Текст
                    Л.Страйер
ШИЭЖЕЖН

Second Edition BIOCHEMISTRY Lubert Stryer Stanford University W.H.Freeman and Company San Francisco
В 3-х томах Перевод с английского канд. биол. наук М.Д.Гроздовой, Под редакцией академика С.Е.Северина Москва «Мир» 1984
ББК 28.072 С-83 УДК 577.1 Страйер Л. С-83 Биохимия: Пер. с англ-М.: Мир, 1984-Т. 1-232 с., ил. В книге ученого из США на самом современном научном уровне рассмотрены ос- новные проблемы биохимии и молекулярной биологии. На русском языке книга выхо- дит в трех томах. В первом томе приведены данные по строению биологических макромолекул, образо- ванию, превращению и хранению энергии в клетке, структуре и функциям ферментов и других биологически активных белков, а также по «молекулярным» болезням. Предназначена для биохимиков, молекулярных биологов, физиологов, химиков, меди- ков, для студентов, аспирантов и преподавателей биологических, химических и меди- цинских специальностей. 2001040000 164 С 041(01М4 ПВДП- “ЗДНе Ч- ’ ББК 28.072 Редакция литературы по биологии Люберт Страйер БИОХИМИЯ Том 1 Ст научи, редактор Л. Г. Тер-Саркисян. Мл. научн. редактор О. А. Горгун, Художник И. Б. Кравцов. Художественный редактор Л. М, Кузнецова. Технический редактор 3. И. Резник. Корректор Т.П. Пашковская. ИБ № 3849 Сдано в набор 17.08.83 Подписано к печати 13.09.84. Формат 70 х 100/16. Бумага офсетная № 1. Печать офсегная. Гарнитура тайме. Объем 7,25 бум. л. Усл. печ. л. 18,85 Усл. кр.-отт. 75,76. Уч. изд. л. 20,87. Изд. № 4/2495. Тираж 17.100 экз. Зак. 665. Цена 2 р. 20 к. ИЗДАТЕЛЬСТВО МИР 129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2. Можайский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам изда- тельств, полиграфии и книжной торговли. 143200, г. Можайск, ул. Мира, 93. © 1975, 1981 by Lubert Stryer © Перевод на русский язык, «Мир», 1984
Предисловие редактора перевода Книга Страйера представляет собой ори- гинальное, очень удачно составленное руко- водство по общей динамической биохимии, которое можно горячо рекомендовать спе- циализирующимся по биохимии студентам университетов, аспирантам, а также препо- давателям, ведущим занятия по биохимии в различных высших и средних специальных учебных заведениях. В книге отлично изло- жены данные о динамике превращении био- логически важных соединений и подробно разобраны ферментативные основы обмена веществ и энергии. Несмотря на обстоятель- ность изложения и сложность приводимых, вполне современных данных по биохимии и молекулярной биологии, материал изла- гается настолько просто и интересно и с та- кими замечательными иллюстрациями, что разобраться в нем не представляет сложно- сти даже для относительно мало подгото- вленного читателя. Использовать книгу Страйера как справочное издание по биохи- мии невозможно: в ней нет таблиц, характе- ризующих состав крови, мочи, органов и тканей, нет описания свойств и структуры различных биологически важных соедине- ний, но зато строго последовательно разби- рается и оценивается физиологическая зна- чимость их превращений. Есть, как мне кажется, и упущения. Например, в книге ни слова не сказано об а- и «-окислении жирных кислот, тогда как описание наруше- ния ос-окисления дает возможность остано- виться на одном из интересных наслед- ственных заболеваний и обсудить процессы гидроксилирования, играющие существен- ную роль при различных реакциях обмена веществ. Во многих других случаях весьма уместно приводятся примеры наслед- ственных заболеваний, связанных с выпаде- нием синтеза того или другого фермента. В этом отношении данная книга предста- вляет несомненный интерес и для врачей, желающих пополнить свое биохимическое образование. С большим удовлетворением можно кон- статировать, что в последние годы перевод- ная биохимическая литература пополнилась после отличною учебника А. Ленинджера такими фундаментальными руководствами, как «Биохимия» Д. Мецлера (М.: Мир, 1980) и «Основы биохимии» А. Уайта, Ф. Хендле- ра, Э. Смита и др. (М.: Мир, 1981). Надо ду- мать, что среди этих книг учебное руковод- ство Страйера займет достойное и почетное место, быстро приобретет популярность у заинтересованных читателей и выполнит таким образом важную роль в распростра- нении и углублении биохимических знаний в нашей стране. С. Е. Северин
Моим учителям П. Брандуейну, Д. Харрису, Д. Смиту, Э. Блауту, Э. Парселлу Предисловие ко второму изданию Развитие биохимии в последние годы шло поразительно быстрым темпом. Этот прогресс расширил наши предста- вления о молекулярных основах жизни и стимулировал развитие многих новых областей исследования. К числу важней- ших направлений современной биохимии следует отнести анализ последовательно- сти нуклеотидов в ДНК, создание и кло- нирование новых сочетаний генов, выяс- нение механизмов регуляции метаболиче- ских процессов, изучение мембранного транспорта и превращения энергии. Одна из задач, которой я руководствовался при подготовке настоящего издания-вве- дение в текст данных, полученных уже после выхода в свет первого издания. Я стремился улучшить качество книги как учебника, используя новый материал при обсуждении общих тем, где это бы- ло возможно, и неоднократно возвра- щаясь к тем или иным принципам. Я также стремился к тому, чтобы изло- жение предмета биохимии оставляло впе- чатление интеллектуальной мощи и кра- соты. Я приношу благодарность Томасу Эмери, Генри Эпстайну, Александру Глейзеру, Роджеру Корнбергу, Роберту Мартину, Джеффри Склару за советы, критические замечания и поддержку в процессе подготовки этого издания. Ро- берт Болдуин, Чарльз Кантор, Ричард Каприоли, Дэвид Эйзенберг, Алан Фершт, Роберт Флеттерик, Герберт Фридман, Хорейс Джексон, Ричард Кейнс, Сун-Хоу Ким, Аарон Клюг, Артур Корнберг, Дэниел Кошланд, Самюэль Латт, Винсент Марчези, Дэвид Нелсон, Гарт Николсон, Вернон Ои, Роберт Ре- нтал, Карл Родс, Фредерик Ричардс, Джеймс Ротман, Питер Сарджент, Го- вард Шахман, Иоахим Силиг, Эрик Шу- тер, Элизабет Симонс, Джеймс Спудич, Теодор Стек, Томас Стейтц, Юдит Стенн, Роберт Трелстад, Кристофер Уолш, Симон Уитни и Бернхард Уиткоп также давали мне ценные советы. Патриция Миттельштадт отредактиро- вала оба издания книги. Я высоко ценю ее вклад и критические замечания. Я благодарен Донне Солмон за ее заме- чательные рисунки. Множество пре- красных электронно-микроскопических снимков мне предоставили Дэвид Слей- тон, Дэвид Дресслер, Джон Хейзер, Линн Мерсер, Кеннет Миллер, Джордж Палла- де, Нигель Ан у ин и Робли Уилльямс. Бетти Хоган перепечатывала рукопись и была незаменимым помощником при подготовке ее к печати. Кэри Лейден и Карен’ Марзотто тщательно выверили гранки. Я хочу поблагодарить также Майкла Грейвса как отличного фотогра- фа. Моя жена Андреа и сыновья Майкл и Дэниел охотно согласились принять эту книгу в члены нашей семьи. Я глу- боко благодарен им за терпение и опти- мизм. Андреа дала мне много полезных советов относительно стиля изложения и расположения материала в этом изда- нии, так же как и в предыдущем. Я глубоко тронут множеством писем читателей по поводу первого издания. Их соображения и критика оказались для меня весьма полезными и послужили стимулом для дальнейшей работы. Я надеюсь на продолжение этого диало- га с читателями и в будущем. Август 1980 г. Люберт Страйер
Предисловие к первому изданию Эта книга-плод накопленного мною опыта преподавания биохимии студентам старших курсов и дипломникам, а также студентам-медикам в Йейле и Станфорде. Я ставил себе целью изложение общих принципов биохимии так, чтобы читатель усвоил основные концепции и овладел биохимической терминологией. Кроме то- го, мне хотелось, чтобы читатель почув- ствовал и оценил процесс поиска и от- крытия в биохимии. Фундаментальные биохимические принципы излагаются при обсуждении следующих основных тем: 1. Конформация-на примере связи ме- жду пространственной структурой белков и их биологической активностью. 2. Выработка и накопление энергии* 3* Биосинтез предшественников макро- молекул. 4. Информация-накопление, передача и экспрессия генетической информации, 5. Молекулярная физиология-взаимо- связь между информацией, конформацией и метаболизмом в физиологических про- цессах. Раскрытие на протяжении последних лет пространственной структуры белков, нуклеиновых кислот и других биомолекул значительно расширило наши представле- ния о молекулярных основах жизни. Из- лагая этот аспект биохимии, я очень ши- роко пользовался молекулярными моде- лями, чтобы создать живое представле- ние об архитектуре и динамике на ма- кромолекулярном уровне. Другой вдохно вляющий и прекрасный аспект биохи- мии-это ее все возрастающая связь с медициной. Я привожу много примероь такой связи. Обсуждение молекулярных болезней, в частности серповидноклеточ- ной анемии, или механизма действия та- ких лекарственных препаратов, как пени- циллин, обогащает преподавание биохи- мии. Наконец, я постарался обрисовать некоторые новые увлекательные области современных биохимических исследова- ний, например молекулярные основы воз- будимости. При подготовке этой книги я широко пользовался советами, критическими за- мечаниями и поддержкой многих коллег и учеников. Лерой Худ, Артур Корнберг, Джеффри Склар и Уилльям Вуд дали мне ценную консультацию относительно общей структуры книги. Ричард Каприо- ли, Дэвид Коул, Александр Глейзер, Ро- берт Леман и Питер Ленджиел ознако- мились с большими разделами рукописи и дали очень много полезных советов. Я крайне обязан Фредерику Ричардсу за те мысли, которыми он поделился со мной относительно конформации макро- молекул, и за подробные указания, как лучше изображать пространственную структуру. Дэрик Баундс, Томас Брокер, Джек Гриффит, Хью Хаксли и Джордж Палладе предоставили мне замеча- тельные электронно-микроскопические снимки. Я также очень благодарен Ри- чарду Дикерсону, Дэвиду Эйзенбергу, Мойзесу Эйзенбергу, Генри Эпстайну, Джозефу Фрутону, Мишелю Голдбергу, Джеймсу Гризолиа, Ричарду Хендерсону, Харви Химелю, Дэвису Хогнессу, Дейлу Кайзеру, Самюэлю Латту, Сьюзан Лёви, Винсенту Марчези, Пиеру Муру, Аллану Озерову, Джордану Поберу, Расселу Рос- су, Эдварду Райху, Марку Смиту, Джеймсу Спудич, Джоан Стейтц, Томасу Стейтцу и Алану Ваггонеру, советами и критическими замечаниями которых я воспользовался при подготовке этой книги. Приношу благодарность Государствен- ному фонду за предоставление денежных Предисловие к первому изданию 7
средств, позволивших мне приступить к написанию этой книги. В самое труд- ное время мне помогли Роберт Глейзер, Терран Киннан и Квигг Ньютон. Одна из задач, которую я поставил перед со- бой, состояла в том, чтобы достичь пол- ного единения слова и рисунка и как можно живее и нагляднее изобразить хи- мические превращения и простран- ственные структуры. Отсюда-моя особая признательность Донне Солмон, Джону Фостеру и Джейн Фостер за выпол- ненные ими рисунки, графики и схемы. Немало людей в Йельском университете способствовало завершению моего труда. Я особенно благодарен Маргарет Бентон и Шарен Уэстин за перепечатку рукопи- си, Уилльяму Полларду-за фотографиро- вание пространственных моделей и Мар- те Скарф за обеспечение компьютерных изображений молекулярных структур (эти изображения легли в основу многих ил- люстраций). Большую помощь мне ока- зали также сотрудники Научной библио- теки во главе с Джоном Харрисоном. Значительная часть книги была написа- на в Аспене. Я должен выразить благо- дарность Физическому центру в Аспене и Институту патобиологии, любезно принимавшим меня не одно лето. У ме- ня сохранились самые теплые воспомина- ния об увлекательных дискуссиях по про- блемам биохимии и молекулярным ас- пектам медицины, происходивших в пре- красном парке Института патобиологии или во время прогулок по живописным окрестностям. Большое удовольствие до- ставляло также посещение концертов в Аспене, особенно после целого дня ин- тенсивной работы. Я искренне благодарен своей жене Ан- дреа и детям Майклу и Дэниелу за их поддержку, терпение и доброе отношение на протяжении всего того времени, пока писалась книга. Они действительно уча- ствовали в ее рождении, процесс которо- го оказался длительнее, чем предполага- лось. Андреа давала мне советы по пово- ду стиля и расположения материала, а также обратила мое внимание на заме- чание китайского ученого XIII века Тай- Т’уна (Tai T’ung, The Six Scripts: plinciples of Chinese writing): «Если бы я ждал со- вершенства, то никогда не закончил бы книгу». Я буду рад любым замечаниям читате- лей. Октябрь 1974 г. Люберт Страйер
ГЛАВА 1. Молекулы и жизнь Биохимия-это наука о молекулярных осно- вах жизни. Существует несколько причин тому, что в наши дни биохимия привлекает большое внимание и быстро развивается. Во-первых, биохимикам удалось выяснить химические основы ряда важнейших биоло- гических процессов. Назовем, в частности, такие выдающиеся достижения, как откры- тие двухцепочечной спирали дезоксирибо- нуклеиновой кислоты (ДНК), расшифровка генетического кода, определение трехмер- ной структуры некоторых белков, описание основных путей метаболизма. Во-вторых, обнаружены общие пути превращения моле- кул и общие принципы, лежащие в основе раз- нообразных проявлений жизни. Оказалось, что столь различные организмы, как бакте- рия Escherichia coli и человек, имеют много общего на молекулярном уровне. Оба орга- низма используют одни и те же строи- тельные блоки для образования макромоле- кул; в принципе одинаково происходит передача генетической информации от ДНК к рибонуклеиновой кислоте (РНК) и далее к белкам; оба вида используют аденозин- трифосфат (АТР) в качестве энергетической валюты. В-третьих, биохимия оказывает все более глубокое воздействие на медицину. Так, например, определение активности ферментов играет в настоящее время важ- ную роль в клинической диагностике. Со- держание определенных ферментов в сыво- ротке крови может служить ценным крите- рием при диагностике недавно перенесенно- го инфаркта миокарда. Кроме того, биохи- мия постепенно создает основу для рацио- нального назначения лекарственных препа- ратов. Исключительную важность предста- вляет выяснение молекулярных механизмов некоторых заболеваний, например серпо- видноклеточной анемии или большого чис- ла врожденных нарушений метаболизма, исследованных к настоящему времени. В-че- твертых, быстрое развитие биохимии в по- следние годы позволило исследователям при- ступить к из уч ению сам ых острых, ко- ренных проблем биологии и медицины. Каким образом на протяжении индивидуального развития из одной клетки возникают такие разнообразные клетки, как мышечная, нерв- ная или печеночная? Как клетки находят друг друга при формировании сложного ор- ганизма? Как контролируется рост клеток? Рис. 1.1. Модель двойной спирали ДНК. Диаметр спирали около 20 А. 1. Молекулы и жизнь 9
Рис. 1.2. П ространственные атомов водорода, азота, кислорода, и серы. дерваальсовых взаимодействий (рис. 1.2). Для обозначения атомов в моделях при- няты следующие цвета: водород - белый, углерод - черный, азот-синий, кислород - красный, фосфор - желтый, сера-желтый. На рис. 1.3 показаны пространственные модели некоторых простых молекул. Модели из шаров и палочек менее точно отражают строение молекул, чем простран- ственные, так как в них атомы представлены в виде шариков меньшего радиуса, чем ра- диус вандерваал ьсовых взаимодействий. Однако эти модели дают более наглядное представление о расположении связей, ко- торые в данном случае изображаются про- сто в виде палочек. Заостренный конец па- лочки указывает направление связи: распо- ложена ли она впереди или позади плоско- сти рисунка. В целом такая модель лучше, чем пространственная, позволяет рассмо- модели углерода, фосфора 5 А Формамид Н h2n-c^ о Каков механизм памяти? Каким образом возникает нервный импульс в сетчатке глаза при действии света? В чем причина рака? Каковы причины шизофрении? 1.1. Молекулярные модели Взаимосвязь между трехмерной структурой биомолекул и их биологической функцией составляет лейтмотив настоящей книги. Для описания архитектуры молекул мы вос- пользуемся атомарными моделями трех типов: 1) пространственными, 2) по- строенными из шаров и палочек и 3) ске- летными. Пространственные модели наибо- лее реалистичны. Размер и конфигурация атома в пространственной модели опреде- ляется его валентностью и радиусом ван- Рис. 1.3. Пространственные модели во- ды, ацетата, формамида, глю- козы и цистеина. NH3+ —С—н I СН2—SH 10 1. Молекулы и жизнь
Рис. 1.4. «-----------------> 10 А Сравнение различных моделей АТР: Л-скелетная, Б-из ша- ров и палочек, В'-простран- ственная. На моделях А и Б атомы водорода не пока- заны. треть сложную структуру. Еще более про- стое представление о строении молекул можно получить с помощью скелетных мо- делей, в которых изображается только моле- кулярная сетка. Сами атомы в скелетных моделях не изображаются, но подразуме- вается, что они расположены в местах пере- сечения связей и на их концах. Скелетные модели часто используют для описания сложных биологических макромолекул, на- пример молекул белка, состоящих из не- скольких тысяч атомов. Сравнение трех ти- пов моделей АТР - пространственной, из шаров и палочек и скелетной-приведено на рис. 1.4. 1.2. Пространство, время и энергия При рассмотрении структуры молекул важ- но представлять себе их размеры (рис. 1.5). Измерения длины на атомарном уровне производят обычно в ангстремах; один анг- стрем (А) равен 10” 10 метра (м) или 0,1 на- нометра (нм). Например, длина связи С—С составляет 1,54 А. Небольшие биомоле- кулы, в частности сахара или аминокис- лоты, как правило, имеют длину в несколь- ко ангстрем. Биологические макромоле- кулы, например белки, по крайней мере в десять раз крупнее. Так, гемоглобин - бе- лок эритроцитов, переносящий кисло- род,-имеет диаметр 65 А. Еще на порядок больше по размеру надмолекулярные ком- плексы. Например, диаметр рибосом-бе- лок-синтезирующих органелл клетки-со- ставляет около 300 А. В диапазоне от 100 А (10 нм) до 1000 А (100 нм) лежат также раз- меры большинства вирусов, Клетки же, как правило, имеют в сотни раз большие раз- меры и измеряются уже в микрометрах (мкм). Например, наибольшая длина эри- троцита равна 7 мкм (7 -104 А). Важно отме- тить, что предел разрешающей способности светового микроскопа составляет около 0,2 мкм (2000 А), что соответствует размеру многих клеточных органелл. Так, в свето- вом микроскопе видны митохондрии-ос- новные производители АТР в аэробных клетках. Большая часть наших представле- ний онкологических структурах размерами от 1 А (0,1 нм) до 104 А (1 мкм) получена благодаря использованию электронной ми- кроскопии и дифракции рентгеновских лу- чей. Молекулы, составляющие живое, подвер- гаются постоянным превращениям. В био- логических системах химические реакции катализируются ферментами, которые спо- собны превращать субстрат в продукт реак- ции за время, исчисляемое, как правило, миллисекундами (мс, 10-3с). Некоторые ферменты работают еще быстрее: реакция завершается за несколько микросекунд (мкс, 10“ 6 с). Конформационные изменения био- логических макромолекул протекают также очень быстро. Например, на раскручивание двойной спирали ДНК, необходимое для ее репликации и экспрессии, требуются лишь 1. Молекулы и жизнь 11
АТОМЫ МАКРО- МОЛЕКУЛЫ МОЛЕКУЛЫ Связь С-С Гемоглобин НАДМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ Предел разрешения светового микроскопа КЛЕТКИ Эритроцит Глюкоза Рибосома Бактерия 1 А 1(Г10 м V 1 10 А 10"9 м 1 нм Ю2 А IO"8 м 103 А 10 ‘7 м 104 А 10 е М 1 мкм 105 А Ю"5 м Рис. 1.5, Размеры некоторых биомоле- кул, надмолекулярных ком- плексов и клеток, микросекунды, Поворот одного домена бел- ка по отношению к другому занимает нано- секунды (нс, 10 “ 9 с). Многие нековалентные связи в макромолекулах образуются и раз- рываются в течение лишь нескольких нано- секунд. Процессы, протекающие еще бы- стрее, можно оценить лишь с помощью очень коротких световых импульсов ла- зерных установок, Примечательно, что на- чальное событие при зрительном восприя- тии-изменение структуры светопоглощаю- щих группировок -происходит в течение нескольких пикосекунд (пс, 10’ 12 с) после поглощения фотона. Все это показывает, что скорости биологических процессов мо- гут варьировать в широких пределах (рис. 1.6). Весьма важно представлять себе также длительность эволюционного вре- мени. Жизнь на Земле возникла 3,5 * 109 лет тому назад, что соответствует 1,Ы017с. Рассмотрим также изменения энергии, происходящие при различных молеку- лярных превращениях (рис. 1.7). Первичным источником необходимой для жизни энер- гии является Солнце. Поглощение видимого света, например фотонов зеленого света, дает 57 килокалорий на моль (ккал/моль). Содержание энергии, запасенной в молеку- лах АТР - универсальной энергетической ва- люты в биологических системах,-соста- вляет 12 ккал/моль. По сравнению с этими величинами средняя энергия каждой из степеней свободы колебательного движения молекул невелика; 0,6 ккал/моль при 25°С, что значительно ниже, чем это требуется для диссоциации ковалентных связей (83 ккал/моль для связи С—С, например). Отсюда следует, что образованный кова- лентными связями скелет биомолекул ста- билен в отсутствие ферментов или притока энергии. С другой стороны, указанная ве- личина тепловой энергии оказывается до- Первичная реакция зрительного восприятия Вращательное движение в белках Ферментативная реакция Деление бактерии 10-12 ( ПС ) 10“9 ( НС ) Раскручивание спирали ДНК 10"6 ( мкс ) Время, 10-3 ( МС ) Синтез белка 1 103 с Рис. 1.6. Типичные скорости протека- ния реакций в биологических системах. статочной для образования или разрыва в биологических системах нековалентных связей, энергия которых составляет обычно лишь несколько килокалорий на моль. Про- цессы выработки и накопления энергии под- робно рассматриваются в части II книги. 12 1. Молекулы и жизнь
Слабая химическая Зеленый Связь Тепловая связь АТР свет С — С Глюкоза L_ 0,1 10 100 ______I 1000 Количество энергии, ккал/моль Рис. 1.7. Некоторые биологически важ- ные величины энергии. 1.3. Структура данной книги Настоящая книга состоит из пяти частей, посвященных следующим основным вопро- сам. I. Конформация и динамика. II. Генерирование и хранение метаболи- ческой энергии. III. Биосинтез предшественников макро- молекул. IV. Генетическая информация. V. Молекулярная физиология. Часть I посвящена главным образом опи- санию взаимосвязи между трехмерной структурой и биологической активностью на примере белков. Подробно рассматри- ваются структура и функция миоглобина и гемоглобина - белков, транспортирующих кислород у позвоночных, поскольку на этом материале можно проиллюстрировать не- которые общие принципы. Гемоглобин представляет особенно большой интерес в связи с тем, что связывание им кислорода регулируется специфическими веществами окружающей среды. Описывается также мо- лекулярная патология гемоглобина, в част- ности серповидноклеточная анемия. В раз- деле, посвященном ферментам, мы познако- мимся с тем, каким образом происходит узнавание субстрата ферментом и как фер- мент может увеличивать скорость реакции в миллион и более раз. Подробно описы- ваются такие ферменты, как лизоцим, кар- боксипептидаза А и химотрипсин, при изу- чении которых были выявлены многие общие принципы катализа. В несколько ином аспекте излагается вопрос о конфор- мации в главе, посвященной двум белкам соединительной ткани-коллагену и эласти- ну. Заключительная глава части I служит введением в проблему биологических мем- бран, представляющих собой организо- ванные белково-липидные комплексы. На- личие мембран в биологических системах обеспечивает создание в клетке отдельных компартментов (отсеков). Часть II посвящена вопросам образова- ния и накопления энергии обмена веществ. В первую очередь рассматривается общая стратегия метаболизма. В клетках происхо- дит превращение энергии из «топливных» молекул в АТР. Образующийся АТР в свою Рис. 1.8. Структура фермент-субстрат- ного комплекса. К карбокси- пептидазе А (гидролитический фермент) присоединен глицил- тирозин (изображен красным). Показана только одна че- тверть фермента. [Lips- comb W. Н., Proc. Robert А. Welch Found. Conf. Chem. Res, 15, 141 (1971)]. 1. Молекулы и жизнь 13
Рис. 1.9. Модель CD Р-диацилглицеро- ла-активированного проме- жуточного продукта в синтезе ряда мембранных липидов. очередь обеспечивает протекание большин- ства эндергонических процессов (т.е. про- цессов, идущих с потреблением энергии). Наряду с АТР в клетках происходит также образование восстановительных эквивален- тов в форме никотин амиддинуклеотид фос- фата (NADPH), расходуемого в процессах биосинтеза. Пути образования АТР и NADPH описываются подробно. Напри- мер, образование АТР при расщеплении глюкозы требует последовательного проте- кания трех процессов-гликолиза, цикла трикарбоновых кислот (называемого также лимоннокислым циклом, или циклом Креб- са) и окислительного фосфорилирования. Последние два процесса участвуют также в образовании АТР при окислении других энергетических ресурсов, а именно жиров и некоторых аминокислот. Этот пример ил- люстрирует принцип экономности на моле- кулярном уровне. В части II рассматри- ваются также две основные формы накопле- ния энергетических ресурсов в клетках, а именно гликоген и гриацилглицеролы (нейтральные . жиры). Заключительная гла- ва этой части книги посвящена фотосинтезу, первичная реакция которого - активиро- ванный светом перенос электрона от одного вещества к другому против градиента хими- ческого потенциала. В части III рассматривается биосинтез предшественников макромолекул. На- чинается эта часть с описания синтеза мем- бранных липидов и стероидов. Особый ин- терес представляет синтез холестерола, С27-стероида, все углеродные атомы кото- рого образуются из двууглеродного пред- шественника. В следующей главе обсу- ждаю гея реакции, ведущие к синтезу ряда аминокислот и гема. Механизмы регуляции этих путей обмена веществ имеют фунда- ментальное значение. Далее рассматривает- ся биосинтез нуклеотидов-активированных предшественников ДНК и РНК. Заключи- тельная глава посвящена интеграции про- 2000 А 0,2 мкм Рис. 1.10. Электронная микрофотогра- фия молекулы ДНК. (Печа- тается с любезного разреше- ния д-ра Т. Broker.) 14 1, Молекулы и жизнь
цессов обмена веществ. Из нее читатель уз- нает, каким образом реакции, идущие с выделением энергии, и реакции, идущие с ее потреблением, оказываются сбаланси- рованными и обеспечивают нужды организ- ма. Накопление, передача и экспрессия (выра- жение в фенотипе) генетической информа- ции составляют основную тему части IV. В начале описываются эксперименты, по- казывающие, что ДНК является генетиче- ским материалом, а также история откры- тия двойной спирали ДНК. Затем следует описание ферментативного механизма ре- пликации ДНК. Далее мы перейдем к экс- прессии генетической информации, заклю- ченной в ДНК, начав с описания данных о роли информационной РНК как промежу- точного переносчика информации. Затем рассматривается процесс транскрипции, т. е. синтез РНК в соответствии с инструкциями, заключенными в матричной ДНК. Из этого логически вытекает описание генетического кода, т.е. взаимосвязи между последова- тельностью оснований в ДНК (или в тран- скрибируемой с нее информационной РНК) и последовательностью аминокислот в со- ответствующем белке. Генетический код, общий для всех живых организмов, прекра- сен своей простотой. Три основания соста- вляют кодон - единицу кода, соответствую- щую одной аминокислоте. Кодоны в инфор- мационной РНК последовательно считы- ваются молекулами транспортных РНК, которые выполняют роль адаптеров в син- тезе белка. Далее мы переходим к механиз- му белкового синтеза, а именно к процессу трансляции, в ходе которого четырехбук- венный алфавит нуклеиновых кислот, в ко- тором каждая буква представлена соответ- ствующей парой оснований, переводится в 20-буквенный алфавит белков. Трансляция происходит на рибосомах и обеспечивается координированным взаимодействием более чем сотни различных высокомолекулярных соединений. В следующей главе описывает- ся регуляция экспрессии генов у бактерий, причем основное внимание уделяется оперо- нам лактозы и триптофана у £. coli, как наи- более изученным в настоящее время. Далее обсуждаются результаты последних иссле- дований экспрессии генов у более высокоор- ганизованных организмов (т.е, у эукариот), отличающихся от бактерий (прокариот) бо- лее высоким содержанием ДНК и наличием оформленного ядра, что обеспечивает диф- ференцировку клеток. Затем рассматри- Рис. 1.11. Модель 11-1/uc-ретиналя-све- топоглощающей структуры в родопсине. Изомеризация этого хромофора под дей- ствием света является первым этапом процесса зрительного восприятия. ваются размножение вирусов и сборка ви- русных частиц. Процесс сборки вирусных частиц иллюстрирует общие принципы образования высокоупорядоченных струк- тур из биологических макромолекул. Осо- бое внимание уделено вирусам, вызываю- щим раковые опухоли у экспериментальных животных. Заключительная глава части IV посвящена образованию новых генов путем рекомбинации, а также обсуждению вопро- са о значении клонирования ДНК. Часть V, озаглавленная «Молекулярная физиология», представляет собой переход от биохимии к физиологии. При изложении материала здесь используются многие из концепций, сформулированных в предыду- щих разделах книги, поскольку физиологии приходится иметь дело с информацией, кон- формацией и процессами метаболизма в их взаимосвязи. Вначале описывается органи- зация клеточных мембран и оболочек бакте- риальных клеток и выясняется вопрос, ка- ким образом клетка определяет положение синтезируемых ею белков. Далее следует из- ложение молекулярных основ иммунного ответа: как организм узнает чужеродные ве- щества. В следующей главе речь идег о про- блеме преобразования энергии химических связей в координированное движение. Как показали исследования последних лет, ак- тин и миозин-основные белки мышц-вы- полняют функцию сокращения в большин- стве клеток высших организмов. Далее описываются молекулярные основы дей- 1. Молекулы и жизнь 15
ствия гормонов, причем особое внимание уделяется некоторым общим темам. Затем мы переходим к транспорту молекул и ионов, в частности Na +, К + и Са2 + . Мо- лекулярные ионные насосы, локализо- ванные в мембранах, транспортируют ионы, создавая градиенты их концентрации, лежа- щие в основе возбудимости. В последней главе, посвященной сенсорным процессам, рассматриваются следующие вопросы: ка- ким образом потенциал действия распро- страняется по нервным клеткам и проходит через синапс? Как одиночный фотон возбу- ждает палочку в сетчатке глаза? Каким образом бактерии определяют источник пи- щи в среде и движутся в направлении к нему? Одна из наиболее привлекательных осо- бенностей биохимии состоит в том, что эта наука постоянно расширяет наши предста- вления о биологических процессах на всех уровнях организации живого.
Часть Конформация и динамика Рассматривается на примере взаимосвязи между пространственной структурой белков и их биологической активностью Модель рибонуклеазы S - фермента, гидро- лизующего рибонуклеиновые кислоты. Цве- том выделены аминокислоты в активном центре, критически необходимые для осу- ществления катализа. Пространственная 2 665 структура этого фермента была раскрыта Фредериком Ричардсом и Гарольдом Уи- кофом (по рисунку, любезно предостав- ленному д-ром F. Richards, S. Anderson и A. Perlo).
ГЛАВА 2. Основные представления о структуре и функции белков Белки играют решающую роль практически во всех биологических процессах. Значение и удивительное разнообразие их функций очевидно из следующих примеров. 1. Ферментативный катализ. В биологи- ческих системах почти все реакции катали- зируются специфическими макромолекула- ми, называемыми ферментами, Некоторые из этих реакций, такие как гидратирование диоксида углерода, очень просты, Другие же, например репликация всей хромосомы, в высшей степени сложны. Почти все фер- менты-мощные катализаторы, повышаю- щие скорости реакции по крайней мере в миллион раз. Так, в отсутствие ферментов химические превращения in vivo удается выявить очень редко. В настоящее время охарактеризовано несколько тысяч фермен- тов, причем многие из них выделены в кри- сталлической форме. Поразителен тот факт, что все известные ферменты являются бел- ками. Следовательно, именно белки опреде- ляют ход химических превращений в биоло- гических системах. 2. Транспорт и накопление. Транспорт многих небольших молекул и ионов осу- ществляется специфическими белками. На- пример, содержащийся в эритроцитах гемо- глобин переносит кислород к тканям, тогда как близкий к нему белок миоглобин запа- сает кислород в мышцах. В плазме крови железо транспортируется в виде комплекса с трансферрином, а в печени оно накап- Часть I 18 Конформация и динамика ливается в виде комплекса с другим бел- ком - ферритином. 3. Координированное движение. Бел- ки-основной компонент мышц. Сокраще- ние мышцы обеспечивается скольжением двух типов белковых нитей относительно друг друга. Координированные движения на микроскопическом уровне, например расхождение хромосом во время митоза или продвижение спермия при помощи жгу- тика, также обеспечиваются сократительны- ми структурами, состоящими из белков. 4. Механическая опора. Высокая упру- гость кожи и костей обусловлена наличием фибриллярного белка коллагена. Рис. 2.1. Микрофотография кристалла гексокиназы - ключевого фер- мента утилизации глюкозы. (Печатается с любезного раз- решения д-ра Т. Steitz и д-ра М. Yeager.)
Рис. 2.2. Поперечный срез летательной мышцы насекомого под элек- тронным микроскопом. Видно, что белковые нити двух типов образуют гексагональные структуры. (Печатается с лю- безного разрешения д-ра М. Reedy.) 5. Иммунная защита. Антитела-это вы- сокоспецифические белки, способные узна- вать и связывать такие чужеродные объекты, как вирусы, бактерии и клетки дру- гих организмов. Таким образом, белки играют жизненно важную роль, различая свое и чужое. 6. Генерирование и передача нервных им- пульсов. Ответ нервных клеток на специфи- ческие импульсы опосредован рецепторны- ми белками. Например, родопсин - фоторе- цепторный белок клеток палочек сетчатки. Молекулы рецепторов, приводимые в дей- ствие специфическими веществами неболь- шой молекулярной массы типа ацетилхоли- на, обеспечивают передачу нервных импуль- сов в синапсах, т.е. в местах соединения нервных клеток. 7. Регуляция роста и дифференцировки. Строгая регуляция последовательности экспрессии генетической информации имеет крайне важное значение для упорядоченно- го роста и дифференцировки клеток. В лю- бой отрезок времени жизни огранизма экс- прессируется только небольшая часть гено- ма клетки. У бактерий основным элементом регуляции служат репрессорные белки, ко- торые заставляют «молчать» специфические участки клеточной ДНК. Совершенно дру- гим путем происходит регуляция белками процесса дифференцировки клеток, что вид- но на примере фактора роста нервов-бел- кового комплекса, под действием которого формируется сеть нейронов у высших орга- низмов. 2.1. Белки построены из аминокислот Основной структурной единицей белков являются аминокислоты. Каждая аминокис- лота состоит из аминогруппы, карбоксиль- ной группы, атома водорода и определен- ной R-группы, присоединенной к атому углерода, называемому а-углеродом (рис. 2.5). R-группы называют боковой цепью по причинам, которые станут оче- видными в ходе дальнейшего изложения. При нейтральном значении pH аминокис- лоты в растворах находятся не в виде неио- низированных молекул, а преимущественно в виде биполярных ионов (цвиттерионов). При этом аминогруппа оказывается прото- нированной (— NH J), а карбоксильная груп- па-диссоциированной ( — СОО). Иониза- ция аминокислоты зависит от значения pH (рис. 2.6). В кислых растворах (например, при pH 1) карбоксильная группа находится в неионизированной форме (—СООН), а аминогруппа ионизирована (—NHJ). В щелочных растворах (например, при pH И), наоборот, ионизирована карбоксильная группа (—СОО-), а аминогруппа не ионизи- Рис. 2.3. Электронная микрофотогра- фия коллагенового волокна. (Печатается с любезного раз- решения д-ра J. Cross и д-ра R. Bruns.) 2. Основные представления о структуре и функции белков 19 2*
Рис. 2.4. Микрофотография ганглия, Видна пролиферация нервов после добавления фактора роста нервов, представляюще- го собой комплекс белков. (Пе- чатается с любезного разреше- ния д-ра Е. Shooter.) рована ( —NH2). Представления о роли pH и кислотно-щелочных свойствах амино- кислот дополнительно обсуждаются в при- ложении к этой главе, Расположение в виде тетраэдра четырех разных химических групп вокруг а-углерод- ного атома обусловливает оптические свой- ства аминокислот. Структуры, представля- ющие собой зеркальное отражение друг друга, называются L- и D-изомерами (рис. 2.7). В состав белков входят только L-аминокислоты, Поэтому в последующем изложении мы будем опускать обозначение изомера, имея в виду, что в тех случаях, ког- да речь идет о структуре белков, подразуме- ваются L-аминокислоты (за исключением специально оговоренных случаев). В белках встречается 20 видов боковых аминокислотных цепей, различающихся по размерам, форме, способности образовы- вать водородные связи и химической реакционноспособности. Подчеркнем, что все белки всех видов живых существ = от бактерии до человека-построены из одного и того же набора 20 аминокислот. Этот уни- версальный белковый алфавит существует уже около 2 млрд. лет. Тот факт, что белки способны выполнять различные функции, обусловлен разнообразием и гибкостью свойств составляющих их 20 структурных элементов. В последующих главах мы уви- дим, как на основе этого алфавита возни- кают сложнейшие трехмерные структуры, благодаря которым белки способны уча- ствовать в столь большом числе биологиче- ских процессов. Рассмотрим этот набор аминокислот. Простейший в их ряду-глицин, у которого на месте боковой цепи находится атом во- дорода (рис, 2.8). У аланина боковая цепь представлена метильной группой. Валин, лейцин, изолейцин и пролин содержат угле- nh2 "и н—с—соон 1 н—с—СОО- 1 1 R 1 R Аминокислота в Аминокислота в форме неиоиизированной форме диполярного иона (цвиттериона) NH3+ Н—с—соо- I Боковая цепь Рис. 2.5. Структура аминокислоты в не- ионизированной форме и в форме цвиттериона. Часть I 20 Конформация и динамика водородные боковые цепи. Пролин, однако, отличается от других 19 аминокислот ос- новного набора тем, что имеет вторичную, а не первичную аминогруппу (рис. 2.9). Строго говоря, пролин является имино- (а не амино-) кислотой. Боковая цепь в проли-
I I I H—C—COOH H—C—COO- H—C—COO~ I + H + | + H + | R R R Форма, преобладающая Форма, преобладающая Форма, преобладающая при pH 1 при pH 7 при pH 11 Рис. 2.6. Зависимость ионизации ами- нокислоты от значения pH. Рис. 2.7. Абсолютные конфигурации L- и D-изомеров аминокислот. Имеются три широко распространенные ароматические аминокислоты: фенилала- нин, тирозин и триптофан (рис. 2.11). У всех вышеперечисленных аминокислот боковые цепи не несут заряда при физиоло- гических значениях pH. Обратимся теперь к аминокислотам с заряженными боковыми цепями. При нейтральном значении pH ли- зин и аргинин несут положительный заряд, а гистидин - либо заряжен положительно, либо нейтрален в зависимости от микро- окружения. Эти основные аминокислоты показаны на рис. 2.12. Боковые цепи глута- миновой и аспарагиновой кислот (рис. 2.13). несут отрицательный заряд. Далее мы бу- дем называть эти аминокислоты соответ- ственно глутамат и аспартат, подчеркивая с сю COO ссо COG COO С--Н с н ' H3N С --Н 'M3N С И * 'О h н сн3 Л™ сн2 Н—С—CH, 1 Н3С сн3 /СН сн2 Н3С сн3 1 сн3 Глицин Аланин Валин Лейцин Изолейцин (Gly) (Ala) (Vai) (Leu) (Не) Рис. 2.8. Аминокислоты с алифатиче- скими боковыми цепями. И сн3 Аланин (Ala) Н2С /СН2 СН2 Пролин (Pro) Рис. 2.9. Пролин отличается от других обычных аминокислот нали- чием вторичной аминогруппы. не присоединена как к аминогруппе, так и к а-углероду, и в результате получается цик- лическая структура. Две аминокислоты-серин и треонин-со- держат алифатические гидроксильные группы (рис. 2.10). тот факт, что при физиологических значе- ниях pH они несут отрицательный заряд. Существуют незаряженные производные глутамата и аспартата - глутамин и аспара- гин (рис. 2.14), которые вместо концевой карбоксильной группы содержат амидную группу. Наконец, у двух аминокислот в бо- ковой цепи находится атом серы. Это ме- тионин и цистеин (рис. 2.15). Как будет по- казано далее, цистеин во многих белках играет особую роль, обеспечивая образова- ние поперечных дисульфидных связей. 2.2. Особые аминокислоты дополняют основ- ной набор, насчитывающий двадцать амино- кислот В ряде белков содержатся особые аминокис- лоты, образующиеся путем модификации обычных аминокислот после их включения 2. Основные представления о структуре и функции белков 21
- С “ H Н—с—ОН I н Серин (Ser) СОО - С- н—с—он I сн3 Треонин (Th г) Рис. 2.10. У серина и треонина боковая цепь представлена алифатиче- ской гидроксильной группой. ным при цинге, развивающейся в резуль- тате недостаточного гидроксилирования коллагена. Еще одна модифицированная кислота - у-карбоксиглутамат. Нарушение карбоксилирования глутамата в протром- бине - белке свертывающей системы крови - может привести к кровоточивости (разд. 8.23). Из обнаруженных в белках модифи- цированных аминокислот чаще всего встре- чается фосфосерин. Действие ряда гормонов опосредуется процессами фосфорилирова- ния или дефосфорилирования специфичес- ких остатков серина в различных белках (разд. 16.11). Тирозин Триптофан (Туг) (Тгр) Рис. 2.11. Фенилаланин, тирозин и трип- тофан имеют ароматические боковые цепи. Аспартат (Asp) сн2 Глутамат (Glu) '•J f С с И - * V ' : Г i л > ? сн2 1 L сн2 1 L сн2 1 2 1 сн2 сн2 с=сн 1 1 сн2 сн2 1 2 ’HN^/NH сн2 1 z N-- Н н 1 NH.r c=nh2* \н? Лизин Аргинин Гистидин (Lys) (Arg) (His) Рис. 2.12. Лизин, аргинин и гистидин имеют основные боковые це- пи. Рис. 2.13. Аспартат и глутамат имеют кислотные боковые цепи. H.N- С -Н сн2 с V nh2 Аспарагин (Asn) сн2 сн2 А о nh2 Глутамин (Gin) Рис. 2.14. Аспарагин и глутамин имеют амидные боковые цепи. в полипептидную цепь. Так, например в со- став коллагена входит гидроксипролин - ги- дроксилированное производное пролина (рис. 2.16). Как будет показано далее (разд. 9.7), дополнительная гидроксильная группа стабилизирует структуру коллагенового во- локна. Биологическое значение этой моди- фикации аминокислоты становится очевид- Часть I 22 Конформация и динамика сн2 сн2 SH сн2 s сн3 Цистеин Метионин (Cys) (Met) Рис. 2.15. Цистеин и метионин имеют се- русодержащие боковые цепи.
Таблица 2.1. Сокращенные обозначения аминокислот Аминокислота Трехбук- венное сок- ращение Однобук- венное обо- значение Аланин Ala A Аргинин Arg R Аспарагин Asn N Аспарагин или аспараги- новая кислота Asx В Аспарагиновая кислота Asp D Валин Vai V Гистидин His H Глицин Gly G Глутамин Gin Q Глутамин или Glx z глутаминовая кислота Глутаминовая кислота Glu E Изолейцин He I Лейцин Leu L Лизин Lys К Метионин Met M Пролин Pro P Серин Ser s Треонин Thr T Триптофан Trp w Тирозин Tyr Y Фенилаланин Phe F Цистеин Cys C 2.3. Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи В белках ос-карбоксильная группа одной аминокислоты соединена с ос-аминогруппой другой аминокислоты пептидной связью (называемой также амидной связью). На рис. 2.17 показано, как из двух аминокислот образуется дипептид с высвобождением одной молекулы воды. Равновесие этой ре- акции сильно сдвинуто в сторону гидролиза, а не синтеза. Следовательно, биосинтез пеп- тидных связей требует притока свободной энергии, тогда как гидролиз идет с высвобождением энергии. При соединении большого числа (обычно более сотни) аминокислот путем образова- ния пептидных связей формируется полипеп- тидная цепь, имеющая неразветвленную структуру (рис. 2.18). Каждую аминокисло- ту, входящую в состав полипептида, назы- вают аминокислотным остатком. Полипеп- тидная цепь имеет определенное направле- ние, поскольку каждый из ее строительных блоков имеет разные концы-либо ос-ами- но-, либо ос-карбоксильная группа. Услови- лись считать, что полипептидная цепь на- соо H2n----с—Н I I н,с. ,СН, Н ОН С00- I +H3N—С— Н СН2 /СН ООС ХС00 С00“ I +H3N—с—Н сн2 о -0—^—0- Гид рокси прол ин у-Карбокси глутамат О-Фосфосерин Рис. 2.16. Ряд модифицированных ами- нокислотных остатков, содер- жащихся в белках: гидрокси- пролин, у-карбоксиглутамат и фосфосерин. Красным пока- заны группы, которые присое- диняются к аминокислотному остатку после его включения в полипептидную цепь. НО Н п Пептидная связь Рис. 2.17. Образование пептидной связи. чинается с N-конца, т. е. с конца, несущего аминогруппу. При изображении последова- тельности аминокислот в полипептидной цепи начинают с N-концевого остатка. Так, в трипептиде аланин-глицин-триптофан аланин несет концевую аминогруппу, а триптофан-концевую карбоксильную группу. Обратите внимание, что триптофан- глицин-аланин - это уже другой трипептид. Полипептидная цепь состоит из регуляр- но повторяющихся участков, образующих основную цепь, и вариабельной части, вклю- чающей в себя характерные боковые цепи (рис. 2.19). Основную цепь называют иногда скелетом, или остовом, молекулы. В ряде белков отдельные боковые цепи соединены между собой дисульфидными свя- зями (мостиками), которые образуются при окислении остатков цистеина. Возникаю- 2. Основные представления о структуре и функции белков 23
N-концевой остаток С-концевой остаток Рис. 2.18. Пентапептид. Каждый амино- кислотный остаток выделен рамкой. Пептидная цепь на- чинается с аминоконца. N—С—С—N—С—C—N—С—С нй Рис. 2.19. Полипептидная цепь состоит из скелета, имеющего регуляр- ную, повторяющуюся структу- ру, и отдельных боковых цепей (Rls R2, R3; показаны зеленым). щий при этом дисульфид называется цисти- ном (рис. 2.20). Каких-либо других кова- лентных связей в белках обычно не встре- чается. 2.4. Белки состоят из одной или нескольких полипептидных цепей Многие белки, в частности миоглобин, со- стоят из одной полипептидной цени; другие содержат две цепи или более, причем цепи могут быть одинаковыми или разными. Так, молекула гемоглобина построена из 2 цепей одного типа и 2 цепей другого типа; эти четыре цепи связаны между собой некова- лентными связями. В некоторых многоцепо- чечных белках полипептвдные цепи соеди- нены дисульфидными мостиками. В инсули- не, например, две составляющие его цепи соединены двумя дисульфидными связями. 2.5. Для очистки белков можно использовать множество различных методов Для выяснения механизма действия белка его необходимо выделить в очищенном ви- де. В настоящее время в чистом виде получе- но уже несколько тысяч белков. В процессе выделения и очистки белок отделяют от других белков и от небелковых соедине- ний, исходя из таких его свойств, как размер Часть I 24 Конформация и динамика молекулы, растворимость, заряд, специфи- ческое сродство связывания. Обычно при- меняют несколько разных методов очистки и сравнивают их эффективность путем опре- дения интересующего белка по какому-то свойству. Например, ферменты определяют по удельной каталитической активности. При этом измеряют также и общее коли- чество белка, что позволяет установить сте- н н О I I II —N--C—С— сн2 SH SH сн7 I Цистеин Цистин Рис* 2.20. Дисульфидный мостик (—S—S —) образуется из сульфгидрильных групп (— SH) двух остатков цистеина. Про- дуктом реакции является оста- ток цистина. Крупные молекулы не проходят через мембрану Рис. 2.21. Разделение молекул по разме- ру путем диализа.
пень очистки данного белка на каждом этапе выделения. Отделение белков от низкомолекулярных веществ проводят путем диализа через по- лупроницаемую мембрану (рис. 2.21). Бел- ки, молекулярная масса которых превышает 15 килодальтон (кДа) остаются внутри обычного диализного мешочка, тогда как более мелкие молекулы и ионы проходят че- рез поры диализной мембраны и выходят из мешочка в диализат. Дальтон (Да)- единица массы, практически равная массе атома водорода (т. е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» поль- зуются как взаимозаменяемыми; например, белок в 20 000 дальтон имеет моле- кулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона (1766-1844), разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальтон (кДа)- единица массы, равная 1000 дальтон. Масса большинства белков лежит в преде- лах от 10 до 100 кдал. Разделение белков по размеру молекулы проводят также методом гель-фильтрации (рис. 2.22). В этом случае пробу наносят на колонку из нерастворимого, но высокогид- ратированного углеводного полимера, со- стоящего из мелких частиц в виде зерен диа- метром обычно 0,1 мм. Обычно используют имеющийся в продаже сефадекс. Небольшие молекулы проникают внутрь частиц поли- мера, а крупные-нет. В результате низко- молекулярные вещества оказываются в вод- ном растворе как внутри частиц, так и между ними, тогда как высокомолеку- лярные-в водном растворе только между частицами. Вследствие этого высокомолеку- лярные вещества, оказавшись в относитель- но меньшем объеме, быстрее проходят сквозь колонку и первыми снимаются с нее. Разделение белков на основе различий в общем заряде осуществляется методом Крупные молекулы не проникают внутрь частиц полимера Частица углевод- ного полимера Мелкие молекулы растворяются в водной фазе внутри частиц полимера Рис. 2.22. Разделение молекул по разме- ру методом гель-фильтрации. ионообменной хроматографии. Если белок имеет положительный заряд при pH 7, то он обычно связывается на колонке ионообмен- ника, содержащего карбоксильные группы, тогда как отрицательно заряженный белок таким ионообменником не связывается. Та- кой положительно заряженный белок сни- мают с колонки путем добавления в элюи- рующий буфер хлористого натрия или какой-либо другой соли. При этом ионы на- трия конкурируют с положительно заря- женными группами белков за места связы- вания на колонке. Те белки, у которых плотность положительного заряда ниже, вымываются с колонки первыми, за ними следуют белки с более высокой плотностью положительного заряда. Помимо общего заряда на поведение белков при ионообмен- ной хроматографии оказывают влияние и другие факторы. Общий заряд белка опре- деляет также и скорость его миграции в электрическом поле. На этом принципе ос- нован метод электрофореза, который мы подробнее обсудим в одной из следующих глав (разд. 5.3). Здесь же стоит отметить вы- сокую разрешающую способность метода электрофореза. Так, используя двумерный электрофорез, удалось получить более 1000 различных фракций при однократном раз- делении белков такого простого организма, как бактерия E.coli (рис. 2.23). Еще один мощный и универсальный спо- соб очистки белков-хроматография по сродству (аффинная хроматография). В ос- нове метода лежит характерное для многих белков высокое сродство к специфическим химическим группам. В частности, расти- 2. Основные представления о структуре и функции белков 25
Рис. 2.23. Белок, связывающий глюкозу Двумерный электрофорез бел- ков Е. colt Метод позволяет выявить более 1000 различных белков этой бактерии. Разделе- ние происходит на основе раз- личий в изоэлектрической точ- ке белков (электрофорез в горизонтальном направле- нии) и на основе различий в молекулярной массе (верти- кальный электрофорез). (Печа- тается с любезного разреше- ния д-ра Р. Н. O’Farrell.) Добавление глюкозы । Г) тельный белок конканавалин А можно вы- делить из неочищенного экстракта, пропус- кая экстракт через колонку, содержащую ковалентно присоединенную глюкозу. Кон- канавалин А, обладающий сродством к глюкозе, связывается с колонкой, тогда как остальные белки, как правило, на колон- ке не адсорбируются. Далее связанный кон- канавалин А снимают с колонки концентри- рованным раствором глюкозы. При этом в участках связывания глюкозы в молекулах конканавалина А происходит замещение присоединенных к колонке остатков глю- козы на глюкозу, находящуюся в растворе (рис. 2.24). Итак, с помощью хроматогра- фии по сродству можно выделять белки, ко- торые распознают какую-то группу X; для этого: 1) X или ее производное ковалентно присоединяют к колонке; 2) наносят на ко- лонку белковую смесь и затем не связавшие- ся белки удаляют буфером; 3) элюируют ис- комый белок, добавляя X в виде раствора высокой концентрации. Часть I 26 Конформация и динамика Высвободившийся белок Рис. 2.24. Хроматография по сродству (аффинная хроматография) конканавалина А (показан желтым) на колонке, содержа- щей ковалентно присоеди- ненные остатки глюкозы (Г). 2,6, Последовательность аминокислот в бел- ках уникальна и детерминируется генами В 1953 г. Фредерик Сэнгер (Sanger) опреде- лил последовательность аминокислот в бел- ковом гормоне - инсулине (рис. 2.25). Эта работа представляет собой веху в развитии биохимии, ибо в ней впервые было показано, что белок имеет строго определенную после- довательность аминокислот. Кроме того, это достижение послужило стимулом для других исследователей подвергнуть анало- гичному анализу большое множество бел- ков. И действительно, к настоящему време- ни установлена полная последовательность аминокислот у нескольких сотен белков. Самое поразительное, что каждый белок имеет уникальную, точно определенную по- следовательность аминокислот. В серии остроумных работ, проведенных в конце
Цепь A S -S Gly-Ue-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-VabCys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu«Asn-Tyr-Cys-Asn 5 ! 10 15 21 Цепь В S S Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala 5 10 1Ь 20 25 30 Рис. 2.25. Последовательность амино- кислот в инсулине крупного рогатого скота. 50-х-начале 60-х годов было обнаружено, что последовательность аминокислот в бел- ках детерминирована генетически. Последо- вательность нуклеотидов в ДНК-веществе наследственности - определяет комплемен- тарную последовательность нуклеотидов в РНК, а последняя в свою очередь опреде- ляет последовательность аминокислот в белке (гл. 25). Более того, синтез всех бел- ков из соответствующих аминокислот имеет единый механизм. Определение последовательности амино- кислот в белках представляет интерес по четырем причинам. Во-первых, такие данные имеют большое значение для выяс- нения молекулярной основы биологической активности белка. Сведения о последова- тельности аминокислот приобретают осо- бую ценность при их сопоставлении с други- ми химическими и физическими характерис- тиками. Во-вторых, изучение последова- тельности аминокислот в сочетании с детальным анализом пространственной структуры необходимо для выяснения тех принципов, на основе которых из полипеп- тидных цепей формируются высокоспеци- фичные трехмерные формы. При этом по- следовательность аминокислот в белке служит связующим звеном между генетиче- ской информацией, заложенной в ДИК, и трехмерной структурой белка, лежащей в основе его биологической активности. В-третьих, изменения в последовательности аминокислот могут привести к нарушению нормальной функции белка, а следователь- но, и к соответствующей болезни. В частнос- ти, такая тяжелая болезнь, как серповидно- клеточная анемия, нередко приводящая к летальному исходу, возникает в результа- те замены всею лишь одной-единствснной аминокислоты в одпом-единственном бел- ке. Таким образом, определение последова- тельности аминокислот относится к новой области медицины-молекулярной патоло- гии. В-четвертых, данные о последователь- ности аминокислот в белке могут многое рассказать о его эволюции. Дело в том, что в неродственных белках эти последователь- ности совершенно различны. Белки лишь в том случае имеют сходную последова- тельность аминокислот, если они происхо- дят от общего белка-предшественника. Сле- довательно, изучение последовательностей аминокислот в белках позволяет просле- дить эволюцию на молекулярном уровне. Белки - называют также протеинами. Последний термин, введенный Барцелиусом в 1838 г.1, подчеркивает важное значение этого класса веществ. Термин образован от греческою слова proteios, что означает «первостепенный». 2.7. Экспериментальные методы определения последовательности аминокислот Рассмотрим сначала, как можно определить последовательность аминокислот в корот- ком пептиде. Допустим, что пептид состоит из 6 аминокислотных остатков, располо- женных в следующей последовательности: Ala-Cly-Asp-Phe-Arg-Gly. 1 Термин «протеин» введен Муллером (Lieben F. Geschichte der Physiologischen Chemie, Leipzig und Wien, I. Deutike, 1935, s. 359)-Прим. ped. (Для обозначения аминокислот использо- ваны общепринятые сокращения, приве- денные в табл. 2.1, стр. 23.) Прежде всего необходимо определить аминокислотный состав пептида. Для этого его гидролизуют до составляющих аминокислот нагрева- нием до 110 С в течение 24 ч в 6 н. НС1. Да- лее аминокислоты полученного гидролиза- та разделяют методом ионообменной хро- 2. Основные представления о структуре и функции белков 27
матографии на колонке с сульфониро- ванным полистиролом. Фракциониро- ванные аминокислоты определяют по окраске, образующейся при нагревании с нингидрином: а-аминокислоты дают с с его помощью можно определить даже один микрограмм аминокислоты, т. е. при- мерно столько, сколько содержится в од- ном отпечатке пальца. Количество амино- кислоты пропорционально оптической нингидрином интенсивное синее окрашива- ние, а иминокислоты, например пролин,- желтое. Метод ионообменной хроматогра- фии обладает высокой чувствительностью: плотности раствора после нагревания с нингидрином. Если требуется определить еще меньшие количества аминокислоты - Рис. 2.26. Аминокислоты, содержащиеся в гидролизате белка, разде- ляют методом ионообменной хроматографии на сульфони- рованном полистироле(напри- мер, дауэкс-50). Для элюции аминокислот с колонки ис- пользуют буферы с возрастаю- щим значением pH. Первым снимается с колонки аспартат, имеющий кислотную боковую цепь; аргинин с основной бо- ковой цепью элюируется по- следним. По оси ординат отло- жено поглощение. Часть I Конформация и динамика порядка нескольких нанограммов, то ис- пользуют флуорескамин, который реаги- рует с а-аминогруппой, образуя сильно флуоресцирующее соединение. О природе аминокислоты судят по объему элюции, т. е. по объему буфера, использованному для вы- мывания данной аминокислоты с колонии (рис. 2.26). Сравнение результатов хромато- графии гидролизата со стандартной смесью аминокислот свидетельствует о том, что исследуемый пептид имеет следующий аминокислотный состав: (Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe). Скобки показывают,что речь идет о составе, а не последовательности аминокислот в пептиде. 28
Мечение НО Q I h // H2N—С—С—Gly—Asp—Phe—Arg—Gly—C О О UH : | Мечение H О о с—С—Gly—Asp—Phe—Arg—Gly—C CH, 0 no2 Гидролиз Gly Asp Gly Phe Arg Рис. 2.27. Определение N-концевого ос- татка пептида. Пептид метят фтординитробензолом (реак- тив Сэнгера) и затем гидроли- зуют. ДНФ-производное ами- нокислоты (в приведенном примере ДНФ-аланин) иденти- фицируют по хроматографиче- ским характеристикам. Для определения в белке или пептиде кон- цевого остатка, несущего аминогруппу, его метят с помощью соединения, образующего стабильную ковалентную связь с азотом Дансилхлорид аминогруппы (рис. 2.27). Впервые для этой цели Сэнгер использовал фтординитробен- зол (ФДНБ), реагирующий с незаряженной oc-NH2-группой с образованием динитрофе- нильного (ДНФ) производного пептида желтого цвета. Связь между ДНФ и конце- вой аминогруппой стабильна в условиях, ис- пользуемых для гидролиза пептидных свя- зей. Поэтому при гидролизе ДНФ-произ- водного пептида Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly в 6 н. НС1 высвобождается ДНФ-аминокис- лота, которую можно идентифицировать хроматографически как ДНФ-аланин. Для идентификации N-концевых амино- кислот в настоящее время часто исполь- зуют дансилхлорид, который при взаимо- действии с аминогруппой дает ста- бильное, интенсивно флуоресцирующее сульфамидное производное. Этот метод по- зволяет выявить N-концевую аминокислоту (после кислотного гидролиза пептидных 2. Основные представления о структуре и функции белков 29
связей), присутствующую в таком незначи- тельном количестве, как несколько нано- граммов. При всех достоинствах методов определе- ния N-концевых аминокислотных остатков с помощью ДНФ или дансилхлорида их, к сожалению, нельзя использовать дважды применительно к одному и тому же пептиду, поскольку последний полностью распадает- ся при кислотном гидролизе. Перу Эдману (Р. Edman) удалось разработать метод мар- кирования N-концевого остатка и отщепле- ния его от пептида без сопутствующего расщепления остальных пептидных связей. Деградация по Эдману (реакция Эдмана) состоит в ступенчатом (по одному) отще- плении аминокислотных остатков с амино- конца пептида (рис, 2.28). Фенилизотиоциа- нат реагирует с незаряженной концевой Q N=C=S Фенилиэотиоционат аминогруппой пептида с образованием фе- нил! иокарбамоильного производного. Да- лее в слабокислой среде происходит отще- пление циклического производного N-кон- цевой аминокислоты, а оставшийся неразру- шенным пептид оказывается укороченным на один аминокислотный остаток, Указан- ное циклическое производное представляет собой фенилтиогидантоин-аминокислоту (ФТГ-аминокислоту). Его идентифицируют методом хроматографии. Далее аминокис- лотный состав укороченного пептида (Arg, Asp, Gly2, Phe) сравнивают с исходным: (Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe). Оказывается, что различие состоит в одном остатке аланина. Следовательно, в исход- ном пептиде аланин занимает N-концевое положение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить на укороченном пептиде. Исходя из аминокислотного состава после второй ступени деградации (Arg, Asp, Gly, Phe) можно прийти к выводу, что вторым остат- Часть I 30 Конформация и динамика ком с N-конца является глицин. Это заклю- чение подтверждают путем хроматографи- ческой идентификации ФТГ-глицина, полу- ченного на второй ступени деградации пептида. Еще три ступени деградации по Эдману позволяют полностью раскрыть по- следовательность аминокислот во взятом пептиде. Стратегию анализа последовательности аминокислот в белках можно определить как «разделяй и властвуй». Белок подвер- гают специфическому расщеплению на более короткие пептиды, последовательность ами- нокислот в которых определяют по Эдману, Специфическое расщепление можно про- изводить химическими или фермента- тивным методами. Так, Б. Уиткоп (В. Witkop) и Э. Гросс (Е. Gross) обнаружи- ли, что бромистый циан (CNBr) расщепляет полипептидную цепь только по пептидной связи, образованной карбоксильной груп- пой остатка метионина (рис, 2.29). Если в белке содержится 10 метиониновых остат- ков, то после обработки бромистым цианом обычно получается 11 пептидов. Высокоспе- цифическое расщепление достигается также с помощью трипсина-протеолитического фермента поджелудочной железы. Трипсин расщепляет полипептидные цепи по пептид- ной связи, образованной карбоксильной группой остатков аргинина и лизина (рис. 2.30). В результате белок, содержащий 9 остатков лизина и 7 остатков аргинина, после расщепления трипсином распадается на 17 пептидов. Каждый из этих пептидов, кроме пептида, расположенного на карбок- сильном конце белка, будет кончаться арги- нином или лизином. Ряд других способов специфического расщепления полипен- тидных цепей приведен в табл. 2.2. Пептиды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеп- лении белка, разделяют методами хромато- графии. Далее последовательность амино- кислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, дости- гается этап, когда последовательность ами- нокислот в отдельных пептидах (фрагмен- тах белка) известна, но остается невыяснен- ной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помощью так называемых перекрывающихся пептидов (рис. 2.31). При этом используют уже не трипсин, а какой-либо фермент, расщепляю- щий полипептидную цепь в других участках, например химотрипсин, который расще- пляет пептидные связи главным образом по
ДЕГРАДАЦИЯ ПО ЭДМАНУ Мечение Ф >- Второй цикл Отщепление Фенилизотиоцианат ФТГ-аланин —Gly^Asp—Phe—Arg—Gly— С о j Мечение —Gly- Asp—Phe—Arg—Gly—C | Отщепление H2N—Gly—Asp—Phe—Arg—Gly- Пептид, укороченный О на один остаток Рис. 2.28. Деградация по Эдману. От пептидной цепи отщепляют меченый N-концевой остаток аминокислоты (ФТГ-аланин на первой ступени деградации). Остаток пептидной цепи при этом не гидролизуется. На вто- рой ступени деградации опре- деляют следующий N-конце- вой аминокислотный остаток. Еще три ступени деградации по Эдману позволят устано- вить всю последовательность аминокислот во взятом пепти- де. 2. Основные представления о структуре и функции белков 31
но но но I II I II , +CNBr —N—С—С—N—С—C--N-C—С-------- »— 1111 HR. Н CH, Н R- I сн2 S СН3 Метионин Рис. 2.29. Бромистый циан расщепляет полипептиды по карбоксиль- ной группе метиониловых остатков. карбоксильным группам ароматических и других больших неполярных аминокис- лотных остатков. Пептиды, образующиеся под действием химотрипсина, неизбежно перекрывают два или более триптических пептида, что используется для установления их последовательности. Таким путем пол- ностью определяют последовательность аминокислот в белке. Описанные методы применимы к белкам, состоящим из одной полипептидной цепи, не имеющей дисульфидных связей. В тех же случаях, когда в белке имеются дисуль- фидные связи или более одной полипептид- ной цепи, то необходимы дополнительные методические приемы. Например, если бе- лок содержит две или более полипептидные цепи, соединенные нековалентными связя- ми, то, воздействуя денатурирующими аген- тами, такими, как мочевина или гуанидинги- дрохлорид, вызывают диссоциацию цепей. Диссоциированные цепи разделяют и толь- ко после этого приступают к определению последовательности аминокислот в каждой из них. Если же полипептидные цепи соеди- нены ковалентными дисульфидными связя- ми, как это имеет место в инсулине, то их окисляют надмуравьиной кислотой; при этом дисульфидные связи разрываются и образуются остатки цистеиновой кислоты (рис. 2.32). Анализ структуры белков удалось значи- тельно ускорить путем создания секвенато- ра-специального прибора для автоматичес- кого определения последовательности ами- нокислот. При таком определении белок в виде тонкой пленки помещают во вра- щающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается деградации по Эдману. Реак- Часть I 32 Конформация и динамика НО н н о ! ii H3N—0-0 Лактон гомосерина Таблица 2.2. Специфическое расщепление полипептидов Реактив Химическое расщепле- ние Бромистый циан Гидроксиламин 2-Нитро-5-тиоциано- бензоат Ферментативное рас- щепление Трипсин Клострипаин Стафилококковая протеиназа Место расщепления пеп- тидных связей, образован- ных: Карбоксильной группой остатков метионина Связь аспарагин—глицин Аминогруппой цистеиновых остатков Карбоксильной группой остатков лизина и аргинина Карбоксильной группой остатков аргинина Карбоксильной группой остатков аспарагиновой и глутамино- вой кислот (глутаминовой кислотой - только в опреде- ленных условиях) тивы и растворители проходят над иммоби- лизованной белковой пленкой, а высвобо- ждающиеся ФТГ-аминокислоты подвер- гаются жидкостной хроматографии при высоком давлении и таким образом иденти- фицируются. Один цикл деградации по Эд- ману занимает при этом менее двух часов. С помощью секвенатора можно определить аминокислотную последовательность поли- пептида или белка, содержащего до ста ами- нокислотных остатков. 2,8. Конформация полнпептндных цепей Поразительная особенность белков состоит в том, что каждый из них имеет четко опре- деленную трехмерную структуру, Как пока- зано ниже, будучи развернутыми или уло- женными случайным образом, полипеп- тидные цепи лишены биологической актив- ности. Функциональные свойства белков определяются их конформацией, т.е. про- странственным расположением атомов.
+ Н20 Трипсин Н О H3N-C-C~ R3 Лизин или аргинин Лизин или аргинин Рис. 2.30. Трипсин гидролизует полипеп- тиды по карбоксильной группе остатков лизина и аргинина* Триптические пептиды Химотриптический пептид Ala—Ala—Trp—Gly—Lys Vai Lys—Ala—A!a—Trp Thr—Asn—Vai—Lys Триптический пептид Триптический пептид Thr—Asn— Vai—Lys—Ala—Ala—Trp—Gly—Lys Перекрывающий химотриптический пептид Рис. 2.3 L Пептид, образующийся при химотриптическом расщепле- нии, перекрывает два трипти- ческих пептида; благодаря это- му можно установить после- довательность расположения пептидов* Цистин Н—N N—Н I I Н—С—СН2— S—S—сн2—с—н с=о о=с о II И—с-о-о-н Н—N Н— с—сн2—SO,’ I с=о Надмуравьиная кислота -o,s— сн2—с—н 3 2 I О—с Цистеиновая кислота Рис. 2.32. Дисульфиды расщепляются надмуравьиной кислотой. Важную роль при этом играет последова- тельность аминокислот, так как в конечном счете именно она определяет конформацию белка* В конце 30-х годов Л. Полинг (L. Pauling) и Р. Кори (R. Corey) начали проводить рент- ген оструктурные исследования аминокис- лот и петидов. Они определяли стандартные длины и углы связей, с тем чтобы исходя из этих данных предсказать конформацию бел- ков. Был обнаружен важный факт; пептид- ная единица обладает жесткой планарной (плоской) структурой. Водород в замещен- ной аминогруппе почти всегда занимает транс-положение по отношению к кислоро- ду карбонильной группы (рис. 2.33). Связь между атомом углерода карбонильной группы и атомом азота пептидной единицы имеет частично характер двойной связи, и, следовательно, вращение вокруг этой (рис* 2*34) связи должно быть заторможено. Длина связи составляет 1,32 А-среднее зна- чение между длинами одинарной связи С—N (1,49 А) и двойной связи C=N (1,27 А). Пептидная группа кую планарную структуру. По- казаны длины связей (в А). 2. Основные представления о структуре и функции белков 33 3-665
Ангстрем (А)- единица длины, равная 10“1Ом. 1 А = 10“10 м = 10“8 см = 10"4 мкм = = 10“1 нм. Названо в честь ученого-спектроскописта А. Ангстрема (1814-1874). В отличие от рассмотренного случая связь между а-углеродным атомом и углеродным атомом карбонильной группы истинно оди- нарная. Следовательно, по обеим сторонам жесткой пептидной единицы вокруг этих О О’ II I + C-N— <---------> — C = N- н н Рис. 234. Планарность пептидной груп- пы обусловлена тем, что связь азот-углерод носит частично характер двойной связи. Жесткая Жесткая структура структура Рис. 235. В области свзей между пеп- тидными группами и а-угле- родными атомами имеется до- вольно высокая степень сво= боды вращения. связей имеется высокая степень свободы вращения (рис. 2.35). Вращения относитель- но этих связей описываются углами ф и ф (рис. 2.36). Для полного описания конформации ос- новной цепи полипептида необходимо знать фиф для каждого аминокислотного остат- ка. 2.9. Периодичные структуры: альфа-спираль, бета-складчатый слой, спираль коллагена Может ли полипептидная цепь быть уложе- на в структуру, состоящую из регулярно по- вторяющихся участков? Чтобы ответить на этот вопрос, Полинг и Кори сравнили ряд потенциально возможных конформаций по- липептидов, построив их точные молеку- лярные модели. При этом строго соблюда- лись экспериментально установленные для аминокислот и небольших пептидов вели- чины углов связей и межатомных рассюя ний. В 1951 г. они предложили две периоди- ческие полипептидные структуры, на- званные соответственно а-спираль и р- складчатый слой. ^-Спираль имеет вид стержня, Туго закру- ченная основная цепь полипептида создает внутреннюю часть стержня, а боковые цепи направлены наружу от основной цепи, рас- Рис. 236. Определение углов фиф: ф характеризует вращение от- носительно одинарной связи Са —С; ф характеризует вра- щение относительно одинар- ной связи Са—N. (Levinthal С. Molecular model building by computer, Scientific American, Inc., 1966.). Часть I Конформация и динамика 34
Рис. 2.37. Модель правозакрученной ос- спирали. А. На спирали пока- заны только ot-углеродные атомы. Б. Показаны только атомы азота (N), образующие скелет молекулы, атомы ос- углерода (Ся) и карбонильного углерода (С). В. Полное изо- бражение спирали. Водо- родные связи (на рис. В обо- значены красными точками) между NH- и СО-группами стабилизируют спираль. полагаясь по спирали (рис. 2.37 и 2.38). а-Спираль стабилизирована водородными связями между NH- и СО-группами основ- ной цепи. СО-группа каждой аминокислоты соединяется водородной связью с NH-груп- пой аминокислоты, расположенной в линей- ной последовательности на 4 остатка впере- ди (рис. 2.39). Таким образом, все СО- и NH-группы основной цепи связаны между собой водородными связями. В проекции на ось спирали один остаток отстоит от друго- го на 1,5 А, а угол между ними составляет 100°, т.е. на полный виток спирали прихо- дится 3,6 аминокислотных остатка. Таким образом, аминокислоты, отстоящие друг от друга на 3-4 остатка в линейной последова- тельности, в структуре а-спирали простран- ственно расположены очень близко друг к другу. Напротив, аминокислоты, разде- ленные в линейной последовательности дву- мя остатками, пространственно распола- гаются на противоположных сторонах спи- рали и поэтому взаимодействие между ними маловероятно. Шаг ot-спирали состав- 2. Основные представления о структуре и функции белков 35 3*
Рис. 2.38. ot-Спираль в поперечном раз- резе. Обратите внимание, что боковые цепи (показаны зе- леным) находятся снаружи спирали. Вандерваальсовы ра- диусы атомов на самом деле больше, чем изображено на ри- сунке ; вследствие этого внутри спирали почти нет свободного пространства. ляет 5,4 А3 расстояние между остатками (по оси)-1,5 А и число остатков на один обо- рот-3,6. Спираль может закручиваться по часовой стрелке (правая спираль) или про- тив часовой стрелки (левая спираль); все ис- следованные ос-спирали белков относятся к правому типу. Содержание ос-спиралей в белках, из- ученных к настоящему времени, крайне ва- риабельно. В некоторых белках, например миоглобине и гемоглобине, ос-спираль ле- жит в основе структуры. Другие белки, на- пример пищеварительный фермент химо- трипсин, практически лишены а-спиральной структуры. Одинарная ос-спираль, о которой речь шла выше, как правило, довольно ко- ротка, обычно менее 40 А в длину. Варианты ос-спиралей используются при образовании длинных тяжей, достигающих 1000 А и бо- лее в длину. Две или более ос-спирали могут закручиваться одна вокруг другой, как тяжи в канате. Такая структура-&-спирализован- ная суперспираль- обнаружена во многих белках: в кератине волос, миозине и тропо- миозине мышц, эпидермисе кожи и фибри- не, в сгустках крови. Спирализованные «ка- наты» этих белков выполняют механиче- скую роль, образуя плотные пучки волокон. «Если принять, что фибриллярные белки эпидермиса, белки кератинизированных тканей, основной белок мышц миозин, а теперь и фибриноген крови-все имеют в основе одну и ту же особую форму молекулярной структуры и потому, вероятно, представляют собой адап- тационные варианты одного исходного принципа, то здесь мы, видимо, столкнулись с од- ним из великих фактов эволюции биологических молекул». К. Bailey, W.T. Astbury, К.М. Rudall, Nature, 1943 Структура ос-спирали была предсказана Полингом и Кори за 6 лет до того, как ее удалось экспериментально выявить мето- дом рентгеноструктурного анализа мио- глобина. Открытие структуры а-спирали представляет собой важную веху в развитии молекулярной биологии, поскольку это от- крытие доказало, что можно предсказать конформацию полипептидной цепи, если точ- но известны свойства ее компонентов. В тот же год Полинг и Кори открыли дру- гой вариант периодической структуры, ко- торый они назвали р-складчатым слоем (р потому, что это была вторая-после ос-спи- н нно н нно н I I I II I I I II I —N—С--С— N—с- С—N—с—С—N—с—с—N—С—С— н I II I I I II I I I II О R2 Н R5 О R4 Н Rs О t____________________) Рис. 2.39. В ос-спирали NH-группа м-го остатка связана водородной связью с СО-группой остатка (и - 4). Часть I 36 Конформация и динамика рали - открытая ими структура). р-Склпд- чатый слой существенно отличается от ос- спирали тем, что он имеет плоскую, а не стержневидную форму. Полипептидные це- пи в р-складках почти полностью вытянуты (рис. 2.40), а не туго скручены, как в ос-спира- ли. Расстояние по оси между двумя приле-
Рис. 2.40. Конформация дипептидной в противоположном направлении осущест- единицы в складчатом р-слос. Полипептидная цепь при этом практически полностью вытя- нута. вляется благодаря наличию одного и того же структурного элемента, называемого р- изгибом. Этот изгиб, имеющий вид шпильки для волос, образуется в результате того, что СО-группа остатка п в полипептидной цепи жащими^ аминокислотами составляет 3,5, а не 1,5 А, как в а-спирали. Другая особен- ность р-складчатой структуры состоит в том, что она стабилизирована водородны- ми связями между NH- и СО-группами раз- ных тяжей полип ептидных цепей, тогда как в сх-спирали водородные связи образуются между этими группами в пределах одной и той же полипептидной цепи. Прилежащие цепи в складчатом P-слое могут идти в одном и том же направлении (парал- лельный P-слой) или в противоположных на- правлениях (антипараллелъный p-слой). На- пример, фиброин шелка состоит почти целиком из «штабелей» антипараллельных Р-складчагььх слоев (рис. 2.41). Аналогичные области р-складчатых слоев встречаются во многих других белках. Особенно широко распространены структурные единицы, со- стоящие из 2-5 параллельных или антипа- раллельных Р-склад ок. Третий тип периодической структуры = коллагеновая спираль-буд$т подробно рас- сматриваться в гл. 9. Эта специализирован- ная структура обеспечивает высокую упру- гость коллагена-основного компонента ко- жи, костей и сухожилий. 2.10. Полипептидная цепь может поворачи- ваться на 180° благодаря образованию р-изгибов Большинство белков имеют компактную шарообразную (глобулярную) форму, обус- ловленную тем, что их полипептцдные цепи делают много изгибов, меняющих напра- вление цепи на 180°. Исследования трехмер- ной структуры многочисленных белков по- казали. что во многих случаях поворот цепи присоединяется водородными . связями к NH-группе остатка (и 4- 3) (рис. 2.42). В ре- зультате направление полипептидной цепи меняется на противоположное. 2.11. Структурные уровни в архитектуре белков Принято различать четыре структурных уровня в архитектуре белковой молекулы. Первичная структура -это просто последо- вательность аминокислот в белке и локали- зация дисульфидных мостиков, если та- ковые имеются. Таким образом, первичная структура представляет собой полное опи- сание ковалентных связей в белке. Вторич- ная структура образуется в результате сте- рического взаимодействия аминокислотных остатков, расположенных вблизи друг друга в линейной последовательности. Некоторые из этих стерических взаимодействий носят регулярный характер, обусловливая тем самым периодичность структуры. Примера- ми вторичной структуры могут служить ос- спираль, складчатый P-слой и коллагеновая спираль. Третичная структура обусловлена стерическим взаимодействием аминокис- лотных остатков, далеко отстоящих друг от друга в линейной последовательности. Сле- дует отметить, что различие между вторич- ной и третичной структурами довольно ус- ловно. Белки, содержащие несколько поли- пептидных цепей, обладают еще одним уровнем структурной организации, а имен- но четвертичной структурой. Под четвер- тичной структурой подразумевают способ 2. Основные представления о структуре и функции белков 37
Рис. 2.41, Антипараллельный р-склад чатый слой, Прилежащие тяжи полипептидной цепи идут в противоположных направле- ниях. Структура стабилизиро- вана водородными связями между NH- и СО-группами прилежащих тяжей. Боковые цепи (показаны зеленым) ле- жат выше и ниже плоскости слоя. укладки цепей относительно друг друга. Каждая полипептидная цепь в таком белке носит название субъединицы. Часто исполь- зуют также термин домен, которым обозна- чают компактную глобулярную единицу белковой структуры. Многие белки состоят из нескольких доменов с массой от 10 до 20 кДа. В белках большой молекулярной массы отдельные домены соединяются ме- жду собой относительно гибкими участками полипептидной цепи. Рис. 2,42. 2Л 2. Последовательность аминокислот опре- деляет трехмерную структуру Взаимосвязь между последовательностью аминокислот в белке и его конформацией была обнаружена Кристианом Анфинсеном (С. Anfmsen) при изучении рибонуклеазы = фермента, расщепляющего РНК, Рибону- клеаза образована одной полипептидной цепью, состоящей из 124 аминокислотных остатков (рис. 2.43). Она содержит четыре дисульфидных мостика, которые можно не- обратимо окислить н адм у рае ъи ной кисло- той с образованием остатков цистеиновой Структура p-изгиба, СО-груп- па остатка 1 изображенного здесь тетрапептида присоеди- няется водородными связями к NH-группе остатка 4; в ре- зультате образуется такой же изгиб, как в шпильке. II н—с^о—он Надмуравьиная кислота кислоты (см. рис. 2.32). Можно также вы- звать обратимое расщепление этих дисуль- фидных связей путем восстановления их та- ким реактивом, как fi-меркаптоэтанол; при Часть I 38 Конформация и динамика
10 50 Рис, 2,43. Последовательность амино- кислот в рибонуклеазе крупно- го рогатого скота. Цветом вы- делены четыре дисульфидные связи* [D* Smyth, W, Н. Stein, Moore S., J. Biol. Chem., 238, 277 (1963)*] этом образуются смешанные дисульфиды НО—СН2-СН2—SH Р-меркаптоэтанол p-меркаптоэтанола с боковыми цепями ци- стеина (рис. 2.44), В присутствии большого избытка p-меркаптоэтанола смешанные ди- сульфиды тоже восстанавливаются, и в ре- зультате образуется белок, в котором все дисульфидные группы (остатки цистина) полностью превращены в сульфгидрильные (остатки цистеина). Оказалось, однако, что при 37° С и pH 7 реакция восстановления ри- бонуклеазы Р-меркаптоэтанолом протекает О II h2n—с—nh2 Мочевина nh2+ сг II 2 h2n— с—nh2 Гуанидингидрохлорид лишь в том случае, если предварительно на- рушают компактную структуру белка, ча- стично развертывая его путем обработки денатурирующими агентами (мочевиной или гуанидингидрохлоридом). Хотя меха- низм действия этих денатурирующих аген- тов до конца не выяснен, все же очевидно, что они разрывают нековалентные связи* Полипептидные цепи, лишенные этих свя- зей, в 8 М растворе мочевины или в 6 М рас- творе гуанидин гидрохлорида свертываются случайным образом, т. е. образуют слу- чайный клубок, о чем судят по таким физи- ческим параметрам, как вязкость и спектры оптического вращения. Если рибонуклеазу обработать Р-меркаптоэтанолом в 8 М рас- творе мочевины, то продуктом реакции бу- дет полностью восстановленная, случайным образом свернутая полипептидная цепь, ли- шенная ферментативной активности. Дру- гими словами, эта обработка вызывает де- натурацию рибонуклеазы (рис. 2.45). Анфинсен сделал очень важное наблюде- ние: если денатурированную рибонуклеазу очистить путем диализа от мочевины и р- меркаптоэтанола, то ферментативная ак- тивность белка постепенно воссталавли- 2, Основные представления о структуре и функции белков 39
Окисленный белок Смешенный дисульфид Восстановленный белок Рис. 2.44. Восстановление дисульфидных связей в белках избытком сульфгидрильного соединения типа р-меркаптоэтанола. вается. Анфинсен понял, как велико значе- ние этого случайного наблюдения, и тут же дал ему объяснение: сульфгидрильные группы денатурированного фермента окис- ляются воздухом, и фермент вновь спонтан- но принимает каталитически активную фор- му. Дальнейшие детальные исследования показали, что путем окисления в соответ- ствующих условиях всех сульфгидрильных групп можно практически полностью вос- становить исходную ферментативную ак- тивность (рис. 2.46). Все исследованные фи- зические и химические свойства такого ренатурированного фермента были практи- чески идентичны свойствам нативного фер- мента. Эти опыты показали, что вся инфор нация, определяющая специфическую про- странствен чую структуру рибонуклеаз ы, заключена в последовательности аминокис- лот. Последующие работы на других белках выявили универсальность этого централь- ного в молекулярной биологии принципа: последовательность определяет конформа- цию. Совершенно другие результаты полу- чаются, если восстановленную (денатуриро- ванную) рибонуклеазу подвергнуть окисле- Нативная рибонуклеаза Рис. 2.45* Восстановление и денатурация рибонуклеазы. Часть I 40 Конформация и динамика нию в 8 М растворе мочевины и лишь после этого удалить мочевину путем диализа. Ферментативная активность такого препа- рата рибонуклеазы составляет только 1% активности нативного белка. Почему при окислении денатурированной рибонуклеазы в отсутствие мочевины ферментативная ак- тивность восстанавливается, а в присут- ствии мочевины - практически нет? Ответ заключается в следующем: когда окисле- нию подвергается случайным образом свер- нутая молекула восстановленного белка, образуются ошибочные дисульфидные пары, т.е. связанными дисульфидными мо- стиками оказываются пары аминокислот, иные, чем в нативном белке. Возможны 105 различных способов связывания восьми ци- стеинов с образованием 4 дисульфидов; только одна из этих комбинаций обладает ферментативной активностью. Остальные 104 комбинации были образно названы «разболтанной» (scrambled) рибонуклеазой. Впоследствии Анфинсен обнаружил, что «разболтанная» рибонуклеаза спонтанно превращается в полностью активную, на- тивную, форму, если в раствор вновь окис- ляемого ферментного белка добавить сле- довые количества р-меркаптоэтанола (рис. 2.47). Добавленный р-меркаптоэтанол катализирует перераспределение дисуль- фидных мостиков, которое в конечном ито- ге приводит к формированию нативной 8 М Мочевина и р -меркаптоэтанол Денатурированная восстановленная рибонуклеаза структуры, что занимает примерно 10 ч. Весь процесс целиком идет за счет снижения свободной энергии системы по мере того, как «разболтанные» конформации превра- щаются в стабильную нативную конформа-
Денатурированная восстановленная рибонуклеаза ----------> Диализ для удаления мочевины и ^-меркапто- этанола Окисление воздухом сульфгидрильных групп вос- становленной рибонуклеазы 1 Нативная рибонуклеаза Рис. 2,46* Ренатурация рибонуклеазы* цию фермента- Таким образом, нативная форма рибонуклеазы является, по-видимому, термодинамически наиболее стабильной структурой. Анфинсен (1964) писал: «Меня поразило, что на самом деле после- довательность аминокислот в молекуле белка, который должен принять точно определенную геометрическую форму, следует рассматривать как мелодию, на- писанную в канонической форме; по пред- писанию Природы эта мелодия, наклады- ваясь сама на себя, должна создать такие гармонические созвучия, которые со- ответствуют биологической функции. Продолжая аналогию дальше, можно предположить, что белки с «разболтанны- ми» дисульфидными мостиками, о ко- торых я говорил выше, дают диссо- нантные созвучия, однако если возникает возможность перестройки при добавле- нии меркаптоэтанола, то путем постепен- ной модуляции вновь достигается та при- ятная гармония, которая свойственна нативному белку. Можно ли на этом ос- новании считать, что музыка Моцарта обладает большей термодинамической устойчивостью, чем музыка Шёнберга, я предоставляю решить философам этой аудитории». 2.13. Формирование свернутой молекулы бел- ков происходит путем ассоциации ос-спиралей и складчатых |3-слоев Как возникает гармония при превращении развернутой полипептидной цепи в сверну- тую молекулу белка? A priori одна из воз- можностей состоит в том, что происходит перебор всех возможных конформаций и выбирается энергетически наиболее вы- годная форма. Сколько времени займет та- кой случайный поиск стабильной струк- туры? Рассмотрим для примера небольшой белок из 100 аминокислотных остатков. Если каждый остаток может принять 3 разные конформации, то общее число воз- можных структур составит З100, или 5 -1047. Если превращение одной структуры в дру- гую происходит за 10“13 с, то общее время поиска оптимальной конформации составит 5 • 1047 • 10“13 с, т.е. 5-1034 с, или 1,6 1027 лет! Отметьте, что это время минимально, поскольку истинное число возможных кон- формаций в расчете на один остаток амино- кислоты выше трех, а время, необходимое для перехода одной конформации в другую, Следовые количества Д-меркаптоэтанола «Разболтанная» рибонуклеаза Рис. 2,47. Образование нативной рибо- нуклеазы из «разболтанной» в присутствии следовых коли- честв р-меркаптоэтанола. Нативная рибонуклеаза 2. Основные представления о структуре и функции белков 41
Временно образующиеся а-спирали Стабилизированные а-спирали (аа -единицы скручивания) Рис. 2.48. Предполагаемые этапы скру- чивания белков. Два участка в развернутой полипептидной цепи на какой-то момент при- нимают структуру а-спирали. Далее происходит стабилиза- ция обеих спиралей благодаря образованию комплекса ме- жду этими участками. играют небольшие участки вторичной структуры. Согласно предложенной моде- ли, короткие отрезки (~ 15 аминокислотных остатков) развернутой полипептидной цепи образуют короткоживущие структуры: а- спирали или P-слои. Эти промежуточные структуры сближаются в результате диффу- зии и стабилизируют друг друга путем фор- мирования комплексов (рис. 2.48). Допу- стим, что произошло сближение двух а-спиралей, или двух P-слоев, или а-спирали и 0-слоя. Образовавшиеся комплексы аа, рр или ар, которые называют единицами скру- чивания, играют далее роль центров, стаби- лизирующих другие выступающие эле- менты вторичной структуры. Эта модель имеет ряд экспериментальных доказа- тельств. Прежде всего, способность поли- пептида к образованию правильной вторич- ной структуры в значительной степени зависит от аминокислотного состава. Так, остатки глутамата, метионина, аланина и лейцина способствуют образованию а- спиралей, тогда как остатки валина, изо- лейцина и тирозина усиливают образование P-слоев. Во-вторых, переход от случайного клубка к а-спирали происходит менее чем за одну микросекунду. Следовательно, корот- кие участки вторичной структуры могут формироваться очень быстро. В-третьих, постулированные единицы скручивания (комплексы аа, РР и ар) представляют собой по существу основные элементы структуры белка. Задача в настоящее время состоит в том, чтобы непосредственно выявить и идентифицировать короткоживущие про- межуточные структуры, образующиеся при специфическом скручивании полипептидной цепи, и таким образом воссоздать тот путь, который приводит к формированию функ- ционально активной структуры белка. вероятно, превышает 10"13 с. Совершенно очевидно, что даже для небольшого белка время выбора энергетически оптимальной конформации путем случайного перебора всех возможных слишком велико. Как же получается, что белки принимают нужную конформацию в течение нескольких секунд или минут? Ответ пока неизвестен, но высказана довольно убедительная гипо- теза, что важную роль в этом процессе Часть I 42 Конформация и динамика Заключение Белки играют ключевую роль почти во всех биологических процессах. Все ферменты, ка- тализаторы химических реакций в биологи- ческих системах, являются белками. Следо- вательно, белки определяют ход биологиче- ских превращений в клетках. Белки уча- ствуют в осуществлении множества других функций,-таких, например, как транспорт веществ и их накопление, координиро- ванные движения, механическая опора, им- мунологическая защита, возбудимость, ре- гуляция роста и дифференцировка. Основной структурной единицей белков
являются аминокислоты. Все белки всех ви- дов живых существ-от бактерии до челове- ка-содержат один и тот же набор из двад- цати аминокислот. Боковые цепи аминокис- лот различаются по размеру, форме, заряду, способности образовывать водородные свя- зи и химической реактивности. Их можно разделить на следующие группы: а) алифа- тические боковые цепи-глицин, аланин, ва- лин, лейцин, изолейцин и пролин; б) гидрок- силированные алифатические боковые це- пи-серин и треонин; в) ароматические боковые цепи-фенилаланин, тирозин и триптофан; г) основные боковые цепи-ли- зин, аргинин и гистидин; д) кислые боковые цепи - аспарагиновая и глутаминовая кис- лоты; е) амидные боковые цепи-аспарагин и глутамин; ж) серусодержащие боковые це- пи-цистеин и метионин. Аминокислоты, в количестве обычно не менее ста, соединяются между собой пеп- тидными связями, образуя полипептидную цепь. Пептидная связь соединяет а-карбок- сильную группу одной аминокислоты с а- аминогруппой другой. В некоторых белках отдельные боковые цепи соединяются ме- жду собой дисульфидными мостиками, образующимися путем окисления остатков цистеина. Белки состоят из одной или не- скольких полипептидных цепей. Каждый бе- лок имеет уникальную последовательность аминокислот, которая детерминируется ге- нетически. Определение последовательно- сти аминокислот в белках проводят следую- щим образом. Сначала определяют общий аминокислотный состав, подвергая кис- лотный гидролизат белка хроматографии на ионообменнике, и проводят идентифика- цию N-концевого аминокислотного остатка с помощью реагента на концевую амино- группу, например дансилхлорида. Следую- щий этап состоит в специфическом расщеп- лении белка на небольшие пептиды. Ис- пользуют, в частности, трипсин, который гидролизует белки по пептидной связи, образованной карбоксильной группой остатков лизина и аргинина. Затем опреде- ляют последовательность аминокислот по- лученных пептидов по методу Эдмана, т.е. путем постепенного отщепления N-концево- го остатка. Наконец, устанавливают после- довательность пептидов в белке путем сопо- ставления последовательностей аминокис- лот в перекрывающихся пептидах. Решающим фактором, определяющим биологическую функцию белков, является их конформация, т.е. расположение в про- странстве атомов белковой молекулы. Из- вестны три регулярно повторяющиеся кон- формации полипептидной цепи: а-спираль, складчатые P-слои и коллагеновая спираль. Короткие участки ос-спирали и р-слоев встречаются во многих белках. Принци- пиально важен тот факт, что трехмерная структура белка определяется последова- тельностью аминокислот; впервые это было обнаружено при изучении рибонуклеазы. Было показано, что восстановленная, раз- вернутая молекула рибонуклеазы способна к спонтанному восстановлению своей струк- туры (с образованием дисульфидных мости- ков между цистеиновыми остатками в пра- вильной комбинации) и полному восстано- влению ферментативной активности, если удалить меркаптоэтанол и мочевину и дена- турированный фермент подвергнуть окисле- нию кислородом воздуха. Скручивание бел- ков осуществляется путем ассоциации ко- ротких полипептидных участков, образую- щих короткоживущую форму а-спирали или р-слоя. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Dickerson R. Е., Geis /., forthcoming. Proteins: Structure, Function and Evo- lution, Benjamin. (Ясное и хорошо иллюстрированное общее описание белков.) Moore S., Stein W.H., 1973. Chemical structures of pancreatic ribonuclease and deoxyribonuclease, Science, 180, 458-464. Anfinsen C,B,, 1973, Principles that govern the folding of protein chains, Science, 181, 223- 230. Книги по химии белков Cantor C.R,, Schimmel P.R., 1980. Bio- physical Chemistry, Freeman. [Имеет- ся перевод: Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия, т. 1-3,- М.: Мир, 1984.] (В гл. 2 и 5 т. 1 и гл. 20 и 21 г. 3 великолепно изло- жены вопросы конформации белков.) Cooper T.G.. 1977. The Tools of Bio- chemistry, Wiley. (Ценное руководст- во по методам белковой химии и другим аспектам биохимии. Четко описаны принципы меюдов.) Neurath Н,, Hill R.L. (eds.J, 1976. The Proteins (3rd ed.), Academic Press. (Многотомный гракзат, содержащий много очень интересных статей.) Haschemeyer R. Н., Haschemeyer А. Е, И, 1973. Proteins: A Guide to Study by Physical and Chemical Methods, Wiley-Interscicnce. Hirs С. И. И<, Timasheff S. N. (eds.), 1977. Enzyme Structure, Part E. Met- hods in Enzymology, vol. 47, Academic 2, Основные представления о структуре и функции белков 43
Press. (Прекрасный сборник статей авторитетных специалистов, посвя- щенный аминокислотному анализу, методам определения концевых групп, химического и ферментатив- ного расщепления, разделения пеп- тидов, анализа последовательности аминокислот, химической модифика- ции и синтеза пептидов.) Schultz G, Е., Schirmer R. Н., 1979. Prin- ciples of Protein Structure, Springer- Verlag. Определение последовательности аминокислот Konigsberg W.H., Steinman H.bL, 1977. Strategy and methods of sequence ana- lysis. In: Neurath H. and Hill R.L. (eds.), The Proteins (3rd ed.), vol. 3, pp. 1-178, Academic Press. Niall H,, 1977. Automated methods for sequence analysis. In: Neurath H. and Hill R. L. (eds.), The Proteins (3rd ed.), vol. 3, pp. 179-238, Academic Press. Needleman S. B. (ed.), 1977. Advanced Methods in Protein Sequence Deter- mination, Springer-Verlag. DayhoffM.O. (ed.), 1972. Atlas of Protein Sequence and Structure, Na- tional Biomedical Research Founda- tion, Silver Springs, Maryland. (При- ведены все известные последователь- ности аминокислот в белках. Атлас переиздается каждые несколько лет.) Ковалентная модификация белков Uy R., Wold F., 1977. Post-transla- tional covalent modification of proteins, Science, 198, 890-896. Hershko A., Fry M., 1975. Post-transla- tional cleavage of polypeptide chains: role in assembly, Ann. Rev. Biochem., 44, 775-797. Glazer A. N., Delange R.J., Sig- man D.S., 1975. Chemical Modification of Proteins, North-Holland. Структура белков Creighton T. E., Experimental studies of protein folding and unfolding, Prog. Biophys. Mol. Biol., 33, 231-297. Baldwin R.L., 1975. Intermediates in protein folding reactions and the mec- hanism of protein folding, Ann. Rev. Biochem., 44, 453-475. Chou P. Y, Fasman C. D., 1978. Empiri- cal predictions of protein conformation, Ann. Rev. Biochem., 47, 251-276. Sternburg M.J.E., Thornton J.M., 1978. Prediction of protein structure from amino acid sequence, Nature, 271, 15-20. Karplus M., Weaver D. L., 1976. Pro- tein-folding dynamics, Nature, 260, 404-406. Levitt ЛТ, Chothia C., 1976. Structural patterns in globular proteins, Nature, 261, 552-558. Chothia C.y 1975. Structural invariants in protein folding, Nature, 254, 304-308. Anfinsen С. B., 1964. On the possibi- lity of predicting tertiary structure from primary sequence. In: Sela M. (ed.), New Perspectives in Biology, pp. 42-50, American Elsevier. Обзоры Advances in Protein Chemistry. Annual Review of Biochemistry. Annual Review of Biophysics and Bioengineering.
ПРИЛОЖЕНИЕ. Понятия кислотности и основности Ионизация воды Вода диссоциирует на ион гидрония (Н3О +) и гидроксильный ион (ОН "). Для простоты ион гидрония обозначим как ион водорода (Н + ), и тогда процесс диссоциации воды в состоянии равновесия примет вид Н2О Н + ( ОН - . Константа равновесия Кр этого процесса составит [Н + ][ОН-] (1) Определение значений pH и рК pH раствора является показателем концен- трации в нем ионов водорода. Значение pH определяют, исходя из равенства pH = 1g 1 [нП => лу [Н + ]. (3) Представим процесс ионизации слабой кис- лоты в состоянии равновесия: НА Н + + А". Кажущаяся константа равновесия К процес- са ионизации выражается уравнением [Н + ][А-] [НА] (4) Отсюда рК кислоты можно определить как где величины в квадратных скобках пред- ставлены в молярных концентрациях. По- скольку концентрация воды (55,5 М) при ионизации меняется мало, уравнение (1) можно упростить: Кн2о = [Н + ][ОН-], (2) где Кн2о_ ионное произведение воды. При 25°С КН2о = 1,0 . 10-14 Следует обратить внимание на обратно пропорциональную зависимость между концентрациями ионов Н + и ОН “. Если повышается концентрация Н +, то снижает- ся концентрация ОН ", и наоборот. Напри- мер, если [Н+] = 10“2 М, то [ОН “] = = 10“12М. Определение кислот и оснований Кислота служит донором протона, основа- ние-акцептором протона. Кислота Н+ + Основание СН3 - соон н+ + СН3 - СОО- Уксусная кислота Ацетат-ион NH4 Н+ + NH3 Ион аммония Аммиак При ионизации кислоты образуется со- ответствующее ей (сопряженное) основание, и наоборот: при протонировании основания образуется соответствующая кислота. Так, уксусная кислота и ацетат-ион являются со- пряженной парой кислота - основание. РК= -lgK = lg 1 IX (5) Из уравнения (4) следует, что рК кислоты представляет собой то значение pH, при ко- тором кислота наполовину диссоциирована. Уравнение Хендерсона-Хассельбальха Какова взаимосвязь между значением pH и соотношением кислоты и основания в рас- творе? Из уравнения (4) можно получить нужную формулу. Сделаем следующее пре- образование: 1 = 1 [А] [Н+] К [НА]. Прологарифмируем это выражение: 18 ЖП = 18 К7 + 181наТ’ (7) Заменив 1g 1/[Н + ] и lg 1/К соответственно на pH и рК, получим рН = рК + 18тйхг (8) Последнее выражение широко известно как уравнение Хендерсона-Хассельбальха. Из уравнения (8) можно вычислить значе- ние pH раствора, если известны молеку- 2. Основные представления о структуре и функции белков 45
кислоты. лярные соотношения А " и НА, а также рК кислоты. Допустим, что имеется раствор 0,1 М ук- сусной кислоты, содержащей 0,2 М ацетат- ионов. рК уксусной кислоты равно 4,8. Сле- довательно, pH раствора составит 0,2 pH = 4,8 + lg—р - 4,8 + lg2 = = 4,8 + 0,3 = 5,1. Аналогично можно рассчитать рК кислоты, если известны соотношение молярных кон- центраций А" и НА и pH раствора. Буферная емкость Сопряженная пара кислота-основание (по- добная приведенной паре уксусная кисло- та - ацетат-ион) обладает важным свой- ством : она препятствует изменению pH раствора. Другими словами, она является буфером. Представим себе, что к раствору уксусной кислоты (НА) добавляют ОН-: НА + ОН- <=» А- + Н2О. График зависимости pH такого раствора от количества добавленных ионов ОН - на- зывают кривой титрования (рис. 2.49). Отме- тим, что кривая имеет точку перегиба при pH 4,8, соответствующую рК уксусной кис- лоты. Вблизи этого значения pH сравни- тельно большие количества добавленных ОН - -ионов вызывают только незначитель- ное изменение pH. В целом именно Часть I 46 Конформация и динамика Таблица 2.3. Величины рК некоторых аминокислот Аминокислота pX (25°C) I-COOH- a-NH3 + - боковая цепь группа группа Аланин 2,3 9,9 Аргинин 1,8 9,0 12,5 Аспарагиновая 2,0 10,0 3,9 кислота Валин 2,3 9,6 Г истидин 1,8 9,2 6,0 Г лицин 2,4 9,8 Глутаминовая 2,2 9,7 4,3 кислота Лизин 2,2 9,2 10,8 Серин 2,1 9,2 Тирозин 2,2 9,1 10,9 Фенилаланин 1,8 9,1 Цистеин 1,8 10,8 8,3 По IT. Edsall, J. Wyman. Biophysical Chemistry, Academic Press, 1958, гл. 8. в области значений своего рК слабые кис- лоты проявляют наилучшие буферные свой- ства. Значения рК аминокислот У аминокислот типа глицина могут ионизи- роваться две группы: а-карбоксильная груп- па и протонированная ot-аминогруппа. Их можно оттитровать путем добавления осно- вания (рис. 2.50). рК а-СООН-группы соста- вляет 2,3, рК а-ЫНз -группы-9,6. Примерно такие же значения рК этих групп и у других аминокислот. У некоторых аминокислот, в частности у аспарагиновой кислоты, мо- жет ионизироваться также боковая цепь. Значения рК ионизирующихся боковых це- пей аминокислот лежат в диапазоне от 3,9 (аспарагиновая кислота) до 12,5 (аргинин) +H.N—С—СООН . - +H3N—С—СОО- ’ I I н н н + ОН“ I 7-1. h2n—с—соо н Рис. 2.50. Титрование ионизирующихся групп аминокислоты.
Вопросы и задачи 1. В химии белка часто исполь- зуются следующие реактивы: CNBr Дансилхлорид Мочевина 6 н. НС1 p-Меркаптоэтанол Н ингидрин Трипсин Фенилизотиоцианат Надмуравьиная кислота Химотрипсин Какой из этих реактивов следует применить при решении следующих задач: а) определение последовательности амино- кислот в небольшом пептиде; б) идентификация аминоконцевого остатка в пептиде (количество которого составляет менее 10“7 г); в) обратимая денатурация белка, не содер- жащего дисульфидных связей. Какой пона- добится дополнительный реактив, если в белке имеются дисульфидные связи? г) гидролиз пептидных связей по карбок- сильной группе ароматических аминокис- лотных остатков; д) расщепление пептидных связей по кар- боксильной группе метионинов; е) гидролиз пептидных связей по карбок- сильным группам остатков лизина и арги- нина? 2. Какое значение pH следующих растворов: а) 10"3 н. НС1; б) 10"2 н. NaOH; в) смеси равных объемов 0,1 М уксусной кислоты и 0,03 М уксуснокислого натрия; г) смеси равных объемов 0,1 М глицина и 0,05 М NaOH; д) смеси равных объемов 0,1 М глицина и 0,05 М НС1? 3. Каково соотношение основания и кислоты при pH 4,5,6,7 и 8, ес- ли рК кислоты равно 6? 4. Мышечный белок тропомиозин представляет собой суперспи- раль состоящую из двух а-спирализованных тяжей. Масса этого белка - 70 к Да. Сред- няя масса одного аминокислотного остатка около ПО Да. Рассчитайте длину моле- кулы. 5. Для расщепления пептидных связей в белках используют без- водный гидразин. Каковы продукты реак- ции? Как можно было бы воспользоваться этим методом для идентификации С-конце- вой аминокислоты? 6. Адренокортикотропный гормон человека представляет собой по- липептид со следующей аминокислотной последовательностью: Ser-Tyr-Ser-Met-Glu- His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys- Lys-Arg-Arg-Pro-V al-Lys-V al-T yr-Pro- Asp- Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe- Pro-Leu-Glu-Phe. а) Рассчитайте примерно общий заряд этой молекулы при pH 7, приняв, что значения рК боковых цепей аминокислот равны при- веденным в табл. 2.3, и считая рК концевых —NHJ- и —СООН-групп равными со- ответственно 7,8 и 3,6. б) Сколько получится пептидов при обра- ботке гормона бромистым цианом? 7. Этиленимин реагирует с бо- ковыми цепями цистеина в бел- ке с образованием S-аминоэтильных про- изводных. Пептидные связи, образованные карбоксильными группами этих модифици- рованных цистеиновых остатков, гидроли- зуются трипсином. Почему? 8. Выделен фермент, катализирую- щий обменные реакции между дисульфидными и сульфгидрильными груп- пами. Неактивная «разболтанная» рибону- клеаза под действием этого фермента бы- стро превращается в каталлитически актив- ную форму. С другой стороны, этот же фермент быстро инактивируется под дей- ствием инсулина. Какой вывод относитель- но взаимосвязи между последователь- ностью аминокислот в инсулине и его трехмерной структурой можно сделать на основании этого факта? Дополнительные вопросы см.: Wood W.B., Wilson J.H., BenhowR. М., HoodL.E. Biochemistry: a Problem Approach, Benjamin, 1974, гл. 2, и Montgomery R.H., Swenson C. A. Quantitative Problems in the Biochemical Sciences, 2th ed., Freeman, 1976, гл. 6-8.
ГЛАВА 3. Переносчики кислорода- миоглобин и гемоглобин Переход от анаэробного существования к аэробному - важнейший этап эволюции, ибо он открыл богатейшие источники энер- гии. В присутствии кислорода из глюкозы можно получить в 18 раз больше энергии, чем в его отсутствие. В ходе эволюции у по- звоночных выработались два основных ме- ханизма, обеспечивающих снабжение кле- ток постоянным и достаточным количе- ством кислорода. Первый - это система кровообращения, которая активно поста- вляет клеткам кислород. Если бы не было системы кровообращения, то размеры аэ- робных организмов не превышали бы мил- лиметра, поскольку диффузия кислорода на большие расстояния оказалась бы слишком медленной и отставала бы от потребностей клеток. Второе важнейшее приспособление для снабжения клеток кислородом - это по- явление в процессе эволюции специальных молекул-переносчиков кислорода, позволив- шее преодолеть ограничения, наклады- ваемые низкой растворимостью кислорода в воде. У позвоночных переносчиками кис- лорода служат белки гемоглобин и миогло- бин. Гемоглобин, содержащийся в эритро- цитах, выполняет функцию переносчика кислорода кровью. Наличие гемоглобина резко увеличивает способность крови пере- носить кислород - с 5 до 250 мл О2 в расчете на один литр крови. Гемоглобин играет так- же жизненно важную роль в транспорте углекислого газа и ионов водорода. Мио- глобин, находящийся в мышцах, выполняет функцию резервного источника кислорода и облегчает транспорт кислорода в мышцах. Часть I 48 Конформация и динамика 3.1. Кислород присоединяется к простетиче- ской группе гема Способность миоглобина и гемоглобина связывать кислород обусловлена наличием в них неполипептидного компонента, а именно гема. Гем определяет также красный цвет этих белков. Вообще очень многие белки содержат прочносвязанные специфические неполипептидные компо- ненты, необходимые для проявления биоло- гической активности. Такие компоненты по- лучили название простетических групп. Белок, лишенный своей простетической группы, называют апопротеином. Гем состоит из органической части и ато- ма железа. Органическая часть -npomonop- фирин -образована из четырех пиррольных групп. Четыре пиррола соединяются мети- леновыми мостиками, образуя тетрапир- рольное кольцо. К нему присоединены 4 ме- тильные, 2 вин ильные и 2 пропионатные боковые цепи. Возможны 15 вариантов про- странственного расположения этих замести- Рис. 3.1. Изображение эритроцита, по- лученное с помощью скани- рующего электронного микро- скопа. (Печатается с любезно- го разрешения д-ра М. Goldman и д-ра R. Leif.)
Изображение эритроцитов (двояковогнутой формы) и лейкоцитов (округлые) в мел- ком кровеносном сосуде, по- лученное с помощью скани- рующего электронного микро- скопа. (Kessel R. G., Kardon R. Н. Tissues and Organs, W. H. Freeman and Company, 1979.) телей. В биологических системах присут- ствует только один из изомеров, назы- ваемый протопорфирин IX. Атом железа в геме присоединен к 4 ато- мам азота в центре протопорфиринового кольца (рис. 3.2 и 3.3). Железо может давать еще дополнительные связи-по обе стороны плоскости гема. Эти направления связей обозначают как пятое или шестое координа- ционные положения. Атом железа в геме может быть в ферроформе ( 4- 2) или ферри- форме (4- 3). Соответствующие формы ге- моглобина называют феррогемоглобин или ферригемоглобин. Ферригемоглобин назы- вается также метгемоглобином. Только феррогемоглобин ( 4- 2) способен связывать кислород. Аналогичная номенклатура при- менима и к миоглобину. 3. Переносчики кислорода - миоглобин и гемоглобин 49 4-665
СОО- соо- сн Н' сн2 сн2 сн2 с нс; £Н C=N н / сн3 н t-CH •с с. Гем (Fe-протопорфирин IX) Протопорфирин IX 2 3.2. Рентгеноструктурный анализ кристал- лов выявляет пространственное расположе- ние атомов Выявление трехмерной структуры миогло- бина Джоном Кендрью (J. Kendrew) и гемо- глобина Максом Перутцом (М. Perutz) яви- лось выдающимся достижением молекуляр- ной биологии. Эти исследования, успешно завершенные в конце 50-х годов, доказали применимость рентгеноструктурного ана- лиза (рентгеноструктурной кристаллогра- фии) для изучения структуры таких макро- молекул, как белки. До 1957 г. самой большой из исследованных этим методом молекул был витамин В12, молекулярная масса которого на порядок меньше молеку- лярной массы миоглобина (17,8 кДа) или гемоглобина (66 кДа). Определение про- странственной структуры этих белков по- служило огромным стимулом для развития белковой кристаллографии. Проводятся ис- следования по установлению простран- ственной структуры большого множества различных белков. Более чем для 50 белков пространственная структура к настоящему времени изучена уже детально. Рентгено- структурный анализ вносит большой вклад в наши представления о структуре и функ- ции белков, потому что это единственный метод, выявляющий пространственное рас- положение большинства атомов в белке. Ценным источником информации о струк- туре биологических макромолекул может служить также электронная микроскопия, однако пока еще она не позволяет выявить Часть I 50 Конформация и динамика архитектуру молекулы на уровне атомов. Прежде чем обратиться непосредственно к пространственной структуре миоглобина и гемоглобина, рассмотрим некоторые ос- новные аспекты метода рентгеноструктур- ного анализа. Прежде всего анализируемый белок должен быть выделен в кристалличе- ском виде. Миоглобин, например, кристал- лизуется при добавлении сульфата аммония к концентрированному раствору белка (рис. 3.4). В концентрации 3 М сульфат ам- мония значительно снижает растворимость миоглобина и тем самым приводит к его кристаллизации. Растворимость большин- Плоскость расположения гема Рис. 3.2. Атом железа в геме способен образовывать шесть связей. Четыре из них расположены в плоскости гема. Пятая нахо- дится по одну сторону от этой плоскости, шестая - по другую. Расположение связанных с же- лезом атомов называют также координационными положе- ниями.
Рис. 3.3. Гем гемоглобина (желтым по- казано Fe, синим -N, крас- ным-О, черным-С). ства белков снижается при добавлении любых солей в высокой концентрации. Этот эффект называется высаливанием. Полу- ченные таким образом кристаллы миогло- бина (рис. 3.5) могут достигать нескольких миллиметров в длину. Для проведения рентгеноструктурного анализа необходимы три компонента: ис- точник рентгеновских лучей, кристалл белка и детектор (рис. 3.6). Рентгеновское излуче- ние с длиной волны 1,54 А получают путем бомбардировки медной мишени ускоренны- ми электронами. Узкий пучок рентгенов- ских лучей направляется на кристалл белка. При этом часть пучка проходит через кри- сталл, не меняя своего направления, тогда как другая часть рассеивается в различных направлениях (дифракция лучей). Рас- сеянные пучки лучей попадают на фото пленку, причем степень потемнения эмуль- сии на пленке пропорциональна интенсив- ности падающих на нее лучей. В основе метода лежат следующие физические прин- ципы : 1. Рентгеновские лучи рассеиваются элек- тронами. Амплитуда волны, рассеиваемой атомом, пропорциональна числу электро- нов в атоме. Так, атом углерода рассеивает лучи в шесть раз сильнее, чем атом водоро- да. 2. Рассеянные волны взаимодействуют друг с другом (интерферируют). Каждый атом вносит свой вклад в отклонение каж- дого пучка лучей. Рассеянные волны могут усиливать или гасить друг друга в зависи- мости от того, совпадают они по фазе или нет. 3. Характер взаимодействия рассеянных волн целиком определяется расположением атомов в исследуемом веществе. 3.3. Этапы рентгеноструктурного анализа миоглобина Кендрью выбрал миоглобин для проведе- ния рентгеноструктурного анализа в силу многих причин: это относительно неболь- шой белок (17,8 к Да), его легко получить в больших количествах, и он легко кристал- лизуется. Кроме того, миоглобин имеет и то достоинство, что он очень сходен с гемогло- бином, исследованием которого уже зани- мался коллега Кендрью Перутц. В работе был использован миоглобин из скелетных мышц кашалота, отличающийся стабиль- ностью и способностью великолепно кри- сталлизоваться. Скелетные мышцы ныряю- щих млекопитающих-китов, тюленей, дельфинов-особенно богаты миоглобином, который служит для резервирования кисло- рода, используемого во время ныряния. Кристалл миоглобина помещают в ка- пилляр и строго ориентируют по отноше- Добавление (NH4)2SO4 Несколько дней Миоглобин в разведенном буфере Миоглобин в Кристаллы миоглобина 3 М (NH4)2SO4. pH 7 Рис. 3.4. Кристаллизация миоглобина. 3. Переносчики кислорода - миоглобин и гемоглобин 4*
нию к пучку рентгеновских лучей и к пленке. В результате прецессионного движения кри- сталла на рентгеновском фотоснимке обра- зуется регулярная решетка пятен (рефлек- сов). Рентгеновская фотография, показанная на рис. 3.7, представляет собой двумерное сечение через трехмерное множество ре- флексов. Кристалл миоглобина дает 25 000 рефлексов. Измеряют интенсивность каждо- го рефлекса. Получаемые величины пред- ставляют собой те исходные эксперимен- тальные данные рентгеноструктурного ана- лиза, которыми оперируют далее. На следующем этапе воспроизводят структуру миоглобина, исходя из полу- ченных значений интенсивности рефлексов: это производится с помощью математиче- ского метода представления сложных функ- ций в виде гармонических рядов Фурье. Од- нако величины интенсивности рефлексов от кристаллов миоглобина дают только часть информации, необходимой для таких расче- тов. Недостающие данные о фазах рас- сеянных пучков лучей получают из полной картины дифракции лучей кристаллом мио- глобина, содержащего тяжелые атомы, на- пример уран или свинец, по одну или две стороны молекулы. После этого переходят к расчету карты электронных плотностей, используя быстродействующие ЭВМ. По счастью, развитие кристаллографических исследований миоглобина совпало по вре- мени с появлением быстродействующих ЭВМ с большим объемом памяти. Окон- чательный расчет по методу рядов Фурье Рис. 3.5. Фотография кристаллов мио- глобина. (Печатается с любез- ного разрешения д-ра J. Ке- ndrew.) Источник рентгенов- ских лучей Рентгеновский пуч —Г" Кристалл Рассеянные лучи Детектор (например, пленка) Рис. 3.6. Схема установки для проведе- ния рентгеноструктурного ана- лиза: рентгеновский луч, кри- сталл, детектор. для миоглобина включал в себя около миллиарда величин. В результате проведенной математиче- ской обработки получают величины элек- тронной плотности в большом числе регу- лярно расположенных в пространстве точек кристалла. При этом трехмерное распреде- ление электронных плотностей имеет вид серии наслоенных один над другим парал- лельных срезов. Каждый срез представляет собой прозрачную пластинку из синтетиче- ского материала, на которой распределение электронных плотностей показано кон- турными линиями (рис. 3.8). Такое изобра- жение можно сравнить с картой рельефа земной поверхности, на которой контурны- ми линиями обозначается высота местности над уровнем моря (рис. 3.9). Следующий этап работы состоит в рас- шифровке карты электронных плотностей. Критическим фактором при этом выступает разрешающая способность метода рентгено- структурного анализа, которая определяет- ся количеством рефлексов, использованных в обратном преобразовании Фурье. Пра- вильность изображения зависит от разре- шающей способности обратного преобразо- вания Фурье, как это показано с помощью оптической аналогии на рис. 3.10. Анализ миоглобина был выполнен в три этапа. На первом этапе, завершенном в 1957 г., анали- Часть I 52 Конформация и динамика
Рис. 3.7. Рентгенограмма кристалла миоглобина. Рис. 3.8. Часть карты электронной плотности миоглобина: уча- сток гема. Пик в центре со- ответствует положению атома железа. (Kendrew J.C., The thredimensional structure of a protein molecule, Scientific American, Inc., 1961.) зу были подвергнуты только 400 внутренних рефлексов на дифракционной картине, что соответствовало разрешению 6 А. Как бу- дет показано несколько ниже, такая карта электронных плотностей низкого разреше- ния описывает полипептидную цепь, но вы- являет мало других деталей структуры. Де- ло в том, что из-за особенностей укладки полипептидных цепей их центры расходятся на 5-10 А. Чтобы выявить расположение групп атомов, отстоящих на 2,8-4,0 А друг от друга, или отдельных атомов, разде- ленных расстоянием в 1,0-1,5 А, требуются карты более высокого разрешения. В 1959 г. была получена карта миоглобина с разре- шением 2 А (10000 рефлексов), а в 1962 г-с разрешением 1,4 А (25000 рефлексов). Пре- дел разрешающей способности рентгено- структурного анализа определяется сте- пенью совершенства структуры кристалла. Для белков этот предел обычно не ниже 2 А. В 1957 г. Кендрью и его сотрудники уви- дели то, чего до них никто не видел: про- странственную структуру белковой моле- кулы во всей ее сложности. Модель, построенная на основании обратного^ пре- образования Фурье с разрешением 6 А, со- стояла из набора отрезков высокой плотно- сти, имеющих именно те размеры, какие и приписывались полипептидной цепи (рис. 3.11). Молекула имела очень ком- пактный вид. Более подробное изучение по- казало, что она состоит из сложной и пере- плетающейся сети этих отрезков, которые Рис. 3.9. Часть физической карты США; показан участок Капитол-пи- ка, штат Колорадо. 3. Переносчики кислорода- миоглобин и гемоглобин 53
Б то шли прямо на некотором протяжении, то делали угол, меняя направление. Располо- жение атома железа в геме было легко уста- новить, так как железо содержит значитель- но больше электронов, чем любой другой атом в белке. Самое поразительное в струк- туре молекулы-это ее неправильность и полное отсутствие симметрии. 3.4. Структура миоглобина характеризуется компактностью и высокой степенью а-спира- лизованности Полученная двумя годами позже карта электронных плотностей миоглобина с вы- соким разрешением содержала колоссаль- Рис. ЗЛО. Влияние разрешающей спо- собности на качество рекон- струированного изображения. Для иллюстрации использован оптический аналог дифракции рентгеновских лучей. А-Пар- фенон, Б-картина дифракции от Парфенона, В и Г-изобра- жения, полученные по данным, взятым из рис. Б. Для получе- ния изображения, показанного на рис. Г, использовано боль- ше точек, чем для получения изображения на рис. В. Со- ответственно изображение Г значительно выше каче- ством. [Печатается с любезно- го разрешения д-ра Т. Steitz (Л) и д-ра D. De Rosier (Б).] Часть I Конформация и динамика Рис. 3.11. Модель миоглобина, получен- ная при низком разрешении. (Любезно предоставлена д-ром J. Kendrew.) 54
Рис, 3-12. Модель миоглобина, получен- ная при высоком разрешении. Показаны . только а-угле- родные атомы. Красным дан гем. (Dickerson R. Е. In: The Proteins, Н. Neurath, ed., 2th ed., v. 2, Academic Press, 1964, p. 634.) ное количество информации относительно деталей структуры белка. Из 1260 атомов, т.е. всех атомов, кроме водорода, положе- ние 120 атомов было определено с точ- ностью, превышающей 0,3 А. Общее распо- ложение основной цепи и гема показано на рис. 3.12. Структура миоглобина имеет сле- дующие особенности: 1. Молекула миоглобина чрезвычайно компактна. Ее объем равен 45 х 35 х 25 А. Внутри молекулы почти нет свободного пространства. 2. Около 75% основной цепи находится в конформации а-спирали. Все а-спирали правозакрученные. Имеется 8 основных участков спирализации, которые обозна- чены первыми 8 буквами латинского алфа- вита: А, В, С, ..., Н. Первый аминокис- лотный остаток в спирали А обозначают А1, второй А2 и т.д. (рис. 3.13). Между областя- ми спирализации находится пять неспира- лизованных участков (обозначаемых, напри- мер, CD, если участок расположен между спиралями С и D). Имеются еще два нейт- рализованных участка: два аминокис- лотных остатка на N-конце молекулы (назы- ваемые NA1 и NA2) и пять остатков-на С-конце (обозначаются соответственно от НС1 до НС5). 3. Не все факторы, определяющие терми- нирование участка спирализации, уже выя- влены. Известно, однако, что важную роль в этом процессе играют остатки пролина. Пролин не может быть включенным в а-с пи- раль (разве только одним концом), потому что пятичленное пирролидоновое кольцо просто не может в ней уместиться. В мио- глобине содержится четыре остатка про- лина и восемь окончаний а-спиральных участков. Ясно, что имеются и другие фак- торы, определяющие завершение спирали. Так, например, в отдельных случаях проис- ходит прерывание а-спирали, если ОН-груп- па серина или треонина взаимодействует с карбонильной группой основной цепи. 4. Пептидные группы имеют планарную структуру. Карбонильная группа занимает транс-положение относительно NH-группы основной цепи. Длина связей и углы между ними соответствуют таковым в дипептидах и близких к ним соединениях. 5. Четко различаются внутренняя и на- ружная части молекулы. Внутренняя часть молекулы почти целиком состоит из непо- лярных остатков лейцина, валина, метио- нина, фенилаланина и не содержит боковых 3. Переносчики кислорода - миоглобин и гемоглобин 55
Val-Leu-Ser-Glu-Gly-Glu-Trp-Gln-Leu- Vai - NA1 NA2 Al A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 Leu-His - Vai -Trp-Ala -Lys-Vai -Glu-Ala-Asp- A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 Al 6 AB1 Bl Val-Ala-Gly- His-Gly-Gin-Asp- lie -Leu- lie - B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 Arg-Leu-Phe- Lys-Ser-His-Pro-Glu-Thr-Leu- 812 B13 B14 B15 B16 Cl C2 C3 C4 C5 Glu- Lys-Phe-Asp-Arg-Phe- Lys - His-Leu- Lys- C6 C7 CD1 CD2 CD3 CD4 CD5 CD6 CD7 CDS Thr-Glu-Ala-Glu-Met- Lys-Ala-Ser-Glu-Asp- 60 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 E1 E2 E3 Leu-Lys- Lys - His - Gly - Vai -Thr-Vai -Leu-Thr- E4 E5 E6 E7 E8 E9 ЕЮ Ell E12 E13 Ala-Leu-Gly-Ala- lie -Leu-Lys-Lys-Lys-Gly- E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 EF1 EF2 EF3 His- His-Glu- Ala-Glu-Leu- Lys- Pro-Leu-Ala- 90 EF4 EF5 EF6 EF7 EF8 F1 F2 F3 F4 F5 Gln-Ser-His-Ala-Thr-Lys-His-Lys- He -Pro- 100 F6 F7 F8 F9 FG1 FG2 FG3 FG4 FG5 G1 He -Lys-Tyr-Leu-Glu-Phe- He -Ser-Glu-Ala- G2 G3 G4' G5 G6 G7 G8 G9 GIO G11 He - He -His-Val-Leu-His-Ser-Arg-His-Pro- 120 G12 G13 G14 G15 G16 G17 G18 G19 GH1 GH2 G ly -Asn- Phe-G ly - Ala -Asp- Ala - G In - G ly - Ala - GH3 GH4 GH5 GH6 H1 H2 H3 H4 H5 H6 Met-Asn-Lys-Ala-Leu-Glu-Leu-Phe-Arg-Lys- H7 H8 H9 НЮ H11 H12 H13 H14 H15 H16 Asp- lie -Ala-Ala-Lys-Tyr-Lys-Glu-Leu-Gly- H17 H18 H19 H20 H21 H22 H23 H24 HC1 HC2 Tyr-GIn-Gly НСЗ HC4 HC5 Рис. 3.13. Аминокислотная последова- тельность миоглобина каша- лота. Цифры и буквы под каждым остатком указывают на его положение в а-спиралях или в неспирализованных участках между ними. Напри- мер, В4 обозначает четвертый остаток в спирали В; ЕР7-7-Й остаток в неспирализованном участке между спиралями Е и F. [Edmundson А. Е., Nature, 205, 883 (1965); Watson Н. С., Prog. Stereochem., 4, 299-333 (1969).] Часть I 56 Конформация и динамика Снаружи Триптофан I /с< HjC он Снаружи Треонин Тирозин цепей глутаминовой и аспарагиновой кис- лот, глутамина, аспарагина, лизина или ар- гинина. Аминокислотные остатки, имеющие полярную и неполярную части, а именно треонин, тирозин и триптофан ориентиро- ваны так, что внутрь обращены их непо- лярные участки. Есть только два полярных остатка внутри молекулы миоглобина - это два гистидина, расположенные в активном центре и играющие главную роль в функ- циональной активности. На наружной сто- роне молекулы расположены как полярные, так и неполярные аминокислотные остатки. 3.5. Участок связывания кислорода в мио- глобине Группа гема локализуется в углублении на молекуле миоглобина. Высокополярные пропионатные боковые цепи гема располо- жены на поверхности молекулы. При физио- Гистидин F8 Н .N I \ Fe О, J, / С В Гистидин Е7 /СН2 Н В Плоскость И-----расположения гема Рис. 3.14. Схематическое изображение участка связывания кислорода в миоглобине. Пятое коорд- инационное положение занято гистидином F8 (прокси- мальный гистидин); кислород связывается в шестом коорди- национном положении; ги- стидин Е7 (дистальный гисти- дин) расположен вблизи ше- стого координационного положения.
Гистидин F8 Гистидин Е7 6-е координационное положение, участок связывания кислорода Гем Рис. 3.15. Модель участка связывания кислорода в миоглобине. По- казаны гем, проксимальный гистидин (F8) и дистальный ги- стидин (Е7). логическом значении pH они находятся в ионизированном состоянии. Остальные части гема погружены внутрь молекулы миоглобина, где ее окружают неполярные, за исключением двух гистидинов, аминокис- лотные остатки. Атом железа в геме присое- динен непосредственно к одному из этих ги- стидинов, а именно к остатку F8 (рис. 3.14 и 3.15). Этот остаток, занимающий пятое координационное положение, называется проксимальным гистидином. Атом железа примерно на 0,3 А выступает над пло- скостью порфирина на стороне гистиди- Ha-F8. Участок связывания кислорода распо- ложен по другую сторону плоскости в шестом координационном положении. Ря- дом располагается второй остаток гисти- дина (Е7), называемый дистальным. Оста- ток дистального гистидина-Е7 с гемом не связан. На рис. 3.16 показан участок карты электронных плотностей, включающий об- ласть гема. Были исследованы три физиологически значимые формы миоглобина: дезоксимио- глобин, оксимиоглобин и ферримиоглобин. По конформации они очень сходны во всем, кроме шестого координационного положе- ния (табл. 3.1). В ферримиоглобине в этом положении стоит вода; в дезоксимиоглоби- не оно свободно; в оксимиоглобине это по- ложение занято кислородом. Связь с О2 на- ходится под углом к связи железо-кисло- род (рис. 3.17). Атом железа при оксигени- ровании пододвигается к плоскости гема примерно на 0,2 А. Важно отметить, что гем, таким образом, не является жесткой структурой. Более того, перемещение атома железа при оксигенировании играет ключе- вую роль в функционировании гемоглоб- ина, что будет показано в следующей главе (разд. 4.11). В контакт с гемом входят аминокис- Таблица 3.1. Окружение гема Чем занято Форма Ва- 5-коор- лент- динаци- ность онное железа положе- ние 6-е коорди- национное положение Дезоксимиоглобин Оксимиоглобин Ферримиоглобин + 2 + 2 + 3 HisF8 HisF8 HisF8 Свободно 02 Н2О 3. Переносчики кислорода- миоглобин и гемоглобин 57
Рис. 3.16. Фрагмент карты электронной плотности миоглобина вблизи участка связывания кислорода. Электронноплотная область, тянущаяся вдоль нижней части карты,- спираль Е. (Печатается с любезного разрешения д-ра’ J. Kendrew.) Плоскость расположения гема х Рис. 3.17. Наклон и ориентация связи кислорода с атомом железа в оксимиоглобине. Угол ме- жду осью О2 и связью Fe -О составляет 12Г. лотные остатки, принадлежащие разным участкам линейной последовательности, в частности остатки С4 и Н14, соответ- ствующие аминокислотам 39 и 138 линей- ной последовательности. Отсюда видно, что участок, связывающий гем, в своей значи- тельной части имеет трехмерную структу- ру- 3.6. Жесткое окружение гема обеспечивает обратимость оксигенирования На долю участка, в котором происходит связывание кислорода, приходится лишь не- большая часть объема всей молекулы мио- глобина. В самом деле, кислород непосред- ственно присоединяется только к атому железа в геме. Какова же роль полипептид- ной части молекулы в связывании и перено- се кислорода? Для ответа на этот вопрос рассмотрим, как связывается кислород сво- бодным гемом. В водном растворе сво- бодный феррогем способен связать кисло- род, но лишь на короткий момент. Объяс- няется это тем, что в воде феррогем быстро окисляется до ферригема, который не связы- вает кислорода. Промежуточным продук- том в этой реакции является сандвичевое со- единение, образованное двумя гемами с О2 Часть I 58 Конформация и динамика
------Оксигемоглобин Рис. 3.18. При связывании кислорода из- меняются спектры поглоще- ния миоглобина и гемоглоби- на в области видимого света. Миоглобин и гемоглобин имеют очень сходные спектры поглощения видимого света. между ними. В миоглобине гем менее чув- ствителен к окислению, поскольку две моле- кулы миоглобина практически не способны к ассоциации и образованию сандвичевого со- единения гем-О2-гем. Образование такого комплекса стерически заблокировано ди- стальным гистидином и другими остатка- ми, окружающими шестое координацион- ное положение. Самые убедительные данные в пользу того, что стерические фак- торы определяют скорость окисления гема, были получены при изучении специально синтезированных модельных соединений. Джеймс Коллман (J. Collman) синтезировал железопорфириновые комплексы, огорожен- ные «частоколом» заместителей (рис. 3.19), имитирующие участки связывания кислоро- да в миоглобине и гемоглобине. В этих со- единениях на одной стороне порфиринового кольца имелась «огороженная» область для связывания О2, тогда как другая сторона оставалась незакрытой и могла связывать основание. Оказалось, что если в качестве основания присоединялся замещенный ими- дазол, этот комплекс (рис. 3.20) приобретал такое же сродство к кислороду, как и мио- глобин. Болес того, «огороженность» ста- билизирует ферроформу этого железо- порфирина, в результате чего он при- обретает способность к обратимому связы- ванию кислорода на длительное время. Ос- новное различие между этим модельным соединением и обычным гемом состоит в наличие заместителей, создающих «огоро- женную» структуру, и тем самым блоки- рующих образование димерного сандвича гем-О2-гем. Следовательно, в миоглобине создается такое микроокружение простетической группы, благодаря которому она приобре- 0 R = NHC-С(СМз>3 Им — Производное имидазола Рис. 3.19, Схематическое изображение «огороженного» железопор- фирина со связанным О2. «Ча- стокол» химических замести- телей препятствует сближению двух порфиринов и образова- нию промежуточного продук- та окисления. 3. Переносчики кислорода- миоглобин и гемоглобин 59
Рис. 3.20. Структурная формула «огоро- женного» железопорфирина. [Collman J., Brauman J. I., Rose E., Suslick K.S., Proc. Nat. Acad. Sci, 75, 1053 (1978).] тает характерные свойства. Это общее пра- вило, что функция простетической группы частично зависит от ее полипептидного окружения, В самом деле, тот же самый гем выполняет совершенно другую функцию в составе цитохрома с-белка конечного участка дыхательной цепи в митохондриях всех аэробных организмов. В цитохроме с гем обратимо переносит электроны, а не кислород. Наконец, совсем другую роль играет гем, входящий в состав фермента ка- талазы, где он разлагает перекись водорода на воду и кислород. 3.7. Присутствие дистального гистидина сни- жает связывание оксида углерода Оксид углерода ядовит, так как, присоеди- няясь к ферромиоглобину или феррогемо- глобину, он препятствует транспорту кисло- рода в организме. Гему свойственно высо- кое сродство к СО. В водном растворе связывание СО свободным гемом происхо- дит примерно в 25 000 раз сильнее, чем связывание О2. Однако в составе гемоглобина или миоглобина сродство гема к СО превышает сродство к О2 только при- мерно в 200 раз. Каким же образом эти бел- ки подавляют природное предпочтение ге- мом оксида углерода? Ответ был получен Часть I 60 Конформация и динамика при рентгеноструктурном анализе и инфра- красной спектроскопии комплексов СО и О2 с миоглобином и модельными железопор- фиринами. Железопорфирины обладают очень высокой степенью сродства к СО; в их комплексах с СО атомы Fe, С и О располо- жены на одной прямой (рис. 3.21). В ком- плексе же миоглобина с СО ось СО нахо- дится под углом к связи Fe—С. Расположе- нию СО на одной прямой со связью Fe—С препятствует главным образом наличие ди- стального гистидина. С другой стороны, ось О2 находится под углом к связи Fe—О как в оксимиоглобине, так и в модельных соеди- нениях. Следовательно, под влиянием белка СО координируется с железом под углом к связи Fe—С, а не на одной прямой с ней. Такая наклонная геометрия, обусловленная глобином, ослабляет взаимбдействие гема с СО и в то же время создает оптимальные условия для связывания О2- Пониженное сродство миоглобина и ге- моглобина к СО имеет очень важное значе- ние для биологических процессов. Оксид углерода представлял потенциальную опас- ность еще задолго до развития индустриа- лизации. Дело в том, что СО образуется эн- догенно при расщеплении гема (разд. 21.16). Таким образом, генерирование оксида угле- рода в организме неразрывно связано с ис- пользованием им гема. Эндогенно обра- зуется такое количество СО, которое блоки- рует ~ 1% участков связывания кислорода в миоглобине и гемоглобине. Разумеется, такой уровень торможения невелик. Однако если бы относительное сродство этих бел- ков к СО было примерно таким, какое ха- рактеризует свободные железопорфирины, то эндогенно образованный оксид углерода вызывал бы серьезное отравление. Приро- да решила вопрос таким образом, что в ходе эволюции появились гемосодержащие белки, которые в силу стерических факторов ослабляют связывание гемом СО, но не О2. 3.8. В растворенном виде и в кристалличе- ском состоянии миоглобин имеет практически одинаковую структуру С помощью рентгеноструктурного анализа высокого разрешения была получена заме- чательно детальная, хотя статическая, кар- тина молекулы миоглобина. Возникает су- щественный вопрос: имеет ли растворенный миоглобин такую же структуру, как миогло- бин кристаллический? Кристаллический миоглобин отличается от растворенного в том отношении, что в процессе кристалли-
h His E7 Рис. 3.21. Структурная основа понижен- ного сродства миоглобина и гемоглобина к оксиду угле- рода. А -связь СО расположе- на на одной прямой со сво- бодным железопорфирином; Б-наклонная геометрия связи СО с миоглобином и гемогло- бином, обусловленная тем, что дистальный гистидин (Е7) пре- пятствует прямолинейному связыванию СО, в результате сродство к СО оказывается значительно сниженным; В-наклонная геометрия связи О2 с миоглобином и гемогло- бином. Связь О2 со свободны- ми железопорфиринами также имеет наклонную геометрию. зации он подвергается воздействию высо- кой ионной силы [3M(NH4)2SO4] и между его отдельными молекулами возникают взаимодействия. Могут ли эти факторы так изменить структуру миоглобина, что кар- тина, полученная при рентгеноструктурном анализе, не приближает нас к пониманию его биологической функции? Ответ на этот вопрос - решительное нет. Имеется целый ряд доказательств, что структура миогло- бина в растворенном виде и в виде кристалла очень сходна. 1. В кристаллическом состоянии миогло- бин функционально активен: он способен присоединять кислород, хотя реакция про- текает и не так быстро, как в растворе. В це- лом реакционноспособность миоглобина в кристаллическом состоянии понижена. 2. Спектр поглощения, характерный для группы гема в миоглобине, растворенном или кристаллическом, один и тот же. Спектры поглощения служат очень чувстви- тельным показателем особенностей микро- окружения гема. 3. Содержание а-спиралей в растворен- ной молекуле оценивают по дисперсии оп- тического вращения и по круговому дих- роизму. Измеренное таким образом количе- ство а-спиралей хорошо согласуется с числом а-спиралей, полученным при ана- лизе карты электронных плотностей крис- талла. Маловероятно, чтобы значительные изменения конформации не сопровожда- лись бы изменением числа спиралей в струк- туре белка. 4. Рентгеноструктурный анализ мио- глобина тюленя показал, что третичная структура этого белка очень близка таковой миоглобина кита. В противоположность этому кристаллические решетки этих мио- глобинов весьма различны, а следователь- но, и взаимодействия между молекулами в этих двух кристаллах неодинаковы. Таким образом, маловероятно, чтобы значи- тельные искажения структуры были бы обусловлены кристаллической решеткой. 3.9. Неполярные взаимодействия играют важную роль в стабилизировании конформа- ции миоглобина Рентгеноструктурный анализ выявляет структуру миоглобина, но не объясняет, по- чему молекула имеет данную структуру, а не иную. В сущности, одна из задач белко- вой химии и состоит в том, чтобы опреде- лить, каким образом аминокислотная по- следовательность задает трехмерную струк- 3. Переносчики кислорода- мшллобин и гемоглобин 61
туру белка. Изучение миоглобина показало, что внутренняя часть молекулы состоит из плотно упакованных неполярных остатков. Остатки таких аминокислот, как валин, лей- цин, изолейцин, метионин и фенилаланин являются гидрофобными. При возможности выбора между водой и неполярной средой они явно предпочитают последнюю. Далее, при плотной упаковке их боковые цепи оказываются сближенными и между ними возникают вандерваальсовы силы притяже- ния. Таким образом, значительная сила при- тяжения, обеспечивающая скручивание бел- ковой молекулы, связана с гидрофобностью указанных аминокислотных остатков, т.е. с их тенденцией к отталкиванию воды. Эти гидрофобные боковые цепи оказываются термодинамически более стабильными, ес- ли они сгруппированы внутри молекулы, а не развернуты в водной среде. Повышение стабильности при скручивании молекулы белка обусловлено ростом энтропии, проис- ходящим при упорядоченном распределе- нии молекул воды вокруг доступных гидро- фобных групп (разд. 6.26). Итак, полипеп- тидная цепь в водном растворе спонтанно скручивается так, что ее гидрофобные бо- ковые цепи оказываются спрятанными внутри, а полярные, заряженные цепи-на поверхности молекулы. ЗЛО. Развернутая молекула миоглобина спонтанно принимает функционально актив- ную конфигурацию Оказывает ли гем влияние на простран- ственную структуру миоглобина? Ответ был получен при изучении апомиоглобина, т.е. миоглобина, лишенного гема. Апомио- глобин получают из миоглобина путем по- нижения pH раствора до 3,5. Поскольку при таком закислении связь между гемом и бел- ком становится слабой, для отделения гема от белка используют экстрагирование орга- ническим растворителем. Далее водную фа- зу, содержащую апомиоглобин, нейтрали- зуют. Измерения дисперсии оптического вращения показали, что при нейтральном значении pH степень а-спирализации в апо- миоглобине составляет 60%, что значитель- но меньше, чем в миоглобине (75%). По данным гидродинамических исследований апомиоглобин менее компактен, чем мио- глобин. Более того, стабильность апомио- глобина гораздо ниже стабильности мио- глобина. Следовательно, наличие гема оказывает заметный эффект на структуру миоглобина. Является ли скручивание апомиоглобина и последующее включение гема спон- танным процессом? Если к нейтральному раствору апомиоглобина добавить мочеви- ну или гуанидин, то молекула белка разво- рачивается (денатурирует). Содержание ос- спиралей в этих условиях (т.е. в 8 М растворе мочевины) близко к нулю. После удаления мочевины путем диализа степень ос-спирализации возрастает до 60%, т. е. апо- миоглобин вновь скручивается. Последую- щее добавление гема к этому раствору при- водит к образованию биологически актив- ного миоглобина (рис. 3.22). При восста- Раскрученный (денатурированный) апомиоглобин (в 8 М растворе мочевины) Частично ренатурированный апомиоглобин Добавление гема Рис. 3.22. Образование миоглобина из денатурированного апомио- глобина. Часть I Конформация и динамика 62
Положение в спирали F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 Д.цепь-Phe- -Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys- 6 -Цепь -Phe- -Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys- Y -Цепь -Phe- -Leu-Ser-Glu-Leu-H is-Cys- \ t Единственные различия в последовательностях из 9 аминокислот Рис. 3.23. Р-, у и S-Цепи гемоглобинов человека обладают сходными аминокислотными последова- тельностями. Для примера по- казаны участки трех цепей с остатками от F1 до F9. новлении в ферромиоглобин такой ренату- рированный белок способен обратимо связывать кислород с исходной эффектив- ностью. Следовательно, сложная трехмер- ная структура миоглобина заложена в самой природе аминокислотной последова- тельности апомиоглобина, соединенного с простетической группой гема. Этот вывод подтвердил универсальность принципа, впервые открытого при исследовании рена- турации рибонуклеазы, а именно: последова- тельность аминокислот определяет конфор- мацию белка. глобинов представляет собой очень инте- ресную проблему, которую мы обсудим в следующей главе. Общая для всех перечне-' ленных гемоглобинов а-цепь содержит 141 аминокислотный остаток. Р-, 5- и у-Цепи со- держат по 146 остатков с очень схожей по- следовательностью аминокислот (рис. 3.23). 3.12. Рентгеноструктурный анализ гемоглобина Как упоминалось ранее, пространственную структуру гемоглобина А определили Макс Перутц и сотрудники. Этот монумен- тальный труд был начат в 1936 г., когда для выполнения дипломной работы Перутц уе- хал из Австрии в Англию в Кембридж и на- чал работать в лаборатории Джона Бернала (J. Bernal), где двумя годами ранее были по- лучены первые рентгеновские отпечатки кристаллов белка. Бернал и студентка- дипломница Дороти Кродфут Ходжкин (D. С. Hodgkin) получили отличные отпечат- ки дифракции пепсина и таким образом по- казали, что белкам свойственна точно опре- деленная структура. Еще в 1934 г. они предсказали перспективность применения рентгеноструктурного анализа как метода, «позволяющего получить гораздо более подробные сведения о белковой структуре по сравнению с тем, что могли дать предше- 3.11. Гемоглобин состоит из четырех поли- пептидных цепей Обратимся теперь к гемоглобину - белку, родственному миоглобину. Если миоглобин состоит из одной полипептидной цепи, то гемоглобин - из четырех. Эти четыре цепи удерживаются вместе нековалентными свя- зями. Каждая цепь содержит один гем, и, та- ким образом, в молекуле гемоглобина имеются четыре участка связывания кисло- рода. Гемоглобин А-основной гемоглобин взрослого организма-состоит из двух це- пей одного типа, называемых a-цепи, и двух цепей другого типа, называемых Р-цепи. В целом субъединичная структура гемогло- бина А описывается формулой а2р2. У взрослых есть, кроме того, минорный ге- моглобин А2, на долю которого приходится примерно 2% общего количества гемогло- бина; субъединичная структура этого гемо- глобина а262. Эмбрионы содержат другие гемоглобины. На ранних этапах эмбрио- нального развития выявляется гемоглобин плода а2с2. На смену ему приходит гемогло- бин F с субъединичной структурой а2у2. Биологическое значение этих разных гемо- Рис. 3.24. Модель гемоглобина при низ- ком разрешении. ot-Цепь пока- зана желтым, Р-цепь - синим, гем - красным. (Perutz М. F., The hemoglobin molecule, Scien- tific American, Inc., 1964.) 3. Переносчики кислорода - миоглобин и гемоглобин 63
Миоглобин Рис. 3.25. Сравнение конформаций глав- ной цепи миоглобина и р-цепи гемоглобина. Сходство кон- формаций совершенно очевид- но. (Perutz M.F., The hem- oglobin molecule, Scientific American, Inc., 1964.) ствовавшие физические и химические под- ходы». Прошло, однако, более 20 лет, преж- де чем этот прогноз оправдался. В тот период, когда Перутц избрал объектом своей работы гемоглобин, самым высоко- молекулярным соединением с расшифро- ванной структурой был краситель фтало- цианин, состоящий из 58 атомов. Перутц же взялся за молекулу в сотни раз большую, Не удивительно, что «мои товарищи смотрели на меня с жалостливой улыбкой... По счастью, экзаменаторы, принимавшие мою дипломную работу, не настаивали на окон- чательном установлении структуры, иначе бы я оставался студентом-дипломником в течение 23 лет». Однако Лоуренс Брэгг (L. Bragg), который вместе со своим отцом впервые в 1912 г. применил рентгенострук- турный анализ, стал в это время во главе Кавендишской лаборатории и поддержал работу Перутца. Он писал: «Я не обманы- вал себя в отношении перспективы. Дело выглядело так, как если бы нулевую вероят- ность успеха помножили на бесконечную важность искомого результата; результат Часть I 64 Конформация и динамика этой математической операции был никому не известен». Успех пришел в 1959 г., когда Перутц получил карту электронной плотно- сти низкого разрешения для оксигемогло- бина лошади. Впоследствии были получены карты высокого разрешения как для окси-, так и дезоксигемоглобина лошади и челове- ка. Гемоглобины этих двух видов очень близки по своей структуре. 3.13. Четвертичная структура гемоглобина Молекула гемоглобина имеет почти пра- вильную форму шара диаметром 55 А. Четыре цепи, образующие молекулу гемо- глобина, расположены в виде тетраэдра (рис. 3.24). Четыре гема, по одному у каждой субъединицы, находятся в углубле- ниях на внешней стороне молекулы. Эти четыре кислородсвязывающих участка рас- положены далеко друг от друга: расстояние между двумя ближайшими атомами железа составляет 25 А. Каждая a-цепь контакти- рует с обеими P-цепями. В то же время взаи- модействия между двумя а- или между дву- мя p-цепями незначительны. 3.14. ос- и р-Цепи гемоглобина очень сходны с миоглобином Пространственные структуры миоглобина и а- и p-цепей гемоглобина обладают пора- зительным сходством (рис. 3.25). Близкое подобие в конфигурации основных цепей этих белков оказалось неожиданным, по- скольку в последовательности аминокис- лотных остатков в этих трех полипептидных цепях существует много различий. Собст-
Положение в спирали Гемоглобин человека F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 а-Цепь -Leu-Ser-Ala- Led -Ser -Asp-Leu- His -Ala- 0-Цепь -Phe-Ala-Thr- Uu -Ser -Glu-Leu- H»s -Cys- Миоглобин кашалота - Leu-Lys-Pro- Lsu -Ala -Gln-Ser- His -Ala- \ 7 Единственные идентичные остатки в последовательностях из 9 аминокислот Рис. 3.26. Сравнение аминокислотных последовательностей мио- глобина кашалота и а- и р-це- пей гемоглобина человека на примере участка от остатка F1 по остатка F9. Последователь- ности аминокислот имеют го- раздо меньше сходства, чем пространственные структуры этих трех полипептидных це- пей. венно только 24 положения из 141 иден- тичны во всех трех полипептидных цепях; это показывает, что очень сходные про- странственные структуры могут быть обус- ловлены совершенно разной последователь- ностью аминокислот (рис. 3.26). Совершенно очевидно, что простран- ственная конфигурация миоглобина каша- лота и а- и P-цепей гемоглобина человека имеет общебиологическое значение. В сущ- ности, эта структура свойственна всем мио- глобинам и гемоглобинам позвоночных. Сложная конфигурация полипептидной це- пы, впервые выявленная на примере миоглобина,-это та основная форма, кото- рую природа предназначила для переносчика кислорода: смысл ее в том, что вокруг гема создается такое микроокружение, которое обеспечивает обратимость связывания кис- лорода, 3.15. Критически необходимые остатки в по- следовательности аминокислот К настоящему времени расшифрованы по- следовательности аминокислот в гемогло- бинах более чем 20 видов животных (от ми- ноги до человека). Полученные данные выявили значительное разнообразие амино- кислот в большинстве положений. Есть, од- нако, 9 положений в последовательности, где стоят одни и те же аминокислоты у всех или почти всех обследованных видов (табл. 3.2). Эти консервативные (инва- риантные) положения имеют особо важное значение для функции гемоглобина. Неко- торые из них входят в состав непосредствен- но участка связывания кислорода. К числу других консервативных положений относит- ся тирозин-НС2, который стабилизирует молекулу, образуя водородную связь между спиралями Н и F. Глицин (В6) сохраняется благодаря своему небольшому размеру: бо- ковая цепь более крупная, чем 1 атом водо- рода, препятствовала бы сближению спира- лей В и Е (рис. 3.27); пролин-С2 имеет важное значение, так как им завершается спираль С. Значительную вариабельность проявляют неполярные остатки внутренней части моле- кулы гемоглобина. Однако во всех случа- ях - это замена одного неполярного остатка на другой, также неполярный (например, аланина на изолейцин). Таким образом, вы- раженный неполярный характер внутрен- ней части молекулы сохраняется неиз- менным. Как было указано выше, в обрати- мом оксигенировании гема важную роль играет его расположение в неполярной ни- Таблица 3.2. Консервативные аминокислотные остатки в гемоглобине Положе- ние Аминокислота Функция F8 Г истидин Проксимальный свя- занный с гемом гисти- дин E7 Г истидин Дистальный гистидин вблизи гема CD1 Фенилаланин Контакт с гемом F4 Лейцин То же B6 Г лицин Разрешает сближение спиралей В и Е C2 Пролин Терминирование спирали HC2 Тирозин Перекрестная связь ме- жду спиралями Н и F C4 Треонин Не установлена H10 Лизин » » 3. Переносчики кислорода миоглобин и гемоглобин 65 5-665
ше, где он защищен от воды. Кроме того, наличие внутренней неполярной сердцевины (core) в молекуле гемоглобина стабилизи- рует его пространственную структуру. Остатки аминокислот на поверхности мо- лекулы крайне вариабельны. В самом деле, очень немногие из них имеют устойчивый положительный или отрицательный заряд. Казалось бы, остатки пролина должны про- являть постоянство, поскольку ими завер- шаются участки спирализации. Однако это не так. Инвариантен только один проли- новый остаток, и в то же время во всех мио- глобинах соответствующие длины и направ- ления спиралей практически одинаковы. Очевидно, существуют другие пути терми- нирования и изгиба а-спиралей. 3.16. Возникновение гемоглобина - новый этап в эволюции До сих пор мы акцентировали внимание на структурном сходстве между миоглобином и гемоглобином. Однако функционально эти две молекулы соврешенно различны. Субъединицы гемоглобина имеют ту же конфигурацию, что и миоглобин. Но соеди- нение субъединиц с образованием тетраме- ра а2р2 приводит к появлению новых свойств огромного биологического значе- ния. Этому вопросу посвящена следующая глава. Заключение Миоглобин и гемоглобин - белки, выпол- няющие у позвоночных роль переносчиков кислорода. Миоглобин облегчает перенос кислорода в мышцах и обеспечивает его на- копление в этой ткани. Гемоглобин, находя- щийся в эритроцитах, является переносчи- ком кислорода в крови. Способность этих белков связывать кислород обусловлена на- личием в их молекуле прочно связанной простетической группы гема. Гем представ- ляет собой замещенный порфирин с цен- трально расположенным атомом железа. Железо в геме может быть в ферроформе (+ 2) или ферриформе (+ 3). Только ферро- форма способна связывать О2. Миоглобин представлен одной полипеп- тидной цепью, состоящей из 153 аминокис- лотных остатков (17,8 кДа), и имеет ком- пактную форму. Во внутренней части молекулы находятся почти исключительно неполярные остатки, тогда как снаружи рас- Часть I 66 Конформация и динамика Рис. 3.27. Перекрест цепей В и Е в мио- глобине. В положении В6 прак- тически всегда стоит глицин, поскольку для более длинной, чем у глицина, боковой цепи нет места. положены и полярные, и неполярные амино- кислотные остатки. Около 75% полипептид- ной цепи имеет структуру а-спирали, при- чем имеется 8 спирализованных участков. Единственный феррогем локализован в не- полярной нише, что защищает его от окис- ления в ферриформу. Атом железа в геме не- посредственно связан с атомом азота боковой цепи гистидина. Этот прокси- мальный гистидин (F8) занимает пятое координационное положение. Шестое координационное положение по другую сторону плоскости гема - это участок связы- вания О2. Второй гистидин, называемый дистальным (Е7), расположен непосред- ственно рядом с этим участком. Прокси- мальный гистидин повышает сродство гема к кислороду, а дистальный гистидин оказы- вает стерический эффект, снижая связывание оксида углерода. Дистальный гистидин и другие аминокислотные остатки вблизи шестого координационного положения подавляют также окисление гема в ферри- форму. Из смеси денатурированного (с разверну- той структурой) апомиоглобина и гема можно получить функционально активный миоглобин. Такой опыт по ренату рации по- казывает, что конформация миоглобина
предопределена последовательностью ами- нокислот в нем; аналогичное явление впервые было установлено в отношении ри- бонуклеазы. Во внутренней части молекулы миоглобина сгруппированы неполярные аминокислотные остатки, что, по-видимо- му, обеспечивает взаимное притяжение, не- обходимое для образования свернутой ком- пактной структуры. Гемоглобин состоит из четырех полипеп- тидных цепей, каждая из которых содержит гем. Гемоглобин А-основной гемоглобин взрослого организма - имеет субъединич- ную структуру ОС2Р2- Гемоглобин А2-минорный гемоглобин взрослых - име- ет состав а252, а эмбриональный гемогло- бин F-a2y2. Пространственные структуры а- и P-цепей гемоглобина и миоглобина обладают поразительным сходством, не- смотря на большие различия в последова- тельности аминокислотных остатков. Срав- нение последовательности аминокислот в гемоглобинах многих видов животных по- казало, что положение девяти аминокислот остается во всех случаях практически инва- риантным. К этой группе консервативных аминокислотных остатков относится не- сколько остатков, расположенных вблизи гема, в частности проксимальный и ди- стальный гистидины. Консервативным свойством является также выраженная не- полярность внутренней части структуры ка- ждой субъединицы. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Kendrew J.C., 1961. The three- dimensional structure of a protein molecule, Sci. Amer., 205 (6), 96-111. Perutz M.F., 1964. The hemoglobin molecule, Sci. Amer., 211 (5), 64 76. Kendrew J. C., 1963. Myoglobin and the structure of proteins, Science, 139, 1259-1266. Рентгеноструктурная кристаллогра- фая Matthews В. W., 1977. X-ray structure of proteins. In: Neurath H. and Hill R.L. (eds.), The Proteins (3rd ed.), vol. 3, pp. 404-590, Academic Press. Holmes K.C., Blow D.M., 1965. The Use of X-ray Diffraction in the Study of Protein and Nucleic Acid Structure, Wiley-Interscience. (Прекрасное опи- сание одного из наиболее важных методов в биохимии.) GluskerJ.P., Truebloob K.N., 1972. Crystal Structure Analysis: A Primer, Oxford University Press. (Ясное, чет- кое описание общих принципов рент- ген оструктурной кристаллографии.) Структура миоглобина н гемоглобина Watson Н. С., 1969. The stereochemistry of the protein myoglobin, Prog. Stereochem., 4, 299-333. (Подробное описание трехмерной структуры фер- римиоглобина кашалота; приведены атомные координаты всех, кроме водорода, атомов в структуре.) Takano Т., 1977. Structure of myoglobin refined at 2,0 A resolution, J. Mol. Biol., 110, 537-584. (Структурный анализ ферримиогло- бина и дезоксимиоглобина каша- лота.) Phillips S.E.V., 1978. Structure of oxymyoglobin, Nature, 273, 247-248. Steigemann W., Weber E., 1979. Struc- ture of erythrocruorin in different ligand states refined at 1,4 A resolution, J. Mol. Biol., 127, 309-338. (Структурный ана- лиз высокого разрешения мономер- ного гемоглобина насекомых, похо- жего на миоглобин и гемоглобин.) Perutz M.F., 1976. Structure and mechanism of haemoglobin, Brit. Med. Bull., 32, 195-208. Ренатурация миоглобина Harrison S. C., Blout E.R., 1965. Re- versible conformational changes of myoglobin and apomyoglobin, J. Biol. Chem., 240, 299-303. Физиологические аспекты Wittenberg J. B., 1970. Myoglobin- facilitated oxygen diffusion: role of myoglobin in oxygen entry into muscle, Physiol. Rev., 50, 559-636. Garby L., Meldon J., 1977. The Respiratory Functions of Blood, Plenum. Молекулярная эволюция Zuckerkandl E., 1965. The evolution of hemoglobin, Sci. Amer., 212 (5), 110-118. Dayhoff M.O., Hunt L. T, McLaug- hlin P. J., Jones D.D., 1972. Gene duplications in evolution: the globins. In: Dayhoff M. O. (ed.), Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, pp. 17-30. National Biomedical Research Foundation, Silver Springs, Maryland. Модельные системы Collman J. P., 1977. Synthetic models for the oxygen-binding hemoproteins, Acc. Chem. Res., 10, 265-272. (B высокой степени информативный обзор по проблеме замещенных «огороженных» порфиринов.) Collman J.P., Brauman J.I., Halbert T.R., Suslick K.S., 1976. Nature of O2 and CO binding to metalloporphyrins and heme proteins, Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 3333-3337. (Описываются структурные основы пониженного связывания окиси углерода миогло- бином и гемоглобином.) Traylor T.G., 1978. Hemoprotein oxygen transport: models and mechanisms. In; van Tamelen E. E. (ed.), Bioorganic Chemistry, vol. 4, pp. 437 468, Academic Press. 3. Переносчики кислорода - миоглобин и гемоглобин 67
Вопросы и задачи 1 - Объем эритроцита в среднем со- ставляет 87 мкм3. Концентра- ция гемоглобина в эритроцитах-в среднем 34 г/100 мл. а) Сколько по весу гемоглобина содержится в одном эритроците? б) Сколько молекул гемоглобина содер- жится в одном эритроците? в) Может ли концентрация гемоглобина в эритроцитах сильно увеличиться? (Под- сказка: исходите из предположения, что ге- моглобин в эритроцитах представлен в виде кубических кристаллов с длиной ребра 65 А.) 2. Сколько железа содержится в гемоглобине человека весом 70 кг? Примем, что объем крови составляет 70 мл/кг и содержание гемоглобина в кро- ви= 16 г/100 мл. 3. Содержание миоглобина в неко- торых мышцах у человека составляет 8 г/кг мышц. У кашалота эта величина достигает 80 г/кг мьпцц. а) Сколько кислорода связывается миогло- бином в мышце человека и в мышце каша- лота? Предполагается, что миоглобин на- сыщен О2. б) В воде тканей (в состоянии равновесия с венозной кровью при t = 37°С) растворяет- ся примерно 3,5 • 10”5 М О2. Каково соотно- шение между кислородом, связанным с мио- глобином, и свободнорастворенным кисло- родом в мышце кашалота? 4. Миоглобин кашалота имеет следующий аминокислотный состав: Ala 5 Gin 5 Leu 18 Ser 6 Arg 4 Glu 14 Lys 19 Thr 5 Asn 2 Gly 11 Met 2 Trp 2 Asp 6 His 12 Phe 6 Туг 3 Cys 0 He 9 Pro 4 Vai 8 а) Определите общий заряд ферромиогло- бина при pH 2, 7 и 9. б) Определите изоэлектрическую точку миоглобина. Изоэлектрическая точка-это значение pH, при котором молекула не имеет заряда. 5. Раствор миоглобина обработан бромистым цианом. а) Каковы продукты расщепления? Вос- Часть I 68 Конформация и динамика пользуйтесь приведенной последователь- ностью аминокислот в молекуле миогло- бина. 6) В водном растворе продукты расщепле- ния содержат очень мало а-спирализо- ванных участков. Как это характеризует ста- бильность а-спиралей в водной среде? 6- Связывание кислорода с мио- глобином описывается простым выражением равновесия: Mb + О2 МЬО2. Пусть [Mb] = концентрация дезоксимио- глобина; [МЬО2]-концентрация оксимио- глобина; рО2-концентрация О2 (выражен- ная в виде парциального давления О2); Р50-эторО2, при котором [Mb] = [МЬО2]. Составьте уравнение, аналогичное уравне- нию Хендерсона-Хассельбальха, где соот- ношение оксимиоглобина к дезоксимиогло- бину было бы представлено как функция рО2 и Р50. 7. Константа равновесия К для связывания кислорода миогло- бином равна 10 6 М, причем К = = [Mb] [О2]/[МЬО2]. Константа скорости связывания О2 с миоглобином составляет 2107 М’^с’1. а) Какова константа скорости отщепления О2 от оксимиоглобина? б) Какова средняя продолжительность су- ществования оксимиоглобинового комплек- са? 8, Светопоглощение А раствора определяется как Л —lg(/0/7), где 10-интенсивность падающего света (на входе), а /-интенсивность прошедшего че- рез раствор света (на выходе). Светопогло- щение раствора зависит от молярного коэф- фициента светопоглощения (коэффициент экстинкции) е (размерность см 1 М “1), кон- центрации с (в М) и длины светового пути I (в см) : А = е/с. Коэффициент экстинкции миоглобина для 580 нм составляет 15000 см-1 М-1. Како- во светопоглощение раствора миоглобина в концентрации 1 мг/мл при длине светово- го пути 1 см? Какой процент падающего света проходит через раствор?
ГЛАВА 4. Гемоглобин: аллостерический белок Переход в процессе эволюции от мономер- ного миоглобина к тетрамерному гемогло- бину сопровождался появлением новых свойств. Молекула гемоглобина значитель- но сложнее, чем молекула миоглобина. Пре- жде всего гемоглобин помимо О2 транспор- тирует Н+ и СО2. Во-вторых, связывание кислорода гемоглобином регулируется спе- цифическими компонентами внутренней среды, а именно Н + , СО2 и органическими фосфорными соединениями. Эти регуля- торы оказывают сильнейшее влияние на способность гемоглобина связывать кисло- род, несмотря на то что они присоединяют- ся к белку в участках, отстоящих далеко от гема. Вообще так называемое аллостериче- ское взаимодействие, т.е. взаимодействие между пространственно разделенными участками, имеет место во многих белках. Аллостерические эффекты играют важней- шую роль в регуляции и интеграции молеку- лярных процессов в биологических систе- мах. Гемоглобин является наиболее изу- ченным аллостерическим белком, и потому имеет смысл более подробно рассмотреть его структуру и функцию. 4.1. Функциональные различия между мио- глобином и гемоглобином Гемоглобин-аллостерический белок, мио- глобин таковым не является. Это различие выражается тремя путями: 1. Присоединение О2 к гемоглобину по- вышает связывание дополнительных моле- кул О2 той же молекулой гемоглобина. Дру- гими словами, кислород связывается с гемоглобином кооперативно. Связывание кислорода миоглобином, напротив, являет- ся некооперативным. 2. Сродство гемоглобина к кислороду за- висит от pH, тогда как миоглобин такой за- висимости не проявляет. Молекулы СО2 также влияют на способность гемоглобина связывать кислород. 3. Сродство гемоглобина к кислороду ре- гулируется органическими фосфорными со- единениями, в частности бисфосфоглицера- том. В результате гемоглобин проявляет меньшее сродство к кислороду, чем миогло- бин. 4.2. Кооперативность связывания кислорода гемоглобином Отношение занятых кислородом участков связывания к их общему числу представляет собой степень насыщения, или просто насы- щение гемоглобина кислородом, и обозна- чается У. Значение У изменяется от 0 (все участки свободны) до 1 (все участки заняты). График зависимости Уот парциального да- Рис. 4.1. Модель гемоглобина при низ- ком разрешении. а-Цепи пред- ставлены желтым, Р-цепи-си- ним, тем-красным. (Perutz M.F., The hemoglobin molecule, Scientific American, Inc., 1964.) 4. Гемоглобин: аллостерический белок 69
вления кислорода рО2 называется кривой диссоциации кислорода. Кривые диссоциации кислорода для гемоглобина и миоглобина различаются в двух отношениях (рис. 4.2 и 4.3). Во-первых, при любом рО2 для мио- глобина насыщение У выше, чем для гемо- глобина. Другими словами, миоглобин обла- дает более высоким сродством к О2, чем гемоглобин. Сродство к кислороду характе- ризуют величиной Р50, численно равной парциальному давлению кислорода, при ко- тором насыщены 50% участков связывания (т.е. У =0,5). Для миоглобина Р50 соста- вляет обычно 1 торр, а для гемогло- бина-26 торр. Торр- единица давления, численно равная тому давлению, которое производит стол- бик ртути высотой 1 мм при 0°С и стандартном ускорении силы тяжести (1 мм Hg). Названа в честь Эванджелисты Торричелли (1608-1647), изобретателя ртут- ного барометра. Второе различие состоит в том, что кри- вая диссоциации кислорода в случае миогло- бина имеет гиперболическую форму, а в слу- чае гемоглобина-сигмоидную. Как будет указано ниже, сигмоидная форма кривой идеально соответствует физиологической роли гемоглобина как переносчика кислоро- да в крови. На молекулярном уровне сиг- моидность формы означает, что связывание кислорода гемоглобином происходит коо- перативно, т. е. присоединение кислорода к одному гему облегчает его присоединение к остальным. Рассмотрим кривые диссоциации кисло- рода с количественной стороны, начав с миоглобина как более простого. Связыва- ние кислорода с миоглобином (Mb) описы- рО2, торр Рис. 4.2. Диссоциационная кривая кис- лорода для миоглобина и ге- моглобина. Насыщенность участков, связывающих кисло- род, показана как функция пар- циального давления кислорода в окружающем растворе. Часть I 70 Конформация и динамика вается следующим уравнением: MbO2 Mb + О2. (1) Константа равновесия процесса диссоциа- ции оксимиоглобина составит [МЬ][О2] [МЬО2] ’ (2) где [МЬО2]-концентрация оксимиогло- бина, [Mb]-концентрация дезоксимиогло- бина, [О2]-концентрация свободного кис- лорода, причем все эти величины выражены в молях на литр. Степень насыщения У опре- деляется как [мьо2] [МЬО2] + [Mb] (3) Производя замещения в уравнении (3) на основе равенства (2), получаем [О2] [О2] + к- (4) Поскольку О2 - это газ, удобнее выражать его концентрацию в виде рО2, т.е. пар- циального давления кислорода (в торрах) в окружающей раствор атмосфере. Тогда уравнение (4) принимает следующий вид: рО2 (5) Уравнение (5) графически выражается ги- перболой. В самом деле, кривая диссоциа- ции кислорода, рассчитанная по уравнению (5) при Р50, равном 1 торр, хорошо соответ- ствует экспериментальной кривой, получен- ной для миоглобина. В отличие от этого для гемоглобина кри- вая диссоциации кислорода имеет сигмоид-
ную форму и не совпадает ни с одной кри- вой, описываемой уравнением (5). Это свидетельствует о кооперативном связыва- нии О2 молекулой гемоглобина. Рассмот- рим крайний случай, когда имеются только дезоксигемоглобин и гемоглобин (НЬ), со- держащий 4 связанные молекулы О2: НЬ(О2)4 <=> НЬ + 4О2. (6) Константа равновесия этой гипотетиче- ской реакции составит [НЬ][О2]< [НЬ(О2)4] (7) и далее (рО2)4 (рО2)* + (Зоо- графически уравнение (8) выражается сиг- моидной кривой (рис. 4.4). Заметим, однако, что расчетная кривая идет круче, чем кри- вая, полученная экспериментально. Други- ми словами, схема процесса, описанная работающей мышцы альвеолах Рис. 4.3. Кривая диссоциации кислоро- да для гемоглобина. На оси абсцисс отмечены значения рО2, характерные для капилля- ров работающей мышцы и для альвеол легких. Обратите вни- мание, что Р50 для гемогло- бина в физиологических усло- виях лежит между этими ве- личинами. бина кислородом лежит между диссоциационными кривыми, рассчитанными для п — 1 (не- кооперативное связывание) и п = 4 (полностью кооператив- ное связывание). уравнением (6), является крайностью. Как же тогда охарактеризовать процесс связывания с промежуточной степенью коо- перативности? В 1913 г. Арчибальд Хилл показал, что кривая, построенная по данным определения связывания кислорода гемоглобином, описывается уравнением, со- ответствующим гипотетическому процессу: НЬ(О2)„ НЬ + пО2. (9) Насыщение У в этом случае составит (рО2)" (ро2г + (Р50)"’ (Ю) После преобразований получим Y _/рО2\" 1 - У \Р5о/ (Н) Последнее уравнение показывает, что от- ношение оксигема (У) к дезоксигему (1 — У) равно возведенному в и-ю степень отноше- нию рО2 к Р50. Прологарифмируем это уравнение: lg 3'7) = ",8p°2~"lgp50' (12> Подчеркнем, что зависимость lg[y/(l — — У)] от lgpO2 выразится прямой с углом 71
наклона п. Такой график называется графи- ком Хилла, а величина наклона п в точке по- лунасыщения кислородом (У=0,5) состав- ляет коэффициент Хилла. Миоглобин дает линейный график Хилла с п=1,0, тогда как гемоглобин-с п = 2,8 (рис. 4.5). Наклон, равный 1,0, означает, что молекулы кислорода присоединяются к миоглобину независимо друг от друга, как это описано в уравнении (1). С другой сто- роны, коэффициент Хилла, равный 2,8, указывает на кооперативное связывание кис- лорода гемоглобином. Присоединение О2 к одному гему облегчает присоединение кислорода к другим гемам того же тетраме- ра, и обратно: отщепление кислорода от одного гема облегчает его отщепление от остальных. Другими словами, в молекуле гемоглобина имеется взаимосвязь между ге- мами. Кооперативность связывания кисло- рода гемоглобином называют иногда взаи- модействием гем—гем. Механизм его мы обсудим ниже. Рис. 4.5. График Хилла для связывания кислорода миоглобином и ге- моглобином. Наклон 2,8 для гемоглобина свидетельствует о кооперативном связывании кислорода; миоглобин, напро- тив, связывает кислород не- кооперативно, о чем свиде- тельствует наклон кривой, равный 1,0. 4.3. Кооперативное связывание кислорода гемоглобином увеличивает транспорт кисло- рода Кооперативное связывание кислорода по- вышает эффективность гемоглобина как переносчика кислорода. При изменении пар- циального давления кислорода насыщение им гемоглобина меняется быстрее, чем это происходило бы в случае независимости всех участков связывания друг от друга. Рассмотрим такой пример. Допустим, что рО2 в альвеолах легких составляет 100 торр, а в капиллярах работающей мышцы-20 торр. Пусть Р50 = 30 торр и п = 2,8. Тогда Ув капиллярах альвеол составит 0,97, а в ка- пиллярах мышц-0,25. Количество высвобо- дившегося в тканях кислорода пропорцио- нально разнице в величинах X т.е. 0,72. Теперь сделаем тот же расчет для гипотети- ческого переносчика кислорода, который ха- рактеризуется тем же Р50 = 30 торр, но не- кооперативно связывает кислород (и = 1). В ЭТОМ Случае Хльвеолы ^>^7, УМЫпщы 0,41 и ДУ= 0,36. Отсюда ясно видно, что коопера- тивное связывание кислорода гемоглобином по сравнению с некооперативным позволяет удвоить высвобождение кислорода в тканях. 4.4. Н+ и СО2 способствуют высвобождению О2 (эффект Бора) Изменения pH в широком диапазоне, а так- же содержание СО2 не оказывают заметно- го действия на связывание кислорода мио- глобином. В случае гемоглобина, напротйв, закисление среды способствует отщеплению кислорода. Снижение pH в физиологических пределах сдвигает кривую диссоциации кис- лорода вправо, т.е. сродство к кислороду уменьшается (рис. 4.6). Повышение концен- трации СО2 (при постоянном pH) также уменьшает сродство к кислороду. В тканях с высоким уровнем метаболизма, например в работающей мышце, образуется много СО2 и кислот. Повышение содержания СО2 и Н+ в капиллярах активно метаболизирую- щих тканей способствует отщеплению О2 от оксигемоглобина. Этот важный механизм повышенной потребности в кислороде, ха- рактерной для тканей с активным метабо- лизмом, был открыт в 1904 г. Кристианом Бором (Ch. Bohr). Противоположный эффект, обнару- женный 10 лет спустя Джоном Холдейном (J. Haldane), имеет место в капиллярах лег- ких. Здесь высокая концентрация О2 способ- ствует отщеплению Н+ и СО2 от гемогло- бина совершенно аналогично тому, как высокая концентрация Н + и СО2 в активно метаболизирующих тканях способствует Часть I 72 Конформация и динамика
высвобождению О2. Эти взаимоотношения между связыванием О2, Н+ и СО2 известны под названием эффект Бора (рис. 4.7). 4.5. Бисфосфоглицерат снижает сродство к кислороду Сродство к кислороду гемоглобина, находя- щегося в эритроцитах, ниже, чем'у гемо- глобина в растворе. Еще в 1921 г. Джозеф Баркрофт (J. Barcroft) поставил вопрос: «Не присутствует ли [в эритроцитах] какое-то третье вещество... составляющее интеграль- ную часть кислород-гемоглобинового ком- плекса?» Действительно, такое вещество есть. В 1967 г. Рейнхолд Бенеш (R. Benesch) и Рут Бенеш (Ruth Benesch) показали, что 2,3-бисфосфоглицерат (БФГ) присоединяет- ся к гемоглобину и тем самым оказывает сильное влияние на его сродство к кислоро- ду. БФГ содержится в эритроцитах пример- но в той же молярной концентрации, что и гемоглобин. В отсутствие БФГ Р50 для ге- моглобина составляет 1 торр, как и для миоглобина, в присутствии БФГ Р50 для ге- моглобина становится 26 торр (рис. 4.8). Та- ким образом, БФГ снижает сродство гемо- глобина к кислороду в 26 раз. БФГ играет важную роль в физиологии: в отсутствие БФГ гемоглобин, проходя через капилляры тканей, где рО2 равно ~ 26 торр, высвобо- ждал бы лишь очень мало О2. БФГ влияет на сродство гемоглобина к кислороду путем присоединения к дезок- сигемоглобину, но не к оксигемоглобину. Связывание кислорода и связывание БФГ - взаимоисключающие процессы. В определенном приближении оксигениро- вание гемоглобина в присутствии БФГ вы- ражается следующим уравнением: Hb -БФГ + 4О2 НЬ(О2)4 4- БФГ. 2,3- бисфосфоглицерат (БФГ) Рис. 4.6. Влияние pH на сродство гемо- глобина к кислороду. Сниже- ние pH от 7,6 до 7,2 приводит к высвобождению кислорода из оксигемоглобина. О2НЬ + Н+ + СО2 В тканях с актив- /Ав легочных ным метаболизмом, | альвеолах например в мышцах I 1 Н+ Ht/ + 02 С02 Рис, 4,7. Сущность эффекта Бора. Ме- ханизм и стехиометрия про- цессов представлены в упро- щенном виде. р02, торр Рис. 4.8. Бисфосфоглицерат снижает сродство гемоглобина к кисло- роду. 4. Гемоглобин: аллостерический белок 73
4.6. Клиническое значение биофосфо- глицерата Выявление роли БФГ в транспорте кислоро- да сыграло важную роль в нескольких обла- стях клинической медицины. Так, например, на протяжении ряда лет оставалось непо- нятным, почему в крови, консервированной в среде кислота- цитрат - декстроза (обще- принятая для консервирования крови среда), сродство к кислороду возрастает: Р50 стано- вится равным 16 вместо 26 торр. Теперь установлено, что повышение сродства к кис- лороду обусловлено одновременным сниже- нием содержания БФГ с 4,5 до менее чем 0,5 мМ за 10 дней хранения крови. Сродство консервированной крови к кислороду имеет крайне важное значение в клинических усло- виях. Если больному переливают большое количество крови с высоким сродством к кислороду, то возникает опасность недо- статочного снабжения кислородом тканей. Попавшие в кровяное русло эритроциты, полностью лишенные БФГ, восстанав- ливают половину его нормального содер- жания за 24 ч. Этот срок может оказаться неприемлемым для тяжелых больных. Та- ким образом, в определенных условиях сле- дует обращать внимание на то, чтобы при переливании крови больной получил эри- троциты с нормальным сродством к кисло- роду. Добавлением БФГ нельзя повысить его содержание в эритроцитах, так как БФГ, обладая высоким зарядом, не проходит че- рез клеточную мембрану. Можно, однако, предотвратить снижение концентрации БФГ в консервированных клетках, добавляя в среду инозин. Незаряженные молекулы инозина проходят через мембрану эритро- цита и внутри клетки в результате сложной серии реакций (разд. 15.4) превращаются Часть I Конформация н динамика в БФГ. В настоящее время инозин широко используется для сохранения функциональ- ной полноценности консервированной кро- ви. Открытие роли БФГ позволило также по- нять и некоторые адаптивные механизмы, включающиеся при нарушении снабжения тканей кислородом (т.е. при гипоксий). Возь- мем для примера больных с тяжелой об- структивной эмфиземой легких. При этом заболевании затруднено поступление возду- ха в бронхиолы; в результате артериальная кровь недостаточно насыщается кислоро- дом. рО2 в артериальной крови таких больных составляет только 50 торр, т. е. оно вдвое ниже, чем в норме. Но при этом про- исходит компенсаторный сдвиг кривой на- сыщения кислородом, обусловленный повы- шением концентрации БФГ с 4,5 до 8,0 мМ. При таком содержании БФГ Р50 становится равным уже не 26, а 31 торр. При Р50 = = 31 торр насыщение кислородом в арте- риях (YJ составляет 0,82, а в венах (Yv)-0,49; артерио-венозная разница (А У) равна 0,33. При нормальном значении Р50 (Р50 — = 26 торр) УА = 0,86, Yv = 0,60 и AY = 0,26. Сдвиг кривой диссоциации кислорода со- здает то преимущество, что увеличивает А У с 0,26 до 0,33. Таким образом, повышение концентрации БФГ приводит к увеличению доставки кислорода в ткани на 27%. При некоторых нарушениях обмена ве- ществ в эритроцитах содержание БФГ из- меняется, что сопровождается соответ- ственным изменением сродства гемогло- бина к кислороду. Эти нарушения обсу- ждаются в одной из следующих глав (разд. 12.18). Нерешенной проблемой физиологии ды- хания является механизм адаптации к высо- те. И в этом случае изменение уровня в со- держании БФГ имеет, по-видимому, суще- ственное значение. Когда человек подни- мается от уровня моря на высоту 4500 м, уже через 2 дня концентрация БФГ в его эритроцитах возрастает с 4,5 до 7,0 мМ и со- ответственно снижается сродство к кисло- роду. Насыщение артериальной крови кис- лородом уменьшается из-за снижения Р50, но количество транспортируемого кислоро- да возрастает (возрастает А У), так как боль- ше высвобождается кислорода в капилляр- ной сети. При спуске с гор на уровень моря концентрации БФГ и Р50 возвращаются к исходным величинам. 74
4.7. Гемоглобин плода характеризуется вы- соким сродством к кислороду Эмбрионам свойственен особый тип гемо- глобина - гемоглобин F (а2у2), который, как уже упоминалось ранее, отличается от гемо- глобина взрослых. Важнейшая особенность гемоглобина F состоит в том, что в физио- логических условиях его сродство к кисло- роду выше, чем сродство к кислороду у ге- моглобина А (рис. 4.9). Более высокое сродство к кислороду гемоглобина F соз- дает оптимальные условия для транспорта кислорода из крови матери в кровь плода. Гемоглобин F оксигенируется за счет гемо- глобина А (находящегося по другую сторо- ну трансплацентарного барьера в кровенос- ной системе плаценты). Высокое сродство крови плода к кислоро- ду известно уже на протяжении многих лет, однако причина этого явления выяснилась лишь недавно. Оказалось, что гемоглобин F слабее связывает БФГ, чем гемоглобин А, и, следовательно, обладает более высоким сродством к О2. В самом деле, в отсутствие БФГ величины сродства этих гемоглобинов располагаются в обратном порядке. Это ка- залось загадочным до тех пор, пока не выяс- нилось, что экспериментальное определение кривых диссоциации кислорода следует проводить при добавлении БФГ, поскольку это соединение присутствует в эритроцитах как плода, так и взрослого. 4.8.. Для проявления аллостерического эф- фекта необходимо взаимодействие субъединиц Рассмотрим структурную основу аллосте- рических эффектов. Гемоглобин можно рас- щепить на составляющие его полипеп- тидные субъединицы. Выделенные а-цепи гемоглобина по своим свойствам имеют' много общего с миоглобином. Сама по себе ос-цепь характеризуется высоким сродством к кислороду, гиперболической кривой дис- социации кислорода и таким связыванием О2, которое нечувствительно к изменению pH, концентрации СО2 и содержанию БФГ. Изолированные p-цепи легко образуют те- трамер р4„ называемый гемоглобином Н. Подобно a-цепи и миоглобину, р4 пол- ностью лишен аллостерических свойств. От- сюда следует, что аллостерические свойства гемоглобина возникают в результате взаи- модействия субъединиц. Функциональная единица гемоглобина-это тетрамер, сос- тоящий из полипептидных цепей двух типов. Рис. 4.9. Эритроциты плода обладают более высоким сродством к кислороду, чем эритроциты матери. В присутствии бисфос- фоглицерата сродство к кисло- роду гемоглобина плода выше, чем у гемоглобина матери. Рис. 4.10. Проекция части карт элек- тронных плотностей оксигемо- глобина (красный) и дезоксиге- моглобина (синий), полученная при разрешении 5,5 А. Пока- заны спирали А и Н двух Р-це- пей гемоглобина. Центральная часть схемы соответствует центральному углублению в молекуле. Здесь показано одно из конформационных из- менений гемоглобина, сопут- ствующих присоединению кис- лорода, а именно сближение двух Н-спиралей. [Perutz М. F., Nature, 228, 738 (1970).] 4. Гемоглобин: аллостерический белок 75
Рис. 4.11. Модель оксигемоглобина при низком разрешении. Показаны два вида контактов между а- и Р-цепями. а-Цепи изобра- жены белым, P-цепи серым. Три гема, видные на модели, обозначены буквой Н. Область а2Ргконтактов показана си- ним, а аД-контакта- желтым. [Perutz M.F., TenEyck L.F., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 36, 196 (1971).] 4.9. Четвертичная структура гемоглобина значительно изменяется при оксигенировании В 1937 г. Феликс Гауровиц (F. Haurowitz) обнаружил, что кристаллы дезоксигемогло- бина при оксигенировании разрушаются. Объясняется это тем, что структура оксиге- моглобина заметно отличается от струк- туры дезоксигемоглобина и оксигениро- ванные молекулы уже не укладываются в кристаллическую решетку дезоксигемо- глобина. В противоположность этому на кристаллы миоглобина, так же как и на кри- сталлы р4, оксигенирование не влияет. Как показал рентгеноструктурный ана- лиз, окси- и дезоксигемоглобин существенно различаются по четвертичной структуре Часть I 76 Конформация и динамика (рис. 4.10). Оксигенированная молекула бо- лее компактна. Например, при присоедине- нии О2 расстояние между атомами железа в р-цепях уменьшается с 39,9 до 33,4 А. Особый интерес представляют изменения в области контактов между а- и р-цепями. Существуют два типа контактов между а- и р-цепями, обозначаемые соответственно а^- и otiр2-контактами (рис. 4.11). При переходе гемоглобина из окси- в дезокси- форму QCjpi-контакт практически не меняет- ся, тогда как а1Р2-контакт претерпевает большие структурные изменения. В резуль- тате присоединения кислорода одна пара субъединиц ар поворачивается относитель- но другой пары ар на 15° (рис. 4.12). Неко- торые атомы в этой области раздела пере- мещаются на расстояние, достигающее 6 А. По существу область контакта atp2 функ- ционирует как переключатель с одной структуры на другую. Каждая из форм тако- го похожего на ласточкин хвост контакта стабилизирована собственным набором во- дородных связей (рис. 4.13). Контакт ajp2 расположен вблизи гемов. Следовательно, структурные изменения в этой области могут оказывать влияние на гем. Важное значение контакта подтвер- ждается также и тем, что у всех позво- ночных он состоит в основном из одних и тех же аминокислотных остатков. Кроме того, практически при всех мутациях, затра-
Дезокси Рис. 4.12. Схема, иллюстрирующая из- менения четвертичной струк- туры гемоглобина при оксиге- нировании. Одна пара а|3- субъединиц сдвигается по от- ношению к другой путем пово- рота на 15° и продвижения на 0,8 А. Оксиформа повернутой пары ар-субъединиц показана красным, дезоксиформа - си- ним. [Baldwin J., Chothia С., J. Mol. Biol., 129, 192 (19Э9).] гивающих контакт взаимодействие гем—гем оказывается сниженным, тогда как при мутациях контакта otjPi этого не происходит. 4.10. Солевые связи между отдельными це- пями придают жесткость структуре дезокси- гемоглобина В оксигемоглобине С-концевые остатки во всех четырех цепях обладают практически полной свободой вращения. В дезоксигемо- глобине, напротив, эти концевые группы за- якорены (рис, 4.14). Дело в том, что, во- первых, карбоксильный конец oq-цепи взаи- модействует с аминоконцом а2-пепи. Во- вторых, боковая цепь аргинина на этом С-конце образует связь с аспартатом а2-цепи. В-третьих, карбоксильный конец ргцепи связан с боковой цепью лизина, принадлежащего ос2-цепи Наконец, имида- зольная боковая цепь С-концевого остатка ргцепи взаимодействует с боковой цепью аспартата, также принадлежащего ргцепи. Эти пары аминокислотных остатков обра- зуют так называемые солевые связи, т. е. не- ковалентные электростатические связи меж- ду противоположно заряженными группа- ми. Из-за образования этих восьми солевых связей дезоксигемоглобин имеет более жесткую, напряженную структуру, чем окси- гемоглобин. Четверти ч ная структура дезоксигемо- глобина обозначается как Т-форма (от англ, tense-напряженная), тогда как четвертич- ная структура оксигемоглобина - как R-фор- ма (от англ, relaxed-релаксированная). Обозначения Т и R обычно используются для описания альтернативных четвертичных структур аллостерических белков, причем Т- форма всегда имеет меньшее сродство к субстрату. 4.11. При оксигенировании атом железа пере- мещается в плоскость порфирина Выше речь шла о конформационных изме- нениях, происходящих на некотором рас- стоянии от гема. Посмотрим теперь, что Оксигенирование Рис. 4.13. Область а ^-контакта при ок- сигенировании переходит от Т- формы к R-форме. Конфигура- ция контактирующих поверх- ностей в виде ласточкина хво- ста позволяет двум субъедини- цам легко скользить относи- тельно друг друга. 4. Гемоглобин: аллостерический белок 77
Asp- .. .His+ Концевая СОО”-группа ... Lys+ 1 Asp- ... Arg+ Концевая СОО“группа ... концевая NH3-группа Рис. 4.14. Перекрестные связи между субъединицами в дезоксигемо- глобине. При оксигенировании эти нековалентные электроста- тические связи легко разры- ваются. происходит с самим гемом при оксигениро- вании. В дезоксигемоглобине о атом железа выступает примерно на 0,6 А из плоскости гема вследствие стерического отталкива- ния, возникающего между проксимальным гистидином и атомами азота порфириново- го кольца (рис. 4.15). При оксигенировании атом железа перемещается в плоскость порфирина, образуя прочную связь с О2. При- рост энергии, обусловленный формирова- нием этой связи, более чем в 10 раз покры- вает затрату энергии на передвижение проксимального гистидина ближе к плоскости гема. Изучение структуры боль- шого числа синтезированных железопорфи- ринов показало, что в соединениях, где заня- то 5 координационных положений, атом железа лежит вне плоскости гема, но если заняты все 6 координационных положений, то атом железа находится в плоскости или почти в плоскости гема. Локализация атома железа зависит также от спина его электро- нов, а именно высокоспиновое состояние способствует расположению вне плоскости. Часть I 78 Конформация и динамика Гистидин F8 Рис. 4.15. При оксигенировании атом железа перемещается в пло- скость гема. Проксимальный гистидин (F8) тянется вслед за атомом железа и становится менее наклоненным. Атом же- леза исходно не лежит в пло- скости гема вследствие стери- ческого отталкивания, возни- кающего между атомом угле- рода имидазольного кольца и атомом азота гема.
Спираль F Рис, 4.16. Конформационные изменения, индуцированные движением атома железа при оксигениро- вании. Проксимальный гисти- дин притягивается атомом же- леза и становится менее накло- ненным. Оксигенированная структура показана красным, дезоксигенированная - синим. [Baldwin J., Chothia С., Mol. Biol., 129, 192 (1979).] 4.12. Движение атома железа передается на другие субъединицы через проксимальный гистидин Каким образом перемещение атома железа в плоскость гема может способствовать переключению четвертичной структуры с Т- формы на R? Ключевым элементом в пере- даче структурных изменений от гема одной субъединицы к другой субъединице служит боковая цепь проксимального гистидина, которую тянет за собой перемещающийся атом железа (рис. 4.16). Гем и прокси- мальный гистидин образуют тесные кон- такты с боковыми цепями 15 аминокис- лотных остатков, и потому при оксигениро- вании меняются структуры спирали F, углов EF и FG. Эти сдвиги передаются затем на области межсубъединичных контактов. Ти- розин НС2, располагавшийся в кармане между спиралями F и Н, выдвигается нару- жу, что приводит к разрыву солевых связей между цепями. В результате равновесие ме- жду двумя четвертичными структурами при оксигенировании сдвигается в сторону R- формы. Итак, изменение структуры внутри одной субъединицы (оксигенирование) приво- дит к изменению структуры в области кон- тактов субъединиц. Таким путем присоеди- нение кислорода к одному гему передается на отдаленные от этого гема части моле- кулы. 4.13. Механизм кооперативного связывания кислорода Почему четвертая молекула О2 связывается гемоглобином примерно в 300 раз прочнее, чем первая? Понять это явление можно из аналогии, приведенной на рис. 4.17. Дезок- сигемоглобин имеет жесткую структуру, усиленную восемью солевыми связями меж- ду четырьмя субъединицами. Присоедине- ние кислорода может произойти лишь после того, как разрыв каких-то из этих связей позволит атому железа переместиться в плоскость гема. Сколько должно разор- ваться солевых связей, чтобы присоедини- лась молекула О2 ? Это зависит от того, ка- кая по счету молекула должна присоеди- ниться: первая, вторая, третья или четвер- тая. Для связывания первой молекулы О2 необходимо разорвать больше связей, чем для связывания последующих. Поскольку разрыв солевых связей требует энергии, присоединение первой молекулы О2 энерге- тически менее выгодно, чем присоединение 4. Гемоглобин: аллостерический белок 79
Рис. 4.17. Пояснение хода оксигенирова- ния гемоглобина на примере почтовых марок. Для того чтобы оторвать одну марку из четырех, нужно разорвать две перфорированные стороны. Чтобы отделить вторую мар- ку, нужно произвести разрыв только с одной стороны; чтобы отделить третью-тоже с одной. После этого четвертая марка остается свободной. остальных. Присоединение же второй и третьей молекул О2 по величине затраты энергии занимает промежуточное положе- ние между первой и четвертой (рис. 4.18). Такое постепенное увеличение сродства к кислороду придает кривой связывания О2 ту сигмоидность формы, которая выявляет- ся экспериментально. Этот аллостерический механизм можно описать и на уровне более тонкой структу- ры. Почти все молекулы дезоксигемогло- бина находятся в Т-форме. По мере после- довательного связывания молекул О2 воз- растает вероятность перехода в R-форму. Сродство Т-формы к 02 в 300 раз ниже, чем сродство R-формы, так как в Т-форме пере- движение проксимального гистидина в плос- кость гема имеет больше ограничений. В частности, в Т-форме проксимальный ги- стидин больше наклонен к плоскости гема Часть I 80 Конформация и динамика (см. рис. 4.16), а потому и увеличено стери- ческое отталкивание, препятствующее его перемещению. Более симметричное положе- ние проксимального гистидина в R-форме облегчает его приближение к гему. Кроме того, в Т-форме участок связывания О2 в 0- субъединице заслонен валином Е11 в боль- шей степени, чем в R-форме. 4.14. Бисфосфоглицерат снижает сродство к кислороду путем образования перекрестных связей с дезоксигемоглобином БФГ специфически связывается с дезоксиге- моглобином в соотношении 1 БФГ на 1 тет- рамер гемоглобина. Это очень интересная стехиометрия. Казалось бы, белок, имею- щий структуру а202, должен обладать по крайней мере двумя участками связывания какого бы то ни было небольшого соедине- ния. Наличие только одного участка связы- вания тотчас же наводит на мысль, что БФГ связывается по оси симметрии молекулы ге- моглобина в центральной полости, где схо- Связываемые молекулы О2 Рис. 4.18. Свободная энергия связи по- следовательных молекул О2 (ср. с моделью, описанной на рис. 4.17). Сродство связыва- ния (-AG0) возрастает, так как для присоединения четвер- той молекулы О2 нужно разор- вать меньше перекрестных свя- зей, чем для присоединения первой.
дятся 4 субъединицы (рис. 4.19). Участок связывания БФГ образован положительно заряженными остатками, принадлежащими обеим P-цепям, а именно: а-аминогруппой, лизином EF6 и гистидином Н21. Очевидно, что эти группы легко взаимодействуют с от- рицательно заряженным БФГ, имеющим при физиологическом значении pH почти 4 отрицательных заряда. Стереохимически БФГ комплементарен констелляции из 6 по- ложительно заряженных групп Р-цепей, обращенных к внутренней полости моле- кулы гемоглобина (рис. 4.20). Более слабое связывание БФГ гемоглобином плода по сравнению с гемоглобином А объясняется тем, что у гемоглобина плода в положении Н21 находится серин, а не гистидин. При оксигенировании БФГ отщепляется, поскольку центральная полость становится слишком мала. В частности, сужается про- межуток между Н-спиралями p-цепей. Кро- ме того, расстояние между а-аминогруппа- ми возрастает с 16 до 20 А, вследствие чего исчезает контакт между ними и фосфатны- ми группами БФГ. Теперь нам понятно, почему БФГ снижает сродство к кислороду. Образуя пере- крестные связи с ft-цепями, БФГ стабилизи- рует четвертичную структуру дезоксигемо- глобина. Другими словами, БФГ сдвигает равновесие в сторону Т-формы. Как уже упоминалось, в дезоксигемоглобине имеет- ся 8 солевых связей, заякоривающих его концевые карбоксильные остатки. Для того чтобы произошло оксигенирование, эти со- левые связи необходимо разорвать. Присое- динение БФГ создает дополнительные со- левые связи, которые должны быть разор- ваны. В итоге сродство гемоглобина к кислороду при присоединении БФГ оказывается сниженным. 4.15. СО2 присоединяется к концевым амино- группам гемоглобина, снижая его сродство к кислороду У аэробных организмов на одну молекулу потребленного О2 образуется примерно 0,8 молекулы СО2. Большая часть СО2 транс- портируется кровью в виде бикарбоната, ко- торый образуется в эритроцитах под дей- ствием карбоангидразы: со2 + н2о <=> нсо; + н+. Значительная часть Н + , высвобождающего- ся в этой реакции, присоединяется к дезокси- гемоглобину и таким образом участвует Участок связывания бисфосфоглицерата Рис. 4.19. Участок связывания бисфос- фоглицерата в центральном углублении молекулы дезокси- гемоглобина. (Perutz М. F. The hemoglobin molecule, 1964.) в эффекте Бора. Кроме того, СО2 транспор- тируется гемоглобином в форме карбамата. В основе этого процесса лежит обратимая реакция между находящимися в неионизи- рованной форме а-аминогруппами гемо- глобина и СО2: R—NH2 + СО2 R—NHCOO” + Н + Связанные карбаматы образуют солевые мостики, которые стабилизируют Т-форму. Отсюда следует, что присоединение СО2 снижает сродство гемоглобина к кислороду. И наоборот, СО2 более прочно связывается с дезоксигемоглобином, чем с оксигемогло- бином. 4.16. Механизм эффекта Бора Каким образом гемоглобин связывает про- тоны при своем превращении из окси- в де- зоксиформу? Очевидно, при этом превраще- нии должно возрастать сродство опреде- ленных участков к Н + . В частности, при превращении из окси- в дезоксиформу дол- жно увеличиваться значение рК отдельных групп, поскольку увеличение рК означает более сильное связывание Н + . Гемоглобин связывает около 0,5 Н+ в расчете на одну высвободившуюся молекулу О2. Это при- соединение Н+ позволяет поддерживать по- 4. Гемоглобин: аллостерический белок 81 6-665
His-2 Рис. 4.20. Способ связи БФГ с дезоксиге- моглобином человека. Бисфос- фоглицерат взаимодействует с тремя положительно заря- женными группами в каждой p-цепи. [Arnone A., Nature, 237, 148 (1972).] стоянство pH в тканях с активным метабо- лизмом. У каких конкретных групп повышается зна- чение рК? Рассмотрим сначала возможные участки связывания Н+ в гемоглобине (рис. 4.21 и табл. 4.1) и затем сузим круг вы- бора. Значения рК карбоксильных групп бо- ковой цепи глутамата и аспартата состав- ляют обычно ~ 4. Маловероятно, что их рК возрастут до 7-8 - условие, необходимое для участия в эффекте Бора. Подобным же обра- зом маловероятно, что значения рК бо- ковых цепей тирозина, лизина и аргинина могут быть сдвинуты в достаточной мере, поскольку обычно их рК превышает 10. От- сюда следует, что эффект Бора может быть обеспечен участием гистидина, цистеина и концевой аминогруппы, так как нор- Часть I 82 Конформация и динамика мальные значения рК этих групп лежат в области 7. Путем сопоставления данных химическо- го и рентгеноструктурного анализа удалось идентифицировать специфические группы, ответственные за эффект Бора. Рентгено- структурный анализ указывал на вовлечение в эффект Бора остатков гистидина, располо- женных на С-конце каждой из p-цепей гемо- глобина (гистидин-146Р). Справедливость этого предположения была проверена сле- дующим путем. Был получен гемоглобин, p-цепи которого не содержали гисти- дина-146. Этого удалось достичь путем ис- пользования карбоксипептидазы В-специ- фического протеолитического фермента, расщепляющего в некоторых полипеп- тидных цепях пептидную связь, образован- ную концевой аминокислотой основного ха- рактера, расположенной на С-конце пепти- да, т. е. содержащей свободную карбоксиль- ную группу. Такая модификация гемогло- бина приводила к снижению эффекта Бора в два раза. Отсюда следует, что гисти- дин-146 обеих P-цепей вносит, по-видимому, основной вклад в эффект Бора. Роль концевых аминогрупп гемоглобина в эффекте Бора была убедительно доказана следующим образом. Концевые амино- группы модифицировали обработкой циа-
Таблица 4.1. Значения рК ионизируемых групп в белках Группа Кислота Основание 4- Н + Типичное зна- чение рК Концевой карбоксил —СООН ?± —СОО“ + Н+ 3,1 Аспарагиновая и глутаминовая кислоты —СООН —СОО + Н+ 4,4 Г истидин —Л NH+ —п N |l J |l J + Н 6-5 Концевая аминогруппа Цистеин ъг ЪГ н н —NH3 —NH2 + Н1- 8,0 —SH —S" + Н+ 8,5 Тирозин —^>—он ^=± —о- + н+ 10,0 Лизин —nh; —nh2 + н+ ю,о Аргинин н /*н/ н ^NH —N—С — N—С + Н+ nh2 nh2 |20 натом, приводящей к образованию карба- моилпроизводного, не способного более связывать Н +. Если карбамоилировали концевые аминогруппы только p-цепей, то эффект Бора сохранялся полностью. Если модификации подвергались концевые ами- ногруппы также и a-цепей, то эффект Бора существенно уменьшался. Рентгеноструктурный анализ дает кон- кретную картину участия этих групп в обес- печении эффекта Бора. В оксигемоглобине гистидин-146р свободно вращается, а в де- зоксигемоглобине этот концевой остаток участвует в ряде взаимодействий. Особенно важное значение имеет взаимодействие имидазольного кольца этого гистидина с отрицательно заряженным аспартатом-94 в той же p-цепи. Непосредственная близость этой отрицательно заряженной группы по- вышает вероятность связывания протона гистидином (рис. 4.22). Другими словами, близость аспартата-94 повышает рК ги- стидина -146. Таким образом, при переходе от окси- к дезоксигемоглобину гистидин-146 R—\ + -NCO + Н+ -> R— с—NH2 II 0 Концевая Цианат Карбамомл- аминогруппа п рои а вод ное приобретает большее сродство к Н+ вслед- ствие локального изменения заряда в его не- посредственном окружении. Аналогичным образом изменяется при дезоксигенировании окружение концевых аминогрупп a-цепей. В оксигемоглобине эти группы свободны. В дезоксигемоглобине концевая аминогруппа одной ос-цепи взаи- 6 рК 8 pH эритроцитов 10 12 Рис. 4.21. Типичные величины рК кис- лотных групп белков. Окруже- ние отдельной группы может изменить ее реальную величи- ну рК в сторону повышения или понижения. 83 Г емоглобии: аллостерический белок 6*
н н х°~ —СНг— С HN Ч \ I о с=с—сн2— н Asp-94 His-146 Рис. 4.22. Аспартат-94 повышает рК ги- стидина-146 в дезоксигемогло- бине, но не в оксигемоглобине. Близость отрицательного за- ряда на аспартате-94 способ- ствует протонированию ги- стидина-146 в дезоксигемо- глобине. модействует с концевой карбоксильной группой другой a-цепи. Близость отрица- тельно заряженного карбоксилированного остатка в дезоксигемоглобине повышает сродство этой концевой аминогруппы к Н+. Данные рентгеноструктурного анализа сви- детельствуют о том, что в эффекте Бора уча- ствует и третья группа, а именно гисти- дин-122 в а-цепи. Итак, окружение трех пар групп, связы- вающих протоны (концевая аминогруппа и два гистидина) в окси- и дезоксигемогло- бине неодинаково. В дезоксигемоглобине это локальное окружение заряжено более отрицательно. В результате при высвобо- ждении кислорода эти группы связывают Н + . 4.17. Коммуникация внутри белковой молекулы Как мы видели, связывание гемоглобином О2, Н + , СО2 и БФГ находится в определен- ной взаимосвязи. Эти молекулы присоеди- няются к пространственно разобщенным участкам, коммуникация между которыми опосредована конформационными измене- ниями внутри белка. Наличие раздельных участков связывания для этих молекул объясняется тем, что различна структура са- мих связываемых молекул. Взаимодействия между разными участками связывания опосредованы изменениями четвертичной структуры. В сущности все известные алло- стерические белки состоят из двух и более полипептидных цепей. Область контакта между двумя цепями способна усиливать и передавать конформационные сдвиги от одной субъединицы к другой. У аллостери- Часть I 84 Конформация и динамика ческого белка нет строго определенных свойств. Напротив, его функциональные свойства зависят от наличия в окружающей среде определенных молекул. Отсюда сле- дует, что аллостерические взаимодействия имеют колоссальное значение для функции клеток. Таким образом, эволюционный пере- ход от миоглобина к гемоглобину привел к появлению структуры, способной восприни- мать информацию из окружающей среды. Заключение Тетрамерный гемоглобин обладает новыми свойствами, которых нет в мономерном миоглобине. Помимо способности транс- портировать О2 гемоглобин способен пере- носить также Н+ и СО2. Более того, присое- динение последних регулируется аллостери- ческими сдвигами, которые представляют собой взаимодействия между простран- ственно разобщенными участками, обусло- вленные конформационными изменениями белка. Гемоглобин-наиболее изученный аллостерический белок. У гемоглобина про- являются три аллостерических эффекта. Во- первых, кривая связывания кислорода гемо- глобином имеет сигмоидную форму, что свидетельствует о кооперативности связы- вания кислорода. Присоединение кислорода к одному гему облегчает присоединение О2 к остальным гемам той же молекулы белка. Эта кооперативность увеличивает количе- ство транспортируемого кислорода. Во- вторых, Н+ и СО2 способствуют отщепле- нию кислорода от гемоглобина-эффект, имеющий большое физиологическое значе- ние, поскольку таким путем увеличивается высвобождение кислорода в тканях с ак- тивным метаболизмом, например в рабо- тающих мышцах. Имеет место и обратный эффект: О2 способствует высвобождению Н+ и СО2 в капиллярах легочных альвеол. Аллостерическая связь между присоедине- нием Н+, СО2 и О2 известна как «эффект Бора». В-третьих, сродство гемоглобина к О2 регулируется также 2,3-бисфосфоглице- ратом (БФГ) - соединением небольшой мо- лекулярной массы, имеющим отрица- тельный заряд высокой плотности. БФГ способен присоединяться к дезоксигемогло- бину, но не к оксигемоглобину. Отсюда сле- дует, что БФГ снижает сродство гемогло- бина к кислороду. БФГ играет важную роль в адаптации организма к высоте и к гипок- сии. Гемоглобин плода обладает более вы- соким сродством к кислороду, чем гемогло- бин взрослого организма, потому что он
связывает меньше БФГ. Аллостерические свойства гемоглобина обусловлены взаимодействием его а- и Р- субъединиц. Жесткость Т-формы (напря- женной) четвертичной структуры опреде- ляется образованием солевых связей между субъединицами, что обусловливает низкое сродство к кислороду. В R-форме эти меж- субъединичные связи отсутствуют и срод- ство к кислороду высокое. При оксигениро- вании атом железа перемещается в пло- скость гема и подтягивает за собой прокси- мальный гистидин. При этом перемещении начинают расщепляться солевые связи и происходит сдвиг равновесия от Т-формы к R-форме. Присоединение к гемоглобину четвертой молекулы О2 происходит значи- тельно легче, чем присоединение первой, так как требует разрыва меньшего числа со- левых связей. БФГ связывается с положи- тельно заряженными группами двух р-це- пей, окружающими центральную полость гемоглобина. Связывание БФГ стабилизи- рует Т-форму и потому снижает сродство гемоглобина к кислороду. Другой аллосте- рический эффектор - диоксид углерода - присоединяется к концевым аминогруппам всех четырех цепей, образуя легко расще- пляемую карбаматную связь. Для ионов во- дорода, также участвующих в возникнове- нии эффекта Бора, имеются три пары участков связывания. Ближайшее окружение двух концевых аминогрупп и двух пар ги- стидиновых боковых цепей в дезоксигемо- глобине обладает большим отрицательным зарядом, чем в оксигемоглобине, и потому после отщепления О2 к этим участкам при- соединяется Н + . СО2 и Н+, подобно БФГ, снижают сродство к кислороду путем стаби- лизации Т-формы гемоглобина. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Perutz M.F., 1964. The hemoglobin molecule, Sci. Amer., 211 (11), 2 14. (Увлекательное описание рентгенос- труктурных исследований гемогло- бина, проведенных* до 1964 г.) Perutz М. F., 1978. Hemoglobin struc- ture and respiratory transport, Sci, Amer., 239 (6), 92-125. (Взгляд на гемоглобин 14 л^т спустя. В этой превосходной статье описываются структурные основы аллостерических свойств гемоглобина.) Обзоры н монографии Perutz М.К, 1979, Regulation of oxygen affinity of hemoglobin: influence of structure of the globin on the heme iron, Ann, Rev. Biochem., 48, 327-386, Bauer C., 1974. On the respiratory function of hemoglobin, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 70, 1-29. Bunn H.F., Forget B. G., Ranney H.M., 1977. Human Hemoglobins, Saunders. Garby L, Meldon J.t 1977. The Respi- ratory Functions of Blood, Plenum. Ли ronin i E., Brunori M., 1971. Hemo- globin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands, North-Holland. Эффект Бора и действие бмсфосфогли- церата Kilmartin J. И, Rossi-Bernardi L.., 1973. Interaction of hemoglobin with hydr- ogen ions, carbon dioxide, and organic phosphates, Physiol, Rev., 53, 836-890. Kilmartin J. V., 1976. Interaction of haemoglobin with protons, CO2, and 2,3-diphosphogIycerate, Brit. Med. Bull., 32, 209-222. Benesch R., Benesch R,E.t 1969. Intracellular organic phosphates as regulators of oxygen release by haem- oglobin, Nature, 221, 618 622. Lenfant C„ Torrance J.D.r Woodson R.D., Jacobs P., Fenich C.A., 1970. Role of organic phosphates in the adaptation of man to hypoxia, Fed. Proc., 29, 1115-1117. Tyuma L, Shimizu K., 1970. Effect of organic phosphates on the difference in oxygen affinity between fetal and adult human hemoglobin, Fed. Proc., 29, 1112-1114. Morpurgo G.t Arese P., Bosia A., Pescarmona G.P., Luzzana M„ Modiano G„ Ranjet 5. K., 1976. Sherpas living permanently at high altitude: a new pattern of adaptation, Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 747-751. Механизм аллостерических взаимо- действий Perutz M.F., 1970, Stereochemistry cooperative effects of haemoglobin, Nature, 228, 726-739. (Изложена заманчивая гипотеза относительно природы аллостерических свойств гемоглобина.) Нopfield J. J1973. Relationship bet- ween structure, cooperativity, and spectra in a model of hemoglobin action, J. Mol. Biol., 77, 207-222. Gelin B. R., Karplus M., 1977. Mecha- nism of tertiary structural change in hemoglobin, Proc. Nat. Acad. Sci., 74, 801 805. Baldwin J.t Chothia C., 1979. Hem- oglobin: the structural changes related to ligand binding and its allosteric mechanism, J. Mol. Biol., 129, 175-220. Вопросы и задачи 1. Как повлияет каждое из перечис- ленных воздействий на сродство гемоглобина А к кислороду in vitro: а) увеличение pH от 7,2 до 7,4; б) увеличение рСО2 с 10 до 40 торр; в) увеличение [БФГ] с 2-10-4 до 8 -10-4 М; 4. Гемоглобин: аллостерический белок 85
г) диссоциация а2Р2 на мономерные субъ- единицы? 2. Как повлияют следующие воз- действия на количество ионов Н + , связываемых гемоглобином A in vitro: а) увеличение рО2 с 20 до 100 торр ( при по- стоянных pH и рСО2); б) реакция гемоглобина с избытком цианата (при постоянном pH)? 3. В эритроцитах птиц и черепах со- держится регуляторное соедине- ние, отличное от БФГ. Эго соединение спо- собно также снижать сродство к кислороду человеческого гемоглобина, освобожденно- го от БФГ. Какое из нижеперечисленных ве- ществ может быть, по вашему мнению, на- иболее эффективным в этом качестве: а) глюкозо-6-фосфат; б) инозитолгексафосфат; в) HPOj”; г) малонат; д) аргинин; е) лактат? 4, Кривая диссоциации кислорода для гемоглобина описывается с хорошей степенью приближения следую- щим эмпирически найденным уравнением: У. (рогГ (рО2г + (РзоГ ’ где п = 2,8. Вывод этого уравнения был опи- сан в разд. 4.2. а) Количество транспортированного кисло- рода пропорционально разнице в степени насыщения А К Рассчитайте ДУ для моле- кулы гемоглобина, прошедшего путь от легкого до работающей мышцы. Пусть Р50 ~ 26 торр, Рдегкое = ЮО ТОРР» Рмышца = = 20 торр. б) Допустим, что связывание кислорода ге- моглобином происходит некооперативно, но Р50 остается равным 26 торр. Чему будет равно Д Удля такого некооперативного пере- носчика кислорода? 5. рК кислоты зависит частично от окружающей ее среды. Какое влияние на рК боковой цепи глутаминовой кислоты окажут следующие факторы? а) тесное сближение с боковой цепью ли- зина; б) тесное сближение с концевой карбоксиль- ной группой белка; в) перемещение боковой цепи глутаминовой кислоты с поверхности белковой молекулы во внутренний неполярный участок? 6. Было измерено сродство к кис- лороду «огороженных» замести- телями железопорфиринов с различными ос- нованиями в пятом координационном поло- жении. С 1-метилимидазолом Р50 оказалась равным 0,49 торр, тогда как с 1,2-диметили- мидазолом - 38 торр. Почему одна дополни- тельная метильная группа так сильно сни- жает сродство к кислороду? 7. Представление об образовании связи лежит в основе понимания многих биохимических процессов. Рассмо- трим белок Р, который способен присоеди- нять вещества А и В вместе или порознь: РВ РАВ *ВА Константы диссоциации этих равновесных процессов определяются следующим обра- зом: к [Р] [А] А“ [РА] ' к _[РВ][А] ВА [РАВ] ’ г .. ИМ Кв [РВ] ’ [РА] [В] Кав [РАВ] ' а) Допустим, что Кд=510“4М, Кв = = 10”3 М,КВд= 10“5 М. Можно ли на этом основании высчитать четвертую константу диссоциации КАВ? Если да, то чему она равна? б) Как влияет А на связывание В? Как влияет В на связывание А? 8. При присоединении к гемогло- бину оксида углерода образует- ся СО-гемоглобин. Кристаллы СО-гемо- глобина изоморфны кристаллам оксигемо- глобина. Каждый гем в гемоглобине спосо- бен связать одну молекулу оксида углерода, но не может связать одновременно СО и О2. Сродство связывания СО примерно в 200 раз выше, чем сродство связывания О2. В резуль- тате вдыхания в течение 1 ч воздуха, содер- жащего 0,1% СО, примерно половина гемов Часть I 86 Конформация и динамика
в гемоглобине оказывается связана с СО, что нередко приводит к летальному исходу. Холдейн и Пристли (Haldane, Priestly) в 1935 г. поставили (и частично разрешили) интересный вопрос: «Если бы действие СО состояло только в уменьшении способности гемоглобина к переносу кислорода и не влияло на другие его свойства, то симптомы отравления угарным газом трудно было бы объяснить в свете имеющихся данных. Так, как мы только что видели, при полунасыщении кро- ви оксидом углерода больной практически безнадежен; с другой стороны, если у челове- ка содержание гемоглобина просто умень- шается в два раза вследствие анемии, то та- кой больной может продолжать работать как обычно». Как объяснить этот кажущийся парадокс? 9. Белок Р способен обратимо связывать низкомолекулярное соединение L. Константа диссоциации К для равновесного процесса Р + L PL составляет К- [Р][Ь] [PL] • Белок Р переносит это соединение из обла- сти высокой концентрации [Ьд] в область низкой концентрации [Ьв]. Допустим, что концентрация соединения L в свободной форме остается постоянной. Белок Р цирку- лирует между А и В. а) Пусть [Ьд] = 10-4 М и [LB] = 1()-6M. При каком значении К транспорт L окажется максимальным? Для решения задачи со- ставьте уравнение для A Y, т. е. для изменения степени насыщения связывающего лиганд участка при переходе от А к В. Далее вырази- те К через АК б) Рассмотрите аналогичным образом пере- нос кислорода гемоглобином. При какой ве- личине Р50 окажется максимальной AY? Примем, что Р в легких равно 100 торр, Р в капиллярах тканей - 20 торр. Сравните по- лученную вами величину Р50 с физиологиче- ским значением, равным 26 торр.
ГЛАВА 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточ ная анемия В 1904 г. чикагский врач Джеймс Херрик (J. Herrick) обследовал больного-студента- негра в возрасте 21 года,-поступившего в больницу по поводу кашля и лихорадочно- го состояния. Больной жаловался на сла- бость, головокружение, головную боль. До поступления на протяжении года он страдал от приступов сердцебиения и недостатка воздуха; последние несколько лет больной все меньше участвовал в спортивных играх и других мероприятиях, связанных с физиче- ской нагрузкой; за 3 года до поступления у него в течение 6 месяцев отмечалось выде- ление гноя из уха. С детства он часто стра- дал от нарывов на ногах, которые заживали очень медленно. При обследовании больного суще- ственных отклонений от нормы в физиче- ском и умственном развитии не отмечалось. Белки глаз были с желтоватым оттенком, слизистые оболочки бледны, лимфатические узлы увеличены. На голенях и бедрах было обнаружено около 20 рубцов. Значительные отклонения от нормы наблюдались со сто- роны сердца: расширение границ, шум. Как писал Херрик, «... создавалось впечатление, что сердце работает под действием какого- то мощного стимулятора, хотя никаких сти- мулирующих сердечных средств больной не получал». Лабораторное обследование включало тщательный анализ кала больного с целью выявления возможных паразитов, вероят- ность заражения которыми у больного, вы- росшего в тропиках, достаточно велика. Од- нако никаких паразитов найдено не было. Часть I 88 Конформация и динамика В мокроте не было обнаружено туберку- лезных палочек. В моче содержались остат- ки клеток, что указывало па поражение по- чек. При анализе крови было установлено резкое отклонение от нормы: Количество эритроцитов Содержание гемоглобина Количество лейкоциюв Обнаруже- но Границы нормы 2,6 106 мл (4,6-6,2)10* мл 8 г/100 мл (14—18 г)/100 мл 15 250 мл 4000-10 000 мл Больной, несомненно, страдал анемией, поскольку содержание гемоглобина было вдвое ниже нормы. Его эритроциты очень различались по размеру, причем многие из них были гораздо мельче, чем в норме. Кро- ме того, выявлялось большое число эритро- цитов, содержащих ядро. Такие ядерные клетки служат предшественниками нор- мальных зрелых эритроцитов, лишенных ядра. Херрик так описал необычные эритро- циты больного: «Красные кровяные тельца отличались непостоянством формы, но что особенно привлекало внимание, это большое число тонких, удлиненных серповидных, по- хожих на полумесяц клеток. Они обнаружи- вались в свежих пробах крови вне зависимо- сти от того, как наносили кровь на стекло. В пробах крови, взятой одновременно у дру- гих лиц и обработанной в точно таких же ус- ловиях, такие клетки не обнаруживались. Несомненно, что они не были ни артефак- том, ни какой-либо формой паразитическо- го организма». Больному было назначено общеукреп- ляющее лечение: отдых, хорошее питание. Через четыре недели он выписался. Само- чувствие его улучшилось, количество гемо- глобина возросло. Однако в крови все еще выявлялись «своеобразные, в форме полу- месяца красные кровяные тельца, хотя их было меньше, чем раньше».
Рис. 5.1. Серповидные клетки в крови больного серповидноклеточ- ной анемией. Вид под све- товым микроскопом. (Печа- тается с любезного разреше- ния д-ра F. Bunn.) Рис. 5.2. Эритроцит больного серпо- видноклеточной анемией; ми- крофотография, полученная с помощью сканирующего элек- тронного микроскопа. (Печа- тается с любезного разреше- ния д-ра J. Thomwaite и д-ра R. Leif.) Херрик был поражен такой клинической картиной и лабораторными данными. Про- шло 6 лет, прежде чем он решился опубли- ковать этот случай, чистосердечно призна- вая, что больному «нельзя даже было поставить какой-либо диагноз». Автор от- метил хронический характер заболевания и разнообразие патологических изменений, выявляемых при осмотре и по лабора- торным данным: увеличение сердца, опуха- ние всех лимфатических узлов, желтуха, ане- мия, признаки повреждения почек. Он пришел к выводу, что происхождение забо- левания нельзя связать с органическим по- ражением какого-либо одного органа. Хер- рик выделил как ведущий симптом наруше- ние картины крови и озаглавил сообщение об этом случае Своеобразные удлиненные и серповидные красные кровяные тельца в случае тяжелой анемии. Херрик высказал предположение, что «первопричиной забо- левания может быть какое-либо неизвестное изменение состава самих телец». 5.1. Серповидноклеточная анемия-хрониче- ская гемолитическая болезнь, передающаяся по наследству Вскоре после публикации Херрика были обнаружены и другие случаи этого заболе- вания, названного «серповидноклеточной анемией». В самом деле, серповидноклеточ- ная анемия - отнюдь не редкая болезнь. В странах с достаточно большой прослой- кой негритянского населения это заболева- ние представляет значительную проблему для здравоохранения. У негров серповидно- клеточная анемия встречается с частотой 4 случая на 1000 человек. В прошлом серпо- видноклеточная анемия приводила обычно к гибели больного, нередко в возрасте до 30 лет, вследствие инфекции, почечной недо- статочности, сердечной недостаточности или тромбоза. Серповидные эритроциты застревают в мельчайших кровеносных сосудах. В ре- зультате нарушается кровоснабжение, что приводит к повреждению различных орга- нов, в особенности почек и костей. Серпо- видные клетки отличаются большей хруп- костью, чем нормальные. Поскольку они легко гемолизируются, их срок жизни уко- рочен. В результате развивается тяжелая анемия. Хроническое течение заболевания проходит через кризы, когда доля серпо- 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 89
2000 А С пт"""" .... Рис. 5.3. Электронная микрофотогра- фия волокон дезоксигениро- ванного гемоглобина серпо- видных клеток. На верхнем рисунке-поперечный срез, на нижнем - продольный срез. Толщина волокон-170 А. [Finch J.T., Perutz M.F., Bertles J.F., Dobler J., Proc. Nat. Acad. Sci, 70, 719 (1973).] проявляются, так как на долю серповидных эритроцитов у них приходится всего лишь 1% общего числа эритроцитов в венозной крови; у гомозиготных индивидов количе- ство серповидных эритроцитов достигает 50%. Однако и носительство признака сер- повидноклеточности, которое встречается у негров в одном случае из десяти, не совсем благоприятно для организма. Так, для носи- телей признака серповидноклеточности мо- жет представлять опасность большая физи- ческая нагрузка в высокогорье, полеты в негерметизированных самолетах, наркоз. Почему? Мы выясним это в ходе дальней- шего изложения. 5.2. Дезоксигенированный серповиднокле- точный гемоглобин имеет пониженную рас- творимость Херрик высказал правильное предполо- жение о локализации первичного дефекта, обусловливающего серповидноклеточную анемию. При снижении концентрации кис- лорода эритроциты больного приобретают серповидную форму на предметном стекле in vitro. Оказалось, что в этих клетках дефек- тен сам гемоглобин. Растворимость дезок- сигемоглобина серповидных клеток при- мерно в 25 раз ниже растворимости нормального гемоглобина. При дезоксиге- нировании концентрированного раствора гемоглобина серповидных клеток образует- ся волокнистый осадок (рис. 5.3). Именно такой осадок деформирует эритроцит, при- давая ему серповидную форму. Гемоглобин серповидных клеток принято обозначать как гемоглобин S (Hb S) в отличие от гемо- глобина А (НЬ А)-нормального гемоглоби- на взрослого человека. видных клеток в крови возрастает особенно сильно. Во время кризов у больного может развиться шок. Серповидноклеточная анемия передается по наследству. Больные серповидноклеточ- ной анемией гомозиготны по дефектному гену, локализованному в одной из аутосом. Люди, получившие один дефектный ген от одного из родителей и один нормальный ал- лель от другого, являются носителями при- знака серповидноклеточности. У таких гете- розигот симптомы болезни обычно не Часть 1 90 Конформация и динамика 5.3. Гемоглобин S отличается от гемоглоби- на А по электрофоретической подвижности В 1949 г. Полинг (Pauling) и его сотрудники изучали физико-химические свойства гемо- глобина в норме, при носительстве признака серповидноклеточности и при заболевании серповидноклеточной анемией. Использо- ванный ими экспериментальный подход со- стоял в следующем: они сопоставляли под- вижность исследуемых гемоглобинов в электрическом поле. Метод определения подвижности в электрическом поле назы- вается электрофорезом. Скорость миграции (К) белка (или какого-либо другого соедине- ния) в электрическом поле зависит от напря- женности электрического поля (£), общего
заряда белка (Z) и сопротивления трения (/). Сопротивление трения определяется разме- ром и формой белка. Указанные величины связаны между собой соотношением Изоэлектрическая точка белка-это зна- чение pH, при котором данный белок не не- сет электрического заряда. При таком зна- чении pH электрофоретическая подвиж- ность равна нулю, поскольку Z = 0 [уравне- ние (1)]. При pH ниже изоэлектрической точки молекула белка заряжена положи- тельно; при значениях pH, лежащих выше изоэлектрической точки, белок заряжен от- рицательно. Гемоглобин. серповидных кле- ток отличается от нормального по изоэлек- трической точке: Рис. 5.4. Зависимость от pH электрофо- ретической подвижности нор- мального гемоглобина и гемо- глобина серповидных клеток. Г емогло- Г емогло- Разни- бин нор- бин серпо- на мальных видных эритроци- клеток тов Оксигемоглобин 6,87 7,09 0,22 Дезоксигемоглобин 6,68 6,91 0,23 Как видно из приведенной таблицы, разли- чие между серповидноклеточным и нор- мальным гемоглобином для окисленной и восстановленной форм одинаково. Различие в электрофоретической подвиж- ности гемоглобина А и S может объясняться изменением либо общего заряда Z, либо коэффициента трения / Сам по себе эффект трения (обусловленный изменением формы) выразился бы в том, что одно вещество дви- галось бы медленнее другого во всем диапа- зоне pH. В рассматриваемом случае этого не происходило, судя по тому, что кривые зависимости электрофоретической подвиж- ности от pH имели одинаковый угол накло- на (рис. 5.4). Кроме того, другие физико-хи- мические исследования, а именно определе- ние скорости седиментации и свободной диффузии показали, что коэффициенты тре- ния оксигенированных форм гемоглобина А и гемоглобина S были одинаковы. На основании этих наблюдений был сде- лан вывод о различии в числе или типе иони- зированных групп в сравниваемых гемоглоби- нах. Сколько таких групп в каждом из гемоглобинов? Ответ дает кривая кислот- но-основного титрования гемоглобинов. В области pH 7 эта кривая почти линейна. Изменение pH раствора гемоглобина на единицу создает разницу почти на 13 заря- дов. Стало быть, различие в изоэлектриче- ских точках на 0,23 соответствует примерно трем зарядам в молекуле гемоглобина. От- сюда следует, что гемоглобин серповидных клеток отличается от нормального нали- чием дополнительных 2-4 положительных зарядов. С чем связано это отличие: с изменением состава полипептидной цепи или с измене- нием гема? Из серповидноклеточного гемо- глобина был выделен порфирин; по данным определения точки плавления и рентгено- структурного анализа он оказался иденти- чен порфирину нормального гемоглобина. Это показывает, что различие между двумя гемоглобинами заключается в особенностях состава полипептидных цепей. У больных серповидноклеточной анемией (всегда гомозиготных по дефектному гену) имеется гемоглобин S и нет гемоглобина А. В то же время у носителей признака серпо- видноклеточности (которые гетерозиготны по гену серповидноклеточности) оба гемо- глобина содержатся примерно в равных ко- личествах (рис. 5.5). Таким образом, в рабо- те Полинга был выявлен бесспорный случай изменения молекулы белка при изменении аллелей кодирующего его гена. Это был первый пример молекулярной болезни. 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 91
5.4. Получение пептидных карт: выявление аминокислотной замены в гемоглобине серпо- видных клеток Итак, электрофоретический анализ показал, что гемоглобин S имеет 2-4 дополни- тельных положительных заряда по сравне- нию с гемоглобином А. Возможны разные пути возникновения такого различия в заря- де молекулы: НЬ А Нейтральная аминокислота Отрицательно заря- женная амино- кислота Отрицательно заря- женная амино- кислота HbS Положительно за- ряженная амино- кислота Положительно за- ряженная амино- кислота Нейтральная амино- кислота Выяснение вопроса, какая конкретно за- мена произошла в гемоглобине S, относится к 1954 г., когда Вернон Ингрем (V. Ingrem) разработал новый метод определения ами- нокислотных замен в белках. Для проведе- ния анализа молекулу гемоглобина расще- пляли на фрагменты, поскольку в неболь- ших пептидах, содержащих примерно по 20 аминокислот, выявить замену аминокис- лоты, безусловно, легче, чем в целой моле- куле белка, значительно большей (в 10 раз) по размеру. Гемоглобин подвергали специ- фическому расщеплению трипсином по пеп- тидным связям, образованным карбок- сильными группами лизина и аргинина. Признак Серповидно- Норма серповидно- клеточная Рис. 5.5. Электрофорез на крахмальном геле при pH 8,6 гемоглобина здорового человека, гемогло- бина носителя признака серпо- видноклеточности и гемогло- бина больного серповиднокле- точной анемией. Поскольку в аР-половине гемоглобина со- держится в общей сложности 27 остатков лизина и аргина, при триптическом гидроли- зе образовалось 28 разных пептидов. Сле- дующий этап состоял в разделении полу- ченных пептидов. Для этого был применен метод двумерного разделения (рис. 5.6). Смесь пептидов наносили в виде небольшо- го пятна в угол большого листа фильтро- вальной бумаги. Далее проводили электро- форез в одном направлении, разделяя таким образом пептиды в соответствии с их об- щим зарядом. Однако полного разделения Смесь пептидов Электрофорез в горизонтальном направлении 1 2 3 45 6 789 If Хроматография в вертикальном направлении Рис. 5.6. Смесь пептидов разделяют пу- тем электрофореза в горизон- тальном направлении с после- дующей хроматографией в вертикальном направлении. Часть I Конформация и динамика смеси при этом не происходило. Многие пептиды накладывались друг на друга. По- этому продолжали процесс разделения, но уже методом хроматографии на бу маге, причем это разделение проводили в напра- влении, перпендикулярном направлению электрофореза. 92
Xроматог рафия - термин введен Михаилом Цветом в 1906 г. применительно к разделению смеси пигментов из листьев растения на колонке карбоната кальция. М. Цвет сравнил этот процесс с «разложением света на спектр». Образовано от греческих слов chroma-цвет и graphein - рисовать, писать. Процедура состояла в следующем: конец бумаги, ближайший к разделяемым пепти- дам, помещали в смесь органических рас- творителей и воды, налитую на дно герме- тично закрывающейся стеклянной банки. При этом растворитель поднимался вверх по бумаге. В такой ситуации каждый пептид мог либо мигрировать с растворителем (не- полярная среда), либо оставаться на обвод- ненной целлюлозе бумаги (высокополярная среда). Такой метод разделения называется распределительной хроматографией. Пеп- тид с наиболее выраженными неполярными свойствами будет растворяться в раствори- теле и, следовательно, подниматься вместе с фронтом растворителя вверх по бумаге; в то же время самый полярный из пептидов останется на бумаге внизу. Рассматри- ваемые методы - хроматография на бумаге и электрофорез-дополняют друг друга, по- скольку они разделяют пептиды на основе независимых свойств; первый-на основе различий в полярности, второй-на основе различий в общем заряде. Вся последова- тельность проведения анализа - избиратель- ное расщепление белка на небольшие пеп- тиды с их последующим разделением в двух направлениях-называется методом пеп- тидных карт (отпечатков пальцев). Получаемые в результате пептидные карты дают очень наглядный результат. По- сле окрашивания нингидрином пятна пепти- дов становятся ясно видны. Сравнение карт гемоглобина А и гемоглобина S показало, что все их пептидные пятна идентичны, за исключением одного. Это пятно элюировали с каждой из пептидной карт и определили, что в обоих случаях оно соответствует пеп- тиду из 8 аминокислот. При последующем аминокислотном анализе обнаружилось, что пептид гемоглобина S отличается от пептида гемоглобина А лишь по одной аминокислоте. 5.5. В p-цепи произошла замена одиой-един- ственной аминокислоты а- и р-Цепи разделили методом ионообмен- ной хроматографии. Далее получили их пеп- тидные карты. Оказалось, что гемоглобин S отличается от гемоглобина А по р-цепи, в частности по N-концевому триптическому Гемоглобин А Гемоглобин S Рис. 5.7. Сравнение окрашенных нинги- дрином пептидных карт гемо- глобина А и гемоглобина S. Красным кружком обведен пептид, по которому разли- чаются эти гемоглобины. (Пе- чатается с любезного разреше- ния д-ра С. Baglioni.) 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 93
пептиду P-цепи. Определив аминокислот- ную последовательность этого пептида, Ин- грем показал, что в $-цепи гемоглобина ‘ S в 6-м положении вместо глутамата стоит валин: Гемоглобин a Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys- Гемоглобин s Val-His-Lcu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys- /Й 2 3 4 5 6 7 8 5.6. ' На поверхности гемоглобина серпо- видных клеток имеются «липкие» участки Валин имеет неполярную боковую цепь, тогда как глутамат - высокополярную. За- мена глутамата валином в 6-м положении р- цепи приводит к тому, что на поверхности гемоглобина S оказывается неполярный остаток (рис. 5.8). В результате раствори- мость дезоксигенированного гемоглобина S значительно снижается, тогда как рас- творимость оксигенированного гемоглобина S практически не изменяется. Этот факт ле- жит в основе всей клинической картины сер- повидноклеточной анемии, а также особен- ностей, характерных для признака серпо- видноклеточпости. Молекулярный механизм появления сер- повидных эритроцитов можно представить себе следующим образом. 1. Замена глутаминовой-кислоты на ва- лин приводит к появлению «липкого» участ- ка (sticky patch) на наружной стороне ка- ждой P-цепи гемоглобина S (рис. 5.9). Такой «липкий» участок имеется как в окси-, так и в дезоксигемоглобине S, но не в гемогло- бине А. 2. В дезоксигемоглобине S имеется уча- сток, комплементарный «липкому» участку (рис. 5.9). Локализация комплементарного участка пока не установлена. Комплемен- тарный участок одной молекулы дезоксиге- моглобина S взаимодействует с «липким» участком другой молекулы дезоксигемо- глобина S, что приводит к образованию агрегатов большой длины, деформирующих эритроцит. 3. В оксигемоглобине S комплемен- тарный участок замаскирован. «Липкий» участок в нем имеется. Однако недоступ- ность комплементарного участка препят- ствует соединению молекул гемоглобина S друг с другом. 4. Таким образом, эритроциты серповид- ной формы появляются в условиях, когда де- Часть I 94 Конформация и динамика зоксигенированная форма гемоглобина S до- стигает высокой концентрации (рис. 5.10). Исходя из этих фактов, можно объяснить ряд клинических симптомов серповиднокле- точной анемии. Так, при появлении серпо- видных эритроцитов в мельчайших сосудах возникает порочный круг. Серповидные клетки блокируют кровеносный сосуд, что создает локальную недостаточность кисло- рода. В результате в этом участке больше гемоглобина переходит в дезоксиформу и еще больше образуется деформиро- ванных, серповидных эритроцитов. У носи- телей п ризн ак а серп овидн ок л еточности симптомов болезни обычно не наблюдает- ся, потому что содержание гемоглобина S в этом случае не превышает половины об- щего количества гемоглобина. При нор- мальной концентрации кислорода такое со- держание гемоглобина S не настолько велико, чтобы вызвать деформацию эритро- цита. Однако при значительном снижении парциального давления кислорода (на боль- шой высоте, например) серповидные эри- троциты могут появиться и у носителей признака серповидноклеточности. Рис. 5.8. Модель дезоксигемоглобина А при низком разрешении, а-Цепи показаны желтым, Р- цепи-голубым. Участок, в ко- тором произошла замена ами- нокислоты в гемоглобине S, отмечен красным. Обратите внимание, что этот участок на- ходится на поверхности моле- кулы. [Finch J.T., Perutz M.F., Bertles J. F., Dobler J., Proc. Nat. Acad. Sci, 70, 721 (1973).]
Окси А Дезокси А Красными треугольниками по- Рис. 5.9. казаны «липкие» участки, имеющиеся как в окси-, так и дезоксигемоглобине S, но от- сутствующие в гемоглобине А. Комплементарный участок изображен в виде зазубрины, соответствующей треугольни- ку. Этот комплементарный участок имеется в дезоксиге- моглобине S и не исключено, что и в дезоксигемоглобине А. 5.7. Дезоксигемоглобин S образует длинные спирализованные волокна Как указывалось выше, дезоксигемоглобин S образует волокнистый осадок, который деформирует эритроциты, придавая им сер- повидную форму (рис. 5.2). При электрон- но-микроскопическом исследовании выяв- ляются волокна двух типов: диаметром 170 А (рис. 5.3) и чаще диаметром 215 А (рис. 5.11). По-видимому, в основном обра- зуются волокна, представляющие собой спираль из 14 нитей, в которой 10 молекул гемоглобина S расположены снаружи и 4 молекулы - внутри (рис. 5.12). Существен- ная особенность этой построенной из нитей спирали состоит в том, что каждая молеку- ла гемоглобина S контактирует по крайней мере с восемью другими. Ясно, что спираль стабилизирована многочисленными связя- ми. Связь с участием валина-6 в 0-цепи сдви- гает термодинамическое равновесие дезок- сиформы гемоглобина в сторону образова- ния волокон, однако это не единственный фактор стабилизации спирали. 5.8. Скорость образования волокон в высо- кой степени зависит от концентрации дезокси- гемоглобина S Кинетика образования волокон дезоксиге- моглобина S имеет большое значение, по- скольку именно от нее зависит, успеет ли эритроцит приобрести серповидную форму за то время, когда он проходит через капил- ляры, т.е. примерно за 1 с. Наиболее важным фактором при этом является кон- центрация дезоксигемоглобина S; это было показано в опытах in vitro, в которых был использован тот факт, что растворимость дезоксигемоглобина S при низких темпера- турах значительно выше, чем при высоких. Полимеризацию дезоксигемоглобина S вы- зывали, быстро повышая температуру рас- твора от 4 до 37°С. Об образовании волокон судили по изменению физических свойств раствора, а именно светорассеяния. При до- статочно низкой концентрации гемоглобина S образование волокон происходит с за- держкой на много минут (рис. 5.13). Время задержки т зависит от концентрации с (точ- нее от термодинамической активности) де- зоксигемоглобина S в соответствии с урав- нением 1/т = fc(c/Csf, Рис. 5.10. Взаимодействие «липкого» участка в дезоксигемоглобине S с комплементарным участ- ком другой молекулы дезокси- гемоглобина S приводит к образованию длинных агре- гатов. Здесь показана одна из сформированных таким обра- зом нитей спирализованного волокна. где Cs - растворимость гемоглобина S при равновесии, к -константа, зависящая от ус- ловий среды, «-показатель степени. Полу- ченное экспериментальным путем значение п оказалось поразительно большим чис- лом-около 10. Другими словами, скорость образования волокон пропорциональна 10-й 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 95
Рис. 5.11. Электронная микрофотогра- фия негативно окрашенного волокна дезоксигемоглобина S. [Dykes G., Crepeau R.H., Edelstein S. J., Nature, 272, 509 (1978) J степени активности гемоглобина S. Следова- тельно, формирование волокон представляет собой высокосогласованный процесс. Изуче- ние кинетики этого процесса показало, что фазой, лимитирующей скорость образова- ния волокон, является образование центра агрегации (нуклеация). После возникнове- ния конгломерата критического размера (примерно из 10 молекул дезоксигемогло- бина S) дальнейший рост волокна происхо- дит очень быстро (рис. 5.14). Указанный размер агрегата соответствует, по-видимо- му, большей части одного витка спирали из 14 нитей (рис. 5.12). Эти данные имеют большое клиническое значение. Они по- казывают, что кинетические, а также тер- модинамические факторы играют важную роль в формировании серповидных эритро- цитов. Даже при высоком содержании де- зоксигемоглобина S эритроциты не при- обретут серповидной формы, если время их прохождения от капилляров тканей к аль- веолам легких, где происходит оксигенация, короче, чем лаг-период процесса волокно- образования. Высокая степень зависимости скорости полимеризации от концентрации дезоксигемоглобина S объясняет также, по- чему носительство признака серповиднокле- точности протекает обычно бессимптомно. Дело в том, что концентрация дезоксигемо- глобина S в эритроцитах гетерозигот при- мерно в 2 раза ниже, чем в эритроцитах со- ответствующих гомозигот, а следовательно, скорость образования волокон должна быть примерно в 1000 раз медленнее (210 = 1024). Рис. 5.12. Б Модель волокна дезоксигемо- глобина S, построенного из 14 спирализованных нитей. А - продольный разрез, Б-попе- речный разрез. Каждый кру- жок соответствует тетрамеру гемоглобина S. [Dykes G., Crepeau R.H., Edelstein S.J., Nature, 272, 509 (1978).] Рис. 5.13. Кинетика образования воло- кон дезоксигемоглобина S in vitro по данным измерения све- торассеяния. Полимеризацию вызывали быстрым повыше- нием температуры от 4 до 37°С. Длительный лаг-период соответствует фазе агрегации (к омпл ексообразованию). Часть I 96 Конформация и динамика
5.9. Высокая частота гена серповиднокле- точности обусловлена его защитным эффек- том в отношении малярии Частота гена серповидноклеточности в не- которых областях Африки достигает 40%. До последнего времени индивиды, гомози- готные по этому гену, погибали, не достиг- нув зрелости; из этого следует, что высокая частота этого гена в популяции могла со- храниться только под сильным давлением естественного отбора. Джеймс Нил (J. Neel) высказал предположение, что гетерозигот- ное состояние должно давать какие-то пре- имущества по сравнению с гомозиготным по нормальному либо по дефектному гену. И действительно, Антони Аллисон (A. Allison) обнаружил, что носительство признака серповидноклеточности служит защитой от заболевания наиболее тяжелой формой малярии, приводящей обычно Рис. 5.15. Распространение гена серпо- видноклеточности в Африке. Высокая частота этого гена ограничена районами, где ма- лярия является основной при- чиной смертности. (Alli- son А. С., Sickle cells and evolution. Copyright 1956, Scientific American, Inc.) Рис. 5.14. Центр агрегации Фаза агрегации при формиро- вании волокон дезоксигемо- глобина А. Сборка центров агрегации происходит медлен- нее, чем дальнейший рост агре- гатов. [Hofrichter J., Ross P.D., Eaton W. A., Proc. Nat. Acad. Sci„ 71, 4864 (1974).] к смертельному исходу. Выявлена отчетли- вая корреляция между распространением малярии и частотой гена серповидноклеточ- ности в Африке (рис. 5.15). Описанный фе- номен представляет собой типичный случай сбалансированного полиморфизма: гетерози- готы устойчивы в отношении малярии и не страдают от серповидноклеточной анемии, тогда как люди, гомозиготные по нормаль- ному аллелю, восприимчивы к малярии. 5.10. Стратегия поиска лекарственных средств для лечения серповидноклеточной анемии Сведения о молекулярном механизме воз- никновения серповидноклеточной анемии позволяют в настоящее время перейти к по- иску специфических нетоксичных препара- тов, предупреждающих или задерживаю- щих развитие клинической картины заболе- вания. Поиски ведутся в трех направлениях. Одна группа перспективных средств-это вещества, тормозящие образование волокон из гемоглобина S. В качестве таких 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 97 7-665
стереоспецифических ингибиторов гелео- образования проходят оценку синтетические олигопептиды, последовательность амино- кислот в которых соответствует N-концево- му участку р5-цепи и другим участкам кон- тактов в молекуле гемоглобина S. Ко второй группе исследуемых веществ отно- сятся соединения, повышающие сродство гемоглобина S к кислороду и тем самым снижающие концентрацию его дезокси- формы. Так, например, цианат проникает в эритроциты и повышает сродство гемо- глобина к кислороду путем необратимого карбамоилирования ^-аминогрупп. Гемогло- бин быстро реагирует с цианатом, потому что HN=C^zzO (изоциановая кислота) в не- ионизированной форме является реакцион- но способным аналогом О—С=О. Вспом- ним, что концевые аминогруппы гемоглоб- ина участвуют в обратимом связывании СО2 (разд. 4.15). На использование цианата в лечении серповидноклеточной анемии воз- лагались большие надежды, пока обширные клинические испытания не выявили его по- бочных токсических эффектов. Так, у неко- торых больных при лечении цианатом раз- вивалось поражение периферических не- рвов, обусловленное, вероятно, тем, что карбамоилированию подвергаются не толь- ко гемоглобин, но и другие белки. Сейчас ве- дется поиск менее токсичных модификато- ров гемоглобина. Третий возможный под- ход к лечению серповидноклеточной ане- мии-снижение общей концентрации гемо- глобина S в эритроцитах. Этого можно достичь, например, увеличением объема клетки. Поскольку скорость образования волокон из дезоксигемоглобина в очень большой степени зависит от его концентра- ции, даже незначительное увеличение объе- ма эритроцита оказало бы выраженный ле- чебный эффект. Отсюда следует, что ионные насосы и каналы эритроцитарной мем- браны-это те потенциальные мишени, на которые должно быть направлено действие терапевтических средств, используемых для лечения серповидноклеточной анемии. 5.11. Молекулярная патология гемоглобина При обследовании больных с симптомами серповидноклеточной анемии, а также при проведении электрофоретического анализа гемоглобинов здоровых людей было обна- ружено более 100 аномальных гемоглоби- Часть I 98 Конформация и динамика Гистидин F8 Fe2+— О2 Гемоглобин А Рис. 5.16. Гемоглобин М Замена проксимального ги- стидина (F8) тирозином приво- дит к образованию гемогло- бина М. Отрицательно заря- женный атом кислорода ти- розина связывается с атомом железа, находящимся в ферри- форме. В шестое координа- ционное положение встает во- да, а не О2. нов. В северной Европе гетерозиготность по варианту гемоглобина А встречается у 1 че- ловека из 300. Частота любого из му- тантных аллелей обычно составляет менее 10-4; это на несколько порядков ниже, чем частота гена серповидноклеточности в рай- онах, эндемичных по малярии. Другими словами, большинство аномальных гемо- глобинов не дает организму никаких пре- имуществ в естественном отборе. Как пра- вило, наличие аномальных гемоглобинов либо никак не влияет на здоровье человека, либо оказывается пагубным. Различают несколько типов аномальных гемоглобинов. 1. Изменена наружная часть молекулы. Почти все замены аминокислот на поверх- ности молекулы гемоглобина безвредны. Гемоглобин S представляет собой порази- тельное исключение. 2. Изменен активный центр. В этом слу- чае в дефектной субъединице не происходит
связывания кислорода, так как структурные изменения вблизи гема непосредственно влияют на связывание кислорода. 3. Изменена третичная структура. Заме- на аминокислот препятствует возникнове- нию нормальной конформации молекулы. Такие гемоглобины обычно нестабильны. 4. Изменена четвертичная структура. Некоторые мутации, затрагивающие участ- ки области контактов, приводят к потере ал- лостерических свойств. В результате нару- шается сродство таких гемоглобинов к О2. 5.12. Гемоглобин М: продукт мутации в ак- тивном центре Замена проксимального или дистального гистидина в группе гема на тирозин приво- дит к стабилизации окисленной (ферри) формы гема, не способной к связыванию кислорода (рис. 5.16). В этом случае ионизи- рованная боковая цепь тирозина образует комплекс с окисленным железом гема. Ука- занная замена может произойти как в а-, так и в p-цепи. Действительно, были обнару- жены все четыре мутантных варианта. Му- тантные гемоглобины, у которых два гема в молекуле постоянно находятся в ферри- форме, называют гемоглобином М. Буква М указывает, что мутировавшие цепи нахо- дятся в форме метгемоглобина (ферригемо- глобина). У людей с гемоглобином М обыч- но отмечается цианоз. Заболевание встре- чается только у гетерозиготных особей, поскольку гомозиготность по этому призна- ку почти всегда приводит к летальному исходу. 5.13. Полярные группы в щели, занимаемой гемом, ослабляют его связывание с полипеп- тндной цепью Еще один тип мутации, затрагивающей ак- тивный центр, выражается в том, что в ще- ли, занимаемой гемом, на место неполярной группы становится полярная. Между гемом и полипептидной цепью существует 60 меж- атомных контактов, причем эти контакты по своей природе неполярны. Поскольку эти неполярные взаимодействия устойчиво со- храняются в нормальных гемоглобинах раз- ных видов животных, можно думать, что большинство из них имеет существенное значение для функционирования молекулы гемоглобина. В самом деле, мутации в участках связывания гема почти всегда приводят к неблагоприятным послед- ствиям. Рассмотрим для примера гемогло- Фенилаланин Рис. 5.17. Локализация фенилаланина CD1, одного из инвариантных остатков в гемоглобине. Аро- матическое кольцо этого фенилаланина находится в контакте с гемом. бин Hammersmith. На месте фенилаланина CD1 (рис. 5.17) в этом гемоглобине нахо- дится серин. В результате такой замены на- рушается связывание гема. Объяснить это можно следующим путем: вероятно, нали- чие полярного остатка серина способствует тому, что в щель, обычно занимаемую ге- мом, проникает вода. 5.14. В результате некоторых мутаций гемо- глобины утрачивают стабильность из-за де- формаций третичной структуры Замены аминокислот в отдаленных от гема участках могут препятствовать возникнове- нию нормальной конформации гемогло- бина и тем самым резко нарушать его функ- цию. Большой интерес в этом отношении представляет гемоглобин Riverdale-Bronx, у которого в положении В6 вместо глицина стоит аргинин. Из-за больших размеров ар- гинин не умещается в том узком простран- стве, в котором должны пересекаться спира- ли В и Е (рис. 5.18). Действительно, во всех нормальных гемоглобинах и миоглобинах положение В6 всегда занято глицином. Ге- моглобин Riverdale-Bronx в результате про- s. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 99 7*
изошедшей аминокислотной замены оказы- вается нестабильным. Гемоглобин Gun Hill принадлежит к числу редко встречающихся аномальных гемогло- бинов, у которых не один, а несколько ами- нокислотных остатков затронуты мутацией. В указанном гемоглобине произошла поте- ря пяти аминокислот в каждой р-цепи, а именно выпал последний аминокислотный остаток в F-спирали и следующие четыре остатка в углу, образованном F- и G спира- лями. В нормальном гемоглобине соответ- ствующий фрагмент полипептидной цепи образует контакты с гемом. Выпадение ука- занного фрагмента в результате мутации приводит к тому, что р-цепи гемоглобина Gun Hill не содержат гема. Клиническое проявление этой мутации - гемолитическая анемия. 5.15. Мутации в области контактов нару- шают аллостерические взаимодействия Для функционирования гемоглобина в каче- стве эффективного переносчика кислорода необходимо сохранение всех его аллостери- ческих свойств. Целостность участка, связы- вающего гем, и правильная укладка субъ- единиц гемоглобина-условие необходимое, но отнюдь не достаточное для полноценно- го функционирования. Важная роль принад- лежит аминокислотным остаткам, локали- зованным в области контактов между субъединицами, так как некоторые из этих остатков передают информацию от одной субъединицы к другой. Контакты между одноименными субъединицами гемогло- бина немногочисленны и по своей природе полярны, тогда как контакты между разно- именными субъединицами обширны и в ос- новном неполярны. Существуют два типа контактов между а- и P-цепями, обозна- чаемые соответственно oqPj и а^. Как уже отмечалось, a tp2-контакт играет, по-види- мому, ключевую роль в передаче аллостери- ческих взаимодействий,-судя по тому, что именно в этой области наблюдается значи- тельное перемещение атомов при оксигени- ровании гемоглобина. Об этом свидетель- ствует и тот факт, что почти все гемогло- бины с заменами в области а1р2'контактов проявляют пониженную кооперативность. Более того, обычно и сродство этих гемогло- бинов к кислороду отличается от нормы. Часть I 100 Конформация и динамика Рис. 5.18. Молекула гемоглобина при- нимает нормальную структу- ру, только если в положении В6 стоит остаток глицина. По- скольку именно в этом участке перекрещиваются спирали В и Е, для большей, чем у глиц- ина, боковой цепи нет места. Например, гемоглобин Kempsey характе- ризуется Р50 = 15 торр, тогда как для нор- мального гемоглобина Р50 равно 26 торр. При этой мутации аспартат в положении G1 в р-цепи заменен аспарагином. Почему та- кая замена проявляется в значительном по- вышении сродства к кислороду? Вспомним, что в дезоксигемоглобине область cq Р2 -контакта в норме стабилизирована во- дородной связью между остатками аспарта- та G1 и тирозина в a-цепи (разд. 4.9). Эта водородная связь обеспечивает устойчи- вость Т-состояния (tense, напряженное), ха- рактерного для нормального дезоксигемо- глобина. Отсутствие указанной водородной связи в гемоглобине Kempsey уменьшает стабильность Т-состояния, сродство к кис- лороду в результате повышается. В обрат- ной ситуации в тех же случаях, когда в ре~ зулыпате мутации нарушается стабиль- ность R (релаксированного) состояния, следует ожидать снижения сродства к кис- лороду. Действительно, Р50 гемоглобина Kansas равен 70 торр. У больных с таким ге- моглобином резко выражен цианоз, по- скольку уровень насыщения кислородом их
артериальной крови составляет 0,6 против 0,97 в норме. В гемоглобине Kansas про- изошла замена аспарагина G4 на треонин, вследствие чего не образуется той водород- ной связи, которая в норме стабилизирует оксигемоглобин. 5.16. Значение открытия мутантных гемоглобинов Выявление мутаций белков-переносчиков кислорода оказало большое влияние на мо- лекулярную биологию, медицину, генетику и антропологию. Мутантные гемоглобины используются в трех линиях исследований. 1. Мутантные гемоглобины позволяют понять взаимосвязь между структурой и функцией нормального гемоглобина. Мута- ция по одному аминокислотному остатку представляет собой высокоспецифическую химическую модификацию молекулы, осу- ществленную самой природой. Такие мута- ции помогают выявить, какая часть моле- кулы имеет наиболее важное значение для функции. 2. На примере мутантных гемоглобинов было впервые обнаружено, что болезнь мо- жет возникнуть в результате замены одной-единственной аминокислоты в одной полипептидной цепи определенного белка. Вся концепция о молекулярных болезнях, составляющая теперь неотъемлемую часть медицины, возникла при изучении гемо- глобина серповидных клеток. 3. Выявление мутантных гемоглобинов расширяет наши представления об эволю- ционных процессах. Мутации служат «сырь- ем» для эволюции. Как показало изучение серповидноклеточной анемии, мутация мо- жет быть одновременно и полезной, и вред- ной. Процесс эволюции может приводить к болезни у отдельных особей; это красочно описали Цукеркандл и Полинг (Zuckerkandl, Pauling 1962): «С субъективной точки зрения эволюция чаще всего сводилась к страданиям от бо- лезни. Эти болезни были, безусловно, мо- лекулярными. Выражение концепции до- бра и зла, которую человек изобразил как свое печальное изгнание из рая, это, мо- жет быть, молекулярная болезнь, обер- нувшаяся эволюцией». Заключение Изменение одной-единственной аминокис- лоты в одном-единственном белке, вызван- ное мутацией гена, может быть причиной определенной болезни. Наиболее изученная молекулярная болезнь - серповидноклеточ- ная анемия. Аномальный гемоглобин больных серповидноклеточной анемией, обозначаемый как гемоглобин S, состоит из двух нормальных a-цепей и двух мутантных p-цепей. Мутация выражается в том, что в р- цепи гемоглобина S в 6-м положении вместо глутамата стоит валин. Такое замещение полярной боковой цепи на неполярную при- водит к резкому понижению растворимости дезоксигемоглобина S. Растворимость же оксигемоглобина S остается нормальной. Дезоксигенированный гемоглобин S обра- зует волокнистый осадок, который дефор- мирует эритроцит, придавая ему форму сер- па. Серповидные эритроциты быстро разру- шаются, что создает в итоге клиническую картину хронической гемолитической ане- мии. Серповидноклеточная анемия возни- кает только у лиц, гомозиготных по мутант- ному гену, детерминирующему синтез Р-це- пи гемоглобина S. У гетерозиготных особей синтезируется и гемоглобин S, и гемоглобин А. Гетерозиготное состояние, называемое признаком серповидноклеточности, проте- кает обычно бессимптомно. Среди негри- тянского населения примерно один человек из десяти гетерозиготен по гену серповидно- клеточности. Такая высокая частота этого мутантного гена, вредоносного для орга- низма в случае гомозиготности, обусловле- на тем, что носительство мутантного гена оказывается полезным признаком-явление, известное как сбалансированный полимор- физм. Лица, гетерозиготные по гену серпо- видноклеточной анемии, оказываются устойчивыми к самой тяжелой, летальной форме малярии. При изучении гемоглобина у гематологи- ческих больных, а также при обследовании здоровых людей было обнаружено более 100 мутантных форм гемоглобина. Гемо- глобины, отличающиеся по электрофорети- ческой подвижности от гемоглобина А, под- вергают анализу методом пептидных карт («отпечатков пальцев») и затем определяют последовательность аминокислот того пеп- тида, по которому исследуемый гемоглобин отличается от гемоглобина А. Выявлено не- сколько классов мутаций гемоглобинов. К мутациям первого класса относятся за- мены аминокислот на поверхности моле- кулы; почти всегда эти замены безвредны, а гемоглобин S составляет поразительное 5. Молекулярные болезни: серповидноклеточная анемия 101
исключение. Мутации второго класса-это замены аминокислот вблизи гема, что обыч- но приводит к нарушению связывания кис- лорода. Например, в гемоглобине М про- ксимальный либо дистальный гистидин заменен на тирозин; в результате гемогло- бин М стабилизирован в ферри(мет)форме и не способен связывать кислород. При му- тациях третьего класса замены происходят во внутренней части молекулы, которые не- редко приводят к изменению третичной структуры и как следствие к нестабильности молекулы гемоглобина. Примером может служить гемоглобин, в котором аргинин стоит вместо глицина в том участке, где гли- цин необходим в силу своей малой вели- чины. Изменения в участках контактов ме- жду субъединицами обычно сопровождают- ся потерей аллостерических свойств. Замены аминокислот, стабилизирующие гемогло- бин в состоянии либо Т, либо R, приводят к изменению сродства к кислороду. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Allison А. С., 1956. Sickle cells and evolution, Sci. Amer., 195 (2), 87-94. Perutz M.F., Lehmann H., 1968. Molecular pathology of human haem- oglobin, Nature, 219,902-909. (О выда- ющихся работах, посвященных более чем 50 мутантным гемоглобинам. Показана корреляция между клини- ческими симптомами и характером изменений структуры гемоглобина.) Серповидноклеточная анемия Dean J., Schechter A. N., 1978. Sickle-cell anemia: molecular and cellular bases of therapeutic approaches. New Engl. J. Med., 299, 752-763; 804—811 and 863-870. (Великолепный обзор, посвященный структурным, генетическим и клиническим аспек- там серповидноклеточной анемии.) Herrick J.B., 1910. Peculiar elongated and sickleshaped red blood corpuscles in a case of severe anemia, Arch. Intern. Med., 6, 517-521. Neel J. V., 1949. The inheritance of sickle-cell anemia, Science, 110, 64 66. Pauling L., Itano H.A., Singer S.J., Wells I. C., 1949. Sickle cell anemia: a molecular disease, Science, 110, 543-548. Ingram V. M., 1957. Gene mutation in human haemoglobin: the chemical difference between normal and sickle* cell haemoglobin, Nature, 180, 326-328. Pasvol G., Weatherall D.J., Wilson R. J. M., 1978. Cellular mec- hanism for the protective effect of haem- oglobin S against P. falciparum malaria, Nature, 274, 701-703. Behe M.J., Englander S. W., 1978. Sickle hemoglobin gelation: reaction order and critical nucleus size, Biophys. J, 23, 129-145. Eaton W. A., Hofrichter J., Ross P.D., 1976. Delay time of gelation : a possible determinant of clinical severity in sickle cell disease, Blood, 47, 621-627. Другие мутантные гемоглобины Bunn И. F., Forget В. G., Ranney H. M>, 1977. Human Hemoglobins, Saunders. Caughey W. S. (ed.), 1978. Biochemical and Clinical Aspects of Hemagiobin Abnormalities, Academic Press. Lehmann H., Huntsman R.G., 1974. Man’s Haemoglobins (2nd ed.), Lippincott. Winslow R. M., Anderson W.F., 1978. The hemoglobinopathies. In: Stanbu- ry J. B., Wyngaarden J. B. and Fredrickson D.S. (eds.), The Metabolic Basis of Inherited Disease (4th ed.), pp. 1465-1507. McGraw-Hill. Bellingham A. J., 1976. Hemoglobins with altered oxygen affinity, Brit. Med. Bull., 32, 234-238. Болезни и эволюция Zuckerkandl E., Pauling L., 1962. Molecular disease, evolution, and genic heterogeneity. In: Kasha M. and Pullman B. (eds.), Horizons in Biochemistry, pp. 189-225, Academic Press. [Имеется перевод: Горизонты биохи- мии./ Под ред. М. Каша, Б. Пюльмана.-М.: Мир, 1964, с. 148-173.] Cavalli-Sforza L. L., Bodmer W. F., 1971. The Genetics of Human Populations, Freeman. (Вопрос о гене- тическом полиморфизме прекрасно представлен в гл. 4 и 5.) Вопросы и задачи 1. При проведении программы обследования обнаружен гемо- глобин с аномальной электрофоретической подвижностью. Судя по пептидной карте трипсинового гидролизата гемоглобина, за- мена аминокислоты произошла в р-цепи. Отсутствует нормальный N-концевой трип- тический пептид (Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu- Glu-Lys). Обнаружен новый триптический пептид, состоящий из 6 аминокислотных Часть I 102 Конформация и динамика остатков. N-концевым остатком в этом пеп- тиде оказался валин. а) Замене каких аминокислот соответ- ствуют эти данные? б) Как этот гемоглобин должен отличаться от НЬА и HbS по электрофоретической под- вижности при pH 8? 2. Ниже показана электрофорети- ческая подвижность ряда му- тантных гемоглобинов А при pH 8,6. — + Электрод---------------------Электрод a b cd Нормальный гемоглобин
Как распределяются места а, Ь, с и d между гемоглобинами следующего состава: Hb D (а 68) Hb J (Р 69) Hb N (Р 95) НЬ С (Р 6) Лизин вместо аргинина Аспартат вместо глицина Глутамат вместо лизина Лизин вместо глутамата 3. Некоторые мутации гена гемо- глобина оказывают влияние на все три гемоглобина At, А2 и F, тогда как другие-только на один из них. Почему? 4. Если гемоглобин человека с признаком серповидноклеточ- ности (т.е. гетерозиготного по гену серпо- видноклеточности) подвергнуть электрофо- резу на крахмальном геле, то выявляются две основные полосы. Одна из них-НЬА° (а2р2), вторая-HbS («гРг)- Отсутствие третьей полосы с промежуточной электро- форетической подвижностью дало основа- ние думать, что гибридной молекулы a2pps не существует. Однако в дальнейшем такой гибридный гемоглобин был обнаружен в растворе. Почему он не выявляется при электрофорезе на крахмальном геле? (Под- сказка: подумайте о влиянии электрическо- го поля на равновесие 2(a2pps) <±<х2р2 + + а202-) 5. НЬА тормозит образование длинных волокон из HbS и по- следующую деформацию эритроцитов (в серповидные клетки) при дезоксигенирова- нии. Как объяснить этот эффект НЬА? 6. При высокой ионной силе гемо- глобин расщепляется в участке оц Р2-контакта на aP-димеры. Какова спо- собность к диссоциации окси- и дезокси- формы гемоглобина Kempsey по сравнению с гемоглобином А?
ГЛАВА 6. Введение в энзимологию Химические реакции в биологических систе- мах редко протекают в отсутствие катализа- тора. Роль таких катализаторов выполняют специфические белки, называемые фермен- тами, Всем ферментам свойственны удиви- тельно высокая каталитическая сила и спе- цифичность. При этом активность многих ферментов регулируется. Кроме того, ряд ферментов непосредственно участвует в трансформации различных форм энергии. Рассмотрим эти отличительные свойства ферментов, имеющие крайне важное значе- ние для биологических процессов. 6.1. Ферменты обладают огромной катали- тической силой Ферменты ускоряют реакции по крайней ме- ре в миллион раз. В самом деле, в отсут- ствие ферментов скорость большинства ре- акций в биологических системах практиче- ски неощутима. Даже такая простая реак- ция, как гидратирование диоксида углерода, В отсутствие фермента перенос СО2 из тканей в кровь и затем в воздух легочных альвеол был бы неполон. Карбоангидраза, катализирующая эту реакцию, принадлежит к числу самых активных ферментов из всех известных. Каждая молекула карбоанги- дразы способна гидратировать 105 молекул СО2 в 1 с. Скорость реакции гидратиро- вания СО2 в присутствии фермента в 107 раз выше, чем в его отсутствие. 6.2. Ферменты обладают высокой специфич- ностью Ферменты обладают высокой специфич- ностью как в отношении катализируемой ими реакции, так и в отношении субстратов, т. е. участвующих в реакции веществ. Каждый фермент катализирует какую-либо одну химическую реакцию или же несколько очень сходных реакций. Степень специфич- ности к субстрату обычно высока, а иногда практически абсолютна. Рассмотрим в качестве примера протео- литические ферменты. Они катализируют реакцию гидролиза пептидной связи: НО НО I II I II —N—С—С—N—С—С— + Н I I I Н Ri Н R2 20 Пептид ? /° —N—С— R Х°“ П Карбоксильный компонент Н О I II Н .N—С—С— ' I r2 Аминный компонент катализируется ферментом: СО2 + Н2О н2со3. о Многие протеолитические ферменты ката- лизируют иную, но сходную реакцию, а именно гидролиз эфирной связи: R,—С—о R; + Н2О —— Rj— cf + НО + н+ о- Кислота Спирт Эфир 104 Часть I Конформация и динамика
Протеолитические ферменты сильно раз- личаются по степени субстратной специфич- ности. Так, субгилизин, син тезируемый определенным видом бактерий, расщепляет пептидную связь независимо от природы прилежащей к ней боковой цени. С другой стороны, трипсин, как уже упоминалось в гл. 2. проявляет высокую специфичность в том отношении, что расщепляет пеп- тидные связи, образованные карбоксильны- ми группами только лизина и артинина (рис. 6.1). Тромбин, участвующий в сверты- вании крови, проявляет еще более высокую специфичность, чем трипсин. Он разрывает только те пептидные связи, которые образо- ваны карбоксильной группой аргинина и аминогруппой глицина (рис. 6.2). Другим примером высокой степени спе- цифичности ферментов может служить ДНК-полимераза I. Этот фермент синтези- рует ДНК. соединяя друг с другом четыре типа нуклеотидов-строительных блоков ДНК. Последовательность нуклеотидов в синтезируемой цепи ДНК определяется последовательностью нуклеотидов в другой цепи ДНК, играющей роль матрицы (рис. 6.3). ДНК-полимераза I отличается по- разительно высокой точностью в выполне- нии тех инструкций, которые задаются ма- трицей. В синтезируемых цепях ДНК оши- бочно включенный нуклеотид встречается реже чем один раз на миллион. 6.3. Активность некоторых ферментов регу- лируется Некоторые ферменты синтезируются в фор- ме неактивного предшественника и перехо- дят в активное состояние в физиолог ически соответствующем месте и времени. Приме- ром регуляции такого типа могут служить пищеварительные ферменты. Так, трипсино- ген синтезируется в поджелудочной железе, а активируется в тонком кишечнике, где в результате расщепления пептидной связи образуется активная форма - трипсин (рис. 6.4). Такой же тип регуляции много- кратно используется в последовательности ферментативных реакций, ведущих к свертыванию крови. Каталитически неак- тивные предшественники протеолитических ферментов называются проферментами, или зимогенами. Еще один механизм регуляции фермента- тивной активности заключается в том, что с ферментом ковалентно связывается не- большая дополнительная группа. Это так называемый механизм ковалентной моди- Гидролизуемая связь НО-; НО I II I II —N —С—C-EN —С—С— Н I JН r2 Лизин или аргинин Рис. 6.1. Специфичность трипсина. Гидролизуемая связь Рис. 6.2. Специфичность тромбина (фактора свертывания крови). Аргинин Глицин Рис. 6.3. Электронная микрофотогра- фия молекул ДНК-полиме- разы I (белые сферические ча- стицы), присоединившейся к нитевидной синтетической ДНК-матрице. (Печатается с любезного разрешения д-ра J. Griffith.) 6. Введение в энзимологию 105
Неактивный предшественник Рис. 6.4. Активация профермента путем гидролиза специфических пеп- тидных связей. фикации. Так, в частности, путем присоеди- нения фосфорильной группы к опреде- ленным остаткам серина регулируется ак- тивность ферментов (разд. 16.11), синтези- рующих или расщепляющих гликоген. О II —СН2—О—Р—о- 0- Фосфорилироеамное производное остатка серина Такая модификация может быть обращена гидролизом. Как присоединение, так и от- щепление фосфорильных и других модифи- цирующих групп катализируется специфи- ческими ферментами. Иной тип регуляции действует в случае многих метаболических последовательно- стей, ведущих к синтезу небольших молекул, например аминокислот. При этом фермент, катализирующий первый этап биосинтеза, подвергается ингибирующему действию ко- нечного продукта биосинтеза (рис. 6.5). Ил- люстрацией этого механизма регуля- ции-ингибирования по принципу обратной связи, или ретроингибирования,- может слу- жит биосинтез изолейцина у бактерий. Пре- вращение треонина в изолейцин осущест- вляется в пять этапов, первый из которых катализируется треониндезаминазой. Когда концентрация изолейцина достигает доста- точно высокого уровня, происходит ингиби- рование фермента, обусловленное тем, что изолейцин присоединяется к регуляторному (а не к каталитическому) участку фермента. Ингибирование фермента в этом случае опосредовано обратимым аллостерическим взаимодействием. При снижении содержа- ния изолейцина до определенного уровня треониндезаминаза вновь становится актив- ной и синтез изолейцина восстанавливается. Часть I 106 Конформация и динамика Активный фермент Специфичность ряда ферментов находит- ся под физиологическим контролем. Осо- бенно интересным примером в этом отно- шении может служить синтез лактозы в молочной железе (рис. 6.6). Лактозо-син- таза - фермент, катализирующий синтез лактозы, состоит из двух субъединиц - ката- литической и модифицирующей. Каталити- ческая субъединица сама по себе неспособна к синтезу лактозы. Роль этой субъединицы состоит в том, что она катализирует присое- динение галактозы к белку, содержащему ковалентно присоединенную углеводную цепь. Модифицирующая субъединица меняет спе- цифичность каталитической субъединицы таким образом, что последняя начинает присоединять галактозу уже к глюкозе, образуя лактозу. Содержание модифици- рующей субъединицы находится под гормо- нальным контролем. Во время беременно- сти в молочной железе синтезируется каталитическая субъединица, содержание же модифицирующей субъединицы незначи- тельно. При родах содержание гормонов в крови резко меняется, что приводит к син- тезу больших количеств модифицирующей субъединицы. Далее модифицирующая субъединица присоединяется к каталитиче- ской, образуя активный лактозо-синтазный комплекс, продуцирующий большие коли- чества лактозы. Из всего сказанного очевид- но, что гормоны могут оказывать физиоло- гический эффект путем изменения специфич- ности ферментов. 6.4. Ферменты осуществляют трансформа- цию различных видов энергии Во многих биохимических реакциях энергия реагирующих веществ переходит из одной формы в другую с высокой степенью эффек- тивности. Так, например, при фотосинтезе энергия света превращается в энергию хи- мических связей. В митохондриях свободная энергия, содержащаяся в низкомолеку- лярных веществах, поступающих с пищей, переходит в энергию аденозинтрифосфата
Ингибирование продуктом Z Рис. 6.5. Ингибирование по механизму обратной связи первого в ме- таболической последователь- ности фермента путем обрати- мого связывания им конечного продукта. >С--------->°-------->Z Конечный продукт I } ствие фермента равновесие установится лишь через несколько часов, тогда как при участии фермента оно будет достигнуто все- го лишь за несколько секунд. Следователь- но, ферменты ускоряют наступление равно- весия, но не сдвигают его. (АТР) - разменной монеты энергетической валюты. Энергия химических связей АТР используется далее во многих процессах. При мышечном сокращении энергия АТР преобразуется в энергию мышечного сокра- щения. В клетках и в субклеточных органел- лах имеются насосы, использующие АТР для транспорта молекул и ионов против хи- мического и электрического градиентов. Эти превращения энергии осуществляются молекулами ферментов, составляющими интегральную часть высокоорганизованных структур. 6.5. Ферменты не сдвигают равновесия реакции Фермент является катализатором, и, следо- вательно, он не может изменять равновесия химической реакции. Это означает, что фер- мент ускоряет как прямую, так и обратную реакцию в совершенно одинаковой степени, Рассмотрим взаимопревращение А в В. Пусть в отсутствие фермента скорость пря- мой реакции (/спр) составит 10-4 с-1, а ско- рость обратной (/сОб[) составит 10“6с-1. Константа равновесия К определяется соот- ношением этих скоростей: io-*С'I А В, 10“6 п-1 К [В] ~ fcnp = 10~4 [AJ ^обр Ю 6 Таким образом, в состоянии равновесия концентрация В будет в 100 раз выше, чем концентрация А, независимо от того, при- сутствует фермент или нет. Однако в отсут- 6.6. Ферменты снижают энергию активации катализируемых ими реакций Химическая реакция А+±В протекает через переходное состояние с более высокой энер- Галактоза Глюкоза Каталитическая единица Модификатор специфичности Рис. 6.6. Синтез лактозы - сахара, со- стоящего из остатков глюкозы и галактозы, происходит под действием фермента, который содержит каталитическую субьединицу и субъединицу, модифицирующую субстрат- ную специфичность. Каталити- ческая субъединица в отсут- ствие субъединицы-модифика- тора катализирует другую реакцию. 6. Введение в энзимологию 107
гией, чем энергия А или В. Скорость прямой реакции зависит от температуры и от разно- сти значений свободной энергии для А и переходного состояния; эта разность на- зывается свободной энергией активации Гиббса и обозначается AG^ (рис. 6.7,А): AG = Спереходное состояние — ^субстрат Скорость реакции пропорциональна коли- честву молекул, свободная энергия которых равна или выше AG+. Доля таких молекул возрастает с повышением температуры. Ферменты повышают скорость реакций путум снижения активационного барьера AG . При взаимодействии субстрата с фер- ментом реакция протекает по новому меха- низму, характеризующемуся более низкой энергией переходного состояния, чем реак- ции, протекающие в отсутствие фермента (рис. 6.7, Б). 6.7. Первый этап ферментативного катали- за - образование фермент-субстратного комплекса Образованию или расщеплению химиче- ских связей каким-либо ферментом предше- ствует формирование фермент-субстратно- го (ES) комплекса. При этом субстрат присоединяется к специфическому участку на ферменте, называемому активным цен- тром. Большинство ферментов проявляет высокую избирательность в отношении связывания субстратов. В сущности, специ- фичность каталитического действия фер- ментов в основном зависит от специфично- сти процесса связывания. Более того, на этой стадии нередко осуществляется и регу- ляция ферментативной активности. Существование фермент-субстратных комплексов было доказано разными спосо- бами. 1. ES-комплексы были непосредственно выявлены с помощью электронной микроско- пии и рентгеноструктурного анализа. Комп- лексы нуклеиновых кислот и их полимераз видны под электронным микроскопом (рис. 63). При рентгеноструктурном анали- зе комплекса карбоксипептидазы А с ее суб- стратом глицил-Ь-тирозином была получе- на подробная информация относительно места и характера связывания субстрата с ферментом в этом ES-комплексе. Без катализатора В присутствии Продукт Б Время протекания реакции Рис. 6.7. А. Определение свободной энергии активации AG t. Б. Фермент ускоряет реакцию пу- тем снижения AG |. 2. При образовании ES-комплекса неред- ко изменяются физические свойства фер- мента, например растворимость или термо- стабильность. 3. Спектроскопические характеристики многих ферментов и субстратов изменяют- ся при образовании ES-комплекса подобно тому, как меняется характерный для дезок- сигемоглобина спектр поглощения при связывании кислорода или при окислении в ферриформу, что было описано ранее (рис. 3.18). Эти изменения проявляются осо- бенно отчетливо, если фермент содержит окрашенную простетическую группу. Хоро- шей иллюстрацией может служить трипто- фан-синтаза-бактериальный фермент, со- держащий в качестве простетической группы пиридоксальфосфат. Этот фермент катализирует синтез L-триптофана из L-серина и индола. При добавлении L-ce- рина к ферменту резко возрастает флуорес- ценция пиридоксальфосфатной группы (рис. 6.8). Последующее добавление второ- Часть I 108 Конформация и динамика
Рис. 6.8. При добавлении субстратов реакции-серина и индола-из- меняется интенсивность флуо- ресценции пиридоксальфос- фатной группы в активном центре триптофан-синтазы. го субстрата - индола - гасит флу оресцен - цию до уровня ниже исходного. Таким обра- зом, флуоресцентная спектроскопия позво- ляет выявить существование комплексов фермент—серин и фермент—серин—индол. Для изучения фермент-субстратного взаи- модействия с успехом применяются и дру- гие спектроскопические методы, в частности методы ядерного и электронного парамаг- нитного резонанса. 4. При образовании ES-комплекса про- является высокая степень стереоспецифич- ности. Например, D-серин не может слу- жить субстратом для триптофан-синтазы. Более того, D-изомер даже не связывается с ферментом. Из этого следует, что участок связывания субстрата имеет строго опреде- ленную геометрическую форму. 5. ES-комплексы удается иногда выде- лить в чистом виде. Если фермент катализи- рует реакцию А + В С, то в некоторых случаях можно выделить комплекс ЕА. Для этого необходимо, чтобы фермент обладал достаточно высоким сродством к А и чтобы В в смеси отсутствовал. 6. При постоянной концентрации фер- мента скорость реакции возрастает с увели- чением концентрации субстрата, пока не бу- дет достигнута максимальная скорость (рис. 6.9). Такой эффект насыщения не свой- ствен реакциям, протекающим без катали- затора. В 1913 г. Леонор Михаэлис (L. Michaelis) рассмотрел понятие макси- мальной скорости ферментативной реакции с позиций образования дискретного ES-kom- плекса. Михаэлис пришел к выводу, что ско- рость реакции достигает максимума при до- статочно высокой концентрации субстрата, так как в этих условиях субстрат занимает все каталитические центры на ферменте. Это положение является самым старым и наиболее общим доводом в пользу суще- ствования ES-комплексов. 6.8. Некоторые свойства активных центров Активный центр фермента - это участок, ко- торый связывает субстраты (и простетиче- скую группу, если она есть) и в котором со- держатся аминокислотные остатки, непос- редственно участвующие в образовании или разрыве химических связей. Такие остатки называют каталитическими группами. Не- смотря на огромное разнообразие струк- туры ферментов, их специфичности и меха- низма каталитического действия, все же можно сделать ряд обобщений в отношении свойств активных центров. 1. На активный центр приходится отно- сительно малая часть общего объема фер- мента. Большая часть аминокислотных остатков в молекуле фермента не контакти- рует с субстратом. Остается загадкой, поче- Рис. 6.9. Скорость ферментативной ре- акции как функция концентра- ции субстрата. 6. Введение в энзимологию 109
Рис. 6.10. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели ключ-замок. Активный центр фермента сам по себе компле- ментарен по форме субстрату. му размер ферментов так велик. Почти все ферменты содержат более 100 аминокис- лотных остатков и имеют массу свыше 10 к Да, а диаметр-свыше 25 А. 2. Активный центр-трехмерное образо- вание. Другими словами, это не точка, не ли- ния и даже не плоскость, а сложная трехмер- ная структура, в формировании которой участвуют группы, принадлежащие разным частям линейной последовательности ами- нокислот. Действительно, как мы уже виде- ли на примере гемоглобина и миоглобина, взаимодействие между аминокислотными остатками, расположенными далеко друг от друга в линейной последовательности, не- редко сильнее, чем взаимодействие между соседними (в последовательности) остатка- ми аминокислот. В лизоциме - ферменте, ко- торый мы рассмотрим подробно в следую- щей главе, основные группы активного центра представлены аминокислотными остатками, занимающими 35, 52, 62, 63 и 101-е положения в линейной последова- тельности из 129 аминокислот. 3. Субстраты относительно слабо связы- ваются с ферментами. Константы равнове- сия ES-комплексов обычно лежат в пре- делах от 10“2 до 10“8 М, что соответствует свободным энергиям взаимодействия от — 3 до — 12 ккал/моль. Сравним эти вели- чины с силой ковалентных связей, соста- вляющей от — 50 до — ПО ккал/моль. Часть I ПО Конформация и динамика 4. Активный центр имеет форму узкого углубления или щели. Во всех ферментах с изученной структурой связывание субстра- тов происходит в таком углублении или ще- ли, куда нет доступа воде, за исключением тех случаев, когда вода является одним из реагирующих веществ. В этом углублении присутствует несколько полярных амино- кислотных остатков, необходимых для связывания и катализа. Неполярный харак- тер всей области в целом способствует связыванию субстрата. Кроме того, щеле- видная форма активного центра создает ми- кроокружение, в котором отдельные по- лярные остатки приобретают особые свой- ства, существенно важные для катализа. 5. Специфичность связывания зависит от строго определенного расположения атомов в активном центре. Субстрат входит в ак- тивный центр, только если он соответствует ему по форме. В 1890 г. Эмиль Фишер (Е. Fischer) использовал сравнение с ключом и замком (рис. 6.10), которое оказалось по существу правильным и исключительно плодотворным представлением о стереоспе- цифичности катализа. Однако, как показы- вают работы последних лет, активные центры некоторых ферментов не являются жесткой структурой, их форма модифици- руется при связывании субстратов. В этих ферментах форма активного центра стано- вится комплементарной форме субстрата Рис. 6.11. Взаимодействие субстратов с ферментами согласно модели индуцированного соответстия. При связывании субстрата происходит изменение формы фермента. Активный центр фермента только после присое- динения субстрата становится комплементарным ему по фор- ме.
Концентрация субстрата [S] Рис. 6.12. График зависимости скорости реакции V от концентрации субстрата [S] для фермента, подчиняющегося кинетике Михаэлиса - Ментен (Утах- максимальная скорость, Км- константа Михаэлиса). только после связывания субстрата. Такой процесс динамического узнавания назы- вают индукцией соответствия (рис. 6.11). Кроме того, некоторые ферменты предпоч- тительно связывают субстрат в напряжен- ной («искаженной») форме, соответствую- щей переходному состоянию. 6.9. Кинетика многих ферментов описывает- ся моделью Михаэлиса - Ментен Для многих ферментов скорость катализа V, таким образом, зависит от концентрации субстрата [S], как это показано на рис. 6.12. При постоянной концентрации фермента и малых значениях [S] V почти прямо про- порциональна [S]. При высоких значениях [S] Упочти не зависит от [S]. В 1913 г. Лео- нор Михаэлис и Мод Ментен (L. Michaelis, М. Men ten) предложили простую модель, объясняющую такую кинетику. Основная их посылка состояла в том, что образование специфического фермент-субстратного ком- плекса является необходимым промежу- точным этапом катализа. Предложенная ими модель, которая простейшим образом описывает кинетические свойства многих ферментов, состоит в следующем: ki кз E + S <=► ES-> Е + Р. (1) *2 Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ES-комплекс; константа скорости этого процесса -/q. Судьба ES-комплекса складывается двояко: он может либо диссо- циировать на Е и S с константой скорости к2, либо подвергаться дальнейшему превра- щению, образуя продукт Р, с константой скорости к3. Постулируется, что продукт ре- акции Р не превращается в исходный суб- страт S; это условие соблюдается на началь- ной стадии реакции, пока концентрация продукта не достигает ощутимого количе- ства. Как связана скорость катализа с концен- трацией субстрата и фермента и скоростями отдельных этапов реакции? Начнем с того, что скорость ферментативной реакции рав- на произведению концентрации комплекса ES на константу к3: K = k3[ES]. (2) Выразим [ES] через известные величины. Скорости образования и распада ES соста- вляют : Скорость образования ES — [Е] [S]. (3) Скорость распада ES = (к2 -I- к3) [ES]. (4) Определим скорость катализа в стацио- нарных условиях. Стационарные условия ха- рактеризуются тем, что концентрация про- межуточных продуктов остается постоян- ной, тогда как концентрации исходных и конечных продуктов меняются. Это имеет место в том случае, когда скорость синтеза ES-комплекса оказывается равной скорости его распада. Если левые части равенств (3) и (4) равны между собой, то равны и правые, т. е. k1[E][S] = (fc2 + k3)[ES]. (5) Преобразуем это уравнение: [ES] = —ИИ—. (6) Уравнение (6) можно упростить, если ввести новую константу Км, называемую констан- той Михаэлиса: „ к2 + к3 Км=^—^~. (7) К Введем Км в уравнение (6): rES,[E][S] LbSJ-—------• (») 6. Введение в энзимологию 111
1/v Наклон = KM/vmai[ Отрезок, отсекаемый на оси х, = -1 /Км Рис. 6.13. Изображение кинетики фер- ментативной реакции на гра- фике двойных обратных вели- чин: 1/У выражена как функ- ция 1/[S]. Наклон кривой ра- вен Км/Knax’ точка пересече- ния с осью у соответствует 1/Итах, точка пересечения с осью х — 1/Км. Рассмотрим числитель в последнем выра- жении. Концентрация несвязанного субстра- та [S] практически равна общей концентра- ции субстрата при условии, что концентра- ция фермента значительно ниже концентра- ции субстрата. Концентрация несвязанного фермента (Е) равна общей концентрации фермента Ет минус концентрация комплек- са ES: [E] = [ET]-[ES]. (9) Подставим это выражение в уравнение (8): [ES] = ([Еу] - [ES]) [S]/KM. (Ю) Решение уравнения (10) относительно [ES] дает psi-^тж (|» или ,12) Подставим выражение (12) в уравнение (2): Часть I 112 Конформация н динамика Отрезок, отсекаемый на оси у, = 1/[S] Максимальная скорость реакции Ттах до- стигается при насыщении активных центров фермента субстратом, т. е. когда [S] намно- го выше при этом условии [S]/([S] + 4- Км) приближается к единице. Следова- тельно, ^ = Л3[Ет]. (14) Подставив это выражение в выражение (13), мы получим уравнение Михаэлиса-Мен- тен: V—V —. (15) ma’[S] + KM Это уравнение соответствует кинетическим данным, представленным на рис. 6.12. При низких концентрациях субстрата, когда [S] намного ниже Км, V = [S] Итаз(/Км» т.е. ско- рость прямо пропорциональна концентра- ции субстрата. При высоких концентрациях субстрата, когда [S] намного выше, чем V = Утах, т. е. скорость реакции максималь- на и не зависит от концентрации субстрата. Значение Км выступает с очевидностью из уравнения (15). Если [S] = Км» то = Fmax/2. Таким образом, Км равна концен- трации субстрата, при которой скорость ре- акции составляет половину максимальной. 6.10. Гтах и Км можно определить, используя различные концентрации субстрата Если фермент работает в соответствии с простой схемой, представленной в уравне- нии (1), то нетрудно определить его констан- ту Михаэлиса Км и максимальную скорость Кпах путем измерения скорости реакции при различных концентрациях субстрата. Удоб- но преобразовать уравнение Михаэлиса— Ментен в такую форму, чтобы графически
оно выражалось прямой. Для этого уравне- ние (15) представляют в виде обратных величин: 1 = 1 *м 1 У Кпах К™ ’ Р] ' (16) Откладывая 1/7 против 1/[S], получаем прямую, пересечение которой с осью ор- динат дает 1/7тах, а угол наклона равен Км/Итах (рис. 6.13). 6.11. Значение величин Км и 7тах Км для разных ферментов варьирует в ши- роком диапазоне величин (табл. 6.1). Для большинства ферментов величина Км ле- жите пределах 10"1 — 10" 6 М. Значение Км фермента зависит от природы субстрата, а также от условий среды: температуры, ионной силы. Константа Михаэлиса Км имеет два смысловых значения. Во-первых, Км-это концентрация субстрата, при кото- рой занята половина активных центров фер- мента. Если известна Км, то можно рассчи- тать, какова доля занятых активных цент- ров /es для любой концентрации субстрата: (17) Во-вторых, Км связана с константами скоростей отдельных этапов катализа, пред- ставленных в уравнении (1). Согласно урав- нению (7), Км равна (Л2 + к3)/кР Рассмот- рим крайний случай, когда к2 намного выше к3, т.е. диссоциация комплекса ES на Е и S происходит гораздо быстрее, чем образо- вание Е плюс продукта реакции. В этих ус- ловиях (к2 » к3) к2 Км=~г- (18) Константа диссоциации комплекса ES описывается уравнением ^ES= [Е] [S] _ к2 [ES] " к. ' (19) Другими словами, если к3 намного меньше, чем к2, то Км равна константе диссоциации ES-комплекса. При указанном условии Км служит мерой прочности ES-комплекса: вы- сокая Км-показатель слабого связывания субстрата; низкая Км - показатель сильного фермент-субстратного взаимодействия. Следует еще раз подчеркнуть, что по значе- нию Км можно судить о сродстве фермента к субстрату только при условии, что к2 зна- чительно больше к3. В действительности так оно и бывает во многих, хотя и не во всех случаях. Максимальная скорость 7тах отражает число оборотов фермента, если известна концентрация активных центров (Ер), так как Кпах = кз[Ет]. (20) Например, при полном насыщении субстра- том растворенная карбоангидраза в концен- трации 10"6 М катализирует образование 0,6 М Н2СО3 в секунду. Отсюда к3 = = 610-5с-1. Кинетическая константа к3 называется числом оборотов. Число оборо- тов фермента-это то количество молекул субстрата, которое превращается в продукт реакции в единицу времени при полном насы- щении фермента субстратом. Число оборо- тов 6Ю5 с"1, характерное для карбоангид- разы,-самое большое из всех известных. Каждый новый каталитический акт проис- ходит через промежуток времени, равный 1/к3, что для карбоангидразы составляет 1,7 мкс. Число оборотов большинства фер- ментов при использовании физиологиче- ских субстратов находится в пределах 104 в секунду (табл. 6.2). Таблица 6.1. Величины Км некоторых ферментов Фермент Субстрат Км. м Химотрипсин Ацетил-L-триптофа- 5 103 Лизоцим намид Г екса-И-ацетилглю- 6- 1(Г6 0- Г алактозидаза козамин Лактоза 410-’ T реониндезаминаза Треонин 5-10-3 Карбоангидраза со2 810-’ Пенициллиназа Бензилпенициллин 5 -10-5 Пируваткарбоксилаза Пируват ДЮ"* НСО’з 110“3 АТР 610"5 Аргинин-тРНК—син- Аргинин ЗЮ'* тетаза тРНК 410’7 АТР ЗЮ'4 6. Введение в энзимологию 113 8 665
6Л2. О степени совершенства кинетики ферментативного катализа судят по крите- рию ^кат/^М Когда концентрация субстрата намного превышает Км, скорость катализа численно равна к3, т. е. числу оборотов, как это описа- но в предыдущем разделе. Однако в физио- логических условиях концентрации субстра- тов в большинстве случаев ниже насыщаю- щих. Отношение [S]/KM обычно колеблется от 0,1 до 1,0. Если [S] « Км, то скорость ферментативной реакции значительно ниже к3, поскольку большинство активных цент- ров остается свободным. Существуют ли та- кие параметры, с помощью которых можно описать кинетику ферментативных реакций в этих условиях? Такие параметры имеются и их можно получить, объединив уравнения (2) и (8): къ И=-=^-[Е][8]. (21) Если [S] « Км, то концентрация свободно- го фермента (Е) практически равна общей концентрации фермента [EJ, и тогда к V = ~^[S] [ЕтЪ (22) ЛМ Таким образом, при [S] « Км скорость фер- ментативной реакции зависит от величины к3/Км и от [S]. В каких границах лежит отношение &3/КМ? Обратите внимание, что оно зависит от к2 и к3, как можно это показать путем замещения Км: &3 к3кг — - =—2-2—. (23) КМ к2+к3 Предел, которого может достичь отноше- ние /с3/Км, определяется значением kt, т.е. скоростью образования комплекса ES. Эта скорость не может превышать число столк- новений фермента с субстратом, контроли- руемое скоростью диффузии. Из-за этого на- кладываемого диффузией ограничения зна- чение кх не может быть выше 10s—109 М-1с-1. Отсюда следует, что верх- ний предел отношения к3/К^ составляет 10М09 М’Ч"1. Это ограничение сохраняет свою силу Часть I 114 Конформация и динамика и применительно к ферментам, имеющим более сложный механизм реакции, чем тот, что описан в уравнении (1). В случае таких ферментов максимальная скорость катали- за при насыщающих концентрациях суб- страта, обозначаемая /скат, зависит не от одной к3, а от нескольких констант скоро- стей. Параметром, характеризующим эти ферменты, является &кат/^м- Для Ря&а ФеР' ментов, в частности для ацетилхолинэсте- разы, карбоангидразы и триозофосфатизо- меразы, отношение ккат/Км колеблется от 108 до-109 М'1 с~\ что свидетельствует о достижении ими практически совершенной кинетики: скорость катализируемых ими ре- акций ограничивается только частотой столкновения фермента с субстратом. Дальнейшее повышение скорости реакции возможно только на основе уменьшения времени диффузии. В действительности ча- сто бывает так, что ферменты, обеспечиваю- щие отдельные метаболические последова- тельности, организованы в сложные комп- лексы (разд. 13.10), благодаря чему продукт реакции, катализируемой одним фермен- том, быстро попадает на следующий фер- мент. Таким образом, ограничения, на- кладываемые скоростью диффузии в раст- воре, частично снимаются тем обстоятель- ством, что субстраты и продукты оказы- ваются в малом объеме на полиферментном комплексе. 6.13. Ферменты могут ингибироваться специ- фическими молекулами Ингибирование ферментативной активно- сти небольшими специфическими молекула- ми и ионами имеет очень важное значение, поскольку в биологических системах служит Таблица 6.2. Максимальное число оборотов некоторых ферментов Фермент Число оборотов (в расчете на 1 с) Карбоангидраза 600000 3-Оксостероид - изомераза 280 000 Ацетилхолинэстераза 25 000 Пенициллиназа 2000 Лак татдег ид роген аза 1 000 Химотрипсин 100 ДНК-полимераза I 15 Триптофансинтаза 2 Лизоцим 0,5
Диизол рол илфтор* фосфат Рис. 6.14. Инактивация химотрипсина и ацетилхолин эстеразы диизо- пропил фторфосфатом. основным механизмом контроля. Подавле- ние ферментативной активности лежит так- же в основе действия многих лекарственных веществ и токсических агентов. Наконец, анализ ингибирования ферментов является одним из подходов к изучению механизмов ферментативного действия. Ингибирование ферментов может быть как обратимым, так и необратимым. При Необратимом ингиби- ровании ингибитор ковалентно соединяется с ферментом или же связывается так проч- но, что диссоциация идет очень медленно. Пример необратимого ингибирования— действие нервнопаралитических ядов на ацетилхолинэстеразу, играющую важную роль в передаче нервных импульсов. Одно из таких отравляющих веществ-диизопро- пил фторфосфат - взаимодействует с имею- щим критическое значение остатком серина в активном центре фермента с образова- нием неактивного комплекса диизопропил- фосфорил — фермент (рис. 6.14). Алкили- рующие агенты, например иодоацетамид, способны к необратимому ингибированию ферментов путем модификации цистеина и других боковых цепей (рис. 6.15). В отличие от рассмотренной ситуации при обратимом ингибировании равновесие между ингибитором и ферментом устанав- ливается быстро. Простейший вид обрати- мого ингибирования-это конкурентное ин- гибирование. Конкурентный ингибитор по- хож на субстрат и потому связывается активным центром фермента (рис. 6.16). Это препятствует связыванию субстрата в том же активном центре. Иными словами, невозможно одновременное связывание субстрата и конкурентного ингибитора. Конкурентный ингибитор уменьшает ско- рость катализа путем снижения доли моле- кул фермента, связавших субстрат. Класси- ческий пример конкурентного ингибирова- ния-действие малоната на сукцинат-дегид- роген азу-фермент, отщепляющий от сук- цината ионы водорода. Малонат отличается от сукцината тем, что имеет не две ме- тильные группы, а одну: С00- 1 соо- 1 1 сн2 1 2 сн2 1 сн2 1 2 СОО- соо- Сукцинат Малонат Физиологически важный пример конку- рентного ингибирования связан с образова- нием 2,3-бисфосфоглицерата из 1,3-бисфос- фоглицерата. Фермент, катализирующий эту изомеризацию,- бисфосфоглицератму- таза-конкурентно ингибируется низкими концентрациями 2,3-бисфосфоглицерата. О О (Фермент!—CH2SH + 1СН2—С —NH2 S СН2—С—NH2 + HI Иод ацетамид Рис. 6.15. Инактивация иодоацетатом фермента, для активации кото- рого остаток цистеина имеет критическое значение. 6. Введение в энзимологию 115 8*
Рис. 6.16. Различие между конку- рентным и неконкурентным ингибитором: слева- фер- мент-субстратный комплекс; в середине- конкурентный ингибитор препятствует связыванию субстрата; спра- ва -неконкурентный ингиби- тор не препятствует связыва- нию субстрата. В сущности, это довольно обычное явление, когда продукт ферментативной реакции ве- дет себя как конкурентный ингибитор в силу структурного сходства с субстратом. При неконкурентном, но тоже обрати- мом ингибировании ингибитор и субстрат могут связываться молекулой фермента одновременно; само по себе это показывает, что участки их связывания не перекрывают- ся. Действие неконкурентного ингибитора заключается в уменьшении числа оборотов фермента, а не в снижении доли связавших субстрат молекул фермента. Возможны и более сложные механизмы ингибирова- ния, когда ингибитор влияет и на связыва- ние субстрата, и на число оборотов фер- мента. Активность фермента может быть инги- бирована также в результате взаимодей- ствия между разными субъединицами оли- гомерного фермента. Этот тип ингибирова- ния, называемый аллостерическим ингиби- рованием, имеет очень важное значение для физиологических процессов. Мы его рас- смотрим несколько ниже. О О II . 11 С—ОРО,2* с—о- I I Н—С— ОН ^=± Н—с— ОРО?- I I Н2С— ОРО32" Н2С—ОРО32" 1,3-бисфосфоглицерат 2,3* бис фосфоглицерат Часть I 116 Конформация и динамика Конкурентный 6.14. Конкурентное и неконкурентное инги- бирование различаются по кинетике Измерение скоростей катализа при разных концентрациях субстрата дает возможность отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного. При конкурентном инги- бировании на графике, где 1/Иотложена про- тив 1/[S], прямая пересекает ось ординат в одной и той же точке независимо от при- сутствия ингибитора; меняется только угол наклона прямой (рис. 6,17). Это показывает, что при конкурентном ингибировании 7тах не изменяется. Особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что при до- статочно высокой концентрации субстрата ингибирование может быть преодолено. В самом деле, субстрат и ингибитор конку- рируют за один и тот же участок. При до- статочно высокой концентрации субстрата почти все активные центры заняты субстра- том и фермент проявляет полную актив- ность. Увеличение угла наклона прямой на графике зависимости 1/Иот 1/[S] указывает на прочность связи конкурентного ингиби- тора. В присутствии конкурентного ингиби- тора уравнение (16) заменяется следующим: где [I] - концентрация ингибитора, а К{-константа диссоциации комплекса фер- мент - ингибитор Е +1 EI, „ _ ИИ (25) Другими словами, в присутствии конкурент- ного ингибитора наклон прямой увеличи- вается на величину f 1 + Рассмотрим фермент с Км, равной 10“4 М. В отсутствие ингибитора V = Итах/2 при [S] = 10 4 М. В присутствии 2-10“ 3 М конкурентного ин-
+ Конкурентный ингибитор 1/[S] Рис. 6.17. Кинетика ферментативной ре- акции на графике двойных обратных величин в присут- ствии (•—•) или в отсутствие (О—О) конкурентного ингиби- тора. Итах не меняется, Км возрастает. гибитора, связывающегося с ферментом с Ki=10-3M, кажущаяся Км составит 3 • 10 4 М. Отсюда V = 7тах/4. При неконкурентном ингибировании (рис. 6.18) Утах уменьшается, а это значит, что пересечение прямой с осью ординат произойдет в более высокой точке. В той же мере возрастает и наклон прямой, равный /И!„ах • В отличие от 7тах Км не изме- няется при этом виде ингибирования. По- вышение концентрации субстрата не сни- мает неконкурентного ингибирования. Мак- симальная скорость реакции У^ах в присут- ствии неконкурентного ингибитора задается уравнением тД _ ^тах тах 1 + [1]/К4 * Рис. 6.18. Кинетика ферментативной ре- акции на графике двойных обратных величин в присут- ствии (V—▼) или в отсутствие (О—О) неконкурентного инги- битора. Неконкурентный инги- битор не влияет на Км, но сни- жает 7тах. 6.15. Лечение отравления этиленгликолем на основе конкурентного ингибирования Ежегодно около 50 человек погибают от от- равления этиленгликолем-добавки в анти- фриз для автомобильных двигателей. Сам 6. Введение в энзимологию 117
Ингибирование этанолом Рис. 6.19. сн.он I 2 СН2ОН Этиленгликоль Этанол подавляет образова- ние щавелевой кислоты из эти- СН2ОН----> СООН СООН Щавелевая кислота ленгликоля. по себе этиленгликоль не обладает леталь- ной токсичностью. Собственно ядом является продукт его окисления - щавелевая кислота. Первый этап превращения - окис- ление этиленгликоля алкогольдегидрогена- зой (рис. 649). Эту реакцию можно эффек- тивно затормозить путем введения боль- шой, почти токсичной дозы этанола. Меха- низм действия состоит в том, что этанол оказывается конкурентным субстратом и потому блокирует окисление этиленглико- ля в альдегидные производные. Этиленгли- коль при этом выводится, не причиняя вре- да. Такой же принцип лежит в основе лече- ния метанольного отравления. 6.16. Аллостерические ферменты не подчи- няются кинетике Михаэлиса-Ментен Модель Михаэлиса-Ментен оказала боль- шое влияние на развитие энзимологии. До- стоинство этой модели - в простоте и широ- кой применимости. Все же не все ферменты подчиняются кинетике Михаэлиса-Ментен. В первую очередь-это большая группа ал- лостерических ферментов, для которых за- висимость скорости реакции V от концен- трации субстрата [S] имеет сигмоидную форму, а не гиперболическую, как пред- сказывает уравнение Михаэлиса-Ментен [уравнение (15)]. Вспомним, что кривая связывания кислорода для миоглобина-ги- перболическая, тогда как для гемогло- бина-сигмоидная. Ситуация с ферментами совершенно аналогична. В аллостерических ферментах один активный центр в молекуле фермента оказывает влияние на другой ак- тивный центр в той же молекуле. В резуль- тате такого взаимодействия между субъеди- ницами связывание субстрата становится кооперативным, и кривая зависимости V от Часть I Конформация и динамика [S] приобретает сигмоидную форму. Кроме того, активность аллостерических фермен- тов может регулироваться воздействием определенных молекул, связывающихся с ферментом в некаталитических участках, подобно тому, как на связывание кислорода гемоглобином влияют бисфосфоглицерат, Н+ и СО2. 6Л 7. Согласованный механизм аллостериче- ских взаимодействий Изящную и четкую модель кинетики алло- стерических ферментов предложили в 1965 г. Жак Моно, Джефри Уайман и Жан- Пьер Шанжё(1 MonodJ. Wyman, J.-P.Chan- geux). Используя их подход, рассмо- трим аллостерический фермент, состоящий из двух идентичных субъединиц, каждая с одним активным центром. Допустим, что субъединицы могут находиться в двух кон- формациях-R и Т. Конформация R (relaxed-релаксированная) обладает высо- ким сродством к субстрату, тогда как конформация Т (tense-напряженная)-низ- ким сродством (рис. 6.20). Вспомним, что так же обозначались две формы четвертич- ной структуры гемоглобина (разд. 4.10). Формы R и Т могут переходить одна в дру- гую. В данной модели делается важное допу- щение, что для сохранения симметрии диме- ра обе субъединицы должны находиться в одном и том же конформационном со- стоянии. Таким образом разрешены состоя- ния RR и ТТ и не разрешено состояние RT. Символами Ro и То обозначают разре- шенные состояния в отсутствие субстрата и L-соотношение их концентраций: Ro^To, (27) L = T0/R0. (28) Чтоб упростить рассуждения, допустим, что субстрат не присоединяется к Т-форме фер- мента. В R-форме димер может связать од- ну или две молекулы субстрата; эти состоя- 118
ния обозначают соответственно Rj и R2: Ro 4- S R15 Ri + S R2, 2[R0] [S] [RJ [S] R [RJ 2[RJ • (29) (30) (31) Согласно полученному уравнению, присое- динение как первой, так и второй молекулы субстрата к R-форме димерного фермента имеет одну и ту же микроскопическую кон- станту диссоциации KR. Коэффициент 2 в уравнении (31) указывает на то, что суб- страт может связаться с любым из двух ак- тивных центров на Ro с образованием Rn и аналогичным образом субстрат может вы- свободиться из любого из активных цен- тров на R2 с образованием RP Выразим степень насыщения Y (т.е. долю активных центров, имеющих связанный суб- страт) как функцию концентрации субстрата Т-форма (низкое сродство к субстрату) R-форма (высокое сродство к субстрату) Рис. 6.20. Схематическое изображение R- и Т-форм аллостерического фермента. [Связавшие субстрат центры] [Общее число центров] ________[Rj] + ^[R2]__________ 2([Т0] + [Ro] + [RJ + [R2]) (32) Произведя замены в этом уравнении в со- ответствии с уравнениями (27) и (31), полу- чаем искомое выражение для Y: Z[S]\ 1+[S]/KR \ / L + (1 + [S]/Kr)2 Изобразим уравнение (33) графически, при- няв Kr = 10“5 М и L = 104. Зависимость Y от [S] выражается сигмоидной, а не гипер- болической кривой (рис. 6.23). Другими сло- вами, это уравнение соответствует коопера- тивному связыванию субстрата. Если число оборотов в расчете на один активный центр одинаково для фермент-субстратных ком- плексов с R: и R2, то график зависимости скорости реакции от концентрации субстра- та также будет сигмоидным, поскольку v = rvmax. (34) Рассмотрим теперь этот процесс связыва- ния (рис. 6.21). В отсутствие субстрата поч- ти все молекулы фермента находятся в Т-форме. В приведенном выше примере на 104 молекул в Т-форме приходится только Рис. 6.21. Модель согласованного меха- низма кооперативного связы- вания субстрата аллостериче- ским ферментом. Присоедине- ние первой молекулы субстра- та сопровождается переходом ТТ-формы с низким сродством к субстрату в RR-форму с вы- соким сродством. 6. Введение в энзимологию 119
одна молекула в R-форме. Добавление суб- страта сдвигает конформационное равнове- сие в сторону образования R-формы, по- скольку именно R-форма связывает суб- страт. Когда субстрат присоединяется к одному активному центру, второй ак- тивный центр должен быть также в R-фор- ме, согласно основному постулату данной модели. Другими словами, переход от Т к R и обратно все субъединицы фермента осу- ществляют согласованно. Следовательно, по мере добавления субстрата доля молекул фермента в R-форме прогрессивно возра- стает и связывание субстрата происходит кооперативно. При полном насыщении ак- тивных центров все молекулы фермента оказываются в R-форме. На основе модели согласованного меха- низма нетрудно объяснить влияние аллосте- рических ингибиторов и активаторов. Алло- стерический ингибитор связывается преиму- щественно с Т-формой, тогда как аллосте- рический активатор связывается преимуще- ственно с R-формой (рис. 6.22). Следова- тельно, аллостерический ингибитор сдви- гает конформационное равновесие Rz±T в сторону Т, а аллостерический актива- торов сторону R. Эти эффекты можно вы- разить количественно через изменение кон- станты аллостерического равновесия L, которая входит в виде переменной в уравне- ние (33). Аллостерический ингибитор повы- шает величину L, тогда как аллостерический активатор понижает ее. Эти влияния пока- заны на рис. 6.23, где Y отложено против [S] при следующих значениях L : 103 (в при- сутствии активатора), 104 (без активатора и без ингибитора), 105 (в присутствии инги- битора). Степень насыщения Y при всех зна- чениях [S] снижается в присутствии ингиби- тора и повышается в присутствии актива- тора. Здесь полезно остановиться еще на двух понятиях: это гомотропные эффекты, ко- торые представляют собой аллостерические взаимодействия между идентичными лиган- дами (связанными молекулами или ионами), и гетеротропные эффекты, т.е. взаимодей- ствия между различными лигандами. В рас- смотренном выше примере кооперативное связывание субстрата ферментом предста- вляло собой гомотропный эффект. В отли- чие от этого влияние активатора или инги- битора на связывание субстрата является Часть I 120 Конформация и динамика Аллостерический Т-состояние Аллостерический Я’Состояние Рис. 6.22. В соответствии с моделью со- гласованного механизма алло- стерический ингибитор (изо- бражен в виде шестиугольни- ка) стабилизирует форму Т, тогда как аллостерический ак- тиватор (изображен в виде треугольника) стабилизирует форму R. Рис. 6.23. Насыщение У как функция кон- центрации субстрата [S] в со- ответствии с моделью согласо- ванного механизма [уравнение (33)]. Показано также влияние аллостерического ингибитора и активатора.
гетеротропным, поскольку в этом случае взаимодействие происходит между молеку- лами разного типа. При согласованном ме- ханизме аллостерических взаимодействий гомотропные эффекты всегда положи- тельны (кооперативный а гетеротропные- либо положительны, либо отрицательны. 6.18. Последовательный механизм аллосте- рического взаимодействия Аллостерические взаимодействия можно описать также с помощью модели последова- тельного механизма, разработанной Дание- лем Кошландом (D. Koshland). В основу мо- дели в простейшем случае положены три постулата. 1. Каждая субъединица может существо- вать в одном из двух возможных конформа- ционных состояний (R или Т). 2. Связывание субстрата изменяет форму той субъединицы, к которой он присоеди- няется. Конформация другой субъединицы при этом существенно не меняется. 3. Конформационные изменения, вы- званные связыванием субстрата на одной субъединице, могут увеличивать или умень- шать сродство к субстрату другой субъеди- ницы той же молекулы фермента. Согласно модели последовательного ме- ханизма процесс связывания субстрата ал- лостерическим ферментом протекает так, как показано на рис. 6.24. Связывание является кооперативным, если у RT-формы сродство к субстрату выше, чем у ТТ- формы. Модель простого последовательного ме- ханизма взаимодействия отличается от мо- дели согласованного механизма в несколь- ких отношениях. Во-первых, модель после- довательного механизма не предполагает равновесия между R- и Т-формами в отсут- ствие субстрата. Напротив, присоединение субстрата индуцирует переход от Т к R. Во- вторых, конформационный переход от Т к R в разных субъединицах фермента проис- ходит не согласованно, а последовательно. Гибридной форме RT отводится важная роль в модели последовательного механиз- ма. В модели согласованного механизма на- личие гибридной формы RT исключается. Эта модель исходит из важной роли симме- трии во взаимодействии субъединиц в оли- гомерных белках и потому предполагает ее сохранение при аллостерических переходах. Модель же последовательного механизма, напротив, построена на предположении, что субъединицы могут взаимодействовать, да- Рис. 6.24. Модель последовательного ме- ханизма кооперативного свя- зывания субстрата аллостери- ческим ферментом. Сво- бодный активный центр RT- формы обладает большим сродством к субстрату, чем ак- тивные центры ТТ-формы. же если они находятся в разных конформа- ционных формах. Наконец, различие заклю- чается также и в том, что в случае согласованного механизма гомотропные взаимодействия всегда должны быть поло- жительными, тогда как в случае последова- тельного механизма они могут быть либо положительными, либо отрицательными. Будет ли вторая молекула субстрата связы- ваться с ферментом более или же менее прочно, чем первая, зависит от природы структурных переходов, вызванных присое- динением первой молекулы субстрата. Какая из моделей правильна? Для одних аллостерических белков хорошо подходит модель согласованного механизма, тогда как для других, по-видимому, применима модель последовательного механизма. Од- нако существует группа аллостерических 6. Введение в энзимологию 121
белков, к которым неприменимы обе моде- ли. Предполагается, что эти белки имеют не два (R и Т), а более конформационных со- стояния. Соответственно для описания ал- лостерических свойств таких белков тре- буются более сложные модели. 6.19. Водородные связи, а также электроста- тические и вандерваальсовы взаимодействия в фермент-субстратных комплексах Обратимые молекулярные взаимодействия в биологических системах опосредуются си- 0 +H3N—Gly—Туг— Zy - чо Субстрат лами трех типов. Складывание макромоле- кул в сложную структуру, связывание суб- страта с ферментом, межклеточные взаимо- действия, т. е. все молекулярные взаимодей- ствия в биологических системах, осущест- вляются благодаря образованию водо- родных связей, а также связей, обусло- вленных электростатическими и вандер- ваалъсовыми взаимодействиями. Эти три основных типа нековалентных связей разли- чаются по своей геометрии, энергии и специ- фичности. Более того, хотя на них всегда сильно влияет присутствие воды, однако этот эффект проявляется по-разному. Рас- смотрим подробнее каждый из этих ос- новных типов связей. 6.20. Заряженные субстраты могут связы- ваться с противоположно заряженными груп- пами фермента Заряженная группа субстрата может реаги- ровать с группой фермента, несущей проти- воположный заряд. Сила такого электро- статического взаимодействия определяется законом Кулона: ',Ч>< где q{ и q2 - заряды соответствующих групп, г - расстояние между ними, D - диэлектриче- ская постоянная среды. Электростатическое взаимодействие наиболее сильно про- является в вакууме (где D = 1) и наиболее слабо-в такой среде, как вода (где D = 80). Часть I 122 Конформация и динамика Примером электростатического взаимо- действия может служить связывание гли- цил-Ь-тирозина с карбоксипептидазой А- протеолитическим ферментом, который отщепляет С-концевые остатки аминокис- лот. Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа дипептидного суб- страта взаимодействует с положительно за- ряженной гуанидиниевой группой аргини- нового остатка на ферменте. Расстояние между этими двумя противоположно заря- женными группами составляет 2,8 А: 4 /—N—СН2—СН2—СН2—[Фермент| H2N Аргининовая боковая цепь фермента Такой тип взаимодействия называют так- же ионной связью, солевой связью, солевым мостиком или ионной парой. Все эти тер- мины имеют одно и то же значение: элек- тростатическое взаимодействие между про- тивоположно заряженными группами. Меж- ду отрицательно заряженным субстратом и положительно заряженной боковой цепью лизинового или аргининового остатка мо- гут возникать электростатические взаимо- действия. Если величины рК имидазольной группы остатка гистидина или концевой аминогруппы полипептидной цепи обеспе- чивают их положительный заряд при дан- ном pH среды, то они также могут функцио- нировать как потенциальные участки связы- вания отрицательно заряженного субстрата. В случае если субстрат имеет положи- тельный заряд, потенциальными участками связывания служат отрицательно заря- женные карбоксильные группы аспартата и глутамата, а также концевая карбоксиль- ная группа полипептидной цепи. 6.21. При связывании субстратов с фермен- тами образуются строго ориентированные во- дородные связи Несмотря на то что многие субстраты не имеют заряда, они связываются с фермента- ми с высокой степенью специфичности и сродства. Основной вид взаимодействия таких субстратов, а также большинства за- ряженных субстратов с ферментами - это образование водородных связей. В водород- ной связи атом водорода связан сразу с дву- мя другими атомами. Тот атом, с которым водород связан более прочно, называют до- нором водорода, тогда как второй
атом-акцептором водорода. По существу водородную связь можно рассматривать как промежуточное взаимодействие, возни- кающее при переносе протона от кислоты к основанию. Атом-акцептор должен иметь частичный отрицательный заряд, который и притягивает водород. Короче говоря, во- дородная связь чем-то напоминает любовь втроем: Донор водорода —О—Н Акцептор водорода ... N — 2,88 А Донор Акцептор водорода водорода I I —N—н ... о— * 3,04 А * При образовании водородных связей в биологических системах атомами-донора- ми служат атомы азота или кислорода, ко- валентно связанные с атомом водорода. Роль атомов-акцепторов выполняют кисло- род или азот. Типы водородных связей и их длины приведены в табл. 6.3. Энергия свя- зей колеблется от примерно 3 до 7 ккал/ моль. Водородные связи прочнее, чем связи, обусловленные вандерваальсовыми взаимо- действиями, но значительно слабее, чем ко- валентные связи. По длине водородные свя- зи занимают промежуточное положение между ковалентными связями и связями, обусловленными вандерваальсовыми взаи- модействиями. Важная особенность водо- родных связей состоит в том, что их энер- гия зависит от геометрии. Водородная связь оказывается наиболее сильной, если донор, водород и акцептор лежат на одной прямой. Если же атом-акцептор расположен под углом по отношению к линии, соеди- няющей атом-донор и водород, то связь бу- дет тем слабее, чем больше этот угол: же к азоту, чем к кислороду, на 0,9 А. Другой пример водородной связи в мио- глобине и гемоглобине - связь между ги- дроксильной группой тирозина НС2 и пептидным карбонилом FG4. Атом кисло- рода в гидроксильной группе тирозина является донором водорода, а атом кисло- рода в пептидной С=О-группе-акцепто- ром: Н . - • о=с Роль водородных связей во взаимодей- ствии субстрата с ферментом хорошо видна на примере связывания уридинсодержащей части субстрата с панкреатической рибону- клеазой - ферментом, расщепляющим рибо- нуклеиновую кислоту (рис. 6.25). В этом случае образуются три водородные связи. 1. Одна из С=О-групп уридинового кольца соединена водородной связью с N—Н-группой пептидной цепи. 2. N—Н-группа уридинового кольца со- единена водородной связью с —ОН-груп- пой остатка треонина. 3. Другая С=О-группа уридинового кольца соединена водородной связью с —ОН-группой остатка серина. 6.22. Белки обладают выраженной способ- ностью к образованию водородных связей Боковые цепи аминокислот и основная пеп- тидная цепь могут давать большое число О О—н • • • О О—Н Сильная Слабая водородная связь водородная связь Мы уже упоминали о водородных связях при обсуждении структуры миоглобина и гемоглобина. В ос-спирали водородная связь соединяет друг с другом —NH- и —СО-группы пептидной цепи. При этом атом азота служит донором водорода, а атом кислорода-акцептором. Расстояние между атомами азота и кислорода соста- вляет 2,9 А; атом водорода находится бли- Таблица 6.3. Типичные размеры во- дородных связей Связь Длина, А О—Н ...О 2,70 О—Н ...О 2,63 О—H...N 2,88 N—Н ...О 3,04 N + — Н ...О 2,93 N—Н... N 3,10 6. Введение в энзимологию 123
различных водородных связей. Так, из 20 встречающихся в белках аминокислот у 11 боковые цепи способны участвовать в обра- зовании водородных связей. Удобно распре- делить эти аминокислоты на группы в зави- симости от образуемых ими типов водо- родных связей. 1. Боковые цепи триптофана и аргинина могут служить только донорами водорода: Уридиновое кольцо в субстрате R Н X Треониновая боковая цель фермента Сериновая боковая цепь фермента Донорная группа водорода в молекула триптофана Донорная группа водорода в молекуле аргинина Рис, 6,25. Образование водородных свя- зей при связывании субстрата рибонуклеазой. (Richards F. М., Wyckoff Н. W., Allewell N., The Neurosciences: Second Study Program, F. O. Schmit, ed., Rockefeller University Press, 1970, p. 970.) 2. Боковые группы аспарагина, глута- мина, серина и треонина могут служить как донорами, так и акцепторами водорода, и в этом отношении они подобны пептидной группе. 3. Способность образовывать водо- родные связи у лизина (и вообще у соедине- ний с концевыми аминогруппами), у аспара- гиновой и глутаминовой кислот (и у других соединений с концевыми карбоксильными группами), а также у пиридина и гистидина зависит от pH. В определенных границах pH они могут служить одновременно и донора- ми, и акцепторами водорода, тогда как при других значениях pH - либо донорами, либо акцепторами, как это показано для аспарта- та и глутамата на рис. 6.26. Иными слова- ми, образуемый этими ионизирующимися остатками тип водородной связи зависит от pH. Может служить .• акцептором водорода —СН2—Сх Н 1 Может служить донором водорода Аспарагин или глутамин Часть I 6.23. Вандерваальсовы взаимодействия играют важную роль в случаях стерической комплементариости Если два каких-либо атома находятся на расстоянии 3-4 А друг от друга, то между ними возникает неспецифическое притяже- ние. Такое притяжение, называемое вандер- ваальсовым взаимодействием, менее специ- фично и значительно слабее, чем электро- статические взаимодействия или водо- родные связи, однако оно имеет не менее важное значение в биологических системах. В основе возникновения вандерваальсовых взаимодействий лежит тот факт, что распре- деление электронного заряда вокруг атома меняется во времени. В любой взятый мо- мент времени распределение заряда не является полностью симметричным. Эта преходящая асимметрия электронного заря- да одного атома вызывает изменение рас- пределения электронов вокруг соседних ато- мов. По мере сближения двух атомов до так называемого расстояния вандерваальсова контакта сила притяжения между ними возрастает (рис. 6.27). На расстоянии, более коротком, чем контактное, начинают пре- обладать очень большие силы отталкива- ния, поскольку происходит перекрывание двух внешних электронных облаков. Кон- тактное расстояние между атомами кисло- рода и углерода, например, составляет 3,4 А, т. е. сумму контактных радиусов ато- ма О (1,4 А) и С (2,0 А). Энергия связи двух атомов, обусловлен- ной вандерваальсовыми взаимодействиями, составляет около 1 ккал/моль. Это значи- 124 Конформация и динамика
Может служить . *--акцептором q * водорода —сн2—cf ____Может служить м донором водорода Протонированная форма аспарагиновой или глутаминовой кислоты Рис. 6.26. ‘ ‘ ’Ч^Может служить —СН2—СЧО акцептором ^0- - водорода Ионизированная форма аспарагиновой или глутаминовой кислоты Способность аспартата и глу- тамата к образованию водо- родных связей. На самом деле вода - активный участник молекулярных взаимодействий в биологи- ческих системах. В этом отношении два ее свойства имеют совершенно особое значе- тельно меньше энергии водородных связей, а также связи, возникающей под влиянием электростатических сил, которая составляет 3-7 ккал/моль. Таким образом, одно от- дельно взятое вандерваальсово взаимодей- ствие имеет очень небольшое значение: сила возникающей связи едва превышает сред- нюю тепловую энергию молекул при ком- натной температуре (0,6 ккал/моль). Ван- дерваальсовы взаимодействия приобретают большое значение только при одновремен- ном сближении множества атомов субстра- та с множеством атомов фермента. Вандер- ваальсово взаимодействие между двумя атомами резко уменьшается, если расстоя- ние между ними превышает контактное все- го лишь на 1 А. Поэтому одновременное взаимодействие многочисленных атомов субстрата со множеством атомов фермента возможно только при условии совпадения форм субстрата и фермента. Другими сло- вами, эффективное вандерваальсово взаи- модействие между субстратом и ферментом возможно лишь при наличии стерической комплементарности. Следовательно, хотя каждое отдельно взятое вандерваальсово взаимодействие неспецифично, специфич- ность возникает при одновременном образо- вании большого числа вандерваальсовых свя- зей. Нужно отметить, что отталкивание, возникающее при сближении двух атомов на расстояние меньше вандерваальсова кон- тактного, столь же необходимо для созда- ния специфичности взаимодействия, как и притяжение. 6.24. Биологически важные свойства воды: полярность воды и ее способность к когезии До сих пор мы не касались вопроса о том, как влияет вода на три основных типа свя- зей, которые мы только что рассмотрели. ние. 1. Молекулы воды полярны. Они имеют не линейную, а треугольную форму, вслед- ствие чего распределение заряда оказывает- ся асимметричным. Ядро атома кислорода оттягивает электроны от атомов водорода, и вокруг последних возникает область с об- щим положительным зарядом. Если вокруг атома кислорода описать тетраэдр так, чтобы в двух его углах находились атомы водорода, то два других угла тетраэдра ока- жутся электроотрицательными. Таким образом, молекула воды представляет со- бой полярную структуру: Область положительного заряда 2. Молекулы воды обладают высоким сродством друг к другу. Группа молекул во- ды образует конгломерат, в котором область положительного заряда отдельной молекулы ориентируется относительно области с отрицательным зарядом одной из близлежащих молекул. Каждая из двух областей с отрицательным зарядом притя- гивает протон от соседней молекулы. В то же время их собственные протоны притяги- вают кислородный конец соседней моле- кулы. Таким образом, каждый атом кисло- 6. Введение в энзимологию 125
Рис. 6.27. Энергия связей, обуслов- ленных вандерваальсовыми взаимодействиями, как функ- ция расстояния между двумя атомами. Рис. 6.28. Структура одной из форм льда. /N—Н” -О=С^ В неполярной среде Н 4i— н- • н О— н---0=(/ н 4 В воде Рис. 6.29. Вода ведет себя как конкурент при образовании водородных связей. Часть 1 126 Конформация и динамика рода является центром тетраэдра, образо- ванного другими кислородами, причем рас- стояние О—О составляет 2,76 А. На рис. 6.28 показана одна из структур льда. При таянии льда высокоупорядочен- ная структура его кристаллов разрывается во многих местах. Однако при этом разру- шается лишь около 15% связей. В жидкой воде каждая молекула Н2О образует водо- родные связи в среднем с 3,4 соседних моле- кул. Таким образом, в жидком состоянии вода сохраняет частично упорядоченную структуру. Процесс образования и распада объединенных водородными связями агре- гатов молекул воды идет беспрерывно. Са- мая удивительная особенность воды-это способность ее молекул соединяться друг с другом. И действительно, в воде число протонов и число свободных пар электро- нов, создающих соответственно положи- тельные и отрицательные полюсы для обра- зования водородных связей, всегда равны между собой. Расположение этих связей в виде тетраэдра приводит к образованию развитой трехмерной структуры. Таким образом, вода обладает высокой когезионной силой. 6.25. Присутствие воды ослабляет полярные взаимодействия Полярность молекул и способность к обра- зованию водородных связей делает воду вы- сокоактивным соединением. Это проявляет- ся в том, что вода ослабляет электростати- ческие взаимодействия и водородные связи, возникающие между другими соединения- ми. При этих полярных взаимодействиях вода ведет себя как очень сильный конку- рент. Рассмотрим, например, как действует вода на образование водородной связи меж- ду карбонильной и амидной группами (рис. 6.29). Водородные атомы воды спо- собны заместить NH-группу в качестве до- нора, а кислородный атом воды - кислород СО-группы в качестве акцептора водорода. Следовательно, образование сильной водо- родной связи между СО- и NH-группами возможно только в отсутствие воды. Сила электростатических взаимодействий в воде по сравнению с вакуумом снижена в 80 раз (80-диэлектрическая постоянная воды). Высокая диэлектрическая постоянная воды отражает такие свойства, как поляр- ность и способность образовывать вокруг ионов ориентированную сольватную обо- лочку, которая ослабляет электростатиче- ское взаимодействие одного иона с другим
Электростатическое взаимодействие в неполярной среде Вода окружает заряженные группы и уменьшает их взаимодействие Рис. 6.30. Вода ослабляет электростати- ческое взаимодействие заря- женных групп. (рис. 6.30). Такие ориентированные соль- ватные оболочки создают собственное элек- трическое поле, противоположное по знаку полю, созданному ионом. В результате спо- собность ионов, окруженных сольватными оболочками, к электростатическим взаимо- действиям оказывается заметно ослаблен- ной. Вода характеризуется исключительно высокой диэлектрической постоянной. 6.26. Гидрофобные взаимодействия: в водной среде неполярные группы стремятся ассоции- ровать Каждый знает, как мелкие капельки масла в воде соединяются в одну большую каплю. Аналогичный процесс происходит и на уровне атомов, а именно неполярные моле- кулы или группы в водной среде объединяют- ся в кластеры. Этот процесс ассоциации обусловлен гидрофобными взаимодействия- ми. Фигурально выражаясь, вода прижи- мает неполярные соединения друг к другу. Гидрофобные взаимодействия играют ре- шающую роль в складывании макромоле- кул, в связывании субстратов с ферментами и во многих других молекулярных процес- сах. Рассмотрим, что лежит в их основе. До- пустим, что в воду вносится молекула непо- лярного соединения, например гексана. В воде при этом образуется полость, из-за чего на какой-то момент разрываются водо- родные связи между молекулами воды. Да- лее сдвинутые со своих мест молекулы воды переориентируются и образуют максималь- но возможное число новых водородных свя- зей. Этого, однако, удается достичь лишь за определенную «плату»: возможностей обра- зования благоприятных водородных связей в решетке воды вокруг молекул гексана зна- чительно меньше, чем в чистой воде. В ре- зультате молекулы воды вокруг молекулы гексана располагаются гораздо более упо- рядоченным образом, чем в остальных ча- стях раствора, а это означает, что энтропия раствора снижается. Посмотрим теперь, что произойдет, если в воде окажутся две моле- кулы гексана. Будут ли они находиться в двух малых полостях (рис. 6.31, А) или же в одной большой полости (рис. 6.31, Б)? Опыт показывает, что две молекулы гексана объединяются и занимают одну большую полость. Это объединение происходит в ре- зультате высвобождения отдельных ориен- тированных молекул воды, окружающих разделенные молекулы гексана. Следова- тельно, в основе гидрофобного взаимодей- ствия лежит увеличение энтропии, обусло- вленное возрастанием степеней свободы высвобожденных молекул воды. Таким образом, неполярные молекулы в воде объе- диняются друг с другом не в силу высокого взаимного сродства, а прежде всего вслед- ствие существования прочных связей между молекулами воды. Заключение Катализаторами в биологических системах служат ферменты; все ферменты-белки. Ферменты высокоспецифичны и обладают огромной каталитической силой. Обычно они повышают скорость реакции по край- ней мере в 107 раз. Ферменты не сдвигают равновесия реакции, а выполняют функцию катализаторов путем снижения энергии ак- тивации химических реакций. Кинетические Таблица 6.5. Диэлектрические постоянные ряда раство- рителей Вещество Диэлектрическая постоянная (20С) Гексан 1,9 Бензол 2,3 Диэ1 иловый эфир 4,3 Хлороформ 5,1 Ацетон 21,4 Этанол 24 Метанол 33 Вода 80 HCN 116 6. Введение в энзимологию 127
Две молекулы гексана Рис. 6.31. Схематическое изображение двух молекул гексана в неболь- шом объеме воды. Л-моле- кулы гексана занимают раз- личные полости в структуре воды. Б-молекулы гексана за- нимают одну общую полость, что энергетически более вы- годно. параметры некоторых ферментов описы- ваются моделью Михаэлиса-Ментен. Со- гласно этой модели, фермент (Е) соединяет- ся с субстратом (S), образуя фермент-суб- стратный комплекс (ES), который либо превращается далее в продукт (Р) реакции, либо диссоциирует на Е и S: fci кз E + S<±ES-E + P. ki Скорость (У) образования продуктов описывается уравнением Михаэлиса-Мен- тен: ' ~ r max [S] + Км ’ Часть I 128 Конформация и динамика где Гтах-скорость реакции при полном на- сыщении фермента субстратом, а Км-константа Михаэлиса, равная концен- трации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от макси- мальной. Максимальная скорость Утах рав- на произведению к3 на общую концентра- цию фермента. Кинетическая константа к3, называемая числом оборотов фермента, показывает, сколько молекул субстрата превратилось в продукт реакции за едини- цу времени в одном каталитическом цен- тре при полном насыщении фермента суб- стратом. Для большинства ферментов чис- ло оборотов лежит в пределах от 1 до 104 в 1 с. Некоторые специфические низкомолеку- лярные вещества и ионы способны ингиби- ровать ферменты. При необратимом инги- бировании ингибитор ковалентно соеди- няется с ферментом или же связывается с ним настолько прочно, что его диссоциа- ция идет очень медленно. В отличие от этого обратимое ингибирование характе- ризуется тем, что равновесие между фер- ментом и ингибитором устанавливается быстро. Конкурентный ингибитор препят- ствует связыванию субстрата в активном центре. Он уменьшает скорость реакции путем снижения относительного количе- ства молекул фермента, связавших суб- страт. При неконкурентном ингибировании ингибитор снижает число оборотов фер- мента. Конкурентное ингибирование в от- личие от неконкурентного снимается при повышении концентрации субстрата; та- ким путем можно различить эти два вида ингибирования. Каталитическая активность многих фер- ментов подвержена регуляции in vivo. В этом отношении особенно важную роль играют аллостерические взаимодействия, т.е. взаимодействия между пространствен- но разделенными участками фермента. Все известные в настоящее время аллостериче- ские ферменты состоят из двух и более субъединиц. Аллостерические взаимодей- ствия опосредованы конформационными изменениями, которые передаются с одной субъединицы на другую. Кривая зависимо- сти скорости реакции V от концентрации субстрата [S] для аллостерических фермен- тов имеет сигмоидную, а не гиперболиче- скую форму. Для объяснения некоторых свойств этих ферментов предложены две модели - модель согласованного механиз- ма и модель последовательного механизма.
Обратимые молекулярные взаимодей- ствия в биологических системах обусло- влены возникновением водородных связей, а также электростатических и вандервааль- совых взаимодействий. Сильнейшее влия- ние на эти взаимодействия оказывает вода благодаря таким своим свойствам, как по- лярность, когезионная сила и способность к образованию водородных связей в каче- стве и донора, и акцептора водорода. В присутствии воды ослабевают электро- статические взаимодействия и водородные связи между другими молекулами и иона- ми. С другой стороны, в присутствии воды усиливается взаимодействие неполярных молекул. Так, при связывании субстрата с активным центром, лежащим в щели на ферменте, происходит исключение воды из этой щели. Отсутствие воды усиливает электростатические взаимодействия и во- дородные связи между ферментом и суб- стратом. Ассоциация неполярных групп субстрата и активного центра фермента обеспечивает значительную часть энергии, необходимой для связывания. Основой специфичности фермент-субстратного взаи- модействия служат, во-первых, водородные связи, имеющие резко выраженный напра- вленный характер, и, во-вторых, форма ак- тивного центра фермента, которая препят- ствует связыванию некомплементарных ей молекул. Узнавание субстрата фермента- ми-это во многих случаях динамический процесс, сопровождающийся конформа- ционными изменениями в активном центре фермента. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Koshland D. E.t Jr,, 1973, Protein shape and biological control, Sei. Amer., 229 (4), 52-64. (Прекрасно из- ложены основные представления о значении гибкости конформации для проявления специфичности и ре- гуляции ферментативного действия.) Книги по энзимологии Fersht 4., 1977. Enzyme Structure and Mechanism, Freeman. [Имеется пере- вод; Фёрпп Э. Структура и меха- низм действия ферментов-М.: Мир, 1980.J (Ясное и четкое изложение ос- новных представлений о механизме фермен гaimbhoi о дейсi вия; особое внимание уделено физическим ас- пектам.) Walsh С, 1979. Enzymatic Reaction Mechanisms, Freeman. (Превосходное описание химических основ ферментативною дейс1вия. Авторы показывают, что огромное количество ферментативных реак- ций, протекающих в биологических системах, можно сгруппировать в несколько основных типов химиче- ских реакций.) Boyer P.D. (ed.), 1970. The Enzymes (3rd ed.), Academic Press. (Мноютомный трактат но фермен- 1ам, содержащий обширную инфор- мацию. В томах 1 и 2- изданных также и в бумажном переплете — приведены общие сведения о струк- туре фермен юв. а 1акже о механиз- ме и pei уляции ферментативной активности. В томе 3 и ‘последую- щих томах помещены подробные ciaibH авторитетных ученых, посвя- щенные отдельным ферментам.) Кинетика и механизм фермента- тивных реакций Fersht A. R., 1974. Catalysis, binding, and enzymesubstrate complementarity, Proc. Roy, Soc., В 187, 397-407. Jencks W, P., 1975. Binding energy, specificity, and enzymic catalysis: the Circe effect, Advan, EnzymoL, 43, 219 410. Knowles J, R.. Alber у W. J1976. Evolution of enzyme function and the development of catalytic efficiency, Biochemistry, 15, 5631-5640. Warshel 4., 1978. Energetics of enzyme catalysis, Proc. Nat. Acad. Sei., 75, 5250 5254. (Рассматривается гипоте- за, в которой подчеркивается важ- ная роль электростатических взаи- МОДСЙС1ВИЙ.) Аллостерические взаимодействия Monad J., Changeux J.-P., Jacob F„ 1963, Allosteric proteins and cellular control systems, J. Mol. Bio!., 6, 306-329. (Классическая работа, в ко- торой изложена концепция об алло- стерических взаимодействиях.) Monad J„ Wyman J., Changeux J,-P., 1965. On the nature of allosteric transition, J. Mol. Biol.. 12, 88-118. (Описание модели согласованно! о механизма аллостерических перехо- дов.) Koshland D. Е., Jr,, Nemethy G., Filmer D., 1966. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits, Biochemistry, 5, 365-385. (Описание модели последо- вательного механизма аллостериче- ских переходов.) Молекулярные взаимодействия и связывание Richards F. М., WyckojJ IE W., AUewell К., 1970. The origin of specificity in binding: a detailed example in a protein-nucleic acid interaction. In: Schmitt F.O. (ed.). The N eurosciences: Second Study Program, pp. 901-912, Rockefeller University Press. Davidson N., 1967. Weak interactions and the structure of biological macromolecules. In: Quarton G.C., Melnechuk T. and Schmitt KO. (eds.), The N eurosc icnccs: A Study Program, pp. 46 56, Rockefeller University Press. Tanford C-, 1978. The hydrophobic effect and the organization of living matter, Science, 200, 1012-1018. 6. Введение в энзимологию 129 9-665
Вопросы и задачи 1. В осуществлении биосинтетиче- ских реакций, например синтеза ДНК, важную роль играет гидролиз пиро- фосфата до ортофосфата. У Е. coli этот ги- дролиз катализируется пирофосфатазой, имеющей мол. массу 120 к Да и состоящей из 6 идентичных субъединиц. Р^ах очищен- ной пирофосфатазы составляет 2800 ед. на 1 мг белка. За единицу активности данного фермента принято количество фермента, гидролизующее 10 мкмоль пирофосфата за 15 мин при 37°С в стандартных условиях определения. а) Сколько молей субстрата в секунду ги- дролизует 1 мг фермента, если концентра- ция субстрата значительно выше Км? б) Сколько молей активных центров содер- жится в 1 мг фермента? Примем, что в каждой субъединице имеется по одному активному центру. в) Каково число оборотов данного фермен- та? Сравните его с упомянутыми в этой главе числами оборота других ферментов. 2. Пенициллин гидролизуется и тем самым инактивируется пенициллиназой - ферментом, имеющимся у ряда резистентных бактерий. Молекуляр- ная масса пенициллиназы из Staphylococcus aureus составляет 29,6 кДа. Измеряли ко- личество пенициллина, гидролизуемого в 12 мл раствора в течение 1 мин в присут- ствии 10“9 г очищенной пенициллиназы как функцию концентрации пенициллина. Примем, что в ходе определения концен- трация пенициллина практически не меня- лась. [Пенициллин], М Количество гидролизовавшегося пенициллина, моль 0,1 10“ 5 0,11 10 “ 9 0,3.10 “ 5 0,25 *10" 9 0,5 • 10 “5 0,34 10“ 9 1,0-10“ 5 0,45 10“ 9 3,0-10“ 5 0,58-10“ 9 5,0 -10 “5 0,61 -10“ 9 лиса-Ментен? Если да, то чему равна Км? б) Чему равна 7тах? в) Каково число оборотов пенициллиназы в этих экспериментальных условиях? При- мем, что на одну молекулу фермента при- ходится один активный центр. 3. Измеряли кинетику фермента- тивной реакции в зависимости от концентрации субстрата в присутствии или в отсутствие ингибитора (I); были по- лучены следующие данные: [S], м Скорость реакции, мкмоль/мин без ингибитора с ингибито- ром 0,3 • 10 - 5 10,4 4,1 0,5 10 - 5 14,5 6,4 1,0-10“ 5 22,5 11,3 3,0-10“ 5 33,8 22,6 9,0 * 10 “ 5 40,5 33,8 а) Чему равны Р^ах и Км в отсутствие ин- гибитора? В присутствии его? б) Каков тип ингибирования? в) Чему равна константа связывания инги- битора? г) Если [S] = l-10“5 М и [1] = 2-10-3 М, то какова доля молекул фермента, связав- ших субстрат? Связавших ингибитор? д) Если [S] = 3-10“5 М, то какова доля молекул фермента, связавших субстрат в присутствии 2 10“3 М ингибитора и в отсутствие его? Сравните соотношение полученных величин с соотношением ско- ростей реакции при тех же условиях. 4. Анализировали кинетику фер- мента, рассмотренного в задаче 3, в присутствии другого ингибитора, доба- вленного в концентрации 10" 4 М: [S], М Скорость реакции, мкмоль/мин без ингибитора с ингибито- ром 0,3 • 10 ‘ 5 10,4 2,1 0,5-10“ 5 14,5 2,9 1,0 10“ 5 22,5 4,5 3,0 -10“ 5 33,8 6,8 9,0-10“ 5 40,5 8,1 а) Постройте по этим данным график в координатах \/V против 1/[S]. Подчи- няется ли пенициллиназа кинетике Михаэ- Часть I 130 Конформация и динамика а) Каковы значения F^ax и Км в присут- ствии ингибитора? Сравните их с вели- чинами, полученными в задаче 3. б) Каков тип ингибирования?
в) Какова константа диссоциации этого ингибитора? г) При [S] = 3 • 10“5 М какая доля молекул фермента связана с субстратом в присут- ствии 10“4 М ингибитора? В отсутствие его? 5. График в координатах 1/И про- тив 1/[S] называют графиком Лайнуивера-Бёрка. Кинетические данные можно изобразить также в координатах К против P7[S], т.е. в координатах Эди — Хофсти. а) Преобразуйте уравнение Михаэлиса- Ментен так, чтобы получить V как функ- цию Р7Н- б) Каков физический смысл наклона кри- вой и точек ее пересечения с осью х и осью у на графике V против P/[SJ? в) Изобразите, как должна выглядеть зави- симость V от в отсутствие ингибито- ра, в присутствии конкурентного ингибито- ра, в присутствии неконкурентного ингиби- тора? 6. В случае аллостерических фер- ментов ингибитор в низких концентрациях часто оказывает активи- рующее действие. Почему? (Подсказка: подумайте об аналогии с СО-гемоглоби- ном.) 7. Гормон прогестерон содержит две кетонные группы. О свой- ствах рецепторного белка, узнающего про- гестерон, известно очень мало. Боковые це- пи каких аминокислот могли бы образо- вать водородные связи с прогестероном при pH 7? (Примем, что боковые цепи в белке-рецепторе имеют те же значения рК, что и в свободных аминокислотах, рас- творенных в воде.) 8. Допустим, что субстраты А и В конкурируют за фермент. Со- ставьте выражение, связывающее соотно- шение скоростей использования А и В (КА/КВ) с концентрацией этих субстратов и с величинами их к3 и Км. (Подсказка: вы- разите КА как функцию к3/Км для субстра- та А и затем сделайте то же для субстрата В.) Можно ли считать, что специфичность определяется только Км? Дополнительные вопросы см.: Wood W. В., Wilson J. Н., Benhow R. М., Hood L. Е., Biochemistry: A Problems Approach, Benjamin, 1974, гл. 6 и 7, а также Montgomery R., Swenson С. A., Quantitative Problems in the Biochemical Sciences, 2nd ed., Freeman, 1976, гл. 11. 9*
ГЛАВА 7. Механизм действия ферментов: лизоцим и карбоксипептидаза В 1922 г. лондонский бактериолог Алек- сандр Флеминг (A. Fleming) простудился. Он был не из тех, кто упускает случай, и бы- стро сообразил, что может использовать свое недомогание как возможность прове- сти эксперимент. Поместив несколько ка- пель носовой слизи на чашку, где выращива- лись бактерии, он через некоторое время с волнением обнаружил, что вокруг сли- зистых выделений бактерии растворились. Флеминг предположил, что в слизи, вероят- но, содержится универсальный антибиотик, поиском которого он как раз занимался. Флеминг установил природу антибакте- риального вещества: это был фермент, ко- торый он назвал лизоцимом -лизо, потому что он растворял (лизировал) бактерии, цим (зим), потому что он был ферментом (энзи- мом). Флеминг открыл, кроме того, новый вид бактерий, особенно чувствительных к действию лизоцима; эти мелкие округлые бактерии он назвал Micrococcus lysodeikticus (“deiktikos”- способный показывать). Фле- минг обнаружил, что много лизоцима со- держится в слезах. Слезы получали от до- бровольцев, которых подвергали «испыта- нию лимоном» - закапывали в глаз немнож- ко лимонного сока. Тогда же в журнале «St. Marry’s Hospital Gazette» была помещена карикатура, изображающая детишек, при- шедших ради нескольких пенсов в лабора- торию Флеминга, где один сотрудник их ко- лотит, а второй собирает слезы! Флеминг был, однако, разочарован, когда обнаружил, Часть I 132 Конформация и динамика что лизоцим не эффективен в отношении наиболее опасных микробов. Спустя 7 лет он все же открыл высокоэффективный анти- биотик - пенициллин, поразительным обра- зом подтвердив замечание Пастера, что слу- чай является к тому, кто его ищет. 7.1. Лизоцим расщепляет клеточные стенки бактерий Лизоцим растворяет клетки определенных видов бактерий, расщепляя полисахарид- ный компонент клеточных стенок. Функция клеточных стенок бактерий-обеспечение механической прочности. Бактерия, лишен- ная клеточной стенки, обычно лопается из- за высокого осмотического давления внутри клетки. Структуру клеточных стенок бакте- Рис. 7.1. Электронная микрофотогра- фия изолированных клеточных стенок Micrococcus lysodeikti- kus. (Печатается с любезного разрешения д-ра N. Sharon.)
N-ацетилглюкозамин (NAG) < < 0=C I Рис. 7.2. / CH3 N-ацетилмурамовая кислота (NAM) Углеводные остатки в полиса- хариде клеточных стенок бак- терий. рий мы подробно рассмотрим в одной из следующих глав. Здесь же остановимся только на структуре их полисахаридного компонента. Полисахарид клеточной стенки содержит два типа сахаров: N-ацетилглюкозамин (NAG) и N-ацетилмурамовую кислоту (NAM). Оба сахара являются производны- ми глюкозамина с ацетилированной амино- группой (рис. 7.2). В NAM углерод С-3 угле- водного кольца образует эфирную связь с боковой цепью лактата. В клеточной стен- ке бактерий NAM и NAG соединены глико- зидной связью между С-1 одного углеводно- го остатка и С-4 другого. Атом кислорода в гликозидной связи располагается либо вы- ше, либо ниже плоскости, в которой лежат углеводные кольца: при «-конфигурации атом кислорода расположен ниже плоско- сти сахара, при p-конфигурации-над этой плоскостью (более подробно о свойствах и номенклатуре сахаров см. гл. 12). Все гли- козидные связи в полисахаридах клеточных стенок имеют Реконфигурацию (рис. 7.3). NAM и NAG расположены поочередно. Итак, полисахарид клеточной стенки бактерий представляет собой полимер чере- дующихся остатков NAM и NAG, соеди- ненных гликозидными связями р (1 —* 4). Да- лее, отдельные цепи полисахаридов соеди- няются поперечными сшивками из коротких пептидов, прикрепляющихся к остаткам NAM. Лизоцим гидролизует гликозидную связь между С-1 NAM и С-4 NAG (рис. 7.4). Дру- гая гликозидная связь-между С-1 NAG и С-4 NAM-при этом нс расщепляется. Субстратом лизоцима служит также хи- тин -полисахарид панциря ракообразных. Хитин состоит только из остатков NAG, со- единенных между собой гликозидными свя- зями р (1 -»4). 7.2. Трехмерная структура лизоцима Лизоцим-относительно небольшой фер- мент. Лизоцим, выделенный из белка ку- риных яиц, где он содержится в большом количестве, представляет собой одну поли- пептидную цепь из 129 аминокислотных остатков и массой 14,6 к Да. В молекуле ли- зоцима имеется четыре поперечных дисуль- фидных мостика, обусловливающих ста- бильность фермента. Последовательность аминокислот в лизоциме показана на рис. 7.5. В 1965 I. Дэвид Филлипс (D, Phillips) с со- трудниками определили трехмерную струк- туру лизоцима. Так впервые была получена карта высокого разрешения для белка, обла- дающе! о ферментативной активностью. Молекула лизоцима оказалась компактной, приближенно эллипсоидной формы разме- рами 45 х 30 х 30 А. Как показано на рис. 7,7, укладка полипептидной цепи носит Рис. 7.3. NAM связана с NAG глико- зидной связью р(1-*-4). 7. Механизм действия ферментов 133
NAG NAM NAG NAM сн3 сн3 NAG NANI o=c o=c I I CH3 CH3 NAG NAM Рис. 7.4. Лизоцим гидролизует глико- зидную связь между NAM и NAG (R-лактильный оста- ток NAM). очень сложный характер. В ней содержится гораздо меньше а-спиралей, чем в миогло- бине и гемоглобине. В некоторых участках полипептидная цепь имеет вытянутую кон- формацию. В одном из этих участков цепь делает поворот и идет в обратном направле- нии параллельно самой себе; при этом два параллельных тяжа соединяются водо- родными связями, образующимися между пептидными группами. Такие участки «шпильки для волос» подобны упоминав- шимся выше антипараллельным $-склад- чатым слоям-регулярно повторяющимся участкам вторичной структуры в белке шел- ка. Внутренняя часть молекулы лизоцима, подобно молекулам миоглобина и гемо- глобина, почти полностью неполярна. Оче- видно, что, как и в случае большинства дру- гих белков, гидрофобные взаимодействия играют важную роль в образовании третич- ной структуры лизоцима. Часть I 134 Конформация и динамика 7.3. Поиски активного центра лизоцима Детальное воспроизведение трехмерной структуры лизоцима еще не раскрывало ме- ханизма его каталитического действия. Бо- лее того, рассматривая карту электронной плотности, трудно было определить хотя бы локализацию активного центра. В отли- чие от миоглобина и гемоглобина в лизоци- ме нет простетической группы, т. е. нет встроенного маркера активного центра. В итоге основную информацию, необходи- мую для идентификации активного центра, определения способа связывания субстрата и выяснения механизма ферментативного действия, удалось получить только при ис- пользовании ингибиторов, а именно при рентгеноструктурном анализе комплексов лизоцима с ингибиторами. Если трехмерная структура белка известна, то определить ме- тодом рентгеноструктурного анализа спо- соб связывания с ним небольших молекул обычно уже нетрудно. Эти опыты легко вы- полнимы, потому что кристаллы белка очень пористы. Даже относительно боль- шие молекулы ингибитора способны диф- фундировать по каналам между молекула- ми белка, попадая в участки специфического связывания. Изменение электронной плот- ности, обусловленное встраиванием допол- нительной молекулы, можно рассчитать не- посредственно по интенсивности рефлексов
Рис. 7.5. кислот в лизоциме из белка ку- риных яиц. Красным показаны остатки, входящие в состав ак- тивного центра. [Canfield R. Е., Liu А. К., J. Biol. Chem., 240, ностный метод Фурье для определения структуры фермент-субстратного (ES) ком- плекса в процессе катализа. Однако в обыч- ных условиях превращение связанного суб- страта в продукт реакции происходит 2000 (1965); Phillips D.С., Sci. Amer, (5) 215, 79 (1966).] значительно быстрее, чем диффузия новых молекул субстрата в кристалл. В некоторых случаях это осложнение удается устранить (используя данные, полученные предвари- тельно на нативном белке) при условии, что структура кристалла не претерпела суще- ственных изменений. Такой подход получил название разностного метода Фурье. Рис. 7.6. Рис. 7.7. Трехмерная структура лизоци- ма. Показаны только а-угле- родные атомы. (Печатается с любезного разрешения д-ра D. Phillips.) Рентгенограмма кристалла ли- зоцима. (Печатается с любез- ного разрешения д-ра D. Phillips.) 7. Механизм действия ферментов 135
Три-Ы-ацетилглюкозамин (три-NAG) Рис. 7.8. Формула три-N-ацетилглюко- замина (три-NAG, или NAG3) - конкурентного инги- битора лизоцима. замедлением каталитического процесса, что достигается путем сильного охлаждения кристалла (например, до — 50~С). Этот экс- периментальный подход получил название криоэнзимологии. Существует и другой под- ход: исследуют комплекс фермента с таким аналогом субстрата, который либо совсем не подвергается никаким превращениям, ли- бо эти превращения происходят очень мед- ленно. Для лизоцима таким аналогом суб- страта оказался тример N-ацетилглюкоза- мина (три-NAG, или NAG3), структура которого показана на рис. 7.8. Олигомеры N-ацетилглюкозамина, содержащие менее 5 остатков, гидролизуются крайне медленно или не гидролизуются совсем. Тем не менее они связываются с активным центром фер- мента. Именно поэтому три-NAG является мощным конкурентным ингибитором лизо- цима. 7.4. Способ связывания конкурентного ингибитора Рентгеноструктурное исследование ком- плекса лизоцима с три-NAG позволило установить локализацию активного центра и выявило, какие взаимодействия обеспечи- вают специфическое связывание субстрата; на этой основе была разработана гипотеза, предсказывающая детальный механизм ферментативного действия лизоцима. Ока- залось, что три-NAG присоединяется к ли- зоциму в щели на его поверхности, занимая при этом примерно половину щели. Связы- вание происходит в результате образования водородных связей и вандерваальсовых Часть I 136 Конформация и динамика взаимодействий. Электростатические взаи- модействия отсутствуют, поскольку в три- NAG нет ионных групп. Водородные связи между три-NAG и лизо- цимом показаны на рис. 7.9. Карбоксильная группа аспартата-101 образует водородные связи с остатками А и В. Наиболее специфи- ческие и прочные водородные связи обра- зуются между ферментом и остатком С ин- гибитора. Здесь появляются четыре водо- родные связи. NH-группа индольного коль- ца триптофана-62 соединяется водородной связью с кислородом при С-6. Соседний аминокислотный остаток - триптофан-63 — аналогичным образом связывается с кисло- родом, стоящим при С-3. Когда три-NAG присоединяется к ферменту, кольцо трипто- фана-62 перемещается на 0,75 А. Прочные водородные связи формируются между СО- и NH-группами ацетамидной боковой цепи остатка сахара С и NH- и СО-группами ос- новной цепй белка, принадлежащими со- ответственно 59-му и 107-му аминокислот- ному остатку. Между три-NAG и ферментом возникает большое число контактов, обусловленных вандерваальсовыми взаимодействиями. Остаток сахара В вовлечен в малое количе- ство полярных контактов с ферментом, но он тесно связан с индольным кольцом трип- тофана-62. Остаток А довольно слабо кон- тактирует с ферментом. 7.5. От структуры фермента-к механизму ферментативного действия 1. Как происходит связывание субстрата? Мы уже говорили о том, что метод рентге- ноструктурного анализа не дает возможно- сти непосредственно определить, как проис- ходит связывание с ферментом эффективно- го субстрата. Однако данные, полученные при рентгеноструктурном анализе комплек- са фермент—конкурентный ингибитор, мо- гут сыграть ключевую роль в решении этой
Рис. 7.9. NAG и лизоцимом. Участвую- щие в образовании водо- родных связей химические группы субстрата показаны си- ним, соответствующие группы фермента - красным. проблемы. Три-NAG заполняет только по- ловину щели в молекуле лизоцима. Это очень многообещающее исходное положе- ние. Было сделано допущение, что наблю- даемое связывание три-NAG как ингибито- ра происходит с образованием тех же связей, которые возникают и при связыва- нии субстрата. Вполне вероятно, что для образования реакционноспособного ES- комплекса требуются дополнительные остатки сахара, способные заполнить вто- рую половину щели. Действительно, после присоединения три-NAG в щели остается место еще для трех остатков сахара. Это об- надеживало, поскольку было известно, что гексамер N-ацетилглюкозамина (гекса- NAG) быстро гидролизуется ферментом. При тщательном построении моделей в щели на ферменте поместились три допол- нительных остатка сахара, обозначенных D, Е и F (рис. 7.10). Остатки Е и F подошли прекрасно, образуя несколько прочных во- дородных связей и контактов, обуслов- ленных вандерваальсовыми взаимодей- ствиями. Однако остаток D входил в щель При нормальной конформации (в виде крес- ла) его атомы С-6 и 0-6 оказывались слиш- ком сближенными с некоторыми группами на ферменте. 2. Какая из связей расщепляется фермен- том? Скорость гидролиза олигомеров N- ацетилглюкозамина стремительно возра- стает при увеличении числа остатков сахара от 4 до 5, т.е. от NAG4 до NAG5 (табл. 7.1). Удлинение субстрата еще на один остаток (NAG6) дает дополнительное увеличение скорости расщепления; однако возрастание числа остатков сахара в субстрате до 8 уже не оказывает действия. Эти данные согла- суются с результатами рентгеноструктурно- го исследования, показавшими, что именно шести остатков сахара достаточно для за- полнения щели, где расположен активный центр. Какая из связей в гекса-NAG расщепляет- ся ферментом? Исходя из того, что три- NAG не подвергается расщеплению, можно считать, что связь А—В (т.е. гликозидная связь между остатками А и В)-это не та связь, на которую действует фермент. Ана- логично этому фермент не может расще- плять и связи В—С. Второе и решающее до- казательство того, что связь В—С не 7. Механизм действия ферментов 137
Рис. 7.10. Способ связывания гекса-NAG (показан желтым) с лизоци- мом. Расположение угле- водных остатков А, В и С (сле- ва) соответствует локализации три-NAG в комплексе с лизо- цимом; расположение остат- ков D, Е и F (справа) предсказа- ли путем модельного построе- ния. Зеленым показаны два аминокислотных остатка, не- посредственно участвующих в катализе. расщепляется ферментом, состоит в том, что NAM не может встать в положение остатка С. Если NAG отлично умещается в участке С, то NAM здесь не умещается из- за лактильной боковой цепи. Между тем в полисахариде клеточной стенки бактерий лизоцим расщепляет связь NAM—NAG. Следовательно, и связь С—D не может под- вергаться расщеплению, если действительно полисахарид клеточных стенок бактерий связывается с лизоцимом таким же обра- зом, как и гекса-NAG. Несоответствие NAM положению С исключает еще одно место ги- дролиза, а именно связь Е—F. Вспомним, что полисахарид клеточной стенки-это че- редующийся полимер NAM и NAG; следо- вательно, если NAM не может занимать по- ложение С, то этот остаток не может стоять и в положении Е. Из приведенных соображений вытекает, что при расщеплении ферментом гексамер- ного субстрата связи А—В, В—С, С—D и Е—F не могут разрываться. Следователь- но, единственным возможным местом рас- щепления субстрата является связь D—Е (рис. 7.11). 3. Какая группа на ферменте непосред- ственно осуществляет катализ? Заключе- ние о том, что гидролиз субстрата происхо- дит по связи D—Е, позволило перейти да- Таблица 7.1. Эффективность олигомеров N-ацетнлглю- козамина в качестве субстратов Субстрат Относительная скорость гидролиза nag2 0 NAG3 1 nag4 8 nag5 4 000 NAG6 30 000 nag8 30 000 Часть I 138 Конформация и динамика
Участки связывания NAG—NAG—NAG—NAG—NAG—NAG Исключается, поскольку три-NAG не гидролизуется NAM—NAG—NAM—NAG—NAM—NAG Исключается, поскольку NAM слишком велик для участка С NAG—NAG—NAG—NAG—NAG—NAG Рис. 7.11. Ход рассуждений, доказываю- щих, что место приложения действия фермента-гликозид- ная связь между углеводными остатками D и Е. лее к выявлению тех групп на ферменте, ко- торые непосредственно осуществляют реак- цию гидролиза. Для этого, однако, нужно еще более точно локализовать место расще- пления субстрата, а именно выяснить, по ка- кую сторону от гликозидного атома кисло- рода происходит разрыв связи. Ответ на * этот вопрос был получен в опытах по фер- ментативному гидролизу в среде, содержа- щей воду, меченную стабильным тяжелым атомом кислорода 18О (рис. 7.12). В выде- ленных по окончании гидролиза сахарах 18О оказался присоединенным к С-1 остатка D, тогда как гидроксильная группа при С-4 в остатке Е содержала обычный изотоп кис- лорода. Отсюда следует, что при гидролизе разрыв связи происходит между С-1 остат- ка D и кислородом гликозидной связи, примы- кающим к остатку Е. Эта работа может служить примером использования изотопов в изучении механизма ферментативного ка- тализа. Без изотопов было бы крайне труд- но, а может быть, и невозможно в данном случае установить точное место приложе- ния действия фермента. Затем перешли к поиску возможных ката- литических групп, которые должны распо- лагаться вблизи расщепляемой гликозид- ной связи. Как указывалось в предыдущей главе, под каталитическими группами под- разумевают те группы фермента, которые непосредственно участвуют в образовании или разрыве ковалентных связей. Наиболее подходящие кандидаты на эту роль-это Единственно возможное место гидролиза группы, способные к образованию водо- родных связей в качестве доноров или акцеп- торов водорода. Отрыв или присоединение иона водорода-это критический этап боль- шинства ферментативных реакций. В лизо- циме единственные остатки, способные быть каталитическими и расположенные вблизи расщепляемой гликозидной свя- зи,-это аспартат-52 и глутамат-55. Остаток аспарагиновой кислоты лежит по одну сто- рону от гликозидной связи, а остаток глута- миновой-по другую. Окружение этих двух кислотных боковых цепей совершенно раз- лично. Аспартат-52 находится в полярном окружении, где он служит акцептором водо- рода в сложной сети водородных связей. Глутамат-35, напротив, расположен в непо- лярной области. Отсюда следует, что при Рис. 7.12. Проведение гидролиза в ме- ченной 18О воде показало, что лизоцим расщепляет связь ме- жду С-1 и О, но не связь между С-4 и О (изображен только ске- лет остатков D и Е). 7. Механизм действия ферментов 139
Asp-52 Рис. 7.13. Структура части активного цен гра лизоцима. Желтым по- казаны кольца D и Е субстрата гекса-NAG. Вблизи субстрата расположены боковые цепи ас- партата-52 (красное) и глута- мата-35 (зеленое). [Lipscomb W.N., Proc. Robert A. Welch Found. Conf. Chem. Res, 15, 150 (1971.)] pH 5, оптимальном pH для гидролиза лизо- цимом хитина, аспарагиновая кислота в по- ложении 52 должна находиться в ионизиро- ванной СОО~-форме, тогда как глутамино- вая кислота в положении 35-в неионизиро- ванной СООН-форме. Расстояние между гликозидной связью и ближайшим к ней атомом кислорода как одной, так и другой кислотной группы составляет примерно 3 А (рис. 7.13). 7.6. Промежуточное образование иона карбо- ния - критический этап катализа На основе изложенных структурных данных Филлипс (Phillips) и сотрудники детально разработали вероятный механизм катали- тического действия лизоцима. В каталитиче- ском цикле они выделили следующие важные этапы. 1. —СООН-группа остатка 35 передает Н+ на связь между С-1 кольца D и глико- зидным атомом кислорода; в результате данная связь расщепляется (рис. 7.14). 2. Это создает положительный заряд на С-1 кольца D. Образовавшийся короткожи- Часть I 140 Конформация и динамика вущий продукт называется ионом карбония. поскольку он содержит положительно заря- женный атом углерода. 3. Димер NAG, состоящий из остатков Е и F, отдаляется от фермента в результате диффузии. 4. Образовавшийся в качестве промежу- точного продукта ион карбония реагирует с ОН “ -группой растворителя (рис. 7.15). Тет- ра-NAG, состоящий из остатков А, В, С и D, отдаляется от фермента путем диффузии. 5. Глутамат-35 вновь протонируется, и фермент может вступать в новый катали- тический цикл. Основные элементы этой схемы катализа следующие. 1. Общий кислотный катализ. Источник протона-глутамат-35, который находится в неионизированной форме и отстоит от гликозидного атома кислорода на опти- мальное расстояние-3 А. 2. Образование в качестве промежуточ- ного продукта иона карбония. Два разных по своей природе фактора, оказывающих ста- билизирующий эффект на ион карбония, значительно облегчают осуществление фер- ментативной реакции. К ним относятся: а. Электростатический фактор, т.е. при- сутствие отрицательно заряженной группы поблизости (в 3 А) от образующегося в каче- стве промежуточного продукта иона карбо- ния. Аспартат-52, находящийся в форме от- рицательно заряженного карбоксилат-иона, электростатически взаимодействует с поло- жительным зарядом на С-1 кольца D. б. Геометрический фактор, а именно де- формация кольца D (рис. 7.16). Гекса-NAG размещается наилучшим образом в щели активного центра фермента при условии,
NAG3| Рис. 7.14. Первый этап постулированно- го механизма действия лизо- цима-перенос Н+ от Glu 35 на атом кислорода гликозид- ной связи. При этом происхо- дит расщепление гликозидной связи и образование иона кар- бонил. что геометрия кольца D меняется от кон- формации кресла к конформации полукрес- ла. Такая деформация способствует ускоре- нию катализа, так как при конформации полукрссла значительно облегчается обра- зование иона карбония. Расположение угле- родных атомов 1,2 и 5 и кислородного ато- ма кольца в одной и той же плоскости при конформации полукресла приводит к тому, что положительный заряд распределяется между С-1 и атомом кислорода кольца. Та- ким образом, связывая субстрат, фермент NAG3| заставляет его принимать форму переход- ного состояния, а именно форму иона карбония. 7.7. Экспериментальное доказательство предложенного механизма ферментативного катализа Основанная на рентгеноструктурных данных гипотеза о характере связывания субстрата и механизме катализа была про- верена постановкой многочисленных хими- ческих экспериментов. Все полученные ре- зультаты подтверждают правильность вы- двинутой гипотезы. Приведем ряд наиболее существенных экспериментальных доказа- тельств. 1. Способ расщепления субстрата. В со- ответствии с предположением о том, что расщепление гексамера происходит между 4-м и 5-м остатками, оказалось, что действи- тельно гекса-NAG расщепляется на тетра- Рис. 7.15. Реакция гидролиза завершает- ся присоединением ОН к промежуточно образовавше- муся иону карбония и Н + к бо- 7. Механизм действия ковой цепи Glu 35. ферментов 141
A Рис. 7.16. Изменение конформации коль- ца D субстрата лизоцима в конформацию полукресла. Л-углеводный остаток в обы- чной конформации кресла; Б-при связывании с лизоци- мом атом кислорода кольца и С-5 в углеводном остатке D перемещаются так, что С-1, С-2, С-5 и О оказываются в одной плоскости, как это по- казано на рис. В. (Phillips D. С., The three-dimensional structure of an enzyme molecule, Copyright 1966 by Scientific American, Inc.) NAG и ди-NAG (рис. 7.17). 2. Сродство связывания. Путем измере- ния равновесия при реакции связывания с ферментом каждого из шести сахаров определяли их вклад в общую величину сво- бодной энергии связей, представленных в гексамере (рис. 7.18). Обнаружилось пора- зительное явление: вклад углеводного остатка D был отрицательным. На связыва- ние остатка D расходовалось около 4 ккал/моль. Этот результат подтверждает гипотезу о деформации остатка D при связывании с ферментом: изменение от кон- формации кресла к конформации полукрес- ла требует энергии. Любопытно также, что остаток С вносит наибольший положи- тельный вклад в сродство связывания. Дей- ствительно, рентгеноструктурные данные показывают, что остаток С образует боль- шое число водородных связей и вандер- ваальсовых взаимодействий. 3. Аналоги переходного состояния. Пред- ставление о деформации углеводного остат- ка D в конформацию полукресла - важный аспект постулированного механизма ката- лиза, поскольку конформация полукресла Часть I 142 Конформация н динамика 5 в характерна для переходного состояния. Как уже отмечено выше, это представление под- тверждается данными о затрате энергии на присоединение остатка D-энергии, расхо- дуемой на деформацию. Другое подтвер- ждение было получено при изучении анало- га переходного состояния субстрата, т.е. соединения, имеющего как до, так и после связывания с ферментом такую же геоме- трию, как субстрат в переходном состоянии. Кольцо D лактонного аналога тетра-NAG (рис. 7.19) в кристалле тетрасахарида имеет конформацию полукресла. При связывании с лизоцимом атомы С-1, С-2, С-4, С-6 и кис- лородный атом кольца D этого аналога рас- полагаются в одной плоскости. Такая кон- формация «софы» сходна с постулирован- ной для переходного состояния конформа- цией полукресла; это означает, что лак- тонный аналог в отличие от тетра-NAG при связывании с лизоцимом деформируется очень мало. Оказалось, что лактонный ана- лог связывается с лизоцимом (в участках связывания от А до D) в 3600 раз сильнее, чем тетра-NAG. Отсюда вытекает, что при деформации кольца D нормального субстра- та скорость расщепления может возрасти примерно в 3600 раз. Роль этого фактора в катализе ясно пред- видел Полинг (Pauling), о чем свидетель- Рис. 7.17. Гекса-NAG гидролизуется с образованием тетра-NAG и ди-NAG.
ствует его лекция, читанная в 1948 г.: «Я полагаю, что ферменты-это моле- кулы, которые по структуре комплемен- тарны активированным комплексам тех реакций, которые они катализируют, т.е. молекулярной структуре, промежуточной между реагирующими веществами и про- дуктами реакции в данном каталитиче- ском процессе. Сила притяжения моле- кулы фермента к активированному ком- плексу приводит к снижению энергии последнего, а следовательно, к снижению энергии активации данной реакции и воз- растанию скорости реакции». 4. Зависимость скорости каталитиче- ской реакции от pH. Скорость гидролиза хитина достигает наиболее высоких зна- чений при pH 5 (рис. 7.20). По обе сто- роны от этого оптимума ферментативная активность резко падает. Снижение актив- ности при сдвиге pH в щелочную сторону обусловлено ионизацией глутамата-35, тогда как при сдвиге pH в кислую сторо- ну-протонированием аспартата-52. Ли- зоцим проявляет ферментативную актив- ность только при условии, что глута- мат-35 находится в неионизированной 6 Рис. 7.18. Вклад каждого из шести угле- водных остатков гекса-NAG в стандартную свободную энергию связывания этого суб- страта. Связывание остатка D идет с потреблением энер- гии. Энергия расходуется на такое изменение формы остат- ка, чтобы он соответствовал активному центру фермента. СН2ОН СН2ОН ! : \ /с—°v —°\ он Н ОН । /С=0 NAG3 \----С NAG3 \------С NHCOCH3 NHCOCH3 Карбонновое производное Лактонный аналог тетра-NAG тетра-NAG Рис. 7.19. Кольцо D лактонного аналога тетра-NAG имеет конформа- цию, похожую на полукресло, и в этом отношении сходно с промежуточным переходным состоянием в реакции, катали- зируемой лизоцимом. Рис. 7.20. Скорость гидролиза хитина (poly-NAG) лизоцимом как функция pH. форме, а аспартат-52 - в ионизированной. 5. Избирательная химическая модифи- кация. Лизоцим сохраняет ферментатив- ную активность, если все имеющиеся в нем карбоксильные группы, за исключе- нием карбоксильных групп глутамата-35 и аспартата-52, подвергнуть этерифика- ции. Остатки 35 и 52 остаются немодифи- цированными, если этерификацию прово- дят в присутствии субстрата. При удале- нии субстрата аспартат-52 этерифици- руется (тогда как глутамат-35 остается неизменным). Модификация аспартата-52 приводит к полной инактивации фермен- та. Это подтверждает предположение о том, что строгая ориентация карбокси- лат-иона аспартата-52 необходима для 7. Механизм действия ферментов 143
A В С D Е F а Рис. 7.21. е в Существование промежуточ- ного продукта гликозил-фер- мент подтверждается способ- ностью лизоцима катализиро- вать, хотя и медленно, реак- цию трансгликозилирования. NAG4 (показан красным) со- единяется с промежуточным продуктом гликозил фермент (показан синим на рис. Б), и в результате образуется NAG6. стабилизации образующегося в качестве промежуточного продукта иона карбо- ния. 6. Транс гликозилирование. При добав- лении к лизоциму тетра-NAG происходит медленное образование гекса-NAG и ди- NAG (рис. 7.21). Существование этой ре- акции, называемой трансгликозилирова- нием, подтверждает наличие одного из важных элементов предложенного меха- низма ферментативной реакции, а именно образования в качестве промежуточного продукта комплекса гликозил — фермент. При обычных гидролитических реакциях этот промежуточный продукт реагирует с ОН ". При трансгликозилировании в ре- акции используется вторая молекула углевода: ROH. Реакция трансгликозили- рования специфична, так как акцептор связывается в участках Е и F в щели ак- тивного центра. Более того, образующая- ся гликозидная связь имеет р-конфигура- цию, как и в субстрате. Таким образом, эти данные подтверждают правильность предполагаемой формы промежуточного продукта катализа. 7.8. Карбоксипептидаза А: протеолитиче- ский фермент, содержащий цинк Перейдем теперь к карбоксипептидазе А- пищеваритсльному ферменту, гидроли- зующему С-концевую пептидную связь в полипептидах. Особенно легко гидроли- зуются пептиды, в которых С-концевой остаток имеет ароматическую или боль- шую алифатическую боковую цепь (рис. 7.22). Этот фермент интересен в том отношении, что по механизму катализа он принципиально отличается от лизоцима. Прежде чем перейти к подробному обсуж- дению механизма действия карбоксипеп- тидазы А, отметим два основных аспекта. 1. Индуцированное соответствие. Связывание субстрата сопровождается значительными изменениями структуры фермента. 2. Смещение электронов. В активном центре фермента содержатся атом цинка и другие группы, которые индуцируют перераспределение электронов в субстра- те, облегчая тем самым процесс гид- ролиза. Трехмерную структуру карбоксипепти- дазы А (рис. 7.23) при разрешении в 2 А Н Н О Н I I II I •N—С—С— N—С— < + Н,0 I I I О- 2 R Н сн Карбоксипептидаза А НН Н I I ^0 I Л) N—С—CZ + +H.N—С— Cf I х0- I о R Рис. 7.22. Реакция, катализируемая кар- боксипептидазой А. Часть I 144 Конформация и динамика
240 Рис. 7.23. Трехмерная структура карбок- сипептидазы А. Показаны только а-углеродные атомы и ион цинка (заштрихованный кружок в центре). [Lips- comb W.N., Proc. Robert А. Welch Found. Conf. Chem. Res., 15, 134 (1971).] получил в 1967 г. Уилльям Липском (W. Lipscomb). Фермент содержит одну полипептидную цепь из 307 аминокислот, имеет компактную форму, которую мож- но приближенно описать как эллипсои. i ную с размерами 50 х 42 х 38 А. 38 А. В ферменте имеются области а-спиралей (38%) и Р-складчатых слоев (17%). С бел- Рис. 7.24. Ион цинка, расположенный в активном центре карбокси- пептидазы А, образует коорд- инационные связи с боковыми ком прочно связан ион цинка, наличие ко- торого необходимо для проявления фер- ментативной активности. Ион цинка рас- положен в углублении близко к поверхно- сти молекулы, причем он образует коор- динационные связи (в виде тетраэдра) с боковыми цепями двух гистидинов, боко- вой цепью глутамата и молекулой воды (рис. 7.24). Рядом с ионом цинка на фер- менте имеется большого размера «кар- ман», в который попадает боковая цепь концевого остатка пептиды ого субстрата. цепями двух гистидинов и глу- тамата. Занимающая 4-ю координационную связь моле- кула воды здесь не показана. (Blow D. М., SteitzT. А., Х-гау diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 39, 78, Copyright 1970 by Annual Reviews, Inc.) 7. Механизм действия ферментов 145 10-665
Рис. 7.25. Схематическое изображение связывания глицилтирозина в активном центре карбокси- пептидазы А. Показан посту- лированный каталитически ак- тивный комплекс. 7.9. Связывание субстрата индуцирует боль- шие структурные изменения активного центра карбоксипептидазы А Представление о характере связывания суб- стратов с карбоксипептидазой А возникло на основе данных, полученных при изучении структуры комплекса этого фермента с гли- цилтирозином. Глицилтирозин - медленно гидролизуемый субстрат. Процесс его связывания (рис. 7.25 и 7.26) можно предста- вить в виде пяти последовательных этапов. 1. Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа глицилтирозина вступает в электростатическое взаимодей- ствие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145. 2. Субстрат через боковую цепь своего тирозина связывается в неполярном карма- не фермента. 3. Водород NH-группы той пептидной Рис. 7.26. Пространственное расположе- ние глицилтирозина в актив- ном центре карбоксипепти- дазы А. Глицилтирозин (суб- страт) изображен красным. (Blow D. М., Steitz Т. А., Х-гау diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 39, 78, Copyright 1970.) Часть I 146 Конформация и динамика связи, которая должна гидролизоваться, со- единяется водородной связью с ОН-груп- пой ароматической боковой цепи тиро- зина-248. 4. Карбонильный кислород той же пеп- тидной связи вступает в координационную связь с ионом цинка. 5. Концевая аминогруппа субстрата образует водородную связь через вклини- вающуюся молекулу воды с боковой цепью глутамата-270. Это взаимодействие, вероят- но, не имеет места в случае реакционноспо-
20 A Рис. 7.27. £ Структура карбоксипептидазы А меняется при связывании субстрата: А - фермент без субстрата (Arg 145 показан желтым, Glu 270-зеленым, Туг 248-синим); Б -фермент- су бстратный комплекс (гли- цилтирозин, субстрат, изобра- жен красным). На рисунке показана только часть моле- кулы фермента. [Lipscomb W. N., Proc. Robert A. Welch Fou- nd. Conf Chem. Res., 15, 140-141 (1971).] io*
Рис. 7.28. Постулированный механизм каталитического действия кар- боксипептидазы A: Glu-270 не- посредственно атакует карбо- нильный углеродный атом ги- дролизуемой пептидной связи, а Туг-248 отдает протон на NH-группу этого пептида. Образующийся в результате ангидрид далее подвергается гидролизу. собного ES-комплекса, и именно оно, воз- можно, является причиной крайне медлен- ного гидролиза глицилтирозина. Связывание глицилтирозина сопровож- дается структурной перестройкой активного центра (рис. 7.27). В сущности, только при- соединив субстрат, каталитические группы фермента принимают правильную ориента- цию положение, впервые постулированное Кошландом (Koshland) в его модели индуци- рованного соответствия. Гуанидиниевая группа аргинина-145, а также карбоксильная группа глутамата-270 перемещаются на 2 А. Связывание карбонильной группы субстра- та с ионом цинка вытесняет из связи с цин- ком молекулу воды. По крайней мере еще четыре молекулы воды вытесняются из не- полярного кармана на ферменте при связы- вании с ними тирозиновой боковой цепи в молекуле субстрата. Самое большое изме- нение конформации-это перемещение фе- нольного гидроксила тирозина-248 на 12 А, т. е. на расстояние, составляющее около 1 /4 диаметра молекулы. Такое перемещение осуществляется в первую очередь, путем свободного вращения относительно одинарной связи —С—С— и состоит в том, что гидроксильная группа тирозина-248, Часть I 148 Конформация и динамика бывшая на поверхности молекулы, переме- щается, оказываясь вблизи пептидной связи субстрата. В результате закрывается по- лость активного центра и тем самым завер- шается превращение ее из области, запол- ненной водой, в гидрофобную. Все эти структурные изменения инициируются, по- видимому, связыванием аргинина-145 с кон- цевой карбоксильной группой субстрата. 7.10. Скорость катализа карбоксипептида- зой А возрастает благодаря смещению электронов На основе данных рентгеноструктурного анализа Липском (Lipscomb) предложил ме- ханизм каталитического действия карбокси- пептидазы А. Постулированная структура реакционноспособного ES-комплекса пока- зана на рис. 7.28. Согласно предложенному механизму, ОН-группа тирозина-248 отдает протон на NH-группу расщепляемой пеп- тидной связи. Карбонильный атом углерода этой пептидной связи подвергается атаке со стороны карбоксильной группы глутама- та-270, которая выступает в данном случае как нуклеофильная группа. Образующийся в результате ангидрид глутамата-270 и кис- лотного компонента субстрата подвергает- ся далее гидролизу. Возможен и другой механизм катализа, также согласующийся с данными рентгено- структурного анализа; он показан на рис. 7.29. По этой схеме глутамат-270 акти- вирует молекулу воды. Образующийся ОН- непосредственно атакует карбо- нильный атом углерода расщепляемой пеп- тидной связи. Одновременно тирозин-248 отдает протон на ее NH-группу, и в итоге пептидная связь гидролизуется. Этот меха- низм катализа отличается от механизма, приведенного на рис. 7.28, тем, что предпо- лагает гидролиз водой непосредственно пептидной связи субстрата, а не промежу-
точно образующегося ангидрида. Прове- денные в последнее время химические и спектроскопические исследования свиде- тельствуют о том, что гидролиз пептидных субстратов осуществляется по прямому ме- ханизму, тогда как гидролиз эфиров проте- кает через промежуточное образование ан- гидрида с глутаматом-270. Какова роль цинка в этих схемах катали- за? Карбонильная группа расщепляемой пептидной связи обращена к иону цинка та- ким образом, что связь С О оказывается более поляризованной, чем обычно; это де- лает карбонильный атом углерода более чувствительным к нуклеофильной атаке. Не- полярное окружение иона цинка увеличи- вает его эффективный заряд и тем самым его способность индуцировать диполь. Сильной поляризации карбонильной группы способствует также близость отри- цательного заряда глутамата-270. Следова- тельно, карбокиспептидаза А индуцирует такое смещение электронов на субстрате, которое повышает скорость катализа. Теперь мы можем оценить значение инду- цированных субстратом структурных изме- нений в активном центре карбоксипепти- дазы А. В результате связавшийся на ферменте субстрат оказывается со всех сто- рон окруженным каталитическими группа- ми. Это обеспечивает возможность катали- за по причинам, о которых говорилось выше. Совершенно очевидно, что только гибкость структуры фермента обеспечи- вает попадание субстрата в сферу действия системы каталитических групп (и выход продуктов реакции из этой системы). В це- лом гибкая структура фермента имеет пре- имущество перед жесткой в том отношении, что она обладает гораздо большим выбо- ром возможных конформаций, пригодных для катализа и сохраняющихся в процессе отбора. Кроме того, индуцированное со- ответствие вносит вклад в повышение спе- цифичности фермента. В самом деле, в слу- чае карбоксипептидазы А субстрат должен иметь концевой карбоксилат-ион; фермент «проверяет» его наличие таким путем: если концевой карбоксилат-ион имеется, то он образует солевую связь с аргинином-145, а это вызывает перемещение тирозина-248 в каталитически активное положение; если же концевого карбоксилат-иона нет, то ти- розин-248 остается на месте и фермент нс проявляет активности. Другими словами, индукция соответствия может функциони- ровать как динамический процесс узнавания. Glu-2 70 Рис, 7*29, Второй возможный механизм каталитического действия кар- боксипептидазы А. Туг 248 выполняет ту же функ- цию, что и на рис. 7.28. В остальном процесс проте- кает иначе: Glu 270 активирует молекулу воды, которая ата- кует карбонильный атом угле- рода расщепляемой пептидной связи. Гидролиз осуществляет- ся прямо, без промежуточного образования ангидрида. Заключение Лизоцим-фермент относительно неболь- шого размера, расщепляющий полисаха- ридный компонент клеточных стенок бакте- рий. По своей структуре указанный полиса- харид представляет собой чередующийся полимер остатков N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты 7. Механизм действия ферментов 149
(NAM), соединенных гликозидными связя- ми р (1 -► 4). Лизоцим гидролизует глизозид- ную связь между С-1 остатка NAM и С-4 остатка NAG. Олигомеры N-ацетилглюко- замина также гидролизуются лизоцимом. При этом гекса-NAG и более длинные поли- меры легко расщепляются ферментом, тог- да как три-NAG и ди-NAG гидролизуются с крайне малой скоростью. Три-NAG — сильный конкурентный ингибитор фермен- та. Трехмерная структура лизоцима и его комплекса с три-NAG изучена на атомар- ном уровне. Установлено, что три-NAG за- нимает половину щели, идущей поперек мо- лекулы фермента, с которым он связывается большим количеством водородных связей и вандерваальсовых взаимодействий. На ос- нове данных о структуре комплекса лизоци- ма с три-NAG была построена модель, предсказывающая, как связывается с лизо- цимом его эффективный субстрат гекса-NAG. Предложена гипотеза механизма катали- тического действия лизоцима; суть гипо- тезы состоит в следующем. Первое; крити- ческими группами для катализа являются неионизированная карбоксильная группа остатка глутамата-35 и карбоксилат-ион ас- партата-52. Обе группы расположены на расстоянии около 3 А от гидролизуемой гликозидной связи, а именно связи между остатками D и Е гексамерного субстрата. Второе: глутамат-35 отдает Н+ связи между С-1 кольца D и гликозидным атомом кисло- рода, что приводит к разрыву этой связи. С-1 кольца D становится положительно за- ряженным; такая переходная форма назы- вается ионом карбония. Третье; ион карбо- ния реагирует с ОН " -группой растворите- ля, а глутамат-35 присоединяет водород, возвращаясь в исходную протонированную форму. После того как продукты реакции удаляются от фермента в результате диффу- зии, лизоцим готов к новому каталитическо- му циклу. Четвертое; скорость катализа зна- чительно увеличивается под действием двух факторов, способствующих промежуточно- му образованию иона карбония; это элек- тростатический фактор, а именно близость отрицательно заряженной боковой цепи ас- партата-52 и геометрический фактор, со- стоящий в том, что кольцо D деформирует- ся, приобретая конформацию полукресла, что приводит к распределению положитель- ного заряда иона карбония между С-1 и ато- мом кислорода углеводного кольца. Карбоксипептидаза А, пищеварительный фермент, расщепляющий С-концевой пеп- тид в полипептидах, служит примером фер- мента, в основе каталитического действия которого лежит совершенно иной механизм. Структура этого фермента и его комплекса с глицилтирозином-аналогом субстрата- раскрыта на уровне атомного разрешения. Связывание глицилтирозина вызывает большие структурные изменения в области активного центра, в результате которых эта область теряет воду и становится гидрофоб- ной. Пример карбоксипептидазы А иллю- стрирует ту важную роль, которую играет в катализе индуцированное соответствие формы фермента форме субстрата. Другая примечательная особенность данного фер- мента состоит в том, что в его активном центре содержится ион цинка, имеющий су- щественное значение для катализа. Карбо- нильный атом углерода расщепляемой пеп- тидной связи поляризуется цинком и стано- вится более чувствительным к нуклеофиль- ной атаке. Здесь мы видим пример индукции смещения электронов в субстрате. При ката- лизе карбоксипептидазой А молекула воды, активированная глутаматом-270, непосред- ственно атакует карбонильную группу рас- щепляемой пептидной связи; одновременно тирозин-248 отдает протон на NH-группу этой связи, и в результате происходит гидролиз. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать Phillips D, С., 1966. The three-dimensio- nal structure of an enzyme molecule, Sei. Amer., 215 (5), 78-90. (Великолепная статья о трехмерной структуре и ме- ханизме каталитического действия лизоцима.) Lipscomb W. N., 1971. Structures and mechanisms of enzymes, Proc. Robert A. Welsh Found. Conf. Chem. Res., 15, 131-156. (Прекрасно иллюстрирован- ное детальное обсуждение структуры и механизмов действия карбоксипеп- тидазы А и ряда других ферментов.) Структура и механизм действия лизо- цима Osserman Е. F., Canfield R. Е., Bey- ch ok S. (eds.), 1974. Lysozyme, Academic Press. Imoto T., Johnson L.N., North A.C. T., Phillips D.C., RupleyJ.A., 1972. Vertebrate lysozymes. In: Boyer P. D. Часть I Конформация и динамика 150
(cd.), The Enzymes (3rd ed.), vol. 7, pp. 666-868, Academic Press. Dahlquist F. W., Rand-Meir T., Rajtery ЛГЛ, 1968. Demonstration of carbonium ion intermediate during lysozyme catalysis, Proc. Nat. Acad. Sci., 61, 1194—1198. Rupley J. A., 1967. The binding and cleavage by lysozyme of N-acetyl- glucosamme oligosaccharides, Proc. Roy. Soc. (B) 167, 416-428. (Предста- влены результаты опытов по гидро- лизу в меченной 18О воде, а также значения G0 при связывании олигоса- харидов и скорости гидролиза лизо- цимов.) Ford L.O.. Jonhson L.N., Mackin Р.А., Phillips D. С., Tjian R., 1974. Crystal structure of a lysozyme-tetrasaccharide lactone complex, J. Mol. Biol., 88, 349-371. Роль напряженности структур при ка- тализе Pauling L., 1948. Nature of forces between large molecules of biological interest, Nature, 161, 707-709. (Содер- жи! предвидение о роли наиряженно- с I и структур в ферментативном ката- лизе.) Wolfenden R., 1972. Analog approaches to the structure of the transition state in enzyme reactions, Acc. Chem. Res., 5, 10 18. Leinhard G. E., 1973. Enzymatic catalysis and transition-state theory, Science, 180, 149-154. Secemski 1.1., Lienhard G.E., 1971. The role of strain in catalysis by lysozyme, J. Amer. Chem. Soc., 93, 3549-3550. Schindler M., Sharon N., 1976. A transition state analog of lysozyme catalysis prepared from the bacterial cell wall tetrasaccharide, J. Biol. Chem., 251, 4330-4335. Warshel A.t Levitt M., 1976. Theoretical studies of enzymatic reactions: dielectric, electrostatic, and steric stabilization of the carbonium ion in the reaction of lysozyme, J. Mol. Biol., 103, 227-249. (Приведены расчеты, по- казывающие, что электростатические факторы в большей мере способ- ствую! образованию иона карбония в молекуле лизоцима, чем стериче- ские.) Структура и механизм действия кар- боксипептидазы А Quiocho F. A., Lipscomb W. N.. 1971. Carb ох у peptidase A: a protein and an enzyme, Advan. Protein Chem., 25, 1-78. (Обзор данных рентгенострук- турного исследования этого фермен- та. Даны атомные координаты.) Makinen М. И7., Yamamura К.. Kaiser Е. Т., 1976. Mechanism of action of carb ox у peptidase in ester hydrolysis, Proc. Nat. Acad. Sci., 73, 3882-3886. (Представлены доказательства обра- зования ковалентного промежуточ- ного продукта ацетил - фермент при гидролизе эфиров.) Breslow R., Wernick D.L., 1977. Unified picture of mechanisms of catalysis by carboxypeptidase A, Proc. Nat. Acad. Sci., 74, 1303-1307. (Приведены данные о прямом гидролизе пеп- тидных субстратов и высказано пред- положение о различии механизмов гидролиза эфиров и пептидов.) Вопросы и задачи 1. Предскажите относительную скорость гидролиза лизоцимом следующих олигосахаридов (буквой G обо- значен остаток N-ацетил глюкозам ин а, бук- вой М-остаток N-ацетилмурамовой кис- лоты) : а) М-М-М-М-М-М б) G-M-G-M-G-M в) M-G-M-G-M-G 2. На основании данных, приве- денных на рис. 7.18, предскажи- те, какие из участков связывания углеводов на лизоциме (от А до F) окажутся занятыми при образовании фермент-субстратного комплекса со следующими олигосахарида- ми (сокращения те же, что и в задаче 1): a) G-G б) G-M в) G-G-G-G 3. Предположим, что при синтезе гекса-NAG гликозидный кисло- род между остатками сахаров D и Е мечен изотопом 18О. Где окажется этот изотоп по- сле гидролиза гекса-NAG лизоцимом? 4. Аналог тетра-NAG, содержа- щий —Н вместо —СН2ОН при С-5 в остатке D значительно сильнее связы- вается с лизоцимом, чем тетра-NAG. Объяс- ните, какие особенности структуры лежат в основе этой разницы в сродстве связыва- ния. 5. Сопоставьте координационные связи атома цинка в карбокси- пептидазе А и атома железа в оксимиогло- бине и оксигемоглобине. а) Какие атомы непосредственно связаны с этими металлами? б) Каким боковым цепям принадлежат свя- занные с металлом группы? в) Какие другие боковые цепи в белках спо- собны связываться с металлом? 6* Экспериментальные данные в пользу прямого гидролиза (рис. 7.29) пептидов карбоксипептидазой А были получены в опытах по изотопному обмену с 18О. N-бензоилглицин, меченный 18О по карбоксильной группе, инкубирова- ли с карбоксипептидазой А. В присутствии L-фенилаланина 18О включался в Н2О. Это- го не наблюдалось, если вместо фенилала- нина в инкубационную смесь добавляли L- Р-фенилмол очную кислоту. Предложите наиболее простую интерпретацию этого эффекта.
ГЛАВА 8. Активация проферментов: пищеварительные ферменты и факторы свертывания крови Ферментативно активная форма лизоцима возникает в результате спонтанного складывания молекулы с образованием ха- рактерной для этого фермента трехмерной структуры. В отличие от лизоцима многие другие белки синтезируются в форме неак- тивных предшественников, которые затем активируются в результате расщепления одной или нескольких специфических пеп- тидных связей. Если каталитически ак- тивный белок называется ферментом (или энзимом), то неактивный предшественник фермента называется проферментом (или зимогеном). Активация белков путем специфического протеолиза-процесс, широко распростра- ненный в биологических системах. Приве- дем несколько примеров. 1. Пищеварительные ферменты, гидроли- зующие белки, синтезируются в желудке и поджелудочной железе в виде профермен- тов (табл. 8.1). 2. Свертывание крови опосредовано кас- кадом реакций протеолитической актива- ции, обеспечивающим быстрый и нарастаю- щий по силе ответ на травму. 3. Некоторые белковые гормоны синтези- руются в виде неактивных предшественни- ков. Например, инсулин образуется из про- инсулина в результате протеолитического удаления пептида. 4. Фибриллярный белок коллаген, содер- Часть I 152 Конформация и динамика жащийся в большом количестве в коже и ко- стях, образуется из растворимого предше- ственника - проколлагена. 8.1. Активация химотрипсиногена происхо- дит путем специфического расщепления одной пептидной связи Химотрипсин - это пищеварительный фер- мент, гидролизующий белки в тонком ки- шечнике. Как и ряд других проферментов и пищеварительных ферментов, он синтези- руется в поджелудочной железе в форме не- активного предшественника - химотрипси- ногена. Вообще поджелудочная железа-это один из органов, наиболее активно синтези- рующих белки. Ферменты и их предшест- венники синтезируются в ацинарных клет- ках поджелудочной железы (рис. 8.1). Внут- ри этих клеток новосинтезированные белки транспортируются из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, где окру- жаются белково-липидной мембраной; так образуются зимогеновые гранулы, которые в электронном микроскопе выглядят как очень плотное тельца. Высокая электронная плотность зимогеновых гранул обусловлена содержанием большого количества белка (рис. 8.2). Зимогеновые гранулы накапли- ваются в верхушке ацинарных клеток и за- тем под действием гормонального или Таблица 8.1. Проферменты, синтезируемые в желудке и поджелудочной железе Место синтеза Профермент (зимоген) Активный фермент Желудок Пепсиноген Пепсин Поджелудочная железа Химотрипсино- ген Химотрипсин Поджелудочная железа Трипсиноген Трипсин Поджелудочная Прокарбокси- Карбоксипепти- железа пептидаза даза Поджелудочная железа Проэластаза Эластаза
Рис* 8.1. Схематическое изображение секреции проферментов (зимо- генов) ацинарной клеткой под- желудочной железы. (По ри- сунку, любезно предоставлен- ному д-ром G. Palade.) нервного сигнала секретируются в проток, ведущий в двенадцатиперстную кишку. Химотрипсиноген образован одной поли- пептидной цепью, состоящей из 245 амино- кислот. Цепь связана пятью дисульфидны- ми мостиками. Химотрипсиноген практиче- ски полностью лишен ферментативной активности. Однако он превращается в ак- тивный фермент, когда под действием трипсина расщепляется пептидная связь между аргинином-15 и изолейцином-16 (рис. 83). Образующийся активный фер- мент, называемый л-химотрипсином, дей- ствует затем на другие молекулы л-химо- трипсина. В результате удаления еще двух пептидов образуется стабильная форма фермента - а-химотрипсин. Дополнитель- ное расщепление при превращении л-химо- трипсина в a-форму в сущности излишне, поскольку л-химотрипсин сам обладает полной ферментативной активностью. По- разительная особенность данного процесса активации состоит в том, что расщепление всего лишь одной специфической пептидной связи превращает белок из каталитически неактивной формы в полностью активную. 8.2. Трехмерная структура химотрипсина Понять суть этого удивительного процесса активации можно, лишь зная в деталях структуру и механизм каталитического дей- ствия химотрипсина. К счастью, фермент этот исследован достаточно хорошо мето- дами химического и рентгеноструктурного анализа. По существу химотрипсин - это один из самых изученных ферментов, и по- этому имеет смысл рассмотреть его более детально. Молекула химотрипсина состоит из трех полипептидных цепей, соединенных двумя межцепочечными дисульфидными связями (рис. 8.4). Масса фермента составляет около Рис. 8.2. Электронная микрофотогра- фия зимогеновых гранул в аци- нарных клетках поджелудоч- ной железы. (Печатается с любезного разрешения д-ра G, Palade.) 8. Активация проферментов 153
1 245 Химотрипсиноген (неактивный) Трипсин Arg рГб” т- Не 2451 it- Химотрипсин (активный) Химотрипсин Ser-Arg and Thr - Asn 14 15 147 148 Ь \з| Г Leu А-цепь [Тб 14б] i Г Не Туг В-цепь |l49 245] Ala С-цепь а-Химотрипсин (активный) Рис. 8.3. Активация химотрипсиногена. S---S S----S S----------S ________, I I____________________. ..Ill । А I I в | I с ' Рис. 8.4. В молекуле а-химотрипсина имеются два межцепочечных дисульфидных мостика и три внутрицепочечные дисуль- фидные связи. 25 кДа. Трехмерную структуру фермента при разрешении 2 А (рис. 8.5) установили Дэвид Блоу (D. Blow) и сотрудники мето- дом рентгеноструктурной кристаллогра- фии. Молекула химотрипсина имеет ком- пактную эллипсоидную форму размером 51 х 40 х 40 А. Все заряженные группы, за исключением трех, абсолютно необхо- димых для катализа, находятся на поверх- ности молекулы. Молекула свернута очень сложно; в отличие от миоглобина и гемо- глобина она содержит очень мало а-спира- лей. Полипептидные цепи в основном вытя- нуты и нередко идут параллельными тяжа- ми на расстоянии друг от друга примерно 5 А. Между пептидными группами в приле- гающих тяжах образуются многочисленные водородные связи. Часть молекулы обла- дает вторичной структурой, напоминающей антипараллельные складчатые слои, как это наблюдалось и в лизоциме. Часть I 154 Конформация и динамика 8.3. Химотрипсин специфичен в отношении ароматических и больших неполярных бо- ковых цепей Биологическая роль химотрипсина-гидро- лизовать белки в тонком кишечнике (рис. 8.6). Равновесие этой реакции сдвинуто почти полностью в сторону гидролиза (> 99%). Однако химотрипсин способен ги- дролизовать с высокой скоростью далеко не всякую пептидную связь. Он действует из- бирательно на пептидные связи, образо- ванные карбоксильными группами аминокис- лот с ароматическими боковыми цепями- тирозина, триптофана и фенилаланина, а также аминокислот с гидрофобными остатками большого размера, например метионина (рис. 8.7). Химотрипсин гидролизует также эфирные связи. Хотя эта реакция не имеет существен- ного физиологического значения, она пред- ставляет интерес в том отношении, что имеет много общего с гидролизом пептид- ной связи (рис. 8.6). По существу, значитель- ная часть сведений о механизме каталитиче- ского действия химотрипсина была получе- на при изучении гидролиза простых эфиров. 8.4. При катализе химотрипсином часть суб- страта ковалентно связывается с ферментом Химотрипсин катализирует гидролиз пеп- тидных и эфирных связей в два отдельных
Рис. 8.5. Трехмерная структура а-химо- трипсина. Показаны только а- углеродные атомы. Цветом от- мечены участвующие в катали- зе остатки. (Blow D.M. In: The Enzymes, P.D. Boyer, ed., 3rd ed., v. 3, Acad. Press, 1971, p. 194) этапа. Впервые это было обнаружено при изучении кинетики гидролиза «-нитрифени л ацетата. При использовании больших количеств фермента можно отчет- ливо проследить наличие двух фаз в высво- бождении одного из продуктов реакции п- нитрофенола (рис. 8.8). Сначала наблюдает- ся быстрое взрывообразное высвобождение n-нитрофенола, после чего он образуется уже с меньшей стационарной скоростью. На первом этапе «-нитрофенилацетат присоединяется к химотрипсину, т.е. обра- зуется фермент-су бстратный (ES) комплекс (рис. 8.9). Эфирная связь в субстрате при этом расщепляется. Один из продуктов реакции - «-нитрофенол - высвобождается, тогда как ацетильная группа субстрата ста- новится ковалентно связанной с ферментом. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и ре- генерированного фермента (рис. 8.10). На- чальная быстрая фаза высвобождения «-ни- трофенола соответствует этапу образования ацетил-ферментного комплекса. Этот этап называется ацилированием. Более медленное стационарное образование «-нитрофенола соответствует этапу гидролиза ацетил-фер- ментного комплекса и регенерации свобод- ного фермента. Этот второй этап, назы- ваемый деацилированием, лимитирует ско- рость всего процесса гидролиза эфиров химотрипсином. Более того, ацетил-фер- ментный комплекс настолько стабилен, что при благоприятных условиях его удается выделить. Механизм катализа химотрипси- Rj—С N —R2 4- Н2О —Ri—\ 4- Н N—R2 Пептид Кислота Амин Ri—С O~R2 4- Н2О —Ri—С 4- НО— R2 + Н+ о- Эфир Кислота Спирт Рис. 8.6. Химотрипсин катализирует ги- дролиз пептидных и эфирных связей. 8. Активация проферментов 155
ном можно представить в виде следующей схемы: Е + S ES -у» Е—Р2 Е Pi р2 где Pi-аминный (или спиртовой) компо- нент субстрата, Е - Р2 - промежуточный продукт, образованный в результате кова- лентного связывания, Р2-кислотный ком- понент субстрата. Особенность этого механизма реакции состоит в образовании промежуточного продукта путем ковалентного связывания; в рассмотренном выше случае происходило ковалентное соединение ацетильной группы с ферментом. В общем случае группа, при- соединенная к химотрипсину на стадии Е-Р2,-это всегда ацильная группа. Таким образом, Е2-Р представляет собой проме- жуточное соединение ацил - фермент, 8.5. Ацильная группа соединяется с необы- чайно реакционноспособным остатком серина на ферменте Место, в котором происходит присоедине- Рис. 8.8. После смешивания химотрип- сина и и-нитрофенилацетата можно наблюдать две фазы образования п-нитрофенола. п-Нитрофенил- Промежуточный п-Нитро- ацвтат продукт ацетил— фенол фермент Рис. 8.9. ОН Ацилирование: образование комплекса ацетил - фермент в качестве промежуточного продукта. [фермент] + Н2О -----> [Фермент] 4 ^С—СН3 + Н + С—сн3 ° II о Промежуточный Ацетат продукт ацетил — фермент 1 СН3 Рис. 8.10. Деацилирование: гидролиз промежуточно образующегося комплекса ацетил - фермент. Триптофан Метионин Рис. 8.7. Химотрипсин гидролизует предпочтительно пептидные связи, образованные карбок- сильными группами аромати- ческих аминокислот, а также аминокислот с большой непо- лярной боковой цепью. Часть I 156 Конформация и динамика ние ацильной группы к ферменту, удалось определить, когда был выделен в чистом ви- де промежуточный продукт Е-Р2, ста- бильный при pH 3. Оказалось, что ацильная группа присоединяется к атому кислорода специфического остатка серина, а именно серина-195. Этот остаток серина проявляет необычно высокую реакционную способ- ность. Его можно специфически пометить каким-либо органическим фторфосфатом,
' Фермент1 СН ОН + Диизопропилфтор- фосфат (ДИФФ) ______н3с—с—сн3 | Фермент' 0 " I СН,0 —р=0 + HF о н3с—с—сн3 н Инактивированный фермент Рис. 8.11. Диизопропилфторфосфат (ДИФФ) инактивирует химо- трипсин путем образования диизопропилфосфорильного производного серина-195. например диизопропилфторфосфатом (ДИФФ), который взаимодействует только с серином-195, давая неактивный высокоста- бильный комплекс диизопропилфосфорил - фермент (рис. 8.11). О повышенной реак- ционной способности серина-195 отчетливо свидетельствует тот факт, что остальные 27 остатков серина в химотрипсине не взаимо- действуют с ДИФФ. О [фермент — СН2—О —С—СН3 Серин Ацетильная 195 группа Химотрипсин - не единственный фермент, инактивирующийся в присутствии ДИФФ. Множество других протеолитических фер- ментов, например трипсин, эластаза, тром- бин, субтилизин, специфически реагируют с ДИФФ, полностью теряя при этом актив- ность. Как и в случае химотрипсина, реак- ция этих ферментов с ДИФФ идет только по одному остатку серина. Отсюда и их общее название - сериновые протеиназы. ДИФФ вступает также в реакцию с остатком серина в ацетилхолинэстеразе - ферменте, играю- щем ключевую роль в передаче нервных им- пульсов в определенных синапсах. Как уже упоминалось в гл. 6, способность ДИФФ инактивировать ацетилхолин эстеразу лежит в основе его использования в инсектицидах и нервно-паралитических газах. 8.6. Участие гистидина-57 в катализе выяв- ляется с помощью аффинной метки Участие в катализе второго аминокислотно- го остатка было установлено путем исполь- зования так называемой аффинной метки, или метки по сродству. Метод заключается в том, что к химотрипсину добавляют веще- ство, которое 1) специфически связывается в активном центре в силу подобия с субстра- том и затем 2) образует стабильную кова- лентную связь с некоторой группой, распо- ложенной на ферменте поблизости. Та- ким веществом является тозил-Ь-фенилала- нинхлорметилкетон (ТФХК), строение ко- торого показано на рис. 8.12. Наличие боковой цепи фенилаланина в ТФХК обеспечивает его специфическое связыва- ние с химотрипсином. Реактивная груп- па ТФХК-это хлорметилкетон. ТФХК атакует химотрипсин только по гисти- дину-57, алкилируя один из атомов азота гистидинового кольца (рис. 8.13). ТФХК- производное химотрипсина лишено фер- ментативной активности. Имеется три дово- да в пользу присутствия гистидина-57 в активном центре фермента. Во-первых, аф- финная метка в высокой степени стереоспе- цифична: D-изомер ТФХК абсолютно неэф- фективен. Во-вторых, присутствие конку- рентного ингибитора трипсина - р-фенил- пропионата - тормозит реакцию с ТФХК. Группа, определяющая специфичность Рис. 8.12. Н Q CHj-C—С—СН2С1 N—Н \ FT Реакционно- способная группа Структура тозил-Ь-фенилала- нинхлорметилкетона (ТФХК), используемого в качестве аф- финной метки химотрипсина (R'-тозильная группа). 8. Активация проферментов 157
В-третьих, скорость инактивации химо- трипсина при добавлении ТФХК находится примерно в такой же зависимости от pH, как скорость катализа. 8.7. Система переноса заряда обеспечивает челночную передачу протона при катализе Каталитическая активность химотрипсина определяется необычайно высокой реак- ционноспособностью серина-195. В физио- логических условиях —СН2ОН-группа обычно инертна. Почему же в активном цен- тре химотрипсина ее реакционная способ- ность столь резко возрастает? Объяснить это можно, исходя из результатов рентгено- структурного исследования трехмерной структуры фермента. Как и можно было предположить еще на основе результатов введения аффинной метки, гистидин-57 рас- положен в непосредственной близости от серина-195. Рядом находится также карбок- сильная группа боковой цепи аспартата-102 (рис. 8.14). По существу каталитическая способность химотрипсина обусловлена взаимодей- ствием этих трех остатков. Аспартат-102 образует водородную связь с гистиди- ном-57, который в свою очередь соединен водородной связью с серин ом-195. Эти три остатка создают систему переноса заряда. Как показано в разд. 8.9, эта система играет ключевую роль в катализе благодаря спо- собности связывать протон (рис. 8.15). По- груженный в молекулу карбоксилат-ион ас- партата-102 поляризует имидазольную группу гистидина-57, что повышает его спо- собность осуществлять челночную передачу протона. При этом аспартат-102 и гисти- дин-57 расположены так, что во время ну- клеофильной атаки субстрата кислородом они акцептируют протон гидроксильной группы серина-195. 8.8. В химотрипсине имеется глубокий кар- ман для связывания ароматической боковой цепи Локализация участков специфического связывания и вероятная ориентация гидро- лизуемой пептидной связи эффективного субстрата были выявлены в результате рентгеноструктурного анализа комплексов химотрипсина с аналогами субстрата. Установлено, что формил-Ь-триптофан связывается с химотрипсином через индоль- Часть I 158 Конформация и динамика I Химотрипсин! п СН2 ’С—— N +ТФхк , НС\ /СН н Гистидин-57 Химотрипсин I СН2—С----N II II НСХ /СН \ сн2 I с=о I R Рис. 8.13. Алкилирование гистидина-57 в химотрипсине воздействием ТФХК. Рис. 8.14. Конформация системы пере- носа заряда в химотрипсине. [Blow D. М., SteitzT.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 39, 86 (1976).] Asp— C- O“- * • 102 H /4 — N N • • • —О—Ser 1 95 HC=C I His 57 Asp—C—0— 102 Б Рис. 8.15. Система переноса заряда в хи- мотрипсине : А - фермент без субстрата; Б-при добавлении субстрата происходит проме- жуточное связывание протона аспартатом-102 и гистиди- ном-57.
ную боковую цепь, которая хорошо со- ответствует по размеру карману на фермен- те вблизи серина-195 (рис. 8.16). Именно наличием этого глубокого кармана объяс- няется специфичность химотрипсина в отно- шении аминокислот с ароматической или иной гидрофобной боковой цепью большо- го размера. При рентгеноструктурном ана- лизе комплексов химотрипсина с аналогами полипептидных субстратов обнаружено большое число водородных связей между основными цепями фермента и субстрата, причем эти водородные связи располагают- ся так же, как в антипаралдельных р-склад- чатых слоях. 8.9. В процессе катализа образуется переход- ное тетраэдрическое промежуточное соедине- ние Широкие рентгеноструктурные и химиче- ские исследования химотрипсина позволили прийти к определенному выводу относи- тельно механизма его каталитического дей- ствия. По-видимому, гистидин-57 и се- рин-195 непосредственно участвуют в рас- щеплении пептидной связи субстрата. Гид- ролиз этой связи начинается с того, что кислородный атом ОН-группы серина-195 атакует карбонильный атом углерода в гид- ролизуемой пептидной связи субстрата. В результате связь между атомами углерода и кислорода в этой карбонильной группе становится одинарной и атом кислорода приобретает отрицательный заряд. Четыре атома, связанные с углеродом карбониль- ной группы, располагаются в виде тетраэд- ра. Образование из плоской амидной группы этого тетраэдрического промежу- точного соединения оказывается воз- можным только благодаря возникновению водородных связей между отрицательно за- ряженным атомом кислорода гидроксиль- ной группы (называемым оксианионом) и двумя NH-группами самой полипептид- ной цепи (рис. 8.17). "В механизме образова- ния упомянутого промежуточного соедине- ния важную роль играет также перенос протона от серина-195 на гистидин-57 (рис. 8.18). Перенос протона значительно облегчается благодаря присутствию си- стемы переноса заряда. Аспартат-102 строго ориентирует положение имидазольного кольца гистидина-57 и частично нейтрали- зует заряд, появляющийся на этом кольце в момент переходного состояния. Протон, накопленный парой гистидин - аспартат, переходит далее к атому азота гидролизуе- Основная цепь 193 Рис. 8.16. Схематическое изображение присоединения к химотрипси- ну формил-Ь-триптофана (ана- лог субстрата). мой пептидной связи, которая в результате разрывается. На этом этапе аминный ком- понент субстрата оказывается соединенным водородной связью с гистидином-57, а кис- лотный компонент-эфирной связью с сери- ном-195. На этом завершается стадия аци- лирования гидролитической реакции. Следующая стадия - деацилирование (рис. 8.19). Аминный компонент субстрата диффундирует прочь от фермента, а на его место в активном центре встает молекула Рис. 8.17. Тетраэдрическое промежуточ- ное соединение в реакциях аци- лирования и деацилирования химотрипсина. Стабильность промежуточного соединения обеспечивают водородные свя- зи, образованные NH-группа- ми основной цепи фермента. Этот участок называется по- лостью оксианиона. 8. Активация проферментов 159
Субстрат Тетраэдрическое Ацил —фермент переходное состояние (промежуточный продукт) Ser 195 —СН2—О н R' о—cz I R—N—Н -сн2-о^ R—N—Н I н N --СН НС N- С I н сн2 Рис. 8.18. Первый этап гидролиза пепти- дов химотрипсином -ац ил иро- вание. Образуется тет- раэдрическое промежуточное соединение. Затем аминный компонент субстрата быстро отделяется от фермента, а фер- мент превращается в ацил— фермент - промежуточный продукт катализа. воды. По сути деацилирование-это процесс, обратный ацилированию, но с заменой амин- ного компонента субстрата на Н2О. Снача- ла система переноса заряда отрывает про- тон от воды. Образующийся ОН" -ион немедленно атакует карбонильный атом углерода ацильной группы, присоединенной к серину-195. Как и при ацилировании, фор- мируется тетраэдрическое промежуточное соединение. Далее гистидин-57 передает протон на атом кислорода серина-195, что приводит к высвобождению кислотного компонента субстрата. Этот компонент от- деляется путем диффузии от фермента, ко- торый может вступить в новый каталитиче- ский цикл. 8.10. Механизм активации профермента Обратимся теперь к вопросу о том, каким образом расщепление всего одной пептид- ной связи в химотрипсиногене превращает его в активный фермент. Трехмерную струк- туру химотрипсиногема исследовал Джозеф Краут (J. Kraut), установивший, что в про- Часть I 160 Конформация и динамика цессе активации фермента его конформация притерпевает ряд изменений. 1. Гидролиз пептидной связи между арги- нином-15 и изо лейцином-16 создает новые С- и N-концевые группы. 2. Вновь образованная N-концевая группа изолейцина-16 загибается внутрь и взаимо- действует с аспартатом-194 внутри моле- кулы химотрипсина (рис. 8.20). Протониро- вание этой аминогруппы стабилизирует активную форму химотрипсина, о чем сви- детельствует характер зависимости фермен- тативной активности от pH. 3. Это электростатическое взаимодей- ствие между положительно заряженной аминогруппой и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом, происходящее в непо- лярной области фермента, запускает ряд конформационных сдвигов. Метионин-192 из глубины молекулы перемещается ближе к поверхности, а остатки 187 и 193 становят- ся более вытянутыми. В результате обра- зуется субстрат-специфичный участок для ароматических и больших неполярных групп. Одну сторону этого участка состав- ляют остатки от 189 до 192. В проферменте эта полость для связывания части субстра- та сформирована не полностью. 4. Тетраэдрическое переходное состоя- ние, возникающее при катализе химотрип- сином, стабилизируется водородными свя- зями между отрицательно заряженным атомом кислорода карбоксильной группы и двумя NH-группами самой полипептид- ной цепи (рис. 8.17). В химотрипсиногене одна из этих NH-групп расположена так, что недоступна для связывания. Следова- тельно, в зимогене и полость оксианиона до конца не сформирована.
Ацил—фермент (промежуточный продукт) V —сн2-о^и Кислотный компонент субстрата Тетраэдрическое переходное состояние R' —сн2—о о cz \ I н. N СН N—CH !i HC \ N—C H CH2 i z N --CH His-57 Asp-102 I Рис. 8.19. Второй этап гидролиза пепти- да химотрипсином - деацили- рование. Ацил—фермент (про- межуточный продукт) гидро- лизуется водой. Деацилирова- ние по существу представляет собой реакцию, обратную аци- лированию, но на место амин- ного компонента субстрата становится Н2О. довательность аминокислот, окружающих серин: Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro. 4. При рентгеноструктурном анализе бы- ло выявлено большое сходство третичной структуры этих трех ферментов (рис. 8.21). В эластазе и трипсине, как и в химотрипси- не, имеется система переноса заряда, а так- же полость оксианиона. 5. Механизм каталитического действия 5. Конформационные сдвиги в остальных частях молекулы очень незначительны. Та- ким образом, «включение» ферментативной активности в белке осуществляется путем отдельных, строго локализованных конфор- мационных сдвигов, запускаемых гидролизом всего лишь одной пептидной связи. 8.11. Трипсин и эластаза: вариации на тему Трипсин и эластаза сходны с химотрипси- ном во многих отношениях. 1. Все три фермента секретируются под- желудочной железой в виде проферментов и активируются путем расщепления одной- единственной пептидной связи. Возникаю- щая при этом концевая аминогруппа заги- бается внутрь молекулы и электростатиче- ски связывается с карбоксилат-ионом аспар- тата-194. 2. Последовательность расположения около 40% аминокислот в этих трех фермен- тах идентична. Для аминокислотных остат- ков, локализованных во внутренней части молекулы, степень идентичности еще выше. 3. Фторофосфаты, в частности ДИФФ, игнибируют все три фермента. Подобно хи- всех трех ферментов почти одинаков. Их эф- фективность в качестве катализаторов обес- печивается тем, что они стабилизируют переходное состояние реакции. Полость ок- сианиона и система переноса заряда - это те существенно важные структурные элементы каждого из ферментов, которые способ- ствуют образованию тетраэдрического про- межуточного соединения. Будучи сходными по структуре и механиз- му действия, эти ферменты поразительным образом различаются по специфичности. Субстрат химотрипсина должен иметь аро- матическую или большую неполярную бо- ковую цепь. Для трипсина требуется суб- страт, содержащий лизин или аргинин. Ни один из этих субстратов не пригоден для эластазы, проявляющей специфичность в отношении небольших незаряженных бо- ковых цепей. Как показал рентгенострук- турный анализ, эта разница в специфично- сти рассматриваемых ферментов обуслов- лена очень небольшими структурными раз- личиями участков связывания субстрата (рис. 8.22). В химотрипсине ароматические мотрипсину, и трипсин, и эластаза содержат в активном центре остаток серина. Более то- го, во всех трех ферментах одинакова после- 8. Активация проферментов 161 11-665
Рис. 8.20. Окружение аспартата-194 и изолейцина-16 в химотрипси- не. Электростатическое взаи- модействие между карбокси- лат-ионом Asp-194 (красный) и а-МН2-группой Не-16 (синяя) играет важную роль в катали- тической активности химо- трипсина. Эти группы распо- ложены в непосредственной близости к системе переноса заряда. [BlowD.M., Steitz Т> A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 30, 86 (1970).] и большие неполярные боковые цепи суб- страта размещаются в неполярном кармане. В трипсине имеется такой же карман, отли- чающийся, однако, от неполярного кармана химотрипсина заменой одного остатка- вместо серина стоит аспартат. Этот аспар- тат в неполярном кармане трипсина обра- зует прочную электростатическую связь с положительно заряженными боковыми це- пями лизина или аргинина субстрата. В эла- стазе же нет такого кармана для субстрата, поскольку два остатка глицина, выстилаю- Часть I 162 Конформация и динамика щие карман в химотрипсине, в эластазе за- менены остатками валина и треонина, имеющими значительно большие размеры. Структурные изменения, происходящие при активации трипсиногена, несколько от- личаются от изменений, связанных с актива- цией химотрипсиногена. Рентгенострук- турные исследования, проведенные незави- симо Робертом Хьюбером и Робертом Строудом (R. Huber, R. Stroud), показали, что при активации трипсиногена происхо- дят значительные изменения конформации четырех протяженных отрезков полипепти- да, составляющих примерно 15% молекулы. Эти области, названные доменами актива- ции, не имеют устойчивой структуры в про- ферменте, но приобретают строго опреде- ленную конформацию в трипсине. Кроме того, полость оксианиона в трипсиногене расположена слишком далеко от гисти- дина-57 и поэтому не может способствовать образованию тетраэдрического промежу- точного соединения. 8.12. Ингибитор панкреатического трипсина прочно связывается в активном центре трипсина Регуляция активности панкреатических про- теиназ осуществляется двумя различными путями. Первый-превращение профермен- та в активную протеиназу путем расщепле- ния одной пептидной связи. Это очень точный механизм «включения» фермента- тивной активности, однако он необратим, и, следовательно, для остановки протеолиза должен существовать второй регуляторный механизм. Эту функцию выполняют специ- фические ингибиторы протеиназ. Например, панкреатический ингибитор трипсина, белок массой 6 кДа, ингибирует активность трипсина, очень прочно связываясь с его ак- тивным центром (рис. 8.23). Константа дис- социации комплекса составляет 10“13 М, что соответствует стандартной свободной энергии связывания примерно — 18 кДа/моль. Примечательная особен- ность этого взаимодействия состоит в том, что комплекс не диссоциирует ни в 8 М рас- творе мочевины, ни в 6 М гаунидингидро- хлориде. Между тем эти денатурирующие агенты практически всегда вызывают диссо- циацию олигомеров белка на составляющие субъединицы. Такая удивительная стабиль- ность рассматриваемого комплекса объяс- няется тем, что ингибитор трипсина являет- ся очень эффективным аналогом субстрата. Рентгеноструктурный анализ показал, что
Рис. 8.21. А Химотрипсин Сравнение конформации ос- новной цепи химотрипсина (А) и эластазы (Б). Локализация системы переноса заряда (остатки 102, 57 и 195) и ос-ами- ногруппы остатка 16 выделена цветом, чтобы подчеркнуть сходство структуры этих фер- ментов. (Hartley В. S., Shotton D. М. In: The Enzymes, P.D. Boyer, ed., 3rd ed., v. 3, Academic Press, 1971, p. 362.) боковая цепь лизина-15 в молекуле ингиби- тора соединяется с боковой цепью аспарта- та в субстрат-специфичном кармане фер- мента. Кроме того, между полипептидными цепями фермента и ингибитора возникает большое число водородных связей. Они рас- полагаются так же, как водородные связи между ферментом и истинным субстратом. Но что самое главное-карбонильная груп- па лизина-15 и окружающие ее атомы инги- битора плотно входят в полость оксианиона в ферменте. Однако весь комплекс как будто застывает на этом промежуточном этапе ка- тализа - видимо, потому, что гистидин-57 фермента, будучи неподвижным, лишен воз- можности перебросить протон на амидный азот ингибитора. Пептидная связь между лизином-15 и аланин ом-16 в панкреатиче- ском ингибиторе трипсина расщепляется, но 6 Эластаза с крайне малой скоростью. Период полу- жизни комплекса трипсин-ингибитор со- ставляет несколько месяцев. Ингибитор обладает очень высоким средством к трип- сину в силу почти идеальной комплементар- ности его структуры активному центру трипсина. Ограниченная подвижность кон- формации ингибитора в участке его связы- вания с ферментом блокирует процесс ката- лиза и приводит к исключительно высокой прочности комплекса с трипсином. 8.13. Дивергентная и конвергентная эволюция сериновых протеиназ Химотрипсин, эластаза и трипсин обладают в целом сходной последовательностью ами- нокислотных остатков, поскольку они воз- никли из общего предшественника. Ген фер- мента-предшественника, по-видимому, не- сколько раз удваивался. В результате последующих мутаций этих генов появи- лись в конце концов современные фер- менты. Возникновение различной специфич- ности в ходе мутаций генов, произошедших от общего предшественника, представляет собой процесс дивергентной эволюции. Сравнивая химотрипсин с бактериальным ферментом субтилизином, мы сталкиваемся с эволюционным процессом другого типа. 8. Активация проферментов 163 н*
Ингибитор Lys-15 сн2 Химотрипсин NH3+ Трипсин Рис. 8.23. Эластаза Рис. 8.22. Очень упрощенное изображе- ние участка связывания суб- страта в химотрипсине, трип- • сине и эластазе. Asp-1 89 Трипсин Основной элемент взаимодей- ствия панкреатического инги- битора трипсина с трипсином состоит в образовании элек- тростатической связи между лизином-15 ингибитора и ас- партатом-189 фермента. Кро- ме того, —NHJ-группа лизи- на-15 соединяется водородной связью с несколькими атома- ми кислорода в субстрат-спе- цифичном кармане молекулы трипсина. Субтилизин - это также сериновая проте- иназа. Однако последовательности амино- кислот в химотрипсине и субтилизине со- вершенно различны, что указывает на их независимое появление в процессе эволю- ции. Например, в молекуле химотрипсина имеется пять дисульфидных мостиков, тог- да как в субтилизине-ни одного. Последо- вательность аминокислот вокруг серина в активном центре субтилизина и химо- трипсина имеет следующий вид: -Gly-Thr- Ser *-Met-Ala-Ser в субтилизине -Gly-Asp- Ser *-Gly-Gly-Pro в химотрипсине Совершенно различны трехмерные струк- туры этих ферментов. Тем более удиви- тельным оказалось сообщение о том, что в субтилизине имеется система переноса за- ряда, состоящая, как и в химотрипсине, из Часть I 164 Конформация и динамика остатков аспарагиновой кислоты, гистидина и серина. Более того, в субтилизине имеется полость оксианиона, стабилизирующая те- траэдрическое промежуточное соединение. Сходство системы переноса заряда, полости оксианиона и механизма катализа в случае субтилизина и химотрипсина-это порази- тельный пример независимой, конвергент- ной эволюции на уровне молекул ферментов. Почему независимые, параллельные эволю- ционные процессы привели к одному и тому же решению в таких разных случаях, как се- риновые протеиназы поджелудочной же- лезы позвоночных и бактериальный субти- лизин? Как описывается далее (разд. 8.16), существует, по-видимому, довольно мало способов расщепления пептидных связей. Изучение нескольких сотен протеолитиче- ских ферментов показало, что имеется, быть может, только четыре основных типа меха- низмов протеолиза и что сериновые проте- иназы распространены наиболее широко.
8.14. Координированная активация панкреа- тических проферментов Расщепление белков в двенадцатиперстной кишке требует одновременного действия не- скольких протеолитических ферментов, по- скольку каждый из них специфичен в отно- шении ограниченного числа боковых цепей. Следовательно, все проферменты должны превращаться в активные ферменты в одно и то же время. Координированный кон- троль процесса активации достигается тем, что для всех панкреатических профермен- тов -трипсиногена, химотрипсиногена, про- эластазы и прокарбоксипептидазы-имеет- ся один общий активатор-трипсин. Откуда же берется достаточно большое количество трипсина, необходимое для активации этих проферментов? Дело в том, что клетки, вы- стилающие двенадцатиперстную кишку, се- кретируют фермент энтеропептидазу1, ко- торая по мере поступления трипсино1ена в двенадцатиперстную кишку гидролизует в нем пептидную связь лизин-изолейцин. Образующееся при этом небольшое количе- ство трипсина активирует трипсиноген и другие проферменты. Таким образом, образование трипсина под действием энте- ропептидазы этап активации активатора: Vai—(Asp)4-И - Не—Vai — Трипсиноген | Энтеропептидаза Vai— (Asp)4— lie—Vai— Трипсин 8.15. Преждевременная активация профер- ментов может приводить к летальному исхо- ду, в частности при панкреатите Существует множество путей защиты под- желудочной железы от протеолитического действия синтезируемых ею ферментов. Прежде всего все панкреатические фер- менты, гидролизующие белки, синтези- руются в виде неактивных проферментов. Далее, в клетках поджелудочной железы они находятся в гранулах, окруженных белково- липидной мембраной. Еще одна мера за- щиты - присутствие в секрете поджелудоч- ной железы ингибитора (разд. 8.12), инакти- вирующего те небольшие количества трип- сина, которые могут в ней оказаться. 1 Этот фермент был открыт Н.П. Шсповальни- ковым и описан им в диссертации «Физиология кишечного сока», изданной в 1899 г. Впослед- ствии ферменту было дано название «энтеро- киназа».- Прим. ред. Место впадения протоков Рис. 8.24. Схематическое изображение поджелудочной железы и ее связи с тонкой кишкой. Поджелудочная железа секретирует также липазы. Одна из них, а именно фосфолипаза А2 синтезируется в виде црофосфолипазы А2, которая затем активируется трипсином. Другие ферменты, расщепляющие жиры, проявляют активность в присутствии солей желчных кислот, поступающих в двенадца- типерстную кишку из печени. Действие этих стероидов состоит в том, что они солюбили- зируют липиды, тем самым делая их до- ступными для ферментативного расщеп- ления липазами. Желчь синтезируется в печени, накапливается в желчном пузыре и из нег о выделяется в двенадцатиперстную кишку, где вместе с панкреатическими ли- пазами участвует в расщеплении жиров. Существует тяжелое, иногда со смер- тельным исходом, заболевание - острый панкреатит. Болезнь эта характеризуется преждевременной активацией протеолити- ческих и липолитических ферментов подже- лудочной железы. При панкреатите эти фер- менты проявляют активность, еще находясь в самой поджелудочной железе. В результа- те происходит разрушение ткани железы и стенок пронизывающих ее сосудов. При- чиной острого панкреатита может быть травма ацинарной ткани. 8.16. Основные т ипы протеолитических фер- ментов - это сериновые протеиназы и карбок- сипротеиназы До сих пор мы рассматривали два класса протеолитических ферментов, а именно 8. Активация проферментов 165
Рис. 8.25. Структура кислой протеиназы из плесени Rhizopus. Показаны а-углеродные атомы. Ак- тивный центр расположен ме- жду двумя долями молекулы во впадине, где размещаются 8 аминокислотных остатков субстрата. Пепсин имеет очень сходную структуру. [Subrama- nian Е., Trends Biochem. Sci., 3, 2 (1978).] цинксодержащие протеиназы (на примере карбоксипептидазы А-см. разд. 7.8) и сери- новые протеиназы. Широко распространена также группа тиоловых протеиназ. Так, в па- паине, получаемом из папайи, в активном центре имеется цистеин, роль которого ана- логична роли серина-195 в химотрипсине. Катализ папаином протекает через образо- вание тиоэфира в качестве промежуточного соединения; в катализе участвует располо- женная вблизи боковая цепь гистидина. Другая большая группа протеолитических ферментов включает карбоксипротеиназы, или, как их еще называют, кислые проте- иназы, поскольку большинство из них ак- тивно только в кислой среде. Наиболее из- вестный представитель этой группы-пеп- син, главный протеолитический фермент желудочного сока. Пепсин мол. массой 34,6 кДа образуется из пепсиногена (профер- мента) путем отщепления N-концевого пеп- тида, состоящего из 44 аминокислотных остатков. Эта активация либо происходит Часть I 166 Конформация и динамика спонтанно (при pH 2 и ниже), либо катализи- руется пепсином. В итоге пепсиноген, секре- тированный в полость желудка, превра- щается в пепсин в течение нескольких секунд. В активном центре пепсина содер- жатся два остатка аспартата. Для проявле- ния ферментативной активности один оста- ток аспартата должен находиться в иони- зированной, другой - в неионизированной форме; это определяет оптимум pH для пепсина - между 2 и 3. Сходные по структуре и ферментативным свойствам карбоксипро- теиназы были выделены из лизосом, осу- ществляющих внутриклеточное расщепле- ние (разд. 20.8), а также из различных плесневых грибов (рис. 8.25). Все карбо- ксипептидазы ингибируются пепстатином (аналогом гексапептидного переходного промежуточного соединения), добавленным в очень низких концентрациях (порядка 10“ 10 М). 8.17. Свертывание крови как каскад реакций активации проферментов Активация белка-предшественника путем разрыва пептидной связи-это один из ос- новных способов регуляции, свойственный различным биологическим системам. Сей- час мы рассмотрим роль активации про- ферментов при образовании кровяного сгустка, представляющем собой один из трех механизмов гемостаза. Два других спо- соба регуляции - это быстрое сужение по- врежденного сосуда и агрегация тромбоци- тов на его стенке для защиты поврежденной поверхности сосуда. Образование кровяного сгустка происхо- дит в результате цепи последовательных превращений, осуществляемых при участии Пусковой механизм: повреждение ткани Фибриновый сгусток Рис. 8.26. В образование сгустка фиб- рина вовлекается взаимодей- ствие трех путей превращений. Пусковой механизм: контакт с аномальной поверхностью Внутренний механизм
Рис. 8.27. Рис. 8.28. Схематическое изображение молекулы фибриногена по данным электронной микро- скопии. Электронная микрофотогра- фия модифицированного фи- бриногена, обладающего упо- рядоченной структурой. Длина повторяющегося отрезка по оси волокна равна 225 А, как и в фибрине, (Печатается с лю- безного разрешения д-ра С. Cohen.) более чем 10 различных белков. Порази- тельная особенность этого процесса состоит в том, что он включает в себя серию актов активации проферментов, В этом каскаде ферментативных реакций активированная форма одного фактора свертывания крови катализирует активацию следующего. В си- лу каталитической природы процесса фак- торы, действующие на начальных этапах пу- ти, требуются в очень малых количествах. Их эффект усиливается многократно благо- даря большому числу последующих этапов, что обеспечивает в итоге быструю ответную реакцию на травму. 8.18. Образование кровяного сгустка требует взаимодействия двух тппов ферментативных превращений В 1863 г. Джозеф Листер (J. Lister) обнару- жил, что в иссеченной яремной вене быка кровь остается жидкой, тогда как в стеклян- ной посуде она немедленно свертывается. Соприкосновение с неприродной поверх- ностью приводило к высвобождению ком- понентов, исходно присутствовавших в кро- ви. Соответственно этот механизм (путь) свертывания крови был назван внутренним. Однако и вещества, в обычных условиях не присутствующие в крови, также могут вы- звать свертывание. Так, при добавлении к плазме экстрактов многих тканей, в осо- бенности мозга, происходит быстрое фор- мирование кровяного сгустка. Этот меха- низм (путь) свертывания называется внеш- ним. При свертывании крови внешний и вну- тренний механизмы (пути) действуют взаи- мосвязанно (рис. 8.26), Для нормального свертывания крови необходимы оба меха- низма, о чем свидетельствуют различные нарушения способности к свертыванию кро- ви, связанные с недостаточностью какого- либо из белков, участвующих лишь в одном из механизмов. Внешний и внутренний ме- ханизмы различаются только на начальных этапах, а затем они объединяются в общий путь, приводящий к образованию фибрино- вого сгустка. 8.19. Фибриноген превращается в фибри- новый сгусток под действием тромбина Наиболее изученный этап процесса сверты- вания-это превращение фибриногена в фи- s. Активация проферментов 167
Рис. 8.29. Электронная микрофотогра- фия фибрина. Длина периода структуры по оси волокна со- ставляет 230 А, т. е. половину длины молекулы фибриногена. (Печатается с любезного раз- решения д-ра Н. Slayter.) брин под действием протеолитического фермента-тромбина. Фибриноген отли- чается от рассмотренных ранее белков (на- пример от лизоцима и химотрипсина) зна- чительно большей массой и удлиненностью формы. По данным электронной микроско- пии, фибриноген имеет вид трех узелков, со- единенных двумя тяжами (рис. 8.27). Длина молекулы-460 А, масса-340 кДа, что при- мерно в 10 раз больше массы химотрипсина. Фибриноген состоит из шести полипеп- тидных цепей, которые попарно разделяют- ся на три типа, причем первая пара обозна- чается Аа, вторая Вр и третья у. Фибриноген, легко растворимый белок плазмы, в результате протеолитического действия тромбина превращается в нера- створимый мономер фибрина. Тромбин расщепляет в фибриногене четыре пеп- тидные связи между аргинином и глицином, В результате этого расщепления высвобо- ждаются четыре пептида: А-пептид из 18 Часть I 168 Конформация и динамика остатков от каждой из двух a-цепей и В-пеп- тид из 20 остатков от каждой из двух Р-це- пей. Эти А- и В-пептиды называют фибрино- пептидами. Молекула фибриногена, лишен- ная фибринопептидов, представляет собой мономер фибрина. Его субъединичная струк- тура -(а, р,у)2; он содержит около 97% ами- нокислотных остатков фибриногена. 8.20. Мономеры фибрина спонтанно обра- зуют фибриллы Растворимость мономеров фибрина значи- тельно ниже растворимости фибриногена. Они спонтанно агрегируют, образуя фи- брин, имеющий форму длинных нераство- римых нитей (фибрилл). Методами элек- тронной микроскопии и дифракции рентге- новских лучей, направленных под малым углом, показано, что фибрин обладает пе- риодической структурой с длиной повто- ряющегося участка 230 А (рис. 8.29). По- скольку длина фибриногена составляет около 460 А, т.е. вдвое больше, предста- вляется вероятным, что мономеры фибрина при агрегации образуют параллельные ряды, сдвинутые относительно друг друга на пол молекулы (рис. 8.30). Чем объяснить, что мономеры фибрина способны агрегировать, а фибриноген, из которого они образуются,-нет? Оконча- тельный ответ на этот вопрос дадут прово- дящиеся детальные исследования структуры молекул. Все изученные к настоящему вре- мени фибринопептиды всех видов позво- ночных обладают большим отрицательным зарядом. В них обнаружено обилие остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Кроме того, в В-фибринопептиде имеется необычное отрицательно заряженное про- изводное тирозина, а именно тирозин-О- сульфат. Видимо, наличие этих, а также и других отрицательно заряженных групп вызывает отталкивание молекул фибрино- o=s=o I 0- Т ироэи н -О*сул ьфа т
Мономер фибрина Рис. 8.30. Период = 230 Предполагаемое расположе- ние мономеров фибрина в фи- бриновом сгустке. При такой укладке мономеров фибрина, когда параллельные ряды оказываются сдвинутыми от- носительно друг друга на пол- молекулы, длина периода структуры составляет 230 А в соответствии с реально суще- ствующей картиной. А ковалентными поперечными связями между боковыми цепями отдельных молекул в фи- бриновых нитях. Установлено, что в ходе ре- акции трансамидирования пептидные связи образуются между боковыми цепями специ- фических остатков глутамина и лизина (рис. 8.31). Фермент, катализирующий эту реакцию,-трансамидаза. Поперечные связи указанного типа встречаются в белках край- не редко. Значение их видно из того, что у больных с врожденной недостаточностью трансамидазы повышена кровоточивость. гена друг от друга. Высвобожденные тром- бином мономеры фибрина обладают поверх- ностью с совершенно другими электрически- ми свойствами, обусловливающими способ- ность к агрегации. Вспомним, что замена всего лишь одной заряженной группы-глу- тамата на валин - является причиной агрега- ции дезоксигемоглобина при серповидно- клеточной анемии. 8.21. Сгусток фибрина стабилизирован кова- лентными поперечными связями Сгусток, образующийся при спонтанной агрегации мономеров фибрина,-еще очень слабый и рыхлый. Затем он стабилизируется 8.22. Тромбин гомологичен трипсину Способность тромбина специфически рас- щеплять связь между остатками аргинина и глицина свидетельствует, по-видимому, о сходстве тромбина с трипсином. И дей- ствительно, такое сходство имеется, что яв- ствует из сопоставления последовательно- стей остатков аминокислот в этих белках. Тромбин имеет массу 33,7 кДа и состоит из двух цепей. Цепь А из 49 остатков не про- являет заметной гомологии с ферментами поджелудочной железы. Цепь В, напротив, очень сходна с трипсином, химотрипсином и эластазой по последовательности амино- кислот. Последовательность аминокислот О Фибрин—СН2—СН2—С—NH2 + +H,N—СН2—СН2—СН2—СН2—Фибрин Глутамин Лизин | Трансамидаза О Фибрин—СН2—СН2—С— N”'CH2—СН2—СН2—СН2~ Фибрин + Г\|Н4‘ I н Поперечно сшитый фибрин Рис. 8.31. ’ Перекрестные связи в фибрине образуются в результате трансамидирования. 8, Активация проферментов 1^9
Рис. 832. Структура протромбина. В ре- зультате расщепления двух пептидных связей (Arg-274— Thr-275 и Arg-323—Ile-324) образуется тромбин. Красным показан отщепляемый N-koh- цевой фрагмент протромбина, в котором локализованы все остатки у-карбоксиглутамата. А- и В-цепи тромбина соеди- нены дисульфидной связью. вокруг серина в активном центре тромбина: Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro, т.е. такая же, как и в сериновой протеиназе поджелудочной железы. Более того, в тромбине имеется и система переноса заряда. Ее трехмерная структура еще не раскрыта, но установлена одна важная особенность, характеризующая участок специфического связывания: в тромбине, как и в трипсине, на дне карма- на, связывающего субстрат, находится оста- ток аспартата. Эта отрицательно заряжен- ная группа несомненно должна электроста- тически связывать положительно заряжен- Часть I 170 Конформация и динамика ную боковую цепь аргинина субстрата. Специфичность тромбина значительно вы- ше, чем специфичность трипсина: тромбин расщепляет только определенные связи ар- гинин-глицин, тогда как трипсин гидроли- зует почти любую пептидную связь, сле- дующую за остатками аргинина или лизина. Как и панкреатические сериновые проте- иназы, тромбин синтезируется в виде про- фермента -п рот ромбы на, имеющего мол. массу 66 кДа. В результате протеолитиче- ского расщепления связи аргинин — трео- нин с аминоконца протромбина высво- бождается фрагмент массой 32 кДа (рис. 8.32). Последующее расщепление связи аргинин — лейцин приводит к высвобожде- нию активного тромбина. В тромбине имеется также ионная пара, аналогичная ионной паре в химотрипсине между поло- жительно заряженной аминогруппой изо- лейцина-16 и отрицательно заряженным асп артатом-194. Сходство последовательностей аминокис- лотных остатков указывает на то, что тром- бин эволюционно близок к сериновым проте- иназам поджелудочной железы. Подтвер- ждением этому служат также сходство механизмов активации сравниваемых фер- ментов и наличие в них системы переноса заряда. Примечательно, что протромбин синтезируется в печени, имеющей в процессе эмбриогенеза общее с поджелудочной желе- зой происхождение. 8.23. Для синтеза протромбина необходим витамин К На протяжении многих лет было известно, что витамин К необходим для синтеза про- тромбина и ряда других факторов свертыва- ния крови. Однако механизм действия этого витамина удалось раскрыть совсем недавно путем исследования аномального про- тромбина, синтезируемого в отсутствии ви- тамина К или же в присутствии антагониста витамина К, например дикумарола. Дику- марол содержится в гниющем доннике, и скот, получающий испорченное сено, поги- бает от геморрагической болезни. Про- изводное дикумарола используется в меди- цине в качестве антикоагулянта для предот- вращения тромбозов у больных с повышен- ной свертываемостью крови. Дикумарол, а также варфарин (рис. 8.33), родственный витамину К по структуре и его антагонист, нашли применение и в качестве сильного крысиного яда. Под влиянием дикумарола в крови коров появляется дефектный про-
Ди кум а рол Варфарин Рис. 8.33. Формулы витамина К2 и двух его антагонистов-дикумарола и варфарина. тромбин, который в отличие от нормально- го не способен связывать Са2 + . Довольно долго это представлялось загадкой, потому что по количеству содержащихся аминокис- лот и по аминокислотному составу, опреде- ленному после кислотного гидролиза, де- фектный протромбин не отличался от нормального. При разделении нормального протромбина на фрагменты было показано, что связывание Са2+ происходит в N-конце- вой области белка (рис. 8.34). Далее было обнаружено, что N-концевой пептид ано- мального протромбина значительно отли- чается от соответствующего пептида нор- мального протромбина по электрофорети- ческой подвижности. Изучение этих пепти- дов методом ядерного магнитного резонан- са позволило установить, что в норме протромбин содержит ранее неизвестную аминокислоту - у-карбоксилглутамат; в аномальном протромбине эта модифици- рованная аминокислота отсутствует. Как оказалось, первые десять остатков глута- мата в N-концевой области протромбина карбоксилированы в у-карбоксилглутамат, причем это карбоксилирование осущест- вляется витамин-К-зависимой фермента- тивной системой. Указанную аминокислоту не удавалось выявить вплоть до последнего времени, потому что при кислотном гидро- лизе происходит потеря у-карбоксигруппы и у-карбоксиглутамат определяется как глу- тамат : СОО- I rH,N— С—Н 3 I сн2 /с< ООС СОСГ у- Карбо кси глутамат 8.24. На фосфолипидной поверхности тром- боцитов протромбин активируется фактором Ха Каскадный характер процесса свертывания крови показан на рис. 8.35. Протромбин ак- тивируется протеолитическим ферментом, называемым фактором Ха. Для удобства факторы свертывания крови обозначаются римскими цифрами. Буква «а» показывает, что фактор находится в активной форме. Итак, протромбин превращается в тромбин в результате протеолитического действия фактора Ха. Это превращение (протромбин тромбин) ускоряется под влиянием фактора V. Фактор V-не фер- мент; это как бы белок-модификатор^ В результате зависимой от витамина К реакции карбоксилирования глутамат (слабо хелирующий Са2 +) превращается в у- карбоксиглутамат, являющийся сильным хелатирующим агентом. Связываясь с Са2 + , протромбин заякоривается на фосфоли- пидных мембранах тромбоцитов, скапли- вающихся в месте повреждения. Функцио- нальное значение присоединения протром- бина к фосфолипидным поверхностям со- 8. Активация проферментов 171
стоит в том, что протромбин оказывается в непосредственной близости от факторов Ха и V, а это ускоряет его активацию более чем в 104 раз. На этом этапе активации N- концевой фрагмент протромбина, содержа- щий участки связывания Са2 +, отщепляется. В результате тромбин высвобождается из связи с фосфолипидными поверхностями и, 1 NH2 Ala Asn Lys Gly Phe Leu Vai 10 Arg Lys Gly Asn Leu 35 20 30 Рис. 8.34. Последовательность амино- кислот N-концевой части про- тромбина [остатки у-карбо- ксиглутамината (Gia) пока- заны красным]. Часть I 172 Конформация и динамика Внутренний механизм Внешний \ механизм \ / \ / Фактор X --* ! Протромбин ---* Фибриноген — Рис. 8.35. Конечные этапы образования фибринового сгустка. Ука- занные три реакции соста- вляют общий механизм свертывания крови. В актива- ции фактора X участвуют про- дукты как внутреннего, так и внешнего механизма. находясь в свободном виде, может активи- ровать фибриноген плазмы. Каким образом активируется фактор X? Этап его активации знаменует собой объе- динение внутреннего и внешнего механиз- мов свертывания крови. Оба механизма приводят к появлению протеолитических ферментов, активирующих фактор X. 8.25. Гемофилия и другие формы нарушения свертывания крови позволили выявить ряд начальных этапов образования кровяного сгустка Биохимическое исследование начальных этапов свертывания крови оказалось значи- тельно сложнее, чем исследование конечных этапов, поскольку факторы, действующие на начальных этапах, находятся в крови в очень малом количестве. Так, если содер- жание фибриногена в 1 мл крови составляет 3 мг, то содержание фактора X-только 0,01 мг. Концентрация ряда других факто- ров, обеспечивающих самые начальные этапы свертывания, еще ниже. Кроме того, эти факторы крайне лабильны. В силу ука- занных причин плодотворным оказался другой подход, а именно исследование больных с нарушением свертывания крови. Наиболее известное заболевание такого типа - гемофилия. Это нарушение сверты- вающей способности крови передается по наследству как сцепленный с полом рецес- сивный признак. Женщины, гетерозиготные по этому признаку, передают дефектный ген потомству, причем само носительство де-
фектного гена проходит бессимптомно. Из- вестным кондуктором гемофилии была ко- ролева Виктория, передавшая дефектный ген в монархические семьи Пруссии, Испа- нии и России (рис. 8.36). Царевич Алексей родился в 1904 г. Он был единственным наследником в царской династии, правившей Россией с XVII в. К тому времени, когда родился царевич, у царя Николая И и императрицы Алек- сандры, внучки королевы Виктории, были четыре здоровые дочери. Уже через 6 недель после рождения царевича его отец отметил в дневнике: «Нынче утром без всякой види- мой причины у маленького Алексея крово- точил пупок. Кровь шла с небольшими перерывами до самого вечера». Признаки болезни усилились, когда Алексей начал ползать и ходить; на руках и на ногах у него стали появляться большие вспухшие синяки. Кровоподтеки становились все крупнее, од- нако врачи были бессильны и не могли облегчить состояния больного. Отчаявшая- ся императрица обратилась тогда к Распу- тину, имевшему репутацию исцелителя. Никто в истории не имел меньшего представления о молекулярных основах ге- мофилии, и никто в истории не получил большего дохода от нее. В течение многих лет Распутин обладал огромным влиянием при русском дворе, так как императрица слепо верила в его способность исцелять. Как мог состояться брак между Нико- лаем и Александрой, если уже было извест- но, что ее брат, племянники и дядя страдают гемофилией? Еще в 1873 г. французский врач Грандидье (Grandidier) рекомендовал, «чтобы все члены семьи больного с крово- точивостью воздерживались от брака». Бо- лее того, на наследственную природу этого заболевания еще в 1803 г. указывал Джон Отто (J. Otto): «Около 70 или 80 лет тому назад женщина по фамилии Смит (Smith) поселилась по- близости от Плимута, графство Нью- Гемпшир, и передала своему потомству следующую идиосинкразию... Удиви- тельным образом только у мужчин возни- кало это странное заболевание, причем не все мужчины в семье были подвержены ему... Хотя женщины не болели, однако они были способны передавать болезнь своим сыновьям.» Как писал Дж. Халдейн (Halldane), «цар- ствующие особы тщательно ограждены от столкновения с неприятной реальностью... Гемофилия царевича Алексея была симпто- мом полного непонимания реальности цар- ствующим домом». 8.26. Внутренний механизм свертывания крови При гемофилии нарушен внутренний меха- низм свертывания крови (рис. 8.37)-белок, называемый антигемофилъным фактором (фактор VIII), либо совсем отсутствует, либо его активность резко снижена. Этот белок, действуя вместе с фактором 1Ха (протеоли- тическим ферментом), активирует фактор X. Сам антигемофильный фактор является не ферментом, а белком-модификатором. Любопытна история открытия фактора IX. Мальчик по имени Стефен Кристмас (S. Christmas) страдал нарушением сверты- вания крови, клинически не отличимым от классической гемофилии ни по симптомати- ке, ни по типу наследования. Как и при гемо- филии, время свертывания его крови, поме- щенной в стеклянную пробирку, было увеличено. Попробовали смешать его кровь с кровью больного гемофилией и с удивле- нием обнаружили, что время свертывания смешанной крови оказалось почти на уров- не нормы. Отсюда со всей очевидностью следовало, что, несмотря на идентичность клинической картины заболеваний, молеку- лярные дефекты у Стефена Кристмаса и больного гемофилией различны. У двух этих больных отсутствовали различные факторы свертывания, поскольку в против- ном случае плазма их крови была бы не спо- собна к взаимной комплементации. Так был открыт новый фактор, обозначенный как фактор IX, или кристмас-фактор. Вообще тест на комплементацию является на- дежным методом исследования, позволяю- щим определить, одни и те же или разные компоненты отсутствуют в двух сравни- ваемых неактивных системах. Ценность этого метода состоит в том, что он дает воз- можность пронумеровать отдельные ком- поненты системы еще до того, как удается их выделить и получить в очищенном виде. Тест на комплементацию широко исполь- зуется в генетических исследованиях виру- сов и бактерий. Кристмас-фактор отделен двумя этапами от пусковой реакции внутреннего механиз- ма свертывания. Пусковым моментом этой последовательности реакций служит кон- s. Активация проферментов 173
I Виктория, (Россия) Рис. 8.36. Генеалогия гемофилии в мо- нархических семьях Европы. На схеме указаны все дети ко- ролевы Виктории и выбороч- но-внуки и правнуки. Лица женского пола обозначены кружками, мужского-квадра- тами; больные гемофилией по- казаны красным. (Stern С., Principles of Human Genetics, 3rd ed., W. H. Freeman and Co., Copyright 1973.) ждении кровеносного сосуда высвобождает- ся так называемый тканевой фактор липо- протеиновой природы. Комплекс тканевого фактора и фактора VII катализирует актива- цию фактора X. Тканевой фактор функцио- нирует как белок-модификатор, поскольку в его отсутствие фактор VII лишен активно- сти. Таким образом, в процессе свертывания крови участвует по крайней мере 3 белка- модификатора: фактор V, фактор VIII и тка- невой фактор. XII такт фактора XII с аномальной для крови поверхностью. Активированный в результа- те этого контакта фактор ХИа вместе с кал- ликреином и кинином превращает фактор XI в активную форму-фактор Х1а, который в свою очередь активирует кристмасс-фак- тор (IX). На всех этих этапах активации про- ферменты превращаются в активные фер- менты. 8.27. Внешний механизм свертывания крови Внешний механизм свертывания, как и внут- ренний, в конечном итоге приводит к акти- вации фактора X. Внешний механизм (рис. 8.38) относительно прост. При повре- Часть I 174 Конформация и динамика 1 XI ---» IX — + Антигемофиль- ный фактор VIII X----» Рис. 8.37. Внутренний механизм сверты- вания крови. Неактивные фор- мы факторов свертывания по- казаны красным, активиро- ванные - желтым. Активиро- ванные факторы катализиру- ют активацию следующих.
8.28, Контроль свертывания крови: пробле- ма, требующая внимания Вполне очевидно, что свертывание крови должно регулироваться очень точно. Грань между геморрагией и тенденцией к тром- бообразованию едва уловима. Образование кровяного сгустка должно происходить очень быстро, но при этом лишь в пределах поврежденного участка сосуда. Почему же этот процесс включает столько этапов? По- чему существуют внутренний и внешний ме- ханизмы и как они связаны между собой? Какие механизмы ограничивают процесс тромбообразования участком поврежде- ния? Эти вопросы интересны не только са- ми по себе, но и в связи с практическими за- дачами предупреждения и лечения сердечно- сосудистых заболеваний. Существенную роль в регуляции тром- бообразования играет лабильность активи- рованных факторов свертывания. Их про- должительность жизни очень короткая, поскольку они быстро разводятся в крово- токе, удаляются из кровеносного русла пе- ченью, расщепляются протеиназами, инак- тивируются специфическими ингибиторами. Наиболее важную роль среди специфиче- ских ингибиторов играет антитромбин III, белок плазмы, инактивирующий тромбин путем образования с ним стабильного ком- плекса. По-видимому, этот комплекс сходен со стабильным комплексом ацил—фермент, образованным трипсином и его ингибито- ром из поджелудочной железы (разд. 8.12). Антитромбин III ингибирует также фак- торы свертывания 1Ха, Ха и Х1а. Ингибитор- Таблица К.2. Факторы свертывания крови Фактор Механизм Функция активной формы Фактор Хагемана (фактор XII) Калликрсин Кинин Предшественник плазменного тромбо- пластина (ППТ) (фактор XI) Кристмас-фактор (фактор IX) Антигемофильный фактор (фактор VIII) Тканевой фактор Проконвертин (фактор VII) Фактор Стюарта (фактор X) Акцелерин (фактор V) Протромбин (фактор II) Фибриноген (фактор I) Фибрин-стабилизирующий фактор (фак- тор XIII) Внутренний » » Внешний » Общий » » » » Активируют фактор XI Активирует фактор IX Оба необходимы для активации фактора X То же Активирует фактор II Стимулирует активацию фактора II Активирует фибриноген (фактор I) ОБРАЗУЕТ ФИБРИНОВЫЙ СГУСТОК Стабилизирует сгусток путем образования поперечных связей в фибрине 8. Активация проферментов 175
Травма Тканевой фактор + Фактор 1 Активированный X --------—* фактор X Рис. 8.38. Внешний механизм свертыва- ния крови. ное действие антитромбина III усиливается в присутствии гепарина-отрицательно за- ряженного полисахарида (разд. 9.16), синте- зируемого тучными клетками, располо- женными вблизи стенок кровеносных сосу- дов. Гепарин действует как антикоагулянт, увеличивая скорость необратимого ком- плексообразования между тромбином и ан- титромбином III. Заключение Активация белков в результате протеолити- ческого расщепления одной или нескольких пептидных связей-широко распростра- ненный механизм регуляции в биологиче- ских системах. Если белок в активированной форме является ферментом, то его неак- тивный предшественник называется про- ферментом (или зимогеном). Наиболее из- ученный процесс активации профермен- та - это превращение химотрипсиногена в химотрипсин, происходящее следующим путем. Под действием трипсина пептидная связь между остатками 15 и 16 в молекуле химотрипсиногена разрывается и в резуль- тате образуется химотрипсин. Возникшая при этом новая концевая аминогруппа изолейцина-16 загибается внутрь молекулы белка, где электростатически связывается с аспартатом-194. Это взаимодействие слу- жит пусковым механизмом для ряда ло- кальных изменений конформации, конечный результат которых - формирование кармана для связывания ароматических (либо боль- ших неполярных) боковых цепей субстрата. Кроме того, формируется полость окси- аниона, стабилизирующая переходное со- стояние. Критическая роль в механизме каталити- ческого действия химотрипсина принадле- жит остатку серина (серин-195) с высокой реакционной способностью. На первом эта- Часть I 176 Конформация и динамика пе гидролиза пептидного субстрата проис- ходит этерификация карбоксильного компо- нента субстрата с гидроксильной группой серина-195, приводящая к образованию ко- валентно связанного промеж уточного про- дукта ацил—фермент. Этот промежуточ- ный продукт гидролизуется на втором этапе катализа. Ключевую роль как в ацилирова- нии, так и в деацилировании фермента игра- ет также гистидин-57. На деле серин-195 ста- новится сильным нуклеофильным агентом в результате формирования ряда водо- родных связей: он соединяется водородной связью с гистидин ом-5 7, который в свою очередь соединяется водородной связью с аспартатом-102, расположенным в глуби- не молекулы. В итоге эти три остатка соста- вляют систему переноса заряда, ускоряю- щую катализ примерно в 103 раз. Такая же система переноса заряда имеется в трипси- не, эластазе и тромбине. Все эти ферменты подобны химотрипсину по аминокислотной последовательности, конформации и меха- низму каталитического действия, но отли- чаются от него по специфичности. Такие ва- риации на одну тему, видимо, результат происхождения от общего предшественника и последующей дивергентной эволюции. Три других основных типа протеолитиче- ских ферментов - это цинксодержащие, тио- ловые и карбоксипротеиназы. Активация проферментов играет также ведущую роль в регуляции свертывания крови. Поразительная особенность процес- са свертывания состоит в том, что он орга- низован как каскад превращений профер- ментов, в котором активированная форма одного фактора свертывания катализирует активацию следующего. Свертывание крови происходит в результате взаимодействия двух последовательностей реакций, полу- чивших название внешнего и внутреннего механизмов. Оба механизма необходимы для нормального свертывания крови. Они сливаются в общий механизм, приводящий к формированию фибринового сгустка. Фи- брин образуется из фибриногена, высокора- створимого белка плазмы, путем гидролиза четырех пептидных связей между остатками аргинина и глицина. Катализирует эту реакцию тромбин - фермент, сходный с трипсином. В результате гидролиза от фи- бриногена отщепляются два А-пептида и два В-пептида, на долю которых прихо- дится около 3% молекулы фибриногена. Образующийся в результате мономер фиб- рина спонтанно полимеризуется в длинные
нерастворимые нити фибрина. Сгусток фибрина стабилизируется далее кова- лентными поперечными связями, образую- щимися-в результате реакции трансамиди- рования между боковыми цепями специфи- ческих остатков глутамина и лизина. Для карбоксилирования остатков глутамата в протромбине и некоторых других факто- рах свертывания необходим витамин К. Связывание ионов Са2 + у-карбоксиглутама- том способствует прикреплению протром- бина к мембранам тромбоцитов, что ведет к ускорению активации протромбина фак- торами Ха и V. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С .чего начать Stroud R.M., 1974. A family of protein-cutting proteins, Sci. Amer., 231 (1), 24-88. (Прекрасное изло- жение общих представлений о структуре, каталитических свой- ствах и эволюции сериновых про- теиназ.) McKusick ИА., 1965. The royal hemo- philia, Sci. Amer., 213 (2), 88-95. Сериновые протеиназы и их профер- менты Blow D.M., 1976. Structure and mechanism of chymotrypsin, Acc. Chem. Res., 9, 145-152. Huber R., Bode W., 1978. Structural basis of the activation and action of trypsin, Acc. Chem. Res., 11, 114-122. Kraut J., 1977. Serine proteases: struc- ture and mechanism of catalysis, Ann. Rev. Biochem,, 46, 331-358. Stround R.M., Kossiakoff A. A., Cham- bers J.L., 1977. Mechanisms of zymogen activation, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 6, 177-193, Boyer P.O. (ed.), 1971. The Enzymes (3rd ed.), vol. 3, Academic Press. (Ука- занный том включает много пре- красных статей о протеолитических ферментах, их профермешах и инги- биюрах.) Кислые протеиназы н их профер- менты Tang 1976. Pepsin and pepsinogen: models for carboxyl (acid) proteases and their zymogens, Trends Biochem. Sci., 1, 205-208. Ингибиторы трипсина Laskowski M., Jr., Kato L, 1980. Protein inhibitors of proteinases, Ann. Rev, Biochem., 49, 593-626. Ruhlmann A., Kukla D., Schwager P., Bartels K., Huber R., 1973. Structure of the complex formed by bovine trypsin and bovine pancreatic trypsin inhibitor, J. Mol. Biol., 89, 73-101. Sweet R.M., Wright H.T, Janin J., Chothia C. H.t Blow D. 1974. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2,6-A resolution, Biochemistry, 13, 4212 4228. Протеиназы в биологических процес- сах Reich Е., Rifkin D. В., Shaw E. (eds.), 1975. Proteases and Biological Control, Cold Spring Harbor Laboratory. (Великолепный сборник с гачей, посвященный роли про- теиназ в разнообразных биологичес- ких процессах, в частности в опло- дотворении, миграции клеток, рас- пространении опухолей, морфо- генезе и метаморфозе.) Fong D., Bonner J.T, 1979. Proteases in cellular slime mold development: evidence for their involvement, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 6481-6485. Свертывание крови Jackson С, M., Nemerson Yt 1980. Blood coagulation, Ann. Rev. Biochem., 49, 765-811. Ratnoff O.D., 1978. Hereditary disorders of hemostasis. In: Stanbu- ry J. B., Wyngaarden J. B. and Fredrickson D.S. (eds.), The Metabolic Basis of Inherited Disease (4th ed.), pp. 1755-1791, McGraw-Hill. Davie E. W., Hanahan D. J., 1977. Blood coagulation proteins. In: Putnam F.W. (ed.), The Plasma Proteins (2nd ed.), pp. 422-544, Academic Press. Ogston D., Bennett B. (eds.), 1977. Haemostasis: Biochemistry, Physiology, and Pathology, Wiley. Stenflo J., Suttie J. W„ 1977. Vitamin К-dependent formation of y-carboxyg- lutamic acid, Ann. Rev. Biochem., 46, 157-172. Link К, P., 1943. The anticoagulant from spoiled sweet clover hay, Harvey Lectures, 39, 162-216. (Увлекатель- ный отчет об открытии дикумарола и его антикоагулянтном действии.) Doolittle R. F., 1973. Structural aspects of the fibrinogen to fibrin conversion, Advan. Protein Chem., 27, 1 109. Tonney N.M., Cohen C., 1977. Crystalline states of a modified fibri- nogen, J, Mol. Biol., 110, 363-385, Massie R-K„ 1967, Nicholas and Alexandra, Dell. (Занимательное изложение, касающееся взаимосвязи между гемофилией и некоторыми событиями русской истории.) Вопросы и задачи 1. Сравните лизоцим, карбоксипеп- тидазу А и химотрипсин. а) Для активности какого из этих фермен- тов необходим ион металла? б) Какой из этих ферментов образован только одной полипептидной цепью? в) Какой из этих ферментов быстро инакти- вируется в присутствии диизопропилфтор- фосфата? г) Какой из этих ферментов образуется пу- тем протеолитического расщепления опре- деленного профермента? 2. Перенос протона от фермента на субстрат-нередко ключевой этап катализа. а) Имеет ли место этот этап при катализе 8. Активация проферментов 177 12-665
химотрипсином, лизоцимом и карбоксипеп- тидазой А? б) Если да, то определите донор водорода в каждом случае. 3. Часто бывает так, что нуклео- фильная группа фермента ата- кует молекулу субстрата. Какая группа слу- жит нуклеофильным агентом при катализе химотрипсином и карбоксипептидазой А? 4. Перечислите факторы, обусло- вливающие каталитическую си- лу ферментов. 5. ТФХК (тозил-а-фенилаланин- хлорметилкетон) используется в качестве аффинной метки химотрипсина. Он инактивирует химотрипсин путем алки- лирования гисгидина-57. а) Предложите аффинную метку для трип- сина, сходную с ТФХК. б) Как определить ее специфичность? в) Какая еще сериновая протеиназа может инактивироваться при использовании такой аффинной метки трипсина? 6. Специфическим ингибитором эластазы служит альдегидное производное одного из ее субстратов: НН п I I /V-Acetyl—Pro— Ala—Pro- N—C—C CH3 H Этот альдегид-аналог промежуточного со- единения, образующегося при катализе эла- стазой. а) С каким остатком в активном центре эла- стазы ковалентно свяжется этот альдегид в первую очередь? б) Какого типа ковалентная связь сформи- руется при этом? 7. Борсодержащие кислоты пред- ставляют собой еще один тип аналогов переходного состояния для фер- ментов, образующих в качестве промежу- точных продуктов ацил-ферментные ком- плексы. Ацетилхолинэстераза-фермент, ги- дролизующий эфирную связь в ацетилхоли- не: О II СН3—С—О СН2—СН2-N(CH3)3 + Н2О Ацетилхолин О II СН3—с—О + НО—СН2—СН2—N(CH3)3 + н + Ацетат Холин Ацетилхолинэстераза специфически ингиби- руется следующим борсодержащим анало- гом ацетилхолина: ОН I i СН3-В - СН2—СН2—СН2—N(CH3)3 Борсодержащий аналог ацетилхолина Каким образом этот борсодержащий ана- лог может присоединиться к активному цен- тру ацетилхолинэстеразы? 8, Для синтеза фактора X, как и для синтеза протромбина, не- обходим витамин К. Фактор X так же, как и протромбин, содержит остатки у-карбок- сиглутамата в N-концевой части. Однако в активированном факторе X в отличие от тромбина эта часть молекулы сохраняется. К каким функциональным последствиям может привести это различие между двумя активированными факторами? 9. Антитромбин III образует не- распадающийся комплекс с тромбином, но не с протромбином. Чем это можно объяснить? 10. Фибрин, подобно миозину, кера- тину и эпидермину, состоит из стержневидных структур, образованных переплетающимися ot-спиралями. Эти а- спирализованные суперспирали (разд. 2.9) содержат повторяющиеся гептапептидные единицы (abed ef д) с гидрофобными остат- ками а и Можете ли вы объяснить, чем обусловлена такая регулярность струк- туры?
ГЛАВА 9. Белки соединительной ткани: коллаген, эластин и протеогликаны дающих высокой упругостью (рис. 9.1). Бо- лее того, структура коллагеновых волокон зависит от типа ткани и соответствует ее специализации. Охарактеризованы четыре типа коллагена (табл. 9.1). Все многоклеточные организмы содержат коллаген, представляющий собой семейство фибриллярных белков. Особенно много коллагена у млекопитающих, где на его долю приходится четвертая часть всех бел- ков. Коллаген является основным фибрил- лярным элементом кожи, костей, сухожи- лий, хряща, кровеносных сосудов, зубов. В этом или ином количестве он содержится почти во всех органах, и именно он объеди- няет клетки в определенные структурные единицы. Помимо этой «структурной» роли в сформировавшихся тканях коллаген играет организующую роль в развиваю- щихся тканях. Отличительным свойством коллагена являете я его способность к фор- мированию нерастворимых фибрилл, обла- Таблица 9.1. Типы коллагена' Тип Состав * Распределение I [a1(I)]2a2 Кожа, сухожилия, кости, ро- говица глаза II [al(H)]3 Хрящ, межпозвоночные дис- ки, стекловидное тело III [al(III)]3 Кожа эмбриона, сердечно-со- судистая система IV Базальная мембрана 1 В насюящсс время охарактеризовано пять типов коллагена, и. учшывая наличие разных молекуляр- ных форм в пределах одного типа (например, колла- ген типа I имеег состав [а1(1)]2я2 либо считают, что существует не менее 10 молекулярных форм колла! спа. При м. пере». Коллаген-слово происходит от греческого выражения «производить клей». 9.L Тропоколлаген как основная струк- турная единица коллагена Нерастворимость коллагена на протяжении многих лет служила препятствием для из- учения его химических свойС1в. Положение изменилось лишь после того, как обнаружи- лось, что коллаген из тканей молодых жи- вотных можно экстрагировать в раствори- мом виде, поскольку на этом этапе в нем от- носительно мало поперечных связей. Отсут- ствие ковалентных поперечных связей в незрелом коллагене позволяет выделить основную структурную единицу, названную т ропоко. i л аг е н ом. Молекулярная масса тропоколлагена со- ставляет около 285 кДа; он cociom из трех полипептидных цепей одинакового размера. Состав цепей зависит от типа колла!ена (табл. 9.11 Коллаген типа I, содержащийся в организме в наибольшем количестве, со- стоит из двух цепей одного тина, обозна- чаемых al (I), и третьей цепи, обозначаемой а2. Коллагены других типов состоят из трех идентичных цепей. Каждая из трех нитей коллагена включает около 1000 аминокис- лотных остатков. Таким образом, основная структурная единица коллагена имеет очень большие размеры, в частности она более чем в 10 раз больше химотрип- сина. 9. Белки соединительной ткани 179
Рис. 9.1. Электронная микрофотогра- фия интактных коллагеновых волокон кожи, Препарат напы- лен хромом. Периодичность структуры по оси волокна со- ставляет 640 А. (Печатается с любезного разрешения д-ра J. Gross.) 9,2. Коллаген обладает необычным составом и необычной последовательностью аминокис- лот В молекуле коллагена примерно 1 /3 амино- кислотных остатков приходится на глицин, что необычайно много для белков. В гемо- глобине, например, содержание глицина со- ставляет только 5% общего содержания Часть I 180 Конформация и динамика аминокислот. Количество пролина в колла- гене также значительно выше, чем в боль- шинстве других белков. Наконец, в колла- гене имеются две аминокислоты, крайне редко встречающиеся в других белках, а именно гидроксипролин и гидроксилизин: ОН 14 з нс—сн2 I I СН2 СН—СОО- 5 \ Z2 1 N + / \ Н Н 4-Г идроксипролин (Нур> ОН е Is д з + H3N- СНг СН СН? СН2 NH3+ |2 с- н I соо- 1 5Гид рОКСИ ЛИЗИН <Hyl) Последовательности аминокислотных остатков в коллагене свойственна высокая степень регулярности: почти каждый тре- тий остаток-это глицин; часто повто- ряются участки глицин-пролин-гидрокси- пролин (рис, 9.2). В этом отношении колла- ген отличается от глобулярных белков, которым несвойственна регулярность по- следовательности аминокислот; помимо коллагена этим свойством обладают фи- броин шелка и эластин. 9.3. Некоторые остатки пролина и лизина в коллагене гидроксилируются Гидроксипролин и гидроксилизин не вклю- чаются в состав полипептидной цепи колла- гена в процессе синтеза белка. Если ввести 13 -Pro-Met- -Pro-Ser- -Pro-Arg- 22 -Leu-Hyp- -Pro-Hyp- -Ala-Hyp- 31 -Рго- Gin - -Phe-GIn- -Pro-Hyp- 40 -Glu-Hyp- -Glu-Hyp- - Ala - Ser- 49 -Pro-Met- -Pro-Arg- -Pro-Hyp- 58 -Pro-Hyp- - Lys-Asn- -Asp-Asp- Рис. 9.2. Последовательность амино- кислот в части цепи al (I) кол- лагена. На протяжении более чем 1000 остатков каждым третьим остатком является глицин.
+ 02 СОО- I сн2 сн2 с=о I соо- Остаток пролина а-Оксоглутарат Пролилгидроксилаза + Аскорбиновая кислота н ° f00’ i1 f с Г2 Н2С\ /СН2 + СО.+ СН2 £ I н' ЧОН С—° О' Остаток Сукцинат 4-гидрокси прол и на Рис. 9.3. Гидроксилирование остатка пролина по С-4 под действием пролилгидроксилазы - фер- мента, активирующего моле- кулярный кислород. крысе 14С-гидроксипролин, то в новосинте- зированном коллагене радиоактивности не обнаружится. Однако при введении 14С-пролина гидроксипролин в коллагене окажется радиоактивным. Следовательно, пролин, но не экзогенный гидроксипролин служит предшественником гидроксипроли- новых остатков в коллагене. Определенные остатки пролина в колла- гене превращаются в гидроксипролин под действием пролилгидроксилазы - фермента, содержащего в активном центре атом желе- за (в ферроформе). Дойором атома кислоро- да, присоединяющегося к С-4 пролина, слу- жит О2. Второй атом кислорода из моле- кулы О2 включается в сукцинат, образую- щийся из второго обязательного субстрата этой реакции - а-оксоглутарата (рис. 9.3). Таким образом, пролилгидроксилаза является диоксигеназой. Примечательная особенность этой реакции гидроксилирова- ния состоит в том, что для ее осуществления необходим восстановительный агент, а именно аскорбиновая кислота (разд. 9.8), благодаря которой сохраняется феррофор- ма атома железа. Рассматриваемая реакция гидроксилиро- вания высокоспецифична. Свободный про- лин не может служить субстратом реакции. Гидроксилированию подвергаются специ- фические участки довольно большой, но еще не спирализованной полипептидной цепи. Гидроксилированию по С-4 подвергаются только те остатки пролина, которые распо- ложены со стороны аминогруппы глициново- го остатка. Помимо этого, несколько остатков пролина гидроксилируется по С-3 другими ферментными системами, причем эти пролины всегда расположены с карбок- сильной стороны глициновых остатков. Под действием лизилгидроксилазы проис- ходит гидроксилирование по С-5 неболь- шой части остатков лизина в коллагене. Как и при гидроксилировании пролина, в про- цессе участвуют молекулярный кислород, а-оксоглутарат и аскорбиновая кислота. Подвергающиеся гидроксилированию ос- татки лизина всегда расположены со сторо- ны аминогруппы остатков глицина. Рис. 9.4. Углеводные компоненты кол- лагена. 9. Белки соединительной ткани 181
Рис. 9.5. Модель тройной спирали кол- лагена. Показаны только а- углеродные атомы. 9.4. К остаткам гидроксилизина присоеди- нены сахара В коллагене содержатся углеводные еди- ницы, ковалентно связанные с остатками ги- дроксилизина. Чаще всего это дисахарид глюкозы и галактозы (рис. 9.4). Присоеди- нение сахаров происходит в результате по- следовательного действия галактозил- трансферазы и глюкозилтранеферазы. Эти ферменты гликозилирования специфичны в отношении остатков гидроксилизина в но- восинтезированном коллагене, еще не пре- терпевшем спирализации. Число угле- водных единиц в тропоколлагене зависит от вида ткани. Так, например, в коллагене сухо- жилий (тип I) это число равно 6, а в колла- гене капсулы хрусталика (тип IV)-ПО. 9.5. Структура тропоколлагена - это тройной спирально скрученный тяж Обратимся к конформации основной струк- турной единицы коллагенового волокна ти- па I. Как показали электронно-микроскопи- ческие и гидродинамические исследования, тропоколлаген имеет форму стержня дли- ной 3000 А и диаметром 15 А. Это один из самых длинных среди известных белков. Для сравнения укажем, что по длине тропо- коллаген в 60 раз больше диаметра химо- трипсина, а по диаметру - в 2 с лишним раза меньше. Каждая из трех полипептидных це- пей имеет форму спирали (рис. 9.5). Кроме того, эти три спирализованные цепи закру- чиваются относительно друг друга, образуя тугую нить. И действительно, коллагеновое волокно обладает удивительной про- чностью: для разрыва волокна диаметром 1 мм нужна сила в 10 кг. Характер спирализации каждой из цепей в трехцепочечной нити коллагена хорошо Рис. 9.6. Модель спирали поли-Ь-про- лина (шрпнс-спираль типа II). Часть 1 182 Конформация и динамика Такая же спираль составляет основу пространственной структуры каждой из трех це- пей тропоколлагена.
Pro Gly Pro Gly Pro Pro Рис. 9.7. Конформация отдельной цепи в тройной спирали коллагена. Изображен участок цепи с по- следовательностью -Gly-Pro- Pro-Gly-Pro-Pro. виден на примере модельного соединения поли-ь-пролина. Этот синтетический поли- пептид имеет спиральную форму (рис. 9.6), совершенно отличную от ос-снирали. В нем отсутствуют водородные связи. Вместо них стабилизацию спирали обеспечивают силы стерического отталкивания пирролидоновых колец в остатках пролина. При спирализа- ции полипептидной цени пирролидоновые кольца располагаются как можно дальше друг от друга, образуя так называемую транс-спираль типа И, структура которой оказывается гораздо более развернутой по сравнению с туго закрученной ос-спиралью. Расстояние между двумя аминокислотными остатками но оси спирали ноли-ь-пролина составляет 3,12 А, тогда как в ot-спирали оно равно 1,5 А. На поворот спирали в поли-L- пролине приходится три аминокислотных остатка. Рассмотрим теперь конформацию от- дельной цепи в трехцепочечной спирали коллагена (рис. 9.7). Каждая, цепь спирали- зована аналогично поли-ь-пролину. Далее три спирализованные цепи закручиваются одна вокруг другой, образуя суперспираль (рис. 9.8). Расстояние между двумя амино- кислотными остатками по оси спирали со- Рис. 9.8. Скелетная модель тройной спирали коллагена. Показана повторяющаяся последова- тельность -Gly-Pro-Pro. 9. Белки соединительной ткани 183
ставляет 2,9 А, а на один виток спирали при- ходится почти 3,3 остатка. Три цепи связаны между собой водородными связями. Донора- ми водорода служат пептидные NH-группы остатков глицина, а акцепторами-пеп- тидные СО-группы аминокислотных остат- ков на других цепях. Водородные связи на- правлены поперечно к длинной оси тропо- коллагенового тяжа. В образовании водо- родных связей, стабилизирующих тройную спираль, участвуют также гидроксильные группы остатков гидроксипролина и моле- кулы воды. Пространственная модель трой- ной спирали коллагена показана на рис. 9.9. 9.6. Малые размеры глицина делают его не- заменимым компонентом структуры Теперь мы можем поставить вопрос: поче- му каждое третье положение в аминокис- Рис. 9.9. Пространственная модель тройной спирали коллагена. (Печатается с любезного раз- решения д-ра A. Rich.) Часть I 184 Конформация и динамика лотной последовательности тропоколлаге- на занято глицином? Во внутреннем про- странстве тройного спирального волокна очень тесно (рис. 9.10). По существу, кроме глицина ни один аминокислотный остаток не мог бы уместиться внутри тройной спи- рали. Поскольку на один оборот спирали приходится три аминокислотных остатка, соответственно каждый третий остаток в ка- ждой из цепей неизбежно глицин. Два остат- ка по обе стороны от глицина оказываются с наружной стороны тройной спирали, где легко размещаются громоздкие кольца остатков пролина и гидроксипролина. Казалось бы, из всех аминокислот гли- цин-наименее важная, так как его боковая цепь-это всего лишь один атом водорода. Однако в организации белковой структуры такая простота может оказаться достоин- ством. Глицин играет очень важную роль именно потому, что он мал и, занимая очень мало места, не препятствует соединению по- липептидных цепей друг с другом. Мы уже сталкивались с этим, рассматривая миогло- бин и гемоглобин, где глицин инвариантно стоит в положении В6, способствуя сближе- нию спиралей В и Е. В химотрипсине в поло- сти» где происходит связывание субстрата, может уместиться большая ароматическая группа только потому, что два остатка, вы- стилающие полость,-это остатки глицина. В эволюции переносчика электронов цито- хрома с самым консервативным аминокис- лотным остатком оказался глицин. В кол- лагене мы вновь сталкиваемся с тем, что глицин играет особо важную роль, расширяя диапазон возможных конформаций при скру- чивании полипептидной цепи. 9.7. Стабильность спирали коллагена зави- сит от кооперативных взаимодействий Если раствор тропоколлагена нагреть, то при характеристической температуре проис- ходит изменение его физических свойств (рис. 9.11). Так, резко падает вязкость рас- твора, что указывает на потерю волокни- стой структуры. Судя по изменению оптиче- ского вращения, исчезает спиральность структуры отдельных щепей. Отсюда сле- дует, что тепловое движение преодолевает те силы, которые стабилизируют тройную спираль, и в результате возникает разорван- ная структура - желатин, имеющий конфи- гурацию статистического клубка. Этот структурный переход возникает дискретно, при определенной температуре, аналогично тому, как происходит плавление кристалла.
Рис. 9.10. Поперечный срез через модель коллагена. Каждая цепь соеди- нена водородной связью с дву- мя другими цепями (точки оз- начают водородную связь), а- Углеродный атом остатка гли- цина в каждой цепи обозначен буквой G. Каждым третьим остатком в последовательно- стях аминокислот должен быть глицин, так как вблизи оси (центра) спирали не остает- ся места для более крупного остатка. Обратите внимание, что пирролидоновые кольца расположены снаружи. Раз- личные цепи тройной спирали показаны разным цветом. Таблица 9.2. Зависимость термостабильности коллаге- на от содержания иминокислот Источник Количество пролина + гидрокси- пролина (в расчете на 1000 остат- ков) Термоста- бильность Темпе- рату- ра те- ла, °C Т ок Т 'пл Кожа теленка 232 65 39 37 Кожа акулы 191 53 29 24-28 Кожа трески 155 40 16 10-14 ние связи. Примером такой кооперативной структуры может служить застежка-молния. В последующих главах мы рассмотрим ряд других высококооперативных макромоле- кулярных структур: ДНК, вирусы, кле- точные мембраны. Температура, при которой спирализован- ность структуры утрачивается наполовину, называется температурой плавления (ТП1). ТШ1 тропоколлагена служит критерием ста- бильности его тройной спирали. Для ин- тактных коллагеновых фибрилл сопоста- вимым показателем является температура сжатия Тсж. Коллагены различных видов организмов различаются по температуре плавления. Оказалось, что Тпл и Тсж колла- генов связаны с температурой тела живот- ного (табл, 9.2). Самой низкой Тпл характе- ризуются коллагены корюшки, тогда как у теплокровных Т11Л достигает наиболее вы- соких значений. Различия в термостабиль- ности коррелируют с содержанием имино- кислот (пролина и гидроксипролина) в коллагене. Чем выше содержание имино- 11 ерешедший в биохимию термин «плавле- ние» стал применяться в случаях, когда по- теря высокоорганизованной структуры про- исходит в узких температурных пределах. Спираль тропоколлагена характеризуется высокой степенью упорядоченности по дли- не. Дискретность структурного перехода при повышении температуры указывает на то, что стабилизация тройной спирали обус- ловлена кооперативными взаимодействия- ми. Другими словами, спирализация обус- ловлена образованием множества усили- вающих друг друга связей, каждая из которых сама по себе относительно слаба. Образование каждой из этих стабилизирую- щих связей в большой степени зависит от того, образуются ли одновременно и сосед- Рис. 9,11. Кривая плавления молекулы коллагена. 9. Белки соединительной ткани 185
кислот, тем стабильнее коллагеновая спи- раль. Содержание иминокислот в коллагене увеличивалось в процессе эволюции от хо- лоднокровных к теплокровным. Итак, стабильность спирали отдельной цепи тропоколлагена зависит от пролипа и гидроксипролина, действующих в качестве замков. Далее тройная спираль стабилизи- руется поперечными водородными связями и вандерваальсовыми взаимодействиями между остатками на разных цепях. Наличие глицина в каждом третьем положении по- следовательности аминокислот служит сте- рическим разрешением для существования суперспирали. Определение температуры плавления хи- мически синтезированных полипептидных моделей коллагена пролило свет на биоло- гическое значение процесса гидроксилиро- вания пролина. Так, обнаружилось, что Тия poly(Pro-Pro-Gly) составляет 24°С, тоща как poly(Pro-Hyp-Gly) равна 58°С; отсюда следует, что гидроксилирование значительно увеличивает стабильность тройной спирали. Этот вывод подтверждается результатами изучения негидроксилированного коллаге- на, полученного путем инкубации клеток су- хожилия с аа'-бипиридилом- соединением, образующим хелатное соединение с желе- зом и потому ингибирующим пролилги- дроксилазу. Синтезированный этими клет- ками негидроксилированный коллаген не образует тройной спирали при 37°С, но бы- стро спирализуется при температуре ниже 24иС. 9.8. Нарушение гидроксилирования - один из биохимических дефектов при цинге Значение гидроксилирования коллагена со всей очевидностью выступает при цинге. Жак Картье (J. Cartier) в 1536 г. очень живо описал эту болезнь, поразившую его спут- ников во время путешествия по реке Св. Лаврентия: «Одни лишились всех своих сил и не мо- гли стоять на ногах... У других к тому же появились на коже багровые пятна крови, которые постепенно покрывали голени, колени, бедра, ягодицы, плечи, руки, шею. Изо рта стал идти зловонный запах, десны так загнили, что отпало все мясо до корней зубов, а сами зубы почти все выпали». Часть I 186 Конформация и динамика Способы предупреждения цинги были в сжатой форме сформулированы англий- ским врачом Джеймсом Линдом (J. Lind), который писал в 1753 г.: «Не раз уже убеждались в том, что зелень, свежие овощи и спелые фрукты-не толь- ко лучшее лекарство, но и самое действен- ное средство для предупреждения этой болезни». Линд настаивал, чтобы в рацион моряков входил лимонный сок. Британское Адми- ралтейство прислушалось к его совету при- мерно через 40 лет. Цинга обусловлена недостаточностью аскорбиновой кислоты (витамина С) в пище. Приматы и морские свинки утратили спо- собность синтезировать аскорбиновую кис- лоту и поэтому должны получать ее с пищей. Являясь сильным восстанови- тельным агентом, аскорбиновая кислота (рис. 9.12) предохраняет от инактивации пролилгидроксилазу, видимо, поддерживая восстановленное состояние атома железа ОН Аскорбиновая кислота Аскорбат-ион Дагидроаскорбиновая кислота Рис. 9.12. Формулы аскорбиновой кис- лоты (витамина С) и ее ионизи- рованной формы - аскорбат- иона. рКа кислотных гидро- ксильных групп аскорбиновой кислоты равно 4,2. Дегидро- аскорбиновая кислота являет- ся окисленной формой аскор- бат-иона.
дисульфидными Проколлаген мостиками) Рис. 9.13. Схематическое изображение превращения проколлагена в коллаген путем отщепления N-концевого пептида (около 15 кДа) и С-концевого пепти- да (около 30 кДа) от каждой из трех цепей. В проколлагене С- концевые пептиды трех цепей связаны между собой дисуль- фидными мостиками. в ферменте. Коллаген, синтезируемый в от- сутствие аскорбиновой кислоты, оказывает- ся недогидроксилированным и, следова- тельно, имеет пониженную температуру плавления. Такой коллаген не может обра- зовать нормальные по структуре волокна, что и приводит к поражению кожи и ломко- сти сосудов, столь четко выраженных при цинге. 9.9. Проколлаген предшественник коллаге- на при его биосинтезе Тройная спираль коллагена типа I in vivo формируется очень быстро. Однако in vitro процесс образования тройной спирали из растворенных цепей al (I) и а2 длится днями и к тому же имеет низкий выход. Чем же объясняется это различие в сборке тропо- коллагеновой спирали in vivo и in vitro? Вспомним для сравнения, как восстанавли- вается структура денатурированного химо- трипсиногена и химотрипсина: денатуриро- ванный профермент спонтанно принимает правильную трехмерную конфигурацию, тогда как фермент к этому не способен. Де- ло в том, что в химотрипсине отсутствует часть структуры, необходимой для возник- новения правильной трехмерной конфигу- рации, а именно два дипептида, которые от- щепляются в процессе активации. По аналогии можно предположить, что неспособность очищенных цепей al (I) и а2 к спонтанному образованию правильной тропоколлагеновой структуры обусловлена отсутствием каких-то элементов, несущих необходимую информацию. Так оно и есть на самом деле. Составляющие коллаген цепи синтезируются в виде предшественников большей массы. Предшественник al (1)-цепи, называемый npo-v.1 (I), имеет массу 140 к Да (тогда как масса al (1)-цепи- 95 кДа). Допол- нительные пептиды локализуются как на N-, так и на С-конце нро-al (1)-цепи (рис. 9,13). Подобным же образом предшественником а2-цепи служит про-а2 с массой 140 к Да. По аминокислотному составу дополнительные пептидные участки в про-al (I) и про-а2 со- вершенно не похожи на основную часть це- пи. В них мало глицина, пролина и гидрок- сипролина. N-концевые пептиды в npo-al (1) и про-а2 содержат внутрицепочечные ди- сульфидные связи. Более того, С-концевые пептиды этих цепей-предшественников свя- заны межцепочечными дисульфидными свя- зями, отсутствующими в коллагене. 9. Белки соединительной ткани 187
Расстояние от старта Рис. 9.14. Электрофоретическое разделе- ние экстракта кожи в поли- акриламидном геле. В кислых экстрактах кожи больных с синдромом Элерса-Данлоса типа VII (Л) присутствует зна- чительное количество прокол- лагена (про-al и про-а2). В норме (Б) проколлаген от- сутствует. [Lichtenstein J. R., Martin G. R., Kohn L. D., Byers P.H., McKusick V.A., Science, 182, 299 (1973).] 9.10. Дополнительные пептиды цепей-пред- шественников отщепляются ферментативно Цепи про-al (I) и про-а2 синтезируются фи- бробластами и секретируются в межклеточ- ное пространство соединительной ткани. Здесь дополнительные пептиды, стоящие на N- и С-концах этих цепей-предшественни- ков, отщепляются специфическими протео- литическими ферментами - проколлаген-пеп- тидазами. Нарушение превращения цепей-предше- Часть I 188 Конформация и динамика ственников в al - и а2-цепи приводит к гене- рализованному повреждению соединитель- ной ткани. Так, например, больные с синдромом Элерса -Данлоса отличаются малым ростом, повышенной растяжи- мостью кожи и избыточной гибкостью су- ставов. При одной из форм этого заболева- ния в экстрактах кожи и сухожилий больных обнаруживается значительное количество проколлагенов (рис. 9.14). Одновременно в фибробластах выявляется снижение про- коллаген-пептидазной активности. Извест- но также наследственное (наследуемое по рецессивному типу) заболевание крупного рогатого скота - дерматоспараксис, которое обусловлено отсутствием проколлаген-пеп- тидазы. Кожа животных в этом случае ста- новится крайне хрупкой, так как нити колла- гена находятся в ней в виде дезорганизо- ванных пучков. При этом значительная часть имеющегося зрелого коллагена типа I содержит al (I)- и а2-цепи с сохранивши- мися N-концевыми пептидами проколлаге- на. Вес изложенное показывает, что отще- пление N-концевых пептидов необходимо для формирования упорядоченных коллаге- новых фибрилл. 9,11. Коллагеновое волокно состоит из сту- пенчато расположенных молекул тропокол- лагена Образование коллагенового волокна проис- ходит во внеклеточном пространстве в ре- зультате спонтанного, специфического со- единения между собой тропоколлагеновых фибрилл. Структура коллагенового волокна была изучена методами рентгеноструктур- ного анализа и электронной микроскопии. Коллагеновое волокно имеет поперечную исчерченность с интервалом 680 А (см. рис. 9.1). В то же время длина молекулы тропоколлагена составляет 3000 А. Таким образом, период структуры волокна в не- сколько раз меньше, чем длина составляю- щих волокно молекул; это показывает, что ряды молекул тропоколлагена не могут ле- жать точно друг над другом. И в самом де- ле, один ряд тропоколлагенов смещен по от- ношению к соседнему ряду примерно на 1 /4 длины молекулы. Отсюда следует, что осно- ву структурной организации коллагенового волокна составляют сдвинутые на четверть ступенчато расположенные параллельные ряды тропоколлагеновых молекул (рис. 9.15). Такая «аранжировка» напоминает музы- кальную фугу (рис. 9.16). Любопытная структурная особенность
Молекула тропоколлагена Промежуток между молекулами тропоколлагена Рис. 9.15. Схематическое изображение структурной организации кол- лагенового волокна. Молеку- лы тропоколлагена (показаны синими стрелками) располо- жены рядами, последователь- но смещенными на 1/4 одна по отношению к другой. Проме- жутки в рядах между молеку- лами тропоколлагена (пока- заны красными квадратами) могут служить центрами каль- цификации при формировании кости. волокна состоит в том, что расположенные в ряд молекулы тропоколлагена не связаны «конец в конец». Между концом одной мо- лекулы и началом следующей имеется про- межуток около 400 А (рис. 9.15).. Этот про- межуток играет особую роль при формиро- вании кости. Кость состоит из органической фазы, почти целиком представленной кол- лагеном, и неорганической , а именно фос- фата кальция. Последний по своему строе- нию близок к гидроксиапатиту с составом Са10 (РО4)6 (ОН)2, Коллаген необходим для образования кости как место отложения кристаллов фосфата кальция. Оказалось, что первые кристаллы откладываются с ин- тервалом порядка 680 А, что совпадает с пе- риодом коллагенового волокна. Вполне ве- роятно, что промежутки вдоль ряда моле- кул тропоколлагена ^выполняют роль цен- тров отложения минеральных составных частей кости. 9.12. Образование коллагенового волокна ре- гулируется проколлаген-пептидазами Молекулы проколлагена в отличие от тро- поколлагена не способны к спонтанному образованию волокна: для этого необходи- мо предварительное отщепление N- и С- концевых пептидов. Таким образом, форми- рование коллагеновых волокон аналогично формированию нитей фибрина. Проколлаген аналогичен фибриногену, тропоколлаген - мономерам фибрина, а проколлаген-пепти- дазы - тромбину. В обеих системах усло- вием образования волокна является специ- фическое протеолитическое расщепление. Фибробласты секретируют проколлаген, но не тропоколлаген (рис. 9.17). Механизмы биосинтеза и секреции аналогичны тем, ко- торые действуют в случае проферментов поджелудочной железы (разд. 8.1) и других секреторных белков (разд. 29.29). Коллаге- новое волокно формируется во внеклеточ- ной жидкости вблизи поверхности фибро- бласта, но не внутри него, поскольку проколлаген-пептидазы находятся вне клет- ки. Концевые пептиды в цепях-предшествен- никах препятствуют несвоевременному формированию волокна. Возможно также, что они участвуют в переносе проколлагена через мембрану фибробласта. На более ран- нем внутриклеточном этапе эти дополни- Рис. 9.16. Пассаж из фуги D-мажор, «Хо- рошо темперированный кла- вир» И. С. Баха. (Erickson R., The structure of music: a listener’s guide, Noonday Press, 1955, p. 130.) 9. Белки соединительной ткани 189
Фибробласт Рис. 9.17. Этапы формирования зрелого коллагенового волокна. тельные пептиды способе 1вуют взаимной ориентации и соединению трех цепей для последующего образования тройной спира- ли. Особое значение при этом имеют межце- почечныс дисульфидные связи. 9,13, Поперечные связи повышают прочность коллагенового волокна Коллаген, подобно фибрину, стабилизиро- ван ковалентными поперечными связями. Коллагеновым волокнам свойственно два типа поперечных связей: внутримолеку- лярные (в пределах одной тропоколлагено- вой единицы) и межмолекулярные (между отдельными тропоколлагеновыми единица- ми). Рассматриваемые связи встречаются только в двух близких белках - коллагене и эластине. В образовании внутримолекулярных попе- речных связей в коллагене участвуют бо- ковые цепи лизина. На первом этапе проис- ходит превращение £-аминоконца лизина в альдегид под действием фермента лизи- локсидазы. Далее два альдегида вступают в реакцию альдольной конденсации (рис. 9.18). При этой реакции енолат-ион, образовавшийся из одного альдегида, при- соединяется к карбонильной группе другого альдегида. Интересна локализация этой внутримолекулярной поперечной связи. В последовательности аминокислот амино- концевого участка al (1)-цепи коллагена гли- цин становится каждым третьим остатком, лишь начиная с положения 13. Следователь- Часть I 190 Конформация и динамика но, лизин-5 находится в неспирализованной области полипептидной цепи, вблизи начала тройной спирали. Гибкость этого неспира- лизованного фрагмента способствует фор- мированию рассматриваемой поперечной связи. Альдольная поперечная связь может пре- вращаться - в результате взаимодействия с боковой цепью 1истидина в гистидин- альдольную поперечную связь (рис, 9.19). Альдегидная группа этого альдоль-гистиди- нового комплекса способна давать шиффо- во основание с друюй боковой цепью, та- кой, как боковая цепь гидроксилизина. В итоге возможно ковалентное связывание четырех боковых цепей дру! с друт ом, при- чем некоторые из этих цепей могут принад- лежать разным молекулам тропоколлагена (рис. 9.20). Количество и тип поперечных связей в коллагене зависят от функции и возраста ткани. Так, коллаген ахиллесова сухожилия крысы характеризуется большим количе- ством поперечных связей, а в коллагене бо- лее эластичного сухожилия хвоста их гораз- до меньше. Значение поперечных связей, придающих волокнам коллагена высокую степень упругости, ясно выступает при ла- тиризме -заболевании животных, вызван- ном поеданием семян сладкого горошка Lathyris odoratus. Токсическим агентом в этом случае является $-аминопропиони- трил, подавляющий превращение боковой N=C—СН2СН2—NH3+ p-Аминопропионитрил цепи лизина в альдегид. Под действием это- го токсина коллаген заболевших животных теряет механическую прочность.
9.14. Коллагеназы - ферменты, специфически расщепляющие коллаген Коллагеназа - это фермент, расщепляющий пептидные связи в определенных участках спирализованных областей коллагена. В от- ношении других ферментов коллаген про- являет очень высокую степень устойчиво- сти. Известны два типа коллагеназ. 1, Один тип коллагеназ синтезируется не- которыми микроорганизмами. Так, Clostrid- ium histolyticum (бактерия, вызывающая га- зовую гангрену) выделяет коллагеназу, рас- щепляющую полипептидную цепь коллаге- на более чем в 200 участках. Фермент гидролизует следующую связь: —X— Gly— Pro—Y— Эта коллагеназа, разрушающая соедини- тельнотканные барьеры организма-хозяина, способствует проникновению (инвазии) вы- сокопатогенного клостридия в организм. Сама бактерия не содержит коллагена и по- тому не подвержена действию коллагеназы. 2. Второй тип-это тканевые коллагеназы, которые обнаруживаются у земноводных и млекопитающих в растущих или подвер- гающихся метаморфозу тканях. Впервые коллагенолитическая активность была выя- влена в хвостовом плавнике головастиков в период метаморфоза (рис. 9.21), когда в течение нескольких дней происходит ре- зорбция больших количеств коллагена в ткани. Для определения коллагенолити- ческой активности маленькие кусочки под- вергающегося метаморфозу хвостового плавника культивировали на слое коллаге- новых волокон. Спустя несколько часов на этом непрозрачном слое появились совер- шенно прозрачные зоны, что указывало на высокую активность коллагеназы (рис. 9.22). Коллагенолитическая активность вы- является также в таких тканях мле- копитающих, которые претерпевают бы- струю реорганизацию, например в матке после родов. Совершенно ясно, что время I Н—N Н—С—(СН2)2— сн2—СН2— NH3+ +H3N—сн2—СН2— О=С I Остатки лизина Ч / \ гн Н—С—(СН2)2— сн2—с, ^-СН-(СН2)2-С-Н о=с н н с=о Альдегидные производные ' I I Н—N N—Н I Н I Н-С- -(СН2)2- СН2-С=р~(Сг- —с—н 0=С £ '=0 I (Ун1 Альдольная поперечная связь (сшивка) Рис. 9.18. Образование альдольной по- перечной сшивки из двух бо- ковых цепей лизина. 9. Белки соединительной ткани 191
•? ? — N—С— С— Н С----N HN I Н—С—(СН2)2 о—с нсх СН ? н -СН2~С-С~(СН н I <Ан Гистидин-альдольная поперечная связь Рис. 9.19. Боковая цепь гистидина может присоединяться по месту двой- ной связи С=С в альдольной сшивке, при этом образуется гистидин-альдольная попереч- ная сшивка. и сила действия тканевых коллагеназ дол- жны находиться под строгим контролем. Коллагеназа головастика обладает уди- вительной спицифичностью. Этот фермент расщепляет тропоколлаген, как бы делая срез через все три цепи в единственном ме- сте-вблизи от аминокислотного остатка 750 в последовательности из 1000 остатков. Два фрагмента, составляющие соответ- ственно 1/4 и 3/4 исходной цепи, при темпе- ратуре тела спонтанно развертываются и становятся доступными действию других протеолитических ферментов. 9Л 5. Эластин - каучукоподобный белок эла- стических волокон Эластин обнаруживается в большинстве ти- пов соединительной ткани наряду с коллаге- ном и полисахаридами. Это основной ком- понент эластических волокон, обладающий способностью растягиваться в несколько раз в длину, а при снятии нагрузки быстро вос- станавливать исходную форму и размер. Эластин находится в большом количестве в стенках кровеносных сосудов, особенно в дуге аорты, расположенной около сердца, и в связках. Очень богаты эластином эла- стические шейные связки травоядных жи- вотных. В коже, сухожилиях и рыхлой со- единительной ткани эластина относительно мало. Часть I 192 Конформация и динамика Очень своеобразен аминокислотный со- став этого белка. Как и в коллагене, одна треть аминокислотных остатков предста- влена глицином. Эластин богат также про- лином. Однако в отличие от коллагена в эластине очень мало гидроксипролина, нет гидроксилизина и мало полярных амино- кислот; эластин богат неполярными алифа- тическими аминокислотами-аланином, ва- лином, лейцином и изолейцином. В зрелом эластине много поперечных свя- зей. По этой причине он практически нера- створим; это затрудняет его изучение. Од- нако из тканей свиней, страдающих дефици- том меди, удалось выделить растворимый предшественник эластина, называемый про- эластином. При дефиците меди блокируется образование альдегидов, необходимых для образования поперечных связей в эластине (как и в коллагене). Изучение аминокислот- ного состава проэластина, имеющего массу 125 к Да, еще не закончено, однако уже полу- чены некоторые интересные результаты. Так, установлено существование нескольких областей белка, обогащенных остатками лизина и аланина. Часто встречаются такие последовательности: -Lys-Ala-Ala-Lys- и -Lys-Ala-Ala-Ala-Lys- Именно в этих участках образуются попе- речные связи. Обнаруженные в коллагене альдольные поперечные связи (рис. 9.18) имеются и в эластине. В обоих белках встре- Рис. 9.20. Внутри- и межмолекулярные поперечные связи в коллагене. [Tanzer M.L., Science, 180, 562 (1973).]
чается еще один тип структуры, создающей поперечную сшивку, а именно лизинонорлей- цин (рис. 9.23), в образовании которого уча- ствуют остатки лизина. Только в эластине обнаружен десмозин, образованный из бо- ковых цепей четырех остатков лизина (рис. 9.24). Значение поперечных связей в эластине состоит, по-видимому, в том, что они обеспечивают способность эласти- новых волокон после растяжения восстана- вливать исходную форму и размер. Участки эластина, расположенные между поперечными связями, богаты глицином, пролином и валином. Последовательности аминокислот в этих участках обладают в ря- де случаев периодичностью (рис. 9.25). Конформация обладающих периодич- ностью областей, а также связь между пе- риодичностью и эластическими свойствами еще не исследованы. В то же время, учиты- вая роль эластина в артериальной динами- ке, представляется важным знать молеку- лярные основы функции данного белка. Это помогло бы понять сущность ряда сердеч- но-сосудистых заболеваний. 9.16. Протеогликаны образуют основное ве- щество соединительной ткани Соединительная ткань богата также протео- гликанами, которые состоят из полисаха- ридных (около 95%) и белковых (около 5%) единиц. Эти полианионы, имеющие очень большие размеры, связывают воду и ка- тионы, образуя основное вещество соедини- тельной ткани, Протеогликаны определяют вязкоэластические свойства суставов и дру- гих анатомических структур, подвергаю- щихся механической деформации. Полиса- харидные цепи протеогликанов, назьь Рис. 9.22. Кусочки хвостового плавника головастика помещены на ре- конструированный коллаге- новый гель (наверху). После 24 ч инкубации при 37°С во- круг каждого кусочка по- является прозрачная зона-ре- зультат активности коллаге- назы (внизу). (Lapiere С. М., Gross J. In: Mechanisms of Hard Tissue Destruction, R. F. Sognnaes, ed„ p. 681, Copyright 1963.) Рис. 9.21. При метаморфозе головастика из хвостового плавника бы- стро исчезает коллаген. (Lapiere С, М., Gross J. In: Mechanisms of Hard Tissue Destruction, R.F. Sognnaes, ed., p. 665, Copyright 1963.) ваемые гликозаминогликанами, построены из повторяющихся дисахаридных единиц, со- держащих производное аминосахара - глю- козамина или галактозамина. По крайней мере один из сахаров в дисахариде имеет отрицательно заряженную карбоксильную или сульфатную группу. Важнейшие глико- заминогликаны-это гиалуронат, хондрои- тинсульфат, кератансульфат, гепарансуль- фат и гепарин (рис. 9.26). Гепарансульфат подобен гепарину, за исключением того, что в нем меньше N- и О-сульфатных групп и больше N-ацетильных групп. 9. Белки соединительной ткани 193 13-665
I H—N I H—C—(CH2)2—CH2—ch2-nh/ o=c I Остаток лизина . N—H I c—CH2—(CH2)2—с—H C=O I Альдегидное производное лизина H-C~(CH2)2 о—с —СН2—СН2— N=C—СН2—(СН2)2—с— н Шиффово основание Н—N I Н—С—(СН2)3 о=с I Н Н I —CH—N — с—сн2—(СН2)2—с— Н Лизилнорлейцин Рис. 9.23. Образование поперечной сшивки в виде лизилнорлейци- на в коллагене и эластине. Н Н О I I II —N—С— С— | (СН2)2 । Н—N lu N—Н I I Н—(j!—СН2—СН2^^' ^сн2—сн2—с—н °4 "С ] 4° I СН2 I (СН2)3 В протеогликанах хряща (рис. 9.27) кера- тансульфат и хондроитинсульфат присоеди- нены ковалентными связями к полипептид- ной цепи, называемой в данном случае сердцевинным белком (или соге-белком). Примерно 140 образованных таким путем субъединиц в свою очередь присоединены с интервалом 300 А нековалентными связя- ми к длинной нити гиалуроновой кислоты. В формировании этого комплекса участвует небольшой связывающий белок. Масса пол- ного комплекса составляет примерно 105 кДа и длину в несколько микрон. Протео- гликаны других тканей могут иметь иную структуру. Это наводит на мысль, что рас- Десмозин Рис. 9.24. Десмозин (поперечная сшивка в эластине) образуется из четы- рех боковых цепей остатков лизинов. -Pro-Gly-Val-GIv-Val-Pro-Gly-VahGly-Val’ -Р ro-G I v - Va l-G h-VabPro-G!v-Val-Ser-Val- -Pro-^.y-Vah3.v-VahPro-^v-Val- ' ' -Val- Рис. 9.25. Часть последовательности аминокислот растворимого предшественника эластина. Ясно виден повторяющийся характер последовательности. Часть I 194 Конформация и динамика
Гепарин Рис. 9.26. Структурные формулы повто- ряющихся дисахаридных еди- ниц в раде основных гликоза- миногликанов. Отрицательно заряженные группы показаны красным, сматриваемый класс очень больших по раз- мерам биомолекул выполняет несколько, пока еще неизвестных функций* Заключение Коллаген представляет собой группу род- ственных белков, обладающих очень высо- кой прочностью, Коллаген является основ- ной волокнистой структурой кожи, костей, сухожилий, хряща, кровеносных сосудов и зубов. Известны четыре типа коллагена, различающиеся распределением в тканях. Основной структурной единицей коллагена является тропоколлаген, состоящий из трех цепей, каждая из которых включает 1000 аминокислотных остатков. Коллаген не- обычайно богат глицином и пролином. Кроме того, в коллагене содержатся гидрок- сипролин и гидроксилизин, редко встречаю- щиеся в других белках. Последовательность аминокислот в коллагене характеризуется той особенностью, что почти каждый тре- тий остаток в ней-глицин. Тропоколлаген представляет собой тройной спирально скрученный тяж длиной 3000 А и диаметром 15 А. Спираль каждой из цепей тропоколла- гена по структуре не похожа на а-спираль. Между NH-группами глицина в одной цепи тропоколлагена и СО-группами в двух дру- гих цепях образуются водородные связи. Кроме того, стабильность коллагеновой спирали зависит от замыкающего эффекта остатков пролина и гидроксипролина, а так- же от водородных связей, образуемых ги- дроксильными группами гидроксипролина. Внутренняя часть тройной спирали зани- мает крайне ограниченное пространство, что обусловливает включение глицина как наименьшей по размеру аминокислоты в ка- ждое третье положение в последователь- ность аминокислотных остатков в тропо- коллагене. В биосинтезе коллагена важную роль играет протеолитическая активация. Три це- пи тропоколлагена типа I синтезируются в виде предшественников большего молеку- лярного веса-npo-otl (I) и про-а2. В этих проколлагеновых цепях некоторые остатки пролина превращаются в остатки гидрокси- пролина под действием пролилгидрокси- лазы. Активность этого фермента про- является при наличии О2, Fe2+ и ос-оксоглу- 9. Белки соединительной ткани 195 13*
Рис. 9.27. А - электронная микрофото- графия протеогликанового аг- регата из хряща эпифиза эм- бриона коровы. Мономеры протеогликанов располагают- ся с регулярными интервалами по двум сторонам удлиненной центральной нити гиалурона- та. (Печатается с любезного разрешения д-ра J. Buckwaiter и д-ра L. Rosenberg.) Б-схема- тическое изображение. (Ros- enberg L. In: Dynamics of Con- nective Tissue Macromolecules, M. Burleigh, R. Poole, eds., North-Holland, 1975, p. 105.) Заказ 665. стр. 33-38. Голдоб- ина С. тарата: в качестве восстанавливающего агента необходима также аскорбиновая кис- лота. Синтезированный в отсутствие аскор- биновой кислоты коллаген непрочен, так как он недостаточно гидроксилирован; та- кая ситуация характерна для цинги. Под действием другого фермента происходит гидроксилирование лизина. Далее к остат- кам гидроксилизина цепей-предшественни- ков присоединяются сахара. Процессы ги- дроксилирования и гликозилирования про- текают в фибробластах, после этого прокол- лагены секретируются во внеклеточную Часть I 196 Конформация и динамика Гиалуроновая кислот Связывающий белок Кератансул ьфат Хондроитинсульфат Сердцевинный белок среду. Здесь амино- и карбоксиконцевые области проколлагеновых цепей отще- пляются проколлаген-пептидазами, образуя тропоколлаген, который спонтанно ассо- циируется в фибриллы. Основой структуры коллагеновых волокон являются парал- лельные ряды молекул тропоколлагена, рас- положенные так, что один ряд сдвинут по отношению к другому на 1/4 длины моле- кулы. Последний этап созревания коллаге- нового волокна-формирование попе- речных связей, придающих дополнитель- ную прочность. Примером могут служить альдольные поперечные связи, возникаю- щие при конденсации альдегидов, образо- ванных путем окисления боковых цепей ря- да остатков лизина. Эластин - это нерастворимый, похожий на резину белок эластических волокон со- единительной ткани. Он способен к обрати- мому растяжению в длину в несколько раз. Такие виды соединительной ткани, как связ- ки и дуга аорты, особенно богаты эласти- ном. Как и в коллагене, в эластине содер- жится много пролина и глицина; в отличие от коллагена в эластине нет гидроксилизина и мало гидроксипролина. Аминокислотный состав эластина характеризуется выра- женным преобладанием неполярных амино- кислот. Последовательность аминокислот в эластине имеет определенную периодич- ность. Так, часто повторяется последова- тельность Pro-Gly-Val-Gly-Val. Эластин синтезируется в виде растворимого предше- ственника, который далее переходит в нера-
створимую форму в результате образова- ния различного рода поперечных сшивок. Одна из таких сшивок представляет собой десмозин-производное четырех остатков лизина. Как и в коллагене, формирование поперечных сшивок в эластине происходит с образованием альдегидов в качестве про- межуточных соединений. Второй основной макромолекулярный компонент соединительной ткани-протео- гликаны, состоит из полисахаридного и бел- кового компонентов. Полисахаридные цепи, называемые гликозаминогликанами, по- строены из повторяющихся дисахаридных единиц, несущих большой отрицательный заряд. Протеогликаны составляют основное вещество соединительной ткани и опреде- ляют ее вязкоэластические свойства. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА С чего начать EyreD.R., 1980. Collagen: molecular diversity in the body’s protein scaffold, Science, 207, 1315-1322. Bornstein P„ Traub W., 1979. The chemistry and biology of collagen. In: Neurath H. and HillR. L. (eds.), The Proteins (3rd ed.), vol. 4, pp. 411-632, Academic Press. Gross J., 1973. Collagen biology: struc- ture, degradation, and disease, Harvey Lectures, 68, 351-432. Ross R., Bornstein P., 1971. Elastic fibers in the body, Sci. Amer., 224 (6), 44-52. Монографии Ramachandran G. N„ Reddi A. H. (eds.), 1976. Biochemistry of Collagen, Plenum. Burleigh P. M, C., Poole A. R. (eds.), 1975. Dynamics of Connective Tissue Macromolecules, American Elsevier. Биосинтез коллагена Prockop D.J., Kivirikko K.L, Tuder- man L., Guzman N. A., 1979. The biosynthesis of collagen and its disorders. New Engl., J. Med., 301, 13-23 and 77-85. Fessler J, H., Fessler L. I., 1978. Biosynthesis of collagen, Ann. Rev. Biochem., 47, 129-162. Jackson D.S,, 1978. Biosynthesis of collagen. In: Amstein H.R.V. (ed.), Amino Acid and Protein Biosynthesis II, International Review of Biochemistry, vol. 18, pp. 233-259, University Park Press. Fessler L.I., Morris N.P., Fessler J.H., 1975. Procollagen: biological scission of amino and carboxyl extension peptides, Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 4905-4909. Bruns R.R., Hulmes D.J.S., Therrien S. F., Gross J., 1979. Procollagen segment- long-spacing crystallites: their role in collagen fibril logen esis, Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 313-317. Tanzer M.L., 1973. Cross-linking of collagen, Science, 180, 561-566. Гидроксилирование коллагена Cardinale G.J., Udenfriend S„ 1974. Prolyl hydroxylase, Advan. Enzymol., 41, 245-300. Hayaishi O. (ed.), 1974. Molecular Mechanisms of Oxygen Activation, Academic Press. Berg R. A., Prockop D. J., 1973. The thermal transition of a non-hydroxylated form of collagen: evidence for a role for hydroxy proline in stabilizing the triple-helix of collagen, Biochem. Biophys. Res. Comm., 52, 115-120. Коллагеназы Gross J., Nagai K, 1965. Specific degradation of the collagen molecule by tadpole collagenolytic enzyme, Proc. Nat. Acad. Sci., 54, 1197-1204. Seif ter S., Harper E., 1971. The collagenases. In: Boyer P.D. (ed.), The Enzymes (3rd ed.), vol. 3, pp. 649-697, Academic Press. Эластин Sandberg L. B., 1976. Elastin structure in health and disease, Int. Rev. Connect. Tissue Res., 7, 159-210. Urry D.W., 1974. On the molecular basis for vascular calcification, Perspect. Biol. Med., 18, 68-84. (Обсуждается связывание эластином ионов кальция.) Гликозаминоглнкяны Lindahl U., Hook М„ 1978. Glycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules, Ann. Rev. Biochem., 47, 385-417. Болезни соединительной ткани Pinnell S. R., 1978. Disorders of collagen. In: Stanbury J. B.. Wyngaarden J.B., Fredrickson D.S. (eds.), The Metabolic Basis of Inherited Disease (4th ed.), pp. 1366-1394, McGraw-Hill. Trelstad R.L, Rubin D., Gross J., 1977. Osteogenesis imperfecta congenita: evidence for a generalized molecular disorder of collagen, Lab. Invest., 36, 501-508. Krone S. M., Pinnell S.R., Erbe R.W., 1972. Lysyl-protocollagen hydroxylase deficiency in fibroblasts from siblings with hydroxylysine-deficient collagen, Proc. Nat. Acad. Sci., 69, 2899-2903. Lapiere C.M., Lenaers A., Kohn L.D., 1971. Procollagen peptidase: an enzyme excising the coordination peptides of procollagen, Proc. Nat. Acad. Sci., 68, 3054-3058. (Выявление молекулярного дефекта при дерма- тоспараксисе-наследственном забо- левании соединительной ткани круп- ного рогатого скота.) Major R.H. (ed.), 1945. Classic Descriptions of Disease (3rd ed.), Thomas. (Данное Картье описание цинги приводится на с. 587 этой книги.) Nishikimi М., Udenfriend S., 1977. Scurvy as Scurvy inborn error of ascorbic acid biosynthesis, Trends Biochem. Sci., 2, 111-112. 9. Белки соединительной ткани 197
Вопросы и задачи 1. Химически синтезированный полипептид поли-Ь-пролин спи- рализуется так же, как и каждая из цепей в тройной спирали коллагена. а) Поли-Ь-пролин не способен образовы- вать тройную спираль. Почему? б) Poly (Gly-Pro-Pro) образует такую же тройную спираль, как и коллаген. Предска- жите, какова будет термостабильность тройных спиралей: poly(Gly-Pro-Gly) по сравнению с poly (Gly-Pro-Pro). в) Может ли poly (Gly-Pro-Gly-Pro) образо- вать такую же тройную спираль, как колла- ген? 2. Дана аминокислотная после- довательность -Gly-Leu-Pro- Gly-Pro-Pro-Gly-Ala-Pro-Gly-. а) Какие из аминокислотных остатков мо- гут гидроксилироваться пролилгидроксила- зой по С-4? б) Какая из пептидных связей должна быть наиболее чувствительна к действию колла- геназы Clostridium histolyticum? 3. В данной главе обсуждалось не- сколько типов ковалентных перекрестных связей в белках. Имеются ли ковалентные связи в следующих белках? Ес- ли да, то какие это связи: а) рибонуклеаза; б) гемоглобин; в) фиб- рин; г) коллаген; д) эластин? 4. В отсутствие одного из субстра- тов - пептидилпролина - про- лилгидроксилаза способна декарбоксилиро- вать а-оксоглутарат. Для этой реакции требуются железо в восстановленной фор- ме, О2 и аскорбиновая кислота. На основе этого факта какой можно сделать вывод о ферментативном механизме реакции ги- дроксилировани