В МИРЕ НАУКИ И ТЕХНИКИ
ИЗДАТЕЛЬСТВО |\/| И Р МОСКВА
PRISCILLA MATTSON
REGENERATION
The Bobbs-Merrill Company, Inc. Indianapolis
ПРИСЦИЛЛА МЭТТСОН
РЕГЕНЕРАЦИЯ— НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ
Перевод с английского канд. мед. наук А. Л. Лиознера под редакцией и с послесловием д-ра мед. наук А. Г. Бабаевой
МОСКВА «МИР» 1982
ББК 28.03;
М97 УДК 591,169
Мэттсон» Н.
MS7 Регенерация — настоящее и будущее: Пер. с англ./Перевод Лиознера А. Л.; Под ред. и с пен слесл. А. Г. Бабаевой.—М.: Мир, 1982,— 175 с., ил. — (В мире науки и техники)
Книга американского биолога в популярной форме излагает современные данные о механизмах восстановления утраченных ор< ганов и тканей у растений, животных и человека.
Для биологов, врачей и широкого круга читателей, интересую* щихся проблемой регенерации.
2001000000 — 062
041 (01) — 82
163 — 82, ч. 1
ББК 28.03
57.022
Редакция научно-популярной и научно-фантастической литературы
© 1976 by the Bobbs-Merrill Company, Inc, © Перевод на русский язык, <Мир», 1982
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА
АНГЛИЙСКОГО ИЗДАНИЯ
Эта книга рассказывает о восстановлении утрачен^ ных органов (регенерации), о медико-биологическом аспекте этой проблемы. Вполне естествен вопрос, какое же отношение может иметь способность про* стейших или, например, червей восстанавливать все тело из ничтожно малых фрагментов к такому высокоорганизованному существу, как человек? Материал, представленный в книге, свидетельствует о том, что восстановительные процессы у человека имеют глубокую связь с приведенными примерами регенерации у низших животных. Исследование способности многих животных к замещению старых или, поврежденных тканей и органов новыми чрезвычайно важно, поскольку позволяет вызвать или усилить регенерационную способность у человека, которая,, как считают, крайне невелика.
Вот два примера поиска подобных подходов. Сломанная кость обычно срастается, восстанавливая, свою целостность. Кости же, утраченные при ампу«, тации конечности или трепанации черепа, не поддав ются восстановлению. Недавно в эксперименте на собаках удалось показать, что кости черепа млекопитающих могут регенерировать. Для этого в каче-, стве обеспечивающей восстановление «подложки» хирурги использовали измельченную костную ткань.
Одним из довольно распространенных факторов, поражающих биологические системы, стало в наше время радиоактивное облучение. В частности, оно широко используется при лечении опухолей, поскольку обладает способностью разрушать раковые клетки, но при этом повреждает и окружающие опухоль
5
совершенно здоровые ткани. Эксперименты последнего времени показали, что для регенерации поврежденных облучением тканей оказывается полезным дополнительное механическое раздражение пострадавших клеток.
Биологи редко сталкиваются с непосредственным приложением своих теоретических исследований к человеку. Но не следует забывать, что для развития медицинской науки важны многие разделы биологической науки. Рассматриваемые в книге вопросы регенерации хорошо иллюстрируют эту мысль. Работа Присциллы Мэттсон отличается высоким уровнем изложения ключевых проблем и наиболее перспективных в будущем направлений науки о регенерации. Я надеюсь, что читателю понравится книга этой исследовательницы, сумевшей всесторонне и глубоко изложить основные вопросы давно разрабатываемой, но неизменно интересной области биологии, избегая при этом погружения в излишние детали и бытующий в лабораториях научный жаргон, чем, к сожалению, страдают многие подобные попытки.
Эдвард Дж. Кормонди
ОТ АВТОРА
Работа над книгой о регенерации доставляла мне удовольствие на всех этапах, несмотря на трудности, которые неизбежны как при сборе и обработке информации, так и при ее обобщении. Я глубоко признательна многим людям, прямо или косвенно способствовавшим, чтобы этот труд был завершен, независимо от того, насколько мне удалось воспользоваться их помощью. Существенную роль при моем знакомстве с основами регенерации и биологии развития сыграло руководство таких ученых, как д-р Джон Форет с зоологического факультета Нью-Гэмп-ширского университета в Дареме, д-р Маркус Сингер и д-р Дуглас Кастон с кафедры анатомии Медицинской школы при Кливлендском университете, штат Огайо. Глубокую благодарность я приношу также моим коллегам, любезно просмотревшим те части рукописи, где излагались вопросы, в которых они являются ведущими специалистами. Им я обязана не только за конструктивную критику по поводу написанного, но и за ценные предложения о включении важных дополнительных материалов. Услуги такого рода мне были оказаны д-рами Маргарет Эгар, На-гуредди Кришнан, Чарлзом Мейером и Рут Нордлен-дер — сотрудниками кафедры анатомии Медицинской школы при Кливлендском университете; д-ром Джеймсом Тернером с кафедры анатомии Медицинской школы имени Боумен-Грея в Уинстон-Сейлеме, штат Северная Каролина, и д-ром Расселом Россом с кафедры патологии Медицинской школы при Вашингтонском университете в Сиэтле. Не менее благодарна я также тем, кто помогал мне при сборе ил-
7
Люстраций, крайне необходимых для книги подобно* го рода; миссис Наде Дейгэн, сделавшей рисунки и схемы, всем друзьям, ободрявшим меня в этом моем начинании. Наконец, я не могу не выразить самой искренней благодарности д-ру Эдварду Кормонди с кафедры биологии Эвергринского колледжа в Олимпии, штат Вашингтон, проявившему столько компе* дентности и такта, когда, будучи редактором книги, помогал мне преодолевать неизбежные трудности, возникающие при подготовке рукописи к печати.
Присцилла Мэттсон
Кливленд, Огайо
Моей матера
ВВЕДЕНИЕ
Большинство людей, в том числе и. научных, работ-* ников, устроено так, что круг их интересов невольно замыкается на относительно небольшом числе проб-* лем, составляющих предмет их занятий. Люди, непо-* средственно не занятые данной проблемой, обычно с меньшим энтузиазмом слушают, или читают что-либо посвященное ее детальному изложению. Но это общее правило, на мой взгляд, совсем не относится к регенерации. Я заметила, что даже те, кто не имеет никакого отношения к биологии, всегда проявляли неизменный интерес к проблемам регенерации. Об этом свидетельствуют их многочисленные вопросы ко мне. Конечно, их интерес мог бы быть удовлетворен чтением научной литературы, ведь проблеме регенерации, посвящены многочисленные публикации, в том числе ряд очень хороших книг. Но большинство- этих книг и статей рассчитаны на читателя, уже имеющего существенный опыт как в биологических науках вообще, так и в исследовании механизмов регенерации у растений и животных. Вот почему эта книга адресована читателям, которым необходимо введение в проблему регенерации, включающее как историю вопроса, так и обзор наиболее важных для настоящего времени исследований.
Главы I и II, включающие: материал о регенерации у беспозвоночных и позвоночных животных, содержат общие представления о том, как животные восстанавливают утраченные части тела, а также ряд вопросов, возникающих по ходу ознакомления с деталями этого процесса. В каждой главе на примере типичного животного указанных групп детально
9
Иллюстрируются как прошлые, так и настоящие исследования, приводятся наиболее вероятные направления будущей работы. В более мелких разделах рассматриваются примеры регенерации у други,, групп низших и высших животных. Материал по регенерации безгранично широк, и не всегда легко было отобрать наиболее достойный описания пример. В конце концов я остановилась на таком принципе отбора материала, который поможет читателю понять, сколь велико разнообразие регенерационных процессов у животных.
В главе III приводятся основные параметры трех исследовательских подходов, разработанных или усовершенствованных на протяжении последних пятнадцати лет и широко применявшихся в опытах по регенерации. Прогресс, достигаемый с применением всего арсенала этих методов и каждого из них в отдельности, показывает, в какой степени успех фундаментальных научных исследований зависит от развития «технологии». Новые подходы к решению тех или иных проблем важны ничуть не менее усовершенствования исследовательских методов. Это положение иллюстрируется в главе IV, где рассказано о четырех ученых, внесших разными путями значительный вклад в наши представления о регенерации. Число биологов, вовлеченных в исследования по регенерации, велико и непрерывно возрастает. Поэтому в этой главе упоминаются имена многих из них, опять же с целью показать читателю многообразие вариаций — на сей раз в подходах к изучению проблемы. Имена исследователей приводятся и в других разделах книги, но с целью облегчить восприятие материала в весьма ограниченном числе. Если читатель захочет больше узнать об отдельных исследователях и их вкладе в проблему, ему будет нетрудно сделать это, обратившись к помещенной в конце книги подборке рекомендаций для дальнейшего чтения.
Глава V, названная «Советские исследования в области регенерации», отражает тот вклад, который был внесен и вносится учеными СССР в изучение регенерации, а также мой собственный интерес к стране, которую я посетила несколько лет назад и надеюсь еще посетить в скором будущем. Блестящей
10
попыткой ликвидации «информационного провала» между нашими странами явились обмены в области космических исследований, и можно надеяться, что не менее успешным будет и обмен знаниями в области регенерации.
Хотя эта книга посвящена в основном регенерации у животных, некоторые весьма ценные и необычные данные о судьбе клеток при восстановительных процессах были получены в исследованиях на организмах, относящихся к миру растений. Наиболее типичные примеры таких исследований составили материал главы VI. Эти работы описаны детально, хотя и не исчерпывают всего материала по регенерации у растений. Автор чувствует себя недостаточно подготовленным для изложения проблемы в таком масштабе.
Начиная с самых ранних из описанных экспериментов и по настоящее время наиболее интригующим феноменом является способность саламандр к полному восстановлению утраченных конечностей. Ученым, занимающимся этой проблемой, обычно задают два вопроса. Ответ на первый из них — могут ли достижения в этой области способствовать разрешению проблемы восстановления конечностей у человека? —• составляет предмет изложения последней главы книги. Мне хотелось представить максимум имеющейся информации, чтобы читатель мог сам ответить на этот вопрос. В отличие от первого ответ на второй вопрос — могут ли исследования в данной области быть вообще полезными в применении к человеку? — безусловно положителен. По мере исследования регенерации у животных и растений непрерывно возникают возможности приложения полученных результатов к тем или иным проблемам медицины. Некоторые из этих возможностей обсуждаются*Ь заключительной части книги.
I
РЕГЕНЕРАЦИЯ У НИЗШИХ ЖИВОТНЫХ
Какие из беспозвоночных животных послужили основными объектами в исследованиях по регенерации? В первую очередь плоские черви, известные биологам под названием планарий. Действительно, многие работы были проделаны на разнообразных видах нла-нарий, часто встречающихся в проточных прудах или ручьях, где эти животные прикрепляются к водным растениям или нижним поверхностям подводных камней. Обычно длина червей чуть больше сантиметра; их легко узнать по треугольной фирме головы и покрытому точками заднему концу тела. Планарии имеют четко выраженную пару глаз на верхней спинной поверхности головного конца и трубчатую глотку, которая начинается от ротового отверстия, расположенного в середине нижней брюшной поверхности (рис. 1). Внешне планарии ничем не примечательны, но они обладают удивительной регенерационной способностью.
Если бы вам предложили составить список литературы по регенерации у планарий, вы бы быстро обнаружили, как нелегка эта задача. Каждому из
Спинная поверхность	Брюшная поверхность
Рис. 1. Планария (винтообразно изогнута, чтобы показать брюшную поверхность),
12
аспектов темы посвящены сотни научных статей, которые стали появляться примерно двести лет назад. Как же высока изобретательность ученых, которым удалось поставить столь большое число разнообразных экспериментов на столь низко организованном животном и получить так много ценной информации о природе механизмов, контролирующих регенерационный процесс! За этот длительный период существенным образом менялись как подходы, так и степень сложности проводившихся экспериментов. Часть исследований, особенно ранних, вошла в фонд учебных работ вводного курса биологии; другие осуществляются на самом современном уровне с использованием широкого набора молекулярно-биологических методов.
РЕГЕНЕРАЦИЯ У ПЛАНАРИЙ
Историю изучения регенерации у планарий можно рассказать по-разному, но мне представляется, что наиболее верным был бы краткий исторический обзор. Из него вы увидите, почему именно восстановительный рост у плоских червей оказался столь интересным для ученых, какие проблемы возникали и каким образом они разрешались, какие вопросы стали предметом пристального внимания в последние годы.
Ранние опыты
План большинства первых опытов по регенерации у планарий был крайне несложным. Плоских червей систематически рассекали на части, после чего каждую из них помещали в небольшие контейнеры с прудовой водой и наблюдали за восстановительным ростом. Несмотря на кажущуюся простоту, удалось получить поразительные результаты. Так, английский исследователь Дж. Р. Джонсон в 1825 году сообщил Лондонскому королевскому обществу следующее:
Недавно я провел ряд экспериментов и получил весьма неожиданные результаты, позволяющие добавить несколько интересных штрихов к истории этих необычных животных. Я имею в виду формирование у плоских червей при особом спо-
13
Рис. 2. Разнообразие процессов регенерации у планарий. А — животное рассечено на несколько фрагментов; Б — удалена голова животного и через верхнюю часть тела сделан продольный разрез. (В кн. Spratt N. Т. Deselopmental Biology, Wadsworth Publishing Co., Belmont, Calif., 1971, 95.)
собе рассечения второй, дополнительной головы: получались двухголовые планарии.
Наблюдения, подобные этому, показали необычную степень регенерационной силы планарий и стимулировали дальнейшее изучение столь примечательной способности.
Многие из этих ранних опытов сравнительно легко повторить, стоит только рассечь планарию пополам— либо вдоль, либо поперек,— и из каждой половинки вскоре регенерирует новое животное (рис. 2). Восстанавливающиеся фрагменты имеют четкую поляризацию, то есть голова формируется из переднего конца отрезка, тогда как хвост из заднего. Двухголовую планарию, подобную той, которая была представлена Лондонскому королевскому обществу, можно получить путем отсечения головы животного с дополнительным продольным рассечением переднего участка тела до глоточного отверстия, после чего планарии представляется возможность регенерировать (рис. 2, Б). Двухвостые планарии образуются вследствие такой же операции, но проделанной на задней части тела червя. В этих случаях необходимо повторять прием продольного надсечения тела на протяжении нескольких дней, иначе части срастаются и дают нормальный организм. Вариантов подобного опыта немало; для их проведения необходимо иметь лишь бритвенное лезвие, достаточное количество червей и, конечно, совершенно обязательное качество, которым в избытке обладали ранние исследователи регенерации,— терпение. Нужно учитывать, что планарии находятся в непрерывном движении, которое осуществляется путем последовательного сокращения и распрямления тела; эти движения обычно не прекращаются и «под ножом».
Бластема и ее происхождение
Исследования по регенерации у планарий, как и многие другие научные исследования, с течением времени стали набирать темп. Ученые стремились понять этапы, через которые проходит эффективный регенерационный процесс. Наибольшее внимание при этом уделялось раневым поверхностям червя, остаю
15
щимся после отсечения тех или иных частей. Оказалось, что по мере заживления раны в месте разреза начинает вырастать образование, по форме напоминающее купол. Это образование, названное первыми исследователями бластемой, или регенерационной почкой (последнее название употребляется чаще), появляется в течение нескольких дней после повреждения тела червя. Затем оно начинает расти и формирует, после соответствующих клеточных преобразований, те части тела, которые требуют восстановления. На ранней же стадии бластема представляет собой скопление совершенно одинаковых на вид клеток, у которых отсутствуют какие-либо отличительные признаки.
Естественно возникает вопрос, который задавали себе и первые исследователи: откуда берутся формирующие бластему клетки? На этот счет существовало две противоположных гипотезы. Одна из них предполагала, что в нормальных условиях в различных участках тела планарии находится определенное количество неспециализированных клеток, называемых «необластами». После нанесенного животному повреждения этот клеточный резерв высвобождается и мигрирует к раневой поверхности, где после ряда клеточных делений дает начало бластеме. Сторонники иной точки зрения предложили следующую гипотезу. После повреждения тела дождевого червя некоторые специализированные клетки утрачивают свои структурные и функциональные характеристики и вновь приобретают свойства, характерные для неспециализированных, зачаточных клеток. Претерпевшие подобную «дедифференцировку» клетки могут быть использованы организмом для формирования бластемы. Если эта теория верна, следует признать, что свойства зрелых клеток, обусловливающие выполнение ими определенных функций, не неизменны, а значит, положение «почечная клетка — всегда почечная клетка» (или мышечная, или железистая) не всегда справедливо.
Борьба вокруг этих гипотез продолжалась достаточно долго, поскольку решение данного вопроса чрезвычайно важно для биологии. Хотя необластиче-ская теория регенерации у планарий впервые была
16
сформулирована еще в 1897 году, порожденная ею дискуссия продолжается практически до сих пор. Несколько ниже вы узнаете, что недавние электронно-микроскопические наблюдения подтвердили нали-чие необластов у плоских червей. Но не меньше данных было и будет получено относительно дедиффе-ренцирующихся клеток, которые во многих случаях действительно вовлекаются в процесс регенерации у растений и животных.
Регуляция регенерации у планарий
Исследователей очень скоро заинтересовал вопрос о возможных путях контроля и регуляции регенерации у планарий. После операции животных содержали при разных температурах, меняли состав и количество получаемой пищи и наблюдали, какое влияние на регенерацию оказывает подобное изменение условий. Повышение температуры ускоряло темп восстановления утраченных частей тела, а голодание в период регенерации никак не сказывалось на интенсивности процесса восстановления.
Изучались и другие возможные регуляционные факторы. Экспериментаторами, например, давно было замечено, что при рассечении планарий на две части в любой точке между передним и задним концами тела первой образуется бластема головного участка. Исследования показали, что при изменении уровня разреза сроки, необходимые для восстановления головы планарии, существенно различаются. Отрастание головного конца происходит быстрее всего, если разрез делается у переднего конца тела червя, и медленнее, если у заднего (рис. 3). Эта закономерность, названная феноменом «темп головы», была открыта в начале нынешнего столетия, и хотя с тех пор проведено немало опытов, между исследователями нет полного согласия по этому вопросу. Тем не менее существует точка зрения, что различия в скорости регенерации головы отражают наличие определенного градиента свойств между головным и хвостовым участками тела каждого червя. Согласно этой гипотезе, темп протекания различных ростовых процессов выше в головном конце планарии и снижается
17
Рис. 3. Время, необходимое для регенерации головы планарии при рассечении животного на различных уровнях. (В статье Dubois F. «Contribution a I’etude de la regeneration chez planaires dulcicoles», Bull. Biol., 1949, 83:213—283.)
по мере удаления к заднему концу тела животного.
Идея о наличии градиента «голова — хвост» была подтверждена несколькими путями. Как вы помните, из небольшого кусочка тела планарии может регенерировать целый новый индивидуум. В большинстве случаев голова, которая первой начинает развиваться на переднем участке фрагмента тела, оказывает какое-то регулирующее влияние на формирование хвоста на противоположном его конце. Но в некоторых случаях после рассечения планарии и последующей регенерации появляются странные существа, обозначаемые термином «двуликий Янус». У этих существ две головы, и располагаются они на противоположных участках тела. Как известно, Янус был богом входа и выхода у древних римлян, и обычно изображался с двумя лицами (одно обращено в прош
18
лое, другое в будущее), возможно, как символ двух поверхностей дверей. «Двуликие Янусы» образуются только в том случае, если сделать чрезвычайно тонкий поперечный срез планарии в ее верхней части ниже глаз (рис. 4). Вероятно, небольшое расстояние между поверхностями срезов препятствует реализации градиента «голова — хвост»: оба конца тела оказываются в равных условиях и не доминируют друг над другом.
Исследования последнего десятилетия дали новое подтверждение градиентной гипотезе. Удалив у червей хвосты, исследователи обездвиживали их внутри желатинового блока, из которого выступал только передний конец планарии. Препятствие для реализации градиента «голова — хвост», подобное тому, которое приводит к образованию «двуликих Янусов», создавалось с помощью химического вещества, известного своей способностью замедлять жизненные процессы. Попытки были успешными: у планарий, извлеченных из блоков, нередко была вторая голова, регенерировавшая из заднего конца тела животного.
Рис. 4. А — формирование «двуликого Януса» из тонкого среза передней части планарии; Б — «двуликий Янус» не возникает, если нижний разрез сделать через некоторое время после первого, когда уже достигнут определенный уровень регенерации и в образующемся фрагменте возник градиент «голова — хвост». (По Goss R. Principles of Regeneration, Academic Press, New
York, 1969, 61.)
19
Останавливающие и пусковые сигналы
Различные части тела плоских червей могут выраба-тывать и выделять вещества, обладающие в отношении регенерации утраченных структур свойствами «останавливающих» или «пусковых» сигналов. В последние годы немалое внимание уделялось возможной роли таких сигналов в регуляции регенерационного роста у планарий. Влияние пусковых сигналов, выявляемое наблюдением за рассеченными планариями, состоит в том, чтобы восстановление утраченных частей тела осуществлялось в определенной последовательности. Если планарии рассекаются на переднюю и заднюю половины как раз позади глотки (напомним, что она размещается в середине брюшной поверхности тела), то голова, возникающая из бластемы задней половины, обусловливает развитие пред-глоточного участка непосредственно позади себя. Вскоре после этого предглоточный отдел, по-видимому, запускает формирование глотки на более отдаленном от головы участке. В результате животное становится вполне нормальным. В научной литературе подобная последовательность формирования частей тела называется индукцией: голова индуцирует формирование предглоточного отдела, а тот в свою очередь индуцирует регенерацию глотки.
Останавливающие сигналы могут быть выявлены с применением более сложных методов экспериментального исследования. Эти сигналы позволяют замедлить или вообще предотвратить регенерацию некоторых частей тела червя. Типичный эксперимент такого рода состоит в отсечении головы у одной планарии (реципиент) и пересадки головы другой планарии (донор) справа или слева от раневой поверхности. Голова донора, приживаясь на новом месте, испускает какие-то останавливающие сигналы, поскольку голова реципиента никогда не регенерирует в подобных условиях. Иными словами, пересаженная голова предотвращает регенерацию той части тела, которая была бы идентична ей самой. По-видимому, подавляющий механизм проявляется и когда планария регенерирует в обычных условиях, 20
предотвращая образование дублирующих частей бластемы.
Природа останавливающих сигналов весьма сне-цифична для определенных частей тела животного. Это доказывается следующим опытом. После удале-ния у нескольких планарий глотки (этот орган обычно хорошо регенерирует) животных делят на три группы. Каждая группа содержится в отдельном сосуде с водой, в которую добавляют растертые в ступках взвеси определенных органов, взятых от других планарий, а именно: глоток, голов или хвостов. Что же происходит в этих трех различных сосудах? Экстракты голов и хвостов не оказывают особого влияния на процесс регенерации глотки, который протекает по обычной схеме. Зато у планарий, содержащихся в растворе с экстрактом глоток, регенерация удаленных глоток существенно замедляется. В глоточных экстрактах явно присутствует специфический останавливающий сигнал: группа червей ведет себя так, 'будто у них имеется неповрежденная глотка, и соответственно формирование этой структуры ограничено.
Нерешенные проблемы
Какие вещества осуществляют сигналы типа «стоп» и «пуск»? Что вызывает их .высвобождение из клеток и каким путем они осуществляют запуск или подавление роста? Каким образом оба типа сигналов взаимодействуют между собой в процессе восстановления утраченных частей тела червя? На все эти вопросы пытаются ответить биохимики, интенсивно занимающиеся изучением регенерации у планарий. Но задача эта нелегка, и она не может быть решена .быстро,
РЕГЕНЕРАЦИЯ У ДРУГИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
В качестве животных, эволюционно менее развитых, чем плоские черви, обычно рассматриваются следующие три группы: простейшие (одноклеточные), губки и кишечнополостные (медузы и родственные им животные). Другие группы беспозвоночных признаются
стоящими на более высокой ступени эволюционного развития, чем планарии. К ним относятся моллюски (двустворчатые, улитки, кальмары), иглокожие (морские звезды и их родственники), кольчатые черви и членистоногие (ракообразные, паукообразные и насекомые). Во всех этих группах беспозвоночных есть виды, имеющие хорошо выраженную регенерационную способность. Перейдем к изложению наиболее интересных примеров регенерационных явлений у этих животных.
Простейшие
Одноклеточные животные, как правило, легко регенерируют, и регенерационный процесс у них протекает гораздо быстрее, чем у любого многоклеточного существа. К таким животным относится, например, инфузория трубач, микроскопический обитатель воды, плавающий и питающийся при помощи волосков-ресничек, сидящих несколькими рядами на его наружной поверхности. Название этой инфузории основано на ее внешнем сходстве с музыкальным инструментом, но гораздо правильнее было бы сказать, что ее тело имеет форму конуса (рис. 5). В естественных условиях трубачи либо прикрепляются к какой-нибудь поверхности с помощью выроста на сужающемся конце тела, либо свободно плавают в воде. Движение ресничек не только обеспечивает передвижение инфузории, но и направляет частички пищи в некое подобие ротового отверстия и глотки, находящиеся на широком конце клетки-животного. Наружное покрытие (эктоплазма) трубача состоит из продольных полос пигментных гранул, чередующихся с бесцветными полосами, на которых расположены ряды ресничек. Внутриклеточный материал (эндоплазма) содержит вкрапления пищи, крупные округлые вакуоли, которые периодически выводят из клетки свое жидкое содержимое, а также два типа ядер — похожий на четки макронуклеус и множество микронуклеусов, разбросанных вокруг макронуклеуса.
Трубачи — своеобразные великаны среди простейших. Возможно, потому они и стали объектом для изучения регенерации у этой группы животных. Тем не менее даже самые крупные трубачи не больше.
22


Глотка
Частички пищи
Реснички
Микронуклеус.
«Рот»
Вырост
Бесцветные полосы
Звено макронуклеуса
Сократительные вакуоли
Полосы пигментных гранул
Рис. 5. Инфузория трубач.
точки в конце предложения. Этот вид сходен с пла-нариями в том, что целое животное способно регенерировать из мельчайших фрагментов собственного тела, даже равного */б4 его исходного размера. Но для этого необходимо, чтобы фрагмент сохранял хотя бы одно звено макронуклеуса, некоторое количество внутриклеточного материала и часть клеточной оболочки с ресничками. Трубачам свойственны и несколько необычные черты регенерационного процесса. Эти животные способны восстанавливать исходную форму даже тогда, когда из клетки выдавлена почти
23
Рис. 6. Регенерация у трубачей после практически полного удаления эндоплазмы (А) и после «сдирания» эктоплазматической оболочки (Б). Регенерация после удаления эктоплазмы обычно протекает ненормально и возникающие особи не выживают. (С разрешения Tartar V. из кн. The Bioiogy of Stentor, Pergamon Press, New York, 1961, 108.)
вся эндоплазма и оставлена только «кожа» (рис. 6, А) . То же самое происходит, если у трубача удалена почти вся эктоплазма. В этом случае оставшаяся часть наружного покрытия клетки наползает таким образом, что. закрывает внутренние структуры и вое-* станавливает целостность инфузории (рис. 6, Б).
Губки
Эти многоклеточные беспозвоночные характеризуются тем, что их тело ограничено стенкой, состоящей из двух слоев клеток и имеющей многочисленные отвер-стия. Внутренний и наружный слои отличаются по своему внешнему виду и специализации. Губки не восстанавливают утраченных частей, но зато обладают необычайной способностью к воссозданию исходной формы в том случае, когда составляющие их клетки отделены одна от другой. Такое разделение легко произвести, если продавить целую губку через влаж-ную кисею в контейнер с охлажденной морской во-» дой. Еще в 1907 году было обнаружено, что клетки, разделенные подобным образом, вскоре начинают двигаться и формировать небольшие округлые скоп* ления. Скопления затем приобретают упорядоченность, характерную, для строения данного животного, после чего часто вырастают до размеров взрослой губки, точно повторяя форму исходного организма ..(рис. 7).
Подобная реагрегация клеток считается видоспецифической, то есть разделенные клетки одного вида
24
Рис. 7. Губка «красная борода». Ярко-красная окраска делает губок этого вида очень удобными в экспериментах по разделе", нию и ре агрегации клеток.
губок не объединяются с разъединенными клетками губок другого вида. Такой тип поведения клеток можно продемонстрировать в опыте с губками разной окраски. Если через кисею продавить губку, имеющую характерный красный цвет, и губку, имеющую желтую окраску, и поместить обе клеточные сус-пензии в банку с морской водой, то губки сформи-руются вновь, но при этом клетки «красного» вида найдут своих одноцветных партнеров, аналогичным образом в отношении клеток одного с ними происхождения поведут себя и «желтые» клетки. Однако в некоторых случаях возможны «ошибки»: клетки с различной окраской во время беспорядочного движения сразу после помещения в воду склеиваются друг с другом. Но в большинстве своем такое сцепление не становится стабильным и вскоре чужеродные клетки разделяются.
Механизм сцепления клеток губок одного вида до конца еще не раскрыт. Ученые полагают, что клетки
25
выделяют в окружающую среду вещество, так называемый фактор связывания, которое обеспечивает способность клеток находить друг друга. Для того чтобы этот фактор присоединялся к наружным клеточным мембранам, необходимо присутствие в среде заряженных ионов кальция и магния. Факторы связывания, вырабатываемые клетками губок различных видов, явно отличаются друг от друга, поэтому клетки, принадлежащие к одному виду, «липки» только для клеток своего вида.
Кишечнополостные
К этой группе беспозвоночных животных относятся кораллы, актинии, медузы и похожие на растения гидрообразные. Наибольшее число работ по регенерационной способности среди животных этой группы было проведено на гидре — крошечном животном с мешкообразным телом; ротовое отверстие гидры окружено венчиком щупалец, несущих многочисленные стрекательные клетки. В зависимости от вида гидроидные полипы живут либо поодиночке, прикрепляясь основанием тела к какой-нибудь поверхности, либо колонией. В процессе восстановления утраченных фрагментов тела особый интерес представ-
Рис. 8. Регенерация у гидры. Каждая половинка рассеченного животного сохраняет исходную поляризацию структур.
2в
ляет факт сохранения исходного расположения органов. Как вы помните, мы уже наблюдали это у планарий. Если гидру разрезать поперек на верхнюю и нижнюю части, то щупальца будут в нормальных условиях отрастать от верхней поверхности нижней части, а стебелек — от раневой поверхности той части, у которой щупальца остались неповрежденными (рис. 8). Возможно, что это обусловлено существованием у гидры внутреннего градиента биологических процессов, напоминающего градиент «голова — хвост» у плоских червей. Однако механизм регенерации у гидры объясняется иным образом, к чему мы и вернемся в дальнейшем.
Иглокожие
У одного из представителей этой группы морских животных (с радиальной симметрией и колючими выростами на коже) можно наблюдать, пожалуй, самый известный пример регенерации — восстановление одного или большего числа лучей, или «рук». Практически у всех видов морских звезд, в каком бы месте им ни отсекали лучи, они легко регенерируют, хотя этот процесс требует для своего завершения много времени — иногда года. Регенерация целого животного возможна даже, когда одновременно отсечены все лучи и оставлен один центральный диск. Hg ничего подобного не произойдет, если взять только отсеченный луч,— для этого требуется хотя бы небольшая часть центрального диска. Лишь у одного рода морских звезд (Linckia) которые по непонятным причинам имеют привычку отбрасывать свои лучи на расстояние двух с половиной сантиметров от диска, отделившийся луч обладает способностью регенерировать недостающие части целого животного. В природе часто можно встретить крупный отломившийся луч звезды _ четырьмя-шестью маленькими лучами, отрастающими от оторвавшегося конца. Такое образование называют «кометой» (рис. 9).
Менее известный способ регенерации можно наблюдать у морских огурцов, или голотурий, тоже иглокожих, чья форма весьма соответствует названию. Морской огурец — это медлительный обитатель дна;
27
Рис. 9. Стадия «кометы» при регенерации морской звезды Lin-ckia из одного луча. Фотография сделана на коралловом рифе примерно в 30 см под водой. (Фото Milne L„ Milne М., Department of Zoology, University of New Hampshire.)
обычно он прикрепляется где-нибудь под камнями, забивается в песок или ил. Тело голотурий представляет собой гибкий мускулистый мешок. При неблагоприятных условиях, например если резко схватить животное, тело голотурий сильно сжимается и весь пищеварительный тракт выбрасывается наружу через отверстие на его конце. Эта странная реакция является, однако, важным охранительным механизмом в борьбе за существование. Некоторые из отторгнув
шихся желез выделяют в воду липкую слизь, кото-рая может защитить морской огурец от возможного нападения. Остающийся почти пустой- мешок из «кожи» и- мышц обеспечивает тем- не менее полную регенерацию утраченных органов. В1 месте обрыва образуется новая ткань, и за 25 дней полностью восстанавливается пищеварительный тракт, а вслед за ним и другие органы.
Моллюски
Моллюски — это один- из самых старых объектов, на которых- проводилось изучение регенерации. Уже в 1768 году итальянский натуралист Ладзаро Спалланцани обнаружил регенерацию у садовой улитки. Его открытие быстро* приобрело известность, так как улитка оказалась способной восстанавливать голову со всеми органами чувств, в частности- глазами. Правда, как показали1 современные исследования, о полной регенерации в данном случае не может быть и речи, но при условии сохранения основного ганглия нервной системы- существенные части ее могут действительно восстанавливаться. Наибольшей регенерационной способностью- среди моллюсков обладают осьминоги — многорукие существа, не имеющие защитной раковины. Для этих животных потеря целой конечности или ее части, например в результате атаки мурены,— обычное дело; Не более чем за неделю ут-раченная конечность отрастает вновь.
Многие улитки, устрицы и другие моллюски, имеющие твердую раковину, могут восстанавливать этот защитный покров после его частичной утраты. Складка ткани, называемая мантией и расположенная между мягким телом моллюска и внутренним слоем раковины, является органом, который секретирует вещества, формирующие раковину. Именно этот слой при повреждении раковины берет на себя восстановительные работы, которые иногда занимают недели и даже месяцы. Когда часть раковины удаляется, подлежащие клетки мантии либо разрушаются полностью, либо выбрасывают часть своего содержимого. Продукты распада служат своего рода строительным материалом при восстановлении раковины. Поврежденная
29
поверхность затягивается тонкой мембраной, на ко-торой начинают Откладываться небольшие кри* сталлы. Их количество постепенно нарастает, пока они не соединяются в плотный слой, смыкающийся с поврежденным краем. Если же вместе с кусочком раковины удаляется и мантия, то сначала моллюск восстанавливает мантию, и лишь затем последняя описанным выше путем восполняет дефект раковины.
У одного из видов двустворчатых моллюсков наблюдается восстановление мягких частей тела, которые могут быть случайно повреждены самим животным, например при резком закрывании раковины. Это происходит чаще всего как реакция на приближающегося врага (механические колебания от движения по дну) или при других признаках опасности. Моллюск, обычно наполовину зарывшийся в илистые отложения, резко сокращает мышцы ноги и одновременно пытается втянуть выступающий сифон — орган, благодаря которому вода прокачивается через жабры. Нередко часть этой длинной структуры отсекается быстро захлопывающимися створками раковины, и регенерация становится необходимой.
Кольчатые черви
Представителей этой группы, к которой принадлежит всем известный дождевой червь, нетрудно узнать по разделенному на одинаковые сегменты телу. И не удивительно, что в исследованиях по регенерации на кольчатых червях, как правило, изучали реакции животных на удаление определенного числа таких сегментов. Частым объектом подобных исследований был многощетинковый морской червь Clymenella, очень удобный тем, что практически у всех его особей одно и то же число сегментов. Один из исследователей заметил, что только у двух из 600 подопытных червей общее число сегментов отличалось от стандартного числа 22. Если отсекать сегменты Clymenella от переднего или заднего конца тела, червь проявляет не меньшую способность к восстановительному росту, чем при своем первичном развитии. В этих случаях на раневых поверхностях образуется бластема трубчатой формы, поначалу не проявляющая тен-
30
Рис. 10. При удалении передних и задних сегментов тела морского червя Clymenella восстанавливается точное число утраченных сегментов. (В статье Moment G. В. «Simultaneous anterior and posterior regeneration and other growth phenomena in mal-danid polychaetes», J. Exp. Zool., 1951, 117:6.)
денции к разделению на сегменты. В дальнейшем растущий участок делится точно на такое число сегментов, которое было утрачено (рис. 10). Восстанавливающиеся части червя никогда не дорастают до исходных размеров, поэтому регенерат всегда нетрудно отличить.
Оказалось, что многие кольчатые черви лучше восстанавливают задние сегменты, нежели передние. У одного вида дождевых червей, имеющего 100 сегментов, удалялось любое их число из задней половины тела, и червь полностью восстанавливал утраченные фрагменты. Но если повреждение наносилось на переднем конце тела, он восстанавливал лишь некоторое число сегментов.
Для регенерации у кольчатых червей, так же как у плоских червей и кишечнополостных, характерно соблюдение полярности: «голова» восстанавливается там, где отсечена передняя часть животного, а «хвост» — где задняя. Как показали эксперименты с некоторыми морскими червями, которые живут в домиках-трубках, в регуляции реакций подобного типа
31
Рис. 11. Результаты рассечения нервной цепочки морского червя и вживления передней и задней ее части в стенку тела.
участвует нервная система. Свойство полярности оказалось присуще самой структуре нервной цепочки червей. В этих опытах не ампутировали ни головной, ни хвостовой концы червя, но рассекали нервную цепочку, концы которой отводили к краям раны и вживляли в стенки тела. Через некоторое время в месте вживления задней половины нервной цепочки формировалась структура, напоминающая голову червя, а в месте вживления другой части цепочки — образование, сходное с хвостом червя (рис. 1.1). Дальнейшие исследования на червях данного типа выявили в их нервном стволе микроскопические гранулы, содержащие какой-то секреторный материал. Естественно предположить, что при нормальном регенерационном процессе большая часть гранул перемещается в сторону передней бластемы вследствие полярности структуры нервной цепочки. Это и приводит к упорядоченности восстановленной структуры тела червя.
82
Членистоногие
Эта группа беспозвоночных включает омаров, крабов, пауков, насекомых и ряд родственных им организмов. Членистоногие имеют сложные глаза на подвижных стебельках и парные суставчатые придатки, которые приспособлены к выполнению самых различных функций — к захватыванию пищи, хождению, плаванию или другим, более специализированным дей-ствиям. Для всех членистоногих характерно сегментированное тело, покрытое твердым наружным
Рис. 12. Регенерирующая конечность равноногого рака, живущего в проточной воде. Культя конечности заключена в камеру из экзоскелета. (В статье Needham А. Е. «Regeneration in the arthropods and endocrine control» из кн. Regeneration in Animals and Related Problems», eds. Kiortsis V., Trampusch H. A. L„ North-Holland Publishing Co., Amsterdam, 1965, 283. Верхний рисунок взят из кн. Goss R. Regeneration, Academic Press, New York, 1969, 102.)
Зак. 52
83
покровом, служащим своеобразным экзоскелетом. Элементы экзоскелета подвергаются периодической смене в процессе развития животного: старый покров сбрасывается и замещается новым, более вместительным. У насекомых и некоторых ракообразных в случае отсечения части конечности регенерация происходит внутри «пакета», который формируется из экзоскелета вокруг оставшейся культи. Под защитой такого панциря конечность развивается полностью и начинает выполнять свои функции после очередной линьки животного (рис. 12).
Некоторые ракообразные и пауки наделены способностью самопроизвольно отторгать часть придатка — обычно при повреждении в результате атаки противника. Для осуществления подобной аутотомии они имеют специальный «ломающий» механизм, мышцы которого под влиянием нервного импульса резко сокращаются и отбрасывают отторгающуюся часть. Утраченный придаток быстро восстанавливается, хотя вновь образующаяся его часть поначалу значительно меньше исходной и дорастает до нормальных размеров лишь после нескольких линек.
Заканчивая обзор по членистоногим, не могу не остановиться на обнаруживаемых у животных данной группы случаях регенерации, когда утраченные придатки тела замещаются частью, отличной от исходного органа. Так например, вместо ампутированного глаза может сформироваться антенна или вместо удаленной ротовой части — ходильная конечность. Эта пока еще до конца не понятая форма регенерации получила название гетероморфоза. По-видимому, тут сказывается влияние уровней, на которых осуществляются ампутации органов. Если глазной стебелек омара отсекается почти у самой головы животного, то вместо него вырастает антенна. При таком отсечении, возможно, повреждается или удаляется нервный узел, к которому идет зрительный нерв. Если операцию провести аккуратно, ничего не повредив, то происходит полноценное восстановление всех структур глаза.
II
РЕГЕНЕРАЦИЯ У ВЫСШИХ ЖИВОТНЫХ
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У САЛАМАНДР
Подавляющее большинство экспериментов по регенерации у позвоночных проведено на земноводных, особенно на саламандрах. Одной из наиболе интересных областей исследования было изучени способности саламандр к полному восстановлению конечностей, строение которых в принципе весьма сходно со строением конечностей человека. В работах, с результатами которых мы сейчас ознакомимся, были использованы два представителя саламандр: тритоны и животные, известные в основном по их латинскому названию Ambystoma — амбистомы
Тритоны составляют широко распространенное семейство земноводных, представители которого обитают в различных частях света. В Соединенных Штатах Америки живет лишь два рода этих животных. Тритоны откладывают икру в водоемах, где и развиваются личинки. После водной стадии личинки путем метаморфоза превращаются во взрослых тритонов, которые проводят часть жизни на суше. Обычный на востоке США тритон Triturus virides-cens1 2 превращается сначала в сухопутную форму, известную как красный тритон, а еще через один— три года после нового изменения внешнего вида вновь возвращается в водную среду (рис. 13)3.
CD CD
1 Родовое название «амбистома» является сокращенным вариантом греческого термина «запихивающий в рот», происходящего от привычки саламандр пользоваться при еде передними конечностями.
2 Родовое имя этого тритона в ряде случаев обозначается как Notophthalmus или Diemyctylus.
3 В брачный период. — Прим., ред.
2*
35
Рис. 13. Взрослый Triturus virldescens. (Фото Barbour R. W. Department of Zoology, University of Kentucky.)
Рис. 14. Личиночная форма (аксолотль) мраморной амбистомы.
Рис. 15. Взрослая форма мраморной амбистомы. (Фото Barbour R. W, Department of Zoology, University of Kentucky.)
36
Именно эта взрослая водная форма тритона наиболее широко использовалась в исследованиях регенерации.
Регенерационная способность амбистом семейства, живущего в Северной Америке, изучалась, как правило, на личиночной, незрелой форме животных, У этой формы, именуемой аксолотлем ’, скелет хрящевой в отличие от костного скелета взрослых животных. К тому же конечности аксолотлей регенерируют гораздо лучше конечностей взрослых амбистом. Итак, мы видим, что эти две формы дают в руки исследователей широкий круг экспериментальных возможностей (рис. 14, 15).
Оба вида саламандр удобны еще и тем, что их легко найти в природе и можно без особого труда содержать в лаборатории. Тритоны часто встречаются на отмелях в прудах с проточной водой или в озерах, где их легко поймать сетью или сачком. Студнеобразные скопления яиц большинства амбистом можно найти в подобных же местах весной. Интересное исключение составляет мраморная амбистома Ambystoma орасит. Этот вид, обитающий на востоке США, выводит потомство в осенние месяцы, что весьма необычно для земноводных. Мраморная амбистома откладывает яйца в заполненные водой углубления, находящиеся на некотором удалении от прудов и озер. Если это скопление яиц перенести в лабораторию, то из них довольно быстро развиваются аксолотли.
Личинок амбистомы, а также взрослых тритонов следует содержать в аквариумах с прудовой или очищенной от хлора водопроводной водой. Но если тритоны прекрасно живут в общих аквариумах, то аксолотлей сразу после их вылупления необходимо перевести в индивидуальный контейнер, скажем в бумажную упаковку от молока, поскольку даже при нормальном питании эти животные склонны откусывать конечности у своих собратьев. За несколько недель личинки вырастают до размеров более двух с половиной сантиметров и могут быть использованы в экспериментах. Яйца амбистомы собирают лишь в
1 Слово «аксолотль» означает на языке ацтеков «слуга Воды».
37
определенные сезоны, только что развившихся личинок можно содержать в холодильнике илн охлаждаемой комнате и изредка кормить — в таких условиях их рост существенно замедляется. За несколько недель до опытов аксолотлей переносят в помещение с комнатной температурой и начинают часто кормить — нормальный ритм их роста восстанавливается.
Регенерация конечностей
Регенерация поврежденной конечности тритона или аксолотля происходит строго упорядоченно. Восстанавливающийся конец округляется, затем приобретает коническую форму, а поскольку он продолжает увеличиваться в длину, то становится похож на ласт. Вскоре начинают закладываться зачатки пальцев, и этот процесс намного опережает окончательное формирование конечности (рис. 16). Регенерировавшая конечность немного уступает по размерам исходной, но в остальном полностью соответствует ей, как по внешнему виду, так и функционально.
Постепенное изменение внешней формы регенерирующей конечности мало что говорит нам о том,что происходит с клетками внутри органа на разных стадиях регенерации. Об этих изменениях можно, однако,
Рис. 16. Последовательные этапы регенерации конечности тритона: через 10 дней после ампутапии (1), 12 дней (2), 14 дней (3), 18 дней (4), 28 дней (5), около 6 недель (6), около 8 недель (7). (В статье Singer М. «The influence of the nerve on regeneration of the amphibian extremity». Quarterly Review of Biology, 1952, 27:170.)
38
Рис. 17. Различные стадии регенерирующей передней конечности тритона. А — через 7 дней после ампутации клетки эпидермиса перемещаются на раневую поверхность и происходит заживление раны. Кость {темная зона в центре) и мышцы {справа и слева от кости) еще не разрушились. Б — через 14 дней после ампутации кость и мышцы в значительной степени дедифференциро-ваны. На вершине регенерирующего участка конечности заметно выпячивание, состоящее из клеток эмбрионального типа (бластема). В — на более поздней стадии происходит редифференцировка клеток и становятся заметными контуры восстанавливающихся костей. (Фото Singer М. «Regeneration of Body Parts», Scientific American, October, 1958, 82; Singer M. Limb Regeneration in the Vertebrates. Addison-Wesley Module in Biology, 1973,6.)
39
узнать с помощью микроскопического исследования. Для этого у группы саламандр удаляют по одной передней конечности, и поочередно с интервалом в день фиксируют ампутированную конечность каждого животного. Получают серию конечностей, претер-певших процесс регенерации в течение одного, двух, трех и более дней. После специальной обработ-ки готовят очень тонкие срезы конечностей по дли* не, закрепляют их на стекле и окрашивают гистоло-гическими красителями, позволяющими легко распознать различные типы клеток. Получается своего рода подневный отчет о судьбе клеток за весь период регенерации.
Первая фаза регенерации, наблюдаемая на срезах,— заживление раны. Наружный покров конечности составляют клетки эпидермиса. После ампутации конечности аксолотля или тритона, в каком бы месте она ни была, определенная часть клеток эпидермиса начинает перемещаться с культи на раневую поверхность и постепенно закрывает ее (рис. 17,А). После нескольких делений клеток на раневой поверхности формируется многослойное образование, именуемое апикальной шапочкой. Очень важным обстоятельством оказался контакт между клетками апикальной шапочки и подлежащими тканями. Если в результате какого-либо воздействия этот контакт нарушался, регенерационный процесс приостанавливался.
Вскоре после заживления раны в культе начинается своеобразный процесс «демонтирования», во время которого постепенно рассасываются ткани, непосредственно прилежащие к раневой поверхности. Особенно заметна перестройка мышечной ткани, волокна которой утрачивают упорядоченное расположение, делаются как бы «растрепанными». Из мышечных пучков выпадают отдельные мышечные клетки, подобные же изменения претерпевают и волокна соединительной ткани вблизи конца культи.
Значительным изменениям подвергается также костная ткань ампутированной конечности. Костная ткань состоит из живых клеток, окруженных матриксом — плотным веществом, продуктом секреции клеток кости. Во время «демонтирования» утрачивается надкостница, костный матрикс разделяется на фраг
40
менты, вокруг которых обнаруживаются клетки не« обычного типа, называемые гигантскими. Эти клетки, содержащие не менее трех ядер, захватывают и переваривают кусочки матрикса точно так, как это делают белые кровяные клетки, захватывающие и разрушающие микроорганизмы. После удаления разрушенного материала освобождается место для роста новой кости и хряща.
В процессе рассасывания тканей, которое протекает значительно быстрее у личиночных форм, нежели у взрослых саламандр, концевая часть культи становится отечной и выпячивается наружу. Позже, как это видно на срезах конечности, в культе формируются скопления идентичных по внешнему виду клеток, утративших специализацию и чрезвычайно сходных с эмбриональными. Слой таких клеток находится на растущем конце поврежденной конечности непосредственно под апикальной шапочкой. Это и есть бластема, или регенерационная почка. Как вы помните, формирование бластемы характерно также для ранних стадий регенерации у планарий, причем происхождение ее клеток до сих пор неясно. Немало споров было и по вопросу о происхождении клеток бластемы в регенерирующих конечностях земноводных. Однако уже несколько десятков лет назад были проведены убедившие всех ученых эксперименты, показавшие, что клетки регенерационной почки берут свое начало не из какого-то резервного источника, а из зрелых клеток тканей культи, располагающихся близ места ампутации. Эти клетки подвергаются дедифференцировке, скапливаются на регенерирующем участке конечности и активно делятся.
Микроскопическое исследование клеток бластемы не обнаружило, какие именно ткани культи послужили их источником. Логично предположить, что они могут происходить из мышечной, костной и соединительной ткани остатка конечности. Но в процессе дедифференцировки утрачиваются все признаки, которые могли бы указать на какую-либо преемственность. Для мышечных клеток характерны вытянутые волокна с поперечно расположенным материалом, обеспечивающим процесс сокращения. Костные и хрящевые клетки распознаются по присутствию
41
матрикса, которым они секретируют в окружающее пространство. Клетки бластемы не имеют ни одного из этих отличительных свойств, хотя по некоторым признакам и напоминают отдельные клетки соединительной ткани, характеризующиеся крайне простой организацией. В последнее время исследователи предложили ряд методов, позволяющих не только «пометить» некоторые типы клеток, вовлекаемых в процесс дедифференцировки и формирования бластемы, но и установить судьбу клеток в уже сформировавшемся регенерате конечности (см. гл. III).
После того как под закрывающим рану эпидермисом накопятся дедифференцированные клетки, бластема приобретает округлую форму, напоминая своеобразный холмик на поверхности культи. В этой фазе регенерации утратившие специализацию клетки начинают бурно делиться (рис. 17, Б), а в бластему постепенно врастают регенерирующие нервные волокна. Достигнув апикальной шапочки, они распространяются между клетками эпидермиса, пронизывая таким образом весь регенерат.
Следующая стадия регенерации — стадия «конической» бластемы — является результатом активного деления дедифференцированных клеток культи. Она характеризуется налаживанием в регенерате нормального кровотока.
Конечность продолжает удлиняться, и в период, называемый стадией редифференцировки, постепенно восстанавливается структура утраченных частей. Первым указанием на восстановление специализации тканей является образование хрящевой «мозоли» вокруг поврежденного конца кости. После этого клетки, составляющие центральный участок бластемы, начинают формировать вокруг себя костный матрикс. Вскоре в регенерирующей конечности проступают очертания восстанавливающихся костей, а чуть позже в клетках бластемы, предназначенных для образования мышечной ткани, уже различаются волокна (рис. 17, В). Мышечные волокна начинают врастать по направлению от культи к регенерирующему участку конечности, ластообразная форма которого указывает на идущий процесс восстановления кисти.
Хотя конечность аксолотля восстанавливается
42
значительно быстрее, чем конечность взрослого тритона, длительность стадии регенерации четко определена как у личиночных, так и у взрослых форм земноводных. У взрослых тритонов, содержащихся при комнатной температуре, заживление раны начинается в первые 24 часа после отсечения конечности. «Бластема-холмик» выявляется через 15 дней, а «бластема-конус» — через 18—21 день. В период образования ластообразной формы конечности и локтевого сгиба темп регенерационного процесса несколько замедляется. Затем регенерируют пальцы, полное число которых (четыре) восстанавливается к концу восьмой недели после ампутации1. В противоположность взрослым земноводным при содержании пятнистого или мраморного аксолотля в условиях комнатной температуры заживление раны начинается в течение всего нескольких часов после ампутации конечности. «Бластема-холмик» выявляется через 7 дней, «бластема-конус» становится видимой на 10-й день регенерации. Ластообразная конечность у этих животных образуется через две недели после операции, а еще через неделю формируются все четыре пальца нормальной конечности.
Необходимы ли для регенерации нервы?
Чтобы процесс регенерации шел нормально, необходимы не только апикальная шапочка, прикрывающая и поддерживающая контакт с дедифференцированны-ми клетками бластемы, но и такие дифференцированные ткани, как нервная и железистая.
Влияние, оказываемое нервной тканью на ход регенерации, обнаруживается в несложном опыте, состоящем в рассечении нервных стволов конечностей аксолотлей или тритонов, подвергающихся регенерации. От спинного мозга к передним конечностям животных отходят три основных нерва; там они
1 В опытах с тритонами Triturus viridescens было показано, что график регенерационного процесса существенно меняется в разное время года. Зимой регенерация протекает значительно медленнее, чем здесь описано. Основным фактором, определяющим интенсивность регенерации, оказалось количество получаемого животным солнечного света.
43
разветвляются на большее число ветвей меньшего диаметра. На уровне плеча эти нервы идут еще тремя большими неразветвленными пучками волокон, лежащими вблизи друг друга. Именно в этом месте их легко рассечь. После такой несложной операции (носящей название «денервация») конечность утрачивает контроль со стороны центральной нервной системы.
Перед проведением денервации (как, впрочем, и при любой хирургической операции, в том числе и при удалении участков конечности) исследователи подвергают экспериментальных животных анестезии. После того как обезболивающий эффект достигнут, животное помещают на увлажненной марле в чашку Петри и ставят на столик микроскопа с малым увеличением. Если операция проводится на взрослом тритоне, для обнажения нервных стволов необходимо рассечь кожу и значительное количество мышечной и соединительной ткани. У личиночных форм добраться до нервов проще, поскольку прикрывающий их слой ткани весьма тонок. После рассечения нервов с помощью глазных ножниц и окончания действия обезболивающего вещества саламандр переносят в контейнеры, в которых они содержались до операции. При успешно проведенной денервации оперированная конечность утрачивает способность двигаться.
Когда начинались эксперименты по выяснению связи регенерационной способности животного с состоянием его нервной системы, исследователи прежде всего хотели знать, будет ли денервация влиять на восстановительный процесс и, если да, то на какой стадии. Если у вас есть собственные соображения по поводу последовательности экспериментов с такой целью, то набросайте этот план и проследите по книге, какие пути были избраны учеными, искавшими ответ на поставленные выше вопросы.
Денервацию проводили в разные сроки по отношению к ампутации конечности. В одних случаях она была осуществлена за несколько дней до удаления лапы, в других ее делали одновременно или спустя какое-то время после ампутации.
Животных ежедневно осматривали, из конечностей готовили срезы и окрашенные препараты для обнаружения под микроскопом каких-либо изменений во 44
внутренней структуре органа. На взрослых тритонах были получены следующие результаты. Если денер-вацию проводили до ампутации или одновременно с нею, образование бластемы никогда не происходи* ло. Рана заживала, наблюдалось некоторое наруше-ние структуры тканей культи, но никаких иных признаков регенерации обнаружить не удавалось. Таким же было течение регенерационного процесса и в случае, когда денервацию проводили вскоре после ампутации, когда бластема еще не успевала сформироваться,— оно бйло ограничено лишь заживлением раневой поверхности. Но если нервы рассекались в период, когда бластема уже была сформирована, конечность тритона восстанавливалась. Таким образом, исследования показали, что нервная система необходима для начала регенерационного процесса, а после того, как сформируется бластема, восстанавливающийся регенерат становится как бы независимым от влияния нервной ткани L
Естественно предположить, что подобная зависимость справедлива и для процессов регенерации у аксолотлей, на самом же деле личиночные формы Ambystoma, подверженные аналогичному процессу денервации, реагируют несколько отличным от тритонов образом. Если бластема уже сформировалась, регенерация, как и у тритонов, продолжается независимо от денервации. Если передняя конечность подвергается денервации до или непосредственно во время ампутации либо сразу после удаления конечности, бластема и в этом случае, как у тритонов, не образуется. Но тут возможно неожиданное явление: денервированные конечности постепенно начинают укорачиваться. Гистологическое исследование показало, что подобная регрессия обусловлена исчезновением тех клеток культи, которые обычно формируют бластему. Что вызывает этот неожиданный эффект и куда
1 Восстанавливающиеся конечности тритона никогда ие становятся полностью независимыми от влияния нервной ткани. Так, например, если денервацию проводят в период редифференцировки клеток бластемы или несколько позже, морфогенез конечности будет происходить и она будет удлиняться, но общий размер регенерирующей лапы будет существенно меньше, чем при нормальном процессе регенерации,
48
мигрируют дедифференцированные клетки культи, не ясно, но отмечено, что, если в остаток конечности вживить — причем в самое разное время после операции — нервные стволы, культя подвергается регенерации, даже если этому предшествовала существенная регрессия.
Регенерация конечности при отсутствии нервов
Итак, наличие неповрежденной нервной ткани является необходимым условием регенерации конечностей, хотя ее влияние необходимо лишь на определенных стадиях восстановительного процесса. Но тут имеется одно интересное исключение из правила. Обнаружено, что, если конечность аксолотля иннервирована небольшим числом нервных волокон пли вообще лишена их с ранних эмбриональных стадий, ее регенерационная способность не утрачивается.
Чтобы обнаружить это явление, необходимо вырастить саламандр, конечности которых никогда не имели нервов. Как этого достичь? На ранних стадиях развития на боковых поверхностях тела зародышей земноводных формируются почки конечностей, которые выглядят небольшими выступами. Закладки постепенно растут и приобретают форму конечностей. Именно в этот период в удлиняющуюся конечность начинают врастать нервные стволы, берущие начало от нервной трубки (закладки спинного мозга эмбриона). Вот если бы извлечь нервную трубку перед началом иннервации конечностей! Но такая операция невозможна — слишком большое число жизненных процессов регулируется нервными импульсами, идущими от головного мозга через нервную трубку, чтобы после ее удаления у животного оставались шансы выжить. Для поставленной задачи необходимо выбрать иной путь.
В период, предшествующий формированию почек конечностей, отбирают пару эмбрионов амбистомы. С нижней правой части тела одного эмбриона и нижней левой части тела другого удаляют наружный слой тканей (эктодерму) и некоторую часть среднего слоя (мезодермы). Обработанные таким образом
46
части эмбрионов совмещают друг с другом и фиксируют на несколько часов. Этого времени оказывается .достаточно для слияния тканей, в результате чего образуются связанные друг с другом на весь период дальнейшего роста «близнецы». На следующей стадии развития у правого эмбриона удаляют нервную трубку. Левый эмбрион, обладающий всеми компонентами нервной системы, нормально питается сам и одновременно дает полное жизненное обеспечение правому члену пары, который становится своеобразным паразитом своего близнеца. Продолжая расти, животные скоро приобретают характерные черты аксолотлей, но близнец-паразит всегда гораздо меньше другого близнеца и его конечности полностью лишены нервов на всех стадиях формирования
Как только подобные пары «близнецов» достигают определенной длины, у правого и левого аксолотлей удаляют конечности. Как и следовало ожидать, ампутированные конечности левых эмбрионов, с нормальной иннервацией, полностью регенерируют. Но неожиданно к столь полному восстановлению оказываются способны н конечности правого эмбриона.
Как же объяснить способность к регенерации лишенной нервов конечности в свете утраты подобной способности денервированными конечностями нормальных саламандр. Одно из возможных объяснений состоит в том, что после вживления нервов в развивающуюся конечность все ее ткани становятся в определенной степени зависимыми от влияния нервной системы, в результате чего регенерационный процесс не может происходить после денервации. Иными словами, конечности становятся «зависимыми» от присутствия в них неповрежденных нервов. Причины такого эффекта до настоящего времени полностью не ясны, однако, конечности «близнецов-паразитов» никогда не содержали нервов и, следовательно, не могли приобрести той зависимости, которая характерна для нормальных конечностей. Именно благодаря
1 Электронная микроскопия иногда выявляла в конечностях близнеца-паразита нервные волокна, но их общее число никогда не превышало 1/10 нормального содержания нервных волокон в конечности аксолотля.
47
«автономному» от нервной системы характеру развития такие конечности и могут регенерировать без нервной ткани.
Эндокринная система и регенерация конечностей
Эндокринная система позвоночных представлена различными железами внутренней секреции, которые вырабатывают биологически активные вещества, называемые гормонами. Гормоны разносятся с током крови по всему организму и либо непосредственно регулируют деятельность какого-нибудь органа, либо стимулируют секрецию других эндокринных желез.
Роль, которую играет тот или иной гормон, можно уяснить следующим образом. У нескольких животных удаляют одну и ту же железу. Наблюдаемые вслед за тем расстройства определенных функций организма позволяют предположить, что данные функции относятся к числу тех, которые регулируются гормонами, выделяемыми удаленной железой. Это предположение можно подтвердить или отвергнуть, если вводить оперированным животным один или целую серию гормонов и наблюдать, произойдет ли восстановление исходной функциональной активности.
Участие эндокринной системы в процессе регенерации конечностей земноводных изучалось примерно по тому же плану, что и при изучении действия нервов. Поскольку известно, что гипофиз («главная железа» внутренней секреции), расположенный у основания головного мозга позвоночных животных, вырабатывает ряд гормонов, прямо или опосредованно влияющих на процессы роста, были поставлены опыты, в которых регенерацию конечностей тритонов и аксолотлей изучали на фоне удаленного гипофиза.
Чтобы обнаружить гипофиз саламандр, животных подвергают анестезии, а затем с помощью пары тонких пинцетов отгибают нёбный отросток верхней челюсти. Крошечный гипофиз, лежащий непосредственно над ним, нетрудно удалить, всосав в оттянутый кончик стеклянной пипетки, после чего отросток возвращают на место.
48
Регенерация в течение 14 дней
8 дней
Удаление	Удаление
гипофиза	регенерирующей
конечности, фиксация, приготовление срезов
!
Ампутация
Рис. 18. Влияние удаления гипофиза на поздних стадиях регенерации. В этом опыте гипофиз удаляли у тритонов через 14 дней после ампутации конечности, а еще через 8 дней из регенерирующей конечности готовили гистологические препараты. Состояние бластемы у тритонов с удаленным гипофизом (группа Б) сравнивали с состоянием бластемы у животных с сохраненным гипофизом (группа А) также на 22-й день после ампутации. На иижних схемах представлены проекции продольных срезов бластемы иа бумагу, разграфленную на квадраты. Площадь проекции бластемы от тритона с гипофизом равна 16,11 квадрата, а от тритона без гипофиза — 9,69 квадрата. Среднее значение для группы А составило 15,91 квадрата, а для группы Б — 9,25. (В статье Tassava R. A. «Hormonal and nutritional requirements for limb regeneration and survival of adult newts». J. Exp. Zool., 1969, 170:38.)
При удалении гипофиза до ампутации, одновре* менно с ней или сразу после нее полное восстановлен ние конечности происходит редко. Если же гипофиз удаляется в период, когда бластема сформирована хотя бы до стадии «холмика», регенерация проходит нормально. Но наличие гипофиза чрезвычайно важ* но и для поздних стадий регенерации конечностей у взрослого тритона. Если гипофиз удаляется на 14-й день после ампутации, то через несколько недель наблюдается заметное отставание в росте развивающихся бластем, а также признаки редифференциров* ки ее клеток (рис. 18).
Для выяснения, какие из гормонов гипофиза не*
49
обходимы для нормального процесса регенерации, взрослым тритонам с удаленным гипофизом вводили разные гормоны, порознь и в сочетании. Наиболее эффективным в поддержании регенерационной способности конечностей тритонов оказалось сочетание двух гормонов — пролактина и тироксина1. Роль этих двух гормонов в развитии и обмене веществ у тритонов,, очень важна, это было известно давно; но, каков путь влияния этих веществ на регенерационный пррцесс, пока неясно.
Поскольку реакция ампутированных конечностей личинок амбистомы на денервацию существенно отличается от той, которая наблюдается у взрослых тритонов, логично ожидать, что удаление гипофиза также по-разному будет влиять на регенерацию у личиночных и взрослых форм саламандр. Подобная точка зрения подтвердилась: регенерация конечностей у аксолотлей протекает нормально независимо от того, удален гипофиз или нет, а если да, то в какое время по отношению к ампутации. У этих личиночных форм земноводных восстановление утраченных конечностей оказывается совершенно независимым от влияния столь важной эндокринной железы.
Перспективы исследований
Чтобы полностью понять процесс восстановления конечностей у земноводных, равно как и процесс восстановления утраченных частей тела у планарий, нужно получить ответы на многие вопросы. Что действительно происходит при дедифференцировке и редифференцировке клеток? Какие ткани культи являются источником клеток бластемы? В чем состоит специфика действия нервных и гормональных факторов на регенерацию конечности и почему личиночные и взрослые формы саламандр по-разному реагируют на денервацию и удаление гипофиза? Таковы основные вопросы. Близки ли мьц к тому, чтобы дать на них ответ. Необходимо подчеркнуть, что благодаря ряду методических усовершенствований и использованию биохимических исследований
1 Тироксин — гормон, вырабатываемый щитовидной железой позвоночных животных и человека. — Прим. ред.
50
(детальнее мы поговорим об этом ниже) в разработке этих вопросов достигнут существенный прогресс. Тем не менее размеры «белых пятен» в данной проблеме еще очень велики.
Несомненно, при чтении этой главы у вас все время возникал еще один вопрос: могут ли достижения в изучении регенерации у земноводных оказаться полезными для стимуляции восстановления конечностей у человека? Немало людей, как специалистов, так и неспециалистов, в разное времй пытались найти ответ на него. Постараемся и мы разобраться в нем в заключительной главе нашей книги.
РЕГЕНЕРАЦИЯ У ДРУГИХ ПОЗВОНОЧНЫХ
К высшим животным относятся следующие пять классов, перечисленных в соответствии с усложнением их организации: рыбы, земноводные, пресмыкающиеся, птицы и млекопитающие. Регенерационная способность присуща всем классам высших животных, но в наибольшей степени она выражена у земноводных. У высших позвоночных можно наблюдать также необычные механизмы восстановительного роста, не встречающиеся у беспозвоночных животных.
Рыбы
Ряд наружных структур многих видов рыб, например плавники, жабры, чешуя, усики (чувствительные органы, расположенные у некоторых видов вблизи рта), сравнительно легко поддаются восстановлению. У этой группы животных выявляется также уникальный тип регенерации, не известный среди других видов животных. Если вы увлекаетесь разведением аквариумных тропических рыб или хотя бы изредка рассматривали их в большом аквариуме зоологического сада, вы знаете, что для «костюмов» обитателей теплых вод характерны яркие полосатые или пятнистые рисунки. У многих из этих видов рыб регенерация плавников сопровождается восстановлением цветового рисунка, свойственного утраченному органу. Подобная регенерация происходит у пресноводной тропической рыбы, известной аквариумистам
51
как данио розовый. Рыба раскрашена чередующимися красными, черными и желтыми полосами, идущими вдоль тела животного, при этом три полосы в том же порядке переходят на плавники. После ампутации плавника на близком расстоянии ог тела рыбы не только восстанавливается общая форма и отдельные часДи утраченного органа, но и четко- проступают раскрашивающие линии, расположенные в том же порядке, как и в удаленном плавнике.
Подробное исследование данио розового с помощью микроскопа показывает, что характерные для этой рыбы цветные полосы состоят из многих клеток, содержащих гранулы соответствующего пигмента — красного, черного или желтого. Но каждый из этих видов пигментных клеток ведет себя по-разному в различные периоды восстановительного роста плавников (рис. 19). После отсечения плавника (через середину красной полосы, расположенной у самого тела рыбы) на раневой поверхности появляется лишенная всякой окраски бластема. Вслед за этим начинают постепенно отрастать костные лучи плавника в наружном направлении от мест их отсечения. Но даже через 20 дней после ампутации плавника, когда его общая структура уже восстановлена, на нем все еще нельзя различить ни одной цветной полосы, кроме исходной красной, сохраненной при операции. Практически вся вновь образованная ткань плавника состоит в это время из клеток, несущих желтый пигмент, и лишь незначительное число клеток несут гранулы черного пигмента. Оба типа клеток выглядят незрелыми и более мелкими по сравнению с нормальными клетками плавника. Это дает основание предположить, что клетки регенерата дифференцировались из бесцветных пропигментных клеток (предшественников пигментных клеток), которые мигрировали во вновь формирующуюся ткань. И лишь позднее происходит восстановление общего характера строения и окраски плавника. Красная полоса приобретает свою исходную ширину, зона, состоящая из смешанных клеток, сохраняет лишь клетки с черным пигментом, а желтая полоса занимает место у внешнего края плавника. Окраска плавника
62
Рис. 19. Данио розовый. Постепенные изменения окраски после удаления трехцветного брюшного плавника. А — распределение пигментных клеток в плавнике взрослой рыбы; расположение пигментных клеток в регенерирующем плавнике через 20 дней после ампутации (Б) и через 45 дней (В). (В статье Good-rich Н. В., Greene J. М. «Ап experimental analysis of the development of a color pattern in the fish Brachydanio albolineatus Blyth», J. Exp. Zool., 1959, 141 :21.)
полностью восстанавливается через 45 дней после его ампутации.
Каким же образом осуществляются все эти процессы? Ведь восстанавливается не только трехцветная окраска плавника, но н практически равная исходной ширина каждой полосы. После проведения многочисленных экспериментов было сделано заключение, что в процессе регенерации происходит своеобразное взаимодействие трех видов пигментных клеток на основе поэтапного клеточного антагонизма:
1,	Вначале в регенерирующем плавнике находятся и черные, и желтые незрелые пигментные клетки, но эта взаимная толерантность (невосприимчивость) не может долго продолжаться. Предполагают, что прн созреваннн
63
желтые клетки выделяют вещество, способное диффундировать на некоторое расстояние и разрушать лежащие рядом с желтыми клетки, несущие черный пигмент.,
2.	В то время как в черно-желтой зоне идет этот процесс деструкции, красные пропигментные клетки постепенно проникают в формирующийся плавник и там в зоне, граничащей с остатком красной полосы, созревают, восстанавливая таким образом ее исходную ширину.
3.	Созревающие красные клетки тоже начинают выделять вещество, обладающее способностью диффундировать и поражать желтые пигментные клетки. Поэтому вблизи красной полосы разрушаются желтые клетки и остаются неповрежденными черные. В результате желтая полоса может восстановиться лишь у внешнего края регенерирующего плавника, что и происходит в действительности, а в середине остается черная полоса.
Хотя предложенные теоретические рассуждения и не объясняют всех явлений, происходящих при восстановлении окраски данио розового, изложенная рабочая гипотеза может служить хорошей основой для дальнейших экспериментов.
Земноводные
Класс позвоночных, называемых земноводными, или амфибиями, делится на две основные группы: хвоста* тые амфибии (саламандры) и бесхвостые (лягушки, жабы). Мы уже познакомились с большим материалом по регенерации конечностей у саламандр — группы амфибий, представители которой не теряют хвост в процессе метаморфоза и проводят большую часть своей взрослой жизни в водной среде. В личиночной стадии хвостатые амфибии могут восстанавливать различные органы и части тела. В дополнение к исследованиям регенерации конечностей у личинок амбистом (аксолотлей) значительное внимание уделяется закономерностям восстановления хвоста и регенерации участков позвоночника. Различные виды тритонов способны во взрослом состоянии восставав*
54
ливать части скелета, глаз и внутренних органов помимо уже известной нам способности к регенерации конечностей.
Из крупных саламандр к регенерации способны представители видов, для которых характерно явление неотении, то есть достижение половой зрелости и размножение при сохранении личиночной организации. Животные этих видов проводят всю жизнь в воде. Примером такого неотенического животного является американский протей (Necturus), довольно часто используемый в опытах по регенерации в США. Его легко узнать по перистым наружным жабрам, сохраняющимся на протяжении всей жизни животного (рис. 20,А). Другим представителем неотениче-ских форм хвостатых амфибий является личинка мексиканской амбистомы, или аксолотль (рис. 20, Б). Мексиканского аксолотля чаще используют для экспериментальных целей, так как его проще содержать в лабораторных условиях по сравнению с протеем. Когда неотенические животные достигают своего максимального размера (более 20 сантиметров), они становятся сходными с крупными саламандрами. Но у последних для полной регенерации конечностей требуется не менее нескольких месяцев, а у протея и аксолотля всего недели. Вот почему протей и аксолотль являются удобным объектом для исследователей, обычно стремящихся получить результаты экспериментов как можно быстрее.
Лягушки и жабы ведут более наземный образ жизни, чем саламандры, и во взрослом состоянии не имеют хвоста. У личиночных форм этих животных (головастиков) регенерируют многие структуры тела, но у взрослых животных при нормальных условиях эта способность отсутствует. Как установлено, резкое падение способности к регенерации конечностей происходит после прохождения головастиками метаморфоза, когда у них развиваются органы, обеспечивающие им способность к выживанию на суше. Но нет правила без исключений. У южноафриканской шпорцевой лягушки (Xenopus) способность к регенерации конечностей сохраняется и во взрослом состоянии. Однако внешний вид регенерирующей конечности Xenopus существенно меняется. Восстановившаяся
65
Рис. 20. Регенерация конечности у неотенических форм земно-водных протекает аномально.
конечность, как правило, заканчивается не кистью а полным набором пальцев, а странной структурой, напоминающей вытянутый шип (рис. 20, В).
Пресмыкающиеся
У многих ящериц при захвате хвоста противником срабатывает отбрасывающий механизм, сходный с имеющимся у некоторых представителей членистоног
5в
гих. Отбросив хвост, животное уходит от опасности^ а утраченный орган постепенно восстанавливается. Поскольку ящерицы — позвоночные животные, их спинной мозг заходит в хвост и защищен костными позвонками. При внезапном сокращении мускулатуры позвонки разделяются в определенной точке, обеспечивая таким образом отбрасывание хвоста.
Пресмыкающиеся могут восстанавливать утрачен-ную чешую, у этой группы сухопутных животных постоянно происходит обновление зубов. Однако хвост является единственным органом рептилий, регенерирующим в нормальных условиях. Восстановительный рост хвоста после его потери в естественных условиях или после удаления хирургическим путем начинается с процесса дедифференцировки тканей культи и последующего образования бластемы, то есть типичных стадий регенерации, с которыми мы уже достаточно познакомились. Но некоторые черты регенерации хвоста у ящериц необычны. Во-первых, при формировании бластемы в ее ткани различима закладка восстанавливающегося спинного мозга, но эта структура берет начало не из дедифференцированных клеток, а растет непосредственно из участка мозга, оставшегося в неповрежденном фрагменте хвоста. Во-вторых, регенерировавший хвост не имеет формы, характерной для исходного органа, как бывает при восстановлении конечностей у земноводных или плавников у рыб. В новом хвосте спинной мозг оказывается восстановленным не на всю свою длину, наружная сегментация не выражена, а костных позвонков вообще нет. Тем не менее происходит реднфференци-ровка тканей мышц и хряща, восстанавливается и чешуя.
Зависит ли регенерация хвоста у ящерицы от присутствия нервов, как это бывает при регенерации конечностей у амфибий? По-видимому, да, поскольку при экспериментально заблокированном выросте спинного мозга восстановления хвоста не произойдет. Но для обеспечения регенерации хвоста оказываются необходимыми не столько сами нервные волокна, сколько клетки, выстилающие спинномозговой канал. Дальнейшие исследования прояснят роль этих клеток в восстановлении хвоста и, возможно, обнаружат
57
общие для амфибий и рептилий закономерности регуляции органами нервной системы восстановительных процессов.
Птицы
О регенерационной способности птиц известно очень мало, за исключением того, что они периодически сбрасывают и восстанавливают перьевой покров. Регенерация выпавших перьев (или перьев, удаленных искусственным путем) очень напоминает процесс роста этих образований у эмбрионов птиц незадолго до их вылупления. В кожном слое эмбриона формируются размещенные в правильной геометрической последовательности небольшие перьевые почки, или сосочки, каждый из которых состоит из внутреннего слоя богатой кровеносными сосудами мягкой пульпы и наружного эпидермального покрова. Постепенно почки начинают расти внутрь кожного слоя. Каждая из них при этом формирует перьевое влагалище, или фолликул, после чего начинается дифференцировка перьевых структур. Затем сосочек удлиняется, растет наружу и вскоре уже выступает из отверстия фолликула. Все более удлиняясь, перьевой сосочек приобретает коническую форму; эпидермальные клетки, занимающие его наружный слой, уплотняются и окружают растущее перо своеобразной защитной оболочкой. Тем временем более глубоко расположенные эпидермальные клетки формируют между защитной оболочкой и пульпой, через которую поступает питание, части будущего пера. Когда перьевой вырост достигает нормальной длины, оболочка вскрывается, находящиеся под ней мягкие части пера раскручиваются, а пульпа постепенно рассасывается. Часть перьевого сосочка в основании каждого фолликула всегда сохраняется, обеспечивая тем самым восстановление пера во время линьки: вновь образующиеся перья просто выталкивают из перьевых влагалищ своих предшественников.
Линька происходит у птиц один-два раза в год, обычно этот процесс связан с периодом размножения. В период ухаживания, предшествующий спариванию, птицы одеты в яркий брачный наряд, тогда как в зимние месяцы — в более скромные одежды. Один 58
перьевой сосочек дает начало перьям и того и другого типа. Обычно птицы не теряют сразу всего перьевого покрова, хотя есть и исключения из этого правила. Например, пингвины — нелетающие птицы— теряют все свои перья одномоментно, и в период линьки их часто можно видеть стоящими в груде перьев. На восстановление оперения пингвинов идет всего 14 дней, поскольку им не требуется регенерировать отсутствующие у этих птиц большие маховые перья.
Млекопитающие
На протяжении всей эволюции животного мира по мере перехода от низших форм к высшим совершенно явно прослеживается постепенное снижение способности животных к восстановлению конечностей или других важных частей тела (восстановительная, или репаративная, регенерация). Эта тенденция так сильно выражена, что у многих высокоорганизованных животных регенерационная способность кажется совсем утраченной'. У теплокровных позвоночных, птиц и млекопитающих, основной тип восстановительного процесса сводится к заживлению случайных повреждений в костях, мышцах, коже или нервных волокнах. Чтобы подробнее рассмотреть ход регенерации в этих структурах у млекопитающих, познакомимся сначала с их нормальным строением и типичными примерами повреждений.
1 У этого общего правила есть, однако, ряд исключении. Во-первых, сила регенерационной способности внутри отдельных групп беспозвоночных и позвоночных животных существенно различается. Паразитирующие простейшие ие способны к регенерации, тогда как свободноживущие, вроде инфузории трубача, прекрасно регенерируют; гидроидные полипы регенерируют гораздо лучше медуз. Не все плоские черви обладают способностью к регенерации утраченных частей тела. Среди земноводных взрослые лягушки и жабы не способны к регенерации, тогда как у саламандр ярко выраженная регенерационная способность присуща и личиночным, и взрослым формам. Другой тип исключений составляют случаи повышения регенерационной способности у животных, относящихся к более высокоорганизованным группам внутри определенных таксонов. Так, например, более высокоорганизованные саламандры (хвостатые амфибии) проявляют во много раз большую способность к регенерации, чем любая из рыб.
59
РЕГЕНЕРАЦИЯ МЫШЦ
Поперечнополосатые мышцы состоят, как показывает микроскопическое исследование, из большого числа длинных цилиндрических клеток, лежащих параллельными пучками и соединенных друг с другом соединительной тканью. Каждое мышечное волокно окружено оболочкой и содержит множество ядер и вытянутых волоконец (фибрилл) с поперечной исчер-ченностью, несущих вещества, которые обеспечивают сократительную деятельность мышц. По периферии мышечного волокна, непосредственно под его оболочкой, при микроскопировании обнаруживаются своеобразные «клетки внутри клетки», получившие название клеток-сателлитов.
При повреждении мышечной ткани млекопитающих, например при сильном сдавливании, происходит разрушение цитоплазмы мышечных волокон в зоне приложения силы. Эта обязательная стадия предшествует любому восстановительному процессу. На следующем этапе включаются в работу фагоциты, клетки-чистильщики, функция которых сводится к активному захвату и поглощению всякого рода патологического и инфекционного материала — бактерий, мертвых клеток или их фрагментов. В поврежденном участке мышцы сохраняются лишь оболочки мышечных волокон, которые не подвергаются воздействию развертывающегося процесса поглощения пораженного материала. После этого в месте повреждения начинают скапливаться миобласты — веретеновидные клетки, имеющие по одному ядру, окруженному небольшим количеством цитоплазмы. Контактируя друг с другом, миобласты сливаются и образуют удлиненные структуры, по форме напоминающие трубочки. Происхождение миобластов недостаточно ясно; их предшественниками могут быть мышечные клетки, клетки соединительной ткани и клетки-сателлиты.
С этого момента регенерация мышц у млекопитающих в значительной степени зависит от сохранности нервной ткани. Если это условие соблюдается, мышечные трубочки, образовавшиеся из слившихся миобластов, начинают расти, проникают в опустевшие полости оболочек прежних мышечных клеток, 60
которые теперь служат как бы каркасом для регенерирующей части мышц. Формируются дополнительные части цитоплазмы, и в них появляются волокон* ца с поперечной исчерченностью. Процесс сопровож-дается восстановлением функциональной активности мышц.
Подобное замещение мышечной ткани (тканевая регенерация) происходит значительно быстрее, чем восстановительный рост мышц при полноценной регенерации конечности у земноводных (регенерация по типу эпиморфоза). Между двумя сравниваемыми процессами есть и еще одно различие. В случае регенерации целой конечности деструкция мускулатуры. культи принимает больший масштаб, чем при тканевой регенерации; кроме того, разрушению подвергаются и оболочки клеток, а появлению новых мышц обязательно предшествует стадия формирования бластемы. Вновь сформированные мышцы регенерировавшей конечности земноводных ничем не отличаются от исходных, тогда как регенерирующие мышцы млекопитающих существенно уступают ио размерам исходным. У низших позвоночных наблюдаются обе формы восстановительных процессов мускулатуры; у беспозвоночных животных, таких, как речные раки, тканевой регенерации мышц вообще не бывает. Восстановление целых конечностей у ракообразных идет по типу эпиморфоза. Интересно, что «программа развития» у речных раков предусматривает восстановление именно целой конечности, а не какой-то определенной ткани, тогда как у эволюционно более продвинутых млекопитающих ситуация становится обратной.
РЕГЕНЕРАЦИЯ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН
Нервная система высших животных подразделяется на центральную и периферическую. Млекопитающие не обладают способностью восстанавливать те или иные части центральной нервной системы (ЦНС), состоящей из головного и спинного мозга, но, как и другие позвоночные, успешно восстанавливают периферические нервы в различных частях тела.
Нервы — это шнуровидные тяжи нервной ткани, образованные пучками нервных волокон, между кото
61
рыми находится соединительная ткань; нерв среднего размера может включать до нескольких тысяч нервных волокон. Исследование под микроскопом показывает, что каждое нервное волокно является отростком (аксоном) одной нервной клетки, или нейрона, основная часть которой (тело) располагается либо в ЦНС, либо близ нее. Аксоны могут достигать значительной длины. Каждый из них заканчивается, разветвляясь, либо в каком-нибудь органе чувств — и в этом случае служит для передачи нервных импульсов от рецепторов к ЦНС (например, тепловых или болевых раздражений),— либо в каком-нибудь функционально-активном органе, например мышце или железе (рис. 21). В последнем случае нервные импульсы передают этим органам «инструкции» ЦНС, вырабатываемые ею в ответ на поступающие сигналы. Аксоны окружены шванновскими клетками, играющими важную роль в регенерации нервов. Имеющие форму спирали плотные слои этих клеток покрывают все волокно, создавая так называемую миелиновую оболочку (рис. 22).
При поражении периферического нерва, несмотря на полное разрушение аксонов на длительном про-
Ядро
Аксон
Миелиновая оболочка
Тело нервной клетки
Рис. 21. Аксон — это отросток нервной клетки, часто покрытый слоем миелина. Двигательные нервы, как показано на рисунке, заканчиваются в мышцах или железах. (В кн. Katz В. Nerve, Muscle and Synapse, McGraw-Hill Book Co., New York, 1966, 4.)
Окончание двигательного нерва
.-> Волокно
^z-поперечнополосатой мышцы
Дендрит
62
Рис. 22. На поперечных срезах аксона видно, как шванновские клетки формируют миелиновую оболочку. (В кн. Katz В. Nerve, Muscle and Synapse, McGraw-Hill Book Co., New York, 1966, 8.)
тяжении, нейроны остаются, как правило, неповрежденными благодаря их центральному расположению. Подобное повреждение обозначают термином «валле-ровская дегенерация»
Процесс дегенерации, в результате которого разрушаются аксон и миелиновая оболочка, распространяется на всю отделенную от нейрона часть нерва, в той же его части, которая осталась при теле нейрона, дегенерирует лишь очень небольшой отрезок. Полученные в последнее время данные показывают, что за процесс деструкции ответственны шванновские
1 По имени английского врача Валлера (правильнее Уоллера), открывшего в 1850 году вторичное перерождение нервных волокон.
63
клетки. Они разрушают аксон извне, а слой миелина, который они, собственно, и составляют, как бы изнутри.
Регенерация оставшейся части аксона начинается тогда, когда этот процесс еще в полном разгаре. Шванновские клетки, сопровождаемые соседними клетками соединительной ткани, начинают размножаться на обоих концах разреза. Растут они навстречу друг другу, закрывая пораженную часть и располагаясь параллельными тяжами. Вслед за этим сообщество новых клеток начинает постепенно занимать место дегенерировавших отрезка аксона и миелиновой оболочки. На концах рассеченного аксона образуются небольшие ростовые конусы, или почки, которые постепенно раздвигают сформированные ранее тяжи. Последние являются как бы направляющими рельсами для роста нервов. Вновь отросшие нервные волокна вскоре окружаются шванновскими клетками, которые образуют новый слой миелина, после чего нервные волокна, пока еще очень тонкие, вновь иннервируют участок тела, который исходно находился под контролем поврежденного нерва.
Нервы, являющиеся компонентами регенерирующей конечности саламандр, восстанавливаются таким же образом. В начальных стадиях восстановительного роста аксоны, проникающие внутрь клеток ранней бластемы, лишены наружной оболочки. Она появляется из шванновских клеток к началу образования пальцевых выростов; нервы становятся миелинизированными к моменту полного восстановления конечности.
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОЖИ
Полный комплекс восстановительных процессов, захватывающих и нервную и мышечную ткани, у человека протекает сравнительно редко, лишь при серьезных повреждениях. Но вы несомненно наблюдали репаративную регенерацию, которая происходит при нанесении значительно менее серьезных поражений. Заживление переломов в костях — процесс, практически недоступный для наблюдения, чего нельзя сказать о заживлении ранки на коже, нанесенной, скажем, при неаккуратном пользовании ножницами.
64
На примере этого процесса вы можете легко познакомиться с закономерностями регенерации кожи.
Кожа человека состоит из наружных слоев эпидермиса и подлежащей дермы. При разрезе кожи в ранку устремляется кровь, вскоре она образует там сгусток, после чего постепенно развивается воспалительная реакция. Ее характерной чертой является выход лейкоцитов (белых кровяных клеток) из неповрежденных кровеносных сосудов близ места поражения и инфильтрация ими раневого участка. Лейкоциты захватывают частицы грязи и бактерии, попадающие в рану (рис. 23, А). К признакам воспаления относятся также болезненность и отечность поврежденного участка кожи. Отек объясняется усилением кровотока в близлежащих кровеносных сосудах, которые в результате существенно расширяются. Кроме того, стенки кровеносных сосудов выделяют довольно большое количество жидкости, которая тоже вызывает растяжение тканей.
Под прикрытием подсохшего кровяного сгустка, или струпа, клетки эпидермиса и дермы постепенно начинают восстановление кожи. Клетки внешних слоев кожи вовлекаются в процесс следующим образом. Под кровяным сгустком скапливаются эпидермальные клетки, перемещающиеся сюда из окружающих неповрежденных участков. Мы уже сталкивались с подобным явлением, обсуждая ход восстановления конечности у земноводных. Образовав сплошной слой, мигрирующие клетки начинают делиться, пока общая масса клеток не обеспечит восстановления нормальной толщины эпидермиса. В это же время фибробласты, составляющие основной клеточный элемент соединительной ткани, мигрируют в пораженную зону и, размножаясь, увеличивают там свое число. Кроме того, фибробласты выделяют фибриллярный белок — коллаген (рис. 23, Б). Молекулы коллагена сначала формируют тонкие нити, образующие ткань раневого рубца, которые позднее распадаются с тем, чтобы соединиться в тонкие пучки, соответствующие исходной неповрежденной соединительной ткани. К этому времени струп отпадает и восстановление кожного покрова в основных чертах завершается (рис 23, В). У детей и молодых лиц заживление ран
3 Зак. 52
65
Эпидермис, мигрирующий внутрь раны
Рис. 23. Стадии заживления кожного разреза у человека.
протекает довольно быстро, но с возрастом время, необходимое для этого процесса, существенно удлиняется.
ДРУГИЕ ВИДЫ РЕГЕНЕРАЦИИ
Термин «регенерация» может употребляться в широком смысле, включая различные восстановительные
66
процессы, отличающиеся от уже известного нам процесса восстановления утраченных частей тела. У многих животных имеется целый ряд органов и тканей, которые подвергаются естественному процессу обновления— так называемой физиологической, или повторной, регенерации. Это касается перьев у птиц, чешуи у пресмыкающихся, экзоскелета у членистоногих и некоторых частей тела у млекопитающих, утрачиваемых в процессе нормальной жизнедеятельности: волос или шерсти, наружных слоев кожи, ногтей, внутренней выстилки матки, клеток крови и т. и. К этому процессу относится и смена рогов у оленей, которая, как вы узнаете позже, является гормонально регулируемым событием, тесно связанным с изменением продолжительности суток в разные времена года в различных климатических зонах.
Еще одним видом регенерации, обозначаемой термином «компенсаторная гипертрофия», является реакция внутренних органов, таких,, как печень или почка, на хирургическое вмешательство. При частичном удалении печени в эксперименте на мышах и крысах наступает компенсация утраченной части органа за счет увеличения оставшейся, хотя восстановления исходной формы печени не происходит. Если удаляются две или три доли печени, оставшаяся часть благодаря быстро -разворачивающемуся процессу клеточного деления достигает суммарных размеров целого органа. По-видимому, существует определенный механизм, регулирующий эту форму клеточного роста, потому что постепенно бурное деление клеток замедляется и вообще останавливается, когда печень достигает нормального размера. То же самое наблюдается при регенерации почки у млекопитающих. Если удалить одну почку, отдельные клетки парного органа начинают увеличиваться в размере и числе, их рост продолжается до тех пор, пока оставшаяся почка не достигнет 60—70% общего веса обеих почек. Это обеспечивает оставшейся почке возможность функционировать с почти двойной интенсивностью и компенсирует потребность организма в очистке от физиологических шлаков.
3*
Ill
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ
Интерес к регенерации не ограничивается последним десятилетием и даже последними столетиями. Самые ранние сведения об этом предмете восходят к мифам Древней Греции. Согласно одному из них, Прометей, похитивший у богов с Олимпа огонь и передавший его людям, был прикован к скале в горах Кавказа, и там в наказание за содеянное прилетавший ежедневно орел клевал его обнаженную печень. Но все, что выклевывала птица за день, полностью восстанавливалось за ночь, и страданиям Прометея не было конца.
Что касается сообщений научного характера, то уже два тысячелетия назад древнегреческий философ и ученый Аристотель дал ряд общих описаний регенерационной способности у животных. Римский ученый Плиний Старший, живший в I веке, также описал несколько случаев регенерации. Экспериментальные же исследования этого феномена в то время, естественно, не предпринимались. Начало им было положено в XVIII веке.
Около 1740 года швейцарский аббат и натуралист Абраам Трамбле провел многочисленные наблюдения и эксперименты над пресноводной гидрой, в результате которых установил высокую регенерационную способность у этого представителя кишечнополостных.
Спалланцани, итальянский монах и натуралист, живший в XVIII веке, исследовал способность различных земноводных к регенерации. В своих опытах он заметил, что взрослые лягушки и жабы не способны восстанавливать утраченные конечности, а также
68
что время, необходимое для регенерации конечностей у саламандр, зависит от внешней температуры и возраста животного. Он впервые обнаружил и дал точное описание различных фаз процесса восстановления конечностей. Кроме того, он провел ряд экспериментов по регенерации у других видов животных. К сожалению, полное описание его работы не сохранилось; мы располагаем лишь кратким ее изложением, включенным Спалланцани в его большой труд Prodromo («Предвестник»), опубликованный в 1768 году.
Хотя в первой половине нашего века был осуществлен ряд фундаментальных работ по регенерации животных разных видов, ученые были лишены возможности применить точные исследовательские методы, что во многом определило ограниченность полученных результатов. К. счастью, прогресс в развитии методов исследования и вообще научной техники позволяет в наши дни преодолевать эти барьеры. Мы опишем три современных метода исследования — авторадиографию, культуру ткани и электронную микроскопию — и постараемся на конкретных примерах показать, какие данные можно получить с применением указанных методов в изучении регенерации.
РАДИОАКТИВНЫЕ ИЗОТОПЫ И АВТОРАДИОГРАФИЯ
Применение радиоактивных изотопов стало по существу незаменимым исследовательским приемом для большинства ученых, работающих в области регенерации. Согласно определению, изотопы — это разновидности одного и того же химического элемента, отличающиеся друг от друга массой атомов. Использование изотопов в экспериментальных целях определяется тем, что многие из них обладают радиоактивностью, то есть способностью самопроизвольно превращать неустойчивые атомные ядра в ядра других элементов, что сопровождается испусканием ядерных излучений; обычные же химические элементы не обладают подобной активностью. Например, существует радиоактивный изотоп углерода, или углерод-14, и нерадиоактивный изотоп того же элемента,
63
известный как углерод-12. Сера, фосфор и водород также входят в число химических элементов, которые, как и углерод, имеют радиоактивные изотопы (радиоизотопы) и часто используются в экспериментах по регенерации.
Для введения изотопов в биологическую систему, используемую при изучении регенерации существует, несколько методов. Захват радиоактивного материала определенными клетками в изучаемой системе и дальнейшая идентификация таких клеток может дать ценную информацию о характере функционирования системы. В подобных исследованиях широко применяется авторадиография, метод регистрации распределения радиоактивных веществ в объекте. Получаемый этим методом радиоавтограф является как бы «фотографией», которую клетки получают с самих себя при «засветке» чувствительных к радиоактивному излучению материалов.
Авторадиография регенерирующей конечности
При изучении регенерации конечности у саламандр можно получить целую серию радиоавтографов, последовательно взятых на разных стадиях восстановительного процесса. Для этого еще до ампутации конечности саламандру подвергают обработке радиоактивным изотопом, в результате чего некоторые клетки конечности становятся «мечеными», то есть включают радиоактивный материал. Затем конечность удаляется и по истечении какого-то времени готовятся продольные срезы регенерата.
Итак, начальная процедура состоит в обеспечении захвата клетками изотопа, удалении конечности, приготовлении срезов. Дальнейшие манипуляции осуществляются в затемненной комнате, где при минимальном освещении на срезы наносят чувствительную к радиоактивному излучению эмульсию (рис. 24,А). При подсыхании эмульсия затвердевает, покрывая предметные стекла со срезами подобием желатинового слоя, сходного с эмульсионным слоем
70
пленок или пластинок, которые обычно используются в фотографии или кино. Всем известный процесс фотографирования состоит в том, что пучок света, проходя через объектив, засвечивает поверхность эмульсии, «рисуя» на ней скрытое от света негатив-нее изображение объекта, которое затем проявляется и закрепляется специальными реактивами. Засветка эмульсии, чувствительной к радиоактивному излучению, происходит, в сущности, подобным же образом, только требует значительно большего времени. Период экспонирования подготовленных срезов занимает иногда недели и даже месяцы (рис. 24, Б). В конце этого периода препараты (называемые теперь радиоавтографами) извлекают в темноте из ящика и проявляют. Места наибольшего затемнения соответствуют локализации радиоактивных изотопов.
При микроскопировании радиоавтографов нетрудно различить захватившие изотоп клетки находящейся в процессе регенерации конечности: в слое эмульсии появлются мелкие черные зерна, которые кажутся наложенными на изображение клетки (рис. 25)« Такие препараты можно фотографировать через микроскоп, но, поскольку клетки и черные зерна лежат в разных плоскостях препарата, получить хорошее изображение обоих объектов непросто.
Радиоавтографы нередко дают информацию, которую трудно добыть другими методами. Как мы уже знаем, после ампутации конечности у аксолотля или тритона часть клеток в тканях культи дедифферен-цируется, теряя черты специализации, и, сформировав блестему, начинает активно делиться. Но возвращаются ли эти клетки к своему исходному типу?. Можно ли представить себе, что, скажем, хрящевые клетки способны приостановить присущую им выработку внеклеточного матрикса, стать морфологически совершенно неотличимыми от других клеток бла-' стемы и потом, после восстановления конечности, редифференцироваться в совершенно иной тип клеток? До последнего времени мы не могли четко ответить на такой вопрос. Ведь для этого необходимо проследить судьбу определенных клеток культи на протяжении ьсех уже известных нам этапов регенерации. И вот сравнительно недавно, проявив
71
72
Рис. 25. При микроскопировании проявленных радиоавтографов мельчайшие зерна «засветки» видны над теми частями клетки, которые содержат молекулы, включившие радиоактивный изотоп.
немалую долю изобретательности, исследователи смогли использовать для решения данной задачи изотопную метку. У аксолотлей удаляли лучевые кости верхней конечности, после чего каждому животному пересаживали новую лучевую кость от другого аксолотля. Важной деталью этого опыта было то, что хрящевые клетки пересаженной кости предварительно помечались радиоактивным веществом. С этой целью каждый аксолотль-донор получал предварительно несколько инъекций радиоизотопа. Через некоторое время после пересадки производили ампутацию конечности у аксолотлей-реципиентов, при этом линия разреза проходила через середину пересаженной кости, содержащей радиоактивную метку. На различны* стадиях последующей регенерации конечности готовились радиоавтографы по описанной выше методике.
Рис. 24. Этапы приготовления радиоавтографов. А — предметные стекла с прикрепленными к ним срезами радиоактивных тканей покрывают специальной эмульсией (жидкой в водяной бане, но застывающей при комнатной температуре). Б — покрытые эмульсией препараты помещают на экспозицию в светонепроницаемую коробку. (В кн. Gude W. D. Autoradiographic Techniques: Localization of Radioisotopes in Biological Material, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, N. J,, 1968, 28.)
73
Рис. '26. Радиоавтограф бластемы конечности Ambystoma, содержащей несколько меченых клеток (указаны стрелками} из пересаженной плечевой кости, предварительно меченной изотопами. Справа клетка в состоянии митоза (Ми). Увеличение 800. (В статье Foret J. Е. «Regeneration of larval urodele limbs containing homoplastic transplants», J. Exp. Zool., 1970, 175 : 321.)
Итак, авторадиография показала (рис. 26), что черные зерна меченых клеток выявляются на стадии образования бластемы поверх ряда одинаково выглядящих клеток регенерационной почки. Ясно, что меченые клетки ведут свое происхождение из вобравшего в себя изотоп хряща трансплантата. На препаратах, полученных на более поздней стадии (когда различные клетки регенерирующей конечности становятся структурно отличными друг от друга), мечеными оказываются только хрящевые клетки, другие же типы клеток — эпидермальные, мышечные, соединительной ткани — не содержат и следа радиоактивного материала. Значит, по крайней мере у аксолотлей, хрящевые клетки, входящие в состав бластемы регенерирующей конечности, в процессе дальнейшего восстановления переходят в дифференцированные клетки исходного типа. Несмотря на то что меченые клетки утрачивают свою структурную специфичность, делятся и становятся неотличимыми от других клеток бластемы, их исходные наследственные свойства сохраняются и затем выявляются вновь.
Но, поскольку данный эксперимент включает мечение только клеток хряща, есть ли у нас основания
говорить, что и другие типы клеток регенерирующей конечности саламандры ведут себя аналогичным об-» разом? В формировании бластемы мышечные клетки, клетки соединительной ткани и другие, по-видимому, участвуют, но сохраняют ли они, подобно хрящевым клеткам, принадлежность к своему исходному типу при редифференцировке или же подвергаются каким-» либо трансформациям, пока вопрос открытый.
Авторадиография при регенерации у губок
Как вы помните, регенерация у губок является, по сути, созданием нескольких новых особей из клеток исходного животного, механически отделенных друр от друга. В процессе объединения (реагрегации)) клетки губок какого-либо вида воссоединяются толь» ко с клетками губок того же вида. Однако исследователи, сделавшие такое заключение, различали клетки губок определенного вида по цвету, а это не всегда легко. Чтобы получить более убедительные данные, в последнее время была предпринята попытка определить вид клеток в восстановленных особях с помощью авторадиографии.
Делалось это следующим образом. Две особи морских губок, принадлежащие к разным видам, подвергались разделению на клетки в двух отдельных контейнерах, после чего им давали возможность pear-регировать. Образовавшиеся сгустки клеток, по одному от каждого вида, помещали в третий контей* нер с морской водой. Затем оставшиеся клетки одного из видов губок метили радиоактивным изотопом и добавляли в третий контейнер, в котором уже находились два агрегата клеток губок. Начиналось каи; бы соревнование между агрегатами за присоединение внесенных в контейнер новых (радиоактивных); клеток.
По прошествии определенного времени полностью сформировавшиеся агрегаты извлекали из контейнеров, подвергали специальной обработке, а приготовленные из них срезы использовали для получения радиоавтографов. Результат исследования был однозначен: меченые клетки воссоединились с немечеными клетками того из агрегатов, который относился ю
75
Рис. 27. Радиоавтографы клеток губок. А—за 18 часов значительное число меченых клеток губки Dysidea crawshayi (МК) воссоединилось с агрегатом немеченых клеток того же вида (НА). Б — за тот же период лишь немногие меченые клетки губки Haliclona variabilis (МК) попали в агрегат немеченых клеток (НА) губки Homaxinella rudis. (В статье McClay D. R. «Ап autoradiographic analysis of the species specificity during sponge cell reaggregation», Biol. Bull., 1971, 141 : 324.)
их виду. Лишь крайне незначительное число клеток присоединилось к агрегату, состоявшему из клеток другого вида (рис. 27). Интересно, совпадает ли этот результат с тем, что вы ожидали увидеть на препаратах? Авторадиография убедительно подтвердила высказанное ранее предположение о том, что реагрегация клеток губок обладает строго видовой специфичностью. Это еще один пример широких возможностей данного метода в определении судьбы и особенностей поведения клеток.
76
КУЛЬТУРА ТКАНИ
Другим исследовательским методом, часто используемым при изучении регенерации, является культура ткани, то есть длительное сохранение и выращивание в специальных питательных средах клеток, тканей, органов или их частей, выделенных из организма растений, животных или человека. Для обозначения этого приема используется латинское выражение in vitro (буквально «в стекле», в стеклянной посуде). В противоположность этому рост в естественных условиях живого организма или живых клеток обозначается как происходящий in vivo (буквально «в живой среде»). Методик культивирования очень много, по общим для всех них является обеспечение культивируемого материала жидкой или твердой средой, способной сохранять физические и химические условия нормального роста клеток. В такую среду обычно вводят различные сахара, аминокислоты и витамины, необходимые для поддержания жизненных процессов. Чрезвычайно важно при культивировании обеспечить полную стерильность всех сред и сосудов. Дело в том, что среды, обеспечивающие питание культивируемых клеток, могут быть и прекрасной питательной средой для различных микроорганизмов, которые, если не принять соответствующих мер, очень быстро размножаются и, внедрившись в культуру, мешают проведению эксперимента. Для предотвращения этого в культуры часто добавляют антибиотики. За те сто лет, которые прошли с момента создания метода культуры ткани, он был использован в очень многих областях научных исследований. Сравнительно недавно его удалось применить и для изучения регенерации. Культивируемый материал не только проще наблюдать, но и гораздо легче подвергнуть широкому спектру экспериментальных воздействий. Реакция на такие воздействия может быть определена непосредственно и объективно. Однако к переносу данных о результатах тех или иных воздействий в культуральных системах на аналогичные процессы, происходящие in vivo, надо относиться осторожно. Не следует забывать, что ис
77
кусственно воспроизвести все воздействия, влияющие на рост клеток в естественных условиях, невозможно. Тем не менее во многих случаях доказано, что между процессами, происходящими в условиях in vivo и in vitro, существует параллелизм.
Для решения каких специфических проблем регенерации может быть использован метод культуры ткани? В первую очередь, для изучения механизмов, лежащих в основе регенерации хвоста у земноводных и пресмыкающихся. Например, при культивировании кончика хвоста головастика в маленьких стеклянных чашках с плотной средой можно наблюдать регенерацию различных типов ткани. Культуры хвоста сохраняются в течение нескольких месяцев и даже демонстрируют движения типа подергивания за счет мышечных сокращений.
Другим подходом к решению проблемы такого рода может быть культивирование клеток из регенерирующего хвоста ящерицы во время фазы респециализации. Для этого выделяют участок хвоста с регенератом нужного срока и получают из него тонкие срезы. Затем отделяют кусочки регенерата, лежащие ниже наружного слоя хвостовой бластемы. В случае нормального завершения регенерационного процесса эти участки бластемы должны стать мышечными клетками. Исходную ткань разъединяют на отдельные клетки. Суспензию клеток получают, например, путем обработки кусочка ткани гидролитическим ферментом—трипсином. Клетки засевают в сосуд с питательной средой и подвергают длительному инкубированию. Будущие мышечные клетки в условиях такого опыта сначала находятся в состоянии покоя — это длится до двух недель. Затем наступает период бурного размножения клеток. Через 30— 50 дней во многих культурах происходят резкие изменения. Клетки вытягиваются, сливаются между собой, в них выявляется поперечная исчерченность, столь характерная для скелетной мускулатуры. Безусловно, такой тип развития культур возможен лишь при строго определенном составе питательной среды. Отсюда неизбежен вывод, что дифференцировка клеток в данной системе зависит от каких-то химических компонентов. Заключение весьма важное для изуче
78
ния природы неизвестных пока факторов, которые управляют in vivo процессом редифференцировки клеток бластемы регенерирующего хвоста. '
Успешными оказались и попытки культивирования регенерирующих конечностей саламандр (либо культей, либо изолированных бластем). На поверхность полужидкой среды помещали ампутированные конечности тритонов. Приче?л конечность иссекали так, чтобы не нарушить ее иннервацию: с сохранением собственного нерва и прилежащего участка спинного мозга, от которого этот нерв отходит. Весь этот сложный блок тканей одновременно помещали в питательную среду. Культуры иннервированных конечностей поддерживали на протяжении 10 дней. После этого из них готовили гистологические препараты для микроскопического анализа точно так же, как это делается при изучении регенерации in vivo. На полученных препаратах наблюдалось образование апикальных шапочек и множества гигантских клеток, признаки дедифференцировки мышечных клеток. Различий в процессах заживления раны и ранней редифференцировки клеток между конечностями, помещенными в культуру, и конечностями, регенерирующими в естественных условиях, на этом этапе практически не было.
Несколько иной метод использовали для изолированных бластем конечностей тритонов. Поверх небольшого сосуда, наполненного до краев жидкой питательной средой, помещали металлическую сеточку. На нее клали небольшой кусочек фильтровальной бумаги, который всасывал среду, находящуюся под сеточкой. Затем на фильтровальную бумагу помещали выделенную из культи конечности тритона бластему, находящуюся на стадии конуса (рис. 28). В таких условиях бластема продолжала еще несколько дней расти, нужно было только периодически ее «питать», то есть заменять питательную среду на свежую. Затем из тканей бластемы получали препараты, на которых при микроскопировании было видно, что на протяжении всего периода пребывания в культуральном сосуде клетки бластемы активно делились. Подобный же метод был использован недавно в опытах по изучению факторов, регулирующих митотическое
79
Рнс. 28. Растущая в культуре бластема конечности тритона. (Фото Babich G. Department of Zoology, University of New Hampshire.)
деление и рост клеток бластемы. В культуральную жидкость вносили компоненты, предположительно влияющие на процесс регенерации, и наблюдали за поведением бластемы.
Кроме бластем конечностей тритона, методом культуры ткани поддерживали бластемы конечностей аксолотлей и головастиков. В некоторых случаях регенерационные почки конечностей удавалось сохранять на протяжении сроков, достаточных даже для респециализации скелетных частей.
Из приведенных здесь примеров видно, сколь важно так подобрать состав среды и режим культивирования, чтобы они были наиболее близки к условиям целостного организма. Такие условия удалось создать для моделей регенерирующих конечностей или хвоста и ряда других систем. Исследования в этом направлении продолжаются: с их помощью удается получать все более интересную информацию. Появляется возможность изучить в таких строго контролируемых условиях факторы, регулирующие рост и развитие тканей и органов при регенерации. Этим исследованиям принадлежит большое будущее.
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Помимо таких тонких методов, как авторадиография и различные варианты культуры ткани, ученые широко применяют другой современный метод исследования — электронную микроскопию.
80
Система линз
Объектив
Проекта
Фотопластинка или флюоресцирующий экран
Источник _ электронов Пучок электронов Конденсор
Источник— электронок Пучок электронов
Первый конденсор"
Второй
Магнитные конденсору «линзы»
Сканирующей устройством
Магнит»'-
«линзы >•
электронов
Катодная лучевая трубка44
\ Усилитель
^нран сигнала Препарат
Рис. 29. Схематическое сравнение оптического (А), просвечивающего электронного (Б) и сканирующего электронного (В) микроскопов.
Выше вы видели несколько фотографий, показывающих, как выглядят срезы регенерирующих конечностей земноводных в обычном оптическом микроскопе. Приготовленный уже знакомым вам способом препарат помещают на столик оптического микроскопа и направляют на него источник света. Отраженные от препарата лучи проходят через систему стеклянных линз и, попадая в глаз наблюдателя, создают увеличенное и рельефное изображение (рис. 29, А). Его можно сфотографировать. Хотя микрофотографии дают достаточно точное общее впечатление об исследуемом объекте, максимальное увеличение, которое получается с помощью оптического микроскопа, не превышает 1000.
В электронном микроскопе вместо лучей видимого света на исследуемый объект попадает пучок электронов, обладающих высокой энергией. Характер изображения зависит от того, как исследуемый объект отклоняет проходящий через него пучок электронов. Для фокусировки в этом приборе используется электромагнит, поскольку пучок электронов представляет собой скопление частиц с отрицательным зарядом. Электроны могут пробегать в воздушной среде не более нескольких миллиметров, поэтому в метровых колоннах электронных микроскопов создается высокий вакуум. Электронный пучок обладает во много раз меньшей длиной волны, чем лучи видимого света, поэтому с его помощью можно исследовать гораздо более мелкие детали и получать гораздо большие увеличения.
В настоящее время используются в основном два вида электронных микроскопов — просвечивающий и более современный сканирующий (рис. 29, Б, В). Эти микроскопы служат для разных исследовательских задач, поскольку дают разные типы изображения. Различаются они и максимально достижимыми увеличениями, и даже способы приготовления препаратов для исследования в микроскопах указанных видов различны.
Просвечивающая электронная микроскопия
В просвечивающем электронном микроскопе пучок электронов генерируется на верху колонны микроско
82
па, а фокусируется на препарате, находящемся в дер* жателе, который располагается внизу колонны. Пре* парат готовится таким образом, что различные его части имеют разную степень «оптической плотности». Пучок электронов, проходя через препарат, рассеивается по-разному в зависимости от электронной плотности объекта. Как и фокусирующее устройство, «линзы» объектива и проектора представляют собой особые электромагниты. Они оказывают совместное действие на пучок электронов, который, проходя через препарат, отклоняется, что и дает увеличенное изображение объекта. Срезы микроскопируе-мого объекта должны быть чрезвычайно тонкими, чтобы рассеиваемые электроны, проходя через него, обладали одинаковой энергией и могли быть сфокусированы «линзой» объектива в одной плоскости. После этого проекционная «линза» обеспечивает окончательное увеличение и направляет электронную «тень» от объекта на флюоресцентный экран в основании колонны. Поскольку покрытие экрана дает вспышки видимого света в тех местах, где на него падают электроны в зависимости от степени электронной плотности объекта на экране чередуются темные и светлые области. Сочетание этих областей образует плоскостное изображение, видимое человеческим глазом. Его можно сфотографировать, заменив экран фотопластинкой.
Просвечивающая электронная микроскопия позволяет увеличивать объекты более чем в 500 000 раз, выявляя тем самым много нового в регенерационных процессах. Вы помните, что при заживлении раны на коже млекопитающих в поврежденном участке дермы скапливаются фибробласты. Это явление связано с выделением на том же месте коллагена. Если посмотреть срез участка кожи, где начинает формироваться шрам, в просвечивающем электронном микроскопе, то видно, что присутствующие на этом участке фибробласты окружены коллагеновыми фибриллами, находящимися на самой ранней стадии формирования (рис. 30). Подобное наблюдение подтверждает предполагавшееся ранее участие фибробластов в процессах заживления. В самих клетках при таких больших увеличениях становятся видимыми многие
83
Рис. 30. Микрофотография фибробласта, полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа. На периферии клетки видны коллагеновые фибриллы в начальных стадиях формирования. Видна также часть ядра. Увеличение около 15 000. (В статье Ross. R. «Wound Healing», Scientific American, June, 1969, 46.)
84
Рис. 31. Схематизированное изображение фибробласта, на котором показаны формирующиеся каналы мембран с прикрепленными к ним рибосомами. Аминокислоты входят в клетку через клеточную мембрану и ’ включаются в белки, синтезируемые на рибосомах. Молекулы белка, которые затем образуют фибриллы коллагена, переносятся в каналы и выделяются из клетки либо через наружные выходы каналов, либо при помощи пузырьков, приближающихся к клеточной мембране и выбрасывающих наружу содержащийся в них материал. (В статье Ross R. «The fibroblast and wound repair», Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society, 1968, 43 : 66.)
органоиды, в частности мельчайшие круглые частицы, называемые рибосомами. Эти клеточные органоиды принимают участие в синтезе белков. В фибробластах, непосредственно вовлекаемых в процесс заживления раны, рибосомы видны вдоль поверхностей лабиринтоподобной системы мембран (рис. 31). Информация очень существенная, так как подобные из
85
менения в других типах регенерирующих клеток свидетельствуют об образовании белков, которые могут выделяться затем через клеточную мембрану.
Сканирующая электронная микроскопия
Сканирующий электронный микроскоп дает значительно меньшее увеличение — максимум 100 000 раз, но этот инструмент позволяет получить незаменимую информацию о состоянии поверхности изучаемого объекта.
Изображение, видимое в сканирующем электронном микроскопе, трехмерно, из-за чего оно более соответствует объекту.
Принцип действия прибора, как и у просвечивающего электронного микроскопа, основан на прохождении пучка электронов в сторону наблюдаемого объекта. Но в этом случае пучок электронов осуществляет процесс сканирования, или прохождения по поверхности объекта, примерно так, как читается книга — по одной строчке в определенный промежуток времени, слева направо и сверху вниз (с той разницей, что сканирование происходит с такой немыслимой быстротой, которая недоступна ни одному читателю). В отличие от просвечивающего микроскопа, дающего фокусное изображение всех частей объекта одновременно, луч сканирующего микроскопа в каждый отрезок времени сфокусирован лишь на какой-то мельчайшей точке объекта. Поскольку электронный луч не проходит через препарат, размеры и толщина объекта не имеют существенного значения, лишь бы его можно было ввести в камеру для исследования. Предварительно пробы материалов, взятые от"растений или животных, должны быть покрыты тончайшей пленкой металла, обладающего электропроводностью. Вследствие этого электроны, испускаемые исследуемым объектом, вторичны — они возникают в результате ударов электронов исходного пучка о металлизированную поверхность объекта.
Хотя вторичные электроны, испускаемые различными точками объекта, обладают различной энергией, качество изображения не страдает, поскольку фокусирование осуществляется не сразу во всех точ-
86
Рис. 32. Микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа при исследовании пучков коллагена в дерме неповрежденной кожи человека. Увеличение 7000. (Фото Сагг К. Е. Department of Anatomy, University of Glasgow.)
ках. Вместо этого заряженные частицы, испускаемые теми или иными точками в определенное время, попадают в блок микроскопа, называемый коллектором, и там их энергия увеличивается с помощью специального устройства. Затем они попадают в катодную лучевую трубку. По виду такая трубка мало чем отличается от обычного телевизионного кинескопа.
87
Поступающий «сигнал» подвергается теперь обратному сканированию по экрану катодной трубки, двигаясь синхронно с лучом, осуществляющим сканирование объекта. И на экране получается изображение объекта, возникающее в результате флюоресценции специального покрытия под воздействием электронного сигнала. Для получения постоянных изображений возникающие на экране картины можно фотографировать с помощью специальной фотокамеры.
Сканирующий электронный микроскоп, как и просвечивающий, используется при изучении процесса заживления ран у млекопитающих, но дает информацию несколько иного рода. Например, вместо того чтобы выявлять детали внутреннего строения фибробластов, он показывает общую картину строения волокон коллагена, секретируемого клетками этого типа. С помощью сканирующего микроскопа удается сравнить распределение и форму волокон в поврежденной коже человека и в нормальном ее участке. Как показано на рис. 32, в дерме нормального участка кожи видны множественные пучки коллагеновых волокон, в то время как через 10 дней после повреждения кожи, то есть на ранней стадии регенерации, в дерме удается выявить лишь незначительное число волокон коллагена. Они не образуют характерных пучков и беспорядочно разбросаны по всему участку. Такие наблюдения помогают объяснить, почему на этой стадии восстановительного роста ткани слабы и ломки, тогда как внешне кожа выглядит зажившей.
Возможности электронной микроскопии в отношении изучения регенерационных процессов еще далеко не исчерпаны. Биологам требуется немалая подготовка и практика, чтобы научиться правильно обращаться с электронными микроскопами, готовить препараты для анализов и интерпретировать наблюдаемые картины. Специалисты, хорошо освоившие работу на таких микроскопах и имеющие с ними дело ежедневно, постепенно узнают все больше о широких возможностях применения столь высоко точных оптических инструментов.
IV
ИССЛЕДОВАТЕЛИ И ПУТИ ИССЛЕДОВАНИЙ
Как вы уже поняли из предшествующего изложения, к регенерации способны многие представители животного царства. Но форма и масштаб восстановительного роста у разных животных могут серьезно различаться. В этой главе нам предстоит познакомиться с четырьмя известными биологами, которым мы в значительной мере обязаны нашими знаниями о восстановлении утраченных органов. Каждый из этих ученых выбрал свой особый путь изучения проблемы регенерации, и вам станет понятно, что какого-то одного пути решения проблемы не существует. Понимание механизма регенерации может складываться лишь из тщательного сопоставления информации, получаемой с применением самых разных экспериментальных подходов.
ЭЛЛИСОН БЕРНЕТТ. РЕГЕНЕРАЦИЯ У ГИДР
Эллисон Бернетт преподает в Северо-западном университете в Эванстоне, штат Иллинойс. Большую часть своей научной деятельности он посвятил исследованию клеточной организации и процессов роста v гидр (Hydra.), относящихся к той же группе беспозвоночных животных, что и медузы, актинии и кораллы. Как еще в 1740 году впервые отметил Трамбле, регенерационная способность гидр не уступает по интенсивности регенерационной способности планарий. Поэтому не удивительно, что именно исследования регенерации у гидр и планарий явились предметом сотен научных сообщений на многих языках мира. Гидры — самый распространенный объект для
89
постановки опытов как с учебной, так и с исследовательской целями.
Эти внешне напоминающие растения животные обычно обитают в прудах, прикрепившись к какому-нибудь водному растению или камню при помощи клеточного диска (подошвы), находящегося у основания тела. На противоположном («головном») конце трубкообразного тела гидры расположен рот, открывающийся в мешковидную пищеварительную полость. Он окружен венчиком щупалец (от шести до десяти), непрерывно двигающихся в поисках пищи. Одним из способов размножения гидр является почкование — образование небольших выпячиваний, или почек, в нижней части тела беспозвоночного. Постепенно на растущих почках формируются щупальца и другие типичные для гидр органы. Затем дочерняя особь отделяется от родительской и начинает самостоятельную жизнь. Образующиеся почки придают гидре обличье многоголового существа. Высокая регенерационная способность животного послужила основанием для того, чтобы назвать его по имени древнегреческого мифологического чудовища девятиголовой Гидры, способной легко восстанавливать головы, отсеченные в схватке (рис. 33). У гидры и родственных ей животных стенка тела состоит из клеток, покрывающих тело снаружи (эктодермы) и обладающих способностью к сокращению, и клеток, выстилающих пищеварительную полость (энтодермы); пространство между этими двумя слоями заполняет тонкий слой студенистого вещества, называемого мезоглеей. Наиболее часто встречающиеся гидры в длину не превышают 30 миллиметров.
Э. Бернетт изучал различные свойства гидр. Первые свои работы он посвятил исследованию структуры и функции специализированных клеток этих необычных животных: нервных клеток, которые создают сеть нервных образований в стенке тела, характерную для всех кишечнополостных; железистых клеток, входящих в состав энтодермы и секретирующих пищеварительные ферменты; а также расположенных на щупальцах стрекательных клеток, способных выбрасывать скрученную нить с ядом, парализующим мелких животных, добычу гидры, и в
90
Рис. 33. Почкующаяся гидра.
целях защиты. Кроме перечисленных во многих ме* стах тела гидры можно обнаружить небольшие клет* ки, лишенные каких-либо специальных функций; их обозначают как промежуточные, или «интерстициаль* ные», клетки («И-клетки»).
Регенерация у гидры
Следующие свои эксперименты Бернетт посвятил изу* чению особых ростовых факторов, которые, как он счи* тает, выделяются гидрой. В пользу существования та* ких веществ говорили наблюдения над характером ре* генерации у гидры, Бернетту и другим исследователям
91
удалось обнаружить, что зона роста животного находится в стенке тела непосредственно под щупальцами. Постоянное образование новых клеток в этой зоне приводит к тому, что лежащие рядом зрелые клетки постепенно оттесняются в двух противоположных направлениях — в сторону щупалец и в сторону основания тела,— а новые клетки, дифференцируясь, замещают их. Когда «старые» клетки достигают концов тела гидры, они слущиваются в окружающую водную среду. Согласно изложенной гипотезе, в случае, если какие-либо из специализированных клеток погибают до окончания процесса миграции, их место занимают близлежащие И-клетки, которые подвергаются соответствующим изменениям и берут на себя функции замещаемых клеток. Последний способ клеточного замещения наблюдается весьма часто: стрекательные клетки постоянно расходуются в процессе захвата добычи, а железистые — в процессе пищеварения. В результате организм гидры подвергается практически непрерывному обновлению (и тем и другим путем), за что это животное не без оснований получило название «бессмертного».
В дополнение к регенерационным механизмам, действующим непрерывно, гидры восстанавливаются и будучи повреждены в результате экспериментальных воздействий. Эти животные способны не только регенерировать любую из утраченных частей, но и полностью восстанавливать тело из любого мельчайшего фрагмента, за исключением щупалец и подошвы. В процессе регенерационного роста отмечается явная полярность: при горизонтальном рассечении гидры пополам «головная» часть, имеющая щупальца, восстанавливает от раневой поверхности стебелек с подошвой, и наоборот. На первый взгляд, у гидры отмечается градиент свойств по линии щупальца — подошва, подобный тому, который был описан на примере планарий. Бернетт, однако, высказал иное предположение. Несколько ранее он вместе с другими исследователями пришел к заключению, что зона роста под щупальцами выделяет особое ростовое вещество, стимулирующее процесс клеточного деления. Теперь же Бернетт предположил, что в той же самой зоне вырабатывается и подавляющее рост вещество
92
и что именно от сочетания этих двух факторов зависит процесс как нормального, так и регенерационного роста гидры.
Модель роста гидры
Для иллюстрации справедливости своих гипотез исследователи нередко прибегают к созданию моделей тех или иных процессов. Предложенная Бернеттом модель регуляции роста гидры (рис. 34) предполагает, что и стимулирующее, и подавляющее рост вещества медленно перемещаются от места своей выработки в сторону основания тела животного, причем подавляющее рост вещество состоит из «текучих» молекул, которые постепенно выходят из тела в окружающую среду.
Какие же особенности регенерации гидры дали Бернетту основание для формулировки принципов
Рис. 34. Полярность в строении гидры может быть объяснена наличием в ее теле градиента регулирующих рост веществ. С — стимулирующее и П — подавляющее рост вещества.
93
работы его модели? Прежде всего, характер регенерации после рассечения. В верхней части, несущей щупальца, продуцируется как подавляющее, так и стимулирующее рост вещества. Логично предположить, что тут будет происходить нейтрализация одного фактора другим. И действительно, мы не наблюдаем роста щупалец на рассеченном конце, наоборот, здесь начинает формироваться стебелек с подошвой и восстанавливается характерная для тела животного полярность. Рост «головы» на раневой поверхности нижней половины гидры подтверждает два других постулата гипотезы: во-первых, в этой половине гидры нет клеток, способных вырабатывать подавляющее рост вещество, и, во-вторых, большая его часть, которая должна была достигнуть этого отдела тела, уже вышла в окружающую среду.
Помимо полярности регенерационного роста гидры модель Бернетта объясняет и некоторые аспекты нормальной формы ее роста, в частности размножение путем почкования. С точки зрения гипотезы о наличии в теле гидры градиента жизненных процессов по линии «щупальца — подошва» трудно понять механизм почкования. Согласно градиентной модели регенерации у планарий, темп любых биологических процессов значительно выше в головном конце животного, а у гидры быстрый рост, необходимый для почкования, происходит на участке тела, весьма отдаленном ог «головы». Но с другой стороны, именно теория Бернетта легко объясняет наблюдаемое в природе явление. Важно только помнить, что предполагаемый фактор подавления роста наделен повышенной «текучестью». Это создает в нижних отделах тела гидры избыток стимулирующего рост вещества, который и обеспечивает активное отрастание дочерних особей в районе стебелька. В «почках» вскоре начинается самостоятельная выработка подавляющего рост вещества, чем и объясняется полярность тела вновь образующихся гидр.
Каковы наиболее важные особенности модели регуляции роста гидры, предложенной Бернеттом? Она объясняет, во-первых, как нормальную, так и восстановительную формы роста этих беспозвоночных при помощи одной универсальной теории, и,
94
во-вторых, наблюдаемую полярность роста взаимодействием двух специфических химических факторов. Это чрезвычайно ценные идеи, но тем не менее модель Бернетта не дает окончательного ответа на все вопросы, связанные с регенерацией у гидры. Ее значение состоит прежде всего в том, что она может послужить основанием для проведения дальнейших экспериментальных исследований, которые в настоящее время проводятся как самим Бернеттом, так и другими учеными, интересующимися данной проблемой.
МАРКУС СИНГЕР. НЕРВЫ И РЕГЕНЕРАЦИЯ
О значении нервов на определенных этапах регенерации конечности у амфибий мы уже говорили. Маркус Сингер из Медицинской школы при Кливлендском университете, штат Огайо, был первым, кто заинтересовался взаимоотношением нервной ткани и процессов регенерации в самых различных аспектах этой проблемы.
В опытах по денервации конечностей тритона Сингер установил, что регенерация зависит от сохранности нерва вплоть до стадии образования хорошо сформированной бластемы культи. Серия дальнейших весьма интересных исследований позволила Сингеру вскрыть возможный путь влияния нервной ткани на восстановительный процесс. Он пришел к заключению, что нервная ткань выделяет какое-то активное вещество, необходимое для протекания регенерации. Сингер говорит о необходимости исследования этого «нейротропного» агента на молекулярном уровне.
Качество необходимой нервной ткани
Каждый нерв, находящийся в конечностях позвоночных животных, состоит как бы из двух частей. Одна из них — сенсорная (чувствительная) — переносит нервные импульсы от конечности к центральной нервной системе независимо от того, каков характер раздражения конечности. Вторая часть—двигательная, она переносит сигналы от центральной нервной системы
05
Б
Рис. 35. А — три основных нерва, иннервирующих переднюю конечность саламандры. Б — каждый нерв начинается от спинного мозга животного в виде двух корешков, которые, соединяясь, образуют спинномозговой нерв. Все чувствительные волокна входят в спинной мозг через задний корешок, а все двигательные выходят из него через передний корешок.
к мускулатуре конечности, обеспечивая реакцию на различные виды раздражений. На первых порах Сингер пытался установить, участвуют ли обе части нерва в восстановлении конечности тритона. Для этого непосредственно перед ампутацией передней конечности тритона ученый рассекал либо все чувствительные окончания трех основных нервов конечности, либо все двигательные (рис. 35). Оказалось, что регенерация успешно протекает при обоих вариантах
96
постановки опыта, то есть при сохранении либо двигательной, либо чувствительной иннервации. Отсюда можно сделать вывод, что влияние нервной ткани на регенерацию не является качественным, поскольку тип нервного волокна, остающегося в рассеченной конечности, никак не сказывается на ее регенерационной способности. Но что можно сказать о количественной стороне дела? Как сказывается на процессе регенерации количество сохраненной нервной ткани?
Количество необходимой нервной ткани
Анализ результатов предыдущих опытов показывает что для нормального восстановления конечности нет необходимости сохранять нервную ткань в обычном количестве. Ведь полное восстановление конечности без чувствительных либо двигательных нервных окончаний идет при явной утрате значительной частя нервов. Но, поскольку полностью денервированная конечность не способна к регенерации, существует, по-виаимому, некое минимальное количество нервной ткани, необходимое для ее восстановительного роста. Сингер предложил схему экспериментов, с помощью которых можно было установить значение такого минимума.
Как чувствительные, так и двигательные окончания трех основных нервов конечности состоят из пучков с определенным количеством нервных волокон, связанных между собой соединительной тканью. На первом этапе опыта устанавливали количество волокон в каждой из частей этих трех нервов. Подготовленные для микроскопирования препараты поперечных срезов нетронутых нервов окрашивали таким образом, чтобы можно было подсчитать число волокон как в чувствительном, так и в двигательном компонентах. При различных вариантах рассечения нервов у экспериментальных животных легко определить число оставшихся нервных элементов — для этого надо только вычесть число рассеченных из уже известного числа волокон данного нерва. Результаты были довольно интересные. Если в конечности оставалось более 1298 нервных волокон, регенерация протекала нормально, если их количество становилось ниже
4 Зак. 52
97
793, регенерация не происходила. Если же число сохраненных нервных волокон лежало в пределах от 793 до 1298, восстановление конечности иногда происходило, а иногда нет. Таким образом, регенерацию обеспечивает некое среднее число нервных волокон (793—1298), так называемый пороговый уровень.
Логично предположить, что отсутствие способности к регенерации конечностей у того или иного животного может быть связано с недостижением порогового числа нервных волокон. Но дальнейшие эксперименты Сингера показали, что способность к регенерации определяется все же не общим числом оставшихся после ампутации нервных волокон. К этому заключению он пришел, сравнив число нервных волокон в конечностях животных ряда видов. У неспособных к регенерации животных, таких, как мыши или взрослые лягушки, полученные цифры были значительно ниже порогового числа у тритонов. Но подсчет числа нервных волокон у Xenopus, южноафриканской шпорцевой лягушки, неожиданно показал, что столь же низкое число нервных волокон у этих животных сочетается с хорошо выраженной регенерационной способностью, которая проявляется и во взрослом состоянии (рис. 36).
Это противоречие было разрешено, когда дополнительно к подсчету волокон определили размер нервов конечностей у представителей различных групп животных. При этом оказалось, что нервные волокна у Xenopus значительно превышают по диаметру такие же волокна у мышей и взрослых лягушек других видов. Вследствие этого степень иннервации конечности Xenopus значительно выше, чем у сравниваемых видов животных со сниженной регенерационной способностью. Под влиянием полученных данных пришлось несколько изменить концепцию порогового уровня. Теперь она гласит, что способностью к регенерации обладают конечности животных, у которых обеспечивается определенный уровень снабжения ампутированной зоны общим количеством нервной ткани, или нейроплазмы.
По мнению Сингера, концепция порогового уровня удачно объясняет, почему в процессе эволюции
98
25
Рис. 36. Число нервных волокон на единицу ампутационной поверхности верхней конечности у различных позвоночных (1 единица = 0,001 мм). Горизонтальная заштрихованная полоса показывает величину порогового уровня нервных волокон, определенную у тритона. (В статье Rzehak К., Singer М. «Limb regeneration and nerve fiber number in Rana sylvatica and Xenopus lae-vis», J. Exp. Zool., 1966, 162 : 18.)
снижается способность к восстановлению конечностей, несмотря на явную эволюционную «полезность» регенерации. Он утверждает, что по мере усложнения центральной нервной системы происходило постепенное снижение количества нервной ткани в конечностях. В связи с этим у высших позвоночных постулируемый его теорией пороговый уровень иннервации конечностей не достигается. При этом Сингер считает, что природа не зря поступилась способностью к восстановлению конечностей, пойдя по пути все большего усовершенствования центральной нервной системы. Приобретение способности принимать быстрые решения, позволяющие животному эффективно защищаться от врагов, обладает в эволюционном плане большей ценностью, чем способность к отрастанию утраченных частей тела.
4*	99
Каким образом нервы стимулируют рост тканей?
Следующим этапом было изучение механизмов влияния нервной ткани на регенерацию. Сингер предположил, что на ранних стадиях регенерации регулирующим воздействием обладает определенное химическое вещество, выделяемое нервами. Денервация конечности саламандр перед или во время образования бластемы останавливает регенерацию из-за того, что прекращается выработка этого вещества. А что, если после денервации каким-то образом компенсировать отсутствие предполагаемого химического фактора-регулятора? Самым трудным при проведении этих опытов оказалось найти способ обработки денервированных регенерирующих конечностей саламандр различными химическими веществами. Пробовали наносить реагенты непосредственно на поверхность культи или вводить их в ткань с помощью шприца. Но ни в том, ни в другом случае возобновления регенерации денервированной культи не происходило. Нельзя было исключить и той возможности, что содержащийся в используемых препаратах химический стимулятор просто не достигал бластемы, как это бывает при его выделении нервами в естественных условиях. Для решения этой задачи Сингер предложил специальный аппарат, который должен был самым близким образом дублировать нормальную деятельность нервов, постепенно выделяя испытываемые вещества непосредственно в бластему конечности. Подобный процесс называется инфузией, в связи с чем изобретение было названо микроинфузионным аппаратом Сингера.
Микроинфузия
Предложенный Сингером аппарат предназначен для непрерывного протекания небольших объемов жидкости через конечности тритонов, денервированные на ранней стадии регенерации. Действие аппарата основано на вращении часового механизма, которое преобразуется в поступательное движение винта. Винт, в свою очередь, приводит в движение поршень не-
100
Рис. 37. После денервации и последующей ампутации в конечности тритонов вводят растворы тех или иных веществ с помощью аппарата Сингера. (В статье Singer М. «Apparatus for continuous infusion of microvolumes of solution into organs and tissues»,	1954, 86 : 379.)
большого подкожного шприца, подающего раствор в тонкую пластиковую трубочку, вставленную на место иглы. Свободный конец трубочки заканчивается стеклянным капилляром, который вводится в плечевую область тритона после обезболивания животного и затем проникает в ткани культи и бластемы. Винтовая часть механизма может быть соединена с подвижной пластинкой, нажимающей на поршни ряда шприцов,— такая модификация дает возможность проводить одновременную инфузию нескольким тритонам (рис. 37).
Тритонов держат под наркозом до пяти часов и за это время проводят инфузию различных химических веществ в регенерирующую конечность. Для того чтобы инфузия соответствовала естественному процессу высвобождения химических веществ тканью нерва, в конечность поступают минимальные объемы испытываемых растворов — около 0,001 миллилитра в час.
Сингер предположил, что наиболее вероятным веществом, оказывающим влияние на регенерационную способность, может быть медиатор (передатчик нервного напряжения) ацетилхолин. Для этого предположения имелось несколько причин. Во-первых,
101
13,0
Рис. 38. Изменения в содержании ацетилхолина на различных этапах регенерации передней конечности у тритона. (В статье Singer М., Davis М. Н., Arkowitz Е. S. «Acetylcholinesterase activity in the regenerating forelimb of the adult newt, Triturus», J. Embryol. Exp. Morph., 1960, 8 : 107.)
известно, что ацетилхолин высвобождается нервной тканью при передаче импульсов. Во-вторых, при определении содержания ацетилхолина в конечности на различных этапах регенерации было обнаружено, что на так называемых нервно-зависимых этапах его количество оказалось большим по сравнению с нормальной тканью. После формирования бластемы и во время фазы респециализации содержание ацетилхолина возвращалось к нормальному уровню (рис. 38).
В регенерирующие конечности тритонов на протяжении разных периодов времени вводили различные
102
концентрации ацетилхолина. Казалось весьма веро-ятным, что инфузия ацетилхолина хотя бы в некоторых случаях обеспечит возможность регенерации денервированной конечности. Но ожидания не оправдались. Инфузия денервированных конечностей ни разу не привела к завершению процесса регенерации.
Несмотря на некоторое разочарование, вызванное результатом этих опытов, его все же следует считать ценным, поскольку он исключает один из возможных механизмов влияния нервной ткани на регенерацию и позволяет сосредоточить внимание исследователей на поисках альтернатив.
Молекулярная биология и регенерация конечностей Природа вещества, с помощью которого нервная ткань оказывает влияние на регенерацию конечностей, до сих пор остается невыясненной. Исследователи, занимающиеся этим вопросом, недавно попытались расшифровать механизм воздействия нервов на регенерирующие клетки, надеясь таким образом определить участвующее в данном процессе вещество*
Когда конечность денервируется в стадии образования бластемы, процесс регенерации прерываетсяд указывая тем самым на остановку жизнедеятельности клеток бластемы. Вполне логично предположить, что денервация воздействует на одну из наиболее важных функций клеток, а именно на процесс синтеза белков.
Детали процесса синтеза белков в клетках описаны в любом руководстве по биологии, но вкратце их можно сформулировать следующим образом. Молекулы ДНК, располагающиеся в ядре каждой клетки, содержат закодированную информацию для синтеза различных белков. Они служат своего рода матрицей для формирования молекул информационной РНК, которые переносят указанную информацию к распо-. ложенным в цитоплазме клеток рибосомам. Именнд здесь происходит процесс сборки белков из отдел ь«* ных «строительных блоков», которыми являются ами4 нокислоты. В опытах с использованием радиоактив* ных изотопов Сингер и его сотрудники пытались определить, какое влияние оказывает денервация конечности тритона в ранней фазе образования бласте*
103
мы на синтез белка в клетках конечности. Они исходили из того, что при денервации данный тип клеточной активности должен останавливаться или хотя бы снижаться.
Аминокислоты, подобно многим другим химическим веществам, могут быть «помечены», если некоторые из элементов заменить на радиоактивные. По интенсивности включения меченых аминокислот в молекулы белка можно определить уровень синтеза белка в клетках бластемы. Соответственно эффект денервации должен проявиться в изменении уровня включения меченых аминокислот в белки, синтезируемые клетками бластемы.
Итак, в ткань регенерирующих конечностей тритонов вводили меченые аминокислоты. Для выявления метки в данном случае применяли не авторадиографию, а другой метод. В разные сроки после введения меченых аминокислот получали бластему, растирали ее и выделяли белки. Пробы полученных материалов помещали в сцинтилляционный счетчик — прибор, позволяющий определить уровень радиоактивности, высвобождаемой определенным количеством белка за минуту.
Результаты проведенных опытов подтвердили исходную гипотезу: препарат белков клеток бластемы денервированных конечностей был значительно менее радиоактивным по сравнению с аналогичным препаратом из конечностей, где иннервация была сохранена. Таким образом, синтез белка в клетках бластемы действительно зависит от присутствия вещества, выделяемого нервной тканью. Для подтверждения этого вывода Сингер провел опыты по культивированию нервной ткани и материал из культур инфузировал в бластемы регенерирующих конечностей, которые были перед тем денервированы. Потом он повторил опыт с радиоизотопным исследованием синтеза белка клетками бластемы. После инфузии материала из культур нервной ткани клетки бластем денервированных конечностей включали меченые аминокислоты примерно с той же интенсивностью, что и клетки бластем с сохраненной иннервацией.
Так впервые был выявлен на молекулярном уров
ни
не эффект выделяемого нервной тканью вещества, влияющего на процесс регенерации конечности. Открытие, важное само по себе, но имеющее и более общее значение,— оно стимулировало интерес ученых к этому аспекту проблемы регенерации и заложило основу изучения специфических регуляторных механизмов данного биологического явления.
ЭЛИЗАБЕТ ХЕЙ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОГО
МИКРОСКОПА
Электронно-микроскопические исследования, проведенные Элизабет Хей в Гарвардской медицинской школе, внесли много нового в наше понимание судьбы отдельных клеток при регенерации. С помощью оптического микроскопа, как мы уже знаем, была определена общая последовательность изменений на уровне клеток, которые происходят в регенерирующих конечностях саламандр на стадиях дедифференцировки, образования бластемы и редифференцировки. Однако ограничение увеличений, достигаемых в оптическом микроскопе, оставляло многие вопросы без ответа. Так, например, при изучении регенерации у планарий микроскопия оказалась неспособной дать ответ, происходит ли формирование бластемы за счет миграции резервных клеток-необластов или за счет дедифференцировки зрелых клеток плоского червя. Тщательные электронно-микроскопические исследования, проведенные Э. Хей, позволили разрешить ряд важных проблем регенерации у беспозвоночных и позвоночных животных и получить много дополнительной информации.
Клетки регенерирующей конечности
При использовании обычного оптического микроскопа оставались неразрешенными три основных вопроса в изучении клеток регенерирующих конечностей саламандр. Первый из них относился к отдельным компонентам клетки, органоидам. Предполагалось, что органоиды клеток культи принимают активное
105
участие в формировании бластемы. Но какие изменения претерпевают органоиды при дедифференцировке зрелых клеток? Детали этого процесса не поддаются изучению в оптическом микроскопе.
Второй вопрос вытекал из данных оптической микроскопии, показавшей, что клетки, составляющие бластему конечности, не несут никаких следов происхождения от тех или иных «родительских» клеток и по строению неотличимы друг от друга. Действительно ли клетки бластемы идентичны? На это указывали многие данные, но все же нельзя было исключить каких-то различий, невидимых в оптическом микроскопе. Требовались дополнительные исследования для того, чтобы доказать, что клетки бластемы действительно утратили все структурные признаки дифференцированных клеток.
Третья проблема касалась неясности в вопросе о том, какие именно ткани конечности подвергаются дедифференцировке и входят в состав бластемы. В особенности это относилось к утере специализации мышечной тканью культи. Микрофотографии, полученные в оптическом микроскопе, показывали, что рассеченные концы мускулатуры конечности становятся «растрепанными» в следующей за ампутацией стадии «демонтирования» и некоторые мышечные клетки в этом участке отделяются от основной мышечной массы, дедифференцируются и мигрируют к раневой поверхности. Тем не менее ряд исследователей придерживались точки зрения, что мышечная ткань не подвергается процессу дедифференцировки. Они считали, что после освобождения поврежденных концов нетронутой мускулатуры от клеточного детрита идет прямое отрастание новой мышечной ткани и проникновение мышц во вновь формируемую часть конечности. Проведенные Хей электронно-микроскопические наблюдения позволили более детально изучить строение цитоплазмы регенерирующих клеток и дали ответ на эти вопросы. Как вы уже, наверное, поняли, для этой цели использовался просвечивающий электронный микроскоп. Исследовали ультра-тонкие срезы нормальных и регенерирующих конечностей аксолотлей со специальным вниманием к структуре клеток мышц и хряща, поскольку эти
106
клетки легко выявляются в зрелом состоянии по выделяемым ими специфическим веществам.
Прежде всего был установлен характер клеток двух упомянутых типов в неампутированной конечности. В цитоплазме зрелых хрящевых клеток при больших увеличениях хорошо просматривались многочисленные мембраны и рибосомы — мелкие внутриклеточные частицы, служащие для сборки белков из аминокислот. Рибосомы находились в тесной связи с мембранными структурами. Можете ли вы вспомнить другой случай выявления подобной картины? Да, нечто подобное мы уже видели на электронных микрофотографиях фибробластов, участвующих в процессе заживления ран. Матрикс, окружающий хрящевые клетки, содержит коллаген, как и ткани рубца, образуемые фибробластами, поэтому оба типа клеток синтезируют молекулы этого белка на рибосомах, связанных с мембранами. В хрящевых клетках нормальной конечности обнаруживается и комплекс Гольджи, который является типичным для железистых клеток. В зрелых мышечных клетках практически все пространство цитоплазмы занято пучками сократительного материала, поперечная исчерчен-ность которого четко выявляется при увеличениях электронного микроскопа.
Электронные микрофотографии показали, что мышечные клетки подвергаются трансформации в тканях бластемы. На препаратах, полученных Хей в ранние стадии регенерации, в местах рассечения мышечной ткани среди множества ядер оставшейся неповрежденной мускулатуры были видны границы вновь образующихся клеток. Здесь же обнаруживались небольшие клетки, в каждой из них было по одному ядру. Позднее эти клетки, по-видимому, мигрировали к раневой поверхности конечности и становились клетками бластемы.
При исследовании в электронном микроскопе клетки ранней бластемы конечности аксолотля четко отличались от зрелых мышечных или хрящевых клеток (рис. 39). Например, цитоплазматические мембраны клеток бластемы были фрагментированными, а рибосомы свободно разбросаны по всей цитоплазме и не прикреплены к мембранам. Хотя комп-
107
Ж
Рис. 39. Электронная микрофотография клетки бластемы регенерирующей конечности аксолотля. Увеличение 10 000. Я — ядро, ядр — ядрышко, Цит — цитоплазма. (В кн. Hay Е. D. Regeneration, Holt, Rinehart and Winston, New York, 1966, 61.)
леке Гольджи в клетках бластемы оставался различимым, он был гораздо меньше по сравнению с комплексом Гольджи в зрелых клетках хряща. Цитоплазма клеток бластемы была развита чрезвычайно слабо, зато ядра обладали гигантскими размерами и содержали четко выраженные ядрышки. Наконец, поскольку изучение ультраструктуры клеток бластемы не выявило даже следов хрящевого матрикса или мышечных фибрилл, было полностью подтверждено заключение, полученное при оптической микроскопии, об идентичности бластемных клеток.
108
Клетки бластемы
Рис. 40. Диаграмма, изображающая процесс дедифференцировки и редифференцировки клеток мышц и хряща при регенерации конечности у Ambystoma. (В кн. Hay Е. D. Regeneration, ed. Rud-nick D., Ronald Press, New York, 1962.)
На электронных микрофотографиях, сделанных в период редифференцировки, было видно, что «упростившиеся» органоиды клеток бластемы по мере восстановления конечности претерпевают постепенные изменения, характер которых определяется тем, какие именно специализированные клетки возникают на месте бластемы. В расположенных центрально клетках-предшественниках хряща постепенно «проявляются» цитоплазматические мембраны с прикрепившимися
109
к ним рибосомами, комплекс Гольджи становится более выраженным, и вскоре вокруг клеток начи-нает обнаруживаться внеклеточный матрикс. В до-вольно поздних стадиях регенерации, когда уже четко видны границы восстанавливающихся костей, будущие мышечные клетки, расположенные в наружных частях бластемы, еще не имеют признаков респециализации. Но затем проступают и эти признаки, клетки удлиняются, а в цитоплазме начинает выявляться сократительный материал. Еще позже клетки сливаются и формируют типичную мышечную ткань (рис. 40). Таким образом, цитологическое исследование фазы респециализации регенерирующих конечностей аксолотля позволило ответить на все три вопроса, поставленных в начале раздела.
Электронная микроскопия и регенерация у планарий
Многие исследователи обнаруживали в оптическом микроскопе группы совершенно неспециализированных клеток, расположенные в разных участках тела плоских червей. Эти клетки не имели каких-либо четких отличий и различались только по характеру окраски их цитоплазмы некоторыми красителями. Поскольку они мигрировали в сторону раневых поверхностей и участвовали в формировании бластемы, их назвали резервными клетками (необластами). Считалось, что необласты распространены у всех видов плоских червей. Недавно Хей провела электронно-микроскопическое исследование этих резервных клеток у нормальных и регенерирующих планарий.
Первое, что она обнаружила в клетках нормальных. плоских червей,— это значительное число структурных деталей, указывающих на то, что исследуемые клетки не были в полном смысле слова неспециализированными. Большие увеличения электронного микроскопа позволили увидеть в этих клетках секреторные гранулы и структуры комплекса Гольджи — четкие «пограничные столбы» железистых клеток. Возникло предположение, что резервные клетки предназначены не столько для реакции на какие-то виды повреждений, сколько для определенной по-
НО
стоянкой функции — выработки и выделения слизи. Слизь покрывает тело червя и позволяет ему с помощью мышечных сокращений перемещаться по самым разным поверхностям.
У регенерирующих планарий электронная микроскопия выявила своеобразные клеточные потоки, направляющиеся в сторону раневой поверхности. Однако в составе этих потоков были обнаружены не только железистые клетки, но и ряд других специализированных клеток. Позднее близ места рассечения червя мигрировавшие клетки постепенно утрачивали черты специализации, то есть дедифференцировались точно таким же образом, как клетки в регенерирующих конечностях земноводных. По достижении раневой поверхности все мигрирующие клетки оказывались полностью дедифференцированными и были готовы к формированию бластемы. Необласты, таким образом, были совершенно не нужны.
Как видите, электронная микроскопия во многих случаях подтверждает данные, основанные на наблюдениях в оптическом микроскопе. Таковы были результаты детального изучения клеток регенерирующей конечности. Но на примере с резервными клетками планарий электронно-микроскопические данные не совпали с результатами, полученными ранее с помощью менее совершенной техники. В связи с этим иногда приходится подвергать повторному исследованию объекты, казалось бы, давно изученные, после чего нередко происходит пересмотр установленных в науке положений.
РИЧАРД ГОСС. РАЗНООБРАЗИЕ РЕГЕНЕРАЦИОННЫХ СИСТЕМ
Ричард Госс работает в Браунском университете города Провиденс, штат Род-Айленд. Свою дгятель-ность он посвятил изучению проблемы регенерации различных органов у весьма широкого круга животных. Мы приведем здесь лишь две его работы, характеризующие чрезвычайную широту его исследовательских интересов. Речь пойдет о регенерации вкусовых усиков (мелких бакенбардоподобных чувствительных выростов, окружающих ротовое отверстие у
111
представителей некоторых видов рыб) и крупных ветвящихся рогов у оленей и лосей, достигающих порой 130 сантиметров в длину.
Регенерация вкусовых усиков
Сом (по-английски «catfish», буквально «рыба-кошка») получил свое название именно благодаря чрезвычайно выраженным вкусовым усикам, очень напоминающим кошачьи усы. Д-р Госс обнаружил, что при отсечении у сома такого усика на его месте образуется бластема и утраченный отросток регенерирует. При микроскопическом исследовании структура усиков оказалась очень простой: каждый из них содержал нервы и кровеносные сосуды, основу органа составлял хрящевой стержень, а на верхушке под слоем эпидермиса находилась вкусовая почка.
Экспериментальное исследование этой миниатюрной регенерационной системы выявило ряд интересных фактов. Бластема, образующаяся после отсечения усика, формировалась только из дедифференци-рованных клеток хряща. Если через небольшой разрез у основания усика удаляли хрящевой стержень, а затем пересекали и сам усик, бластема не формировалась и отросток не регенерировал. Поскольку хрящевой стержень оказался необходимым для регенерации усика, логично было предположить, что если в один усик поместить несколько стержней (можно до четырех), то после ампутации усика с пересечением всех стержней появляющийся отросток будет содержать столько стержней, сколько их было в'культе. Но эксперимент выявил в регенерирующем усике только один стержень. По-видимому, бластема вкусового усика «запрограммирована» на формирование нормального числа стержней в отростке, и присутствие дополнительных структур в культе не влияет на нормальный рост.
Регенерация рогов у оленей
В- дальнейшем Госс сосредоточил свое внимание на изучении регенерации рогов у оленей. Периодическое естественное замещение этих структур являтся. по-
112
видимому, единственным примером регенерации столь сложного органа у млекопитающих. Тем не менее он показывает, что и у теплокровных животных возможно восстановление крупных частей тела. Поэтому неудивителен большой интерес, проявляемый многими исследователями к изучению данной формы регенерации. В силу этого общий характер роста и судьба тех или иных клеток при восстановлении оленьих рогов, а также факт гормональной зависимости процесса регенерации изучены достаточно хорошо. Гос-, су, однако, удалось открыть в последнее время ряд новых способов воздействия природных сигналов на стимуляцию гормональной активности организма.
В ранний период роста у самцов оленя по обеим сторонам черепа, несколько выше и позади глаз, появляются небольшие костные выросты, или пеньки. Позднее нй этих местах образуются мягкие округлые «роговые почки», которые затем удлиняются и ветвятся. Рост и развитие рога происходит из верхнего его конца, но окостенение хрящевых клеток осуществляется постепенно по мере удаления от основания рога снизу вверх. Подобный градиент дифференцировки тканей отмечается при каждом цикле регенерации рогов.
У самцов оленей, живущих в зоне умеренного пояса, сбрасывание и отрастание рогов происходит ежегодно, причем у разных видов наблюдаются довольно существенные вариации как в размере рогов, так и в интенсивности процесса их восстановления. Госс составил таблицы, которые показывают, что у более крупных животных рост рогов идет быстрее. У лосей, самых крупных представителей семейства оленей, рога могут достигать в длину 129,5 сантиметра и расти со скоростью 2,75 сантиметра в день (рис. 41, А, Б). У всех оленей по мере окостенения растущего рога пронизывающие его кровеносные сосуды перекрываются костной тканью, и кожа с короткими густыми волосами («вельвет»), покрывающая рога снаружи, лишаясь кровоснабжения, лопается и отпадает. Отпадение рогов, превратившихся в плотную компактную костную массу, происходит значительно позже, тогда, когда в месте соединения рогов и пеньков появляются клетки, разрушающие костные
ИЗ
структуры. Ранки быстро заживают и рост рогов начинается заново. У большинства видов отпадение рогов происходит в конце зимы или весной, регенерацию можно видеть в летние месяцы, а сбрасывание «вельвета» проходит как раз перед периодом размножения, то есть осенью. Все эти процессы приводятся в движение зависящими от времени года колебаниями гормональной активности у оленей. Снижение количества гормона тестостерона весной стимулирует отпадение рогов и начало регенерации, а повышение его уровня осенью приводит к постепенному окостенению рогов и потере «вельвета».
114
Длина рогов, см
150
Март Апрель Май Июнь Июль Август Сентябрь
Время, месяцы Ь
Рис. 41. А — рога лося гораздо крупнее, чем рога лани (в середине схемы) или пятнистого оленя (внизу). Б — кривые роста рогов у оленей тех же видов. Стрелки указывают сроки сбрасывания старых рогов. (В статье Goss R. J. «Problems of antlero-genesis», Clinical Orthopaedics, 1970, 69 : 229.)
Если вы живете в средней полосе, вы знаете, что в разные времена года длина светового дня различна. Цикл роста рогов и изменений гормонального уровня у оленей связан непосредственно с сезонными изменениями длины светового дня. Госс создал в своих экспериментах режим искусственного освещения, чтобы получить ответы на следующие вопросы; во-первых, можно ли изменить цикл смены рогов, удлиняя или укорачивая длительность искусственного освещения, и, во-вторых, будет ли происходить замещение рогов в условиях, когда длина светового дня будет постоянной на протяжении всего календарного года?.
115
На первом этапе своих экспериментов он подвергал оленей воздействию «светового года» (полный годовой .цикл возрастания и убывания длины светового дня), который на шесть месяцев расходился по фазе с обычным годом, то есть зимой дни становились длиннее, а летом — короче. Подопытных животных (пятнистых оленей — небольших, легкого сложения оленей, живущих в естественных условиях на Дальнем Востоке, но встречающихся в зоопарках всего мира) содержали в неотапливаемом помещении, где температура подвергалась естественным годовым изменениям. Специальный календарный механизм был соединен с осветительными приборами, с помощью которых поддерживалось «извращение времен года»: осенью по мере падения температуры длина светового дня постепенно увеличивалась, тогда как весной с потеплением световой день сокращался. При содержании в таких условиях регенерация рогов у пятнистого оленя приходилась на зимние месяцы, а сбрасывание — на осень. Животные подверглись полной адаптации к извращенным условиям освещения, во всяком случае, в том, что касалось роста и регенерации рогов.
Стремясь всесторонне проверить свою гипотезу, Госс в следующих опытах подвергал животных воздействию нескольких искусственных световых циклов на протяжении одного календарного года. Для этого календарный механизм настраивали так, чтобы он пропускал каждый второй день. Это обеспечило проведение за год двух годовых циклов изменения продолжительности светового дня. Если же механизм пропускал по два или три дня, годовые циклы повторялись трижды или четырежды в год. При помещении в такие условия пятнистые олени начинали терять рога дважды, трижды или четырежды в год в соответствии с числом экспериментальных годовых циклов. Из-за сокращения циклов длина отраставших рогов была, естественно, значительно меньше, чем при нормальном цикле (рис. 42, А, Б).
В следующем эксперименте Госс удлинил цикл светового года. Для этого календарный механизм дважды повторял каждый нормальный день, создав
116
Рис. 42. А — задержка роста рогов у пятнистого оленя при «трехмесячном» годе. Б — рога взрослого пятнистого оленя в период, когда они достигают максимальной длины. (В статье Goss R. J. «Photoperiodic control of antler cycles in deer. I, Phase shift and frequency changes», J. Exp. Zool., 1969, 170:315.)
117
тем самым «двадиатичетырехмесячный год». Теперь ученый пытался получить ответ на следующие вопросы: продлится ли цикл роста рогов у содержащихся в таких условиях оленей все 24 месяца и скажется ли это на размерах рогов или нет? Ответ на первый вопрос оказался неодинаковым в опытах на оленях разного возраста: взрослые животные не изменяли цикла смены рогов, тогда как молодые олени легко приспосабливались к новой длительности «года», восстанавливая рога всего один раз за фактически два календарных года. Что же касается второго вопроса, то ни разу не наблюдалось отрастания рогов, превышающих по длине нормальные, хотя аномалии в характере их роста иногда были. Но во всех случаях искусственного изменения времен года наблюдаемые биологические эффекты не носили постоянного характера: большинство оленей по возвращении к естественному содержанию восстанавливали обычную цикличность роста рогов.
Может ли какой-нибудь искусственно созданный световой режим полностью приостановить смену рогов? С этой целью экспериментатор вообще исключал какие-либо колебания в продолжительности светового дня. На протяжении ряда лет специальную группу оленей содержали в условиях смены света и темноты ровно через 12 часов. Подобные условия были идентичны тем, которые наблюдаются на экваторе. Свет включали в 6 часов утра и гасили в 6 часов вечера. В этой группе большинство оленей вообще утратили способность к смене рогов, их регенерационный цикл был полностью нарушен. Кроме того, было установлено, что утеря цикла связана с постоянно повышенным уровнем тестостерона.
И наконец, в последнем варианте опытов Госс воздействовал на группу оленей с помощью постоянных на протяжении календарного года циклов, состоящих из неравных периодов света и темноты: восемь, шестнадцать или двадцать четыре часа света сопровождались соответственно шестнадцатью, восемью часами темноты или свет не выключали вообще. В каждом таком случае искусственно удлиненных или укороченных световых дней животные оказались
118
способны с достаточно большой точностью определять фактический ход времени. Они сменяли рога один раз в год и удивительно близко к срокам, когда этот процесс протекает в естественных условиях. Эти результаты дают веские основания предполагать, что оленям свойствен внутренний ритм типа «биологических часов». (В предыдущих опытах Госса такой ритм подвергался адаптационным изменениям при искусственных извращениях годовых циклов или полностью нарушался при переводе животных в «экваториальные» условия освещения, когда свет и темнота чередовались каждые 12 часов.) Каков бы ни был физиологический механизм наблюдаемого внутреннего ритма, он зависит от главного фактора — неравенства продолжительности светлых и темных периодов в каждом 24-часовом цикле.
Из результатов, полученных другими исследователями, вытекает, что тип реакции, наблюдаемой у оленей, не исключение. У большого круга животных физиологические изменения и приспособительные реакции тесно связаны со сменой дня и ночи, сменой времени года, чередованием приливов и отливов. Во многих случаях, когда животных извлекали из естественной среды обитания и лишали многочисленных ее «сигналов», они тем не менее сохраняли чувство времени и соответственно поддерживали свои нормальные биологические циклы *.
Результаты опытов Госса по регенерации рогов у оленей позволяют предположить, что сходным образом может осуществляться и регуляция других форм восстановительных процессов. Действительно, в последнее время наши знания о явлениях, относящихся к функционированию «биологических часов», непрерывно расширяются. И по-видимому, недалек тот день, когда мы узнаем, каким образом приводится
1 Сходная способность, по-видимому, присуща и человеку, в чем вы можете убедиться на собственном примере или примере своих знакомых. Многие люди могут служить для себя своего рода «будильниками»: способны прерывать свой сон в любое заданное время дня или ночи.
119
в движение этот удивительный часовой механизм природы.
Биологи, с которыми мы познакомились в этой главе, продолжают свои исследования по регенерации. Эллисон Бернетт в экспериментах на гидрах уточнил механизмы регуляции роста у этих кишечнополостных животных. Кроме того, он пытается приложить некоторые из своих теорий к анализу регенерации у позвоночных. Поскольку основные закономерности жизнедеятельности клеток у животных различных эволюционных групп чрезвычайно близки, естественно, что специалисты по росту и развитию какой-то одной группы животных стремятся распространить свои выводы на другие. Маркус Сингер, установив, что высвобождаемый нервной тканью фактор может влиять на клеточные механизмы синтеза белка несколькими путями, занялся поисками биохимической «мишени» этого вещества в клетках бластемы конечности. Среди многих аспектов нейробиологии, которыми он интенсивно занимается, его особое внимание привлекает изучение структуры и функций миелиновой оболочки аксонов. Что касается Элизабет Хей, то ее мастерство электронного микроскописта служит теперь уже не только задачам изучения регенерации. Она исследовала тонкую структуру самых разных эмбриональных клеток — в частности, клеток сердца и хрусталика куриного эмбриона — и сопоставила свои наблюдения с функциями этих клеток в процессе эмбрионального развития. Ричард Госс в настоящее время наибольшее внимание уделяет таким процессам компенсаторной регенерации, как восстановление ткани печени и почки млекопитающих после удаления соответствующего органа. По мнению Госса, углубление знаний об этих процессах приведет к открытию специфических регуляторов роста тканей и органов у млекопитающих.
Работы этих ученых — и только что описанные, и осуществляемые ими в настоящее время — представляют, конечно, лишь часть той большой исследовательской деятельности, которая посвящена изучению регенерационных процессов. Только вместе взятые, они могут дать целостную картину каждого
120
конкретного процесса. Но в общем перспектива пред* ставляется обнадеживающей. Регенерация стала важным разделом биологии развития — отрасли науки, занимающейся изучением закономерностей нормального и патологического роста, клеточной дифференцировки, экспериментальной эмбриологии и многими другими близкими проблемами. Благоприятные перспективы развития новой отрасли науки определяются еще и тем, что в последние годы в нее непрерывно вливаются новые энтузиасты изучения регенерации.
V
СОВЕТСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ
По числу работ и глубине охвата проблемы исследования советских ученых в области регенерации в последние годы непрерывно расширялись, и весьма вероятно, указанная тенденция сохранится и в будущем. Поэтому для нас представляет большой интерес ознакомление с развивающимися в СССР направлениями в изучении регенерации, как с частью планомерно организованной государственной программы научных исследований.
ОСНОВНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ РЕГЕНЕРАЦИИ В СССР
В исследованиях по регенерации в СССР в последнее время максимальное внимание уделяется тем аспектам восстановительного роста, которые могут иметь самое непосредственное применение в меди* цине. Советские исследователи изучают явления, связанные с восстановлением костей, печени и мышечной ткани позвоночных, с надеждой, что более глубокое понимание механизмов этих процессов поможет найти условия для стимуляции восстановительной способности тех тканей и органов, в которых она обычно выражена слабо. В ряде основных областей такой подход оказался весьма результативным, прекрасным примером чему являются исследования по регенерации черепа.
РЕГЕНЕРАЦИЯ ЧЕРЕПА
Используя в своих экспериментах собак, советские исследователи создали уникальный метод, с помощью которого они индуцировали регенерацию черепа. У под-
122
опытных животных удаляли участок черепа площадью примерно десять квадратных сантиметров, избегая при этом повреждения мозговых оболочек, находящихся непосредственно под костной тканью. Часть образовавшихся в черепе пустот заполняли похожим на опилки материалом, полученным путем механического размельчения кусочков черепа или костей конечности от других животных. В тех случаях, когда костный наполнитель не применялся, густоты постепенно заполнялись мягкой фиброзной тканью, на что уходило от двух до шести месяцев. При использовании же «опилок» череп полностью восстанавливался за год.
В чем состоит специфическая роль подобного костного наполнителя? Для ответа на этот вопрос животных исследовали в различные периоды послеоперационного времени. В течение первой недели наблюдалось постепенное рассасывание костных «опилок» и закладывание по всей поверхности изъятого участка черепа маленьких островков костных клеток. Через несколько месяцев в зоне операции можно было видеть существенное количество новообразованной костной ткани, хотя она не была похожа на материал, из которого обычно построен череп. Это образование напоминало своеобразную «губку», состоящую из больших костных островков, отделенных друг от друга и от остальной ткани черепа мягкой фиброзной тканью с большим количеством кровеносных сосудов. Вполне логично предположить, что продукты распада костных «опилок» каким-то образом стимулировали превращение фиброзных клеток в костные. На протяжении года образовавшиеся костные островки сливались, и вся оперированная зона заполнялась костью более или менее обычной структуры, регенерирующая ткань плотно срасталась с окружающими костями черепа по всему периметру иссечения.
Следующая серия экспериментов была посвящена разработке методики, позволяющей неопределенно долгое время сохранять полученные фрагменты кости до их использования. После испытания ряда методик советские ученые пришли к выводу, что пригодные для восстановительной хирургии костные наполни
123
тели можно сохранять, если заморозить их в смеси твердой углекислоты (сухого льда) и спирта при —78 °C и затем хранить при —40 °C. Подвергнутые подобному замораживанию, костные «опилки» способствуют регенерации черепа лишь чуть хуже свежей костной ткани.
При нейрохирургических операциях нередко возникает необходимость в удалении больших участков черепной коробки. Поскольку костная ткань черепа человека тоже не регенерирует в естественных условиях, эксперименты по использованию костных наполнителей и их консервации могут иметь существенное клиническое значение. Советские исследователи недавно сообщили о предварительных успешных результатах применения данной методики для восстановления дефектов черепа у человека.
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ, НАНЕСЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ
Другая область изучения регенерации, которой уделяется первенствующее внимание в советских медикобиологических исследованиях, относится к влиянию радиоактивного облучения на клетки организма. Несмотря на преимущественное внимание к медицинским аспектам исследований, основная часть этих экспериментов проводится на млекопитающих; в данном случае в качестве экспериментальных животных используются аксолотли — личиночная форма саламандр, способная регенерировать свои конечности в нормальных условиях. Давно известно, что при обработке конечности саламандр определенной дозой рентгеновского облучения способность к регенерации полностью утрачивается. Заживление раны наступает, но после этого выявляются лишь незначительные признаки клеточной дедифференцировки и всех последующих этапов нормального процесса восстановления конечности.
Несколько лет назад советские исследователи впервые сообщили о некотором успехе, полученном при попытках восстановить регенерационную способность после облучения. Облученные культи аксолотлей в течение пяти дней подвергали механическому
124
раздражению: захватывали и раздавливали пинцетом их внутренние ткани. Такое воздействие сопровождалось полной регенерацией конечностей у 40— 50% аксолотлей, что указывало на обратимость эффекта облучения. Механическая травма вызывала дедифференцировку облученных клеток, что приводило к наступлению всех последующих фаз нормального регенерационного процесса.
Сходного эффекта удалось добиться позднее с помощью биохимических методов, целью которых было: во-первых, точно выявить вызванные облучением изменения, проходящие на молекулярном уровне, и попытаться предотвратить влияние таких изменений на ход регенерации; и, во-вторых, введя животным определенные препараты, сделать эффект облучения обратимым и заставить клетки культи функционировать по обычному регенерационному «плану». Практическое значение подобных исследований очевидно. Возможность поражения отдельных тканей или органов ионизирующим излучением в настоящее время достаточно реальна для лиц ряда профессий, а также для больных, подвергающихся радиотерапии. К сожалению, пока еще отсутствуют реальные способы обеспечить нормальную функцию тех или иных пораженных в результате облучения клеток. Советские исследователи надеются, что в ближайшем будущем подобную ситуацию удастся изменить.
СВЯЗИ СОВЕТСКИХ УЧЕНЫХ С УЧЕНЫМИ ДРУГИХ СТРАН
В последние годы в крупных городах СССР состоялся ряд международных конгрессов и конференций, в программу которых входило много тем, ка-касающихся различных аспектов регенерации. Примерами могут служить IX Международный конгресс анатомов 5 Ленинграде (1970 г.) и IX Международная эмбриологическая конференция в Москве (1969 г.). На указанных международных форумах происходил оживленный обмен научной информацией, обсуждались планы будущих исследований. Хотя во время конференций докладчики говорили, как правило, на
125
своем родном языке, аудитории были оборудованы системами, обеспечивавшими каждому участнику возможность слушать синхронный перевод на английском или русском языке. Во время частных бесед ученым помогал штат специальных переводчиков. Иностранные участники съездов и конференций имели возможность посетить советские учебные и научно-исследовательские институты и непосредственно ознакомиться с их работой. Подобная форма обращения оказалась взаимно полезной как для хозяев, так и для гостей перечисленных форумов.
Связь между советскими исследователями и их зарубежными коллегами значительно расширилась за счет специальных программ научного обмена; одной из них является программа совместных исследований Академии Наук СССР и Национальной Академии Наук США. В рамках указанной программы отдельные американские и советские ученые получили возможность поработать в течение определенного времени в лабораториях стран — участниц данного соглашения. Участники программы считают весьма ценным ее осуществление и надеются, что при поддержке правительств обеих стран в ближайшем будущем удастся получить интересные результаты.
VI
РЕГЕНЕРАЦИЯ У РАСТЕНИЙ
Феномен регенерации наблюдается не только у животных, но и у растений. Более того, восстановительные процессы как у низших, так и у высших представителей растительного царства распространены гораздо шире — настолько, что считаются как бы само собой разумеющимися. Некоторые механизмы регенерации у растений дают специалистам по биологии развития уникальный экспериментальный материал. Сейчас мы перейдем к изложению одного из них.
«БОКАЛ РУСАЛКИ»
Одноклеточная зеленая водоросль идеально подходит для постановки экспериментов по изучению механизмов регенерации на молекулярном уровне. Морскую водоросль Acetabularia можно найти в тропических и субтропических морях многих частей света.
Чтобы понять, почему ацетабулярию часто называют «бокалом русалки», достаточно лишь раз взглянуть на это растение, но и при более внимательном осмотре не сразу увидишь, что весь организм водоросли состоит из одной клетки. Во-первых, ацетабулярия достигает нескольких сантиметров в высоту, а во-вторых, состоит из трех отдельных частей: похожей на корень ризоидальной части, с помощью которой растение прикрепляется к придонным камням, тонкого растущего вверх «стебля» и похожей на шляпку структуры, расположенной на его вершине. Виды ацетабулярии различаются по строению шляпки. Например, у Acetabularia mediterranea шляпка похожа на зонтик. Несмотря на внешнее
127
сходство этих водорослей с высшими растениями, цитоплазма всех трех частей водоросли не прерывается и они действительно являются отделами одной и той же клетки. Крупное единственное ядро водоросли находится в ризоидальной части растения.
Каким образом осуществляется регуляция клеточного роста, и в частности морфогенеза (развития формы), при восстановлении утраченных частей тела у растений или животных? На одноклеточной ацета-булярии был проведен ряд опытов, доказывающих важную роль нуклеиновых кислот в процессах морфогенеза. Значение ДНК, содержащейся в ядре клеток, которые участвуют в процессе регенерации, несомненно, но каким образом она взаимодействует с цитоплазмой клетки при восстановлении исходных размеров и формы последней, совершенно непонятно. Счастливое стечение обстоятельств в случае с «бокалом русалки» сделало возможным хотя бы частичное решение этого вопроса. Во-первых, все виды аце-табулярии способны к восстановлению утраченных шляпок; разрез заживает, и исходная форма растения восстанавливается примерно за месяц. Для регенерации шляпки не обязательно, чтобы ядро было цело; если удалить шляпку и через некоторое время перерезать стебель над ризоидальной частью растения, шляпка полностью восстановится (рис. 43, А). Во-вторых, было обнаружено, что можно легко пересаживать верхнюю часть (стебель со шляпкой) аце-табулярии одного вида на нижнюю часть растения (ризоиды) другого. Была проведена серия опытов с целью выяснить механизм влияния ядра и цитоплазмы на развитие формы регенерирующей шляпки.
На первом этапе эксперимента у водорослей двух видов Acetabularia удаляли шляпки, а вслед за тем и ризоидальные основания; стебли растений пересаживали от одного к другому, и они, таким образом, прикреплялись ко дну с помощью «чужих» ризоидов. Очень часто первая шляпка, регенерировавшая у такого растения, относилась к промежуточному типу, неся черты сходства с обеими родительскими формами. Однако, если регенерировавшую шляпку удаляли, все последующие регенераты внешне ничем не отличались от того вида, которому принадлежало 128
Рис. 48. А — несмотря на отсутствие ядра новая шляпка у Асе-tabularia регенерирует. В — регенерировавшая шляпка Acetabula-ria будет характерна для того вида растений, у которого взято ядро при пересадке.
пересаженное ядро (рис. 43, Б). Таким образом, у «бокала русалки» диспетчерский центр информации по регенерации шляпки находится в ядре, и приказы о реконструкции шляпки передаются от ядра через цитоплазму к вершине стебля, где они и осуществляются практически.
Биохимическая интерпретация результатов данного эксперимента исходит из предположения, что информация для восстановления шляпки поступает в форме информационной РНК- Мы уже знаем, что эта форма нуклеиновых кислот осуществляет передачу «кода» для синтеза белков от ДНК в ядре клетки к расположенным в цитоплазме рибосомам. Информационная РНК ацетабулярии, кодирующая белки шляпки, стабильна и имеет длительный период жизни, повиольку регенерация шляпки может
5 Зак. 52
129
происходить и спустя некоторое время после удаления ядра. Это заключение подтверждается опытами с пересадкой, в которых, как вы помните, часто регенерировали шляпки промежуточной формы по отношению к родительским видам водорослей. Произошло это потому, что образующий шляпку участок цитоплазмы некоторое время получал информационные импульсы от исходного ядра уже после фактического замещения его ядром другого вида. Образование шляпки промежуточного типа явилось следствием реализации комбинированной инструкции от обоих ядер — старого и нового.
При некоторых других воздействиях на «бокалы русалки» были получены данные и о вовлечении РНК в морфогенез шляпки. Так, в одном из опытов после удаления шляпки, а затем и ризоидов верхняя часть стебля подверглась ультрафиолетовому облучению. (Эта форма радиации способна поражать нуклеиновые кислоты.) В результате новая шляпка не образовалась. В другом эксперименте после обработки верхушки стебля ферментом рибонуклеазой, расщепляющей молекулы РНК на мелкие фрагменты и соответственно нарушающей ее функции, формирование шляпки также не произошло. В третьем эксперименте водоросли, лишенные шляпок, но сохраняющие ядра, обрабатывали антибиотиком — актиномицином D — препаратом, препятствующим синтезу РНК на матрицах ДНК- И этот способ обработки помешал регенерации. Итак, совершенно ясно, что восстановление какого-либо участка ацетабулярии не может происходить при подавлении продукции рнк или разрушении ее молекул, выделяемых в цитоплазму, поскольку в этих случаях прерывается поступление информации о том, каким образом должны воссоздаваться утраченные структуры.
Результаты описанной здесь работы о роли ядра и цитоплазмы при регенерации у Acetabularia — лишь небольшая часть того, что известно о молекулярной биологии этих интересных клеток. Получено много важной информации о том, где локализуются, синтезируются и как функционируют различные нуклеиновые кислоты данной системы. Для изучения «бокалов русалки» используются недавно разработайте
ные биохимические методы и электронная микроскопия. Эти водоросли еще долго будут оставаться ценным экспериментальным объектом для изучения закономерностей восстановительного роста.
РЕГЕНЕРАЦИЯ У МОРКОВИ — «МНОГО ИЗ ОДНОГО»
Представим себе, что вы составляете своего рода «памятный листок» о способах регенерации у растений и животных, об организмах, у которых наблюдаются восстановительные процессы. Естественно, в первую очередь вы включите туда различные виды восстановления утраченных и поврежденных частей сложных многоклеточных организмов. Эта восстановительная способность у высших позвоночных ограничена отрастанием нервов, замещением поврежденной мышечной ткани и регенерацией костных й кожных повреждений. Примеров такого типа регенерации немало. У многоклеточных организмов также возможно восстановление всего тела из небольшого его фрагмента, как мы видели у гидры или планарий. С этой точки зрения реакция на повреждение у одноклеточных организмов во многом напоминает таковую у их более сложно организованных эволюционных «потомков» — так происходит восстановление определенной специализированной части, например шляпки у «бокала русалки», или возникает новая клетка из некоторых своих компонентов, как у инфузории трубача. К другому типу регенерации (если этот термин понимать более широко) вы отнесете разрастание клеток печени в ответ на удаление ее части или клеток второй почки после удаления первой. И в том, и в другом случае восстановительный рост обусловливается необходимостью компенсации функций утраченных органов или их частей. Следующее место в вашем списке должно занять периодическое естественное замещение таких структур, как рога или перья. Наконец, нельзя не вспомнить о регенерации, которая состоит в сборке заново или реагрегации разъединенных клеток организма. Она характерна для губок.
Еще один тип регенерации, совершенно не похожий ни на какой из упомянутых выше классических
5*	131
процессов, был обнаружен у моркови. Одна индивидуальная клетка, полученная из тканей зрелого многоклеточного растения моркови, может при определенных условиях культивирования восстановить целый организм, включая корни, цветки и семена.
Этот тип регенерации, который можно назвать «восстановление из бесконечно малого», был открыт, когда небольшие кусочки корня моркови выращивали методом культуры ткани (в опытах использовали или обыкновенную, или дикую морковь, известную как «кружево королевы Анны»), При использовании обычной культуральной среды рост эксплантатов был ограниченным: клетки несколько увеличивались в размере, но не делились. В исходную культуральную жидкость добавляли различные вещества в надежде стимулировать клеточное деление, а следовательно, и рост растения. Опыты были безуспешными, пока в культуральную жидкость не добавили молоко кокосовых «орехов». В присутствии этого питательного вещества клетки моркови начали удивительно быстро расти. За несколько дней развилось бурное клеточное деление, после чего эксплантаты стали быстро увеличиваться, как по размеру, так и по числу входящих в них клеток.
Для продолжения опытов культуральные сосуды, содержащие эксплантаты моркови, помещали в специальный вращающий аппарат, так что кусочки растения контактировали то с воздухом, то с жидкой средой. В результате некоторые клетки срывались с поверхности растущих фрагментов, и неожиданно они-то и оказались жизнеспособными. При переносе в новые флаконы с добавлением кокосового молока такие отдельные клетки делились и образовывали многоклеточные скопления. В дальнейшем каждое скопление претерпевало постепенные изменения, при ближайшем рассмотрении напоминавшие обычные стадии развития зародышей моркови. Вначале становились заметными скопления клеток сердцевидной формы, затем эти образования приобретали торпедовидную форму. Если на этой стадии растения переносили в плотную желатинообразную среду, у цик формировались стебли и корни; позже, достигая стадии вврослого растения, такая «регенерировавшая»
132
Часть культурального флакона
Сохранившийся корень
Поперечный срез корня
Зародыш моркови, возникший из культивируем ых клеток
Свободные клетки в суспензии
Эксплантаты, культивированные в среде с молоком кокосового ореха
Рис. 44. Восстановление целого растения моркови из одной клетки корня, эксплантированной из зрелой моркови. (В статье Steward F. С. et al., «Growth and development of cultured plant cells», Science, 1964, М3 (January): 20—27.)
морковь ничем не отличалась от обычной. Например, во время цветения в центре ее совершенно белых цветков были заметны типичные для моркови мелкие красные пятнышки (рис. 44).
Как и в случае восстановления шляпки ацетабу-лярии, регенерация моркови в присутствии кокосового молока 1 является одной из проблем, стоящих перед биологией развития. Эта отрасль науки настойчиво ищет ответ на вопрос: насколько постоянна специализация клеток, происходящая во время эмбриогенеза? В обычных условиях морковь вырастает из одной оплодотворенной яйцеклетки. Семя прорастает, происходят определенные изменения ростка и отдельные части растения постепенно приобретают типичный для зрелого организма вид. Описанный здесь эксперимент свидетельствует, однако, что каждая отдельно взятая клетка взрослого растения никогда не утрачивает потенциальной способности восстановить целое новое растение, то есть содержит весь клеточный механизм, необходимый для реализации подобного плана. Среда с кокосовым молоком как бы «демаскирует» клеточную информацию, необходимую для регенерационного процесса, осуществляет реактивацию всей цепочки событий, лежащих на пути от эмбриона до взрослого организма. Эти эксперименты показывают лишь, что подобный ход событий в принципе возможен,— на самом деле точный механизм явления остается скрытым от нас. Мы можем только сказать, что рассмотренные нами примеры восстановительных процессов у растений дают немалую пищу для размышлений.
1 Недавно было обнаружено, что молоко кокосового ореха в подобных опытах может быть заменено сходными жидкостями от родственных растений и даже искусственной средой, содержащей определенную комбинацию факторов, регулирующих клеточный рост. Аспарагус и табак, помещенные в аналогичные условия, показали сходный тип регенерации.
VII
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У ЧЕЛОВЕКА
Различия в регенерационной способности у животных разных видов были обнаружены итальянским натуралистом Ладзаро Спалланцани, впервые поставившим изучение регенерации на путь эксперимента. Эти различия показались ему во многом загадочными. Особенно тот факт, что головастики восстанавливали утраченные конечности, а превратившись в лягушек, теряли эту способность. Результаты опытов натолкнули его на следующие размышления:
Но если животные способны восстанавливать конечности в молодом возрасте, почему же они не делают этого в своем дальнейшем развитии?.. Можно ли отнести столь удивительную способность к восстановлению лишь за счет действия водной среды, в которой обитают молодые животные? Но ведь этому противоречат наблюдения над саламандрами, которые восстанавливают части своего тела и при жизни на суше.
Далее, предполагая, что способность к восстановлению конечностей, которую ему удалось наблюдать у земноводных, не обязательно ограничивается животными этой группы, но может, хотя бы и в скрытой форме, быть присуща человеку, Спалланцани оптимистично продолжает:
Если вышеупомянутые животные, как водные, так и земноводные, восстанавливают свои конечности, когда их содержат на суше, почему не представить, что другие животные, обитающие на суше постоянно... и лучше известные нам, не наделены той же силой? Быть может, они приобретают способность к восстановлению с помощью
13&
каких-либо полезных усовершенствований? И следует ли считать химерой надежду на то, что мы сами сможем когда-нибудь воспользоваться подобной силой природы?
Сегодня, перед лицом огромных успехов во всех областях науки о живом, при непрерывном росте понимания биологических процессов на клеточном и молекулярном уровнях взгляд на проблему регенерации конечностей у человека как на абсолютно неразрешимую едва ли имеет приверженцев. Оптимизм в оценке проблемы основан на конкретных достижениях науки о регенерации в последние десятилетия. Используя различные подходы, исследователи открыли за это время некоторые из «полезных усовершенствований», о которых мечтал Спалланцани. Ученым удалось выявить регенерацию конечностей у высших позвоночных, у которых подобная способность в естественных уеловиях никогда не встречалась.
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У ВЗРОСЛЫХ ЛЯГУШЕК И ПРЕСМЫКАЮЩИХСЯ
Для объяснения различий в регенерационной способности представителей разных классов позвоночных Маркус Сингер предложил теорию «порогового уровня нервного обеспечения». Согласно этой теории, по мере совершенствования центральной нервной системы в процессе эволюции животных количество нервной ткани в периферических частях тела уменьшается. Так число нервов в конечностях высших позвоночных оказывается ниже порогового уровня, способного обеспечить регенерацию. Концепция порогового уровня иннервации отталкивалась, как вы помните, от опытов, показавших, что для обеспечения регенерации в конечности тритона должно сохраниться определенное число неповрежденных нервных волокон. В конечностях лягушек и более высокоорганизованных позвоночных число нервных волокон оказалось ниже постулированного теорией порогового уровня. Как же проверить истинность этой теории и по возможности — более прямым путем?
136
Рис. 45. Увеличив снабжение культи нервной тканью, можно вызвать регенерацию передней конечности лягушки. (В статье Singer М. «Induction of regeneration of forelimb of the frog by augmentation of the nerve supply», P.S.E.B.M., 1951, 76:415.)
Для осуществления этой задачи ученые поставили ряд экспериментов. Первый из них иллюстрируется схемой, представленной на рис. 45. Была сделана попытка увеличить нормальную иннервацию культи передней конечности взрослой лягушки путем вживления в нее седалищного нерва из задней конечности того же животного. Ученые надеялись таким способом дополнительно обеспечить конечность нервной тканью и, может быть, стимулировать регенерационную способность животного. В обычных условиях после ампутации конечности у взрослой лягушки поверх раневого края культи нарастают эпидермис и дерма. Между этой шапочкой эпителиальных клеток и тканями культи формируется слой фиброзной соединительной ткани, который препятствует дедифференцировке и последующей регенерации. Но если направление хода нерва изменить указанным выше образом, удается в значительной мере достигнуть цели, ради которой ставился опыт. Уже через две-три недели после произведенных операций видны явные признаки вторичного роста, указывающие на дедифференцировку и формирование бластемы в культе. Затем рост конечности проходил ряд стадий, обычно наблюдаемых в восстанавливающихся конечностях саламандр. Через восемь-десять недель после операции,
137
то есть в заключительных стадиях регенерации, наблюдалось образование самых разных форм конечностей. В одних случаях намечался изгиб конечности, как бы образование локтевого сустава; в других — конец конечности уплощался, напоминая формирование кисти в регенерате конечности аксолотля; в третьих — на растущем конце культи формировались неровности, как будто здесь закладывались пальцы. В целом ту или иную степень развития восстановительного процесса демонстрировали почти все 100% оперированных лягушек. Этот результат — серьезное доказательство справедливости исходной гипотезы Сингера 1.
Поскольку опыты с отклонением хода нерва на взрослых лягушках прошли удачно, ученые попытались повторить их с более высокоорганизованной группой позвоночных — пресмыкающимися. Хотя некоторые представители этого класса и восстанавливают хвост, регенерация конечностей у них при нормальных условиях никогда не происходит. В опыте с хамелеоном (представитель семейства хамелеоновых подотряда ящериц) сразу после ампутации в культю задней конечности вживляли седалищный нерв из другой задней конечности. В 50% случаев животные с конечностью, «обогащенной» нервной тканью, демонстрировали определенные признаки регенерации. Правда, у этих пресмыкающихся регенерационная способность восстанавливалась не так легко, как у лягушек. Тем не менее увеличение количества нервной ткани несомненно стимулировало в какой-то степени регенерацию конечности хамелеона. «Пороговая теория» получила, таким образом, дополнительное экспериментальное обоснование.
1 Это не первое описание стимуляции регенерационного процесса в конечностях взрослых лягушек. Несколькими годами раньше было показано, что дедифференцировку и определенную степень отрастания конечности можно вызвать, если подвергать культю ряду воздействий, например погружать ненадолго в концентрированный раствор различных солей или прижигать ее заживающий конец. Но все эти воздействия оставались без последствий, если конечность была денервирована. По-видимому, травмы снижают до какой-то степени требования к порогу нервного обеспечения конечности.
138
ИЗМЕНЕНИЯ В НАПРАВЛЕНИИ ХОДА НЕРВОВ И ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОНЕЧНОСТИ
Опыты с изменением направления хода нервов были поставлены и на тритонах. Это кажется странным, ведь конечности саламандр регенерируют и без дополнительной иннервации. Но подсадка нерва в этом случае создавала еще одну возможность изучения роли нервной ткани в процессе регенерации. Опыты показали, что вживление нерва в участок тела, не являющийся в норме местом формирования конечности, создало индуцирующий импульс для образования новой конечности.
Прежде всего на грудном участке тела тритона и граничащем с ним участке передней конечности выделяли прямоугольный лоскут кожи. Все манипуляции проводили с обезболиванием. Подлежащие мышцы груди слегка рассекались острыми ножницами. При подобной операции ткани груди подвергались примерно той же степени повреждения, что и ткани культи при отсечении конечности тритона. После этого выделяли плечевой нерв передней конечности, освобождая его от окружающих тканей. Нерв разрезали на уровне локтевого сгиба и вживляли
Рис. 46. Через 3 месяца после травмы плеча у тритона и вживления нерва в этот участок образовалась дополнительная конечность. (В статье Bodemer Ch. W. «The development of nerve-induced supernumerary limbs in the adult newt, Triturus viridescens», J. Morph., 1958, 102:575.)
139
в рассеченные мышцы там, где конечность отходит от туловища.
Последующие события точно напоминали ход регенерации конечности у тритона в обычных условиях. Примерно через 40 дней в месте вживления нерва образовывалась маленькая, но вполне сформированная дополнительная конечность с хорошо развитыми костями и мускулатурой (рис. 46). Этот опыт еще раз продемонстрировал роль нервной ткани в качестве активизирующего и регулирующего фактора в регенерационном процессе.
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Успех операций по отклонению хода нервов у земноводных и пресмыкающихся привел к попыткам активизировать подобным же образом регенерацию у млекопитающих. В качестве подопытных животных для проверки концепции порогового уровня нервной ткани выбрали опоссумов. Поскольку млекопитающие являются самой высокоорганизованной группой животных в эволюционном ряду, а человек принадлежит к этой группе, возможность получения положительного результата вызывала понятное нетерпение. Выбор подопытного животного был продиктован наблюдением, что «молодые» ткани обладают наибольшей регенерационной способностью. Вспомните два хорошо известных вам примера. Личиночные формы многих саламандр регенерируют значительно быстрее, чем взрослые саламандры, что же касается головастиков, то их регенерационная способность практически полностью исчезает при метаморфозе в лягушку. Детеныш опуссума рождается недоразвитым. Время развития зародыша в матке матери очень непродолжительно — не более 12—13 дней. Покинув родовые пути, маленькие опоссумы заканчивают ранний этап развития в особой сумке для вынашивания детенышей на животе матери. В этой сумке они легко доступны экспериментатору и в то же время оберегаются матерью и обеспечиваются ею пищей (рис. 47).
Опоссумов отлавливали и сажали в клетку, чтобы знать точный возраст потомства. Поскольку никто не
140
Рнс. 47. Выводок опоссума менее чем через 24 часа после родов в сумке матери (сантиметровая шкала). (В статье Mizell М., Isaacs J. J. «Induced regeneration of hindlimbs in the newborn opossum», Am. Zoologist, 1970, 10 : 143.)
изучал, регенерируют конечности у новорожденных опоссумов или нет, этот процесс был исследован в нормальных условиях, без каких-либо дополнительных вмешательств. Перед началом опыта анестезировали родившую самку и открывали ее сумку настолько, чтобы извлечь новорожденных опоссумов для операции на микроманипуляторе. Конечности крошечных зверьков отсекали на уровне лодыжки или запястья и затем через небольшие промежутки времени осматривали, чтобы узнать, появились признаки регенерации или нет. В большинстве случаев процесс ограничивался лишь заживлением раны, и только у одного опоссума сформировалась типичная бластема. Микроскопическое исследование показало, что практически у всех животных клетки культи проявляли тенденцию к дедифференцировке.
Эти результаты вдохновили исследователей на попытки получить более выраженную регенерационную реакцию путем повышения уровня снабжения конечности нервной тканью. Но вместо проведения
141
операции по изменению хода нервов ученые воспользовались другим способом снабжения дополнительной нервной тканью. У части новорожденных опоссумов после их умерщвления извлекали передний мозг. Его разрезали в охлажденном физиологическом растворе и каждый кусочек вживляли в канальцы, проделанные заостренной стеклянной трубочкой в подлежащей ампутации конечности одно-двухдневных опоссумов.
Опоссум представляет собой идеальную модель для такого эксперимента. Большинство млекопитающих за время эмбрионального развития приобретают способность к иммунной реакции. В результате в любое время после рождения организм отторгнет ткань, пересаженную от другого животного. Лимфоциты, вырабатываемые тимусом, направляются к чужеродной ткани и полностью разрушают ее структуру *. К счастью, степень развития новорожденных опоссумов столь невысока, что тимус к моменту появления животных на свет лишь начинает закладываться. Поэтому в первые недели жизни иммунный механизм еще не действует, а значит, и пересаженные чужеродные ткани не отторгаются.
Через 2—4 дня после операции конечности, в которые была вживлена нервная ткань, подвергались ампутации. Приблизительно четвертая часть оперированных опоссумов демонстрировала регенерацию конечностей. Через 18 дней после ампутации формировались вполне узнаваемые структуры ступни, а через 32 дня уже были видны три пальца (рис. 48). В нескольких опытах вместо кусочков мозга имплантировали ткани иного происхождения, но тогда ампутированная конечность не регенерировала. Это позволяет с уверенностью сказать, что именно введение «в систему» дополнительной нервной ткани было решающим в восстановлении конечности опоссума.
1 При пересадке органов у человека отторжение предотвращают с помощью специальных препаратов, подавляющих иммунную реакцию организма. Кроме того, в качестве доноров стараются выбрать близких родственников, поскольку вероятность отторжения «родственной» ткани существенно меньше.
142
Рис. 48. А — задняя конечность 24-дневного опоссуума. В эту конечность в двухдневном возрасте имплантировали кусочки мозговой ткани и через 4 дня ее ампутировали. Б — в та же конечность и вторая неампутированная задняя конечность. Животному 38 дней. В — обе задних конечности на 69-й день жизни оперированного опоссума (миллиметровая шкала). (В статье Mizell М., Isaacs J. J. «Induced regeneration of hindlimbs in the newborn opossum», Am. Zoologist, 1970, 10:147.)
БИОЭЛЕКТРИЧЕСТВО И РЕГЕНЕРАЦИЯ
Отсутствие у высших позвоночных способности к восстановлению утраченных конечностей исследовалось с использованием н другого подхода. Если поместить электроизмерительный прибор на растение или животное, нетрудно обнаружить на нем как положительно, так и отрицательно заряженные участки. Такие участки называют биоэлектрическими полями. По-видимому, между двумя точками тела с противоположными зарядами происходит передача биоэлектрического потенциала. Уже давно предполагают
Рис. 49. А — диаграмма распределения биоэлектрических полей у тритона. Б — положительно заряженные зоны совпадают с основными скоплениями нервной ткани. Отрицательный заряд распределяется вдоль нервных стволов, идущих в конечности и хвост, нарастая по напряженности от центральной части тела в сторону конечностей. (В статье Becker R. О. «The bioelectric factors in amphibian limb regeneration», Journal of Bone and Joint Surgery, 1961, 43A : 646.)
144
связь между биоэлектрическими потенциалами и различными ростовыми процессами, но лишь сравнительно недавно начаты исследования влияния биоэлектрических факторов на процесс регенерации конечностей.
Первым этапом этих исследований было определение заряженных полей на коже взрослых тритонов. Локализацию и напряжение биотоков (выраженное в милливольтах) переносили на контур тела животных (рис. 49). Полученная диаграмма составлена из пунктирных линий, соединяющих точки, несущие одинаковый заряд и одинаковую силу тока. Если подобное распределение биополей сравнить с диаграммой, на которой представлено общее строение нервной системы тритонов, то видно, что положительно заряженные зоны совпадают с тремя основными точками тела тритона, где сосредоточена нервная ткань, а отрицательно заряженные зоны соответствуют местам ответвления нервов от центральных масс нервных клеток. Измерения, проведенные в разных участках верхней конечности, показали, что величина отрицательного электрического заряда постепенно нарастала от плечевого отдела к кончикам пальцев.
Характер биотоков у амфибий с высокой и слабой регенерационной способностью
Изменяются ли биоэлектрические потенциалы при ампутации конечности у тритона? Чтобы ответить на этот вопрос, измерительный прибор помещали у самой линии отсечения конечности. Результаты измерения показали, что сразу же после ампутации электрический заряд конечности изменился на противоположный (стал положительным). По мере заживления раны и восстановления конечности проводились дальнейшие измерения. Положительный заряд поддерживался в зоне регенерата на протяжении шести дней, хотя напряженность его не была стабильной. Примерно на восьмой день после операции, когда активно формировалась бластема, напряжение биотоков резко падало, и в зоне появлялся отрицательный заряд с напряжением, значительно превосходившим исходное. Позднее, в период редифференцировки и восстановления
6 Зак. 52
145
Рис. 50. Изменения биоэлектрических потенциалов во время регенерации конечностей у саламандр. (В статье Becker R. О. «The bioelectric factors in amphibian limb regeneration», Journal of Bone and Joint Surgery, 1961, 43A : 649.)
формы конечности, напряжение биотоков постепенно возвращалось к исходному уровню (рис. 50).
У кооперированных лягушек распределение биоэлектрических полей совпадало с тем, которое наблюдается у тритонов. Каких же изменений биоэлектричества следует ожидать у них после ампутации конечности, учитывая, что во взрослом состоянии эти животные утрачивают способность к регенерации?
У лягушек после ампутации конечности также наблюдалась перемена заряда от отрицательного к положительному, однако положительный заряд поддерживался значительно дольше, а возвращение к исходному отрицательному происходило крайне медленно — без резкого скачка, как у тритонов (рис. 51). Поскольку хорошо известно, что у лягушек не происходит необходимой для образования бластемы дедифференцировки клеток культи, вполне логично связать феномен «переключения» заряда конечности с формированием у тритонов бластемы.
146
Время после ампутации, дни
Рис. 51. Изменения биоэлектрических Потенциалов во время регенерации конечностей у лягушек. (В статье Becker R. О. «The bioelectric factors in amphibian limb regeneration», Journal of bone and Joint Surgery, 1961, 43A : 650.)
И тут же перед исследователями встал вопрос: «Что нужно сделать для повышения отрицательного заряда в ампутированной конечности лягушки?» — поскольку подобное изменение может стимулировать угасшую регенерационную способность. В поисках ответа было предложено несколько интересных методов. В одном из них прикладывание к культям конечностей лягушек электродов очень скоро сопровождалось признаками дедифференцировки клеток, образования бластемы и частичной регенерации. Другой метод состоял в препарировании части основного нервного ствола передней конечности лягушки и соединении его с проводником электрического тока. После ампутации этой конечности к культе подавался электрический импульс, по заряду и напряжению имитировавший нормальный биоэлектрический потенциал конечности. В этом случае удалось получить желаемый результат: у большинства лягушек выявлялись четкие признаки восстановительного роста,
6*
147
хотя и в очень широком диапазоне — от типичной конической бластемы до асимметричных разрастаний ткани, имеющих отдаленное сходство с формирующимися пальцами.
Биотоки и переломы костей
В нашем рассказе о биоэлектричестве и регенерации есть еще один интересный аспект. Восстановление костей после переломов — общепризнанный пример регенерационного процесса. Совсем недавно исследователи заметили, что переломы костей у земноводных сопровождаются определенным изменением биоэлектрического потенциала. Это заставило их провести более углубленное изучение данного процесса.
После перелома ткани, окружающие поврежденную кость, как бы приподнимаются над местом повреждения за счет кровоизлияния и образования гематомы — скопления кровяных клеток и соединительнотканных волокон в результате повреждения кровеносных сосудов. Была сделана серия электронномикроскопических снимков, показывающих состояние красных кровяных клеток (эритроцитов) через разные промежутки времени после перелома. Фотографии показали, что клетки крови начинали дедифференци-роваться вскоре после образования гематомы. Изменения происходили в определенном порядке. Типичный эритроцит земноводных имеет овальную форму и четко очерченное плотное ядро. Поскольку основная функция эритроцита — снабжение различных клеток организма кислородом и выведение углекислоты, его цитоплазма заполнена гемоглобином, белком, способным соединяться с тем или другим газом. В цитоплазме эритроцитов, взятых из гематомы через два часа после перелома, практически уже не оставалось гемоглобина, кроме того, клетки были в значительной степени округлившимися. Естественно, проследить судьбу одной и той же клетки не удалось, но на микрофотографиях, полученных через большие промежутки времени, выявлялась дальнейшая дедифференцировка эритроцитов и их постепенное превращение в неспециализированные клетки эмбрионального типа. Общий вид этих
143
клеток крови мало чем отличался от клеток бластемы в регенерирующей культе конечности земноводных.
Дальнейшие наблюдения показали, что примерно через три недели после перелома начинается редифференцировка неспециализированных клеток гематомы и на месте дедифференцированных эритроцитов формируется «гребешок» хряща. Это образование постепенно замещается новообразованной костной тканью, и еще через 1—3 недели процесс заживления кости заканчивается.
Влияние электричества на культуру эритроцитов
Из изложенного можно заключить, что между всплеском биоэлектрического потенциала, сопровождающим перелом, и дедифференцировкой эритроцитов внутри гематомы существует некая причинная связь. Для проверки этого предположения был поставлен следующий эксперимент.
Брали пробу свежей крови земноводных и помещали ее в закрытую стеклянную или пластмассовую камеру. На клетки, находящиеся в камере, воздействовали токами различной силы, но малого напряжения. За состоянием эритроцитов вели непрерывное наблюдение в микроскоп. Вскоре было обнаружено, что при определенных силах тока красные кровяные клетки проходят начальные этапы дедифференцировки. Часть этих клеток перенесли в культуральную среду и сохраняли в ней до 10 дней. На электронных микрофотографиях изменения культивируемых эритроцитов были очень похожи на изменения дедиф-ференцирующихся клеток гематомы, наблюдаемые в естественных условиях. Таким образом, слабые электрические раздражения приводили к тому, что клетки утрачивали все признаки специализации.
Индукция регенерации у млекопитающих с помощью биоэлектричества
Могут ли исследования биотоков оказаться полезными для стимуляции восстановления конечностей млекопитающих? Многие исследователи отвечают на
149
этот вопрос однозначно. Они считают, что биоэлектрические явления сопровождают процесс ампутации конечностей у всех, позвоночных, однако у форм, не способных к регенерации, сила биотоков недостаточна для стимуляции дедифференцировки клеток. Соответственно у них не происходит и формирования бластемы. Если это так, то могут быть найдены пути активизации биоэлектрических потенциалов в культях конечностей млекопитающих (например, с помощью методов, использованных у лягушек), которые должны приводить к определенному уровню развития восстановительных процессов.
Убедительное подтверждение этой теории получил Роберт О. Беккер, ученый-ортопед, работающий в госпитале для ветеранов в городе Сиракузы, штат Нью-Йорк. Именно доктору Беккеру принадлежит большая часть той работы по биоэлектрическим потенциалам, с которой мы только что познакомились. Недавно он поставил эксперимент, в котором к раневому краю ампутированных конечностей молодых крыс приложил электрический потенциал, после чего у них появились признаки регенерации. Ампутацию конечностей проводили у двадцати однодневных крыс на уровне верхней части плечевой кости; под остающуюся часть мускулатуры Беккер вживлял электроды. Выбор силы тока основывался на результатах экспериментов с земноводными. Некоторые крысы получали воздействие током той же силы, которая вызывала дедифференцировку у культивируемых на искусственных средах эритроцитов. В контрольных опытах величина тока была выше или ниже этого уровня, либо электростимуляцию не проводили совсем.
Через определенные интервалы после ампутации конечности удаляли и подвергали гистологической обработке. Микроскопические препараты срезов оценивали по системе от «О до 4+» в зависимости от выявляемых в них признаков роста. Оценка 1+ означала, что некоторая степень роста ткани выражена, но бластема еще не начинала формироваться; 2+ соответствовала формированию бластемы; 3+ означала, что формирование бластемы сопровождается признаками редифференцировки мышц или хряща в
150
растущей конечности, и, наконец, оценка 4+ соответствовала полноценно организованной регенерации всех тканей. В исходных опытах значительная часть животных демонстрировала восстановительный процесс на 4-Ь, что выражалось в реконструкции целой плечевой кости, практически неотличимой от соответствующей нормальной кости. Поскольку формировались новые скелетные мышцы и были видны регенерирующие нервы и кровеносные сосуды, выраженность регенерационного процесса можно было считать эквивалентной стадии «позднего конуса» при регенерации конечности саламандр. Происхождение клеток бластемы, послуживших исходным материалом для новообразования ткани крысиной конечности, остается неясным. Единственно, что можно сказать по этому поводу, так это то, что какие-то ткани в зоне ампутации способны ответить на электростимуляцию и обеспечить клетками формирующуюся бластему.
Беккер считает, что результаты экспериментов с молодыми крысами дают основание надеяться на подбор оптимальных условий электростимуляции, способной обеспечить формирование бластемы и у других млекопитающих. По-видимому, возможна и последующая редифференцировка изменившихся клеток, тем не менее перед использованием подобного подхода в опытах на человеке необходимо проделать еще большую предварительную работу. Не исключено, что даже обеспечив все вышеперечисленные условия и факторы, необходимые для регенерации у других животных, мы все же не добьемся восстановления конечностей у высших млекопитающих просто потому, что в процессе эволюции они утратили способность отвечать на подобные стимулы. Если это так, то нужно будет искать какие-то другие «клетки-мишени», которые способны дедифференцироваться и формировать бластему у этих высших животных.
РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У ЧЕЛОВЕКА — ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ
Итак, удастся ли когда-нибудь получить регенерацию конечностей у человека? Постараемся ответить на этот вопрос, опираясь на уже представленные нами
151
данные и ряд фактов, полученных в самое последнее время.
Все исследователи согласны, по крайней мере, в одном пункте. Перед тем как перейти к непосредст-венным попыткам активизации восстановления конечностей у человека, необходимо лучше разобраться в подобных процессах, происходящих в природе, а также выяснить пути, с помощью которых можно вызвать регенерацию у тех животных, у которых она в обычных условиях, как и у человека, не происходит.
Некоторые земноводные способны к регенерации конечностей в естественных условиях. Для обеспечения нормального восстановительного процесса необходимы следующие условия:
1.	Клетки культи, расположенные непосредственно рядом с линией ампутации конечности, должны подвергнуться дедифференцировке и сформировать бластему — образование, из которого будут черпаться клетки, идущие на восстановление утраченных структур.
2.	В ранний период регенерации должен произойти контакт между эпидермальными клетками апикальной шапочки и внутренними компонентами культи. Кроме того, как на ранних, так и на поздних этапах регенерации, особенно у взрослых животных, необходимо действие ряда гормонов.
3.	В культе конечности должно присутствовать количество нервной ткани, превышающее некоторое пороговое значение (в пересчете на площадь поверхности ампутации); причем это условие должно сохраняться по крайней мере до полного формирования бластемы.
У ряда позвоночных, у которых в нормальных условиях регенерация конечностей не происходит, восстановительную способность можно активизировать несколькими путями. Один из таких путей, исходящий из потребности в обеспечении порогового уровня нервной ткани в конечности, состоит в создании дополнительных источников иннервации культи. У лягушек и некоторых ящериц можно достигнуть повышенного уровня иннервации без особых трудностей,
152
просто изменяя направление хода нервов. В результате операций такого рода, выполняемых по нескольким схемам, конечности восстанавливались, хотя и в разной степени завершенности. Значительно труднее выполнять подобные операции на млекопитающих. Новорожденные опоссумы оказались уникальной природной моделью для проведения экспериментов такого типа. Поскольку эти млекопитающие рождаются чрезвычайно недоразвитыми, кусочек мозговой ткани, имплантированный в культю конечности новорожденного, не отторгается иммунологическим механизмом. Имплантаты мозга выполняют столь нужные экспериментаторам функции: конечности с пересаженными имплантатами после ампутации в значительной степени восстанавливаются. Еще в первых опытах на молекулярном уровне было установлено, что регенерация конечности у земноводных сопровождается выделением нервной тканью особого химического фактора, влияющего на синтез белка в клетках ранней бластемы. Эти эксперименты были в дальнейшем продолжены. Исследователи, определявшие также синтез ДНК и РНК (рис. 52), установили, что выработка всех трех типов клеточных макромолекул резко изменялась после денервации. Природа нейротропного агента, участвующего в описанных явлениях, остается пока неясной. Необходимо получить более точные сведения о его действии на чувствительные точки клеток.
Второй подход возник благодаря обнаружению биоэлектрических полей у земноводных и последующим открытиям, связанным с этим феноменом. У земноводных, которые восстанавливают конечности в естественных условиях, биоэлектрические изменения коррелировали с удалением конечности и этапами ее восстановления. Сходные реакции наблюдались у земноводных и при заживлении переломов костей. Попытки воспроизвести этот биоэлектрический потенциал искусственным путем приводили к появлению признаков регенерационного процесса у лягушек и молодых крыс. Но каким путем воздействует электрический потенциал на клетки и их перемещения, необходимые для формирования бластемы, все еще не ясно. Остается также неизвестным,
153
Рис. 52. Синтез РНК, ДНК и белка в клетках бластемы регенерирующей конечности тритона через разные промежутки времени после ее денервации в сравнении с подобной же активностью клеток бластемы противоположной конечности, у которой сохранена иннервация. В ранние сроки после денервации в регенерате происходило резкое возрастание синтеза всех макромолекул. Вскоре этот подъем сменялся падением уровня биосинтеза до значений намного ниже контрольных, и такое состояние сохранялось несколько дней. (В статье Singer М., Caston J. D. «Neurotrophic dependence of macromolecular syntheses in the early limb regenerate of the newt, Triturus», J. Embryol.
Exp. Morph., 1972, 28 : 4.)
какие модификации необходимо внести в электрические воздействия, чтобы применять их на высших млекопитающих.
Ни один из упомянутых подходов не был связан с факторами, предположительно действующими на редифференцировочной стадии регенерации. Эти факторы, результатом действия которых является восстановление нормальной формы и взаимного расположения тканей конечностей, возможно сходны с теми формообразовательными стимулами, которые
154
контролируют развитие конечности у эмбриона. Но прежде чем заниматься подробным анализом редиф-ференцировочных факторов, необходимо в первую очередь научиться получать бластемы конечностей у животных, которые в обычных условиях их не формируют, и обеспечивать их сохранение.
Круг исследований процесса регенерации конечностей на молекулярном уровне непрерывно расширяется; по-видимому, это направление в будущем привлечет к себе особое внимание и окажется наиболее плодотворным. Достаточно вспомнить, что развитие именно этого направления позволило в недавнем прошлом решить многие проблемы биологических и медицинских наук. Поэтому ответ на вопрос, возможна или нет регенерация конечностей у человека, зависит от того, как относиться к следующим двум постулатам. Первый из них состоит в том, что понимание механизма естественных регенерационных процессов в молекулярном аспекте достижимо, несмотря на трудности, лежащие на этом пути. Второй постулат исходит из преемственности исследований по регенерации: то есть, опираясь на усовершенствование экспериментально-технической базы, можно добиться переноса достижений, полученных в опытах со способными к регенерации животными, на виды, у которых в естественных условиях регенерация отсутствует. Если вы примете справедливость высказанных постулатов, то поймете, что вопрос о возможности регенерации конечностей у человека требует комплексного ответа, базирующегося прежде всего на расширении исследований восстановительных процессов у низших форм животных. Это помимо всего прочего может служить и ряду других важных целей.
НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОНЕЧНОСТЕЙ
Существует несколько аспектов исследований по регенерации у низших позвоночных, которые уже сейчас могут принести пользу в лечении болезней! и травм у человека. Это относится в основном к выбросу
155
нервной тканью фактора, влияющего на обмен веществ и питание клетки.
Повреждение периферического нерва млекопитающих нередко приводит к процессу, собирательно называемому валлеровской дегенерацией. В этих случаях шванновские клетки разрушают часть аксонов и миелиновых оболочек, оказавшихся изолированными в результате травмы. Как происходит активизация этого процесса? Общепринято следующее объяснение. В обычных условиях вещества, вырабатываемые в теле нейрона, распространяются по всей длине аксона, поддерживая общую интеграцию нервной ткани и миелиновой оболочки. (Весьма вероятно, что нейроном вырабатывается тот самый «нейротропный агент», без которого не может осуществляться ранний этап регенерации у земноводных.) Логично предположить, что если нерв перерезан на каком-то уровне, целостность его функции не может быть сохранена, так как распространение активного вещества по аксону не происходит; по-видимому, это и является «сигналом», включающим процесс дегенерации.
Каков практический вывод из такой концепции? По этому поводу существует несколько интересных, хотя и чисто умозрительных заключений. Первое из них касается заболевания, называемого рассеянным склерозом. Это хроническое прогрессирующее заболевание нервной системы характеризуется демиелинизацией, то есть распространенным процессом разрушения миелиновой оболочки (защитного слоя) периферических нервов. Как следствие этого—утрата способности аксонов к проведению нервных импульсов. Ухудшается зрение больного, нарушается координация движений. Причина заболевания пока неизвестна, и нет каких-либо средств ее лечения '.
Правда, в научной литературе высказывается мнение, что при этом тяжелом заболевании можно было бы использовать известный нам нейротропный агент, если бы удалось его выделить в больших количествах из нормально функционирующих нервов,
1 Совсем недавно получен ряд данных о вирусной природе этого заболевания.
156
сконцентрировать и ввести в те части тела больного, которые поражены распадом миелина. Вполне возможно, что в результате такого воздействия деструкция нервов приостановилась бы и в развитии заболевания наступил перелом.
Подобный метод лечения в принципе можно использовать и в случаях травматических поражений центральной нервной системы человека, особенно спинного мозга. При травме (разрезе) проводящих путей спинного мозга регенерация участков нервных волокон, соединенных с телом нейрона, как это имеет место в периферических нервах, не происходит. Наблюдается лишь ограниченный восстановительный рост, но отрастающие на небольшие расстояния искривленные волокна не способны проникнуть в рубцовую ткань, образующуюся на месте травмы. Как и при повреждении периферических нервов, происходит дегенерация отделившихся от нервных клеток частей аксонов, и, поскольку «культя» аксона не способна регенерировать, участки тела, находящиеся ниже уровня повреждения спинного мозга, обречены на паралич.
Многие годы регенерацию спинного мозга у человека считали совершенно невозможной, но в последнее время эта точка зрения частично пересматривается. Если со временем удастся получить концентраты нейротропного агента, его можно будет наносить непосредственно на поврежденные нервные стволы сразу же после травмы. Поскольку распад отделенных частей волокон таким путем будет замедляться, а ограниченная способность к регенерации оставшихся частей аксонов может быть стимулирована, допускается возможность воссоединения рассеченных концов нервов, в результате чего пострадавший сможет полностью восстановить контроль ЦНС над участком тела, который должен был бы быть парализован.
Другой важной точкой приложения теории о нейротропном агенте может быть лечение детей, рождающихся с дефектами конечностей. В некоторых случаях здесь возможно удалось бы использовать операцию по изменению направления хода нервов, с помощью которой, как вы помните, удавалось
157
добиваться возникновения дополнительных конечностей у саламандр. В процессе таких исследований удастся, видимо, узнать и о причинах тех врожденных нарушений, из-за которых дети рождаются с дополнительными конечностями или пальцами. Аномалии развития конечностей, связанных с различными вредными факторами среды, представляют другой тип врожденных дефектов; некоторые из них также могут иметь отношение к нашей теме. Так, например, препарат талидомид, транквилизатор, широко применявшийся беременными женщинами до того, как стали известны его вредные свойства, вызывал укорочение и деформацию конечностей у зародышей. Получены данные, что талидомид влияет на клетки формирующихся конечностей опосредованно. По-видимому, это вещество действует на некоторые компоненты нервной системы зародыша. Последовательность событий, приводящая к формированию дефектной конечности типа «ласт тюленя», в настоящее время достаточно точно определена. Этому в известной мере способствовали наши знания о том, каким образом нервная ткань влияет на недифференцированные клетки конечностей саламандр, обеспечивая их участие в процессе нормального морфогенеза.
В дополнение можно упомянуть еще о ряде возможностей практического применения данных, полученных при изучении регенерации конечностей у позвоночных. В частности, имеется много параллельных свойств у клеток, дающих рост опухолей, и клеток, образующих ранние бластемы конечностей. В обоих случаях первоначально специализированные зрелые клетки возвращаются к «эмбриональному» состоянию и бурно размножаются. В дальнейшем, однако, клетки бластемы подвергаются редифференцировке и связываются друг с другом таким образом, что вызывают реконструкцию ранее существовавших органов и тканей, а клетки опухолей растут совершенно бесконтрольно и практически не подвергаются какой-либо тканевой организации. Видимо, это свойство дало основание Мернлу Роузу, автору недавно вышедшей книги о регенерации, назвать опухолевый рост «никогда не кончающейся регенерацией». Он считает, что опухолевые клетки, утра
158
Чивающие, как известно, способность к взаимному сцеплению друг с другом, утрачивают соответственно и способность к взаимному контролю. Согласно этой теории, клетки бластемы сохраняют способность к реакции на регуляторные импульсы, исходящие из размножающейся клеточной массы, когда она достигает определенного объема. Под воздействием таких импульсов происходит редифференцировка и поляризация ростовых процессов, что и ведет в конце концов к упорядоченному замещению утраченной части конечности. Высказанная теория приводит автора к неожиданному предположению. Если в течение определенного времени собирать метаболические продукты из большой массы культивируемых опухолевых клеток и обеспечить их биологическую стабильность, то введение этих агентов животным, у которых растут опухоли того же вида, может сопровождаться подавлением неорганизованного размножения опухо-вых клеток in vivo. Предварительные опыты показали, что предположение Роуза не лишено практических оснований. Возможно, в будущем удастся провести более углубленные сравнения свойств клеток опухоли и бластемы. Помимо чисто теоретической важности такого сопоставления оно может принести новые плодотворные идеи для практической медицины.
Продолжая наш перечень, который должен подтвердить, что время, потраченное на изучение регенерации конечностей у тритонов, потрачено не зря, вновь вернемся к данным о формировании бластемы и ограниченной регенерации после воздействия на культю слабыми электрическими токами. Они позволяют сделать один важный вывод: при любом переломе кости появляются слабые электрические импульсы, являющиеся стимуляторами дедифференцировки клеток, необходимой для восстановления кости. Отсюда вытекает, что если искусственным путем обеспечить возникновение токов, по характеристикам сходных с возникающими в естественных условиях, то они должны существенно способствовать регенерации кости. Эту идею уже удалось проверить в достаточно большом числе экспериментов. Электропитание от специальных батареек подавалось на электроды, размещаемые близ точек
159
переломов у больных, у которых процесс восстановления костей был чем-либо осложнен. В ряде случаев при подаче слабых токов к местам переломов на протяжении нескольких недель у больных наблюдали выраженную стимуляцию восстановления костей. При использовании подобной методики не представляется уже фантастичным восстановление в будущем целых участков утраченных костей за счет собственных регенерационных «ресурсов» организма — перспектива более предпочтительная, чем использование распространенных в настоящее время металлических или пластиковых «протезов».
Не хотелось бы оставлять без внимания еще два практических применения регенерационных исследований. Во-первых, изучение возможностей восстановления тканей и органов человека после повреждающего действия ионизирующих излучений. Во-вторых, исследования по регенерации конечностей у позвоночных, в основном у амфибий, тесно соприкасаются с изучением ревматизма и ревматоидного артрита. При этих заболеваниях, называемых коллагенозами, происходит избыточная выработка экстрацеллюлярных веществ в костной и соединительной ткани. С изучением регенерации тесно смыкаются также исследования мышечных дистрофий, при которых нарушаются взаимоотношения нервной и мышечной тканей конечностей.
Столь большие возможности практического применения обосновывают необходимость продолжать углубленное изучение регенерации конечностей позвоночных. Нетрудно заметить, что многие из направлений изучения регенерации по своим последствиям выходят далеко за рамки только данной проблемы. Так, например, молекулярно-биологическое направление по существу имеет дело с общими вопросами регуляции функций животной клетки. Надо полагать, что все перечисленные нами аспекты работы имеют вполне самостоятельное значение, ибо сегодня никто не решился бы предсказать, какой из них кратчайшим путем ведет к логической цели всех описанных нами поисков — к наиболее полной реализации регенерационных способностей тканей и органов человека.
ЛИТЕРАТУРА
СТАТЬИ
Berrill N. J. «The Indestructible Hydra». Scientific American, December 1957, 118.
Gibor A. «Acetabularia: A Useful Giant Cell». Scientific American, November 1966, 118.
Modell W. «Horns and Antlers». Scientific American, April 1969, 114.
Ross R. «Wound Healing». Scientific American, June 1969, 40.
Singer M. «The Regeneration of Body Parts». Scientific American, October 1958, 79.
Steward F. C. «The Control of Growth in Plant Cells». Scientific American, October 1963, 104.
КНИГИ
Brondsted H. V. Planarian Regeneration. Pergamon Press, New York, 1969, 276 p.
Всесторонний обзор охватывает почти двухсотлетнюю историю изучения проблемы. Голладский ученый, посвятивший многие годы исследованию регенерации у планарий, затрагивает самые разные аспекты этой темы, включая детальное описание строения и физиологии плоских червей. Кроме того, он излагает теории, с помощью которых в разные исторические периоды пытались объяснить закономерности регенерационных процессов, и рассказывает о современных молекулярно-биологических исследованиях. Книга включает обширную библиографию по данному вопросу.
Goss R. J. Principles of Regeneration. Academic Press, Inc., New York, 1969, 287 p.
Прекрасно иллюстрированная книга рассказывает о регенерации у беспозвоночных и позвоночных животных и у растений. Автор подробно описывает вклад, внесенный в изучение регенерации теми или иными исследователями или группами ученых, каждая глава снабжена отдельным библиографическим указателем. Важным дополнением книги Госса является изложение основных сведений йо морфологии, эволюции и физиологии описываемых групп животных, что облегчает понимание механизма происходящих у них
161
регенерацонных процессов. Заключительная глава называется «Нерешенные проблемы регенерации», в которой автор, признанный пионер изучения регенерации у многих типов животных, намечает ряд аспектов проблемы, где современные знания являются недостаточными.
Нау Е. D. Regeneration. Holt, Rinehart and Winston, New York, 1966, 148 p.
Книга посвящена обзору регенерационной способности в различных группах животного царства, но основное внимание уделено регенерации конечностей у амфибий, в особенности процессу дедифференцировки клеток регенерирующей конечности амбистомы, что составляет предмет непосредственного интереса автора. Текст хорошо дополнен графиками и иллюстрациями, много электронных микрофотографий. Каждая глава снабжена указателем литературы.
Kiortsis V., Trampusch Н. A. L., eds. Regeneration in Animals and Related Problems. North-Holland Publishing Co., Amsterdam, 1965, 568 p.
Сборник статей основан на материалах симпозиума, .проходившего в 1964 году в Афинах (Греция), в котором участвовало около 50 ученых из 11 стран. Содержит три раздела: 1) общий обзор основных проблем изучения регенерации, 2) исследования на беспозвоночных, 3) исследования на позвоночных. Каждая из вошедших в сборник статей, отражающих содержание докладов симпозиума, дополнена материалами дискуссий, которые там происходили.
Morgan Th. Н. Regeneration. The Macmillan Co., New York, 1901, 314 p.
Этот классический труд в области регенерации стал библиографической редкостью, его можно найти лишь в коллекциях некоторых университетов или в больших публичных библиотеках. Автор, лауреат Нобелевской премии за работы по генетике, проводил исследования и по регенерации. Стало широко известно его утверждение, что исследования по регенерации рано нли поздно приведут к возможности восстанавливать утраченные конечности у человека. Книга включает материал пяти лекций курса «Регенерация н экспериментальная эмбриология», прочитанного в Колумбийском университете в январе 1900 года. В ней Моргай систематизирует все, что было известно о регенерации у различных животных и растений, включая его собственные наблюдения над планариями и дождевыми червями. Огромный библиографический указатель содержит практически все работы по регенерации, написанные с начала XVII по конец XIX века.
Полежаев Л. В. Утрата и восстановление регенерационной способности органов и тканей у животных,— М.: Наука, 1968, 322 стр.
Автор развивает тезис о том, что утрата регенерационной способности, произошедшая в процессе эволюции, обратима. Путем к ее восстановлению может быть стимуляция разрушением тканей и клеточной дедифференцировки после 162
утраты органов. Затем следует изложение методов, использованных им для достижения поставленной цели, а также результатов, полученных в его лаборатории за тридцатипятилетний период (когда в советских исследованиях по регенерации четко наметился переход от моделей на амфибиях к моделям на млекопитающих). И наконец, автор намечает возможные перспективы исследований по регенерации. Очень полный указатель цитированных работ, включая материалы исследований, выполненных в СССР.
Rose S. М. Regeneration: Key to Understanding Normal and Abnormal Growth and Development. Appleton-Century-Crofts, New York, 1970, 264 p.
Чем выше развитие организма, тем более специализированными становятся функции его клеток. Современные представления о механизме данного явления сводятся к тому, что повышение степени дифференцировки клеток зависит от подавления (репрессии) функций некоторых участков клеточной ДНК, или генов. Автор, имеющий большой личный опыт изучения ряда регенерационных систем, считает, что наблюдаемая у многих животных полярность регенерационных процессов может помочь нам понять тот «язык», на котором клетки «обшаются» друг с другом, передавая информацию, необходимую для осуществления репрессии генов. В свете этой идеи он описывает развитие генетической теории клеточной дифференцировки от Менделя до современных достижений молекулярной биологии. Далее обсуждаются материалы о регулирующих рост молекулах, полученные в опытах по регенерации хрусталика и конечностей у амфибий, по регенерации растений, простейших, червей и кишечнополостных. Роуз приходит к заключению, что подобные регулирующие механизмы могут действовать в период эмбриогенеза и утрачиваться при опухолевом росте. Каждая глава снабжена списком литературы,
Schmidt A. J. Cellular Biology of Vertebrate Regeneration and Repair. L’niveisity of Chicago Press, Chicago, 1968, 420 p. Автор сосредоточил свое внимание на биохимических аспектах заживления ран и регенерации конечностей у амфибий. Основываясь на материалах операций по реплантации (возвращению на место) поврежденных или полностью отделенных от тела конечностей или их частей, он допускает возможность того, что трансплантирование конечностей человека станет когда-нибудь обычной хирургической процедурой. Книга содержит перечень самых последних научных статей по указанной тематике.
Singer М. Limb Regeneration in the Vertebrates. An Addison-Wesley Module in Biology. No. 6. Addison-Wesley Publishing Co., Inc., Boston, 1973, 27 p.
По мнению автора, процессы регенерации и эмбрионального развития имеют ряд общих черт. Многое из того, что сегодня не ясно в отношении поведения эмбриональных клеток, в равной мере относится и к регенерирующим системам,
163
лишь с той разницей, что в последнем случае речь идет о клетках взрослого организма. Эти вопросы подробно анализируются на модели регенерации конечностей у амфибий и излагаются возможные, зачастую альтернативные ответы на них. Основной акцент сделан на роли нервной системы в регенерации конечностей. Дискуссия, описанная в главах II, IV и VII, имеет особый интерес, поскольку она основана на сведениях «из первых рук» и насыщена экспериментальными данными самого Сингера.
ПОСЛЕСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА
Проблема регенерации относится к числу наиболее захватывающих проблем биологии. Неослабевающий интерес к этой области знания определяется многими обстоятельствами и прежде всего ее исключительной важностью в решении целого ряда основополагающих вопросов как биологии, так и медицины. Навряд ли в настоящее время требует специальной аргументации положение о том, что восстановительная способность в той или иной форме проявляется у всех организмов, что это универсальное свойство всего живого. Без этой способности сохранение жизни на Земле было бы невозможно, так как любое незначительное повреждение или заболевание привело бы к гибели животного.
Русскими и особенно советскими исследователями внесен огромный вклад как в создание теоретических основ учения о регенерации, так и в экспериментальную разработку различных аспектов ее изучения.
Сегодня можно с гордостью утверждать, что именно благодаря работам советских ученых пересмотрена регенерационная способность целого класса. Накоплен огромный фактический материал, который свидетельствует о том, что у млекопитающих, в том числе у человека, степень проявления регенерации ряда органов, особенно внутренних, не только не ниже, но иногда даже выше, чем у низших позвоночных (рыб, земноводных, пресмыкающихся). Несомненно, в недалеком будущем эти наблюдения станут достоянием широкого круга врачей и откроют новые перспективы в изучении некоторых болезней.
155
Напряженная творческая работа советских биологов отражена в десятках монографий, посвященных самым различным аспектам изучения регенерационного процесса. Среди научно-популярных книг наибольшую известность получили книги Студитско-го А. Н. «Восстановление органов и тканей животного организма» (М.: Знание, 1952), Воронцовой М. А. «Восстановление утраченных органов у животных и человека» (М.: Советская наука, 1953) и Лиозне-ра Л. Д. «Восстановление утраченных органов» (М.: Изд-во АН СССР, 1962).
После выхода в свет последней на русском языке научно-популярной книги по этой проблеме прошло двадцать лет. За столь большой промежуток времени накопилось много новых фактов, одни вопросы получили окончательное решение, в ^другие внесены некоторые коррективы. Технический прогресс (электронная микроскопия, авторадиография, цитофотометрия) повысил возможности ученых, дав им в руки более совершенный инструмент для точных исследований.
В книге Присциллы Мэттсон представлено современное состояние проблемы регенерации, хотя автор использует и ставшие классическими, давно утанов-ленные факты, и те кардинальные вопросы, решение которых до сих пор не утратило своей актуальности. История развития учения о регенерации, острая полемика 40—50-х годов, упорная борьба против постулата «чем выше организовано животное, тем ниже его регенерационная способность», возглавленная советскими исследователями,— все это осталось в прошлом. В книге отражен лишь результат этой борьбы — признание наличия регенерации у млекопитающих и высокая оценка работ советских ученых, их вклада в разработку столь сложной, важной и интересной проблемы.
Четкая систематизация фактического материала проводится под флагом пропаганды исторического метода в биологии, то есть изучения процессов регенерации в эволюционном аспекте. Автор нисколько не сомневается, что изучение регенерации даже у беспозвоночных животных служит лучшему пониманию закономерностей восстановительного роста у млекопитающих, в том числе у человека. Например,
166
хорошо известно, что истоками многих разделов современной физиологии и иммунологии у млекопитающих были скромные работы на низших позвоночных (лягушках) и беспозвоночных (одноклеточных) организмах. К сожалению, в настоящее время эволюционный подход в изучении регенерации используется не так широко, как в недалеком прошлом.
Между тем сравнительный аспект изучения регенерации, равно как изучение нервной системы и системы желез внутренней секреции, по мнению Мэттсон, необходимы, чтобы научиться управлять восстановительными процессами. Наглядным примером такой возможности служат опыты с отведением нерва, что приводит к развитию конечностей (у амфибий) не в обычном месте, и подсадкой ткани мозга в ампутационную культю конечности, что индуцирует ее регенерацию (у млекопитающих) пусть и очень несовершенную, но отчетливо выраженную.
В связи с индукцией регенерации хочется еще раз напомнить о работах М. А. Воронцовой, считавшей, что если подобрать соответствущие условия, то и у млекопитающих можно получить регенерацию органов, относящихся к категории нерегенерирующих. В частности, регенерацию конечности, которая в определенных условиях проявляет свою потенциальную регенерационную способность.
Пусть еще недостаточно ясна степень участия той или иной системы регуляции в управлении восстановительными процессами, но общее направление исследований, неуклонно растущую тенденцию изучения этих процессов Мэттсон уловила правильно и на ярких примерах показала участие в них нервной системы и желез внутренней секреции.
К сожалению, роль третьей системы регуляции— системы иммуногенеза, столь необходимой для многих процессов нормального и патологического роста тканей,— осталась вне поля зрения автора. Между тем значение ее в обеспечении развития регенерации несомненно, о чем свидетельствуют результаты многочисленных экспериментов последнего времени.
Большой заслугой автора является горячее желание привить читателям уважительное отношение к
167
труду научных работников, вызвать чувство гордости, восхищения красотой исследовательской мысли, экспериментальных моделей. Отходя от традиционной схемы построения научно-популярных книг, Мэттсон в специальной главе представляет четырех американских ученых — Госса, Бернетта, Хей и Сингера — с ее точки зрения, наиболее известных в области изучения регенерации и обсуждает самые важные работы каждого из них. Конечно, названы имена далеко не всех современных ученых, заслуживающих такой чести, но те, чьи имена названы, безусловно это заслужили.
Несмотря на то что глава, в которой рассказано о регенерационной способности растений, не дает полного представления о многообразии проявления у них восстановительной реакции, привлечение этого материала вполне оправданно. Оно позволяет прочувствовать универсальность феномена регенерации для всей живой природы и демонстрирует, как можно решить сложные теоретические вопросы, в частности о роли ядра и цитоплазмы в регенерационных процессах, экспериментируя с чрезвычайно простыми объектами — одноклеточными растениями.
Особого упоминания заслуживает глава, посвященная исследованиям в Советском Союзе. П. Мэттсон очень верно оценила медицинскую направленность исследований в СССР, исключительный интерес советских ученых к анализу регуляторных механизмов восстановления, изучению регенерации после радиоактивного облучения, их колоссальный вклад в учение о регенерации в целом. Тем не менее некоторые суждения автора, сложившиеся на основе беглого знакомства с организацией научных исследований в нашей стране и общения с отдельными исследователями, требуют определенных дополнений.
В книге Мэттсон относительно подробно рассказано лишь о работах проф. Л. В. Полежаева, широко известного своими опытами по восстановлению регенерационной способности нерегенерирующих органов и тканей (конечностей бесхвостых амфибий и костей черепа млекопитающих) и внесшего большой вклад в разработку проблемы регенерации. Однако не меньшего внимания заслуживают работы и тех
168
ученых, благодаря которым регенерация у млекопитающих стала объектом систематического изучения.
М. А. Воронцова и А. Н. Студитский одновремен* но и независимо друг от друга пришли к выводу, что мнение о постепенном снижении регенерационной способности в процессе эволюции и полной ее утрате у таких высокоорганизованных животных, как млекопитающие, ошибочно. М. А. Воронцова со своими учениками провела многочисленные эксперименты по изучению регенерации большинства внутренних органов млекопитающих (печени, почек, селезенки, слюнных желез, яичников, семенников), в результате чего было показано, что способность к восстановлению у этого класса животных не утрачивается, а приобретает иную форму — форму своеобразной компенсаторной гипертрофии. Этот способ регенерации, характеризующийся тем, что восстанавливается масса органа без восстановления его первоначальной формы, получил название «регенерационной гипертрофии». Такое восстановление обеспечивает нормализацию нарушенной функции, что является самым главным для внутреннего органа, форма которого в отличие от наружного не столь существенна для обеспечения функциональной деятельности.
А. Н. Студитский создал новые тонкие модели, с помощью которых можно в определенных условиях эксперимента продемонстрировать высокую степень регенерационной способности у млекопитающих. Конечность у млекопитающих регенерировать не будет, а вот полностью восстановить даже самую крупную кость в организме можно, если произвести поднадкостничное вылущивание этой кости с оставлением эпифизарного хряща. Мышцы, обычно отличающиеся слабой восстановительной способностью, проявляют ее, если их предварительно измельчить. Эти эксперименты решили проблему свободной пластики мышц, которая считалась неразрешимой в клинической хирургии. Под влиянием этих работ регенерацией измельченных мышц стали усиленно заниматься за рубежом.
Один из виднейших исследователей регенерации внутренних органов Л. Д. Лиознер внес большой вклад в изучение особенностей такого типа восста
169
новления, который осуществляется путем регенерационной гипертрофии, в выявление черт, отличающих его от других типов роста (компенсаторной гипертрофии, физиологической регенерации, эмбрионального развития). Особый интерес представляет цикл работ Л. Д. Лиознера и его сотрудников по выявлению механизмов регуляции регенерационной гипертрофии и факторов, влияющих на нее, в частности гуморальных, возрастных и иммунологических, а также роли функциональной нагрузки.
Исследователь регенерации желез внутренней секреции А. А. Войткевич создал теорию о роли гормонов в обеспечении регенерации. Большое значение для практической медицины имеют работы по изучению регенерации патологически измененных органов. Это направление успешно разрабатывается двумя коллективами, возглавляемыми проф. Д. С. Саркисовым и проф. Б. П. Солопаевым. Не менее важным направлением в исследованиях советских ученых является выяснение действия ионизирующего излучения на регенерационную способность тканей, а также поиски возможности восстанавливать утраченную в результате этого регенерационную способность (Э. Е. Уманский, Л. Д. Лиознер, Г. С. Стрелин, Л. В. Полежаев, А. Н. Студитский, В. П. Михайлов) и повышать устойчивость к облучению (А. Н. Студитский, Г. С. Стрелин). Самый крупный центр в СССР, а может быть и в мире, по исследованию регенерации у беспозвоночных создан проф. Б. П. Токи-ным и проф. Г. П. Коротковой (кафедра эмбриологии биологического факультета ЛГУ).
В столь коротком очерке трудно осветить все многообразие работ по регенерации, которые ведутся у нас в стране. Но даже приведенный перечень пополнит те сведения, которые дает автор.
Книга Присциллы Мэттсон — это своеобразный путеводитель в современное состояние важной для биологии и медицины проблемы регенерации. Как справедливо указывает автор, будущее этой проблемы — в координации усилий ученых всех стран мира.
А. Г. Бабаева
ПРЕДМЕТНО-ИМЕННОЙ УКАЗАТЕЛЬ
Авторадиография исследования по регенерации 68—76 конечностей амбистомы 70, 73—74 регенерация у губок 75—76
Аксон регенерация 62—64, 133, 158—159 структура и функция 63 шванновские клетки и миелиновая оболочка, взаимоотношения 62—63, 158—159
Аксолотль происхождение названия 37 регенерация конечностей 55 рентгеновское облучение 126—127
Актиномицин D 132
Амбистома (Ambystoma) географическое распространение 37 личинки 37 образ жизни 37 происхождение названия 35 регенерация 35—37, 54—56 рост 37 содержание 37—38
Аминокислоты 77, 100—103
Амфибии 51
генерация 54—56, 60
Анестезия 44, 101, 141, 143
Антибиотики 77, 132
Апикальная шапочка нервных волокон врастание 43 формирование 40, 79 функция 40, 42, 154
Аристотель, исследование по регенерации 68
Ацитилхолин, функция, уровень, микроинфузия 100—103 нуклеиновые кислоты и регенерация 131—132 регенерация 129—133 структура 129—131
Беккер Р. О., исследования по ре* генерации 152—153
Белки, синтез Acetabularia 131 клетки бластемы конечности 103— 105, 120, 155 фибробласты 83—85 хрящ 107
Бернетт Эллисон, исследования по регенерации 89—95, 120
Беспозвоночные основные группы животных 21— 22 регенерация 21
Биология развития 121, 129, 136 «Биологические часы» 120 Биотоков влияние на культю конечности крысы 152— 153, 155, 161
нервы конечности лягушки 148, 155
переломы костей 150—151, 155, 161
эритроциты 151
Биологическое поле регенерирую* щей конечности
лягушки 147—148
тритона 146
Биоэлектричество
при регенерации 146—153, 161
экспериментальные подходы 155— 156
Бластема
вкусового усика 112
внутриклеточные регуляторные сигналы 160
кольчатых червей 30—31
конечностей млекопитающих 143, 152—153, 155
«конус» 42, 43, 79, 150
кровоснабжение 42, 154
необходимость формирования
152—155
плавника рыб 52
планарий 15—17, 20-21, 38, 105, 110—111
происхождение и судьба клеток 15—17, 38—40. 50, 57, 73— 74, 105—110, 111, 152—153, 156—157
распределение биоэлектрического поля 147—149
регенерация конечностей у амфибий 45. 48—49. 64. 70—73, 79— 80. 105-110, 139, 147, 148— 150, 153—155, 157
хвоста ящерицы 57, 78
'«холмик» 43, 49
'«Бокал русалки» {см. Acetabularia)
Вакуоль 22
Баллер (Уоллер) 63
Валлеровская дегенерация, происхождение термина 63
«Вельвет» 113
Вкусовой усик у сома 112
Волосы, регенерация 67
Воспалительная реакция 65
Выстилка матки, регенерация 67
Гематома 150—151
Гемоглобин 151
Гигантские клетки 41, 79
Гидра
градиентная теория регенерации 93—95
интерстициальные клетки 91—92
как представитель гидрообразных 89—95
полярность при регенерации 91—95 почкование 90, 94—95
ранние опыты 89
171
регуляция нормального и реге» нерациоииого роста 93—95
Гидрообразные градиентная теория 27 регенерация 26—27, 133
Гипофиз 48—50
Глетка, у планарий 12—15 регенерация 20—21
Гольджи комплекс 107, 108, ПО Гормоны влияние на регенерацию рогов 113, 116, 118
регенерация конечностей у амфибий 48—50
функция 48
Госс Ричард, исследования по регенерации 111—121
Градиентная теория регенерации гидрообразиые 27 гндра 91—93 планарии 18—19, 27, 93—95
Данио розовый 52 «Двуликий Янус» 18—19 Дедифференцнровка клеток вкусового усика регенерация 112 мышц 41, 105—ПО отсутствие 152, 154 после денервации 45—46 регенерация конечностей
амфибий 43, 71—74,	106-110,
138—140, 147—150, 154 млекопитающих 143
регенерация у планарий 17, 110—111 регенерация хвоста ящерицы 57 хряща 43, 71—74, 107—110, 112 электронная микроскопия 105—110 эритроцитов 151—152
«Демонтирования» стадия 40, 60, 106 Денервация
влияние иа синтез белка ЮЗ-104, 155
качественный н количественный эффекты 95—99
регенерирующей конечности у амфибий 43—48, 95—99
Дерма 65—66, 88
Джонсон Дж. Р. 13
ДНК 103 при регенерации 130—132 регенерирующей конечности три-» тона 155
Дождевой червь, регенерация 30
Жабы отсутствие регенерации 55, 59, 68 классификация 54
Железистые клетки гидры 90—93 планарий 16, 111
Заживление ран конечностей у амфибий 44, 79, 125, 148 оленей 113 планарий 15 скорость 66 человека 64—66
Зубы, регенерация у пресмыкающихся 57
Иглокожие 22 регенерация 27—29
Иммунный ответ 144, 155
Имплантаты нервной ткани 143—
145, 154 Индукция 20 In vitro и in vivo, определение 77
Катодная трубка 87
Кишечнополостные 21
регенерация 26—27, 59
Клетки крови, регенерация 67
Клеточного антагонизма теория
52—54
Когти, регенерация 67
Кокосовое молоко 134—135
Коллаген, образование
в клетках хряща ПО фибробластами 65, 83—85
'«Комета» 27
Компенсаторная гипертрофия 67 Кости регенерация
биотоки 150—151
гематома 150
естественная 59, 124, 133
после перелома 64
при регенерации конечности 40—41 черепа млекопитающих 124—126
Красный тритон 35
Культура ткани 69, 77—80
бластемы хвоста ящерицы 78 изолированной бластемы конечно*
сти 79
конечности тритона 79—80 моркови 133—136
хвоста головастика 78 регенерация 30—32
Лейкоциты 65
Лимфоциты 144
Линька
у птиц 58—59
у членистоногих 34
Лондонское королевское общество 13
Лось ПО
Лягушка, регенерация классификация 54
Linckia, регенерация 27
Макромолекулы 155
Макроиуклеус 22
Млекопитающие 51
регенерация 59—67
Маития 29—30
Матрикс внеклеточный
кости и хряща 40—41, 162
хряща 74, 107—108
Мезодерма 46
Метаморфоз
взаимосвязь с регенерацией 55, 137, 142
у саламандр 54
Мех, регенерация 67 Микроиифузия 100—105 Микронуклеус 22 Микроскоп оптический 82 электронный
просвечивающий 82—85
сканирующий 86—88
Молекулярно-биологические исследования при регенерации 130— 133
конечности тритона 103—105, 155-157
172
Моллюски 21, 29—30
Морковь, регенерация in vitro 134—136
Морфогенез 45, 130, 132, 160
Мыши, размер нервных волокон ко* иечностей 98—99
Мышцы поперечнополосатые дедифференцировка 41—42, 106, 110 миелиновая оболочка 62—64, 120, 157 микроскопическая картина 60 миобласты 60 при регенерации конечностей у амфибий 41—42, 79, 106—108 регенерация путем эпиморфоза 61 редифференцировка 42, 75, 79, 109, 156
тканевая регенерация 61, 124, 133
Нейрон 62
Нейроплазма 98
Нейротропный агент (фактор) демиелинизирующие заболевания 158 регенерация конечности тритона 95, 100, 104, 120, 155, 158—160 регенерация спинного мозга 159
Необласты 16—17, 106, 110-111 Неотения 55—56
Нервы
биотоки 150—151
взаимоотношения шванновских клеток и миелиновой оболочки 62—64, 158
взаимосвязь с мышцами 162
«зависимость» при регенерации конечностей 44—46
in vitro 79
микроскопическая картина 62—63 операция отведения 139—142, 154 размер волокон 97—99 регенерация 42, 61—64, 133, 152— 153, 157—159
регенерация мышц 60—61 функция ацетилхолина 101 чувствительные и двигательные отделы 95—97
Нервные ганглии (узлы) 34
Нервная система позвоночных, основные отделы 62
Нервный ствол выведение 32 регенерация у кольчатых червей 30—32 секреторные гранулы 32
Нервная трубка 46—49
Ногти, регенерация 67
Олени
Омары, регенерация 33
Оперение 58
Опоссум
развитие 142—144, 155 регенерация
Оптическая микроскопия вкусового усика регенерация 112 при регенерации конечиос!ей 40, 105. 108, ПО, 143 регенерация у планарий 110—111 типы тканей млекопитающих 59—66 эритроциты 151
Опухолевый рост, связь с регенерацией 160—161
Осьминог 29
Пальцев образование 38, 43, 55, 64, 140, 150
Пересадка органов 144
Периферическая нервная система 61—64, 158—159
Перьевое влагалище 58
Перья
линька 58—59
регенерация 58—59 рост 58—59
Печень, регенерация 67, 68, 120, 124, 133
Пигментные клетки инфузории трубача 22—24 плавника рыб 52
Пингвин 59
Плавник, характер окрашивания при регенерации 51—54
Планарии анатомия 12—13 бластемы формирование 15—19, 41, 105, 108, 110 влияние голодания 17 влияние температуры 17 глотка 20—21 градиентная теория 17—19, 27, 93-95
'«двуликий Янус» 18—19 индукция 20—21 необласты 16, 105, 110—111 полярность 13, 27 ранние опыты 13—15 «темп» головы 17 электронная микроскопия 17, ПО
Плечевая кость 74
Плиний старший, исследования по регенерации 68
Подавляющее рост вещество, у гидры 92—93
Позвонки 57 Позвоночные классы 51 регенерация 51
Полярность при регенерации гидра 92—95 гидрообразные 26 кольчатые черви 30—32 планарии 15, 27 саламандр конечности 161
Пороговый уровень иннервации как экспериментальный подход 154 модификация 97—99 определение в эксперименте на тритонах 97—99 эволюционные изменения 138 Почка, регенерация 67, 120. 133 Почкование у гидры 90, 93—95 Пресмыкающиеся 51 регенерация 56—58
Прометей 68
Простейшие 21, 59, 133
Протей американский (Necturus), регенерация конечностей 55
Птицы 58
регенерация 58—59
Пульпа 58
Prodromo 69
Радиоизотопы 69—70, 103—105 Рак речной, регенерация 61
173
Ракообразные 33—34, 61
Раневая поверхность
конечностей
амфибий 40, 147
молодых крыс 153
планарий 111
человека 65
Рассеянный склероз 158
Реагрегация клеток, у губок 24—
26. 75—76, 133
Регенерация
гетероморфоз 34
опухолевый рост 160—161
репаративная 59
связь с линькой 34, 58—59
связь с метаморфозом 55, 137, 142
тканей 61, 133
физиологическая 67
эволюция 59, 99, 138, 142, 153
эпиморфоз 61
Регенерация конечностей у амфибий
амбистома
авторадиография 70—75
акболотль 55, 126
in vitro 79—80
клетки бластемы 74—75. 107—
ПО
оптическая микроскопия 105— 107, 110—111
при денервации 46—48
электронная микроскопия 105— 110
головастики 55, 137, 142
лягушка
бластемы формирование 138— 139, 148, 155
вызывание путем отведения нерва 139—140, 155
вызывание с помощью электростимуляции 151 — 152
дедиффереицировка клеток 139, 148—149
до метаморфоза 55, 137, 142
заживление ран 139
отсутствие 55. 59, 69, 137, 138, 146—147
пороговый уровень иннервации 97—99, 138—140. 154
после травмы 140
стадии 139
Xenopus как исключение 55—56, 98
протей 55
тритон
влияние нейротропного агента 95, 100, 104, 155
in vitro 78—80
количественные и качественные показатели обеспечения нервной тканью 95—99
микроинфузия 100—103, 104—105
молекулярная биология	103—
105. 155—157
пороговый уровень иннервации 98—99, 138, 154
уровень ацетилхолина 101—102
участие нервов в регуляции 103-105, 154-155
характеристики биоэлектриче* ского поля 146
саламандры апикальная шапочка 40, 41—43, 79. 154
бластема 38—43, 49,	150—151,
154, 159
влияние денервации 46—48
влияние света 43
кровоснабжение 44
обзор необходимых условий 154 практическое применение 157— 162
происхождение и судьба клеток бластемы 44—46, 153, 161
ранние опыты 68—69. 137 регенерация нервов 45, 64 роль эндокринных желез 48—50, 154
стадии 38—43, 48—50, 70, 139, 152—155
Регенерация конечностей у млекопитающих
молодые крысы 152—153
происхождение клеток бластемы 153, 157
редифференцнровка 152—153 электростимуляция 152—153, 161 опоссум
бластемы формирование 143
имплантаты нервной ткани 143— 145, 155
пороговый уровень иннервации 142. 154
человек 51, 137—138, 154—157
Регенерация конечностей у пре* смыкающихся, отклонение нервов и пороговый уровень иннервация у ящериц 140, 154— 155
Регрессия 47
Редифференцировка клеток
общность с эмбриональным раз* витием 157
при регенерации конечностей у амфибий 42, 45, 73—75, ЮЗ-109. 160
характеристики биоэлектрического поля 147
хвост ящерицы 56—57
хрящ 42, 73—74, 109, 152
Рентгеновское облучен не поражающее действие 126. 162 при экспериментах по регенерации 126—127, 162
Реснички 22
Рибонуклеаза 132
Рибосомы ЮЗ. 106—107, 131
Ризоиды 130—132
РНК ЮЗ
бластемы конечности тритона 155 при регенерации у Acetabularia 131—133
Рога оленей, регенерация 67, 112— 120. 133 влияние гормонов 114, 118 регуляция «биологическими часами» 118—119
рост 113
света влияние 114—119
Роуз Мерил 160—161
Рыбы, регенерация 51—54, 59
^Световой год» 116
174
Сгусток 65—66, 150
Соединительная ткань заболевания 162 культи конечности лягушки 139 мышцы 60 нервы 64, 97 при регенерации конечностей амфибий 41—43, 75 мышц 60 нервов 64
Сом, вкусового усика регенерация 112
Специализированные типы клеток 90—93
СССР, направления в исследованиях по регенерации 124
Стимулирующее рост вещество, у гидры 92—93
Сумка материнская 142
Талидомида эффект 159—160 «Темп» головы 17 Тестостерон 113>—114, 118 Тимус 144 Тироксин 48 Травма 126—127, 140 Трамбле 68. 89
Тритон 35—37
отведение нервов 141 регенерация 35—38, 55 содержание 37
Ультрафиолетовое облучение 132
Фагоцит 60
Фактор связывания 26
Фибробласты, при регенерации кожи человека 65, 83—85, 107
Фолликул 58
Хамелеон 140, 154—155
Хвост амбистома, регенерация 55 головастики, регенерация in vitro 78 ящерицы
клетки бластемы при регенерации in vitro 78
регенерация 56—57
Хей Элизабет, исследования по регенерации 105—111, 120
Хрящ авторадиография 73—75 дедифференцировка 40,	73—75,
102—108. 113
заживление переломов	костей
150-151
матрикс 38—43, 73 редиффереицировка 42, 74—75, 79, 109, 153
рогов 113 скелетный 41 электронная микроскопия 107—110
Центральная нервная система (ЦНС) 44, 61, 99, 138
Человек, регенерация конечностей 51, 137—138, 153—157
Черви кольчатые 22 полярность 31 регенерация 30—32 роль нервного .ствола 31—32
формирование бластемы 31—32
Черви плоские 22
Чешуя 51
Членистоногие 33
линька 34
регенерация 33—34, 61
Шпорцевая лягушка (Xenopus) нервные волокна конечностей 98 регенерация конечностей 55—56, 98
Щупальца 26—27, 90—92
Эволюция
группы беспозвоночных 21—22
классы позвоночных 51
связь с регенерацией 59, 61, 99, 138, 142, 154
Экзоскелет 34, 67
Эксплантаты, у моркови 134—136
Эктодерма 46
у гидры 90
Эктоплазма 22
Электромагниты 81—83
Электронная микроскопия 69, 80 денервированные конечности 47 при регенерации планарий 17, 110—111
просвечивающая, у Aceiabularia 133
регенерирующая кожа человека 88, 107
регенерирующая конечность амбистомы 105—110
сканирование кожных дефектов у человека 88
эритроцитов 151
Электронный пучок 82—83
Эмбриогенез 136
Эмбриология
взаимосвязь с регенерацией 157
Эмбриологические исследования 120—121
Эмбриональные клетки 41, 150
Эмбрионы (зародыши) амбистомы 45—46 конечности 157, 160 ' кур 120 млекопитающих 144 моркови 135—136 нервная система 159 птиц 58
Эмульсия фотографическая 70—71
Эндоплазма 22
Энтодерма 90
Эпидермис
амфибий 40, 74
вкусового усика 112
оленей 113
птиц 58
регенерация 64—66
человека 65—66
Эпидермиса раны кожи человека 65 при регенерации конечностей у амфибий 40, 43. 65
Эритроциты дедиффереицнровка 151—152 функция 151
Ящерицы 140, 154—155
175
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА АНГЛИЙСКОГО
ИЗДАНИЯ............................. 5
ОТ АВТОРА........................... 7
ВВЕДЕНИЕ............................ 9
I.	РЕГЕНЕРАЦИЯ	У	НИЗШИХ	ЖИВОТНЫХ ...	12
II.	РЕГЕНЕРАЦИЯ	У	ВЫСШИХ	ЖИВОТНЫХ •	•	.	35
III.	СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ............................  68
IV.	ИССЛЕДОВАТЕЛИ И ПУТИ ИССЛЕДОВАНИЙ 89
V.	СОВЕТСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ..........................   122
VI.	РЕГЕНЕРАЦИЯ У РАСТЕНИЙ..............127
VII.	РЕГЕНЕРАЦИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ У ЧЕЛОВЕКА 135
ЛИТЕРАТУРА . . . ...................... 161
ПОСЛЕСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА .... 165
ПРЕДМЕТНО-ИМЕННОЙ УКАЗАТЕЛЬ.............171
Присцилла Мэттсои
РЕГЕНЕРАЦИЯ — НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ
Научный редактор Р. Дубровская.Мл. научный редактор М. Харузина Художник В. Стуликов. Художественный редактор Л. Безручеиков.
Технический редактор И. Креиделева. Корректор К. Водяиицкая
ИБ № 2359
Сдано в набор 30.12.81. Подписано к печати 25.05.82, Формат 84 X 108 1/32.
Бумага типографская № 2. Гарнитура латинская. Печать высокая.
Объем 2.75 бум. л. Усл. печ. л. 9.24. Усл. кр.-отт. 9.53. Уч.-изд. л. 8.78.
Изд. № 12/1388. Тираж 50 000 экз. Зак. 52. Цена 50 коп.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР»
129820, Москва, И-110, ГСП, 1-й Рижский пер,, 2.
Ленинградская типография № 2 головное предприятие ордена Трудового Красного Знамени Ленинградского объедииеиия «Техническая книга» им. Евгении Соколовой Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли.
198052, г. Ленинград, Л-52, Измайловский проспект, 29.