Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) - Остерман Л.А.

Автор: Остерман Л.А.

Теги: другие физико-химические методы анализа (кроме оптических) медицина химия биология биохимия практическое пособие издательство наука

Год: 1981

Похожие

Хроматография белков и нуклеиновых кислот

Аффинная хроматография. Методы

Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии

Газовая экстракция в Хромато- графическом анализе. Парофазный анализ и родстеенные методы

Текст

543.545.4:54^96
Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых
кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое
пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
В книге детально описана современная аппаратура, изложены
практические приемы постановки экспериментов, проанализирова-
но влияние на их результаты различных физико-химических пара-
метров. Рассмотрены все варианты и модификации описываемых
методов. Даны ссылки на оригинальные экспериментальные рабо-
ты, опубликованные в ведущих журналах мира по декабрь 1980 г.
Книга рассчитана на биохимиков, медиков, фармакологов, ра-
ботников пищевой промышленности.
Табл. 4, илл. 77, библиогр. 294 назв.
Ответственный редактор
член-корресцондент АН СССР
Г. П. ГЕОРГИЕВ
_ 21005—414
О ———— 684—82 Кн. 2.2001040000
055(02)—81
© Издательство «Наука», 1981 г.
Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ВВЕДЕНИЕ
Электрофорез занимает сейчас центральное место среди мето-
дов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной
научной литературе редко можно встретить статью, в которой
бы на той или иной стадии фракционирования или характери-
стики этих биополимеров не был использован электрофорез. Ме-
тод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по та-
ким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная
масса), пространственная конфигурация, вторичная структура
и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать
как порознь, так и в совокупности.
Физический принцип метода заключается в следующем. На-
ходящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают неко-
торым суммарным электрическим зарядом, величина и знак ко-
торого зависят от pH среды. Если через этот раствор, заключен-
ный в канал из изолирующего материала, например стеклянную
трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала
установится определенный градиент напряжения, т. е. сформи-
руется электрическое поле. Его напряженность измеряется раз-
ностью потенциалов по концам рабочего канала (или его уча-
стка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля мак-
ромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом миг-
рируют в направлении катода или анода, причем их трение об
окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависи-
мости от величины заряда и размеров молекулы приобретают
разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.
Постепенно исходный препарат, состоявший из различных моле-
кул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с
одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределя-
ются по длине канала (рис. 1, справа).
На рисунке, помимо рабочего канала (трубки), показаны не-
которые необходимые компоненты системы. Во-первых, это два
электрода, представленные спиральками из платиновой прово-
локи, а во-вторых, электродные резервуары. Через находящиеся
в них буферные растворы и рабочий канал замыкается электри-
ческая цепь между электродами,
Рабочий канал не случайно заштрихован. Дело не только в
том, что, будь он просто заполнен жидкостью, изображенная
8
схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего
резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность мож-
но обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную фор-
му. Такие приборы использовались на первых этапах развития
метода (электрофорез в свободной жидкости); Хуже другое: в
жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и
смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных при-
борах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изобра-
жено штриховкой. Достаточно чи-
стая и хорошо смачиваемая (гид-
рофильная) пространственная
сетка геля удерживает жидкость
от вытекания и препятствует кон-
векции. Вместе с тем используе-
мые гели содержат очень много
жидкости (80—99,5%), в которой
(т. е. в рабочем буфере) и мигри-
руют макромолекулы. Наличие
сетки геля вносит важную допол-
нительную деталь в картину элек-
трофоретической миграции. Те-
перь фракционируемые макромо-
лекулы любых размеров неизбеж-
Рис. 1. Схема простейшего прибо- но сталкиваются с нитями поли-
ра для электрофореза в геле мера, образующего сетку геля,
я-до начала фракционирования, б- ЧТО увеличивает ЭффвКТИВНОб
после pm окончания трение о среду, а следовательно,
снижает скорость движения мо-
лекул. Очевидно, что препятствия
для миграции становятся особен-
но серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек
геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом
случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность
различных макромолекул и степень разделения оказывает соот-
ношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация,
когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кис-
лот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их
миграция прекратится.
В настоящее время почти исключительно используются по-
лиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя кон-
центрацию полимера, можно получать гели с очень широким
диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электри-
ческие заряды макромолекул путем вариации pH буфера, а их
конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих аген-
тов или детергентов. Все это придает методу электрофореза ис-
ключительную гибкость.
Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макро-
молекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их
диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серь-
4
езно, что протекание через жидкость электрического тока неиз-
бежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные моле-
кулы белков и нуклеиновых кислот диффундируют не слишком
быстро. Однако проблема теплоотвода и, главное, его равномер-
ности по всему гелю очень важна еще и потому, что скорость
миграции макромолекул в электрическом поле зависит от тем-
пературы. Неравномерность нагревания геля неизбежно приве-
дет к искажению зон и ухудшению их разделения.
В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул ос-
таются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный
препарат добавляют краситель, молекулы которого несут элек-
трический заряд того же знака, что и фракционируемые макро-
молекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже пере-
двигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зо-
ны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции
наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем
у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца
трубки, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффу-
зии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стек-
лянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так,
что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том
самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофоре-
за. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окраши-
вание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно
связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек
красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндриче-
ского ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы раз-
делившихся компонентов исходной смеси белков.
Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких
пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами.
Такие пластины имеют важное преимущество: па них можно
одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно
их вносят с одного края геля па равных расстояниях друг от
друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле не-
зависимо от своих соседей, образуя свой набор зон. На фото-
графии такой пластины (рис. 3) хорошо видна серия параллель-
ных «треков», исчерченных поперечными полосами окрашенных
зон, в которых располагаются (в данном случае) олигонуклео-
тиды различной длины.
Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют ме-
тоды обнаружения разделенных зон по их радиоактивности.
К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке по-
средством авторадиографии или флюорографии и различные
способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных
сцинтилляционных счетчиков.
Преимущества пластин не ограничиваются экономией вре-
мени и места при обработке большого количества препаратов.
Важнее другое: поскольку гель заливают в форму для полиме-
5
Рис. 2. Трубки с ПААГ после окончания электрофореза
Горизонтальные полоски — окрашенные белковые зоны
Рис. 3. Пластина агарозного геля после разделения фрагментов ДНК
Окраска люминесцентным красителем (бромистым этидием)
ризации жидким, то его концентрация, состав буфера и содер-
жание добавок строго одинаковы по всему сечению геля. Следо-
вательно, плотность тока и напряженность электрического поля
также одинаковы. Это обеспечивает строго идентичные условия
фракционирования разных препаратов и дает возможность до-
стоверного сопоставления их состава путем сравнения положе^
ния полос в параллельных треках. Если добавить к этому зна-
чительно более выгодные условия теплоотвода от тонкой пла-
стинки геля по сравнению с цилиндром, то станет понятной ис-
ключительная популярность этой системы электрофореза в по-
следние годы.
Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются,
современные методы электрофореза. В качестве «носителей»
жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата цел-
люлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, цел-
люлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для
разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют
свои преимущества, однако для фракционирования белков, ну-
клеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время исполь-
зуют почти исключительно гель-электрофорез, поэтому только
он и будет подробно описан.
Рассмотрение начинается с характеристики исходных мате-
риалов и процессов их полимеризации. Затем, чтобы освобо-
дить дальнейшее изложение от повторений, будет описана тех-
ника приготовления гелей и соответствующая аппаратура. Гла-
в
ва 3 посвящена электрофорезу белков. После замечаний общего
характера будут подробно рассмотрены различные современные
приемы и варианты электрофореза. В отдельные разделы выне-
сены способы окрашивания, элюции из геля и регистрации ра-
диоактивности фракционированных белков, поскольку эти при-
емы в большинстве своем одинаковы для всех вариантов элек-
трофореза. Главу заключает описание способов препаративного
разделения белков. Такая же структура изложения принята для
рассмотрения электрофореза нуклеиновых кислот (глава 4). За-
мечания общего характера, изложенные в предыдущей главе, во
многом относятся к фракционированию обоих типов биополи-
меров, поэтому здесь будут рассмотрены только специфические
особенности электрофореза нуклеиновых кислот. В обеих по-
следних главах для иллюстрации различных эксперименталь-
ных приемов электрофоретического разделения биополимеров
разбираются многие новейшие работы. Разумеется, при этом
приводятся только наиболее существенные данные. Более де-
тальное описание следует искать в оригинальных публикациях,
на которые будут даны ссылки.
Глава 1
ГЕЛИ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
ПОЛИАКРИЛАМИДНЫИ ГЕЛЬ (ПААГ)
Исходные материалы
Акриламид (СН2=СН—CONH2) представляет собой белый
кристаллический порошок. Хорошо очищенный продажный пре-
парат содержит не более 0,05% акриловой кислоты. Его 5%-ный
водный раствор должен иметь pH не ниже 5, а оптическая плот-
ность 1%-ного раствора при 290 нм (Амо) не должна превышать
0,15. Такой препарат можно использовать без дополнительной
очистки или перекристаллизации. Акриламид следует хранить
сухим, в темной посуде, предпочтительно на холоду. В этих ус-
ловиях он может храниться до года. Акриламид токсичен (воз-
действует на кожу и нервную систему), поэтому отвешивать и
растворять его следует в перчатках и под тягой.
Недостаточно чистый препарат можно перекристаллизовать.
Для этого J0 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при
50°, фильтруют при этой же температуре, затем охлаждают до
—20°, быстро промывают кристаллы холодным хлороформом и
высушивают в вакуум-эксикаторе. Для освобождения от УФ-по-
глощающих примесей акриламид можно обработать активиро-
ванным углем. Для этого в маточный 30—40%-ный водный рас-
твор акриламида в смеси с метиленбисакриламидом добавляют
7
активированный уголь (примерно 50 г/л), суспензию перемеши-
вают в течение 30 мин и фильтруют сначала через бумажный, а
затем через стекловолокнистый фильтр. •
NN'-Метиленбисакриламид («Бис») — (СН2=СН—CONH)2-
СН2 — используют в качестве «сшивки» линейных полимеров ак-
риламида. Продажные препараты, содержащие не более 0,02%
акриловой кислоты, не нуждаются в дополнительной очистке.
В случае необходимости Бис можно перекристаллизовать из
ацетона (12 г/л) в тех же условиях, что и акриламид. Условия
хранения и токсичность — такие же, как у акриламида.
В качестве «сшивки» иногда используют этилендиакрилат —
СН2=СН—СО—О—СН2—СН2—О—СО—СН=СН2, а также
NN'-диаллилтартардиамид (ДАТД) —СН2=СН—СН2—NH—
СО—СН(ОН)— СН(ОН)— СО—NH—СН2—СН=СН2. С их по-
мощью получают «растворимые» гели. В первом случае эфирную
связь можно разорвать обработкой геля щелочью или водным
раствором пиперидина. Гели, сшитые ДАТД, растворяются за
20—30 мин при комнатной температуре в 2%-ной йодной кисло-
те. Использование растворимых гелей на основе акриламида
будет рассмотрено ниже.
Персульфат аммония производится в виде белого кристалли-
ческого порошка или гранул. Его используют в качестве инициа-
тора процесса полимеризации. Гомолитический разрыв связи
’ между атомами кислорода в молекуле персульфата аммония
о
о
II .
NHj-O-S-O-O-S-O-NH,
•И ! II
О I о
приводит к образованию двух достаточно долго живущих сво-
бодных радикалов с одним неспаренным электроном у атома
кислорода:
О
II
NHt—О—S—О'
II
О
Такой радикал стимулирует разрыв двойной связи в молекуле
акриламида и присоединяется к ней таким образом, что снова
образуется радикал с неспаренным электроном, но уже у атома
углерода:
О н
II I
NH4—O-S-O-CHj-C
II I
О CONH,
Этот радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи
и присоединение следующей молекулы акриламида с образова-
8
нием нового радикала и т. д. Цепная реакция полимеризации
идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой,
не образуют обычную ковалентную связь. По тому же механизму
в растущую цепочку линейного полимера может одной из своих
концевых винильных групп встроиться и метиленбисакриламид.
Второй его конец может точно так же оказаться в составе дру-
гой линейной полимерной цепочки, и образуется «сшивка».
Персульфат аммония в водном растворе постепенно разлага-
ется, поэтому следует использовать только свежеприготовлен-
ные растворы. Сухой препарат хранится лучше, хотя и он мед-
ленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препа-
раты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены,
но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата
аммония в воде имеет рН<2, то он непригоден. Отметим попут-
но, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с
успехом использовать, например, персульфат калия.
Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желто-
оранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворя-
ется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желто-
зеленую окраску.
Рибофлавин также может служить инициатором полимериза-
ции. При освещении его водного раствора видимым светом
(445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-
корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворен-
ным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет раз-
ложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО'),
инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.
К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком
строгие требования, так как он, являясь очень эффективным ини-
циатором, используется в гораздо меньших концентрациях
(~ 0,005%), чем персульфат аммония.
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД)—(СНз) 2N—СН2—СН2—
—N(CHS)» — представляет собой бесцветную жидкость с плот-
ностью 0,78 г/см8. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД —
около 6,7 М.
ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором поли-
меризации акриламида, но служит катализатором этого процес-
са, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в
своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации ак-
риламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значи-
тельно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД
можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к пер-
сульфату.
В качестве катализатора в последнее время нередко исполь-
зуют диметиламинопропионитрил — (CHS)2N—СН2—СН2—CN
(М=102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вно-
сят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.
9
Процесс полимеризации ПААГ
При подготовке определенной серии опытов удобно заранее
приготовить концентрированный (30—40%) водный раствор ак-
риламида и метиленбисакриламида с определенным соотноше-
нием обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холо-
дильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточ-
ный раствор буфера, например 10-кратной концентрации.
ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в
воде непосредственно перед началом опыта.
Для приготовления геля маточные растворы мономеров и бу-
фера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную ко-
нечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до рас-
четного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор
деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному
насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и за-
ливают в трубку или между стеклами для формирования пла-
стин. При правильном выборе концентраций персульфата и
ТЕМЕД полимеризация занимает 30—40 мин. Ее следует вести
вдали от яркого источника света.
Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс.
Наибольшую опасность для нормального протекания полимери-
зации акриламида представляет растворенный в воде кислород,
молекула которого является определенного рода бирадикалом
и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикаль-
ной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов
необходима именно для удаления из нее растворенного кислоро-
да. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием—
так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но
как только интенсивное выделение пузырей газа закончится,
деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испаре-
ния воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при
комнатной температуре.
Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может
помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора ос-
торожно наслаивают до высоты 3—5 мм деаэрированную кипя-
чением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке фор-
мы через иглу от шприца с помощью перистальтического насо-
са. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации
геля. Вначале граница между гелем й водой исчезает, но затем
вновь появляется, что указывает на окончание процесса полиме-
ризации.
Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то фор-
му с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой
«дневного света> с расстояния около 5 см в течение 30—45 мин.
Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным
инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распа-
да не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время кай
нон персульфата может вступать в реакцию с белками, созда-
10
вая артёфакты при их фракционировании. В тех случаях, когда
это существенно, персульфат удаляют путем предварительного
электрофореза («преэлектрофореза») геля до внесения в него
препарата,.однако полностью это сделать не удается. Тем не ме-
нее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отда-
ют персульфату, поскольку при работе с рибофлавином доволь-
но трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования рас-
творов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует
полимеризации, а с другой — он необходим, хотя и в небольшом
количестве, для самого процесса инициации с участием рибо-
флавина.
Полимеризация—экзотермический процесс, поэтому в слу-
чае высокой концентрации акриламида во избежание образова-
ния пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо
обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации
увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образо-
вания свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для
замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее про-
должительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимери-
зацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести
на холоду.
Гель получается наиболее однородным, если время полиме-
ризации составляет 30—40 мин. Обычно этого добиваются эм--
пирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата.
Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимо-
сти от концентрации акриламида и качества самого персульфа-
та. С увеличением содержания акриламида концентрацию пер-
сульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно
внести различные количества данного препарата персульфата
в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида,
наблюдая продолжительность полимеризации в них.
Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать
примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия
молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их при-
близительную эквимолярность. Напомним, что при использова-
нии кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать
вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем,
нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Су-
щественной роли это не играет, если только гель не обнаружи-
вает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав-
торадиографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо сни-
зить.
Состав буферов, используемых для электрофореза белков и
нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации ак-
риламида. Природа, концентрация и pH буфера определяются
особенностями самого процесса электрофореза, которые будут
рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает такжщфи-
сутствие мочевины (даже.в высоких концентрациях), гуанидин-
хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как Ж*
11
децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. рахароза
даже способствует полимеризации и улучшает механические
свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содер-
жать посторонних примесей. /
Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклян-
ных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детер-
гентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть ще-
точкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погру-
зить пластины или трубки на 1—2 ч в хромпик. Иногда их моют
горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной
поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.
ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концент-
рации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержа-
ния геля в устройствах с вертикальным расположением трубок
или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает тепло-
передачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования
шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой
шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхне-
го электродного резервуара, может образоваться между боко-
выми торцами пластины геля и прокладками, определяющими
его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного
выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или
чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля
вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с на-
полнителями, а также смазки, которыми нередко герметизиру-
ют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку
(лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком
из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего
края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы
при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для доста-
точно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использо-
вать без смазки.
Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько
прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение
из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится за-
труднительным. В этом случае можно силиконировать стекло
или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к ко-
торому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой
концентрации акриламида — вполне надежно. Полимеризацию
геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пласти-
ной плексигласа удобно проводить для последующего горизон-
тального электрофореза. После окончания полимеризации плек-
сиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на ох-
лаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для гори-
зонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое,
налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в
камеру, заполненную азотом.
Особого внимания требует полимеризация «градиентных» ге-
Жй с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло-
12
выделение при полимеризации такого геля будет заметно боль-
ше в его'нижней части, где содержание акриламида выше, а это
может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению
градиента? Во избежание такого явления вместе с концентраци-
ей акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем
инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы полимеризация
начиналась с'верхнего края пластины или трубки и постепенно
распространялась вниз.
Выбор концентраций мономеров
Для удобства изложения используются следующие обозна-
чения: Т — процентное отношение суммарной массы обоих мо-
номеров к объему их раствора, С — процентное отношение мас-
сы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Ве-
личина Т практически варьирует в пределах 3—30%, а С, как
правило, составляет 1—5%, что соответствует отношению акри-
ламид/Бис в пределах от 99: 1 по 19: 1. Однако в некоторых
особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать
С до 20% и более. При указании значений Т и С значок «%» да-
лее будет опущен.
Чем же диктуется выбор значений Г и С? Прежде всего, на
этот выбор накладывают ограничения механические и адсорб-
ционные свойства геля. Например, гели с Т^5 и С=1 оказыва-
ются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь
из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увели-
чивать степень сшивки (повышать величину С до 3—5), т. е. от-,
ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При
этом происходит одновременное повышение прочности геля и
ухудшение его способности прилипать к стеклу — гель как бы
«замыкается». Мелкопористые гели (Т около 20) при высоком
содержании «сшивки» оказываются хрупкими и мутными, по-
этому для них величина С не должна превышать 1—2.
На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем
мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величи-
на Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом
глубже.
Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран-
ственной решеткой с жесткими ячейками определенного средне-
го размера. При малых значениях С он представляет собой ско-
рее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных
точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние
между этими точками вдоль нити (при 0^2) в среднем равно
50—100 мономерных единиц. Такая система не может быть
внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-
видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных
полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энер-
гия, миграция . молекул замедляется и происходит своеобразное
«трение» их О гель. Однако жестких ограничений на размер
13
мигрирующих молекул такая система не накладывает/ и это
очень существенно. J
Чем больше содержание акриламида (а величина Г, в основ-
ном, определяется им), тем гуще нити полимера, меныпе проме-
жутки между ними и сильнее трение. Увеличение .содержания
<сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля так как сред-
няя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при
этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедля-
ется, — именно этого и можно было ожидать. Одйако далее кар-
тина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением
С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значе-
ниях Г) ослабляется. При С>15 гель ведет себя как крупнопо-
ристый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутрен-
няя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому,
совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, располо-
женным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономер-
ных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным
н вероятным многократное связывание нескольких параллельно
идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют
хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка
оказывается действительно жесткой — нити в пучках раздвинуть
невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образу-
ются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой
геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биопо-
лимеров.
Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде-
вании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов
связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями.
Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-
нопористости и прочности, характерное для этих гелей.
Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы-
соким содержанием метиленбисакриламида (С>15) хрупки,
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN'-диаллилтартардиа-
мидом. Например, гель с Т=5 и С=15, сшитый ДАТД, оказы-
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при
этом он механичееки прочен, хорошо сцепляется со стеклом и
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е.
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4: 1 [Spath, Koblet,
1979].
Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме-
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в
Геле («') ио сравнению с их подвижностью в свободной жидко-
.14
стис такими же, как у буфера геля, значениями pH и ионной си-
лы раствора (й0). Электрофоретическую подвижность определя-
ет как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч)
при напряженности поля 1 В/см. Величина щ зависит от соотно-
шейия суммарного электрического заряда макромолекулы (при
данном рН)\и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек-
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую-
щая миграций, вдоль силовых линий поля сила трения о жид-
кость пропорцйональна линейному размеру молекулы, а следо-
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства
кислых белков в свободной жидкости при pH 8,8 лежит в пре-
делах 0,1—0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас-
сой молекулы и величиной и», очевидно, быть не должно.
В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е.
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что
имеет место соотношение: \п(и'/и0) =— kRT, Величина коэффи-
циента торможения kB (порядка 0,1—0,4) зависит от среднего
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи-
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр-
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина
(М=12 400) до 3,61 нм для церулоплазмина (Л<=151000).
Для эффективного разделения белков при электрофорезе в
ПААГ соотношение и'/и9 должно составлять 0,1—0,2. Отсюда
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01—0,1 см/ч на 1 В/см. При
напряженности поля 10—20 В/см этому соответствуют скорости
миграции белков в диапазоне 0,1—2 см/ч. Таким образом, при
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст-
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров-
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел-
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно-
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить
время фракционирования в 2—3 раза.
Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо-
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа-
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным.
Разделение в этом случае будет происходить только за счет
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле
is
(при малых значениях Г), т. е. как бы в свободной жидкости,
почти не используя эффект трения молекул о гель. По/крайней
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.
Ориентировочно о характере различия электрофоретических
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож-
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас-
сы и изоэлектрические точки, а также содержаний в них ионо-
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы/приблизитель-
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не-
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп-
нопористый гель и попробовать поварьировать pH буфера.
Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче-
ственного рассмотрения—заключение об определенной свобо-
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем
«сшивки» (С в пределах 2—5). В любом случае выбор значений
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото-
рых, в частности, следует варьировать pH буфера и продолжи-
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).
В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо-
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций
ПААГ (Т):
М, тыс.
Дальтон
10-40
Т, %
М, ТЫС.
Дальтон
40-100
15-20
10-15
100-300
>300
Т. %
5-10
5
Приступая к электрофоретическому фракционированию био-
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен-
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден-
тификации и сопоставления положения соответствующих полос.
АГАРОЗА
Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агаро-
зы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макро-
молекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза—это особо
чистая фракция природного линейного полисахарида агара, ко-
торый извлекают из некоторых видов морских водорослей. В по-
лимерной цепи агарозы чередуются p-D-галактопираноза и 3,6-
ангидро-а-£-галактопираноза. Молекулярная масса ее состав-
ляет 10*—10*. Гелеобразование идет, как уже указывалось, пу-
тем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет
водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обра-
зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.
16
При\ температурах 84—96° (а у специальных типов —уже
при 70°)\ раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость —
«плавится». Вязкость расплавленного 1 % -ного раствора агаро-
зы составляет 10—15 сП, что примерно соответствует вязкости
50%-ного раствора сахарозы «ри комнатной температуре. Рас-
творы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерези-
сом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низ-
ких температурах (36—42°). У легкоплавких типов агарозы эта
температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает
манипуляции с расплавленной агарозой — можно не опасаться
преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплав-
ленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают
до 50—55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в
формы; это удобно и не связано с возникновением значительных
тепловых деформаций.
t Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено
не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и
свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель
представляет собой не вполне равновесную систему: со време-
нем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость.
Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень
медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует вы-
держивать в течение,-по крайней мере, 12 ч (открытые пластины
для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной
камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных
гелей агарозы.
Температуры плавления и гелеобразования зависят от содер-
жания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать
3—4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В ага-
розе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их при-
сутствие существенно влияет не только на температуры плавле-
ния и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.
В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают силь-
но выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эн-
досмоса, сущность которого сводится к следующему.
Отрицательно заряженные остатки серной кислоты непо-
движно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствую-
щие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фа-
зе и под действием электрического поля мигрируют в направле-
нии катода. Их место занимают катионы, поступающие из анод-
ного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратиро-
ванных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидко-
сти, находящейся внутри геля, и вместе с ней — растворенные в
водной фазе геля макромолекулы. Они «дрейфуют» вместе с
жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под
действием электрического поля.
В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделя-
ют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к
аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд-
17
©
ЮМ VWA \ЛАЛЛ
©
Рис. 4. Влияние эндосмоса в агарозном геле наг характер
фракционирования двунитевых ДНК одинакового разме-
ра [Johnson et al., 1980] /
/ — сверхскрученная ДНК; 2 — линейная; 3 — кольцевая; сте-
пень эндосмоса увеличивается слева направо
шает разделение. Ввиду этого агарозу под-
вергают специальной очистке, и содержание
иона сульфата в продажных препаратах не
превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающие-
ся слабо выраженным эндосмосом, содержат
менее 0,3% сульфата. В случае необходимо-
сти можно провести дополнительную очистку
агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH
в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаж-
дением 50%-ным этанолом [Lonnerdal, Laas, 1976].
Насколько существенно эндосмос может влиять на резуль-
таты электрофореза, видно из даннь/х Джонсона и др. [John-
son et al., 1980]. Авторы использовали три типа агаро-
зы с различной способностью к эндосмосу (значения — тг со-
ставляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном
и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы
этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК
фага ФХ 174-сверхскручеиной, кольцевой и линейной. С усиле-
нием эндосмоса не только происходило сильное замедление ско-
рости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже)
менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому,
различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-раз-
ному.
Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает
еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результа-
те чего полосы расплываются с образованием «хвостов».
Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью ко-
эффициента относительной миграции (—тг). Знак «минус» здесь
только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые
кислоты «сносит» в сторону, противоположную направлению их
миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоро-
стей миграции незаряженного полимера (за счет только эндос-
моса) и сходного с ним по структуре полианиона при электро-
форезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы
ниже будет использована номенклатура фирмы «Miles». По дан-
ным каталогов, в частности по значениям — тг, ее нетрудно сопо-
ставить с обозначениями других фирм, тем более что большин-
ство из них получает свои препараты от одного- и того же произ-
водителя — фирмы «Marine Colloids Inc.».
Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) —тг =
=0,14-0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выражен-
ный эндосмос (—т.т=0,234-0,26). Агароза типа ME занимает
промежуточное положение (—т, = 0,154-0,2). Чем меньше в ага-
18
розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростати-
ческого угталкивания между молекулами полимера и выше их
способность к связыванию водородными связями. Агароза с по-
вышенными температурами плавления и гелеобразования (тип
HGT) имеет —mr< 0,1; именно она чаще всего используется
для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная техно-
логическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволя-
ет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженны-
ми температурами плавления и затвердевания — тип LGT («Sea
plaque» по номенклатуре фирмы «Marine Colloids»). Такая ага-
роза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается
жидким при физиологической температуре (37°); кроме того,
плавление геля можно осуществить при температуре более низ-
кой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуно-
электрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к ка-
тоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению,
была разработана специальная агароза типа НЕБО с сильно вы-
раженным эндосмосом (—/пг>0,3). Этого удалось добиться не
за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых по-
прежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорб-
ция белков на агарозе этого типа почти не происходит.
Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-
филизированного порошка. Для приготовления геля выбр-анной
концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем
буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термо-
стате при 90—95° около 2 ч для образования истинного раство-
ра полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обрат-
ным холодильником.
Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смеши-
вают с раствором агарозы в горячем виде (при 50—60°). Они
не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду,
что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водород-
ные связи, несколько затрудняет образование геля. Например,
гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при
75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].
Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию ага-
розы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза
готовят путем заливки дозированного объема расплавленной
агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нуж-
ного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером
имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.
Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, дик-
туется размерами фракционируемых макромолекул. Средний
размер пор 2 %-кого геля агарозы приблизительно соответству-
ет диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с
массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием
агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе
поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биопо-
лимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом
19
поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют ага-
розные гели с концентрацией 0,4—2%. Ниже для ориентировки
представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %)
для некоторых распространенных объектов фракционирования:
Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид , 0,4
Рестрикты ДНК (5—20 тыс. пар оснований) 0,7
мРНК, Денатурированная обработкой метилртутью 1,0
Реовирусная двунитевая РНК (500—5000 пар оснований) 1,5
Рибосомная РНК 1,75
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100—1000 пар оснований) 2,0
Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей
агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в тер-
мостате при данной температуре. Это необходимо для полного
выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем
обеспечивается одновременное застывание всего геля и одно-
родность его структуры.
СМЕШАННЫЙ ГЕЛЬ (АГАРОЗА+ПААГ)
Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно
вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5—2,5% акрила-
мида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют
совместно с 0,5—0,6% агарозы. Имеет место своеобразный «сим-
биоз»: чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий
гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их
комбинация образует гели с отличными* механическими характе-
ристиками.
Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше
причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризую-
щийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоре-
тическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас,
придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образо-
вания такой структуры надо обеспечить условия, при которых
агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Ис-
ходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония
и ТЕМЕД.
Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего раз-
бавления, прогревают, как описано выше, и'выдерживают в те-
чение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соот-
ветствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэри-
руют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно зали-
вают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает
агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появ-
лением границы, лежащей на 2—5 мм ниже края геля агарозы.
Для обеспечения формирования узкой начальной полосы пре-
парата при вступлении его. в гель имеет смысл спустя час после
окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пла-
стину и обрезать гель ниже границы полимеризации акрилами-
да. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель, и за-
20
лить пдверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и форми-
ровать «карманы» для внесения препаратов [Schwingnamer,
Shepherd^ 1980].
В качестве примера можно назвать успешное разделение пу-
тем электрофореза в смешанном геле (1,7% ПААГ+0,5 агаро-
зы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishi-
naga, Yamamoto, 1980].
АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ ПЛЕНКА,
ИМПРЕГНИРОВАННАЯ ПААГ
Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопори-
стую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого
полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она
смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акрила-
мида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во
всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По оконча-
нии полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить
и отмыть. Таким способом нетрудно получить «пластинку» тол-
щиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от ге-
ля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый
препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Fren-
kel, Blagrove, 1978].
Глава 2
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ
И АППАРАТУРА
Рассмотрим основные технические приемы приготовления
и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение
целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналити-
ческого электрофореза: вертикального в трубках, вертикально-
го в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препа-
ративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы
подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к
ним, а также условий протекания самого процесса электрофоре-
за будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвящен-
ных описанию различных вариантов электрофоретического
фракционирования белков и нуклеиновых кислот.
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ТРУБКИ
Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то пре-
имущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом
его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность ге-
ля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни-
21
Рис. 5. Прибор для электрофореза
в вертикальных трубках /в разре*
зе) /
1 — верхний электродный, резервуар;
2 — центральный цилиндр; 3 — верхний
платиновый электрод; 4~ резиновая
прокладка; 5 — трубочка с гелем; € —
нижний электродный резервуар; 7 —
нижний платиновый электрод
кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см.
выше). Под действием собственного веса они могут постепенно
сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают,
главным образом, в случае препаративного электрофореза, ког-
да соотношение поверхности и объема колонок геля способству-
ет его сползанию.
Все приборы с вертикальным расположением гелей конструк-
тивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположени-
ем, так как верхний электродный резервуар должен быть под-
нят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах
сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с труб-
ками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые про-
кладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара.
Схема такого прибора показана на рис. 5.
Трубки (12—18 штук) с уже заполимеризованным в них ге-
лем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верх-
ние концы выступали над дном резервуара. Если используют не
все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе
с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на
нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором рас-
стоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар элек-
тродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки-оказы-
ваются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой
же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой
или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждаю-
щей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной
формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за
продвижением. фронта красителя в процессе электрофореза.
В резервуарах должны быть закреплены электроды из платино-
вой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать-
22
ся такДчтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попада-
ли на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протека-
нию через них тока. Объемы электродных резервуаров доста-
точно велцки, чтобы pH находящегося в них буфера не изменял-
ся под влиянием продуктов электролиза.
Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электро-
форез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5—6 мм и длину
около 10 см. Фирма «Bio-Rad» в своем приборе модели 155 пред-
лагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до
14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти
сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При
изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в
пламени горелки во избежание образования незаметного на
глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после
окончания электрофореза.
Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок за-
клеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают
их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор моно-
меров сразу после добавления и надежного смешивания с ним
раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из
пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний
участок трубки, предназначенный для внесения препарата, ос-
тавался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или
изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем
разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза
(см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабо-
чего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером
верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой
раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него
воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем
в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают
верхним электродным буфером.
Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный ре-
зервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее
конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает элек-
тродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой
с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препа-
рат, в который добавляют предварительно 5—10% сахарозы.
Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхно-
сти геля; препарат должен выливаться с высоты 2—3 мм над
гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей
повышенной плотности. При любом варианте электрофореза на-
до быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от
взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соби-
раться на торце геля и нарушать однородность тока по его сече-
нию, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон.
В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить
центрифугированием.
23
Рис. 6. Система для обра-
зования линейного градиен-
та концентрации ПААГ в
трубках
/— пачка трубок; 2— перисталь-
тический насос; 3 — смеситель
градиента
Выше уже упоминалось о возможности использования гра-
диента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по
высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведе-
ны соображения, касающиеся подбора концентраций иниции-
рующих добавок в этом случае. Преимущества таких «градиент-
ных» гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиент-
ных гелей используют такие же смесительные устройства, как
при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацент-
рифугирования. В этом случае также можно получать линейные
и нелинейные градиенты, «выпуклые» и «вогнутые», в том чис-
ле экспоненциальные.
В смеситель можно поместить раствор мономеров с макси-
мальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительно-
го устройства — соответственно разбавленный раствор. Затем
можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно цен-
трифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду ма-
лого объема трубки (2—4 мл). Кроме того, почти всегда жела-
тельно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой
градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку
параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее ре-
зинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, что-
бы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном.
Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из
трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6).
Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе гради-
ентного устройства должен находиться раствор мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре — концентрированный рас-
твор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере
поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно
увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-
ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концент-
рированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения
в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально
необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше на-
чинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, нахо-
дящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.
24
Следует помнить о необходимости промывки смесительного
устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после
окончания их использования, до того как в них произойдет по-
лимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему
нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подво-
дящую к нему трубку.
По окончании полимеризации всю пачку трубок следует из-
влечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и
обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя техни-
чески и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за
счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора
мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-
rentz, 1976].
В описанном приборе для вертикального электрофореза элек-
трическая цепь надежно замыкается непосредственными кон-
тактами обоих концов трубок с электродными буферами. Одна-
ко надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было
пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения тру-
бок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струей жид-
кости, направленной из шприца с согнутой иглой.
По окончании электрофореза гель из трубки извлекают.
В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и
затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов
трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от
ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с дру-
гого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленно-
го несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель
отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5—1% какого-
нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю
возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над кото-
рым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удале-
ния геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой
из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой кон-
центрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а
трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему
путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно
съеживается и отстает от стенки.
Основным недостатком электрофореза в трубках является
затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси ге-
ля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к
стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответствен-
но окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотво-
да можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах
диаметром 0,7—1,5 мм [Condeelis, 1977].
25
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Для электрофореза белков обычно используют пластины
шириной 8—14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8—
28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, на-
пример при секвенировании, нередко ведут в больших пласти-
нах размером 33X43 см, что диктуется максимальным размером
рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гид-
ролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины
ПААГ длиной 90 см (Pirtle et al., 1980].
Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а за-
тем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя
пластинами зеркального стекла толщиной 5—6 мм. Расстояние
между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона
или плексигласа («спейсеров») и определяет толщину геля.
Прокладки шириной 10—15 мм устанавливают вдоль боковых
краев стекол. Для аналитических целей, как правило, исполь-
зуют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от
0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уп-
лотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердев-
шего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно
такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю
стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боко-
вых прокладок.
Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-
фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-
сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки
из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро:
шо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а
также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые про-
кладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и
к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю про-
кладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу,
следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в по-
лость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную
прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по все-
му периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажи-
мают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.
При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
Проще — заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопласты-
рем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать.
Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с про-
кладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания
не произойдет. Для надежности можно сначала залить неболь-
шой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а
потом залить остальной ее объем.
Описано применение в качестве прокладки П-образной по-
лоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать
ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка
2в
не нуждается я смазке (Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо
нижней прокладки сделать в нижней части формы «пробку» из
ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боко-
выми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавлива-
ют в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирую-
щими добавками, так, чтобы 'заполнить нижнюю часть формы
на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок.
Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаива-
ют воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и
внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают.
Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над проб-
кой и промыть поверхность буфером геля. Фирма «Bio-Rad»
предлагает для заливки пластин геля простое устройство, по-
зволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми
прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой рези-
ны. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее
уплотнение осуществляют просто пластилином.
Собранную и уплотненную одним из описанных способов
форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор
мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ
толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-
вать— в горизонтальном положении пластин. Это значительно
упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее
по торцам пластин водостойкой липкой лентой.
В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно за-
тем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как бы-
ло показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препа-
раты фракционируют в параллельных друг другу «треках».
В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд
одинаковых углублений прямоугольной формы — «карманов»,
куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не
заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют
«гребенку» из тефлона или плексигласа такой же или чуть мень-
шей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные
зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой.
На боковом сечении можно’видеть, что верхняя часть гребенки
немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как
гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно —до упора
выступу о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показа-
ны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю про-
кладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы
выступают наружу. За эти. концы нижнюю прокладку и выни-
мают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже
показаны только три.Зажима (с правой стороны пластин).
Гель или агарозу заливают между пластинами с таким рас-
четом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель за-
полнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают
27
Рис. 7. Форма для полимеризации
вертикальной пластины геля
/ — стеклянные пластины; 2 — прокладки;
3— гребенка; 4 —зажим
вставлять с некоторым переко-
сом, чтобы под ее зубцами не за-
держивались пузырьки воздуха.
Для этой цели торцы зубцов
предварительно смачивают, по-
терев их о стекло с налитым на
него раствором акриламида.
В тех случаях, когда готовят
двухслойный гель, по окончании
полимеризации нижнего геля во-
ду отсасывают, поверхности про-
мывают буфером верхнего геля,
заливают этот последний и уже
в него устанавливают гребенку.
Когда гель готов, вынимают
нижнюю прокладку или снимают
липкую ленту и осторожно вы-
таскивают гребенку. При работе
с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам
гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться не-
ровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос
в геле.
В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля
пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На
границе между двумя слоями разной пористости полоса ис-
ходного препарата будет выгодным образом сужаться.
Перегородки между близко расположенными карманами в
агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Опи-
сан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из
плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее
верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пла-
стинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но
не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ши-
рине интервалов между перегородками, так что форма оказыва-
ется уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув фор-
му, заливают агарозу с противоположной стороны. После за-
стывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов
оказываются разделенными перегородками из плексигласа, кон-
цы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975}.
Для получения пластин с градиентом пористости геля по вы-
соте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной
пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную
трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом слу-
чае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь
мономеров малой концентрации, а резервуар — более концент-
рированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить гра-
диента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-
зующемся геле.
28
Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых
снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят
в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка
трубок. Фирма «Pharmacia» (Швеция) предлагает для этой це-
ли специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых
набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по
двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акрила-
мида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через
отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установле-
на только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида
и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого
сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из
плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в ла-
боратории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не гра-
диентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-
ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый
мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку
и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации
мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обре-
зают [Kerckaert, 1978].
Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках
можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров
разной концентрации путем многократного переворачивания
пластины или трубок в наклонном положении.
В литературе описано много конструкций приборов для
электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предла-
гают различные фирмы. Наибольшее распространение получила
конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером
(рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных
условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямо-
угольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой
имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой
же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между кото-
рыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными
зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпа-
ли. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, что-
бы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вто-
рая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли пе-
редней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов,
между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осущест-
влено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера.
Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма
«Bio-Rad» в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструк-
цию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой про-
кладки.
В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой
проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично по-
гружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается
там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец
29
Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах
(фирмы cPharmacia»)
Рис. 'Л ^Прибор Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Stjfc
«О
оказывается приподнятым над дном резервуара. После погру-
жения надо внимательно проверить, не осталось ли между пла-
стинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить
струей жидкости из согнутой иглы шприца.
Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином
вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора
так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный
буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять пре-
паратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на пол-
ную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.
Недавно был предложен очень простой, целиком (включая
пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для
вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-
се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по
всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон элект-
родным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно пере-
мешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне
прибора змеевик, Этим компенсируется худшая, чем у стекла,
теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации
этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно сла-
бого сцепления ПААГ с плексигласом.
Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ
установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют
снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара.
Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок
прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют
за счет трения в прорезях прокладок («Bio-Rad», «Pharmacia»)
либо прижимают к ним шлифованными торцами («Desaga»).
В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, по-
этому приходится ограничиваться использованием фирменных
пластин и гелей определенной толщины.
Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-,
верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в при-
бор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и
насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов.
Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказы-
вается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до
некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта
температура оказывается практически одинаковой по всему его
сечению. Именно это обстоятельство является решающим для
обеспечения хорошего качества разделения.
В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке
и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь
между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем
же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-
ers, 1.971]. Конструкция прибора становится совсем простой, н
отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах.
Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во-всех случаях
аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста-
31
ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом не-
сколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического
сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего
через гель (см. ниже).
По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаи-
вая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают
между пластинами со стороны карманов и слегка поворачива-
ют. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала прой-
ти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, на-
блюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно прони-
кает воздух, а потоц уже приподнять пластину. Со второй пла-
стины гель снимают руками и переносят в ванночку для фикса-
ции или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с
пластины за «нерабочий» конец, лучше все же работать в пер-
чатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверх-
ности геля при современных чувствительных методах окрашива-
ния может оставить на геле артефактное белковое пятно. При
авторадиографии влажный гель, лежащий на’ одной пластине,
можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.
ГОРИЗОНТАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Преимущество такого расположения — не только в компакт-
ности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба
электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных
ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.
Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла
от пластинки геля — в его каналах циркулирует охлаждающая
вода.
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке,
помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку
препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных «колод-
цев», расположенных на некотором расстоянии от его края.
Электрическая цепь замыкается через 8—10-слойные фитили из
фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в элект-
родные резервуары, а другим — прижатые к гелю с перекрытием
в 10—12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель сле-
дует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей
между ними.
Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах
препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза
от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на ано-
де образуется свободная кислота, а на катоде — щелочь, кото-
рые по плотности отличаются от электродных буферов, а это
может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч,
электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы
и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция
жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются — и бу-
фер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе
32
«Мультифор» (LKB, Швеция) циркуляция буфера не преду-
смотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.
Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время
работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую ино-
гда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в
случае существенного охлаждения от конденсации на его поверх-
ности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка
изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фити-
лей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия на-
блюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по
конструкции приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) по пери-
метру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка
с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке,
оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого
прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фити-
лей используется специально обработанная целлюлоза с повы-
шенной влагоемкостью.
Рис. 10. Схема прибора «Муль-
тифор» для электрофореза в
горизонтальных пластинах
(фирмы LKB)
/ — антиконденсационная крышка;
2 — электродный резервуар; 3 — ко-
лодец для внесения препарата; 4 —
гель; 5 — фитиль; 6 — охлаждающий
столик
Рис. 11. Наложение фитилей
на гель в приборе «Мульти-
фор»
2 Л. А. Остермав
33
Рис. 12. Наложение антиконденсацион-
ной крышки
Рис. 13. Внесение препарата в ко-
лодцы геля
Описанные приборы не предъявляют строгих требований к
качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля
не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ
для прибора «Мультифор» ведут в форме, уплотненной по всем
четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из
своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув
прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя
образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и
толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается
во время электрофореза. Пластину из плексигласа после поли-
меризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных
выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесе-
ния препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для
«Мультифора» — 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить
и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разли-
вался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микро-
шприцем (рис. 13).
При сборке формы на стеклянную пластину накладывают
еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажи-
мают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаи-
вать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно
не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней
гель может и не заполимеризоваться. После осврбождения геля
оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать филь-
тровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее сле-
дует охладить в холодильнике.
Перед использованием ПААГ желательно выдержать не ме-
нее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание под-
сыхания, Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),
94
й? Следует Зсрйнйть в холодильнике, так как ДДС-Ма мо-
жет выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на ох-
лаждающий столик следует налить на него несколько милли-
литров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой
контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл прс>-
вести на столике водонесмываемым фломастером две линии на
расстоянии примерно 15—20 мм от каждого из противополож-
ных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно
уложить края фитилей, что немаловажно для созданий й геле
однородного электрического поля.
Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же
начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель
склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно
следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером пре-
парата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает рас-
пределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно
пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в
препарат 10—20% глицерина.
После электрофореза можно хранить гель на том же стекле,
обернув его целлофаном, или предварительно перенести на ме-
таллическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную
бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На
этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно
и высушить.
Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе
можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально ус-
тановленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло опре-
деленного размера и на него выливают расплавленный раствор
агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать
так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для
препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB реко-
мендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы че-
рез прорези наложенного на пластину специального шаблона со
щелями. Препарат объемом 2—4 мкл вносят в щель шаблона,
откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравни-
тельно простое приспособление, смонтированное на столике для
заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно
к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при. заливке агарозы
образовать колодцы для препаратов. Перед использованием
пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфе-
ре в течение суток.
При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе использу-
ют относительно большие токи, которые могут нагревать фити-
ли из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать
тоже из агарозы — заливкой ее 1—2%-ного раствора в специ-
альные камеры; ^описаны конструкции соответствующих прибо-
ров (Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980].
На рис, 14 показан разрез одного из таких простых приборов.
В приборе фирмы «Bio-Rad» (модель 1415) фитилями из 0,5%-
35
2*
1
4
Рис. 14. Прибор для препа-
ративного горизонтального
электрофореза ДНК в ага-
розном геле с агарозными
фитилями
1 — электродные резервуары; 2—
форма для заливки агарозы;
<3 — съемные перегородки; 4 —
гребенка
ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мо-
стики, на которых можно вести препаративный электрофорез
ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.
Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата
описано приготовление гелей для горизонтального электрофоре-
за толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушива-
ния такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом
пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже мечен-
ных 3Н препаратов [Amaldi, 1972].
Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах
ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования
нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель разме-
ром 30 X 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали
на металлический охлаждающий столик самодельного прибора,
накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности
прижимали к столику давлением наполненной воздухом подуш-
ки [Kutateladze et al., 1979].
зв
Глава 3
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОЙ
В двух предыдущих разделах были детально описаны прак-
тические приемы подготовки и проведения опытов по электро-
форезу. Это позволяет приступить к подробному анализу, си-
стематизации и сопоставлению физической сущности и потенци-
альных возможностей многочисленных и разнообразных вари-
антов этого метода, развитых за последние годы. В главах 3 и 4
мы попытались представить более или менее целостную картину
бурного развития электрофоретических методов исследования
белков и нуклеиновых кислот по состоянию на середину 1980 г.
Главная задача изложения — выяснение существа и возможно-
стей каждого из рассмотренных ниже вариантов. Однако следу-
ет еще раз подчеркнуть абсолютную необходимость совершен-
ного овладения описанной выше техникой эксперимента, без
которой попытки реализации самых блестящих замыслов зара-
нее обречены на провал.
Из множества рассмотренных ниже экспериментальных ра-
бот в интересах экономии места и концентрации внимания на
главном будут взяты только самые существенные количествен-
ные данные. Не следует пытаться по ним воспроизвести эти ра-
боты — для этого необходимо тщательно изучить цитируемый
первоисточник.
Рассмотрению конкретных вариантов в обеих главах пред-
посланы довольно подробные замечания общего характера, ко-
торые постоянно следует иметь в виду при анализе и сопостав-
лении этих вариантов.
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА
Миграция белков в геле
Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность
биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в
свободной жидкости (м0), которая определяется отношением
суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, об-
условливающим отличие и' от ий, является сила трения о гель,
которая зависит от соотношения линейных размеров макромо-
лекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс бел-
ков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляюще-
го большинства индивидуальных белков не превышают 500 000.
Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесооб-
разным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести
только по величине отношения заряда к массе. Как правило,
электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5—20%
акриламида.
Белки являются цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а
следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять
37
путем Изменения pH буфера, в котором полимеризуют ПААГ и
ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим.
Очевидно, что оптимальное значение pH рабочего буфера обус-
ловливает не максимальный заряд, а максимальное различие
зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэто-
му в большинстве случаев нецелесообразно использовать экст-
ремальные величины pH рабочего буфера, слишком удаленные
от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных
кислых белков оптимальные значения pH буфера оказываются
в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков
идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков
(гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать
слабокислые буферы (pH 4—5). Эти белки различаются по ве-
личине суммарного положительного заряда и мигрируют в на-
правлении от анода к катоду.
Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от
рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при
образовании зоны локальная концентрация белка может ока-
заться значительной. Поэтому приходится использовать буферы
с концентрацией 0,1—0,2 М. и более. При этом следует учиты-
вать, насколько близко к границе буферной области лежит рабо-
чее значение pH. Если такое приближение к границе необходи-
мо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр-
ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электро-
проводности буферов рассмотрен ниже.
Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только
от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости бел-
ковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агре-
гации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или
менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упа-
ковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные
белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем
самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эф-
фект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеи-
новых кислот.
Для однозначного определения молекулярной массы белка
по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесооб-
разно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей
жесткость. Именно такой прием используется при электрофоре-
зе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно
это будет рассмотрено ниже).
Напряженность электрического поля (Н)
Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка
геля длиной I Е = Н1. В проводящей ток жидкости приложен-
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко-
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным
38
сопротивлением цепи R (I—E/R). В ПААГ проводящей жидко-
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера.
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря-
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим
вкладом можно пренебрегать.
Электрическое сопротивление буфера определяется двумя
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро-
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ-
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу-
ферах ионов С1~ и СН3СОО" электропроводность первого буфе-
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче-
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры-
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может,
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен-
ностью электрического поля.
Если в любой электрической цепи последовательно включе-
ны два различных по своей величине сопротивления R{ и Rit то
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них
за счет падения на нем напряжения Et = IRlt а через второе — за
счет Ez=IR2. Полное напряжение по всей электрической цепи
£'=£1+Ег. Если Ri сильно отличается от то и также от-
личается от Ег. При изменении сопротивлений двух участков рас-
пределение напряжений на них может существенно измениться,
оставаясь в сумме своей неизменным.
Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух
последовательно расположенных участков, где при полимериза-
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра-
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:
следовательно, различными могут быть и падения напряжения
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе-
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па-
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив-
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за<
висит от их длины и определяется только концентрациями и под-
вижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию
можно себе представить в двух простейших вариантах.
Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно,
ионы на двух участках геля (А и В) одинаковы, но концентра-
ция буфера на участке А в 10 раз меньше. Это приведет к тому,
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В.
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля,
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их
9»
концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се-
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет
одинаковым, что и означает неизменность тока / по всей длине
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что
количество ионов в Л не истощается — оно пополняется за счет
ионов, поступающих из электродного буфера.
Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо-
их участках одинаковы, но ионы на участке А отличаются на-
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (м0), так как сетка геля
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле
Л содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном pH),
а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов-
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже-
ние распределится между участками Л и В так, что напряжен-
ность поля в Л будет соответственно выше, причем именно на-
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио-
нальная произведению подвижности на напряженность поля,
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.
В более сложных случаях могут различаться как подвижно-
сти ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряжен-
ности электрического поля в двух последовательно расположен-
ных участках геля устанавливаются такими, что они компенси-
руют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем
геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень
разными. Очень важно, что это различие существенным образом
влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же
белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На том
участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться
быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рас-
смотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белковых
зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что
сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в од-
нородном по напряженности электрическом поле, чтобы разде-
ление белков отражало истинное различие их собственных ха-
рактеристик — молекулярных масс и электрического заряда.
Выбор буфера рабочего геля
Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от
природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что
сама по себе величина pH практически не сказывается на элект-
ропроводности геля. Даже при pH 4 концентрации протонов
(0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по
сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет
видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и
к ионам ОН~ в реально используемом диапазоне pH щелочных
буферов,
40
В то же время косвенным образом выбор pH может сильно
влиять на электропроводность данного буфера, определяя сте-
пень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый
Трис-НС1-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис+, С1~ и не-
заряженные молекулы Триса. Для этого буфера рКв=8,1. Это
означает, что при pH 8,1 ровно половина молекул Триса несет
положительный заряд, практически целиком за счет протонов
соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в рас-
творе находится такое же количество ионов С1_. Таким образом,
при pH 8,1 0,1 М Трис-HCl содержит 0,05 М Трис+ и 0,05 М С1_.
Электропроводность этого буфера будет определяться, в основ-
ном, ионами С1~, так как их подвижность намного выше, чем у
тяжелых ионов Трис+. 0,05 М С1~ обеспечивает достаточно вы-
сокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же
концентрации и pH имеет значительно меньшую элект{?опровод-
ность, так как подвижность аниона СН3СОО_ явно ниже, чем
С1-.
При pH 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-HCl увеличится
примерно вдвое, так как этот pH лежит вблизи границы буфер-
ной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизирова-
ны; следовательно, концентрация С1_ составит около 0,1 М. На-
оборот, при pH 8,9 электропроводность этого буфера значитель-
но ниже, чем при pH 8,1, так как для титрования до pH 8,9 по-
требуется заметно меньше НС1.
Существенную роль в определении электропроводности иг-
рает выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко
понять, что К- или Na-фосфатные буферы, как и Трис-HCl, от-
личаются высокой электропроводностью за счет ионов К+ и
Na+. То же относится к К- или Na-ацетатным буферам. Между
тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концент-
рации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-
фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отлича-
ется меньшей электропроводностью. Относительно низкую
электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и
Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что
электропроводности буферных систем, в которых не участвуют
легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щело-
чей, относительно невелики. Это важное заключение будет иг-
рать существенную роль в дальнейшем изложении. К сожале-
нию, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.
Таким образом, электропроводность рабочего буфера опре-
деляется тремя факторами: концентрацией, необходимой для
поддержания нужного pH в белковых зонах, степенью диссоциа-
ции буферных веществ при этом pH и характером участвующих
в диссоциации ионов.
Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних
солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутству-
ющую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, сле-
дует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-
41
Цйю до О,Й5 М. Ня избыток солй б прёпараТё указывает, между
прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя
граница полосы препарата сразу после его вступления в гель.
При нормальном разделении должна иметь место как раз об-
ратная картина — резкая передняя и более диффузная задняя
граница полосы. Это можно проконтролировать путем окраши-
вания пробного геля через 20—30 мин после начала электрофо-
реза или при использовании люминесцентных маркеров (см.
ниже).
Помимо суммарной электропроводности, определенную роль
играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигри-
рующих в том же направлении, что и разделяемые макромоле-
кулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей под-
вижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы
большие органические ионы: Трис+ (катион), остатки барбиту-
ровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как
глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях
Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании ще-
лочных белков, а барбитуратный — для кислых белков вблизи
нейтральной области pH буфера.
Выделение тепла при электрофорезе
Высокая электропроводность буфера нежелательна, посколь-
ку ограничивает возможность повышения напряженности элект-
рического поля в геле из-за увеличения тока и связанного с этим
выделения тепла. Между тем, именно напряженность поля обес-
печивает всегда желательное ускорение миграции белков.
Электрическая мощность, рассеиваемая в виде тепла в геле,
равна произведению силы тока на падение напряжения по длине
геля (1Е). В главе 1 было отмечено, что разумной продолжи-
тельности электрофореза соответствует напряженность поля
10—20 В/см. Кстати, как показывает практика, при заметном
превышении этих значений качество полос в обычных условиях
охлаждения ухудшается. Для геля длиной 20 см такой напря-
женности соответствует напряжение 200—400 В. При воздуш-
ном охлаждений вертикально расположенных пластин эффектив-
ный теплоотвод возможен при рассеиваемой мощности не более
20 Вт, что соответствует силе тока 50—100 мА на пластину.
В приборе GE-2/4 фирмы «Pharmacia» /рис. 15) с принудитель-
ным жидкостным охлаждением пластин уровень мощности мо-
жет быть увеличен до 100 Вт с соответствующим повышением
напряженности поля и ускорением фракционирования белков.
Приборы для электрофореза в горизонтальных пластинах успеш-
но осуществляют теплоотвод при мощности до 40 Вт.
В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля
может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого
является замена более подвижных ионов буфера в геле на ме-
нее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе
42
Рис. 15. Прибор для электрофореза в вертикальных пластинах с циркуляцией
буфера (Тип GE-2/4 фирмы «Pharmacia»)
Как уже отмечалось, для сокращения продолжительности
разделения и уменьшения диффузии зон электрофорез желатель-
но вести при максимальном напряжении. Его начальное значе-
ние ограничивается требуемой вначале силой тока и максималь-
но допустимой для данного прибора мощностью. По мере роста
сопротивления в геле сила тока снижается, и напряжение мож-
но увеличивать. Современные источники напряжения делают
это автоматически, поддерживая заданный постоянный уровень
мощности, рассеиваемой в геле. От опасного (с точки зрения
надежности изоляции) повышения напряжения при этом можно
застраховаться, ограничив максимально допустимую его вели-
чину. Достигнув ее, прибор переключается на режим поддержа-
ния постоянного напряжения, поэтому при дальнейшем возра-
стании сопротивления сила тока и расходуемая в геле мощность
начинают снижаться.
В некоторых случаях сопротивление всей цепи электрофоре-
за может и уменьшаться. В частности, это может происходить
как из-за нагревания геля (напомним, что подвижность ионов
с температурой возрастает), так и за счет накопления ионов в
электродных резервуарах. В этих случаях источник тока, отрегу-
лированный на постоянную мощность, автоматически снижает
напряжение, а максимально допустимая сила тока может быть
заранее ограничена. Такого типа источники («Constant power
supply») выпускаются фирмами «Pharmacia» - (модель
ECPS 3000/150) и LKB (модель 2103). В других типах источнй-
43
ков (EPS 500/400 фирмы «Pharmacia» и модель 500 фирмы
«Bio-Rad») можно заранее установить постоянные значения на-
пряжения или тока и задать величину максимально допустимой
мощности, по достижении которой соответственно напряжение
или ток начинают автоматически уменьшаться.
Загрузка геля. Ширина белковых зон
Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет
тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофо-
резе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон
(пблос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку
геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от со-
става белковой смеси и характера разделения полос. В качестве
ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка
1 мг суммарного препарата белка на 1 см2 сечения геля. Для
кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответ-
ствует примерно^75мкЬ белка, а для трубки диаметром 6 мм •—
до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно
проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке бел-
ковые полосы бывают резкими в передней своей части и размы-
тыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью
преципитации белка в Момент вступления его в гель, когда все
макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная кон-
центрация их сильно увеличивается.
Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких
зон. Ограничения в этом случае накладываются только метода-
ми обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет
во времени, всегда желательно сокращение продолжительности
электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вы-
зывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос.
Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает
немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем
снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следо-
вательно, увеличивается продолжительность электрофореза.
В простом варианте электрофореза желательно наносить бел-
ковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота ис-
ходного слоя препарата была не более 2—3 мм. Выполнить это
условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной
концентрации исходного препарата. На основании приведенных
выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препа-
рате должна составлять 3—5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти
эту трудность; они направлены на концентрирование белкового
препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель.
Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем
область с повышенной напряженностью поля, где белки мигри-
руют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода
из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую
полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади
44
Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4—
30% ПААГ)
а — начало фракционирования белков сыворотки; б — тот же гель после 60 ч диффузии
при комнатной температуре и выключенном напряжении; в — через 6 ч после возобновле-
ния электрофореза
молекулы белка «догонят» впереди идущие молекулы, замедлив-
шие свое движение при вступлении в рабочий гель.
Область с повышенной напряженностью поля можно создать
в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малопод-
вижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход исполь-
зован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного
ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного
препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5—10 раз ме-
нее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на
гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое примене-
ние в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого
приема.
Другой очень эффективный способ сужения полос — исполь-
зование градиента пористого геля. В этом случае при миграции
вдоль геля передний край каждой полосы все время оказывает-
ся в области ч*ь более концентрированного геля, чем задний.
Молекулы- белка, расположенные ближе к переднему краю по-
лосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что
и приводит, к непрерывному сужению полос в ходе их продви-
жения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстри-
ровали специалисты фирмы «Pharmacia» на выпускаемых этой
фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации
ПААГ (4—30%). Начав электрофоретическое фракционировав
ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли'
пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диф-g
фузий полностью размывала сформировавшиеся было белковые!
полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза
удавалось получить четкую картину полос, содержащую все
обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).
45
Введение мочевины и р-меркаптоэтанола.
Некоторые артефакты
Высокая концентрация белков в зонах может привести к их
осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди-
мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко-
торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис-
ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра-
щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент-
рации 4—8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности
деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож-
ность частичного разложения мочевины с образованием циано-
вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно-
сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять
сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением
геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи-
лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход-
ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель-
, ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас-
твор мочевины (ЮМ) суспендируют с бифункциональной ионо-
обменной смолой (например. АП 561x8) в соотношении 5 г
смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе-
ратуре.
fi-Меркаптоэтанол в концентрации 1—5% нередко вносят в
исходный белковый препарат для предохранения его от окисле-
ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер-
гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей
и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева-
ния белкового раствора до 90—100° в присутствии не только ₽-
меркаптоэтанола или его аналогов, но и ДДС-Na.
В некоторых случаях при использовании боратного буфера
или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз-
можно образование комплексов компонентов буфера с белками.
Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь-
ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по-
лосы раздвоятся. Проверить такого рода Артефакт можно по-
вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про-
цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета
при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две
полосы.
В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представ-
ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации
долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо-
соб их удаления — «преэлектрофорез», т. е. пропускание тока
через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу-
чаях для полной очистки от радикалов во'время преэлектрофо-
реза через гель пропускают такие связывающие их соединения,
как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или
гидрохинон.
49
При фракционировании оченьмалых количеств белка может
оказаться заметной сорбция их на геле (белки «размазывают-
ся» по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход-
ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про-
ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он
насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.
Лидирующие красители
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препа-
рат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что
и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом свя-
зываться с белками, а скорость его продвижения по гелю долж-
на быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего
белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно от-
рываться от белков, чтобы его прохождению до конца пласти-
ны или трубки соответствовало использование большей части
находящегося в них геля для фракционирования белков. Быть
может, по ассоциации с велосипедными гонками за лидером, этот
краситель называют лидирующим («tracker dye»).
В щелочных и нейтральных буферах, когда кислые белки за-
ряжены отрицательно и мигрируют к аноду, а также для любых
белков в комплексе с ДДС-Na (см. ниже) используют отрица-
тельно заряженные красители. Наибольшее распространение по-
лучил бромфеноловыи синий, имеющий достаточно сложную
структуру; в его состав, в частности, входят два дибромфеноль-
ных остатка. Иногда используют еще более сложно построен-
ный краситель — ксиленцианол, электрофоретическая подвиж-
ность которого примерно вдвое ниже, чем бромфенолового сине-
го, поэтому его используют при фракционировании крупных бел-
ков и нуклеиновых кислот.
Бромфеноловый синий
Для характеристики электрофоретической подвижности бел-,
ка в данных условиях электрофореза принято указывать отно-
шение расстояния, пройденного белковой полосой от начала рж
бочего геля, к аналогичному расстоянию до полосы красителя
в этом же геле. Это отношение, как и в хроматографии, обозна-
чают Rf.
47
В качестве положительно заряженного красителя для элект-
рофореза в кислой среде, когда белки мигрируют в направлении
катода, используют метиловый зеленый или пиронйн.
Метиловый зеленый
2С1
Пиронин
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРАМ И ЗАРЯДУ
В этом случае в электродных резервуарах и для полимериза-
ции ПААГ используют один и тот же буфер, поэтому такую си-
стему иногда называют непрерывной, или простой. Строго гово-
ря, непрерывность нарушается тем, что буфер, в котором вносят
белковый препарат, с целью концентрирования исходной зоны
разбавляют в 5—10 раз водой.
Подбор оптимальных условий электрофореза сводится к вы-
бору следующих параметров: пористости геля и степени его
сшивки, т. е. значений Т и С (см. главу 1); природы, концентра-
ции и pH буфера; диссоциирующих добавок (если это необхо-
димо); максимально допустимой мощности, напряжения и силы
тока, а также продолжительности разделения; объема и кон-
центрации исходного препарата; процедуры предварительной об-
работки препарата.
Выбор значений Т и С в зависимости от молекулярных масс
разделяемых белков был подробно обоснован в главе 1. Чаще
всего с белками работают при Т=3,54-20 и С=1ч-3.
Выбор рабочего буфера
Для обеспечения хорошей электрофоретической подвижности
и сохранения вместе с тем ощутимых различий в суммарных
^электрических зарядах белков выбирают pH буфера, отличаю-
щийся на 3—4 единицы от среднего значения р/ для белков дан-
ного типа. Если эти значения неизвестны, то желательно соста-
мть себе представление о характере зарядов белков при раз-
личных pH по характеру их сорбции на ионообменных смолах.
Для кислых белков часто используют буфер с pH 8,9, для
щелочных — с pH 4,3—4,5. В качестве слабощелочных буферов
48
для кислых белков йрцменяют Трис-HCl, Трис-глициновый,
Трис-боратный или Трис-барбитуратный. Для щелочных белков
чаще всего используют К-ацетатный и Трис-ацетатный буферы,
а иногда, если белок это выдерживает, то и просто уксусную
кислоту в концентрации 0,9 М или 5% (0,9 М СН3СООН имеет
pH 2,4; 0,1 М— pH 2,87). О преимуществах буферов, не содер-
жащих легко подвижных ионов (С1_, К+), было сказано выше.
Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощ-
ности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность
электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более
высоких значениях напряженности возможны искажения формы
белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, напри-
мер, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см2.
Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см
в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении
120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно
используют меньшие величины тока — около 3 мА на трубку.
Для вертикальной пластины размером 10X14 см и толщиной
1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при
напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены
лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза
они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбран-
ных систем оказываются не очень значительными, так как для
любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция —
использовать максимально возможную напряженность поля при
максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности
тока.
В двух приведенных простейших примерах напряженность
поля в геле можно рассчитывать просто путем деления напря-
жения, указываемого источником тока, на длину геля. При этом
пренебрегают падением напряжения в электродных резервуа-
рах — на участке цепи между электродами и гелем. В том слу-
чае, когда электродные буферы находятся в непосредственном
контакте с гелем, это вполне допустимо.
Иначе обстоит дело в приборах с горизонтально расположен-
ными пластинами. Например, для электрофореза в приборе типа
«Мультифор» при ширине пластины 20 см и толщине геля 1 мм
плотности тока 20 мА/см2 соответствует его сила 40 мА. Паде-
ние напряжения в самом геле длиной 10 см при напряженности
поля 15 В/см составит, очевидно, 150 В. Однако напряжение, ко-
торое надо установить на источнике тока, должно быть сущест-
венно выше ввиду значительного падения напряжения на фити-
лях, соединяющих буферные резервуары с гелем. Это падение
напряжения трудно оценить, поэтому для выяснения значения]
напряженности поля в самом геле прибор «Мультифор» снабжен!
специальным вольтметром' измеряющим падение напряжения
мейсду двумя точками поверхности геля, находящимися на опре-’
деленном расстоянии друг от друга. В рассмотренном примере
использовали Трис-глициновый буфер с довольно высоким элект-
49
рическим сопротивлением. Мощи ость,/расход у ем а я в приборе
«Мультифор», в этом случае составит всего лишь 6 Вт (150 ВХ
Х0.04 А). Иная картина получится, если тот же гель заполиме-
ризовать в 0,1 М Na-фосфатном буфере с pH 7,1. Электропровод-
ность этого буфера довольно высока за счет легко подвижных ио-
нов Na+. Измерения в том же приборе показывают, что уже при
напряженности поля 5 В/см (падение напряжения — 50 В на
пластину) плотность тока в геле возрастает до 100 мА/см2.-Если
довести напряженность поля в геле до 15 В/см, то сила
тока через пластину сечением 2 см2 (20X0,1 см) составит
600 мА. При падении напряжения на геле, равном 150 В, это
привело бы к совершенно неприемлемому уровню тепловыделе-
ния (мощность 90 Вт). Однако дойти до этого режима практи-
чески невозможно ввиду большого падения напряжения на фи-
тилях, их разогрева, обсыхания и дальнейшего увеличения со-
противления. В итоге, при работе с фосфатным буфером прихо-
дится ограничивать силу тока (~200 мА) и работать при пони-
женных значениях напряженности электрического поля. Соот-
ветственно увеличивается и продолжительность электрофореза.
Еще раз подчеркнем, что электропроводность любого буфера
определяется не только концентрацией, но степенью и характе-
ром его ионизации (близостью pH к рКв буфера и подвижностью
образующих ионов). Концентрации рабочих буферов в пределах
0,05—0,1 М можно считать ориентировочно нормальными, хотя
для слабо ионизированных буферов, используемых вблизи гра-
ницы их буферной области, можно встретить в литературе и бо-
лее высокие значения концентрации — вплоть до 0,4 М.
В непрерывной системе сопротивление геля не должно замет-
ным образом изменяться в процессе электрофореза. Как след-
ствие этого, не должна изменяться и расходуемая мощность. По-
вышение напряжения источника, работающего в режиме посто-
янного тока, или уменьшение силы тока при постоянном напря-
жении говорят о каких-то неполадках в электрической цепи, на-
пример: о высыхании фитилей или нарушении контактов между
ними и гелем.
Использование мочевины
Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков
в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации
от 2 до 8 М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый
препарат. В электродные буферы вносить мочевину не нужно,
так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а сле-
повательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводно-
1ти буфера присутствие мочевины практически не сказывается.
аЬднако под влиянием нового окружения могут изменяться рК
отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно
повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность
белков.
50
В концентрированных растворах мочевины происходит дена-
турация белков, часть дисульфидных мостиков рвется и полипеп-
тидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как
хаотический клубок. Денатурация не является полной и может
быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от
природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе
этой концентрации иногда приходится искать компромисс меж-
ду опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой де-
натурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим
только, что образование цианата в растворах мочевины идет ус-
коренно при щелочных pH, поэтому щелочные буферы с'добав-
кой мочевины следует использовать сразу после их приготовле-
ния.
Для составления геля пользуются обычно «маточными» рас-
творами повышенной концентрации. Удобно, например, приго-
товить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (Т=40). На-
помним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мо-
номеров к конечному объему их раствора, а С — отношение мас-
сы NN'-метиленбисакриламида к сумме масс двух мономеров.
Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточ-
ного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего
геля параметры T=10 и С=2,6, то при составлении маточного
раствора можно взять Т=40 и С=2,6. Практически это означа-
ет, что надо отвесить (40x2,6)/100= 1,04 г метиленбисакрилами-
да и 40—1,04 = 38,96 г акриламида и растворить их в воде до ко-
нечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь
двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае по-
лезно проверить, что pH буфера сохраняется при соответствую-
щем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных раство-
ров мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.
Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объ-
еме, который можно не учитывать. Для этого готовят концент-
рированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата,
остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он
не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда
можно пренебрегать.- Выбор содержания персульфата аммония
и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необхо-
димость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля
были подробно рассмотрены в главе 1.
Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее
добавляют во все маточные растворы. При растворении моно-
меров до Г=40 концентрацию мочевины приходится ограничи-
вать значением 2—3 М. Зато маточный раствор буфера можно
приготовить на 10 М мочевине и такой же концентрации раствор
ее использовать для доведения до расчетного объема вместо
воды.
Особо .гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина,
при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присут-
ствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать
S1
фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сна-
чала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом
переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной
кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез
проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кис-
лоте с 5 М мочевины [d’Abbis et al., 1979].
В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе
сохранить ферментативную активность белка — либо для по-
следующей его элюции и использования, либо для обнаружения
с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстра-
та ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом
случае концентрированного раствора мочевины является неже-
лательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет
снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов
зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить
устойчивость фермента при выбранной величине pH рабочего
буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина
pH в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого ще-
лочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].
Иногда следует проверить сохранность ферментативной ак-
тивности белка в ходе электрофореза в связи с возможностью
разобщения фермента с другими белками или необходимыми
для его работы кофакторами. Такую проверку можно проводить
следующим образом: на разных стадиях электрофореза выре-
зать и гомогенизировать участки геля, содержащие соответству-
ющую белковую полосу, и прямо в гомогенате, в сопоставимых
условиях, проверять сохранение активности фермента, исполь-
зуя возможность диффузии субстрата реакции в гель, а ее про-
дукта — из геля.
Загрузка геля и подготовка препарата
Исходный белковый препарат растворяют в том же рабочем
буфере, но меньшей концентрации (в 5—10 раз). По рассмот-
ренным выше причинам это приводит к значительному сужению
исходной зоны белков при ее вступлении в гель. Если электро-
форез идет в присутствии мочевины, то ее концентрация в раз-
бавленном буфере должна быть такой же, как в рабочем буфе-
ре геля. Еще раз подчеркнем необходимость удаления солей из
препарата; в противном случае эффект концентрирования белка
при вступлении в гель будет смазан. Недавно был предложен
простой и остроумный способ диализа белкового раствора в кап-
ле на плавающем мембранном фильтре [Marusyk, Sergeant,
1980].
Иногда проводят предварительное полное восстановление
белка путем прединкуба.ции его в течение ночи при комнатной
температуре в буфере с pH 8,5—9, содержащем 0,1 М р-мерка.ц-
тоэтанола и 9 М. мочевины (щелочное значение pH буфера спо-
собствует восстановительному эффекту 0-меркаптоэтанола).
62
В раствор препарата добавляют до 10% глицерина или саха-
розы, чтобы облегчить его подслаивание под электродный буфер
(см. выше). Наконец, в препарат вносят еще и краситель, на-
пример бромфеноловый синий до концентрации 0,01%. Мигра-
ция этой «лидирующей» зоны до конца геля определяет момент
окончания электрофореза. Заметим кстати, что при последую-
щей фиксации белков бромфеноловый синий обесцвечивается.
Если далее предполагается определение величины то поло-
жение окрашенной полоски сразу после извлечения геля из фор-
мы следует отметить (например, вколоть в гель тонкую прово-
лочку).
Как уже подчеркивалось, препарат должен быть заведомо
свободен от пыли, нерастворенных белков и других частиц. Пос-
ле внесения препарата в трубку или карман пластины на 5—
15 мин включают напряжение, пониженное примерно вдвое про-
тив расчетного. За это время лидирующий краситель должен
полностью войти в гель. Такая процедура улучшает условия
формирования исходной белковой полосы в геле. Затем перехо-
дят на расчетный режим электрофореза по напряжению и силе
тока.
Вопросы фиксации, окраски и других методов обработки бел-
ков после электрореза, как и способы определения радиоактив-
ности и элюции белков, рассмотрены отдельно ниже.
Некоторые примеры
Теперь для иллюстрации целесообразно привести некоторые
примеры, отнюдь не отражающие всего безграничного разнооб-
разия приложений электрофореза белков, даже в его простей-
шем, только что рассмотренном варианте.
Обзорный клинический анализ белков сыворотки человека. В приборе с
горизонтальным гелем (типа «Мультифор») одновременно можно обследоват^
сыворотку кровн 20 пациентов. Условия разделения: гель указанных выше
размеров, Т=3,5, С=2,6; 0,1 М Трис-глициновый буфер, pH 8,9; напряжен-
ность поля 15 В/см, сила тока 45 мА; температура охлаждающей воды 10Q;
преэлектрофорез в течение 30 мин при силе тока 50 мА. Препараты сыворотки
разбавляют в отношении 1 :3 тем же буфером, разведенным в 10 раз. Объем
каждого препарата 5 мкл. В первые 10 мин электрофореза силу тока снижа-
ют до 20 мА. Скорость миграции бромфенолового синего 4,5 см/ч; общая про-
должительность электрофореза 1,3 ч. На рис. 17, А сопоставлены картины
фракционирования белков сыворотки 10 пациентов с различными заболева-
ниями (по два препарата от каждого). Крайние слева и справа пары треков
содержат сыворотку нормальных доноров. Направление миграции белков —
снизу вверх. Интенсивные пятна вверху — низкомолекулярные компоненты
сыворотки.
Заметно лучше, особенно в области крупных белков, те же препараты
разделяются в более концентрированном геле (Т=7,5; С—2,6), однако в этом
случае часть наиболее крупных белков выпадает в осадок на границе геля
53

2
**** Ш
ЙИШ «ЙЖ
А
..^lir...?
Рис. 17. Фракционирование белков сыворотки пациентов с различного рода заболеваниями в горизонтальной пластине
на приборе «Мультифор» [Fehrnstrom, Moberg, 1977]
А — 3,5%-ный ПААГ; Б — 7,5%-ный ПААГ; миграция белков — снизу вверх

(рис. 17,6). Скорость миграции бромфеноловоГо синего 1,8 см/ч при рабочей
силе тока 40 мА; продолжительность разделения 2,8 ч [Fehrnstrom, Moberg,
1977].
Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
5%-ный (0,9 М) раствор уксусной кислоты с добавлением 4—
8 М мочевины часто используют для электрофоретического
фракционирования гистонов [Panyim, Chalkley,- 1969]. Молеку-
лярные массы гистонов лежат в диапазоне 11—22 тыс. дальтон,
поэтому для их разделения используют мелкопористые гели
(7= 15-5-20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-
ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью
обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в
этой простой системе разделяются довольно плохо. От них за-
метно отстает относительно более крупный гистон Н1. В каче-
стве лидирующего красителя используют пиронин.
Недавно Спайкер описал систему фракционирования гисто-
нов в двуступенчатом ПААГ с «кислой мочевиной». Основной
рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в
0,9 М CHSCOOH с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована
полоска формирующего геля: 7,5% ПААГ в 0,375 М CHjCOOK,
pH 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напря-
жении — за 1—2 ч. Качество полос и их разрешение в такой си-
стеме сильно выигрывают [Spiker, 1980].
Электрофорез «в кислой мочевине» успешно используют и
для фракционирования других щелочных белков: рибосомных,
факторов инициации трансляции, субъединиц РНК-полимеразы
и др. Впрочем, намного более совершенное разделение сложных
смесей этих белков происходит при двумерном электрофорезе,
когда фракционирование «в кислой мочевине» используют в од-
ном из направлений. Ниже, при анализе метода двумерного
электрофореза, будут даны соответствующие ссылки.
Если есть опасение, что воздействие уксусной кислоты на бе-
лок может оказаться слишком жестким, то ее 50%-ный раствор
титруют КОН до pH 4,3—4,5. При этом надо иметь в виду, что
электропроводность такого буфера будет за счет ионов калия
значительно выше, чем одной уксусной кислоты, что потребует
соответствующего уменьшения напряжения, подаваемого на
гель.
Описано электрофоретическое разделение гистонов и при
pH 7,8 (0,18 М глицилглицин, титрованный NaOH), которое ис-
пользуется для изучения гистон-гистонового взаимодействия и
некоторых лабильных модификаций гистонов. Все гистоны, кро-
ме Н1, при этом почти одинаково и относительно слабо заряже-
ны, поэтому фракционирование идет главным образом по моле-
кулярной массе. Добавление мочевины предупреждает агрега-
цию гистонов, однако несколько изменяет взаимное расположе-
ние полос. Мочевина разворачивает гистоны Н2А, Н2В и НЗ,
но не влияет на конфигурацию Н1 и Н4. По-видимому, эти по-
55
следние развернуты и в отсутствие мочевины [Hoffman, Chalk-
ley, 1976].
Щелочные белки рибосом удается разделять не только в кис-
лых, но и в слегка щелочных условиях, например в Трис-борат-
ном буфере, pH 8,7. Электрофорез проводят в 4 %-ном ПААГ
[Howard, Traut, 1973]. Исходный белковый препарат полимери-
зуют в геле с мочевиной на середине высоты трубки. Вблизи изо-
электрической точки часть рибосомальных белков оказывается
заряженной отрицательно, а. другая — положительно. Миграция
в электрическом поле идет в обе стороны, к катоду и аноду. Ще-
лочные белки рибосом при pH 8,7 растворяются с трудом и толь-
ко в присутствии 6 М мочевины, которую вводят также и в бу
фер геля.
Электрофорез хроматина. Электрофоретическое фракциони-
рование хроматина после его обработки микрококковой нуклеа-
зой ведут в буфере низкой ионной силы, например в 0,01 М три-
этиламмоний-НС1 (pH 7,6; 2 мМ ЭДТА), что обусловлено плохой
растворимостью хроматина в более концентрированных буферах.
Хроматин в целом (благодаря ДНК) заряжен отрицательно и
мигрирует к аноду. Удается разделить субнуклеосомы, моно-
нуклеосомы с различным содержанием ДНК и белков, лежащих
вне их «ядра» («core»), а также ди- и тринуклеосомы. Ввиду
малой электропроводности разбавленного буфера при напря-
женности 15 В/см сила тока через трубку диаметром 6 мм со-
ставляет всего лишь 3 мА. Электрофорез в трубках длиной 7 см
занимает 1,5 ч.
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО РАЗМЕРУ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДДС-Na
Существо метода
Рассмотренный выше электрофорез белков в простой систе-
ме удобно использовать для их разделения, но не для характери-
стики. Электрофоретическая подвижность каждого белка в про-
стой системе зависит одновременно и от его суммарного заряда,
и от молекулярной массы, и от конфигурации, и, наконец, от
жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих
факторов неизвестен и может существенно изменяться в зави-
симости от условий электрофореза. Для установления строгой
количественной корреляции между каким-либо одним из пере-
численных параметров и электрофоретической подвижностью
белка надо исключить влияние всех остальных.
Электрофорез в ПААГ с использованием ДДС-Na позволяет
фракционировать белки в зависимости от значений, только од-
ного параметра — их., молекулярной массы. Для этого белки в
исходном растворе препарата обрабатывают не менее чем трех-
1 кратным избытком ДДС-Na. За счет гидрофобных взаимодей-
ствий детергент примерно одинаково связывается с подавляю-
щим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДДС-Na на
66
1 мг белка [Reynolds, Tanford, 1970]. Огромный избыток пол-
ностью диссоциированных остатков сульфокислоты, привноси-
мых с детергентом, в большинстве случаев делает несуществен-
ной роль собственного заряда белка. Постоянство соотношения
детергент/белок делает практически одинаковым отношение от-
рицательного заряда к массе для любого белка, даже для гисто-
нов с их заметным собственным положительным зарядом. Бла-
годаря электрическому отталкиванию
тесно расположенных по поверхности
белка остатков серной кислоты поли-
пептидная цепочка распрямляется и
приобретает форму жесткого эллипсои-
да вращения. Его малая ось имеет дли-
ну 1,6 нм, а размер большой линейно
связан с числом аминокислотных остат-
ков, а следовательно, с молекулярной
массой белка. Это справедливо лишь
длОеразвётвленных полипептидов, ли-
шенных дисульфидных мостиков, поэ-
Рис. 18. Линейная завися-
мость логарифма молеку-
лярной массы (lg М) от от-
носительного расстояния
миграции белков (Rf) при
электрофорезе в ПААГ
тому одновременно с обработкой ДДС-
Na необходимо обеспечить полную де-
натурацию белка и разрыв всех S—S-
связей. С этой целью белковый препа-
рат обрабатывают высокой концентра-
цией 0-меркаптоэтанола при повышен-
ной температуре.
Электрофоретическая подвижность
(и') жесткого комплекса белок—ДДС-Na оказывается связан-
ной с молекулярной массой белка (М) простым соотношением:
и'=А—В lg М, где Л и В — коэффициенты, зависящие от порис-
тости геля, температуры и других условий эксперимента. Вели-
чину и' удобнее представлять в относительных единицах, выра-
жающих отношение путей миграции белка и бромфенолового
синего за время электрофореза, т. е. в значениях введенной ра-
нее величины Rf. Такая замена отразится только на значениях
коэффициентов Л и В. Нет смысла определять эти коэффициенты
в каждом опыте. Одновременно с фракционированием исследуе-
мой смеси можно провести электрофорез набора белков-«марке-
ров», молекулярные массы которых точно известны. Разумеется,
вся предварительная обработка ДДС-Na и меркаптоэтанолом
должна быть строго одинаковой для исследуемого препарата и
маркеров. При электрофорезе в пластине для смеси маркеров
можно отвести отдельный трек. При использовании трубок мар-
керы лучше добавить прямо в препарат, так как нельзя гаран-
тировать строгой идентичности условий электрофореза в двух
разных трубках, д
По окончании электрофореза, измерив пути миграции бром-
фенолового синего и каждого из маркеров, можно рассчитать
значения Rf и, зная молекулярные массы маркеров, построить
S7
экспериментальную зависимость 1g М от Rf для данного опыта.
Если пористость геля выбрана удачно (см. ниже), такая зави-
симость получается линейной (рис. 18). Определив теперь Rt
для интересующего нас белка, из графика можно найти для него
величину IgAf и подсчитать М. Положение и наклон прямой
на графике изменяются при вариации концентрации ПААГ и
других условий эксперимента, поэтому нельзя пользоваться ка-
кой-либо стандартной калибровкой. График зависимости lg М
от Rf надо строить для каждого опыта. Отметим также, что при
определении R} надо вводить поправки на набухание или съежи-
вание геля при фиксации, окраске белков и удалении красителя,
приводя все к исходному линейному размеру.
Метод определения молекулярной массы белков электрофоре-
зом в ПААГ с ДДС-Na завоевал себе прочную репутацию и ис-
пользуется очень широко. Тем не менее следует проявлять из-
вестную осторожность. Исследуемый белок может оказаться
принадлежащим к той, по-видимому, сравнительно немногочис-
ленной, категории белков, для которой количественное соотно-
шение в комплексе с ДДС-Na существенно отличается от 1 : 1,4.
Есть данные о том, что на полноту комплексообразования с
ДДС-Na может влиять распределение зарядов по полипептид-
ной цепочке. Показано, например, что обработка рибонуклеазы
малеиновой кислотой снижает количество связывающегося с ней
ДДС-Na с 1,9 до 0,3 г на 1 г белка. Такая обработка не изме-
няет заметным образом молекулярной массы рибонуклеазы, но
вносит отрицательный заряд карбоксила на место положитель-
ного заряда аминогруппы. С другой стороны, на связывании
ДДС-Na с лизоцимом обработка малеиновой кислотой никак не
сказывается [Tung, Knight, 1972]. Ненормальное связывание
ДДС-Na может быть также обусловлено необычной обогащен-
ностью белка какой-либо гидрофильной аминокислотой. Глико-
протеиды хуже связываются с ДДС-Na, чем чистые белки.
Разной степенью связывания ДДС-Na, по-видимому, следует
объяснить и успешное разделение а- и p-цепей глобина кролика
электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ с ДДС-Na. Различие моле-
кулярных масс этих цепей (15419 и 16 000) вряд ли само по
себе могло бы обеспечить это разделение (Wood, Shaeffer, 1975].
Недавно было показано, что единственная мутационная замена
аминокислоты (Арр->-Цис) в белке с молекулярной массой 26 000
приводит к кажущемуся изменению этой величины на 1000. Су-
щественно отметить, что такое изменение связано с заменой
только одного из нескольких остатков аргинина, входящих в со,-
став белка. Следовательно, в этом случае играет роль еще и
окружение аргинина [Noel'et al., 1979].
Рассмотренные примеры не могут дискредитировать плодо-
творный метод определения молекулярной массы белков элект-
рофорезом с участием ДДС-Na. Они лишь указывают на необхо-
димость некоторой осторожности и критичности в оценке ре-
зультатов эксперимента, особенно с малоизученными белками.
68
Выбор пористости геля
При данной пористости (концентрации) геля описанная выше
линейная зависимость имеет место только для белков, молеку-
лярные массы которых лежат в определенном интервале. Слиш-
ком крупные для данного геля белки, очевидно, вовсе не смогут
мигрировать в нем. Подвижности слишком малых белков, для
которых поры геля практически не создают препятствий, будут
зависеть не от их молекулярной массы, а только от отношения
заряда к массе. Как указывалось, в присутствии ДДС-Na это
отношение одинаково для большинства белков. Для ориентиров-
ки можно назвать некоторые цифры. Так, для одинаково сши-
тых гелей (С=3,3) были рекомендованы следующие значения Т
в зависимости от молекулярной массы белков (М) [Dunker,
Rueckert, 1969]:
Т, % 5 10 15
М, тыс. дальтон 18—330 10—100 10—60
Фирма BDH для своего стандартного набора белков-марке-
ров в интервале М 56—280 тыс. дальтон предлагает использо-
вать гели с 7=3,3, а в интервале 14—72 тыс.— с 7=10; в обоих
случаях С=2,6. Отметим попутно, что эффект торможения миг-
рации биополимеров в слабосшитых гелях с С <2,6 быстро ос-
лабляется с уменьшением С при неизменном значении Т. По-
видимому, в этом случае ярко проявляется способность жестко-
го комплекса белок—ДДС-Na раздвигать гибкие, слабосшитые
нити акриламида.
Для определения молекулярных масс пептидов та же фирма
выпускает набор стандартных фрагментов миоглобина с диапа-
зоном М 2,5—17 тыс. Для него и соответствующих пептидов ре-
комендуется использовать сильно сшитый гель (7=12,5; С=
= 9), содержащий 8 М мочевину, которая усиливает торможение
малых пептидов в геле.
О важности правильного выбора пористости геля можно су-
дить из сопоставления двух картин разделения набора из семи
маркерных белков (рис. 19) [Fehrnstrom, Moberg, 1977]:
Белок Af, дальтон IgM Белок Af, дальтон 1g м
Цитохром с 11 700 4,068 Овальбумин 43000 4,634
Миоглобин 17 200 4,236 у-Глобулин (Н-цепь) 50000 4,699
у-Глобулин (L-цепь) 23 500 4,371 Человеческий альбумин 68 000 4,832
Карбоангидраза 29 000 4,462 Трансферрин 77000 4,886
Разделение вели в приборе «Мультифор», использовав 5%- и
10%-ный ПААГ. Легко видеть, что в 5%-ном геле миоглобин
движется почти с такой же скоростью, как и цитохром с. При
перенесении результатов этих опытов на графики (рис. 20) по-
лучается, как и следовало ожидать, что точка, отвечающая по-
59
Рис. 19. Влияние Порйстб-
сти геля на характер миг-
рации различных белков-
маркеров [Fehrnstrom, Mo-
berg, 1977]
/ — цитохром с; 2 — миоглобин;
3 — у-глобулин; 4 — карбоан-
гидраза; 5 — овальбумин; 6 — че-
ловеческий альбумин; 7— тран-
сферрин; 8 — смесь всех марке-
ров. А—5%-ный ПААГ; Б —
10%-ный ПААГ
Рис. 20. Графики зависимо-
сти lg М от построенные
по данным рис. 19
ложению цитохрома с в 5%-ном геле, выпадает из прямой ли-
нии, проходящей через все остальные точки, тогда как для 10% -
ного геля она оказывается на такой прямой.
Присутствие мочевины и неионных детергентов
Хотя для коротких олигопептидов присутствие мочевины ока-
зывается полезным, при электрофорезе белков ее не следует
вводить в гель. Мочевина вносит конформационные изменения в
структуру белка. Влияние этих изменений как на степень связы-
вания ДДС-Na, так и на характер миграции комплекса белок-
ДДС-Na в геле еще не изучено.
во
Из аналогичных соображений следует удалять из белкойбго
препарата перед его обработкой ДДС-Na другие детергенты, в
частности неионные. Иногда это удается добиться за счет вне-
сения в препарат еще большего избытка ДДС-Na, с тем чтобы
он вытеснял неионный детергент из связи с белком, образуя с
ним свободно растворенные смешанные мицеллы. Такие мицел-
лы могут «уходить» от комплекса белок—ДДС-Na, быстро миг-
рируя в электрическом поле [Nielsen, Reynolds, 1978]. Широко
используемый для .растворения мембранных белков "Тритон
X-100 сильно мешает проведению, электрофореза, в. ПАА Г с
ДДС-Na. Его можно извлечь из белкового препарата экстрак-
цйёи~хлороформом. Чтобы предотвратить выпадение плохо рас-
творимых белков в осадок, перед экстракцией к препарату сле-
дует добавить ДДС-Na до 1%, который в хлороформ не перехо-
дит [Horikawa, Ogawara, 1979].
Выбор рабочего буфера геля
Из изложенного ясно, что pH буфера в этом варианте элект-
рофореза не играет существенной роли, так как заряд белка оп-
ределяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают
с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионер-
ской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто ис-
пользуют 0,1 М Na-фосфатный буфер, pH 7,1. Его концентрация
обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в
электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве по-
следнего берут 0,01 М Na-фосфат, pH 7,1. Как уже указывалось,
такое различие обеспечивает концентрирование исходной поло-
сы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однакд
ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера на-
пряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см,
что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат-
ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий бу-
фер, например имидазолфосфатный, pH 7. Молярность рабочего
буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препара-
та концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить
напряженность поля и сократить продолжительность электрофо-
реза.
В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер,
что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентраци1у 0,1%7
Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля
одно время оспаривалась [Stoklosa* Latz, 1974]. Авторы цити-
руемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком
прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофоре-
за. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходи-
мость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный
буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na
может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда
скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-
61
Rd, последний будет терять ДДС-Na й изменять свою подвиги -
ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было пред-
ложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного
Электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной об-
работки ДДС-Na и p-меркаптоэтанолом авторы сначала вели
электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован-
ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (pH 7) с 0,1%
ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре
заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быст-
рой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем
от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло
уже по заряду белков. При этом pH буфера можно с самого на-
чала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделе-
ния, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na pH роли
не играет.
Подготовка белкового препарата
На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопо-
ставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции
можно только в том случае, когда есть уверенность в полной де-
натурации белка при обработке его ДДС-Na.
Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор
процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против
0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% 0-мер-
каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации
ДДС-Na и 0-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и
прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация
белка при этом должна составлять около 1 мг/мл (Weber et al.,
1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз,
прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что
трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитиче-
скую активность в присутствии 1 % ДДС-Na, но прогрев при
100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Por-
ter, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюда-
ется неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100°
можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нане-
сением препарата на гель в него дополнительно добавляют р-
меркаптоэтанол до концентрации 4—5%.
Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода
рекомендуют при определении молекулярной массы малоизу-
ченного белка проверить полноту его денатурации. Для этой це-
ли они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка
по более сложной прописи, гарантирующей его полную денату-
рацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный 0-меркаптоэтанол с по-
следующим алкилированием йодацетамидом). После этого фор-
мируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют Картины
электрофореза белка, обработанного обычным способом, и кон-
трольного препарата.
62
С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи-
ды, при кипячении с 1% ДДС-Na и 1% р-меркаптоэтанола мо-
гут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях прихо-
дится уменьшать концентрацию p-меркаптоэтанола или не вво-
дить его совсем.
При повышенной температуре иногда обнаруживается уси-
ленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация
белка многократно увеличивает его доступность"для атаки про-
теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эф-
фективных Ингибиторов. Если опасность протеолиза существу-
ет, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные
ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл)
и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).
Проведение электрофореза
Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего
напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то
здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве-
дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро-
водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро-
форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за
собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень
сильно зависит от температуры!. При длительном электрофоре-
зе электродные буферы следует обновлять.
Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение,
ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным;
даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные'
различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо-
действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности
определения молекулярной массы малых белков и олигопепти-
дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М
мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля.'
В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви-
ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов
с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая
линейная зависимость lg М от Rf [Kato et al., 1975], однако точки
для инсулина (Л4=5782) и глюкагона (Af=3483) из графика
этой зависимости выпадали.
Разделение улучшается в случае малых исходных количеств
белка (1—5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око-
ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного
белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот-
ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует
поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения
молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге-
лях с различным содержанием акриламида.
В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список
рколо 40 стабильных белков, которые можно использовать в кв-
99
честве стандартных маркеров в интервале М 12—200 тыс. даль-
тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно
при ЛГ>70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому
фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке-
ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на
основе только одного белка с хорошо известным значением М,
сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров
обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое
время был описан и в лабораторной практике (Inouye, 1971].
Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан-
зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик-
сировать их.положение при УФ-освещении без окраски' геля.
При определении молекулярной массы коллагена использо-
вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно- в том
случае, если строить график зависимости от расстояния мигра-
ции не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп-
тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско-
рость миграции зависит именно от размера молекулы белка —
переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее
значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав
коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици-
на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].
Окрашивание и элюция белков
Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах,
но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с ис-
пользованием ДДС-Na, сделать именно, здесь
После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашива-
ют, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-25Q
(см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% мета-
нола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а
затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и
добавкой ионообменника AG 501X8 для связывания красителя.
Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Од-
нако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным
детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и
фиксации белков. Для малых белков фиксация при окрашива-
нии может оказаться'ненадежной. Их лучше фиксировать пред-
варительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-
те (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и пре-
пятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания.
10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше
это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в
течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, по-
этому его целесообразно включить в фиксирующий белки рас-
твор.
Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в
0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до-
64
вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распре-
деление между жидкой фазой и белками в пользу последних.
Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от
красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски не-
сколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ни-
же будут оценены возможности повышения ее чувствительности
с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхло-
рид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь умест-
но отметить, что их присоединение к белкам исходного препара-
та не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.
Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из под-
робно рассмотренных ниже способов, в частности повторной
элюцией-из кусочков геля встряхиванием в течение б—12 ч при
37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с
0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя
бикарбонат, и растворяют.в воде до 0,1 исходного объема. За-
тем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению
к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо
растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и
промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более
полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный,
как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объе-
ма, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната' аммония с 6 М
мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции бел-
ка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do-
wex 1x2 (200—400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером.
Мочевину затем удаляют диализом.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подав-
ляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной
Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка
ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы
ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется
всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение
исходной белковой полосы можно получить просто за счет раз-
бавления буфера, в котором вносится препарат. Больший инте-
рес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка
ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот при-
ем будет рассмотрен ниже.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно
использован для фракционирования белков хроматина без их
предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч
против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% 0-меркаптоэта-
нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч — против
свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого
его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще
2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесяте-
ро меньше ДДС-Na и 0-меркаптоэтанола. При такой обработке
ДНК отделяется от белка й не мешает протеканию последующе-
го электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].
3 Л. А. Остерман 55
ступенчатый электрофорез
(DISC-ELECTROPHORESIS)
Отличительной особенностью этой системы является полиме-
ризация в одной трубке или пластине двух гелей: рабочего, мел-
копористого, и непосредственно над ним — «формирующего»,
крупнопористого. Кроме степени пористости, эти два геля резко
различаются по pH и молярности буферов, в которых они поли-
меризуются. Отсюда и название системы — ступенчатый элек-
трофорез. По-английски его сокращенно называют «disc-electro-
phoresis» (от слова «discontinuous» — прерывистый). Этот вид
электрофореза был предложен Орнстейном и Дэвисом еще в са-
мом начале становления метода электрофореза в ПААГ [Ornste-
jn, Davis, 1964].
Пористость, длина и выбор буфера для нижнего (рабочего)
геля определяются точно такими же соображениями, что и для
простого непрерывного электрофореза. Единственное, что здесь
своеобразно — это обязательное использование в составе рабо-
чего буфера быстроподвижных ионов, мигрирующих в том же
направлении, что и белки, например: иона С1~ для щелочных бу-
феров или иона К+—;для кислых. Выше отмечалось, что ис-
пользование таких ионов невыгодно, так как приводит к огра-
ничению напряженности поля и скорости миграции белков.
Однако в данном случае использование «быстрых» ионов дик-
туется самим существом метода, как это будет ясно из дальней-
шего изложения. Заметим, кстати, что если концентрация этих
ионов и зависит от pH буфера, то их электрофоретическая под-
вижность от pH совершенно не зависит.
В формирующем геле небольшой протяженности (1—3 см)
фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение
этого геля — собрать смесь всех белков перед переходом в ра-
бочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может со-
ставлять сотые доли миллиметра независимо от первоначаль-
ного объема препарата. Для рабочего геля она является исход-
ной зоной для фракционирования, а это резко повышает его
разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле
белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сде-
лать минимальной (7=2,54-3). Формирующий гель -полимери-
зуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель
(следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), од-
нако по концентрации и значению pH эти буферы не одинаковы.
Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный,
буфер рабочего геля — щелочной или кислый. Смысл этого раз-
личия будет раскрыт ниже.
Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор
электродного буфера, находящегося в контакте с белковым пре-
паратом и формирующим гелем («верхнего» буфера в случае
‘ использования системы с вертикальным расположением геля).
В этом буфере подвижность иона, мигрирующего в том же на-
ев
правлении, что и белок, должна сильно зависеть от рЙ. Для
этого удобно использовать цвиттерионы, например простые ами-
нокислоты (глицин и 0-аланин). Их изоэлектрические точки ле^
жат в нейтральной области pH (для глицина р/=5,97). При
этом диссоциации карбоксила с потерей протона и .появлением
отрицательного заряда соответствует рК0,=2,34, а ионизации
концевой аминогруппы с присоединением протона и образова-
нием положительного заряда — рКвз=9,6. При pH 5,97 все мо-
лекулы глицина ионизированы по обоим концам и их суммар-
ный заряд равен нулю.
При сдвиге pH окружающей среды в щелочную сторону про-
исходит нейтрализация части молекул глицина по аминогруппе,
в то время как карбоксильные остатки всех молекул сохраняют
свой отрицательный заряд. Процесс этот — чисто статистиче-
ский, и для каждой отдельной молекулы можно говорить толь-
ко о большей или меньшей вероятности того, что она превратит-
ся в отрицательный ион или останется нейтральной. В совокуп-
ности же множества молекул при данном pH заряд будет нести
вполне определенная их доля. При незначительном сдвиге pH от
изоэлектрической точки, например при pH 6,8, эта доля будет
очень мала. При рН=рКв, (9,6), согласно определению рК, уже
половина всех молекул должна быть нейтрализована по амино-
группе и, следовательно, заряжена отрицательно. Для фигури-
рующих ниже значений pH 8,3 и 8,9 количество отрицательных
ионов глицина будет меньше 50%, но все-таки значительным.
Описанные, изменения доли заряженных молекул глицина
(или аланина) используются в системе ступенчатого электрофо-
реза. Для разных ступеней используют разные буферы, содер-
жащие, однако, в своем составе одно и то же слабое основание
или слабую кислоту, обеспечивающие собственно буферный эф-
фект: в щелочной буферной системе, где удобно фракциониро-
вать кислые белки, это может быть Трис, а в кислой системе
для разделения гистонов — уксусная кислота.
Рассмотрим для примера щелочную систему Орнстейна и
Дэвиса (рис. 21). Верхним буфером служит 0,005 М Трис, тит-
рованный добавлением глицина до pH 8,3. Глицин по отноше-
нию к Трису выступает в роли слабой кислоты. Для достижения
pH 8,3 концентрацию глицина приходится довести до 0,038 Af.'
При pH 8,3, как мы видели, значительная доля его молекул
должна быть заряжена отрицательно, что обеспечивает хорошую
электропроводность верхнего электродного буфера.
Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в
0,0625 М Трис-HCl, pH 6,8. В таком же буфере вносят и препа-
рат (с добавкой, как обычно, до 10% глицерина или сахарозы).
Первоначально электропроводность этого буфера будет тоже
высокой благодаря ионам С1_. Их концентрация при pH 6,8 до-
статочно высока (см. выше).
Наконец, рабочий гель полимеризуют в 0,375 М Трис-HCl,
pH 8,9. Обращает на себя внимание высокая концентрация бу-
«7
з*
Рис. 21. Схема ступенчатого электрофореза
А — перед включением напряжения; В — момент концентрирования препарата в тонкую
исходную полоску; В — фракционирование белковых зон
фера, необходимая по двум причинам. Во-первых, при pH 8,9
буферная емкость Трис-HCl уже мала, а в этом буфере должны
мигрировать сконцентрированные белковые полосы. Во-вторых,
относительное содержание ионов С1~ при таком значении pH не-
велико, и для обеспечения необходимой электропроводности кон-
центрацию буфера приходится увеличивать. Нижний электрод-
ный буфер существенной роли не играет. Например, можно
взять 0,1 М Трис-НС!, pH 8,1.
Теперь рассмотрим процессы, протекающие в этой системе
после включения электрического напряжения. В первый момент
напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступе-
нях системы и начнется переход белков из буфера препарата в
формирующий гель. В это же время в верхней части формирую-
щего геля начнет развиваться новая ситуация. Под действием
поля ионы С1_ будут быстро уходить в направлении рабочего
геля, а на их место из электродного буфера будут поступать
ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с pH 6,8. При
этом, как следует из изложенного, большинство молекул глици-
на восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и пере-
станет участвовать в проведении тока. Сопротивление буфера
препарата, а за ним и верхней части формирующего геля резко
возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. Не-
68
многочисленные при pH 6,8 заряженные молекулы глицина
ускорят свое движение к аноду, обеспечивая непрерывность
электрического тока по всему гелю.
Неправильно представлять себе дело так, что только малое
число молекул глицина будет мигрировать в поле, а остальные
останутся на месте. Состояние диссоциации-ассоциации амино-
групп— это статистическое равновесие, захватывающее всю со-
вокупность молекул глицина, находящихся в растворе. Поэтому
все они (рывками) будут мигрировать в направлении анода, но.
в каждое мгновение электрический заряд будет переносить лишь
небольшое число молекул, заряженных именно в это мгновение.
Но вернемся к событиям, развивающимся в геле.
Мы видели,, что в верхней части формирующего геля возни-
кает область повышенной напряженности поля, в которой ока-
зываются и успевшие перейти в гель белки. Естественно, что
они мигрируют в ней относительно быстро. Так же быстро идет
переход белков из буфера препарата в формирующий гель.
Впрочем, белки мигрируют все же медленнее, чем ионы глици-
на, так как отношение заряда к массе у белков меньше. Описан-
ные явления постепенно распространяются на весь формирую-
щий гель. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого ге-
ля. Вплотную за ними к границе с рабочим гелем подходит
глицин. Теперь весь формирующий гель находится в зоне повы-
шенной напряженности поля. В этом поле ускоренно движутся
белки, уже перешедшие из исходного раствора препарата в фор-
мирующий гель. Никакого их концентрирования пока не проис-
ходит; оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие моле-
кулы белка достигнут границы рабочего геля. Тем временем
линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в рабочий гель,
где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напря-
женности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина ока-
зываются при pH 8,9, который обеспечивается степенью иони-
зации и высокой концентрацией Триса. При этом pH большая
часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ио-
ны. Эти нейтральные молекулы оказались в рабочем геле в силу
статистического характера миграции глицина, который был
описан выше. Электропроводность Трис-глицинового буфера в
верхней части рабочего геля оказывается столь же высокой, как
и Трис-HCl (этого добились подбором pH 8,9 и концентрации
всех компонентов системы). Напряженность электрического по-
ля в рабочем геле соответственно остается низкой, и это обстоя-
тельство играет решающую роль в концентрировании белков.
Впереди идущие молекулы белков достигают границы раз-
дела и переходят в. рабочий гель, где попадают в область низ-,
кой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает.
Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в
объеме формирующего геля, т. е. в области высокой напряжен-
ности поля, и движутся' быстро. Потом и они входят в рабочий
гель и почти останавливаются. Это происходит со всеми моле-
69
Пулами препарата. Находившиеся далеко сзади молекулы бел-
ка догоняют (почти догоняют) ушедшие вперед молекулы. Весь
исходный препарат, каков бы ни был его начальный объем, в
самом верху рабочего геля стягивается в тонкую полоску бел-
ков. Отсюда и начинается их медленная миграция в мелкопори-
стом геле при щелочном значении pH, т. е. фракционирование
белковой смеси. Между тем граница раздела ионов хлора и гли-
цина уходит все дальше вперед, и через какое-то время весь ра-
бочий гель оказывается в Трис-глициновом буфере примерно с
тем же pH. Замена буфера не сказывается на разрешающей
способности рабочего геля, а то обстоятельство, что фракцио-
нирование белков начинается с узкой исходной зоны, дает колос-
сальный выигрыш — разрешающая способность системы в целом
резко увеличивается. Для полноты картины отметим, что заря-
женные ионы Трис+, участвуя в поддержании pH буфера, будут,
замещая друг друга, медленно мигрировать вверх, в сторону ка-
тода. Ввиду малой подвижности этих ионов их вклад в электро-
проводность невелик.
Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко
представить себе и для кислого буфера рабочего геля, В качест-
ве слабой («буферной») кислоты можно использовать уксусную,
а роль быстро мигрирующего иона «поручить» К+. В качестве
цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, бе-
рут 0-аланин. Подбор количественного соответствия концентра-
ций и pH дает следующую пропись для построения системы. Для
получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор ук-
сусной кислоты титруют КОН до pH 4,3. Буфер формирующего
геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора ук-
сусной кислоты до pH 5,8. Буфер верхнего электрода (анода)
получают из 0,Х>35 М водного раствора ^-аланина, титруя его до
pH 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует
не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что pH
буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков
оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно
на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и на-
столько же ниже — для кислого).
Мочевину, детергенты (ДДС-Na, Тритон Х-100 и Твин-80), а
также p-меркаптоэтанол или дитиотреитол можно вводить в со-
став буферов обоих гелей, например: с целью растворения труд-
норастворимых белков или для защиты их от окисления.
Как уже упоминалось, ступенчатый электрофорез можно ис-
пользовать и для разделения белков, находящихся в комплексе
с ДДС-Na. Такая система была разработана Лэммли еще де-
сять лет назад [Laemmli, 1970]. С тех пор она приобрела чрез-
вычайную популярность. Хотя выше и было вйсказано некото-
рое сомнение в том, что ее использование всегда оправдано, си;
стема заслуживает подробного описания.
В качестве рабочего геля в ней используют 10%-ный ПААГ,
формирующего — 3%-ный; для обоих гелей С=2,6. Буфером
70
рабочего геля, как и у Ористейна и Дэвиса, служит 0,375 М
Трис-HCl (pH 8,8) с добавлением ДДС-Na до 0,1 %. Попутно
отметим, что 0,1%-ный ДДС-Na не препятствует развитию бак-
териальной флоры при комнатной температуре, поэтому его на-
до хранить на холоду. Электрофорез ведут в трубках диаметром
6 мм и длиной 15 см. Рабочий гель полимеризуют на длину
10 см, формирующий — на 1 см. Для формирующего геля Лэм-
мЬи использовал буфер вдвое большей концентрации, чем Орн-
стейн и Дэвис (0,125 М Трис-HCl, pH 6,8, с 0,1% ДДС-Na).
Для полимеризации в. оба геля он вносил по 0,025% персульфа-
та аммония и ТЕМЕД. Верхний электродный буфер Лэммли
содержал Трис впятеро более высокой концентрации, чем цити-
ровалось выше (0,025 М), титрованный глицином до той же ве->
личины pH (8,3), чему соответствовала и впятеро более высокая
концентрация глицина (0,192 М). 0,1% ДДС-Na присутствовал
и в этом буфере.
Белковый препарат (0,2—0,3 мл) вносят в 0,0625 М Трис-
HCl (pH 6,8), содержащем 10% глицерина и 0,001% бромфено-
лового синего. В препарат добавляют ДДС-Na до 2% и р-мер-
кацтоэтанол до 5%, а затем прогревают его в течение 1,5 мин
на кипящей водяной бане. Цель такой обработки была указана
выше. Если исходный белковый препарат имеется в виде осадка-,
то его следует сначала растворить в буфере, а потом уже до-
бавлять ДДС-Na из концентрированного раствора. В противном
случае на поверхности осадка комплекс белок—ДДС-Na может
образовать корку, препятствующую его полному растворению
(Maizel, 1971].
Электрофорез при силе тока 3 мА на трубку занимает 7 ч.
Фиксацию белков в 50%-ном растворе ТХУ ведут в течение ночи,
окрашивание свежеприготовленным 0,1%-ным раствором СВВ
R-250 в 50%-ной ТХУ — в течение часа при 37°. Избыток краси-
теля из геля вымывают диффузией в 7 %-ной уксусной кислоте.
Система ЛэммЛи так же успешно используется для электро-
фореза в пластинах ПААГ. Для иллюстрации на рис. 22 пока-
зано расположение полос при сопоставлении субъединичного
состава трех РНК-полимераз амебы [D'Alessio et al., 1979]. Хо-
рошо видна высокая степень разрешения близких по молеку-
лярной массе полипептидов. Иногда ступенчатый электрофорез
по Лэммли используют в сочетании с градиентом пористости
рабочего геля, что еще более повышает разрешающую способ-
ности метода (Mahadik et al., 1976]. В случае угрозы агрегации,
например при фракционировании кислых белков хроматина, б
оба геля системы Лэммли можно ввести мочевину [Wilson, Spel-
sberg, 1975].
Имеются подтвержденные данные о том, что система, пред-
ложенная Лэммли, чувствительна к качеству ДДС-Na [Swaney
et al., 1974; Matheka et al., 1977]. Препараты, полученные от од-
них фирм («Pierce», «Matheson, Coleman and Bell»), дают хоро-
шие результаты, в то время как с другими препаратами ДДС-
71
Рис. 22. Фракционирование
РНК-полимераз I, II и III
амебы в системе Лэммли
[D’Alessio et al., 1979]
Цифрщ слева — молекулярные
массы некоторых субъединиц
(тыс. дальтон)
Na (BDH, «Serva») разрешение полу-
чается плохое, а белки менее под-
вижны. Этот эффект зависит и от
того, какие белки разделяются. Для
других буферных систем он не наблю-
дается, но белки разделяются в них
зачастую вообще хуже, чем в системе
Леммли. Природа описанного эффек-
та непонятна. По-видимому, при высо-
кой концентрации Триса связывание
ДДС-Na с белками зависит от моле-
кулярного состава детергента. Анализ
методом газовой хроматографии пока-
зывает, что продажные препараты
ДДС-Na неоднородны. В них может
содержаться до 10% примесей, имею-
щих значительно больше чем 12 ато-
мов углерода на молекулу.
Отмечено также, что некоторые,
особенно высокомолекулярные, белки
после первоначального полного их
восстановления обработкой р-меркап-
тоэтанолом и ДДС-Na в ходе электро-
фореза снова частично окисляются с
образованием дисульфидных мости-
ков между полипептидными цепями,
что приводит к размыванию полос и не-
воспроизводимости результатов раз-
деления. Рекомендуется восстанов-
ленное состояние белкового препарата
закреплять путем его алкилирования
по SH-группам обработкой йодацета-
мидом. Для этого исходный препарат
инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количе-
ству внесенного для восстановления белка р-меркаптоэтанола
при 50° в течение 15 мин. От избытка йодацетамида и побочных
продуктов реакции можно не избавляться, а наносить всю инку-
бационную смесь прямо на гель [Lane, 1978].
Ступенчатый электрофорез в сочетании с обработкой ДДС-
Na успешно используется для пептидного анализа и сопоставле-
ния белков по пептидному составу. В 1977 г. группа авторов с
участием Лэммли предложила для этой цели систему двумерно-
го электрофореза, в которой ферментативный гидролиз белков
проводят без их элюции, непосредственно в геле, после чего ве-
дут электрофорез во втором направлении, позволяющий сопо-
ставлять пептиды [Cleveland et al., Ю77]. В первом направлении
используют описанную выше систему Лэммли для разделения
смеси сопоставляемых белков. После кратковременной окраски
С целью обнаружения полос индивидуальных белков последние
72
вырезают и вымачивают в буфере формирующего геля. Затем
их помещают в карманы пластины геля второго направления,
добавляют туда по 10 мкл того же буфера, но содержащего 20%
глицерина, а потом наслаивают еще по 10 мкл буфера, но с 10%
глицерина, в котором растворена сооответствующая протеаза.
Во втором геле снова сформирована система ступенчатого элек-
трофореза по Лэммли. Включают напряжение, а когда бром-
феноловый синий приблизится к границе рабочего геля, напря-
жение на 30 мин отключают. За это время протеаза, которая
тоже перешла в формирующий гель, гидролизует белок непо-
средственно в нем. В присутствии ДДС-Na протеолиз проходит
не полностью, но в определенных условиях воспроизводимо.
В ходе дальнейшего электрофореза пептиды разделяются и мо-
гут быть сопоставлены в параллельных треках пластины.
Без существенных изменений этот подход был использован
и другими авторами (Przybyla- et al., 1979; Gadasi et al., 1979].
В аналогичной работе [Bordier, Crettol-Jarvinen, 1979] в первом
направлении использовали систему Лэммли в сочетании с гра-
диентом пористости рабочего геля в пластине — концентрация
ПААГ изменялась от 5 до 17,5%. При внесении в карманы геля
второго направления полоски индивидуальных белков, вырезан-
ные из пластины первого направления, заливали расплавлен-
ным 1%-ным раствором агарозы, чтобы фиксировать их исход-
ное положение на дне кармана. В другой недавней работе
[Nikodem, Fresco, 1979] белки гидролизовали бромистым циа-
ном. Как и в предыдущей работе, в первом направлении белки
фракционировали ступенчатым электрофорезом с обработкой
ДДС-Na в градиенте пористости геля, вырезали слегка окрашен-
ные полоски белков и обрабатывали их BrCN прямо в геле.
Реакцию вели в маленьких пластмассовых флаконах под тягой.
Затем полоски геля вымачивали в буфере и переносили в кар-
маны пластины второго направления для разделения пептидов.
Другие авторы {Boulikas et al., 1980] аналогичным образом про-
водили промежуточный гидролиз белков в геле N-бромсукцин-.
имидом. В первом направлении белки разделяли электрофоре-
зом в «кислой мочевине».
Особенно совершенной оказалась двумерная система фрак-
ционирования белков и пептидов, предложенная О’Фаррелом
[O’Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также
ибпользована методика Лэммли в сочетании с градиентом пори-
стости ПААГ. Подробный разбор системы О’Фаррела и ее мо-
дификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направ-
лении в ней используется не электрофорез, а электрофокусиро-
вание^
ГРАДИЕНТ ПОРИСТОСТИ ПААГ
В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько
примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь
рассмотрим возможности этого метода подробнее.
73
Техника приготовления гелей с изменяющимися Вдоль На-
правления миграции белков размерами пор, или, как их назы-
вают, «градиентов пористости ПААГ», была подробно описана
в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль
градиента достигается путем увеличения концентрации акрил-
амида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет це-
лый ряд существенных преимуществ.
Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков
в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые
зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель
усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков
достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их
может практически прекратиться. Для разных зон этот момент
наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны
мигрируют до своего конечного положения, соответствующего их
размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положе-
ния, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для бел-
ков разной величины конечные положения окажутся в разных
участках градиента пористости. К моменту окончания процесса
фракционирования в целом все белковые зоны займут свои ста-
ционарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет
включено электрическое напряжение. Таким образом, экспери-
ментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза.
Его продолжительность можно выбрать «с запасом», например
поставить опыт на ночь.
Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное
сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в пе-
редней части каждой зоны постоянно оказываются в области
чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны.
Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем не-
много сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот
процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедитель-
ная иллюстрация эффективности такого противодействия была
приведена выше (см. рис. 16).
При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает
необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести
электрофорез в простой непрерывной системе и не очень забо-
титься об объеме исходного препарата. Сделанное замечание
находится в противоречии с цитированными выше недавними
работами, где градиентный гель использовали в сочетании со
ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при та-
ком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но
не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обус-
ловлено определенным консерватизмом и «перестраховкой».
По существу, картина разделения белковых зон при электро-
форезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соот-
ношения размеров белков в препарате и характера градиента
пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофо-
реза играет второстепенную роль. Поэтому( в частности, можно
74
использовать любые буферы сравнительно малой концентра-
ции (0,03—0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака
заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что
для данного метода немаловажно, так как скорости миграции
белков при приближении к конечным положениям существенно
уменьшаются.
Указанные преимущества объясняют растущую популяр-
ность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их
приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять,
почему такая ведущая фирма, как «Pharmacia», специализиро-
валась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ.
Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами
78X78x2,7 мм для двух интервалов концентраций .ПААГ: 2—
16% и 4—30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента по-
ристости в этих пластинах подобран так, что в пределах некото-
рого диапазона молекулярных масс нативных глобулярных бел-
ков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миг-
рации белка (до конечного положения) от логарифма его моле-
кулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой
к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий
фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс та-
ковы: для РАА 2/16 —от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА
4/30 — от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это озна-
чает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с мо-
лекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имею-
щие массу более 2 млн. — не войдут в него. Последняя цифра
может относиться, конечно, только к белковым комплексам или
нуклеиновым кислотам.
Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, поль-
зоваться и для разделения комплексов белок—ДДС-Na. Ламбен
обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный
градиент концентрации ПААГ в интервале 3—30% позволяет
проводить электрофорез до полной обстановки белков с молеку-
лярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо-
следующее линейное соотношение: lgAf=A lgТ+В, где М —
молекулярная масса белка, а Т — концентрация ПААГ в месте
расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта
концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от нача-
ла пластины. А и В — коэффициенты, указывающие на линей-
ный характер зависимости. Определять их нет нужды, если име-
ется возможность воспользоваться, как обычно, набором мар-
керных белков. Обработку исходного препарата можно прово-
дить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ
с ДДС-Na [Lambin, 1978].
Недавно Ламбен и Файн [Lambin, Fine, 1979]' предложили
способ определения молекулярной массы нативных белков (без
ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте кон-
центрации ПААГ (3—20%). Оказалось, что для любого белка
характер его непрерывно замедляющегося движения в таком
75
геле хорошо описывается линейной зависимостью: ^t=aD-{-b,
где t — любой момент времени с начала электрофореза, пока
белок еще движется; D — пройденное им к этому моменту рас-
стояние в геле; а и Ь — постоянные в данном опыте величины.
Для каждого конкретного белка такую зависимость легко
получить экспериментально. Удобно, наприМер, в разные карма-
ны одной пластины геля последовательно, через известные про-
межутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого
белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на
пластине будет известна продолжительность электрофореза, а
расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже
для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точ-
кам строят график зависимости от D, имеющий вид прямой
линии. Тангенс угла наклона этой прямой — значение коэффи-
циента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-
циент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он
крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что
соотношение между логарифмами коэффициента а и молеку-
лярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный ха-
рактер в широком интервале молекулярных масс — от 20 до
950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном урав-
нении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для
трех стандартных буферов: фосфатного (pH 7,2), Трис-боратно-
го (pH 8,2) и Трис-барбитуратного (pH 9,8). Так, для 0,01 М
Na-фосфатного буфера (pH 7,2) имеет место зависимость:
lgAf=l,93 lga+6,99. Точность определения молекулярной мас-
сы невысока — в среднем ±20%. Однако важное достоинство
метода состоит в возможности оценивать суммарную молеку-
лярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссо-
циируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя
результаты определения молекулярной массы некоего белка
описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с
использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строе-
ние белка.
В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хо-
рош только для разделения белков по размерам. В случае раз-
деления по заряду он может даже ухудшить результат, так как
белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров
при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же
месте.
ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ
Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда
удается осуществить в ходе одного опыта даже с применением
описанных выше приемов повышения разрешающей способно-
сти электрофореза в ПААГ. Всегда достаточно высока вероят-
ность того, что в данной системе электрофореза различные бел-
ки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров,
либо ввиду совпадения значений их электрофоретических под-
,76
вижностей при выбранном значении pH, либо, наконец, в ре-
зультате неблагоприятной для разделения комбинации этих
параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после
первого электрофоретического фракционирования смеси бел-
ков следует проверить на гомогенность, используя ее как исход-
ный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно
сделать одновременно для всех полос первого разделения, или,
как его часто называют, «разделения в первом направлении».
Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека
из пластины первого направления, накладывают на стартовую
зону пластины «второго направления». Контакт между двумя
гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стар-
товым буфером или, для надежности, расплавленным раствором
агарозы в этом же буфере. Электрофорез ведут в направлении,
перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомо-
генная белковая полоса может дать несколько пятен, если при
новых условиях электрофореза подвижности первоначально об-
разовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми.
В результате на пластине второго направления после прокра-
шивания выявляется картица распределенных по всей поверх-
ности пятен, напоминающая «фингерпринт» в двумерной тонко-
слойной хроматографии. Число пятен, которое удается разли-
чить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к
двум тысячам (!).
При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно,
чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из труб-
ки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщи-
ной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине сле-
дует образовать продольно расположенную полость, предпочти-
тельно клиновидного сечения, куда можно заложить цилиндрик
геля и залить его там буфером, агарозой или даже заполиме-
ризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образо-
вания и форма сечения этой полости не играют большой роли.
Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или по-
лоска геля первого направления должны лежать параллельно
краю геля в пластине второго направления. Можно, например,
воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис. 23).
Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для элек-
трофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978а].
Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают пло-
ский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направ-
ления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вы-
резания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии)
удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным
Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].
В каждом из направлений двумерного электрофореза ис-
пользуют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую спе-
цифическим особенностям фракционируемых белков. Широкое
применение дЬуйерный электрофорез нашел, например, для
77
Рис. 23. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman,
Dowben, 1978а]
Рис. 24. Результаты двумерного электрофореза рибосомальных белков [Mets,
Bogorad, 1974]
I — первое направление; II — второе направление
анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном,
слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют ча-
ще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель,
чтобы различие молекулярных размеров по возможности не
сказывалось на разделении белков в этом направлении, т. е. не
накладывалось на разделение по заряду. Во втором направле-
нии в этом случае белки разделяют по их размерам.
Так, Мете и Богорад электрофорез рибосомальных белков в
первом направлении проводили в трубках диаметром 4 мм и
длиной 10 см [Mets, Bogorad, 1974]. 4°/о-ный ПААГ полимери-
зовали в буфере с pH 5. При этом все рибосомальные белки за-
ряжены положительно и различия значений их суммарных за-
рядов выражены наиболее ярко. В буфер вводили 8 М мочевину,
чтобы помешать агрегации белков. При полимеризации геля
вносили больше ТЕМЕД, чем персульфата аммония (0,1 и
0,03%), так как в кислой среде каталитическая активность
ТЕМЕД понижена (см. главу 2). 0,1—0,2 мг смеси рибосомаль-
ных белков вносили растворенными в 8 М мочевине с 10 мМ ди-
тиотреитолом. Разделение вели при силе тока 1,5 мА на трубку
в течение 4—5 ч. Во втором направлении использовали ступен-
чатый электрофорез. Рабочим гелем служил 10%-ный ПААГ,
полимеризованный в буфера с pH 6,75. Формирующий гель —
такой же, как гель первого направления (4% ПААГ, pH 5). Его
полимеризовали вокруг геля из трубки, уложенного в клиновид-
ное расширение над пластиной. Концентрацию мочевины в этом
геле снизили до 7 М, чтобы цилиндрик не мог всплыть во время
полимеризации. В качестве медленно мигрирующего иона верх-
него электродного буфера использовали MES (2- (N-морфолино-
78
этенсульфокислоту) — продажный препарат для составления
буферов с рК. 6,15. Быстрым ионом служил остаток уксусной
кислоты. В состав верхнего буфера ввели также 1% ДДС-Na и
0,01 % тиогликолевой кислоты, которая, как уже упоминалось,
служит для очистки гелей от остаточных свободных радикалов
персульфата аммония. Она мигрирует из электродного буфера
в гель, где и движется впереди белков. Отметим, что преэлек-
трофорез в ступенчатой системе невозможен — он нарушил бы
распределение ионов по ступеням. Однако его можно провести
предварительно, использовав в качестве верхнего обычный бу-
фер с быстро мигрирующим ионом, а затем заменить его, как
описано выше. Верхний электрод является катодом, анод рас-
положен внизу. Под действием поля ДДС-Na из верхнего элек-
тродного буфера мигрирует в гель. В цилиндрике геля первого
направления он образует комплексы’ с белками. Далее отрица-
тельно заряженные комплексы белок—ДДС-Na выходят из ци-
линдрика и фракционируются ступенчатым электрофорезом в
пластине. Обработка белков ДДС-Na, таким образом, происхо-
дит в отсутствие 0-меркаптоэтанола. Его отчасти заменяет мо-
чевина; кроме того, исходно, до электрофореза в первом направ-
лении, белки восстанавливают 10 мМ дитиотреитолом. Электро-
форез во втором направлении ведут в течение 5 ч при силе тока
25 мА на пластину. Метод удобен тем, что между разделениями
в первом и втором направлениях нет надобности вымачивать
гель, так как буфер геля первого направления — тот же, что и у
формирующего геля второго направления. Результаты электро-
фореза представлены на рис. 24.
В другой работе [Howard, Traut, 1973} разделение рибосо-
мальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в
4 %-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-
боратном буфере, pH 8,7. При этом pH часть белков рибосом
оказывается заряженной отрицательно, а другая часть — поло-
жительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной
1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его
на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер-
девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно-
меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в
интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ
агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавлен-
ном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряже-
ния миграция белков шла в обе стороны —к катоду и аноду.
Во втором направлении разделение белков вели по их размерам,
но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину
еще более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (Т=
= 18,25; 6=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кисло-
те, титрованной КОН до pH 4,5, также с добавлением 6 М моче-
вины. В этом случае все белки были заряжены положительно и
мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя ис-
пользовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля
79
вдоль его продольной оси вырезали плоскую полоску, вымачи-
вали ее в 0,013 М К-ацетатном буфере (pH 5,2) с 8 М мочеви-
ной. Полоску зажимали между стеклянными пластинками фор-
мы и прямо на нее заливали раствор мономеров рабочего геля.
Катионом верхнего электродного буфера служил глицин
(~0,19 М), титрованный уксусной кислотой до pH 4. Таким об-
разом, осуществлялась система ступенчатого электрофореза,
где в качестве быстрого иона выступал К+, а медленного— гли-
цин. Отметим, что в системе Орнстейна и Дэвиса глицин фигу-
рировал в качестве медленного аниона, а здесь он служил ка-
тионом. Возможность такого двоякого использования вытекает
из цвиттерионной природы глицина. Формирующим гелем в этой
системе служила сама полоска, вырезанная из геля первого на-
правления. Аналогичная система двумерного электрофореза ри-
босомальных белков описана и в другой работе (Sherton, Wool,
1974].
Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных
белков по заряду в первом направлении использовал ступенча-
тый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с pH 4,6 —
в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с pH 6,5 — в формирующем).
Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе
с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуще-
ствлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направ-
ления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены
молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения
с маркерами во втором направлении) и оценены их количествен-
ные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени
крысы.
Интересный подход к фракционированию рибосомальных
белков был использован в недавней работе [Hoffman, Dowben,
1978b]. При разделении в первом направлении авторы исполь-
зовали различие в протяженности гидрофобных участков по-
верхности у разных белков рибосомы. Оно проявлялось в степе-
ни связывания этих белков с мицеллами Тритона Х-100, который
вводили при полимеризации геля до концентрации 0,15%. Ком-
плексы белков с Тритоном Х-100 разделяли по размеру в 8%-ном
ПААГ в присутствии 2 М. мочевины. Концентрация детергента
была оптимальной; при меньших концентрациях он мало влияет
на подвижность белков, а при больших, как уже отмечалось,
препятствует последующей обработке ДДС-Na, который в этой
работе использовали при фракционировании белков во втором
направлении. Подробнее об использовании Тритона Х-100 в этих
целях будет сказано в следующем разделе.
В качестве лидирующего красителя при фракционировании
рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предло-
жено использовать FeCl3. Ионы Fes+ в присутствии уксусной
кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, миг-
рирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных
белков [Bernabeu et al., 1979].
$о
Рис. 25. Сочетание хроматографии с электрофорезом в геле агарозы [Bloom,
Anderson, 1979]
/ — хроматографическая колонка; 2 — обессоливание в «биофибрах», 3 — перистальтиче-
ский насос; 4 — раствор агарозы; 5 — нагреватели; 6 — трубка для электрофореза; 7 —
охлаждающая смесь
Рис. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (на-
правление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление
II) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979]
Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие ще-
лочные белки. Например, факторы инициации белкового синте-
за из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционирова-
нии каждого из них в первом направлении по заряду в кислой
мочевине, а во втором — по размерам ступенчатым электрофо-
резом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979].
Двумерный электрофорез белков хроматина описан Бакае-
вым и соавторами [Bakayev et al., 1978]. В первом направлении
хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фрак-
ционировали в 5%-ном ПААГ и буфере низкой ионной силы
(0,01 М ТЭА-НС1, pH 7,6) на олиго-, моно- и субнуклеосомы за
счет заряда входящей в их состав ДНК, как это было описано
выше. Во втором направлении авторы использовали в одном
случае фракционирование белков хроматина по размеру в си-
стеме Лэммли после вымачивания геля первого направления в
1%-ном растворе ДДС-Na. Детергент обеспечивал и диссоциа-
цию белков от ДНК. В другом варианте разделения диссоциа-
цию осуществляли С помощью цетавлона, а электрофорез во
втором направлении вели в кислой мочевине. Во втором вариан-
те хорошо выявлялась группа быстро мигрирующих негистоно-
вых белков хроматина (HMG-белков). Для анализа этих белков
авторы экстрагировали их 0,35 М раствором NaCl, очищали
осаждением ТХУ (2—L20%) и разделяли двумерным электрофо-
резом, причем в первом направлении использовали фракциони-
рование по заряду в кислой мочевине, а во втором—разделение
по размерам в 15%-ном ПААГ после обработки ДДС-Na.
81
Двумерный электрофорез субъединиц различных РНК-поли-
мераз в уже цитированной работе д’Алессио и соавторов про-
водили в двух вариантах разделения белков по заряду в первом
направлении. В обоих вариантах использовали ступенчатую си-
стему электрофореза: в одном — с кислым буфером (pH 4,3) для
рабочего геля, в другом —со щелочным (pH 9,4). Во втором на-
правлении в обоих случаях белки фракционировали по их раз-
мерам после обработки ДДС-Na в системе Лэммли [d’Alessio et
al., 1979].
Мы не случайно в качестве примеров двумерного электрофо-
реза рассмотрели только случаи фракционирования щелочных
белков. Для кислых белков все другие варианты двумерного
фракционирования вытеснила уже упоминавшаяся система
О’Фарелла. Щелочные белки до последнего времени плохо раз-
делялись в этой системе, однако недавно была предложена ее
модификация, позволяющая успешно вести разделение и щелоч-
ных белков.
Блум и Андерсон предложили оригинальный метод двумер-
ного разделения белков [Bloom, Anderson, 1979]. Собственно,
электрофорез в нем используется только во втором направле-
нии. Фракционирование белков в первом «направлении» осуще-
ствляется на хроматографической колонке (рис. 25). Элюат с
колонки обессоливают, пропуская его через «биофибры», погру-
женные в 10%-ный раствор ДДС-Na с 1% [}-меркаптоэтанола.
Затем его подогревают до 96° и по каплям смешивают с раство-
ром расплавленной при такой же температуре агарозы. Оба
раствора подают одним двухканальным перистальтическим на-
сосом, и горячая смесь постепенно заполняет погруженную в лед
трубку. Таким образом, в трубке полимеризуется элюат с хро-
матографической колонки, т. е. по длине геля располагаются
белковые зоны в той последовательности, как они выходят из
колонки. Затем гель извлекают из трубки и накладывают на
пластину ПААГ, заливают расплавленной агарозой и ведут
электрофорез в системе Лэммли. В частности, авторы элюирова-
ли гистоны с колонки оксиапатита линейным градиентом кон-
центрации NaCl (0—>1,5 М) в 1 мМ. Na-фосфатном буфере
(pH 6) с 6 М мочевиной. Гистоны выходили, не разделившись,
а лишь растянувшись по элюату. Во втором направлении ис-
пользовали электрофорез в присутствии ДДС-Na в градиенте
пористости ПААГ (8—<25%). На пластине гистоны оказались
прекрасно отделенными друг от друга (рис. 26). В частности,
гистоны Н2А и Н2В далеко отошли от НЗ благодаря значитель-
ному различию в их сродстве к оксиапатиту.
Исходный препарат в такой постановке опыта может быть
и не элюатом с колонки, а реакционной смесью, в которой со
временем происходят изменения белкового состава, например
в результате протеолиза. Маркерные белки с известной молеку-
лярной массой можно прикапывать при заполнении трубки так,
что их положение по ее длине будет заведомо определенным.
82
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ТРИТОНА Х-100 И ЦЕТАВЛОНА
Тритон Х-100
Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло-
хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за-
частую улучшает их растворимость и, к тому же, в отличие от
мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются
вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их
биологическая активность.
Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел-
ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в
1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали
с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном
буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на
формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел-
ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость
белка, однако разделение полос оказывается более надежным,
если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро-
вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко-
торый приходится дольше отмывать.
Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо-
вать не только для растворения, но и для фракционирования
белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел-
ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ-
ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут
связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо-
лекулу (родопсин — до 70). Это дает прирост эффективной мо-
лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон
(молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост
легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.
В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел-
ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра-
ции 4 мг/мл 5 %-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5%
p-меркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли
Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков
из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос
в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно
вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде-
ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона
Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про-
цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и
мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь-
но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного
ПААГ (С=0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус-
ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100.
Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ
со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-
83
ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног-
да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер-
жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо-
дится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного
ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за
счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима-
ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его
сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства
силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек-
тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло-
ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл
протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М. мо-
чевиной. Возобновляли преэлектрофорез. еще на 45 мин, поме-
няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после
этого вносили белковые препараты ц вели электрофорез при по-
стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр-
ности напряжения (белки мигрируют к катоду).
В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель-
ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-
П и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву-
мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при-
сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна-
чала в 1,5 М Трис-НС1 (pH 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М
Трис-НС1 (pH 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это-
го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро-
фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез
позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним
только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви-
ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.
Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в
5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви-
ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и fi-це-
пей глобина- [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура-
цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% р-мер-
каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять
гидрофобные свойства белка.
Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле,
полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона
Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре-
электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином.
В более поздней работе [Levy et al., ^УЭ] для разделения гисто-
нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе-
ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100+4 М
мочевины.
Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100
использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-
ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по-
этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком-
плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-
84
мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны
мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри-
босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5% -
ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз-
личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков.
ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от-
носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,
отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].
Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий
комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле-
ний, использовался довольно часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar-
rard, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977].
В последние годы описано применение в тех же целях других,
сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после
обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ-
ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в
0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы
«Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, BellvS, 1978]. Гистон Н2А
печени и других органов мыши при этом удалось разделить на
два компонента, гистон НЗ — на три или четыре; в ряде случа-
ев расщеплялся и гистон Н1. В другой работе [Allis et al., 1979]
был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-
ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 ибМ
мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1 +
-гН2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ-
лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.
Цетавлон
Цетилтриметиламмонийбромид (цетавлон) — положительно
заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na раство-
ряет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеино-
вые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофоре-
зе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавто-
ры предложили заменить ДДС-Na на цетавлон (Panyim et al.,
1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению бел-
ков за счет связывания с гидрофобными участками полипепти-
дов. Благодаря электростатическому отталкиванию положитель-
но заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи рас-
прямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетав-
лоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положитель-
но. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми
кислотами как «жирный катион» и осаждает их из раствора.
Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаи-
модействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает
в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при
слегка повышенной температуре (37е), в термостате. Кроме то-
гр, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окра-
шивание геля ведут при температуре 80—100°.
85
Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использова-
ли 10%-ный ПААГ (С—1,5), полимеризованный в 0,00 М Na-ацетатном буфе-
ре (pH 4,6) с 0,09% цетавлона. Примерно таким же буфером заполняли элек-
тродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до кон-
центрации 0,25—0,5 мг/мл в 0,01 М Na-ацетатном буфере (pH 4,6) с 0,5%
цетавлона и 1% Р-меркаптоэтанола. Назначение последнего — такое же, как
при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инку-
бировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На
трубку (10X0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5—10 мкг белка).
Электрофорез вели при силе тока 8—10 мА на гель и напряженности поля
8—10 В/см< В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный рас-
твор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 16%-ной
уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30—60 мин при тем-
пературе 80—100°. Отмывали излишек- красителя в 0,9 М уксусной кислоте
при той же температуре.
Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки це-
тавлоном также наблюдается линейная зависимость между ло-
гарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его мигра-
ции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать
молекулярные массы белков в интервале 15—90 тыс. дальтон.
Эли и соавторы недавно предложили модификацию описан-
ной выше системы [Ely et al., 1979]. Они заменили персульфат
аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициа-
тора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН рас-
творим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаж-
дения цетавлона при полимеризации геля.
В качестве рабочего буфера геля использовали 0,1 М Na-фосфат (pH 7)
с и,1 % цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали
в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфёре, но содержащем
0,5% цетавлона и 10—15% iP-меркаптоэтанола. Лидирующий краситель —
малахитовый зеленый. Электрофорез в 10 %-ном ПААГ при силе тока 8 мА на
трубку (10X0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-
ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором
СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% этанола, в течение
10 ч.
Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциа-
ции белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением
ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с- це-
тавлоном. При низких значениях pH связывание цетавлона с ги-
стонами и негистоновыми белками хроматина носит избиратель-
ный характер, что способствует их электрофоретическому раз-
делению.
Фракционирование белков по степени их гидрофобности мож-
но преобразовать в разделение по заряду с помощью следующе-
го приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли раз-
меров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворен-
ной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCl и 0,5% Тритона
86
Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом «со
сдвигом заряда» [Bhakdi et al„ 1977]
А — без дополнительных детергентов; Б — с добавлением ДОХ; В — с добавлением це-
тавлона
Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-
оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует
мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками бел-
ка в количестве, пропорциональному размеру этих участков.
Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешан-
ные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответ-
ственно положительный или отрицательный заряд, существенно
превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе
белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и вели-
чиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать «элек-
трофорезом со сдвигом заряда». Необычное введение в буфер
геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости
белков, так и образованию мицелл. Напряженность поля при
этом приходится снижать до 4,5 В/см.
Аналогичный подход был использован для обнаружения гид-
рофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi
et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели
в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, пе-
реносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы,
но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во
втором направлении (II) все гидрофильные белки ложились на
диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали
из нее (рис. 27).
Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном
Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавло-
ном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам
выявить значительное число дополнительных фракций при раз-
делении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направ-
лениях использовалась система ступенчатого электрофореза
(3,3%-ный ПААГ — формирующий, 15%-ный — рабочий). По-
лимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в пер-
вом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При
этом отпадала необходимость вести электрофорез во. втором на-
87
правлении немедленно по окончании, первого разделения и обе-
спечивалась возможность оценить качество последнего. Цетав-
лон, который вносили в верхний электродный буфер (0,1'5%),
мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова
растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание
образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для
геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для
предупреждения фотоокисления. гистонов гели держали вдали
от яркого света [Bonner et al., 1980].
В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных
липопротеидов главная проблема связана с их растворением.
Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надеж-
ного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворя-
ются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты.
Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого
полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в
13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диа-
метр которой на 0,1—0,2 мм больше, чем у той, которая исполь-
зовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез [Мок-
rasch, 1978]. В другом варианте электрофореза водонераствори-
мых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь
фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объ-
ем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, по-
этому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки
в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменя-
ли описанной выше смесью [Pusztai, Watt, 1973].
ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ
Обнаружение и локализацию белковых зон после их разде-
ления электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуще-
ствляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как ок-
рашенные полоски или пятна различной интенсивности, в
зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вы-
мачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь
него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как
правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания
полос за это время белки иногда предварительно фиксируют
осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10% - или
50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию сов-
мещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси
уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.
Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам
гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера ге-
ля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции
его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно
менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без
особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачи-
ванием его в относительно большом объеме растворителя с не-
88
сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффу-
зии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее
ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных
белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто в
смеси с метанолом, который улучшает растворимость красите-
ля. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37—
50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опас-
ность ослабления окраски полос. 4
Все типы обычно используемых красителей для белков несут
на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-
Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]
мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспенди-
ровать немного ионообменной смолы, связывающей краситель
и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто исполь-
зуют для этой цели смолу смешанного типа AG 501X8.
Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков ми-
нут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле
накладывают на гель в поперечном направлении — перпенди-
кулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с
белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро
выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специ-
альный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электро-
фореза. Такие приборы («дестейнеры») имеются в продаже, но
их легко изготовить и в лаборатории.
Простое устройство для этой цели описано и схематически
изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержа-
веющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смо-
ченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в
ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже
верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля
кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смочен-
ной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюми-
ниевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом.
К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от
источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфора-
ции в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Че-
рез пластину геля размером 12X7X0,3 см нужно пропускать
ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15—20 мин. Находящиеся в
89
осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непро-
должительном поперечном электрофорезе остаются на своих ме-
стах в геле.
До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если
в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологи-
ческой активности, то их локализацию в геле можно осуществить
с помощью специфической ферментативной реакции или цепи
реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вы-
мачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется,
фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и прихо-
дится мириться с некоторым размыванием белковых полос.
Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффунди-
руют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красите-
лей; и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.
Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миг-
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную,,
смесь белков можно окрасить красителем «Remazol» [Griffith,
1972], который ковалентно связывается с~'белком й 'мигрирует
вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в
присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг бел-
ка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCl с 0,2 М Na2HPOt и 10%
ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогре-
вают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного кра-
сителя белок переосаждают ацетоном.
Чувствительность окрашивания белков многократно увеличи-
вается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных
красителей. Многие из них связываются с белками или пептида-
ми, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно
использовать для наблюдения за ходом электрофореза после
предварительной обработки исходного препарата.
Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные
марки красителей и особенности их применения.
Кислые красители
Исторически для окраски белков в геле были прежде всего
использованы давно апробированные промышленные красители
для шерсти — сложные молекулы с несколькими ароматически-
ми кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодей-
ствия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначаль-
ное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия суль-
фогрупп красителей с положительно заряженными аминокислот-
ными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется
ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофоб-
ными связями.
Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окра-
шивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовал-
ся при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается
на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты
90
или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказы-
вается положительным за счет остатков лизина, аргинина и ги-
стидина, так что для белков используются преимущественно кис-
лые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют
свой отрицательный заряд и при низких значениях pH.
В прошлом десятилетии широко использовали «амидо-
шварц» — краситель с фирменным названием «Amido Black 10В»
(сейчас его выпускают под названием «Naphthalene Black 12В»),
Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксус-
ной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краси-
тель— кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокра-
щенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствитель-
ность и линейную зависимость интенсивности окраски от концент-
рации Щелка в более широком ее диапазоне. Краситель выпус-
кают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориенти-
ровки приведена структурная формула второго из них. Структура
СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метильных групп.
Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями
«PAGE blue 83» и «PAGE blue G-90» соответственно.
Обилие ароматических колец в структуре красителей типа
СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в раз-
бавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к
кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные
растворы, содержащие 9—10% уксусной кислоты и 40—45% ме-
танола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-2&) в
этой смеси составляет 0,1—0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250
растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей
10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное — вода). Возможны
и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель дол-
жен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждаю-
щем-Лелок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать.
Их наличие не говорит о плохом выборе растворителя, так как
91
препараты красителя, изготавливаемые для промышленных це-
лей, редко бывают чистыми.
Продолжительность окрашивания зависит от толщины и по-
ристости геля и может варьировать от 2—3 до 12 ч. Для ускоре-
ния процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с рас-
створом красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с
белком красителя ведут, как описано выше, например вымачи-
вая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей
7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях раство-
римость красителя достаточна для вымывания его свободных
молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электро-
форез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то
лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и
20% метанола.
Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля — в ван-
ночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля
должно составлять примерно 3:1, при отмывке — 5:1 или даже
10: 1 с двумя-тремя стенами растворителя. Если в растворитель
добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмыв-
ку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно опи-
сано выше.
Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специаль-
ном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются
сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впро-
чем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой
электрофореграммы при опенке количественного соотношения
белков в полосах, так как связывание красителя зависит не толь-
ко от концентрации, но и от^химического состава и конформации
белка.
Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели
можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиоле-
товому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значи-
тельно легче).
В этом случае необходимо тщательно очищать или перекри-
сталлизовывать акриламид для уменьшения его собственного
поглощения в ультрафиолетовой области спектра.
Другая возможность количественной регистрации электрофо-
реграммы заключается в денситометрировании его фотографии.
В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения коли-
честв белка в полосах может еще усугубиться за счет нелиней-
ности чувствительности фотопленки и других особенностей фото-
графического процесса.
Наиболее надежным способом количественных измерений яв-
ляется счет радиоактивности в белковых полосах при условии
однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси
и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее ска-
зано ниже.
После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но впол-
не надежна обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На
92
порядок более высокую чувствительность Окраски можно полу-
чить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют
относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Го-
товят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном вод-
ном растворе НС1О4, фильтрованием освобождаются от крупных,
не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе
вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации
коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окраши-
вает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена
наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не
сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-ко-
ричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель
переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность
окраски полос при этом увеличивается, а фон становится проз-
рачным и светло-голубым — часто его можно не отмывать [Hol-
brook, Leaver, 1976]. Описан и другой вариант использования
СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H2SO4, а затем в
12%-ной ТХУ [Blakesley, Boezi, 1977].
Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда
используют краситель «Fast green FCF> [McMaster-Kaye, Kaye,
1974]. Его можно использовать и для других белков. Он менее
чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных
оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования,
так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем «Fast
green», вымывается из белковых полос, причем иной раз неоди-
наково для различных белков [Bertolini et al., 1976].
Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при
недостаточной продолжительности окрашивания можно столк-
нуться с артефактом — возникновением «двойной полосы». На
самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух
своих торцевых поверхностей.
Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или
в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом.
Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и
протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при
такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и
вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально'
иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электро-
фореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5 %-ном растворе фор-
мальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до
0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пеп-
тиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мости-
ков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами
ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть ра-
зительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных
белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на
самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na
красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас-
93
творе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Na
красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном рас-
творе формальдегида в 25%-ном этаноле [Steck et al., 1980].
Другие красители и методы окрашивания
Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.
Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А13+ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250-f-0,l М. A1(NOS)s+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола +1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7 %-ной уксусной кислоте [Hege-
nauer et al., 1977].
Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием «Stains-all», формула которого представ-
лена ниже.
0,1 %-ный маточный раствор этого, красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация — 0,0012% в 0,01 М Трис-HCl (pH 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды — в синий, бел-
ки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий,
а РНК—в голубовато-пурпурный. Однако по. чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,
94
который из-pa этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].
Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных pH такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже pH 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(р/>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные — кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (pH 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол—вода (1:2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].
Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра’в фотографическом процессе, так как «передержанный»
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.
Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видймому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.
95
Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки сбответствует пластинам размером 140Х
Х140Х0,8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Bruns-
wick gyrotory shaker», модель 2) co скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.
Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4 %-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNOs+100 мл воды). При эяюм может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20X20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мин. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида
(разбавлен из продажного 38%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле);
при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7 %-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.
Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10~4 мкг/мм2. По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и-соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.
Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
1 становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол—вода—глицерин (70:27 : 3) в течение 5 мин.
96
В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.
После двумерного разделения белков в ПААГ по О’Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СНзСООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин —5%-ной
СНзСООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного споласкивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфрамо-
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na2COs,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ны.й раствор СНзСООН,
а затем промывают его водой.
Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски, серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].
Флюоресцентные красители
Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических
форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые —
при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их пог-
лощения в растворе лежит в области 330—360 нм, флюоресцен-
ции — 510 нм. Молярная экстинкция £=4,3’ 10е.
SO2C1
Данзилхлорид
В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток
присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным
образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность
флюоресцировать сохраняется.
4 Л. А. Остерман Д7
Данзилирование белков и пептидов позволяет следить за хо-
дом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей
длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо
проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции бел-
ков при данзилировании практически не изменяется, поэтому не-
большие примеси данзилированных препаратов можно исполь-
зовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных бел-
ковых смесей.
Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет
проводить пептидный анализ данзилированных белков после их
разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом
удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые,
но и внутренние пептиды. Дело в том, что данзилирование, хотя
и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам,
происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-
теина и тирозина, e-NHz-rpynnaM лизина и по гистидину. Цен-
ным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-
ных протеаз не создает никаких помех при картировании пепти-
дов.
Недавно описано данзилирование белков для последующего
разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na
(в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют
до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (pH
8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют ‘/is объема 10%-ного раствора
данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, ин-
кубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный
данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутно-
желтую суспензию, тем не менее данзилирование в ней происхо-
дит. Раствор просветляется после добавления */i5 объема 0-мер-
каптоэтанола и дополнительной инкубации,в течение 15 мин.
Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхло-
рида.
Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки под-
вергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные про-
дукты данзилировании быстро отделяются от белков и уходят
вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения
белков под контролем данзилированных аликвот. При этом ис-
пользуется электрофоретическая элюция белковых полос из ге-
ля. Описан также пептидный анализ разделенных белков элек-
трофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабоче-
го геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков
под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом
[Stephens, 1975].
Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наиме-
нованием «Fluram»), — желтовато-белый порошок, хорошо раст-
воримый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетбнитриле. Хра-
нить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, осо-
бенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными
аминами (концевыми аминогруппами, e-NHj-группами лизина)
98
е водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие
продукты в соответствии с представленной ниже схемой.
Флуоресцамин Амин Флуоресцирующий продукт
Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции
имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и макси-
мум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюо-
ресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресци-
руют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не
создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт мож-
но не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При ис-
пользовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов
перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит до-
полнительный отрицательный заряд (за счет образующегося
карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность
окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных
ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.
В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали
для окраски белков после их двумерного фракционирования электрофокуси-
ровкой и электрофорезом по методу О’Фаррела. Белки фиксировали в пласти-
не геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% ме-
танола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюо-
ресцамином). Гель споласкивали в 7 %-ной уксусной кислоте, помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2 ч — в 0,04 М раствор борной кисло-
ты в ДМСО, титрованный NaOH до pH ,10. Затем добавляли равный объем
раствора флюоресцамина (ОД мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение
8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при ос-
вещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.
Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способ-
ность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствитель-
ность и разрешающая способность окраски флюоресцамином
примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок за-
висимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количе-
ства белка больше — вплоть до 7 мкг белка на 1 см2 в пятне или
полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не да-
лее, чем для 3 мг/см2.
Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом
было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974].
Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации
99
4»
0,5—1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (pH 8,5) с 5%
ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора
флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей
очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза.
Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски
флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для
контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично исполь-
зовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофо-
резом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано исполь-
зование для окрашивания белков перед электрофорезом родст-
венного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-
фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин,
этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно
флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе
не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.
В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой
дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и
абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирую-
щего продукта — при 390 нм, флюоресценции — при 745 нм.
Реакция идет лучше в щелочной среде (pH 9,5.) Продукт устой-
чив в интервале pH 2—10. Интенсивность флюоресценции — в
2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь не-
значительно уменьшается в случае предварительной обработки
белка ДДС-Na и 0-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствитель-
ность метода очень высока: по утверждению авторов, им удава-
лось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от
флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких ме-
сяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными
цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окраши-
вание ведут в 0,01 М боратном буфере (pH 9,5), энергично пере-
мешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.
Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для
окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделе-
нием электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды,
обработанные ДДС-Na и 0-меркаптоэтанолом, окрашивали в
0,1 М Li-боратном буфере (pH 9,5), добавляя к ним в пятикрат-
ном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.
100
Ортофталевый альдегид , (ОФА) в присутствии р-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов,
давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с при-
веденной ниже схемой.
+ HSCH2CH2OH
+ H2N-R
ОФА
Флуоресцирующий продукт
ОФА растворим в воде, но лучше — в метаноле, этаноле, аце-
тоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при
pH 3—9. При использовании ОФА его сначала растворяют в
одном из перечисленных органических растворителей, а потом
смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и
значения pH. Максимум возбуждения флюоресцирующего про-
дукта — при 340 нм, флюоресценции — при 445 нм. Раствор са-
мого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода — выше,
чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных
продуктов выражен сильнее.
Использование ОФА для окрашивания комплексов белок—
ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-
dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфат-
ном буфере (pH 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% 0-меркап-
тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали
при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда
добавляли */s объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и вы-
держивали в темноте 2—3 ч.
Локализация ферментов после электрофореза
В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях
(без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности.
Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с
помощью специфических реакций, дающих окрашенные продук-
ты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофак-
торов, необходимых для протекания определенной ферментатив-
ной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих
окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить
быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их
полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует,
его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви-.
жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией
фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять,,
каково будет поведение субстрата в электрическом поле во вре-
мя электрофореза.
101
Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом
(«индикаторном») геле на основе агарозы или импрегнировать
ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза
белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность наклады-
вают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют
в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей
цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикатор-
ных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих
случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с
дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в каче-
стве заключительного этапа реакции воспользоваться нефермен-
тативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,
что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продук-
ты (схема реакции приведена ниже),
2Н
Тетразолиевая соль
NH
—сС
Формаэан
В качестве примера можно назвать часто употребляющийся
препарат «Methyl thiazolyl blue» (МТТ) или еще более сложное
соединение «Nitro blue tetrazolium» (NBT). В окисленном виде
обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает сине-
пурпурную, а вторая — иссиня-черную окраску. Реакция восста-
новления красителей ускоряется в присутствии промежуточного
переносчика электронов «Phenazine methosulfate» (PMS) или
нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели
фирмой «Boehringer» под названием «Meldolablue» [Turner,
Hopkinson, 1979].
102
Для обнаружения в геле протеолитических ферментов пред-
ложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофо-
реза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе
цитохрома с в буфере с pH 8,5, содержащем 8 М мочевину и
1,7 мМ СаС12. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диф-
фундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет
по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром су
остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне
[Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на
гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для
удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После
трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотоплен-
ке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушаю-
щих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].
Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него
вносят ДНК (Ю мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы
для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то
в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофоре-
за. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеино-
вых кислот — бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается
весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где
нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нук-
леаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во
время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием
ДДС-Na из геля вымывают.
Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно
выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Мож-
но также исследовать оптимизацию условий, необходимых для
активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробо-
вать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью
кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз.
Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяс-
нения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окра-
шивание бромистым этидием в описанных опытах можно заме-
нить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо-
вать меченную 32Р нуклеиновую кислоту или синтетический
полинуклеотид [Iborra et aL, 1979].
Выше указывалось, что для локализации ферментов по их
активности электрофорез желательно проводить в условиях,
исключающих возможность денатурации. Однако в недавней ра-
боте [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку цело-
го ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электро-
форезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки
их детергентом при повышенной температуре. Денатурация ока-
зывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na от-
мывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в
течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, pH 7,6. Ферментативная
активность в ряде случаев восстанавливается.
юз
По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермен-
та имеет смысл денатурировать его кратковременной обработ-
кой 6 М. гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при раз-
бавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная
конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке
ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих
несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предваритель-
ную обработку p-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исклю-
чить. Впрочем,, то же самое относится и к одноцепочечному трип-
сину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S—S-связей в
нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие
более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.
В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофо-
реза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе
конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой,
например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979],
или радиоактивно меченного введением 12SI [Horst et al., 1980].
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na
Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы по-
зволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в при-
сутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее
простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0—4°.
При боковом освещении на фоне черного'бархата непрозрачные
белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачно-
го геля. По-видимому, комплексы белок—ДДС-Na служат ядра-
ми конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, раство-
римость которого очень сильно зависит от температуры. При
отогревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чув-
ствительности этого метода — 0,2 мкг белка на 1 мм’ площади
пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описан-
ный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержа-
щем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5—10 мин при —70°.
В местах расположения белковых зон за счет связывания части
свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая не-
прозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрач-
ным [Bachrach, 1981].
Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после
окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25°
в 10—12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный
ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, вы-
падает в осадок — гель становится белым и непрозрачным. Бел-
ки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрач-
ные полосы хорошо видны на темном фоне при освещении геля
сбоку и снизу. Чувствительность метода — 0,1 мкг белка на 1 мм’
площади пятна или полосы.
104
ЭЛЮЦИЯ БЕЛКОВ ИЗ ГЕЛЯ
Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из по-
лоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного
времени при 37—40°. Этот прием пригоден как для свободных
белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения
диффузии белков из геля последний измельчают, например рас-
тирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элю-
ции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий
буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда
электрофорез белка проводили без него. Это делают для облег-
чения растворения белков. После окончания экстракции гель
»удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок
можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью
ацетона с 0,1 М НС1 (6:1), а затем чистым ацетоном. Осажден-
ный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и
Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом бе-
лок в 0,05 М Na-фосфатный буфер (pH 7,5) с 0,1% ДДС-Na и
1 мМ ФМСФ 1 при 37° в течение ночи при встряхивании. Белок
в комплексе с ДДС-Na осаждали (за счет ДДС-Na) добавле-
нием КС1 до 0,2 М и выдерживанием при 0°. Дрешер и Ли гомо-
генизировали кусочки геля в малом объеме 1 %-ного раствора
ДДС-Na и элюировали белки в течение ночи при 40°. Такая кон-
центрация ДДС-Na оказалась необходимой для растворения
белков, осажденных в геле в ходе их фиксации кислотой и окра-
шивания [Drescher, Lee, 1978]. В другой работе [Sreekrishna
et al., 1980] белки, предназначенные для последующего амино-
кислотного анализа, элюировали из ПААГ гомогенизацией в
0,05 М растворе бикарбоната аммония с 0,05% ДДС-Na и инку-
бацией в течение 10 ч при 37°. Бикарбонат аммония удаляли
повторной лиофилизацией. От ДДС-Na избавлялись, осаждая
белок добавлением 9 объемов подкисленного ацетона после рас-
творения лиофилизированного препарата в воде до концентра-
ции 1% по ДДС-Na.
Иногда для улучшения растворения осажденного в геле бел-
ка экстракцию ведут в 1%-ном ДДС-Na с 6 М мочевиной [Buis-
son et al., 1976]. Щелочные негистоновые белки хроматина мож-
но экстрагировать 66%-ной уксусной кислотой на холоду [Rab-
bani et al., 1980]. Белки рибосом после двумерного электрофореза
и окраски СВВ R-250 можно также элюировать 66 %-ной уксус-
ной кислотой. Краситель легко затем удалить на микроколонке
ДЭАЭ-целлюлозы прямо в той же кислоте. Анионный по своей
природе краситель десорбируется с белка и полностью задержи-
вается на анионообменййке, а щелочные рибосомальные белки
с ним не связываются [Bernabeu et al., 1980].
Описан способ экстракции белков в комплексе с ДДС-Na
60%-ной муравьиной кислотой [Gibson, Сгасу, 1979], которую
1 Фенилметилсульфонилфторид — ингибитор протеаз.
105
затем упаривают, а сухой остаток суспендируют в 6 н. НС1. Бе-
лок при этом растворяется, а ДДС-Na остается в осадке. Его
удаляют центрифугированием, а краситель из раствора белка в
кислоте извлекают троекратной экстракцией октанолом. Соля-
ную кислоту удаляют высушиванием в струе азота, разбавив
предварительно препарат водой.
Возможен и другой подход. Сначала ДДС-Na и краситель
экстрагируют из ПААГ без растворения осажденного в полосах
белка. Этого добиваются пятикратной гомогенизацией геля в
растворе, содержащем 10% ТХУ и 30% этанола. Гель каждый
раз осаждают центрифугированием. Из очищенного таким обра-
зом геля белки экстрагируют 0,1 М NaOH в течение 2 ч при 37°
при встряхивании [Djondjurov, Holtzer. 1979]. Для малых кон-
центраций белков в полосах этот метод не подходит, так как
часть белков вымывается при обработке геля ТХУ.
Нефиксированные белки удобно извлекать из геля возобнов-
лением электрофореза до выхода белка из геля. Содержащую
нужный белок полосу (или пятно) в геле локализуют сопостав-
лением с окрашенными белками в параллельном контрольном
треке на пластине, который предварительно отрезают, или в конт-
рольной трубке. Можно фиксировать положение полос и с по-
мощью данзилированных маркеров (см. выше). Вырезанный из
геля участок помещают в трубку на небольшую «пробку» из
крупнопористого ПААГ или агарозы и заливают буфером, а на
нижний конец трубки надевают заполненный буфером диализ-
ный мешочек. Затем возобновляют электрофорез и ведут его до
тех пор, пока белок не выйдет из трубки в мешочек [Weliky
et al., 1975]. Особенно удобно следить за выходом белка при на-
личии данзилированных маркёров. Если находящийся в диализ-
ном мешочке буфер содержит в избытке неионный детергент
(2% NP-40) и 8 М мочевину, то ДДС-Na практически полностью
вытесняется из связи с белком и уходит через мембрану к аноду
[Tuszynski et al., 1977].
Описан вариант, при котором белок электрофоретически
элюируют в трубку большего диаметра, где на пробке из ПААГ
лежит слой оксиапатита, уравновешенного 0,1 М Na-фосфатным
буфером (pH 7,2) с 0,1% ДДС-Na. Несмотря на действие элект-
рического поля, белок собируется на оксиапатите, откуда его
затем, разобрав всю систему, можно элюировать 0,5 М фосфат-
ным буфером [Ziola, Seraba, 1976].
Нитроцеллюлозные мембранные фильтры обладают способ-
ностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользо-
ваться для получения «реплики». Фильтр накладывают на по-
верхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки
тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно
такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре мож-
но проводить идентификацию белков, например гибридизацией
их с меченной заР ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устрой-
ство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы,
106
показано схематически на рис. 29. К пластине геля с двух сторон
металлическими сетками через пропитанные буфером поролоно-
вые прокладки прижимают нитроцеллюлозные фильтры (18Х
Х18 см) рабочей поверхностью к гелю. Фильтры предваритель-
но смачивают буфером, чтобы в них не оставалось окклюдиро-
ванного воздуха. Для этого следует дать им некоторое время по-
плавать на поверхности буфера, а потом уже погрузить в него.
Если электрофорез шел в присутствии ДДС-Na, белки пред-
Рис. 29. Устройство для диф-
фузии белков из геля на нит-
роцеллюлозный фильтр [Bo-
wen et al., 1980]
1 — сетка из нержавеющей стали;
2 — поролон; 3 — нитроцеллюлоз-
ный фильтр; 4 — ПААГ

варительно освобождают от него, вымачивая гель в 0,01 М рас-
творе Трис-HCl (pH 7), содержащем 0,05 М NaCl, 2 мМ ЭДТА
и 4 М. мочевину, в течение 3 ч с перемешиванием. Для более
полного освобождения от ДДС-Na в этот раствор можно сначала
ввести 1% Тритона Х-100, а потом отмывать тем же буфером без
детергента. Собранную, как описано выше, многослойную систе-
му погружают в 2 л того же буфера, но без мочевины. Диффузия
идет при комнатной температуре в течение 36—48 ч с одной сме-
ной буфера.
Белки на фильтре можно окрасить, а радиоактивные — обна-
ружить флюорографией (см. ниже). Для этого высушенный
фильтр ненадолго замачивают в 10%-ном растворе ППО в эфи-
ре и накладывают на него рентгеновскую пленку. Флюорогра-
фия или авторадиография с фильтра идет значительно лучше,
чем с геля, так как белки сорбируются на поверхности мембран-
ного фильтра.
Выход белков из геля на фильтр можно значительно уско-
рить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пла-
стины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это
было описано для электрофоретической отмывки красителя
[Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как
в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-
лозный фильтр («Millipore НА») накладывают на гель только с
одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под дейст-
вием электрического поля. Весь «сэндвич» помещают в прибор
для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение
так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см.
Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (напри-
мер, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех
компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в
0,7 %-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из
геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел-
107
люлозе. Однако не следует допускать перегрузки фильтра: его
сорбционная емкость составляет примерно 0,15 мкг белка на
1 мм1 поверхности. Для проверки можно вслед за первым поло-
жить второй листок нитроцеллюлозы — на нем не должно быть
белка.
Если разделение белков вели в комплексе с ДДС-Na, то и
элюировать их можно в этом комплексе. В таком случае следует
использовать буфер того же типа, какой используют для верхне-
го электродного резервуара ступенчатой системы электрофореза
по Лэммли (0,192 М глицин, 25 мМ Трис, 20%-ный метанол;
pH 8,3). Направление миграции белков — к аноду. Выход белка
при этом получается неполным.
Перешедшие на фильтр белки Таубин и соавторы идентифи-
цировали иммунологически. Подробное рассмотрение метода вы-
ходит за рамки этой книги, поэтому ниже он описан лишь вкрат-
це. Фильтр вымачивали в 3%-ном растворе бычьего сывороточ-
ного альбумина для насыщения оставшихся свободными центров
сорбции, затем инкубировали с антисывороткой к интересующе-
му белку, промывали и инкубировали с «индикаторными» анти-
телами к иммуноглобулинам первой сыворотки, конъюгирован-
ными с флюоресцентным красителем или меченными радиоактив-
но. Перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр
существенно облегчает их иммунологическую идентификацию,
так как крупные молекулы у-глобулинов плохо диффундируют
в гель, тогда как фильтр сорбирует белки на своей поверхности
и они легко доступны для антител.
Описанный прием идентификации можно использовать во
всех случаях, когда белок способен образовывать специфические
комплексы (гормон—рецептор, рецептор—цАМФ, белок—нукле-
иновая кислота и др.), — конечно, при условии, что его активные
группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу.
Впрочем, последнее требование может относиться лишь к неболь-
шой доле молекул белка данного типа, достаточной для иденти-
фикации всей полосы.
Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распро-
странение этого метода на любые белки связано с использова-
нием так называемой «диазобумаги», на которой предварительно
закреплены афинные сорбенты, например: антитела или антиге-
ны [Erlich et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла
себе применение главным образом для гибридизации нуклеино-
вых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для
описания ее особенностей. Отметим только способ переноса бел-
ков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в си-
стеме Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М. Na-фосфатным
буфером (pH 7,4) с 0,15 М. NaCl и 0,5% Тритона Х-100 при ком-
натной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку
фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером,
накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой
фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян-
108
ную пластинку грузом. Буфер, поднимающийся из кюветы через
гель к сухой фильтровальной бумаге, за 1—2 ч при комнатной
температуре вымывает основную массу белка из геля. Нужный
белок задерживается на афинном сорбенте, остальные же уходят
дальше, в фильтровальную бумагу.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ БЕЛКОВ
ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ
Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио-
активности белков, а также способы оценки эффективности этих
методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в
очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы
оценки радиоактивности белков после их электрофореза в
ПААГ.
Счет радиоактивности в элюатах белка
Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.
Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок—
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных^фйльтрах’типа_«МИНроге НА». К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6~М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок — ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].
Для качественного определения радиоактивности “С и 1251
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на
бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].
109
Другой вариант с использованием фильтров типа GF/С вклю-
чает диффузию* нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH4OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].
Растворение ПААГ
Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить
растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по-
вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода.
Если белки мечены 14С, то к раствору Н2О2 следует добавить
NHtOH до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный
“СО2. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в
такой смеси при 65® в течение 4—6 ч и далее просчитывать ра-
диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако
эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз-
можность артефактов — тушения и хемолюминесценции — вы-
ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного
растворения геля в Н2О2 с NHtOH иногда предпочитают исполь-
зовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радио-
активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-
zura, 1971]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в
30%-ной Н2О2 с 5% NH*OH (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил-
лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз-
ванием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелоч-
ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле-
дяной уксусной кислоты.
Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и
без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю-
билизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ
в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60—
65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при ана-
логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и
выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New Eng-
land Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать
3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион-
ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель на-
бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец,
недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий
6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10Х hydroxide» в 1 л то-
луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера-
туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка fAloyo, 1979].
Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето-
дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в
ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-
110
шие результаты, по данным автора, дает обработка предвари-
тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе-
ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в то-
луоле, содержащим 0,5% НПО и 0,05% вторичного сцинтиллято-
ра MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно
предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Solue-
ne 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же
толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав-
ляет около 60%, а выход достигает 90—95%.
Полное растворение геля легко осуществить в том случае,
когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель
сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла-
ве 1 уже был назван в этом качестве NN'-диаллилтартардиамид
(ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в
йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте
растворимого геля используют NN'-(l,2-AHOKCH9THneH)-6HcaKpH-
ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и
глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4
при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O’Connel, Brady, 1976]
утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос-
производимыми характеристиками, чем при использовании
ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-
цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида
[Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в 0-меркаптоэтаноле за
2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон-
костей, которые необходимо учитывать во избежание образова-
ния дополнительных, устойчивых к воздействию р-меркаптоэта-
нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN'-Бисакрилилцистамин в
настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и
ДОЭБА.
Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори-
мые ПААГ не получили широкого распространения — скорее
всего, ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень
легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы,
но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых
кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло-
жить до следующей главы.
Импрегнирование сцинтиллятора в гель
Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра-
диоактивности белка после электрофореза — вместо элюции бел-
ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек
геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со-
хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна.
В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо-
лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его — на
толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому,
лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.
111
При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачность, как
это происходит при вымачивании его в этаноле.
Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз-
резание, следует стремиться к тому, чтббы в одном кусочке геля
была вырезана целая полоса или всё белковое пятно. Широко
распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди-
наковые диски толщиной 1—1,5 /мм неудачна, так как разрез
«вслепую» может попасть на середину полосы. В результате это-
го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в
двойном объеме геля, что дщ:т ложную картину вдвое более ши-
рокого и низкого пика ра/Щоактивности на электрофореграмме.
Разумеется, для того -чтобы правильно вырезать белковую
полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон-
центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак-
ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ-
ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,,
например серебром, поможет решить эту проблему.
Авторадиография
Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине г.еля
можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады-
вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель-
ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре.
Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю
пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров-
ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не-
скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч-
ными проявителями, предназначенными для получения макси-
мально контрастного изображения. Под действием р-излучения
участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами,
чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех
случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или
йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус-
каемые им р-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток
между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду
их сильного поглощения в геле.
Потеря энергии р-частиц в геле достаточно велика и в слу-
чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед
авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен-
ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-
тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на
фильтровальную бумагу («Whatman ЗММ»), под нее подклады-
вают пористую прокладку и перфорированную металлическую
пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при-
соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей
воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую
прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть
множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-
112
ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по-
ристую основу и накрйрают листом тонкой резины, которую при-
сасывает вакуумом. Во\избежание прилипания резины к гелю
под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши-
вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не-
возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.
Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-
ную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film»,
например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма
LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио-
графии препаратов, меченных тритием, под названием «LKB-
Ultrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности,
а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией.
Это облегчает проникновение в нее «слабых» p-электронов три-
тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви-
тельность метода авторадиографии для регистрации “С можно
оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив-
ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде-
ленная по площади 1 см2, надежно регистрируется за 24 ч экспо-
зиции.
Для регистрации у-излучения ,251 удобно применять способ
«непрямой» авторадиографии. у-Излучение регистрируется рент-
геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те-
ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый
«интенсифицирующий экран», .покрытый твердым сцинтиллято-
ром (CaVOJ. Под действием у-излучения экран флюоресцирует,
а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение
и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку
экран удален от геля на толщину пленки, а не все у-частицы вы-
летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш
в чувствительности получается значительный.
Для непрямой авторадиографии следует использовать экра-
нированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R»
и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую-
щие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Pont» (США)
под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфарм-
завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.
Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва-
рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле-
ния), соответствующей ЛВ40 = 0,2-4-0,3. Объяснение этого стран-
ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey,
Mills, 1975].
Флюорография
Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит
113
из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который испрйьзуют при непрямой
авторадиографии. По существу говоряутакой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины /геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкоро сцинтиллятора.
Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.
Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в
нем сжимаются.
Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стек-
ленеет») , а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-
114
верхностью геля и пенкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, Через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].
Недавно было указано да возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 йин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
гледует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).
После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
тивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.
Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.
Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку SH и “С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по 3Н, в белки второй — по 44С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (3Н + “С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранироваиную
пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только “С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].
115
Авторадиографией и флюорографией мо&но пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5—1,5 N0. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].
Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их «репликами» белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.
ПРЕПАРАТИВНЫЙ электрофорез белков
Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения
в качестве препаративного метода фракционирования и очистки
белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности
осуществления равномерного теплоотвода из большой массы ге-
ля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плос-
кой). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле гра-
диенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому
ухудшению качества разделения белков.
Вторая трудность связана с необходимостью создания удоб-
ной и Надежной камеры элюции для сбора белков по мере их
последовательного выхода из геля. В многочисленных конструк-
циях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру соз-
давали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от
нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохране-
ния качества разделения, белков камера элюции очень малого
объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться
элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны
сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной
пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб
геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в каме-
ру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков
из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.
Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодо-
леть указанные трудности. Препаративное фракционирование
белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную
мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного
резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание
сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее по-
д'авался под гидростатическим давлением, уравновешивающим
а скорость элюции задавалась перистальтическим на-
сосЬм, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму
незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного
ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе-
118
нии ряда белков с молекулярными массами 100—500 тыс. при за-
грузке в гель 4 мг белка [Hardman, Капе, 1980].
Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении
проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полиме-
ризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной
мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембра-
ной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из
них используется для подкачки, вторая — для слива элюирую-
щего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб
геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое пере-
мещение на очень малое расстояние вызывается кратковремен-
ной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так созда-
ется камера элюции: она существует только то время, которое
необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем
открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием
собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается.
Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, ли-
бо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной
маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры поляр-
ность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную,
что помогает десорбции белков с мембраны.
Проще и надежнее вести элюцию заранее окрашенных белко-
вых полос последовательно, одну за другой, в сменные диализ-
ные мешочки [Sun, Hall, 1974]. В цитируемой работе ПААГ по-
лимеризовали тоже в цилиндре из плексигласа диаметром 3 см,
по оси которого проходила трубка для дополнительного охлаж-
дения геля циркулирующей водой. Гель высотой 21 см поддержи-
вался снизу найлоновой сеткой. Сменные диализные мешочки
легко одевались на нижний конец цилиндра с помощью поли-
этиленовых переходников. Перед снятием очередного мешочка
полярность напряжения на короткое время реверсировали. Та-
ким образом авторам удалось выделить из 6 мг исходного бел-
кового препарата три компонента, относительно мало различаю-
щиеся между собой по молекулярной массе (43, 47 и 53 тыс.
дальтон).
Возможно построить препаративную систему электрофореза
с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края
пластины ПААГ. Фирма «Bio-Rad» предлагает для этой цели
специальные прокладки, используемые при полимеризации геля.
Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю ра-
бочего геля толщиной до 6-мм по обеим его сторонам две тру-
бочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков.
Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют
пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочек-ги
на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над
этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом за-
мещает элюирующий буфер.
Для препаративного фракционирования белков нередко ис-
пользуют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и
117
из несколько других соображений, чем создание узкой началь-
ной полосы. Наличие дополнительного формирующего геля при
большой загрузке предохраняет от преципитации белка на гра-
нице рабочего геля, позволяет увеличить объем препарата, обес-
печивает удаление из него остатков соли до начала процесса
рабочего разделения и, наконец, снимает необходимость преэлек-
трофореза, так как основная часть персульфата успевает уйти
из рабочего геля к аноду до того, как в этот гель вступают бел-
ки. Максимальная загрузка ПААГ при препаративном фракцио-
нировании белков может достигать 5 мг на 1 см2 сечения геля.
Общим недостатком любых устройств с последовательной
элюцией белков в конце пути их миграции через весь гель явля-
ется продолжительность этого процесса и, в силу этого, диффу-
зия белковых зон (особенно для белков, выходящих последни-
ми), поэтому сейчас на практике отдают предпочтение обычному
(хотя и с увеличенной загрузкой) фракционированию белков в
трубках диаметром до 1,7 см или в толстых пластинах. Фракцио-
нирование ведут с примесью окрашенных «свидетелей», как было
описано выше. Аликвоту разделяемой смеси белков окрашивают
ремазолом [Sun, Hall, 1974] или посредством данзилирования
[Tijssen, Kurstak, 1979; Schetters, McLeod, 1979]; окрашенные
полосы вырезают и белки элюируют из геля за счет диффузии
или электрофореза (см. выше).
Следует иметь в виду, что при элюции белков из геля может
выходить большое количество линейного полиакриламида, не
вошедшего в состав матрицы геля. Он не обнаруживается при
оценке чистоты белка аналитическим электрофорезом. Между
тем аналитическое ультрацентрифугирование показывает, что
количество элюированного полиакриламида может быть таким
же, как и самого белка. Дополнительную очистку белка в этом
случае можно провести его сорбцией на ионообменную смолу
[Brooks, Sander, 1980].
Недавно был предложен оригинальный способ электрофоре-
тической элюции белков одновременно из нескольких полос ге-
ля, вырезанных из пластины после препаративного электрофоре-
за [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой
пропитанного буфером сефадекса Г-25 «суперфайн» толщиной
2—3 мм. С интервалом в 1—1,5 см перпендикулярно длинной
стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укла-
дывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс
через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут уголь-
ные электроды и подают напряжение. Под действием электриче-
ского поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежа-
щий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в мик-
роколояки и белки из них элюируют.
Кстати, можно просто заполнить сефадексом вертикальную
колонку и использовать его в качестве антиконвекционной среды
для препаративного электрофореза белков. Это, конечно, уже не
электрофорез в геле, и качество фракционирования будет заве-
118
домо хуже, но для грубого разделения смеси белков оно может
быть вполне приемлемым.
Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой
смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора саха-
розы (10—45%) в буфере с pH 8,5. Электрофорез вели в цилиндре
диаметром 12 см и высотой 17 см [Walters, Bont, 1979]. Тонкость
метода — в наслаивании препарата на раствор сахарозы с по-
мощью металлического сита, которое поднимается по мере уве-
личения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском
жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет на-
Рис. 30. Схема электрофоретиче-
ской^ элюции белков из геля в се-
фадекс [Judd, 1979]
/ — полоски, вырезанные из геля; 2 —
сефадекс Г-25 «суперфайнж; 3 —уголь-
ные электроды; 4 — смоченная буфе-
ром фильтровальная бумага
нести 30 мл исходного белкового препарата совершенно ровным
слоем толщиной 3 мм. Электрофорез во избежание разогрева
жидкости ведут при малой плотности тока (0,2 мА/см2) в тече-
ние 15 ч. Фракции собирают, сливая содержимое колонки через
воронку, расположенную в ее нижней части. Препаративный
электрофорез в 5—25 %-ном градиенте сахарозы в 0,1 М Трис-
боратном буфере (pH 8) с 6 М мочевиной был недавно исполь-
зован для очистки фотохимически сшитого комплекса тРНК и
тРНК-синтетазы [Renaud et al., 1979].
К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого от-
ношения не имеют, так как являются примерами электрофореза
в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение
электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за
последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических це-
лей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен
электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, раз-
личных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.),
который широко применялся при фракционировании пептидов,
аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биоло-
гически важных молекул, в том числе и в высоковольтных ва-
риантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл
метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК
двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение
вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфе-
ре (pH 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором — на ДЭАЭ-
бумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емко-
сти ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гид-
ролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные ра-
диоактивным фосфором.
119
Сейчас методы фракционирования низкомолекулярных био-
логических объектов электрофорезом на твердых носителях на-
столько энергично и успешно вытесняет жидкостная хроматогра-
фия под высоким давлением (ЖХВД), что рассматривать их
уже не имеет смысла. Впрочем, изредка электрофорез на твер-
дом носителе еще используют и для фракционирования белков.
Так, сравнительно недавно было описано очень хорошее разде-
ление девяти модификаций казеина молока электрофорезом на
полосках ацетатцеллюлозы. Эти модификации различались уров-
нем фосфорилирования белка, и разделение шло по величине
электрического заряда [West, Towers. 1976].
Глава 4
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА
Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов
электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фрак-
ционирования белков некоторыми характерными особенностями,
вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное,
что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицатель-
ный и значительный по величине суммарный электрический за-
ряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фос-
форной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH
окружающей среды, а отношение заряда к массе практически
одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляю-
щем большинстве случаев фракционирование их при электрофо-
резе идет за счет различия размеров молекул, а .не их зарядов.
Выбор буфера геля и напряженности
электрического поля
Выбор буфера геля в описанной выше ситуации не играет
существенной роли. Неудивительно, что ассортимент буферов,
традиционно используемых в обычных, неденатурирующих усло-
виях электрофореза нуклеиновых кислот, очень ограничен. Как
для ПААГ, так и для гелей агарозы чаще других используют
предложенный еще в 1968 г. 0,089 М Трис-боратный буфер
[Pegcock. Dingman, 1968]. Для приготовления его в 10-кратной
концентрации на 1 л конечного раствора берут 108 г Триса и
55 г борной кислоты. Иногда такой же буфер используют в кон-
центрации 0,05 М. Нередко используют Трис-фосфатный буфер,
pH 7,7 (0,036 М Трис+0,03 М NaHsPO4) и Трис-ацетатный с
добавлением ацетата натрия (0,05 М. Трис-ацетат, pH 8,3+0,04 М
120
CH3COONa). Иногда используют также 0,025 М Na-веронало-
вый (pH 8,7), 0,05 М Na-фосфатный (pH 7) и некоторые другие
буферы.
Для разделения коротких олигонуклеотидов удается исполь-
зовать и вклад заряда их оснований. При кислых значениях pH
этот вклад может быть заметным и зависеть от нуклеотидного
состава полимера. С этой целью употребляют, например, 0,025 М
Na-цитратный буфер, pH 3,5.
Если электрофорез надо вести в условиях, обеспечивающих
денатурацию нуклеиновой кислоты, то они могут быть созданы,
в частности, полимеризацией геля в 0,02—0,03 М растворе NaOH.
Другие варианты — с добавлением в буфер денатурирующих
агентов — рассмотрены ниже.
Электропроводность многих названных буферов обусловлена
присутствием ионов Na+ в концентрации 0,02—0,04 М, которая
может служить для ориентировки при подборе буфера иного со-
става. Добавим еще, что во все буферы, как правило, вносят
ЭДТА до концентрации 1—2 мМ. Это необходимо не только для
блокирования активности нуклеаз, но и для предупреждения
осаждения нуклеиновых кислот двухвалентными металлами, осо-
бенно в щелочной среде.
Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с
учетом обеспечения теплоотвода, как для белков, но и с таким
расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не
превышала 5 В/см (обычно работают с напряженностями 0,5—
2 В/см). При больших значениях напряженности поля крупные
молекулы нуклеиновых кислот могут, деформируясь, «протиски-
ваться» через поры геля независимо от своей массы [Maxwell
et aL, 1979]. К этому мы еще вернемся ниже.
Выбор характера геля и его пористости
Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их
фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. На-
пример, при определении нуклеотидной последовательности ДНК
или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе
олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных
звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких со-
тен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и
пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ
с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной зада-
чи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использо-
вать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже
целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электро-
форез ведут в гелях агарозы.
Для нуклеиновых кислот вирусов и крупных плазмид можно
рекомендовать 0,4—0,5%-ные гели агарозы. Для фракциониро-
вания рестриктов ДНК, содержащих 5—20 тыс. пар оснований
(КВР), т. е. с молекулярной массой до 15 млн. дальтон, употре-
121
бляют 0,7—0,8%-ные гели агарозы. Для более коротких рестрик-
тов и гибридных молекул ДНК—РНК, а также для денатуриро-
ванной метилртутью РНК используют 1 — 1,2%-ные гели. Для
двунитевой РНК реовируса длиной 0,5—5 КВР удобно вести
электрофорез в 1,5%-ном геле агарозы, а однонитевые (напри-
мер, рибосомальные) РНК разделяют в 1,75 %-ном геле. Нако-
нец, мРНК и короткие рестрикты ДНК (100—1000 пар основа-
ний) можно фракционировать в 2%-ном геле. Впрочем, для элек-
трофореза РНК чаще используют смешанные гели, содержащие
2—3% ПААГ и 0,4—0,6% агарозы (см. главу 1).
Для фракционирования по размерам очень высокомолеку-
лярных ДНК с молекулярной массой до НО млн. Север исполь-
зовал гели агарозы малой концентрации (вплоть до 0,1%). Такие
гели являются полужидкими по своей консистенции и могут
быть использованы только в варианте горизонтального электро-
фореза. На стеклянной пластине сначала заливают «рамку» из
1,5%-ной агарозы, которую затем заполняют агарозой малой кон-
центрации [Sewer, 1980]. В то время как скорость миграции дву-
нитевой линейной ДНК в свободной жидкости не зависит от ее
молекулярной массы (ввиду постоянства отношения заряда к
линейному размеру), электрофорез в гелях агарозы малой кон-
центрации обнаруживает эффект значительного трения ДНК о
гель. Даже для ДНК с М = 2 млн. скорость миграции увеличива-
ется в 1,5 раза при переходе от 0,5%-ной агарозы к 0,1 %-ной, а
для ДНК с М=25 млн. это увеличение оказывается шестикрат-
ным, причем в 0,1 %-ной агарозе такая ДНК мигрирует еще вдвое
медленнее, чем в свободной жидкости.
Исследование показало, что в 0,1 %-ном геле агарозы рас-
стояние миграции полос связано с логарифмом молекулярной
массы ДНК линейной зависимостью в интервале от 6 до 110 млн.
дальтон. Для получения хорошего разделения полос электрофо-
рез в гелях низкой концентрации следует вести при малых зна-
чениях напряженности электрического поля. Например, для ука-
занного выше варианта разделения ДНК в 0,1%-ном геле агаро-
зы автор рекомендует ограничиться напряженностью поля
0,34 В/см. Длительность электрофореза при этом составляет
20 ч.
Аналогичное, хотя и менее детальное, исследование возмож-
ностей фракционирования высокомолекулярных ДНК в гелях
агарозы малой концентрации было проведено ранее [Fangman,
1978]. Здесь молекулярная масса фракционируемой ДНК дохо-
дила до 500 млн. (ДНК вируса G из Вас. megatherium, выделен-
ная обработкой вируса горячим саркозилом с последующей очист-
кой центрифугированием в градиенте плотности раствора CsCl).
Подробно описаны предосторожности, необходимые при манипу-
ляциях с такой ДНК во избежание ее разрыва под действием
гидродинамических сил.
122
Влияние вторичной структуры
Третья особенность электрофореза нуклеиновых кислот за-
ключается в сильной зависимости их поведения в геле от вторич-
ной структуры.
Двунитевые и однонитевые структуры. В поведении однони-
тевых (РНК, денатурированная ДНК) и двунитевых молекул
нуклеиновых кислот многое определяется их размерами. В слу-
чае коротких полинуклеотидных цепей нативная двунитевая мо-
лекула имеет более жесткую структуру, чем таких же размеров
однонитевая. Она труднее изгибается, проходя через пространст-
венную сетку геля. В силу этого, например, относительно корот-
кие двунитевые фрагменты ДНК при близких к нейтральному
значениях pH будут отставать при электрофорезе в ПААГ от де-
натурированных ДНК такой же длины. Это будет иметь место
даже для ДНК фага ФХ-174 с молекулярной массой 3,5 млн.
дальтон. Однако для более крупных молекул ситуация может
измениться на противоположную. Длинная двунитевая цепочка
оказывается уже в целом довольно гибкой: она продвигается че-
рез поры геля, как бы «извиваясь ужом». Между тем одноните-
вая цепь той же длины сворачивается в «хаотический клубок»
такого размера, что его продвижение в геле оказывается более
затрудненным. В этом случае денатурированная ДНК при элек-
трофорезе отстает от нативной. Такую картину, например, мож-
но наблюдать для ДНК фага РМ2 с молекулярной массой 7 млн.
[Johnson, Grossman, 1977].
Естественно, что граница обращения описанного эффекта за-
висит от размера пор геля. Кроме того, скорость миграции дена-
турированной ДНК сильно увеличивается в присутствии ионов
Na+. Последние нейтрализуют заряд фосфатов, взаимное оттал-
кивание которых придает некоторую жесткость и одинарной
нити, и хаотический клубок становится компактнее.
Кольцевые ДНК. Двунитевые ДНК форм I, II и III. Вирус-
ные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды
бактерий могут иметь структуру замкнутого двунитевого кольца.
Нативное состояние такого кольца — «сверхскрученное». Кольцо
в целом сворачивается в «жгут», что сильно увеличивает его
компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух нитей
кольца имеется единичный разрыв сахарофосфатной цепи, то
«жгут» разворачивается и силами электростатического отталки-
вания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность
молекулы становится меньше, наружные размеры увеличиваются
(форма II). Форма I при электрофорезе всегда мигрирует быст-
рее, чем форма II. Что касается линейной двунитевой молекулы
ДНК (форма III), то она может мигрировать быстрее или мед-
леннее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней молеку-
лярной массы, в зависимости от среднего размера пор геля. Для
крупнопористого геля решающим фактором может оказаться
компактность формы I, для мелких пор на первый план выступа-
123
ет большая гибкость линейной молекулы. Так, для двунитевой
репликативной ДНК фага РМ2 в 0,6%-ном геле агарозы скоро-
сти миграции трех форм при электрофорезе убывают в порядке
I—III—II. Те же ДНК в 1,4%-ном геле мигрируют в последова-
тельности III—I—II. Чем больше напряженность электрического
поля, тем при более низкой концентрации геля агарозы прояв-
ляется преимущество гибкости формы III. Под воздействием по-
ля, как уже упоминалось, линейная молекула ДНК может отно-
сительно легко деформироваться, приспосабливаясь к простран-
ственной конфигурации пор в геле.
Микель и соавторы имели в своем распоряжении более 10 ис-
ходных сверхскрученных пл азмидных ДНК с молекулярными мас-
сами от 3,6 до 55 млн. Облучением в присутствии бромистого
этидия из них были получены расправленные кольцевые молеку-
лы с разрывом в одной нити, а с помощью рестриктазы Есо RI —
линейные двунитевые молекулы той же молекулярной массы, что
и исходные плазмиды [Mickel et al., 1977]. Авторы сопоставля-
ли электрофоретические подвижности всех этих молекул в гелях
агарозы различной концентрации. Было обнаружено, что ДНК
в виде расправленного кольца (форма II) не только мигрирует
медленнее двух остальных форм, но, начиная с молекулярной
массы 14—16 млн., вообще не входит даже в 0,6%-ный гель ага-
розы (рис. 31).
Скорость миграции линейных двунитевых молекул ДНК
уменьшается с увеличением их молекулярной массы, но лишь до
определенного предела. При молекулярной массе более 5 млн.
в 1,6%-ном геле агарозы и более 12 млн. в 0,8%-ном линейные
молекулы ДНК мигрируют с одинаковой скоростью независимо
от их молекулярной массы (!) и, следовательно, не могут быть
разделены электрофорезом. Это происходит именно вследствие
гибкости длинных молекул ДНК. Их противоположные концы
мигрируют в электрическом поле независимо друг от друга, и
вся молекула, извиваясь, проходит через гель одинаково легко
(или одинаково трудно) при любой ее длине.
При очень больших значениях молекулярных масс то же ста-
новится характерным и для сверхскрученных колец (форма I).
В своей сверхскрученности они тоже приобретают своеобразную
линейную форму (так сказать, структуру «второго порядка») со
всеми вытекающими из ее относительной гибкости последствиями.
Здесь уместно напомнить цитированные в главе 1 данные о
различном влиянии эндосмоса в агарозе на скорости миграции
трех разных форм двунитевой ДНК (см. рис. 4). В той же работе
сообщается о малопонятном влиянии степени загрузки геля ага-
розы на характер миграции в нем ДНК. По данным авторов, при
увеличении количества ДНК, вносимого в один колодец горизон-
тального геля агарозы, от 0,2 до 5 мкг скорости миграции всех
трех форм двунитевой ДНК увеличиваются, а полосы заметно
расширяются. При этом загрузку можно было увеличивать за
счет одной только формы I, а увеличение скорости и расшире-
124
Рис. 31. Зависимость электрофоретической подвижности (U') двунитевых
плазмидных ДНК различного типа в 1%-ном геле агарозы от молекулярной
массы (Af) и напряженности электрического поля [Mickel et al., 1977J
Типы ДНК: / — сверхскрученная (I); 2 — кольцевая (II); 3 — линейная (III). А— 8 в/см;
S — 4 В/см
ние полос происходило в равной мере для всех трех форм [John-
son et al., 1980].
РНК может иметь существенно более невыгодную для мигра-
ции в геле вторичную структуру, чем ДНК. Дело в том, что у
крупных молекул РНК эта структура представлена многочислен-
ными, торчащими во все стороны «шпильками». Такая молекула
не может продвигаться- через поры геля, «извиваясь ужом», ведь
«уж», по определению должен быть гладким! Поэтому, напри-
мер, РНК с молекулярной массой 0,7 млн. даже не входит в
5%-ный ПААГ, в то время как нативная ДНК с молекулярной
массой, составляющей несколько десятков миллионов дальтон,
может в таком геле мигрировать с вполне заметной скоростью
[Flint, Harrington, 1972]. Нечто аналогичное может происходить
при частичной денатурации ДНК, когда на прежде «гладкой»
двунитевой молекуле образуются вздутия хаотических клубков
там, где образовались области разрыва водородных связей меж-
ду двумя нитями.
Маркерные молекулы
Во многих случаях электрофореза, описанных ниже, бывает
желательно оценить молекулярные размеры (или молекулярную
массу) фракционируемых нуклеиновых кислот. Для этой цели
удобно иметь набор молекул того же типа, но известной длины.
Проведя разделение смеси таких маркеров в отдельном треке
пластины геля, можно сопоставить положение полосы исследуе-
мой нуклеиновой кислоты в параллельном треке с расположени-
ем полос маркерного набора. Для РНК с этой целью используют
тРНК, 5S РНК,, рибосомальные и другие РНК известного раз-
мера. Для ДНК роль маркеров выполняет обычно набор фраг-
ментов известной длины, полученных при расщеплении хорошо
126
изученной ДНК определенными рестриктазами. Таковы, напри-
мер, наборы рестриктов ДНК фага X, получающихся при пере-
варивании ее рестриктазами Hind III и Есо RI,—порознь и со-
вместно [Murray К-, Murray N., 1975].
Лидирующие красители
В качестве лидирующих красителей при электрофорезе нук-
леиновых кислот используют бромфеноловый синий и ксилен-
цианол. Следует только иметь в виду, что в крупнопористых ге-
лях агарозы малые фрагменты ДНК могут обгонять даже бром-
феноловый синий.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В МЯГКИХ УСЛОВИЯХ
^Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК
Целые плазмиды можно обнаружить и отделить от ДНК бак-
терии-хозяина электрофорезом в 0,8%-ном геле агарозы.
Например, Телфорд и соавторы лизировали колонии бактерий, отобран-
ные по устойчивости к определенному антибиотику, обработкой 1%-ным рас-
твором ДДС-Na и протеиназой К при 60° в стандартном Трис-фосфатном
буфере (0,036 М Трис+0,03 М NaH2PO4+l мМ ЭДТА, pH 7,8), при 50° сме-
шивали лизат с равным объемом расплавленного 0,6%-ного раствора агарозы
и наносили на пластину 0,8%-ной агарозы, полимеризованной в том же буфе-
ре, Электрофорез вели в течение ночи при напряженности поля 2 В/см. Затем
гель окрашивали в течение часа бромистым этидием Д1 мкг/мл). При наблю-
дении под ультрафиолетовой лампой наряду с мощной полосой бактериальной
ДНК видны полоски неповрежденных сверхскрученных ДНК плазмид, кото-
рые уходят вперед (рис. 32). Позади двунитевой линейной ДНК бактерий
мигрируют полоски, соответствующие расправленным кольцам плазмидных
ДНК (форма II). На одной пластине геля проводили обследование несколь-
ких штаммов бактерий для отыскания в них рекомбинантных плазмид более
крупного, чем в норме, размера [Telford et al., 1977].
Для решения такой же задачи другие авто-
ры использовали 1%-ный [Barnes, 1977] и
1,2%-ный гели агарозы [Fantoni et al.,
1979]. Очевидно, что концентрацию агарозы
можно варьировать в зависимости от ожидае-
мого размера плазмид. Выбор буфера, как
уже указывалось, не играет большой роли.
Рис. 32. Отделение кольцевой (/) и сверхскрученной
(5) плазмидных ДНК от основной массы ДНК Е. coli
(2) электрофорезом в 0,8 %-ном геле агарозы [Telford
et al, 1977]
Цифры слева — молекулярные массы маркеров, млн. дальтон
128
Так, для разделения плазмид и их крупных рестриктов ис-
пользовали 0,8%-ный гель агарозы, а в некоторых случаях и
3,5%-ный ПААГ, полимеризованные в 0,089 М Трис-боратном
буфере (pH 8,5) с 2,5 мМ ЭДТА [Smith et al., 1979]. В таком же
буфере, но в 1,4%-ном геле агарозы, разделяли рестрикты ДНК
фага X с целью обследования бактериальных экстрактов на на-
личие в них рестриктаз. Бромистый этидий (1 мкг/мл) вводили
в гель еще при его полимеризации [Lui et al., 1979].
Рестрикты ДНК фага SV-40 разделяли электрофорезом в 1,5%-ном геле
агарозы (0,04 М Трис-ацетатный буфер, pH 7,9+0,02 М CHsCOONa+l мМ
ЭДТА+0Д мкг/мл бромистого этидия). Агарозу полимеризовали в трубках
размером 15X0,6 см, немного суженных на нижнем конце для предотвраще-
ния сползания геля. Перед использованием их выдерживали в течение 12 ч на
холоду. ДНК (1—Ю мкг) вносили на гель прямо в 25—100 мкл инкубацион-
ной смеси с рестриктазами, добавив в эту смесь до 10% сахарозы и до 0,0Г%
бромфенолового синего. Электрофорез вели при комнатной температуре и
напряжении 60—80 В, т. е. при напряженности поля 4—5 В/см. Для разде-
ления комплементарных нитей отобранных таким образом рестриктов ДНК
денатурировали прямо в вырезанных полосках геля, вымачивая нх в 0,3 М
NaOH в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем их еще 30 мин дер-
жали в 0,015 М NaOH. Наконец, агарозу расплавляли и выливали в трубки
на заранее полимеризованную, но уже в буфере низкой ионной силы, 1,4%-
ную агарозу. В качестве буфера использовали 6 мМ Трис+7,2 мМ NaH2PO«+
+0,2 мМ ЭДТА, pH 7,7. Электрофорез в течение 8 ч вели при напряжении
85 В и температуре 4°. Благодаря низкой температуре и малой ионной силе
буфера ренатурации ДНК в ходе электрофореза не происходило [Perlman,
Huberman, 1977].
В классической работе Максама и Гилберта по секвенирова-
нию ДНК комплементарные нити, полученные в результате пред-
варительной денатурации фрагментов ДНК в 0,3 М NaOH, уда-
валось полупрепаративно разделять электрофорезом в градиенте
концентрации ПААГ (5—10%). Разделение вели в пластинах
толщиной 0,3—1 см и шириной 3 см в нейтральном буфере
(0,05 М Трис-борат, pH 8,3, с 1 мМ ЭДТА). Исходную концен-
трацию ДНК, опять-таки во избежание ренатурации, брали не-
большой [Maxam, Gilbert, 1977].
Анализ размеров фрагментов ДНК в моно- и олигонуклеосо-
мах после частичного переваривания хроматина микрококковой
нуклеазой можно вести в мягких условиях и без предваритель-
ной депротеинизации ДНК. Недавно было показано, что добав-
ление к такому хроматину до 0,4 % саркозила освобождает ДНК
от связи с белком. Вместе с тем саркозил не вносит искажений
в картину электрофореза ДНК (в отличие от ДДС-Na, способно-
го захватывать часть ДНК). На пластину геля можно вносить
прямо всю инкубационную смесь, так как белки хроматина в
комплексе с саркозилом не образуют четких полос и создавае-
мый ими фон лишь диффузно накладывается на резко очерчен-
ные полосы ДНК. Элетрофорез вели в 1,4 %-ном геле агарозы
127
(0,04 М Трис-HCl, pH 7,9, +5 мМ CHsCOONa + l мМ ЭДТА+
4-0,1 мкг/мл бромистого этидия). Можно использовать и 3,5 % -
ный ПААГ в обычном 0,09 М Трис-боратном буфере, pH 8,3
[Creusot, Christman, 1980]. Такой же подход возможен для осво-
бождения и электрофореза РНК из рибосом.
Фракционирование РНК
В классической работе Пикока и Дингмэн нативные РНК от
тРНК До 30 S РНК рибосом печени фракционировали в смешан-
ных гелях, содержащих от 1,5 до 3% ПААГ (С=5) и 0,5% ага-
розы [Peacock, Dingman, 1968]. Рабочий буфер геля — все тот
же 0,09 М Трис-борат (pH 8,3) с 3 мМ ЭДТА, электродные буфе-
ры разбавлены в 10 раз. Для гелей с различным содержанием
акриламида электрофоретические подвижности соответствующих
РНК заметно отличались друг от друга, но во всех случаях для
данного геля имела место обратная линейная зависимость рас-
стояния миграции молекул РНК от логарифма их молекулярной
массы. Эта зависимость сохранялась в интервале молекулярных
масс от 20 тыс. до 2 млн. дальтон.
Шуерх и соавторы обнаружили, что оптимальное фракциони-
рование двунитевых РНК реовируса в интервале молекулярных
м^сс от 0,3 до 3 млн. получается в 7,5%-ном ПААГ (С=2,6).
Однонитевые РНК в том же диапазоне молекулярных масс луч-
ше разделять в смешанном геле (1,8%-ный ПААГ с 0,6% агаро-
зы и добавлением мочевины до 6 М) [Schuerch et al., 1975]. В по-
следнем случае электрофорез приходилось вести в трубках из
стекла «Perspex», вымоченных в течение ночи в 1%-ном ДДС-Na
и промытых перед использованием стерильной водой (лишенной
РНКаз), так как обычное стекло плохо сцепляется с гелем столь
малой концентрации.
Фракционирование РНК с молекулярной массой до 15 млн.
удается успешно проводить в слабосшитом 2,2%-ном ПААГ
(С=2) [Shaaya, 1976]. В свете отмеченной выше трудности ми-
грации РНК в геле из-за наличия в них «шпилек» этот успех
можно связать с увеличением возможности раздвигания слабо-
сшитых нитей акриламида (см. главу 1). Манипулировать с та-
ким гелем нелегко, но возможно.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ ГЕЛЯХ
Как следует из изложенного, фракционирование нативных,
двунитевых молекул ДНК по'размерам с помощью электрофоре-
за в гелях агарозы возможно, но до определенных значений их
молекулярной массы. Фракционирование нативных высокополи-
мерных РНК затруднено наличием двунитевых «шпилек» и не-
определенностью их числа и размеров. Выше шла речь об элек-
трофорезе денатурированных молекул ДНК в мягких условиях,
в нейтральной области pH рабочих буферов. При этом однони-
128
тевые структуры могут сохраниться в ходе электрофореза толь-
ко при условии их очень малой концентрации. В противном слу-
чае происходит частичная ренатурации этих молекул. Кроме то-
го, однонитевые фрагменты ДНК и РНК даже при малой кон-
центрации в мягких условиях электрофореза удается разделить
относительно грубо—лишь при значительном различии их моле-
кулярных масс. Это связано с не поддающимся учету влиянием
фактора гибкости одиночных нитей, их способностью свертывать-
ся в клубки, а также с возможностью существования в них ло-
кальных двунитевых участков. Такие участки могут иметь на-
тивное происхождение (палиндромы ДНК, «шпильки» РНК) или
возникать случайным образом при наличии более или менее
комплементарных последовательностей нуклеиновых оснований
в составе одной гибкой нити.
Воспроизводимое фракционирование однонитевых молекул
ДНК и РНК, а также определение их молекулярной массы по
скорости миграции в геле оказываются возможными только при
сохранении условий денатурации в ходе самого электрофореза.
Поэтому во всех случаях, когда нет необходимости сохранить
нативную структуру, нуклеиновые кислоты предпочитают фрак-
ционировать электрофорезом в денатурирующих условиях, или,
как говорят, в «денатурирующих» гелях. Это означает, что внут-
ри геля создается среда, препятствующая комплементарному спа-
риванию одинарных нитей нуклеиновых кислот или их участков.
В некоторых случаях эта среда способствует распрямлению
нитей, что делает зависимость скоростей миграции от значений
длины полинуклеотидов более строгой, обеспечивает возмож-
ность их тонкого фракционирования и оценки молекулярной мас-
сы (сопоставлением с маркерами). Рассмотрим различные вари-
анты электрофореза в денатурирующих гелях и их использова-
ние.
Щелочные гели
Уже отмечалось, что вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы
можно использовать разбавленные водные растворы щелочи
(0,02—0,03 М. NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной
среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного
увеличения концентрации персульфата аммония и соответствен-
но ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щело-
чи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатиче-
скому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые
ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде рас-
правленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они
короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых мо-
лекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул ока-
зывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных
молекул той же длины.
Еще раз подчеркнем, что в щелочную среду обязательно надо
вносить достаточное количество ЭДТА (2—3 мМ) для того, что-
5 Л. А. Остерман 129
Рис. 33. Зависимость отно-
сительной электрофоретиче-
ской подвижности фрагмен-
тов линейной двунитевой
ДНК фага Т7 от их длины
[McDonnell et al., 1977]
Подвижность бромфенолового
синего равна 9,5. Цифры у кри-
вых — значения напряженности
электрического поля, В/см.
Электрофорез в 1,6%-ном геле
«щелочной агарозы»
бы связать все остаточные Mg2+. В противном случае ионы маг-
ния «сшивают» нити нуклеиновых кислот и они даже могут вы-
падать в осадок.
Если исходный раствор нуклеиновых кислот был сильно за-
буферен, его надо предварительно подтитровать щелочью. Бром-
феноловый синий в щелочной среде постепенно обесцвечивается,
поэтому его следует вносить в исходный препарат непосредствен-
но перед началом электрофореза. Еще лучше в качестве лиди-
рующего красителя в этом случае использовать бромфеноловый
зеленый. Он устойчив к воздействию щелочи, а по электрофоре-
тической подвижности сходен с бромфеноловым синим.
Как и для нативной ДНК, при выбранной пористости геля
скорость миграции денатурированной ДНК в щелочной среде
становится независимой от молекулярной массы, если она пре-
вышает определенное значение. Это происходит тем раньше, чем
мельче поры геля и чем выше напряженность электрического
поля.
Из рис. 33 [Me Donell et al., 1977] можно видеть, что надеж-
ное разделение денатурированных ДНК по размеру в 1,6%-ном
геле «щелочной» агарозы при напряженности электрического
поля 10 В/см удается провести только для молекул с исходным
размером (до денатурации), меньшим 2 КВР, т. е. с молекуляр-
ной массой менее 1,5 млн. При напряженности поля 0,5 В/см
можно фракционировать и молекулы с исходной длиной 8 КВР,
т. е. с молекулярной массой порядка 6 млн. дальтон. Молекулы
ДНК короче 1 КВР разделятся при любой напряженности поля
в рассматриваемом интервале ее значений.
В недавней работе [Andersson et al., 1979] 1,4%-ный гель
агарозы полимеризовали в 0,03 М NaCl с 2 мМ ЭДТА, но в ка'-
честве верхнего электродного буфера использовали 0,03 М NaOH
р‘2 доМ ЭДТА. Ион ОН- мигрирует из электродного буфера в гель
130
быстрее, чем молекулы ДНК, и обеспечивает для них денатури-
рующие условия в геле. Фракционирование вели в течение 14—
16 ч при напряженности поля 2,2 В/см.
Электрофорез в щелочной среде, помимо оценки молекуляр-
ной массы, позволяет обнаружить однонитевые разрывы в исход-
ных двунитевых структурах ДНК. Надо иметь в виду, что при
сильнощелочных значениях pH остатки гуанина и тимина при-
обретают отрицательный заряд. Это надежно обеспечивает не-
возможность ренатурации ДНК, но может сказаться на соотно-
шении электрофоретических подвижностей разных молекул ДНК
или двух комплементарных нитей одной молекулы, особенно
если размеры-этих молекул невелики и различия нуклеотидного
состава не усредняются.
Гели, содержащие мочевину.
Секвенирование ДНК и РНК
Ввиду только что отмеченного обстоятельства разделение ко-
ротких олигонуклеотидов строго по их длине предпочитают вести
в гелях, где фиксация однонитевого состояния нитей ДНК или
РНК обеспечивается не щелочью, а присутствием высокой кон-
центрации мочевины. Образуя прочные водородные связи с нук-
леиновыми основаниями, мочевина препятствует их комплемен-
тарному спариванию. Сама по себе мочевина не распрямляет
нити полинуклеотидов, но в отсутствие нейтрализации фосфатов
ионами металлов эти нити оказываются достаточно расправлен-
ными для того, чтобы обеспечить надежное разделение олигонук-
леотидов длиной в несколько сотен мономерных звеньев, отли-
чающихся между собой всего лишь на одно звено. Именно такая
задача стоит при использовании электрофореза в современных
методах определения последовательности оснований («секвени-
рования») в молекулах ДНК и РНК.
За последние годы предложено несколько подходов к секве-
нированию нуклеиновых кислот. Подробное их рассмотрение
здесь было бы неуместно. Тем не менее представляется целесо-
образным включить сюда хотя бы беглый очерк используемых
для этой цели изящных и остроумных методов, выделяя при этом
характерные особенности используемых в них приемов электро-
фореза.
Максам и Гильберт использовали для секвенирования мечен-
ные по 5'-концам радиоактивным фосфором одинарные нити де-
натурированных фрагментов ДНК [Maxam, Gilbert, 1977]. Были
разработаны химические методы расщепления полидезоксирибо-
нуклеотидов по заранее известным нуклеотидам. Концентрации
реагентов и условия гидролиза подобрали так, что подавляющее
большинство индивидуальных нитей случайным образом разры-
валось только в одном из множества возможных мест. Все эти
места равноправны. В результате при каждом методе обработки
огромного множества нитей получали полный набор всех возмож-
131
5*
Рис. 34. Секвенирование ДНК по
методу Максама и Гилберта (см.
текст)
будут располагаться между полосами
иых фрагментов, длина 'каждо-
го из которых определялась
расстоянием одного из нуклео-
тидов (именно того, по которо-
му идет расщепление при дан-
ном методе обработки) от
меченого конца нити ДНК.
Очевидно, что число таких
фрагментов будет равно числу
нуклеотидов данного вида в по-
линуклеотиде. Фактически при
каждом расщеплении получа-
ется два фрагмента, но радио-
активно меченным является
только один из них, прилежа-
щий к 5'-концу ДНК, а регист-
рируются только меченые фраг-
менты.
Электрофорез совокупности
таких фрагментов в денатури-
рующем геле (с мочевиной)
дает серию полос, своеобраз-
ную «лестницу», выявляемую
методом авторадиографии. Для
четырех разных химических об-
работок получается четыре раз-
личные «лестницы». Электро-
форез проводят в параллельных
треках на одной пластине геля
и сравнивают получающиеся в
них картины. «Перекладины»
(полосы) одной «лестницы»
других, в соответствии
с последовательностью расположения нуклеотидов в нити ДНК.
Сопоставляя одновременно все четыре «лестницы» и зная спе-
цифику каждого из четырех методов расщепления, можно ус-
тановить всю последовательность нуклеотидов в ДНК — «про-
читать» ее на авторадиографическом снимке геля.
Картина такого разделения показана на рис. 34. Три группы
по четыре трека соответствуют трем различным продолжитель-
ностям электрофореза. Группа а с наименьшей продолжитель-
ностью выявляет последовательность оснований, непосредствен-
но прилегающих к меченому концу нити. При большей длитель-
ности электрофореза (б) короткие фрагменты ДНК успевают
выйти из геля, зато разделяются и становятся различимы поло-
сы более длинных фрагментов, отвечающие более удаленной от
конца нити последовательности оснований. На треках группы а
эти полосы были стиснуты в начале геля. То же самое относится
к группе треков в по отношению к группе б.
132
В каждой группе из четырех треков можно различитьв сум-
ме 100—150 полос и расшифровать последовательность нуклео-
тидов на участке ДНК соответствующей длины. Эти последова-
тельности перекрываются, что позволяет в результате определить
непрерывную последовательность длиной в 300—400 мономерных
единиц, прилежащих к б'-концу нити ДНК. То же самое можно
проделать и для второго ее конца, если радиоактивным фосфо-
ром пометить З'-конец нити (методы введения такой метки от-
работаны) . Выбирая с помощью рестриктаз различные, тоже пе-
рекрывающиеся куски ДНК, описанным способом удается секве-
нировать участки генома длиной в несколько тысяч нуклеотидов.
Теперь обратимся к специфике соответствующего метода элек-
трофореза. Естественно, что электрофорез коротких фрагментов
ведут не в агарозе, а в 20%-ном ПААГ (С=3,2). В качестве бу-
фера геля используют 0,05 М Трис-борат (pH 8,3) с 1 мМ ЭДТА
и 7 М мочевиной. Персульфат аммония вносят в концентрации
3 мМ, ТЕМЕД — до концентрации 0,017% (1,5 мМ). Полимери-
зация геля в пластине 33X43X0,15 см занимает 30 мин. В пре-
параты фрагментов ДНК добавляют мочевину (до 5 М) и по
0,025% лидирующих красителей: бромфенолового синего и кси-
ленцианола. Для разрушения возможных агрегатов перед нане-
сением на гель препараты прогревают в течение 15^р при 90°.
Перед электрофорезом гель выдерживают не менее 10 ч. Разде-
ление ведут при температуре 30—40° и напряжении 400—1200 В
на пластину. При длине 40 см этому отвечает напряженность
поля 10—30 В/см. Для коротких олигонуклеотидов такое высо-
кое значение напряженности поля вполне допустимо, а скорость
разделения от этого заметно выигрывает. Бромфеноловый синий
мигрирует вместе с фрагментами длиной в 10 нуклеотидов, кси-
ленцианол—с фрагментами в 28 нуклеотидов. Электрофорез
ведут в течение 36 ч с 12-часовым сдвигом моментов внесения
препаратов для трех названных выше групп.
В методе, предложенном примерно в то же время Сенджером
и соавторами, использован другой (ферментативный) подход к
решению задачи секвенирования-ДНК (Sanger et al., 1977]. Од-
нонитевая ДНК здесь выступает в качестве матрицы для синте-
за с помощью ДНК-полимеразы I радиоактивно меченной ком-
плементарной нити ДНК. Этот синтез обрывается из-за присут-
ствия в обычной смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов еще
и некоторого количества одного из дидезоксирибонуклеозидтри-
фосфатов. Включение в синтезируемую нить ДНК такого дефект-
ного нуклеотида делает невозможным ее дальнейшее удлинение.
В результате этого синтез обрывается, причем на вполне опреде-
ленном нуклеотиде, дефектный аналог которого введен в данную
реакционную смесь. И опять для множества нитей матричной
ДНК получается совокупность всех возможных фрагментов раз-
личной длины, радиоактивно меченных и оканчивающихся на
одном и том же заранее известном нуклеотиде.
133
Внося в четыре инкубационные смеси четыре различных ди-
дезоксирибонуклеозидтрифосфата, получают группу из четырех
наборов соответствующих фрагментов. Денатурацией их отделя-
ют от матричной ДНК, которая в дальнейшем участия не при-
нимает, поскольку нерадиоактивна. С помощью электрофореза,
как и в методе Максама и Гилберта, получают четыре «лестни-
цы» полос. При их сопоставлении можно определить нуклеотид-
ную последовательность новосинтезированной комплементарной
нити, а тем самым и исходной, секвенируемой нити ДНК.
Легко видеть, что с точки зрения электрофореза ситуация в
методе Сенджера оказывается точно такой же, как в методе
Максама и Гилберта. То же самое можно сказать и о ряде дру-
гих методов секвенирования: ДНК по Сенджеру, но с использова-
нием меченного по одному 5'-концу рестрикта и метода «ник-
трансляции» [Maat, Smith, 1978]; РНК с использованием хими-
ческой модификации и гидролиза по модифицированным нуклео-
тидам [Peattie, 1979]; мРНК с помощью «обратной транскрип-
тазы» и модификации более раннего метода Сенджера (« + »- и
«—»-реакции) [Brownlee, Cartwright, 1977]; РНК с участием
Qfl-репликазы и терминации реакции за счет дезоксирибонук-
леозидтрифосфатов [Kramer, Mills, 1978]; РНК с использовани-
ем набора специфических рибонуклеаз [Simoncsist et al., 1977];
РНК после неполного гидролиза в горячей воде с последующим
введением радиоактивного фосфора на б'-концы получающихся
при этом фрагментов [Gupta, Randerath, 1979].
- При всем разнообразии этих методов на заключительном эта-
пе всюду применяют электрофорез в ПААГ, полимеризованном
в Трис-боратном буфере с добавлением мочевины до 7—8 М.
Всем им присуще одно и то же затруднение, возникающее при
сопоставлении и расшифровке «лестниц» полос фрагментов. Это
затруднение заключается в иногда наблюдающемся аномальном
сжатии полос за счет образования при электрофорезе двуните-
вых структур в областях расположения палиндромов ДНК и
шпилек РНК.
Мочевина не всегда может успешно препятствовать образо-
ванию двунитевых структур. С этой точки зрения желательно
вести электрофорез при более высокой температуре, способству-
ющей их разрушению. Во избежание создания градиентов темпе-
ратуры и искажения полос при этом необходимо улучшить тепло-
отвод, например путем уменьшения толщины геля до 0,4 мм. По-
вышение температуры геля обеспечивается просто увеличением
начального напряжения до 1500 В на пластину (1300 В после ее
разогрева до равновесной температуры). Попутно это еще и зна-
чительно ускоряет разделение [Sanger, Coulson, 1978].
С той же целью в методах секвенирования, использующих
комплементарный матричный синтез, предложено заменять в ин-
кубационной смеси гуанозинтрифосфат на инозинтрифосфат. Де-
ло в том, что пара И—Ц имеет только две водородные связи,
тогда как пара Г—Ц — три. Такая замена сильно ослабляет дву-
134
нитевые структуры [Mills, Kramer, 1979]. Эти же авторы описы-
вают использование более сильного, чем мочевина, денатуриру-
ющего агента при электрофорезе в целях секвенирования ДНК,
а именно—90%-ного раствора формамида.
Имеются данные [Lutter, 1979] о том, что разделение полос
при секвенировании заметно улучшается, если отношение NN'-
метиленбисакриламида к акриламиду в ПААГ увеличить до 1:6
(С=14,3). В главе 1 быЛо отмечено, что структура ПААГ при
этом становится совсем иной, чем при обычных малых значени-
ях С. По утверждению автора, такие гели легко выявляют раз-
личие в один нуклеотид при длине фрагмента ДНК в 160 нук-
леотидов. Между прочим Люттер считает авторадиографию не
очень надежным методом локализации полос, особенно в случае
крупных фрагментов. Он предпочитает отмечать полосы черни-
лами при ультрафиолетовом освещении окрашенных бромистым
этидием гелей, используя способность глаза суммировать эффект
окраски по всей ширине полосы.
Электрофорез в 2,8%-ном ПААГ и Na-ацетатном буфере с
7 М мочевиной использовали недавно для очистки вирусной РНК
[Both, Air, 1979]. Что касается электрофореза РНК в гелях ага-
. розы, то и здесь добавление 7 М мочевины заметно улучшает
разделение полос и воспроизводимость результатов. Кроме того,
в этих условиях РНК легче переходит на диазобумагу [Locker,
1979] (см. ниже). Агарозу растворяют непродолжительным ки-
пячением в 6 М растворе мочевины, содержащем 15 мМ йодаце-
тата, 0,036 М NaH2PO4 и 1 мМ ЭДТА (pH 7,4). Иодацетат вво-
дят для подавления активности РНКаз в агарозе. Электрофорез
ведут при относительно большой для высокомолекулярной РНК
напряженности электрического поля (5 В/см) в течение 3—6 ч.
Повышение напряженности поля не сказывается на разрешении
полос РНК именно благодаря присутствию мочевины.
В заключение отметим, что мочевину нельзя отнести к чис-
лу агентов, сильно денатурирующих нуклеиновые кислоты. 6 М
мочевина разрушает агрегаты, разворачивает, но не полностью
денатурирует РНК, а достаточно комплементарная структура
двунитевой ДНК или гибрида ДНК—РНК в ее присутствии со-
храняется.
Денатурирующие гели с формамидом
В отличие от мочевины, формамид является весьма сильным
денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную
Структуру полинуклеотидов—как водородные связи, так и «стэ-
$инг-взаимодействие» между плоскостями гетероциклических ко-
нуклеиновых оснований. Электрофоретическая подвижность
нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от
Молекулярной массы, что открывает возможность ее определения
£ Помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК.
135
0 12 3 4 5
Подвижность, см2В~1с~1
Рис. 35. Линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы РНК
и ее электрофоретической подвижностью при электрофорезе в 4 %-ном ПААГ,
полимеризованном в формамиде [Staynov et al., 1972]
/—5 — препараты РНК известной молекулярной массы
Рис. 36. Двумерный электрофорез рестриктов ДНК фага X [Fisher, Lerman,
1979)
Направление / — электрофорез в 1%-ном геле агарозы; направление 2 — электрофорез в
4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок
(0—7 М мочевины и 0—40% формамида)
Стэйнов и соавторы показали, что в сильно сшитом 4,6%-ном
ПААГ (С=13), полимеризованном в 98%-ном формамиде, ско-
рость миграции молекул РНК размером от 5S до 28S связана
линейной зависимостью с их молекулярной массой (рис. 35)
[Staynov et al., 1972]. Для обеспечения электропроводности в
формамид добавляли NaCl до концентрации 0,02 М.
Электрофорез вели в вертикальных пластинах длиной 10 см при толщине
3 мм. На каждый трек вносили по 10 мкг РНК. Напряженность поля— 10 В/см,
продолжительность разделения 4 ч; гель окрашивали пиронином. Формамид
деионизировали, перемешивая в нем катионообменную смолу Dowex 50WX$
20/50 (Н+) в виде 3%-ной суспензии в течение 45 мин (лучше перемешивать
с 5%-ной суспензией смолы AG 501X8 в течение 2 ч). Мономеры акриламида
и ТЕМЕД (0,2%) растворяли прямо в чистом формамиде. Соль и персульфат
аммония (из расчета конечной концентрации 0,12%) растворяли в воде, но в
50-кратной концентрации, чтобы при добавлении этого раствора к формамиду
его концентрация оставалась равной 98%.
Акриламид хорошо полимеризуется в формамиде, давая не-
сколько более мягкие гели, так что 4%-ный ПААГ в формамиде
имеет примерно такие же механические свойства, как 2,5%-ный
водный ПААГ. Вместе с тем и подвижность РНК в гелях на
основе формамида выше, °ем в обычном ПААГ такой же кон-
центрации.
136
.... Было описано разделение й аналогичных условиях (8,6% -ный
ПАДГ; С=13) мРНК для а- и p-цепей глобина кролика [Kaza-
zian et al., 1974]. В этих опытах успех разделения зависел от
незначительных и не совсем понятных вариаций условий. На-
пример, полосы двух глобиновых мРНК не разделялись, если
NaCl добавляли к формамиду не в виде концентрированного вод-
ного раствора, а в сухом виде. Подчеркивается необходимость
проведения преэлектрофореза.
В другой работе [Marcu et al., 1978] электрофорезом очища-
ли мРНК из плазмацитомы мыши. Использовали 4,1 %-ный ПААГ
(С=14,5), полимеризованный в 98%-ном формамиде, содержа-
щем 0,02 М Трис-ацетатный буфер (pH 7,2) с 2,5 мМ ЭДТА.
Такой же буфер использовали в электродных резервуарах. Элек-
трофорез вели в трубках размером 9,5 X 0,6 см. Преэлектрофо-
рез — в течение 30 мин.
Недавно описано разделение электрофорезом на пластинах
6%-ного ПААГ в 98%-ном формамиде фрагментов ДНК, выде-
ленных из мононуклеосом. Окрашивание вели 0,005%-ным рас-
твором «Stains-all» в 50%-ном формамиде в течение 16 ч [Lew
et al., 1979].
Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и
более низкая концентрация формамида. Например, показано, что
3%-ный денатурирующий гель (С=11) для электрофореза РНК
можно готовить на 65%-ном водном формамиде [Bean et al..
1980]. Электропроводность обеспечивал 0,02 М Na-фосфатный
буфер, pH 7.
Интересное использование комбинации денатурирующих эф-
фектов формамида и мочевины предложили Фишер и Лерман.
По длине ПААГ создавали градиент концентрации формамида
(0—40%) и мочевины (0—7 М) и вели электрофорез двуните-
вых рестриктов ДНК при 60°. Для каждого рестрикта в зависи-
мости от его нуклеотидного состава на градиенте имеется точка,
Где происходит частичная денатурация ДНК. Как уже отмеча-
лось, это приводит к резкому замедлению миграции, связанному
£ образованием локальных «вздутий» на гладкой молекуле ДНК.
Рестрикт образует остро очерченную полосу. Таким образом,
Осуществлялось фракционирование по составу рестриктов одина-
ковой длины [Fischer, Lerman, 1979].
Этот прием был использован авторами работы и в двумерном
варианте электрофореза. В первом направлении (пластина 1%-
ной агарозы длиной 17 см) рестрикты ДНК разделяли по их раз-
мерам. Во втором направлении использовали слабосшитый (С=
>=2,6) 4%-ный ПААГ, полимеризованный в указанном выше гра-
диенте концентрации денатурирующих агентов. В нем фракцио-
нирование рестриктов происходило по нуклеотидному составу.
Ж Качестве буфера в обоих направлениях использовали 0,04 М
^рис-ацетат (pH 8) с 0,02 М CHjCOONa и 1 мМ ЭДТА. Полоску
Нгарозы из геля первого направления помещали над ПААГ с
Фазором в 2—3 мм и заливали расплавленным раствором 1%-ной
137
агарозы. Пластина второго направления снаружи омывалась
анодным буфером, термостатированным при 60°. На рис. 36 мож-
но видеть, как разделяются близкие по своим размерам рестрик-
ты в простом случае переваривания ДНК фага X рестриктазой
Есо RI. Обработка этой же рестриктазой суммарного препарата
ДНК Е. coli дает более 250 пятен. Авторы полагают, что разре-
шающую способность метода можно довести до регистрации
1000 фрагментов (лимитирует разделение в первом направле-
нии).
Локализацию наиболее «легкоплавкого» участка внутри каж-
дого рестрикта ДНК можно осуществить сопоставлением карти-
ны расположения в денатурирующем градиенте набора фрагмен-
тов, полученных дроблением рестриктной ДНК ультразвуком, с
положением целого рестрикта. Длина фрагментов ДНК играет
второстепенную роль при электрофорезе в денатурирующем гра-
диенте, и глубина проникновения в гель фрагмента, содержаще-
го наиболее легко денатурирующий участок данного рестрикта,
будет практически такой же, как и целого рестрикта. Остальные
фрагменты уйдут вперед — дальше по денатурирующему гради-
енту [Fischer, Lerman, 1980].
Раствор расплавленной агарозы в формамиде при остывании
не образует геля. Это легко понять, если вспомнить, что нити
агарозы связываются в пучки, образующие пространственную
сетку, не ковалентными, а водородными связями; их-то и разру-
шает формамид.
Денатурирующие гели с формальдегидом
Формальдегид легко реагирует с аминогруппами нуклеино-
вых оснований, давая их метоксипроизводные:
nh2
NH-CHj-OH
С—II —*-
\/
Эта реакция успешно конкурирует с образованием водород-
ных связей по этим же аминогруппам, в результате чего форм-
альдегид является сильным денатурирующим агентом для нук-
леиновых кислот. Разумеется, нити нуклеиновой кислоты после
денатурации формальдегидом оказываются модифицированны-
ми, однако эта реакция обратима — выдерживанием в воде при
60° можно удалить формальдегид и восстановить нормальную
структуру нитей нуклеиновой кислоты, что видно, например, по
восстановлению их способности к гибридизации.
Большую опасность представляет возможность образования
прочных метиленовых мостиков между основаниями. Однако при
3%-ной концентрации формальдегида в рабочем буфере и срав-
нительно небольшой загрузке геля (4—5 мкг на трубку) мети-
138
леновые мостики не образуются [Yaneva et ai., 1977]. В цити-
руемой работе'ДААГ, полимеризованный в 0,02 М Na-фосфатном
буфере (pH 7) с 3% формальдегида, использовали для опреде-
ления молекулярных масс фрагментов ДНК. В таком геле имеет
место линейная зависимость между логарифмом молекулярной
массы ДНК и расстоянием ее’миграции при электрофорезе. Ис-
пользованный в этой работе 3%-ный (1 М) раствор формальде-
гида вполне обеспечивает денатурацию нуклеиновых кислот, хотя
в последнее время нередко используют и вдвое большую концен-
трацию.
Ввиду его высокой концентрации формальдегид должен быть
очень чистым. Достаточно очищен формальдегид фирмы «Ма1-
linckroat». Следует работать со свежеприготовленным раство-
ром формальдегида, без следов помутнения. Нейтрализовать рас-
твор до pH 7 можно NaOH. Для приготовления денатурирующе-
го геля на основе агарозы формальдегид добавляют к расплав-
ленному водному раствору агарозы при 60° вместе с буфером.
В одной недавней работе [Rave et al., 1979] был описан электрофорез
поли (А)-РНК в денатурирующем геле агарозы, содержащем 6% формальде-
гида в 0,04 М Na-фосфатном буфере. РНК перед нанесением на гель денату-
рировали в 50%-ном растворе формамида с 6% формальдегида в том же бу-
фере при 60° в течение 5 мин. Затем препарат быстро охлаждали и добавляли
в него, как обычно, глицерин и бромфеноловый синий. В электродные резер-
вуары заливали такой же буфер, содержащий 3% формальдегида. После
окончания электрофореза гель вымачивали в течение 5 мин в воде при 60°.
Этого было достаточно для снятия формальдегида с РНК, которую затем,
после частичного щелочного гидролиза, переводили диффузией из геля на
диазобумагу по методу Олвина [Alwine et al., 1977]. Несмотря на предшест-
вующую обработку формальдегидом, поли (А)-РНК на диазобумаге успешно
гибридизуется с ДНК.
В другой недавней работе [Schwinghamer, Shepherd, 1980] методом элек-
трофореза определяли молекулярные массы меченной тритием РНК длиной
300—4000 нуклеотидов (0,1—1 млн. дальтон). Для этой цели использовали
гель, содержащий 2,2% акриламида (С=4) и 0,5% агарозы, полимеризован-
ный в 0,05 М Na-фосфатном буфере (pH 7,2) с 5 мМ ЭДТА и 2,2 М (6,6%)
формальдегида. Таким же буфером заполняли электродные резервуары. РНК
предварительно денатурировали нагреванием при 60° в течение 10 мин в 50%-
ном растворе формамида в 0,025 М Na-фосфатном буфере с 2,5 мМ ЭДТА и
2,2 М формальдегида. Электрофорез вели в пластинах размером 11Х14Х
Х0,15 см в течение 17 ч при силе тока 17 мА; преэлектрофорез — при силе
тока 25 мА в течение 1 ч.
Импрегнирование ППО для флюорографии в гель такого со-
става нельзя вести в чистом диметилсульфоксиде, так как гель
разбухает. Непригоден и чистый метанол—в нем гель сжимает-
ся. Опытным путем подобрали смесь ДМСО с метанолом (4 : 1),
в которой и растворяли НПО до концентрации 10%. Линейный
график для определения молекулярной массы получали при по-
строении зависимости квадратного корня из молекулярной дли-
139
ны РНК (числа нуклеотидов) от логарифма расстояния мигра-
ции в геле. /
Описан опыт совместного использования денатурирующих
эффектов формамида (52%) и формальдегида (3%) для фрак-
ционирования РНК в геле, содержащем 1,6% акриламида и 0,6%
агарозы [Lizardi, Engelberg, 1979]. Денатурирующие агенты
вводили в 0,04 М триэтиламмониевом буфере (pH 7,5) с 1,3 мМ
ЭДТА. Рабочая электропроводность буфера обеспечивалась ми-
грацией ионов хлора из верхнего электродного буфера, содер-
жавшего еще и 2,5 мМ NaCl.
Гели, содержащие гидроокись мети л ртути
Для приготовления гелей можно использовать продажный
препарат гидроокиси метилртути (CH3HgOH) или получить это
соединение из более доступного йодида метилртути CH3HgI (фир-
мы «Koch-Light»), как было описано еще в 1922 г. [Sneed, May-
nard, 1922]. CH3HgOH должна хорошо растворяться в воде —
плохо растворимые препараты непригодны. Это — сильнотоксич-
ное и слегка летучее соединение. С концентрированными раство-
рами следует манипулировать в вытяжном шкафу, крайне осто-
рожно. В растворах с концентрацией менее 10 мМ гидроокись ме-
тилртути не очень опасна. Тем не менее даже над открытой го-
ризонтальной пластиной агарозы, содержащей 10 мМ CH3HgOH,
обнаруживается значительный уровень содержания паров ртути
в воздухе.
Гидроокись метилртути присоединяется по азоту колец в ура-
циле (тимине) и гуанине:
CH3HgOH+H< j CH3Hg—N |+н2о
Эти атомы азота участвуют в образовании водородных свя-
зей между нуклеиновыми основаниями, чем и объясняется дена-
турирующий эффект гидроокиси метилртути. Эффект настолько
силен, что CH3HgOH вводят в денатурирующий гель в концен-
трации 5—10 мМ. Гидроокись метилртути действует еще сильнее,
чем формамид (некоторые ГЦ-богатые РНК не денатурируют и
в чистом формамиде). Вместе с тем это соединение связывается
с основаниями не очень прочно и легко снимается при вымачи-
вании геля после электрофореза в 0,1 М растворе дитиотреито-
ла. CH3HgOH сильно взаимодействует с аминами и сульфгид-
рильными группами, поэтому нельзя для гелей, содержащих гид-
роокись метилртути, использовать аминосодержащие буферы,
например Трис, а также вводить в гель |}-меркаптоэтанол. Из
буфера геля следует исключить и ЭДТА, так как он образует с
гидроокисью метилртути заряженный комплекс и таким обра-
зом способствует выходу ее из геля [Chandler et al., 1979].
140
Бэйли и Дэвидсон для определения молекулярной массы РНК использо-
вали электрофоре! в денатурирующем 1%-ном геле агарозы, содержащем
5 мМ CHjHgOH. Агарозу расплавляли в боратном буфере (pH 8,2) и добав-
ляли раствор гидроокиси метилртути. Ее вводили в той же концентрации и в
раствор препарата, но не в электродные буферы. После окончания электро-
фореза, перед окрашиванием бромистым этидием, гель вымачивали 30 мин в
0,6 М растворе ацетата^ аммония. Аммоний связывает метилртуть, которая
несколько мешает взаимодействию нуклеиновых кислот с бромистым этидием
[Bailey, Davidson, 1976].
При подготовке ПААГ по обычной прописи гидроокись метил-
ртути не следует вносить в раствор мономеров, так как она ме-
шает полимеризации. Можно вводить CHjHgOH вымачиванием
геля в соответствующем растворе, но можно и совсем обойти это
затруднение. Было выяснено, что CHjHgOH мешает полимери-
зации ПААГ за счет взаимодействия с персульфатом аммония.
Замена последнего на персульфат калия позволяет осуществить
полимеризацию 8%-ного ПААГ в присутствии гидроокиси метил-
ртути. Однако для получения такого же эффекта денатурации,
как в агарозе, приходится заметно увеличивать концентрацию
CHjHgOH— до 20 мМ для полной денатурации РНК- Неясно,
происходит ли снижение денатурирующей способности за счет
инактивации части молекул гидроокиси метилртути при. свобод-
норадикальной полимеризации ПААГ или она как-то связывает-
ся гелем.
Недавно [Maxwell et al., 1979] денатурирующий 1%-ный гель
агарозы, содержащий 10,5 мМ CHjHgOH, был использован для
исследования гетерологичности ядерных РНК и мРНК клеток
животного происхождения. При напряженности электрического
поля 3,3 В/см была обнаружена линейная зависимость расстоя-
ния миграции при электрофорезе от квадратного корня из вели-
чины молекулярной массы РНК вплоть до размеров порядка
45S. Более крупные молекулы РНК мигрируют аномально быст-
ро в силу своей гибкости (см. выше).
Гидроокись метилртути значительно легче реагирует с имин-
ными атомами азота урацила и тимина, чем с азотом гуанина,
поэтому была исследована возможность использования непол-
ной денатурации при пониженном содержании CHjHgOH в 1%-
ном геле агарозы для фракционирования трудноразделимых РНК
за счет различия их устойчивости к денатурации [Chandler et al.,
1979]. Такое фракционирование оказалось возможным. Авторам
удалось, например, в присутствии 0,5 мМ CHjHgOH разделить
рибосомальные 23S и 25S РНК, что иначе сделать не удается.
После обработки 1,5 мМ раствором гидроокиси метилртути ме-
тодом электрофореза были разделены 5S РНК из разных орга-
низмов (дрозофилы и Е. coli).
141
Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем
Для полноты картины отметим, что нуклеиновые кислоты пе-
ред электрофорезом можно денатурировать и/обработкой глио-
ксалем. При этом нет необходимости вносить/лиоксаль в гель й
вообще создавать в нем денатурирующие условия, так как дена-
турация глиоксалем в обычных условиях необратима. Глиоксаль
прочно присоединяется по двум атомам азота гуанина:
Денатурацию глиоксалем ведут в пластмассовых пробирках
с крышками в 0,01 М растворе Na-фосфата (pH 7), содержащем
1 М глиоксаль в 50% -ном диметилсульфоксиде, при 50° в течение
1 ч [McMaster, Carmichael, 1977].
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГРАДИЕНТОВ ПОРИСТОСТИ ПААГ
Преимущества электрофореза в градиенте пористости (кон-
центрации) ПААГ были отмечены в предыдущем разделе при
обсуждении фракционирования белков. По-видимому, нет осно-
ваний предполагать, что эти преимущества не будут ощутимы и
при фракционировании нуклеиновых кислот. Вероятно, лучших
результатов можно ожидать в денатурирующих гелях, поскольку
гибкость нитей нативных нуклеиновых кислот в обычных гелях
может смазывать эффект торможения полос при уменьшении
размера пор.
Широкого применения в последние годы электрофорез нук-
леиновых кислот в градиенте пористости ПААГ не нашел, хотя в
более ранних работах были получены многообещающие резуль-
таты.
Так, Миро и соавторы еще в 1971 г. в таком градиенте проде-
монстрировали очень хорошее разделение РНК из ядрышек
HeLa в интервале размеров 18—45S. На приведенной в их рабо-
те электрофореграмме (рис. 37) видны острые пики и убедитель-
ное разделение таких близких по величине молекул, как пред-
шественник рибосомальных РНК (45S) и промежуточная фор-
ма его процессинга (41S) [Mirault et al., 1971].
Для фракционирования РНП авторы той же работы использовали экспо-
ненциальный градиент (2—6%) концентрации ПААГ (С=4,8). Электрофорез
проводили в кварцевых трубках длиной 17 ём. Во избежание конвекции при
полимеризации одновременно создавали градиент концентрации глицерина
(2,5—20%). Трубки заполняли сверху в наклонном положении. Для улучше-
142
Рис. 37. Разделение суммарной РНК из ядрышек HeLa электрофорезом 0 экс-
поненциальном градиенте концентрации ПААГ [Mirault et al., 1971]
ния смачивания стекла их предварительно споласкивали в 2%-ном водном
растворе детергента Brij-35 и высушивали. То обстоятельство, что в нижней
части трубки полимеризовался 6 %-ный гель, позволило в верхней ее части
иметь 2 %-ный ПААГ без добавления агарозы. Для извлечения геля после
окончания электрофореза трубки замораживали при —70°, потом быстро по-
догревали в горячей воде, чтобы успела подплавиться только наружная по-
верхность геля, и выталкивали его снова в ванну со смесью гексана с сухим
льдом. Для геля и электродных резервуаров использовали один и тот же
неденатурирующий буфер (0,04 М триэтаноламин+0,02 М CHsCOONa+2 мМ
ЭДТА; pH 7,4). Объем препарата мог быть большим, вплоть до 1 мл на труб-
ку, так как полосы обострялись в ходе продвижения по градиентному гелю,
как было описано выше для белков. Напряженность электрического поля
10 В/см.
Джепесен в 1974 г. разделял рестрикты ДНК фага X и вируса
SV-40 электрофорезом в линейном градиенте концентрации (2,5—
7,5%) ПААГ (С=9), образованном в пластинах размерами 12 X
Х14 и 20X40 см при толщине геля 3 мм [Jeppesen, 1974]. Одно-
временно формировали градиент концентрации сахарозы (10—
20%) в буфере геля. Форму для геля заполняли через трубочку,
опущенную до ее дна, так что более плотные слои раствора мо-
номеров и сахарозы вытесняли менее плотные вверх. Заполнение
начинали с чистого буфера (0,04 М Трис-ацетат, pH 8,3,
+0,02 М CHsCOONa+2 мМ ЭДТА). Концентрация ТЕМЕД в
смесителе градиентного устройства, содержавшем 2,5%-ный
раствор мономеров, была почти в 6 раз выше, чем в резервуа-
ре, поэтому полимеризация геля в пластине начиналась сверху
(см. главу 2). Карманы для препаратов формировали в дополни-
тельном стартовом геЛе (2,5%-ный ПААГ), полимеризованном
143
в том же буфере, но разбавленном в 5 раз. Препарат вносили в
буфере, разбавленном еще вдвое. Необходимость' этих мер для
предварительного концентрирования полос на границе рабочего
геля, в котором создан градиент пористости,/ представляется
сомнительной. Электрофорез вели в течение 12—16 ч на холоду
или 6—8 ч при комнатной температуре. Приведенные в работе
фотографии (окрашивание 0,02 %-ным метиЛеновым синим в
темноте) впечатляют тонкостью полос разделенных рестриктов
ДНК.
ДВУМЕРНЫЙ электрофорез нуклеиновых кислот
И ИХ ФРАГМЕНТОВ
Двумерный электрофорез полинуклеотидов не получил тако-
го широкого распространения, как в случае белков, поскольку
возможности воздействия на электрофоретическую подвижность
изменением pH буфера геля ограничены. Нуклеиновые кислоты
не поддаются и электрофокусированию, которое используется в
одном из направлений столь эффективного разделения белков по
О’Фарреллу. Тем не менее двумерное фракционирование нуклеи-
новых кислот можно вполне успешно использовать для разделе-
ния их по размерам, если воздействовать на вторичную и третич-
ную структуры денатурирующими агентами.
Так, в работе [Garel et al., 1977] двумерным электрофорезом
разделяли до 40 индивидуальных тРНК из суммарного препара-
та. В первом направлении (пластина 20X40X0,15 см) фракцио-
нирование вели в 9,6%-ном ПААГ, полимеризованном в обычном
0,089 М Трис-боратном буфере (pH 8,2) с 7 М мочевиной. Разде-
ление происходило по длине молекул, полностью утративших
свою вторичную структуру. Гель второго направления полиме-
ризовали в таком же буфере, но мочевину добавляли лишь до
концентрации 4 М. По-видимому, вторичная структура тРНК
при этом частично восстанавливалась — в различной степени для
разных индивидуальных тРНК. Концентрацию ПААГ во втором
направлении соответственно увеличивали до 20%.
Тот же подход, но в упрощенном варианте, был использован
несколько ранее [Varricchid, Ernst, 1975]. Здесь для разделения
тРНК в обоих направлениях был использован практически один
и тот же гель (15- и 16%-ный ПААГ), но в буфере первого на-
правления присутствовала 7 М. мочевина, а во втором направле-
нии ее не было вовсе. Было получено 45 пятен тРНК.
В этих работах были использованы хорошо выраженные и
качественно универсальные вторичная и третичная структуры
транспортных РНК. Для мРНК нет достоверных общих данных
по таким структурам, однако наличие многочисленных двуните-
вых «шпилек», по-видимому, является их широко распространен-
ной, хотя и не обязательной особенностью. Этим обстоятельст-
вом удалось воспользоваться для выделения двумерным электро
форезом гистоновых мРНК из множества других [Burckhardt,
Birnstiel, 1978].
144
В первом ^правлений электрофорез вели в трубках длиной
9 см и диаметрам 2,2 мм при умеренной температуре и в буфере
обычной концентрации. Для электрофореза во втором направле-
нии в пластине размером 9X17X0,2 см создавали комплекс де-
натурирующих условий: концентрацию буфера снижали в 20 раз,
температуру повышали до 35° и, главное, вводили 5 М мочевину.
Концентрация ПААГ в обоих направлениях была одинаковой
(6%), как и напряженность электрического поля.
Оказалось, что только гистоновые мРНК расположились на
диагонали, идущей под углом 45° к сторонам пластины. Иными
словами, только они мигрировали во втором направлении с той
же скоростью, что и в первом. Все остальные мРНК тоже вы-
строились в одну линию, но ее наклон указал на замедление
миграции во втором направлении. Это замедление, по аналогии
с электрофорезом тРНК авторы приписывают денатурации и
разворачиванию молекул. По их мнению, гистоновые мРНК либо
с самого начала не имели вторичной структуры (шпилек), либо,
наоборот, их вторичная структура выдерживала использованные
денатурирующие воздействия. Эту трактовку трудно принять без
дальнейших уточнений, так как молекулы РНК с торчащими из
них жесткими шпильками должны, по-видимому, мигрировать в
геле медленнее, а не быстрее, чем хаотические клубки денату-
рированных РНК. Аналогию с тРНК можно проводить только
в том случае, если будет показано, что мРНК в нативном состоя-
нии тоже обладают компактной третичной структурой.
Выше отмечалось, что для относительно коротких олигонук-
леотидов электрофоретическая подвижность может зависеть от
"pH буфера, особенно в кислой области pH, когда начинает ска-
зываться вклад положительных зарядов цитозина и аденина.
Этим обстоятельством можно воспользоваться для двумерного
элекрофореза.
.Так, Локард и соавторы разделяли продукты неполного гид-
ролиза мРНК в первом направлении электрофорезом в пласти-
нах (20X40X0,2 см) 10,5%-ного ПААГ (С=4,8), полимеризо-
ванного в 0,025 М лимонной кислоте (pH 3,5) с7М мочевиной.
^Электрофорез при напряженности поля 5 В/см вели до миграции
^ромфенолового синего на расстояние 23 см для -анализа олиго-
нуклеотидов короче 40 звеньев и на расстояние 33 см для более
длинных фрагментов. Затем вырезали полоску геля шириной
1 см и длиной 16 см и зажимали ее между пластинками формы
второго направления на расстоянии 1 см от ее нижнего края.
Во втором направлении использовали 21 %-ный ПААГ в 0,09 М
Грис-боратном буфере (pH 8,3) с 7 М мочевиной. Этот гель по-
лимеризовали в два этапа. Сначала его заливали до такого
уровня, чтобы он едва покрывал полоску геля первого направ-
ления, и быстро полимеризовали, использовав повышенную кон-
центрацию’ персульфата аммония. Уплотнив таким образом низ
формы, заливали и полимеризовали остальной гель. Электрофо-
рез вели в направлении снизу вверх при напряженности поля
145
10 В/см. Для олигонуклеотидов, содержащих менее 40 мономер*
ных звеньев, разделение заканчивали в тот момент, когда бром-
феноловый синий опять мигрировал на 23 см, а для олигонуклео-
тидов длиной в 25—60 звеньев — когда ксиленцианол проходил
расстояние в 27 см. Для более длинных олигомеров электрофо-
рез вели до выхода ксиленцианола из геля [Lockard et al., 1978].
Привлекательной особенностью этого метода являётся воз-
можность секвенирования нуклеотидных последовательностей
путем анализа расположения пятен на пластине второго направ-
ления. Для этого, разумеется, необходимо, чтобы неполный гид-
ролиз был неспецифичным и чтобы все сопоставляемые олигонук-
леотидные фрагменты начинались с одного и того же конца,
например с меченого 5'-конца исходной РНК (при условии, что
пятна регистрируются авторадиографически). Иными словами,
нужно располагать, как и в ранее рассмотренных методах секве-
нирования, полным набором фрагментов, отличающихся по дли-
не на один нуклеотид.
Сдвиг соседних пятен во втором направлении будет примерно
одинаковым для всех фрагментов, отличающихся на один нук-
леотид, так как разделение в этом направлении происходит стро-
го по размерам. Другое дело —в первом направлении. Здесь
(при pH 3,5) присоединение к предыдущему фрагменту остатка
уридиловой кислоты увеличивает его массу и одновременно при-
вносит единичный отрицательный заряд. Таким образом, отно-
шение суммарного заряда к массе почти не изменяется. Присоеди-
нение же цитидилового остатка только увеличивает массу, но
заряда не вносит, так как отрицательный заряд фосфата ком-
пенсирован положительным зарядом основания. Очевидно, что
фрагмент, удлиненный на «звено цитозина», будет при электро-
форезе мигрировать медленнее, чем фрагмент, удлиненный на
«звено урацила», хотя оба они будут отставать от неудлиненного
фрагмента за счет возрастания трения о гель.
Аденин и гуанин занимают в этом отношении промежуточное
положение (для Ц, А и Г величины рД'а равны соответственно
4,5, 4,2 и 3,2).
В результате конечная картина расположения пятен на пла-
стине тоже напоминает лестницу, но уже не с перекладинами
(полосками на треке), а как бы со ступенями. Каждое пятно от-
мечает одну ступень лестницы, и ему соответствует олигонуклео-
тид, отличающийся по длине от своих соседей на одно звено.
В силу рассмотренных выше причин ступени этой лестницы ока-
жутся одинаковой высоты, но различной ширины. Учитывая
влияние на эту ширину присоединения каждого из нуклеотидов
и переходя от ступени к ступени, можно расшифровать всю по-
следовательность оснований в олигонуклеотиде.
Похожая в принципе система двумерного анализа нуклео-
тидной последовательности, где в первом направлении исполь-
зовали электрофорез на ацетатцеллюлозе при pH 3,5, а во вто-
ром — тонкослойную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, полу-
чила образное наименование «Wandering spot analysis» («метод
блуждающего пятна») [Silberklang et al., 1977].
Двумерный электрофорез в горизонтальной пластине агарозы
недавно был использован для выявления скрытых разрывов в
двунитевых фрагментах ДНК. В приборе Мак-Доннала с ага-
розными фитилями (см. рис. 14) сначала вели разделение смеси
фрагментов по их размерам электрофорезом в 1,6%-ном геле
агарозы, полимеризованной в нейтральном буфере. Препарат
вносили в колодец, расположенный в углу пластины со стороны
анода. На расстоянии 9,5 см разделялись фрагменты ДНК из
хроматина, обработанного микрококковой нуклеазой, в интер-
вале молекулярных масс от 50 тыс. до 6 млн. (по ДНК). По
окончании разделения в первом направлении пластину выреза-
ли, вымачивали в воде и в 0,03 М NaOH с 2 мМ ЭДТА (pH 12,3).
Затем ее устанавливали снова в прибор, повернув на 90°, опять
заливали фитили из 1%-ной агарозы и вели электрофорез во
втором направлении в денатурирующих условиях («щелочная
агароза»). Одинарные нити из целых двунитевых фрагментов
располагались по диагонали, разделяясь, как и в первом направ-
лении, по своим размерам. Скрытые разрывы двунитевой ДНК
обнаруживались тем, что от пятен, лежащих на диагонали, в на-
правлении анода тянулись «хвосты» более мелких обрывков ни-
тей FModak, Beard, 1980].
Аналогичную систему двумерного электрофореза олигонук-
леотидов (сначала по зарядам при pH 3,5, потом по размерам)
можно использовать и после полного гидролиза РНК какой-либо
специальной рибонуклеазой, например РНКазой Т1. Тогда сово-
купность фрагментов РНК, оканчивающихся гуанином, может
служить для расшифровки последовательности этой РНК. В це-
лях авторадиографического обнаружения и последующей элю-
ции соответствующих пятен фрагменты в исходной смеси после
гидролиза можно пометить радиоактивным фосфором по их
5'-концам с помощью 82Р-АТФ и полинуклеотидкиназы.
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЫЕ СЛУЧАИ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Электрофорез в геле агарозы
тройного комплекса ДНК — РНК-полимераза — РНК
Был провёден матричный синтез РНК с помощью РНК-поли-
меразы Е. coli. Один из рибонуклеозидтрифосфатов был радио-
активно меченным по фосфору. В качестве матриц использовали
рестрикты ДНК (или ДНК «разрезали» рестриктазами после
окончания синтеза РНК). Процесс транскрипции ограничивали
по времени и концентрации трифосфатов таким образом^ чтобы
новосинтезированная меченая РНК содержала не более 100—
200 нуклеотидов. Тройной комплекс транскрипции подвергали
электрофорезу в пластине 1,2%-ного геля агарозы размером
147
15X22X0,2 см. Буфер геля —обычный: 0,04 М Трис-ацетат
(pH 7,9) с 0,02 М CH3COONa и 1 мМ ЭДТА. Электрофорез вели
в течение 8 ч при напряженности поля 4,5 В/см. Затем, окраши-
вая препарат бромистым этидием, наблюдали расположение в
геле рестриктов ДНК, а с помощью авторадиографии выявляли
те из них, на которых проходил синтез РНК. Таким образом
можно было находить участки начала транскрипции и наблю-
дать за ее кинетикой [Chelm, Geiduschek, 1979].
Выявление мРНК при электрофорезе
суммарной РНК в геле агарозы
В этом случае использовали гибридизацию поли (А)-последо-
вательности мРНК в ходе самого электрофореза с полиуридило-
вой кислотой, закрепленной на стекловолокнистом фильтре
Рис, 38. Вычленение мРНК из
суммарного препарата при элект-
рофорезе в геле агарозы с по-
мощью стекловолокнистых фильт-
ров с закрепленной на них поли-
уридиловой кислотой [Egyhazi,
Ossoinak, 1979]
1 — препарат; 2 — фильтр
GF/C [Egyhazi, Ossoinak, 1979]. Поли (У) фиксировали на филь-
тре ультрафиолетовым облучением. Для приготовления геля
между пластинками формы размером 9X5X0,3 см, установлен-
ными вертикально, полимеризовали сначала небольшой слой
0,5%-ного геля агарозы, в котором с помощью выступов в одной
из пластинок формировали два рядом расположенных колодца
для препаратов шириной 10 мм и глубиной 2 мм каждый. Ага-
розу растворяли в 0,12 М NaCl с 0,03 М Трис-HCl (pH 7,5), 0,5%
ДДС-Na и 2 мМ ЭДТА и заливали раствор до уровня на 1 мм
выше выступов. Охлаждали форму, снимали одну из пластинок
и на торец слоя агарозы против колодцев клали две полоски
фильтров размером 3X11 мм (рис. 38). На одном из фильтров
была закреплена полиуридиловая кислота, второй был свободен,
и оба смачивались тем же буфером. Затем пластинку формы
возвращали на свое место и поверх фильтров заливали и поли-
меризовали 1,25%-ный гель агарозы во всем объеме формы. Еще
раз разобрав форму, пластину агарозы устанавливали в прибор
для горизонтального электрофореза.
В колодцы вносили суммарный препарат РНК и начинали
электрофорез, ограничив напряженность поля в течение первого
14В
часа значением 1,6 В/см. За это время РНК выходила из колод-
цев и мигрировала сквозь фильтры. На том из них, где закреп-
лена поли (У), задерживались все молекулы поли (А)-РНК.
Рабочий буфер как раз и был выбран так, чтобы создать опти-
мальные условия для гибридизации поли(А)—поли(У). Через
второй, свободный фильтр все РНК проходили без задержки.
Затем фильтры вынимали, оставшиеся от них щели заливали
агарозой и продолжали электрофорез в нормальных условиях до
полного разделения всех прошедших через фильтры РНК. Далее
методом авторадиографии сопоставляли две параллельные кар-
тины фракционирования. В треке РНК, прошедших через фильтр
с поли (У), нехватало некоторого числа полос, по сравнению с со-
седним треком. Эти полосы, очевидно, и принадлежали молеку-
лам поли (А)-РНК, которые таким образом выявлялись и фрак-
ционировались.
Использование жидкого (ие сшитого) ПААГ
В главе 1 уже отмечалось, что слабосшитый ПААГ не пред-
ставляет собой жестко фиксированную пространственную ре-
шетку. Мигрирующие в таком геле макромолекулы раздвигают
спутанные, но гибкие и на довольно протяженных участках сво-
бодные нити полиакриламида. Интересно было проверить эти
представления на модели вовсе не сшитого полиакриламида.
Боде [Bode, 1977] проводил полимеризацию акриламида из
его 7,5%-ного раствора в 0,1 М фосфатном буфере (без добавле-
ния метиленбисакриламида) с помощью обычных инициаторных
добавок под вакуумом в течение ночи. Он получил очень вязкую
жидкость, содержащую длинные и спутанные нити «линейного»
полиакриламида. Эту жидкость он смешивал в различных про-
порциях с расплавленным 1%-ным раствором агара. При охлаж-
дении смесей получались достаточно прочные гели, в которых
жесткая и крупнопористая пространственная сетка агара была
заполнена полужидким линейным полиакриламидом. Эта систе-
ма обеспечивала такое же хорошее электрофоретическое разде-
ление белков, как и нормальный ПААГ с тем же содержанием
акриламида. Правда, нижний конец трубки при этом приходи-
лось закрывать диализной пленкой во избежание вытекания
«геля».
Зависимость расстояния миграции белков в этой системе от
логарифма их молекулярной массы при электрофорезе в при-
сутствии ДДС-Na тоже оказалась линейной. Для РНК эффект
торможения наблюдался уже при концентрации акриламида
0,25%.
Важное преимущество системы заключается в том, что такой
«гель» можно расплавлять и извлекать разделенные электрофо-
резом полосы из жидкости, как описано ниже для гелей ага-
розы.
14»
ОКРАШИВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
В подавляющем большинстве случаев для окрашивания ДНК
и РНК после электрофореза в ПААГ или гелях агарозы исполь-
зуют бромистый этидий — фенантреновый краситель, несущий
положительный заряд и обладающий способностью внедряться
в двунитевые участки нуклеиновых кислот между плоскостями
соседних пар оснований.
Коэффициент молярной экстинкции бромистого этидия при
480 нм — 5800. Оптической плотности раствора при 480 нм, рав-
ной единице, отвечает его концентрация 70 мкг/мл. Бромистый
этидий ограниченно растворим в воде. Его водные растворы
флюоресцируют с максимумом при 590 нм. Существуют четыре
оптимальных значения А, для возбуждения флюоресценции (мак-
симумы поглощения): 300, 336, 360 и 545 нм. Наиболее безопасно
с точки зрения фотодеградации нуклеиновых кислот использо-
вать для возбуждения Х=300 нм. Этой длине волны соответст-
вует наибольшая длительность высвечивания, и при фотографи-
ровании в этом случае источник света можно погасить [Brunk,
Simpson, 1977].
Флюоресценция резко усиливается при интеркаляции броми-
стого этидия в нуклеиновую кислоту, что и используется для
окрашивания ДНК и двунитевых участков РНК. Однако броми-
стый этидий позволяет обнаружить и присутствие однонитевых
нуклеиновых кислот в геле. Это происходит за) счет связывания
и концентрирования красителя в результате его электростатиче-
ского взаимодействия с остатками фосфорной кислоты.
Чувствительность метода обнаружения нуклеиновых кислот
в гелях с помощью бромистого этидия очень высока: в гелях ага-
розы легко удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг
ДНК, а в ПААГ — доли микрограмма. Рабочая концентрация
водного раствора красителя при окрашивании нуклеиновых кис-
лот в гелях составляет около 1 мкг/мл. В таком растворе гель
вымачивают в течение 0,5—1 ч или же вводят бромистый этидий
в рабочий буфер геля при его полимеризации.
Флюоресценцию наблюдйют и фотографируют при освещении
длинноволновым ультрафиолетовым светом (например, лампой
М-16 «Black Ray») с оранжевым светофильтром. Наилучшая
150
чувствительность отмечена при использовании пленок «Polaroid#
типа 55 или 57. Отмывать гель после окрашивания не нужно, так
как фоновая флюоресценция водного раствора красителя указан-
ной концентрации мала. Если после элюции ДНК из геля бро-
мистый этидий необходимо удалить, то это можно сделать хро-
матографией на колонке «Dowex 50» в 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,4)
с 1 мМ ЭДТА.
Различить ДНК и РНК, находящиеся в одном геле, можно с
помощью красителя «Stains-all», применение которого для окра-
шивания белков и гликопротеидов было описано в предыдущей
главе. Там же были приведены рабочие концентрации этого кра-
сителя и условия окрашивания.
«Stains-all» окрашивает ДНК в синий, а РНК — в голубовато-
пурпурный цвет. Однако, как уже указывалось, чувствительность
окрашивания невысока.
В числе красителей, использующихся в качестве лидирующих
при электрофорезе белков в кислых буферных системах, был
упомянут метиловый зеленый. Он специфически окрашивает
ДНК, но не связывается с РНК. В недавней работе [Peters, Dah-
mus, 1979] было описано использование метилового зеленого для
определения концентрации ДНК в растворе в присутствии РНК.
По-видимому, есть все основания предполагать, что с его по-
мощью возможно обнаружение ДНК в геле в аналогичной ситуа-
ции. Чувствительность, разумеется, при этом должна быть на-
много ниже, чем для флюоресцентных красителей.
Впрочем, среди недавно появившихся флюоресцентных кра-
сителей есть и такой, который избирательно окрашивает ДНК в
присутствии РНК,— 4,6-диамидино-2-фенилиндол-2НС1 (фирмен-
ное обозначение — DAPI). Краситель флюоресцирует при 454 нм,
а оптимум возбуждения его флюоресценции находится при
372 нм. Он достаточно хорошо растворим в водных буферах.
ПААГ или гели агарозы после электрофореза можно вымачи-
вать в растворе DAPI (например: в 5 мМ трис-НС1, pH 7,2, с
0,01 М NaCl) в течение 1 ч, а затем отмыть фон тремя сменами
воды в течение 3 ч. Рабочая концентрация красителя 0,1 мкг/мл.
При этом он прочно связывается с ДНК, а РНК не окрашивает.
Чувствительность окрашивания ДНК — того же порядка, что и
у бромистого этидия [Kapuscinski, Yanagi, 1979].
Среди красителей, широко использовавшихся до недавнего
времени для окрашивания РНК в ПААГ, можно, кроме «Stains-
all», назвать также акридиновый оранжевый, метиленовый си-
ний, толуидиновый синий и пиронин. Все они обладают одним
общим недостатком: окрашивание влечет за собой фотодеграда-
цию молекул РНК. В тех случаях, когда этого необходимо избе-
жать, например для последующей элюции РНК, окрашивать
гель следует в темноте.
Акридиновый оранжевый в качестве флюоресцентного краси-
теля обладает, по сравнению с бром'истым этидием, рядом недо-
статков: он дает довольно высокий фон флюоресценции, который
151
трудно отмывается, а чувствительность окрашивания — на поря-
док ниже [обнаруживает 0,1 мкг ДНК в полосе).
Акридиновый оранжевый
Но у него есть и важное преимущество: окрашивание акри-
диновым оранжевым позволяет надежно различить полосы дву-
нитевых (нативных) и однонитевых (денатурированных) нуклеи-
новых кислот. Проникая, подобно бромистому этидию, в двуни-
тевые участки нуклеиновых кислот, акридиновый оранжевый при
освещении ультрафиолетовым светом дает зеленую флюоресцен-
цию (Х1ШЮ=530 нм). В то же время электростатическое присоеди-
нение этого красителя к однонитевым участкам по остаткам
фосфорной кислоты, в отличие от бромистого этидия, приводит
к резкому изменению флюоресценции и смещению ее максимума
В красную область (Лиакс = 640 нм).
Рабочая концентрация акридинового оранжевого при окра-
шивании гелей 30 мкг/мл (в 0,01 М. Na-фосфатном буфере, pH 7),
а продолжительность окрашивания — около 30 мин. Отмывать
фон самого геля можно в том же буфере в течение 2—3 ч при
комнатной температуре (лучше в эмалированной кювете, по-
скольку эмаль сорбирует акридиновый оранжевый, который по-
том нетрудно отмыть горячей водой). Гель фотографируют при
освещении ультрафиолетовым светом (Х = 254 нм) на цветную
пленку, например «Polaroid Туре 108 Color film».
Окрашивание РНК нефлюоресцентным красителем метиле-
новым синим еще недавно использовалось довольно широко, но
сейчас почти не употребляется ввиду своей непрочности: после
необходимой для удаления фона длительной отмывки окрашен-
ные полосы заметно расплываются. Толуидиновый синий дает
лучшие результаты. Его рабочая концентрация — 0,7% в смеси
уксусной кислоты, метанола и воды (1:1:8).
Толуидиновый синий
Окрашивание ведут в течение 16 ч. Отмывают гель в той же
смеси, но в пропорции 0,5:1 :8,5, либо за счет дйффузии, либо
электрофоретически. Однако фон окраски полностью не отмы-
вается, и в этом отношении предпочтение следует отдать окра-
шиванию РНК пиронином. Пиронин используется как для окра-
шивания РНК, так и в качестве лидирующего красителя, поэтому
152
его структура была приведена выше. Рабочая концентрация пи-
ронина при окрашивании РНК 0,5% (в тех же условиях, что и
для толуидинового синего). Хорошо прокрашиваются полосы,
содержащие 0,3—0,5 мкг РНК |Marcinka, 1972].
ЭЛЮЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ГЕЛЕЙ
Элюция из ПААГ за счет диффузии
Простейший прием элюции нуклеиновых кислот из ПААГ сво-
дится к вымыванию их за счет диффузии в солевых растворах,
однако ввиду высокой молекулярной массы нуклеиновых кислот
этот процесс занимает много времени. Для его ускорения стара-
ются уменьшить путь диффузии макромолекул из геля в жид-
кость, т. е. максимально измельчить гель. В неоднократно цити-
рованной классической работе Максама и Гильберт по секвени-
рованию ДНК вырезанный из 8%-ного ПААГ участок геля
растирали силиконированной стеклянной палочкой в запаянном
снизу пластмассовом наконечнике «эппендорфовской» пипетки на
1 мл над слоем стеклянной ваты, затем добавляли 0,6 мл 0,5 М
CHjCOONH*, содержащего 10 мМ (CHsCOO)2Mg, 0,1% ДДС-Na
и 0,1 мМ ЭДТА, закрывали наконечник парафильмом и выдер-
живали 10 ч при 37°. Потом запаянный кончик обрезали и экст-
ракт ДНК выдавливали кратковременным центрифугированием
из наконечника пипетки в силиконированную пробирку. Стеклян-
ная вата задерживала в наконечнике частицы геля. Высокая
концентрация соли в элюирующем растворе и присутствие
ДДС-Na препятствовали агрегации молекул ДНК. ЭДТА и
ДДС-Na блокировали остаточную активность нуклеаз.
Иногда для измельчения геля его растирают внутри обычного
шприца вращением' его поршня. На дно шприца предварительно
кладут плотно прилегающий к стенкам кружок фильтровальной
бумаги, через которую затем и продавливают экстракт. Исполь-
зуют и стеклянные гомогенизаторы малого объема. Можно про-
давливать предварительно измельченный гель через иглу шприца
(21-го калибра для 1,8%-ного ПААГ и 16-го — для 7,5%-ного
ПААГ).
В элюирующий раствор из указанных соображений иногда
вводят до 1 М NaCl. В других случаях, когда нет оснований опа-
саться агрегации молекул, элюцию ведут при физиологических
концентрациях соли или даже в разбавленных буферах. Если
сохранение высокой молекулярной массы элюируемой нуклеино-
вой кислоты не существенно, то имеет смысл измельчить ее мо-
лекулы еще в геле, обработав его суспензию ультразвуком. Это
заметно ускоряет диффузию и выход нуклеиновой кислоты из
геля [Schuercn et al., 1975].
И все же во всех случаях экстракцию за счет диффузии при-
ходится вести длительное время и не на холоду, поэтому следует
помнить об опасности деградации (особенно РНК) и принимать
163
меры по блокированию активности соответствующих нуклеаз.
Посуда должна быть хорошо прожарена, буферы — автоклави-
рованы. В них нередко вводят ингибиторы нуклеазной актив-
ности.
Вместе с нуклеиновыми кислотами из геля неизбежно вымы-
ваются примеси белков и короткие нити полиакриламида. Для
дальнейшей очистки нуклеиновых кислот используют следующие
приемы: фенольную депротеинизацию, переосаждение этанолом
или изопропанолом, осаждение РНК 0,2 М СаС1г при pH 5,5—6
[Dolja et al., 1977].
От ДДС-Na, часто необходимого для успешной элюции ну-
клеиновой кислоты, можно избавиться осаждением его в виде
калиевой соли после добавления к экстракту концентрирован-
ного раствора КС1. Все осаждения производят с использованием
микропробирок в настольных скоростных центрифугах («Ерреп-
dorf», «Beckman»).
Обычно вместе с нуклеиновыми кислотами переосаждается и
низкополимерный, водорастворимый полиакриламид, выходящий
вместе с ними из геля. От него можно избавиться осаждением
нуклеиновой кислоты с помощью кислот (ТХУ, НС1О4), однако
целостность ее молекул при этом может пострадать. Если это
неприемлемо, то для экстракции нуклеиновых кислот из геля
следует применить буфер, содержащий 0,1—0,15 М NaCl, а затем
из него осадить их добавлением цетавлона до 0,1%. Осадок це-
тавлоновой соли нуклеиновой кислоты можно растворить энер-
гичным встряхиванием в 20%-ном растворе ацетата калия, т. е.
переводом ее в водорастворимую калиевую соль [Young Y., Yo-
ung R., 1974]. Можно освобождаться от цетавлона растворением
соли в крепких растворах NaCl с последующим осаждением эта-
нолом и другими способами. Однако всегда следует иметь в виду,
что нет способа проверить, полностью ли цетавлон вытеснен
ионами металла из связи с нуклеиновой кислотой. Между тем
в некоторых случаях, например для восстановления физиологи-
ческой «компетентности» нуклеиновых кислот, примеси цетавло-
на могут создавать серьезные помехи.
Элюция из гелей агарозы
Для элюции ДНК из гелей агарозы предложен целый ряд ме-
тодов, использующих особенности структуры этих гелей, а так-
же возможность их растворения и плавления.
Выдавливание раствора ДНК из геля. Выше было указано,
что гель агарозы представляет собой переплетение не сшитых
между собой химически пучков нитей, образующих крупнопори-
стую пространственную решетку. Такое своеобразие структуры
позволяет осуществить, в частности, выдавливание жидкости из
геля вместе с растворенной в ней ДНК. Эффективность этой опе-
рации повышается после замораживания геля, что, по-видимому,
можно объяснить разрывами нитей растущими кристалликами
льдэ.
154
Так, срезы геля агарозы толщиной 3 мм можно заморозить
при —20е, поместить между листками парафильма и сжимать
пальцами в течение нескольких секунд — до 70% массы геля вы-
течет в виде жидкости. Для ускорения замораживания геля его
можно подержать в течение 15 с в сухом льду, а потом выдер-
жать при —20е. Не следует, однако, допускать охлаждения геля
ниже указанной температуры. Под действием давления лед вну-
три геля плавится, подобно тому как плавится лед под коньками,
и чем ниже температура, тем большее давление необходимо для
его плавления. К остатку геля можно добавить еще 50 мкл бу-
фера и сжатие повторить. Наконец, всю систему надо промыть
1 мл воды и агарозу удалить центрифугированием. Выход по
ДНК составляет при этом около 70%. Показано, что ДНК с мо-
лекулярной массой до 50 млн. (как линейная, так и кольцевая)
остается неповрежденной [Thuring et al., 1975].
Сжатие геля агарозы можно осуществить и центробежной си-
лой. В этом случае процедура извлечения ДНК сводится к замо-
раживанию и оттаиванию измельченного геля с последующим
скоростным центрифугированием в бакет-роторе.
Относительно небольшие (устойчивые к действию срезываю-
щих сил) молекулы ДНК можно извлечь из агарозы после энер-
гичной гомогенизации геля (например, с помощью «Sorvall
omnimixer») или после продавливания его через иглу шприца
26-го калибра. Обрывки нитей агарозы легко осаждаются цент-
рифугированием при 10000 g в течение 10 мин. Растворенная
в буфере геля ДНК остается в супернатанте с выходом до 80%.
Растворение геля агарозы. Гели агарозы сравнительно легко
растворяются в концентрированных водных растворах KI и Nal,
а также в 5 М NaClO*. Однако возникают определенные трудно-
сти в связи с необходимостью последующего разделения раство-
ренных ДНК и агарозы.
В свежеприготовленном растворе, содержащем 1,3 г/мл KI,
0,01 М Трис-НС1 (pH 7,5) и 1 мМ ЭДТА, гель агарозы полностью
растворяется при 37° за 45 мин. Раствор можно нанести на ко-
лонку оксиапатита, уравновешенного 0,05 М Na-фосфатным
буфером (pH 6,9), отмыть агарозу тем же буфером, а затем
элюировать ДНК 1 М Na-фосфатом. Затем, если надо, фосфат
можно удалить путем диализа против 0,2 М СН8СООК (pH 5)
с 20 мМ ЭДТА, а ДНК осадить этанолом [Dodgson et al., 1979].
Сорбция и десорбция ДНК с оксиапатита приводят к нару-
шению целостности высокомолекулярных фрагментов ДНК, на-
пример рестриктов. Вогельстайн и Гиллеспи рекомендуют рас-
творять гель агарозы, добавляя насыщенный водный раствор ,
Nal в соотношении 2: 1 к объему геля. Гель растворяется при
комнатной температуре и осторожном встряхивании за несколь-
ко часов, а если допустимо энергичное встряхивание (с помощью
прибора «Vortex»), то за несколько секунд. Из этого раствора
ДНК можно избирательно осадить добавлением ‘/а объема аце-
тона. Осадок образуется при комнатной температуре за 1 ч. Его
155
можно собрать центрифугированием с ускорением 10000 g при
15° за 60 мин. Агароза остается в растворе, а осадок ДНК про-
мывают 4 раза 75%-ным ацетоном и высушивают (Vogelstein,
Gillespie, 1979].
Другой вариант извлечения ДНК из раствора агарозы пред-
ложен этими же авторами для препаративных целей. Хорошо
известно, что ДНК из концентрированного солевого раствора
легко сорбируется на стекле, что вовсе не свойственно агарозе.
Рис. 39. Сорбция ДНК (1) и РНК
(2) на стекловолокнистом фильт-
ре GF/С в концентрированных
растворах NaClO* [Chen, Thomas,
1980]
Как и в предыдущем случае,
гель агарозы растворяют в двой-
ном объеме насыщенного раст-
вора Nal. Растворение ведут в
полиэтиленовом флаконе, куда
вносят еще и тонкий стеклянный
порошок (скорость оседания в
воде — не более 2 мм/мин) из
расчета 1 г порошка на 1 мг
ДНК. Флакон медленно перево-
рачивают в течение 3—4 ч при
комнатной температуре. За это
время гель растворяется, а ДНК
практически полностью сорбиру-
ется на стекле. Порошок собира-
ют центрифугированием, отмы-
вают от остатков агарозы 70%-
ным раствором Nal и десорбируют ДНК со стекла раствором,
содержащим 0,1 М NaCl, 0,01 М. Трис-HCl (pH 7,2) и 1 мМ
ЭДТА в 50 %-ном этаноле при 37° в течение 30 мин.
Недавно описан аналогичный подход с использованием сорб-
ции ДНК на стекловолокнистый фильтр GF/C (Chen, Thomas,
1980]. Гель агарозы растворяли в 6 М водном растворе NaClO*.
При комнатной температуре это занимало' несколько минут.
Между тем при такой концентрации перхлората натрия ДНК
сорбировалась на GF/С полностью (рис. 39)—до 10 мкг на
фильтр диаметром 6 мм. Авторы рекомендуют положить фильтр
GF/С на лист фильтровальной бумаги и, перенося его каждый
раз на сухое место, последовательно наносить в центр фильтра
па 100 мкл следующих растворов: промывочного буфера (6 М
NaClO* в 0,01 М Трис-НС1, pH 7,5, с 1 мМ ЭДТА), раствора геля
в 6 М NaClO4, снова промывочного буфера (10 порций) и, нако-
нец, 10 порций этанола для удаления NaClO*. После этого ДНК
с фильтра элюируют 20 мкл 1 мМ Трис-HCl (pH 7,5) с 0,1 мМ
ЭДТА при 37° в течение 30 мин. Элюат собирают центрифугиро-
ванием фильтра в микропробирке с отверстием в ее кончике.
Выход ДНК достигает 80%. Фаговая ДНК размером 10 КВР
остается при этом интактной, а ДНК фага к (48 КВР) частично
деполимеризуется.
Если сохранение полимерности ДНК не обязательно, то по-
сле растворения геля агарозы в концентрированном растворе
156
перхлората натрия ДНК можно очищать от агарозы на окси-
апатите, как было описано для растворения геля в KI [Humphries
et al., 1979].
Расплавление агарозы. Использование описанной в главе 1
легкоплавкой агарозы типа LGT (фирмы «Miles») или «Sea Pla-
que» («Marine Collo~ids») позволяет заменить растворение геля
его расплавлением при температуре, лежащей ниже точек плав-
ления ДНК или двунитевых участков РНК.
Вислэндер отделял высокомолекулярную мРНК от расплав-
ленной агарозы мягкой обработкой фенолом. Он суспендировал
гель агарозы в 5—10 объемах рабочего буфера, расплавлял при
65° в течение 5 мин, добавлял равный объем горячего фенола,
насыщенного тем же буфером, перемешивал в течение 15 мин и
центрифугировал (12000 g-, 10 мин). Водно-фенольная суспен-
зия расслаивалась, агароза уходила в интерфазу, а мРНК ока-
зывалась в водном буфере. После повторной обработки фенолом
ее осаждали этанолом. Средний выход мРНК составлял 80%.
Повторный электрофорез показал, что молекулы РНК размера-
ми 4S, 18S, 35S и даже 75S оставались при этом неповрежден-
ными. Такой же результат был получен для ДНК полиомы и
фага A [Wieslander, 1979].
Лэнгридж и соавторы недавно описали отделение ДНК от
расплавленной агарозы методом двухфазного распределения с
участием бутанола [Langridge et al., 1980]. ДНК в расплавлен-
ном растворе агарозы обрабатывали 1%-ным раствором цетав-
лона в водонасыщенном бутаноле при 37\ При этой температуре
агароза типа «Sea Plaque» еще не застывает. Цетавлоновая
соль ДНК уходила в бутанольную фазу, агароза оставалась в
водной фазе. Перевод ДНК в натриевую соль не представляет
большого труда.
Аналогичный прием можно использовать и для геля обычной,
не легкоплавкой агарозы, в которой электрофорез РНК прово-
дили в присутствии 6 М мочевины. Благодаря мочевине (см.
выше) гель обычной агарозы плавится при 75° за 1,5 мин и не
застывает даже при 20° в течение 1 ч. Концентрация цетавлона
в этом случае несколько выше.
Показано, что бутанол не нарушает трансформирующую спо-
собность плазмидной ДНК- Другие биологические свойства на-
тивных ДНК и РНК также остаются без изменений. Однако вы-
ход ДНК в бутанольную фазу резко снижается, если ее молеку-
лярная масса превышает 10 млн. Причины этого неясны.
Что касается РНК, то после электрофореза в геле агарозы с
добавлением 6 М мочевины всеми другими способами она элюи-
руется очень плохо. Данный же способ дает высокий выход очень
чистой РНК, обладающей, например, высокой матричной актив-
ностью. Последнее обстоятельство указывает на полноту очистки
от агарозы, которая, как известно, ингибирует трансляцию РНК-
Можно расплавить обычную агарозу при 70°, если в геле со-
держится 50%-ный раствор формамида. Как и в случае мочеви-
ны, формамид способствует разрыву водородных связей, скреп-
ляющих гель агарозы. Естественно, что такие гели используются
только для фракционирования денатурированных ДНК.
Электрофоретическая элюция
Большой отрицательный заряд нуклеиновых кислот открыва-
ет широкие возможности для их электрофоретической элюции из
ПААГ и гелей агарозы. Предложено много вариантов соответ-
ствующих устройств. В подавляющем большинстве из них нук-
леиновые кислоты элюируют в диализный мешочек или в каме-
ру, отделенную от анодного резервуара диализной мембраной.
Однако нуклеиновые кислоты хорошо сорбируются на диализной
пленке, и без принятия специальных мер их потери могут быть
значительными. В числе таких мер можно назвать реверсию на-
правления тока на короткое время перед опорожнением мешоч-
ка, внесение балластной (немеченной) нуклеиновой кислоты,
когда это допустимо, и, наконец, предварительную обработку
диализной пленки с целью уменьшения ее сорбционной способно-
сти. Для этого, помимо обычного кипячения в 5 %-ном растворе
NaHCO4, промывки водой и кипячения в 5 мМ растворе ЭДТА,
диализные мешочки рекомендуется вымачивать в течение 12 ч
на холоду в уксусном ангидриде и затем хорошо промывать во-
дой [Perlman, Huberman, 1977]. Сорбционную способность диа-
лизной пленки иногда насыщают предварительной промывкой
раствором бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и даже
вводят БСА в буфер, заполняющий диализный мешочек [Kiessig,
Grodzicker, 1979]. Однако с этим связана необходимость после-
дующего отделения элюированной ДНК от белка.
В конструктивном отношении устройства для электрофорети-
ческой элюции выполняются как с вертикальным, так и с гори-
зонтальным расположением геля. Простейший из вариантов с
вертикальным расположением представляет собой обрезанную
сверху пластиковую пипетку на 10 мл с диализным мешочком на
конце. В пипетку помещают пробку из стекловолокна, на кото-
рую и выдавливают из шприца измельченный гель. Пипетку
заполняют буфером и с помощью U-образной трубки соединяют
с катодным резервуаром [Galibert et al., 1974].
В препаративном варианте для электроэлюции однонитевых
рестриктов ДНК из геля агарозы его можно расплавлять и по-
вторно заливать в трубку, на конец которой следует затем на-
деть заполненный буфером диализный мешочек. Элюцию можно
вести в обычном приборе для вертикального электрофореза в
трубках. Контроль за выходом ДНК из геля в мешочек удобно
осуществлять с помощью бромистого этидия, введенного в состав
буфера.
Вместо расплавления кусок агарозного геля можно залить
расплавленной агарозой, как показано на рис. 40 [Case, Daneholti,
1976]. В стеклянную трубку с установленным внутри нее на не-
158
Рис. 40. Камера для электроэлюции ДНК из геля агарозы [Case, Daneholt,
1976]
/ — трубка; 2 — верхнее резиновое кольцо; 3 — кусочек геля агарозы; 4 — пробка; 5 —
верхний электродный буфер; 6 — заливка агарозой; 7 — нижнее резиновое кольцо; 8 — ка-
мера элюции; Р —диализная пленка; а — внесение кусочка геля на пробке в трубку;
б — готовая к элюции система
Рис. 41. Двумерное фракционирование множества рестриктов ДНК животного
происхождения в агарозном геле с помощью сорбции их на оксиапатите [Та-
bak, Flavell, 1978]
а —колодец для контрольного препарата; б — колодцы, заполненные оксиапатитом; в —
канавка для внесения исходного гидролизата ДНК
котором расстоянии от края резиновым кольцом снизу на рези-
новой пробке вносят подлежащий элюции кусок агарозного геля.
Сверху его заливают агарозой, расплавленной в таком же, как
у рабочего геля, буфере. Затем пробку вынимают и агарозу за-
крепляют еще одним резиновым кольцом. На конец трубки наде-
вают диализную мембрану, заполнив предварительно образую-
щуюся таким образом камеру элюции буфером (в перевернутом
положении трубки). В нормальном положении трубки буфер вно-
сят над верхним резиновым кольцом, а затем всю систему вклю-
чают в цепь прибора для вертикального электрофореза.
В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести
электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких по-
лосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979].
На рабочий столик прибора устанавливают пластину 1%-ного
геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный
гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кис-
лот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вы-
резают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть
примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля.
Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают
вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают
диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает
Дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке рас-
полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные
тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно
169
каждого окна вплотную к его катодному краю. Доливают буфер
в окна до уровня пластины агарозы и во избежание его испаре-
ния всю ее накрывают стеклом. Электроэлюцию ведут при силе
тока 10 мА на холоду в течение 5—10 ч. Нуклеиновые кислоты
выходят внутрь диализных мешочков, откуда их затем отсасыва-
ют вместе с буфером. Авторы метода указывают, что выход при
этом составляет 50—70% для РНК и 70—90% для ДНК, а так-
же подчеркивают чистоту и нативность получаемых таким обра-
зом препаратов.
Назначение диализного мешочка или мембраны состоит в том,
чтобы помешать вышедшей из геля нуклеиновой кислоте мигри-
ровать дальше к аноду. Этого можно добиться и другим путем:
поместить на пути миграции сорбент, прочно связывающий нук-
леиновую кислоту, причем сделать это так, чтобы по окончании
элюции и сорбции нуклеиновой кислоты можно было бы легко
извлечь сорбент из геля и уже из него простыми средствами
элюировать нужный препарат. Этот вариант имеет еще и то пре-
имущество, что сорбент может избирательно сорбировать только
нуклеиновую кислоту и тем самым осуществлять ее очистку от
следов агарозы и других примесей, выходящих из геля.
В качестве сорбента можно, например, использовать
ДЭАЭ-бумагу «Whatman DE-81». Диск из такой бумаги выма-
чивают в электродном буфере и прижимают к анодному концу
трубки с гелем с помощью полиэтиленовой трубки с закраинами
[Malhorta et al„ 1978]. В цитируемой работе таким образом пре-
паративно разделяли 4S и 5S РНК, слабо окрашенные (для на-
блюдения за их выходом) метиленовым синим прямо в геле. По
мере выхода нужных фракций РНК диски DE-81 заменяли све-
жими. Краситель с дисков смывали этанолом, а РНК элюировали
тремя порциями 2 М триэтиламмоний-бикарбонатного буфера
(pH 9,5), который потом удаляли лиофилизацией.
В горизонтальном варианте электрофоретической элюции
ДНК из геля Табак и Флавелл в качестве сорбента использовали
оксиапатит. Фракционирование ДНК вели электрофорезом в
пластине 1 %-ного геля агарозы в 0,04 М Трис-ацетате (pH 7,7),
содержащем 0,02 М. CH3COONa, 1 мМ ЭДТА и 0,5 мкг/мл бро-
мистого этидия. По окончании электрофореза под ультрафиоле-
товым освещением перед каждой флюоресцирующей полосой
ДНК со стороны анода скальпелем вырезали канавку шириной
1—2 мм на всю глубину пластины. Канавку заполняли оксиапа-
титом, суспендированным в том же буфере, и прикрывали плен-
кой. Возобновляли электрофорез и вели его до того момента,
пока полоски ДНК в параллельном, контрольном треке не про-
двигались дальше местоположения канавок в рабочих треках.
После этого оксиапатит из каждой канавки отбирали пастеров-
ской пипеткой и переносили на маленькую колонку, заполненную
сефадексом Г-50. ДНК элюировали из оксиапатита 1 М Na-фос-
фатом. Проходя через сефадекс, элюат освобождался от фосфата,
и ДНК выходила из колодочки, растворенная в нужном буфере.
160
Таким образом была получена интактная ДНК с выходом около
80% [Tabak, Flavell, 1978].
В этой же работе описано развитие такого подхода для дву-
мерного электрофореза, позволяющее, например, быстро оты-
скать фрагмент ДНК, содержащий интересующий исследователя
ген, среди тысяч фрагментов, получающихся при обработке ка-
кой-либо рестриктазой высокомолекулярной ДНК животных.
Идею метода легко понять из рассмотрения рис. 41.
Сначала в длинную канавку, вырезанную в пластине толстого
(20X20X3 см) 0,7 %-ного геля агарозы, загружают 5 мг рестрик-
тазного гидролизата ДНК в 10 мл горячего буфера, содержащего
0,3% агарозы, которая там и застывает. Размеры канавки^-
12X0,4 см при глубине 2,6 см. Электрофорез в первом направ-
лении (/) дает сплошную размытую картину — многочисленные
рестрикты ДНК расходятся на всю высоту пластины. Затем ве-
дут электрофорез в перпендикулярном направлении (2). В этом
направлении с анодного края пластины, в шахматном порядке
перекрывая все ее поле, расположены 25 колодцев сечением
2X5 мм и глубиной 2,8 см. Колодцы заполнены оксиапатитом.
После электрофореза во втором направлении в течение 24—28 ч
при силе тока 250 мА ДНК из каждого противолежащего слоя
целиком собирается в соответствующем колодце и сорбируется
там на оксиапатит. Его извлекают, и 25 препаратов ДНК одно-
временно элюируют на колоночках сефадекса, как было описано
выше. Затем каждый из 25 препаратов денатурируют и аликвоту
его вносят в один из карманов обычной пластины агарозы (или
ПААГ), где в 25 параллельных треках идет дальнейшее фрак-
ционирование рестриктов ДНК. В каждом треке разделяется
свой набор полос теперь уже двукратно фракционированных
фрагментов. Эти полосы можно перенести по методу Созерна
(см. ниже) на нитроцеллюлозный фильтр и там гибридизовать
с меченой мРНК для обнаружения рестрикта, содержащего иско-
мый ген. Этот ген оказывается очищенным в 20—40 раз, что по-
зволяет приступить к его клонированию.
В упрощенном варианте электрофоретической элюции рест-
риктов ДНК из горизонтальной пластины агарозы в качестве
сорбента используют просто фильтровальную бумагу «Whatman
8ММ». Полоску такой бумаги закладывают в щель, вырезанную
в пластине рядом с окрашенной бромистым этидием полосой
ДНК (со стороны анода). За полоской бумаги в эту же щель
закладывают и диализную пленку. Возобновляют электрофорез
и ведут его до тех пор, пока ДНК не перейдет в бумагу, контро-
лируя этот процесс под УФ-освещением [Gurvitz et aL, 1980]. По
существу, в этом случае имеет место не сорбция, а обычная элек-
трофоретическая элюция ДНК в камеру, которая образована
толстой фильтровальной бумагой, смоченной буфером. После
элюции ДНК с бумаги и промывки диализной мембраны авторы
получали 70%-ный выход чистой интактной ДНК. Так же можно
элюировать и РНК.
6 Л. А. Остерман 1^1
Перенос нуклеиновых кислот из геля
на нитроцеллюлозные фильтры и диазобумагу
Упомянутый выше перенос ДНК из агарозы на нитроцеллю-
лозу, предложенный в 1975 г. Созерном, основан на избиратель-
ной способности мембранных нитроцеллюлозных фильтров (на-
пример, «Millipore НА») сорбировать на своей поверхности дена-
турированную ДНК [Southern, 1975]. В оригинальном методе
Созерна денатурированную ДНК из геля просто вымывают креп-
ким солевым раствором. Ток жидкости от геля к нитроцеллюлозе
обеспечивается капиллярными силами. Как показано на рис. 42,
на стекло кладут лист фильтровальной бумаги («Whatman
ЗММ»), смоченной солевым раствором (3 М NaCl+0,3 М Na-цит-
рат). На него кладут полоску геля между двумя полосками плек-
сигласа такой же толщины, что и гель. На полоску геля накла-
дывают нитроцеллюлозный фильтр, смоченный разбавленным
солевым раствором (0,3 М NaCl+0,03 М Na-цитрат). Его края
заходят на полоски из плексигласа. Затем кладут две полоски
бумаги «Whatman ЗММ», смоченные тем же раствором, причем
так, что они примерно на 5 мм перекрывают фильтр с двух его
противоположных сторон. Наконец, все это сверху накрывают
несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Этот «сэнд-
вич» выдерживают в течение нескольких часов, иногда добавляя
концентрированный раствор солей к нижнему листу бумаги
«Whatman ЗММ» (в зазоре между полоской геля и полосками
плексигласа жидкости быть не должно).
Значительная доля ДНК вымывается из геля током жидко-
сти, идущим от нижнего листа фильтровальной бумаги через
гель и нитроцеллюлозный фильтр к верхним, первоначально су-
хим, слоям бумаги. На нитроцеллюлозе эта ДНК прочно сорби-
руется в тех местах, которые лежат непосредственно над поло-
сами ДНК в геле. Высокая концентрация соли способствует
сорбции. После этого с помощью известных методов гибридиза-
ции на нитроцеллюлозных фильтрах (их рассмотрение выходит
за рамки этой книги) можно идентифицировать отдельные по-
лосы ДНК в этой «копии», а следовательно, и в самом геле.
В описанном методе, несмотря на его очень широкое приме-
нение в генной инженерии, есть свои слабые стороны. Так, круп-
ные рестрикты ДНК плохо переносятся из геля на нитроцеллю-
лозу, а малые фрагменты (200—300 оснований) плохо на ней
сорбируются.
В этом плане в качестве «сорбента» для ДНК следует пред-
почесть уже упоминавшееся диазотированное бензилоксиметиль-
ное производное целлюлозы, получающееся путем определенной
обработки фильтровальной бумаги («Whatman 540»). Эта так
•называемая «диазобумага», или «ДБМ-бумага», была разрабо-
тана Олвином и соавторами [Alwine et al., 1977]. В главе 3 ука-
зывалось на возможность ее использования для получения афин-
ных сорбентов, применяющихся для задержания определенных
162
Рис. 42. Система переноса ДНК из геля агарозы на нитроцеллюлозный фильтр
путем ее вымывания [Southern, 1975]
/—нитроцеллюлозный фильтр; 2— полоска геля агарозы; 3 и 4 — влажная фильтроваль-
ная бумага; 5 — пластины плексигласа; 6 — сухая фильтровальная бумага
белков, вымываемых из геля после электрофореза. Для этого на
ДБМ-бумагу надо было сначала «посадить» антитела или дру-
гие связывающие белок «лиганды». Здесь дело обстоит проще:
нуклеиновые кислоты любого размера связываются с самой
ДБМ-бумагой ковалентными связями по ее диазониевым груп-
пам. Вместе с тем сохраняется их способность гибридизоваться
с комплементарными молекулами.
Система переноса нуклеиновых кислот из геля на ДБМ-бума-
гу, описанная Олвином и соавторами, отличается от системы
Созерна только тем, что здесь отпадает необходимость исполь-
зовать крепкий солевой раствор. Нуклеиновые кислоты из геля
можно вымывать слабым боратным или фосфатным буфером.
Ввиду того, что ДБМ-бумага надежно связывает и мелкие
фрагменты нуклеиновых кислот, эффективность переноса ДНК
из геля на бумагу можно значительно повысить путем дробления
ДНК непосредственно в полосах, полученных в результате элек-
трофореза. Для этой цели было предложено гель агарозы после
электрофореза вымачивать в 0,25 М НС1, что влечет за собой
частичную апуринизацию ДНК, а затем обрабатывать солью и
щелочью (1 М NaCl + 0,5 М NaOH), что вызывает разрыв нити
ДНК по местам апуринизации. Полученные таким образом
фрагменты ДНК легко переходят на ДБМ-бумагу, сохраняя свою
способность к гибридизации [Wahl et al., 1979].
Система переноса, использованная в этой работе, еще проще.
Нейтрализованный вымачиванием в буфере гель кладут на два
листа бумаги «Whatman ЗММ», смоченной 1 М раствором
Na-ацетата (pH 4). Влажную бумагу вокруг пластины геля про-
сто прикрывают пленкой, на гель кладут ДБМ-бумагу, а на
нее — два листа сухой «Whatman 3 ММ» и толстый слой сухих
бумажных салфеток. Для равномерности контактов все это при-
жимают небольшим грузом через стеклянную пластинку. Пере-
нос ДНК занимает 2—3 ч. Такой перенос можно осуществлять
одновременно в обе стороны от пластины геля — на два листка
163
6*
ДБМ-бумаги с целью получения двух одинаковых реплик [Smith,
Summers, 1980].
Естественно, что перенос можно ускорить наложением элек-
трического поля в поперечном направлении — от геля к нитро-
целлюлозе или ДБМ-бумаге, т. е. заменить вымывание ДНК из
геля ее электрофоретической элюцией. Недавно было описано
очень простое устройство для этой цели в виде разъемной рамки
из плексигласа с диализной пленкой и электродами из платино-
вой проволоки [Bittner et al., 1980]. Гель агарозы кладут на про-
питанный буфером нитроцеллюлозный фильтр или ДБМ-бумагу,
с обеих сторон к ним прикладывают пропитанные буфером лист-
ки фильтровальной бумаги и все это зажимают между двумя
половинками рамки. Ее помещают в ванночку с тем же буфером
и включают напряжение «поперечного электрофореза». Напря-
женность электрического поля приходится регулировать в зави-
симости от величины фрагментов ДНК, чтобы мелкие фрагменты
не «проскакивали» через нитроцеллюлозу или ДБМ-бумагу до
того, как они успеют закрепиться на них. Очень крупные моле-
кулы ДНК авторы рекомендуют фрагментировать после электро-
фореза, обрабатывая их малой концентрацией ДНКазы прямо
в геле.
Одновременно аналогичное устройство для электрофоретиче-
ского переноса ДНК, РНК и белков из геля агарозы на ДБМ-бу-
магу было описано в другой работе [Stellwag, Dahlberg, 1980].
Авторы отмечают, что неденатурированная ДНК с ДБМ-бумагой
связывается плохо — более 90% ее уходит при промывке бумаги.
Впрочем, двунитевые рестрикты ДНК фага PMF2 связываются
с эффективностью 77%. Возможно, что это происходит за счет,
однонитевых участков ДНК в местах рестрикции. За счет неко-
валентного связывания ДНК и РНК (а также полисом) ДБМ-бу-
мага, независимо от активности своих диазониевых групп (см.
ниже), сорбирует 25—30 мкг нуклеиновой кислоты на 1 см2. Не-
ковалентно связанный материал можно снять промывкой соле-
вым раствором, содержащим 0,1% ДДС-Na, в течение ночи.
Важно отметить наблюдение авторов, касающееся быстрой
инактивации ДБМ-бумаги при ее хранении во влажном состоя-
нии (25 мМ Na-фосфатный буфер, pH 5,5, при 4°) после диазо-
тирования. За 12 ч связывающая способность бумаги падает до
20% от первоначального уровня, а за сутки утрачивается пол-
ностью. Инактивация идет ускоренно в слабощелочной среде.
При pH 8—9 полная потеря активности бумаги наступает через
2 ч.
Недавно Томас показала, что короткие фрагменты ДНК
(100—200 нуклеотидов), а также РНК можно прочно «посадить»
на нитроцеллюлозные фильтры переносом из геля агарозы по
методу Созбрна, если перед электрофорезом их денатурировать
в 1 М растворе_глиоксаля в 50%-ном водном диметилсульфокси-
де. Электрофорез следует вести при нейтральном значении pH,
чтобы сохранить присоединение глиоксаля по остаткам гуанина.
164
Глиоксаль препятствует частичной ренатурации нуклеиновой
кислоты во время переноса из геля, что необходимо для связы-
вания ее с фильтром. В ходе последующей фиксации нуклеиновой
кислоты на фильтре глиоксаль снимается, поэтому можно осу-
ществить ее тестирование путем гибридизации с меченой комп-
лементарной молекулой [Thomas, 1980].
Нативную ДНК можно переносить из агарозы на ДЭАЭ-бу-
магу вымыванием током слабого солевого раствора, как и в слу-
чае метода Созерна. При манипуляции с листами ДЭАЭ-бумаги
ввиду ее хрупкости следует применять определенные приемы
[Winberg, Hammarskjold, 1980]. В частности, предварительную
обработку бумаги кислотой и щелочью следует вести в пачках
по 20—40 листов, а для дальнейших переносов на отдельные ли-
сты накладывать полиэтиленовую пленку. Нативная ДНК с
Л4^6 млн. переходит на ДЭАЭ-бумагу за 24 ч; для элюции ДНК
с Л1<2 млн. достаточно 6 ч. Полосы ДНК на бумаге обнаружи-
вают, наливая на ее поверхность раствор бромистого этидия в
исходном буфере. Вырезанные затем полоски элюируют 1 MNaCl
при центрифугировании в микропробирках с проколотым кончи-
ком. Авторадиографию осуществляют, как обычно,— наложени-
ем рентгеновской пленки. Емкость бумаги «Whatman DE-81» со-
ставляет до 15 мкг ДНК на 1 см2 бумаги.
В препаративном варианте нативную ДНК можно элюировать
электрофоретически в микрогранулированную ДЭАЭ-целлюлозу,
которой заполняют канавку, вырезанную рядом с полосой ДНК
в геле. Для элюции ДНК с помощью 1 М NaCl ДЭАЭ-целлюлозу
переносят в микроколонку.
В заключение отметим еще один частный случай избиратель-
ной сорбции РНК, вымываемой из геля. Речь идет об элюции
мРНК после электрофореза в 2%-ном геле агарозы прямо из
измельченного геля на микроколонку олиго (дТ)-целлюлозы.
Агарозу на колонке обильно (500 мл на 0,2 г геля) промывают
0,5 М КС1 в 0,01 М Трис-HCl (pH 7,4). РНК постепенно вымы-
вается из геля, и содержащаяся в ее составе мРНК сорбируется
на олиго (дТ)-целлюлозе. Затем агарозу удаляют из колонки, а
мРНК элюируют буфером без соли [Auger, Saunders, 1977].
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ
Для оценки радиоактивности нуклеиновых кислот после элек-
трофореза используют те же приемы, что были описаны в главе 3
Для белков (счет радиоактивности жидких элюатов, растворение
геля, авторадиография и непрямая авторадиография с интенси-
фицирующими экранами и, наконец, флюорография). В подав-
ляющем большинстве случаев нуклеиновые кислоты метят радио-
активным фосфором. Ввиду высокой энергии его ^-излучения для
регистрации положения полос в геле пользуются авторадиогра-
фией или непрямой авторадиографией.
165
Для количественного счета радиоактйвности после электро-
фореза в геле агарозы последний можно просто расплавить. К по-
лоске агарозы, содержащей нуклеиновую кислоту, добавляют
0,5 мл 1 н. НС1 и нагревают до 90е НС1 частично гидролизует
нуклеиновую кислоту, что улучшает ее растворимость в сцинтил-
ляторе; кроме того, HCI предотвращает хемолюминесценцию.
Расплавленную агарозу охлаждают до 60°, добавляют 10 мл
«Biofluor», «Aquasol-2», или другого толуол-тритонового сцин-
тиллятора и хорошо перемешивают. Выход радиоактивности со-
ставляет почти 100%.
ПРЕПАРАТИВНЫЙ электрофорез
НУКЛЕИНОВЫХ кислот
Для препаративного электрофореза ДНК и РНК в гелях ага-
розы Хаген использовал трубки диаметром 5,9 или 7,7 см, просто
обрезав для этой цели мерные цилиндры на 1 или 2 л. Расплав-
ленную в соответствующем буфере агарозу он заливал на высоту
12—15 см. Камера элюции на нижнем конце цилиндра была
образована двумя сетками и диализной мембраной. Элюцию вели
непрерывно со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве элюента исполь-
зовали нижний электродный буфер, в который для охлаждения
цилиндр погружали на всю высоту геля. Буфер поступал в ка-
меру элюции по ее периферии и отсасывался через трубку, вы-
веденную из центра нижней сетки камеры {Hagen, 1979]. Агароза
не прилипает к стеклу цилиндра, поэтому во избежание мигра-
ции нуклеиновых кислот по зазору вдоль стенок препарат вно-
сили в углубление меньшего диаметра, чем цилиндр, сформиро-
ванное на верхнем торце геля агарозы при ее застывании. За-
метного перетекания буфера по зазору не происходило, так как
гель находился под гидростатическим давлением столба жидко-
сти высотой 10 см (верхний электродный буфер). Проблему
нагревания геля решали путем снижения плотности тока в 3—
4 раза против обычного для цилиндрических гелей значения и
удлинения времени электрофореза до 2 сут.
С помощью такой же системы успешно фракционировали
10 мг суммарного препарата нуклеиновых кислот дрожжей [Bos-
tian et al., 1979]. Разделение нельзя было назвать хорошим (4S
и 5S РНК практически не разделялись). Кроме того, при непре-
рывной элюции получались сильно разбавленные препараты, из
которых нуклеиновые кислоты приходилось осаждать с добав-
лением носителя.
По-видимому, для препаративного электрофореза нуклеино-
вых кислот следует предпочесть другую систему [Polsky et al.,
1978]. В этом случае разделение 35 мг рестриктазных фрагмен-
тов ДНК проводили в горизонтальной пластине агарозы сече-
нием 45 см2. Для внесения препарата в гель и его элюции слу-
жили прямоугольные камеры, прилегающие к торцам пластины
(рис. 43). Камера элюции объемом 12 мл была отделена от сле-
166
Рис. 43. Схема устройства для препаративного фракционирования ДНК в тол-
стой пластине агарозы с прерывистой элюцией [Polsky et al., 1978]
1 — командное устройство; 2 — источник напряжения; 3 — датчик уровня буфера -в камере
элюции; 4 — камера элюции; 5 — камера для препарата; 6 — элюирующий буфер; 7 и
10 — насосы; 8 — диализная мембрана; 9 — коллектор фракций; 11 — пластина агарозы
дующего за ней анодного резервуара диализной мембраной.
Электрофорез на расстоянии 8 см вели при напряженности поля
10 В/см. Камеру элюции автоматически опорожняли в коллектор
фракций через каждые 30 мин и снова заполняли свежим буфе-
ром. Электрическое напряжение на это время отключали. Ин-
тервал времени между опорожнениями камеры можно было ре-
гулировать. Благодаря такой прерывистой элюции значительного
разбавления препаратов не происходило. ДН-К, свободную от
примесей агарозы, получали с выходом около 90%. Ее можно
непосредственно подвергать дальнейшей рестрикции, сшиванию
лигазой и т. д. Недавно описан упрощенный вариант этой же
системы [Wertz et al., 1980].
Значительно быстрее, хотя и с заметно меньшим выходом
(50—75%), препаративное разделение ДНК в толстой пластине
агарозы (35X13X3 см) производили Праудфут и Баралль
[Proudfoot, Baralle, 1979]. В канавку, вырезанную в пластине
0,8%-ного геля агарозы, вносили 5 мг рестриктов ДНК в смеси
с 0,5%-ным раствором агарозы. Электрофорез вели при малой
плотности тока (0,5 мА/см2). Полосы ДНК обнаруживали с по-
мощью бромистого этидия. Затем перед каждой полосой, со сто-
роны анода, в геле вырезали канавку шириной 1 см. В нее укла-
дывали диализную пленку так, чтобы закрыть анодную сторону
канавки, и заполняли ее буфером. Возобновляли электрофорез
и вели его до тех пор, пока полосы ДНК полностью не выходили
в канавки (наблюдение при ультрафиолетовом освещении).
В 70-е годы был описан целый ряд других устройств для пре-
паративного фракционирования нуклеиновых кислот электрофо-
резом при вертикальном расположении геля, однако по произ-
водительности, простоте и надежности они явно уступают рас-
смотренным выше примерам.
167
ЛИТЕРАТУРА
d’Abbis A., Pantaloni C.f Bechet J.-
J.— Europ. J. Biochem, 1979, 99,
p. 261—272.
Allis C. D., Glover С. V. C, Gorov-
sky M. A.— Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1979, 76, p. 4857—4861.
A logo V. /.— Anal. Biochem., 1979,
99, p. 161—164.
Alwine J. C,t Kemp D. L, Stark
G, R — Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1977, 74, p. 5850—5354.
Amaldi P — Anal. Biochem., 1972, 50,
p. 439—441.
Anderson L. E.f McClure W. 0.—
Anal. Biochem., 1973, 51, p. 173—
179.
Andersson P.t Goldfarb M. P.f Wein-
berg R. A.—Cell, 1979, 16, p. 63—
70.
Auger L. Г, Saunders G. F.— Anal.
Biochem., 1977, 79, p. 338—348.
Bachrach H. L — Anal. Biochem.,
1981, 110, p. 349—354.
Bailey J. M., Davidson H.— Anal. Bio-
chem., 1976, 70, p. 75—85.
Bakayev V. V.t Bakayeva T. G.,
Schmatchenko V. V, Georgiev
G. P.—Europ. J. Biochem., 1978,
91, p. 291—301.
Barger В. O., White F, C.f Pace J. L,
Kemper D. L.> Ragland W. L.—
Anal. Biochem., 1976, 70, p. 327—
335.
Barnes W. M.— Science, 1977, 195,
p. 393—394.
Baumann G., Chrambach A.—Anal.
Biochem., 1976, 70, p. 32—38.
Bean W. J., Sriram Jr. G.t Webster
R. G.—Anal. Biochem., 1980, 102,
p. 228—232.
Bernabeu C., Martinez O., Vazquez D.,
Ballesta J. P. G.—Anal. Biochem.,
1979, 92, p. 203—204.
Bernabeu C.> Sanchez-Madrid F.,
Amils R.— Europ. J. Biochem., 1980,
109, p. 285—290.
Bertolini M. J., Tankersley D. L.>
Schroeder D. D.— Anal. Biochem.,
1976, 71, p. 6—13.
Bhakdi S., Bhakdi-Lehnen B., Bjer-
rum O. J.— Biochim. et biophys. ac-
ta, 1977, 470, p. 35—44.
Bhatnagar Y. M., Bellve A. R.— Anal.
Biochem., 1978, 86, p. 754—760.
Bittner M., Kupferer P., Morris C. F.—
Anai. Biochem., 1980, 102, p. 459—
471.
Blakesley R. W., Boezi J. A.—Anal.
Biochem., 1977, 82, p. 580—582. ,
Blanksteln L. A., Stollar B. D., Frank-
lin S. G., Zweider A., Levy S. B.—
Biochemistry, 1977, 16, p. 4557—
4562.
[Bloom K. S., Anderson J. N.— Anal.
Biochem., 1979, 98, p. 410—416.
Bode H. Л—Anal. Biochem., 1977, 83,
p. 204—210.
Bonner W. M., Laskey R. A.— Europ.
J. Biochem, 1974, 46, p. 83—88.
Bonner W. M., West M. H. P., Sted-
man J. D.— Europ. J. Biochem,
1980, 109, p. 17—23.
Bordier C., Crettol-Jarvinen A.— J.
Biol. Chem, 1979, 254, p. 2565—
2567.
Bostlan K. A, Lee R. C., Halvorson
H. O.— Anal. Biochem, 1979, 95,
p. 174—182.
Both G. W.t Air G. At— Europ. J. Bio-
chem, 1979, 96, p. 363—401.
Boullkas T., Wiseman J. M., Garrard
W. T.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1980, 77, p. 127—131.
Bowen B., Steinberg /, Laemmli U. K,
Weintraub H — Nucl. Acids Res,
1980, 8, p. 1—9.
Bray D., Brownlee S. M — Anal. Bio-
chem, 1973, 55, p. 213-221.
Broadmeadow A. C. C.t Wilce P. A.—
Anal. Biochem, 1979, 100, p. 87—
91.
Brooks K. P.t Sander E. G.— Anal.
Biochem, 1980, 107, p. 182—186.
Brownlee G. G.— In: Laboratory tech-
niques in biochemistry and molecu-
lar biology/Ed. T. S. Work, E. Work.
Amsterdam: North-Holland, 1972, 3,
p. 1-25.
Brownlee G. G.t Cartwright E. AL—
J. Mol. Biol, 1977, 114, p. 93—117.
Brunk C. F, Simpson L.— Anal. Bio-
chem, 1977, 82, p. 455—462.
Buisson M., Reboud A.-M., Reboud У.-
P.—Anal. Biochem, 1976, 75,
p. 656—659.
Burckhardt J., Birnstiel M.-L.— J. Mol.
Biol, 1978, 118, p. 61—78.
Burger W.-C., Schroeder R. L.—Anal.
Biochem, 1976, 71, p. 384—392.
Case S. R, Danehoit B.—Anal. Bio-
chem, 1976, 74, p. 198—206.
Chamberlain J. P.— Anal. Biochem,
1979, 98, p. 132—135.
Chandler P. M.t Rimkus D,, David-
son N.— Anal. Biochem, 1979, 99,
p. 200-206.
Chelm В. R, Geiduschek E. Р,— Nucl.
Acids Res, 1979, 7, p. 1851—1867,
168
Chen C. W., Thotnas С. A.— Anal. Bio-
chem., 1980, 101, p. 339—341.
Chen-Kiang S., Stein S., Udenfriend
S — Anal, Biochem., 1979, 95,
p. 122—126.
Cleveland D. W.f Fischer S, G., Kirsch-
ner M. W., Laemmli U. K — J. Biol.
Chem., 1977, 252, p. 1102—1106.
Condeelis J. S.—Anal. Biochem., 1977,
77, p. 195—207.
Creusot F., Christman J. K.— Anal.
Biochem., 1980, 103, p. 343—349.
D’Alessio V. M., Perna P. J., Paule
M /?.—J. Biol. Chem., 1979, 254,
p. 11282—11287.
De Wachter R., Fiers W,— Meth. En-
zymol., 1971, 21, p. 167—178.
Djondjurov L., Holtzer H — Anal. Bio-
chem., 1979, 94, p. 274—277.
Dodgson J. Strommer L, Engel
/. D.—Cell, 1979, 17, p. 879—887.
Dolja V. V., Negruk И. L> Novikov
V. K., Atabekov J. G.—Anal. Bio-
chem., 1977, 80, p. 502—506.
Drescher D. G., Lee K. S.—Anal. Bio-
chem., 1978, 84, p. 559—569.
Dunker A, K., Rueckert R. R.— J. Biol.
Chem., 1969, 244, p. 5074—5079.
Egyhazi E., Ossoinak A.—Anal. Bio-
chem., 1979, 92, p. 280—289.
Eley M. H.t Burns P, C., Kannapell
С. C., Campbell P. S.— Anal. Bio-
chem., 1979, 92, p. 411—419.
Elgin S. C. R.—Meth. Enzymol., 1975,
40, p. 144—160.
Eng P. R., Parkers С. O.— Anal. Bio-
chem., 1974, 59, p. 323—325.
Erlich H. A., Levinson I. Rt/ Cohen
S. N., McDevitt J.— J. Biol. Chem.,
1979, 254, p. 12240-12247.
Fangman W. Nucl. Acids Res.,
1978, 5, p. 653—666.
Fantoni A., Bozzoni I., Ullu E., Fara-
ce M. G.— Nucl. Acids Res., 1979, 6,
p. 3505—3518.
Fehrnstrom H.t Moberg U.— LKB-Ap-
plication Note, 1977, N 306.
Fernandes P. B., Nardi R. V., Frank-
lin S. G — Anal. Biochem., 1978, 91,
p. 101—114.
Fischer S. G,t Lerman L,
1979, 16, p. 191—200.
Fischer S. G., Lerman L.
Nat. Acad. Sci. USA,
p. 4420—4426.
Flint D. H., Harrington R. E — Bio-
chemistry, 1972, 11, p. 4858—4863.
Floyd G, A., Merrick W. C., Traugh
К A.— Europ. J. Biochem., 1979, 96,
P. 277—286.
S.- Cell,
S.— Proc.
1980, 77
Franklin S. G., Zweidter A.—Nature,
1977, 266, p. 273—275.
Frenkel H. L, Blagrove R, /.— Anal.
Biochem., 1978, 84, p. 583—588.
Furlan M., Perret B. A., Beck E. A.—
Anal. Biochem., 1979, 96, p. 208—
214.
Gabriel O.— Meth. Enzymol., 1971, 22,
p. 578-604.
Gadasi H.f Maruta H.f Collins Z. H.,
Korn E. D.— J. Biol. Chem., 1979,
254, p/3631—3636.
Galibert F., Sedat /., Ziff Е,— J. Mol.
Biol., 1974, 87, p. 377—407.
Garel L-Р., Garber R. L, Siddiqui
M. A. Q.— Biochemistry, 1977, 16,
p. 3618—3624.
Garrard W. T.-FEBS Lett., 1976, 64,
p. 323—^325.
Gezelins G — Anal. Biochem., 1977, 80,
p. 627—634.
Gibson D. R., Cracy R. W.— Anal.
Biochem., 1979, 96, p. 352—354.
Girvitz S. C., Bacchetti S., Rainbow
A. /., Craham F. L.— Anal. Bio-
chem., 1980, 106, p. 492—496.
Goodman D.f Matzura H.— Anal. Bio-
chem., 1971, 42, p. 481—486.
Griffith L P.—Anal. Biochem., 1972,
46, p. 402—412.
Gupta R. C., Randerath K— Nucl.
Acids Res., 1979, 6, p. 3443—3458.
Hagen F. S — Anal. Biochem., 1979,
93, p. 299—305.
Hager D. A., Burgess R, R.— Anal.
Biochem., 1980, 109, p. 71—86.
Hamana K.> Iwai K.—J. Biochem.,
1976, 79, p. 125—132.
Hamilton M. G.— Meth. Enzymol.,
1974, 30, p. 540—545.
Hansen J. N.— Anal. Biochem., 1976,
76, p. 37—44.
Hansen /. N., Phetffer В. H., Boch-
nert J. A.—Anal. Biochem., 1980,
105, p. 192—201.
Hardman D. A., Kane J. P.— Anal.
Biochem., 1980, 105, p. 174—180.
Hearing V. J., Klingler W. G., Ekel
T. M., Montague P. M.—Anal. Bio-
chem., 1976, 72, p. 113—122.
Hegenauer Л, Ripley £., Nace G —
Anal. Biochem., 1977, 78, p. 308—
311.
Helenius A., Simons K — Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1977, 74, p. ‘529-
532.
Helliner C. W., Wunner W. H,— Anal.
Biochem., 1971, 39, p. 333—338.
Herrick G.— Anal. Biochem., 1980, 108,
p. 346—347.
169
Higgins R. C„ Dahrttus M, £.—Anal.
Biochem., 1979, 93, p. 257—260,
Hoffman P. J., Chalkley R.—Anal.
Biochem., 1976, 76, p. 539-546.
Hoffman W. L., Dowben R. M.— Anal.
Biochem., 1978a, 89, p. 414—422.
Hoffman W. L., Dowben R. Af.—Anal.
Biochem., 1978b, 89, p. 540-549.
Holbrook I. B., Leaver A. G.— Anal.
Biochem., 1976, 75, p. 634—636.
Horikawa S., Ogawara //.— Anal. Bio-
chem., 1979, 97, p. 116—119.
Horst M. N., Mahaboob S., Basha M.,
Baumbach G. A., Mansfield E. H.,
Roberts R. M.— Anal. Biochem.,
1980, 102, p. 399—408.
Howard G. A., Traut R. R — FEBS
Lett., 1973, 29, p. 177—180.
Humphries S. E., Young D., Carrol
D.— Biochemistry, 1979, 18,
p. 3223—3231.
Iborra F., Huet L, Breant B., Sente-
пае A., Fromageot P — J. Biol.
Chem., 1979, 254, p. 10920—10924.
Inouye K.— J. Biol. Chem., 1971, 246,
p. 4834—4838.
Jackowski G., Liew С. C.—Anal. Bio-
chem., 1980, 102, p. 321—325.
Jeppesen P. G. N.— Anal. Biochem.,
1974, 56, p. 195-207.
Johnson P. H., Grossman L. /.— Bio-
chemistry, 1977, 16, p. 4217—4225.
Johnson P. H., Miller M. Gross-
man L. /.— Anal. Biochem., 1980,
102, p. 159—162.
Joshi S., Haenni A.-L — FEBS Lett.,
1980, 118, p. 43—46.
Judd W.~ Anal. Biochem., 1979, 93,
p. 373-379.
Kaplan D. A., Russo R., Wilcox G.—
Anal. Biochem., 1977, 78, p. 235—
243.
Kapuscinski /., Yanagi K — Nucl.
Acids Res., 1979, 6, p. 3535—3542.
Kato T., Sasaki M., Kimura S.— Anal.
Biochem., 1975, 66, p. 515—522.
Kazazian H. H., Snyder P. G,f Cheng
T.— Biochem. and Biophys. Res.
Communs, 1974, 59, p. 1053—1061.
Kerckaert J. P.— Anal. Biochem., 1978,
84, p. 354—360.
King L. E., Morrison M — Anal. Bio-
chem., 1976, 71, p. 223—230.
Kiessig D. F., Grodzicker T.~~ Cell,
1979, 17, p. 957-966.
Kramer F. R.t Mills D. R.— Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1978, 75, p. 5334—
5338.
Kubo K., Isemura Г., Takagi T.~~ Anal.
Biochem., 1979, 92, p. 243—247.
Kutateladze 7. W., Axelrod V. D., Cor-
bulev V. G.t Belzhelarskaya S. N.,
Vartikyan R. M.— Anal. Biochem.,
1979, 100, p. 129—135.
Lacks S. A., Springhorn S.— J. Biol.
Chem., 1980, 255, p. 7467—7473.
Laemmli U. /(.— Nature, 1970, 227,
p. 680—685.
Lambin P.— Anal. Biochem., 1978, 85,
p. 114—125.
Lambin P., Fine /. M.— Anal. Bio-
chem., 1979, 98, p. 160—168.
Lane L. C.—Anal. Biochem., 1978, 86,
p. 655—664.
Langridge J., Langridge P., Bergquist
P. L.—Anal. Biochem., 1980, 103,
p. 264—271.
Laskey R. A., Mills A. D.— Europ. J.
Biochem., 1975, 56, p. 335—341.
Leinen J. G., Wittliff J. L.— Anal. Bio-
chem., 1978, 86, p. 279—286.
Levy B., Connor W., Dixon G. H.— J.
Biol. Chem., 1979, 254, p. 609—620.
Lizardi P. M., Engelberg A.—Anal.
Biochem., 1979, 98, p. 116—122.
Lockard R. E., AJzner-Deweerd B.t
. Heckman J, E., MacGee J., Tabor W.,
RajBhandary U. L.— Nucl. Acids
Res., 1978, 5, p. 37—56.
Locker J.— Anal. Biochem., 1979, 98,
p. 358—367.
Lonnerdal B., Laas T.— Anal. Bio-
chem., 1976, 72, p. 527—532.
Lorentz K.—Anal. Biochem., 1976, 76,
p. 214—220.
Lui A. С. P., McBridge В. C., Vovis
G. F., Smith M — Nucl. Acids Res.,
1979, 6, p. 1—16.
Lutter L, C — Nucl. Acids Res., 1979,
6, p. 41—56.
Maat J,t Smith A. /. H.— Nucl. Acids
Res., 1978, 5, p. 4537—4546.
Mahadik S. P., Korenovsky A., Rap-
port M. M—Anal. Biochem., 1976,
76, p. 615-633.
Maizel J. V.—Meth. Virol., 1971, 5,
p. 179-192.
Malhorta L. C., Murthy M. R. V., Cha-
udhary K. D — Anal. Biochem., 1978,
86, p. 363—370.
Marceau N., Blais R., Balaux N.—
Anal. Biochem., 1975, 68, p. 17—25.
Marcinka /(.— Anal. Biochem., 1972,
50, p. 304-308.
Marcu К. B., Valbuena O., Perry
R. P.— Biochemistry, 1978, 17,
p. 1723—1733.
Marusyk R., Sergeant A.—Anal. Bio*
chem., 1980, 105, p. 403—409.
170
Matheka H. D., Enzmann P.-J„ Bach-
rach H. L.f Migl B.— Anal. Biochem.,
1977, 81, p. 9—17.
Maxam A. M., Gilbert W.— Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1977, 74, p. 560—
564.
Maxwell I. H.t Maxwell F.t Hahn
W. E.—Anal. Biochem., 1979, 99,
p. 146—160.
McConkey E. Н,— Anal. Biochem.,
1979, 96, p. 39—44.
McDonell V. W., Simon M. N., Studi-
ёг F. W.— J. Mol. Biol., 1977, HO,
p. 119—146.
McMaster С. К.» Carmichael 6. G —
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74,
p. 4835—4838.
McMaster-Kaye R., Kaye J. S.—Anal.
Biochem., 1974, 61, p.‘ 120—132.
Merril C. R„ Switzen R. C.t Van Keu-
ren M. L — Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1979, 76, p. 4335-4339.
Merril C. R., Dunan M. L., Goldman
D.— Anal. Biochem., 1981, 110,
p. 201—207.
Meis L. Л, Bogorad L.—Anal. Bio-
chem., 1974, 57, p. 200—210.
Mickel S., Arena V., Bauer W.— Nucl.
Acids Res., 1977, 4, p. 1465—1482.
Mills D. R., Kramer F. R,~ Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1979, 76, p. 2232—
2235.
Mirault M.-E., Scherrer K., Hansen L.—
Europ. J. Biochem., 1971, 23, p. 372—
386.
Modak S. P., Beard P,— Nucl. Acids
Res., 1980, 8, p. 2665—2678.
Mokrasch L. C.— Anal. Biochem., 1978,
88, p. 263—270.
Murray K., Murray M—J. Mol. Biol.,
1975, 98, p. 551—564.
Newrock К. M.> Cohen L. H.t Hend-
ricks M. B.t Donnelly R, Л, Wein-
berg E. S.—Cell, 1978, 14, p. 327—
336.
Nielsen T. B., Reynolds J. A.—Meth.
Enzymol., 1978, 48, p. 3—10.
Nikodem V., Fresco J. R.— Anal. Bio-
chem., 1979, 97, p. 382—386.
Nishinaga K., Yamamoto R.— Anal.
Biochem., 1980, 108, p. 185—189.
Noel D., Nikaido K., Ames G. F.-L.—
Biochemistry, 1979, 18, p. 4159—
4166.
Noelken M. E., Wisdom B. J., Hudson
B. G.—Anal. Biochem., 1981, 110,
p. 131—136.
Oakley B. R., Kirsch D. R., Morris
N. R.—Anal. Biochem., 1980, 105,
p. 361-366.
O’Connel P. В. H., Brady С. К—Anal.
Biochem., 1976, 76, p. 63—73^
O’Farrell P. H — J. Biol. Chem., 1975,
250, p. 4007—4021.
Ornstein L., Davis B, J.— Ann. N. Y_
' Arad—Sci.. 19fi4. 121. d. 321-403.
Panyim S., Chalkley R.— Arch.' Bio-
chem. and Biophys., 1969, 130,
p. 337—346.
Panyim S., Thitiopongranich R., Supa-
timusro D.—Anal. Biochem., 1977,
81, p. 320—327.
Paus P. N.— Anal. Biochem., 1971, 42,
p. 372—376.
Peacock A. C., Dingman C. W.— Bio-
chemistry, 1968, 7, p. 668—674.
Peattie D. A.—Proc. Nat. Acad. Sci.
USA, 1979, 76, p. 1760—1764.
Perlman D., Haberman J. A«—Anal.
Biochem., 1977, 83, p. 666—677.
Peters D. L., Dahmus M. E.—Anal.
Biochem., 1979, 93, p. 306—311.
Pirtle R., Kashdan M., Pirtle Du-
dock B.— Nucl. Acids Res., 1980, 8,
p. 805-816.
Polsky F., Edgell M. H., Seidman J. G.,
Leder P.— Anal. Biochem., 1978, 87,
p.’397—410.
Porter W. H., Preston J. L — Anal.
Biochem., 1975, 66, p. 69—77.
Proudfoot N. J., Baralle F. E.— Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,
p. 5435—5439.
Przybyla A. E., MacDonald R. J., Har-
ding J. D., Rider R. L., Rutter
W. Л—J. Biol. Chem., 1979, 254,
p. 2154—2159.
Pusztai A., Watt W. B.— Anal. Bio-
chem., 1973, 54, p. 58—65.
Rabbani A., Goodwin G. H.t Walker
J. M., Brown E., Johns E. W.— FEBS
Lett., 1980, 109, p. 294—298.
Rave N.f Crkvenjakov R.f Boedtker
H.— Nucl. Acids Res., 1979, 6,
p. 3559—3568.
Renaud NL, Dietrich A., Giege R.t Re-
my P.t Ebel Л-P.—Europ. J. Bio-
chem., 1979, 101, p. 475—483.,
Reimolds J. A., Tanford C.— Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 1970, 66, p. 1002—
1007.
Rosemblatt M. S., Margolies M. N.,
Cannon L. E.t Haber E.— Anal. Bio-
chem., 1975, 65, p. 321—330.
Rosenthal A. L„ Lacks S. A.— Anal.
Biochem., 1977, 80, p. 76—90.
Rovera G.t Magarian C., Borun T. W.—
Anal. Biochem., 1978, 85, p. 506—
518.-
Rachel R., Gross Л—Anal. Biochem.
1979, 92,. p. 91—98,
171
Ruchel R., Retief A. E., Richter-Land-
sberg C.— Anal. Biochem., 1978, 90,
p. 451—464.
Sanger F,, Coulson A. R.— FEBS
Lett., 1978, 87, p. 107—112.
Sanger F., Nicken S., Coulson A. R.—
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74,
p. 5463—5467.
Savic A., Poccia D.— Anal. Biochem.,
1978, 88, p. 573—579.
Schetters H., McLeod B.— Anal. Bio-
chem., 1979, 98, p. 329—334.
Schuerch A, R., Mitchell W. R., Jok-
lik W, K~ Anal. Biochem., 1975, 65,
p. 331—345.
Schwinghamer M. W., Shepherd R. J.—
Anal. Biochem., 1980, 103, p. 426—
434.
Serwer A—Biochemistry, 1980, 19,
p. 3001—3004.
Shaaya E.— Anal. Biochem., 1976, 75,
p. 325—328.
Sherton C. C., Wool I. G.— Meth. En-
zymol., 1974, 30, p. 506—526.
Shortess D. K.— Anal. Biochem., 1974,
60, p. 329—331.
Shuster L.— Meth. Enzymol., 1971, 22,
p. 412—433.
Silberklang M.f Gillum A. M., Raj В ha n-
dary U. L.—Nucl. Acids Res., 1977,
4, p. 4091—4108.
Simoncsist A., Brownlee G. G.,
Brown R. S., Rubin J. A, Guil-
ley H.— Nature, 1977, 269, p. 833—
836.
Smith D. E., Searle P. F., Willi-
ams J. G — Nucl. Acids Res., 1979,
6, p. 487—506.
Smith G. E., Summers M. D.— Anal.
Biochem., 1980, 109, p. 123—129.
Sneed M. C., Maynard J. L.— J. Amer.
Chem. Soc., 1922, 44, p. 2942—2948.
Sorimachi K, Condliffe P. G.—Bio-
chem. and Biophys. Res. Communs,
1977, 77, p. 526—532.
Southern E. M.— J. Mol. Biol., 1975,
98, p. 503—517.
Spath P. Koblet H,~ Anal. Bio-
chem., 1979, 93, p. 275—285.
Spiker S.— Anal. Biochem., 1980, 108,
p. 263—265.
Sreekrishna K.f Jones С. E., Guet-
zow K. S., Prasad M. R., Jo-
shi V. C.—Anal. Biochem., 1980,
103, p. 55—57.
Staynov D. Z., Pinder J. C., Crat-
zer W. B.— Nature. New Biol., 1972,
235, p. 108-110.
Steck G., Leuthard A, Bttrk R, A—
Anal. Biochem., 1980, 107, p. 21—
24.
Stein M., Varricchio F.— Anal. Bio-
chem., 1974, 61, p. 112—119.
Stellwag E. J., Dahlberg A. E.— Nucl.
Acids Res., 1980, 8, p. 299—318.
Stephens R. E.— Anal. Biochem., 1975,
65, p. 369—379.
Stoklosa J. T,, Latz H. W,— Biochem.
and Biophys. Res. Communs, 1974,
58, p. 74—79.
Studier F. W.— L Mol. Biol., 1973, 79,
p. 237—248.
Sugden B., DeTroy B., Roberts R. J.,
Sambrook J.— Anal. Biochem., 1975,
68, p. 36—46.
Sun S. M., Hall T. C.— Anal. Biochem.,
1974, 61, p. 237—242.
Swaney J. B., Vande Woude G. F„
Bachrach H. L.— Anal. Biochem.,
1974, 58, p. 337—346.
Tabak H. F„ Flavell R. A.—Nucl.
Acids Res., 1978, 5, p. 2321—2332.
Telford Л, Boseley A, Schaffner W.,
Birnstiel M.— Science, 1977, 195,
p. 391—395.
Thomas P. S.—Proc. Nat Acad. Sci.
USA, 1980, 77, p. 5201—5205.
Thuring R. W. J.f Sanders Л A M.,
Borst A—Anal. Biochem., 1975, 66,
p. 213-220.
JTijssen P,, Kurstak _E.— Anal. Bio-
cFeni., 1979, 9§Гр- 97—104.
Towbin H,, Staehelin T., Gordon J.—
Proc. Mat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,
p. 4350—4354.
Tung J.-S., Knight C. A.—Anal. Bio-
chem., 1972, 48, p. 153—163.
Turner V. S., Hopkinson D. A.— FEBS
Lett., 1979, 105, p. 376—378.
Tuszynski G, P.f Damsky С. H., Fuh-
rer J. A, Warren L,— Anal. Biochem.,
1977, 83, p. 119—129.
Varricchio F., Ernst F. J.— Anal. Bio-
chem., 1975, 68, p. 485—489.
Vogelstein B., Gillespie p.— Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,
p. 615-619.
Wahl G. M„ Stern M.t Stark G. R.-~
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,
p. 3683—3687.
Wallace R. W., Yu P. H., Dieckert J. P.,
Dieckert J. IF.—Anal. Biochem.,
1974, 61, p. 85—92.
Walters /. A. L, I., Bont W. S.—Anal.
Biochem., 1979, 93, p. 41—45.
Ward C. IF.—Anal. Biochem., 1976, 74,
p. 242—245.
Watts J. IF., King J. M,, Sakai F.—
Anal. Biochem., 1977, 79, p. 579—
582.
Weber K, Osborn M.— J. Biol. Chem.,
1969, 244, p. 4406-4412.
172
Weber K-\ Pringle Z. R., Osborn M.~
Meth. Enzymol, 1972» 26, p. 3—27.
Weidekamm E., Wallach D. F. H., Fliic-
kiger R.— Anal. Biochem., 1973, 54,
p. 102—114.
Weliky N., Leaman D. H., Kail-
man B. J.— Anal. Biochem., 1975, 67,
p. 507—514.
Wertz G. W., Davis N. L„ Ed-
gell M. N.— Anal. Biochem., 1980,
106, p. 148—155.
West D. W., Towers G. E.— Anal. Bio-
chem., 1976, 75, p. 58—66.
Wienand U., Schwarz Z., Feix G.—
FEBS Lett, 1979, 98, p. 319—322.
Wieslander L.— Anal. Biochem., 1979,
98, p. 305—309.
Wilson E. M., Spelsberg T. C.-^-Meth.
Enzymol, 1975, 40, p. 171—176.
Winberg G., Hammarskjold M, L.—
Nucl. Acids Res, 1980, 8, p. 253—
264.
Wood T. G., Shaeffer R.— Anal. Bio-
chem, 1975, 63, p. 135—140.
Yaneva M., Mladenova Z, Dessev G.—
Anal. Biochem, 1977, 77, p. 332—
339.
Young Y. P. L, Young R. Z.—Anal.
Biochem, 1974, 58, p. 286—293.
Ziola B. R., Ser aba D. G.— Anal. Bio-
chem, 1976, 72, p. 366—371.
Часть вторая
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Г
ВВЕДЕНИЕ
Современный этап развития молекулярной биологии и биохимии
характеризуется быстрым прогрессом методов исследования и
непрерывным совершенствованием, усложнением и удорожанием
соответствующей аппаратуры. В то же время уровень подготов-
ленности исследователей к использованию в полной мере новых
методических возможностей и новой техники очень часто отстает
от этого прогресса.
Такой разрыв имеет место и для методов фракционирования
и характеристики биополимеров с помощью ультрацентрифуги-
рования, несмотря на то что этот метод нельзя отнести к числу
новых. Непрерывно совершенствуются и усложняются ультра-
центрифуги, быстро растет ассортимент роторов, разнообразие
их геометрических параметров и особенно быстро — максималь-
ные скорости вращения, а вместе с ними и перегрузки материа-
лов роторов и пробирок. Все это выдвигает совершенно новые
требования к условиям эксплуатации ультрацентрифуг, уходу за
роторами и пробирками. Незнание этих требований или прене-
брежение ими в лучшем случае приводит к неудаче опыта, а в
худшем и, к сожалению, нередком — к аварии столь дорогостоя-
щей машины.
В последние годы один за другим были разработаны и успеш-
но используются совершенно новые типы градиентов плотности
взамен традиционных сахарозного и простых цезиевых. Это от-
крыло такие возможности фракционирования, о которых еще
три-четыре года назад не приходилось и мечтать (например,
разделение совершенных и несовершенных гибридных молекул
нуклеиновых кислот или нативных нуклеопротеидов по их плот-
ности). Вместе с тем в силу такого расширения возможностей
обоснованный выбор режима ультрацентрифугирования стано-
вится' все более трудным делом; по мнению некоторых авторите-
тов [Rickwood, 1978], его следует отнести к сфере искусства и
интуиции.
Мы не согласны с такой точкой зрения и предлагаем здесь
достаточно надежные способы предварительного выбора и рас-
чета режима центрифугирования в соответствии с поставленной
задачей. Они могут заменить обычную сегодня практику эмпи-
рического подбора режима путем многочисленных пробных опы-
174
тов или. некритического повторения описанных в литературе, за-
частую Далеко не оптимальных условий эксперимента. Это весь-
ма существенно с точки зрения экономии времени, ценных пре-
паратов й, особенно, расходования весьма ограниченного ресур-
са продолжительности службы ультрацентрифуг и роторов.
В свете‘\изложенного мы приводим ниже все необходимые све-
дения о конструкциях и правилах эксплуатации ультрацентри-
фуги, роторов и пробирок на примере наиболее распространенной
системы «Beckman-Spinco». Далее, опираясь на разбор физиче-
ской сущности различных процессов седиментации при минимуме
общедоступной теории, будут выведены упрощенные зависимо-
сти, позволяющие осуществлять выбор режима зонально-скоро-
стного или равновесного центрифугирования. Для быстроты и
удобства использования часть из них представлена в виде номо-
грамм. Наконец, все, что было в периодической научной литера-
туре до конца 1980 г. интересного в отношении новых типов
Градиентов и новых подходов к использованию ультрацентрифу-
гирования, включено либо в основной текст, либо в иллюстри-
рующие его примеры. Все относящиеся к делу табличные данные
включены в соответствующие разделы изложения.
Глава 1
ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ТЕОРИИ
СЕДИМЕНТАЦИИ
Частица (под которой далее будем понимать и макромоле-
кулу) в пробирке вращающегося ротора испытывает действие
радиально направленной центробежной силы Рд. Как известно из
механики, Fa = M(n2r. Для жидкости с учетом выталкивающей
силы Л1=К(р—рс). Здесь М — действующая масса частицы, г;
со — угловая скорость вращения, рад/с; г—радиус вращения,
см; р и рс—'Плотность соответственно частицы и среды, г/см3;
V— объем частицы, см’. Для сферической частицы диамет-
ром D V^hnD3, тогда ^“‘/«лД’Ср—рс)и2г.
Частица движется вдоль радиуса со скоростью v (см/с), при
этом сила трения действует в обратном направлении: FT=fv.
Здесь f — коэффициент трения, пропорциональный вязкости сре-
ды т]с (в сантипуазах) и линейному размеру частицы. Согласно
закону Стокса, для сферы f=Злт)<Д Скорость частицы под дей-
ствием центробежной силы будет нафастать до тех пор, пока
сила трения не уравновесит центробежную силу (после чего ско-
рость станет постоянной); Fa = F7, или ‘/влР’(р—рс)(вгг=3лт]с1>о
Отсюда
= 1 D* (Р - Рс) ю*г
V 18 »1с
175
где и=2лп/60 = 2лЛг-1000/60. Здесь п — угловая скбрость,
об/мин; N — то же, тыс. об/мин. Тогда, подставляя <a2f= 1,097-
• 104 №, получим
Р2(р —р )№r 1,097 • 104
о = к------------•, где к — —--------.
Пс 19
Из рассмотрения этой зависимости можно сделать следующие
выводы.
1. При одинаковых плотностях частицы большего размера
оседают намного быстрее, чем мелкие (в формулу входит Z)2).
2. Скорость оседания v пропорциональна плотности частицы.
Особенно сильно это проявляется в условиях, когда плотность
среды рс близка к плотности частиц р. Возможна ситуация, когда
мелкие, но более плотные частицы будут оседать быстрее, чем
крупные.
3. Скорость оседания частиц пропорциональна квадрату чис-
ла оборотов ротора.
4. Чем больше вязкость среды г)с, тем медленнее оседают
частицы.
5. Скорость оседания пропорциональна расстоянию частицы
от оси вращения ротора (г). Это расстояние увеличивается по
мере продвижения частицы, поэтому при постоянстве прочих
условий скорость оседания частицы должна непрерывно возра-
стать. Если это нежелательно, следует повышать плотность и
вязкость среды в радиальном направлении, чтобы они компен-
сировали увеличение г; это достигается созданием нарастающего
градиента плотности и вязкости среды.
Плавучая плотность частиц. Плотность частицы обусловлена
не только ее химическим составом и пространственной структу-
рой, но и количеством прочно связанной с ней воды. Эта вода
движется вместе с частицей, значительно уменьшая ее эффек-
тивную плотность. Количество связанной с частицами воды
уменьшается в присутствии высокой концентрации ионов и гид-
рофильных молекул. Они связывают воду, тем самым препят-
ствуя гидратации частиц. С другой стороны, некоторые ионы или
молекулы могут прочно связываться с частицами, увеличивая,
как правйло, их эффективную плотность.
Таким образом, эффективная плотность частиц, определяю-
щая скорость их оседания, сильно зависит от химической при-
роды и концентрации веществ, растворенных в среде, в которой
ведется центрифугирование. Поэтому для данных частиц в дан-
ной среде вводят понятие «плавучей плотности». Ее можно опре-
делить экспериментально, измерив плотность среды, в которой
движение частиц прекращается, как только разность р—рс ста-
новится равной нулю.
Плавучая плотность частиц определенной химической при-
роды может изменяться очень сильно. Например, плавучая плотт
ность ДНК в воде составляет примерно 1,1 г/см3, а в концентри-
176
рованн^м растворе CsCl — около 1,7 г/см3, в то время как соб-
ственна^ плотность ДНК, вычисленная по ее химическому соста-
ву, близка к 2 г/см3. Это позволяет представить, какое количе-
ство воды может прочно связаться (за счет водородных связей)
с ДНК в водном растворе!'
Отметим еще, что как плотность и вязкость среды, так и сте-
пень гидратации частиц (а значит, и их плавучая плотность)
зависят от температуры среды. Наконец, отклонение формы ча-
стиц от сферической также сказывается (правда, не очень силь-
но) на скорости их оседания.
Глава 2
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГА
От технически грамотного осуществления процесса ультра-
центрифугирования (выбор режима будет рассмотрен далее) за-
висит успех эксперимента, а также сохранность и срок службы
дорогостоящей машины, поэтому эксплуатацию центрифуги нель-
зя полностью доверять техническому персоналу: слишком велик
риск ошибки и потери экспериментального материала. Основные
правила эксплуатации ультрацентрифуги, способы контроля, ха-
рактерные особенности и «подводные камни» в постановке экспе-
римента должен знать и проверять сам экспериментатор при
каждом ультрацентрифугировании препарата. Рассмотрим их
на примере наиболее распространенного типа центрифуг «Spin-
со» серии L5 (модели L-75 и L-65—<с водяным охлаждением,
модель L-50 — с воздушным). Для других моделей они анало-
гичны.
ПРИНЦИП действия и расположение
важнейших узлов
Рассмотрим работу важнейших узлов и принцип действия
ультрацентрифуги (рис. 44). Ротор свободно насаживается на
вал электродвигателя. Во избежание трения ротора воздух из
камеры откачивают. Откачивание начинают форвакуумным на-
сосом через полость диффузионного масляного насоса. Если по-
следний не включен, то форвакуумный насос может откачать
воздух из системы до давления 0,1—0,5 мм рт. ст. При этом вся
влага из камеры удаляется, но, конденсируясь, смешивается с
маслом форвакуумного насоса, ухудшая его характеристики, по-
этому масло надо периодически заменять. Включение диффузи-
онного насоса означает подачу электрического напряжения на
его нагреватель (Я). Масло в насосе закипает, и пары его за-
полняют верхнюю полость, сорбируя воздух. Наружная стенка
насоса охлаждается змеевиком с водой. Пары масла конденси-
177
Рис. 44. Расположение основных узлов ультрацентрифуги «Spinco-L5> (см.
текст)
руются и стекают вниз, унося сорбированный воздух. Таким об-
разом достигается разрежение, равное 10_3 мм рт. ст. (или 1 мкм
рт, ст., поскольку шкала указателя вакуума градуирована имен-
но в этих единицах).
Уплотнение камеры ротора обеспечивает кольцевая резино-
вая прокладка (77). Ее прижимает свободно лежащая тяжелая
крышка камеры. Доступ воздуха в камеру после остановки ро-
тора осуществляется автоматическим открыванием клапана
Kt. Воздух проходит через фильтр-осушитель ФР
Электродвигатель также охлаждается змеевиком с водой.
Вода попадает через сменный фильтр Ф2 и клапан Кг- Во избе-
жание перегрева двигателя нормальная подача воды контроли-
руется на выходе автоматическим расходомером АВ («аварий-
ный — вода»). Если расход воды падает ниже 1,4 л/мин, про-
исходит автоматическое отключение центрифуги.
Место ввода вала электродвигателя в вакуумную камеру
уплотнено скользящим подшипником, в который постуает мас-
ло из основного масляного бака. Во избежание засасывания
масла в камеру оно во время работы протекает через подшип-
ник и отсасывается во вспомогательный, герметический масля-
ный бак, полость которого подключена к форвакуумному насо-
су. Нормальный расход масла через подшипник составляет
20 мл/ч. После остановки двигателя и выключения форвакуум-
ного насоса автоматически открывается клапан К», и масло из
вспомогательного бака стекает в основной. Часть масла расхо-
дуется на смазку коробки передач электродвигателя и стекает
в поддон. Это — необратимый расход масла, и допустимое зна-
178
чение ёго составляет около 3 мл/ч. Емкость основного масляно-
го бака\2,3 л. Уровень масла в нем контролируется по выведен-
ному наружу указателю уровня (У). Пополнение бака маслом
ведут че^ез горловину (Г), прикрытую от пыли крышкой. Пре-
кращение\подачи масла в подшипник во время работы приво-
дит к аварии, поэтому с основным масляным баком, кроме
указателя уровня, связано автоматическое устройство аварий-
ного выключения центрифуги при опорожнении бака — AM
(«аварийный — масло»).
Авария неизбежна и в случае превышения допустимой для
данного ротора скорости вращения: ротор разрывается центро-
бежными силами. Это может произойти в результате ошибки
экспериментатора при задании скорости. Специальное аварий-
ное устройство, описанное ниже, защищает центрифугу от та-
кой ошибки. На схеме оно обозначено АС («аварийный — ско-
рость»). На днище каждого ротора наклеено кольцо с череду-
ющимися зеркальными и зачерненными секторами. У разных
роторов число секторов различно. Под дном камеры, вблизи
подшипника вала, располагается лампочка, прикрытая линзой.
Ее свет, отражаясь от чередующихся зеркальных секторов, па-
дает на фотоэлемент и генерирует электрические импульсы, ча-
стота которых обусловлена скоростью вращения ротора и чис-
лом секторов в кольце. Если эта частота превышает установлен-
ный предел, аварийное устройство выключает центрифугу.
Рядом с АС под дном камеры находится приемник инфра-
красного излучения ротора (Т), непрерывно регистрирующий
его температуру. Сверху он прикрыт полиэтиленовой пленкой.
Показания его фиксируются стрелкой прибора — указателя
температуры и (чисто электрическим путем) сопоставляются с
температурой, заданной левым (синим) индикатором этого
прибора. В зависимости от результатов такого сопоставления
включаются либо выключаются системы нагревания и охлаж-
дения камеры (на схеме не показаны). Правый (красный) ин-
дикатор того же прибора в регулировании температуры не уча-
ствует. Он выполняет роль аварийного выключателя центрифу-
ги в том случае, когда, несмотря на регулировку, температура
ротора поднимается выше заданного этим индикатором пре-
дельного значения (например, при неисправности системы
охлаждения или нарушении герметичности в камере).
ПРОВЕРКА ГОТОВНОСТИ ОСНОВНЫХ СИСТЕМ
К ПУСКУ
Масляная система. Проверку уровня масла в основном баке
производят по указателю уровня. Для длительного центрифу-
гирования необходимо рассчитать требуемое количество масла,
исходя из расхода 23 мл/ч. Полный бак может обеспечить в
лучшем случае 100 ч работы. Следует проверить, закрыта ли
горловина бака крышкой.
179
В ходе центрифугирования следует проверять истинный рас-
ход масла по убыли его в основном баке за несколько1 йасов ра-
боты. Этот расход может быть намного выше приведенных пас-
портных данных, особенно после длительной эксплуатации цен-
трифуги, поэтому следует скорректировать расчеты й, если не-
обходимо, дополнить основной бак. Необходимо помнить, что
опорожнение бака приведет к преждевременной остановке цен-
трифуги.
Система подачи воды. Перед каждым длительным центри-
фугированием следует снять и прочистить входной фильтр Фг-
Из-за его засорения расход воды в ходе опыта может умень-
шиться, и автомат АВ выключит центрифугу.
Камера и ротор. Крышка камеры открывается только при
подаче напряжения в сеть (переключатель «Power»). Открыв
крышку, следует убедиться в том, что выполнены перечислен-
ные ниже условия.
1. Лампочка аварийного контроля скорости АС горит и
линза ее чиста.
2. Полиэтиленовая пленка, прикрывающая приемник тепло-
вого излучения (Г), цела и не испачкана. Порванную пленку
необходимо заменить только полиэтиленовой (полиэтилен про-
ницаем для инфракрасного излучения). Пленку и линзу можно
промывать спиртом.
3. Кольцевая прокладка (77) в торце камеры чиста и хоро-
шо смазана.
4. Камера не запотела. В случае необходимости следует
протереть ее чистым полотенцем для защиты форвакуумного
насоса от чрезмерного попадания в него воды.
5. Зеркальные секторы на дне ротора чисты и лишены ца-
рапин (см. ниже; нельзя двигать ротор по столу!).
6. Ротор не запотел (запотевший ротор следует протереть
снаружи).
7. При опускании ротора на место две ведущие шпильки на
торце вала электромотора не попали на две ведомые шпильки
в гнезде ротора; во избежание этого перед установкой ротора
надо заметить положение его шпилек в гнезде. Для «бакет-ро-
торов» после установки их на место следует проверить правиль-
ность и свободу подвески всех бакетов; при установке бакет-ро-
тора нужно держать его за головку, а не за ножку.
Осушитель воздуха в фильтре Фь Силикагель в осушителе
должен быть голубым. Розовый силикагель следует заменить.
Его регенерируют сушкой тонким слоем в печи при 225° в тече-
ние 2 ч.
ПУСК ЦЕНТРИФУГИ
Включение вакуумной системы. Форвакуумный насос вклю-
чают (кнопкой «Vacuum») сразу после закрывания крышки ка-
меры. О включении судят по звуку его работы. Лампочка заго-
рается не сразу, а по достижении вакуума порядка 500 мкм
180
рт. ст. 'Если этого не произойдет по истечении нескольких ми-
нут, надо прервать опыт и проверить исправность насоса и чис-
тоту прокладки камеры. Диффузионный насос включают кноп-
кой «Diff. pump». Лучше всего это сделать, когда форвакуум-
ный насос обеспечит снижение давления до 200 мкм рт. ст.
Необходимо помнить, что диффузионный насос должен рабо-
тать в условиях достаточно .высокого разрежения, иначе пары
масла загораются и насос выходит из строя. Атмосферный воз-
дух не должен попадать в горячий диффузионный насос, поэто-
му воздух в камеру по окончании центрифугирования можно
впускать не раньше, чем через 5 мин после выключения диф-
фузионного насоса. Впуск воздуха (открытие клапана Ki) про-
изводится при выключении форвакуумного насоса (та же кноп-
ка «Vacuum»). Диффузионный насос выключается автоматиче-
ски, как только начнется процесс остановки ротора, «о для лег-
ких роторов и при использовании торможения он может занять
менее 5 мин. Однако воздух нельзя впускать в камеру до исте-
чения этого срока, несмотря на остановку ротора.
Выбор температуры центрифугирования. Ротор с пробирка-
ми целесообразно предварительно выдержать несколько часов
при температуре центрифугирования, поэтому при выборе ре-
жима опыта целесообразно остановиться на температуре в поме-
щении, холодной комнате или холодильнике, где можно пред-
варительно выдержать ротор. Нельзя быстро охлаждать ротор
в морозильнике. Градиент температуры вызывает напряжение
в материале ротора, что может привести к аварии.
Выбранную рабочую температуру задают положением лево-
го (синего) индикатора йа приборе — указателе температуры.
Правый (красный) индикатор лучше сначала отодвинуть по-
дальше от синего, так как в ходе установления температурного
режима .возможны незначительные, постепенно затухающие ко-
лебания температуры. При близком расположении красного ин-
дикатора к синему эти колебания могут вызвать необоснованное
выключение центрифуги. После установления теплового режи-
ма красный индикатор можно придвинуть ближе, если необхо-
димо воспрепятствовать даже небольшому повышению темпе-
ратуры ротора против заданной.
Тонкостенная камера центрифуги охлаждается примерно за
5 мин (защитная броня находится снаружи от системы термо-
регулирования), поэтому предварительное охлаждение камеры
нецелесообразно; к тому же, оно повлечет за собой конденсацию
влаги на стенке во время установки ротора.
Задание частоты («скорости») вращения. Диск задания ча-
стоты вращения следует подводить к выбранному значению
всегда с одной и той же стороны (любой) — это улучшает вос-
производимость регулировки. Указатель частоты допускает
ошибку на 500 об/мин. Точно частоту вращения можно опреде-
лить по счетчику суммарного числа оборотов центрифуги, вос-
пользовавшись секундомером.
181
Задание продолжительности центрифугирования, Для зада-
ния времени центрифугирования, не превышающего/ 30 мин,
диск установки времени следует сначала перевести за отметку
30 мин, а затем вернуть в нужное положение. Для досрочной
остановки центрифуги диск следует повернуть до нулевой от-
метки. Это можно делать в любом направлении вращения. ди-
ска.
Регулирование ускорения и торможения ротора. Рукоятка
«Acceler. rate» регулирует одновременно и скорость разгона
(максимальная скорость достигается вращением рукоятки по
часовой стрелке до упора), и интенсивность торможения ротора.
Последнее возможно только при включенном тормозе (кнопка
«Brake»). Положение рукоятки можно менять в ходе центри-
фугирования. В любом случае тормоз отключается при умень-
шении частоты вращения до 50 об/мин.
Собственно пуск центрифуги. Горящая лампочка «Speed
normal» указывает на правильность подготовки центрифуги к
пуску. Его осуществляют нажатием кнопки «Start/run», кото-
рую надо держать несколько секунд, пока она не засветится.
Окончание работы центрифуги. После полной остановки ро-
тора гаснет лампочка «Speed normal». Теперь можно выклю-
чить охлаждение (кнопка «Refrig.») и, убедившись, что с мо-
мента начала процесса остановки ротора уже прошло 5 мин,
форвакуумный насос (кнопка «Vacuum»). Когда воздух запол-
нит камеру (прекратится шипение), можно отодвинуть крыш-
ку и вынуть ротор. Если центрифугирование вели с охлаждени-
ем, желательно немедленно закрыть камеру и снова включить
форвакуумный насос, давая камере возможность прогреться до
комнатной температуры без образования конденсата на ее
стенках.
Не следует держать камеру открытой во избежание попада-
ния пыли на уплотнительную кольцевую прокладку (П). Ее
следует периодически промывать спиртом и смазывать.
Глава 3
РОТОРЫ И ПРОБИРКИ
УГЛОВЫЕ РОТОРЫ
Угловые роторы (рис. 45) используют для сбора осадков при
дифференциальном центрифугировании и для фракционирова-
ния частиц при равновесном центрифугировании (см. ниже).
Фирма «Beckman» обозначает угловые роторы чйслом, указы-
вающим максимально допустимое число оборотов. Если ротор
изготовлен из титана, после цифры ставится значок «Ti». Иног-
182
гмакс
Рис. 45. Схема углового
ротора (см. текст)
да посДе цифры стой? точка, за которой следует еще одна циф-
ра, обозначающая вариант ротора для одного и того же макси-
мального числа оборотов (50 Ti, 50.2 Ti, 50.3 Ti). Фирма MSE
обозначает свои угловые роторы числом и объемом пробирок.
Ниже рассмотрены более распространенные роторы фирмы
«Beckman». Данные по роторам фирм MSE, «Dupont-Sorvall»,
IEG, «Heraues Christ» можно найти в литературе [Rickwood,
1978].
Ниже перечислены важнейшие параметры углового ротора:
число и объем пробирок; максимально допустимое число оборо-
тов (для жидкости с плотностью psg
^1,2 г/см’); минимальное и максималь-
ное расстояние концов пробирки от оси
вращения (гмиа, гиакс); угол наклона про-
бирок а. Иногда указывают максималь-
ное относительное центробежное ускоре-
ние (в единицах g — ускорения свобод-
ного падения); его принято вычислять
ДЛЯ Г макс*
Многочисленные угловые роторы
фирмы «Beckman» можно разбить на
следующие группы.
1. Высокоскоростные роторы (ско-
рость вращения — 50—80 тыс. об/мин) с
узкими и длинными пробирками (16Х
Х76 мм) объемом 13,5 мл; угол а со-
ставляет 23,5—26°. К ним относятся сле-
дующие роторы: 50Ti, 65, 70.1Ti, 75Ti и
80Ti. Все они имеют гмвв в интервале 3,7—
3,9 см и гмако около 8 см и используются для быстрого осаждения
малых частиц (узкие пробирки) или для равновесного ультра-
центрифугирования. Кстати, по своей геометрии ротор 50Ti точ-
но совпадает с широко использовавшимся недавно ротором 40.
2. Высокоскоростные роторы с пробирками относительно
большого объема. Роторы 42.1, 50.2 Ti, 55.2 Ti, 60 Ti и 70 Ti име-
ют пробирки объемом по 38,5 мл, роторы 35 и 45 Ti — по 94 мл.
Угол а для большинства этих роторов лежит в интервале 23—
25°, а у ротора 42.1 а=30°. Значения гМакс, естественно, больше,
чем у роторов предыдущей группы (9—10,4 см), тогда как зна-
чения гивв такие же, как в группе 1 (3,5—3,9 см). Дальше обыч-
ного отстоят от оси вращения пробирки ротора 50.2 Ti, несуще-
го 12 пробирок объемом по 38,5 мл (гмив=5,3 см, гиакс= 10,8 см).
Роторы этой группы, помимо осаждения частиц из разбавлен-
ных суспензий, могут также быть использованы для равновес-
ного ультрацентрифугирования.
3. Роторы общего назначения из алюминия (19, 21, 30, 40
и 50) для широкого диапазона умеренных скоростей вращения
(19—50 тыс. об/мин), чему соответствует широкий набор объе-
мов пробирок (10—250 мл).
183
4. Роторы с малым углом наклона пробирок (14—20е), удоб-
ные для флотации липидов (30.2, 40.3 и 50.3).
5.. Ротор 40.2 с необычно большим углом наклона (40°). Его
следует предпочесть для осаждения частиц, плохо удерживаю-
щихся на стенке, так как в нем слабее выражена конвекция
жидкости.
В последнее время начали появляться роторы необычной
конструкции, например ротор 25 на 100 пробирок по 1 мл, рас-
положенных в три ряда, или ротор LP-42T1 на 72 микропробир-
ки по 0,175 мл.
На днище любого из роторов вокруг посадочного гнезда рас-
полагается разделенное на зеркальные и зачерненные секторы
кольцо. Как уже указывалось, оно используется для аварийно-
го выключения центрифуги в случае превышения допустимой
для данного ротора скорости вращения. Кольцо удерживается
липким составом. При повреждении его можно снять и заме-
нить запасным, согласно инструкции фирмы. Замену кольца на
другое, с большим числом секторов, следует произвести и после
исчерпания ротором его первоначального ресурса работы, ког-
да в силу усталости материала максимально допустимую ско-
рость вращения следует снизить на 10%.
Крышки роторов снабжены уплотнительными резиновыми
кольцами, которые смазывают и туго зажимают. Это необхо-
димо для обеспечения герметичности внутренней полости рото-
ра (отделения ее от камеры).
в миллиметрах
25,4x89
38,1X102
Размеры:
в дюймах
1Х31/2
11/2x4
Объем, мл
38,5
94,0
Пробирки для угловых роторов
Для угловых роторов в основном применяют пробирки че-
тырех размеров (наружных):
Размеры: №
н _ Объем» л
в миллиметрах в дюймах
2,7X63,5 1/2x21/2 6,5
6x76,2 5/8 x 3 13,5
В качестве материала для изготовления пробирок исполь-
зуют нитроцеллюлозу, полиалломер (сополимер этилена и
пропилена) и поликарбонат. Полиалломерные пробирки всех
указанных размеров выпускаются в двух вариантах: тонкостен-
ные и толстостенные. Последние можно использовать без кры-
шек. Нитроцеллюлозные толстостенные пробирки выпускаются
только для объема 6,5 мл. Поликарбонатные пробирки изготов-
ляют только толстостенными. Для всех размеров производятся,
но употребляются редко, пробирки из нержавеющей стали.
Фирма MSE использует для изготовления пробирок поликарбо-
нат и полипропилен.
Нитроцеллюлозные пробирки прозрачны, удобны для на-
блюдения зон после равновесного центрифугирования, а также
184
для сбора материала путем прокалывания пробирки со дна или
сбоку, непосредственно под зоной. Однако они непрочны и не
выдерживают больших нагрузок, поэтому нитроцеллюлозные
пробирки объемом 38,5 мл нельзя использовать в высокоскоро-
стных роторах, отнесенных выше к группе 2, если предполага-
ется работать при скоростях вращения, близких к максималь-
ным. Отметим попутно, что нитроцеллюлоза сорбирует нуклеи-
новые кислоты, что особенно опасно для разбавленных раство-
ров. С этим можно бороться добавлением балластных нуклеи-
новых кислот или внесением в среду для центрифугирования
саркозила либо додецилсульфата натрия (ДДС-Na). Сорбция
нуклеиновых кислот резко ослабляется после вымачивгуяия про-
бирок в течение суток в 0,1 М ЭДТА. По-видимому, в -процессе
сорбции участвуют ионы тяжелых металлов из материала про-
бирок.
Толстостенные поликарбонатные пробирки тоже прозрачны,
но для прокалывания непригодны. Как и нитроцеллюлозные,
они не выдерживают автоклавирования, поэтому в случае не-
обходимости их стерилизуют ультрафиолетовым облучением.
Наиболее удобные полиалломерные пробирки полупрозрачны,
причем тонкостенные можно прокалывать. Их можно автокла-
вировать, но не более одного раза. Пробирки из нержавеющей
стали нельзя заполнять полностью (ввиду их большой массы),
если предполагается работать на максимальных оборотах ро-
тора.
Пробирки любого типа можно использовать для центрифуги-
рования водно-солевых растворов, в том числе для градиентов
солей цезия, KI, Nal, а также сахарозы, глицерина, метризами-
да, фиколла и перколла (см. главу 5). Вместе с тем следует про-
являть осторожность при выборе материала пробирок для цен-
трифугирования кислот, щелочей и органических растворите-
лей. Так, поликарбонат не выдерживает контакта с этими ве-
ществами, а в нитроцеллюлозных пробирках можно использо-
вать из органических растворителей лишь толуол и хлороформ.
Полиалломерные и полипропиленовые пробирки устойчивы к
действию 10%-ных растворов щелочей, 50%-ной СН3СООН,
ТХУ, этанола, метанола, изопропанола, диметилформамида и
диметилсульфоксида, однако и их нельзя использовать для цен-
трифугирования суспензий, содержащих фенол, толуол, хлоро-
форм, ацетон или диоксан. Для этого пригодны лишь полиэти-
леновые пробирки и стаканы с завинчивающимися крышками,
которыми комплектуются низкоскоростные центрифуги. Впро-
чем, и полиэтилен плохо выдерживает контакт с хлороформом;
в этом случае, кроме стекла, пригодна только нитроцеллюлоза.
Отметим также, что водные растворы гуанидинтиоцианата раз-
рушают поликарбонатные пробирки, но безвредны для поли-
пропиленовых.
Тонкостенные пробирки обязательно, а толстостенные —
в большинстве случаев закрывают уплотнительными крышка-
185
Рис. 46. Пробирка для
углового ротора с крыш-
кой (см. текст)
ми. Они имеют двоякое назначение: пре-
пятствуют деформации тонкостенных
пробирок под действием центробежных
сил и обеспечивают, в дополнение к про-
кладке крышки ротора, защиту центри-
фугируемой жидкости от воздействия на
нее вакуума камеры. Типичная конструк-
ция крышки показана на рис. 46 (в раз-
резе) .
Внутрь пробирки свободно входит
втулка (/), на которой лежит уплотни-
тельное резиновое кольцо (2). В сво-
бодном (несжатом) состоянии оно так-
же свободно входит внутрь пробирки. На
выступающий вверх стержень втулки на-
девается колпачок (3), облегающий про-
бирку снаружи. Колпачок удерживается
на втулке гайкой (4), навинчивающейся
на стержень втулки. Отсюда следует не-
допустимость полного свинчивания гай-
ки со стержня, когда втулка находится
внутри пробирки, поскольку это приведет
к падению втулки в пробирку. Первона-
чально, в момент надевания крышки на пробирку, гайка ослаб-
лена и несжатая резинка входит внутрь пробирки. Очень важно
убедиться, что это действительно произошло, т. е. пробирка упер-
лась в колпачок. Затем гайку завинчивают, и втулка подтяги-
вается к колпачку. Резиновое кольцо сдавливается, диаметр его
увеличивается, оно плотно прижимается к внутренней поверх-
ности края пробирки, обеспечивая герметичность. Тонкость
этой, на первый взгляд простой, операции заключается в том,
что при завинчивании гайки втулка механически ничем не удер-
живается от проворачивания. Ему препятствуют только силы
трения втулки об резинку и резинки о стенку пробирки, поэто-
му резинка, втулка и верхняя часть пробирки обязательно дол-
жны быть сухими. Нельзя не только смазывать резинку, но и
допускать проникновения жидкости к верхнему краю пробирки,
поэтому заливать жидкость в пробирку следует так, чтобы она
не смачивала ее края; если же это случилось, их надо проте-
реть. Кроме того, пробирку следует заливать только до уровня
нижнего края втулки, иначе при установке втулки
поднимется по зазору между втулкой и пробиркой и смочит ре-
зинку и край пробирки.
Если все трущиеся поверхности остались сухими, гайка лег-
ко затягивается «до упора», обеспечивая уплотнение. Чтобы
вращающий момент от гайки ко втулке был минимальным, на-
резку на стержне втулки следует каждый раз слегка смазывать
специальной смазкой «Spincot» или любой другой густой смаз-
кой. Монтаж крышек выполняют до уравновешивания проби-
186
жидкость
рок. Затем пробирку следует заполнить жидкостью дополна
(для тонкостенных пробирок это совершенно обязательно). Ес-
ли препарата не хватает, то наслаивают масло. Для оконча-
тельного заполнения внутри стержня втулки имеется канал, ку-
да вводят длинную иглу шприца; из него дополняют пробирку
до появления жидкости в канале, после чего небольшое количе-
ство ее отсасывают обратно, чтобы оставить место для установ-
ки уплотнительного винта. Герметизацию канала обеспечивают
ввинчиванием в него уплотнительного винта с коническим кон-
цом (5). Этот винт упирается в нейлоновую прокладку, вмон-
тированную в нижнюю часть канала стержня втулки. Ввинчи-
вать винт рекомендуется только специальным шестигранным
ключом. Уравновешивать пробирки следует до установки
уплотнительного винта, с помощью того же шприца. При этом
винт кладут на чашку весом вместе с пробиркой. Не следует за-
бывать о чистоте иглы шприца и уплотнительного винта.
Очень важно быть максимально внимательным к выбору
крышек. Даже для пробирок одинакового объема фирма изго-
товляет крышки нескольких типов, существенно отличающиеся
друг от друга, хотя нередко похожие внешне. Во-первых, нель-
зя использовать для тонкостенных пробирок крышки, предна-
значенные для толстостенных. На первый взгляд, это может по-
казаться возможным, так как колпачки у этих крышек одина-
кового размера (соответственно одинаковому наружному диа-
метру пробирок). Однако диаметры уплотнительных резинок
разные, и в случае ошибки уплотнить пробирку не удастся. Во-
вторых, следует иметь в виду, что крышки одинакового разме-
ра могут быть изготовлены из разных материалов (алюминия,
стали или титана) и, следовательно, существенно отличаться
друг от друга по массе. Разумеется, можно уравновесить в це-
лом две пробирки с крышками разной массы, но это означает,
что одна из пробирок будет заполнена не до конца. Иногда
подбор крышек облегчается их окраской (путем анодирования)
в красный или синий цвет. Усиленной конструкции красные
алюминиевые крышки для пробирок используют в роторах с
красными крышками — высокоскоростных роторах типа 2 с
пробирками большого объема (см. выше).
Во всяком случае, до начала заполнения пробирок надо
тщательно подобрать крышки, убедиться в их идентичности,
комплектности и надежности уплотнения на пустых пробирках.
В ходе эксперимента этим заниматься уже некогда. Не следует
смешивать втулки, резинки и колпачки от крышек разного ти-
па. Крышки после работы необходимо разобрать, промыть и
просушить, затем вновь собрать и хранить в собранном виде.
Уход за роторами и пробирками
Для роторов чрезвычайно опасна коррозия. После работы
их надо тщательно сполоснуть теплой дистиллированной водой,
вытереть, в том числе и внутри гнезд, марлевым тампоном на
187
палочке, и подсушить фэном. Не следует оставлять их сохнуть.
Если центрифугировали концентрированные солевые растворы
или другие активные жидкости, то роторы следует предвари-
тельно промыть мягким детергентом, но не вымачивать в нем.
Большинство лабораторных детергентов — щелочные, поэтому
они непригодны для мытья роторов, особенно алюминиевых.
Детергент должен быть нейтральным.
Наружную поверхность ротора следует оберегать от ударов
и царапин. Особенно тщательно нужно следить за чистотой и
отсутствием царапин на зеркальном секторном кольце ограни-
чения скорости вращения. Царапины на зеркальных секторах
могут способствовать генерированию дополнительных импуль-
сов в аварийном устройстве ограничения максимальной скоро-
сти, так что центрифуга будет выключаться, не достигнув мак-
симально допустимого числа оборотов. В старых моделях рото-
ров секторное кольцо не утоплено в основание ротора, поэтому
их ни в коем случае нельзя двигать по столу и ставить на шеро-
ховатую или грязную поверхность.
Гнезда ротора внутри (и пробирки снаружи) при установке
пробирок должны быть совершенно сухими, поэтому необходи-
мо следить за образованием конденсата. Пленка жидкости
между поверхностью гнезда ротора и пробиркой опасна не
только как причина коррозии: в ходе центрифугирования эта
пленка сползает на дно гнезда, и пробирку «присасывает», при-
чем вынуть ее бывает нелегко.
Малейшие выбоины, трещинки и царапины на поверхности
ротора и особенно внутри гнезд при колоссальных рабочих на-
грузках приведут к локальному концентрированию напряжения
в материале, развитию трещин и в конечном итоге могут стать
причиной разрыва ротора, поэтому тщательное обращение с
ротором и регулярный осмотр являются обязательными усло-
виями его эксплуатации.
Уплотнительные резинки следует'регулярно промывать спир-
том и смазывать тонким слоем вакуумной смазки. Чрезмерная
смазка, особенно резинки большого размера, вредна, как и
слишком сильная затяжка крышки, ведущая к некоторому ее
прогибу и освобождению резинки. Известны случаи, когда
вследствие этих двух ошибок наружную резинку разрывало
центробежными силами.
Пробирки надо каждый раз внимательно осматривать, что-
бы выявить трещины на дне пробирки или вдоль образующей
цилиндрической ее части. Колпачок и втулку крышки следует
проверять на отсутствие выбоин, трещин и эллиптичности. Осо-
бое внимание следует обратить на место перехода втулки в
нарезной стержень. Надежность упора конуса уплотнительного
винта следует проверить при сборке крышки.
Выбор и установка крышек, уравновешивание и герметиза-
ция пробирок описаны выше. Можно добавить, что уравнове-
шивание следует производить с точностью, по крайней мере,
188
+ 0,1 г, поэтому предварительно следует проверить чувстви-
тельность весов.
Если одна из пробирок «холостая», т. е. служит только для
уравновешивания, то ее следует заполнять жидкостью такой же
плотности, как и в рабочей пробирке. Нередко заполнение ра-
бочей пробирки бывает двухслойным. Например, на слой кон-
центрированного раствора CsCl, занимающий иной раз лишь
половину пробирки, наливают минеральное масло (см. ниже).
В этом случае холостую пробирку следует заполнять точно так
же для обеспечения одинакового положения центров тяжести
в обеих пробирках. Нарушение этого требования приводит к
вибрации ротора.
Отметим, что затяжка крышки пробирки до упора, т. е. до
тех пор, когда она не проворачивается на пробирке, не должна
требовать большого усилия. Если крышка не «схватывается»
пробиркой, следует проверить правильность выбора крышки,
целость ее резинки, отсутствие влаги на поверхности пробир-
ки у ее верхнего края, смазку стержня и неповрежденность
его нарезки. Крышки красного цвета, особо нагружаемые при
центрифугировании на максимальных оборотах, следует затя-
гивать специальным, тарированным по усилию ключом. Герме-
тичность пробирки после установки уплотнительного винта
можно проверить, сжимая тонкостенную пробирку в руке.
Вынимать пробирку из ротора после окончания центрифуги-
рования следует только с помощью специального приспособле-
ния, ввинчивающегося в стержень втулки. Целесообразно сна-
чала слегка провернуть пробирку в гнезде, чтобы убедиться в
отсутствии «присасывания» или таким образом избавиться от
него, а уже затем вытягивать пробирку. Нельзя пользоваться
для извлечения пробирок гаечным ключом, плоскогубцами и
другими «подсобными» средствами, повреждающими гайку,
крышку и края гнезда ротора.
Мыть пробирки и крышки следует в разобранном виде 1%-
ным раствором нейтрального детергента, горячей и дистилли-
рованной водой.
РОТОРЫ СО СВОБОДНО ПОДВЕШЕННЫМИ
ПРОБИРКАМИ (БАКЕТ-РОТОРЫ)
Эти роторы несут три или шесть пробирок, устанавливаемых
в свободно подвешенные металлические гильзы — «бакеты» (от
английского «bucket» — «.ведро»). Первоначальная свободная
подвеска служит только для фиксации исходного положения
бакетов. Уже при малой частоте вращения ротора бакеты по-
ворачиваются горизонтально, их упругая начальная подвеска
слегка деформируется, и они опираются на тело ротора своими
специальными мощными поясками-выступами. Контакт осуще-
ствляется по участку сферической поверхности.
Пробирки в бакеты устанавливают свободно, причем так,
чтобы край пробирки выступал из гнезда на 3 мм. Это позволя-
189
ет легко вынимать пробирки пинцетом. Завинчивающиеся ме-
таллические колпачки герметизируют не пробирку, а всю внут-
реннюю полость каждого бакета. Уплотнение обеспечивается
плоской резиновой прокладкой. Следует каждый раз проверять
ее .наличие и чистоту и слегка смазывать вакуумной смазкой.
Все бакеты данного ротора имеют одинаковую массу, поэто-
му можно уравновешивать только пробирки. Однако необходи-
мо убедиться, что гнезда бакета внутри сухие и чистые. В трех-
позиционных бакет-роторах все три пробирки должны иметь
одинаковый вес, а в шестипозиционных можно уравновешивать
пробирки попарно, но все же желательно, чтобы вес всех про-
бирок был примерно одинаков. Последнее, впрочем, необяза-
тельно. Можно использовать шестипозиционный бакет-ротор
для центрифугирования только двух, трех или четырех проби-
рок, но не при скоростях вращения, близких к максимальной.
Подвешивать бакеты следует только на «свои» места, в со-
ответствии с выбитыми на них и на гнездах ротора номерами.
В трехпозиционных бакет-роторах для первоначальной подвес-
ки используют ввинчивающуюся в тело ротора ось, проходя-
щую через «ушки» бакета. Если на силовом пояске бакета име-
ется плоский участок, он обязательно должен быть обращен
внутрь, к оси ротора. В шестипозиционных бакет-роторах под-
веска осуществляется с помощью крючков, а иногда путем уста-
новки бакета в сферическое гнездо тремя последовательными
движениями: снизу вверх, кнаружи и вниз. В любом случае эк-
спериментатор обязан предварительно разобраться в системе
подвески пустых бакетов в данном роторе и натренироваться в
ее осуществлении. Правильно подвешенный бакет, независимо
от системы, должен висеть вертикально и легко покачиваться
в радиальном направлении по отношению к оси ротора. Невер-
но подвешенный бакет неизбежно явится причиной аварии цен-
трифуги.
Переносить бакет-роторы и опускать их в камеру центрифу-
ги следует, держа их за головку, а не за ножку, так как в по-
следнем случае можно незаметно нарушить подвеску бакетов.
Хотя на пробирку в. бакет-роторе и не действует поперечно
направленная центробежная сила, заполнять тонкостенную про-
бирку надо до уровня, отстоящего от ее края не более чем на
3 мм — в противном случае она сомнется. Если объем центри-
фугируемой жидкости недостаточен, следует дополнить его ва-
зелиновым, парафиновым или минеральным маслом. Толсто-
стенную пробирку можно заполнять не полностью. Пробирки
снаружи и бакеты внутри обязательно должны быть сухими,
иначе пробирки, особенно нитроцеллюлозные, могут лопнуть.
Все сказанное выше о необходимости чистоты и бережного
обращения с угловыми роторами справедливо и для бакет-ро-
торов, бакетов, элементов их подвески и секторного кольца на
днище ротора. Аналогичны и требования к выбору материала
пробирок.
190
В наименованиях бакет-роторов фирмы «Beckman» перед
цифрами, имеющими такой же, как для угловых роторов, смысл,
стоят буквы «SW» (от английского «swing» — «качаться»). Эти
роторы можно разбить на три группы:
1 Высокоскоростные роторы с пробирками объемом 4;4 и
5 мл (SW 50.1, SW 55 Ti, SW 60 Ti и SW 65 Ti). Они удобны для
равновесного и зонально-скоростного центрифугирования, где
не требуется особенно хорошее разрешение.
2. Роторы для умеренных скоростей вращения, но с относи-
тельно длинными пробирками объемом от 13,2 до 17 мл. Они
особенно удобны для разделения близких по массе частиц ме-
тодом зонально-скоростного центрифугирования в градиенте
плотности сахарозы. К этой группе относятся роторы SW 28.1
(SW 27.1), SW 40 Ti и SW 41 Ti.
3. Роторы для невысоких скоростей вращения с пробирка-
ми большого объема — SW 25.1 с тремя пробирками по 34 мл,
SW 25.2 (3X60 мл) и SW 28 (SW 27; 6X38,5 мл).
Подробнее геометрия бакет-роторов будет рассмотрена в.
главе 5, посвященной зонально-скоростному центрифугирова-
нию.
РОТОРЫ С ВЕРТИКАЛЬНЫМИ ПРОБИРКАМИ
Особое применение находят роторы с пробирками, ориенти-
рованными вертикально в течение всего процесса центрифуги-
рования. Достоинства вертикального расположения пробирок
и возможности таких роторов будут рассмотрены ниже. Здесь
лишь укажем, что роторы этого типа выпускают все три веду-
щие фирмы: «Beckman», MSE и «Dupont-Sorvall».
Фирма «Beckman» производит роторы с вертикальными
пробирками четырех типов: VAI-26, VTi-50, VTi-65 и VTi-80.
Буквой V обозначен ротор с вертикальными пробирками; далее
указаны материал ротора и максимально допустимая частота
вращения (в тысячах об/мин). Два первых ротора несут по во-
семь пробирок объемом 39 мл каждая, два последних — по во-
семь пробирок объемом 5,1 мл.
МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМАЯ ЧАСТОТА
ВРАЩЕНИЯ РОТОРА
Эта величина обозначена в маркировке каждого ротора,
однако возможны три случая, относящиеся к роторам любого
типа, когда работать при такой частоте нельзя.
Случай 1. Исчерпание первоначального ресурса длитель-
ности работы ротора. Для алюминиевых роторов он составляет
2500 ч, для титановых — 10000 ч. К этому времени из-за чере-
дующихся расширения под действием центробежных сил. и по-
следующего сжатия развивается «усталость» материала и сни-
жается его прочность. После указанного срока максимально
191
допустимую частоту вращения следует снизить на 10%. Для га,
рантии от аварии желательно сменить секторное кольцо огра-
ничения скорости на днище ротора (согласно инструкции фир-
мы).
Случай 2. Использование утяжеленных пробирок (сталь-
ных или с адаптером) или заполнение пробирок жидкостью,
плотность которой превышает 1,2 г/см3 (CsCl, Cs2SO4, KI и др.).
В этом случае максимально допустимую скорость вращения
(Л^акс) надо снизить пропорционально квадратному корню из
отношения плотностей:
Ломакс (р)^)ДЬ?-Л^.
Здесь Л/Макс(р) обозначает максимально допустимое число
оборотов в минуту для случая, когда пробирки целиком запол-
нены жидкостью плотностью р. Легко подсчитать, например,
что для раствора CsCl с исходной плотностью р=1,7 г/см3
максимальную частоту вращения необходимо снизить на 20%.
Случай 3. Опасность кристаллизации соли у дна пробир-
ки. По мере формирования градиента, например, при равновес-
ном центрифугировании в концентрированном растворе CsCl
(см. ниже), плотность раствора и концентрация соли у дна про-
бирки возрастают и могут достигнуть значений, соответствую-
щих насыщению раствора (р=1,91 г/см3), т. е. начнется выпа-
дение кристаллов соли. Плотность их высока (для CsCl она со-
ставляет 4 г/см3), и развивается очень большое локальное дав-
ление на дно пробирки, а через него — и на гнездо ротора. Это
давление может разрушить пробирку и привести к аварии ро-
тора.
Выпадение соли в осадок зависит от ее исходной концентра-
ции, а также от геометрии ротора, степени заполнения проби-
рок и температуры. Все эти параметры определяют крутизну
градиента плотности и, следовательно, концентрацию раствора
у дна пробирки. В главе 6, посвященной равновесному центри-
фугированию, даны методы расчета крутизны. Кроме того, в
описании роторов фирмы «Beckman» приводятся графики для
определения максимально допустимого числа оборотов в зави-
симости от всех указанных параметров. Например, из графи-
ков для ротора SW 50.1 можно найти, что при 100%-ном запол-
нении пробирок раствором CsCl с начальной плотностью р =
= 1,7 г/см3 из-за опасности кристаллизации максимальную ча-
стоту вращения при 20° следует снизить с 50 до 31,5 тыс. об/
/мин, а при 0° — до 25 тыс. об/мин.
Следует также помнить и об опасности замерзания жидко-
сти в пробирках в случае неверной установки системы охлаж-
дения. Замерзание жидкости может привести к аварии ротора
при любой скорости вращения подобно тому, как лопаются во-
допроводные трубы, когда в них замерзает вода.
192
ЗОНАЛЬНЫЕ РОТОРЫ
По характеру проходящих в них процессов седиментации ро-
торы этого типа сходны с бакет-роторами. Роль пробирок здесь
выполняют четыре сектора, образуемые вставной крестовиной
из норила — химически очень инертного, но довольно мягкого ч
материала. Крестовина обеспечивает вращение жидкости вме-
сте с ротором и возникновение центробежной силы. Направле-
ние оседания частиц — к периферии ротора по всей высоте его
объемистой полости. Массивная крышка ротора навинчивается
на его корпус, прижимая установленное в канавке уплотняющее
резиновое кольцо. Внутри лопастей крестовины проходят кана-
лы, соединяющие центральную и периферическую области ро-
тора с переходным устройством, расположенным в верхней ча-
сти ротора (рис. 47). Назначение переходного устройства —
обеспечить возможность заполнения и опорожнения ротора «на
ходу», т. е. при вращении его на малых оборотах (2—3 тыс.
об/мин). Это необходимо для создания первоначального гради-
Рис. 47. Схема зонально-
го ротора ТМ4 с пере-t
ходным устройством (см.1
текст)
Справа — расположение ло-
паток в роторе
Рис. 48. Последователь-
ность операций при ис-
пользовании зонального
ротора (см. текст)
7 Л. Д. Остерман
193
ента плотности среды в роторе и его сохранения в процессе от-
бора фракций. Плотность среды нарастает от центра ротора к
периферии, причем такая закономерность сохраняется с начала
и до конца опыта благодаря действию центробежной силы.
Переходное устройство образовано сочетанием верхней ча-
сти крестовины и съемного узла — переходника («seal assemb-
ly»). В верхней части крестовины имеются центральное отвер-
стие, соединенное коротким каналом с центральной областью
ротора, и кольцевая канавка, от которой внутри лопастей идут
каналы к периферии ротора. Для удобства сочленения с пере-
ходником крестовина заканчивается конусом.
Переходник представляет собой единое, заранее смонтиро-
ванное устройство, которое на ходу можно вдвинуть в отверстие
крышки ротора и плотно посадить на конус крестовины. Не
весь переходник при этом начинает вращаться. В его конструк-
ции есть вращающаяся часть, которая сцепляется (благодаря
силе трения) с ротором, и неподвижная, на которой укреплены
трубки отвода жидкости. Механическая связь между этими дву-
мя частями осуществляется через шарикоподшипник, гидравли-
ческая — через хорошо притертые и прижатые пружиной торцы
двух цилиндров. Верхний, неподвижный цилиндр —• стальной.
Нижний, вращающийся, изготовлен из «рулона» — тефлона,
наполненного тонким абразивом («jeweller’s rouge»), обеспе-
чивающим его самополировку.
В верхнем цилиндре закреплены четыре трубки. Централь-
ная трубка входит в центральный канал верхнего цилиндра,
совпадающий с таким же каналом нижнего; продолжением по-
следнего является отверстие в крестовине, ведущее к централь-
ной- области ротора. Одна из боковых трубок (более длинная)
выходит в кольцевую канавку на торце верхнего цилиндра. Эта
канавка совпадает с точно такой же, выполненной в верхнем
торце вращающегося цилиндра. Из этой последней через вер-
тикальные каналы в теле цилиндра и затем снова через пару
совмещенных канавок жидкость поступает в крестовину и да-
лее к периферии полости ротора. Остальные две трубки верх-
него цилиндра служат для подачи и отвода охлаждающей во-
ды. Разумеется,- описанные системы циркуляции жидкости всю-
ду (кроме непосредственно трущихся поверхностей стали и ру-
лона) разделяются между собой уплотнительными резиновыми
кольцами.
Переходник с помощью байонетного зажима (подобного то-
му, которым присоединяется пожарный шланг) легко устанав-
ливается на неподвижную, специально смонтированную в каме-
ре центрифуги пластину из плексигласа. Она выполняет и за-
щитные функции, поскольку установка переходника и его сня-
тие, а также заполнение и опорожнение системы происходят во
время вращения ротора.
После заполнения ротора и снятия переходника в отверстие
ротора ( также на ходу) вставляют уплотнительную пробку.
194
Внутри пробки тоже есть шарикоподшипник, так что эта опе-
рация не представляет опасности для руки оператора. Затем
крышку камеры центрифуги закрывают и частоту вращения
ротора увеличивают до нужного значения, предварительно от-
качав воздух из камеры, как описано выше. По окончании рас-
четного времени центрифугирований частоту вращения снижа-
ют до 2000 об/мин, впускают воздух в камеру, вынимают проб-
ку из ротора, вновь устанавливают переходник и начинают про-
цесс извлечения содержимого ротора по описанной ниже схеме.
Для того чтобы осуществить пуск центрифуги с открытой
крышкой камеры, нужно специальным ключом через выведен-
ное для него на панель гнездо перевести центрифугу в режим
зонального центрифугирования, повернув ключ из положения
«Normal» в положение «Zonal».
При помощи схем 1—6 (рис. 48) опишем последовательность
операций при использовании зонального ротора. На схемах
1—3 изображено образование градиента плотности среды для
центрифугирования, например раствора сахарозы. Через систе-
му каналов к периферии ротора насосом (ступенчато или плав-
но) подают сначала менее плотную, а затем более плотную жид-
кость. Последняя оттесняет первую от наружной стенки в глубь
ротора. Когда весь расчетный объем градиента (обычно 60—
70% полного объема ротора) войдет в ротор, подкачку наибо-
лее плотной жидкости продолжают до тех пор, пока жидкость
не появится в трубке центрального канала. Таким образом из
ротора полностью удаляется воздух, чему способствует и кони-
ческая форма центрального стержня крестовины.
На схеме 4 показан этап внесения препарата. Его накачива-
ют насосом или подают из шприца через центральный канал, в
то время как лишний объем «подушки» вытекает обратно через
периферийную систему каналов. Для хорошего разделения объ-
ем препарата не должен превышать 10% объема полости рото-
ра. Подавать его следует медленно и плавно. Для улучшения
фракционирования целесообразно вносить препарат также в
растворе сахарозы небольшой плотности, а затем на него на-
слаивать буфер (около 7% объема ротора). Таким образом
препарат оттесняют от конического стержня крестовины, и он
образует ровный цилиндрический слой, лежащий на градиенте.
На схеме 5 показан конечный момент зонально-скоростного
центрифугирования. Ротор закрыт пробкой и вращается с боль-
шой скоростью. Частицы распределились вдоль градиента в со-
ответствии с их константами седиментации.
Наконец, на схеме 6 изображена ситуация в момент сбора
и фракционирования градиента. Вновь на малой скорости че-
рез переходное устройство на периферию ротора подается жид-
кость, более плотная, чем та, что входит в состав градиента, на-
пример 60%-ный раствор сахарозы. Градиент последовательно,
от менее плотной до более плотной его части, вытекает через
центральный канал. Выносимые им частицы регистрируются
195 7*
Рис. 49. Крестовина и ко-
нусное кольцо (тип В-29)
(см. текст)
денситометром, флюориметром и (в проточной кювете) счет-
чиком радиоактивности и далее попадают в коллектор фрак-
ций.
В некоторых случаях сбор градиента удобнее начинать с бо-
лее плотной части, т. е. с периферических слоев жидкости в ро-
торе. Такая ситуация возникает, например, в том случае, когда
нужные частицы располагаются близко к концу градиента.
Иногда фракционирование ведут в два этапа. На первом этапе,
когда быстро оседающие частицы подходят к концу градиента,
рабочее центрифугирование прерывают и на малой скорости
вытесняют конец градиента вместе с этими частицами через пе-
риферическую систему каналов наружу. Затем через эту же
систему подкачивают плотную «подушку» и отодвигают остав-
шуюся часть градиента от стенки ротора. На втором этапе
фракционирования ротор вновь разгоняют до рабочей скорости
вращения и производят разделение медленно оседающих ча-
стиц обычным способом.
Для вытеснения жидкости через периферическую систему
каналов буфер или воду подкачивают через центральный ка-
нал, однако в зональном роторе с обычной крестовиной зоны
градиента оказываются смазанными. Удобнее для тех же стан-
дартных разборных роторов пользоваться специальной кресто-
виной (тип В-29) и дополнительным кольцом, придающим на-
ружной стенке полости ротора форму перевернутого конуса
(рис. 49). В этой системе зоны градиента, не искажаясь, одна
за другой выходят через периферическую систему, каналы ко-
торой связаны с верхним «углом» конической полости ротора.
Фирма «Beckman» выпускает пять модификаций роторов
описанного типа. Роторы Ti-14 и А1-14 отличаются друг от дру-
га материалом, из которого они изготовлены, и соответственно
максимально допустимыми скоростями вращения: 48 и 35 тыс.
об/мин. Вместимость обоих роторов 665 мл. Два других одина-
ковых по конструкции зональных ротора (Ti-15 и А1-15) вмеща-
ют по 1675 мл и могут работать при скоростях вращения 32 и
22 тыс. об/мин соответственно. Высокоскоростной Титановый ро-
тор Z-60 объемом 330 мл может работать на скорости 60 тыс.
об/мин. Он имеет определенные конструктивные отличия от на-
званных выше роторов, но в принципе сходен с ними и приме-
няется с тем же самым переходником.
196
Заполнение зонального ротора при открытой камере центри-
фуги занимает немало времени (около 1 ч). Если работают с
охлаждением, то при этом происходит столь значительное на-
копление конденсата на стенках камеры, что для достижения
вакуума, необходимого для разгона ротора до высокой скоро-
сти, воздух из камеры приходится откачивать в течение несколь-
ких часов. При этом весь конденсат попадает в масло форва-
куумного насоса. Было предложено в этом случае закрывать
камеру легкой крышкой из плексигласа с уплотнениями для
ввода трубок. Крышку можно прижать к уплотнительной про-
кладке, откачивая воздух из камеры водоструйным насосом
[Webb, Clark, 1976].
Ультрацентрифуги фирмы «Beckman» снабжают еще и про-
точным ротором типа CF-32T1, допускающим частоту вращения
до 32 тыс. об/мин. Его используют обычно для сбора вирусов
из большого объема лизатов. Операции такого рода имеют
лишь косвенное отношение к исследованию белков и нуклеино-
вых кислот, поэтому конструкция проточного ротора здесь не
рассмотрена.
Фирма MSE выпускает зональные роторы В-14 и В-15 ана-
логичной конструкции, причем каждый в двух вариантах (из
алюминиевого сплава и титана). Зональными роторами (JCF-Z)
на 20 тыс. об/мин комплектуются и лабораторные рефрижера-
торные центрифуги II-21 фирмы «Beckman».
Особенности эксплуатации и ухода
1. Не следует разгонять зональный ротор до больших ско-
ростей, если он не заполнен целиком, т. е. до полного вытесне-
ния воздуха из его полости. Изготовленная из норила крестови-
на может быть разорвана центробежными силами, если она не
опирается на жидкость.
2. При заполнении и опорожнении ротора, особенно если
меняется направление движения жидкости в системах кана-
лов, надо тщательно избегать проникновения в ток жидкости
воздушных пузырей. Такой пузырь, всплывая от периферии ро-
тора к его центру, может нарушить плавность градиента плот-
ности, поэтому при различных подключениях (сосудов к насо-
су, шприца к трубке и т. д.) соответствующие эластичные (и
прозрачные) трубки должны быть зажаты артериальными за-
жимами. Полезно установить ловушку для воздушных пузырей
на пути жидкости от насоса к периферической системе каналов
ротора. Перед подключением всей системы наружных трубок и
насоса к ротору надо проверить их чистоту и заполнить буфе-
ром, удалив весь воздух.
3. Главной проблемой при эксплуатации зонального ротора
является опасность подтекания жидкости между двумя близко
расположенными системами каналов в переходном устройстве.
На трущихся торцевых поверхностях двух цилиндров гидрав-
197
лического уплотнения Не должно быть царапин, выбоин и дру-
гих повреждений. Торец нижнего цилиндра, изготовленного из
мягкого рулона, можно подшлифовать вручную на чистой плос-
кой поверхности. Верхний (стальной) цилиндр при наличии по-
вреждений следует заменить. Надо иметь в виду, что материал
этого цилиндра подвержен коррозии, поэтому его нельзя остав-
лять влажным. Коррозия торца цилиндра может развиться за
одну ночь. Каждый раз после использования переходник надо
разобрать и промыть, а все его детали высушить.
Подтекать могут и различные уплотнительные резинки, что
можно обнаружить по появлению жидкости в центральной
трубке в самом начале заполнения ротора. Во время заполне-
ния целесообразно погрузить конец центральной трубки в ста-
кан с водой и следить за непрерывностью тока воздушных пу-
зырей вплоть до окончания заполнения ротора. Подтекание си-
стемы уплотнений при подаче жидкости через центральную
трубку (при внесении препарата) можно обнаружить, если ко-
нец трубки, идущей от периферической системы каналов рото-
ра, погрузить в стакан с жидкостью той же плотности, что и
«подушка» под градиентом. Менее плотная жидкость, с кото-
рой вносится препарат, при подтекании попадет в эту трубку,
минуя ротор, и обнаружит себя в более плотной жидкости иду-
щими вверх струйками.
Для предварительной проверки уплотнения ротор заполняют
водой, подслаивают под нее плотную «подушку», а затем по-
дают подкрашенную воду в центральный канал ротора. Быст-
рое появление краски в трубке периферической системы свиде-
тельствует о подтеканиях. Помимо повреждения торцов тру-
щихся цилиндров и резиновых прокладок, причинами подтека-
ния могут служить ослабление пружины, прижимающей верх-
ний цилиндр к нижнему; засорение каналов, ведущее к повы-
шению противодавления при подаче жидкости; вибрация пере-
ходника при нецентральной его посадке на ротор или вследст-
вие износа подшипника.
4. Если центрифугирование предполагается вести на холо-
ду, зональный ротор предварительно охлаждают (в собранном
виде) в течение 4—5 ч в холодной комнате. При этом его по-
лость должна быть закрыта пробкой во избежание конденсации
влаги внутри ротора. Заполнение градиентом ведут через зме-
евик, погруженный в баню со льдом, со скоростью 40—50 мл/
/мин. Препарат через центральную трубку наслаивают со ско-
ростью 5—10 мл/мин. С такой же скоростью наслаивают и бу-
фер на препарат.
.5. При равновесном центрифугировании в градиенте плот-
ности раствора CsCl резиновое кольцо, уплотняющее крышку
зонального ротора, желательно менять после каждого опыта,
поскольку раствор CsCl разъедает резину. После опыта ротор
разбирают, вынимают крестовину и все детали тщательно спо-
ласкивают теплой водой. Через каналы крестовины прогоняют
198
теплую воду, а затем спирт для предохранения от появления
микрофлоры. Засорившиеся каналы можно прочищать ерши-
ком для курительной трубки.
Все уплотнительные резинки следует регулярно снимать;
канавки и сами резинки промывать и сушить, резинки слегка
смазывать вакуумной смазкой. Резьбу, на которую навинчива-
ется крышка ротора, надо смазывать после каждой промывки.
Необходимо следить за чистотой и смазкой подшипника пере-
ходника (он не должен шуметь), проверять степень сжатия и
отсутствие коррозии пружины.
• ♦ •
Ознакомившись достаточно подробно с используемой техни-
кой, перейдем к рассмотрению основных методов ультрацентри-
фугирования, применяемых для очистки и фракционирования
белков, нуклеиновых кислот и субклеточных органелл: диффе-
ренциального, зонально-скоростного и равновесного (изопикни-
ческого). Они будут рассмотрены в этом же порядке. Под «час-
тицами» будем, как и прежде, понимать не только молекуляр-
ные агрегаты, но и макромолекулы.
Глава 4
РАЗДЕЛЬНОЕ ОСАЖДЕНИЕ ЧАСТИЦ
(ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ)
В главе 1 было показано, что скорость осаждения частиц
пропорциональна квадрату их линейного размера и разности
плотностей частицы и среды (р—рс). Если стоит задача разде-
лить центрифугированием смесь разнородных частиц примерно
одинаковой плотности (значительно большей, чем плотность
среды), то различие в плотностях частиц решающей роли не
играет, а на первый план выступают размеры частиц. Пусть
смесь частиц равномерно распределена по объему пробирки,
как, например, в исходном гомогенате клеток. Если различия
в линейных размерах частиц значительны, то скорости их осе-
дания будут сильно различаться. При достаточно длительном
центрифугировании, разумеется, все частицы осядут на дно
пробирки. Но можно так подобрать скорость вращения ротора
и время центрифугирования, что в осадке окажутся лишь са-
мые крупные частицы, причем даже те из них, которые вначале
находились вблизи мениска. Менее крупные частицы при этом
почти целиком останутся в надосадочной жидкости (суперна-
танте), за исключением тех, которые вначале уже находились
вблизи дна пробирки (они окажутся в составе осадка).
199
Для хорошей очистки супернатант осторожно сливают, оса-
док вновь суспендируют в объеме пробирки и повторяют цен-
трифугирование. При этом загрязнение осадка крупных частиц
более мелкими значительно уменьшается. Эту операцию можно
повторить 2—3 раза. В свою очередь, при центрифугировании
первого супернатанта на большей скорости или в течение бо-
лее длительного времени можно отделить частицы средних раз-
меров от еще более мелких, и т. д.
Итак, суть операции фракционирования частиц — в пооче-
редном, раздельном их осаждении на дно пробирки. Этот про-
цесс достаточно очевиден и хорошо знаком, однако необходимо
все же дать некоторые практические рекомендации, относящие-
ся к суспендированию осадков. Так, очень нежелательно образо-
вание комков, взвешенных в жидкости. Они могут долгое вре-
мя не расходиться, удерживая внутри менее крупные частицы,
от которых нужно избавиться при повторном центрифугирова-
нии. Чтобы избежать образования комков, надо с минималь-
ным количеством буфера (или вовсе без него) долгое время
растирать осадок стеклянной палочкой по стенке пробирки. Па-
лочка должна быть не слишком тонкой (всего в 3—4 раза
меньше по диаметру, чем пробирка) и заканчиваться ровной
сферой, без каплевидного утолщения. Осадки могут быть и не-
видимы, но их все равно следует растирать. При центрифуги-
ровании в угловом роторе следует заметить, какая сторона про-
бирки была наиболее удалена от оси во время вращения рото-
ра, и растирать невидимый осадок вдоль образующей этой сто-
роны. С этой целью целесообразно предварительно пометить
краской пробирки в одной точке снаружи и устанавливать их в
ротор меткой наружу.
Раздельное осаждение частиц, очевидно, будет более эф-
фективным, если не весь объем пробирки заполнен смесью, а
между препаратом и дном пробирки (в бакет-фоторе) находит-
ся «пустой» слой, через который мелкие частицы не успеют
пройти за время центрифугирования. Это обеспечит полное вы-
деление крупных частиц за одно центрифугирование. Чтобы во
время нанесения препарата на «пустой» слой жидкости не про-
исходило их смешивания, эта жидкость должна быть более
плотной, например можно использовать раствор сахарозы.
В некоторых случаях используют и различие плотностей ча-
стиц, вводя в «пустой» слой достаточно концентрированный рас-
твор сахарозы, сходный с частицами по плотности. В этом слу-
чае разность (р—рс) начинает играть важную роль. Продолжи-
тельность центрифугирования приходится, естественно, увели-
чить, зато степень очистки может быть очень высокой. Иногда
(например для мембран) удается подобрать концентрацию рас-
твора сахарозы в «пустом» слое так, что его плотность оказы-
вается ниже плотности одних частиц и выше плотности других.
Последние вообще не могут войти в плотный слой сахарозы и
собираются на его границе. Можно создать не одну, а две или
2W
три такие границы и в ходе центрифугирований «рассортиро-
вать» по ним частицы в соответствии с их плавучими плотно-
стями. Однако все это можно осуществить только в бакет-рото-
рах. В угловых роторах частицы сначала оседают на стенку
пробирки, а уже потом в виде сгустков соскальзывают на ее дно.
Выбор ротора для раздельного осаждения частиц обуслов-
лен объемом центрифугируемой жидкости, размером частиц
(константой седиментации s20iW — см. ниже) и необходимостью
по возможности сократить время центрифугирования. Послед-
нее определяется максимально допустимой скоростью враще-
ния ротора и его геометрией. Обычно фирма для каждого рото-
ра указывает значение параметра К, учитывающего эти его
характеристики. Зная значение К, можно легко рассчитать вре-
мя центрифугирования t (в часах), необходимое для практиче-
ски полного осаждения из всего объема пробирки частиц с кон-
стантой седиментации s20.w в невязкой (водной) среде при мак-
симальной скорости вращения ротора: t=KlsM^. Значения
$20ф„ измеряются в единицах Сведберга (см. ниже). Например,
для ротора 50.2 Ti /С=72, а для ротора 30 Л=209 (оба ротора
могут быть загружены одинаково: 12 пробирок по 38,5 мл). Лег-
ко видеть, что осаждение рибосом (s20 w=80) в роторе 50.2 Ti
можно осуществить за 1 ч, а для ротора 30 потребуется около
2,5 ч.
Глава 5
ЗОНАЛЬНО-СКОРОСТНОЕ
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Особенности этого типа центрифугирования отражены в его
названии: «скоростное», потому что частицы разделяются по
скорости оседания, причем плотность их значительно больше,
чем плотность среды, и «зональное», так как частицы разных
размеров оседают более или .менее ограниченными слоями —
зонами. Осадков не образуется. После того как зоны достигнут
оптимального распределения вдоль радиуса вращения, центри-
фугирование прекращают, и зоны частиц извлекают одну за
Другой. Таким образом, в отличие от предыдущего случая, час-
тицы разных размеров очищаются не раздельно, а одновремен-
но, при одном центрифугировании.
Исходную смесь частиц разных размеров наносят .в виде
тонкого слоя на более плотную среду, заполняющую весь объ-
ем пробирки бакет-ротора или полости зонального ротора (для
зонально-скоростного центрифугирования используют только эти
Два типа роторов). В ходе центрифугирования наиболее тяже-
лые частицы быстро продвигаются ко дну пробирки или к пе-
201
риферической области зонального ротора, в определенной сте-
пени (что обусловлено диффузией) сохраняя очертания исход-
ного слоя. За ними с отставанием, но тоже в виде отдельного
слоя, двигаются менее крупные частицы, затем еще более мел-
кие и т. д. Так образуются дискретные зоны, или полосы частиц,
отличающихся друг от друга скоростью оседания.
Для того чтобы зоны были узкими, необходимо противодей-
ствовать конвекции жидкости, в которой движутся частицы.
Эффективный способ подавления конвекции — увеличение
плотности этой жидкости вдоль радиуса вращения в направле-
нии от центра к периферии. Для этого создают так называемый
«градиент плотности среды». Например, можно заполнить про-
бирку бакет-ротора водным раствором сахарозы, концентрация
которого нарастает в направлении от мениска жидкости ко дну
пробирки, а затем уже на этот «градиент сахарозы» (как его
для краткости называют) наслаивать препарат — смесь под-
лежащих разделению частиц.
Хотя главное назначение градиента плотности среды — пре-
пятствовать конвекции, он может играть еще одну немаловаж-
ную роль в процессе фракционирования частиц. Вспомним
уравнение скорости оседания частиц (см. главу 1):
D4p-Pc)№r
о — /с .
Пс
Из уравнения видно, что скорость движения частиц и, следо-
вательно, соответствующих зон при постоянстве всех прочих
параметров должна увеличиваться по мере продвижения вдоль
радиуса вращения, т. е. вдоль оси пробирки бакет-ротора. Мо-
жет случиться так, что зона наиболее тяжелых частиц достиг-
нет дна пробирки раньше, чем две зоны наиболее легких частиц
успеют заметно отойти от мениска и разделиться между собой.
Нарастанию скорости осаждения частиц можно помешать, ес-
ли предусмотреть увеличение плотности и вязкости среды (рс
и т|с) вдоль радиуса вращения (длины пробирки). Но это как
раз и имеет место при наличии градиента плотности. Более то-
го, если плотность и вязкость среды увеличиваются значитель-
но (при «крутом» градиенте), то влияние факторов рс и г]с ока-
жется сильнее, чем влияние увеличения г, и по мере приближе-
ния к дну пробирки движение зон будет замедляться.
Таким образом, экспериментатор имеет возможность управ-
лять изменением скорости оседания частиц вдоль пробирки в
интересах полного (и быстрого) разделения всех интересующих
его зон. Эта возможность обусловлена свободным выбором ха-
рактера градиента плотности среды.
202
КОНСТАНТА СЕДИМЕНТАЦИИ
Зонально-скоростное центрифугирование используют не
только для разделения (фракционирования) частиц, но и для
определения их характеристик — размеров и плотности. С этой
целью удобно ввести величину, зависящую только от этих двух
параметров частицы и поддающуюся количественному опреде-
лению методом ультрацентрифугирования. В интересах сопо-
ставления различных экспериментальных данных эта величина
должна иметь универсальный характер, т. е. не зависеть от ус-
ловий ее определения. Такой величиной служит константа се-
диментации частицы.
При выводе конечного управления в главе 1 отмечалось, что
скорость оседания частицы при центрифугировании (и) пропор-
циональна величине о2г (со — угловая скорость вращения ро-
тора). Скорость оседания частицы, радиус (расстояние от оси
вращения до ее местоположения) и угловая скорость ротора
не характеризуют непосредственно частицу (как диаметр и
плотность) или среду. Отношение этих параметров называют
коэффициентом седиментации: 5=у/<в2л
Воспользовавшись выражением для V, содержащим со2г (см.
главу 1), легко найти, что
,, ^(Р-Рс)
s = к ------- .
Лс
В случае сферической частицы k' — Отсюда видно, что значе-
ние коэффициента седиментации не зависит от скорости враще-
ния и типа ротора, а только от размера и плотности частицы, а
также от плотности и вязкости среды центрифугирования. По-
следнее обстоятельство, очевидно, неприемлемое для универсаль-
ной величины, характеризующей только саму частицу, можно
обойти, если проводить центрифугирование всегда в одной и той
же, «стандартной» и хорошо воспроизводимой среде. В качестве
такой среды условились взять воду при температуре 20° С. Плот-
ность и вязкость воды при 20° (p2o(W и t]2o,w) хорошо известны.
Коэффициент седиментации частицы, определенный центрифуги-
рованием в стандартной среде (s20,w), зависит только от пара-
метров частицы; его называют константой седиментации данной
частицы:
Чзо, w
Для определения константы седиментации не обязательно
проводить центрифугирование в воде. Можно воспользоваться
результатами центрифугирования в любой среде, если известны
ее характеристики (рс и тц) и удается определить коэффициент
седиментации s. Формула перехода от коэффициента седимента-
203
ции частицы (в данном опыте) к ее константе седиментации по-
лучается при делении выражения для s20,w на выражение для s;
при этом k' и D2 сокращаются:
_ (Р Рао, w) Чс
^ao(w — * ~ Г •
4ao,w (Р Рс)
Удобнее вместо величины s вновь ввести те эксперименталь-
ные параметры, которые служат для ее определения:
_ v (Р ~~ Pao.w) Чс
Sa°,W ^4a0,w(P-Pc)
Таким образом, можно найти константу седиментации части-
цы (sao.w), если определить скорость ее оседания (о) в момент,
когда она находится на расстоянии г от оси ротора, вращающе-
гося с угловой скоростью При этом должны быть известны
плавучая плотность частицы р, а также плотность и вязкость
среды (рс, т]с) в той самой точке, где находится частица. Значе-
ния плотности и вязкости воды при 20° (p2o,w и Th».») имеются в
справочнике. Размерности для v, <в и г — соответственно см/с,
рад/с и см. Вторая дробь в выражении для s20>w дает безразмер-
ный множитель, поэтому получаемая размерность s20>w— секун-
ды.
Скорость оседания частицы очень мала; а угловая скорость
вращения ротора велика. Это приводит к столь малым абсолют-
ным значениям s20,w, что для выражения константы седиментации
условились ввести специальную величину — сведберг (в честь
шведского исследователя), обозначаемую «S», причем 1S =
= 10-1* с. Когда говорят, что константа седиментации рибосом
животных равна 80S, это означает, что s20w=80- 10-1’ с.
ИЗОКИНЕТИЧЕСКИИ ГРАДИЕНТ ПЛОТНОСТИ
Как же рассчитать константу седиментации, используя ре-
зультаты эксперимента? Эта задача очень упрощается, если про-
филь градиента плотности таков, что увеличение радиуса ком-
пенсируется изменениями плотности и вязкости среды вдоль него,
и все частицы движутся с постоянными скоростями, которые оп-
ределяются только их размерами. Градиенты, отличающиеся та-
кой особенностью, называют «изокинетическими». Подчеркнем,
что изокинетичность градиента определяется геометрией ротора
и распределением концентрации (например, сахарозы) вдоль
пробирки.
Она не зависит ни от размеров частиц (следовательно,
и от скорости их оседания), ни от скорости вращения ротора.
Так как константа седиментации любой частицы — величина
постоянная, то при условии постоянства скорости оседания из ос-
новной формулы для s20,w следует неизменность вдоль изокине-
204
тического градиента следующего выражения:
о 1 (Р Pjo.w) Пс
r n»o,w<P-Pc)
Разумеется, величина со2 также не зависит от положения час-
тицы в пробирке. Таким образом, скорость оседания частицы в
изокинетическом градиенте и ее константа седиментации связа-
ны простой зависимостью: s20,w= (p/а2) и. Для двух частиц, име-
ющих разные константы седиментации — s20iW1 и s20,W2) но одина-
ковые плотности (р входит в состав р) и оседающих в одной и
той же пробирке, отношение скоростей оседания в данном опыте
будет равно отношению их констант седиментации:
$2I),wJS20,W2 = VjVz.
Но при постоянстве скорости движения путь, пройденный части-
цей, равен произведению ее скорости на время центрифугирова-
ния. Поэтому если расстояние двух частиц (практически зон) от
мениска жидкости к моменту окончания центрифугирования обо-
значить Ц и 12, то будет справедливо соотношение:
$20,W,/$20, w2 — IJlt.
Это соотношение подсказывает простой способ определения кон-
станты седиментации исследуемых молекул путем сопоставления
их с «маркером» — веществом такой же природы (белок, ДНК
или РНК), но с известным значением s20,w. Оба эти вещества
надо, предварительно смешав, разделить зонально-скоростным
центрифугированием в изокинетическом градиенте плотности, а
затем по соотношению расстояний, пройденных их зонами от ме-
ниска, рассчитать искомую величину: $2o,w = $2o,«m((//m). Буквой
«м» обозначен маркерный препарат. Для цилиндрической части
пробирки отношение расстояний от мениска можно заменить от-
ношением соответствующих им объемов. Опорожнять пробирку в
этом случае удобнее, начиная с мениска (см. ниже). Объемы не-
редко заменяют числом капель. При этом следует проявлять
осторожность, так как объем падающей в коллектор капли зави-
сит от поверхностного натяжения и плотности жидкости, а они
неодинаковы на разных участках градиента плотности.
Практически изокинетическим оказывается линейный гради-
ент концентрации сахарозы от 5 до 20% для бакет-ротора
SW 50.1 (он аналогичен ротору SW 39, снятому с производства).
Та же картина для этого ротора наблюдается и при градиенте от
15 до 30% сахарозы.
В бакет-роторах новой конструкции с удлиненными пробир-
ками действительно изокинетическими оказываются только гра-
диенты с экспоненциальным профилем. Расчеты параметров та-
ких градиентов опубликованы в виде соответствующих таблиц
[McCarty et al., 1974]. Способы образования в пробирках гради-
205
ентов плотности (как линейных, так и экспоненциальных) описа-
ны ниже. I
Однако, как будет видно из приведенных ниже графиков, про-
стые линейные градиенты плотности сахарозы в диапазонах 5—
20% и 15—30% и для этих роторов дают не слишком большие от-
клонения скорости оседания частиц от постоянных значений.
В первом приближении их можно считать изокинетическими в
использовать для расчетов по указанному выше простому спосо-
бу. Серьезность вносимой таким упрощением ошибки следует со-
поставлять с сохранностью положения зон при «раскапывании»
градиента, точностью измерения объемов и шириной зон.
Еще лучше использовать два маркера, один из которых осе-
дает быстрее, а другой — медленнее, чем интересующая иссле-
дователя зона. Константу седиментации для этой зоны можно
рассчитывать по известным константам седиментации маркеров
и относительному расположению пика зоны препарата между пи-
ками маркеров путем линейной интерполяции.
В качестве маркеров для РНК удобно использовать рибосом-
ные РНК с константами седиментации 16S и 23S (бактериаль-
ные), 5S, 18S и 28S (из рибосом животных), а также транспорт-
ные РНК (s20,w=4S). Маркерами для ДНК часто служат двуни-
тевые фаговые ДНК определенной структуры. Ниже приведены
характеристики некоторых из них:
Источник маркера Структура ДЧК 820, w«s
ФХ174 Кольцевая 16,0
ФХ174 >, сверхскрученная 20,7
ФХ174 >, рднонитевая 22,7
Аденовирус 12 Линейная 30,7
Фаг % > 36,2
> Кольцевая 40,9
Фаг Т5 Линейная 48,5
Фаг Т2 > 65,0
Практически удается разделить и охарактеризовать с по^
мощью зонально-скоростного центрифугирования частицы, отли-
чающиеся между собой по значению s20,w не менее чем на 10%.
ВЫБОР СРЕДЫ
Для создания градиентов плотности среды при зонально-ско-
ростном центрифугировании нашли применение растворы следу-
ющих веществ: сахарозы, глицерина, метризамида («Metrisami-
de»), фиколла («Ficoll») и перколла («РегсоП»), Первые два ве-
щества общеизвестны, поэтому приведем краткие характеристи-
ки трех остальных.
Метризамид — фирменное название довольно сложного про-
изводного трийодбензойной кислоты. К бензольному кольцу,
кроме трех атомов йода, присоединены еще ацетамид и N-метил1
2W
ацетамид.
NH
Карбоксильная группа бензойной кислоты блокирована амид-
ной связью с 2-амино-З-дезоксиглюкозой. Молекулярная масса
метризамида — 789. Наличие трех атомов йода обеспечивает вы-
сокую собственную плотность этого вещества (2,17 г/см3). Оста-
ток глюкозы и три карбонильных кислорода обусловливают
очень хорошую растворимость в воде. Метризамид хорошо раст-
воряется и в метаноле, этаноле, диметилформамиде и диметил-
сульфоксиде. Вместе с тем ионогенные группы отсутствуют —
'молекула не несет заряда; лишь при pH 10 проявляются слабо-
кислые свойства.
Метризамид химически инертен и устойчив в диапазоне
pH 2,5—12. С биополимерами он не взаимодействует, даже прак-
тически не влияет на степень их гидратации в растворе (не отни-
мает воду). Метризамид не осаждается кислотой и 70%-ным
этанолом — белки и нуклеиновые кислоты легко осадить из его
-раствора.
. К недостаткам метризамида относятся следующие. Ультра-
фиолетовое облучение его (и даже дневной свет), а также нагре-
вание выше 55° ведут к частичному освобождению йода. Раство-
ры метризамида нельзя автоклавировать: их стерилизуют филь-
трованием. Метризамид сильно поглощает в ультрафиолетовой
.области спектра (lMa«c=242 нм), в том числе при 260 и 280 нм, но
'не мешает окраске биополимеров, например нуклеиновых кислот,
бромистым этидием. Для сцинтилляторов на основе диоксана й
-нафталина метризамид является очень сильным тушителем, а
'для тритон-толуольных — умеренным (падение эффективности
счета до 20%). Определение РНК с орцином, ДНК с дифенила-
мином и белка по методу Лоури нельзя проводить в присутствии
метризамида — его следует удалить ультрафильтрацией.
Метризамид довольно слабо окрашивается обычным краси-
телем для белков — СВВ. Если разбавить фракцию после цен-
•трифугйрования до концентрации метризамида менее 4% и та-
кой же раствор метризамида использовать в кювете сравнения,
207
то содержание белка во фракции можно определять по связыва-
нию с ним красителя (Gogstad, 1980].
Твердый метризамид в виде белого порошка можно хранить
как угодно долго при комнатной температуре, если он защищен
от света. Растворы его могут быть атакованы микроорганизма-
ми. Метризамид выпускает норвежская фирма «Nyegaard».
Фиколл-400 — полисахарид, полученный сополимеризацией
сахарозы и эпихлоргидрина, с молекулярной массой 400000, хо-
рошо растворимый в воде и устойчивый в широком диапазоне
pH (при рН<3 гидролизуется). Следует избегать его контакта
с сильными восстановителями и окислителями. По плотности
растворы фиколла уступают растворам сахарозы той же концен-
трации, а по вязкости заметно их превосходят. Главным достоин-
ством фиколла является малое (при концентрации ниже 20%)
осмотическое давление его растворов. Большой размер молекул
фиколла не позволяет им проходить через клеточные мембраны,
поэтому его используют для создания градиентов плотности при
центрифугировании клеток, клеточных органелл и частиц, свя-
занных с мембранами. Эти градиенты применяют не только при
зонально-скоростном, но и (чаще) при равновесном центрифуги-
ровании [Aspray et al., 1975]. Порошкообразный фиколл произ-
водит шведская фирма «Pharmacia».
Фиколл используют также в смеси с метризоатом натрия, ко-
торый отличается от метризамида отсутствием замещения по
карбоксилу трийодбензойной кислоты. Эта смесь с плотностью
1,077 г/см3, малой вязкостью и малым осмотическим давлением
служит для очистки лимфоцитов крови за один цикл центрифу-
гирования. Фирма «Pharmacia» выпускает такую смесь под на-
званием «Ficoll-Paque», фирма «Nyegaard» — «Lympho-prep.».
Перколл представляет собой коллоидные частицы SiOa раз-
мером около 17 мкм, покрытые поливинил пирролидоном и поэто-
му совершенно инертные. Суспензии перколла той же концентра-
ции, что и других перечисленных веществ, имеют наибольшую
плотность. Вязкость этих суспензий в воде велика, но резко сни-
жается при добавлении NaCl до 0,15 М. Суспензии перколла
.можно автоклавировать.
Благодаря относительно крупным размерам частицы перкол-
ла в ходе центрифугирования сами достаточно быстро оседают,
образуя градиент плотности по высоте пробирки. Эту плотность
можно определять не по коэффициенту преломления (не истин-
ный раствор!), а лишь пикнометрически. Недавно фирма «Phar-
macia» начала выпуск специальных порошков с точно известной
плотностью. Десять типов таких порошков, различающихся
окраской, могут быть использованы для калибровки градиентов
плотности перколла. Фирменное название этих порошков—«Den-
sity Marker Beads».
Перколл применяют лишь для очистки клеток и достаточно
крупных клеточных органелл, осуществляемой обычно в режи-
ме равновесного центрифугирования.
208
Рис. 50. Плотность (р) и вязкость (т|) водных растворов перколла (/), метри-
замида (2), сахарозы (<?), фиколла (4) и глицерина (5) в зависимости от их
концентрации
Хотя фиколл и перколл не используют для фракционирования
белков и нуклеиновых кислот, интересно сопоставить плотность
(р) и вязкость (т]) растворов всех пяти названных веществ в за-
висимости от концентрации (рис. 50). Следует обратить внима-
ние на то, что концентрации выражены отношением массы рас-
творенного вещества к объему раствора (m/V) *. Значения р и q
даны для 20°.
Из рассмотрения графиков можно сделать ряд выводов.
1. Фиколл и перколл явно непригодны для зонально-скорост-
ного центрифугирования белков и нуклеиновых кислот. При тех
концентрациях, которые необходимы для обеспечения устойчиво-
сти градиента плотности, вязкость их растворов слишком высока.
2. Вязкость и плотность растворов глицерина, особенно в об-
ласти высоких концентраций, нарастают медленнее, чем раство-
ров сахарозы и метризамида, но таким образом, что для раство-
ров глицерина и сахарозы с одинаковой плотностью вязкость
оказывается значительно выше у глицерина. Поэтому центрифу-
гирование в градиенте плотности глицерина используют главным
образом в тех случаях, когда это диктуется какими-либо допол-
нительными соображениями, например стабилизирующим дей-
ствием глицерина на активность некоторых ферментов.
3. Метризамид имеет определенные преимущества перед са-
харозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При
одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида не-
сколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — сущест-
венно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиен-
тов плотности растворов метризамида требуются заметно мень-
шие его концентрации. И все же метризамид практически почти
не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что
объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,—
очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот
в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения
1 В английской литературе это отношение обозначается w/t>.
209
(разность р—рс в выражении для о). Правда, это не относится к
белкам, но зонально-скоростное центрифугирование преимуще-
ственно используют именно для фракционирования нуклеиновых
кислот. Второе немаловажное обстоятельство — относительная
дороговизна метризамида по сравнению с сахарозой. Наконец,
третья причина обусловлена поглощением света в ультрафиоле-
товой области (проблема обнаружения зон) и тушением сцин-
тилляции.
Метризамид имеет весьма существенные преимущества при
проведении равновесного центрифугирования, поэтому дальней-
шее знакомство с его физико-химическими характеристиками и
использованием его растворов отложим до соответствующей
главы.
Таким образом, почти единственным (во всяком случае, пре-
имущественно употребляемым) материалом для создания гради-
ентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании
является сахароза. Остановимся подробнее на свойствах ее рас-
творов, способах образования градиентов плотности, выборе ре-
жимов центрифугирования и приведем несколько примеров цен-
трифугирования в градиентах сахарозы.
ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТВОРОВ САХАРОЗЫ
В табл. 1 приведены необходимые экспериментатору значения
плотности (р, г/см’) и вязкости (т|, сП) растворов сахарозы для
двух наиболее часто употребляемых температур—5 и 20°. Кон-
центрация растворов выражена в массовых процентах. Для при-
готовления соответствующего раствора надо взять навеску саха-
розы, численно равную выбранному проценту, и добавить воды
Таблица 1. Плотность (р, г/см3) и вязкость (п, СП) растворов сахарозы и
глицерина
Параметр Концентрация раствора, мае. %
5 10 15 20 25 30 35 40 45 . 50
Р *1 11,020 |1,753 11,041 12,073 11,062 |2,513| Сахароза при 5° 11,08411,10711,131 13,13514,042 | 5,422 11,1561 1,1821 1,2091 1,236' 17,636111,453|18,604)33,160
Р П 11,012 11,769 11,025 |2,073 11,0381 12,429 Глицерин при (1,051I1,065| 12,85913,3971 5° 11,0781 14,105 11,092 |5,090 11,105 | 6,552 11,1191 1,433 18,904113,071
Р п 11,018 |1,148 11,038 11,337 11,059 11,592, Сахароза при 20° 11,08111,10311,127 11,94612,44913,184 11,151 14,323. 11,177 16,163 11,2031 l,23ff 19,376)15,420’
р п 11,010 11,159 11,022 |1,335 1 11,035 |1,539 Глицерин при 11,04711,060 11,7801 2,077 20° 11,073 2,460 11,086 12,980 11,099 13,734 |1,1131 14,9101 1,12в: 6,919
210
или буфера до 100 г (можно по объему, считая плотность водных
растворов равной 1). Для сопоставления приведены также зна-
чения плотности и вязкости .растворов глицерина.
Следует отметить, что при увеличении температуры с 5 до 20°
плотность растворов сахарозы и глицерина уменьшается незна-
чительно, в то время как их вязкость падает весьма существенно,
особенно в случае концентрированных растворов.
Для оценки возможности фракционирования в градиентах
плотности сахарозы ниже приведены усредненные значения пла-
вучей плотности (в г/см3) основных биологических объектов в
растворах сахарозы:
Белки 1,24—1,32 Мембраны 1,13-1,18
ДНК 1,42 Митохондрии 1,19
Хроматин 1,36 Лизосомы 1,21
РНК 1,49 Хлоропласты 1,21
Рибосомы 1,41
Разумеется, эти данные ориентировочны и могут несколько
изменяться от объекта к объекту. Однако из сопоставления их
с табличными следует возможность зонально-скоростного фрак-
ционирования белков и нуклеиновых кислот при умеренных кон-
центрациях растворов сахарозы (до 40%) и затруднительность
такого фракционирования для мембран и содержащих мембра-
ны органелл. Вместе с тем возможно их разделение в ступенча-
тых градиентах плотности сахарозы — на интерфазах.
Нередко в литературе концентрацию растворов сахарозы ука-
зывают в молях на литр или в виде процентного отношения мас-
сы сахарозы к объему раствора (m/V). Для удобства сопостав-
ления данных и определения плотности по табл. 1 ниже пред-
ставлен перевод выраженных таким образом концентраций в
массовые проценты; по этим цифрам можно построить рабочие
графики для пересчета:
Моль/л Мас. % Моль/л Мас. % Моль/л Мас. % m/V, % Мас. %
0,25 8,3 1,1 33,0 2,0 54,6 10 9,6
0,3 9,9 1,2 35,6 2,1 56,7 15 14,2
0,4 13,0 1,3 38,1 2,2 58,9 20 <8,6
0,5 16,1 1,4 40,6 2,3 61,0 25 22,9
0,6 19,1 . 1,5 43,0 2,4 63,0 ' 30 27,0
0,7 22,0 1,6 45,4 2,5 65,0 35 31,1
0,8 25,2 1,7 47,8 40 34,8
0,9 27,6 1,8 51,0 45 38,5
1,0 30,3 1,9 52,3 50 42,1
60 ' 49,0'
Следует обратить внимание на то, что содержание сахарозы в
растворе в массовых процентах значительно ниже.чемконцен,-
трацня, выраженная отношением массы к объему (особенно для
концентрированных растворов). При анализе литературных дан-
ных надо точно знать способ выражения концентрации.
-W1
Сахароза — инертное, стабильное вещество, однако при авто-
клавировании ее растворы могут карамелизоваться. Между тем
их стерилизация нередко необходима, так как сахароза ввиду
ее биологического происхождения может содержать примеси раз-
личных ферментов, в частности рибонуклеаз. Растворы сахаро-
зы лучше всего стерилизовать добавлением (на 30 мин) до 0,1 %
диэтилпирокарбоната (ДЭП) — мощного ингибитора рибонукле-
аз. После обработки ДЭП разлагают на СО2 и этанол нагревани-
ем раствора при 60° в течение нескольких часов. Следует пом-
нить, что ДЭП очень ядовит!
Часто в сахарозе содержатся примеси тяжелых металлов. Их
удаляют, пропуская раствор сахарозы через колонку, заполнен-
ную хелирующей смолой («Chelex-ЮО»). Загрязнения, поглоща-
ющие свет в ультрафиолетовой области, удаляют обработкой ак-
тивированным углем (50 г угля добавляют к 1 л 50%-ного рас-
твора сахарозы, кипятят в течение 5—10 мин и фильтруют).
Ряд фирм продает сверхчистые («RNase free») препараты са-
харозы, однако не следует слишком доверять такой аттестации.
Лучше все-таки в буфер для растворения сахарозы ввести инги-
биторы нуклеаз или протеаз и ЭДТА, особенно если намечается
длительное центрифугирование при комнатной температуре.
Растворы сахарозы чаще всего готовят в водных буферах с
pH, близким к нейтральному. При высокой концентрации саха-
роза связывает значительную часть воды, что может привести к
агрегации макромолекул любого рода (как при осаждении спир-
том или этиленгликолем). В качестве контрмеры прибегают к
добавлению диссоциирующих агентов (солей в повышенной кон-
центрации, иногда гуанидинхлорида или мочевины, нередко 0,2—
1 % ДДС-Na).
При центрифугировании денатурированной ДНК или однони-
тевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию
и агрегацию за счет образования случайных водородных связей
между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-
нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непри-
годна (гидролиз!), но можно создать градиент плотности рас-
творением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах
формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в
100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты на-
зывают «денатурирующими градиентами сахарозы». Следует
помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, по-
этому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО раз-
рушает нитроцеллюлозные и поликарбонатные пробирки. Из
него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешива-
нием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной
ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты
нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2—
3 мин при 80° для разрушения уже образовавшихся агрегатов.
812
ПРОФИЛЬ ГРАДИЕНТА САХАРОЗЫ
Технически проще всего осуществить «линейный градиент»,
в котором концентрация сахарозы (и плотность раствора) ли-
нейно увеличивается от мениска ко дну пробирки. Разность меж-
ду концентрациями раствора у мениска и у дна пробирки, равная
15%, вполне достаточна для предотвращения конвекции. Выбор
концентрации начала градиента (на мениске) зависит от плот-
ности наслаиваемого на градиент препарата. Если это водно-со-
левой раствор, можно начинать градиент с 5%-ной концентрации
сахарозы; часто употребляют градиент 5—20%. Если же наносят
клеточный гомогенат в 0,25 М сахарозе (8,3%), то градиент начи-
нают обычно с 15%-ного раствора. Как будет показано ниже, для
линейных градиентов сахарозы с диапазоном изменения концен-
траций в 15% (например, 5—20 или 15—30%) повышение вязко-
сти приблизительно компенсирует, увеличение центробежной
силы за счет продвижения частиц вдоль радиуса вращения (дли-
ны пробирки).
Если же в состав препарата входят частицы с очень больши-
ми значениями константы седиментации и есть необходимость
затормозить их оседание при подходе ко дну пробирки, то ис-
пользуют либо более крутые линейные градиенты (с диапазоном
20 или 25%), либо градиенты вогнутой формы. Увеличение кру-
тизны градиента приводит к сужению полос (зон) частиц. Перед-
ний край зоны, вступая в область повышенной вязкости и плот-
ности раствора сахарозы, замедляет свое движение по сравне-
нию с задним краем. Однако по той же причине уменьшается и
расстояние между зонами, поэтому разрешение (разделение)
зон или пиков не очень зависит от крутизны градиента. Если раз-
деляют вещества с близкими значениями s2o,w. то берут пологие
градиенты плотности, а узость зон стараются обеспечить за счет
тонкости начального слоя. Компенсировать при этом уменьшение
объема препарата за счет увеличения концентрации вещества в
нем можно лишь в определенных пределах. Дело в том, что плот-
ность раствора препарата накладывается на плотность градиен-
та сахарозы. В силу диффузии препарат внутри зоны распреде-
лен неравномерно, профиль распределения имеет форму колоко-
ла. Если концентрация препарата в зоне невелика, то это нало-
жение не нарушит общего характера нарастания плотности гра-
диента вдоль пробирки. Если же концентрация вещества в зоне
значительна, то у переднего ее края образуется локальный учас-
ток «обратного градиента плотности», т. е. плотность на этом
участке убывает (за счет препарата) в направлении от мениска
к дну пробирки. Это приводит к конвекции жидкости и размыва-
нию зоны. Ясно, что чем круче градиент плотности сахарозы, тем
меньше скажется на нем вклад плотности препарата. Именно
поэтому для пологих градиентов сахарозы следует опасаться
«перегрузки» зон при увеличении концентрации препарата в ис-
ходном слое. Довольно часто плохое разрешение зон при зональ-
213
но-скороСтном центрифугировании в градиентах сахарозы бывает
обусловлено именно этой причиной.
Для белков и нуклеиновых кислот и градиентов обычной кру-
тизны исходная концентрация вещества в препарате не должна
превышать значений порядка 1 мг/мл.
СОЗДАНИЕ ГРАДИЕНТА ПЛОТНОСТИ САХАРОЗЫ
Простейшее устройство для создания линейного градиента са-
харозы (рис. 51) представляет собой два цилиндрических сосуда
одинакового диаметра, соединенные у дна каналом с краном или
зажимом. Один из цилиндров имеет еще и выводную трубку ма-
лого диаметра, через которую жидкость подается в центрифуж-
ную пробирку. В этом же цилиндре должна находиться мешал-
ка, обеспечивающая смешивание каждой порции жидкости, по-
ступающей из сосуда 1 (резервуара), со всем объемом жидкости
в сосуде 2 (смесителе). Цилиндры могут быть стеклянными,
соединенными между собой мягкой трубкой с зажимом, или вы-
сверленными вместе с каналами в блоке плексигласа.
Если в смесителе находится более плотный раствор сахарозы,
то плотность вытекающей из смесителя жидкости линейно умень-
шается и ее можно постепенно наслаивать в пробирку от дна
кверху. Если же в смесителе находится менее плотный раствор,
то плотность вытекающей жидкости линейно возрастает и ее
можно подавать через длинную иглу от шприца с обрезанным
концом все время на дно пробирки. Более плотные слои сахарозы
будут вытеснять вверх менее плотный раствор, образуя правиль-
ный линейный градиент плотности. Затем иглу осторожно выни-
мают; градиент при этом не нарушается.
Первый вариант заполнения проще, но непригоден для поли-
алломерных и поликарбонатных пробирок, материал которых не
смачивается водой. По стенке пробирки вместо непрерывной и
слабой струйки жидкости будут сбегать капли, нарушая гради-
ент. Нитроцеллюлозные пробирки смачиваются, но могут не вы-
держать большой скорости центрифугирования. Смачивание
улучшается, если добавить в раствор сахарозы ДДС-Na до
0,01%. Скорость заполнения не должна превышать 1 мл/мин для
пробирок диаметром 25 мм, а для более узких пробирок должна
быть соответственно ниже.
Имеется много вариантов фирменных устройств такого рода,
однако их легко изготовить и своими средствами. Для каждого
типа (объема) пробирок надо иметь отдельное устройство. Для
более надежного перемешивания и уменьшения вклада послед-
них порций смеси, когда уровень жидкости в цилиндрах опуска-
ется до соединительной трубки, отношение диаметра к высоте
цилиндра в момент начала формирования градиента должно
составлять 1 : 3 или 1:4.
Даже при создании такого простейшего устройства встают
свои -проблемы. Например, магнитная мешалка непригодна: вра-
ки
щающийся на дна сосуда магнитик либо
не будет успевать перемешивать весь
объем цилиндра, либо образует воронку,
что приведет к изменению соотношения
уровней жидкости в двух цилиндрах.
Мешалка в виде платиновой петли с
приводом сверху от электродвигателя
лучше, но не очень эффективна. Лучше
всего перемешивать жидкость винтооб-
разной пластинкой, изготовленной из по-
догретого плексигласа, таким образом,
чтобы при ее вращении от двигателя
винт гнал жидкость вверх (как в смеси-
телях фирмы LKB). Но надо учитывать,
что ее постоянное по всей высоте ци-
линдра сечение уменьшает эффективную
площадь цилиндра.
Строго говоря, площади — и, следо-
вательно, диаметры — двух цилиндров и
не должны быть одинаковыми. Одинако-
выми должны быть объемы смешивае-
Рис. 51. Устройство для
создания линейного гра-
диента плотности рас-
твора
1 — резервуар: 2 — смеситель
мых растворов. Однако исходный уро-
вень жидкости более высокой плотности будет ниже, чем уровень
менее плотной жидкости, если они заполняют два сообщающих-
ся между собой цилиндра, поэтому площадь основания цилинд-
ра, в который заливается более концентрированный раствор са-
харозы, 'должна быть больше площади основания второго ци-
линдра, заполненного менее концентрированным раствором. От-
ношение этих площадей должно быть равно отношению плотнос-
тей двух растворов, или, что то же, отношению исходных уров-
ней жидкости в цилиндрах. Можно изготовить цилиндры одина-
кового диаметра и в тот из них, где находится менее плотная
жидкость, вставить стеклянную палочку соответственно подоб-
ранного сечения.
Для упрощения иногда идут на изначально неодинаковое за-
полнение двух цилиндров равного диаметра: менее плотного рас-
твора сахарозы наливают с таким избытком, чтобы при открыва-
нии канала между цилиндрами исходные уровни жидкости в них
остались без изменения. Тогда жидкость не будет перетекать из
одного цилиндра в другой до начала заполнения пробирки. С та-
ким избытком можно примириться, так как цилиндры все равно
не могут опорожниться до конца, поэтому суммарный объем жид-
кости в них должен несколько превышать намеченный объем гра-
диента (что устанавливается эмпирически).
Следует избегать образования воздушного пузыря в соедини-
тельном канале. Начинать заливать резервуар следует при от-
крытом кране канала. После заполнения его жидкостью нужно
закрыть кран и закончить заливку резервуара. Затем следует на-
полнить расчетным объемом жидкости смеситель и открыть сое-
215
динительный кран. Такая последовательность заполнения обес-
печивает немедленное начало формирования градиента при по-
даче жидкости из смесителя в пробирку.
Выходная трубка, ведущая к пробирке, должна быть корот-
кой и не слишком узкой, чтобы жидкость пошла по ней самоте-
ком, без предварительного ее заполнения. В начале трубки ста-
вят винтовой зажим, позволяющий регулировать скорость выте-
кания жидкости.
Некоторые фирмы выпускают смесители для' одновременного
заполнения трех пробирок с помощью многоканального пери-
стальтического насоса. При этом ввиду практически неизбежно-
го разброса диаметра трубок насоса редко удается добиться од-
новременного заполнения всех пробирок и, следовательно, оди-
наковых градиентов. Лучше повторять операцию формирования
градиента поочередно, в строго одинаковых условиях.
Если сечения резервуара и смесителя неодинаковы, то гради-
ент будет нелинейным. Выпуклость или вогнутость градиента
(по отношению к оси абсцисс) зависит не только от того, какой
из цилиндров имеет больший диаметр, но и от того, в каком из
них находится более плотный раствор.
Если диаметр резервуара больше диаметра смесителя
(рис. 52, /), то начальные изменения плотности будут резче вы-
ражены, чем в случае линейного градиента, зато конец градиен-
та будет более пологим. Это означает, что если в резервуаре на-
ходится более плотный раствор сахарозы, то градиент будет вы-
пуклым (а), а если менее плотный — вогнутым (б). Только ва-
риант б пригоден для создания градиента сахарозы с резким на-
растанием плотности у дна пробирки. Жидкость, вытекающую
из смесителя, в этом случае придется наслаивать по стенке про-
бирки.
Если диаметр резервуара меньше диаметра смеситель
(рис. 52, 2), то начальные изменения плотности относительно не-
велики и градиент начинается более полого, чем линейный. Это
будет компенсировано резким изменением плотности в конце
формирования градиента. Теперь ситуация становится обратной.
Вогнутый градиент с резким нарастанием плотности в области
высоких ее значений образуется в том случае, если в резервуаре
находится более плотный раствор сахарозы (в). Вносить его в
пробирку можно только на дно, через иглу шприца.
Отклонения от линейности тем значительнее, чем больше раз-
ница диаметров резервуара и смесителя. Все рассмотренные слу-
чаи описываются общим уравнением для формирования градиен-
та в сообщающихся между собой открытых цилиндрах:
sp
/ у
PV = Рр — (Рр ~ рем) I 1 ~ v v I
\ *р ~Г Ием /
Здесь ру — плотность жидкости, вытекающей после расходова-
ния объема V; «р» и «см» — индексы, относящиеся соответствен-
216
но к резервуару и смесителю; рр и рси — исходные значения плот-
ности; Vp и Усм — исходные объемы; Sp и SCM — площади сечения
цилиндров. В частности, при равенстве диаметров цилиндров по-
лучается линейная зависимость вида
PV = Рем + (рр — Рем) v — •
*р 'I *см
Экспоненциальный градиент сахарозы образуется в том слу-
чае, если объем жидкости в смесителе остается постоянным
(рис. 53). Жидкость из бюретки или делительной воронки (/)
поступает в смеситель (2) по мере вытекания из него смеси.
Шприц нужен для того, чтобы создать в полости смесителя пер-
воначальное давление воздуха, уравновешивающее гидравличе-
ский напор столба жидкости в бюретке. В этом случае при от-
крывании крана бюретки жидкость не начнет поступать в смеси-
тель до начала вытекания из него смеси в пробирку. Этот же
шприц используют для заполнения трубочки сифона. Возможны
и другие конструкции, в том числе и описанные выше сообщаю-
щиеся цилиндры, у которых смеситель закрыт пробкой. При этом
можно использовать магнитную мешалку, так как уровень жид-
кости в смесителе не имеет значения.
Если в смесителе находится более плотный раствор сахарозы,
то градиент будет вогнутым (рис. 53, я), а если менее плотный —
выпуклым (б). В обоих случаях крутой участок изменения плот-
ности находится в начале формируемого градиента. Вариант я
с заполнением пробирки по стенке используют для торможения
тяжелых частиц при подходе ко дну пробирки. Вариант б с за-
полнением через иглу со дна удобен для разделения близких по
скорости оседания зон. На крутом участке градиента, вблизи ме-
ниска, они сужаются, а на более пологом — лучше расходятся
между собой.
Экспоненциальный градиент используют и для создания изо-
кинетических условий центрифугирования в более длинных про-
бирках, чем у ротора SW50.1. Его расчетными параметрами в
этом случае являются концентрации растворов сахарозы в сме-
сителе и резервуаре (бюретке), а также объем смесителя. Чем
меньше этот объем по сравнению с полным объемом градиента
(Ю, тем круче изменяется градиент на начальном участке.
Объем жидкости в бюретке роли не играет — он только должен
быть больше, чем объем пробирки. При равенстве объемов сме-
сителя и пробирки форма градиента лишь незначительно отли-
чается от линейной. Однако конечная концентрация смеси будет
ненамного больше (в отличие от описанного выше линейного гра-
диента), чем средняя величина между концентрациями раство-
ров в смесителе и резервуаре. Заметная крутизна градиента об-
наружится при соотношении VCM/Vn=’/t. При этом конечная кон-
центрация смеси будет близка к концентрации раствора в резер-
вуаре (рис. 54).
217
Рис. 52. Формирование нелинейных градиентов плотности растворов в сооб-
щающихся цилиндрических сосудах разного диаметра (см. текст)
Рис. 53. Устройство для создания экспоненциального градиента плотности
раствора (см. текст)
Z — резервуар; 2 — смеситель
Для предварительного расчета формы градиента можно вос-
пользоваться следующим выражением:
__
РУ = Рр — (Рр — Рем) в ,
где ру — плотность смеси после вытекания объема V; рр и рсм—
соответственно плотности растворов в резервуаре и в смесителе;
— объем смесителя.
218
Рис. 54. Влияние объема смесителя (/— Рис. 55. Заполнение пробирки
5 мл; 2—20 мл) на форму экспоненциаль-
ного градиента плотности раствора
Наслоение препарата на градиент
При осуществлении этой ответственной операции нужно До-
биться того, чтобы препарат лег на градиент ровным тонким сло-
ем, и не допустить его смешения с верхними слоями градиента.
Наслаивать препарат удобно из пипетки с насаженным на нее и
оттянутым до малого диаметра полиэтиленовым наконечником.
Пробирку лучше слегка наклонить (градиент от этого не постра-
дает). Наконечником пипетки надо коснуться мениска градиен-
та, а затем отвести его по стенке пробирки немного вверх, оста-
вить влажный след, и затем уже по нему медленно спускать пре-
парат, постепенно отодвигая наконечник так, чтобы он оставался
чуть выше поверхности слоя препарата (рис. 55). В этой опера-
ции целесообразно попрактиковаться, используя окрашенный
раствор такой же плотности, как у препарата.
Тонкостенная пробирка должна быть перед центрифугирова-
нием заполнена почти доверху (нужно лишь оставить свободны-
ми примерно 3 мм от края для захвата ее пинцетом). Если объем
градиента мал, то поверх препарата с указанными предосто-
рожностями наслаивают парафиновое масло (р=0,89 г/см’).
Толстостенные пробирки можно заполнять не до конца, но при
этом нагрузка на их стенки (в силу неидеальной цилиндрично-
сти) оказывается столь велика, что срок службы сокращается, и
никогда нельзя заранее предсказать, когда пробирка может раз-
рушиться. Поэтому надежнее заполнять доверху пробирки и это-
го типа. В отношении ухода за пробирками, способов стерили-
зации и постоянного наблюдения за деформацией или появлени-
ем трещин остаются в силе все рекомендации, изложенные выше
для пробирок угловых роторов.
Перед установкой пробирки в бакет надо обязательно удосто-
вериться в том, что она сухая снаружи и в бакете нет влаги.
В противном случае, как уже указывалось, может произойти
«прилипание» пробирки к стенке бакета. Если это все-таки про-
изошло, не следует вытаскивать пробирку силой — это повлечет
за собой смешивание градиента. Лучше провести «фракциони-
219
рование» градиента одним из описанных ниже способов, не вы-
нимая пробирки из бакета. Надо следить также за чистотой по-
садочного гнезда самого ротора и конца вала электродвигателя
в камере центрифуги. Ротор должен выниматься из камеры лег-
ко, без рывка, который может привести к нарушению градиентов
в пробирках.
Следует внимательно следить за температурой. Нежелатель-
но допускать изменения температуры градиента после его фор-
мирования. Все растворы, смеситель градиента, бакеты и сам ро-
тор следует выдерживать при температуре центрифугирования
перед созданием градиента и установкой пробирок на место.
Если это неудобно, то, по крайней мере, после формирования
градиента надо дать ему уравновеситься (одновременно с рото-
ром) при температуре центрифугирования в течение не менее
чем трех часов, а потом уже наслаивать препарат, выдержанный
при той же температуре.
В самом начале центрифугирования следует задать центри-
фуге минимальное ускорение (см. главу 2). Именно в процессе
набора скорости чаще всего происходит смешивание слоя препа-
рата с верхней частью градиента, в результате чего существенно
ухудшается разделение зон. Останавливать центрифугу при
фракционировании в градиенте плотности следует без торможе-
ния. Рабочую скорость центрифугирования, как правило, выби-
рают максимально допустимой для данного ротора с учетом
плотности раствора. Для сахарозы это в большинстве случаев
несущественно: ее плотность достигает значения 1,2 г/см3 лишь
при концентрации 45%. Работа на максимальной скорости поз-
воляет уменьшить продолжительность центрифугирования и рас-
ширение зон за счет диффузии.
Фракционирование («раскапывание») градиента
В препаративных опытах, когда зоны хорошо видны (напри-
мер, рибосомы — по мутности), можно сверху пастеровской пи-
петкой с загнутым под прямым углом кончиком отсасывать «пу-
стые» слои раствора сахарозы и — одну за другой — разделив-
шиеся зоны. Другой, также достаточно грубый способ состоит в
прокалывании пробирки иглой шприца сбоку, непосредственно
под зоной, и отсасывании ее.
Для аналитических целей это непригодно. Вначале широко
практиковалось «раскапывание» градиентов при помощи иглы,
которой протыкали дно тонкостенной пробирки. Этот простой
способ имеет ряд недостатков. Во-первых, при свободном паде-
нии капель из иглы их размер меняется по мере изменения плот-
ности вдоль градиента и отсчет равного числа капель не обеспе-
чивает равенства объемов фракций. Между тем это существенно
для определения положения зон и расчета констант седимента-
ции. Можно, разумеется, между иглой и коллектором фракций
поставить перистальтический насос и тем обеспечить постоянство
220
скорости вытекания жидкости из пробирки, но в самом насосе
неизбежно некоторое перемешивание градиента. Во-вторых, ха-
рактер течения жидкости у дна пробирки к скошенному кончику
иглы не может быть симметричным, что приводит к некоторому
размыванию зон. Наконец, есть опасность попадания осадка со
дна пробирки в первые фракции градиента и засорения им иглы.
Второй распространенный ва-
риант — отсасывание градиента
со дна через опущенную сверху __
иглу с ровно обрезанным кон- “
цом — тоже не очень хорош: гра-
диент, как и в предыдущем слу-
чае, проходит через насос. Кроме
того, внутри иглы он движется в
«обратном направлении» — более
плотные слои оказываются выше,
чем менее плотные, что приводит
к их некоторому перемеши-
ванию.
Рис. 56. Устройство для фракцио-
нирования градиента плотности
методом вытеснения
Лучше всего вытеснять гра-
диент вверх, подавая более плот-
ную жидкость через иглу на дно
пробирки. Для сбора градиента
на пробирку надевают кониче-
ческий колпачок, заканчивающийся трубкой (рис. 56). В каче-
стве вытесняющей жидкости можно использовать 55—60%-ную
сахарозу, однако концентрированные растворы сахарозы очень
вязки, что создает некоторые трудности. Норвежская фирма
«Nyegaard» разработала и выпускает под торговым названием
«Maxidens» специальную жидкость, обладающую рядом ценных
свойств. По плотности (1,9 г/см’) она не только превосходит лю-
бой раствор сахарозы, но и сравнима с насыщенным раствором
CsCl (см. ниже). В то же время вязкость ее — такая же, как у
воды. «Maxidens» не смешивается с водными растворами и со-
вершенно инертна по отношению к биологическим материалам,
неводным растворителям, иногда используемым для создания
градиентов плотности сахарозы, а также к материалам проби-
рок. Ее можно использовать многократно, а в случае загрязне-
ния промывать водой, с которой она затем легко расслаивается.
При комнатной температуре «Maxidens» хранится сколь угод-
но долго. Вытесняющую жидкость можно подавать насосом
с постоянной скоростью, а фракции в коллектор отбирать по
времени. Ввиду некоторой пульсации тока жидкости от пери-
стальтического насоса лучше воспользоваться шприцем с ме-
ханической подачей от электродвигателя. Можно подавать вы-
тесняющую жидкость и из бюретки порциями, равными выб-
ранному объему фракций.
Недавно предложено очень простое устройство для отсасыва-
ния градиента в направлении от мениска ко дну через плаваю*
221
Щую нейлоновую .пробку с трубочкой в середине [Olenick, Lo-
renz, 1979]. Надежной апробации оно еще не прошло.
Обнаружение полос (зон, пиков) в случае достаточной кон-
центрации в них белков или нуклеиновых кислот нередко ведут
по поглощейию света в ультрафиолетовой области спектра. Для
частиц иногда удается регистрировать мутность в диапазоне
длин волн 500—600 нм. Желательно, чтобы трубки, идущие от
пробирки с градиентом к проточной кювете денситометра и, да-
лее, к коллектору фракций, во избежание смешивания градиен-
та в них были по возможности короткими и тонкими. Объем про-
точной кюветы также должен быть небольшим. Движение жид-
кости по кювете и трубкам должно происходить снизу вверх —
опять-таки во избежание образования участков «обратного гра-
диента», где более плотная жидкость окажется над менее плот-
ной. Разумеется, это справедливо для тех случаев, когда фрак-
ционирование градиента начинают от мениска. В случае отсасы-
вания со дна пробирки, наоборот, жидкость в трубках и кювете
должна течь сверху вниз.
Для определения радиоактивности вносят аликвоты из каж-
дой фракции прямо в сцинтиллятор или подсушивают их пред-
варительно на фильтрах. В том случае, когда из-за малой радио-
активности в сцинтиллятор приходится вносить значительный
объем, следует иметь в виду, что в тритон-толуольных сцинтил-
ляторах сахароза может выпадать в осадок или образовывать
двухфазную систему со значительным тушением. В этом случае
лучше использовать смесь Брэя на основе диоксана и нафталина.
Детектирование с помощью определенной химической или
ферментативной реакции может потребовать удаления среды, в
которой проводилось центрифугирование. Сахароза при высокой
концентрации, например, ингибирует активность многих фермен-
тов. Удалить ее можно диализом или гель-фильтрацией.
При препаративном фракционировании ДНК зонально-ско-
ростным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
можно для подбора режима воспользоваться предварительной
окраской ДНК бромистым этидием. Центрифугирование затем
можно прервать и наблюдать положение зон ДНК в пробирке,
освещая ее ультрафиолетовым светом (336 нм). После отделения
зон бромистый этидий экстрагируют бутанолом [Raafat-El-Ge-
wely, Helling, 1980].
Определение плотности во фракциях сахарозного градиента
(для водных растворов) можно производить путем измерения ко-
эффициента преломления, пользуясь для расчетов следующей за-
висимостью: р0=2,7329п20—2,6425. В этой формуле коэффициент
преломления п2в измеряют при 20°, а плотность раствора сахаро-
зы рассчитывают для температуры 0°. Расчет плотности может
оказаться необходимым для проверки линейности градиента или
для определения плавучей плотности частиц.
222
ВЫБОР РЕЖИМА ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ
Выше было приведено выражение для константы седимента-
ции частицы. Запишем его еще раз, введя в правую часть множи-
тель 10“ чтобы величину выразить в единицах Сведберга
Sao.w —
t> (Р Pao.w) Чс IQ18
ПаолЛР —Ро)
Х*«гс
Рис. 57. Обозначение радиусов вра-
щения в пробирке бакет-ротора
Здесь v — скорость оседания частицы, см/с; ©—-угловая ско-
рость вращения, рад/с; г — расстояние частицы от оси вращения
(см. рис. 57) ; р — плавучая плот-
ность частицы, г/см’; рс — плот-
ность среды, г/см’; т|о— вязкость
среды, которую можно выра-
жать, например, в сантипуазах,
если в тех же единицах предста-
вить вязкость воды при 20°
(т]20, w); Рао, w — ПЛОТНОСТЬ ВОДЫ
при 20°, г/см*. Проведем^ некото-
рые преобразования и упрощения
этого выражения. С достаточной
степенью точности можно при-
нять, что рм, w= 1 г/см’, а т]20. w=
= 1 сП. Вместо г подставим эк-
вивалентное ему выражение
Гмин (г/Гкжв). Величину со* выра-
зим в тысячах оборотов в мину-
ту (Л7), а скорость оседания v — в
в знаменатель введем множитель
формулу для s20,w и преобразовав ее, найдем уравнение скоро-
сти оседания частицы:
сантиметрах в час, для чего
3600. Подставив все это в
о = 4-
Мин
г(р — Рс)
/mim(P ~' 1) Лс _
Выражение в квадратных скобках (обозначим его а) — без-
размерная величина, так как в числителе дроби подразумевается
еще и г]!01Т=1 сП. Для частиц с известной плотностью (р), вы-
бранного линейного градиента концентрации сахарозы и опреде-
ленного ротора (для которого известны гмжв и г^) значение а
в любой точке градиента легко рассчитать с помощью табл. 1, в
которой даны значения плотности и вязкости растворов сахаро-
зы. Если разбить всю длину градиента от гя„ до гиако на равные
участки и подсчитать а для’ промежуточных точек, можно по-
строить график изменения скорости оседания частиц данного
типа при центрифугировании в данных условиях вдоль всего гра-
диента.
223
Для выбора условий центрифугирования путем приближен-
ного расчета можно построить номограммы, применимые для ре-
шения большинства практических задач такого рода. Разнооб-
разие возможных вариантов эксперимента следует ограничить
разумным набором стандартных условий. Например, для сахаро-
зы можно ограничиться следующими диапазонами концентрации
(в %): 5—20, 5—30, 10—25, 10—35, 15—30 и 15—40. Три из них
Таблица 2. Характеристики бакет-роторов с длинными пробирками
Ротор гмин, CM г макс, ом г макс !г мин Максималь- ное'центро- бежное ус- корение, g Ем- кость пробир- ки, мл Число проби- рок Длина пробир- ки, мм
SW25,2 6,7 15,2 2,27 107000 60,0 3 89
SW27 (SW28) 7,5 16,1 2,14 131000 38,5 6 89
SW27.1 (SW28.1) 6,8 16,8 2,15 135 000 17,0 6 102
SW40 Ti 6,7 15,9 2,37 284 000 14,0 6 95
SW41 Ti 6,6 15,2 2,30 286 000 13,2 6 89
(с интервалами в 15%) обеспечивают, как будет видно из даль-
нейшего, почти изокинетический характер градиентов. Три дру-
гих (с интервалами в 25%) обусловливают значительное замед-
ление оседания частиц по мере их приближения ко дну пробир-
ки. Условия для проведения опыта с использованием других диа-
пазонов концентраций можно приближенно оценить путем со-
ответствующей интерполяции предлагаемого набора номограмм.
Выберем два наиболее удобных значения температуры: 5 и
20°. Для плавучей плотности частиц можно ограничиться тремя
значениями: 1,3, 1,4 и 1,5 г/см3. Из приведенных выше данных
следует, что значения р для любых белков и нуклеиновых кислот
лежат вблизи одного из этих значений. Выбор плотности, как
будет видно далее, не сильно влияет на характер соответствую-
щих кривых. В оценочных расчетах вполне можно принимать,
что для белков р=1,3 г/см3, для ДНК—1,4, а для РНК—1,5.
На первый взгляд, серьезные затруднения должны возникнуть
' ввиду разнообразия набора бакет-роторов. Однако если ограни-
читься роторами с длинными пробирками («Beckman-Spinco»),
которые разработаны именно для фракционирования в градиен-
те плотности, то окажется, что гмян и гмакс у них меняются незна-
чительно (табл.2).
Еще меньше изменяется отношение гма11С/гиия, определяющее
диапазон значений г!гкаа в выражении для а (от 1 до гмаис/г„ин)-
Это позволяет провести все построения для одного «обобщенно-
го» ротора, достаточно хорошо представляющего любой из при-
веденных в таблице. Примем для него значение гма,ге/гмин = 2,25.
Для расчетов разобьем градиент на пять частей, выбрав следую-
224
Рис. 58. Изменение скоростей осе-
дания частиц по длине пробирки
при центрифугировании в различ-
ных градиентах плотности раство-
ров сахарозы (см. текст)
а — 5—20%; 6-5-30%; в 10—25%;
г- 10-35%; д - 15-30%; с - 15-40%;
верхние пучки кривых — при температу-
ре 20°, нижние —5°; верхняя кривая
каждого пучка соответствует плотности
1,5, средняя — 1,1, нижняя — 1,3 г/см3
щие значения г/г^ 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 и 2,25. Сферичностью
дна пробирки для этих оценочных расчетов можно пренебречь.
Теперь в нашем распоряжении имеются все данные для по-
строения номограмм зависимости величины а от местоположения
частицы и характера градиента сахарозы. Местоположение час-
тицы будем характеризовать отношением x/L (х—расстояние,
пройденное частицей от мениска, L — длина пробирки). Величи-
на а входит в простое выражение, описывающее изменение ско-
рости оседания частицы при ее движении вдоль градиента: v =
= 4-10~6 s20,w№rMlina. Константа седиментации частиц при выбо-
ре режима центрифугирования предполагается известной (хотя
бы ориентировочно). Значение гмпп определяется выбором ротора
(табл. 2). Значение N (в тысячах оборотов в минуту) задает
экспериментатор. Существенно, что ни одна из этих трех величин
нс зависит от характера градиента сахарозы и положения части-
цы в пробирке. Поэтому ход кривых для а на номограммах
(рис. 58) описывает характер изменения скорости движения час-
тицы вдоль выбранного градиента в любом из перечисленных
выше роторов, независимо от размеров этой частицы (ее кон-
станты седиментации) и числа оборотов центрифуги. Эти вспомо-
8 Л. А. Остерман
225
гательные номограммы не нужны для выбора параметров (ско-
рости и продолжительности) центрифугирования, поэтому они
даны в мелком масштабе. Однако их качественное сопоставление
позволяет уяснить многие особенности оседания частиц в различ-
ных градиентах сахарозы и сделать ряд важных выводов.
1. Ни один из градиентов не является строго изокинетическим
(ему бы отвечала горизонтальная прямая). Вместе с тем изме-
нения скорости для относительно пологих градиентов, с интер-
валом концентраций в 15%, невелики (жирные линии). Во всех
случаях при таком интервале скорость движения частиц от ме-
ниска сначала несколько повышается за счет увеличения радиу-
са, затем немного снижается за счет нарастания вязкости рас-
твора. В целом эти два фактора компенсируют друг друга, и
скорость оседания частиц у дна пробирки примерно такая же,
как у мениска жидкости.
2. Для относительно крутых градиентов (с интервалом в
25%) скорость оседания частиц снижается за счет быстрого на-
растания вязкости почти по всей длине градиента, За исключени-
ем небольшой области вблизи мениска. У дна пробирки скорость
оседания частиц примерно в 2 раза меньше, чем у мениска.
3. Температура сильно влияет на скорость оседания, прежде
всего за счет значительного увеличения вязкости растворов са-
харозы при пониженной температуре (см. табл. 1).
4. Чем в более высокой области концентраций сахарозы ле-
жит интервал, тем, естественно, меньше скорость оседания. При
переходе от интервалов, начинающихся с 5%, к интервалам, на-
чинающимся с 15%, скорость уменьшается примерно в 1,5 раза.
5. Различия плотности препаратов сказываются слабо й всег-
да одинаково: более плотные частицы движутся быстрее. Раз-
личия в скорости более заметны к концу градиента.
Подчеркнем еще раз, что все эти выводы относятся к харак-
теру изменений скорости оседания частиц. Абсолютное значение
этой скорости определяется константой седиментации и особенно
сильно зависит от числа оборотов ротора (№).
Время, необходимое для достижения частицей определенного
положения в пробирке, т. е. определенного значения г, может
быть выражено интегралом:
/ f <
J V
гиин
Здесь t выражено в часах, если г—-в сантиметрах, a v — в сан-
тиметрах в час.
Располагая кривыми изменения скорости вдоль градиента,
можно провести графическое интегрирование. Величины s2»,w и
№ не зависят от г и войдут в виде делителей в окончательную
формулу, которую, подставляя выражение для v, запишем в сле-
226
дующем виде:
10б s
$ №
где 2 =
1 С dr_
0’4ГМИН 01
гмин
Величина гмин введена в знаменатель множителя, стоящего
перед интегралом, чтобы параметр 2 тоже получился безразмер-
ным. Таким образом, единственный оставшийся параметр «обоб-
щенного ротора» — Гмин — вообще не входит в окончательное вы-
ражение для времени центрифугирования t. Физически это озна-
чает, что одну и ту же долю длины пробирки частицы проходят
за одно и то же время (при прочих равных условиях) в любом
бакет-роторе, отвечающем требованию «обобщения» (гманс/гмин =
= 2,25). Действительно, чем больше гмин, тем выше начальная
скорость оседания, но тем больше и абсолютная длина пробирки,
равная 1,25 гмия.
Изменения параметра 2 по длине пробирки «обобщенного ро-
тора» приведены на рабочих номограммах для выбранных ранее
градиентов (рис. 59). На оси абсцисс по-прежнему указана доля
длины градиента (длины пробирки минус 3 мм, на которые ме-
ниск жидкости отстоит от ее верхнего края), обозначенная x/L.
Несмотря на ряд. допущений, эти номограммы с успехом могут
служить для расчета продолжительности центрифугирования,
если выбрана скорость вращения ротора (N), примерно известна
константа седиментации (s20,w), выбран градиент и задано поло-
жение частицы по его длине к моменту окончания центрифугиро-
вания. По положению частицы (в долях длины или объема гра-
диента) из соответствующего графика легко найти значение 2
и рассчитать t по приведенной выше формуле.
Естественно, что все кривые начинаются от нуля и идут толь-
ко с нарастанием, которое для градиентов 5—20 и 10—25% прак-
тически линейно. Для градиента 15—30% заметно отклонение
от линейности из-за некоторого замедления движения частиц
вблизи дна пробирки. Для градиентов с интервалом концентра-
ций в 25% нелинейность выражена явно: при приближении ко
дну пробирки скорость оседания частиц снижается существенно,
особенно для градиента 15—40%.
Как и следовало ожидать, кривые для р=1,3 г/см’ лежат
выше, чем для р = 1,5 г/см3 (менее плотные частицы движутся
по градиенту медленнее).
При фракционировании частиц с относительно близкими зна-
чениями s20,w следует воспользоваться одним из пологих гради-
ентов с интервалом концентраций в 15%.
Последовательность расчета такова. Выбирают конечное по-
ложение на градиенте частиц с наибольшим значением s20,w. Оп-
ределяют параметр 2 и по нему время центрифугирования t для
максимально возможной скорости вращения ротора N. Затем из
той же формулы по уже найденным значениям Nat для констан-
227
8*
—---1 _---2 ----3
Рис 59. Номограммы для расчета времени центрифугирования (/) в различ
ных градиентах плотности растворов сахарозы (см. текст)
/ - 1,3; 2—1,4; з- 1.5 г/см3
228
Рис. 59 (продолжение)
229
ты седиментации наиболее легкой частицы рассчитывают пара-
метр 2 и по нему из графика находят положение этой частицы в
пробирке к моменту окончания центрифугирования. Если разре-
шение покажется недостаточным, можно попытаться сделать гра-
диент еще более пологим (с интервалом в 10%). Для этого слу-
чая нет графиков, но можно представить, что скорость движения
частицы вдоль градиента будет возрастать почти на всем его
протяжении и более тяжелая частица «убежит» от более легкой
за время центрифугирования. Однако не надо забывать об умень-
шении устойчивости такого градиента в отношении конвекции.
Если окажется, наоборот, что различие в константах седимента-
ции фракционируемых частиц столь велико/что легкие частицы
не успеют заметно удалиться от мениска, когда наиболее тяже-
лые уже приблизятся ко дну, то следует воспользоваться одним
из более крутых градиентов (с интервалом в 20 или 25%).
В первом приближении эти же номограммы можно исполь-
зовать для оценки неизвестной величины s20)W по положению час-
тицы на градиенте в результате центрифугирования. Это поло-
жение позволяет определить по номограмме значение парамет-
230
15~40°/о сахарозы
Рис. 59 (окончание)
231
pa S, а поскольку время центрифугирования t и скорость враще-
ния N известны, то из той же зависимости легко найти, что
10»S
Здесь t измеряют в часах, N — в тысячах оборотов в минуту.
Можно, наоборот, предсказать положение на градиенте час-
тицы с известной константой s20,w после центрифугирования в оп-
ределенных условиях. Для этого достаточно рассчитать величи-
ну S = s20]S^№- 10_s и с помощью соответствующего графика опре-
делить конечное положение частицы (x/L).
Для более точного определения s20,w, как уже указывалось,
следует воспользоваться истинно изокинетическим или почти изо-
кинетическим (линейным с интервалом концентрации в 15%)
градиентом и одним или двумя «маркерами».
Можно построить номограммы, подобные приведенным, но бо-
лее точные, для определения s20,w без маркера, по положению
частиц в результате центрифугирования в линейном градиенте
сахарозы. В этом случае их следует строить отдельно для каждо-
го ротора и наперед условиться о заполнении полусферического
дна пробирки «подушкой» определенного объема, не участвую-
щей в формировании градиента плотности раствора сахарозы.
Сам градиент тоже должен иметь строго определенный объем.
Все эти ограничения не слишком обременительны, но не следует
забывать, что при «раскапывании» градиента точность определе-
ния положения пиков соответствующих зон не очень высока, так
что определение значений s20>w с точностью, превышающей ±5%,
вряд ли реально.
НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ
В ГРАДИЕНТАХ САХАРОЗЫ
С помощью предложенных выше подходов проанализируем
несколько описанных в литературе примеров использования зо-
нально-скоростного центрифугирования в градиентах сахарозы с
точки зрения выбора режима. Одновременно составим представ-
ление о порядках значений скорости и продолжительности цен-
трифугирования в наиболее типичных случаях фракционирова-
ния белков и нуклеиновых кислот. Примем следующие приблизи-
тельные значения плавучей плотности (р, г/см3): для белков 1,3;
для ДНП 1,35; для ДНК и РНП 1,4; для РНК 1,5.
Фракционирование рибонуклеопротеидов
Пример 1. Фракционирование мРНК информосом и поли-
сом из мышцы зародыша цыпленка [Jain, Sarkar, 1979}. Исполь-
зовали мРНП из обоих источников после очистки их на оли-
го(дТ)-целлюлозе (р=1,4 г/см3). Ожидаемый диапазон для
гзг
s2o,w —от 10 до 90S—довольно велик. Чтобы весь он уложился
на градиенте, авторы выбрали крутой градиент плотности саха-
розы: 15—40%. Был использован ротор SW40Ti при 5° и частоте
вращения 39 000 об/мин.
Проведем сначала сами расчет времени центрифугирования,
а затем сравним его с тем, которое использовали авторы. Для
частиц с s20>w=90S выберем конечное положение на 0,8 длины
градиента, т. е. x/L=Q,8. Из соответствующего графика (рис. 59)
находим, что 2=10,4. Тогда t= (105-10,4)/90 • 392 = 7,6 ч. Для час-
тиц с s20,w=10S 2=s2l),w/№10“4 = 10-7,6-392-10"4 = 1,15. Из того
же графика находим, что наиболее легкие частицы (10 S) в этом
случае к концу центрифугирования пройдут примерно 0,1 длины
градиента,— это вполне приемлемо.
Авторы работы центрифугировали в течение 7 ч.
Пример 2. Фракционирование РНП из ядер печени лягуш-
ки [Maxwell, Fischer, 1979]. В работе использовали градиент са-
харозы 10—30%, центрифугировали в роторе SW27.1 с частотой
26 000 об/мин при 2° в течение 9 ч. Посмотрим, где должны ока-
заться в конце центрифугирования частицы с константами седи-
ментации 10 S и 90 S.
Для s20,w=90 S найдем, что 2=90-9-262-10-4=5,4. В приве-
денных номограммах нет кривых, отвечающих градиенту 10—
30%. Для приблизительной оценки проведем на графике (см.
рис. 59) кривую, идущую ниже, чем кривая для градиента 10—
35% (5°; р=1,4), но выше, чем соответствующая кривая для
10—25% сахарозы. Эта грубая интерполяция позволит найти от-
носительное положение 90S частиц на градиенте: x/L = 0,7. За-
метим, что, свободно варьируя построение этой вспомогательной
кривой в этих пределах, мы не сможем значительно удалиться от
найденного значения x/L. Это видно и из того, что для градиента
10—35% и 2=5,4 мы определили бы x/L = 0,64, а для градиента
10—25% xjL=Q,lb. Отсюда следует, что для качественной оцен-
ки ситуации точность предлагаемого графического метода впол-
не достаточна.
Для s20,w—10S (2=0,6) аналогичным путем найдем: х/£ =
= 0,1. Сравнивая этот результат с предыдущим примером, мож-
но заключить, что при меньшей скорости вращения ротора, ис-
пользовав более пологий градиент в области несколько меньших
концентраций сахарозы и увеличив время центрифугирования до
9 ч, авторы получили примерно такое же распределение частиц
по градиенту. Однако если бы они центрифугировали в течение
И ч, то распределение было бы еще лучше (для 10 S частиц
x/L = 0,12, а для 90 S — 0,8).
Здесь уместно отметить достаточно большую свободу выбора
условий зонально-скоростного центрифугирования и возмож-
ность их широкого варьирования в разумных пределах. Важно
лишь обоснованно оценить эти пределы — порядок значений ско-
рости и продолжительности центрифугирования, а главное —
выбрать наиболее удобную форму градиента сахарозы. К тому
233
же, такая оценка освобождает экспериментатора от стремления
точно и без критического осмысливания копировать описанные в
литературе условия эксперимента, как видно из следующего при-
мера.
ПримерЗ. Полупрепаративное разделение 40S и 60S субъ-
единиц рибосом животного происхождения [Martin et al.,
1971]. Условия центрифугирования: ротор SW27 (6x38,5 мл),
градиент 10—30% сахарозы, частота вращения 27 000 об/мин,
температура 4°, продолжительность 8 ч.
Проверка, аналогичная описанной выше, показывает, что
60S субъединицы в этом случае не доходили даже до середины
пробирки, а расстояние между пиками составляло примерно 0,15
длины градиента. Если задать для 60S субъединиц положение
х/Е=0,8, то следовало бы центрифугировать 14 ч. При этом рас-
стояние между пиками 40S и 60S увеличилось бы примерно до
0,25 длины градиента, но они расширились бы за счет диффузии.
По-видимому, надо признать неудачным выбор градиента. Для
относительно близких значений s20,« субъединиц (их отношение
равно 1,5) следовало бы выбрать градиент 5—20% сахарозы, тем
более что исходный препарат у авторов растворен в водно-
солевом буфере без сахарозы. В этом случае после 8 ч центри-
фугирования при той же скорости пики субъединиц занимали
бы на градиенте положения, соответствующие примерно 0,5 и
0,75 его длины.
Пример 4. Фракционирование полисом разного размера из
печени крысы [Ramsey, Steele, 1976]. Для полисом плавучую
плотность можно считать равной 1,4 г/см3. При переходе от
моносом ко все более крупным полисомам значение s20,M возра-
стает от 80S нелинейно: для димеров s20lffi= 123S, для триме-
ров— 154S. Прирост все время уменьшается, и для декамеров
sM,e=316S, а не 800S. Причина этого в том, что константа
седиментации вообще увеличивается не пропорционально массе
частицы s2o,»=AAf°-38). Кроме того, крайние рибосомы в длин-
ной полисоме оседают почти независимо друг от друга. В пре-
дельном случае, при отсутствии связи между рибосомами, вся
их совокупность характеризовалась бы значением $2о,ш = 805.
Ясно, что центрифугировать следует недолго, чтобы моносо-
мы оставались в начале пробирки, а в конце ее еще находились
к моменту окончания опыта частицы с $20,ш порядка 400S. Для
ротора SW27 хорошо бы взять градиент, близкий к изокинетиче-
скому, но в области относительно больших плотностей раствора
сахарозы, так как отношение крайних значений константы
седиментации значительно (400:80=5). Для градиента 15—
30% сахарозы на холоду и максимального числа оборотов
ротора (27 000 об/мин) прикинем время центрифугирования,
обеспечивающее продвижение 400S частиц на 0,7 длины гради-
ента (чтобы увидеть и «хвост» разделения — крупные полисомы,
не разделившиеся на отдельные пики). Из соответствующего
графика (см. рис. 59) для x!L=Q,l найдем 2 = 6,5, а из основ-
234
ной формулы /=2,2 ч. При этом оказывается, что для моносом
х/Л = 0,13, что вполне удовлетворительно.
В цитируемой работе использовался истинно изокинетиче-
ский градиент сахарозы (см. выше) 15—27,8%. В этом градиенте
тяжелые полисомы в нижней части пробирки будут оседать
несколько быстрее, чем в линейном градиенте 15—30%, так что
понятно, почему авторы работы остановились на продолжитель-
ности центрифугирования, равной 1,75 ч. Полученный ими
А260
Рис. 60. Профиль фракциони-
рования полисом печени крысы
центрифугированием в гради-
енте плотности раствора саха-
розы [Ramsey, Steele, 1976]
0 12 24 Дно
Объем градиента, мл
профиль фракционирования свидетельствует о хорошем разде-
лении (рис. 60).
Иногда для разделения полисом используют более крутой
градиент сахарозы (15—40% или 0,5—1,5 М, т. е. 16,1—43%).
В этих случаях центрифугируют при частоте вращения ротора
SW41Ti около 40 тыс. об/мин в течение такого же времени
(примерно 2 ч).
Фракционирование РНК
Пример 5. Фракционирование суммарной РНК [Panasci
et al., 1977]. Если необходимо при одном центрифугировании
разделить весь набор РНК от 4S до 28S (1:7), то следует вос-
пользоваться крутым градиентом с интервалом концентраций в
25% (например 10—35%) при максимальной скорости враще-
ния ротора SW40TL
Авторы работы именно для такого градиента и этого ротора
использовали следующий режим центрифугирования:
30 000 об/мин, 14 ч при 4°. Этот выбор режима представляется
неудачным. Оценочные расчеты с помощью номограмм (р =
= 1,5 г/см3) показывают, что для 28S РНК х/А=0,45, а для 4S
0,06.
Лучше всего было бы предварительно отделить 4S и 5S
РНК от 18S и 28S РНК методом гель-фильтрации.
Пример 6. Очистка поли(А)-РНК [Mansson et al., 1979].
Предполагаемая константа седиментации для поли (А)-РНК —
около 10S. В качестве маркера для уточнения этой величины
выбрали рибосомальную 18S РНК. В первом варианте авторы
использовали градиент 5—20% сахарозы и 0,01 М Трис-НС!
(pH 7,6) с 5 мМ ЭДТА и 1% ДДС-Na (последнее — во избежа-
ние агрегации), ротор SW41Ti, ускорение 176000 g, продолжи-
235
тельность центрифугирования 22 ч при 20°. Для оценки выбора
этих условий с помощью номограммы придется сначала по
центробежному ускорению определить частоту вращения ротора.
Ускорение принято указывать по дну пробирки. Максимальное
значение центробежного ускорения при частоте 41 тыс. об/мин
для ротора SW41Ti равно 286 000 g (из фирменного описания).
Отношение скоростей вращения равно квадратному корню из
отношения центробежных ускорений. Отсюда следует, что
авторы использовали ротор при частоте вращения 32 тыс. об/мин
(JV=4iy 176/286). Следовательно, для указанных в работе усло-
вий опыта и s20,m = 10S 2 =з2(),Д№10-5= 10-22-322-10_s = 2,25.
Из графика (см. рис. 59) для градиента 5—20% при 20° и р=
= 1,5 находим, что x/L=0,66. Это вполне приемлемая точка гра-
диента, и положение пика ria приведенном в работе профиле от-
вечает расчету. Однако маркер (18S РНК) при этом практически
окажется на дне пробирки.
Во втором варианте авторы использовали более широкий (и
крутой) интервал концентраций сахарозы (5—25%) и растворяли
ее в буфере на основе 70%-ного раствора деионизированного
формамида («денатурирующий градиент»). При тех же значени-
ях частоты вращения ротора и температуры центрифугирование
пришлось вести 54 ч (вместо 22 ч). Поли (А)-РНК оказалась в
середине пробирки, зато оба маркера (5S и 18S РНК) хорошо
видны на градиенте. Использование формамида для полного
«разворачивания» всех молекул РНК (полной денатурации)
повышает точность определения «2(),и с помощью маркерных
РНК, однако за это приходится «расплачиваться» чуть ли не
трехкратным увеличением продолжительности центрифугирова-
ния ввиду значительного увеличения плотности и вязкости
среды.
Чистый формамид при 20° имеет вязкость (rj) 3,76 сП и плот-
ность (р) 1,334 г/см3. В первом приближении можно считать,
что эти значения для водных растворов формамида изменяются"
(от г| = 1 и р=1 для воды) пропорционально его концентрации.
Для 70%-ного раствора формамида в воде можно ориентировоч-
но считать т]=2,92 сП, а р= 1,234 г/см3. Если сопоставить эти
значения с табличными данными для водных растворов сахаро-
зы, можно видеть, что такую же вязкость имеет 29%-ный раствор
сахарозы, а плотность — д'аже 50%-ный раствор. Между тем в
данном случае вязкость и плотность раствора формамида накла-
дываются на аналогичные параметры раствора сахарозы. Этот
градиент по-прежнему необходим для предотвращения конвек-
ции и замедления оседания тяжелых частиц. Данные для более
точной характеристики растворов сахарозы в водных растворах
формамида отсутствуют, но рассмотренные результаты (увели-
чение времени центрифугирования в 3 раза для 70%-ного раст-
вора формамида) могут служить отправной точкой при эмпири-
ческом подборе оптимальных условий центрифугирования.
286
В качестве другого денатурирующего агента используют
диметилсульфоксид .(ДМСО). В чистом виде он также обладает
повышенной вязкостью и плотностью по сравнению с водой
(при 20° т) = 2,473 сП, а р = 1,1 г/см3), однако этот прирост не
столь велик, как при использовании формамида, поэтому
иногда используют градиент сахарозы, растворенной в 99%-ном
ДМСО. Так, в одной из работ [Harpold et al., 1979] было про-
ведено фракционирование РНК в градиенте 5—20% сахарозы,
растворенной в 99%-ном ДМСО (1% использовали для внесения
Триса и ЭДТА). Центрифугирование в роторе SW27 при макси-
мальном числе оборотов и температуре 29° заняло 70 ч. Фракци-
онирование РНК в аналогичном градиенте сахарозы, но раство-
ренной в 50%-ном водном растворе ДМСО, заняло 24 ч при
частоте вращения ротора (SW40Ti) 40 тыс. об/мин и темпера-
туре 20°.
Таким образом, следует иметь в виду, что введение высоких
концентраций денатурирующих агентов (формамида и ДМСО)
заставляет увеличить продолжительность центрифугирования в
2—4 раза.
Фракционирование ДНК
Нативную ДНК можно фракционировать или очищать в нейт-
ральном градиенте сахарозы, растворяя ее в 0,01 М трисовом
или фосфатном буфере, содержащем 0,1—0,15 М NaCl 1 мМ
ЭДТА и 0,1% саркозила. Последний необходим для уменьшения
сорбции ДНК на стенках пробирки.
Пример 7. Фракционирование ДНК после осторожного
фенолом в присутствии дезоксихолата (ДОХ) с последующей
выделения из клеток L 1210 (Kiper et al., 1979]. ДНК выделяли
экстракцией из интерфазы парааминосалициловой кислотой с
0,5 М NaCl без осаждения этанолом. Такая обработка позволи-
ла получать ДНК с константами седиментации 13—60S.
Фракционирование вели в градиенте 5—20% сахарозы при
38 тыс. об/мин (ротор SW40Ti) и комнатной температуре в те-
чение 3,25 ч. Проверка распределения по градиенту с помощью
номограмм при р=1,4 г/см3 и 20° дает для крайних значений
указанного диапазона s2o>«> значения хЩ равные 0,18 и 0,85 со-
ответственно.
При обычном выделении получают нативную ДНК с интер-
валом значений s2M 10—30S. Ориентировочно режимы центри-
фугирования в этом случае можно принять такими же, как при
фракционировании РНК рибосомных субъединиц: градиент 5—
20% сахарозы, температура 20°, время центрифугирования
5—6 ч при 40 тыс. об/мин и И —13 ч — при 27 тыс. об/мин. Это
время указано для линейной двунитевой ДНК. Кольцевая двуни-
тевая ДНК в виде свободного кольца (с разрывом в одной из
нитей) оседает быстрее, чем линейная. Еще быстрее оседает
кольцевая сверхскрученная ДНК в присутствии высокой кон-
центрации соли (~ 1 М NaCl).
237
Щелочной градиент сахарозы используют для денатурации
ДНК, обнаружения скрытых разрывов, оценки истинных разме-
ров «развернутой» молекулы ДНК. При pH 12,1—12,3 линейные
молекулы ДНК денатурируют, а плазмиды сохраняют свою
двунитевую кольцевую структуру. Щелочные градиенты обычно
получают, растворяя сахарозу в 0,1—0,3 М NaOH с 0,7—
0,9 М NaCl. В этих условиях денатурируют любые двунитевыё
структуры. Сверхскрученные ДНК могут сохранить нативность
в 0,1 М NaOH, если концентра-
цию соли снизить до 0,15 М. По-
видимому, соль при высокой кон-
центрации вызывает диссоциа-
цию от ДНК остаточых белков,
скрепляющих двунитевую струк-
туру.
Для щелочных градиентов не-
желательно присутствие ионов
Mg2+, Са2+ и РО43_ : Mg выпада-
ет в осадок в виде Mg(OH)2 и за-
хватывает ДНК, Са2+ и РО4’~
взаимодействуют с ДНК, замет-
Рис. 61. Обнаружение фрагментов
Оказаки центрифугированием в
градиенте плотности щелочного
раствора сахарозы [Okazaki,
1971]
но увеличивая ее константу седи-
ментации. Ввиду этого в щелоч-
ные градиенты, как правило, вво-
дят 1 —5 мМ ЭДТА.
Чаще всего используют гради-
ент 5—20% сахарозы. Скорость и
время центрифугирования зависят от полимерности ДНК.
Пример 8. Очистка бактериальной ДНК [Rupp, Howard-
Flanders, 1971]. Протопласты бактерий наслаивают прямо на
щелочной градиент 5—20% сахарозы, растворенной в 0,3 М
NaOH с 0,7 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Происходит лизис, свободная
от белка бактериальная ДНК денатурирует и быстро оседает.
В роторе SW 50.1 при 40 тыс. об/мин и 20° центрифугирования
длится 1 ч.
Легко подсчитать, что ДНК с s20,w= 100S пройдет за это
время около 3 см по пробирке длиной 5,1 см.
Для ДНК с константой седиментации около 20S (ДНК
ФХ174, SV=40 и др.) режимы центрифугирования примерно
такие же, как в нейтральном градиенте: 12—15 ч при 25—
27 тыс. об/мин и температуре 20° й 18—24 ч — при 5°. При
40 тыс. об/мин продолжительность центрифугирования соответ-
ственно уменьшается.
Пример 9. Обнаружение фрагментов Оказаки [Okazaki,
1971]. Бактерии получали импульсную метку *Н-тимидином
продолжительностью от 2 с до 2 мин. Анализ размеров новосин-
тезированной (меченой) ДНК проводили центрифугированием в
щелочном градиенте 5—20% сахарозы в 0,1 М NaOH с 0,9 М
NaCl и 1 мМ ЭДТА; ротор SW 27.1. При 25 тыс, об/мин и 4е
23в
центрифугирование длилось 16 ч. Как видно из рис. 61, на гра-
диент хорошо укладывались как пик фрагментов Оказаки
(s2o,m= 10S), так и зрелая ДНК, фрагментированная в широком
диапазоне (20—60S).
Пример 10. Малые фрагменты ДНК после переваривания
ДНКазой I [Hell et al., 1972]. Разделение проводили в очень
пологом щелочном градиенте 5—10% сахарозы центрифугиро-
ванием в бакет-роторе MSE (6Х 14 мл) при 24,5 тыс. об/мин и
20° в течение 36,5 ч. Молекулярную массу фрагментов рассчиты-
вали, используя соотношение: а20)Ш = 0,0528 М°>*. Для нейтральных
градиентов и нативной ДНК соответствующая зависимость
[Studier, 1965] имеет вид: s20,B = 0,0882 M°-S‘e.
* * *
В заключение еще раз отметим, что выбор режима зональ-
но-скоростного центрифугирования в градиенте плотности
растворов сахарозы достаточно свободен. Изменение продолжи-
тельности центрифугирования на ±20%, как правило, не очень
сильно меняет характер фракционирования. Важно лишь пра-
вильно оценить соотношение значений з2,,ш разделяемых компо-
нентов в препарате, диктующее выбор крутизны градиента
сахарозы. Затем для максимально допустимой скорости имею-
щегося в распоряжении бакет-ротора (с длинными пробирками)
с помощью номограмм следует найти ориентировочную продол-
жительность центрифугирования. Ее можно затем уточнить
после первого пробного опыта.
Если нет необходимости центрифугировать на холоду, следует
предпочесть работу при 20°. Качество разделения от этого
практически не страдает, так как усиление диффузии компенси-
руется сокращением продолжительности опыта. Между тем
расход рабочего ресурса центрифуги уменьшается почти вдвое.
В начале главы были указаны причины относительно редкого
использования глицерина для создания градиентов плотности
при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его
недостатком является более высокая вязкость растворов по сра-
внению с растворами сахарозы той же плотности. Однако не-
давно повышенная вязкость концентрированных растворов
глицерина была использована для фракционирования относи-
тельно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его
микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6—
76% (по объему) глицерина при 130 000 g в течение 16 ч. Про-
филь олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно рас-
пределялся по этому градиенту [Rennie, 1979].
230
Глава 6
Рис. 62. Гауссова кривая
распределения плотности
в полосе препарата при
равновесном центрифуги-
ровании (см. текст)
РАВНОВЕСНОЕ (ИЗОПИКНИЧЕСКОЕ)
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Идея метода состоит в создании такого градиента по длине
пробирки, чтобы плотность у дна была больше, чем у наиболее
плотных, а у мениска — меньше, чем у наименее плотных частиц
фракционируемой смеси. При достаточно длительном центрифу-
гировании частицы будут двигаться вдоль градиента до тех пор,
пока не достигнут положения, в котором
плотность среды равна их плавучей плот-
ности. Движение прекратится, частицы
разной плотности расположатся в различ-
ных участках градиента, т. е. будет осуще-
ствлено их фракционирование по плотно-
сти.
По крайней мере, пять особенностей
такого разделения можно предсказать
сразу.
1. Процесс центрифугирования должен
быть длительным, так как при подходе к
положению равной плотности (изопикни-
ческому положению) частицы будут дви-
гаться замедленно.
2. Вязкость среды вследствие этого яв-
ляется нежелательным фактором.
3. Размеры частиц и, следовательно, их масса не скажутся
на окончательном распределении. Положение на градиенте
определяется только их плотностью, хотя начальная скорость
миграции из области иной плотности градиента будет больше у
тяжелых частиц.
4. Частицы будут двигаться к положению равновесия как из
области более низкой плотности градиента, чем их плавучая
плотность, так и из области более высокой плотности. Таким
образом, наряду с седиментацией, может происходить и флота-
ция. Это означает, что нет необходимости наносить тонкий на-
чальный слой препарата и можно даже смешать его со всем
объемом градиента.
5. Из сказанного следует, что при равновесном центрифуги-
ровании допускается более высокая емкость загрузки препара-
том, чем при зонально-скоростном, и нет опасности образования
локальных участков обратного градиента (см. выше).
В области равновесия частицы будут располагаться в виде
полосы, ширина которой определится соотношением процесса
концентрирования за счет седиментации — флотации и процесса
диффузии. Ширина полосы будет тем меньше, чем круче гради-
ент плотности среды (dp/dr) и чем больше масса частиц: с уве-
личением массы уменьшается их склонность к диффузии. Рас-
пределение концентрации вещества в полосе описывается сим-
240
метричной гауссовской кривой (рис. 62). Ее основной параметр —
полуширина полосы (о), которую определяют на высоте, со-
ответствующей 0,607 от максимального значения концентрации
в середине полосы (с0). Математическое выражение гауссов-
ской кривой имеет следующий вид:
(г^г0)я
20
с =-сое ,
где е— основание натуральных логарифмов. При г=г* (см.
рис. 6) получим: c=cj^e.
Теория показывает, что полуширина полосы о связана с
массой сольватированной частицы Mt плотностью р0, крутизной
градиента в центре полосы dp0/dr, угловой скоростью вращения
со, расстоянием от центра полосы до оси вращения г0 и абсо-
лютной температурой раствора (Г) следующей зависимостью:
о2 — *Гр0
(dp0/dr) toV0
где R — универсальная газовая постоянная.
Из этого соотношения, зная условия центрифугирования
(со, Г), положение центра полосы (г0) и параметры градиента
в нем (р0, dpo/dr), по полуширине полосы можно определить
массу частицы. Следует иметь в виду, что при этом опеделяют
массу сольватированной частицы, т. е. молекулы с присоединен-
ной к ней водой, масса которой в иных случаях может быть со-
измерима с собственной массой частицы.
Для предварительной оценки возможности регистрации по-
лосы полезно указать, что концентрация вещества в центре
полосы с0 связана с первоначальной концентрацией его (с) при
исходном равномерном распределении во всем объеме простым
соотношением: со = О,4 Lcja, где L — длина пробирки.
Ширина полосы 2о фигурирует в оценке разрешения двух
близко расположенных полос. Оно может считаться надежным,
если расстояние между вершинами соседних пиков вдвое боль-
ше их ширины, т. е. превышает 4а. Из этого не следует, что раз-
решение полос улучшается с увеличением крутизны градиента
dpo/dr. Полосы действительно становятся уже, но при этом и
сближаются, что увеличивает опасность их смешивания при
«раскапывании» градиента.
СПОСОБЫ ОБРАЗОВАНИЯ
И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ГРАДИЕНТОВ ПЛОТНОСТИ
Из приведенных в предыдущей главе данных следует, что
сахароза и глицерин непригодны для создания необходимого в
этом случае градиента. Плавучая плотность нуклеиновых кис-
лот выше, чем самых концентрированных растворов сахарозы
241
и глицерина. Для белков могут быть найдены варианты, отве-
чающие нужному соотношению плотностей, но лишь с исполь-
зованием очень плотных и вязких растворов сахарозы. Вряд
ли имеет смысл искать другие органические соединения, при-
годные для этой цели. Необходимость их высокой концентра-
ции для обеспечения большой плотности требует очень хоро-
шей растворимости в воде, а это означает высокое содержание
карбонильных и гидроксильных групп, т. е. наличие сильных
межмолекулярных водородных связей и, следовательно, боль-
шую вязкость раствора.
Перспективны элементоорганические соединения, содержа-
щие тяжелые атомы. Для них высокая плотность раствора мо-
жет быть обеспечена при умеренной концентрации. Именно на
этом пути был найден и успешно использован для равновесного
центрифугирования описанный выше метризамид.
Другой подход связан с использованием концентрирован-
ных растворов солей. Они могут быть весьма плотными, не
внося существенных изменений в вязкость среды. NaCl и КС1
не годятся для этой цели, так как составляющие их элементы
принадлежат к числу относительно легких и не могут обеспечить
необходимой плотности растворов. Но уже Nal и KI отвечают
поставленной задаче, также как CsCl, Cs2SO4 и некоторые дру-
гие (в том числе и органические) соли цезия и рубидия. Малая
вязкость растворов солей имеет и отрицательную сторону: она
настолько облегчает их собственную диффузию, что рассчиты-
вать на сохранность в течение длительного времени искусст-
венно сформированного градиента плотности не приходится.
Зато при достаточно больших скоростях вращения ротора сами
молекулы этих солей оседают под действием центробежной си-
лы, создавая градиент плотности, нарастающий от мениска ко
дну пробирки. Формированию такого градиента противодейст-
вует диффузия, идущая от более концентрированных слоев
раствора к менее концентрированным. При достаточной про-
должительности центрифугирования оба процесса приходят в
равновесие и устанавливается стабильный для данной скорости
вращения градиент плотности солевого раствора. Если началь-
ную плотность раствора соли обозначить р0, то после сформи-
рования градиента плотность раствора у дна пробирки будет
больше ро, а у мениска — меньше р0.
Профиль равновесного градиента для раствора любой из
солей определяется конкретными параметрами данного экспе-
римента: начальной плотностью раствора, скоростью вращения
ротора, геометрией ротора и пробирок. Равновесный градиент
не будет линейным, так как центробежное ускорение увеличи-
вается пропорционально радиусу вращения. Теория показы-
вает, что крутизна градиента плотности солевого раствора в
любой его точке, отстоящей на расстояние г от оси вращения
ротора, прямо пропорциональна центробежному ускорению:
dp/dr—<й2г/р0-
242
Как видно из табл. 3, значение коэффициента 0О зависит от
природы соли и начальной плотности ее раствора [Birnie,
1978]. Из сопоставления таблицы и формулы следует, что наи-
более крутой градиент образуют растворы Cs2SO4. Крутизна
градиентов в растворах CsCl при тех же условиях примерно в
2 раза меньше. Растворы KI и Nal образуют еще более пологие
градиенты плотности. Крутизна градиентов повышается с уве-
Таблица 3. Значение коэффициента Ро (X 10~*) для растворов некоторых солей
Ро при 25е, г/см* Соль
CsCl Cs2SO4 RbCl KI Nal
1,05 - 7,90 8,70
1,10 — — — 4,28 5,10
1,15 — — — 3,44 3,80
1,20 2,04 1,06 3,42 2,55 3,19
1,25 *— — — 2;21 2,86
1,30 1,55 0,76 2,76 1,96 2,82
1,40 1,33 0,67 2,25 1,73 —
1,50 1,22 0,64 — — —
1,60 1,17 0,66 — —
1,70 1,14 0,69 — —
1,80 1,12 0,74 — —- —
1,90 1,12 — — — —
личением начальной плотности любого из этих растворов. Для
растворов Cs2SO4 это справедливо только до значения р=
= 1,5 г/см3, но более высокие концентрации растворов данной
соли и не используются (см. ниже).
Крутизна градиента пропорциональна квадрату числа обо-
ротов ротора. Как уже отмечалось, чрезмерная крутизна гра-
диента может приводить к такому сближению соседних полос
фракционируемой смеси частиц, что их раздельное извлечение
после окончания центрифугирования станет затруднительным.
Поэтому в большинстве случаев равновесное центрифугирова-
ние ведут не при максимальной скорости вращения ротора,
хотя при этом и увеличивается продолжительность опыта.
Наконец, из формулы видно, что крутизна градиента нара-
стает в направлении от мениска ко дну пробирки. Это обстоя-
тельство также полезно учитывать при планировании экспе-
римента.
Выражение для dp/dr легко интегрируется, позволяя полу-
чить формулу для расчета абсолютной величины разности плот-
ностей у дна пробирки (рмакс) и на мениске (рмив) после уста-
новления равновесного градиента плотности при данной угловой
скорости вращения ротора (со):
Др — Рмакс рмин в
0)1 (гмако •** гмин)
Ж
243
Природа солевого раствора и его начальная концентрация здесь
учитываются коэффициентом р0, геометрия ротора — величйна-
МИ Гманс И ГМин«
Ввиду нелинейности градиента точка е плотностью раство-
ра, равной начальной (р0), окажется не на середине длины гра-
диента, а несколько ближе ко дну пробирки. Практически это
обстоятельство учитывают следующим образом: выбирают та-
кую начальную плотность раствора соли, чтобы она была не-
сколько больше плавучей плотности тех частиц (макромоле-
кул), полосы которых желательно получить на середине про-
бирки.
Координату (радиус г0) точки с плотностью, равной началь-
ной плотности р0, можно найти из соотношения
„ __ 1 / гмака + гмакс гмин “Ь гмнн
Отметим, что положение этой точки не зависит ни от при-
роды и концентрации соли, ни от скорости вращения ротора.
Отсчитывая от этой точки, можно найти плотность рг в лю-
бой точке градиента г из очевидной зависимости: рг=Рот
+ и2(г2— г02)/2£0. Это выражение выведено для бакет-роторов.
Как будет показано далее, равновесное центрифугирование целе-
сообразнее вести в угловых роторах, но и для них в первом при-
ближении данная зависимость может быть использована.
Для бакет-роторов SW41 и SW65 недавно опубликованы
таблицы и графики для выбора начальной плотности растворов
CsCl, обеспечивающей получение желаемой плотности у дна
пробирки при равновесии, в зависимости от скорости вращения
ротора при температуре 25° [Reicn, Zarybnicky, 1979].
Следует иметь в виду, что профиль равновесного градиента
плотности сохраняется только во время вращения ротора при
расчетном числе оборотов. При замедлении вращения перед
остановкой ротора диффузия уже не уравновешивается центро-
бежными силами. Это особенно проявляется у обоих концов
градиента, в то время как в средней его части наблюдается
определенная компенсация: диффузия соли из какого-либо
среднего слоя в сторону мениска пополняется диффузией в него
из соседнего слоя со стороны дна пробирки. Практически в
срединных трех четвертях длины градиента форма его сохра-
няется вплоть до полной остановки ротора. Именно здесь, а не
вблизи краев градиента, должны располагаться зоны фракцио-
нируемых частиц. Само собой разумеется, что «раскапывать»
равновесный градиент надо немедленно по окончании центри-
фугирования.
Аналогично происходит и образование градиента плотности.
Изменения начинаются также с его концов, где нет компенса-
ции, но уже не диффузии, а оседания частиц. Постепенно эти
изменения захватывают всю длину градиента, как показано на
244
t=0
Рис. 63. Кинетика уста-
новления равновесного
распределения плотности
при длительном ультра-
центрифугировании кон-
центрированного раство-
ра хлористого цезия
серии рисунков (рис. 63). Отсюда следует, что протяженность
градиента (длина пробирки) должна сильно влиять на время,
необходимое для достижения равновесия. Теория показывает,
что это время (/) с точностью до 1 % от идеального может быть
найдено из соотношения /=^(гмакс— гмив)2. Коэффициент про-
порциональности k зависит от вязкости среды, температуры и
природы соли. Для растворов CsCl &=5,6. Если радиусы вы-
ражены в сантиметрах, то t получается
в часах.
Чтобы оценить порядок значений t,
подсчитаем его, например, для бакет-ро-
тора SW50.1, пробирки которого длиной
51 мм целиком заполнены раствором
CsCl. Из данных ротора имеем: гМакс=
= 10,7 см, гиин = 6 см. Подставив эти зна-
чения в приведенную формулу, получим
/=120 ч. Аналогично для ротора SW41T1
можно найти /=400 ч. Однако эти зна-
чения очень велики и не соответствуют
известной практике, когда равновесное
центрифугирование проводят за 40—60 ч.
Здесь нет противоречия, так как равно-
весное центрифугирование, как будет
видно ниже, ведут или в угловых роторах
(где длина градиента намного меньше),
или при неполном заполнении пробирок
бакет-ротора, или же фактически далеко
от равновесного режима (отчего иной раз
и получают плохое разрешение полос).
Следует отметить, что время установления равновесного гра-
диента не зависит от скорости вращения ротора. На первый
взгляд, это кажется парадоксальным. Казалось бы, что при
большей скорости вращения равновесный градиент должен был
бы образоваться скорее. Но вспомним, что при большей скоро-
сти и различие плотностей на концах градиента (Др) должно
быть больше, т. е. процесс расслоения исходного однородного
раствора соли должен пройти дальше, чем при малой скорости.
Есть еще один важный фактор, определяющий выбор про-
должительности центрифугирования. Речь идет о времени, не-
обходимом для миграции молекул вещества к положению рав-
новесия из всего объема градиента, т. е. о времени формирова-
ния полос. При этом в расчетах следует исходить из наихудшей
ситуации, т. е. убедиться, что продолжительность центрифуги-
рования достаточна для миграции наиболее мелких молекул
(с минимальным значением sao,w) от мениска (или от дна) до
их положения равновесия. Точная формула для подсчета вре-
мени миграции (/к) выглядит следующим образом:
= 113Р0(р,-1)
245
Здесь pt и Ti—соответственно плавучая плотность и равновес-
ная координата на градиенте частиц с интересующей нас кон-
стантой седиментации s2o,wi; Af — частота вращения ротора;
тыс. об/мин; t„ — время миграции, г.
Время миграции, в отличие от времени установления гради-.
ента, очень сильно зависит от частоты вращения ротора. И ес-
ли положение частицы на градиенте при равновесии не зависит
от ее размеров, то время достижения этого положения тем
больше, чем меньше размер частицы. Последнее обстоятельст-
во является решающим.
В выражении для tM явным образом не фигурирует длина
градиента (пробирки). Но чем она больше, тем больше разли-
чаются значение плотности градиента у мениска и плавучая
плотйость частицы и, следовательно, тем больше начальная
скорость ее движения по градиенту.
Длительность центрифугирования надо планировать, ориен-
тируясь на большую из двух величин: времени установления
градиента t и времени миграции частиц t„. Ниже это будет про-
иллюстрировано на конкретных примерах.
Вполне может оказаться, что Казалось бы, что в этом
случае положение всегда легко исправить увеличением числа
оборотов ротора, которое входит в знаменатель выражения для
в четвертой степени. Но не следует забывать об одновремен-
ном увеличении крутизны градиента и возможном вследствие
этого ухудшении разрешения полос. Удачным при этом может
оказаться двухстадийное центрифугирование. На первой ста-
дии его ведут при максимальной скорости в течение некоторого
(сравнительно небольшого) времени, достаточно как для фор-
мирования крутого градиента, так и для миграции частиц до
их равновесных положений по плотности. Затем число оборотов
ротора уменьшают до расчетного значения и выдерживают еще
некоторое время, необходимое для перестройки градиента за
счет диффузии на расчетную крутизну. Полосы вещества будут
расходиться по своим местам на этом новом, более пологом
градиенте,' на что потребуется значительно меньше времени,
чем при одностадийном центрифугировании, так как они уже
сформированы.
В целом время,- затраченное на оба этапа, может оказаться
вдвое меньшим, чем при центрифугировании на расчетной ско-
рости в течение всего опыта. При этом необходимо убедиться
в том, что на первом этапе, при центрифугировании на макси-
мальной скорости, не произойдет перегрузки ротора и концен-
трация соли у дна пробирки не превысит предела ее раствори-
мости (р=1,91 г/см3), как было подробно рассмотрено выше.
246
ВЫБОР СОЛИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГРАДИЕНТА ПЛОТНОСТИ
Выбор соли диктуется в первую очередь соотношением плот-
ностей ее концентрированных растворов и плавучей плот-
ности в них белков и нуклеиновых кислот. Плотности насыщен-
ных растворов наиболее часто употребляемых солей высоки:
2,01 г/см 3 для Cs2SOt, 1,91—для CsCl, 1,9 — для Nal и 1,72—
для KI. Вместе с тем ионы этих солей сольватируются — свя-
зывают воду, отнимая ее у биополимеров. Плавучая плотность
последних сильно увеличивается по сравнению с той, которая
Таблица 4. Плавучая плотность биополимеров в растворах солей, г/см3
Биополимер Содер- жание (Г+ Ц), % Соль
CsCl CssSO4 Nal KI
Нативная ДНК
Cl. perfringens 31 1,692 4,421 1,520 1,488
мыши 40 1,700 1,423 1,522 —
Е. coli 50 1,710 1,426 1,535 1,500
М. lysodeikticus Денатурированная ДНК 71 1,731 1,435 1,551 1,512
мыши 40 1,715 1,445 1,574 —
Е. coli 50 1,725 1,450 1,580 —>
РНК
ядер мыши — >1,9 1,640 1,62-1,65 —
рибосом мыши — >1,9 — 1,670 1,620
рибосом Е. coli — >1,9 1,663 — —
рибосом дрожжей — >1,9 — — 1,620
Глобиновая мРНК — >1,9 — 1,680 —
Двунитевая РНК реовируса — >1,9 1,610 1,570 1,570
Гибрид РНК-ДНК — 1,775 1,485 1,540 —
Белки — 1,30-1,33 — — —
Хроматин, фиксированный НСНО 1,384 — — —
Полисомы, фиксированные НСНО 1,51-1,53 — —
Полисомы + 50 мМ Mg2+ — — 1,46-1,48 — —
характерна для них в воде или в растворах сахарозы *. В мень-
шей степени это сказывается на белках, плавучая плотность
которых в концентрированных растворах любой из солей близ-
ка к 1,3 г/см3,, зато плавучая плотность нуклеиновых кислот и
нуклеопротеидов увеличивается весьма существенно (табл. 4)
[Birnie, 1978].
1 Существует точка зрения, согласно которой увеличение плавучей плотности
биологических макромолекул связано еще и с проникновением ионов соли
внутрь сольватных оболочек этих молекул.
247
В t 60
II
g? Л7-
0
a
5 XjMJi
Рис. 64. Сопоставление картин рас-
пределения разных классов нуклеи-
новых кислот при одинаковых режи-
мах центрифугирования в равновес-
ных градиентах плотности растворов
различных солей [Birnie, 1978]
/ — нативная ДНК; 2 — денатурированная
ДНК; 3 -гибрид ДНК-РНК; 4 -РНК;
a — Cs2SO4 (ро^Еб! г/с.м3); б —CsCl (р0—
-1,75 г/см3); в-Nal (ро-1,55 г/см8)
~ рр/см3
1,6
- 1,5
/,4
20
10
> ®
I
20
I
1,6
-1,5
7,4
6
-1,6
/2345
1 °
§ _
s

- 4 7
Из сопоставления данных таблицы с плотностями насыщен-
ных солевых растворов ясно, что осуществить равновесное цен-
трифугирование РНК в градиенте плотности CsCl невозможно,
а в градиенте KI — весьма затруднительно.
Совершенно иная картина наблюдается, при равновесном
центрифугировании биополимеров в растворах метризамида,
который практически йе связывает воду. Плавучая плотность
нуклеиновых кислот в этом случае оказывается в пределах
1,12—1,17 г/см3. Вытекающие отсюда возможности и особенно-
сти равновесного центрифугирования в градиенте метризамида
рассмотрены ниже. Здесь же уместно качественно сопоставить
картины распределения разных классов нуклеиновых кислот в
равновесных градиентах плотности растворов различных солей
при одинаковых режимах центрифугирования (рис. 64). Это
позволит, в частности, еще раз обратить внимание на различия
крутизны соответствующих градиентов, изображенных в одина-
ковом масштабе.
В рассматриваемом случае центрифугирование проводили в
роторе MSE 10X10 Ti при частоте вращения 45 тыс. об/мин
и 25° в течение 68 ч. Вносили по 4,6 мл исходного раствора
соли, содержащего 5—10 мкг меченной по 3Н смеси нуклеино-
вых кислот. Начальные плотности солевых растворов р0 были
выбраны так, чтобы в каждом случае разделить максимальное
число различных классов нуклеиновых кислот. Например, для
градиента Cs2SO4 оно равно четырем: от нативной ДНК до
РНК. При центрифугировании в градиентах CsCl и Nal РНК
оказывается в осадке на дне пробирки. Любопытно различие в
относительном расположении пика гибрида ДНК — РНК для
градиентов растворов солей цезия и Nal. Можно предполо-
248
жить, что здесь сказывается взаимодействие ионов с молеку-
лами гибридной нуклеиновой кислоты [Birnie, 1978].
При использовании концентрированных растворов солей
для создания градиентов плотности необходимо учитывать их
активность в качестве диссоциирующих агентов. Это весьма
существенно при центрифугировании белков (которые могут
денатурировать и выпадать в осадок), но особенно пагубно
влияет на нуклеопротеиды (например, рибосомы), которые дис-
социируют. То же самое относится к мультиферментам и дру-
гим белковым комплексам, состоящим из нековалентно связан-
ных субъединиц. Нуклеопротеиды и белковые комплексы можно
анализировать центрифугированием в солевых градиентах толь-
ко после их предварительной сшивки формальдегидом или глу-
таровым альдегидом, однако это, естественно, несколько изме-
няет их седиментационные характеристики и лишает эти веще-
ства биологической активности.
Еще одно неудобство использования концентрированных со-
левых растворов связано с их способностью осаждать некото-
рые детергенты, в частности ДДС-Na. Его следует заменять
саркозилом, который значительно лучше растворяется в кон-
центрированных растворах солей.
Следует помнить, что в продажных препаратах солей могут
содержаться примеси тяжелых металлов, которые образуют
комплексы с нуклеиновыми кислотами, существенно изменяя
их свойства. Поэтому, если нет уверенности в полной чистоте
соли, ее раствор следует пропустить через колонку хелатной
смолы (например «Chelex-100» фирмы «Bio-Rad»), объем кото-
рой должен быть приблизительно в 10 раз меньше, чем объем
солевого раствора. Во избежание забивания колонки нераство-
ряющимися кристаллами раствор надо предварительно отфиль-
тровать ч^рез стекловолокнистый фильтр GF/С. В градиентный
раствор, как правило, вносят также ЭДТА в концентрации 1 —
10 мМ. Всю посуду рекомендуется промывать водой, очищенной
от следов тяжелых металлов также на хелатных колонках.
С другой стороны, образование комплексов некоторых тяже-
лых металлов (Ag+, Hg2+) с нуклеиновыми кислотами в опре-
деленных условиях носит избирательный характер и может
быть использовано для создания различий в плавучей плотности
разных типов нуклеиновых кислот. Этот и другие приемы це-
ленаправленной модификации плавучей плотности нуклеиновых
кислот (например, путем присоединения некоторых антибиоти-
ков или красителей) будут рассмотрены ниже.
Иногда с целью денатурации и разрушения вторичной струк-
туры белков и нуклеиновых кислот солевые градиенты исполь-
зуют в сочетании с гуанидинхлоридом, мочевиной, формамидом
или диметилсульфоксидом. Эти вещества следует тщательно
очищать от посторонних ионов, пропуская их растворы через
колонку деионизирующей смолы типа AG 501X8. Для нейтра-
лизации неизбежно образующегося при использовании мочеви-
249
ны цианата в состав градиентного раствора вводят буфер (нап-
ример, 10 мМ Трис-НС1).
Ниже рассмотрены особенности каждого из названных соле-
вых градиентов. Различные технические аспекты их приготов-
ления и использования подробно проанализируем на примере
самого распространенного — градиента плотности растворов
CsCl. Затем отметим особенности и принципиальные отличия
других солевых градиентов. Отдельно остановимся на равновес-
ном центрифугировании в градиентах плотности растворов мет-
ризамида.
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ CsCl
Эти градиенты используются в основном для фракциониро-
вания ДНК, реже — для разделения белков или фиксированных
формальдегидом нуклеопротеидов. Иногда их применяют для
очистки малых количеств РНК, оседающей на дно пробирки.
Ниже приведены некоторые значения плотности (р) и коэф-
фициента преломления га (при 25°) водных растворов CsCl в
зависимости от их концентрации в массовых процентах и мо-
лях на литр:
Концентрация: мае. % моль/л р, г/см1 п Концентрация: мае. % моль/л р, г/см1 п
10 0,64 1,079 1,3405 50 4,70 1,582 1,3885
20 1,39 ; 1,174 1,3498 60 6,36 1,785 1,4072
30 2,28; 1,286 1,3607 65,1 7,40 1,910 1,4185
40 3,37 1,420 1,3735 (насыщ.)
Более подробные данные можно найти в справочниках. Для
практических целей вполне достаточно по приведенным здесь
данным построить кривую зависимости плотности от концентра-
ции и пользоваться ею при приготовлении исходного раствора
для равновесного центрифугирования.
Для точного определения плотности по коэффициентам пре-
ломления во фракциях после «раскапывания» градиента (а это
необходимо делать хотя бы из-за искажения градиента в про-
мессе остановки ротора; см. выше) можно пользоваться
следующими соотношениями: р20 = 1О,928гаго—13,593 (при 20°);
р25= Ю,860га25 —13,497 (при 25°). В частности, плотности р=
= 1,7 г/см3 отвечает концентрация 56 мае.%, или 5,65 М CsCl.
Проще всего брать навеску сухого CsCl, численно равную (в
граммах) выбранной концентрации раствора в массовых про-
центах, и добавлять водного буфера до 100 г. Можно пользо-
ваться и насыщенным раствором CsCl. Для этого 700 г CsCl
растворяют с подогревом в 300 мл воды, остуживают до 25° и
сливают с осадка. Если нужно приготовить объем V раствора
CsCl плотностью р, то следует отмерить объем концентриро-
ванного раствора VK= V(p —1)/0,91 и добавить объем буфера
250
V6y$=V—VK. Приготовление растворов первым способом дает
более точные значения р. Если препарат имеется в виде разбав-
ленного раствора в буфере, то расчетное количество CsCl вно-
сят прямо в этот раствор.
При точном определении плотности по коэффициенту прелом-
ления п надо учитывать вклад буфера. Он может быть несуще-
ственным в отношении плотности, но заметным в отношении п.
Следует измерить п буфера и рассчитать п раствора CsCl (в
воде) по соотношению: пСвс1 = нИабл — (n6y*—пв<,ды). До измерения
га во фракциях после раскапывания градиента их не следует
держать в открытых пробирках вследствие испарения воды. Не-
обходимо также внимательно следить за температурой рефрак-
тометра.
Буфер для образования градиента плотности CsCl выбирают
в соответствии с задачей эксперимента. В простейшем случае
это может быть 0,01 М Трис-HCl (pH 7) с 5 мМ ЭДТА.
Преформирование градиента
Для ускорения формирования равновесного градиента кон-
центрации CsCl имеет смысл непосредственно перед центрифу-
гированием провести преформирование градиента в центрифуж-
ных пробирках. Разумеется, это имеет смысл делать только в
тех случаях, когда фракционируют частицы с достаточно боль-
шими значениями s20,w> так что продолжительность центрифуги-
рования определяется именно формированием градиента, а не
миграцией частиц к положениям равновесия.
Сначала выбирают среднее значение плотности р0, например
1,7 г/см3. Затем, в зависимости от предполагаемого различия
плотностей компонентов смеси, задают интервал плотности —
разность ее значений у дна и у мениска градиента после его
формирования, например Др=0,24 г/см’. Объем градиента оп-
ределяется также заранее. Для ротора SW50.1 при заполнении
пробирок целиком можно взять объем 5 мл.
Чаще всего ограничиваются трехступенчатым преформиро-
ванием градиента. Готовят три раствора CsCl плотностью
Ро+Др/2, р0 и р0—Др/2. Равные объемы этих растворов осторож-
но наслаивают один за другим в указанном порядке в центри-
фужную пробирку так, чтобы суммарный объем был равен выб-
ранному объему градиента. Все растворы приготовлены на
одном и том же буфере и содержат фракционируемую смесь
частиц в одинаковой концентрации. Последнее, впрочем, необя-
зательно. Если необходимо очистить препарат и ориентировоч-
ное положение его полосы на градиенте известно заранее, то
Целесообразнее весь исходный материал внести в одну «ступень»
градиента.
Иногда градиент разбивают на пять ступеней. Для выбранно-
го примера — это пять ступеней по 1 мл со следующими значе-
ниями плотности: р1 = р0+Лр/2= 1,7+0,12= 1,82; р2=р0+Др/4=
251
= 1,7+0,06=1,76; р3=р0=1,7; р4=р0-Др/4= 1,7-0,06= 1,64;
р5=р0 — Др/2= 1,7—0,12= 1,58 г/см3.
Легко видеть, что средняя плотность раствора CsCl оста-
нется равной 1,7 г/см3, но ступенчатое преформирование участ-
ков с нарастающей ко дну плотностью растворов в несколько
раз сократит время формирования плавного равновесного гра-
диента по всей пробирке.
Линейный градиент плотности раствора CsCl можно префор-
мировать с помощью такого же смесителя градиента, какой
был описан ранее при рассмотрении градиентов плотности са-
харозы. Тяжелая жидкость должна иметь плотность р0+Др/2,
а легкая р0 —Др/2. Обязательно надо позаботиться о том, чтобы
площадь основания цилиндра, содержащего тяжелую жидкость
(обычно смесителя), была больше площади основания второго
цилиндра (резервуара) в соответствии с отношением плотностей
двух жидкостей. Для приведенного выше примера это отноше-
ние равно 1,82: 1,58=1,15. Можно рассчитать, что для создания
такого соотношения площадей (в случае цилиндров равных
диаметров) в резервуар придется вставить палочку, диаметр ко-
торой равен 0,36 диаметра цилиндра.
Иногда имеет смысл провести преформирование градиента,
заведомо отличающегося от равновесного для выбранной скоро-
сти центрифугирования, и, тем не менее, в нем осуществить
равновесное центрифугирование. Например, можно преформиро-
вать пологий градиент, а частоту вращения ротора задать боль-
шую, но центрифугировать непродолжительное время — так,
чтобы частицы успели собраться в полосу на пологом участке
градиента, прежде чем он успеет измениться. При этом исполь-
зуется уже отмеченное выше обстоятельство: изменения гради-
ента (в соответствии со скоростью вращения) начинаются с
его концов, а средняя часть довольно долго остается неизменной.
Время сохранения преформированного градиента в таких
неравновесных условиях должно зависеть от длины пробирки,
подобно тому как от нее зависит время формирования градиен-
та. Действительно, можно показать, что в центральной трети
пробирки преформированный градиент любого профиля сохра-
нится неизменным в течение времени /с=0,15 (гмакс— гмин)2 (в
часах). Для нормального случая истинно равновесного центри-
фугирования, независимо от использования преформирования,
скорость вращения выбранного ротора однозначно определяет-
ся заданным интервалом плотностей градиента Др. Приведен-
ную выше формулу для Др в практических целях можно пе-
реписать, выразив угловую скорость вращения ротора <о (рад/с)
через число тысяч оборотов в минуту JV(<os= 1,09-104№) следу-
ющим образом:
Др = - 4ии)-
Ро
252
Следовательно,
V2 _ _______Apflo_______
0,545- 104 ’
Для приведенного выше примера Др = 0,24 г/см’, гякке =
= 10,73 см, гмив —5,97 см (ротор SW50.1). Начальному значению
р0=1,7 г/см3 из таблицы для градиента CsCl соответствует
р0= 1,14; 109. Подставляя эти значения в формулу, получаем:
№ — 630, т. е. ?7=У63О~25 тыс. об/мин.
Из графиков фирмы для ротора SW50.1 находим, что такая
частота вращения ротора вполне допустима с точки зрения
перегрузок и опасности кристаллизации CsCl. Если бы мы хо-
тели вести центрифугирование на холоду, то ее следовало бы
увеличить, так как на холоду при равновесии образуется более
пологий градиент, однако из тех же графиков следует, что на
холоду частота вращения 25 тыс. об/мин является предельной
и значение Др = 0,24 г/см3 при р0=1,7 г/см’ в этом роторе по-
лучить нельзя. Пришлось бы пойти на неполное заполнение
пробирок ротора.
Равновесное центрифугирование
в угловых роторах
Только что рассмотренный пример касался бакет-ротора,
однако равновесное центрифугирование в градиенте плотности
растворов CsCl лучше вести в угловых роторах. Рассмотрим
процесс образования градиента в этом случае (рис. 65).
Пусть первоначально пробирка заполнена раствором CsCl
одинаковой концентрации по всему объему. Выделим мысленно
три молекулы 1, 2 и 3, находящиеся на разных уровнях внутри
пробирки. Каждая из них будет испытывать действие центро-
бежной силы, направленной перпендикулярно оси вращения ро-
тора. Пока они находятся вдали от наружной стенки пробирки,
их поведение будет точно таким же, как поведение молекул в
пробирке бакет-ротора. На каждом из уровней начнет формиро-
ваться градиент плотности раствора. В сечениях 1 и 3, удален-
ных от стенки пробирки, со временем установится равновесие
седиментации и диффузии молекул, как было описано для ба-
кет-ротора. Очевидно, что равновесная плотность в сечении 1
будет ниже, чем в сечении 3, поскольку сечение 1 находится
ближе к оси вращения ротора.
Что же будет происходить в сечении 2, прилегающем к стен-
ке пробирки? Следует помнить, что мы имеем дело с ионами
или молекулами (в случае метризамида), не склонными сли-
паться и образовывать осадок на стенке. Под действием центро-
бежной силы они будут стремиться, независимо друг от друга,
соскользнуть вниз по наклонной стенке пробирки. Но внизу
располагается область более высокой плотности раствора, сфор-
мировавшаяся в соответствии с большим значением максималь-
ного радиуса вращения для этого слоя жидкости. Диффузия
253
Рис. 65. Частицы на разных уровнях (/—5) пробирки .углового ротора (см.
текст)
Рис. 66. Сопоставление расслоения жидкости в пробирках бакет-ротора (а) и
углового ротора (б)
Рис. 67. Изменение расположения слоев жидкости в пробирке при вращении
углового ротора
а — исходное положение; б —в неподвижном роторе; в —во вращающемся роторе
идет во всех направлениях, в том числе и вдоль стенки пробир-
ки. Она будет компенсировать соскальзывание ионов и молекул
таким образом, что оба процесса уравновесят друг друга и
в областях жидкости, прилегающих к стенке; на каждом из
уровней установится равновесное значение плотности, соот-
ветствующее максимальному радиусу вращения для этого
уровня. В результате распределение плотностей градиента в
пробирке углового ротора окажется таким же, как в пробирке
бакет-ротора, но как бы послойно сдвинутым в осевом направ-
лении. На рис. 66 ради наглядности это изображено для четы-
рех дискретных зон разной плотности, соответственно заштри-
хованных.
Такое послойное смещение будет реально иметь место в том
случае, если преформировать ступенчатый градиент плотности
в пробирке углового ротора. Начнем, очевидно, с наслаивания
растворов разной плотности в вертикально стоящей пробирке
(рис. 67, а). Затем установим ее наклонно в ротор (рис. 67, б).
Границы раздела слоев разной плотности, очевидно, останутся
горизонтальными. По мере ускорения вращения ротора и нара-
стания центробежной силы более плотные слои жидкости будут
стремиться занять наиболее удаленную от оси вращения часть
объема пробирки, вытесняя оттуда менее плотную жидкость.
Аналогичным образом поведут себя и остальные слои, в каждом
случае уступая удаленную часть объема пробирки более плот-
ному слою жидкости. В результате при достаточно большой
скорости вращения ротора (когда центробежные силы во много
раз превысят силу тяжести) все слои расположатся в том же
порядке, что и вначале,, но границы между ними будут прохо-
дить вертикально (рис. 67, в). Произойдет переориентация слоев.
Если этот процесс пройдет быстро и плавно («разгон» рото-
254
ра), то границы между слоями на какое-то время останутся
четкими. Затем, в ходе вращения ротора при постоянной скоро-
сти, вследствие совокупности процессов диффузии и седимента-
ции границы между слоями исчезнут и установится непрерыв-
ный равновесный градиент плотности раствора. Профиль этого
градиента, как и для бакет-ротора, будет определяться ско-
ростью вращения ротора, исходной плотностью раствора р0 и
значениями гМакс и гмин, которые приводятся в описании угловых
роторов и отсчитываются так, как показано на рис. 68.
Очень часто пробирки углового ротора заполняют плотным
раствором соли не полностью и сверху наслаивают легкое мас-
ло. Это делается как' для того, чтобы избежать перегрузки ро-
тора на максимальной скорости вращения, так и для того, что-
бы исключить из процесса ориентации градиента область про-
бирки, прилегающую к ее крышке, где плавность этого процесса
нарушается. В таком случае все расчеты профиля градиента,
естественно, надо вести исходя из значения гмия для границы
между плотным раствором соли и маслом. Из чисто геометри-
ческих соображений вытекает следующее соотношение:

ГМИНрр — Г МИИ +
dcosa
~~2
sin а.
Здесь d — диаметр пробирки, см; V<> —полный объем пробир-
ки, мл; УРр — объем градиента, мл; а — угол наклона пробирок
в роторе.
Используя эти величины и имея в виду описанную выше
картину вертикального смещения слоев различной плотности,
приближенные расчеты интервала плотностей Др, времени
установления градиента t и времени миграции частиц к поло-
жению равновесия можно проводить по тем же формулам, что
и для бакет-роторов.
Рассмотрим особенности фракционирования препаратов в
угловом роторе. В момент достижения равновесия зоны частиц
будут расположены вертикально (рис. 69, а). В ходе останов-
ки ротора произойдет обратная переориентация всего градиен-
та плотности, а вместе с тем и разделенных зон частиц (рис.
69, б). Зоны при этом не нарушатся. Когда пробирка будет
вынута из ротора и установлена вертикально для раскапыва-
ния градиента, его окончательная ориентация произойдет под
действием силы тяжести, а зоны расположатся горизонтально
(рис. 69, в). Расстояние между зонами при этом увеличится,
что облегчит их фракционирование.
Важно отметить, что из-за наклонного положения пробир-
ки во время вращения ротора длина градиента плотности в
направлении действия центробежной силы будет намного
меньше, чем для пробирки такого же размера в бакет-роторе.
Одновременно площади сечений, перпендикулярных этому нап-
равлению, в частности площади зон частиц, будут соответст-
255
Рис. 68. Обозначение радиусов вращения в пробирке углового ротора (см.
текст)
Рис. 69. Изменение расположения слоев жидкости в пробирке при остановке
углового ротора
а — во время вращения; б — после остановки; в — пробирка, вынутая из ротора
Рис. 70. Переориентация градиента плотности {а — г) при вращении ротора с
вертикальными пробирками
венно больше. Вследствие укорочения градиента его формиро-
вание заметно ускорится, как и время миграции частиц к
положениям равновесия.
Если режимы центрифугирования подобраны так, что из-
менение плотности на всей длине градиента Др одинаково для
углового и бакет-ротора, то зоны частиц в угловом роторе бу-
дут уже и расположатся ближе друг к другу в силу большей
крутизны градиента. Однако переориентация после окончания
центрифугирования переведет их точно в такое же положение,
как в бакет-роторе. Выигрыш во времени центрифугирования
без изменения разрешающей способности метода сочетается
при этом с возможностью использовать большее число проби-
рок одновременно.
Если же начальные плотности солевых растворов (р0),
объемы градиентов и скорости вращения для углового и ба-
кет-ротора одинаковы, то в угловом роторе в силу уменьшения
длины градиента значение Ар будет намного меньше. После
остановки ротора и переориентации градиента картина распре-
деления зон частиц в, угловом роторе будет такой же, как при
центрифугировании в пологом градиенте плотности в бакет-ро-
торе: зоны окажутся сильно раздвинутыми между собой, хотя
256
и будут заметно более широкими. Поэтому для разделения
близких по плотности компонентов смеси частиц предпочитают
использовать угловые роторы. В тех же случаях, когда необ-
ходимо разделить частицы, сильно отличающиеся между собой
по плавучей плотности, преимущество отдают бакет-роторам.
Центрифугирование в роторах
с вертикальными пробирками
Проведенное рассмотрение переориентации градиента в
угловых роторах делает возможным ознакомление с крайним
случаем такой переориентации — в роторах с вертикально стоя-
щими пробирками. Оказалось, что такие роторы имеют опре-
деленные преимущества по сравнению с угловыми и бакет-
роторами. Сначала преформируют градиент плотности и его
слои располагаются горизонтально (рис. 70, а). По мере плав-
ного разгона ротора до частоты вращения 1 000 об/мин слои
градиента переориентируются .так, что в конце концов распо-
лагаются вертикально (б—г). При остановке ротора происхо-
дит обратная переориентация градиента и зон частиц, как и в
случае углового ротора. Даже в этом, крайнем случае ни гра-
диент, ни зоны не искажаются, если остановка ротора произ-
водится достаточно плавно. Преимущество быстроты формиро-
вания равновесного градиента плотности здесь выражено мак-
симально, так как вся длина градиента укладывается в
диаметре пробирки.
Однако ротор с вертикальными пробирками можно успеш-
но использовать и для зонально-скоростного центрифугирова-
ния вместо бакет-ротора. В отличие от углового ротора отно-
сительно тяжелые частицы не будут здесь попадать на стенку
пробирки вплоть до момента прохождения ими всего градиен-
та плотности. Приведенные выше рассуждения о том, что стен-
ка пробирки углового ротора не влияет на образование гра-
диента плотности солевого раствора, не относятся к поведению
фракционируемых частиц при зонально-скоростном центрифу-
гировании, ведь плотность этих частиц заведомо больше, чем
максимальная плотность раствора сахарозы. Попав в любой
части пробирки на ее стенку, частицы, а тем более их агрега-
ты, будут легко соскальзывать по стенке на дно пробирки.
Всего этого не будет в вертикально стоящей пробирке.
После формирования градиента плотности раствора саха-
розы в вертикальной пробирке на него, как обычно, наслаи-
вают раствор исходного препарата. Находясь в растворе саха-
розы малой концентрации, препарат в ходе переориентации
градиента оказывается распластанным вдоль ближайшей к оси
ротора стенки пробирки. Толщина его слоя при этом уменьша-
ется в несколько раз, что способствует лучшему разделению
зон. Для того чтобы к моменту начала осаждения частиц слой
препарата отошел от стенки пробирки и принял оптимальную
форму прямоугольного сечения, на него предварительно наслан-
9 Л. А. Остерман
257
вают небольшое количество буфера или масла, как это практику-
ется для зональных роторов.
Для того чтобы наиболее тяжелые частицы не попали на
дальнюю от оси вращения стенку пробирки, где они могут об-
разовать осадок и не сняться при реориентации градиента, на
дно пробирки предварительно помещают «подушку» из кон-
центрированного раствора сахарозы или максиденса (см.
выше). После окончания центрифугирования и реориентации
тяжелые частицы будут лежать на этой подушке.
Ввиду весьма кардинальной перестройки градиента при
разгоне и остановке использование роторов с вертикальными
пробирками требует особенно плавного протекания этих про-
цессов. В современных центрифугах для этой цели предназна-
чены специальные устройства.
Таким образом, на практике в настоящее время бакет-рото*
ры используют для зонально-скоростного центрифугирования,
угловые — для равновесного, а роторы с вертикальными про-
бирками — как для того, так и для другого. Для сбора осад-
ков при дифференциальном центрифугировании одинаково
пригодны как угловые, так и бакет-роторы, а роторы с верти-
кальными пробирками неудобны: осадок образуется не на дне.
а вдоль образующей цилиндрической части пробирки.
Следует еще раз обратить внимание на важность выбора
материала пробирок для угловых роторов и роторов с верти-
кальными пробирками при равновесном центрифугировании в
солевом градиенте, особенно в том случае, когда градиент за-
полняет лишь часть объема пробирки и на него наслаивают
масло. Нагрузка на пробирку в поперечном направлении ока-
зывается очень значительной и неравномерной. Пробирки из
более жестких материалов (полипропиленовые и поликарбо-
натные) могут трескаться, поэтому предпочтение следует от-
дать прочным и пластичным полиалломерным пробиркам.
Фракционирование и детектирование
равновесных градиентов
Эти операции при равновесном центрифугировании произ-
водятся с помощью тех же приемов, что и при зонально-скоро-
стном. Фракционировать лучше всего вытеснением вверх с ис-
пользованием максиденса. CsCl растворим в хлорной кислоте,
поэтому нуклеиновые кислоты после фракционирования в гра-
диенте CsCl удобно осаждать добавлением НС1О4 до 10%.
При концентрации ниже 2,3 М (30%) CsCl не осаждается даже
при добавлении двух объемов этанола, который осаждает це-
зиевую соль нуклеиновой кислоты. После предварительного
разбавления ее можно перевести в натриевую на колонке со
смолой «Dowex 50>> в Na+—форме.
Некоторые сложности могут возникнуть при определении
радиоактивности во фракциях. CsCl и метризамид являются
сильными тушителями сцинтилляторов на основе диоксана и
258
нафталина, поэтому для них следует йёпользОйать толуоЛ-трй-
тоновые сцинтилляторы. При работе с градиентами плотности
иастворов Cs2SO4 следует учитывать способность иона сульфа-
та осаждать большинство сцинтилляторов. В этом случае
фракции после градиента необходимо разбавлять в 20 раз либо
удалять Cs2SO4 осаждением или гельфильтрацией.
Растворы KI и Nal при внесении в сцинтиллятор требуют
защиты от окисления. .Эти растворы также сильно поглощают
свет в ультрафиолетовой области, мешая денситометрии нук-
леиновых кислот. Зато бромистый этидий не влияет на плаву-
чую плотность нуклеиновых кислот, поэтому в растворах КД и
Nal его удобно использовать для окраски препаратов.
Примеры центрифугирования
в градиентах плотности растворов CsCl
Разделить нативную и денатурированную ДНК простым
равновесным центрифугированием в градиентах CsCl и Cs2SO4
не удается, поскольку различие в плавучих плотностях этих
ДНК слишком мало. Актиномицин D образует комплекс толь-
ко с нативной ДНК, снижая ее плотность, но он присоединяет-
ся предпочтительно к ГЦ-богатым участкам ДНК, что снижа-
ет ценность его использования для разделения однонитевых и
двунитевых молекул.
Пример 1. Очистка высокомолекулярной ДНК из фибро-
бластов человека [Waters, 1979].
Фибробласты лизировали 0,5%-ным раствором саркозила, содержащим
0,5 мМ ЭДТА и 0,2 мг/мл протеиназы К, при 37° в течение 8 ч, очень осто-
рожно депротеинизировали фенолом при pH 8 и диализовали против буфера.
В 4 мл диализата растворяли 5 г CsCl, создавая концентрацию 56,5%, чему
соответствует начальная плотность ро=1,7 г/см8. Смесь заливали в пробирку
углового ротора «Spinco-40», дополняли ее маслом и центрифугировали в те-
чение 40 ч при 37 тыс. об/мин и 20°. Собирали 30 фракций по 0,13 мл. Из каж-
дой фракции отбирали по 10 мкл, осаждали ДНК 50 %-ной ТХУ и определяли
радиоактивность. Плотность раствора CsCl во фракциях определяли с по-
мощью рефрактометра.
Проверим выбор режима центрифугирования. Плотность су-
хого CsCl — около 4 г/см’. Следовательно, 5 г соли занимают
объем 1,25 см’. При растворении объемы можно считать прак-
тически аддитивными. Следовательно, объем градиента Vrp =
= 5,25 мл. Для ротора 40 гМиВ=3,8 см, гМа№=8,1 см, а=26°.
Объем пробирки У0=13,5мл, ее диаметр й=1,6см. Отсюда
минимальный радиус для градиента
— q я । 1,6 cos 26® । 13,5 5,25 . qco с оа.*..
Гмин™, = 3,8 4---------1---——— sin 2bu = 6,26 см,
а время установления градиента /=5,6 (8,1—6,26)’= 19 ч.
Очевидно, это время не лимитирует продолжительности цент-
рифугирования.
259
9*
Подсчитаем время, необходимое для миграции очищенных
молекул ДНК- Ввиду специальных предосторожностей при вы-
делении можно полагать, что s2O,w=20S. Для р0=1,7 г/см’ из
табл. 3 (для CsCl при 25°) находим: р0= 1,14» 10’. Ориентиро-
вочно предположим, что полоса расположена посередине гра-
диента: г=(8,1 + 6,26)/2=7,18 см. Плавучую плотность ДНК
будем приближенно считать равной р0(1,7 г/см’). Подставляя
указанные значения в выражение для оценки времени мигра-
ции, находим:
/м== ИЗ,1,14.10» =466
374 • 7,18» • 20
Это значение примерно соответствует использованному в
опыте (40 ч). Проверим теперь возможность кристаллизации
CsCl у дна пробирки:
Ал _ 0,545-Ю4-^^»-6,26») = 0 174 г/см8
1,14-10»
С учетом нелинейности градиента и с запасом полагаем,
что рмакс=ро+О,1 = 1,8 г/см’; это заведомо меньше, чем плот-
ность насыщенного раствора (1,91 г/см’), так что кристаллиза-
ции можно не опасаться.
Пример 2. Очистка плазмид из Agrobacter tumefaciens
[Currier, Nester, 1976]. Основную массу ДНК бактерии-хозяи-
на удаляли денатурацией при pH 12,2 и переводом в феноль-
ную интерфазу в присутствии 0,5 MNaCl. Плазмидная ДНК не
денатурировала и оставалась в водной фазе. Ее соосаждали с
фосфатом магния, растворяли в 0,1 М ЭДТА и диализовали.
Плазмидная ДНК на этой стадии была еще значительно заг-
рязнена ДНК хозяина. Дальнейшую очистку ее вели центрифу-
гированием в градиенте CsCl с добавлением бромистого этидия,
который сильнее интеркалирует в линейную ДНК хозяина, чем
в кольцевую ДНК плазмид, увеличивая различие их плавучих
плотностей. К 8 мл раствора смеси ДНК в буфере добавляли
8 г CsCl и 0,6 мл раствора бромистого • этидия в воде
(10 мг/мл). Таким образом, концентрация CsCl составляла
48%, чему соответствует начальная плотность раствора р0=
= 1,55 г/см’. Столь малое значение р0 обусловлено снижением
плавучих плотностей ДНК обоих типов (плазмидной— в мень-
шей степени) за счет интеркаляции бромистого этидия, конеч-
ная концентрация которого составляла 360 мкг/мл. Используя
тот же угловой ротор («Spinco-40»), центрифугировали в тече-
ние 50—70 ч при 35000 об/мин и 14°. Полиалломерные пробир-
ки прокалывали сбоку и собирали фракции, регистрируя флю-
оресценцию бромистого этидия при ультрафиолетовом освеще-
нии (360 нм).
Из литературы известно, что различие плотностей линей-
ной и плазмидной ДНК вследствие интеркаляции бромистого
260
этидия может составлять около 0,04 г/см’. Выясним, каков был
интервал плотности градиента в данном опыте, для' того чтобы
сопоставить его с этим значением. Объем сухого CsCl соста-
вил 2 см3, а объем градиента Кгр=8+2+0,6= 10,6 мл. Анало-
гично предыдущему легко найти, что rM,Hq> =5,14 см. Значение
0о для CsCl ц|ри р0=1,55 г/см3 можно найти интерполяцией из
табл. 3: 0О= 1,195-10’. Тогда
Это значение в 5 раз больше, чем ожидаемая разность плотно-
стей плазмидной и хозяйской ДНК, что вполне достаточно
Рис. 71. Разделение плазмидной
ДНК (/) и ДНК бактерии-хозяи-
на (2) равновесным центрифуги-
рованием в градиенте плотности
CsCl [Currier, Nester, 1976]
для хорошего разделения обоих пиков на градиенте, если рс
выбрано приблизительно правильно. С другой стороны, кру-
тизна градиента не слишком велика и различие в 0,04 г/см’
позволит надежно разделить соответствующие зоны. Приве-
денная в работе седиментограмма подтверждает сделанный
прикидочный расчет: рики отстоят друг от друга на 10 фрак-
ций, т. е. на ’/б длины градиента (рис. 71). Из нее же видно,
что можно было бы взять еще меньшее значение начальной
плотности р0 или же уменьшить концентрацию бромистого
этидия. Обычно его добавляют в концентрации 100 мкг/мл.
Проверка показала, что время установления градиента /=49ч.
а время миграции плазмиды /м=30 ч. При расчете была исполь-
зована константа седиментации плазмиды s20,w=36S, опре-
деленная по известной для нее молекулярной массе Af=32-10*
с помощью простой формулы s2o,w=0,0882Alo-3‘e. Однако нет
уверенности, что малые обломки ДНК хозяина за время цент-
рифугирования успеют достигнуть равновесного положения на
градиенте и не будут загрязнять полосу плазмидной ДНК, по-
этому в аналогичной работе [Conrad, Campbell, 1979] от низ-
комолекулярной ДНК предварительно избавлялись осаждени-
ем слоя препарата через 30 мл раствора CsCl плотностью
1,3 г/см3 на «подушку» с р= 1,7 г/см3. Время центрифугирова-
ния подбирали так, чтобы низкомолекулярные обломки ДНК
не успевали достигнуть интерфазы.
Наряду с бромистым этидием, в последние годы для интер-
каляции в ДНК и отделения сверхскрученной плазмидной
261
ДНК используют йодистый пропидий Так, в недавней работе
[Pettijohn, Pfenninger, 1980] равновесным центрифугирова-
нием в градиенте плотности CsCl с начальной плотностью
1,55 г/см3 в присутствии 0,3 мг/мл йодистого пропидия надеж ч
но отделяли сверхскрученную плазмидную ДНК от кольцевой,
несущей единичные разрывы в одной из нитей. Центрифугиро-
вание вели в роторе Ti 50 при частоте вращения 40 тыс. об/мин
в течение 48 ч при 20°.
Пример 3. Разделение ДНК по (Г+Ц)-составу с по-
мощью антибиотика дистамицина A [Tatti et al., 1978]. Этот
антибиотик связывается с ДНК преимущественно по AT-6oira-
тым участкам, снижая ее плавучую плотность. Эмпирическая
формула для определения плавучей плотности ДНК после об-
работки антибиотиком в зависимости от доли общего числа
оснований, приходящейся на гуанин и цитозин,— Д(Г+Ц) —
имеет вид: р=0,4+2,87Д(Г+Ц). Таким образом, для мыши,
у которой Д (Г + Ц)=0,4, ДНК приобретает р=1,55 г/см3, в то
время как у Е. coli, где Д(Г+Ц)=0,5, плотность ДНК р=
= 1,83 г/см3, т. е. различие в плотностях значительно.
В цитируемой работе разделяли 3Н-ДНК Е. coli и 32Р-ДНК
из фага РМ2. Центрифугирование вели в бакет-роторе SW50.1
в объеме 2,5 мл при 36000 об/мин в течение 24 ч при 20°. На-
чальная плотность раствора CsCl составляла 1,63 г/см3, а ра-
бочая концентрация дистамицина А 8 мгк/мл (esej=3,4-10* в
0,02 М. NaCl). Дистамицин А после фракционирования удаля-
ли диализом в течение ночи против 0,01 М. Трис-НС1 (pH 9,5)»
с 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА.
Сходный, но менее выраженный эффект дает антибиотик
нетропсин. Его рабочая концентрация равна 150 мкг/мл (емв=
=2,02 -10*).
Пример 4. Очистка ядерных РНП-частиц из эритробла-
стов утки [Maundrell, Scherrer, 1979].
Из очищенных ядер РНП-частицы экстрагировали при 37* 0,01 М Трис-
НС1 (pH 8) с 0,1 М NaCl и 1 мМ АТФ (АТФ способствует выходу частиц из
ядра). Их собирали центрифугированием при 60 000 об/мин в течение 4 ч и
предварительно очищали зонально-скоростным центрифугированием в гради-
енте сахарозы, собирая фракцию с константой седиментации около 40S. Эту
фракцию переносили в полиалломерные пробирки ротора SW 41, фиксировали
добавлением глутарового альдегида до 6% в течение 1 ч при 0°, а затем сме-
шивали с концентрированным водным раствором CsCl с таким расчетом, что-
бы исходная плотность при центрифугировании составляла 1,5 г/см3, а объем
смеси — 5 мл. Остальной объем пробирки (8 мл) заполняли парафиновым
маслом. Центрифугирование вели при 30 000 об/мин и 25’ в течение 60 ч. Со-
бирали 30 фракций. 40 S РНП-частицы выходили острым пиком в области
р='1,4 г/см3. Аналогичным образом исследовали плавучую плотность рибосом,
а по ней определяли содержание в них белка. Рибосомы фиксировали обра-
боткой 6%-ным раствором формальдегида.
262
Очень большое значение плавучей плотности РНК в раст-
ворах CsCl может быть использовано для очистки малых ко-
личеств РНК от ДНК или белков путем простого центрифуги-
рования через некоторый объем 5,7 М CsCl (р>1,7 г/см3).
Очищенная РНК садится на дно пробирки, а все остальное
|ДНК, белки и др.) остается в супернатанте или над слоем
концентрированного раствора CsCl (Кдрег et al., 1979; Payvar,
Schimke, 1979].
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ Cs2SO4
Как следует из приведенных выше данных о плавучих плот-
ностях, градиенты плотности растворов Cs2SO4 наиболее удоб-
ны для фракционирования РНК. При использовании литера-
турных данных следует внимательно следить за тем, как выра-
жена концентрация Cs2SO4—в массовых процентах или через
отношение массы к объему (m/V). Из приведенных ниже дан-
ных видно, к какой существенной ошибке может привести под-
мена одного способа выражения концентрации другим (значе-
ния р даны для 25°):
Конце мае. % нтрация: m/V, % моль/л Р, г/см’ Конце мае. % нтрация: m/V, % моль/л Р, г/см*
10 10,7 0,30 1,086 40 58,8 1,62 1,469
20 23,8 0,66 1,190 45 70,3 1,94 1,562
25 31,4 0,87 1,257 50 82,2 2,27 1,644
30 39,5 1,09 1,317 64 128,5 3,56 2,010
35 48,5 1,34 1,388 (насыщ.)
Плотность можно вычислить через коэффициент преломления
водного раствора (при 25°) по формулам: р25= 12,120 n2S—
— 15,166 (для р2В= 1,1-=-1,4 г/см3; п25= 1,340-5-1,366), р25=
—13,699п25—17,323 (для р25=1,4ч-1,8 г/см3, м25= 1,366-5-1,396).
Все, что было сказано о выборе, предварительном расчете и
создании градиентов плотности CsCl, относится и к градиен-
там Cs2SO4 — с учетом, разумеется, соответствующих таблич-
ных значений р„ и с поправкой на большую крутизну градиен-
тов Cs2SO4. Равновесное центрифугирование также чаще всего
ведут в угловом роторе.
Неприятная особенность концентрированных растворов
Cs2SO4 состоит в том, что РНК в них может агрегировать и вы-
падать в осадок. Во избежание этого в раствор вводят мочевину
(до 4 М) или диметилсульфоксид (до 10%). В этом случае ана-
лиз распределения плотности после фракционирования градиен-
та затруднен тем, что мочевина неравномерно распределяется по
градиенту, поэтому использование коэффициента преломления
невозможно и приходится обращаться к прямому взвешиванию в
пикнометре.
При планировании и расчете градиента плотности Cs2SO4
ввиду его крутизны особое внимание следует уделить проверке
' 263
вероятности кристаллизации соли у дна пробирки. Контрольных
графиков для Cs2SO4 фирма «Beckman» не дает, поэтому прихо-
дится проводить прикидочный расчет для оценки диапазона
плотности градиента (Др) и значения р у дна пробирки (см. при-
мер 1 для градиента CsCl). Плотность насыщенного раствора
Cs2SO4 при 25° равна 2,02 г/см3.
Допустимая загрузка цезиевых градиентов плотности опреде-
ляется поставленной задачей, и в первую очередь близостью пла-
вучих плотностей разделяемых компонентов смеси. Для ориен-
тировки укажем, что разделение двух типов молекул ДНК, от-
з
Дно Длина пробирки Мениск
Рис. 72. Разделение РНК, ДНК и
белков из ядер фибробластов хо-
мячка равновесным центрифугиро-
ванием в градиенте плотности
CS2SO4 [MacLeod et al., 1979]
7 — РНК (Р-Е66 г/см8); 2-ДНК (1.40
г/см3); 5 —белки (1,23 г/см8)
личающихся по плотности на 0,005 г/см3, в градиенте CsCl и
угловом роторе с пробирками по 10 мл вряд ли удастся осуще-
ствить при загрузке большей, чем 50 мкг ДНК на градиент. В то
же время, при отделении ДНК от РНК в градиенте Cs2SO4 в
таком же роторе суммарную загрузку градиента можно довести
до 5 мг.
Приведем несколько примеров использования равновес-
ного центрифугирования в градиенте плотности растворов
Cs2SOt.
Пример 1. Разделение ДНК, РНК и белков из ядер фиб-
робластов хомячка [MacLeod et al., 1979}.
Очищенные ядра растворяли в 6 М растворе гуанидинхлорида с 10 мМ
ЭДТА, pH 7. При этом все нуклеиновые кислоты диссоциировали от связан-
ных с ними белков. Для уменьшения вязкости производили обработку ультра-
звуком, а углеводы удаляли экстракцией этилацетатом. 2,2 мл ядерного лиза-
та в полиалломерной пробирке ротора SW 50.1 смешивали с 2,8 мл 2,2 М рас-
твора Cs2SO4, содержащего 10 мМ ЭДТА и 9% ДМСО, и центрифугировали
при 35 000 об/мин н 20° в течение 40 ч. Три хорошо разделившиеся полосы
собирали, проколов пробирку у дна (рис. 72). Нуклеиновые кислоты обнару-
живали по УФ-поглощению, белок — по окрашиванию флюоресцамином. Плот-
ность фракции определяли путем взвешивания аликвот по 10 мкл в калибро-
ванных капиллярах.
Проверим опасность кристаллизации Cs2SO4 у дна пробирки
при такой постановке опыта. Исходная концентрация соли при
указанном разбавлении составляет 1,23 М, т. е. 32,8 мае. %. Как
следует из приведенных выше данных, этой концентрации соот-
ветствует начальная плотность р0=1,36 г/см3. Из табл. 3 интер-
поляцией находим, что р0=0,71 • 10’. Пробирки ротора SW50.1 за-
полнены целиком (скорость вращения намного меньше макси-
264
мальной), поэтому гмакг= 10,7 см, rMBH=6 см (из описания рото-
ра). Подставляя эти значения в соответствующую формулу,
находим
. 0,545 - 104 • 35’ < 10,7а - 6«) п , 3
Др = —2----------5—1------— = 0,74 г/см3.
0,71 • 10’
Даже если принять, что в силу нелинейности градиента прирост
плотности от исходного значения р0 к максимальному у дна про-
бирки составляет 0,44 г/см3, то рмаКс= 1,364-0,44= 1,8 г/см3. Это
значение еще далеко от плотности насыщенного раствора Cs2SO4
(2,01 г/см3), способного к кристаллизации.
Кстати, найденное значение Др (0,74 г/см3) позволяет по
достоинству оценить выбор градиента и режима центрифугиро-
вания в рассмотренном опыте. Диапазон плотностей, в который
укладываются все три полосы (считая по основаниям пиков),
составляет примерно 0,5 г/см3, т. е. лишь немногим меньше, чем
весь диапазон плотностей градиента. В результате полосы рас-
пределились по всей длине градиента, обеспечив наилучшее раз-
решение, но ни одна из них не оказалась в опасной близости от
края пробирки.
Пример 2. Разделение фрагментов ДНК фага к.
Двунитевая ДНК фага А хорошо изучена. Ее молекулярная
масса составляет 32 млн. Отдельные участки этой ДНК резко
различаются по содержанию ГЦ-пар.
ДНК дробили по длине в блендоре при 30 000 об/мин до
фрагментов с Ма 1,5 млн. К раствору этих фрагментов в 5 мМ
боратном буфере, pH 9 (5—50 мкг/мл), добавляли HgCl2 до мо-
лярного отношения Hg2* к фосфатам ДНК, равного 0,22. Опти-
мум этого отношения надо подбирать для каждого типа ДНК.
Например, для ДНК фага Т2 отношение Hg2+/P=0,35. Затем
добавляли Cs2SO4 до концентрации 42 мае.%, что соответству-
ет ро—1,5 г/см3. Ионы Hg*+ связываются в указанных условиях
преимущественно АТ-богатыми участками, заметно увеличивая
их плавучую плотность по сравнению со средним для чистой
ДНК-значением р (1,42 г/см3). Центрифугирование вели в ро-
торе <Spinco-50Ti> при 36 000 об/мин в течение 48 ч на холоду.
Фракцию ДНК регистрировали по радиоактивности (она была
мечена 3Н). Получилась четкая картина разделения фрагментов
по содержанию ГЦ-пар. АТ-богатые участки располагались бли-
же ко дну пробирки (рис. 73).
Аналогично, хотя и менее эффективно, можно использовать
ионы серебра. Характер их связывания сильно зависит от pH
среды. При слегка кислых pH Ag+ связывается только с ГЦ-
парами ДНК, а при рН>9,2— предпочтительно с АТ-парами.
К концентрированному раствору ДНК в 5 мМ боратном буфере
(pH 9,2) добавляют AgNOs до молярного отношения Ag+/P=0,4.
затем приливают концентрированный раствор Cs2SOt с таким
расчетом, чтобы конечная плотность составляла 1,5 г/см3, и цен-
трифугируют аналогично предыдущему. Есть указание на то, что
265
добавлять следует именно раствор Cs2SO4. При добавлении су-
хого сульфата цезия высокомолекулярная ДНК может выпадать
в осадок [Cortadas et al., 1979].
Пример 3. Фракционирование по ГЦ-составу с использо-
ванием БАМД. Еще более эффективно (по сравнению с ионами
ртути) использование в тех же целях ртутного производного,
известного под фирменным названием «БАМД»—3,6-бис-(аце-
токсимеркурметил) -диоксан. Оно также преимущественно вза-
Рис. 73. Разделение фрагментов
ДНК фага X по ГЦ-составу рав-
новесным центрифугированием в
градиенте плотности Cs2SO4 в при-
сутствии ионов ртути [Skalka,
1971]
Цифры над пиками — содержание Г+Ц
в процентах
имодействует с АТ-богатыми участками ДНК- Синтез БАМД
описан в литературе [Edsall et al., 1954].
пл ос—CH— Hg—СН2—< У-СН2—Hg—сн— соон
'--о/
БАМД
Сейчас это соединение производится фирмой «Serva»
(BAMD). Образование комплекса БАМД с ДНК идет при энер-
гичном перемешивании их растворов в 0,1 М Na2SO4 с 5 мМ Na-
бората (pH 9,2). Оптимальное молярное отношение БАМД/Р=
= 0,18. Начальная плотность раствора Cs2SO4 должна состав-
лять примерно 1,47 г/см3. В присутствии Na2SO4 и бората соот-
ношение между коэффициентом преломления п25 и плотностью
раствора Cs2SO4 имеет вид: n2S =1,26364-0,07346р.
С использованием БАМД, например, очищали ГЦ-богатую
сателлитную ДНК из тимуса теленка [Cortadas et al., 1977]. Цен-
трифугирование вели в роторе «Spinco-65» при 35 000 об/мин в
течение 60 ч или в роторе «Spinco-ЗО» при 25 000 об/мин в тече-
ние НО ч. Часть ДНК садилась на дно, остальная масса обыч-
ной ДНК располагалась вблизи него и только сателлитная
(ГЦ-богатая) ДНК выходила отдельным пиком вблизи мени-
ска.
Равновесным градиентным центрифугированием в три этапа
удалось разделить сателлитные ДНК из тимуса с плавучими
плотностями (в CsCl) 1,706; 1,715 и 1,723 г/см3. На первом эта-
пе использовали центрифугирование в градиенте Cs2SO4 с уча-
стием БАМД, на втором — с участием ионов Ag+. На третьем
268
^тапе уже хорошо очищенные сателлитные ДНК разделяли рав-
новесным центрифугированием в пологом градиенте плотно-
сти раствора CsCl [Streeck, Zachau, 1978].
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ
ТРИХЛОРАЦЕТАТОВ ЦЕЗИЯ И РУБИДИЯ
Фракционирование РНК в градиентах плотности Cs2SO4 име-
ет ряд недостатков. Уже упоминалось, что высокомолекулярная,
а особенно двунитевая РНК легко выпадает в осадок. Эти гра-
диенты характеризуются большой крутизной: для частоты вра-
щения ротора 45 000 об/мин, р0=1,6 г/см3 и объема градиента
3 мл при равновесии изменение плотности на каждый сантиметр
длины градиента составляет 0,305 г/см3. Однонитевую и двуни-
тевую РНК в таком градиенте разделять не удается.
Нейтральный градиент плотности раствора СС13СООС$ ока-
зывается в тех же условиях намного более пологим — плотность
на длине 1 см изменяется всего лишь на 0,171 г/см3. Максимум
плотности составляет 1,8 г/см3 (4 М CCLCOCs). РНК не осаж-
дается, одно- и двунитевую РНК удается разделить между со-
бой. Раствор трихлорацетата цезия прозрачен при 280 нм. Рибо-
нуклеаза в нем инактивируется, а ДНК и белки отделяются от
РНК.
Для приготовления CCl3COOCs раствор продажного препа-
рата Cs2CO3 титруют трихлоруксусной кислотой до pH 7, проду-
вая азот, обрабатывают в течение ночи активированным углем
при комнатной температуре и фильтруют через миллипоровый
фильтр (0,22 мкм). Затем раствор упаривают досуха в пле-
ночном испарителе, белые иглы растирают в порошок и сушат
до постоянного веса в вакууме над Р2О5 при комнатной темпера-
туре. Для водных растворов при 25° справедливы следующие
соотношения: ра5=7,6232п25—9,1612 и p25=0,1880C-j-1,0012,
где С —молярная концентрация раствора.
Плавучие плотности некоторых биополимеров в водных раст-
ворах CCljCOOCs таковы (в г/см’):
Белок оболочки полиовируса 1,523
ДНК 1,576
Двунитевая (репликативная) РНК полиовируса 1,668
Однонитевая РНК полиовируса 1,758
Для разделения одно- и двунитевой РНК полиовируса с помощью три-
хлорацетата цезия использовали ротор SW 65 Т1 с пробирками по 3 мл, в ко-
торых преформировали градиент, образованный пятью степенями по 0,6 мл с
плотностями 1,805, 1,716, 1,625, 1,535 и 1,445 г/см3 [Burke et al., 1978]. Равно-
весие устанавливалось при частоте вращения 45 000 об/мин за 24—36 ч (без
преформирования — втрое дольше). Полиовирус лизировали инкубацией в
3,9 М растворе CCl3COOCs при 50° в течение 1 ч.
267
Разделение однонитевой и двунитевой РНК происходило
весьма успешно, как видно из приведенной в работе седименто-
граммы. ДНК и белок также хорошо отделялись от двунитевой
РНК- По-видимому, можно отделить и гибрид ДНК — РНК от
ДНК и РНК-
CClsCOORb готовят на основе продажного препарата Rb2COs,
как было описано для CClsCOOCs. При 260 нм концентрирован-
ные растворы CClsCOORb непрозрачны, а при 280 нм 4 М раст-
вор имеет Л280=0,5. Насыщающая концентрация — 5 М. Форму-
лы для выражения плотности (при 25°) через коэффициент пре-
ломления (п) или молярную концентрацию (С) имеют следую-
щий вид: р25==6,5869п25— 7,7805; р25=0,1448С4-1,0045. Диапа-
зон изменения плотности в растворах CClsCOORb— от 1,0 до
1,728 г/см3, а крутизна градиента еще меньше, чем для
CGl'sCOOCs. В указанных в начале раздела условиях она состав-
ляет примерно 0,156 г/см3 на 1 см.
Центрифугирование в градиенте плотности раствора
CClsCOORb было использовано для- разделения денатуриро-
ванной и нативной ДНК [Burke, Bauer, 1977]. Плавучая плот-
ность денатурированной ДНК в растворе этой соли равна
1,675, а нативной—1,498 г/см3. Таким образом, разность плот-
ностей этих ДНК составляет 0,177 г/см3, т. е. более чем в 10 раз
превышает соответствующую разность в растворе CsCl
(0,016 г/см3). Центрифугирование вели в роторе SW65T1 в те-
чение 36 ч при частоте 45000 об/мин и температуре 25°. Гради-
ент объемом 3 мл преформировали из пяти ступеней с плотно-
стями 1,695, 1,635, 1,575, 1,515 и 1,455 г/см3. Разделение натив-
ной и денатурированной ДНК оказалось настолько полным, что
можно рассчитывать на отделение молекул с однонитевыми
участками (несовершенных гибридов ДНК) от чисто двуните-
вых молекул (рис. 74). Весьма вероятна также возможность от-
деления целых кольцевых молекул от молекул с разрывами в
одной из нитей с использованием различий в их склонности к
денатурации.
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ KI и Nal
К преимуществам градиентов KI и Nal относится их большая
емкость, обусловленная отсутствием угрозы агрегации РНК или
ДНК. В каждую пробирку ротора 50 Ti объемом 13,5 мл можно
вносить до 2 мг нуклеиновой кислоты. KI не осаждается этано-
лом, поэтому с его помощью нуклеиновые кислоты можно пере-
водить в осадок непосредственно из фракций градиента. Насы-
щающая концентрация KI составляет около 6,15 М, что соот-
ветствует плотности 1,72 г/см3. Формулы для определения плот-
ности таковы: p2S=0,6996С4-1,0087; p25 = 5,8356n2S — 6,7858;
С=8,2964л25— 11,0818, где С — концентрация KI г/мл [Wolf,
1975]. Плавучая плотность ДНК в концентрированных раство-
268
Рис. 74. Разделение нативной (2) и денатурированной (/) ДНК равновесным
центрифугированием в градиенте плотности трихлорацетата рубидия [Burke,
Bauer, 1977]
Рис. 75. Отделение гибрида ДНК — РНК от РНК равновесным центрифугиро-
ванием в градиенте плотности KI [Cooper, Moss, 1979]
/ — РНК (*Н>; 2-ДНК (МР)

pax KI составляет 1,51, а РНК—1,61 г/см3 [Gonzalez et al.,
1978].
Ввиду сильного поглощения света растворами KI при
А,<280 нм для обнаружения нуклеиновых кислот обычно при-
меняют бромистый этидий. Для качественного обнаружения по-
лос нуклеиновых кислот можно использовать и экстинкцию при
285 нм (в этой области длин волн поглощение раствора KI рез-
ко падает).
Перед определением радиоактивности во фракциях после
центрифугирования KI желательно удалить, так как освобожда-
ющийся из него йод сильно тушит сцинтилляцию. Однако и пос-
ле осаждения нуклеиновых кислот этанолом или ТХУ следы
йода остаются. Фильтры с осадками можно сушить наколотыми
на булавки при 80° в течение 2 ч — при этом йод улетает. Затем
следует смочить фильтр 100 мкл воды и определять радиоактив-
ность в толуол-тритоновом сцинтилляторе.
В качестве примера рассмотрим выделение мРНК, индуци-
руемой вирусом, путем отбора гибридов РНК — ДНК равновес-
ным центрифугированием в градиенте KI [Cooper, Moss, 1979].
Суммарно меченную 3Н-мРНК выделяли из клеток, заражен-
ных вирусом, а 32Р-ДНК — из вируса. Гибридизацию 32Р-ДНК
и 3Н-мРНК вели в условиях образования «R-петель» (80%-ный
формамид с 0,44 М NaCl при 37°), когда ДНК — РНК-гибри-
дизация превалирует над реассоциацией ДНК (предваритель-
но денатурированной). В соСтав гибридов с вирусной ДНК вхо-
дила только вирусспецифическая мРНК, которая таким образом
и отбиралась. После гибридизации 0,5 мл раствора смешивали
с 4,5 мл солевого раствора, полученного растворением 55 г
KI в 50 мл 0,02 М Трис-HCl (pH 7,5), содержащего 10 мМ
В-меркаптоэтанол. Градиент KI устанавливается медленно, по-
этому центрифугирование вели в роторе 50.1 при частоте
35 000 об/мин и 18° в течение трех-четырех дней. Гибрид ДНК—
269
РНК хорошо отделялся от основной массы 3Н-РНК (рис; 75).
Для определения радиоактивности аликвоты по 20 мкл каждой
фракции без переосаждения растворяли в 0,6 мл 0,15 М 0-меркап-
тоэтанола и добавляли 7 мл толуолтритонового сцинтиллятора.
Меркаптоэтанол препятствует окислению KI и освобождению
йода; сам же KI тушителем не является.
Градиенты плотности растворов Nal часто используют для
разделения денатурированной и нативной ДНК. Различие пла-
вучих плотностей этих ДНК в растворе Nal (0,035 г/см3) намно-
го меньше, чем в случае CCl3COORb, но. все же достаточно ве-
лико для успешного их разделения. Однако в отношении емко-
сти градиент Nal превосходит градиент CCl3COORb. Плотность
раствора Nal можно оценить из соотношения: р20=5,ЗЗЗп25—
—6,118 (для р=1,1-4-1,8).
К сожалению, получить чистый препарат Nal значительно
труднее, чем КГ
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ
МЕТРИЗАМИДА
Ввыше была приведена структура молекулы метризамида и
были отмечены основные физико-химические характеристики
его водных растворов. Они не нашли применения для зонально-
скоростного центрифугирования, но все шире используются в ре-
жиме равновесного, поэтому здесь уместно привести более под-
робные данные, характеризующие растворы метризамида:
Концентрация Коэффициент преломления (л1о) Плотность, г/сма Вязкость, сП
m/V, % моль'л при 5° при 20° при 5* при 20е
10 0,127 1,3483 1,056 1,051 2,0 1,3
20 0,253 1,3646 1,111 1,106 2,9 1,6
30 0,380 1,3809 1,166 1,161 4,0 2,3
40 0,507 1,3971 1,221 1,216 6,7 3,6
50 0,638 1,4133 1,276 1,271 11,9 6,0
60 0,760 1,4295 1,331 1,326 25,0 11,0
7п 0,887 2,4458 1,386 1,381 59,0 26,0
80 1,014 2,4620 1,440 1,436 150,0 58,0
Для вычисления плотности раствора метризамида через его
коэффициент преломления, измеренный при 20° (п20), можно
пользоваться следующими соотношениями: р5=3,453п20 — 3,601;
р20 = 3,350п20—3,462. Концентрация, выраженная в виде процент-
ного отношения массы метризамида к объему раствора (zn/V,%),
связана с коэффициентом преломления следующим образом:
С = 613,5лг20 — 817.
Из приведенных данных видно, что плотность растворов мет-
ризамида мало зависит от температуры, в то время как для вяз-
кости зависимость от температуры очень значительна.
Метризамид в отличие от сахарозы и тем более, солей, связы-
вает очень мало воды. Этим обусловлена высокая степень гид-
270
ратании и, соответственно, низкие значения плавучей плотности
нуклеиновых кислот в растворах метризамида (в г/см3):
Нативная ДНК 1,12 60S субъединицы рибосом
Денатурированная ДНК 1,15 (+Mg2+) 1,31
РНК Белки 1,17 1,22—1,27 40S субъединицы рибосом (+Mg3+) 1,2.3
Гликоген 1,25 80S рибосомы (+Mg2+) 1,30
Хроматин (высокомолеку- лярный) 1,2 Полисомы (-[- Mg2+) Мембраны 1,30 1,14—1,26
Хроматин после обработки микрококковой нуклеазой 60S субъединицы рибосом (+ЭДТА) 40S субъединицы рибосом (+ЭДТА) 1,18-1,24 1,21 1,22 Митохондрии Лизосомы 1,14 1,14
Гидратация белков не столь сильно выражена, как в случае
нуклеиновых кислот, поэтому значения плавучей плотности бел-
ков в растворах метризамида примерно такие же, как в раство-
рах сахарозы. О степени гидратированности нуклеиновых кис-
лот можно судить по тому, что их собственная плотность близка
к 2 г/см3 [Cohen, Eisenberg, 1968]. Можно себе представить,
какое количество воды прочно связывается с молекулами нуклеи-
новой кислоты, если их плавучая плотность падает до значений
1,12—1,17 г/см3. Плавучая плотность и степень гидратации нук-
леиновых кислот даже в концентрированных растворах метри-
замида практически такие же, как в воде. Зато в этих условиях
существенный вклад в плотность макромолекул вносят связан-
ные с ними катионы. Это хорошо видно на примере связывания
магния с рибосомами и их субъединицами — плотность стано-
вится значительно выше, чем даже у чистого белка. Любопытно,
что, согласно этим данным, магний связывается в основном с
60S субъединицей рибосомы. Отметим также, что фрагментиро-
вание хроматина микрококковой нуклеазой дает набор фрагмен-
тов разной плотности, что означает разделение хроматина на
участки, связанные с разным количеством белка.
Сопоставляя данные по плавучим плотностям со значениями
плотности растворов метризамида, легко видеть, что плавучие
плотности всех перечисленных биологических объектов перекры-
ваются относительно умеренными концентрациями водных раст-
воров метризамида. Вместе с тем высокая плотность самого мет-
ризамида (2,17 г/см3 — за счет трех атомов йода) придает ему
способность, подобно CsCl или KI, образовывать градиент плот-
ности при длительном центрифугировании и большой скорости
вращения ротора. Отсюда вытекает возможность использования
водных растворов метризамида в качестве среды для равновес-
ного центрифугирования в градиентах плотности. Малая плаву-
чая плотность биополимеров в растворах метризамида, его хи-
мическая инертность и отсутствие диссоциирующего воздействия
дают ему преимущества по сравнению с солевыми растворами.
271
Но есть и недостаток — относительно высокая вязкость раство-
ров метризамида. Градиент его плотности при центрифугирова-
нии образуется медленно. Растворы метризамида при концентра-
ции более 40% настолько вязки, что их вносят не пипеткой, а
шприцем.
Градиент плотности метризамида следует преформировать
ступенчато за сутки до опыта, для того чтобы ступени имели воз-
можность сгладиться за счет диффузии. Зато эти градиенты хо-
рошо сохраняют свой профиль. Например, преформированнЫй
градиент метризамида может сохранять линейность (не отвечаю-
щую его равновесному распределению) в течение десятков часов
центрифугирования.
В угловом роторе, где длина градиента мала, можно обой-
тись без преформирования. Форма равновесного градиента плот-
ности раствора метризамида получается довольно сложной,
близкой к экспоненциальной (из-за вмешательства вязкости).
Иногда она оказывается слишком крутой, поэтому предпочита-
ют преформировать неравновесный линейный градиент, и вос-
пользоваться его устойчивостью для сравнительно непродолжи-
тельного центрифугирования.
При фракционировании нуклеиновых кислот для воздействия
на их плавучую плотность можно варьировать добавки соли и
pH среды. Фракционирование белков в градиентах метризамида
не очень удобно ввиду высокой вязкости необходимых для этой
цели довольно концентрированных растворов метризамида
(40—50% m/V). Особенно ценен метризамид для равновесного
фракционирования нуклеопротеидов, которые в его растворах
не диссоциируют и имеют небольшую плавучую плотность. Мет-
ризамид можно использовать в щелочной среде (pH 12), когда
ДНК денатурирует, и удается, например, изучать распределение
белков по комплементарным нитям молекул ДНК [Russev, Tsa-
nev, 1976].
Для-удаления примесей тяжелых металлов, особенно при
малых концентрациях нуклеиновых кислот, растворы метризами-
да следует очищать на колонках «Chelex-ЮО».
Для иллюстрации возможностей использования градиентов
метризамида приведем три 'примера.
Пример 1. Очистка мРНП из мышцы зародыша цыпленка
[Bester et al., 1980]. Рибосомы и мРНП-частицы осаждали цен-
трифугированием при 200 000 g в течение 5 ч, а затем вводили
метку по белку из 14С-формальдегида в присутствии боргидрида
Na. Препарат вносили в 5 мл 40%-ного раствора метризамида в
0.1 М. КО, содержащем 3 мМ MgCl2, 10 мМ 0-меркаптоэтанола
и 0,01 М Трис-HCl (pH 7,4). Центрифугирование вели в бакет-
роторе SW65Ti на скорости 39 000 об/мин при 4й в течение 54 ч.
При этом, как видно из седиментограммы (рис. 76), градиент
метризамида еще далеко не достиг равновесной формы — измере-
ния коэффициента преломления (п20) во фракциях (по 0,25 мл)
обнаружили горизонтальную площадку в середине градиента.
272
Тем не менее два пика радиоактивности хорошо разделились.
Более плотному пику отвечало значение р = 1,27 г/см’; как раз
такое значение можно было ожидать для рибосом при относи-
тельно малом содержании Mg2+ (3 мМ). Легкая фракция распо-
лагалась на градиенте в положении, где пм= 1,37 и р= 1,13 г/см’.
Последнее значение близко к плавучей плотности РН.К. По-види-
мому, мРНП-частицы в этом случае содержали мало белка.
Пример 2. Исследование плавучей плотности ДНК и хро-
матина печени крысы [Kondo et al., 1979].
Использовался преформированный линейный градиент 10—
60% (m/V) метризамида при 5° с диапазоном плотностей
Дно Номер фракций
Рис. 76. Разделение рибосом (/) и
мРНП-частиц (2) из мышцы зародыша
цыпленка центрифугированием в гради-
енте плотности метризамида [Bester et
al., 1980]
Рис. 77. Изменение плавучей плотности
(р) ДНК (в) и хроматина (б) в раство-
ре метризамида в зависимости от кон-
центрации солей [Kondo et al., 1979]
1 — MgCl,; 2-NaCl
Концентрация соли, М
1,056—1,331 г/см3. Препараты вносили на дно пробирки в 70%-
ном растворе метризамида. ДНК и хроматин всплывали, а бел-
ковые примеси оставались у дна пробирки. Центрифугировали в
роторе SW50 («Hitachi») при частоте 35 000 об/мин. Благодаря
преформированию градиента время центрифугирования можно
было ограничить 12 ч. Форма градиента при этом не успевала
заметно измениться. Плотность определяли рефрактометри-
чески.
Для ДНК, растворенной в 1 мМ Трис-НС! (pH 8), плавучая
плотность р=1,13 г/см3. В присутствии солей (NaCl и MgCh)
эта плотность увеличивалась. Первоначальное снижение плот-
ности ДНК при малых концентрациях NaCl авторы не коммен-
тируют (рис. 77, а). Возможно, что начальный этап связывания
ионов Na+ с ДНК еще характеризуется такой степенью их гид-
дратации, что результирующая плотность натриевой соли ДНК
оказывается даже ниже, чем у ДНК в Трис-буфере. Далее, по-
видимому, решающую роль играет снижение активности воды и
273
степени гидратации молекул ДНК за счет связывания воды при
повышенной концентрации NaCl в растворе. Увеличение плот-,
ности в присутствии MgCl2 естественнее всего объяснить связы-
ванием Mg2+ с ДНК без выигрыша в степени гидратации.
Поведение хроматина в присутствии солей более сложно, так
как связано еще с двумя процессами: конденсацией хроматина в
солевых растворах относительно малой концентрации (5 мМ
MgCl2 или 0,14 М NaCl) и диссоциацией белка от ДНК. Исход-
ная плавучая плотность нефрагментированного хроматина в
1 мМ Трис-HCl (pH 8) составляла 1,165 г/см3 (рис. 77, б). Ход
экспериментальной зависимости для MgCl2 можно объяснить
сменой следующих процессов: конденсации хроматина, диссоциа-
ции белков от ДНК и присоединения Mg2+ к освобожденной от
белка ДНК. Ход зависимости для NaCl обусловлен сначала кон-
денсацией хроматина, а затем диссоциацией белков. Следует от-
метить, что в присутствии метризамида хроматин под влиянием
соли дйссоциирует заметно легче, чем без него. Так, если в 1 М
водном растворе NaCl соотношение белок/ДНК в хроматине со-
ставляет 0,5—0,8, то при высокой концентрации метризамида в
солевом растворе такой же крепости оно падает до 0,05. Отсюда
следует, что концентрацию соли в растворе обязательно надо
учитывать при сопоставлении результатов различных экспери-
ментов, связанных с определением плавучих плотностей ДНК и
хроматина в градиенте плотности метризамида.
Недавно [Murphy et al., 1980] равновесным центрифугирова-
нием в градиенте плотности метризамида удалось отделить но-
восинтезированный, импульсно меченный хроматин от основной
массы хроматина. Новосинтезированный хроматин отличается
более высокой плотностью, что, по-видимому, объясняется более
плотной упаковкой в нем нуклеосом.
Пример 3. Разделение «тяжелой» и «легкой» нитей ДНК
(Russev, Tsanev, 1979]. Меченую ДНК из растущих в присут-
ствии 5-бромдезоксиуридина клеток асцита Эрлиха сначала, во
избежание спутывания, дробили ультразвуком на фрагменты
длиной до 1000 пар оснований. Затем ее денатурировали в 25 мМ
NaOH (pH 12,5) втечение 10—20 мин и 0,5 мл такого препарата
ДНК смешивали с 4,5 мл 22 %-ного раствора метризамида, под-
щелоченного NaOH до pH 11—11,5. Центрифугирование вели в
угловом роторе «Spinco-50 Ti» на скорости 33 000 об/мин при 5° в
течение 72 ч. Таким образом, исходная концентрация метриза-
мида составляла примерно 20%, чему отвечает плотность р0=
= 1,111 г/см3. Фракции по 0,25 мл нейтрализовали и определяли
их радиоактивность. «Легкая» и «тяжелая» ДНК в опыте были
помечены соответственно “С- и 3Н-тимидином. Методами реги-
страции двойной радиоактивной метки были легко выявлены два
достаточно хорошо разделившихся пика исходной и новосинте-
зированной ДНК, меченной 5-бромдезоксиуридином. Их плаву-
чие плотности составляли соответственно 1,10 и 1,12 г/см3. При
частоте вращения 33 000 об/мин равновесный градиент плотно-
274
сти метризамида имеет достаточно пологий профиль, чтобы
обеспечить уверенное разделение пиков однонитевых ДНК, от-
личающихся по плавучей плотности всего на 0,02 г/см3.
Глава 7
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
В ЗОНАЛЬНЫХ РОТОРАХ
В большинстве случаев зональные роторы используют для зо-
нально-скоростного центрифугирования в градиенте плотности
раствора сахарозы на стадии препаративного выделения и очи-
стки макромолекул или частиц из большого объема материала.
При подаче в ротор линейного градиента, т. е. раствора, в ко-
тором концентрация сахарозы увеличивается пропорционально
объему подаваемой жидкости, в нем создается нелинейный —
«вогнутый»—градиент концентрации сахарозы («эффект ра-
диального разбавления»). Это легко понять, если мысленно рас-
смотреть положение внутри зонального ротора двух одинаковых
объемов подаваемого линейного градиента сахарозы, из которых
один взят из начального, а другой — из конечного участка этого
градиента. Каждый из двух одинаковых объемов обусловливает
один и тот же прирост концентрации сахарозы (условие линей-
ности подаваемого в ротор градиента). В цилиндрической про-
бирке бакет-ротора этим одинаковым приростам плотности соот-
ветствуют и одинаковые участки длины пробирки, так как сече-
ние ее неизменно. Градиент оказывается линейным по длине,
вдоль пути миграции молекул. В зональном же роторе двум оди-
наковым объемам соответствуют цилиндрические слои разной
толщины: большей близ центра и меньшей у его периферии.
Это означает, что один и тот же прирост концентрации сахарозы
будет растянут во внутренней зоне градиента и сжат вблизи на-
ружной стенки ротора. Иначе говоря, градиент плотности будет
характеризоваться увеличением крутизны своего профиля при
переходе от внутренней зоны к периферической, т. е. будет вог-
нутым. В целях получения более близкого к линейному профиля
градиента в ротор подают иногда не линейный, а выпуклый (нап-
ример, экспоненциальный) градиент сахарозы (см. выше).
Так, для препаративного разделения рибосомных субъединиц
в зональный ротор Ti-15 подавали экспоненциальный градиент са-
харозы [Sypherd, Wireman, 1974]. В смесителе постоянного объе-
ма (700 мл) находился раствор сахарозы с концентрацией 7,4%,
а в резервуаре —50%-ный раствор. Объем градиента был не-
большим (всего 700 мл), что обеспечивало в роторе диапазон
концентраций 7,4—38%. Вместе с подушкой из 45%-ной сахаро-
зы градиент занимал лишь половину объема ротора — слой в
3 см, прилегающий к наружной стенке. Центральная зона ротора
была заполнена буфером. Незначительная выпуклость градиеи-
275
та (Усм=Угр) компенсировала не очень сильное радиальное раз-
бавление в периферическом слое жидкости. Естественно, что пре-
парат рибосом (2 мг) в этом случае тоже вносили со стороны
стенки ротора (в 100 мл О—5%-ного градиента сахарозы) перед
введением градиента, когда ротор был заполнен буфером без са-
харозы. Затем подслаивали градиент сахарозы и «подушку», ко-
торые оттесняли препарат к центру ротора. Такой способ внесе-
ния препарата дает лучшее качество фракционирования, чем на-
слоение препарата на градиент через центральный канал ротора
с последующим введением тем же путем еще и буфера.
Центрифугирование вели при скорости 35 000 об/мин в те-
чение 5,5 ч. Разделение ЗОЯ-и 50S субъединиц было очень хоро-
шим. Элюцию вели через центральный канал подкачкой 60%-но-
го оаствора сахарозы на периферию ротора. -•
Экспоненциальный градиент раствора сахарозы (6—30%) в
5 м1М Трис-НС! (pH 7) с 1 мМ ЭДТА и 20 мМ КС! был исполь-
зован и для препаративного разделения моно-, ди-, три- и тетра-
нуклеосом из хроматина зародышей цыпленка [Wittig В., Wit-
tig S., 1977]. В этом случае ротор Ti-14 был заполнен градиентом
сахарозы почти полностью: 600 мл градиента, 30 мл раствора
препарата (600 мг ДНК) и 20 мл буфера над ним. Центрифуги-
рование вели при частоте 45 000 об/мин и температуре 1° в те-
чение 21 ч. Попутно отметим, что хорошего разделения олигоме-
ров нуклеосом удавалось добиться только в том случае, когда
после обработки стафилококковой нуклеазой хроматин дополни-
тельно переваривали рибонуклеазой и переосаждали 5 мМ
MgCl2. В противном случае вблизи мениска и в зоне моно-, ди-
и тринуклеосом оказывалось большое количество постороннего
материала, маскирующего картину разделения олигонуклеосом.
В качестве примера использования вставки типа В-29 и сбо-
ра фракций через периферический канал можно указать на рабо-
ту, авторы которой очищали зональным центрифугированием в
роторе Ti-15 гранулы зимогенов из поджелудочной железы кры-
сы [Schneider, Smith, 1977].,
В ротор вводили 1 л градиента сахарозы (14—50%) и еще 0,25 л 50%-ной
сахарозы подслаивали под него в качестве «подушки». Освобожденный от
ядер гомогенат поджелудочных желез 8 крыс в 0,25 М сахарозе наслаивали
через центральный канал, а поверх него вводили еще 50 мл 0,126 М сахарозы.
Центрифугировали всего лишь 30 мин при 15000 об/мнн, а затем опоражни-
вали ротор на скорости 2000 об/мин подачей воды через центральный канал.
Вслед за подушкой 50%-ной сахарозы выходил четкий пик зимогенов, иден-
тифицированный по ферментативной активности амилазы. Затем отдельно
выходил пик митохондрий (сукцинатдегидрогеназная активность), а вслед за
ним, в верхней половине градиента, все остальные компоненты гомогената.
278
Седиментационный анализ с использованием аналитической
ультрацентрифуги не рассматривается в данной книге. В срав-
нительно недавнем прошлом этот метод использовался широко,
особенно для определения молекулярных масс биополимеров.
Сейчас, судя по числу публикаций и свертыванию производства
аналитических ультрацентрифуг, сфера его применения явно су-
жается. Причинами этого, по-видимому, являются следующие:
1) ограниченная значимость получаемых данных, поскольку
определяется молекулярная масса сильно сольватированных
молекул, несущих на себе неопределенное количество молекул
растворителя;
2) сложность и дороговизна аппаратуры;
3) развитие более простых и достаточно точных методов оп-
ределения молекулярных масс и гомогенности биополимеров
(гель-фильтрации, электрофореза в геле и электрофокусирова-
ния) .
Тем не менее упомянем о двух публикациях, в которых ана-
литическое ультрацентрифугирование использовалось для опре-
деления молекулярной массы белков- по методу . Арчибальда
[Bernstine, 1979; Tack et al., 1979].
ЛИТЕРАТУРА
Aspray D. W., Pitts A., Pret-
low // T. G.— Anal. Biochem., 1975,
66, p. 353—364.
Bernstine E. G.— J. Biol. Chem., 1979,
254, p. 83—87.
Bester A. J., Durrheim G.t Ken-
nedy D. S., Heywood S. M.— Bio-
chem. and Biophys. Res. Communs,
1980, 92, p. 524—528.
Birnie G. D.—In: Centrifugal separa-
tions in molecular and cell biology/
/Ed. G. D. Birnie, D. Rick wood. L.:
Butterworth, 1978, p. 169, 170.
Burke R. L., Anderson P. J.,
Bauer W. R.—Anal. Biochem., 1978,
86, p. 264—270.
Burke R, L, Bauer W. R.— Nucl.
Acids Res., 1977, 4, p. 1891-1910.
Cohen G., Eisenberg H.— Biopolymers,
1968, 6, p. 1877—1892.
Conrad S. E., Campbell 7. L.—Nucl.
Acids Res., 1979, 6, p. 3289—3304.
Cooper J. A., Moss B.— Nucl. Acids
Res., 1979, 6, p. 3599—3612.
Cortadas J., Macaya G,t Bernardi G.—
Europ. J. Biochem., 1977, 76, p. 13—
19.
Cortadas /., Olofsson B., Meunier-Ro-
tival M., Macaya G., Bernardi G.—
277
Europ. J. Biochem., 1979, 99, p. 179—
186.
Currier T. C., Nester £. IF.—Anal.
Biochem., 1976, 76, p. 431—441.
Edsall D. T.f Maybury R. M., Simp-
son R. B., Straenle R.— J. Amer.
Chem. Soc., 1954, 76, p. 3131—3140.
Gogstad G. O.—Anal. Biochem., 1980,
106, p. 524—528.
Gonzalez F. J., Garret С. T., Wiener D.,
Caine M. D.— AneL Biochem., 1978,
85, p. 146-156.
Harpold M. M., Dobner R., Evans R.,
Bancroft F. C., Darnell /. £.—
Nucl. Acids Res., 1979, 6, p. 3133—
3144.
Hell A., Birnie G. D., SUmming T, K.,
Paul /.— Anal. Biochem., 1972, 48,
p. 369-377.
Jain S. K, Sarkar S.—Biochemistry,
1979, 18, p. 745—753.
Kiper M., Bartels D., Herzfeld F.,
Richter G.— Nucl. Acids Res., 1979,
6, p. 1961—1978.
Kondo T.t Nakajima Y.t Kawaka-
mi M.—Biochim. et biophys. acta,
1979, 561, p. 526—534.
MacLeod M. С.» Mansfield В. K.,
Huff A., Selkirk J. R.—Anal. Bio-
chem., 1979, 97, p. 410—417.
Ma as son P.-E.t Carter D. B., Silver-
berg A. B.f Tully D. B.t Har-
ris S. E.— Nucl. Acids Res., 1979,
7, p. 1553—J1565.
Martin T, E.t Wool I. G.t Cast-
les J. Л—Meth. Enzymol., 1971, 20,
p. 417—429.
Maundrell K., Scherrer K~ Europ. J.
Biochem., 1979, 99, p. 225—238.
Maxwell E. S., Fischer M. S.— Biochim.
et biophys. acta, 1979, 562, p. 302—
318.
McCarty /С S., Vollmer R. T., McCar-
ty K. S.—Anal. Biochem., 1974, 61,
p. 165-183.
Murphy R. F.f Wallace R. B., Bon-
ner 7.—Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1980, 77, p. 3336—3340.
Okazaki R.—Meth. Enzymol., 1971, 21,
p. 296-304.
OlenickJ. G., Lorenz P. E.— Anal.
Biochem., 1979, 97, p. 72—76.
Panasci L. C.t Green D. C., Fox P. A.,
Schein P. S.— Anal. Biochem., 1977,
83, p. 678—688.
Payvar F., Schimke R — Europ. Bio-
chem., 1979, 101, p. 271—282.
Pettijohn D. E., Pfenntnger O,— Proc.
Nat. Acad. Sci. USA, 1980, 77,
p. 1331—1335.
Raafat El-Gewely M., Helling R. B.—
Anal. Biochem., 1980, 102, p. 423—
428.
Ramsey J. C., Steele W. /.— Bioche-
mistry, 1976, 15, p. 1704—1712.
Reich M.f Zarybnicky V.— Anal. Bio-
chem., 1979, 94, p. 193—201.
Rennie P. S.—J. Biol. Chem., 1979,
254, p. 3947—3952.
Rickwood D.— In: Centrifugation:
A practical approach/Ed. D. Rick-
wood. L.; Wash.: Inform. Retrieval
Ltd, 1978, p. 15—32.
Rupp W. D., Howard-Flanders P.-~
Meth. Enzymol., 1971, 21, p. 237—
244.
Russev G., Tsanev R.— Nucl. Acids
Res., 1976, 3, p. 697—708.
Russev G.> Tsanev R.— Europ. J.
Biochem., 1979, 93, p. 123—128.
Schneider W. C., Smith G. //.— Anal.
Biochem., 1977, 80, p. 373—382.
Skalka A.—Meth. Enzymol., 1971, 21,
p. 341—350.
Streeck R. E.t Zachau H. G.—Eur. J.
Biochem., 1978, 89, p. 267—279.
Studier E. W — J. Mol. Biol., 1965, 11,
p. 373—390.
Sypherd P. Wireman /. IF.—Meth.
Enzymol., 1974, 30, p. 349—354.
Tack B. F., Morris S. C., Prahl J. W.—
Biochemistry, 1979, 18, p. 1497—
1503.
Tatti /С M„ Hudspeth £. S., John-
son P. H„ Grossman £. /.— Anal.
Biochem., 1978, 89, p. 561—571.
Waters R.— J. Mol. Biol., 1979, 127,
p. 117—127.
Webb G., Clark D. G.— Anal. Bio-
chem., 1976, 71, p. 629—631.
Wittig B., Wittig S.—Nucl. Acids Res.,
1977, 4, p. 3901—3917.
Wolf H.— Anal. Biochem., 1975, 68,
p. 505—511.
предметный указатель
Агрегация макромолекул в сахарозе
212
Акридиновый оранжевый 151
Акриламид 7
Аналитическое ультрацентрифугиро-
вание 276
Антиконденсационная крышка 33
БАМД, 3,6-бис- (ацетоксимеркурме-
тил)-диоксан 266
Бисакрилилцистамин 111
«Бис» (NN'-метиленбисакриламид) 8
Бромистый этидий 150, 260
Бромфеноловый синий 47, 53, 130
Время миграции к равновесию 245
Время установления градиента 245
Высушивание ПААГ 112
Вытеснение градиента 221
Гидрофобные белки 86, 87
Гидрохинон 46
Гистерезис плавления агарозы 17
Гистоны 84—87
Гликопротеиды, регистрация 104
Глобин 84
Градиент
концентрации ПААГ 24, 28, 45, 73
плотности сахарозы 202
плотности глицерина 239
Градиентные гели
готовые цластины 75
приготовление 24, 28, 143
«Гребенка» 27
Данзилхлорид 97
Двойная метка в ПААГ 115
Двойная полоса 93
Двухстадийный электрофорез 62
Двухстадийное центрифугирование
240
ДПС-Na, удаление 105—107, 154
Деаэрация ПААГ 10
Деионизация мочевины 46
Денатурирующий градиент сахарозы
Денситометрирование электрофоре-
грамм 92
Дестейнер 89
Диализ микроколичеств белка 52
NN'-диаллилтартардиамид 8, 14
Диазобумага (ДБМ-бумага) 108, 162
Диметиламинопропионитрил 9
Диметилсульфоксид в градиенте саха-
розы 237
Дистамицин А 262
Диффузионный насос 177, 181
Диэтилпирокарбонат 212
Длительность равновесного центрифу-
гирования 240
ДОЭБА, NN'- (1,2-диоксиэтилен) -бис-
акриламид 111
ДЭАЭ-бумага, перенос ДНК 165
Загрузка цезиевого градиента 264
Засвечивание пленки ИЗ
Извлечение ПААГ из трубки 25
Иммунологическая идентификация 108
Индикаторный гель 102
Инициаторы полимеризации 8, 86
Интенсифицирующий экран 113
Йодистый пропидий 262
Карбамоилирование белка 46, 51
«Карманы» в геле 27
Катализаторы полимеризации 9
«Кислая мочевина» 55, 87
Коллаген, определение массы 64
«Колодцы» в геле 32, 34
Кольцевые ДНК 124, 126
Комплексы буферов с белками 46
Комплексы ДЦК с ионами 249, 265
Концентрация геля
агарозы 19, 121
ПААГ 14-16, 59
Коэффициент
относительной миграции 18
седиментации 203
торможения в геле 15
Крестовина зонального ротора 193
«Кристаллизация» геля агарозы 17
Крутизна градиента сахарозы 213
Ксиленцианол 47
Кумасси ярко-голубой 91
Легкоплавкая агароза 19
Лейкорибофлавин 9
Линейный полиакриламид 118, 149
Липопротеиды 63, 88
Лэммли, система 70
279
Максама и Гилберта, метод 131
Маркерные белки 57, 59, 63
Маркеры для седиментаций 205
Маточные растворы ПААГ 51
МДФФ (2-метокси-2,2-дифенил-3-фу-
район) 100
Мембранные белки 84, 88
Меркаптоуксусная кислота 46, 79
NNT-метиленбисакриламид («Бис») 8
Метиленовая синяя 152
Метиловая зеленая_48г 151
Мегоксигруппы в агарозе 17
Метризамид 206
Метризоат натрия 208
Механические свойства ПААГ 13
Мицеллы детергентов 87, 104, 109
Мощность тепловая 42
«Мультифор» 33
Напряженность поля 3, 38
Нелинейные градиенты 216
Непрерывная система ПААГ 48
Негро псин 262
Ни троцел л юлозные
пробирки 184
фильтры 106, 109, 162
Норил 193
Обратный градиент плотности 213
Окисление белков 72, 84
Оксиапатит, элюция ДНК из геля 160
Ортофталевый ангидрид (ОФА) 101
Отделение ДНК бутанолом 157
Отмывка фона в ПААГ 89, 92
Относительное расстояние миграции
(Л/) 47, 57
Очистка
плазмид 260
сахарозы 212
Параметры концентрации ПААГ 13
Парафиновое масло 219
Пептидный анализ 72
Перегрузка зон в градиенте сахарозы
213
Переориентация градиента 255
Переходное устройство 193
Перколл 208
Персульфат
аммония 8
калия 141
Пиронин 48, 152
Плавление агарозы 17
Полужидкие гели агарозы 122
Полуширина полосы 241
Постоянной мощности, источник 43
Преэлектрофорез 1'1, 46, 79, 118
Приготовление
геля агарозы 19
ПААГ 10, 51
Присасывание пробило» 188, 219
Пробирки
полиалломерные 184
поликарбонатные 184
Простая система ПААГ 48
Протамин 84
Протеолитические ферменты 103
Профиль градиента 242
Радиальное разбавление 275
Радиоактивные чернила 115
Распределение плотности в полосе 241
Растворимые гели акриламида 8
Растрескивание ПААГ 11, 114
Расход масла 178
Рентгеновские пленки 113
Реперные отметки 115
Рестрикты ДНК 127
Ресурс работы ротора 191
Рибофлавин 9
«Рулон» 194
Салицилат натрия 115
Самоограничение миграции 74
Сведберга, единица 223
Сдвиг заряда при электрофорезе 87
Сенджера, метод 133
Серебром, окраска белков 95
Силиконирование формы для ПААГ
12
Сильно сшитый ПААГ 14
Сканирование гелей 92
Скорость
миграции белка 15
оседания частиц 176, 225
Скрытые разрывы в ДНК 147
Созерна, метод 162
Солюбилизаторы ПО
Сорбция
- белков на ПААГ 47
ДНК на стекле 156
на диализной пленке 158
«СпеЙсеры» 26
Стадиера, прибор 29
Стерилизация сахарозы 212
Структура геля агарозы 14
Сужение белковых зон 74
Счет радиоактивности после центри-
фугирования 258
«Сшивка» акриламидного геля 8
ТЕМЕД (тетраметилэтилендиамин) 9
Тетразолиевая соль 162
Тефлоновые прокладки для ПААГ 12
Тиоглнколевая кислота 46, 79
Толуидиновая синяя 152
«Трек» 5, 27
1,10-Фенантролин 63
Ферменты 52, 90, 101
Фиколл 208
Фиксация пептидов в геле формаль-
дегидом 93
280
Флавинмононуклеотид 86
Флотация 240
Флюоресцамин 98
ФМСФ (фенилметилсульфонилфто-
рид) 63, 105
Формазан 102
Формамид в градиенте сахарозы 236
Формирующий гель 66
Формирование градиента плотности
242
Фосфопротеиды, окраска в геле 94
Фракционирование ДНК по составу
266
Хроматина
электрофорез 56, 65, 81, 86, 127
центрифугирование 274
Цетавлонам, 85, 154
Цистамин 84, 88 ,
Шунтирующий ток 12
Щелочной градиент сахарозы 238
Щелочные белки 81
Щелочные красители 95
Экспоненциальный градиент 217
Электропроводность буфера 39—41
Электрофорез в растворе сахарозы
119
Электрофоретическая
подвижность 14, 57
элюция 106, 118, 158, 164
Эндосмос 17
Этилендиакрилат 8
ФИРМЕННЫЕ НАИМЕНОВАНИЯ РЕАКТИВОВ
Amido Black 91
Aquasol ПО
Coomassie Brilliant Blue (СВВ R-250,
СВВ G-250) 91
DAPI 151
Density Marker Beads 208
Econofluor 110
Fast Green 93
Ficoll-Paque 208
Fluram 98
Lubrol WX 85
Maxidens 221
MTT (Methyl thiazolyl blue) 102
Meldolablue 102
Naphtalene Black 91
NCS (Nuclear Chicago solubilizer) 110
NTB (Nitro blue tetrazolium) 102
PAGE blue 83, PAGE blue G-90 91
PMS (Phenazine methosulfate) J02
Protosol 110
Remazol 14
Soluene 110
Stains all 94, 151
Tracker dye 47
ОГЛАВЛЕНИЕ
Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Введение .......................................................... 3
Глава 1
Гели для электрофореза............................................. 7
.Полиакриламидный гель (ПААГ)...................................... 7
Исходные материалы............................................. 7
Процесс полимеризации ПААГ.................................... 10
Выбор концентраций мономеров.................................. 13
Агароза........................................................... 16
Смешанный гель (агароза+ПААГ)..................................... 20
Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ................... 21
Глава 2
Техника приготовления гелей и аппаратура........................ 21
Вертикально расположенные трубки................................... 21
Вертикально расположенные пластины.............................. 26
Горизонтально расположенные пластины............................ 32
Глава 3
Электрофорез белков............................................. 37
Замечания общего характера...................................... 37
Миграция белков в геле...................................... 37
Напряженность электрического поля (Я)..................... 38
Выбор буфера рабочего геля................................... 40,
Выделение тепла при электрофорезе........................... 42
Загрузка геля. Ширина белковых зон.......................... 44
Введение мочевины и 0-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты . 46
Лидирующие красители........................................ 47
Разделение белков по размерам и заряду.......................... 48
* Выбор рабочего буфера............................................ 48
Использование мочевины...................................... 50
Загрузка геля и подготовка препарата........................ 52
Некоторые примеры........................................... 53
Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na............ 56
Существо метода . .......................................... 56
Выбор пористости геля....................................... 59
283
Присутствие мочевины и неионных детергентов................... 60
Выбор рабочего буфера геля.................................... 61
Подготовка белкового препарата............................... 68
Проведение электрофореза...................................... 63
Окрашивание и элюция белков................................... 64
Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis)................... 66
Градиент пористости ПААГ.......................................... 73
Двумерный электрофорез в ПААГ..................................... 76
Электрофорез с использованием Тритона Х-100 и цетавлона .... 83
Тритон Х-100.................................................. S3
Цетавлон...................................................... 85
Окрашивание белков в ПААГ......................................... 88
Кислые красители.............................................. 90
Другие красители и методы окрашивания......................... 94
Флюоресцентные красители . . ................................. 97
Локализация ферментов после электрофореза.................... 101
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na..................104
Элюция белков из геля........................................... 105
Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ . 109
Счет радиоактивности в элюатах белка......................... 109
Растворение ПААГ.............................................НО
Импрегнирование сцинтиллятора в гель......................... 111
Авторадиография..............................................112
Флюорография.................................................ИЗ
Препаративный электрофорез белков................................ 116
Глава 4
Электрофорез нуклеиновых кислот.................................. 120
Замечания общего характера....................................... 120
Выбор буфера геля и напряженности электрического поля .... 120
Выбор характера геля и его пористости........................ 121
Влияние вторичной структуры ................................. 123
Маркерные молекулы.............................. . 125
Лидирующие красители ....................................... 126
Электрофорез в мягких условиях................................... 126
Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК................... 126
Фракционирование РНК......................................... 128
Электрофорез в денатурирующих гелях.............................. 128
Щелочные гели................................................ 129
Гели, содержащие мочевину. Секвенирование ДНК и РНК ... 131
Денатурирующие гели с формамидом............................. 135
Денатурирующие гели с формальдегидом......................... 138
Гели, содержащие гидроокись метилртути....................... 140
Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем . . . ............. 142
Использование градиентов пористости ПААГ......................... 142
Двумерный электрофоре^ нуклеиновых кислот и их фрагментов ... 144
Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот .... 147
Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК—-РНК-поли-
мераза—РНК................................................... 147
284
Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы
Использование жидкого (не сшитого) ПААГ.....................
Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ......
флюция нуклеиновых кислот из гелей...............................
i Элюция из ПААГ за счет диффузии................................
. . Элюция из гелей агарозы......................................
Электрофоретическая элюция..................................
Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры
и диазобумагу...............................................
Определение радиоактивности .....................................
Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот....................
Литература.......................................................
148
149
150
153
153
154
158
162
16$
166
168
Часть вторая
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Введение....................................................... 174
Рлава 1
Основные понятия теории седиментации............................175
Глава 2
Ультрацентрифуга.............................................. 177
Принцип действия и расположение важнейших узлов.................177
Проверка готовности основных систем к пуску.....................179
Пуск центрифуги ................................................180
Глава 3
Роторы и пробирки.............................................. 182
Угловые роторы..................................................182
Пробирки для угловых роторов ..............................184
ч Уход за роторами и пробирками.................................187
{Роторы со свободно подвешенными пробирками (бакет-роторы) . . . 189
Роторы с вертикальными пробирками.......................... . 191
Максимально допустимая частота вращения ротора..................191
Зональные роторы................................................193
| Особенности эксплуатации и ухода............................. 197
‘У'лава 4
Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199
ргава 5
Донально-скоростное центрифугирование............................. 201
Жонстанта седиментации.............................................203
^зокинетический градиент плотности.................................204
$ыбор среды...................................................... 206
Характеристики растворов сахарозы..................................210
’’Профиль градиента сахарозы...................................... 213
J ^Ьздание градиента плотности сахарозы............................214
Наслоение препарата иа градиент ..............................219
285
Фракцйониройанйе («раскапывание») градиента . . . < . < , . 220
Выбор режима центрифугирования................................... 223
Некоторые примеры центрифугирования в градиентах сахарозы . . . 232
Фракционирование рибонуклеопротеидов..........................232
Фракционирование РНК . . . ...................................235
Фракционирование ДНК..........................................237
Глава 6
Равновесное (изопикническое) центрифугирование ........ 240
Способы образования и общая характеристика градиентов плотности . 241
Выбор соли для создания градиента плотности.......................247
Градиенты плотности растворов CsCl................................250
Преформирование градиента ... 251
Равновесное центрифугирование в угловых роторах...............253
Центрифугирование в роторах с вертикальными пробирками . . 257
Фракционирование и детектирование равновесных градиентов . . 258
Примеры центрифугирования в градиентах плотности растворов CsCl 259
Градиенты плотности растворов CssSCU............................. 263
Градиенты плотности трихлорацетатов цезия и рубидия...............267
Градиенты плотности растворов KI и Nal............................268
Градиенты плотности растворов метризамида.........................270
Глава 7
Центрифугирование в зональных роторах.............................275
Литература........................................................277
Предметный указатель..............................................279
ЛЕВ АБРАМОВИЧ ОСТЕРМАН
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ
И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ:
Электрофорез и ультрацентрифугирование
(практическое пособие)
Утверждено к печати
Институтом молекулярной биологии
Академии наук СССР
Редактор издательства П. П. Горожанин
Художник В. Н. Тикунов
। Художественный редактор Т. И. Алексеева
^ические редакторы В. Д. Прилепская, Л. И. Куприянова
Корректоры Г. Н. Лащ, К. П. Лосева
ИБ Na 21608
Сдано в набор 12.06.81
Подписано к печати 28.08.81
Т-24124. Формат 60Х90*/1в
Бумага книжно-журнальная
Гарнитура литературная
Печать высокая
Усл. печ. л. 18. Усл. кр.-отт. 18. Уч.-изд. л. 19,1
Тираж 8000 экз. Тип. зак. 5455
Цена 1 р. 50 к.
/ Издательство «Наука»
117864 ГСП-7, Москва, В-485, Профсоюзная ул., 90
2-я типография издательства «Наука»
121099, Москва, Г-99, Шубинский пер., 10