участвуют в узнавании и первых этапах взаимодействия бакте-
риальной клетки с поверхностью корневого волоска соответст-
вующего растения.
Во внешней мембране бактерий кишечной группы содер-
жится энтеробактериальный общий антиген (ОА), представляю-
щий собой гетерополимер, образованный N-ацетилированными
аминосахарами. Важную иммунодетерминантную роль играет
N-маннозаминуроновая кислота (МУК), которая также опреде-
ляет отрицательный заряд антигена. Частично МУК эстерифи-
цирована пальмитиновой кислотой, что придает части молекулы
гидрофобные свойства. У некоторых штаммов ОА связан с яд-
ром ЛПС, заменяя в этих молекулах ЛПС О-антигенные цепи.
ОА содержат штаммы всех родов бактерий, относящихся к Еп-
terobacteriaceae, но не другие бактерии. Штаммы Enterobacte-
riaceae, лишенные ОА, видимо, являются мутантами. Сыворотка
к ОА реагирует со всеми бактериями, имеющими его.
44
Фосфолипидный компонент внешней мембраны не обнаружи-
вает каких-либо особенностей. Здесь присутствуют фосфатидил-
этаноламин (ФЭ) и фосфатидилглицерин (ФГ), вообще харак-
терные для бактериальных мембран. Во внешней мембране
Е. coll содержится больше ФЭ и меньше ФГ, чем в цитоплазма-
тической мембране.
Липопротеин — один из основных компонентов внешней мем-
браны. Липопротеин представителей семейства Enterobacteria-
сеае был подробно изучен американским ученым Брауном, поэ-
тому в литературе его нередко именуют липопротеином Брауна.
Во внешней мембране бактериальная клетка содержит до
1 • 106 молекул липопротеина, таким образом, белок липопро-
теина представлен в клетке относительно большим числом
молекул.
Липопротеин имеет молекулярную массу около 7000. Вни-
мание исследователей обращает на себя достаточно высокая
стабильность иРНК, определяющей синтез белковой части липо-
протеина. Время ее жизни 11,5 мин (время жизни иРНК цито-
плазматических белков около 2 мин). Белок липопротеина
Брауна относительно небольшой и состоит всего из 58 аминокис-
лот, его первичная структура полностью расшифрована. В этом
белке с небольшими изменениями повторяется последователь-
ность из 15 аминокислот. Это позволяет предположить, что
в эволюции происходила дупликация гена, первоначально коди-
ровавшего белок, состоящий всего из 15 аминокислот. Молекула
белка образует правильную а-спираль, один оборот которой
образован 3,6 аминокислотными остатками. Каждый третий,
затем четвертый, затем опять третий и т. д. аминокислотные
остатки представлены гидрофобными аминокислотами, в резуль-
тате чего все гидрофобные аминокислоты расположены с одной
стороны молекулы.
Аминогруппа N-терминального лизина каждой третьей моле-
кулы липопротеина соединена с карбоксильной группой ДАП
муреина, причем с липопротеином связана одна из 10—12 ДАП,
входящих в состав муреина.
К С-терминальной аминокислоте липопротеина — глицерин-
цистеину (тиаминопропионовая кислота) присоединены через
эфирные связи две жирные кислоты и одна — через амидную
связь. У Е. coli жирные кислоты, присоединенные эфирными свя-
зями, аналогичны жирным кислотам, входящим в состав фосфо-
липидов, тогда как около 65% жирных кислот, присоединенных
амидными связями, составляет пальмитиновая, а остальные —
мононенасыщенные жирные кислоты.
Получены lpo-мутанты Е. coll, лишенные липопротеина. Они
выделяют в окружающую среду периплазматические белки и
обладают повышенной чувствительностью ко многим токсиче-
ским агентам, в том числе к ЭДТА. При делении таких мутан-
тов цитоплазматическая мембрана и муреиновый слой нор-
45
мально функционируют, образуя перетяжку между дочерними
клетками, по внешняя мембрана в местах образования пере-
тяжки не следует за муреиновым слоем и образует обращенные
наружу пузыри. Таким образом, лишенные липопротеина му-
танты жизнеспособны, но у них нарушены функции внешней
мембраны.
Белки основы (major) присутствуют во внешней мембране
грациликутных в количестве более 100 000 молекул на клетку,
что составляет около 80% белка внешней мембраны. У Е. coll
имеется порядка 10 различных белков основы, однако у данной
клетки одновременно может быть 2—3, но не более 5 разных
белков, а иногда присутствуют молекулы лишь одного белка.
Некоторые из упомянутых 10 белков вообще несовместимы, т. е.
не могут быть представлены в мембране одной и той же клетки.
Молекулярная масса различных белков основы 29 000—50 000,
их молекулы содержат чередующиеся гидрофильные и гидро-
фобные участки.
Одна из функций этих белков — формирование в мембране
гидрофильных пор, через которые осуществляется диффузия
молекул с массой до 600, иногда и несколько большей, но не
более 900. Это означает, что через поры могут проходить са-
хара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды, но
не тетрасахариды и пентапептиды. Через обычные поры катионы
проходят в 2—4 раза эффективнее, чем анионы, что, видимо,
зависит от наличия заряда у начала поры. Белки, образующие
гидрофильные поры во внешней мембране, называют также по-
ринами. Необходимо иметь в виду, что не все белки основы
являются поринами. Поры, образованные разными поринами,
обладают различной проницаемостью, но транспорт, обеспени-
ваемый ими, неспецифичен.
Различные штаммы Е. coll обладают разными поринами:
Е. coli В обычно содержит один порин Omp F, Е. Coli К 12—
Отр F и Omp С.
Молекулы порина образуют тримеры, пронизывающие толщу
мембраны. Фиксирование их в определенном порядке на муреи-
новом слое приводит к образованию гексагональной сетки с рас-
стоянием между центрами тримеров 7,7 нм. В результате полу-
чается относительно стабильная структура — матрикс мембраны,
поэтому эти порины относят к так называемым белкам мат-
рикса. Они связаны с муреином нековалентно, около 60% по-
верхности муреинового слоя покрыто белками матрикса. Сет-
чатая белковая структура может быть выявлена при обработке
клеток 2%-ным раствором додецилсульфата натрия, растворяю-
щего все остальные компоненты мембраны. При 70° С в растворе
додецилсульфата происходит отделение поринов от муреина без
нарушения структуры белка. Белковая сетка на поверхности
муреиновых мешочков может быть воспроизведена in vitro, но
только при наличии в системе липопротеина. Связь белков мат-
46
скрученными молеку-
Рис. 15. Гипотетическая мо-
дель организации поры внеш-
ней мембраны [Rienzo е. а.,
1978].
к — канал поры; лп — липопротеин;
п — порин; пг — пептидогликан
(муреин).
рикса с муреином значительно ослабевает у мутантов, лишен-
ных липопротеина, а также при разрушении липопротеина трип-
сином. Поэтому считают, что соединение поринов с муреином
осуществляется при участии липопротеина.
Гипотетическая схема организации поры и связи поринов
с липопротеином и муреином приведена на рис. 15. В соответ-
ствии с этой схемой три молекулы порина, образующие (3-струк-
туру, окружают водную пору диаметром 1,5—2 нм. Каждая мо-
лекула порина стабилизирована тремя
лами липопротеина, из которых од-
на ковалентно соединена с муреи-
ном.
Прочность оболочки грациликут-
ных и форма их клетки определя-
ются не только муреином, но и бел-
ковым матриксом внешней мембра-
ны. Если растворить лизоцимом
слой муреина, остается белковая
сетка, сохраняющая размеры и
форму клетки. Однако и мутанты,
совершенно лишенные белков мат-
рикса, сохраняют нормальную фор-
му.
У Е. coli К 12 сумма матрикс-
ных белков Omp F и Omp С обычно
остается постоянной, но их относи-
тельное содержание варьирует в за-
висимости от условий. Например,
в средах с высоким осмотическим
давлением образуется преимущественно белок Omp С. Инте-
ресно, что регуляция синтеза этих белков осуществляется
на уровне транскрипции, а в роли выключателя выступает ги-
потетический осмосенсор, расположенный, видимо, в поверх-
ностных структурах клетки. Регуляторные механизмы клетки
позволяют поддерживать содержание белков во внешней мемб-
ране на определенном уровне, несмотря на снижение количества
или исчезновение отдельных из них в результате мутаций.
Если Е. coll лизогенизируется фагом РА-2, белки Omp F и
Omp С перестают синтезироваться и вместо них образуется по-
рин, обозначаемый как белок 2. Угнетение синтеза поринов на-
блюдается также под воздействием некоторых R-плазмид.
Структура белка 2 закодирована в вирусном геноме, так же как
структура репрессора, выключающего синтез обычных поринов.
Белок 2 в отличие от них не служит рецептором для частиц
фага РА-2, таким образом, описанный механизм определяет им-
мунность бактерий к заражению гомологичным вирусом.
Порин Lam В синтезируется клеткой только в присутствии
индуктора — мальтозы и подобно другим поринам определяет
47
диффузию через мембрану мелких молекул, но, кроме того, спе-
цифически облегчает транспорт мальтозы и мальтодекстринов
с молекулярной массой более 600. При этом он кооперируется
с периплазматическим белком, связывающим мальтозу. Воз-
можно, последний локализуется у основания поры. Наряду
с Lam В в присутствии мальтозы индуцируется синтез 4 других
белков, участвующих в ее транспорте. Клетки, содержащие бе-
лок Lam В, при невысоких концентрациях мальтозы в среде
поглощают ее в 1200—500 раз интенсивнее, чем неадаптирован-
ные клетки. Однако мутанты, неспособные к синтезу Lam В,
тоже могут расти на мальтозе, так как она проникает и через
другие поры, однако совсем не растут за счет мальтодекстринов.
Белок Lam В тоже фиксирован на муреине, хотя и слабее, чем
Omp F и Omp С. Он является рецептором для ряда бактерио-
фагов, в том числе и бактериофага %. Как уже упоминалось,
включение в мембрану этого белка происходит только в при-
сутствии липопротеина, lpo-мутанты не содержат в мембране
Lam В и не заражаются бактериофагом X.
У мутантов, потерявших порины Omp F и Omp С, количе-
ство фосфолипидов относительно белка возрастает в 2—3 раза,
но количество ЛПС и липопротеина остается прежним.
Порины служат рецепторами для вирусов и колиципов. По-
рин Omp F — для фагов Т-2, TP-1, Tula и колицинов А, Е-2,
Е-3, К, L, N, S; порин Omp С — для фагов РА-2, Tulb, Т-4,
Mai, 434. Белок 2 — для колицинов Е-2 и Е-3 (но не для гомо-
логичного фага).
Синтез протеина Е — порина индуцируется одновременно
с синтезом щелочной фосфотазы при недостатке фосфора
в среде. Этот белок, вероятно, связан с транспортом фосфора,
он служит рецептором для фагов ТС-23, ТС-45, колицинов Е-2
и Е-3.
Omp А — белок основы не является порином, но относится
к белкам матрикса и играет весьма существенную роль в стаби-
лизации структуры внешней мембраны. Он является рецептором
для нескольких фагов и колицинов и, кроме того, для F-фимб-
рий, т. е. определяет реципиентные возможности клетки. Omp А
связан с муреином и так же, как порины, ассоциирован с липо-
протеином.
Мутанты, потерявшие Omp-порины, приобретают устойчи-
вость к соответствующим фагам и колицинам, а также к ионам
тяжелых металлов, например Си2+. Они могут быть селекциони-
рованы именно в средах с ионами меди, что связано со сниже-
нием проницаемости внешней мембраны. При выращивании на
богатых средах мутанты фенотипически неотличимы от форм
дикого типа, однако не растут или растут очень плохо в средах
с низкими концентрациями глюкозы, метионина, лейцина, гисти-
дина и ряда других субстратов. Для роста лишенных поринов
мутантов концентрации глюкозы или лактозы должны быть не
48
меньше 0,2 и 1% соответственно. Таким образом, транспорт
веществ через поры, образованные поринами, имеет решающее
значение для бактерий, обитающих в средах с низкими концен-
трациями пищевых субстратов, а при высоких концентрациях
оказываются эффективными другие системы транспорта через
внешнюю мембрану. Очевидно, что порины особенно важны для
бактерий, обитающих в естественных средах, и не столь суще-
ственны для бактерий, культивируемых в лаборатории.
Различные представители семейства Enterobacteriaceae обна-
руживают серологическое родство белков основы внешней мем-
браны, что свидетельствует о значительном консерватизме соот-
ветствующих генов. Все же порины обнаруживают значительную
изменчивость даже у близко родственных форм, тогда как белок
Отр А очень консервативен и почти не различается у кишеч-
ных бактерий, а его первичная структура оказывается почти
сходной у Е. coli., Vibrio parahaemolyticus, Pasteurella multocida,
Pseudomonas fluorescens и ряда других бактерий. Как было от-
мечено выше, этот белок имеет особое значение для стабилиза-
ции структуры внешней мембраны и, видимо, поэтому его строе-
ние не может существенно изменяться.
Минорные белки внешней мембраны составляют вторую
группу белков, наряду с белками основы определяющих ее свой-
ства. Во внешней мембране Е. coli К 12 содержится около
50 различных белков, которые так же, как и белки основы, не-
сут транспортные и рецепторные функции. Их обозначают как
минорные, хотя число их молекул в мембране иногда значи-
тельно.
К минорным белкам Е. coli относят белок, рецептирующий
и транспортирующий витамин В12. Одновременно он является
рецептором фага BF 23 и колицина Е. На поверхности клетки
присутствует обычно 200—250 таких рецепторов.
Транспорт нуклеозидов через внешнюю мембрану зависит от
белка tsx, значение которого возрастает при недостатке нуклео-
зидов. Они могут проникать в клетку и иным путем, например
через поры, образованные поринами, но специфический транс-
порт более эффективен. Между различными нуклеозидами не
наблюдается конкуренции при транспорте, что свидетельствует
о том, что белок tsx, видимо, также образует поры. Он служит
рецептором фага Т-6 и колицина К.
Белки внешней мембраны имеют важное значение в процес-
сах транспорта в клетку железосодержащих соединений. Железо
необходимо бактериям, как и любым живым организмам, однако
в нейтральных или щелочных средах минеральные формы же-
леза находятся в нерастворимом состоянии, бактериям же до-
ступно только железо, входящее в состав органоминеральных
комплексов. Оно недоступно также большинству бактерий, по-
падающих в организм человека или животного, так как прочно
4 Б. В. Громов
49
связано специальными белками хозяина — это прежде всего
трансферрин крови и лактоферрин молока и других жидкостей
организма. Кональбумин связывает железо, находящееся в белке
куриного яйца. Все эти белки являются факторами неспецифи-
ческого иммунитета и определяют так называемый «пищевой им-
мунитет». Многие свободно живущие бактерии, и особенно пара-
зитические и симбиотические, выработали специальные меха-
низмы, обеспечивающие их железом.
Е. coli К 12 обладает тремя специфическими системами для
транспорта железа, и во всех случаях центральную роль в транс-
порте играют белки внешней мембраны.
Система транспорта Fe-цитрата индуцируется в присутствии
цитрата, при этом во внешней мембране появляется новый белок
Fee А, рецептирующий цитрат Fe. Более эффективными яв-
ляются системы, которые включают синтезируемые микроорга-
низмами соединения, хелатирующие железо. Это прежде всего
сидерофоры — низкомолекулярные вещества. £. coli в средах
с недостатком железа синтезирует и выделяет энтерохелин, пред-
ставляющий собой 2,3-дегидробензолсерин — циклический три-
мер, эффективно отщепляющий Fe2+ даже от железосодержащих
белков трансферрина и лактоферрина. Комплекс энтерохелина
с железом способен связываться со специфическим белком внеш-
ней мембраны Fep А; в клетке энтерохелин гидролизуется, осво-
бождая железо. Синтез белка Fep А, так же как и энтерохелина,
репрессируется при высоком содержании в среде растворенного
железа.
Внешняя мембрана Е. coli имеет также систему транспорта
феррихрома — циклического гексапептида, образованного тремя
остатками глицина и тремя остатками (З-М-ацетил-Ь-р-гидрокси-
орнитина. Феррихром образует стабильный комплекс с ионами
трехвалентного железа. Феррихром синтезируют и выделяют
в среду некоторые грибы. Е. coli, хотя сама и не образует фер-
рихрома, обладает весьма специфичной системой его транспорта,
в котором принимает участие белок внешней мембраны Fhu А.
В процессе транспорта происходит восстановление железа и мо-
дификация (ацетилирование) феррихрома, в результате чего он
теряет сродство к железу, и оно освобождается в цитоплазму.
Белок Fhu А служит рецептором фагов Т-1, Т-5, 0 80, колицина
Col М и антибиотика альбомицина.
Полифункциональность — характерное свойство белков внеш-
ней мембраны. При этом механизмы, обеспечивающие различные
функции, неодинаковы и осуществляются разными участками
белковых молекул. Кроме того, эти функции не всегда одина-
ково выражены. Так, у белка, транспортирующего витамин ВГ2,
рецепция колицина Е и фага BF 23 эффективно выражена только
в течение короткого периода после его синтеза, тогда как этот
белок способен обеспечивать транспорт витамина BV2 в течение
длительного времени. Мутанты, устойчивые к колицину Е, могут
50
сохранять чувствительность к фагу BF23 и нормально транс-
портировать витамин Bj-2.
Конкурентные взаимоотношения между субстратами одного
белка иногда наблюдаются, а иногда отсутствуют. Например,
между транспортом витамина В12 и колицина Е, с одной сто-
роны, и рецепцией фага BF23 — с другой, наблюдаются конку-
рентные взаимоотношения. В то же время мальтоза не препят-
ствует рецепции белком Lam В фага X, а нуклеозиды не препят-
ствуют рецепции белком tsx фага Т-6.
Во внешней мембране присутствует белок, связанный с опре-
деленным участком хромосомы — ori С, что, видимо, имеет зна-
чение для регуляции клеточного цикла бактерии.
Интересно отметить, что характер колоний, образуемых бак-
териями на поверхности агара, в значительной степени опреде-
ляется белками внешней мембраны.
Ферментативные функции белков внешней мембраны, по-ви-
димому, весьма ограничены. У Е. coli во внешней мембране
обнаружена фосфолипаза А, но в неактивной формег фермент
активируется только при переходе во внешнюю среду.
Общий план строения внешней7 мембраны один для всех
грамотрицательных бактерий — грациликутных, хотя детали ее
строения зависят от природы организма. Это справедливо и
в отношении белков внешней мембраны. Так, у Pseudomonas
aeruginosa во внешней мембране присутствует порин F. Он об-
разует гораздо более крупные поры по сравнению с поринами
энтеробактерий и пропускает молекулы с массой до 6000. Од-
нако в мембране Р. aeruginosa этот белок образует очень мало
пор, и поэтому проницаемость ее мембраны для гидрофильных
молекул весьма ограничена. С этим связывают относительную
устойчивость этой бактерии к гидрофильным антибиотикам. При
росте на мальтозе Р. aeruginosa образует порин D-1, сходный
с Lam В — порином Е. coli, а при росте в средах, дефицитных
по фосфору, синтезирует мембранный белок Р, формирующий
в мембране узкие каналы, специфичные для анионов. Диаметр
молекул, проходящих через эти каналы, не должен превышать
0,7 нм. Очевидно, эти поры пропускают анионы, в том числе
фосфаты, но не антибиотики, имеющие более крупные молекулы.
Индуцируемые системы транспорта железа, включающие
синтез специфических сидерохромов и транспортных белков
внешней мембраны, обнаружены у азотфиксирующей бактерии
Azotobacter vinelandii. Во внешней мембране Klebsiella pneu-
monia^ обнаружен фермент, расщепляющий амилозы с сильно
разветвленными молекулами.
Кроме перечисленных органических соединений внешняя мем-
брана содержит двухвалентные катионы, необходимые для со-
хранения ее целостности. Как уже было отмечено, «вытягива-
ние» из мембраны катионов при помощи ЭДТА — самый простой
прием нарушения ее целостности. У некоторых морских б акте-
4* 51
рий, постоянно обитающих в воде с высоким содержанием ка-
тионов, последние можно удалить из мембраны простой отмыв-
кой. Так, у некоторых морских Pseudomonas мембрана пол-
ностью удаляется простой отмывкой в растворе NaCl с сахаро-
зой (для сохранения осмотического давления раствора и целост-
ности клетки).
Внешняя мембрана обладает трансмембранным потенциалом,
она отрицательно заряжена со стороны периплазмы. Заряд соз-
дается, видимо, за счет присутствующих в периплазме полианио-
нов. Величину заряда внешней мембраны Е. coli оценивают
в 20—30 мВ в условиях обычных питательных сред. Величина
потенциала сильно зависит от катионного состава среды. Мем-
бранный потенциал, вероятно, имеет значение для процессов
трансмембранного транспорта. Каких-либо активных механиз-
мов, создающих потенциал внешней мембраны, пока не обнару-
жено.
Периплазма или периплазматическое пространство является
полностью отграниченным от цитоплазмы компартментом
клетки грациликутных: снаружи она ограничена внешней мем-
браной, изнутри — цитоплазматической. Толщина периплазмы
обычно около 10 нм, но ее объем в значительной степени зави-
сит от условий среды, прежде всего от осмотических свойств
раствора, поэтому в некоторых случаях периплазма может
включать до 20% всей находящейся в клетке воды. Периплазма
содержит муреиновый слой и раствор, в состав которого входят
специфичные для нее белки и олигосахариды. В периплазме со-
держатся также неорганические молекулы.
Муреин грациликутных обычно составляет около 10% от
массы оболочки, в редких случаях достигает 25%, а у некото-
рых морских псевдомонад составляет всего 1,2%. Толщина му-
реинового слоя у разных форм тоже варьирует, но обычно не
превышает 1,6—3,0 нм. Поскольку мономолекулярный слой му-
реина имеет толщину около 1 нм, можно предполагать, что здесь
муреин образует несколько таких слоев. Муреин обладает проч-
ностью и упругостью, при растворении других компонентов
клетки он сохраняет форму, образуя своеобразный муреиновый
мешочек или саккулу. Сетка муреиновых молекул, лежащая
в основе саккулы, не представляет сколько-нибудь существен-
ного препятствия для проникновения молекул органических и
минеральных соединений.
Муреин грациликутных относится к А-1 подтипу и обычно
одинаков у представителей различных групп бактерий. Но в ред-
ких случаях все же обнаружены модификации обычной струк-
туры муреина. Так, у штаммов Neisseria gonorrhoeae в полиса-
харидной части муреина наблюдается О-ацетилирование. У не-
которых фотосинтезирующих бактерий, относящихся к роду
Rhodopseudomonas и размножающихся почкованием, в муреине
частично отсутствует N-ацетилирование глюкозамина. Эти незна-
52
чительные отличия тем не менее придают муреину устойчивость
к лизоциму, и следовательно, могут иметь приспособительное
значение.
Модификации полисахаридных цепей муреина обнаружены
у Caulobacter—бактерии, имеющей стебельки. Муреин клетки
содержит больше мурамовой кислоты, чем глюкозамина, а му-
реин стебелька, напротив, больше глюкозамина, чем мурамовой
кислоты. В последнем случае, естественно, уменьшается число
пептидных мостиков, что придает муреину большую лабиль-
ность, вероятно, необходимую для образования тонких цилин-
дрических стебельков.
В пептидной части муреина у спирохет мезо-ДАП иногда
заменена орнитином, а у анаэробной Fusobacterium nucleatum
вместо ДАП обнаружена необычная аминокислота лантионин.
В периплазме содержатся белки двух типов — гидролитиче-
ские ферменты и транспортные белки. У Е. coli в периплазме
находятся рибонуклеаза I, щелочная и другие фосфатазы, дезок-
сирибонуклеаза I и другие гидролазы. Иногда периплазму гра-
циликутных рассматривают как аналог лизосом эвкариот.
Периплазматические транспортные белки — это переносчики,
связывающие соответствующие субстраты и транспортирующие
их от внешней мембраны к цитоплазматической. По причинам,
пока неизвестным, транспорт некоторых веществ в клетки гра-
циликутных связан с участием периплазматических белков-пере-
носчиков, тогда как транспорт других от этих белков не зави-
сит. В составе периплазматических белков у Е. coli обнаружены
белки, связывающие галактозу, рибозу, арабинозу, глютамин,
цистин, фосфат. У Salmonella typhimurium найден периплазма-
тический белок, связывающий сульфат, а у Comomonas белок —
переносчик фенилаланина. Е. coli содержит белок, специфически
связывающий лейцин (LS-белок), и другой белок, связывающий
лейцин, изолейцин и валин (LIV-белок). Первичная структура
последнего полностью расшифрована группой советских ученых
во главе с Ю. А. Овчинниковым.
Периплазматические белки-переносчики освобождаются
в окружающую среду при холодовом осмотическом шоке, но
неизвестно, находятся они в периплазме в свободном состоянии
или непрочно связаны с цитоплазматической мембраной. Осмо-
тический шок нарушает поступление в клетку тех соединений,
транспорт которых связан с белками-переносчиками. Добавле-
ние в среду после шока соответствующих белков иногда стиму-
лирует их транспорт. Нарушение транспорта при потере свя-
зывающего белка обычно не является полным, так как в боль-
шинстве случаев перенос того или иного вещества определяется
несколькими механизмами. Однако иногда, например при по-
ступлении глутамина в клетки Е. coli, существует лишь одна
система транспорта, включающая связывающий белок. Поэтому
перенос глутамина полностью прекращается после холодового
53
осмотического шока. Многие периплазматические белки выде-
лены в чистом виде и подробно изучены. Их сравнительно не-
большие молекулы обладают массой в пределах 25 000—42 000.
Обычно молекула имеет один активный центр для связы-
вания субстрата. Предполагают, что периплазматические транс-
портные белки ассоциированы со специфическими интеграль-
ными белками цитоплазматической мембраны, которые и обус-
ловливают транспорт соответствующего субстрата через цито-
плазматическую мембрану, образуя в ней гидрофильную пору.
Потеря периплазматических белков не приводит к гибели
клетки. При генетических нарушениях структуры внешней мем-
браны образуются Leaky-мутанты, у которых периплазматиче-
ские белки постоянно вытекают в среду. Такие мутанты жизне-
способны, хотя и не совсем полноценны.
Кроме белков в периплазме грациликутных содержится осо-
бый класс олигосахаридов, синтез которых ассоциирован с ли-
пидным обменом. Эти олигосахариды содержат по 8—10 глико-
зильных остатков, образующих сильно разветвленную молекулу
с р-1,2 и р-1,6 связями. Они имеют молекулярную массу 2200—
2600, т. е. неспособны проникать через поры внешней мембраны.
В состав молекул олигосахаридов входят 1-фосфоглицерол и
фосфоэтаноламин, происходящие из мембранных фосфолипидов.
Иногда с олигосахаридами эфирными связями соединены О-сук-
цинильные остатки, что придает молекулам отрицательный за-
ряд. (Обычно молекула имеет около 5 отрицательных зарядов.)
Эти олигосахариды, видимо, играют решающую роль в осморе-
гуляции клетки грациликутных. Концентрация растворенных
ионов и метаболитов в цитоплазме Е, coli порядка 300 mos М,
осмомолярность периплазмы примерно такая же, и это защи-
щает цитоплазматическую мембрану от неблагоприятного для
нее перепада концентраций. При росте бактерий в среде с низ-
кой осмомолярностью количество периплазматических олигоса-
харидов может достигать 7% от сухой массы клетки. Их моле-
кулы, так же как контрионы, нейтрализующие отрицательные
заряды этих молекул, определяют высокое осмотическое давле-
ние в периплазме.
В средах с концентрацией растворенных веществ, уравнове-
шивающей внутриклеточное осмотическое давление, наблюдается
лишь незначительный синтез олигосахаридов. Снижение концен-
трации среды приводит к появлению внутреннего давления на
цитоплазматическую мембрану, которое, как полагают, воспри-
нимается осморецептором, находящимся в мембране. Сигнал от
осморецептора вызывает образование белков, необходимых для
синтеза периплазматических олигосахаридов.
У некоторых видов грациликутных на внешней мембране
имеется слой регулярно расположенных белковых субъединиц,
формирующих тетрагональные или гексагональные структуры
(рис. 16). Субъединицы образованы кислыми протеинами с раз-
54
видимости, они несут за-
а
ж#
личной молекулярной массой, например у Acinetobacter —
67 000, у Spirillum serpens — 125 000—150 000. Сетчатые слои
формируются на поверхности мембраны в результате само-
сборки белковых молекул. Белок Acinetobacter образует сеть и
при отсутствии внешней мембраны, для этого нужны только
ионы С1~. При образовании на поверхности мембраны сетчатых
структур карбоксилы этого белка и отрицательно заряженные
группы мембранных белков соединяются через двухвалентные
ионы. Поэтому белковая сетка сходит с поверхности бактериаль-
ных клеток при обработке их ЭДТА, когда в оболочке бактерий
Mg2+ замещается на Na+. Функциональное значение белковых
слоев не вполне понятно, но, по всей
щитные функции, создавая допол-
нительный барьер между клеткой
и окружающей средой.
Оболочка Deinococcus radiodu-
rans (Micrococcus radiodurans), от-
носящегося к эубактериям, обнару-
живает тем не менее ряд необыч-
ных черт. Типовой штамм D. radio-
durans был выделен из мяса после
воздействия на него высокой дозой
у-излучения. Видовое наименование
отражает высокую радиоустойчи-
вость этого организма, а в само-
стоятельный род он был выделен
благодаря особенностям строения
оболочки.
Снаружи от цитоплазматической мембраны клетка D. radio-
durans окружена относительно тонким муреиновым слоем (8—
20 нм). Муреиновый слой перфорирован, т. е. в нем имеются
регулярно расположенные отверстия, расстояние между кото-
рыми около 18 нм. Муреин D. radiodurans содержит L-орнитин
вместо ДАП. Над муреиновым слоем расположен промежуточ-
ный компартментализованный, т. е. разделенный на отдельные
участки слой. Затем идет мембранный слой, по своей структуре
аналогичный внешней мембране грациликутных. Он богат ли-
пидами и содержит липопротеин, хотя компонентов ЛПС здесь
не обнаружено. Над внешней мембраной расположен слой, обра-
зованный гексагонально уложенными белковыми молекулами.
Между этим слоем и внешней мембраной на ультратонких сре-
зах выявляется прозрачное для электронов пространство. Бел-
ковый слой обладает необычно высокой химической устойчи-
востью. При 30° С он не разрушается при воздействии 1 М
NaOH, 8 М мочевины, 1 М ЭДТУ, 3 М гуанидин HCI или
1%-ного додецилсульфата натрия. Высокая устойчивость бел-
кового слоя и его связь с внешней мембраной определяются
высокой гидрофобностью слагающего его белка.
б
6м
Рис. 16. Строение поверхности
Methylomonas albus [Jeffries а.
Wilkinson, 1978].
а — белковый слой (вид сверху);
б — срез поверхности клетки;
вм — внешняя мембрана.
55
D. radiodurans по Граму окрашивается положительно, но
его оболочка имеет структурное сходство с оболочкой грацили-
кутных. Считают, что этот организм, видимо, очень давно отде-
лился от эволюционной ветви фирмакутных.
D. radiodurans образует тетрады, в которых клетки разде-
лены только муреиновым слоем, тогда как другие слои обо-
лочки— общие для всех 4 клеток. При освобождении из тетрад
клетки приобретают все слои оболочки.
Оболочки архебактерий очень разнообразны как по строе-
нию, так и по составу. В зависимости от особенностей строения
М-ацетил-D -глюкозамин
N-ацетил-и-талазамин -
Рис. 17. Строение псевдомуреина.
они окрашиваются по Граму положительно или отрицательно,
однако независимо от отношения к окраске оболочки архебак-
терий никогда не имеют строения, идентичного оболочкам фир-
макутных или грациликутных.
Оболочки некоторых метанобразующих бактерий, относя-
щихся к Methanobacteriaceae, в том числе Methanobacterium,
Methanobrevibacterium, содержат так называемый псевдому-
реин. Подобно муреину он образован гликаном, молекулы кото-
рого соединены короткими пептидными мостиками. В составе
гликана чередуются остатки Ы-ацетил-О-глюкозамина и N-аце-
тил-Ь-талозаминоуроновой кислоты, соединенные р-1,3 связями
(рис. 17). Пептидные мостики из чередующихся L- и D-амино-
кислот в псевдомуреине не обнаружены. Метанобразующие бак-
терии, имеющие псевдомуреин, окрашиваются по Граму поло-
жительно.
56
Methanosarcina barkeri обладает массивной ригидной обо-
лочкой, образованной гетерополисахаридом, состоящим из са-
харов, аминосахаров и уроновых кислот.
У Methanococcus, Methanomicrobium и Methanogenum обо-
лочки состоят из субъединиц гликопротеина или протеина, соб-
ранных на поверхности клетки в гексагональную сеть. Эти бак-
терии не содержат в оболочках псевдомуреина и окрашиваются
как грамотрицательные.
Совсем необычное строение имеет Methanospirillum hungatii.
Она одета белковым цилиндрическим чехлом, состоящим из
овальных субъединиц. Чехол одевает всю спиральную многокле-
точную нить (рис. 18). Между клетками находятся простран-
Рис. 18. Строение архебактерии Methanospirilium hungatii [Zeikus a. Bowen,
1975].
« — белковый чехол; во — внутренняя оболочка; к — конечный спейсер; с — межкле-
точный спейсер; н — нуклеоид; в — включение; мв — мембранное включение; цм —
цитоплазматическая мембрана.
ства — спейсеры, также окруженные веществом чехла. По спей-
серам может происходить разрыв нити. Каждая клетка, кроме
того, одета внутренним гомогенным слоем оболочки, под кото-
рым находится цитоплазматическая мембрана.
Представители другой группы архебактерий — крайние гало-
фильные бактерии, также лишены муреина. Оболочка некоторых
галофилов, относящихся к роду Halococcus, образована сульфа-
тированным гетерополисахаридом, у видов рода Halobacte-
rium — гликопротеином.
Как уже было упомянуто, архебактерия Thermoplasma ли-
шена плотной оболочки и одета мембраной. Полагают, что
отсутствие оболочки здесь первично, в отличие от микоплазм,
произошедших от грамположительных эубактерий.
§ 4. Протопласты, сферопласты,
L-фор м ы
При разрушении муреинового слоя оболочек фирмакутных
или грациликутных литическими ферментами или при наруше-
нии синтеза муреина у растущих бактерий оболочка теряет ри-
57
гидность и механическую прочность. Обычно грамположительные
фирмакутные легче подвержены подобным воздействиям, тогда
как для разрушения оболочки грамотрицательных грациликут-
ных, имеющих дополнительный барьер проницаемости — внеш-
нюю мембрану, необходимы дополнительные воздействия, на-
пример ЭДТА, липазами, трипсином и др. В условиях обычных
питательных сред и в средах природных бактериальная клетка
обладает определенным тургором, так как внутриклеточное
осмотическое давление, обычно соответствующее у бактерий
5—30 атмосферам, выше осмотического давления среды. Мем-
браны находятся под постоянным давлением изнутри, которое
уравновешивается за счет механической прочности оболочки,
прежде всего ее муреинового компонента. При нарушении му-
реинового слоя клетка за счет внутреннего давления округляется
и раздувается, ее объем увеличивается в несколько раз за счет
растяжения мембраны, но затем мембрана лопается и клетка
разрушается, как бы растворяется. Этот процесс называют
лизисом клетки. Следует иметь в виду, что избыточное внутри-
клеточное давление является обычно основной, но не единствен-
ной причиной лизиса. Существенное влияние на этот процесс
оказывают такие факторы, как температура, присутствие в рас-
творе различных веществ, особенно соединений, так или иначе
влияющих на состояние мембран.
Если структура муреина нарушена, но муреиновый слой обо-
лочки сохраняется, происходят нарушения процессов деления
и роста клетки, образуются клетки неправильной формы,
обычно удлиненные, раздутые, часто грушевидные, колбасовид-
ные, иногда изогнутые или спирализованные — так называемые
инволюционные или гетероморфные формы. Они либо растут и
делятся и при снятии фактора, вызвавшего их образование,
дают нормальное потомство, либо постепенно отмирают.
В определенных условиях клетки, даже полностью лишенные
муреинового слоя, могут и не лизироваться. Основным условием
стабилизации таких клеток является достаточно высокая кон-
центрация растворенных веществ в среде. Часто используют
сахарозу или маннит в концентрациях 0,1—1,0 М, но для сохра-
нения целостности таких клеток требуются определенные зна-
чения pH, температуры, необходимо наличие энергетического
субстрата, определенных катионов и т. п. Все эти условия видо-
специфичны.
Клетки с разрушенной оболочкой принимают округлую
форму. Если они окружены только цитоплазматической мембра-
ной, их называют протопластами, если оболочка разрушена не
полностью — сферопластами. Грациликутные бактерии обычно
образуют сферопласты, у которых сохраняются элементы внеш-
ней мембраны. Протопласты и сферопласты в 3—10 раз крупнее
исходных клеток. Они осуществляют обмен веществ, характер-
ный для исходных клеток, например фиксируют азот, образуют
58
споры. Можно наблюдать их рост и иногда деление. В конце
концов, протопласты и сферопласты либо ревертируются в нор-
мальные бактериальные формы при снятии фактора, разрушаю-
щего муреин, либо трансформируются в L-формы (см. далее),
либо гибнут. Легко ревертируют в исходные формы сферопла-
сты, протопласты, как правило, отмирают или превращаются
в L-формы. Характерная особенность сферопластов и протопла-
стов— отсутствие у них внутриклеточных мембран типа мезо-
сом, которые в процессе трансформации клетки выбрасываются
в окружающую среду. Получение протопластов широко практи-
куется в исследованиях, связанных с изучением бактериальных
мембран.
Сферопласты, протопласты или подобные им формы гетеро-
морфного роста могут явиться переходной стадией в процессе
превращения бактерий в L-формы. Как L-формы обозначают
бактерий, способных к развитию при отсутствии у них оболочки.
Буква L — первая буква названия Листеровского института
в Англии, где впервые обратили внимание на развитие морфо-
логически весьма необычных микроорганизмов. Переход бакте-
рий в L-форму происходит под воздействием специфических или
неспецифических агентов, нарушающих структуру или синтез
оболочки. В экспериментальной практике в качестве такого воз-
действия чаще всего используют пенициллин. Неизвестно от
чего зависит судьба клетки, потерявшей оболочку, большинство
их гибнет и только некоторые переходят в L-формы.
Морфология L-форм мало зависит от морфологии исходной
бактерии. В культуре L-форм обнаруживаются клетки размером
0,2—50 мкм. Они шаровидные, но присутствуют нитевидные
образования и бесструктурные массы. В отличие от протопла-
стов, в клетках L-форм присутствуют внутренние мембранные
системы и миелиноподобные структуры. L-формы лучше растут
на агаре, чем в жидкой среде, они образуют колонии, проникаю-
щие в агар и имеющие характерную форму перевернутой шляпы.
Мицеллы агара, видимо, способствуют делению элементов L-
форм. Колонии растут медленно, но иногда достигают значитель-
ных размеров. При пересевах таких колоний повторный рост
удается получить только при перенесении достаточно большой
биомассы L-форм. Последние легко разрушаются при механи-
ческих воздействиях, например в процессе приготовления микро-
скопических препаратов с помощью бактериологической петли,
а также при изменениях осмотического давления среды, хотя
могут развиваться и в средах относительно невысокой концен-
трации. Иногда L-формы развиваются только на средах с сыво-
роткой или обнаруживают другие потребности, не характерные
для исходных форм бактерий.
Из-за отсутствия оболочки у L-форм нет определенной формы
и не функционируют нормальные механизмы клеточного деле-
ния. В колониях обычно присутствуют: 1) так называемые эле-
59
ментарные тела размером 0,2—1 мкм — минимальные способные
к репродукции элементы L-форм; 2) шаровидные или неправиль-
ной формы тела размером 1—5 мкм; 3) большие тела размером
5—50 мкм; 4) нитевидные структуры различного диаметра;
5) бесструктурные массы, в которых границы отдельных кле-
ток не видны. В отличие от нормальных клеток L-формы часто
содержат крупные вакуоли.
Описано несколько способов образования элементарных тел
L-формами. Они могут отпочковываться от поверхности клетки
или от мембраны вакуоли, а также в результате отделения мем-
браной участка внутри клетки или дробления ее содержимого.
У L-форм наблюдается не только деление, но и слияние фор-
мирующих их элементов, что, видимо, имеет значение при фор-
мировании колоний. Если в колонии присутствуют элементы
с разным геномом, в результате слияния клеток может проис-
ходить рекомбинация, приводящая к образованию гибридных
клеток.
К образованию L-форм способны любые бактерии. Имеются
наблюдения, свидетельствующие о том, что образование L-форм
происходит не только в лаборатории, но и в природных усло-
виях. В этой форме бактерии менее активны, чем в нормальном
состоянии, однако L-формы нечувствительны к любым агентам,
влияющим на оболочку, в частности они. устойчивы к ряду
антибиотиков. Поэтому переход в L-форму можно рассматри-
вать как способ переживания бактериями неблагоприятных
условий.
Различают нестабильные и стабильные L-формы. Первые при
исключении фактора, вызвавшего их образование, более или
менее быстро регенерируют в нормальные бактериальные
клетки. Стабильные L-формы существуют без изменений в раз-
личных условиях среды. В некоторых случаях они являются
мутантами с нарушениями в генах, ответственных за синтез обо-
лочки, однако, вероятно, бывают стабильные L-формы с ненару-
шенным геномом. Синтезу оболочки, возможно, препятствуют
нарушения нормальной пространственной организации биосин-
тетических процессов, отсутствие молекул — затравки и т. п.
Исследования L-форм представляют существенный интерес
для медицинской микробиологии, поскольку в этой форме в ор-
ганизме человека и животных могут сохраняться патогенные
бактерии. Убедительным доказательством того, что L-формы
иногда обладают селективным преимуществом, является факт
закрепления их в эволюции некоторых бактерий и превращения
в микоплазмы, которые рассматриваются в качестве самостоя-
тельной группы бактерий.
60
Глава II
ВНЕШНИЕ (НАДОБОЛОЧЕЧНЫЕ) СТРУКТУРЫ
§ 1. Капсула
Капсула представляет собой слизистый слой, расположен-
ный над оболочкой бактериальной клетки. Капсула может в не-
сколько раз превышать по толщине клетку, а может быть и
очень тонкой, невидимой в световом микроскопе, — тогда гово-
рят о микрокапсуле. Не всегда легко разграничить дополнитель-
ные компоненты собственно оболочки и вещество капсулы.
Капсула легко выявляется в световом микроскопе при нега-
тивной окраске или после обработки бактерий специфическими
антикапсульными антителами и при последующем наблюдении
таких клеток в фазово-контрастном микроскопе. Исследование
капсул в электронном микроскопе затруднительно, так как их
вещество прозрачно для электронов и плохо фиксируется при
использовании обычных методов. При дегидратации капсулы
обычно деформируются или разрушаются. При электронно-ми-
кроскопических исследованиях применяют специальные методы
обработки капсул в зависимости от их химического состава.
Вещество капсулы четко отграничено от окружающей среды,
хотя капсула не имеет структурно обособленной оболочки.
Кроме слизей, образующих капсулу, бактерии могут синтезиро-
вать и слизи, растворяющиеся в окружающей среде. Иногда
в культуре присутствуют и капсулы, и аморфная слизь одина-
кового химического состава. Например, у Leuconostoc mesente-
roides декстраны формируют капсулу и растворяются в среде.
У некоторых форм капсулы по мере старения клеток превра-
щаются в аморфный полисахарид. Клетки Zoogloea ratnigera,
играющие ведущую роль в образовании основы активного ила,
в молодом возрасте окружены капсулой, но по мере старения
популяции частично отмирают и вещество капсул становится
аморфной основой частиц ила.
Могут быть получены мутанты, выделяющие химически неиз-
мененные молекулы вещества капсулы, но не способные обра-
зовывать обособленную капсулу, т. е. существует механизм,
обеспечивающий локализацию и закрепление молекул на по-
верхности клетки. Вещество капсулы примыкает к поверхности
61
оболочки клетки. Макромолекулы, составляющие капсулы ряда
грамотрицательных бактерий, на одном из концов имеют ли-
пидный компонент, при помощи которого они как бы заякорены
в липидном бислое внешней мембраны.
В световом микроскопе капсулы обычно выглядят гомоген-
ными. Электронно-микроскопические исследования иногда вы-
являют в них фибриллы, направленные перпендикулярно обо-
лочке или параллельно ей, а иногда образующие сетчатую
структуру. Глобулярные структуры обнаружены в капсулах не-
которых стрептококков, глобулярные и фибриллярные — в дек-
страновых капсулах Leuconostoc mesenteroides. Видимые в элек-
тронном микроскопе капсульные фибриллы иногда образуются
в процессе дегидратации при приготовлении препаратов, т. е.
являются артефактами. У некоторых бактерий, например у Ba-
cillus megaderium, фибриллярное строение капсулы выявляется
и при изучении реплик со сколов замороженных бактерий, не
подвергавшихся высушиванию.
Химический состав капсул весьма разнообразен, но это все-
гда вещества с высокой молекулярной массой — до 1000 000,
гидрофильные и часто несущие отрицательный заряд.
У ряда видов Bacillus капсула образована поли-Э-глутамино-
вой кислотой. Глутамильные остатки связаны через у-карбок-
сильные группы. Капсулы сложного строения, состоящие из двух
компонентов — полипептидного и полисахаридного, имеют
клетки некоторых штаммов Bacillus megaterium. Наиболее
обычны полисахаридные капсулы, в состав которых, однако,
могут входить азотсодержащие соединения и фосфат. Так,
структура субъединицы капсульного полисахарида пневмокок-
ков типа 34 включает галактопиранозильный и глюкопирано-
зильный остатки. Соединение субъединиц осуществляется через
рибитфосфат, т. е. полисахарид структурно является тейхоевой
кислотой (рис. 19). Стрептококки групп А и С образуют кап-
сулу, состоящую из гиалуроновой и глюкуроновой кислот и глю-
козамина. Капсульный полисахарид Вас. polymyxa состоит из
глюкозы, маннозы, ксилозы и уроновой кислоты. Капсула Е. coli
серотипа К 29 образована полисахаридом, содержащим остатки
маннозы, глюкозы, глюкуроновой кислоты и галактозы в экви-
молярных соотношениях. К глюкуроновой кислоте присоединены
боковые цепи из маннозы, глюкозы и пирувата. Молекулы по-
лисахарида состоят примерно из 300 таких повторяющихся субъ-
единиц. Капсульный полисахарид Е. coli серотипа К 42 содержит
галактозу, галактуроновую кислоту, фруктозу и О-ацетильные
остатки в соотношении 1:1:1: 0,5, а у Streptococcus pneumoniae
типа 15 F — D-галактозу, D-глюкозу, 2-ацетамидо-2-дсзокси-О-
глюкозофосфат и О-ацетильные остатки в соотношениях
3:1:1 1:2.
Большинство капсульных полисахаридов синтезируется из
сахаронуклеотидных предшественников, при этом гликозильные
остатки последовательно переносятся на растущие цепи полиса-
харида. В этом процессе участвует липидный переносчик цито-
плазматической мембраны. Имеются сведения о том, что веще-
ство капсулы грамотрицательных бактерий выделяется в местах
контактов внешней и цитоплазматической мембран. Сахара, вхо-
дящие в состав большинства типов капсул, синтезируются клет-
кой в процессе обычного промежуточного обмена, состав среды
мало влияет на их биосинтез.
Иначе идет синтез капсул, построенных из декстрана (поли-
глюкоза) или левана (полифруктоза). Эти полисахариды обра-
зуются экзогенно непосредственно из экзогенного субстрата —
сахарозы, и только из нее. Цепь полисахарида удлиняется в ре-
зультате трансгликозилирования, процесс синтеза не требует
АТФ. На поверхности клетки образуется фермент-полисахарид-
ный комплекс, определяющий пространственную локализацию
полисахарида.
Капсула легко может быть отделена от клетки, что, однако,
не приводит к гибели бактерии. Несложно получить мутантные
бескапсульные клоны, которые в лабораторных культурах ра-
стут вполне нормально. В литературе даже бытует представле-
ние о вероятной бесполезности капсул для бактерий. Однако это
совершенно неверно. В условиях естественной среды обитания
бактерий капсулы обеспечивают их выживание и селективные
преимущества, хотя функции капсул не всегда установлены. Это
прежде всего защитные функции. Установлено, что вещество
капсулы предохраняет бактериальные клетки от действия токси-
ческих веществ, а в случае патогенных форм — от действия за-
щитных сил макроорганизма. В частности, инкапсулированные
клетки плохо фагоцитируются. Инкапсулированные клетки сво-
63
бодно живущих бактерий плохо перевариваются заглатываю-
щими их беспозвоночными, что было продемонстрировано, на-
пример, для клеток азотобактера. Капсула стрептококков
группы А не только защищает клетки от фагоцитоза, но и пре-
пятствует их контакту с кислородом, высокие концентрации ко-
торого для них токсичны. В результате инкапсулированные
клетки могут хорошо развиваться в обычной атмосфере.
Капсула защищает клетку от заражения многими бактерио-
фагами, хотя существуют бактериофаги, которые специфически
адсорбируются на веществе капсулы и проникают через нее,
проделывая ходы за счет активности собственных ферментов.
Имеются наблюдения, свидетельствующие о большей радио-
резистентности инкапсулированных клеток по сравнению с клет-
ками, лишенными капсул.
Отрицательно заряженное вещество капсул, поглощая и акку-
мулируя катионы из окружающей среды, создает пул катионов,
которые затем могут быть использованы для нужд клетки. Су-
ществуют данные, правда, нуждающиеся в проверке, о том, что
на веществе капсулы могут адсорбироваться ферменты, которые
оказываются, таким образом, иммобилизованными и работают
в непосредственной близости от бактериальной клетки. Это,
в частности, относится к гидролитическим ферментам, экскрети-
руемым в среду миксобактериями и бактериями рода Cytophaga.
Использование бактериями таких иммобилизованных ферментов
имеет очевидное приспособительное значение.
Вещество капсул обычно высоко гидрофильно и способствует
поглощению влаги бактериями, развивающимися в условиях
ограниченной влажности. В некоторых случаях она служит для
прикрепления бактериальной клетки к плотной поверхности.
Хорошим примером в этом отношении является капсула Strep-
tococcus mutans — одного из основных возбудителей кариеса
у человека. S. mutans образует фермент глюкозилтрансферазу,
под воздействием которой из экзогенной сахарозы синтези-
руется глюкан, в момент синтеза приклеивающий бактерию
к поверхности зуба. Клейкость этого глюкана определяется на-
личием в нем большого числа а-1,3-связей. В результате при-
крепления бактерий к поверхности зуба образуются зубные
бляшки и развивается кариес. Мутанты S. mutans, потерявшие
способность к синтезу капсулы, не образуют зубные бляшки и
не вызывают кариес.
Своеобразной капсулой можно считать аморфную массу цел-
люлозных молекул, синтезируемых Acetobacter xylinum. Целлю-
лозные пленки-плотики всплывают к поверхности среды вместе
с заключенными в них клетками бактерий, обеспечивая опти-
мальную аэрацию клеток. В условиях стационарной неаэрируе-
мой культуры клетки, синтезирующие клетчатку,’ имеют явное
селективное преимущество перед мутантными клетками, поте-
рявшими эту способность.
64
Вещество бактериальных капсул обладает свойствами анти-
гена и в значительной степени определяет антигенную специ-
фичность данных бактерий. У штаммов одного вида химическое
строение и антигенная специфичность капсульного вещества
иногда весьма сильно различается. Антигенные особенности
капсул используют для серотипирования пневмококков. У Е. coli
имеются как лишенные капсул, так и образующие ее штаммы,
среди последних известно более 80 различных типов капсуль-
ного К-антигена.
У некоторых патогенных бактерий вещество капсулы, видимо,
служит для иммунологической мимикрии — образования микро-
организмом антигена, родственного антигену хозяина, иммунная
система которого не может вырабатывать антител против такого
антигена. Капсула Yersinia pestis, например, содержит антиген,
родственный антигену эритроцитов человека 0-й группы крови.
Люди этой группы крови не образуют антител против У. pestis
и, таким образом, оказываются беззащитными.
§ 2. Пили
Пили, называемые также фимбриями или ворсинками,
весьма широко распространены у бактерий. Они представляют
собой прямые белковые цилиндры, отходящие от поверхности
клетки. Строение и~ функции пилей различны, у одной и той же
бактерии могут присутствовать пили разной природы. Их функ-
ции не всегда понятны, но во всех изученных случаях пили так
или иначе участвуют в прикреплении бактериальной клетки
к субстрату.
Больше всего сведений касается пилей кишечных бактерий,
прежде всего Е. coli, У этой бактерии могут быть пили общего
типа и половые.
Пили общего типа Е. coli тоже различаются. Пили типа 1
прочно связаны с клеткой, и для того, чтобы их оторвать от нее,
нужны значительные усилия, большие, чем для удаления жгути-
ков или половых пилей. Они также устойчивы и к химическим
воздействиям — сохраняются в 6 М мочевине, 1 N NaOH, устой-
чивы к додецилсульфату натрия и трипсину. Эти пили разру-
шаются только при кипячении в растворе с низким значением
pH, что вызывает необратимую денатурацию их белка. Раство-
рение пилей без разрушения белковых молекул удается осуще-
ствить в насыщенном растворе гуанидингидрохлорида. Белок,
образующий пили общего типа 1, имеет молекулярную массу
Пили типа 1 располагаются перитрихально, т. е. по всей по-
верхности бактерии, у одной клетки может быть 50—400 пилей
длиной до 1,5 мкм. Диаметр этих пилей около 7 нм, а отвер-
стия—2,0—2,5 нм.
5 Б. В. Громов
65
Образование пилей общего типа 1 определяется генами, рас-
положенными в хромосоме. Их активность подвержена фазовым
вариациям, т. е. ген может быть активен или нет. Обычно в куль-
туре присутствуют как клетки, имеющие много пилей общего
типа 1, так и лишенные их. Клетки, находящиеся в той или иной
фазе, могут быть легко отселекционированы. Размножению кле-
ток, лишенных пилей, способствует выращивание культуры на
агаре, тогда как клетки с пилями получают преимущество при
выращивании культуры в жидкой среде без аэрации. При этом
они образуют пленку.
Пили типа 1 придают бактериям гидрофобность, снижают их
электрофоретическую подвижность. Они вызывают агглютина-
цию эритроцитов за счет того, что такие бактерии приклеи-
ваются к эритроцитам (так же, как к другим клеткам живот-
ных). Благодаря этим пилям бактерии прикрепляются также
к клеткам растений и грибов, к неорганическим частицам.
В присутствии маннозы нарушается гемагглютинация и при-
крепление бактерий к животным клеткам вообще, поскольку
пили типа 1 прикрепляются к поверхностным рецепторам, со-
держащим маннозу. В присутствии маннозы соответствующие
участки пилей заняты ее молекулами. Адгезивность пилей зави-
сит также от гидрофобности образующего их белка пилина.
С маннозными рецепторами реагируют участки пилей, располо-
женные по всей их поверхности, тогда как за гидрофобные взаи-
модействия ответственны окончания пилей.
Пили типа 2 сходны с пилями 1-го типа, но не вызывают
агглютинации эритроцитов, не способствуют образованию бак-
териями пленки в жидкой среде. Антигенно они близки к пилям
1-го типа и, видимо, представляют собой их мутантную форму.
Описан и еще ряд вариантов пилей, близких к пилям 1-го типа.
Связи пилей общего типа 1 с патогенностью у штаммов Е. coli
не удается обнаружить. У энтеропатогенных штаммов обычно
образуются другие пили, кодируемые плазимидными генами.
Известно несколько типов таких пилей, причем обнаруживается
связь типа пилей со специфичностью бактерий в отношении тех
или иных животных.
Пили, известные как антигены К 88 и К 99, тоньше и лабиль-
нее пилей 1-го типа. Они вызывают гемагглютинацию, устойчи-
вую к маннозе, и способствуют прикреплению бактерий к клет-
кам кишечного эпителия животных, но не человека. Пили 987 Р
определяют способность £. coli прикрепляться к эпителию тон-
кого кишечника новорожденных свиней; морфологически они
похожи на пили 1-го типа. Пили, определяемые генетическим
фактором CFA/1, вызывают агглютинацию человеческих эритро-
цитов и найдены у патогенных для человека штаммов. Молеку-
лярная масса белков пилинов, кодируемых плазмидными генами
14 500—26 200.
66
У энтеропатогенных штаммов Е. coli пили являются одним
из факторов патогенности, обеспечивающим им возможность
прикрепления к кишечному эпителию. Колонизация бактериями
эпителия способствует эффективному взаимодействию выделяе-
мого ими энтеротоксина с клетками эпителия. В результате
происходит нарушение водного обмена ткани, что клинически
проявляется как диаррея. При этом бактерии энергично размно-
жаются в тонком кишечнике, а затем в большом количестве вы-
носятся в окружающую среду, что способствует их распростра-
нению.
Половые пили Е. coll образуются у клеток донорских штам-
мов, отличающихся от изогенных реципиентных наличием у кле-
ток особого генетического детерминанта — полового фактора,
или фактора трансмиссивности, который либо является авто-
номным репликоном (F-фактор), либо входит в состав автоном-
ного репликона, либо интегрирован с бактериальной хромосомой.
Фактор трансмиссивности находится в составе плазмид—фак-
торов множественной устойчивости к антибиотикам (R-фак-
торы), факторов колициногенности и ряда других плазмид. По-
ловые пили отличаются от пилей общего типа по строению и
антигенной специфичности, пили, кодируемые различными гене-
тическими детерминантами, также различны.
Половые F-пили, определяемые F-факторами, представляют
собой белковые цилиндры, перпендикулярные поверхности
клетки, толщиной 8,5—9,5 нм и длиной до 1,1 мкм. Они легко
могут быть отделены от клетки при встряхивании бактерий.
F-пили образованы белком с молекулярной массой 11 800. В со-
ставе F-пилина отсутствуют пролин, цистеин, гистидин, аргинин.
К молекуле пилина присоединены две фосфатные группы и оста-
ток D-глюкозы, связанные с белком ковалентными связями.
Пилин содержит сравнительно много кислых и гидрофобных
аминокислот. Он синтезируется на рибосомах, связанных с ци-
топлазматической мембраной и в цитоплазме не обнаружи-
вается. Пул пилина, видимо, накапливается в цитоплазматиче-
ской мембране. Его молекулы в процессе синтеза содержат до-
полнительную сигнальную последовательность аминокислот,
отщепляющуюся при транспорте через мембрану. F-пили легко
диссоциируют в растворах додецилсульфата натрия и разру-
шаются органическими растворителями, что связано с гидро-
фобностью пилина. Бактерии, имеющие F-пили, приобретают
новый антиген, у них изменяется поверхностный заряд. Бакте-
рии с F-пилями мало подвижны, проявляют тенденцию к авто-
агглютинации, например при понижении значения pH среды.
Это также происходит за счет богатства пилина кислыми и ги-
дрофобными аминокислотами.
Для образования F-пилей необходима активность, по край-
ней мере, 13 генов. Сборка трубочек пилей происходит на цито-
плазматической мембране в местах ее контакта с внешней мем-
5*
67
браной. Трубочка пили проходит через слой муреина и внешнюю
мембрану. Для сборки и сохранения пилей необходима энергия.
Образованию пилей препятствуют цианид, динитрофенол, азид
натрия. Возможно, в процессе сборки происходит фофорилиро-
вание пилина.
Обычно клетки с дерепрессированным F-фактором образуют
1—2 пили, а в анаэробных условиях и на богатой среде — до
5 пилей. Причина стимуляции пилеобразования в анаэробных
условиях неизвестна. У клеток с оторванными пилями быстро
отрастают новые, за 30 с пиля достигает V2 нормальной длины,
а полностью формируется за 4—5 мин. Сформированные пили
сохраняются на поверхности клетки 4—5 мин, а затем сбрасы-
ваются. Это свидетельствует в пользу точки зрения о том, что
пили — активные образования.
Пили, определяемые фактором Col I, образованы иным пи-
лином, на них не адсорбируются фаги, специфичные для F-пи-
лей, но имеются специфичные для них фаги. Так называемые
мужские фаги адсорбируются на половых пилях, РНК-содержа-
щие фаги — на их боковых поверхностях и нитчатые фаги, со-
держащие одноцепочечную ДНК, — на кончиках этих пилей.
Нитчатый фаг препятствует конъюгации.
При конъюгации к реципиентной клетке присоединяется ко-
нец половой пили, при этом рецептором служит белок внешней
мембраны реципиентной клетки. Сначала этот контакт не очень
прочный и легко может быть нарушен при гидродинамических
воздействиях. При этом пары распадаются при множественном
заражении РНК-содержащими фагами или в присутствии ионов
Zn2+. Через несколько минут контакт становится более прочным,
происходит сближение клеток и образование между ними цито-
плазматического мостика. Имеются данные, свидетельствующие
о том, что передача ДНК может происходить и без образования
цитоплазматического мостика, а непосредственно через отвер-
стие в пиле. Инактивация пилей антисывороткой и любые по-
вреждающие их воздействия приводят к нарушению процесса
конъюгации, в то время как нарушение целостности внешней
мембраны или муреинового слоя до некоторого предела не
влияют на донорские свойства клетки, имеющей пили.
После установления контакта с реципиентной клеткой через
пилю в донорскую клетку передается сигнал, вызывающий на-
чало конъюгационного синтеза ДНК. Механизм работы половых
пилей еще окончательно не установлен. Ряд наблюдений свиде-
тельствует в пользу модели, предполагающей активную функцию
пилей. Согласно этой точке зрения после установления контакта
с клеткой реципиента или с вирусом пиля сокращается или втя-
гивается в клетку. Эта модель подтверждается как косвенными,
так и прямыми наблюдениями. На электронно-микроскопических
препаратах можно проследить, как после адсорбции нитчатого
мужского фага на их кончиках пили укорачиваются, а затем
68
нити фага оказываются на поверхности клетки. Сокращение
пилей вызывает KCN или арсенат. После воздействия этими
ингибиторами пили не обнаруживаются ни на поверхности кле-
ток, ни в окружающей среде, но можно наблюдать адсорбцию
на поверхности клеток мужских фагов и антител, специфичных
к концам пилей, т. е. их кончики, видимо, продолжают высту-
пать над поверхностью клетки. При фаговой инфекции в даль-
нейшем происходит растворение белковой оболочки нитчатого
фага в цитоплазматической мембране бактерии и освобождение
его ДНК в цитоплазму. При инфицировании РНК-содержащими
мужскими фагами сначала образуется комплекс фаговой РНК
с пилином, а фаговый капсид освобождается в среду.
Обычно синтез пилина находится под контролем цитоплаз-
матических репрессоров. В некоторых случаях удается наблю-
дать определенные закономерности в регуляции образования
пилей. Так, в случае Col 1-фактора каждая клетка, получившая
при конъюгации плазмиду Col I, образует пили, их активное
образование происходит у клеток 4—8 последующих генераций.
Однако затем только единичные клетки в популяции образуют
пили, поскольку у большинства бактерий синтез пилина репрес-
сирован. Подобная репрессия, как считают, имеет приспособи-
тельное значение, поскольку клетки без пилей не чувствительны
к мужским бактериофагам, которые могли бы уничтожить всю
популяцию. Единичные клетки с пилями способны обеспечить
конъюгацию. При контакте таких клеток с популяциями реци-
пиентных бактерий начинается лавинообразное распространение
плазмиды, поскольку образование пилей сначала не репресси-
ровано.
Половые пили обычно образуют только активно растущие
клетки, клетки из культуры, находящейся в стационарной фазе
роста, обычно лишены пилей и являются плохими донорами.
Как уже было отмечено, существует много более или менее
различающихся плазмид, способных определять образование
половых пилей, которые также несколько различаются. Рецеп-
торы на поверхности реципиентных клеток обладают разной
степенью сродства к разным пилям, что может сильно влиять
на эффективность конъюгации бактерий.
Пили, подобные пилям Е. coli, образуют и другие представи-
тели Enterobacteriaceae. Половые пили имеют Vibrio, Pasteu-
rella, Aeromonas, Pseudomonas.
У Neisseria gonorrhoeae, только что выделенных от больных,
обнаруживаются длинные (до 5 мкм) пили. При культивирова-
нии гонококков на искусственных питательных средах селектив-
ные преимущества имеют мутанты, потерявшие пили, поэтому
лабораторные культуры обычно пили не образуют. Пили гоно-
кокков обеспечивают их прикрепление к поверхности слизистых
оболочек и препятствуют фагоцитозу, т. е. являются факторами
патогенности гонококков. Показано, что антисыворотка к пилям
69
гонококков может быть использована для лечения больных го-
нореей. Пили гонококков, обозначаемые аир, образованы пи-
линами, несколько различающимися молекулярными массами,
антигенно и рядом других свойств, а- и р-пили могут быть у кле-
довольно много
Рис. 20. Клетки Agrobacteriutn,
связанные пилями в звездчатые
скопления. Ув. Х2000.
ток одного и того же штамма.
Полярные или перитрихальные пили были обнаружены
у 8 видов Pseudomonas из 15 исследованных. У форм с поляр-
ными пилями они расположены на обоих полюсах или только на
одном. У некоторых штаммов за счет монополярных пилей обра-
зуются звездчатые скопления клеток. Аналогичные клеточные
комплексы образуют представители родов Rhizobium и Agro-
bacterium (рис. 20).
наблюдений, свидетельствующих
о возможной связи между неко-
торыми типами полярных пилей
и способностью бактерий к так
называемому дергающемуся дви-
жению. Такого типа пили имеет,
например, Pseudomonas aerugi-
nosa. Пили сократимы, поэтому
клетки, имеющие их, приобрета-
ют способность к дергающемуся
движению, которое заключается
в медленном периодическом пе-
ремещении отдельных клеток и
колоний по плотному субстрату,
например агару. Сократимые пи-
ли Р. aeruginosa кодируются хро-
мосомными генами и служат ре-
цепторами для 6 различных бак-
териофагов, в том числе РНК содержащих, нитчатых и фага
с длинным несократимым отростком.
Описанная подвижность является единственным способом
передвижения клеток Acinetobacter calcoaceticus. У этой бакте-
рии имеются пили диаметром 5 нм и до 10—15 мкм длиной.
Такие пили образуют только активно растущие клетки, они ис-
чезают у бактерий, перешедших в стационарную фазу роста.
В то же время у клеток Acinetobacter могут быть и более тон-
кие перитрихальные пили диаметром около 3 нм, не имеющие
отношения к подвижности бактерий.
Способность к образованию передвигающихся колоний штам-
мами Moraxella и Pasteurella также связана с наличием у кле-
ток этих бактерий полярных пилей. Они обнаружены и у грам-
положительных бактерий, например у Streptococcus sanguis,
хотя здесь пили встречаются реже, чем у грамотрицательных.
Создается впечатление, что движение за счет работы сокра-
тимых пилей у прокариот является как бы аналогом амебоид-
ного движения эвкариот.
70
У некоторых фирмакутных обнаружены и перитрихальные
пили. Так, у штаммов Streptococcus faecalis они достигают
0,5 мкм в длину и 4,5 нм в диаметре. Число пилей на клетку
варьирует от нескольких штук до нескольких сотен, хотя не все
клетки в культуре имеют пили. Многочисленные перитрихальные
пили до 10 мкм длиной имеют клетки Corynebacterium renale.
У некоторых бактерий наличие пилей характерно для опре-
деленных стадий жизненного цикла. Так, у подвижных клеток
Caulobacter до 8 пилей образуется на полюсе, несущем жгутик.
Их толщина около 4 нм, а длина может достигать нескольких
микрометров. Имеются РНК содержащие фаги, адсорбирую-
щиеся на этих пилях. Пили Caulobacter служат для прикрепле-
ния к различным субстратам, хотя высказывалось мнение о связи
их с конъюгацией.
Самостоятельный интерес представляют пили подвижных
клеток миксобактерий. Здесь они, видимо, не имеют отношения
к передвижению отдельных клеток, зато необходимы для коор-
динированного передвижения масс клеток ла стадии роения,
предшествующей образованию плодовых тел. Предполагают, что
эти пили обеспечивают межклеточные контакты, в результате
которых клетки в рое двигаются координированно.
Шипы — своеобразные структуры, представляющие собой
полые цилиндры длиной до 1—3 мкм и толщиной около 65 нм,
расширяющиеся у основания. Обнаружены на поверхности кле-
ток некоторых планктонных морских бактерий, близких к псев-
домонадам. Шипы укреплены на поверхности внешней мембраны
бактериальной оболочки и довольно легко могут быть оторваны
при механических воздействиях, например при обработке бак-
терий в гомогенизаторе, но устойчивы к химическим воздей-
ствиям, органическим растворителям, ЭДТУ и др., однако могут
быть отделены при обработке бактерий проназой.
Шипы образованы белком спинином (лат. spina — шип)
с молекулярной массой 19 000. В условиях, благоприятных для
их образования, каждая клетка имеет около 10 шипов. Это
соответствует приблизительно 2,5 • 105 молекулам спинина, т. е.
на его долю приходится в этом случае значительная часть от
общего количества белка бактерии. Клетки, снабженные ши-
пами, могут иметь полярный жгутик и пили, но чаще образуются
либо жгутик и пили, либо шипы. Клетки с шипами обычно не-
подвижны. На интенсивность образования шипов сильно влияют
условия среды — температура, величина pH, концентрация
солей.
Молекулы спинина уложены в плотную спираль, субъединицы
прочно связаны по ходу спирали и между ее витками. Шипы
формируются в результате самосборки белковых молекул.
Бактерии с шипами быстрее оседают, чем клетки без шипов,
благодаря большей их плотности. При низких значениях pH
такие клетки имеют тенденцию к агглютинации, но при этом не
71
образуют компактных масс и сохраняют хороший контакт со
средой. Имеются сведения о том, что бактерии с шинами не-
охотно поедаются беспозвоночными. Образование шипов несом-
ненно способствует выживанию бактерий в естественной среде,
но основная их функция пока неизвестна.
Трубчатые выросты, отличные от пилей и шипов, обнаружены
у некоторых метилобактерий. У Methylocystis echinoides клетка
снабжена 300—350 трубочками, расположенными на поверхно-
сти клетки перпендикулярно оболочке. Диаметр трубочек около
40 нм, длина до 0,3 мкм. На электронно-микроскопических пре-
паратах видна периодическая исчерченность поверхности трубо-
чек, расстояние между темными участками 6 нм. Трубочки об-
разованы спирально закрученной цепочкой субъединиц. Поверх-
ность трубочек окрашивается рутениевым красным, что говорит
о наличии здесь полисахарида. Основание трубочки связано
с наружной мембраной бактериальной оболочки, но в оболочке
под трубочкой имеется канал, достигающий цитоплазматической
мембраны. У основания этих выростов обнаружена повышенная
активность окислительных ферментов. Функциональное значе-
ние трубочек остается неясным.
Глава III
ОРГАНИЗАЦИЯ ЦИТОПЛАЗМЫ
§ 1. Цитоплазматическая мембрана
Цитоплазматическая мембрана является главным барье-
ром между цитоплазмой бактериальной клетки и окружающей
средой. Разрушение цитоплазматической мембраны приводит
к гибели клетки.
В основе цитоплазматической мембраны лежит липидный
бислой. Расстояние между центрами его полярных областей
4,0—4,5 нм, толщина гидрофобной области 3—3,5 нм.
На срезах бактерий или отпрепарированных мембран цито-
плазматическая мембрана выявляется трехслойной — два элек-
тронно-плотных слоя ограничивают электронно-прозрачный цен-
тральный слой. Обычно толщина мембраны на срезах соответ-
ствует 7—8 нм, однако эта величина варьирует у разных орга-
низмов и зависит от условий приготовления препаратов. Так,
после последовательной фиксации клеток глутаровым альдеги-
дом — осмием поперечное сечение цитоплазматической мем-
браны Streptococcus faecalis составляло 8,5 нм, Micrococcus ly-
sodeikticus—10,5 нм, а после фиксации только глутаровым аль-
дегидом соответственно 9,5 и 10,2 нм.
На репликах, полученных со сколов замороженных бактерий,
обычно выявляются две поверхности, соответствующие цито-
плазматической мембране. Скол обычно проходит по центру
гидрофобной области мембраны, расщепляя ее на два лепестка,
которым соответствует вогнутая внешняя (В, или EF) и выпук-
лая внутренняя (А, или PF) поверхности (см. рис. 9 и 12). На
этих поверхностях находятся частицы диаметром 9—11 нм, рас-
положенные в норме диффузно и соответствующие белково-ли-
пидным комплексам. На А- и В-поверхностях они расположены
асимметрично, их плотность у разных бактерий может сущест-
венно различаться. У Streptococcus faecalis на •В-поверхности
обнаружено порядка 200—400 частиц, а на A-поверхности до
4200—5000 частиц на мкм2.
При использовании метода негативного контрастирования на
мембранах многих аэробных бактерий обнаружены грибовид-
73
ные выросты с диаметром головки около 9 нм, прикрепленные
к мембране ножкой, имеющей толщину около 2 нм. Эти грибо-
видные структуры сходны со структурами, имеющимися на внут-
ренних мембранах митохондрий. У некоторых Bacillus при не-
гативном контрастировании мембран выявлены более мелкие
глобулярные структуры.
При разрушении протопластов или сферопластов в резуль-
тате осмотического шока или при обработке их ультразвуком
основная часть фрагментов разрушенных мембран замыкается
в пузырьки различного размера. У грациликутных такие пу-
зырьки могут быть образованы как цитоплазматической, так и
внешней мембранами или их элементами. Диаметр таких пу-
зырьков соответствует сотым или десятым долям микрометра.
Пузырьки обычно сохраняют основные функции, присущие мем-
бранам. При этом они могут быть «невывернутыми» или «вывер-
нутыми», у первых мембрана ориентирована по отношению
к окружающей среде, так же как у бактериальной клетки, а
у вторых наоборот. Поскольку мембраны несимметричны,
а процессы транспорта метаболитов носят векторный характер,
свойства «вывернутых» и «невывернутых» пузырьков разли-
чаются.
Функциональной стабильности мембраны способствуют ионы
Mg2+ и Са2+, при этом большое значение имеет ионная сила рас-
твора. В растворах с низкой ионной силой происходит отделе-
ние от мембраны слабосвязанных с ней белков, при этом мем-
брана теряет соответствующие функции.
Цитоплазматические мембраны фирмакутных удобно иссле-
довать, так как чувствительные к лизоциму оболочки этих
бактерий могут быть легко удалены полностью. Еще проще по-
лучить мембраны микоплазм. У грациликутных фракции цито-
плазматической мембраны можно отделить от фракций внешней
мембраны при помощи разделительного центрифугирования. При
этом маркером внешней мембраны служит ЛПС.
Цитоплазматические мембраны бактерий в целом сходны
с мембранами эвкариотических клеток, однако они богаче бел-
ками, чем, видимо, можно объяснить свойственную бактериаль-
ным мембранам полифункциональность.
Детергенты, т. е. поверхностно активные вещества, оказы-
вают сильное воздействие на мембраны, особенно ионные детер-
генты. При воздействии детергентами изменяется проницаемость
мембраны, в среду выходят внутриклеточные компоненты, чем
и определяется бактерицидный эффект поверхностно-активных
соединений. При действии детергентами на препараты мембран
последние дробятся на фрагменты различного размера. От мем-
бран отделяются белки и белковые комплексы. При обработке
особенно сильными детергентами, например додецилсульфатом
натрия, мембрана распадается на мелкие фрагменты, при этом
74
активность мембранных белковых ферментных комплексов на-
рушается.
Стабильность мембраны нарушается при воздействии хела-
тами, например ЭДТУ, связывающими двухвалентные катионы,
прежде всего Mg2+, образующий сшивки между мембранными
фосфолипидами.
В благоприятных для организма условиях мембрана обла-
дает определенной упругостью и может растягиваться. Так,
клетки Acholeplasma laidlawii, помещенные в гипотонические
растворы, набухают с увеличением поверхности на 47—51% без
нарушений целостности мембраны. Мембраны с замерзшим
липидным слоем чувствительны к осмотическому шоку и легко
разрушаются.
Липиды обычно составляют 15—50% от сухой массы мем-
браны. У большинства бактерий основная часть мембранных
липидов (70—90%) представлена амфофильными фосфолипи-
дами.
Структурную основу молекулы мембранного фосфолипида
составляет фосфатидная кислота (ФК), образованная глицери-
ном и остатками жирных кислот (R). Фосфатидная кислота
в свободном виде содержится в мембранах бактерий в неболь-
шом количестве, обычно же к ней присоединены остатки спир-
тов, аминокислот и др. (X):
X
I
О
I
О=Р—ОН
I
н н о
I I I
Н-С-----G---СН2
I I
о о
с!:=о с==о
Характерными для бактерий мембранными фосфолипидами яв-
ляются: фосфатидилэтаноламин (ФЭ) (I), фосфатидилглицерин
(ФГ) (II), дифосфатидилглицерин или кардиолипин (КЛ) (III):
I II
фк-сн2-сн2—nh2 фк—ch2—ch—сн2
I I
он он
III
ФК-СН2-СН-СН2 - ФК
I
он
75
Эти фосфолипиды характерны и для мембран эвкариот. В не-
больших количествах в мембранах бактерий содержится свобод-
ная ФК, фосфатидилинозит (ФИ), фосфатидилсерин (ФС) и
редко фосфатидилхолин (ФХ). N-метилированные дериваты ФЭ
обнаружены у Thiobacillus, Clostridium и Rhizobium. Сфинго-
липиды характерны для Bacteroides. Некоторые бактерии, осо-
бенно анаэробы — обитатели рубца жвачных животных, содер-
жат плазмалогены — фосфолипиды с алкильными группами,
соединенными с глицерином винилэфирными мостиками, причем
в качестве заместителя «X» выступает этаноламин, холин или
серин:
CH2-O-CH^CH-R
I °
II
СН —О C-R
I °
I H
CH9—О—P—О—X
I
OH
Основным фосфолипидом грациликутных обычно является ФЭ,
образующийся в результате присоединения к ФК серина с по-
следующим отщеплением карбоксильной группы.
Состав фосфолипидов в бактериальных мембранах может
сильно изменяться без нарушения функций мембраны. Однако,
если содержание ФЭ в мембране Е, coli снизится более чем на
50%, рост клеток прекращается, вместе с тем даже при полном
отсутствии кардиолипина он продолжается.
В мембранах фирмакутйых часто присутствует лизилфосфа-
тидилглицерин (Лиз-ФГ). Включение в мембрану различных
количеств фцсфолипидов с положительно заряженными груп-
пами позволяет бактериям регулировать заряд мембраны.
Наблюдается некоторая асимметрия в распределении фосфо-
липидов в мембранах. Так, у Micrococcus lysodeikticus в мем-
бранах содержится 65,6% КЛ, 24,5% ФГ и 10% ФИ. КЛ почти
равномерно распределен между ее лепестками, тогда как почти
весь ФГ расположен на наружной, а ФИ на внутренней поверх-
ности мембраны. Отрицательный заряд цитоплазматической
мембраны, по крайней мере у Е. coli, создается в основном за
счет кислых фосфолипидов — КЛ и ФГ. Первому приписывают
решающую роль в приобретении мембраной небислойной кон-
формации, что, видимо, играет существенную роль в процессах
мембранного транспорта.
Гликофосфолипиды, содержащие остатки различных саха-
ров— глюкозы, маннозы, галактозы, рамнозы, глюкуроновой
кислоты, более характерны для фирмакутных, чем для грацили-
кутных. У тех и других обнаруживаются также липиды, не со-
76
держащие фосфора, моно-, ди- и три-гликозилглицериды (I) и
ацилированная глюкоза (II):
При выращивании Pseudomonas diminuta в хемостатной
культуре, лимитированной по фосфору, наблюдали почти полное
исчезновение из мембран фосфолипидов и замещение их кис-
лыми и нейтральными гликолипидами, не содержащими фос-
фора. В мембранах микоплазм гликолипиды представлены
в значительных количествах, что обеспечивает относительную
устойчивость этих лишенных оболочки бактерий к осмотиче-
скому шоку.
В цитоплазматической мембране бактерий присутствуют ка-
ротиноиды, менахиноны, убихиноны, полиизопреноидные произ-
водные, в том числе промежуточные продукты синтеза макро-
молекул оболочки. Как известно, у фирмакутных с цитоплазма-
тической мембраной ассоциированы липотейхоевые кислоты,
представляющие собой линейный полимер глицерофосфата
с гликолипидом, прикрепленным к одному из его концов через
терминальный фосфор.
В мембрану бактерий из окружающей среды могут вклю-
чаться соединения, обычно в ней отсутствующие. Например,
холестерин включается в мембраны Bacillus, Micrococcus, Pro-
teus, а экзогенные стерины — в мембраны Mycoplasma, что необ-
ходимо для существования этих организмов.
В мембранах бактерий, в отличие от мембран эвкариот, как
правило, отсутствуют полиненасыщенные жирные кислоты и со-
держатся жирные кислоты, необычные для эвкариот.
Бактерии обычно содержат насыщенные жирные кислоты
с прямой цепью 16:0 и 18:0. Число углеродных атомов у бак-
териальных жирных кислот обычно не превышает 20. Ненасы-
щенные кислоты с одной двойной связью и кислоты с цикло-
пропановым кольцом характерны для грациликутных, а также
для стрептококков и лактобацилл. Жирные кислоты Е. coli
представлены на схеме:
77
Кислота Структура % от суммы
Пальмитиновая Преобладающие CH3-(CH2)i4COOH 25—40
(16:0) Пальмитолеиновая Н Н 1 1 СНз— (СН2) 5—С=С— (СН2) 7-СООН 25—40
(16:1) Дис-вакценовая н н 1 1 СНз- (СН2) 5-С = С— (СН2) 9-СООН 25—35
(18:1) Лауриновая Минорные СНз—(СН2)10-СООН 0-1
(12:0) Миристиновая СН3—(СН2)12—СООН 1—5
(14:0) Дис-9,10-метилен- сн2 СНз—(СН2)5—С—С—(СН2)7—соон 1-20
гексадекановая (17:0) Стеариновая 1 I Н н СНз—(СН2)16—СООН 0—1
(18:0) Лактобацилловая СН2 СНз— (СН2) 5—С-С- (СН2) 9-соон 0—1
(19:0) 1 1 Н Н Примечание: содержание чис-9,10-метиленгексадекановой кислоты воз-
растает от 1 до 20% при переходе бактерий в стацио-
нарную фазу роста.
У фирмакутных содержится большое количество Ci5- и Сп-
кислот с разветвленной цепью — изо-(1) и антеизо-(II) кислоты:
I 11
СН3 СН3
! 1
СН3-СН-(СН2)Л-СООН СН3-СН2-СН-(СН2)Л—соон.
У некоторых ползающих бактерий много (45—65%) развет-
вленных кислот, например для Flexibacter характерна кислота
20:5w3.
Состав жирных кислот бактериальных мембран сильно
варьирует. Этот признак пытаются использовать в качестве си-
стематического, хотя обычно осуществляют определения жирно-
кислотного состава всей клетки, а не только ее цитоплазмати-
ческой мембраны.
78
Большинство микоплазм не синтезируют жирные .кислоты,
последние должны содержаться в среде. Исключение составляет
Acholeplasma laidlawii, которая способна синтезировать насы-
щенные и удлинять ненасыщенные экзогенные жирные кислоты.
Она может расти без экзогенных жирных кислот, довольствуясь
собственными насыщенными кислотами. Многие штаммы мико-
плазм не только не синтезируют, но и не трансформируют жир-
ные кислоты и растут только при наличии в среде набора этих
соединений. Некоторые штаммы микоплазм развиваются только
на средах с разветвленными жирными кислотами, например
изопальмитатом, изостеаратом. Если в среде присутствует
только одна подходящая жирная кислота, то всего одна жирная
кислота содержится и в мембране этих бактерий, которые при
этом нормально растут.
На строение бактериальной мембраны распространяется
жидкостно-мозаичная модель, разработанная для мембран эв-
кариот. Мембрана образована текучим компонентом — липид-
ным бислоем. Липиды и встроенные в их слой белки образуют
подвижную мозаику. Под жидкостным состоянием понимают
способность фосфолипидных молекул к вращению и латераль-
ному перемещению в соответствующем лепестке мембраны. Это
состояние определяется как жидкостно-кристаллическое. В то
же время липидный бислой должен быть достаточно хорошим
барьером для молекул и ионов.
При понижении температуры липиды переходят в квазикри-
сталлическое состояние, когда молекулы жирных кислот плотно
упакованы и неподвижны. Они вытянуты и ориентированы пер-
пендикулярно плоскости мембраны. В этом состоянии подвиж-
ность молекул крайне ограничена, а мембрана имеет макси-
мальную толщину и минимальную поверхность.
В состоянии жидкого кристалла молекулы жирных кислот
подвижны, но ориентированы преимущественно перпендику-
лярно плоскости мембраны. При этом толщина мембраны умень-
шается, а ее поверхность увеличивается. Подвижность молекулы
жирной кислоты возрастает к центру мембраны. Скорость их
диффузии в мембранах in vivo точно не установлена, но счи-
тается, что в течение секунд молекула может «пройти» всю
длину бактериальной клетки. Переход липида из одного ле-
пестка мембраны в другой определяется как «флип-флоп», что
считается маловероятным событием, хотя он необходим для об-
мена липидов. Имеются данные, свидетельствующие об участии
мембранных белков в подобных переходах.
Кристаллизация мембраны может происходить только в до-
статочно протяженной области, включающей несколько молекул
липидов. Температура, при которой плавятся липиды, зависит
и от природы жирных кислот, и от взаимодействий соседних
липидных молекул. Прямые палочковидные молекулы насыщен-
ных жирных кислот могут быть очень тесно уложены. Темпе-
79
ратура их плавления, так же как переходная температура, по-
вышается с увеличением длины молекулы. Наличие двойной
связи резко понижает температуру плавления, так как приводит
к изгибу молекулы (рис. 21). При этом двойная связь в цис-
положении вносит больший беспорядок в укладку молекул, чем
в транс-положении. В молекуле жирной кислоты атомы угле-
рода уложены по спирали под углом 11 Г, в области же двойной
связи угол увеличивается до 123°, а в цис-положении изменяется
направление хода молекулы. Наличие одной ненасыщенной
связи может понизить температуру плавления более чем на
80° С. Изоразветвленные цепи оказывают аналогичный эффект,
причем антеизо- больший, чем изо-.
Природа полярной головки липида также влияет на темпе-
ратуру его плавления. Кроме того, отрицательно заряженные
ш и w m
а б 6 г
Рис. 21. Расположение липидов в
мембранах с различными жирными
кислотами.
а — кислота с насыщенной прямой цепью;
б — мононенасыщенная транс; в — моно-
ненасыщенная цис; г — разветвленная изо.
полярные головки взаимодействуют с двухвалентными катио-
нами, особенно с ионами Mg2+, стабилизирующими структуру
липидного слоя. Липидные молекулы, тесно ассоциированные
с белками мембраны, не участвуют в фазовых переходах. В ре-
альной гетерогенной мембране при данной температуре могут
быть домены, находящиеся в разных состояниях.
В активно растущих и делящихся клетках, как правило, мем-
браны более жидкие и содержат больше липидов. Например,
у микоплазм отношение липид/белок мембраны при переходе
в стационарную фазу роста уменьшается в 2—3 раза.
При охлаждении сначала кристаллизуется часть липидов,
содержащая преимущественно насыщенные жирнокислотные
остатки. Большая часть белков и липиды, связанные с ними,
вытесняются при этом в более жидкие области. Фрагменты мем-
браны Е. coli с различным соотношением белков и липидов были
выделены из клеток, выращенных на среде с линоленовой кис-
лотой (18:3). Сферопласты выдерживали при различных тем-
пературах и разрушали при помощи осмотического шока. Фраг-
менты мембран разделяли центрифугированием в градиенте
плотности. Если лизис клеток проводили при 46° С — выше верх-
ней границы фазового перехода, то получалась одна мембран-
ная фракция с плотностью 1,17 г/см3. Из сферопластов, разру-
шенных при 4° С, т. е. вблизи нижней границы фазового пере-
хода, были выделены три фракции с плотностями 1,11; 1,17 и
1,23 г/см3. Первая фракция содержит очень мало белка, а по-
следняя— самая тяжелая, наоборот, богата белком. На репли-
80
ках со сколов мембран, замороженных от 46° С, обнаруживаются
равномерно распределенные по поверхности мембраны частицы.
При замораживании от 4° С в мембране гладкие участки чере-
дуются с заполненными частицами участками. После лизиса при
4° С около 70% мембранных везикул большие, диаметром 400—
600 нм, и почти совсем не содержат частиц, и около 30% вези-
кул меньшего размера отличаются высоким содержанием ча-
стиц.
Как кристаллизация липидов, так и слишком малая их вяз-
кость отрицательно влияют на жизнеспособность клетки. Напри-
мер, мутант Bacillus stear other mophilus, не способный к синтезу
или удлинению насыщенных жирных кислот с достаточно длин-
ной цепью, не может расти при столь же высокой температуре,
при которой еще нормально растет дикий штамм, однако оба
штамма практически одинаково растут при более низких темпе-
ратурах.
Гомеовязкостная адаптация. У бактерий вязкость мембраны
остается приблизительно одинаковой при различных температу-
рах выращивания. Это достигается прежде всего за счет изме-
нения количества ненасыщенных и разветвленных жирных
кислот, входящих в ее состав. Однако для нормального функ-
ционирования мембраны, по крайней мере у Е, coli, насыщенные
жирные кислоты необходимы. Если их содержание падает ниже
15% от суммы жирных кислот, мембрана теряет свои барьерные
свойства для малых ионов.
В принципе мононенасыщенные жирные кислоты могут быть
заменены кислотами, имеющими в центральной части молекулы
какую-либо группу, способную препятствовать плотной упаковке
углеводородных цепей. Это могут быть кислоты с циклопропа-
новым кольцом, разветвленные, оксикислоты, бромированные и
полиненасыщенные. Такие кислоты действительно способны под-
держивать рост ауксотрофов с нарушенным синтезом ненасы-
щенных жирных кислот.
В обычных условиях мембрана Е. coli является «излишне
жидкой», что не дает клетке определенных преимуществ при
неизменной температуре или при незначительном ее понижении,
но может спасти клетку при резком понижении температуры, что
вполне вероятно. Аналогичным образом у Streptococcus mutans,
обитающего во рту человека, липидный состав мембраны обес-
печивает рост организма и при более низкой температуре, чем
температура человеческого тела.
Гомеовязкостная адаптация у бактерий может определяться
различными механизмами. Жирнокислотный состав клеток Achp-
leplasma laidlawii, выращенной в среде без экзогенных жирных
кислот, практически постоянен даже при изменениях темпера-
туры роста. В присутствии экзогенных жирных кислот изменение
жирнокислотного состава мембраны обеспечивает гомеовязкост-
ную адаптацию организма. Изменение жирнокислотного состава
6 Б. В. Громов
81
мембраны происходит в этом случае только за счет различной
растворимости в липидном бислое экзогенных жирных кислот.
Изменяя характер жирных кислот, содержащихся в среде, можно
изменить состав жирных кислот в мембране и соответственно
температурные характеристики роста Acholeplasma laidlawii
(таблица). Абсолютная нижняя граница роста 8°С не зависит
от фазового состояния липидов, так же как и абсолютная верх-
няя граница 44° С, т. е. температурные характеристики орга-
низма зависят не только от состояния липидов в мембране. При
температурах между этими крайними точками обнаруживается
зависимость пределов роста от температур фазового перехода
мембранных липидов. Оптимальная и максимальная темпера-
туры роста несколько уменьшаются в случае совсем жидких
мембран, содержащих олеиновую и линолевую кислоты. В за-
висимости от характера жирной кислоты резко изменяется ми-
нимальная температура роста. При этом оказывается, что клетки
могут еще расти, если хотя бы 10% мембранных липидов на-
ходятся в жидкостно-кристаллическом состоянии.
Температуры роста Acholeplasma laidlawii и фазового перехода
мембранных липидов (по: McElhaney, 1976)
Жирная кислота в среде Температуры роста, °C Температуры фазового перехода, °C
минимальная оптимальная максимальная средняя точка область перехода
18:0 28 38 44 41 25—55
18 : 0 i 18 36 44 32 18—42
18: W 10 36 44 21 5-32
18: 1 с 8 34 40 —13 —22 —24
При снижении температуры выращивания Е. coll К 12 на-
блюдается увеличение относительного содержания ненасыщен-
ных жирных кислот в цитоплазматической мембране. У Bacil-
lus и Clostridium при изменении температуры изменяется отно-
сительное количество мононенасыщенных жирных кислот или
положение метильной группы у разветвленных кислот — при по-
нижении температуры от изо- к антеизо. Например, Bacillus
licheniformis при 20° С содержит 43% ненасыщенных кислот,
а при 35QC — 15%.
Гомеовязкостная адаптация определяется сочетанием зави-
симых от температуры изменений специфичности ацилтрансфе-
раз на уровне синтеза фосфолипидов и изменений активности
систем синтеза жирных кислот, определяемых изменениями
силы гидрофобных взаимодействий, которые, по крайней мере
у Е. coli, выступают в роли регулятора синтеза определяемых
жирных кислот.
82
Мембраны бактерий, выращенных при разных температурах,
отличаются не только составом жирных кислот, но иногда и ха-
рактером полярных липидных головок. Так, у Acholeplasma laid-
lawii синтез моноглюкозилдиглицерида усиливается при пони-
жении температуры и увеличении содержания насыщенных жир-
ных кислот. В мембранах Bacillus megaterium, выращенных при
более высокой температуре, отмечено увеличение количества
кислых фосфолипидов и обнаружены изменения в составе мем-
бранных белков. Протопласты, полученные из клеток Вас. mega-
terium, выращенных при этих условиях, оказались устойчивее
к осмотическому шоку и менее проницаемы, чем полученные из
бактерий, росших при низкой температуре.
Мембранные белки составляют около 50% поверхности цито-
плазматической мембраны Е. coli. Примерно 10% мембраны
образовано прочно связанными белково-липидными комплек-
5
о
Рис. 22. Взаимодействие белков с липидным бислоем мембраны.
а __ в _ белки (а — поверхностные, б — периферические, в — интеграль-
ные). Заштрихована гидрофобная часть молекул белка.
сами. Молекула любого встроенного в мембрану белка окружена
45—130 и более липидными молекулами. Около половины сво-
бодных липидов связано с периферическими белками мембраны.
Белковый состав цитоплазматической мембраны более разно-
образен, чем липидный. Так, в цитоплазматической мембране
Е. coli К 12 обнаружено около 120 различных белков. В зави-
симости от ориентации в мембране и характера связи с липид-
ным бислоем принято условно разделять связанные с мембра-
ной белки на периферические и интегральные. Периферические
белки в свою очередь могут быть разделены на два типа: соб-
ственно периферические, связанные с липидами в основном
электростатически, но часто погруженные в гидрофобную об-
ласть, и поверхностные, связанные исключительно электроста-
тическими взаимодействиями и находящиеся вне гидрофобной
области мембраны (рис. 22).
Периферические белки слабо связаны с мембраной и легко
могут быть освобождены при изменении ионной силы раствора
или при воздействии хелатами. Они обычно растворяются в ней-
6*
83
Рис. 23. Организация
АТФазного комплекса Е.
coli [Walker е. а., 1982].
Объяснения в тексте.
тральном водном буфере и находятся в растворе без липида.
Такие белки, обладающие энзиматической активностью, не нуж-
даются для ее проявления в присутствии липида. К перифери-
ческим белкам относятся НАДН-дегидрогеназа, малатдегидро-
геназа и др., а также некоторые белки, входящие в АТФазный
комплекс (рис. 23). АТФазный комплекс представляет собой
группу определенным образом расположенных белковых субъ-
единиц, контактирующих с цитоплазмой, периплазматическим
пространством и образующих в мемб-
ране канал, через который осуществ-
ляется переход протона. Участок комп-
лекса, обозначаемый Fi, погружен
в цитоплазму, а и с — компоненты уча-
стка То — гидрофобными сторонами мо-
лекул (заштрихованы на рисунке) по-
гружены в мембрану. Субъединица Ь
частично погружена в мембрану своей
гидрофобной частью и осуществляет
связь мембранной и цитоплазматиче-
ской частей ферментного комплекса,
а также связь синтеза АТФ в участке
F\ с протонным потенциалом в мем-
бране. Субъединицы а, Ь и с обеспе-
чивают протонный канал (обозначен
пунктиром). Другие компоненты комп-
лекса обеспечивают его структурную
и функциональную целостность.
белков с липидами мембраны опреде-
ляется главным образом гидрофобными взаимодействиями, кото-
рые могут быть настолько, прочными, что эти белки отделяются
от элементов мембраны только при жестких воздействиях —
детергентами, органическими растворителями, растворами мо-
чевины. В растворе они обычно ассоциированы с липидами и
часто нуждаются в их присутствии для проявления энзиматиче-
ской активности. К интегральным белкам мембраны Е. coli
относятся, например, сукцинатдегидрогеназа, цитохром Ь. При
взаимодействии с мембраной интегральным белком становится
полипептидный антибиотик — грамицидин А.
Связь интегральных
§ 2. Транспортная функция
цитоплазматической мембраны
Транспорт гидрофильных молекул через цитоплазматиче-
скую мембрану определяется системами специфических белков,
синтез которых часто индуцибилен.
Как правило, перенос определенной молекулы может осуще-
ствляться несколькими путями, причем специфичность и эффек-
тивность транспортных систем может сильно различаться. Так,
84
например, галактозу £. coli может транспортировать при по-
мощи, по крайней мере, 7 различных систем переноса.
Обычно принято выделять 4 типа транспортных систем, обес-
печивающих проникновение молекул в бактериальную клетку:
1) пассивная диффузия, 2) облегченная диффузия, 3) активный
транспорт и 4) перенос радикалов.
Пассивная диффузия определяется только разностью кон-
центраций молекул вне и внутри клетки. Процесс не стереоспе-
цифичен, и поэтому не наблюдается конкурентных отношений
между структурными аналогами.
мому, обеспечивает проникно-
вение в клетку молекул воды.
Существенное значение пас-
сивная диффузия приобретает
при нарушениях жизнедеятель-
ности клетки.
При облегченной стереоспе-
цифичной диффузии наблюда-
ются конкурентные взаимодей-
ствия между структурными
аналогами. Скорость транспор-
та при повышении концентра-
ции субстрата возрастает толь-
ко до определенного предела,
т. е. имеет место насыщение
системы транспорта. Облегчен-
ная диффузия связана с рабо-
той специфических переносчи-
ков, находящихся в мембране.
Обычно происходит симпорт
субстрата с протоном и бел-
ком-переносчиком
Подобный процесс, по-види-
Рис. 24. Схема сопряжения протон-
ного насоса и симпорта протонов с
субстратом (с) при участии мем-
бранного симпортера [Tristram,
1978].
показано в нижней
(транспортер), как это
части схемы на рис. 24. Процесс облегченной диффузии может
быть не сопряжен с энергетическими реакциями, но у голодаю-
щих клеток этот транспорт обычно нарушается.
Активный транспорт тоже связан с работой специфического
белка-переносчика, но в этом случае функционирует еще спе-
циальная система, обеспечивающая транспорт энергией. Он
может идти против градиента концентрации. Энергетическое
обеспечение активного транспорта обычно объясняют, исходя из
хемиосмотической теории Митчелла. При дыхании в располо-
женной в мембране дыхательной цепи происходит выброс про-
тонов. Их перенос через мембрану создает протондвижущую
силу Др, определяемую мембранным потенциалом Дф (отрица-
тельный внутри клетки) и градиентом протонов ДрН (внутри
щелочной)
Др — Дф — ZpH,
где Z — фактор перевода pH в мВ.
85
У Е. coli, стрептококков и ряда других бактерий Аф в норме
составляет 50—250 мВ.
Протондвижущая сила создается также в результате фото-
синтетического транспорта электронов, гидролиза АТФ. По-
следний особенно важен для бактерий, у которых отсутствуют
цепи цитохромов, например для Streptococcus faecalis. Мембран-
ные белки выступают в роли симпортеров, образуя и перенося
комплекс субстрат — протон — симпортер (рис. 24). Возможен
также унипорт — перенос только одного субстрата (без про-
тона) и антипорт — перенос двух разных субстратов в противо-
положных направлениях.
Активный транспорт может быть обусловлен также искусст-
венно созданным мембранным потенциалом. Электрохимический
градиент возникает за счет перехода через мембрану проникаю-
щего в клетку аниона, например SIN-, или за счет выхода из
клетки иона К+ в присутствии ионофора валиномицина, обра-
зующего в мембране поры, через которые К+ свободно диффун-
дирует. Обычно содержание К+ в клетке выше, чем в среде, его
выход создает протондвижущую силу и облегчает транспорт
в клетку сахаров и аминокислот. На такого рода транспорт не
влияют ингибиторы АТФазы или дыхания.
Снижение значения pH среды также может способствовать
транспорту, в частности сахаров и аминокислот, за счет транс-
мембранного градиента pH.
В зависимости от особенностей субстрата составляющие
протондвижущей силы могут иметь различное значение для его
транспорта. Так, при физиологических значениях pH лизин не-
сет положительный заряд, глютаминовая кислота отрицатель-
ный, изолейцин нейтрален. В опытах со Streptococcus faecalis
было установлено, что изолейцин переносится как симпортер,
за счет протондвижущей силы (Аф— Z-pH). Транспорт лизина
осуществляется переносчиком, функционирующим как унипор-
тер, и определяется мембранным потенциалом Аф, глютамат
переносится симпортом, т. е. одновременно с протоном, и при
этом не несет заряда. Таким образом, его транспорт опреде-
ляется только градиентом pH (—Z-ApH).
В процессе жизнедеятельности клетки происходит постоян-
ный вынос протонов из клетки в среду, т. е. их концентрация
в клетке низка. Поэтому комплекс симпортер—протон—субстрат
распадается, и последний высвобождается в цитоплазму. У го-
лодающих клеток выноса протонов не происходит, и их концен-
трация в клетке возрастает. В конце концов может создаться
обратный градиент протонов и начаться вынос субстратов из
клетки. Поэтому у голодающих клеток нарушается не только
процесс активного транспорта, но и облегченной диффузии.
Для транспорта в клетку Е. coli сахаров используются раз-
личные системы транспорта (рис. 25). Транспорт лактозы опре-
деляется белком М цитоплазматической мембраны, являющимся
86
продуктом гена lac Y лактозного оперона, перенос лактозы осу-
ществляется как симпорт сахара с протоном. Транспорт р-метил-
галактозидов происходит с участием специфического периплаз-
матического белка и белков цитоплазматической мембраны.
В транспорте мальтозы участвуют специализированный белок
порин внешней мембраны Lam В, периплазматический белок и
белки цитоплазматической мембраны. Две последние системы
используют энергию АТФ, переноса протона в процессе транс-
порта субстрата здесь не происходит.
Рис. 25. Системы активного транспорта сахаров у Е. coli [Wal-
ker е. а., 1982].
Поглощение аминокислот Е. coll осуществляется путем ак-
тивного транспорта. Системы транспорта аминокислот весьма
специфичны, хотя иногда одна система может переносить ряд
структурно близких аминокислот, а одна и та же аминокислота
может переноситься несколькими системами. Транспортные си-
стемы ряда аминокислот включают периплазматические связы-
вающие белки, они могут быть конститутивными или индуци-
бельными. У Е. coli, например, имеется индуцибельная система
транспорта триптофана. Кроме систем переноса аминокислот
у Е. coli имеются различные транспортные системы для дипеп-
тидов (в LL-конфигурации) и олигопептидов.
Транспортные системы аминокислот, не связанные с пери-
плазматическими белками-переносчиками и, следовательно,
устойчивые к осмотическому шоку, например транспорт про-
лина, серина, фенилаланина, глицина и цистеина, в равной мере
могут быть обеспечены энергией за счет дыхания или гидролиза
АТФ. Эти системы не чувствительны к арсенату, резко снижаю-
щему пул АТФ в клетке, но не затрагивающему систему созда-
ния мембранного потенциала в процессе дыхания. Эти системы,
однако, чувствительны к действию ингибиторов — разобщителей
87
электронного транспорта. В анаэробных условиях эти системы
зависят от активности АТФазы. Таким образом, для них основ-
ное значение имеет протондвижущая сила, которая создается
за счет дыхания или гидролиза АТФ (см. рис. 24).
Системы, включающие работу периплазматических белков-
переносчиков, и чувствительные к осмотическому шоку у Е. coll
системы транспорта глютамина, аргинина, ДАП, лейцина, изо-
лейцина нуждаются непосредственно в АТФ. В анаэробных
условиях они могут транспортироваться за счет гликолитически
продуцируемого АТФ в отсутствие АТФазной активности (у му-
тантов). Эти системы чувствительны к арсенату, но относительно
устойчивы к разобщителям.
Рис. 26. Схема фосфотрансферазной системы транспорта сахаров Е< coli
[Tristram, 1978].
Объяснения в тексте.
В процессе работы транспортных систем, устойчивых к осмо-
тическому шоку, происходит одновременное поступление прото-
нов в клетку, но при работе систем, имеющих периплазматиче-
ские белки, не происходит поглощения клеткой протонов, т. е.
схема, приведенная на рис. 24, справедлива только для транс-
порта, не связанного с работой периплазматических белков.
Перенос радикалов играет важную роль в транспорте ряда
соединений у многих бактерий. Подобные системы изучены
у представителей Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Staphy-
lococcus aureus, Bacillus subtilis. У этих бактерий обнаружена
фосфоэнолпируватная транспортная система для переноса ряда
сахаров. Она включает 4 белка, 3 из которых участвуют в про-
межуточных реакциях фосфорилирования (рис. 26). Фермент I
и белок НРг (устойчивый к температуре протеин) расположены
в цитоплазме и участвуют в фосфорилировании многих углево-
дов. В присутствии фермента I и фосфоэнолпирувата (ФЭП)
НРг фосфорилируется в НРг—Р и переносит фосфатную группу
на глюкозу, маннозу или фруктозу. Этот процесс катализируется
88
белками цитоплазматической мембраны — НА и II В. Фермент
ПА специфичен для глюкозы, фруктозы или маннозы, т. е.
имеются три его разновидности. Фермент IIВ неспецифичен.
Специфическую функцию иногда может выполнять цитоплазма-
тический белок, известный как фактор III, тогда в системе уча-
ствует только один мембранный белок II В. Наблюдаются и
другие модификации этой системы у разных бактерий.
Мутанты по белку II В плейотропны, т. е. сразу теряют спо-
собность поглощать ряд сахаров, а мутанты по белкам ПА
недостаточны лишь в отношении транспорта сахара, специфич-
ного для данного мутантного белка. У Staphylococcus aureus,
видимо, все используемые данной бактерией сахара транспор-
тируются при помощи фосфотрапсферазной системы.
Нуклеозиды и основания, входящие в состав нуклеиновых
кислот, переносятся в клетку Е. coli благодаря системе транс-
локации радикалов, транспорт жирных кислот с Cs по Cie У этой
бактерии также связан с их модификацией.
Транслокация белковых молекул. Предшественники белков,
экспортируемых через цитоплазматическую мембрану, синтези-
руются на связанных с ней полисомах. Они большего размера
и имеют дополнительную гидрофобную последовательность на
N-конце пептидной цепи. Молекула транслоцируется через мем-
брану по мере ее синтеза. Процессинг предшественников осуще-
ствляется с помощью мембранно-связанных сигнальных пепти-
даз после пересечения белком мембраны. Детали механизма
транспорта белков еще окончательно не установлены. Суще-
ствует несколько моделей, с помощью которых пытаются объяс-
нить этот процесс. Согласно широко принятой сигнальной гипо-
тезе транслокация белка происходит через пассивный белковый
канал, образуемый специфическими рецепторными белками мем-
браны при взаимодействии с ней сигнального пептида секрети-
руемого белка (рис. 27). Для транслокации используется энер-
гия элонгации полипептидной цепи на рибосомах. Согласно
другим моделям транслокация осуществляется непосредственно
через липидный бислой. Мембранно-триггерная модель предпо-
лагает самосборку и изменение конфигурации белка при его
переходе из водной среды в мембрану (рис. 27). Ряд данных
свидетельствует о необходимости для транспорта экспортируе-
мых белков одновременного синтеза липидов. В 1982 г. М. А. Не-
смеяновой была предложена модель сопряженной транслока-
ции белка и фосфолипидов, предполагающая активную роль
фосфолипидов мембран, выступающих в качестве лидеров
в транслокации белка (рис. 28). Согласно этой модели гидро-
фильный участок N-концевого сигнального пептида секретируе-
мого белка, который синтезируется на рибосомах, инициирует
связь белка с мембраной путем образования ионного взаимо-
действия между его положительно заряженным 'участком и от-
рицательно заряженным фосфолипидом, например кардиолипи-
89
ном внутренней поверхности цитоплазматической мембраны.
Следующий за дистальным гидрофобный участок сигнального
пептида внедряется в мембрану в форме петли. Экранирование
заряда фосфолипида и высокая подвижность жирных кислот —
необходимое условие для такого внедрения. Результатом взаи-
шиш
/г
Рис. 27. Механизмы транслокации белка через цито-
плазматическую мембрану согласно сигнальной (а) и
мембранно-триггерной (б) гипотезам [Несмеянова,
1982].
р — рецепторные белки мембран, образующие белковый канал;
LP — лидерная пептидаза; Е — электрохимический градиент.
модействия сигнального пептида с фосфолипидами является
инициация их трансмембранного движения. При этом взаимо-
действии заряд фосфолипида гасится, и, теряя гидрофильные
свойства, фосфолипид приобретает способность передвигаться
в гидрофобную область мембраны и увлекает за собой связан-
ный с ним пептид. При этом вновь синтезируемый белок и фос-
90
фолипид способствуют движению друг друга. Сигнальный пеп-
тид за счет сил, возникающих в процессе- его синтеза на рибо-
сомах, толкает фосфолипид, который в свою очередь тащит за
собой белок. Можно предположить, что взаимодействие синте-
зируемого белка с фосфолипидом инициирует потерю мембраной
Сигнальная пептидаза
Рис. 28. Модель транслокации белка через цитоплазматическую мембрану,
сопряженной с транслокацией фосфолипидов [Несмеянова, 1982].
1 — вновь синтезированный пептид, содержащий N-дистальный заряженный участок
сигнальной последовательности; 2 — пептид связывается с отрицательно заряженным
фосфолипидом; 3 — гидрофобный участок пептида синтезируется и внедряется в мем-
брану в форме петли; 4, 5 — кислый фосфолипид теряет свой заряд и начинает
транс-бислойное движение, индуцируя образование гидрофильного канала и протаски-
вая гидрофильную часть секретируемого белка через канал; 6, 7 -- элонгация поли-
пептида завершается, сигнальная последовательность удаляется пептидазой и белок
высвобождается из мембраны.
бислойной конфигурации. При «флип-флоп» движении фосфо-
липидов образуется гидрофильный липидный канал, через ко-
торый основная гидрофильная часть белка линейно транслоци-
руется по мере синтеза, протаскиваемая движущимися фосфо-
липидами с заякоренным сигнальным пептидом. На внешней
стороне цитоплазматической мембраны сигнальный пептид от-
щепляется сигнальной пептидазой.
§ 3. Внутриклеточные мембранные
системы
В клетках многих бактерий при исследовании их различ-
ными методами не удается обнаружить каких-либо других мем-
бран, кроме цитоплазматической. Развитые системы внутрикле-
точных мембран имеют фотосинтезирующие, хемосинтезирующие
и некоторые другие бактерии.
Мезосомы представляют собой часто относительно простые,
а иногда и довольно сложные впячивания цитоплазматической
мембраны, характерные для разнообразных бактерий. Имею-
щиеся в литературе о них данные весьма противоречивы.
Характер мезосом и их количество в клетках одной и той же
бактерии может сильно варьировать в зависимости от метода
91
исследования, поэтому не всегда возможно доказать даже реаль-
ность существования этих структур.
У бактерий, оболочка которых проницаема для данного кра-
сителя, мезосомы можно выявить методом негативного контра-
стирования целых клеток. Для этого обычно используют фосфо-
ровольфрамовую кислоту. Если окраска не удается, клетки
предварительно обрабатывают ЭДТА для нарушения целост-
ности внешней мембраны. При таком способе окраски краситель
проникает в мезосомы, и они становятся темными на фоне свет-
лой цитоплазмы (рис. 29). Разумеется, нельзя исключить воз-
можность возникновения артефактов за счет нарушения целост-
ности клетки под воздействием красителя.
Рис. 29. Негативно контрасти-
рованная клетка бактерии с
полярно расположенной мезо-
сомой. Ув. X 15 000.
Рис. 30. Мезосомы грамположительной
бактерии, ассоциированные с клеточной
перегородкой. Ув. хЗОООО.
На срезах бактерий мезосомы представляют собой ламелляр-
ные стопки или спирально упакованные ламеллы, везикулярные
или тубулярные структуры, а также смешанные мембранные
системы, образованные трубочками, пузырьками и ламеллами
(рис. 30). Мезосомы выявляются преимущественно как ламеллы
при использовании фиксатора низкой ионной силы и бедного
двухвалентными катионами, тогда как при использовании фик-
сатора с NaCl и ионами Са2+ обнаруживаются преимущественно
пузырьки диаметром около 35 нм. При использовании стандарт-
ного фиксатора по Рейтеру и Келленбергеру или при предфик-
сации глутаровым альдегидом выявляются трубочки, цепочки
пузырьков и ламеллярные элементы. Пузырьки и ламеллы
видны также на репликах со сколов замороженных бактерий.
Сравнительно многим наблюдениям соответствует схема строе-
ния мембранного комплекса, приведенная на рис. 31. Мезосом-
ный комплекс ограничен мешкообразной инвагинацией цито-
плазматической мембраны. Мембрана мезосомы в свою очередь
92
соединена с внутренним трубчатым выростом, тесно закручен-
ным в клубок. Общая длина трубочек такого комплекса может
достигать 10 мкм, т. е. может быть в несколько раз больше, чем
длина самой бактерии.
Мезосомы у одних бактерий выявляются чаще, у других
реже. Для фирмакутных они более характерны, чем для граци-
ликутных, однако, по-видимому, нет оснований говорить о ме-
зосомах как о структурах, характерных для определенных форм
бактерий.
Очевидно, что под названием мезосомы описаны образова-
ния различной природы. Наиболее обычным и легко обнаружи-
Рис. 31. Строение мезосомного комплекса [Burdett, 1972].
в — ветвящиеся внутренние трубочки; к — контакт внутренних мем-
бран с мембраной мешочка; м — мембрана, окружающая мешо-
чек; с — скопление пластинчатых мембранных элементов; т — труб-
чатые элементы.
ваемым типом мезосом являются мембранные кольцевые впячи-
вания цитоплазматической мембраны, расположенные в зоне
образования клеточной перегородки в клетках фирмакутных. По
мнению некоторых авторов, только эти образования и следует
называть мезосомами. Они формируются в зоне роста клеточ-
ной перегородки, их форма и строение сильно варьируют даже
у клеток одного вида. Это могут быть ламеллярные выросты,
простые или спирально закрученные, трубчатые элементы, тоже
простые или скрученные в спиральный клубок (рис. 32). Мезо-
сомы на срезах обнаруживаются с обеих сторон перегородки
или только на стороне одной из дочерних клеток. По мере роста
перегородки их строение изменяется. Например, у Micrococcus
lysodeikticus в начале деления клетки мезосомы пластинчатые,
93
но позже наряду с ламеллярными и трубчатыми элементами
появляются пузыревидные элементы мембран, в первую очередь
в части мезосомы, удаленной от растущей перегородки. После
завершения образования перегородки ламеллы мезосом пол-
ностью распадаются на пузырьки, сначала собранные в гроздья,
а затем выбрасываемые в периплазму. При этом мезосома исче-
зает, а у вновь образующейся перегородки возникают новые ин-
вагинации цитоплазматической мембраны.
Образование перегородок у фирмакутных в некоторых усло-
виях может происходить и без дифференцировки мезосом, в том
числе и у тех видов, у которых мезосомы обычно выявляются.
Таким образом, мезосомы не являются абсолютно необходимыми
для нормального деления. Поскольку полоса инициации клеточ-
ного деления у бактерий детерминирована, функциональная
Рис. 32. Типы строения истинных мезосом [Би
рюзова, Поглазова, 1977].
а — ламеллярный; б — г — тубулярный типы.
дифференцировка мезосомы или соответствующего участка ци-
топлазматической мембраны представляется несомненной.
Термин нуклеоидосомы относится к мезосомоподобным обра-
зованиям, связанным с хромосомой. Связь ДНК со специфиче-
ским участком мембраны необходима для функционирования
генома, однако, так же как истинные мезосомы, нуклеоидосомы
выявляются не у всех бактерий и не всегда, т. е. их присутствие
в клетке не обязательно. По широко распространенному убеж-
дению нуклеоидосомы определяют расхождение дочерних хро-
мосом после репликации. Связанные с хромосомой инвагинации
могут иметь различное строение, они выявляются как ламелляр-
ные или трубчатые структуры или в виде мешочков, включаю-
щих и ламеллы, и трубочки.
Весьма дискуссионным является вопрос о возможной связи
с мезосомами ферментов дыхательной цепи аэробных бактерий.
По мнению некоторых исследователей, основанному на данных
цитохимических наблюдений, преимущественно светооптических,
но отчасти и электронно-микроскопических, определенные мем-
бранные структуры являются центрами дыхательной активности
бактерий, т. е. представляют собой своеобразные аналоги мито-
94
хондрий. При окраске клеток ряда бактерий специфическими
для митохондрий флюорохромами — берберинсульфатом, ауро-
фосфином и тетрациклином в каждой клетке окрашивается не-
сколько гранул. На гранулах также происходит восстановление
януса зеленого, солей тетразолия и азотнокислого теллура.
Число гранул в клетке зависит от ее физиологического состоя-
ния. В стационарной фазе роста- культуры клетки содержат
единичные гранулы, в лаг-фазе происходит увеличение числа
гранул.
Некоторые исследователи рассматривают мезосомы как
участки проникновения в клетку трансформирующей ДНК и
прикрепления эписом, а также как выделительный аппарат и
место синтеза экзоферментов. Однако согласно другому весьма
распространенному мнению, мезосомы бактерий функционально
инертны и образуются в результате нарушения координации
биосинтетических процессов, когда в клетке появляется избыток
мембранного материала. Скопления внутрицитоплазматических
мембран действительно часто образуются в клетках с нарушен-
ным обменом. Высказывается также мнение, что во многих слу-
чаях мезосомы представляют собой артефакты и образуются
в результате неадекватных методов фиксации или предшествую-
щих ей операций. Иногда, однако, внутриклеточные мембранные
структуры выявляются и на репликах со сколов замороженного
материала. В пользу биохимической инертности многих мезосом
свидетельствуют наблюдения, в соответствии с которыми мем-
браны мезосом на сколах почти лишены глобулярных структур,
в отличие от цитоплазматической мембраны. У фирмакутных
мезосомы выталкиваются из клетки при образовании протопла-
стов. Это позволяет частично разделить мембраны мезосом и
собственно цитоплазматические, хотя такое разделение может
и не быть полным. Тубулы мезосом, изолированные, например,
из Micrococcus lysodeikticus, не обладали сукцинатдегидроге-
назной и НАДФН-оксидазной активностями, содержание в них
цитохромов и АТФ было ниже, чем во фракции цитоплазмати-
ческой мембраны.
Функциональная роль мезосом в бактериальной клетке
остается неясной, представление о мезосомах как о специали-
зированных мембранных органеллах бактериальных клеток
пока нельзя считать доказанным.
Хроматофоры. Для некоторых групп бактерий характерно
наличие и других внутриклеточных мембранных систем различ-
ного строения (рис. 33), которые являются производными цито-
плазматической мембраны и пространственно с ней связаны,
хотя такая связь не всегда обнаруживается.
На внутриклеточных мембранных системах, обозначаемых
как хроматофоры, локализованы процессы фотосинтеза у пур-
пурных бактерий. У Rhodospirillum, Thiocysiis, Ohromatium и
многих других пурпурных бактерий мембранные структуры
95
хроматофора имеют вид трубочек и пузырьков диаметром 20—
100 нм. Трубочки и пузырьки образуют в клетке сложную мем-
бранную сеть и в многочисленных участках сохраняют связь
с цитоплазматической мембраной. На репликах со сколов таких
мембран на внутренних поверхностях лепестков обнаруживаются
частицы диаметром 7 и 10 нм.
У других видов пурпурных бактерий, например у Thiocapsa
pfennigii, хроматофор образован системой трубочек, располо-
женных параллельными рядами или ветвящихся. Хроматофоры
Rhodopseudomonas gelatinosa и Rh. tenue представляют собой
сдвоенные мембранные пластины, являющиеся выростами цито-
плазм заческой мембраны. Сдвоенные фотосинтетические мем-
Рис. 33. Срез бактериальной
клетки в области развитой
мембранной внутриклеточной
системы. Ув. X 30 000.
Рис. 34. Последовательные этапы
(1—4) формирования в почках Rho-
domicrobium vannielii хроматофора
как деривата цитоплазматической
мембраны [Whittenbury a. Dow,
1977].
браны обычно называют тилакоидами. В клетках некоторых
пурпурных бактерий тилакоиды собраны в стопки. Стопки дис-
ковидных тилакоидов имеются в клетках ряда видов Rhodo-
pseudomonas и Ectothiorhodospira. Почкующиеся формы пур-
пурных бактерий Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas viridis
и др. имеют хроматофоры в виде пластинок, расположенных па-
раллельно клеточной стенке. Такой хроматофор иногда состоит
из нескольких тилакоидов, на полюсах клетки он имеет отвер-
стия, через которые в почки может проходить ДНК после де-
ления нуклеоида. При почковании тилакоиды остаются в мате-
ринской клетке, а в почке образуются заново (рис. 34).
В отличие от хлоропластов растений хроматофоры бактерий
могут исчезать и образовываться заново. Это явление наблю-
дается у бактерий, способных к гетеротрофному развитию
в темноте. При этом хроматофоры в темноте исчезают и вновь
образуются при выращивании бактерий на свету. Наибольшее
96
Рис. 35. /Мембранные
monas methanica (а)
bovis (б) [Тюрин, Гальченко, 1976].
системы Methylo-
и Methylobacter
количество хроматофоров наблюдается в клетках бактерий, вы-
ращиваемых при низких интенсивностях света.
Системы внутриклеточных мембран имеются у большинства
нитрифицирующих бактерий, характер их строения различен
у разных видов. У Nitrosomonas europea — это стопки перифери-
ческих ламелл. У Nitrobacter winogradskyi параллельные обо-
лочке ламеллы расположены у одного из полюсов клетки.
У Nitrosococcus oceanus стопки ламелл сосредоточены в центре
клетки, а у Nitrosococcus mobilis цитоплазматическая мембрана
образует трубчатые выросты. Внутриклеточные мембраны от-
сутствуют у Nitrosospira, предполагают, что это связано с тем,
что у этой бактерии в результате ее своеобразного строения
относительно велика поверх-
ность самой цитоплазмати-
ческой мембраны.
Развитые системы внут-
риклеточных мембран ха-
рактерны для метанокисля-
ющих бактерий — метило-
бактерий. У них встречают-
ся два типа таких мембран.
Мембраны I типа представ-
ляют собой стопки плотно
упакованных везикулярных
дисков, распределенных по
всей цитоплазме (рис. 35).
Они обнаружены у Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus.
Мембраны II типа, характерные, например, для Methylosinus,
Methylocystis, Methylobacterium, представляют собой спаренные
мембранные слои, расположенные по периферии цитоплазмы.
Функциональная роль внутриклеточных мембран метилотрофов
не вполне ясна. Предполагают, что благодаря их наличию увели-
чивается локальная концентрация субстратов (метана и кисло-
рода) метанмонооксигеназы, происходит пространственное сбли-
жение всех компонентов, участвующих в окислении метана. Об-
разование внутриклеточных мембран и степень их развитости
определяются условиями культивирования и функциональным
состоянием клеток. В частности, мембраны более развиты при
относительно низком содержании кислорода и метана. Иногда
мембраны в клетках вообще отсутствуют’, таким образом они
не являются обязательными для осуществления процесса окис-
ления метана (в отличие от хроматофоров, без которых у бак-
терий не может осуществляться процесс фотосинтеза).
Мембранные структуры I типа образуются за счет инваги-
нации цитоплазматической мембраны на одном из полюсов, хотя
точка контакта внутриклеточных и цитоплазматической мембран
может быть несколько сдвинута от полюса. Мембраны либо
образуют стопки, в которых межмембранное пространство не-
7 Б. В. Громов
97
прерывно, либо их формирование имеет дискретный характер,
в результате чего образуются отдельные уплощенные везикулы.
Системы внутриклеточных мембран наблюдаются у бакте-
рий, окисляющих алканы, причем они образуются в клетках
бактерий при окислении низкомолекулярных алканов, например
этана, пропана, но при развитии бактерий на алканах Сю и бо-
лее мембраны в клетках отсутствуют.
Мембраны архебактерий обладают особым составом липидов
и резко отличаются в этом отношении от мембран эубактерий
и эвкариот. Гликолипиды архебактерий содержат пары идентич-
ных изопреноид-разветвленных полностью насыщенных С2о фи-
танов (I) или С40 бифитанов (II), соединенных эфирными свя-
зями:
1
СН20н сн.он
II I
I I
сн — снг
I
снг—он
Диэфир состоит из глицерина с 2 цепями С20 фитанола, тетра-
эфир образован 2 остатками глицерина, соединенными 2 одина-
ковыми парами С40 бифитанилдиола. Диэфир является един-
ственным гликолипидом у некоторых крайне галофильных бак-
терий. Тетраэфиры присутствуют у термофилов Thermoplasma
и Sulfolobus. Ди- и тетраэфиры содержатся также в мембранах
метанобразующих бактерий. У разных видов они содержатся
в различных соотношениях. Цепи фитанила могут быть как
ациклическими, так и содержать циклопентильные кольца. На-
личие в молекуле колец способствует ее стабилизации в мем-
бране, снижает текучесть мембраны. Особенно много цикличе-
ских групп имеется в молекулах фитанила из мембран Sulfo-
lobus, растущего при высоких температурах.
Диэфиры архебактерий способны образовывать обычные
билипидные мембраны. Молекула тетраэфира имеет длину по-
рядка 4,5—7,5 нм, тогда как толщина всей мембраны около? нм.
Очевидно, что мембрана, образованная тетраэфирами, представ-
ляет собой липидный монослой. При скалывании замороженных
бактерий такие мембраны не расщепляются на два лепестка.
В мембранах архебактерий присутствуют полярные фосфо-
и гликолипиды, образованные на основе ди- и тетраэфиров.
В состав нейтральных липидов архебактерий входят изопрено-
идные и гидроизопреноидные углеводороды, прежде всего сква-
лены (Сзо-изопреноиды).
98
Отличие липидов архебактерий от липидов эубактерий и эв-
кариот является одним из свидетельств особого эволюционного
пути этой группы организмов. Интересно, что изопреноиды,
сходные с таковыми архебактерий, в том числе С20 изопреноид,
происходящий из фитанилового диэфира, обнаруживают в со-
ставе нефтей и древних осадочных пород. Считают, что это
свидетельствует о большой роли архебактерий в жизни био-
сферы в древние периоды ее эволюции.
Особые разновидности мембран обнаружены у крайне гало-
фильных архебактерий — галобактерий. При помещении палоч-
ковидных клеток Halobacterium в дистиллированную воду их
оболочки растворяются. Из полученного гомогената раздели-
тельным центрифугированием можно выделить фракции крас-
ных и пурпурных мембран. Красные мембраны содержат бак-
териоруберины — характерные для галобактерий красные пиг-
менты, фракция пурпурных мембран — белок бактериородопсин,
подобно родопсину глаза животных связанный с ретиналем.
Пурпурные мембраны представляют собой специализированные
участки цитоплазматической мембраны и могут составлять до
50% ее поверхности. Они образуются при выращивании бакте-
рий на свету в анаэробных условиях. Молекулы бактериородоп-
сина лежат в одной плоскости и собраны по 3 в группы, кото-
рые расположены гексагонально в мембране. Молекула белка
в значительной ее части представлена а-спиралью и, пронизы-
вая мембрану насквозь, выполняет функцию протонного насоса,
работающего за счет энергии света, осуществляющего синтез
АТФ. Таким образом, пурпурные мембраны осуществляют осо-
бый тип фотосинтеза и снабжают клетку АТФ.
§ 4. Нуклеоид
Клетка Е. coli содержит одну хромосому, представляющую
собой замкнутую в кольцо молекулу ДНК, длина которой, по
данным разных исследователей, может достигать 1,1—1,6 мм.
Количество ДНК в клетке Е. coli зависит от скорости роста,
у быстро растущих клеток на хромосоме имеется несколько
репликационных вилок, клетки могут содержать несколько ну-
клеоидов. У некоторых бактерий клетка в норКте содержит не
одну, а много хромосом. Так, вегетативные клетки Вас. subtilis
имеют от 2 до 9 геномов и соответственно несколько нуклеои-
дов, в клетке Azotobacter vinelandii около 40 хромосом, органи-
зованных в один нуклеоид. Множественные геномы содержат
многие цианобактерии.
Содержание ДНК в клетках прокариот в значительной сте-
пени определяется размерами клетки — чем она больше, тем
больше ДНК, хотя это не означает соответствующего увеличе-
ния объема генетической информации.
7*
99
ДНК бактериальной клетки и связанные с ней системы реп-
ликации, репарации, транскрипции и трансляции не отграни-
чены от остальной части клетки мембраной, т. е. у бактерий
отсутствует ядерпая оболочка. Тем не менее у большинства
форм легко может быть выявлена центральная ядерная зона,
которую называют нуклеоидом (образование, подобное ядру),
или нуклеоплазмой. В этой зоне клетки сосредоточены связан-
ные с хромосомой метаболиты и процессы. Определенная ком-
партментализация нуклеоида проявляется, например, в экспе-
риментах с мечеными дезоксирибонуклеозидами, когда вклю-
чение экзогенных меченых предшественников в ДНК может
происходить без предварительного достижения равновесия экзо-
генного субстрата с пулом соответствующих соединений в цито-
плазме.
Нуклеоид можно выявить в световом микроскопе после ис-
пользования только светооптических специфических для ДНК
окрасок по Фельгеиу или по Гимза, в флюоресцентном микро-
скопе— после окраски соответствующими флюорохромами, на-
пример акридином оранжевым. Нуклеоид виден в фазовокон-
трастном микроскопе, причем особенно хорошо, если бактерии
помещены в среду с высокой концентрацией желатины. Этот
метод представляет особый интерес, так как при этом клетку
ничем не травмируют. Нуклеоид здесь обычно выглядит как
темное более или менее компактное образование, часто палоч-
ковидное. Можно видеть также делящиеся нуклеоиды. Довольно
много сведений в литературе имеется относительно изменений
формы и компактности нуклеоидов в зависимости от условий
среды и состояния бактерий, однако природа таких изменений
и их функциональное значение остаются непонятными.
При исследовании в электронном микроскопе реплик со ско-
лов нефиксированных замороженных бактерий, находившихся
в экспоненциальной фазе роста, нуклеоид не выявляется, но
выявляется у клеток, предварительно фиксированных осмием.
На срезах после фиксации клеток осмием по Рейтеру—Кел-
ленбергеру нуклеоид представлен светлой центральной зоной,
содержащей нити коагулировавшей ДНК толщиной 2—7 нм
(рис. 36, 37). При фиксациях с использованием глутарового
альдегида нуклеоид выглядит более гомогенным. Предложены
методы фиксации нуклеоида с использованием глутарового
альдегида и солей урана, при которых сохраняется его дисперс-
ность. Нередко на отдельных срезах нуклеоид выглядит как бы
раздробленным на участки, при изучении серий срезов, однако,
оказывается, что эти участки соответствуют частям одного
целого. ДНК у бактерий составляет 2—3% от сухого веса
клетки, нуклеоид, однако, занимает гораздо большую долю
объема клетки.
На срезах иногда можно обнаружить контакты нуклеоида
с цитоплазматической мембраной, а у фирмакутных с мезосо-
100
мой (нуклеоидосомой). По некоторым наблюдениям у фирма-
кутных нуклеоид более компактный и занимает относительно
меньшую часть объема клетки, чем у грациликутных.
В семидесятые годы было проведено много исследований
нуклеоидов, выделенных из клетки в виде компактных структур.
Такие нуклеоиды обычно обозначают как компактные хромо-
сомы (folded chromosome). Можно получить два типа таких
хромосом: связанные с элементами оболочки или свободные
от них. Эти нуклеоиды имеют константы седиментации соответ-
ственно 3200 S и 1600 S.
Рис. 37. Срез клетки почкующейся
бактерии Hyphomicrobium. У в.
X 40 000.
Рис. 36. Зоны нуклеоида на попереч-
ных и продольных срезах вибриона.
Ув. X15 000.
г — гифы; н — зона нуклеоида; пом —
включения ПОМ; р — рибосомы.
Для получения нуклеоида, связанного с оболочкой,клетки,
помещенные в 20%-ную сахарозу, быстро обрабатывают лизо-
цимом-ЭДТА , а затем лизируют смесью двух неионных детер-
гентов Brij-58 и дезоксихолата в присутствии 1 М NaCl. Эту
смесь наслаивают на градиент сахарозы (10—50% w/v) и цен-
трифугируют при 17 000 g 15 мин. Для получения свободного
нуклеоида используют продолжительную обработку лизоцимом
и ионными детергентами, например саркозилом. Связанный
с оболочкой нуклеоид содержит кроме ДНК много РНК, белки,
липиды и муреин. Нуклеоид, свободный от элементов оболочки,
состоит в основном из ДНК и РНК и содержит ДНК-полиме-
разу. Нуклеоид, полученный из клеток активно растущей куль-
туры, имеет 1, 2 хромосомы, 1—3 тыс. молекул РНК, что со-
ставляет до 30% массы такого нуклеоида, причем около 40%
этой РНК приходится на долю рибосомальной РНК.
При изучении компактных нуклеоидов в электронном микро-
скопе видны тела, состоящие из многочисленных суперспирали-
101
зованных петель, отходящих от плотной центральной области
(рис. 38). У нуклеоидов, свободных от элементов оболочки, наи-
большая длина нити, образующей одну петлю, до 20 мкм, а всего
таких петель — около 140. При обработке клеток РНКазой цен-
тральная область нуклеоида становится менее плотной, поэтому
можно предположить, что РНК сосредоточена именно здесь.
У связанного с оболочкой нуклеоида бывают видны остатки
оболочки, связанные с петлями или центральной зоной. При
обработках РНКазой или ДНКазой резко уменьшается кон-
станта седиментации нуклеоида и возрастает его объем. Ста-
бильность структуры компактного нуклеоида, очевидно, обес-
печивается связями РНК — РНК и РНК — ДНК в центральной
Рис. 38. Строение компактной хромосомы Е. coli
[Kleppe е. а., 1979].
его зоне. РНКаза снижает плотность центральной области, и
при этом константа седиментации падает до 400—500 S. Обра-
ботка ДНКазой приводит к потере ДНК суперспирализованной
структуры, к расширению и распрямлению петель (рис. 38).
Седиментальная константа полностью релаксированной хромо-
сомы снижается до 130 S. Обработка протеазами также может
снижать спирализацию петель нуклеоида.
Описанные структуры стабильны только в солевых растворах
достаточно высокой концентрации, при снижении концентрации
соли нуклеоид быстро разрушается. Вместо соли для стабили-
зации нуклеоида могут быть использованы полиамины.
Нуклеоиды, выделенные из голодающих клеток или клеток,
выдержанных в присутствии различных ингибиторов обмена или
мутагенов, как правило, обладают пониженной константой се-
диментации. Компактные нуклеоиды с аналогичными свойствами
102
были получены из ряда грациликутных и фирмакутных. Наблю-
даются некоторые количественные различия в процедурах, не-
обходимых для получения нуклеоидов, несколько различаются
их константы седиментации.
Существуют убедительные доводы в пользу того, что струк-
тура компактных нуклеоидов представляет собой в значитель-
ной степени артефакт. Высокая концентрация солевого раствора
вызывает агрегацию молекул
РНК; рРНК и иРНК, связанные
с ДНК в процессах транскрип-
ции и трансляции, агрегируя, об-
разуют центральную часть, тог-
да как суперспирализованные
петли соответствуют неактивным
в данное время участкам ДНК.
Возможность образования подоб-
ных структур определяется тем,
что у бактерий процессы тран-
скрипции и трансляции идут од-
новременно и одни и те же моле-
кулы иРНК могут быть одновре-
менно связаны с ДНК и рибосо-
мами.
В неразрушенной бактериаль-
ной клетке центральная область
на срезах выглядит рыхлой, а ри-
босомы сконцентрированными в
основном по периферии нуклео-
плазмы (рис. 36). Авторадиогра-
фические исследования Е. coli
показали, что синтез РНК про-
исходит в основном в цитоплазме
вдоль мембран, но не в централь-
ной области нуклеоида. Кроме
Рис. 39. Модель организации ну-
клеоида Е. coli [Kleppe е. а.,
1979].
ори — точка origin на хромосоме бак-
терии; р — рибосомы, вм — внешняя
мембрана; м — муреин; цм — цито-
плазматическая мембрана.
того, известно, что многие белки бактерий синтезируются на
рибосомах, связанных с цитоплазматической мембраной. В про-
цессе образования компактного нуклеоида происходит как бы
инверсия РНК с периферии в центр образующейся структуры.
Модель структуры активного нуклеоида in vivo, очевидно,
должна учитывать высокую степень связи транскрипции и транс-
ляции и возможность синтеза на рибосомах, связанных с мем-
браной. Одна из подобных схем приведена на рис. 39. В соот-
ветствии с этой моделью неактивная в данное время ДНК
суперспирализована и уложена в центре нуклеоида, тогда как
по его периферии расположены деспирализованные петли, от
которых происходит синтез иРНК, причем иРНК соединена
с ДНК через РНК-полимеразу, а также связана с цитоплазма-
тическими или мембранно-связанными рибосомами. Суперспи-
103
рализованные неактивные участки нуклеоида могут быть стаби-
лизированы гистоноподобными белками, которые при некоторых
методах анализа обнаруживаются в ассоциации с ДНК бак-
терий.
Существенных изменений в состоянии нуклеоида в процессе
прохождения бактерией клеточного цикла не наблюдается, за
исключением уплотнения нуклеоида перед спорообразованием.
В этом отношении прокариота резко отличаются от эвкариот.
Хромосома всегда связана с мембраной, число точек связи
может достигать 20 и более. Имеется, по крайней мере, два типа
Рис. 40. Клетки Blattabacterium— бактерии симбионта тара-
кана на срезе. Ув. Х20 000.
связи — за счет связи ДНК со специфическим мембранным бел-
ком и через рибосомы, связанные с мембраной при синтезе
транслоцируемых белков. Специфическая связь хромосом с мем-
браной осуществляется в точке origin или около нее. Интересно,
что гены, определяющие синтез белков на рибосомах, связан-
ных с цитоплазматической мембраной, образуют на хромосоме
около 15 кластеров, что хорошо согласуется с 20 точками кон-
такта ДНК с мембраной.
В заключение необходимо отметить, что у некоторых бакте-
рий — внутриклеточных паразитов и симбионтов — сколько-ни-
будь определенно локализованной нуклеоплазмы не выявляется.
На срезах клеток видно множество мелких ДНК-содержащих
участков. Подобным образом ДНК распределена, \ например,
в клетках бактерий — симбионтов таракана — Blattabacterium
(рис. 40). Детали организации ДНК в клетках подобных бакте-
рий неизвестны.
104
Бактериальные рибосомы имеют константу седиментации
70 S. Строение рибосом эубактерий, архебактерий и эвкариот
в основных чертах сходно, однако имеются отличия в деталях
организации как РНК, так и белков. В частности, различна
форма малых субъединиц (рис. 41). У субъединиц архебактерий
и цитоплазматических рибосом эвкариот имеется носик или
клюв, отсутствующий у эубактериальных рибосом, субъединица
эвкариотической рибосомы от-
личается от бактериальных на-
личием лопастей. Строение ри-
босом у представителей одно-
го царства заметно не разли-
чается.
Молекулярная масса эубак-
териальной рибосомы 2,20—
2,65-106, молекулярные массы
50 S и 30 S субъединиц
1,55—1,8-106 и 0,7—0,85-106
соответственно. Соотношение
РНК/белок в субъединицах
около 1,5. Меньшая субъедини-
ца 30 S содержит молекулу
16 S РНК с молекулярной мас-
сой около 5,5-105, а большая
субъединица молекулы РНК
23 S и 5,5 S с молекулярными
массами 1,1-106 и 0,4-105.
Рибосома содержит 53 бел-
ковых молекулы. Малая субъ-
единица кроме 16 S РНК име-
ет 21 молекулу белков, обозна-
чаемых S1—S 21 в соответст-
вии с их положением в поли-
акриламидном геле при хрома-
тографии. Большая субъедини-
ца кроме 23 S и 5 S РНК со-
держит 34 белковых молеку-
лы, обозначаемые L 1—L 34.
Рис. 41. Строение рибосомы [Lake,
1983].
А — С — малые субчастицы эубактерий
(А), архебактерий (В), цитоплазматиче-
ской рибосомы эвкариот (С)\ D —эубак-
териальная рибосома, связанная с мем-
браной. / — транслирующая область; // —
область выхода белка; /// — цитоплазма-
тическая мембрана бактерии; /V —син-
тезируемая молекула белка; EF — G —
фактор элонгации; 1 — клюв (носик);
2 — головка; 3 — платформа; 4 — тело;
5 — лопасти.
Большинство белков находится в рибосоме в одной копии.
Имеются 3—4 копии только белков L 7 и L 12. РНК и белки
расположены в субъединицах в определенном порядке. Топо-
графия различных белков на поверхности субъединиц выяс-
няется путем мечения рибосом антителами, специфичными для
определенных рибосомальных белков, и последующего иссле-
дования в электронном микроскопе.
Образование рибосом из РНК и белков как в бактериальной
клетке, так и в пробирке происходит в результате многоступен-
чатой сборки. Нетранслирующие рибосомы в клетке постоянно
105
обмениваются субъединицами, полная рибосома формируется
в процессе работы. Для стабилизации рибосомы необходимы
ионы Mg2+. Число рибосом на геном линейно растет при увели-
чении скорости роста, а скорость синтеза белка на рибосому
постоянна, т. е. скорость роста клетки определяется скоростью
образования рибосом и их числом в клетке. Например, клетка
Bacillus licheniformis при времени генерации 120 мин содержит
около 12,5 тысяч рибосом, при времени генерации 60 мин —
34,4 тысячи, а при времени генерации 35 мин — 92 тысячи.
Для прокариот характерна ассоциация процессов транскрип-
ции и трансляции — в результате образуются комплексы рибо-
сом, иРНК и ДНК. При электронно-микроскопическом иссле-
довании материала из лизированных бактерий обнаруживаются
нити ДНК толщиной 1,5—2,0 нм, от которых отходят ветви
иРНК с прикрепленными к ним полисомами. Иногда можно
наблюдать регулярное увеличение числа рибосом в полисомах
на ветвях иРНК. Более короткие полисомы, очевидно, являются
более молодыми, и по их расположению можно судить о на-
правлении синтеза иРНК на ДНК. Свободные, не связанные
с ДНК полисомы в бактериях почти не встречаются.
§ 5. Включения
Несколько неопределенным термином включения обычно
обозначают такие структуры в клетках бактерий, которые, оче-
видно, не являются абсолютно необходимыми для их жизнедея-
тельности и либо присутствуют в клетках, либо отсутствуют.
Однако природа и функции включений могут быть совершенно
различными. Их принято подразделять на включения, окружен-
ные белковой мембраной, и включения, лишенные такой мем-
браны. Способность к образованию чисто белковых мембран
является интересной особенностью прокариотических клеток,
в которых самостоятельные компартменты, ограниченные на-
стоящими мембранами, отсутствуют.
К включениям, окруженным мембраной, относят газовые
вакуоли. Они обнаружены только в прокариотических клетках
и образованы скоплениями газовых пузырьков (рис.42). Газо-
вый пузырек представляет собой полый цилиндр длиной 200—
1000 нм и диаметром порядка 75 нм, окруженный белковой
мембраной толщиной 2 нм. Белковые молекулы в мембране уло-
жены в плотную спираль. Их гидрофобные аминокислоты
обращены внутрь пузырька, а гидрофильные — наружу. Это пре-
пятствует проникновению воды внутрь газового пузырька. Бел-
ковые молекулы образуют мембрану газового пузырька в ре-
зультате сборки, пузырьки можно получить из раствора белка
в пробирке. Состав газа в пузырьках бактерий соответствует
составу газов в окружающей среде, при перепадах давления
пузырьки легко спадаются и вновь не могут быть наполнены
газом. Газовые вакуоли встречаются у представителей различ-
106
ных групп бактерий. Обычно это обитатели планктона, у кото-
рых газовые вакуоли служат для снижения удельной массы
организма. Встречаются газовые вакуоли и у обитателей илов,
например у некоторых Methanosarcina. Здесь они способствуют
локализации бактерий в поверхностных относительно богатых
пищей слоях ила. Газовые пузырьки образуют колпачки на спо-
рах некоторых Clostridium. Таким образом, газовые вакуоли
обнаруживаются в клетках фирма-
кутных, грациликутных и архебак-
терий.
В бактериальной клетке могут
присутствовать включения запасных
веществ, которые накапливаются
при избытке экзогенных субстратов,
прежде всего энергетических, и ис<
пользуются клеткой при недостатке
подобных веществ. Чаще всего это
полисахариды, поли-0-оксимасляная
кислота (ПОМ) и волютин (поли-
фосфаты) .
Важной функцией запасных ве-
ществ, видимо, является обеспече-
ние, прежде всего энергетическое,
синтеза индуцибельных ферментов
в период адаптации клеток к сре-
дам, в которых нет иных доступных
клеткам источников энергии кроме
субстратов этих ферментов.
Могут быть бактерии однозапа-
сающие, дву- или полизапасающие,
Рис. 42. Газовые вакуоли на
срезе клетки цианобактерии.
Ув. X 60 000.
хотя такое разделение весьма ус-
ловно. Так, в клетках Е. coli может накапливаться гликоген,
в клетках Вас. megaterium — гликоген и ПОМ, Chromatium
okenii способен образовывать полисахарид, ПОМ, полифосфаты
и элементарную серу, хотя полисахариды и ПОМ обычно яв-
ляются альтернативными запасными веществами. Природа за-
пасаемого субстрата определяется систематическим положением
организма и условиями культуры. Часто, хотя и нс всегда, аце-
тат способствует накоплению ПОМ или липидов, но у некото-
рых бактерий ПОМ может накапливаться и за счет глюкозы.
Поли-р-оксимасляная кислота (ПОМ) представляет собой
полиэфир р-оксимасляной кислоты, где мономеры соединены
сложной эфирной связью за счет карбоксильной и гидроксиль-
ной
р-оксимасляной кислоты:
групп соседних молекул
НН г Н Н п НН
II II |1
ОН—С-С—С- О-С-С—С— О-С-С—С—он
I I II
сн3 н о
I I II I I II
сн3 н о сн3 н о
107
ПОМ синтезируется бактериями с различным типом питания,
но, видимо, отсутствует у строго анаэробных хемотрофов, на-
пример у Clostridium, но является превалирующим запасным
веществом у Azotobacter, Rhizobium, Zoogloea, Bacillus, фото-
трофных бактерий.
Молекулярная масса нитей ПОМ еще точно не установлена,
так как при выделении из клеток неизбежно происходит частич-
ная деградация ее молекул. В зависимости от физиологического
состояния бактерий длина нитей изменяется. Молекулярная
масса ПОМ, видимо, может достигать нескольких тысяч.
В клетках бактерий ПОМ находится в виде округлых, иногда
продолговатых гранул различного размера, их диаметр дости-
гает 200—800 нм. Они окрашиваются Суданом черным В в чер-
ный и Суданом III в красный цвета, хотя эти красители не яв-
ляются специфичными для ПОМ и окрашивают также различ-
ные липидные включения. На срезах после фиксации осмием
овальные гранулы ПОМ имеют умеренную плотность для элек-
тронов, причем центральная их часть менее электроноплотная,
чем периферия. Гранулы образованы фибриллами, имеющими
длину 10—15 нм, которые состоят из нескольких цепочек поли-
мера и образуются в результате одновременных процессов его
синтеза и кристаллизации. При кристаллизации депочки моно-
меров ПОМ располагаются в виде двойной спирали, закручен-
ной вправо, стабильность спирали поддерживается за счет ме-
тилкарбонильных взаимодействий.
Гранулы ПОМ окружены белковой мембраной, толщина ко-
торой варьирует у разных бактерий от 2,2 до 8,0 нм. С этой
мембраной связаны ферменты синтеза и распада ПОМ.
ПОМ имеет точку плавления в пределах от 160 до 182° С,
удельный вес 1,23—1,25 г/см3, растворяется в спиртах с числом
углеродных атомов, равным трем и более, в пиридине, хлоро-
форме, диоксане, толуоле, 1 М NaOH, камфоре. ПОМ совер-
шенно не растворяется в воде, эфире, метиловом и этиловом
спиртах, ацетоне, предельных углеводородах, четыреххлористом
углероде, разбавленных минеральных кислотах. Исходным про-
дуктом биосинтеза ПОМ является ацетил-КоА. Поэтому у мно-
гих бактерий синтез ПОМ стимулируется в присутствии ацетата
или веществ, катаболизм которых идет с образованием аце-
тата. D-(—) р-оксибутилил-КоА-полимераза (синтетаза) тесно
связана с мембраной гранул и обычно теряет активность при
отделении от них.
У некоторых бактерий, например у Вас. cereus и Azotobacter,
для которых ПОМ является характерным запасным продуктом,
усиление ее синтеза наблюдается при увеличении концентрации
глюкозы в среде. Синтез ПОМ в клетках Micrococcus halodeni-
trificans наблюдался в присутствии глицерина, пирувата и аце-
тата, но не в присутствии других испытанных веществ, в том
числе органических кислот, хорошо усваиваемых бактерией.
108
ПОМ накапливается в клетках Rhodospirillum rubrum при
фотоассимиляции ацетата и р-оксибутирата, но если в среде
присутствуют малат или сукцинат — накапливается гликоген.
Видимо, ацетат и бутират превращаются в ацетильные остатки,
минуя пируват, что способствует накоплению ПОМ. Малат и
сукцинат, превращаясь в пируват, далее трансформируются
в полисахариды за счет обратного хода цепи гликолиза.
Важным фактором, способствующим накоплению ПОМ, яв-
ляется лимитирование экзогенного источника азота. При пере-
несении активно растущих клеток автотрофных псевдомонад,
окисляющих водород в среду без азота, можно наблюдать уве-
личение их массы и размеров исключительно за счет накопления
ПОМ. Клетки синтезировали ПОМ из СО2, окисляя водород
в соответствии с уравнением
25Н2 -Ь 8О2 + 4СО2 — (С4Н6О2) + 22Н,О.
У аэробных бактерий повышенная аэрация обычно снижает
накопление ПОМ, которая наиболее активно синтезируется^
в микроаэрофильных условиях (но не в анаэробных). В усло-
виях оптимальных сред накопление гранул ПОМ обычно начи-
нается при переходе бактерий в стационарную фазу роста,
а в проточной культуре больше ПОМ синтезируется при невы-
соких скоростях размножения.
При помещении клеток, содержащих гранулы ПОМ, в среду
без источника углерода и энергии они начинают энергично ис-
пользовать ПОМ, который в этих условиях оказывается един-
ственным субстратом эндогенного метаболизма. При этом
клетки, богатые ПОМ, дольше сохраняют жизнеспособность, чем
клетки, лишенные этих включений. У некоторых бактерий, на-
пример у автотрофных псевдомонад, окисляющих водород, ПОМ
может служить одновременно источником энергии и углерода
и обеспечивать белковый синтез в присутствии доступного источ-
ника азота, но у других бактерий используется только как
энергетический субстрат, причем ее углерод не включается
в белковый синтез. Это характерно, например, для Pseudomonas
saccharophila, Bacillus megaterium. У некоторых Bacillus мак-
симум накопления ПОМ предшествует началу спорообразова-
ния. В процессе образования спор ПОМ полностью или частично
расходуется, хотя ее накопление не является обязательным
условием для спорообразования. Аналогичным образом у Azoto-
bacter накопление ПОМ предшествует образованию цист, при
образовании которых ПОМ расходуется. У этих бактерий фор-
мирование цист можно стимулировать экзогенным бутиратом.
Предполагают также возможную связь азотфиксации с мета-
болизмом ПОМ у Azotobacter и Rhizobium.
В некоторых случаях ПОМ может составлять до 80% от
массы клетки. Постоянного обмена ПОМ в клетках бактерий,
109
видимо, не происходит, однако при соответствующих условиях
система, связанная с распадом и использованием ПОМ, как бы
включается. Распад гранул полимера происходит за счет их
гидролиза, определяемого действием специфической деполиме-
разы, в результате которого получаются мономеры, де- или
тримеры р-оксимасляной кислоты. Ди- и тримеры разрушаются
под действием соответствующих гидролаз, [3-оксибутират окисля-
ется в ацетоацетат-НАД специфичной р-оксибутиратдегидроге-
назой, а ацетоацетат распадается до ацетата, который и мета-
болизируется через цикл трикарбоновых- кислот. У некоторых
бактерий, например у Rhodospirillum rubrum и Rh. japonicum,
деполимераза ПОМ связана с мембраной гранул, но у других
бактерий, например у Вас. megaterium, может быть и не свя-
зана с ней. С мембраной гранул ПОМ ассоциирован ингибитор
белковой природы, в присутствии которого гидролиз-ПОМ не
происходит. При соответствующих условиях в клетке образуется
специфический активатор, который нейтрализует действие ин-
гибитора. Последний может быть инактирован также путем об-
работки клеток трипсином.
Многие бактерии, способные накапливать в клетках ПОМ,
разрушают ее экзогенные гранулы, выделяя в среду деполиме-
разу. Образующийся при разрушении гранул бутират исполь-
зуется клетками для роста. ПОМ обнаружена только у прока-'
риот. Эукариотические организмы не обладают ферментами,
необходимыми как для синтеза, так и для гидролиза ПОМ,
поэтому ее накопление бактериями, выращиваемыми в целях
получения пищевой или кормовой биомассы, крайне нежела-
тельно. Относительно легко могут быть получены мутанты, ли-
шенные способности накапливать ПОМ.
Полисахаридные включения бактерий представляют собой
глюканы и образованы D-глюкозой.
Многие бактерии образуют полисахарид, близкий по строе-
нию к крахмалу, точнее к амилопектину, цепи которого сильно
разветвлены (рис. 43). Остов молекулы имеет гликозидные
связи а(1—3)-типа, связи в точках ветвления а (1—6)-типа.
Ветви отходят в среднем через каждые 12 остатков глюкозы
в основной цепи. Раствором Люголя полисахарид окрашивается
в красно-фиолетовый цвет. Его молекулярная масса может до-
стигать 1 млн. Степень ветвления молекул полисахарида у раз-
ных бактерий различается. У некоторых форм он близок к гли-
когену, у которого степень ветвления больше, чем у крахмала,
и точки ветвления располагаются через каждые 8—10 остатков
глюкозы в основной цепи.
Полиглюкозидные гранулы на срезах выглядят ^круглыми
электронно-прозрачными образованиями до 200 нм диаметром,
обычно лишены мембраны, хотя имеются свидетельства суще-
ствования белковой мембраны, окружающей полиглюкозидные
гранулы некоторых бактерий, например Clostridium pasteuria-
ПО
пит. Гранулы могут быть растворены и полисахарид извлечен
из бактерий при обработке горячим раствором КОН.
Накопление полисахаридных гранул обычно стимулируется
недостатком азота при избытке источника углерода и энергии.
При выращивании бактерий в оптимальных средах накопление
полисахарида обычно наблюдается при переходе бактерий в ста-
ционарную фазу роста.
Биосинтез бактериального полисахарида идет при участии
трех ферментов: АДФ-глюкозофосфорилазы, гликогентрансфе-
разы и фермента ветвления. Важную роль играет аллостериче-
ская регуляция активности первого фермента, определяемая
метаболитами основных путей углеродного обмена данного ор-
ганизма. У кишечных бактерий, например, активатором этого
СН20Н 6Cri20H
6 Сн 2
Рис. 43. Строение нитей амилопектина.
фермента является фруктозо-1,6-дифосфат, а ингибитором АМФ.
Регуляция синтеза полисахарида осуществляется также на
уровне генома, у кишечных бактерий предполагают наличие
гликогенного оперона, включающего несколько генов. У Е. coli
содержание полисахарида может достигать 25% от массы
клетки.
Накопление полиглюкозида для некоторых бактерий может
играть важную экологическую роль. Например, обитающий
в ротовой полости человека Streptococcus mitis в условиях, не-
благоприятных для быстрого роста, и при избытке глюкозы
около 90% ассимилированной глюкозы трансформирует в поли-
сахарид, содержание которого при этом может достигнуть 50%
от массы клетки. В дальнейшем запасенный полисахарид мо-
жет служить единственным источником углерода и энергии для
развития бактерии. Обитающие в ротовой полости человека
бактерии, а также представители рода Neisseria могут осуще-
ствлять синтез внутриклеточного глюкана из сахарозы за счет
активности фермента амилосахаразы.
111
Гранулы волютина, или метахроматина, накапливаются
в клетках разнообразных микроорганизмов, в том числе бак-
терий. Название волютин происходит от видового названия
крупной спириллы Spirillum volutans, для которой характерны
многочисленные крупные включения, состоящие, правда, не из
волютина, а из ПОМ. Метахроматином волютин называют по-
тому, что некоторые красители при окрашивании волютина
изменяют цвет. В значительных количествах волютин накапли-
вается в клетках некоторых коринеформпых бактерий, его вклю-
чения в клетках Corynebacterium diphtheriae называют тельцами
или зернами Бабеша—Эрнста в честь ученых, впервые обратив-
ших на них внимание. Волютин окрашивается основными кра-
сителями, например нейтральным красным, толуидиновым си-
ним, метиленовым синим. Два последних красителя дают
метахроматическую окраску, при которой включения окраши-
ваются в фиолетово-красный цвет. Включения волютина окра-
шиваются при низких значениях pH и сохраняют окраску в кис-
лой среде, что и служит основным показателем принадлежности
включений к волютиновым. Зерна волютина растворяются
в горячей воде и слабой щелочи, нерастворимы в спирте, эфире,
хлороформе. Метахроматически окрашиваются и зерна ПОМ,
с чем и была связана ошибка при названии волютина в честь
Spirillum volutans, содержащей крупные зерна ПОМ.
Волютиновые гранулы образованы полифосфатами, и му-
танты бактерий, лишенные способности к их синтезу, не содер-
жат гранул волютина. В основе метахроматической окраски
гранул лежит взаимодействие поликатионов, каковыми яв-
ляются основные красители, с полианионами, в данном случае
с полифосфатами, что вызывает сдвиг максимума поглощения
красителей в сторону большей длины волны. Суть этой реакции
состоит в полимеризации красителя на макромолекулах поли-
аниона. При исследовании срезов бактерий в электронном ми-
кроскопе волютиновые гранулы плавятся и испаряются под
действием пучка электронов.
Волютин обычно образует овальные гранулы диаметром до
1 мкм. Плотность гранул Micrococcus lysodeikticus, определяе-
мая по их поведению при центрифугировании в градиенте саха-
розы, равна 1,23. Гранулы волютина состоят преимущественно
из полифосфатов, но в препаратах гранул, выделенных из кле-
ток, обычно обнаруживаются примеси РНК, ДНК, белка. Ха-
рактер молекулярной организации полифосфата в волютиновых
гранулах не выяснен окончательно. Предполагают, что нити
полифосфата осаждаются на цитоплазматическом материале и
тесно спирализуются, что вызывается высокой концентрацией
катионов в цитоплазме. Полифосфат волютиновых гранул син-
тезируется за счет активности фермента фосфаткиназы, которая
катализирует реакцию
АТФ + (НРО3)„ - АДФ + (НРО3)л+1.
112
Разрушение гранул волютина иногда происходит за счет
активности ряда ферментов, связанных с фосфорным обменом.
Волютиновые гранулы представляют собой запас фосфора, ко-
торый может быть использован клеткой. В то же время поли-
фосфаты содержат макроэргические связи и являются депо
энергии, хотя считается, что их роль как источника энергии не-
значительна.
В редких случаях отмечена зависимость накопления и раз-
рушения волютина в бактериях от стадий их клеточного цикла.
Так, при изучении синхронных культур Corynebacterium diphthe-
riae установили, что волютин накапливается в клетке перед
делением и расходуется в процессе деления. Чаще оказывается,
что в клетках экспоненциально растущей культуры, когда фос-
фор содержится в среде в избытке, количество волютиновых
гранул в клетках остается постоянным, при снижении скорости
роста, а также при уменьшении фосфора в среде их число сни-
жается. Имеются, однако, и противоположные наблюдения. Так,
у Micrococcus lysodeikticus волютин присутствует в клетках ло-
гарифмически растущей культуры и исчезает из клеток старею-
щих культур, т. е. при переходе в стационарную фазу роста.
Как оказалось, разные штаммы этого вида существенно разли-
чаются по способности к накоплению волютина, один штамм
накапливал волютин до 2—3% от массы клетки, другой — до
9-12%.
В зависимости от организма и условий культуры различной
может быть степень полимеризации полифосфатов волютиновых
гранул.
Особенно энергичное накопление волютина происходит при
перенесении бактерий из среды, лимитированной по фосфору,
в среду, богатую фосфатами.
Карбоксисомы, или полиэдральные тела (рис. 44), обнару-
жены в клетках, всех цианобактерий и у некоторых фототроф-
ных и хемолитоавтотрофных бактерий. Это ромбовидные или
шестигранные включения до 500 нм диаметром. Обычно они
располагаются в области нуклеоплазмы. На срезах клеток, фик-
сированных осмием, эти тела умеренно плотные для электронов
с тонкозернистым содержимым. Включения состоят в основном
из молекул D-рибулезо-1,5-дифосфаткарбоксилазы — ключевого
фермента фото- и хемосинтеза. Элементарные молекулы фер-
мента, выделенные из частиц, имеют диаметр около 10 нм.
У различных организмов размеры карбоксисом могут несколько
различаться. У штаммов Nitrobacter и Thiobacillus карбокси-
сомы правильной икосаэдрической формы имеют диаметр по-
рядка 100—120 нм и довольно однородны по размерам, окру-
жены белковой мембраной 3—4 нм толщиной. Карбоксисомы,
выделенные из клеток Nitrobacter и Thiobacillus, содержат
кольцевые молекулы ДНК, напоминающие плазмидные ДНК.
8 Б. В. Громов
113
Предполагают, что в этой ДНК закодирован белок мембраны,
окружающей частицу.
Функции карбоксисом пока непонятны. Они присутствуют
у всех цианобактерий, но не являются обязательными компо-
нентами клеток анаэробных фототрофов и хемолитоавтотрофов.
Термином рапидосомы (лат. rhapis — палка) были обозна-
чены структуры, напоминающие отростки фагов или молекулы
некоторых колицинов. Рапидосомы освобождаются при лизисе
Рис. 44. Полиэдральное те-
ло (карбоксисома) на сре-
зе клетки цианобактерии.
Ув. X 80 000.
Рис. 45. R-тела Caedobacter taeniospira-
lis. У в. X 50 000—60 000.
а, б — продольный (а) и поперечный (б)
срезы R-тела; в, г — частично раскрученная
(в) и раскрученная (г) лента R-тела.
клетки, однако могут быть обнаружены на срезах и разных
неразрушенных бактерий. В некоторых случаях в составе рапи-
досом кроме белка обнаружена РНК. Природа и функции этих
включений в клетке остаются невыясненными. Предположение
о возможной связи рапидосом с репликацией хромосомы в тече-
ние последних лет не нашло подтверждения. Возможно, они
представляют собой частицы дефектных фагов.
Включения серы присутствуют в клетках бактерий, окисляю-
щих сероводород, например в клетках Beggiatoa. В световом
микроскопе они имеют вид округлых капелек, расположенных
в цитоплазме, однако изучение ультратонких срезов этих бак-
терий показало, что в действительности капельки серы распо-
114
ложены в инвагинациях цитоплазматической мембраны, т. е.
они находятся в периплазме.
R-тела— округлые, светопреломляющие включения, образо-
ванные тесноскрученной белковой лентой (рис. 45), обнаружены
у бактерий рода Caedobacter— симбионтов инфузорий параме-
ций. Под влиянием снижения величины pH, нагревания, обра-
ботки додецилсульфатом или фосфоровольфрамовой кислотой
R-тело раскручивается, превращаясь в более или менее пере-
крученную ленту. Свойства R-тел разных штаммов бактерий
несколько различаются. Раскручивание может быть обратимым
или необратимым и начинается либо с внешней, либо с внут-
ренней стороны R-тела. Образование этих включений в клетке
обычно сопровождается появлением икосаэдрических фагопо-
добных частиц, иногда с отростками. Они находятся свободно
в цитоплазме бактерии или расположены на поверхности бел-
ковой ленты. Формирование R-тел определяется вирусными или
плазмидными генами. В популяции бактерий только, часть кле-
ток образует R-тела, причем такие клетки обычно уже не могут
делиться. Парамеции, содержащие клетки Caedobacter, стано-
вятся «убийцами», поскольку свободные от симбионтов инфу-
зории в их присутствии гибнут. Гибель происходит в результате
заглатывания инфузориями R-тел, освобождаемых в среду за-
раженными животными.
R-тела обнаружены у свободноживущей водородокисляю-
щей бактерии, названной Pseudomonas taeniospiralis. Этот вид
по многим свойствам отличается от видов Caedobacter.
Магнитосомы присутствуют в клетках бактерий, обладаю-
щих магнитотаксисом, т. е. способных плыть вдоль линий маг-
нитного поля. Магнитосомы представляют собой окруженные
мембраной частицы Fe3O4. У разных видов бактерий форма,
число и характер распределения магнитосом в клетке могут
различаться. У Aquaspirillum magnetotactium, например, магни-
тосомы имеют форму куба со сторонами 40—50 нм и располо-
жены цепочкой вдоль оси клетки.
8*
Глава IV
ЖГУТИК КАК ОРГАН ДВИЖЕНИЯ БАКТЕРИИ
§ 1. Строение жгутика
Бактерии были открыты благодаря их подвижности, обра-
щающей на себя внимание микроскописта. Впервые подвижные
бактерии наблюдал Левенгук в 1676 г., который отнес их к ани-
малькулам, т. е. к животному царству: тогда считали, что ра-
стения двигаться не могут. Локомоторным органом плавающих
бактерий является жгутик. Во всех группах бактерий, в том
числе и среди архебактерий, встречаются жгутиковые формы,
т. е. жгутики очень древнее приобретение этих организмов. В то
же время жгутики, подобные бактериальным, у эвкариот не
обнаружены.
У некоторых бактерий вегетативные клетки имеют жгутики
и подвижны, у других — жгутиковые клетки представляют со-
бой только одну из стадий жизненного цикла и обычно предна-
значены для распространения организма. Подобные одиночные
подвижные клетки образуют нитчатые бактерии Sphaerotilus,
Leptothrix и др. Снабжены жгутиками и подвижны споры вод-
ных актиномицетов. У некоторых бактерий, клетки которых
после деления неравноценны, только дочерняя клетка снабжена
жгутиком. Так обстоит дело у почкующихся бактерий Hypho-
microbium и Rhodomicrobium, простекобактерий, Caulobacter
и др.
Характер расположения жгутиков на теле бактерии может
быть различным. У бактерий монотрихов имеется 1—2 жгутика
на полюсах клетки (рис. 46, а), к таким бактериям относятся
представители родов Pseudomonas, Nitrosomonas, Thiobacillus.
Для некоторых монотрихов характерно субполярное расположе-
ние жгутиков, т. е. несколько в стороне от полюса клетки. Это
некоторые штаммы Rhizobium и Agrobacterium, подвижные
клетки Seliberia (рис. 46, б).
Бактерий, обладающих пучком жгутиков, состоящим из не-
скольких десятков отдельных нитей, называют лофотрихами.
Сюда относятся виды Spirillum, архебактерия с палочковидными
клетками Halobacterium и др. Субполярный пучок жгутиков,
116
состоящий из 10—30 нитей, имеют подвижные клетки Sphaero-
tilus.
У перитрихов более или менее многочисленные жгутики рас-
положены по всему телу, а полюса обычно лишены их. По не-
скольку жгутиков имеют клетки многих штаммов Rhizobium,
Azotobacter. Перитрихами являются подвижные представители
Enterobacteriaceae. У Е. coli и сальмонелл жгутиков немного,
обычно 6—7 при росте в бульоне и только 2—3 при росте в бед-
ной среде.
Циклические явления, связанные с изменениями характера
жгутикования, наблюдаются у Proteus. В популяциях этих кле-
ток, выращиваемых на плотной среде, активный рост и деление
Рис. 46. Полярные жгутики (а) у псевдомонады и субполярные (б) жгутики
Seliberia. Ув. X10 000.
относительно коротких палочек, имеющих по несколько жгути-
ков, сменяется образованием гигантских клеток, очень подвиж-
ных. Это происходит на так называемой стадии роения, когда
бактерии очень быстро распространяются по влажной поверх-
ности агара. При росте на плотных средах эти бактерии обра-
зуют концентрические круги, отражающие чередующиеся пе-
риоды роста и роения. У гигантских клеток Proteus mirabilis,
находящихся в стадии роения и имеющих в длину 50—100 мкм,
число жгутиков на единицу объема клетки возрастает в 50 раз
и их количество на клетку достигает 1000. У них жгутики зани-
мают около 1% поверхности тела, тогда как у обычных клеток
всего около 0,02 % ее поверхности.
Нить жгутика большинства бактерий представляет собой
белковый цилиндр 12—20 нм толщиной, а более сложно устроен-
ные жгутики имеют толщину до 35 нм. Обычно у клеток дан-
ного штамма жгутики либо простые, либо сложные, но наблю-
дается и так называемый смешанный тип жгутикования. Слож-
117
ные жгутики, нить которых дополнительно окружена чехлом,
обнаружены у штаммов Vibrio, Bdellovibrio, Proteus. У Vibrio
cholerae Inaba чехол жгутика образован белком с молекуляр-
ной массой 45 000, отличным от белков, входящих в состав обо-
лочки бактерий. Сложные жгутики имеют некоторые штаммы
Rhizobium.
Смешанное жгутикование характерно для представителей
вибрионов и псевдомонад. У Vibrio alginolyticus имеется один
одетый чехлом полярный жгутик 25 нм толщиной при росте
бактерии в жидкой среде. При росте на агаре бактерия образует
латеральные жгутики толщиной 15 нм. Латеральные жгутики,
возможно, служат больше для прикрепления клеток бактерий
к плотному субстрату, чем для движения. Изменение характера
жгутикования в данном случае можно рассматривать как при-
способление бактерии к существованию в разных условиях
среды, хотя он зависит и от других факторов — величины pH,
состава среды, температуры. Аналогичный двойственный харак-
тер жгутикования описан и у другого вида Vibrio — V. рага-
haemolyticus.
У клеток Pseudomonas rhodos одновременно имеется два
типа жгутиков: жгутики обычного строения и сложные толщи-
ной 18 нм, состоящие из внутреннего цилиндра и чехла, обра-
зованного тремя уложенными в тесную спираль лентами шири-
ной 4,7 нм каждая. В состав сложного жгутика входит один
белок с молекулярной массой 55 000. Сходные по строению
сложные жгутики имеет Rhizobium lupini штамм Н-13—3.
Жгутики можно легко увидеть в электронном микроскопе
после оттенения тяжелыми металлами или негативного контра-
стирования. В электронном микроскопе исследуют сухие пре-
параты, строение жгутиков на которых может быть измененным.
Пучки жгутиков можно увидеть в световом микроскопе при ис-
пользовании темнопольного или фазово-контрастного устройств.
Отдельные жгутики слишком тонки, чтобы их можно было уви-
деть в световом микроскопе без специальных обработок. Пучки
жгутиков имеют лофотрихи, иногда перитрихи.
Жгутик состоит из нити, крюка и базальной структуры. Жгу-
тиковая нить, лежащая в плоскости микроскопических препа-
ратов, выглядит волнообразно изогнутой. Наблюдения в тем-
ном поле за пучками жгутиков свидетельствуют о том, что нити
представляют собой трехмерные спирали. В процессе приготов-
ления электронно-микроскопических препаратов нить, вероятно,
несколько деформируется, но для данного организма, наблюдае-
мые в препаратах волнообразно лежащих жгутиков, длина
волны и амплитуда являются определенными величинами. По-
лучены мутанты с так называемыми курчавыми жгутиками,
имеющими в 2 раза и более уменьшенную «длину волны»,
а также мутанты с прямыми жгутиками. Такие бактерии не спо-
собны к нормальному движению.
118
Длина полностью выросшей нити жгутика обычно соответ-
ствует примерно трем длинам тела бактерии и равна в боль-
шинстве случаев 10—20 мкм, но у некоторых спирилл длина
жгутиков может достигать 70 мкм и более.
Жесткость нити жгутика примерно в 100 раз больше, чем
жесткость нити белка F-актина. Это свидетельствует о неправо-
мерности сравнения белка жгутика с сократимыми белками эв-
кариот.
Нить жгутика образована белком-флагеллином, содержание
которого может достигать 2% от массы бактерии. Молекуляр-
ная масса флагеллинов обычно 25—60 000, например у Bacillus
subtilis — 33 000, а у Е. coli — 60 000. Аминокислотный состав
флагеллина у разных бактерий несколько различается, ио в ис-
следованных к настоящему времени препаратах белка отсут-
ствуют или содержатся в следовых количествах цистеин, трип-
тофан, тирозин, пролин и гистидин. У некоторых Salmonella и
Spirillum флагеллин содержит метиллизин. Метилирование ли-
зина происходит уже после его включения в флагеллин и осу-
ществляется продуктом специального гена, расположенного
у сальмонелл около гена Н-1, определяющего структуру фла-
геллина.
Флагеллин обладает антигенной специфичностью, его назы-
вают Н-антигеном. У сальмонелл его молекула содержит 9 ан-
тигенных детерминант, из них 4 штаммоспецифичны, а осталь-
ные являются общими для группы штаммов. Флагеллины дру-
гих бактерий (Bacillus, Lislerella) также имеют штаммоспеци-
фичные и общие антигенные детерминанты. У нативного жгу-
тика есть антигенные детерминанты, отсутствующие у раство-
ренного флагеллина.
Тсрмоустойчивость флагеллина неодинакова у разных бак-
терий, причем в нити флагеллин устойчивее, так как структура
жгутика стабилизирует белок. Для жгутиков Bacillus критиче-
ская температура, при которой происходит скручивание спирали,
находится в пределах от 54 до 77° С, в зависимости от термо-
устойчивости вида. Жгутики термофильных бактерий устойчивее
других не только к температуре, но и к воздействиям кисло-
тами, мочевиной, додецилсульфатом натрия. После тепловой
денатурации нить жгутика становится чувствительной к протео-
литическим ферментам, обычно не действующим на нативный
жгутик.
При снижении или повышении значения pH наблюдается
изменение характера спирали, сначала в несколько раз сни-
жается шаг, а затем она из нормальной левозакрученной ста-
новится правозакрученной. Предполагают, что подобные изме-
нения происходят и во время функционирования жгутика.
При низких или высоких значениях pH, а также в резуль-
тате обработки мочевиной, гуанидином или детергентами про-
исходит растворение жгутика, и молекулы флагеллина переходят
119
в раствор. Растворенные молекулы при соответствующем изме-
нении условий могут путем самосборки вновь образовать нить.
В зависимости от условий образующиеся нити прямые или спи-
ральные. Обычно для самосборки нити необходима затравка —
кусочек нити жгутика. Включение молекул флагеллнна в расту-
щий жгутик происходит в 2 этапа. Начальный этап заключается
в обратимом связывании молекулы с концом нити, второй —
соответствует встраиванию мономера в нить. При этом проис-
ходят конформационные изменения молекулы и увеличение за-
нимаемого ею объема.
Концы нити жгутика неравноценны. Проксимальный конец,
т. е. конец, обращенный к телу бактерии, выпуклый (Н-конец),
другой, дистальный, напоминает по форме хвост рыбы (Т-ко-
нец). Рост нити жгутика может происходить только с Т-конца,
как в препаратах, так и у живых бактерий. Молекулы раство-
ренного флагеллина овальные, отношение ее осей около 1 :9.
В процессе роста жгутика молекулы флагеллина, видимо, про-
ходят через отверстие в нити. Просвет цилиндра нити жгутика
около 3 нм диаметром. Жгутики могут удлиняться и за счет
молекул флагеллина, добавленных во внешнюю среду. То, что
жгутик растет с дистального конца, было установлено прямыми
наблюдениями. Температурные мутанты, образующие при нераз-
решающей температуре прямые жгутики, выращивали сначала
при разрешающей температуре, при этом они образовывали
нормальные спиральные жгутики. Затем бактерии переносили
в условия неразрешающей температуры и через некоторое время
исследовали в электронном микроскопе. У таких бактерий жгу-
тики у основания были волнистыми, а в дистальной части —
прямыми.
Условия, необходимые для самосборки флагеллинов разного
происхождения, могут существенно различаться. Обычно само-
сборка происходит в солевых растворах, например в 33%-ном
сульфате аммония для флагеллина Salmonella typhimurium.
Характер укладки флагеллина в нити окончательно еще не
установлен. Молекулы, видимо, располагаются под некоторым
углом к оси жгутика, образуя цилиндр (рис. 47). Укладка мо-
лекул флагеллина в сложных жгутиках отличается большим
разнообразием.
Замечательной устойчивостью обладает флагеллин жгутиков
Thiobacillus thiooxydans. Жгутики этой бактерии разрушаются
только при температуре выше 70° С, хотя она не является тер-
мофильной. Жгутики выдерживают обработку 10 н. ацетамидом,
1 н. H2SO4, 2%-ным трипсином и разрушаются только после
часовой экспозиции в 10 н. H2SO4.
Обычно у бактерии имеется только один структурный ген
флагеллина и соответственно образуется только один тип этого
белка. Однако у Caulobacter crescentus жгутик состоит из двух
флагеллинов, различающихся молекулярной массой, хотя и
120
сходных по аминокислотному составу. Эти белки — продукты
двух близко расположенных на хромосоме генов, вероятно, об-
разовавшихся в результате дупликации исходного единствен-
ного гена. Проксимальная часть нити жгутика обогащена фла-
геллином В, а дистальная — флагеллином А.
Флагеллины разных бактерий идентичны функционально, но
различаются молекулярной массой и аминокислотным составом.
Известно широкое варьирование антигенной специфичности
флагеллинов даже у разных штаммов одного вида. Подобная
изменчивость характерна, например, для сальмонелл, у которых
даже флагеллины одного антигенного типа могут иметь разли-
чия в первичной структуре. Легко могут быть получены мутанты
с измененной антигенной специфичностью флагеллина, полно-
стью сохранившего функциональную полноценность.
Подобный широкий полиморфизм флагеллинов у бактерий
предполагает наличие в его молекулах наряду с консерватив-
ными легко изменчивых участков. У сальмонелл мутации в по-
следней (терминальной) четверти гена флагеллина (Н-гена)
приводят к появлению безжгутиковых мутантов, т. е. это суще-
ственный участок молекулы флагеллина. В центре гена линейно
расположены сайты, определяющие антигенную специфичность
молекулы, но не ее функции. Соответствующая им часть моле-
кулы белка находится на поверхности нити жгутика. Возмож-
ные здесь аминокислотные замены, делеции или вставки обычно
не влияют на способность молекул к самосборке в нить жгутика.
Различия молекулярных масс флагеллинов разных бактерий
также определяются различием аминокислотных последователь-
ностей именно в этом участке молекулы. Вместе с тем в суще-
ственной для функционирования части молекулы флагеллина
отмечена значительная гомология аминокислотных последова-
тельностей даже у систематически далеких бактерий — Bacillus
и Salmonella. Эти консервативные участки молекулы флагел-
лина расположены по обоим ее концам. Мутации к курчавости
связаны с изменениями в N-терминальной части молекулы,
а мутанты с прямыми жгутиками имеют нарушения в С-терми-
нальной части молекулы.
У Е. coli имеется один ген флагеллина hag-ген. Salmonella
обладают двумя генами флагеллина Н-1 и Н-2, причем актив-
ным в данный момент может быть только один из них, что
определяет фазовую изменчивость антигенной специфичности
флагеллина сальмонелл. Активность генов изменяется с часто-
той порядка Ю-3 на клетку на генерацию. Периодическое изме-
нение антигенной специфичности флагеллина для сальмонелл,
паразитирующих в организме животных, должно иметь приспо-
собительное значение.
Генетический механизм фазовой изменчивости понятен из
схем, приведенных на рис. 48 и 49. С геном Н-2 соединен эле-
мент, контролирующий выражение оперона, в который входит
121
ген Н-2 и ген rh 1, определяющий синтез белка репрессора Н-1-
гена. Когда этот элемент «включен», синтезируются продукты
генов Н-2 и rh 1, ген Н-1 репрессирован и синтезируется только
Н-2-флагеллин. Когда регулирующий элемент «выключен», гены
Н-2 и rh 1 не транскрибируются и синтезируется флагеллин Н-1.
Физическим механизмом, определяющим изменение состояния
Н-2-оперона, является инверсия последовательности, содержа-
щей промотор Н-2-оперона. В инверсии участвуют ген hin, про-
дукт которого катализирует инверсию участка, и два цис дей-
ствующих «X» сайта, ограничивающих инвертируемый участок.
Рост нити жгутика может идти за счет одновременно проис-
ходящего синтеза флагеллина или за счет использования его
н? off
Рис. 47. Модель нити жгутика,
образованного продолговаты-
ми молекулами флагеллина
[Bode е. а., 1972].
Н1 бепок
Рис. 48. Модель регуляции актив-
ности Н-1 и Н-2-генов флагеллина
у Salmonella [Silverman, 1980].
rH — регуляторный ген; on — ген Н-2
«включен»; off — ген Н-2 «выключен».
молекул, накопленных в цитоплазме, — так называемого пула
флагеллина. Показано, что пул флагеллина у Proteus vulgaris.
иногда составляет до 0,07% от массы клетки. Скорость роста
нити жгутика зависит от видовой принадлежности организма,
стадии развития и условий культивирования. У Pseudomonas
aeruginosa в оптимальных условиях роста жгутик появляется
у дочерней клетки к моменту разделения клеток и полностью
отрастает в течение 30 с после их разделения. Для отращивания
функционально полноценного жгутика Е. coli требуется 10 мин
и более. У Salmonella typhimurium при 37° С рост нити жгутика
происходит со скоростью около 0,12—0,14 мкм/мин, у других
бактерий она может достигать 0,3—0,5 мкм/сек. Однако ско-
рость роста жгутика экспоненциально снижается с увеличением
его длины, возможно, из-за сложности прохождения молекулами
флагеллина канала жгутика. При самосборке нити in vitro ско-
рость этого процесса не зависит от длины нити.
122
Крюк жгутика представляет собой структуру, к которой
крепится нить жгутика. Это изогнутый белковый цилиндр, со-
ставляющий около 1% от массы всего жгутика. Крюк может
быть толще нити жгутика, например у Proteus vulgaris и
Е. coll, или, как у Proteus mirabilis, иметь тот же диаметр, что
и нить.’ Длина крюка у разных бактерий варьирует в пределах
от 30 до 90 нм. Белок крюка отличен от флагеллина по моле-
кулярной массе и антигенной специфичности, но характери-
зуется отсутствием тех же аминокислот. Он устойчивее флагел-
лина к низким значениям pH, нагреву, мочевине и др. Синтез
белка крюка у Е. coll определяется геном Па К, но имеется еще
ген, регулирующий его длину. Получены мутанты, образующие
суперкрюки, состоящие из такого же белка, но гораздо более
длинные, т. е. характеризующиеся нарушением терминации
сборки крюка. У сложных жгутиков Pseudomonas rhodos крюк
тоже сложный и состоит из центрального цилиндра и чехла.
У различных серотипов Salmonella белки крюков антигенно
не различаются. Взаимодействие клеток с антителами к белку
крюка не приводит к их обездвиживанию. Видимо, изменчивость
антигенных свойств крюка не имеет для Salmonella приспосо-
бительного значения.
Проксимальная часть крюка соединена с палочкой или осью,
входящей в состав базальной структуры жгутика. Его функ-
циональное значение до конца не выяснено. Крюк, видимо, слу-
жит лабильным связующим звеном между жесткой нитью жгу-
тика и базальным телом, стабильно укрепленным в оболочке
бактерии. Действительно, при движении Е. coli нити нескольких
жгутиков, прикрепленных к различным участкам клетки, обра-
зуют косу у одного из полюсов. Для того чтобы нить, прикреп-
ленная к оболочке, могла изогнуться под нужным углом, крюк
должен быть чрезвычайно гибким. Подобное рассуждение спра-
ведливо и в отношении бактерий с полярно расположенными
жгутиками, если последние оказываются на переднем конце
клетки и при движении направлены назад.
Базальная структура жгутика может быть отделена от
клетки после растворения муреина лизоцимом, а мембран — де-
тергентами. Она составляет около 1% от массы жгутика, но
устроена сравнительно сложно. У Е. coli и многих других граци-
ликутных она состоит из четырех колец, встроенных в оболочку
бактерии, цилиндра и палочки-оси, на которой крепятся кольца
и основание крюка (рис. 50). Дистальные кольца — L-кольцо,
встроенное во внешнюю мембрану (L — от липополисахарида),
и P-кольцо, встроенное в слой муреина (Р — от пептидоглика-
на), соединены не только палочкой-осью, но и цилиндром. Эти
кольца обнаружены только у грамотрицательных бактерий —
грациликутных и, видимо, несут функцию, связанную с укреп-
лением базальной структуры в оболочке. Проксимальные кольца
имеются у всех бактерий, это — М-кольцо, связанное с цито-
123
плазматической мембраной, и S-кольцо, или статер. На элек-
тронно-микроскопических препаратах часто встречаются па-
лочки, потерявшие отдельные кольца, что свидетельствует об
относительно слабой связи колец с палочкой-осью, на которой
они укреплены. Методом ротационной симметрии показано, что
кольца имеют ось симметрии 16-го порядка, т. е., видимо, со-
стоят из 16 субъединиц.
Базальная структура образована 9—12 различными белками
с молекулярными массами от 9000 до 60 000. Базальную струк-
hirt белок 22,5 нм
Рис. 49. Модель инверсий элемента,
контролирующего активность Н-2-гена
Salmonella [Silverman, 1980].
М — молчащая ДНК. Объяснения в тексте.
Рис. 50. Строение базальной
структуры жгутика грамотрица-
тельной бактерии.
цм — цитоплазматическая мембрана;
мс — муреиновый слой; вм — внешняя
мембрана; М, Р, L, S — кольца; п —
палочка; к — крюк; нж — нить жгу-
тика.
ТУРУ удается отделить от клетки только при довольно жестких
обработках. Возможно, не все ее элементы при этом сохра-
няются.
Синтез белков базальной структуры определяется Па-генами,
нарушения в которых приводят к Р1а~-фенотипу. Р1а~-мутанты
неподвижны за счет нарушений в жгутиковых структурах. Од-
нако могут быть получены мутанты, обладающие всеми струк-
турами жгутикового аппарата, но неподвижные. Это Mot-му-
танты с «парализованными» жгутиками. Такие бактерии легко
могут быть отселекционированы в присутствии %-фага, который
прикрепляется к жгутику, закручивая вокруг жгутика свои ба-
зальные нити. За счет вращения жгутика происходит переме-
щение фага к его основанию, где и происходит инъекция фаго-
124
вой ДНК в клетку хозяина. Неподвижные клетки не подвержены
инфекции.
Гены Па, mot, che, обеспечивающие реакции хемотаксиса,
сгруппированы в трех определенных районах хромосомы, при-
чем расположение жгутиковых генов на хромосоме Е. coli отра-
жает особенности их функционирования. Гены со сходными
функциями обычно группируются вместе, часто в одном опе-
роне. Гены Па из разных районов хромосомы несут и разные
функции.
Транскрипция жгутиковых генов контролируется по иерархи-
ческому принципу, при котором транскрипция одной группы ге-
нов регулируется продуктами другой. Система циклический
АМФ — АМФ-регуляторный белок контролирует выражение Па 1
Рис. 51. Порядок сборки базальной структуры жгу-
тика [Suzuki е. а., 1978].
Обозначения, как на рис. 50.
Па В-оперона, продукты которого являются позитивными эффек-
торами выражения группы определенных fla-генов. Продукты
последних в свою очередь являются позитивными эффекторами
третьей группы генов, включающей некоторые fla-гены, hag-ген
и все mot- и che-гены. Существенно, что ген флагеллина, т. е.
наиболее обильно синтезируемого жгутикового белка, находится
в основании этой пирамиды. Существует механизм, определяю-
щий временную и пространственную организацию сборки жгу-
тикового аппарата. На основе изучения Fla-мутантов была вы-
явлена последовательность синтеза и сборки элементов базаль-
ной структуры (рис. 51).
У перитрихов в течение клеточного цикла число жгутиков
у клетки удваивается, и каждая дочерняя клетка получает при-
мерно одинаковое их количество. Имеются наблюдения, свиде-
тельствующие о существовании механизмов, обеспечивающих
синхронность образования жгутиков и клеточного деления.
§ 2. Механизм работы жгутика
Жгутик представляет собой относительно жесткую спи-
раль, обычно закрученную против часовой стрелки, в период
эффективной работы жгутик тоже вращается против часовой
125
стрелки (если осмотреть на плывущую бактерию сзади). Жгу-
тик работает подобно винту корабля. Пучок жгутиков у лофо-
трихов образует одну массивную спираль. У перитрихов с не-
большим числом жгутиков при движении они тоже собираются
в пучок. Характер работы жгутиков у перитрихов с большим
числом жгутиков, например у гигантских клеток Proteus, пока
мало понятен. Такие бактерии плавают хуже, чем моно- или
лофотрихи, часто кувыркаются, но зато хорошо перемещаются
по влажной поверхности плотного субстрата, например агара,
т. е. лучше ползают, чем плавают.
Обычно жгутик расположен на заднем конце плывущей
клетки, но жгутик или пучок жгутиков, расположенные спереди,
тоже могут эффективно двигать клетку, и в этом случае они
направлены назад и вращаются сбоку от нее. Вращение жгу-
тика вызывает вращение клетки, но в противоположном направ-
лении, однако поскольку клетка все же значительно массивнее
жгутика, она совершает намного меньше оборотов. Имеющиеся
данные относительно частоты вращения жгутиков и клеток до-
вольно противоречивы. Очевидно, что скорость вращения нити
жгутика, а следовательно, и скорость поступательного движения
организма зависят от видовой принадлежности бактерии, ее
физиологического состояния, температуры, состава среды. Ча-
стоту вращения пучка жгутиков у бактерий можно определить
при темнопольной микроскопии, но с достаточной достоверно-
стью только у крупных бактерий. Так, частота вращения пучка
жгутиков спириллы около 40 об/с, а тело вращается при этом
со скоростью 12—14 об/мин. Скорость поступательного движе-
ния, например Thiospirillum jenense,— 87 мкм/с. У Chromatium
okenii жгутики совершают 40—60 оборотов в секунду, и бакте-
рия движется со скоростью 46 мкм/с. Относительно быстро
плавают спириллы и вибрионы. Нетрудно рассчитать, что спи-
рилла проплывает около 30 см/ч. Скорость вибрионов иногда
может превышать 100 мкм/с. Для холерного вибриона зафик-
сирована скорость, при которой за час он может проплыть около
80 см. Скорость плавания некоторых других бактерий состав-
ляет у Pseudomonas aeruginosa — 56 мкм/с, Е. coli— 16 мкм/с,
Bacillus licheniformis — 21 мкм/с, Sporosarcina urea — 28 мкм/с.
Направление вращения нити жгутика может изменяться.
Если левозакрученная спираль начинает вращаться по часовой
стрелке, бактерия останавливается или начинает кувыркаться.
При изменении направления вращения жгутика у Е. coli изме-
няются и его конфигурация, и направление хода спирали. Нить
жгутика трансформируется в правоспиральную структуру, при-
чем шаг спирали уменьшается и получаются «курчавые» жгу-
тики. Переход к правой спирализации начинается у проксималь-
ного конца нити и движется к дистальному. Предполагают, что
гидродинамическая сила, воздействующая на жгутик во время
изменения направления вращения, является причиной возник-
126
новения правой спирализации. Такие жгутики неспособны обра-
зовывать правильную косу, отчего клетки начинают кувыркаться
или дрожать, не совершая при этом поступательного движения.
Подобные трансформации жгутика наблюдали у Е. coli, однако
неясно, насколько они универсальны.
Жесткая спираль нити жгутика вращается за счет работы
базального тела, представляющего собой своеобразный электро-
мотор. Вращение жгутика, вызываемое вращением базальной
структуры, было доказано прямыми наблюдениями. Е. coll по-
мещали на предметное стекло в каплю суспензии антител кфла-
геллину, которые имеют тенденцию адсорбироваться на поверх-
ности стекла. За счет взаимодействия антител со жгутиками
бактерии прикреплялись к стеклу. Прикрепленные клетки
быстро вращались, периодически изменяя направление. Оче-
видно, что вращение клетки могло происходить лишь за счет
вращения жгутиков. В другом эксперименте к прямым жгути-
кам неподвижного мутанта были прикреплены частицы латекса.
В микроскопе можно было видеть, как частицы латекса враща-
лись вокруг невидимой оси. Наблюдали также вращение му-
тантов Е. coli, у которых отсутствует нить жгутика и образуются
суперкрюки, при условии, что бактерии прикреплены к стеклу
антителами к белку крюка. Это свидетельствует о том, что нить
жгутика не играет во вращении активной роли. А. Н. Глаголев
наблюдал вращение клеток Rhodospirillutn, прикрепленных
к поверхности стекла. Они располагались перпендикулярно
к плоскости препарата и напоминали винт. При их вращении
создавалось впечатление, что спираль приближается к наблю-
дателю или удаляется от него в зависимости от направления
вращения жгутиков.
Предполагают, что вращение жгутика определяется враще-
нием М-кольца, тогда как другие кольца базальной структуры
неподвижны и служат для крепления в оболочке бактерии оси-
палочки, через которую вращение кольца передается на крюк,
а затем на нить жгутика.
Энергетика вращения жгутика обеспечивается трансмем-
бранной протондвижущей силой ДцН+ в соответствии с меха-
низмом, рассмотренным ранее (см. с. 85). АТФ не обязателен
для движения и сам по себе его не обеспечивает. Известно, что
АТФ перестает синтезироваться при Ap,H+<180 мв, движение
же сохраняется и при ДцН+ = 20 мв, поскольку обеспечивается
непосредственно ДцН+. В поисках благоприятных условий бак-
терии могут двигаться и в отсутствие синтеза АТФ, хотя и с по-
ниженной скоростью, поскольку скорость вращения жгутиков
зависит от величины мембранного потенциала.
Гипотетическая схема работы жгутикового мотора была
предложена в 1978 г. А. Н. Глаголевым и В. П. Скулачевым.
Предполагают, что локализованное в цитоплазматической мем-
бране М-кольцо содержит на периферии поясок из —NH2 групп
127
(рис. 52). Одна из серии аминогрупп открывается в верхний
протонпроводящий путь. Анионная группа, например карбок-
сильная, прикреплена к мембране в начале нижнего протонпро-
водящего пути. Протонирование —NH2 приводит к электроста-
тическому притяжению между —NH3+ и —СОО“ группами. По-
скольку —NH3+ прикреплена к М-кольцу, колесо поворачивается,
чтобы сблизить —NH3+ и —СОО~ группы. Постулируется, что
расстояние между двумя протонными полуканалами равно рас-
стоянию между двумя соседними аминогруппами. Вращение
М-кольца приводит к перемещению следующей аминогруппы
к верхнему протонному пути. Протонирование —СОО~ —МН3+
группой сопровождается выбросом Н+ через нижний полуканал
Рис. 52. Модель работы протон-
ного мотора — базальной струк-
туры жгутикового аппарата бак-
терии [Glagolev, Skulachev, 1978].
ц — цитоплазма; остальные обозначе-
ния, как на рис. 50.
Рис. 53. Базальная структура осе-
вой нити Treponema reiter [Hougen,
Birch-Andersen, 1971].
он — осевая нить; бк — базальное кольцо;
остальные обозначения, как на предыду-
щих /рис.
в цитоплазму. Число транслоцированных за один поворот про-
тонов равно числу —NH2 групп. Предполагают, что на один
оборот мотора расходуется около 103 протонов.
Особенности движения спирохет. Спирохеты (порядок Spiro-
chaetales)—спиральные грамотрицательные бактерии, их тело
состоит из протоплазматического цилиндра, ограниченного цито-
плазматической мембраной, и внешнего чехла, образованного
муреиновым слоем оболочки и внешней мембраной, т. е. обо-
лочка спирохет имеет такое же строение, как и оболочки других
грациликутных. Однако у спирохет спиральный протоплазмати-
ческий цилиндр перекручен с пучком осевых нитей, расположен-
ных в пространстве между цилиндром и внешним чехлом. Осе-
вые нити спирохет являются аналогами жгутиков других бак-
терий. Число отдельных осевых нитей у разных видов варьирует
от 2 до 100 и более. Осевая нить одним концом укреплена на
полюсе протоплазматического цилиндра, другой конец остается
свободным. Осевые нити лишь немного короче тела спирохеты
и в центральной его части перекрываются пучками нитей,
укрепленных на полюсах клетки. Осевые нити соединены с про-
128
топлазматическим цилиндром при помощи крюка и базальной
структуры, состоящей из палочки-оси, и в зависимости от вида
1 или 2 колец (рис. 53).
Базальная структура осевой нити спирохеты аналогична ба-
зальной структуре жгутика и, очевидно, также служит для вра-
щения оси нити.
Спирохеты всегда очень подвижны и способны осуществлять
разнообразные движения, при этом тело изгибается, образуя
вторичные спирали, вращается на одном месте или совершает
поступательные движения.
Попытки объяснить механизм движения спирохет предпри-
нимались многократно, однако к настоящему времени имеются
лишь более или менее правдоподобные гипотезы. Относительно
подробно аргументирована схема, объясняющая механизмы
движения лептоспир, разработанная
Бергом с соавторами.
Рис. 54. Типы движений лептоспиры {Berg е. а., 1978].
Л — первый тип; Б — второй тип; а — поперечный срез клетки; б — вид сбоку. Осевая
нить вращается по часовой стрелке, шифрами обозначены позиции.
Можно предположить, что осевые нити лептоспир мало эла-
стичны и спиральны, тогда как протоплазматический цилиндр
более эластичен. Осевые нити лептоспир довольно короткие, две
из них укреплены на противоположных полюсах клетки. Форма
концов тела лептоспиры может изменяться и определяется ра-
ботой нити, укрепленной на противоположном полюсе. Если
нить не вращается или вращается в одном направлении, соот-
ветствующий конец образует крюк, если нить вращается в дру-
гом направлении, концевая часть клетки образует ‘вторичную
спираль. Это будет зависеть от того, соответствует ли направ-
ление вращения нити ходу ее спирали и цилиндра.
Возможно два типа движения клетки лептоспиры. В первом
случае предполагается, что внешний чехол и протоплазматиче-
ский цилиндр фиксированы друг относительно друга в цент-
ральной части клетки. Тогда вращение нитей приводит к коле-
бательным движениям концов клетки (рис. 54, а). Внешний
чехол и протоплазматический цилиндр изгибаются, но не вра-
щаются. Второй тип движения связан с вращением и изгиба-
9 Б. В. Громов 129
нием протоплазматического цилиндра и внешнего чехла, вызы-
ваемого вращением осевых нитей (рис. 54, б).
В любом случае клетки совершают поступательное движе-
ние, если нити, укрепленные на противоположных концах клет-
ки, вращаются в противоположных направлениях. При этом ве-
дущий конец клетки спирален, а задний крючкообразно изогнут.
Движущая сила возникает в основном за счет волнообразных
Рис. 55. Формы тела лептоспир
при движении в жидкости [Berg
е. а., 1978].
а—в — вращение без поступательного
движения, г —движение бактерии на-
право.
движений переднего конца клет-
ки, связанных с вращением пе-
редней осевой нити (рис. 55).
Движение наиболее эффектив-
но, если спираль осевой нити за-
кручена вправо (если смотреть
на бактерию со стороны базаль-
ной структуры) и вращается по
часовой стрелке, а протоплазма-
тический цилиндр представляет
собой левозакрученную спираль,
или, наоборот, осевая нить лево-
закрученная, вращается против
часовой стрелки, а цилиндр за-
кручен вправо. В этом случае
возникают волнообразные движе-
ния. Изменение направления вращения нити приводит к образо-
ванию крюка. У некоторых клеток крюк на заднем конце клетки
не образуется; видимо, у таких клеток имеется только одна осе-
вая нить. Если же у клетки один конец прямой, а на другом
образуется крюк, тело ее вертится, но не совершает поступа-
тельного движения. Когда обе осевые нити вращаются в одном
и том же направлении, клетка не совершает поступательного
движения. При этом оба конца клетки колеблются в противо-
положных направлениях или на обоих концах образуются крюки.
В вязкой среде лептоспира может двигаться поступательно
при вращении прямого тела, ввинчиваясь в среду подобно што-
пору.
§3. Таксисы бактерий
Само по себе движение бактерий, независимо от его на-
правленности, не имеет большого смысла и едва ли может иметь
приспособительное значение. Видимо, все подвижные бактерии
способны перемещаться в направлении, определяемом теми или
иными внешними стимулами. Движение, ориентированное отно-
сительно направления стимула, называют таксисом.
У бактерий в зависимости от природы стимула различают
фототаксис, магнетотаксис, термотаксис, вискозитаксис, хемо-
таксис и геотаксис, существование последнего проблематично.
130
Фототаксис, т. е. движение к свету или от него, обнаруживают
прежде всего фототрофные бактерии.
Магнетотаксис — способность плыть по силовым линиям маг-
нитного поля земли или магнита — свойствен бактериям, оби-
тающим в стоячих водах. В клетках этих магнетобактерий
имеются специальные включения ферритина, выполняющие
функцию магнитной стрелки. В северном полушарии магнето-
бактерии плывут в направлении северного полюса, в южном —
в направлении южного. В силу характера расположения маг-
нитных линий земли бактерии фактически перемещаются не
к полюсам, а ко дну водоема, к илу, где сосредоточены источ-
ники пищи бактерий.
Вискозитаксис — способность реагировать на изменение вяз-
кости раствора и плыть в направлении ее увеличения или сни-
жения. У некоторых спирохет обнаружен положительный виско-
зитаксис, т. е. они плывут в направлении возрастания вязкости.
Для спирохет, паразитирующих в теле человека и животных,
это имеет приспособительное значение, поскольку приводит
к движению в направлении поверхности слизистых оболочек.
У Е. coli обнаружен отрицательный вискозитаксис. Изменения
вязкости среды, видимо, воспринимаются жгутиком, но меха-
низм передачи сигнала на мотор пока не изучен, так же как
и в случае магнетотаксиса.
Наибольшее внимание исследователей привлечено к изуче-
нию хемотаксиса, т. е. движения в определенном направлении
относительно источника химического вещества — эффектора.
Бактерии определяют наличие градиента концентрации эффек-
тора в пространстве или во времени. Для каждого организма
все вещества могут быть разграничены на не вызывающие так-
сисов и на эффекторы — аттрактанты и репелленты. Аттрак-
танты— это вещества, привлекающие бактерий, репелленты —
вещества, их отпугивающие. Для плавающих бактерий един-
ственным установленным пока механизмом таксиса является
клинокинез, при котором направление движения зависит от из-
менения частоты изменений направления движения. Конкретный
механизм клинокинеза бактерий был выяснен к 1972 г. в лабо-
раториях Берга и Кошланда. В отсутствие градиентов аттрак-
тантов или репеллентов клетка плывет прямо в течение 1—2 с,
затем в течение долей секунды кувыркается или дрожит и затем
снова плывет по прямой в другом, случайно выбранном направ-
лении. Как уже было описано, поступательное движение опре-
деляется вращением жгутиков против часовой стрелки, а ку-
выркание происходит при изменении направления вращения.
Монотрихи не кувыркаются, но останавливаются и затем плы-
вут в другом направлении. Длина пробега возрастает, если бак-
терия плывет в направлении увеличения концентрации аттрак-
танта или уменьшения концентрации репеллента. Если бактерия
плывет в направлении уменьшения концентрации аттрактанта
9*
131
или увеличения концентрации репеллента, частота изменений
направления вращения жгутика, т. е. частота кувыркания, воз-
растает.
Чувствительность бактерий к градиенту очень высока, бак-
терии иногда реагируют на разницу концентрации вещества
между полюсами клетки в I/104, однако в действительности
реакция определяется изменением концентрации во времени
в процессе передвижения клетки по градиенту концентрации.
Соответствующую реакцию клетки можно наблюдать, если резко
изменить концентрацию эффектора в среде, так что градиента
не образуется. Это позволяет некоторым авторам говорить о су-
ществовании у бактерий определенного механизма химической
памяти.
Изменение частоты кувырканий после изменения концентра-
ции стимула длится только в течение некоторого времени адап-
тации, после чего восстанавливается исходная частота. В зави-
симости от ряда условий период адаптации длится от несколь-
ких секунд до нескольких минут. Период адаптации есть то
время, в течение которого «стирается» информация о предше-
ствующей концентрации эффектора.
Способность клетки реагировать на градиенты соответствую-
щих веществ определяется наличием у бактерий специфических
хеморецепторов. С углублением и развитием исследования хемо-
таксиса все время растет число рецепторов, существование ко-
торых приходится допустить. У Е, coli, видимо, имеется не ме-
нее 30 различных рецепторов. Они представляют собой белки,
синтезируемые, подобно разным ферментам, независимо от при-
сутствия индуктора или только в результате индукции. Рецеп-
торы обладают специфичностью, т. е. каждый рецептор спосо-
бен связываться только с определенными, обычно родственными
веществами. Механизмы, определяющие специфичность рецеп-
торов, пока неизвестны. Один и тот же субстрат иногда может
реагировать с несколькими рецепторами, хотя эффективность
рецепции обычно сильно различается. Эффект определяется
степенью сродства вещества к данному рецептору и числом
молекул рецептора, которыми располагает клетка. Рецепторы
распознают вещества, образуя с ними комплексы, при этом ни
транспорт, ни метаболизм субстрата не обязательны для рецеп-
ции. Быть может, взаимодействие субстрата с рецептором ана-
логично реакции антитела с антигеном.
Некоторые рецепторы, например рецепторы галактозы,
мальтозы и рибозы у кишечной палочки, являются периплазма-
тическими белками и одновременно как белки-переносчики
участвуют в транспорте этих сахаров, хотя это и не является
обязательным для рецепции. Рецепторами для других сахаров,
например глюкозы у кишечной палочки, могут быть соответ-
ствующие ферменты II фосфотрансферазной системы транс-
порта (см. с. 88). Это мембранные белки, но и в этом случае
132
рецепторные и транспортные их функции не взаимозависимы.
Аминокислотные рецепторы не участвуют в транспорте соответ-,
ствующих аминокислот.
Кислород при так называемом аэротаксисе, видимо, акцеп-
тируется цитохромом О. Существуют рецепторы для Н+ и ОН"
ионов. Могут быть и менее специфические реакции, например
на соединения, изменяющие мембранный потенциал.
Сигнал от некоторых рецепторов передается на метилакцеп-
торные белки, входящие в состав цитоплазматической мембраны.
При этом, видимо, образуется комплекс эффектора, рецептора
и метилакцепторного белка. Метилакцепторные белки являются
аминокислотными рецепторами. У кишечной палочки биохими-
чески охарактеризовано три метилакцепторных белка. Опреде-
ленный рецептор после реакции с соответствующим эффектором
связывается с соответствующим метилакцепторным белком, т. е.
имеется несколько путей передачи информации через метилак-
цепторные белки, и эти пути могут быть не одинаково эффек-
тивны хотя бы потому, что число молекул метилакцепторных
белков может быть различно. В зависимости от ситуации каж-
дая молекула метилакцепторного белка может метилироваться
в нескольких участках. Метилируется глютаматный радикал
белка (рис. 56). У кишечной палочки увеличение концентрации
аттрактанта приводит к усилению метилирования соответствую-
щего белка, хотя у других бактерий может наблюдаться обрат-
ная зависимость. В метилировании принимает участие фермент
метилтрансфераза, переносящий метильную группу с С-адено-
зилметионина на белок. У мутантов, дефицитных по метионину,
при отсутствии в среде метионина хемотаксис может быть на-
рушен.
Метилакцепторный белок может деметилироваться фермен-
том метилэстеразой. Взаимодействие процессов метилирования
и деметилирования, видимо, определяет частоту кувырканий
клетки, хотя конкретные механизмы переноса сигнала с метил-
акцепторного белка на мотор жгутика остаются неизвестными.
Метилакцепторные белки, таким образом, являются элементом
химической памяти бактерий и связаны с механизмами адап-
тации. Однако в некоторых таксисах эти белки не принимают
участия, например в аэротаксисе и таксисах, связанных с бел-
ками фосфотрансферазной системы. Высказано весьма гипоте-
тическое предположение о значении транспорта Са2+ из клетки
при работе жгутика и о возможной зависимости внутриклеточ-
ного содержания Са2+ от заряда метилакцепторных белков,
изменяющегося при метилировании.
Так или иначе, для передачи сигнала от рецепторов к «мо-
тору» жгутика требуются, по крайней мере, продукты 12 генов.
Одна из предложенных схем передачи сигнала при хемотаксисе
приведена на рис. 57. Хемоэффекторы проходят через внешнюю
мембрану и соединяются с рецепторами в периплазме: рибозо-
133
связывающим белком (РСБ), галактозосвязывающим белком
(ГСБ), мальтозосвязывающим белком (МСБ) или с рецепто-
рами, расположенными в цитоплазматической мембране: ман-
ноза с белком pts М, глюкоза с pts G (белки фосфотрансфераз-
ной системы), серин с tsr-белком, аспартат с tar-белком, О2
с цитохромом О и т. п. При сигналах, идущих через метилак-
цепторные белки — ter, tsr, trg, процесс адаптации зависит от
метилирования этих белков и деметилирования, катализируе-
мых метилтрансферазой (R) и метилэстеразой (В) соответ-
ственно. Для сигналов, передающихся через другие сигнальные
сн он
S-аденозилметионин
Рис. 56. Цикл метилирования метилакцепторных белков
(МАБ) при хемотаксисе бактерий [Hazelbauer, 1980].
Объяснение в тексте.
белки (pts М, pts G, pmf), адаптация не зависит от метилиро-
вания. «С» и «V» на схеме обозначают выключатели жгутико-
вого мотора, A, W, Y, Z, S — продукты генов, необходимые для
передачи сигнала, функции которых пока неизвестны.
Если в среде создаются градиенты нескольких аттрактантов
или аттрактантов и репеллентов, конечный результат опреде-
ляется суммацией отдельных сигналов, однако здесь могут на-
блюдаться достаточно сложные взаимодействия. Если аттрак-
тант присутствует в среде, не образуя градиента, он не вызы-
вает таксиса, но взаимодействует с соответствующими рецепто-
рами, вызывая, например, определенный уровень метилирова-
ния метилакцепторного белка. Кроме того, рецепторы оказы-
ваются занятыми и не могут связываться с другими аттрак-
тантами. При этом возможны конкурентные взаимодействия.
134
В условиях сложных сред наблюдаются не всегда понятные
эффекты. Высказывается предположение о существовании ком-
плексов рецепторов, в которых состояние каждого рецептора
может влиять на свойства остальных.
Существуют различные методы изучения хемотаксиса бак-
терий, но наиболее простым и адекватным является метод, ис-
пользовавшийся еще в прошлом веке Пфеффером и .модифи-
цированный применительно к количественным оценкам Адлером
более десятилетия тому назад. Суть метода заключается в том,
что во взвесь бактерий помещают капилляры: контрольные —
Рис. 57. Передача сигнала при хемотаксисе Е. coli и Salmonella typhimurium
[по Koshland в модификации Niwano, Taylor, 1982].
С — серин; А — аспарагин; М — мальтоза; Р — рибоза; Г — галактоза; Гл — глюкоза;
Ма — манноза.
с буферным раствором и опытные — с испытуемым веществом.
Если это аттрактант, бактерии скапливаются в опытном капил-
ляре в значительно большем числе, чем в контрольном. Тот же
эффект наблюдается, если репеллент содержится в основной
среде, но отсутствует в опытном капилляре. Для каждого ве-
щества могут быть определены пороговая концентрация и кон-
центрация насыщения. Пороговые концентрации разных веществ
сильно варьируют: от 10~6 и даже 10-8 М до 10-2 и 10-1 М. На-
сыщающие концентрации тоже могут быть очень различными,
но никогда аттрактант не становится репеллентом, и наоборот.
В качестве аттрактантов и репеллентов у бактерий фигури-
руют разнообразные вещества. Аттрактантами могут быть ами-
нокислоты, многие или только некоторые, сахара, многоатомные
спирты, витамины, нуклеотиды, неорганические катионы и
135
анионы; репеллентами — жирные кислоты, некоторые аминокис-
лоты, спирты, фенолы, неорганические ионы. Ионы водорода и
гидроксила для многих бактерий являются репеллентами, по
для некоторых они аттрактанты. Наиболее универсальным
аттрактантом для аэробных и репеллентом для анаэробных бак-
терий является кислород. Аттранктанты часто представлены пи-
щевыми субстратами, а репелленты бывают ядовиты, однако
прямой целесообразностью невозможно объяснить «выбор»
бактериями аттрактантов и репеллентов. Аттракция не связана
с метаболизмом субстратов и не зависит от пищевых потребно-
стей бактерий. Не все вещества, которые могут быть использо-
ваны и даже необходимы для организма, выступают в роли атт-
рактантов, также не все ядовитые соединения являются репел-
лентами и не все репелленты вредны. Так, ацетат является
репеллентом для кишечной палочки, но он для нее не токсичен
и даже может использоваться в энергетическом обмене. В на-
стоящее время признается сигнальное значение аттрактантов
и репеллентов, наличие градиентов которых в природе может
свидетельствовать об определенной экологической обстановке.
Так, наличие тех или иных аминокислот, служащих аттрактан-
тами для многих гетеротрофных бактерий, может прежде всего
свидетельствовать об идущем распаде белка и, следовательно,
наличии разнообразной пищи. Такие репелленты, как ацетат
и другие органические кислоты, этанол, понижение значения pH,
могут свидетельствовать о заселенности субстрата, поскольку
являются обычными продуктами бактериальных брожений.
Таксисы можно рассматривать как элементарную форму пове-
дения. Развитие подобных элементарных поведенческих реак-
ций в эволюции жизни на Земле имело весьма существенные
последствия.
Глава V
РОСТ И ДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ
Период от возникновения организма бактерий до прекра-
щения его существования называется онтогенезом. Для одно-
клеточных бактерий онтогенез равнозначен клеточному циклу,
который клетка проходит от деления до деления. Клеточный
цикл включает процесссы, связанные с ростом и делением клетки.
У бактерий иногда можно наблюдать рост без деления или де-
ление без роста, однако в норме эти процессы тесно взаимосвя-
заны и, как правило, с большим трудом поддаются раздельному
анализу. Эта особенность является характерным свойством про-
кариотической клетки. Вместе с тем процесс деления значи-
тельно легче нарушить, чем рост, а в некоторых случаях, на-
пример, L-формы могут неограниченно долго существовать при
нарушении нормальных механизмов деления клетки.
Клеточный цикл, не связанный с дифференцировкой, яв-
ляется вегетативным клеточным циклом. Согласно Виттенбари
и Дау, у бактерий можно выделить следующие типы вегетатив-
ного клеточного цикла: 1) мономорфный, при котором в нор-
мальных условиях образуется только один определенный морфо-
логический тип клеток, 2) диморфный, когда при делении воз-
никают две клетки, различающиеся формой, размерами или
имеющие другие отличительные признаки, и 3) полиморфный,
характерный для бактерий, которые могут в зависимости от
особенностей среды обитания образовывать два (или более)
морфологически различных типа клеток, каждый из которых
характеризуется определенными и постоянными особенностями
клеточного цикла. Изменения морфологии при этом не яв-
ляются отражением патологических процессов, т. е. физиоло-
гически нормальны.
Мономорфный клеточный цикл характерен для большинства
бактерий, в том числе для £\ coll. Диморфный клеточный цикл
наблюдается у почкущихся форм бактерий, имеющий про-
стеки, и некоторых других. Лучше всего он изучен у Caulobac-
ter. Полиморфный клеточный цикл описан у бактерий рода
137
Arthrobacter, некоторых почкующихся бактерий, у представите-
лей Actinomycetales,
Процессы дифференцировки связаны со специфическими
модификациями клеточных циклов. Дифференцировка — это по-
следовательные процессы клеточного цикла, приводящие к об-
разованию специализированного типа клеток. Такие дифферен-
цированные клетки обладают способностью превращаться
в обычные вегетативные (эн-
доспоры бактерий) или, вы-
полнив свою функцию, отми-
рают (клетки, отпочковываю-
щие экзоспоры).
Развитие — это комплекс-
ное явление, включающее
рост и дифференцировку, в
том числе дифференцировку
некоторых клеток в многокле-
точных комплексах, специали-
Рис. 58. Образование сетчатых ко-
лоний Pelodictyon.
зированных на выполнение
специфических функций, обес-
печивающих выживание вида
(дифференцированные клетки
в жизненном цикле миксобак-
терий). Понятие развития
больше применимо к популя-
ции бактерий, а не к индивиду.
Можно отметить некоторые
общие закономерности роста и
деления бактериальных кле-
ток. Основной рост клетки
обычно идет вдоль ее длинной
оси, а деление происходит в
плоскости, перпендикулярной
этой оси. Бактерии, имеющие
разнообразную форму, в том
числе большинство кокков,
тоже растут вдоль некоторой
оси. Как уже отмечалось,
только в очень редких слу-
чаях, например у цианобактерий, относящихся к Pleurocapsales,
рост шарообразных клеток идет равномерно во все стороны
с последующим дроблением огромного кокка на многочислен-
ные мелкие дочерние клетки. Рост палочек вдоль длинной оси,
вероятно, целесообразен, так как при этом объем клетки увели-
чивается более или менее пропорционально ее поверхности.
Если бы палочки росли вширь, то поверхность увеличивалась бы
медленнее, чем объем, что снизило бы эффективность обмена
клетки со средой. Кроме того, при росте вширь и продольном
138
делении синтез вещества оболочки был бы во времени разделен
с синтезом других клеточных компонентов, что для бактерий
нежелательно. Действительно, разделение во времени различ-
ных синтетических процессов неизбежно привело бы к удлине-
нию клеточного цикла.
Как уже говорилось, у большинства бактерий не наблю-
дается полярности клеток, но у некоторых клеток концы все же
неравноценны. В последнем случае при делении образуются
«зеркальные» особи, что хорошо прослеживается у бактерий
с асимметричными клетками.
Отмеченные закономерности определены генетически и лег-
ко могут быть-нарушены, а в некоторых случаях имеют место
и естественные отступления. Например, у бактерии Pelodyction,
образующей сетчатые колонии, нормальные поперечные деления
клетки чередуются с продольными (рис. 58), причем это чере-
дование довольно строго регулируется.
§ 1. Мономорфный клеточный цикл
Е. coli — типичная одноклеточная бактерия с мономорф-
ным клеточным циклом. В процессе роста клетки идет линейное
непрерывное увеличение ее поверхности и объема, но незадолго
до наступления деления скорость роста скачкообразно увеличи-
вается, т. е. характер роста клетки Е. coli билинейный.
К делению клетки приводит последовательность событий,
в которой может быть выделен ряд периодов. Период I пред-
шествует началу репликации хромосомы (инициация), т. е.
в течение этого времени у новой клетки синтеза ДНК не проис-
ходит. Период I, продолжительность которого варьирует, можно
обнаружить только у бактерий, время генерации которых более
60 мин. За периодом I следует период С, в течение которого
происходят инициация репликации, репликация ДНК и ее тер-
минация. При этом окончание периода С определяется терми-
нацией очередного раунда репликации, новообразовавшиеся
дочерние хромосомы могут содержать репликационные вилки,
соответствующие следующим раундам деления. Поэтому окон-
чание периода С не обязательно означает окончание синтеза
ДНК.
Третий период D занимает время от терминации раунда ре-
пликации хромосомы до разделения клетки. Иногда выделяют
еще Т-период — время от начала до конца образования пере-
городки и перетяжки между дочерними клетками.
Все эти этапы в литературе часто рассматривают как пе-
риоды клеточного цикла, хотя они не всегда соответствуют ста-
диям онтогенеза клетки. В быстро растущих клетках одновре-
менно идут процессы, обеспечивающие два или даже три
последующих деления. Так, независимо от скорости роста при
139
времени генерации от 20 до 70 мин длительность С-периода
составляет около 40 мин, а D-периода — около 20 мин. При
времени генерации более 40 мин синтез ДНК в клетке преры-
вист, при генерации длительностью 40 мин и меньше — непре-
рывен. У быстро растущих клеток в определенный момент
наблюдается удвоение интенсивности синтеза ДНК. Поскольку
скорость репликации ДИК по ходу репликационной вилки счи-
тается постоянной, удвоение интенсивности синтеза можно объ-
яснить удвоением числа реплицирующихся вилок, как это
условно показано на рис. 59. Из приведенной схемы также
видно, что во всех случаях для удвоения хромосомы необходимо
40 мин, а время между удвоениями хромосомы и делением
клетки соответствует 20 мин. Время генерации может быть зна-
чительно меньше времени удвоения хромосомы благодаря тому,
что на ней одновременно имеется несколько репликационных
вилок, и, таким образом, дочерняя клетка сразу после деления
Рис. 59. Репликация хромосомы Е. coli в зависи-
мости от времени генерации [James, 1978].
Прямой линией обозначена условно кольцевая хромо-
сома, точкой — вилка репликации.
уже содержит частично реплицированный геном. С моментом
удвоения числа репликационных вилок связывают также уве-
личение скорости линейного роста поверхности и объема
клетки. Естественно, что быстро растущие клетки содержат
больше ДНК, чем медленно растущие, но при этом концентра-
ция ДНК в клетке, так же как и относительный объем ну-
клеоида, больше у медленно растущих клеток.
Зона нуклеоида удлиняется по мере роста клетки в длину,
затем нуклеоид делится перетяжкой. У быстро растущих клеток
физическое разделение нуклеоида приблизительно совпадает
с моментом терминации репликации хромосомы. Но момент де-
ления нуклеоида может значительно отставать от терминации
репликации хромосомы у медленно растущих клеток. Образо-
140
вание перетяжки между дочерними клетками начинается еще
до полного разделения нуклеоида.
Время между инициациями раундов репликации хромосомы
не зависит от продолжительности С- и D-периодов, которая
также может изменяться независимо. При увеличении времени
генерации до 60 мин и более изменяется длительность С- и
D-периодов, хотя отношение C/D=2 изменяется мало. Тепло-
вой шок клеток синхронизирует деление, но не репликацию
ДНК, т. е. действует на D-период.
Процесс образования перетяжки у Е. coli В/г, т. е. Т-период,
при времени генерации в 60 мин и менее не зависит от скорости
роста и составляет примерно 10 мин. При более медленном
росте этот период пропорционально увеличивается, составляя
около 1/6 времени всего клеточного цикла. Между завершением
образования перетяжки и расхождением дочерних клеток про-
ходит не более минуты.
Обнаруживается определенная взаимозависимость между
скоростью роста клетки, ее средней массой и состоянием хро-
мосомы. Первым событием, приводящим в конечном счете к де-
лению клетки, является инициация репликации хромосомы.
В нормальных условиях этот процесс контролируется массой
клетки. Подобная закономерность позволила Донаши и Беггу
в 1970 г. сформулировать концепцию элементарной клетки (unit
cell). Элементарная клетка — это клетка наименьших возмож-
ных размеров (у Е. coll В/г ее длина 1,7 мкм) с одной нереп-
лицированной хромосомой. Если такую клетку’ поместить
в среду, где время ее генерации 60 мин, то, как было описано
выше, произойдет репликация хромосомы, удвоение массы
клетки и рост в длину до 3,4 мкм. Затем такая клетка делится
на две также элементарные клетки. В несинхронной культуре
они будут соответствовать 1—2 эквивалентам элементарной
клетки. При помещении элементарной клетки в более богатую
среду, где время ее генерации соответствует, например, 30 мин,
масса клетки через 30 мин удвоится, но репликация хромосомы
еще не закончится, и удвоение массы клетки вызовет инициацию
новых раундов репликации хромосомы, однако первое клеточ-
ное деление произойдет только через 60 мин после прохожде-
ния клеткой С- и D-периодов. Ко времени деления масса клетки
будет эквивалентна 4 элементарным клеткам, а дочерние особи
получают уже частично реплицированную хромосому и их масса
будет примерно эквивалентна 2 элементарным клеткам. В даль-
нейшем клетки будут делиться каждые 30 мин, в несинхронной
культуре их масса будет варьировать от 2 до 4 эквивалентов
элементарной клетки. Рассуждая аналогичным образом, легко
убедиться, что при времени генерации 20 мин масса клеток
в культуре будет эквивалентна 4—8 элементарным клеткам.
Завершение репликации хромосомы — необходимое условие
для наступления деления клетки Е. coll В/г. Задержка репли-
141
кации приводит к образованию длинных нитчатых неделящихся
клеток, например после УФ облучения или в присутствии инги-
биторов синтеза ДНК и даже мутантных плазмид с наруше-
ниями синтеза ДНК при неразрешающей температуре. Репара-
ция повреждений ДНК приводит к задержке деления, так же
как и процессы, связанные с конъюгацией. Это объясняется
существованием соответствующих регуляторных механизмов, по-
лучены мутанты, у которых деление не зависит от терминации
синтеза хромосомы. При нарушениях репликации ДНК у таких
мутантов образуются лишенные ДНК нежизнеспособные клетки.
Механизм разделения дочерних клеток у Е. coli В/г по опи-
саниям различных авторов несколько различается. Так, иногда
наблюдают синхронный рост всех элементов оболочки, при этом
клетки разделяются перетяжкой без образования клеточной
перегородки, иногда же описывают формирование перегородки
из цитоплазматической мембраны и слоя муреина. Для выяв-
ления перегородки у Е. coll и других грациликутных рекомен-
дуют префиксировать клетки 5—10%-ным акролеином и
0,25%-ным глютаровым альдегидом, так как после обычной
фиксации осмием или глютаровым альдегидом перегородка не
обнаруживается.
В течение D-периода происходит изменение характера син-
теза муреина, подтверждения этому были получены при изуче-
нии особенностей действия на растущие клетки р-лактамных
антибиотиков, способных специфически ингибировать различные
процессы, связанные с синтезом муреина, в частности процессы,
ведущие к удлинению клетки или к ее делению. Так, пеницил-
лин G при малых концентрациях препятствует делению клетки
Е. coli, что приводит к образованию нитей, а при высоких кон-
центрациях вызывает лизис клеток. Это, вероятно, зависит от
повышенной чувствительности к антибиотику ферментов, уча-
ствующих в процессах, связанных с делением, но не с удлине-
нием клетки.
Производное пенициллина G — соединение FL 1060, вызы-
вает образование сферических клеток, не нарушая деление кле-
ток и не вызывая их лизиса. Здесь происходит специфическое
нарушение процесса удлинения клетки. Эффект того или иного
соединения, относящегося к антибиотикам р-лактамной группы,
зависит от сродства данного вещества к тому или иному фер-
менту цитоплазматической мембраны, причастному к синтезу
муреина. Добавление к культуре меченного С14 пенициллина G
с последующим электрофоретическим выделением комплексов
антибиотика с белками позволило установить наличие в цито-
плазматической мембране 6 реагирующих с этим антибиотиком
белков. FL 1060 связывается только с одним из этих белков.
У мутанта, устойчивого к FL 1060, этот фермент отсутствует,
и мутант растет в виде сферических клеток. Очевидно, этот
белок является специфическим ферментом, определяющим удли-
142
нение клетки. Аналогичным образом цефалексин, также р-лак-
тамный антибиотик, специфически связывается с другим бел-
ком, что нарушает деление клетки, но не ее рост в длину.
В пользу представлений о различии ферментов, участвующих
в синтезе муреина в процессе роста и деления, говорят также
результаты непосредственного определения активности фермен-
тов в процессе роста и деления бактерий. Исследование удель-
ной активности трех ферментов, связанных с синтезом муреи-
на,— карбоксипептидазы I, карбоксипептидазы II и амидазы
в клетках Е. coll, синхронизированных разделением в градиен-
тах плотности сахарозы, показало, что активность карбокси-
пептидазы I и амидазы существенно не меняется по мере роста
клеток, тогда как активность карбоксипептидазы II возрастает
втрое в период деления. Кроме того, термочувствительные му-
танты с нарушением клеточного деления при непермиссивной
температуре содержат сниженное количество этого фермента.
Данные некоторых опытов с использованием ингибиторов син-
теза РНК или белка — рифампицина и хлорамфеникола — сви-
детельствуют о необходимости белкового синтеза в период тер-
минации очередного раунда репликации хромосомы или позже,
в период деления клетки. Этот гипотетический белок получил
даже название терминационного. Однако ни белковый синтез,
ни синтез РНК в течение всего D-периода не являются необхо-
димой предпосылкой деления, а в некоторых условиях прекра-
щение синтеза белка и РНК за 20 мин до деления не препят-
ствуют ему.
Довольно сложным представляется вопрос о локализации зон
роста оболочки Е. coli в процессе удлинения клетки при деле-
нии. О локализации синтеза муреина можно судить по положе-
нию участков, где в первую очередь происходит его лизис под
воздействием пенициллина. По наблюдениям Донаши с соавто-
рами, такие участки расположены по центру клетки у относи-
тельно крупных бактерий, выросших на богатой среде, а у кле-
ток, взятых с бедной среды, положение таких участков варьи-
рует в зависимости от стадии клеточного цикла. У мелких
клеток, соответствующих элементарной клетке, такой участок
расположен сначала около полюса, по которому прошло пред-
шествующее деление. По мере роста клетки расстояние от зоны
синтеза муреина до старого полюса не меняется, но происходит
удлинение клетки со стороны молодого полюса, поэтому зона
синтеза муреина постепенно приближается к центру клетки,
готовой к делению.
Сходные закономерности были обнаружены Донаши и при
изучении распределения на поверхности внешней мембраны
растущих клеток рецепторов бактериофага Т-6. Однако исполь-
зование флюоресцирующих антител к антигенам оболочки, когда
включение нового материала должно было бы снизить свечение
143
предварительно адсорбировавших антитела участков, и авто-
радиографического метода при изучении ДАП недостаточных
мутантов, вырастающих в присутствии меченой ДАП, позво-
лило получить данные о диффузном росте оболочки Е. coli,
У фирмакутных рост клеточной оболочки прослеживается
легче, хотя механизмы регуляции клеточного деления у них
изучены еще меньше, чем у кишечной палочки.
Характер роста и клеточного деления грамположительных
кокков, относящихся к разным родам, несколько различается.
Рост всегда идет вдоль оси симметрии клетки, а деление в плос-
кости, перпендикулярной этой оси. У стрептококков ее направ-
ление стабильно, следовательно, они делятся всегда в одной
плоскости. У стафилококков деление происходит в двух взаимно
перпендикулярных плоскостях, ось симметрии после каждого
деления перемещается на 90°. Деление клетки в трех взаимно
перпендикулярных плоскостях при соответствующих перемеще-
ниях оси симметрии приводит к образованию пакетов.
Закономерности роста оболочки стрептококков исследованы
при помощи флюоресцирующих антител, специфичных к анти-
генам оболочки, и авторадиографически, по включению мече-
ного предшественника во вновь синтезируемую оболочку. В пер-
вом случае растущие клетки обрабатывают флюоресцирующим
антителом, затем помещают в среду без антител. Через неко-
торое время оболочка в экваториальных зонах клеток перестает
светиться, тогда как остальные ее участки светятся по-преж-
нему. Это, очевидно, свидетельствует о локальном росте обо-
лочки, так как при диффузном росте краска равномерно рас-
пределялась бы по всей поверхности. При использовании авто-
радиографического метода клетки, выращенные на среде
с меткой, фиксируют, получают ультратонкие срезы и помещают
их на слой фотоэмульсии. Через некоторое время фотоэмульсию
проявляют и препараты просматривают в электронном микро-
скопе. Зоны, содержащие радиоактивные изотопы, обнаружи-
вают по темным трекам. У стрептококков они расположены по
экватору клетки.
Особенности клеточного деления изучены у Streptococcus
faecalis, S. haemoliticus, S. pneumoniae. Характерной особен-
ностью изученных штаммов, значительно облечающей контроль
за ростом клетки, является наличие на поверхности клетки
экваториального утолщения клеточной стенки или пояска. Пер-
вый признак начала деления — появление утолщения клеточной
стенки под пояском в зоне инициации деления (рис. 60). Внут-
реннее ее утолщение дает начало клеточной перегородке, кото-
рая симметрично врастает внутрь клетки подобно диафрагме.
При этом синтез вещества клеточной стенки идет преимущест-
венно у внутреннего края перегородки. Одновременно с ростом
клеточной перегородки идет процесс ее расщепления на два
слоя, расходящиеся в разные стороны у поверхности клетки и,
144
таким образом, превращающиеся в новые участки перифериче-
ской клеточной стенки. Первым этапом их образования является
расщепление поверхностного валика и образование на его ме-
сте выемки, зона которой ограничена двумя новыми валиками,
обозначающими теперь границу между старой частью клеточной
стенки, образованной в течение предыдущей генерации, и новой,
возникшей в течение текущей генерации.
По мере роста клетки и увеличения площади перифериче-
ской стенки постоянно уменьшается периметр клеточной пере-
городки. Пропорционально его уменьшению происходит враста-
ние перегородки внутрь клетки, сопровождаемое уменьшением
отверстия, соединяющего дочерние клетки. При этом площадь
поверхности перегородки почти не изменяется вплоть до ее пол-
ного замыкания. Наряду с увеличением площади клеточной
Рис. 60. Рост оболочки и деление Streptococcus faecalis [Hig-
gins, Shockman, 1976].
а, б — появление эоны инициации синтеза оболочки (а) и выемки
на пояске (б), в — рост перегородки и новых участков перифериче-
ской оболочки. Затемнены новая оболочка и перегородка.
стенки утолщаются перегородка и новая часть периферической
стенки. Линейный рост и утолщение стенки могут быть до неко-
торой степени разделены, так как, видимо, существуют различ-
ные механизмы регуляции этих процессов. При угнетении бел-
кового синтеза линейный рост стенки прекращается, но процесс
утолщения вновь синтезированной ее части продолжается.
Рост новой периферической клеточной стенки идет вдоль про-
дольной оси клетки с одинаковой скоростью симметрично в обе
стороны от клеточной перегородки. Отношение длины новой
части периферической клеточной стенки к длине перегородки до
некоторой степени зависит от условий культуры: чем это отно-
шение меньше, тем мельче дочерние клетки. При угнетении
синтеза ДНК это отношение возрастает, и для зав-ершения син-
теза клеточной перегородки, видимо, необходимо завершение
репликации хромосомы, которая в норме идет параллельно с ро-
стом и делением клетки.
Механизмы, приводящие к расщеплению клеточной перего-
родки и расхождению дочерних клеток, до конца не выяснены.
Не вызывает сомнений необходимость специфических литических
Ю Б. В. Громов
145
ферментов для расщепления клеточной перегородки. У стрепто-
кокков обнаружена ацетилмурамидазная активность, приуро-
ченная главным образом к зоне роста клеточной стенки. Лити-
ческий фермент связан с клеточной стенкой и находится в ос-
новном в латентном состоянии, но может быть активизирован,
например при обработке клеток протеазами. При воздействиях
такого рода, так же как при помещении активно растущих кле-
ток в условиях голодания в буферный раствор, происходит пре-
ждевременное разделение клетки по экватору с образованием
двух полусфер. В норме активность фермента регулируется та-
ким образом, что расщепление перегородки точно следует за
Рис. 61. Деление Staphylococcus aureus.
/ — геометрия деления [Tzagoloff, Novick, 1977]: пунктирными линиями обозначены
сечения плоскостей деления; темным — часть оболочки, полученная от материнской
клетки; светлым — вновь синтезированная часть оболочки; А—Д — точки на клеточной
перегородке. 2 — механизмы клеточного деления [Tzagoloff, Novick, 1977]: а — инициа-
ция деления, действие надрезающей литической системы; б поперечный срез зоны
инициации (заштрихованы участки материнской оболочки); в — действие слущиваю-
щей литической системы; г — дезинтегрирующей литической системы; д—-расщеп-
ляющей литической системы. Пунктиром обозначена локализация расщепляющей ли-
тической системы; стрелками — точки приложения активности соответствующих лити-
ческих систем.
ее ростом. В то же время старая часть клеточной стенки стреп-
тококков не подвержена действию литических ферментов, пока
не удается обнаружить каких-либо признаков круговорота ее
вещества.
Интересной особенностью роста и деления клетки стрепто-
кокка является то, что здесь эти процессы не могут быть
сколько-нибудь четко отдифференцированы.
Клеточное деление стафилококков отличается рядом специ-
фических особенностей (рис. 61). В то время как у стрептокок-
ков расщепление клеточной перегородки происходит по мере ее
роста и внешне создается впечатление постепенного деления
клетки за счет образования перетяжки, у стафилококков сна-
чала образуется перегородка, расщепление которой происходит
только в самый момент деления. Растущая клетка остается
146
круглой или слегка овальной до самого момента расхождения
дочерних клеток. Расщепление перегородки происходит быстро,
толчком, но не является полным. Дочерние клетки сразу при-
нимают округлую форму. Так как перегородка расщепляется не
полностью, то клетки остаются связанными. Хотя плоскости
последовательных делений клетки перпендикулярны друг другу,
неразделенные участки перегородки могут быть расположены
на ней случайным образом, поэтому и образуются характерные
гроздьевидные скопления клеток.
Деление Staphylococcus aureus начинается с образования
утолщения — валика на внутренней стороне клеточной стенки
в зоне инициации деления. Валик опоясывает всю клетку в плос-
кости деления. Деление стафилококков связано с активностью
ряда литических систем. Во-первых, материнская клеточная
стенка разрезается специальной литической системой непосред-
ственно над растущей перегородкой. Здесь происходит рост
участка новой периферической стенки, которая частично раздви-
гает материал материнской стенки, а частично образует под-
стилающий ее слой. Материнская клеточная стенка при этом:
служит как бы матрицей, определяющей форму нового слоя
стенки. Примерно 2/3 новой поверхности дочерней клетки после
деления может образоваться за счет бывшей клеточной пере-
городки и около V3 — за счет собственного роста перифериче-
ской стенки. На поперечном срезе зона роста клеточной стенки
в первое время напоминает силуэт летящей птицы, крылья ко-
торой образованы периферической клеточной стенкой, а тело —
клеточной перегородкой. Происходящие в зоне роста синтети-
ческие процессы имеют, по крайней мере, четыре точки прило-
жения: благодаря им происходят линейный рост и утолщение
перегородки и периферической стенки.
В нормальных условиях рост периферической стенки сопро-
вождается активностью слущивающей литической системы, от-
деляющей внешний старый слой стенки от внутреннего моло-
дого, и дезинтегрирующей литической системы, растворяющей
этот слущенный слой. В результате отторжения части старой
стенки на поверхности клетки нередко остается своеобразный
шрам, обозначающий границу новой и старой клеточных стенок.
При нарушении литических процессов, например в присут-
ствии ингибиторов, вся новая клеточная стенка может оказаться
заключенной внутри старой. Клеточная перегородка сначала
иногда асимметрична, но по мере ее роста эта асимметричность
постепенно уменьшается. Перегородка врастает внутрь клетки
подобно диафрагме, внутренний край ее утолщен, причем валик
может иметь форму шестигранника, отверстие в клеточной пе-
регородке также может быть не круглым, но правильным шести-
гранником.
В присутствии высоких концентраций ингибиторов белкового
синтеза — хлорамфеникола, пуромицина, актиномицина наблю-
10* 147
дается полное подавление линейного роста перегородки и стенки,
но процесс их утолщения продолжается. При этом угнетены
также литические системы, разрушающие материнскую стенку,
в результате клетки оказываются окруженными очень толстыми,
иногда многослойными стенками. Угнетение процессов линей-
ного роста перегородки и стенки наблюдается также в присут-
ствии ингибитора репликации ДНК — митомицина. Клетки с из-
лишне утолщенными стенками могут восстановить нормальное
строение в благоприятных условиях за счет активирования соот-
ветствующих литических систем. Утолщение клеточной стенки
при неблагоприятных условиях, а затем разрушение ее поверх-
ностных слоев, возможно, являются адаптационными механиз-
мами стафилококков, обеспечивающими их выживание при не-
благоприятных воздействиях, в частности в присутствии ряда
7 2 3
Рис. 62. Формирование пере-
городки и молодого полюса
клетки Bacillus.
1—4 — последовательные стадии
роста; перегородка заштрихована,
оболочка клеточного полюса свет-
лая.
лекарственных препаратов и анти-
тел.
Как следует из вышеизложен-
ного, принятая схема деления ста-
филококков предполагает постоян-
ный круговорот вещества клеточ-
ной стенки. По данным прямых био-
химических определений за период
одной генерации происходит обнов-
ление примерно 15% муреина и
тейхоевых кислот клеточных стенок
St. aureus.
Деление Bacillus. У бацилл, в отличие от кокков, процессы
роста и деления клетки происходят не одновременно. Они де-
лятся за счет врастания и расщепления перегородки, при этом
перегородка растет быстрее, чем расщепляется (рис. 62).
У бацилл обнаружен круговорот муреина, в процессе которого
происходит растворение внешних слоев оболочки. У Вас. subti-
lis круговорот муреина был изучен при помощи включения ме-
ченой ДАП в муреин ДАП-дефицитных мутантов. После неко-
торого периода выращивания такие мутанты переносили вереду
с обычной ДАП. Появление в среде метки свидетельствовало
о разрушении ранее синтезированного муреина. Оказалось, что
метка появляется в среде после 2—3 генераций, т. е. сначала
меченый субстрат попадает в муреин, находящийся на внутрен-
ней поверхности оболочки, и только после растворения наруж-
ных слоев оказывается на поверхности клетки. Аналогичный
вывод следует из наблюдений за адсорбцией фага SP 50 на
оболочке Вас. subtilis. Этот фаг адсорбируется тейхоевой кис-
лотой, выходящей на поверхность клетки. При выращивании
бактерий в фосфордефицитной среде происходит снижение со-
держания в оболочке тейхоевой кислоты, однако исчезновение
фаговых рецепторов становится заметным только после сниже-
ния ее содержания на 20% и более. При помещении таких кле-
148
ток в среду с иным характером лимитации и богатую фосфором
наблюдается обратный процесс, т. е. содержание тейхоевых
кислот возрастает, опережая появление фаговых рецепторов.
Отсюда следует, что у Вас. subtilis происходит постоянный син-
тез муреина по всей поверхности оболочки и постепенное рас-
творение ее поверхности. Круговорот вещества оболочки нару-
шается при угнетении белкового синтеза у Вас. subtilis, при
этом она становится значительно толще нормы.
Меченый предшественник муреина распределяется практи-
чески равномерно по всей длине клетки Вас. subtilis, что обычно
считается доказательством диффузного роста оболочки. При
этом синтез и отложение нового муреина происходят с внутрен-
ней стороны оболочки на уровне цитоплазматической мембраны.
Старый муреин отодвигается к поверхности клетки, где, ви-
димо, равномерно распределяется по мере ее увеличения. Ис-
ключительно из вновь синтезированного муреина состоят только
клеточные перегородки, соответственно полюса клетки после
деления и узкие участки поверхности над перегородками. В зоне
образования последних иногда удается обнаружить опоясываю-
щие клетку шрамы, которые разделяют поверхности старой и
новой оболочек, подобно тому как это имеет место у кокков.
Однако в отличие от стрептококков у бацилл не удается про-
следить движения этих шрамов к центру клетки по мере роста
оболочки.
§ 2. Диморфный и полиморфный
клеточные циклы
Диморфный клеточный цикл характерен для грациликут-
ных, лучше всего он изучен у бактерий рода Caulobacter и
близких к ним форм. Процесс размножения Caulobacter вклю-
чает образование двух типов клеток: подвижных со жгутиками
и неподвижных клеток, имеющих стебелек. И те и другие могут
расти и делиться, проходя, однако, несколько различающихся
клеточных циклов (рис. 63). При этом изменяется активность
10—20% генов, явление, которое пока не удается обнаружить
у бактерий с мономорфным клеточным циклом. Подвижные
клетки можно рассматривать как дочерние, а неподвижные
клетки, снабженные стебельками, как материнские. Клеточные
циклы материнских и дочерних клеток различаются характером
репликации ДНК. У подвижных клеток наблюдается предсин-
тетический (Ci) период, соответствующий времени образования
стебелька, период синтеза ДНК (S) и постсинтетический период
(G2). ДНК синтезируется только в клетках, имеющих стебелек,
длительность S- и (^-периодов у обоих типов клеток практи-
чески совпадает.
149
90 30
Рис. 63. Клеточный цикл Caulobac-
ter crescentus [Degen, Newton, 1972].
G, S-периоды: отсутствия синтеза ДНК
(G), синтеза ДНК (S). Цифрами обозна-
чено время периодов (в мин).
Подвижная клетка Caulobacter имеет один полярный жгутик
и несколько полярных фимбрий или пилей, при помощи которых
она прикрепляется к плотному субстрату. Пили Caulobacter
могут функционировать как рецепторы для РНК-содержащих
фагов и ДНК-содержащего фага СвК. Подвижные клетки неспо-
собны к делению до тех пор, пока у них не образуется стебелек.
Его формирование происходит на полюсе клетки, противополож-
ном несущему жгутик, и сопровождается потерей клеточной
подвижности, при этом жгутик сбрасывается вместе с крюком
и стержнем. Пили используются для прикрепления к субстрату
или исчезают, что так или иначе приводит к потере бактерией
чувствительности к упомяну-
тым фагам. Поскольку белок
фимбрий не обнаруживается
в среде, они, видимо, втягива-
ются внутрь клетки.
В условиях голодания или
в среде с субстратами, для
усвоения которых требуется
индукци я соответствующих
ферментов, наблюдается за-
держка цикла на стадии не-
подвижных клеток со стебель-
ками. Видимо, именно на этой
стадии поступает стартовый
сигнал, запускающий клеточ-
ный цикл.
Стебелек представляет со-
бой вариант простеки, способ-
ствует увеличению клеточной
поверхности и облегчает транспорт в клетку элементов пищи.
Показано, что в оболочке стебельков функционируют транспорт-
ные системы, например система транспорта глюкозы.
В стебельке могут образовываться перегородки довольно
сложной структуры. Они представлены концентрическими коль-
цами (обычно 5), окружающими центральное ядро. Кольца раз-
рушаются под действием лизоцима, следовательно, они образо-
ваны муреином.
Бактерии, размножающиеся почкованием, имеют диморфные
или полиморфные клеточные циклы. Почкование у бактерий
является разновидностью бинарного деления и у некоторых
форм мало отличается от деления. Так, у нитрифицирующей
бактерии Nitrobacter agilis и фотосинтезирующей бактерии
Rhodopseudomonas acidophila клетки делятся, но их рост проис-
ходит с одного полюса и образующиеся особи неравноценны.
Дочерняя клетка имеет жгутик, но, прежде чем перейти к де-
лению, она должна дозреть, при этом она теряет жгутик. По-
150
добное неравноценное деление иногда определяют как почкова-
ние. У Rhodopseudomonas palustris и Rhodopseudomonas viridis
на полюсе материнской клетки образуется короткий толстый
вырост, конец которого разрастается, образуя дочернюю клетку.
У Hyphomicrobium, Rhodomicrobium и близких к ним форм на
одном из клеточных полюсов отрастают тонкие и длинные гифы,
иногда ветвящиеся. Гифа содержит цитоплазму и окружена обо-
лочкой такого же строения, что и клеточная оболочка. Дочер-
няя клетка начинает развиваться как вздутие на конце гифы,
после деления нуклеоида материнской клетки хромосома прохо-
дит через гифу в дочернюю клетку — почку. У разных бактери-
альных форм ДНК находится в почке уже на самых ранних
стадиях ее формирования или поступает в почку, по величине
равную половине материнской клетки. Дочерние клетки остаются
связанными с материнской или, приобретая жгутик, уплывают.
Перед отделением почки между ней и гифом образуется пере-
городка. Перегородки могут возникать и непосредственно
в гифах. У Rhodomicrobium при образовании многоклеточных
комплексов — колоний в гифах формируются перегородки на
определенном расстоянии от дочерних клеток. У бактерий, об-
ладающих развитой внутриклеточной плазматической мембран-
ной системой, например у Nitrobacter и Rhodomicrobium, в до-
черней клетке мембраны синтезируются заново.
Характерной особенностью бактерий, размножающихся
почкованием, является выраженная полярность клетки. У неко-
торых форм обнаружена асимметрия внутриклеточных структур.
У Nitrobacter стопка внутриклеточных мембран имеет форму
подковы, открытой к растущему концу клетки. Хроматофор
Rhodomicrobium имеет отверстие, через которое может прохо-
дить ДНК в процессе роста клетки. У этой бактерии нуклеоид
локализуется у основания растущей гифы. В ходе развития до-
чернего организма материнская клетка практически не получает
вновь синтезированного материала и постепенно стареет.
У штамма Rhodomicrobium vannielii, исследованного Виттей-
бари и Дау; материнская клетка может дать начало только
4 дочерним клеткам, после чего отмирает.
У некоторых штаммов Hyphomicrobium можно наблюдать
полиморфный клеточный цикл, причем при выращивании бак-
терии на метаноле происходит образование гиф и овальных
почек, а при выращивании на метиламине — кистевидных кле-
ток, от которых отпочковываются подвижные дочерние особи
(рис. 64). Образование многогранных и лопастных клеток у не-
которых штаммов Hyphomicrobium наблюдается в стареющих
культурах, выращиваемых и на других субстратах (рис. 65).
Неясно, можно ли считать подобные многогранные или лопаст-
ные клетки нормальными.
Полиморфный клеточный цикл характерен для бактерий, от-
носящихся к роду Arthrobacter. При росте в богатых средах
151
Arthrobacier образует палочковидные неправильной формы
клетки, которые делятся, образуя дочерние палочки в течение
логарифмической фазы роста. При переходе культуры в ста-
ционарную фазу роста палочковидные клетки в результате так
называемого редукционного деления образуют по несколько
(обычно по 3) кокков. Такие кокки, помещенные в свежую бо-
гатую среду, сначала удлиняются, превращаясь в палочки, ко-
торые затем начинают делиться. Характерной особенностью
палочковидных клеток Arthrobacter является также их склон-
ность при делении образовывать фигуры, напоминающие рим-
скую цифру V. Таким образом, смена морфологических форм
Рис. 65. Формирование треугольной
почки на гифе Hyphomicrobium.
Ув. ХЮ ООО.
Рис. 64. Полиморфный клеточный
цикл у Hyphomicrobium [Whittenbu-
гу, Dow, 1977].
/, 2 — морфология клеток при росте
в среде с метиловым спиртом (1), с ме-
тиламином (2).
Arthrobacter определяется стадией роста культуры, однако у не-
которых видов размножающаяся популяция может целиком
состоять из одних кокков. Так, в среде, содержащей минераль-
ные соли и глюкозу, Arthrobacter crystallopoietes развивается
как кокк, а в среде с сукцинатом или в богатых средах слож-
ного состава популяция состоит из активно делящихся палочек.
Рост и деление палочек происходит интенсивнее, чем кокков, но
неизвестно, что здесь причина, а что следствие, т. е. растет ли
культура быстрее потому, что состоит из палочек, или она со-
стоит из палочек, потому что растет быстрее. При делении как
палочек, так и кокков происходит образование клеточной пере-
городки и асимметричный рост новой клеточной оболочки
(рис. 66). После деления на поверхности клетки некоторое время
сохраняются шрамы, подобно тому как это имеет место у ста-
филококков. По расположению шрамов можно судить о направ-
лении роста оболочки, поскольку они отделяют старую оболочку
152
от новой. При делении кокков клеточная перегородка обра-
зуется в плоскости, перпендикулярной плоскости предшествую-
щего деления, которой соответствует кольцевидный шрам на по-
верхности клетки. Дочерние клетки как бы раскатываются
в разные стороны от плоскости деления. Начало роста новой
оболочки сопровождается появлением и постепенным расхож-
дением двух новых кольцевых шрамов, отделяющих ее с двух
сторон от оболочки материнской клетки. Новые шрамы распо-
ложены на поверхности клетки перпендикулярно старому шраму,
сохранившемуся от предыдущего деления. При этом старый
о
Рис. 66. Рост и деление Arthrobacter crystallo-
poieies [Kolenbrander, Hohman, 1977]
a, 6 — размножение в стадии кокков (а) и палочек (б);
1 — вид сбоку; 2 — вид сверху; 3 — рост клетки в длину;
4 — образование У-образных фигур и разделение клеток.
Заштрихована вновь синтезированная оболочка; пункти-
ром обозначены шрамы, отделяющие новую оболочку
от старой.
шрам разрезается на два полукольца, переходящих соответ-
ственно к двум дочерним клеткам. Каждая из них получает
полусферу материнской клетки, содержащую старый шрам, и
полусферу, образованную вновь синтезированной оболочкой.
Обе полусферы разделены новым шрамом, опоясывающим те-
перь экватор клетки.
Рост и деление палочковидных клеток A. crystallopoietes
происходит в две стадии (рис. 66). Сначала клетка удлиняется
за счет однонаправленного роста оболочки*. Старая часть клетки
не растет, но, несколько расширясь, принимает овальную форму.
Одновременно с ростом клетки в длину происходит образование
разделяющей клеточной перегородки. После достижения клет-
кой определенной длины и образования перегородки начинается
односторонний рост оболочки с одновременным расщеплением
153
перегородки, так что образуются У-образные пары клеток. Од-
носторонний рост оболочки сопровождается образованием новой
пары шрамов, которые сначала расположены параллельно ста-
рому, но несколько дальше от центра клетки. По мере расхож-
дения клеток новые шрамы также У-образно расходятся. В ре-
зультате деления образуются две не вполне одинаковые клетки
(рис. 66). Рост клетки после каждого деления происходит со
стороны одного и того же полюса и в одном и том же направ-
лении. Одна из дочерних клеток получает один шрам, и вся ее
оболочка является новой, тогда как другая клетка получает всю
старую оболочку с несколькими шрамами. На одной клетке
удается обнаружить 2—3 шрама, но не более. Очевидно, мате-
риал оболочки, образующий шрам, постепенно разрушается.
Неизвестно, происходит ли при этом старение клетки.
Полиморфный клеточный цикл характерен для Geodermato-
philus, относящегося к Actynomycetales, и некоторых других
бактерий.
Глава VI
ТИПЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ БАКТЕРИЙ
§ 1. Эндоспоры
Споры (эндоспоры) бактерий — уникальные по структуре
и свойствам образования. Бактериальная спора не имеет ана-
логов по степени устойчивости к неблагоприятным факторам
среды.
Эндоспоры — особый тип покоящихся клеток фирмакутных,
т. е. бактерий с грамположительным типом оболочки, хотя не-
которые образующие споры виды могут по методу Грама окра-
шиваться отрицательно. Особое внимание привлекает факт
формирования эндоспоры внутри материнской клетки — споран-
гия, при этом происходит поглощение одной клеткой другой,
процесс, который несколько напоминает эндоцитоз, у бактерий
обычно отсутствующий.
К настоящему времени описано более 15 родов бактерий,
образующих эндоспоры. Эти организмы различаются как мор-
фологически, так и по физиологии и экологии. Образование спор
не является необходимым этапом их онтогенеза. Речь идет
о том, что в условиях, благоприятных для вегетативного роста
бактерий, споры могут не образовываться в течение неопреде-
ленно долгого времени. Также мутанты, потерявшие способность
к образованию спор, в лабораторной культуре вполне жизнеспо-
собны. В естественной среде такие мутанты, однако, оказы-
ваются неконкурентоспособными, т. е. образование спор яв-
ляется приспособлением, необходимым для существования соот-
ветствующих видов.
Одна клетка образует одну спору, увеличения числа орга-
низмов при этом не происходит, поэтому эндоспорообразование
не есть способ размножения бактерий. Эндоспоры представляют
собою стадию покоя и приспособлены к перенесению неблаго-
приятных условий.
Спорообразование обычно стимулируется недостатком
в среде пищевого субстрата, однако этот процесс весьма чув-
ствителен к окружающим условиям. Пределы температуры, зна-
чения pH, водной активности, концентрации кислорода и по-
155
верхностного натяжения обычно даже уже для спорообразова-
ния, чем для вегетативного роста, тогда как оптимумы близки
или совпадают. Некоторые факультативные анаэробы хорошо
растут в анаэробных условиях, но при этом спор не образуют.
Способность к образованию спор определяется наличием
специальных генов, комплекс которых иногда определяют как
спорулон, хотя они не оформлены в виде какой-либо определен-
ной структуры, но несколько их групп-оперонов расположены
в различных участках хромосомы.
Имеются данные в пользу представления о решающем зна-
чении пуриновых нуклеотидов в инициации спорообразования.
Так, у Вас, subtilis спорообразованию всегда предшествует сни-
жение уровня гуанозинтрифосфата (ГТФ). В норме у Вас, sub-
tilis спорообразование инициируется недостатком в среде С,
N или Р, но если под воздействием ингибиторов или у мутантов
снижается пул ГТФ, наступает спорообразование независимо от
присутствия других метаболитов и АТФ. При этом интенсив-
ность спорообразования обратно пропорциональна снижению
ГТФ.
По косвенным расчетам Вас, subtilis имеет примерно 42 спо-
ровых оперона, каждый из которых содержит около 3 генов,
таким образом, всего споровых генов 150—200. События, свя-
занные с прохождением клеткой определенной стадии спорооб-
разования, могут зависеть от активности генов из разных опе-
ронов. В процессе спорообразования продолжают работать и
вегетативные гены. Переход к спорообразованию определяется
не репрессией вегетативных генов, но дерепрессией споровых.
Механизмы блокирования их активности при вегетативном ро-
сте имеют сходство с катаболитной репрессией.
С переходом к спорообразованию у многих Bacillus связан
синтез полипептидных антибиотиков, которые подавляют веге-
тативный рост продуцента. Предполагают, что эти антибиотики
несут регуляторную функцию, влияя на процесс транскрипции.
Показано, например, что мутанты Вас, brevis, не способные
к образованию антибиотика грамицидина, не образуют полно-
ценных спор, добавление грамицидина к клеткам на определен-
ных стадиях спорообразования «излечивает» эти дефекты. Гра-
мицидин избирательно влияет на связывание РНК-полимеразы
с теми или иными промоторами генома.
Для начала спорообразования необходимо завершение реп-
ликации хромосомы, причем сигнал к спорообразованию должен
быть получен еще в период репликации. Если репликация за-
канчивается в богатой среде, наступает вегетативное деление.
В процессе образования споры хромосома не реплицируется,
таким образом, в спору попадает одна или несколько полностью
реплицированных хромосом.
При образовании споры имеют место явления трех катего-
рий: процессы, непосредственно ассоциированные с образова-
156
нием споры, их нарушение делает -спорообразование невозмож-
ным; процессы, связанные со спорообразованием, но не являю-
щиеся абсолютно необходимыми, соответствующие мутанты не
теряют способность к образованию спор; наконец, это процессы,
определяемые теми же условиями, что и образование спор, на-
пример голоданием, но непосредственно со спорообразованием
не связанные. Они сохраняются у мутантов, дефектных по спо-
рообразованию.
Процесс спорообразования принято подразделять на 6 после-
довательных стадий (рис. 67), смена которых определяется
Рис. 67. Морфологические изменения, сопровождающие
прохождение бактериями различных стадий спорообра-
зования.
Объяснения в тексте.
активированием соответствующих генов. При этом один из про-
дуктов работающего по данной стадии оперона служит индук-
тором активности последующих генов, выключение любого этапа
делает невозможными последующие. Дерепрессия споровых ге-
нов до 3-й стадии спорообразования обратима, и изменение
среды может привести к их репрессии и переходу клетки к веге-
тативному росту.
Процесс образования споры довольно продолжителен, у аэ-
робных мезофильных бацилл он занимает около 8 ч.
Если Вас, brevis выращивать в среде с глюкозой, то к концу
экспоненциального роста происходит резкое падение величины
pH, исчезновение из среды глюкозы и накопление уксусной и
пировиноградной кислот, которые затем начинают усваиваться
благодаря активации ферментов цикла трикарбоновых кислот
157
(ЦТК), ранее репрессированных за счет глюкозного эффекта.
Активация ЦТК необходима для перехода клетки к спорообра-
зованию. Мутанты, дефектные по аконитазе — ключевому фер-
менту этого цикла, теряют способность к спорообразованию.
Для многих Bacillus, в том числе Вас. cereus, Вас. subtilis,
характерно образование экстрацеллюлярных протеаз перед на-
чалом спорообразования, что, однако, не обязательно для спо-
рообразования, поскольку известны спорулирующие протеазоот-
рицательные мутанты.
Переходящая к спорообразованию вегетативная клетка обя-
зательно содержит 2 нуклеоида или более. При спорообразо-
вании у некоторых штаммов Вас. megaterium проявляется по-
лярность клеток, при этом спора образуется у полюса, дисталь-
ного относительно перегородки, образовавшейся при предшест-
вующем делении клетки. Механизм этой полярности не ясен, не
удалось установить и какой-либо закономерности в характере
расхождения нитей ДНК при ядерном делении, предшествующем
спорообразованию, т. е. разнокачественное™ нуклеоидов.
Стадия 1 характеризуется прежде всего необычным поведе-
нием ДНК, образующей осевой тяж вдоль клетки. У видов
Bacillus oczbqw тяж проходит через всю клетку и включает
в себя всю ДНК клетки, тогда как у некоторых видов Clostri-
dium он образуется только частью содержащейся в клетке ДНК
и располагается на одном из полюсов клетки, занимая лишь
незначительную часть ее длины.
Конденсацию ДНК в относительно компактную структуру
в процессе спорообразования связывают с изменением актив-
ности генома, с прекращением репликации хромосомы, транс-
крипции и трансляции вегетативных генов и потерей ДНК связи
с рибосомами и мембраной. Показано, что на первых двух ста-
диях спорообразования активность генома низка.
Цитоплазма спорогенной зоны обычно не содержит включе-
ний запасных веществ.
Стадия 2 характеризуется отделением от осевого тяжа ДНК
участка, соответствующего хромосоме, который движется к по-
люсу клетки. Затем часть цитоплазмы клетки с заключенной
в нее хромосомой отделяется цитоплазматической мембраной,
врастающей так же, как при клеточном делении, но здесь обо-
лочка клетки участия в делении не принимает. В результате
образуются две разделенные мембраной клетки, неравные по
размерам. В это время процесс спорообразования еще обратим.
Если бактерии перенести в условия, благоприятные для веге-
тативного роста, деление будет завершено слоями оболочки и
образуются две вегетативные клетки разной длины. Обе в даль-
нейшем могут делиться, хотя меньшая медленнее.
События, происходящие на второй стадии спорообразования,
определяются генами, по крайней мере 8 оперонов, расположен-
ных в разных участках хромосомы.
158
Для многих видов Bacillus, в том числе для Вас. subtilis,
Вас. megaterium, Вас. cereus, Вас. thuringiensis, характерен
синтез протеаз в процессе спорообразования. Протеазам припи-
сывают различные функции в спорообразовании, в том числе
участие в круговороте белка, интенсивно идущем в этот период,
модификации ДНК-зависимых РНК-полимераз и белков —
предшественников споровых покровов. В некоторых случаях
очевидна связь споровых протеаз со споровыми белками. Так,
у Вас. megaterium в спорах находится предшественник специ-
фической протеазы, разрушающей низкомолекулярные белки
споры во время ее прорастания. В споре протеазы или их пред-
шественники могут быть локализованы в сердцевине или обо-
лочке, как, например, у Вас. cereus.
Рис. 68. Проспора (а), формирующаяся (б) и сформированная (в) спора
на срезах клеток Вас. polymyxa. Ув. X 10 000.
О — оболочка спорангия; ДМ — двойная мембрана проспоры; К — кортекс; По — по-
кровы споры.
Между 2-й и 3-й стадиями спорообразования происходит вра-
стание двойной мембраны или септы так, что в результате об-
разуется округлая проспора, окруженная двумя мембранами
(рис. 68, а). У некоторых видов в этом процессе принимает уча-
стие мезосома. Проспора в конце концов совершенно отделяется
от мембраны материнской клетки и как бы свободно плавает
внутри нее. На этом этапе происходит резкое изменение свойств
мембран проспоры, на срезах они окрашиваются менее кон-
трастно, чем цитоплазматическая. Считают, что в этот момент
происходит изменение их транспортных свойств. Процесс спо-
рообразования становится необратимым, причем не только для
проспоры, но и для материнской клетки, которая уже не может
вернуться к вегетативному росту.
Проспора остается у полюса клетки или, у некоторых ви-
дов, перемещается к ее центру. В процессе образования про-
159
споры две окружающие ее мембраны оказываются расположен-
ными зеркально, т. е. внешний, ранее обращенный к среде ле-
песток внутренней мембраны обращен наружу, а у внешней
мембраны — внутрь. При этом, вероятно, эффективный транс-
порт веществ внутрь проспоры из цитоплазмы материнской
клетки может обеспечиваться только за счет пассивной или об-
легченной диффузии. Функциональная зеркальность мембран
проспоры была подтверждена в экспериментах с выделенными
проспорами Вас. megateriiun. АТФазная, НАДН-дегидрогеназ-
ная и L-малатдегидрогеназная активность не обнаруживаются
у целых клеток-спорангиев, так как эти ферменты локализо-
ваны на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны
и не контактируют с окружающей клетку средой. На препара-
тах проспор эти активности сразу выявляются, так как у них
внешняя мембрана конвертирована. Однако в проспору интен-
сивно поступают из материнской клетки некоторые аминокис-
лоты, дипиколиновая кислота (ДПК) и ионы Са2+. Именно после
завершения образования проспоры бактерия начинает интен-
сивно потреблять из среды ионы Са2+, которые в конце концов
могут составить до 2% от сухой массы споры и в молярном
выражении превысить сумму всех других находящихся в споре
катионов. Поступление Са2+ в спорангии, т. е. в спорулирующую
клетку, происходит в результате энергозависимого активного
транспорта, но из цитоплазмы спорангия в проспору он посту-
пает за счет диффузии. Внутри проспоры образуется комплекс
Са с дипиколиновой кислотой, так что концентрация свобод-
ного Са2+ в проспоре оказывается низкой и не препятствует его
диффузии из клетки.
Предполагают, что именно образование окруженной двумя
мембранами проспоры в результате поглощения одной клеткой
другой после деления могло быть в эволюции первым этапом,
приведшим к образованию эндоспор. Подобная проспора, обра-
зующаяся в условиях голодания, за счет полярности двух ее
мембран изолирует клетку от среды, уже не содержащей пищи,
что снижает интенсивность ее обмена и может оказаться для
нее спасительным.
На 4-й стадии между двумя мембранами проспоры начи-
нается образование муреинового слоя (рис. 68,6; 69). Процесс
идет в 2 стадии. Сначала образуется примордиальный (зачаточ-
ный) слой, который после прорастания споры станет оболочкой
проростка. Затем над ним откладывается несколько видоизме-
ненный муреин, образующий толстый слой коры или кортекса.
Синтез вещества кортекса продолжается вплоть до созревания
споры. Муреин кортекса является более кислым, чем муреин
оболочки, за счет того, что многие остатки мурамовой кислоты
не содержат пептидов или соединены лишь с 1—3 аминокисло-
тами, которые не образуют сшивок и, следовательно, имеют
свободные карбоксильные группы. Например, в муреине веге-
160
тативных клеток Вас. sphaericus около 60% остатков мурамо-
вой кислоты связаны через пептидные мостики с соседней моле-
кулой полисахарида, а в спорах — только около 6%. Тейхоевые
кислоты и другие дополнительные полимеры оболочек в кор-
тексе не обнаружены.
У Вас. cercus одновременно с кортексом или даже раньше
начинает образовываться экзоспориум. Последний заклады-
вается как мембрана на наружной стороне внешней мембраны
проспоры, сначала со стороны, противоположной полюсу клетки.
Затем экзоспориум как бы обрастает спору. У некоторых Clost-
ridium экзоспориум начинает закладывается со стороны по-
люса клетки.
В отличие от Bacillus, у которых образование кортекса при-
урочено к 4-й стадии спорообразования, а покровов к 5-й ста-
дии, у Clostridium начало закладки покровов опережает начало
формирования кортекса.
С дн вм С вп 0 вм 3 С 6н 0 К ди П 3 С дн 0 К вм Ц П 3
Рис. 69. Формирование оболочек споры.
3—6 — стадии спорообразования; с — сердцевина споры; вн — внутренняя мембрана;
вм — внешняя мембрана; о — примордиальный слой муреина (оболочка проростка);
э — экзоспориум; к — кортекс; п — покровы; ц — цитоплазма материнской клетки.
По мере развития проспоры происходит усиление ее способ-
ности к светопреломлению, вероятно, связанной с обогащением
споры комплексом ДПК — Са. В фазово-контрастном микро-
скопе проспора выглядит серой. Способность к светопреломле-
нию является характерной особенностью зрелой бактериальной
споры. Повышение светопреломления связано с белковым син-
тезом и не происходит в присутствии его ингибиторов.
На стадиях 3 и 4 проспора, выделенная из спорангия, осмо-
тически нестабильна и нежизнеспособна.
На 5-й стадии спорообразования у бацилл начинают форми-
роваться покровы споры. На срезах они сначала имеют вид
отдельных коротких электронно-плотных линий или пластинок,
расположенных цугом в цитоплазме спорангия в 20—30 нм от
наружной мембраны проспоры. Пластинки затем разрастаются
и сливаются, образуя непрерывные слои вокруг споры. Внешняя
мембрана проспоры становится плохо заметной на срезах, хотя,
видимо, сохраняется и в дальнейшем.
На 5-й стадии продолжается накопление спорой ДПК и Са,
повышается устойчивость ее к органическим растворителям, на-
ЦБ. В. Громов
161
пример октанолу, хлороформу, спора становится светлой в фа-
зовом контрасте. Она уже осмотически стабильна, но сохраняет
термочувствительность. Выделенные из спорангия проспоры
могут прорастать, при этом их прорастание индуцируется теми
же индукторами, что и прорастание зрелых спор, но не наблю-
дается термоиндукции прорастания.
На 6-й стадии спорообразования заканчивается формирова-
ние всех характерных структур споры, она приобретает термо-
устойчивость. Иногда выделяют еще 7-ю стадию, на которой
происходит лизис спорангия и выход споры в окружающую
среду. При этом материнская клетка, или спорангий, до самого
последнего момента сохраняет активность. Развитие споры
определяется активностью двух геномов — материнского и про-
споры. Геном материнской клетки определяет синтез ДПК,
белков, покровов споры, экзоспориума, выростов и газовых ва-
куолей у спор, содержащих эти структуры. От активности ге-
нома материнской клетки зависит образование ассоциирован-
ных со спорообразованием протеаз, антибиотиков и токсинов,
а также литических ферментов, образующихся на последнем
этапе спорообразования. Определенная степень координации
метаболизма материнской клетки сохраняется вплоть до ее ли-
зиса. Так, например, клетка, содержащая сформированную
спору, может некоторое время сохранять подвижность, хотя,
в конце концов, она гибнет и лизируется. Подобное разделение
труда между геномами проспоры и спорангия, видимо, объяс-
няет наличие в спорообразующей клетке двух нуклеоидов и не-
возможность образования двух спор вокруг обоих нуклеоидов.
В процессе образования споры материнская клетка иногда пре-
терпевает морфологические изменения. Так, у Clostridium ра-
steurianum при спорообразовании происходит удлинение клетки
и ее утолщение с одного конца. Кроме того, вокруг клетки об-
разуется капсула полипептидной природы.
Строение зрелой споры у разных видов соответствует одной
и той же схеме. Сердцевина споры содержит белки и нуклеино-
вые кислоты, на их долю приходится не более 50—60% сухой
массы споры, остальную ее часть составляют ДПК и другие
низкомолекулярные вещества. У Вас. subtilis в споре содер-
жится одна хромосома, но у других видов их может быть не-
сколько. Структура ДНК хромосомы не претерпевает каких-
либо изменений. Спора содержит также обычные рибосомы и
различные ферменты, большинство из которых ничем не отли-
чаются от соответствующих ферментов вегетативной клетки.
Липиды вегетативной клетки и споры одинаковы, хотя количе-
ственное содержание определенных жирных кислот может быть
различным.
До 15% белка сердцевины споры Вас. megaterium состав-
ляют основные низкомолекулярные белки, богатые полярными
аминокислотами и не содержащие цистеина и триптофана. Эти
162
белки очень чувствительны к действию протеолитических фер-
ментов и быстро разрушаются при прорастании споры за счет
активности специфических споровых протеаз. Первоначально
предполагали, что эти белки представляют собой запас-
ной продукт споры, используемый при прорастании. Возможно,
однако, что они несут более важную функцию и, образуя ком-
плексы с ДНК, так изменяют ее структуру, что она становится
термо- и радиоустойчивой. Подобную функцию приписывают
также дипиколинату кальция, который заполняет пространство
между макромолекулами сердцевины споры, препятствуя их
взаимодействиям. При прорастании споры дипиколинат кальция
выходит из споры и заменяется водой, при этом объем сердце-
вины не изменяется. В процессе же образования споры, в ос-
новном на 4-й стадии, объем сердцевины уменьшается примерно
на 50% по сравнению с проспорой, что некоторые исследователи
связывают с его обезвоживанием.
Сердцевина споры окружена цитоплазматической мембра-
ной, липиды которой находятся в упорядоченном кристалличе-
ском состоянии геля. В их стабилизации, возможно, принимают
участие ионы Са2+. Как уже говорилось, над мембраной нахо-
дится примордиальный муреиновый слой, а затем толстый слой
кортекса (рис. 68, в, 69). Последний занимает 13—60% от
объема споры, хотя образующий его муреин составляет всего
9—15,% от массы споры. Это несоответствие объясняют высокой
обводненностью кортекса. Даже довольно значительное его
уменьшение может заметно не повлиять на свойства споры, но
имеется определенный минимум массы кортекса, ниже которого
спора теряет термоустойчивость.
На срезах споры кортекс выглядит как массивный электрон-
но-прозрачный слой, у покоящихся спор гомогенный, у прора-
стающих или разрушающихся — фибриллярный.
Как уже было отмечено, муреин кортекса является кислым
за счет того, что только незначительная часть остатков мура-
мовой кислоты несет пептиды, часть занята только остатками
L-аланина, а часть не соединена с аминокислотой и образует
лактам:
Снгон-
J----------о
11*
163
Видимо, лактам, пептид и аланин чередуются в молекуле му-
реина. Состав пептидов кортекса может несколько отличаться
от состава пептидов муреина оболочки. Длина нитей полисаха-
ридной части муреина кортекса больше, чем у вегетативных
клеток, и соответствует 80—100 дисахаридным остаткам. Син-
тез мурамового лактама начинается одновременно с синтезом
ДПК.
Кортекс и зародышевая стенка кроме муреина содержат ряд
литических ферментов, которые активируются при прорастании
или при механическом нарушении целостности споры. У Вас.
subitilis, Вас. cereus, Вас. megaterium это главным образом N-
ацетилмурамил-М-аланиламидаза и эндо-М-ацетилглюкозами-
нидаза.
Снаружи кортекс ограничен внешней мембраной проспоры,
которая, правда, не всегда может быть выявлена на срезах.
Затем следуют покровы споры. Между мембраной и покровами
находятся захваченные при спорообразовании участки цито-
плазмы материнской клетки. Некоторые исследователи считают,
что здесь локализуются литические системы, играющие важную
роль при прорастании споры.
Над кортексом споры одеты слоистыми покровами, число и
строение которых у разных видов бывают различны. У многих
видов покровы дифференцированы на три слоя: внутренний,
средний и внешний. Каждый из этих слоев в свою очередь мо-
жет состоять из нескольких чередующихся электронно-плотных
и электронно-прозрачных слоев. При этом внешний покров
часто структурирован (рис. 69, в). При исследовании реплик со
сколов замороженных спор в их покровах выявляются разнооб-
разные упорядоченные структуры.
Покровы споры состоят из белка обычно с небольшой при-
месью углеводов и липидов, иногда содержат много фосфора.
В состав покровов Вас. subtilis входит 4 главных белка и
около 10 дополнительных, 9 из этих 14 белков начинают синте-
зироваться еще на'2-й или 3-й стадии спорообразования. Белки
формируют покровы слой за слоем так, что последующие слои
накладываются на предыдущие. У зрелой споры выявляются
три основных слоя покровов, но они имеют комплексное строе-
ние. Внешний слой содержит белок, синтезированный одним из
первых, и белок, синтезируемый на поздних стадиях спорооб-
разования. Именно внешний покров обеспечивает устойчивость
спор к лизоциму. Покровы споры обеспечивают ее устойчивость
к лизоциму и другим ферментам, органическим растворителям,
поверхностно активным соединениям, придают споре гидрофоб-
ность. Покровы чувствительны к щелочам, мочевине, сильным
детергентам, например додецилсульфату. При нарушении це-
лостности покровов сохраняется термоустойчивость и радио-
устойчивость споры и ее способность к светопреломлению. При
обработке крепкой кислотой спора разрывается и ее содержи-
164
мое выходит. При этом, видимо, происходит освобождение Са2+
из его комплекса с ДПК, и спора разрывается за счет создав-
шегося внутреннего высокого осмотического давления.
Экзоспориум образует как бы свободный мешок, внутри ко-
торого лежит спора, контактируя с ним только в некоторых
участках. Экзоспориум выявляется не у всех видов, но имеются
наблюдения, свидетельствующие о том, что иногда он тесно
прилежит к поверхности покровов споры и тогда может быть
обнаружен только при использовании специальных методов.
У разных видов строение экзоспориума различно. Обычно в его
состав входят белки, липиды, углеводы. Базальный слой экзо-
спориума образован белком и формируется в результате само-
сборки белковых молекул. Этот процесс можно воспроизвести
в пробирке. Экзоспориум не представляет собой барьера про-
ницаемости.
Экзоспориум Cl. botulinum типа А состоит из 15 параллель-
ных слоев общей толщиной более 100 нм. Своеобразный тол-
стый экзоспориум у спор CL tyrobutyricum состоит из тонкого
наружного слоя и толстого, внутреннего с поперечной исчерчен-
ностью. У Cl. pasteurianum он тонкий и на одном из полюсов
имеет крупную пору. Внешний слой многослойного экзоспо-
риума Cl. bifermentans покрыт волосовидными придатками.
У многих Clostridium ламеллы экзоспориума состоят из гекса-
гонального расположенных субъединиц диаметром 4-5 нм. Экзо-
спориум Cl. botulinum типа Е представлен одним тонким слоем
из рыхло уложенных фибрилл. У Cl. corinoforum — трехслой-
ный экзоспориум, имеет толщину 75—80 нм и представляет со-
бой мешок, открытый с одной стороны. Спора остается в нем
после лизиса клетки благодаря тому, что на ее покровах
имеются отростки, соединенные с внутренней поверхностью
экзоспориума. У этого вида с покровами споры связан газовый
колпачок, состоящий из газовых пузырьков. Такие споры всплы-
вают, что может иметь экологическое значение, обеспечивая
распространение вида.
Экзоспориум, видимо, никогда не бывает полностью замкну-
тым, и ограниченная им цитоплазма сообщается с остальной
частью цитоплазмы спорангия. Вместе с тем экзоспориум соз-
дает определенную компартментацию цитоплазмы. Именно
здесь у Cl. corinoforum происходит синтез белка газовых пу-
зырьков, образующих затем газовый колпачок споры. Здесь же
происходит образование различных выростов и придатков
споры.
У многих видов рода Clostridium споры снабжены различ-
ными придатками и выростами. По классификации, предложен-
ной В. И. Дудой, можно выделить 6 типов и 16 разновидностей
выростов спор Clostridium (рис. 70). 1-й тип — трубчатые вы-
росты, которые могут иметь капсулярный слой, латеральные
разветвления или шляпки; 2-й тип — лентовидные выросты; 3-й
165
тип — булавовидные выросты, располагающиеся на споре по
одному или по несколько перитрихально; 4-й тип — фибрилляр-
ные тяжи; 5-й тип — волосовидные выросты, расположенные
пучками на полюсе споры или по всей поверхности споры; 6-й
тип — древовидные выросты. В составе выростов обнаружены
белки, полисахариды, липиды.
Функциональное значение выростов спор Clostridium остается
неясным. Предполагают, что они являются одним из средств
пространственно^! организации (компартментализации) процес-
сов в спорулйрующих клетках. В частности, в трубках спор С/.
penicillum обнаружена дсгидрогеназная активность. Было вы-
сказано также предположение о том, что выросты могут пред-
Рис. 70. Строение придатков спор различных видов Clostridium.
1 — Cl. felsineuni (спора без выростов и экзоспориума); 2 — Cl. pasteurianum .(спора
с экзоспориумом без выростов): 3—11 — споры с экзоспориумом и выростами: 3 — С1.
sporosetosum, 4 — Cl. sporopenatum, 5 — Cl. saprogenes, 6 — Cl. sporofaciens, 7 — Cl.
sartagoformum, 8 — Cl. corineforum, 9 — Cl. penicillum, 10 — Cl. sporocristum, 11 — Cl.
taeniosporum.
ставлять собой периферические хемосенсорные структуры,
играющие роль при прорастании спор. Показано, однако, что
споры нормально прорастают и после искусственного удаления
выростов. Представляется вероятным, что хотя бы в некоторых
случаях они могут играть определенную роль при распростра-
нении спор, подобно газовым колпачкам, способствуя переносу
спор током жидкости.
Выросты длиной до 2 мкм, аналогичные пилям вегетативных
клеток бактерий, обнаружены у спор Вас. cereus и Вас. thurin-
giensis. Пили имеют толщину около 6,8 нм и снабжены внут-
ренним каналом. Они прикреплены к экзоспориуму в разных
его участках. Функции этих пилей неизвестны, их сходство с пи-
лями вегетативных клеток бактерий' может быть только внеш-
ним.
Зрелые споры круглые или овальные, их размеры у данного
штамма либо весьма стабильны, либо, например, у штаммов
Вас. megaterium довольно сильно варьируют. Споры иногда
окрашены и в массе выглядят желтыми или коричневыми.
Споры не окрашиваются при использовании обычных методов,
принятых в светооптической микроскопии, но без труда фикси-
166
руются методами, принятыми в электронно-микроскопическил
исследованиях. Характерной особенностью спор является спо-
собность к светопреломлению (рис. 71). Индекс светопрелом-
ления споры (около 1,55) близок к таковому сухого белка.
Споры могут содержать до 79% воды, многократно высказыва-
лось мнение, что эта вода сосредоточена только в районе кор-
текса, тогда как сердцевина обезвожена, имеются, однако, на-
блюдения, свидетельствующие о равномерном распределении
воды в спорах.
Некоторые бактерии одновременно со спорами образуют
параспоральные тела, которые не являются элементами спор
Рис. 71. Споры Вас. megaterium
в фазовоконтрастном микроскопе.
Ув. Х2000.
Рис. 72. Параспоральные тела
представителей рода Bacillus.
а — белковый кристалл Вас. thu-
ringiensis; б — белковое тело Вас.
medusa; в — латеральное тело Вас.
laterosporus.
или нормальными компонентами бактериальной клетки
(рис. 72). Наиболее известными и хорошо изученными параспо-
ральными телами являются белковые кристаллы, формирую-
щиеся в клетках Bacillus thuringiensis одновременно со спо-
рами. Эти белки токсичны для насекомых, Вас. turingiensis
находит широкое применение при разработке методов биологи-
ческой борьбы с вредными насекомыми.
В клетках Вас. medusa одновременно со спорами образуется
преломляющее свет тело, по форме похожее на спору, но не
способное к росту.
У Вас. laterosporus спора как бы находится в лодочке (ка-
ноэ), образованной интенсивно окрашивающимся светооптиче-
скими красками веществом. Таксономический статус двух по-
следних видов неясен-
Бактериальные споры обладают уникальной устойчивостью
к ряду неблагоприятных воздействий. Широко известная высокая
167
устойчивость спор к температуре может быть весьма различной
и зависит от температуры, при которой происходит вегетатив-
ный рост соответствующего вида. Для мезофильных видов рода
Bacillus установлены общие закономерности, заключающиеся
в том, что при прогреве спор во влажной среде число жизнеспо-
собных спор снижается на порядок за 10 мин при температурах
75—121° С для разных видов, причем эти температуры на
46±7°С выше температур, максимальных для роста, и коррели-
руют с ними. При прогреве сухих спор при температуре 125° С
90% спор обычно гибнет за 5 мин — 2 ч, но споры некоторых
форм могут быть гораздо устойчивей. Так, 90% гибели спор ме-
зофильного штамма Bacillus sp. АТС 22380 (АТС — Американ-
ская коллекция типовых культур) при 125° С наблюдается
только через 239 ч. Ферменты, находящиеся в споре, устойчи-
вее к температуре, которая на 38° С выше температуры, к кото«
рой устойчивы те же ферменты, находящиеся в растворе. Споры,
образованные данным видом при более высокой температуре,
обычно устойчивее. Однако споры некоторых видов мало устой-
чивы к температуре, так споры Cl. botulinum типа Е при 80е
гцбнут за несколько минут.
Природа термоустойчивости споры до сих пор остается не
вполне понятной. Широкую известность получила гипотеза, вы-
сказанная в 1975 г. Гулдом и Дрингом, так называемая гипо-
теза расширяющегося кортекса. Она основана главным обра-
зом на том наблюдении, что спора с нарушенными покровами,
проницаемыми для двухвалентных катионов, в присутствии по-
следних становится термочувствительной. У нормальной споры
покровы непроницаемы для двухвалентных катионов. Кортекс
расширен за счет электростатических сил между отрицатель-
ными зарядами муреина, что определяет механическое давле-
ние на сердцевину. Свободные контрионы, вероятно, главным
образом К создают высокое осмотическое давление в области
кортекса, механический и осмотический факторы приводят
к обезвоживанию сердцевины и, следовательно, к ее термостой-
кости. Если покровы нарушены, то в присутствии двухвалент-
ных катионов происходит нейтрализация отрицательных заря-
дов муреина и коллапс кортекса, сердцевина гидратируется и
теряет термоустойчивость. Аналогичные процессы имеют место
и при естественном прорастании споры, когда за счет распада
комплекса ДПК—Са ионы Са2+ выходят из сердцевины в район
кортекса.
Как уже было отмечено, некоторые ученые склонны прида-
вать большее значение в обеспечении термоустойчивости споры
комплексу ДПК—Са. Можно предположить, что все специфи-
ческие элементы споры, в том числе покровы, кортекс и ком-
плекс ДПК—Са, должны нести функции, определяющие ее
свойства.
1G8
Повышенную устойчивость спор к ферментам, ядам, органи-
ческим растворителям можно в основном объяснить барьерной
ролью белковых покровов споры.
Процесс прорастания споры принято подразделять на три
стадии — активацию, инициацию и вырастание.
Активация означает готовность споры к прорастанию, при
этом сохраняется ее устойчивость к температуре, способность
к светопреломлению и др. Активация происходит в процессе ста-
рения спор, и тогда она необратима. Активация в сильной сте-
пени зависит от температуры. Так, у спор Вас. mycoides, сохра-
няемых при 20° С, наблюдали увеличение числа прорастающих
при посеве спор в течение 20 дней. Чем выше температура, тем
быстрее осуществляется активация, например споры Вас. cereus
удавалось полностью активировать за 45 м при 65° С, но при
34° С нужно было выдерживать их в течение 48 ч. Активация
может быть достигнута снижением величин pH, воздействиями
редуцирующими агентами, в этих же случаях возможна деак-
тивация.
Инициация прорастания необратима и длится в течение не-
скольких минут, при этом наблюдается определенная последо-
вательность событий. Сначала снижается устойчивость споры
к прогреванию, выход в среду ДПК—Са, спора становится тем-
ной в фазовом контрасте, хорошо окрашивается и, наконец,
в среду начинает освобождаться глюкозамин и ДАП из раство-
ряющего кортекса. Происходит снижение светорассеяния сус-
пензией спор. Последний показатель удобно использовать для
количественной оценки прорастания. Процесс инициации зави-
сит от температуры, влажности, величины pH раствора, но мо-
жет проходить в условиях, исключающих вегетативный рост.
Например, инициация спор Вас. megaterium осуществляется
в анаэробных условиях, где рост невозможен, при рН = 5 и
выше, тогда как рост идет только при pH выше 6,4. Инициация
нечувствительна к действию антиметаболитов, не зависит от
присутствия источников азота, фосфора. Опа может быть вы-
звана неспецифическими механическими воздействиями, обра-
боткой спор ультразвуком, растиранием со стеклянными бусами,
воздействием давлением в несколько сот атмосфер. Подобная
индукция инициации не является естественной и, вероятно, не
имеет существенного биологического значения. Большой инте-
рес представляет индукция инициации, вызываемая специфиче-
скими индукторами. Индукторами могут быть различные орга-
нические и неорганические вещества, очень часто некоторые
аминокислоты. Для спор Вас. cereus, например, индуктором
является L-аланин, как и для многих других видов бацилл.
Индуктор выполняет роль сигнала, подобно тому как это про-
исходит в случае хемотаксиса. При этом также метаболизм
индуктора не обязателен. Например, прорастание спор Вас. me-
gaterium в равной мере инициируется глюкозой и ее неметабо-
169
лизируемыми аналогами. Предполагают, что соответствующий
сигнал воспринимается рецептором, расположенным на внут-
ренней мембране споры. Начальные этапы прорастания споры
как будто не требуют затрат энергии.
В первые минуты прорастания разрушается до 25% белков
споры, это прежде всего низкомолекулярные белки, синтезиро-
ванные при спорообразовании. У Вас. megaterium их разруше-
ние осуществляется специфической протеазой споры, действую-
щей только на эти белки. По мере дальнейшего прорастания
споры активность этой протеазы снижается и затем исчезает.
Рис. 73. Жизненный цикл спорообразующей
бактерии — паразита нематод [Sayre, Wergin,
1977].
Оказалось, что при спорообразовании в проспоре накапливается
белок с молекулярной массой 46 000, который в процессе созре-
вания споры превращается в белок с молекулярной массой
41 000, и наконец, при прорастании споры в белок с молекуляр-
ной массой 40 000, который и обнаруживает активность. Пре-
вращение белка с массой 41 000 в белок с массой 40 000 не тре-
бует затраты энергии, но дальнейшая деградация специфической
протеазы — энергозависимый процесс.
Вырастание — это процесс активного роста, однако имеются
некоторые отличия процессов, происходящих при вырастании и
вегетативном росте. При вырастании идет активный синтез
белка и РНК, но репликация ДНК начинается только через
1—2 ч после начала прорастания споры. Сначала происходят
процессы репарации повреждений ДНК, произошедших в период
покоя споры.
170
74. Строение нитчатой бактерии из
Рис.
кишечника мыши [Chase, Erlandsen, 1976].
а — вегетативный трихом; б — эндоспорообразо-
вание; в — образование прикрепительных (г)
клеток.
В процессе прорастания споры происходит лизис ее оболо-
чек или их разрыв и выход проростка из оболочек. Тот или
иной способ прорастания характерен для данного вида.
Процессы, связанные со спорообразованием, изучены преи-
мущественно у видов Bacillus и Clostridium. При спорообразо-
вании у некоторых других организмов могут наблюдаться инте-
ресные особенности.
Эндоспоры образует Oscillospira guilliermondi, обитающая
в кишечнике травоядных
животных, в том числе
морских свинок. Эта бак-
терия-представляет собой
длинные (до 100 мкм)
спиральные трихомы,
грамположительна. Три-
хомы многоклеточные,
клетки узкие, клеточные
перегородки находятся на
различных стадиях фор-
мирования. При переходе
к спорообразованию в
части трихома образова-
ние перегородок прекра-
щается или начавшие об-
разовываться перегород-
ки прекращают рост. В
результате образуется
крупная клетка с круп-
ными круглыми спорами
обычного строения. В три-
хоме обычно образуется
1—2 споры.
Образование эндоспор
у некоторых видов может
быть связано с прохож-
дением бактерией специа-
лизированного жизненного
мепно являющиеся инфицирующей стадией организма, образует
бактериальный паразит нематод (рис. 73). Округлая спора на-^
ходится внутри экзоспориума, имеющего чашевидную форму, и
окружена кольцом фибриллярного материала. Плоская сторона
этого комплекса прикрепляется к кутикуле нематоды, после чего
спора прорастает в трубке, проходящей внутрь тела животного,
где формируется примитивный мицелий. Отдельные клетки ми-
целия, сильно разрастаясь, превращаются в спорангии, в кото-
рых формируются споры. После лизиса зараженной нематоды
споры оказываются в почве, где заражают новых животных. Из
одной умершей нематоды может освободиться до 2 млн. спор.
цикла. Так, эндоспоры, одновре-
171
Своеобразный цикл развития обнаружен у спорообразую-
щей нитчатой бактерии, обитающей в подвздошной кишке мы-
шей (рис. 74). Бактерия образует многоклеточные нити-трихомы,
прикрепленные к эпителиальным клеткам слизистой кишечника
с помощью специальных конечных прикрепительных клеток.
Внутри клеток трихома могут образовываться эндоспоры типич-
ного строения. Они выходят во внешнюю среду и служат для
заражения новых животных. Но кроме эндоспор внутри трихо-
мов могут образовываться прикрепительные клетки, служащие
для распространения бактерии внутри зараженного животного,
т. е. для образования новых трихомов. Так же, как и при споро-
образовании, формирование прикрепительных клеток происхо-
дит в результате асимметричного деления и процесса поглоще-
ния одной клеткой другой, причем поглощенная клетка одно-
кратно делится. Прикрепительные клетки после созревания
выходят из материнской клетки и прикрепляются к слизистой
кишечника, давая начало новому трихому. Для этого они снаб-
жены «прикрепительной пятой» — специализированным заост-
ренным полюсом, который при контакте со слизистой кишечника
погружается в лунку, образующуюся за счет впячивания мем-
браны эпителиальной клетки.
§2. Другие типы
дифференцировки бактерий
Кроме эндоспор у бактерий могут быть обнаружены дру-
гие покоящиеся клетки, которые, однако, не обладают подобной
эндоспорам устойчивостью. Бактериальная клетка может быть
целиком превращена в покоящуюся клетку. Таким образом фор-
мируются, например, так называемые цисты.
Цисты азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter и про-
цесс их образования изучены у A. vinelandii. Цисты наблю-
даются в старых культурах, но могут возникать и при выращи-
вании клеток в среде с n-бутанолом, и особенно активно при
перенесении клеток из культуры, экспоненциально растущей
в среде с глюкозой, в среду с 0,2%-ным гидроксибутиратом.
Подобный прием позволяет получить синхронное образование
цист, более 90% клеток за 4—6 дней превращается в цисты.
Зрелые цисты — округлые светопреломляющие образования, со-
держащие сердцевину, т. е. цитоплазму с нуклеоидом и грану-
лами ПОМ. Сердцевина окружена цитоплазматической мембра-
ной и двумя слоями оболочек: интиной — сравнительно электрон-
но-прозрачной толстой внутренней оболочкой, и многослойной
внешней оболочкой — экзиной. Цисты содержат примерно в два
раза больше липидов, чем вегетативные клетки, причем в их
172
составе обнаружены необычные липиды, в том числе пироны,
локализованные в сердцевине и частично в экзине.
Интина по объему примерно равна сердцевине, она состоит
более чем на 40% из углеводов, преимущественно полиманнуро-
новой кислоты, содержит также липиды и белки. Цисты устой-
чивее вегетативных клеток к механическим воздействиям, высу-
шиванию, лизоциму, ЭДТА-лизоциму. Устойчивость к нагрева-
нию цист не намного выше, чем вегетативных клеток.
Прорастание цист происходит в средах с доступными источ-
никами углерода. В среде с глюкозой процесс прорастания за-
б
Рис. 75. Образование (а) и прорастание (б) экзоспор Rhodomi-
crobium vannielii [Whittenbury, Dow, 1977].
Объяснения в тексте.
нимает около 8 ч, к этому времени молодая клетка выходит
через разрыв экзины, однако этот проросток окончательно пре-
вращается в полноценную вегетативную клетку только к двена-
дцатому часу роста. В процессе прорастания расходуется ПОМ,
содержащийся в цистах.
Такие покоящиеся клетки, как цисты, образуют Bdellovibrio,
некоторые метилотрофные бактерии, спирохеты.
Arthrobacter globiformis в некоторых условиях, например
в средах, богатых источниками углерода, но дефицитных по
азоту, образует округлые или лимоновидные тела, окруженные
несколько утолщенной оболочкой и содержащие многочислен-
ные гликогеновые гранулы. Эти тельца получили название ци-
ститы. В свежей среде они отпочковывают вегетативные клетки
173
нормального размера и формы. Неясно, можно ли рассматри-
вать циститы в качестве определенной стадии жизненного цикла
бактерии или это патологическое нарушение морфологии орга-
низма.
Экзоспоры образуют некоторые почкующиеся фотосинтези-
рующие и метанолокисляющие бактерии. У Rhodomicrobium
vannielii экзоспоры формируются на конце гифы материнской
клетки, причем у изученного в этом отношении штамма одна
клетка может последовательно сформировать не более 4 спор
(рис. 75). В данном случае дифференцировку определяет мате-
ринская клетка. Сформировавшаяся экзоспора, отделяясь от
гифы, некоторое время остается связанной с материнским орга-
низмом за счет небольшой слизистой капсулы. Экзоспоры не-
сколько мельче вегетативных клеток и обладают характерной
угловатой формой. У экзоспор под вегетативной клеточной обо-
лочкой формируется дополнительный толстый слой оболочки.
В экзоспорах содержание фотосинтетических пигментов на-
много ниже, чем у вегетативных клеток. Клетка, перешедшая
к образованию спор, уже не может образовывать вегетативные
клетки и в конце концов погибает.
Экзоспоры плохо окрашиваются обычными красками и при
наблюдении в световом микроскопе выглядят как светопрелом-
ляющие тела.
Экзоспоры значительно устойчивее вегетативных клеток
к высушиванию, облучению УФ и прогреву, они выдерживают
кипячение в течение нескольких минут, хотя устойчивость к на-
греванию у них все же ниже, чем у эндоспор. В отличие от
эндоспор экзоспоры не содержат дипиколиновой кислоты и не
обладают повышенной устойчивостью к лизоциму.
У Rh. vannielii процесс прорастания экзоспор занимает 3—
4 ч. В течение первых 60 мин экзоспоры теряют способность
к светопреломлению. Спора прорастает одной или несколькими
гифами, образующимися из ее вершин (рис. 75). При этом про-
цесс идет одним из альтернативных путей — либо образуется
только одна гифа, на которой отпочковываются последовательно
4 дочерние клетки, либо вырастают две гифы и более, но тогда
на каждой из них образуется только одна вегетативная клетка.
У некоторых метилотрофных бактерий экзоспоры отпочковьь
ваются непосредственно от материнской клетки (рис. 76).
Образование специализированных клеток и прохождение
жизненных циклов характерно для многих облигатно паразити-
ческих или симбиотических бактерий, особенно для внутрикле-
точных паразитов и симбионтов. Это, очевидно, связано с тем,
что условия внутри клеток резко отличны от условий внешней
среды. Сохранение во внешней среде и распространение вида
обеспечивается только специализированными клетками, орга-
низованными иначе, чем клетки, активно питающиеся и размно-
жающиеся. Такие специализированные клетки у некоторых бак-
174
терий называют элементарными телами (ЭТ), в отличие от ве-
гетативных клеток — инициальных или ретикулярных тел (ИТ).
Последние обычно имеют характерное для грациликутных
строение, хотя иногда наблюдаются особенности, свойственные
тем или иным видам.
Жизненные циклы, включающие образование элементарных
тел, характерны для бактерий рода Rickettsiella— внутрикле-
точных паразитов беспозвоночных. В зараженных клетках рик-
кетсиеллы развиваются в вакуолях. Вегетативные клетки (ИТ)
довольно крупные, несколько варьируют по размерам и форме.
Они размножаются бинарным делением, а затем превращаются
в гигантские клетки, иногда содержащие кристаллические вклю-
чения, или в ЭТ. Функ-
ции гигантских клеток
неизвестны. ЭТ мельче
вегетативных клеток, име-
ют правильную форму
палочек, на ультратонких
срезах после обычных
фиксаций выглядят весь-
ма электронно-плотными.
ЭТ никогда не делятся,
но являются инфекцион-
ными, при этом в орга-.
низме восприимчивого хо-
зяина превращаются в
ИТ. Rickettsiella не раз-
виваются на питательных
средах, механизмы, регу-
Рис. 76. Формирование экзоспор Methylo-
sinus trichosporium [Titus e. a., 1982].
a — вегетативная клетка с характерной склад-
кой; б, в — образование почки (вздутия) (б) и
перетяжки (в); г — отделение экзоспоры от ма-
теринской клетки.
лирующие прохождение
ими жизненного цикла, неизвестны. У разных форм, относимых
к Rickettsiella, строением ЭТ, как правило, мало различаются,
однако имеются особенности строения, характерные только для
ЭТ данного вида. На рис. 77 приведена схема строения ЭТ
Rickettsiella, основанная на данных изучения срезов и сколов
ЭТ в электронном микроскопе. ЭТ — мелкие палочки длиной
0,5—0,2 мкм, обладают высокой плотностью, поэтому требуются
специальные методы фиксации для приготовления электронно-
микроскопических препаратов. В центре частицы расположено
палочковидное очень плотное для электронов центральное тело.
На поперечных срезах оно овальное или имеет форму много-
гранника с 6—8 гранями. Центральное тело представляет собой
сильно сконденсированный нуклеоид.
Между центральным телом и оболочкой находится субстан-
ция, имеющая среднюю плотность для электронов, в ней сим-
метрично от центрального тела расположены отдельные ча-
стицы, видимо, рибосомы, по 20—40 на ЭТ.
175
ЭТ окружено двумя мембранами — внутренней и внешней.
На внутренней мембране на сколах обнаруживаются некомпле-
ментарные выпуклости и ямки, подобно тому как это харак-
терно для цитоплазматической мембраны бактерий. Внешняя
мембрана на сколах имеет глобулярную структуру. Между мем-
бранами расположен электронно-плотный слой, образованный
муреином, который у ИТ очень тонок и не всегда выявляется.
Таким образом, для ЭТ характерна большая степень упорядо-
ченности их ультраструктуры и уплотненное состояние вещества.
Предполагают, что ЭТ обезвожены и за счет этого обладают
повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям.
У облигатных внутриклеточных паразитов позвоночных —
хламидий вегетативная стадия представлена ИТ. Это сравни-
тельно крупные (до 1 мкм и более диаметром) плеоморфные,
Рис. 77. Строение элементарного тела Rickettsiella [Louis
е. а., 1977].
цм — цитоплазматическая мембрана; вм — внешняя мембрана;
пс — промежуточный электронно-плотный слой; н — нуклеоид;
р — рибосомы.
обычно овальной формы клетки, содержащие диспергирован-
ный, не всегда различимый на срезах, нуклеоид и рибосомы. ИТ
окружены двумя мембранами, между которыми иногда на сре-
зах виден очень тонкий, около 0,8 нм толщиной электронно-
плотный слой, вероятно, образованный муреином, хотя его на-
личие у хламидий пока окончательно не доказано. В оболочке
хламидий обнаружены липиды, белки, глюкозамин и галактоз-
амин. ИТ размножаются бинарным делением с образованием
перетяжки, но они не инфекционны. Например, при развитии
Chlamydia psittaci в культуре L-клеток в течение первых 19 ч
не наблюдается увеличения числа инфекционных единиц, хотя
число ИТ возрастает. Затем инфекционность возрастает экспо-
ненциально, при этом ИТ превращаются в ЭТ, неспособные де-
литься, но обладающие инфекционностью. ЭТ устойчивы к осмо-
тическому шоку и к действию литических ферментов, освобож-
дающихся из лизосом при разрушении ткани. ИТ в этих усло-
виях разрушаются. ЭТ хламидий — палочки довольно правиль-
ной формы толщиной около 0,3 мкм. Они окружены плотной
оболочкой й содержат очень электронно-плотный на срезах ну-
176
клеоид. Таким образом, ЭТ хламидий имеют определенное
сходство с ЭТ риккетсиелл. При изучении целых клеток хла-
мидий в высоковольтном электронном микроскопе у них уда-
лось выявить плотную крестообразную сердцевину и выступы
размером 15:25 нм. Они покрывают около 50% поверхности
тела и расположены гексагонально с расстоянием между цен-
трами 65 нм.
Известно много бактерий, являющихся симбионтами или па-
разитами простейших. Еще в конце прошлого века учеником
И. И. Мечникова В. В. Хавкиным были изучены и описаны бак-
терии, развивающиеся внутри
В. В. Хавкиным Holospora. Для
ный цикл, обеспечивающий
поддержание и распростране-
ние организма. Holospora
obtusa строго избирательно
заражает микронуклеус Para-
mecium caudatum. Ее клетки
грамотрицательны, вегетатив-
ные клетки веретеновидные
2,0—2,5 мкм длиной. Они де-
лятся, образуя перетяжку, в
зараженном ядре скаплива-
ется несколько сотен таких
клеток.
ядер парамеции, названные
Holospora характерен жизнен-
Рис. 78. Жизненный цикл Holospora
obtusa [Осипов, 1981].
Некоторые веретеновидные
клетки перестают делиться,
УДЛИНЯЮТСЯ И превращаются В Объяснения в тексте,
покоящиеся клетки — споры
длиной 15—18 мкм (рис. 78). На ультратонких срезах споры
одна ее часть выглядит гомогенной и имеет сравнительно не-
большую плотность для электронов, тогда как другая очень ин-
тенсивно окрашивается, ее сложная структура включает систе-
му мембран, часто сдвоенных и расположенных преимуществен-
но по периферии клетки. Мембраны ограничивают зернистый
электронно-плотный материал. Споры никогда не делятся. При
делении инфузории они попадают в остаточное тело после митоза
ядра и выбрасываются из клетки в среду, где могут заглатываться
другими животными. Существенное значение для дальнеших
событий, видимо, имеет низкое значение pH в пищеварительных
вакуолях. Особенностью спор Holospora является их способ-
ность к мгновенному выбросу содержимого из оболочки в рас-
творах 0,05—0,25 М НС1, после чего остается пустой чехол.
Выход содержимого споры осуществляется через пору правиль-
ной формы, расположенную приблизительно в средней части
споры. После пастеризации (5 мин при 80° С) или высушивания
споры перестают реагировать на НС1. В результате ряда слож-
ных процессов вышедший из споры зародыш достигает ядра
12 Б. В. Громов
177
парамеции, где дает начало популяции вегетативных клеток,
т. е. в данном случае клеточная дифференцировка обеспечивает
передачу симбиотических бактерий через среду.
Сложные жизненные циклы характерны для миксобактерий.
Их вегетативные клетки палочковидные с закругленными или
заостренными концами имеют строение, типичное для клеток
грациликутных. Клетки ползают по плотному субстрату, меха-
низм этого движения не выяснен. При этом обнаруживается два
типа генетически обусловленных поведенческих реакций — дви-
жение одиночных клеток регулируется иначе, чем движение
клеток в массе. Имеют значение хемотаксические стимулы,
а также прямые межклеточные контакты. Вегетативные палочки
размножаются бинарным делением. В определенных условиях,
обычно при недостатке пищи и на поверхности плотного суб-
страта, клетки, собираясь в массы, формируют плодовые тела,
состоящие из слизи и дифференцированных покоящихся кле-
ток— миксоспор. У представителей некоторых родов миксо-
споры мало отличаются от вегетативных клеток, у других отли-
чаются сильно. В последнем случае миксоспоры округлые или
овальные, обладают сильным светопреломлением и окружены
дополнительной оболочкой. Такие миксоспоры называют микро-
цистами. У некоторых форм миксоспоры заключены в споран-
гии. Наиболее сложно устроены плодовые тела миксобактерий
Chondromyces apiculatus и Stigmatella aurantiaca. У этих бак-
терий плодовые тела состоят из головки, укрепленной на про-
стых или ветвящихся стебельках и служащей для прикрепления
многочисленных цист. Стебельки и головки образованы затвер-
девшей слизью с заключенными в ней отдельными клетками.
После разрушения плодового тела цисты распространяются
в среде и в благоприятных условиях прорастают, при этом из
каждой цисты выходит целая популяция вегетативных клеток.
Большинство видов миксобактерий культивируются с трудом,
и в лабораторных условиях плохо воспроизводятся их жизнен-
ные циклы. Удобным для лабораторных исследований является
вид Myxococcus xanthus, ставший в последние годы излюблен-
ным модельным объектом при изучении биологии миксобакте-
рий. М. xanthus образует плодовые тела сравнительно простой
морфологии, содержащие термоустойчивые микроцисты. Исчер-
пав из среды элементы пищи, вегетативные клетки прекращают
деление и собираются в агрегаты (рис. 79). Роль регулятора
при этом выполняют тетрагуанозин и пентафосфаты, содержа-
ние которых в клетках возрастает в условиях голодания. Как
известно, эти соединения играют регуляторную роль и у других
бактерий. При образовании плодовых тел около 20% клеток
превращаются в микроцисты, остальные гибнут и лизируются,
давая строительный материал для образования плодового тела.
Перед образованием микроцисты клетка заканчивает раунд
репликации хромосомы, но инициации следующей репликации
178
не происходит, т. е. микроциста, так же как эндоспора, полу-
чает только полностью реплицированные хромосомы. У М. xant-
hus микроцисты округлые; муреин их оболочки обогащен пеп-
тидными сшивками. Кроме того, микроциста окружена допол-
нительной, преимущественно полисахаридной оболочкой. Около
50% этого полисахарида образовано остатками N-ацетилгалак-
тозамина, в его составе имеется также глюкоза. На поверхно-
сти микроцисты находится белок S, связь которого с поверх-
ностью микроцисты определяется зависимой от Са2+ самосбор-
кой белковых молекул. Микроцисты устойчивее вегетативных
Рис. 79. Жизненный цикл Myxococcus xanthus [Dworkin,
1973].
1 — вегетативный рост; 2 — образование плодовых тел и миксо-
спор; 3 — образование миксоспор под влиянием глицерина; 4 —
прорастание миксоспор.
клеток к нагреванию, высушиванию, механическим воздей-
ствиям, ультрафиолетовому облучению. Образование плодовых
тел происходит только при культивировании бактерий на плот-
ной среде. Можно искусственно вызвать синхронное образова-
ние микроцист, в том числе и в жидкой среде, без образования
плодовых тел добавлением к среде 0,5 М глицерина или неко-
торых других соединений. В этих условиях через 100 мин клетки
превращаются в округлые микроцисты, созревание которых
происходит примерно за 4 ч. Такие микроцисты схожи с нор-
мальными, образующимися при формировании плодового тела
(рис. 79).
Сложный жизненный цикл, по-видимому, должен иметь для
миксобактерий приспособительное значение, так как миксобак-
12* 179
терии существуют за счет внеклеточного гидролиза нераствори-
мых макромолекул — клетчатки, крахмала, белка, муреина
(у хищных видов). Для эффективного гидролиза макромолекул
необходимо создание некоторой минимальной концентрации со-
ответствующих ферментов, что обеспечивается только при опре-
деленной плотности клеток бактерий на субстрате. При вегета-
тивном росте необходимая плотность клеток достигается склон-
ностью бактерий к роению, т. е. к совместному движению. При
истощении субстрата происходит снижение концентрации про-
дуктов гидролиза, что включает механизмы клеточной диффе-
ренцировки. В плодовых телах покоящиеся клетки защищены
от неблагоприятных внешних воздействий слоем слизи и, кроме
того, находятся в скоплениях. У форм, клетки которых заклю-
чены в цисты, она, вероятно, содержит некоторый минимум кле-
ток, необходимый для успешного развития роя после прораста-
ния цисты. У М. xanthus, не имеющего цист, прорастание
микроцист в бедных средах происходит, только если их концен-
трация превышает некоторый минимум, что также может обес-
печить образование роя сразу после прорастания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Последние десятилетия характеризуются значительными
успехами в области изучения структуры и функций бактериаль-
ной клетки. Во многих случаях расшифрована молекулярная
структура элементов клетки, более или менее выяснены меха-
низмы, обеспечивающие их функции. Значительно менее по-
нятны механизмы, регулирующие пространственную и времен-
ную организацию синтетических реакций, обеспечивающих
структурную определенность клетки и регулярность процессов
роста и деления. Относительная простота организации прока-
риотической клетки не исключает возможности функционирова-
ния весьма сложных регуляторных механизмов, исследование
которых еще только начинается.
Вместе с тем прогресс в области изучения структуры и функ-
ций прокариотической клетки принес подтверждения представ-
лениям об известной ограниченности эволюционных возможно-
стей прокариот. Ограниченная компартментализация и, ве-
роятно, с ней связанная ограниченность размеров и объема
препятствуют значительным усложнениям организма, дифферен-
цировке и возникновению истинно многоклеточных организмов.
Представляется правдоподобным предположение об исключи-
тельно комбинаторной изменчивости современных прокариот,
когда приобретение любого нового свойства с неизбежностью
ведет к потере другого, имевшегося ранее, но прогрессивного
усложнения организма не происходит. Принимая во внимание
длительность периода эволюции прокариотической клетки, прак-
тически соответствующей всему известному периоду существо-
вания жизни на Земле, вполне можно допустить, что эволю-
ционные возможности прокариотической клетки исчерпаны. Не
следует, однако, недооценивать возможности влияния на ход
эволюции прокариотической клетки антропогенных воздействий,
иногда резко изменяющих условия существования бактерий и
нередко вносящих в эти условия совершенно новые элементы.
181
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Абеквоза 38
Адъювант 34
Активация спор 169
Активный транспорт 85
Амидазы 20
Аминокислоты муреина 15
Амплитуда жгутика 118
Антиген
— «Н» 119
— «О» 37
Антигенная специфичность 27
Арабиногалактан 32
Архебактерий
— определение 11
— мембран 98
— оболочки 56
Аттрактанты 131
N-ацетилглюкозамин 14
Аэротаксис 133
Базальная структура жгутика 128
Бактериодопсин 99
Бактериофаги
— рецепторы 48
Бацитрацин 23
Белки
— интегральные мембран 83
— матрикса 46
— метилакцепторные 133
— минорные 49
— основы 46
— периплазмы 53
— периферические мембран 83
— транспортные 53
Белок
— «А» 29
— «М» 29
— Omp F 46
— Omp С 46
— 2 47
— tsx 49
— Fee А 50
Бляшки зубные 64
Вискозитаксис 131
Включения 106
Внешний чехол спирохет 128
Внешняя мембрана 34
Внутриклеточные мембраны 91
Волютин 112
Вырастание спор 170
Выросты спор 166
Газовые вакуоли 106
Галофильные бактерии 12
Гептозы 39
Гетероцисты 7
Гигантские клетки
— риккетсий 175
Гидролазы 20
Гликоген 110
Гликозидазы 20
Гликопептид 14
Гликопротеиды 28
Гликофосфолипиды 76
Глюкозаминопептид 14
Гомеовязкостная адаптация 81
Градиент протонов 85
Грамицидин 156
Грамотрицательные бактерии 13
Грамположительные бактерии 13
Грациликутные 13
Грибовидные структуры мембран 74
Группы муреинов 16
Движение спирохет 128
Дезоксигексозы 38
Декстраны 61
Дергающаяся подвижность 70
Дистальные кольца жгутика 124
Дифференцировка бактерий 138
Диффузия
— молекул в мембране 85
— облегченная 85
— пассивная 85
182
Длина волны жгутика 118
Жгутики
— курчавые 118
— простые 117
— рост 120
— сложные 117
— строение 118
Жирные кислоты
— антеизо 80
— изо 80
— ЛПС 42
— мембран 77
— микоплазм 79
Иммунологическая мимикрия 30
Инициация спор 169
Интина цист 172
Капсула 61
Капсульные антигены 65
Карбоксисомы 113
Кардиолипин 75
Кислота
— ацетилмурамовая 14
— гликолилмурамовая 30
— диаминопимелиновая 15
— дипиколиновая 160
— мурамовая 14
— поли-р-оксимасляная 107
Кислоты
— глицеринтейхоевые 24
— глюкозилтейхоевые 25
— липотейхоевые 26
— миколовые 31
— рибиттейхоевые 24
— тейхоевые 24
— тейхуроновые 27
Кислотоустойчивость
микобактерий 32
Клеточный цикл
— вегетативный 137
— диморфный 137
— мономорфный 137
— полиморфный 137
Клинокинез 131
Кокки 8.
Колитоза 38
Колицины
— рецепторы 48
Конъюгация бактерий 69
Корд-фактор 33
Корды микобактерий 34
Кортекс спор 160
Красные мембраны 99
Круговорот оболочки 147
Крюк жгутика 123
Кувыркание бактерий 131
Лактоферрин 50
Лепестки мембраны 73
Лизилфосфатидилглицерин 67
Лизис бактерий 58
Лизоцимы 19
Липид А 41
Липиды
— мембран 75
— микобактерий 30
Липополисахарид 36
Липопротеин 45
Лофотрихи
— формы бактерий 116
Магнетосомы 115
Магнетотаксис 131
Мальтоза
— транспорт 87
Манно-октонат 39
Мезосомы 91
Мембранный потенциал 86
Метанобразующие бактерии 12
Метилобактерии 97
Метилтрансфераза 134
Микобактерии 30
Микококки 30
Миколаты 30
Микоплазмы 60
Микроцисты 178
Миксобактерии 178
Миксоспоры 178
Многоклеточность 6
Монотрихи 116
Мотор жгутика 127
Мужские фаги 68
Мукопептид .14
Муреин 14
Мутанты
— Leaky 41
— Ipo 45
— R 41
Некридии 7
Нить жгутика 118
Нуклеоид 97
Нуклеоидосома 94
Общий антиген энтеробактерий 44
Олигосахариды периплазмы 54
Онтогенез бактерий 137
Организованные колонии 8
Осевая нить спирохет 128
Осмотический шок 36
О-специфическис цепи 37
Ось жгутика 124
Параспоральные тела 167
Паратоза 38
Пептидные мостики муреина 16
Пептидогликан 14
Пептиды оболочки 16
Перегородка клетки 144
183
Перенос радикалов 88
Перетяжка клетки 139
Периплазма 52’
Пили
— общего типа 65
— половые 67
Пилин 67
Пирогенный эффект 44
Пищевой иммунитет 50
Покровы споры 164
Полисахариды запасные НО
Полиэдральные тела 113
Полярность клетки 139
Порины 46
Почки бактерий 150
Почкующиеся бактерии 150
Примордиальный слой оболочки 160
Прокариоты 4
Проксимальные кольца жгутика 124
Прорастание споры 169
Простеки 11
Простекобактерии И
Протеазы при спорообразовании 159
Проспора 159
Протопласты 57
Псевдомуреин 56
Пузырьки мембранные 74
Пурпурные мембраны 99
Размеры бактерий 6
Рапидосомы 114
Репелленты 131
Рецепторы клеток 132
Рибитфосфат 24
Рибосома 105
Риккетсий 175
Рутениевый красный 24
Ретикулярные тела 175
Сапрофитные микобактерии 32
Серотипы 37
Сидерофоры 50
Симбионты простейших 177
Симпорт 86
Сердцевина споры 162
Сквалены 98
Скорость бактерии 126
Смешанное жгутикование 117
Соматический антиген 37
Спейсеры клеточные 57
Спинин 71
Спириллы 10
Спирохеты
— движение 129
— строение 128
Спорангий 178
Спорогенная зона 158
Стадии спорообразования 157
Стадия роения
— протея 117
Стафилоккоки 146
Стебельки 11
Сферопласты 57
Таксисы бактерий 130
Температура
— переходная 80
— плавления липидов 80
Тетрапептиды муреина 16
Тивелоза 38
Тилакоиды 96
Типы симметрии бактерий 8
Трансгликозилирование 21
Транслокация радикалов 88
Транспептидирование 22
Транспорт
— аминокислот 87
— галактозидов 87
— мальтозы 87
Трансферрин 50
Трихом 7
Трубчатые выросты 72
Ундекапренол 51
Унипорт 86
Фазовая изменчивость 121
Феррихром 50
Фимбрии 65
Фирмакутные 13
Флагеллин
— антигенность 119
— гены 121
— полиморфизм 121
— самосборка 122
— строение 121
Форма бактерий 8
Фосфолипаза А 51
Фосфолипиды мембран 75
Фототаксис 130
Хемотаксис 131
Хемотипы муреина 16
Хитин 15
Хламидии 176
Хромосома бактерии 99
Хроматофоры 95
Центральное тело риккетсий 176
Цианобактерии 13
Цилиндр
— базальной структуры 124
Циститы 174
Цисты 172
Цитоплазматическая мембрана 73
Цитоплазматический
— цилиндр 128
Цитрат-Ре-транспорт 50
Шипы 71
184
Экзина цисты 172
Экзоспора 173
Экзоспориум 65
Электрохимический градиент 86
Элементарная клетка 141
Элементарное тело 176
Энергетика движения 128
Эндопептидазы 20
Эндоспора 155
Эндотоксин 44
Энтерохелин 50
Эубактерий. 11
Ядро ЛПС 39
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ
К главе I.
Балашова В. В. Микоплазмы и железобактерии. М., 1974. 64 с.
Громов Б. В. Ультраструктура синезеленых водорослей. Л., 1976. 96 с.
Гусев М. В., Никитина К. А. Цианобактерии. М., 1979. 228 с.
Дуда В. И. Архебактерий — новое царство живых организмов. — При-
рода, 1984, № 2, с. 13—25.
Захарова И. Я., Варбинец Л. Д. Углеводсодержащие биополимеры мем-
бран бактерий. Киев, 1983. 125 с.
Калакуцкий Л. В., Агре Н. С. Развитие актиномицетов. М., 1977. 287 с.
Корнелли Т. В. Липиды микробактерий и родственных микроорганизмов.
М., 1984. 160 с.
Моруа Андре. Жизнь Александра Флеминга. М., 1964. 331 е.
Наумова И. Б. Тейхоевые кислоты в регуляции биохимических процес-
сов у микроорганизмов. — Биохимия, 1978, т. 43, вып. 2, с. 195—207.
Пешков М. А. Систематика и биология многоклеточных бактерий по-
рядка Caryophanales Peshkoff. М., 1977. 262 с.
Прозоровский С. В., Кац Л. Н., Каган Г. Я. L-формы бактерий. М.»
1981. 337 с.
Соловьева Т. Ф., Оводов Ю. С. Биологические свойства эндотоксинов
грамотрицательных бактерий. — Усп. совр. биол., 1980, т. 90, вып. I (4),
с. 62—79.
Шибаев В. Н. Биосинтез углеводных цепей полимеров клеточной поверх-
ности бактерий. — Усп. биол. химии, 1982,, т. 23, с. 61—101.
Braun 1Л, Hantke К. Biochemistry of bacterial cell envelopes. — Ann. Rev.
Biochem., 1974, vol. 43, p. 89—121.
Fogg G. E., Stewart W. D. P., Fay P., Walsby A. E The blue-green algae,
London —New York, 1973, 459 p.
Gibbons N. E., Murray R. G. E. Proposal concerning the higher taxa of
bacteria. — Intern. J. Syst. Bacteriol., 1978, vol. 28, N 1, p. 1—6.
Hall M. N., Silhavy T. I. Genetic analysis of the major outer membrane
proteins of Escherichia coli. — Ann. Rev. Genet., 1981, vol. 15, p. 91—142.
Jeffries P., Wilkinson J. F. Electron microscopy of the cell wall complex
of Methylomonas albus. — Arch. Microbiol., 1978, vol. 119, p. 227—229.
Kandler O. Cell wall structures and their phylogenetic implications. —
Zbl. Bakt. Hyg., Abt. Orig., 1982, vol. C3, p. 149—160.
Luderitz O., Freudenberg M. A., Galanos Ch., Lehmann V., Rie-
tschel E. Th., Shaw D. H. Lipopolysaccharides of gram-negative bacteria.—1
Current topics in membranes and transport. 1982, vol. 17, p. 79—151.
Rienzo Di. J. M., Nakamura K-, Inouye M. The outer membrane proteins
of gram-negative bacteria: biosynthesis, assembly, and functions. — Ann. Rev.
Biochem., 1978, vol. 47, p. 481—532.
Schleifer К. H., Kandler O. Peptidoglycan types of bacterial cell walls
and their taxonomic implications. — Bacteriol. Revs., 1972, vol. 36, N 4,
p. 407—477.
Shockman G. D., Barrett J. F. Structure, function, and assembly of cell
walls of gram-positive bacteria. — Ann. Rev. Microbiol., 1983, vol. 37, p. 507—
528.
Sleytr U. B. Regular arrays of macromolecules on bacterial cell walls:
structure, chemistry, assembly, and function. — Int. Rev. Cytology, 1978,
vol. 53, p. 1—64.
Stackebrandt E., Woese C.R. The evolution of prokaryotes. — In: Molecular
and cellular aspects of microbial evolution. — Symp. Soc. Gen. Microbiol.»
1981, vol. 32, p. 1—31.
Zeikus J. G., Bowen V. G. Fine structure of Methanospirillum hungatii. —
J. Bacteriol., 1975, vol. 121, p. 370—380.
186
К главе II.
Навашин С. М., Голуб Е. И. Конъюгация у бактерий: взаимодействие
донорских и реципиентньис клеток в процессе образования пар. — Усп.
совр. биол., 1976, т. 82, вып. 2, с. 210—221.
Cohen С., Phillips G. N. Jr. Spikes and fimbriae: a-helical proteins form
surface projections on microorganisms. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981,
vol. 78, p. 5303—5304.
Henrichsen J. Twitching motility. — Ann. Rev. Microbiol., 1983, vol. 37,
p. 81—95.
Sleytr U. B., Messner P. Cristalline surface layers on bacteria. — Ann.
Rev. Microbiol., 1983, vol. 37, p. 311—340.
К главе III.
Бирюзова В. И., Поглазова М. Н. О гетерогенности бактериальных ме-
зосом. — Усп. микробиол., 197-7, т. 12, с. 28—41.
Гельман Н. С., Лукьянова М. А., Островский Д. Н. Мембраны бактерий
и дыхательная цепь. М., 1972, 246 с.
Германович В. Н. Транспорт азотистых оснований и нуклеозидов у бак-
терий. — Усп. совр. биол., 1977, т. 83, вып. 2, с. 226—239.
Некое В. Г., Берестовский Г. Н. Липидный бислой биологических мем-
бран. М., 1982, 224 с.
Несмеянова М. А. О возможном участии кислых фосфолипидов транс-
локации секретируемых белков через цитоплазматическую мембрану бак-
терий. — Молекулярная биол., 1982, т. 16, вып. 4, с. 821—828.
Романов В. И. Физиологическая роль и метаболизм поли-р-оксимасляной
кислоты у микроорганизмов. — Усп. биол. химии, 1977, т. 18, с. 211—230.
Рубан Е. Л. Синтез и гидролиз липидов у микроорганизмов. — Прикл.
биохимия и микробиол., 1980, т. 1*6, вып. 4, с. 490—501.
Тюрин В. С., Гальченко В. Ф. Субмикроскопическое строение мембран-
ного аппарата метанотрофных бактерий. •— Микробиология, 1976, т. 45,
вып. 3, с. 503—506.
Burdett I. D. J. Bacterial mesosomes. — Sci. Progr., Oxford, 1972, vol. 60,
p. 527—546.
Cronan J. E., Gelmann E. P. Physical properties of membrane lipids.
Biological relevance and regulation. — Bacteriol. Revs., 1975, vol. 39, N 3,
p. 232—256.
Ebersold H. R., Cordier J.-L., Luthy P. Bacterial mesosomes: method de-
pendent artifacts. — Arch. Microbiol., 1981, vol. 130, N 1, p. 19—22.
Rleppe K., Ovebo S., Lossius J. The bacterial nucleoid. — J. General
Microbiol., 1979, vol. 112, p. 1 —13.
Lake J. A. Evolving ribosome structure: domains in Archaebacteria, Eubac-
teria, and Eucariotes. — Cell, 1983, vol. 33, p. 318—319.
Lengworthy T. A., Tornabene T. G., Holzer G. Lipids of Archaebacteria.—
Zbl. Bakt. Hyg., Abt. Orig., 1982, vol C3, N 2, p. 228—244.
McElhaney R. N. The effect of alterations in the physical state of the
membrane lipids on the ability of Acholeplasma laidlawii В to grow at va-
rious temperatures. — J. Molecular Biol., 1974, vol. 84, p. 145—157.
Pittijohn D. E. Procaryotic DNA in nucleoid structure. — CRC Critical
Rev. Biochem., 1976, vol. 4, p. 175—202.
Raetz C. R. H. Enzymology, genetics and regulation of membrane phos-
pholipid synthesis in Escherichia coli. — Microbiol. Revs., 1978, vol. 42, N 3,
p. 614—659.
Ryter A., Chang A. Localisation of transcribing genes in the bacterial cell-
by means of high resolution autoradiography. — J. Molecular Biol., 1975,
vol. 98, p. 787—810.
Stronington O. G., Pettijohn D. E. The folded genome of Escherichia co-
li isolated in a protein-DNA-RNA complex. — Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1971, vol. 68, p. 6—9.
187
Tristram H. Transport of organic solutes by bacteria. — In: Companion
to microbiology, ed. A. T. Bull a. Meadow P. M., London — New York, 1978,
p. 297—320.
Walker J. E., Saraste M.} Gay N. J. E. coli Fi ATP-ase interact with a
membrane protein component of proton channel. — Nature, 1982, vol. 298,
p. 867—869.
Woldringh C. L., Nanninga N. Organization of the nucleoplasm in Escherichia
coli visualized by phase-contrast light microscopy, freeze-fracturing and thin
sectioning. — J. Bacteriol., 1976. vol. 127, N 3, p. 1455—1464.
К главе IV.
Глаголев A. H. Таксис у бактерий. — Усп. микробиол., 1983, т. 18,
с. 163—192.
Поглазов Б. Ф., Метлина А. Л„ Новиков В. В. Современные представ-
ления о механизме движения бактерий. — Изв. АН СССР, Сер. биол., 1981,
№ 5, с. 672—689.
Berg Н. С., Bromley D. В., Charon N. W. Leptospiral motility. — In:
Relat. Struct. Funct. Procaryotic cell., 28th Symp. Soc. Gen. Microbiol., Univ.
Southampton. 1978, p. 285—294.
Bode W.. Engel. Winklmair D. A model of bacterial flagella based
on small-angle X-ray scattering and hydrodynamic data which indicate an
elongated shape of the flagellin protomer. — Eur. J. Biochem., 1972, vol. 26,
p. 313—327.
Doetsch R. N., Sjoblad R. D. Flagellar structure and function in eubac-
teria. — Ann. Rev. Microbiol., 1980, vol. 34, p. 69—108.
Glagolev A. N., Skulachev V. P. The proton pump is a molecular engine
in motile bacteria. — Nature, 1978, vol. 272, N 5650, p. 280—282.
Hazelbauer G. L. Bacterial chemotaxis: molecular biology of a sensory
system. — Endeavour, N. S., 1980, vol. 4, p. 67—73.
Hougen К. H., Birch-Andersen A. Electron microscopy of endoflagella and
miciotubules in Treponema reiter. — Acta path, microbiol. scand. Section B,
1971, vol. 79, p. 37—50.
lino T. Genetics of structure and function of bacterial flagella. — Ann.
Rev. Genet, 1977, vol. 11, p. 161—182.
Niwano M., Taylor B. L. Novel sensory adaptation mechanism in bac-
terial chemotaxis to oxygen and phosphotransferase substrates. — Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, p. 11—15.
Suzuki T., I no T., Horiguchi T., Yamaguchi S. Incomplete flagellar struc-
tures in nonflagellate mutants of Salmonella typhimurium. — J. Bacterio!.,
1978, vol. 133, p. 907—915.
Silverman M. R. Building bacterial flagella. — The Quart. Rev. Biol.,
1980, vol. 55, p. 395—408.
Weibull C. Movement. — In: The bacteria. / Ed. J. C. Gunsalus a.
R. Y. Stanier. New York, 1960, vol. 1, p. 153.
К главе V.
Degen S. T., Newton A. Dependence of cell division on the completion
of chromosome replication in Caulobacter crescentus. — J. Bacteriol., 1972,
vol. 110, p. 852—856.
Donachie W. D. Cell division in bacteria. — In: Mechanism and regulation
of DNA replication, New York —London, 1974, p. 431—445.
Giesbrecht P., Wecke J., Reinicke B. On the morphogenesis of the cell wall
of Staphylococcus.— Intern. Rev. Cytol., 1976, vol. 44, p. 225—318.
Higgins M. L., Shockman G. D. Study of a cycle of cell wall assembly in
Streptococcus faecalis by three-dimensional reconstructions of thin sections
of cells. — J. Bacteriol., 1976, vol. 127, p. 1346—1358.
James R. Control of DNA synthesis and cell division in bacteria. — In:
188
Companion to microbiology, ed. Bull A. T. a. Meadow P. M., London — New
York. 1978, p. 59—76.
Kolenbrander P. E., Hohman B. J. Electron microscopic study of cell
surface rings during cell division and morphogenesis of Arthrobacter cry-
stallopoietes. — J. Bacteriol., 1977, vol. 130, p. 1345—1356.
Shapiro L. Differentiation in the Caulobacter cell cycle. — Ann. Rev. Mi-
crobiol., 1976, vol. 30, p. 377—407.
Whittenbury R„ Dow C. S. Morphogenesis and differentiation of Rhodomi-
crobium vannielii and other budding and prosthecate bacterial. — Bacteriol.
Revs., 1977, vol. 41, p. 754—808.
Tzagoloff H., Novick R. Geometry of cell division in Staphylococcus
aureus. — J. Bacteriol., 1977, vol. 129, p. 343—350.
К главе VI.
Дуда В. И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий. — Усп.
микробиол., 1982, т. 17, с. 87—117.
Осипов Д. В. Проблемы гетероморфизма ядер у одноклеточных орга-
низмов. Л., 1981, 167 с.'
Aronson A. S., Fitz-James Oh. Structure and morphogenesis of the bac-
terial spore coat. — Bacteriol. Revs., 1976, vol. 40, p. 360—402.
Breadbury H., Foster J. R., Hammer B., Lindsay J., Murrell W. G. The
source of the heat resistance of bacterial spores. — Biochem. Biophys. Acta,
1981, vol. 678, N 2, p. 157—164.
Chase D. G., Erlandsen S. L. Evidence for a complex life cycle and endo-
spore formation in the attached, filamentous, segmented bacterium from murine
ileum. — J. Bacteriol., 1976, vol. 127, p. 572—683.
Dworkin M. Cell — cell interactions in the myxobacteria. — In: Microbial
differentiation. — Symp. Soc. Gen. Microbiol., 1973, vol. 23, p. 125—142.
Louis C., Yousft A., Vago C.t Niclas G. Etude par cytochimie et cryode-
capage de 1’ultrastructure d’une Rickettsiella de crustace. — Ann. Microbiol.
Inst. Pasteur, 1977, vol. 128 B, p. 177—205.
Mandelstam J. Bacterial sporulation: a problem in the biochemistry and
genetics of a primitive developmental system. — Proc. Roy. Soc. London, B,
1976, vol. 193, N 4, p. 89—106.
Sayre R. M., Wergin W. P. Bacterial parasite of a plant nematode — mor-
phology and ultrastructure. — J. Bacteriol., 1977, vol. 129, p. 1091—1101.
Titus J. A., Reed W. M., Pfister R. M., Dugan P. R. Exospore formation
in Methylosinus trichosporium. — J. Bacteriol., 1982, vol. 129, p. 354—360.
Warth A. D. Molecular structure of the bacterial spore. —• Adv. Microbial
Physiol., 1978t vol. 17, p. 1—47.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 3
Введение 4
Глава I. Бактериальные оболочки 14
§ 1. Строение и синтез муреина —
§ 2. Оболочка фирмакутных 23
§ 3. Оболочка грациликутных 34
§ 4. Протопласты, сферопласты, L-формы 57
Глава II. Внешние (надоболочечные) структуры 61
§ 1. Капсула —
§ 2. Пили 65
Глава III. Организация цитоплазмы 73
5 1. Цитоплазматическая мембрана —
§ 2. Транспортная функция цитоплазматической мембраны 84
§ 3. Внутриклеточные мембранные системы 91
§ 4. Нуклеоид 99
$ 5. Включения 106
Глава IV. Жгутик как орган движения бактерий 116
§ 1. Строение жгутика —
S 2. Механизм работы жгутика 125
$ 3. Таксисы бактерий 130
Глава V. Рост и деление бактерий 137
§ 1. Мономорфный клеточный цикл 139
§ 2. Диморфный и полиморфный клеточные циклы 149
Глава VI. Типы дифференцировки бактерий 155
§ 1. Эндоспоры —
§ 2. Другие типы дифференцировки бактерий 172
Заключение 181
Предметный указатель 182
Указатель литературы 186
ИБ № 2168
Борис Васильевич Громов
СТРОЕНИЕ БАКТЕРИЙ
Учебное пособие
Редактор Т. Н. Пескова
Обложка художника А. Г. Голубева
Художественный редактор О. Н. Советникова
Технический редактор Г. М. Матвеева
Корректоры К. Я. Бенина, Т, Г. Павлова
Сдано в набор 30.01.85. Подписано в печать 12.07.85. М-27955. Формат бум. 60X90Vjb.
Бумага тип. № 2. Гарнитура литературная. Печать высокая. Усл. печ. л. 12.
Усл. кр.-отт. 12,19. Уч.-изд. л. 12,46. Тираж 4500 экз. Заказ 782. Цена 40 коп.
Издательство ЛГУ имени А. А. Жданова. 199164, Ленинград, Университетская наб., 7/9
Типография № 2 Ленуприздата, 192104, Ленинград, Литейный пр., 55