/
Автор: Омелянский В.Л.
Теги: биология микробиология биологические науки вирусология вирусы
Год: 1940
Текст
В. Л. ОМЕЛЯНСКИЙ
ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО
ПО МИКРОБИОЛОГИИ
ИЗДАНИЕ ВТОРОЕ,
ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЙ
Под общей редакцией
Заслуженного деятеля науки
проф. Б. Л. ИСАЧЕНКО
Всесоюзным Комитетом
по делам высшей школы при СЕК СССР
допущено в качеств? учебного пособия
для биофаков университетов
дч
39 с/J-
ИЗДАТЕЛЬСТВО АКАДЕМИЙ НАУК СОЮЗА ССР
МОСКВА 1М0 ЛЕНИНГРАД
Ответственный редактор
Проф. Б. Л. ИСАЧЕНКО
ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ
Практическое руководство по микробиологии В. Л. Омелян-
ского вышло в 1922 г. и с тех пор не переиздавалось. За это время
методы микробиологических исследований подверглись
значительным изменениям. Достаточно, например? указать, что 16
лет назад определение активной кислотности У нас только
начинало входить в микробиологическую практику, а об окислительно-
восстановительном потенциале еще в лабораториях не знали.
Методы прямого подсчета микроорганизмов ?акже еще не были
разработаны Виноградским; при исследования аэробного
разложения целлюлозы, нитрификации и ряда дрУгих процессов за
это время были выработаны новые методы исследования. Так как
срок для переработки руководства был установлен издательством
(Биомедгиз) очень короткий, то выполнить эту сложную задачу
можно было только при совместной работе ряда специалистов,
взявших на себя труд пересмотреть и дополнить одни отделы
описанием новых методов, а другие — совершенно переработать.
Конечно, такую переработку и дополнение пособия, нужду в
котором остро ощущают все работающие в микробиологических
лабораториях, выполнить удачно при большем количестве
сотрудников было не легко, и недостатки сделанного выступают
резко. Нельзя не отметить, что привлеченные Я работе микрооио-
логи взялись за нее не только охотно, но с большим интересом,
учитывая необходимость притти на помощь молодым кадрам.
Главным образом в этой работе приняли участие сотрудники
Микробиологического института Академии Наук, затем многие
микробиологи ленинградских и московских исследовательских
учреждений.
Таким образом, вокруг работы по переизданию книги собрался
крупный коллектив, разделивший ее между собой, по
возможности, ближе к основной специальности каждого- Приняли участие
в работе следующие лица: Баринова С. А., Бычковская А. А.,
Егорова А. А., Иерусалимский Н. Д., Имшенецкий А. А.,
Исаченко Б. Л., Канель Э. С, Кизель А. Р., Красильников Н. А., Кре-
тович В. Л., Крисе А. Е., Кудрявцев Н. А., Лунц А. М., Маытей-
фель А. Я., Мейсель М. Н., Михлин М. Д., Мишустиь Е. Н.,
Муратова М. А., Нахимовская М. И., Селибер Г- Л., Симакова
Т. Л., Худяков Я. П., Шапошников В. Н., Дітробиндер М. Ф.
1* 3
Придерживаясь возможно ближе к тексту 1-го издания
сПрактического руководства», нами внесены преимущественно те
методы исследования, которые были проверены, но не
исключительно только те, которые давали хороший результат. В книге,
возможно, имеется много пропусков и неясностей, за указание
которых коллектив будет весьма благодарён. Не все методы
описаны с одинаковой полнотой, об исследовании многих процессов
м о многих группах микроорганизмов 'сказано очень мало, о
некоторых вообще не упомянуто, что зависело от того, что не
все стороны жизни микроорганизмов с одинаковой полнотой
были затронуты исследованиями в нашей лаборатории.
Названия микроорганизмов сохранены те же, как и в
((Основах микробиологии». Список главнейшей литературы
приводится в «Основах». Многие весьма хорошие методы, описанные
в «Лабораторной практике» не вошли в руководство, которое
и без того оказалось большего объема, чем намечалось, а
журнал «Лабораторная практика» легко доступен читателю.
Рецепты питательных сред и т. п. приводятся в том виде,
как они даны авторами, для облегчения использования не всегда
доступной литературы.
В частях, подвергшихся большей переработке, указывается
литература.
Редактор
ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ
Лицам, приступающим к. изучению микробиологии,
необходимо ознакомиться с основными бактериологическими методами
и приобрести в этой области известный навык. Между тем в
русской научной литературе до сих пор не было подходящего
руководства для этой цели. Это побудило нас взяться за составление
практического пособия по бактериологической методике,
потребность в котором давно ощущается.
При составлении его мы несколько отошли от обычного
шаблона подобных руководств, стараясь дать все необходимое для
научного изучения микробов, а не одни только практически
важные методы прикладной бактериологии. Таким образом,
руководство это, по своему замыслу, должно служить необходимым
дополнением к теоретическому курсу микробиологии.
Большинство пособий по бактериологической методике на
иностранных языках составлены по одному из двух планов. В одних
материал расположен по ходу практических занятий в течение
семестра с целью наиболее экономного использования времени.
В других изложение методики не стеснено каким-либо условным
планом работ или определенным сроком их и располагается в
систематическом порядке. Этот последний план представляется
нам более целесообразным и принят в настоящей книге. Он не
4
стесняет пользуюпттхся книгой лиц рамками какого-либо одного
курса, предоставляя каждому свободу в выборе наиболее
подходящего для него распределения занятий в соответствии с
количеством отводимых для этого часов, техническим снаряжением
лаборатории, характером теоретического курса, дополнением
к которому служат эти занятия, и т. д. При планировке занятий
экономия времени проще всего достигается комбинированием
быстро выполняемых бактериологических работ с более
длительными бактериологическими исследованиями и культурой
микробов на искусственных средах.
Для лиц, интересующихся специальными отделами
микробиологии — медицинской, технической, сельскохозяйственной,
руководство это может служить первоначальным справочником —
своего рода введением к более специальному курсу. Методы
медицинской бактериологии — опыты на животных, реакции
иммунитета и пр. — в книге не упоминаются вовсе; они подробно
изложены в многочисленных практических руководствах по
медицинской бактериологии, имеющихся и на русском языке (см.
справочник в конце книги). Равным образом почти не затронуты методы
исследования простейших (Protozoa).
Видное место в книге отведено весьма поучительному и
целесообразному методу элективных культур, введенному в науку
Виноградским и получившему дальнейшую разработку в трудах
Бейеринка (Beijerinck).
В особых главах приводятся методы исследования энзимов,
а в приложении — наиболее употребительные приемы
химического анализа продуктов выделения микробов. Последнее
сделано для облегчения изучения биохимизма микробов. Книге
вообще придан характер руководства, обильно снабженного
необходимыми сведениями для контролирования химической
работы микробов. Чтобы не слишком нарушать цельность
изложения, пришлось более сложные приемы анализа вынести в особое
«Приложение» в конце книги.
Описание различных приемов бактериологического
исследования сделано с надлежащей обстоятельностью, так, чтобы
начинающий мог проделать их, по возможности,
самостоятельно.
Практические работы по микробиологии требуют большой
осмотрительности, порядка и точного выполнения указаний
методики, подчас довольно стеснительных. В особенности это важно
при работах с патогенным материалом, когда несоблюдение
необходимых мер предосторожности связано с угрозой заражения.
А так как никогда не исключена возможность случайного
нахождения патогенных микробов в исследуемом материале, то для
ограждения себя и окружающих от опасности заражения
необходимо во всех случаях, даже при работах с сапрофитными
микробами, соблюдать надлежащую осмотрительность, точно
придерживаясь установленных правил
Рекомендуется начинающему вести подробный дневпик
занятий. Запись облегчает усвоение пройденного, заставляя
внимательнее относиться к каждой проделанной операции. Полезно
это и как школа дисциплины для будущей самостоятельной
работы, так как приучает, не полагаясь на память, тщательно
заносить в дневник все проделанное за день.
В случае неизбежных неудач работающий должен, не
сваливая вину на метод, найти источник ошибки и устранить его в
будущем. Здесь широкое поле для проявления самодеятельности
и разумной настойчивости занимающегося с целью доведения
предпринятой работы до конца. Для руководителя практические
занятия дают в руки прекрасное средство разобраться в
индивидуальности работающего и распознать будущего полезного
деятеля в области науки.
Быть может, предлагаемый труд окажется не бесполезным
и для более опытных бактериологов, как сводка методических
приемов, не всегда удерживающихся в памяти. Но, главным
образом, автор имел в виду молодых, начинающих микробиологов,
которым и посвящает эту книгу.
Если она послужит вящшему насаждению
бактериологического знания в России и нарастанию кадров русских
микробиологов, автор сочтет свой труд производительно затраченным.
За указаний на недосмотры, неясности, ошибки и прочее,
совершенно неизбежные в первом издании, автор заранее
приносит свою глубокую благодарность.
Автор
I
ГЛАВА Г
УСТРОЙСТВО ЛАБОРАТОРИИ. ОПИСАНИЕ МИКРОСКОПА
1. УСТРОЙСТВО ЛАБОРАТОРИИ
Благоустроенная лаборатория для бактериологических
занятий должна удовлетворять ряду требований как по
расположению комнат, так и по их оборудованию. Сообразно с целями
преподавания или с характером выполняемых работ, и планировка
лабораторных помещений может быть различной, но все же здесь
можно дать несколько общих указаний относительно условий,
которым должно удовлетворять подобное помещение.
Бактериологическая лаборатория обыкновенно состоит из
следующих помещений: 1) комната для заведующего, 2) комната(ы)
для помощника (ов), 3) зал для практикантов, 4) комната (ы)
для специалистов, 5) химическая лаборатория, 6) библиотека и
весовая комната (здесь же могут помещаться аппараты для
объемного химического анализа), 7) микрофотографическая комната,
термостатная, стерилизационная и служительская.
К этому надо добавить вспомогательные помещения:
переднюю, коридор и пр.
Комнаты для микроскопических занятий должны быть
обращены окнами на север — на свободное, незастроенное и не
заросшее деревьями пространство. Если постройки и деревья находятся
в некотором отдалении, они не мешают. Если окна обращены
на юг, то в солнечные дни их завешивают белыми шторами для
защиты от ярких солнечных лучей, утомляющих глаз при микро-
скопировании, губительно действующих на микробов и не
безопасных для самого микроскопа, так как под их влиянием может
расплавиться клей, связывающий линзы в системах. Окна
делаются с большими просветами, «зеркальные» или с переплетом
лишь в верхней части. Нижняя часть оконных рам не должна
открываться внутрь, чтобы не препятствовать ставить предметы
у окна и не уменьшать полезной площади рабочего стола (рис. і).
Микроскоп помещается на устойчивом столе, так как сотрясение
мешает точным микроскопическим исследованиям. Расстояние
микроскопа от окна должно быть около 1 м.
Пол в лаборатории можно выстлать линолеумом по бетону
или каменными плитками. Последние менее приятны для ног,
/**
4
но зато такой пол не боится ни кислот ни пятен от анилиновых
красок (смывают крепкими кислотами). Стены и потолки в
лабораторных помещениях должны быть гладкими, без карнизов и
украшений, во избежание оседания на них пыли. По той же
причине лабораторную мебель лучше делать с закругленными краями,
без узорных закраин. Нижняя часть помещения окрашивается
светлой масляной краской, лучше всего желтоватого цвета, а
верхняя часть и потолок белятся известью или окрашиваются
известковой краской, впитывающей влажность.
Комнаты должны хорошо вентилироваться. Для усиления
тяги у отверстия вытяжных, труб должны быть газовые рожки
или электрические вентиляторы.
Рис. 1. Стол для бактериологических работ.
Столы для микроскопирования располагаются перед окнами.
Их высота — около 80 см. Если пол тряский, то столы удобнее
укреплять на кронштейнах вдоль стен (рис. 1).
Поверхность столов хорошо покрывать линолеумом с
деревянной закраиной, которая не должна выдаваться над уровнем
самого линолеума. Столы нередко покрываются стеклянными
досками или белой полированной лавой.
Для окраски деревянных лабораторных столов Вортман (Wort-
mann) предложил следующий способ. Готовят два раствора:
t) CuS04 100 г 2) Солянокислого анилина » 100 г
КСЮ4 50 NH4C1 40
Воды 615 Воды 615
Обе жидкости трижды попеременно наносятся на
окрашиваемую поверхность стола, после высыхания предыдущей краски.
Затем поверхность стола смывают теплой водой и, когда
высохнет, протирают кипяченым льняным маслом. Наконец, моют мыль-
8
ной водой. Поверхность стола приобретает черный цвет,
устойчивый к щелочам и кислотам.
Клёкер (Klocker) предлагает для этой же цели следующий
рецепт, который он считает лучшим. Приготовляются два
раствора:
Л) Солянокислого анилина в 4 л
воды 600 г
U) Хлорной меди 86
Хло['нонислого калия 67
Хлористого аммония 33
Воды 1000
Непосредственно перед употреблением смешиваются 4 объема
первого раствора с 1 объемом второго и этой смесью 4 или 5 раз
натирается поверхность стола (с промежутками каждый раз
в 1 сутки). Затем стол протирается тряпкой, смоченной льняным
маслом. При этом
способе черный цвет
достигается быстрее.
Воздух в
лабораторном помещении
должен быть по
возможности свободен от
пыли и зародышей, в
особенности
плесневых спор,
систематически загрязняющих
культуры. В
лаборатории, поэтому, поле-
вно время от времени
производить
основательную дезинфзк-
цию.
Сказанное обязывает к соблюдению в лабораторном
помещении педантической чистоты и порядка. Столы после работы должны
быть убраны, и ничего лишнего на них не должно оставаться.
Только при этом условии их можно содержать в чистоте и
свободными от пыли. Все культуры и аппараты, по окончании работы,
должны быть помещены в шкафы. Нельзя бросать на пол окурки,
обгоревшие спички, обломки стекла, ватные пробки и т. п. Для
мусора в каждой комнате находится эмалированное ведро или
стеклянная банка с дезинфицирующим раствором. Ежедневно
эти вместилища очищаются.
В служительской комнате, если она достаточно вместительна,
могут находиться стерилизационные аппараты (см. гл. II). Здесь
же производится мойка посуды. Если нет кранов с горячей водой,
то для быстрого согревания воды там, где есть газ, можно с
удобством пользоваться аппаратом Флетчера (Fleischer) (рис. 2).
Вымытая посуда высушивается на особых досках (рис. 3, стр. 10),
Рис. 2. Аппарат Флетчера для быстрого
нагревания воды газовой горелкой.
2. МИКРОСКОП, УЛЫРАМИКРОСКОП И МИКРОФОТОГРАФИЯ
Микроскоп представляет собой важнейшее орудие
бактериологического исследования. Знакомство с ним обязательно для
всякого, приступающего к бактериологическим занятиям.
Это тем более необходимо, что применяемый в бактериологии
микроскоп имеет целый ряд конструктивных особенностей и требует s
специального знакомства с его устройством.
Микроскопы бывают простые — с одним увеличительным
стеклом и сложные — с окуляро* и объективом. Простые
микроскопы называются лупами.
Сложный микроскоп
состоит из штатива
и оптической части
(рис. 4).
Штатив микроскопа
приготовляется из меди
или чугуна, должен
быть устойчив и с
хорошо пригнанными
частями. Он обладает
боковым шарниром,
допускающим наклонение
трубы под любым углом
(откидной штатив).
Штатив снабжен сле-
дующими^частями:
1) Труба
микроскопа (тубус),
несущая сверху окуляр
Рис. 3. Доска с колышками для сушки сте- и внизу объектив. Она
клянной посуды. может передвигаться
вверх и вниз с помощью
двух систем. Для грубого передвижения служит кремальера, или
зубчатка, приводимая в движение двумя боковыми винтами; ею
пользуются при слабых увеличениях, а также для
первоначальной грубой установки препарата при сильных системах. Для
более точной установки служит микрометрический винт, каждый
полный поворот которого при помощи верхней головки (старая
система с призматическим винтом) или двух боковых (современная
система с боковым винтом) передвигает трубу микроскопа на 0.1 мм.
В современных конструкциях больших исследовательских
микроскопов микрометрический винт, а иногда также и кремальера
перемещены ближе к ножке штатива, что позволяет во время
работы держать руку не на весу, а в менее напряженном
положении, на столе.
Микрометрический винт является одной из наиболее нежных
частей микроскопа,и обращение с ним требует особой осторожности.
Окуляр
ВЫдбифнаа
яастЬ трубЬі
Зубиатна
РевояЬбер с J
абъентШт
Микрометриче
скии оинт
Столик
Его движения должны быть совершенно свободны в обе стороны.
Если винт не вращается в одну сторону, это указывает, что ход
его лройден до конца и надо его вывинтить в обратную сторону.
*У штативов с боковым микрометрическим винтом обычно
имеются с правой стороны две черточки, указывающие крайние
положения микрометрического винта.
Иногда винт работает плохо, так как труба и прилегающие
части с трудом движутся вследствие загустения масла. В этом
случае их поле зно
смазать жидким
вазелином.
Труба микроскопа
состоит из двух
частей, входящих одна
в другую и могущих
раздвигаться. При
пользовании
масляной иммерзиеи
наилучшее изображение
получается при
определенной длине тру
бы. В микроскопах
Цейсса длина трубы,
считая от ве р хнего
края тубуса до
верхнего края оправы
объектива, т. е.
длина трубы
включительно с соединением
между тубусом и
объективом, должна быть
равна 160 мм, в
микроскопах Лейтца —
170 мм, а в больших
английских
микроскопах — 250 мм.
Если объектив непосредственно навинчен на трубу, то деления
на выдвижной части тубуса показывают длину его;
следовательно, в микроскопах Цейсса эту трубу нужно выдвинуть до 160.
Если же объектив насаживается на трубу при помощи
револьвера или салазок, то тубус надо вдвинуть на длину этих частей
так, чтобы длина остатіась прежней — 160 мм.
Советские микроскопы (рис. 5), снабженные прекрасной
оптикой, построены по тину лучших биологических микроскопов
Цейсса.
К большим современным штативам обычно прилагается косая
монокулярная или бинокулярная насадка для тубуса,
исключающая необходимость наклонения штатива под углом Некоторые
11
Шарнир для.
наклонении
Конденсор
Зеркшш
Рис
Поиска
4 Большой микроскоп с круглым
подвижным столиком
фирмы (Цейсе, Рейхерт) изготовляют штативы с косым
бинокулярным тубусом (рис. 6).
Хотя большим выдвижением трубы и можно достигнуть
большего увеличения, но при атом значительно страдает ясность
изображения, особенно при пользовании иммерсионной
системой. Не надо забывать, что детали избражения раскрывает только
объектив, а не окуляр. Последний лишь усиливает увеличение,
ничего нового не прибавляя к изображению в смысле выяснения
подробностей. Напротив,
изображение теряет в ясности
вследствие ослабления освещения-
Ряс. 5. Микроскоп советского
изготовления.
Рис. 6. Штатив с косым
бинокулярным тубусом.
2) Столик микроскопа. На нем двумя зажимами
укрепляется предметное стекло. В лучших моделях микроскопов
имеется центрируемый, вращающийся и двигающийся по двум
взаимно перпендикулярным направлениям подвижной стол, так
называемый вращающийся крестообразный стол. В более простых
моделях имеется лишь крестообразный стол (невращающийся).
Нередко пользуются привинченным к столику микроскопа
«подвижным етоликом», позволяющим передвигать препарат в
рапные стороны с помощью системы винтов и отмечать места
препарата по делениям двух взаимно перпендикулярных
нониусов. Через Отверстие в средней части столика микроскопа
проходит линза отсоетителя Аббе, верхняя плоская сторона
которой находится на одном уровне с поверхностью столика
12
микроскопа. В случае надобности осветитель может быть слегка
опущен.
3) Конденсор (осветитель) Аббе, находящийся под
столиком микроскопа, представляет собой систему сильных линз,
посылающих широкий конус лучей света, сходящихся в
плоскости препарата. При освещении рассеянным дневным светом, т. е.
параллельными лучами, конденсор нужно поднять как можно
выше — так, чтобы плоская поверхность верхней линзы пришлась
на уровне поверхности столика. В этом случае фокус лучей,
проходящих через конденсор, находится в плоскости препарата.
Напротив, при искусственном освещении, когда источник света
находится недалеко от микроскопа, посылая к зеркалу расходящийся
пучок лучей, осветитель Аббе должен быть опущен до тех пор,
Рис. 7. Гаэокалильная лампа с шаром,
наполненным раствором сернокислой меди.
пока изображение источника света не будет в плоскости препарата.
Если это изображение слишком резко (накаленные нити
электрической лампы), то слегка понижают конденсор Аббе или освещают
препарат вогнутой стороной зеркала. Конденсор Аббе снабжен
диафрагмой, суживающейся и расширяющейся, как зрачок нашего
глаза (Iris diaphragma).
При суженной диафрагме все краевые лучи задерживаются,
и к препарату пропускаются лишь одни центральные лучи.
Сдвинув диафрагму несколько в сторону от оптической оси, получаем
косое освещение, дающее более резкие контрасты света и тени.
Окрашенные препараты рассматриваются при полном освещении
Аббе, неокрашенные—при суженной диафрагме или при
опущенном конденсоре. Если неокрашенные препараты рассматриваются
при слабом увеличении, то конденсор лучше всего убрать или
сдвинуть в сторону.
28
Если при работе желательно использовать полностью
возможности конденсора (его апертуру), то между конденсором и
нижней поверхностью предметного стекла необходимо поместить кап
лю иммерсионного (кедрового) маслэ.
4) Внизу микроскопа находится подвижное плосковогнутое
зеркало, служащее для отражения света внутрь микроскопа.
Лучше всего
пользоваться дневным светом,
отраженным от белого
предмета, например от
светлого облака или от белой
стены противоположного
дома. Не так хорош свет,
отраженный от голубого
неба. Резкость прямых
солнечных лучей
смягчают матовым светом
вставленным в
ирис-диафрагму конденсора Аббе.
Желтый свет от
электрической лампы или от
газовой горелки смягчают
голубым стеклом или
пропускают \ его через
шар, наполненный
слабым раствором медного
купороса или аммиачным
раствором окиси меди
(готовится прибавлением
аммиака к раствору
медного купороса, рис. 7)
При искусственном
освещении удобнее
производить тонкие микроско -
пические исследования,
особенно неокрашенных
и живых объективов.
5) Оптическая часть
сложного микроскопа со
стоит, кроме конденсора
Рис. 8 Сложный микроскоп с изображением Ag6e из объектива
хода лучей в нем ' п лг™~™
J и окуляра.
Увеличение, даваемое мішроскопом, равняется произведению
увеличений его объектива й окуляра. Ход лучей в микроскопе
изображен на рис. 8.
Наиболее важную и ценную часть микроскопа составляют
объективы. Микроскоп должен быть снабжен ио крайней мере
двумя сухими системами (с собственным увеличением в 10—20 и
Ы
40—60 раз) и иммерсионной системой, увеличивающей в 90 и
120 раз. Сухие системы служат для общего обзора препарата, для
рассмотрения колоний и пр. Когда объектив навинчивается
непосредственно на тубус или на револьверное приспособление, то
центрировка объектива не нужна. Если же пользуются саночным
аппаратом, то необходимо центрировать объектив. Для этого
применяют самый слабый окуляр и устанавливают
изображение суженной до конца диафрагмы конденсора, среднее
отверстие которой должно приходиться в центре поля зрения
(регулирование производится двумя винтами, которыми снабжены
салазки).
Главное значение в бактериологическом исследовании имеет
иммерсионная или масляно-погружная система (рис. 9). Лучшие
из современных объективов — апохроматы (рис. 10). Их недо-
Рис. 9 Наглядно показывает
преимущество иммерсионной системы перед сухой.
KL — разрез через покровное стеклышко, CDBN —
через переднюю линяу объектива. Луч GO, попадая в
стекло, изменяет первоначальное направление и
приближается к оптической оси АВ [ОН). Выйдя затем в
воздух, он отклоняется от оси и принимает направление
EF, не попадая в объектив и теряясь для освещения.
если между покровный стеклышком и линзой поместить
жидкость одного показателя преломления со стеклом,
например кедровое масло (PMCN), то луч света НО,
попадающий в отекло под тем же углом, что и луч GOt
преломившись в точке О, сохраняет ото направление
(OD) и дальше и таким образом попадает в линзу.
Рис. 10. Апохромат, состоя
щий из 10 линз.
статок — некоторая
кривизна плоскости
изображения, благодаря чему
приходится отдельно
устанавливать на середину и на
края препарата. Спокойнее для работы и вполне пригодны для
точных микроскопических исследований более дешевые и более
прочные ахроматы. Оптические недостатки современных
объективов (сферическая и хроматическая аберрации) устраняются
комбинацией стекол различного состава и различной кривизны, а у
апохроматов — и применением исправляющих их недостатки
окуляров (компенсационные окуляры).
На оправе иммерсионных систем обозначается их фокусное
расстояние: у апохроматов в миллиметрах (1.5—2—3), а у
ахроматов в английских дюймах (*/12 дюйма, т. е. несколько больше 2 мм).
Степень увеличения объектива равна частному от деления 250 мм,
1а
т. е. числа, выражающего расстояние ясного зрения для нор-
иального глаза, на фокусное расстояние его в мм. Таким образом,
250
апохромат с ф. р. в 1.5 мм увеличивает в —или в 167 раз, с ф. р.
в 2 мм — в 125 раз и с ф. р. в 3 мм — в 83.3 раза.
На оправе современных объективов (советских и заграничных)
обозначается даваемое ими увеличение. Наиболее часто
применяются объективы с увеличением в 8 х, 10 X, 20 X, 40 х,60 X, 90 х
и 120 X (три последних иммерсионные). Собственное увеличение
окуляра указывается на оправе его верхней линзы.
Так как, благодаря короткому фокусному расстоянию,
иммерсионные системы почти вплотную лриближаются к плоскости
препарата, то толщина покровных стеклышек (см. ниже) не
должна превышать известных пределов (0.15—0.17 мм).
Апохроматические объективы с большими числовыми
апертурами (сухие и водно-иммерсионные) обычно имеют так
называемую коррекционную оправу, с помощью которой можно корре-
гировать отклонения в толщине покровных стекол (от 0.1 до
0.2 мм).
Не имеющие такой оправь* объективы коррегированы на
толщину покровных стекол, равную 0.17 мм.
JLtk работы о апохроматическими объективами
целесообразно иметь покровные стекла определенной толщины, вымеренные
с помощью измерителя покровных стекол.
На оправе апохроматов и современных ахроматических
объективов обозначается, кроме фокусного расстояния, также
величина «числовой апертуры», зависящая от показателя
преломления иммерсионной жидкости (кедрового масла) и от углового
отверстия пучка лучей, проходящих через линзу. Чем больше
апертура, чем больше света попадает в микроскоп, тем яснее
изображение и выше анализирующая способность системы.
Высший предел последней —две черты, отстоящие одна от другой на
расстоянии в 0.12 микронов (микрон =0 001 мм).
Сухие объективы имеют числовую апертуру меньше единицы.
Объективы с апертурой, равной единице и выше, являются
иммерсионными. Максимальная числовая апертура масляно-иммер-
сионного объектива с собственным увеличением в 60 х и 90 х —
около 1.4.
Если объектив замутится и перестанет давать ясные
изображения, его не следует самому развинчивать и чистить, а надо
отослать в специільную мастерскую — лучше всего на фабрику,
где он приготовлен.
Для контроля анализирующей способности объективов
пользуются пробной пластинкой Аббе и апертометром или, за
неимением их, панцырями диатомей, обладающими очень тонким
строением. Сухие системы проверяются установкой на палцырь Pleu-
rosigma angulatum с ячеистой структурой, а масляно-погруж-
ные — на панцырь Surirella gemma или Amphipleura pellucida.
16
Окуляры имеются двух родов: Гюйгенса и компенсационные.
Первые применяются с ахроматами, вторые — с апохроматами
или с сильными ахроматами (-гк") » имеющими апертуру не
менее 0.85.
При длине тубуса в 160 мм в микроскопах Цейсса
увеличение компенсационного окуляра старой модели равно его номеру.
Таким образом, увеличение в микроскопе Цейсса с
компенсационным окуляром 12 и
объективом в 3 мм будет равняться 12 х
250
Х-^-,т. е. в 1000 раз, а комби-
нация окуляра 18 и объектива с
фок. расст. 1.5 мм дает увеличение
в 3000 раз.
Увеличение микроскопов,
имеющих современную оптику,
определяется простым перемножением
собственного увеличения
объектива на увеличение окуляра. Эти
величины, как указывалось,
обозначаются на оправах оптических
систем.
В качестве рабочей
комбинации удобно брать сочетание
сильного объектива со слабым
окуляром: получается отчетливое
изображение и большое поле зрения.
Сильные окуляры мало пригодны
при работе с ахроматами, так как
при этом резко выступают
оптические недостатки последних.
Иногда микроскопированию
мешает засорение оптических
стекол пылью, чаще всего верхней линзы окуляра, в чем можпо
убедиться вращением окуляра. Если при этом вращении в поле
зрения соринки не движутся, это указывает на загрязнение
объектива, и его надо протереть с двух сторон, ни в коем случае не
'развинчивая оправы.
При монокулярном микроскопировании надо приучаться
держать оба глаза открытыми, пользуясь ими попеременно, чтобы
не утомлять зрение. Кому трудно привыкнуть к этому, тот может
закрыть глаз свободным опусканием века.
Искусство в совершенстве владеть микроскопом требует
продолжительной практики и большого технического навыка
(подробности относительно установки препарата — см. гл. III, п. 2).
Надо приспособиться к микроскопу, которым предстоит пользо
ваться и держать его в чистоте, предохраняя от пыли стеклянным
2 Руководство по микробиологии
Рис. И. Микроскоп с
рисовальным аппаратом.
3 9ЧX
П
колоколом. Если окна обращены на юг и в комнату проникают
прямые солнечные лучи, то лучше пользоваться коричневым
колоколом или колоколом, одна половина которого закрашена
масляной краской. Иммерсионная система микроскопа должна быть
после работы вычищена от кедрового масла мягкой холстинкой
или батистовым платком, слегка смоченным бензином. Следует
избегать пользоваться для этого ксилолом, так как он растворяет
канадский бальзам и портит линзы.
При продолжительной работе в течение дня достаточно
очищать иммерсионные системы от кедрового масла один раз, в конце
работы. Пыль со штатива, столика и окуляров убирается мягкой
кисточкой.
Из вспомогательных приспособлений к микроскопу назовем:
нагревательный столик, рисовальный аппарат (рис. 11), лампу
для микроскопирования и пр. Их описание можно найти в
специальных руководствах по микроскопии.
Измерение микроскопических объектов
Для измерения микроскопических объектов служат
окулярные и предметные (объектные) измерительные микрометры. С
помощью первых производится непосредственное измерение
объектов, вторые нужны для определения абсолютного значения
делений окулярного микрометра.
Окулярный микрометр представляет собою круглую
стеклянную пластинку с выгравированной в центре линейкой,
разделенной на равные части. Иногда вместо линейки имеется сеточка
(сетчатый измерительный окуляр). Окулярный микрометр
вкладывается в окуляр на диафрагму, между верхней и нижней
линзами. Особенно удобны специальные измерительные окуляры,
с выдвигающейся верхней частью, с помощью которой можно
устанавливать на резкость измерительную линейку.
Для определения значения делений окулярного микрометра
служит объектный микрометр, построенный по типу
микроскопического препарата, у которого между предметным и покровным
стеклами имеется линейка, длиною в 0.5 мм, разделенная на 50
равных частей. Каждое деление объектного микрометра, таким
образом, равно 10 микронам (0.01 мм).
Чтобы опред^гить значение делений окулярного
микрометра, необходимо установить, какое количество его делений
умещается в определенном количестве делений объектного
микрометра.
Величина же одного деления объектного микрометра известна
и равна 10 микронам.
Так, например, если в 4 делениях объектного микрометра точно
умещается 20 делений окулярного микрометра, то, зная, что
каждое деление объектного микрометра равно 10 микронам, а 4
J8
деления — 40 микронам, без труда определяем, что 1 деление
окулярного микрометра равно А микронам \у^)*
Если в определенном количестве делений объектной линейки
не укладывается целое число делений окулярной линейки, то
рекомендуется небольшим выдвижением тубуса устранить это
затруднение. Однако, нужно помнить, что вычисленное при
выдвинутом (тубусе значение делений окулярного микрометра будет
действительно лишь при данной длине тубуса.
Определение величины деления окулярного микрометра
должно быть Сделано для каждого из имеющихся объективов отдельно
(для малого, среднего увеличений и для иммерсионной системы).
Полученные данные с указанием, для какой комбинации
окуляра и объектива (а также при какой длине тубуса) они
действительны, рекомендуется свести в табличку и хранить в ящике
микроскопа.
Для более быстрых и точных измерений объектов пользуются
винтовым окулярным микрометром, состоящим из окуляра,
снабженного боковым винтом, передвигающим крестообразную
нить внутри окуляра. Передвижения этой нити регистрируются
специальным указателем, передвигающимся одновременно с нею
по неподвижной шкале.
На шкале с помощью указателя откладываются целые числа
величины объекта, дробные ?ке (сотые доли) — на барабане винта,
передвигающего крестообразную нить. При измерении перекрест
нити устанавливается сначала у одного, затем у другого конца
объекта.
Чтобы определить величину деления неподвижной шкалы в
микронах, нужно ее предварительно измерить с помощью
объектного микрометра по способу, указанному выше.
Употребляемые при микроскопировании предметные и
покровные стекла готовятся из лучшего стекла и имеют обыкновенно
следующие размеры: предметные стекла — формат 76 х26 мм,
толщина не свыше 2 мм; покровные стекла —квадратные, формат
18 х18 мм, толщина 0.15—0.17 мм. Применяются стекла и других
размеров (покровные стекла прямоугольные 18 х26 мм, круглые
и пр.).
Поверхность стекла должна быть совершенно чистой. Капли
воды равномерно расплываются по ней, отнюдь не собираясь
в отдельные мелкие капельки, как бывает на жирной поверхности.
Не бывшие в употреблении покровные стекла обмывают сна
чала смесью равных частей спирта и эфира, затем бензином и
вытирают мягким чистым платком. Разумеется, нельзя для этого
пользоваться уже бывшим в употреблении платком, которым
вытирается кедровое масло с иммерсионной системы. Можно также,
как это делает А. Мейер (A. Meyer), обрабатывать стекла сначала
крепкой серной кислотой, а затем спиртом, в котором они и
сохраняются впрок.
2* №
Предметные и покровные стекла хорошо очищаются жидкостью
следующего состава:
дтзухромовокислого калия 40 г
воды 150 см8
После растворения, идущего лучше при нагревании, раствор
охлаждают и прибавляют понемногу
концентрированной серной кислоты 230 см3
Очищенные этой жидкостью стекла тщательно промывают
в воде.
Для очистки покровных стеклышек, уже бывших в
употреблении, можно рекомендовать следующий способ: стекла несколько
раз кипятят в смеси 6% растворов двухромовокислого калия и
серной кислоты; ополаскивают сначала водой, затем спиртом, в
котором стекла и сохраняют; перед употреблением их обтирают.
На чистоту стекол должно быть обращено особенное внимание
в некоторых случаях, например при окраске жгутиков.
Упомянем о
некоторых технических
приспособлениях,
употребляемых при микроско-
пировании.
Для исследования
микробов в живом со-
Рис. 12. Пинцет Корнэ. стоянии применяются
предметные стекла с
выемкой (см. гл. III, п. 2) или на предметные стекла наклеиваются
шлифованные стеклянные кольца. Изучение действия
газообразных веществ на микроорганизмы проводится в особых, так
называемых газовых камерах.
В простейшем виде это — стеклянное кольцо, снабженное
двумя трубочками (приводящей и отводящей), приклеенное к
предметному стеклу, образующему дно камеры. Крышей камеры
служит покровное стекло, прикрепляемое с помощью вазелина
пли парафина. На нижнюю поверхность покровного стекла до
заделки камеры наносится капля с исследуемыми организмами.
Для изолирования отдельных клеток микроорганизмов и их
спор, а также для экспериментального исследования клеток
(состояния оболочки, цитоплазмы, вакуома) нередко пользуются
микроманипулятором. Этот прибор состоит из системы
микрометрических винтов, двигающих в разных плоскостях тончайшие
стеклянные иголочки, крючочки и пипетки. Для
микробиологических целей наиболее пригодны микроманипуляторы системы
Чемберса (Chambers).
Для захватывания покровных стеклышек служат пинцеты
Корнэ (рис. 12).
20
Рис. 13. Флаконы для кедрового
масла. В правом — масло
содержится во внутреннем узном
вместилище, а в наружном налит
бензин.
Кедровое масло хранится в особых двойных склянках (рис. 13).
Наружная склянка содержит также запас бензина для
протирания системы после масла. При этом надо иметь в виду, что
кедровое масло (Oleum juniperi virginicae) имеется в продаже двух
сортов: одно, сгущенное с
показателем преломления 1.52, служит
в качестве иммерсионной
жидкости, а другое, не сгущенное,
употребляется для просветления
гистологических срезов и не годится
для иммерсионных систем.
Следует избегать пользоваться
суррогатами иммерсионного масла.
Служащий для заделки
канадский бальзам удобнее всего иметь
заключенным в металлические
трубки или в склянки с
колпачками вместо пробок.
Для хранения спирто-водных
растворов красок служат
склянки с пипетками, помещающиеся в особых штативах (рис. 14 и 15).
Если препараты микробов представляют научную ценность
и их желательно сохранить, пользуются ящиками (рис. 16) или
папками для препаратов (рис. 17 и 18), где они регистрируются
и сохраняются впрок.
Для обнаружения
субмикроскопических
организмов или
тонких структур, не
различаемых в наиболее
сильные ив
современных микроскопов,
служат
ультрамикроскопы, отличающиеся
от обыкновенных
микроскопов способом
освещения препарата.
В ультрамикроскопе
применяется принцип
яркого бокового
освещения с помощью
сильного источника света (лампа «лилипут)), лампа точечная и др.)>
вследствие чего получаются изображения на темном фоне (рис. 19).
Имеется много моделей ультрамикроскопа, начиная с
громоздкой установки Зигмонди (Zigmondi) и оидентопфа (Siedentopf),
имеющей теперь историческое значение, и кончая совершенно
простым приспособлением в виде конденсора, накладываемого
на столик обыкновенного микроскопа или помещаемого под ним.
21
Рис. 14. Деревянный штатив с 8 склянками для
красок.
Рис. 15. Флаконы для красок с пришлифованными
пипетками и резиновыми сосочками.
Рис. 17. Картонная папка для хранения 20
микроскопических препаратов.
Сжеаа — ааврнтая, оправа — открытая.
ГеИн;я1білпереВЯННЫЙ ящик Для
«Ранения 100 микроскопических
препаратов.
22
Рис. 18. Картонный ящик для
хранения микроскопических препа*
ратов.
Очень удобны комбинированные светло и тбмяопольные
конденсоры, допускающие переход от обычного мякроскопирования
(в светлом поле) к ультрамикроскопии (в темном поле) без смены
конденсора простым передвижением рычагов диафрагмы-ирио.
Наиболее совершенный тип — параболоид-конденсор Аббе о
центральным затемнением. Этот параболоид вставляется вместо
осветителя Аббе. Предметные стекла должны быть из лучшего
стекла и совершенно чистыми, без царапины* При
рассматривании между линзой параболоид-конденсора и предметным
стеклом помещается капля кедрового масла. Для микроскопирования
служат сильные сухие системы, например апохроматы с фокусным
расстоянием в 4 и 3 мм, ахромат с собственным увеличением 40 х
и 60 х, объективы № 7 Рейхерта
(Reichert) и Лейца (Leitz).
Иммерсионные системы с
апертурой выше единицы должны быть
снабжены диафрагмами (ирис или
воронкообразными), уменьшающими
апертуру.
Ультрамикроскопические частицы
становятся заметными в виде ярко
светящихся точек на темном поле.
Обыкновенный микроскоп открывает
тысячные доли миллиметра, а
ультрамикроскоп — миллионные.
Ультрамикроскопом пользуются
и для изучения обычных
микроскопических объектов. Так, с помощью
ультрамикроскопа удобно изучать
движение бактерий, явление
агглютинации и т. п. Очень эффектные
картины дает наблюдение движения спирохет возвратного тифа
в крови (рис. 19) и бледной спирохеты в материале из
сифилитических язв.
Рис 19 Возбудитель
возвратного TH(J)a(Spirochaeta Obermei-
егі) в крови больного На ряду
со спирохетами видны красные
и один белый кровяные шарики.
Полезным подспорьем при бактериологических
исследованиях служит микрофотография, дающая точное изображение
микробов. Комнату для микрофотографических снимков лучше
устраивать в нижнем этаже здания, подальше от улицы — во
избежание сотрясения аппарата. Более сложные и дорогие, но
зато и более совершенные микрофотографические аппараты,
например большой горизонтальный аппарат, располагаются
горизонтально на двух столах: на одном — освещение и микроскоп,
на другом — камера. Более дешевые и простые аппараты
устанавливаются вертикально и гораздо удобнее в обращении (рис.
20). Весьма удобны микрофотографические насадочные камеры
типа «Фоку» («Phoku»), «Контакс» («Contax») и т. п. (рис. 2і).
Источником света для микрофотографии служат сильные
23
низковольтные лампы, точечные лампы (PunktUcht) или
электрическая дуговая лампа. Источник света располагается в
расстоянии около 35 см от микроскопа (в горизонтальных аппаратах —
дальше). С помощью системы линз и диафрагм пучок центральных
лучей света пропускают через входное отверстие конденсора
Аббе, диафрагма которого закрыта на 1j2: фокус лучей должен
сходиться в плоскости препарата.
Рис. 20. Вертикальный микрофотогра- Pj*c. 21.
Микрофотографический аппарат. фическая насадочная
камера.
По пути к микроскопу свет фильтруется, гДроходя через
стеклянные кюветы с плоскими стенками, наполненные одной из
следующих жидкостей, предложенных Цеттно^ым (Zettnow):
і) сухой азотнокислой медью . 160 г 2) медным купоросом . . . 175 г
чистой хромовой кислотой. 14 двухромово«ислым калием 17
дестиллированной водой . 250 см8 серной кислотой .... 2 см*
дестиллироранной водой . 250
Растворы эти пропускают, главным образом, желтые и желто-
зеленые лучи, по отношению к которым обыкновенные пластинки
мало чувствительны. Следует поэтому брать ортохроматические
пластинки, светочувствительный слой которых окрашен эритро-
зином в красный цвет.
При освещении дуговой электрической лампой жидкости
%4
Цеттнова употребляются в неразбавленном виде. При более слабом
освещении, например Ауеровской лампой, жидкости вдвое
разбавляются водой, чтобы не удлинять чрезмерно
продолжительность экспозиции.
Весьма удобны для фильтрования света светофильтры
советские, а также английской фирмы Реттен (Wratten) в Уэйнрайт
(Wainwright). Имеется серия их для лучей различной длины.
Состоят они из слоя окрашенной в различные цвета желатины,
заключенной между двумя стеклянными пластинками.
Для снимков бактерий пользуются апохроматом с фокусным.
1"
расстоянием в 3 мм или ахроматом в— . При малом вертикальном
і it
аппарате в первом случае берут компенсационные окуляры,
а во втором —окуляры Гюйгенса. При большом горизонтальном
аппарате Цейсса применяют проэкционный окуляр с раздвижным
винтовым ходом. Таких окуляров имеется два: № 2 и № 4. Раз-
движение окуляра может быть установлено эмпирически по
резкости изображения, отбрасываемого на матовую пластинку камеры.
Для определения степени увеличения на матовую пластинку
фотографической камеры отбрасывается изображение «объект-
микрометра», т. е. предметного стекла, в средней части которого
наклеено круглое покровное стеклышко с начерченным на нем
миллиметром, разделенным на 100 частей. Если 10 делений объект-
микрометра (=0.1 мм), отброшенные на матовое стекло, займут
на нем длину в 100 мм, то увеличение — в 1000 раз, при котором
бактерии обычно и снимают.
Большой горизонтальный микрофотографический аппарат
должен быть точно центрирован, т. е. все части его — освещение,
микроскоп и камера — должны находиться на одной оптической
оси: Проще всего это достигается с помощью бечевки, которую
туго натягивают, пропустив через всю установку (с микроскопа
снимают оптические части). Один конец бечевки укрепляют
в месте источника света, а другой — в центре кассеточного
отверстия камеры, в которое вставляют кусок толстого картона и
в центре его укрепляют бечевку.
Препараты для фотографирования сильно окрашивают гек-
цианвиолетом, фуксином, по Граму (Gram), серебром и т. п.
Слабая окраска метиленовой синькой мало пригодна для
фотографирования.
Для снимков, особенно со светофильтрами''(см. выше),
необходимо употреблять ортохроматические пластинки, чувствительные
к зеленым и желтым лучам.
Время экспозиции зависит от силы освещения, густоты
препарата и пр. При слишком продолжительной экспозиции может
пострадать установка препарата, и изображение получится нерезкое.
Подробные сведения по микрофотографии, проявлению и
печатанию снимков можно найти в специальных руководствах (см.
литературу).
25
ГЛАВА IT
АППАРАТЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, МЕТОДЫ
СТЕРИЛИЗАЦИИ
1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ПОСУДА И АППАРАТЫ
Приспособление для посева
Для заражения питательных сред чаще всего служат
платиновые иглы, петли и шпатели-иглы (рис. 22), вставленные в
металлические или стеклянные держалки. Для приготовления
посевной платиновой иглы кусок платиновой
проволоки, длиною в 8 см и диаметром около
0.4—0.5 мм, вставляют в расплавленный
конец стеклянной палочки или зажимают
в алюминиевую держалку Колле (Kolle)
(рис. 23). Для приготовления петли конец
платиновой иглы загибают завитком
(диаметром около 3 мм). Весьма удобен
платиновый шпатель, приготовляемый из
толстой иглы расплющиванием конца ее (рис. 22).
До и после посева платиновые иглы и
петли медленно проводят через пламя га-
80Вой горелки (их лучше держать при
этом вертикально) для уничтожения
оставшихся на них микробов. Правило это
необходимо соблюдать самым строгим образом,
с каким бы материалом ни имелось дело.
При этом обжигают не только самую иглу,
но и примыкающую к ней часть держалки,
вводимую при посеве внутрь сосуда.
Платиновые иглы служат для отвивок
из колоний, для заражения уколом в
плотную среду и т. п., платиновые петли — для
пересевов из жидкости, игла шпатель —
для снятия налета бактерий с поверхности
плотной среды. Вместо платиновой иглы
можно пользоваться хромникелевой проволокой. Нередко для
зараж *ния жидким материалом пользуются пипетками Пастера,
т. е. гытянутыми в капилляр стеклянными трубками (рис. 24).
26
а
Рис 22. Платиновые
иглы различной
формы
а —острая, Ь—пряной
шпатель о — закругленный
шпатель ж d—ланцет
Конец капилляра запаян, а другая сторона трубки закрыта
ватной пробкой. В таком виде пипетки стерилизуются. х Перед
посевом конец капилляра проводят через пламя, обламывают
прокаленным пинцетом и через капилляр засасывают внутрь пипетки
ft
Рис 2'і
Платиновые иглы с
держалками —
металлической
(слева) и стек-
ляннойсправа.
П
И
1
V
Рис. 25 Заражение
поверхности плотной питательной
среды в чашке Пеіри изогнутой
под прямым углом стеклянной
палочкой (шпатель Дригаль-
ского)
Рис 24
Пипетка
Пастера-
Ру.
Ряс. 26.
Препаровальные иглы
Рис. 27. Пинцет и
ножницы для
микроскопических работ.
посевную жидкость, которую затем выдувают в засеиваемый
сосуд.
Для больших посевов можно пользоваться стерилизованными
стеклянными трубками или градуированными пипетками.
1 Из стеклянной трубки, диаметром в 7—8 мм, вырезают отрезки
длиной в 20—25 см Слегка оплавив конец, затыкают отверстия ватой, вводя
ее в трубку на і лубину до 2 см, и в таком виде трубки стерилизуют сухим
жаром Когда нужна пипетка, среднюю часть трубки вытягиваюі в капилляр
длиною в 40—50 см, которые затем переплавляют в средине Таким образом
оолучаются две стерильные пипетки
27
Распределение посева равномерным слоем по иоверхност
плотной питательной среды производят изогнутой под углом сте
клянной палочкой (рис. 25).
Волосные капилляры удобны для отвивки из мельчайших
колоний, которые не удается захватить иглой. Капилляром
делают укол в колонию, и затем конец капилляра с вошедшим
в него посевным материалом обламывают в засеиваемом сосуде.
Иногда требуется предварительно расщепить посевный
материал, например полусгнившую бумагу и т. п. В этих случаях
пользуются препаровальными иглами (рис. 26), пинцетами и
ножницами (рис. 27).
Сосуды для культур
Пробирки
Обычный размер пробирок — длина 16 см, диаметр 16 мм
(в дюймах 6Xj). He бывшие в употреблении пробирки отдают
много щелочи, переходящей в питательную среду. Во избежание
этого их следует до употребления прокипятить со слабым
раствором соляной кислоты или с водным раствором, содержащим 6%
К2Сг207 и 6% крепкой H2S04. Для пробирок и вообще для бак
териологической посуды берется особым образом отпущенное
стекло, не мутящееся при стерилизации.
В каждую пробирку наливают около 1.4—1.3 ее объема пита
тельной среды. Для плотных сред, застывающих при наклонном
положении пробирки, берется меньшее количество, для жидких
сред — большее.
Не лишен значения способ приготовления ватных пробок для
пробирок и колб. На рис. 29 дано изображение трех ватных
пробок; одна сделана правильно, две другие — нет. На рис. 28
показан способ их приготовления. При вынимании пробок следует
их вращать, чтобы оторвать от стекла приставшие полоски ваты.
При простом вытягивании из пробирки пробка часто
растрепывается и часть ее остается в горлышке сосуда.
Для культивирования микробов на ломтях картофеля служат
широкие пробирки с перетяжкой внизу (рис. 30), а для
анаэробных культур — с такой же перетяжкой и с отводной трубкой
для выкачивания воздуха (рис. 31).
При стерилизации сухим жаром пробирки помещают в
металлические корзины (рис. 32) или обвертывают «лимонной бумагой)).
В термостате засеянные пробирки хранятся в папочных
коробках (рис. 33).
Для более быстрого обозрения серии зараженных пробирок
их помещают в обыкновенном деревянном штативе, употребляемом
в химических лабораториях.
28
¦*'*&**' -
Рис. 28. Приготовление ватных пробок.
Слева — плоский кусок ваты, в средине — он зк? после загиба краев, еирма — вкатывание дробкя.
^м/
Рис. 29, Слепа— правильно
сделанная ватная пробка, в средине
и справа — вид пробок,
приготовленных неправильно.
Рис. 32.
Проволочная корзина
для помещении
пробирок при
стерилизации.
rji
•\
/
Рис. 30.
Пробирка
Глобига для
культуры
микробов на
картофеле.
Рис. 31.
Пробирка
Ру Для
культуры
анаэробов.
29
Рис. 33. Слепа направо: колба Виноградского с картофельной пластинкой
впереди, эрленмейеропская колба с пипеткой, флакон Сойки с гигантской
колонией дрожжей, колба Креслинга, чашка Петри, эа ней папочная-
коробка с пробирками.
К
Рис. 35. Видоизменение чашки Петри. Крышка из желто-
бурого стекла, защищающего разводку от действия света.
Рис. 34. Чашка Петри,
Рис. 36. Культура бактерий
на разрезанных пополам
клубнях картофеля, помещенных
в двойной чашке Эсмарха.
Рис. 37, Двойная чашка
Эсмарха.
Двойные чашки
Они были предложены Петри (Petri) в 1887 г. (рис. 34) и теперь
всюду применяются для изолирования микробов на плотных
средах, заменив менее удобные пластинки Коха (Koch).
Обыкновенный размер чашек Петри: диаметр 8—10 см, высота 1.5 см.
Для музейных культур предпочтительнее брать чашки с
диаметром в 15 см. На рис. 35 дается изображение видоизмененной чашки
Петри.
Культура на ломтях картофеля ведется в малых чашкам
Петри диаметром в 5—7 см и высотой в 1—3 см. На рис. 36 изо
бражена двойная стеклянная чашка с
содержащимися в ней 7 ломтями картофеля с разводками на
них.
При продолжительном хранении в чашках
Петри питательные среды подсыхают и
растрескиваются. Чтобы избежать этого, их помещают во
влажной камере. Для этого служат большие
кристаллизационные чашки, представляющие собой те
же чашки Петри, но больших размеров и высокие
(диаметр 25 см, высота 8—9 см). Они носят
название чашек Эсмарха (Esmarch) (рис. 37). На дно
чашки кладут несколько кружков
фильтровальной бумаги, смоченных водой или, во избежание
развития плесени, 2.5% раствором медного
купороса. Затем кладут пустую чашку Петри, а на
нее — чашки с культурой, после чего
кристаллизационную чашку закрывают.
Для анаэробных культур в пустоте влажной
камерой может служить эксикатор с 2.5%
раствором медного купороса на дне. Если в
эксикаторе хранятся пробирки, то ватные пробки
необходимо хорошо обжечь, во избежание развития
плесеней (особенно при продолжительном
хранении). Если и это не помогает, то, по Бредеману (Bredemann),
обожженные пробки смачивают сверху кисточкой, смоченной
спиртовым раствором салициловой кислоты г и затем выдерживают
1—2 часа при 28° для испарения спирта. Оставшаяся на вате
салициловая кислота препятствует развитию плесеней; по Го-
лицинскому, от развития плесневых грибков на ватных пробках
предохраняет смачивание пробок из гигроскопической ваты
раствором парафина в эфире.
Бродильные трубочки Каша-Дургама (Durgham)
6—8 см3 жидкой питательной среды, например мясопептон-
ного бульона с 1% виноградного сахара, наливают в
обыкновенную пробирку, в которую затем опускают вверх дном другую
1 1 г на 100 см3 спирта.
Рис. 38.
Бродильная
трубочка Каша-
Дургама.
Si
маленькую пробирочку (8x0.8 см) (см. дальше—спиртовое
брожение). Закрыв большую пробирку ватной пробкой,
стерилизуют в автоклаве (до закрытия крана автоклава надо
продолжительное время выпускать пар, чтобы удалить из маленькой
трубочки последние следы воздуха). По окончании стерилизации
и охлаждения жидкости вся маленькая трубочка должна быть
сплошь наполнена ею. Если этого не удалось достигнуть,
повторяют стерилизацию, поместив пробирку в автоклаве в наклонном
положении для облегчения выхода воздуха.
Выделяющийся при брожении газ собирается в верхней части
маленькой пробирки, которая всплывает при этом над поверх-
Слеаа— о культурой В. сЫі (выдо- гпь. tu.
певме гава), справа — о куль- Слева (а)—* бродильный аппарат Эйнгорна-Смита, онра~
турой в. typhi (нет газа). ва (Ь)^— бродильная трубка Дунбара.
Аппарат Эйнгорна-Смита (Elnhorn-Smith)
Расширенная часть этого аппарата (рис. 39) должна быть таких
размеров, чтобы в ней могла вместиться вся жидкость из закрытого
колена трубки; иначе, при энергичном выделении газа, выдавленная
жидкость может частью вылиться из аппарата. Питательным
раствором наполняется все закрытое колено и небольшая часть
открытого, до расширения. Если после стерилизации в закрытом колене
останется пузырек воздуха, его выгоняют осторожным наклонением
аппарата. Недостаток аппарата — в трудности его очистки.
Трубка Дунбара (Dunbar)
Запаянная с одного конца стеклянная трубка, длиной в 30 см
и шириной в 0.8 см, изогнута под углом в 40° таким образом,
чтобы длина закрытого колена была 20 см, а открытого — 10 см
-32
(рис. 40). При стерилизации закрытое колено кладется
горизонтально, будучи наполнено средой. Если после стерилизации
останется в нем пузырек воздуха, его выгоняют наклонением трубки.
Рис. 41 Колба Виноград-
ского для аэробных
культур.
Рис. 42. Колба Креслинга.
При энергичном брожении часть жидкости может быть выброшена
газом из открытого колена, что при работе с патогенными
бактериями не безопасно.
Чтобы избежать выбрасывания
жидкости из открытого колена,
в настоящее время применяются
несколько измененные бродильные
трубки, у которых длина
закрытого колена равна 10 см, а
открытого — 20 см. Стерилизация трубок
производится без особых
предосторожностей. Трубки помещаются
в простые и очень удобные
специальные штативы — металлические
или деревянные.
Колбы для культивирования микробов
Для культуры аэробных
микроорганизмов часто применяются
укороченные эрленмейеровские
колбы с широким дном (колба
Виноградского — рис. 41) или
колба с цилиндрической нижней
частью (колба Креслинга—рис.42),
но можно пользоваться и обыкновенными
Рйс. 43. Бродильная колба
с отводной трубкой для
собирания выделяющихся газов.
э р ленмеиеро вскими
колбами, а за неимением их — и обычными химическими (рис. 33).
Для анаэробных культур пригодны бродильные колбы с длин*
ным горлом. Их наполняют доверху питательным раствором и
3 Руководстве по иикр?биодогяк ***
Рис. 44. Плоские колбы Сойки.
Слева — толстостенная с шлифованными ст?нкаян,
справа — из тонкого стекла.
Рис. 45. Флакон Сойки
с гигантской колонией
Bad. violaceum на мясо-
пептонном агаре.
Рис. 46. Колбочки ГТастера различной формы.
Рис. 47.
Четырехугольная склянка Линднера
для массовых культур.
Вверху склянка с
тонким ровным слоем
плотной среды, внизу — с
косым слоем.
Рис. 48, Флакон Ру для массовых
разводок.
закрывают каучуковой пробкой1 с проходящей через нее
изогнутой трубкой для собирания газов (рис. 43). Запасная колба В
служит в качестве приемника для жидкости, вытекающей из
бродильной колбы А при стерилизации. Когда колба А
стерилизована и заражена, колбу В отнимают и загнутый нижний конец
отводной трубки погружают в ртутную ванну для собирания
газов. Чтобы исключить диффузию воздуха через каучуковую
пробку, ее иногда покрывают ртутью (С).
Очень демонстративны музейные культуры в плоских
сосудах Сойки (Soyka) с шлифованными сторонами (рис. 44). Их
особенно можно рекомендовать для выращивания гигантских
колоний, так как в чашках Петри последние часто загрязняются
плесенями. Заражать надо среднюю часть среды, которая должна
быть подсохшей, иначе колония расплывается по всей поверхности.
Когда гигантская колония приобрела характерный вид, горлышко
колбы заливают сургучом или парафином или же замазывают
пластелином (рис. 45).
Для сохранения посевного материала впрок служат пастеров*
ские колбочки различной формы (рис. 46); для массовых разводок
на плотных средах — флаконы, изображенные на рис. 47 и 48.
В число предметов снаряжения бактериологической
лаборатории входят также многие мелкие предметы из обычного
инвентаря химических лабораторий: газовые горелки, электрические
нагреватели, водяные бани, эмалированные кувшины и кастрюли,
таганы, фарфоровые чашки и тигли, термометры, эксикаторы,
измерительные пипетки, цилиндры и колбы, воронки, склянки и
.банки с притертой пробкой, химические стаканы и т. п. На
описании этих предметов мы не будем останавливаться в виду
их общеизвестности.
Еоллодийные мешки, пергаментные трубки и диффузные гильзы
Первые нередко применяются при работах с патогенными
бактериями. Их готовят одним из следующих способов.
Обыкновенную пробирку обливают снаружи толстым слоем
тройного коллодия. Когда он подсохнет (но не высохнет
окончательно), ножом обрезают верхний край и слой коллодия снимают
с пробирки выворачиванием наизнанку. Мешок опускают в воду
и стерилизуют. Затем в него вводят разводку бактерий, и верхнюю
часть мешка завязывают и заливают коллодием. В таком виде
культура может быть введена, например, в брюшную полость
животных для наблюдения за действием ядов, выделяемых бактериями.
Другой способ предложен Келлерманом (Kellerman). 10 г
1 Для предохранения каучуковых предметов от высыхания и порчи их
хранят в закрытых металлических коробках в прохладном
помещении.Вулканизированный каучук можно хранить под водою. Особенно вредны для
каучука сухой воздух и свет. Слегка подсохший каучук можно вновь сделать
эластичным, погрузив его на некоторое время в 5% аммиак, нагретый до 40°,
и размяв.
3* 3S
нитроклетчатки растворяют в смеси 150 см3 крепкой уксусной
кислоты и 50 см3 абсолютного этилового спирта. г Немного этой
жидкости наливают в пробирку и вращением последней в
горизонтальном положении равномерно распределяют по стенкам ее
(избыток сливают). Пробирку оставляют, отверстием вниз,
подсыхать — от нескольких минут до одного часа. Чем больше
масса высыхает, тем она становится плотнее и менее
проходимой для бактерий и вообще для взвешенных в жидкости
коллоидальных тел. Когда слой коллодия высохнет до нужной
степени, в пробирку наливают воду и вытягивают коллодийный
мешок. В него наливают питательный раствор, стерилизуют
в автоклаве, заражают и конец закрывают, как описано выше.
Для опытов диализа хорошо служат пергаментные трубки.2
Перед употреблением в дело необходимо тщательно их испытать
на целость. Если окажется небольшое отверстие, его можно
смазать жидким белком и свернуть последний осторожным
нагреванием. Способ проверки пергаментных трубок на целость описан
в главе о нитрификации.
Можно получить пленку для диализа, погружая
фильтровальную бумагу в раствор коллодия в концентрированной уксусной
кислоте. Дав стечь жидкости, бумагу погружают в воду. Иногда
пропитывают бумагу 3—4% раствором желатины.
Весьма распространены за границей диффузионные гильзы,
изготовляемые фирмой Шлейхе и Шюлль (Schleiche u. Schull).
Они не должны пропускать коллоидов. Испытание можно
производить, наполняя их белком или пептоном: первый задерживается,
второй проходит.
Для проверки на белок приготовляют 5% раствор яичного
белка и из отстоявшейся жидкости 5 см3 переносят в промытую
в течение получаса проточной водой гильзу, не касаясь краев
ее, а поверх наливают слой толуола в 0.5 см высотою,
Снаряженную таким образом гильзу переносят в небольшую эрленмейеров-
скую колбу, в которую налито 20 см3 дестиллированной воды и
поверх — слой толуола. Покрыв колбу часовым стеклышком,
ставят ее в термостат при 37° С на сутки, по истечении которых
испытывают диализат на содержание белка с помощью биурето-
вой реакции (см. «Приложение» в конце книги). Гильзы,
пропускающие через свои стенки белок, бракуются как негодные.
Выдержавшие это испытание гильзы исследуют па пептон.
Гильзу прополаскивают в течение часа в проточной воде и 15
сек. в кипятке. Внеся в нее 5 см3 0.5% раствора пептона,
поступают далее, как было описано для белка. Через сутки к 10 см3
диализата прибавляют 0.2 см3 1% раствора нингпдрина и кипя-
1 Для растворения 10 г нитроклетчатки может служить также смесь 12 г
эфира и 28 г абсолютного спирта.
2 Для приготовления в лаборатории пергаментной бумаги плотную
фильтровальную бумагу быстро пропускают через смесь: 4 части H2S04-f-l часть
Н20, после чего промывают водой до исчезновения реакций на H2S04;
образующийся амилоид пропитывает бумагу, цементируя ее.
Зв
тят в пробирке в течение 1 мин. Смотря по количеству диализи-
рованного пептона, появляется фиолетовое окрашивание
различной густоты. Если пептона не оказывается вовсе, гильза
выбрасывается как негодная.
Выдержавшие оба испытания гильзы промывают сутки в
проточной воде, затем полминуты в кипятке и сохраняют в банках
с притертой пробкой в воде под слоем толуола.
Центрофуги
Центрофуги служат для отделения взвешенных в жидкости
частиц от самой жидкости, что удается лишь при заметной
разнице в удельных весах. Центрофуги имеются с ручным
(рис. 49), водяным и электрическим
двигателями. При пользовании центро-
фугой следует обращать внимание на
одинаковую нагрузку пробирок, иначе
ход аппарата будет неправильный,
с толчками, и центрофуга подвергается
порче. Пробирки, в которые наливают
центрофугируемую жидкость, делаются
из толстого стекла и снабжены нередко
сужением: в нижней части^ где
собирается осадок.
Термостаты
Термостатами называются
деревянные или металлические шкафы,
служащие для выращивания микробов
при постоянной температуре, которая
устанавливается с помощью особых
приспособлений, носящих название
терморегуляторов. Последних имеется Рис 49. Центрофуга для
много типов. На принципе неодина- 4 пробирок с ручным дви-
кового расширения различных метал- гателем.
лов основано устройство
терморегулятора Ру (Roux) (им снабжен большой термостат Ру). Он
состоит из двух толстых полос цинка и стали, спаянных между
собою и изогнутых в виде буквы (J (или прямых). Одно из колен
прочно фиксировано, а другое свободно движется при перемене
температуры вследствие неодинакового сокращения обоих
металлов. Это колено соединено с особым приспособлением,
увеличивающим приток газа к горелке, смотря по тому, в какую
сторону движется свободное колено регулятора.
Имелось два главных типа термостатов: воздушные и
водяные. Первые нагреваются теплым воздухом, проходящим по
системе медных труб вдоль термостата. Таков термостат Ру (рис. 50).
Водяные термостаты снабжены двойными стенками, в
промежутке между которыми находится теплая вода.
37
Для нагревания термостатов служат газовые горелки. Где
газа нет, можно пользоваться угольными электрическими
лампочками или керосиновыми лампами. Теперь распространены почти
исключительно электрические термостаты.
Полезно иметь в лаборатории термостаты, установленные на
разных температурах:
а) при работе с патогенными микробами и некоторыми сапро-
фитами необходим термостат, установленный на 37°;
б) лучшая температура
для большинства сапрофитов
28° или 30 — 35°, и в этих
пределах должен быть
установлен отдельный термостат;
в) для хранения
желатиновых культур температура
не должна превышать 20—
22°. В лаборатории можно
найти место (на термостате
или под ним, возле горелок),
где температура
соответствует этому.
Не следует двери
термостата держать долго
открытыми во избежание
охлаждения его. Вынув культуру
для просмотра, надо тотчас
же закрыть двери термостата,
а не рассматривать ее при
раскрытых дверях, как часто
делают.
В больших лабораториях
устраиваются отдельные
термостаты комнаты, где могут
вестись массовые разводки.
Это необходимо в
технических лабораториях,
приготовляющих различные бак-
те риальные препараты в
больших количествах
(туберкулин, маллеин, различные
токсины и т. п.).
В тех случаях, когда в термостатной комнате не только
выращивают бактерии, но ставят опыты, требующие определенной
температуры и в то же время, например, нужно собрать
продукты выделения бактерий (газообразные), устраивают в комнате
водопровод с раковиной и электропроводку для
нагревательных приборов.
Рис. 50. Воздушный термостат Ру.
Теплый воздух от имеющихся внизу
горелок проходит по медным трубам
вдоль всего термостата, выходя через
верхнее отверстие.
№
2. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПРИБОРОВ, СОСУДОВ И СРЕД
Стерилизация сухим жаром
Мелкие лабораторные предметы, как платиновые иглы,
пинцеты, ножницы и пр., стерилизуют нагреванием на пламени
бунзеновской горелки. Обеззараживание сухим жаром более
крупных предметов и большого количества мелкой стеклянной
посуды—пробирок, чашек Петри и пр.—производится в печи
Пастера (Pasteur) (рис. 51). Так
называется обложенная снаружи асбестом
печь с двойными стенками из
листового железа и с медным дном. Печь
нагревается сильной газовой горелкой.
Имеются печи, нагреваемые
электричеством. Термометр, опущенный внутрь
печи, показывает температуру. Печь
либо прикрепляется к стенке, либо
снабжается ножками.
Для стерилизации пробирки
закрывают ватными пробками и в
проволочной корзине (рис. 32) помещают в
печь. Чашки Петри обвертывают
лимонной бумагой и складывают в печи
стопками по 5 чашек, обвернутых вместе
еще раз или помещенных в особые
медные футляры. Бумагу развертывают Рис 51 Печь ПастеТ)а с
только перед употреблением чашек в двойными стенками * для
дело. стерилизации сухим жаром
Нагревание производится в тече- стеклянной посуды.
ние 1—2 час. при 150—170°.
Поднимать температуру выше не следует, так как при 180° уже
начинают сильно буреть ватные пробки и бумага. Хорошо
стерилизованные пробирки узнаются по легкому побурению ватных пробок.
Стерилизация иаром и пастеризация
Стерилизуют паром предметы, изменяющиеся и портящиеся
от действия сухого жара, например различные питательные среды,
резиновые вещи и т. п. Но и действие пара не во всех
случаях применимо: например, по отношению к жидкостям,
содержащим спирт (спирт улетучивается), к сыворотке (свертывается)
и т. п. Этими особенностями различных субстратов, подлежащих
стерилизации, и объясняется разнообразие приемов стерилизации.
Пастеризация и тиндализация
Для стерилизации жидкостей, не выдерживающих высокой
температуры, Пастер предложил принцип частичного
обеззараживания при невысоких температурах, названный по его имени
пастеризацией. Прием этот основан на том, что большинство
бесспоровых микробов погибает при нагревании до 50—60° в
течение 15—30 мин. или до 70—80° в течение 5—10 мин. На практике
обыкновенно несколько удлиняют продолжительность
пастеризации. Так, для пастеризации молока его обыкновенно
нагревают при 70—75° в течение 30 мин. или при 80° в течение 15 мин.
и затем быстро охлаждают. В общежитии такое молоко иногда
называют стерилизованным, что неправильно, так как при
пастеризации значительная часть микробов выживает (споровые виды).
К числу наименее устойчивых к высоким температурам
микробов принадлежат холерные вибрионы. Другие виды, например
стрептококки и туберкулезные бациллы, напротив, отличаются
устойчивостью к высоким температурам, выдерживая нагревание
при 70° почти в течение часа.
В бактериологической практике пастеризацией нередко
пользуются для разделения споровых и бесспоровых видов бактерий.
Пастеризацию в этом случае можно производить при более
высокой температуре, например при 90°. В пастеризованной жидкости
остаются живыми лить споры.
Пастеризацию небольших количеств жидкости производят,
разлив эту жидкость пипеткой по
пробиркам и нагревая их в водяной
бане при нужной температуре. В
контрольную пробирку с водой
погружается термометр, чтобы определить
время, когда температура жидкости
достигнет нужного предела,— момент, с
которого считается время пастеризации.
Повторная стерилизация, имеющая
целью абсолютную стерилизацию
данной жидкости при невысокой
температуре, носит название тиндализации,
по имени английского ученого Тин да ля
(Tyndall), введшего этот прием. Идея
тиндализации заключается в том, чтобы
в промежуток между отдельными
пастеризациями дать спорам прорасти и
последующей пастеризацией убить
проросшие клетки. Однако практическое
значение этого приема очень ограничено
в виду неверности результата,
проистекающей от того, что не все споры
прорастают в промежутки между
нагреваниями, а, с другой стороны, часть
вегетативных клеток может вновь
образовать споры и в таком виде
противостоять действию высокой температуры.
Стерилизация текучим паром
Ее производят в течение 3 дней под ряд, нагревая
стерилизуемые предметы в кипятильнике Коха по — — ~ часа ежедневно.
Рис. 52. Кипятильник Коха
для стерилизации текучим
паром. Пар свободно
выходит черев щели неплотно
закрывающейся крышки.
Текучепаровой кипятильник Коха (рис. 52) представляет
собой цилиндр из оцинкованной жести, обложенный снаружи
каким-нибудь плохим проводником тепла —линолеумом, асбестом
или шерстяным войлоком — и закрывающийся сверху коническим
шлемом, свободно снимающимся. Дно делается из меди и имеет
вогнутую форму наподобие котла. В него наливают воду, а над ее
поверхностью устраивают подставку с отверстиями для
прохождения пара; на нее устанавливают стерилизуемые предметы.
В некоторых кипятильниках Коха имеется Приспособление для
поддержания в них постоянного уровня
воды.
Время стерилизации (от 3/4 до 1х/2 часа,
смотря по величине стерилизуемых
предметов) считается с момента энергичного
выделения пара из кипятильника. В виду
обильного парообразования кипятильник лучше
помещать в вытяжном шкафу.
Если в лаборатории имеется автоклав
(см. ниже), то его с успехом можно
приспособить и для стерилизации текучим паром,
так что в приобретении отдельного
аппарата пет особой яадо&ностя.
Стерилизация насыщенным паром иод
давлением
Это — наиболее надежный способ
стерилизации, производимой в герметически
закрывающемся толстостенном котле — так
называемом автоклаве (рис. 53). Автоклавы
бывают различных систем, но в общем они
построены так: массивная медная крышка
снабжена трубкою с краном для выхода
ьоздуха и пара, манометром для
определения величины давления пара внутри
котла и предохранительным клапаном для
выхода пара при повышении давления
свыше меры и для предотвращения
возможного разрыва котла. Пружину
предохранительного клапана обыкновенно
устанавливают таким образом, чтобы дать выход пару
при давлении, превышающем 2 атмосферы,
или при температуре свыше 120—121°.
На дно автоклава наливают воду, а над ней, на этажерке,
располагают стерилизуемые предметы. Автоклав нагревается
сильными газовыми спиральными горелками или электричеством.
Приводим цифры различных давлений и температур пара при разных
установках автоклава:
Рис. 53. Автоклав для
стерилизации
насыщенным паром под
давлением Вверху
слева —
предохранительный клапан, в
средине — манометр,
справа — кран для
выпускания воздуха
и пара.
41
Давление
Р
1.5 атм. і 112е
2 121
3 134
4 145
5 153
Надежная стерилизация достигается нагреванием при 120—
121° в течение получаса. Такой стерилизацией обычно и
пользуются в лабораторной практике. Иногда давление доводят до
3 атм. (134°), если стерилизуемый материал не портится при этой
температуре. При стерилизации жидкостей, содержащих сахар,
давление поднимают лишь до 1.5 атм. (112°) во избежание
карамелизации сахара.
Стерилизация в автоклаве ведется следующим образом.
Поместив на решетке автоклава стерилизуемые предметы, зажигают
горелку и герметически привинчивают крышку автоклава. Кран
оставляется открытым, пока весь воздух не будет выгнан парами
воды. Чтобы убедиться в этом, струю пара пропускают через
сосуд с водой. Если воздух еще имеется, то пар, проходя через воду,
издает треск. Необходимость полного вытеснения воздуха
диктуется тем, что убивающее бактерий действие насыщенного пара
сильнее, чем смеси пара с воздухом. Когда начинает выделяться
струя чистого пара, кран закрывают и следят за манометром,
стрелка которого начинает передвигаться. Когда он достигнет
нужного деления, например 2 или 3 атм. (121 или 134°), то
уменьшают огонь в горелке, чтобы давление дальше не повышалось,
и отмечают время начала стерилизации. По истечении 20—30 мин.
газ закрывают и ждут, когда стрелка обратным движением
достигнет своего исходного положения. Тогда осторожно открывают
кран и окончательно выравнивают давление снаружи и внутри
автоклава. Только после этого отвинчивают крышку автоклава
и вынимают стерилизуемые предметы. Если открыть кран слишком
рано, когда внутри автоклава еще значительное давление, то
стерилизуемая жидкость может вскипеть и выбросить ватные
пробки, которыми закрыты сосуды.
Холодная стерилизация
Метод «холодной стерилизации» Швейцера (Kaltsterilisa-
tionsmethode) основан на бактерицидном действии летучих
антисептиков в условиях бескислородного вакуума.
Сконструированный для этой цели аппарат (рис. 54) состоит из цилиндрического
толстостенного стеклянного сосуда а с плотно притертой крышкой.
Каучуковая пробка, закрывающая отверстие d в крышке,
соединена с ртутным манометром е. С помощью бокового отверстия с
наружный воздух, пройдя через три последовательно соединен-
1 Включительно с нормальным давлением одной атмосферы.
Следовательно, число прибавочного давления, сверх атмосферного, будет
везде на единицу меньше,
4%
ные склянки t, s и г с щелочным раствором пирогаллола> попадает
в сосуд. Второе боковое отверстие Ъ сцабжено двумя
стеклянными трубками: через одну из них д в сосуд проходят пары
антисептика, через вторую к производят выкачивание воздуха. Разме-
Рис. 54. Аппарат для холодной стерилизации по Швейцеру.
стив стерилизуемые объекты и плотно притерев крышку,
выкачивают из сосуда воздух и вслед за этим снова его наполняют возду-
хом3 освобожденным от углекислоты, кислорода и
микроорганизмов благодаря прохождению через склянки с пирогаллолом. Эту
операцию повторяют 3—4 раза. Выкачав в
последний раз воздух и проверив вакуум по маномэтру,
осторожным поворачиванием крана h впускают в
сосуд пары антисептика. Когда пространство
насытится парами, о чем узнают по появлению капель
антисептика, стекающих в подставленный стаканчик
/, закрывают кран и оставляют прибор на несколько
часов (2—6) в покое. Закончив, таким образом,
стерилизацию, приступают к удалению паров антисептика.
Для этого многократно в течение 1—2 часов
производят поочередно разрежение сосуда и. наполнение его
свежим стерилизованным воздухом. Для
окончательного удаления паров антисептика полезно просте-
рилизованные среды 2—3 дня выдержать в термостате.
Швейцер приводит перечень антисептиков,
подобранных им для стерилизации различного рода
материалов растительного и животного происхождения.
В опубликованной в 1937 г. монографии х дано
описание техники приготовления твердых и жидких
питательных сред для культивирования бактерий,
низших и высших грибов, водорослей и споровых расте-
г G. Sen wе і z е г. Einfuhrung in die Kaltsterilisationsmethode. Fischer,
Jena, 1937. Также «Arch, fur Mikrobiologie», B. 7, 1936. SS. 297—314.
Работа требует принятия некоторых мер предосторожности; в соседстве не
должно быть открытого пламени, нельзя курить; нельзя употреблять смеси
веществ, которые могут влиять друг на друга. В исключительных случаях
возможны небольшие взрывы.
42
Рис. 55.
Фарфоровая
свеча Пасте-
ра-Шамбер-
лана.
ний.Там же приведена аппаратура и методика ведения
стерильных культур высших растений и растительных тканей.
Из веществ, рекомендуемых для применения при стерилизации,
следует упомянуть формалин, этиловый эфир,
концентрированный раствор аммиака. Употребляются также смеси веществ.
Стерилизация фильтрованием через пористые перегородки
Для обеспложивания изменяющихся и легко портящихся
от нагревания жидкостей прибегают к фильтрованию через
мелкопористые перегородки, задерживающие микробов в своих
ходах. Чтобы заставить
жидкость пройти через такой
фильтр,пользуются разницей
давления по обе стороны его
стенок. Этого достигают
нагнетанием или выкачиванием
воздуха.
Пористые фильтры, или
«свечи», приготовляются из
разных материалов:
1) фильтрыПастера—Шам-
берлана из фарфоровой глины
(рис. 55);
2) Фильтры Нортмей-
ера — Беркефельда (North-
meyer — Berkefeld) из
инфузорной земли(кремнеземные);
3) фильтры Пукалля (Ри-
kall) в форме баллона из
плотной обожженной глины;
4) мягкие фильтры из
асбеста.
Большинство фильтров
приготовляют в виде полых
внутри цилиндров, закрытых
с одной стороны. Фильтры
бывают различной степени
пористости и проходимости
для жидкостей. Так, марка
В «свечей» Пастера — Шам-
берлана мелкопористая, а
марка F — крупнопористая;
по наблюдениям Розенталя, марка L лучше задерживает
бактерии. Поры свечей Беркефельда еще крупнее (марка W —
крупнопористая, N — нормально пористая и U — мелко-пористая).
Чем поры крупнее, тем быстрее идет фильтрование.
Фильтрование через свечи можно производить или снаружи
внутрь (рис. 56) или изнутри наружу (рис. 57).
Ы
Риг. 56. Аппарат
для фильтрования
малых количеств
жидкости.
Фильтруемая жидкость
наливается в
цилиндр, внутри
которого помещена
свеча открытым
концом вниз Из
эрленмеиеровской
колбы
выкачивается воздух, и
жидкость поступает в
нее, пройдя через
поры свечи. Весь
аппарат
предварительно
стерилизован в автоклаве.
Рис. 57. Аппарат
Китазато для
фильтрования. Из
верхнего баллона
фильтруемая
жидкость поступает
внутрь свечи;
просачиваясь через ее
стенки, она
попадает в нижний
приемник. Через
боковую трубку
выкачивается
воздух.
Перед употреблением фильтры стерилизуют кипячением в воде
или нагреванием в автоклаве. Обжигать их непосредственно
на огне, за исключением асбестовых фильтров, не рекомендуется,
так как они при этом легко дают трещины и приходят в
негодность. И при влажной стерилизации надо постепенно поднимать
температуру во избежание растрескивания фильтров.
Бывшие в употреблении свечи сначала промывают водой,
пропуская ее через стенки фильтра в направлении, обратном
тому, в каком происходило фильтрование. Таким путем удаляется
главная масса приставших к поверхности бактерий и слизи.
Если загрязненные фильтры сохранять некоторое время во
влажном состоянии, то бактерии и плесени проникают внутрь
капиллярных ходов, иногда проходя через
всю толщу стенок. Если при этом образуются
споры, то их затем трудно убить простым
кипячением. В таком случае приходится
стерилизовать свечи в автоклаве или сухим
жаром в муфельной печи. Главный недостаток
пористых фильтров заключается в их
хрупкости, трудности очистки и быстром заса-
ривании пор.
Если в стенках фильтра образовались
хотя бы мельчайшие трещины, он уже не
годен к употреблению. Контроль целости
стенок производится накачиванием воздуха
с помощью двойного каучукового баллона
в опущенную в воду свечу. Если в каком-
нибудь месте свечи через стенку проходят
пузырьки воздуха, то фильтром нельзя
пользоваться. Другой способ состоит в
пропускании через свечу взвеси какой-нибудь мелкой,
легко распознаваемой бактерии, например
В act. fluorescens liquefaciens.
Если в профильтрованной жидкости
окажется эта бактерия, фильтр пропускает.
Для фильтрования небольших количеств
жидкости применяется «свеча-лилипут» из инфузорной земли.
При фильтровании через свечи на их стенках остаются не только
взвешенные частицы, но и некоторые растворенные коллоидальные
вещества, например энзимы, токсины, красящие вещества и пр.
С другой стороны, мельчайшие бактерии, не видимые в
обыкновенный микроскоп, свободно проходят сквозь стенки этих фильтров.
Свечи иногда прилаживаются к водопроводным кранам для
очистки воды (рис. 58). Их неудобство заключается в медленной
фильтрации и необходимости частой очистки от приставшей грязи,
которая забивает поры и почти останавливает фильтрацию.
Методы химической стерилизации будут нами рассмотрены
в другом месте (см. гл. V).
Рис. 58. Свеча
Пасте ра-Шамберлана,
приделанная к
водопроводному крану.
3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Питательные среды бывают естественные и искусственные.
К первым принадлежат: молоко, яйца, картофель, морковь и т. п.
Ко вторым — искусственно составленные, как мясопептонные
среды.
Наиболее употребительные питательные среды должны
находиться в лаборатории для надобности занимающихся, но не
следует приготовлять впрок слишком больших запасов их, так как
они высыхают и становятся непригодными для дела. J3 запасе
должно находиться такое количество их, которое может быть
израсходовано примерно в 2—3 недели. Скоро высыхающие среды, как
картофель, морковь и др., лучше готовить по мере надобности.
Сохраняют среды в прохладном, защищенном от света и не
слишком влажном помещении. В сырости ватные пробки напитываются
влагой и через них прорастает мицелий плесеней, попадающих,
таким образом, внутрь стерилизованных сосудов. Вообще
необходимо обращать внимание на то, чтобы ватные пробки оставались
сухими. Если после стерилизации они увлажнились, их следует
быстро высушить над газовой горелкой или поставить на
несколько часов в термостат.
В каждой проволочной корзине или папке, где хранится та
или другая питательная среда, должен быть листок бумаги с
обозначением состава и времени приготовления среды.
Надо всячески остерегаться попадания в питательные среды
малейших следов дезинфицирующих веществ, которые поэтому
не должны храниться в сосудах, предназначенных для
приготовления сред. Равным образом не следует мыть руки сулемой или
карболовой кислотой при приготовлении сред.
Для более быстрого приготовления сред полезно иметь в
лаборатории 10% растворы различных солей: фосфорнокислого
калия, сернокислого магния, поваренной соли, сернокислого и
фосфорнокислого аммония, соды и др. в плотно закрытых склянках
во избежание высыхания. Из этих растворов отмеривают
определенные количества, которые и прибавляют к питательным средам (в 10
см3 указанных растворов содержится по 1 г соответственной соли).
Мы ограничимся описанием приготовления наиболее
употребительных питательных сред.
Мясопептонный бульон (МПБ)
Сначала приготовляют мясную воду следующим образом. 500 г
мелко изрубленного или измолотого на котлетной машинке
свежего мяса (лучше всего «котлетной мякоти»),1 освобожденного от
костей, сухожилий и жира, обливают в эмалированной кастрюле
одним литром водопроводной воды, нагретой до 50°, и оставляют
1 Наивысшими питательными свойствами обладает телятина; воловье
мясо — хуже, еще хуже — конина. Притом бульон из последней мутнее,
чем из воловьего мяса. Из мороженого мяса тоже получается мутный бульон.
46
в тепле на 0.5—1 час пли в холодном месте на 12 час.
Процеживают экстракт через марлю или холст и полученную жидкость
нагревают до кипения (можно — в коховском кипятильнике) в течение
30 мин. Свернувшиеся белки отфильтровывают через холстинку,
положенную на широкую стеклянную воронку. Затем платок
с находящимся на нем осадком отжимают, и жидкость еще раз
отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр в
литровый измерительный цилиндр. Недостающий до 2 л объем
доливают водопроводной водой. Полученную таким образом слегка
кислую жидкость выливают в полуторалитровую колбу, которую
закрывают ватной пробкой и стерилизуют при 120° в
течение 20 мин. В таком виде «мясная вода» может сохраняться
долгое время.
Для приготовления питательного бульона растворяют при
нагревании 10 г пептона х в 1 л теплой мясной воды и 5 г поваренной
соли. Еще горячую жидкость слегка подщелачивают содой до
посинения влажной красной лакмусовой бумажки. В присутствии
фенолфталеина щелочная реакция в этом случае еще не обнару-
1 Имеется много различных сортов пептона, представляющих собой смесь
альбумоз с истинными пептонами. Хороший препарат должен содержать
лишь первые продукты гидролиза белков с высоким частичным весом и быть
свободным от вредных примесей, В наибольшем употреблении были до сих
пор два препарата пептона: французский —Шапото (Chapoteaut) и немецкий—
Витте (Witte), приготовленный из фибрина. В настоящее время имеются
пептоны советского изготовления. В зависимости от взятого для приготовления
среды препарата пептона могут изменяться и получаемые результаты.
Так, по Гримберту (Grimbert), один и тот же микроб образует индол с одним
пептоном и не образует с другим.
Можноисамому приготовить пептон 6esособых затруднений. Приведем два
рецепта. 1) По Кронтовскому и Бронштейну, воловье или телячье мясо
тщательно очищают от жира, сухожилий и пр, и измельчают на котлетной
машинке. Свежие свиные желудки, очищенные от жира, остатков пищи и т. п., также
измельчаются на котлетной машинке; 1 кг измолотого мяса смешивают с 400 г
свиных желудков и помещают в большую бутыль, куда затем наливают 10 л
воды, к которой прибавляют 1% чистой соляной кислоты, уд. в. 1.124.
Бутыль закрывают и ставят в термостат при 37° на двое суток, причем время
от времени ее взбалтывают. Содержимое бутыли затем фильтруют через
марлю, фильтрат кипятят в течение 10—15 мин., пропускают через ватный фильтр,
нейтрализуют едким натром, нагревают до кипения и фильтруют через
бумажный фильтр. Полученный прозрачный раствор пептона можно разлить в
колбы, стерилизовать и сохранять неопределенно долгое время.
Для приготовления бульона к этому раствору пептона прибавляют равный
объем мясной воды, 0.5% поваренной соли и устанавливают слабощелочную
реакцию. 2) Пептон из свиных желудков, по Мартину (Martin),
приготовляется следующим образом. 200 г хорошо очищенных и размолотых на котлетной
машинке свиных желудков смешивают с 10 см3 очищенной крепкой соляной
кислоты и 1 л воды, и смесь оставляют на сутки при 50°. Под влиянием
пепсина происходит самопереваривание белков. Смесь нагревают до 100°,
фильтруют через вату, осторожно нейтрализуют при 80° едким натром до слегка
щелочной реакции. Нагрев до 120°, жидкость снова отфильтровывают и,
разлив по пробиркам, стерилизуют.
Для приготовления питательных сред полученный раствор пептона
смешивают с равным объемом мясного отвара (без соли),
47
живается. Она получается лишь при дальнейшем прибавлении
щелочи. Наиболее благоприятная для развития большинства
бактерий щелочность среды лежит между этими двумя пунктами.1
Обыкновенно после установки нейтральной реакции по лакмусу
прибавляют на 1 л бульона 1.5 г кристаллической соды или около
10 см3 нормального раствора соды.
Для более точной нейтрализации к5см3бульона приливают45 см3
воды, кипятят и еще горячую жидкость титруют децинормальным
раствором едкого натра в присутствии 1 см3 раствора
фенолфталеина до появления розового окрашивания, не исчезающего в
течение 5 мин. На основании полученных данных рассчитывают по-
потребное для нейтрализации всего бульона количество щелочи,
которая прибавляется в виде нормального раствора, но его
прибавляют на 5—10 см3 меньше, чем требуется по расчету. В
Америке в большом распространении шкала для обозначения
кислотности или щелочности среды в градусах. По этой шкале
обозначается число кубических сантиметров нормальной кислоты или
щелочи, потребной для нейтрализации 1000 см3 среды. Перед числом
ставится знак + , если среда кислая, требущая для нейтрализации
1 Приводим способ приготовления раствора лакмуса по Кюбель-Ти-
ману (Kubel-Tiemann). Растертый в порошке лакмус повторно обрабатывают
горячей дестиллированной водой и отфильтровывают. Фильтрат слегка
подкисляют уксусной кислотой и выпаривают на водяной бане до густоты сиропа,
но не досуха. Полученную массу постепенно разбавляют 90% спиртом,
сливают в колбу и обрабатывают избытком того же спирта. При этом осаждается
очень чувствительная к изменению реакции среды часть индикатора, в то
время как менее чувствительная часть и уксуснокислый калий переходят
в раствор. Осадок растворяют в дестиллированной воде при нагревании и
отфильтровывают; сохраняют в склянке с ватной пробкой. Лучше раствор
стерилизовать, иначе может развиться плесень.
Лзолитмин представляет собой очищенный препарат лакмуса. 2.5 г мелко
истертого азолитмина растворяютв 100 см3 дестиллированной воды при
нагревании в течение получаса. Фильтруют и, если нужно, стерилизуют в
течение 15 мин. ежедневно, Здня под ряд. Этот индикатор более стоек, чем лакмус
Весьма чувствительную лакмусовую бумагу готовят следующим
образом: 0.5 г мелко истертого азолитмина растворяют в 200 см3 дестиллированной
воды +22.5 см3 децинормального едкого натра. К отфильтрованному раствору
прибавляют затем 50 см3спирта. Этим раствором пропитываютхорошую, бедную
золой фильтровальную бумагу и, высушив ее на шнурке, разрезают на ленты.
Раствор фенолфталеина готовится растворением 0.5 г порошка
фенолфталеина в 50 см3 этилового спирта, к которому затем прибавляют 50 см3
дестиллированной воды или (по Гедройцу) і г фенолфталеина,растворенного в 100 см8
96° алкоголя.
Своеобразное отношение лакмуса и фенолфталеина к установлению
реакции бульона объясняется нахождением в последнем дифосфатов, т. е.
двуосновных солей фосфорной кислоты. В то время как монофосфаты с обоими
индикаторами показывают кислую реакцию, а трифосфаты — щелочную, дифос-
фаты с лакмусом показывают щелочную реакцию, а с фенолфталеином —
кислую.
Если питательную среду желательно получить слабокислой реакции,
прибавляют к ней фосфор в виде однокалиевой соли (КН2Р04); если же
желательна слегка щелочная реакция, берется двукалиевая соль (К2НР04). Для
исправления реакции слишком кислых или слишком щелочных сред
прибавляют к ним растворы соды и соляной, фосфорной или молочной кислоты.
48
прилития щелочи, и знак —, если среда щелочная, нуждающаяся
в прибавлении кислоты. Таким образом, знак + 15° будет
обозначать кислую среду, для нейтрализации 1 л которой требуется
15 см3 нормального раствора едкого натра, а —15°—щелочную
среду, требующую для нейтрализации столько же нормального
раствора соляной кислоты. Отношение различных микробов к
реакции среды не одинаково: так, холерный вибрион предпочитает
щелочные среды, а туберкулезный бацилл—слегка кислые. Об
определении активной реакции среды (рН) сведения имеются в
приложении.
Питательный бульон должен быть совершенно прозрачным.
Для его «осветления» осторожно вылитые белки двух яиц
сбивают в пену с двойным количеством воды; полученную массу
прибавляют к охлажденному до 50° бульону и тщательно с ним
смешивают. Бульон затем ставят на 30 мин. в автоклав. Белок
свертывается и увлекает из жидкости взвешенную муть.
Отфильтровав затем бульон через влажный двойной складчатый фильтр,
получают вполне прозрачную жидкость. Если первая порция
мутна, ее снова берут на фильтр. Упорно остающуюся муть можно
удалить кипячением с инфузорной землей или с обрывками
фильтровальной бумаги.
Прозрачный бульон разливают в пробирки и стерилизуют.
Бульон можно приготовлять также из мясного экстракта
Либиха (Liebig) (Extractum carnis Liebig г) или бульона Магги.
На 1 л водопроводной воды берут 10 г экстракта Либиха, 10 г
пептона, 2 г поваренной соли и 2 г фосфорнокислого калия. Двух
последних солей можно, впрочем, и не прибавлять в виду
содержания их в достаточном количестве в экстракте. Указанную
смесь нагревают в течение 1 часа в автоклаве, фильтруют, если
нужно — устанавливают реакцию и полученный бульон
осветляют, как описано. Бульон этот несколько уступает по
питательности мясному и темнее, чем он.
Фирмой Мерка (Merck) изготовляется сухой препарат из
бульона Магги, пептона и питательных солей (Ragit-Bouillon).
22 г этого бульона растворяют в 1 л водопроводной воды и
стерилизуют, разлив по пробиркам. Имеются в сухом виде и плотные
среды: Ragit-agar растворяют в количестве 45 г на 1 л воды. Эти
сухие среды очень удобны для экспедиций и полевых опытов.
Для получения бульона, совершенно свободного от сахара,
Смит (Smith) рекомендует заразить мясную воду кишечной
палочкой и оставить на ночь в термостате при 37° (не дольше 14—16 час).
Жидкость начинает бродить, и ее кислотность значительно воз-
1 Его готовят вывариванием 1 части мяса в 8—10 частях воды.
Отфильтрованный раствор сгущают до получения вязкой массы. Из 30 частей мяса
добывается t часть экстракта. Последний содержит около 60% органических
веществ: 23% воды и 17% минеральных солей. В состав органических веществ
мясного экстракта входят: клеевые вещества, креатин, кр?атинин, ксантия
и др. Из солей больше всего фосфорнокислого калия, много поваренной соли,
есть соли кальция, магнк,я, железа и пр.
4 Руководство во нлкробяодогяж «»
растает. Из такой перебродившей мясной воды готовится обычным
способом бульон. Для уверенности в том, что весь сахар в нем
сброжен, пробу бульона наливают в аппарат Эйнгорна и еще раз
заражают кишечной палочкой. Если сахара нет, брожение не наступает.
Для специальных целей и для культуры отдельных микробов
к бульону прибавляют различные примеси:
1) В большом употреблении бульон с 1—2% виноградного
сахара (глюкозы) —так называемый «сахарный бульон». Во
избежание карамелизации сахара среду стерилизуют не выше 110—112°.
2) Бульон с 3—6% глицерина.
3) Нейтральный бульон с прибавлением лакмусовой настойки
для обнаружения кислото- и щелочеобразования.
4) Бульон с фенолфталеином. Обычный раствор этого
индикатора (стр. 47) разбавляют водой в 20 раз и 0.5—0.7 см3 отого
раствора прибавляют к 5 см3 бульона. К агаровой среде прибавляют
1 см3 того же раствора фенолфталеина на 5 см3,
5) Бульон с оскулином. К мясопептонному бульону
прибавляют 0.1—0.5% эскулина и столько же лимоннокислого железа
(Ferrum ciiricum); бактерии, разлагающие эскулин, окрашивают
среду в черный цвет.
Для определения восстановительных свойств бактерий к 1 л
бульона прибавляют следующие вещества:
1) 10 капель (около 1 см3) 1% водного раствора метиленовой
синьки. Восстановление лучше идет на плотной среде, например
на агаре. Краска обесцвечивается.1
2) 12 см3 концентрированного водного раствора лакмуса. И в
этом случае восстановление (обесцвечивание) лучше идет на агаре.
3) 10 см3 2% раствора индигокармина, отдельно
стерилизованного. Краска обесцвечивается.
4) 10 см* 2% раствора теллуристого натрия (Natrium tellu-
rosum). Особенно хорошие результаты получаются на агаре
(на 1 пробирку агара прибавляют 2 капли 2% раствора).
Колонии бактерий, действующих восстанавливающим образом, на этой
среде чернеют вследствие выпадения металлического теллура.
Восстановление обычно наступает на 2—7-й день. Благоприятно
влияет прибавление к мясопептонному агару 0.5—1% декстрозы
и, наоборот, неблагоприятны среды, богатые белком и не
Содержащие сахара.
5) Агар с нейтральротом. На 100 см3 мясопептонного агара
прибавляют 0.3% декстрозы и 1 см3 насыщенного водного
раствора нейтральрота. Заражение уколом. Под влиянием
восстановительных бактерий красный цвет переходит в желтый, особенно
если среду покрыть небольшим слоем жидкого парафина.
..»!.¦¦ ¦ ¦ I — — 4
1 Вихерн (Wichern) рекомендует употреблять раствор метиленовой
синьки, содержащий на 1 л дестиллированной воды 1 г синьки (Methy-
lenblau med pur. Grubler) и 8.5 г хлористого натрия 1 см3 этого
раствора прибавляют к 10 civr* питательной среды, которая покрывается сверху
слоем жидкого парафина.
Мяеопептонная желатина (МПЖ)
Прозрачные плотные среды, получающиеся путем прибавления
к жидким субстратам остуденяющих веществ, как желатина (10%),
агар-агар (2%), карраген (5%) и пр., применяются для
изолирования и культуры микробов. Первой была применена
мяеопептонная желатина, введенная в практику Брефельдом, а затем
пропагандированная Кохом и его учениками. Она готовится
прибавлением к мясопептонному бульону лучшей белой желатины,
придающей ему плотную консистенцию. Для приготовления мясопептон-
ной желатины из мясного экстракта к 1 л воды прибавляют:
мясного экстракта Либиха . 10 г
пептона Витте 10
белой желатины 100
кристаллической соды ... 1.5
Сама по себе желатина представляет неопределенного состава
слегка кислый продукт, приготовляемый путем вываривания
хрящей и костей и состоящий главным образом из глутина. В виду
содержания в ней органических азотистых веществ она
представляет некоторую питательную ценность. Для нейтрализации 100 г
желатины требуется от 20 до 30 см3 нормального раствора щелочи.
Даже самые чистые сорта желатины обыкновенно содержат следы
сернистой кислоты. Вследствие этого после прибавления желатины
к нейтральному бульону необходимо вновь нейтрализовать содой
до слабо щелочной реакции и, если нужно, отфильтровать.
Мяеопептонная желатина имеет вид прозрачного эластичного
студня, температура плавления которого зависит от процентного
содержания желатины, от большей или меньшей щелочности
среды, продолжительности стерилизации и пр.
В зависимости от содержания желатины температура
плавления среды изменяется следующим образом:
Содержание і° плавления
желатины среды
5% 22°
10 24
15 25
25 26.5
В теплое летнее время мяеопептонная желатина готовится
обыкновенно с 15% желатины. Большие концентрации применяются
также при щелочных жидкостях. Сохранять желатину следует
в прохладном месте.
В жарком климате, где температура комнат летом высока,
пользуются смешанными желатино-агаровыми средами с более высокой
точкой плавления. На 1 л бульона прибавляют обыкновенно 50 г
желатины и 7.5 г агар-агара.
Продолжительное нагревание выше 100° вызывает частичную
пептонизацию желатины и понижает точку ее застывания. Для
стерилизации желатиновых сред рекомендуется повторно нагревать
4* &і
их в коховском кипятильнике в течение 3 дней под ряд по 20 мин.,
погружая ее, тотчас по стерилизации, в холодную воду для
быстрого остывания. Мы предпочитаем стерилизовать ее один раз в
автоклаве при 110° в течение 15 мин., однако полной уверенности
в стерильности в этом случае не может быть, и до употребления
в дело среду нужно испытать на стерильность (выдержать
несколько пробирок в термостате).
Рис. 59. Культуры Рис 60 Разводки на
уколом в желатину косой желатине.
а— слабо аэробный рост, а, Ъ к с — различные виды
Ь — анаэробный рост, с— штриха.
резко аэробный рост
Как питательная среда, мясопептонная желатина имеет ряд
достоинств и недостатков
Ее достоинства: 1) легкость приготовления и удобство
разливок в чашки Петри, 2) отсутствие отдачи воды и превосходное
схватывание стекла, 3) прозрачность, 4) характерный рост на этой
среде многих микробов и возможность разграничения их на
разжижающие и неразжижающие виды.
Недостатки мясопептоиной желатины: 1) низкая температура
плавления, что ограничивает пользование температурами,
наиболее благоприятными для роста бактерий; 2) затруднительность
изолирования медленно растущих видов из смеси вследствие
обилия разжижающих желатину микробов; 3) кропотливость
стерилизации желатиновых сред.
Расплавленную желатину разливают по пробиркам и дают
застыть либо в вертикальном положении для заражения уколом
(рис. 59), либо в косом — для заражения штрихом (рис. 60).
Мясопептонный агар (МПА)
Агаровые среды, приготовляемые прибавлением 1.5—2% агар-
агара г в жидкой питательной среде, были предложены
Фанни-Анжелиной Гессе (A. Hesse).
Агар-агар есть растительный студень, добываемый из морских
водорослей,находимых на восточноазиатском побережье и
употребляемых туземным населением в пищу. Он состоит в главной массе
из смеси углеводов (полисахаридов), но содержит также небольшое
количество азотистых веществ (0.2—0.3 азота). Он имеется в
продаже в различных видах: 1) обычно — длинные сморщенные
стебельки, напоминающие сердцевину гусиных перьев, 2)
легкорастворимый порошок агара (часто фальсифицируется примесью муки)
и 3) трудно-растворимый агар в виде прессованных
четырехгранных брусков (наиболее чистый препарат).
Температура плавления агаровых сред — около 100°. Будучи
расплавлены, они застывают при температуре около 40°. Реакция
агар-агара слегка щелочная. Его прибавление в количестве 1.5 —
2% мало влияет на реакцию среды.
После остывания агар отдает «конденсационную воду»,
собирающуюся внизу пробирки. Чем меньше концентрация агара, тем
больше выделяется воды. В 3% агаре ее почти не^ бывает.
При продолжительном
нагревании, особенно в слегка кислой
среде , агар-агар частично гидролизи-
руется, что в большей или меньшей
степени всегда происходит при
стерилизации.
Агар, вымоченный в воде в тече- „ ,. ^
Г7 - Рис. 61 Приготовление косого
ние нескольких часов, быстрее рас- г агара
творяется, чем сухой.
Немалые затруднения представляет фильтрование агаровых сред.
Удобнее всего производить его в автоклаве при 120°, фильтруя
через складчатый фильтр в стеклянной воронке с углом в 33°.
При разливке горячих агаровых сред по пробиркам стараются
не смочить средой верхнего края пробирки, во избежание
приклеивания ватной пробки к стеклу. Для приготовления «косого агара»,
т. е. разлитого косым слоем, пробиркам дают остыть в
наклонном положении (рис. 61), причем среда не должна достигать
ватной пробки на 1—2 см. Застывший агар оставляется в
наклонном положении на несколько часов (лучше оставлять его на ночь),
иначе он может сползти по стенкам пробирки. Как и
желатиновые среды, агаровые имеют свои достоинства и недостатки.
Их достоинства: 1) возможность пользоваться любой
температурой для культивирования микробов, 2) характерный рост
некоторых микробов.
1 Так называемый архангельский агар прибавляют обычно, после
промывки, в количестве 5—7%, некоторые сорта 2—3%, Одесский агар в
промывке не нуждается.
йЗ
Их недостатки: 1) трудность фильтрования, 2) неполная
прозрачность, 3) отдача воды и плохое схватывание стекла.
Для лучшего схватывания стекла к агаровым среда.м иногда
прибавляют 2% желатины или 0.1% гуммиарабика.
Для получения чистого агар-агара, совершенно свободного
от следов экстрактивных веществ, рекомендуется следующий
прием. Приготовляют 3% раствор агара в дестиллированной воде,
отфильтровывают и разливают нетолстым слоем в ряд больших
кристаллизационных чашек. Застывший агар разрезывают
шпателем на куски и заливают дестиллированной водой почти до краев
чашки, которая ставится в термостат при 37°. В воду выщелачи
ваются экстрактивные вещества, и она загнивает. Через день-два
всю жидкость сливают и заменяют свежей. Когда и эта вода
замутится и загниет, ее опять заменяют новой и так до тех пор, пока
вода не перестанет мутиться. Через 2—3 недели, таким образом,
получают очень чистый агар, почти совершенно лишенный
переходящих в раствор экстрактивных органических веществ. Его
хранят либо во влажном состоянии под водой в склянке с притертой
пробкой, либо в высушенном виде.
Среда Маассена (Maassen) из телячьего или свиного мозга
Мозг пропускают через мясорубку, растирают в ступке,
смешивают с двойным количеством воды и нагревают 1— часа в те-
кучем пару; затем смесь процеживают через полотно и к полученной
молочного цвета жидкости, после ее охлаждения, прибавляют (в
количестве, равном весу взятого мозга) раствор куриного белка в воде
(1 часть взбитого или протертого через полотно белка на 2 части
воды); эту смесь снова нагревают г/2 часа в текучем пару; наконец,
к ней прибавляют 1.8% агара, 2% пептона (1% пептона Витте
и 1% пептона Шапото) и снова разогревают до полного
растворения агара; фильтруют в текучем пару. Среда обладает почти
нейтральной реакцией. Следует избегать излишнего и
продолжительного нагревания ее.
На этой среде хорошо удается рост некоторых видов,
отказывающихся расти на обычных мясопептонных средах.
Картофель и крахмальные среды
Сухая масса картофеля содержит около 6% азотистых веществ,
около 10% жировых, до 78%углеводов (из них 75% крахмала,
2% целлюлозы и 1% сахара) и около 2% золы. На состав
картофеля оказывает влияние время употребления его в дело, т. е.
берется ли он осенью, вскоре после сбора, или весною, пролежав
зиму в погребе.
Для культуры бактерий выбирают отборные клубни так
называемого салатного картофеля, очищают щеткой под сильной
струей воды для удаления приставших частиц земли, потом срезают
54
шелуху и удаляют «глазки» и поврежденные места; картофель
вновь промывают под краном и разрезают пополам или на ряд
дисков толщиной в 0.5—0.75 см. г
Кружки для малых чашек Петри (диаметр 7 см) приготовляют
следующим образом: края картофельных ломтей обрезают от руки
или с помощью штампа и ломти кладут в чашки на несколько слоев
фильтровальной бумаги для впитывания излишней влаги. Если
культивируемый микроб образует кислоту, то поверхность
картофеля натирают мелом, так как картофель обладает слегка кислой
реакцией. Иногда для устранения кислотности вываривают
картофель в 1% соде.
Для культуры на картофель в пробирках берутся пробирные
цилиндры большого размера с перехватом внизу (рис. 31),
на котором ломоть картофеля задерживается; нижняя часть
служит для стока воды, выделяемой при выварке картофеля. Без этой
предосторожности картофель частично был бы погружен в воду.
Можно пользоваться и обыкновенными пробирками больших
размеров, бросив на дно обломок стеклянной трубки, служащей
опорой для картофеля, или кусок гигроскопической ваты. Ломти
картофеля вырезываются двояко: в одних случаях из крупного
клубня картофеля вырезают цилиндрическим пробоем
соответственной величины цилиндры и косым срезом рассекают их на два клина;
в других — вырезывают продолговатые плоские или
клинообразные ломти по формату пробирки.
Должно быть обращено серьезное внимание на стерилизацию
картофеля, так как на нем всегда имеется много стойких споровых
палочек («картофельные бациллы»). Развиваясь на поверхности
картофеля, бациллы эти образуют характерный морщинистый
налет различных оттенков; серовато-белый —¦ Вас. mesentericus
vulgatus и желто-бурый — Вас. mesentericus fuscus. Мы
стерилизуем обыкновенно при 120° в течение 20—25 минут.
Посевный материал втирают шпателем-иглой в поверхность
картофеля.
Для лучшего развития некоторых бактерий, например Bad.
tuberculosis,картофель вымачивают в5% водном растворе глицерина.
Из картофеля приготовляют также целый ряд других сред.
Упомянем о некоторых из них:
1) Картофельная кашица. Очищенный картофель
растирают с молоком, водою или 1 % содой и помещают на дно эрлен-
мейеровской колбы или чашки Петри слоем в 1 см. После
стерилизации поверхность картофельной массы заражают.
2) Картофельная вода с глицерином,
предложенная для культуры Bact. tuberculosis. Приготовляется
следующим образом: 500 г очищенного картофеля растирают на
терке и оставляют на ночь в холодном месте с 500 см3 воды.
Отстоявшуюся жидкость осторожно декантируют, доливают до 1 л водой,
1 Чтобы картофель не темнел, необходимо после очистки хранить его
под водою, а не на воздухе.
66
кипятят в течение 1 часа на водяной банке, отфильтровывают и,
после прибавления 4% глицерина, разливают в сосуды и стерилизуют.
3) Картофельная желатина, предложенная для
культуры Bad. typhi. 100 г картофельной массы выжимают сквозь
густую холстину. Мутный сок смешивают с животным углем
(Carbo animale), кипятят и отфильтровывают. К прогретой в
течение часа в коховском кипятильнике прозрачной жидкости
прибавляют 10% желатины, нагревают еще раз, фильтруют и стерилизуют
при 110°. К стерилизованной желатине Эльснер (Eisner) советует
прибавлять еще стерилизованный 1% раствор йодистого калия.
Гримберт (Grimbert) и Реми (Remy) составили синтетическую
среду, заменяющую картофельный сок. На 1 л дестиллированной
воды она содержит:
Мальтозы 1 г
Растворимого крахмала 2
Аспарагина 2
Фосфорнодвукалиевой соли 2
Сернокислого калия 2
Сернокислого магния 2
Кислого яблочнокислого аммония . . 2
Углекислого магния ........ 1
К картофельным средам примыкают крахмальные:
1) Раствор крахмала. Приготовленный обычным
способом крахмальный клейстер мало пригоден для культуры
микробов вследствие малой питательности. Рекомендуется
поэтому предварительно слегка сахарифицировать его. Отмеренное
количество воды или питательного раствора кипятят и к нему,
при беспрерывном помешивании, медленной струей приливают
болтушку крахмала в небольшом объеме воды. При таком
приготовлении не получается комков. Раствор затем охлаждают до 80°
и прибавляют взвесь в воде размолотого солода в количестве
0.5—1%. Разжижение крахмала наступает почти моментально,
и поэтому раствор тотчас же нагревают до 100°, чтобы прекратить
действие диастаза.
2) Крахмальный студень по Смиту. Зг
порошка чистого крахмала обливают 10 см3 того или другого жидкого
питательного раствора и 5—6 дней под ряд нагревают при 75—85°
в течение 2—3 часов.
3) Рисовая масса по Сойке (Soyka) и Кралю
(Krai). 10 г рисовой муки тщательно растирают в ступке с 15 см3
молока и 5 см3 мясопептонного бульона. Полученную массу
переносят в чашки Петри или в эрленмейеровские колбы и
стерилизуют повторно при 100°. Масса застывает белым гладким слоем,
засеваемым с поверхности. Среда хороша для выращивания
плесеней.
Для этой же цели могут служить ломти хлеба или хлебная
кашица (мязга). Для приготовления последней высушенный хлеб
(белый или черный) растирается в порошок, который насыпается
горизонтальным слоем в эрленмейровскую колбу или в чашку
Петри и осторожно увлажняется водой (на 25 г порошка
прибавляют около 15 см3 воды).
Для разводок пигментных бактерий иногда пользуются
макаронами и облатками. Бельіе макароны из лучшей муки разрезы-
вают на куски около 4.5 см длиной, помещают в пробирку и
заливают водой на 1 см выше верхнего края макарон. Кипятят 15 мин.,
пока макароны не размякнут, осторожно сливают воду и
закрывает пробирку ватной пробкой; стерилизуют при 110°.
Остающееся на дне небольшое количество воды не мешает. Облатки
помещают в чашки Петри, пропитывают питательным раствором
и стерилизуют.
Для выращивания микробов применяют те же среды из
моркови, свеклы и других овощей, пригодных вследствие большого
содержания сахара для культуры многих микробов.
Солодовые среды
Для культуры дрожжей, уксуснокислых, молочнокислых и мас-
лянокислых бактерий нередко применяются солодовые среды.
Проще всего пользоваться пивным суслом с пивоваренного завода
охмеленным или без хмеля. Где нет возможности пользоваться
этим источником, готовят солодовые среды в лаборатории.
Приготовление заторного суела (Maische, Mout de Mere)
1) Крепкий раствор состоит из смеси 250 г солодовой
ячменной муки, 250 г ржаной муки и 500 см3 водопроводной воды. Среда
эта, будучи отфильтрована, показывает 24° Баллинга (Balling)
или 14.1° Бомэ (Borne). Содержание сахара не должно превышать
8—10° Баллинга, а для работ с дрожжами — даже 6—8°, что
соответствует почти такому же процентному содержанию сахара.
2) Разбавленный раствор крепостью в 14—15° Баллинга
употребляется для культуры молочнокислых бактерий. Еще более
разбавленные растворы —для уксуснокислых и маслянокислых бактерий.
Способ приготовления состоит в следующем. Отмеренное
количество водопроводной воды (1 л) нагревают до 48—50°С и в нее
понемногу всыпают отвешенное количество солодовой ячменной
муки (100—250 г), беспрерывно помешивая, чтобы избежать
образования комков. Температура жидкости поддерживается на 45°
в течение получаса, чтобы образовалось возможно больше диастаза
(амилазы). В следующие полчаса температуру поднимают до 55—
58°С и поддерживают ее на этом уровне в течение 1 часа и более, не
повышая его, чтобы не разрушить амилазу,—до тех пор, пока
взятая проба жидкости после остывания перестанет давать посинение
с иодом, т. е. до полного сахарифицирования крахмала.
Получается сильно мутная окрашенная жидкость, отстаивающая
обильный осадок. Жидкость декантируют или просеивают через сито
с отверстиями в 1 мм, отцеживают через платок и разливают в за-
07
ранее стерилизованные колбы или пробирки, 1 стараясь не
запачкать их горлышка, ибо в таком случае ватные пробки прилипают
к стеклу. Иногда к этой среде прибавляют мел для нейтрализации
кислот, образующихся при разложении сахара микробами.
Стерилизовать можно нагреванием в автоклаве при 110° в
течение 15—20 мин., хотя предпочтительнее стерилизовать повторным
нагреванием в текучепаровом аппарате: первые 3 дня — по
полчаса (в промежутках среда оставляется на холоду); на 4-й день,
за несколько часов до очередной стерилизации, ставят среду
при 35—40°С. На 5-й день жидкость не подвергают стерилизации,
а сохраняют при 25—30°. Последняя стерилизация производится
на 6-й день в течение 1 часа.
Рост дрожжей хорошо удается на среде состава:
Водопроводной воды й000 см8
Солодовой муки 100 г
Виноградного сахара 20
Пептона • 5
Солодовый акстракт (can de malt)
Среда эта готовится из солодовой муки, без примеси ржаной.
Хорошо сахарифицированныіі раствор длительно кипятят для
полного удаления белков, которые затем отфильтровывают через
платок (или декантируют отстоявшуюся жидкость). Если
желательно получить особенно прозрачный раствор, жидкость
осветляют белком (стр. 48).
Готовую среду разливают в пробирки или колбочки и
стерилизуют, как и заторную жидкость (см. выше). Из углеводов среда
содержит, главным образом, мальтозу и декстрин.
Солодовый экстракт можно получить готовым на пивоваренных
заводах. Его испаряют на водяной бане до густоты жидкого
сиропа и, разлив по колбам, стерилизуют при 100° в течение 30 мин.
В лаборатории, где производится исследование дрожжей,
уксуснокислых и молочнокислых бактерий,среда эта должна быть всегда
в запасе. Солодовое сусло имеет слегка кислую реакцию и содержит
около 0.1% молочной кислоты. Если нужно, его осторожно
нейтрализуют.
Молоко и молочные среды
Высокое питательное значение молока объясняется содержанием
в нем всех необходимых для питания элементов. Так, в состав
коровьего молока входят следующие части:
Воды 88%
Молочного сахара 4.5
Жира 3.5
Казеина 3.5
Минеральных соединений около . 1 2
1 Мы предпочитаем сначала прокипятить жидкость для свертывания
белков. Долив затем водою до 1 л, жидкость фильтруют и, разлив по колбам,
стерилизуют в течение 20 мин. при 115°.
2 В молоке встречаются следующие соли: NaCl, КС1,КН2Р04, К2НР04,
MgHPO*, СаНР04, Са3(Р04)2і лимоннокислый калий, кальций и магний и др.
68
'Для культивирования микробов употребляется обыкновенно
свежее обезжиренное (снятое) молоко, или так называемый о б-
р а т. Обрат получается сепарированием цельного молока,
нагретого до 34°. Кислотность обрата не должна быть выше 22°
Тернера. Его разливают по пробиркам (по 8 см3 в каждую).
Стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 мин. или один раз
при 110° в течение получаса, или при 120° в течение 15 мин.
Молочная сыворотка получается свертыванием
молока с помощью сычужного -энзима (Labferment, Labessenz).
На 1 л молока добавляют около 0.1 г сычужного фермента,
растворенного предварительно в теплой воде при 40° в течение часа.
Сверток разбивают стеклянной палочкой
и молоко нагревают на водяной
бане до 80°. Сыворотку отцеживают
через холстинку и к ней прибавляют
0.5—1% пептона и 0.5% поваренной
соли. Нагревают в течение часа в
коховском кипятильнике или 20 мин.
в автоклаве при 115° и фильтруют
через бумажный фильтр. Для
получения плотной среды к этой
сыворотке прибавляют агарили желатину
и стерилизуют в течение 20 мин.
при 115°. Если культивируются
кислотообразующие бактерии,
например молочнокислые, прибавляют еще
отдельно стерилизованный мел.
Выросшие на этой последней среде
колонии молочнокислых бактерий
узнают по прозрачным зонам вокруг них (рис. 62).
Пептонизированное молоко по Иенсену (іеп-
sen) приготовляется обработкой молока в течение 1—2 суток
0.1—0.2% пепсина и 0.33% соляной кислоты. Молоко становится
прозрачным. Остающуюся легкую муть, если она не исчезает
при нейтрализация, удаляют свертыванием яичного белка
(стр. 48).
Молочный агар. 71/,, г агар-агара кипятят в 100 см3
дестиллированной воды до полного растворения, подливая воду
по мере ее испарения. К раствору прибавляют 400 см3 молока
и яичный белок, размешанный в воде. Кипятят и, отфильтровав
выпавшие белки сначала через полотно, а затем через бумажный
фильтр, разливают по пробиркам и стерилизуют при 120°
в течение 10 мин.
Молочный агар можно приготовить и по другому способу.
Стерилизуют ряд пробирок, по 5 см3 снятого молока в каждой.
Отдельно стерилизуют 3% водный раствор агар-агара, тоже
разлитый в пробирки по 5 см3. В нагретую стерилизованную
чашку Петри выливают содержимое двух пробирок—одной
Рис. 62. Колонии
молочнокислых бактерий на меловом
агаре с молочной сывороткой.
69
с молоком, другой с агаром, нагретых до 50°. Их тщательно
смешивают осторожным наклонением чашки в разные стороны.
Когда молочный агар застынет, его несколько дней сушат в
термостате при 37°. Среду заражают одной или несколькими чертами
но поверхности. Если по краям штриха появятся белого цвета
осадки, это указывает на выпадение казеина; если же вокруг
штриха наблюдается зона прояснения среды, это служит
указанием на выделение микробом протеолитического энзима.
Молочный агар по Эйкману (Eijkmann). Отдельно
стерилизуют снятое свежее молоко и мясопептонный агар. Еще
теплыми они смешиваются с соблюдением асептических
предосторожностей в отношении: 1 часть молока на 3—6 частей агара. При
совместной стерилизации молока с агаром образуются хлопья казеина.
Молочный агар по Кунце (Kuntze). В 100 см3
воды растворяют 8 г молочного сахара и 3 г агар-агара. К
полученному раствору прибавляют 200 см3 молока и 3 г пептона.
Несколько раз нагревают при 100°, и образовавшийся осадок
отфильтровывают через вату. Прозрачную жидкость разливают и
стерилизуют.
Молочная сыворотка с лакмусом по
Петру ш е к у (Petruschek). К нагретой до 40° смеси равных частей
снятого молока и воды понемногу прибавляют только 1%
соляной кислоты, чтобы казеин свернулся и выпал в осадок. Большого
избытка кислоты следует избегать. Осадок казеина
отфильтровывают через полотно, и фильтрат точно нейтрализуют раствором
соды до нейтральной реакции по лакмусу, после чего ставят на 1 —
2 часа в коховский кипятильник. Замутившуюся жидкость вновь
отфильтровывают, еще раз кипятят и, если нужно, исправляют
реакцию, которая должна быть нейтральной. Затем прибавляют
стерилизованный раствор лакмуса до ясного окрашивания сыворотки
в фиолетовый цвет.
Молоко с лакмусом или азолитмином. К
слегка подщелоченному молоку прибавляют стерилизованный
раствор лакмуса или азолитмина (стр. 47) до явно фиолетового
оттенка. Еще удобнее иметь всегда готовые стерилизованные
растворы индикаторов и прибавлять их по мере надобности при
помощи стерильной пипетки.
Геннеберг (Henneberg) свертывает молоко нагреванием с
разбавленной (1 : 5) серной кислотой. Свернувшийся казеин удаляют
фильтрованием и сыворотку нейтрализуют избытком мела при
нагревании.
Молочная сыворотка по Кохенди (Gohendy)
для культуры болгарской палочки. 1 л молока кипятят в течение
5 мин., после чего к нему прибавляют 1.5 см3 соляной кислоты.
Выпавший казеин спустя несколько минут отцеживают через
редкий холст. Сыворотку слегка подщелачивают содой до рН = 7.0—
7.2 и к 1 л ее прибавлят 300 см3 воды, 3 г желатины, 15 г
тростникового (свекловичного) сахара и 15 г аедтона, Прогрев эту омвоь
в автоклаве при 115° в течение 20 мин., отфильтровывают и
разливают в сосуды. Стерилизуют при 115° в течение 2 мин.,
отфильтровывают и разливают в сосуды. Стерилизуют при 115° в течение 20
мин. Прибавив к этой сыворотке 1.5—2% агара, получают
плотную среду, пригодную для изолирования болгарской палочки.
Хорошей средой для того же микроба служит молоко или
молочная сыворотка с прибавлением 1% пептона и 6—8% экстракта
дрожжей. Последний готовится, по Рубинскому, следующим
образом. 100 г прессованных дрожжей растирают в ступке в
равномерную массу со 100 см3 воды и, поместив в большом стакане,
нагревают в коховском кипятильнике в течение 0.5—1 часа. Трижды
отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученную
прозрачную желтую жидкость стерилизуют в небольших колбочках и
сохраняют до употребления. К пробирке молока или молочной
сыворотки можно прибавлять по 0.5 см3 этого экстракта.
Молоко с дрожжевым ау т'о лизатом. К 1 л
молока прибавляют 5% нейтрального аутолизата дрожжей,
приготовленного следующим образом. На 2 кг пресованных дрожжей
добавляют 2 л прокипяченной и остуженной до 60° воды.
Смешивают в гомогенную массу и нагревают на водяной бане до 49—50°,
Ставят в термостат на 72 часа при 50°. После этого нагревают в
автоклаве при 105° в течение получаса. Затем несколько раз фильтруют
для получения прозрачной жидкости с 0.9% содержанием азота.
После фильтрования осадок разводят 1200 см3 воды и снова
отфильтровывают. Обе жидкости смешивают, причем средний процент азота
в среде получается 0.6—0.8. Разводят до содержания азота 0.5%,
который лучше для этого определять сжиганием по Кьельдалю.
Жидкость нейтрализуют до рН 6.8, разливают по небольшим
колбочкам и стерилизуют в течение 15 мин. при 115°.
Эта среда хороша для поддержания коллекции молочнокислых
микробов, так как в ней молочнокислые не так чувствительны
к образуемой ими молочной кислоте.
Вместо молока некоторые [Касцелли (Cascelli) — в «Centr.
f. Bakt. I Abt., 117, 1930] указывают на возможность замены его
в бактериологической практике молоком из сои.
Куриное яйцо
Куриное яйцо применяют в качестве питательной среды целиком
или отдельно белок и желток. Белок содержит, главным образом,
альбумины и глобулины, а желток — лецит-альбумин и виттелин.
По Гюппе (Ніірре), яйцо обмывают сначала горячей мыльной
водой, а затем раствором сулемы. х Ополоснув яйцо стерильной
водой,в более узком конце его делают небольшое отверстие в
скорлупе прокаленной стальной иглой, избегая образования трещин.
В отверстие вводят пипеткой или капилляром посевный материал,
1 Применение сулемы не вполне безопасно, так как она может
проникнуть через мельчайшие трещины скорлупы внутрь яйца. Лучше поэтому,
обмыв яйцо мыльной водой, облить его спиртом и остаток последнего сжечь.
61
вдувая его внутрь яйца. Отверстие затем покрывают кусочком
стерилизованной бумаги и заливают коллодием.
Иногда употребляют в качестве питательной среды ломтик
яруто сваренного белка или желтка, помещая их в пробирки или
в чашки Петри.
Для приготовления среды из алкали-альбумината, по Розен-
талю (Rosenthal) и Шульцу (Schulz), к 6 см3 прожатого сквозь
холстинку яичного белка прибавляют 2.4 см3 1% раствора едкого
кали шли натра и 2.6 см3 воды. Смесь эту оставляют на несколько
часов при комнатной температуре, а затем выливают в чашки
Петри или в пробирки и нагревают на водяной бане до 96—98°.
Белок при этом свертывается в полупрозрачный, слегка опалесци-
рующий слой. Примесь солей делает его еще прозрачнее, но среда
становится менее плотной. Свертывание белка при темпратуре выше
90° может вести к разрывам среды под влиянием паров воды.
Алкали-альбуминат из мяса готовится подобным же образом.
20 г размолотого мяса растирают с 250 см3 3% раствора едкого
натра и оставляют при 37° на 24—30 часов. Когда мясо
растворится, жидкость отфильтровывают и нейтрализуют соляной
кислотой в присутствии лакмуса; затем, смотря по надобности,
прибавляют сахар, глицерин, различные соли и пр. Для плотной
среды прибавляют агар или желатину.
Яичный бульон Безредки и Жншиля
а) Яичный белок взбивают с 10 объемами воды, приливаемой
постепенно. Смесь фильтруют через гигроскопическую вату,
нагревают до 100° и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат
разливают в пробирки (по 10 см3) или в колбы (по 100 см3) и
стерилизуют.
б) Яичный желток взбивают с 10 объемами воды и к смеси
прибавляют нормальный раствор едкого натра до тех пор, пока
жидкость настолько просветлеет, что останется лишь легкая опалес-
ценция. Нагревают до 100°, профильтровывают через бумажный
фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют.
К 500 см3 стерилизованного мясного бульона (без пептона,
но с 5% глицерина) асептически прибавляют по 100 см3 растворов
(а) и (б). Смесь разливают в пробирки.
Этим же бульоном можно смачивать с поверхности агаровые
среды (оставить на ночь, чтобы бульон впитался).
Среда с овомукоидом по Лангштейну
(Langstein) и Майеру (Mayer). Белок от 5 яиц понемногу
прибавляют, при беспрерывном помешивании, к 500 см3 кипящей
воды. Затем слегка подкисляют уксусной кислотой и еще раз
кипятят. Отфильтрованный раствор сгущают до 200 см3,
нейтрализуют содой, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют
при 110°.
Среда эта содержит, кроме небольших количеств виноградного
сахара и солей, главным образом белковое вещество — овомукоид,
G2
содержащее до 35% глюкозамина, т. е. столько же, сколько его
содержится в муцине слюны.
На этой среде превосходно удается рост многих микробов.
Чтобы сохранить вирулентность патогенных бактерий (крысо-
и мышеубивающих), С. С. Мережковский применил с успехом
следующую среду: куриное яйцо, сваренное вкрутую, очищается
от скорлупы, белок (без желтка) измельчается и на каждые 10 г
его наливают 100 см3 обыкновенной питьевой воды. Колбу с
белком и водой помещают в автоклаве и держат при 1 атм. 5 мин.
Отвар фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют.
Кровяная сыворотка
Кровяная сыворотка впервые была введена в практику
Кохом как среда для культуры Bad. tuberculosis. Она применяется
в жидком и свернутом виде. Добывают ее чаще всего уколом в
яремную вену.
Спожевытекшею из раны кровью асептически наполняют
совершенно сухие и слегка на-
гретиі» большие стеклянные
цилиндры, обеззараженные
последовательной обработкой
раствором сулемы, спиртом и
•>фиром. Цилиндры сначала
ставят в термостат при 37° С
на полчаса, а затем оставляют
па двое суток в холодном месте,
причем выпадает кровяной
сгусток. Его отделяют от стенок
цилиндра, прозрачную
сыворотку отсасывают
стерилизованным сифоном или пипеткой
и разливают в стерилизованные
пробирки по 10 см3.
Так как сыворотка
свертывается уже выше 58—60°, то,
при желании пользоваться ею
как жидкой средой,
стерилизация представляется весьма затруднительной (пользуются тинда-
лизацией при 56—58°). Лучше всего собрать сыворотку асептически
и с соблюдением необходимых предосторожностей разлить по
стерилизованным сосудам. Для уверенности в том, что среда не
загрязнена, ее выдерживают в течение нескольких дней в
термостате. Стерильная среда не должна мутиться. Иногда для лучшей
уверенности в стерильности прибавляют к сыворотке хлороформ
(на 1 л 5—10 см3) и затем удаляют его испарением при 37°.
Для приготовления плотной сыворотки ее свертывают
нагреванием при 70—80° в особом аппарате (рис. 63) при наклонном
положении пробирок. Сыворотка, свернутая при температуре
Рис. 63. Аппарат Коха для сверты
вания сыворотки.
выше 80°, становится мутной. Стерилизуют сыворотку повторным
нагреванием при 56° в течение нескольких дней под ряд, по
2—6 час. ежедневно. Сыворотка должна быть плотной, с
гладкой поверхностью, совершенно прозрачной и с небольшим
количеством конденсационной воды внизу пробирки.
Для культуры дифтерийных палочек Леффлер (Loffler)
предложил смесь кровяной сыворотки с сахарным бульоном (1%
виноградного сахара) в отношении 3:1. Смесь эта свертывается
при 90—95°.
Готовятся среды и из сыворотки человеческой крови,
получаемой из плаценты при родах. Можно пользоваться также
различными выпотными жидкостями, например асептической
водяночной жидкостью из hydrocele и пр.
Приведем способы приготовления нескольких экстрактов,
могущих служить в качестве основной среды для изучения
различных био-химических процессов.
Почвенная вытяжка
1 кг хорошей садовой земли обливают 1 л водопроводной воды
и нагревают в автоклаве при 115° в течение 30мин. После
фильтрования слитой мутной жидкости через складчатый бумажный
фильтр получают около 600—800 см3 фильтрата.Если жидкость
мутна, ее просветляют кипйчением с тальком. Фильтрат нейтрализуют
и употребляют в дело. К экстракту, разбавленному водой (100 см3
экстракта и 900 см3 воды) не мешает прибавить 0.5% фосфорно-
двукалиевой соли. По Фишеру (Fischer) лучше экстрагировать
землю не водой, а 0.1% раствором соды, так как при этом извлекается
больше гуминовых веществ.
Если желают приготовить среду с солью гуминовой кислоты,
то для получения последней поступают, как указано в гл. 23-й
(стр. 199).
Сенной отвар
40 г сухого сена кипятят в 1 л воды, фильтруют, нейтрализуют
содой и разливают по пробиркам.
Бобовый отвар
100 г белых бобов прибавляют к 1 л воды и некоторое время
осторожно кипятят, избегая растрескивания бобов и оклейстеривания
крахмала. Еще горячую жидкость отфильтровывают.
Вытяжка из льняных волокон
50 г льняной пакли нагревают полчаса в автоклаве при 115°
с 1 л водопроводной воды. Полученную бурую жидкость
отфильтровывают, нейтрализуют содой до слегка щелочной реакции и в
таком виде применяют. Прибавление этой вытяжки в различных
пропорциях к питательной среде облегчает рост многих бактерий.
64
Дрождеевая вода (отвар дрожжей)
Отвар этот готовится следующим образом: 70 г свежих
прессованных или 7—10 г сухих дрожжей полчаса кипятят в 1 л дестил-
лированной воды, дают отстояться на холоду в высоком стакане,
декантируют и затем ншдкость фильтруют.К фильтрату прибавляют
1 л воды и еще раз кипятят полчаса (для лучшей прозрачности
можно прибавить до кипячения взбитый с водою яичный белок).
Фильтруют в стерильные колбы по 200 см3. Их стерилизуют, нагревая
по 20 мин. в коховском кипятильнике в течение двух дней. Этот
отвар служит для питания дрожжей и бактерий. См. также
приготовление экстракта дрожже? по Рубиновому (стр. 60).
Безбелковые синтетические среды
Приведем состав некоторых безбелковых синтетических сред,
предложенных для культуры микробов. Состав везде показан
(в граммах) на 1 л дестиллированной воды. 1
Среда Пастер* Среда Френкеля (Frankel)
Тростникового сахара . • &0О Поваренной соли 5
Виннокислого аммония • М> Фосфорнодвукалиевой соли 2
Золы лпожжей . 0.75 Молочнокислого аммония б
«золы дрожжей «.« Аспарагиновокислого
натрия 4
Среда Кона
Среда Сюлливана (Sulliyan)
Виннокислого аммония . «0 Глицерина 10
Фосфорнооднокалиевойсо- Поваренной соли 5
ли . , 5 Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния . . . 5 Молочнокислого аммония 0.5
* -г н, Аспарагиновокислого на*
Фосфорнотрикальциевой тоия 10
соли " Азотнокислого калия . . 0.2
Сернокислого магния • . 0.2
Среда Ушинского Плотная среда Мейера (A. Meyer)
Глицерина 30—40 Декстрозы 1
гт * гч ^ Виннокислого аммония . , 1
ПоъаренжА соя» *-7 Азотнокислого калия . . . 0.5
Фосфорнодвукалиевой соли 2—2.5 Кристаллической соды . . 0.5
Молочнокислого аммония 6—7 Фосфорнодвукалиевой со-
Аспарагиновокислого нат- ли 1
рИЯ щ з.4 Хлористого кальция . . . 0.1
v * * л л Сернокислого магния . . . 0.3
Хлористого кальция. . . 0.1 Поваренной соли 0.1
Сернокислого магния . . . 0.2—0.4 Хлорного железа 0.01
Агар-агара • 12.5
При засеве землей на этом агаре вырастает гораздо больше
бактерий, чем на мясопептонном.
1 Для получения дестиллированной воды, совершенно свободной от
аммиака и азотистой кислоты, к воде прибавляют 2% концентрированного
раствора КМп04 и оставляют на сутки; отгоняют и к перегону прибавляют
небольшое количество KHS04; снова перегоняют, причем отбрасывают
первые фракции.
5 Руководство но кякробяодогш
6S
Среда Маассена (Maassen) Среда Брсдемана (Bredemann)
Яблочнокислого калия ... 7 Тростникового сахара .... 20
Аспарагина 10 Аспарагина 10
Фосфорнодвукалиевой соли . 2 Фосфорнодву калиевой соли . 1
Кристаллической соды ... 2.5 Серномагниевой соли .... 0.3
Сернокислого магния .... 0.4 Поваренной соли 0.1
Хлористого кальция 0.01 Хлористого кальция 0Л
Хлорного железа 0.01
Кроме того к среде прибавляется маннит, сахар, глицерин и
т. п. в количестве от 1.5 до 4%.
Плотная среда Сюлливапа (Snllivan)
Глицерина 20
Пептона Витте 15
Поваренной соли 3
Фосфориодвукалиевой соли 1.5
Сернокислого магния 0.5
Молочнокислого аммония 0.5
Сернокислой окиси железа следы
Хлористого кальция »
Агар-агара 19
Для культивирования плесеней, специально для Aspergillus
mger Раулин (Raulin) предложил синтетическую среду состава:
Воды 1500 см3
Тростникового сахара 70 г
Винной кислоты 4
Азотнокислого аммония 4
Фосфорнокислого аммочия 0.6
Углекислого калия 0.6
Углекислого магния 0.4
Сернокислого аммония 0.25
Сернокислого цинка 0.07
Сернокислого желеэа 0.07
Кремнекислого калия - 0.07
Оптимум рН — 3.7 —
Хорошо удается культура плесеней и на среде более простого
состава:
Воды 1000 см8
Тростникового сахара 50 г
Азотнокислого аммония 3
Фосфорнооднокалиевой соли 1
Сернокислого магния 1
Железного купороса следы
Геннеберг (Henneberg) для культуры плесеней применял
следующие растворы:
1) Дестиллированной воды ....... 1000 см8
Виноградного сахара ....!.... 100 г
Фосфорноодноаммониевой соли .... 2
Пептона 10
Азотнокислого калия 2
Сернокислого магния 0.5
Хлористого кальция 0.1
66
2) Дестиллированной воды 1000 см3
Тростникового сахара 100 г
Азотнока лиевой соли 2
Фосфорнооднокалпевой го іи 1
Сернокислого магния 0 5
Хлористого кальция 0 1
Хорошей средой для культуры плесневых грибков является
среда с агаром или желатиной Вельтье (Woltje).
Аспарагина 10 г
Фосфорнооднокалпевой соли 5
Сернокислого магния 2 5
Сахарозы 7 5
Дестиллированной воды 1000
Реакция среды — рН -= \ 2
Для выращивания зеленых водорослей предложено, много
сред. Приведем состав некоторых (в граммах на 1 л воды):
Среда Бейеринка (Beijerinck) Среда Артари
Азотнокислого аммония ... 05 Азотнокислого аммония . . . 2.5
Фосфорнооднон а лиевой соли . О 2 Фосфорнодву калиевой соли . 1
Сернокислого магния .... 0.2 Сернокислого магния .... 0 25
Хлористого кальция ..... о-1 Хлорного железа следы
Железного купороса следы
Среда Молиша (Molisch) Среда Шарпантье (Charpentier)
Азотнокислого калия .... 02 Виноградного сахара .... 10
Фосфорнодвукалиевой соли . 0.2 Фосфорнодвукалиевой соли . 2
Сернокислого магния .... 02 Азотнокислого калия .... 2
Сернокислого кальция .... 02 Сернокислого магния .... 1
Азотнокислого кальция ... 0.05
Сернокислой закиси железа . следы
Прекрасно удается рост зеленых водорослей на обыкновенном
мясопептонном агаре с 0.5—1 % виноградного сахара, а также на
вреде:
Водопроводной воды 1000 см3
Пептона 5 г
Виноградного сахара 5
Агар-агара 15
Хорошо растут одноклеточные зеленые водоросли, по моим
наблюдениям, на плотной среде состава:
Дестиллированной воды 1000 см3
Маннита . 10 г
Сернокислого аммония 1
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
Поваренной соли ОД
Агар-агара 20
При замене аммониевой соли азотнокислым калием рост
получается слабее. О культуре водорослей см. дальше стр. 260.
Состав сред для выращивания дрожжевых грибов см. в главе
о спиртовом брожении (стр. 202).
5' 67
Обилие всевозможных синтетических сред, предложенных для
культуры микробов, дает широкий простор для различных
комбинаций питательных соединений. Выбор того или иного источника
углерода и азота зависит от особенностей бактерий; что же
касается потребности в минеральных соединениях, то она так
незначительна, что обычно вводимые в состав питательных сред
количества их (0.05—0.2%) значительно превышают действительную
потребность в них. Питание микробов, как и высших растений,
подчиняется закону минимума, по которому среда лишь постольку
может считаться пригодной для роста, поскольку она содержит
потребный минимум всех необходимых для данного вида элементов
в усвояемой форме. х Среда может содержать избыток углеродистых
или азотистых соединений, но если в ней нет хотя бы одного из
потребных элементов, например серы, той наличие всех других
составных частей среды обесценивается. Поэтому при составлении
минеральной основы среды надо обращать внимание на
присутствие всех нужных элементов, а не только на их количества.
Укажем на простой состав минеральных солей, обыкновенно
применяющийся нами при изучении биохимизма бактерий. На 1 л
дестиллированной воды берется:
Фосфорнодвукалиевой соли ... 1 г
Фосфорнодвуаммониевой сола . . 1
Сернокислого магния 0.5
Хлористого кальция 0.1
Поваренной соли следы
Железного купороса »
Упомянем о составе некоторых сред, применяющихся с
диагностическими целями при изучении патогенных микробов, но
могущих найти применение и при исследовании сапрофитов.
Пептонная вода
Для определения содержания холерных вибрионов в воде к
900 см3 исследуемой воды прибавляют 100 см3 раствора,
содержащего: пептона и поваренной соли по 10%, соды 0.2% и
азотнокислого калия 0.1%.
Для исследования воды на кишечную палочку применяется
более концентрированный раствор, содержащий: пептона и
виноградного сахара — по 10% и поваренной соли — 5%.
Для проб на образование индола, аммиака и нитритов нередко
пользуются пептонным раствором Дунгама (Dunham), содержащим
1 Вопрос о потребности микробов в тех или иных минеральных
составных частях среды очень трудно решается экспериментальным путем. Такие
опыты нельзя, например, ставить в обычных стеклянных сосудах, так как
иа стекла переходят в раствор калийные, натровые и магнезиальные соли
кремневой кислоты. Во избежание этого применяют кварцевую посуду или
так наз. пайрекс; внутренность сосудов покрывают слоем парафина. Далее,
все употребляемые в дело растворы должны быть безукоризненной чистоты.
И только при соблюдении всех этих условий можно получить правильный
ответ на поставленные вопросы.
68
1% пептона и 0.5% поваренной соли. Его разливают в пробирки,
по 8 см3 в каждую. Если микроб не образует азотистой кислоты
из пептона, то к среде прибавляют 0.2% KNOa и вновь пробукя,
не образовалась ли азотистая кислота под влиянием исследуемого
микроорганизма.
Лакмусовый агар Дригальского-Конради (Drig-alski-Conradt)
Для получения 1 л среды приготовляется два раствора:
а) 2 фунта измолотого лошадиного мяса настаивают на холоду
с 1 л воды в течение суток. На другой день отфильтровывают
через холстинку и отжимают мясной сок, объем которого доливается
водой до 1 л (мясной сок можно заменить 1 % мясным экстрактом
Либиха). Затем к жидкости прибавляют по 1% пептона и нутрозы1
и 0.5% поваренной соли. Жидкость кипятят в течение часа,
фильтруют через холстинку и прибавляют 3% агар-агара. Кипятят
3 часа в коховском кипятильнике; там же еще раз фильтруют
через холстинку.
б) 150 см3 лакмусовой настойки (стр. 47) кипятят в течение
10 мин. и прибавляют 15 г молочного сахара, после чего
вторично кипятят.
Горячий раствор (б) приливают к расплавленному агару (а)
и, если нужно, смесь подщелачивают 10% содой до слабощелочной
реакции, после чего к жидкости прибавляют 3 см3
стерилизованного и еще теплого 10% раствора соды и 10 см3
свежеприготовленного раствора 0.1 г химически чистого кристалл-виолета В [Хехст
(HOchst)] в 100 см3 стерильной дестиллированной воды.
Колонии кишечной палочки на этой среде красного цвета,
а тифозного бацилла — синего.
Среда Эндо (Kndo)
К 1 л расплавленного нейтрального мясопептонного агара
(с 3—4% агара) прибавляют 10 см3 10% раствора соды, 5 см3
свеженасыщенного на холоду и отфильтрованного спиртового раствора
фуксина, 10 г химически чистого молочного сахара и 25 см3
свежеприготовленного 10% раствора чистого сернистокислого натрия
(Natrium sulfurosum). После растворения прибавленных веществ
среду разливают по пробиркам, по 15 см3 в каждую, и стерилизуют.
В горячем виде среда имеет розовый цвет, холодная она почти
бесцветна. Сохранять ее необходимо в темном месте. Колонии
кишечной палочки на этой среде имеют яркокрасный цвет.
Среда с теллуристым калием Конради-Троха (Conradl-Troch)
Для дифференцировки дифтерийного бацилла приготовляют
три раствора:
а) кровяная сыворотка (бычачья или лошадиная);
б) бульон с двойным содержанием пептона (2%), глюкозы (1%)
1 Патентованное питательное средство (кавеин-натрий).
€9
и с 0.6% двуяблочнокислого кальция (Calcium bimalirum);
в) 1% раствор теллуристого калия (Kalium tellurosum)
Три части сыворотки смешивают с одной частью бульона и к
100 см3 смеси прибавляют 2 см3 раствора теллуристого калия или
натрия. Колонии дифтерийной палочки на этой среде принимают
черный цвет.
Среда Булира (Boullr)
Применяется для обнаружения кишечной палочки в воде.
Настой 500 г мелко нарубленного мяса в 1 л воды по истечении
суток процеживают через полотно, отжимают, доливают до 1 л и
прибавляют 25 г пептона, 15 г поваренной соли и 30 г маннита;
кипятят I1 2 часа, нейтрализуют содой, отфильтровывают и стерилизуют
в течение 2 час. в текучепаровом аппарате (кипятильник Коха).
К объему этой жидкости прибавляют 2 объема исследуемой
воды и смесь подкрашивают прибавлением 2% (по объему)
стерилизованного 0.1% водного раствора нейтральрота. Жидкость
затем ставят при 46° в трубках Дунбара или в аппаратах Эйнгорна
(рис. 39). В присутствии кишечной палочки уже через 12—24
часа в закрытом колене появляется муть и начинается выделение
газа, собирающегося вверху. Одновременно жидкость теряет свои
красный цвет, который переходит сначала в зеленоватый, а затем
в желтый. Прибавив к среде лакмус, убеждаются в образовании
кислоты.
Таким образом обнаруживаются четыре главных свойства
кишечной палочки: рост при 46°, выделение газа, восстановление
нейтральрота и образование кислоты.х
Среда с эскулшюм
Дестиллированной воды 1000 см3
Пептона 20 г
Эскулина 0.5—1
Лимоннокислого железа (Ferrum citri-
cum) 0.1—0 5
Можно прибавить также 3—5 г таурохолевокислого натрия.
В качестве плотной среды может служить для характеристики
В. Соіі:
Дестиллированной воды 1000 г
Пептона 20
Таурохолевокислого натрия 5
Эскулина 1
Лимоннокислого желеча . . • 1
Желатины 100
или агара 15
На этой среде получаются колонии черного цвета В. соіі,
В. pneumoniae, Str. іасШ, В. subtilis, В. prodzgiosum, В. тусоь-
des, В. buthyricus, некоторых дрожащей и плесеней.
1 Методы исследования воды и др. на наличие кишечной палочки см.
пособия по сани гарной бактериологии и Методы стандартных исс
ледова і ии.
70
ГЛАВА III
О
ИЗОЛИРОВАНИЕ МИКРОБОВ, БАКТЕРИОСКОПИЯ И МИКРО-
ТЕХНИКА
1. МЕТОДЫ ИЗОЛИРОВАНИЯ МИКРОБОВ
Для изучения морфологических и физиологических свойств
микробов необходимо располагать чистыми культурами,
состоящими из скопления одного и того же вида, без примеси посторонних.
Существуют два
главнейших метода и юлпро-
вания микробов:
а) метод
механического разделения
отдельных микробов из
смеси («метод
разбавления»);
б) биологический
метод выращивания
микробов в виде отдельных
колоний на плотных
средах, причем и в эюм
< лучае приходится
прибегать к разбавлению
посевного материала.
Изолированию
микроба обыкновенно
предшествует накопление его
в жидкой разводке, для
чего пользуются «методом элективной или избирательной куль-
туры»(сведения о нем будут даны ниже).
Метод разбавления
Исторический метод этот предшествовал изолированию
микробов на плотных средах. Им пользовался в своих работах Пастер,
его же применял Листер (Lister) для изолирования молочнокислых
бактерий. Метод имеет ограниченное применение в виду неверности
получаемых результатов.
На рис. 64 изображена схема получения чистых разводок
методом разбавления. В пробирке а — густая смесь трех видов кокка,
71
а
Рис 64
Ъ с d e j
Схема получения чистых разводок
методом разбавления
бацилла и спирилла. В следующих пробирках Ь и с — постепенное
уменьшение числа бактерий под влиянием разбавления, т. е.
переноса капли посевного материала из предыдущей пробирки в
новую со стерилизованной средой. В пробирке е количество бактерий
уже так невелико, что капля жидкости, взятая отсюда, будет со-
Рис. 65. Посев в жидкую среду
держать в громадном большинстве случаев лишь один зародыш
и, следовательно, при засеве ею получится чистая разводка
одного из этих видов (d— /). На рис. 65 изображен посев в
жидкую среду.
Изолирование на плотных средах
В качестве плотной прозрачной среды впервые была
предложена мясопептонная желатина. Разливки ее производили
первоначально &3. стеклянных
пластинках по Коху (рис. 66). В
настоящее время они совершенно
оставлены и замерены двойными
чашками Петри (рис. 67).
Рис 67. Чашка Петри.
Рис. 66. Аппарат Коха для выливания
желатинных пластинок. На
горизонтальной доске лежит одна пластинка.
Разливки мясонептонной желатины в чашках Петри
В станкане с водой, нагретой до 30—35°, помещают несколько
пробирок с расплавленной мясопептонной желатиной. Берут одну
из них, захватив ее между большим и указательным пальцем
левой руки, обращенной ладонью вверх, так чтобы пробирка
находилась в горизонтальном положении во избежание попадания
в нее зародышей из воздуха, беспрерывно оседающих на свободные
поверхности в виде «микробного дождя». Вынимают из пробирки
ватную пробку (прием см. гл. 3) и защемляют ее между средним
и безымянным пальцами той же руки таким образом, чтобы
бывшая внутри пробирки часть ватной пробки была обращена вниз
и не касалась руки.1 Слегка обжигают на пламени газовой горелки
1 Проводя эти методические приемы, мы не склонны преувеличивать
их значение. И всяким другим приемом можно пользоваться, если он
достигает цели.
72
край пробирки и вводят внутрь ее поеевный материал с помощью»
платиновой иглы или петли. Плотный материал растирают на
внутренней поверхности стекла и смывают расплавленной желатиной.
Пробирку затем закрывают ватной пробкой, предварительно
обжегши ее, х и осторожно размешивают расплавленную желатину.
Это достигается наклонением пробирки в разные стороны и
раскатыванием ее между ладонями. Надо избегать образования
пузырьков в желатине и стараться
не запачкать средой ватной
пробки.
Берут вторую пробирку
с расплавленной желатиной
и, вместе с зараженной,
захватывают, как выше
укапано, между большим иука-
аатслыіим пальцами левой Рис G8 пересев из одной пробирки в
руки. Пшшмпют вптпые другую,
пробки и нажимают их:
одну - мгжду средним и безымянным пальцами, а другую —
мпжду Гнмі,ш)іішым и мизинцем левой руки (рис. 68). Обжигают
кран пробирки и, взяв стерильной платиновой петлей часть
материала из первой пробирки, переносят его во вторую. Повторив
аиражение еще один или два раза, закрывают пробирки ватными
пробками и во вновь засеянной размэшивают желатину, как уже
было описано. Таким образом делают и третье разбавление, беря-
для посева из второй
пробирки 4—6 петель.
Если исходный
материал был очень богат
микробами, то делают еще 4-е
и Г)-е разбавления,
увеличивая всякий раз число
петель, служащих для посева. Рис. 69. Выливание желатины в чашку
Поеевный материал мо- Петри.
жно разбавлять и иным
способом, заражая им последовательно ряд пробирок со
стерилизованной водой2 и заражая желатину из этих разбавленных
материалов. Получив, таким образом, ряд разбавлений посевного
материала, приступают к разливкам.
Сначала выливают в чашку Петри содержимое первой пробирки,
обжегши предварительно ее край (рис. 69). Чашка Петри
помещается на особом горизонтальном столе с холодной водой под ним (рио.
66). Желатина должна распределиться равномерным слоем по все-
1 Горящую или тлеющую пробку прямо вставляют в пробирку, где она
сама быстро гаснет.
2 В лаборатории полезно иметь готовыми стерилизованные пробирки с во.
допроводной водой или с физиологическим раствором поваренной соли (0.85%)
Они могут служить и для сохранения посевных материалов в течение работы"
73
му дну чашки. Это достигается осторожным наклонением
последней в разные стороны так, чтобы не запачкать средой крышки.
Таким же образом выливается содержимое остальных пробирок
в другие чашки. Когда желатина застынет, чашки Петри
помещаются в двойной чашке Эсмарха (Esmarch) (рис. 37) и сохраняются
при 20—22°.
Если в посевном материале было много видов, разжижающих
желатину, то отвивки из колоний делают возможно раньше или же
прикасаются палочкой ляписа к разжижающим
желатину колониям, чтобы избежать разжижения
среды и дать возможность образоваться колониям
неразжижающих видов.
Вопрос о том, каким разбавлением
пользоваться для отвивки из колоний, решается видом
пластинок; иногда это бывает первое разбавление,
а иногда 4-е или 5-е.
Если желательно разлить питательную среду
по одинаковому числу кубических сантиметров
в каждую пробирку, пользуются разливательной
воронкой Трескова (рис. 70).
Можно изолировать микробов на желатиновой
среде и не прибегая к чашкам Петри — по
способу Эсмарха.
В широкие пробирки наливают по 5 см3
расплавленной мясопептонной желатины и стерилизуют.
Засеяв ряд пробирок различно разбавленным
материалом, надевают на ватные пробки резиновые
колпачки, каждую пробирку с охлажденной почти
до застывания желатиной погружают в ледяную
воду или под струю холодной воды, быстро
вращая вокруг оси почти в горизонтальном
положении (желатина, однако, не должна достигать
ватной пробки). Делается это таким образом: нижний
конец пробирки слабо зажимают между пальцами
левой руки, а правой вращают ее, как бы
ввинчивая бурав. Желатина при этом распределяется
тонким слоем на внутренней поверхности
пробирки. Из выросших колоний можно произвести отвивку, хотя
технически она несколько затруднительнее, чем отвпвка из чашки Петри.
Разливки агаровых сред
Если для выращивания бактерий нужна более высокая
температура (35—37°), то для разливок служат агаровые среды.
Пробирки с расплавленным мясопептонным агаром помещают
в водяную баню с температурой в 45°. Перед заражением их
охлаждают до 40—41°. Разбавление производится таким же образом,
как описано для желатины, но только надо манипулировать быстро
во избежание застывания среды. Выливают в чашки возможно
Рис. 70
Разливательная
воронка
Трескова с боковым
измерительным
цилиндром для
вливания в
пробирки
одинаковых
количеств
жидкости.
74
охлажденную среду, так как горячая отдает много воды и плохо
схватывается стеклом. В виду неизбежной отдачи воды чашки с
агаровыми разливками ставят на несколько дней в термостат в
опрокинутом положении для стенания воды на крышку чашки.
Полезно на внутреннюю сторону крышки наложить кружок
стерилизованной фильтровальной бумаги и нанести на него несколько
капель глицерина. Вследствие своей
гигроскопичности глицерин
поглощает воду и не дает образоваться
каплям воды на поверхности среды.
Рис. 71. Заражение поверхности плотной Рис. It. Колонии микробов
питательной среды в чашке Петри изо- на плотной питательной
гнутой под прямым углом стеклянной па- среде.
Рис. 74. Колонии Vibrio cholerae
asiaticae на желатине.
Колония слева — 3-начальной стадии
разжижения, справа—в сильно подвинупшейся, с ясио
видимой зоной разжижения.
Другой недостаток агаровых сред—их неполная
прозрачность — затрудняет исследование колоний, выросших в толще
среды. Поэтому удобнее производить заражение поверхности за
стывшего агара при помощи изогнутой под тупым углом
стеклянной палочки (рис. 71). Поверхность агара не должна содержать
капель влаги, так как при этом колонии сливаются и
изолирование не удается.
ЛОЧКОЙ.
Рис. 73. Колония Вас.
anthracis на поверхности
желатины.
75
Рио.
поверхности
В спешных случаях, когда нет под рукой стериливованных-
чашек Петри, можно изолировать нужный микроб, размазыная
одной и той же петлей посевный материал по поверхности агара
(не касаясь конденсационной воды) в ряде пробирок (не менее 6—8)
о косо застывшим агаром. На последних мазках посев будет
настолько редок, что без
труда удастся изолирование
из отдельных колоний.
Выросшие на плотных
средах колонии,
принадлежащие различным видам,
различаются по своему
внешнему виду (рис. 72),
окраске, внутреннему
строению, окаймлению,
профилю, консистенции и
пр. На рис. 73 изображена
поверхностная колония
сибиреязвенной палочки
на желатине, на рис. 74—
холерного вибриона и на
рис. 75—тифозного
бацилла. Первая колония имеет
вид запутанного клубка
ниток, вокруг второй
видна зона разжижения, и
колония вследствие этого
сидит в углублении;
наконец, у третьей —тифозной
колонии—характерно
центральное ядро с
отходящими жилками и фигура
окаймления. На рис. 76
изображена однодневная
колония дифтерийного
бацилла на агаре с
сывороткой. На рис. 77 дано
изображение колоний
туберкулезной палочки,
напоминающих по виду головки
цветной капусты, а на
рис. 78 — разводка
туберкулезного бацилла на
глицериновом агаре. Рис. 79
дает вид складчатой
колонии картофельного бацилла. На рис. 80 изображены гигантские
колонии трех диких дрожжей—Sacch. Pastorianus 1,11 и III на
среде с сахаром. Структура колоний во всех трэх случаях различная.
7в
75. Bact. typhi на
желатины.
Г:>Л' .'¦;¦-¦¦•-' -¦.*.* *v ч! •": ¦'•-.'>:' ;;*:_:\ v-
Рис. 76. Колония Bad. diphthenae
на агар? с сывороткой.
Рис. 77. Крупные колонии Bad.
tuberculosis на картофеле.
Рис. 79. Рост картофельного
бацилла (Лас. mesentericus)
ыа ломте картофеля.
Рис. 78. ?ас(. (и
berculosis на
глицериновом агаре.
ю
:і
Рис. 80. Колонии ?*. Pastorianus II, 5. intermedium, ?. Pastorianus II и Л"
vaLuius (S. Pas to г can us III).
* 4
Колонии исследуются сначала невооруженным глазом, а за
тем более сухими системами (система А. Цейсса, 2 или 3 Лейца).
Если колонии слишком мелки и среда вполне прозрачна,
применяются и сильные увеличения. Колонии удобнее рассматривать,
опрокинув чашку Петри и отмечая чернилами на стекле колонии,
предназначенные для отвивки.
Из намеченной колонии берут часть материала обожженной на
огне платиновой иглой и заражают стерилизованную питательную
среду —жидкую или плотную. При заражении плотной среды
различают посев штрихом и уколом. Посев штрихом производится
чертой или змейкой по поверхности косо застывшей плотной
питательной среды. Если желают убедиться в чистоте посевного
материала, его размазывают по всей поверхности косого агара в
нескольких пробирках. Колонии должны быть всюду однообразны.
Материал из подсохшей колонии полезно сперва смочить в
конденсационной воде посевной пробирки с агаром, а затем уже вести
посевную черту.
Посев уколом производится введением
прививной иглы с посевным материалом
в толщу питательной среды. Укол должен
проходить по оси пробирки, в равном
расстоянии от краев, и доходить почти до дна
пробирки. На рис. 81 изображен один из
приемов заражения уколом. Засеваемая
пробирка обращена отверстием вниз, чтобы
уменьшить опасность загрязнения среды
из воздуха. При заражении уколом
питательные среды, особенно желатина,
должны быть свежими и не подсохшими.
Подсохшая желатина (с сильно вогнутым
мениском) дает обыкновенно трещину при
уколе. Такую желатину можно исправить,
прибавив к ней стерилизованной воды и
вновь переплавив, но лучше пользоваться
свежеприготовленной средой. При
заражении уколом, помимо общей картины роста,
отмечают, разжижается ли желатина,
образуются ли газы и пр.
Рис. 81. Посев уколом в
плотную среду.
Пробирка держится в
опрокинутом виде для
предохранения среды от
загрязнения микробами,
могущими попасть вместе с
пылью из воздуха.
Способ Гапс?на (Hansen) для получения
культуры дрожжей из одной клетки (Kinzcll-Knltur)
Часть культуры дрож?кей тщательно
взбалтывают в стерилизованной воде или
в 0.5% растворе NaCl для разъединения
клеток и исследуют, сколько дрожжевых
клеток содержится в капле этой взвеси.
Если количество их слишком велико, то делается одно или
несколько разбавлений до тех пор, пока в жидкости окажется такое
78
количество клеток, чтобы при заражении этим материалом
солодовой желатины в одной капле последней было по одной или по
нескольку клеток дрожжей. Каплю такой засеянной желатины
размазывают равномерно тонким слоем на стерилизованном
покровном стекле, которое затем прикрепляют (слоем желатины*
вниз) к предметному стеклу с выемкой (влажная камера—рис. 82).
При увеличении в 40—
60 раз исследуют слой
желатины и отмечают
чернилами места
заключенных в ней
дрожжевых клеток. В таком
виде влажная камера
сохраняется в течение рис. 82. Предметное стекло с выемкой
двух суток при 20°, по- для исследования микробов в висячей
еле чего рассматривают капле,
под микроскопом
образовавшиеся колонии. Они должны быть расположены
изолированно и не сливаться с другими колониями. Из таких колоний
делают отвивки. Преимущество метода Гансена перед разливками
в чашках Петри заключается в том, что здесь при выращивании
колонии заведомо исходят из одной единственной клетки, тогда*
как там колония может произойти из случайно склеившихся
нескольких клеток.
Капельная культура дрожжей (Tropfehen-Kiiltur) Линднера (Lindner)
Разводкой дрожжей заражают солодовый раствор или пивное
сусло таким образом, чтобы в небольших каплях содержалось
по одной дрожжевой клетке (если содержится больше, делают
разбавление). На стерилизованное покровное стеклышко
стерильной зубочисткой из гусиного пера или обыкновенным стальным
пером наносится ряд небольших капель, и оно помещается во
влажной камере (см. дальше стр. 82). Все капли исследуют
под микроскопом и отмечают тушью на поверхности стекла те из
них, которые заключают лишь одну дрожжевую клетку. Из этой
капли производят затем отвивки.
Видоизменение этого метода представляет способ Бурри (Burri)»
(Tuschepunkt-Kultur), пригодный и для более мелких объектов,
например бактерий. Исследуемым бактериальным материалом
заражают пробирки с жидкой, тушью (см. дальше) и разбавляют'
до тех пор, пока в одной небольшой капле будет лишь один
зародыш. Капли располагаются в ряд на стерилизованном
предметном стекле и исследуются под микроскопом. Обожженным тонким
рисовальным пером капли наносятся рядами на питательную
желатину в чашке Петри и накрываются большим стерилизованным
покровным стеклышком. Под чашку подстилается лист белого
картона, и капли туши исследуются под микроскопом, при от-
крытой чашке Петри, сначала слабыми, а потом сильными систе-
7&
мамп. Благодаря темному фону туши бесцветные зародыши вит
под микроскопом. Отметив капли, содержащие заведомо лишь ог
клетку, берут из них или из выросших колоний материал для
вивок. Для этого снимают стеклышко с приставшими капля
с поверхности желатины и материалом из этой капли заража
подходящую среду.
Счет колоний
Наиболее прямой путь для определения количества микробоі
в данном образце — непосредственное сосчитывание их при
помощи счетной камеры Цейсса, употребляемой для счета кровяных
телец (окуляр 4, объектив D Цейсса). Способ этот, однако, не
получил большого распространения в виду связанных с ним
технических трудностей, зависящих от ничтожных размеров бактерий.
{В настоящее время получил распространение прямей метод Ви-
ноградского (см. 329). Таким путем определяется всегда большее
число микробов, чем с помощью обычно применяющегося метода
счета колоний. Это объясняется тем, что здесь сосчитываются
все — и живые и мертвые микробы. В камере Тома, по Хорвату,
можно подсчитывать число бактерий, применив для этого раствор,
состоящий из 96° спирта — 10 см3, глицерина — 30 см3, дестил-
лированной воды—60 см3, концентрированного спиртового
раствора генциан-виолетт —10 капель (т. е. около 0.5 см3). С другой
стороны, не лишен недостатков и способ счета колоний,
вырастающих на данной среде при заражении исследуемым
материалом, ибо нет такой среды, на которой бы все содержащиеся в
данном образце микробы образовали колонии, и не может быть таких
внешних условий культивирования (температура, приток
кислорода, воздуха и т. п.), которые бы одинаково подходили для всех
микробов. Сказанное заставляет относиться с большой
осторожностью к абсолютному значению цифр, полученных путем счета
колоний. Самое большее, что могут дать эти цифры, это —
материал для сравнительных определений, да и то при непременном
условии пользования строго одинаковой методикой.
Для посева берут, смотря по богатству исследуемого образца
бактериями, 1 см3 или часть его. В последнем случае к 1 см3
исследуемого материала прибавляют 9—4Э—99 см3
стерилизованной воды и из полученной равномерной эмульсии в том или
другом разведении берут для анализа 1 см3. Посев небольшими
каплями распределяется по дну стерилизованной чашки Петри, в
которую затем наливают расплавленную желатину или агар,
надлежащим образом охлажденные. Посевный материал тщательно
смешивают с питательной средой наклонением чашки в разные
стороны, но так, чтобы не запачкать крышки. Чашку затеаі
оставляют в горизонтальном положении до застывания среды.
На агаровых средах, сохраняемых при 35—37°, счет колоний
можно производить дня через два, а на желатиновых, сохраняемых
so
при 20—22°, через 7—10 дней. Но при исследовании воды счет
колоний и на желатиновых пластинках производится через двое
суток. Если много разжижающих желатину видов, их рост
прекращают прикосновением палочкой ляписа.
В зависимости от количества появившихся на пластинке коло-'
ний поступают различно. Если колоний немного, их сосчитывают
Рис. 83. Аппарат Волльфюгеля для счета колоний.
на всей пластинке, повернув чашку вверх дном и пользуясь
лупой. Сосчитанные колонии отмечают чернилами или тушью на дне
чашки. При большем числе колоний их сосчитывают на
нескольких участках пластинки. Зная площадь сосчитанных участков
и площадь всей чашки, 'легко вычислить количество колонии на
всей пластинке.
Для счета
колоний предложено
несколько аппаратов.
Наиболее
употребительные из них
аппарат Волльфюгеля
(Wollfhugel),
пластинка Лафара (La-
far) и счетная камера
Шумбурга (Schum-
burg).
В аппарате
Волльфюгеля (рис. 83)
черная стеклянная
пластинка разделена
на 144 квадрата, в 1 см2 каждый, причем квадраты,
расположенные по диагоналям, в свою очередь разделены на 9 малых
квадратов каждый. Этой пластинкой пользуются теперь мало.
б Руководство ио викробвологии * "-*
Рис. 84. Слева пластинка Лафара для счета
колоний в чашках Петри. Справа—плоская счетная
камера Шумбурга.
Рациональное деление счетной пластинки на секторы—как
в пластинке Лафара (рис. 84). Дно почти всякой чашки Петри
слегка выдается в средней части, вследствие чего слой питательной5
желатины по краям чашки толще, чем в середине. Естественно,
что и число колоний в 1 см2 по периферии чашки будет больше,
чем в центральной части. Деление поверхности чашки на секторы
в значительной степени устраняет этот недостаток.
Такую пластинку можно приготовить самому. Для этого
стеклянную пластинку нагревают и, установив горизонтально,
покрывают тонким слоем расплавленного воска. Затем разграфляют
поверхность иглою (царапая ею до стекла) на участки и обливают
фтористоводородной (плавиковой) кислотой. Через несколько
минут пластинку обмывают горячей водой, удаляя воск, причем
на стекле становится видимым узор разграфления вследствие
разъедания стекла плавиковой кислотой.
В счетной каме'ре Шумбурга (Schumburg) (рис. 84) деления
нанесены на верхней части плоской колбы, в которую
наливается засеянная питательная среда.
Если в лаборатории не имеется ни одного из приспособлений
для счета колоний, можно разграфить бумагу по образцу
пластинки Лафара на круге, соответствующем по величине чашке
Петри.
При небольшом числе колоний их сосчитывают в 10 и более
равных квадратах аппарата Волльфюгеля, выводят среднее число
колоний, приходящееся на 1 квадрат (1 см2), и затем умножают
полученное число на число квадратов, занимаемых поверхностью
чашки Петри.
Если число колоний велико, счет производят в малых
квадратах аппарата Волльфюгеля и дальше поступают, как выше
описано.
При очень большом числе мелких колоний их сосчитывают
под микроскопом. Сначала, поместив на столике микроскопа
предметный микрометр (Objectmikrometer), определяют диаметр
поля зрения при данной установке (окуляр, объектив, длина тру-
, бы). Зная диаметр поля зрения, определяют его площадь по
формуле ttR2 (радиус R равен половине диаметра). Зная площадь
чашки Петри, которую определяют по той же формуле, легко
вычислить, скольким полям зрения она соответствует. Располагая
этими данными, сосчитывают число колоний в 10—20 полях
зрения, выводят среднее и умножают его на отношение между
площадями чашки и поля зрения.
Если в лаборатории не имеется предметного микромера, то
для измерения поля зрения на столик микроскопа кладут
линейку, разделенную на миллиметры или полумиллиметры. Взяв
соответственные объектив и окуляр, а также регулируя увеличение
микроскопа выдвиганием или вдвиганием тубуса, можно достигнуть
того, что ширина поля зрения будет точно соответствовать 1, 4.5
или 2 мм. Дальнейшие вычисления производят, как выше указано.
82 '
Густота колоний на пластинке не должна переходить
известных пределов, за которыми сосчитывание колоний уже дает
сомнительные результаты. В этом случае надо сделать
разбавления и в одном из них сосчитать число выросших колоний.
2. БАКТЕРИОСКОПИЯ И МИКРОТЕХНИКА
Микробы изучаются под микроскопом: 1) в неокрашенном
состоянии (живыми или убитыми) и 2) в окрашенном виде.
Неокрашенные препараты
Изучение микробов в неокрашенном виде представляет не
малые трудности вследствие их ничтожных размеров, но вместе с тем
оно имеет и большие преимущества, так как микробы изучаются
в неповрежденном виде. При обычном приготовлении препаратов
уже одно высушивание приводит нередко к частичному
плазмолизу содержимого клетки, не говоря уже о более глубоком
нарушении нормального строения клетки под влиянием сложной
обработки препарата красящими веществами. ,
Висячая капля
Прием висячей капли, введенный в практику Кохом, служит
для изучения микробов в живом состоянии и для ознакомления
с историей их развития, подвижностью, характером деления,
образованием и прорастанием спор, отношением к химическим
раздражителям и т. п.
В висячей капле рассматривают эмульсию живых микробов
в жидкой питательной среде или в физиологическом растворе
поваренной соли (0.85%). Не следует брать слишком густую взвесь
микробов, так как это затрудняет наблюдение отдельных клеток.
Можно слегка подкрасить жидкость фуксином, нейтральротом
или метиленовой синью. Не оказывая вредного действия на
микробов, это облегчает установку препарата и дальнейшие
наблюдения.
На стерилизованное покровное стеклышко наносится небольшая
плоская капля жидкости с взвешенными в ней бактериями.
Стеклышко затем быстро поворачивают каплей вниз и накладывают на
предметное стекло с углублением в середине (рис. 82) таким
образом, чтобы капля свободно свисала в углублении, не касаясь
ни дна, ни краев его. Края выемки должны быть смазаны вазелжном
(или, еще лучше, смесью равных частей вазелина и жидкого
парафина), к которому плотно прижимают покровное стеклышко.
Капля, таким образом, оказывается герметически заключенной
во влажной камере. Для заделки стеклышка можно пользоваться
также зажженной тонкой восковой свечой, быстро проводя
светильней по краю покровного стекла; стекающий воск плотно
заделывает препарат. (Для той же цели может служить обмазка краев
покровного стеклышка тонкой кисвочкой, смоченной коллодием.)
6* 8S
Если заделка не герметическая, то в высыхающей жидкости
возникают токи, увлекающие микробов. Неопытный наблюдатель может
смешать это пассивное движение с произвольным движением
бактерий.
Препарат исследуют сперва слабой сухой системой с
отодвинутым в сторону осветителем Аббе, при суженной диафрагме и
освещении вогнутой стороной зеркала. В центре поля зрения
устанавливают край капли в виде дугообразной линии с осевшими
по одну сторону ее мелкими капельками влаги. г Нанеся затем
на поверхность покровного стеклышка каплю кедрового масла,
рассматривают препарат с помощью иммерсионной системы при
слегка расширенной диафрагме и при освещении плоской стороной
зеркала. При установке иммерсионной системы следует слегка
передвигать из стороны в сторону препарат — тогда легче
заметить движущуюся тень края капли.
Наблюдение во влажной камере можно производить длительно—¦
в течение недели и более. В любой момент можно закрепить ту или
иную стадию роста микроба. Для этого снимают покровное
стеклышко и, после высушивания, окрашивают препарат и заключают
в канадский бальзам.
Для наблюдений в висячей капле при более высоких
температурах пользуются термостатом Нутгаля (Nuttall) (рис. 9) или
электрическим нагревательным столиком.
Исследование в висячей капле анаэробных микробов
производят, пользуясь различными приспособлениями, например —
проф. Никифорова («Zeitschrift fur Hyg»., Т. 8), Брааца (Braatz,
«Centralbl. f. Bakt.», 2. Abt. T. 8) и др.
По способу Никифорова покровное стеклышко с нанесенной
каплей накладывают на предметное стекло, но так, что выемка
последнего с одной стороны не вполне закрывается им. В
образовавшуюся щель платиновой петлей вносят каплю
концентрированного раствора пирогаллола, после чего покроішое стеклышко
надвигают на выемку до тех пор, пока не образуется с
противоположной стороны щель. В последнюю таким же образом вводят каплю
раствора едкого кали. После этого передвижением стеклышка
закрывают всю выемку предметного стекла и заделывают препарат,
как описано выше. Смесь едкого кали с пирогаллолом поглощает
весь кислород в замкнутом пространстве и делает возможным
развитие анаэробов. Буреющая смесь пирогаллола с щелочью
должна располагаться кольцом по краю выемки, не стекая на дно ее,
иначе будет затруднено микроскопирование.
Так как для начинающих установка препарата при
исследовании микробов в висячей капле представляет не малые затруднение,
1 Так как в герметически закрытом пространстве, где свешивается капля,
воздух насыщен паром, то малейшее понижение температуры вызывает
осаждение капель влаги на стенках «влажной камеры», особенно же на
покровном стекле, в непосредственной близости к капле. Эти капельки облегчают
установку препарата.
Ы
то можно рекомендовать воспользоваться сначала более простым
методом ((раздавленной капли». Небольшая капля исследуемой
жидкости наносится на обыкновенное предметное стекло, на нее
накладывается покровное стеклышко, препарат исследуется под
микроскопом. Пузырек воздуха, попавший под стекло, в этом случае
не только не мешает, а, напротив, облегчает установку препарата —
по краям его обыкновенно собираются аэробные подвижные
микробы.
„Негативный" способ Бурри (Вшті)
По способу Буррй фон препарата заливают жидкой тушью,
оставляя тела микробов неокрашенными, вследствие чего
получается как бы негативное их изображение. Пользуются
различными сортами туши (например жидкой тушью марки «Pelikan-
tusche 541» или «Perltusche» Гюнтера — Вагнера или Грюблера).
Одну часть туши смешивают с девятью частями дестиллированной
воды (или же разбавляют водой в отношении 1 : 1 или 1 : 2)
и стерилизуют при 110° в течение 30 мин. в пробирках, закрытых
ватными пробками. Можно также, не прибегая к стерилизации
паром, прибавить к туши несколько капель формалина. До
употребления разбавленная и стерилизованная тушь должна
сохраняться в спокойном состоянии по крайней мере в течение двух
недель, чтобы взвешенные крупные частицы успели осесть. Для
приготовления тушевьіх препаратов берут верхние части
отстоявшейся жидкости.
Каплю туши наносят на предметное стекло, тщательно
смешивают с каплей жидкости, содержащей микробов, и смесь тонким
слоем размазывают но поверхности предметного стекла краем
покровного стеклышка. Когда темный слой высохнет, препарат
исследуют под микроскопом; бактерии резко выступают в виде
ярко освещенных бесцветных телец на темном фоне препарата.
Иногда тушь сама по себе содержит бактерии, и поэтому
необходимо предварительно исследовать ее под микроскопом.
Тушь можно заменить кислыми анилиновыми красками, не
красящими бактерий, как нигрозин, конго-рот, кислый фуксин и др.
Можно также воспользоваться раствором колларгола.
Рекомендуется брать 1% раствор, но мы получали более ясные картины
с 10% раствором (см. окраску капсул).
Наблюдения над живыми бактериями на плотной среде
В инструкции «Общества американских бактериологов»
рекомендуется поступать следующим образом. Из вылитой тонким
слоем пластинки питательного агара вырезают кусочек,
смазывают исследуемой культурой (если нужно — разведенной)
и накладывают зараженной стороной на стерилизованное
покровное стеклышко. Последнее заделывают во влажную камеру,
как выше описано.
вг>
По Пальчиковскому, берут стерилизованное предметно
отекло с углублением, в которое прибавляют несколько капель
питательного агара таким образом, чтобы верхняя часть холмика
из агара приходилась на уровне плоскости стекла. Иглой,
смоченной культурой, производят крестообразный посев
(минимальный), после чего углубление покрывают стерилизованным
покровным стеклышком, которое заделывают парафином. Если
препарат приготовлен удачно, то покровное стеклышко, опираясь
краями на плоскость предметного стекла, в средней своей части
слегка касается верхушки агарового холмика с крестообразным
посевом на нем. На эту часть агара и устанавливают микроскоп
для наблюдений за развитием микробов.
Окрашенные препараты
Прижизненная окраска
Ее преимущество — в отсутствии опасности образования
искусственных продуктов обработки, как ото наблюдается при
изготовлении высушенных и фиксированных препаратов, и в возможности
выявления некоторых функциональных особенностей микробной
клетки.
Большинство известных красок, применяемых для
прижизненной окраски, в большей или меньшей степени токсичны для живых
микроорганизмов, особенно в значительных концентрациях.
Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при
которой окрашенные организмы остаются живыми длительное время
и способными к размножению. Для прижизненной окраски проти-
стов, грибов (в том числе дрожжевых грибков), синезеленых
водорослей и бактерий применяют краски: нейтральрот, бриллиант-
крезилблау, янусгрюн, везувин, нильблаусульфат в очень сильных
разведениях от 0.001 до 0.0001%. Иногда лучшие результаты
получаются при разведении этих красок физиологическим раствором
поваренной соли или фосфатным буфером со слабокислыми или
слабощелочными значениями рН.
Известное значение имеет так называемая субвитальная
окраска, во время которой организм медленно умирает. Эта окраска
производится или просасыванием под покровным стеклом более
концентрированных растворов красок, обычно употребляемых для
прижи зненной окраски (0.1 —0.01 %), или помещением капли
жидкости с исследуемыми микроорганизмами на предметное стекло,
покрытое тонким слоем краски.
Способ Наканиши (Nakanischi). Чистое предметное стекло
обливают насыщенным водным раствором метиленовой сини,
высушивают и обтирают сухой тряпкой до тех пор, пока налет краски
не примет светлоголубого оттенка. На покровном стеклышке
приготовляют мазок исследуемых бактерий и стеклышко, еще влажным,
накладывают на вышеописанное предметное стекло. Под
микроскопом можно наблюдать, как микробы, оставаясь живыми (не
теряя своей подвижности), постепенно окрашиваются в синий цвет.
86
Способ Ружичка (Ruiicka). Приготовляется смесь равных
частей 0.5% водных растворов нейтралърота и метиленовой сини.
Несколько капель этой смеси, равномерно распределенные на
поверхности предметного стекла, высушивают в термостате при 37°.
Нанося на высохшую краску каплю исследуемого материала,
накрывают ее покровным стеклышком и исследуют под микроскопом.
Способ Фикера (Ficker). Окраска производится просасыва-
нием под покровным стеклышком 0.1% водного раствора
метиленовой сини и 2% молочной кислоты.
Для окраски живых бактерий предложены также: 10%
раствор везувина (бисмаркбраун), 0.33% раствор далии, 0.01
^раствор нейтральрота, слабый водный раствор гематоксилина и др.
Нейтральрот в слабых концентрациях (1 : 10 000—100 000)
окрашивает прижизненно в клетках высших растений, грибов,
дрожжей и некоторых бактерий вакуоли; у грибов и дрожжей
вызывает выпадение волютина — метахроматина (вещества,
близкого к зимонуклеиновой кислоте), обычно находящегося в
растворенном состоянии в вакуолях.
Янусгрюн в очень слабых концентрациях (1 : 50 000—500 000)
окрашивает прижизненно и субвитально хондриосомы
(митохондрии, хондриоконты) в разнообразных животных и растительных
клетках, в том числе у водорослей, грибов, дрожжей и Protozoa.
^ Приготовление и окраска фиксированных препаратов
1) Приготовление мазка. Мазки приготовляются на покровных
и предметных стеклах. Предметные стекла прочнее и дешевле
покровных, и на них можно приготовить мазки больших размеров,
но окраска
препарата на них
требует
большого расхода
краски. Берут
небольшую каплю
жидкости,
содержащей оак- рис> g5 приготовление мазка на предметном стекле
терии (материал с помощью покровного стеклышка,
из плотных сред
разбалтывается в воде), и краем покровного стеклышка (рис. 85)
или платиновой петлей распределяют ее равномерно тонким слоем
по поверхности предметного стекла, которое должно быть чистым
и нежирным, иначе жидкость собирается в капли, и еене.удается
равномерно распределить. Без нужды не следует слишком
растирать материал по стеклу, ибо этим нарушается естественное
расположение клеток в культуре, например, разрываются цепочки
стрептококков, обрываются жгутики и т. п.
Некоторые мазки, * например из жидкостей, богатых сахаром,
из мочи и др., при ополаскивании водою легко смываются. Чтобы
87
Рис. 86. Вас. anthracis.
Препарат отпечаток с
трехдневной колонии на
желатине. %
Увслич. 1000.
этого избежать, к исследуемой жидкости прибавляют каплю
яичного белка. Такой препарат, высушенный и фиксированный, уже
не смывается, так как свернувшийся белок плотно пристает к
стеклу. Белок заготовляют впрок, смешивая
его с равным объемом 4% борной
кислоты, т. е. насыщенным при комнатной
температуре раствором.
Для лучшего прикрепления
объектов, особенно более крупных (протисты,
грибки, нитчатые бактерии), к
предметному или покровному стеклу последние
смазываются тонким слоем смеси
равных частей яичного белка и глицерина.
Когда ставят задачей исследовать
естественное расположение микробов в
колониях на поверхности плотной
среды, то приготовляют так называемый
«препарат-отпечаток». Для этого на
поверхность агаровой или, лучше,
желатинной среды с выросшими на ней
колониями осторожно накладывают
предметное или покровное стекло, слегка
нажимают его и тотчас же снимают,
стараясь не сдвинуть его в сторону, чтобы
не размазать отпечатка. В удачном случае на стекле получается
точный отпечаток колонии с характерным расположением
микробов в ней (рис. 86).
Для исследования
тонкого строения
колоний микроорганизмов
иногда прибегают к
фиксации этих колоний на
субстрате, осторожному
обезвоживанию в
спиртах возрастающей
крепости, заливке в
парафин и производству
тонких (2—3 микрона)
срезов на микротоме.
Обработка таких срезов
проводится как обычных
гистологических
препаратов.
2) Высушивание. Препарат обычно высушивают при комнатной
температуре без нагревания; для ускорения высыхания препарат
осторожно подогревают, мазком вверх, над запасным пламенем
бунзеновской горелки. Если препаратов много, их высушивают на
медном дне термостата или на нагревательном столике (рис. 87).
Ф$-^го
Рис. 87. Нагревательный столик Коха из
согнутой в 3 ярусах медной пластиИки.
Если высушиваемые препараты содержат патогенных
микробов, их накрывают стеклянным колпаком или мелкой сеткой,
особенно летом, во избежание переноса заразы мухами.
3) Фиксация. Фиксация препарата имеет целью: а) убить
микробов (бесспоровых) и сделать безопасным дальнейшее обращение
с ними, б) обеспечить лучшее прилипание к стеклу во избежание
смывания препарата и в) сделать мазок более восприимчивым к
окраске, так как мертвый белок лучше красится.
Цитологическая фиксация имеет главной своей целью убить
организм с наименьшим изменением клеточных структур и без
образования, по возможности, ложных структур (артефактов).
Обычный прием фиксации, предложенный Кохом, —
нагревание на пламени газовой горелки. Захваченный между большим
и указательным пальцами препарат 4—5 раз проводится, мазком
вверх, через наиболее горячую часть пламени газовой горелки.
Быстрота проведения через пламя регулируется ощущением
жжения в пальцах. Если мазок взят из культуры патогенных
бактерий и края стекла замазаны культурой, то стекло надо брать
пинцетом. Для изучения строения бактериальной клетки фиксация
нагреванием не годится.
В этих случаях прибегают к фиксации химическими веществами.
Для'этой цели служит один из следующих способов:
а) Фиксация этиловым спиртом. Крепкий
спирт * действует почти мгновенно. Этот способ хорош для
фиксации препаратов из крови и гноя (95% спирт в течение 10—15 мин).
Чем раствор спирта слабее, тем фиксация должна быть
продолжительнее.
б) Фиксация смесью равных объемов
этилового спирта и эфира. На препарат наливают
несколько капель смеси и дают им испариться.
в) Фиксация безводным метиловым
спиртом. Время фиксации 2—3 мин. Спирт сливается, и препарат
высушивается.
г) Фиксация ацетоном происходит в течение 5 мин.
д) Фиксация парами формалина или
уксусной кислоты. Достаточно подействовать в течение
нескольких минут продажным раствором или более разбавленным
(не ниже 4%).
Удобнее всего фиксацию проводить в чашке Петри, к
верхней крышке которой водой прикрепляются покровные стекла
мазками вниз, а на дно наливается формалин, слегка
подогреваемый.
1 Абсолютный спирт приготовляется из покупного спирта
обезвоживанием его прокаленным медным купоросом. Прокаливание производится в
фарфоровой чашке или тигле до полного побеления этой соли. На 1 л
спирта прибавляют около 150 г безводного медного купороса. Спирт
хранится в стеклянной банке с пришлифованной пробкой. На дне банки
должен быть слой прокаленной медной соли.
8Э>
е) Фиксация парами 1—2% водного
раствора осмиевой кислоты. Стеклянную трубочку с
заключенной в ней */4 г осмиевой кислоты тщательно обмывают эфиром,
спиртом и дестиллированной водой и разбивают энергичным
встряхиванием в толстостенной склянке темного стекла с притертой
пробкой, после чего приливают 25 см3 дестиллированной воды (1%
раствор). Продолжительность действия 0.5—3 мин. Сухой или
влажный препарат помещают на подставке в закрытую склянку
с указанным раствором осмиевой кислоты на дне или накладывают
^его, мазком вниз, на горлышко открытой склянки с осмиевой
кислотой и выдерживают минут пять. При этом способе фиксации
остается неизменным строение клетки.
По Аргутинскому, в чашке Петри помещается часовое
стеклышко, на которое кладется кусок стеклянной ваты, пропитанной
1—2% раствором осмиевой кислоты. На стеклышке помещается
предметное стекло с еще влажным мазком, после чего чашка Петри
закрывается крышкой. По прошествии 1—2 мин. препарат
высушивают, осмиеву кислоту удаляют обработкой препарата в течение
5—10 мин. слабым раствором перекиси водорода. Затем препарат
хорошо промывают водой, высушивают и окрашивают.
ж) Фиксация 10% раствором азотносе-
ребряной соли (ляписа) заканчивается в течение 10 мин.
з)1% раствором сулемы фиксируют в течение 10—15
мин,, после чего препарат промывают раствором поваренной
¦соли и водой.
и) Жидкость Флемминга (Flemming).
Слабый раствор
3% хромовой кислоты 25 см*
1% осмиевой » 30
і% уксусной » 10
Дестиллированной воды . 55
Фиксация продолжается несколько дней.
Крепкий раствор
1% хромовой кислоты 75 см8
2% осмиевой » 20
Крепкой уксусной кислоты 5
»
Фиксация достигается очень быстро.
к) Жидкость Мюллера (Мііііег)
ДвухромовокалиевоЙ соли 2.5 г
Сернокислого натрия 1
Дестиллированной воды 100 см3
л) Жидкость Буэна (Bouin) (особенно пригодна для
ядерных структур)
Пикриновой кислоты насыщенный водный
раствор 75 сма
Формалина неразбавленного .,,.... 25
Ледяной уксусной кислоты 5
90
м) Жидкость Карнуа (Сагпоу)
Ледяной уксусной кислоты а
Абсолютного спирта 6
Хлороформа 3
н) Жидкость Шампи (Qiampy) (один из лучших
цитологических фиксаторов) ^
3% раствор двухромокалиевой соли ... і см3
1% хромовой кислоты 7
2% осмиевой кислоты 4
4) Окраска. Начинающие иногда затрудняются определить,
на какой стороне стекла находится мазок. Последний выступает
явственно, если подуть на стекло теплым дыханием; где мазка нет,
вся поверхность стекла становится равномерно матовой от
остывших частиц пара. Можно также поцарапать мазок иглой — должен
остаться след от нее.
Фиксированный сухой препарат обливают краской при помощи
пипетки (рис. 12), которою не следует касаться стекла. Выбор
краски и длительность окрашивания зависят от особенностей
препарата. Так, для изучения строения клетки предпочтительнее брать
слабые растворы красок, действуя ими длительное время. Для
микрофотографии рекомендуется перекрашивать препараты. Обычно
действуют красящим раствором при комнатной температуре в
течение нескольких минут, но иногда окраску ведут часами и даже
в течение суток. В этом случае препарат опускают, мазком вниз,
в часовое стеклышко с краской, накрытое другим стеклышком.
Для усиления действия краски можно вести окрашивание при
легком подогревании. Перекрашенные препараты можно слегка
ослабить, облив их на несколько секунд слабым раствором спирта
или 0.5% уксусной кислотой. Такая обработка способствует
также очищению фона. Пятна от краски на столе и руках выводят,
обмывая сначала 20% серной кислотой, а затем 60% спиртом.
5) Промывание и временное заделывание. Краску удаляют
легкой струей веды или опуская захваченный пинцетом препарат
в чашку с водой. Если материал был патогенный, то промывные
воды необходимо обеззаразить.
Промытый и еще влажный препарат на предметном стекле
накрывают покровным стеклом и тщательно отжимают фильтровальной
бумагой, впитывающей выступающую из-под стеклышка воду. В
неотжатом препарате возникают токи воды, увлекающие бактерии,
которые беспрерывно движутся в поле зрения, мешая исследованию.
Так как вода плохо пристает к грибнице плесневых грибов,
то препараты плесеней обрабатывают 60% спиртом с прибавлением
нескольких капель аммиака, расщепив препаровальными иглами
(рис. 23) мицелий в этой жидкости. Отсосав затем жидкость куском
фильтровальной бумаги, прибавляют разбавленный глицерин
и в нем рассматривают препарат.
6) Сохранение препарата впрок. Проще всего, сняв покровное
стеклышко, дать препарату высохнуть и сохранять его в таком
91
виде, снабдив соответственной надписью. Если покровное стекло
плотно пристало, то его по краям обводят водой, проникающей
под стекло, и тогда оно легко снимается.
Иногда препараты на предметном стекле рассматривают без
покровного стекла, помещая каплю кедрового масла прямо на
сухой мазок. В этом случае, если препарат желательно сохранить,
кедровое масло удаляют, облив стекло ксилолом, который
растворяет масло; ксилолу затем дают стечь, придав стеклу вертикальное
положение.
Для заделки в канадский бальзам употребляются лучшие сорта
его, не содержащие кислоты. Однако и в них препараты
постепенно обесцвечиваются, особенно при окраске метиленовой синью.
На сухую поверхность мазка наносят небольшую каплю
бальзама, не содержащую пузырьков воздуха. Если они есть, их
удаляют прикосновением горячей платиновой иглы. Полезно слегка
нагреть стекло, чтобы бальзам стал жиже, после чего накладывают
покровное стеклышко. Делают это таким образом, что сначала
захватывают каплю бальзама одним из краев стекла, а затем,
постепенно опуская поднятый край стекла, достигают
равномерного растекания бальзама под ним, без пузырьков воздуха.
Излишек бальзама удаляют из-под втекла надавливанием поверхности
последнего ногтем или тупой палочкой. Выступившие капли
бальзама можно удалить фильтровальной бумагой, смоченной
ксилолом, или же, когда бальзам затвердеет, соскабливают его ножом
и окончательно очищают края стеклышка ксилолом.
При заделке препаратов в бальзам необходимо иметь в виду,
что в нем бактерии кажутся значительно меньшими, чем в воде
(приблизительно в отношении 2 : 3), и, кроме того, теряются
некоторые подробности строения, например плохо заметны капсулы.
Микроорганизмы (особенно грибки) меньше изменяются, если
препараты заделать в кедровое масло.
Для заделки препаратов, в особенности плесеней, может
служить также глицериновая желатина одного из следующих составов:
а) Раствор желатины в глицерине в отношении 1 : 4.
б) Смешивают 50 см3 глицерина с 42 см3 дестиллированной воды.
При слабом нагревании растворяют в этой жидкости 7 г желатины
и 1 г карболовой кислоты. Готовую смесь фильтруют через
бумагу при нагревании в коховском кипятильнике. Масса эта
применяется в нагретом до 50° состоянии, а мазок плесени должен
быть еще влажным и содержать глицерин (см. выше, стр. 91).
Отжав покровное стеклышко, обводят его края парафином или
воском, а поверх — асфальтовым лаком.х
1 Приводим состав некоторых лаков:
Асфальтовый лак. При нагревании растворяют 45 г асфальта
в 22 5 г льняного масла и 100 г терпентинного масла. Последнее служит для
разведения лака, если он загустеет.
Каучуковый кит т. Раствор 1 г каучука и 16 г мастикса
в 40 см3 хлороформа.
92
7) Микроскопирование. Когда препарат готов, на сухую
поверхность покровного стеклышка наносят небольшую каплю
кедрового масла, в которую погружают объектив. Удерживая голову
сбоку микроскопа, под контролем глаза, осторожным движением
большого винта опускают объектив почти вплотную к стеклу,
.однако, не прикасаясь к нему, чтобы не испортить системы ине
раздавить препарата. В видах предосторожности слегка двигают
предметное стекло в разные стороны, чтобы легче заметить, если
объектив коснется стекла. Когда объектив достаточно опущен, его
постепенно поднимают вверх, следя за наступлением момента, когда
появится изображение в микроскопе — сначала неясное, а затем
все более и более отчетливое. г Тогда устанавливают наилучшее
освещение поля зрения, передвигая зеркало и опуская или
поднимая осветитель Аббе, после чего окончательно устанавливают на
резкость изображения препарата осторожным передвижением
трубы микроскопа при помощи микрометрического винта. Если
нужно, слегка суживают диафрагму Лббе для получения более
резкого изображения.
Обычная ошибка у начинающих — установка не на плоскость
препарата, а на верхнюю часть покровного стекла с приставшими
к нему соринками, пятнами краски и пр.
Часто затруднения при установке возникают оттого, что
препарат был почти целиком смыт при промывании после
окраски (см. стр. 91).
Когда микроскопирование окончено, поднимают трубу
микроскопа, снимают препарат и очищают объектив от кедрового масла.
Краски
Большинство красок, применяющихся в бактериологии,
принадлежит к производным бензола и добывается из
каменноугольной смолы.
Они представляют собою нейтральные соединения, построенные
по типу солей, содержащие хромофорные группы (красящее
начало) и ауксохромньге группы (группы, придающие
соединению способность к электролитической диссоциации и, тем самым,
свойство красителя). Эти группы присоединены к бензольному
кольцу.
Классификация красок основана на химическом строении
хромофоров и для наиболее важных биологических красок может
быть представлена следующей таблицей [по Конну (Conn)],
частично сокращенной.
1 Мы предпочитаем устанавливать препарат не при обратном движении
трубы снизу вверх, а при опускании ее. Как только объектив коснется капли
кедрового масла, труба микроскопа осторожно опускается дальше, но уже
под контролем глаза, до тех пор, пока пе появится сначала туманное, а потом
и более ясное изображение препарата^
93
1 Нитрокраски
Пикриновая кислота
II Азогруппа
Метилоранж, Бисмаркбраун, оранж G, красное конго, судан III и судан IV.
III Антрахиноновая і руппа
Ализарин
IV Хинон-иминовая группа, в состав которой
входят:
1) Тиазины — тионин, толуидинблау, метиленовая синька
2) Оксазины — брпллианткредельблау, нильблау
3) Азины
а) аминоазины — нейтральрот
б) сафранины — сафранин О
в) индулины — нигрозин
V Фенил-метановые краски
1) Диамино-три-фенил метаны малахитгрюн, брйллиантгрюн, лихтгрюн
2) Триамино-три фенил метаны фуксин основной, фуксин кислый, метил
виолет, генциан-виолет, метилгрюн
VI Ксантеновые краски
1) Пиронины пиронин G и В
2 Дериваты флуорана, эозины, эритрозин, бенгальская розовая
В. зависимости от того, какие группы ^амдао-или тидрокснлъ-
ные) превалируют в ауксохромах краски,— последние будут
основными (ядерными) или кислыми (протоплазматическими).
Бактерии окрашиваются почти исключительно ядерными
(основными) красками, хотя некоторые, как Staphylococcus
pyogenes, окрашиваются и кислыми. Назовем важнейших
представителей той и другой группы красок:
Основные краски Кислые краски
Красные
Нейтральрог
Пиронин
Сафранин
Фуксин
Фиолетовые
Генциан-виолет
Далия
Кристалл-виолет
Метил-виолет
Гематоксилин
1ионин
Синие
Виктория
Метиленовая синь
Зеленые
Малахитовая зелень
Метиловая зелень
Янусгрюн
Коричневые
Везувин
(Бисмаркбраун)
Хризоиднн
Черные
Инду лин
К расные и розовые
Кислый фуксин
Эозин
Эри грозин
Тропеолин
Желтые
\урантия
Конго
Пикриновая кислота
флюоресцин
Черные
Нигрозин
Комбинацией контрастных цветов основных и кислых красок
можно дифференцировать ядро от протоплазмы, например при
окраске простейших.
Кроме анилиновых красок, в бактериологии находят
применений также краски иного происхождения, например кармин,
добываемый из кошенилевой вши, и гематоксилин, получаемый
из кампешевого дерева.
Из сухих анилиновых красок, продающихся в виде порошков,
готовят обычно насыщенные спиртовые или крепкие водные
растворы, сохраняющиеся впрок, но сами по себе не пригодные для
окраски бактерий. К спирту прибавляют столько сухой краски,
чтобы на дне оставался нерастворимый осадок. Из этих
насыщенных растворов готовятся разбавленные спиртоводные растворы
красок, которыми и окрашивают микробов. Растворы эти не столь
прочны, как спиртовые, но они могут служить в течение нескольких
месяцев. Для их приготовления к воде, налитой в склянку для
красок, прибавляют по каплям столько насыщенного спиртового
раствора краски, чтобы раствор перестал просвечивать в толстом
слое, а в горлышке склянки просвечивал. Иногда растворы эти
приготовляют по особым рецептам (см. ниже), что необходимо для
точной работы и для получения сравнимых результатов. Иногда
готовят для окраски и водные (без спирта) 1—2% растворы сухих
анилиновых красок.
Для усиления действия красок пользуются: 1) увеличением
концентрации их, 2) прибавлением к их растворам таких веществ,
как анилин, щелочи, карболовая кислота, формалин и пр., 3)
продолжительностью окраски, 4) нагреванием красящего раствора,
5) предварительным протравливанием препарата
железо-аммиачными квасцами, таннином и т. п.
Приведем некоторые подробности, относящиеся к более
употребительным анилиновым краскам.
1) Метилеповая синь (синька) тетра-метил тионин:
СН
з
СН
/N-
СН.
= Nf-GH
3
G1 3
Растворимость при 26°С в воде 3.55%, в алкоголе — 1.48%.
Эта краска обладает слабой красящей силой, не
перекрашивает препарата и не грязнит его фона.
При окраске метиленовой синью бактерии кажутся несколько-
меньших размеров, чем при окраске генциан-виолетом или
фуксином.
Для окраски бактерий применяются спиртоводные растворы
различной крепости: на 1 см3 насыщенного спиртового раствора
краски берут 10 и 40 см3 воды. Растворы эти обозначают 1 : 10
и 1 : 40.
Более значительной красящей способностью обладают
растворы с прибавлением щелочи:
а) Щелочная синь Коха: на 100 см3 воды прибавляют
0.5 см3 насыщенного спиртового раствора краски и 1 см31%
раствора едкого кали.
9S
,6) Щелочная синь Лёффлера: тот же рецепт,
но содержание сини не 0.5 см3, а 30 см3.
Обе краски можно готовить впрок, так как при сохранении
качество этих красок лишь повышается: в них образуется особое
красящее начало, метахроматически окрашивающее различные
части клетки. Так, зерна волютина окрашиваются в фиолетово-
красный цвет, слизь —- в розовый и протоплазма — в синий.
В присутствии этого красного начала в щелочной сини можно
убедиться, взболтав ее с хлороформом или эфиром, в которых эта
краска растворяется с красным цветом. Метахроматические
свойства метиленовой сини объясняются присутствием в ней особого
вещества — азура, которое было получено Гимзой (Giemsa) в
чистом виде. В продаже имеются два препарата этой краски: Azur
I — чистый солянокислый азур и Azur II — смесь равных частей
Azur I и Methylenblau medicinale.
Метиленовая синь с карболовой кислотой готовится по рецепту
Кюне (Ktihne).
Метиленовой сини 1.5 г
Жидкой карболовой кислоты 5 г
Абсолютного спирта 10 см3
Воды 95
2) Метил-виолет. Обычно смесь тетра,-пента-и гекса-метил-
тіара-розанилина. Растворимость при 26° С в воде 2.93%, в
алкоголе — 15.21%.
Хорошая ядерная краска, известная во многих разновидностях,
обусловливаемых количеством введенных в частицу метиловых
групп. Их обозначают условными знаками; В — RB, 6—3R и др.
Разновидности отличаются по оттенкам. Столь часто
употребляющаяся в бактериологической практике превосходная краска ген-
циан-виолет представляет собой неочищенный препарат метил-
виолета. И этой краске отчасти присуще свойство метахромазии,
так как слизистые капсулы вокруг бактерий окрашиваются ею в
красно-фиолетовый цвет, а само тело бактерий — в фиолетовый.
Насыщенный спиртовый раствор этой краски готовится так же,
как описано для метиленовой сини.
Краски этой группы (призводные пара-розанилина) вкомбинации
с иодом прочно удерживаются некоторыми бактериями, трудно
извлекаясь спиртом, на чем основан способ окраски по Граму
(Gram) (см. ниже).
3) Кристаллвиолет (гексаметил-пара-розанилин)
СН'\?1 /—\-nCH°
\ /~N\ch,
9G
Растворимость при 26°С в воде 1.68%, в алкоголе —13.87%.
В бактериологической практике применяется в тех же
случаях, как и метил-виолет и генциан-виолет. Перед последними
имеет то преимущество, что является не смесью веществ, а имеет
определенный химический состав.
4) Фуксин основной. Продажный основной фуксин представляет
собой смесь пара-розанилина и розанилина и их гомологов.
Формула пара-розанилина:
С1
И. | у / N-NH
h>N=<Z>=c
/
2
N >-NH2
Превосходная красная краска, отличающаяся большой
прочностью. Насыщенный спиртовый раствор готовят растворением
30 г сухой краски в 300 см3 96% спирта.
Спиртоводный раствор приготовляется прибавлением 10—20 см3
насыщенного спиртового раствора к 100 см3 дестиллированной
воды.
Водный раствор готовят растворениемі—Югфуксина в 100см3
воды.
Чаще употребляется карболовый раствор фуксина по Цилю
(Ziehl) или Чаплевскому (Czaplewsky) (см. окраску спор).
В большом употреблении также разбавленные растворы кар-
бол-фуксина (1:2; 1:4; 1 : 10 и 1 : 20). Чем более разбавлены
растворы, тем длительнее должно быть окрашивание.
Разбавленные растворы карбол-фуксина быстро портятся, и
потому их надо готовить всякий раз наново.
Основной фуксин не следует смешивать с кислым фуксином
[Фуксин S.,MareiiTaS., Рубин S. (Fuchsin S., Magenta S., Rubin S)],
представляющим собой двунатриевую соль розанилин-трисуль-
фоновой кислоты. Кислый фуксин является хорошей протоплаз-
матической краской, широко применяется патологами для
окраски по ван-Гизону (van Gieson) и для цитологических окрасок
(митохондрии).
5) Нейтралърот (нейтральная красная) представляет собою
амшю-диметил-амино-толуфен-азониум-хлорид:
С1
СН3
/
— N =
— СН0
Растворимость при 25°С в воде — 5.64%, в алкоголе — 2.43%.
В слабощелочной среде до почти нейтральной реакции (рН — 7.0)
дает растворы желтого цвета, в слабокислой — красного и мали-
7 Руководство по микробиологии 97
ново-красного цветов, вследствие чего может служить индикатором»
Чаще всего применяется для прижизненной окраски в
разведениях от 1 ; 10 000 до 1 : 50 000. Для прижизненной окраски
клеток и тканей в живом организме производят инъекцию 0.25—0.5%
раствора краски на физиологическом растворе.
Для окраски фиксированных препаратов применяется в виде
1 —1>5% водного раствора. Перед употреблением краску
фильтруют.
6) Везувии (Бисмаркбраун). Представляет собою дигидро-
хлорид-бензол-т-диазобис-т-фенилендиамин. растворимость при
26°С в воде 1.36%, в алкоголе —1.08%. Иногда применяется
при окраске по Граму (Gram) в качестве дополнительной краски
(вместо фуксина). 0.4 г краски растворяют в 200 см3 кипящей воды
и после охлаждения отфильтровывают. Окраска микробов довольно
вялая; лучше красятся ткани. Чаще применяется для
прижизненной окраски в разведении от 1 : 10 000 до 1 : 50 000.
7) Янусгрюн Б. (зеленый Янус) представляет собою соединение
ли-метил-сафранина с диаметил-анилином с помощью азогруппы.
С2Н5 \ N
с,н5/
=N —
G1
\/\
N = N
Растворимость при 26°Ц в воде 5.18%, в алкоголе — 1.12%.
В слабых водных растворах (1 : 50 000 до 1 : 500 000)
окрашивает прижизненно и субвитально митохондрии в животных и
растительных клетках. Легко восстанавливается биологическими
объектами, переходя в розовую, а затем в бесцветную форму
(лейкоформу).
8) Сафранин. Представляет собою смесь дя-метил и три-метил
феносафранина:
СН
N =
СН
СН,
N Н,
— N
N =
СН
CJ
NH2 и NH2
— N =
NH.
СН,
CI
Растворимость при 2б°Ц в воде 5.45%, в алкоголе — 3.41%.
6 г сухой краски растворяют в 200 см3 кипящей воды и, по ох-
98
лаждешш, фильтруют или же: 0,1 г растворимого в спирте саф
ранина растворяют в 50 см3 95% спирта и прибавляют 50 см3 воды.
9) СуданIIIпредставляет собою бензол-азо-бензол-азо-2-нафтол:
N = N
У\
но
— N = N-
Растворимость при 26°Ц в алкоголе 0.15%, в воде не растворим.
Это вещество не является собственно краской, так как не
способно образовывать солеобразных соединений. Благодаря
растворимости в жирах способно их окрашивать, чем широко и
пользуются. Судан III, так же как и судая IV являются важными
красками для выявления жиров. Обычно пользуются насыщенным
раствором в 45 и 70° спирту, в смеси 70° спирта и чистого ацетона,
в молочной кислоте или в равной смеси 96° спирта и глицерина.
10) Эритрозии представляет собою натриевую соль тетра-иод-
флуоресцеина:
J 3
NaO
— О-
С-
= 0
— COONa
Прекрасная пр'отоплазматическая краска, красящая подобно
эозину. Широко применяется для окраски бактерии, особенно в
почве (по методу Виноградского). Для этого приготовляют 1%
раствор сухой краски в 5% водном растворе карболовой кислоты.
Рецепты приготовления растворов других красящих веществ,
применяемых для специальных окрасок, будут даны в
соответственных местах текста.
Специальные методы окраски
I. Если препарат, кроме микробов, содержит также клеточные
элементы, как в мазках из крови, то красят смесью основной и
кислой анилиновой краски: первая окрашивает тела бактерий и ядра
клеток, а вторая — протоплазму последних. Чаще всего
употребляется для этой цели комбинация метиленовой сини и эозина.
а) Способ Эрлиха (Ehrlich) — Хенципского. Окраска произво-
7* 99
дится следующим образом. Сначала препарат одновременно
фиксируется и. окрашивается путем обработки в течение 2 мин. жидкостью:
1% раствора желтоватого эозина (Eosin
gelblich) в 60% спирте 100 см3
10% раствора формалина 20
Промыв, препарат обрабатывают в течение 0.5—1 мин. слабым
раствором метиленовой сини. Ядра клеток и тела микробов
окрашиваются в синий цвет, а протоплазма — в розовый.
б) По другому способу, часто применяемому для окраски гноя,
малярийных мазков крови и пр., препарат сначала окрашивают
слабым раствором метиленовой сини в течение 1—2 мин., а затем,
после промывания водой, окрашивают в течение 0.5 мин. 1%
раствором эозина. Окраска—такая же, как в предыдущем способе.
II. Способ Романовского был предложен им в 1891 г. для
окраски малярийных паразитов и известен во многих
видоизменениях. Удобнее всего пользоваться жидкой краской Гимза (Giemsa),
представляющей смесь азура II (стр. 96) с эозином, растворенных
в глицерине и метиловом спирте. Перед употреблением краску
разбавляют, прибавляя 10 капель ее к 10 см3 воды, и этим раствором
в течение 15—20 мин. красят фиксированный спиртом препарат.
Для усиления действия краски к 10 см3 водного раствора ее
прибавляют 1 кашпо 0.1% раствора углекислого калия. Краска обладает
в высокой степени избирательным сродством к различным частям
протоплазмы. Так, на мазках крови малярийного больного
хроматин окрашивается в красный цвет,1 протоплазма паразита—в
синий, пигмент —в буро-черный, красные кровяные тельца —в
оранжево-красный, ядра лейкоцитов—в красно-фиолетовый,
протоплазма лейкоцитов — в светлосиний.
Превосходные результаты получаются так?ке с красками Бе-
рсстнева, Лейшмаиа (Leishmann) и др. Подробности их
приготовления и способы окраски можно найти в практических
руководствах по медицинской бактериологии (см. их список в конце книги).
III. Кислотоупорные бактерии, например Bact. tuberculosis,
окрашиваются обыкновенно карбол-фуксином при нагревании.
Для обогащения мазка туберкулезными палочками мокроту
нередко обрабатывают антиформином (смесь равных частей 10%
жавелевой воды и 5—10% едкого кали), быстро растворяющим тела
бактерий, кроме туберкулезной палочки.
Опишем два способа окраски мазков из мокроты
туберкулезного больного.
а) Способ Цаль-Пее/ььсеиа (Ziehl-Neelsen). Из мокроты,
вылитой в чашку Петри, выбирают сгустки и раздавливают между двумя
предметными стеклами. Стекла разъединяют и, если слой густ,
повторяют эту операцию на свежем стекле, пека не получится ма-
1 Красное окрашивание ядерной субстанции вызывается не эозином,
а красным красящим началом, содержащимся в метиленовой сини.
too
8ок достаточно прозрачный. На высохший мазок наливают
карболовый фуксин Циля или Чаплевского (их приготовление —см.
спорообразование) и нагревают 1—2 мин. до парообразования.
Промыв водой, препарат обливают 23% серной или 15% азотной
кислотой и действуют ею 3—5 сек., пока красная краска не
исчезнет. Основательно промыв водой, окрашивают препарат метиле-
новой синью в течение 10—60 сек., после чего окончательно
промывают. При удачной окраске туберкулезные бациллы должны быть
красного цвета, слизь — светлосиней, а посторонние бактерии —
темпосиними.
Ь) Способ Германа (Hermann). Мазок мокроты туберкулезного
обливается свежеприготовленной краской, состоящей из смеси 3
частей 1% водного раствора углекислого аммония и 1 части
насыщенного спиртового раствора кристалл-виолета; нагревают
несколько минут и, промыв водой, обесцвечивают 10 % азотной
кислотой или 95% спиртом. Еще раз промыв водой, окрашивают в
течение 1 мин. краской следующего состава:
Везувина 2 г
95% спирта 60 см3
Дестиллированной воды 40 »
IV. Для окраскн гонококков в мазках из трипперного гпоя
предложено множество способов. Приведем два из них:
а) Способ Паппеигейма (РаррепЬеші) и Кристалловича
(Krystallowytz). Мазок окрашивается в течение 1 мин. в
следующем растворе:
2% водного раствора карболовой
кислоты 80 см3
Глицерина 20 »
Этилового спирта 2.5 г
Метиловой зелени 0.15»
Пиронина 0.25»
Гонококки окрашиваются в яркокрасный цвет, ядра
лейкоцитов — в бледнозеленый, а их протоплазма — в слаборозовый.
б) Способ Пика (Pick) и Якобсона (Jacobsohn), К 20 см3 воды
прибавляют 15 капель карбол-фукспна Циля и 8 капель
насыщенного спиртового раствора метпленовой сини. Окраска
производится в течение 0.5 мин.
V. Окраска по Граму. Отношение к окраске по Граму является
важным диагностическим признаком бактерий, и потому
необходимо остановиться на этом способе подробнее.
1) Высушенный и фиксированный, возможно тонкий мазок
(предпочтительнее приготовить его из молодых культур)
обрабатывается в течение 1—2 мин. раствором Эрлиха:
Насыщенного спиртового раствора генци-
ан-виолега 11 см3
Анилиновой воды 100 »
101
Краска должна быть выдержана в течение суток, иначе она дает
осадки. Перед употреблением ее профильтровывают. Сохраняется
она недолго.
Иногда раствор Эрлиха вдвое разбавляют водою.
Генциан-виолет можно заменить метил-виолетом (Melhylvio-
lett Hochst 6 В. BN), кристалл-виолетом, викториаблау и другими
красками, относящимися к производным пара-розанилина.
Анилиновая вода приготовляется взбалтыванием избытка
светлого анилина в дестиллированной воде и фильтрованием через
двойной смоченный фильтр до полной проарачности жидкости.
Анилиновую воду можно готовить также растворением 3 см3
анилина в 10 см3 этилового спирта и последующим разбавлением в
100 см3 воды.
Вместо раствора Эрлиха применяют иногда более прочный
карболовый генциан-виолет. 1 г краски растворяют в 10 см3 спирта
и полученный раствор выливают в 100 см3 5% раствора очищенной
карболовой кислоты. Для полной прозрачности раствора к нему
прибавляют немного спирта.
2) Ополоснув препарат водой, обрабатывают его в течение 1—2
мин. луголевским раствором (иода 1 г, йодистого калия 2 г и воды
300 см3). Окрашивающиеся по Граму бактерии образуют
нерастворимое в спирте соединение краски с иодом, удерживающееся
протоплазмой.
Так как иод не растворим в воде, растворяясь в крепком
растворе йодистого калия, то для приготовления луголевской
жидкости сначала растворяют 2 г KJ в 5 см3 воды и затем уже в этом
растворе — 1 г иода (для ускорения растворения эму смесь
растирают в фарфоровой ступке), после чего доливают водой до 300 см3.
Некоторые предпочитают перед обработкой луголевским
раствором не обмывать препарат водой, а удалять краску
фильтровальной бумагой.
3) Препарат ополаскивается водой и обрабатывается 95 %
спиртом, пока от мазка не перестанут отходить струйки краски.
Обычно на это требуется 0.5—1 мин. На операцию обесцвечивания
должно быть обращено особенное внимание, так как от нее
главным образом зависит удача всей окраски. При недостаточной
обработке спиртом все бактерии сохраняют краску, а при
чрезмерной — все обесцвечиваются.
4) Ополоснув препарат водою, дополнительно окрашивают его
в течение 1—3 мин. сильно разбавленным фуксином, нейтраль-
ротом, сафранином или везувином.
Красящиеся по Граму бактерии принимают темнофиолетовый
цвет, а обесцвечивающиеся — дополнительный (красный или
коричневый).
Хорошим объектом для этой окраски служит пленка,
образующаяся на поверхности закисшего вина и содержащая смесь
окрашивающихся по Граму дрожжевых клеток с некрасящимися по
этому способу уксуснокислыми бактериями. Дрожжевые клетки при-
М02
нимают темнофиолетовую окраску, а уксуснокислые бактерии —
дополнительную.
Для уверенности в правильном ведении окраски можно
рекомендовать следующий простой прием. На покровное стеклышко
наносят рядом три мазка: один заведомо красящегося по Граму
вида, другой—некрасящегося и третий—исследуемого. В
правильности окраски убеждаются по виду двух контрольных мазков
(красящегося и обесцвечивающегося по Граму).
Способ Грама не всегда дает постоянные результаты, так как
окраска зависит от состояния культуры (возраст, расовые
особенности и т. п.).Так, палочка проказы В. leprae красится по Граму
в тканях и обесцвечивается —¦ в разводках. Неверные результаты
получаются также с М. gonorrhoeae, В, руосуапеит,В? oedemaUs
maligni, с различными представителями группы proteam и с
некоторыми другими видами. Некоторые из них удерживают окраску по
Граму при обесцвечивании препарата не спиртом, а анилином или
смесью 2 частей анилина и 1 части ксилола. При окраске по Граму
гонококков рекомендуют не ополайкивать препарат водой при
последовательных обработках, а удалять предыдущий раствор
фильтровальной бумагой. По данным Шмидта (Schmidt), В. coli,
выращенный на некоторых средах, приобретает способность краситься по
Граму.
По Граму красятся По Граму обесцвечиваются.
Почти все кокки (кроме гонококка), М. gonorrhoeae В. Friedlanden
М. caiarralis и М. intracellular is В. coh В. mallei
Почіи все аэробные споровые бацил- Я. typhi В. руосуапеит
лы В. subtihs, В. antkracis, В. В. influenzae В. oedematis malignt
mesenterwus и др. В, pestis V. cholerae asiaticae
Из бесспоровых, большинство флюо- Спириллы и спирохеты
ресцирующих видов, В. diphtheri- -Е- aerogenes
ае В. tuberculosis, В. tetani и др. * Proteus vulgaris
Лучистые грибы, дрожжи Oidium,
Demahum и др.
ГЛАВА IV
МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ. МЕТОДЫ
ОКРАШИВАНИЯ
1. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Измерение величины микробов
Величина микробов может изменяться в зависимости от
условий их культивирования и обработки препарата, т. е, от способов
фиксации, окраски и заключения микробов. Так, на высушенном.
мазке микробы кажутся более мелкими; в перекрашенных
препаратах, наоборот, — большими; заключенные в канадский
бальзам — значительно меньшими, чем заключенные в воде. Если
прибавить к сказанному несовершенство методов измерения, то
станет ясно, насколько шатки получаемые результаты. Вследствие
всех этих причин данные различных авторов подчас до такой
степени не сходятся, что некоторые (например, Матцушита (Matzu-
schita) BCBoeu«Bakteriologische Diagnostik») избегают пользоваться
этим признаком для разграничения видов.
Единицей измерения микробов служит микрон, или 0.001 мм,
обозначаемый греческой буквой ji.На фотографических снимках
микробов, снятых при увеличении в 1000 раз, каждый миллиметр
рисунка соответствует одному микрону препарата. Микромикроном
(jjljjl) обозначается величина, соответствующая 0.001 микронат
или 0.000.001 миллиметра.
Предельной величиной, еще могущей быть измеренной в
наиболее сильные из современных микроскопов, является 0.1 ji, или
100 jijjL. Более мелкие частицы уже не различимы: вместо них
появляются дифракционные кружки. Поэтому все данные, где
размеры микрооов или их частей, например жгутиков, показаны
в точных цифрах ниже этих пределов, надо считать сомнительными.
Окраска капсул
Образованию слизистых капсул вокруг тела бактерий способ*
ствует большое содержание в питательной среде углеводов,
усвояемых данным видом, и бедность среды азотистыми веществами.
Присутствие капсул легко узнается по характерному
расположению бактерий даже на неокрашенных препаратах: бескапсульные
101
бактерии плотно прилегают друг к другу, почти без просвета
между смежными клетками, тогда как кансульные клетки нигде
но примыкают одна к другой, будучи раположены в некотором
расстоянии друг от друга (рис. 88 А и В); более тесному
расположению их мешают слизистые капсулы, невидимые при обычной
окраске препарата.
Еще нагляднее обнаруживаются капсулы, особенно у крупных
форм, если к культуре примешать каких-нибудь мелких бактерий.
Заполняя фон препарата, они этим обнаруживают существование
капсул вокруг клеток.
У капсульных патогенных микробов легче обнаружить капсулы
на материале, взятом из крови и органов зараженного животного.
Хорошим объектом для изучения капсул у бактерий служат:
Azotobactex chroococcum, LeuconostQC mesenterioides, Bact. rhinoscle*
romatis, Pneurnobacillus
Friedlanderi, Вас. anthracis
и др.
В воде капсулы видны
гораздо отчетливее, чем в
канадском бальзаме. Для
заделки препаратов
капсульных бактерий
применяется обыкновенно
кедровое масло или 2% раствор
поваренной соли. Рис. 88. Расположение клеток бескапсуль
Для обнаружения кап- ного (А) и капсулыюго (В) бацилла.
сул предложено три рода
окраски: 1) негативная окраска препарата жидкой тушью, 2)
окраска одной краской и 3) контрастная окраска двумя красками.
Негативпая окраска жидкой тушью
На предметное стекло наносят 1—2 петли жидкой туши (ее
приготовление — см. стр. 85) и петлю исследуемых бактерий.
Жидкости тщательно смешивают, и смесь размазывают по стеклу краем
покровного стекла (стр. 87). На темном фоне препарата явственно
выступают клетки капсульных бактерий, в то же время заметна
граница между капсулой и телом бактерий.
Еще нагляднее картина тушевого препарата окрашенных
бактерий. G Azotobacter chroococcum мы получали превосходные
результаты следующим простым способом. На предметное стекло
наносят каплю наполовину разбавленного водой карбол-фуксипа
Циля (см. стр. 109), в которой размешивают петлю агаровой
культуры Azotobacter. Через 2—3 мин. к этой массе прибавляют каплю
жидкой туши, тщательно смешивают и размазывают по стеклу.
Бесцветные капсулы резко выступают между темным фоном
препарата и окрашенными в красный цвет телами бактерий (рис. 89).
Столь же отчетливые результаты получаются с колларголом
и кислыми анилиновыми красками (стр. 94).
10&
Окраска препарата одной краской
Способ Фридлендера (Friedlander). Высушенный при комнатной
температуре и фиксированный на пламени газовой горелки
препарат обрабатывают 1% уксусной кислотой в течение 3 мин. Слив
ішслоту, вновь высушивают препарат при комнатной температуре.
Затем его окрашивают в течение нескольких секунд (до 1 мин.)
свежеприготовленным насыщенным раствором генциан-виолета
в анилиновой воде. Основательно промыв водой или 0.85% NaCl,
рассматривают препарат в тех же жидкостях. Если окраска
получилась слишком густая, то препарат слегка обесцвечивают 1%
уксусной кислотой или 50% спиртом в течение нескольких секунд
и вновь промывают в воде.
Способ Джоне (Johne). Мазок нагревают в течение 1—2 мин.
до образования паров с 2% водным раствором генциан-виолета
или метил-виолета. Сполоснув
водой, обесцвечивают в течение 6—
10 сек. 2% раствором уксусной
кислоты. Окончательно промывают
водой и рассматривают (но не в
канадском бальзаме). Капсулы
особенно ясно видны на мазках
патогенных микробов прямо из органов
животного.
Способ Pu66epma(Ribbert).
Раствор, содержащий на 100 см3
воды 50 см3 спирта и 12.5 г
крепкой уксусной кислоты, насыщают
при легком нагревании далией и
в полученную краску погружают
препарат на время от нескольких
секунд до одной минуты, после чего
тотчас промывают водой. При
удачной окраске протоплазма бактерий
принимает темнофиолетовый цвет,
а капсулы —~ светлофиолетовый.
Способ Гейма (Негт). Окраска
полихромной метиленовой синью
с последующим промыванием водою. Протоплазма бактерий
окрашивается в синий цвет, а капсулы—в красно-фиолетовый.
Способ Ольта (ОН). В 100 см3 кипящей воды растворяют 2 г
сафранина и отфильтровывают. В этой свежеприготовленной
краске препарат нагревают в течение 0.5—1 мин., после чего промывают
водой. Тела бактерий окрашиваются в красно-бурый цвет, а
капсулы — в желтый.
СпособНиколля^ісоіі). Для окраски служит следующий раствор
Насыщенного спиртового раствора генциан-виолета . . 10 см3
1% раствора карболовой кислоты 100 »
Рис. 89. Капсулы Azotobacter,
видимые благодаря прибавлению к
препарату жидкой туши,
образовавшей равномерный темный фон.
Тела бактерий окрашены
фуксином, капсулы — бесцветны. Уве-
лич. 1000.
100
Затем дифференцируют в смеси 2 частей спирта с 1 частью
ацетона.
Способ Вейденрайха-Гамена (Weidenreich-Hamen). Фиксация
осмиевой кислотой. Окраска по Гимза (Giemsa).
Контрастная окраска двумя красками
Способ Кауфмана (Kaufman). В течение 2 и более часов
препарат окрашивается при 35° лёфлеровской синью (стр. 95), Промыв
водой, слегка подщелоченной едким натром, высушивают и в
течение 2 мин. обрабатывают 0.5 раствором азотносеребряной соли.
Вновь промыв той же щелочной водой, окрашивают препарат в
течение 30 сек. раствором фуксина (1 часть насыщенного
спиртового раствора краски на 200 частей воды). Окончательно
промывают щелочной водой. Бактерии окрашиваются в синий цвет,
а капсулы — в розовый.
Способ Клетта (Klett). Препарат подвергают окраске кипящим
раствором метиленовой сини (1 часть краски + 10 частей спирта -f-
100 частей воды), тщательно промывают водой и дополнительно
окрашивают в течение 5 сек. раствором фуксина (1 часть краски-(-10
частей спирта + 100 частей воды). При удачной окраске тела
бактерий синего цвета, а капсулы — розовые.
Для определения химической природы веществ, входящих в
состав оболочки, служат следующие микрохимические реакции.
Реакции на целлюлозу
а) Целлюлоза окрашивается в фиолетовый цвет раствором хлор-
цинк-иода. Реактив готовится растворением 30 г хлористого цинка,
5 г йодистого калия и 1 г иода в 14 см3 воды. Беренс (Behrens) берет
те же составные части в отношениях: 20 + 6.5 + 1.3 + 10.5.
б) Иодом и серной кислотой целлюлоза окрашивается в синий
цвет. Сначала препарат обрабатывают раствором 0.4 г иода и 1.4 г
йодистого калия в 100 см3 воды (приготовление — см. стр. 102),
а затем раствором 2 частей крепкой кислоты в 1 части воды.
в) Под влиянием швейцерова реактива целлюлоза сначала
набухает, а затем растворяется.
Реактив Швейцера (Schweizer) проще всего готовится
растворением медных стружек или медной сетки в крепком аммиаке при
доступе воздуха. Медные стружки помещают в цилиндрическую
стеклянную воронку с краном и смачивают крепким аммиаком (30%,
уд. в. 0.91). Дают медленно стечь жидкости через
полуоткрытый кран и вновь обливают ею стружки. Повторяют эту операцию
до тех пор, пока не получится реактив, энергично растворяющий
вату. Реактив сохраняется около недели. Его растворяющую силу
всякий раз испытывают перед употреблением: в нем должна быстро
и нацело растворяться гигроскопическая вата.
Реактив готовят также растворением гидрата окиси меди в
крепком растворе аммиака в присутствии небольшого количества амми-
107
яяной соли или растворением 5 частей тонко измельченной CuSO и
1 части соды в крепком аммиаке. 4
Реакции можно проделать последовательно на одном и том же
препарате в том порядке, как они приведены. Для этого
пользуются следующим простым приспособлением.
Мазок исследуемых бактерий высушивают на предметном стекле
и к нему прибавляют каплю воды. Вдоль длинного края стекла
кладут капилляр и поверх накладывают большое покровное стекло
(21— 26 мм) так, чтобы одна из сторон его поместилась на
капилляре. Края покровного стекла, параллельные длинном сторонам
предметного стекла, обводят парафином или воском с помощью
изогнутой под прямым углом толстой проволоки, укрепленной
на пробке (рис. 90, внизу). Конец проволоки нагревают на газовой
горелке и, прикоснувшись к парафину, обводят края. На коротких
сторонах покровного стекла таким
же образом наносят валики из
парафина, но здесь—¦ на поверхности
стекла, в некотором отдалении от
края. Снаряженное таким образом
предметное стекло изображено на
Lpuc. 90, где а — капилляр, Ъ —
заделка покровного стекла пара-
Е=~^~И фином и с — парафиновые валики.
Назначение последних —
предохранить объектив от действия
реактивов, которые пропускают
через препарат. Пипеткой или
стеклянной палочкой наносят
реактив с одного края (короткого)
покровного стеклышка, а с
противоположного жидкость
всасывается полоской фильтровальной бумаги, вследствие чего
устанавливается ток реактива через препарат. Таким же путем,
просасывая воду под стеклом, можно отмыть препарат от реактива
и обработать следующим. За действием реактива следят, наблюдая
дод микроскопом отдельные места препарата.
а
\
д
¦
ГйН
с
f
/
*/
/
Рис. 90. Приспособление для
обработки препарата красками и
химическими реактивами проса-
сыванием растворов.
Внизу—вделанная в пробку
медная"проволока для заделки в парафин
или воск.
Реакции на пектиновые вещества
Обработанный ппзейцеровьш реактивом препарат промывают
аммиаком, затем водой, 1% уксусной кислотой и окончательно
водой. Для обнаружения пектиновых веществ служат следующие
реакции:
а) Пектиновые вещества окрашиваются в оранжевый цвет 0.5%
раствором сафранина в 0.5% уксусной кислоте. Спирт и глицерин
обесцвечивают препарат.
б) Пектиновые вещества окрашиваются в яркокрасный цвет
0.О1—0.02% водным раствором краски Rutheniumrot.
108
Реакции па капозу (окружающая клетку бактеряатьная слизь)
Препарат перекрашивают 1% раствором кораллина в 25—30%
соде и затем короткое время обесцвечивают 4% раствором соды.
Исследуют в глицерине. Вся клетка бесцветна за исключением
каллозы, окрашенной в красный цвет. Каллоза легко растворима
в слабых растворах щелочей и нерастворима в воде, спирте и швей-
церовом реактиве.
Некоторые слизи (муцин) хорошо красятся крепким водным
раствором тионина.
Реакции на литнив
а) Красное окрашивание с флюроглюцином и соляной кислотой.
б) Желтое окрашивание со смесью насыщенного водного
раствора сернокислого анилина с несколькими каплями серной
кислоты. Реактив готовят также прибавлением 10 капель к 100 см3
1 % раствора сернокислого анилина.
Окраска спор
Уже простым исследованием неокрашенного препарата, при
сильно суженной диафрагме осветителя Аббе, можно убедиться в
присутствии спор в виде сильно преломляющих свет, однообразных
по величине и по форме, круглых или эллипсовидных телец внутри
клеток. При обработке обычными анилиновыми красками тельца
эти остаются неокрашенными. Для их окраски прибегают к
обработке препарата сильно де йствующими красящими растворами,
стараясь достигнуть контрастной окраски спор и плазмы клетки.
Почти все предложенные способы основаны на одном и том же
принципе; сначала сильно перекрашивают препарат, затем
частично обесцвечивают его, отнимая краску у плазмы и оставляя
ее у споры, и, наконец, окрашивают плазму в дополнительный
цвет.
Для окраски спор обычно применяют карболовый фуксин,
готовящийся различным образом:
а) Карболового, фуксин Цалл. Его приготовляют, растворяя
10 см3 насыщенного спиртового раствора фуксина в 10Э см3 5%
карболовой кислоты или же следующим образом: 1 г фуксина
растирают в фарфорвой ступке с 10 см3 спирта и к полученной массе
прибавляют 5 г кристаллической карболовой кислоты, беспрерывно
растирая. Затем постепенно прибавляют 100 см3 воды ,г
б) Карболово-глицериповый фуксин по Чаплевскому. 1 г
фуксина растворяют в фарфоро-вой ступке с 5 см3 жидкой карболовой
кислоты (Ас. саг bo I. Hquef.) и, не прекращая растирания,
постепенно приливают 50 см3 глицерина и 100 см3 воды.
1 Для окраски бактерий употребляют разведенный в 5—10 раз водой
карболовый фуксин Пфейдера (Pfeiffer). Эту краску надо готовить по мере
надобности, так как она быстро портится.
109
Препарат нагревают с краской в течение нескольких минут
до плавления,но не доводя до кипения. По мере испарения жидкости
подливают новую краску, не давая ей подсохнуть на препарате.
Затем краску сливают и препарат промывают водой.
"В качестве обесцвечивающих средств предложены различные
растворы:
а)1—5%растворы кислоты (серной, соляной, азотной, уксусной).
б) 33% раствор этилового спирта.
в) Кислый спирт Каатцера (Kaatzer).
90% этилового спирта .... - . . . . 100 см3
Воды 200 »
Крепкой соляной кислоты 20капель
Время обесцвечивания колеблется в зависимости от
особенностей препарата, и дать поэтому общие указания довольно трудно.
Колебания могут быть от нескольких секунд до нескольких минут.
Поэтому приходится для каждого препарата отдельно определять
время обесцвечивания. В сущности, от удачи этой операции
зависит успех всей окраски. Обесцвеченный препарат промывают водой.
Для дополнительной окраски пользуются метиленовой синью,
окрашивая ею препарат от полминуты до нескольких минут,
после чего его окончательно промывают водой.
За успешным выполнением всех этих операций можно следить,
контролируя под микроскопом с помощью сильной сухой системы
состояние препарата после каждой обработки. После окраски
карбол-фуксином должны быть окрашены в красный цвет и
вегетативное тело и споры, после обесцвечивания — только споры.
Если споры плохо красятся, то препарат предварительно
обрабатывают — сначала хлороформом (1—2 мин.), а затем в течение
10 мин. 5% раствором хромовой кислоты [способ Мёллера (М51-
іег)] и лишь тогда приступают к окраске.
Орзага (Orsaga) рекомендует, до обработки препарата
карболовым фуксином, протравить его в течение 5—10 мин. жидкостью:
0.5% салициловокислого натрия .... 4 части
5% уксусной кислоты 1 часть
Препарат затем высушивают, фиксируют на огне и дальше
подвергают окраске, как выше указано.
По Aujeszcu, высушенный препарат обрабатывают в течение
3—4 мин. горячим 0.5% раствором соляной кислоты, промывают,
высушивают, фиксируют через огонь и обычно окрашивают.
Клейн (Klein) слабо нагревает в течение 6 мин. эмульсию
бактерии в физиологическом растворе поваренной соли с прибавлением
равного объема карболового фуксина. Затем приготовляет мазки,
высушивает их, фиксирует на огне и дальше окрашивает обычным
способом.
Хорошие результаты дает способ Тезинга (Thesing).
Высушенный на воздухе препарат фиксируют тройным проведением
через пламя, обливают 1 % раствором хлорной платины (PtCl4)
ЛО
и доводят до кипения. Тотчас промывают водой, и, облив карбо
ловым фуксином, нагревают до однократного вскипания. Смывают
краску и, не промывая препарата, обесцвечивают 33% спиртом,
после чего тотчас основательно промывают водой под краном.
Дополнительно окрашивают метиленовой синью в течение 3 мин.
Наблюдать прорастание спор можно следующим
простым приемом. Из богатой споровой культуры приготовляют
густую эмульсию в очень небольшом количестве стерилизованной
водопроводной воды и пастеризуют ее (80° —10 мин.). 2—3 капли
итой эмульсии переносят на стерилизованное покровное
стеклышко, распределяют по его поверхностии высушивают. Поверх мазка
наливают каплю расплавленного агара (при 40°) и, когда он
застынет, покровное стеклышко прикрепляют к предметному стеклу с
выемкой («влажная камера», стр. 83). Снаряженное таким образом
предметное стекло помещают при оптимальной температуре для
данного вида и время от времени контролируют под микроскопом
состояние спор. Когда прорастание началось, препарат сохра-
п яют при комнатной температуре, чтобы несколько замедлить
процесс.
Можно поступать и таким образом. Густую эмульсию спор -
(или конидий плесеней и лучистых грибов) приготовляют в соот-
иетственной питательной жидкости и по каплям распределяют на
ряде покровных стекол (стерилизованных), накладывают их,
каплей вниз, на стерилизованные предметные стекла с выемкой, не
смазанные по краям вазелином; их затем помещают в чашки Петри
с несколькими кружками влажной бумаги на дне. В таком виде
культуру сохраняют при 20—25° или при комнатной температуре.
Через определенные сроки покровные стекла снимают и капли
быстро высушивают (на дне термостата). Препараты затем
фиксируют на огне и окрашивают. Таким образом, получается серия
препаратов с последовательными фазами прорастания спор. В
качестве питательной среды предпочтительнее брать не бульон,
пачкающий препарат, а синтетическую среду, хотя бы и менее
питательную.
Для изучения прорастания спор Клинковштром (Klinckow-
strom) 1) применял спороносный материал в возрасте от 2 до 12
месяцев с агара, 2) прогревал его в пробирочке с 2 см3 воды 70—75е
в течение 5 мин., 3) прогретый материал размазывал по
предметному стеклу, 4) высушивал при комнатной температуре, 5)
набрав пипеткой расплавленную при 40—50° мясопептонную
желатину, покрывал ею мазок, 6) предметное стекло с мазком помещал
во влажную камеру (контроль можно вести в висячей капле),
7) проросший материал высушивал на воздухе 1 час, 8) препарат
фиксировал 15 сек. над горлом колбы с кипящей водой, 9) переносил
его для растворения желатины на 5 мин. в водяную баню 60—70°,
10) окрашивал препарат разбавленным карболовым фуксином
в течение 10—20 мин., 11) промывал препарат, высушивал и
заключал в канадский бальзам.
ill
Спорообразование у дрожжей носит
своеобразный характер. Чтобы оно наступило, необходимы известные
условия. Дрожжевые клетки должны быть молоды и хорошего
питания, с накопленными запасными веществами, необходимыми
для образования аскоспор. Предназначенную для
споруляциикультуру в течение двух суток раза 2—3 пересеивают на свежую
питательную среду (лучше всего на пивное сусло).
Чтобы вызвать спорообразование, такую хорошо «откормленную»
культуру переносят в условия скудного питания на слегка кислую
среду [Вельтен (Welten)]. Ганзен (Hansen) предложил культуру
на гипсовых блоках, * приготовляемых замепгиванием
2 объемов порошка гипса с 3 объемами воды (подробности
приготовления см. гл. VII, п. 3). Их помещают в кристаллизационные
чашки гладкой поверхностью кверху,
заражают и наполовину заливают
дестиллированной водой (рис. 91).
Заражение призводится на
поверхности гипсового блока очень
ограниченным количеством материала.
Таким образом осуществляются все
условия, необходимые для
спорообразования: свободный приток
воздуха, надлежащая степень влажности
и благоприятная температура (25 —
30°). Обыкновенно уже через 30
часов у большинства клеток появляются
споры.
По Городковой, можно вызвать спорообразование у молодых
активных дрожжей более простым способом, а именно засеивая
ими среду состава:
Дистиллированной воды 1000 см3
Агар-агара 10 г
Пептона , 10 »
Мясного экстракта 10 *>
Поваренной соли 5 »
Виноградного сахара 2.5 ь
На этой среде дрожжи быстро развиваются в течение первых
часов, но затем, вследствие небольшого содержания сахара, рост
прекращается, и клетки приступают к спорообразованию. Через
2 —3 дня в культуре оказывается множество спороносных клеток.
Бейеринк (Beijerinck) поступал еще проще; он производил
высев на среду, состоящую из дестиллированной воды и агар-агара
(«чистого», т. е. выщелоченного, —стр. 53). Делэлся штрих на
косом агаре, и культура оставлялась на несколько дней при
21— 2->°Ц.
1 По Марпману (Marpmann), для той же цели удобнее пользоваться негла-
вуроваиными фарфоровыми тиглями, помещенными в опрокинутом виде
в двойные картофельные чашечки на нескольких кружках фильтровальной
бумаги.
112
Рис. 91. Гипсовый блок для
получения аскоспор¦ у
дрожжей.
Движение бактерий и окраска жгутиков
Подвижность бактерий не является их постоянным признаком.
Описаны случаи, когда бактерия, заведомо подвижная при своем
выделении из естественного субстрата, теряет впоследствии это
свойство, и его не удается вновь восстановить.
Далее неоднократно указывалось на то, что клетки одного и
того же вида, неподвижные при 37°, приобретали активную
подвижность при более низкой температуре (15—20°). Возможно также
существование неподвижных (лишенных жгутиков) штаммов у
видов, обычно считающихся подвижными (например, Bact,
paratyphi В.).
Превосходным объектом для наблюдения движения бактерий
служат крупные спириллы, например хорошо видимые в сильные
сухие системы при суженной диафрагме. Культуру,
предназначенную для обнаружения жгутиков, следует предварительно в
течение нескольких дней ежедневно пересеивать на свежий субстрат:
в этих условиях подвижность микроба усиливается. С
поверхности молодой агаровой культуры (агар должен быть свежим,
с конденсационной водой) берут часть культуры и распределяют
в капле стерилизованной водопроводной воды. Движение можно
наблюдать, пользуясь методом «висячей* или «раздавленной»
капли (стр. 83).
Если нет под руками чистой разводки подвижных бактерий,
то материалом для наблюдения движения бактерий может служить
капля навозной жижи, лучше всего свиной. В ней почти всегда
имеются крупные спириллы, энергично движущиеся и с хорошо
красящимися жгутиками. х
Произвольное движение бактерий легко отличить от
броуновского движения взвешенных в жидкости частиц, носящего
беспорядочный пассивный характер. Подвижные бактерии оживленно
движутся в поле зрения, перегоняя друг друга и изменяя
направление движения, а спириллы и спирохеты —извиваясь при этом всем
телом. Если возникает сомнение в природе движения, то к
культуре прибавляют 5% карболовой кислоты или 0.1% сулемы.
Если и в этом движение сохраняет свой прежний характер, это
указывает на броуновское движение. Следя за скоростью
движения бактерий, не надо упускать из виду, что оно окажется более
1 Для обогащения жидкости спириллами может служить следующий
раствор, предложенный ван-Итерсоном (van Iterson):
Водопроводной воды 1000 сма
Уксуснокислого кальция 2 г
Пептона 0.05
Фосфорнодвукалиевой соли 0.05
Жидкостью наполняют высокий цилиндр. Для заражения служит ил.
При 32° на поверхности вскоре появляется пленка, состоящая из крупных
спирилл. Для изолирования пригоден агар Цеттнова (Zettnow); мясной воды
{стр. 46) 1000 см3, пептона 1 г, сернокислого аммония 1 г, азотнокислого
калия 1 г и агар-агара 11 г.
8 Руководом ** шробкодогси
из
быстрым в соответствии со степенью увеличения микроскопа.
Некоторые бактерии передвигаются с исключительной быстротой.
Так, скорость движения у Вас. suhtilis равна 200 р. в секунду.
При обычных методах микроскопии в неокрашенном состоянии
жгутики незаметны вследствие их ничтожных размеров и почти
одинаковой преломляемости со средой. Их удается наблюдать лишь
у очень крупных видов, например у некоторых серобактерий.
Последние вообще представляют весьма удобный объект для
наблюдения движения бактерий, так как их тело, набитое сильно пре
ломляющими свет каплями серы, при небольших увеличениях
кажется почти черного цвета и ясно видимо без окраски.
У других бактерий неокрашенные жгутики видны в темном поле
зрения. При этом методе подвижные бактерии помещаются в
каплю жидкой среды, содержащей 1 % желатины, и пользуются
достаточно сильным источником света.
Жгутики являются цитоплазматическими образованиями и
имеют форму конической спирали. Последнее необходимо учитывать
при их измерении. Длина жгутиков обычно бывает обратно
пропорциональна величине бактерий. У коротких клеток жгутики
относительно и абсолютно длиннее, чем у крупных палочек. Бактерии,
вышедшие из споры, вначале не имеют жгутиков; они появляются
через 30—60 мин. после прорастания. Рост отдельных жгутиков
происходит довольно быстро, каждые 2—3 минуты жгутик
удлиняется на 1 ji.
Лишь в редких случаях удается окрасить жгутики обычными
анилиновыми красками, например у некоторых спирилл и живых
холерных вибрионов, с помощью слабого раствора фуксина
(1 часть карболового фуксина на 4 части воды). Но, как правило,
до окраски жгутиков препарат предварительно обрабатывают
протравой, и только в таком случае становятся видны жгутики.
Предложены различные способы окраски жгутиков, но ни один
из них не обеспечивает успеха во всех случаях. В зависимости і т
индивидуальных свойств микробов и от особенностей культуры,
в каждом отдельном случае приходится выбирать тот или иной
способ, причем нет никаких опорных пунктов для этого выбора;
попросту пробуют несколько способов и останавливаются на
дающем лучшие результаты. Как уже сказано, окраске предшествует
протрава препарата. Цель этой операции заключается в том, чтобы,
покрыв тело бактерии слоем протравляющего вещества и окрасив,
сделать жгутики доступными наблюдению. Без этого они, как
ультрамикроскопические объекты, невидимы для глаза. Кроме того,
протравленный препарат легче воспринимает окраску.
Для успешной окраски жгутиков необходимо соблюдение
следующих условий:
1) Чистота покровного стекла (способы
очистки — см. стр. 19 и 20).
2) Соответственное приготовление
препарата. Препарат приготовляют из свежей агаровой разводки,
JJ4
не старше суточной, а для некоторых видов (сенная палочка) —
12-часовой. Часть материала, взятую из посевной черты, — ближе
к конденсационной воде, где больше влаги, переносят в пробирку
с 1 —2 см3 стерильной водопроводной воды. Пробирки выдерживают
30—60 мин. при комнатной температуре. Затем взвесь бактерий
петлей переносится в каплю воды, нанесенную на покровное стекло
При распределении материала на стеклышке надо соблюдать
осторожность, чтобы механически не повредить жгутиков и не
оторвать их от тела бактерий (тем не менее оборванные жгутики
встречаются во всяком препарате, даже приготовленном самым
тщательным образом). Предпочтителен мазок, где бактерии
расположены изолированно друг от друга. Воду на стеклышках
распределяют возмо?кно тонким слоем, чтобы ускорить высыхание
препарата: при продолжительном высыхании часто теряются жгутики
Свободные концы жгутиков нередко склеиваются друг с другом
образуя «косы», обнаружить которые в препарате легче, чем
отдельные жгутики. Образование «кос» можно наблюдать в темном
поле и у живых бактерий; особенно выражено оно на полужидклх
вязких средах.
Способ Леффлера {Loffler) —исторически один из первых
способов, предложенных для окраски жгутиков. Во многих случаям
он дает превосходные результаты.
3) П р о т р а в а. 12 г таннина растворяют при нагревании
в 48 см3 воды и к этому раствору прибавляют 30 см3 насыщенного
раствора фуксина в 95% спирте. Раствор отфильтровывают и со
храняют в склянке с пришлифованной пробкой. Протрава
готова к употреблению через несколько суток после пршотовіения
и может сохраняться в течение нескольких месяцев Перед
употреблением ее отфильтровывают. Протраву наливают на мазок в
таком количестве, чтобы покрыть всю поверхность покровного
стеклышка. А. Мейер (A. Meyer) рекомендует протравлять в течение
3—5 мин. яри комнатной температуре. Николь (Nicolle) и Мора
(Могах) советуют нагревать препарат с протравой несколько рас
до появления пара, всякий раз смывая протраву водой и приливая
свежую. При нагревании препарат следует слегка двигать в
разные стороны во избежание пригорания осадка.
Обработанный протравой препарат тщательно промывают водой
(кроме того, можно его один раз ополоснуть спиртом) и осадок по
ьраям стеклышка, а также обратную сторону его вытирают куском
фильтрованной бумаги.
4) Окраска. Мейер рекомендует 1% раствор Saurevio-
lett 6В в 50% спирте. По нашим наблюдениям, превосходные ре
гультаты получаются с такой же крепоіти раствором далии <H«>if-
maiins-viclett). Н^г[е^ают окраской в течение 10 мин. до
появления пара. Если препарат получился грязный, следует ополоснуть
его спиртом.
Можно пользоваться и другими красками. Мейер располагает
их по возрастающей силе действия в следующем порядке:
8*- 115
а) 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина на 10
частей воды.
б) Карболовый фуксин Циля (Ziel) (стр. 109).
в) Раствор фуксина в анилиновой воде: 2 см3 анилина
взбалтывают с 50 см3 воды, эмульсию отфильтровывают через мокрый
фильтр и к прозрачному раствору прибавляют 5 см3 насыщенного
спиртового раствора фуксина. До употребления смесь должна
отстояться в течение 12 часов. Краска не прочна.
г) Насыщенный раствор фуксина в анилиновой воде.
С этими красками препарат нагревают до появления пара.
Способ Вунге (Bunge) (видоизменение способа Лёффлера).
Протрава. В течение 1—2 мин. препарат нагревают до
образования пара со свежеприготовленной протравой следующего
состава:
5% раствора полуторахлористого железа . . 1 часть
Насыщенного водного раствора таннина . . 3 часта
Перед употреблением к этой протраве иногда прибавляют 3%
раствор перекиси водорода до наступления красно-бурого
окрашивания, после чего протраву отфильтровывают.
Окраска. Промытый препарат оьрашивают при легком
подогревании карболовым генциан-виолетом или карболовым
фуксином.
Способ Пепплера (Peppier).
Протрава. Растворяют 20 г таннина в 80 см3 воды при
слабом нагревании на водяной бане и охлаждают до 20°, после
чего к раствору постепенно приливают 15 см3 2.5% водного раствора
чистой хромовой кислоты (без примеси серной). Смесь эту
оставляют на 4—6 дней при температуре не ниже 18°, после чего
отфильтровывают через двойной складчатый фильтр исохраняютвзакрытом
сосуде при температуре не ниже 18°. Перед употреблением лучше
отфильтровывать. Если в протраве, вследствие понижения
температуры, образовался осадок, то склянку ставят на несколько
часов при 20°.
Краска. Смесь 10 см3 5% спиртового раствора генциан-вио-
лета с 2.5 см3 жидкой карболовой кислоты и 100 см3 воды. Краску
оставляют на несколько дней и затем, не встряхивая, фильтруют.
При замене генциан-виолета фуксином получается более слабая
окраска, но фон препарата чище.
Способ протравления и окраски
препарата. Препарат обливают свежепрофильтрованной протравой
и оставляют при 18° на 1—5 мин. (лучше обрабатывать
одновременно 3 препарата: один —1 мин., другой — 3 и третий— 5 мин.).
Слить протраву и хорошо промыть препарат тепловатой водой.
Окраска длится 2 мин. без нагревания. Микробы окрашиваются
в темнофиолетовый цвет, а жгутики — несколько светлее.
Способ еан-Эрменгема (van Ermengem) (фотографический).
1) В качестве протравы готовятся два раствора;
на
а) 2% водный раствор осмиевой кислоты,
б) 10—25% водный раствор таннина.
За несколько дней до окраски 1 объем раствора (а) смешивают
с 2 объемами раствора (б) и на 100 см3 этой смеси прибавляют 4—5
капель крепкой уксусной кислоты. Жидкость отфильтровывают
через влажный фильтр и оставляют на несколько дней, пока она
не примет темнофиолетовый цвет. Препарат обрабатывают нтой
жидкостью в течение получаса при комнатной температуре или в
течение 4 мин. при 50—60°.
2) Промывают сначала водой, затем спиртом.
3) Препарат погружают на несколько секунд в 1% водный
раствор азотносеребряной соли.
4) Не промывая препарата, переносят его на несколько секунд
в раствор:
Галловой кислоты (Ac. gallicum) .... 5г
Таннина (Ac. taimicum) 3
Уксуснокислого натрия ... 10
Дестиллированной воды 350 см*
5) Вторично погружают препарат в серебряную ванну (см. 3)
и держат в ней, пока он не начнет чернеть.
6) Промыв водой, исследуют под микроскопом.
Если получилась слабая окраска, то с тем же препаратом еще
раз проделывают операции 4—6. Если же окраска получилась
слишком сильная и препарат грязен, то оставляют его на несколько
дней на свету и затем на 1 сек. погружают в раствор 1 г хлорного
золота в 2—3 л воды.
По этому способу бактерии окрашиваются в черно бурый цвет,
а жгутики — в черный.
Способ Гинтербергера (Hinterberger). Этот способ представляет
видоизменение предыдущего. Препарат, фиксированный
нагреванием при 100—110° в течение нескольких минут, погружают в
протраву ван-Эрменгема (см. его способ) на полчаса. Сполоснув водой,
погружают препарат в 95% спирт, вторично промывают водой
и обрабатывают 1% раствором азотнокислого серебра, после чего
несколько раз опускают в 0.7% раствор поваренной соли и в 30%
раствор аммиака. Избыток аммиака удаляют 95% спиртом. Затем
препарат обрабатывают следующим раствором:
3% галловой кислоты 20 см8
50% раствора уксуснокислого натрия . • 2
Дестиллированной воды ......... 20
Слив жидкость, обрабатывают препарат 0.25% раствором азот-
носеребристой соли, пока мазок не почернеет. Окраска такая же,
как в способе Эрменгема.
Способ Це п пнова.
Приготовление препарата. Небольшую пеглю
исследуемых бактерий прибавляют к капле воды, а из нее такую же
петлю переносят в другую каплю воды, к которой прибавлены 1—2
117
капли 2% осмиевой кислоты. Из этой второй капли берут материал
для мазка.
Протрава. Юг таннина (Taiminum lerviss. puriss. Merck)
растворяют в 150 см3 воды, нагретой до 40—50°. К раствору
прибавляют 27—28 см3 5% раствора рвотного камня (Tartarus sti-
biatus) и нагревают жидкость до растворения образовавшегося
осадка. Если протрава при охлаждении сильно мутится, к ней
прибавляют немного таннина. Если же протрава слишком
прозрачна, к ней прибавляют 1 см3 раствора рвотного камня. Протрава
должна сильно опалесцировать, не давая, однако, осадка. При
нагревании она становится совершенно прозрачной. Для лучшей
сохранности к ней можно прибавить кристаллик тимола. Протравой
пользуются тотчас после приготовления, и она служит довольно
долго.
Препарат помещают, мазком вниз, в часовое стеклышко и
заливают нагретой протравой.В таком нагретом состоянии протраву
поддерживают в течение 2—10 мин. (например, на нагревательном
столике —рис. 87), Если протрава плохо действует, к 10 см3 ее
прибавляют 2-3 капли раствора рвотного камня и вторично
обрабатывают препарат.
Когда при охлаждении протрава начнет мутиться, препарат
вынимают и тщательно промывают водой. Промывание нужно вести
осторожно, так как протравленный мазок легко смывается.
Окраска (обработка серебром). 2—3 г сернокислого
серебра взбалтывают с 200 см3 воды для насыщения этой солью.
К равным объемам этого раствора и воды в пробирке понемногу
прибавляют при встряхивании 33% раствор этиленамина до тех
пор, пока первоначально образовавшийся осадок не растворится,
стараясь не приливать избытка этого реактива (избыток
нейтрализуют серебряной солью). Полученный раствор может сохраняться
в склянке с притертой пробкой и в темноте в течение года.
Наступающее легко побурение раствора не отражается на его действии.
Сухое стеклышко с протравленным мазком обливают этим
раствором и нагревают до появления пара и почернения мазка.
Промыв водой, рассматривают в микроскоп. Жгутики окрашиваются
в черный цвет.
Примечания: 1) Серебряный раствор для окраски можно
приготовить следующим образом: 5 г азотнокислого серебра растворяют в 30 см*
дестиллированной воды и прибавляют 6 г сернокислого натрия. Когда
жидкость отстоится, еесливают с осадка и последний хорошо взбалтывают с 20см3
дестиллированной воды. Дав отсюяться, сливают жидкость и повторяют ту ж?
операцию с осадком еще и еще раз. Около 4 г осадка переносят в склянку
темного стекла с притертой пробкой и обливают 500 см3 дестиллированной воды.
Хорошо встряхивают и оставляют на несколько часов отстояться. Жидкость
над осадком содержит насыщенный раствор серносеребряной соли, которым
и можно пользоваться.
2) Если жгутики слабо окрасились, препарат усиливают золотом. В трех
капельницах приготовляют следующие растворы: а) 0.01 г хлорного золота
в 20 см3 дестиллированной воды; б) 1 г соды в 50 см3 дестиллированной воды;
в) 1 г пирогаллола в 20 см3 этилового спирта с прибавлением 2 капель
крепкой уксусной кислоты.
118
На мазок наливают несколько капель раствора золота, через минуту
смывают водой, затем-—4 капли раствора соды и 1—2 капли раствора пирогалол-
ла. Слегка нагревают в течение 1 мин. и промывают водой. Эту операцию
усиления можно повторить еще раз.
Способ Л. Валенти (Luca Volenti). Отличаясь большой
простотой, этот способ дает иногда недурные результаты. Протравой
служит 20% раствор таннина, с которым препарат слегка
нагревают в течение 2—3 мин. Промытый препарат обрабатывают
карболовым фуксином Циля в течение 10—12 сек., при легком
подогревании. Когда краска охладится, повторяют нагревание еще раз.
Способ ?енигетти (Beniguetti) За 2 — 3 дня до окраски
приготовляют 3 раствора:
A) Сернокислого цинка 1 г
Таннина 15
Дестиллированной воды 100 см3
Б) Насыщенный водный раствор квасцов
B) Насыщенный спиртовой раствор ген-
циан-виолета
Смешивают перед окраской: 5А+5Б -(- 3 В. Эту смесь
наливают на фиксированный препарат и подогревают в течение
2—3 мин. до появления паров. Затем промывают и исследуют под
микроскопом.
Способ Броухилля(Вгоі^ЫН). Для протравы и окраски
одновременно служит раствор:
Дестиллированной воды 30 см3
Насыщенного спиртового раствора орсе-
ина 15
20% раствора таннина 10
Раствор должен быть приготовлен дней за 10 до окраски.
Перед окраской раствор отфильтровывают и наливают в часовое
стеклышко. В краску, мазком вниз, погружают 'препарат и слегка
подогревают стеклышко на водяной бане в течение 15 мин. до едва
заметного парообразования. Затем ополаскивают водой и
заделывают обычным способом в канадский бальзам.
Некоторые бактерии обладают активной подвижностью, но
лишены жгутиков (миксобактерии, нитчатые серобактерии).
Поступательное движение миксобактерии, повидимому, зависит
от выделения слизи на концах клеток, набухающей затем в
жидкости, т. е. движение носит реактивный характер. Методика
изучения подвижности миксобактерии описана в другом месте (стр. 260).
Инволюционные формы
Много бактерий, например Вас. mycoides, Bad. coli, Vibrio
cholerae asiaticae и др., легко образуют инволюционные формы
на обычном питательном агаре с прибавлением 1—3% солей (LiCl,
NaCl, MgS04Hflp.) В этих условиях образуются гигантские
полиморфные клетки — шаровидные, веретенообразные или имеющие вид
119
крупных спирилл. Появление атипических формв культуре может
происходить под влиянием различных внешних факторов
(температура, добавление углеводов к среде, реакция среды и т. л.).
Иногда крупные клетки рассматриваются как одна из стадий
развития бактерий (гонидангии, артротециты). Правильнее,
однако, считать их за реактивные формы, образующиеся при
условиях, неблагоприятных для размножения.
2. ОКРАСКА И ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖИМОГО МИКРОБНОЙ
КЛЕТКИ
Для тонких цитологических исследований необходимо
пользоваться наиболее совершенными и точными оптическими приборами,
например микроскопом Цейсса, снабженным апохроматом (фок.
расст. 3 мм или, еще лучше, 2 мм; апертура 1.40), и
компенсационными окулярами. Должно быть обращено внимание также на
достаточно яркое освещение поля зрения.
В качестве материала для морфологических и цитологических
исследований предпочтительнее брать более крупных микробов,
например: дрожжевые грибки, Oidium lactis, Вас. megatherium,,
В. mycoides, Spirillum volutans, различные серобактерии и др.
. Ядро
Обнаружение ядра — одна из наиболее трудных задач
цитологии бактерий, тем более что до сих пор нельзя считать прочно
установленным, что принимать за ядро, и потому оценка
получаемых картин до известной степени субъективна. Самые
разнообразные элементы клетки принимались р а зличными а вто р ами
за ядра.
Ружичка (Ruzicka) считает ядром всю клетку, Бючли (Biitschli)
— протопласт, Менкль (Мепсі) — волютин и т. д.
В последние годы у бактерий неоднократно были обнаружены
морфологически дифференцированные и делящиеся ядра [Гол-
лянд (Hollande), Бадиан (Badian), Барнар (Barnard), Штилле
(Slille) и др.] Однако ядерная природа описываемых структур не
может считаться доказанной.
Новые методы исследования —микроскопия в темном поле
и микрофотография в ультрафиолетовом свете — также не
разрешили вопроса о существовании ядра у бактерий.
По определению А. Мейера, ядро представляет собою
содержащееся в клетке округлое образование, несколько сильнее
преломляющее свет, чем протоплазма. При отмирании клетки оно
разрушается, и потому на высушенных препаратах его нельзя наблюдать.1
Для обнаружения ядер надо применять специальные
фиксирующие средства или кипячение в воде.
1 Ниже мы увидим, что некоторые способы обнаружения ядер основатпв
на окраске сухих препаратов.
120
При этом нужно иметь в виду, что наличность или отсутствие
ядра зависит от стадии развития и условий культивирования
бактерии: в одних случаях в клетке может находиться лишь хромидиаль-
иая система в виде рассеянной зернистости, в других — вполне
оформленное ядро. Пражмовский (Prazmowski) в своих
исследованиях над строением клетки Azotobacter указывает, что для
удачи окраски ядра непременным условием является выбор
подходящего материала путем внимательных наблюдений над живыми
бактериями в висячей капле. Если содержимое бактерий
представляется в виде однородной массы, без заметной дифференцировкя-
структурных элементов, то такой материал не пригоден для
исследования. Лишь когда в неокрашенной клетке заметно
неравномерное распределение плазмы, видны вакуоли и зернистость,—¦
материал может быть с успехом использован для окраски ядра.
В виду частого нахождения в бактериальной клетке различных
включений, нередко смешиваемых с ядром, не лишен значения
способ предварительной обработки препарата различными
жидкостями с целью освобождения клетки от этих включений. Способ
втот был применен Линде (Linde) при исследовании строения клетки
Cladothrix dichotoma. Материал вносился для фиксации в
нагретую до кипения смесь:
Сулемы Юг
Спирта 100 см*
Воды 100
Крепкой уксусной кислоты 2
я оставался в этой жидкости в течение 1 часа до полного
охлаждения ее. При этом растворялись метахроматические зерна (волю-
тин). Затем препарат промывался в постоянно обновляющейся воде
в течение 6 час, после чего переносился на 12—14 час. в 25% спирт.
Затем он погружался в ванны, содержавшие все возрастающие
концентрации спирта, вплоть до абсолютного (стр. 89), а из него
на сутки в хлороформ для растворения жира. Из хлороформа
препарат вновь переносился в спирт, затем в смесь 1 часть спирта
-f-і часть глицерина+1 часть воды и, наконец, в краску (железный
гематосиклин стр. 123).
Можно рекомендовать более простой способ растворения волго-
тина (метахроматина). Взвесь бактерий в воде нагревается в
пробирке, погруженной в водяную баню при 90° в течение 10 мин.
Исчезновение зерен, происходящее после такой обработки, говорит
против их ядерной природы. Параллельно изучаются
микроскопически картины в препаратах, приготовленных из клеток, не
подвергавшихся нагреванию.
Во избежание глубоких нарушений нормального строения
клетки Пражмовский рекомендует прижизненную окраску
бактерий. Такие краски, как карбол-фуксин и ему подобные,
решительным образом изгоняются им из практики цитологических
исследований. Равным образом следует избегать высушивания препарата
и фиксации на пламени газовой горелки. Действуя 2.5% водным
122
раствором красок на живых бактерий, Пражмовский наблюдал
постепенный ход окраски, сопровождавшийся медленным
отмиранием клетки, причем ядро и зерна хроматина окрашивались
нередко спустя много часов после гибели клетки.
По мнению Пражмовского, только в таком случае
внутриклеточные образования можно признать за ядра, если они красятся
такой ядерной par excellence краской,как метиловая зелень (Methyl-
%тйп) 1
Автор пользовался краской следующего состава:
Дестиллированной воды 10 см3
Насыщенного водного раствора
метиловой зелени 10—15 капель
Свежеприготовленного раствора
фуксина 5—15 «
(Фуксин готовился растворением 2 см3 насыщенного
спиртового раствора фуксина в смеси 10 см3 спирта и 10 см3 воды).
Краской этой лучше пользоваться через 8—10 дней после
приготовления, причем она сохраняется в течение 3 месяцев и более.
При обработке этой краской ядро принимает синий цвет, а
протоплазма — розовый.
Для прижизненной окраски бактерий Митрофанов применял
0.25% водный раствор метиленовой сини, следя за постепенным
окрашиванием клетки. По окончании окраски препарат
фиксировался концентрированным раств ром сулемы в 0.75% растворе
поваренной соли и заключался в глицерин.
А. Мейер для окраски ядра вносил в каплю формалина,
помещенную на предметном стекле, небольшую петлю эмульсии
бактерий и оставлял в ней в течение 4—5 мин. Затем туда же
прибавлялись 1 —2 капли свежеприготовленного спиртоводного раствора
фуксина, который готовится следующим образом: 2 см3 насыщенного
спиртового раствора фуксина смешивают с 10 см3 спирта и 10 см3
воды; перед употреблением 15 капель этого раствора прибавляют
к 10 см3 воды; тщательно смешивают платиновой иглой и
оставляют на 10 минут, время от времени перемешивая массу. Если по
истечении этого срока окраска не достигнута, то окрашивание
продолжается еще 5 мин. При последующем обесцвечивании 1%
серной кислотой сначала обесцвечивается протоплазма, а затем ядро.
Применяя этот способ окраски, Мейер находил иногда до 6 ядер
в клетке. ,
Дуглас (Douglas) и Дистазоі (Distaso) рекомендуют окраску
ядра у бактерий краской Гимза (Giemsa) (стр. 100). Влажный
препарат, приготовленный в смеси равных частей нормального
раствора поваренной соли и кровяной сыворотки, фиксируют в течение
5 мин. в парах осмиевой кислоты с примесью уксусной (на 1 см3
осмиевой кислоты 1 капля уксусной), затем высушивают мазок
1 С этим едва ли можно согласиться, так как, строго говоря, «ядерных
красок», окрашивающих только ядра, не существует.
V42
на воздухе и окрашивают в течение 30 мин. раствором, содержащим
15 капель краски Гимза в 10 см3 воды. Препарат затем
дифференцируется в 10—25% спирте.
Со времени классических исследований Бючли по цитологии
синезеленых водорослей и некоторых серобактерий — в
большом употреблении для обнаружения ядра у бактерий
примененный им для этой цели гематоксилин. Он фиксировал свои
препараты высушиванием спиртом, пикриново-серной и осмиевой
кислотами. х Лучшая окраска получалась с помощью гематоксилина
Деляфильда (Dela-
field), причем
явственно выступало
«центральное тело»
(рис. 92).
Приводим состав
наиболее
употребительных растворов
гематоксилина:
1) К в асцовый
гематоксил ин
Деляфильда.
К 200 см3
концентрированного водного
раствора аммиачных
квасцов прибавляют
раствор 2 г
гематоксилина в 12 см3
абсолютного спирта и
оставляют смесь на
воздухе и на свету в
течение 3—4 дней.
Жидкость отфильтровывают и к ней прибавляют смесь 50 г
глицерина и 50 г метилового спирта. Жидкость сохраняют до тех пор,
пока она не приобретет темной окраски, после чего ее отфильтро-
ODOCTD
Рис. 92. Строение бактерий по Бючли.
1—Chromatium Оквпіі, 2—Bacterium lineolat 3—6
серобактерии, 7—Ophidomona jenensis, 8—9 Spirillum undula.
1 Гильермон (Chiilliermond) при исследовании ядра у дрожжей
фиксировал препарат следующими жидкостями:
1) Жидкость Буэн (Bouin) (пикроформол)
Насыщенного водного раствора пикриновой кислоты . . 75 см3
Крепкой уксусной кислоты 5
Формалина 20
2) Жидкость Перени (Рёгёпу)
5°/о хромовой кислоты 3 см3
10°/о азотной кислоты 4
90—95°/о этилового спирта 1000
Продолжительность фиксации этими жидкостями — около 12 часов.
Результаты получались превосходные. Дальнейшая окраска производилась
гематоксилином.
Подробные указания относительно ядра у дрожжей можно найти
в статье Геннеберг (Henneberg) в «Centralbl. f. Bact.» (2), t. 44, стр. I, 1915.
123
вывают и сохраняют в склянке с притертой пробкой. Перед
применением краску разбавляют большим или меньшим количеством
воды. Слабые растворы красят медленнее (иногда несколько дней),
но лучше. Крепким раствором можно окрасить препарат в полчаса.
2) Железный гематоксилин Гейденгайна
(Heidenhain).
а) Жидкость для протравы и дифференцирования:
Железо-аммиачных квасцов 2.5 г
Дестиллированной воды 100 см3
б) Раствор краски:
Гематоксилина 1 г К этому раствору черев
Этилового спирта .... 10 смя месяц прибавляют рав-
Дестиллированной воды . 90 ный объем воды
Препарат обрабатывают раствором квасцов (а) в течение 3—
12 час, основательно промывают водой и окрашивают жидкостью
(б) в течение 1—1.5 суток.
Промыв большим количеством воды, дифференцируют
раствором квасцов (а) в течение 20—60 мин. Продолжительность
дифференцирования контролируется видом препарата под
микроскопом (иногда в дифференцировании вовсе нет надобности).
Затем окончательно промывают и заделывают препарат.
3) Квасцовый гематоксилин Эрлиха (Ehr-
iich).
Гематоксилина 2 г
Концентрированной уксусной
кислоты 10 см»
Глицерина 100
Эі илового спирта 100
Воды 100
Калиевых квасцов до насыщения
Краску долгое время выдерживают на свету. Через 4—5 дней
она приобретает кровавокрасный цвет. Отфильтровав, ее
сохраняют в склянках с притертой пробкой.
Приведем в качестве примера два способа окраски
гематоксилином, примененные Мейером для обнаружения ядра у
Clostridium Pasteurianum.
1) Эмульсию бактерий 2 мин, кипятят в воде и затем центро-
фугируют. Слив воду, смешивают осадок бактерий с 0.5%
раствором железо-аммиачных квасцов и оставляют на сутки при частом
встряхивании./Вновь отцентрофугировав осадок, прибавляют
к нему 0.5% раствор гематоксилина. Через сутки центрофуги-
руют, и петлю осадка наносят на предметное стекло в каплю
разбавленной соляной кислоты (5 капель крепкой кислоты на 10 см*5
воды). Под влиянием кислоты плазма и споры обесцвечиваются,
а внутри споры становится видимым ядро (рис. 93, / и g). При дшГ
фрренцировке не соляной кислотой, а вышеприведенным раство
ром квасцов явственно Шліоіудает вакуолизация в плазме и в спорг
124
(рис. 93, h). По этому способу хорошо дифференцируется ядро
также у дрожжей (можно брать более крепкие растворы
квасцов и краски).
2) Эмульсию клостридия промывают водой с помощью центро-
фуги и в течение 3 час. фиксируют в флемминговой жидкости
(ітр. 90), наполовину разбавленной водой. Центрофугируют
и осадок 6 раз промывают водой, всякий раз центрофугируя и
слипая предыдущую жидкость. Затем к воде в течение 2—3 дней
постепенно по каплям приливают спирт, пока его содержание не
достигнет 20%. Центрофугируют и окрашивают осадок бактерий
гематоксилином Деляфильда, наполовину разбавленным водой. Через
сутки жидкость отделяют центрифугированием и петлю
бактериальной массы для
дифференцирования
переносят в каплю смеси:
10% раствора
этилового спирта . . 10 сма
10% спиртового
раствора соляной
кислоты .... 3 капл»
Ay
{-¦¦
ъ
Рис. 93. Строения ядра у Clostr. Pasteuna-
пит% по А. Мейеру.
Плазма принимает
светлоголубой цвет,
оболочка красится
сильнее , а ядро имеет вид
темной точки,
окруженной более светлой зоной
(рис. 88, А).
Обособленные хро-
матиновые структуры
сравнительно легко мо-
іут быть окрашены в гигантских бактериальных клетках
шаровидной или овальной формы, появляющихся иногда в культурах
самопроизвольно или, чаще, под влиянием различных внешних
факторов. Эти крупные клетки иногда рассматриваются как
прогрессивные стадии жизненного цикла бактерий, которые содержат
ядра. Окрашивание таких «ядерных форм» производят основными
красками или по Гимза. Находящиеся в клетках хроматиновы?
образования могут быть весьма полиморфными и достигают
больших размеров.
Хроматинавыо зерна
Для окраски зерен хроматина в клетке служат различные
комбинации метиленовой сини с эозином.
Способ Гимза. Воздушносухой препарат фиксируют в течение
2—3 мин. этиловым спиртом и затем окрашивают в течение 10—
15 мин. раствором Гимза (стр. 100).
Способ Цеттнова. Для окраски служат следующие растворы.
12S
Раствор А.
1% раствора метиленовой сини 50 см9
5% » соды . . . 3
10% » тимола в спирте 0.5
Раствор Б.
10% водный раствор эозина (Eosin В. Hochst).
В смеси 2 частей раствора А и 1 части раствора Б окрашивают
препарат в течение 2—5 мин. Если нужно, дополнительно
дифференцируют 0.5% раствором метиленовой сини, слабо
подкисленной уксусной кислотой или 0.2% раствором эозина.
Способ Цимана (Ziemann). Препарат окрашивают в течение
30—40 мин. смесью:
1% раствора метиленовой сини 1 часть
0.1% раствора эозина (A. G. или В. А.
Hochst) 6 частей
Для хроматияового нуклеинового вещества характерна
растворимость в 10% поваренной соли и в концентрированном растворе
соды. В желудочном соке оно не растворяется.
Обработав высушенный на предметном стекле препарат 90%
спиртом, переносят в желудочный сок или в смесь: 1 часть пепсин-
глицерина Грюблера + 3 части воды + 1 часть 0.2% соляной
кислоты; ставят при 40° и ежечасно вынимают препарат из
переваривающей жидкости, промывают водой и окрашивают 1% раствором
метиловой зелени (Methylgrun) в 0.5% уксусной кислоте
(окрашивается хроматин). Полнота переваривания белков
обнаруживается отрицательным отношением стромы клетки к окраске
метиленовой синью. Обработав препарат 10% поваренной солью,
растворяют хроматин — препарат перестает краситься метиловой
зеленью.
Специфично для хроматина нуклеальное окрашивание,
получающееся при обработке препаратов по способу Фейльгена (Feulgen).
Сущность этого микрохимического метода заключается в том, что
при гидролизе специфичной для ядерной субстанции тимонуклеи-
новой кислоты освобождаются альдегиды, дающие с реактивом
Шиффа (Schiff) фиолетовое окрашивание.
Реакция Фейльгена производится следующим образом. В
небольшую каплю воды, находящуюся на предметном стекле,
переносятся бактерии с плотной среды. Исследуемый материал
вносится таким образом, чтобы в центре капли имелось 1—2 комочка
бактериальной массы. Препараты во влажном состоянии
фиксируются парами ледяной уксусной или осмиевой кислоты,
высушиваются при 40° и помещаются в кюветки с 96° спиртом на двое
суток. Вынутые из спирта препараты помещаются в фарфоровый
стаканчик, содержащий лНСі, нагретую до 60°.
Гидролиз производят при этой температуре в течении 10 мин.
Затем препараты погружаются на 1—2 мин. в холодную п НС1 и
12G
переносятся в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа). Для
приготовления последнего 1г растертого вступке фуксина (Diamant-
fuchsin) растворяют в 200 см3 кипящей дестиллированной воды,
горячий раствор фильтруется, охлаждается до 50° и к нему
добавляется 20 см3 п HG1.
В бутылку темного стекла с притертой пробкой вместимостью
в 230—250 см3 насыпается 1 г NaHS03 и в нее же переливается
раствор фуксина, остывший до 20°. Через сутки фуксин обесцвечивается
и жидкость в толстом слое приобретает слегка желтоватый
оттенок. Хранить реактив Шиффа необходимо в темноте, в
герметически закрытой склянке.
Препараты помещаются в фуксинсернистую кислоту и
выдерживаются в течение 3—4 час. Обычно через 20—30 мин. более толстые
участки препарата (комочки) окрашиваются в фиолетовый цвет.
Из реактива Шиффа препараты переносятся в кюветки с водой,
содержащей S02. Готовится она непосредственно перед
употреблением следующим образом. Дестиллированной воды 200 см3, 10%
раствора NaHS03 10 см3 и п HG1 10 см3. Препарат последовательно
промывается в трех кюветках по 20 мин. в каждой. Затем следует
промывка в дестиллированной воде в течение 30—60 сек.,
высушивание и заделка в канадский бальзам.
Контродем служат препараты, не подвергавшиеся гидролизу
и не помещавшиеся в холодную соляную кислоту, в остальном
обработанные так же. Контрольные препараты должны оставаться
совершенно неокрашенными.
Реактив Шиффа легко диссоциирует,и регенерировавший фуксин
быстро окрашивает различные структуры бактериальной клетки.
Такое вторичное окрашивание имеет красный цвет и является
основным источником ошибок при изучении строения бактериальных
клеток с помощью реакции Фейльгена.
Волютин (метахроматические зерна)1
Термин «волютин» предложен А. Мейером по названию
бактерии Spirillum volutans, у которой эти включения им впервые
были изучены. 2 Представляя собой запасное азотистое вещество,
повидимому производное нуклеиновой кислоты, волютин
заключается в клетке в виде различной величины и фэрмы полужидких
зерен, число и расположение которых бывает самым
разнообразным. В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина
выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью.
Последняя, однако, меньше, чем у капель жира.
1 Название «метахроматические зерна», предложенное Бабес для
клеточных включений, отличающихся метахромозией, употребляется часто как
равнозначащее волютину
2 Некоторые авторы (Пражмовский) считают излишним введение этого
нового термина, таь как волкиин ничем не разнится от метахроматических
зерен Тем не менее мы удерживаем это название в виду его
распространенности.
127
Волготин у бактерий может быть в особых вакуолях, где он
находится в состоянии золя. При витальной окраске волютин
постепенно переходит в гель и выпадает в виде зерен. Применяя слабые
растворы (1 : 5 тыс.) нейтральрота, брильянтрезилблау и ме-
тиленовой сини, можно проследить, как в клетке появляются
верна, постепенно увеличивающиеся в своих размерах. После
растворения зерен волютина (см. ниже) в окрашенных клетках
остаются бледные вакуоли. Помимо Sp. volutans хорошим
объектом для изучения являются молочнокислые палочки (Z?. casei),
длинные клетки которых содержат несколько крупных зерен
волютина.
Волютин появляется в клетках только на средах, содержащих
фосфорные соединения. В отсутствии последних волютин не
образуется. С большой ясностью это можно наблюдать на разводках
Azotobacter и у дрожжей.
Волютин обладает рядом характерных признаков:
1) Растворимость. При комнатной температуре
зерна волютина растворяются в воде в 2—3 дня, а в кипящей воде —
в несколько минут. На сухих фиксированных препаратах
растворимость уменьшается, и зерна волютина выдерживают даже
пятиминутное кипячение.
1 % серная или соляная кислота растворяет волютин через сутки,
а 5% — в 5—10 мин.
Свежеприготовленная жавелевая вода растворяет волютин
вместе с протоплазмой в 5 мин.
Жирорастворяющие вещества, как хлороформ, бензол, эфир,
спирт, четыреххлористый углерод и др., не растворяют волютина.
Он отчасти растворим при 5 мин. воздействии в растворе 2 частей
хлорал-гидрата в 2 частях воды.
2) Окраска. При окраске метиленовой синью зерна
волютина густо окрашиваются в сиие-фиолетовый цвет, а протоплазма —
в голубой. Под влиянием 5% раствора соды окраска волютина
исчезает, а окраска протоплазмы остается. Промыв водой и вновь
окрасив тем же раствором метиленовой сини, получают опять окраску
волютина. х Это указывает на то, что сода лишь обесцвечивает,
но не растворяет волютина.
Обратное отношение наблюдается при действии на
окрашенный препарат 1 % серной кислоты: волютин сохраняет окраску,
а протоплазма обесцвечивается.
Если окрашенный метиленовой синью препарат обработать
раствором иода (2 г иода +1 г К J -f- 200 см3 воды), то плазма
окрашивается в желтобурый цвет, а зерна волютина в почти черный.
Под влиянием 5% соды зерна волютина обесцвечиваются, а
протоплазма восстановляет свою прежнюю голубую окраску.
Превосходная дифференциальная окраска верен волютина
может быть достигнута различными способами:
1 Эти последовательные обработки препарата можно производить,
пользуясь приспособлением, описанным на стр. 108.
128
Способ Нейссера (Neisser). Приготовляют 3 раствора:
а) Мотиленовой сини 1 г
96% этилового спирта 20 см3
Дестиллированной воды 1000
Крепкой уксусной кислоты .... 50
б) Кристалл-виолета 1 г
Этилового спирта 10 см3
Дестиллированной воды 300
в) Хризоидина і г
Горячей дестиллированной воды . . 300 см3
(после охлаждения отфильтровать)
Смешивают 2 части раствора (а) с 1 частью раствора (б) и
окрашивают препарат этой смесью в течение 1 сек. Сполоснув водой,
дополнительно окрашивают раствором в течение 3 сек. Волютин
окрашивается в синий или черный цвет, а протоплазма — в
коричневый.
Способ этот был предложен Нейссером для окраски Bact. di-
phteriae, но дает превосходные результаты и с другими бактериями.
Известен в нескольких видоизменениях.
Способ Любинского. Сначала препарат обрабатывают в течение
0.5—2 мин. раствором:
Пиоктанина Мерка'(Merck) ?.25 г
5% уксусной кислоты 100 см3
Промыв водой, дополнительно окрашивают 0.1 % раствором
везувина в течение 0.5 мин. Зерна темнооиние, протоплазма —
темнофиолетовая. Блюменталь и Липскеров вместо везувиана
рекомендуют брать 0.3% раствор хризоидина.
Способ Тринкаса {Trincas). Препарат окрашивают 1 мин.
следующей краской:
Толуидинблау 0.25 г
Этилового спирта 5 см3
2% уксусной кислоты 100
Слив краску, препарат дополнительно окрашивают в течение
1 мин. 1% раствором везувина. Зерна волютина окрашиваются
в черно-синий цвет, а плазма — в бледнозеленый.
Способ Пишфильда (Pitfield). Готовят раствор:
Азотнокислого серебра 5 г
Дестиллированной воды 5 см3
Насыщенного спиртового раствора
фуксина 3
Препарат обливают этой краской и нагревают до кипения
жидкости. Слив ее и ополоснув препарат водой, дополнительно
обрабатывают его кипящим раствором:
Пирогалловой кислоты 1 г
10% раствора едкого натра 5 см3
Дестиллированной воды 10 »
9 PyKOBOgciBO до микробиологии А%У
Слив жидкость и промыв препарат водой, обрабатывают его
карболовой водой (10 капель карболовой кислоты на 10 см3 воды).
Волютин окрашивается в черный цвет, а протоплазма — в
красный.
Способ Омелянского (видоизмененный способ окраски спор).
Окрашивают препарат в течение 0.5 мин. без нагревания карбол-
фуксином Циля. Промыв водой, обесцвечивают 1 % серной
кислотой в течение 20—30 сек. Затем, промыв водой, дополнительно
окрашивают метиленовой синью (1 : 40) в течение 15—20 сек. и
заделывают препарат в глицерин. Зерна волютина —красные,
протоплазма — синяя.
В заключение перечислим отличительные признаки зерен
хроматина и волютина (метахроматические зерна):
а) по способу Романовского хроматиновые зерна окрашиваю-
ются в красный цвет (стр. 100);
б) в окрашенном метиленовой синью препарате зерна
хроматина обесцвечиваются 1 % серной кислотой (а волютина — нет);
в) наоборот, 5% раствор соды обесцвечивает зерна волютина,
но не хроматина;
г) при последовательной обработке препарата метиленовой
синью, иодом и 5% содой (см.выше), зерна волютина
обесцвечиваются, а хроматин сохраняет синий цвет;
д) кипячение в воде в продолжение 2 мин. растворяет волютин,
но не хроматин;
е) положительную реакцию Фейльгена могут дать только зерна
хроматина, так как при гидролизе препарата в горячей соляной
кислоте волютин растворяется.
Гликоген
Из микробов, почти всегда содержащих гликоген («животный
крахмал») назовем дрожжевые грибы, Вас. subtilis, Clostridium
Pasteurianum и др. Гликоген встречается чаще в виде включений
в клетке, иногда же в растворенном состоянии, пропитывая
протоплазму.
Для обогащения гликогеном берут свежую культуру дрожжей
на пивном солоде и,слив с осадка дрожжей отстоявшуюся жидкость,
приливают 20% раствор тростникового сахара.Через сутки клетки
дрожя^ей оказываются переполненными гликогеном.Если осадок
дрожжей сохранить затем под водой, то гликоген сбраживается
и клетки его больше не содержат.
Гликоген не окрашивается обычными анилиновыми красками
и по Граму (Gram), Характерна для него окраска иодом в красно
бурый цвет, для чего предпочтительнее пользоваться крепким
раствором иода (7 г иода +20 г йодистого калия +100 см3 воды). Так
как капли жира тоже отчасти окрашиваются иодом, то реакцию
лучше производить после экстрагирования жира из клетки. В
сомнительных случаях препарат с иодом заделывают по краям пара-
130
фином и оставляют на сутки. При нагревании препарата до 60°
окраска иодом исчезает, после охлаждения вновь появляется.
Гликоген растворяется в 3 мин. при кипячении бактерий с 5%
серной кислотой. Иногда к гликогену бывает примешана гранулеза,
и тогда с иодом получается синее окрашивание, если раствор
иода слабый, и красяо-бурое, если крепкий.
Гранулеза (яоген)
Включение амилоидного вещества, близкого к крахмалу, но,
повидимому, не тождественного с ним, часто встречаются у масля-
нокислых бактерий в стадии, предшествующей спорообразованию,
-например, у Clostridium Pasteurianum. Гранулеза окрашивается
иодом в синий цвет, в остальном же повторяет свойства гликогена.
Получить отчетливую реакцию на гранулезу можно у бацилла
мочки льна — Granulobacter pectinovorum. Раствор Люголя
впускается в раздавленную каплю под покровное стекло с одной
стороны. Такая прогрессивная окраска дает возможность проследить
за различными стадиями окрашивания гранулезы. Непосредственно
перед спорообразованием вся клетка окрашивается диффузно в серо-
синий цвет. Во время формирования споры количество гранулезы
в клетках Granulobacter pectinovorum уменьшается, и у плектри-
диев со зрелой спорой обнаруживаются только единичные синие
верна.
Жир
Для изучения включений капель жира хорошим материалом
могут служить В. megatherium, В. mycoides, В. tumescens, старые
культуры грибков Endomyces vernalis и др. Накоплению жира
в бактериальной клетке способствует культура на средах, богатых
углеводами (мясопептонный агар с 2% глюкозы, картофель). В
молодых клетках встречается обыкновенно большое число мелких
капель, а у взрослых они собираются в крупные капли.
Эффектные картины дает микроскопия живых клеток с
каплями жира в темном поле.
Капли жира растворяются следующими жидкостями:
а) Крепкая уксусная кислота. В препарате,
опущенном на некоторое время в крепкую уксусную кислоту,
капли жира целиком растворяются, а протоплазма принимает
пенистый вид, особенно яено заметный после промывания
препарата водой со следами аммиака и окраски метиленовой синью.
Строго говоря, в уксусной кислоте растворяются лишь эфирные
летучие масла; что же касается жирных масел, оставляющих
прочное пятно на фильтровальной бумаге, то они в уксусной кислоте
либо вовсе не растворимы, либо растворяются лишь частично.
б) Хлора л-гидра т. Раствор 5 г хлорал-гидрата в 2 ем3
воды быстро растворяет капли жира. Можно брать также насыщен-
»* 131
ный спиртовой раствор хлорал-гидрата. Наоборот, жавелевая
вода, растворяя протоплазму, оставляет нетронутыми капли жира.
Что касается хлороформа и спирта, то вследствие плохого
проникновения их через оболочку клетки, особенно разросшуюся,
слизистую, они не пригодны для растворения капель жира в клетке.
Повидимому, блестящие включения, находящиеся в клетках
бактерий, не являются свободными каплями жира, а представляют
собой структуры с белковой оболочкой. Поэтому правильнее
называть их липопротеиновыми тельцами. Это подтверждается
своеобразным отношением включений к растворителям и возможностью
окрасить их после соответствующей обработки препарата
основными красками.
Для окраски жира служат препараты, фиксированные 40%
формалином, или же живой материал. Красками служат:
а) Раствор 0.4 г диметиламидоазобензола в 100 см3 95%
этилового спирта. На предметное стекло наносят каплю этой жидкости,
каплю воды и петлю эмульсии исследуемых бактерий. Плазма
остается бесцветной, а капли жира окрашиваются в желтый цвет.
б) Раствор 0.1 г Судана (Sudan III) в 20 см3 95% спирта или в
концентрированной молочной кислоте. В капле воды на предметном
стекле приготовляют эмульсию исследуемых бактерий и в нее
вносят малую петлю раствора Судана. Плазма остается бесцветной, а
капли жира окрашиваются в красный цвет. По Чапеку (Czapek), АР-
Sudan служит лучшей краской для обнаружения включений жира.
Превосходную контрастную окраску капель жира дает
комбинация метиленовой сини с Суданом. По Мейеру, поступают
следующим образом. Петлю бактериальной эмульсии смешивают на
предметном стекле с каплей 40% формалина и оставляют на 5 мин.
К фиксированному таким образом препарату прибавляют каплю
раствора метиленовой сини (1 : 40) и оставляют на 10 мин. Затем
туда же прибавляют ушко свежеприготовленной смеси равных
объемов концентрированного спиртового раствора Судана и воды.
Плазма окрашивается в синий цвет, капли жира в розовый, а вакуо
ли остаются бесцветными.
в) Одну каплю 1 % раствора диметшшарафенилендиамина
смешивают на предметном стекле с эмульсией бактерий и прибавляют
несколько петель раствора а — нафтола в 1 % соде. Через несколько
минут, при доступе воздуха, жидкость начинает синеть. Из нее
приготовляют препарат, в котором капли жира оказываются
окрашенными в темносиний цвет. Неудобство этого способа — в
крайней непрочности обоих растворов, которые всякий раз должны
приготовляться наново. х
1 Дитрих иЛибермейстер [Dietrich u Liebermeister, Cent-
ralhl. Bakt. (I), т. 32], полагают, что включения, синеющие от указанных
реактивов, не могут считаться каплями жира, так как они лишь еле
розовеют при окраске Суданом и не растворяются в кипящей воде и не
окрашиваются метиленовой синью. Авторы полагают, что они состоят из какой-то
модификации плазмы, ближе не изученной.
132
г) Раствор альканны (спиртовой настой корня растения
Alcanna tinctoria из сем. бурачниковых) окрашивает нейтральный жир
в сине-фиолетовый цвет; в присутствии свободных жирных кислот—
в розовый цвет. Недостаток краски — ее свойство давать осадки,
вследствие чего препарат получается грязный. .
д) Краска Scharlach R. (Fettponceau). Все жиры окрашиваются
в яркокрасный цвет.
е) Осмиевая кислота (1%). Почернение от осмиевой кислоты
происходит вследствие восстановления ее в металлический осмий,
сообщающий каплям жира, в зависимости от толщины слоя,
коричневую или черную окраску. Насыщенные кислоты —
стеариновая, пальмитиновая и др. —¦ не дают реакции с осмиевой
кислотой. Дают реакцию встречающиеся иногда в .клетках микробов
ненасыщенные кислоты — олеиновая и линолевая.
В препаратах, фиксированных и окрашенных гематоксилином,
метиленовой синью или фуксином, капли жира остаются
бесцветными. Если их многой они достаточно крупные, то в окрашенной
цитоплазме бактерий видны большие светлые участки круглой
формы, имитирующие вакуоли. После обработки нефиксированных
клеток некоторыми реактивами жировые тельца легко
окрашиваются основными красками. В качестве протравы применяют:
насыщенный раствор пикриновой кислоты, 1% раствор а-нафтола или
фенола в 1 % растворе соды. Слабее действует 1 % водный раствор
сулемы. Последующую окраску жировых включений производят
водными растворами фуксина, метил-виолета, далии или генциан-
виолета в концентрации 1 : 1 тыс. Цитоплазма бактерий
окрашивается дополнительно: эритрозином, вассерблау, лихтгрюном. Этот
способ дает возможность получить демонстративные препараты.
Сера
Включения серы наблюдаются в клетках серобактерий в виде
полужидких маслянистых капель, сильно преломляющих
свет и обладающих Двойным лучепреломлением. При 70° мелкие
капли сливаются в более крупные. На высушенных препаратах
серобактерий капли серы могут быть растворены в сероуглероде,
абсолютном спирте, в растворе едкого калия и соды (в последней—
при нагревании).
Убив серобактерий высокой температурой и обработав
препарат в течение 1 мин. концентрированной пикриновой кислотой,
можно, после промывания водой, вызвать кристаллизацию серы
в виде одноклиномерных кристаллов, чаще расположенных вне
клеток.
Известковые тельца (оксалиты)
Они встречаются у некоторых серобактерий в виде телец,
менее лучепреломляющих, чем капли серы (включения эти
наблюдались в клетках Achromatism oxaliferum и у серобактерии Thio-
physa).
133
В то время как капли серы включены в периферический слой
плазмы и особенно хорошо заметны при установке на верхнюю
поверхность клетки, известковые тельца расположены в
центральной вакуоле и явственно выступают при установке на оптическое
сечение клетки (рис. 94). После гибели клетки они легко
растворяются в воде и в кислотах, но не растворяются в спирте. Как
внутри отмирающей клетки, так и вне ее известковые тельца
нередко дают начало образованию кристаллов.
Рис. 94. Thiopysamacrophysa Делящаяся клетка слепа—
вид сверху, справа — в оптическом сечении.
Н» правом рисунке но периферии — капли серы, в центре — оксалиін
Увелич 1000
Вакуоли
Для наблюдения вакуолей в клетке лучше брать живой
материал и выбирать крупных микробов (например, молочную
плесень (Oidium lactis). При глубокой установке на^оптическое
сечение клетки вакуоли вырисовываются в виде светлых пятен, а при
поднятии трубы — в виде темных. Еще явственнее они выступают
на препаратах, слегка подкрашенных метиленовой синью (1 :10)
или иодом. И здесь картина меняется в зависимости от установки
микроскопа на оптическое сечение или верхнюю часть клетки.
При окраске иодом протоплазма принимает желтобурый цвет,
а вакуоли, наполненные клеточным соком, —красно-бурый, как
гликоген.
ГЛ А В А У
ФИЗИЧЕСКИЕ И ХИМИЧЕСКИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
НА МИКРОБОВ. МЕТОДЫ АНАЭРОБНЫХ КУЛЬТУР
1. ФИЗИЧЕСКИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА МИКРОБОВ
Плазмолиз
Плазмолизом называется съеживание протоплазмы под влиянием
растворов, концентрация которых превышает концентрацию
клеточного сока. Плазмолизированное содержимое сильно преломляет
свет, собираясь в один или несколько шаров внутри клетки. При
всяком высушивании препарата наступает частичный плазмолиз
под влиянием постепенного сгущения раствора. Это
обстоятельство надо иметь в виду при морфологических исследованиях.
Чтобы вызвать явление плазмолиза, А. Фишер (A. Fischer)
смешивает небольшое количество бактериальной массы с
поверхности мясопептонного агара с 1% сахара на предметном стекле
с 3—5 каплями 0.5—1% раствора азотнокалиевой соли или 1.75—
2.5% раствора поваренной соли (другие авторы рекомендуют брать
5—10% растворы). Небольшую каплю этой массы размазывают
тонким слоем на покровном стеклышке, высушивают в течение 3—
10 мин., фиксируют и окрашивают.
Для установления нужной для плазмолиза концентрации
исходят из наблюдений в висячей капле. Отметив наименьшую
концентрацию, вызывающую в этих условиях плазмолиз, пользуются
на мазках в 3—5 раз более слабой концентрацией, во избежание
образования на высушенных препаратах кристаллов соли,
затемняющих микроскопическую картину.
Сухой мазок фиксируют на пламени и окрашивают спиртовым
раствором краски. Водные растворы красок для этой цели не
пригодны, так как в них плазмолизированное содержимое клетки вновь
набухает, заполняя всю клетку.
Хорошими объектами для наблюдения плазмолиза служат
Vibrio cholerae asiaticae,. 5. typhi, В. coli и др. Напротив, сенная
палочка, сарцины, стафилококки не годятся для этого.
Чтобы показать, как дрожжи под влиянием растворов солей
при плазмолизе отдают воду, их можно погружать в определенные
объемы растворов поваренной соли на некоторое время (30 мин.),
135
а затем, бросив их на фильтры, на бухнеровскую воронку,
отсосать воду; по увеличению объема отсасывающейся воды
устанавливают факт отдачи дрожжами воды. Для этой цели лучше
воспользоваться специально сконструированным М. Я. Калюжным
аппаратом (рис. 95). Этот аппарат состоит из градуированной бюретки
с притертым краном внизу и расширением вверху, которое
оканчивается горлышком для бухнеровской воронки и манометра.
Факт отдачи воды дрожжами при плазмолизе можно установить
также, прибавив к прессованным дрожжам кристаллическую
поваренную соль (Калюжный). Смесь
дрожжей с солью оставляют в мензурке на
5—10 мин., размешивая осторожно
стеклянной палочкой с резинкой на конце;
разжиженные дрожжи бросают затем на
бухнеровскую воронку с несколькими
кружками фильтровальной бумаги и
отфильтровывают отданную дрожжами воду.
Осмотическое значение дрожжевой клетки
определяют по потере веса навески
дрожжей или по потере веса дрожжевой
клетки.1 Мишустин определяет осмотическое
давление бактериальной клетки по
изменению объема после центрифугирования.2
По Селиберу и Кацнельсон, осмотическое
значение дрожжевой клетки равняется
РХС пС
__і ИЛИ
Р пЛ
Н Вакуум
насосу
где Р и п обозначают
навеску дрожжей или число дрожжевых
клеток в 1 г дрожжей до погружения
в раствор соли и Рх и пг —те же величины
после погружения в раствор соли и
фильтрования или центрофугирования; как
показали исследования М. Я. Калюжного,
при определении осмотического давления
следует принимать во внимание не вес и
потерю в весе всей клетки, а только
осмотически подвижной части клетки; поэтому
определение осмотического давления
(значения) клетки по способу Селибера и Кацнельсон дает несколько
преувеличенные цифры, но ошибка тем менее, чем слабее раствор,
который употребляется для плазмолиза. (По этому вопросу см.
статьи Калюжного и Селибера, Известия Научного
института им. П. Ф. Лесгафта, т. XX, вып. 3, 1937 г.)
Рис. 95. Аппарат для
измерения количества
воды, выделяемой
дрожжами при плазмолизе
(по М. Я. Калюжному).
1 Селибер и Кацнельсон,
км. Лесгафта, т. 14, 1928.
2 Мишустин. Микробиология, т. 2, 1933, стр. 63-
f. Bakt», II» Abt., т. 93, 1935, стр. 371—388.
130
Известия Научного института
71; «Centralbl,
Рис. 96. Прибор для
определения выносливости бактерий
к температуре. Внизу
изображена одна из пепеток.
Температура
Для определения выносливости
бактерий к высоким температурам
мы пользуемся короткими
пастеровскими пипетками с двумя ватными
пробками—наружной и внутренней—
как изображено внизу рисунка 96.
Ряд таких пипеток стерилизуют
сухим жаром, затем конец запаянного
капилляра оттягивают в тончайший
волосок, который обламывают
прогретым на огне пинцетом. Волосок
этот опускают в эмульсию
исследуемых микробов; жидкость всасывается
в капилляр, и конец его вновь
запаивают. Ряд таких пипеток с
исследуемым материалом вставляют в
отверстие асбестового картона, которым
накрыта ванна, установленная на
нужной температуре (рис. 96). Через
определенные сроки вынимают по
одной трубке и охлаждают их в
ледяной воде. Затем конец капилляра
стерилизуют, последовательно
погружая его в ванны с 0.2% сулемой,
спиртом и эфиром. Вынутый из
эфира капилляр быстро высушивают
над пламенем газовой горелки и
конец его обламывают стерильным
пинцетом. Содержимое выдувают
на поверхность плотной
питательной среды, пригодной для
развития данного вида, и размазывают
но пей.
Если колонии вырастут, это
указывает, что микробы не были убиты.
Часто перед предельной
температурой, убивающей микробов,
замечается замедленное появление
колоний, и они развиваются в очень
ограниченном количестве.
Для нагревания в капиллярах
можно расположить опыт и так,
как изображено на рис. 97.
Для определения устойчивости спор А. Мейер рекомендует
применять пробирочки 8—9 см длины с отверстием в 8—9 мм. Проби-
[ючки наполняют на 1 см (не выше) простой водой, закрывают ко-
137
Рис. 97. Аппарат для
определения выносливости бактерий
к высоким температурам.
мочком фильтровальной бумаги, а сверху станиолью,
прикрепленной резиновым кольцом, и стерилизуют. По охлаждении петлей
вносят снятый с косого агара бактериальный налет в воду на дне
пробирочки, стараясь при этом, чтобы материал не попал на ее
стенки. Затем пробирки вставляют до половины в пробковую
пластинку с соответствующими отверстиями и опускают в воду,
кипящую в бане, замечая время опускания. Для разных видов бактерий
время кипячения различно [см. Б л а у (Blau), Centralbl. f.
Bakt., II, 1904].
Споры для сравнения с другими опытами должны иметь
21-дневный возраст и быть снятыми с одинаковых сред, указанных Мейе-
ром. Тогда ре зультаты могут
быть сравнимы с таблицами
устойчивости.
Для нагревания больших
количеств жидкости часть
культуры наливают в
стерилизованную пробирку с отводной
трубкой (рис. 98, А), открытый конец
запаивают, а отводную трубку
соединяют с каучковой трубкой
(рис. 98, В). Запаянную
пробирку обматывают несколькими
оборотами свинцовой трубки и
в таком виде опускают в ванну,
установленную на нужной
температуре. Спустя определенный
срок пробирку вынимают из
ванны и опускают в холодную
воду для быстрого охлаждения.
Затем, надрезав напильником
запаянный конец трубки и
обжегши его, обламывают и
содержимое пробирки выдувают
в стерилизованную среду или в стерилизованную пустую пробирку.
Если нагреваемый материал ввести в пробирку осторожно,
не прикасаясь пипеткой к стенкам ее, то можно прогревать
материал и в незапаянных обыкновенных пробирках.
Выносливость бактерий к высоким температурам можно
испытывать, пропитывая ими стерилизованные кусочки фильтровальной
бумаги и подвергая соответственному нагреванию. Этой бумагой
затем заражается питательная среда.
Другой, классический, прием подобных определений — метод
шелковинок. Шелковую нить нарезают кусками длиной в 1 см,
которые стерилизуют сухим жаром при 150° в течение получаса,
поместив в чашки Петри. Шелковинки затем пропитывают
эмульсией исследуемых, бактерий в физиологическом растворе
поваренной соли (0.85%) и высушивают при комнатной температуре, раз-
138
Приспособление для
стеризации посева.
А — пробирка с отводной трубкой, В — та же
пробирка после запайки. К ней пракренляют
груз, и она опускается в ванну, установленную
на нужной температуре.
ложив их на кусках стерилизованной бумаги в чашках Петри.
Затем их подвергают действию высокой температуры и заражают
питательную среду.
Как уже упоминалось в другом месте (стр. 39), действием
высокой температуры пользуются в лабораторной практике для
разделения споровых и бесспоровых видов (пастеризация посева),
особенно если споры отличаются большой выносливостью к
нагреванию. На этом основан способ выделения Вас. subtilis (сенной
палочки) из сухого сена, состоящий в следующем: 100 г сена мелко
изрезываю?, обливают 1 л воды, нагретой до 40°, и тщательно в ней
перемешивают, после чего оставляют на несколько часов в
термостате при 35—37°. Не фильтруя, жидкость сливают через платок,
разливают в
несколько колб и нагревают
в коховском
кипятильнике 15 —30 мин.,
затем вновь ставят в
термостат при 35°"
Вынимая колбы
через 1, 2, 3 суток,
наблюдают
различные стадии развития
сенной палочки: 1)
стадию молодых
подвижных палочек,
2) стадию зооглеи и
3) спорообразование
(спороносные клетки
и зрелые,
высыпавшиеся споры)(рис. 99).
В ненагретом сенном настое развиваются различные бактерии
плесени простейшие.
Рис. 99. Вас. subtilis. Различные стадии развития.
Увелич. 1500.
Свет
Для опытов со светом нужны самые простые приспособления.
Темную камеру легко устроить во всякой лаборатории. Если
требуется осветить лишь один участок культуры, то сосуд плотно
обвертывают несколькими слоями непропускающей свет
черной бумаги, служащей для упаковки фотографических
пластинок, за исключением участка, подвергающегося воздействию
света.
Опыты с монохроматическим светом ставят, пользуясь колоколом
Сенебье (Senebier) с двойными стенками (рис. 100). Для красного
цвета служит обыкновенно раствор двухромовокислого калия,
а для синего — аммиачный раствор окиси меди.
Для той же цели Мейнхольд (Meinhold) рекомендует следующие
растворы анилиновых красок;
хзэ
Если в лаборатории не имеется колокола Сенебье, раствором
краски можно наполнить высокий стакан или широкую пробирку
Краска
Цвег
красный
красно-желтый
оранжево-желтый
Нейтральрот в воде . .
Метилоранж в воде
Сафронин в растворе медного купороса ....
Бисмаркбраун в конц. растворе медного
купороса желтый
Берлинерблау в растворе щавелевой кислоты . . сине-зеленый
Sauregrun + Methylgrun в растворе купороса . светлосиний
Параметилблау в растворе медного купороса . темносиний
Метил-виолет -f метиленовая синь в растворе
медного купороса фиолетовый
и в них погрузить пробирку с исследуемой культурой, а верхнюю
часть стакана закрыть черной фотографической бумагой или,
закрыв пробирку
(стакан) пробкой, укрепить
в ней пробирку в
висячем положении. В тех
случаях, когда
культуры должны быть
помещены в определенную
газовую смесь или
желательно пропускать
под колоколом Сенебье
воздух и т. п., можно
применять колокол
Сенебье с подставкой (рис.
101), описанной
Исаченко. 1
Под влиянием
прямых солнечных лучей,
при доступе кислорода
воздуха, в питательной
среде возникают
окислительные процессы с
образованием
продуктов, задерживающих развитие бактерий,
например^ перекиси водорода. Появление последней легко может быть
обнаружено. Половину чашки Петри с питательным агаром
закрывают черным экраном и чашку в течение 10—20 мин.
подвергают действию прямых солнечных лучей. В освещенной части
среды образуется перекись водорода. Для ее обнаружения
пластинку обливают сначала крахмальным клейстером, содержащим
небольшое количество йодистого калия, а затем слабым раствором
железного купороса. В синий цвет окрашивается лишь та половина
Рис. 100.
Колокол Сенебье с
двойными
стенками, в
промежуток между
которыми
наливается
окрашенная
жидкость. Служит
ДЛЯ ОПЫТОВ В
монохроматическом свете.
=0
Рис. 101. Подставка Иса-
ченк? под колокол Сенебье
для обмена воздуха или
газов.
Известия Главного ботанического сада, 1926,
140
Рис. 102. Опыт Бухнера с Bad. typhi.
Пластинки, Которая была подвергнута действию света.1 Если тот
же опыт проделать в отсутствии воздуха, то перекиси водорода
не образуется.
Для доказательства губительного действия прямых солнечных
лучей на бактерии Бухнер (Buchner) произвел следующий опыт.
В чашку Петри тонким слоем
наливался мясопептонный
агар, обильно зараженный
культурой В. typhi. Затем на
дно чашки наклеивался
какой-нибудь фигурный
непрозрачный экран (Бухнер брал
экран в виде слова «typhus»),
и чашка, обращенная дном к
свету, подвергалась в течение
1—1х/2 часов действию
прямых солнечных лучей, после
чего буквы удалялись и
чашка ставилась в термостат. Так
как бактерии размножались,
образуя колонии и мутя агар,
лишь в затемненных местах
пластинки, то через сутки на
ней выступала
соответственная фигура (слово «typhus») —
на прозрачном фоне остального агара (рис. 102). Если дно чашки
закрыть непрозрачным экраном с вырезанным на нем тем же
словом «typhus» и подвергнуть действию света, то через сутки
на сплошь
замутившейся пластинке
появятся прозрачные
буквы того же слова
«typhus». Убивающее
бактерии * действие
света усиливается,
если к среде
прибавить 0.01% эозина.
Столь же
наглядным опытом Молиш
(Molisch) обнаружил
благоприятное влияние света на пурпурные бактерии. Он брал
предметное стекло с выемкой в средине (рис. 82) и наполнял
последнюю доверху густой эмульсией бактерий Rhodospirillum pho-
tometricum, после чего накрывал стекло покровным стеклышком
так, чтобы под ним не оставалось пузырька воздуха. Края стеклыш-
1 Так как перекись в од о род а в присутствии FeS04 выделяет ив йодистого-
калия 4- иод (2KJ-j-H202 = 2KHO-|-J2), последний окрашивает крахмальную
клетку в синий цвет.
А В С
Рис. 103. Опыт Молиша Rhodospirillum photo-
metricum.
141
ка обводились лаком, а посредине плотно накладывался крест
из непропускающего свет материала (цинк, толстый картон).
Снаряженное таким образом стекло (рис. 103а) подвергалось
действию рассеянного дневного света или света ауэровской лампы
в течение получаса. Когда удалялся крест, то под ним в жидкости
получалась прозрачная фигура креста, тогда как вся остальная
часть выемки содержала густую эмульсию бактерий (рис. ЮЗЬ).
Явление длится лишь несколько минут, после чего картина
меняется в обратном направлении: бактерии устремляются в
центральное крестообразное пространство, оставляя прозрачной всю
остальную часть выемки (рис. 103с). Это последнее явление
объясняется стремлением бактерий занять еще не использованные участки
среды.
2. ХИМИЧЕСКИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА МИКРОБОВ
Химиотаксис
Для изучения химического действия на микробов
применяются различные методы.
Капиллярный метод Пфейффера (Pfeiffer). Из совершенно
чистой тщательно промытой и высушенной стеклянной трубки
вытягивают тонкий капилляр с просветом около 0.05—0.1 мм
и разрезают на куски длиной в 1^2 см. Чтобы край капилляра был
ровный, его обламывают о сторону предметного стекла. Один конец
капилляра запаивают, а открытый погружают в исследуемую
жидкость, налитую в часовое стеклышко (рис. 104). Последнее, вместе
с капилляром, помещают в эксикатор, из которого затем
выкачивают часть воздуха так, чтобы жидкость заняла 112 или 3/4 высоты
капилляра, а вверху осталось немного воздуха (его отсутствие
замедлило бы движение бактерий). ]
На предметное стекло наносят каплю воды, содержащую
эмульсию исследуемых бактерий (подвижных), и в нее погружают
открытый конец капилляра, предварительно тщательно обмытый
снаружи водой. Каплю эмульсин с вдвинутым в нее капилляром
покрывают стеклышком и исследуют под микроскопом сухой системой.
Если картина получается неясная, прибегают к боковому
освещению темного поля (стр. 23). Положение капилляра должно
'быть таково, чтобы запаянный конец его был обращен вверх,
а открытый вниз, что возможно только при горизонтальной
установке микроскопа. Если бактерии собираются у отверстия
капилляра, — явление носит название положительного химиотаксиса,
если же они убегают от диффундирующего из капилляра
вещества, — отрицательного.
1 Можно наполнить капилляры и иным способом, без выкачивания
воздуха; открытый с двух концов капилляр опускают в исследуемую жидкость,
поднимающуюся в силу волосности на известную высоту; верхний конец
капилляра после этого залепляют воском (Ротерт).
142
Капельный метод Массара (Massart). На предметное стекло
наносят две капли: одну — с эмульсией микробов, другую —
с исследуемым веществом. Между ними устанавливают связь
тонкой полоской воды и наблюдают за распределением микробов. Еще
проще — к краю капли с эмульсией микробов приложить кристалл
исследуемого твердого вещества и следить за реакцией микробов.
Метод Иеннингса (Jennings). Постановка
опыта по существу такая же, как изображено
на рис. 90 (стр. 108). Под покровным стеклом—
эмульсия микробов, сбоку капиллярной
пипеткой вводится исследуемая жидкость.
Микроскопический метод «бактериальных
пластинок» Беиеринка. На дно стеклянного
цилиндра бросают боб или несколько горошин
или кусок какого-нибудь корнеплода
(картофель, морковь и т. п.) и цилиндр доверху
доливают водой. Так как питательные элементы
переходят в раствор со дна цилиндра, где
находится органическое вещество, то микробы
развиваются сначала внизу столба жидкости, в
непосредственной близости к источнику
питания. Затем-j по мере диффузии питательного
вещества в верхние слои жидкости, и бактерии
поднимаются все выше и выше, располагаясь
ясно видимым слоем («пластинкой») в месте, где
встречается диффундирующий сверху кислород
и снизу — ток органического вещества.
«Пластинка» ясно заметна в виде слоя густой
бактериальной мути, часть которой можно засосать
капилляром для микроскопических исследований.
Химическая дезинфекция
Методы практической дезинфекции
излагаются в специальных руководствах. Здесь мы
ограничимся перечнем наиболее
употребительных дезинфицирующих веществ.
а) Сулема применяется обыкновенно в виде
0.1—0.2%раствора в 0.5% соляной кислоте. Так как сулема свертывает белок,
образуя нерастворимые альбуминаты, то ее применение для
дезинфекции бе локсо держащих жидкостей довольно ограничено.
В этих случаях приходится прибавлять к раствору винную
кислоту, йодистый или цианистый калий, растворяющие осадки
ртутных альбуминатов. Сулема не пригодна для стерилизации
металлических инструментов, так как от нее последние чернеют. При долгом
хранении растворы сулемы постепенно разлагаются, теряя свою
силу. Если в сулемовый раствор погрузить медную пластинку
и она через полчаса покроется слоем амальгамы, это служит
указанием, что в растворе не менее 0.02% сулем^ь
143
О О
ч_
й?
Рис. 104, Химиота-
ксис.
a — часть «апли воды ь
Bacfc. fluoresces Iiqueia-
еіепз и запаянный е
одного конца капилляр,
ч наполовину наполненный
слегка щелочным б°/,
раствором пептона; у
отверстия капилляра
видно скопление микробов
(через 4MHH.J, о— ~—-
часа позже, скопление
бактерий в верхненчаотн
капилляра у пузырька
воздуха. Увелич. 50.
б) Карболовую кислоту (ф >нол) применяют в 3—5%
растворах. Концентрированные водные растворы карболовой
кислоты действуют на микробов слабее. Нагревание усиливает ее
действие.
в) Формалин. Под этим названием известен в продаже
36—40% раствор формальдегида (муравьиного альдегида).
Применяют обыкновенно разбавленные водные растворы: 2 и 4%.
При нагревании формалина выделяются ядовитые пары,
вызывающие слезотечение и раздражающие слизистые оболочки. По
окончании дезинфекции запах формалина удаляется аммиаком.
Из часто применяющихся дезинфицирующих средств назовем
еще:
г)3% раствор перекиси водорода.
д) 10%—20% известковое молоко.
е) 4 % раствор хлорной извести.
ж) Смесь равных объемов 1% растворов
минерального хамелеона (марганцовокислого
калия) и соляной кислоты.
з) Хлороформ и эфир.
Последние два вещества, как легко испаряющиеся при
сравнительно невысоких температурах, нередко применяются для
предохранения от загнивания и порчи жидких сред, не выдер?киваю-
щих высоких температур, например жидкой кровяной сыворотки.
Хлороформ и эфир, сравнительно быстро убивая вегетативные
формы, не уничтожают спор даже в течение нескольких месяцев,
например спор сибиреязвенной палочки.
Часто комбинируют действие химических веществ и нагревание.
Так, для стерилизации инструментов кипятят их в течение */4 часа
в 1—2% двууглекислой соде или в 3—5% карболовой кислоте.
3. МЕТОДЫ АНАЭРОБНЫХ КУЛЬТУР
Кислород воздуха губительно действует на анаэробные
бактерии в первое время их роста на свежей питательной среде. Когда
развитие культуры началось, она теряет чувствительность к
свободному кислороду. Последний оказывает в этом случае отчасти
даже возбуждающее действие на рост анаэробных бактерий [Кюр-
штейнер (Ktirsteiner)]. Следовательно, практически важно
создать строго анаэробные условия лишь в начальный период роста.
Если требуется достигнуть предварительно грубого разделения
аэробных и анаэробных видов, можно воспользоваться
приспособлением Бейеринка, изображенным на рис. 105. Питательным
раствором наполняют доверху левое закрытое колено и до половины—
правое открытое. Последнее делается с расширением, чтобы служить
приемником для жидкости, вытесняемой газами из закрытого
колена при возникновении брожения. Аэробы преимущественно
накопляются в открытом колене трубки, а анаэробы —в закрытом.
Отломав оттянутый конец закрытого колена, можно взять часть
жидкости для исследования.
144
Рис. 105. Сосуд Бей-
еринка для грубого
разделения аэробов
и анаэробов.
Описание различных методов анаэробных культур мы
расположим по их основным принципам.
1) Механическая защита от
кислорода воздуха. Еще Пастер
применял культуру анаэробов в высокой
пробирке, заливая жидкую питательную
среду слоем масла или жидкого вазелина.
Кох поверхность питательной желатины
покрывал слюдяной, а Санфеличе (Sanfe-
Нсе)—стеклянной пластинкой. Еще лучше
слой плотной питательной среды, зараженной
анаэробными бактериями и вылитой в чашку
Петри, тотчас после застывания облить 7 см3
1.2% раствора агар-агара в
дистиллированной воде. Слой агара плотнее покрывает
среду, чем слюдяная или стеклянная пластинка.
Шилль (Schill) и Марпман (Магрташі) в
пробирку с засеянной плотной питательной
средой (еще не застывшей) вводят другую
стерилизованную пробирку меньшего диаметра:
^)тим достигают распределения питательной среды тонким слоем
между двумя стенками пробирок. Когда колонии вырастут,
соответственную часть наружной пробирки вырезают и делают
отвивку.
На том же принципе основан способ Тренкмана (Trenckmann).
Берут два часовых стеклышка, одно диаметром в 10 см, а другое —
в 9. С помощью небольших изогнутых цинковых пластинок
(0.5 х 4 см) разъединяют оба стекла таким образом, чтобы получился
между ними слой питательной среды определенной толщины. Среду
наливают в большее стекло и покрывают меньшим. Когда
колонии вырастут, из них легко сделать отвивки, сняв верхнее
стекло.
Удобен способ Виньяля-Вейона (Vignal-Veillon). Берут
стеклянную трубку, длиною около 30 см и шириной 3—6 мм, и один
конец ее вытягивают в капиллярную трубку, а у другого делают
перетяжку и вставляют ватную пробку. Стерилизованную и еще
теплую трубку наполняют насасыванием свежепрокипяченной и
«засеянной средой, стараясь, чтобы в нее не попали пузырьки
воздуха. Капилляр затем запаивают и трубку помещают в термостат.
Если лосев был не слишком густой (чтобы избежать этого, делают
несколько разведений), то в среде вырастают ясно видимые
снаружи колонии анаэробных бактерий. Из любой из них можно сделать
отвивку, надрезав напильником и отломив трубочку в
соответственном месте. Если к среде прибавлено несколько капель 2% раствора
индигокармина для сообщения ей синего цвета, то в месте
появления колоний индиго восстанавливается (обесцвечивается).
Культура большинства анаэробов хорошо удается и в
обыкновенных пробирках (лучше — высоких), на две трети залитых свеже-
10 Руководство по кккробнодогок х?0
прокипяченной расплавленной плотной средой. Посев
производят уколом длинной платиновой иглы до самого дна пробирки.
В нижних слоях среды развиваются анаэробы («высокая культура»
Либориуса (Liborius).
Опыты брожения в анаэробнь^х условиях удобно производить в
длинногорлых колбах, изображенных на рис. 106. В бродильную
колбу А доверху наливают исследуемую жидкость, и колбу
соединяют с запасной колбой В, служащей приемником для жидкости,
вытекающей из А при стерилизации. Когда колба А стерилизована
и заражена, колбу В отнимают и загнутый нижний конец
отводной трубки погружают в ртутную ванну для собирания газа.
Чтобы исключить диффузию
воздуха через каучуковую
пробку, ее иногда заливают
ртутью С.
2) Культура в
безвоздушном
пространстве была предложена
впервые Пастором. На рис. 107
изображена трубка Грубера.
После заражения среды из
трубки выкачивают воздух и
запаивают ее в узком месте;
желатину затем распределяют
тонким слоем на внутренних
стенках трубки для удобства
Рис. 106. Бродильная колба с отводной ОТВИВКИ колоний (рис. 108).
трубкой для собирания выделяющихся Аналогичное приспособление
газов. было предложено
одновременно и Ру.
'Последовательное снаряжение его трубки с выкачанным
воздухом видно на рис. 109. В стадии 1 производится заражение среды,
в стадии 2—выкачивание воздуха и запаивание трубки, в стадии
3 —изображена трубка в готовом виде, как она выдерживается в
термостате.
Анаэробные культуры можно помещать также в обыкновенный
химический эксикатор, из которого затем выкачивают воздух
(рис. 110). Крышку притирают к ранту эксикатора смесью сала с
воском (1:1). х
Разводки анаэробов на ломтях картофеля можно с удобством
вести в пробирках Ру с выкачанным воздухом (рис. 111).
Методика Мейера, описанная им в «Zentralbl. f. Bact.» (2),
' т. 15, стр. 37, 1906 г., допускает культивирование бактерий прі\
любом парциальном давлении кислорода. Методика хороша для
точных исследований, но требует специальной аппаратуры.
1 Замазка для эксикатора: 1 г мелко нарезанной резины (невулканизиро-
ванной), 1 г парафина и 2 г вазелина сплавляются до получения вполне
однородной массы.
146
Рис. 108. Трубка Грубера после
выкачивания воздуха и
запаивания. Питательная среда
распределена по стенкам, и на ней
видны выросшие' колонии.
3) Поглощение кислорода воздуха. Чаще
всего для анаэробных культур применяют поглощение кислорода
воздуха щелочным раствором пирогаллола. Быстрее всего идет
поглощение смесью равных объемов 5% раствора пирогаллола и
12.5% едкого калия. Чаще всего берут 10% растворы обеих
составных частей. Гемпель (Hempel) и Гальдано (Haldano) рекомендуют
пользоваться раствором 10 г пирогаллола в 100 см3 75%
раствора КОН.
Аппаратами служат прпборы "
Бухнера (Buchner) и Омелянского,
пользование которыми видно из
прилагаемых рисунков (112 и 113).
Весьма удобен способ Райта-
Бурри (Wrlght-Burri). Свежепро-
кипяченный и быстро
охлажденный бульон
в обыкновенной
пробирке заражают
анаэробным видом,
закрывающую
пробирку пробку из простой
(негигроскопической)
ваты, обрезают
ножницами, Хорошо
обжигают и вталкивают
обожженным
пинцетом поглубже в
пробирку; на ее место
вставляют пробку из
гигроскопической
ваты (может быть не
стерилизована) и тоже
слегка проталкивают
в пробирку, но так,
чтобы между обеими. Рис. 107. Тру-
пробирками остава- бка Грубера
r r для культуры
лось воздушное про- ?нээро?ов '?0
странство.На эту вер- выкачивания
хнюю пробку нали- воздуха).
вают 1 см3 20% рас- *
твора пирогаллола и 1 см3 20% раствора едкого кали, после чего
пробирку плотно закрывают влажной гуттаперчевой пробкой и
ставят в термостат (рис. 114).
Мы обыкновенно пользуемся для анаэробных культур
комбинированным способом выкачивания воздуха и поглощения остатков
кислорода щелочным раствором пирогаллола. Культуру помещают
в эксикатор, изображенный на рис. 110, причем среда должна быть
свежекипяченной или, еще лучше, свежеприготовленной. На дно
to* 14?
Рис. 109. Трубка Ру для
культуры анаэробов в
безвоздушном
пространстве.
,
I
эксикатора наливают 10% раствор едкого каля, а на нем помещают
открытую чашку Петри с насыпанным в нее сухим пирогаллолом.
Снаряженный таким образом эксикатор плотно вакрывают и
выкачивают ив него воздух. После этого осторожным наклонением
эксикатора смешивают пирогаллол
с раствором щелочи. Так как
смешение это происходит в
пространстве лишь со следами воздуха, то
жидкость при этом лишь слабо
буреет. В таком виде эксикатор
сохраняют. Если крышка и кран
эксикатора плохо притерты и дро-
пускают воздух, то раствор
пирогаллола быстро буреет, являясь
таким образом лучшим
показателем недостигнутого анаэробиоза.
В удачном случае цвет пирогал-
лольного раствора не изменяется
при сохранении разводки.
Если культура ведется на
плотной среде в чашках Петри, то, во
избежание высыхания среды в
безвоздушном пространстве, полезно
поставить в эксикатор небольшой
стакан с водой.
Культуры в пробирках ставят
на дно эксикатора, а пирогаллол
ваключают в п^кет из
фильтровальной бумаги, прижав его
пробирками к стенке эксикатора.
Смешение со щелочью и здесь
достигается наклонением аппарата.
&) Механическое вытеснение воздуха
индифферентным газом. Чаще всего служит для этого
водород и углекислый газ, особенно первый. Культура
производится в пробирках Френкеля (Frunkel) или в аппарате
Боткина.
Пробирку Френкеля (рис. 115) закрывают каучуковой пробкой с
проходящими через нее двумя трубками — одной, доходящей до
дна, и другой, оканчивающейся под пробкой. Когда весь воздух
вытеснен индифферентным газом, обе трубки, как показано на
рисунке, запаивают, и желатина распределяется по внутренним стенкам
пробирки.
Для анаэробных культур в чашках Петри может служить
аппарат Боткина (рис. 116). Чашки помещают на этажерке внутри
колокола В, через который пропускают индифферентный газ по
трубкам F и G. Колокол закрыт сниву слоем жидкого парафина,
налитого в чашку А.
і4а
Рис. 110. Культура анаэробов в
чашках Петри, помещенных в
эксикатор, иэ ноторого аатем был
выкачап воздух.
Водород добывают действием 20% серной кислоты (марки «Ри-
rissimuim) на цинк, который тоже должен быть вполне чистым. Для
ускорения выделения водорода к цинку
прибавляют немного медного купороса.
Для добывания водорода удобно
пользоваться двумя сообщающимися склянка-
^во»
Рис. 111.
Пробирка Ру для
культуры анаэробов на
картофеле.
ми с нижними
тубусами, соединенными
каучуковой трубкой. В
одном сосуде —
серная кислота, в
другом — цинк.
Поднимая или опуская пер-
Рис. 112.
Трубка Бухнера для
анаэробных
культур, ва-
нрытая
каучуковой пробкой.
Внутри трубки
на подставке
помещена
пробирка с
анаэробной
культурой. Внизу (р)
—щелочной
раствор
пирогаллола.
Рис. 113. Аппарат Оме-
лянского для культуры
анаэробов.
Аппарат А закрывают шцеяон
В, который пришлифован к
слегка суживающемуся горлышку
аппарата. Для устранения
диффузия воздуха через шлиф, в
воротник С наливают ртуть. В
расширенный Нижний конец
аппарата А наливают щелочной рао-
*вор пирогаллола.
вый сосуд, можно
увеличивать или уменьшать давление газа. Выделяющийся водород
для очищения пропускают через ряд промывных склянок: а) с
крепкой серной кислотой для поглощения паров воды, б) с 10%
раство.ром едкого кали для поглощения углекислого газа и
сероводорода—для последнего вводят иногда особую склянку с 10%
уксуснокислым свинцом, в) с люгольским раствором иода (стр. 102)
для разрушения летучих органических веществ —и г) с
щелочным раствором пирогаллола (стр. 147) для поглощения
кислорода.
Полнота вытеснения воздуха водородом доказывается
спокойным горением последнего. Во избежание взрыва, который возможен,
если в сосуде еще остался кислород воздуха, в среднюю часть длинной
149
выводной трубки вставляют тампон, скатанный из медной сетки.
В присутствии воздуха горение водорода сопровождается треском,
и пламя тотчас гаснет.
Наиболее подходящим для анаэробных культур, вполне
инертным газом следует признать азот. Газ этот, являющийся отбросом
при добывании кислорода из
жидкого воздуха, можно иметь
в сгущенном виде (в
металлических цилиндрах). Его не трудно
и самому добыть из воздуха по
способу Пілёзинга (Schlosing).
Ток воздуха, очищенного серной
кислотой и едким кали,
пропускают через накаленную до
тёмнокрасного каления
стеклянную, фарфоровую или чугунную
'И
А
Рис. 114.
Пробирка для
анаэробной
культуры по Райт-
Бурри.
Рис. 115.
Приспособление
Френкеля для культуры
анаэробных
бактерий в токе
индифферентного газа.
Рис. 116. Аппарат Боткина для
культуры анаэробов в чашках Петри,
трубку длиной в 1м,
наполненную медными стружками или
черненой медью. В трубке
поглощается весь кислород воздуха, а выходящий азот, промытый
серной кислотой и щелочью и пропущенный через несколько
склянок со щелочным раствором пирогаллола, собирают в большом
газометре, наполненном водой.
По Штоку (Stock) и Нильсену (Nielsen) азот добывают
осторожным нагреванием раствора:
NaN02 H85 г
NH4G1 185
К2Сг207 95
Воды 1000 см3
Смесь выделяет около 80 л газа. Его собирают в газометр и перед
употреблением в дело очищают. Примесь N0 удаляют
пропусканием газа через склянку со смесью 5 объемов насыщенного
раствора К2Сг307 и 1 объема концентрированной H2S04.
160
5) Прибавление к питательной среде веществ,
действующих восстанавливающим образом.
Число восстановляющих веществ, предложенных различными
авторами для прибавления к питательной среде, на которой выращиваются
анаэробные бактерии, весьма велико. Назовем главнейшие:
а) 1—2% виноградного сахара [или, по Лоренти (Lorenti), 2.5%
крахмала].
6) 0.3—0 5% муравьинокислого наііия.
в) 0 1% пирокатехина или эйконогена.
г) 0 1% индигокармина (нейтрального индигосернокислого натрия).
д) Реактив Шутценберга (Schutzenberger) (Natriumhydrosulfit).
е) 8 капель 1% раствора сернистого натрия на 10 см3 среды.
ж) Сернистый амоний
Приводим способ приготовления среды с сернистым аммонием по
Ривасу (Rivas). Для этого необходимо иметь 4 раствора:
а) Слабо щелочной бульон с 1% глюкозы и 1.5% пептона.
б) 10% раствор индигокармина в дестиллированной воде,
прокипяченный в течение 1 часа.
в) 1% раствор аммиака в стерилизованной воде.
г) Сероводородную воду, приготовленную следующем образом* 100—
150 см3 дестиллированной воды наливают в эрленмейеровскую колбу,
закрытую ватной пробкой, через которую проходит стеклянная
трубка, доходящая до дна колбы и с внешней стороны закрытая
ватой. После стерилизации в автоклаве (120°—15 мин.) через воду
пропускают в іечение 5 мин. ток сероводорода, промытого 30% серной
кислотой.
К 479 см3 бульона (а) прибавляют 20 см3 сероводородной воды (г),
к которой было прибавлено 10—12 капель аммиачного раствора (в) и 1 см3
раствора индигокармина (б). Этот бульон наливают в пробирки с пере-
тнжкой и заливают сверху слоем масла.
Присутствием восстановляющих веществ, вероятно, объясняется
рост анаэробных бактерий при свободном доступе воздуха на
средах с прибавлением свежевырезанных кусочков паренхиматозных
органов, например кусочков почки кролика и т. п. Такое же
действие оказывает прибавление к среде кусочков сырого или
стерилизованного картофеля, живых или убитых культур дрожжей,
железо-аммиачных квасцов и др.
€реда Тароцци-Вржосека (Tarozzi-Wrzosek)
Мясного экстракта - 1%
Пептона 1
Поваренной соли 0.5
К 100 см3 жидкости прибавляют 2 г картофеля или кусочек
паренхиматозного органа.
6) Культура в смеси с аэробными
организмами. Этот способ культуры анаэробов, в сущности,
воспроизводит естественные условия роста их в природе, где
примешанные аэробные виды, жадно поглощая кислород воздуха, создают
местные анаэробные условия. Первые наблюдения в этом
направлении принадлежат Пастеру. Практическое значение этого способа
довольно ограничено, так как при этом приходится иметь дело со
151
смешанными культурами, а это затрудняет изучение физиологии
анаэробов. Дебран (Debrand) предложил вести массовые культуры
столбнячной палочки в смеси с Вас. subtilis при доступе воздуха.
Смешанная культура не препятствует нормальной выработке
столбнячного токсина.
В лабораторной практике мы нередко пользуемся смешанными
культурами споровых анаэробных микробов с бесспоровыми
анаэробными, например Clostridium Pasteurianum с Bad. fluorescens для
легкого поддержания разводки анаэробов в длинном ряде генераций.
Вновь получить чистую культуру легко путем пастеризации.
Г Л А В А VI
БИОХИМИЗМ МИКРОБОВ
1. ПИГМЕНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Одно из проявлений биохимизма микробов выражается в
выработке красящих веществ — пигментов.
По химическому составу пигменты микробов не однородны.
Одни растворимы в воде и разведенном спирту и совершенно не
растворимы в органических растворителях (антоцианы, гидроактино-
хромы и т. д.); другие растворяются в органических растворителях
и не растворимы в воде (каротиноиды и т, д.); третьи прочно свя-
' заны с клеточной плазмой и не растворимы ни в воде, ни в
органических растворителях без разложения клеточной плазмы; затем
встречаются хромогены, выделяемые клетками наружу и в
результате окисления окрашивающие субстрат в коричневые тона. У
отдельных видов микробов окраска может зависеть от сочетания
представителей перечисленных групп пигментов.
Многие пигменты микробов относятся к группе каротиноидов.
Они легко кристаллизуются. Кристаллы различной формы, часто
с металлическим блеском; окраска от светложелтой до темнофиоле-
товой. В растворителях: эфир, бензин — светлые тона; в
сероуглероде — темные до фиолетового цвета. При спектроскопировании
видны 2 или 3 полосы в синей или фиолетовой части спектра. На
воздухе каротиноиды легко окисляются. Некоторые из каротиноидов:
а-, Р", ф- каротин и криптоксантин являются провитаминами А.
Пигментные мик"робы служат превосходным материалом для
демонстраций на лекциях и незаменимы для музейных ж
выставочных культур. Остановимся вкратце на описании некоторых из
них.
1) Bacterium prodigiosum {«чудесная палочка»). Весьма
распространенная бактерия, образующая кровавокрасный пигмент.
Хорошей средой для пигментообразования этой бактерии служит
картофель,1 на ломтях которого В, prodigiosum образует превосходный
пигмент. Для целей демонстрации клубни картофеля разрезают
пополам и Срезом вверх помещают в большой двойной чашке, дно
1 Хорошо образуют пигмент на картофеле также: розовые дрожжи, Sar-
cina aurantiaca, Dematium pullula-ns, некоторые одноклеточные зеленые
водоросли ¦ Др.
163
которой устлано сложенной в несколько рядов фильтровальной
бумагой. В таком виде картофель стерилизуют при 120° и затем каждый
ломоть заражают отдельной пигментной бактерией. Получается
очень красивая и демонстративная культура (рис. 117).
Рис. 117. Открыта л двойная чашка Коха с кружками
картофеля, засеянными пигментными бактериями.
На искусственных питательных средах образование пигмента
происходит тоже обильно, например, на среде состава:
Дестиллированной воды 1000 см3
Пептона . .- 10 г
Аспарагииа 2
Уксуснокислого натрия 2
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
Агара 20
Подкислить 2 каплями молочной кислоты 1
Оттенки пигмента бывают различные — от кирпичнокрасного
до малинового — в зависимости от состава и реакции среды.
Часто приходится наблюдать, что мазок имеет кирпичнокрасный
оттенок, а конденсационная вода в пробирке окрашена в
тёмнокрасный или малиновый цвет.
Красный пигмент не образуется на средах, не содержащих
магниевых солей. Весьма демонстративен следующий опыт. Пригото-
1 На этой же среде прекрасный золотисто-оранжевый пигмент
образует Staphylococcus pyogenes aureus,
154:
вляют среду, содержащую 1% аспарагина, 0.5% глюкозы, 0.2%
КН2Р04 и 0.25°/0 Na2C03. К одной половине ее прибавляют 0.04%
MgS04, а к другой — столько же K2S04. На первой образуется
красный пигмент, на второй — нет.
По нашим наблюдениям, бесцветный рост В. prodigiosum
появляется на среде с мочевокислым калием.
При 37—39° В. prodigiosum тоже образует бесцветный налет.
Если вести культуру попеременно при 25 и 37°, то чередуются
красные и бесцветные зоны роста.
По Коссовичу (Kossowicz),Z?. prodigiosum образует лимонножел-
тый пигмент, диффундирующий в среду, на следующем субстрате;
Дестиллированной воды 1000 см3
Тростникового сахара (сахарозы) .... 30 г
Фосфорнодвукалиевой соли 2.5
Фосфорнодвуаммониевой соли 2.5
Сернокислого магния 2.5
Хлористого аммония 2
Фосфорнокальциевой соли 0.05
Окрашивание наступает через 2—3 недели и позднее. f
Пигмент В. prodigiosum —продигиозин — растворим в спирте,
эфире, хлороформе, сероуглероде и бензоле. От прибавления
щелочей он желтеет, а под влиянием восстанавливающих веществ,
например, водорода in statu nascendi, он обесцвечивается.
2) Bad, pyocyaneum (бацилл синего гноя). Отличное
образование синезеленого пигмента этим видом мы получали при 37° на
среде состава:
Пептона 30 г
Декстрозы (виноградного сахара) .... 5
Фосфорнооднокалиевой соли 1
Сернокислого магния 2
Мясопептонного бульона 100 см3
Водопроводной воды 900
Пигмент сохраняет свой цвет около недели, а затем постепенно
начинает буреть.
В. pyocyaneum образует различные пигменты: зелено-желтый —-
бактериофлюоресцин, синий — пиоцианин и красный — пиоксан-
тин. Образованию первого способствует слегка щелочная реакция,
а второго — кислая. На 2% растворе пептона в водопроводной воде
образуется пиоцианин, на яичном белке—флюоресцин, а на желтке—
ииоксантин. Пигментообразованию способствуют также соли
фосфорной и серной кислот, особенно магнезиальные.
Превосходный зелено-синий пигмент образует В. pyocyaneum
на среде, содержащей 1% аспарагина и минеральные соли (Сели-
бе р).
Если свежую, сильно окрашенную разводку В. pyocyaneum
взболтать с хлороформом, то последний извлекает пиоцианин,
окрашиваясь в красивый небесноголубой цвет, а остающаяся жидкость
сохраняет зелено-желтый цвет бактериофлюоресцина. Раствор
15й
пиоциакина краснеет от нескольких капель соляной кислоты, а от
щелочи вновь синеет. Хлороформенный раствор пиоцианина очень
непрочен, изменяя свой цвет сначала в зеленоватый, а затем
в желтый.
3) Bad. fluorescens. Образуемый этой формой пигмент — бак-
териофлюоресцин растворим в воде и окрашивает среду в
зеленоватый цвет. Optimum роста — около 25°.
4t) Bad. cyanogenum ила syneyaneum (бацилл синего молока}.
В жидких разводках хорошо растет на смеси равных частей молока
и мясопептоиного бульона. На плотных средах рост хорошо
удается на сахарном агаре (1 % декстрозы и 0.2% фосфорнокислого
аммония) и на желатине. Пигментообразование не наступает при
температуре 37°. Температура не должна превышать 30°. Хорошо растет
на слабокислых средах и при 10—12°.
Нам приходилось наблюдать энергичное пигментообразование
на синтетической среде следующего состава:
Дестиллированной воды 1000 см1
Глицерина 10 г
Фосфорнокислого аммония 2
Фосфорнооднокалиевой соли I
Сернокислого магния 0.5
Агар-агара . .' 20
Бесцветная среда быстро окрашивается в черно-синий цвет. г
Подходящей средой для пигментообразования является
картофель. Красивый сине-фиолетовый пигмент образуется на молоке
или молочной сыворотке с прибавлением 2% декстрозы при
заражении Bad. cyanogenum и молочнокислыми бактериями.
Благоприятствующая пигментообразованшо роль последних определяется
тем, что они вызывают кислую реакцию среды, при которой
предпочтительно образуется синий пигмент — синцианин. Кроме него
В. cyanogenum вырабатывает также бактериофлюоресцин. По
данным Тумма (Thumm), на среде с лимоннокислым аммонием
В. cyanogenum образует только синцианин, а на среде с аспараги-
ном — только бактериофлюоресцин.
Синцианин хорошо растворим в воде и не растворим в спирте,
эфире и хлороформе.
5) Bact.violaceum цринадлежит к сравнительно плохо растущим
видам. Хорошо удается его культура на сахарном агаре при 20—
25°. Среда должна быть свежей и заражение обильным.
Фиолетовый пигмент растворим в спирте. От прибавления серной кислоты
он желтеет, а от щелочи принимает смарагдо-зеленый цвет. В
анаэробных условиях образует бесцветный налет.
Для выделения В. violaceum Бейеринк рекомендует плотную
среду, содержащую 2% агара, 1—2% сухого фибрина или
пшеничной клейковины (Weitzengluten) и 0.002% КС1. Вылить в чашку
Петри и поверхность облить отстоявшейся болтушкой садовой
1 На этой же среде хорошо образует растворимый в воде розовый
пигмент В act lactit rubefacient.
156
земли. При 22—25° уже черев несколько дней появляются
фиолетовые колонии.
Еще проще способ Якобсона (Jacobson), Кусочек белого хлеба
помещают в стеклянную трубку и кладут под водопроводный
кран, из которого вода г медленно капает. Падающие капли,
разбиваясь о край трубки, беспрерывно орошают мякоть мельчайшими
брызгами. Чрез несколько дней мякиш окрашивается в
фиолетовый цвет от развившихся в нем клеток Bact. violaceum.
Для изолирования лучше всего пользоваться агаром с 1%
фибрина и без солей фосфора (Из «Folia microbiological, t. XV, p. 207,
1916).
6) Sarcina aurantiaca прекрасно пигментирует на ломтях
картофеля, слегка смазанных мелом. Если к оранжевому налету-этой сар-
цины прибавить серной кислоты, то получается индигово-синее
окрашивание, постепенно переходящее в красно-фиолетовое.Такой
же переход цвета от прибавления кислоты наблюдается и у
Staphylococcus pyogenes aureus.
Пигменты этих видов — ^-каротин и зеаксантин — не
растворимы в воде и хорошо растворяются в органических
растворителях: спирте, петродейном и серном эфирах, бензине, бензоле
и сероуглероде. Они относятся к каротиноидам, так же как и
желтые пигменты Sarcina lutea — сарцинин и ксантофилл.
7) Micrococcus agilis образует превосходный кровавокрасный
пигмент на ломтях картофеля при 20—25°. Вид принадлежит к
медленно растущим.
8) Azotobacter chroocoecam. Лучшей средой для образования
бурого пигмента этим видом, по Омелянскому и Северовой,
является следующая:
Льняной вытяжки (стр. 64) или
водопроводной ВОДЫ 1000 СМ3
Декстрина 20—30 г
Фосфорнодвукалиевой соли 0.2
Мела і0
Агар-агара 15
К среде полезно прибавить до стерилизации комок земли.
Заражается поверхность застывшего агара в чашках Петри или в
пробирках (косой слой). Колонии сначала бесцветны, затем постепенно
буреют и, наконец, принимают почти черный цвет. Пигмент не
растворим в воде, окрашиваются только колонии бактерий.
9) Вас. mesentericas niger а его разновидности. Густой темно-
бурый пигмент образуется на среде:
Дестиллированной воды 1000 см3
Пептона . • . - 10 г
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
Агар-агара 20
1 В опытах Якобсона была нехлорироваинан вода; с хлорированной
водой опыт может не удаться.
/
167
К этой среде полезно прибавить 1% мясного экстракта Либиха.
Пигментообразованию способствует прибавление к среде
тирозина.
10) Красные и розовые дрожжи. Обильный рост и пигментооб-
разование на сусло-агаре и картофеле. Большинство пигментов этих
видов относится к числу каротиноидов.
11) Черные «дрожжи» {Saccharomyces niger) —очень
требовательный к питательным средам вид, в неблагоприятных условиях
быстро вырождающийся. Лучший рост — на солодовых средах
(стр. 56).
12) АктиномицетЫ) проактиномщеты, микобактерии, мико-
кокки. Многие виды этих микроорганизмов образуют пигменты при
культивировании на различных питательных средах. Среди
окрашенных форм можно найти все цвета и различные оттенки в
зависимости от интенсивности окраски или смешения двух или
нескольких пигментов. Для актиномицетов субстратом, который
благоприятствует пигментообразованию, является видоизмененная среда
Чапека (Gzapek):
ДестиллированноЙ воды. 1000.0 см3
КС1 0.5 г
MgS04 0.5
К2НР04 4.0
FeS04 0.01
NaN03 2.0
Глюкозы 30.0
Мела 3.0
Агар-агара 20.0
Для проактиномицетов, микобактерий и микококков — сусло-
агар с мелом и вышеуказанная среда.
13) Плесневые грибы. Большинство из них образует пигмент
различных оттенков. В иных случаях цвет культуры изменяется в
зависимости от реакции среды — и тогда характерны изменения
цвета на средах с селитрой и с аммонийной солью. В первом случае,
при разложении селитры, среда приобретает щелочную реакцию
(образуются углекислые соли), а в другом —кислую вследствие
освобождения кислоты из аммонийной соли. Культивируя на
подобных средах РепгсгШит multicolor, Григорьева-Манойлова и Пораде-
лова получали кровавокрасный пигмент на среде с селитрой и лимон-
ножелтый — на среде с аммонийной солью.
Методы извлечения и разделения пигментов
Водорастворимые пигменты в жидкой среде отделяют от
культуры фильтрацией через бумагу. Если клетки вследствие малой
величины проходят через бумагу, то пользуются фильтрами Зейтца
или крупнопористыми свечами Шамберлана и Беркефельда, но
только в тех случаях, когда фильтры не адсорбируют пигментов.
Пигменты на агаровых средах отделяются путем растирания всей
агаровой массы с культурой в ступке с холодной и горячей водой.
158
Извлечение ведется до того времени, пока свежие порции воды
будут неокрашенными. Если после этой процедуры растертая масса
остается окрашенной (остались нерастворимые в воде пигменты!),
то с пей поступают так же, как в отношении извлечения водонерас-
творимых пигментов. Разделение водорастворимых пигментов
производится путем применения метода хроматографической адсорбции
(см. ниже).
Для извлечения нерастворимых в воде пигментов поступают
следующим образом: культуру в жидкой среде центрофугируют,
а затем окрашенный осадок переносят в ступку с чистым песком;
культуру на твердой среде осторожно снимают лопаточкой или
шпателем под слоем абсолютного спирта и затем переносят в
ступку, в ступке культура тщательно растирается под слоем
соответствующего растворителя до полного извлечения всех пигментов.
Так как в большинстве случаев полученные растворы содержат
смесь пигментов, то затем приступают к их разделению. Для этой
цели предложено много методов. За последние годы большое
применение в разделении красящих веществ нашел метод
хроматографической адсорбции Цвета. Сущность его заключается в следующем;
если пропустить через вертикальную трубку, наполненную
адсорбентом, раствор, содержащий смесь пигментов, то после
промывания чистым растворителем различные пигменты оказываются
адсорбированными на различных высотах колонки, образуя окрашенные
зоны. После механического разделения зон можно выделить
укрепленные на адсорбенте пигменты.
Размеры трубки зависят от количества подлежащих разделению
пигментов и их способности адсорбироваться. Лучше применять
трубки диаметром в 1 см и высотой от 15—20 см. При наполнении
трубки адсорбентом надо стараться, чтобы порошок хорошо осел, и
нажимать на него довольно равномерно, чтобы зоны были по
возможности равные. В некоторых случаях лучше сделать суспензию
адсорбирующего вещества в нейтральной жидкости (например, в петро-
ие&иом. эфире) и. н&лші&ть ее в трубку, в. которой еогд&ется вакуум.
В качестве адсорбентов применяют окись магния, окись кальция,
окись алюминия, углекислый кальций и т. д. Для водных
растворов пигментов хороши глиноземы специальных фабричных марок.
Выбор адсорбента чрезвычайно важен и определяет результат опыта.
В качестве растворителей для водонерастворимых пигментов
применяют петролейный эфир, бензол и сероуглерод. Эти растворители
не должны содерл^ать спиртов, ибо достаточно ничтожного
количества их, чтобы помешать адсорбции.
После наполнения трубки адсорбентом колонку смачивают
растворителем и затем пропускают раствор пигментов. После того как
раствор пропущен, пропускают чистый растворитель до тех пор,
пока окрашенные зоны на колонке станут четкими и ясно
разграниченными. Затем колонку выдавливают из трубки и разрезают на
части, следуя окрашенным зонам. Для извлечения (элюции)
пигментов из адсорбента применяют петролейный эфир или бензол
159
с небольшой примесью спирта. Для извлечения водорастворимых
пигментов пользуются буферными растворами с различным рН.
Для разделения пигментов группы каротиноидов полезно до хро-
матографической адсорбции произвести предварительное разделение
растворителями. Если прибавить к вытяжке пигментов в 90%
метиловом спирту бензин или петролейный эфир, то a-, [J-, ф- каротин,
ликопин, эфиры ксантофиллов и каротиноиды с одним атомом 02
перейдут в бензинный resp. петролейно-эфирный слой (эпифазные
пигменты), а ксантофиллы с большим числом атомов 02 останутся
в спирту (гипофазные пигменты). Ксантофиллы с одним атомом 02
отделяются от бензинной фазы 95% метиловым спиртом, а эфиры
ксантофиллов—омылением 5%кКОН в этиловом спирту.
Адсорбцию углеводородов (a-, [J-, ф-каротин, ликопин) обычно ведут на
окисях Mg, Са, А1, а ксантофиллов — на СаС03.
Для характеристики полученных пигментов изучают их
отношение к различным растворителям, кислотам и щелочам. Если
пигмент получен в чистом виде, то устанавливается химический состав
его. Очень важно выяснить оптические свойства пигментов. Для
пигментов характерно избирательное поглощение в определенной
части спектра. Для спектроскопирования можно применить любой
спектроскоп с небольшой дисперсией и снабженный шкалой для
определения местоположения максимума поглощения в mji. При
спектроскопировании обычно пользуются сероуглеродом в
качестве растворителя. Вследствие большого удельного веса он
сдвигает полосы поглощения ближе к красной части спектра, что
позволяет точнее определить положение полос, находящихся в более
преломляемой части спектра.
2. СВЕТЯЩИЕСЯ БАКТЕРИИ
Для получения разводки светящихся бактерий Молиш (Molisch)
рекомендует следующий прием. Кусок рыночного мяса или
очищенную от внутренностей рыбу (лучше морскую), сырую или
сваренную, наполовину погружают в 3% раствор поваренной соли или
в морскую воду1 и под колоколом оставляют в прохладном и темном
месте (при 5—10°). Обыкновенно через сутки начинается свечение.
Свечение куриного яйца можно вызвать, разбив, но не очистив
его от скорлупы, и смазав поверхность рыночным мясом.
Погруженное наполовину в солевой раствор (см. выше), яйцо начинает
светиться на 1—3-й сутки.
Для питания некоторых фотобактерий (Photobacterium indicant^
Phot, luminosum) достаточно одного азотистого органического
соединения, для других (Phot, phosphorescens) — необходимо еще не-
1 Для искусственного приготовления морской воды в 100 смадестилли-
рованной воды растворяют: 2.5—3 г NaCl, 0.4—0.5 г MgCl2, 0.2—0.25 г MgS04,
0.1 г CaS04 и 0.07—0.1 г KG1. К этому раствору прибавляют ничтожные
следы фосфорнокислого и углекислого кальция, гидрат окиси железа, кремне-
кислоту и др.
160
большое количество (0.1%) безазотистого вещества, например
декстрозы или глицерина. Phot, phosphoreum культивируется на среде:
Пептона (Poulene) 1%
Глицерина 2
NaCl 3
Водопроводной воды 100
Посевы поставить при температуре 17—20°.
Обычно для культуры фотобактерий служат бульонные среды,
приготовленные из рыбы, предпочтительнее морской. На обычных
мясопептонных средах с солью свечение гораздо слабее.
Для Phot. Italicum подходящей средой является:
ДестиллированноЙ воды 1000 см3
Свежего судака х • 500 г
Поваренной соли 30
Пептона 30
Аспарагина 5
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
Агар-агара 20
(или желатины) 100
Сварив, фильтруют (еще лучше, не фильтруя, растереть рыбу и
прожать сквозь холст) и стерилизуют при 115° в течение 30 мин.
Через сутки после заражения поверхности этой среды
культурой Phot. Italicum наступает свечение, удерживающееся
день-другой, а затем постепенно угасающее.
Хорошей средой служит субстрат такого же состава, как
вышеприведенный, но с заменой судака соленой, невымоченной
селедкой (200 г). В этом случае нет надобности отдельно прибавлять
попаренную соль. Среда очень хороша для опытов свечения, но для
длительного поддержания культуры непригодна, так как
фотобактерии на ней быстро вырождаются. Хорошее свечение Молині
наблюдал на среде состава:
Водопроводной воды . 1000 сма
Поваренной соли 30 г
Пептона 10
Глицерина 5
Желатины 100
Для демонстраций свечения фотобактерий ими обильно
заражают (накануне лекций) поверхность агара в больших пробирках
или чашках Петри. Минут за 10 до демонстрации полезно опустить
пробирки в тепловатую воду (около 35°): свечение при этом
временно усиливается. Оно усиливается также, если налет
фотобактерий размешать петлей, смоченной в 1% растворе декстрозы.
Очень показательны опыты, имеющие целью обнаружить
зависимость свечения от притока в культуре кислорода воздуха. В
высоком цилиндре, почти доверху залитом 3% раствором
поваренной соли, густо разбавляется бактериальный налет с нескольких
1 Судак может быть заменен свежей сельдью, окунем, ершом и др.
И Руководство по микробиология Х?Х
пробирок ярко светящейся культуры. Вся жидкость в цилиндре
начинает светиться. Если цилиндр оставить в покое, то уже через
полчаса и менее свечение исчезает, за исключением верхнего слоя,
продолжающего светиться попрежнему. Перемешав жидкость с воздухом
опять вызываем ее свечение и т. д. Опыт очень демонстративен.
Эффектная картина получается, если жидкость из переставшего
светиться цилиндра переливать длинной струей в широкую чашку:
жидкость рассыпается блестящими брызгами и ярко светится на дне
чашки.
8. КИСЛОТО- И ЩЕЛ0ЧЕ0БРА30ВАНИЕ
Образование кислых или щелочных продуктов обмена является
одним из характерных признаков микробов.
Кислоты образуются чаще всего за счет разложения
углеводов и многоатомных спиртов, а также в тех случаях, когда для
азотного питания служат аммонийные
соли (освобождается кислота). В
таких случаях, во избежание
зависания среды, надо вести
культуру в присутствии мела,
нейтрализующего образующиеся
кислоты.
Щелочи образуются при
распаде белков и их производных, а
также мочевины, вследствие
выделения аммиака. Щелочи
освобождаются также при питании
микробов селитрой и при распаде солей
органических кислот. Если
накопление щелочи в среде
нежелательно и реакцию надо длительно
поддерживать слегка кислой, то к
среде прибавляют винный камень или
мочевую кислоту — соединения, слабо растворимые в воде.
Для обнаружения кислотообразования бактериями
применяются различные методы.
Среды с прибавлением мела. К обычному мясопептонному агару
или желатине прибавляют отдельно стерилизованную густую взвесь
мела, отчего среда становится молочнобелой. Смесь эту тонким
слоем разливают в чашки Петри и заражают разбавленным
материалом. Когда колонии кислотообразующих бактерий вырастут,
вокруг каждой из них образуется прозрачное диффузионное поле
вследствие растворения мела (рис. 118). По величине зоны
растворения можно приблизительно судить об энергии
кислотообразования. Если рядом с такой колонией расположится колония микро-
ба-щелочеобразователя, то район растворения мела получится с
ущербом со стороны этой колонии.
Рис. 118. Колонии молочнокислых
бактерий на меловом агаре с
молочной сывороткой.
Вместо мела можно прибавлять к среде другие карбонаты,
например углекислый магний или углекислый цинк. Последняя среда
дает возможность дифференцировать молочнокислые и
уксуснокислые бактерии, так как первые очень чувствительны к
углекислому цинку, а вторые — нет.
Среда с мочевой кислотой, а) По Бергхаузу (Berghaus) к 100 см3
воды прибавляют 0.73 г углекислого лития и 1.68 г чистой мочевой
кислоты; хорошо взболтав и дав затем жидкости отстояться,
декантируют или отфильтровывают ее. 15 см3 полученного раствора
прибавляют к 75 см3 слегка щелочного 2% питательного агара с
1% декстрозы, после чего приливают еще 10 см3 воды.
Образующаяся кислота вызывает появление типичных конгломератов мочевой
кислоты.
б) по Омелянскому, избыток мочевой кислоты нагревают с 1%
раствором едкого кали; по охлаждении отфильтровывают
остающуюся нерастворенной мочевую кислоту. К фильтрату прибавляют:
Виноградного сахара 2%
Фосфорнодвукалиевой соли 0.1
Сернокислого магния 0.05
Агар-агара 2
Под влиянием бактерий, разлагающих виноградный сахар с
образованием кислоты, в агаре выделяются характерные кристаллы
мочевой кислоты. Таковы бактерии из группы В. subtilis,
кишечная палочка, многие плесени и пр.
Среды с прибавлением различных индикаторов:
а) Среда с лакмусовой настойкой (стр. 47 и 68).
б) Среда с фенолфталеином (стр. 47).
в) Среда с азолитмином (стр. 47). К среде
прибавляют столько 1% водного раствора азолитмина, чтобы от одной
капли 1/100-нормального раствора кислоты или щелочи получалось
ясное окрашивание, красное или синее.
г) Среда с кислым фуксином. На 1 л среды
прибавляют 8 см3 0.5% раствора кислого фуксина и нейтрализуют до
обесцвечивания. От образующейся под влиянием бактерий кислоты
среда краснеет.
д) Среда с кон г о-р от. На 1 пробирку МПА (8—10 см3
среды) прибавляют 5 капель 1% водного раствора конго-рот. Под
влиянием кислоты красное окрашивание переходит в синее.
г Для определения содержания кислоты или щелочи в среде
необходимо пользоваться при титровании индикаторами,
обнаруживающими присутствие даже наиболее слабых кислот и щелочей.
А. Мейер рекомендует:
1) для титрования кислот — раствор 0.5 г розоловой кислоты в
50 см3 этилового спирта с добавлением затем 50 см3 воды; буро-
желтый раствор розовеет, когда жидкость становится щелочной;
2) для титрования щелочи — раствор 0.05 г диметиламидо-
азобензола в 100 см3 96% спирта. Светложелтый раствор от кислоты
краснеет.
И* 163
Титрование производится 1/10-нормальными растворами едкого
кали и серной кислоты.
4. БРОДИЛЬНАЯ ПРОВА
Отношение исследуемого микроба к сбраживанию Сахаров
испытывают различным образом:
а) мы применяем культуры в пробирках, на 3/4 наполненных
питательным раствором. Часть пробирок ставят в аэробные условия,
а часть в анаэробные —помещают в эксикатор (рис. НО), из
которого затем выкачивают воздух.
б) Можно опыты эти ставить, пользуясь бродильными
трубочками Каша—Дургама, трубками Дунбара или аппаратом Эйнгор-
на —Смита (стр. 31).
в) При необходимости производить массовые бродильные пробы
с различными сахарами, в том числе подчас редкими и дорого стоя-
щими, не лишен значения прием Линднера — Роджерса (Lindner —
Rogers), требующий минимального расходования материала.
Способ был предложен Линднером для дрожжей. Различные
сахары тщательно растирают, чтобы удобно было брать
приблизительно одинаковые
количества их платиновым
шпателем. В выемку предметного
стекла (рис. 119) прибавляют
Рис. 119. Бродильная проба по Линд- 1—2 капли стерилизованной
неРУ- воды, в которой взвешены
соответственные разводки
дрожжей, и затем щепотка сахара. Жидкости в выемке должно быть
столько, чтобы под покровным стеклом не осталось пузырьков воздуха.
Если жидкости много, то избыток ее отжимают стерилизованной
фильтровальной бумагой и края стеклышка обмазывают
вазелином. Стеклышко затем помещают в термостате при 25°. Через 12—
24 часа, в случае брожения, под стеклышком заметны пузырьки
углекислого газа, природа которого устанавливается
прибавлением к краю стеклышка капли раствора щелочи: газ поглощается
почти целиком,
Роджерс применил способ Линднера к исследованию бактерий.
Бульон, совершенно свободный от углеводов, наливают в пробирку,
стерилизуют и сильно подкрашивают лакмусом; затем заражают
исследуемым видом и на несколько часов ставят в термостат.
Различные сахары стерилизуют в отдельных пробирках в виде густых
сиропов. Предметные стекла с выемкой и покровные стекла
стерилизуют в чашках Петри. Затем прибавляют в выемку зараженный
бульон и соответственный сахарный сироп (1 петлю), после чего
стеклышко заделывается, как выше описано. Возникновение
брожения обнаруживается пузырьками газа под покровным стеклышком
и покраснением бульона.
Недостаток метода Линднера — Роджерса состоит в опасности
загрязнения культуры и в ненадежности, вследствие этого, получае-
1в4
П
мых результатов. Более надежны опыты в бродильных трубках
(стр. 34), аппаратах Эйнгорна—Смита или с трубочками Каша—Дур-
гама (стр. 33). При этом для изучения бродильной способности
дрожжей наиболее часто Применяется дрожжевая вода (приготовление
ее — см. стр. 64) с 2% испытуемого сахара, а для бактерий —
бульон с 1% сахара и лакмусом или другие среды в зависимости от рода
бактерий.
б* ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
МИКРОБОВ
Состав сред, предложенных для обнаружения восстановительных
свойств бактерий, уже приводился нами выше (стр. 50 и 151).
Шульце (Schultze) предложил среду для быстрого обнаружения
этих свойств. Это — обыкновенный мясопептонный агар с
прибавлением равных частей следующих растворов:
а) Щелочной раствор а-нафтола. К 100 см3
кипящей воды прибавляют 1 г а-нафтола и растворяют его прибавлением
по каплям концентрированного раствора едкого натра. После
охлаждения выпадает избыток нафтола. Вновь прибавляют щелочь,
пока жидкость не перестанет мутиться; получается прозрачный,
слегка буроватый раствор.
б) 1% раствор паранитрозодиметиланили-
н а. Среда на воздухе темнеет и потому всякий раз составляется
наново. При росте на ней действующие восстанавливающим образом
микробы окрашиваются в зеленый цвет.
Вейгман (Weigmaun) и Вольф (Wolff), для обнаружения
восстановительных свойств бактерий предлагают пользоваться
желатиновой средой, приготовленной из молочной сыворотки с 1%
пептона и небольшим количеством серного цвета (отдельно
стерилизуется взвесь его в воде). 20 см3 распределяются на стенках
двухлитровой колбы при вращении ее под струей холодной воды. К ватной
пробке подвешивают бумажку, пропитанную уксуснокислым
свинцом. Образующийся при восстановлении: H2S дает PbS (бумажка
чернеет).
Для обнаружения восстановительного действия бактерий и
разложения ими муравьияокислой соли может служить среда Омелян-
ского. К обыкновенному мясопептонному бульону прибавляют 0.5%
муравьинокислого натрия, устанавливают реакцию и подкрашивают
среду 0.5% насыщенным водным раствором нейтральрота. Среду
разливают по пробиркам, в которые вкладывают опрокинутые
трубочки Каша — Дургама (рис. 38) и стерилизуют. Под влиянием
бактерий, обладающих восстановительными свойствами, среда
быстро изменяет свой первоначальный красный цвет в желтый.
Может быть применена для той же цели и плотная среда: 2.5—
3% агара, 1 % виноградного сахара и 1 % насыщенного водного
раствора нейтральрота, прибавленных к бульону. Посев
производится уколом в высокий слой. Обесцвечивание среды начинается
снизу.
16S
Вихерн (Wichern) предложил количественный способ для
определения восстановительных свойств бактерий при помощи
титрования треххлористым титаном. Подробности — в оригинальной
статье («Zeitschr. f. physiol. Chemie», т. 57, стр. 365, 1908), а также
в позднейшей работе Фреда (Fred) в «CentralbL f. Bakt.» (2), т. 35,
стр. 399, 1912).
Окислительный агар Шульце приготовляют смешением двух
растворов: 1) 1% Годного раствора диметилпарафенилендиамина
(можно брать хлоргидрат) и 2) щелочного раствора а-нафтола (его
приготовление — см. стр. 165). Две части 1-го раствора прибавляют
к одной части 2-го и смесь многократно фильтруют. Одну часть
этой смеси прибавляют к 3 частям мясопептонного агара. На этой
среде, обладающей светлоголубым цветом, следующие бактерии
вызывают резкое посинение, т. е. проявляют окислительное действие:
В, руосуапеит, В. subtilis, В. anthracis, Vibrio cholerae, дрожжи
и др. Напротив, В. dysentheriae, St. pyogenes aureus и др. не
вызывают посинения (об окислительно-восстановительном потенциале
см. в «Приложении»).
6. АУКСАНОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД
Метод этот был предложен Бейеринком для определения
пригодности различных соединений для питания микробов.
Приготовляют водный раствор 2% агара или, лучше, 10% желатины без
всяких других примесей, и в нем распределяются исследуемые микробы
(до застывания). Сама по себе среда эта не пригодна для развития
большинства микробов; они не образуют на ней колоний, и пластинки
после заражения остаются прозрачными.
Если же на поверхность застывшей среды в различных местах
прибавить капли исследуемых растворов, то там, где встречаются
диффузионные токи нужных для питания соединений, создаются
условия, благоприятные для питания и размножения содерясащих-
ся в среде микробов, и в этих местах вырастают колонии, среда
мутится, и получается так называемая ауксанограмма. Самый, же
метод, простой и удобный, Бейеринк назвал ауксанографией.
Поясним примером. Чтобы доказать необходимость фосфатов
для питания дрожжей, распределяют в 10% водной желатине
обыкновенные винные дрожжи и после застывания среды на
поверхность пластинки прибавляют капли двух родов: 1) раствор смеси
виноградного сахара и аспарагина и 2) раствор фосфорнокислого
калия. Среда мутится (вследствие образования колоний) только
в тех местах, где соприкасаются диффузионные поля обеих
капель, и таким образом доказывается, что сама по себе смесь
аспарагина с виноградным сахаром, без примеси фосфатов, не
пригодна для размножения дрожжей.
Приведенный опыт не дает ответа на вопрос, нужны ли
и аспарагин и виноградный сахар для питания дрожжей. Вопрос
решается новой постановкой ауксанографического опыта. К 10%
водной желатине прибавляют раствор фосфорнокислого калия
и взвесь винных дрожжей. После застывания пластинки на
поверхность ее прибавляют отдельно капли растворов аспарагина
и виноградного сахара. Рост обнаруживается лишь в месте
соединения диффузионных полей аспарагина и сахара, и таким
образом доказывается необходимость обоих соединений для
питания дрожжей.
Желатинная среда с фосфатом и аспарагином может служить
для испытания отношения дрожжей к различным безазотистым
(по нелетучим) соединениям — углеводам, некоторым спиртам,
солям органических кислот и пр.
Среда с фосфатом и сахаром служит для установления
питательного значения различных азотистых соединений,
прибавляемых на поверхность пластинки.
Ауксанографическим методом можно пользоваться и для
определения антисептического действия различных жидкостей. Среда
в этом случае должна содержать все необходимые для питания
соединения (в вышеприведенном примере — виноградный сахар,
аспарагин и фосфаты) и поэтому она сплошь мутится от
образующихся колоний, за исключением зон распространения
антисептических жидкостей, где среда остается прозрачной.
Для определения выделения дрожжами энзимов, действующих
на различные углеводы, Бейеринк применял среду следующего
состава:
Водопроводной воды 1000 см3
Желатины 100 г
Фосфорнооднокалиевой соли 0.5
Хлористого аммония 0.5
Для некоторых дрожжей, например для Sacch. apiculatus,
S. fragrans и S. Kefir, вместо хлористого аммония прибавляют к
среде 1% пептона или 0.5% аспарагина.
К среде вышеприведенного состава прибавляют 0.5—5%
углевода и при 32—37° равномерно засеивают ее соответственными
дрожжами, после чего выливают пластинки в чашки. Дрожжи
выбираются таким образом, чтобы источником углеродного питания
для них могли служить продукты гидролиза прибавленного
углевода, а не сам он.
На поверхность желатины наносят капли исследуемой энзим-
содержащей жидкости или кладут кусочки фильтровальной бумаги,
ею пропитанной. Жидкость должна быть стерильной и не содержать
примеси антисептических веществ. В контрольном опыте берется
та же жидкость, но прокипяченная.
Если жидкость содержит соответственный энзим, то в
ближайшей окружности капель через некоторое время появляется
помутнение, вследствие образования колоний дрожжей.
Исследовав отношение различных дрожжей к углеводам,
Бейеринк установил следующие типы (на таблице плюс обозначает, что
дрожжи усваивают соответственный углевод, а минус — что не
усваивают),
167
Тип дрожжей
строза
Левулеза
Сахароза
Лактоза
Мальтоза
Декстрин
Декстрозные дрожжи
(Sacch. apiculaius и др.) . . . .
Сахарозные дрожжи
{Sacch. fragrans и Др.)
Мальтозные дрожжи
[Sacch, cerevisiae, Sacch. ellip-
soideus и Др.)
Лактозные дрожжи
(Sacch. Kefir, Sacch. Tyrocola и
др.)
Полис ахаридные дрожжи
(Sacch. acetaethyhcus и Др.) . .
+
+
-ь
+
+
+
+
+
+
+
_
+
+
+
+
_
—
—
+
—
—
+
—
+
+
Приведенная таблица заимствована из работы Бейеринка
(Beyerinck. —СЫ. Bakt. 1 Abt.; Bd. 11; 68; 1892). Часть
наименований дрожжей в настоящее время не употребляется.
Ауксанографяческий метод пригоден и для различных бактерий,
например для светящихся или пигментных, если среда светится
или окрашивается лишь под влиянием продуктов гидролиза
данного углевода, а не его самого.
ГЛАВА VII
КРУГОВОРОТ АЗОТА
1. ГНИЕНИЕ БЕЛКОВ
Гнилостные микробы накопляются в культуре при разложении
любого белкового вещества — будет лп это кусок мяса или рыбы,
яичный альбумин или какой-нибудь сложный субстрат о
преобладающим содержанием белка. Если желательно изучить споровую
микрофлору гнилостных микробов, то субстрат пастеризуют. Если
внимание привлекают анаэробные гнилостные виды, то культуру
ведут без доступа воздуха.
Весьма наглядно проявляется действие гнилостных бактерий
в обычном мясопептоняом бульоне с брошенным в него кусочком
свернутого яичного белка. Под влиянием действия гнилостных
микробов белок становится прозрачным, углы его сглаживаются, он
постепенно уменьшается в размерах и, наконец, исчезает
совершенно. Если при этом реакция среды становится резко щелочной и
в образовавшемся осадке удастся обнаружить под микроскопом
кристаллические иглы тирозина, а из сгущенной жидкости
выпадает лейцин, — это служит указанием на трипсшшое
переваривание белка под влиянием бактерий.
Существуют специальные приемы для накопления отдельных
гнилостных видов. Так, для получения бактерий из группы Proteus
кусок сырого мяса оставляют в стакане с водою на ночь при
комнатной температуре: утром из замутившейся воды делают разливки на
мясопептонной 5—7% желатине и, когда вырастут колонии,
делают отвивки из тех, которые отличаются фигурным ростом
(колонии с отростками, «колонии-рои»).1
Два других метода выделения Proteus предложены
Мечниковым. Исследуемым материалом производится укол в высокий слой
мясопептонной желатины. Через несколько дней при комнатной
температуре наступает разжижение желатины. 1—2 каплями этой
разжиженной желатины заражают бульон, из которого затем делают
разливки на мясопептонной желатине и из выросших колоний
Proteus получают чистую культуру.
1 Свойство давать колонии с отростками присуще, однако, не только
Proteus, но и некоторым другим подвижным видам. Красивые волокнистые
локоны образует В, mycoides.
169
По третьему способу исследуемым материалом заражают
конденсационную воду в пробирке с косым мясопептонным агаром. Через
несколько дней при 37° беловатый налет Proteus начинает
постепенно подниматься по поверхности агара снизу вверх вследствие
исключительной подвижности этого вида. Взяв частицу налета в
верхней части пробирки, заражают конденсационную воду в другой
пробирке и ждут, пока микроб поднимется вверх по агару. Повторяют
эту операцию еще и еще раз, пока не получится вверху агара вполне
чистая культура.
Главнейший представитель этого рода —Proteus vulgaris
необычайно распространен в природе, отличаясь большой
невзыскательностью к условиям существования. Не даром Гофмейстер
(Hofmeister) назвал его «настоящим пролетарием среди бактерию).
Весьма распространенный в почве гнилостный микроб — Вас.
mycoides выделяется из водной взвеси земли путем разливок на
агаре. Одной петлей заражают поверхность агара в ряде чашек
Петри и делают отвивки из колоний, имеющих вид переплетенных
нитей или прядей волос.
В разложении белков принимают деятельное участие также
Вас. subtilis (его выделение из сена см. стр. 139), Вас. mesentericus.
Вас. megatherium и некоторые другие аэробные спорообразующие
виды.
Из испражнений без особых затруднений удается выделить
споровые анаэробные гнилостные виды: Вас. putrificus, Вас. са-
daveris sporogenes, Вас. perfringens.
Для культуры гнилостных видов проще всего пользоваться
обычными мясопептонными средами: могут служить и синтетические
среды с пептоном или нативным белком. Среды эти не должны
содержать много углеводов, так как в таком случае, при смешанном
посеве, микрофлору гнилостных бактерий могут подавить
кислотообразующие виды, разлагающие углеводы.
Ни один из продуктов гнилостного разложения не может
служить надежной опорой для характеристики гнилостного процесса.
Только совокупность признаков определяет его. Остановимся на
способах обнаружения главнейших продуктов гнилостного распада.
1) Аммиак. Для обнаружения выделения аммиака культурой
в ватную пробку пробирки зажимают полоску влажной красной
лакмусовой бумаги, свободно свешивающуюся в пробирку, но так,
чтобы она не касалась среды, и плотно закрывают пробирку
резиновым колпачком или пергаментной бумагой. Посинение
лакмусовой бумаги указывает на выделение культурой летучей щелочи
(аммиака). Следить за аммонификацией белка можно и
количественно, определяя содержание аммиака перегонкой с магнезией, и
титрованием.
Реактивом Несслера (Nessler) (стр. 183) можно обнаружить
присутствие аммиака лишь на минеральных и лишенных сахара
средах. В бульоне реактив разлагается с образованием черного
осадка закиси ртути,
170
2) Триметиламин узнают по характерному запаху селедочного
рассола. Для более точного определения жидкую культуру
перегоняют в вакууме с окисью магния и в перегоне триметиламин
осаждают хлорным золотом.
3) Сероводород, а) Для определения H2S, по Бейеринку, к слегка
щелочному мясопептоиному агару или желатине прибавляют
столько углекислого свинца, чтобы получилась равномерно белая
непрозрачная масса в тонком слое среды. При росте колоний, выделяющих
сероводород, замечается их побурение или почернение
(образование PbS) (рис. 120). Чтобы затруднить улетучивание H2S, можно
залить культуру тонким слоем водного агара или покрыть
стеклянной пластинкой, после
того как уже выросли
колонии.
б) По Моррису (Morris)
производят укол в пробирку
с питательным агаром,
содержащим 0.1 % уксуснокислого
свинца (свинцовый сахар).
Укол лучше вести между
агаром и стенкой пробирки,
чтобы яснее было видно
почернение посевной линии.
Иногда насыщенным
раствором уксуснокислого свинца
смачивают нижний конец
ватной пробки или
пропитывают им полоску
фильтровальной бумаги, 1 ущемляют
ее между пробкой и краем
пробирки так, чтобы конец
не касался среды, и
покрывают пробирку колпачком из
черной, не вулканизированной резины или пергаментной бумагой.
За почернением бумажки следят ежедневно, так как черная окраска
может исчезнуть под влиянием окисления. Почернение бумаги
нередко сопровождается серебристой побежалостью и указывает не
только на сероводород, но и на меркаптаны—вообще на летучие,
содержащие серу соединения.
в) По способу Фромме (Fromme) к мясопептонной желатине
прибавляют 3% виннокислого железа (Ferrum tartaricum oxid)2 и за-
1 Для этой цели равбавленный раствор уксуснокислого свинца
обрабатывают раствором едкого натра до тег пор, пока образовавшийся сначала
осадок н? растворится. Полученной жидкостью пропитывают чистую
фильтровальную бумагу, высушивают е? при комнатной температуре, разрезают на
полоски и хранят в закрытой склянке.
8 Соль эту можно приготовить самому. Полуторахлористое железо
осаждают раствором едкого кали: отфильтрованный и отмытый гидрат окиси
железа растворяют в винной кислоте.
Рис. 120. Чашка Петри с мясопептон-
ным агаром, к которому прибавлен
углекислый свинец. Черные колонии
гнилостного микроба.
171
ражают уколом в среду. Колонии бактерий, выделяющих H2S,4ep«
неют вследствие образования сернистого железа.
Эрнст (Ernst) прибавляет к среде лишь 0.5% виннокислого
железа и подщелачивает содой до слегка щелочной реакции.
Получается желатина цвета мадеры.
Вместо виннокислого железа можно прибавить к МПЖ са-
харатжелеза, приготовленный растворением в 1 л воды 10 г
свекловичного сахара, 1 г полуторахлористого железа и 0.74 г едкого натра
в разбавленном растворе.
Для количественного определения сероводорода 10—25—50 см3
исследуемой жидкости прибавляют к избытку 1/100
нормального раствора иода, подкисленного соляной кислотой. Образуется
муть вследствие выделения серы. Избыток свобрдного иода
титруют 1/100 нормальным раствором серноватистонатриевой соли.
Разница указывает на количество иода, связанного
сероводородом (1 см3 нормального раствора иода соответствует 17 мг H2S
и 40 мг SOa).
4) Меркаптан. Это летучее соединение обладает запахом гнилой
капусты, особенно ясно заметным при подкислении жидкости
уксусной кислотой. Для обнаружения меркаптана применяются
различные реакции:
а) Если содержащие меркаптан газы пропускать через 3%
раствор уксусносвинцовой соли, то выпадает лимовгножелтый
объемистый осадок, постепенно буреющий. Если меркаптана лишь следы,
то на поверхности реактивной жидкости появляется легкий
налет в виде паутины. В присутствии больших количеств H2S и
полисульфидов осадок имеет краоноватобурый оттенок и быстро
чернеет.
б) Обычной реакцией на меркаптан служит изатиносерная
кислота (мелко истертый изатин, растворенный в крепкой H2S04).
Берут хлоркальциевую U-образную трубку и одно колено ее
наполняют кусочками хлористого кальция, а другое — кусочками
пористой глины, смоченными изатиносерной кислотой. Газ, проходя
через слой хлористого кальция, высушивают и действуют им затем
на изатиносерную кислоту, вызывая позеленение ее.
в) При пропускании содержащих меркаптан газов через 3%
раствор цианистой ртути образуются характерные белые хлопья,
всплывающие на поверхность жидкости. Их отфильтровывают,
растворяют в соляной кислоте и образующийся меркаптан пропускают
через раствор уксусносвинцовой соли [см. а].
5) Индол. Для его определения предложено много способов,
а) Способ Сальковского (Salkowsky). Семидневную
бульонную разводку сначала нагревают с 4 см3 10 % серной кислоты,
а затем с 0.5—2 см3 0.05% раствора азотистонатриевой соли.
Красно-фиолетовое окрашивание указывает на индол.
Известно несколько разновидностей этого способа:
Способ Сальковского — Китазато (Kitasato). Культуру веду?
в бульоне с 5% пептона. К 10 см3 семидневной культуры приливают
172
1 cms 0.02% водного раствора азотистокалиевой соли, а затем
несколько капель концентрированной серной кислоты. На агаровую
культуру сначала наливают раствор азотистокалиевой соли: через
несколько минут его сливают и прибавляют серную кислоту.
Способ Тобей (Tobei). .Культуру ведут в жидкой среде,
содержащей 1% пептона и 0.5% поваренной соли. Через несколько
суток к жидкости прибавляют 10 капель крепкой серной
кислоты и взбалтывают; затем постепенно приливают 30 капель
0.02% раствора азотистонатриевой соли, держа пробирку почти
горизонтально.
б) Способ Морелли (МогеШ). Полоски фильтровальной
бумаги пропитывают горячим насыщенным раствором щавелевой
кислоты. При высыхании они покрываются кристаллами щавелевой
кислоты. Такие полоски подвешивают в пробирке с культурой
(зажимают ватной пробкой) над жидкостью, В присутствии индола—
красное окрашивание.
в) Способ Эрлиха (Ehrlich). К 10 см3 однодневной
бульонной разводки сначала прибавляют 5 см3 раствора:
Парадиметиламидобенвальдегида .... 4 г
96% этилового спирта 380 см8
Концентрированной соляной кислоты . • 80 »
Затем приливают 5 см3 насыщенного водного раствора надсерно-
кислого калия (Kalium persulfuricum). Прибавление последней
соли, впрочем, не обязательно.
Индол дает интенсивно красное окрашивание. Чем оно гуще и
чем скорее наступает, тем больше индола. В сомнительных случаях
краску извлекают встряхиванием с амиловым спиртом.
г) Способ Вертело (Berthelot) (видоизменение способа
Эрлиха). Лучшими средами для индолообразования, по Вертело,
служат те, которые содержат триптофан, например среда с
пептоном, полученным при панкреатическом переваривании казеина.1
Что касается продажных препаратов пептона, то с одними индол
образуется, с другими — нет.
Недостатком существующих методов определения индола
(способы Эрлиха и Сальковского) является то, что в культуре нередко
образуются иные вещества, дающие с реактивами на индол такое
же красное окрашивание. Не помогает делу отгонка части культуры
1 По Зельтеру (Selter), хорошей средой для индолообразования служит:
Водопроводной воды 1000 см3
Пептона 100 г
ФосфорнодвунатриевоЙ соли 5
Сернокислого магния I
Блейш (Bleisch) рекомендует среду:
Дестиллированной воды 1000 см3
Пептона Витте (Witte) 20 г
Поваренной соли 5
0.8% раствора KN03 30—50 капель
На выход индола влияет качество взятого препарата пептона.
173
и определение индола в перегнанной жидкости, так как некоторые
бактерии, не образуя индола, отщепляют вещества, дающие индол
при перегонке или при простом кипячении с водой, например индол-
карбоновую кислоту. Поэтому Вертело считает наиболее
рациональным следующий способ определения индола.
К10—15 см3 исследуемой жидкости (с слегка щелочной реакцией),
находящейся в узкой пробирке, приливают равный объем чистого
эфира,1 и смесь взбалтывают в течение нескольких минут. Затем
жидкость оставляют в покое, пока не прояснится слой эфира (для
ускорения можно прибавить несколько капель спирта). Пипеткой
берут несколько кубических сантиметров прозрачного эфирного
слоя, остерегаясь втянуть находящуюся внизу жидкость. К
эфирной вытяжке прибавляют четвертую часть по объему 4% раствора
парадиметиламидобензальдегида в 96% спирте и встряхивают
пробирку для смешивания обеих жидкостей. Затем, с помощью
вытянутой в капилляр трубки, опущенной до дна пробирки,
приливают 2—3 см3 крепкой соляной кислоты. Оставляют в покое на
5 мин. и исследуют на листе белой бумаги.
Следы индола обнаруживаются красным, со слегка фиолетовым
оттенком, кольцом в месте соприкосновения обеих жидкостей.
Если индола много, вся нижняя жидкость краснеет.
Сине-фиолетовый оттенок указывает на примесь скатола.
Некоторые микробы образуют индолоуксусную кислоту. Она
дает нитрозо-индольную реакцию (см. выше), но не реакцию Эр-
лиха. Кроме того, с соляной кислотой и полуторахлористым
железом эта кислота дает вишнево-красное окрашивание.
6) Креатинин [реакция Вейля (Weyl)]. Средой служит
водный раствор 2% пептона и 0.5 поваренной соли. К 5 см3
убитой разводки прибавляют 1—2 капли 15% раствора едкого натра
и 7 капель свежеприготовленного 10% раствора нитропруссид-
ного натрия. В присутствии креатинина жидкость принимает
рубиновокрасный, иногда вишневокрасный цвет. Через 1—5 мин.
красный цвет переходит в соломенножелтый. Если красную
жидкость подкислить уксусной кислотой, то цвет изменяется
вначале в зеленоватый, а затем в синий (реакция Сальковского).
От прибавления избытка щелочи раствор вновь краснеет. Если
жидкость слабокрасного цвета, то для реакции Сальковского ее
следует нагреть.
Чтобы была уверенность в полученном результате, надо
убедиться, что пептон, на котором велась культура, не содержит ни
креатина, ни креатинина. Испытывается сначала раствор пептона,
а затем пептон после 15-минутного кипячения с слабой серной
кислотой (с последующей нейтрализацией углекислым барием и
фильтрованием).
Образование креатинина и индола идет обыкновенно
параллельно.
1 Для очистки его сначала взбалтывают с третьей частью (по объему)
5% раствора соды, а затем (дважды) с д?стиллированной водой.
174
7) Триптофан. Распад пептона с образованием триптофана —
довольно обычное явление. Для этого служит 3—5% раствор
пептона в воде или бульоне. Засеянные пробирки выдерживают при
37° в течение 10—12 дней. Если за ото время не появляется
реакции на триптофан, то бактерии признаются не образующими его.
По «триптофанной пробе» делают заключение о распаде
белков до стадии аминокислот (лейцина и тирозина). Вещество,
обусловливающее эту реакцию, триптофан или протеинохромо-
ген, представляет собою индоламинопропионовую кислоту.
Пробу производят в слегка кислом растворе. К подкисленной
уксусной кислотой жидкости приливают бромной или хлорной воды
(последнюю проще всего готовят, приливая соляную кислоту
к хлорной извести, причем она может служить несколько дней).
Излишка реактива следует избегать. В присутствии триптофана
получается красное окрашивание.
8) Пробу тирозиназой производят для определения, какого
типа расщепление белка вызывается микробами: триптическое или
пепсинное. Если от прибавления тирозиназы (см. энзимы)
жидкость сначала краснеет, а затем буреет и чернеет, это указывает
на продукты триптического распада. Продукты пепсинного
переваривания от тирозиназы сначала краснеют, а затем зеленеют.
Продукты триптического переваривания,кроме того, дают с
бромной водой реакцию триптофана (см. выше).
По Бейеринку, для той же цели, т. е. для различения
пепсинного и триптического переваривания, может служить
подкисленная или подщелоченная желатина. Пепсин хорошо разжижает
желатину при содержании 10 см3 нормального раствора кислоты
на 100; при 1 см3 пептическое действие очень слабо, а при 1 см3
нормального раствора щелочи оно вовсе не происходит. Напротив,
оптимальное действие трипсина наблюдается при содержании
2—3 см3 нормальной щелочи и прекращается лишь при 6 см3
на 100.
у9) Формалиновая проба. Различают разжижение желатины с
образованием продуктов (альбумоз), затвердевающих от
прибавления формальдегида, и пептонизацию желатины, когда
затвердевания не наступает (пептон). Так, холерный вибрион при 37°
разжижает желатину уже в течение первых 30 час, но пептониза-
цияее наступает лишь по истечении 35 суток. Об условиях ггептони-
зации желатины можно найти указания в статье Тирабоіни (Тіга-
boschi, реф. в «Centralbl. f. Bakt.», 2. Abt. t/21, стр. 433, 1908).
10) Содержание растворимых белков обнаруживается
реакцией с сульфосалщиловой кислотой. К 1 см3 исследуемого
раствора приливают в пробирке 5 см3 воды и 2—3 капли 5% уксусной
кислоты, нагревают до кипения и содержимое отфильтровывают в
другую пробирку с несколькими кубическими сантиметрами 20%
раствора сульфосалицшювой кислоты. В присутствии растворимых
белков получается белый осадок.
175
2. БРОЖЕНИЕ МОЧЕВИНЫ
Разлагающие мочевину бактерии (уробактерии) широко
распространены в природе. Их можно встретить в почве, навозе,
гниющей моче и т. д. Распад мочевины протекает по следующему
уравнению:
(NH1),CO + 2H,0==(NH4)aCO,
Особенно показательно брожение мочевины в моче. Моча,
загнившая при 25—30° в колбе, наполовину наполненной
ею, мутится и реакция ее становится резко щелочной
вследствие образования углекислого аммония. Это последнее
соединение легко распадается на аммиак и углекислоту, в силу
чего загнившая моча приобретает запах аммиака. В этих
условиях в моче чаще всего появляется кокковидный микроб
Micrococcus итеае.
Вообще аммиачный распад мочевины может быть вызван весьма
разнообразными бактериями, так как фермент уреаза довольно
распространен у представителей этой группы микроорганизмов.
К уробактериям могут быть отнесены многие кокковидные
бактерии, как-то: Urococcus van-Tieghemi, Urococcus Dowdoswelli, Uro-
sarcina Hansenii, Planosarcina ureae.
Очень много имеется палочковидных бесспоровых уробактерий,
как, например: Urobacillus Miquelii, Urobac. Jakschii, Вас. eryth-
rogenes, Urobact. citrofilum^ Urobac. Leubei.
Среди споровых бактерий так-яе встречаются уробактерии. К
их числу следует отнести Urobac. Pasteuriiy Urobac. Duclauxii,
Urobac, Miquelii и т. д.
Многие бактерии изучены весьма поверхностно и, возможно,
в дальнейшем ряд видов уробактерий, описанных как
самостоятельные виды, окажутся тождественными.
Специфические уробактерии вызывают энергичный распад
мочевины, что связано, очевидно, с их способностью переносить
весьма щелочную реакцию среды. Сбраживать мочевину в
большей или меньшей степени могут также различные гнилостные
бактерии, как-то: Bacterium vulgare, Bad. prodigiosum, Bad.
fluorescens.
Исследования последнего времени, а также ряд указаний
старых авторов отмечают весьма специфическое отношение отдельных
уробактерий к источникам углеродистого и азотного питания.
Например, по данным Мишустина и Рубенчика, некоторые
разлагающие мочевину бактерии плохо усваивают сахара и
значительно лучше — соли органических кислот.
По Зёнгену, многие уробактерии хорошо развиваются на
углеводах, солях жирных и летучих кислот. К подобным формам
относятся Bacillus erythrogenes, Urobacilbus Jackschii.
В отношении азотного питания могут быть отмечены у
отдельных уробактерий известные особенности. Например, Лёнис (Lohnis)
170
указывает, что Urobacillus Pasteurii нуждается в белке. По
данным же Мишустина, некоторые уробактерии могут развиваться
лишь в присутствии минерального азота или мочевины, легко
превращающейся в аммонийную соль.
Указанные нами моменты могли бы послужить основой для
составления элективных питательных сред. К сожалению, однако,
они используются в весьма малой степени, так как физиология
описанных до настоящего времени уробактерий изучена весьма
недостаточно.
Для получения обогащенной культуры уробактерий
пользуются следующими приемами:
1. По Бейеринку, часто берут мясопептонный бульон с 5—10%
мочевины, который заражают исследуемым материалом, например
землей. В бульоне получают преобладание микробы, разлагающие
мочевину,под конец почти совершенно подавляющие другую
микрофлору. Обычно бывает достаточным выдержать среду несколько
дней при 30°.
При накоплении споровых форм исходный посевной материал
пастеризуют, а для выделения сардин и кокков ведут культуры
при низких температурах.
Для изолирования чистых культур уробактерий делают
высевы на плотные среды (например, мясопептонный агар),
содержащие 2% мочевины.
2. Для накопления Urobacillus Pasteurii служит
мясопептонный бульон с прибавлением 10% мочевины (по Бейеринку). После
стерилизации среды в текучепаровом аппарате появляется слегка
щелочная реакция вследствие частичного распада мочевины с
образованием аммиака. Среду заражают пастеризованной
эмульсией садовой земли или навоза и ставят при 23—30°, Сначала
появляется неспецифическая микрофлора, затем уробактерии
(Urobac. Miqueliiy Urobac. Leubei) и в конце концов всех подавляет
Urobac. Pasteurii, причем мочевина разлагается до конца, если
ее содержалось не свыше 12%.
До выделения чистой культуры обогатительную среду следует
держать при 30° дней 10, а при более низкой температуре —
дольше.
Чистую культуру Urobac. Pasteurii можно получить
разливками на твердых средах, содержащих 2% мочевины.
Помимо ряда культуральных особенностей для этого микроба
характерно, что он не растет на обычном мясопегггонном агаре, без
добавки к нему (NH2). C02 или (NH4)2 C03. Urobac. Miquelii и
Urobac. Leubei могут развиваться на обычном мясопептонном
агаре.
На твердой среде Urobac. Pasteurii разливается медленно.
Молодые колонии расплываются на поверхности среды, прозрачны
и стеклообразны. Бейоринк указывает, что значительной величины
колонии этбго микроба достигают спустя 2—3 недели после
посева.
12 Руководство до микробиологии
177
3. Для накопления некоторых уробактерий, по данным Ёейе-
ринка, может быть пригодна следующая среда:
Водопроводной воды . 100 сма
Мочевины 5 г
Фосфорнооднокалиевой соли 0.025
Соли органической кислоты
(уксуснокислого натрия, сегнеіовой соли, яблоч-
нокислого аммония) 4
Накопление уробактерий происходит в течение 10 дней при 30°.
4. Средами, содержащими органические кислоты, для
накопления уробактерий пользовался Зёріген. Их состав колебался в
следующих пределах:
Водопроводной воды Д00 см3
Мочевины 3—5 г
ФосфорнодвукалиевоЙ соли 0.025—0.05
Соли органической кислоты (яблочной,
винной, лимонной и т. д.) 0.5—1
ііри выдерживании в термостате вараженной исследуемым
материалом среды через 3—4 дня накопляются уробактерии,
которые м^гут быть выделены посевом на твердую среду.
По данным Зенгена, при заражении описанных сред почвой
в них накопляются следующие виды уробактерий: Urobac. Leu-
Ъеі) Urobac. Madoxiiy Вас. Freudenreichii, Urobac. Duclauxii^
Urobac. Jaksckii, Вас. erythrogenes.
Зёнген указывает, что для улучшения роста и деятельности
уробактерий к жидкой среде можно прибавлять некоторые
коллоидальные вещества, как кремнекислоту и кровяной уголь. Энергия
разложения мочевины при этом повышается (до 30%).
5. Для обогатительных культур уробактерий можно
использовать также среду следующего состава:
Почвенной вытяжки . . 100 см*
Мочевины < 5 г
ФосфорнодвукалиевоЙ соли 0.05
6. Рубенчик для выделения уробактерий пользовался
нижеследующей средой:
Дестиллированной воды 100 см"
Мочевины 5 г
Фосфорнотрехкалиевой соли 0.1
Поваренной соли 0.1
Сернокислого магния 0.05
Железа треххлорного следы
Источника органического углерода
(сахара, многоатомного спирта или соли
органической кислоты) 1%
Отдельные бактерии, как указывает Рубенчик, предпочитают
определенное органическое соединение. Например, Urobacterium
178
citrofilum лучше всего развивается на лимоннокислых солях,
Urobac. arnylovorum на молочнокислых солях и т. д.
Обычно при температуре термостата 20—30° достаточно
обогащенная культура уробактерий на средах вышеприведенного
состава получается в несколько дней.
Для изолирования культуры уробактерий могут служить
нижеследующие твердые питательные среды:
і) Мясопептонный агар или мясопептонная желатина с 2%
мочевины. Раствор мочевины рекомендуется стерилизовать отдельно
и по соответствующему расчету прибавлять к стерильной твердой
среде. В пробирку, содержащую 7—8 см3 питательной среды,
нужно прибавить 1 см3 15% водного раствора мочевины.
При изготовлении желатинной среды лучше брать не 10%
желатина, как обычно, а 12%, так как примесь мочевины понижает
ее желатинизируюіцие свойства.
2) Среда Бейеринка — МП Ж с 0.3% углеаммонийной соли
и 2% мочевины. По наблюдениям Мишустина, некоторые
уробактерии без минерального азота плохо развиваются даже в
щелочной среде. Для подобных форм весьма подходит среда Бейеринка,
причем (NH4)2 С03 берется как аммонийная соль, обладающая
щелочными свойствами.
Так как уробактерии выносливее других микробов к
углекислому аммонию, то для усиления элективных свойств и других
сред можно к ним прибавлять немного этой соли.
3) Среда Зёнгена:
Водопроводной воды 1000 сма
Хлористого аммония 0.6 г
Фосфорнодву калиевой соли 0.5
Яблочнокислого кальция 5
Желатины 100
4) Для изолирования и культуры уробактерий можно
воспользоваться любой из жидких питательных сред, добавив к ним агар
или желатину (среды Рубенчика, Зёнгена и др.).
На плотных средах с мочевиной и кальциевыми солями вокруг
колоний уробактерий выпадают кристаллы СаС03 и СаНР04 —
обычно палочкообразной формы с утолщенными круглыми
концами (бисквиты).
Очень типичен вид колоний на среде Бейеринка:
20% отвара дрожжей 100 см3
Мочевины 2—3 г
Желатины 10
Если на эту среду перенести колонию уробактерий, то уже
через несколько минут вокруг нее образуется ореол из аморфного
осадка СаС03 и СаНР04 в виде тончайшей ирризирующей
пленки, дающей явления цветных колец Ньютона. Колонии других
бактерий этой реакция не дают,
12* 179
По Зёнгену, весьма подходит для обнаружения ирризации
следующая среда:
Водопроводной воды 1000 см3
Мочевины 2 г
Яблочно- или лимоннокислого кальция 0.5
Лимоннокислого аммония 0.05
Агар-агара 2
К еще теплой расплавленной среде по каплям прибавляют
раствор фосфорнодвукалиевой соли до тех пор, пока не появится
слабая опалесценция. Если среда приготовлена правильно, то
пластинки из нее почти прозрачны. Нанесенная на поверхность
среды капля раствора углекислого аммония вызывает ирризацию.
При приготовлении сред с мочевиной надо иметь в виду, что
в водных растворах в случае повышения температуры мочевина
частично распадается. В силу этого среды с мочевиной
рекомендуют стерилизовать в два приема: сначала, при 115—120°, среду
без мочевины, а затем, прибавив нужное количество мочевины,
осторожно еще раз стерилизуют среду в текучепаровом аппарате.
В этих условиях лишь ничтожная часть мочевины разлагается
с образованием аммиака. Еще лучше прибавлять к среде
мочевину, обеспложенную пропусканием через свечу Пастера — Шам-
берлана.
Мочевину можно также стерилизовать в порошке сухим
жаром при 106° в течение Ч2 часа [Леубе (Leube)], а затем внести
в питательную среду. При отмеченной температуре мочевина не
распадается.
За деятельностью уробактерий следят по возрастающему
содержанию аммиака в среде. Контролем служит сосуд, не
зараженный уробактериями. Для определения аммиака можно
пользоваться следующими приемами:
1. Титрованием образовавшегося аммиака кислотой с обратным
оттитровыванием щелочью. В отдельных случаях, в зависимости от
энергии распада мочевины, можно крепость титрованных
растворов менять от децинормальных до нормальных.
Титрование употребляется обычно для работ
ориентировочного характера, так как щелочные вещества при развитии
бактерий могут получаться и не из мочевины. Процесс распада
мочевины тем не менее в подщелочении среды играет основную роль.
2. Виховер (Vichoever) советует удалять образовавшийся
аммиак из среды током воздуха, пропуская затем этот последний
через известный объем титрованной кислоты. Первоначальн -
среда освобождается от свободного аммиака, затем жидкость
подщелачивается и возобновляется пропускание воздуха,
который удаляет аммиак, бывший в связанном состоянии. Для
ускорения отгона аммиака анализируемую среду можно нагреть
погружением содержащего ее сосуда в теплую воду. Нагрев нельзя
вести выше 40°, так как при более высокой температуре
начинает распадаться мочевина. Это обстоятельство мешает, между
Х80
прочим, приложить метод Кьельдаля в обычном его виде для
отгонки аммиака из сред, содержащих мочевину.
Метод Виховера крайне кропотлив. Одно определение требует
4—б часов. Детали этого метода описаны в «Сеп?гаіЫ. fur Bact.».
II Abt., В. 39, 1913—1914, S. 282—288.
3. Об энергии распада мочевины можно судить по
количеству ее, оставшемуся в неразрушенном состоянии в среде. Очень
простой и точный способ количественного определения даже
ничтожных количеств мочевины при помощи осаждения ксант-
гидролом описан Фоссом (Fosse) в «Annales de Г Inst. Pasteur»,
т. 30, 1916 и т. 34, 1920.
Метод заключается х в получении кристаллического
производного мочевины с ксантгидролом по уравнению:
С Н
(NH2)3CO-f2GHOH</ 6 *\о-+
—*0< >CHNH-CO — HNHG< >C
хс6н4/ хс6н4/
Здесь получается из одной молекулы мочевины и двух
молекул ксантгидрола одна молекула диксантилмочевины —
соединения, практически не растворимого в воде и спирте.
Этот метод дает возможность производить осаждение мочевяны
из среды, сильно загрязненной посторонними примесями. Диксан-
тилмочевина обладает высоким молекулярным весом — 420,
в то время как мочевина имеет только 60, т. е. производного
вещества получается в 7 раз больше, чем было по весу мочевины.
Последнее обстоятельство приобретает особенно важное значение
при определении очень малых количеств мочевины; не трудно
выделить 2—3 мг, а микроскопически распознать даже 0.01 мг
мочевины. Для определения мочевины следует поступить так: к 4 см3
жидкости, содержащей примерно 0.5% раствор мочевины,
прибавляют 15 см3 уксусной ледяной кислоты, затем 23 см3 10% раствора
ксантгидрола в метиловом спирте и оставляют стоять на 1—2
часа. Надо осаждать мочевину в 70% уксусной кислоте.
Выпадающий белый осадок диксантилмочевины, представляющей
собой белые шелковистые иголки, отсасывают на бухнеровской
воронке, промывают метиловым спиртом до удаления уксусной
кислоты, высушивают при 110° и взвешивают; содержание азота
в нем должно быть 6.66%.
Узнав вес диксантилмочевины, легко определить количество
мочевины, имевшееся в определяемом материале. В виду
чувствительности метода Фосса для анализа надо брать лишь часть
жидкости, в которой развивались уробактерии.
1 Метод описан у проф. Н. Н. Иванова («Методы физиологии и биохимии
растений»).
1S1
Для изучения разложения гиппуровой и мочевой кислот
применяют среду:
Водопроводной воды 1000 см3
Натриевой соли соответственной кислоты 3 г
Фосфорнодвукллневой соли 0.5
Этот раствор наливают по 10 см3 в ряд малых эрленмейеров-
ских колб и заражают навозом.
8. НИТРИФИКАЦИЯ
1-я фаза. Окисление аммиака в азотистую кислоту
Комком хорошей огородной (или вообще перегнойной, но не
лесной) земли величиной в фасоль засеивают колбу Виноград-
ского1 (рис. 121), содержащую около 0.5 г углекислой магнезии
и 50 см3 следующего раствора:
Дестиллированной воды . . . . • .... 1000 см*
Сернокислого аммония ......... 2 г
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
Хлористого натрия . 2
Сернокислой закиси железа 0.4
В растворе образуется бурый осадок фосфорнокислого железа;
поэтому при разливании в сосуды надо хорошо встряхивать
жидкость. Колбы закрывают ватными проб-
г^"~>\ ками и стерилизуют при 120° 15 мин.
Щ,і J Засеянные колбы выдерживают при
25—30°. Обыкновенно уже на 5—6-й
^. J\ день в жидкости появляется азотистая
кислота, содержание которой
постепенно возрастает и в то же время
параллельно уменьшается содержание
аммиака. Реактивами служат: для азотистой
кислоты —цинк-иод-крахмальный
раствор, а для аммиака —реактив Несслера.
^^==^r=^d Приготовление цинк-иод-крахмаль-
иого раствора: 4 г крахмала растирают
Рис. 121. Колба Виноград- в фарфоровой ступке с небольшим
ноского для аэробных культур, дичеством воды и при беспрерывном
взбалтывании постепенно приливают эту
молочную жидкость к кипящему раствору 20 г хлористого цинка
в 100 см3 дестиллированной воды. Смесь кипятят (доливая
испаряющуюся воду) до тех пор, пока крахмал растворится и
жидкость станет прозрачной. Затем прибавляют 2 г сухого йодистого
1 Сосуды этого вида — укороченные эрлекмейеровские колбы с широким
горлом —- удобны для ведения окислительных процессов, так как в них
обеспечена широкая аэрация культуры. Тонкий слой жидкости в опытах
нитрификации имеет особое значение, так как нитрифицирующий микроб
развивается на дне сосуда — в осадке углекислого магния, нуждаясь в то н$в
время в широком притоке кислорода с поверхности.
182
цинка, доливают до 1 л и фильтруют. Реактив сохраняют в склян»
ке с притертой пробкой в темноте. Способ пользования см. ниже.
Реактив Грисса (Griess) на азотистую кислоту:
Раствор 1-й. Раствор 0.5 г сульфаниловой кислоты в 150 см3
разбавленной уксусной кислоты.
Раствор 2-й 0.1 г а-нафтиламина кипятят с 20 см3 воды и
к нему прибавляют 150 см3 разбавленной уксусной кислоты.
Берут в пробирку по 1 см3 обоих растворов,кипятят, прибавляют
10 см3 исследуемой жидкости и вновь кипятят. В присутствии
азотистой кислоты наступает красное окрашивание. Реактив очень
чувствителен, и потому, во избежание ошибки, пробирки и
пипетки должны быть тщательно вымыты.
Реактив Несслера (двойная соль йодистых ртути и калия,
растворенная в едком кали) готовится следующим образом: 50 г
йодистого кали растворяют в 50 см3 горячей дестиллированной воды
и к раствору
прибавляют горячий
концентрированный
раствор сулемы до тех
пор, пока не
перестанет исчезать
образующийся красный
осадок. Тогда
жидкость фильтруют и к
фильтрату
прибавляют раствор 150 г
едкого кали в 400 см3
дестиллированнойво-
ды, а затем еще
несколько кубических
сантиметров раствора
сулемы. После охлаждения доводят объем жидости до 1 л.
Приготовленный таким образом реактив должен храниться в хорошо
закрытой склянке. По мере надобности берут пицеткой
отстоявшуюся прозрачную жидкость. Если мало аммиака,с реактивом
получается желтое или оранжевожелтое окрашивание, если много—
то красно-бурое.
Пробы на аммиак и азотистую кислоту удобно производить на
белой фаянсовой пластинке с несколькими рядами углублений,
употребляемой для акварельных красок (рис. 122). Для пробы на
аммиак в одно из углублений вносят несколько капель несслерова
реактива и с одного края опускают петлю с испытуемой
жидкостью. В присутствии аммиака желтый цвет реактива изменяется
в коричнево-красный; по степени окраски можно судить об
относительном содержании аммиака.
По одному исчезновению аммиака нельзя заключить о
начавшейся нитрификации, так как в щелочном растворе аммиак
постепенно улетучивается. Для уверенности в начавшейся нитрифи-
183
Рис. 122. Форфоровая пластинка с
углублениями, применяющаяся для акварельных красок,
Удобно для капельных химических проб.
©
нации необходимо удостовериться в появлении в жидкости
азотистой кислоты.
Пробу на азотистую кислоту производят таким образом. В
одно из углублений прибавляют 3 капли раствора
цинк-иод-крахмала и 1 каплю разбавленной серной кислоты (1:3 или 1:5).С края
вносят в реактив петлю культуры. Если в жидкости содержится
азотистая кислота, то наступает быстрое посинение жидкости
(азотистая кислота выделяет из иодисто-водородпой соли свободный
иод, вступающий во взаимодействие с крахмалом1). По
интенсивности окраски судят об относительном содержании азотистой
кислоты, отмечая в дневнике соответственными знаками.
Параллельно должно вестись подробное микроскопическое
обследование культуры (после появления
азотистой кислоты).
Когда первая порция аммиака окислена,
прибавляют к жидкости новую порцию серно-
аммониевой соли. 10% раствор этой соли
стерилизуют в небольшой эрленмейеровской
колбе, снабженной градуированной пипеткой
(рис. 123), и из этого раствора прибавляют
к культурной жидкости 1 см3 (0.2%). На этот
раз окисление идет быстрее, так как культура
обогатилась специфическими бактериями.
Третья порция окисляется еще быстрее и т. д.,
однако ускорение процесса идет лишь до
известного предела, так как успешному ходу
нитрификации в дальнейшем препятствуют: 1)
растворение углекислого магния и 2) накопление
азотистомагниевой соли.
Когда окислено несколько порций
аммонийной соли, пересеивают в другую колбу, таким
же образом снаряженную. Пересев производят
каплей жидкости со дна, так как бактерии
находятся главным образом в осадке углекислой магнезии.
Нитрификация наступает быстрее, чем при заражении землею, и
идет правильнее. По мере исчезновения аммиака и здесь
прибавляют серноаммонийную соль.
Сделав еще один или два пассажа и убедившись путем
микроскопического исследования, что культура достаточно обогащена
специфическим микробом, приступают к его изолированию на плотной
среде. Для выделения нитрозного микроба было испробовано
много плотных сред, но лучшей следует признать предложенный
Виноградским кремневый студень.
/ способ. К чистой соляной кислоте (уд. вес 1.10) постепенно
приливают при постоянном помешивании равный объем жидкого
Рис. 123. Эрлен-
мейеровская
колба с пипеткой для
хранения
стерилизованных
растворов.
1 Таким же образом действуют КМп04, Вг, Щ02 и некоторые другие
соединения с окислительной функцией.
181
стекла (возможно чистого кремнекислого калия или натрия уд.
веса 1.05—1.06) и оставляют смесь на некоторое время для
основательного смешения. Полученную смесь диализируют через
пергаментную перепонку сначала в проточной, а затем в дестил-
лированной воде до тех пор, пока диализируемая жидкость не
перестанет давать муть с раствором азотнокислого серебра.
Мы предпочитаем вести диализ в пергаментных трубках,
тщательно проверенных на их целость. Для этого, зажав плотно
винтовым зажимом один конец трубки, наполняем ее водой и держим
некоторое время в вертикальном положении. Для диализа
пользуются лишь такими трубками, через которые при этой пробе не
просачивается вода. В трубки наливают по 200—300 см3 смеси и 2—3
трубки укладывают в большую фарфоровую или эмалевую
чашку. Диализ сначала проточной, а затем дестиллированной водой
заканчивают в 2—3 суток. Полученный прозрачный или лишь
слегка опалесцирующий раствор гидрозоля выливают из трубок
в хорошо промытую склянку с притертой пробкой и сохраняют
впрок. Этот раствор, содержащий около 2% кремнекислоты,
служит исходным материалом для приготовления пластинок.
Поступают следующим образом: в небольших эрленмейеров-
ских колбах, закрытых ватными пробками с пропущенными через
них градуированными пипетками (рис. 123), стерилизуют
следующие четыре жидкости:
1) Дестиллированной воды 100 см3
Сернокислого аммония 3 г
Фосфорнодвук а лиевой соли 1
Сернокислого магния 0.5
2) 2% раствор сернокислой закиси
железа
3) Насыщенный раствор поваренной соли
4) Густая взвесь основной углекислой
магнезии в дестиллированной воде.
На 50 см3 стерилизованного в небольшой колбочке гидрозоля
прибавляют 2.5 см3 первого раствора, 1 см3 второго и столько
четвертого, чтобы смесь приняла молочный вид. Осторожно
взболтав жидкость, выливают ее в 3 чашки. Чашки устанавливают
горизонтально и в каждую прибавляют, в центр ее, по одной капле
раствора поваренной соли (третий раствор). Обыкновенно уже
через час начинается застывание раствора в прозрачный
стекловидный студень; однако, чтобы студень окреп, следует дать ему
постоять сутки и затем еще некоторое время подсушить в термостате
в опрокинутом положении.
На гладкую поверхность застывшего студня наносят каплю
жидкой культуры и осторожно распределяют по всей площади
изогнутой стеклянной палочкой (рис. 71). Той же палочкой, не
заражая ее вновь, проводят штрихи по поверхности студня второй и
третьей чашки. Таким образом получают три разбавления.
Чашки ставят в термостат при 25—30° сначала в опрокинутом Положе-
нии, чтобы выделившаяся вода собиралась на крышке чашки,
откуда ее удаляют затем стерилизованными полосками
фильтровальной бумаги. Хорошо приготовленный студень не должен
отдавать слишком много воды, и поверхность студня должна
оставаться после этого такой же гладкой, как и до отдачи воды.
Можно заражать пластинки и внутрь. Для этого каплю жидкой
культуры вносят в еще жидкий гидрозоль тотчас после
прибавления 1, 2 и 4-го растворов, а затем, вылив содержимое колбочки в
чашки Петри, прибавляют к каждой каплю 3-го раствора.
Обычно уже в недельный срок в чашках можно обнаружить
появление азотистой кислоты. Для пробы на нее у края чашки
платиновой иглой-шпателем вырезают кусочек студня и
опускают в цинк-иод-крахмальный реактив с прибавлением серной
кислоты. Отчетливое синее окрашивание указывает на
появление нитрификации. Таким же образом производят испытание на
аммиак — опусканием кусочка студня в реактив Несслера.
Когда реакция аммиака исчезнет, «подкармливают» микробов
прибавлением в образовавшиеся при выемке проб углубления по
1—2 капле 10% стерильного раствора сернокислого аммония с
помощью пипетки, изображенной на рис. 123. Повторяют эту
операцию «подкармливания» несколько раз, всякий раз после
исчезновения аммиака. При этом, начиная от места прибавления
сернокислого аммония, пластинка постепенно становится прозрачной,
вследствие чего в этой части легко обнаружить присутствие
мельчайших колоний (с помощью лупы или слабой сухой системы
микроскопа). Колонии сильно преломляют свет и ограничены
темными, слегка угловатыми контурами. Сначала они бесцветны,
затем становятся желтоватыми и, наконец, приобретают
характерный темнобурый оттенок. При более сильных увеличениях
удается отчетливо видеть зернистое строение колоний. По мере роста
колоний на участках пластинки, еще мутных от осадка
углекислой магнезии, среда вокруг колоний проясняется вследствие
растворения углекислого магния образующейся азотистой
кислотой
Отвивки удобно производить из поверхностных колоний. К
сожалению, они часто бывают загрязнены посторонними видами,
и потому необходимой предосторожностью является
предварительное внимательное исследование как самой намеченной для
отвивки колонии, так и препарата из нее. Колонию берут с
пластинки с помощью укола концом свежевытянутого из
стерилизованной стеклянной трубки тонкого открытого капилляра. Конец
капилляра с вошедшей внутрь жидкостью погружают в раствор
для нитрозного организма (стр. 182), налитый в количестве 15 см3
в небольшие эрленмейеровские колбочки, и здесь ударом о
дно колбы обламывают этот конец. Если колонии очень мелки, то
отвивку из них капилляром производят под контролем лупы.
Отвивки производят из ряда колоний в отдельные колбочки. Чем
больше произведено о^вивок, тем больше шансов получить чистую
культуру, так как всегда приходится считаться с значительным
процентом неудачных или загрязненных отвивок.
Засеянные указанным способом колбочки ставят при 30°. Те
колбы, в которых появилась нитрификация, проверяют на
чистоту содержащихся в них культур с помощью: а) их
микроскопического исследования и б) пересевов на мясопептонный агар,
на агар Гейдена (Heyden), в питательный бульон и т. п. Чистыми
признаются культуры, выдержавшие оба эти испытания, т. е. те, у
которых при микроскопическом исследовании не обнаружено
примеси посторонних видов и которые не дают роста на
органических средах.
II способ. В небольшой колбочке, закрытой ватной пробкой,
с пропущенной через нее градуированной пипеткой, кипятят
взвесь двойной аммонийно-магниево-фгіЬфорнокислой соли (на
100 см3 стерильной воды берется 0.5 г NH4MgP04).
На приготовленный (см. стр. 184) в чашках Петри
кремнекислый студень вносят 10 см3 этой взвеси, распределяют ее
равномерно по поверхности геля и затем подсушивают, приоткрыв
крышку чашки Петри, в термостате при 50—60°.
Необходимо остерегаться полного удаления влаги, так как
последнее вызывает быстрое растрескивание пластинки. В случае
пересушивания ее, можно прибавить 1—2 см3 стерильной воды.
На поверхность готового студня наносится (стеклянным
крючком или палочкой) определенное количество комочков
исследуемой почвы, причем сухая почва увлажняется чуть-чуть
стерильной водой. Чашки Петри с засеянным кремнекислым гелем
помещаются в опрокинутом положении во влажную камеру,1
так как иначе происходит высыхание и растрескивание геля.
Выделившаяся вода из геля на крышках чашек Петри
удаляется стерильными полосками фильтровальной бумага.
Нитрифицирующие бактерии культивируются при температуре 25—28°.
За началом и развитием процесса нитрификации судят по
появлению положительной реакции на азотистую кислоту (стр. 184).
0 густоте нитрифицирующих бактерий в почве Виноградский
предлагает судить по количеству так называемых «зон
просветления», которые получаются вследствие растворения NH4MgP04
под вл іянием образующейся азотистой кислоты. Чем больше
число комочков почвы, у которых наблюдаются «зоны просветления»,
тем богаче почва нитрифицирующими бактериями. Отвивки
бактерий производятся из колонии в жидкую среду Виноградского и
Омелянского или в 10 см3 стерильной воды, из которой после
хорошего взбалтывания 1 см3 переносится на заранее
приготовленные, как указано выше, кремнекислые пластинки.
III способ. В 1933 г. Виноградский предложил новую методи-
1 Влажной камерой может служить любой большой химический стакан
или банка, на дно которой наливается вода-f-0.1% AgN03 и помещается
подставка (крышка чашек Петри или Коха) для чашек Петри. Сверху стакан ва-
крывается стеклянной пластинкой.
лат
ку выделения нитрифицирующих бактерий как I, так и II фазы.
Для выделения нитрозных бактерий приготовляются следующие
стерильные растворы:
1) Солевой раствор, содержащий в 200 см3 воды:
Фосфорнодвуьалиевой соли 0.5 г
Сернокислого магния 0.3
Хлористого натрия 0.3
Сернокислого железа (закисного) ... 0.02
Сернокислого маріанца 0.02
Солей цинка, титана, молибдена и
алюминия (одна из этих солей) следы
2) Раствор, содержащий в 200 см3 воды:
Сернокислого аммония 10 г
На приготовленные '-(см. стр. 184) кремнекислые пластинки
(диаметр которых 10 см) вносится 2 см3 1-го и 1см3 2-го растворов,
после чего их подсушивают в термостате при температуре не
выше 50°. После этой операции на кремнекислые пластинки
вносится 1 г углекислого кальция (СаС03) или 0.5 г углекислого
магния (MgCO3)+0 01 г СаС03, предварительно хорошо растертых
в стерильных ступках с минимальным количеством стерильной
воды. Вращательным движением распределяют СаС03 (или MgC03)
по всей поверхности кремнекислого студня и затем опять
подсушивают, избегая избытка влаги.1 На полученную таким
образом эмалевую поверхность кремнекислого студня наносят 150
комочков исследуемой почвы правильными линиями на равном
расстоянии друг от друга.
Для определения количества нитрифицирующих бактерий в
почве поступают следующим образом: на аналитических весах
отвешивают некоторое количество исследуемой почвы
(приблизительно около 0.1 г) в стерильном тигельке Гуча и затем,
встряхивая слегка рукой тигелек над эмалиевой поверхностью
кремнекислого геля, на пего наносят мельчайшие частицы почвы.
После посева тигелек Гуча снова взвешивают и узнают по разнице
в весе количество засеянной почвы. Чашки с засеянными
кремнекислыми пластинками помещают, как указано выше, во влажную
камеру и культивируют в термостате при 25—28°. За началом и
развитием процесса судят по появлению реакции на HNOa и «зон
просветления» около частиц почвы.
Для исследования какой-либо суспензии или воды вносят 1 см3
их на кремнекислый гель сразу же после внесения СаС03 (или
MgC03), хорошо перемешивают вращательным и колебательным
движениями и высушивают при температуре не выше 35°.
Каждый образец исследуемого объекта (почвы, илы, вода и
др.) необходимо засевать на две кремнекислые пластинки,
приготовленные: первая с СаС03 и вторая с MgC03 + 0.01 г СаСОз>,
так как неодинаковая реакция среды, получающаяся при приго-
1 Вносить одновременно оба раствора и СаС03 (или MgC03) не
рекомендуется, так как в щелочной среде происходит улетучивание NHj.
188
товлении пластинок с вышеуказанными солями, может выявить
различные виды нитрозных бактерий.
При выделении чистых культур нитрозных бактерий
производятся пересевы с отдельно выросших колоний в 10 см3 стерильной
воды, из которой для получения редко лежащих колоний
рекомендуется делать 1—2 разведения. 1 см3 последнего разведения
вносится на поверхность кремнекислого геля (как указано выше)
одновременно с внесением на него СаС03 (или MgC03). Подсушивание
последних производится при температуре не выше 30—35°.
Через 3—4 пассажа получаются чистые культуры нитрозных
бактерий. Последние могут сохраняться на кремнекислом геле (во
влажной камере) без пересева в течение 8 месяцев — 1 года.
Приготовление кремнекислых пластинок. Агар
и желатину, являющиеся в плотных средах твердой основой питательной
среды, бывает иногда необходимо заменить сугубо синтетической средой,
как, например, кремнекислый гель. Эта среда, предложенная впервые Вино-
градским, приготовлялась ранее по рецепту, указанному на стр. 184. В
настоящее время пластинки изготовляются следующим образом. К соляной
кислоте (уд. вес і. 10—1.08 или, по Бомэ (Baume), 13—8°) постепенно
приливают при помешивании равный объем жидкого стекла (раствора
кремнекислого натрия или калия (уд. вес 1 06-—1.08 или, по Бомэ, 8—10,°6). Смесь
немедленно нагревают почти до кипения, чтобы выгнать всегда имеющуюся
в жидком стекле С03, и разливают по стерильным чашкам Петри по 30 см3
на чашку в 10 см диаметром (нагреванием устраняется появление в толще
образующегося геля пузырьков в виде чечевичен) Чашки оставляют в покое
на горизонтальном столе на несколько часов (лучше на ночь) до образования
кремнекислого студня.
Когда кремнекислый гель будет достаточно плотным, чашки помещают
в большой батарейный стакан или фотографическую ванну и промывают
водопроводной водой при помощи опущенной до дна стакана резиновой трубки,
надетой на водопроводный кран. Кремнекислые пластинки промываются
так в течение 2—3 суток, а затем 2—3 раза горячей дестиллированной водой.
По удалении хлоридов (проба с 1% AgN03) пластинки готовы к употреблению.
Приготовленные кремнекислые пластинки пропитывают затем горячей
соответствующей средой, взятой в количестве 3 см3 на чашку Петри.
Концентрация всех составных частей в пропитывающей гель питательной среде
должна быть в 5—1 раз бблыная, чем в соответствующих жидких средах. После
этого пластинки ставят для просушки в термостат при 50—60°. Затем,
завернув в пергаментную бумагу,стерилизуют в автоклаве при 112° 15 мин.
Если пропитывающая гель среда — щелочной реакции или содержит мел,
то после стерилизации гель несколько размягчается. Впоследствии
стерилизацию пластинок производят без мела, мел же стерилизуется отдельно и
стерильно н< носится на поверхность пластинки после стерилизации.
Кремнекислые пластинки, употребляющиеся для выделения и культивирования про-
тотрофных бактерий, в виду специфичности последних, можно не
стерилизовать в автоклаве.
Из других плотных сред, предложенных для изолирования ни-
трозного микроба, упомянем о следующих:
1) Среда Бейеринка. Выщелоченный агар (стр. 52
и 53) с прибавлением 0.2% двойной фосфорнокислой соли
аммония-натрия, 0.05% хлористого калия и мела (рис. 124).
2) Магнезиально-гипсовые пластинки
Омелянского. Равномерную смесь гипса с 1% углекислого
189
магния замешивают на воде до консистенции густой сметаны
(2 части порошка гипса на 3/4 части воды) и полученную
полужидкую массу выливают в круглые бумажные формочки (в виде
воротничков), расположенные на поверхности зеркального стекла.
Когда гипс отвердеет, бумажную форму срывают и гипсовый
кружок кладут
зеркально-гладкой стороной кьерху в высокую
чашку Петри. В последнюю
затем наливают столько
раствора для нитрозных микробов
(стр. 182), чтобы он занимал
половину высоты гипсового
кружка. При стерилизации
жидкость впитывается гипсом, и
ее замещают новой порцией
той же жидкости, отдельно
стерилизованной, стараясь при
этом не облить верхней
поверхности пластинки. Заражение
Рис. 124. Рост иитрозиого микроба прои3подят толстой петлей или
на агар? Бейеринка с мелом, dapa- *\ „ „ л „
жение штрихом на поверхности, изогнутой стеклянной палочкой,
Темные линии и точки места коло- которыми размазывают по по-
нин, растворивших мел. верхности пластинки каплю
культуры (рис, 125).
Макринову принадлежит следующее видоизменение этого
способа. Тщательно смешивают 300 частей гипса, 30 частей
углекислого магния и 3 части двойной фосфорнокислой соли аммония-
магния. Смесь обливают (до образования однородной полужидкой
массы) следующим
раствором:
2 г сухих
опавших листьев или
150—250 г
черноземной земли нагревают
15 мин. при 115° в
автоклаве с 1 л воды
и в отфильтрованном
экстракте раство-
Рис. 125. Рост Nitrosomonas на гипсовой пла- ряют: 2 г поваренной
стинке. соли, 1 г фосфорно-
двукалиевой соли,
0.5 г сернокислого магния и 0.4 г сернокислой закиси железа.
Жидкость доливают водой до 1 л и стерилизуют.
3) По Перотти (Perotti), пластинки приготовляется из куска
углекислого магния с прибавлением обычного питательного
раствора. Эти пластинки не так прочны, как гипсовые, и легко
рассыпаются. Желтоватые колонии нитрозного микроба
{Nitrosomonas) на этой среде, по мере развития, углубляются вследствие рас-
творения углекислого магния образующейся азотистой кислотой
(рис. 126).
4) Омелянский культивировал нитрозного микроба на
кружках фильтровальной бумаги, сложенных пачкой в чашке Петри и
залитых до половины йысоты обычным раствором солей с
прибавлением углекислого магния.
Количественное определе- ^****
ние азотистой кислоты
титрованием минеральным
хамелеонов— см, Вег. d. deutsch,
chem. Ges.,T. 38, 4, стр. 3911,
1905.
2-я фаза. Окисление
азотистой кислоты в азотную
Для выделения иэ почвы
возбудителя второй фазы
нитрификации, так называемого
нитратного микроба (JSitroba-
cter), применяется методика,
аналогичная той, которая уже
была описана для первой Рис- 126- Колонии Nilrosomonas на
Фаотіт Qttcpi_ тттжгрототтт t,v « пластинке из углекислой магнезии. На
азы. Здесь питательным рас- мест? колоний образовались углубления
твором служит жидкость: вследствие растворения MgC03.
Дестиллированной воды 1000 см3
Азотистонатриевой соли 1 г
Безводной соды 1
Поваренной о.оли 0.5
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Сернокислого магния ¦ . . 0.3
Железного купороса (сернокислой закиси
железа) 0.4
По 50 см3 этого раствора наливают в колбы Виноградского,
стерилизуют при 120° 15 мин. и заражают землей.
За ходом нитрификации следят по исчезновению азотистой
кислоты (реактив — см. стр. 184) и появлению азотной кислоты
(реактив: дифениламин и крепкая серная кислота). Пробу с
дифениламином Производят таким образом. В углубление
вышеописанной фаянсовой пластинки (рис. 122) наливают 3—4 капли
крепкой серной кислоты и бросают кристаллик дифениламина. г
Когда он, при помешивании платиновой иглой, растворится,
с края углубления вводят в жидкость петлю культуры. В
присутствии азотной кислоты в жидкости через некоторое время
1 Мо?кно также приготовить реактив смешением:
Крепкой H2S04 100 см3
5%раствора сернокислого дифениламина . 5
10% раствора HG1 5
появляется сине-фиолетовое, до темгосинего, облако. Реакция
доказательна только в отсутствии азотистой кислоты, так как и с
последнею она получается. Если в жидкости содержится HN02, то
для обнаружения HN03 к части жидкости прибавляют несколько
кубических сантиметров 10% раствора NH4C1 и 12/2 часа кипятят
с обратно поставленным холодильником, после чего испытывают
дифениламином.
По мере окисления азотистой кислоты, к жидкости прибавляют
свежие порции ее соли, пользуясь вышеописанным
приспособлением (стр. 184), и исследуют культуру под микроскопом (окраска
карбол-фуксином!).
В таких же условиях производят дальнейшие пересевы (3—
5 пассажей). Когда культура достаточно обогатится специфическим
микробом, приступают к его выделению.
Для выделения нитратных бактерий на кремнекислых
пластинках поступают следующим образом. В стерильных колбочках
приготовляются два раствора: 1-й — солевой раствор того же
состава,который приведен при описании методики выделения нитроз-
ных бактерий, и 2-й — раствор, содержащий соль KN02 в
следующем количестве: на 200 см3 воды — 6 г KN02.
2 см3 1-го раствора, 1 см3 2-го раствора и 0.5 г стерильного
каолина1 (предварительно хорошо растертого) вносят в стерильную
колбочку, кипятят в течение 2—3 мин. и затем переносят на
приготовленный гель. Вращательными и колебательными движені^і-
ми поверхность геля равномерно покрывают порошком каолина.
Подсушивание чашек с кремнекислым гелем, засев и
выделения в чистую культуру проводят так, как указано выше при
описании методики выделения нитрозных бактерий.
Более подробное изучение активности нитрифицирующих
бактерий приведено в статье: Winogradsky, Annal. de l'Inst.
Pasteur, Mars, 1933, № 3.
Хорошей средой для изолирования Nitrobacter служит
предложенный Виноградским нитрат-агар состава:
Водопроводной воды 1000 см3
Азотистокислого натрия 2 г
Соды безводной 1 »
Фосфорнодвукалиевой соли следы
Агар-агара 15 г
Заражают поверхность агара при помощи изогнутой под
углом стеклянной палочки. Недели через две развиваются мелкие,
сероватые, округлые, слегка зернистые колонии. Отвивку из них
лучше всего производить с помощью открытых капилляров. Ими
прикасаются к колониям и затем обламывают концы в
небольших посевных колбочках с жидкой средой вышеприведенного
состава (по 15 см3 в каждой).
1 Каолин вносят на поверхность геля для получения ровной эмалевой
поверхности, на которой лучше заметны развивающиеся колонии
нитратных бактерий.
192
Когда в гараженной колбочке возникает нитрификация
(окисление азотистой кислоты в азотную), проверяют чистоту
культуры высевами на мясопептонный агар или на агар Гейдена.
Количественное определение одновременно HJ\Oa и HINOa дано
в конце книги, в «Приложении».
4. ДЕНИТРИФИКАЦИЯ
Процесс денитрификации возникает при заражении землей,
навозом, сточной водой и т. п. материалами растворов, содержащих
селитру на ряду с безазотистым органическим веществом.
Благоприятен затрудненный приток кислорода воздуха и температура
около 35°. В качестве сред для возбуждения этого процесса были
предложены:
1) Мясопептонный бульон (или отвар соломы) с прибавлением
0.1% селитры.
2) Среда Гилътей (Giltay).
Приготовляют два раствора:
а) Дестиллированной воды 250 см9
Азотиокалиевой соли 2 г
Аспарэгина • 1
б) Дестиллированной воды 500 см8
Лимоннокислого натрия 5 г
Фосфорноодноналиевой соли 2
Сернокислого магния ..... I . - 2
Хлористого кальция 0.2
Полуторахлористого железа следы
Иногда прибавляют еще 10 г глюкоаы.
Растворы (а) и (б) сливают вместе и доводят общий объем
жидкости до 1000 см3. Жидкость должна иметь нейтральную реакцию.
В ней выпадают кристаллы кислой фосфорномагниевой соли
(MgHP04 + ЗН20 в виде иголок).
3) Применяются также среды более простого состава,
содержащие кальциевые соли органических кислот, например среда:
Водопроводной воды 1000 см8
Кальциевой соли органической кислоты 20 г
Азотиокалиевой соли - . &—2
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Ее; и берется виннокислый кальций, то в жидкости накопляется
Bad Statzeriy если же лимоннокислый кальций, — то В. denitro-
fliiorescens. Можно брать также яблочнокиолый кальций, винно*
кислый калий пли натрий и другие соли. Бейеринк заменял соли
органических кислот 2% маннита или глицерина, а ван-Итер-
сон (van Iterson) — 2% фильтровальной бумаги (фильтровальная
бумага растирается в фарфоровой ступке с соответственным
количеством воды до получения кашицы). Азотнокалиевую соль
можно заменить азотнокальциевой. Это имеет то преимущество,
что жидкость не приобретает слишком щелочной реакции при
начавшейся денитрификации»
13 Рук' водствр по микробиологии
Опыты ведутся в залитых доверху сосудах, закрытых
каучуковой пробкой с отводной трубкой. Под пробкой не должно быть
пузырьков воздуха (рис. 127).
Когда через 2 или 3 дня при 35° жидкость забродит, дела.ют
пересев в такую же среду, из нее в новую и т. д. За ходом деии-
трификации можно следить по исчезновению азотной
кислоты, появлению азотистой, аммиака (реактивы — см.
нитрификацию), по выделению газа и пр.
После нескольких пассажей приступают к выделению
специфических бактерий на плотных средах, для чего может служить
любая из вышеприведенных сред с прибавлением агара или
желатины. Вылив зараженную среду в чашку Петри, слой застывшего
агара покрывают стерильным агаром такого
же состава. Денитрифицирующие бактерии
узнаются по пузырькам газа, выделяемым
колониями.
Для выделения морских
денитрифицирующих бактерий служат такие же среды, но
с прибавлением 3% морской или поваренной
соли.
Интересную группу денитрифицирующих
бактерий представляют те, для которых
Рис. 127. Опыт д?ни-
трификащш, по
Лиске.
источником энергии является сера,
окисляемая ими в серную кислоту. Для их
накопления Бейеринк применил следующий раствор:
Речной 1 воды 100 см3
Серного цвета 100 г
Азотнокислого калия 0.5
Фосфорнодвукалиевой сЪли 0.2
Соды 0.2
Мела 20
Через 5—б дней при 30° начинается выделение азота. Делают
пересев в такой же раствор, в котором речная вода заменена де-
стиллированной с прибавлением 0.01% хлористого магния. В этих
условиях размножается Thiobacillus denitrificans, который может
быть выделен на той же среде с агаром.
Имеется группа денитрифицирующих бактерий,
восстанавливающих серноватистокислые соли. Их культивировал Лиске (Ьіеь }
ке) на среде:
ДестиллированкоЙ воды 1000 см3
Серноватистокислого натрия
Азотнокислого калия . . .
Двууглекислой соды . . . .
Фосфорнодвукалиевой соли .
Хлористого магния . . . . .
Хлористого кальция . . . .
Полуторахлористого железа
5 г
5
1
0.2
0.1
следы
1 Бейеринк брал воду из каналов Дельфта (Grabenwasser).
Водопроводная вода не всегда пригодна из-за хлорирования ее.
194
Этим раствором наполняют доверху небольшие эрленмейеров-
ские колбы и закрывают каучуковой пробкой с отверстием, через
которое проходит дважды изогнутая стеклянная трубка,
опущенная в ртуть (рис. 127) и наполненная тем же раствором.
При 25° культура вскоре начинает энергично выделять газ (азот,
углекислый и сернистый газы), а на стенках колбы бактерии
образуют налет. Возбудителем этого процесса является небольшая
бесспоровая палочка.
Колонии денитрифицирующих бактерий легко могут быть
распознаны на нитрат-крахмальном мясопептонном агаре с 0.1%
селитры и 0.5% растворимого крахмала. Для этого одну
половину пластинки с выросшими колониями обливают раствором
йодистого калия и соляной кислотой. Колонии бактерий,
действующих на селитру восстановительным образом с образованием
азотистой кислоты, окружены ореолом синего цвета (выделение
иода из йодистого калия под влиянием азотистой кислоты и
реакция иода на крахмал).Из колоний такого же вида на необлитой
половине пластинки делают отвивки.
. Для обнаружения денитрификаторов мы с успехом
пользовались средой:
ДестиллированноЙ воды 1000 см3
Азо'гнонатриевой соли 5 г
Растворимого крахмала 5
Пептона 1
Йодистого калия 0.5
Фосфорнодвукэлиевой соли 0.5
Сернокислого магния 0.3
Поваренной соли 0.3
/ гар-агара 20
'Берут частицу агара вблизи колоний и опускают в раствор
соляной кислоты. Быстрое посинение указывает на
принадлежность колонии к денитрифицирующему виду.
5. ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА
Клубеньковые бактерии
.Изолирование клубеньковых бактерий производится
следующим образом. Выбирают корень бобового растения с хорошо
развитыми клубеньками и тщательно промывают в нескольких водах
для удаления приставшей земли. Ножницами отрезают
наиболее крупные клубеньки и опускают на 5 мин. в чашку Петри с
0.1% раствором сулемы, а оттуда стерилизованным пинцетом —
в спирт, который удаляют обжиганием на пламени. Тем же
пинцетом клубеньки переносят в стерилизованную чашку Петри и
стерилизованными ножницами (или ножом) разрезают на части.
Из содержимого клубенька платиновой иглой берут небольшую
частичку и ею заражают расплавленный маннитный агар состава:1
1 Можно предварительно разбавить посевной материал следующим
образом. На дно стерилизованной чашки Петри наносят ряд капель стерильной
13*
195
Почвенной внтязкки (стр. 63) ?000 см*
Ма пиита 10 г
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Агар-агара ......... . . . 45
Как всегда, делают несколько разбавлений. Через несколько
дней появляются мелкие, беловатые, студенистые колонии
клубенькового микроба (Bad. radicicola), из которых делают отвивки на
косой агар такого же состава или на жидкую среду. На косо-
застывшем маннитном агаре В. radicicola образует обильный
слизистый налет. При долгом хранении культуры в ней
появляются типичные бактероиды (ветвистые формы).
Из других сред, предложенных для культуры клубеньковых
бактерий, приведем состав еще двух:
а) Среда Вейеринка. Отвар листьев и стеблей
бобового растения с прибавлением: 7% желатины, 0.25% аспарагина
и 0.5% тростникового сахара. Отвар подкисляют яблочной
кислотой (0.6 см3 нормальной яблочной кислоты на 100 см3
раствора).
б) Среда Мазэ (Maze). 100 г белых бобов (белой фасоли)
прибавляют к 1 л водопроводной воды, нагревают в коховском
кипятильнике в течение получаса, избегая оклейстеривания крахмала
(бобы не должны развариваться ). Отфильтровывают и к фильтру
прибавляют 2% тростникового сахара, 1 % поваренной соли и
следы двууглекислого натрия. Вместо последней соли можно
прибавить мел.
На среде Мазэ, особенно с прибавлением 0.2—0.4% кофеина,
клубеньковые бактерии образуют много бактероидов. По Мазэ,
появлению последних способствует также прибавление винной
и лимонной кислоты, по Гильтнеру (НііШег) — экстракта корней
бобовых, по Нейману — мочевины. По данным Шюхтинга (Schtich-
ting), бактероиды образуются при затрудненном притоке
кислорода, например если покрыть штрих на агаре слоем
стерилизованной воды. Вообще же точные условия образования бактероидов
в искусственных культурах еще недостаточно выяснены.
Для испытания вирулентности (прививочной силы)
клубеньковых бактерий поступают следующим образом: семена
соответственного бобового растения обмывают тщательно водой, затем
помещают в 0.1% раствор сулемы 1 на 10—15 мин. и основательно
прополаскивают стерильной водой до исчезновения реакции на
хлор с азотнокислым серебром. Положив семена в чашку Петри
на мясопептонный агар, следует убедиться в стерильности его.
Простерилизованные семена проращивают на влажной
стерилизованной фильтровальной бумаге или, еще лучше, на водном ага-
воды. Частичку клубенька растирают в одной из капель. Иа густой массы
переносят маленькую петлю во вторую каплю и размешивают, затем в третью
и т. д. Из этих разбавлений делают высевы на плотную среду.
1 По Арциховскому, стерилизовать семена лучіве в 1.5% бромной воде
в течение 30—45 мин. Для испытания на стерильность их помещают в
пробирки с бульоном на 4—5 суток. Бульон должен остаться прозрачным»
1&в
ре в чашке Петри. Через 1—2 дня наклюнувшиеся семена
смачивают эмульсией исследуемых бактерий и переносят с соблюдением
необходимых предосторожностей в стерильные сосуды с песком или
с питательным агаром следующего состава: дестиллированной
воды—500.0, MgSO4-0.5, К2НРО4~0.5, Са (POJ, — 0.1, FeS04—
следы, агара — 0 75—1 %.
Проросток разрастается, внедряясь корнями в среду.
Появление клубеньков на агаризованной среде легко обнаружить
вследствие ее прозрачности. В песке клубеньки обнаруживаются
после изъятия растения с корнями. Для этого растение осторожно
вынимают вместе с приставшим песком и отмывают его водой от
корней. г
Для удачи такого опыта требуется большая тщательность
работы. Образование клубеньков происходит при достаточно
сильном освещении проростков. Весной и летом клубеньки
образуются чаще, быстрее и в большем количестве, чем зимой.
Для окраски бактерий внутри клубеньков из последних делают
микротомі.ые срезы, которые затем окрашиваются смесью равных
частей фуксина и метиленовой сини в 1 % уксусной кислоте. Ткань
клубеньков окрашивается в синий цбет, бактерии—в красный,
а слиаистые тяжя остаются бесцветными.
Azotobaeter chroococcum
Для выделения Azotobaeter chroococcum из почвы лучше всего
брать в качестве посевного материала тучную огородную или
садовую землю. Ею обильно заражают налитый тонким слоем в колбу
Вдноградского следующий раствор Бейеринка;
Водопроводной воды 1000 см"
Маннита 20 г
Фосфорнодвукалиевой соли 0.2
Маннит можно заменить декстрином, глицерином, яблочиокис-
лым кальцием (0.5%) и другими солями органических кислот.
Менее пригодны среды о виноградным сахаром, так как в них
часто получает преобладание маслянокислое брожение. Через
несколько дней при 25—30° на поверхности жидкости образуется
жирная пленка, сначала серовато-белая, а затем постепенно
буреющая. Микроскопическое исследование препарата из этой
пленки обнаруживает присутствие большого количества
характерных крупных клеток Azotobaeter с большими слизистыми
капсулами.
Дальнейшие пересевы в такую же среду производят, перенося
частичку пленки в стерильную жидкость. Когда во 2-й или 3-й
генерации исследование пленки обнаруживает достаточное обога-
1 Можно также помещать проростки на тонком слое ваты, положенной
поверх Кноповского раствора в пробирке. В этом случае, однако, нельзя
вырастить большого растения и наблюдать развитие клуоеньков Сиосоо іар-
рисона (Hamsoa) и Бартоу (Bartow) см. «Centralis, f. Bakt.», 11. Abt., т 19,
стр. 264.)
107
щение ее клетками Azotobacter, приступают к его изолированию на
плотной среде такого же состава, но с прибавлением 1.5—2% агар-
агара.
Из молодой культуры, в которой еще не образовалась плотная
пленка, а лишь заметна легкая муть, берут петлей часть
материала и тщательно разбалтывают в небольшом количестве
стерильной воды с примесью песка для лучшего разъединения клеток
Azotobacter. Из этой пробирки материал переносят в другую, а из
* нее — в третью. Поверхность плотной маннитной среды заражают
этим материалом различного разбавления с помощью изогнутой
под углом стеклянной палочки. Через несколько дней при 25° на
поверхности маннитной среды появляются выпуклые матовые
колонии, напоминающие капли крахмального клейстера. На
ряду с ними обыкновенно встречаются тоже выпуклые, но
стекловидные прозрачные колонии Вас. radiobacter (или просто Radio-
bacter) — мелкой палочки, названной так Бейеринком по ее
свойству образовать радиальные сочетания клеток в виде звезд
Предназначенные для отвивки изолированные колонии подвер
гают подробному исследованию. Убедившись при помощи сильной
лупы или слабой сухой системы, что колония однородна и не
сливается с другой, соседней, из нее приготовляют препарат,
который должен состоять только из клеток Azotobacter. Как ни
кропотливы эти предосторожности, они необходимы, так как к
слизистой капсуле Azotobacter часто прилипают посторонние микробы
и отсеянная культура оказывается загрязненной.
При учете Azotobacter в почвах лучшие результаты дает
метод гелевых пластинок, предложенный Виноградским.1
Приготовляют кремнекислый гель следующим образом: соляная
кислота уд. веса 1.19 разбавляется водой до уд. веса 1.10 (удельный
вес определяется ареометром). Растворимое стекло
(кремнекислый натрий) раг^бавляется водой до уд. веса 1.06. К
определенному объему соляной кислоты (уд. вес 1.10) прибавляется при
помешивании равный объем жидкого стекла (уд. вес 1.06). Смесь
хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри. Спустя
несколько часов смесь затвердевает в плотную студнеобразную
ма^су. Приготовленные таким образом гелевые пластинки
промывает в воде до полного удаления хлоридов. Обычно промывка
протекает 2—3 суток в проточной водопроводной воде, затем
промывают в горячей дестиллированно$, сливая последнюю 2—3 раза.
Слив остывшую воду с пластинок в пробирку, производят
реакцию на присутствие в ней хлора, прибавляя 2—3 капли 1%
азотнокислого серебра (AgN03). Появление мути в воде указывает на
присутствие хлора, следовательно пластинки необходимо снова
промывать под краном; если же промывная вода остается
прозрачной, то это указывает на пригодность пластинок к
употреблению.
1 Winogradsky. Etude sur la microbiologie du sol% sur la me-
thode. Ann. Inst. Pasteur, № 4, 1925.
198
Приготовленные гелевые пластинки пропитываются
питательным раствором Бейеринка или Эшбих слегка подсушиваются в
термостате, и затем производится посев комочками исследуемой^
почвы. Комочки величиной в просяное зерно раскладываются
на поверхности пластинок в количестве 40—60. Засеянные чашки
для предохранения от высыхания помещаются в эксикатор и в
термостат при 25°Ц.
Через несколько дней вокруг комочков появляются слизистые
колонии, которые в случаях типичного Azotobacter постепенно
буреют. Микроскопический контроль дает окончательный ответ
на присутствие в выросших колониях Azotobacter.
В некоторых случаях
Azotobacter находится в почве в
латентном состоянии и не
обнаруживается указанными выше у
способами. Виноградский2 в
таких случаях предложил метод
почвенных пластинок, который
заключается в следующем.
В стерильные чашки Коха
помещают определенную
навеску почвы, прибавляют маннит
1:100 или крахмал 5:100,
увлажняют водой до кашицеобразной
массы, тщательно
перемешивают, почву распределяют в
чашки ровным слоем,
поверхность ее Приглаживают лопа- Рис. 128. Колонии Azotobacter chro-
точкой. Чашки с такими поч- ососсит на декстриновом агар? с
мелом.
венными пластинками
помещают в термостат при 25°.
Спустя 2—3 дня на поверхности пластинок появляются
слизистые колонии, которые микроскопируют и определяют.
Среда Эшби г
Дестиллированная вода. , 1000.0 см3
Маннит 20.0 г
Фосфорнодвукалиевая соль ...... 0.2
Сернокислый магний 0.2
Хлористый натрий 0.2
Сернокислый калий 0.1
Мел. 5.0
Для опытов фиксации свободного азота предпочтительнее
телевые пластинки, пропитанные или раствором Бейеринка, или
1 A s h b у. Some observation on the assimilation of atmospheric by a
free living soil organism. Azot. chroococcum of Beijerinck. Journ. Agr.
Sc., v.% 1907.
aWinogradsky et Zieniiecka. Sur la pouvoir fixateur
;des terres. Ann, In§t, Past,, t. 63, 1928.
X99
почвенным раствором (стр. 63), или раствором с солями гумино-
вой г или пектиновой кислот (см. гл. VIII, п. VI). На 150 см3 ман-
нитной среды берут 5 см3 экстракта или 0.1 г вышеназванных
солей.
Лучшей средой для пигментообразования Azotobacter служит
декстриновый агар с мелом (рис. 128).
Clostridium Pasteurianuxn
Для накопления Clostridium Pastearianum Виноградским
предложена следующая среда:
Дистиллированной воды 1000 см3
Виноградного сахара 20 г
Фосфорнодвукалиевой соли Я
Сернокислого магния ... . . - 0.5
Поваренной соли ^
Сернокислой закиси железа ? следы
Сернокислого марганца , . )
100 см3 этой жидкости наливают в колбу Виноградского
(рис. 121) и к ней прибавляют около 4 г мела. В виду
содержания сахара стерилизация производится при невысокой
температуре (106—110° в течение 30—45 мин.).
Для заражения служит комок земли (лучше пастеризованной)
величиной с фасоль, который бросают на середину дна и не
разбалтывают в жидкости. При 25—30° через несколько дней
при спокойном стоянии сосуда поверхность жидкости
затягивается тончайшей пленкой аэробных бактерий, и одновременно
со дна колбы начинают подниматься пузырьки газа—признак
наступившего маслянокислого брожения. Газоотделение
начинается от комка земли и постепенно распространяется на всю
жидкость, так что вскоре вся поверхность ее покрывается
сплошной пеной выделяющихся газов, а находящийся на дне
мел склеивается бактериальной слизью в сплошную корку.
1 Для приготовления гуминовой кислоты просеянную через тонкое сито
вемлю в течение недели обрабатывают 1% НС1. время от времени сливая е?
и заменяя свежей Слив кислоту окончательно, заливают землю дестиллиро-
ванной водой, затем, слив ее, нейтрализуют и обрабатывают 1% раствором
соды Образующаяся при этом натровая соль гуминовой кислоты переходит
в раствор, окрашивая его в бурый цвет. Отфильтровывают и фильтрат
осаждают разбавленной НС1. Снова отфильтровывают, промывают водой и вновь
растворяют в 1% соде. Повторяют эту операцию еше два раза, всякий раз
следя за тем, чтобы при растворении гуминовой кислоты избегать щелочи
и оставлять часть осадка н?растворенным. Приготовленная описанным
способом гуминовая кислота содержит лишь следы окиси железа и кремнекис-
лоты, нацело растворяясь в щелочах.
Аммиачную соль гуминовой кислоты Мюнц (Muntz) и Ленэ (1?аіпё)
приготовляют следующим образом: садовую землю обрабатывают соляной
кислотой для растворения известковых солей и выделения свободной гуминовой
кислоты Осадок промывают водой до полного удаления хлористого кальция
и затем растворяют в небольшом избытке аммиачной воды. Отстоявшуюся
жидкость осторожно сливают и испаряют остаток аммиака в вакууме над
серной кислотой.
20О
N.
В то ж? время разводка начинает надавать аапах масляной
кислоты или ее эфиров (запах сладких рожков, яблок и т. п.).
Подвергнув разводку микроскопическому исследованию,
находим, что бактериальное население пленки и осадка не
одинаково. Пленка состоит из скопления аэробного вида (если посев
был пастеризован, то спорового), а в осадке мела мы встречаем
массовое развитие Clostridium Pasteurianam в виде характерных
веретенообразных клеток с продолговатою спорой внутри,
дающих гранулезную реакцию с иодом.
Дальнейшие пересевы производятся всякий раз заражением
частичкой мела со дна предыдущей колбы. Когда культура
достаточно обогатилась клостридием,
приступают к его изолированию
на смазанных мелом ломтях
картофеля (стр. 54) в анаэробных
условиях. Удобнее всего
пользоваться для этого культурой в
безвоздушном пространстве
(эксикатор с выкачанным воздухом —
стр. 148).
Дней через 5—7 при 30—35° на
поверхности картофеля
появляются выпуклые, желтоватые
колонии, пронизанные пузырьками
газа (рис. 129). Вскрыв эксикатор и
убедившись пу*$м
микроскопического исследования препаратов,
приготовленных из отдельных
колоний, что они принадлежат кло-
стридию, делают отвивки на
стерильные пробирки с ломтями
картофеля, смазанного на поверхности мелом. На картофеле кло-
стридий нередко образует инволюционные формы, временно
теряя способность к спорообразованию.
Поддерживать споровой материал можно, засевая колбы Ви-
ноградского смесью клостридия с каким-нибудь бесспоровым
аэробным видом, например Bad. fluorescens или Azotobacter
chroococcum. Когда нужно возвратиться к чистой культуре, это
достигается пастеризацией подобной искусственной смеси (при
условии образования спор клостридием).
Рис. 129. Культура Clostridium
Pasteurіапипг на ломте
картофеля, смазанном мелом. Кратерооб-
раэиый вид колоний.
глава vm
КРУГОВОРОТ УГЛЕРОДі
1. СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ
Исходным материалом для выделения дрожжевых грибков
могут служить самые различные материалы: продажные
прессованные дрожжи, зрелый виноград, ягоды, сладкие фрукты, изюм,
осадки на дне бутылок легкого вина и пина, хлебные закваски,
слизистое истечение деревьев, различные соленья, варенье и т. д.
Ими заражают солодовое сусло, водный раствор мальцэкстракта,
сок винограда, ягод, настой изюма,1 0.1% раствор мальтопепто-
наа с 10% глюкозы или какую-либо другую сахаристую
питательную среду. При 25— 30° Ц брожение быстро возникает, н в
жидкости обильно размножаются дрожжи.
Накоплению дрожжевых грибов в культурах благоприятствуют
следующие их особенности:
1) способность развиваться при сравнительно невысоких
температурах, мало подходящих для большинства бактерий;
2) возможность роста в анаэробных условиях;
3) выносливость к сравнительно высокому содержанию
этилового спирта в среде (до 15%), препятствующему развитию
посторонних видов;
4) хороший рост в слегка кислых средах, тогда как для
большинства бактерий благоприятна слегка щелочная реакция сред.
Приведем состав ряда синтетических сред; предложенных
для культуры дрожжей: (см. стр. 203).
На синтетических средах с азотом в виде аммонийных солей
или даже асиарагина дрожжи, особенно пріі небольшом посеве,
развиваются очень слабо. В настоящее время это объясняется
недостатком так называемых ростовых веществ (Wuchsstoff),
1 Его готовят по Коху следующим образом: 400 г сладкого изюма
обливают 1300 см3 воды и оставляют на і—2 дня на холоду, после чего изюм
растирают в ступке и жидкость оставляют с ним еще на несколько дней.
Жидкость затем отжимают, процеживают через бумажный фильтр,
прибавляют к ней 0.25 г хлористого аммония и разливают по сосудам, стерилизуют.
2 Продажный мальтопептон представляет собою экстракт корней
проросших зерен ячменя. 1 часть сухих корней кипятят в течение 4 час. с 15—20
частями воды и отфильтровывают. Полученная вытяжка во Франции носит
название «eau de touraillons».
202
а) Среда Ганзена (Hansen) г) Среда Гайдука (Hayduck)
Дестиллированной воды . ЮОО см3 Водопроводной воды . . » 1000 ш*
Виноградного сахара или Тростникового сахара . . йЕОО г
мальтозы 50 г Аспарагина 2.5
Пептона до Фосфорнооднокалиевой со-
Фосфорнооднокалиевойсо- ли ... - і.О
ли . . , 3 Сернокислого магния . . . 0.3
Сернокислого магния . .' 2-5 д) Среда Геннеберга (Henucberg)
б) Среда Леберле-Вилля (Leberle- Дестиллированной воды . а000 см3
Will) Тростникового сахара . . 350 г
Дестиллированной воды . іООС см3 -Асларагина 3
Виноградного сахара . . 20 г Лчил^ пептона **¦¦•• ь
Пептона 20 Фосфорнооднокалиевой со-
Фосфорнодвукалиевой соли 4.5 ^ ли о
Сернокислого магния . . . 2.а Сернокислого магния . . . 2
Фосфорнокальциевой соли Мела ь
(СаРН04) ....... 0.5 е) Среда Геннеберга с аммонийной
ч л ™ •-. /х СОЛЬЮ
в) Среда Манера (Mayer) ¦ дес,ГИЛЛИрованной воды . 1000 см»
Дестиллированной воды . Ю00 см3 Тростникового сахара . . 150 г
Мясного экстракта . . . следы Фосфорноодноаммониевон
Виноградного сахара . . fl5 г соли 2
Фосфорнодвукалиевой соли 5 Фосфорнооднокалиевой со-
Сернокислого магния. . , 5 ли 2
Фосфорнокислого кальция 0.5 Сернокислого магния ... 3
Азотнокислого аммония , 0.75 Мела 5
прибавление которые к синтетическим средам сильно улучшает
развитие дрожжей (см. ряд исследований Ниль-Нильсена (Niels-
Nielsen) в «Compt. nmd. labor. Garlsberg», за 1936/37/38 годы
там же приводится и литература). Источником ростовых веществ
являются различные растительные отвары. Обычно для
улучшения синтетических Питательных сред пользуются солодовым
суслом, которое добавляется в количестве до 2 см3 на 100 см3 среды
(сусло крепостью 10—Ц° Баллинга) или дрожжевой водой — до
4 см3 на 100 см3 среды.
В качестве плотных сред для изолирования дрожжевых
грибов могут служить вышеперечисленные жидкости с прибавлением
2% агара или 10% желатины. Особенно хороши солодовые среды.
Пригодны также МПЖ и МПА с 1% виноградного сахара.
Хорошо растут дрожжи на среде состава:
Дестиллированной воды 1000 см"
Виноградного сахара 50 г
Мальц-зкстракта 10
Агар-агара іЪ
Очень ускоряет рост дрожжей и вызываемое ими брожение
прибавление к средам различных коллоидов, как: торф,
фильтровальная бумага, кровяной уголь, садовая земля, гуминовокислый
натрий (0.1%) и т. п.
Розовые дрожжи обычно изолируют из воздуха. Чашку с
плотной, сахарсодержащей средой оставляют некоторое время откры-
203
той на воздухе и затем выдерживают ее при 35°. Отвивки
производят из появившихся розовых колоний.
Для накопления пленочных дрожжей, относяпщхся к родам
Mycoderma, Pichia и Hansenula (Willia), Бейеринк рекомендует
разбавленный раствор уксусноаммонийной соли со следами
фосфорнокислого калия. На этой среде пленочные дрожжи получают
преобладание, образуя сухую и тусклую пленку на поверхности.
Их клетки имеют удлиненную форму и содержат по несколько
светопреломляющих зерен. Для дальнейшей культуры микодерм
Бейеринк предлагает среду:
Водопроводной воды 2000 см1
Виноградного сахара 100 г
Фосфорнокислого аммония 2
Хлористого калия 0.1
Сернокислого магния 0.05
Другой способ для накопления пленочных дрожжей
предлагает Линднер (Lindner). Смоченными ячменными зернами
наполняют широкую стеклянную трубку и, легко закрыв ее ватной
пробкой, оставляют при комнатной температуре. Через некоторое
время на поверхности з^рен появлялись выцветы пленочных
дрожжей в виде розеток, издававших приятный фруктовый запах.
Для накопления дрожжевых грибов, находящихся в рыночном
молоке, — Петерсон (Troili Petersson) к 100 см3 молока прибавляет
2 см3 3% раствора перекиси водорода (в 10 раз разбавленного Рег-
hydrol) и ставит молоко при 37°. Оно при этом не закисает, а в нем
вскоре появляется дрожжевой запах и начинается брожение
(иногда и растворение казеина). Дрожжи затем изолируются обычным
способом (см., например, способ Гансена и Линднера, стр. 77
и 78).
Споры образуются у дрожжей при температуре около 25е и
в условиях недостаточного питания.
Діри исследовании дрожжевого материала его сначала
подвергают микроскопическому анализу: определяют вид и величину
дрожжевых грибов, процент отмерших клеток, наличие
плесневых грибов и бактерий. Устанавливается, какого рода брожение
(верховое или низовое) и как скоро возникает в пивном сусле при
25°Ц после заражения исследуемым материалом.
О применении ауксанографического метода для определения
отношения дрожжей к различным углеводам уже упоминались
в другом месте (стр. 166).
На гипсовых блоках материал исследуют на споры (см. 112).
После выделения чистых культур дрожжей приступают к их
изучению. Прежде всего устанавливают, принадлежат ли
выделенные культуры к спорогенным или аспорогенным дрожжевым
организмам. Большинство видов спорогенных дрожжей
относительно легко образуют споры на солодовом агаре через 3—5 -7 дней
при 25°Ц. Если же на этой среде споры не обнаруживаются, то
делают посевы на агар Городковой, на щелочной мясопеп-
20А
тонный агар, морковь, картофель и на гипсовые блоки (стр. 112).
Форма спор, способ их образования и прорастания характерны
для различных родов дрожжей. При определении вида необходимы
добавочные исследования (см. проф. А. П. Ситников,
Микробиология брожения, Москва, 1936; A. Guilliermond,
The yeasts, New York, 1920; А. К 1 о с k e г, Die Garungsorgaaia-
men, Berlin, 1924; StellingDekker,
Die Sporogenen He fen. Amsterdam, 1931).
При определении аспорогенных дрожжей
можно пользоваться монографией J. Lo d-
d е г, Die anaskosporogenen Hefen,
Amsterdam, 1934, где указана также обширная
литература по этой группе организмов.
После установления вида приступают к
более подробному изучению отдельных
свойств их, могущих быть использованными
для практических целей (в виноделии, при
Производстве кормовых дрожжей и пр.).
Приемы лабораторных исследований,
связанных с биологическим контролем
производств, весьма разнообразны и не могут быть
изложены здесь, тг±і как имеются
специальные руководства на русском языке по
соответствующим отраслям промышленности.
Вырастающие колонии дрожжей
исследуют макро- и микроскопически. Отдельные
колонии высевают в пивное сусло и
определяют характер брожения (верховое
или низовое) и количество образовавшегося
спирта.
Для пивоварения важно установить,
имеется ли примесь диких дрожжей к
культурным. Дрожжи для этого, по Ганзену,
культивируют при 25° Ц (верховые дрожжи при 12°) на пивном сусле
в течение суток. Берут часть жидкости сверху, где
преимущественно скопляются дикие дрожжи, и заражают свежее сусло.
Через сутки делают высев на гипсовые блоки (при 25 и 15° Ц).
Если в течение 3 суток образовались споры, это указывает на
присутствие диких дрожжей.
Для обнаружения ничтожной примеси диких дрожжей
пользуются культурой на 10% тростникового сахара с 4% винной кис*
лоты при комнатной температуре. В 4 суток делают 4 пересева
на такую же среду. Из последней культуры заражают колбу с
пивным суслом. Через сутки этим материалом засевают гипсовые
блоки при 25 и 15° Ц.
Для демонстрации брожения перед аудиторией может служить
простой прибор. Небольшую колбу наполняют доверху сахарсо-
держащей жидкостью и после заражения плотно закрывает кау-
Рис. 130. Прибор для
оп ределения силы
брожения и высоты
подъема жидкости:
а — бродящая жидкость, 6—
пробирка с раствором
фуксина, с — трубка., в которую
вытесняется раствор
фуксина.
чуковой пробкой, через которую проходит открытая с двух кон
цов стеклянная трубка. Нижний конец ее доходит почти до дн<
колбы, а верхний высоко выдается над пробкой. Когда начнете?
брожение, выделяющиеся газы, собираясь над пробкой, вытес
няют жидкость из колбы в трубку, и уровень жидкости в ней
поднимается. Другое приспособление изображено на рис. 130.
Определение этилового спирта. Для
обнаружения ничтожных количеств его удобен способ Клокера (Кіо-
скег). В пробирку наливают 5 см3 исследуемой жидкости и
закрывают каучуковой пробкой с проходящей через нее стеклянной
трубкой в 80 см длиной и в 3 мм шириной (по наружному диаметру).
Пробирку в наклонном положении медленно нагревают на сетке,
избегая сильного вспенивания жидкости и толчков. В присутствии
спирта в трубке образуются круглые маслянистые капли («слезы»),
стекающие по трубке обратно. Чем
меньше спирта, тем выше в трубке
'обнаруживаются эти капли.
Пользуясь этим способом, можно открыть
такие ничтожные количества спирта,
как 0.002% п даже 0.001%.
Йодоформе иная проба
по Мюнцу (Miintz). Около
100 см3 жидкости медленно
перегоняют до тех пор, пока не отгонится
10 см3. К этому перегону
прибавляют немного соды (около 2 г) и 0.1 г
иода в виде мелкого порошка.
Нагревают при взбалтывании на водяной
бане при температуре в 60° до
растворения иода. При охлаждении
выпадают желтые кристаллы йодоформа,
характерные по запаху и виду (шестиугольные таблички, рис. 131).
Можно их перекристаллизовать иа эфира. Из летучих
органических веществ иодоформенную пробу дают также ацетон и
альдегида. г По Бредеману, к перегнанному раствору спирта
прибавляют раствор едкого кали до явно щелочной реакции, нагревают
жидкость до 50° и затем приливают разбавленный раствор* иода
(можно брать люголевскийраствор) (стр. 102). В присутствии
значительных количеств спирта быстро образуется обильный осадок
желтых кристаллов йодоформа; если же спирта следы, то
слабый осадок образуется лишь после двухчасового стояния
жидкости.
Рис. 131. Вид кристаллов
йодоформа под микроскопом.
1 В их присутствии можно убедиться пробой с фуксиносернистой
кислотой (реактив Шиффа). Последняя готовится пропусканием сернистого газа
в раствор фуксина до обесцвечивания. В присутствии альдегида раствор
краснеет. Альдегиды характеризуются также восстановлением рммиачного
раствора серебра, из которого при нагревании выделяется металлическое сереоро.
Другие реакции на альдегид см. «Приложение», стр. 372.
200
Другую пробу на этиловый спирт производят прилитием к
испытуемой жидкости нескольких капель разбавленной серной
кислоты и небольшого кристаллика двухромовокислого калия.
При слабом нагревании выделяется уксусный альдегид,
узнаваемый по запаху и по тому, что он чернит зажатую в горлышке
сосуда бумажку, смоченную аммиачным раствором серебра
(готовится пропитыванием ленты фильтровальной бумаги раствором
азотносеребряной соли в крепком аммиаке).
Если к 1 см3 спиртовой жидкости прибавить 3 см3 крепкой
HN03, содержащей в растворе 0.5% К2Сг207, то при комнатной
температуре через несколько минут появляется сине-фиолетовое
окрашивание. Этой реакцией обнаруживается присутствие спирта
и альдегида, но не ацетона.
Упомянем еще о чувствительной пробе Вертело с хлористым
бензоилом. 1 см3 исследуемой жидкости встряхивают с очень
небольшим количеством хлористого бензоила и с избытком слабого
раствора едкого натра до исчезновения запаха хлористого бензоила.
Вместо него в присутствии этилового спирта развивается
характерный запах этилового эфира бензойной кислоты.
Для количественного определения спирта в очень
разбавленных растворах применяется часто способ Никлу (Nicloux),
основанный на окислении спирта хромовой смесью [см. Bull, de la
Soc. Ghimique de Paris (3 serie), t. 35, p. 330, 1906; см. также
«Handbuch der Biochem. Arbeitsmethoden», т, 2, стр. 7].
Количественное определение этилового спирта методом
иодирования см. «Ztschr. f. physiol. Ch.», т. 50, стр. 22.
В последние годы Нейбергу удалось вызвать разложение
сахара дрожжами в двух новых направлениях:
1) Брожение с образованием уксусного альдегида и глицерина
по уравнению:
СвН12Ов = СН3• СОН 4- С3Н8Оа + С02.
Брожение это возникает, если к питательной среде прибавлен
достаточный избыток (2—3%) щелочной или щелочноземельной
соли сернистой кислоты (Na2S04, NaHS03, CaS03H др.). Соль
вступает в соединение с альдегидом, препятствуя восстановлению
последнего в этиловый спирт. Выход альдегида и глицерина зависит
от количества прибавленной соли.
Нейберг предложил постановку опыта для лекционного
демонстрирования этого типа распада сахара. К 20 см3 10% раствора
тростникового или виноградного сахара, помещенного в широкой
пробирке, прибавляют (равномерно распределяя встряхиванием)
2 г сернистокислого кальция 1 и 2 г прессованных дрожжей.
Контрольная пробирка остается без прибавления CaSOj. Через
V4—х/2 часа при 30—35° в жидкости образуется альдегид. Для его
1 Если в лаборатории нет CaS03, его можно заменить смесью
Na3S034-CaCl2.
207
обнаружения берут пипеткой 3 см3 не отфильтрованной жидкости
и прибавляют 0.5 см3 4% раствора нитропруссидного натрия и
2—3 см3 3% раствора пиперидина. Появление темноголубого
окрашивания указывает на содержание в жидкости альдегида. В
контрольной пробирке он не обнаруживается.
2) Брожение с образованием этилового спирта, уксусной
кислоты и глицерина по уравнению:
X6H1,Oe+H,0 = CJHeO + C,H4Ot + 2C,HB0I + 2C01
Брожение возникает в присутствии углекислых, борнокислых
и фосфорнокислых солей, окиси магния и гидрата окиси цинка.
2. УКСУСНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Возбудители этого брожения весьма распространены в природе,
часто встречаясь в пыли, на поверхности зрелых ягод винограда,
в закисшем пиве и вине и пр.
Брожение возникает, если оставить при 30—35° открытый
сосуд со слегка подкисленным уксусной кислотой пивом, к которому
прибавлено 3—4% тростникового сахара, или со слабым
виноградным вином. Через сутки или двое поверхность жидкости
покрывается тонкой серовато-белой пленкой, состоящей из
уксуснокислых бактерий, за деятельностью которых можно следить путем
ежедневного титрования пробы жидкости N/10 NaOH. Появление
Фого или другого вида вависит в значительной степени от
температуры.
При температурах 25—35° развиваются обычно В. rancens
(на пиве чаще всего появляется именно этот вид), В. Pasteurianum
и др. При невысоких температурах (не выше 20—22°) развивается
иногда В. асеіі, В. rnelanogenum, В. хуііпит и др., но чаще всего
в этих условиях поверхность покрывается сплошной белой,
матовой, толстой пленкой Myooderma (пленочные дрожжи), которая
вскоре начинает морщиться и поднимается на стенки сосуда.
Так как некоторые виды Mycoderma способны к окислению
уксусной кислоты до углекислоты и воды и так как она быстро
захватывает поверхность, не давая развиваться уксуснокислым
бактериям, она является нежелательной примесью в описываемых
опытах.
Чтобы устранить развитие Mycoderma, пользуются ее плохим
ростом на кислых средах при высокой температуре. Чем выше
температура опыта, тем ниже может быть кислотность среды: при 20°—
20%, а при дальнейшем повышении температуры на 5° можно
уменьшить кислотность на 5%, так что при 35° достаточна уже
кислотность в 5%, а при 40° можно и вовсе не прибавлять кислоты.
Однако надо помнить, что для большинства уксуснокислых
бактерий оптимум их роста, а для многих и максимум, лежит ниже
43°. Развитие Mycoderma задерживается также прибавлением
к жидкости этшюаого спирта (до 5%).
208
Особенно интересны о производственной точки ерения виды
бактерий, участвующие в производстве уксуса из вина (орлеанский
способ) и из спирта [скорый способ Шюценбаха (Schuzenbach)].
К первым относится В. orleanense и В. xyhnoides. Выделение
их можно провести на разведенном суслом виноградном вине или
на сусле со спиртом из пленки чанов, работающих по орлеанскому
способу. Рост начинается островками, затем сливающимися и
дающими довольно плотную пленку. Выделение проводится на
сусловом агаре со спиртом.
Ко вторым принадлежат 5. curvum и В. Schuzenbachi,
выделяющиеся из чанов, работающих по скорому способу. Для
выделения их необходимо предварительно поставить
накопительную культуру. Для этого стружка из производственного чана
асептически вносится в колбу Эрленмейера со стерильным
пивным нехмельным суслом (6° Баллинга), к которому прибавлено
3% спирта.
Жидкость наливается на 1.5—2 см так, чтобы стружка
высовывалась из жидкости. Развитие пленки идет медленно. Появляется она
обычно отдельными островками. После появления пленки
производят посев из нее на чашки Петри с сусловым агаром со спиртом.
Имеются ли где-либо в природе бактерии скорого способа или
они представляют собой «культурные расы», — до сих пор точно
не установлено.
В. xyhnum является вредителем производства при работе но
скорому способу, так как она образует слизь, закупоривающую
промежутки между стружками и мешающую аэрации и, кроме
того, очень легко окисляет дальше образовавшуюся уксусную
кислоту до С02 и Н20. Она характеризуется чрезвычайно плотной,
кожистой, толстой слизистой пленкой и может быть выделена или
из чанов уксусных заводов или описываемым далее способом.
К смеси 1 части хорошего красного или белого вина с 2 частями
воды прибавляют 1 часть винного уксуса х и ставят жидкость при
25—30°. Через некоторое время на поверхности жидкости
появляются слизистые островки. Изолировать микроба можно на той
же среде (или на 0.5% дрожжевом экстракте) с прибавлением 3%
глицерина и 1.5% агар-агара. Из колоний делают высев на
разбавленное водою вино с прибавлением 3% глицерина (высота слоя
жидкости 4.5 см). При 28—29° жидкость постепенно покрывается
толстой прозрачной слизистой зооглеей В. хуііпит. Через несколько
дней среда начинает энергично восстановлять фелингову жидкость
вследствие окисления глицерина в диоксиацетон СН3ОН-СО«
• СН2ОН. Кетон этот восстановляет фелингову жидкость даже на
холоду.
Рост уксуснокислых бактерий наблюдается на дрожжевой воде +
6—7% спирта. Стерилизуют при 110° в течение 20 мин. Потеря
спирта при этом небольшая.
1 Так как в нем обычно встречается В. хуііпит.
14 йуководство по микробиологии -ЯОЭ
Геннеберг рекомендует следующие синтетические среды для
культуры уксуснокислых бактерий:
1) Дестиллированной воды 1000 см*
Виноградного сахара 30 г
Пептона 10
Мясного экстракта НО
Этилового спирта 40 см8
2) Дестиллированной воды 5000
Виноградного сахара 20 г
Сернокислого аммония 3
Фосфорнооднокалиевой соли .... 2
Сернокислого магния 2
Этилового спирта 20 см8
Однако далеко не все уксуснокислые бактерии хорошо растут
на этих растворах.
За ходом окисления спирта можно следить на специально
поставленном опыте. В эрленмейеровскую колбу, емкостью около
250 см3, наливают 50 см3 прозрачной воды и, после стерилизации,
прибавляют 5% спирта и 1% уксусной кислоты. Заразив чистой
культурой уксусных бактерий и поместив колбу в термостат,
следят затем за исчезновением спирта и нарастанием
кислотности. Когда весь спирт окислен, содержание уксусной кислоты
начинает понижаться вследствие окисления ее уксуснокислыми
бактериями.
Плотными средами для изолирования уксуснокислых
бактерий могут служить желатина и агар на пивном нехм?ланом сусле,
крепостью 6° Б^ілинга, с 2—3% спирта.
Вместо сусла можно также применять слабое вино или пиво.
Так как при нагревании вина и пива часть спирта
улетучивается, то после стерилизации на 100 см3 жидкости прибавляют
2—2.5 см3 этилового спирта.
При изолировании следует для посева пользоваться
культурами, в которых поверхностный рост появился, но еще не
образовалась сплошная пленка и которые уже издают явственный запах
уксусной кислоты.
Одним из характерных признаков уксуснокислых бактерий
служит внешний вид пленок и их отношение к окраске иодом.
Так, пленки В. Pasteurianum и В. Kiitzingianum синеют от ио^а,
а В. acetic В. rancens и др. принимают желтую окраску. Однако
пленки старых культур иногда теряют способность окрашиваться
иодом в синий цвет.
В. Pasteurianum на жидких средах образует сухую
морщинистую пленку; В. ascendens — тонкую, сухую пленку, высоко
поднимающуюся на стенки сосуда; В, Kutzingianum — гладкую и
слизистую, подымающуюся по стенкам сосуда; В. теіі — такую же
пленку, но не всползающую на стенки; В^хуііпит образует на
поверхности спиртовой жидкости толстую слизистокожистую
пленку, дающую реакции на цедапод?ву.
210
Однако необходимо указать, что характер шт?нки сильно
зависит от среды: на пиве, например, пленка часто имеет совсем
другой вид, чем на сусле со спиртом.
По своему химизму уксуснокислые бактерии представляют
весьма ценный реактив для выполнения целого ряда
окислительных реакций.
Интересующихся вопросом отсылаем к следующим статьям:
Bertrand («Ann. de Ch. et de Physique», ser. 8, T. 3, стр. 181, 1904),
Waterman («Centralbl. f. Bakt.», 2, т. 38, стр. 451, 1913), Hermann
u. Neuschul («Bioch. Zeitschr.», т. 233, стр. 129, 1931), Virtanen ц,
BMund («Bioch. Zeitschr.», т. 169, 1926).
Для изучения и характеристики чистых культур
уксуснокислых бактерий можно предложить следующую программу:
1) Форма колоний в чашках Петри на сусловом агаре или
желатине со спиртом.
2) Морфология бактерий: длина ж ширина особей, наличие
цепочек, наличие инволюционных форм (при каких условиях).
3) Рост в капельной культуре (движение).
4) Развитие пленки на сусле со спиртом и характер ее. Окраска
ее иодом. Наблюдение за тем, остается
ли жидкость прозрачной или ОТаНОВИТ-
5) Максимальное начальное
количество спирта, выносимое культурой.
(Различные количества спирта прибавляются
к суслу крепостью 6° Баллинга).
6) Способность бактерий к
дальнейшему окислению образовавшейся
уксусной кислоты. Следя за развитием
культуры в предыдущем опыте и проводя
периодическое титрование
образовавшейся кислоты, можно видеть, что после
образования возможной при данном количестве спирта
концентрации кислоты бактерии начинают потреблять кислоту, иногда до
полного ее уничтожения. Однако это потребление возможно только
в определенных пределах рН, характерных для каждого вида
бактерий.
7) Максимальное количество образуемой культурой кислоты.
К культуре на сусле с небольшим количеством спирта (5—7%) по
мере потребления последнего добавляются новьіе порции спирта, г
за нарастанием кислотности следят периодическим титрованием.
Прекращение нарастания кислотности или уменьшение ее
характеризуют использование спирта.
^г
Ж
Рис. 132. Прибор для
исследования разложения или
окисления летучих
органических веществ.
1 Прибавлять спирт лучше всего небольшими порциями через тонкую
трубочку, вставленную в ватную пробьу колбочки и опушенную до дна, так
как иначе спирт всплывает на поверхность и может повредить пленку
(наблюдение Пасте ра).
14* 211
Прибавление спирта вызывает повышение кислотности, пока
fie будет достигнут максимум, характерный для данного вида.
8) Температурный оптимум и максимум роста и кислотооб-
разования.
9) Окисление различных углеводов и спиртов (2% углевода
на дрожжевой воде); титрование через 1%—2 месяца.
Необходим незараженный контроль. Надо помнить, однако, что некоторые
гещества, обычно применяемые в наборе углеводов и спиртов,
не дают кислых продуктов при окислении (глицерин — диокси-
ацетон; маннит —левулезу, которая многими бактериями дальше
не окисляется, и т. д.).
10) Вкус и запах получаемого уксуса.
Для опытов с летучими веществами, как низшие спирты
(метиловый и этиловый), альдегиды, кетоны (ацетон и др.)і может
служить следующее приспособление (рис. 132). В одну из банок
наливают летучее вещество, а в другую — минеральный питательный
раствор, зараженный землею, навозом, илом и т« п. или чистой
культурой исследуемого вида.
8. ЛИМОННОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Лимонная кислота образуется различными грибами. Особенно
Сильно выражена способность накапливать лимонную кислоту
у Aspergillus mger. Его можно выделить с разных объектов,
лучше с заплесневелых фруктов, ягод и сухих фруктов и т, д.
[7, стр. 25)].
Различные штаммы Asp. niger обладают очень разной
способностью в отношении образования лимонной кислоты (1, 2, 6, 7).
По отдельным наблюдениям у грибов, хорошо образующих
лимонную кислоту, спорообразование на жидкой питательной среде
наступает относительно поздно, в большинстве случаев на 8—10-й
день. Такие штаммы образуют темноокрашенные конидии на
высоких конидиеносцах [1, стр. 114; 7, стр. 25, 10, 1; 8, стр. 130].
Плесневые грибы удобно выращивать и сохранять на агаре
с пивным суслом или на моркови.
Для поддержания способности грибов образовать лимонную
кислоту необходимо сохранять гриб после начала
спорообразования при температуре от 0 до 5°.
Для получения лимонной кислоты с помощью «готовых
пленок» Asp. mger нужно вырастить пленку гриба на питательном
растворе, в состав которого входят все питательные вещества в
избыточном количестве, например следующего состава:
NH4NOa 0.3%
КН2Р04 0.1
MffSO47H,0 0.05
FeCl3 . . . э , . . 0.003
ZnS047H20 0.005
Сахара . . . , .... -5
212
Питательная среда разливается по колбам в таком
количестве, чтобы высота слоя жидкости в колбе была 2—2.5 см
(при работе со сменными растворами удобны колбы
эллипсоидальной формы с тубусом внизу, предложенные проф. Бутке-
вичем).
Колбы закрываются ватными пробками и стерилизуются
обычным способом.
Для достижения быстрого и равномерного развития гриба в
питательный раствор необходимо внести достаточное количество
спор и равномерно распределить их по поверхности.
Оптимальная температура для развития разных штаммов
Asp. niger колеблется от 25 до 35°.
Продолжительность роста пленок на питательном растворе
для отдельных штаммов Asp. niger будет разной, так как от
срока выращивания их на питательном растворе указанного
состава зависит активность пленок в отношении образования
лимонной кислоты. Обычно достаточно выращивать пленки 2—3
суток [2].
По истечении данного времени питательный раствор сливается
и заменяется на 20% раствор сахара. Длительность пребывания
пленок на сахарном растворе зависит от способности гриба
накоплять лимонную кислоту.
Лимонная кислота может накапливаться и на питательном
растворе, если ограничить рост пленки путем уменьшения в среде
азота или фосфора и увеличения содержания сахара. Ограничение
развития пленок недостатком калия или магния не вызывает
накопления лимонной кислоты. Некоторый избыток этих элементов
является необходимым условием образования и накопления
кислоты.
В качестве питательной среды для выращивания гриба и
накопления лимонной кислоты можно применять среду следующего
состава [3]:
NH4NOa 0.15%
или KNOs 0.36
или NaN08 0.3
KHtP04 A 0.02
Мк&047НлО У- 0.01
Fed, 0 003
ZnSO47IIa0 0.005
Сахар 20
Некоторые штаммы А$р. niger сохраняют способность
образовать лимонную кислоту продолжительное время, поэтому из-под
пленок таких грибов можно слить первый сброженный раствор
и заменить новым раствором сахара. Эту операцию можно
повторить с успехом несколько раз [2J.
Обычно в культурах Asp. niger на ряду с лимонной кислотой
образуются щавелевая и глюконовая кислоты. Количество этих
Ш
кислот в е'реде зависит от применяемого штамма Asp, niger и от
условий опыта. Известно, что хорошие кислотообразователи при
кислой реакции среды накапливают лимонную кислоту. При
сбраживании ими 20% раствора сахара в течение б—8 дней образуется
б—12% лимонной кислоты. Выход лимонной кислоты от
потребленного сахара составляет в этом случае 50—30%.
Нейтральная и слабощелочная реакции среды
благоприятствуют накоплению щавелевой кислоты. Имеются штаммы Asp.
ntger со слабо выраженной способностью к образованию лимонной
кислоты, но накапливающие обильно в среде глюконовую кислоту.
Глюконовая кислота образуется также и штаммами, которые в
обычных условиях накапливают лимонную кислоту. Это можно
достигнуть путем понижения концентрации солей в питательной
среде в 25 раз и добавлением мела.
В таких условиях при сбраживании 20% раствора сахара в
течение 5—б дней образуется около 10% глюконовой кислоты,
выход которой от потребленного сахара составляет около
100% [4].
По данным Кюри (Curie), Aspergillus niger вызывает не
меньшее образование лимонной кислоты из сахара при условии
большой концентрации последнего и малого содержания азотистых
веществ. По этому способу в Америке лимонная кислота уже
получалась технически.
4. МОЛОЧНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Выше уже был указан состав жидких и плотных сред,
приготовляемых из молока и молочной сыворотки и служащих для
культуры молочнокислых бактерий (стр. 58—60).
Бейеринк предлагает среду из отвара дрожжей (стр. 64) с
прибавлением5—10% виноградного или молочного сахара,
8%желатины или 0,75% агар-агара и мела. Последнего прибавляют
столько, чтобы и в тонком слое среда оставалась молочнобелой и
непрозрачной. Если желательно на этой среде дифференцировать
молочнокислые бактерии от уксуснокислых, то вместо мела берут
углекислый цинк, к вредному действию которого молочнокислые
бактерии очень чувствительны, в то время как уксуснокислые
растут на такой среде хорошо.
Хороши для культуры молочнокислых бактерий солодовые
среды, например:
Дестиллированной воды 1000 см3
Молочного или виноградного сахара . . 100 г
Мальц-экстракта 20
Мела 20
Эта же жидкость с прибавлением 1.5% агара или 10%
желатины может служить в качестве плотной среды.
Иенсен (О. Jensen) рекомендует среду:
Водопроводной воды 1000 см3
Виноградного сахара 10 г
Молочного сахара 10
Пептона Витте 20
ФосфорнодвукалиевоЙ соли 2
Хлористого натрия . . . 2
Сернокислого магния 1
Еще лучшими средами для выделения молочнокислых бактерий
являются среды, приготовленные из солодового сусла 6—8° Бал-
линга, к которому прибавлено 1—2% мела. На синтетических
средах молочнокислые бактерии растут лишь очень слабо.
Для получения деятельной расы обычной в наших широтах
молочнокислой бактерии, вызывающей естественное скисание
молока, Streptococcus lactis (Bad. lactis acidi Leichmann),
поступают следующим образом. Берут несколько образчиков свежего
молока и им наполняют ряд высоких цилиндров (около 300 см8
емкостью). Цилиндры ставят при 32—34° и отмечают, в каком из
них скорее всего скиснет молоко (не позже 14 часов) и где сгусток
будет наиболее плотный, без пузырьков и трещин, с приятным
запахом. Из нижних.слоев этого скисшего молока часть материала
переносят петлей в колбочку с 10 см 3 стерильной воды для
разбавления. Отсюда заражают пробирку мясопептонной желатиной
или МПА, которую затем выливают в чашку Петри. При 20—22°
через день-два на желатине и при 33° на агаре появляются
желтоватые тонкозернистые колонии с ровным краем; поверхностные
напоминают мелкие капли воды, внутренние — чечевички.
Убедившись, что колонии принадлежат Strept. lactis, из них делают
отвивки на косо застывшую желатину или агар такого же состава.
Для определения активности полученной расы небольшим
количеством материала заражают 300 см3 стерилизованного молока,
которое должно свернуться не позже 1—12 часов при 32—34°
и обнаружить кислотность не ниже 80—85° Тернера (Thorner),
т. е. на 10 см3 молоко должно пойти 8—8.5 см3 децинормального
раствора NaOH. Затем переносят одну петлю культуры в пробирку
со стерильным молоком или о молоком + аутолизат дрожжей.
Кислотность молока по Тернеру определяют титрованием деци-
нормальным раствором едкого натра при индикаторе
фенолфталеине. Для титрования берут 10 см3 молока, разбавленного 20 см3
воды. Число кубических сантиметров щелочи, употребленной на
нейтрализацию кислоты, умножают на 10 и получают, таким
образом, «градусы» Тернера (1° Тернера соответствует 9 мг
молочной кислоты).
При определении кислотности молока по Сокслету (Soxhlet)
и Генкелю (Henkel) титруют молоко г/4 раствором едкого натра.
Градусы Сокслета поэтому в 2V2 Раза меньше градусов Тернера.
Кислотность свежего молока по Тернеру равна 14—16°,
Для выделения болгарской налочки плотной средой служит
216
агар Кохенди (СоЪепсіу) (стр. 60). Колонии этой палочки под
микроскопом имеют характерный вид пучков ваты, лучше всего
различаемых при несколько затемненном поле микроскопа.
Бертран (Etertrand) и Дюшасек (Duchacek) пользовались для
культивирования болгарской палочки солодовым раствором
следующего состава:
Водопроводной воды 1000 смя
Ячменного солода , . 30 г
Пептона • 10
Мела (лучше осажденного) , 30
Лактозы (молочного сахара) ....,, 20—50
Солод кипятят в воде в течение 1 часа, затем жидкость
фильтруют и прибавляют остальные составные части. Для выращивания
болгарской палочки применяют также «ростковую среду»,
приготовленную следующим образом:
25 г солодовых (ячменных) ростков кипятят с 500 см3 воды в
течение 10 мин/, остывший отвар процеживают через полотно и
устанавливают на 430 см3; сюда прибавляют один яичный белок,
прожатый через полотно в 40 см3, и ставят эту смесь в текучий пар
на У2 часа; свернувшийся белок отфильтровывают через бумажный
фильтр, и, прибавив к совершенно прозрачному раствору 1.5%
пептона Витте, 2% тростникового сахара и 2% агара, ставят в
автоклав на у2 часа при 1 атмосфере; эатем разливают по пробиркам
и стерилизуют, как обыкновенно.
Макринов с успехом культивировал различные виды
молочнокислых бактерий на ячменном отваре с молочным сахаром,
пептоном, солями и мелом.
200 г ячменных зерен обливают 1 л водопроводной воды и
нагревают на слабом огне до тех пор, пока в жидкости не обнаружатся
первые признаки реакции на крахмал (проба раствором иода),
К отфильтрованной жидкости, долитой до 1 л, прибавляют:
Молочного сахара 30 г
Пептона г 2
Фосфорнокислой аммонийно-магниевой соли . . 15
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Сернокислого магния 0.5
Мела 30
Перевивки выделенных молочнокислых бактерий, чтобы они
не потеряли своей активности, рекомендуется производить в
лаборатории зимой не реже, чем через 10 дней, летом — через каждые
5 дней Пробирки со свернувшимся молоком следует выставлять
из термостата и хранить в прохладном темном месте.
Поддерживать культуры молочнокислых бактерий лучше всего в молоке с
дрожжевым аутолизатом (стр. 60). По Нортрупу (Northrup),
дрожжи (например розовые) и их фильтраты через свечу
оказывают благоприяіное действие на рост и активность
молочнокислых бактерий. Последняя сохраняется неизменной в течение года
и более* Благоприятный эффект объясцяется присутствием в дрог#-
916
жах протеолитических энзтгмтга, улучшающих условия азотистого
питаішя бактерий, и понижением кислотности вследствие
разложения дрожжами молочной кислоты. Освободиться от примеси
розовых дрожжей легко, оставив на 2 суток смесь при 37°. При
этой температуре дрожжи отмирают, и молочнокислые бактерии
легко снова выделить последующими разливками. Королев
рекомендует для сохранения активности молочнокислых бактерий
поддерживать их с молочными дрожжами Тогігіа, от которых
впоследствии освобождаются так же, как указано выше. Культуры
можно тогда перевивать гораздо реже — через 3—4 месяца.
Для сохранения молочнокислых бактерий неизмененными со
всеми их свойствами Иенсен применил агаровую среду с 0.25%
глюкозы и 0.5% пептона (из казеина) с прибавлением мела.
Для изолирования молочнокислых палочек типа Bad Delbrilcki
или Bad. acidificans longissimus применяют следующий прием.
В колбу с солодовым отваром присыпают немного солодовой
муки или растертого солода и ставят при 48—50° Ц на сутки. Если
по истечении этого времени на поверхности жидкости не
образуется бактериальной пленки {Вас, subtilis), а в самой среде
появляется легкая муть, переливающаяся волнообразно при
наклонении колбы, то это указывает, что в жидкости накопился нужный
вид. Титрование обнаруживает в этом случае большую
кислотность жидкости, а под микроскопом оказывается масса тонких,
длинных бесспоровых неподвижных палочек.
Для заражения может служить сок кислой капусты и огурцов
или капля взвеси обыкновенных прессованных (пекарных)
дрожжей, выдержанной в течение 1—2 суток при 50°. Иногда в этом
последнем случае развиваются «дикие» молочнокислые бактерии со
слабой кислотообразующей способностью.
Ароматообразующие молочнокислые микробы рекомендуется
выделять на капустном агаре следующего состава:
500 г кочанной свежей капусты прокипятить в 1 л
водопроводной воды, отфильтровать, довести до 1 л, добавить:
Фосфорнокислого натрия двуосновного . . . 0.2%
Сернокислого магния 0.1
Дрожжевого аутолизата 0.1
Пептона 0.5
Глюкозы 1
Лимоннокислого натрия 0-1
рЫ среды 6.8—7.0
Ароматообразующие выделяются также на мясопелтонном
агаре с 2% сахарозы и 2% аутолизата дрожжей, рН 6.6—6.8.
Ароматообразующие в отличие от Sir, lactis совсем не изменяют
цвет лакмусового молока или если и изменяют в розовый цвет,
то в дальнейшем последний восстанавливается. Сохраняют их
в молоке с дрожжевым аутолизатом. Молочнокислые и соіі-подоб-
ные бактерии, встречающиеся в силосованных кормах, овощах
U другом растительное материале7 выделяют в Микробиологи-
917
ческом институте С.-х. академии им. Ленина на каиустном агаре
с мелом.
Измельчают белую капусту (осеннего урожая) и отжимают
сок под бактериологическим прессом (при неимении пресса можно
через марлю руками). Сок разводят пополам водой, фильтруют
через вату, прибавляют к нему мел в количестве 1—2% и агар 2%.
Стерилизуют при 120° 15 мин. Колонии молочнокислых и соіі-
подобных дают через 3 суток зоны растворения мела, причем соіі-
подобные дают более слабые зоны, чем типичные молочнокислые
бактерии.
Молочнокислые бактерии из кислого теста выделяют на
сусло-агаре (стр. 56) с мелом. Более склонные к анаэробным
условиям выделяют из агара, налитого в пробирки высоким слоем,
или из трубок Вейона (Veillon).
Газообразование лучше всего
проявляется в заторном сусле в трубках Дун-
бара. Поддерживаются культуры в
жидкой среде —сусло+мел.
По Геннебергу, для разделения
молочнокислых бактерий и дрожжей
смесь их нагревают до 58—60°.
Высев из такого прогретого материала
дает колонии одних молочнокислых
бактерий, более устойчивых к
температуре.
Вокруг колоний молочнокислых
бактерий на молочном агаре (стр.
59) получаются иногда прозрачные
зоны (рис. 133) вследствие
растворяющего действия бактерий на
казеин.
Если пластинку с колониями молочнокислых бактерий
облить 3% раствором лереклси водорода, то выделения кислорода
в местах колоний не замечается. Это отсутствие каталазы (см.
энзимы) составляет характерную особенность большинства
молочнокислых бактерий. Колонии других видов в этих условиях
покрываются пеной выделяющегося кислорода.
Мазки молока, после высыхания, обливают смесью эфира со
спиртом для удаления жира и одновременной фиксации и затем
окрашивают. Препараты из свернувшегося молока помещают в
небольшую чашку и обливают смесью 5 частей хлороформа
с 1 частью концентрированного спиртового раствора метиленовой
сини. Жидкость сливают, препарат ополаскивают водой,
высушивают и сохраняют впрок (стр. 91). Лучшей краской для
препаратов молока является метиленовая синь, так как она слабо
окрашивает основной фон (казеин), давая наиболее чистые препараты.
Кроме того, метиленовая синь хорошо окрашивает зерна во-
лютина, чаето встречающиеся в молочнокислых палочках и для
218
Рис. 133. Колонии
молочнокислых бактерий на меловом
агаре с молочной сывороткой.
них характерные. Если препарат окажется перекрашенным,
рекомендуется опустить его на 1—2 мин. в спирт. При этом казеин
обесцветится быстрее, чем микробные тела, и препарат окажется
более чистым и рельефным.
Все молочнокислые микробы хорошо красятся по Граму.
Можно производить только половинную окраску по Граму, т. е.
госле обесцвечивания спиртом и ополаскивания водой опускать
дополнительную окраску. Тогда получается окраска только
бактерий на бесцветном фоне казеина.
Методы определения молочной кислоты см. в «Приложении».
5. МАСЛЯНОКИСЛОЕ БРОЖЕНИЕ
Во-збудителн этого брожения часто встречаются в верхних
слоях почвы, в навозе, в загрязненной воде, в пыли, в молоке,
в сыре, на поверхности зерен злаков, на бобах и горохе.
Морфологически большинство маслянокислых бактерий
узнаются по: 1) спорообразованию, 2) подвижности, 3)
гранулезной реакции (посинению от прибавления иода) а 4) по обилию
веретенообразных и булавовидных клеток.
Накоплению в культуре маслянокислых бактерий способствуют:
1) их анаэробиоз (опыты ставят в отсутствии воздуха), 2) наличие
у них спор (посев пастеризуют) и 3) способность сахарифициро-
вать крахмал (для наколл&ния берут крахмальные среды, не
содержащие сахара).
По старинному рецепту Гелиоа (Gelia) и Пелуза (Pelouze)
для возбуждения маслянокислого брожения варажают кусочком
гнилого оыра 10% раствор сахара, которым наполнена доверху
колба с осадком мела на дне. Как показал Пастер, при этом
сначала возникает молочнокислое брожение сахара, а затем молочно-
известковая ооль разлагается маслянокислыми бактериями.
Бейеринк рекомендует следующий прием. В колбу наливают
дестиллированную воду с 5% глюкозы и 5% мелко измельченного
фибрина (можно заменить 1—2% пептона)- Жидкость кипятят
для удаления воздуха. Во время кипения к жидкости прибавляют
комок садовой земли, по возможности быстро остужают и ставят
колбу при 35°. Уже через сутки или двое брожение бывает в
полном ходу, и жидкость начинает издавать сильный запах
масляной кислоты. Во избежание остановки брожения при чрезмерном
повышении кислотности жидкости, к ней прибавляют мел. В
указанных условиях развивается главным образом Granulobacter
saccharobutyricum (Бейеринк).
Проще получить маслянокислое брожение по способу Прингс-
хейма (Pringsheim). В небольшую длинногорлую колбу (или
высокую пробирку) бросают несколько ломтей неочищенного
картофеля, заливают водою почти до горла и пастериэуют при 80°
в течение 10 мин., после чего ставят в термостат при 37°. Черев
1—2 суток развивается маслянокисл-ое брожение. В начальных
239
стадиях брожения в культур? появляется масса подвижных
анаэробных палочек. В висячей капле можно наблюдать более
оживленное движение внутри капли сравнительно с периферией
(наблюдение Пастера).
Легко вызвать маслянокислое брожение в лактате кальция,
который при сохранении его во влажном состоянии легко
подвергается маслянокислому брожению. Для постановки
накопительной культуры 20—25 г сырого лактата кальция, полученного с
производства молочной кислоты после первой кристаллизации,
растворяют в 75—80 см3 тепловатой воды и ставят в термостат
на 40°. Уже на следующий день заметно обильное газовыделение.
Жидкость при этом остается нейтральной и неприятного запаха,
свободной масляной кислоты поэтому нет.
Выделение маслянокислых бактерий в силу их строгой ан-
аэробности в чистой культуре представляет некоторые
трудности и осуществляется общими методами культуры анаэробов
(стр. 144).
в. АЦЕТОНОЭТИЛОВОЕ БРОЖЕНИЕ
Это брожение отличается от аценобутилового брожения (см.
дальше) тем, что эдеоь не образуется бутилового спирта и
масляной кислоты, а получается ацетон, этиловый спирт, уксусная и
муравьиная кислоты и газы: С02 и Н2.
Соотношение между ацетоном и этиловым спиртом обычно
около 1:2, но оно сильно зависит от культуры и среды (Бакони).
Уксусной кислоты образуются значительные количества;
муравьиной—несколько меньше. Отношение С02 к Н2 около 58 : 40 (об. %).
Это брожение вызывается бактериями, описанными под на-
враниями В. macerans [Шардингер (Schardinger)] и В. acetoethy-
licus [Нортроп (Northrop)], возможно представляющими один вид.
Оба эти организма являются споровыми факультативными
анаэробами.
Для выделения их весьма удобен следующий метод. Стерили-
вуют в высоких пробирках картофель, нарезанный кусочками и
залитый высоким слоем воды. Заражают кусками гнилого кар-
т ф°ля, причем выбирают такой клубень, у которого вся
внутренняя часть превратилась в жидкую массу и плотными остались
только наружные слои.
После заражения пробирки нагревают около часа в кипящей
воде, охлаждают и помещают в термостат при 40°.
Очень часто при этом выделении наблюдается загрязнение
В. mesentericus, который также встречается на картофеле и споры
которого тоже очень устойчивы к нагреванию. Так как В. mesen-
te^icus — аэробный организм, то дальнейшие пересевы
накопительной культуры удобнее вести, заливая поверхность
жидкости в пробирках стерильным вазелиновым маслом.
Также элективные условия можно создать, прибавляя к среде
1—2% ацетона (по Бакони),
Выделение чистой культуры ведется на чашках Петри с ней*
тральным сусловым агаром в аэробных условиях. Особенно
большие колонии получаются на сусловом агаре с мелом.
Поддержание культуры ведется на картофельном заторе с
мелом. Бактерии очень чувствительны к кислоте (opt. рН для ро-
ста — 8—9), и потому культуру надо вести с прибавкой мела,
который необходимо часто и старательно взмучивать.
Брожение идет значительно медленнее, чем ацетонобутило-
вое, и длится, при тех же концентрациях затора, 6—7 дней.
Молодая культура имеет характерный запах яблок.
7. АЦЕТОНОБУТИЛОВОЕ БРОЖЕНИЕ
Это брожение идет с образованием ацетона, бутилового и
этилового спирта (в отношении 30 : 60 : 10), кислот (масляной и
уксусной, приблизительно в равных количествах) и газа (С02 и
Н2, в отношении 60 : 40 по объему, 60 : 2 по весу). Таково
направление брожения в условиях неусредняемого субстрата.
Возбудитель ацетонобутилового брожения, Clostridium ace-
tobutylicum, встречается в почве, на поверхности зерен хлебных
злаков, в муке.
Он является строгим анаэробом и морфологически близко
стоит к маслянокислым бактериям, давая, так же как и они, кло-
стридии, гранулезную реакцию и обладая в молодом состоянии
довольно энергичной подвижностью.
Выделение можно вести на кукурузном заторе (6%
кукурузной муки), заражая его землей или зернами хлебных злаков.
После заражения пробирки прогреваются 45 сек. в кипящей
водяной-бане, перетягиваются на горелке, откачиваются при
помощи водоструйного или масляного насоса, запаиваются (трубки
Грубера —см. описание приборов для анаэробных культур,
стр. 144) и помещаются в термостат при 36—37°.
Брожение начинается при сильном газообразовании. По ходу
брожения необходимо спустить образовавшийся газ, распаивая
запаянный конец на горелке. После нескольких посевов на
кукурузном заторе необходимо провести выделение на
картофельном агаре в анаэробных условиях.
Споры бактерий можно сохранять в течение нескольких лет
в запаянных пробирках в отбродившей бражке или на
стерильном песке. Оживление спор ведется так же, как указано для
выделения культуры. Опыт заражается 3—6-м пересевом от спор;
пересевы ведутся каждые 16—20 часов.
Кроме заторов ti3 муки хлебных злаков, хорошее брожение
получается на картофельном заторе [Вейцман (Weizmann)]. На
синтетических средах с пептоном брожение сильно зависит от
количества и качества пептона. Удовлетворительно идет брожение на
с#еде Спшшана (Speakmann);
221
КоНР04 0.05%
КН,Р04 0.05
MgSO< ,, . . 0.02
NaCl 0.001
ilnS04 0.001
Углеводов 0.3
Пептон Витте 0.25 *
Для характеристики культуры необходимо провести брожение
на 7—8°/0 кукурузном заторе, причем часть колб с обычной
ватной пробкой служит для определения кислотности по ходу
брожения (максимум нормально наблюдается на 12—16-м часу).
Получается кривая кислотности, являющаяся весьма
характерной для ацетонового брожения. Другая часть колб с той же
средой снабжается затворами с H2S04 для вадержки улетучивающейся
вместе с газами воды. В этих колбах ведется по ходу брожения
определение количеств выделяющегося газа путем
взвешивания. Кривые газообразования также характерны для этого
брожения, причем максимум скорости газообразования
наблюдается в нормальном брожении спустя несколько часов после
максимума кислотности.
Брожение идет оявнь бурно и заканчивается черва 48—32
часа после начала.
Вид бродящего затора очень своеобразен: воя твердая часть
его поднимается кверху и дает шюхную слизистую массу, а
жидкость постепенно осветляется.
Морфологическая картина по ходу брожения следующая:
вначале видны цепочки клеток и нити; затем появляется много
подвижных одиночных форм, а также соединенных по две;
гранулезная реакция положительна; в момент максимума
кислотности часть палочек начинает принимать форму клостридиев; в кло-
стридиях появляются споры (большая часть палочек не
превращается в клостридии); споры освобождаются от тела бактерий;
контуры палочек, не перешедших к спорообразованию,
становятся не резкими, они слабо окрашиваются (аутолиз); к концу
процесса аутолиз усиливается, и на фоне слабо очерченных
палочек заметны свободные споры.
Окраска, по Граму, у молодой культуры положительна.
После конца брожения определяется содержание ацетона в
бражке (наиболее удобен метод Мессингера — Гудвина, см.
«Приложения») и спиртов (бутилового и этилового, см. «Приложения»).
В условиях усреднения среды (например, мелом) процесс
принимает иное направление — уменьшается количество ацетона и
спиртов и увеличивается количество кислот (кальциевых солей).
При тщательном усреднении можно свести количество
получаемого ацетона и спиртов к нулю и чрезвычайно повысить выход
кислот.
1 Спшшан употребляет пептон Difco ш дает его 0.5%.
222
S. ВРОЖЕШГВ ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Для возбуждения процесса брожения пектиновых веществ
применяют методику, в основном разработанную Фрибесом.
Берут льняную солому, из нее приготовляют снопики,
перевязанные ниткой в двух местах. Приготовленные снопики
вываривают в продолжение 7—10 мин, в кипящей воде для удаления
экстрактивных веществ. Воду сливают,
а снопики помещают в пробирки с
водопроводной водой и стерилизуют при 105°
в течение 15 мин. Еще теплые после
стерилизации пробирки варажают кусочком
льняной соломы и помещают в эксикатор,
из которого тотчас выкачивают воздух.
Через день или два при 35° в пробирках
возникает брожение и снопики
выделяющимися газами выносятся на поверхность
замутившейся жидкости (рис. 134). Через 5—7
дней брожение прекращается. Из
отбродившей пробирки отерильным пинцетом или
иглой вынимают снопик и переносят в
стерилизованную чашку Петри. Разрезают нитки,
связывающие снопики, и берут одну
соломинку для заражения такой же новой
пробирки с льняным снопиком.
Пересевы на лен делаются несколько раз.
Благодаря незначительному содержанию в
субстрате питательных веществ побочные
брожения вскоре прекращаются и на
снопиках остается преимущественно культура
специфического микроорганизма, загрязненная
не более чем 2—3-мя видами наиболее
стойких бактерий.
В нахождении на отбродившей льняной
соломе специфических возбудителей мочки
льна (брожения пектиновых веществ)
убеждаются, приготовив препарат отжатием жидкости из влажной
ооломинки пинцетом на покровное стеклышко.
Для получения чистой культуры анаэробного возбудителя
этого процесса — Granulobacter pectinovorum или Бас. felsineus
и др» лучше всего пользоваться морковным агаром, который
готовится на морковном отваре. Для приготовления морковного
отвара берут 200 г свежей моркови, измельченной теркой, на 1 л
водопроводной воды и кипятят в течение 1 часа с прибавлением
мела для нейтрализации кислот.
Жидкость из накопительной культуры (споры со льна)
кипятят 1—2 мин. и ватем пастеровской пипеткой вносят в пробирку
с расплавленным агаром, из которой еще не застывший агар тот-
223
Рис. 134. Слева —
незаряженная пробирка
со снопиком льна на
дне; справа — такая
же пробирка в период
брожения льна.
час же набирают в пастеровские пипетки, оттянутые в капилляр,
и после застывания агара пипетки помещают в термостат при
35-37°.
На второй день в капиллярах вырастают мелкие бледносеро-
ватые колонии, агар же внутри капилляров, под влиянием
образующихся газов, разрывается на отдельные кусочки. На 2—3-й сутки
колонии увеличиваются в размере, становятся оранжеватыми и
иногда принимают яркожелтую окраску.
Выделение отдельных колоний из капилляра не представляет
трудностей. По близости от колонии капилляр надламывается
стерильным пинцетом, конец капил^
ляра обжигается и помещается в
стерильную чашку Петри. Запаянный
конец капилляра нагревается на
очень слабом, коптящем пламени
горелки. Нагретый от конца пипетки
воздух выталкивает агар в чашку
Петри без расплавления всего агара
в капилляре (пипетке). Из чашки
Петри платиновой иглой выделяют
маленький кусочек агара с одной
ГС
колонией. Кусочек с одной колонией
помещают в пробирку с
картофельной кашицей или морковным
отваром. В том и другом случаях
брожение идет хорошо и образуется
большое количество газа.
Чистая культура не получается
после одной отвивки; очистку
необходимо повторять несколько раз.
Кроме того для выделения чистой
культуры применяется метод полу-
Рис. 135. Культура анаэробов чения колоний на поверхности агара
в чашках Петри, помещенных с rrr r
в эксикатор, иа которого ва- в анаэробных условиях. Посев произ-
тем был выкачан воздух. водят размазыванием капли
жидкости, выжатой из соломинки, на косой
агар в пробирках или в чашках Петри» Пробирки помещают
в эксикатор, из которого затем выкачивается воздух (рис. 135).
Через несколько дней при 35° на поверхности агара появляются
желтоватые, выпуклые колонии бактерий мочки льна.
Средой для возбуждения аэробного разложения пектиновых
веществ служит следующая:
Водопроводной воды 1000 см-1
Сернокислого аммония 0.5 г
Фосфорнодвукалиевои соли .... 0J3
Мела 20
По 10 см3 этой жидкости наливают в ряд небольших арленмейе-
ронеких колб, прибавляют в каждую льнаиой соломы и ааражают
224
землей. Колбочки выдерживают при 25е. Через неделю делают
посев. Изолирование цроизводят на мясопептонной желатине.
Распространенным возбудителем пектинового брожения
следует считать Вас. felsineus, выделенный впервые Карбоне в
Италии. Как показали исследования 3. С. Марковой, этот микроор-
ганиам имеет довольно широкое распространение на льнах СССР,
и ему следует приписать ведущую роль в тепловой мочке льна
(рис. 136), представляющей бактериоскопическую картину
самопроизвольной мочки льна и мочки стерильного льна чистой
культурой Вас. felsineus*
Рис. 136. Бактериоскопическая картина микрофлоры
стебля (2-е сутки) при мочк? стерильного льна нуль-
турой Вас. felsineus (по 3. С. Марковой).
Для накопления Вас. felsineus можно пользоваться средой
следующего состава: КН2Р04 0.1%, MgS04 0.025%, пептона 0.5%,
галактозы 1%, мела — следы; из мочек можно выделять и без
накопления. Для его выделения можно пользоваться агаром,
приготовленным на этом питательном растворе. Характерным для Вас.
felsineus следует считать пушистые колонии, имеющие в
большинстве случаев оранжевую окраску, мацерацию и оранжевую
, окраску картофеля в жидкой среде.
Следует указать, что Вас. felsineus чувствителен к качеству
агара и пептона. При частых пересевах он может потерять
активность. Для активирования рекомендуется провести его через сте-
U> Руководство во мвкробиолога ^2*5
рильный лен, выделить из одной колонии и затем работать с
первыми генерациями (Л. П. Крутикова).
Вас. felsineus мацерирует стерильные льняные снопики без
прибавления мела, в то время как Granulobacter pectinovorum
дает полную мочку только в присутствии мела.
При мочке льна и других лубо-волокнистых растений важно
выяснить групповой и количественный состав микрофлоры мочки.
А. Л. Бычковская пользовалась для этого различными средами.
Для выделения возбудителей пектинового и маслянокислого
брожения были применены следующие среды: 1) картофель с мелом
по Рушману, 2) крахмальная среда с мелом, 3) среда с
экстрагированным льняным лубом. Так как бактерии этой группы главным
образом сосредоточиваются в соломе и извлечь их стерильно без
механического измельчения покровных тканей очень трудно, то
для их обнаружения был принят следующий способ; льняные
стебли измельчаются ножницами в крошку и навеска в 0.5 г такой
крошки заворачивается в марлевый сверток, завязывается с двух
концов и перед опытом закладывается внутри снопиков. В нужный
момент сверток извлекается и переносится в мерное количество
стерильной воды, при этом предварительно перерезается один из
завязанных концов. После 10-минутного предварительного
встряхивания с бусами готовятся обычным путем нужные разведения.
Количественный подсчет Вас. felsineus производится по числу
оранжевых и белых пушистых колоний в галактоза-агаре в
трубках Вейона.
Для учета сопутствующей микрофлоры могут быть применены
следующие среды:
~ 1) мочильный агар с мелом для бактерий, сбраживающих соли
жирных кислот, 2) сусло-агар с мелом для аэробных кислотообра-
зователей, главным образом молочнокислых, 3) среда Кесслера для
coli-подобных бактерий. Подсчет производится по количеству
забродивших пробирок по таблицам Мак-Креди. г
Мочильный агар готовится, согласно 3. С. Марковой,
следующим образом: проводится самопроизвольная мочка с мелом,
мочильная жидкость кипятится полчаса в аппарате Коха, после
остывания фильтруется и нейтрализуется; на этой жидкости
готовится агар с прибавлением (NH4)2 S04 (0.1%) или пептона
(0.5% в качестве источника азота). Колонии микроорганизмов,
разлагающих соли жирных кислот, можно узнать под
микроскопом по кристаллам СаС03, которые выпадают в большом
количестве на колониях или вблизи колоний.
Для получения пектиновых веществ в последнее время
применяется методика Эрлиха. Исходным материалом служит сахарная
свекла в свежем виде или в виде свекольного жома с сахарного
завода.Материал измельчается на мясорубке, причем свекольный жом
предварительно размачивается. При употреблении свежей
сахарной свеклы материал прессуется для удаления сока и выщелачп-
1 См. Молочнокислое брожение, стр. 214.
226
вается холодной водой. После этого для удаления остальных, не
нужных экстрактивных веществ материал обрабатывается
приблизительно 2 л дестиллированной воды на каждые 100 г воздушно-
сухого вещества. Обработку ведут в кастрюле соответствующего
размера при 55—60° в течение 1 часа. После этого вытяжку
отфильтровывают и остаток отжимают руками или под прессом.
Обработку водой повторяют до тех пор, пока водная вытяжка не
перестанет давать реакцию на углеводы с а-нафтолом.
Освобожденный таким образом от Сахаров и легко
растворимых в воде минеральных веществ материал подвергают для
извлечения пектина обработке дестиллированной водой при 100°
в течение 1 часа.
Исходный пектин, содержащийся в клеточных стенках,
нерастворим ни в холодной, ни в теплой воде, но при действии "воды,
нагретой до 80° и выше, он постепенно превращается в
растворимый в воде гидропектин.
Извлечение пектина приходится повторять при 100° до 10—
12 раз. Полученные при 100° вытяжки фильтруются через
бумажную мязгу и полученная прозрачная жидкость выпаривается в
фарфоровой чашке на водяной бане досуха. Пектин получается
в виде листочков или сплошной массы желтоватого или светлоко-
ричневого цвета. Масса легко отстает от фарфоровой чашки. Ее
собирают и измельчают в ступке или мельницей в тонкий
порошок. Выход 50% от сухого вещества.
Гидропектин представляет собой комплекс или смесь арабана
и кальциево-магниевой соли пектиновой- кислоты. Высушенный
и измельченный гидропектин применяется в микробиологических
работах для исследования на сбраживание его
микроорганизмами пектинового брожения.
9, РАЗЛОЖЕНИЕ КРАХМАЛА
Не все сорта крахмала одинаково легко подвергаются
воздействию микробов. Так, пшеничный крахмал легче ими
разлагается, чем картофельный. Влияние оказывает и физическое
состояние крахмала: сваренный, превращенный в клейстер крахмал
разлагается несравненно быстрее сырого.
Крахмал подвергается воздействию микробов как при доступе
воздуха, так и в анаэробных условиях. Разрушение крахмала
контролируют реакцией крахмала с иодом (синее окрашивание).
Образование синего иод-крахмального соединения х
происходит только при наличии HJ или MJ. Чем ниже температура, тем
интенсивнее синее окрашивание. При нагревании окраска
исчезает, при охлаждении вновь появляется, если не весь иод
улетучился. Синее окрашивание наступает немедленно лишь в чистых
крахмальных растворах. Окраску задерживают вещества, обла-
.... і.ді _ ¦ — і —
1 По Дюкло (Duclaux), окраска крахмала иодом представляет собою
не химическую реакцию, а физическое явление, подобное окраске в розовый
цвет раствора иода в хлороформе и в бурый — раствора в сероуглероде.
15* 227
дающие большим химическим сродством к иоду, как свободные
щелочи, углекислые щелочи, сероводород, сернистый газ и др.
Присутствие в жидкости большого количества декстринов
задерживает окраску; первые капли иода не вызывают ее. Если к не
вполне осахаренному пивному затору прибавлять по цаплям
раствор иода, то появляющееся синее окрашивание при
взбалтывании исчезает, так как иод вступает в какое-то другое соединение,
и только после прибавления значительных количеств иода
получается длительная синяя окраска.
Разложение крахмала микробами начинается с его гидролиза.
Под влиянием амилазы крахмал превращается в декстрин, а
последний под влиянием декстриназы — в мальтозу и изомальтозу.
В дальнейшем мальтоза гидролизируется под влиянием мальтазы
с образованием виноградного
сахара.
Для обнаружения амилазы
у микробов приготовляют агаре
крахмальным клейстером и
разливают его в чашки Петри. На
этой среде вокруг колоний
микробов, выделяющих амилазу,
образуется прозрачный ореол.
Приобработке агараиодом среда
окрашивается в синий цвет, за
исключением красновато-бурых
или бесцветных (прозрачных)
зон вокруг колоний. Если
гидролиз дошел до стадии декстрина,
то зоны вокруг колоний
окрашиваются иодом в красно-бурый
цвет; если же из крахмала
образовалась мальтоза или
виноградный сахар, то участки среды
вокруг колоний остаются бесцветными (рис. 137).
Если крахмал гидролизирован до стадии мальтозы или
виноградного сахара, особенно последнего, то дальнейший распад
его, под влиянием различных микробов, протекает по типам
спиртового, молочнокислого, маслянойислого и других брожений.
Легче других подвергается воздействию микробов
растворимый крахмал. Для его приготовления картофельный крахмал
обливают 7.5% НС1 и оставляют при комнатной температуре на двое
суток, время от времени взбалтывая жидкость и дважды сменяя
кислоту. Слив последнюю и промыв крахмал сначала водой, а
затем разбавленным раствором соды, получают вещество,
сохраняющее строение и все свойства крахмала, но хорошо растворимое в
кипящей воде в любой пропорции. При охлаждении раствора из
него выделяется коллоидальный крахмал. Если было растворено
свыше 8% крахмала, то при охлаждении жидкость застывает в
228
Рус. 137. Гидролиз крахмала Azoto-
Ьасіег'ом. 7-й день роста на агаре с
0.5°/о растворимого крахмала.
сплошную алебастрового вида массу. Необходимо отметить,
что горячий раствор такого крахмала не смешивается с водным
раствором желатины — получается эмульсия.
Получение растворимого крахмала по способу Фернбаха (Fern-
bach) и Вольфа (Wolff). 250 г картофельного крахмала промывают
в 1 л дестиллированной воды, дают отстояться и воду
декантируют. Затем обрабатывают втечениеі—2час. 4% раствором НС1
в дестиллированной воде, после чего пропускают смесь через бух-
неровский фильтр. Отфильтрованный крахмал промывают
несколько раз дестиллированной водой до нейтральной реакции на
гелиактан (orange). Высушивают в чашке при 90° до полной
растворимости крахмала в воде.
10. РАЗЛОЖЕНИЕ КЛЕТЧАТКИ
Аэробное разложение клетчатки
Получение элективных культур аэробных целлюлозных
бактерий. На чашки Петри с кремнекислым гелем помещают
круглые фильтры. Последние увлажняют 2—2.5 см3 среды
Гетчинсона или Виноградского, имеющих следующий состав.
Среда Гетчинсона
Фосфорнодвукалиевой соли , • , ,
Хлористого кальция
Сернокислого магния
Хлористого натрия
Хлорного железа
Азотнокислого натрия
Дестиллированной воды . . , . .
рН среды 7.2—7.3
Среда Виноградского
Фосфорнооднокалиевой соли 1 г
Сернокислого магния 0.5
Хлористого натрия 0.5
Сернокислого железа 0.01
Сернокислого марганца 0.01
Углекислого кальция 20.0
Азотнокислого калия 4.0
Дестиллированной воды 1000 см8
Добавлением 10% углекислого калия рН среды
доводится до 7.2.
После стерилизации чашек на фильтры помещаются мелкие
частицы исследуемого материала (почва, ил, торф), и посевы
выдерживаются при 25° в течение 3—5 дней. Вокруг частиц почвы
на клетчатке появляются цветные зоны желтого, оранжевого,
бурого или зеленого цвета. Развитие целлюлозных бактерий,
не образующих пигмента, сопровождается образованием
неокрашенных зон разложения- целлюлозы, просвечивающих при про-
1 Оригинальная методика Виноградского несколько сложнее. В
практику вошла более упрощенная модификация способа,
«в»
1 г
0.1
0.3
0.1
0.01
2.5
1000 см8
1
ходящем свете. Для наиболее распространенной с природе
миксобактерии, разлагающей клетчатку, именно Мyxococcus [Cyto-
phaga) Hutchinsonii, характерно появлепие желтых, влажных,
покрытых слизью пятен, сравнительно медленно
распространяющихся по поверхности фильтровальной бумаги. Аналогичные зоны,
но только окрашенные в оранжевый цвет, дает Myxococcus el-
lipsosporus. Представители рода Cellvibrio образуют менее влажные,
но быстро увеличивающиеся в своих размерах пятна. Некоторые
миксобактерии дают на клетчатке плодовые тела оранжевого или
бурого цвета, состоящие из цист.
При другом способе получения элективных культур на дно эр-
ленмейеровских колб наливают тонким слоем одну из
вышеуказанных сред и в нее погружают плоеный фильтр нижним концом
вверх. В простерилизованные колбы со средой вносят материал,
содержащий целлюлозные бактерии. Развитие миксобактерии,
разлагающих клетчатку, сопровождается образованием желтой
или оранжевой полоски на' уровне жидкости. В дальнейшем
фильтр постепенно оседает и покрывается слизью. Для
вибрионов характерно быстрое разрушение фильтра на отдельные
волокна в течение 3—4 дней.
Еще проще постановка опыта в пробирке с опущенной в нее
и наполовину погруженной в жидкость полоской фильтровальной
бумаги.
В жидкой среде одновременно с бактериями, разлагающими
клетчатку, развивается также посторонняя микрофлора, и
поэтому эти методы не пригодны для получения очищенных культур.
Таким_ способом можно только установить присутствие
целлюлозных бактерий в том или ином субстрате.
Для микроскопии кусочки разлагающейся бумаги
переносятся иглой в каплю воды на предметном стекле и тщательно
разрываются иглами на отдельные воло'кна. В раздавленной капле
в волокнах целлюлозы обнаруживаются бактерии, разлагающие
клетчатку. Параллельно приготовляются фиксированные и
окрашенные препараты. Клетки миксобактерии плохо воспринимают
краску, поэтому препараты рекомендуется перекрашивать.
Производится также окрашивание жгутиков. Форма и строение
клеток дает возможность уже в элективных культурах составить
представление о систематическом положении целлюлозных
бактерий.
Длинные с заостренными концами вегетативные клетки мик-
сококков подвижны, но не имеют жгутиков. Укорачиваясь, они
превращаются в круглые или овальные микроцисты. У
целлюлозных миксобактерии из рода Sorangium клетки имеют
цилиндрическую с закругленными концами форму. Они активно подвижны,
лишены жгутиков и содержат зерна хроматина. Вибрионы,
разлагающие клетчатку, имеют меньшие размеры клеток, чем
миксобактерии, и обладают характерной для вибрионов подвижностью. На
талюое клетки имеется один длинный жгутик. Зерен хроматина нет*
23Q
Выделение чистых культур
Изолировать вибрионы не трудно, так как они образуют
отдельные колонии на крахмальном агаре (раствор Хетчиясона 4-
+2% крахмала+1% агар-агара) или целлюлозном агаре.
Последний приготовляется следующим образом. Фильтровальная
бумага в количестве 5 г разрывается на мелкие кусочки и
обливается 200 см3 кипящей дестиллированной воды. Бумага
переносится в ступку и возможно тщательно растирается. К
измельченной клетчатке добавляется 800 см3 дестиллированной воды,
необходимое количество солей для приготовления 1 л среды Хетчин-
сона и 1% агар-агара. Разливая агар, необходимо следить за тем,
чтобы он быстро застыл, в противном случае клетчатка успевает
осесть на дно чашки и становится недоступной для бактерий.
Целлюлозный агар иногда рекомендуют приготовлять из
клетчатки, растворенной в серной кислоте или швейцеровом реактиве,
а затем осажденной. Однако такая обработка изменяет целлюлозу,
и поэтому лучше пользоваться вышеуказанным методом.
Для посева некоторое количество полуразрушенной клетчатки
переносится из элективной культуры на поверхность
крахмального или целлюлозного агара и размазывается шпателем. Через
2—3 дня появляются мелкие, круглые, гладкие и полупрозрачные
колонии вибрионов. На крахмальном агаре сопутствующие
бактерии развиваются раньше и рост их обильнее, чем вибрионов;
поэтому на чашках необходимо внимательно отыскивать небольшие
колонии СеШіЪгіо. Производя отсевы из колоний в жидкую среду
с фильтровальной бумагой, убеждаются в способности вибрионов
разрушать клетчатку.
Целлюлозные миксобактерии, развивающиеся на
крахмальном агаре (Sorangium, Archangium), могут быть изолированы в
чистой культуре таким же образом.
Миксококки, разлагающие целлюлозу, не растут на средах без
клетчатки и не дают изолированных колоний на целлюлозном
агаре, распространяясь на поверхности среды (стелющийся рост).
Для выделения их в чистой культуре может быть применен
следующий метод. Из элективных культур на чашках с гелем,
путем повторных пересевов из периферических участков
цветных зон, получают очищенную культуру, состоящую из миксо-
кокка и обычно одной неспороносной сопутствующей бактерии.
Нагревая очищенную культуру, устанавливают минимальную
температуру, убивающую микроцисты данного вида. Затем
производят нагревание при более низкой (на 2—3°)
температуре. Сопутствующая бактерия при этом погибает, и пересевы
нагревавшейся культуры в серию пробирок с полосками
фильтровальной бумаги и питательной средой дают рост одного миксо-
кокка. Устойчивость микроцист к высокой температуре может
вариировать у различных видов. Обычно прогревают культуры
при 58—68° в течение 10 минут, л
23J
Для изучения истории развития целлюлозных бактерий
стерильные кусочки целлофана размером 5 мм2 увлажняются средой
Хетчинсона и помещаются на покровное стекло, края которого
предварительно смазаны вазелином. На целлофан наносится
петлей небольшое количество взвеси клеток из чистой культуры.
Покровное стекло с целлофаном помещается на предметное стекло
с луночкой. Наблюдения ведутся при 25° (подогревательный
столик). Бактерии развиваются на целлофане, и это дает
возможность наблюдать подвижность, деление, образование
микроцист и т. п.
Кусочки целлофана с размножающимися на них
целлюлозными бактериями могут быть зафиксированы, окрашены и
заделаны в канадский бальзам.
Количество клетчатки, разлагаемой бактериями, определяется
следующим образом. Чистая культура засевается на высушенные
и взвешенные круглые фильтры, помещенные на чашки Петри
с гелем. После окончания опыта оставшаяся неразрушенной
клетчатка снимается с геля и переносится на предварительно
взвешенный складчатый фильтр. Поверхность геля смывается кипящим
1% раствором соды для удаления отдельных волокон
целлюлозы, приставших к его поверхности. Клетчатка и слизь на
фильтре промываются последовательно горячими 1% растворами соды
и соляной кислоты, а затем кипящей дистиллированной водой.
Выяснив вес оставшейся целлюлозы, вычисляют процент ее
разрушения. Вместо круглых фильтров можно пользоваться также
кружками хлопчатобумажных или льняных тканей (полотно, нансук,
батист и т. п.). Для вибрионов характерно быстрое и неглубокое
разрушение клетчатки; миксококки развиваются медленнее, но
постепенно почти полностью разлагают целлюлозу.
В опытах с колбами клетчатку необходимо помещать на слой
стеклянных бус или отрезки стеклянных трубок. Слой
питательной среды над кружками фильтровальной бумаги не должен
превышать 1—2 мм. Но и в этом случае аэрация недостаточна и
разложение клетчатки происходит медленнее-, чем на чашках.
Интенсивный распад целлюлозы можно получить, пропуская через
жидкую среду воздух или кислород.
Присутствие аэробных целлюлозных бактерий в почве может
быть обнаружено по методу Кристенсона. Почву, увлажненную
до 60% от полной влагоемкости, помещают в чашку Коха. На
поверхность почвы накладывают и плотно к ней прижимают
широкую полоску стерильной фильтровальной бумаги. Закрытые
чашки выдерживаются при 25—28° (сохраняя указанную
влажность почвы) в течение 20—30 дней. На 4—6-й день начинадот
появляться зоны разложения клетчатки. Характер и окраска пятен,
а также микроскопия неокрашенных и окрашенных препаратов,
приготовленных из разрушающихся волокон целлюлозы,
позволяют сделать некоторые выводы о систематическом положении
возбудителей процесса и их распространении в почве.
232
Изучение способности почвы разлагать целлюлозу
производится следующим образом. Снимают 'поверхностный слой почвы
и куски простерилизованной фильтровальной бумаги
укладывают на определенной глубине. Сверху клетчатку снова
засыпают землей. Через 7—9 дней клетчатку извлекают из почвы и
по количеству зон разложения и результатам микроскопии можно
судить об интенсивности процесса. Демонстративные препараты
могут быть получены также при зарывании в почву стекол
с фильтровальной бумагой по методу Холодного.
Для количественного учета целлюлозных бактерий в почве
различные разведения почвенной болтушки засеваются в
небольшие колбы с минеральной средой и погруженными в нее
плоеными фильтрами (подробнее о методе разведений см. стр. 71).
При обычных условиях культивирования разложение
целлюлозы не сопровождается образованием редуцирующих веществ и
летучих кислот. Для накопления глюкозы в среде создаются
условия, затрудняющие ее окисление. С этой целью у колб с 5—8-
дневными культурами СеШгЬгіо срезаются ватные пробки и
заливаются парафином. Через 2—3 месяца определяют количество
разрушенной целлюлозы и образовавшейся глюкозы.
Для накопления плесеней, разлагающих клетчатку, в чашку
Петри кладут 2 кружка фильтровальной бумаги и смачивают
раствором следующего состава:
Водопроводной воды 1000 см*
Азотнокислого аммония 0.5 г
Фосфорнооднокалиевой соли - . . 0.5
Заражают землей или оставляют чашку открытой на воздухе
в течение 12 часов. В дальнейшем чашку сохраняют при
комнатной температуре 2—3 недели, следя за тем, чтобы бумага не высохла.
Грибы по силе своего действия на целлюлозу располагаются в
следующем порядке: Botrytis vulgaris, Epicoccum purpurascens,
Cladosporium herbarum, Aspergillus niger и т. д."
Некоторые высшие грибы, как Merulius lacrirnans и Polypo-
rus vaporarius, энергично разлагают целлюлозу.
Анаэробное брожение клетчатки
Чтобы вызвать анаэробное брожение клетчатки, заражают
илом или навозом высокогорлые колбы (рис. 138), содержащие
куски фильтровальной бумаги и мел и залитые доверху
раствором следующего состава:
Дестиллированной воды 1000 см*
Фосфорнокислого аммония .... і г
Фосфорнодвукалиевой соли .... 1
Сернокислого магния ....... 0.5
Доваренной соад * . , еледн
?33
Через педелю или две при 35° возникает брожение с
образованием кислот и выделением газов. Раствор мутится, а находящаяся
на дне фильтровальная бумага
становится вялой, принимая
желтый оттенок, ослизняется с
поверхности и постепенно
разъедается микробами, распадаясь на
отдельные волоконца. На высоте
брожения полуразрушенные куски
бумаги увлекаются током газов
вверх колбы, образуя как бы
пробку в верхней части горла.
Элективные свойства
вышеприведенной среды настолько велики, что
уже через 2—3 пересева в
указанных условиях культура явственно
обогащается специфическими
микробами: волокна
полуразрушенной бумаги (рис. 139) окружены
со всех сторон довольно
длинными, тонкими, слегка изогнутыми
палочками с конечной круглой
спорой.
Если последовательные пересевы в вышеуказанных условиях
вести без нагревания посевного материала, то устанавливается
Рис. 138. Бродильная' колба с
отводной трубкой для собирания
выделяющихся газов.
Рис. 139. Полоски, фильтровальной бумаги,
изъеденной Вас. cellulosae.
обыкновенно метановое брожение клетчатки, идущее с
выделением СН4 и СОа. Если же один из первых пересевов пастеризовать
(при 75° — 15 мин.), то в жидкости возникает водородное
брожение с выделением Н^ и СОа.
234
Анаэробный распад клетчатки происходит по типу масляио-
кислого и сопровождается образованием, кроме
вышеуказанных газообразных продуктов, также масляной и уксусной
кислот.
Очень показательно действие микробов — возбудителей этого
процесса на льняную солому, приводящее к полному разрушению
лубяных пучков.
Для получения накопительных культур термофильных
целлюлозных бактерий применяют следующую среду;
NaNH4HP04-4Н20 1.5 г
КН„Р04 0.5
К2НР04 0.5
MgS04 0.4
NaCI 0.1
MnS04 1 1 капля
FeS04 / 1% раствора
Пептон 5 г
СаС03 20
Водопроводная вода .... 1000 см1
рН 7.0—7.4
На дно пробирок, имеющих длину 30 см, помещают
небольшие кусочки фильтровальной бумаги. Высота ело я клетчатки 1.5—
2 см. Среду наливают высоким слоем (22—23 см) и после
стерилизации пробирки заражают конским навозом. Посевы
выдерживают при 60°. Спустя 4—5 дней начинается выделение газа.
Кусочки бумаги становятся вялыми, окрашиваются в желтый цвет,
и постепенно бумага превращается в аморфную желтую массу,
лежащую на дне тонким слоем. При микроскопии в молодых
культурах обнаруживают палочки, находящиеся в волокнах
клетчатки. В более старых культурах встречаются удлиненные клетки
с овальными спорами на конце. Пересевы культуры производятся
большой железной петлей, впаянной в длинную стеклянную
палочку. С помощью петли переносят полуразрушенную клетчатку
в свежую среду.
При термофильном брожении клетчатки образуются
этиловый спирт, муравьиная, уксусная, масляная, молочная кислоты,
водород и углекислый газ.
В элективных культурах анаэробных целлюлозных бактерий
обычно имеется несколько видов сопутствующих бактерий. Среди
них встречаются как аэробные, так и анаэробные виды. От
неспороносных форм легко освободиться нагреванием культуры
(100°—10 мин.). Затем производят многократные пассажи
культуры на жидкой среде в строго анаэробных условиях
(выкачивание воздуха вакуумным насосом из пробирок). Таким путем
очищают культуру от аэробных спороносных спутников. Труднее
избавиться от анаэробных бактерий, образующих споры.
Хувин (Khouvine) получила чистую культуру, промывая при
пересеъах кусочки разлагающейся бумаги стерильной водой.
23ё
Изолированная ею Вас. cellulosae dissolvens хорошо сбраживала
целлюлозу в анаэробных условиях на следующей среде:
Фосфорнокислого калия, двузамещеішого 1 г
Хлористого натрия 1
Пептона, полученного действием фермента
панкреатической железы 1
Углекислого кальция ... - 2
Клетчатки 10—20
Воды 750 см3
Фекального экстракта 250
Для выделения термофильных бактерий Снежно (Snieszko)
предложил следующую методику.1 Культура целлюлозных
бактерий пересевается в пробирки с мясопептонным бульоном. На
этой среде сопутствующая микрофлора развивается, тогда как
споры целлюлозных бактерий не прорастают. Затем пробирки
нагреваются при 100° в течение 10—15 мин., бактерии-спутники
убиваются и из бульона делаются пересевы на среду с клетчаткой.
Одновременно в эту же среду вносится чистая культура дрожжей
(Saccharomyces cerevisiae), в присутствии которых начинают
развиваться целлюлозные бактерии. Однако данный метод не всегда
дает надежные результаты, так как среди бактерий,
сопутствующих целлюлозным, могут быть виды, не развивающиеся на бульоне.
Чистые культуры бактерий, сбраживающих клетчатку при
высоких температурах, культивируются следующим образом.2
Фильтровальная бумага разрывается на мелкие кусочки, равные
приблизительно 0.5 см2. Последние вносятся на дно сухих
пробирок в таком количестве, чтобы их слой был не более 1 см.
В пробирки наливается среда, состоящая из 75% минерального
раствора с пептоном (ее состав был приведен выше при описании
методики получения накопительных культур термофильных
бактерий) и 25% мясопептоиного бульона. Лучше вместо бульона
добавлять такое же количество фекального экстракта. Последний
получается при настаивании 100 г испражнений в 1000 см3 де-
стиллированной воды в течение 12 часов. Жидкость затем
отфильтровывается через марлю и стерилизуется; выпавший осадок снова
отфильтровывается.
После посева целлюлозных бактерий выкачивают воздух из
пробирок при 5—7 мм ртутного столба. При 60° через 3—4 суток
брожение заканчивается, и вся целлюлоза превращается в
бесструктурную желтую массу. Хорошее брожение целлюлозы
возможно также на вышеуказанной среде с пептоном при
внесении в нее перед стерилизацией небольших кусочков печени или
почек. На минеральных средах только с пептоном чистые культуры
термофильных целлюлозных бактерий не развиваются.
1 Этот способ был впервые применен Омелянским, но ему таким путем
не удалось получить чистых культур (В. Омелянский, О водородном
брожении целлюлозы, Арх. биол. наук, 7, 1899, стр. 1—27).
2 Более подробно методика изложена в статье Л, Имшенецкого.
Микробиология 1939. Вып. 2.
236
В качестве плотных сред применяется целлюлозный агар
следующего состава:
Целлюлозы . . . 20 г
^Углекислого кальция 20
Агар-агара 20
Среды с пептоном и фекальным экстрактом 1000 см*
рН среды 7.2—7.3
Фильтровальная бумага тщательно растирается в ступке с
небольшим количеством жидкой среды, потом переносится в колбу,
содержащую 400 см3 среды, и продолжительное время
взбалтывается. К равномерной взвеси отдельных волокон целлюлозы
в жидкости добавляется остальное количество среды, мел и агар-
агар. Среда нагревается и после растворения агар-агара ее
разливают высоким столбиком в пробирки и стерилизуют. Разливая
среду, необходимо все время ее взбалтывать. Посев целлюлозных
бактерий производят в расплавленный и несколько остывший
агар. После заражения пробирки сразу помещаются в холодную
воду, иначе клетчатка осядет на дно. Посевы выдерживаются при
60°. Развитие бактерий в целлюлозном агаре с мелом
сопровождается образованием газа. В толще среды появляются трещины
и на 3—4-й день столбик агара разрывается.
11. РАЗЛОЖЕНИЕ ЖИРА
Разложение жиров происходит энергичнее, если источником
азотистого питания служит органическое вещество. При этом,
однако, сильно понижаются элективные свойства среды, и на ряду
с жирорасщепляющими микробами развивается множество
гнилостных и других микробов. Поэтому, опыты накопления жирорас-
щепляющих видов предпочтительнее вести в присутствии
аммонийных или азотнокислых солей. Приведем состав некоторых
минеральных растворов, предложенных для этой цели:
а) Раствор Рана (Rahn)
Дестиллированной воды 3000 см*
Фосфорнодвукалиевой соли 5 г
Фосфорнокислого аммония (NH4)3P04 . , 5
Сернокислого магния ... 1
Хлористого кальция ..... 1
Хлорного железа и поваренной соли . . следы
б) Раствор Зёнгена (Solmgen)
Водопроводной воды 1000 см8
Фосфорнодвукалиевой соли ....... 5 г
Мела 5
Двойной аммиачно-магнез иальной соли
фосфорной кислоты 1
в) Раствор с селитрой
Водопроводной воды ¦ . 1000 см8
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5 г
Азотнокислого калия 1
Хлористого аммония ,.-.•« 1
237
К растворам этим прибавляют иногда сахара, маннит,
глицерин и т. д.
Что касается прибавления к указанным средам жира, то Ран
поступает следующим образом. Расплавленное говяжье или
свиное сало он выливает в эрленмейеровскую колбу и, наклонив ее,
дает салу застыть на стенке колбы (рис. 140). Затем в колбу
приливает раствор.
Ленис (Lohnis) иЗенген прибавляют к раствору мелко
измельченный жир в количестве 0.3—0.5%. Можно брать бутирин, три-
стеарин,трипальмитин7 триолеин, свежее сало и пр.
Для эмульсирования жира, например оливкового масла,
служит раствор гуммиарабика или же эмульсия 3 яичных желтков
в 100 см3 дестиллированной воды.
Естественную эмульсию жира представляет
молоко.
Заражают землей, маслом, молоком,
масличными семенами и прогорклым
орехом. Колбочки выдерживают при 37°.
Обычно в жидкости обильно развиваются
плесени, которые в течение 2—3 месяцев
образуют углубление в слое жира.
Зенген наблюдал развитие бактерий
при разных температурах: если культура
велась при 18—25°, то появлялись кокки,
мелкие флюоресцирующие палочки и Bact.
punctatum, при 30—37°—Bact. lipolyticum
(несколько разновидностей).
Для качественных проб на
расщепление жиров Зенген пользовался следующим
простым приемом. Он покрывал тонким
слоем стерилизованного жира внутреннюю
поверхность стерильной сухой пробирки
и после застывания жира наливал в нее
стерилизованную жидкую питательную среду, наиболее
благоприятную для данной бактерии. г В присутствии жирорасщеп-
ляющих бактерий, обыкновенно уже через 2—3 дня, часть
жирового слоя, омываемая питательным раствором, белеет,
обыкновенно в тех местах, где обильнее рост микробов (у аэробов—
на поверхности жидкости, у анаэробов — внизу).
Для изолирования служит агар с эмульсированным жиром.
Ран употреблял 1.5% агар с минеральными солями и прибавлял
к нему пальмовое масло. Жир эмульсируется с агаром.
Всплывший наверх слой жира снимают, а нижнюю часть, лишь слегка
замутившуюся от капелек жира, употребляют для пластинок.
Ленис применял мясопептонный агар с 0.5% бутирина. Мутная
среда вокруг колонии жирорасщепляющих бактерий просветляется.
1 Сама по себе эта среда не должна образовать кислоты под влиянием
исследуемых микробов.
238
Рис 140 Опыт
разложения сала по Рану.
а — питательный раствор, Ъ —
слой застывшего сала
Можно пользоваться питательной желатиной такого состава:
Дестиллированной воды 1000 сма
Бутирина или триолеина 5 г
Азотнокалиевой соли 1
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Других неорганических солей следы
Желатины 150—200 г
В местах образования колоний получается просветление среды
(исчезает муть).
Для исследования жирорасщепляющих микробов часто
пользуются следующей методикой Эйкмана (Eijkmann). На дно чашки
Петри наливают расплавленное говяжье или свиное сало и
тотчас сливают обратно. На дне остается тонкий слой жира,
приставший к стеклу. На него наливают чуть-чуть теплый слой
питательного агара или, еще лучше, накладывают тонкую, уже
затвердевшую пластинку агара. Последний заражают на поверхности
исследуемым видом. Через 1—2 недели под колониями жирорасщеп-
ляющих микробов жир белеет и становится непрозрачным. При
снятии агаровой пластинки эти участки омыленного жира
Снимаются вместе с нею.
По Шрейберу (Schreiber), хорошей средой для жирорасщеп-
ляющих видов служит следующая:
Пептонной воды (1% пептона и 1% NaGl) 194 см8
Миндального масла 6 г
Мела ..* і (
Для эмульсирования жира 60 г миндального масла растирают
с 30 г хорошо измельченного гуммиарабика, затем прибавляют
45 см3пептонной водыи все вновь тщательно растирают. Полученную
эмульсию выливают в двухлитровую колбу и доливают до черты
пептонной водой. Тем не менее после стерилизации жир часто
поднимается на поверхность.
Чтобы сделать эмульсию возможно более однородной, жир
энергично взбалтывают в расплавленном агаре и выливают в чашки
Петри, помещенные в снег. Вследствие быстрого застывания жир
не успевает всплыть.
Руен помещал чашки с расплавленным агаром с жиром в
оцинкованные ящики, находящиеся в снегу.
Тернер (Turner) предлагает для установления факта расщепления
жира микроорганизмами прибавлять к питательному агару с
жиром сернокислую нильскую синь (Nilblausulfat); эта краска дает
в кислой среде синюю окраску, при рН=7.3—7.5 — красную
окраску. Этот способ испытывался в последнее время Иенсеном
и Гретти (Jensen and G г е 11 ie, Food Res., v. 2, 1937, p.
97—120, реф. «Centralbl. f. Bakt.», II AbL, 98, 1938, p. 266). При
этом способе готовятся и стерилизуются отдельно питательный
агар (с рН=7.4, посредством прибавления 0.5 г Na2HPO4,Kl00 см3
питательного агара) и эмульсия жира или масла. Для при-
239
готовления эмульсии берут 100 см3 очищенного хлопкового или
кокосового масла, 2 г траганта (по Тернеру, 3 г индийской камеди)
и 200 см3 горячей дестиллированной воды; тщательно взбалтывают,
пока шарики масла не будут диаметром 10jx; эмульсия
стерилизуется 15 мин. в автоклаве при 1 атм.; в пробирку с 5.5 см3
расплавленного агара прибавляется по 0.75 см3 эмульсии масла и 0.1%
нильской сини. При определении числа расщепляющих жир
микроорганизмов в жире, для лучшего распределения зародышей,
к воде, в которой приготовляется соответственное разведение,
прибавляют 1% олеата или таурохолята натрия. Для
установления наличия микроорганизмов, окисляющих жиры, Иенсен и Грет-
ти засевают чашки с агаром с жиром без нильской сини;
постоявшие в термостате засеянные чашки обливаются 0.5% водным
раствором диметил-р-фенилдиаминхлорнда. Колонии,
образующие оксидазу, принимают розово-красную окраску; еще лучше
употребление 0.4% водного раствора тетра-метилен-р-фенилдиа-
минхлорида, дающего пурпурную окраску.
Гольдин для учета жирорасщепляющих микроорганизмов
пользуется методом печаток. г
ъ Селибер для установления факта расщепления жира
микроорганизмами выращивает последние в минеральной среде, к которой
в качестве источника азота прибавляется фосфорнокислый
аммоний (0.1—0.2%) или пептон (0.1—1%); растительное масло
берется в количестве 2 см3 на 50 см3 среды. Эти среды могут служить
как для накопления микроорганизмов, расщепляющих жиры,
так и для изучения действия микроорганизмов на жиры. Для
определения кислотности жир извлекается эфиром, и титруются
отдельно эфирная вытяжка и водный раствор. Для
экстрагирования жира каждой колбочки употребляется 30 см3 эфира; эфирная
вытяжка получается трехкратным продолжительным
взбалтыванием с последующим отделением эфирного слоя. Перед
титрованием к эфирной вытяжке прибавляется 10 см3 спирта. Чтобы
быстро ориентироваться в способности микроорганизмов расщеплять
жиры, можно титровать культуры, не извлекая жира эфиром,
но при этом получаются менее точные результаты. В качестве
индикатора при титровании применяется фенолфталеин.
Для более подробного изучения изменений, претерпеваемых
жиром под действием микроорганизмов, жир, остающийся после
очистки эфира, подвергают анализу обычными методами;
определяют число омыления, кислотное йодное число, температуру
застывания или плавления жира и другие физические и химические
показатели, характеризующие жиры и масла. В качестве реакции
на наличие альдегидов в остаточном жире пользуются реакцией
Шиффа с фуксинсернистой кислотой или реакцией Крейса; в
последнем случае на жир или эфирный раствор жира действуют 0.1 %
эфирным раствором флорглюцина; при наличии альдегидов
получается розовая или красная окраска.
1 См. «Микробиология», т. III, 1934, стр. 274—276.
240
Разложение жира в анаэробных условиях или при
затрудненном доступе воздуха можно вызвать, засеяв минеральный
раствор почвой и налив сверху высокий слой стерильного
растительного масла (Селибер). Таким же способом можно вызвать
разложение жира, заражая илом или почвой, в которых имеются
микроорганизмы, восстанавливающие сульфаты (Селибер, Кацнельсон,
Седых),
12. РАЗЛОЖЕНИЕ ГЛЮК03ИД0В, ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА
И ВОДОРОДА
Разложение глюкозидов (амигдалина, арбутина)
сопровождается образованием кислот, за нарастанием которых легко
следить качественно (лакмус) и
количественно (титрование).
Бульонная среда с прибавлением
0.1% эскулина и 0.1% лимоннокислого
железа служит для дифференциального
распознавания В. соіі и В. lactis aero-
«enes. Под влиянием первого
почернение наступает не раньше 2 суток, а под
влиянием второго —через сутки и
притом в более сильной степени.
Почернение вызывается соединением железа
с эскулетином, образующимся при
расщеплении эскулина.
Состав сред с эскулином для
распознавания В. соіі был приведен на
стр. 49.
Для окисления метана в эрленмей-
рровскую колбу наливают тонким слоем
среду следующего состава:
Дестиллированной воды 1000 см3
Двойной аммиачно-магниевой соли
фосфорной кислоты 1 г
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Сернокислого кальция . , 0.1
Заразив тучной землей, навозом или сточной водой,
вытесняют из колбы третью часть воздуха метаном. Через 2—4 дня
при 30—37° на поверхности жидкости появляется красноватая
пленка, состоящая из Вас. methanicus.
Зенген построил специальный прибор для культуры этого
вида (рис. 141).
Для окисления водорода средою служит следующая жидкость:
Дестиллированной воды 1000 см3
Азотнокислого калия 2 г
Кислого углекислого натрия 1
Фосфоонодвукалйевой соли 0.5
Сернокислого магния 0.2
Полуторахлористого железа следы
16 Руководство по микробиологии 2А1
Рис. 141. Аппарат Зенгсна
для культуры микробов в
искусственной атмосфере
различных газов.
Сначала сосуд А наполняют доверху
питательным раствором и засеивают.
Затем через кран В пропускают
нужный газ или смесь газов, причем
жидкость вытесняется в сосуд D.
Под конец закрывают краны В и С.
Жидкость наливают тонким слоем в эрлснмейеровскую колбу,
заражают землей и колбу наполняют гремучим газом с примесью
углекислоты. Опыт ведут при 27—33°.
Для изолирования служит мясопептонная желатина или агар
состава:
Дестиллированной воды 1000 см3
Азотнокислого калия 1 г
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Выщелоченного агара (стр. 53) 20
ГЛАВА IX
КРУГОВОРОТ СЕРЫ, ЖЕЛЕЗА, ФОСФОРА.
ИЗБИРАТЕЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ
1. МИКРОБЫ, ВОССТАНОВЛЯЮЩИЕ СЕРНО-, СЕРНИСТО- И СЕРНО-
ВАТИСТОКИСЛЫЕ СОЛИ И СВОБОДНУЮ СЕРУ
Бейерияком и ван-Дельденом (van Delden) предложена
следующая среда для накопления в культуре спирилла, восстапов-
ляющего сернокислые соли (Spirillum desulfuricans):
Водопроводной воды 3000 см3
Молочнокислою натрия 5 г
Аспарагинэ Д
Сернокислого магния 1
Фосфорнодвукалиевой соли 0.5
Железного купороса следы
Засев производят илом, сточной водой, землей и т. п.
Эту среду можно видоизменять, заменив молочнокислый нат*
рий яблочно- или янтарнокислым, аспарагин — пептоном или
аммонийной солью, сернокислый магний — гипсом. Рекомендуют
также прибавлять к жидкости немного этилового спирта. Для
морских форм может слу?кить эта же среда с прибавлением 3%
поваренной соли.
Культуру можно вести в высокогорлых колбах (рис. 130)
или, как поступал Исаченко, в склянках в 100 см3 с притертой
пробкой. Он их наполнял на !/2 или 2/3 питательной средой и,
закрыв горлышко ватной пробкой, стерилизовал.
Стеклянные пробки, завернутые в лимонную бумагу, стерилизовал
отдельно сухим жаром. Стерилизованную жидкость заражал илом
или сточной" водой и склянку доливал доверху той же
стерилизованной жидкостью, после чего плотно закрывал
стеклянной пробкой. Для лучшей герметичности горлышко склянки
можно погрузить в расплавленный парафин. Культуры ведут
при 25—30°.
Если ил беден восстановляющими спириллами, то, по Бейе-
ринку, надо брать меньше молочнокислого натрия и прибавить
к жидкости пемного сернокислого натрия.
lb* 24S
Для обнаружения десульфурирующих бактерий в сточной
воде Бейеринк к 1 л этой воды прибавлял:
і) 3 смЗ солодового отвара, 1 г кристаллической соды и 0.2 г соли Мора
или:
2) 2 г гипса, по 0.05 г яблочнокислого натрия и аспарагина, 0.1 г
фосфорнокислого калия и 1 г соды.
Условия культуры те же, что были описаны выше.
Плотными средами могут служить приведенные растворы с
прибавлением агара или желатины. В присутствии железных солей
колонии десульфурирующих бактерий окрашиваются в черный
цвет (вследствие образования сернистого железа).
Восстановление сернисто- и серноватистокислых солей
происходит легче, чем сернокислых. В соответствии с этим, и число
микробов, вызывающих этот восстановительный процесс,
значительно больше (дрожжи, кишечная палочка и пр.).
Бейеринк наблюдал этот процесс в следующей среде:
Водопроводной воды 3000 см3
Виноградного сахара 50 г
Аспарагина , 1
Фосфорнодвукалиевой соли 1
Серноватистокислого натрия 0.5
Уже через сутки в жидкости появляется сероводород.
Хорошие результаты при культуре десульфурирующих бактерий можно
было получить (Исаченко, Бактерии Сев. Ледов, океана,
Петроград, 1914) на среде, указанной Бейеринком с изменениями:
Морской воды 100 см3
Аспарагина 0.25 г
Молочнокислого железа 0.1
Сернокислого магния 0.2
Фосфорнокислого калия 0.2
Углекислого наірия 0.25
Ван-Дельден применял также среду и такого состава:
Дестиллированной воды 100 см3
К2НР04 0.5 г
MgS04 - 0.25
FeS04 следы
Молочнокислого натрия 0.25 г
Аспарагина 0.1
Для культуры десульфурирующих бактерий Баарс применял
следующую среду:
Водопроводной воды 1000 см3
* К2НР04 0.5 г
NH4CI 1.0
GaS04 1.0
MgS04 2.0
Соли Мора следы
Органическое вещество прибавляют в количестве 30 millimol
на литр, рН=7.8. Перед посевом в склянку прибавлялся 1 см3
244
0.1 N водного раствора H2S. Как органические вещества могут
служить: 1) первичные алкоголи (метиловый спирт составляет
исключение), 2) многоатомные спирты, 3) альдегиды и кетоны,
4) сахара (глюкоза, фруктоза и манноза), 5) а оксикислоты и
р оксикислоты (а и (3 оксимасляная), 6) различные другие
органические кислоты, 7) некоторые азотсодержащие вещества (аспа-
рагин и др.)-
Различные виды десульфурирующих бактерий отличаются
между собой отношением к органическим веществам.
Прибавление к среде аспарагинане обязательно, и можно
получить хорошее развитие Microspira на среде (Баарс):
Водопроводной воды 1000 см3
КяНР04 0.5 г
NH4C1 1.0
Молочнокислого натрия 3.5
СаС13 следы
MgCl2 »
Необходимо удалять все следы кислорода, и поэтому получение
культуры облегчается пропусканием водорода. Microspira ЯиЪеп-
tschickii — единственная из известных — может развиваться на
уксуснокислых солях, что служит диагностическим для нее
средством.
Пелып культивировал М. aestuarii из Каспийского моря
на среде следующего состава:
Ультрафильтрованной морской воды. . 1000 см3
Аспарагина 1.5 г
Са(С3Н,03) 7.5
NH4MgP04 -6HaO 2.0
NaHCOs 0.2
FeS04 0.02
Количество аспарагина, в зависимости от цели, может быть
увеличено в 2 раза, а молочнокислого кальция или натрия —
в 4 раза.
Хорошие результаты получены им были также на (Среде:
Дестиллированной воды 3000 см3
Аспарагина 3.0 г
NaC3H603 - . . 35.0
Na2S04 16.0
NaCl 5.0
- NH4MgP046H20 2.0
KC1 0.2
FeS04 0.02
(фосфатные растворы 0.25 M на 60 мл среды по 10 мл^
После кипячения к среде добавляют небольшое количество
раствора Na2S для связывания растворенного кислорода.
Пробки покрывают замазкой Кренгеля (канифоль+ воск).
Для доказательства восстановления серы к свежепрокипя-
ченой мясной воде (стр. 46) прибавляют 0.1% молочнокислого
железа или соль Мора и этим раствором наполняют две колбы:
245
одну с серным цветом, другую без него. Заражают илом из
сточного канала или загрязненной землей. При 30° уже через сутки
обнаруживается выделение сероводорода (почернение вследствие
образования FeS), особенно в колбе с серным цветом.
Еще легче вызвать образование сероводорода, прибавив к мя-
сопептонному бульону немного серного цвета или серного молока
и заразив илом или землей.
Приготовление серного молока
2 весовые части серного цвета нагревают с 13 частями воды
и 1 частью гидрата окиси кальция до перехода серы в раствор.
Сильно разведенный раствор пятисернистого кальция осаждают
разведенной соляной кислотой. Через 12 час. взвешенная сера
осаждается в виде бело-желтоватого осадка, который
отфильтровывают, промывают и сушат в эксикаторе над хлористым
кальцием. Эту серу в различных пропорциях прибавляют к
питательным средам.
Количественное определение H3S — см. стр. 171.
2. СЕРОБАКТЕРИИ
Для получения разводки серобактерий Виноградский бросал
на дно высокого стеклянного цилиндра кусок корневища сусака
(Butomus umbellatus), прибавлял немного ила и гипса и заливал
цилиндр доверху водопроводной водой. Приблизительно через
неделю вода начинала издавать легкий сероводородный запах,
а через месяц микроскоп открывал в ней присутствие
серобактерий, количество которых настолько быстро возрастало, что вскоре
скопления их можно было видеть простым глазом. В этих
условиях чаще всего развивались бесцветные нитчатые серобактерии,
покрывающие корневища Butomus сероватым войлоком.
Хорошие результаты были получены нами на среде состава
5% отвара солода іООО см*
Виноградного сахара 5 г
Пептона I
Серного цвета d0
Агар-агара 20
Расплавленный агар засеивают OLdium lactis и разливают
в чашки Петри. Когда через несколько дней при 30° начинается
выделение сероводорода, агар разрезывают на куски и несколько
кусков бросают на дно высокого цилиндра, залитого доверху
водопроводной водой и накрытого стеклянной пластинкой. Через 10—
15 дней на поверхности жидкости появляется толстая пленка,
содержащая, на ряду с различными микробами, нити Beggiatoa,
сплошь набитые каплями серы. В этих условиях серобактерии
живут очень долго, не теряя своей серы, следовательно
обеспеченные сероводородным питанием.
Серобактерии часто развиваются в виде ясно видимого мутноп)
24$
слоя в цилиндре, причем положение этого слоя, его уровень в
жидкости изменяется в зависимости от энергии выделения
сероводорода снизу (рис. 142 и 143).
Для обнаружения сероводородной зоны в нижней части
жидкой культуры Егунов пользовался реактивной нитью,
приготовляемой из. тончайшей бумажной
нити, обработанной слабым
раствором полуторахлористого
железа (Fe2Gl6), потом аммиаком;
окраска от соли железа должна
быть едва заметна; после
тщательной промывки нить кладут в де-
Ь
стиллированную воду, чтобы не
дать высохнуть, куски ее
испытывают сероводородом или сернистым
аммонием — она должна чернеть
по всей длине без перерывов;
сохранять ее можно в воде, но лучше
пользоваться свеже
приготовленной нитью. Надев на один конец
стеклянный груз, а другой
прикрепив к длинному стеклянному
крючку, ее погружают в культуру. Рис. 142.
Рис. 143.
Рис. 142. Пластинка серобактерий
в цилиндре с
лиманнойгрязью,залитой водой:
а — уровень жидкости, Ь — пластинка
серобактерий, с— слой грязи.
Рис. 143. Пластинка серобактерий
по Егунову.
Нить должна быть целиком
погружена в жидкость, потому что
иначе вследствие волосности и
испарения происходит концентрация
солей на ней и возникают
неизбежные при этом токи жидкости.
По данным Боргардта, серобактерии образуют типичную
пленку в воде, налитой на агар следующего состава:
Дестиллированной воды 1000 см3
Сернистого калия (K2S) 3 г
Фосфорнодвукалиевой соли 0.2
Хлористого аммония 0.1
Хлористого магния 0.1
Агар-агара . , 30
По Молишу, легко получить разводку пресноводных или
морских пурпурных бактерий, прибавив к соответственной воде какое-
либо органическое вещество, например сено, сваренное куриное
яйцо, свежую воловью кость, гниющую морскую траву, морскую
рыбу и т. п. Пурпурные бактерии развиваются очень медленно,
предпочтительнее на сильно освещенных местах, в высоких
цилиндрах, доверху наполненных водой.
Для изолирования служит агар состава: 3
Водопроводной воды 4000 см1
Пептона 5г.
Виноградного сахара(или глицерина). . 5
Агар-агара 18
Ы7
Культуру ведут в высоких пробирках, которые выдерживают
на свету. Когда колонии станут заметными, пробирку разрезают
и делают отвивки из красных колоний.
Бейеринк применял для накопления культуры и такой
сравнительно простой прием: взяв склянку с илом и водой, закрытую
пробкой, прибавлял немного сероводорода и выставлял ее на свет.
Время от времени склянку он встряхивал и прибавлял
сероводород. После оседания ила жидкость делалась прозрачной, а
через 14 дней или 2 месяца на стенках склянки и в глубине ила
появлялись пурпурные пятна. Склянку после этого можно больше
не встряхивать, но сероводород прибавлять более часто.
Пипеткой можно насосать ил с Chromatium, развившимся на нем.
Исаченко применял для получения культур морской ил,
который вместе с морской водой помещал в высокие цилиндры, а к
воде прибавлял для ускорения развития десульфурирующих
бактерий немного среды ван-Дельдена.
Гинсбург-Карагичева применяла культуры
десульфурирующих бактерий, развившиеся в пробирке внутри агара,
приготовленного на среде ван-Дельдена, сверху агара наливала материал
с пурпурными бактериями.
Как в том, так и в другом случае этими способами удавалось
вызвать развитие пурпурных бактерий.-
Ван-Ниль(уап Niel) культивировал пурпурных и зеленых
бактерий и получал чистые их культуры на среде:
Дестиллированной воды .... 1000 см3
NH4G1 0.1%
К8НР04 0.1 (лучше 0.05)
MgCl, 0.1 (лучше 0.02)
NaHG03 0.1
Na2S • 9Н20 0.1
Среду рН = 8.0—8.5 он заражал небольшим количеством
материала из нечистой культуры. Склянку залолняд средой доверху
и плотно закрывал притертой пробкой.
Развитие бактерий происходило на 2—3-ю неделю и достигало
максимума после 4—6 недель.
Если в первых посевах развивается несколько форм, то в
последующих пересевах число их уменьшается постепенно и
получается микроскопически чистая культура.
Так как развитие пурпурных бактерий происходит на свету,
то можно прибегнуть к искусственному освещению электрическими
лампочками в 25—50 W, помещенными на расстоянии 20—30 см
от культуры.
Склянки с культурами можно ставить в шкаф с постенными
полочками для склянок, а в средине шкафа, одну над другой,
поместить 4 лампочки по 25 W. Температура внутри такого
освещаемого термостата (термолюминостат) будет 25—10°.
Необходимое изменение рН среды может быть достигнуто
прибавлением Na2C03 или Н3Р04.
24S
При приготовлении среды Na2S в виде 10% раствора
стерилизовать отдельно, так же как и 10% растворы Na2C03 и Н3Р04,
служащие для установления рН среды.
В качестве твердой среды ван-Ниль применял агар, промытый
в водопроводной воде, которую он сменял каждые 2—3 дня; затем
2 дня сменял дестиллированную воду и потом тщательно промывал
агар в дестиллированной воде.
В раствор 2.5% агара он прибавлял NH4Cl —1%, К2НР04—
0.05%, MgCl2 —0.02% (а для морских форм еще и NaGl в
соответствующей концентрации). До застывания агара при 45° к среде
добавить нужное количество отдельно стерилизованных Na2S и NaHC03.
рН среды установить стерильными растворами Н3Р04 и Na2C03.
В пробирку с жидким агаром внести затем небольшое
количество материала, содержащего бактерии, и сотрясением ее
распределить в агаре. Несколько капель из этого агара перенести в
следующую пробирку и т. д. в 6—8 последовательных пробирок.
Для быстрого застывания агара пробирки после посева ставить
в холодную воду. На поверхность агара, чтобы затруднить приток
воздуха, налить стерилизованную смесь равных частей парафина
(с точкой плавления 50°) и жидкого парафина. Пробирки надо
поставить в освещаемый термостат. Обычно колонии появляются
на 2—3-й день в первых пробирках, а на 7-й день они заметны и
в последних разведениях (1—10 колоний в 6—8-м разведении).
Пробирку, в которой не более 50 колоний, нужно разрезать
в нижней части и вытолкнуть агар со всеми предосторожностями
против загрязнения в стерилизованную чашку Петри. В чашке
стерилизованным скальпелем (проведенным над пламенем горелки)
вырезается из колонии небольшой кусочек для микроскопирования,
чтобы убедиться в ее чистоте. Если колония окажется
микроскопически чистой, то делается из нее по указанному выше способу
вторая серия разведения в пробирки с агаром, с которой опять
поступают так же, как с первой серией, ибо получить культуру
чистую в строго бактериологическом смысле слова не легко.
Каждый пересев проверяется под микроскопом.
После того как, по крайней мере, в третьей серии пересевов
появились колонии, из них можно уже сделать пересевы в склянки
с*жидкой средой.
Полезно при этом убедиться (посевами на мясные среды) в
отсутствии в культурах обычных бактерий. Нужно заметить, од-,
нако, что не редко в культурах развиваются все же на ряду с
пурпурными бактериями и зеленые серобактерии, которые (по
Виноградскому) благоприятствуют развитию пурпурных.
Мюллер (Mtiller) для культуры пурпурных бактерий применял
среду:
NaGl 2%
(NH2)S04 0.1
К2НР04 0.05
MgS04 0.02
NaHG03 0.5
249
К среде прибавляли 0.1—0.05% Na2S-9HaO, который
стерилизовался отдельно, a NaHC03 прибавляли к среде, пропустив
его через фильтр Зейца (Seitz). Культуру ведут при полном
удалении кислорода.
Для культуры пурпурных серобактерий пригодна также среда
(принятая А, Д. Пельш):
Дестиллированной воды . . . 100%
NH4C1 0.1
К2НР04 0.05
MgCl2 0.02
NaHG03 0.5
Na2S . 9Н20 0.2
Раствор NaHG03 (5 %) стерилизуют ультрафильтрацией че-
рез асбестовые ультрафильтры в приборе по типу Зейца (см.
А. П е л ь ш, Труды Бородинской биологической станции, т. VIII,
3, 1935). Остальную среду 10% концентрации стерилизуют
кипячением. Культуры ведут на свету, ночное освещение
электролампой.
Сосуды (Мора) емкостью 50—100 см3 закрывали притертой
пробкой, заливаемой толстым слоем замазки Кренгеля (кани-
фоль-f-BocK).
рН—7.5 устанавливается колориметрически, по Михаэлису,
добавлением растворов Н3Р04 и Na2G03.
Для накопления тионовокислых бактерий, окисляющих сер-
новатистокислые соли в соли тетратионовой и серной кислоты,
Натансон (Nathanson) рекомендует морскую воду с 0.1—1°/0
Na2S203 или следующий раствор:
Дестиллированной воды 1000 см*
Серноватистонатриевой соли 2—10 г
Поваренной соли 30
[Хлористого магния 2.5
Азотнокальциевой соли 1
Фосфорнодвунатриевой соли 0.5
Углекислого магния щепотка
Заражают морским илом, издающим запах сероводорода.
Через 1—2 дня на поверхности жидкости появляется белая
пленка, содержащая капли аморфной серы и палочку, которая легко
может быть изолирована на агаре такого же состава. Колонии через
несколько дней приобретают опаково-белый вид или они
прозрачны и ирризируют.
Пресноводные формы растут в налитой тонким слоем жидкости
следующего состава:
Водопроводной воды 1000 см1
Серноватистонатриевой соли 5 г
Двууглекислой соды 1
Фосфорнодвукалиевой соли 0.2
Хлористого аммония 0.1
Хлористого магния 0.4
Заражают сточным илом нестерилизованную жидкость,
поверхность которой через 2—3 дня покрывается серой и бактериями.
Изолирование на той же среде с агаром.
Еще проще протекает окисление серноватистокислых солей
иод влиянием Thiobacillus (Thidbacterium) thioparus с образованием
сернокислой соли и серы, отлагающейся вне тел микробов. Вид
;>тот можно культивировать на среде, состав которой приведен
на стр. 194, лишь с заменой серы серноватистонатриевой солью.
Тионовокислые бактерии, окисляющие серу и ее соединения,
используют в качестве источника энергии серу, тиосульфаты или
сульфиды, а углерод — из С02 или из карбонатов.
Описанная Бейеринком Thiobacillus thioparus развивается
на среде, предложенной им:
Дестиллироваиной воды . . 1000 см3
Na2S2(V5H20 5.0 г
NH4GI 0.1
NaHCO, d.O
Na2HP04 0.2
MgCI, 0.1
Двууглекислый натрий и тиосульфат следует фильтровать
отдельно. На поверхности среды через несколько дней после
посева появляется тонкая пленочка, состоящая из серы. В
дальнейшем пленочка увеличивается, хорошо заметен ее желтый цвет.
Для получения чистых культур из развившихся на приведенной
среде тионовокислых бактерий служит твердая среда,
приготовленная по тому же рецепту, но с добавлением агар-агара (2%
заграничного или 5—6% нашего). Реакция среды щелочная.
Для получения культур тионовокислых Th. thiooxydans
падо приготовить следующую среду:
Дестиллироваиной воды . . 1000 см5
(NH4)2S04 0.2 г
КН,Р04 3.0
MgS04-7H20 0.5
СаС12 0.25
FeSO* следы (0.О0П
S 10.0
Среду разлить по колбочкам (по 100 см3), серу отвесить и
прибавить после стерилизации жидкой среды, стерилизуя ее
отдельно в сухой пробирке. Стерилизовать по 30 мин. в течение
3 дней.
Для выделения из почвы хорошие результаты получаются,
если накопить бактерий в почве до посева. С этой целью взять
60 частей почвы? 30 фосфата и 10 серы, все хорошо перемешать,
смочить водой до 00% влажности, доливая воду по мер§
подсыхания почвы. Приблизительно через 2—3 месяца развитие
тионовокислых бактерий достигает максимума и нерастворимые
фосфаты растворяются. Можно взять новую почву и заразить ее
старой; процесс при этом пойдет много быстрее. Такой почвой,
36і
обогащенной бактериями, заразить затем жидкую среду. Через
4—5 дней жидкость помутнеет и реакция ее сделается заметно
кислой. Пленки на поверхности не образуется. Пересевы делать
каждые 7—10 дней. Реакция среды может дойти до рН=2.0.
Для получения чистых культур пригодна среда:
Дестиллированной воды 1000 см5
Na2S303 Ь г
NH4G1 0.1
СаС13 0.24
К2НР04 3.0
Агара 20.0
Были предложены и другие среды, которые вполне пригодны
для культуры тионовокислых бактерий, отличающихся между
собой физиологическими особенностями. Поэтому при
исследованиях необходимо испробовать посевы на различных средах.
Среда Траутвейна (Trautwein, Zentralbl. fur Bakt.,
II, Bd. 53, 1921)
Na2S204 0.2%
MgCl, 0.01
KNO3 0.1
Na2HP04 0.02
NaHG03 0.1
pH — 9-0 (после стерилизации)
Прибавляя агар (2%) к этой среде, можно получить твердую
среду.
Старки (Starkey, Paper № 189, Journ. Series of the New
Jersey Agric. Exp. Station) для получения Th. thiooxydans применил
среду:
Дестиллированной воды .... 100 см3
(NH4)2S04.5HaO 0.02—0.04 г
КН2Р04 0.3-0.4
СаС12 0.025
MgS04 0.05
FeS04 0.001
Серы 1.0
или Na2S2Oa 0.5
S отвешивать отдельно для каждой колбы или склянки.
Реакции рН=3.0 достигать прибавлением H3P04(-j-)' Стерилизовать
1
текучим паром 3 дня по — часа. Na2S303 стерилизовать отдельно
и прибавлять в каждую склянку в нужном количестве.
Другая среда, твердая, примененная Старки, была следующая:
Дестиллированной воды 1000 см3
Na2S303-5H20 5.0 г
кн2ро4 з.о
NH4G1 і. . . . 0.1
MgCla 0.1
СаС1а 0.25
Агара 20.0
252
Липман, Ваксман и Иоффе (Lipman, Waksman и Joffe, 1921)
применили для выделения из почвы тионовокислых бактерий
(77г. thiooxydans) среду:
Дестиллированной воды 3000 см3
(NH4),S04 2.0 г
К2НР04 1.0
MgS04 0.5
KG1 0.5
FeS04 0.01
Декстрозы 10.0
Серы 10.0
Са3(Р04)2 10.0
Реакция после стерилизации рН =6.0—6.2 Са3і(Р04)2 и S
отвешивать отдельно и прибавлять в каждую колбу (на 100 см3)
по 1 г. Стерилизовать по 30 мин. ежедневно 3 дня.
Исследуя горячие источники (термы) Японии, Эмото (Emoto,
Bot. Magazine, Tokyo, В. 47, 1933; три статьи) применил с
хорошими результатами среду следующего состава:
Na2S203 0.5%
MgCl2 0.01
NH4G1 0.01
СаНР04 0.5
КН2Р04 0.3
реакция рН =5.2—5.4
Для получения твердой среды прибавить 2% агара.
3. ЖЕЛЕЗОБАКТЕРИИ
Для получения разводки железобактерий Виноградский
бросал в высокий цилиндр вываренное в большом количестве воды
сено, прибавлял туда же свежеосажденный гидрат окиси железа
и заражал небольшим количеством ила или тины. Цилиндр затем
заливался доверху колодезной водой, через некоторое время на
поверхности жидкости и на стенках сосуда появлялись ржавые
пятна, постепенно разраставшиеся^ вскоре покрывавшие стенки
цилиндра сплошным войлоком железобактерий, главным образом
Leptothrix ochracea и некоторых других.
По Молишу, если в литровый цилиндр прибавить 100 г земли,
500 см3 водопроводной воды и 0.5 г двойной аммиачно-железной
соли лимонной кислоты, то при 20° через некоторое время в
жидкости появляются хлопья железобактерий из родов Crenothrix
и Cladothrix.
Накопление в жидкости Leptothrix ochracea происходит, по
Молишу, в следующих условиях. В высокий бокал, покрытый
стеклянной пластинкой, наливают водопроводной воды с прибавлением
0.05% манганпептона [Мерка (Merck)]. При комнатной
температуре обыкновенно уже на 3—1-й день появляются краснобурые
хлопья железобактерий, главным образом Leptothrix ochracea,
а также Cladothrix, Antophysa и др. Через 1—2 недели на поверх-
Z63
ности жидкости образуется темнобурая пленка. Пересев
производят в нейтрализованный торфяной отвар (вываривается 1 кирпич
торфа в 1 л воды) с примесью 0.025% манганпептона. Когда через
несколько дней на поверхности жидкости появятся хлопья
железобактерий, приступают к их изолированию на той же среде с
прибавлением 10% желатины (перед застыванием слегка
подщелачивают среду). Колонии железобактерий на этой среде дней через
9 достигают величины в 0.5—2 мм. Сначала они бесцветны, затем
слегка желтеют и, наконец, принимают краонобурый оттенок.
Колонии постепенно углубляются в желатину. При отвивке из
них в жидкую среду наблюдается энергичный рост: на поверхности
жидкости образуется пленка толщиной до 3 мм.
Изолирование Spirophyllum ferrugineum, по Лиске, ведут
следующим образом. В наполненные водопроводной водой эрлен-
мейеровские колбы прибавляют крупные железные стружки и
немного экстракта опавших листьев — столько, чтобы жидкость
не приняла желтого цвета. Не мешает прибавить на дно немного
ила из бассейна, где имеется Sp. ferrugineum. Рост
железобактерий обычно появляется уже на 4-й день. Производя пересевы в
такую же стерилизованную жидкость, можно добиться очень
обогащенных культур. Дальнейший пересев делают в небольшую
эрленмейеровскую колбу, в которой налита слоем, в 2 см,
следующая жидкость:
Дестиллированной воды ,......, 1000 см3
Сернокислого аммония - . 0.5 г *
Хлористого калия 0.05
Сернокислого магния 0.05
Фосфорнодвукалиевой соли 0.05
Азотнокислого кальцин 0.01
До употребления стерилизованная жидкость должна
сохраняться несколько дней на воздухе для насыщения кислородом,
В каждую колбу затем прибавляют по 0.05 г стерилизованных
сухим жаром железных опилок и заражают молодой колонией Sp.
ferrugineum. Колбу помещают под стеклянным колпаком, куда
пропускают около 1% углекислого газа. На 4-й день на стружках
обыкновенно появляется сплошной налет или же на стенках
колбочки островки железобактерий светложелтого цвета.
Температура должна быть около 6°. Роль углекислого газа состоит в том,
что в его присутствии железо переходит в двууглекислую соль.
Бюсген (Btisgen) культивировал железобактерии в очень
разведенном растворе мясного экстракта. Для изолирования служила
плотная среда [Гёфлих (Hoffiich)]:
Водопроводной воды 1000 см*
Мясного экстракта 0.5 f
Желатины 45
По Лиске (Lieske), железобактерии растут на 1% водном агаре
с 0.01% уксуснокислого марганца и на чистых пептонных раство-
pax. В последнем случае прибавление разбавленного раствора
МпС03 усиливает рост. Присутствие СОа полезно для роста.
Для получения в лаборатории культур морских
железобактерий Буткевич помещал принесенный драгой полужидкий ил в
банку; ил оседал вниз, и при высоте его слоя около 14 см над ним
образовывался слой воды толщиной около 2 см. Банка, в которой
находился ил, закрывалась пробкой, залитой парафином, и
помещалась на окно при температуре 10—12°. Через 2—3 недели на
поверхности, над слоем отстоявшейся воды, появлялся налет ржа-
вобурого цвета из беломорского ила и ярко кирпичнокрасного
цвета из Баренцова моря.
Рёсслер (Rossler) получал разводку Crenothriz polyspora
следующим образом. Кусок кирпича, величиной около 1.5 см3,
прокаливают в закрытом фарфоровом тигле и после охлаждения
вносят в стерилизованный 0.02% раствор железного купороса,
налитый в небольшую эрленмейеровскую колбу. Заражают
несколькими кубическими сантиметрами исследуемой воды.
Через несколько дней на поверхности кирпича появляются
железобактерии, и вода буреет, а через несколько недель весь кусок
кирпича покрывается налетом железобактерий. Обработав этот
налет крепкой соляной кислотой, можно наблюдать под
микроскопом нити Crenoihrix polyspora.
Для обнаружения железа в закисной форме в неорганических
и органических соединениях служит реакция Чугаева. К слабо
подкисленной жидкости прибавляют спиртовой раствор демитил-
глиоксима, раствор сернокислого гидразина (немного), небольшой
избыток аммиака и кипятят в течение нескольких минут.
Жидкость принимает, смотря по содержанию железа, различный
оттенок: от светло розового до вишневокрасного. Окисное железо
этой реакцией не обнаруживается.
Культура железобактерий может быть и на среле
следующего состава (Виноградский):
Дестиллированной воды 1000 см3
NH4N03 0.5 г
NaN02 0.5
К2НР04 0.5
MgS04-7H2O 0.5
СаС12 0.2
Аммиачно-железной соли лимонной
кислоты 10.0
Культуры железобактерий в искусственных средах удаются
не всегда, так как физиология этих организмов еще не вполне
известна, а по имеющимся данным отношение к органическим
веществам не у всех представителей этой группы одинаково.
Необходимо добиться точного определения микроорганизма, который
собираются культивировать, и затем применять для его культуры
те приемы, которые описаны для него в соответствующей
литературе (см. С h о 1 о d п у, Die Eisenbakterien, Jena, 1926; в этой
256
монографии дана литература вопроса и описаны морфологические
признаки главнейших представителей). В водоемах железные
бактерии встречаются как среди охристого осадка, так и в виде
ватообразных хлопьев.
4. РАСТВОРЕНИЕ ФОСФОРНОКИСЛЫХ СОЛЕЙ
Растворение фосфатов бактериями можно обнаружить весьма
простым опытом. На дно чашки Петри насыпают небольшое
количество стерилизованной нерастворимой фосфорноизвестковой соли
Са3(Р04)2, а поверх наливают слой агара, содержащего 2%
раствор виноградного сахара в почвенном экстракте. Осторожным
наклонением чашки соль смешивают с агаром, который затем
заражают бактериями, разлагающими сахар с развитием кислот.
Вырастающие при 30—35° колонии постепенно окружаются
прозрачными ореолами вследствие растворения фосфатов.
Получается картина, напоминающая изображенную на рис. 133.
5. БАКТЕРИИ, РАЗЛАГАЮЩИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ
Разложение парафина, керосина и других углеводородов
вызывается различными микроорганизмами. Для культуры их Зен-
ген применял следующую среду:
Водопроводной воды 1000 см3
NH4C1 0.5 г
К2НР04 0.5
Парафина Ю.О
СаС03 следы
Для выделения в чистые культуры он применял твердую
среду:
Дестиллированной воды 1000 см3
К2НР04 0.5г
MgS04 0.5
NH4C1 0.5
Агара 20.0
Керосина пары
Среда Таусона, примененная им, имеет состав:
Ca(N03)2 0.1%
KN03 0.1
MgS04 0.025
К2НР04 4- КН2Р04(1 . 1) 0.025
Fe2(S04)3 0.0005
Углеводород прибавляют в количестве 1%, среда имеет рН =
=6.8—7.6 в зависимости от свойств культуры.
Для приготовления твердой среды к минеральному раствору
солей прибавить 1.8—2% выщелоченного агара.
Тауш (Tausz) и Донат (Donath) (Oxydation des Wasserstoffs...
mittels Bakterien. Hoppe-Seyler's Ztschr. f. Physiol. Ghemie, Bd.
190, 1930) для окисления водорода выделенной ими и<* земли
Bact oliphaticum liquefaciens применили неорганическую среду:
266
Дестиллированной воды 600 см3
MgNH4P04 1 г
Са904 (хим. чист.) 0.1
К2НР04 0.8
FeCla , следы
KJ »
Объем был доведен до 1 л пропусканием водяных паров.
Твердой средой служил следующий состав: 45 г агара лучшего
качества [Мерк (Merck)] растворялись в 500 см3 воды и затем
пропускался водяной пар (при встряхивании агара), пока объем не
был доведен до 1 л. После этого агар был вылит в высокий
стеклянный цилиндр, который был поставлен в аппарат Коха для
оседания взвешенных частиц на 6 часов. Когда агар затвердевал,
то верхняя светлая его часть распределялась по пробиркам и
трижды стерилизовалась в текучем паре.
Казерер (Kaserer) дает следующую среду для бактерий,
окисляющих метан:
Дестиллированной воды 1000 см3
NH4C1 . .' 1.0 г
К2НР04 0.5
MgS04.7H20 0.2
РеС13 следы
Метан получают нагреванием порошка уксуснокислого
натрия и гидроокиси бария на песчаной бане; выделяющийся газ
промывают бромной водой и едким натром и собирают над водой
и газометр. Так как метановые бактерии аэробны, то в сосуды
с культурами нужно пропустить смесь метана и кислорода, причем
последнего должно быть около 2%.
Казерер применил для культуры бактерий (Hydrogenomonas),
окисляющих водород:
Дестиллированной воды * 1000 см3
NH4G1 1.0 г
NaHC03 0.5
КаНР04 0.5
MgS04-7H80 0.2
FeCl3 следы
Для культуры Вас. pycnoticus была предложена среда
следующего состава:
NH4C1 1.0 г
NaHC03 1.0
КНоР04 0.5
MgS04-7HaO 0.1
NaCl 0.1
Реакция среды рН ==7.1—7.2,что достигается NaHG03+ КН2Р04.
Стерилизовать среду фильтрацией через пористые свечи.
Источником энергии служит водород, прибавленный к атмосфере, но
микроорганизмы могут жить в отсутствии водорода и за счет
органического вещества (тогда гетеротрофы).
17 Руководство по микробиологии "57
6. ИЗБИРАТЕЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ МИКСОБАКТЕРИИ, ПЛЕСЕНЕЙ,
ЛУЧИСТЫХ ГРИБКОВ, ВОДОРОСЛЕЙ, АМЕБ И ЦИЛИАТ
Миксобактерииг
В природе миксобактерии встречаются преимущественно на
разлагающихся растительных остатках, навозе различных жи
вотных и в почве. Многие из них не растут на мясопептонных
средах и поэтому не учитываются при обычных
микробиологических анализах.
Для: выделения копрофильных видов миксобактерии в чашки
Коха насыпается слой почвы толщиной 1—1.5 см. На поверхность
почвы помещается 5—6 кусочков стерильного кроличьего навоза,
который перед стерилизацией промывается водопроводной водой
в течение одного часа. Почва и навоз слегка увлажняются, и
чашки помещаются в эксикаторы, на дне которых налита вода.
Эксикаторы выдерживаются в течение 15—20 дней при 25—30°.
Почвенные миксобактерии образуют на поверхности навоза плодовые
тела красноватого, оранжевого, бурого или зеленоватого цвета.
Последние микроскопируются при небольших увеличеріиях
сначала на поверхности навоза, а затем в капле воды, куда они
переносятся иглой. Устанавливаются размеры и форма плодовых
тел и отдельных цист. У видов, имеющих цистофоры, выясняется
их характер и высота. Затем плодовые тела раздавливаются
покровным стеклом. У миксокоинов они содеря^ат шаровидные
микроцисты («споры»); цисты других миксобактерии (Sorangium,
Polyangium, Chondromyces и др.) наполнены сократившимися
клетками палочковидной формы, тесно прилегающими друг
* Другу-
Получить рост миксобактерии можно также на некоторых
твердых субстратах. Различные виды не одинаково хорошо
развиваются на приведенных ниже средах. Поотому исследузмый материал
лучше засевать сразу на несколько сред.
Плотные среды для миксобактерии
1. Грибной агар. Измельченные грибы: Boletus
scaler (подберезовик) 50 г и Bol. rufas (подосиновик) 50 г
отвариваются в 1000 см3 водопроводной воды. Жидкость фильтруется через
марлю и к ней прибавляется 5 г крахмала и 20 г агар-агара.
2. Дрожжевой агар. Сухих пивных дрожжей (Sacch.
cerevisiac) 50 г, крахмала 5 г, агар-агара 20 г, водопроводной
воды 1000 см3.
3. Навозный агар. В 1 л водопроводной воды
отваривается 100 г кроличьего навозя. После фильтрации (марля)
добавляется 5 г крахмала и 20 г агар-агара.
1 Составлено по неопубликованным материалам Имшенецкого и
Солнцевой.
258
4. Картофельный агар. Реакция сред устанавли-
иаотся рН=6.3—6.7. Засеянные чашки помещают в термостат
при 25° и через 8—15 дней отыскивают, в большинстве случаев,
окрашенные колонии миксобактерий. При микроскопии колоний
обнаруживают типичные группировки клеток и различные стадии
образования цист и плодовых тел. Иногда на чашках, особенно
наросших грибами, появляется несколько концентрических
колец, состоящих из плодовых тел миксобактерий. Последние лучше
развиваются в условиях симбиоза с другими бактериями и
нередко образуют «смешанные колонии». В этих случаях на
поверхности бесцветных колоний посторонних бактерий видны
окрашенные плодовые тела миксобактерий. Отдельные
физиологические группы миксобактерий (разлагающие клетчатку или хитин),
иыцеляются на специальных элективных средах.
Изолировать чистые культуры миксобактерий иногда удается
сразу путем отсевов из отдельных колоний, выросших на одной
из вышеуказанных сред. Хорошие результаты дает метод,
основанный на способности некоторых видов миксобактерий давать
стелющийся рост, быстро распространяющийся по поверхности
греды. Выделение производится следующим образом.
Смешанная культура вместе с вырезанным иглой небольшим кусочком
агара переносится на чашку с плотной средой. Ее состав:
гуммиарабика 5 г, агар-агара 10 г, водопроводной воды 1000 см3.
Непосредственно вокруг кусочков агара развиваются
сопутствующие бактерии, тогда как колония миксобактерий быстро
распространяется в виде тонкого налета на участки среды, свободные
от посторонних бактерий. Отсевы из края такой колонии дают
чистую культуру. Этот метод особенно пригоден для выделения
Chondromyces и Мelittangium. В тех случаях, когда выделение
миксококков на плотных средах не удается, производят
нагревание культуры, которое убивает сопутствующих бактерий.
Спутники обычно бывают неспороносными палочками, менее
устойчивыми к высокой температуре, чем микроцисты миксококков.
Нагревание производится при 55—70° в течение 10 минут, в
зависимости от терморезистентности микроцист. Последующие
высевы лучше делать в жидкие среды.
Изолированные миксобактерий культивируются на одной из
приведенных выше сред при 20—25° в эксикаторах, на дно
которых налита вода.
В качестве жидких сред применяются навозный,
картофельный дрожжевой или грибной отвар. На поверхности отвара иногда
образуются пленки с плодовыми телами. Все же на твердых
средах миксобактерий дают более обильный рост.
Некоторые виды миксобактерий, образующие плодовые тела
в симбиозе с другими бактериями, утрачивают эту способность
при выделении их в чистой культуре.
Активная подвижность при отсутствии жгутиков — одна из
характерных особенностей миксобактерий. В жидкой среде она
17* 259
»
менее заметна. Подвижность клеток изучают на тонких пленках
агара, для приготовления которых расплавленная среда
набирается в пастеровскую пипетку и наливается на простерилизован-
ное в пламени горелки и не успевшее остыть покровное втекло.
Последнее ложится наклонно таким образом, чтобы с него стекал
избыток среды. Наиболее тонкий участок агаровой пленки
оставляется на покровном стекле, остальной агар удаляется
стерильным скальпелем. На пленку агара наносится взвесь клеток миксо-
бактерий в воде, и покровное стекло помещается на предметное
стекло с луночкой (края луночки предварительно обмазываются
вазелином).
(Микроскопируя край микроколоний, развивающихся через
сутки, наблюдают за подвижностью клеток, продвигающихся по
поверхности среды.
Лучистые грибки (актиномицеты)
Для выделения лучистых грибков из почвы применяют
синтетический агар следующего состава:
ДестиллированноЙ воды
KN03
MgCOg
КН2Р04
NaCl
FeS04
Мела
Агара
f Сахарозы
Однакапля почвенного раствора наноситсяна поверхность агара
в чашку Петри и размазывается стеклянным костыликом. Спустя
5—10 дней вырастают колонии актиномицетов, которые
распознаются по общему виду и характерному землистому запаху.
Многие виды актиномицетов хорошо развиваются на мясопеп-
тонном агаре, и при выделении их из почвы или других
субстратов можно производить высевы на эту среду. При этом посевы
следует производить не слишком густой взвесью; в противном
случае бактерии, как наиболее быстро развивающиеся организмы,
разрастутся по всей поверхности и покроют колонии
актиномицетов. Чашки следует просматривать на 10—15-е сутки, так как
многие виды актиномицетов развиваются медленно.
Культура водорослей, амеб и цилиат
В последнее время чрезвычайно широкое, почти универсальное
распространение получили следующие среды:
Жидкие среды
1) Среда Кнопа (Кпорр) (слабо кислая) на. дестилли-
рованно# воде.
260
. 1000 см3
J.0
0.5
0.5
0.5
0.001
1.0
2.0
20.0—30.0
Основные растворы
Ca(N03)2 крист 10%
или обезвож В.8
KNOs 5
MgS04 + 7H„0 5
КНРР04. , ". 5
(Fe2Cl6 0.1)
Из основных растворов приготовляется исходи.а я
однопроцентная среда:
Ca(N03)a 10 см8 Ингредиенты вливают в указан-
KNOa 5 ном цорядке в дестиллированную
MgS04 + 7Н20 5 воду; КНаРО* прибавляют по кап-
КН2Р04 5 лям, причем раствор все время
1*гО Дест 150 взбалтывают.
(FeaCle—1 наилн в случае
надобности)
Исходная среда может сохраняться почти неограниченное
кремя. Из нее, путем соответственного разведения
дестиллированной водой, изготовляют среды требуемой концентрации (наиболее
употребляемы 0.05% и 0.01% среды).
В ряде случаев лучшие результаты дают следующие
модификации среды Кнопа:
а) Среда для вольвокса, спирогиры и некоторых других форм.
Основные растворы
Ca(NOa)a крис і 10%
KN08 5
MgS04 + 7H20 5
КН2Р04 5
К3С03 1
Fea(S04)3 4
Для изготовления среды берут:
Ca(N03)2 10 см3
KNO, 5
MgS04 + "Н20 5
КН2Р04 5
KaS08 5
Н20 дест 970
и к полученной среде прибавляют 1 см3 разведенного в отношении
1 : 7 раствора Fe2(S04)3.
б) Щелочной раствор Кнопа, рН=7.1 [модификация по Шрай-
беру (Schreiber)]:
Ga(N03)2 0.25
MgS04 0.06
KNOs . . .« 0.06
К8НР04 0.06
H20 дест 1000 см3
(FeS04 — 1 капля, в случае надобности)
261
2) Среда Бенеке (Benecke) (слабо щелочная)
NH4NO, 4%
СаС12 2
MgS04 + 7Ы>0 .... 2
К2НР04 2
Из основных растворов готовят среды требуемой концентрации
путем разведения дестиллированной водой. Наиболее
употребляемы 0.05% и 0.01 % среды. Ингредиенты вливаются в воду в
указанном порядке: К3НР04 прибавляют по каплям, причем раствор
все время взбалтывают.
Указанные растворы можно забуферить При помощи
фосфатных буферов по Зёрензену (Sorensen), однако степень буферности
обычно незначительна.
Для морских форм:
3) С р е д а Л л л е н a (Allen)
Раствор А
KN03 5% (в дест. воде)
Раствор %
Na„HP04 4 г
СяСХ,- . — . . ^ 4
HG1 2 см3
Fe.Clfi 2 г
Н2Ъ дест 80 см3
Среда: 1 л морской воды (чистой)+2 см3 раствора А-j-l см3
раствора Б.
4) С р е д а К к л л и а н a (КлПіап).
Раствор Л
NaN03 2 Г
KN03 • . . 2
NH4N03 1
* Н20 дест J0i) гмз
Раствор Б. раствор Б средц Аллена.
Среда: 1 л морской воды (чистой!)-|-2 см3 раствора А-f-l см*
раствора Б.
Иногда рекомендуется прибавлять еще на 1 л среды по 0.5 см3
следующих растворов:
Раствор В
KNOa "... 5 г
ЩВ04 -Ь 7Н*0 5
Fe8(S04)a 0.1
ИвО дест 100 см3
Если культуры не предназначаются для точных опытов, то
прекрасные результаты дает:
5) Земляная вытяжка — 2 кг тучной земли кипятят в 2 л
водопроводной или прудовой воды на водяном пару в течение
2в2
Ca(N03)2
КНС08 .
Р
*
*
^ с т в о
р
Г
20
5
100
г
см3
t часа, дают отстояться 1—2 дня, декантируют в плотно
закрывающиеся сосуды и, после добавления 20—50 см3 эфира на 1 л
вытяжки, оставляют стоять на холоде до наступления полной
прозрачности (обычно 4—6 недель). Перед употреблением разбавляют
п 4—6 раз дестиллированной водой и стерилизуют, причем эфир
испаряется.
Земляную вытяжку можно смешивать в любых пропорциях
о одной из вышеуказанных сред, что представляет собой удобный
путь для постепенного приучения организмов к культуре в
растворах чистых минеральных солей.
Необходимым условием для культуры и протистов в жидких
средах является абсолютная чистота дестиллированной воды,
посуды и реактивов, а также хороший сорт стекла, из которого
изготовляются сосуды (лучше всего кварц, иенское, пайрекс,
Дружная Горка), так как протисты очень чувствительны ко
всякого рода загрязнениям и особенно к веществам, отдаваемым
в раствор низшими сортами стекла. Если нет посуды из хорошего
стекла, то рекомендуется внутреннюю поверхность сосудов
покрыть тонким слоем парафина.
Твердые среды
1) Среда Омелянского:
Дестиллированной воды 1л
Маннита 10 г
Сернокислого аммония 1
Фосфорнодвукалиевой соли I
Сернокислого магния 0.5
Поваренной соли 0.1
Агара 20
2) 1—2% агар на 0.05% среде Кнопа (можно подщелочить
содой).
3) 1—2% агар на 0.05% среде Бенекке.
4) Торфяной агар.
Раствор А:
Дестиллированной воды 1000 см3
(NH4)3P04 0.2 г
MgS04 + 7H.O 0.05
СаС]2 • 0.05
GaS04 0.05
К2НР04 0.05
Fe2C]6 1 кайля
&% раствора
»
Р а с т в о р Б: 250 г торфа кипятят в 1 л воды 2—3 часа,
охлаждают, фильтруют, разбавляют дестиллированной водой до окраски
крепкого чая.
Среда: 100 см3 раствора А+1СЮ см3 раствора Б+4 г агара.
Почти во всех твердых средах агар может быть заменен
кремневым студнем, пропитываемым питательным раствором, напри-
2вЗ
мер средой Кнопа или Бенекке. Для этого обычное жидкое
стекло (кремнекислый натр) разводят водой, пока удельный вес не
достигнет 1.08, затем разбавляют равным количеством НС1,
разливают в чашки Петри, где оно быстро застывает, промывают 24
часа в текущей воде, наливают сверху питательный раствор и через
несколько часов вновь сливают его.
Помимо указанных сред, хорошие результаты часто дают среды,
содержащие точнее неопределимые органические вещества,
например:
1) Бульон: 125 г обезжиренного мяса (без жил) пропускают
через мясорубку, кипятят 1—lVa часа в 1 д дистиллированной
воды, снимают жир и пену, фильтруют, прибавляют 1 г пептона на
100 см3 бульона, в случае надобности осветляют яичным белком
и нейтрализуют. Жидкая среда состоит из 10 см3 бульона на 90 см3
воды. Агар: 10 см3 бульона на 90 см3 воды. Агар: 10 см3 бульона +
+90 см3 прудовой воды+1—2 г агара (среда должна обладать
щелочной реакцией!).
2) Мясной экстракт: 0.025% раствор мясного
экстракта Либиха. Агар:0.3—0.5 г мясного экстракта Либиха+20 г
агара+1 л прудовой воды.
Э*и среды особенно пригодны для протистов, питающихся
бактериями. Что касается паразитов, то обитаюшдіе в кишечнике
культивируются обычно в смесях белковых веществ (яичный
белок и желток, сыворотка и т. п.), а обитающие в крови — в
твердых или жидких смесях, содержащих главным образом кровь
млекопитающих. Культура тканевых и клеточных паразитов
еще почти никогда не удавалась.
В общем почти всех протистов можно культивировать в
какой-либо одной из указанных сред. Часто специальные
требования культивируемого организма (например, в отношении
концентрации солей, рН и т. п.) заставляют слегка модифицировать
эти среды в том или ином отношении. Во всяком случае, судить
о непригодности какой-нибудь среды для данного организма
можно только на основании многочисленных опытов в разное
время года и с разными географическими расами (экотипами),
гак как в природных условиях свойства организмов подвержены
различным колебаниям, от которых зависит и их способность
жить и размножаться в данной среде.
С большими затруднениями связано обычно получение
абсолютно стерильной культуры, так как к поверхности клеток часто
прилипают бактерии, освободиться от которых весьма нелегко.
Для этой цели применяют следующие методы:
1) Метод обогащения исходных культур.
Исходную (нечистую) культуру помещают в условия,
благоприятствующие массовому росту и размножению того протиста,
который хотят культивировать. Таким путем часто удается настолько
2в4
подавить рост сопутствующих организмов, что уже при втором
или третьем пересеве в тех же условиях получается
практически чистая культура. К сожалению, методы таких
обогатительных культур еще мало разработаны. С зелеными
водорослями хорошие результаты дают стеклянные трубочки, на дне
которых лежит слой казеина (или сыра), на нем слой земли и
сверху налита вода (3—4 см); эти трубочки стерилизуются,
затем их заражают каплей воды, содержащей организм,
который хотят культивировать, и ставят в хорошо освещенное
место (но не на прямой солнечный свет!). Для гетеротрофных,
свободно живущих организмов с осмотическим питанием
применяется тот же метод, с заменой казеина желатиной, а земли —
навозом. Иногда таких же хороших результатов удается
достигнуть, используя реакции организма на внешние раздражения
(фототаксис, химиотаксис и т. п.): протисты собираются в каком-
нибудь месте сосуда (например, зеленые водоросли у
освещенного или, наоборот, затемненного края), откуда вылавливаются
стерильной пипеткой; при многократном повторении можно
таким путем получить абсолютно стерильную культуру.
Аналогичный метод для амеб состоит в том, что их высеивают
на агар, а на некотором, не слишком большом расстоянии
высеивают бактерии, служащие им пищей. Амебы расползаются по агару у
освобождаясь при этом частично от сопутствующих организмов^
и собираются около бактерий. В результате повторных пересевов
в таких же условиях получается чистая двучленная культура
(амебы+бактерии). Если сопутствующих организмов не очень
много, то иногда бывает достаточно просто высеять амеб на агар
и затем пересевать отдельные особи, дальше всего отползшие
от своего исходного положения.
2) Метод стерилизации цист. Там, где он
применим, этот метод дает наилучшие результаты. Получить цисты
обычно не представляет затруднений. Они образуются при самых
различных неблагоприятных внешних условиях (истощение или
высыхание питательной среды, отсутствие пищи, повышенная
или пониженная кислотность и т. п,). Цисты стерилизуют
нагреванием (не свыше 60°1) или воздействуют антисептическими
средствами, плохо проникающими через оболочку цисты (HGlt
КМп04 и т.п.). Известные затруднения встречаются обычно при
прорастании цист. Если оно не наступает после переноса в свежую,
содержащую пищу среду, то можно попробовать перенести цисты
в гипотоническую среду или несколько раз попеременно
высушивать и вновь смачивать их. Отметим, что у многих иротистов
цисты теряют способность прорастать, если их отрывают от
субстрата, на котором они образовались.
3) Метод вытеснения. Исходная (нечистая)
культура заражается бактерией, служащей пищей для протиста,
который хотят культивировать, и размножающейся очень интенсивно
(например, Bad. fluorescens); таким образом, более или менее
26&
быстро вытесняются остальные сопутствующие бактерии. Этот
метод рекомендуется употреблять только в тех случаях, когда
вытесняющая бактерия предназначается в качестве пищи ужб
в нормальной культуре протиста; в качестве же промежуточной
пищи она может затруднить переход к нормальному питанию.
(В ряде случаев можно поступать и наоборот: вносить протисты,
которые хотят культивировать, в культуру интенсивно
размножающейся бактерии, которая служит им пищей.)
Особого рода затруднение встречается иногда при выделении
культуры из одной клетки (клона): рассаженные по одиночке
особи не размножаются. В таких случаях обычно помогает
добавление среды (фильтрованной!), в которой раньше находилась
массовая культура.
Вообще абсолютно стерильные культуры протистов или
культуры, содержащие помимо протиста только один какой-нибудь
вид, служащий ему пищей (так называемые двучленны^ чистые
культуры), применялись еще очень редко и методика их
получения разработана далеко не достаточно. Надо, однако, сказать,
что незначительные загрязнения культур бактериями обычно не
представляют опасности при экспериментах (особенно в средах,
содержащих только чистые минеральные соли), если только эти
загрязнения не состоят из очень активных в биохимическом
отношении форм и если не предполагается постановка точных опытов
по физиологии питания протистов.
Важным фактором культуры всех гетеротрофных организмов,
не питающихся осмотичевки, является пища. Вообще говоря,
протисты не очень разборчивы в этом отношении, так что их част»
можно приучить к той пище, которая наиболее удобна для
экспериментатора, поскольку это позволяет величина протиста и
предназначенного ему в пищу организма (так, типичных пожирателей
бактерий вроде парамеций можно приучить питаться мелкими
водорослями). Встречаются, однако, и более или менее узкие
специалисты. Зеленые одноклеточные водоросли в чистой
культуре являются обычно наилучшей пищей для гетеротрофных
протистов, во-первых, потому, что, пользуясь ими, легче избежать
бактериальных загрязнений, а во-вторых, потому, что протисты,
вообще плохо переносящие однообразную диэту, обычно
чувствуют себя лучше, когда эта диэта состоит из зеленых
одноклеточных водорослей. Если приучение к зеленой пище оказывается
невозможным, то лучше пользоваться для питания такими
гетеротрофными организмами, которые сами питаются чисто
осмотическим путем (например, Polytoma, дрожжи), так как их легче
получить в чистой культуре. Во все случаях рекомендуется
испробовать и кормление неживыми органическими образованиями
в соответственно' размельченном виде (крахмал,
коагулированный желток и белок и т. п.). Иногда удается поставить
трехчленные чистые культуры, где один гетеротрофный организм служит
пищей другому, а сам питается аутотрофными организмами,
развитое
кающимися в той же культуре (например, Am. proteus —+ Stentor
lioselli—>- Gonium в среде Кнопа). Наконец, отметим, что в
некоторых случаях (например, Glaucoma piriformis) удается заставить
перейти к чисто осмотическому питанию такие формы, которые
в обычных условиях заглатывают свою пищу.
Относительно выбора пищи надо указать, что грамположи-
тельные и кислотоупорные бактерии часто дают неблагоприятные
результаты. Из зеленых одноклеточных водорослей наиболее
подходящие Chlorogonium и отчасти Gonium. Эйглены, диатомовые и
хламидомонады поедаются лишь в довольно редких случаях.
Хлореллы своим интенсивным ростом (а может быть и химическими
воздействиями) часто полностью подавляют рост организмов,
которым они д?лжны служить пищей. Из бесцветных
одноклеточных, помимо указанных Polytoma и дрожжей, можно применять
мелких инфузорий, например Colpidium colpoda, и цисты мелких
амеб. Пищу надо давать в умеренном количестве, так как многие
протисты «объедаются» до смерти и кроме того часто подвержены
вредным (химическим?) воздействиям со стороны организмов,
служащих им пищей. Последние должны быть хорошо очищены
от остатков среды, в которой они находились, от мертвых особей
и т. п. Для этого удобней всего использовать их реакции на
внешние раздражения (фототаксис, химиотаксис и т. д.); если же
это невозможно, то очистку можно производить цеытрофугиро-
ванием.
Специальные указания
1) Водоросли, Зеленые водоросли хорошо культивируются
при искусственном освещении, для чего обычно бывает достаточно
электрической лампы в 300 ватт (охлаждение текущей водойі).
Этот метод имеет то преимущество, что делает культуры
независимыми от солнечного света и дает возможность непрерывно
культивировать формы, обычно погибающие зимой от недостатка
света. Длительность освещения можно регулировать автоматически,
например при помощи так называемых часов для счетчиков
двойного тарифа. Культуры вместе с осветительной аппаратурой
помещаются в не слишком маленькую, хорошо проветриваемую
темную камеру. Описаны различнее системы таких аппаратур
(«искусственное солнце» по Гартману или Прингсгейму, термо-
люминостат). Если пользоваться искусственным светом
невозможно или нежелательно, то культуры зеленых водорослей ставят
в хорошо освещенное место, но не на прямой солнечный свет,
который часто (но не всегда!) оказывает вредное влияние (лучшее
место для таких культур —около окна, обращенного на север).
Среди бесцветных жгутиковых с осмотическим питанием имеется
ряд форм (Polytoma, Chilomonas, Astasia и др.)7 которые хорошо
развиваются только в средах, содержащих жирные кислоты
(в частности, уксуснокислый натрий).
267
2) Rhizopoda. Крупные амебы обычно не поддаются культуре
на агаре. Зато их сравнительно легко культивировать в жидких
средах в виде двухчленной (с зелеными водорослями) или
трехчленной (амеба — гетеротрофный протист — зеленые водоросли)
чистой культуры. Некоторые солнечники требуют добавления
к среде кремния (например, кремнекислого натрия).
Раковинные амебы: мелкие формы легко культивируются на агаре,
питаясь бактериями, более крупные — в жидких средах с
зелеными водорослями (Chlorogonium) в качестве пищи; эти формы
очень трудно очистить от сопутствующих бактерий. Некоторые
амебы поедают свои собственные цисты или цисты более мелких
форм.
3) Инфузории. Мелкие формы культивируются на агаре с
бактериями, более крупные—в жидких средах (Кнопа, Бенекке,
настое сена, салата, растворах мясного экстракта), если
возможно — с зелеными водорослями {Chlorogonium, Gonium, мелкие
хламидомонады с тонкой оболочкой) в качестве пищи; из
бактерий лучше всего пользоваться интенсивно размножающимися
формами вроде Bad fluorescens. Кроме того, можно давать
гетеротрофных жгутиковых, мелких инфузорий и цисты амеб. Некоторые
формы являются узкими специалистами в отношении питания.
Формы с симбиотическими зоохлореллами можно культивировать
абсолютно стерильно на свету в жидких средах {Paramecium Ьц/ч
saria).
ГЛАВА X
ЭНЗИМЫ ИЛИ ФЕРМЕНТЫ
1. ОБЩИЕ СВОЙСТВА ЭНЗИМОВ
Энзимы извлекают из тканей и органов животных и растений,
а также из микробных тел двояким образом: 1) простым
экстрагированием водой или глицерином и 2) растиранием с кварцевым
песком или инфузорной землей с последующи^ отжиманием массы
, под прессом. В некоторых случаях сами клетки (бактерии, грибы,
железистые клетки) выделяют энзимы нарушу; энзиматический
раствор получается в виде питательной среды, от которой
отфильтрована клетка, или в виде экскретируемого сока.
Полученные растворы обычно в таком вцде и употребляют
в дело, но иногда их подвергают очистке с цельіо удаления
неактивных белков. Для этого пользуются одним из следующих приемов:
1) Осаждение сернокислым аммонием. К водному экстракту
сначала прибавляют насыщенного раствора сернокислого аммония,
чтобы получился 25—30% раствор, и 2 капли 1о°/0 раствора соды.
Эту смесь оставляют на сутки, затем осадок отфильтровывают и
к фильтрату опять прибавляют концентрированный раствор
сернокислого аммония до содержания в 60—66 °/0і причем опять
выпадает небольшой осадок, в котором содержится энзим. Осадок
отфильтровывают, взбалтывают в четверном — шестерном
количестве хлороформной воды, полчаса или час встряхивают в
аппарате для взбалтывания и диализируют сначала в проточной, а
затем в дестиллированной воде, пока в промывных водах не
исчезнет аммиак. Диализ обыкновенно длится несколько дней.
2) Осаждение спиртом или ацетоном. Прибавляют около
5 объемов 95% спирта или ацетона. Осадок после образования
хлопьев отфильтровывают или декантируют, і\ потом
отфильтровывают, отжимают между фильтровальной бумагой, растворяют
в воде и отфильтровывают нерастворимую часть. Фермент
находится в растворе.
3) Увлечение энзима из раствора аморфными осадками
(фосфорнокислый кальций, углекислый магний и Др.). Энзимы
фиксируются также углем, каолином, гидроокисью алюминия и пр.
Раствор энзима лучше всего сохранять на холоду без всякого
прибавления антисептических веществ. Там, где это технически
269
невыполнимо, к 100 см3 раствора прибавляют антисептик в
следующих количествах: толуола и хлороформа по 1—2 см3,
тимола — 1г.
Лучше всего пользоваться толуолом, так как он менее влияет
на энзимы. Глицериновые вытяжки не нуждаются в
антисептиках.
Необходимо пользоваться возможно свежим материалом
энзимов. Если раствор замутился или стал издавать гнилостный
запах, он уже не годится для опытов.
Характеризуя действие энзимов, необходимо точно отмечать
условия опыта: температуру, реакцию среды, концентрации
ферментного препарата и субстрата и пр., ибо все это оказывает
влияние на активность энзимов. Для некоторых ферментов
существуют совершенные методы очистки их от сопутствующих веществ.
О содержании фермента в жидкости судят по эффекту его
действия, который сравнивают с условно принятой единицей.
Исследуемый фермент постепенно разбавляют в ряде
пробирок и определяют, при каком разведении сила действия энзима
такова же, как в контрольном растворе энзима. Так, если 0.5 ом3" >
испытуемого раствора энзима вызывает в одних и тех же условиях
такой же химический эффект, как 1 см3 контрольного раствора,
то мы в праве заключить, что содержание энзима в первом случае
в 2 раза больше, чем во втором. При одинаковом химическом
эффекте концентрация фермента пропорциональна скорости
реакции.
Некоторые имеющиеся в продаже препараты представляют
превосходный материал Для изучения энзимов. Так,
приготовляемый фирмой Парке, Девис (Parke, Davis) препарат «Така-
диаста» содеряшт в весьма активном состоянии следующие
энзимы: амилазу, протеазу, химозин и эрепсин. Хорошие
ферментативные препараты выпускаются еще целым рядом других
иностранных фирм. Отдельные ферментативные препараты начинают
изготовляться в СССР.
Для длительного сохранения энзимов лучше всего высушить
их в пустоте и сохранять в трубочке с выкачанным воздухом
в темном прохладном месте. Сухие препараты энзимов хорошо
сохраняются в закрытой склянке под толстым слоем петролейного
эфира.
2. АМИЛАЗА (ДИАСТАЗ)
а) Амилаза из слюны, по Конгейму (Cohnheim). Для усиления
слюноотделения ополаскивают рот эфиром. К полученной слюне
прибавляют немного фосфорной кислоты и затем осторожно
нейтрализуют разбавленной известковой водой. Осадок фосфорноиз-
вестковой еоли увлекает с собой амилазу и другие белковые
вещества. Отфильтровывают осадок и промывают количеством воды,
равным объему взятой слюны. Полученный раствор осаждают епир-
470
том. Во многих случаях можно пользоваться просто
профильтрованной слюной без всякой иной очистки.
б) Амилаза из солода, по Линтнеру (Lintпег). Тонко
измолотый солод (лучше всего брать зеленый солод) или солодовую муку-
обрабатывают 4 частями 20% спирта и оставляют на сутки.
Жидкость отделяют декантацией, осадок отфильтровывают и к
общему фильтрату прибавляют двойное количество абсолютного
спирта. Выпадает хлопчатый осадок. Прозрачную жидкость
сливают и осадок быстро отфильтровывают, лучше всего на фарфоровом
фильтрате с отсасыванием. После однократного промывания
спиртом и эфиром осадок растирают в ступке с небольшим количеством
спирта, после чего вновь отфильтровывают, промывают спиртом
и эфиром и высушивают в вакууме. Все операции приготовления
амилазы должны производиться возможно быстрее, так как не
вполне обезвоженная амилаза быстро портится в присутствии
воздуха.
Повторяя несколько раз растворение в воде и осаждение
спиртом, можно значительно очистить энзим, но его активность при
этом заметно уменьшается.
в) Амилаза, вырабатываемая микробами. Для накопления
микробов, сахарифицирующих крахмал, применяют картофель или
искусственные среды с прибавлением крахмала. Так, Круифф
(Kruyff) для накопления образующих амилазу форм рекомендуем
заражать землей следующий раствор:
Водопроводной воды . . .
Картофельного крахмала .
Пептона (каззина) ....
Фосфорнодвукалиевой соли
Сернокислого магния . . .
Полуторахлористого железа
Жидкость наливают в эрленмейеровсшіе колбы тонким слоем
и выдерживают при 30—40°. Об амилолитическом действии судят
по исчезновению характерной для крахмала окраски после
прибавления иода.
Для той же цели может служить и любая другая крахмальная
среда — например, водопроводная вода с брошенными в нее
ломтями картофеля.
На кислых крахмальных средах, оставленных некоторое время
открытыми на воздухе, развиваются вырабатывающие амилазу
плесени или лучистые грибы.
Полученная тем или иным способом амилаза сначала
разжижает крахмальный клейстер, а затем превращает его в декстрин
и мальтозу.
Установлено, что для полного расщепления крахмала
необходимо участие двух типов амилазы: «декстршшрующей» альфа-
амилазы и «сахарогенн?й» бета-амилазы. Оба фермента можно
изолировать. Их соотношения в разных препаратах различны.
271
1000 см3
0.2 г
0.05
j- следы
Если к 100 см3 кипящей воды прибавить 10 г картофельного
крахмала, разведенного в 20 см3 тепловатой воды, то получают
густой клейстер. Охладив его до 70—75°, прибавляют несколько
кубических сантиметров раствора амилазы и помещают сосуд
в водяную баню, установленную на той же температуре.
Клейстер постепенно разжижается, превращаясь в прозрачную
жидкость. Она содержит декстрины и лишь немного сахара; иодом
окрашивается в синий цвет.
Охладив жидкость, вновь прибавляют немного раствора
амилазы и температуру жидкости устанавливают на 50—60°.
Производя время от времени пробы на сахар (кипячение о фелинговой
жидкостью), можно убедиться в постепенной сахарификации
крахмала. Еще нагляднее это можно обнаружить, окрашивая
жидкость иодом; синий цвет постепенно переходит в фиолетовый,
красный и желтый.
а) Определение силы амилазы по Вольгемупгу (Wohlgemuth).
К 10 пронумерованным пробиркам прибавляют постепенно
уменьшающиеся в 2 раза дозы исследуемого энзима.
Затем к каждой пробирке,
начиная с 10-й, прибавляют
по 5 см3 охлажденного 1 %
раствора крахмала.
Для его приготовления 1 г
растворимого крахмала
растирают в фарфоровой чашк?
с 100 см3 воды до тех пор,
пока не получится совершенно
равномерная взвесь. Тогда
чашку помещают на
кипящую водяную баню,
безостановочно помешивая,
нагревают 10—15 мин., пока
раствор не станет почти
совершенно прозрачным. Его
переливают в измерительный
цилиндр и доливают водой до
100 см3. Если при охлаждении выпадает небольшой осадок, его
отфильтровывают через складчатый фильтр. Такой раствор может
сохраняться несколько дней в холодном месте. Прибавлять к
нему антисептические вещества не следует, так как это
способствует свертыванию крахмала.
Поверх жидкости наливают еще 0.5—1 см3 толуола. Закрыв
пробирки пробками, ставят их в термостат, установленный на
38°. Через сутки пробирки для быстрого охлаждения опускают
в ледяную воду, чтобы остановить действие энзима. 3 минуты
спустя все пробирки наполняют водопроводной водой почти доверху
и в каждую прибавляют по несколько капель 1/10 нормального
раствора иода. Встряхнув, определяют, в какой пробирке жидкость
1
о ^
St
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ао
Смесь в см3
Воды
1
1
1
1
а
і
і
а
Раствора
амилазы
1
1 (из 1)
1 [ » 2,
1 , » 3
1 » 4
1 » 5
і U б)
1 ( » У)
1 ( » 8)
1 (» 9)
Количество
раствора
амилазы
в пробирках
в см3
1
. 0.5
0.25
0.125
0.062
0.031
0.016
0.008
0.004
0.002
272
от иода приняла не синий, а фиолетовый цвет. Следующий номер
обыкновенно принимает под влиянием иода желтобурьгй цвет.
Эту пробирку и принимают в расчет, так как в ней произошло
полное расщепление крахмала.
Так, если это был № 5 (0.062 см3), то вычисление на 1 см3
амилазы производят простой пропорцией:
0.062 5 см3 5
т. е. амилолитическая сила 1 см3 раствора энзима при 38° в
течение 24 час. равна 80.65 см3 1% раствора крахмала.
Для более быстрого определения силы амилазы Вольгемут
предлагает другой — получасовой способ. Здесь раствор
крахмала берут 0.1%, раствор иода 1)ъ0 нормальный. В каждую
пробирку приливают по 2 см3 крахмального раствора и пробирки
погружают в воду, нагретую до 38°. В остальном способ
манипулирования и вычисления, как выше описано.
б) Определение силы амилазы по Линтнеру. Способ этот
обычно применяют на пивоваренных заводах для определения
амнлодитической силы вытяжек солода, которые приготовляют
экстрагированием 25 г солода в 500 см3 воды в течение 6 часов
при комнатной температуре и фильтрованием.
К 10 нумерованным пробиркам приливают от 0.1 до 1 см3
раствора солода. Затем к каждой прибавляют по 10 см3 2 %
растворимого крахмала и по 5 см3 фелинговой жидкости.
Осторожно смешивают содержимое пробирок и погружают их на 10 мин.
в кипящую воду, поместив в металлическую корзину. Вынув
пробирки, отмечают, при каком наименьшем содержании
солодового экстракта синяя жидкость в пробирке обесцветилась или
приняла желтый оттенок (восстановление меди). При расчете
силы амилазы принимают за 100 такой раствор, 0.1 см3 которого
в указанных условиях образует такое количество сахара, которое
восстанавливает 5 см3 фелинговой жидкости. Амилолитическую
силу перечисляют затем на сухой солод.
в) Диффузионный способ Висмана — Эйкмана (Wysmann —
Eijkmann). На поверхность желатиновой пластинки с крахмалом
наносят каплю исследуемой жидкости. Амилаза диффундирует
в желатину и гидролизирует крахмал, что обнаруживается обли-
тием пластинки раствором иода. Для бактерий, растущих лишь
при 37°, применяют крахмал-агарные пластинки.
г) Ауксанографический способ Бейеринка (стр. 166 примыкает
к предыдущему способу с тою лишь разницей, что здесь для
обнаружения амилолитического эффекта служит не иод, а культуры
специальных дрожжей, именно: одну из крахмальных пластинок
засевают дрожжами, произрастающими на декстриновых средах
(5. acetaethylicus), другую—на мальтозных [S. cerevisiae, S.
ellipsoideus). Если гидролиз был слабый — до стадии декстрина,
то вокруг прибавленной капли исследуемой жидкости вырастают
13 Руководство по микробиологии 273
лишь декстриновые дрожжи, если же гидролиз дошел до стадии
мальтозы, то мальтозные дрожжи. Способ интересен с
принципиальной стороны, но не может иметь широкого применения на
практике.
Вышеописанные методы основаны на исследовании тех
изменений, которые происходят в субстрате под действием фермента.
Для определения амилазы существует целый ряд способов,
основанных на определении конечного продукта диастатического
расщепления крахмала — мальтозы. Одним из этих методов
является нижеследующий метод Виндиша — Дитриха — Коль-
баха. Он основан на окислении иодом альдегидной группы
мальтозы 10 см3 исследуемой на действие амилазы жидкости,
приливаемой к 25—30 мл /г/10 раствора иода. Действие фермента
немедленно прекращается. Затем постепенно вносят 30—40 мл
п/10 едкого натра, оставляют на 10—15 мин. и остаток иода
титруют гс/10 гипосульфитом после слабого подкисления
разбавленной серной кислотой. 1 мл /г/10 иода соответствует 0.01711 г
мальтозы.
СпН21О10СОН -f J, + 3NaOH=CnH„O10COONa +2NaJ +2Н20.
3. САХАРАЗА, ИНВЕРТПН, ИНВЕРТАЗА
Этот энзим получают из прессованных дрожжей и из культуры
плесневого гриба Aspergillus niger.
а) Способ Осборна (Osborn). 500 г прессованных дрожжей
растирают с 500 см3 96% спирта и через 16—24 часа
отфильтровывают с отсасыванием жидкости. К осадку прибавляют 500 см3
хлороформной воды (на 500 см3 воды 2.5 см3 хлороформа) и в
течение 6 дней сохраняют при 30—35°, часто взбалтывая жидкость.
Затем фильтруют через большой складчатый фильтр, собирая
жидкость в литровые сосуды, на 3/4 наполненные 96% спиртом.
Образующиеся осадки отфильтровывают, промывают спиртом и
высушивают в пустоте над крепкой серпой кислотой. Если
желательно дальнейшее очищение, прибегают к диализу.
б) Способ Михаэлиса (Michaelis). 100 г прессованных
дрожжей растирают с песком и полученную массу в течение 3—
6 часов встряхивает с 200 см3 воды, к которой прибавлено 2 см3
хлороформа. Затем жидкость отфильтровывают. Реакция
фильтрата должна быть явно кислой. Если нужно, прибавляют
несколько капель 10% уксусной кислоты. На каждые 100 см3
фильтрата прибавляют затем 15—20 г каолина, и жидкость хорошо
встряхивают, после чего фильтруют. Первые порции фильтрата
обыкновенно бывают мутными. Их вновь берут на фильтр, пока
не начнет стекать вполне прозрачная жидкость. Иногда она
окрашена в желтоватый цвет.
в) Способ Дюкло (Duclaux). Плесень Aspergillus niger
культивируют при 35° в течение 4 дней в большом количестве
274
налитой тонким слоем жидкости Раулина (Raulin) (стр. 64). 1.
Когда плесень окрасится в бурый цвет, жидкость сливают,
заменив ее небольшим количеством стерильной дестиллированной
воды. Эту операцию повторяют два иди три раза. Наконец,
оставляют мицелий с 150 см3 дестиллированной водьг на 2—3 дня при
.'і5—37° и затем отфильтровывают. Полученный таким образом
слегка кислый раствор (вследствие окисления сахара в
щавелевую кислоту) содержит очень активный инвертин. 2
Грецес (Grezes) несколько видоизменил этот способ. Он
высушивал мицелий Aspergillus niger при 36—37° до постоянного веса,
растирая его в порошок, и настаивал с водой при 36° в течение
2 часов. Затем жидкость отфильтровывал.
Раствор сахаразы может сохраняться очень долго (годами)
в безвоздушном пространстве или покрытый сверху слоем
парафинового масла.
Определение силы сахаразы. Ф е р н б а х (Fernbach) за
единицу силы сахаразы принимает такое его количество, которое
инвертирует 0.2 г тростникового сахара в течение 1 часа при 56°
в присутствии 0.1% уксусной кислоты [по Бертрану (Bertrand),
лучше брать 0.01% кислоту]. Определение ведется следующим
образом. В ряд нумерованных пробирок прибавляют по 4 см3
50% раствора тростникового сахара, по 1 см3 10% уксусной
кислоты и по 5 см3 воды. Затем в пробирки прибавляют
возрастающие дозы раствора сахаразы (1, 2, 3, 4 и 5 см3). Оставляют на
час при 35°, быстро охлаждают и прибавляют несколько капель
раствора соды, чтобы остановить процесс. Тогда в каждой
пробирке определяют количество инвертированного сахара жидкостью
Фелинга (Feling) (на тростниковый сахар эта жидкость не
действует). Таким образом устанавливают, в какой пробирке
инверсия доведена до конца. Если это была пробирка с 5 см3 раствора
инвертина, то энзим содержится в жидкости лишь в виде следов.
Если же полная инверсия достигнута в пробирках с 1 или 2 см3
раствора, то исследуемая жидкость содержит активный энзим.
4. ЛАКТАЗА, МАЛЬТАЗА, ЭМУЛЬСИН, ЭСКУЛДН
Лактаза
Лактаза была впервые найдена у кефирных дрожжей — Sacch.
Kefir. Расщепляет молочный сахар на глюкозу и галактозу.
Покупные кефирные зерна растирают с водой и оставляют на час
при комнатной температуре. При этом в раствор переходит
лактаза (вместе с сахаразойта эмульсином). Отфильтровав жидкость,
можно подвергнуть энзим обычной очистке осаждением.
1 Берут двухлитровые колбы Ру и к ним приливают по 250 см3 жидкости
Раулина.
2 Этот раствор содержит и другие энзимы — мальтазу, трегалазу, цел-
лазу, эмульсин.
18* 273
Для контроля действия лактазы можно пользоваться
реактивами Барфеда (Barfoed) и Рубнера (Rubner) на виноградный
сахар (см. «Приложение»). Количественное определение лактазы —
см. Рона, Практикум по физиологической химии, 1930, стр. 165.
Мальтаза
Встречается у многих дрожжевых грибов (Sacck. cerevistae,
S. ellipsoideus и пр.), всегда содержится в солодовом экстракте
и в кровяной сыворотке.
Для извлечения мальтазы из дрожжей их растирают с
пемзой и настаивают в воде или расстилают свежие дрожжи тонким
слоем, медленно высушивают при 40° и извлекают водой.
Реактивами и здесь могут служить жидкости Барфеда и
Рубнера. Можно также следить за гидролизом мальтозы при помощи
поляризационного аппарата.
Определение содержания мальтазы — см. А. К и з е л ь,
Практическое руководство по биохимии растений, 1934.
Эмульсин
Добывают экстрагированием хлороформной водой мелко
истертого миндаля. Для осаждения белков прибавляют пару капель
концентрированной уксусной кислоты. Фильтрат обрабатывают
спиртом. Эмульсин выпадает в виде белого порошка,
растворимого в воде.
Эмульсин содержится также в кефирных зернах, на ряду с
мальтазой.
Деятельный препарат эмульсина имеется в продаже.
Эмульсин гидролитически расщепляет [і-глюкозиды с
образованием ' виноградного сахара; а-глюкозиды разлагаются
мальтазой, полученной из настоя дрожжей, с образованием
виноградного сахара. 1 часть эмз^льсина прибавляют к 2 частям
р-глюкозида, растворенного в 20 частях воды. Смесь оставляют
на 15—20 час. при 30—35° Ц. О действии эмульсина судят по
количеству разло?кившегося глюкозида. Отщепление
моносахаридов ведет к увеличению восстанавливающей способности
раствора.
5. ЛИПАЗА
Липазами называются энзимы, расщепляющие жиры на их
составные части — глицерин и кислоту. В зависимости от того,
разлагают ли они нейтральные жиры, лецитин, монобутирин
или другие сложные эфиры, различают собственно липазу, или
стеапсин, лецптиназу, монобутиразу и зстеразу.
а) Собственно липаза (стеапсин) весьма
распространена в животном и растительном царстве. Жиры энергично
разлагаются многими плесенями, а из бактерий липаза ВСТре-
^76
чается у Вас. fluorescens liquefaciens, Micr. telragenus, Вас.
tuberculosis, В. typhi, Vibrio ckolerae и др.
Для определения липазы в исследуемой жидкости действуют
этой жидкостью на какое-либо нейтральное масло г и затем
устанавливают, изменилась ли реакция раствора. Чем сильнее
кислая реакция, тем дальше подвинулось расширение жира.
Готовят обыкновенно среду с эмульсией жира, которую точно
нейтрализуют на лакмус. В случае липолитического эффекта лакмус
краснеет.
Для приготовления эмульсии оливкового или касторового
масла к ним при беспрерывном встряхивании прибавляют деци-
нормальный раствор едкого натра до тех пор, пока после
прибавления 2 капель раствора фенолфталеина жидкость не примет
розового цвета. Тогда ее энергично взбалтывают. Получается
совершенно однородная эмульсия, которая держится в течение
недели.
Эмульсию оливкового масла готовят также взбалтыванием его
в растворе гуммиарабика.
По Круиффу (Kruyff), для обнаружения липазы можно
культивировать жирорасщепляющие микробы, например Вас.
fluorescens на среде состава:
Дестиллированной воды 100 см3
Триолеина 5 г
Азотнокалиевой соли 1
Фосфорнодвука лиевой соли 0.5
Неорганических солей (стр. fiR) .... следы
Желатины % 150—200 г *
Если бактерия восстанавливает азотную кислоту в азотистую,
то вокруг колоний образуются белые круги из тонких
кристаллов.
б) Лецитиназу вырабатывают многие бактерии и
дрожжи. Она отщепляет от лецитина одну молекулу жирной кислоты,
образуя лизоцитин.
Для приготовления эмульсии лецитина 2 г его при нагревании
растворяют в 5 см3 метилового спирта и к раствору, при
беспрерывном помешивании, прибавляют 100 см3 воды, после чего жидкость
основательно встряхивают. Получается равномерная, молочного
цвета, эмульсия, которую нагревают несколько минут на кипящей
водяной бане до полного улетучивания спирта.
Определение лецитиназы, как и стеапоина, — по увеличению
кислотности.
г) Эстераза. Так называется энзим, расщепляющий
сложные эфиры жирного и ароматического рядов на спирт и кислоту.
Определяется таким же путем, как липаза.
1 При отсутствии нейтрального масла учитывают кислотное число
масла, имеющего кислую реакцию.
277
6. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ И СЫЧУЖНЫЕ ЭНЗИМЫ, АВТОЛИЗ
И ГЕМОЛИЗ
Протеаза
Существует целый ряд протеолитических энзимов,
различающихся по характеру своего действия. Все разжижающие
желатину виды бактерий содержат этот фермент. Имеется он и у
некоторых неразжижающих видов. Так, если растереть с
инфузорной землей туберкулезные или тифозные бациллы и отжать
гидравлическим процессом полученную массу, то в жидкости
удается обнаружить присутствие протеазы.
Лучшей средой для выделения протеолитических энзимор
микробами служат белковые субстраты, не содержащие
углеводов. Количество выделяемой протеазы и сила ее действия
колеблются у одного и того же вида в зависимости от условий
культуры и состава среды. Кроме желатины,* микробы растворяют
также свернутую кровяную сыворотку, фибрин, яичный белок,
казеин и другие белки.
По характеру и глубине действия микробные протеазы можно
разделить на несколько типов:
а) микробные триптазы, близкие к трипсину и
расщепляющие, как и он, белки с образованием пептонов и аминокислот;
б) микробные пепсиназы, близкие к пепсину и
вырабатываемые растущими на слегка кислых растворах плесенями и
некоторыми бактериями, например Bad. fluorescens liquefaciens.
в) бактериолизины, или энзимы, растворяющие тела
бактерий, и гемолизины (гемотоксины), растворяющие красные
кровяные шарики.
Количественных методов определения бактериальных нро-
теаз имеется несколько. Для сравнения могут служить имеющиеся
в продаже препараты протеаз: желудочный сок Pepsinum puriss,
трипсин Pancreatinum absolutum и др.
1) Способ Шуфена (Schoufen) (качественный).
Приготовляют 7.5% желатину на тимоловой воде и перед ее застыванием
к ней прибавляют тончайший порошок киновари, который в ней
равномерно распределяется. По 5 см3 этой желатины выливают
в ряд пробирок и каждую охлаждают под струей холодной воды
в косом положении в течение 10 сек., после чего тотчас ставят
вертикально. При этом на стенках остается лишь тонкий слой
желатины, а остальная стекает вниз, где и застывает. Тогда
в пробирку наливают испытуемый раствор с прибавлением 1%
карболовой кислоты. Самое ничтожное разжижение становится
заметным, так как порошок киновари падает на дно, образуя
внизу красный слой.
Эту же пробу можно проделать в чашке Петри, налив в нее
тимоловую желатину и положив сверху кусок фильтровальной
бумаги, пропитанной исследуемой жидкостью. В зависимости
278
от содержания протеазы растворяется большая или меньшая зона
желатины вокруг и под бумагой.
2) Способ Ферми (Fermi). К 1 л дистиллированной воды
прибавляют 5 см3 хлороформа, основательно встряхивают и
фильтруют. В этой хлороформной воде растворяют 50 г желатины при
слабом нагревании.
В ряд нумерованных пробирок наливают возрастающие дозы
раствора энзима и в каждую прибавляют затем по 2 см3
вышеприведенной желатины. Все пробирки ставят при 38° на 4 часа,
а затем на 20 час. в ледник. Отмечают, в какой пробирке
желатина не застывает.
3) Способ Фулъд-Гросса (Fuld-Gross). В 10 нумерованных
пробирок прибавляют постепенно уменьшающиеся дозы
исследуемого раствора. Затем к каждой пробирке приливают по
2 см3 0.1% раствора казеина, который готовят следующим
образом,
К 0.1 г казеина [по Гаммерштену (Hammersten)], помещенного
в склянке емкостью в 200 см3, прибавляют 5 см3 децинормального
раствора едкого натра и 25 см3 воды. Стакан нагревают на сетке
до однократного кипения, после чего ставят в холодную воду и
избыток щелочи нейтрализуют децинормальной соляной
кислотой (около 4.5 см3). Доливают водой до 100 см3. Сохранять раствор
надо на холоду. В этих условиях им можно пользоваться в
течение 2 суток; дальше он начинает мутиться.
Раствор казеина можно готовить также растворением 0.1 г
казеина в 100 см3 0.1% раствора соды при нагревании.
Пробирки помещают на 1 час в водяную баню, установленную
на 38°. По охлаждении к пробиркам прибавляют по 6 капель
раствора уксусной кислоты (1 часть уксусной кислоты, 49 частей
дестиллированной воды и 50 частей 96% спирта). Где остался
неразложенный казеин, там от уксусной кислоты наступает более
или менее заметное помутнение. Там же, где весь казеин
разложен, раствор остается прозрачным.
Расчет силы энзима производится, как было описано на
примере амилазы.
Пепсин
Определение по Грюцнеру (Grtitzner) (Рона, Практикум
физиологической химии, 1930, стр. 211).
Субстратом служит окрашенный кармином белок-фибрин.
При переваривании белка краска переходит в раствор.
Интенсивность окраски раствора пропорциональна активности фермента
или количеству ферментного препарата.
Окрашенный фибрин готовится следующим образом; свеже-
полученный фибрин отжимается, измельчается и хранится в
глицерине. Окрашивается фибрин 0.25—0.50% аммиачным
раствором кармина. Промытый 0.1% соляной кислотой окрашенный
фибрин (10.1 г) переносится в стаканчик, содержащий эту же кис-
27U
лоту (5 мл) и испытуемый на пенсии раствор; через определенны\
промежуток времени окрасжа омеси, еодержащей испытуемый рас
твор, сравнивается со стандартом.
Пептидазы
Эти ферменты расщепляют поли- или дипептиды на более ко
роткие цепочки или на отдельные молекулы аминокислот. II.*
вестны поли- и дипептидазы. Среди пептидаз наблюдается боль
шая специфичность в отношении аминокислот, входящих в но
липептид, и способа их соединения. Смесь пептидаз кишечноп
тракта животного организма иначе называется эренсином.
Для обнаружения действия пептидазы испытуемую
жидкость прибавляют к раствору дипептида или трипептида в
фосфорном буфере (рН 7.8 для дипептида и рН 7.0 для
полипептида). Оставляют их при 30° некоторое время в зависимости от
активности фермента. Действие фермента может быть обнаружено
но приросту свободных карбоксильных групп, которые титруются
щелочью в 85% метиловом спирте. Действие фермента можно
также контролировать по нарастанию свободных NH2-rpynn. Оба яти
метода подробно описаны в Практическом руководстве по
биохимии растений А. Р. Кизеля (1934, стр. 235—238).
Сычужный энзим (химозин)
Для добывания сычужного энзима предложено несколько
способов. Приведем два из них:
1) Способ Зёльдлера (Soldner). Телячий желудок высушивают
и хранят в течение 3 месяцев. Затем его тонко измельчают и
экстрагируют 5% раствором хлористого натрия. К экстракту
прибавляют NaCl до получения 10% раствора. При этом выпадает
буро-серый осадок, энергично свертывающий казеин молока.
2) Способ Блюменталя ( Blumenthal). Телячий желудок тонко
размалывают и в течение суток экстрагируют при 30°Ц 5%
раствором NaCl. Фильтрат подкисляют 1% НС1, причем выпадает
осадок, не содержащий энзима. Тогда повышают концентрацию
кислоты до 5% и насыщают раствор хлористым натрием. В течение
3 суток встряхивают жидкость сначала при 30°, а под конец при
35°. Оставляют на двое суток в спокойном состоянии и собирают
всплывшую хлопчатую белую пену. Будучи высушена при 28е,
масса эта затем хорошо растворяется в воде, представляя почти
чистый сычужный энзим.
Свойство вырабатывать сычужный энзим весьма
распространено среди бактерий и грибов. Этот энзим отличается от
сычужного фермента животного происхождения. Им обладают почти все
пептонизирующие бактерии. При свертывании молока под
влиянием этого энзима казеин переходит в параказеин. По Бангу
(Bang), существуют две разновидности сычужного энзима —
химозин и парахимозин. Первый очень чувствителен к нагреванию,
и на его действие не оказывает влияния прибавление хлористого
2SO
*
кальция, второй обладает противоположными свойствами. Паро
химозин обладает также протеолитическими свойствами.
При испытании жидкости на содержание в ней сычужного
энзима к 2—4 см3 точно нейтрализованного раствора прибавляют
10 см3 свежевыдоенного молока и смесь ставят при 37°. Молоко
свертывается в 5—30 мин., смотря по содержанию энзима.
Проба на содержание этого энзима может быть произведена
также на молочном агаре Эйкмана. Присутствие химозина
обнаруживается появлением сгустков казеина вокруг капли
исследуемой жидкости, помещенной на поверхности агара.
Автолиз
Под автолизом понимают самопереваривание организма под
влиянием содержащихся в нем ферментов. Автолиз микробов
вызывается различными способами:
а) Эмульсию бактерий в физиологическом растворе нагревают
1 час при 60 ° и на 1—2 дня помещают при 37°.
б) Эмульсию 2 агаровых культур в 10 см3 дестиллированной воды
оставляют на 6—24 часа при комнатной температуре и при
беспрерывном встряхивании.
в) По Безредка, взвесь агаровой культуры в 0.75% растворе
поваренной соли нагревают в течение 1 часа при 60°и высушивают
в пустоте. 1 г сухой массы растирают в агатовой ступке в
течение 1 часа с 0.3—0.45 г поваренной соли. Не прекращая
растирания массы, приливают к ней 1—2 см3 дестиллированной воды.
Затем смывают в колбочку таким количеством воды, чтобы
получился физиологический раствор поваренной соли, и
оставляют на сутки.
Гемолиз
Многие микробы (стафилококки, стрептококки, холерные
вибрионы и др.) вырабатывают вещество, растворяющее красные
кровяные шарики. Пальтауф (Paltauf) называет его гемотокси-
ном в отличие от гемолизина, образующегося в теле животного
под влиянием впрыскивания ему красных кровянных шариков.
При постановке опытов гемолиза необходимо держаться
строго определенных правил. Асептически взятую крояь лошади или
барана, к которой прибавлено 0.1% щавелевокислого аммония,
чтобы предотвратить свертывание, дефибринируют и дважды
промывают красные кровяные шарики в 0.85°/0 NaCl, чтобы
удалить всю сыворотку, которая может задержать гемолиз.1
Шарики смешивают с расплавленным и охлажденным до 45—50° агаром
1 Кровь дефибринируют энергичным взбалтыванием со стеклянной дробью
в течение 10 мин. После того как она отстоится, красные кровяные шарики
отсасывают от сгустка фибрина и дважды промывают 0.85% NaCl с
применением центрофугирования. Промывание оканчивают, когда над осадком
получится вполне бесцветный раствор Такая взвесь шариков в физиологи
чес ком растворе может сохраняться на холоду в течение нескольких дней.
281
в отношении 1:5 и смесь выливают в чашки Петри. Посев
производят штрихом по поверхности застывшей мутной среды и чашку
ставят в термостат. Незначительный гемолиз выражается
образованием узкой прозрачной зоны вокруг посевной черты; при
сильном гемолизе образуется широкая зона.
Для контроля одну пластинку оставляют в термостате
незасеянной.
7. ОКСИДАЗЫ
Имеются два типа окислительных энзимов:
1) прямые оксидазы (лакказа, тирозиназа, салици-
лаза и др ), активирующие недеятельный кислород воздуха и
фиксирующие его на подлежащие окислению вещества;
2) непрямые оксидазы, проявляющие свою
окислительную способность только при посредстве перекисей;
-такова, например, пероксидаза, содержащаяся в хрене.
Ограничиваясь сказанным по вопросу о классификации и
природе оксидаз, опишем получение некоторых из них.
а) Тирозиназа окисляет тирозин * с образованием
окрашенных в бурый цвет продуктов.
1) Получение тирозиназы из картофеля^ по Штаубу (Sxaub).
7—8 кг получающейся при чистке картофеля кожуры смачивают
спиртом, размалывают на кофейной мельнице в густую массу и
быстро отпрессовывают. Бурый сок выливают в равный объем
94% спирта. Когда объемистый осадок отстоится, спиртовый
раствор сливают сифоном и-осадок отделяют фильтрованием. Пока
он еще не успел высохнуть, его обрабатывают водой с примесью
толуола. Через день отфильтровывают осадок и прозрачную
жидкость осаждают избытком крепкого спирта. С отстоявшегося
осадка спирт удаляют декантацией. Осадок переносят на
небольшой складочный фильтр, промывают спиртом и быстро высушивают
в вакууме при температуре, не превышающей 25°, над крепкой
серной кислотой. Полученная таким образом тирозиназа не
содержит лакказы (окрашивает в синий цвет гваяковую настойку лишь
в присутствии перекисей, например перекиси водорода). Водные
растворы тирозиназы всякий раз готовятся наново для опытов
и долго сохраняться не могут.
2) Получение тирозиназы из грибов. Особенно богаты тирози-
назой грибы из родов Russula (сыроежки) и Araricus.
Пользуются свежими или высушенными грибами. Свежие
грибы мелко крошат и отжимают густой сок, содержащий тирозиназу.
Он настолько богат ею, что для опытов его обыкновенно
разбавляют водою в 10 раз. Отжатый сок сохраняют в наполненных
доверху склянках под толстым слоем толуола. Он не утрачивает
своей активности очень долго.
1 Тирозин почти нерастворим в воде и хорошо растворим в водном
растворе сахара (1 г тирозина растворяют в 530 см3 воды, содержащей
80 г сахара).
282
Для сушки выбирают свежесобранные, нечервивые грибы.
Со шляпок снимают ножом слизь, грибы крошат и сушат на
воздухе. Сухие грибы сохраняются годами в широкогорлых
склянках, неплотно открытых. Для приготовления тирозиназы 1 г
сухих грибов растирают в ступке с 10 см3 дестиллированной воды,
на 0.5—1 час оставляют при комнатной температуре и
фильтруют.
Тирозиназа из грибов содержит примесь лакказы. Она
окрашивает гваяковую смолу без прибавления перекиси. Тем не менее
обе оксидазы можно исследовать отдельно, не разделяя их, так как
тирозиназа действует лишь в слабощелочном растворе, алакказа —
в слабокислом.
3) Получение тирозиназы из пшеничных отрубей. Отруби
обрабатывают 4 частями воды, насыщенной хлороформом.
Через 4—5 часов жидкость пропускают через марлю, и осадок
отжимают прессом. Отжатую жидкость центрофлггируют и
прозрачный раствор осаждают тройным объемом 90% спирта. Центро-
фугируют и промывают небольшим количеством 80% спирта,
затем осадок растворяют в воде. Нерастворивншеся белки отделяют
центрофугированием и полученный раствор осаждают 3—4
объемами спирта. Осадок высушивают в вакууме над крепкой
серной кислотой. Полученный порошок целиком растворяется в
воде, не содержит лакказы (не дает посинения с гваяковой
настойкой ) и окрашивает насыщенный при комнатной температуре
водный раствор тирозина сначала в розовый, затем в
красно-бурый и, наконец, в почти черный цвет.
4) Получение тирозиназы из культур микробов. Тирозина-
зу содержат разводки Actinomyces chromogenes, Bad. phosphores-
cens и др. Из растертой массы микробов оксидаза извлекается
водою или смесью 1 части воды с 2 частями глицерина. Дальше —
обычные приемы очищения: осаждение спиртом, растворение
осадка в воде и фильтрование через фарфоровую свечу.
Реакция тирозиназы на раствор тирозина была изучена Бур-
кело (Bourqueloi) и Бертраном (Bertrand). Изменение цвета
тирозина — от розового, через красно-бурый до почти черного
Встряхивание жидкости ускоряет окисление. Смотря по
содержанию тирозиназы, почернение наступает в срок от нескольких
часов до суток.
Если испытуемый раствор не дэет заметной реакции с
тирозином, ее можно попытаться усилить, прибавив ничтожное количество
перекиси водорода (на 10 см3 жидкости 0.5 см3 0.05% раствора
перекиси).
Тирозин может быть заменен 0.1—1% раствором паракре-
зола или, еще лучше, адреналином. К раствору тирозиназы
прибавляют 2—3 капли покупного 0.1°/0 раствора адреналина.
Смена цветов та же, что и с тирозином.
б) Лакказа окисляет вещества ароматического ряда с
двумя и более гидроксильньши или амидными группами, образуя
283
темноокрашенные продукты, причем орто- и парасоединения
окисляются лучше, чем метавоедавення.
Лакказу получают из млечного сока, вытекающего из
надрезов коры лакового дерева Rhus vernicifera (она содержится в
минимальных количествах и в других растениях). Сок
обрабатывают 6—8-весовыми частями спирта, осадок отфильтровывают и
промывают спиртом до тех пор, пока промывная жидкость не
перестанет мутиться от прибавления воды. Осадок растворяют
в воде, вновь осаждают спиртом, промывают им и высушивают в
пустоте над серной кислотой. Полученный белый порошок,
содержащий много лакказы, легко растворим в воде и глицерине. Лак-
каза окрашивает следующие вещества: гваякол, гидрохинон,
ордші, фенолфталеин, пирогаллол, альфа-нафтол в смеси с парафе-
нилендиамином и др.
Присутствие лакказы легко обнаружить на свежих срезах
картофеля (надо выбрать клубни с большим числом «глазков»),
облив их гваяковой настойкой.1 Через несколько минут насту
пает посиненріе, идущее от периферии.
Гваяковая настойка уже под влиянием рассеянного света
связывает кислород воздуха и синеет. Поэтому слабое посинение,
наступающее через продолжительное время, не доказательно. Реак
ция с оксидазой дрожжей наступает в несколько минут. Реакция
очень чувствительна к щелочам и кислотам, особенно к первым.
Поэтому жидкость должна быть строго нейтральной или слабо
подкисленной уксусной кислотой, не вредящей реакции.
Эрлих (Ehrlich) предложил для обнаружения оксидаз
реакцию посинения смеси диметилпарафенилендиамина с альфа-
нафтолом. Петри производит эту реакцию следующим образом.
Исследуемым на оксидазу микробом заражают поверхность
МПА (мясо-пептон-агар) в чашке Петри. Чашку опрокидывают и
на крышке помещают раздельно сухой альфа-нафтол (с содой ) и
диметшшарафешшендиамин (можно брать и хлоргидрат его).
Пары обеих составных частей раствора действуют на культуру
и вызывают посинение зернистых включений у бактерий.
Из других реактивов на оксидазы упомянем:
а) раствор гваякола — принимает кирпичнокрасный цвет;
б) водный раствор [реактива Шёра (Schor)] —принимает пур-
пуряокрасное окрашивание;
е) водный раствор белого индиго нейтральной или
слабощелочной реакции — быстро синеет:
г) раствор пирогаллола (реактив Бертрана) — быстро
принимает краснобурый цвет, причем выпадают кристаллы пурпуро-
галлина.
1 Но Бертану, 5 г гваяковой смолы растворяют при нагревании в
60—70 см3 96% этилового спирта, фильтруют и прибавляют 30 см3 воды.
Настойку гваяковой смолы всякий раз приготовляют наново, так как в
постоявшей может появиться перекись водорода, что лишает значения
показание этого реактива.
284:
Лакказа,по всем данным, тождественна с полифенолокоидазой,
которая хорошо изучена и содержит медь в качестве активной части.
Перокеидаза
Окисляет полифенолы лишь в присутствии органических
перекисей (оксигеназ) или перекиси водорода. Содержит в своей
активной, небелковой части гемин. Играет значительную роль в
растительном организме и в жизни бактерий. Значение перокси-
дазы для животного организма еще не выяснено. Определяется по
ко іичеству продуктов окисления пирогаллола или гваякола. В
первом случае продуктом окисления является пурпурогалин,
который может быть определен весовым путем или по
интенсивности окраски его раствора в серном эфире (в воде пурпурогалин
слабо растворяется). При действии на гваякол перокеидаза в
присутствии перекиси водорода дает окрашенный продукт — тетрагвая-
кохинон. Употребляются 1°/0 раствор пирогаллола и 0.1° 0 раствор
перекиси водорода. Раствор ферментов берется в количестве от
одной капли до 1 мл в зависимости от активности.
Дегидразы
Этим названием обозначают ферменты, переносящие слабо
связанный водород с одного органического вещества (например,
спирта, аминокислоты и др.) на другое. Первое вещество, которое
служит донатором водорода, при этом окисляется, второе,
служащее акцептором, восстанавливается. Дегидразы обладают
большой специфичностью, которая определяется белковой частью
ферментного комплекса. Большинство дегйдраз нуждается в соучастии
коферментов или кодегидраз, без которых они не способны
производить какое-либо ферментативное действие (см. «Зимаза»).
В «зависимости от специфичности действия, говорят об алкоголь-
дегидразе, амино-дегидразе, гексозо-дегидразе и т. д. Для
обнаружения действия дегидразы вносят в пробирку, закрывающуюся
пришлифованной пробкой с краном для выкачивания воздуха,
(пробирка Тунберга), 2—Змл испытуемой жидкости, содержащей
дегидразу, 1 мл 1°/0 раствора субстрата, в соответствии со
специфичностью изучаемой дегидразы (например, альдегида при альдеги-
дразе) и 1—2 капли водного раствора метиленовой сини (1:1000).
Смесь окрасится в синий цвет. Через открытый кран выкачивают
воздух до началакипения жидкости, не разъединяя с насосом,
закрывают кран и ставят пробирку в стакан с теплой водой. При наличии
дегидразы жидкость обесцвечивается, так как метиленовая синь,
отнимая водород от окисляемого вещества, переходит в лейкобазу.
8. КАРБОКСИЛАЗА, КАТАЛАЗА И ЗИМАЗА
Карбоксилаза
Карбоксилазой называется энзим, открытый Нейбергом (Neu-
berg) и разлагающий кетокислоты жирного и ароматического
ряда с выделением С02 и образованием соответствующих альде-
285
гидов. Энзим этот содержится в дрожжах и может быть
выделен из свежих и сухих дрожжей.
К взвеси дрожжей в воде прибавляют не свыше 1 % кислоты
(обыкновенно берут пировинограднуюилищавелево-уксусную
кислоту). При 37° вскоре возникает брожение. Так как
образующийся уксусный альдегид кипит уже при 21°, то бродильную колбу
снабжают холодильником и приемником.
Для обнаружения уксусного альдегида в перегоне можно
пользоваться реакцией Римини (Rimini). 1 см3 перегона обрабатывают
1—2 см3 свежеприготовленного 4% раствора нитропруссидного
натрия и 1—2 каплями 3—5°/0 пиперидина. В присутствии
уксусного альдегида получается темносинее окрашивание, постепенно
переходящее в фиолетовое, красное и, наконец, желтое.
Каталаза
а) Получение каталазы из плесени. Шода
(Choaat) и Бах (Bach) получили каталазу из культуры
плесени Aspergillus niger в растворе Раулина. Не ожидая, пока плесневая
пленка покроется конидиями, ее снимают, растирают со стекло?!
в кашицу, прибавляя воду, содержащую следы соды. Полученную
массу отфильтровывают и прозрачный фильтрат осаждают спиртом.
б) Получение каталазы из дрожжей по
Исаеву. Пивные дрожжи тщательно промывают,
отфильтровывают через фарфоровый фильтр, отжимают и тонким слоем
высушивают на воздухе. Сухой порошок растирают с небольшим
количеством воды и кварцевым песком и в течение 2—3 дней
извлекают 8—10-кратным количеством воды, насыщенной
хлороформом. Отфильтровывают и прозрачный фильтрат обрабатывают
равным объемом 96% спирта. Осадок промывают спиртом и
эфиром и высушивают над серной кислотой в эксикаторе (в вакууме).
Для опытов употребляют водную вытяжку из этого порошка.
Для качественного обнаружения каталазы к исследуемому
раствору прибавляют несколько кубических сантиметров
продажной перекиси водорода и встряхивают. В присутствии каталазы
тотчас начинается выделение газа (кислорода). По силе выделения газа
можно заключить о большем или меньшем содержании каталазы:
в иных случаях выделяется лишь несколько пузырьков, в других
происходит бурное вскипание.
Сила каталазы определяется по количеству разлоя^енной
перекиси водорода или по объему выделившегося кислорода.
Обычно применяют титрование перекиси водорода
хамелеоном в присутствии серной кислоты. Пока в жидкости остается
перекись, хамелеон восстанавливается, обесцвечиваясь при этом.
Когда вся перекись водорода разложена, первая же капля
хамелеона окрашивает жидкость в розовый цвет. Для этого определения
необходимо иметь: а) 1% раствор перекиси водорода, б) деци-
нормальный раствор хамелеона (15.8 г Кп04 на 1 л воды) и
в 10% серную кислоту.
Х80
5—іО см3 раствора каталазы выливают в колбу емкостью в 150—
200 см3, содержащую 20 см3 раствора перекиси водорода, и
оставляют на 20 минут при комнатной температуре. По истечении этого
срока подливают 10 см3 серной кислоты, 30—40 см3 воды и жидкость
тотчас титруют до появления розовой окраски. Необходимо
контрольное титрование с теми же составными частями, но без
прибавления каталазы.
Зимаза
Для получения зимазы — комплекса энзимов, вызывающих
спиртовое брожение сахара, до недавнего времени применялся
исключительно способ Бухнера, требующий дорого стоящих
приспособлений. Теперь он утратил свое значение, так как А. Лебедевым
найден более простой способ, имеющий еще то преимущество,
что получаемая зимаза не содержит гликогена и не способна к
самосбраживанию. По активности она не только не уступает зима-
ве Бухнера, но дая?е превосходит ее.
Приготовление зимазы по способу Лебедева состоит из
следующих операций:
1) Промывание и отжимание дрожжей.
Ведро свежих пивных дрожжей выливают в цилиндрический
сосуд, вместимостью в 50 л, ставят под водопроводный кран, на
который надета каучуковая трубка, и медленной струей промывают.
Время от времени дрожжи надо перемешивать деревянной
палкой. Промывание производят до тех пор, пока вода не станет
совершенно прозрачной и неокрашенной. Дают дрожжам отстояться?
иоду сливают и дрожжи выбрасывают на кусок холста (платок),
положенный поверх сита с отверстиями в 5 мм. Когда вода
стечет, поднимают 4 конца платка, связывают их шнурком и
отжимают дрожжи на обыкновенном ручном прессе, завернув в
плотную ткань. Если пресса нет, его можно заменить двумя досками и
простым надавливанием сверху. Отжимают до тех пор, пока масса
не станет настолько сухой, что ее можно просеять через выше-
упо мянутое сито.
2) Высушивание дрожжей. Просеянные дрожжи
рассыпают слоем в 1—1.5 см на фильтровальной бумаге в
термостате с температурой в 25—30°. Сушка длится 2 суток.
Значение высушивания дрожжей состоит в том, что оно
ослабляет сопротивляемость оболочки к прохождению через нее
коллоидальных растворов. Возможно такясе, что оболочка
растворяется энзимами дрожя;евой клетки, особенно энергично дей-
' твующими при 35°.
3) Приготовление дрожжевого сока. В
чашку, емкостью около 500 см3, вносят 50 г высушенных
дрожжей, прибавляют 150 см3 воды и хорошо перемешивают стеклянной
палочкой до получения однородной массы. Чашку затем ставят
в термостат при температуре 35° на 2 часа или при 25° на 6 часов.
Фильтруют через складчатый фильтр и полученным прозрач»
287
ным фильтратом пользуются для опытов. Если фильтрование
длится долго и его производят в тепле, то фильтрат охлаждают льдом.
Вместо фильтрования можно применить также центрофугирова-
ние или отжатие под прессом.
При смешении с половинным объемом 50% раствора
тростникового сахара при 30°, уже через J/4—1 час начинается
равномерное выделение углекислого газа, длящееся очень доліЧ). Для
большей наглядности опыт производят в аппарате Эйнгорна—Смиту
(рис. 39). Выделяющийся газ собирается в закрытом колене.
Исследования Гарднера (Hardner) и Юнга
(Joung) показали, что диализ разделяет зимазу
на два компонента — проходящий и не
проходящий через диализирующую перепонку.
Каждая из этих составных частей в
отдельности не вызывает спиртового брожения; последнее
наступает, если действовать их смесью.
Весь комплекс ферментов, вызывающих
спиртовое брожение, называют голозимазой; не-
диализируемую часть ¦— апозимазой, диализи-
руемую — козимазой.
Таким образом голозимаза = апозимаза +ко-
зимаза. Апозимаза, в свою очередь, также
содержит ряд ферментов, действующих в
определенной последовательности на сахарную
молекулу или на промежуточные продукты ее
распада. Сюда относятся: а) гексокиназа, превра
щающая стойкую молекулу сахара в нестойкую
форму; б) фосфатаза — синтезирующая и
разлагающая соединения гексозы с фосфорной
кислотой; в) оксидоредуказа, ускоряющие
сопряженные реакции одновременного окислении
одного вещества и восстановления другого (сюда
относятся также мутаза, ускоряющая так
называемую «реакцию Канншщаро», т. е.
одновременное окисление и восстановление
альдегидов); г) карбоксилаза, действующая на
карбоксильную группу пировиноградной кислоты с отщеплением
С02 и образованием альдегида. Что касается козимазы, то она
представляет собой ту часть ферментного комплекса, которую
часто называют коферментом и которая вступает непосредственно
в химическую реакцию с субстратом, давая промежуточные,
нестойкие соединения. Недиализируемая, белковая часть
ферментного комплекса определяет его специфичность. Козимаза является
производной пиридина.
Бродильной способностью обладают также ацетоновые
дрожжи, или Зимин, т. е. дрожжи, убитые ацетоном.
Количественное определение бродильной силы зимазы (или
живых дрожжей) по Бухнеру.
288
Рис. 144. Эрлен-
мейеровскаяколба
с затвором Мейсля
и винтелем Бун-
зена.
В эрленмейеровскую колбу емкостью в 100 см3 прибавляют
20 см3 дрожжевого сока, 0.2 см3 толуола и 8 г мелко истертого
тростникового сахара; последний быстро растворяют при
энергичном встряхивании содержимого. Колбочку закрывают затвором
Мейеля (Meisbl) (рис. 144). В затвор наливают 1—2 см3 крепкой
H2S04 для удержания влаги и сверху затвор закрывают вентилем
Бунзеяа (Bunsen), допускающим выход газа, но не обратное
проникновение внутрь колбы. Вентиль приготовляют из черной
резиновой трубки длиной 5 см (толщина стенок — 0.5 мм). Трубку
закрывают стеклянной палочкой, а в средней части острым
ножом или бритвой делают продольный разрез в 1 см длиной.
Снаряженную таким образом колбочку с вентилем взвешивают
до опыта п через определенные промежутки времени в течение
опыта. Но потере в весе (выделение С02!) судят о силе брожения.
Углекислоту, растворенную в жидкости, не принимают в расчет,
так как точность метода не настолько велика, чтобы это могло
оказать заметное влияние. Способ пригоден для определения силы
брожения в различные периоды его по количествам выделяющейся
С02, т. е. по потерям в весе аппарата.
19 Руководство по микробиология
ГЛАВА XI
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДА. СХЕМА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИИ.
КОЛЛЕКЦИЯ МИКРОБОВ. ВЫСТАВОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДА У БАКТЕРИЙ
Распространено мнение, особенно среди начинающих
бактериологов, что определение вида у бактерий представляет столь же
простое и несложное дело, как и у высших животных и растений.
А между тем это одна из самых трудных бактериологических
задач, требующая большой опытности и к тому же далеко не всегда
решаемая G надлежащей уверенностью.
Причин этому много. Из них главнейшая заключается в
скудности и изменчивости морфологических признаков этих
мельчайших существ. Не говоря уже о таких видах, как Proteus vulgaris
и близкие к нему формы, для которых полиморфизм является
одним из характерных признаков, подобная же изменчивость
свойственна и многим другим видам, хотя и в меньшей степени.
И поэтому, на основании одного изучения внешней организации
микробов не представляется возможным разграничить виды и
надежно ориентироваться среди подавляющей массы этих внешне-
однообразных существ. По необходимости приходится поступиться
требованиями ортодоксальной систематики, опирающейся лишь
на данные морфологии и истории развития, и привлечь для
разграничения видов физиологические признаки, бйохимизм микробов,
особенности роста на различных питательных средах,
местонахождение в природе и т. д.
К сожалению, и здесь не замечается постоянства и
устойчивости признаков. Так, разжижающий желатину вид нередко
утрачивает это свойство после нескольких пересевов на
специальные среды, как это описано по отношению к Proteus vulgaris и др.
Иногда наблюдают обратное явление: неразжижающие виды
приобретают это свойство после проведения их через животный
организм. Так, описаны разжижающие расы кишечной палочки,
гноеродного стрептококка и других неразжижающих видов. Все это
вносит большую путаницу и создает серьезные затруднения при
установлении вида.
Чтобы не загромождать и без того обширный бактериологиче-
290
ский каталог новыми, недостаточно проверенными видами,
необходимо при всякой новой работе, с одной стороны, произвести
возможно полное, всестороннее исследование выделенного
микроба, а с другой — сравнить полученные результаты с
данными других авторов, изучивших близкие виды. К сожалению, в
этом последнем отношении весьма часто приходится
наталкиваться на крайнюю неполноту имеющихся характеристик микробов.
Обыкновенно при описании нового вида авторы не
придерживаются какой-либо определенной системы. Одни преимущественное
внимание уделяют морфологическому описанию, отводя
биохимизму микроба совершенно второстепенное место; другие
поступают как раз наоборот. И в том, и в другом случае картина
остается неполной и не дает возможности сравнить изучаемый вид
с ранее описанными. Если прибавить к этому, что часто не
приводятся необходимые методические подробности, облегчающие
сравнение, то легко представить себе исключительные трудности и
полнейшую неопределенность, с которыми приходится сталкиваться.
В особенности это относится к сапрофитным видам, где отсутствует
столь важный для их дифференцировки признак, как действие на
живой организм.
Сказанным определяется необходимость выработать такой план
описания микробов, который мог бы служить руководящей нитью
при их определении. Было бы желательно, чтобы подобный план
был принят на международном съезде бактериологов для
обязательного пользования им, равно как точно и подробно указаны все
методические приемы. 2 В этот план должна входить
исчерпывающая морфологическая, цитологическая и физиологическая
характеристика изучаемого вида и особенности его роста на
различных питательных средах. Должен быть выяснен биохимизм
устанавливаемого вида — его отношение к азотному и
углеродному питанию," пределы его реактивности, вызываемые им
энзимные процессы и т. п. И только при таком всестороннем
исследовании, обнимающем с возможною полнотою разнообразные
свойства микробов, мы получаем прочную опору для установления
вида. Из сказанного ясно, насколько сложной и ответственной
задачей является определение вида у бактерий и какие серьезные
требования оно предъявляет к исследователю,желающему получить
объективно-доказательные данные. ^
Книги и «ключи», к которым обычно прибегают при
установлении вида [Эйзенберг (Eisenberg), Мацушита (Matzuschita),
Мигула (Migula), Берджи и др.], в руках начинающего могут
оказать лишь весьма сомнительную пользу. Сравнительно
доступнее по своей наглядности бактериологический атлас Ле-
1 В Америке «Общество американских бактериологов» («The Society of
American Bacteriologists») выработало подобную систему определения вида,
в которую входят морфологические, культурные, физические и
биохимические признаки, а также патогенные свойства. Для краткого обозрения
признаков вида принята условная цифровая система обозначений (стр. 293).
19* 291
мана-Ноймана (Lenmann-Neumann), хотя он включает весьма
ограниченное число видов, преимущественно патогенных.
В дальнейшем мы приведем в систематическом порядке
признаки, которыми обычно пользуются для определения вида у
микробов. Признаки эти мы даем с возможной подробностью,
чтобы облегчить задачу установления вида и не затруднять
подысканием терминов для характеристики свойств микробов при
описании.
Одним из важных признаков, нередко облегчающим
определение вида, служит местонахождение микроба в природе и
способ его накопления в культуре. Так, пленка, развивающаяся на
поверхности скисшей спиртовой жидкости (пиво, легкое вино),
обычно состоит из уксуснокислых бактерий: плесень,
вырастающая на поверхности скисшего молока, чаще всего Oidium
lactis] молоко в наших широтах скисает под влиянием Bact. lactis
acidi (Str. lactis) Лейхмана (Leichmann), а в южных странах —
под влиянием Bact. bulgaricum. Если в солодовом сусле при 48—
50° Ц разовьется сильно кислотообразующая длинная,
неподвижная, бесспоровая палочка, можно быть уверенным, что
перед нами — молочнокислая бактерия Bad. Delbrucki или Bact.
acidificans longissimus. Если то же солодовое сусло или отвар
сена предварительно прогреть в течение часа в текучепаровом
аппарате и оставить затем при 30—35°, то на поверхности жидкости
часто появляется складчатая, сероватая пленка, образованная
Вас. subtilis или родственным ему видом. На картофеле,
обильно смоченном водой, обычно развиваются «картофельные бациллы»
типа Вас. mesentericus в аэробных условиях и маслянокислые
бактерии — в анаэробных. И таких примеров можно привести
множество.
Едва ли нужно напоминать, что, прежде чем приступить к
характеристике микроба, необходима полная уверенность в чистоте
культуры. В случае малейших подозрений на этот счет следует
очистить разводку высевом на плотную среду и отвивкой из
отдельной колонии. Только располагая вполне надежным
материалом, можно приступить к изучению вида. Работа же с материалом
подозрительной чистоты приводит к непроизводительной затрате
времени и к получению результатов, не имеющих никакой
научной ценности.
А. Мейер рекомендует, кроме того, предназначенный для
определения бактериальный вид предварительно пересеивать в
течение месяца на соответственной среде, чтобы для исследования
располагать материалом, «воспитанным» в одинаковых условиях.
Если изучается спорообразующий вид, то надо получить вполне
зрелые споры и производить высевы прогретым споровым
материалом (2 мин. на водяной бане).
За ростом на питательных средах необходимо внимательно
следить в течение недели и более, отмечая постепенные изменения і
в культуре. Если полученные результаты в каком-либо отношении
292
вызывают сомнение, опыт следует повторить, не жалея
затрачиваемого на это времени.
Предлагаемая ниже схема определений, необходимых для
точного установления вида микробов, в общем соответствуег схеме,
принятой «Обществом американских бактериологов».
Для краткой характеристики главнейших свойств микробов
тем же обществом принято определение признаков по
следующей цифровой системе (A Numerical System of Recording the
Salient Characters of an Organism. Group Number).
Образует эндоспоры
He образует эндоспор
Аэробный
Факультативно анаэробный
Анаэробный
Разжижает желатину
Не ра^/ьижает желатины
Образует кислоту и газ из дектрозы
Образует кисло іу, но не газ из декстрозы
Не образует кислоты из декстрозы
Не расіет на декстрозе
Образует кислоту и газ из лактозы
Образует кислоту, но не газ из лактозы
Не образует кислоты из лактозы
Не растет на лактозе
Образует кислоту и газ из сахарозы
Образует кислоту, но не іаз из сахарозы
Не образует кислоты из сахарозы
Не растет на сахарозе
Восстановляет нитраты с образованием газа
Не восстановляет нитратов
Восстановляет нитраты без образования газа
Флюоресцирует
Фиолетовый пигмент
Синий
Зеленый
Желіый
Оранжевый
Красный
Бурый
Розовый
Бесцветный
Л00
200
10
20
30
1
2
01
02
03
04
01
02
03
04
001
002
003
004
0001
0002
0003
00001
00002
00003
00004
00005
00006
00007
00008
00009
00000
000001 Сильное диастатическое действие на картофельный крахмал
000002 Слчоое диастатическое действие на картофельный крахмал
00000J Оісугсгвие диасгатического действия на картофельный крахмал
0000001 Образует кислоту и іаз из глицерина
0000002 Образует кислоту, но не газ из глицерина
0000(03 Не образует кислоты из глицерина
0000004 Не растеі на ілицерине
Таким образом, В. соіі по этой системе имеет обозначение: 222
111 102, а В. alcaligenes — 212 333 102.
Морфология
Морфологические признаки даются по отношению как к
молодым, так и зрелым культурам и по отношению к росту микроба,
по крайней мере, на одной жидкой и одной плотной среде, чаще
2у;і
всего мясопептонной. Молодой культурой для большинства
микробов считают 1—2-суточную при 37°, а при 20° не позже 2—3 суток.
Для приготовления сред нужно пользоваться однообразными
методами. При каждом морфологическом описании надо
упомянуть состав среды, температуру роста микроба и возраст
культуры.
1) Вегетативные клетки (жидкая среда).
Форм а: круглая (кокк). Короткая или длинная палочка,
короткие или длинные цепочки, нити, веретенообразные,
клинообразные, булавовидные клетки. Клетки, изогнутые в виде запятой
(вибрионы), короткие или длинные спириллы, спирохеты.
Размеры: предельные и средняя величины клеток.
Концы клетки: закругленные, срезанные под прямым
углом, вогнутые.
В культуре на тонком слое питательного агара, помещенном на
покровном стеклышке во влажной камере («Agar Hanging Block»
американских авторов), отмечают расположение клеток: цепочки
короткие (2—8 клеток) и длинные (свыше 8 клеток), параллельные
ряды цепочек и пр.
2) Спорангии (спороносные клетки) в жидких средах.
Форм а: палочка, эллипсис, веретено, булава, барабанная
палочка.
Размеры: предельные и средняя величины спорангия.
Расположение споры: центральное, полярное.
3) Споры. /
Форма: круглая, эллипсовидная, продолговатая.
Размеры: предельные и средняя величины.
Оболочка споры: толстая, тонкая.
Оболочка спорангия: приставшая к споре или нет.
Прорастание споры: экваториальное, косое, полярное,
биполярное, разрастание всей клетки.
4) Движение бактерий и расположение жгутиков.
Исследование движения бактерий производится наблюдением
во влажной камере неокрашенных жидких культур, молодых и
зрелых, причем отмечают быстроту и характер движения.
На окрашенных препаратах (способ окраски) определяют
расположение жгутиков*, полярное (монотрихи и лофотрихи),
биполярное (амфитрихи) и по всей поверхности (перитрихи).
Полярные жгутики могут быть ординарные или в виде пучков. Отмечают
длину жгутиков и их вид (прямые, извитые).
5) Капсулы. Способ их обнаружения, размеры и отношение
к микрохимическим реакциям. Условие образования капсул.
6) Зооглеи или псевдозооглеи и условия их образования.
7) Инволюционные формы. Факторы, способствующие их
появлению.
8) Окрашивание анилиновыми красками (фуксин, генциан-
виолет, карбол-фуксин, метиленоваясиньидр.). Специальная
окраска по Граму. Кислотоупорные бактерии.
294
9) Цитология клетки. Включения жира, гликогена, метахро-
мптических зерен (волютина). Хроматин. Ядро.
Рост на питательных средах
Для выращивания большинства микробов обычно применяют
мясопептоннъте среды. Признаки роста на них являются
наиболее распространенными дифференциальными отличиями микробов.
Мясоііептонный бульон
Пленка: ирризирующая, тонкая, жирная, слизистая,
сухая, складчатая, хлопчатая.
Муть: временная, постоянная; слабая, умеренная, сильная;
однородная, хлопчатая, с шелковистой волнистостью.
Осадок: скудный, обильный, плотный, зернистый,
хлопьевидный, слизистый.
Отмечают также запах и цвет бульона. В иных случаях
отмечают процентное содержание поваренной соли, задерживающее
рост бактерий, рост в бульоне, с примесью хлороформа и пр.
Мясопептонная желатина
1) Колонии на поверхности желатины.
Рост: медленный, быстрый.
Вид: колонии точечные, круглые, чечевицеобразные,
неправильные, мицелиевидные, нитевидные, корневидные, в виде
лучистого венца. При рассматривании колоний в проходящем
свете [«на свет» они бывают темные (непрозрачные) или
просвечивающие, иногда отливающие в тот или иной цвет (серый,
голубоватый и пр.)1.
Края: гладкие, волнистые, лопастные, зубчатые,
неправильно углубленные, разорванные, бахромчатые, ворсинчатые,
нитчатые, кудрявые.
Профиль: плоский, выпуклый, крутоизогнутый, кратеро-
видно углубленный (разжижение).
Поверхность: блестящая, жирная, шагреневая, тусклая,
опаковоматовая, мучнистая, бугристая, морщинистая,
просвечивающая, ирризирующая.
Внутренний узор: колонии однородные,
мелкозернистые, грубозернистые, чешуйчатые, неправильно пятнистые,
струйчатые, радиально или концентрически исчерченные.
Разжижение: быстрое, медленное, чашевидное, кратеро-
видное.
Более тщательно колонии исследуют под микроскопом при
небольших увеличениях. Отмечают вид не только поверхностных,
но и внутренних колоний. Производят микрофотографическис
снимки.
Большие услуги оказывает изучение препаратов-отпечатков
(стр, 88).
?85
2) Рост по уколу в желатину.
Желатина не должна быть пересохшей, так как в этом случае
она при уколе растрескивается. Перед уколом рекомендуют
держать желатину в тепловатом месте, чтобы она стала более вязкой.
Непосредственно после укола черта не должна быть видна.
Рост: лучший в верхней части черты — в виде гвоздя
(аэробы), равномерный по всей черте (факультативные анаэробы)
и лучший внизу (анаэробы).
Линия укола: сплошная нитевидная, в виде цепочки
колоний или узелков, волосисто-, перисто- или древовиднораз-
ветвленная, иглистая, елкой (прямой или опрокинутой).
Разжижение: равномерное по всей ширине пробирки
(послойное) или цилиндрическое, мешком, воронкой, чулком,
кратером (рис. 145). Отмечают начало разжижения и конец его.
Быстрота, а отчасти и характер разжижения зависят от темпе-
а b с d e
Рис. 145. Рост по уколу в желатину (разжижение):
в—кратеровидное, Ь—реповидное, с—воронкой, #~ мешком, е—слоями.
ратуры, от концентрации и сорта желатины, от состава среды
(прибавление сахара и пептона понижает скорость разжижения)
и т. д.
Цвет: отмечают цвет посевной черты и окрашивание
остальной желатины, флюоресценция и пр.
Газообразование: колонии пронизаны пузырьками
газа, газообразования не замечается.
Мясопептонпый агар
а) Колонии на агаровой среде менее характерны, чем на
желатиновой. Отмечают быстроту роста (при различных
температурах), форму поверхности, окаймление, профиль, структуру
и цвет колоний (подробности см. — колонии на желатине).
б) Штрих на косом агаре.
Косую поверхность агаровой среды заражают штрихом,
проведенным платиновой петлей снизу вверх по поверхности агара,
не погружая, однако, петли в конденсационную воду. Для
нормального роста микробов необходимо, чтобы среда была свежая,
29в
не высохшая. Для сравнительных исследований предпочтительно
пользоваться агаром одной и той же варки.
Рост: скудный, умеренный, обильный.
Посевная черта: в виде сплошной нити с ровными
или зазубренным:/ краями; рост, распространяющийся по обе
стороны от штриха (диффузный), перистый, древовидный, корневид-
Рис. 146. Рост при посеве чертой на поверхности агара:
а—нитевидный, Ъ — бугристый, с—четко видный, d — диффуавый,
е — ветвистый.
ный; рост четковидный в виде цепи изолированных колоний по
штриху (рис. 146).
Профиль: плоский, выпуклый.
Поверхность: блестящая, ирризирующая, матовая,
опаковая.
Консистенция: штрих сочный, вязкий, маслянистый,
клейкий (тянущийся), кожистый, сухой (ломкий).
abode
Рис. 147. Рост по уколу в агар:
а — нитевидный, Ь — чвткооб равный, с — бугристый, 4—~ волосастый,
t — ветвистый.
Цвет посевной черты и среды. Флюоресценция.
Запах культуры.
Отмечают также форму отдельных колоний: круглая, овальная,
чечевицеобразная, в виде виноградного листа и т. д. (см.
характеристику колоний на желатине).
в) Укол в агар менее характерен, чем в желатину, и
потому им редко пользуются. Типичен лишь для немногих видов
(рис. 147).
297
Кровяная сыворотка Лёффлера
Рост на посевной черте. Описание по тому ж
плану, что и для агара. Отмечают день начала и конца разжиже
ния.
Молоко
Свертывание: быстрое, медленное, отсутствует. День
начала свертывания и отделения сыворотки. Реакция
свернувшегося молока.
Реакциямолока: на 1—2—4—10 и 20-й день.
Пептонизация свертка казеина: медленная,
быстрая; начало, конец; пептонизация без предварительного
свертывания.
Консистенция: вязкая, тягучая, без изменения.
Цвет: бурый, красный, синий, зеленый.
В иных случаях весьма показателен рост на молоке с
прибавлением лакмуса. Отмечают изменение цвета или обесцвечивание
лакмуса.
Картофель
Рост на поверхности ломтя картофеля описывают по тому же
плану, что и на поверхности агара. Можно пользоваться к
искусственно приготовленным крахмальным студнем (стр. 56) для
обнаружения амилолитяческого действия и окраски среды.
Синтетические среды
Наблюдают рост на синтетических средах [среды: Ушинского,
Кона (СоЬп) и др. — см. стр. 65].
Лучшая среда для длительного поддержания культурь
данного вида. Отмечают щелочность или кислотность этой среды
выраженную величиной рН (см. «Прилоя\ение»).
Физиология и биохимизм микроба
1) Отношение к кислороду. Об отношении
микроба к кислороду можно судить по характеру роста при уколе х
желатину или агар. Аэробный рост в виде гвоздя и анаэробный —
в нижней части укола — лишь крайние случаи наблюдающегося
разнообразия роста. Для факультативно анаэробных видов
характерен равномерный рост по всему уколу (стр. 52).
Более точная методика, предложенная А. Мейером для
определения отношения микробов к различному содержанию
кислорода в окружающей атмосфере («Centraibl. f. Bakt», (2), т. 15,
1906 г., стр. 337), едва ли выполнима по своей сложности в
обычной лабораторной обстановке. Мы ограничиваемся обыкновенно
двумя пробами: культурой в тонком слое жидкости (в эрленмейе-
ровской колбе) и в высоком слое свежепрокипячеыной среды в
вакууме.
298
2) Азотное цитание. Рост на средах с пептоном, ас-
парагином, гликоколем, мочевиной, селитрой и аммонийной солью.
Азотные соединения прибавляют в количестве 0.1—0.2%.
Фиксация свободного азота.
3) Углеродное питание. Испытывают рост на
средах с прибавлением:
а) спирта (этиловый спирт, глицерин, эритрит, маннит, дульцит);
б) пентозы (арабиноза);
в) гексозы (виноградный сахар, галактоза,
левулёза);
г) дисахарида (тростниковый сахар, мальтоза,
лактоза);
д) полисахарида (декстрин, инулин, крахмал,
целлюлоза);
е) солей органических кислот (муравьиной,
уксусной, масляной, яблочной, винной);
ж) глюкозида (эскулин, амигдалин, арбутин) и
з) жира.
Исследуемые содинения должны быть химически
чистыми, без примеси веществ посторонних.
Их прибавляют в количестве 1 %, лучше всего, к
синтетическим средам (стр. 65) с 0.1 — 0.2%
пептона или фосфорнокислого аммония.
При опытах со спиртами следует по окончании
роста микробов испробовать среду на присутствие
альдоз или кетоз с помощью фелинговой жидкости
(см. «Приложение»).
Относительно левулёзы надо иметь в виду, что
она разлагается нагреванием, начиная с температуры
в 40°, и потому раствор с этим сахаром надо
обеззараживать фильтрованием через свечу.
Отмечают изменение реакции среды (можно
подкрасить лакмусом).
4) Газообразование. Обыкновенно берут
бульон с прибавлением 0.5—1°/0 исследуемого сахара.
Бульон не должен содержать другого сахара, например
имеющегося в мясе и удаляемого предварительным сбраживанием
при помощи дрожжей или кишечной палочки (стр. 49) или же
приготовлением бульона из слегка загнившего мяса. Опыты ведут
и аппаратах Смита — Эйнгорна или Каша—Дургама (стр. 39).
Одновременно отмечают кислотообразование.
При заражении уколом в высокий слой плотной сахарной среды
газообразование выражается в разрыве последней образующимися
газами (рис. 148).
5) Продукты обмена: аммиак и другие щелочи,
кислоты, сероводород, индол, триптофан, продукты восстановления
нитратов, восстановление метиленовой сини и нейтральрота.
Энзимное действие (амилаза, протеаза и др.). Указания ОТНОСИТель-
239
Рис. 148.
Разрыв
питательного
агара
газами под
влиянием
бактерий.
но производства этих и иных проб в связи с вызываемым
процессом даны в соответственных местах текста.
6) Выносливость к кислотам и щелочам.
Рост микроба при подкислении или подщелачивании среды до
различной степени.
7) Температурные данные. Минимум, оптимум и
максимум температуры для роста данного вида. А Мейер придает
значение определению прорастания спор при различных
температурах, считая это важным дифференциальным признаком.
Споровым материалом, предварительно прокипяченным для
уничтожения вегетативных клеток, заражают подходящую для
данного вида жидкую среду и разливают в ряд пробирок с
соблюдением необходимых предосторожностей. При различных
температурах выдерживают по две пробирки и время от времени
исследуют под микроскопом их содержимое на прорастание спор.
Если желательно получить более точные данные, то жидкость
исследуют в счетной камере Цейсса (стр. 79) и определяют
число проросших спор в единице объема.
Определяют также выносливость спор к высоким
температурам.
8) Устойчивость к высушиванию, замораживанию, свету,
действию антисептических веществ и пр.
9) Гемолиз (стр. 281).
Патогенные свойства
1) Восприимчивые к заражению животные и растения.
2) Течение заболевания и наблюдаемые явления.
3) Экто-и эндотоксины.
4) Ослабление вирулентности культур и условия ее
поддержания.
2, КРАТКАЯ СХЕМА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАПЯТИЙ
Напоминая еще раз сказанное в предисловии относительно
планировки практических занятий, мы здесь приведем лишь
примерную краткую схему, которая может быть дополнена или
сокращена применительно к лабораторным условиям.
1) Приготовление питательных сред.
Стерилизация посуды. Приготовление мясопептоиных сред: бульона,
желатины и агара. Стерилизация молока. Приготовление и
стерилизация ломтей картофеля в чашках Петри и в пробирках Ру.
Специальные среды, применительно к биохимическим
особенностям микробов.
2) Бактериологическое исследование
естественных материалов. Застоявшаяся вода.
Навозная жижа. Настой сена. Настой картофеля пли гороха.
Зубной налет. Капля гноя. Испражнения.
300
3) Наблюдения за ростом отдельных
микробов на различных средах: а) посев В.
subtilis в бульон, молоко , на косую поверхность агара, укол в
желатину, колонии на желатине в чашке Петри; б) рост на косом агаре
Staphylococcus pyogenes aureus, Micrococcus tetragenes, Sarcina jlava,
Sp, volutans, Sacch. cerevisiae.
4) Микроскопическое исследование
микробов, упомянутых в предыдущем параграфе. Окраска
бактерий генциан-виолетом или фуксином, а дрожжей — метилено-
вой синью.
Окраска спор В. subtilis, В. megatherium; окраска по Граму
Micrococcus tetragenus или Staphylococcus pyogenes. На том же
стеклышке для сравнения сделать мазок В. соіі (не красится по
Граму). Окраска жгутиков Spirillum volutans. Характер
движения этого вида в висячей капле (или в «раздавленной капле»).
Капсулы Azotobacter chroococcum при окраске препарата фуксином
и заливке жидкой тушью. Метахроматические тельца у Az. chrooco-
сит и у дрожжей (окраска метиленовой синью).
5) Методы изолирования микробов.
Получение отдельных колоний микробов путем оседания зародышей
из воздуха на поверхность агаровой пластинки. Отсев из
отдельных колоний на косой агар. Микроскопическое изучение
выделенных форм. Изолирование микробов на мясопептонной желатине
при заражении водой. Три разведения. Счет колоний. Посевы
землей на сухую поверхность мясопептонного агара в чашках Петри
(несколько разбавлений). Изучение выделенных микробов.
6) Изолирование микробов из
искусственной смеси их. Можно брать комбинации: а) В. соіі
-{-Staphylococcus pyogenes -f- В. subtilis; б) В. prodigiosum +
Sarcina aurantiaca + В. fluorescens + Penicillium glaucum или
Asp. niger или какие-нибудь другие сочетания микробов.
7) Систематическое наблюдение за
развитием культуры Вас. subtilis в сенном отваре. Способ,
предложенный для выделения Вас. subtilis из сенного отвара, уже
был описан раньше в другом месте (стр. 139). Имеется несколько
видоизменений его. Так, Роберте и Бухнер обливают сено
возможно малым количеством воды и оставляют на 4 часа при 36°.
Слитый настой разбавляют водой до уд. веса 1.004 и усредняют
содой. Жидкость кипятят затем в течение часа в колбочке,
закрытой ватной пробкой, и вновь оставляют при 36°. Через сутки
образуется пленка сенной палочки. Ежедневное наблюдение ла
культурой в течение трех суток. Желательно зафиксировать на
препаратах: 1) подвижную стадию, б) стадию зооглеи (неподвижная
стадия), в) спороносные клетки и г) зрелые, высыпавшиеся споры.
Изолирование сенной палочки на обычном МПА или на выварке
сена с прибавлением агара или желатины.
8) Культура анаэробных видов. Удобным
объектом является Clostridium Pasteurianum или какая-нибудь
301
другая маслянокислая бактерия. Гранулезная реакция при
обработке препарата иодом.
9) Метод накопления характерных групп
микробов (см. круговорот азота и углерода).
Исследование молока.
10) Энзимные процессы (см. энзимы).
3- КОЛЛЕКЦИЯ МИКРОБОВ. ВЫСТАВОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ
Коллекция микробов
Возможно полная коллекция микробов — музей живых
культур — составляет необходимую принадлежность всякой
благоустроенной лаборатории, особенно в небольших провинциальных
городах, где затруднено получение разводок со стороны.
Поддержание «живого гербария» лаборатории в надлежащей чистоте и
в физиологически
деятельном состоянии требует от
заведующего музеем
основательного знакомства с
условиями
культивирования отдельных микробов
и связано с немалой
затратой времени и труда.
Пересевы на свежие
среды должны
производиться по крайней мере
один раз в месяц. Для
большинства микробов —
на мясопептонные среды,
но для отдельных микробов
требуются специальные
субстраты: для дрожжевых и плесневых грибов — сахарные
или солодовые среды, для светящихся бактерий — рыбные,,
для кислотообразующих — среды с мелом и т. д. Много
трудностей представляет поддержание культур таких видов, как
нитрифицирующие, азотфиксирующие бактерии, железо-и
серобактерии и им подобные. Здесь уже требуется специальная
осведомленность хранителя коллекции по каждой отдельной группе.
С известными техническими трудностями связано также
поддержание в чистоте коллекции анаэробных видов.
Если коллекция содержит патогенных микробов, особое
внимание должно быть обращено на поддержание их вирулентности.
Для этого необходимо, не ограничиваясь простыми пересевами
со среды, время от времени проводить заразный материал через
организм восприимчивого животного.
Пробирки с разводками сохраняют в папочных коробках или
в толстостенных стаканах — по нескольку пробирок разного
возраста в каждом. Иногда их помещают в ряд на этажерках
(рис. 149).
S02
Рис. 149. Выставочная этажерка с
разводками в больших пробирках.
Рекомендуется размещать микробов в коллекции таким
образом, чтобы соседние разводки отличались друг от друга
резкими признаками во избежание случайного смешения их:
бесцветные виды чередуются с пигментными, разжижающие желатину
с неразжижающими, хорошо растущие со слабо растущими
и т. д.
Культуры хранят в темном шкафу, снабженном вытяжной
трубой, так как многие разводки издают противный запах. Кроме
того, в закрытом помещении скопляется влага, что вызывает
опасность прорастания ватных пробок плесневыми грибами. Для
предохранения против этого иногда смачивают ватные пробки
1% раствором салициловой кислоты. Пользоваться таким приемом
следует, однако, лишь в исключительных случаях и с большой
осторо?кностью, так как введение антисептических веществ в
сосуды для культуры связано с опасностью для самих разводок.
Культуры заносят под соответственными номерами в каталог со
всеми необходимыми подробностями, относящимися к каждой
из них: отмечают происхождение культуры, время пересева,
состав среды, температуры культивирования, активность
разводки и т. п.
Если из музейной культуры требуется произвести отвивку, то
первый пересев берут для коллекции, а остальные служат для
отпуска.
Выставочные культуры
Их приготовляют в сосудах больших размеров — в эрлен-
мейеровских колбах, чашках Петри, в больших пробирках и т. п.
Предпочтительно употребляют посуду, еще не бывшую в
пользовании, с чистыми незамутившимися стенками. На прозрачность
агаровых и желатиновых сред должно быть обращено особое
внимание.
Музейные и выставочные культуры обычно консервируют
прибавлением к ним различных дезинфицирующих веществ. К
сожалению, это отражается на внешнем виде культур — они тускнеют,
теряют свою окраску и постепенно приходят в негодность, так
что через некоторое время их приходится заменять вновь
приготовленными. В виду этого многие предпочитают герметически
заделывать живые аэробные культуры, рост которых вскоре
прекращается вследствие недостатка кислорода.
В зависимости от свойств микроба применяются различные
способы культивирования и консервирования. Так, для
приготовления выставочной культуры плесеней Линднер
рекомендует следующий прием. В круглодонную или обычную
химическую колбу, емкостью в 500 см3, наливают 7 см3 солодовой
желатины и распределяют ее равномерным слоем по стенкам,
поворачивая колбу вокруг своей оси сначала на воздухе,
а затем иод струей холодной воды. Заражение производят
где-либо сбоку колбы. Получается рост гигантской плесневой
303
колонии, яспо видимой снаружи благодаря тонкому слою
желатины. Консервирование производится естественно путем
постепенного высыхания желатины.
Из бактериальных культур превосходный материал для
выставок и музеев представляют разводки Proleus mirabULs, Вас.
mycoides и др. Перв\ю приготовляют заражением штрихом
косой мясопептонной желатины, а вторую — агар-агара.
Для убивания бактериальных культур применяют
обыкновенно формалин. Из сосудов с культурой вынимают ватные
пробки и, смочив нижний конец их 8—10 каплями формалина, вновь
закрывают сосуды. Во избежание испарения формалина ватные
пробки обвязывают пергаментной бумагой или же сосуды
ставят в герметически закрытое помещение, наполненное парами
формалина, например в эксикатор с положенными на дно кусками
ваты, пропитанными формалином. Смотря по величине сосуда,
действие паров формалина продолжается от нескольких дней до
двух недель, после чего сосуды запаивают или заливают
парафином, белым сургучом и т. п.
Формалин не пригоден для консервирования бульона и
молока, так как первый желатинизируется, а второе свертывается от
паров формалина.
Надежнее всего запаивание конца пробирки или горлышка
колбы на паяльной лампе, причем запаиваемый край равномерно
оттягивают. Вату при этом лучше совсем удалить.
Заливку парафином производят следующим образом. Ватную
пробку тщательно обжигают, слегка вдвигают внутрь пробирки и
заливают расплавленным парафином. В образовавшееся после его
остывания углубление вторично наливают парафин до верхнего
края пробирки. При остывании парафин сжимается и отстает от
стекла, вследствие чего культура со временем высыхает.
При заливке сургучом поверх вдвинутой ватной пробки
накладывают тонкий кружок пробки или картона, а на него уже
льют сургуч.
Не вполне предохраняет от высыхания и заделка пластили-
пом. Последний представляет собою массу, состоящую из глины^
жира, воска и гумми. Валик из пластилина накладывают по краю
пробирки, в него вдавливают кружок из картона и поверх
замазывают пластилином так, чтобы покрыть всю свободную
поверхность кружка и его края.
Хороша для заливок менделеевская мастика. В я^елезной
кастрюле расплавляют 100 г канифоли и 25 частей желтого воска
и, при беспрерывном помешивании, постепенно прибавляют 40
частей порошка мумии (краска). Массу прогревают несколько
часов при беспрерывном помешивании и, еще горячей, выливают
через медное сито в мокрую деревянную форму. Этой мастикой
культуры заливают так же, как и сургучом.
Для консервирования формалином желатиновых культур в
чашках Петри на внутреннюю сторону крышки накладывают кру-
304:
жок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра,
чем у самой крышки. Накрыв чашку, придают бумаге
соответственную форму, т. е. пригибают ее края. Бумагу затем смачивают
формалином, накладывают на чашку вместе с крышкой и оставляют
на несколько дней, лучше всего в формалиновой камере (см.
выше). При слишком продолжительном действии формалина
желатина отдает воду.
Иногда желатиновые пластинки обливают 0.2% раствором
сулемы или смесью равных частей спирта и глицерина с примесью
сулемы. Раствор этот через 1—2 дня сливают. Чашку затем
замазывают пластилином или заливают парафинот/t. Чтобы при
заливке парафин не проник внутрь чашки, по краям ее прокладывают
свернутую в несколько рядов ленту фильтровальной бумаги или,
еще лучше, круглый фитиль.
Весьма удобна заливка парафином чашки Петри, помещенной
в другую, большего диаметра. В промежутке между ними почти
доверху наливают парафин. В этом
случае не приходится
опрокидывать чашки. Способ этот пригоден
для заделки картофельных
культур.
Для той же цели предложены
двойные чашки Сойки — Краля
(рис. 150). В чашку вкладывают
плотно входящий внутрь кружок Рис.150. Двойная чашка Сойни-
« "л j г уj Краля для музейных культур,
картофеля, стерилизуют и
засеивают. Когда колонии достигнут
предельного развития, крышку снимают и чашку временно
покрывают стерилизованным часовым стеклышком. Крышку
нагревают на огне градусов до 70 и шлифованный край ее
погружают в нагретую до 70° парафиновую ванну. Быстро сняв
часовое стеклышко, покрывают чашку крышкой, плотно прижав,
но не вращая ее. Пока парафин еще не вполне застыл, наружную
щель покрывают новым слоем парафина. Избыток парафина
после застывания удаляют ножом, вытирают сухой холстинкой и
наружную щель покрывают лаком (стр. 92).
Культуры пигментных бактерий на ломтях картофеля уже
описывались в другом месте (стр. 153).
Для получения гигантских колоний дрожжей, которые
представляют благодарный материал для музейных культур, служат
обыкновенно солодовые среды (стр. 56). Мы с успехом пользовались
средой следующего состава:
Виноградного сахара 5 г
Мальтозы 5
Пептона 5
Фосфорнооднокалиевой соли 2
Сернокислого магния 2
Желатины 150
20 Руководство цо микробиологии
ЗОб
Эти вещества растворяют при нагревании в 1 л 10% солодового
экстракта. Последний приготовляют, как описано на стр. 51.
Среду эту выливают в колбы Креслинга (рис. 151) или в че-
тыреугольные склянки со скошенной желатиной (рис. 152). Для
Рис. 151. Колба Креслинга.
;Рис. 152. Четыреугольная склянка
Линднера для массовых культур.
Вверху склянка с ровным слоем плотной
среды, внизу — с косым слоем.
окончательного
образования гигантской
колонии требуется длительный срок — иногда до двух месяцев.
Несколько меньших размеров гигантские колонии получают
в плоских флаконах Сойки (рис. 153)
вследствие небольшого количества питательной
среды.
Для получения гигантских колоний на
агаровых средах необходимо, чтобы
поверхность агара была сухой, иначе
колония расплывается по всей поверхности.
При пользовании флаконами Сойки
следует до заражения оставить их на сутки в
термостате горлышком вниз и, только
убедившись в сухости поверхности агара,
засеивать среднюю часть агара.
Запаивание сосудов или эаделка их
парафином, сургучом, мастикой и т. п. не
удобны в том отношении, что в
получающемся при этом герметическом
пространстве при переменах температуры влага
сгущается в капли, оседс ющ'ле на
внутренних стенках и закрывающие таким
образом вид культуры. Для устранения
этого недостатка предложено заполнять все
свободное пространство сосуда над
культурой какой-нибудь прозрачной средой.
По Мюиру (Миіг), убитую формалином агаровую или желати-
зоа
Рис. 153. Флакон Сойки
с гигантской колонией
Bad. violaceum на мясо-
пептонном агаре.
новую культуру заливают тонким слоем желатины следующего
состава:
Дестиллированной воды, насыщенной на
холоду тимолом 1000 см3
Глицерина 200 г
Уксуснокислого калия 50
Желатины х 100
Среду слегка подкисляют несколькими каплями уксусной
кислоты, просветляют белком (стр. 48) и отфильтровывают.
Расплавив эту желатину при 40°, часть ее осторожно наливают
тонким слоем на поверхность среды. Когда желатина застынет,
в сосуд прибавляют 4—5 капель формалина и заливают
доверху жидкой средой состава:
Дестиллированной воды, насыщенной на
холоду тимолом 1000 см3
Глицерина 200 г
Уксуснокислого калия 50
Накрыв сосуд бумагой, оставляют его на 1—2 дня в покое,
чтобы все пузырьки воздуха поднялись вверх. Тогда поверх
жидкости наливают слой расплавленного парафина. Когда он
застынет, покрывают его слоем лака (стр. 92) до тех пор, пока
поверхность его не сравняется с верхним краем пробирки.
Для желатиновых культур Мюир пользуется часовым
стеклышком, укрепляемым внутри чашки Петри и в таком виде
стерилизуемым. В него стерилизованной пипеткой наливают засеянную
питательную желатину, чашку покрывают крышкой и оставляют?
при 22—23° до тех пор, пока колонии не разовьются. Тогда
часовое стеклышко вынимают из чашки, устанавливают
горизонтально и поверх него наливают слой вышеописанной тимоловой
желатины с прибавлением 5 капель формалина. Когда слой этот
застынет, поверх наливают новый слой той же желатины до краев
стекла и, пока она еще не застыла, стеклышко покрывают
стеклянной пластинкой, стараясь, чтобы внутри не осталось пузырьков,
воздуха. Пластинку надавливают пальцем или какой-нибудь
тяжестью до полного застывания желатины. Тогда часовое
стеклышко опрокидывают и края его обмазывают густым слоем лака, а
поверх него наклеивают полоску цветной бумаги.
Можно таким же способом зафиксировать культуру и
непосредственно в чашке Петри (без часового стеклышка), но в этом случае
трудно избежать пузырьков воздуха внутри.
По способу Гастингса (Hastings) для заделки служит 2%
•водный раствор агар-агара, приготовленного по Бейеринку (стр.
Ъ'Л). Расплавленный агар смешивают с равным объемом чистого
глицерина и к смеси прибавляют 2°/0 бесцветной карболовой
кислоты. Этим агаром, охлажденным до 22—25%, заливают культуры
2 Желатина должна быть высшего качества, совершенно бесцветной
и иетемнеющей.'
'2і>* 307
доверху. Недостаток способа заключается в неполной
прозрачности служащей для заливания массы. Музейные культуры,
приготовленные таким способом, имеют надлежащий вид только при
освещении сильным проходящим светом.
Для консервирования отдельных колоний предложено
несколько способов.
1) По Гарре (Garre), намеченную колонию с частью
окружающей среды переносят на предметное стекло и высушивают над
крепкой серной кислотой до половины или даже до трети
первоначального объема. Затем
ее заливают расплавленной
глицериновой желатиной
(стр. 92) и накрывают
покровным стеклышком.
2) По Якоби (Jacobi),
желатиновую пластинку с
предназначенной для
консервирования колонией подвергают
дублению путем обработки 1 %
раствором двухромовокалие-
вой соли на свету. Когда
желатина затвердеет, колонию
с окружающей средой
вырезают, тщательно промывают
водой, затем обрабатывают
спиртом и, как описано,
заключают между покровным
и предметным стеклом.
3) KyqoK желатиновой
среды с колонией кладут на
предметное стекло,
накрывают покровным и заливают
Ъвежерасплавленной
желатиной. В таком виде препарат
подвергают воздействию па-
отвердеет, края покровного
Рис. 154. Разборная пыставочная
витрина (модель Королева) с
диапозитивами, пробирками, сосудами Сойки,
чашками Петри,плоскими пробирками
Краля, колбами Эрленмейера и пр.
ров формалина. Когда желатина
стеклышка обводят лаком.
4) По способу Липера (Liper), на стерилизованное покровное
стеклышко, помещенное в чашке Петри, наносят каплю
засеянной плотной среды. Когда вырастут колонии, стеклышко
высушивают над серной кислотой, окрашивают *ц заключают в
канадский бальзам.
Что касается витрин для выставочных и музейных культур,
то они устраиваются применительно к характеру экспонатов и
их количеству. При этом надо иметь в виду, что культуре на
прозрачных плотных средах особенно эффектны при проходящем
свете. На рис. 154 приводится изображение одной из подобных
витрин (модель Королева). '
509
ГЛАВА XII
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА, ВОЗДУХА, ВОДЫ И ПОЧВЫ
1. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА
Бактериологическое исследование
При рассматривании с помощью иммерзионной системы
препарата из капли цельного молока бросается в глаза большое
количество разбросанных в поле зрения, сильно преломляющих свет
капель жира различной величины. В снятом молоке их
значительно меньше. Кроме того, попадаются белые кровяные шарики
и клетки эпителия (главным образом в молоке от коров, больных
воспалением вымени), а также всевозможные случайные
загрязнения: волокна, шерсть, частицы навоза и пр.
Для обнаружения присутствия микробов высушенный на
покровном или предметном стеклышке препарат молока
погружают на полчаса в смесь спирта с эфиром или в хлороформ для
растворения жира и одновременной фиксации, а затем окрашивают
метиленовой синью, которая для молока является лучшей
краской. По Аренсу (Arens), препарат погружают на 5 мин. в смесь
5 см3 хлороформа с 15—20 каплями насыщенного спиртового
раствора метиленовой сини. При этом способе одновременно
происходит обезжиривание, фиксация и окрашивание препарата, который
эатем ополаскивают водой, высушивают и, если нужно,
заключают в канадский бальзам.
Хороший результат получается, если высушенный препарат
опустить на 2—3 минуты для одновременной окраски и
фиксации в смесь метилового спирта, эфира и метиленовой сини, затем
ополоснуть водой и высушить при легком подогревании. Смесь
приготовляют следующим образом: 50 см3 метилового спирта и
50 см3 эфира смешивают, растворяют в этой смеси 0.5 г
кристаллической метиленовой синьки и фильтруют через складчатый фильтр
в банку с притертой пробкой, где раствор и хранится.
Быстрое окрашивание препаратов молока без
предварительного высушивания его производится так: 1 каплю молока
смешивают с 1 каплей крепкого аммиака (для растворения казеина) и с
1 петлей насыщенного раствора генциан-виолета или метилено-
гой сини. Слегка нагрев препарат над огнем горелки, накрывают
его покровным стеклом и рассматривают под микроскопом.
30&
Опыты накопления различных групп бактерий, встречающихся
в рыночном молоке
a) Str. lactis {Bad, lactis acidi) — обычная в наших широтах
молочнокислая бактерия (стр. 215), вызывающая естественное
скисание молока, легко может быть выделена разливкой на
обычной мясопептонной желатине или агаре.
б) Лактобациллы. Каплей рыночного молока или
петлей хорошей сметаны, где микроскопически предварительно были
обнаружены лактобациллы, заражают молоко с экстрактом
дрожжей по Рубинскому (стр. 60) и ставят при 37° (лучше при 45°).
Когда молоко скиснет, из него делают пересев в такую же среду.
На среде Коэнди (стр. 60), при засеве ее на 3-й генерации,
появляются характерные волосистые колонии бактерий типа
болгарской палочки. По опытам Зархиной, хорошим способом для
накопления лактобацилл является прогревание молока,
подкисленного 1 % молочной кислотой, при 50° в течение 40 минут.
в) Молочные дрожжи. К 100 см3 молока прибавляют 2 см3
3% раствора перекиси водорода (в 10 раз разведенного пергидроля
Мерка). При 37° через некоторое время возникает брожение,и
молоко начинает издавать запах дрожжей. Убедившись в их
присутствии микроскопическим исследованием, приступают к
изолированию на среде с молочной сывороткой или с солодовым
суслом.
г) Слизеобразующие виды можно накопить в
молоке, прибавив к нему 5% хлористого кальция и заразив землей
или хлевным навозом. При температуре не выше 15%,
обыкновенно в недельный срок, в молоке развиваются
слизеобразующие виды.
Образование слизи можно рассматривать как защитную
реакцию против неблагоприятных внешних условий. Слизистые виды,
например, более устойчивы к высоким температурам. По Бурри
(Burri) и Тени (Thoni), образованию слизистых видов
способствует прибавление к среде пленочных дрожжей (Mycoderma).
д) В и д ы, придающие молоку фруктовый
запах. По Бейеринку и ван-дер-Леку (van der Leek), рыночное
молоко нагревают в эрленмейеровской колбе до 30° и к нему
прибавляют 0.01% сычужного фермента, растворенного в теплой воде.
Жидкость затем выливают в чашки Петри высотой в 1 см. Когда
при 30° молоко через 20—30 мин. свернется, его дальше
сохраняют при 23°. х Обычно уже через сутки появляется фруктовый
запах.
Специфических бактерий изолируют на желатине с молочной
сывороткой. /
е) Ароматообразующие бактерии.
Производят разливки достаточно разведенного рыночного молока или
1 При температурах свыше 23° получают преобладание молочно-кис-
лые бактерии, а при температурах ниже 15° — флюоресцирующие виды.
310
кисломолочного продукта на капустном агаре (стр. 217).
Специфические бактерии изолируют в молоко с дрожжевым аутоли-
.чатом. Ароматообразующие в большинстве случаев свертывают
молоко очень медленно или совсем его не свертывают. Определяют
способность ароматообразующих давать летучие кислоты и диа-
цетил. Определение см. в приложении.
ж) Маслянокислые и пептонизирующие
бактерии. Свежекипяченое молоко разливают высоким слоем
в небольшие колбочки или пробирки и заражают землей. Один
ряд пробирок нагревают при 70—80° в течение 5—10 мин.; через
некоторое время при 38° в них развивается маслянокислое
брожение, узнаваемое по выделению газа и появлению запаха
масляной кислоты. Другой ряд пробирок нагревают при 100° в
течение 5—10 мин.; в них обыкновенно развиваются бактерии,
растворяющие казеин («пептонизирующие»).
з) Пептонизирующие бактерии определяют
на кальций-казеиновом агаре (Calcium kaseinatagar). Кальций-
казеиновый агар приготовляется перед употреблением из 1 части
4% раствора кальций-казеината и 3 частей разжиженного 3% пи-
іательного агара. Смесь разливают по чашкам перед засевом.
Она не выдерживает стерилизации. 4% раствор
кальций-казеината получается путем растворения б г казеина (по Гаммерстену—
Мерку) в 150 см3 на 2/3 насыщенной известковой воды. После
растворения, которое лучше всего получается в сотрясатель-аппарате,
препарат разливается по колбочкам по 25 см3, стерилизуется и
сохраняется в запас. Агар состоит из 5 г пептона, 3 г экстракта
Либиха, 30 г агара, 1000 см3 дестиллированной воды, рН = 7.5.
Готовый агар разливается по 75 см3, стерилизуется и держится
в запасе.
Посевный материал размазывается шпателем Дригальского
непосредственно на застывшей поверхности среды. Вокруг пепто-
низирующих колоний получается просветление.
•и) Молочная плесень (Oidium lactis). Развивается
часто на поверхности самопроизвольно скисшего молока в виде
белого пушистого ковра.
Для ее выделения по поверхности пленки осторожно
проводят стерилизованной платиновой иглой и заражают пробирку
с 10 см3 расплавленной желатины с дрожжевой водой; тщательно
смешав с жидкостью посевный материал, выливают его в
стерильную чашку Петри. Отсюда делают еще два разведения в той же
среде и все чашки ставят в термостат при температуре не выше
20°. Через несколько дней появляются отдельные колонии,
которые в чашках 2-го и 3-го разведений должны быть достаточно
отделены друг от друга. Рассматривая их при самом слабом
увеличении, можно увидеть, что от колоний отходят в разные стороны
извитые нити гриба. Из отдельных колоний Oidium lactis делают
отвивку в пробирку с косо застывшей желатиной, поставленной на
дрожжевой воде, или на солодовый агар.
211
Разросшиеся на чашках Петри колонии начинают издавать
запах сыра, так как гриб разлагает белки и желатину подобно
микробам, действующим при созревании сыра. Oidiurn lactis
играет роль в созревании сыра, понижая кислотность сырной
массы. Для обнаружения кислоторазлагающей способности
молочной плесени заражают чистой культурой ее дрожжевую воду с
прибавлением 1% пептона и 1% молочной кислоты (содержание
последней в жидкости точно устанавливается титрованием). 50 см3
этого раствора наливают в колбу Виноградского, стерилизуют
х/4 часа в текучем пару, заражают молочной плесенью, помещают
в термостат при 20°. Через несколько недель в жидкости можно
констатировать резкое понижение кислотности.
Тот же процесс происходит и при созревании сыра. Молочная
плесень вместе с Penicillium glaucum разрушают и нейтрализуют
образующимся из пептона аммиаком молочную кислоту сыворотки
свежей сырной массы. Таким образом последняя подготовляется
к дальнейшему развитию в ней пентонизирующих бактерий,
играющих ррль в созревании сыра. Поэтому-то мягкие и тощие сыры,
особенно богатые молочной кислотой, созревают снаружи внутрь
соответственно постепенной нейтрализации и разрушению
кислоты, тогда как более бедные кислотой твердые сыры, как эмен-
тальский и эдамский, созревают равномерно во всей массе.
Бактериологическое исследование молока
Так как молоко содержит обыкновенно большое количество
всевозможных микробов, то для исследования предварительно
его разбавляют. Для этого стерилизуют 3 колбы, содержащие по
100 см3 водопроводной в,оды. Колбу № 1 заражают 1 см3
исследуемого молока, колбу № 2 — 1 см3 материала из ¦ предыдущей
колбы и колбу № 3 — 1 см3 из колбы № 2, всякий раз беря для
васева новую пипетку.
Из каждой из этих колб берут материал для разливок: двух
агаровых и одной желатиновой чашки.
а) Разбавление 1:1 000. Из колбы № 1 берут по 0.1 см3 (содерж.
0.001 см3 молока) и прибавляют в 3 пробирки; в две — с
расплавленным и охлажденным до 40° МПА и в одну — с расплавленной
МПЖ, стараясь равномерно распределить в среде посевный
материал.
б) Разбавление 1: 100 000. Для свежего молока первое
разбавление в 1000 раз слишком велико. Можно брать разведение
в 10 и 100 раз. Поступают, как в предыдущем случае, взяв 0.1 cms
посевного материала из колбы № 2. *
в) Разбавление 1 :1 000 000. Та же операция с посевным
материалом из колбы № 3, взятым в количестве 1 см3.
6 чашек агара сохраняют при 30°, а 3 чашки с желатиной —
при комнатной температуре. На агаре через сутки, а на я^елатине
через несколько дней определяют число выросших колоний, соот-
312
ветствующих данному количеству молока (приняв условно, что
каждая колония произошла от одной бактерии).
Если желательно определить содержание в молоке
молочнокислых бактерий, то поступают, как выше описано, но все
высевы производят на агар Коэнди с мелом или солодовый агар с
мелом или капустный агар с мелом (стр. 217). Колошщ молочных
бактерий узнают по прозрачным ореолам вокруг них и
сосчитывают.
С успехом может быть применен при бактериологическом
анализе молока казеиновый агар, приготовляемый, по Айерсу (Ayers)?
следующим образом:
а) 10 г казеина растворяют при кипячении в 300 см3 дестилли-
рованной воды, к которой прибавлено 7 см3 нормального раствора
едкого натра. Для лучшего растворения казеина полезно
оставить жидкость на несколько часов, после чего ее доводят до 500 см'а.
Реакция яшдкости должна быть, по принятой в Америке шкале
Фюллера (стр. 48), между -(-0.1 и -f- 0.2.
б) Отдельно растворяют 10 г агар-агара в 500 см3 дестиллиро-
ванной воды.
Оба раствора (а + б) смешивают, среду фильтруют,
разливают по пробиркам и стерилизуют.
Для определения общего количества микробов в молоке с
успехом можно применить более быстрый и не менее точный
метод микропластинок Фроста (Frost), несколько
усовершенствованный и дополненный позднейшими исследователями [А. К л а р е н-
б у р г-0 й е н (A. Clarenburg-Oijen), Le lait, т. VII. № 64, 1927,
p. 321, и Хейфец М. А., Микробиология, т. VII, 1938, стр. 219].
Этот метод является микромодификацией метода Коха.
Метод Ф р о с т а. В пробирку со стерильным 2% мясо-
пептонным агаром, тщательно осветленным, разлитым точно по
1 см3 и нагретым до 45°, вводят 1 см3 исследуемой жидкости (в
случае надобности — после соответствующего разведения). Смесь
тщательно перемешивают. Немедленно набирают из этой смеси
. стерильной толстостенной пипеткой в 1—0.5 см3, слегка нагретой
над пламенем горелки, некоторое количество смеси и наносят
точно 0.1 см3 ее на квадратик площадью 4 см2 стерильного
предметного стекла, предварительно нагретого до 40—45°. (Площадь в
4 см2 или очерчивается заранее тушью на обратной стороне стекла,
или стекло при нанесении смеси кладется на миллиметровую
бумагу, на которой очерчено 2 квадрата по 4 см2). Платиновой
проволокой, кончик которой согнут под прямым углом, смесь быстро
распределяют на квадрате. Из каждой пробы делают по 2 микропла-
стинки на одном стекле.
После этого стекло кладут на горизонтальную поверхность
па г/з — 1 мин. для застывания агара, а затем помещают во
влажной камере в термостат, на необходимый для прорастания
микроколоний срок. Влажной камерой может служить неплотно
прикрытые крышкой эксикатор, батарейный стакан или банка; на
31$
дно камеры должно быть налито немного воды с непахучим каким-
нибудь антисептиком (например, AgN03, 2—5 мг на 1 л.).
Инкубацию посевов ведут: при 37°—4 часа, при 27 —
30° — 6 час, при комнатной температуре (до 18°)— сутки.
После инкубации агаровую микропластинку осторожно
сушат при 90° 2—3 мин. или в термостате при 50—60°. Препараты
окрашивают 2—3 сек. метиленовой синью. (3 г сини + 20 см3
спирта; 1 часть насыщенного спиртового раствора на 9 частей
цестиллированной воды). Кларенбург и Ойен рекомендуют
погружать препарат на 2 мин. в раствор Bleu de thionine (Bleu de thio-
nine 1 г, кристаллического фенола 2.5 г растворяют в 400 см3 воды,
фильтруют и прибавляют 20 г ледяной уксусной кислоты).
Краску смывают осторржно слабой струей воды и сушат.
Подсчитывают число выросших микроколоний под микроскопом с
окуляром 4х и иммерзией 90 х в 20—40 полях зрения в зависимости
от густоты посева.
Вычисляют среднее число колоний для одного поля зрения, и,
чтобы получить количество микробов в 1 см3 молока, умножают
полученное среднее чи<;ло на предварительно установленный
коэффициент пересчета, вычисленный для взятых систем микроскопа
следующим образом: так как на пластинку нанесено 0.1 см3 смеси
агара (что соответствует 0.05 см3 исследуемого молока, т. е. 7го см3),
площадь всего мазка 400 мм3, а площадь поля зрения
микроскопа, высчитанная при помощи объект-микрометра, —S мм2, то
v. ,- 400.20 тт
чтот коэффициент будет равен —~—. Для вышеуказанных систем
при длине тубуса микроскопа 160 мм, он постоянен и равен
-около 145 000.
При анализе молока по этому методу наилучшие результаты
получаются при 1—5—20 микроколониях в поле зрения. Понятно,
что при слишком малом количестве микробов в 1 см3 этот метод
неприемлем, так как тогда во всем препарате будет содержаться
так мало микробов, что 1 колония придется на 50—100 полей
зрения. При ожидаемом слишком большом загрязнении молока
его следует соответственно развести стерильной водой. В случае
исследования парного молока посевы приходится выдерживать в
термостате более долгие сроки, так как за 4—5 час. при 30°,
обычно необходимых для получения ответа, не успевают исчезнуть
бактерицидные свойства молока, препятствующие быстрому
проросту колоний.
Этот метод применим и в других случаях исследований на
общее количество микробов, когда желают получить более быстрый
ответ при очень незначительном расходе питательной среды.
Кроме того метод Фроста дает возможность одновременно с
количественным учетом производить и морфологический анализ
выросшей микрофлоры, так как в препаратах прекрасно виден
характер пророста и образования микроколоний, а также их
морфологическая структура.
314:
Методы непосредственного подсчета микробов под микроскопом
Существует несколько вариантов метода непосредственного
подсчета микробов под микроскопом [метод Виноградского — для
почвы, подсчет клеток в счетной камере Тома, Тюрка — для
дрожжей].
Для молока наибольшим распространением пользуются методы
1>рида и Дрейера-—Королева.
Метод Брида. Точно калибрированной пипеткой
отмеряют 0.01 см3 хорошо перемешанной исследуемой жидко-
ти и размазывают на площади 1 см2 предметного стекла,
юмещенного на строго горизонтальной поверхности на милли-
іетровой бумаге с 2 зачерненными квадратиками в 1 см2. (Очень
ороши для этого метода предметные стекла с матовой поверхно-
гью, на которой имеется по 3 блестящих квадратика в 1 см2.
Матовая поверхность препятствует расплыванию капли за
границы очерченного квадратика). Выдувание из пипетки не
допускается. Вместо пипетки молоко можно отмеривать платиновой
петлей, диаметр которой рассчитан таким образом, чтобы капля
молока равна была 0.01 ом3 (см. прямой метод Виноградского, стр.
.429). Препарат сушат, фиксируют спиртом, обезжиривают эфиром и
окрашивают метиленовой синью (стр. 95; окраска мазков для
препаратов из молока). Количество микробов считается по диагоналям
в 20—50 полях зрения с объективом 90 х (иммерзйя) и окуляром
10х. При счете за единицу считают все могущие дать одну
колонию образования (например, диплококк, сарцину, цепь
стрептококка). Считать лучше с окулярной сеткой. Чтобы получить
общее количество микробов, содержащихся в 1 см3, среднее число
микробов, полученное для одного поля зрения, умножают на
предварительно установленный коэффициент пересчета, высчитанный
для взятых систем микроскопа. (Расчет коэффициента см.
«Прямой метод Виноградского».)
Существенные недостатки метода Брида, как и всех прямых
методов вообще: во-первых — невозможность получить сколько-
нибудь точные результаты при слишком малом числе клеток,
содержащихся в субстрате; во-вторых — подсчет мертвых клеток:
в-третьих — трудность точного отмеривания 0.01 см3 жидкости.
Однако все же этот метод для целых серий однотипных
исследований очень удобен и быстр и дает вполне сравнимые
удовлетворительные результаты, хотя и превышающие в несколько раз
результаты, полученные для общего количества микробов по
методу Коха.
Метод Дрейера — Королева, Приготовляется стандартная
суспензия из убитых фиксированием клеток какого-либо микроба
(например, одного вида африканских дрожжей Schizosacharomyces
pombe) определенного титра (например, 10 000 000 клеток в 1 см3)1
1 Подробное изготовление суспензии — см. статью С. А. Королева —
«Новый метод непосредственного счета клеток под микроскопом, при
* 315
Суспензия перед каждым анализом тщательно взбалтывается,
0.5—1 см3 хорошо перемешанного исследуемого молока
смешивают в небольшой пробирочке, сильно встряхивая, с равным
объемом стандартной дрожжевой суспензии Королева,
содержащей 10 000 000 клеток в 1 см3.
При изготовлении титрованной суспензии дрожжей по
способу проф. С. А. Королева производят следующее:
1) Выращивание дрожжей путем посева 2-суточной культуры
Schizosacharomyces porribe в сусло, хорошо отфильтрованное
после предварительного нагревания до температуры стерилизации
(сусло после стерилизации должно быть совершенно прозрачным).
Количество питательной среды берется в зависимости от
количества требуемой суспензии; примерно для 12 л суспензии с титром
в 10 000 000 нужно брать 1 л сусла. Выдержка при температуре 30°.
2) Просмотр микроскопических препаратов во время роста
(необходимо следить, чтобы препарат давал однообразные клетки,
не должно быть копулирующих клеток, что в дальнейшем может
затруднять подсчет).
3) Убивание дрожжевых клеток нагреванием в колбе до 80°
(осторожно, чтобы не выбросило жидкость выделяющейся
углекислотой).
4) Отстаивание дрожжевьгх клеток, путем хранения их на
"холоду в течение суток (но не более).
5) Центрофугирование, отделение грязи и промывание 3—4 раза
5% фенолом (можно дестиллированной водой), а после этого к
осадку прибавляется 5% фенола и в таком виде материал может
сохраняться неопределенно долгое время.
После этой предварительной обработки и прежде чем
приступить к окрашиванию, необходимо из осадка приготовить
фиксированный и окрашенный метиленовой синью препарат. В таком
препарате должны быть только однородные клетки
Schizosacharomyces pombe; во всяком случае в нем не должно быть бактериальных
клеток. Если они есть, то материал не годится. От крупных
частиц грязи можно освободиться дальнейшим промыванием и цен-
трофугированием.
6) Окраска дрожжевых клеток карболовым раствором метил-
виолета (1 часть насыщенного 3% спиртового раствора метил-
виолета и 8 частей 5% фенола) до темно-фиолетового цвета, что
отчетливо видно при просмотре препарата с нигрозином. На 1
объем уплотненного осадка необходимо прибавить 15—20 объемов
приготовленного раствора краски.
7) Промывание 2.5% раствором фенола до возможно полного
исчезновения краски в растворе.
8) Прибавление к отмытому осадку 5% фенола до 1 л и
приготовление разведений для подсчета в камере Тома.
общем плане микробиологического учета», Бюллетень № 77, Труды
Вологодского мол. хим. инст.
316
9) Установка титра дрожжей путем подсчета в камере Тома
лли Тюрка.
10) Разбавление имеющейся основной суспензии до 10 000000
клеток в 1 см3 (А. М. Скородумов а, Практическое
руководство по технической микробиологии молочного дела,
1933).
Из полученной смеси тотчас же после встряхивания берется
капля или большая петля смеси, наносится на обезжиренное,
слегка нагретое предметное стекло (хотя для молока
обезжиривать стекло и не столь важно) и размазывается на площади
большего или меньшего размера. Величина мазка не имеет значения.
Мазок высушивается, фиксируется обычным способом (см. способ
Брида) и окрашивается,—в тех случаях, когда в исследуемом
материале не предполагается наличия дрожжеподобных клеток,
которые при счете трудно отличить по форме от клеток
суспензии,— обычным способом метиленовой синью. В тех же случаях,
когда в исследуемом материале могут встретиться дрожжеподоб-
ные организмы, на фиксированный и охлажденный мазок наносят
несколько капель раствора Люголя, тотчас же препарат промывают
водой, обесцвечивают погружением в спирт (моягао в денатурат) и
промывают водой. После просушивания мазок окрашивают
метиленовой синью. Сущность этого метода окраски заключается в
том, что клетки стандартной суспензии, при своем приготовлении
окрашенные генциан-виолетом, после обработки люголевским
раствором приобретают полную окраску по Граму (темнофиолетовую),
в то время как остальные клетки, в том числе и: дрожжи,
находящиеся в исследуемом материале, окрашиваются метиленовой
синью только в голубой цвет. При подсчете, пользуясь также
объективом 90х (иммерзия) и окуляром 10х, подсчитывают в
каждом поле зрения отдельно количество бактериальных клеток
исследуемого молока и дрожжевых клеток суспензии. Результаты
подсчетов по каждому полю зрения записываются двумя
столбцами. Просматривают так же, как по Бриду, 20—50 полей
зрения. По окончании просмотра складывают отдельно числа
дрожжевых клеток суспензии (один столбец цифр) и числа других
клеток микрофлоры (второй столбец). Разделив полученную
сумму клеток микрофлоры на соответствующую сумму дрожжевых
клеток суспензии и умножив на титр суспензии (если он равен
10000 000, то просто к полученному частному приписывается 7
нулей), получают количество микробов, находящихся в 1 см3
исследуемой жидкости.
В этом методе, так же как и в методе Брида, при наличии
большого количества микробов в поле зрения удобно вести подсчет с
окулярной сеткой.
Методы микроскопического подсчета хотя имеют
вышеуказанные недостатки, но благодаря простоте и быстроте
выполнения позволяют быстро дать характеристику микрофлоры молока
и отнести его к той или иной категории до поступления молока в
317
продажу. Эги методы не пригодны для определения степени
загрязнения пастеризованного и стерилизованного молока, так как
в таком молоке имеются мертвые клетки.
Метод предельных разведений
Для некоторых групп микроорганизмов, плохо растущих на
искусственных твердых питательных средах, лучшие результаты
дает так называемый метод предельных разведений, хотя, по
существу, этот метод менее точен, чем чашечный.
Берется последовательный ряд десятичных разведений из
испытуемого материала с таким расчетом, чтобы 2 последних
разведения были выше того, при котором, по предположению, один
микроб будет содержаться в 1 см3. Из четырех последних разведений
делаются посевы в пробирки с элективной для данных микробов
жидкой средой, например для молочнокислых такой средой
является молоко. Стерильной пипеткой вносят 1 см3
соответствующего разведения в каждую пробирку, отмечают, из какого именно
разведения посеяно в ту или другую пробирку. После посева
пробирки ставят в термостат при соответствующей температуре.
Через несколько дней (обыкновенно через 10) наблюдают, при
каких разведениях молоко (обрат) в пробирках свернулось;
определяют кислотность, причем за минимальную кислотность
свертывания молока для молочнокислых микробов обыкновенно
принимает 50° Тернера. Если, например, молоко свернулось в
разведениях 1/1 000 000,1/100 000 и меньших и не свернулось в больших
(1/10 000000), то количество микробов можно предполагать от
1 000 000 до 10 000 000. Более точную цифру для количества
микробов получим, если заражать из каждого разведения по 2—3
пробирки с питательной средой. Для простоты можно брать также
среднюю величину между пределами, например для нашего
случая, так как количество микробов колеблется в пределах от
1000 000 до 10 000 000, эта вероятная величина будет = 5-5 млн.
Эгот метод особенно целесообразен как дополнение к чашечному
для учета вероятных пределов молочнокислых микробов, плохо
растущих на мясопептонном агаре, но хорошо растущих в молоке
(тип. Bad, casei E.)
В этом методе необходимо обязательно брать для каждого
разведения и каждого посева новую стерильную пипетку (А. М.
Скородумов а, Практическое руководство по технической
микробиологии молочного дела, 1933).
Этот метод в лабораторной практике часто носит название
метода титров и применяется при различных других
микробиологических исследованиях, например при определении титра Vh-
шечной палочки и т. п.
318
Редуктаза молока
В молоке различают редуктазу двух родов:
1) Редуктаза самого молока, или физиологическая редуктаза.
Она восстанавливает метиленовую синь (1 часть насыщенного
спиртового раствора синьки на 39 частей дестиллированной воды)
\\ присутствии альдегидов при 70° [реакция Шардингера (Schar-
dinger)}.
2) Редуктаза бактериального происхождения, содержание
которой тем больше,чем сильнее молоко загрязнено микробами.
Разливают в пробирки по 10 см3 исследуемого молока и
прилипают по 0.25—0.5 см3 смеси:
Насыщенного спиртового раствора мети-
леиовой сини 5 см3
Дестиллированной воды 195
Нейссер Вексберг (Neisser Weksberg) предложил реактив,
состоящий из:
Метиленовой сини 1г
Абсолютного спирта 20 смэ
Дестиллированной воды 29
Раствор хорошо сохраняется. Перед употреблением его
разводят физиологическим раствором поваренной соли (0.85%) в
отношении 1:250.
По скорости обесцвечивания О. Иенсен (О. Jensen) и Хтэ. Бар-
тель (Chr. Barthel) подразделили молоко на следующие 4
категории:
Разделение молока
ні категории
Нремя обесцвечивания .
Качество молока • - .
Количество микроорга-
I
Больше
Ь1/2 час.
Хорошее
Меньше
х/г МЛН.
II
б1/!—2 часа
Среднее
7з—4 млн-
ш
2 часа—
—20 мин.
Плохое
4—20 млн.
IV
Менее
20 мин.
Очень
плохое
Больше
20 млн.
Равномерно смешав молоко с краской, прибавляют несколько»
кубических сантиметров жидкого вазелина так, чтобы он
покрыл поверхность молбка, и нагревают пробирки в водяной бане
при 45—4/° (другие рекомендуют вести нагревание только при
температуре 38—40° и даже при 37°). Чем быстрее молоко
обесцвечивается, тем оно недоброкачественнее и богаче микробами.
Хорошее молоко сохраняет синий цвет в течение 7 час, а очень
плохое иногда обесцвечивается менее чем в 15 мин. Среднее
молоко обесцвечивается в 2—6 час.
319
Бродильная проба молока
Около 40—50 см3 молока наливают в большие стерилизованные
пробирки и выдерживают в течение 12 час. при 38—40° (в водяной
бане). Вполне доброкачественное молоко при этом не изменяется.
Молоко с преобладанием молочнокислых бактерий скисает в
сплошную студенистую массу. Развивающееся брожение с
выделением газов указывает на присутствие в молоке марлянокислых
или фекальных бактерий, главным образом кишечной палочки и на
его недоброкачественность. Если выпавший сгусток казеина
начинает пептонизироваться, это указывает на большое содержание
протеолитических видов.
Относительное содержание в молоке фекальных бактерий
узнается пробой в эскулин-бульоне (стр. 49) при 38—40°. Чем
богаче молоко фекальными бактериями, тем при меньшем
заражении наблюдается почернение эскулин-бульона.
Проба са каталазу
В аппарат Эйнгорна-Смита (стр. 31) вводят 15 см3 молока и
5 см3 1% (по весу) раствора перекиси водорода и смесь хорошо
взбалтывают. Через 2 часа отсчитывают объем выделившегося
кислорода. При очень большом содержании каталазы закрытое
колено трубочки иногда совсем наполняется газом, а последний
выходит наружу. Такое молоко должно быть признано негодным
к употреблению. При нормальном содержании каталазы в
молоке образуется в закрытом колене не свыше 2.5 см3 газа.
Пробой на каталазу различают кипячёное или некипяченое
молоко. В пробирку прибавляют 1 см3 исследуемого молока и 1 см3
крахмального 1% клейстера с прибавлением небольшого
количества!^. Взбалтывают смесьи прибавляют к ней каплю в 5 раз
разбавленного водой продажного 3% раотвора перекиси водорода. Если
молоко некипяченое, то оно почти моментально окрашивается в
синий цвет, так как Н302 под влиянием каталазы выделяет 02,
выделяющий J из KJ (свободный J окрашивает крахмал в синий
цвет).
Проба Морреса (Morres) (определение «сычужного градуса»
молока)
Нередко молоко, особенно в летнее время, обладая почти
нормальной кислотностью, тем не менее свертывается при
кипячении. Это объясняется появлением в постоявшем молоке
микробов, вырабатывающих сычужный фермент. Для определения
«сычужного градуса» молока Моррес предложил простую пробу.
Если к молоку осторожно, по каплям, приливать слабую
кислоту при беспрерывном встряхивании колбочки, то до момента
свертывания казеина стекающая жидкость оставляет на стенках
равномерный опалесцирующий след, но, как только казеин
320
свернулся, в стекающей жидкости становится ясно видимой
мельчайшая муть его.
Для производства этой пробы к 40 см3 молока прибавляют по
каплям децішормальную серную кислоту, пока не наступит
свертывание казеина. Нормальное молоко, при исходной кислотности
около 7° по Сокслету, свертывается около 26°, т. е. после
увеличения исходной кислотности на 19°. Последнее число выражает
«градусы свежести молока», т. е.
F = Z—5,
где F — «градусы свежести молока» (Frischegrade), Z — «градусы
свертывания» и S — «градусы кислотности».
Очевидно, свежесть молока будет тем меньшей, чем ниже
кислотность свертывания молока Z и чем выше исходная кислотность
его iS. Понижение Z идет параллельно с повышением сычужных
свойств в молоке, а повышение 5 зависит от деятельности главным
образом молочнокислых бактерий.
Зная кислотность свертывания нормального молока и
определив таковую в исследуемой пробе, легко установить
«сычужный градус» (Labgrade) молока L в виде разницы между
первой и второй.
Пороки молока
Они вызываются развитием в молоке различных вредных
бактерий.
а) Синее молоко. Возбудители — Bad. cyanogenum и Bad.
cyannofluorescens.
б) Красное молоко. . Возбудители — Bad. prodigiosum
и Bad. ladis erythrogenus.
в) Желтое молоко. Возбудитель — Bad. synxantkum.
г) Горькое молоко. Возбудитель — Bad. ladis amari.
д) Слизистое молоко. Возбудители — Bad. ladis viscosi,
Bi ladis piiuitosi, В. Guillebeau.
е) Г н и л о е молоко. Возбудители — Proteus vulgaris, В. foeti-
dus ladis.
Патогенные микробы в молове
Встречаются: Bad. tuberculosis, Bad. typhi, различные стреп-
то-и стафилококки и др.
Бактериологическое исследование сыра
Пробы берут из различных участков сыра, разрезанного
стерилизованным ножом. При изучении микрофлоры сыра в период
его созревания пробы берут в различные стадии созревания.
Взятую пробу растирают с водой в стерилизованной ступке и
полученную массу анализируют путём разливок на соответственных
средах (обычные мясопептонные среды, молочный агар и т. п.).
21 Руководство по микробиология
321
2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА
Содержащихся в воздухе бактерий проще всего можно об
наружить методом оседания Коха. Берут чашку Петри с питатель
ным агаром, желатиной или с ломтем сваренного картофеля и и
течение некоторого времени (от нескольких минут до получаса
смотря по содержанию бактерий в воздухе) оставляют открытой.
Вместе с пылью и мельчайшими капельками влаги бактерии
опускаются на субстрат и здесь образуют колонии. По
относительному количеству их можно судить о
сравнительном богатстве воздуха
микробами, но для более точного
количественного анализа метод не
пригоден, так как не известен объем
воздуха, из которого попали на
поверхность среды зародыши. По
приблизительному расчету, на площадь в
100 см3 в течение 5 мин. осаждается
столько микробов, сколько
содержится в 10 м3 воздуха.
Методы более точного
бактериологического анализа воздуха
основаны на пропускании определенного
объема воздуха через
стерилизованную жидкую или плотную среду,
удерживающую все взвешенные ввоз-
духе частицы, в том числе и
микробов, после чего среду эту исследуют
на количество содержащихся в ней
микробов (стр. 79). Зная объем
воздуха, из которого попали
зародыши, можно судить о содержании
в нем микробов.
Способ Гессе состоит в просасы-
вании воздуха через трубку,
внутренняя поверхность которой покрыта слоем питательной
желатины (рис. 155). Трубка (4x70 см) укреплена на треножнике в
горизонтальном положении и закрыта с одного конца резиновым
колпачком с отверстием посредине, а с другого—каучуковой
пробкой, через отверстие которой проходит стеклянная трубка,
соединенная с аспиратором. При медленном просасывании воздуха через
аппарат микробы прилипают к слою желатины, на которой
затем в соответственных местах появляются колонии. Число их
указывает на число зароды ией, бывших в прошедшем через аппарат
объеме воздуха. Для уверенности в том, что действительно все
бактерии задержаны^келатиной, убеждаются в стерильности
воздуха, прошедшего через аппарат.
В аппарате Микеля (Miquel) (рис. 156) воздух пропускается
медленной струей через жидкую среду, удерживающую все взвешен-
322
Рис. 155. Аппарат Гессе для
бактериологического анализа
воздуха. Вверху трубка со
слоем желатины на
внутренней поверхности. Две
конические колбы служат
аспиратором.
ные в нем частицы. Войдя через верхнее горло баллона (после
снятия колпачка а), воздух мелкими пузырьками проходит
через жидкость (бульон, вода) и выходит череа трубку, соеди
ценную с аспиратором Количество прошедшего череа аппарат
воздуха определяют по количеству вытекшей из аспиратора воды.
Трубка cd служит для
выливания жидкости, в которой затем
обычным способом (стр 79)
определяют количество
микробов.
В аппарате Штрауса (Strauss)
и Вюрца (Wurt/) (рис 157)
определенный объем воздуха
проходит по тонкой трубке еСВ
через расплавленную желатину,1
находящуюся в узком конце ци-
Рис, 1оЬ. Аппарат Микеля.
Рис. 157 Аппа-
раі Штрауса и
Вюрца.
Рис 158 Рис 159 Аппарат Петри для бактериола-
Песочный гического исследования воздуха Слева —
фильтр стеклянные трубочки, пустая и с песком
Петри в центре—воздушный насос, справа—штем
пеля дня приготовления сеточек
линдра А, и отдает ей все свои зародыши. По окончании про-
сасывания воздуха внутреннюю ватную пробку в колене D, на
которой могли задержаться микробы, сбрасывают внутрь цилиндра
21
1 Во избежание вспенивания к желатине прибавляют каплю масла
323.
Охладив аппарат, распределяют желатину равномерным
слоем на внутренней поверхности цилиндра (по Эсмарху) и
затем определяют число выросших колоний.
Описанный аппарат можно заменить пробиркой,
закрытой каучуковой пробкой, через которую проходят
две стеклянные трубки: одна —до дна, другая—до
пробки. Таким приспособлением пользовался Гюпп?
(Нйрре).
Большое распространение получили способы
бактериологического анализа воздуха при помощи
фильтрования его через пористые тела.
По способу Петри, воздух прогоняют
нагнетательным насосом через стеклянную трубку (2x9 см),
разделенную 4 металлическими сетками на 2 отделения,
наполненные мелким песком (диам. от */4 до 1/3 мм).
Насос снабжен поршневым цилиндром и счетчиком для
определения числа оборотов поршня (рис. 158 и 159).
При всасывании воздуха (со скоростью до 10 л
з минуту) все зародыпи остаются на первом песочном
фильтре, а второй должен остаться стерильным для
уверенности в точности определения. По окончании
пропускания воздуха из обоих отделений трубки
засеивают песком чашки с желатиной и подсчитывают число
выросших колоний. Неудобство способа заключается
в том, что не всегда с уверенностью можно отличить
попавшие в желатину песчинки от выросших колоний.
Фикер (Ficker) поэтому предлагает вместо песка
пользоваться мелкой стеклянной дробью. Кроме того, насоо
он заменяет резиновым баллоном, емкостью в 1/2 л.
УПо Микелю, задерживающие бактерии трубки
наполняют мелким порошком сернокислого натрия или
сахара, после растворения которых в получающейся
жидкости обычным путем определяют содержание
задержанных микробов (рис. 160).
*¦••'.
•V*--
,і,'
?¦:¦:
;1 *.V
Рис. 160.
Трубка
Ми к е ля
дляфиль-
трования
воздуха
через
аорошок
сахара
или
нокислого
натрия.
а. исследование воды
Проба воды для бактериологического анализа
берется с соблюдением всех необходимых
предосторожностей против загрязнения извне и с таким расчетом,
чтобы она соответствовала средней пробе исследуемого
образца. Так, при взятии пробы водопроводной воды,
необходимо предварительно выпустить из крана
большое количество воды, чтобы не брать порций ее,
застоявшихся в узких каналах водопроводной сети и
содержащих обыкновенно большое количество бактерий. Пробу
ключевой воды нужно брать непосредственно у выхода ключа,
так как при дальнейшем движении вода загрязняется
почвенными бактериями. Пробу речной воды берут в некотором рас-
324
стоянии от берега. Если река широкая (например Нева, Волга
и т. п.), то пробы следует брать не только посредине реки,
но и ближе к берегу (например, на расстоянии */4 ширины реки).
Если в реке заметны отдельные струи, то при взятии проб
8то нужно принять во внимание и взять пробы из этих
струй. Такие струи хорошо бывают заметны при впадении
притоков или при извилистом течении реки. В морях пробы нужно
брать или через известные расстояния друг от друга или же
принимая во внимание морские течения,
нанесенные на карту, но особенно необходимо
исследовать границы двух течений, как содержащие
большие количества бактерий. Из колодца
предварительно откачивают воду, чтобы
избежать случайного поверхностного загрязнения
и т, д.
Посев исследуемой воды производится здесь
же на месте, тотчас после взятия пробы, во
избежание последующего размножения
микробов. Если это невыполнимо, то до анализа пробу
следует сохранять (не долее 2—3 часов) в япщке
со льдом или с охладительной смесью. Для
анализа берут 1 см3 воды или десятые и даже
сотые доли его и заражают определенный объем
мясопептонной желатины (агара) в чашках
Петри. Если нужно, делают несколько
разбавлений. Чашки оставляют при 22° и подсчет
колоний производят через 2—3 суток.
Необходимо, во всяком случае, чтобы при
сравнительных исследованиях срок выдерживания
пластинок оставался одним и тем же.
Для взятия проб с глубины применяют
аппарат Эсмарха (рис. 161) — толстостенная,
широкогорлая коническая колба, закрытая
ватной пробкой, обвернутой каучуком, и
заключенная в массивную металлическую оправу.
Стерилизованный аппарат опускают на
желаемую глубину и здесь, подняв свинцовый груз, нажимающий
каучук, наполняют аппарат водой. Затем, вновь опустив свинец.
закрывают склянку и извлекают ее на поверхность. В других
приспособлениях для той же цели на глубину опускают
стерилизованный сосуд, из которого предварительно был выкачан
воздух. На желаемой глубине оттянутый конец склянки
обламывают (аппарат Ру, рис. 162) или разбивают грузом кончик
эвакуированного баллона [аппарат Склаво-Чаплевского (Sclavo-
Czapl w ki), рис. 163], и он наполняется водой, после чего аппарат
извлекают на поверхность.
Все эти приборы пригодны для взятия проб с небольших
глубин и преимущественно в пресных водах. При микробиоло-
&2?
Рис. 161. Аппарат
Эсмарха для
взятия проб воды о
глубины.
гических исследованиях в морях или в глубоких и больших
водоемах они не пригодны. Для этой цели при морских
исследованиях были предложены діугие приборы [у нас—Исаченко,
Буткевича; за границей — ііортье (Portier) и др.)- В них так
же, как и в приборах Ру и Склаво-Чаплевского, пробы воды
заполняют эвакуированные баллоны, кончики которых на
определенной глубине отбивает груз (так называемый «почтальон»), і у-
щенный с корабля по тросу;,
и баллон заполняется быстрй
входящей в него водой.
Отбив верхний конец баллона,
можно пипеткой набрать из
него нужное количество воды
для посевов. [Приборы
Исаченко в различных
видоизменениях описаны в
Известиях Ботанического сада
и были применены при
исследованиях в Черном море
и в Арктике. Прибор
Буткевича описан в
«Микробиологии» (1932) и
применялся при исследованиях
в Арктике].
Нередко воду приходится
исследовать на содержание
в ней тех или иных
патогенных бактерий — палочки
тифа, кишечной палочки,
холерного вибриона и др. &
этом случае применяют
элективные методы для
накопления данного вида в
жидкости. Для накопления
холерных вибрионов применяют
пептонную воду (стр. 68),
а для кишечной палочки —
чаще всего среду Булира
(Bulir) (стр. 69). Нельзя,
однако, ограничиваться одними опытами накопления; для
полной уверенности необходимо более точно определить
соответственный вид, придерживаясь методики, специально
разработанной для этой цели. (См. руководства по санитарной
бактериологии).
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ
До недавнего времени бактериологическое исследование почвы
имело целью исключительно определение общего числа соде ржа-
Рис. J62. Прибор Ру Рис. 163. Аппарат
Склаво - Чаплев-
v ского.
для взятия проб
с глубины.
На желаемой глубине,
потянув веревку,
обламывают оттянутый
конец сосуда (А).
Недостаток прибора — его
ломкость.
На глубине конец труб*
ки Ь с выкачапныы вов~
духом разбивают грузом
а. Внутрь трубки тотчас
устремляется вода, и
пробку извлекают
наружу.
320
щихся в ней зародышей. Для этой ц°ли применялись обыкновенно
мясопептонные среды с агаром или желатиной. Первые
заражались поверхностно, а вторые внутрь. Неудобство первых — в
быстром зарастании поверхности агара, а вторых — в развитии
разжижающих колоний, рост которых приходится
приостанавливать прикосновением к ним палочкой ляписа.
Выдерживают пластинки продолжительное время (до 10 дней), так как
колонии некоторых видов, например столь распространенных
в почвенном слое лучистых грибов, появляются сравнительно
поздно.
Для той же цели могут служить и синтетические среды, на-
прим., агар, предложенный Липманом (Lipman) и Брауном (Brown),
следующего состава:
Водопроводной воды 1000 см5
Виноградного сахара 10 г
Пептона 0.5
Фосфорнокислого калия (КаНР04) . . . 0.5
Сернокислого магния 0.2
Агар-агара 20
Но наиболее подходящими для роста почвенных бактерий
являются среды с прибавлением почвенной вытяжки (см. стр. 63).
В своих многочисленных почвенных исследованиях Ваксман
(Waksman) пользуется агаром несколько иного состава:
Дестиллированной воды 1000 смя
Виноградного сахара 10 г
Порошка яичного альбумина 0.25
К2НР04 0.5
MgS04 0.2
Fe2(S04]3 следы
Агар-агара 15 г
Все составные части этой среды, за исключением порошка
альбумина, разводятся в кипящей воде и фильтруются. Альбумин
растирается в ступке в небольшом количестве воды, к нему
прибавляется кацля раствора фенолфталеина и децинормальный
едкий натр до яснорозового окрашивания.
Суммарный бактериологический анализ почвы,
основывающийся на числе колоний, вырастающих на обычных бульонных
средах или на синтетических средах (например, вышеприведенного
состава), может дать лишь самые общие указания для оценки
бактериальных сил почвы. Обилие бактериального населения в
почвенном слое может служить лишь самым общим указанием на
жизнь почвы и ее плодородие. Появление в значительном
количестве некоторых показательных форм может в то же время дать
и более ценные указания. Так, обилие разжижающих желатину
видов указывает на гнилостные процессы в почве и на богатство ее
азотистым органическим веществом. По большему содержанию
плесеней и лучистых грибов судят о богатстве почвы навозом и т. п.
327
За последнее время все большее значение приобретают
специальные методы определения деятельных сил почв, вызывающих
полезные или вредные для сельского хозяйства процессы:
гниение белков, нитрификацию, денитрификацию, фиксацию азота
и т. п. Такого рода анализ почвы — биохимический — является
весьма ценным дополнением к анализам
механическому и химическому.
Чтобы получить правильный ответ
относительно бактериальных сил почвы, необходимо:
1) умело взять пробу почвы так, чтобы она
соответствовала средней пробе данного участка;
2) произвести бактериологический анализ
непосредственно после взятия пробы;
3) иметь готовыми среды для засева почвой
с целью обнаружения тех или иных микробов.
Для получения средней пробы почвы из
разных мест исследуемой площади берется
возможно большее число проб так, чтобы общий вес
их достигал 5—10 кг. Хорошо перемешав эту
землю, ^прут небольшое количество ее,
протирают с іВозь мелкое сито и отвешивают
потребное для анализа количество или же
ограничиваются объемной мерой (небольшая
платиновая ложечка).
Для взятия проб из глубоких слоев почвы
применяют бурав Френкеля (Frankel) (рис. іві),
внутренняя полость которого во время бурения
остается закрытой. На нужной глубине бурав
поворачивают — полость при этом открывается
(а) и внутрь цилиндра попадает земля, затем
новым поворотом в обратную сторону закрывают внутреннюю
полость и извлекают бурав наружу. Если бактериологический
анализ почвы производится не тотчас же, а спустя некоторое
время, то количество микробов в ней может либо уменьшиться
(жирная пахотная почва), либо возрасти — и получится ответ»
не соответствующий действительности.
Рис 164. Бурав
Френкеля для
взятия проб из
глубоких слоев
почвы:
т — в открытом, Ь — в
закрытой виде.
Способ Реми (Нету)
Способ этот состоит в том, что большим количеством
исследуемой земли (10% по отношению к весу среды) заражают ряд
растворов, служащих для обнаружения химизма различных групп
бактерий. Зараженные среды ставят в термостат и, по истечении
известного времени, подвергают химическому исследованию,
чтобы определить, вызван ли тот или иной процесс. Для определения
гнилостных свойств почвы берут белковую среду и определяют
количество образовавшегося аммиака. Если исследуют азот-
фикеирующие свойства почвы, бе4у оезазотистут среду и опре-
328
деляют выигрыш азота. При испытании нитрифицирующих сил
почвы берут минеральную среду с аммонийною солью и определяют
содержание образовавшихся нитратов и т. д. Мы видим таким
образом, что для оценки почвы в бактериологическом отношении
Реми исходил ив определения не количества микробов, а
степени производимого ими действия. В этом — оригинальность его идеи.
Способ Реми не лишен, однако, и многих существенных
недостатков. Если даже согласиться с основной мыслью Реми,
видящего центр тяжести в определении деятельных сил почвы, то нельзя
не признать, что способ его не дает уверенности в том, чт"о
определенная в экспериментальных условиях активность микробов
соответствует таковой же в естественных условиях, т. е. в почвенном
слое.
Метод С. Н. Виноградского
На предварительно взвешенном стерильном часовом
стеклышке отвешивают 1 г исследуемой почвы с точностью до 0.01 г
іт помещают в стерильную пробирку (№ 1). В последнюю вносят
4 см3 стерильной дистиллированной воды, взбалтывают ее с почвой
в течение 5 мин., дают отстояться 30 сек. и затем получившуюся
взвесь переливают в пробирку для центрофугирования (№ 2).
В пробирку № 1 дважды приливают 3 см** стерильной
дистиллированной воды, встряхивают и дают отстояться 30 сек, а затем
получившиеся взвеси переносят в ту же пробирку для
центрофугирования № 2.
Осадок почвы в пробирке № 1 заливают 4 см3 стерильной
дистиллированной воды. Половина взвеси из центрофужной пробирки
№2 переносится в другую центрофужную пробирку (№ 3),
которая центрофугируется ручной центрофугой до 50, а затем до
100 оборотов. Виноградский получал таким образом 3 осадка и
3 взвеси:
Осадок № 1 — в первоначальной пробирке.
» №2 — в первой центрофужной пробирке (пробирка «N? 2).
> «N* 3 — во второй центрофужной пробирке после
центрофугирования (пробирка № 3).
Взвесь «N* 1 — в первой центрофужной пробирке (пробирка № 2).
» № 2—во второй центрофужной пробирке после 50
оборотов центрофуги (пробирка № 3).
? JV» 3—в той же пробирке после 100 оборотов рукоятки
центрофуги (пробирка № 3).
Из каждой взвеси и из каждого осадка приготовляют
препараты на определенной поверхности предметного стекла. Стекла
предметные должны быть хорошо обезжирены, для чего их моют
хромовой смесью, ополаскивают водой и помещают в банку с
чистым спиртом. На подсушенные препараты, приготовленные
из осадка, наносят каплю 1 % агара; на препараты,
приготовленные из взвеси, —0.1% агара. После нового подсушивания
препараты фиксируют 2 мин. в абсолютном спирте, а затем окра-
шивают карболовым эритрозином г при комнатной температуре
в течение 20—30 мин.
При просматривании под микроскопом приготовленных
препаратов наблюдается обычно, что наименьшее количество
микробов — в осадке , первоначальной пробирки и наибольшее —
в осадке пробирки после центрифугирования. В препаратах,
приготовленных из взвесей, наблюдается обратная картина:
наибольшее количество бактерий — в взвеси первоначальной
пробирки и наименьшее — в взвеси, центрофугируемой в 3-й
пробирке. Для определения количества микроорганизмов в почве
поступают следующим образом.
На поверхности предметного стекла вычерчивают алмазом
контур квадрата, площадью в 1 см2. Сте лышки, приготовленные
таким образом и хорошо обезжиренные, взвешивают на точных
весах, после чего на поверхность квадрата наносят петлю из
первоначальной взвеси и распределяют по всей поверхности
квадрата. По высыхании препарата стекла взвешивают вторично,
и разница в весе дает вес почвенных частиц, нанесенных на
стекло. Препарат фиксируют 2 мин. абсолютным спиртом и
окрашивают карболовым эритрозином без подогревания в течение
20—30 мин. Микроскопирование препарата производят с иммер-
зией1/і8или Via- В каждом препарате просматривают 100 полей
зрения и в каждом поле зрения подсчитывают общее количество
бактерий, а затем выводят среднее количество бактерий в 1 поле
зрения.
Зная количество почвы, нанесенное на поверхность 1 см2
и количество полей зрения, укладывающихся в 1 см2, легко
получить общее количество бактерий на 1 г исследуемой почвы.
Пример. Разница в весе при взвешивании стеклышка—
0.001 г. Площадь поля зрения = 0.05 мм2. Площадь поля зревия
высчитывают при помощи микрометрической линеечки.
Количество полей зрения, помещающихся в площади 1 см 2, =
100 ММ' оллл
п—; „ = 2000 раз.
0.05 мм- г
Среднее количество бактерий в одном поле зрения = 5.
На поверхности 1 см2 мы имеем: 5 бактерий х2000 = 10 000
бактерий. Вес почвы, нанесенной на поверхность 1 см 2 стекла, =
0.001 г. Таким образом, 0.001 г почвы содержит 10 000 бактерий,
а следовательно:
1 г почвы= 10 000 000 бактерий.
1 Приготовление карболового эритрозина*
Дестиллированной воды 100 смЗ
Фенола (карболоыая хим. чистая крист. кислота) 5 г
Эритрозина 5
330
Основной метод подсчета бактерий, предложенный С. Н. Вино-
градским, претерпел в некоторых деталях ряд изменений,
описание которых мы приводим ниже.
Видоизменение метода С. Н. Виноградского Шульгиной
Из средней пробы исследуемого образца берут 5 г почвы,
помещают в колбочку Эрленмейера емкостью в 250 см3 и
заливают 50 см3 стерильной водопроводной воды. Встряхивают
колбочку рукой в течение 5 мин. После встряхивания взвесь
отстаивают в течение 1—2 сек. Из полученной суспензии берут
0.01 см3 стерильной пипеткой и распределяют на поверхности
площади в 4 м2 предметного стекла. После подсыхания препарат
заливают раствором агара 1:1000, фиксируют абсолютным спиртом
и окрашивают карболовым эритрозином. Препарат хорошо
промывают водой, подсушивают и просматривают под микроскопом
с имерсией х/12 или Vie; Поля зрения подчитывают в шахматном
порядке в количестве 100. Подсчет бактерий производится, как
описано выше (стр. 330).
Видоизменение метода С. Н- Виноградского Степановой
На технических весах отвешивают в стерильных условиях
(как описано выше) 1 г исследуемой почвы, взятой из средней
пробы образца. Навеску помещают в стерильную сухую пробирку
и заливают 4 см3 стерильной воды.
Пробирку встряхивают рукой в течение 5 мин., затем в нее
вливают 6 см3 стерильной воды и после однократного
встряхивания суспензии дают отстояться 10 сек.; после этого на
площадь 1 см2 приготовленных заранее предметных стекол наносят
суспензию вымеренной петлей и равномерно распределяют по
всей поверхности 1 см3.
Петлю вымеряют следующим образом: 1) на аналитических
весах взвешивают сухую платиновую петлю;1 2) взвешенной
петлей берут каплю воды и снова взвешивают. Разница в весе
между первым и вторым взвешиванием дает вес суспензии,
нанесенной на поверхность 1 см 2 предметного стекла.
На каждый исследуемый образец приготовляют 4 мазка.
После того как мазки подсохли, их фиксируют абсолютным
спиртом и окрашивают карболовым эритрозином в течение 10—15 мин.
Подсчитывают 40—50 полей зрения. Расчет бактерий на 1 г почвы
производят так же, как указано выше, при описании метода
Виноградского.
Видоизменение метода С. Н. Виноградского Германовым
Германов в своей работе указывает на то, что при обработке
почвы хлористым натрием в значительной степени ослабляется
1 Точнее вымерять петлю следующим образом: на точных химических
весах взвешивается предметное стекло, затем на это стекло наносится 10 петель
воды или суспензии и снова взвешивается. Разница в весе дает вес 10 петель.
331
адсорбция бактерий коллоидами. Поэтому Германов
предлагает пользоваться следующей методикой при подсчете
количества бактерий:
«1 г исследуемой почвы обрабатывается абсолютным спиртом,
высушивается в сушильном шкафу при 70—80°, после чего
помещают на фильтр и промывают 1.0% раствором NaCl до полного
удаления Са (проба фильтра с щавелевокислым аммонием).
Затем навеску переносят в колбочку Эрленмейера и
взбалтывают в течение 10 мин. Из колбочки переносят взвесь в центро-
фужные пробирки, в которых производятся отмучивание: 1-?
отмучивание после 25 оборотов ручной центрофуги, 2-е
отмучивание после 5-минутного стояния і тех же пробирках, 3-я
фракция — осадок. Фракции доводят до определенного объема
стерильной водой и взбалтывают, после чего 0.1 см3 этой
суспензии наносят стерильной пипеткой на площадь 3 см2 предметного
стекла. Препараты высушивают в эксикаторе над серной
кислотой в парах хлороформа и толуола. Далее их окрашивают
карболовым ?ритрозином и в каждом препарате просматривают
80 полей зрения.
Подсчет бактерий в каждой отдельной фракции производится,
как указано, при описании метода Виноградского (стр. 329).
Под микроскопом просматривают все фракции: 1) в фильтрате,
2) 1-е отмучивание, 3) 2-е отмучивание, 4) в осадке».
Количество бактерий, полученное в каждой отдельной
фракции, суммируется, и получается общее количество бактерий на
1 г исследуемой почвы.
Метод Мальчевской
Мальчевская очень детально разработала метод подсчета
бактерий, пользуясь для распыления почвенных аггрегатов, подобно
Германову, способом К. К. Гедройца.
Метод Мальчевской состоит в следующем:
«1 г воздушносухой почвы, растертой в фарфоровой ступке
и просеянной через 0.5-мм сито, переносят в колбочку Эрлеп-
мейера и заливают 50 см3 дестиллированной воды. После 20-
минутного встряхивания суспензию центрофугируют в
пробирках 25 оборотами ручной центрофуги средней скорости и затем
отстаивают в течение 1 мин. Суспензию сливают в мерную
колбочку на 200 см3 и доливают стерильной водой или
стерильным раствором 0.02% желатины — в случае легко смывающихся
с предметного стекла почвенных частиц. На осадок, оставшийся
в центрофужных пробирках, снова наливают стерильную воду
в количестве 5 — 7 см3 пробирки, заткнутые пробками, сильно
встряхивают до тех пор, пока осадок не перемешается с
водой. Смесь центрофугируют несколькими десятками оборотов и
вливают в другую мерную колбу после 6-минутного
отстаивания (2-я фракция). В пробирки наливают стерильную воду
332
и встряхивают ее до тех пор, пока взвесь над осадком не станет
совсем прозрачной.
3-ю фракцию смывают в 3-ю мерную колбу и также доливают
водой до метки. На предметное стекло, приготовленное, как
описано выше, наносят алмазным карандашом контур площадки
1 см3 и порядковый номер. Стекла просушивают над пламенем
горелки. Для получения однородно горизонтальных мазков
пользуются горизонтальным столиком, установленным с помощью
уровня. Колбы тщательно взбалтывают в течение 1 мин., из
полученной взвеси берут градуированной пипеткой 0 02 см3 и
выжимают быстро на середину квадратика в 1 см2. Тотчас же
легким прикосновением платиновой иглы каплю доводят до
углов квадратика, но отнюдь не размазывают. Высушенные
мазки фиксируют под стеклянным колоколом в парах
формалина, окрашивают 5% раствором карболового эритрозина. Краску
с мазков смывают опусканием в горизонтальном положении
предметных стекол в несколько банок с водой. В каждом
препарате подсчитывают до 20 полей зрения. Подсчет бактерий в
каждой отдельной фракции производят, как указано при
описании метода Вино градского.
Почвы, в которых адсорбция бактерий очень значительна,
обрабатывают NaCl. 1 г почвы помещают на фильтр и промывают
1.0% норм, стерильным раствором до тех пор, пока не исчезнет
реакция на Са в фильтрате (щавелевокислым аммонием), после
чего фильтр прорывают и осадок переводят в орленмейеровскую
колбу, в которой идет обработка обычным методом. Фильтр
промывают стерильной водой с 0.00С4 норм. NaOH. Промывные
воды прибавляют к содержимому эрленмейеровской колбы.
Промытый фильтр погружают в мерную колбу со стерильной водой,
встряхивают, после чего берут мазок для подсчета бактерий,
оставшихся на фильтре. Кроме того делают подсчет бактерий на
нескольких фильтрах из той пачки, из которой был взят фильтр».
Для учета общего количества бактерий в почве — количества
бактерий, полученные в отдельных фракциях, суммируют.
Метод Разумова
Метод проращивания был применен впервые Разумовым для
выявления Azotobacter. В настоящее время он употребляется
для выявления не только Azotobacter, но и других
физиологических групп бактерий, и заключается в следующем:
1 г почвы отвешивают в стерильной пробирке и взбалтывают
в течение 3 мин. с 10 см3 стерильной воды. После 1-минутного
отстаивания берут 1 см3 суспензии и смешивают с 4 см3
стерильной плотной питательной среды, после чего 0.05 см3 этой
среды наносят на площадь 4 —6 см2 предметного стекла и
равномерно на ней распределяют. Предметные стекла с подсушенными
мазками помещают во влажной стерильной камере в термостат
333
(при температуре 28—30°) на определенный срок. Срок
проращивания устанавливают отдельно для каждой группы бактерий. По
окончании опыта мазки фиксируют абсолютным спиртом,
окрашивают 5% карболовым эритрозином и просматривают под
микроскопом.
Таким образом удается учесть живые бактерии,
развивающиеся на данной питательной среде.
Метод Холодного
Для качественной характеристики микрофлоры почвы и
определения относительной густоты населения почвы Холодный,
видоизменив метод Росси, предложил следующий метод (метод
пластинок).
На ровной поверхности почвы делают перпендикулярный
к поверхности глубокий разрез острым ножом. В этот разрез
вставляют чистое предметное стекло так, чтобы длинная сторона
стекла была параллельна поверхности почвы, и не превышала
ее. Сверху разрез закрывают почвой или листьями. Место, где
заделано стекло, отмечают вставленными палочками с двух
сторон стекла. На палочке обозначают дату ' номер опыта.
Стекло оставляют на 3 недели х в почве, после чего с одной
стороны стекла почву удаляют очень осторожно ножом (чтобы
не задеть стекла). В образовавшуюся ямку стекло быстро
откидывают и вынимают. Исследуют под микроскопом ту
сторону стекла, которая не обращена к ямке. Обратную же сторону
вытирают тряпочкой, высушивают на воздухе и укладывают
в папку для препаратов. В лаборатории стекло фиксируют над
пламенем спиртовой горелки, после чего его помещают в банку
с водой так, чтобы сторона стекла, которую будут исследовать,
была обращена книзу. Большие частицы почвы, прилепившиеся
к предметному стеклу, падают на дно сосуда. Затем стекло
промывают под водопроводным краном и дестиллированной водой.
После промывания препарат окрашивают карболовым
эритрозином в течение 30 мин. при комнатной температуре, хорошо
промывают дистиллированной водой и сушат под стеклянным колпаком.
Приготовленный таким образом препарат помещают на подвижной
столик микроскопа и просматривают с иммерсией г/12 или 1/1ь.
Кроме того, Холодный пользуется методом пластинок для
изучения микробов, разлагающих клетчатку. Он помещал для
этого кусочки фильтровальной бумаги на предметные стекла
и зарывал их в почву. Через 2 месяца фильтровальная бумага
на некоторых стеклах была совершенно разрушена. При микро-
скопировании препарата наблюдались в них волокна клетчатки,
сплошь покрытые бактериями или переплетенными гифами
грибов. Таким образом, удается наблюдать разложение клетчатки
в естественных условиях.
1 В настоящее время закладывание стекол производится на менее
продолжительный срок,
:і34
Метод Конна
Этот метод отличается от метода Холодного только тем,,
что закладывание предметных стекол производится в почву,
которая помещена в лаборатории в банки или в большие
химические стаканы.
Метод Крючковой
Крючкова внесла в метод Холодного следующие изменения;
предметные стекла, как и по методу Холодного, закладывают
в почву. По окончании опыта их вынимают, высушивают на воздухе,
освобождают от крупных почвенных частиц и заливают
питательным агаром различных сред. Культивируют во влажной
камере в термостате. Срок проращивания устанавливается
отдельно для каждой группы микроорганизмов. По окончании
опыта стекло подсушивают, фиксируют абсолютным спиртом
и красят карболовым эритрозином при комнатной температуре
30 мин.
Подсчет выросших колоний производят на площади 1 см2
под лупой или, в случае очень мелкихчколоний, под микроскопом
с малым увеличением (объектив № 3). В последнем случае
подсчет ведется по методу Виноградского.
Определение гнилостных свойств почвы.
10 г земли засеивают 100 см3 1% раствора пептона, налитого в
эрленмейеровскую колбу. Из двух колб одну сохраняют при
20° Ц 4 дня, а другую — 8 дней, после чего жидкость
анализируют: в 25 см3 фильтрата определяют количество аммиака
отгонкой с обожженной магнезией (Magnesia usta). Чем больше
отщеплено аммиака, тем энергичнее шел гнилостный процесс.
Описанный способ был несколько видоизменен впоследствии
самим Реми. 50 г земли он прибавлял к 250 мм3
физиологического раствора поваренной соли, стерилизованного вместе с
стеклянными бусами, и встряхивал в течение 5 мин. 10 см3
полученной таким образом взвеси он прибавлял для заражения к
100 см3 1% раствора пептона.
Впоследствии Реми брал гораздо меньшие количества земли
для заражения (0.1—0.5%), а в качестве азотистого вещества
не пептон, а желатину. Он пользовался средой состава:
Чистой желатины 1 г
Фосфорнодвукалиевой соли 0.1
Сернокислого магния 0.1
Углекислого натрия 0.1
Эти составные части растворяют в 100 см3"* стерилизованной
водной вытяжки из 10 г исследуемой почвы. Если вытяжка
обладает кислой реакцией, ее усредняют. Опыт в этом случае длится
7—8 суток.
Разложение мочевины. Употребляется 5—10%
раствор мочевины в обыкновенном мясном бульоне, не
содержащем пептона. Заражают 10 % земли и оставляют при 20°. Через
335
каждые 2 дня в течение 10 дней жидкость титруют г/10—г/м
нормальной серной кислотой и на основании полученных данных
рассчитывают процент разложенной мочевины.
Нитрификация. Состав среды и условия постановки
опыта —см. стр. 181. Вместо двух опытов (для 1-й и 2-й фаз
нитрификации) можно ставить один с жидкостью для нитроз-
ного организма, так как образующаяся азотистая кислота
окисляется дальше до азотной кислоты. Об энергии нитрификации
судят по количеству образующейся азотной кислоты после
месячного сохранения культуры.
Де нитрификация. В качестве среды употребляют
раствор Гилътая (Giltay) (стр. 193) или же, как рекомендует
Леыис (Lohnis), почвенную вытяжку (стр. 63) с 0.2% азотно-
калиевой соли и 1% виноградного сахара. Бартель советует
повысить содержание селитры до 0.3%, так как тогда время
разложения ее в процессе денитрификрцги более растягивается,
и разниці между отдельными почвамг выступает резче.
Заражение —10% земли. Температура —20°. Условие
процесса — см. стр. 193.
Фиксация азота. Определяют обычно азотусвояю-
щую силу в аэробных условиях на маннитной среде Бейеринка
(стр. 196) в присутствии 0.5% мела. Сосудами служат эрленмей-
еровские колбы или колбы Виноградского. Суждение об азото-
фиксирующей силе почвы составляют на основании
сравнительного определения азота в зараженной и контрольной колбе.
Разложение клетчатки (по Христенсену). В
?рленмейеровскую колбу, емкостью в 300 см3, насыпают
количество земли, соответствующее 50 г сухой почвы. Землю эту
распределяют на дне колбы таким образом, чтобы она
равномерно покрыла 4/в площади дна. В оставшуюся свободной часть
дна колбы осторожно приливают из пипетки дестиллированную
воду, быстро всасываемую землей. Избытка воды следует
избегать. На поверхность земли затем накладывают 2 полоски чистой
фильтровальной бумаги размером 5 х 30 мм и плотно
прижимают к земле стеклянной палочкой. Колбу оставляют при 25°,
следя за тем, чтобы бумага и земля не высыхали. Каждые два
дня отмечают степень разложения бумаги.
Выделение углекислого газа. Значение этого
определения для оценки бактериальных сил почвы сомнительно,
так как углекислый газ может образоваться в результате н?
только биологических, но и чисто химических процессов.
Бродильная способность почвы.
Исследуемой землей заражают раствор:
Дестиллированной воды 1000 см8
Виноградного сахара 40 г
Пептона 1
Фосфорнодвукали?вой соли 0.5
ззв
Жидкость наливают в колбу, заражают 10% земли и ставят
при 20—25° Ц. Об энергии брожения судят по потере в весе сосуда.
Пригодны для этого определения колбы, снабженные затвором
Мейсоля для поглощения влажности (рис. 163).
Так как в способе Реми, при обильном заражении землей,
состав среды претерпевает значительное изменение в зависимости
от химических особенностей исследуемого образца земли, то Хри-
стенсен, ?келая отдельно выяснить влияние этого фактора,
предложил в способ Реми ввести контрольное испытание. Оно состоит
в засеве контрольной колбочки не только
землей, но и культурой специфического микроба,
химическое действие которого желательно
обнаружить. Это дает возможность определить
угнетающее или благоприятствующее влияние
химических составных частей почвы на течение
специфического процесса, независимо от
содержания в самой почве соответственных агентов.
Если при данной постановке опыта
специфический процесс связывания свободного азота,
нитрификация и т. п. не происходит, то с
уверенностью можно сказать, что причиной этого
служит состав почвы или ее реакция.
Видоизменение способа Реми (по Фишеру,
Фогелю, Коху и др.)
Сущность его заключается в том, что
прибавляют не землю к соответственному
питательному раствору, а наоборот — последним
смачивают землю. При такой постановке опыта,
как полагают авторы, химическая деятельность
микробов протекает в условиях более близких к
естественным. Способ этот, однако, связан с
большими техническими затруднениями при
химическом контроле действия микробов.
Метод Гильтпсра—Штермера (Hiltner — StBrmer)
Метод этот основан на ином принципе, чем способ Реми.
Заражая питательный раствор, содержащий вещество, на которое
Направлено химическое действие специфических микробов,
постепенно уменьшающимися количествами исследуемой земли, авторы
определяли, при каком наименьшем количестве земли еще
вызывается характерный процесс. Чем меньшей дозой вызывается
процесс, тем, очевидно, больше в исследуемой почве специфических
возбудителей его.
Удача этого метода, как и метода Реми, в значительной мере
зависит от выбора подходящей среды для соответственного про-
22 Руководство по микробиология 337
Рис. 165. Эрлен-
мейероЕіская колба
с затвором Meficc-
ля и вентилем
Бунзена
цесса. Получаемый количественный учет содержания в почве
характерных групп микробов, как и в способе Реми, не свободен от
возражений и едва ли может претендовать на особую точность.
Методы выделения и количественного учета миколитичсских
микробов
Методы выделения
Метод почвенных комочков. В чашках Петри
на 1% картофельном агаре (или на другой среде, в зависимости от*
гриба) выращивается гриб. После того как поверхность агара
покроется мицелием, на него наносят маленькие комочки
исследуемой увлажненной почвы. Чашки ставят во влажную камеру в
термостат при 25—30° Ц. В большинстве случаев вокруг почвенных
комочков через 3—15 дней (в зависимости от почвы) начинается
растворение гриба. Зона растворений постепенно увеличивается.
Наконец, агаровая пластинка становится совершенно обнаженной.
На некотором удалении от комочков почвы из зоны
растворившегося гриба можно на обычных средах выделить бактерии,
способные к лизису не только при перенесении их с гриба на гриб, но
и после культивирования на искусственных питательных средах
вне связи с грибом. Правда, во втором случае наблюдается иногда
значительное понижение или даже утрата миколитической
способности.
Картофельный агар готовят следующим образом:
Очищенного картофеля 200 г
Агара 10
Воды водопроводной 1000 см3
Навеску очищенного картофеля нарезают ломтиками и
заливают водой. Кипятят 30 мин., доливают воду до первоначального
объема, отфильтровывают через полотно, кладут 1% агара и
стерилизуют.
Метод почвенных пластинок. Гриб
выращивается в жидкой питательной среде; когда разовьется мицелий,
среда сливается и мицелий промывается водой. Промытый
мицелий из колбы переносится на поверхность почвы в ч*ашку Коха.
Толщина слоя такого мицелия достигает 5 мм и больше.
В некоторых случаях (в зависимости от почвы) масса мицелия
с поверхности покрывается обильным пушком воздушных гиф.
Наблюдается слабое развитие мицелия и на поверхности почвы.
В других случаях мицелий, как бы ни была велика его масса,
совершенно не проявляет признаков роста. Со временем толстый
слой грибной массы постепенно превращается в тонкую
стекловидную пластинку, а через месяц на поверхности почвы совсем
невозможно обнаружить видимых следов мицелия.
Лизис, как правило, начинается от почвы с нижней поверхности
мицелия и через 3—5 дней доходит до верхней поверхности. В это
338
время на поверхности мицелия появляются специфические
бактерии, которые пронизывают всю его толщу и производят
интенсивный лизис гиф. В препаратах из такого мицелия под
микроскопом можно видеть только пустые оболочки гиф гриба и массу
бактерий. G появлением первых признаков лизиса (3—5 дней)
с поверхности мицелия производится выделение бактерий
обычным способом. Выделенные бактерии испытываются на
способность вызывать лизис гриба.
Количественный учет
Из навески почвы, например 1 г, готовится ряд разведений.
1 см3 соответствующего разведения вносится в пробирку с 5—-7-
суточной культурой гриба на жидкой среде. Средой для гриба
служит обычным образом приготовленная почвенная вытяжка.
Пробирки после засева почвенных разведений выдерживаются
в термостате при 25—30°Ц 10—15 дней. В течение этого времени
в пробирках, куда попали миколитические бактерии, мицелий
совершенно растворяется; там, куда они не попали, мицелий
остается нормальным. В процессе лизиса мицелий исчезает полностью
или свертывается в компактный маленький побуревший комочек,
состоящий из скопления бактерий и обрывков гиф, который при
легком встряхивании распадается на мелкие хлопья. Титр мико-
литических бактерий определяется по пробиркам, зараженным
наибольшими разведениями почвы, вызвавшими лизис гриба.
Подсчет производится на 1 г абсолютно сухой почвы.
Например, в ряде последовательных разведений лизис гриба наступил
в пробирках со всеми разведениями до Ю-6, а в 10~в лизиса
уже нет. Значит, количество миколитических бактерий в 1 г
взятой почвы —10ь. На каждое разведение берется по 2—3 пробирки
жидкой культурьГ гриба.
Метод испытан, главным образом, на нескольких видах Fusa-
rium. При работе с другими грибами, возможно, потребуется
почвенную вытяжку заменить другой средой.
22*
ПРИЛОЖЕНИЕ
В соответствии с планом руководства, в основу которого
положен химический контроль микробного процесса, автор дает в
приложении описание главнейших приемов химического анализа,
главным образом органических веществ, чаще всего встречающихся
при микробиологических работах.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА ПО ЕЬТЗЛЬДАЛЮ (KJEbJOAHL)
Способ основан на сжигании органического вещества крепкой
серной кислотой. При этом углерод сжигается до С02, водород
до Н20, а азот переходит в аммиак; сама же серная кислота
частично восстанавливается в S03. Образовавшийся аммиак затем
вытесняют щелочью и перегоняют в титрованный раствор серной
кислоты.
Для определения берут около 2 г вещества — больше или
меньше см тря по содержанию азота. В основу р&счета кладут
содержание 0.2—0.3 г белкового вещества в навеске. Если желательно
определить азот в осадке, то после отцеживания и высушивания
его сжигают серной кислотой вместе с фильтром. Для определения
азота в растворе отмеренный объем жидкости, после подкисления
серной кислотой, выпаривают досуха в служащей для сжигания
колбочке из тугоплавкого стекла, закрытой стеклянным затвором,
• а остаток сжигают.
Серная кислота,употребляемая для сжигания, не должна
содержать соединений азота. Для ускорения сжигания Гуннинг
и Альтенберг (Gunning u. Altenberg) прибавляют к 20 см3
серной кисл >ты 1 г металлической ртути и 15—18 сернокалиевой
соли (Kalium sulfuricum z. Analyse nach Kpldahl). Для той же
цели к серной кислоте прибавляют иногда 10% серного ангидрида
(Acidum sulfuricum arhydricum) или 20% фосфорного ангидрида
(Ac. phosphori 'um anhydricum).
Вначале нагревание ведут умеренно; когда же станет
выделяться сернистый газ, пускают полное пламя. Почерневшая от
серной кислиты жидкость при сжигании постепенно
обесцвечивается. Если не удастся достигнуть полного обесцвечивания,
то к жидкости прибавляют несколько кристаллов
минерально
ного хамелеона КМп04. Без особой надобности этого делать не
следует.
Для отгонки алімттака служит полутора-двухлитровая кругло-
донная или эрленмейеровская колба из тугоплавкого стекла.
В нее налипают 100 см3 чистой, не содержащей азотных
соединений дестиллированной воды. Затем туда же вливают содержимое
колбочки. Для многократного ополаскивания последней служат
150 см3 дестиллированной воды, причем промывные воды сливают
в ту же перегонную колбу. Сначала приливают лишь 3—5 смя
воды, особенно если сжигание производят со ртутью; при
прилитии сразу большого количества осадок на дне колбы плохо
отстает от стекла. Когда в перегонную колбу влиты последние
порции промывной воды, туда же прибавляют несколько капель
раствора фенолфталеина и, для более спокойного кипения, чайную
ложку талька или цинковой пыли. Не мешает опустить в жидкость
несколько запаянных с одного конца капилляров, длиной в 15—
20 см.
Нейтрализация кислоты и подщелочение жидкости
производятся 40% раствором едкого натра или едкого калия. С
последним кипячение протекает несколько спокойнее. Количество
щелочи, потребной для подщелочения 20 см3 кислоты,
определяют предварительным опытом.
Если сжигание производилось в присутствии ртути, то к
жидкости прнбагляют несколько граммов тиосульфата натрия
или 7—8 см3 10% раствора сернистого калия (K2S).
Щелочь и сернистый калий вливают в закрытую каучуковой
пробкой колбу через особую воронку скрапом. Перегонная колба
соединена стеклянной трубкой, проходящей через холодильник,
с приемником, в котором находятся 20—35 см3 ~ или -
H2S04. Приемником служит трубка Пелиго или небольшая
эрленмейеровская колбочка. В последнем случае отводную трубку
опускают в жидкость.
Перегонку заканчивают, когда отогнано больше половины
жидкости. Дестиллят иногда получается мутный от перехода
в него избытка серы. г
Серную кислоту титруют — или -- NaOH в присутствии
раствора лакмоида с малахитовой зеленью. Для приготовления этого
индикатора 10 г тонко истертого лакмоида растворяют в 150 см3
этилового спирта, отфильтровывают и к фильтрату прибавляют
10—15 см3 2% спиртового раствора малахитовой зелени (Маіа-
chitgrim), после чего раствор вторично отфильтровывают./
1 Что'ы избежать этого, сернисты^ калий прибавляют к жидкости до
ощелочения ее и кипятят для удаления сероно города в течение 10—15 мин.
Кипячение прекращают, когда появится запах сернистою rada. Дав
жидкости остынуть, подщелачивают ее и перегоняют.
&41
гс
а
х
сб
ЕГ
О
S
S
О*
С
а> 2
о я
х х
х-?
Н S
ft.
сб
ГС
о,
Хо
о
с
н
О S
« s
о
с
03
3
о
Он
аз
CD
ft.
a
с
3
f-
X
cd
о
Ok
і сб
О И
и >>
X ft
G. U
X -
О -
к
S
кг
Л
ф
1 >
56 ч
* х
о ее
s g
со Я
К ?
я
о
^^
О CD
? л
аз 2
ч
и
S
2 2
гс
яг ™
р.
S
сб Ф
ft
о
з
X
со
3
ч
о
о
х н
Е- та
3 3
со S
S
х ч
ч о
CD О
VO
>>
о о
Р-Я
s«
ft* a
С м
О) X S Я
со О cd *s
fct Н о X сб
ш
о
и
о
я
3
CD
\о
О
о
о
ГС
a
В"
. X
CD со
¦О Ш
ft.
>>0 ft.CC Р
- х о х S
оЙНх
ft-гі Xg
cd о
X
ч
с
ей сб
X 0_
CD
ft-o
О
и- <Ь
Ч О
О
Ф
X сб
сб О
С Н
и о
СО Д
CD
xw
rt -
ст_ со
ГС
О
СО
- ft. ^
о х
дни
х ю и
ЕС
X
X
а»
X
Я
«
о
о
<D
3
и
5
X -_
сз ?
• ° х
S 5 g
5-»е*х
О ft.
ft. У Ф
с и
CD О
<D X О
X
го
Сб
ft.
X
X
о
О
X
сб о
W
CD
X"
х х ,5г7 s
Ч О КЮ сс
CD сб ft- X Q,
ь P.CU t,
X сб
гб X >*
ь- о fti
со сС >4
fee а. ft.
х
со <в
6- О
CD CD О
о. gw
X
a
х
сб
X
X
cd a
щ
?- СО
CD
>> со
S 3
Я ft-л я о
О О ° CD X
п х х я дз
а ь к Ч
Й х cd о
Ч X
о о
g CD » СО
СО
• Я
CD О
Q.C-
О с;
х 5
н~
%^
го
ft.
И
t- —t
гс ч
S 2
а, >»
3
X
сб
0J
«0ц
РЗ
Ч" Сб
Я
X «
н о
аМ
а .«и
IS і §-
о= я * в
Й О
X ^»
>а О
X о
03
ft
О
X
н
о
И ей
о н
с|
^ а
х ?
CD
ч
о
ГС
— х
о
ГС >>
а ^
а ®
X о
g ч
CQ X
О
X
ГС
сб
а
я
а>
Ч
о
S
X
о
ч
3
ч
гс «
с s
CD
CD О
3 И
я о
сб Н
О го
СС 47*
ftS
№ О
S
tt
CD
ft-
PQ
Ч
О
a
ч °
о
CD Ч
О О)
CQ VO
03
о
^^
О |
«8
О X
°9
Ф X
s Я
X
О о
S aS
§х g
СО У <D
о сб a
о, Я х"
сс к
х о
о 3
О to
со
р^а
ft
о t-
S 2
о g
сб Ч
ю
ft
с
о
X
о
со
CD
Я
X
CD X
-г ч
О О
X
а
CD
к о
4 ч
Я О
о я
05 сб
О
я
и
я о
яю
О Я
5и
р- 6 g
а х |
g CD О.
Э О О
Я 2 П
S CD Н
ГС >^0
ft. И сб
&- CD PU
сб
ft.
о
X
ft н
а о
X
о
CD
гс 2
а °
.2
Ч ш
X
о
к
к
а
Я
2
>> CD
і Н
Я S
s ft-
2Д.
г*
X
CD
ч
X
о о
X X
сб
^сб^О О
О4--.© в
<^с> Я
" о
\о
й щ я
сб з; О
ft^ ft.
о
6 х •
Н Я S
2 ^^ я
ft-ftb a
s К н
X
гс
сб
О Ф Ж
о. о Ч
ft-йнЙ
^» —
а
W
CD >-<
о X
X «
о о-
сб Я
Р- О
X
О <и
я о
ft X
&а
ч
3
о
сб
ft,
X
сб
S х
X О
S ЕС
—" Сб
о
CD О
СС X
сб Я
X О
ч н
? х
со ^
?*§
х н
^ 2
сб
ЛгКл
х и
о
сб
§S|?
ft. Я
ч
о х
ft
гс S
>^ -
О о
о
К X сб CD
ft- CD Й
с ft. a
tr Ч
a a
а сб1-
X X .
Сб нО
И - Н
CD ГС О
ft, О о
t- m X
gig
9 a ?
"в
TJ Сб
з а, я
ftiX ев
я о о
СЗ Сб fL,
м a ?>
s; 5 *
? Эта
х I S
1 х 5
S *• °
ч к о
о сб a
PL щ
О В ф
ft-a, a
С fc- Я
&.S
CD
н х
2 s
ГС О
ft-X
о с
X о
Р- га
М сб
О я
г °
CD -•f
х —'
н ^
о
CD
ЕГ
a
ч
о
X
>>С5
« ч
о о
ч
о я -
X о, аз
С 2-
X
сб
И
я
сб
я s
CD
СС пЗ
Ч со
сб
>> хг х о
(-
о
tt
о
я
S
о
Я со
Ч vo
а о
S-*
с о
^5
GJ О
SP X
W
Ч Ь
о 2
О сб
X X
сб ft- Н
о со о
о о о
w ft-X
ОСЫ
a
2
сб 2
к
о
ffl X >»
X
X «J
s 5 я
го S н
о я Я
ft.<D Я
3
Я G
о о
4z2
ч^:
к?
34^
еб
я
о
о <и
я с
Я Я
ее
о
н
"Т
к
ч
родо
С
я
Р,
Ф
к
ч
гг
о
В
я
еван
а>
Я
я
сб
я
Э
со
Р.
о
рое
р.>.
?н
о
1 f
к я
о о
ь
а>
ее X
Я *
со
я к
ОС
!?«>.
я «я -
с
к
ь Ф Я
TJ О
и: р.
я я я
гз -в ^
и со \о
tt _ Я
о я
= ^ s
2 я
я ч w
я . -.
т; >»ч
Ю>в< Я
Quft
о— 5
с^ ?
ХЯ
г-
* Е:Я
се ф ф
Я Я П
S Я О
ю к %
я ^
Э стГ
еб х
P. jq
Я Ч
о о
¦— н
я
55 Э
с 5
Я я
г >>
>> сг
а, ев
f- о гг
„ й ш
2 ? я
о я «
со Я <
О
н
с
S
и
Я а
Ф Р.
S
о
я
ф
Е^ га
Ч
о
CD
Е-
Р- О
0J
3
н
" О
Ч
Я si
О
я о
я
я
о
J-4
А
ГО
Р
о
° ?
1=5 2
я a-
О пз
сб Q.
р-»о
о
Ф о
а ч к
Е-
О
с;
о
я
о2
я >>
я Д.
Я
О еі
5я
га •
go
я ^
coU
Я Я
Й о
S со
Я Q.
Я о
CD m
Ч ™
Я -і
? сб
О Я
Я
° ч
о Л
Ю СС
Сч
и я
ч
е- аі
2 й
сб сб
а
Я ь
н
сО О
к
«Is
s 5 »
« і- Сб
^ о
о
ю
сб
го
сб
о '
к
«
я
й
я .
О сб О
С- ffl CQ
сб
» 1 I
>,о я
г^ а, н
оья
ц Я ^
- д й
« я
Я j- сб
сб * о
Я f. Н
Й ? я
5 ь ь
8g х
«- о a
К Я сб
сб Я со д
Ф Я Я Я
л я о -
fr
я
со
¦? ^* *¦*
ф Р- О
ЕГ Я Q-
сЗ О
с я
я
о
?-, -
«Я
Ф
О
а
о
О Ф
ч я
о я
Я с«/
е Е
я
CD
S і
со (=1
Я в
я13
ф °
О Ч
S" со О,
о о •-
в си ф
3L
ф
о
со
о
Е-
Ф
О
я
е
я
я
сб
И
Я
a
си
о
СО И
си S
л о
>iU Ф
w я
с_> я
ф Я
сб 3
сб к^ СО
я
я
Й § 6
6
Ля5
s S S
О S ей
С Я о
Я 2Г
3
S И
я
я
р
Is
сб
°-я
я р
о о
о
я
ф 5
га
ф
к
о
ч
я
2
свес я
Эч
а? аэ
Я о
я? о
с^ t
Ф *-} V"
Ft
Сч cj»
§ И С!
СЦ Ф Ч
ОнО
U CJ
Ф '
ч
о к с
я о
с о
Н Он
2 Й ю
Ч Ч сб
Ф Ф CL
АО Ь
— я
W CQ J3
&.« ч
Ф Ш О
со а, к
Е- Я о
§s
о
о
н со,
я о
н о
к
Is
щ ?5
о я
о 2
И и
U о
а
н
я « о
я о я
я г^х,
Я ад
о a
я к
f-« CD
ф
Д cj
я
га я
Я v р, Я ^
ч ° * s
о &Я Эв
с ft ь л ф
2 ^ ч
с- ? К ° °
Э о * 3 н
я о р о
S^ я о «
&Я ф >,s
я я о о ч
Рч
я я
о
я
Я"
я
сб
ф
Е-»
я °
»8
О о
К я
Б 1
Я 1
^^
сб
я ©
« a
<и Я
* CD
р-ь
И Я
Б,
сб К
^ я
я
? ч «
сб^
О ¦
Я «S
я о
Ф Е-1
Р, О
х ч я
о о
ф
о
я я
СС Я
Я сб
Р,
« Я
Я эЯ
Я о
S Я
a
сб
Р.
Я
О
ф
о
ч
ф
Й
Я о
Р-Я^
к
vo
от
Я
Я
я
я
р- 2,
> я
о со
Я VO
4 ч 2
к ° ч
5 гс S
Я О *
Ф Я
Р* со
'А Я
к
к: я
QJ Сб
ч я .
я rt*^
в S? g
я ^2
ф _^ **
р-^я
Й сб
*св"
р, р,
О О
R
ев
X
Я
(V*
Сн
•ч-"
нЧ
. ,
vr>
Гб
н
О
Ч
CJ
Я
tf,
sx
Сб
Я
Я о
Ф
S
я
р.
я.
go
я g-®
н о о
со -—--—
Ф
Я
я
сб
0*
К g
еб Я
Я Я
Е- Я
О ф
2 &
Сб 5?
5С2
еб еб
я а,
Я сб
? Я
S
еб о
Р. К
о р?
щ Ф
О Я
еб Ч
Р Я
ее , о Я , .
^в< Ч Р Й сб
о о е м н
- я * ч
Я щ
"г* Я
л Я
О о
О о
S Я Я
сб С К
Ф О ф -
и о g Я © a
О CA СО о Я
Я Е- Я g Н Я
ffl ^SclSS
Й я 2 я S g
о Й 2. я *§« 5
о
СП
Я
ф Ф 0
Р « ГО О
Си
О Е- Я Я
5- н р „
Я Ен Я
сб
>>я ,
О ей і«
*ч S CD Я
р а,-р я
^ Г^ сб
ьа
сб ,
сг ф
Я --ч
S s 2
1-3 "s
р. ?і О
с ф н
Ч ^ і-*
о
я
05
=3 Л S ^
^ о g я
р.
я
^^?
к
PS
я
го
о
2
В
Р.
С
Ф ?
о я
Р. я
ф CQ
с я
х а
й
К о
о
в
и s
Я о
° Р.
3
В
Я
Е->
Я
ев
Ф
і ГО
Ф Д
га ц
Л ft,
ft. t.
О 2
к
КЗ
Я"
В
Л
о
go
с
ее
09
к
ч
о
Е-
$ ля
53 о а
р Ф
О Ч
н rt Я
О ft. ГО
2 «=>
s a a
о
о
о
и о-Ч
О С
о
и
а
ч
ГО ¦*
ЧО
о со
а Л
©
о
а
о
аз
ft.
а
о
РЗ
о
а
а
Он
го
а
о,
А «в
я=*« а
о§
а
ф «з
о а
со ^
ф
а *з
¦ о
ф
ч «
ф
я ? сЗ о u
ч а >&я
а
а
о
ч
го
5?
В
а
я
реак
ф
н
ф
го
н
3
в*
О
я
о
*Х
ге
я
X
ен;
я
CJ
к
о.
>?<
го"
а
а
ч
о
а
г
а
Я"
а «
« о
8,3
а ч
а °<
го >>
а >?<
ГО ф
^ а
Во.
с а
си°
е- ?
? 3 ю
^§«
© 2 3
юкн
©ар;
о ф
° г
Sea н
^ о ф
г1? я а
? и
?*3 О
Я Ф К
.Ой
§я"«
а ~
я go
ф ил
« го
§ «^
ш Я
а
Я«
ft-S
о а
^ 2
о а
а я
3 я
н р.
2 к
4 я
a
a a
. о
ф 2 •
о я ?
„ ф 2
a h ч
Ч S
re Я
? -
4 X
a ro
a ft-
a o
ro д
a o
i—f
и
к
* S
я ю
ет
Я
a
о
я
о
н
ф
го
« •
о
о
я
a
я
го
го ..
-1
°.s
'^ a
ф к
го л
Е? Я
Ф К С
&. р^а.
Р-Я
Р- -
к - к
«¦Его
я ? я
а а сз
PS О Ф
? * °
a >s
го я
a
я
ф
ЕГ
О
ГО Ш
„ Я1
л Я
5 о
й а.
я **
Я S.
^^!
С cd
х 2
ГО Ч
я ё
° 5
е- a
я н
о
н
ф ф
а о
S s
CD ^^
4
о
я
e
я я^
о a
ro ч
о- о
a a
о
ИГ
л
ч
о
a
ф
о
я
о
ей
а.
го
а,
a
о
ф
о
я
о
ей
а*
а ф
2 я
Е я
Е ГО
ф я
Ь я
о
я
Q-
ф
В*
я
^ Я
CD Ч
го я
>>
Ч со
G а,
>—• a
а о
и w
го
sg
«3
Ф Й
я л
го
я
и*
я
a
о
го го
а. ^
a ro
о a
я
я
го
CQ
S
Э
го
о я
о °
Н Ф
о ф
в я
О- О
ф
о
Н Ф
и я
из 2
о го
S *
Ф Я
>эЧ
н я
Ф О.
5е
я
н
о го
го со
я
Я* «J
Ч с^
я §
а ^я
го ^^
а ^^
^ го
оа
а и
а го
•^ о
а и
о
я
я
о
о ф
о о
в
а
s ч
Ф О
?- Ю
О
г?
а
g-5
Ф Н
ft. О
а ч
го
а
ч
со Я
ф
? 2
?1
о.
я
Ф О
а о
ф л
I 2
м Я Я
S ft, О
ей Ф Ч
о я
я
а
ч
го
со м
а о
^* s
го
а
ч
а, ф
а
зЯ
Ф
Я
X
о а
о
в
S
ф я
я о
я
го
а
Я
я
О. О
и а
я
я fc
ф л
О га
Я ft*
а а
я о
а
я
ф
я
я
ф
о
я
о
о w-«
Р a -
Ф С
ГО да
ft-S
? s
еэ
о a
го ч
о. о
ю
ф
о го
а я
^^
й
?*> ф
я SC с ч н
н
я
я
я
я
X
я
и
о
о
с-
о
ч
о
я
го
ь
го
я
о
и
о
a
«
ф
s
о
я
н
3
ф ф
и
ф О
ч
о
о
я
н
я
н
я
я
а ю
2
S го
Я Ф
а я
а с
Ч a
о го
а а»
о >--
I 5 a
й 8 ф *
Р-ГО К ч
Я я ГО о
я • а я
чО о, ф
со я о
ft.
«
3
a
о
a
я
го
Я
Рн
Ф
О
я ft-cc
a « го
ь- >^ a
crop
о о G
ft.
Я"
н
о
ч
о
я
Ф к
ft.*
го
X
х&
я 3tq
я gW
о*зО
о о^5
ft- Я h-i
С SO
к
№ Я
ф ГО
ч я
го
я
я
>і
Рч
U
я
л го
и с
° я
*г* Г4
? ft-
я
Я Я
Я Ф
о
Я
tr»
го°
ГО i-r-t
я і-ц
яи
ft.35
05
го
a
я
ч
о
я
го
ft.
ч:
О О-^
О 3
X О ч
«:
ГО
ф Ф ГО Я ^^
. ь >?* ft. S t-
t- л. аі *t Ф
Д oJS ф"^
о о
3 Ь*
о rj
^я
Я s Я
о
ф
_ - Я
а ё я
а о
а
я s
S
a
я
ft.
54^
Так как дегтиллированная вода, реактивы и пр. содержат
следы азота, то для устранения ошибки ставят параллельный
опыт «влу/ тую», т. е. со всеми входящими в определение
веществами, кроме исследуемого. Полученное при этом контрольном
опыте количество азот^ вычитают из количества азота, найденного
для исследуемого вещества.
Кроме описанного метода, применяется так называемое
микроопроделение азота по Кьельдаль — Бэнг — Прегль.
Принцип определения тот же, но, применяя этот метод, можно
отвешенное на микровесах вещество брать в количестве 3—5 мг
или 0.1—0.2 см3 жидкости, отмеренное в пипетке Прегля.
Описание метода см. Кизель, Практическое руководство по
биохимии растений: 1934, стр. 122.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЖНННОГО И ПЕПТИДНОГО АЗОТА
ПО ЗЁРЕНСЕНУ (HEiVHIQUES — SOItENSEN)
Это определение служит ценным указанием на распад
белковой частицы, обнаруживая количество свободных аминогрупп,
которых бывает тем больше, чем значительнее распад
пептидных комплексов.
1. Определение амипного азота
Аминокислоты, обладая свободными аминной и
карбоксильной группами, являются амфотерными соединениями, могущими
играть роль оснований и кислот. Формальдегид, вступая с ними
во взаимодействие, замещает аминогруппу группой метилена;
например, с аланином (ашшопрошюновая кислота) реакция
протекает по уравнению:
сн3 сн3
СН —NH.-f Н-СОН = СН N:CH2-J-H20.
СООН СООН
Лишившись аминной группы, аминокислота приобретает
кислую реакцию, а освободившаяся карбоксильная группа может
быть протитрована щелочью. А так как каждой свободной
карбоксильной группе отвечает свободная аминогруппа, то по
данным титрования судят о количестве последних.
Для определения служат три раствора:
1) Формалиновая смесь, приготовляемая прибавлением к
500 см3 продажного 30—40% формалина 10 см3 0.5% раствора
фенолфталеина в 50% спирте.
2 и 3) Пентинормальные растворы едкого натра и соляной
кислоты
(^NaOH и -?.НСі).
34В
Употребляемое в опыте количество формалина и свежепро-
кипяченной дестиллированной воды необходимо предварительно
вытитровать и поправку «К» принять в расчет при определениях.
Если исследуют твердое вещество, его растворяют в воде
или экстрагируют. Белок удаляют, нагрев подкисленный слабой
уксусной кислотой материал на водяной бане до 100°. Осадок
отфильтровывают, промывают горячей водой и берут для
анализа определенную часть фильтрата.
Если в материале имеется большое количество фосфорной
и угольной кислот, их надо удалить. Содержание аммиака должно
быть определено, так как аммиачный азот титруют по
формалиновому способу вместе с аминным азотом. Большое количество
аммиачных солей препятствует точности определения.
Исследуемую жидкость помещают в небольшую эрленмейе-
ровскую колбу и тщательно нейтрализуют с помощью
чувствительной азолитминовой бумажки (стр. 47), после чего туда же
последовательно приливают:
1) 10 см 3 формалиновой смеси (см. выше),
2) 5 см» -?NaOH + количество его, требуемое поправкой
«К» (см. выше), и
3)5см! ?НС1.
Прибавление щелочи и кислоты в одинаковых количествах
имеет целью создать надлежащую концентрацию ионов.
Благодаря взаимодействию между формальдегидом и
аминокислотой, раствор приобретает кислую реакцию. Его титруют
до яркокрасного окрашивания. г Умножив число кубических
сантиметров щелочи, пошедшей на это титрование, на 2.8,
получаем вес аминного азота в миллиграммах. Из этого числа
вычитают аммиачный азот.
2. Определение пеппггідиого азота
В пептидных комплексах аминная группа одной аминокислоты
связана с карбоксильной — другой и поэтому не вступает, во
взаимодействие с формальдегидом Но если пептид подвергнуть
гидролизу, то он распадается на составляющие его
аминокислоты, которые, в свободном состоянии, уже могут быть протит-
рованы по формалиновому способу.
Для гидролиза к исследуемой жидкости прибавляют равный
объем крепкой соляной кислоты (уд. вес 1 19), наполовину
разбавленной водой, и, закрыв колбу асбестовой пробкой,
нагревают в автоклаве (150°—11/2 часа). Содержимое затем
переливают в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане до-
1 Условность установления оттенка, до которого надо доводить цвет
жидкости, составляет слабую сторону определения Целесообразно
установить этот оттенок на основании параллельного определения аминного азога
ло другому способу, например по Ван-Сляйку.
М46
суха. К остатку приливают дестиллированную воду и, если нужно
обесцветить жидкость, прибавляют 2% раствор азотнокислого
серебра, избегая малейшего избытка этого реактива.
Отфильтровав от выпавшего осадка хлористого серебра, промывают
осадок и в фильтрате определяют аминный азот. Вычтя из
полученного числа ранее определенный (до гидролиза) аминный азот,
находим количество пептидного азота. Чем его больше по
отношению к сумме аминного и пептидного азота, тем незначительнее
распад белковой частицы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА ПО ВАН-СЛЯЙКУ
(VAN SLYKE)
В основу метода положена реакция взаимодействия между
аминами и азотистой кислотой с выделением свободного азота;
R.NH2+HN02=ROH + H20+N2.
Азотистая кислота получается действием крепкой уксусной
кислоты на азотистонатриевую соль. Образующиеся при этом
окислы азота вытесняют из прибора воздух. При определении
объема образовавшегося при вышеописанной реакции азота они
поглощаются щелочным раствором минерального хамелеона
(КМп04).
Способ очень удобный и точный, но требует специального,
довольно сложного прибора, в описание которого мы не входим,
отсылая к статье ван-Сляйка в «Biochemische Arbeitsmethoden»,
т. V, стр. 995, и т. VI, стр. 278.
1. Осаждение истиипыэс (патуралъпыэс, пативпых)
белков: альбумина и глобулина
а) Кипячение в присутствии уксусной
кислоты. Жидкость слегка подкисляют слабой уксусной
кислотой (на 5—10 ом3 жидкости 1—2 капли уксусной кислоты)
и кипятят, пока не выпадет хлопчатый осадок. Для лучшего
осаждения белка полезно прибавить к жидкости небольшое
количество поварэнной соли. Избытка уксусной кислоты следует
избегать, так как в нем растворяется часть белков (растворимые
ацидальбумины). Выпавший осадок промывают горячей водой
и определяют азот по Кьельдалю. Однако полного осаждения
белков таким путем редко удается достигнуть, и при прибавле-'
нии к фильтрату нескольких капель красной соли (железно-
синеродистого калия) получается муть. Для полного осаждения
фильтрат несколько минут кипятят с избытком свежеосажден-
ных водных окисей свинца или цинка и отфильтровывают.
б) Адсорбция белковых веществ
каолином. К 100 см3 жидкости, слегка подкисленной несколькими
каплями 10% уксусной кислоты, небольшими порциями прибав-
347
я
о
я
о
а
я
га
О
Е
и»
«о
я
R
«в
Ю
О
»
Я
ф
ь
о
ft
в
к
я
я
ев
ф
to
ф
чани
ф
Прим
птоны
ф
е
3
я
я
я
ft
о
Первичные
геины
Про:
я
я
к
сб
Ф
&•
3
со
о
?
Р*>
ю
аль
альбумозы
ч я я
с Е са
S о я?
е-. ^<ч
о - ^
rt S S v?
5я«
ч°я i:
о
И я о
я к
я
о
ь
г
я
я
3
&*
ft
ф
я
о
ф
X
я
ft
с
ф
я
я
SS я
я ~
1 Сверты
кипячени
сб ей •
Е- ft Я
О О >>
ч я
Ot-и
а о *
*2-я
Я Я
ГО » X
К ^гм
0 0е4
>>_
Укс
(на 10
белка
w
я
(=;
"5Г
н
о
ч
о
я
к
Л!
сусноі
а
о
о
я
ф
к
я
сажде
о
осаж-
ф
при
ф
я
я
ф
ГО
О
ф
Ч
о
фи-
ения
я *
я
актер
ее к ore
ft r
я я
X m
я
о
S
я
н
я
я
Я щ
3 кг
О ей
го к
К ?
* со
2 °
33 Я
5 ^
О ш
С о
і і
э з
СО rj
саждение па
бавления р
о объема наі
О
і
Ф
Я
я
іние
Осажде
о
ft О
я я
ф
вор
t-l
о
ctf
ft
тральном
а*
Я со
ftH
ss
3
я
я
в
3
Нас
S
s
я
о
Я
ft
ф 9
о Ч
о
твор
НОЙ С<
1 1 1
ИГ О Я
о ^>ft
я
я
я
ф
ч
о
я
2
я
ч
о
о
го"
укс
5
О
ленн
о
я
я
1
я
ft ф
[ного раство
ж
ф
3"
гка подкисл
ф
ч
о
о
н
о
ч
о
я
я
«3
о
я
W1
я
о уксусной .
и,
о
я
соре
н
о
эЯ
О
о
ч
о
1
>
о
я
го
я
Эсадок, раст
ющийся при
ф
вани
Сверты
я
н
о
ч
о
я
я
я
гі
я
н
о
03
-<
я
ft
Б
о
н
ф
раз
ю
о
ф
я
со
'садк
о
.
Я Я
S А
О я
я *
ч- Я
я 5 я
*. я м
>* О т)
5 ~ «
го «Й
QJ С Ч
ft 3 X
?-. Я О
Я
О
осад
Белый
+
^д Я
«О
w о
я
Я
Я Я
Я сО
Р Я
Кра
уксус
я
о
ЕС
я
о
о
S3
3
я
S
и
ф
вани
Сверты
к
ей
Ч
О
Я
Я
о
я
о
р->
Укс
медь
348
ляют 15—20 г каолина при беспрерывном встряхивании, после
чего отфильтровывают через фарфоровую воронку Бюхнера
(«нучу»), а еще лучше—через проталькованный фильтр в
вакууме. Первые порции бывают обыкновенно мутнъц и их вновь
переносят на фильтр.
в) Осаждение по Штуцеру — Барнштейну
(Stutzer —Barnstein). 1—2 г исследуемого вещества измельчают
и просеивают через сито с отверстиями в 1 мм, затем кипятят
с 50 см 3 воды (в случае содержания крахмала нагревание ведут
на водяной бане в течение 10мин). К жидкости прибавляют 25 см3
6% раствора медного купороса и затем, при помешивании, 25 см3
1.25% раствора NaOH. Когда остаток отстоится, жидкость
сливают через фильтр и осадок взбалтывают с водой. Эту воду
сливают через тот же фильтр, на который затем переносят и самый
осадок. Промывают горячей водой до исчезновения реакции на
серную килоту ВаС12 или на медь (с KjFeCye). В промытом и
высушенном осадке определяют содержание азота по Кьельдалю.
Умножив полученное число азота на множитель 6.25, узнаем
содержание белков.
2ш Осаждение алъбумоз сернокислым цинпом
К 100 см3 жидкости прибавляют 2 см 3 серной кислоты (1:4)
и насыщают тонко измельченным сернокислым цинком. Через
сутки осадок отфильтровывают и промывают слегка
подкисленной водой, насыщенной сернокислым цинком. В осадке — аль-
бумозы. Содержание азота определяют по Кьельдалю.
Полученное число, умноженное на 6.25, дает количество альбумоз. Если
в жидкости содержалось много аммиака, то может получиться
ошибка вследствие выпадения в осадок двойной соли (N Н4)
S04 -\- ZnS04. Если есть основание опасаться этого, то осадок
от Ът\ 504 долгое время кипятят с жженой магнезией и затем только
определяют азот или отдельно определяют аммиачный азот
и вычитают полученное число.
3. Частичное осаждение пептонов таппипом
50 г талнина растворяют в 500 см3 воды и к раствору
прибавляют сначала 50 ом3 нормального раствора едкоіЮ натра,
а затем дестиллгроваяпую воду до 1 л; законен, приливают
еще 15 см3 і0% раетнора винного камня. К исследуемой жид-
когт-і прибавляют большой избыток этого раствора и через 12
часов отфильтровывают выпавший осадок, і)—б раз промыв его
той же жидкостью, олределяют в нем содержание азота по
Кьельдалю.
349
4. Оса ждем/ив пептоиов (а также пептидов, гистгі-
дипа, аргипипа и лизииа) фосфорновольфрамовой
кислотой
Жидкость, из которой были удалены протеазы, сгущают до
содержания около 1% сухого вещества, слегка подкисляют
серной кислотой и осаждаю^ фосфорновольфрамовой кислотой. г
10—20% водный раствор кристаллической фосфорновольфра-
мовой кислоты Мерка приливают по каплям, при беспрерывном
взбалтывании жидкости, до тех пор пока не перестанет
появляться муть. Избытка следует избегать, так как некоторые
осаждаемые при этом продукты, например диаминокислоты, отчасти
растворимы в избытке фосфорновольфрамовой кислоты.
Образовавшийся осадок растворяют, нагревая жидкость, и вновь его
осаждают при охлаждении. При этом выпадает
кристаллический или зернистый осадок, легко фильтруемый.
Жидкость с выпавшим осадком оставляют на 4—6 часов при
40°, а затем на двое суток при комнатной температуре для
полного осаждения гистидина.
Осадок затем отфильтровывают через тальковый фильтр и
промывают 4% серной кислотой или смесью 2.5%
фосфорновольфрамовой кислоты и 3.5% соляной кислоты («Biochemische Аг-
beitsmethoden, т. V, стр. 1017). Фильтрат не должен мутиться
от капли фосфорновольфрамовой кислоты.
Разница в содержании азота в исходном растворе и в
фильтрате после осаждения указывает на содержание азота в осадке
(умножив, на 6.25, получаем количество пептонов). Сжигание
фильтрата по Кьельдалю, происходит с большим трудом (см.
ttBiochemische Arbeitsmethoden*, т. Ill, стр. 235).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТИСТОЙ И АЗОТНОЙ КИСЛОТ
Метод совместного определения азотистой и азотной кислот,
предложен Мейзенгеймером и Геймом и описан ими в «Berichte
der Deutschen Chemischen Gesellschaft», XXXVIII —4, 1905,
стр. 3834. Способ заключается в следующем (рис. 166):
слабощелочную жидкость, содержащую в растворе нитриты и нитраты,
вводят в небольшую (около 75 см3) колбу, заткнутую резиновой
пробкой, через которую пропущены 3 стеклянные трубки. Одна
из них, изогнутая под прямым углом и доходящая почти до дна
колбы, соединяется резиновым шлангом с источником углекислого
газа. Другая, оканчивающаяся тотчас под пробкой и изогнутая
сверху под прямым углом, состоит из двух колен, соединенных
резиновой трубкой с винтовым зажимом, и служит для отвода паров
и газов из колбы в эвдиометр, наполненный 12% раствором NaOH
и погруженный в открытую ванну с тем же раствором; конец
1 Ее можно самому приготовить в лаборатории: 120 г Na2 НР06 и 200 г
вольфрамовонатриевои соли разводят в 1 л воды и прибавляют 100 см3
серной кислоты (і ; 3).
350
нижнего колена этой трубки шзогнут пол острым углом и вытя
нут в тонкое отверстие, подводимое под эвдиометр; конец этот
полезно обвернуть резиновой трубкой для ослабления ударов
о стенки эвдиометра при кипячении. Третья трубка, прямая,
оканчивается снаружи воронкой с краном и служит для
введения в колбу реагентов. Сначала, а течение 10 мин., энергичным
током вполне чистой углекислоты вытесняется из всего прибора
воздух углекислоту, получаемую из прибора Киппа (Кірр),
следует промыть в дрекслеровской стклянке раствором
углекислого калия, чтобы задергать увлекаемые частички НСі :
затем, убедившись, что весь воздух из аппарата удален (пузырьки.
Рис. 166. При "юр для опре деления азотистой и
ааогной кислот по способу Мейсенгеймера и Гейма.
выходящего газа должны всецело поглощаться NaOH), замедляеді
ток С02, подводим изогнутый конец газоотводной трубки под
наполненный 12% раствором NaOH эвдиометр, вводим через
воронку в колбу с испытуемой жидкостью 10—15 см3 5%
раствора йодистого калия и затем постепенно 15—20 см3
разведенной (1:3) соляной кислоты (важно, чтобы до начала анализа
трубка воронки под краном была заполнена водой). Тотчас же
начинается образование окиси азота с выделением иода,
окрашивающего более или менее интенсивно исследуемую жидкость.
Путем слабого подогревания микрогорелкой ускоряем
выделение ISO и далее нагреваем жидкость почти до кипения. Вся окись
азота током углекислоты переводится в эвдиометр. Ход реакции
виден из следующих уравнений:
' HCI + KJ = KCI + HJ;
Н J + HNOj, = NO -J- J + H,0.
35 i
Когда объем газа, не поглощаемого в эвдиометре, более не
прибывает, снимаем последний, взбалтываем его содержимое для
окончательного поглощения следов С02, переносим в высокий
цилиндр, наполненный водой, и через 10—15 мин. отсчитываем
объем газа, отмечая температуру воды, воздуха и стояние
барометра. Если в оставшейся в колбе жидкости требуется
определить и содержание азотнокислой соли, то ставим на
газоотводную трубку другой эвдиометр, наполненный таким же раствором
едкого натра, а через воронку вводим в колбу 10—20 см3
насыщенного раствора хлористого железа в крепкой соляной кислоте
и далее поступаем так, как при определении азотной кислоты
по методу Шульце — Тимана, видоизмененному Шпигелем
(Spiegel), т. е., закрыв зажимом приводящую С02 трубку, сильно
кипятим жидкость, из которой вместе с водяными парами и
парами соляной кислоты вытесняется образующаяся из
азотнокислой соли окись азота. Когда в колбе остается настолько мало
жидкости, что дальнейшее кипячение становится невозможным,
пропускаем через прибор снова ток углекислого газа, которым
вытесняем последние остатки N0. Реакция выражается
следующим уравнением:
HNOi + 3FeCla + 3HCl = NO + 3FeCl, + 2H20.
Когда вся окись азота соберется в эвдиометре, переносим его
в цилиндр с водой и по истечении 10 мин. отсчитываем. Зная
стояние барометра во время отсчета объема газа и температуру воды,
где производился отсчет, приводим по известной фі рмуле
отсчитанные объемы NO к 760 мм давления и 0° температуры:
v _Vt{B — h)
0 760(1 + 0.0036710)*
Вес 1 см3 NO при 760 и 0° = 1343 мг; поэтому 1 см3 NO
соответствует 1702мг N203 или 2.105 1ШОяи 2.417 Na05 или 2.8203мгГШ03.
ОПТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ САХАРИСТЫХ
ВЕЩЕСТВ
Оптически деятельными или вращающими плоскость
поляризации называются вещества, обладающие свойством отклонять на
некоторый угол плоскость поляризации проходящего через них
поляризованного луча.
Оптическую деятельность обнаруживают:
1) твердые кристаллические вещества, вследствие
особенностей их кристаллического строения, и
2) жидкие или растворенные органические вещества с
асимметрическим строением частицы.
Для выражения оптической деятельности жидких или
растворенных органических соединений Био ввел понятие «удель-
вого вращения».
352
Удельным вращением, обозначаемым знаком [а], называется
утол вращения, который обнаруживает жидкость, содержащая
в 1 см3 1 г оптически активного вещества (т. е. гипотетический
100% раствор), при прохождении поляризованного света через
столб жидкости длиной в 1 дм. Для отдельных Сахаров это
величина постоянная.
Удельное вращение выражается формулой (а) = ~. —, где а —
1*С
наблюдаемый угол вращения; / — длина трубки в дециметрах и
с — концентрация, т. е. число граммов исследуемого вещества в
100 см3 раствора (с в этой формуле может быть заменено
выражением p.d, где р — весовой процент оптически активного
вещества в 100 граммах раствора^ ad — удельный вес жидкости;
з то время, как величина с изменяется от температуры,
величина р — нет).
Как сказано, удельпое вращение (а) есть в известных
условиях величина постоянная для данного соединения, и потому,
если з жидкости содержится лишь одно оптически деятельное
вещество, то по вышеприведенной формуле определяют:
100 а 100 о
С = тт-г, ИЛИ р = г---р. ¦
Таким образом, определение сахара сводится лишь к
измерению угла вращения а, так как остальные величины известны.
Величина а, изменяется от природы света: угол вращения
увеличивается от красной к фиолетовой части спектра.
Обыкновенно определяют удельное вращение либо для смешанного
белого света (обозначается знаком ([а]/), либо для однородного
желтого натриевого света, соответствующего фрауэнгоферовой
линии (обозначают знаком ([a] D). Чтобы перевести вращение,
полученное при смешанном свете на линейной шкале Солейль —
Венцке, на вращение прп однородном натриевом свете и при
круговой шкале, умножают полученное число на коэффициент
0.347 (для виноградного сахара на 0.344.)
Определение удельного вращения производят обыкновенно
при длине столба жидкости в 2 дм по возможности с 10%
раствором и при температуре около 17.5 —20°.
Свежеприготовленные растворы некоторых Сахаров,
например виноградного и молочного, обладают почти вдвое большими
вращениями по сравнению с вращением растворов,
простоявших сутки. Это явление носит название «биротации». У
мальтозы, наоборот, свежеприготовленные растворы вращают слабее.
Чтобы устранить это явление, достаточно свежеприготовленные
растворы прокипятить в течение 1fA часа.
20°
Для 10% виноградного сахара удельное вращение [а] -д- =
20°
= 52° 74', а для. растворов до 15% [а] -^-=52° 8'; следовательно,
23 Руководство по ывкробяологцъ
353
с-
С5
га
*3
>4
Н
виноград
К
д
и
ев
ф
Рн
И -
*s Д
eg
4 2
ф *
о8
г л
ь я
о w
ГО д
д
о
1=С =*-¦
бож
ото
о ^
к 2
о s
о д
? s
д о
Д д
ч о
& "-»
?• о
s д
9-^
ГО
га
tC из
ф н
С «^
я ч
о
д -*
2§
ара, должна
іной соли,
фильтровать^
S ® Й
Й »-0
° сС
а
Ф О
д к
*т*
га _
д rt
ft а,
а. о
?. m
п н
о о
о го
О.
го
жо
,. ?-»
? о
2 д
го д
И ф
^ 5
д о
с са
О н«
я ^
ЙЙ
С Q
Р «
ы у-,
о —
д о
К
05 —
s s
д **
го ?Г
в к
СО сС
го а
Н ft
ГО
о.
do
II
д
д о>
Я Ф
S
о ^
Нд
ф
a
О й
о a -
к д я
" 5
о д
ГО
о
ф
S
го
со
о
н
5 Д
Д^ Д
ГО **"
я -,
к д д
Ф Н Д
о. a &
ДНО
I
о 2
ГО -Я
Р-сй ^
д со Д
3
со
О
Н
is°
О
я
н
о
сэ
в-
Ф 5
tc ч
3 О
И Д
о
о. д
к4
го
ft **
ГОД
X го
ГО Q,
о vo
о
о
со
S
д
д
е-
CJ
н
й S
го
о
ф
S
са
А Н «
С О и
? ГО Л
8 а
И Ф
ф S
ft
д
5 д о
о
и
д 3
Ф Ю
о
го
п.
о , к
? °
U. Я
- ф
о
д д
о
к °
д ft о
го о о
и о. д
а
Л
s€
к
о
с
«
о
3 зД
д о
о к
го
•г-
го го
го д
Я s
го
о _
и
S
д
«3
о
н
Ф v^
н
CD 03
го о
со д
д
о
о
д
о
о
U
о
ю
го
О*
с
оэ
д
ф Ji
Is
СГ О-
о
6>»
ГО Он
ft Н
с п
5 °
- 2 о
S ?>, Д
д
о
S
S и
Ф о
ф
CJ
о
S
о
ф
д-S
ГО S
со
5 л
ft ^,
к го
с? ft
о -с
д д
S я"
Д ГО
ш m
^?
го ft
ftK
и 4
2и
к Л ° р.
п О L- ^
«П Д §.
и S я
rt г^ Д Ч
Сн
о
н д
m К tC _.
Д Б «S О
Е д о Я «
ё й И ¦ о
2- >> 5 ч
« ft ^р* ф
3 го д о д;
CD Д ft ^
о о И о
СО Д О
К ft«
го
эД
3
д
д s
3 2
tx го
2 н о
§8"
S
И
а S
о
со Л
И
е-
2
_ к
CQ н п
го го
fto
д
ft
.- с
S
о я
ft Д
° &•
н о
о
Л ГО
ft Д
3
ю
S
ft
[-
ф
3
а
ф
Й
Й
о
ft
к к
с? го
о
с
S
И О
д
ей о
VO Д
о д
ft го
Я Е
ь
го
ft
го
ftC
R.
с
го
д
л
и
К
О сС
fto
Ио
Д
ГО О
ft Д
го д
X ф
го с
О Ф
s о
CQ С
в
о
н
о J
о
о
к
о 3
>—,
«а ю
Н Д
ф ф
5 3
ft ГО
ф ft
ЕГ ГО
л
о 2
к 5
го
.со
И* .
ft
с
к
S
S ГО
Д ft
s д
fto
Д ft
н
ф
И
Я"
ф
д
о
д
- 3 G>
s д г
Н ft
Д S
Д VO
к о.
ft
д
с
?? сс
Й н
Е?в
ф S
ч к
О н
Е2 о
о
д ч
д д
і о
д
3 го
о
2
д
ЕГ
о го
ф д
я *
ф
о
ч
ф
о
с
Оу
д о
в с
о
о о
Д X
д о
Ф сС
Я- ft
д
о
д
оД
3
з-
о
го
д
с ^_
О- ft
д о
ft Д
н
free
ft
о
о
се
в
И"
д
го
ф
354
о о
О Ф
х д
? Я
си
S
ра
о
е-
С5 ft
Ч
Ф -f*
^ о
аз
я ?
п 2
о
га
Й ?
ft в
~ ft
о
Е-
ш
К
ч 6
^ a a
ф о 2
3 й Д
п О "С
го га со
ві°
Л **" 05
ft X Ч
О О Ю
^ ?;
о "
CD Я
= 2
О ft ы
і— ее
S я о
^С ft CD
>)tt СО
?* Д ?
" к о
X « s
= ?
a a
га
§ л *
« s s
^ О Ч
У К Ф
5 я я
ft ~ д
В О О
^
д
га
ь
о
н
>>
о
S
ft
д
J
ь
33
ft
t>
н
о
о
о4^
ю
CN
О
О
'О
»
р
CJ
^н
СС
ГО
ft
СС
и
со
с_>
ft
О
га
н
а
с
ft
О
(-.
О
X
п.
о
я
о га
ftp;
X
сС
с_
О
д
о
со
S
п
СС
Е-
а
га
X
и:
ей
ft
и,
о
к
a
га
о
И .. S
зД
о
о
е-
га
Ч
ей
со
ft
д о
О W
— СС
? a
СС
га о
© н
ft
С" _
о g S
ftU
О СО
Ч
О
Д
^ CD
д я
о
я
ч
о
ее ее" 5
>~> Ф CD
? ? СО
о ;з г
Я о >-*-
га Лч
о^§
Э 9 о
g & к
ft га
«в
a s
rag
ft ;r
? S
ftcT
? га к
*- с* "ч
cc U
- О
д в
И cd
Ч
О
сС
ft
СО
5 °
Т5
CD
ft
я
s
я5
«
о
га
CD
о
%
о
ft
53«
Д S ¦:-
3 Д- о
cj ¦? га
го ¦* »с
ft со
^ - к
с- _ Ю
ф О н
га к
Д- сб
еі
2 е- л
°- © ft
-б си g*
и о. g
со >s^
со
о
ей
о
о
1)
ей
и
сб
Д
ф
9 >-
is
о
? ^
s д
5°
И
<Р
R К
О Д
а?
сб
г»
| 3 &
ftg-jS
я
ft
CD
Я
СО
га R
О сС
W F
СО rt S
О ЙЩ
О О Е-
«
СО
о
и
2&в
S
Е
cd га
^сй
CD К
Д
О
ft CD
ее га
га да
о о
д га
- га
**
О к
ей о
д я
П сС
ftO
S*
* д
д к
с- О
о га
- о
СС
ft
Я
сб
? В
д 3
РЗ га
т< I
СО к О
Е-1 га
¦S a
О ? S
*п со
га со д
f- д д
° — а>
^ О у
ЛД ^
R Ч
CD
ft
СО
д
О
д
д
ш
с
CD
О
О
д
^^*;
СС
д
д
ф
д
д
Й
о
к
ё-2
m со
н га
со
ft
о
са
н
ftS
ftio
СО
S3
?
CD
>»
Ф
ч
О
О
а
сз я
cj га
д о
ft >>
>-ч
й О
О f-
ft О
о д
Е-
СС
ее
с
S
га
о S ?
X д о
м- •"¦
S R —
« га «
ф -в о
S \о Д
« 2
о д
3 п
ф га
?^ СО
еіо
2 S
PS ft
и Д
о
д
S
ф
ft о
ф
О CD
В Н
д
CD
ft
га
ф
о
ft
о
Е-
О
X
Ф
X
3 S
« В
о я
О К
I
о д
д ft
га
сС Д С" *о
тз о
га R
«S
я
я
ф
га
со
ю
со
сС
га
о
t-
о
д
ф
о ft
СО О
ft Д
ft S _
о w 2
н
о
аз
ft*3
О
*
S
о
СО
о
с о
Ф Ч
ft ф
к я
о
S
X
о ^
ccg0
S
X
о
д
о с.
Г4 IrH 14
СО Ф *
to S Р^
Й *
СС О О
S R К
О Ч
га
юо
Ен «
2 Е.
К СС
ft fcC
о о
га ю
н о
со ^
ft д
3 ф
н и:
И
S
га д
со
д
га и
о о
s
к
О
"ея"
Я
О
о
я
ч
а
X
о
га
ч
о
о
к
СО сС
с- н
?3 ^
S
о
я
га
о —
is
сО
Ф ей
ф
S
ft
со
о
Д 05
kCL
СО
ф СО
*** ф
CD l
И 5
-*-s
5 °
Яго
КС.
СО
Ф сб
Рн ft
Ф
U
23*
355
к
а
гтЛ
I—I
ев
Е
а
о.
е
ф
3
а
сб
?
ГО
Сб
К
в
а
Я"
а
сб
©
а.
S і
о ?
со a
и -
а к
4 S
в a
га
S
3
a
в
a
к
a a>
С
a
о
л
Sa
О О
a a
«: «
ее
о
о
S
е
a S ~
гЗ Ж Я
" a s
ц, со Я
сб Л П.
a a a
сб к a
се * а,
о о га
a a
а к ^
^н о
о«2 к
а ч g
О со «
сэ сб О
сб с a
га о
О н °
ах
к
а> a
в в
со
ее
a
(Я О сб
ч а в
С Ч О
С- о О
_ >>о —
в >-, я rt
a tr
a o
в *¦¦
« «
й со ^ч
Ф Л г* S
оО и
CQ
Н
О
да
_ ?Г
И сб ?
а о
в
a
а»
ч
^»
X
a—~
в >»
в
о,
3
а
tc
к а
о.
8 к* да
ш
В « О
S к
я н
Сб О
?§?
О д
&55 ЕЙ
О 3 "=5
к н да
о 3 а
В ¦? &1
сц а сб
к га
в а
в
• за
og
. ч
га й
к g
а ? сг
a ^g
Сб ГО О
Q.C3 Ч
ь ах
а
к
а
а
Сб
а
2
о
о
©
ч
о
о
С
ч
-
* I
Я J
Во
да II
?"
Сб ц
* ч
а о
О О
О ?
В
еда
05
а о
а
о
8
Н
О
д ПО
О. I О
о
CD Н
В1
а
а.
о
и
п
Я
a
о ф
сб
К
S
ч
a
Э
Сб
а.
a
к о
н
о,
a
a
о
a
о
сб
О.
a
о
в
о
е 5
а а, о
И аэ
§«
^§
« о
я 2
5?
Ч В
о ?
О К
a
s
a
o=g
я*
a
a
a
a
К
о
a
о
О
a a
с I-,
s і н ?
5 ^? 3
2 2 о. о
о о a
Н сб л
2 а со
а в о да
н ? a ^
о 5 - о
о я л s
gg a 2
w a сз -
5 сь,к к
в с s о
сб F-
сб Й
м
О
о
о
в
Сб S-
ю а
S я
о а
и да
н а
I I .Я
hQ rt e
ч р. §
о к: с
а в сб
° ^ а
-а а
сб
Я* С5
О сб
га к
9 - к
га о а
аа 5
I- т- й Н
2 к о s
4 tr a
2 о =*о
5 а а яч
К о ?
о- s
о a g да
а о "
S F, О g
о^ га s3 ?
Ом CD В
ю нн \о а
о о а
5>а,^б
^ a a
ч *"•
О И Е-
2 2
п
ю
сб
К
Ф
ч
a
^5
о 5
В га
сб 0 a
а га ex
^ да
_ о a
2 a
2 о
« о в »
S в о о
° В f;
о- *j>
о
н »
о s
о о
сб Й —
В Ф _
н сб 2
В СО га
га о S
в К 2
в ее g
ИВА
ВВП
О •*• А
о
ад
а>
о.
t-
га
a
в
в
о- >я ч в
о « S^
= о а©
в о
Ч в
о R
В CQ *¦
о w a
о. а
р S
о да ч
о в и
о а
^ сб
§ сб а
х S Й
§ ° S*
а °
о ? Й
п t. с"
,К -
сб а
о
а
а -ч
в в
га о
га >,
с о
к а
в >,
с-
Ч
?О Е-
_Ч
«dXD g
а
si
а га
в
о
3
о
га
В О Ч
в о
Е^ О
В
н
Is
о '?*
^ га
В
Сб Ц
О
°га
ф в
в о
н
, да
да 3"
ь сб
О-
8 я
К
сб
с
05 О
В Я
га ^
В
сб
а
а
С5
а н
ч
а
я г^ а
о в^__в
В Со О*
с cd да
ч tc о
I
о
>>
ОнТГ
да
а
ал
а а
?«
сб
да га
Рн Q.
да
В
со а
а .
aCL
ф га
а
ч
о
3
о
U
о
а
о
в
сб
О.
СС |
в
в
в
ЗЪв
по формуле с=гтгГ/* гДе 1 = 2 дц., мы оудеа* иметь с = t)2°8,—2==s
- 0,947а.
Удельное вращение
Молочного сахара 52°53' (с = 1,9037-у)
Мальтозы 137°5' ( = 0,7273-у)
Тростникового сахара .... 6б°5' ( = l,50fi-j)
Левулезы от 30°2' до 93е
Для измерения угла вращения существуют двоякого рода
аппараты:
1. Поляризационные аппараты или поля-
ристробометры, пригодные для исследование любого оптически
деятельного вещества, снабжены круговой шкалой и
приспособлены для освещения однородным (натриевым) светом.
2. Сахариметры служат лишь для определения
содержания сахара в растворах и освещаются смешанным белым
светом. Они снабжены двумя клинообразными кварцевыми
пластинками н линейной шкалой. Кварцевые пластинки служат для
определения степени вращения раствора. Чем йэшже к основанию
клина, тем больше вращение; чем ближе к вершине, тем оно
меньше. Таким образом по передвижению кварцевых пластинок
судят о степени вращения.
Обыкновенный или натриевый свет пропускают сначала через
поляризатор или николеву призму, приготовленную из крупного
кристалла исландского шпата, наискось разрезанного на две
равные части и вновь склеенного канадским бальзамом.
Прошедший через николеву призму поляризованный луч
пропускают через раствор оптически деятельного вещества,
заключенного в стеклянной трубке. Поляризованный луч при этом
отклоняется от первоначального направления на некоторый угол,
зависящий от концентрации раствора, длины трубки и температуры.
Величину вращения поляризованного луча определяют при
помощи другой николевой призмы, или анализатора,
показывающего угол вращения в градусах дуги на круговой или на
линейной шкале. Шкала сахариметра указывает непосредственно
процентное содержание сахара.
При производстве определения вращают анализатор до тех
пор, пока получится равномерное освещение обеих половин поля
врения в полутеневом аппарате. После этого отсчитывают, на
сколько градусов круга пришлось передвинуть шкалу.
Имеются различные системы поляризационных аппаратов,
и показания их не одинаковы. Зная их, легко пересчитать
показания одного аппарата на градусы другого. Так, каждый градус
линейной шкалы Солейль — Венике = 0.3463° круговой шкалы
(например, Вильда).
367
В качестве примера, мы остановимся подробнее на описании
полутеневого аппарата Шмидт — Геныпа, где свет проходит
через следующие части: осветительную линзу, поляризатор,
кварцевый клин, анализатор и зрительную трубку.
При наполнении трубки оптически-недеятельной жидкостью,
например водой, правильно установленный на нуле аппарат дол-
:кен давать равное освещение обеих половин поля при
совпадении нулей нониуса и шкалы (ряд определений). Если этого*
нет, то с помощью прилагаемого к аппарату ключа нониус
должен быть передвинут на надлежащее место или же, установив
отклонение, вычитают его затем из получаемого результата.
У сахариметров все оптические части фиксированы и не
нуждаются в особой установке. Регулируется только зрительная труба,
чтобы ясно видна была линия, разделяющая круг, и последний
был резко очерчен. Глаз наблюдателя помещается в расстоянии
1—3 см от глазной линзы.
Для контроля правильности установки сахариметра исходят
из двух точек: 0° для воды и 100° для раствора, содержащего
26.048 г тростникового сахара в 100 см3 воды.
Чтобы в аппарат не попадал посторонний свет, лучше вести
наблюдение в темной комнате.
Лампу для освещения (газовая, спиртовая или керосиновая)
берут с круглой или плоской горелкой и помещают в расстоянии
15—20 см от аппарата, смотря по силе света, так чтобы призма
поляризатора не нагревалась. Изображение пламени, пройдя
через осветительную линзу, проэцируется на диафрагму
анализатора. Для проверки установки непосредственно перед
источником света помещают заостренный кусочек проволоки, а на
диафрагме— листочек белой бумаги.На бумаге должно получиться
резкое изображение острия.
Осветительная линза ставится как раз посредине между
источником света и диафрагмой анализатора. Расстояние же между
ними должно быть равно двойному фокусному расстоянию линзы.
Желтое натриевое пламя получают, поместив в пламя
сильной газовой горелки кусок асбеста, пропитанный
эквимолекулярной смесью NaCl + Na2HP04.
Если исследуемый раствор окрашен, его необходимо
обесцветить. Не слишком темные сахарные растворы обесцвечивают
прибавлением 3—5 см3 взвеси водной окиси алюминия к небольшого
количества уксуснокислого свинца 1 или же по 10 см3 растворов
квасцов и уксуснокислого свинца на 100 см3 сахарного раствора.
Наполняют обыкновенно двудециметровую трубку исследуе-
1 Его приготовляют следующим образом: 3 части уксуснокислого свинца,
1 часть свинцового глета (РЬО) и 0.5 частей воды нагревают на водяной бане
в закрытом, сосуде до тех пор, пока желтый цвет смеси не перейдет в белый
и красновато-белый. Тогда постепенно вливают 9.5 частей воды, еще
нагревают несколько часов, дают отстояться и фильтруют. На 100 см3 сахарного
раствора приливают 5—12 см3 этого раствора.
358
мылі раствором до образования выпуклого мениска на поверхности,
который срезают стеклянным кружком. В трубке не должно
оставаться пузырьков воздуха. Затем трубку завинчивают (не
слишком туго, так как от слишком сильного сжатия стекло может
приобрести вращательные свойства), помещают в желоб
поляриметра и закрывают его крышкой.
Если жидкость вращают вправо, то темнеет правая половина
круга, а если влево, то затемняется левая половина. Или же:
если призму анализатора поворачивают по направлению
движения часовой стрелки, то исследуемый раствор вращает плоскость
поляризации вправо; если же в обратную сторону, то влево.
1° линейные шкалы Венцке в аппаратах Шмидта и Геныпа =
= 0.26048 г тростникового (свекловичного) сахара = 0.3265 г
виноградного сахара (глюкозы).
1° аппарата с линейной шкалой = 0.3468° аппарата с
круговой шкалой.
Оптическое определенгіе випоградиого сахара1
В зависимости от процентного содержания (р) удельное
вращение глюкозы (а) изменяется следующим образом:
р Ь] р М р Н
5—52 61 20—53 0S 35—53 79
10—52 74 25—53.29 40—54.08
15—52.90 30—53.53 45—54.39
Для растворов с содержанием до 15% виноградного сахара
можно принять, без особой погрешности, величину (а) = 52.80.
По Толленсу, для глюкозы связь между удельным вращением
и процентным составом выражается формулой:
[д^°=52.50-|- 0.0188р + 0.000577р2.
Оптическое определение молочного сахара в молоке
Существует несколько способов:
1) 50 см3 молока кипятят с 25 см3 20—25% раствора свинцо
вого сахара. К еще горячей жидкости прибавляют 5 см3 10%
раствора квасцов, охлаждают, доливают водой до 100 см3 и
отфильтровывают. Фильтрат подвергают оптическому исследованию.
Объем образовавшегося осадка достигает 3 см3 и принимается во
во внимание при расчете анализа.
2) 100 см3 молока свертывают после прибавления 6 см3
10—15% уксусной кислоты и отфильтровывают через полчаса
(небольшая муть фильтрата, получающаяся вследствие
прохождения капелек жира, не мешает). 50 см3 фильтрата кипятят
с 3—4 см3 уксуснокислого свинца, удельный вес 1.2.
Испарившуюся жидкость после охлаждения сосуда доливают водой до
первоначального объема, отфильтровывают и исследуют.
1 Качественные реакции на виноградный сахар, см. стр. 354.
359
3) 100 см3 молока свертывают, как во 2-м методе, или с 6 см&
10—15% серной кислоты. 50 см3 фильтрата обрабатывают на
холоду 5 см3 продажной фосфорновольфрамовой кислоты.
Отфильтровывают и. подвергают оптическому исследованию*
Результат умножают на 1.1.
Во 2 и 3-м методах прибавляют для свертывания по 6 см3
кислоты, так как таков приблизительно объем выпадающего осадка.
Вследствие этого объем получающейся в фильтрате сыворотки
соответствует объему исходного молока.
По 3-му методу получается на 0.15% большие числа, чем
по 2-му, а по 2-му —на 0.15% больше, чем по 1-му.
Шмегер считает 3-й метод наиболее точным.
Определение сахара титрованием фелитовой жидкостью
Фелинговой жидкостью называют щелочной раствор окиси
меди, восстановляющийся при нагревании с сахаром с
образованием красной закиси меди Си 02 или желтого гидрата СиОН.Ко
личество восстановленной меди служит мерой содержания сахара
в исследуемой жидкости.
Фелингову жидкость приготовляют в виде двух растворов,
сливаемых вместе непосредственно перед употреблением. Состав
растворив следующий:
1) Растворяют в 500 см3 дестиллированной воды 34.639 г
химически чистого медного купороса (GuS04 + 5Н20),
перекристаллизованного из разбавленной азотной кислоты и трижды
из воды, затем отжатого между листами фильтровальной бумаги
и высушенного на воздухе в течение 12 часов.
2) Растворяют 173 г трижды перекристаллизованной сегнето-
вой соли (KNaC4H4Oe + 4Н20) в 400 см3 воды и 100 см3
натровой щелочи, содержащей 51.6 г едкого натра. Этот раствор
всякий раз надо приготовлять заново, так как он изменяется
при хранении.
Соотношения между сахарами (в 1% растворе) и фелинговой
жидкостью выражаются определенными числами:
Декстроза (виноградный сахар) . . .
Левулеза (плодовый сахар, фруктоэа)
Инвертированный сахар
Лактоза (молочный сахар)
Лактоза после инверсии
Галактоза
Мсільтоза (солодовый сахар)
1 г сахара
восстано?ля-
ет след>ющее
количество
фелинговой
жидкости
в см*
210.4
«94.4
202.4
148.0
202.4
496.0
ША
і00 см«
фелинговой
жидкости
восстановля-
ют следующее
количество
сахара в г
0.4753
0.5144
0.4941
0.6757
0.4941
0.5102
0.778S
зсо
Определение сахара производят в два приема: сначала
приблизительное, затем точное.
1) Приблизительное определение. Его цель—
установить приблизительную концентрацию сахара в
исследуемой жидкости, чтобы затем приготовить 1% раствор для
точного опыта. Смешивают по 25 см3 обоих составных частей
фелинговой жидкости и нагревают до кипения в глубокой
фарфоровой чашке или в эрленмейеровской колбе. Исследуемый
раствор приливают понемногу к кипящей жидкости до тех пор,
пока она не обесцветится после продолжительного кипения,
т. е. пока в ней не восстановится весь медный купорос.
Определяют по таблицам содержание сахара и разбавляют раствор
водою (или сгущают его) до содержания сахара немного менее 1 %.
2) Точное определение. Снова смешивают по 25 см3
обеих составных частей фелинговой жидкости и кипятят с
соответственным объемом 1% сахарного раствора; если это была
декстроза, то прибавляют 23 см3, если левулеза, то 25 см3, если
молочный сахар, то 33 см3 и т. д. (см. таблицу на стр. 360), *
Декстрозу и инвертированный сахар кипятят 2 мин., мальтозу—
4 мин., молочный сахар — 6 мин.
Жидкость затем быстро процеживают через двойной плотный
фильтр и последний тотчас удаляют, не ожидая, пока вся
жидкость профильтруется, иначе оставшаяся на фильтре закись
меди может окислиться на воздухе и перейти в фильтрат. Если
фильтрат окрашен в синий или сине-зеленый цвет, это указывает,
что сахарного раствора было прилито мало. Если фильтрат
желтого цвета и трудно определить на-глаз, содержатся ли в нем
следы медной соли, то его подкисляют уксусной кислотой и
приливают раствор желтой соли — тёмнокрасное окрашивание
указывает на значительное содержание медной соли, бледнорозо-
вое — на следы ее, отсутствие окрашивания — на полное
восстановление всей меди.
В зависимости от исхода этого первого определения, при
повторном опыте приливают 1 см3 больше или меньше сахарного
раствора. Пользуясь таким же приемом и в дальнейшем,
постепенно сближают пределы двух последовательных определений
до тех пор, пока разница между ними не будет превышать 0.1 см3,
и тогда берут среднее между ними, т. е. 0.05 см3. Для
подобного точного определения требуется обыкновенно 5—6
титрований. 2
Точность определения довольно велика: при 100 см3 фелинго-
1 50 см3 фелинговой жидкости восстановляют 0.237 г декстрозы в 1%.
растворе, т. е. около 23 см3, и т. д.
2 Рейшауэр (Reischauer) и Круис (Kruis) несколько упрощают
вышеописанный прием. Налив в ряд пробирок по 5 см3 сахарного раствора, они затем
приливают в отдельные пробирки возрастающие дозы фелинговой жидкости.
Одновременно нагрев все пробирки, наблюдают, в какой из них вся медь
восстановлена.
Зв?
вой жидкости она колеблется в пределах* 0.2%; но если
исследуемая жидкость содержит неопределенную смесь Сахаров, то
титрование фелинговой жидкостью дает лишь приблизительные
результаты. Надо также иметь в виду, что, помимо различных
Сахаров, медь из фелинговой жидкости восстановляют дубильная,
галловая, мочевая, мышьяковистая кислоты и некоторые другие
соединения.
При очень небольших содержаниях сахара в исследуемой
жидкости пользуются обыкновенно разбавленными растворами
фелинговой жидкости, например в 4 раза: по 10 см3 обеих
составных частей -f- 80 см3 воды.
Если исследуемая жидкость окрашена, то конец реакции
устанавливают следующим образом. К фильтрату от кипячения с
фелинговой жидкостью прибавляют небольшое количество
декстрозы и вновь кипятят в фарфоровой чашке. Дав отстояться,
жидкость сливают и дно вытирают куском фильтровальной бумаги.
Если в фильтрате оставалась в растворе медная соль, то от
прибавления сахара она восстановится, и бумага окрасится
осадком Си20 в красный цвет.
Если жидкость содержала белок или пептон их
предварительно удаляют осаждением фосфорновольфрамовой кислотой. Сначала,
прибавив несколько капель известковой воды, сильно сгущают
раствор и осаждают небольшим избытком
фосфорновольфрамовой кислоты (стр. 350). Осадок промывают водой со следами той
же кислоты и в общем фильтрате удаляют фосфорновольфрамовую
кислоту осаждением насыщенным раствором едкого барита, а от
избытка последнего избавляются осаждением сернонатриевой
солью. В фильтрате (если нужно —сгущенном) определяют
обычным способом сахар.
Для установления титра фелинговой жидкости пользуются
чистым препаратом декстрозы (1°плавл. 144—146°), высушенной при
103—107° до постоянного веса.
В качестве примера приведем анализ 40% раствора декстрозы.
Предварительный опыт. На восстановление 50см3
фелинговой жидкости идет 8 см3 этого раствора, который
содержит, следовательно, 0.2376 г декстрозы (см. табл. на стр. 360).
Чтобы получить 1 % раствор, доливают 8 см3 до 24 см3.
Точное определение.К 50 см3 фелинговой жидкости
последовательно прибавляют следующие количества 1% раствора
исследуемого сахара (в куб. сайт.).
Фильтрат:
Сине-зеленый 23
Зеленоватый 24
Желтый 25
Желтый (с желтой солью •—тёмнокрасное окрашивание) 24.5
Желтый (с желтой солью—розовое окрашивание) ... 24.7
Желтый (с желтой солью — нет окраски) 24.8
302
Точный результат: 24.75 см3, т. е. в этом объеме сахарного
раствора содержится 0.2376 г декстрозы.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРА ПО
ИЕГТРАЯУ
Метод основан на том, что закись меди, образующаяся при
кипячении раствора сахара с избытком фелинговой жидкости,
восстановляет в кислом растворе сернокислую окись железа в
закисную соль, и количество последней определяют титрованием
минеральным хамелеоном.
Для определения служат четыре раствора:
1) Чистого кристаллического медного купороса ... 40 г
Десі ил тированной воты наполнить до 1 л
2) Чистой сегнетовой соли (двойной виннокислой соли
качия— натрия) 200 г
Едкого натра в палочках . . . 150 »
Дестиллированной воды до 1 л
3) Сернокислой окиси железа (без примеси закисной
соли—проба минеральным хамелеоном) 50 г
Крепкой серной кислоты 200 см3
Дестиллированной воды до 1 л
4) Минерального хамелеона 5 г
Дестиллированной воды до 1 л
Определение производят следующим образом. В небольшую
эрленмейеровекую колбу, емкостью около 150 см3, вливают 20 см3
исследуемого раствора, содержащего не более 0.5% сахара
(лучшие результаты получают в пределах концентраций 0.05 —
0.45%). Затем в ту же колбу приливают по 20 см3 растворов 1 и
2-го и, вскипятив жидкость, ставят на 10 мин. в кипящую ванну,
а затем переносят в холодную воду. Дав закиси меди осесть,
прозрачную, слегка голубоватую жидкость процеживают через
асбестовый фильтр в небольшую толстостенную коническую
склянку с боковой отводной трубкой для выкачивания воздуха,
стараясь по возможности не замутить осадка и не перенести его
на фильтр. Оставшуюся на дне колбы красную закись меди
обливают дестиллированной водой, взбалтывают и, дав отстояться,
вновь декантируют через фильтр.
Закончив промывание, приливают к осадку закиси меди,
оставшемуся в склянке, 20 см3 раствора 3-го. Осадок быстро
растворяется, и жидкость приобретает зеленоватый цвет. Ее быстро
пропускают через асбестовый фильтр с осадком закиси меди,
выкачивая воздух из колбы. Переведя всю закись меди в раствор
и промыв асбестовый фильтр водой, титруют образовавшуюся
сернокислую соль закиси железа минеральным хамелеоном до
появления розового окрашивания.
Продолжительность всего определения не превышает 15—20
мин.
363
Примечание ft. Установление титра минерального хамелеона
(раствор 4-й). 0/25 г чистого щавелевокислого аммония (NH4)jG404 +
4- Н,0 нагревают в стакане до 60—80° со 100 см3 воды и 2 см3
крепкой серной кислоты. Из бюретки приливают раствора минерального
хамелеона до появления розового окрашивания, для чего требуется
около 22 см3.
Реакция протекает по уравнению:
5HtCf04 + 2КМп04 Н- 3H2S04 = 10С0.2 + 2MnSO, -f-
+ K2S04 + 8H80. (1)
Для пересчета титра на медь исходят пз уравнений (2) и (3):
10FeSO4+ 2KMn04+ 8H2S04=-5Fe (S04), 4- K2S04 +
+ 2MnS04-f-8H20. (2)
Сп,0 + Fe2 (S04)3 -f- H2S04 = 2Cu S04 + 2FeS04 4- H20. (3)
Теким образом, одна частица щавелевой кислоты или ее
аммиачной соли эквивалентна 2Ге и 2Gu.
Поэтому, умножая количество взятой щавелево-аммиачной
**>ли (0.25 г) на —^~~— , т. е. на 0.8951, получаем количество
*?еди, отвечающее израсходованному на титрование количеству
минерального хамелеона.
Примечание 2. Приготовление асбестового фильтра. Трубка для
асбестового фильтра имеет длину около 14 см. Ее верхняя часть,
размерами 6.1—1 см, имеет цилиндрическую форму и оканчивается
сужением для удержания асбеста.
Сначала помещают в нижней части трубки длинноволокнистый
асбест и слегка уминают; затем идет невысокий слой из более
мелкого асбеста и, наконец, идет слой, состоящий из самых тонких
волокон асбеста. Такой асбест получают, взболтав в воде хороший нежно-
волокнистый асбест и дав ему слегка отстояться. Взмученную часть
профильтровывают через асбестовый фильтр, на поверхности
которого и остаются взвешенные части. Этот последний слой, высотой
в 2—3 мм, собственно и является фильтрующим слоем, а лежащие
под ним служат ему лишь опорой (их общая высота — около 1 см).
Один и тот же филх*і|* служит для многих определений, и потому не
надо жалеть времен*" на тщательное его приготовление.
Ниже приводимые таблицы, составленные для безводных
Сахаров, показывают соотношение между количеством определенной
анализом меди и содержавшегося в жидкости сахара (в мг).
1 63.6 — атомный вес меди, а $42.1 — частичный вес щавелево-аммиач-
пой соли.
364
Глюкоза
о.
га
К
Я
О
(0
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
п
23
24
?5
Медь
20.4
22.4
24.3
26 3
28.3
30.2
32.2
34.2
36.2
38.1
40 1
42.0
43.9
45.8
47.7
49.6
Сахар
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
л
51.5
53.5
55.3
57.2
59.1
60.9
62.8
64.6
66.5
68.3
70.1
72.0
73.8
75.7
77.5
Сахар
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Медь
79 3
81.1
82.9
84.7
86.4
88.2
90.0
91.8
93.6
95.4
97.1
93.9
100.6
102.3'
104.1
105.8
Сахар
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
Медь
107.6
109.3
111.1
112. В
114.5
116.2
117.9
119.6
121.3
123.0
124.7
128.4
128.1
129.8
Сахар
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85 ,
86
Медь
131.4
1J3.1
134.7
136.3
137.9
139.6
141.2
142.8
144.5
146.1
147.7
149.3
150.9
152.5
154.0
15э.6
Сахар
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
I
О
157.2
158.8
160.4
162.0
163.6
165.2
166.7
168.3
169.9
171.5
173.1
174.6
176. і
177.8
Инвертированный сахар
Медь
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
?5
Сахар
20.6
22.6
24.6
26.5
28.5
30 5
32.5
34.5
36.4
3S.4
40.4
42.3
44.2
46.1
48.0
49.8
Медь
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Сахар
51.7
53.6
55.5
57.4
59.3
61.1
63.0
64.8
66.7
68.5
70.3
72.3
74.0
75.9
77.7
Медь
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Сахар
79.5
81.2
83.0
84.8
86.5
88.3
90.1
91.9
93.6
95.4
97.1
98.8
100 6
102.3
104.0
105.7
Медь
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
Сахар
107.4
109.2
110.9
112.6
114.3
115.9
117.6
119.2
120.9
122.6
124.2
125.9
127.5
129.0
Медь
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
Сахар
130.8
132.7
134.0
135.6
137.2
138.9
140.5
142.1
143.7
145.3
14G.9
148.5
150.0
151.6
153.2
1j4.8
Медь
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
too
Сахар
1'6.4
1о7.9
159.5
161.1
162.6
164.2
165.7
167.3
168.8
170.3
171.9
173.4
175.0
176.5
Мannoза
Сахар
10
20
30
40
50
Медь
20.7
40.5
59.5
78.0
95.9
Сахар
60
70
80
90
100
Медь
113.3
130.2
146.9
163.3
179.4
806
Галактоза
face
X
сб
U
>о
0>
со
И
>я
И
ф
сО
И
а?
ей
ГО
и:
сб
х
сб
н
сі>
ей
ей
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
19.3
21.2
23.0
24.9
26.7
28.6
30.5
32.3
34.2
36.0
37.9
39.7
41.6
43.4
45.2
47.0
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
48.9
50.7
52.5
54.4
56.2
58.0
59.7
61.5
63.3
65 0
66.8
(8.6
70.4
72.1
гз-.ъ
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
75.6
77.4
79.1
80.8
82.5
84.3
86.0
87.7
89.5
91.2
92.9
94.6
96.3
98.0
99.7
101.5
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
103.2
104.9
106.6
108.3
110.0
111.6
113.3
115.0
116.0
118.3
120.0
121.7
123.3
125.0
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
126.6
128.3
130.0
131.5
133.1
13'і.8
136.4
138.0
139.7
141.3
142.7
144.6
146.2
147.8
149.4
151.1
87
88
89
90
91
92
93
94
95
У6
97
98
99
100
—г
О"
152.7
154.3
156.0
157.6
159.2
160.8
162.4
164.0
165.6
167.2
168.8
170.4
172.0
173.6
Сорбоза
Рампоза
Сахар
10
20
30
40
50
Медь
15.4
30.4*
45.8
59.9
74.2
Сахар
60
70
80
90
100
Медь
88.4
102.3
115.9
129.4
142.8
Сахар
.10
20
30
40
50
Медь
19.3
38.2
56.8
75.2
93.2
Сахар
60
70
80
90
100
Медь
111.0
128.2
145.4
162.2
178.6
366
Лрабииоза
Сахар
'ю
20
30
40
50
Медь
21.2
41.9
62.0
81.5
100.6
Сахар
60
70
80
90
100
Медь
119.3
137.5
155.3
172.7
189.8
Сахар
Ксилоза
Медь | Сахар
Мель
10
20
30
40
50
20.1
39.6
58.7
77.3
95.4
60
70
80
90
100
113.2
130.6
147.6
164.2
180.5
Мальтоза
(таблица составлена для безводного сахара)
Сахар
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Медь
11.2
12.3
13.4
14.5
15.6
16.7
17.8
18.9
20.0
21.1
22.2
23.3
24.4
25.5
26.6
27.6
Сахар
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Медь
28.9
30.0
31.1
32.2
33.3
34.4
35.5
36.5
37.6
38.7
39.8
40.9
41.9
43.0
44.1
Сахар
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Медь
45.2
46.3
47.4
48.5
49.5
50.6
51.7
52.8
53.9
55.0
56.1
57.1
58.2
59.3
60.3
61.4
Сахар
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
Медь
62.5
63.5
64.6
65.7
66.8
67.9
68.9
70.0
71.1
72.2
73.3
74.3
75.4
76.5
Сахар
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
Медь
77.6
78.6
79.7
80.8
81.8
82.9
84.0
85.1
86.1
87.2
88.3
89.4
90.4
91.5
92.6
93.7
Сахар
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
Медь
94.8
95.8
96.9
98.0
99.0
101.1
101.1
102.2
103.2
104.2
105.3
106.3
107.4
108.4
Лактоза
(таблица составлена для безводного сахара)
о«
со
X
со
л
н:
©
S
а
ев
X
сО
hQ
к:
S
л
СО
X
OS
Д
к
О)
Сч
сО
X
сО
л
И
р«
сО
X
сО
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
14.4
15.8
17.2
18.6
20.0
21.4
22.8
24.2
25.6
27.9
28.4
29.8
31.1
32.5
33.9
35.2
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
36.6
38.0
39.4
40.7
42.1
43.4
44.8
46.1
47.4
48.7
50.1
51.4
52.7
54.1
55.4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
56.7
58.0
59.3
60.6
61.9
63.3
64.6
65.9
67.2
68.5
69.4
71.1
72.4
73.7
74.9
76 2
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
77.5
78.8
80.1
81.4
82.7
83.9
85.2
86.5
87.7
89.0
90.3
91.6
92.8
94.1
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
95.4
96.6
97.9
99.1
100.4
101.7
102.9
104.2
105.4
106.7
107.9
109.2
110.4
111.7
112.9
114.1
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
115.4
116.6
117.9
119.1
120.3
121.6
122.8
124.0
125.2
126.5
127.7
128.9^
130.2
131.4
Превосходный иодометрический метод определения сахара см.
«Arch, fur Pharmacie», т. 247, стр. 516, 1909 г,
367
РЕЗОРЦИНОВАЯ РЕАКЦИЯ ФИШЕРА НА УГЛЕВОДЫ
Эта чувствительная реакция нриложима ко ьсем углеводам.
2 см3 слабого водного раствора исследуемого вещества
смешивают с 0.2 г резорцина. Перемешивая стеклянной палочкой
смесь, пропускают через нее газообразную хлористоводородную
кислоту до насыщения и оставляют на 12 час. при комнатной
температуре. Разбавленный раствор нейтрализуют едким натром. От
прибавления нескольких капель фелинговой жидкости раствор,
в случае нахождения в нем сахара, окрашивается в характерный
красно-фиолетовый цвет.
Нерастворимые углеводы, как крахмал, предварительно тонко
растирают, обливают водой и затем поступают, как описано.
ПОЛУЧЕНИЕ ОЗАЗОНО? САХАРОВ
Реактив готовят растворением 10 г фенплгидразина и 10 см*
ледяной уксусной кислоты в таком количестве воды, чтобы
общий объем достиг 100 см3.
При действии избытка этого раствора на сахар образуются
характерные для отдельных Сахаров кристаллы озазонов с
определенной точкой плавления.
Для получения глюкоаааона нагревают на водяной бане в те- ^
чение 1 часа смесь 50 см3 1% раствора глюкозы с 10 см3 реактива. і
Выпадают кристаллы глюкозазоиа. Их основательно промывают
на фильтре сначала водой, а затем 20 см3 метилового спирта.
Высушив кристаллы, исследуют их форму и точку плавления (205°).
РЕАКЦИЯ НА КЕТОЗЫ
1) Р е а к ц"и я Селиванова. Она служит для
обнаружения левулезы (фруктозы) и тех ди-и полисахаридов, в
состав которых входит левулеза (тростниковый сахар, инулин).
Исследуемый раствор смешивают с равным объемом крепкой
соляной кислоты, наполовину разбавленной водой, и прибавляют
крупинку резорцина. При нагревании все кетозы дают резкое
красное окрашивание, а альдоаы обычно только буреют.
2) Реакция Леве (Loewe). К 1 см3 исследуемого
раствора прибавляют в—8 капель раствора орсеина [ Кальбаум (КаЫ-
baum)] и 1 см3 85% раствора фосфорной кислоты. Нагревают до
кипения и выдерживают 10 мин. на кипящей водяной бане. В
присутствии левулезы, смотря по содержанюю последней, наступает
более или менее интенсивное желтое окрашивание, а при
остывании образуется желтый осадок. Прсле нейтрализации жидкости
желтый цвет переходит в оранжевый. Таким путем в 1 см3
жидкости можно определить левулезу в 0.005% растворе. Присутствие
других Сахаров не препятствует реакции.
3) Реакция Пиноффа (Pinoff) и Гуде (Gude).
Нагревание при 40° в течение 15 мин. исследуемой жидкости
368
с концентрированным аммиачно-молибденовым раствором. В
присутствии левулезы получается голубое окрашивание.
Для количественного определения левулезы служит реакция
с дефениламином в спиртово-сернокислом растворе. Окрашенная
жидкость исследуется затем калориметром Генера (Hehner),
Подробности см. —Chem. Ztg. H. 58, S. 625, 1914.
РЕАКЦИИ НА ПЕНТОЗЫ
J) Флороглюциновая проба. При нагревании о
насыщенным раствором флороглюцина в крепкой соляной
кислоте получается вишневокрасное окрашивание (этой реакцией
можно обнаружить примесь древесной массы к бумаге).
2)Орциновая проба. При кипячении с солянокислым
орсином получается сначала фиолетовое, а затем сине-зеленое
окрашивание, исчезающее, если жидкость не охлаждать. Реактив
приготовляют прибавлением 30 см3 воды к раствору 0.5 г орсина
в 30 см3 крепкой соляной кислоты (уд, вес 1.19).
ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ ВРОЖЕНИЯ
Органические кислоты и нейтральные соединения (спиртьт,
кетоны, альдегиды) являются обычными продуктами обмена
у микробов. Анализ нейтральных продуктов должен
производиться после отделения их от других составных частей бражки. За
немногими исключениями (например, глицерин), эти продукты
относятся к легколетучим соединениям. Температура кипения их
самих или же их азеотропических смесей с водой в большинстве
случаев бывает ниже 100 °, и поэтому удаление их из бражки
осуществляется без труда при помощи простой перегонки. В случае
применения небольшого дефлегматора (с 2—3 расширениями)
или при насыщении жидкости хлористым натрием отгонка
облегчается. Объем дестиллята, который необходимо отогнать, чтобы
летучие продукты были удалены практически нацело, зависит от
их содержания в перегоняемой жидкости: чем выше
концентрация, тем больше должен быть объем дестиллята. Примерные нормы
перегонки таковы, считая объем бражки за единицу:
Чтобы сконцентрировать
нейтральные продукты
(укрепить дестиллят), прибегают к
ряду последовательных
перегонок, собирая отгон каждый
раз в круглодонную колбу
подходящего размера и
производя следующую перегонку
непосредственно из нее. На
приемной колбе с помощью
Концентрация
продуктов
(в %)
Объем дестиллята
при
простой
перегонке
при
перегонке с
дефлегматором
при
перегонке
с NaCl
1—3
4—5
6—7
0.4—0.6
0 6—0.7
0.7—0.8
0.3—0.4
0 5—0.6
г
0.3—0.4
0.5—0.6
0.6—0.7
1 При такой высокой концентрации применение дефлегматора не
рекомендуется, так как значительная часть продуктов остается на стенках
дефлегматора.
24 руководство по микробиологи*
369
черты отмечают уровень, до которого нужно собрать дестиллят.
Колба плотно соединяется с холодильником (оставляется лишь
небольшая щель для выхода воздуха) и во время отгонки
снаружи охлаждается.
Перегоняемая жидкость должна быть предварительно
нейтрализована для связывания кислот. С этой целью в отдельной
пробе путем титрования определяют кислотность и, исходя из
нее, в перегоняемую жидкость добавляют по расчету потребное
количество щелочи. Избытка ее следует избегать. Если
брожение шло с мелом, то бражку сначала освобождают от мела путем
фильтрования или декантации. Дополнительная нейтрализация
бывает нужна и в этих случаях, так как с органическими кислотами
мел обычно реагирует не до конца, и жидкость имеет кислую
реакцию.
Для связывания летучих щелочных соединений дестиллят
подкисляют фосфорной кислотой и перегоняют вторично. К
последнему приему прибегают не всегда. Он бывает, например,
необходим при определении количества нейтральных продуктов
по удельному весу дестиллята.
' Отгон с нейтральными продуктами сразу или после нескольких
последовательных перегонок собирают в мерную колбу
подходящей емкости, доводят водой до метки и употребляют для
качественного и количественного анализов. Присутствие спиртов и других
летучих соединений легко заметить уже во время самой
перегонки по появлению как бы жирных капель на стенках верхней
части холодильника. Чем больше продуктов, тем дольше
держатся эти капли. Реакцию можно уточнить, налив немного
бражки в пробирку, закрытую каучуковой пробкой с длинной
стеклянной трубкой (проба Клокера). После осторожного нагревания
на стенках трубки появляются такие же жирные капли, и тем выше,
чем меньше нейтральных продуктов. Качественные реакции на
важнейшие продукты даны в следующем разделе.
Для определения общего количества нейтральных продуктов
сконцентрированный с помощью 2—3 перегонок дестиллят
собирают в пикнометр и находят удельный вес, произведя для этого
взвешивание при определенной температуре пикнометра с дестил-
лятом (а) и пустого пикнометра (Ь). Если объем пикнометра vy
то истинный удельный вес дестиллята при температуре t° будет
равен:
Часто также определяют условный удельный вес — по отношению •
к весу равного объема воды при той же температуре:
тліо g —&
где d — удельный вес воды при температуре t°. При более точных
определениях удельный вес приводится ко взвешиванию в пус-
370
тоте. Зная удельный вес раствора, по таблицам находят
концентрацию анализируемого продукта. Если имеется смесь различных
соединений,™ содержание их выражаютусловно по этиловому спирту,
используя для этого таблицу Генера (Иванов, стр. 366) или
Виндкша (Windisch) (К и з е л ь, стр. 296). * В обеих таблицах
вес выражен по отношению к весу воды при той же температуре
(D та-). Удельные веса встречающихся в брожениях нейтральных
соединений обычно довольно близки (около 0.8).
Вместо пикнометра удельный вес можно определять весами
Мора—Вестфаля (менее точно).
Другой способ определения состоит в том, что укрепленный
(сконцентрированный) дестиллят насыщается поташом, причем
нейтральные продукты высаливаются и собираются сверху в
виде слоя, объем которого может быть измерен. Описание способа
см. ниже — «Метод высаливания нейтральных продуктов». Если
высолилось не меньше 5—10 мл, то слой снимается,
высушивается вторично поташом и подвергается фракционированной
разгонке из маленькой колбочки Вюрца. Температура кипения укажет
на состав нейтральных продуктов брожения.
Помимо вышеуказанного, для количественного определения
спиртов, альдегидов и кетонов в смеси друг с другом и в
отдельности существует еще ряд методов. Так, этиловый спирт в чистом
растворе окисляют хромовой смесью в уксусную кислоту.
Существующие многочисленные методы различаются или составом
окисляющей смеси, или способом определения затраченного
окислителя (см. Fres. Ztschr., 29, 609, 1890; Вег. d. ch. G., 30, 741,
1897; Ch. Z., I, 226, 1898; Journ. Am. ch. Soc, 20, 293, 1898; Ch.
Z., II, 745, 1903; Bl. Soc. Ch. Fr. (3), 35, 330, 1906; Ann. Fals.,
17, 410, 1924; ibid., 18, 235, 1925; Chim. Ind., 589, 1925; Bioch.
Ztschr., 188, 365, 1927; Ann. Fals., 21, 139,1929; Ann. Brass. Dis-
tel., 10/IV, 1932; Journ. Soc. Ch. Ind., 52,239,1933; Bioch. Ztschr.,
278, 30, 1936). В некоторых методах определяют образующуюся
уксусную кислоту (Ind. Eng. Chem., An. Ed., 3, 387, 1931; ibid.,
4, 20, 1932; Ch. Z., I, 758,1935; Analyst, 59, 319, 1934). Ниже
описан один из более точных методов окисления («Определение
этилового спирта путем окисления»). См. также Иванов, стр. 44
и К и з е л ь, стр. 249.
Ацетальдегид обычно определяют способом связывания с
бисульфитом. Определение его в смеси со спиртом см. Bioch. Ztschr., 64,
249, 1914; idib., 89, 390, 1918; Fres. Ztschr., 53, 433, 1914;
Иванов, стр, 46.; К и з e л ь, стр. 250.
Ацетон удобнее всего определять иодоформенным методом
(описание см. ниже). В условиях метода этиловый спирт
реагирует с иодом в 400—600 раз слабее, чем ацетон (J. Am. Ch. Soc,
1 Н. Н. Иванов. Методы физиологии и биохимии растений, изд.
3, Ленинград, 1935; А. Р. К и з е л ь. Практическое руководство по
биохимии растений, Москва—Ленинград, 1934.
24*
»J
19, 316, 1897; Analyst, 41, 245, 1916; J. Am. Ch. Soc, 42, 39,1920;
Ch. Z. II, 864, 1925; ibid., II, 2989, 1926; Ztachr. Anal. Ch., 93,
335, 1933. В виду этого присутствие спирта даже в количестве,
превышающем ацетон в 4—6 раз, не может еще вызвать заметной
ошибки. Метод определения с гидроксиламином см. ОСТ/ВКС 5456
на ацетон химически чистый. В тех случаях, когда ацетон имеется
в виде небольшой примеси к спирту, определение его можно
сделать колориметрически по реакции с салициловым альдегидом
(см. «Качественные реакции на ацетон»).
Определение н.-бутилового спирта основано на окислении
его хромовой смесью в масляную кислоту и отчасти — в уксусную,
по количеству которых вычисляют его содержание. Пользуясь тем
же методом окисления, можно проанализировать смесь ацетона,
н.-бутилового, этилового и изопропилового спирта. При этом
этиловый спирт количественно окисляется в уксусную кислоту, а
бутиловый — в смесь масляной и уксусной кислоты,
соотношение которых при соблюдении определенных условий бывает
постоянно. Изопропиловый спирт окисляется в ацетон. Ацетон
же почти не окисляется, давая лишь немного уксусной кислоты,
на которую при расчетах вносится поправка. Определив
присутствующий вначале ацетон и ацетон, образовавшийся при
окислении изопропилового спирта, и установив количество
образовавшейся при окислении спиртов масляной и уксусной кислот,
можно вычислить содержание каждого из компонентов в
отдельности (см. Ind. Eng. Chem., An. Ed., 3, 387, 1931; ibid., 4, 20,
1932; Ch. Z., I, 758, 1935; Analyst, 59, 319, 1934; Ind. Eng. Chem.,
An. Ed., 7, 180,1935; Journ. Bact.,29, 333,1935; Журнал
прикладной химии, 10, 1314, 1937).
Количественное определение ацетоина (ацетилметилкарбино-
ла) см. Journ. Biol. Chem., 74, 495, 1927).
Глицерин, обладающий высокой температурой кипения,
остается вместе с кислотами в остатке после отгонки других
нейтральных продуктов брожения. При систематическом ходе анализа
летучие кислоты отгоняются с водяным паром (см. ниже
«Определение летучих кислот»), а глицерин снова остается в перегонной
колбе вместе с нелетучими кислотами и другими нелетучими
компонентами бражки. Для дальнейшей очистки используют
нерастворимость глицерина в эфире. Количественный анализ
глицерина — см. Кизель, стр. 113.
Качественные реакции на нейтральные продукты брожения,
Уксусный альдегид (ацеталъдегид); СН3-СОН-Мол. вес 44*03.
Уд. вес. D = 0.782. Т° кипения 20.8°. В воде полностью растворим.
1)РеакцияРиминис пиперидином и нитропруссидным
натрием (см. стр. 286) —голубое окрашивание.
2) Восстановление аммиачного раствора
азотнокислого серебра (почернение).
372
3) Восстановление фелинговой жидкости.
4) Восстановление двухромовокислого
калия; 0,5% раствор этой соли в азотной кислоте в присутствии
альдегида изменяет свой желтый цвет в фиолетово-синий.
5) Реакция Либеыа (Lieben) с йодоформом (см. ниже
(«Ацетон»),
6) Реакция В и н д и ш а. Свежеприготовленный 10%
раствор солянокислого метафенилендиамина в присутствии
альдегида минут через 10 желтеет. Через час появляется зеленая
флюоресценция.
7) Реакция Мёлера (МбЫег). В склянке, емкостью около
1V2 л) с хорошо пришлифованной пробкой, к 150 мл 0.1%
водного раствора фуксина (fuchsin arsenfrei или rubin extra)
приливают 100 мл раствора NaHS03 (уд. вес. 1. 31), хорошо смешивают,
прибавляют 1000 мл воды и затем 15 мл чистой H2S04 (уд. вес
1.84). Часов через 10—12 реактив обесцвечивается. В
присутствии альдегида реактив краснеет; особенно чувствителен
уксусный альдегид.
Другие реакции — см. Кизель, стр. 251; Бернгауэр, стр. 227—
229. і
Этиловый спирт: СН3СгТ2ОН. Мол. вес 46.05. Уд. вес —см.
таблицу. Т° кипения 78.4°. В воде полностью растворим.
1. Реакция Либена. К нагретому до 50—60° раствору
(Ягирта приливают раствор иода в йодистом калии и затем
добавляют избыток едкой щелочи. В виде мути выпадают кристаллики
йодоформа с характерным запахом. При небольшое содержании
спирта помутнение наступает не сразу. В тех же условиях
йодоформ образуется из ацетальдегида и ацетона.
2. При нагревании с уксусной кислотой в присутствии крепкой
серной кислоты образуется уксусно-этиловый эфир с характерным
запахом грушевой эссенции.
3. Высоленный поташом спирт (см. выше «Определение
нейтральных продуктов») при нагревании с хлористым/? — нитробензоилом
в бензольном, пиридиновом или эфирном растворе образует
твердый осадок этил-/?-нитробензоата. Нейтрализовав жидкость
водной щелочью, отгоняют растворитель. Полученный продукт
после очистки употребляется для идентификации спирта. Т°
плавления 57°.
Другие реакции — см. Бернгауэр, стр. 226—229; Кизель, стр.
250.
Н.-бутиловый спирт (н.-бутанол): СН3-СН2-СН2 • СН2ОН.
Мол. вес 74.08. Уд. вес — см. таблицу. Т° кипения 117.8°.
С водой образует азеотропическую (постояннокипящую) смесь
состава: бутанола 62.2%, воды 37.8%. Т° кипения азеотроиа
92.6°. С водой смешивается частично: при 20° растворяет в себе
до 20% воды и сам растворяется в воде при той же температуре
1 К. Бернгауэр. Окислительные брожения. Ленинград, 1935.
Х73
до 7.9%. В присутствии ацетона или этилового спирта
растворимость его в воде чрезвычайно возрастает.
1) Бутиловый спирт обладает слабым, но специфическим
запахом. При вдыхании вызывает кашель.
2) При нагревании раствора н.-бутилового спирта с хромовой
смесью образуется масляная кислота, присутствие которой
легко обнаружить по характерному запаху или по реакции
получения масляно-этилового эфира.
3) В присутствии других нейтральных продуктов
н.-бутиловый спирт удобнее всего обнаруживается по высокой
температуре кипения при фракционированной разгонке смесп
продуктов, высушенной поташом (см. «Определение нейтральных
продуктов»).
Ацетон: СН3СОСН3. Мол. вес 58.05. Уд. вес—см. таблицу.
Т° кипения 56.2°. В воде полностью растворим.
1) Реакция Либена. Образование на холоду
йодоформа при действии раствора иода и какой-нибудь щелочи: едкого
натра, аммиака или соды (общая реакция с уксусным альдегидом;
этиловый спирт дает ее только с кристаллическим иодом или при
нагревании).
2)РеакцияЛегаля (Legal). Свежеприготовленный
раствор нитропруссидного натрия в присутствии едкого натра дает
красное окрашивание, скоро переходящее в желтобурое (от
прибавления уксусной кислоты на короткое время вновь появляется
красное окрашивание). Эту же реакцию получают и с креатини-
ном [реакция Вейля (Weyl), стр. 174].
3) Реакция Рейнольда (Remold). Свежеосажденная
окись ртути растворяется в ацетоносодержащей жидкости и может
быть обнаружена в растворе осаждением сернистым аммонием.
4) Реакция с фуксиносернистой кислотой
(см. «Ацетальдегид»),
В отличие от альдегида, ацетон не восстановляет двухромо-
вокислого калия (см. реакция 4 на уксусный альдегид).
5) Реакция Фромм ер а. К 1 мл раствора ацетона
добавляют 1 мл крепкого раствора КОН (50 г в 100 мл) и 0.5 мл
5% спиртового раствора салицилового альдегида. После
нагревания на водяной бане при 50° в течение 25 мин. появляется яркое
оранжевое окрашивание. Спирт и ацетальдегид этой реакции не
дают. Реакция может быть использована для количественного
определения: с этой целью вместе с испытуемым раствором в тех
же условиях проводят реакцию с чистыми растворами ацетона
известной крепости (0.005 — 0.010%) и полученные окраски
сравнивают колориметрически (см. Коренман, Журн. прикл. химии,
т. 6, 1002, 1933).
Другие реакции см. Бернгауэр, стр. 230 — 232.
Ацетилметилкарбанол (ацетоин): СН3• СО¦ СНОН • СН3. Мол.
вес 88.07. Уд. вев. D % = 1.002. Т° кипения 145°. В воде
растворим полностью,
274
1) К нескольким миллилитрам перегона прибавляют немного
фелинговой жидкости до окраски в светлосиний цвет. Через
несколько мгновений фелингова жидкость восстановляется при
обыкновенной температзфе (т. е. жидкость обесцвечивается, и
выпадает осадок красной закиси меди).
2) К части жидкости прибавляют 1/1о ее объема следующего
раствора: 10 г фенилгидразииа + Ю мл крепкой уксусной
кислоты -\- дестиллированной воды до объема в 100 мл. При нагревании
на кипящей водяной бане в течение 30—40 мин. выпадают желтые
иглы озазона.
3) Реакция Фогеса — Проскауера (Voges—Proskauer). К Змл 1%
раствора пептона Витте прибавляют равный объем 10% раствора
едкого натра. Осторожно приливают на .поверхность этой
смеси 2—3 мл отогнанной жидкости. На границе — красное
кольцо.
, Глицерин: СН2ОН.СНОН.СН2ОН. Мол. вес. 92.06. Уд. вес
1.26. Т° кипения 290°. В воде растворим полностью.
1) При нагревании водного раствора глицерина с борной
кислотой образуется акролеин, легко узнаваемый по характерному
едкому запаху и по потемнению в его парах бумажки, смоченной
азотнокислым серебром.
2) Специфическую реакцию на акролеин дает Вуазенэ (Voisenet).
К 4 мл исследуемой жидкости прибавляют: а) 1 мл 10% раствора
яичного белка (готовится прибавлением 5—7 мл воды к одному
яичному белку) и б) 15 мл крепкой НС1, содержащей N02
(готовится прибавлением 1/10 мл 3.6% раствора KN02 к 200 мл
концентрированной НС1). При нагревании до 50° смесь, при
наличности акролеина, зеленеет. Если акролеина меньше Veuoo? то
жидкость постепенно синеет.
3) Количественное определение глицерина по методу Цей-
зеля (Zeisel) и Танто (Tanto) —см. в «Zeitschr. f. analyt. Chemie»
за 1903г. Глицерин можно обнаружить и следующим простым
способом: 2 капли глицерина смешивают с 2 каплями расплавленного
фенола и 2 каплями H2S04 и осторожно нагревают до 120°;
образующаяся при этом бурая слизистая масса по охлаждении
растворяется в аммиаке с карминовокрасным цветом.
МЕТОД, ВЫСАЛИВАНИЯ НЕЙТРАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ
БРОЖЕНИЯ1
Для анализа берут такой объем бражки, в котором
содержится предположительно не меньше 3—4 г нейтральных летучих
соединений, и путем ряда последовательных перегонок получают их
в чистом растворе крепостью 8—15 весовых процентов. При
перегонках учитываются сделанные выше указания (см. «Опре-
1 Журн. прикл. химии, 11, 539, 1938; Journ. Bact., 14, 399, 1927.
373
деление нейтральных продуктов»). Последнюю перегонку
производят без дефлегматора в бутирометр Бабкока (Babcoock). Этот
последний с успехом может быть заменен особой колбочкой,
приготовленной из куска бюретки. Общий вид колбочки емкостью в
•70 мл показан на рис. 167. В колбочку заранее насыпают
гранулированный чистый поташ из расчета 1 г на 1 мл дестиллята. Поташ
(уд. вес 2.3) займет около 0.3 общего объема колбочки, и на долю
раствора остается 0.7 общего объема («рабочий объем»). Дестиллят
должен стекать по стенке колбочки и проникать на дно под
поташ. Колбочка снаружи все время энергично
охлаждается водой пли льдом. Перегонку кончают, когда
жидкость почти достигнет верхней части шейки.
Тогда колбочку плотно затыкают каучуковой пробкой,
перевертывают и путем встряхивания шаровидной
части добиваются разрыхления поташа и
перемешивания его с жидкостью. Затем колбочку ставят н
стакан с водой поставляют часов на 12—20. Раствор
поташа становится прозрачным, на дне остается
небольшой избыток нерастворившегося поташа, а
в градуированной шейке собираются высоленные
продукты брожения в виде резко отграниченного
слоя. По делениям на шейке измеряют их объем.
Одновременно определяют температуру воды в
стакане. Затем, взяв из таблицы соответствующий
удельный вес и умножив его на объем высоленных
продуктов, узнают их вес.
Следует заметить, что путем высаливания
поташом нельзя добиться полного отделения спиртов
и других соединений от воды: часть их остается в
нижнем слое и, наоборот, в верхний слой переходит
некоторое количество воды. При вышеуказанном
соотношении (8—15 г продуктов в 100 мл раствора)
количество остающихся в нижнем слое продуктов
бывает равно количеству воды, поглощенной
верхним слоем, в результате чего объем этого
последнего совпадает с истинным объемом продуктов. При желании
получить продукты в чистом виде, верхний слой снимают и4
высушивают дополнительно поташом.
Необходимое для анализа количество бражки, емкость
колбочки для высаливания, число и способ перегонок выбирают
согласно сделанным выше указаниям. Например, при
концентрации 1.5—2.5% берут 250 мл бражки в круглодонную колбу
на 700—800 мл и отгоняют из нее 80—85 мл через дефлегматор Вюр-
ца на 2—3 шарика и холодильник Либиха в круглодонную колбу на
200—250 мл, охлаждаемую водой. В последнюю колбу всыпают
20 г NaCl и проі одят вторую отгонку уже без дефлегматора в
колбочку для высаливания на 65—70 мл (рабочий объем 50 мл), в ко1
торую заранее помещают 45—50 г поташа.
370
Рис. 167.
Общий вид
колбочки
для
высаливания на
70 мл
(рабочий объем
50 мл).
Таблице удельных весов ацетона, н.-бутилового и этилового спиртов
Температура (в
град. Ц)
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Удельные веса ( D —-\
Н.-бутиловый
спирт
0.8171
0.8164
0.8156
0.8149
0.8141
й. 8134
0.8126
0.81185
0.8111
0.81035
0.8096
0.8089
0.8081
0.8073
0.8066
0.8058
0.80505
0.8043
0.80355
0.8028
0.80205
Ацетон
0.8015
0.8004
0.7993
0.7982
0.7971
0.7960
0.7949
0.7938
0.7927
0.79155
0.79045
0.7893
0.7882
0.7871
0.7860
0.7849
0.7838
0.7827
0.78155
0.7804
0.7793
Этиловый
спирт
0.7979
0.7970
0.79G2
0.795а
0.7945
0.7936
0.7928
0.7919
0.79Ц
0.7902
0.7894
0.7885
0.787?
0.7868
0.78596
0.7851
0.7842
0.7834
0.7825
0.78166
0.7808
Смесь ацетона.
н.-бутилового
и этилового
спирта в
отношении
3.6:1
0.8105
0.8096
0.8088
0.8079
0.8070
0.8062
0.8053
0.8044
0.8036
0.8027
0.8018
0.8010
0.8001
0.7992
0.7984
0.7975
0.7966
0.7957
0.7949
0.7940
0.7931
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТИЛОВОГО СПИРТА ПУТЕМ ОКИСЛЕНИЯ:
[По Бенедикту (Benedict) и Норрису (Norris), в переработке В. В. Перво-
аванского и Б. Архангельского] 1
Для анализа необходимы следующие растворы:
4) 0.2 N раствор К2 Сг207 (9.8 г в 1л).
2) 0.1 TV раствор соли Мора (39 г FeS04 (NH<)2 S04.6H2Q
п 100 мл концентрированной H9S04 в 1 л).
3) 0.1 N раствор КМпО€ \ЗЛ г ~ в 1л).
'В колбу Эрленмейера на 200 мл вливают 20 мл водного раствора,
содержащего не более 40 мг спирта, добавляют 20 мл раствора
(1), 10 мл крепкой H2S04 (уд. вес 1.84) и, соединив с обратным
холодильником, нагревают на сильно кипящей водяной бане
в течение 15—20 мин. К горячему еще раствору приливают
50 мл раствора (2) и непрореагировавший избыток соли Мора отти-
тровывают 0.1 N перманганатом (раствор 3) до слаборозового
окрашивания.
1 Труды Всес. н.-иссл. пнет, спиртовой промышл., сб. 1, 58—63, 1933 г.
377
В тех же условиях производится контрольное определение,
только вместо испытуемого раствора берут 20 мл дестиллирован-
ной воды.
В основе метода лежат следующие реакции: спирт окисляется
бихроматом в уксусную кислоту, непрореагировавший остаток
бихромата восстанавливается солью Мора, а избыток последней
оттитровывается перманганатом. В контрольном определении,
без спирта, в реакцию с солью Мора вступает весь первоначально
взятый бихромат, вследствие чего здесь избыток "соли Мора
сокращается по сравнению с опытным определением на величину,
эквивалентную количеству спирта. Грамм-эквивалент этилового
спирта при окислении его бихроматом равен 46:4 = 11.5. Отсюда
следует, что 1 мл 0.1 іУраствора отвечает 11.5 : 10 = 1.15мгспирта.
Исходя из указанных соображений, количество этилового
спирта в мг в 20 мл взятого раствора вычисляют по следующей
формуле:
х =(А —Б)-1.15,
где А —количество перманггната (число мл 0.1 N раствора),
затраченное на опытное определение, и В — количество перманга-
ната, затраченное на контрольное определение.
В присутствии других спиртов или альдегидов метод не
пригоден.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЦЕТОНА НО МЕСС ИИГ'ЕРУ — ГУДВИНУ
(Messlnger— Goodwin)1
Метод основан на том, что в щелочной среде из ацетона и иода
образуется йодоформ. Иод дают в избытке, непрореагировавший
остаток его оттитровывают гипосульфитом и отсюда узнают,
сколько иода вступило в реакцию. По количеству
прореагировавшего иода вычисляют количество ацетона, зная, что в этой
реакции ацетон шестивалентен, а поэтому 1 мл O.liV раствора соответ-
ствует = 0.Уо75 мг ацетона.
Для определения употребляется водный раствор ацетона
крепостью 0.2 — 0.4%, что достигают соответствующей перегонкой и
разбавлением. В колбу Эрленмейера на 200 мл с каучуковой или,
еще лучше, с притертой стеклянной пробкой наливают 15 мл IN
щелочи, вливают туда же 5 мл испытуемого раствора и, закрыв
пробкой, оставляют на 5 мин. По прошествии этого срока в колбу
приливают 25 мл '0.1N раствора иода (из пипетки или из
бюретки). Приливание производят тонкой струйкой или частыми
каплями при непрерывном размешивании так, чтобы каждая новая
капля пода немедленно же обесцвечивалась. Добавив иод, колбу
1 Вег. d. chem. Ges , 21. 3366, 1888; Fr. Ztschr. An. ch., 29, 562, 1890;
Journ. Soc. Chem. Ind , 10, 166, 1891; Journ. Am. Gh. Soc, 19, 316, 1897;
vr Ztschr. An. Ch., 35, 503, 1896; Journ. Am. Ch. Soc , 42. 39. 1920; Ch.
Z , I, 602, 1935.
378
закрывают и оставляют на 10—15 мин., после чего в нее вливают
16 мл 1 N H2S04 и освободившийся избыток иода тотчас же отти-
тровывают 0.1 N гипосульфитом. В конце титрования добавляют
в качестве индикатора 0.5—-1 мл 0.5% раствора крахмала.
В тех же условиях проводят холостое титрование, взяв
вместо 5 мл раствора ацетона 5 мл воды.
Расчет производят по следующей формуле^
яс = (4 —В). 0.9675,
где х — количество ацетона в мг, А — число мл 0AN
гипосульфита, затраченное на холостое титрование; Б — число мл O.liV
гипосульфита, затраченное на опытное титрование.
ОТГОНКА ЛЕТУЧИХ КИСЛОТ
Оставшуюся после отгонки нейтральных продуктов в
перегонной колбе нейтральную или слегка щелочную жидкость
подкисляют винной, фосфорной или серной кислотой и летучие
кислоты отгоняют с водяным паром. Винная кислота особенно
пригодна в тех случаях, когда брожение велось в присутствии
мела и жидкость содержит известковые соли, так как осадок
виннокислого кальция хорошо оседает. В этом случае жидкость
из перегонной колбы количественно переносят в мерную
колбу подходящей емкости, добавляют столько винной кислоты,
чтобы освободить кислоты из их солей, и доводят колбу до
метки. Отстоявшуюся прозрачную жидкость через сутки осторожно
сливают с осадка и отмеренный объем ее (100—200 мл) помещают
в колбу для отгонки с водяным паром. При пользовании
минеральными кислотами поступают так же, но подкисление проводят
более осторожно, избегая большого избытка. С этой целью
добавляют в качестве индикатора 2—3 капли насыщенного раствора
меіил-виолета, изменяющего окраску (из фиолетового в зеленый
цвет) лишь под влиянием свободных минеральных кислот.
Для перегонки с водяным паром употребляется (рис. 168)
круглодонная колба с длинной шейкой емкостью в 250—500 мл,
в зависимости от объема жидкости: жидкость должна занимать
не более 1ji — х/з колбы. Колба закрывается каучуковой
пробкой с 2 стеклянными трубками, одна из которых, короткая,
соединяется с холодильником Либиха, а другая, длинная, доходит
до дна колбы и служит для впуска пара. В качестве
парообразователя употребляется или специальный медный (хуже —
железный) аппарат или стеклянная колба на 2—3 л. Помимо
соединения с перегонной колбой, он оборудуется еще длинной
трубкой, доходящей почти до дна. Трубка эта служит
предохранителем против случайного повышения давления. Общий вид
установки показан на рисунке.
Доведя воду в паровике до кипения, соединяют его с
перегонной колбой, содержимое которой предварительно нагревается
379
почти до кипения. Чтобы ускорить отгонку, бывает
целесообразно до пропускания пара перегнать половину объема жидкости
непосредственно на горелке. В течение всей перегонки уровень
жидкости поддерживается приблизительно постоянным, для чего
время от времени колбу подогревают горелкой. Приемником
служат две колбы Эрленмейера на 200—250 мл, подставляемые
поочередно. Собрав в первую приемную колбу 100 мл отгона (на
колбе с этой целью заранее отмечается уровень с помощью черты),
подставляют вторую колбу, в которую также собирают 100 мл,
а в это время оттитровывают первый отгон. Для удаления углекн-
Рыс. J 68. Установка для отгонки летучих кислот.
слоты дестиллят прогревается с обратным холодильником до
начала кипения, холодильник споласкивается и еще горячая жидкость
оттитровывается 0.L/V баритом в присутствии фенолфталеина.
Можно титровать и едкой щелочью, но в этом случае выделение
кислот в чистом виде будет затруднено. Оттитрованный дестиллят,
как и все следующие порции, сливают в общую посуду, а колбу,
не споласкивая, снова подставляют в качестве приемника.
Кислотность отгоняемых порций постепенно уменьшается.
Перегонка считается законченной, когда 2—3 последние порции
будут иметь небольшую (меньше 1 мл 0 1 N) и постоянную
кислотность. Обычно требуется отогнать не менее, чем 15—20 порций.
Затраченное для титрования всех порций количество барита укажет
на общее содержание летучих кислот.
Собранный вместе отгон сгущают выпариванием, добавляют
к нему по расчету такое количество раствора серной кислоты,
чтобы осадить весь Ва в виде BaS04, доводят до точного объема,
фильтруют через сухой фильтр и получают таким путем раствор
380
летучих кислот в свободном виде. Этот раствор употребляется для
качественного и количественного анализов.
Следуау указать, что молочная кислота отчасти летуча с
водяным паром, и поэтому при значительном ее содержании
анализ на летучие кислоты дает преувеличенные результаты. В
подобных случаях необходимо произвести вторичную перегонку.
Здесь очень удобен ускоренный способ отгонки с фосфорной
кислотой вместо кропотливой отгонки с водяным паром. В кругло-
донную колбу на 250 мл помещают 50 мл кислотного дестиллята,
20 г NaH2P04-H20 и 15 мл Н3Р04 (уд. вес. 1.7). Уровень
жидкости отмечается чертой. Отгонку проводят на медленном огне
в мерную колбу на 250 мл, причем через капельную воронку в
перегонной колбе все время поддерживается постоянный уровень
путем добавления воды. Отгонку заканчивают, когда соберется
около 240—245 мл дестиллята, и мерную колбу доводят водой до
черты. Практически все летучие кислоты переходят в дестиллят.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕТУЧИХ КИСЛОТ З&ИРНОГО РЯДА
Полученный чистый раствор кислот употребляется для
качественного и" количественного анализа. Качественные реакции
на отдельные кислоты описаны в двух нижеследующих разделах.
При наличии только двух кислот соотношение их удобно
определить по методу Дюкло или его упрощенной разновидности —
методу Виртанена (Virtanen) (описание их см* ниже). Методы эти
дают также достаточно точные результаты при наличии третьей
кислоты, но в столь незначительных количествах, что ими можно
пренебречь. Вообще же говоря, при трех и более кислотах эти
методы мало пригоды. Если одна из трех кислот —
муравьиная, то она может быть определена непосредственно по
сулемовому методу Финке (Fincke) —Уткина (см. В. Ztschr., 51, 253,
1913; Тр. НИХФИ, 3, 46, 1923; см. также Демьянова,1 стр. 230),
а две другие кислоты определяются в отдельной пробе после
ее разрушения (Иванов, стр. 181; Демьянов, стр. 234). В случае
нескольких кислот может быть применен способ
фракционированного осаждения серебряных солей (см. ниже). Кроме того,
для определения смеси кислот существует еще ряд методов,
основанных или на различной окисляемости кислот, или на
различной растворимости их в органических растворителях.1
Частные реакции летучисо кислот э/сирного ряда
Кислоты, относящиеся к первым членам ряда, легко
растворимы в воде, и каждая из них обладает своеобразным запахом.
1 Н. Я. Демьянов и Н. Д. Прянишников. Общие приемы
анализа растителънык веществ. Мсгкпа—Ленинград, 1934.
1 Бег. d. chera Ges., 46, 1171, 1913; Journ. Am- chem. Soc., 40, 453,
1918; Journ. Bact., 17, 79, 1929, Ind. Eng. ch.; Arf. Ed., 3, 264, 1931; Ana
Be. Agronom. Fr., 2, 504, 1932; Ind. Eng. ch., An. Ed., 5, 247, 1933.
381
В нижеследующей таблице приводятся некоторые данные,
относящиеся к низшим членам ряда.
Формула
СН202
С2Н402
с3н6о2
с4н8оа
с6н10о2
СвН12Оа
Название
Муравьиная кислота .
Уксусная кислота . .
Пропионовая кислота .
( Норм, масляная кислота
\„
\ Изомасляиая кислота
( Изопропилуксусная
¦
или изовалериновая
Метилзтилуксусная
Капроновая кислота .
Строение
Н-СООН
CH..GOOH
CJVCOOH
с3н7.соон
снзч
>сн.соон
сн3/
СН3ч
>сн.сн2.
сн3/
-соон
сн3 ч
>сн.соон
с,н/
СН^СН2)4.СООН
Температура
кипения
101°
118
141
162
154
177
174
205
% Ag в
серебря ной
соли
70.6
63.9
59.0
55.3
51.6
48.4
В качестве реакций для обнаружения отдельных летучих
кислот применяют следующие:
1) Муравьиная кислота. Она редко образуется
в сколько-нибудь значительных количествах при разложении
Сахаров. Характерно быстрое потемнение серебряной соли.
Нагревают до кипения нейтральный раствор соли муравьиной кислоты
с раствором AgN03, причем восстановляется серебро и
выделяется С02.
При обработке муравьиной кислоты раствором К2Сг207
в HN03 получается синее окрашивание. Тёмнокрасное
окрашивание— с хлорным железом (см. Уксусная кислота). Ць.ч-^
ковая соль муравьиной кислоты не растворима в абсолютное,
спирте. Другие реакции —см. Кизель, стр. 255; Бернгауэр,
стр. 225.
2) Уксусная кислота. В нейтральном растворе солей
уксусной кислоты хлорное железо (полуторахлористое железо)
дает тёмнокрасное окрашивание вследствие образования
уксуснокислого железа. При нагревании выпадает буроватый осадок
основной соли. Эту же реакцию дают муравьиная и пропионовая
кислоты. Реакция малочувствительна. После прибавления
равных объемов этилового спирта и крепкой серной кислоты при
нагревании развивается запах уксусноэтилового эфира. От
прибавления AgN03 появляется белая муть, исчезающая при
нагревании и при охлаждении вновь возникающая (белые иглы).
При сухой перегонке кальциевой соли уксусной кислоты в при-
382
сутствии избытка мела образуется ацетон и ацетальдегид,
которые улавливаются небольшим количеством воды. В тех же
условиях из муравьиной кислоты образуется формальдегид и
ацетальдегид. Для обнаружения той и другой кислоты при совместном
присутствии определяют в дестилляте после сухой перегонки
формальдегид и ацетон с помощью специфических реакции:
ацетон —реакцией Фроммера (см. «Ацетон»); формальдегид —
следующим способом: к 5 мл жидкости прибавляют 2 is л
свежего молока и 7 мл крепкой соляной кислоты, содержащей
3 капли 1% раствора хлорного^ желе за. После кипячения в
течение 1 мин. при наличии формальдегида появляется фиолетовое
окрашивание.
3) Пропионовая кислота. Ее основная
свинцовая соль легко растворима в холодной воде, а в кипящей почти
не растворима, отличаясь в этом отношении от свинцовых солей
муравьиной, уксусной и масляной кислот.
4) Масляные кислоты. Масляная кислота узнается
по характерному запаху прогорклого масла, издаваемому при
нагревании ее солей с серной кислотой. При нагревании капли
масляной кислоты с 0.5 мл. 96° этилового спирта и 10 каплями крепкой
H2S04 развивается характерный запах масляноэтилового эфира
(запах ананаса). Для нормальной масляной кислоты характерна
плохая растворимость кальциевой соли в горячей воде.
Насыщенный на холоду водный раствор этой соли при нагревании мутится.
Нормальный бутират кальция кристаллизуется с 1 частицей
воды и содержит ее 7.758%. Изобутират кальция
кристаллизуется с 5 частицами воды и содержит 29.605% ее.
Определение летучих кислот жирного рада по Агулону (Agulhon)
К нейтральному по
. фенолфталеину 1 %
раствору нііриевой
соли летучей кислоты
прибавляют равный
объем серного эфира и
ватем постепенно, кап-
Ля за каплей,
приливают, при
беспрерывном помешивании, 2 %
раствор медного
купороса,
Эфирный слой
бесцветен К раствору
натриевой соли
прибавляют равный объем ук-
сусноатилового эфира и,
по каплям, 5% раствор
полугорахлористого
железа
Эфирный слой
окрашивается в синий цвет.
К раствору натриевой
соли прибавляют
равный объем бензина и,
по каплям, 2% раствор
медного купороса
Эфирный
слой
бесцветен
Эф) ирный
слой
окрашен в
желтый цвет
Бензинный слой
бесцветен
Бензинный слой
окрашен в
синий цвет
Уксусная
кислота
Пропионовая
кислота
Масляная
кислота
Валериановая
кислота.
Капроновая
кислота
383
Ъ) Валериановая кислота характеризуется
сбоям запахом и малой растворимостью в воде. По этому признаку е?
легко отличить от масляной кислоты (1 часть изовалериановой
кислоты при 20°Ц требует для растворения 26.6 частей воды).
б) Следующий член ряда СбНі202 — капроновая
кислота — уже почтя не растворима в воде.
Способ Дюкло для определения летучисс кислот
Способ основан на том, что в слабых растворах летучие
кислоты следуют определенным законам перегонки, характерным для
каждой кислоты.
В небольшую круглодонную колбу, емкостью в 250—300 мл,
вливают точно 110 мл водного раствора, содержащего не более
1—2% летучих жирных кислот, и жидкость подвергают
перегонке, причем отгон собирают отдельными порциями по 10 мл.
Приемниками служат 10 узкогорлых колбочек или пробирок,
калибрированных по 10 мл. Перегонка должна вестись с таким расчетом,
чтобы за 40—45 мин. перегналось 100 мл (10 мл остаются в
перегонной колбе). Для устранения перегревания жидкости на медную
сетку накладывают кусок асбестового картона (с вырезом
посредине) , защищающий боковые стенки колбы от перегревания.
Каждую из 10 перегнанных фракций и оставшуюся в колбе
жидкость титруют известковой водой (насыщенный водный
раствор извести) в присутствии фенолфталеина. Иногда для
титрования предпочитают пользоваться O.liV раствором Ва (ОН)а,
а в качестве индикатора берут лакмус, доводя реакцию до
явственно синего оттенки- Можно также титровать 0.1 N едкой
щелочью в присутствии фенолфталеина.
Суммируя результаты титрований, узнают, сколько
миллилитров щелочи затрачено на 1-ю фракцию (10 мл), на 1 -f 2-ю
фракции (20 мл), на 1 + 2 + 3-ю фракции (30 мл) и т .д. Получен-
ные числа выражаются в процентах к общему количеству щелочи,
затраченной на титрование всех 10 фракций -j-остаток (т. е. 110 мл).
Получают ряд характерных чисел («числа или коэффициенты
перегонки»), по которым можно установить природу кислот и
их количественное соотношение.
Если результаты перегонки изобразить графически,
откладывая по оси абсцисс объем дестиллята и по оси ординат —
содержание в ней кислот в процентах (т. е. числа перегонки), то
после соединения между собою отложенных точек получится кривая
отгонки, характерная для каждой кислоты: для муравьиной и
уксусной кислот кривая будет сверху вогнута; для пропионовой
кислоты получится слегка выпуклая кверху линия, для масляной
и более высоких кислот выпуклость будет увеличиваться все
больше. Для смеси кислот кривая займет промежуточное положение,
В случае смеси высших и низших кислот кривая может
приобрести 5-образную форму.
384
Каждая кислота из смеси кислот перегоняется в
разбавленных растворах так, как будто в ра творе была она одна, т. е.
следуя свойственному ей закону перегонки. Если, например,
мы имеем смесь эквивалентных количеств уксусной и масляной
кислот, то характер перегонки определится числами,
представляющими среднее арифметическое между числами перегонки
той и другой кислоты в отдельности. Предварительная
ориентировка относительно природы кислот производится на основании
качественных проб, обнаруживающих присутствие той или иной
кислоты (см. выше); о составе кислот отчасти можно судить уже
по кривой перегонки.
Приводим числа, характеризующие постепенный ход
перегонки первых пяти кислот жирного ряда (числа приводятся по
Кирову):
Н°
фракций
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Муравьиная
3.3
7.0
10.9
15.1
19-Э
25.1
31.1
38.2
47.1
60.2
Уксусная
5.9
12.0
18.7
25.6
32.7
40.4
Аь 7
57.5
67.6
80.0
Про
пионовая
11.5
22.8
33.5
44.0
54.0
63.3
72.6
81.0
88.5
95.0
Масляная
18.2
34.3
48.7
61.1
71.7
80.6
87.7
93.1
97.0
99.0
Валери іно-
вая
32.0
54.7
71Л
82.6
90.3
95.1
97.8
99.2
99.9
100.0
Чистая пропионовая кислота дает почти те же числа
перегонки, что и смесь равного числа частиц уксусной и масляной кислот.
Для отличия можно воспользоваться следующим простым
приемом. Подлежащую исследованию жидкость перегоняют
наполовину и затем обе половины отдельно исследуют по Дюкло, т. е.
подвергают фракционированной перегонке. Если жидкость
содержала одну пропионовую кислоту, то обе части дадут ту же
картину перегонки. Если же была смесь уксусной и масляной
кислот, то в первой половине отгона будет содержаться
преимущественно масляная кислота, а во второй — уксусная, что и
обнаружится тотчас же перегонкой обеих половин по Дюкло.
Этот же метод предварительного разделения жидкости
перегонкой на две равные части может быть применен и при анализе
сложных смесей кислот, когда непосредственная перегонка по
Дюкло дает неясные результаты.
Соотношение кислот рассчитывается для каждой из 10
фракций в отдельности, и из всех расчетов берлт среднее. Наиболее
точные и верные результаты дают средние фракции (40—70 мл).
25
Вычисление для какой-либо n-ной фракции производится по
следующим общим формулам:
где х —доля высшей и у — доля низшей кислоты (считая их сумму
за единицу), crt— число перегонки для испытуемой смеси, ап —¦
для низшей кислоты, Ъп — для высшей кислоты.
Например, пусть при анализе смеси уксусной и масляной
кислот было найдено, что общая кислотность всех 110 мл равна 80 мл
0.1 гУ, а кислотность суммы первых ¦ пяти фракций (50 мл)
равна 38.6 мл 0.1 Л". Следовательно, число перегонки для итой фрак-,
ции составит
я== 38^100 = 48>3о,.
Отсюда, обращаясь к таблице, мы находим, что доля масляной
кислоты составляет:
_4Я13 —32.7 _ J5.6 п /П
Х — тГ7^32.7 ~~ 3^0 "" U"W*
а доля уксусной кислоты: у= 1—0.4=0.6.
Зная соотношение кислот, не трудно вычислить их
абсолютное количество в 110 мл жидкости: для маслиной кислоты —
0.4-80=32 мл. 0.1 N и для уксусной кислоты—О 6-80 = 48мл 0.1 iV,
или же в весовых единицах: 8.8 32 = 281.6 мг для масляной
кислоты и 6-48 = 288 мг для уксусной кислоты.
Ниже помещены готовые таблицы для анализа смесей кислот.
В этих таблицах для 100 мл. отгона (см. последние столбцы)
даны вышеупомянутые числа перегонок, т. е. кислотность отгона,
выраженная в процентах к общей кислотности 110 мл. Числа для
остальных фракций (от 10 до 90 мл отгона) имеют другой смысл;
они представляют собой кислотность от* она, перечисленную
в процентах к кислотности 10 фракций (100 мл отгона), не
учитывая кислотность остатка в колбе (10 мл).
Способ Впртанена (Ytrtanen) и Нулъппи (Pufkkf)
для определения соотношения летучисс кислот
Этот способ представляет собою упрощенную и уточненную
разновидность метода Дюкло.
Для проведения анализа из отгона кислот (см. выше — «От-*
гонка летучих кислот») берут с помощью пипеток 200 мл,
переносят в сухую колбу Эрленмейера на 300 мл и соединяют колбу с
холодильником, как указано на рис. 169. Изогнутый форштосс
холодильника, имеющий поперечник около 1 см, вста-вляется
непосредственно в горлышко колбы. Жидкость доводят до
кипения и в течение 55—65 мин. отгоняют 2 фракции, каждая точно па
50 мл. Приемниками служат мерные колбы на 50 мл. Каждая
386
Таблииы для смесей кислот
Смесь масляной кислоты с уксусной
Чистая масляная
Аіаслян.
уксус-
ная
АО
8
6
5
4
3 5
3
2 5
2
і 5
1
1
1
1
1
1
і
і
і
1
1
1
Чистая ;
' с1'5
: 2 5
: 3
• 3 5
4
4.5
5
6
8
10
уксусная
10
мл
18.4
17 6
17 3
М 1
16 8
16 1
16 3
16.0
15 7
15 2
14 5
13 4
12 4
11.6
11 0
10 6
10 2
9 9
9 7
9 5
9.2
8 8
8 5
7.4
20
34 7
33 2
32 8
32 3
' j q
31 4
31 0
30.5
29.6
28 7
27 8
',6.0
24 0
22 7
21 7
.0 9
20 3
19 8
19 4
19 1
18 5
17 8
17.4
15.2
30
49 1
47 2
'•6.8
46 1
45 6
44.8
44.3
43 7
42.9
41.7
40 1
37 6
35.1
33 2
31 9
30 6
30 1
29 4
28 Q
28.5
27 8
26.8
26 2
23 4
40
01 7
59 5
58 9
58 2
57 5
56 7
56.1
55.4
54 4
53.1
51 3
48 4
45 4
4* 3
41 8
40 7
39.8
19.0
%8 4
37 9
37 1
tt 0
35.2
32 0
50
72.4
70 7
69 7
fiS 7
68 0
67.1
66.4
65 7
64 7
63 3
61.4
58 3
55 1
52 8
51.3
50.1
49 1
48 3
47 7
47 1
46 2
45 1
44.3
40.9
60
^\ 4
79 1
78 5
77 7
77 і
76 2
75 6
74 9
73.9
72 5
70 6
67 6
64.5
62.2
60 7
59.6
58 6
57.8
57 1
56 6
55 8
54 6
53 9
50.5
70
88.6
86 5
86 0
85 3
84.7
83.9
83 4
82 8
81 8
79.9
78 8
76 2
73 4
71 1
70 0
69 0
68 1
67 4
66 8
66 3
65 6
64 5
6^ 9
60.9
80
94 0
92 4
92 0
91 4
90 9
90 3
89 8
89 3
88 6
87 6
86 3
84 1
81 9
80 3
79.2
78 1
77 6
77 1
76 6
76 2
75 5
74.7
74.3
71 9
90
97 8
96 9
96 7
96 3
96 1
95 6
95.4
с»5.1
94 7
94.0
93 2
91 9
90 5
89 5
88 8
88 4
87.9
87.6
87.3
87 1
86.7
86.2
85,8
84.4
100
01 0
97 3
96 9
96.3
95 Я
95.2
94 8
94.2
9^ 6
92 7
91 4
89 5
87 6
86 3
85.5
84.7
84 2
83.8
83 4
83 0
82.7
82.1
81 7
80.0
Смесь масляной кислоты с муравьиной
Чистая м ісляная
Аіаслян.
иная
ао
5
4
3
2
1
1
1
1
1
1
муравь-
1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
10
Чистая м> равьи-
10
мл
18 4
J7.6
17 0
16 6
16 2
15 3
13 5
11 3
10 0
9 2
8 7
7 3
5 5
20
34.7
33 3
32 1
31.5
30 7
29 2
25 9
22.0
19 8
18 3
17 3
14 8
11 6
30
49 1
47.4
45 8
45 1
43 9
41 9
37 4
32 1
24 1
27 1
25 8
22 5
18 1
40
61 7
59 6
57 7
59 6
55 5
50
72 4
70 1
64 1
67 2
65.8
53 1 65 2
47 8
41 1
38 0
35 7
34 1
30 2
25.1
57 5
50 8
47 0
44 5
42 8
38 6
32.9
60
81 4
7^.1
77 1
76 1
74 7
72 1
66 4
59 6
55 7
53 2
51.5
47 3
41.7
70
88 6
46 4
84 5
83 7
82 3
80 0
74 6
68 3
64 7
62.4
60 8
56 8
51.6
80
94 0
92 3
°0 7
СЮ 0
88 8
86.9
82 4
77 2
74 2
72 3
71 0
67 7
63.5
90
97 8
96 8
95 8
95 4
94 6
92.9
90.5
87 1
84 8
83.7
83 1
81.0
78 2
100
99.0
95 5
92 5
91 2
89 3
86 1
79.6
73 1
69 9
67 9
66 6
63.7
60.2
25*
387
Смесь уксусной кпелоты с муравьиной
У кс, ус н.:
вьиная
10
5
4
3
2
1
1
1
1:
1
і.
мура-
: 1
1
1
1
1
1
2
3
4
5
10
10
мл
7.2
7.1
7.0
7.0
6.8
6.5
6.2
6.0
5.9
5.8
5.7
20
14.9
14.7
14.6
14.5
14.2
13.7
13.1
12.7
12.5
12.3
12.0
30
23.0
22.7
22.5
25.3
21.9
21.1
20.2
19.7
19.4
19.2
18.7
40
31.5
31.1
30.9
30.6
30.1
29.0
27.8
27.2
26.8
26.5
25.9
50
40.3
39.8
39.6
39.3
38.7
37.5
36.1
35.4
35.0
34.7
33.9
60
49.8
49.3
49.1
48.6
48.1
46.7
45.2
44.4
43.9
43.5
42.7
70
60.2
59.6
59.4
59.0
48.3
56.9
55.3
54.4
53.9
53 6
52.7
80
71.3
70.7
70.5
70.1
69.5
68.2
66.8
66.0
65.5
65.2
64.4
90
83.9
83.5
83.4
83.1
82.6
81.7
80.6
80.1
79.7
79.5
78.9
100
78.J
76.7
76.0
75.0
73.4
70.1
66.8
65.1
64.1
63.5
62.0
Смесь валериановой и масляной кислот
Чистая
валериановая
Валериан.:
масляная
10: 1
5: 1
4: 1
3: 1
2: 1
1- 1
1: 2
1: 3
1: 4
1: 5
1:10
10
мл
32.0
30.8
29.7
29.3
28.6
27.5
25.2
22.9
21.8
21.1
20.6
19.6
20
45.7
52.9
51.4
50.7
49.7
48.1
44.7
41.3
39.4
38.7
38.0
36.5
30
71.1
69.1
67.4
66.7
65.1
63.8
60.2
56.5
54.7
53.6
52.8
51.2
40
82.6
80.7
79.1
78.4
77.1
75 7
72.2
68.7
66.9
65.9
65.2
63.6
50
90.3
88.7
87.3
86.7
85.8
84.4
81.4
78.4
76.9
76.0
75.4
74.1
60
95.1
93.8
92.8
92.4
91.7
90.5
88.3
86.0
84.8
84.1
83.7
82.6
70
97.8
96.9
96.2
95.9
95.5
94.7
93.2
91.3
90.6
90.4
90.1
89.4
80
99.2
98.7
98 3
98.9
97.9
97.5
96.6
95.8
95,3
95.1
94.9
94.5
90
99.8
99.6
99.5
99.4
99.3
99.2
98.9
98.6
98.4
98.3
98.2
98.1
100
100
99.9
99.8
99.7
99.7
99.5
99.3
99.2
99.2
99.2
99.1
99.1
фрикция оттитровывается целиком O.liV едкой щелочью.
Кислотность 1-й фракции и 1-f- 2-й фракции выражают в процентах к
кислотности во всех 200 мл перегоняемой жидкости («коэффициенты
перегонки»). Последняя кислотность вычисляется по данным
предварительного титрования.
Коэффициенты перегонки зависят от продолжительности
перегонки, поэтому горелку следует отрегулировать так, чтобы вся
отгонка укладывалась в 55—65 мин. Кроме того, коэффициенты
для всех кислот, за исключением уксусной, несколько меняются
в зависимости от концентрации (в методе Дюкло этими
колебаниями пренебрегают). В виду сказанного, для повышения
точности результатов, сначала делают приближенный расчет
соотношения
Рис. 169. Колба для отгонки летучих кислот.
Название
кислот
Концентрация
кислоты в
перегоняемой
жидкости
Коэффициенты
перегонки
ния кислот, беря из таблицы коэффициенты перегонки дтт тех
концентраций, которые кажутся наиболее близкими к имеющимся в
действительности
концентрациям. У звав ж? ]
таким образом
соотношение кислот, а
отсюда—их действительную
концентрацию (конечно,
с некоторым
приближением), производят
окончательный точный
расчет. По каждой
фракции (50 мл и 100 мл)
производят отдельный
расчет и берут из них
среднее. Расчет делают
по той же формуле,
которая дана в описании
метода Дюкло.
В таблице
приведены коэффициенты
перегонок для
отдельных кислот. Для
промежуточных
концентраций
коэффициенты находят
путем интерполяции.
Пример
расчета: дана смесь
масляной и уксусной
кислот. Кислотность
200 мл равна 40.2 мл
O.liV , кислотность
50 мл дестиллята (1-я
фракция) — 13.3 мл.
0.1./V и кислотность
100 мл дестиллята
(1-я-}-2-я фракции) —
24.0 мл О.Ш.
Для 1-й фракции
коэффициент пере-
13.3-100
гонки с50 = -^2- =
= 33.1° 0. Коэффициенты (по таблице) для уксусной кислоты а50 =
17.2% и для масляной (условно) Ьт = 43 2%. Отсюда вычисляем
приближенное содержание масляной кислоты:
%
Число
M-io.liV
ь 200
мл
для 1-Гі
фракции
для
1-й+ 2-й
фраьции
Муравьиная
Уксусная
Пропио-
новая
Масляная
'
{
(
1
1
V
'
V
0.02
0.07
0.24
0.42
0.53
0.00
O.ol
0.07
0.09
ОДЗ
1.32
0.01
0.16
0.29
0.88
2.29
1
9.8
30.2
101-2
1М.0
230.8
30.0
168.6
17.6
23.0
33.8
357.0
11.6
36.2
66.4
200.0
520.0
10.0
10.2
10.6
10.6
10.8
17.2
17.2
29.9
30.0
30.0
30.6
42.5
43.1
4.1.6
4^.8
44.1
22
22
23
23
24
36.6
36.6
57.5
57.6
57.G
58.5
73.5
74.4
74.8
75.0
75.3
Х =
'50
dj
-SqO _ 33.1-17 2 _ n fi1.
— aj0— 43.2—17.2 —u'Ui>
889
0 61.40.2—24.5 мл O.liV.
Теперь по таблице (путем интерполяции) мы находим истинный
коэффициент перегонки, отвечающий содержанию 24.5 мл 0 IN
масляной кислоты в 200 мл раствора. Он раьен 42.8%. Пользуясь
им, делаем точный расчет:
**> = Ц4ЕіУ = 0.621,
что отвечает 0.621x40.2 =25.0 мл O.liV масляной кислоты в
200 мл раствора.
Подобным же образом производится расчет для 100 мл де-
стиллята:
_24 <М00_5970/ .
С100 ~~лп 9 °^*' 10)
40 2
сюо — аію 59.7 — 36.6
Xl°°""bim —aim-74.0 —Зб.б-"'0101
0 618 х 40.2 =24.8 мл 0.1 N масляной кислоты в 200 мл.
Среднее из обоих расчетов:
25.0 + 24.8 п, 0 Л , Л,
*- = 24.У мл 0.1 /V,
Уксусная кислота вычисляется по разности:
40.2 — 24.9=15.3 мл 0.1 N в 200 мл. раствора.
Определение летучих эюирпъег кислот в виде серебрмнызо
солеи
Способ этот применяется при сравнительно большом
содержании кислот в исследуемой жидкости.
Жидкость точно нейтрализуют содой, аммиаком или
углекислым кальцием. Если берут последний, то жидкость кипятят
и отфильтровывают от избытка углекислой соли.
Нейтрализованную содой жидкость выпаривают на водяной бане до
появления пленки на поверхности и оставляют в покое для
кристаллизации. Полученную натриевую соль, если нужно, перекристалли-
зовывают из слабого спирта и осаждают азотнокислым серебром.
Серебряные соли перекриоталлизовывачгг из горячей воды,
высушивают в фарфоровом тигле при 50—60°Ц до постоянного веса и
взвешивают. Затем тигель прокаливают и определяют вес
выделившегося серебра. По содержанию серебра в соли заключают
о природе кислоты (см табл. на стр. 382).
Со смесями солей получают, естественно, промежуточные
цифры.
Для разделения смесей кислот можно применить способ
фракционированного осаждения серебряных солей, пользуясь их
различной растворимостью в воде.
*9&
Серебро
Растворимость
в 100 частях
воды при 20°
Уксуснокислое 1.037
Проп ионовоь полое 0.836
Маслянокислое 0.485
Взлериановоьиелое , 0.185
Капроновой ислое 0.078
Каприловокислое не растворимо
К растворимым солям (например, баритовым) исследуемых
кислот последовательно прибавляют небольшими порциями
раствор азотносеребряной соли и определяют содержание серебра
в полученных солях.
Определение лимонной, гцавелевой и глюконовой кислот
по методу Пушнеаича (1, 29 4)
Определение лимонной, щавелевой и глюконовой кислот
проводится на основании различной растворимости кальциевых солей
этих кислот.
Выделение глюконовой кислоты. К 50 см3
жидкости добавляют СаС03 в достаточном количестве для
насыщения свободных кислот и нагревают в коховском стерилизаторе.
В виду выделения при этом больших количеств углекислого газа,
следует добавлять мел постепенно, иначе возможны потери
вместе с поднимающейся пеной.
Жидкость фильтруется горячей. В осадке — лимоннокислый
и щавелевокислый кальций, а в растворе — глюконовокислый
кальций.
Определение глюконовой .кислоты
путем выделения ее. После отделения лимоннокислого и
щавелевокислого кальция фильтрат упаривают в вакууме
наполовину и добавляют постепенно при помешивании около трех
объемов 90% спирта. При этом выпавший осадок частью в
аморфном, частью в кристаллическом состоянии отфильтровывается
после нескольких дней. Затем осадок снова растворяется в
горячей воде. Раствор отфильтровывают от содержащегося цитрата
кальция, добавляют около трех объемов 90% спирта и оставляют
стоять. Выпавший кристаллический осадок отсасывается на нуче,
промывается спиртом и высушивается в эксикаторе. Полученный
глюконат кальция содержит еще небольшую примесь цитрата каль-
шія (примесь цитрата кальция можно обнаружить посредством
реакции Деншке). От этой примеси легко освободиться путем
растворения в 30% спирте при нагревании и
перекристаллизации из этого раствора при охлаждении.
Са (СеНи 07)2 содержит 9.30% Са.
Определение глюконовой кислоты по С а.
Глюконовую кислоту мон;нв определить по количеству кальция,
находящегося в растворе. В фильтрате, после отделения лимон-
391
нокислого и щавелевокислого кальция, кальций осаждается
щавелевокислым аммонием. Щавелевокислый кальций определяется
обычным путем титрованием перманганатом.
1 см3 0.1 iVKMn04 соответствует 0.0196 г глюконовой кислоты.'
Разделение щавелевой и лимонной
кислот. Осадок лимоннокислого и щавелевокислого кальция
обрабатывается 2.25% соляной кислотой. Количество соляной
кислоты д^жно быть эквивалентно количеству взятого мела.
Определение щавелевой кислоты. После
нагревания и отстаивания осадок щавелевокислого кальция
отфильтровывается и титруется ХМп04.
1 см3 0 1 N КМп04 соответствует 0.0063 г щавелевой кислоты
(С2Н204. 2Н20).
Определение лимонной и щавелевой пиелот по методу
Ьутпевича— Лерніауера (1, %9 3, d9 5)
Определение щавелевой кислоты. К 20 см3
раствора добавляют 10 см3 уксусной кислоты или 2 см3 20%
соляной кислоты (при употреблении уксусной кислоты вместе с
щавелевокислым кальцием осаждается некоторое количество
лимоннокислого кальция).При подкислеиии соляной кислотой происходит
уменьшение щавелевокислого кальция, который несколько
растворяется.
Нагревают до кипения. Затем прибавляют несколько куб.
сантиметр. 10% раствора СаС12 и снова нагревают до кипения.
При этом выпадает в осадок щавелевокислый кальций,
который оставляют на кочь, после чего осадок отфильтровывают
через плотный фильтр, промывают декантацией и на фильтре
горячей водой. Влажный осадок смыьается с фильтра обратно в
стакан струей горячей воды. Через фильтр в стакан
припускается теплая, разбавленная серная кислота (1:7)до растворения
осадка. Раствор, нагретый до 70°, оттитровывается O.liV раствором
RMn04 до появления слаборозового окрашивания.
1 см3 O.liV K.M11O4 соответствует 0.0063 г щавелевой кислоты
(С,Н204- 2Н20).
Определение лимонной кислоты. После
удаления осадка щавелевокислого кальция фильтрат нагревается до
кипения, нейтрализуется аммиаком, упаривается на водяной бане,
вновь нагревается до кипения и осаждается тройным
количеством 96% спирта. Осадок лимоннокислого кальция
отфильтровывается, промывается 50—60% спиртом и высушивается при 130°.
Определение лимонной кислоты по методу Гартмапа и Хиллига
(Uarttnan and UUlUj) (79 8, 9)
В эрленмейеровскую колбу емкостью около 400 см3 вносится
около 40см3 раствора, содержание лимонной кислоты в котором не
должно превышать 200 мгр (30—125 мг). Затем туда добавляется
S92
10 смя серной кислоты (1*1) и 5 смя бромистого каттия (15 г
бромистого калия на 40 см3 воды). Эта смесь помещается на 5 мин. в
водяную баню, нагретую до 48—50°. После ^того прибавляют сразу
5% раствор марганцовокислого калия в таком количестве, чтобы
сохранилась его исходная окраска (около 50 см3). Жидкость
взбалтывают в закрытой колбе 1 мип. Затем смесь снова помещается
на 4 мин. в водяную баню, температура которой поддерживается
не выше 55°. При окислении необходимо уменьшать давление >
колбе, приоткрывая пробку. В случае недостатка пермангана-
та определение необходимо переделать. После окисления и бро-
мированпя охлаждают смесь в ледяной воде и добавляют (около
20 см3) сернокислого закисного железа, охлажденного в ледяной
воде, до растворения перекиси марганца (40 г сернокислого
записного железа в 100 см3 воды, содержащей 1 см3 концентрированной
серной кислоты). Затем сильно взбалтывают до тех пор, пока не
выпадет в кристаллическом виде пентобромацетон, и помещают
в холодильник на ночь. 3 ітем осадок переносится возможно быстро
на (теклянный фильтр или тигель Гуча и промывается сразу 50 см3
ледяной воды. Отмечают объем фильтрата. Важно, чтобы
фильтрация совершилась ъозможно скоро. Осадок сушат в вакуум-
эксикаторе над серной кислотой и взвешивают. Лучше сушить
осадок в слабом токе сухого воздуха. Для удаления пентабромаце-
тона содержимое тигля обрабатывают тремя порциями спирта по
20 см3 каждая и тремя такими же порциями афира. Тигель вновь
высушивают и взвешивают. Разница двух взвешиваний
представляет вес пентабромацетона.
Лимонная кислота вычисляется по формуле:
X —1.05 (0.424Р f 0.017 S)
Х = мг безводной лимонной кислоты
Р —вес пентабромацетона в мг
S — объем фильтрата в см5
Коэффициент 0.424 соответствует безводной лимонной
кислоте.
Вместо весового способа определения пентабромацетона Коме-
тиани предложил иодометрический метод его учета.
По этому способу осадок растворяется в 96% спирте (25—50 см3).
Раствор после прибавления 5 см3 ледяной уксусной кислоты
нагревается в течение 5 мин. на водяной бане, нагретой почти до
кипения. Затем добавляется 5 см3 йодистого натрия (20% раствор
в 96% спирте) и оставляется на водяной бане еще 5 мин. После
15-минутного стояния при комнатной температуре раствор
разбавляется в 10—12 раз водой и титруется х/ю — ^го^
раствором серноватистокислого натрия.
1 ом-* l/10N раствора серноватистокислого натрия соответствует
3.2 мг безводной лимонной кислиты.
393Г
Примечание. Если в анализируемой пробе содержится
более 1 г сахара и значительное количество других
органических веществ, то необходимо применять осаждение
уксуснокислым свинцом в присутствии спирта.
Качественная реакция на лимонную кислоту Дениже
Приготовление реактива Дениже. 5г
красной окиси ртути растворяют в горячей смеси 20 см3
концентрированной серной кислоты и 100 см3 воды.
В пробирку к 5 см3 исследуемого раствора добавляют 1 см3
реактива Дениже и доводят до кипения. Затем добавляют 5
капель 0.2% раствора КМпО. Смесь обесцвечивается, и в случае
присутствия лимонной кислоты образуется тотчас же муть или
осадок. Осадок представляет cq6oii ртутное соединение ацетон-
дикарбоновой кислоты.
Можно обнаружить меньше, чем 0 0005 г лимонной кислоты.
При больших разбавлениях добавляют только десятую часть
ртутного реактива и 1 каплю перманганата.
Примечание 1. В случае присутствия в растворе
щавелевой и фумаровой кислот выпадает осадок, который
необходимо отфильтровать.
Примечание 2. Яблочная кислота дает тоже реакцию
с реактивом Дениже.
1. Butkewi Hch, Bioch. Zeitschr. 131, 327, 1922. 2. But-
kewitsch, Birch. Zeitschr. 154, 177,1924. 3. Bernhauer, Bioch.
Zeitschr. 172,296, 1926. 4. Иванов H H. Методы физиологии и
биохимии растений. 5. Берн г ay ер, Окислительные брожения.
-6. Deniges, Ann. de Chim et de Phys. (VII), 18, 382, 1899.
7. Hartmann and Hiilig. Journ. of the association of
official agricultural chemist. 13, 99, 1930. 8. Kometiani,
Zeitschr. fur anal. Chemie, 86, 359, 1931. 9. Менжинская Е. и
Трофимова E. Сборник работ лаборатории лимонной
кислоты. Центр, кондит. научно-иссл. инст., вып. 47, 1935.
МОЛОЧНАЯ КИСЛОТА
Она образуется —как побочный продукт —при
разнообразных брожениях и как главный — при молочнокислом. Ее
определению должно предшествовать получение в чистом виде, т. е.
отделение от других продуктов брожения Природу кислоты
характеризуют способ получения и следующие свой тва:
а) оптические свойства свободной кислоты и ее солей и
б) свой тва цинковых солей, для которых характерны:
кристаллическая форма, вращение плоскости поляризации,
содержание воды и растворимость в воде и спирте.
Для качественного распознавания молочной кислоты служат
следующие реакции:
394
1) С п о с о б Уффельмана (Uffelmann). Реактив Уффель-
мана имеет состав:
5% карболовой кип лоты 10 см3
5% рапв)ра пилу горахлористого железа . 2 »
ДестиллированноЙ воды . . . , 2о »
Реактив приготовляют ex tempore; он обладает аметигтово-
синим цветом, который в присутствии молочной кислоты бы тро
переходит в желтый или желто-зеленый. Однако ту же реакцию
обнаруживают и другие органические кислоты: щавелевая,
винная, ябіочная п д,р. Минеральные кислоты совершенно
обесцвечивают реактив Уффельмана Медленное изменение цвета
реактива в желтый может быть обусловлено присут<твием в жидкости
сахара и ф>сфорнокислых солей. Все эти ограничения делают
весьма сомнительным практическое значение этого реактива.
2) Способ Герцога (Herzog). Раствор молочной кислоты
нейтрализуют углекислым серебром и сгущают на водяной бане.
Вьпавшее в осадок молочнокислое серебро нагревают с
небольшим количеством иода в пробирке, закрытой пробкой, через
которую проходит дважды изогнутая длинная трубка, опущенная
концом в пробирку с водой. Под влиянием иода молочнокислое
серебро разлагается с образованием альдегида. Последний
перегоняется и определяется в водном растворе.
Его присутствие открывают реакцией с нитропруссидным
натрием и пиперидином (стр. 286) или другими способами (стр. 372),
3) Способ перевода в альдегид. К 10 см3
раствора молочной кислоты или ее соли прибавляют 10 см3 10%
раствора серной кислоты и, вскипятив, приливают по каплям 2%
раствор марганцевокалиевой соли. Молочная кислота почти нацело
переходит причтом в уксусный альдегид, который узнается по
запаху и по характерным реакциям (см. стр. 372).
4) Способ Беренса. Нейтрализовав молочную кислоту
аммиаком, прибавляют щепотку иттриевой соли. Выпадают в
осадок характерные микроефериты иттриевомилочной соли,
обладающие двойным лучепреломлением.
5) Способ Гопкинса. В пробирку наливают несколько
капель исследуемой жидкости, 5 см3 крепкой серной кислоты и
11 капель насыщенного раствора сернокислой меди. Взболтав,
нагревают в течение 5 мин. на водяной бане при 100°. После
охлаждения прибавляют несколько капель 0 2% спиртового раствора тио-
фена
В присутствии молочной кислоты получается вишневокрасное
окрашивание. С янтарной и лимонной кислотой окрашивания
не получается. С винной кислотой — фиолетовое окрашивание.
При систематическом анализе продуктов брожения1 нелетучие
кислоты находятся в остатке после отгонки спиртов и летучих ки-
сло'і из слегка подкисленной щавелевой кислотой жидкости.
1 См. в статье Пенцкого в «Centraibl. f. Bact.», т. IX, стр. 304, 1891.
395
Выпарив остаток на водяной бане до густоты сиропа, длительно
взбалтывают его с большим количеством эфира, насыщенного
водой. Эфирный слой сливают и, прибавив к нему небольшое
количество воды, перегоняют на водяной бане с обычными
предосторожностями. Оставпшйся в колбе раствор молочной кислоты кипятят
с животным углем, отфильтровывают и исследуют
поляризационным аппаратом.
От избытка щавелевой кислоты п других нелетучих кислот
молочную кислоту освобождают кипячением с окисью цинка или
с углекислым цинком. Выпавший в осадок щавелевокислый цинк
отфильтровывают и фильтрат сгущают на водяной бане досуха.
Полученный осадок перекристаллизовывают из небольшого
количества горячей воды. Если в числе продуктов брожения была
янтарная кислота, она может быть отделена от молочной кислоты
благодаря меньшей растворимости в воде ее цинковой соли.
Отфильтровав жидкость еще раз, исследуют находящиеся в
фильтрате цинковые соли молочной кислоты с целью определить,
какая разновидность находится в жидкости: оптически
деятельная или нет?
Фильтрат выпаривают на водяной бане почти досуха и
оставляют для кристаллизации. Через сутки образуется
мелкокристаллический осадок, состоящий из тонких призматических
кристаллов, часто собранных в розетки. Их отделяют, а к
маточному раствору прибавляют немного спирта, причем
наблюдается дальнейшее выпадение осадка молочноцинковой соли. Ее
перекристаллизовывают из горячей воды. Для облегчения
кристаллизации к воде можно прибавить при охлаждении немного спирта.
Приводим свойства цинковых солей:
Оптически Оптически
недеятельной дся іельных
Формула lCeHfi03)2Zn+3H20 (C3II603)Zn+2H20
% содержание воды* 18.18 1,2. ЬУ
% содержание окиси цинка . . 27.27 29.0*
Растворимость при 1о° .... 1.67% Ь.70%
Вращение плоскости
поляризации 0 +9°
Соли молочной кислоты вращают поляризованный свет в
направлении, противоположном вращению свободной молочной
кислоты, т.е. соли правовращающей кислоты вращают влево, а лево-
вращающей — вправо.
Степень удельного вращения солей увеличивается с
разбавлением.
Для определения отклонения плоскости поляризации
молочной кислоты можно пользоваться также литиевыми ее солями,
вращающими в 10 раз сильнее свободной кислоты (подробности
см. Zeitschr. f. physiol. СЬ., т. 60, стр. 13, 1910).
1 Определяется путем высушивания до постоянного веса при 110°.
306
Для определения молочной кислоты в скиотпем молоке
последнее отфильтровывают через складчатый фильтр и осадок
несколько раз промывают холодной водой. Отфильтрованную
сыворотку вместе с промывными водами выпаривают досуха на
водяной бане, сухой остаток сильно подкисляют фосфорной
кислотой и повторно встряхивают с эфиром при нагревании с
обратно поставленным холодильником. Эфир отгоняют и
оставшуюся сиропообразную желто-бурую массу растворяют в небольшом
количестве воды. Раствор кипятят сначала с углекислым цинком,
а затем с животным углем. Обесцвеченную жидкость
отфильтровывают и фильтрат сгущают на водяной бане; выпадают кристаллы
молочнокислого цинка, которые еще раз перекристаллизовывают и,
собрав на неглазурованной фарфоровой пластинке, высушивают
над крепкой серной кислотой в вакууме. Природу цинковой соли
устанавливают по содержанию в ней воды и цинка, по
растворимости и по отношению к поляризованному свету (см. выше).
КАЧЕСТВЕННЫЕ ПРОБЫ НА ЯНТАРНУЮ КИСЛОТУ
1) Пиррольная проба. К нeбoльшrмv количеству
исследуемой жидкости прибавляют несколько куоических
сантиметров аммиачного раствора и выпаривают в пробирке до объема
в 1 см3. К жидкости прибавляют затем около 1 г цинковой пыли,
впитывающей жидкость. Полученную массу прокаливают на голом
огне. Сначала выделяется аммиак, а затем, когда масса станет
полусухой, начинает выделяться пиррол. Тогда в верхней части
пробирки помещают сосновые стружки, смоченные крепкой
соляной кислотой. Выделяющимися парами пиррола стружки
окрашиваются в красный цвет.
Если янтарная кислота содержится в жидкости в виде солей
щелочноземельных или тяжелых металлов, то к раствору
предварительно прибавляют несколько кристаллов фосфорноаммиач-
ной соли и лишь затем — аммиак или же заменяют аммиак
углекислым аммонием (см. Ze^lschr. f. physiol. Ch., т. 31, стр. 575,
1901).
2) П р о б а с Fe2Cle. Поместив кристалл янтарной кислоты на
часовое стеклышко, прибавляют несколько капель аммиака и
выпаривают досуха. Растворив аммонийную соль в небольшом
количестве воды, прибавляют несколько капель раствора Fe(iCle.
Образуется обильный студенистый осадок янтарнокпслого
железа охряного цвета.
АНАЛИЗ МОЛОКА ПО БЕРТРАНУ И ЪЕЙСВЕЛЕРУ
(«Ann. Past.», т. 20, стр. 977, 190G]
Чтобы избежать ошибки вследствие испарения молока при
выдерживании культуры в термостате, определяют тару сосуда
и точный вес содержащегося в нем молока (100 г). Приступая
к анализу, добавляют к культуре воду до первоначального ьеса.
Z97
При анализе скисшего молока необходимо энергичным
встряхиванием основательно разбить осадок, чтобы получилась по
возможности однородная масса.
1* Определение кислотности
Берут точно 20 г молока и титруют центинормальным едким
натром в присутствии фенолфталеина.1 Так как белковые
вещества молока связывают некоторое количество фенолфталеина, то
к концу титрования не мешает прибавить еще несколько капель
его.
Кроме молочной кислоты, при брожении образуется
обыкновенно в ничтожных количествах еще внутренний эфир молочной
кислоты.
СН8-СН-СО0Н
2СН.-СНОН-СООН= I +Н20.
соо.снон.сн3
Кислотность эфира соответствует половине кислотности
молочной кислоты, из которой он произошел, как видно из
приведенного уравнения. Для определения содержания этого эфира
поступают следующим образом.
К точно нейтрализованному молоку приливают избыток цен-
тинормального раствора едкого натра (5 см3) и молоко оставляют на
полчаса при комнатной температуре. За это время молочный эфир
омыляется щелочью, и обратным титрованием центинормальной
серной кислотой определяют количество щелочи, пошедшей на
омыление. Присоединив это количество щелочи к первоначальному
(пошедшему на титрование свободной кислоты), узнают общее
количество образовавшейся при брожении молочной
кислоты—свободной и в виде эфира. Разумеется, должна быть принята во
внимание и вычтена первоначальная кислотность молока.2
2, Определение жиров гі казеина
Точно взвешивают 10 г молока в небольшом сосуде и
прибавляют 1.5% раствора едкого натра до растворения казеина. На
это идет обыкновенно от 6 до 18 см3, см тря по кислотности
молока. Отметив объем пошедшей щелочи, переливают жидкость в
разделительную воронку с краном. Сосуд ополаскивают 5—10 см3
1 Обычно кислотность молока определяется по Тернеру (см. стр. 215).
2 Определяемая титрованием кислотность бывает всегда больше
действительной, так как щелочью нейтрал ичуется не только свободная и связанная
с казеином кислота, но и кислые фосфаты, а также свободный казеин.
Последний титруют до образования тринатриумказ?ина (в молоке содержится
двуосновное соединение его).
Прибавление воды к одинаковому количеству молока увеличивает
кислотность, так как в раствор переходят фосфаты. Наоборот, в
стерилизованном молоке титрованием определяетсяурньше молочной кислоты, чем в сыром,
так как частичио выпадает трикалъциумфосфат, сьяаьшаклций кислоту.
398
96° спирта и зат^м 10—20 см3 эфира, причем смывные жидкости
сливают в ту же воронку.
Закрыв воронку, осторожно двигают жидкость, стараясь па
возможности привести в соприкосновение оба слоя, но не
эмульгируя жидко ти. Жиры при атом растворяются в эс[ире. Дав
хорошо отстояться обоим слоям, открывают кран и выливают
слегка опалесцирующий щелочной раствор, содержащий казеин.
а) Жиры. Эфирный слой предварительно промывают
несколькими кубическими сантиметрами воды, которую приливают
пипеткой вдоль стенки воронки. Эту промывную воду,
выпущенную через кран, присоединяют к раствору казеина. Эфирный слой
выливают через верхнее отверстие воронки в тарированную
стеклянную чашку. Воронку ополаскивают небольшим количеством
эфира, который сливают в ту же чашку. Эфир испаряют при
комнатной температуре и осадок жиров высушивают при 100° до
постоянного веса.
б) Казеин. Содержащую казеин щелочную жидкость,
вместе с промывной водой, переливают в большую пробирку,
емкостью около 100 см3, и к ней прибавляют по каплям
небольшой избыток 15% уксусной кислоты для осаждения казеина;
жидкость при этом беспрерывно размешивают стеклянной палочкой.
Осадок казеина отделяют пентрофугированием и декантируют
находящуюся сверху жидкость. К осадку прибавляют 50—60 см3
де 'тиллированной воды и вновь центрофугируют; еще раз
повторяют .)ту операцию. Все 3 жидкости последовательно фильтруют
через взвешенный небольшой фильтр. В фильтрате — жидкость,
содержащая весь сахар и растворимый азот (см. ниже).
Оставшийся на дне трубки казеин размешивают с 50—60 смэ
96° спирта и переносят на тот же фильтр. Осадок промывают
сначала небольшим количеством спирта, а затем 25—50 см3 эфира.
При этом промывании казеин дегидратируется, и таким образом
удаляются последние следы жиров. Фильтр с осадком затем
высушивают при 105° до постоянного веса и взвешивают. Из
полученного веса вычитают вес золы.1
Что касается спирто-эфирного раствора, получившегося от
промывания казеина, то его выпаривают в бокале сначала при
обыкновенной температуре, а затем на водяной бане. Взвешивают,
затем осадок смывают эфиром, и бокал вновь взвешивают. Разница
между обоими взвешиваниями указывает на содержание жира,,
которое надо присоединить к найденному ранее.
, 3. Определение растворимого азота
Жидкость, содержащую сахар и «растворимый азот» (см. выше,
б), сгущают на водяной бане в стеклянной чашечке до объема около
1 Если анализируется стерилизованное нагреванием молоко, как обычно
при бактериологических работах, то вместе с казеином в осадке находится
и альбумин.
5 см3 я переливают в баллон с длттнттоГі птейкоА. в котором и
закапчивают выпаривание на водяной баке. Сиропообразную массу
обрабатывают '10 см3 кипящей серной кислоты в присутствии
небольшой капли ртути. Образовавшийся аммиачный азот определяют по
методу Макенна (Maquenne, Bull, de la Soc, Chim. de Paris, т. 21,
стр. 312, 1899).
Все реактивы, которыми пользуются при отом анализе (спирт,
едкий натр, уксусная кислота и пр.), должны быть испробованы
на содержание азота.
4. Определение сахара1
Во взвешенный баллон с двумя метками на 50 и 55 см3 наливают
50 см3 молока и взвешивают. Затем доливают до 55 см3 раствором
сернокислой ртути (на 50 г ртути 17 см3 серной киглоты) б'}0 Сомэ
(в количестве воды до 30 см3). Смешав м >локо с 5 см3 этой жидко ти,
осадок отфильтровывают. К фильтрату прибавляют избыток
цинковой пыли и встряхивают с нею до тех пор, пока не перейдет в
осадок вся ртуть (капля жидкости не должна давать серого пятна
на отполированной медной пластинке). Отфильтровывают и в
фильтрате определяют сахар по способу Бертрана (стр. 303).
Когда это произнедено, приступают к гидролизу молочного
сахара. Для этого 20 см3 отстоявшейся жидкости наливают в
небольшой сосуд с 1 см3 раствора соляной кислоты (22° Бомэ).
Кипятят в течение 45 мин. с обратно поставленным холодильником.
Охлажденную жидкость точно нейтрализуют содой, доводят объем
до 50 см3, отфильтровывают осадок водной окиси цинка и вновь
определяют содержание сахара по способу Бертрана .
Трийя (Trillat) и Сотой (Sauton) (Ann. Past., т. 20, стр. 991,
1906) предлагают способ определения белковых веществ в молоке,
основанный на осаждении их формальдегидом. 5 см3 молока
доливают водой до 25 см3 в колбе вместимостью в 100 см3 и кипятят
в течение 5 мин. Прибавив 5 капель продажного формалин*, вновь
кипятят 2—3 мин. Через 5 мин. прибавляют к жидкости 5 см3 1%
уксусной кислоты при помешивании стеклянной палочкой.
Выпавший мелкий осадок собирают на небольшом взвешенном
фильтре и промывают дестиллироваиной водой. Промывные воды не
должны давать осадка ни с одним из реактивов на белковые
вещества.
Фильтр переносят в экстракционный аппарат. Извлечение жира
производят с помощью ацетона, который извлекает его гораздо
быстрее, чем эфир. Осадок высушивают при 75—80° до постоянного
веса. Осадок — белого цвета, не прилипает к бумаге и не дает
жирного пятна.
1 Качественная реакция на молочный сахар предложена Мллфатти
(Malfdtti). Берут 10 см5 исследуемого раствора и к ним ирионнлнют 5—8
капель 10% едкого натра и 5 см3 Зи/0 аммиака. При легком нагревании
получается роаоьое окраишьашіе.
400
Одновременно определяют и содержание жира путем
выпаривания ацетонового экстракта во взвешенном сосуде.
Простой способ определения сахара в молоке описан Алли-
ком (видоизменен Гинзбергом). К 50 см3 молока, налитого в
измерительную колбу, емкостью в 250 см3, прибавляют 10 см3 фосфор-
иовольфрамовой кислоты (1 часть фосфорновольфрамовой
кислоты и 1 часть крепкой соляной кислоты на 8 частей воды) и доливают
дестиллированной водой до 250 см3. Осадок быстро
отстаивается. Жидкость над ним декантируют или фильтруют и
определяют в ней содержание сахара титрованием фелинговой жидкостью.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ
Концентрация водородных ионов какого-нибудь рэсттю*м
может быть определена двумя методами: электрометрически и
колориметрически.
Электрометрический метод
Этот метод основан на том, что электрод, погруженный в
раствор, содержащий водородные ионы, приобретает некоторый
электрический заряд. Все дело сводится жы.еппо к определению этого
заряда.
Согласно теории электролитической упругости растворения,
предложенной Нернстом, металлы, погруженные в какую-нибудь
жидкость, выделяют в раствор электрически заряженные
атомы, т.-е. ионы. Так как эти ионы представляют собой катионы и,
следовательно, несут на себе положительные заряды, то при своем
выделении они отнимают эти положительные заряды от металла и
сообщают их жидкости. Поэтому металл по отношению к раствору
сказывается заряженным отрицательно.
Во время процесса отделения ионов металла достигается
состояние равновесия, которое зависит, главным образом, от
электростатических сил. В виду того, что величина этих сил,
стремящихся воспрепятствовать отделению положительно заряженных
катионов от отрицательно заряженного металла, чрезвычайно
велика, равновесие достигается очень быстро. Поэтому часто
оказывается, что количество перешедших в раствор ионов
невозможно обнаружить при помощи аналитических методов.
Однако в этом случае, вследствие большого числа ионных
зарядов, возникает разность потенциалов между металлом и
раствором.
По Нернсту, сила, с которой металл посылает в раствор ионы,
называется «электролитической упругостью растворения». Ее
величина постоянна и зависит только от природы металла и
обычно обозначается через Р.
Количество ионов металла, переходящих в раствор или
стремящихся перейти в раствор, зависит прежде всего от величины Р.
26 Руководство по никробкологиа ' 401
Но, кроме того, оно зависит еще от количества находящихся в
растворе ионов того же металла или от их осмотического давления р.
Следовательно, если металл погружается не в воду, а в
раствор какой-нибудь соли того же металла, то достижение
равновесия будет зависеть от концентрации находящихся уже в
растворе ионов.
Из этого ясно, что разность потенциалов
междуметаллом и раствором ( или заряд, который
получает металл) может служить масштабом для
определения концентрации в растворе
ионов того или иного металла, служащего
электродом.
По Нернсту, заряд, полученный металлической пластинкой,
погруженной в раствор соответствующих ей ионов,
определяется по формуле:
где: тг — величина заряда, В — газовая константа, Т —
абсолютная температура, Р — электролитическая упругость
растворения металла, F—количество электричества, связанное с
одним грамм-эквивалентом = 96 450 кулонов, р — осмотическое
давление ионов в растворе.
Уравнение это дает численную зависимость между измеренной
величиной электрического заряда и искомым количеством
ионов в растворе.
Теперь представим себе, что в качестве электрода будет служить
платиновая пластинка, х насыщенная газообразным водородом. В
атмосфере газообразного водорода платина насыщается
поглощаемым ею водородом, вследствие чего превращается в
водородный электрод, т. е. ведет себя по отношению к раствору так, как
если бы мы имели дело с металлической пластинкой, состоящей
из твердого водорода.
Если такой электрод, насыщенный водородом, опустить ь
какой-нибудь раствор, содержащий ионы Н + , то, определяя
заряд этого электрода, мы сможем определить концентрацию
водородных ионов раствора.
Тогда в уравнении Нернста Р будет электролитическая
упругость растворения водорода; р — осмотическое давление ионов
водоро'да. Последнее пропорционально их концентрации с.
Подставляя в формуле Нернста, получаем:
ТГ = 1с — =—- \& ' -1'
В этой формуле тг является зарядом электрода.
Практически измерить непосредственно потенциал одного
электрода невозможно. Для этой цели два электрода соединяются
1 Платина принадлежит к группе так называемых благородных металлов,
402
в элемент, причем потенциал одного электрода должен быть
известен, и уже по разности иотенциалови одному известному находят*
потенциал (заряд), характеризующий концентрацию водородных
ионов.
Если составить элемент из двух платиновых электродов,
насыщенных водородом, погруженных в раствор с разной
концентрацией ионов Н + , то электродвижущая сила или разность
потенциалов выразится формулой:
Так как электролитическая упругость растворения водорода
у обоих электродов будет одинакова, то:
Теперь, если мы в качестве электрода сравнения возьмем
нормальный водородный электрод, т. е. насыщенный водородом
платиновый электрод, погруженный внормальный раствор
водородных ионов, т. е. в раствор, содержащий 1 грамм-эквивалент
ионов водорода в 1 л воды, тогда формула примет такой вид:
„ RT, I RT, 1
? = _0.0581g[H4;-lg[H4 = ^ (при 17°Ц).
Но отрицательный логарифм из концентрации водородныж
ионов условились обозначать через символ рН. Поэтому:
Рн=оіг8(17°Ч)-
Таким образом, рН легко вычислить из последней формулы .
Нужно только всегда помнить, что Е — это разность
потенциалов цепи, в которой одним
полуэлементом является нормальный водородный
электрод, а другим полуэлементом—
водородный электрод в исследуемой жидкости
Это нужно иметь в виду потому, что обычно в качестве
электрода сравнения употребляют не «нормальный водородный
электрод* (употребление его вызывает большие неудобства), а
каломельный электрод, потенциал которого отличается от потенциала)
нормального водорода.
Поэтому при вычислении рН разность потенциалов
(электродвижущая сила), измеренная при помощи каломельного
электрода, перечисляется на нормальный водородный электрод.
Итак, при электрометрическотопределении рН задача
сводится к определению электродвижущей силы элемента, составленного
из двух электродов: одного—погруженного в испытуемую
жидкость, и другого имеющего строго постоянный потенциал. В
качестве второго обычно применяют насыщенный каломельный.
26* М№
Электродвижущая сила этого элемента измеряется по метод
г:омпексации Поггендорфа и сводится в простейшем случае к
следующему.
Берут измерительную проволоку из иридиевой платины вім
длиной и натягивают на горизонтальную деревянную шкалу,
снабженную делениями на миллиметры и подвижным контактом,
так называемый мостик Уитстона. Концы проволоки при помощи
зажимов на концах ее соединяются с полюсами 2-вольтового
аккумулятора. По длине проволоки мы имеем равномерно
убывающий потенциал.
Измеряемый элемент включается в боковую цепь таким
образом, что положительный полюс элемента присоединяется к тому
концу проволоки, к которому подведен -)- аккумулятора, а
отрицательный— через нулевой инструмент с подвижным контактом.
После того как все рключено, двигают по проволоке мостика
подвижной контакт до тех пор, пока не находят такое его положение,
іри котором 9. д. с. (электродвижущая сила) в боковой цепи
сравнится разностью потенциалов между концом мостика и под-
іижным контактом (отсутствие тока устанавливается при помощи *
гулевого инструмента). Тогда, обозначая а. д. с. аккумулятора
через ЕаУ а э. д. с. испытуемого элемента через і? , получим:
Еа, _ 1000
Я*_ аЪ '
о5 аЪ — длина отрезка на мостике от начала шкалы до по-
>жения подвижного контакта.
Если известна э. д. с. аккумулятора, то можно вычислять э. д.с.
следуемого элемента. Но так как о. д. с. аккумулятора не
постоянна, то приходится прибегать к следующему приему:
выключают исследуемый элемент и вместо него включают элемент с
достоянной э. д. с. (обычно кадмиевый нормальный элемент Весто-
•иа с ? = 1.0183 при 20°Ц) и находят вторую нулевую точку
(Ь%) на мостике.
Тогда
Еа «000
Деля' второе равенство на первое, получим:
Е~ аЪ
•х
П
Ew аЬг
у? аЬ Ew
\ е. искомая э. д. с. равна произведению из длины отрезка аЪ
(выжженной в мм) на э. д. с. нормального элемента (выраженную в
вольтах), деленному на длину отрезка аЪи характеризующую ком-
Л04
пенсацию тока нормального элемента; из этого определения
э. д. с. аккумулятора устранена.
Электрометрическое определение можно производить двумя
способами: водородным и хингидронным.
Водородный способ определения рН
При этом способе составляется цепь из двух полуэлементов.,
Одним полюсом в этой цепи служит водородный
электрод, погруженный в испытуемый раствор; другим— к а л о-
MSJ
W
А
к
да
Л
¦V~V-
У
/
У
У
У
н
I
\
\.
-+- А
I
Ь г . /
Рис. 170. Схема соединения отдельных частей
ирибораприводородно-каломельном методе
определения рН.
С—каломельный электрод; W-—водородный электрод; ЛГ —
нормальный элемпіт Вестона; Е — капилляр — электрометр Липмаыа;
/ — ключ; К— переключатель; А — аккумулятор.
м е л ь н ы й электрод. Оба электрода приводятся в
соприкосновение при помощи промежуточного раствора, в качестве
которого служит насыщенный раствор КС1 (для уничтожения
могущих возникнуть диффузионных потенциалов).
Расположение отдельных частей прибора для
электрометрического определения рН видно из схемы (рис- 170).
К левому концу мостика присоединяется + аккумулятора,
+ нормального элемента (N) и каломельный электрод (С).
Отрицательный полюс нормального элемента через контакты
3 и 1 переключателя, капилляр-электрометр*Липмана (или
стрелочного гальванометра) и ключ соединяется с подвижным контактом.
Второй полюс нулевого инструмента присоединяется к
верхнему контакту ключа, а водородный электрод (W) через контакты
40*~>
іі и 1, через нулевой инструмент и ключ соединяется также с
подвижным контактом.
Ход определения. Прежде всего приготовляют
водородный электрод (см. ниже). За несколько минут до начала
определения соединяют концы измерительного мостика с
аккумулятором, чтобы к началу измерения э. д. с. аккумулятора стала
более постоянной (первое время после замыкания тока его
9. д. с. быстро падает).
Когда водородный электрод готов и весь прибор собран в
цепь, включают нормальный элемент Вестона (в дальнейшем
сокращенно Вестон). Для этого переводят ртутный переключатель
на контакты S и 1, которые соединяют нормальный элемент
<с нулевым инструментом и, передвигая подвижной контакт по
мостику и замыкая на короткое время ток при помощи ключа,
находят на мостике нулевую точку для Вестона.
Записывают положение подвижного контакта на мостике,
отсчитывая до сотых долей сантиметра. После этого, переключая на
контакты 2 и 1, в цепь вводят элемент с водородным электродом и
передвижением подвижного контакта и замыканием тока находят
второе нулевое положение. После окончания определения
выключают аккумулятор.
Пример вычисления. Нулевая точка для водородно-
каломельной цепи (а) = 30.25 см. Пулевая точка для нормального
элемента (Ь) = 50.95 см.
По формуле:
^ = Длх=1-0183.|^|1 = 0-6044 V- (1)
да w Ь 50.95 v '
Ех = э. д. с. водородно-каломельной цепи.
Еад = э. д. с. Вестона (при 15°Ц = 1.0183).
Для вычисления рН нужно вычислить, какова была бы э. д. с.
цепи, если бы вместо каломельного электрода в качестве
электрода сравнения служил нормальный водородный. И так ках?
каломельный электрод заражается выше нормального водородного
на 0.2525 V (?° = 15°), то из найденной величины Ех нужно
вычесть эту величину.
0.6044 V
— 0.2525 V ,9.
0.3419 V" '^
рН = оТо57Г(t =ls°c7 ^о^Г = 5'98 (3)
Приборы, примеияющгіеся при электрометрическом
определении рН
Водородный электрод и его приготовление
Существует множество модификаций водородного электрода,
но наиболее употребительным является водородный электрод
Гассельбаха. Устройство его видно из рис. 171.
40в
Перед тем как наполнить его испытуемым раствором,
необходимо предварительно платинированную платиновую пластинку
насытить водородом.
Насыщение водородом этого электрода происходит
следующим образом:
Воронку и отходящую от нее трубку наполняют испытуемой
жидкостью; одновременно с этим жидкостью наполняют и
изогнутую трубку В, после чего закрывают кран F и зажим с. Далее
открывают оба стеклянных крана CnD,
зажим d; одна из верхних боковых
трубок соединяется с кипповским
аппаратом и через прибор пропускается ток
водорода, который после выхода из
кипповского аппарата проходит через
ряд промывных склянок, содержащих:
1) перманганат (прибл. 2%), 2) щелоч-
ный раствор пирогаллола, 3)
концентрированный раствор сулемы и 4) дестил-
лированную воду.
После г/2- или 3/4-часового
пропускания газа электрод насыщается
водородом, затем закрывается зажим d и
открывается зажим С; жидкость
входит в прибор и вытесняет часть
водорода.
Когда конец электрода погрузится
до половины в жидкость, сначала быстро запирают краны С и
D, а затем зажим с и покачиванием сосудика, путем переведения
его из горизонтального в вертикальное положение около 200 раз,
достигают насыщения жидкости водородом. Первую жидкость
сменяют второй, открывая одновременно зажимы end.
Каломельный электрод и его приготовление
Каломельным электродом называется ртутно-каломельный
полуэлемент.
В качестве электрода служит ртуть. В качестве электродной
жидкости — раствор КС1, насыщенный трудно растворимой
каломелью (Hg2Cl2), которая дает ионы" ртути.
Потенциал каломельного электрода зависит от концентрации
хлористого калия в электродной жидкости. Поэтому различают
1/liV, l/10iV и насыщенный каломельный электрод. На практике
чаще всего употребляют насыщенный каломельный электрод
(насыщенный раствор KG1).
На дно сосудика вносится слой хорошо очищенной ртути, так
чтобы она вполне закрывала платиновый контакт. Платиновая
проволочка должна быть предварительноамальгамирована,для чего
ее опускают в 2% раствор сулемы, пропускают ток аккумулятора в
течение 3—4 мин., причем платиновая проволока соединяется с
407
Рис. 171. Водородный
электрод по Гассельбаху.
минусом аккумулятора, а плюсом служит другой платиновый
электрод. Затем проволочка промывается водой и высушивается
оттягиванием воды фильтровальной бумагой.
После отого в фарфоровой чашке тщательно растирают
небольшое количество каломели с насыщенным раствором чистого
хлористого калия: немного подождав, сливают раствор с осевшей
каломели. Все это повторяют несколько раз. Кашицу из каломели
наносят затем тонким слоем на ртуть. Для этого к кашице
прибавляют небольшое количество раствора хлористого калия и
всасывают его через боковую трубку, предварительно укрепив
сосудик в вертикальном положении. После того как каломель хорошо
осела, наполняют сосудик до 2/3 объема, также путем всасывания,
насыщенным раствором KGL
Следует обратить внимание на то, чтобы в боковой
соединяющей трубке не остался пузырек воздуха, иначе прохождение токг
будет очень затруднено или даже совсем преграждено.
Величина потенциала каломельного электрода отличается
большим постоянством. Она отличается от величины потенциала
нормального водородного электрода на величину, зависящую огг
температуры.
Для насыщенного каломельного электрода эта разница
сводится к следующему:
При t° Разница При t° Разница
15° 0.2525 30° 0.242
18 0.2503 35 0.238
20 0.2488 38 0.2350
25 0.2458 40 0.234
»
Нулевой инструмент. В качестве нулевого
инструмента пользуются капилляр-электрометром Лимпана или
чувствительным стрелочным гальванометром (как показал опыт,
работа с последним гораздо удобнее).
Капилляр-электрометр Липман а—сосуд
(форма изображена на рис. 170) в обоих коленах которого ртуть
преходит в соприкосновение с разбавленным раствором серной
кислоты. Он устроен таким образом, что-наличность малейшего тока
вызывает изменение поверхностного натяжения в мениске ртутл
узкого колена и, следовательно, его передвижение в капилляре
прибора, наблюдаемое в горизонтальный электрометр, и всегда
должен быть замкнут на себя.
Если электрометр потерял несколько свою чувствительность,
можно освежить поверхность ртути в капилляре, перелив
несколько капель ртути из одного колена в другое.
Хипгидроппый способ определения рН
Описанный выше водородный метод электрометрического
определения рН имеет и методически и по существу основное значение.
Однако он громоздок и страдает некоторыми другими недостатками
40S
В связи с этим в последние годы чрезвычайно большое
применение для электрометрического определения рН получила
модификация этого метода, основанная на применении введенного
Вильманом в лабораторную практику так называемого хингид-
ронного электрода.
Метод этот чрезвычайно прост, так как нет надобности
насыщать водородом электрод, а ч вместо него в испытуемый раствор
прибавляется щепоточка (на кончике ножа) хингидрона.
Неудобство этого метода состоит в том, что область
применения хингидронного электрода уже водородного; при помощи
хингидронного электрода молено измерять рН до 7.8; в условиям
большей щелочности (рН=8.0)онуже не приемлем, так как
происходит разложение хингидрона.
Хингидрон — вещество, мало растворимое в воде, но
перешедшая в раствор часть хингидрона распадается на 1 часть хинона и
1 часть гидрохинона. Между хіщоном и гидрохиноном протекаеі
обратимая окислительно-восстановительная реакция:
С6Н4(ОН)2^С6Н402 + Н2.
Хингидрон, распадаясь на равное количество хинона и
гидрохинона, поддерживает ее на постоянном уровне. Поэтому и
концентрация молекулярного водорода все время остается постоянной.
Следовательно, платиновый электрод, опущенный в раствор
хингидрона, действует как водородный электрод с
чрезвычайно низким, но постоянным давлением водорода, а следовательно,
его потенциал зависит от концентрации водородных ионов (Н+) в
растворе.
Но отношению к водородному электроду хингидронный
заряжается положительно, и его потенциал = 0.7042 (fc°=18°).
Влияние температуры на потенциал хингидронного
электрода выражается простой зависимостью:
Ht = 0.7175 — 0.00074 t,
где П^ — потенциал, измеренный при данной t°.
При измерении рН при помощи хингидронного электрода ж
качестве электрода сравнения также употребляется насыщенный,
каломельный электрод.
При этом при рН = 6.35 потенциал становится равным нулю;
для более кислых растворов он будет иметь положительное
значение, а для более щелочных —отрицательное.
При хиигидронном методе определения рН вычисляется по
формуле:
тт 0.4541 — Е
где Е — находимая из опыта электродвижущая сила цепк
хингидронный электрод — каломельный электрод.
405
Когда Е будет иметь отрицательный знак, тогда вместо
вычитания Е складывается с 0.4541.
Схема электрометрической установки
при хингидронном методе принципиально не отличается от уста-
лніки, описанной для водородного метода определения.
Разница только та, что при хингидронном методе цепь «хингидронный
Рис. 172. Схема соединения отдельных частей
прибора при хингидронном методе
определения.
АВ— лоетик, 77 — подвижной контакт, Alt—аккумулятор»
W— вестов, кал — каломельный алектрод, ИеП. —
хингидронный электрод, ПК — переключатель. Способы включение
(пунктирные линии на ,,ПК'*). 2—выключен один вестон,
2 — включена испытуемая цепь, 3 — испытуемая день
включена последовательно с вестоном,
электрод —каломельный электрод» включается не самостоятельно,
как при водородном методе определения рН, а последовательно
с нормальным элементом Вестона (схема — рис. 172).
При этом включении положительный полюс Вестона
присоединяется к левому концу мостика (куда присоединяется и плюс
аккумулятора), а отрицательный полюс Вестона соединяется или
с испытуемым или с каломельным электродом; второй электрод
цепи (не соединенный с минусом Вестона) присоединяется через
ключ и нулевой инструмент к подвижному контакту мостика.
Это делается потому, что, как указано выше, при рН =6.5
потенциал равен нулю (в цепи не будет тока), а при изменении
знака придется в ходе определения переключать электроды
(положительный полюс всегда должен быть присоединен к плюсу
аккумулято р а),
Ход определения. К нескольким куб. сантим,
испытуемого раствора прибавляют щепоточку (на кончике ножа) хингид-
рона, тщательно перемешивают в целях насыщения раствора
410
хиитидроном и погружают в раствор платиновый электрод (непла-
тинированный).
При помощи сифончика, наполненного агаром,
приготовленным на насыщенном растворе КС1, испытуемый раствор
соединяется с каломельным электродом.
Измерения производят так же, как и при водородном методе;
сначала включают в цепь один Вестон (соединение 1, рис. 172)
и находят на мостике нулевую точку; затем включают в цепь
Вестон + измеряемую цепь (соединение 3, рис. 172) и находят
вторую нулевую точку.
Пример вычисления:
Данные опыта. К отрицательному полюсу присоединен
электрод;
нулевая точка при включении одного Вестона = 52.50(a);
» » цепи Вестон -\- испытуемая цепь = 35.60(b).
Вычисление:
1) Е= Ej^ = 1.0183 V52-5^~n5'5° = + 0-329 V;
a
2) рН =
0.4541 — Е
0.058
52.50
0.4541 — 0.329
0.058
2.33.
Колориметрический метод
В основе колориметрического определения рН лежит свойство
целого ряда веществ, так называемых индикаторов, изменять
свою окраску в зависимости от изменения рН растворов.
Для каждого индикатора можно указать характерную для
него зону рН, в пределах которой он дает переход окраски; вне
этой зоны индикаторы принимают свою (уже постоянную)
кислотную и щелочную окраску.
Для колориметрического определения рН необходимо иметь
серию индикаторов с соприкасающимися зонами, так чтобы она
охватила всю амплитуду рН от 0 до 14.
Основная серия индикаторов по Кларку и Лебсу
Ходовое название
Тимоловый синий
Бромфеноловый синий
Метиловый красный
Бромирезоловый пурпуровый
Бромтимоловый синий
Феноловый красный
г)езоловый красный
1ИМОЛОВЫЙ СИНИЙ
Крезолфталеин
Район
применимости
рН
1.2—2.8
3.0—4.6
4.4—6.0
5.2—6.8
6.0—7.6
6.8—8.4
7.2—8.8
8.0—9.6
8.2—9.8
Окраска при
переходе от кислой
к щелочной
красно-желтая
желто-синяя
красно-желтая
желто-пурпурная
желто-синяя
желто-красная
желто-синяя
бесцветно-красная
Концентрация
в %
0.04
0.04
0.02
0.04
0.04
0.02
0.02
0.04
0.02
411
Для определения рН в биологических жидкостях достаточно
иметь серию индикаторов по Кларку и Лебсу (см. табл. на
стр. 411).
Существует несколько модификаций колориметрического
метода определения рН* Приводим основной.
Еолориметрическнй метод с применением буферных
смесей
Метод основан на сравнении окраски индикатора в
исследуемом растворе со шкалою его переходных тонов, полученной путем
прибавления того же самого количества индикатора к ряду
стандартных растворов, соответствующих по своему рН интервалу
индикатора.
Ход определения. Прежде всего находят
подходящий для данного случая индикатор, дающий с испытуемым
раствором переходную окраску. Вместе с этим определяется и
приблизительный район рН.
Остановив свой выбор на определенном индикаторе,
составляют служащую для сравнения шкалу.
Отбирают несколько одинаковых пробирок из бесцветного
стекла, которые при заполнении их 10 см3 имеют одинаковую
высоту столба. В каждую пробирку наливают одинаковый объем
стандартного раствора (приготовление см. ниже) с разным рН.
На- каждой пробирке обозначают рН стандартного раствора, и
все пробирки помещают на штативе соответственно их рН. Затем,
в такую же пробирку отмеривают такой же объем испытуемого
раствора и ко всем растворам быстро прибавляют одинаковое
количество индикатора (несколько капель). Осторожно
взболтав растворы, ищут для испытуемого раствора подходящее место
в шкале, для чего одно гнездо в штативе должно остаться
свободным. Пробирку с испытуемой жидкостью помещают в то место, где
ее окраска является промежуточной между двумя пробирками или
совпадает с одной из них. Зная рН раствора, который по окраске
совпадает с испытуемым, узнают рН последнего.
В случае окрашенности или неполной прозрачности
испытуемого раствора за каждой пробиркой со стандартным раствором
помещают вторую с испытуемым раствором без индикатора; а за
пробиркой с испытуемым раствором помещают пробирку с де-
стиллированной водой. Ясно, что свет, пройдя через две пробирки,
претерпит вполне сравнимое изменение как в буферных смесях,
так и в испытуемом растворе. Определение в этом случае
проводится с помощью так называемого компаратора.
Приготовление стандартных растворов.
Для стандартных растворов применяются так называемые
буферные растворы.
Характерной чертой буферных растворов является их способ-,,
ность противостоять изменениям рН (например, при приливанип
кислоты или щелочи). Чем больше способность какого-либо рас-
412
твора противостоять смещению рН, тем больше его «буферность».
Такими растворами являются смеси слабых кислот и их осно.-
вания. Каждая пара веществ (кислота 4* соль этой кислоты)
обнаруживает буферное действие в определенных пределах рН,
например, смесь СН3СООН и CH3GOONa обнаруживает свое
буферное действие в пределах 3.6—5.5.
Не останавливаясь на выведении формулы, укажем, что концен-
трация водородных ионов такой смеси[Я+]=^К А где К—кон-
станта диссоциации кислоты, Сх—концентрация кислоты, Сг —
концентрация соли.
Как видно из формулы, концентрация водородных ионов
такой смеси не зависит ни от концентрации кислоты, ни от
концентрации соли, а только от отношения их концентраций, а потому
характерной для буферных растворов является их способность
противостоять изменению рН даже при многократном их
разведении.
Каждая буферная смесь обнаруживает свое действие в
определенных пределах рН. Наибольшее буферное действие проявляет
такой раствор , когда С1=С2, т. е тогда, когда [Н+] численно
равняется константе диссоциации кислоты.
В іхачеств? буферных смесей употребляют смеси, различных
кислот с их солями в зависимости от пределов рН, которое нужно
определить. Наиболее употребительными буферами
колориметрического определения рН в биологических жидкостях являются
фосфатные буфера, т. е. смесь одно замещенного и двузамещенного
фосфата (КНаР04 и К2НР04 или NaH2P04 и Na2HP04).
Наибольшее буферное действие эти смеси проявляют в пределах рН 5.8—•
7.6. Для получения ряда буферных смесей приготовляют отдельно
1/15 м раствора КН2Р04 и К2НР04,а затем смешивают их в
следующей пропорции:
КН<>Р04__ 8 1 1 A JL 1 1
К2НРО*— Л 1 1 ' і ' 1 ' 2 ' 4 ' У
рН = 5.8, 6.1, 6.4, 6.7, 7.0, 7.3, 7.6,
т. е. получается серия растворов с рН, отличающихся друг от
друга на 0.3.
Смеси приготовляют на воде, предварительно освобожденной
от С02. Для этого дестиллированную воду кипятят, а затем
охлаждают в сосуде, защищенном трубкой с натронной известью,
вставленной в пробку,
рН приготовленных растворов проверяют электрометрически.
ЭЛЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА
Современное изучение влияния различных факторов на
организм развивается в том направлении, чтобы отличить общий запас
фактора от его активной части.
?13
По отношению к кислотности и щелочности эта задача
разрешена введением методики определения активной концентрации
водородных ионов (рН).
Подобно этому в последние годы все больше и больше
приходят к убеждению,что для понимания
окислительно-восстановительных процессов и влияния окислительных свойств среды на
организм недостаточно учитывать только «общую окисляемость»
среды, например титруя ее с перманганатом.
Для характеристики окислительно-восстановительной
способности среды необходимо еще определять способность этой
среды восстанавливать или окислять соприкасающиеся с ней
объекты.
В этом отношении выяснилась такая же разница, как между
«активной» и «общей» кислотностью растворов, т. е. между рН и
концентрацией кислоты, определяемой титрованием.
Окислительно-восстановительным потенциалом (в
дальнейшем сокращенно О-В потенциал или, как его обозначают Eh)
называется тот потенциал, который получает электрод из
благородного металла, если его погрузить в раствор, содержащий смесь из
окислителя и восстановителя, например F++ и F+ + + .
Eh — величина, характеризующая напряжение О-В
способности данной среды и, следовательно, дающая указание, в каком
направлении пойдет реакция, если данный раствор смешать
с другим раствором, с иным Eh. Именно, если О-В потенциал
одного раствора {Eh) больше О-В потенциала другого раствора
[Eh2), то первый раствор будет окислять второй, сам же он будет
восстанавливаться; процесс этот будет продолжаться до тех пор,
пока смесь обоих растворов не примет какой-то промежуточный
О-В потенциал.
Основная формула для выражения О-В потенциала:
?ь — ?* + 7ГЯ1п\ШГ
Еп—потенциал электрода в вольтах, R —газовая константа,
Т — абсолютная температура, F —количество электричества,
связанное с одним грамм-эквивалентом, т. е. 96500 кулонов,
п — валентность реагирующего вещества. [Ох] — концентрация
окислителя, например F+ + + y [Red]—концентрация
восстановителя.
Е0 — так называемый нормальный потенциал; это тот
потенциал который примет электрод, когда он будет погружен в
раствор, содержащий равные молекулярные количества окислителя
и восстановителя, т. е. когда [Ox]=[Red].
Как видно из формулы, О-В потенциал раствора зависит
прежде всего от свойства и отношения концентрации растворенных
веществ.
Но в каждой естественной среде, особенно в живой няазме,
существует мноя^ество различных окислителей и
восстановителе
лей. Здесь окисная форма водорода, т. е. пон водорода и водород
молекулярный, здесь и окись и закись железа, а также различные
другие органические и неорганические соединения. Они все
вместе определяют тот потенциал, до которого заряжается электрод,
когда мы его вносим в среду. О-В потенциал характеризует
среду не в отношении активности одной какой-нибудь О^В нары,
а дает результирующую всех О-В активностей.
Но какую же окислительно-восстановительную пару мы
вставим в формулу, чтобы выразить Еп этой среды.
Как учит физическая химия, в среде, в которой
устанавливается физико-химическое равновесие, имеет место следующее
отношение:
[H4_[F + + 4_[Mn+ + +]
[HJ — [F++] |Mn++] "*•«¦*
г. е. отношение количества окисной формы к количеству закисной
формы того же вещества будет одинаковым для всех. Поэтому
для характеристики среды в О-В отношении можно ограничиться
одной парой. Так как в каждой водной среде обязательно имеются
гсоны водорода, то О-В потенциал любой среды удобно выражать
именно через эту пару.
[H+]f
Как выше было указано, О-В потенциалом называется тот
потенциал, который получает пластинка из благородного металла
при погружении ее в данную среду. Так как мы не можем измерить
потенциал одного отдельного электрода, а определяем всегда
разность потенциалов между двумя электродами, то при
определении О-В потенциала приходится поступать так же.
Если мы О-В потенциал будем определять по отношению к
нормальному водородному электроду, мы получим такое вы-
ражение:
Подставив для К, Г, F их числовые значения, мы имеем при-
t° = 18° {Т =* 273 -Jr 18) выражение;
Из этой формулы видно, что Еь зависит, с одной стороны, от
концентрации ионов водорода (числитель дроби), с другой — от
концентрации атомного водорода.
Как известно, отрицательный логарифм концентрации
водородных ионов обозначается через рН. Соответственно
отрицательный логарифм концентрации молекулярного водорода,
выраженного в атмосферах, можно обозначить символом гН2.
41&
После этого формула принимает еще более простой вид:
Еь =-0.029 (гН—2рН),
гН — отрицательный логарифм величины, которая
соответствует давлению водорода в растворе.
Чем больше концентрация водорода в растворе, тем сильнее
эго восстановительная способность.
Величина концентрации водорода выражается обыкновенно
в атмосферах и, подобно концентрации водородных ионов,
выражается через степени 10 (например, 1 атмосфера = 10°). И точно
так же, как для выражения концентрация водородных ионов, и
здесь употребляют не самую ее величину, а отрицательный
логарифм.
Так, например, в растворе, насыщенном водородом под
атмосферным давлением, [Н2]=1 атм. =40°, гН==0.
В растворе, где концентрация водорода будет = 1037, гН = 27.
Ясно, что восстановительная способность раствора тем
больше, чем меньше гіі.
Eh определяется непосредственно из опыта, т. е. электрод из
благородного металла погружается в испытуемую среду, и
измеряется разность потенциалов (электродвижущая сила) между
ним и каломельным электродом.
Из наблюдаемой разности потенпяалов вычисляют, какова
была бы разность между потенциалом электрода в испытуемой
жидкости и так называемым нормальным водородным электродом.
Полученная величина и есть О-В потенциал данной среды,
или Eh (буква h в этом символе как раз и обозначает, что потенциал
измерен по сравнению с нормальным водородным электродом),
гіі вычисляется по формуле после предварительного
определения Eh и рН.
Электрометрический метод
определения^ чрезвычайно прост и по технике ничем не отличается от
электрометрического определения рН. Наоборот, определение
О-В потенциала з*пР01и.ается тем? чт0 нет надобности в
насыщении электрода водородом или прибавлением хингидрона, как при
определении рН.
В испытуемую жидкость погружают электрод пз
благородного металла, например платины. Этот электрод соединяется в цепь
о каломельным электродом при помощи изогнутой трубки (сифон-
чика), заполненной агаром, приготовленным на насыщенном рао+
творе КС1.
Все дело сводится к определению разницы потенциалов
(электродвижущей силы, сокращенно э. д. с.) этой цепи.
Измерение электродвижущей силы такой цепи (испытуемая жйд-
кость — каломельный электрод) производился точно так Щ$я
416
как и при электрометрическом определении рН, при помощи
компенсационного метода Погтендо'рфа.
Полученная непосредственно из опыта величина потенциала
(Ех) перечисляется на нормальный водородный
где Еа — разница в величине потенциалов нормального
водородного и каломельного.
(Выражение это является алгебраической суммой, а потому,
когда Ех будет иметь отрицательный знак, то Ес будет вычитаться).
Сборка прибора такая же, как при хингидронном
методе определения рН, т. е. цепь «испытуемый электрод —
каломельный электрод» включается не самостоятельно, как при
водородном определении рН, а последовательно с нормальным элементом
Вестона (см. схему 172 на стр. 410).
При таком соединении, из показаний мостика сразу видно,
является ли измеряемый электрод положительным или
отрицательным.
Если, например, с минусом Вестона соединен испытуемый
электрод и при измерении оказалось, что э. д. с. такой составной цепи
меньше э. д. с. одного Вестона, то, значит, испытуемый электрод
отрицателен по отношению к каломельному.
Примеры вычисления:
1-й случай. Минус Вестона соединен с каломельным
электродом.
а) Данные опыта:
Мт—нулевая точка одного Вестона = 520.
М —нулевая точка цепи Вестон 4- измеряемая цепь = 320.
«=18°Ц.
Таккак il/wa?<ilf w,to каломельный электрод отрицателенпо
отношению к испытуемому, т. е. последний будет иметь знак плюс.
б) Расчет:
й Е = Д^М» —М^ = 1Л183(520-320) = ^ Q.392'V.
2) Eh = Ex—Ec = 4-0.392-f 0.2503 = +0.642 V.'
рН = 6.83 (отдельное измерение)
3) гН = <Ж + 2РН = OS + 2-6.83 = 35.80.
Если при этих же цифровых данных минус Вестона был бы
соединен с испытуемым электродом, то последний был бы
отрицателен по отношению к каломельному и имел бы знак минус.
Тогда:
?л = —0.392 + 0.2503 = —0.142 V.
гН = —g^|| 4-2-6.83=8.76. *
27 Руководство по микробиологии ?17
2-й случай. Минус Вестона соединен с каломельным электродом.
а) Данные опыта: A/^—810; Afw=520.
t°=17°. Так как при этом М№Д?>М^, то, значит, каломельный
электрод положителен по отношению к испытуемому, и последний
будет иметь знак минус.
б) Расчет:
Ех = - 1-ОШ (810-520) __ 0 568 у
Eh = — 0.568 + 0.2509 = — 0.317 V.
'Н = -0-^ + 2.6.20=1.47.
Электроды и их приготовление. Для
электрометрического определения Eh в биологических жидкостях
употребляют платинированные платиновые электроды, т. е. покрытые
платиновой чернью.
Для приготовления электродов берется платиновая
пластинка размером в 0.5x0.5 = 0.25 см2. К ней припаивается небольшой
кусок платиновой проволоки толщиной в 0.3 мм. Другой конец
проволоки впаивается в стеклянную трубочку, в которую для
контакта наливается немного ртути.
Платинирование электродов. Прежде всего
необходимо очистить электроды с H2S04 и хромовой смесью.
После обработки хромовой смесью электрод хорошо
промывают с дестиллированной водой и некоторое время оставляют его
в воде.
Платинирование производят электрометрическим путем. В
раствор хлорной платины (3 г хлорной платины растворяют в 100 см3
воды и прибавляют туда 0.02 — 0.03 г уксуснокислого свинца)
вставляются два электрода: один—постоянный,
второй—платинируемый. Последний соединяется с отрицательным, а
постоянный — с положительным полюсом 4-вольтового
аккумулятора. Во время прохождения тока электрод
покрывается слоем платины и постепенно чернеет.
Нужно следить за тем, чтобы во время платинирования в
жидкости происходило не сильное выделение газа; для этого лучше
между аккумулятором и электродом включить реостат для
регулирования силы тока.
Иовые электроды следует платинировать 5 мин. Электроды,
бывшие в употреблении, достаточно платинировать в течение
1 мин. По окончании платинирования электрод тщательно
ополаскивают дестиллированной водой, затем насыщают и
восстанавливают водородом. Это также производят электрометрическим путем;
продолжительность обработки х/2 — 1 мин. Для этого электроды
погружают в раствор 10% H2S04.
Соединение с аккумулятором такое же, как при
платинировании, т. е. восстанавливаемый электрод соединяется с отри-
418
дательным полюсом аккумулятора. В заключение электрод
опять промывают дестиллированной водой и хранят в 1/10 N
растворе H?S04.
ИЗМЕРЕНИЕ Eh В КУЛЬТУРЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для определения Eh в культуре микроорганизмов устраивают
таким образом, чтобы электроды (не менее 2—3, чтобы можно
было брать среднее из их показаний) все время находились в
жидкости и чтобы определения производились, не вынимая их оттуда.
В простейшем случае это устраивается следующим образом.
В корковой пробке диаметром, немного меньшим, чем диаметр
горлышка колбы, просверливают четыре отверстия: в три из
них вставляют стеклянные трубочки со впаянными в них
электродами, а в четвертую — стеклянную трубку, которая позже
заменяется изогнутой трубкой (сифон), заполненной агаром,
приготовленным на насыщенном растворе КС1;корковую пробку
тщательно обертывают ватой, и вся пробка с электродами вставляется в
горлышко колбы с питательной средой.
Все это приспособление стерилизуется вместе со средой, а
агаровый сифон стерилизуется отдельно и вставляется в колбу
после стерилизации колбы с электродами.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРОВЫХ СИФОНОВ
Агар для приготовления сифонов готовится следующим обра-
80м:
3 г агара растворяют в 100 см3 воды и к полученному
коллоидному раствору прибавляют при помешивании 10 г чистого KCL
В горлышко колбы, наполненной агаром, вделываются
несколько сифонов, подобно тому как это делали с электродами. На
свободный конец сифончика надевают резиновую трубку, куда встав*
ляется стеклянная трубочка с ватной пробкой. Все это стерили
?уется в автоклаве 20мин.при 120°.После стерилизации горячий агар
насасывается в сифончик до ватной пробки в стеклянной
трубочке. После того как агар в сифоне застыл, вытаскивают его из колбы
о агаром и осторожно вставляют в отверстие испытуемой колбы
27*
СПРАВОЧНИК
Сравнение русских мер с метрическими
Русские меры Метрические меры
Линейные меры
1 верста, или 500 саженей 1.06 километра
1 сажень, или 3 аршина, или 7 футов 2.18 метра
1 аршин, или 16 вершков, или 28 дюймов 0.71 »
J вершок, или 1.75 дюйма 44.45 миллиметра
1 фут, или 12 дюймов 304 8 »
1 дюйм, или 10 линий 1 25.4 »
Меры веса
1 пуд, или 40 фунтов 16.38 килограмма
1 фунт, или 32 лота 0.41 »
1 лот, или 3 долотника 12.79 грамма
1 золотник, или 96 долой 4.26 »
Меры жидких тел
1 ведро (1/40 бочки), или 10 штофов, или 20 бутылок . 12.299 литра
1 бутылка 614.9 см3
Аптекарский вес
1 аптекарский фунт (=7/8 торгового фунта), или 12
аптекарских унций, или 84 золотника 358.32 грамма
1 унция, или 8 драхм - - 29.86 »
1 драхма, или 3 скрупула 3.73 »
і скрупул, или 20 гран 1.24 »
1 гран 62.21 миллиграмма
Меры поверхн*остей
1 десятина, или 2.400 кв. сажен 1.0925 гектара =
= 2.7 английского
акра=
= 4.28 прусскогЪ
моргена
Английские меры
1 фут 0.14 русской сажени
1 миля (1760 ярдов] =1.51 русской версты
1 акр (4840 кв, ярдов)—0.37 русской десятины
1 галлон (4 кварты = 8 пинт) = 0.37 русского ведра
1 фунт [16 унций) = 1.11 русского фунта
42в
Сравнительная таблица вершков, дюймов и сантиметров
Вершки
1
2
3
4
Вершки
9
10
11
12
Дюймы
1
2
3
4
5
6
Сантиметры
1
2
3
4
5
Дюймы
1.75
3.50
5.25
7.00
Дюймы
15.75
17.50
19.25
21.00
Вершки
0.57
1.14
1.71
2.28
2.86
3.43
Дюймы
* 0.39
0.79
1.18
1.57
1.97
Сантиметры
4.41
8.89
13.33
17.78
Сантиметры
40.00
44.44
48.89
53.33
Сантиметры
2.52
5.04
7.55
10.07
12.59
15.11
Вершки
0.22
0.45
0.67
0.90
1.12
Вершки
5
6
7
8
Вершки
13
14
15
16
Дюймы
7
8
9
10
11
12
Дюймы
8.75
10.50
12.25
14.00
Дюймы
22.75
24.50
26.25
28.00
Вершки
4.00
4.57
5.14
5.71
6.28
6.85
Сантиметры Дюймы
6
7
8
9
10
Термометры
Сравнение шкал
2.36
2.76
3.15
3.54
3.94
Цельсия Реомюра Фаренгейта
100° 80.0°
50 40.0
37 26.6
0 0
—25 —20.0
—50 —40.0
212.0°
122.0
98.6
32.0
-13.0
-58.0
Сантиметры
22.22
26.67
31.11
35.55
Сантиметры
57.78
62.22
66.67
71.11
Сантиметры
17.63
20.15
22.67
25.16
27.70
30.48
Вершки
1.35
1.57
1.80
2.02
2.52
Чтобы перевести градусы Р в градусы Ц, надо разделить число
градусов Р на 4 и помножить на 5, например:
12ор s 1^± в 15° Ц.
* Чтобы перевести градусы Р в градусы Ф, надо данное число градусов
Р разделить на 4, частное помножить на 9 и к произведению прибавить 32.
421
Атомные веса важнейших элем ей то в
Авот (N) 14.008
Алюминий (А1) 27.1
Барий (Ва) 137.4
Бор (В) 10.9
Бром (Вг) 79.92
Висмут (Ві) 209.0
Водород (Н) 1.008
Железо (Fe) 55.84
Иод (J) 126.92
Калий (К) 39.10
Кальций (Са) 40.07
Кислород (О) 16.000
Кремний (Si) 28.06
Магний (Mg) 24.32
Марганец (Мп) 54.93
Медь (Си) 63.57
Молибден (Мо) 96.0
Мышьяк (As) 74.96
Натрий (Na) 23.0
Ртуть (Hg) 200.6
Свинец (РЬ) 207.2
Серебро (Ag) 107.88
Сора (S) 32.07
Углерод (С) 12.00
Фосфор (Р) 31.04
Хлор (G1) 35.46
Хром (Сг) 52.0
Цинк (Zn) 65.37
Удельный вес и весовое процентное содержание этилового спирта
при 1б°Ц (по Менделееву)
Уд. вес
1.000
0.991
0.984
0.978
0.972
0.965
0.958
0.949
0.940
0.929
0.919
% спирта
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Объемный
% (по Трал-
лесу)
—
—
—
—
—
—
_
—
53
58
Уд. вес
0.907
0.896
0.884
0.873
0.861
0.849
0.836
0.823
0.809
0.794
—
% спирта
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
—.
Объемный
% (по Трал-
лесу)
63
68
72.5
77
81.5
85.5
89.5
93
97
100
—
Для приготовления из обычного у нас 95-процентного спирта растворов
различной крепости смешивают следующие количества этого спирта
и воды:
95°
спирта
95 см3
79
74
68
63
53
Воды
5
21
26
32
37
47
см*
Крепость
полученного спирта
90°
75
70
65
60
50
422
Удельный вес и весовое процентное содержание аммиака в его водных
растворах при 15°Ц [по Кариусу (Carius)]
Уд. вес
0.8844
0.8864
0.8976
0.9106
0.9251
%
NH,
36
35
30
25
20
/д. вес.
0.9414
0.9593
0.9790
0.9959
1,000
% N
115
АО
5
1
0
NH,
Удельный вес и процентное содержание растворов едкого кали при 15°Ц
[по Гердаху (Gerlach)j
Уд. вес % К НО
вес
1.009
1.041
1 083
1.128
1.177
1.230
1.288
1
5
10
15
20
25
30
ц. вес
1.349
1.412
1.475
1.539
1.604
1.667
1.729
%
кно
35
40
45
50
55
60
65
Удельный вее и процентное содержание растворов едкого натра при 15°Ц
[по Лунге (Lunge)]
Уд. вес ¦ % NaHO Уд. вес % NaHO
1.007
1.060
1 116
1.171
1.231
1.285
0.59
5.20
10.30
15.15
20.60
25.50
1.332
1.383
1.438
1.483
1.530
30.00
35.00
40.47
45.16
50.10
Удельный вее и процентное содержание аютной кислоты при 15°Ц
[По Кодьбу (Kolb)]
Уд. вес % HNO,
1.022
1.077
1.089
1.120
1.157
1.185
1.218
1.251
1.284
1.323
4.00
13.00
15.00
20.00
25.71
30.00
35.00
40.00
45.00
50.99
д. вес
1.346
1.374
1.400
1.423
1.442
1.460
1.478
1.495
1.514
1.530
% HNO,
55.00
60.00
65.07
69 96
75.00
80.00
85.00
90.00
95.27
100.00
Удельный вее и процентное содержание соляной кислоты при 15°Ц
(По Кольбу)
Уд. вес % HG1 Уд. вес % НС1
1.007
1.029
1.052
1.075
1.100
1.5
5.8
10.4
15.0
19.9
1.125
1.152
1.180
1.199
1.210
24.8
30.2
35.7
39.8
42.4
423
Удельный вес и процентное содержание серное кислоты при 15°Ц
(По Кольбу)
Уд
д. вое
1.007
1.037
1.075
1.108
ft. 152
1.190
1.231
1.-274
1,30ft
1.357
% h8so4
ft.9
5.8
10.8
15.2
20.8
25.8
30.9
36.0
40. г
45.6
ц. вес
Л. 397
4Л53
1.498
1.563
1.615
1.671
1.732
1.796
і.ш
% H2SO,
49.8
55 Л
59.6
65.5
70.0
74.7
79.9
86.5
100.0
Перечисление градусов ареометра на удельный вес
Оно производится по формулам:
Ареометр
Для жидкостей
о удельным
весом больше 1
(100-градусный ареометр Гэй-Люссака
(Gay-Lussac) d =*
Ареометр Baume при 15°Ц d ==>
d — удельный вес;
п — показание градуса ареометра.
100
100—я
144.3
144.3
п
Для жидкостей
с удельным
весом меньше 1
d =*
100
100 -fn
144.3
444.3 -f ?
Охлаждающие смеси
Жидкий воздух — 190°
Твердый углекислый газ. — 78.8
7 частей снега + 10 частей кристалл. СаСЬ — 54.9
1.1 ч. снега 4- 1 ч. 65.5 % H2SO* . . . / — 37
Снег + абсолютный спирт — 30
1 ч. снега -f 1 ч. кристалл. СаС12 — 29
1 ч. снега + 1 часть NaGl — 22
1 ч. NH4N03 + 1.3 ч. воды — 16
Жидкости, кипящие при различных температурах
Хлороформ 60°
3 ч. метилового спирта 4- 7 ч. этилового спирта .... 70
Этиловый спирт * * 75
7 ч. этилового спирта -f 4 ч, пропилового спирта ... 80
1 ч. этилового спирта + 8 ч. пропилового спирта ... 90
Вода 100
Толуол 107
Равные объемы толуола и ксилола 121
Ксилол 136
Анизол 150
Кумол 161
Анилин *. 180
Нафталин 200
Дифениламин 310
?24
Жидкости для выпаривания иа водяной бане при температура*
выше 100°
Насыщенный раствор NaCl 108°
NaN03 120
K2G03 135
СаС12 180
ZnCl2 300
ВАЖНЕЙШИЕ РЕ АКТИНЫ
1. Серная кислота. Обычные примеси: Pb, As, Fe, Са,
HN03, N02. Концентрированная кислота: уд. вес 1.840; в 100
граммах раствора содержится 95.6 г H2S04. Разбавленная кислота: уд
вес 1.139; в 100 г раствора содержится 15.9 г HoS04 (1 г
крепкой H2S04 + 4 Н20).
2. Азотная кислота. Примеси: H2S04, HQ.
Концентрированная кислота: уд. вес 1.40; в 100 г содержится 65 г HN03,
Разбавленная кислота (на 1 объем крепкой кислоты 2 объема
воды); уд. вес 1.20; в 100 г содержится 32.5 г HN03.
3. Соляная кисло та. Примеси: CI, Fe2,Cl„, H2S04, S02, As.
Концентрированная кислота: уд. вес 1.19; в 100 г содержится
24 г НС1. Разбавленная кислота: уд. вес —1.060; в 100 г
содержится 12.0 г ПС1(на 1 объем крепкой кислоты 1.5—2 объема воды).
4. Уксусная кислота. Примеси: H2S04, НС1, Си, РЬ,
Fe, Са. В 100 г содержится 50 г С2Н402.
5. Щавелевая кислота. Примеси: Fe, К, Na, Са.
Реактив содержит 10 г кристаллической кислоты в 100 г раствора.
6. Е д к и й натр. Уд. вес 1.17; крепкий раствор 1:2 (33%).
Разбавленный раствор в 100 г содержит 15 г NaOH. Примеси:
А1203, Si02, H2S04, Cl
7. Е д к о е кали. Уд. вес. 1.27; раствор 1:2 (33%).
8. А м м и а к. Уд. вес 0.958. В 100 г содержится 10.5 г NH3.
9. Водная окись бария (ВаН„0„.8НяО). Раствор
5:100.
10. С о д a (Na2C03 + 10Н2О). Примеси: соли соляной,
фосфорной, серной и кремневой кислот. Раствор 20:100.
11. Фосфорнокислый натрий (NaHP04. 12Н20). Раствор 5:100.
12. Нашатырь. Раствор 10:100.
13. Щавелевокислый аммоний [(NH4)2C204.H20)]. Раствор
5 : 100.
14. Углекислый аммоний. Раствор 20 : 100.
15. Азотистокислый натрий. Раствор 20:100.
16. Минеральный хамелеон (КМп04). Раствор 10:100.
17. Желтая и красная соли (K4FeCy6 и KeFe2Cyl2). Растворы
5:100.
18. Роданистый калий (KCNS). Раствор 10:100.
19. Хлористый барий (ВаС12+2Н20). Растворы 10:100.
20. Хлористый кальций (CaCl2-j- 6Н20). Раствор 5 : 100.
21. Сернокислый магний (MgS04+ 7Н20). Раствор 10:100.
425
22. Полуторахлористое железо. Раствор 10:100.
23. Уксуснокислый свинец. Раствор 10:100.
24. Сернокислая медь (медный гсупорос). Раствор 10:100.
25. Сулема (HgCla). Раствор 5:100.
26. Азотнокислое серебро (ляпис). Раствор 5:100.
27. Реактив Несслера (Nessler) — см. стр. 183. Фрерикс (Fre-
richs) и Мангейм (Mannheim) для приготовления этого реактива
прибавляют к раствору смеси 2.5 г KS и 3.5 г HgS2 в 3 см3 воды
100 г 15% КОН, 0.5 г талька и отфильтровывают жидкость после
долго дневного стояния.
28. Реактив Гревса ( Graves) на аммиак. Смешивают раствор
80 г NaCl в 130 см3 воды со 100 см3 насыщенного на холоду раствора
HgCl2; к смеси постепенно прибавляют 70 см3 1% раствора LiCOa
и фильтруют жидкость после прибавления к ней 3—5 г талька.
Реактив столь же чувствителен, как и реактив Несслера, и
применим в присутствии таких солей, которые мешают применению
последнего.
29. Раствор индиго. 1 часть порошка индиго постепенно вносят
в 4—б частей дымящейся серной кислоты, избегая повышения
температуры. Через некоторое время разбавляют в 20 раз водою и
отфильтровывают.
30. Лакмусовая бумажка. Растворяют 1 часть лакмуса в
6 частях воды, отфильтровывают и разделяют на две равные части;
к одной прибавляют несколько капель H2S04, пока цгет п?
начнет изменяться на красный, и к этому кислому раствору
прибавляют вторую половину, неподкисленную. Пропитывают
полученным раствором полоски фильтровальной бумаги и
высушивают. См. также стр. 47.
31. Куркумовая бумажка. Порошок куркумового корня
извлекают спиртом и этим раствором пропитывают полоски
фильтровальной бумаги.
32. Фелингова жидкость. См. стр. 360.
33. Хлористый натрий. Насыщенный на холоду раствор.
Содержит 31.8% NaCl; физиологический раствор 0.85 —0.9%.
34. Индикаторы:
а) Лакмусовая настойка. ^
б) Азолитмин \ (см. стр. 47).
в) Фенолфталеин. J
г) Конго. Растворяют в разбавленном спирте. От щелочи
краснеет, от кислоты синеет.
д) Лакмоид и малахит-грюн. См. стр. 341.
е) Метилоранж. 0.1 —0.2% водный раствор. От щелочи
желтеет, от кислоты краснеет. Пригоден только для крепких кислот.
ж) Розоловая кислота. 0.2% спиртовый раствор,
нейтрализованный баритовой водой. От кислоты желтеет, от щелочей краснеет.
з) Ализарин. 1 % водный раствор, от щелочей принимает
фиолетовый, а от кислоты — зелено-желтый цвет.
и) Метил-виолет.
42G
ПЛАН АНАЛИЗА
Жидкость доводится до определенного объема и для анализа
берутся отмеренные части.
Отдельные пробы
1. Микроскопическая картина (микробы, осадки).
2. Цвет жидкости, запах, муть, кристаллические или зернистые
образования.
3. Реакция жидкости.
4. Проба на NH3.
5. » на H2S и меркаптаны.
6. » на индол и скатол (в отгоне из щелочного раствора).
7. » на триптофан.
8. » на фенолы (Миллонов ре актив,перегон с парами воды).
9. В фильтрате оптическое исследование.
10. » цветная реакция на белки.
11. В 100 см5 летучие кислоты по Дюкло и отдельные реакции.
12. Определение азота по Кьельдалю в цельной жидкости и
в фильтрате.
13. Определение белкового азота по Штуцеру.
14. Осаждение 95° спиртом (азот в осадке и в растворе).
15. Определение аммиачного азота.
16. » амидного азота.
17. » пептидного азота.
18. Подкислить уксусной кислотой, прибавить животного
угля, прокипятить и отфильтровать.
19. Осаждение ZnS04.
20. » таннином.
21. t фосфорно-вольфрамовой кислотой.
КНИГИ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕХНИКЕ, АТЛАСЫ
И ОПРЕДЕЛИТЕЛИ МИКРОБОВ і
Abderhalden. Handbuch der biochem. Arbeitsmethoden, 1910—1912
(отдельные главы). 2-е ивд. 1920 г. Handbuch der biolog. Arbeitsmethoden.
Abel. Bacteriologisches Taschenbuch, 27. Aufl., 1925. Имеется русский
перевод.
Абель. Бактериология, 1914.
Абрамов, Атлас патогенных микроорганизмов, 1947.
Behrens-Kuster. Tabellen zum Gebrauch bei mikroskopischen
Arbeiten, 8. Aufl., 1908.
В e г g ? y. Manual of Determinative Bacteriology, 1926. Имеется русский
перевод. 1936.
В ? s s о л. Technique microbiologique, 5-? 6d., 19II.
Віау? et Guggenheim. Manuel pratique de diagnostic bacteriolo-
gique et de technique appliquee a la determination des bacteries, 1914.
В о n g e r t, Bakt. Diagnostik der Tierseuchen, 1908.
Бронштейн. Лабораторная техника, 1939.
В и г г і. Tuscheverfahren, 190У.
Burgess. Soil Bacteriology laboratory Manual, 1914.
Chester. A manual of determinative bacteriology, 1901.
Citron. Методы иммунодиагностики и иммунотерапии, 1911,
Clark, Hydrogen-ion concentration, 1922.
Conn. Practical Dairy-Bacteriology, 1910.
Courmont. Precis de bacteriologie pratique, 1911.
D i p p e 1. Das Mikroskop und seine Anwendung.
Eisenberg. Baktcriologische Diagnostic, 1891. Русский перевод: Э ft з е н-
6 e p г. Бактериологическая диагностика, 1886.
Е m i с h. Lehrbuch der Microchemie, 1911.
Encyclop&die der mikroskopischen Technik, herausgegeben. v. Ehrlich und Wei-
gert, Bd. 1, II, 1910.
Eulenburg, Kolle u. Weintraub. Руководство к клиническим
способам исследований и применение их к частной врачебной диагностике.
Eyre. Bacteriological Technic, 1913.
Финкельштейн. Серодиагностика по Вассерману.
Fraenkel u. Pfeiffer. Mikrophotographischer Atlas der Bakterien-
kunde, 1895.
Фридман. Иммунитет (пер. Святловского), 1910.
Н a g е г nnd Ы е г. Das Mikroskop und seine Anwendung, 1920.
H ager-Tobler Das Mikroskop und seine Anwendung, 1У25.
Горовиц-Вл?сова. Определитель бактерий, 1934.
^ о г h о m Laboratory Course in Bacteriology, 1915.
Janke-Zikes. Arbeitsmethoden der Mikrobiologie, 1928.
Иванов. Методы физиологии и биохимии растений- 1935.
Kahlfeld-Wahlich. Bakteriologische Nahrboden-Technik, 1929-
Kaiserling. Die mikrophotographischen Apparate und ihre Handha-
bung, 1918.
1 Хотя в настоящей книге не приводятся данные, относящиеся к
медицинской бактериологии, тем не менее в указателе литературы мы приводим
перечень книг и из этой области; подробный список литературы имеется также
в «Основах микробиологии» В. Л. Омелянского-
4^8
К a m e n. Bakt. Untersuchungen f. klinisch-diagnostische u. hygienische
Zwecke, 1908.
К и з e л ь. Практическое руководство по биохимии растений, 4934.
Kisskalt u. Hartmann. Praktikum der Bacteriologie u. Protozo-
ologie, 1909 (русский перевод К. и Г., Практический курс
бактериологии, 1915).
Klein. Handbuch der Pflanzenanalyse, I—IV, 1931—1933.
Klopstock u. Kowarsky. Praktikum der klinischen chemisch-
mikroskopischen u. bakteriologischen Untersuchungsmethoden, 1909
(имеется русский перевод, 1911).
Koch. Mikrobiologisches Praktikum, 1922.
Коренман. Краткое пособие по качественному микрохимическому
анализу, 1931.
К u s t е г. Kultur der Mikroorganismen, 4913.
Laborators Manual in General Microbiology, 1916.
L e e- M e у е г. Grundziige der mikroskopischen Technik, 1911.
Lehmann u. Neumann. Atlas u. Grundrissd. Bakteriologie, 6 Aufl.,
1920 (русск. изд.).
Lipman a. Brown. Laboratory Guide in Soil Bacteriology, 1911.
L 6 h n i s. Landw.-bakt. Praktikum, 2. Aufl., 1920.
Mace. Atlas de Microbiologic, 1898.
Mace. Traite pratique de Bakteriologie, 1912.
Масленников и Солнцев. Исследование молока и молочных
продуктов, 1931.
Matzuschita. Bact. Diagnostic, 1902.
Мейер и Майе р. Новые методы диагностики и лечения сифидиса, 1911.
Meyer. Practicum der botanischen Bakterienkunde, II. Practicum, 1903.
Michaelis. Wasserstoffionenkonzentration, 1922.
Мисловицер. Определение концентрации водородных ионов в
жидкостях, 1931.
М й 1 1 е г. Техника серодиагностических методов, 1910.
Наумов. Методы микологических и фитопатологических исследований,
1937.
Никитинский. Практические занятия по общей микробиологии, 1922.
Никифоров. Микроскопическая техника, 1919.
N і с о 1 1 е. Traite de technique microbiologique, 1902.
Огнев. Микроскоп, 1925.
Палладина. Практическое руководство по бактериологии молока и
молочных продуктов, 1931.
Политова. Руководство к производству химико-бактериологических
исследований отделений и выделений человеческого организма, 2-е изд. 1913.
Предт?ченский. Руководство к клинической микроскопии для
врачей и студентов.
Reed. A manual of bacteriology for agricultural and general science students,
1914.
Рона. Практикум по физиологической химии, 1930.
Саватеев. Микроскоп, его устройство и обращение с ним, 1926.
С е р к о в с к и й. Пособие для распознавания микробов, 1898.
Симакова. Методика бактериологического и биохимического
исследования почв, 1931.
С и н и ц ы н. Определитель паразитов, вып. 1, Простейшие, 1915.
Schneider. Bact. Methods in Food and Drug laboratory, 1915.
Скородумов а. Практическое руководство по технической
микробиологии молочного дела, 1933.
Стандартные методы исследования питьевых и сточных вод, 1927.
Циммерман. Микроскоп, 1896.
Willstatter. Untersuchungen uber Enzyme, I—II, 1928.
Винокуров. Техника саиитарно-гигиеничес( их исследований, 1939.
Волков. Краткие основы съемки через микроскоп, 1935.
X а р и т. Практикум по биологической химии, 1933.
429
ОГЛАВЖВШПКЯ
Стр.
Предисловие ко 2-му изданию 3
Предисловие к 1-му изданию 4
Глава 3. Устройство лаборатория. Описание микроскопа . ... 7
1. Устройство лаборатории —
2. Микросьоп, ультрамикроскоп и микрофотография 10
Глава П. Аппараты. Питательные среды. Методы стерилизации 26
4. Бактериологическая посуда и аппараты ^ —
2. Стерилизация приборов, сосудов и сред 39
3. Питательные с^еры 46
Глава III. Изолирование микробов. Бактериоскопия и микротехника 71
1. Методы изолирования микробов —
2. Бактериоскопия и микротехника 83
Глава IV. Морфологии микробной клетки. Методы окрашивания 104
1. Морфология микробной клетки . , ., —
2. Окраска и исследование содержимого клетки 120
Глава V. Физические и химические воздействия на микробов.
Анаэробиоз 135
і. Физические вовд?йстеия на микробов —
2. .Химические воздействия на микробов 142
3. Методы анаэробных культур і'Л
Глава VI. Биохимизм микробов 153
1. Пигментные микроорганизмы —
2. Светящиеся бактерии 160
3. Кислото- и щелочеобрааование 162
4. Бродильная проба 164
5. Восстановительные и окислительные свойства микробов 165
(6. Ауксанографичесьий метод 166
Глава VII. Круговорот азота 169
1. Гниение белков —
2. Брончегие мочевины 176
3. Нитрификация 182
4. Денитрификация 193
Ъ. Фиксация атмосферного азота 193
Глава VIII. Круговорот углерода 202
1. Спиртовое брожение —.
2. Уксуснокислое брожение 208
430
Стр.
3. Лимоннокислое брожение 212
4. Молочнокислое брожение 214
5. Маслянокислое брожение . to 219
6. Ацетоноэтиловое брожение 220
7. Ацетонобутиловое брожение 221
8. Брожение пектиновых веществ 223
9. Разложение крахмала 227
10. Разложение клетчатки '. 229
11. Разложение жира 237
12. Разложение глюкозидов. Окисление метана и водорода .... 241
Глава IX. Круговорот серы, железа и фосфора. Избирательные
"культуры 243
1. Микробы, восстаповлякщие серно- сернисто- и серноватистокис-
лые соли и свободную серу —
2. Серобактерии 246
3. Железобактерии 253
4. Растворение фосфорнокислых солей 256
5. Бактерии, разлагающие углеводороды —
6. Избирательные культуры миксобактерий, плесеней, лучистых
грибов, водорослей амеб и цилиат 258
Глава X. Энзимы или ферменты 269
1. Общие свойства энзимов —
2. Амилаза (диастаз) 270
3. Сахараза, инвертин, инвертаза щ 274
4. Лактаза, мальтаза, эмульсин, эскулин 275
5. Липаза 276
6. Протеолитические и сычужные энзимы, автолиз и гемолиз . . . 278
7. Оксидазы 282
8. Карбоксилаза, каталаза и вимаза 285
Глава XI. Онределение вида. Схема практических эаннтий.
Коллекция микробов. Выставочные культуры 290
1. Определение вида у бактерий —
12. Краткая схема практических занятий 300
3. Коллекция микробов. Выставочные культуры 302
Глава XII. Исследование молока, воздуха, воды и почвы . . . 309
1. Исследование молока —
2. Исследование воздуха 322
3. Исследование воды 324
4. Исследование почвы 32G
Приложение 340
Спх ківочник 420
Книги по микробиологической технике 425
Редактор издательства 3, И. Берман
Технический ред. О. Н. Персиянинова
Корректор Л. Л Афанасьева
Сдано в набор 14/IX 1939 г. Подписано к печати
26/Ш 1940 г. Формат 60X^2 в */„. Объем 27 п. л.
Учегн.-яздаг. л. 33.2. В 1 п. л. 48 300 тип, зн.
Тираж 20 000 экз. Уполн. Главлита Х& A.2288I.
РИСО № 1156. АНИ № 1387. Заказ № М32.
1-я Образцовая типография ОГИЗА РСФСР
треста „Полиграфкнига". Москва, Валовая 28.
ОПЕЧАТКИ
Imp,
60
415
199
282
С№р<ж&
Vb ск.
5 »
5 »
ао ->
Напечатано
(стр. 47)
( Hoffmanns-viclett)
atmospheric
Araricus
Следует,
(стр. *S)
(Uoffmanns-vioiett)
atmospheric ^itrogeii
Agaric us
(Руководство so м^-гобиологил