БЕК 52.64
Б 82
мм,
РМ
УДК 57.083.2(035)
Л. Б. БОРИСОВ, Б. Н. КОЗЬМИН-СОКОЛОВ, И. С. ФРЕЙДЛИН,
3. Ф. ФЕДОРОВА. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии/
Под ред. Л. Б. БОРИСОВА. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина. 1984. —
256 с., ил.
Л. Б. БОРИСОВ — проф., зав. кафедрой микробиологии 1 ЛМИ им.И. П. Пав-
лова.
Во второе издание (первое вышло в 1979 г.) включены новые разделы:
«Прикладная иммунология», «Клиническая микробиология и иммунология^»
«Общая и медицинская микология». Более подробно изложены материалы ijp
санитарной микробиологии и лабораторной диагностике вирусных инфекци™
Все основные разделы руководства подразделены на темы и занятия, построен-
ные по единому принципу. Приведен перечень диагностических, профилакти-
ческих и лечебных препаратов, применяемых при описываемых заболеваниях.
Руководство соответствует программе, утвержденной Министерством здраво-
охранения СССР, и предназначено для студентов медицинских институтов.
Рисунков 90. Таблиц 60. Схем 24.
Рецензент А. П. КРАСИЛЬНИКОВ, проф., зав. кафедрой микробиологии
с вирусологией и иммунологией Минского медицинского института

4107000000-150
039(01)—84
© Издательстве «Медицина», Москва, 1979
© Издательство «Медицина», Москва, 1984, с изменениями
ПРЕДИСЛОВИЕ
За время, прошедшее после выхода 1-го издания «Руко-
водства к лабораторным занятиям по микробиологии», полу-
чила дальнейшее развитие специализация студентов лечебных
факультетов по одной из трех основных медицинских
специальностей—терапии, хирургии, акушерству и гинекологии.
Поэтому возникла необходимость в более тесной связи
микробиологии с клиническими дисциплинами. Проведенные
авторами анализ и оценка интеграции преподавания микро-
биологии с медико-биологическими и клиническими дисципли-
нами' показали, что в учебных пособиях недостаточно полно
изложены вопросы клинической микробиологии и иммуноло-
гии, знание которых необходимо лечащему врачу. Для устране-
ния этого существенного недостатка кардинальным образом
перестроено данное руководство, в которое включены основ-
ные положения клинической микробиологии и иммунологии:
характеристика всех этапов микробиологической диагностики
бактериальных, вирусных и грибковых заболеваний, преиму-
щества, сроки проведения и информативность микробиологи-
ческих методов исследования, анализ и оценка их результа-
тов. Это облегчит будущему лечащему врачу постановку
окончательного диагноза заболевания и решение вопроса
об этиологической и патогенетической роли выделенных
микроорганизмов, а также выбор и назначение иммунологи-
ческих и химиотерапевтических препаратов. Указанные сведе-
ния необходимы также врачу-эпидемиологу для проведения
эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболе-
ваний с целью установления источника и путей передачи
инфекции. Патогенные микроорганизмы распределены в за-
висимости от патогенетических и эпидемиологических’ осо-
бейностей вызываемых ими заболеваний (гнойных, респира-
торных, кишечных, трансмиссивных и др.), которыми обуслов-
лен выбор материала для их микробиологической диагности-
1 Борисов Л. Б., Козьмин-Сокомв Б. Н., Фрейдлин И. С. Интеграция препода-
вания микробиологии, вирусологии и иммунологии с другими дисциплинами
лечебного факультета. — Микробиология, 1981,"N» 3, с. 83—89.
3
ки, с чем прежде всего сталкивается лечащий врач, исходя
из поставленного им предварительного диагноза заболевания.
Кроме того, темы «Микрофлора организма человека»,
«Антибиотики» переработаны с целью* усиления их клини-
ческой направленности. Для студентов санитарно-гигиени-
ческого факультета написана специальная тема «Санитарно-
бактериологическая оценка объектов окружающей среды и
пищевых продуктов».
Как и в первом издании, сохранены целевая направленность
лабораторных занятий и план их построения. Все темы
изложены таким образом, чтобы их можно было изучить на
одном или нескольких практических занятиях.
Авторы выражают благодарность ассистентам кафедры мик-
робиологии I ЛМИ им. И. П. Павлова В. В. Бабкову,
Г. П. Петровой и Н. К. Артеменко за участие в работе
над руководством, а также всем преподавателям медицинских
институтов за сделанные ими критические замечания и по-
желания по первому изданию руководства.
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
В данном разделе описаны устройство и оборудование
бактериологической, вирусологической и серологической
лабораторий, а также основные методики, применяемые при
бактериологических и вирусологических исследованиях: микро-
скопия, стерилизация, приготовление питательных сред, спо-
собы культивирования микроорганизмов, и выделение чис-
тых культур. С помощью указанных методов изучаются
морфологические, культуральные и биохимические признаки
бактерий и вирусов, проводится санитарно-бактериологическая
оценка объектов окружающей среды и пищевых продуктов.
Рассматриваются также методы определения активности анти-
биотиков, чувствительности бактерий к ним и основы гене-
тики бактерий.
Проведенные лабораторные работы позволят студентам
закрепить знания, полученные на лекциях, и овладеть навы-
ками микробиологических исследований, чтобы использовать
их при лабораторной диагностике бактериальных и вирусных
заболеваний, а также санитарно-бактериологических исследова-
ниях окружающей среды.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ
И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ
Тема 1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ
И СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ
Программа занятия
1.	Организация микробиологических (бактериологических, вирусологических
и серологических) лабораторий и правила работы в них.
2.	Основные приборы и оборудование микробиологических лабораторий.
3.	Микроскопы и микроскопическая техника.
Демонстрация
1.	Устройство и применение основных приборов и оборудования, исполь-
зуемого в микробиологических лабораториях: термостата, центрифуг, автоклава,
сушильного шкафа и др., инструментария и посуды.
5
2.	Устройство биологического микроскопа. Различные типы микроскопии:
темнопольная, фазово-контрастная, л юминесцентная, электронная.
3.	Препараты дрожжей и бактерий при различных типах микроскопии.
Задание для выполнения лабораторной работы
Микроскопировать и зарисовать препарат дрожжей.
Правила работы в микробиологических лабораториях
Работа в микробиологической лаборатории медицинского
учреждения проводится с возбудителями инфекционных забо-
леваний — патогенными микроорганизмами. Поэтому для пре-
дохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать
правила внутреннего распорядка.
1.	Все сотрудники должны работать в медицинских халатах,
шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата
категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие
надевают на лицо маску из марли. Работа с особо опасными
микроорганизмами регламентируется специальной инструкцией
и проводится в режимных лабораториях.
2.	В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
3.	Рабочее место должно содержаться в образцовом по-
рядке. Личные веши сотрудников следует хранить в специ-
ально отведенном месте.
4.	При случайном попаданий заразного материала на стол,
пол и пр. это место необходимо тщательно обработать
дезинфицирующим раствором.
5.	Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов
и их уничтожение должны производиться согласно специаль-
ной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов
регистрируют в специальном журнале.
6.	По окончании работы руки следует тщательно вымыть,
а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.
Принципы организации и оборудование бактериологической,
вирусологической и серологической лабораторий
Бактериологические, вирусологические и серологические
лаборатории входят в состав санитарно-эпидемиологических
станций (СЭС) и крупных больниц. В лабораториях СЭС
выполняются бактериологические, вирусологические и серо-
логические анализы материалов, полученных от больных и
контактировавших с ними лиц, обследуются бактерионосители
и проводятся санитарно-микробиологические исследования
> воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и различных
предметов.
б
В бактериологических и серологических лабораториях
больниц проводятся диагностические исследования при кишеч-
ных и гнойных инфекциях, дифтерии, туберкулезе и др.,
а также исследования по контролю за качеством дезинфек-
ции и стерилизации. Диагностика особо опасных инфекций
(чума, туляремия, бруцеллез и др.) осуществляется в специаль-
ных лабораториях, организация и деятельность которых
строго регламентированы.
В вирусологических лабораториях проводится диагностика
заболеваний, вызванных вирусами (грипп, полиомиелит и др.),
хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф,
Ку-лихорадка и др.). При организации и оборудовании виру-
сологических лабораторий учитывается специфика работы с
вирусами, клеточными культурами и куриными эмбрионами,
требующая строжайшей асептики.
Лаборатории обычно размещаются в нескольких помеще-
ниях, которые в зависимости от объема работы и целевого
назначения занимают определенную площадь. В каждой лабо-
ратории предусмотрены: а) боксы для работы с отдельными
группами бактерий или вирусами; б) помещения для серо-
логических исследований, приготовления цитательных сред,
стерилизации, мойки посуды; в) виварий с боксами для
здоровых и подопытных животны'х;. г) регистратура для при-
ема и выдачи анализов. Наряду с этими помещениями в
вирусологических лабораториях имеются боксы для специальной
обработки исследуемого материала и для работы с клеточны-
ми культурами.
Лаборатории снабжены следующим оборудованием: биологи-/
ческими иммерсионными микроскопами с дополнительными
приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство,
темнопольный конденсор и др.), люминесцентным микроско-
пом, термостатами, приборами для стерилизации (автоклав,
сушильный шкаф, свертыватели), pH-метрами, аппаратом для
получения дистиллированной воды (дистиллятор), центрифуга-
ми, техническими, аналитическими весами, аппаратурой для
фильтрования (фильтр Зейтца и др.), водяными банями,
холодильниками, аппаратом для изготовления ватно-марлевых
пробок, набором инструментов (бактериологические петли,
шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабораторной посудой
(пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы,
пастеровские и градуированные пипетки) и др.
В лаборатории имеется место для окраски микроскопических
препаратов, где находятся растворы красок, спирт, кислоты,
фильтровальная бумага и пр. Каждое рабочее место снабжено
газовой горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфициру-
7
Рис. L Термостат.
ющим раствором. Для повседневной
работы лаборатория должна распола-
гать необходимыми питательными
средами, химическими реактивами,
диагностическими препаратами и дру-
гими лабораторными материалами.
В крупных лабораториях имеются тер-
мальные комнаты для массового выра-
щивания микроорганизмов, постановки
серологических реакций.
Аппаратура для выращивания микро-
организмов, стерилизации и других
микробиологических целей
1.	Термостат. Аппарат, в котором
поддерживается постоянная темпера-
тура. Оптимальная температура для
размножения многих микроорганизмов
37°С. Термостаты бывают суховоздуш-
ными и водяными (рис. 1). Использу-
ются для культивирования микроорга-
низмов.
2.	Микроанаэростат. Аппарат для вы-
ращивания микроорганизмов в анаэроб-
ных условиях.
3.	Сушильный шкаф (печь Пастера). Предназначен для
стерилизации лабораторной посуды и других материалов.
4.	Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под
давлением (рис. 2, а, б). В микробиологических лабораториях
используются автоклавы разных моделей (вертикальные, го-
ризонтальные, стационарные, переносные).
5.	Холодильники. Используются в микробиологических
лабораториях для хранения культур микроорганизмов, пита-
тельных сред, кройи, вакцин, сывороток и прочих биологи-
чески активных препаратов при температуре около 4°С. Для
сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0°С исполь-
зуются низкотемпературные холодильники, в которых под-
держивается температура -20°С и ниже.
6.	Центрифуги. Применяются для осаждения микроорганиз-
мов, эритроцитов и других клеток для разделения неоднород-
ных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях исполь-
зуют центрифуги, работающие на разных скоростях.
7.	Прибор для счета колоний (рис. 3). Полуавтоматический
8
Рпс. 2. Автоклавы.
а — горизонтальный; б — вертикаль-
ный (схема); 1 — стерилизационная
камера; 2 —кран для выхода воз-
духа; 3 — манометр; 4 — предох-
ранительный клапан; 5 — водопаро-
вая камера; б —воронка для запол-
нения автоклава водой; 7 — отвер-
стия для поступления пара в сте-
рилизационную камеру; 8 — крышка;
9 — подставка для размещения
стерилизуемых материалов.
Рпс. 3. Прибор для
счета колоний микро-
организмов.
1	— столик для чашки Петри;
2	— игла с пружинным уст-
ройством; 3 — показатель
счетчика; 4 — тумблер для
включения импульсного
счетчика; 5— тумблер для
включения лампы освеще-
ния счетчика.
Рис. 4. Микроскопы.
а — общий вид микроскопа «Биолэм»; б — схема микроскопа МБР-1: 1 — основание микрос-
копа; 2 — предметный столик; 3 — винты для перемещения предметного столика; 4 — клеммы,
прижимающие препарат; 5 — конденсор; б — кронштейн конденсора; 7 — винт, укрепляющий
конденсор в гильзе; 8 — рукоятка перемещения конденсора; 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы
конденсора; 10 — зеркало; 11 — тубусодержатель; 12 — рукоятка макрометрического винта;
13 — рукоятка микрометрического вннта; 14 — револьвер объективов; 15 — объективы;
16 — наклонный тубус; 17 — винт для крепления тубуса; 18 — окуляр.
счетчик, снабженный иглой с пружинным устройством. Лег-
кий нажим иглы на участке дна чашки Петри, соответству-
ющей положению колонии, оставляет на стекле метку. При
этом держатель поднимается вверх, цепь замыкается и
показания счетчика увеличиваются на единицу.
Микроскопы и методы микроскопии
Для микробиологических исследований используют несколь-
ко типов микроскопов (биологический, люминесцентный,
электронный) и специальные методы микроскопии (фазово-
контрастный, темнопольный).
Биологический микроскоп. В микробиологической практике
применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-1,
МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, Биолам Р-1 и др. Они предназначены
для изучения формы, структуры, размеров и других признаков
различных микроорганизмов, величина которых не . менее
мкм.
10
Рпс. 5. Ход лучей
в иммерсионной
системе.
Микроскоп состоит из двух частей — оптической и механической (рис. 4).
К оптике микроскопа относятся объективы, которые состоят из фронтальном
(нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных линз, исправляющих
недостатки оптического изображения. Объективы подразделяются на сухие
и иммерсионные (от immersio — погружение). В микроскопах МБР-1 и МБИ-1
два сухих объектива и один иммерсионный. Данные о каждом объективе
имеются на его оправе; 1)Х8, 40, 90; 2) числовая апертура; 3) заводской номер.
Наряду с этими обозначениями иммерсионные объективы 90 имеют дополни-
тельный буквенный индекс ОН или МИ (объектив иммерсионный или масля-
ная иммерсия), а также черную маркировочную линию в нижней части объектива.
Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокусное
расстояние (У—1,5—3 мм). При микроскопии ее погружают в каплю предвари-
тельно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления
которого (1,52) близок к показателю преломления стекла. При этом устраня-
ются неизбежные потери попадающих в объектив лучей света,
Предельная разрешающая способность иммерсионного
микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа опреде-
ляется произведением увеличения объектива на увеличение
окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным
объективом 90 и окуляром 10 составляет: 90ХЮ-=900 раз.
Ход лучей в иммерсионной системе показан на рис. 5. .
Дополнительные приспособления к биологическому микроско-
пу. Эти приспособления позволяют максимально использовать
все его возможности, облегчают условия работы и значитель-
но расширяют диапазон применения. В микробиологических
лабораториях обычно используют следующие приспособления:
1.	Темнопольные кардиоид- и параболоид-конденсоры, .
2.	Фазово-контрастное приспособление КФ-1, КФ-4 и дру-
гие модели.
3.	Бинокулярная насадка, приближающая микроскопию к
условиям естественного зрения.
4.	Осветители ОИ-7, ОИ-19, обеспечивающие оптимальное
и стабильное освещение. Интенсивность света регулируется
реостатом,
41
а	б
Рис. 6. Ход лучей в темнопольных конденсорах.
а — параболоид-конденсор; б — кардионд-конденсор; 1 — объектив; 2 — иммерсионное
масло; 3 — препарат; 4 — зеркальная поверхность; 5 — диафрагма.
5.	Окуляр-микрометр и объект-микрометр, предназначенные
для измерения микроскопических объектов.
6.	Нагревательный столик, устанавливаемый вместо предмет-
ного столика микроскопа для обеспечения постоянной тем-
пературы 37°С и применяемый при длительном наблюдении
за живыми микроорганизмами.
7.	Рисовальный аппарат для зарисовки препарата, с помо-
щью которого можно одновременно видеть изображение
объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроско-
па, и обводить на бумаге контуры объекта.
8.	Цветные, нейтральные и тепловые оптические светофильт-
ры, устанавливаемые между источником света и микроскопом
и применяемые при микрофотографии и при специальных
методах микроскопии.
9.	Микрофотонасадки МФН-1, МФН-3 и другие модели для
фотографирования микроскопических объектов.
10.	Микроустановка для цейтраферной (прерывистой) микро-
киносъемки, в сочетании с фазово-контрастной микроскопией
используемая для изучения динамики развития и размножения
микроорганизмов, влияния на них разных факторов и многих
других вопросов.
12
Рис. 8. Фазово-контрастное устройство.
а — фазовые объективы; б — вспомогательный микроскоп; в — фазовый конденсор.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле
зрения основана на явлении дифракции света при сильном
боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших
частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью пара-
болоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный
конденсор в биологическом микроскопе (рис. 6, а, б).
Параболоид-конденсор имеет затемнение в центре, задерживающее централь-
ные лучи света, и внутреннюю зеркальную поверхность для отражения лучей.
В кардиоид-конденсоре лучи сначала отражаются от выпуклой поверхности,
затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора,
проходят в косом направлении и не попадают в объектив, в связи с чем поле
зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объекта лучи,
которые образуют весьма характерное изображение ярко светящихся контуров
микробных клеток и других частиц, находящихся в препарате на темном фоне
(рис. 7).
Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении
изменений по фазе, возникающих при прохождении световой
волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты,
в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом.
С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые
изменения световых волн, проходящих через объект, превра-
щаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся
видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую
контрастность изображения, которая может быть позитивной
или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют
темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив-
13
Рис. 9. Люминесцентный микроскоп МЛ-2.
а — общий вид; б — схема: 1 — основание микроскопа; 2 — тубусодержатель; 3 — предметный
столик; 4 — кронштейн с конденсором; 5 — электропульт ПРЛ-5; 6 — рукоятка полевой диаф-
рагмы: 7 — рукоятка для переключения освещения; 8 — револьверный диск с «запирающими»
светофильтрами; 9 — рукоятка включения ахроматической линзы; 10 — револьвер объек-
тивов; 11 светофильтры в оправах; 12 — винты для центрировки лампы* 13 — рукоятка
ным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на
темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный
микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособле-
ние КФ-1 или КФ-4 (рис. 8). В их комплект входят:
1.	Специальные объективы с фазовыми кольцами, изменяющие фазу и
уменьшающие амплитуду световой волны. На оправе фазовых объективов
обозначен дополнительный буквенный индекс «Ф»: Ф-10, Ф-20, ФЛО и ФОИ-90.
2.	Фазовый конденсор с револьвером специальных кольцевых диафрагм
для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие для наблюдения
препарата обычным методом с ирисовой диафрагмой.
3.	Вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр
при наблюдении за центровкой освещения.
Прн фазово-контрастной микроскопии используют осветители типа ОИ-7
или ОИ-19.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.
Основана на явлении фотолюминесценции (рис. 9).
Люминесценция (от lumen — свет) — свечение веществ, возникающее после
воздействия на них каких-либо источников энергии: света, электронных лучей,
ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под
влиянием света. Свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет
возбуждающий, поэтому возбуждают люминесценцию коротковолновыми лу-
чами. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает
лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает
цветное изображение объекта. Длина волны излучаемого света (цвет люминес-
ценции) зависит от физико-химической структуры люминесцирующего вещества.
Первичная (собственная) люминесценция наблюдает-
ся без предварительного окрашивания объекта, вторичная
(наведенная) возникает после окраски препаратов специаль-
ными люминесцирующими красителями—ф лю орох рома-
м и. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными
методами обладает рядом преимуществ: ^возможностью исследова-
ния живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом
материале в небольших концентрациях вследствие высокой
степени контрастности.
В лабораторной практике люминесцентная микроскопия
широко применяется для выявления и изучения многих
микроорганизмов.
Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты,
размеры которых лежат за пределами разрешающей способ-
ности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп
перемещения коллектора; 14 — рукоятка полевой диафрагмы; 15 — крышка гнезда свето-
фильтров; 16 — винты пентрировки полевой диафрагмы; 17 — микрометрический винт;
18 — микрометрический винт; 19 — оправа коллектора; 20 — коробка с механизмами грубого
и тонкого перемещения препарата; 21 — винт для крепления насадки; 22 — винты для
центрировки полевой диафрагмы; 23 — бинокулярная насадка; 24 — рукоятка тормоза грубого
движения; 25 — рукоятка переключения освещения; 26 — рукоятка для перемещения препарата
в горизонтальной плоскости; 27 — защитная втулка; 28 — корпус ртутной лампы; 29 — кювета
с дистиллированной водой.
15
a
Рис. 10. Электронный микроскоп.
а —общий вид; в—схема колонки: / — ручка для регулировки юстирующего устройства;
2 — устройство, фиксирующее пучок электронов; 3 — камера для сеток, на котором поме-
щаются исследуемые объекты; 4 — противозагрязнительнос устройство; 5 — диафрагма
объективной линзы; 6 —диафрагма поля зрения; 7 — бинокулярная лупа; 8 — флюоресцент-
ный экран; 9 — электронная пушка; 10 — конденсорные линзы; // — устройство, фокуси-
рующее пучок электронов; 12 — стигматор объективной линзы; 13 — объективная линза;
14 — промежуточные линзы; 15 — проекционная линза; 16 — фотоэкспонометр; 17— Фото-
камера.
применяется для изучения вирусов, тонкого строения различ-
ных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других
субмикроскопических объектов (рис. 10). Световые лучи в
таких микроскопах заменяют поток электронов, имеющий
при определенных ускорениях длину волны около 0,005 нм,
т. е. почти в 100000 раз короче длины волны видимого
света. Высокая разрешающая способность электронного микро-

б
скопа, практически составляющая 0,1—0,2 нм, позволяет
получить общее полезное увеличение до 1000000 раз.
Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют
сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие
рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая
способность этих приборов значительно ниже, чем у электрон-
ных микроскопов «просвечивающего» типа.
Методические указания
Работа с любым микроскопом состоит из правильной
установки освещенности поля зрения и препарата и его
микроскопии разными объективами. Освещение может быть
естественным (дневным) или искусственным, для чего исполь-
зуют специальные источники света, например осветитель ОИ-7.
При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом
следует строго придерживаться определенного порядка в ра-
боте: 1) на приготовленный и окрашенный мазок нанести
небольшую каплю иммерсионного масла и поместить препарат
на предметный столик (укреплять зажимами не обязательно);
2) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объекти-
ва 90; 3) осторожно опустить тубус микроскопа до погруже-
ния объектива в каплю масла; 4) установить ориентировоч-
ный фокус при помощи макрометрического винта; 5) провести
окончательную фокусировку препарата микрометрическим
винтом, вращая его в пределах только одного оборота.
Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом,
так как это может повлечь поломку препарата или фрон-
тальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объек-
тива 0,1—1 мм).	1
По окончании работы микроскопа необходимо специальной
тряпочкой тщательно вытереть масло с иммерсионного
объектива и перевести револьвер на малый сухой объектив 8.
Техника фазово-контрастной микроскопии. 1.Установить
в микроскоп фазовый конденсор и соответствующий фазовый объектив. Револьвер
конденсора поставить в положение «О». 2. Поместить препарат на предметный
столик. 3. Установить освещение так, чтобы четкое изображение нити электро-
лампы находилось в плоскости полностью открытой ирис-диафрагмы конден-
сора. 4. Заменить окуляр вспомогательным микроскопом МИР-4 и перемеще-
нием его окуляра сфокусировать фазовое кольцо объектива до получения чет-
кого темно-серого изображения. 5. Установить диафрагму в соответствии с
фазовым объективом. В поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы.
6. С помощью центрировочных винтов конденсора полностью совместить
светлое и темное кольца. 7. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром
и микроскопировать препарат. 8. При смене объектива или препарата вновь
проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом. Правильное
18
выполнение всех условий обеспечивает достаточно высокую контрастность
изображения.
Техника темнопольной микроскопии. 1. Заменить обычный
конденсор в микроскопе темнопольным (параболоид- или кардиоид-конденсор).
2. Для создания оптически гомогенной среды на верхнюю линзу темиополь-
ного конденсора нанести каплю дистиллированной воды или иммерсион-
ного масла. Поднять конденсор до соприкосновения капли воды или масла
с предметным стеклом. 3. Установить достаточно сильный и стабильный источ-
ник света (например, осветитель ОИ-7) и провести точную юстировку освети-
тельной системы микроскопа.
Возможные ошибки при микроскопии в темном поле связаны с наличием
пузырьков воздуха между конденсором и предметным стеклом, неправильной
установкой конденсора и другими причинами.
Техника люминесцентной микроскопии. В повседневной
работе объект обычно освещают сверху через объектив в падающем свете
При этом используют синие световые фильтры ФС-1 (2 мм), ФС-2 (4 мм) и
желтый фильтр Ж-18 для запиты глаз.
При работе с микроскопом МЛ-2 необходимо: 1) включить вилку блока
питания микроскопа в электрическую сеть; 2) поворотом по часовой стрелке
установить рукоятку регулятора напряжения у красной точки; 3) тумблер иа
лицевой стороне блока питания установить в положение «ВКЛ» (включено)
и нажать кнопку зажигания лампы микроскопа; если лампа ие загорается, повер-
нуть рукоятку регулятора напряжения на несколько миллиметров по часовой
стрелке и вновь нажать кнопку (на кнопку нажимать не более 2—3 с); 4) после
зажигания лампы установить рукоятку регулятора рабочего тока на отметку 4 А;
через 10 мин после включения лампы микроскопа можно начинать исследование
препаратов.
Люминесцентную микроскопию проводят в затемненной комнате.
Методы приготовления препаратов для тем-
нопольной, ф а з о в о-к онтрастнойилюминесцент-
ной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контраст-
ной микроскопии готовят нативные препараты («раздавлен-
ная» капля и др.); микроскопируют с объективом 40 или
специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой,
позволяющей регулировать численную апертуру от 1,25 до
0,85. Толщина предметных стекол не должна превышать
1—1,5 мм, покровных—0,15—0,2 мм.
Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных
стеклах препараты-мазки или нативные препараты, которые
окрашивают специальными флюоресцентными красителями:
акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином,
корифосфином. При работе с иммерсионным объективом
используют нефлюоресцирующее масло.
Приготовление препаратов для исследования в
электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят
на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электро-
нов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей
и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную метал-
лическую сеточку.
.19
МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
В данном разделе рассматриваются морфологические осо-
бенности основных представителей многообразного мира
микроорганизмов: бактерий, вирусов и грибов. Бактерии от-
Рис. 11. Формы бактерий.
а — шаровидные; б — палочковидные; в — извитые
носятся к царству прока-
риотов. Согласно класси-
фикации Берги (1974), в
него входят фото- и ско-
тобактерии (индиффе-
рентные к свету). Послед-
ние подразделяются на
три класса: 1) бактерии;
2) бактерии, являющиеся
облигатными внутрикле-
точными паразитами (рик-
кетсии и хламидии);
3) бактерии, лишенные
клеточной стенки (мико-
плазмы).
Классы подразделяют-
ся на порядки, семейства,
роды и виды. Ряд групп
микроорганизмов (грибы,
простейшие) относится к царству эукариотов. Вирусы выде-
лены в отдельное царство Vira.
Темя 2. МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ
Бактерии—одноклеточные микроорганизмы. Они имеют
разнообразную форму и довольно сложную структуру, опре-
деляющую многообразие их функциональной деятельности.
Для бактерий характерны четыре основные формы: сфериче-
ская (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая
и нитевидная (рис. 11).
Бактерии шаровидной формы —кокки —в зависимости от
плоскости деления и расположения отдельных особей под-
разделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), дип-
лококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), ста-
филококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки
(образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или
16 кокков).
Палочковидные бактерии располагаются в виде одиноч-
ных клеток, дипло- или стрептобактерий.
Извитые формы бактерий—вибрионы и спириллы, а
20
также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых
палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спираль-
ными завитками.
Размеры бактерий колеблются от 0,1 до 10 мкм. В состав
бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка,
цитоплазматическая мембрана и цитоплазма, в которой со-
держатся нуклеоид, рибосомы и включения (рис. 12). Некоторые
бактерии снабжены жгутиками (рис. 13) и ворсинками. Ряд
бактерий образуют споры, которые располагаются терминально,
субтерминально или центрально (рис. 14); превышая попереч-
ный размер клетки, споры придают ей веретенообразную
форму.
Для изучения морфологии бактерий из них готовят на-
тивные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки,
которые окрашивают анилиновым красителем. В основе
окраски лежат сложные химические и физико-химические
реакции. Протоплазма бактерий, особенно в фиксированных
мазках, обладает сродством к основным красителям. Поэтому
для их окраски используют главным образом основные кра-
сители: метиленовый синий, кристаллический фиолетовый,
везувин и др. Для выявления различных структурных элемен-
тов в бактериальной клетке применяют нейтральные и
кислые краски.
v Различают простые и сложные методы окраски (по Граму,
Цилю —Нельсену и др.). Последние имеют дифференциально-
диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к
красителям расценивают как тинкториальные свойства.
Рис. 13. Жгутики бактерий (схема).
а — монотрих; б — лофотрих; в — амфитрих;
г — перитрих.
Рис. 14. Споры бактерий (схема).
а — терминальное расположение; б — субтер-
мииальное; в ~ центральное.
21
Рис. 15. Актиномицеты.
Существуют специальные мето-
ды окраски, которые используют
для выявления жгутиков, кле-
точной стенки, нуклеоида и
разных цитоплазматических
включений.
Актиномицеты (Actinomyces)
относятся к порядку Actinomy-
cetales. Клетки актиномицетов
обычно имеют вид длинных
и ветвящихся нитей (рис. 15),
напоминающих в ряде случаев
мицелий одноклеточных гри-
бов, но встречаются также палочковидные и кокковидные
формы. Нити мицелия имеют длину 100—600 мкм и толщину
0,2—1,2 мкм. Актиномицеты размножаются спорами, попереч-
ным делением и почкованием. Они не имеют выраженной
капсулы, жгутиков и ворсинок. Как и другие бактерии, актино-
мицеты окрашиваются анилиновыми красителями. Обычно их
окрашивают простыми методами или по Граму. Актиномицеты
являются грамположительными микроорганизмами.
Программа занятия
1.	Формы бактерий и методы их изучения.
2.	Ультраструктура бактериальных клеток (изучение электронно-микроскопи-
ческих фотографий).
3.	Простые и сложные методы окраски.
Демонстрация
1.	Методика приготовления мазков из бактериальных культур и их окраска.
2.	Различные морфологические формы бактерий в препаратах-мазках, окра-
шенных простыми методами.
3.	Подвижность бактерий в препарате «висячая» капля.
4.	Мазок из смеси бактерий. Окраска по Граму
5.	Препарат актиномицета. Окраска по Граму.
6.	Мазок из чистой культуры капсульных бактерий. Окраска по Бурри -Гинсу.
7.	Мазок из чистой культуры дрожжей, содержащих зерна волютина.
Окраска по Нейссеру.
8.	Мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий. Окраска по методу
Ожешки.
9.	Мазок из чистой культуры кислотоустойчивых бактерий. Окраска по
Цилю — Нельсену.
10.	Методика определения размеров микробной клетки с техникой градуиров-
ки окулярного микрометра по объект-микрометру.
11.	Структурные компоненты бактериальной клетки на электронно-микроско-
пических фотографиях.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Определить форму клеток неизвестной бактериальной культуры, исполь-
зуя простой метод окраски.
2.	Определить форму клеток и отношение к окраске по Граму разных
бактерий, содержащихся в исследуемой смеси бактериальных культур.
3.	Определить наличие спор, зерен волютина и кислотоустойчивость
исследуемой бактериальной культуры, используя соответствующие методы
окраски.
4.	Определить подвижность исследуемых бактерий. Составить протокол и
сдедать заключение по результатам проведенных исследований (см. табл. 1).
Методические указания
Приготовление препаратов для микроскопического иссле-
дования.
Взятие материала для исследования. Для приготовления
препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы
или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной
пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели
препаровальные иглы.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку,
а петлю за петледержатель — в правую. Петлю прожигают
в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением
вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV
пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки.
Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внут-
реннюю поверхность, после чего легким скользящим движе-
нием берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки,
снова обжигают ее край и затыкают пробкой. После при-
готовления препарата петлю обязательно прожигают (стерили-
зуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы
можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и
закрывая отверстие II пальцем.
Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в
живом состоянии.
Метод «висячей» капли. Препарат готовят на по-
кровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бакте-
риальной культуры. Затем предметное стекло с лункой,
края которой предварительно смазывают вазелином, прижи-
мают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в
центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат
покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном
препарате капля должна свободно висеть над лункой, не
касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале исполь-
зуют малый сухой объектив 8, под увеличением которого
23
находят край капли, а затем устанавливают объектив 40 и
исследуют препарат.
Метод «раздавленной» капли. На поверхность
обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуе-
мого материала или суспензию бактерий и покрывают ее
покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не
выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют
препарат с объективом 40.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь
микробов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового
синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат
«висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют.
После микроскопии препараты «раздавленной» или «висячей» кап-
ли опускают в дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при-
готовления препарата на обезжиренное предметное стекло
наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида
натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и
распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий
и равномерный мазок диаметром около 1—1,5 см, только
при таком распределении материала в мазке можно увидеть
изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый
материал содержится в жидкой среде, то петлей его непо-
средственно наносят на предметное стекло и готовят мазок.
Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого возду-
ха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх)
медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя
горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно
прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при
дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может
вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, маз-
ки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки
из культур микроорганизмов фиксируют погружением на
5—20 мин в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифо-
рова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Методы окраски мазков
Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают
каким-либо одним красителем, например фуксином водным
(1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают
водой, высушивают и микроскопируют.
Сложные методы. Включают последовательное нане-
сение на препарат красителей, различающихся по химическому
24
составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ.
Это позволяет выявить определенные структуры клеток и
дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по методу Грама. 1. На фиксированный мазок
наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолето-
вого через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин
ее снимают, а краситель сливают.
2.	Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.
3.	Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение
30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек
красителя.
4.	Промывают препарат водой.
5.	Докрашивают мазок водным раствором фуксина в тече-
ние 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопи-
руют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиоле-
товый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 16).
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью
удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиоле-
тового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в прони-
цаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий,
а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке
грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный
слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны
грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных
бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности
клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комп-
лекс протеин — рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме
составляет 8 :1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1 :1.
Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится
при pH 2,0—3,0, у грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором
йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки
в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей
степени, чем у грамотрицательных.
Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бак-
терий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных
бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и
резистентности к обесцвечиванию спиртом.
Окраска по Граму имеет важное дифференциально-диаг-
ностическое значение и широко используется в микробиологии.
К грамположительным бактериям относятся стафилококки,
стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии тубер-
кулеза и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки,
кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут ок-
рашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста,
особенностей культивирования и других факторов, изменяющих
структуру клеточной стенки.
Основная ошибка, допускаемая при окраске по Г раму,
25
состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка
спиртом. В первом случае грамположительные бактерии мо-
гут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиоле-
товым и приобретать красный цвет (характерный для грамот-
рицательных бактерий) в результате последующей докраски
мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательные бакте-
рии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового
фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблю-
дать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски
по Г раму).
-Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля —
Нельсена. 1. На фиксированный мазок наносят карболовый
раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и
подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.
2.	Снимают бумагу, промывают мазок водой.
3.	На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или
3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечи-
вания.
4.	Промывают водой.
5.	Докрашивают мазок водным раствором метиленового
синего в течение 3—5 мин.
6.	Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной
стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества ли-
пидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты.
Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и
тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высо-
кая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски
усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными
клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет.
При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчи-
вые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым
синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остают-
ся окрашенными фуксином в красный цвет (рис. 17).
Окраска спор по методу Ожешки. 1. На нефиксированный
мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и
подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просуши-
вают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю — Нельсену. Споры бакте-
рий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные фор-
мы—синий (рис. 18).
Окраска зерен волютина по методу Нейссера. 1. На фикси-
рованный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин.
2.	Наносят раствор Люголя на 10—30 с.
26
п
3.	Промывают препарат водой.
4.	Мазок докрашивают водным раствором везувина или
хризоидина в течение %—1 мин.
5.	Промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие
в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому
избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в
темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой ре-
акцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окраши-
вается в желтый цвет (рис. 19).
Обнаружение капсул по методу Бурри—Гинса. 1. Готовят
препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с кап-
лей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем
готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высу-
шивают и фиксируют.
2. На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.
3. Промывают водой, высушивают на воздухе и микроско-
пируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет,
а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно-
розовом фоне (рис. 20).
Измерение микробов
Все микроскопические объекты измеряются в нанометрах (нм)
и микрометрах (мкм): 1 мкм=10-3 мм; 1 нм-=10~8 мм; 1 мкм—
=1000 нм. Для измерения микробов применяются окуляр-мик-
рометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для
непосредственного измерения объекта и представляет собой
стеклянную пластинку, в центральной части которой нанесена
шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет
собой стекло, в середине которого имеется эталонная шкала,
разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы известна и
указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-мик-
рометра равно 10 мкм.
Величину микроорганизмов измеряют окуляр-микрометром, помещая его на
диафрагму окуляра делениями вниз, величину делений —с помощью объект-
микрометра: пластинки, в центре которой нанесена линейка длиной 1 мм.
Линейка разделена на 100 делений, каждое из которых равно 10 мкм. Объект-
микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа так, чтобы одно
из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Линейки
обоих микрометров должны располагаться параллельно. Затем отмечают число
делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число делений
окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), уста-
навливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр
заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бактериальной
клетки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при
которой была измерена величина его делений.
27
Результаты работы по изучению бактериальной культуры
протоколируют (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика культуры по морфологическим п тинкториальным
признакам (форма протокола)
Форма клеток	Величина	Окраска по Г раму	Наличие			^Кислото- _ устойчи-	Подвиж- ность	Вклю- чения
			спор	кап- сул	зерен волю- тина	вость		
								
Тема 3. МОРФОЛОГИЯ СПИРОХЕТ
Спирохеты —извитые подвижные бактерии, относящиеся к
порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae. Патогенные
спирохеты принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema,
Leptospira.
Клетка спирохеты имеет цилиндрическую извитую форму,
содержит цитоплазму, отграниченную цитоплазматической мем-
браной,. снаружи которой расположена клеточная стенка со
слабовыраженным пептидогликановым слоем. Патогенные
спирохеты имеют длину 3—20 мкм и толщину 0,1—0,5 мкм.
Представители отдельных родов различаются по длине и
толщине, числу и характеру завитков (табл. 2; рис. 21).
Спирохеты грамотрицательны. Боррелии в отличие от трепо-
нем и лептоспир хорошо окрашиваются анилиновыми краси-
телями. Морфологию трепонем и лептоспир изучают путем
микроскопии живых микроорганизмов в препаратах «раздав-
ленная» или «висячая» капля в темнопольном или фазово-
контрастном микроскопе, а также в мазках, окрашенных по
Романовскому—Гимзе или специальными методами, например
серебрением.
Программа занятия
1. Методы изучения морфологии спирохет.
2. Дифференцирование спирохет по морфологическим признакам.
28
Рис. 21. Морфология спирохет.
а — трепонемы; б— боррелии; в —лепто-
спиры.
Демонстрация
1.	Движение лептоспир в темнополь-
ном микроскопе.
2.	Препарат лептоспир по Бурри.
3.	Препарат бледной трепонемы по
Бурри.
4.	Препарат боррелий в толстой капле
крови. Окраска по Романовскому —
Гимзе.
Задание для выполнения
лабораторной работы
Определить родовую принадлежность спирохет в готовом мазке, окрашен-
ном по Романовскому—Гимзе, используя данные, приведенные в табл. 2.
Методические указания
Морфологию спирохет изучают в препаратах «раздавленная»
капля и в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе.
Нативные препараты микроскопируют в темном поле или с
помощью фазово-контрастного микроскопа, наблюдая за актив-
ным и характерным движением спирохет и особенностями
их формы.
Приготовление мазков из крови. На чистое
обезжиренное стекло ближе к одному из его концов поме-
щают каплю крови. Другое предметное стекло, имеющее
шлифованный край, прижимают под углом 45° к капле крови,
а затем скользящим движением передвигают его к свободному
концу первого стекла. При этом кровь распределяется по
предметному стеклу тонким слоем. Высушивают препарат
на воздухе, фиксируют в жидком фиксаторе (метиловый спирт
или смесь этилового спирта и эфира).
Для приготовления «толстой» капли на предметное стекло
наслаивают 2—3 капли крови, распределяя ее до величины
10-копеечной монеты. После высушивания на воздухе осто-
рожно наливают несколько капель дистиллированной воды
на 10—15 мин для удаления гемоглобина из эритроцитов.
Окрашивание препарата по Романовскому-
Гимзе смесью метиленового синего, эозина и
аз ура. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 кап-
ли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—20 мин.
Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
29
Таблица 2. Морфологические признаки спирохет
Род	Количество и харак- тер завитков	Характер движения	Окраска по Романовскому — Гимзе
Borrelia Treponema Leptospira	3—10, крупные, не- равномерные 8—12, мелкие, рав- номерные Многочисленные первичные за- витки; вторич- ные завитки в виде буквы S	Толчкообразное, сгиба- тельно-поступательное Плавное, сгибательно- поступательное Очень активное, враща- тельно-поступательное	Сине-фиоле- товая Бледно-розовая Розово-сире- неватая
По Романовскому—Гимзе спирохеты возвратного тифа окра-
шиваются в фиолетовый цвет, эритроциты крови —в розовый,
ядра лейкоцитов —в фиолетовый. Трепонемы окрашиваются
в бледно-розовый цвет, лептоспиры —в розово-сиреневатый.
Тема 4. МОРФОЛОГИЯ РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ.
МОРФОЛОГИЯ МИКОПЛАЗМ
Риккетсии и хламидии относятся к классу Rickettsia облигат-
ных внутриклеточных паразитов, который делится на два
порядка: Rickettsiales и Chlamidiales.
Риккетсии представляют собой мелкие грамотрицательные
микроорганизмы, характеризующиеся выраженным полиморфиз-
мом — образуют кокковидные, палочковидные и нитевидные
формы (рис. 22). Размеры риккетсий варьируют от 0,5 до
3—4 мкм, длина нитевидных форм достигает 10—40 мкм.
Спор и капсул не образуют, окрашиваются по Здродовскому
в красный цвет.
Хламидии имеют шаровидную, овоидную или палочко-
видную форму. Их размеры колеблются в пределах 0,2—1,5 мкм.
Морфология и размеры хламидий зависят от стадии их
внутриклеточного цикла развития, для которого характерно
превращение небольшого шаровидного элементарного образо-
вания в крупное инициальное тельце с бинарным делением.
Перед делением частицы хламидий обволакиваются образова-
нием, напоминающим бактериальную капсулу. Хламидии
окрашиваются 'по Романовскому—Гимзе, грамотрицательны,
хорошо видны в прижизненных препаратах при фазово-
контрастной микроскопии.
К классу Mollicutes относится только один порядок
Mycoplasmatales. Представители этого порядка — микоплазмы —
30
отличаются от бактерий отсутствием клеточной стенки.
Вместо нее они содержат трехслойную липопротеидную
цитоплазматическую мембрану. Размеры микоплазм колеб-
лются в пределах 125—250 мкм. Они имеют форму круглых,
овальных или нитевидных образований, грамотрицательны.
Программа занятия
Изучение морфологических признаков риккетсий, хламидий и микоплазм.
Демонстрация
1. Хламидии в инфицированных клетках эпителия конъюнктивы, мазках-
отпечатках из органов и культуры ткани.
2. Электронно микроскопические фотографии риккетсий, хламидий и
микоплазм.
Задание для выполнения лабораторной работы
Изучить морфологию риккетсий в препарате, окрашенном по Романовскому-
Гимзе.
Рис. 22. Морфологические
типы риккетсий. Кокко-
видные, палочковидные и
мицеллярные формы.
31
Методические указания
Окраска риккетсий по методу Здродовского. 1. Окрашивают
мазок разведенным фуксином Циля (10—15 капель на 10 мл
дистиллированной воды) в течение 5 мин.
2.	Промывают водой.
3.	Обрабатывают мазок 0,5% раствором лимонной кислоты
или 0,01% раствором хлористоводородной кислоты.
4,	Промывают водой.
5.	Окрашивают метиленовым синим в течение 1 мин.
6.	Промывают водой, высушивают препарат.
Риккетсии по методу Здродовского окрашиваются в красный
цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют,—
в голубой, ядра — в синий.
Тема 5. МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ
Вирусы человека, животных, растений, насекомых и бакте-
рий (фаги) выделены в царство вира (Vira). Они отличаются
от других микроорганизмов своей ультраструктурной органш
зацией и наличием только одного типа нуклеиновой кисло-
ты-РНК или ДНК. Внеклеточная форма существования
вируса называется вирионом. Размеры вирионов колеблются
от 15—20 до 300—500 нм. Они имеют палочковидную или
цилиндрическую форму (вирус табачной мозаики), нитевидную
форму в виде изгибающихся тонких нитей шириной около
10 нм и длиной до 500 нм и более (вирусы растений и
некоторые фаги), сферическую форму, напоминающую много-
гранники (пикорнавирусы, аденовирусы), форму параллелепипе-
да (поксвирусы) и булавовидную или сперматозоидную форму
(вирусы бактерий—фаги).
Простейшие вирионы состоят из нуклеиновой кислоты и
белковой оболочки — капсида, который плотно ее окружает.
В морфологическом отношении их характеризуют как нуклео-
капсиды, а в химическом — как нуклеопротеиды.
Капсиды вирионов состоят из отдельных структурных
субъединиц (полипептидные цепи), объединенных в симмет-
ричные группы по кубическому или спиральному типу сим-
метрии (рис. 23, а, б). Объединения единиц с кубическим
типом симметрии называются морфологическими единицами,
или капсомерами, которые могут быть обнаружены при
электронной микроскопии. Капсиды построены из определен-
ного числа капсомеров, характерного для каждой группы
вирусов с кубическим типом симметрии. Например, у адено-
вирусов (рис. 24, а, б) капсид построен из 252 капсомеров.
У вирионов со спиральным типом симметрии структурные
32
Рис. 25. Вирус табачной
мозаики (ВТМ).
а — модель ВТМ. Изображен
фрагмент вирусного капсида,
построенного из одинаковых
спирально расположенных бел-
ковых субъединиц. Между
субъединицами помещается
цепочка РНК, конфигурация
которой целиком определяется
их спиральным расположением.
Часть спирали РНК условно
показана свободной; б — вири-
оны ВТМ. Электронная микро-
скопия.
а
2-639
Рис. 26. Вирус оспы.
а — строение вириона оспы (схема):
1 — фрагмент цитоплазматической
оболочки, захваченной вирионом при
выходе из клетки; 2 — пространство
между этой оболочкой и поверхностью
вириона; 3 — внешняя осмиофильная
мембрана оболочки вириона; 4 — сред-
няя осмиофильная мембрана оболочки
вириона; 5 — внутренняя мембрана обо-
лочки вириона; 6 — боковое (лате-
ральное) тело; 7 — фрагмент клеточной
оболочки; 8 — внутривирусная Гранула;
9 — локальное втяжение оболочки; Ю —
тяж связывающий компонент нуклеоида
с оболочкой; 11 — вирусоплазма; /2 —
внешняя осмиофильная мембрана обо-
лочки нуклеоида; 13 — средняя осми-
офобная мембрана оболочки нуклеоида;
14 — внутренняя осмиофильная мембра-
на оболочки нуклеоида- 15 — нуклеоидо-
плазма; 16 — осмиофобный компонент
S-образной структуры; 17— кольцо-срез
спиральной укладки ДНК (гипотеза);
18 — центр этого кольца; 19 — внутрен-
ний компонент S-образной структуры
нуклеоида- 20 — центральный компо-
нент S-образной структуры нуклео-
ида; б — вирион натуральной оспы.
Электронная микроскопия. X 230 000.
Видна S-образная структура нуклеоида.
Рис. 27. Фаги.
а — фаг Та. Электронная микроскопия; X 100 000. Видны гексагональная головка, отросток
с фибриллами, базальная пластинка; б — адсорбция фага Та на клетках Е. coli в скани-
рующем электронном микроскопе.
субъединицы уложены в виде спирали вокруг оси (рис. 25,
а, б). К таким вирионам относятся вирус табачной мозаики,
миксовирусы. Сложно устроенные вирионы, например вирусов
оспы, гриппа, имеют внешнюю оболочку — суперкапсид
(рис. 26, а, б), в состав которого входят липиды и поли-
сахариды, принадлежащие клетке хозяина. Для фагов, имеющих
сперматозоидную форму, характерен смешанный тип симметрии,
так как капсид их головки построен по кубическому типу
симметрии, а субъединицы капсида отростка объединены по
спиральному типу симметрии (рис. 27).
Программа занятия
Изучение морфологии и ультраструктуры вирионов различных вирусов человека,
животных, бактерий (фагов).
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Изучить морфологию вируса осповакцины в препарате, окрашенном по
Морозову.
2. Изучить структуру простых и сложных вирионов по схемам и электронно-
микроскопическим фотографиям.
Методические указания
Для окраски по способу Морозова готовят три реактива:
1) к 1 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 2 мл 40%
раствора формалина и доводят дистиллированной водой до
объема 100 мл; 2) 5г танина вносят в 1 мл карболовой
кислоты и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл;
3) к 5 мл раствора нитрата серебра добавляют по каплям
раствор аммиака до легкой опалесценции.
Техника окраски: 1) высушенный мазок фиксируют
раствором 1 в течение 1 мин, затем раствор сливают и
мазок промывают водой; 2) протравляют его раствором 2 в
течение 1—2 мин при подогревании до появления паров,
после чего промывают водой; 3) окрашивают мазок раство-
ром 3 при подогревании до появления темно-коричневого
цвета, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
При этом вирусы окрашиваются в черный цвет.
АСЕПТИКА И АНТИСЕПТИКА. ДЕЗИНФЕКЦИЯ
Асептика —система мероприятий, предупреждающих вне-
сение (попадание) микроорганизмов из окружающей среды в
ткани или полости человеческого организма при лечебных
и диагностических манипуляциях, а также в материал для
36
исследования, в питательные среды и культуры микроорганиз-
мов при лабораторных исследованиях. Асептика предусмат-
ривает стерилизацию инструментов и материалов, спе-
циальную обработку рук медицинских работников, соблю-
дение особых санитарно-гигиенических правил и приемов
работы. Методы и правила асептики должны строго соблю-
даться при производстве лечебных и профилактических пре-
паратов, а также в работе микробиологических Лабораторий.
Антисептика — комплекс лечебно-профилактических
мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов,
способных вызвать инфекционный процесс на поврежденных
или интактных участках кожи и слизистых оболочек. В ка-
честве антисептиков используются различные химические сое-
динения, оказывающие антимикробное действие: 70% этило-
вый спирт, 5% спиртовой раствор йода, 0,5—2% раствор
хлорамина, 0,1% раствор КМпО4, 0,5—1% раствор формалина,
1—2% спиртовые растворы метиленового синего или бриллиан-
тового зеленого, различные детергенты.
Антимикробные вещества добавляют также к различным
материалам используемым для изготовления перевязочных
средств, лейкопластырей, для пломбирования зубов, изготов-
ления зубных протезов и т. п. с целью придания им бак-
терицидных свойств.
Дезинфекция—обеззараживание объектов окружающей
среды: уничтожение патогенных для человека и животных
микроорганизмов с помощью химических веществ, обладаю-
щих антимикробным свойством. К наиболее распространен-
ным дезинфицирующим веществам относятся хлорная
известь (0,1—10% раствор), хлорамин (0,5—5% раствор), фенол
или карболовая кислота (3—5 % раствор), лизол (3—5% раствор),
двутреть основная соль гипохлората кальция—ДТСГК (0,1—10%
раствор). Выбор дезинфицирующего вещества и его концентра-
ций зависит от материала, подлежащего дезинфекции.
Некоторые вещества (борная кислота, мертиолат, глицерин,
фенол) применяют как консерванты для приготовления ле-
чебных и диагностических сывороток, вакцин и других препа-
ратов.
Тема 6. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ЭФФЕКТИВНОСТИ СТЕРИЛИЗАЦИИ И ДЕЙСТВИЯ
АНТИСЕПТИЧЕСКИХ И ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ
Программа занятия
1.	Антимикробное действие физических и химических факторов.
2.	Методы стерилизации.
3.	Аппаратура, используемая для стерилизации.
4.	Методы определения эффективности стерилизации, действия антисеп-
тических и дезинфицирующих веществ.
С т е р и л и з а ц и я — обеспложивание, т. е. полное уничто-
жение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в
различных материалах. Стерилизацию проводят физическими
методами: 1) воздействием высокой температуры: 2) путем
ультрафиолетового облучения; 3) механическим путем — фильтра-
цией жидкостей через бактериальные фильтры, а также хи-
мическими методами.
Физические методы стерилизации. 1. Прокаливание
в пламени спиртовки или газовой горелки.
Данный способ применяется ограниченно, например для ”
стерилизации бактериологических петель, препаровальных
игл, пинцетов.
2.	Стерилизация кипячением. Этим методом стери-
лизуют шприцы, мелкий хирургический инструментарий, пред-
метные и покровные стекла и некоторые другие предметы. Их
помещают в стерилизаторы, в которые наливают воду. Для
устранения жесткости и повышения температуры кипения к воде
добавляют 1—2% раствора бикарбоната натрия. Кипячение
производят не менее чем 30 мин. Однако данный метод не
обеспечивает полной стерилизации, так как некоторые вирусы
(например, вирус гепатита) и споры бактерий могут остаться
жизнеспособными.
3.	Стерилизация сухим жаром, или суховоз-
душная стерилизация в сушильном шкафу (пе-
чи Пастера). Метод основан на бактерицидном действии
нагретого до 165—180°С воздуха. При более высокой температу-
ре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую
завернута посуда, а при более низкой температуре требуется
больший срок стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стек-
лянную посуду: чашки Петри, пробирки, пипетки и др.
4.	Стерилизация паром под давлением в ав-
токлаве (см. рис. 2).
Один из наиболее эффективных методов стерилизации, который
широко применяется не только в микробиологической практике,
но и в клинической медицине. Работа с автоклавом требует
точного выполнения специальной инструкции и соблюдения
правил безопасности. Многие питательные среды, перевязочный
материал, белье стерилизуют при давлении 1 атм в течение
15—20 мин, питательные среды с углеводами—при 0,5 атм в
течение 15 мин, а обеззараживание инфицированного материала
производят при 1,5—2 атм в течение 20—25 мин (табл. 3).
Максимальную температуру пара измеряет максимальным
термометром, который помещают в автоклав вместе со стери-
38
Таблица 3. Соотношения между давлением, температурой и продолжитель-
ностью стерилизации в автоклаве
Давление пара, атм	Температура, °C	Время стерилизации, мин
0	100	30-60 (дробно)
0,5	111	20-30
1	121	15-20
1,5	127	15-20
2	133	15
лизуемым материалом. В некоторых случаях используют хими-
ческие вещества с определенной температурой плавления: бен-
зонафтол (110°), бензойную кислоту (120°С).
5.	Стерилизация текучим паром в аппарате
Коха или в автоклаве. Данный вид стерилизации (при
незавинченной крышке и открытом выпускном кране) основан
на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных
клеток. Он применяется в тех случаях, когда стерилизуемый
материал не выдерживает высокой температуры, например
питательные среды с витаминами, углеводами. Для полного
обеспложивания применяют принцип дробной стерилизации,
т. е. стерилизуют материал при 100°С (или 80—90°С) в течение
20—30 мин 3 дня подряд. При этом вегетативные клетки поги-
бают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Последующее
двукратное прогревание обеспечивает достаточно надежную
стерильность материала.
6.	Тиндализация. Дробная стерилизация материалов при
58—56°С в течение часа 5—6 дней подряд. Применяется для
стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре
веществ (сыворотка крови, витамины и др.).
7.	Пастеризация. Данный метод основан на антибакте-
риальном действии температуры в отношении вегетативных
клеток, но не бактериальных спор. Нагревание материала про-
изводится при температуре 50—65°С в течение 15—30 мин или
70—80°С в течение 5—10 мин с последующим быстрым охлажде-
нием. Обычно пастеризуют напитки и пищевые продукты (вино,
пиво, соки, молоко и др.).
8.	Стерилизация ультрафиолетовыми лучами.
Метод основан на бактерицидном действии УФ-лучей с дли-
ной волны 260—300 мкм. Для стерилизации воздуха в боксах,
операционных, детских учреждениях используют бактерицидные
лампы разной мощности (БУВ-15, БУВ-30).
Механическая стерилизация (фильтрование). Данный метод
основан на механической задержке микроорганизмов и их
спор мелкопористыми фильтрами с определенным диаметром
39
Рпс. 28. Установка для фильтрования в условиях вакуума.
/.— фильтр Зейтца; 2 —колба Бунзена для сбора фильтрата; 5 —переходная трубка с
ватным фильтром; 4, 5 — вакуумные краны; б — ловушка.
пор. В лабораторной практике широко применяется фильтра-
ция материала через асбестовые и мембранные фильтры с
разным диаметром пор. Эти фильтры помещают в разъемную
часть цилиндрической воронки Зейтца, обе части которой
скрепляются барашкообразными болтами. Трубчатый конец
воронки через резиновую пробку вставляют в колбу Бунзена.
Перед фильтрацией вся смонтированная система с асбестовым
фильтром стерилизуется в автоклаве. Мембранные фильтры
стерилизуют отдельно кипячением, а потом вставляют в
стерильную воронку Зейтца. Фильтрация проводится с помощью
вакуум-насоса, к которому присоединяют колбу Бунзена
(рис. 28).
Асбестовые фильтры выпускаются диаметром 35 и 140 мм;
различают фильтрующую марку (ф) и стерилизующую (сф).
Мембранные фильтры представляют собой пластинки толщи-
ной около 0,1—0,5 мм и диаметром 35 мм из нитроклетчат-
ки или ацетилцеллюлозы. В зависимости от размеров пор
эти фильтры имеют номера 1—5 (размеры пор соответствен-
но равны 350—1200 нм). Оба типа фильтров рассчитаны на
однократное применение. Фильтрование используют для
стерилизации жидких материалов, не выдерживающих нагре-
вания (сыворотка крови, антибиотики), для получения бакте-
риальных токсинов, фагов и разных продуктов жизнедеятель-
ности бактерий.
Химические методы стерилизации. Используют различные
химические вещества (см. с. 37), обладающие бактерицидным
свойством, но в лабораторной практике применяют ограни-
ченно.
40
Демонстрация
Аппаратура (автоклав, сушильный шкаф, фильтрационная установка),
используемая для стерилизации.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Учесть результаты опытов, поставленных с бактериальными тест-
объектами для контроля эффективности стерилизации, проведенной путем
кипячения и автоклавирования. Сделать заключение.
2.	Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-лучей
на стафилококк и кишечную палочку.
3.	Учесть результаты опытов, поставленных для определения антимикроб-
ного действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Сделать заклю-
чение.
Методические указания
Изучение антибактериального действия высоких температур.
В три пробирки с питательным бульоном поместить шелко-
вые нити, смоченные смесью споровой и неспоровой куль-
тур. Первую пробирку подвергнуть автоклавированию, вто-
рую — кипячению; третью (контроль) никакому воздействию
не подвергать. Посевы выдержать в термостате при 37°С
в течение 24 ч. Отметить результат поставленного опыта и
сделать заключение.
Изучение антибактериального действия Уф-лучей. Суспен-
зию стафилококка или Е. coli в изотоническом растворе
хлорида натрия в объеме 1 мл поместить на стерильное
часовое стекло и облучить лампой БУВ-30 в течение 15 мин
на расстоянии 10—20 см от центра лампы. Облученную и не-
облученную (контроль) суспензии бактерий засеять в пита-
тельный бульон и инкубировать при 37°С в течение 16—24 ч,
после чего отметить результаты: отсутствие помутнения
среды связано с гибелью облученной культуры бактерий,
в контроле — наличие роста (помутнение).
Определение антимикробного действия антисептических' и
дезинфицирующих веществ. 1. Приготовить два вида тест-объек-
тов: а) шелковые нити, смоченные культурой Е. coli; б) шел-
ковые нити, смоченные спорообразующей культурой (с боль-
шим содержанием спор). Нити поместить в растворы фено-
ла (5%), лизола (5%), хлорной извести (10%) на 5 и 60 мин,
после чего отмыть от исследуемых веществ, засеять в пита-
тельный бульон и поместить в термостат до следующего
дня. Контрольные тесты не подвергать действию химических
веществ. Отметить результат поставленного опыта и сделать
заключение.
2. Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами
исследуемых веществ и поместить на поверхность питатель-
41
ного агара в чашке Петри, засеянной (газоном) тест-культу-
рой стафилококка или кишечной палочки. Чашки инкубиро-
вать в течение суток при 37°С. Об антибактериальном дейст-
вии исследуемых веществ судят по зонам задержки роста
бактерий, образующихся вокруг дисков.
ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
В данном разделе изложены основные методы микробиоло-
гического исследования: приготовление питательных сред,
техника посевов и пересевов, способы культивирования
микроорганизмов в лабораторных условиях и выделение чис-
тых культур. Изучение физиологии бактерий заключается в
исследовании их пищевых потребностей, ферментов, участ-
вующих в пластическом и энергетическом метаболизме,
характера роста и размножения на плотных и жидких
питательных средах. Наличие общих закономерностей в
метаболизме разных микроорганизмов сочетается с существен-
ными различиями в путях и способах превращения веществ
и энергии. На этом основаны их дифференцирование и
идентификация — важнейшие этапы в микробиологической
диагностике инфекционных заболеваний. Наряду с прикладным
значением изучение метаболизма у бактерий открыло широ-
кие перспективы для познания биохимических и генетических
механизмов, ответственных за наследственную информацию
и способы ее реализации, систему регуляции синтеза белка
и другие процессы, протекающие в микробной клетке.
Тема 7. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Питательной средой в микробиологии называют среды,
содержащие различные соединения сложного или простого
состава, которые применяются для размножения бактерий
или других микроорганизмов в лабораторных или промышлен-
ных условиях.
Любая питательная среда должна отвечать следующим
требованиям: содержать все необходимые для размноже-
ния определенных микроорганизмов вещества в легкоусвоя-
емой форме, иметь оптимальную влажность, вязкость, pH,
быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую сре-
ду стерилизуют определенным способом в зависимости от
ее состава.
Ряд питательных сред готовят непосредственно в микро-
биологических лабораториях из продуктов животного или
42
растительного происхождения (говяжье мясо, молоко, яйца,
сыворотка крови, овощи, дрожжи, казеин) или из искусствен-
но полученных из этих продуктов веществ (пептон, амино-
пептид, дрожжевой и кукурузный экстракты).
Большое значение имеет наличие в питательной среде
ростовых факторов, которые играют роль катализаторов мета-
болических процессов, главным образом витаминов группы В,
никотиновой кислоты и др.
По консистенции питательные среды могут быть
плотными, жидкими и полужидкими. Плотные среды гото-
вят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полу-
жидкие— 0,3—0,7% агара, который представляет собой продукт
переработки особого вида морских водорослей и в застыв-
шем состоянии придает среде плотность. Агар плавится при
температуре 80—86°С и затвердевает при температуре около
40°С.
В некоторых случаях для получения плотных питатель-
ных сред используют желатин (10—15%). Такие естественные
среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный
белок, сами по себе являются плотными.
В бактериологической практике чаще всего используют
сухие питательные среды, которые изготовляются в промышлен-
ных масштабах — триптические гидролизаты дешевых непище-
вых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический
казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться
в течение длительного времени, удобны при транспортировке
и имеют относительно стандартный состав.
По целевому назначению питательные среды де-
лят на основные, элективные и дифференциально-диагности-
ческие.
К основным относятся среды, применяемые для выращи-
вания многих бактерий. Это триптические гидролизаты рыб-
ных продуктов или казеина, из которых готовят жидкую
среду —питательный бульон и плотную —пи та те ль-
ны й агар. Такие среды служат основой для приготовления
более сложных: сахарных, кровяных, сывороточных и других
комбинированных, удовлетворяющих пищевые потребности
более требовательных патогенных бактерий. В качестве
основных иногда используют синтетические питательные
среды, приготовленные из навесок определенных минеральных
солей, к которым добавляют аминокислоты, витамины,
глюкозу. К ним также можно добавлять пептон, кукурузный или
дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Синте-
тические среды чаще всего применяют в научно-исследова-
тельской практике, а синтетические среды с упомянутыми
43
экстрактами — в микробиологической промышленности при
получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.
Элективные питательные среды предназначены для изби-
рательного выделения и накопления микробов определенного
вида из материалов, содержащих разнообразную посторон-
нюю микрофлору. Создавая элективные для определенных
микробов питательные среды, исходят из биологических
особенностей, которые отличают данные микробы от боль-
шинства других. Например, избирательный рост стафилококка
наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия,
холерного вибриона — в щелочной среде и т. д.
Дифференциально-диагностические питательные среды при-
меняются для разграничения отдельных видов (или групп)
микроорганизмов. Принцип построения дифференциально-диаг-
ностических сред основан на том, что разные виды бакте-
рий различаются между собой по биохимической активности
и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих
субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав
дифференциально-диагностической среды входят следующие
основные компоненты: а) основная питательная среда, обеспе-
чивающая размножение бактерий; б) определенный химический
субстрат (например, лактоза), различное отношение к которо-
му является диагностическим признаком для данного микро-
ба; в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде),
изменение цвета которого свидетельствует о биохимической
реакции и наличии данной ферментной системы у исследуе-
мого микроорганизма. Дифференциально-диагностические сре-
ды широко используются в лабораторных микробиологических
диагностических исследованиях для дифференциации и
идентификации бактерий.
Программа занятия
1. Питательные среды и ингредиенты, используемые для их приготовления
2. Техника приготовления питательных сред
Демонстрация
1.	Ингредиенты, используемые для приготовления питательных сред.
2.	Питательные ср^ды: основные, дифференциально-диагностические, элек-
тивные, синтетические.
3.	Приготовление питательной среды из порошка или пасты.
4.	Определение pH питательного бульона.
Методические указания
Приготовление питательных сред. Основные среды. Пасту
триптического гидролизата растворяют в определенном объеме
44
дистиллированной воды, устанавливают pH, разливают в
соответствующую посуду, закрывают ватно-марлевыми пробками
и стерилизуют в автоклаве. Порошок питательного агара
вносят в определенный объем воды и кипятят в течение
10—15 мин, после чего разливают в чашки Петри или
пробирки. Для приготовления скошенного питательного агара
пробирки с разлитым агаром оставляют застывать в наклон-
ном положении на столе.
Кровяные, сывороточные и асцитические
среды. К расплавленному и остуженному до 45—50°С пита-
тельному агару стерильно добавляют 5—10% дефибриниро-
ванной крови или в таком же количестве сыворотку крови,
или 25% асцитической жидкости, хорошо перемешивают и
сразу же разливают в чашки Петри, пробирки или другую
лабораторную посуду. Для приготовления жидкой среды
такие же количества сыворотки или асцитической жидкости
добавляют к питательному бульону.
Среды с углеводами. К питательному агару или
бульону добавляют 0,5—1% глюкозы или другого углевода.
Стерилизацию производят текучим паром или паром под дав-
лением 0,5 атм.
Элективные питательные среды. Пептонная вода 1%,
pH 8,0. Элективна для холерного вибриона, который размно-
жается быстро, опережая рост других микробов. Щелочная
реакция среды не препятствует росту холерных вибрионов,
но тормозит рост других микроорганизмов.
Щелочной агар. Плотная среда: питательный агар,
pH 7,8, аналогично предыдущей среде, элективен для холер-
ного вибриона.
Среда Леффлера. Смесь 1 ч. лошадиной сыворотки
и 3 ч. сахарного бульона, скошенная в пробирках при
нагревании в аппарате Коха, элективна для дифтерийных
палочек. Быстрый рост этих микробов (4—6 ч) обеспечивает
элективность среды.
Среда Мюллера. Элективна для тифо-паратифозных
бактерий, которые значительно менее, чем кишечные палочки,
чувствительны к тетратионату натрия (это соединение обра-
зуется в питательном бульоне, куда добавляют раствор
Люголя и серноватистокислый натрий).
Желточно-солевой агар (Ж С А). Содержит повы-
шенные концентрации хлорида натрия (8—10%), которые не
препятствуют размножению стафилококков, что создает
элективность этой среды для данных микробов. Среда
дифференцирует стафилококки, продуцирующие лецитовител-
лазу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по
45
образованию зон помутнения с перламутровым оттенком
вокруг колоний лецитовителлазоположительных микробов
(фермент расщепляет лецитиназу куриного желтка, который
вносится в расплавленный и остуженный до 45°С питательный
солевой агар).
Дифференциально-диагностические среды. Среды Г и с-
са. К 1% пептонной воде добавляют 0,5% определенного уг-
левода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индика-
тор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH);
разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок
(трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян)
для улавливания газообразных продуктов, образующихся при
разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим
паром или паром под давлением 0,5 атм; поплавок при
этом заполняется питательной средой. Среда при pH 7,2—7,4
бесцветна. При разложении углеводов приобретают красный
цвет.
Промышленность выпускает в виде порошка полужидкие
среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного го-
лубого и розоловой кислоты). Индикатор ВР при нейтральной
реакции среды бесцветен, в кислой среде он имеет синюю
окраску, в щелочной — красную. Образующийся газ разрывает
столбик полужидкого агара.
Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который
состоит из высушенного питательного агара с 1 % лактозы
и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом
натрия. Перед употреблением определенную навеску порошка
вносят в дистиллированную воду, кипятят, а затем разливают
по чашкам Петри. Свежеприготовленная среда бесцветна
или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозополо-
жительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-крас-
ный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные
бактерии образуют бесцветные колонии.
Среда Левина. Выпускается, в виде порошка и состо-
ит из высушенного питательного агара с лактозой, К2НРО4,
метиленовым синим и эозином. Готовится так же, как и сре-
да Эндо. Среда темно-фиолетового цвета. Лактоположитель-
ные бактерии образуют колонии насыщенного синего цвета,
лактозоотрицательные — бесцветные колонии.
Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается
в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой,
бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минераль-
ными солями и индикатором (нейтральный красный). Эта
среда является не только дифференциально-диагностической,
но и селективной, так как подавляет рост многих микро-
46
бов (кишечная палочка и др.) и способствует лучшему росту
некоторых болезнетворных бактерий (возбудители брюшного
тифа, паратифов, дизентерий). Лактозоотрицательные бактерии
образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозополо-
жительные — красные.
Среды для культивирования анаэробов. Среда Вильсона —
Блера (железосульфитный агар). Приготовляется из питатель-
ного агара, к которому добавляют глюкозу, NasSOa, FeCl2
(хлорид железа). Анаэробные клостридии (Cl. perfringens) обра-
зуют на этой среде колонии черного цвета за счет восста-
новления NasSOs в NajS (сульфит натрия), который, соеди-
няясь с хлоридом железа, дает осадок сульфата железа
черного цвета.
Среда Китта — Тароцци. Состоит из питательного бульона,
0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для
адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на
кипящей водяной бане в течение 10—15 мин для удаления
воздуха. С целью изоляции от атмосферного воздуха среду
заливают небольшим слоем вазелинового масла.
Тема 8. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ
И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Чистой культурой называется популяция бактерий
одного вида или одной разновидности, выращенная на
питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют
по одному признаку на биологические варианты — биовары
(син: биотипы). Биовары, различающиеся по биохимическим
свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам —
сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Куль-
туры микробов одного и того же вида, или биовара, выде-
ленные из различных источников или в разное время из
одного и того же источника, называют штаммами, кото-
рые обычно обозначаются номерами или какими-либо симво-
лами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологи-
ческих лабораториях получают из изолированных колоний, пересе-
вая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой пита-
тельной средой.
Колония представляет собой изолированное скопление
бактерий одного вида, или биовара, выросших на плотной
питательной среде в результате размножения одной или
нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных
видов отличаются друг от друга по своей морфологии,
цвету и другим признакам.
47
Чистую культуру  бактерий получают для проведения
диагностических исследований, которые заключаются в иден-
тификации, т. е. определении родовой и видовой принадлеж-
ности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения
их морфологических, культуральных, биохимических и других
признаков (см. схему 1).
Морфологические и тинкториальные приз-
наки бактерий изучают при микроскопическом исследовании
мазков, окрашенных разными методами, и нативных препара-
тов.
Культуральные свойства характеризуют питатель-
ные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных
и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются
по морфологии колоний и особенностям роста культуры.
Биохимические признаки бактерий определяются
набором конститутивных и индуцибельных ферментов, при-
сущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологи-
ческой практике таксономическое значение имеют чаще все-
го сахаролитические и протеолитические признаки бактерий,
которые определяют на дифференциально-диагностических
средах.
Для идентификации бактерий до рода и вида имеют зна-
чение пигменты, окрашивающие колонии и культуры в
разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют
Serratia marcescens (палочка чудесной крови), золотистый
пигмент—Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк),
сине-зеленый пигмент—Pseudomonas aeruginosa (палочка синезе-
леного гноя).
Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа)
проводят дополнительные исследования по выполнению
соответствующего маркера — определению фермента, антигена,
чувствительности к фагам.
Программа занятия
1. Получение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.
2. Методы идентификации бактерий, используемые при определении их,
родовой, видовой и типовой принадлежности.
Демонстрация
1.	Техника посева петлей, пипеткой, иглой, шпателем.
2.	Аппаратура, используемая для культивирования аэробных и анаэробных
бактерий.
3.	Характер роста разных бактериальных культур на плотных и жидких
питательных средах, различные типы колоний, «пестрые» ряды бактерий с
разной ферментативной активностью.
4.	Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий.
48
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Выделить чистую культуру аэробных бактерий из исследуемого материала.
2. Идентифицировать выделенную культуру по морфологическим, тинкто-
риальным, культурным и биохимическим свойствам, используя схему 1. Составить
протокол по проведенным исследованиям, как показано в табл. 4.
Методические указания
ТЕХНИКА ПОСЕВОВ И ПЕРЕСЕВОВ
Универсальным инструментом для производства посевов
является бактериальная петля?Жроме нее, для посева уко-
лом применяют специальную бактериальную иглу, а
для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные
шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей
используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые
предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклян-
ных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров.
Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения сте-
рильности. У пастеровских и градуированных пипеток широ-
кий конец закрывают ватой, после чего их помещают в
специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.
При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в
левую руку, а правой вынимают из нее ватную пробку над
пламенем горелки, набирают петлей посевной материал, после
чего закрывают пробирку пробкой, \как описано на с. 23. Затем
в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным
материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды,
и зигзагообразным движением распределяют материал по ско-
шенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край
пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в
пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами
надписывают, указывая дату посева и характер посевного мате-
риала (номер исследования или название культуры).
При работе с пипеткой прежде всего ее освобождают от
бумаги или вынимают из пенала, быстрым движением прово-
дят над пламенем горелки, вводят в пробирку и остужают
об ее внутреннюю сторону. Затем всасывают посевной материал
ртом и, соблюдая описанные выше правила, выдувают его в
пробирку или другую лабораторную посуду.' Микробную куль-
туру безопаснее всасывать через резиновую трубку или с
помощью резиновой груши. Отработанную пипетку опускают
в банку с дезинфицирующим раствором. Таким же образом
производят посевы пастеровскими пипетками, предварительно
обламывая запаянный конец.,;
49
Посевы газоном производят шпателем ца питательный агар
в чашке Петри. Для этого, приоткрыв крышку, петлей или
пипеткой наносят посевной материал на поверхность питатель-
ного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки,
остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают
материал по всей поверхности среды. При этом крышку при-
держивают левой рукой и одновременно вращают чашку, не
отрывая ее от стола. После инкубации посева появляется
равномерно сплошной рост бактерий.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого
материала, содержащего, как правило, смесь различных микро-
организмов, является одним из этапов любого бактериологи-
ческого исследования, проводимого с различными целями:
диагностики заболеваний, определения микробной обсеменен-
ности окружающей среды и т. д. Для выделения чистой куль-
туры применяют методы, основанные на: 1) механическом
разобщении бактериальных клеток; 2) предварительной обра-
ботке исследуемого материала с помощью физических или
химических факторов, оказывающих избирательное антибактери-
альное действие; 3) избирательном подавлении размножения
сопутствующей микрофлоры физическими или химическими
факторами во время инкубации посевов; 4) способности не-
которых бактерий быстро размножаться в организме чувстви-
тельных к ним лабораторных животных (биопробы).
/Для механического разобщения клеток бактерий иссле-
дуемый материал петлей или пипеткой наносят на поверхность
питательного агара в чашку Петри и равномерно распределяют
стерильным шпателем. Затем этим же шпателем (не прожигая
его в пламени горелки) материал растирают по поверхности
питательного агара во второй чашке.
Посев материала также делают бактериальной петлей. Для
этого в верхней части чашки густо заштриховывают зигзаго-
образными движениями петли небольшой участок агаровой
среды, освободив таким образом петлю от излишнего материала.
Затем наносят параллельные штрихи по остальной части среды.
Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который
заключается в перемешивании различных разведений исследу-
емого материала с расплавленным и остуженным питательным
агаром в колбе или пробирке. После этого его разливают в
чашки Петри и инкубируют в термостате. Для уничтожения
сопутствующих неспорообразующих микроорганизмов иссле-
50
дуемый материал прогревают при 80°С или подвергают крат-
ковременному кипячению. Споры микроорганизма при этом
сохраняются и при посеве прогретого материала на питательную
среду прорастают, образуя чистую бактериальную культуру в
том случае, если принадлежат только данному виду. Если в
исследуемом материале содержатся споры разных видов бак-
терий, то данный метод для получения чистой культуры непри-
годен.
Подавление размножения посторонней микрофлоры при
посеве исследуемого материала на питательные среды дости-
гается воздействием на них каких-либо факторов, не препят-
ствующих размножению основного микроба: неодинаковой
оптимальной температуры для роста разных бактерий, анти-
биотиков или других химических веществ, а также фагов.
В первом случае посевы инкубируют при температуре, задер-
живающей рост сопутствующей микрофлоры. Так, например,
для выделения чистой культуры бактерий чумы посевы инку-
бируют при температуре около 5°С. Во втором случае в пита-
тельную среду вносят соответствующее вещество или фаг в
строго определенной концентрации, препятствующей размно-
жению сопутствующих бактерий, но не оказывающей выражен-
ного ингибирующего действия на исследуемый микроб.
Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике .
иногда применяются и другие, например для выделения чистой
культуры бактерий протея (Proteus vulgaris) используют его
способность к «ползучему» росту.
Для выделения чистых культур большинства бактерий
обычно затрачивается не более 2—3 сут. Для выращивания
микобактерий туберкулеза этот срок удлиняется до 4—6 нед.
Процесс выделения чистой культуры можно разделить на
несколько этапов.
Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок,
окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют.
Для посева исследуемый материал в случае необходиости
разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором
хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения на-
носят петлей на поверхность питательного агара в чашку
Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно
распределяя материал по всей ее поверхности. После посева
чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают
в термостат при 37° С на 18—24 ч.
Второй этап. Просматривают чашки и изучают изоли-
рованные колонии, обращая внимание на их форму, величину,
консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии
клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой
51
колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопи-
руют. Для виделения и накопления чистЪй культуры одну
изолированную колонию или несколько различных изолирован-
ных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным
агаром или какой-либо другой питательной средой. Для этого
часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.
Третий этап. Отмечают характер роста выделенной
чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется
однородным ростом. При микроскопическом исследовании
окрашенного мазка,- приготовленного из такой культуры, в нем
обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные
клетки. Однако в случае выраженного полиморфизма, присущего
некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры
наряду'с типичными встречаются и другие формы клеток.
ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБНЫХ
БАКТЕРИЙ
Посевы на анаэробную микрофлору, как спорообразующую
(клостридии), так и особенно неспорообразующую (вейлонеллы,
бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных
условиях. Первоначальные посевы делают на обогатительные
среды типа Китта—Тароцци, затем пересевают на плотные средЫ;
сахарный кровяной агар в чашки Петри, в пробирки с сахарным
питательным агаром или другими средами для получения
изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэроб-
ных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят
мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на
среду Китта—ТароЦци и агаровые среды для выделения чистой
культуры.
При выделении спорообразующих анаэробных бактерий
(клостридии) первоначальные посевь! прогревают на водяной
бане при 80° С в течение 20 мин для уничтожения вегета-
тивных клеток посторонней микрофлоры, которая может при-
сутствовать в исследуемом материале (схема 1).
ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ
Идентификацию выделенных бактериальных культур прово-
дят путем изучения морфологии бактерий, их культуральных,
биохимических и других признаков, которые присущи каждому
виду.
Культуральные признаки. К ним относятся морфологические
особенности колоний бактерий, характер роста на плотных и
в жидких питательных средах.
52
Схема 1. Выделение и идентификация чистой культуры бактерий
аэробные бактерии выращивают в присутствии кислорода воздуха, анаэробные бактерии — в бескислородной среде; некоторые
бактерии лучше растут при повышенном содержании СО2.
53
I
I
Колонии различаются по величине, форме, цвету, консис-
тенции, контуру края, структуре и характеру поверхности
(рис. 29). По величине колонии могут быть крупные (диаметр
более 4—5 мм), средние (2-4 мм) и малые (1—2 мм), по форме —
круглые, розеткообразные, в форме листа и т. п. Цвет колонии
зависит от выработки определенного пигмента — белого, жел-
того, красного и др. Колонии беспигментных бактерий бес-
цветны. По консистенции различаются сухие, влажные, сочные
или слизистые колонии. Поверхность колонии'бывает гладкой,
морщинистой, исчерченной, плоской, плосковыпуклой, вдавлен-
ной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахром-
чатым'. Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую
внутреннюю структуру.
Характер роста бактерий в чистой культуре, выращенной
на скошенном питательном агаре, может быть сухим, влажным,
ползучим, складчатым, пигментированным. В жидкой питатель-
ной среде одни бактериальные культуры дают диффузное по-
мутнение, другие характеризуются придонным, пристеночным
ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности
среды, другие — осадок на дне пробирки.
Биохимические признаки. Для определения способности
микроорганизмов ферментировать углеводы (сахаролитические
свойства) используют короткий и длинный «пестрый» ряд.
К первому относятся жидкие среды Гисса с моно- и дисаха-
ридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с шести-
атомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый» ряд наряду
с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными
моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.),
полисахаридами (инулин, крахмал, гликоген и др.) и спиртами
(глицерин, дульцит, инозит и др.). В качестве индикатора ко
всем средам добавляют реактив Андреде или ВР.
Чистую культуру исследуемого микроба засевают петлей
в среды «пестрого» ряда. Посевы инкубируют при 37°С в
течение 18—24 ч или более длительно. В том случае, если
бактерии ферментируют углевод до образования кислых про-
дуктов, наблюдается изменение цвета среды: при разложении
углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изме-
нением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если исполь-
зуются среды с полужидким агаром, то образование газа регист-
рируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации
цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют
не все, а только определенные для каждого вида углеводы,
входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая
картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индика-
тором называют «пестрым» рядом (рис. 30).
54
Для определения протеолитических ферментов производят
посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20% желатина,
пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22° С
в течение нескольких дней. При наличии протеолитических
ферментов бактерии разжижают желатин, причем в этом месте
образуется фигура, напоминающая воронку или елочку.
В посевах в пептонную воду определяют продукты расщеп-
ления пептона после инкубирования в течение 2—3 сут при
37°С —ставят реакции на аммиак, индол, сероводород и др.
Реакция на аммиак. У экую полоску лакмусовой
бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкаса-
лась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует
о наличии аммиака.
Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с
культурой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое
энергично перемешивают и добавляют несколько капель реак-
тива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензаль-
дегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола
наблюдается розовое окрашивание; при осторожном наслаивании
образуется разовое кольцо (см. рис. 35).
Реакция на сероводород. Делают посев культуры
бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей
реактивы для выявления HsS (смесь солей: сульфат железа,
тиосульфат натрия, сульфит натрия). При наличии H2S проис-
ходит почернение агара (см. рис. 35).
Обнаружение каталазы. На предметное стекло
наносят каплю 1—3% раствора перекиси водорода и вносят
в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает
перекись водорода на НгО и Оа. Выделение пузырьков кисло-
рода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий
фермента каталазы.
Результаты работ по идентификации выделенной культуры
протоколируют (табл. 4).
Таблица 4. Характеристика культуры по морфологическим и физиологическим
признакам (форма протокола)
Описание морфоло- гии кле- ток бак- терий	Окраска по Граму и други- ми мето- дами	Описание характера роста			Биохимические свойства								Наимено- вание рода и вида куль- туры
					ферментация				образование				
		коло- нии	культуры на питательном										
					глюкозы	лактозы	2 о я X я О	мальтозы!	маннита	индола	H,S	1 каталазы	
			буль- оне	ага- ре									
													
55
В бактериологической практике иногда ограничиваются
изучением сахаролитических и протеолитических Признаков
исследуемых бактерий, если это является достаточным для
их идентификации. В необходимых случаях проводят изучение
других признаков, например восстановление нитратов, декар-
боксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмоко-
агулазы, фибринолизина и других ферментов, а также опреде-
ление антигенной структуры, чувствительности к фагам, виру-
лентности и т. д.
Тема 9. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РИККЕТСИЙ
И ХЛАМИДИЙ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ
Риккетсии и хламидии — облигатные внутриклеточные бак-
терии, которые не растут на искусственных питательных средах.
Вирусы также являются облигатными внутриклеточными
микроорганизмами, но они принципиально отличаются от всех
внеклеточных и внутриклеточных бактерий; отсутствием
клеточной организации, ферментов строительного и энергети-
ческого метаболизма, наличием одного типа нуклеиновой
кислоты (ДНК или РНК), неспособностью к бинарному делению.
Для культивирования риккетсий, хламидий и вирусов исполь-
зуют клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствитель-
ных лабораторных животных.
Программа занятия
1. Культивирование риккетсий, хламидий и вирусов в клеточных куль-
турах, куриных эмбрионах и в организме лабораторных животных.
2. Методы выявления (индикации) вирусов в культуре клеток и в курином
эмбрионе.
Клеточные культуры. Культуры клеток готовят из тканей
животных или человека. Культуры подразделяют на первичные
(неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Переви-
виваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к
условиям, обеспечивающим им постоянное существование
in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков
пассажей.
Приготовление первичной культуры клеток складыва-
ется из нескольких последовательных этапов; измельчения
ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания
полученной однородной суспензии изолированных клеток от
трипсина с последующим суспендированием клеток в питатель-
ной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199
с дабавлением телячьей сыворотки крови.
Клетки эпителиальной и соединительной тканей растут в
суспензии; при оседании они довольно прочно прикрепляются
56
к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются
в виде’пласта, состоящего из одного слоя клеток (монослоя).
Перевиваемые однослойные клеточные культуры
приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток,
обладающих способностью длительно размножаться in vitro
в определенных условиях. К ним относятся злокачественные
клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки
матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные
клетки амниона человека, почек обезьяны и др.
К полуперевиваемым культурам относятся диплоид-
ные клетки человека. Они представляют собой клеточную
систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года)
диплоидный набор хромосом, типичный для соматических
клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не
претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно
отличаются от опухолевых.
Все работы с культурами клеток требуют строжайшего
соблюдения правил асептики во избежание заноса в них раз-
личных микроорганизмов из окружающей среды.
/После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток,
которая начинает расти и развиваться, ее заражают материалом,
содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые
микроорганизмы проникают внутрь клеток, где и размножаются;
В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отме-
чается большое количество коккобациллярных форм, запол-
няющих целиком цитоплазму или ядро клеток, которые затем
гибнут.
' Хламидии также рассматривают в окрашенных по Рома-
новскому—Гимзе препаратах клеток,.в которых наблюдают раз-
личные формы размножающихся микроорганизмов.
размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток
судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может
быть обнаружено микроскопически и характеризуется мор-
фологическими изменениями клеток. При этом часть из них
погибает и отслаивается от стенки пробирки.\Вирусные частицы,
освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют
другие клетки, которые через некоторое время также погибают.
В результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются
лишь отдельные клеточные островки.
’Характер ЦПД, вызванный разными вирусами, неодинаков.
При репродукции одних (парамиксовирусы, герпесвирусы) на-
блюдается слияние клеток с образованием синцития, других
, (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток,
третьих (аденовирусы) — агрегация клеток (рис. 31, а, б) и т. д.
ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая клеточную
57
Рис. 31. Культура клеток.
а — неизмененные клетки; б — цитопатические изменения в клетках (ЦПД).
культуру под микроскопом в разные сроки после ее заражения
вируссодержащим материалом) Некоторые вирусы (энтерови-
русы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие —
в более поздние сроки (на 4-6-й день). Характер ЦПД вирусов
используют как для их обнаружения (индикации), так и для
ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой
принадлежности.
|один из методов индикации вирусов основан на способ-
ности поверхности клеток, в которых они репродуцируются,
адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции
(рис. 32). Для ее постановки в культуру клеток, зараженных
вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого
времени контакта клетки промывают изотоническим раствором
хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток
остаются прилипшие эритроциты.
Другой метод — реакция гемагглютинации. Приме-
няется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости
клеточной культуры либо хорион-аллантоисной или амниоти-
ческой жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию —
скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок — вызывают
вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин.
58
Количество вирусных час-
тиц определяют методом
титрования по ЦПД в
культуре клеток. Для этого
клетки культуры заражают
десятикратным разведени-
ем вируса. После 6—7-днев-
ной инкубации их просмат-
ривают на наличие ЦПД.
За титр вируса принимают
наибольшее разведение, ко-
торое вызывает ЦПД в 50%
зараженных культур. Титр
вируса выражают количест-
вом цитопатических доз
(ЦПДБ0).
Более точным количест-
венным методом учета от-
дельных вирусных частиц
является метод бляшек
(рис. 33). Культуру клеток
заражают вирусом и покры-
вают тонким слоем агара.
После инкубирования посе-
вов в течение нескольких
суток на агаровом покрытии
появляются просветленные
участки определенной фор-
мы (бляшки), представляю-
Гцие собой участки погиб-
ших клеток в сплошном
монослое клеточной куль-
туры. Каждая бляшка обра-
зуется при размножении
одной вирусной частицы и
хорошо заметна в виде круг-
лого светлого участка на
красном фоне клеток, при-
жизненно окрашенных нейт-
ральным красным. Титр ви-
руса, установленный этим
Рнс. 32. Адсорбция эритроцитов на по-
верхности клеток, зараженных вирусом
(гемадсорбция).
Рнс. 33. Колонии (бляшки) вирусов в
клеточной культуре.
а — бляшки вируса ньюкаслской болезни; б —
бляшки вируса Коксаки.
методом, выражают числом
бляшкообразующих единиц
(БОЕ) в 1 мл. Размеры,
морфология и сроки появ-
59
ления бляшек отличаются не только у разных видов вирусов,
но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Пере-
численные признаки используются для селекции штаммов и
получения так называемых чистых линий вирусов.
Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать
по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплаз-
ме зараженных клеток. Включения имеют различную форму
и размеры от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места
скопления вирусных частиц или реакцию клетки на присутст-
вие в ней вируса и могут быть выявлены в препаратах, приготов-
ленных из зараженной ткани и окрашенных по Романовско-
му-Гимзе или флюорохромами. В последнем случае исполь-
зуют люминесцентную микроскопию.
Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с
клеточными культурами и подопытными животными значитель-
но реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами,
а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью
и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения
чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диаг-
ностических целях, а также для приготовления разнообразных
препаратов (вакцины, диагностикумы) используют куриные
эмбрионы л возрасте от 8 до 12 дней. О размножении
упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим
изменениям, которые обнаруживают после вскрытия эмбриона
на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, напри-
мер гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации
(РГА) с куриными или другими эритроцитами.
К недостаткам данного метода относятся невозможность
обнаружения исследуемого микроба без предварительного вскры-
тия эмбриона, а также наличие в нем большого количества
белков и других соединений, затрудняющих последующую
очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных
препаратов.
Лабораторные животные. На практике чаще всего исполь-
зуют беспородных лабораторных животных. Видовая чувстви-
тельность животных к определенному вирусу и их возраст
определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих
случаях только новорожденные животные чувствительны к
тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам
Коксаки).
Преимущество данного метода перед другими состоит в
возможности выделения тех вирусов, которые плохо репроду-
цируются в культуре или курином эмбрионе. К его недостат-
кам относятся контаминация организма подопытных животных
посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходи-
60
мость последующего заражения клеточной культуры для по-
лучения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки
исследования.
Применяют подкожный, внутрикожный, внутримышечный,
внутрибрюшинный, субдуральный и другие методы заражения
лабораторных животных.
Демонстрация
1. Этапы приготовления однослойной клеточной культуры.
2. Цитопатические изменения клеток, вызванные репродукцией в них вируса.
3. Техника заражения вирусами и вскрытие куриного эмбриона.
Задание для иьшолнения лабораторной работы
1. Определить репродукцию вируса в клеточной культуре и курином эмбри-
оне: а) по ЦПД; б) с помощью реакции гемагглютинации с куриными эрит-
роцитами.
Методические указания
Изучение ЦПД вирусов. Для исследования клеток пробирку
помещают на предметный столик микроскопа так, чтобы мо-
нослой находился сверху. Местоположение монослоя клеток
в пробирке определяют по черте, предварительно проведенной
карандашом на противоположной стороне. Морфологические
изменения клеток выявляют при микроскопическом исследова-
нии пробирки с культурой с помощью объектива 8 при
опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме. При сравне-
нии клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с
незараженными клетками в контрольной пробирке отмечают
полное или островковое разрушение пласта клеток или
другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса.
Заражение куриных эмбрионов. Исследуемый материал вводят
в аллантоисную и амниотическую полости, хорион-аллантоис-
ную оболочку или желточный мешок куриного эмбриона
(рис. 34). Перед заражением скорлупу яйца над воздушной
камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают на пламени,
смазывают 2% йодной настойкой, вторично протирают спир-
том и обжигают.
Для заражения в аллантоисную полость в скорлупе над
воздушной камерой (границы ее заранее обводят карандашом
при просвечивании яйца) проделывают небольшое отверстие
с помощью ножниц, скальпеля или специального буравчика.
Шприцем вводят 0,1—0,2 мл вируссодержащего материала
на глубину 2—3 мм ниже границы воздушной камеры. От-
верстие в скорлупе заливают расплавленным парафином.
61
1
Рис. 34. Способы заражения куриного эмбриона.
I — в амнион; 2 — в аллантоисную полость; 3 — в желточный меток.
Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки макси-
мального накопления вируса (через 48—72 ч инкубации при
37°С). После обработки спиртом и 2% йодной настойкой
скорлупу рассекают ножницами немного выше очерченной
карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так,
чтобы избежать попадания скорлупы в полость (рис. 35).
Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и
рассматривают хорион-аллантоисную оболочку вокруг места
заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов пораже-
ния — геморрагий, белесоватых очагов (рис. 36). Затем пасте-
ровской пипеткой прокалывают хорион-аллантоисную обо-
лочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают ал-
лантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллан-
тоисную оболочку, которую дважды промывают изотони-
ческим раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри
и отмечают на черном фоне наличие специфических по-
ражений.
Постановка РГА. После вскрытия куриного эмбриона ал-
лантоисную жидкость отсасывают и разливают в пробирки или лун-
ки плексигласовой пластины в объеме 0,5 мл (для контроля
берут 0,5 мл такой же жидкости незараженного эмбриона).
Затем добавляют по 0,2 мл 1% суспензии отмытых куриных
эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре.
Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания
эритроцитов: I I I Ь выраженная гемагглютинация — тонкая
62
Рис. 35. Вскрытие куриного эмбриона.
пленка из склеившихся эритроцитов на дне пробирки, име-
ющая вид зонтика; I Г ! наличие просветов в пленке; ++
наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся
эритроцитов; + хлопьевидный осадок эритроцитов, окружен-
ный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; — рез-
ко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контро-
ля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при
ее отсутствии в контрольных указывает на содержание
вируса в исследуемой жидкости.
Тема 10. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ВИРУСЫ (ФАГИ)
/
Вирусы бактерий (фаги), или бактериофаги, широко
распространены в окружающей среде — водоемах, почве. Фаги
кишечных бактерий — кишечной палочки, шигелл, сальмонелл —
могут быть выделены из сточных вод и испражнений.
Стафилофаги обнаруживаются в слизи из носоглотки, на
коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий анаэробной
раневой инфекции—в раневом отделяемом, почве. Наличие
фага в среде указывает на присутствие чувствительных к
нему бактерий.
Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают
инфекцию, заканчивающуюся лизисом бактериальных клеток и синтезом
новых фаговых частиц. Умеренные фаги не лизируют зараженные ими клетки.
63
Рис. 36. Поражение на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона,
з араженного вирусом оспы.
ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении
неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой
называется лизогенией, а бактерии, несущие в'своей хромосоме фаговую ДНК
(профаг), являются лизогенными. Они широко распространены в природе.
Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной куль-
туры сопровождается, их лизисом и просветлением среды. На газоне чувстви-
тельных бактерий, выращенных на агаровой среде в чашке Петри, фаги обра-
зуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации.
Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или
стерильных пятен — бляшек (рис. 37, а, б). Они имеют морфологию, харак-
терную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при
внедрении ее и последующей репродукции в бактериальных клетках.
Для получения «чистой линии» фага (свободной от при-
меси других фагов) проводят последовательные пассажи
морфологически однотипных негативных колоний на газоне
одного и того же бактериального штамма.
Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью
в отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые
могут поражать только отдельные варианты одного и того
же вида бактерий. Их используют для определения фаготи-
пов (фаговаров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются
фаги, лизирующие несколько родственных видов бактерий.
В практической работе фаги применяют для: 1) фаготипи-
рования бактерий, т. е. определения фаготипа по лизису
штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифи-
64
ческими фагами, что важно для маркировки исследуемых
культур при эпидемиологическом анализе заболеваний; 2) фа-
годифференцировки бактериальных культур с целью установ-
ления их видовой принадлежности; 3) фагодиагностики,
заключающейся в выделении фага из организма больного
(например, из испражнений), что косвенно свидетельствует
о наличии в материале соответствующих микробов^ 4) фаго-
профилактики — предупреждения некоторых заболеваний
(например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидеми-
ческом очаге; 5) фаготерапии — лечения некоторых инфекци-
онных заболеваний, вызванных, например, шигеллами, про-
теем, стафилококком, палочкой синезеленого гноя.
Программа занятия
1.	Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
2.	Методы индикации фага.
3.	Методы титрования фага по Грациа,
Демонстрация
1. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.
2. Методика обнаружения лизогенных бактерий.
Задание для выполнения лабораторной работы
По результатам поставленных опытов: а) рассчитать титр фага по методу
Грациа; б) определить спектр литического действия поливалентного фага;
в) определить фаготип стафилококковых культур, выделенных при пищевом
отравлении.
Методические указания
Выделение фага из объектов окружающей среды. Для
получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного
материала (вода, суспензия фекалий и др.), пропуская его
через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответст-
вующей бактериальной культурой засевают в бульон и инку-
бируют при 37°С в течение 18—24 ч. После лизиса культуры
оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугирова-
нием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие
фага в фильтрате определяют качественными и количествен-
ными методами.
Качественный метод определения фагов £. coli. Чашку
Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной
культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при
37°С в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят
каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противо-
положному краю. После суточной инкубации в термостате
4-639
65
Рис. 37. Негативные колонии (стерильные пятна) бактериофагов.
а — пятна фага Та; б — пятна фага Ti.
просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса на
месте стекания капли фага.
Количественный метод — определение титра фага по Грация.
Для постановки опыта предварительно: а) разливают пита-
тельный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;
б) приготовленный полужидкий (0,7%) питательный агар,
разлитый по 3—4 мл в пробирки, растапливают в водяной
бане. Делают десятикратные разведения исследуемого фага
(10~2~10~7, но может быть и дальше, в зависимости от
предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида
натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10~7)
смешивают с таким же объемом суточной бульонной куль-
туры чувствительных к фагу бактерий и выливают в про-
бирку с полужидким агаром, охлажденным до 45°С. Смесь
быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри,
где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят
смесь из следующего разведения фага (10-6) с бактериями
и полужидким агаром и выливают на поверхность агара
в другой чашке, затем — из разведения 10~5. После застыва-
ния второго слоя агара чашки инкубируют при 37°С.
Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют
сплошной газон роста на поверхности питательного агара.
Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и осво-
бождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаго-
вых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь
цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном
бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна, или
негативные колонии фага. Число этих пятен соответствует
66
количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из
него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц
в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характери-
зующая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5).
Определение спектра литического действия фага. Чашку с
питательным агаром делят на квадраты по числу испытуе-
мых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей на-
носят каплю соответствующей бульонной культуры и распре-
деляют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем
на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской
пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После
суточной инкубации в термостате просматривают чашку,
отмечая те квадраты, г^де имеется сплошной лизис бактерий
или так называемые стерильные пятна на бактериальном га-
зоне. Количество различных бактериальных культур, которые
лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра
его литического действия.
Таблица 5. Результаты титрования фага по методу Грациа (форма протокола)
№ исследуе- мой пробы	Число «стерильных» пятен фага, полученных при посевах проб в разведениях			Число фаго- вых частиц в 1 мл
	кг’	КГ*	10"’	
1	370	42	3	7,3 • 107
2	463	50	6	1,0 • 10»
3	37	4	0	7,7 • 10е
Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульонную
культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара
в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем
делят нах квадраты, на которые пастеровской пипеткой
наносят по одной капле различных типоспецифических фагов.
После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те
квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фагртип бакте-
риальной культуры определяется тем типом фага, который
вызывает ее лизис (рис. 38).
Определение лизогении. Исследуемую бульонную культуру
центрифугируют с целью отделения фага от бактерий.
В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг,
он будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявле-
ния фага надосадочную жидкость засевают на газон инди-
каторной (чувствительной) бактериальной культуры, на кото-
ром через сутки инкубации при 37°С образуются очаги
лизиса — «стерильные» пятна.
4*
67
Рис. 38. Схема постановки
опыта фаготипирования куль-
туры стафилококка. Цифрами
обозначены типовые стафило-
кокковые фаги.
При отрицательном результате опыта исследуемую бакте-
риальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению
с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем
поступают так же, как и в предыдущем опыте.
Тема 11. ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ
Генетические механизмы изменчивости бактерий обуслов-
лены модификациями, мутациями, рекомбинациями, а также
приобретением различных плазмид. При этом изменяется
один или несколько признаков одновременно в зависимости
от числа мутировавших (при мутациях) или приобретенных
(при рекомбинациях) генов. Так, например, при S-*-R мута-
ции, как правило, изменяются морфология колонии, антиген-
ные и вирулентные свойства бактерий.
Плазмиды контролируют разнообразные признаки у бакте-
рий: образование бактериоцинов — колицинов (Col-плазмиды),
резистентность к антибиотикам (R-плазмиды) и др. Бактерио-
цины продуцируют различные бактерии, например кишечная
палочка, шигеллы, сальмонеллы. Колицины, образуемые раз-
ными сероварами Е. coli, могут отличаться друг от друга
по спектру чувствительных к ним бактерий. Метод опреде-
ления спектра чувствительных к определенному колицину
бактерий называется колицинотипированием, а метод опреде-
ления типа самой Col-плазмиды (Col A, Col В и др.) —
колициногенотипированием. Данные методы позволяют
маркировать бактерии одного и того же вида или биовара,
что имеет эпидемиологическое значение для установления
источника инфекции.
68
R-плазмиды контролируют образование ферментов, разру-
шающих или модифицирующих разные антибиотики, напри-
мер р-лактамаз, разрушающих пенициллины. R-плазмиды
благодаря своей трансмиссивности передаются от одних
бактерий другим, способствуя тем самым формированию анти-
биотикорезистентных популяций бактерий.
Программа занятия
1.	Модификации у бактерий и методика их обнаружения.
2.	Мутации у бактерий и методика их выделения.
3.	Изучение генетических рекомбинаций у бактерий в опытах трансформа-
ции, трансдукции и конъюгации.
4.	Методы изучения бактериоциногении (определение колицинотипа и
колициногенотипа Е. coli).
Демонстрация
1. S- и R-формы колоний Е. coli и других бактерий.
2. Различные методы, используемые при изучении генетики бактерий.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Установить модификационную или мутационную природу утраты
подвижности бактериями Proteus vulgaris.
2.	Доказать мутационную природу возникновения устойчивости к стреп-
томицину по результатам опыта Лурия и Дельбрюка.
3.	Определить частоту образования трансформантов (рекомбинантов) по
данным опыта трансформации признака Strr (сзрептомицинорезистентности)
у Вас. subtilis.
4.	Определить частоту образования трансдуктантов Е. coli по данным опыта
специфической трансдукции фагом X dgal.
5.	Определить частоту образования рекомбинантов 1еи+ по данным опыта
конъюгации между Hfr-клетками Е. coli и F--клетками Е. coli.
6.	Определить частоту образования рекомбинантов (трансконъюгантов) при
передаче R-плазмиды, контролирующей множественную резистентность к
антибиотикам, от одного штамма Е. coli другому.
7.	По результатам поставленных опытов определить наличие Col-плазмид
у разных штаммов Е. coli и их колициногенотип.
Методические указания
Постановка опыта по выяснению механизма действия фено-
ла на подвижность культуры бактерий Proteus vulgaris. Су-
точную культуру засевают в две пробирки с питательным
бульоном, в одну из которых был предварительно внесен
раствор фенола в конечной концентрации 1:100. После инку-
бации при 37°С в течение 18—20 ч определяют подвижность
бактериальных клеток в препаратах «висячая» капля, при-
готовленных из обеих пробирок. Для решения вопроса о
модификационном или мутационном механизме утраты под-
69
10мл МПБ
0осеВ~Юг~103 бактерий/мл
~\Нильтира. содержащая
— стрептрмициноистоичиБые
бактерии
\'ЛосеВ~ 10г-103боктерий/мл
ВысеВ no 0,1 мл на
чашки смпл содрр-у,VJ vJ \J U kJ,
жощие 100 единиц ВысеВ по 0,1 мл В чашки с МПА, содержащие по 100
стрептомицина	единиц стрептомицина
I	—*-----1
.зо\гв\з^\гз\з1
Рис. 39. Схема постановки опыта флюктуации (флюктуационного теста) по
Лурия и Дельбрюку. Цифрами обозначено количество стрептомициноустойчи-
вых колоний на агаровой среде в чашках Петри.
вижности культурой протея, обработанной фенолом, ее
пересевают в пробирку с бульоном и инкубируют до следу-
ющего дня. Затем готовят препарат в «висячей» капле и
определяют подвижность. Реверсия (восстановление) утрачен-
ного признака свидетельствует о модификационной природе
наблюдаемой изменчивости.
Постановка флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка
для выявления частоты спонтанных мутаций, возникающих
в бактериальной популяции без предварительного воздействия
какого-либо мутагена. Для определения частоты Strr спонтан-
ных мутантов в культуре Е. coli, чувствительной к стрепто-
мицину, ее засевают одновременно в одну пробирку с 10 мл
питательного бульона и в 10 пробирок с 1 мл той же среды
так, чтобы в каждой пробирке содержалось примерно
100—1000 клеток. После суточной инкубации посевов из
каждой пробы делают высевы на чашки Петри с питательным
агаром, содержащим 100 ЕД стрептомицина. Пробы из 1-й
пробирки («общей» культуры) в объеме 0,1 мл засевают на
10 чашек, пробы из 10 пробирок («независимых» культур)
в объеме 0,1 мл —на отдельные чашки. Таким образом,
делают посевы на 20 чашек, которые инкубируют в течение
18—20 ч (рис. 39).
На агаровой среде могут вырасти колонии только из тех
бактерий, которые резистентны к 100 ЕД стрептомицина.
70
В том случае, если стрептомицинрезистентные бактерии
образовались только в течение суточного контакта с анти-
биотиком, число колоний на всех чашках должно быть
примерно одинаковым. Это свидетельствовало бы об адапта-
ционном механизме устойчивости к стрептомицину. Образо-
вание на чашках различного числа колоний, выросших
при высеве каждой из 10 «независимых» культур, указывает
на предсуществование мутантных Strr клеток в исследуемой
популяции бактерий. Данный вывод подтверждается тем, что
мутации могут проявляться только в некоторых «независимых»
культурах. Значительные колебания (флюктуации) числа му-
тантных клеток в разных «независимых» культурах обуслов-
лены временем возникновения мутаций. Культура, в которой
мутация произошла задолго до высева на чашки, должна
содержать большое число Str' клеток и наоборот. При
высевах из «общей» культуры такие флюктуации не смогут
проявиться, поскольку мутанты независимо от момента их
возникновения будут равномерно распределены по всей
популяции бульонной культуры.
Постановка опыта трансформации (рис. 40). Реципиент —
штамм Вас. subtilis Strs (сенная палочка, чувствительная к
стрептомицину). Донор —ДНК, выделенная из штамма Вас.
subtilis Str' (устойчивого к стрептомицину). Селективная
среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питатель-
ный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.
К 1 мл бульонной культуры Вас. subtilis добавляют
1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37°С в тече-
ние 30 мин. Затем в пробирку вносят 0,1 мг/мл раствора
ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК,
не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штам-
ма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения
количества образовавшихся стрептомициноустойчивых рекомби-
нантов (трансформантов) 0,1 мл неразве денной смеси (по-
скольку число трансформированных клеток крайне незначитель-
но) высевают на селективную среду в чашку Петри. Для
определения количества клеток реципиентной культуры при-
готовляют ее десятикратные разведения в изотоническом
растворе хлорида натрия до 10-5—10“® (для получения сосчи-
тываемого количества колоний), которые в объеме 0,1 мл
высевают на питательный агар без стрептомицина, а для
контроля —на агар со стрептомицином. На последней среде
реципиентная культура не должна расти, поскольку она
чувствительна к стрептомицину. Посевы инкубируют при
37°С. На следующий день учитывают результаты опыта и
определяют частоту трансформации по отношению коли-
71
честна выросших рекомбинантных клеток к числу клеток
реципиентного штамма.
Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного
штамма, разведенного в 10-5, выросло 170 колоний, а при
высеве 0,1 мл неразведенной смеси —68 колоний рекомби-
нантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась
в результате размножения только одной бактериальной
клетки, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содер-
жится 170 • 105 жизнеспособных клеток, а в 1 мл —170 • 106,
или 1,7 • 108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68
рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 -102. Таким
образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:
У - -4,0 IO-
1,7 Ю”
Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 41).
Реципиент — штамм Е. coli lac-, лишенный р-галактозидазного
оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуци-
руюший фаг — фагХс^а!, в геноме которого часть генов за-
мещена Р-галактозидазным опероном Е. coli. Он является
дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфек-
цию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обо-
значается буквой d (фаг Л dgal) с названием содержащегося
в его геноме бактериального оперона gal. Селективная
среда —среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии
бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии,
а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма
приобретают красный цвет с металлическим оттенком.
К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного
штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага X dgal в
концентрации 10е—107 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют
при 37°С в течение 60 мин, после чего приготовляют ряд
десятикратных разведений (в зависимости от предполагаемой
концентрации бактерий) для получения сосчитываемого ко-
личества колоний. Из пробирки с разведением 10 е высевают
по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо и равномер-
но распределяют шпателем по поверхности среды. Посевы
инкубируют до следующего дня, после чего отмечают ре-
зультаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отно-
шению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов),
обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного
штамма. Так, например, после посева 0,1 мл смеси в разве-
дении 10-е на чашке со средой Эндо выросло 138, 170 и
160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой
72
и последней чашках — пять и одна колония трансдуктантов
красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом
случае будет равна:
(5 + 1)-ю-ю6___________б
(138 + 170 + 160) 10 • 10°	468
Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента
хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез
лейцина (рис. 42). Донор —штамм Е. coli К12 Hfr leu+
Str*. Реципиент — штамм Е. coli К12 F- leu- Str'. Селектив-
ная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюко-
зосолевая среда [КН2РО4 —6,5 Г, MgSO4—0,1 г, (NH4)2SO4 —1 г,
Са (NO3)2—0,001 г, FeSO4 — 0,0005 г, глюкоза —2 г, стрепто-
мицин — 200 ЕД/мл, дистиллированная вода — 1 л].
К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл
бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37°С
в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2 —10~3 и вы-
севают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки
Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов.
В качестве контроля на ту же среду высевают донорный и
реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней,
так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а
второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру
донорного штамма высевают на селективную среду без
стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную
среду (питательный агар) с антибиотиками для определе-
ния числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до
следующего дня при 37°С. После подсчета числа выросших коло-
ний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества
рекомбинантных клеток к реципиентным. Так, например,
после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных
культур в разведении 10-2 выросло 150 колоний рекомбинан-
тов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разве-
дения 10-6 —75 колоний. Таким образом, частота рекомби-
нации будет равна:
150 10 - 100	] с . jo5
---------т— - — ---т— 2,0 10"»
75 10 10°	7,5 10°
Постановка опыта конъюгации с целью передачи R-плазми-
ды, контролирующей множественную устойчивость к антибио-
тикам — стрептомицину (Strr), тетрациклину (Тсг) и хлорамфени-
колу (Сшг). Донор —штамм Е. coli К12 R+ leu- Str' Tc' Cm'
Реципиент—штамм Е. coli К12 R- leu+ Str' Тс ° Cms
Селективная среда — минимальная глюкозосолевая среда, со-
73
держащая упомянутые антибиотики в концентрации 50 мкг/мл
каждый.
В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульон-
ной культуры донора и реципиента. Смесь инкубируют при
37°С в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл на чаш-
ку с селективной средой с тремя антибиотиками. На данной
среде вырастут только колонии рекомбинантов (трансконъюган-
тов), которые приобрели резистентность к данным антибиоти-
кам. Отсутствие роста донорного и реципиентного штаммов
на этой среде объясняется тем, что первый нуждается в
лейцине^ а второй чувствителен к антибиотикам. Частоту
формирования трансконъюгантов определяют по отношению
количества клеток трансконъюгантов к числу клеток реццпи-
ентного штамма. Так, например, при высеве 0,1 мл культуры
реципиентного штамма в разведении 10-4 на глюкозосолевую
среду с лейцином образовалось 20 колоний, а при высеве
0,1 мл неразведенной смеси —60 колоний трансконъюгантов.
Таким образом, частота формирования трансконъюгантов
равна:
Определение колициногенных факторов. Исследуемые
культуры Е. coli засевают уколом в питательный агар в чаш-
ке Петри (по 7—8 уколов на одну чашку). Посевы инкуби-
руют при 37°С в течение суток, после чего на внутреннюю
поверхность крышки чашки помещают кусочек ваты, смо-
ченной хлороформом, в парах которого погибают бактерии.
Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл
расплавленного и остуженного до 45°С полужидкого (0,7%)
питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульон-
ной индикаторной культуры. В качестве таковой подбирается наибо-
лее чувствительная к данному типу колицина культура E.coli.
Через 18—24 ч инкубации посевов при 37°С учитывают резуль-
таты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуци-
рующих колицины, появляются прозрачные зоны подавления
роста индикаторного штамма.
Определение колицинотипа. В питательный агар в чашке
Петри уколом засевают эталонные штаммы бактерий с
известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37°С
в течение 24 ч, после чего бактерии убивают в парах
хлороформа. Затем по поверхности агара равномерно распре-
деляют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого
агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры
E.coli неизвестного колициногенотипа (например, Col А,
74
Col В и др.). Через 18—24 ч отмечают результаты опыта
по наличию или отсутствию роста исследуемой культуры
вокруг эталонных штаммов. Рост наблюдается лишь в том
случае, если обе культуры (исследуемая и индикаторная)
имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат
идентичные Col-плазмиды. В противном случае вокруг эталон-
ных штаммов появляются прозрачные зоны подавления
роста бактерий.
АНТИБИОТИКИ
Антибиотики занимают ведущее место среди химиотерапев-
тических средств, используемых для лечения различных
бактериальных инфекций. В зависимости от происхождения,
химического строения, механизма антибактериального действия
и числа чувствительных к ним бактерий (спектр антибакте-
риального действия) антибиотики подразделяют на ряд групп.
Наряду с антибиотиками узкого спектра (пенициллины, це-
фалоспорины) широко применяются антибиотики широкого
спектра действия (тетрациклины, левомицетин и др.).
В связи с широким распространением антибиотикорезистент-
ных бактерий выбор препарата для лечения определенного
Таблица 6. Классификация бактерий по степени их чувствительности к
антибиотикам
Антибиотик	Группа бактерий			
	I	II	ш	IV
	чувстви- тельные	среднечувст- вительные	умеренно- устойчивые	устойчивые
Бензилпенициллин	0,25	16	128	>128
Метициллин	0,25	—	—	—
Ампициллин	0,25	16	128	>128
Карбенициллин	—	16	128	>128
Цефалоспорины	2	16	128	>128
Стрептомицин	4	—	128	>128
Канамицин	4	—	128	>128
Неомицин	4	—	128	>128
Г ентамицин	0,5	4	64	>128
Левомицетин	1	8	—	—
Тетрациклины	1	4	64	>64
Эритромицин	1	4	64	>64
Линкомицин	1	4	64	>64
Примечание. Цифрами обозначены минимальные ингибирующие концентрации
антибиотика в мкг/мл или ЕД/мл; — группа не установлена.
75
больного зависит прежде всего от чувствительности к дан-
ному антибиотику выделенного возбудителя. В настоящее
время бактерии по степени их чувствительности к антибио-
тикам разделены на четыре группы (табл. 6).
Тема 12. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ
АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ
Программа занятия
1.	Рассмотрение (по таблицам и схемам) механизмов антибактериального
действия важнейших групп антибиотиков.
2.	Качественные и количественные методы определения чувствительности
бактерий к антибиотикам.
3.	Метод определения активности антибиотика в жидкостях организма
человека (кровь, моча и др.).
4.	Метод определения р-лактамазы.
Демонстрация
1.	Препараты различных антибиотиков.
2.	Стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, для опре-
деления чувствительности к ним бактерий.
3.	Таблицы и схемы антимикробных спектров важнейших групп антибиоти-
ков и механизмов их антибактериального действия.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Поставить опыт по определению чувствительности стафилококка к раз-
личным антибиотикам методом дисков.
2. По результатам поставленных опытов определить: а) минимальную инги-
бирующую концентрацию пенициллина для различных бактериальных культур
методом серийных разведений; б) концентрацию пенициллина (ЕД/мл), содер-
жащегося в сыворотке крови больного; в) способность различных штаммов
стафилококка продуцировать р-лактамазу, инактивирующую пенициллин.
Методические указания
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засе-
вают газоном на питательный агар в чашке Петри, после
чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном
расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие опре-
деленные дозы разных антибиотиков (рис. 43). Посевы инку-
бируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки
роста культуры стафилококка судят об ее чувствительности к
соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста
диаметром до 10 мм культура расценивается как малочувстви-
тельная, а свыше 10 мм —как высокочувствительная. В том
случае, если диски пропитаны разными концентрациями одного
76
Таблица 7. Определение чувствительности бактериальной культуры к анти-
биотику методом серийных разведений
№ пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика, мгк/мл	Исследуемая культура, мл	Рост бактерий (помутнение среды)
1	1 :100	100	0,1		
2	1 : 200	50	0,1	—
3	1 :400	25	0,1	—
4	1 :800	12,5	0,1	—
5	1 : 1600	6,25	0,1	+
6	1 :3200	3,12	0,1	+
7	1 мл бульона без антибиотика		0,1	+ (контроль)
Примечание. — отсутствие роста исследуемой бактериальной культуры; + наличие
роста. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 12,5 мкг/мл.
и того же антибиотика, можно установить наименьшую дозу
препарата, к которой чувствительна исследуемая бактериальная
культура.
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
методом серийных разведений. Данным методом определяют
минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую
рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной
раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика
(в мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буфер-
ном растворе. Из него готовят все последующие разведения
в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению
добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содер-
жащей 10е —107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю
пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий
(контроль культуры). Посевы инкубируют при 37°С до следу-
ющего дня, после чего отмечают результаты опыта по помут-
нению питательной среды, сравнивая с контролем культуры.
Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает
на задержку роста исследуемой культуры бактерий содержащейся
в ней минимальной ингибирующей дозой антибиотика (табл. 7).
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
методом серийных разведений в питательном агаре. Данный
метод определения минимальной ингибирующей концентрации
антибиотика более точен, чем предыдущий. Готовят двукратные
разведения антибиотика, после чего к 1 ч. каждого разведения
добавляют 9 ч. питательного агара, расплавленного и остужен-
ного до 45° С. Смесь хорошо перемешивают в пробирке и
выливают в чашку Петри. Приготовленные таким образом
77
чашки, каждая из которых содержит определенную концен-
трацию антибиотика, делят на 20 секторов так же, как при
фаготипировании стафилококка. На агаровую поверхность
каждого сектора петлей засевают суточную бульонную куль-
туру исследуемой бактериальной культуры. Посевы инкубируют
при оптимальной температуре до появления роста в контрольной
чашке, не содержащей антибиотика, после чего учитывают
результаты. Минимальная ингибирующая концентрация анти-
биотика определяется по видимой задержке роста бактерий по
сравнению с контролем на чашке, содержащей наименьшее
количество данного препарата.
Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях
организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок.
В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика,
в другом—исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку
вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса
с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пени-
циллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий
используют стандартный штамм Staph, aureus, а при определе-
нии стрептомицина—Е. coli. После инкубирования посевов при
37°С в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помут-
нению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие рас-
щепления глюкозы тест-бактерйями. Концентрация антибиотика
определяется умножением наибольшего разведения исследуемой
жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную
концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост
тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение
исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий,
равно 1:1024, а минимальная концентрация эталонного анти-
биотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, —
0,313 мкг/мл, то произведение 1024-0,313 =320 мкг/мл состав-
ляет концентрацию антибиотика в 1 мл.
Определение способности Staph, aureus продуцировать Р-лак-
тамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульоИной культуры стан-
дартного штамма стафилококка, чувствительного к пеницил-
лину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45° С
питательного агара, перемешивают и выливают в чашку
Петри. После застывания агар а в центр чашки на поверхность
среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам
диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инку-
бируют при 37°С до следующего дня, после чего отмечают
результаты опыта. О способности исследуемых бактерий проду-
цировать р-лактамазу судят по наличию роста стандартного
штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой
культуры до самого диска.
78
МИКРООРГАНИЗМЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
И САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ
Микроорганизмы широко распространены в воздухе, воде,
почве и окружающих предметах, а также находятся в организме
человека и животных. Патогенные микробы, обитающие в
организме больных и бактерионосителей, попадают в окружа-
ющую среду и циркулируют в ней в течение определённого
времени. Заражение окружающей среды делает ее фактором
передачи инфекций, хотя она и не является средой обитания
для патогенных микроорганизмов, так как они в ней не раз-
множаются.
В данный раздел включены две темы. Одна из них, посвя-
щенная микрофлоре организма человека и методам, позволя-
ющим установить качественные и количественные изменения
в ее составе, рассчитана на студентов всех факультетов меди-
цинских институтов. Другая тема посвящена санитарно-бак-
териологическим исследованиям, которые играют решающую
роль в практической работе санитарных врачей и эпидемиоло-
гов при санитарно-гигиенической оценке объектов окружающей
среды, пищевых продуктов, напитков и состояния персонала
пищевых, детских и больничных учреждений, что имеет большое
значение в борьбе с инфекционными заболеваниями. Данная
тема предназначена главным образом для студентов санитарно-
гигиенических факультетов.
Тема 13. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Микрофлора организма человека включает различные микро-
организмы, обитающие на кожных покровах, слизистых оболоч-
ках органов: ротовой полости, зева, носоглотки, верхних участ-
ков респираторного тракта, кишечника, особенно толстой кишки,
и т. д. Одни из них являются постоянными (или облигатными)
обитателями организма человека, другие — временными (факуль-
тативными или транзиторными). Среди последних нередко
встречаются патогенные микроорганизмы.
Качественный и количественный состав микрофлоры чело-
века меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста,
питания и др. Кроме того, колебания в составе микробной
флоры тела человека могут быть обусловлены возникновением
заболеваний и применением химиотерапевтических и иммуно-
логических средств, прежде всего антибиотиков. Оценка качест-
венного и количественного состава микрофлоры организма
человека по определенным показателям позволяет установить
ее нарушения и связанные с ними последствия — дисбактериоз.
79
Программа занятия
1. Качественный метод определения состава микрофлоры организма человека.
2. Метод изучения количественных изменений в составе микробного
биоценоза различных полостей и органов человеческого организма.
Демонстрация
1.	Окрашенные мазки, приготовленные из чистых культур бактерий — пред-
ставителей облигатной микрофлоры человека.
2.	Микрофлора фекалий ребенка при естественном и искусственном вскар-
мливании.
3.	Чашки с количественным посевом материала, содержащего дрожжеподоб-
ные грибы рода Candida.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Определить микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева и
фекалий на основании данных бактериоскопического исследования.
2.	Сделать смывы с кожи лица, рук для установления состава имеющихся
там бактерий.
3.	Определить по готовым посевам количественный состав грибов рода
Candida в кишечнике в динамике заболевания.
Методические указания
Для' качественного изучения состава микрофлоры исполь-
зуют микроскопический и микробиологический методы иссле-
дования. Препараты-мазки готовят из зубного налета, смывов
со слизистой оболочки зева, окрашивают их по Граму и микроско-
пируют (рис. 44). Из зубного налета можно приготовить при-
жизненные препараты в «раздавленной» капле и микроскопи-
ровать их в темнопольном или фазово-контрастном микро-
скопе для обнаружения подвижных микроорганизмов.
Для микробиологического исследования делают смывы с
кожи лица, рук или других частей тела тампоном, смоченным
в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем этим же там-
поном делают посев на питательные среды в чашках Петри.
Кроме того, отдельный тампон помещают в пробирку с глюко-
зопептонной средой для обнаружения бактерий группы кишеч-
ных палочек (состав среды см. с. 83). Ориентировочно иденти-
фикацию микроорганизмов проводят по характеру выросших
колоний, газообразованию на глюкозопептонной среде и мор-
фологии клеток в мазках, окрашенных по Граму.
Для количественных посевов берут определенный объем
исследуемого материала (например, смывы из зева) или опре- ,
деленную навеску (например, фекалий), разводят в изотони-
ческом растворе хлорида натрия (в зависимости от предпола-
гаемой концентрации) и делают посевы соответствующих
80
разведений на питательные среды: для выявления гемолити-
ческих стрептококков или стафилококка — на кровяной агар,
для выделения Е. coli —на среду Эндо, для выделения грибов
рода Candida —на среду Сабуро. Посевы производят таким
образом, чтобы получить сосчитываемое количество колоний.
Такие исследования повторяют через определенные сроки,
чтобы сделать заключение о количественных изменениях в
составе микрофлоры (особенно важно —в динамике заболе-
вания).
Тема 14. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Программа занятия'
1.	Методы изучения микрофлоры окружающей среды.
2.	Методы санитарно-бактериологической оценки воды, воздуха и почвы.
3.	Мембранный метод определения коли-индекса воды.
4.	Определение микробного числа воздуха при помощи прибора Кротова
и методом седиментации.
5.	Методы определения перфрингенс-титраи коли-титра почвы.
6.	Рост гемолитического стрептококка на кровяном агаре.
7.	Рост Staph, aureus на желточно-солевом агаре.
8.	Рост протея в посеве по Шукевичу.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Провести оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха,
воды, почвы по результатам следующих опытов: а) определение микробного
числа воздуха; б) определение микробного числа водопроводной воды и от-
крытых водоемов; в) определение бродильного титра и коли-индекса воды;
г) определение микробного числа, коли-титра и перфрингенс-титра почвы.
2.	Определить присутствие Е. coli на коже рук и предметов обихода методом
смывов.
3.	Провести санитарно-бактериологическую оценку молока, лимонада, мяса
и мясных консервов.
Методические указания
Для оценки санитарно-гигиенического состояния различных
объектов окружающей среды, воды, пищевых продуктов и на-
питков проводятся санитарно-бактериологические исследования,
целевое назначение которых состоит в определении эпидеми-
ческой безопасности указанных объектов. Выявление в них
1 Количество занятий по данной теме неодинаково на разных факультетах.
На лечебном, педиатрическом и стоматологическом факультетах занятия про-
водятся по сокращенной программе, в основном на демонстрационном мате-
риале, на санитарно-гигиеническом факультете — в виде самостоятельной работы
студентов, которая занимает несколько практических занятий.
81
патогенных микроорганизмов служит показателем эпидеми-
ческой опасности, но прямое обнаружение их сопряжено с
рядом трудностей, связанных прежде всего с низкой концен-
трацией данных микроорганизмов, которые, как правило, не могут
размножаться в воздухе, воде И 'почве. Поэтому в санитарно-
микробиологической практике применяют косвенные методы,
основанные на определении микробной обсемененности того
или другого объекта и на обнаружении в нем так назы-
ваемых санитарно-показательных бактерий.
Таблица 8. Санитарно-показательные бактерия окружающей среды н пище-
вых продуктов
Объект	Характер загрязнения	Санитарно-показательные бактерии
Вода	Фекальное	Бактерии группы кишечных палочек (Е. coli, Citrobacter freundii, Entero- bacter aerogenes), Str. faecalis
Почва	»	Те же бактерии и клостридии (Cl. perfringens, Cl. sporogenes и др.)
	Разлагающиеся отбросы	Термофильные бактерии, Proteus vulgaris
Пищевые продукты	Фекальное	Бактерии группы кишечных пало- чек, Str. faecalis, Proteus vulgaris
	Орально-капельное	Staph, aureus
Предметы обихода	Фекальное	Бактерии группы кишечных пало- чек, Proteus vulgaris, Str. faecalis
	Орально-капельное	Staph, aureus
Воздух	»	Staph, aureus, Str. pyogenes
О микробной обсемененности судят по микробному чис-
лу — общему количеству микроорганизмов, содержащихся в
единице объема или массы исследуемого объекта (1 мл воды,
1 г почвы, 1 мз воздуха). Содержание санитарно-показательных
бактерий оценивается по двум показателям —титру и ин-
дексу. Титром называется та минимальная масса или объем,
85
в котором обнаруживаются данные бактерии, индексом — коли-
чество санитарно-показательных бактерий, содержащихся в 1 л
жидкости, 1 г плотных веществ, 1 мз воздуха.
К санитарно-показательным бактериям относятся предста-
вители облигатной микрофлоры организма человека и тепло-
кровных животных, для которых средой обитания является
кишечник или респираторный тракт. Они обладают следу-
ющими свойствами: 1) постоянно выделяются в большом
количестве с калом или капельками слизи из респираторного
тракта; 2) не имеют других мест обитания; 3) способны сох-
раняться в окружающей среде в течение тех же сроков, что и
патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или респи-
раторном тракте; 4) неспособны интенсивно размножаться на
каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои
свойства. Перечисленные признаки присущи ряду бактерий, ко-
торые признаны санитарно-показательными для различных
объектов окружающей среды (табл. 8).
Санитарно-показательные бактерии группы кишечных пало-
чек (БГКП) принадлежат к разным трибам семейства Entero-
bacteriaceae. Их дифференцируют по различным признакам.
Важнейшие из них приведены в табл. 9.
Обнаружение Е. coli в разных объектах окружающей среды,
пищевых продуктах считается наиболее достоверным показа-
телем свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же
объектах Citrobacter и Enterobacter указывают на относительно
давнее фекальное загрязнение.
Таблица 9. Дифференциально-диагностические признаки БГКП
Вид бактерий	Признак					
	продукты сбражива- ния	метило- вый красный	реакция Фогеса — Проска- уэра	индоло- образова- ние	рост на цитрат- ной среде	рост в присут- ствии KCN
E.coli	Смесь кислот	+	—	+	-	-
Citrobacter freundii	То же	+		р	+	+
Enterobacter aerogene!	Бутан- диол	—	+	—	+	+
Условные обозначения: + положительная реакция; — отрицательная реак-
ция; р — различные реакции.
83
Присутствие Cl. perfringens, Cl. sporogenes и других клост-
ридий в почве свидетельствует об ее фекальном загрязнении,
причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии
образуют споры, что позволяет им длительно переживать в
окружающей среде (в частности, в почве).
Обнаружение в объектах окружающей среды Str. faecalis
также свидетельствует об их фекальном загрязнении.
Термофильные бактерии включают группу разных бактерий
(Lactobacillus lactis, Str. thennophilus и др.), размножающихся
при температуре 60°С и выше. Они не являются постоян-
ными обитателями кишечника человека и не служат кри-
териями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое
увеличение количества этих бактерий в саморазогревающемся
навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении
почвы разлагающимися отбросами.
Бактерии, принадлежащие к трибу Proteae (Proteus vulgaris
и др.) семейства Enterobacteriaceae, широко распространены в
природе. Они являются гнилостными бактериями и в большом
количестве встречаются на разлагающихся останках животных
и растений. Обнаружение этих бактерий в каких-либо пищевых
продуктах свидетельствует о гнилостном распаде.
Гемолитические стрептококки (Str. pyogenes), так же как
и фекальный стрептококк, относятся к семейству Streptococ-
сасеае. Являясь транзиторными обитателями носоглотки, зева,
они выделяются с капельками слизи орально-капельным путем.
Рис. 45. Аппарат Кротова для бактериологического исследования воздуха.
84
Сроки выживания гемолитических стрептококков в окружающей
среде практически не отличаются от сроков, характерных для
большинства других возбудителей воздушно-капельных инфек-
ций. Обнаружение гемолитических стерептококков в воздухе
помещений указывает на возможное его загрязнение микро-
организмами (бактерии, вирусы и др.), содержащимися в зеве,
носоглотке, верхних отделах респираторного тракта человека и
являющимися возбудителями воздушно-капельных инфекций.
Staph, aureus является факультативным обитателем носо-
глотки, зева, а также кожных покровов человека. Его присутствие
в воздухе помещений или на находящихся там предметах
является показателем орально-капельного загрязнения. Одно-
временное обнаружение золотистого стафилококка и гемолити-
ческих стрептококков свидетельствует о высокой степени загряз-
нения воздуха.
Определение микробного числа воздуха
Количественные микробиологические методы исследования
воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации),
аспирации или фильтрации.
Седиментационный метод. Две чашки Петри с питательным
агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего
посевы инкубируют в термостате при 37°С. Результаты оце-
нивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих
чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается
чистым, 250—500 колоний — загрязненным в средней степени,
при количестве колоний более 500 — загрязненным.
Аспирационный метод. Более точный количественный метод
определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осущест-
вляется с помощью приборов. Прибор Кротова (рис. 45) устроен
таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается
через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей
чашку Петри с питательным агаром; при этом частицы аэрозоля
с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фик-
сируются на всей его поверхности, поскольку чашка (под
входной щелью) находится в постоянном вращении. После
инкубации посева в термостате производят расчет микробного
числа по формуле:
а - 1000
х~ V
где а —количество выросших на чашке колоний; И—объем
пропущенного через прибор воздуха, л; 1000 —искомый объем
воздуха, л.
85
Для определения микробного числа воздуха используют
питательный агар, для выделения гемолитических стрептокок-
ков—кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового,
с последующим контрольным микроскопированием и выбороч-
ным пересевом подозрительных колоний на кровяной агар.
Staph, aureus выявляют методом посевов воздуха на желточно-
солевой агар.
Состав сред. Кровавой агар с генциановым ф и о л е т о в ы м:
2% питательный агар с 5—10% дефибринированной крови лошади, кролика
или барана и генциановый фиолетовый (1 ; 50 000). Желточно-солевой
агар: 2% питательный агар с 10% хлорида натрия, 20% (по объему) желточной
взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раствора хлорида
натрия!.
Для исследования воздуха могут быть применены и другие
приборы (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАБ-1 — пробоот-
борник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 —прибор для
отбора воздуха), в которых определенный объем воздуха про-
пускается через жидкости или фильтры, а затем делаются
мерные высевы на питательные среды. Используя ПАБ-Г и
ПОВ-1, можно исследовать большие объемы воздуха и обнару-
живать патогеннее бактерии и вирусы. Непосредственное
обнаружение патогенных и условно-патогенных бактерий —
возбудителей внутрибольничных инфекций (стафилококки,
синегнойные палочки и другие грамотрицательные бактерии)
в настоящее время проводится при исследовании воздуха
стационаров: хирургических, акушерско-гинекологических и др.
При возникновении внутрибольничных инфекций стафило-
кокковой этиологии проводят исследование на выявление источ-
ников и путей распространения инфекции; определяют иден-
тичность стафилококков, выделенных из объектов окружающей
среды, а также от больных и обслуживающего персонала путем
фаготипирования. Нормативные показатели микробного числа
и содержания Staph, aureus, разработанные для воздуха боль-
ничных помещений, приведены в табл. 10.
Таблица 10. Критерии оценки микробного обсеменения воздуха в больничных
помещениях
Исследуемый объект	Микробное число	Staph, aureus (в 250 л)
Воздух операционных: до начала работы во время ее Воздух родильных залов	Не выше 500 » » 1000 » » 1000	Не должно быть То же » »
86
Определение микробного числа воды
Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду откры-
тых водоемов —в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят
в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10—12 мл
расплавленным и остуженным до 45—50°С питательным агаром,
коуорый тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют
при 37°С в течение 24—48 ч. Воду из открытых водоемов
засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых
инкубируют при 37°С в течение суток, а другую —2 сут при
20°С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности
и в глубине среды колоний и вычисляют микробное
число воды — количество микробов в 1 мл.
Определение коли-титра и коли-индекса воды
Коли-титр воды измеряется минимальным количеством
воды (в мл), в котором обнаруживаются БГКП, кол и - ин-
дек с — количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой
воды. Коли-титр воды определяют бродильным методом и
методом мембранных фильтров.
Бродильный метод. Воду открытых водоемов в объемах
100; 10; 1 и 0,1 мл засевают в глюкозопептонную среду,
причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл)
используют концентрированную среду, содержащую десятикрат-
ные количества указанных веществ.
Состав г л ю к оз о и еп то и и о й среды: 1% пептонная вода, 0,5% глю-
козы, 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок.
Для исследования водопроводной воды делают посев 4
проб по 100 мл и 10 проб по 10 мл или 3 проб по 100 мл и 3 проб
по Ю мл в концентрированную среду и 3 проб по 1 мл в обычную
глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток
при 37°С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в
поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят
посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки,
окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий
дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и
Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudo-
monadaceae и других оксидазаположительных бактерий, оби-
тающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают
2—3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят
штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-п-
фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет
бумаги не изменяется, при положительном — она окрашивается
в синий цвет в течение 1 мин.
87
Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу,
вновь исследуют в бродильном тесте —вносят в полужидкий
питательный агар с 0,5% глюкозы и инкубируют при 37°С
в течение суток. При положительном результате определяют
коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТа 18963—73 (табл. 11).
Таблица 11. Определение коли-индекса при исследовании 500 мл воды
Количество положитель- ных результатов анализа воды из 5 флаконов по 100 мл	Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)		Коли-титр
		нижний	верхний	
0	Менее 2	0	6,о	Более 455
1	2	о,1	12,6	455
2	5	0,5	19,2	196
3	9	1,6	29,4	109
4	16	33	52,9	62
5	Более 16	8,0	—	Менее 62
Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3
помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена,
которая присоединяется к вакуум-насосу (см. рис. 28). Мембран-
ные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистил-
лированной воде. Воду из водопроводной сети Москвы и Ленин-
града и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 500 мл,
воду других городов — в объеме 333 мл. Чистую воду открытого
водоема фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загряз-
ненную перед фильтрацией разводят стерильной водой. Затем
фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку
Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчи-
тывают количество выросших колоний, типичных для БГКП.
Из 2—3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают
по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с
выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом,
не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной
диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор
окрашивает колонию в синий цвет. Две — три колонии, не изме-
нившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду
с 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С.
При наличии газообразования подсчитывают количество крас-
ных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из зна-
чения которого вычисляют коли-титр. Например, если коли-
индекс равен 5, то коли-титр составит 200 (1000 : 5 = 200).
Нормативные показатели микробного числа, коли-титра и коли-
индекса воды приведены в табл. 12.
88
Таблица 12. Нормативы для водопроводной воды (ГОСТ 2874—73)
Показатель	Норма
Общее количество бактерий в 1 мл неразбавленной воды, не более Количество БГКП, определяемое по плотной среде с примене- нием концентрации бактерий на мембранных фильтрах в 1 л воды (коли-индекс), не более При использовании жидких сред накопления коли-титр, не менее	100 3 333
Для определения титра Staph, faecalis готовят десятикрат-
ные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме
1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, полимик-
синовая и др.), инкубируют при 37°С в течение 2 сут, а затем
через 24 и 48 ч производят высевы на чашки с плотными
элективно-дифференциальными средами: агар КФ, агар ТТХ
(среда с трифенилтетразолхлоридом), полимиксинотеллуритный
агар. Идентифицируют фекальные стрептококки по виду коло-
ний, морфологии клеток и окраске по Граму. На среде с ТТХ
Staph, faecalis образует колонии темно-красного цвета, на агаре
с теллуритом — черного цвета.
Состав сред. Среда КФ: 2% питательный агар с 1% дрожжевого экст-
ракта, 2% мальтозы, 0,1% лактозы, 0,4% азида натрия, 0,06% карбоната натрия,
индикатор бромкрезоловый красный. Полимиксиновая среда: пита-
тельный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, полимиксин М 200 ЕД/мл,
индикатор бромтимоловый синий. Полимиксинотеллуритный
агар: питательный агар, дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, кристаллический
фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0,01% теллурита калия.
Агар ТТХ: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, кристал-
лический фиолетовый 1 :800 000,0,01% ТТХ.
При определении индекса Staph, faecalis пользуются статис-
тическими таблицами, применяемыми при установлении коли-
индекса. Кроме того, с этой целью используют метод мемб-
ранных фильтров.
Для обнаружения патогенных бактерий максимальные
объемы воды пропускают через мембранные фильтры, которые
затем помещают в жидкие элективные среды или на поверх-
ность плотных дифференциально-диагностических сред.
Определение микробного числа почвы
Почву берут на глубине 10—15 см стерильным ножом
(из разных мест исследуемой территории в количестве 10
и большего числа проб) и помещают в стерильную банку.
Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с
водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной
89
суспензии готовят разведения 10“3,10-4,10~5. Из двух последних
разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7% расплавлен-
ного и остуженного до 45°С питательного агара, после чего
выливают в чашки Петри с 2% питательным агаром. Посевы
инкубируют при 37°С. Затем подсчитывают количество вырос-
ших колоний и определяют микробное число.
Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра
термофильных бактерий почвы
Различные разведения почвенной суспензии засевают по
1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43°С
в течение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме,
применяемой при определении коли-титра воды.
Для определения перфрингенс-титра различные разведения
почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным
обезжиренным молоком или железосульфитной средой Виль-
сона— Блера, приготовленный ex tempore. Посевы инкубируют
при 43°С в течение 24—48 ч, после чего учитывают результаты
по свертыванию молока или по образованию черных колоний
Cl. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера.
Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопи-
руют и вычисляют перфрингенс-титр.
Состав сред. Среда Кесслера: 1% пептонная вода, 5% желчи, 0,25%
лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грамположительных
бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера:
3% питательный агар, 1% глюкозы, 2% сульфита натрия, 0,08% хлорида железа.
Для определения титра термофильных бактерий разведения
почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают
расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы
инкубируют в течение суток при 60°С, а затем подсчитывают
количество выросших колоний и делают пересчет на 1 г почвы.
Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят
по комплексу показателей, из которых наиболее важным явля-
ется установление степени фекального загрязнения (табл. 13).
Таблица 13. Оценка фекального загрязнения подзолистых почв Подмосковья
Характеристика почвы	Коди-титр	Перфрингенс-титр	Общее число бак- терий, млн / г
Чистая Загрязненная Сильно загрязненная	1,0 и выше 0,9-0.01 0,009 и ниже	0,01 и выше 0,009-0.0001 0,00009 и ниже	До 0,5 0,5-5,0 5,1 и более
90
Определение фекального зап>язнения предметов
обихода (инвентарь, оборудование, мебель, посуда,
игрушки н др.) и рук персонала
Стерильным ватным тампоном, увлажненным изотоническим
раствором хлорида натрия, делают смыв с исследуемого пред-
мета. Тампон помещают в среду Кесслера или втирают в поверх^
ность среды Эндо. Посевы на плотных средах инкубируют при
37°С, на жидких средах —при 43°С. Для исследования гладких
поверхностей и тканей используют также специальные трафа-
реты, представляющие собой металлические формы в виде
усеченного конуса, в которые наливают расплавленную и охлаж-
денную до 45—48°С среду Эндо (двойной концентрации) или
питательный агар. После застывания и затвердения агаровый
гель стряхивают в стерильную чашку Петри и инкубируют при
37°С в течение суток. Выросшие колонии подсчитывают и иден-
тифицируют по схеме. Зная площадь агарового геля, определяют
число колоний на 1 CM2.
Обсемененность предметов обихода золотистым стафилокок-
ком и фекальным стрептококком устанавливают аналогичным
способом, используя для этого соответствующие питательные
среды (см. методы исследования воды и воздуха).
Санитарно-бактериологическое исследование молока
в Молочных продуктов
О санитарно-бактериологическом состоянии молока и молоч-
ных продуктов судят по микробному числу и коли-титру.
Для определения микробного числа пастеризованное молоко
разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия
(1:10, 1:100, 1:1000) и 1 мл каждого разведения выливают на
дно стерильной чашки Петри, которую затем заливают расплав-
ленным и остуженным агаром. Посевы инкубируют при 37°С
в течение суток, после чего подсчитывают количество выросших
колоний.
Для определения коли-титра цельное пастеризованное моло-
ко засевают в шесть пробирок со средой Кесслера: в три
пробирки вносят по 1 мл молока, а в остальные три—по 0,1 мл
(1 мл молока, разведенного в 10 раз стерильной водой). Посевы
инкубируют при 43°С в течение суток, после чего из забро-
дивших проб делают посевы на среду Эндо и инкубируют при
37°С. Из выросших колоний красного цвета готовят мазки,
окрашивают по Граму, микроскопируют и делают посев на среду
Козера, а также в пептонную воду с 1% глюкозы. Пробирки
с посевами на среде Козера инкубируют при 37°С, а на среде
91
с глюкозой —при 43° С в течение суток. При оценке результатов
учитываются бактерии, вызывающие брожение глюкозы с обра-
зованием кислоты и газа, но не дающие роста на цитратной
среде Козера.
Таблица 14. Определение коли-титра в пастеризованном молоке, сливках,
кефире и других молочных продуктах
Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах, мл						Коли-титр, мл
ио	1,0	1,0	0,1	0,1	0,1	
										—	БолееЗ.О
+	—	—	—	—	—	3,0 .
+	+	—	—	—	—	Менее 3,0
+	+	+	—	—	—	Более 03
+	+	+	+	—	—	03
+	+	+	+	+	—	Менее 03
+	+	+	+	+	+	
Таблица 15. Санитарно-бактернологическне нормативы для молока в молочных
продуктов
Продукт	Документ, регламентирую- щий качество	Допустимое количество микробов в I мл или I г, не более	Коли-титр, не менее
Молоко пастеризованное:	ГОСТ 13277-67		
группа А		75 000	3
» Б		150 000	03
Молоко во флягах, цистернах		300 000	03
Сливки пастеризованные:	РТУ 50-69		
группа А		100 000	3
» Б		300 000	0,3
Молоко сгущенное с сахаром	ГОСТ 2903-65	50 000	оз
Какао со сгущенным молоком и			
сахаром	ГОСТ 718-54	35 000	0,3
Кофе со сгущенным молоком и			
сахаром	ГОСТ 719-54	35 000	0,3
Молоко сухое:	ГОСТ 4495-74		
высший сорт		50 000	0,1
первый »		70 000	0,1
Мороженое	ОСТ 4973-74	100000	03
Детские молочные смеси пасте-			
ризованные и вареные	Инструкция		
	ГСИ СССР	•	
	123—137132		
	1963 г.	500	11,1
Молоко сухое для детей грудного			
возраста	| ГОСТ 9873-61	500	11,1
92
Состав среды Козера: дистиллированная вода, 0,15% фосфата натрия-аммо-
ния, 0,1% фосфата калия однозамещенного, 0,02% сульфата магния, 0,25% цит-
рата натрия.
Аналогичным образом исследуют сливки, молочнокислые
продукты, мороженое. Величину коли-титра устанавливают по
таблицам ГОСТа (табл. 14 и 15).
Для обнаружения в молоке патогенных бактерий делают
посевы на соответствующие элективные и дифференциально-
диагностические среды с последующим выделением чистых
культур и их идентификацией.
Санитарно-бактериологическое исследование напитков
(лимонад, минеральные воды)
При исследовании лимонада и минеральных вод определяют
микробное число и коли-титр, используя при этом методы,
применяемые для исследования питьевой воды. Перед иссле-
дованием лимонад нейтрализуют 10% раствором гидрокарбо-
ната натрия, проверяя реакцию с помощью лакмусового инди-
катора. Отобранные пробы минеральной воды выдерживают
при 43°С в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр
определяют методом мембранных фильтров. С этой целью
500 мл воды фильтруют через мембранные фильтры (100 мл
через один фильтр), после чего их промывают стерильной водо-
проводной водой для удаления остатков минеральных солей
и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют
при37°С. После определения коли-индекса высчитывают коли-титр.
Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада и
минеральных вод соответствуют нормативам питьевой водо-
проводной воды. Такие же требования предъявляются к воде,
используемой для изготовления кваса и различных фруктово-
ягодных безалкогольных напитков.
Санитарно-бактериологическое исследование мяса,
колбасных издений н мясных продуктов
При исследовании мяса определяют количество бактерий
в мазках-отпечатках, которые готовят из кусочков мяса размером
2 X1,5 X 2,5 см. Мазки окрашивают по Граму и микроскопируют.
Мясо считается свежим, если в поле зрения обнаружено не
более 10 палочковидных бактериальных клеток, и сомнительно
свежим, если количество бактерий превышает 30. При выяв-
лении большего числа бактерий мясо оценивается как несвежее.
При исследовании колбасных изделий и мясных продуктов
определяют микробное число, а также устанавливают присутст-
93
вие кишечных палочек, сальмонелл, бактерий рода Proteus и
клостридий. Для проведения этих исследований из продукта
готовят 20% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия,
которую высевают на различные питательные среды. Для опре-
деления микробного числа исследуемую взвесь (неразведенную
и разведенную в 2 раза) в количестве 0,5 мл вносят в стерильную
чашку Петри, заливают расплавленным и охлажденным пита-
тельным агаром. Посевы инкубируют при 37°С в течение 48 ч,
после чего подсчитывают количество выросших колоний.
Присутствие Е. coli устанавливают по их способности
сбраживать лактозу до кислоты и газа при 43°С в течение
24 ч. Исследуемую взвесь (1 г продукта) засевают в среду
Кесслера, после чего из нее делают высев на среду Эндо. Из
характерных для этих бактерий красных колоний готовят мазки,
окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для выделения сальмонелл взвесь засевают на соответст-
вующие элективные среды, после чего выделяют чистые куль-
туры бактерий и идентифицируют их по методике, принятой
для изучения этих бактерий (см. с. 183).
Бактерии рода Proteus выявляют по методу Шукевича.
Для этого взвесь вносят в конденсационную воду свежескошен-
ного питательного агара. Посев инкубируют при 37°С в течение
суток. При наличии протея наблюдается ползучий рост. При
этом в мазках определяются грамотрицательные палочки.
Для обнаружения анаэробных, спорообразующих бактерий
делают посев в две пробирки со средой Китта—Тароцци; одну
из них после посева нагревают в течение 20 мин при 80°С
для уничтожения вегетативных клеток. Посевы инкубируют при
37°С в течение 5 сут. При появлении роста готовят мазки,
окрашивают по Граму и микроскопируют. Кроме того, проверяют
способность выделенных бактерий восстанавливать сульфит
натрия в сульфат. Для этого их засевают в среду Вильсона—
Блера, где анаэробы образуют черные колонии за счет выпадения
черного осадка сульфата железа, образующегося в результате
соединения сульфата натрия с хлорным железом, содержащимся
в среде.
Колбасные изделия и продукты из мяса не должны содер-
жать кишечных палочек, сальмонелл, бактерий рода Proteus
и анаэробных спорообразующих бактерий. Общее количество
бактерий в 1 г не должно превышать 1000.
Санитарно-бактериологическое исследование
консервов
При исследовании консервов определяют присутствие аэроб-
ных и анаэробных бактерий. По эпидемиологическим показаниям
94
выявляют Cl. botulinum и проводят исследование на наличие
ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследо-
ванием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде
с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдерживая в
термостате при 37°С в течение 5 сут, после чего моют теплой
водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю
крышку смоченной спиртом горящей ватой. Извлеченное содер-
жимое засевают для выявления аэробной флоры в две пробирки
с бульоном, а для обнаружения анаэробной флоры — в две
пробирки со средой Китта—Тароцци, содержащей 0,15% агара.
Посевы инкубируют при 37°С в течение 5 сут. При появлении
признаков роста аэробные бактерии пересевают на питательный
агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шукевичу) и на питатель-
ный агар с 1% глюкозой. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл,
вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажден-
ным до 45—48°С питательным агаром с 1% глюкозы. После
застывания на поверхность среды помещают стерильное пред-
метное стекло (для создания анаэробных условий) и посевы
инкубируют в течение суток при 37°С. Из выросших колоний
получают чистые культуры, которые затем идентифицируют
по обычной схеме.
Для выявления ботулинического токсина исследуемые пробы
консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию нейтра-
лизации токсина антитоксической противоботулинической сы-
вороткой типов А, В, С, Е, F на белых мышах. В консервах
не допускается присутствие Cl. botulinum и его токсина, С1.
perfringens и других патогенных бактерий.
Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указывает
на недостаточную эффективность примененных методов консер-
вирования и возможность порчи. Присутствие сапрофитных
аэробных бацилл (Вас. subtilis, Вас. mesentericus) является
допустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консерв-
ных банок.
ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
В данном разделе изложены основные методы изучения
тесно взаимосвязанных процессов инфекции и иммунитета.
Характер их взаимосвязи определяется биологическими свойст-
вами микроба и состоянием иммунной системы организма
хозяина. Студенты должны последовательно ознакомиться с
методами оценки вирулентности и токсичности патогенных
бактерий, диагностическими возможностями эксперименталь-
ного заражения и вскрытия лабораторных животных. Из имму-
нологических методов исследования выборочно представлены
некоторые методики изучения факторов естественного иммуни-
тета: фагоцитоза, комплемента в связи с оценкой иммуноло-
гического статуса организма человека и выявлением иммуно-
дефицитных состояний. С целью изучения иммунной системы
организма, обеспечивающей специфический иммунный ответ,
дано краткое описание основных методов исследования иммуно-
компетентных клеток (Т- и В-лимфоцитов). Основное внимание
следует уделить изучению серологических реакций, которые
широко используются при лабораторной диагностике различных
заболеваний, а также принципам применения специфических
диагностических, лечебных и профилактических препаратов.
Тема 15. ПАТОГЕННОСТЬ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ МИКРОБОВ.
ТОКСИНЫ
Программа двух занятий
1.	Методы экспериментального заражения и иммунизации животных.
2.	Бактериологическое исследование трупов павших животных.
3.	Изучение факторов патогенности бактерий.
4.	Методы определения силы токсина.
Демонстрация
1.	Методы выявления факторов патогенности, подавляющих защитные
механизмы организма хозяина: капсулы у патогенных бактерий, корд-фактора
у патогенных микобактерий.
2.	Кератоконъюнктивальная проба Шсреня на морской свинке.
3.	Определение вирулентности бактерий или силы токсина методом зара-
жения животных.
96
Задание для выполнения лабораторной работы
Занятие 1-е
1.	Заразить белую мышь подкожно суточной бульонной культурой испы-
туемых бактерий.
2.	Посеять культуру стафилококка на среды для изучения факторов пато-
генности.
3.	Поставить дермонекротическую пробу.
4.	Провести внутривенно иммунизацию кролика убитой вакциной для
получения имунной сыворотки (первое введение антигена).
Занятие 2-е
1.	Произвести бактериологическое исследование трупов белых мышей,
павших после заражения. Определить присутствие возбудителя в органах и
тканях, отметить наличие капсул. Сделать заключение о форме инфекции и
возможных причинах гибели животного.
2.	Отметить результаты посева стафилококка да питательные среды и
сделать соответствующее заключение.
3.	Отметить результаты дермонекротической пробы на кролике.
4.	Провести иммунизацию кролика убитой вакциной (второе введение
антигена).
Методические указания
Экспериментальное заражение животных. Инфекционный
процесс может быть искусственно воспроизведен путем зараже-
ния лабораторных животных; кроликов, морских свинок,
белых мышей, белых крыс и др. Экспериментальное заражение
животных производится для: 1) изучения патогенности и виру-
лентности микроорганизмов; 2) выделения чистой культуры
возбудителя из различных материалов (метод биопробы); 3) вос-
произведения экспериментальной инфекции, испытания лечеб-
ного действия химиотерапевтических препаратов и других
целей.
Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно,
внутримышечно, внутривенно, перорально, интраназально,
внутритрахеально, интрацеребрально и внутрибрюшинно. Перед
началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют.
Мышь при заражении берут за хвост, опускают на стол, туловище
быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по
спине, захватывают кожу над головой; животное фиксируют
в левой руке в растянутом положении. Взвесь микробов опре-
деленной концентрации набирают в шприц через иглу. Шприц
держат, как писчее перо, в правой руке.
При подкожном заражении иглой прокалывают кожную
складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содер-
жимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв
место инъекции ватой, смоченной спиртом.
5-639
97
Рис. 46. Внутрибрюшинное заражение белой мыши.
При внутрибрюшинном заражении животное фиксируют
головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме.
В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая
иглу под острым углом, затем переводят шприц в положение,
перпендикулярное к брюшной стенке, толчкообразным движе-
нием прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца
(рис. 46).
Инструменты стерилизуют кипячением.
Бактериологическое исследование трупов белых мышей.
Для обнаружения микроба, вызвавшего гибель животного, опре-
деления его локализации в организме и выделения чистой
культуры возбудителя производят вскрытие зараженного живот-
ного сразу после его гибели, соблюдая правила асептики во
избежание загрязнения посторонними бактериями. Мышь поме-
щают брюшком кверху на марлю, смоченную дезинфициру-
ющим раствором, поверх слоя застывшего парафина в ванночке
и прикрепляют булавками за лапки. Тщательно обрабатывают
кожу раствором какого-либо антисептика. Вскрытие производят
стерильными инструментами.
Делают продольный разрез кожи по прямой линии от нижней
челюсти до лобка, осторожно отсепаровывают в стороны.
Отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических
узлов; при необходимости из них делают мазки-отпечатки и
посевы.
Грудную полость вскрывают поперечным разрезом под мече-
видным отростком и двумя продольными разрезами через ребра
параллельно грудине. Откладывают вырезанный лоскут и
осматривают органы грудной полости, отмечая в протоколе
наличие экссудата (рис. 47). Для посева крови из сердца его
98
Рис. 47. Вскрытие мыши.
1 — 4 этапы вскрытия.
поверхность прижигают раскаленным кончиком пинцета и
вводят капилляр стерильной пастеровской пипеткой в полость
сердца. Затем каплю крови из пипетки выдувают в пробирку
со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпечатки и делают
посевы.
Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брюшины
ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы полости,
5*
99
отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и
консистенцию печени, селезенки, надпочечников, мезентериаль-
ных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы
из этих органов на питательные среды. Для приготовления
мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек
небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются
к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки
фиксируют в жидком фиксаторе и окрашивают метиленовым
синим. При микроскопии отмечают присутствие микроба-
возбудителя в различных органах и тканях. Результаты посевов
учитывают на следующий день после инкубации в термостате.
Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после
вскрытия подлежит уничтожению.
Методы оценки вирулентности патогенных бактерий
и силы токсинов
Патогенность и токсигенность являются видо-
выми генотипическими признаками микроорганизмов. Фенотипи-
ческое проявление патогенного генотипа выражается в вирулент-
ности (степени патогенности), а токсигенность проявляется
фенотипически в способности образовывать токсины.
Вирулентность является штаммовым признаком, кото-
рый определяется метаболической активностью бактериаль-
ных клеток, их компонентами и продуктами, подавляющими
защитные механизмы организма хозяина, в том числе фагоцитоз,
способствующими колонизации и распространению бактерий в
организме (инвазивность), повреждающими клетки и ткани
хозяина.
К факторам, подавляющим защитные реакции организма,
относятся капсульное вещество бактерий (полисахариды или
полипептиды), протеины клеточной стенки бактерий (М-протеин
стрептококка, А-протеин стафилококка), корд-фактор микобак-
терий, липополисахариды энтеробактерий и др. Колонизация
(заселение) бактерий обусловлена наличием пилей (ворсинок)
или свойствами клеточной стенки, от которых зависит прили-
пание бактерий. Инвазивные и повреждающие свойства бактерий
связаны с образованием ферментов, способствующих расщеп-
лению биополимеров тканей. К таким ферментам относятся
гиалуронидаза, фибринолизин, коллагеназа, нейраминидаза,
ДНК-аза и др.
Токсигенность бактерий фенотипически проявляется
в образовании белковых токсинов, полностью или частично
секрета руемых в окружающую среду. Эндотоксины, являющиеся
компонентом липополисахаридного слоя клеточной стенки,
100
освобождаются только после разрушения клетки, обусловливая
токсическое действие на ткани макроорганизма.
Вирулентность и токсичность патогенных бактерий представ-
ляют собой разные, но взаимосвязанные формы проявления
патогенного генотипа. Они измеряются в специальных едини-
цах: минимальных смертельных дозах (Dosis letalis minima) -
DLM. За 1 DLM принимают наименьшую дозу возбудителя
или белкового токсина, которая вызывает гибель 95% заражен-
ных животных. Чаще пользуются более точной дозой: LDso,
вызывающей гибель 50% зараженных животных.
Определение ферментов, обусловливающих
инвазивность бактерий
1.	Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту,
которая перестает давать с уксусной кислотой сгусток муцина.
Для определения этого фермента в пробирку с субстратом,
содержащим гиалуроновую кислоту, вносят суточную культуру
бактерий или фильтрат бульонной культуры и инкубируют в
течение 15 мин при 37°С. Затем добавляют 2—3 капли крепкой
уксусной кислоты. В пробирках, где содержится гиалуронидаза,
не происходит образования сгустка.
2.	Плазмокоагулаза выявляется при посеве испыту-
емой культуры в 0,4 мл стерильной цитратной плазмы крови.
Посевы инкубируют при 37°С в течение 2—5 ч. В случае вы-
работки фермента происходит свертывание плазмы, и в конт-
роле она остается жидкой.
3.	Гемолизины определяют путем посева испытуемой
культуры «бляшками» в чашку Петри с кровяным агаром.
Чашкр инкубируют в термостате при 37°С в течение суток.
В положительном случае вокруг «бляшек» образуются зоны
гемолиза.
Определение вирулентности с помощью биологических
проб на лабораторных животных
Дермонекротическая проба. Кролику внутрикожно вводят
0,2 мл бульонной испытуемой культуры при помощи туберку-
линового шприца с тонкой иглой. В положительном случае
через 2—3 сут на месте введения образуется очаг некроза
(рис. 48).
Кератоконъюнктивальная проба. Суточную агаровую культуру
бактерий стандартной петлей диаметром 5 мм вводят под
нижнее веко глаза морской свинки. Через 2—4 сут оценивается
101
Рве. 48. Дермонекротическая проба.
а — отрицательная реакция; б — положи-
тельная реакция.
выраженность керато-
конъюнктивита по наличию
помутнения роговицы, на-
гноения и изъязвления
(проба Шереня).
Определение вирулент-
ности бактерий или силы
токсина. Испытуемые пре-
параты в определенных
дозах вводят группам лабо-
раторных животных с по-
следующей регистрацией
их гибели и расчетом ле-
тальных доз. Обязательным
условием при этом является
строгая стандартизация:
вида, пола, массы живот-
ных, условий их содержа-
ния, полноценности пита-
ния и т. д. Ряд десятикрат-
ных разведений токсина
(или культуры бактерий)
вводят нескольким группам
животных. Через опреде-
ленный срок отмечают
число погибших животных
в каждой группе и произ-
водят расчет LD50.
Иммунизация кролика
для получения иммунной
сыворотки. Для получения
иммунной сыворотки про-
водят цикл иммунизации кролика убитой вакциной — взвесью
убитых бактерий, содержащей 1 млрд, микробных тел в 1 мл.
Вакцину вводят в краевую вену уха кролика 3 раза с интервалами
в 6 дней. Через 7 дней после последнего введения антигена
у кролика берут кровь, из которой готовят сыворотку и титруют
для выявления в ней антител.
Тема 16. ФАГОЦИТОЗ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ
ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА
Естественный иммунитет организма обеспечивается клеточ-
ными факторами (микро- и макрофаги крови и тканей), а также
гуморальными вне- и внутрисосудистыми факторами (лизоцим,
102
комплемент и другие белки сыворотки крови). При оценке
иммунологического статуса организма принято определять фаго-
цитарную активность лейкоцитов крови, уровни содержания в
сыворотке крови лизоцима и комплемента.
Программа занятия
1.	Изучение стадий фагоцитоза и фагоцитирующих клеток в опыте фаго-
цитоза in vivo (в организме подопытного животного).
2.	Определение фагоцитарных показателей и показателя опсонофагоци-
тарной реакции в опыте in vitro (в исследуемой крови людей).
3.	Исследование гуморальных факторов естественного иммунитета.
Демонстрацяя
1.	Миграция и хемотаксис фагоцитирующих клеток.
2.	Фагоцитоз бактерий в тканевой культуре макрофагов.
3.	Незавершенный фагоцитоз гонококков в мазке из уретрального гноя
больного гонореей.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Учесть результаты посева крови из трупа белой мыши, сделанного на
прошлом занятии, и дать заключение.
2.	Заразить белую мышь внутрибрюшинно взвесью стафилококка для
изучения явления фагоцитоза in vivo. Проанализировать защитную роль фаго-
цитоза в организме.
3.	Определить показатель опсонофагоцитарной реакции на основании
подсчета фагоцитарных показателей в готовых мазках, приготовленных ранее
при постановке этой реакции in vitro. Сделать заключение.
4.	Провести иммунизацию кролика убитой вакциной (третье введение
антигена).
5.	Учесть и оценить результаты определения титра лизоцима в слюне.
Методические указания
Постановка опыта фагоцитоза на белых мышах. За 24 ч до
постановки опыта белым мышам вводят внутрибрюшинно по
2—3 мл стерильного 1% раствора крахмала. Это вызывает скоп-
ление в брюшной полости фагоцитирующих клеток как резуль-
тат асептического воспаления и хемотаксиса фагоцитов к крах-
малу. Затем мыши вводят внутрибрюшинно 1 мл двухмиллиард-
ной взвеси белого стафилококка. Через 30 мин брюшную стенку
мыши прокалывают концом тонкого капилляра пастеровской
пипетки и набирают несколько капель экссудата. Из него
готовят мазки на предметных стеклах, высушивают на воздухе,
фиксируют и окрашивают раствором метиленового синего в
течение 3—4 мин.
При микроскопии мазков отмечают наличие микрофагов
(полиморфно-ядерных клеток) и макрофагов (мононуклеаров)
103
с поглощенными стафилококками, окрашенными в интесивно
синий цвет на фоне светло-голубой цитоплазмы фагоцитов
(рис. 49). Отмечают в препарате отдельные стадии фагоцитоза:
прилипание, захват, частичное переваривание.
Постановка опсонофагоцитарнон реакции. В пробирку с одним
объемом стерильного 2% раствора цитрата натрия вносят два
объема свежевзятой крови и один объем взвеси бактерий,
содержащей 1 млрд/мл микробных клеток, убитых нагреванием
при 80°С в течение часа. Содержимое пробирки перемешивают,
инкубируют в течение 30 мин при 37°С, затем готовят мазки
и окрашивают по Романовскому—Гимзе. В мазке подсчитывают
количество бактерий, захваченных каждым из 25 нейтрофилов.
По результатам учета определяют следующие фагоцитарные
показатели: фагоцитарный показатель (индекс) — процент фаго-
цитирующих нейтрофилов, фагоцитарное число — среднее коли-
чество фагоцитированных бактерий на один нейтрофил. Пока-
затель опсонофагоцитарной реакции (ПОФР) вычисляют по
формуле: ПОФР = За + 2Л + 1с + 0</, где л —число нейтрофилов,
содержащих свыше 41 бактерии; b — число нейтрофилов, содер-
жащих 21-40 бактерий; с—число нейтрофилов, содержащих
от 1 до 20 бактерий; d— число нейтрофилов, не содержащих
бактерий. Максимальный показатель при такой системе учета
составляет 75. Ориентировочно считают, что показатель в пре-
делах 10—24 характеризует слабоположительную реакцию,
25—49 — ясно выраженную, 50—75 — резко положительную реак-
цию. Ясно выраженная и резко положительная реакции харак-
теризуют опсонизирующую активность сыворотки больного и
функциональную активность фагоцитов.
Определение титра лизоцима в слюне. Готовят ряд последо-
вательных разведений слюны в пробирках, в каждую из кото-
рых вносят по 1 мл суспензии суточной культуры Micrococcus
lysodeiticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел. После
инкубации в термостате в течение 3 ч определяют титр лизоцима
по последнему разведению, в котором наблюдается полный
лизис бактерий — просветление. Оценку активности лизоцима
можно проводить по степени мутности с использованием
фотоэлектроколориметра или по изменению оптической плот-
ности микробной взвеси нефелометрическим методом.
Тема 17. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА
ОРГАНИЗМА
Современные методы определения иммунологического ста-
туса организма человека включают ряд тестов для дифферен-
цированной оценки Т- и В-систем иммунитета. Оценка кле-
точного иммунитета (Т-системы) проводится путем определения;
104
1) количества Т-лимфоцитов в крови методом спонтанного
розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана (Е-ро-
зетки); 2) функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции
бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) in vitro под влиянием
митогенов или антигена либо по уровню продукции лимфоци-
тами гуморальных медиаторов клеточного иммунитета (лимфо-
кинов) в тестах подавления миграции макрофагов и др., а также
при постановке кожных проб гиперчувствительности замедлен-
ного типа (ГЗТ) для оценки возможной предварительной сен-
сибилизации организма к данному антигену (аллергену).
Оценка гуморального иммунитета (В-системы) проводится
путем определения количества В-лимфоцитов в крови реакцией
иммунофлюоресценции с антисывороткой против иммуногло-
булинов человека или путем выявления на В-лимфоцитах
рецепторов для комплемента — с помощью теста розеткообра-
зования лимфоцитов с эритроцитами, несущими на себе комп-
лекс: антиэритроцитарные антитела + комплемент (ЕАС-розет-
ки). Функциональная активность В-лимфоцитов оценивается
косвенно по уровням сывороточных иммуноглобулинов (1g) раз-
личных классов: A,G, М.
Программа занятия
1,	Методы оценки Т-системы иммунитета.
2.	Методы оценки В-системы иммунитета.
3.	Методы оценки специфической сенсибилизации организма.
Демонстрация
1.	Результаты теста угнетения миграции макрофагов.
2.	Результаты определения концентрации сывороточных иммуноглобулинов
по Манчини.
3.	Различные виды аллергенов.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Произвести учет результатов метода розеткообразования лимфоцитов с
эритроцитами барана для количественной оценки содержания в крови
Т-лимфоцитов.
2.	Произвести учет результатов РБТЛ для оценки функциональной актив-
ности Т-лимфоцитов.
3.	Произвести учет результатов метода ЕАС-розеток для количественной
оценки содержания в крови В-лимфоцнтов.
4.	Отметить результаты кожно-аллергической пробы, поставленной на
предварительно сенсибилизированной морской свинке.
5.	Получить иммунную сыворотку крови кролика после проведенного
цикла иммунизации (титр антител определить на следующем занятии).
Методические указания
Метод розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами
барана является наиболее простым и самым распространенным
105
методом количественного учета Т-лимфоцитов периферической
крови людей. При смешивании лимфоцитов человека и эрит-
роцитов барана последние присоединяются избирательно
только к Т-лимфоцитам, образуя так называемые розетки.
Розеткообразующей клеткой считают лимфоцит, присоединив-
ший три эритроцита барана и более. У здоровых людей
Т-лимфоциты составляют 50—70% от общего числа лимфоцитов.
Метод ЕАС-розеток. Один из простых методов количест-
венного учета В-лимфоцитов крови человека. В этом случае
тест розеткообразования ставят, как и в случае Е-розеток, но
с эритроцитами барана, предварительно инкубированными
последовательно с антиэритроцитарными антителами, а затем
с комплементом. Такие эритроциты присоединяются избиратель-
но к клеткам, несущим рецепторы для комплемента, в том
числе к В-лимфоцитам. У здоровых людей В-лимфоциты
(ЕАС-розетки) составляют 15—25% от общего числа лимфоцитов.
РБТЛ. При культивировании лимфоцитов крови человека в
присутствии митогенов — фитогемагглютинина (ФГА) или спе-
цифического антигена — малые лимфоциты увеличиваются в
размерах и превращаются в бластные клетки, активно синте-
зирующие ДНК. Этот феномен называется бластной
трансформацией лимфоцитов. Сравнение результатов
производят по отношению к лимфоцитам, культивированным
в тех же условиях без стимуляторов. При морфологическом
учете РБТЛ по окончании срока культивирования делают мазки
клеток, окрашивают по Романовскому—Гимзе и подсчитывают
количество бластных форм на 100 лимфоцитов в препарате.
У здоровых людей РБТЛ с ФГА дает 60—80% бластных форм,
что характеризует нормальный уровень функциональной актив-
ности Т-лимфоцитов.
При активации лимфоцитов под влиянием митогенов или
антигенов они выделяют в среду клеточные медиаторы —
лимфокины, по выходу которых также можно оценивать
функциональную активность Т-лимфоцитов. Из них наиболее
изучен фактор, угнетающий миграцию макрофагов. Выявляют
этот фактор в тесте угнетения миграции макро-
фагов. Можно, например, поместить макрофаги (моноциты)
в лунки, вырезанные в слое агарозы. За 24 ч инкубации они
образуют вокруг лунки равномерную зону миграции. В при-
сутствии лимфокина миграция клеток резко заторможена и
зона миграции уменьшена.
Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов
по Манчини. Образцы исследуемых сывороток помещают в
лунки агарового геля, который содержит антитела против
IgM, IgG или IgA в известной концентрации. Диффундирующие
106
в агар иммуноглобулины образуют кольца преципитации с
антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от
содержания в сыворотке иммуноглобулинов соответствующего
класса. Уровень сывороточных иммуноглобулинов отражает
функциональное состояние В-системы иммунитета.
Постановка и оценка кожно-аллергической пробы. Для
выявления специфической сенсибилизации (при туберкулезе,
бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожные
аллергические пробы. Например, при постановке пробы Манту
туберкулиновым шприцем внутрикожно вводят раствор тубер-
кулина определенной концентрации. Реакцию учитывают через
24 и 48 ч, определяя степень ее выраженности. Гиперемию и
инфильтрат вокруг места введения оценивают следующим
образом: + размером до 5 мм,+4-до 1 см, +++больше 1 см,
а также наличие везикулы и лимфангита (рис. 50).
Тема 18. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ.
РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ
Программа занятия
1.	Изучение реакции агглютинации: механизм, роль отдельных ингредиен-
тов, диагностическое применение для определения титра специфических
антител в сыворотке крови больных и идентификации вида микроорганизма.
2.	Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РИГА) и реакция
торможения пассивной гемагглютинации (РТПГ А)..
3.	Метод выявления неполных антител (проба Кумбса).
Реакция агглютинации бактерий протекает в две фазы. Пер-
вая, специфическая, невидимая фаза реакции агглютинации
состоит во взаимодействии антител с антигенными детерминан-
тами, расположенными на поверхности бактерий и других кор-
пускулярных частиц. Вторая, видимая, фаза реакции, протека-
ющая лишь в присутствии электролита в среде, заключается
в склеивании и оседании на дно пробирки иммунных комп-
лексов в виде хлопьев или зерен, видимых невооруженным
глазом.
Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной
антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие
иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают R-фор-
мы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотони-
ческом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде
клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате
снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных
клеток в изоэлектрической зоне происходит склеивание —
наступает «кислотная» агглютинация.
107
В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний
реакцию агглютинации очень часто применяют как для иден-
тификации видов и сероваров бактерий с помощью диагности-
ческих агглютинирующих сывороток, так и для определения
присутствия антител в сыворотке больного по известным
антигенам (диагностикумам), т. е. для серодиагностики.
Количество агглютинирующих антител в иммунной сыворот-
ке оценивается их титром—наибольшим разведением сыворотки,
в котором еще наблюдается „выраженная (++) реакция агглю-
тинации со взвесью бактерий.
При различных инфекционных заболеваниях накопление
специфических антител в сыворотке идет с неодинаковой ско-
ростью и достигает разных величин. В связи с этим принято
говорить о диагностическом титре антител—той величине титра,
при которой можно с уверенностью поставить серологический
диагноз заболевания в определенный его период. При многих
инфекциях наиболее надежным диагностическим признаком
считается не наличие антител, а нарастание их титра в дина-
мике заболевания, которое выявляется путем постановки
серологических реакций с парными сыворотками, т. е. получен-
ными дважды от одного и того же больного.
Реакция агглютинации внешне проявлется по-разному в зави-
симости от величины клеток, наличия жгутиков у бактерий
и антител к ним.
При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами
применяют реакцию непрямой, или пассивной, гемаг-
глютинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют
на инертных монодисперсных частицах или клетках, например
на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие
нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием
иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену
(РПГА). Реакция отличается высокой чувствительностью и
позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации
антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обна-
ружения антигена в исследуемом материале эритроциты пред-
варительно нагружают специфическими антителами и также
ставят РПГА.
При помощи РПГА определяют полные (бивалентные)
антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) ан-
титела не выявляются этим методом, так как, соединяясь
с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации
частиц в крупные конгломераты. Для выявления неполных,
например антирезусных, антител в исследуемой сыворотке
используют специальную реакцию — пробу с антиглобу-
линовой сывороткой, которая получила название р е а к -
108
ции Кумбса'. Реакция проходит в два этапа; 1) связывание
эритроцитами (резус +) неполных антиэритроцитарных антител,
содержащихся в сыворотке крови; 2) агглютинация эритроцитов
при добавлении антиглобулиновой сыворотки в результате ее
взаимодействия с фиксированными на эритроцитах неполными
антителами — иммуноглобулинами,
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках для опре-
деления титра специфических антител в сыворотке, полученной от кролика
на предыдущем занятии.
2.	Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью
идентификации изучаемых бактерий. Объяснить отрицательные результаты
в контрольных пробирках, исходя из необходимого сочетания ингредиентов,
участвующих в реакции агглютинации.
3.	Отметить результаты РПГА: а) определить титр специфических антител
в сыворотке крови по результатам РПГА и б) присутствие специфического
антигена в исследуемом материале от больного по результатам РПГА. Объяс-
нить необходимость контролен в РПГА.
4.	Отметить результаты реакции Кумбса: определить титр неполных анти-
резусных антител в сыворотке беременной женщины. Объяснить, какие конт-
роля должны сопровождать реакцию Кумбса.
Методические указания
Получение иммунной сыворотки. Из уха или сердца кролика
на 7-й день после окончания иммунизации берут кровь, по-
мещают в термостат при 37°С на 10—15 мин. После сверты-
вания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки стеклян-
ной палочкой и выдерживают при 4°С в течение часа для
лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сыворот-
ки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой.
Титрование исследуемой сыворотки. Схема постановки реак-
ции агглютинации для определения титра антител приведена
в табл. 16. Сначала готовят основное разведение сыворотки,
которое в зависимости от титра может составлять 1; 50, 1:100
или 1:1000. Затем делают серию разведений сыворотки путем
последовательного переноса 1 мл из предыдущей пробирки в
следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл
разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового
объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят
1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую
пробирку с разведениями сыворотки и в контрольную про-
бирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси
бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки
1 Антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека получают
путем гипернммунизации кролика человеческой сывороткой.
109
Таблица 16 Титрование исследуемой сыворотки (форма протокола)
Результаты
встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем
сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции
агглютинации производят, оценивая последовательно каждую
пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхи-
вании.
Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими
знаками: 1-1 I I полная агглютинация — хлопья агглютината в
абсолютно прозрачной жидкости; I I I неполная агглютинация —
хлопья в слабоопалесцирующей жидкости; ++ частичная агглю-
тинация—хлопья различимы, жидкость слегка мутная; + слабая,
сомнительная агглютинация — жидкость очень мутная, хлопья
в ней плохо различимы; — отсутствие агглютинации — жидкость
равномерно мутная (рис. 51).
Реакцию учитывают как положительную при наличии отчет-
ливой агглютинации, выраженной не менее ++ в опытной
пробирке, и отсутствии агглютинации в обеих контрольных
пробирках. За титр сыворотки принимают последнее ее раз-
ведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается
не менее чем -Н-.
Реакция агглютинации на стекле (пластинчатая реакция
агглютинации). Ставится с одним разведением диагностической
агглютинирующей сыворотки, которое в зависимости от ее
титра составляет 1 :10, 1 :25,1:50 или 1 ; 100. Предметное
стекло делят восковым карандашом пополам. На одну поло-
вину наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия,
а на другую —каплю сыворотки. Затем петлей в каждую
каплю вносят небольшое количество бактериальной культуры
но
Рис. 51. Реакция агглютинации.
а — плохо выраженная; б — хорошо выраженная
и переметиают круговыми движения-
ми в каждой капле до получения равно-
мерной взвеси. Стекло можно слегка
подогреть, высоко держа над пламенем
горелки в течение 2—4 мин. Реакция
протекает быстро. Наблюдают за
появлением зерен агглютината в кап-
лях. Учет производят через 3—5 мин
(рис. 52).
РПГА. Реакцию используют либо
для выявления специфических антител
в сыворотке больного при серодиаг7
ностике, либо для идентификации
неизвестного возбудителя или инди-
кации его антигенов в исследуемом
патологическом материале. Соответственно используют стан-
дартные (коммерческие) эритроцитарные диагностикумы или
суспензионные антитела, полученные путем сенсибилизации
обработанных танином (танизированных) эритроцитов антите-
лами. В лунках пластмассовых пластин готовят последователь-
ные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагнос-
тический титр. Затем в каждую лунку вносят одинаковый
объем (0,05 мл) 3% суспензии нагруженных антигеном эритро-
цитов — соответствующего эритроцитарного диагностикума.
Через 2 ч инкубации при 37°С учитывают результат, оценивая
внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрица-
тельная реакция — осадок эритроцитов в виде компактного
диска или колечка с ровными краями на дне лунки, поло-
жительная реакция — характерный кружевной вид осадка
эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями (рис. 53).
Реакция Кумбса. Для выявления неполных антител, напри-
мер к резус-антигену эритроцитов в сыворотке беременной,
реакция ставится в два этапа: .1) к двукратным разведениям
испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие ре-
зус-антиген, и выдерживают при 376С в течение часа;
2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам
добавляют кроличью античеловеческую антиглобулиновую
сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем разведении).
После инкубации в течение 30 мин при 37°С результаты
оценивают по наличию гемагглютинации (положительная
реакция). Контроли ингредиентов реакции: 1) антиглобулино-
вая сыворотка + заведомо сенсибилизированные эритроциты;
ill
Рнс. 52. Реакция агглютинации на стекле.
а — наличие агглютинации; б — отсутствие агглютинации.
Рнс. 53. Реакция пассивной гемагглютинации (схема).
Эр — эритроциты; Аг — антиген; Ат — антитело.
2) нормальная сыворотка + эритроциты +антиглобулиновая
сыворотка; 3) исследуемая сыворотка + эритроциты (без ре-
зус-антигена) + антиглобулиновая сыворотка (рис. 54).
Тема 19. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ.
РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ И ЕЕ ВАРИАНТЫ.
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД
Программа занятий
1. Реакция преципитации; механизм, варианты постановки (кольцепреци-
питация, преципитация в геле, иммуноэлектрофорез) и их диагностическое
применение.
2. Иммунофлюоресцентный метод Кунса.
112
Рнс. 54. Реакция Кумбса (схема).
Реакция преципитации характеризуется осаждением специ-
фических мелкодисперсных антигенов эквивалентным ко-
личеством антител в присутствии электролита. Выпадение
нерастворимого комплекса антиген — антитело в виде осадка
наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингре-
диентов. Образовавшийся комплекс может раствориться в
избытке антигена или антител. Антиген должен иметь
характер прозрачного коллоидного раствора.
В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний
реакция преципитации служит главным образом для выявле-
ния или идентификации антигена (преципитиногена) по
известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела
(преципитины). Для приготовления коллоидных антигенов,
участвующих в реакции преципитации, используют различные
методы их экстракции из исследуемого материала: физи-
ческие, химические и биологические.
113
Рис. 55. Иммунофлюоресцентный метод Кунса (схема).
д —прямой метод; б—непрямой метод; ЛГ—антиген; Ат — антитело; АГС— антигло-
булиновая сыворотка.
Иммунофлюоресцентный метод. Обнаружение бактериальных
и вирусных антигенов в инфицированных материалах, тканях
животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих
антител (сывороток) получило широкое применение в диагности-
ческой практике. Иммунофлюоресцентный метод относится
к экспресс-диагностике, не уступая другим серологическим
реакциям по чувствительности и специфичности (рис. 55).
Рнс. 56. Иммунофлюоресцентный метод Кунса. Выявление вируса корн в
клетках инфицированной им тканевой культуры.
114
Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на
способности некоторых флюорохромов (например, изотиоциа-
ната флюоресцеина) вступать в химическую связь с сыворо-
точными белками, не нарушая их иммунологической специ-
фичности.
При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса
специфические флюоресцирующие антитела, связавшиеся с
микробными антигенами, образуют комплексы, которые
светятся при люминесцентной микроскопии препаратов
(рис. 56). Недостатком прямого метода Кунса является не-
обходимость приготовления широкого набора флюоресци-
рующих специфических сывороток против каждого изучаемого
антигена.
Непрямой метод предусматривает использование одной
универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулино-
вой, содержащей антитела только против кроличьих глобу-
линов. В связи с тем что диагностические антисыворотки
содержат кроличьи глобулины (так как их получают путем
иммунизации кроликов), они реагируют с флюоресцирующей
антиглобулиновой сывороткой в качестве антигена и вмес-
те с тем соединяются с гомологичным исследуемым анти-
геном (микроорганизмом) как антитела. При этом на
образовавшемся комплексе (специфические антитела+исследуе-
мый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобули-
новые антитела, вызывая его свечение при люминесцентной
микроскопии.
Демонстрация
1. Иммунофлюоресцентный метод Кунса.
2. Иммуноэлектрофореграммы.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Отметить результаты титрования сыворотки, проведенного на предыдущем
занятии, определить титр антител и объяснить отрицательные результаты
в контрольных пробах, исходя из необходимости сочетания ингредиентов,
участвующих в реакции агглютинации.
2.	Поставить реакцию кольцепреципитации для определения природы
антигена в исследуемом материале. Объяснить отрицательные результаты в
контрольных пробирках.
3.	Отметить результаты реакции преципитации в геле, поставленной с
целью определения токсигенностн дифтерийной палочки с помощью анти-
токсической сыворотки.
Методические указания
Реакция преципитации. Проводится с прозрачными коллоид-
ными растворимыми антигенами, экстрагированными из па-
тологического материала, объектов внешней среды и чистых
культур бактерий. Один из распространенных методов хими-
115
ческой экстракции антигенов бактерий — получение комплексно-
го антигена по Буавену с помощью гидролиза бактерий
трихлоруксусной кислотой. В реакции используются прозрач-
ные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими
титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки при-
нимают то наибольшее разведение антигена, которое при
взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образова-
ние видимого преципитата — помутнения.
Реакция кольцепреципитации. Ставится в узких пробирках
(диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-03 мл преципи-
тирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медлен-
но, по стенке, держа пробирку в наклонном положении,
наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторож-
но переводят в вертикальное положение. Результаты опыта
протоколируют (табл. 17).
Таблица 17 Реакции преципитации с буавеновскнм антигеном (форма
протокола)
Ингредиенты, мл	Ns пробирки			
	1	2	3	4
Тифозная антисыворотка Дизентерийная	» Нормальная сыворотка Изотонический раствор хлорида натрия Исследуемый антиген	ед од	од од	од од	III О О
Результаты				
Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае поло-
жительной реакции в первой пробирке на границе между
сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат
в виде белого кольца. В остальных (контрольных) пробирках
преципитат не образуется (рис. 57).
Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают
агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном
расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят
сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные
испытуемые антигены или один и тот же антиген в различ-
ных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах
оптимальных соотношений на месте встречи антигена и
антител образуются мутные полосы —дуги преципитации
(рис. 58).
116
Рис. 57. Реакция преципитации.
1 — преципитирующая сыворотка + исследуемый материал; 2 — преципитирующая сыво-
ротка + гомологичный преципитиноген; 3 — преципитирующая сыворотка + контрольный
экстракт без антигена; 4 — преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида
натрия; 5 — нормальная сыворотка + исследуемый антиген; б — нормальная сыворотка +
+ контрольный экстракт без антигена.
В случае постановки реакции преципитации с различными
разведениями антигена можно установить титр преципитиру-
клцей сыворотки — максимальное разведение антигена, которое
дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновид-
ностей реакции преципитации в геле позволяет определять
токсигенность исследуемых бактерий (например, дифтерийной
палочки) с помощью антитоксической сыворотки. Для этого
в чашку Петри на питательную среду помещают полоску
стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитокси-
ческой противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсу-
шивают в термостате и засевают испытуемыми культурами
в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги, на
расстоянии 0,6—0,8 см от ее края. В качестве контроля
используют заведомо токсигенную культуру. Чашки инкуби-
руют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной
культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином
образуются линии преципитации в виде дуг (рис. 59).
Иммуноэлектрофорез. Исследование проводится в два
этапа: 1) электрофоретическое разделение исследуемого ма-
териала в агаре; 2) иммунологический анализ. В агаре парал-
лельно оси миграции электрофоретических фракцйй вырезают
траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую
антитела к исследуемым антигенам. В случае реакции
между антигенами и диффундирующими в агар антителами
формируется преципитат в виде дискретных дуг, соответст-
117
Рнс. 58. Реакция преципитации в
геле по Оухтерлони.
вующих индивидуальным
системам антиген—антитело
(см. рис. 58).
Иммунофлюоресцентный
метод. На предметном
стекле готовят мазок из
испражнений больного ко-
лиэнтеритом, фиксируют
на пламени и обрабатывают
иммунной сывороткой, со-
держащей антитела к воз-
будителям колиэнтерита.
Для образования комплекса
антиген — антитело препа-
рат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37°С
в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изото-
ническим раствором хлорида натрия — удаляют несвязавшиеся
с антигеном антитела. Затем на препарат наносят флюорес-
цирующую антиглобулиновую сыворотку, выдерживают в
течение 15 мин при 37°С и препарат тщательно промывают
изотоническим раствором хлорида натрия. В результате свя-
зывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с
фиксированными на антигене специфическими антителами
образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые
обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.
Тема 20. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА.
РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
Для постановки реакции лизиса и реакции связывания
комплемента (РСК) используют комплемент, который содер-
жится в сыворотке крови морских свинок. Гемолитическая
активность комплемента термолабильна и полностью утрачи-
вается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при
56°С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген —
антитело его действие проявляется в реакции лизиса анти-
гена, если это клетки, или не сопровождается никакими ви-
димыми изменениями, если это мелкодисперсные или раство-
римые антигены. Для учета результатов данной реакции
РСК вводят вспомогательную (индикаторную) гемолитическую
систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изо-
тоническом растворе хлорида натрия и гемолитической
118
Рис. 59. Определение токсигенности
коринебактерий дифтерии в реакции
преципитации в агаре.
^сыворотки кролика, получен-
ной путем его иммунизации
упомянутыми эритроцитами.
Положительная РСК характе-
ризуется задержкой гемолиза
вследствие адсорбции ком-
племента системой антиген —
антитело (рис. 60). Отрицатель-
ная РСК характеризуется на-
личием гемолиза, поскольку
свободный комплемент связывается с системой эритроциты
барана —гемолитическая сыворотка кролика. РСК обпапяет
высокой чувствительностью И специфичностью, что позволяет
использовать ее для серодиагностики многих заболеваний,
а также для выявления антигенов в крови больного. Кроме
того, ее применяют для идентификации бактерий, вирусов
и других антигенов.
Для постановки РСК требуется точное определение коли-
чественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в
реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента,
гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана.
Поэтому постановке основного опыта предшествуют титрова-
ние гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разве-
дения, титрование комплемента и выбор его рабочей дозы,
титрование других ингредиентов.
Программа занятия
1. Реакция лизиса (гемолиза).
2. РСК; механизм, роль отдельных ингредиентов, техника постановки и
диагностическое применение.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Отметить результаты титрования комплемента и рассчитать рабочую
дозу для постановки РСК.
2.	Отметить результаты титрования гемолитической сыворотки и рассчитать
рабочее разведение для приготовления гемолитической системы.
3.	Поставить РСК (первую и вторую фазы) для определения присутствия
специфических антител в испытуемой сыворотке по известному антигену.
Объяснить результаты контрольных проб и необходимость их постановки,
исходя из механизма РСК.
119
система
исследуемая
+ сыворотка. +
Рт нет
Гемолиз
Рис. 60. Реакция связывания комплемента (схема).
Аг — антиген; А т — антитело; Эр — эритроциты; Гем. сыв. — гемолитическая сыворотка.
Методические указания
Приготовление и титрование ингредиентов для РСК.
Комплемент. Для определения титра и рабочей дозы про-
изводят титрование комплемента с помощью реакции им-
мунного гемолиза. Для этого свежую сыворотку морской
свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия
от 1:10 до 1:40 (табл. 18). К 0,2 мл каждого разведения
комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы
(смеси равных объемов 3% суспензии эритроцитов в г изото-
ническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворот-
ки в разведении, соответствующем ее тройному титру).
Пробирки выдерживают при 37°С и через 30 мин определя-
ют титр комплемента — наибольшее разведение компле-
мента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в при-
сутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу
комплемента рассчитывают, исходя из его титра. Рабочая
доза комплемента должна быть выше титра на 25%. Так,
например, при титре комплемента 1 : 20 в качестве рабочей
дозы берут его предыдущее разведение 1:15 (см. табл. 18).
120
Таблица 18. Титрование комплемента (форма протокола)
Ингредиенты, мл	ЬГо пробирки							
	1	2	3	4	5	6	7	8
Комплемент в разведе- нии 1:5	03	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1		
Изотонический раствор хлорида натрия	03	0,4	03	0,4	0,5	0,6	0,7	0,2
Избыток, который уда- ляется из пробирки	0,4	0,4	0,2	оз	0,4	0,5	0.6	—
Получаемые разведения комплемента	1:10	1:15	1:20	1:25	1:30	1:35	1:40	—
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Инкубация при 37°С в течение 30 мин
Результаты
Антигены изготовляются -производственными институ-
тами из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных
антигенов, гаптенов, экстрактов тканевых липидов.
Взвесь эритроцитов барана получают из дефибри-
нированной крови барана, отмывая эритроциты изотоническим
раствором хл'орида натрия до полной бесцветности и про-
зрачности надосадочной жидкости, и готовят из них 3 %
взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия.
Гемолитическая сыворотка, приготовленная путем
3—4-кратной внутривенной иммунизации кролика 50% взве-
сью бараньих эритроцитов, инактивирована при 56°С (разру-
шен комплемент) и на этикетке ампул имеет обозначенный
титр — максимальное разведение данной сыворотки, которое
обеспечивает полный лизис 3 % взвеси эритроцитов барана
в присутствии комплемента при 37°С в течение часа
(рис. 61). Для РСК в качестве рабочей дозы берут гемоли-
тическую сыворотку в тройном титре.
Постановка основного опыта. После установления титра и
рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК
(табл. 19). Испытуемую и контрольные сыворотки предва-
рительно инактивируют нагреванием при 56°С в течение
30 мин. Стандартная схема постановки РСК предусматривает
проведение первой фазы — соединение антигена, испытуемой
сыворотки и комплемента при 37°С в течение 30 мин. При
постановке РСК на холоду эту фазу проводят при 0—4°С
в течение 18—20 ч, что повышает чувствительность реакции.
121
Таблица 19. Основной опыт реакции связывания комплемента (форма
протокола)
Ингредиенты, мл
JNs пробирки
	1	2	3	4	5	6	7
Испытуемая сыворотка в разве- дении 1 :5	0,2			0,2			
Положительная сыворотка	—	0,2	—		—	—	—
Отрицательная	»	—	—	0,2	—	—		
Антиген	0,2	0,2	0,2	—	од	—	—
Изотонический раствор хлори- да натрия	—			—	0,2	0,2	0,4	0,6
Комплемент в рабочей дозе	0,2	0,2	0,2	0,2	ОД	0,2	
Инкубация на холоду при 0-4°С в течение 18—20 ч или при 37°С в течение 30 мин
Г емолитическая система
Инкубация при 37°С в течение 20—30 мин
Результаты
После добавления в каждую пробирку по 0,4 мл гемолити-
ческой системы пробирки встряхивают и выдерживают
20—30 мин при 37°С. Результаты опыта оценивают, отмечая
наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см.
табл. 19): реакцию считают положительной при полной за-
держке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и
эритроциты оседают на дно, отрицательной—при полном
лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена
(«лаковая кровь»). Степень задержки гемолиза оценивают в
зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины
осадка эритроцитов на дне (I I I I, +++, -Н-, +).
В качестве контроля (2-я и 3-я пробирки) учитывают реак-
цию с заведомо положительной и заведомо отрицательной
сыворотками; 4-я и 5-я пробирки служат для проверки анти-
комплементарных свойств сыворотки и антигена; в 6-й и 7-й
пробирках контролируется качество комплемента и гемолити-
ческой системы.
Тема 21. ВАКЦИНЫ И ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ
Программа занятия
1, Способы приготовления вакцин.
2. Получение диагностических и лечебно-профилактических сывороток.
Вакцинами называются препараты, предназначенные для
создания искусственного активного иммунитета. Некоторые
вакцины применяют для лечения инфекционных заболеваний.
Вакцины делят на живые и убитые, корпускулярные и хи-
мические. К вакцинным препаратам относятся также анаток-
сины.
Живые' вакцины готовят из микроорганизмов, обладающих
стойко сниженной вирулентностью, но сохранивших иммуноген-
ные свойства. Убитые (температурой или действием химических
веществ) корпускулярные вакцины содержат инактивированные
микроорганизмы. Химические вакцины готовят из антигенов,
экстрагированных из бактериальных клеток химическими мето-
дами. Анатоксины готовят из экзотоксинов, обезвреженных
формалином.
Вакцины выпускают в жидком и сухом виде. Сухие вакцины
состоят из микроорганизмов, высушенных методом лиофили-
зации.
Все вакцинные препараты подлежат государственному контро-
лю для установления их безвредности, иммуногенности и сте-
рильности (для убитых вакцин). Признаками негодности вакцин
являются наличие посторонних частиц и хлопьев, изменение
физических свойств и цвета, повреждение ампулы и др.
Иммунные сыворотки делятся на лечебно-профилактические
и диагностические. Лечебно-профилактические сыворотки и
иммуноглобулины получают из крови гипериммунизированных
лошадей или крови иммунизированных или переболевших
людей.
Диагностические сыворотки получают путем иммуни-
зации кроликов. Эти сыворотки подразделяются на агглюти-
нирующие, преципитирующие и гемолитические; применяются
для постановки серологических реакций с целью идентифи-
кации микроорганизмов.
Демонстрация
1. Различные виды вакцин, анатоксинов, иммуноглобулинов и иммунных
сывороток. Адъюванты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Приготовить стафилококковую аутовакцину.
2. Определить силу антитоксической сыворотки по известному токсину с
помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином (реакция флоккуляции).
123
122
Таблица 20. Реакция флоккуляции (форма протокола)
Ингредиенты, мл	№ пробирки						
	1	2	3	4	5	6	7
Токсин, содержащий 20 Lf в 1 мл	2.0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0
Исследуемая сыворотка	0,2	03	0,4	0,5	0,6	—	0,6
Инкубация при 45°С в течение 30 мин
Результаты по «инициальной» флоккуляции						
Этапы приготовления стафилококковой ауто-
вакцины. Убитую аутовакцину приготовляют из штамма
возбудителя, выделенного непосредственно от больного
1.	Посев стафилококка в пробирку со скошенным питатель-
ным агаром.
2.	Проверка чистоты выросшей культуры (микроскопия
мазка).
3.	Получение маточной взвеси микробных клеток путем
смыва культуры 5 мл изотонического раствора хлорида натрия.
4.	Прогревание бактериальной взвеси на водяной бане при
70—80°С в течение часа.
5.	Контроль на стерильность (высев из прогретой «взвеси
на питательные среды).
6.	Стандартизация вакцины по оптическому стандарту: 1 мл
прогретой микробной взвеси разводят определенным количе-
ством стерильного изотонического раствора хлорида натрия,
сравнивая ее мутность с мутностью оптического стандарта
(1 млрд/мл); остальной объем взвеси бактерий разводят,
добавляя соответствующее количество изотонического раствора
хлорида натрия.
Реакция флоккуляции. В результате взаимодействия
токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпа-
дают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя
(«инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген
и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.
124
Реакцию ставят в два этапа. 1. По стандартной сыворотке
устанавливают количество Lf (Limes flocculationis) в 1 мл
токсина. Lf токсина определяется его количеством, которое
дает «инициальную» флоккуляцию с международной единицей
(ME) сыворотки. Установив силу токсина, приступают к опре-
делению силы сыворотки.
2. Известной силы токсин и испытуемую антитоксическую
сыворотку разливают в пробирки в определенном объеме,
как показано в табл. 20. Пробирки выдерживают в водяной
бане при 45°С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в
одной из них. «Инициальная» флоккуляция проявляется в той
пробирке, где количество токсина соответствует количеству
международных единиц сыворотки. Например, если флоккуля-
ция произошла в 3-й пробирке, значит в 0,4 мл сыворотки
находится 40 ME. Следовательно, 1 мл сыворотки содержит
40:0,4 = 100 ME.
ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА ВАЖНЕЙШИХ ИНФЕКЦИОННЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ И КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
В данном разделе изложена лабораторная диагностика бак-
териальных, грибковых и вирусных инфекций1, которая про-
водится для установления этиологической и патогенетической
роли выделенных из организма больных микробов, опреде-
ления иммунологических сдвигов и аллергических состояний,
выбора эффективных химиотерапевтических и иммунологиче-
ских препаратов. Особое значение при этом имеет диагностика
заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями и
грибами рода Candida, развитие которых связано с резким
снижением иммунологической реактивности организма, интен-
сивной антибиотикотерапией и другими причинами. Подобные
инфекции нередко возникают у больных, госпитализированных
в хирургические, терапевтические, детские и другие отделения,
а также среди новорожденных в акушерских клиниках. В этих
случаях инфекции называют внутрибольничными, или госпиталь-
ными, а раздел микробиологии, изучающий условно-патоген-
ные и некоторые патогенные бактерии — возбудители госпи-
тальных и других форм инфекций, — клинической микробио-
логией.
С целью приближения проводимых студентами диагности-
ческих микробиологических исследований к практической
деятельности лечащего врача и решения частных вопросов
клинической микробиологии рассматриваемые микроорганизмы
сгруппированы с учетом патогенетических и эпидемиологи-
ческих признаков вызываемых ими заболеваний и подразделены
на возбудителей раневых, гнойных, воздушно-капельных,
кишечных, зоонозных, кровяных, трансмиссивных и венери-
ческих инфекций. Это дает возможность обосновать выбор
материала и направление микробиологического исследования,
1 Лабораторная диагностика протозойных инфекций изложена в учебнике
В. Д. Тимакова, В. С. Левашева и Л. Б. Борисова «Микробиология» (М., 1983).
126
исходя из предварительного клинического диагноза болезни.
Полученные лабораторные данные необходимы лечащему вра-
чу для постановки окончательного диагноза заболевания и наз-
начения рациональной антибиотике- и иммунотерапии. Врач-
эпвдемиолог использует результаты микробиологических и
иммунологических исследований для проведения эпидемиологи-
ческого анализа заболеваемости с целью установления источ-
ника инфекции, путей ее передачи, выявления микробоносителей
и других целей.
Материал для исследования
Выбор материала определяется прежде всего предваритель-
ным клиническим диагнозом заболевания и его стадией, что
решает лечащий врач. В зависимости от стадии болезни микро-
организмы могут находиться в зеве, носоглотке, лимфатических
узлах, крови, кишечнике и выделяться в окружающую среду
с мокротой, фекалиями, мочой. Так, например, при брюшном
тифе и паратифах бактерии в начале болезни содержатся в
крови, а затем выделяются с испражнениями и мочой; при
полиомиелите вирус в первой стадии болезни выделяется
с испражнениями, а затем в течение короткого срока обнару-
живается в крови; при сепсисе микроорганизмы всегда находятся
в крови; при респираторных инфекциях бактерии и вирусы,
как правило, выделяются с мокротой, а при кишечных — с испраж-
нениями.
Существенное значение для оценки полученных лаборатор-
ных данных имеет характер исследуемого материала. Так,
например, выделение микроорганизмов из стерильных (у здоро-
вых людей) жидкостей (кровь, перитонеальная, плевральная,
спинномозговая жидкость, моча, взятая катетером из мочевого
пузыря) свидетельствует об инфекционном заболевании. В то
же время выделение микроорганизмов из испражнений, мокроты,
со слизистой оболочки зева, из мочеполовых путей, с поверхнос-
ти кожных и слизистых покровов требует их обязательной диф-
ференциации от нормальной микрофлоры соответствующих
полостей и органов. При этом сами представители нормальной
микрофлоры, являющиеся условно-патогенными, могут явиться
возбудителями болезней.
При взятии исследуемого материала от больных людей
или бактерионосителей требуется соблюдение определенных
правил.
1.	Материал следует брать до применения антибиотиков или
других химиотерапевтических препаратов.
2.	Материал нужно брать в достаточном количестве, соблю-
127
дая правила асептики, чтобы не загрязнить его микроорга-
низмами окружающей среды. Взятие стерильного материала
(кровь и др.) производят так, чтобы не загрязнить его микро-
организмами-представителями нормальной микрофлоры орга-
низма человека.
При гнойно-воспалительных процессах гной собирают из глубины раны;
при респираторных заболеваниях берут гнойные комочки мокроты или собирают
промывные воды бронхов, или исследуют кусочки ткани, взятые при биопсии;
при болезнях мочевыводящих путей собирают среднюю порцию мойи или
берут мочу из мочевого пузыря катетером; при кишечных инфекциях собирают
кал в стерильные банки, а также берут промывные воды желудка и желчь,
которую получают при зондировании; при венерических заболеваниях материал
берут из уретры или половых органов после обмывания их водой с мылом
у мужчин и спринцевания (без применения антисептиков) у женщин; материал
из зева и носоглотки берут специальными тампонами, которые помещают в
стерильную пробирку, или производят посев у постели больного. Посев сте-
рильного материала (кровь и другие не содержащие микробов жидкости у
здоровых лиц) также лучше делать у постели больного. Для серодиагности-
ческого исследования берут кровь из пальца или вены, из которой в лабора-
тории получают сыворотку.
3,	Исследуемый материал в возможно короткие сроки следует
доставить в бактериологическую, микологическую, вирусологи-
ческую или серологическую лабораторию. Его доставка должна
производиться в лабораторной посуде или специальных кон-
тейнерах при сохранении первоначальной температуры мате-
риала, или при охлаждении, замораживании сухим льдом (в
зависимости от характера материала). Любой метариал, направ-
ляемый в лабораторию, должен сопровождаться соответству-
ющим направлением, в котором указываются фамилия, имя
и отчество больного, вид материала и дата его взятия,
предварительный клинический диагноз заболевания.
Направления и методы исследования
Выбор направления исследования зависит от предваритель-
ного клинического диагноза заболевания, основанного на пред-
положении лечащего врача о возможной природе болезни —
бактериальной, микозной или вирусной. В зависимости от этого
применяют соответствующие методы исследования. Все методы
клинической микробиологии и иммунологии можно разделить
на четыре группы: 1) микроскопические (бактериоскопические,
вирусоскопические); 2) микробиологические (бактериологичес-
кие, микологические, вирусологические); 3) биологические, или
биопробы; 4) иммунологические (серодиагностика, кожно-аллер-
гические пробы, тесты для оценки иммунологического состояния
организма). Перечисленные методы отличаются друг от друга
трудоемкостью, сроками проведения исследований, чувствитель-
128
ностью и специфичностью, а также информативностью получен-
ных данных.
Микроскопический метод. Применяется главным образом
для обнаружения бактерий и грибов в патологическом материале.
Вирусоскопическое исследование проводится редко и с ограни-
ченными целями, в частности для обнаружения элементарных
вирусных частиц и их включений: телец Бабеша—Негри при
бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе, риноцитоско-
пическое исследование при гриппе.
Основным недостатком микроскопического метода является
сложность идентификации обнаруженных микробов, а в некото-
рых случаях невозможность их дифференциации (например,
кишечной палочки от сальмонелл или шигелл). При некоторых
бактериальных инфекциях и микозах диагностическая ценность
микроскопического исследования весьма велика и является
основанием для постановки окончательного диагноза заболе-
вания, например лептоспироза, возвратного тифа, первичного
сифилиса, гонореи, дерматомикозов, кандидозов, глубоких
микозов. Преимущество микроскопического исследования
состоит в том, что для его проведения требуется всего не
более 30-60 мин.
Достоверность микроскопического метода значительно по-
вышается при проведении иммунофлюоресцентного исследо-
вания, которое придает ему специфичность. В настоящее время
иммунофлюоресцентный метод (ИФМ) широко применяется
для обнаружения разнообразных микроорганизмов в патологи-
ческом материале.
Микробиологические (бактериологический, микологический,
вирусологический) методы. Основаны на выделении чистой
культуры возбудителя и ее последующей идентификации на
основании морфологических, культуральных, биохимических,
антигенных (серологических) и других признаков. Микробиоло-
гическая диагностика осложняется в случае выделения не одной,
а двух и более культур патогенных или условно-патогенных
бактерий. Располагая чистой культурой бактерий, можно опре-
делить ее патогенные признаки в опытах на животных или
in vitro, а также чувствительность к антибиотикам.
Микологические исследования осуществляются реже, чем
бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика
микозов достаточно надежна. Микологические исследования
проводят при диагностике кандидозов путем определения
нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода
Candida, а также глубоких микозов.
Вирусологический метод является наиболее достоверным в
диагностике вирусных инфекций. Однако его трудоемкость,
6-639
129
связанная с приготовлением клеточных культур, обработкой
исследуемого материала, а также со сравнительно частым
получением отрицательных результатов, органичивает примене-
ние данного метода. Кроме того, он требует затраты срав-
нительно большого времени, особенно при проведении «сле-
пых» пассажей. Во многих случаях вирусологический метод
используют для ретроспективной диагностики вирусных ин-
фекций.
Все микробиологические исследования наиболее информатив-
ны и достоверны, особенно если они подтверждены допол-
нительными серологическими данными (выявление антител к
выделенному возбудителю или возбудителям).
Для эпидемиологического анализа вспышек бактериальных
инфекций проводят типирование культур, выделенных от раз-
ных больных и из других источников (вода, пищевые продукты
и т. д.) с целью установления их биовара, серовара, фаговара
на основании изучения биохимических, антигенных особен-
ностей или чувствительности к фагам соответственно.
Кроме того, микробиологические исследования проводят
для выявления бактерионосителей среди детей и взрослых,
в том числе работников медицинских и пищевых учреж-
дений.
Биопробы. Основаны на неодинаковой чувствительности
разных лабораторных животных к определенным микроорганиз-
мам. Данный метод заключается в заражении животных опре-
деленного вида, возраста и массы тела чистыми культурами
микробов или исследуемым материалом. В первом случае
биопробы используются для дифференциации патогенных
микроорганизмов, одни из которых вызывают заболевание или
гибель этих животных, другие не оказывают подобного дейст-
вия. Во втором случае биопробы применяют для выделения
чистой культуры возбудителя из патологического материала,
загрязненного посторонними микроорганизмами, в результате
чего посевы данного материала на питательные среды не
дают положительного результата. Кроме того, биопробы при-
меняются для изучения вирулентности выделенной чистой
культуры.
Иммунологические методы. Включают серодиагностику,
кожно-аллергические пробы, методы оценки клеточного (Т-
системы) и гуморального (В-системы) иммунитета.
Серодиагностика основана на обнаружении специфи-
ческих антител в сыворотке крови больного человека и опре-
делении накопления их в процессе заболевания. В последнем
случае сроки исследования значительно удлиняются и ответ
может быть получен из серологической лаборатории в период
130
реконвалесценции, что придает данному методу ретроспектив-
ный характер.
Особое значение серологическое исследование имеет в
лабораторной диагностике вирусных заболеваний в связи с
серьезными трудностями, возникающими при выделении многих
вирусов из организма человека и их последующей идентифи-
кации. Серологические исследования часто проводятся и для
эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости.
С этой целью определяется наличие специфических антител
у здоровых лиц, что свидетельствует о перенесении ими соот-
ветствующей инфекции или во всяком случае о контакте с ее
возбудителем.
Кожно-аллергические пробы применяются для
выявления гиперчувствительности к различного рода антигенам
(аллергенам) при диагностике ряда инфекционных заболеваний
(туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.), а также атопий и других
неинфекционных аллергических состояний.
Методы оценки иммунологического состоя-
ния организма человека включают ряд тестов, по
которым судят о количестве и функциональной активности
Т- и В-лимфоцитов.
После изучения частной и клинической микробиологии и им-
мунологии студенты должны уметь использовать приобретенные
знания для оценки роли микроорганизмов в этиологии и патоге-
незе бактериальных, грибковых и вирусных заболеваний, а также
четко представлять себе информативность микробиологических
и иммунологических методов лабораторного анализа в соответст-
вии с этапами течения болезни.
ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ
ИНФЕКЦИИ
В настоящее время раневая и нераневая гнойная инфекция
часто встречается в хирургической, акушерско-гинекологичес-
кой, терапевтической, педиатрической и других клиниках.
Нередко она носит характер внутрибольничной (госпитальной)
инфекции. Возбудителями раневой и гнойной инфекции явля-
ются различные бактерии, которые относятся к разным поряд-
кам, семействам, родам и видам. Среди них —аэробные и
анаэробные формы, грамположительные и грамотрицательные
палочки и кокки (табл. 21).
Несмотря на разное систематическое положение, перечислен-
ные в табл. 21 бактерии обладают общей патогенетической
особенностью — способностью вызывать гнойно-воспалитель-
б*	131
Таблица 21. Возбудителе раневой инфекции и гнойно-воспалительных про-
цессов	_______________
Аэробные бактерии	Анаэробные бактерии
Staph, aureus и другие виды Str. pyogenes Str. faecalis Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) E. coli	Cl. perfringens Cl. oedematiens и другие возбудители ра- невой анаэробной инфекции (газовой гангрены) Clostridium tetani — возбудитель столб- няка Peptococcus sp. Peptostreptococcus sp. Bacteroides sp. Veillonella sp.
ные процессы. Они поражают различные органы респиратор-
ного, кишечного, мочеполового трактов, кожные покровы,
вызывают сепсис. Некоторые из них являются возбудителями
не только гнойных инфекций, но и таких нозологических форм
заболеваний, которые не сопровождаются выраженным гнойно-
воспалительным процессом.. Например, стрептококки вызывают
скарлатину, катаральную ангину, гломерулонефрит, рожистое
воспаление наряду с типичными гнойными инфекциями
стрёптодермиями, флегмонами.
Стафилококки, стрептококки, протей, кишечная палочка и
анаэробные бактерии нередко вызывают смешанную инфекцию
в разнообразных сочетаниях как между собой, так и с другими
микроорганизмами — вирусами, грибами.
При локальных поражениях материалом для исследования
служит гной или другое отделяемое, а при генерализованных
формах инфекции (сепсис, септикопиемия) — кровь, стерильно
взятая для посева из вены. Вследствие того что возбудители
раневой и гнойной инфекции являются как аэробными,- так
и анаэробными бактериями, их выделение из исследуемого
материала требует применения разных методов. Аэробные бак-
терии (стафилококки, стрептококки, псевдомонас, протей и
эшерихии) выделяют в обычных условиях, используя для
посевов соответствующие питательные среды. Анаэробные
бактерии (бактероиды, пептококки и вейллонеллы) выделяют
в строго анаэробных условиях, соблюдая определенные правила
взятия материала, посевов на питательные среды и их инку-
бирования в анаэробных условиях.
Тема 22. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ СТАФИЛОКОККАМИ
И СТРЕПТОКОККАМИ
Гнойную инфекцию чаще всего вызывают стафилококки
(сем. Micrococcaceae), которые относятся к виду Staph, aureus,
реже к видам Staph, epidermidis и Staph, saprophyticus, стрепто-
кокки (сем. Streptococcaceae) — Str. pyogenes, Str. faecalis, реже
Str. pneumoniae. Кроме того, при стоматологических заболева-
ниях встречаются Str. sanguis, Str. mutans, Str. mitis и др.
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики стафилококковых и
стрептококковых инфекций.
2.	Бактериоскопическая и бактериологическая диагностика заболеваний,
вызванных стафилококками и стрептококками.
3.	Выявление источников заражения при внутрибольничной стафилокок-
ковой инфекции.
4.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Демонстрация
1.	Мазки из чистых культур стафилококков и стрептококков.
2.	Стафилококки и стрептококки в мазках из гноя.
3.	Рост а- и р-гемолитических стрептококков на кровяном агаре.
4.	Определение серогруппы стрептококка в реакции преципитации с сыворот-
ками А, В, С, D.
5.	Этапы бактериологического исследования при сепсисе.
6.	Антистрептоли шновая реакция с О-стрептолизином.
7.	Международный набор стафилококковых фагов, стафилококковая ауто-
вакцина, стафилококковый анатоксин, токсин Дика, преципитирующие стреп-
тококковые сыворотки, сухой О-стрептолизин. Антибиотики. Лечебные стафило-
фаги и стрептофаги.
Задание для выполнения лабораторной работы
Занятие 1-е
Микробиологическое исследование гноя при подозрении на стафилокок-
ковую или стрептококковую инфекцию. Материал — гной из раны (раневое
отделяемое). Микробиологическое исследование для выявления источника
стафилококковой внутрибольничной инфекции. Материал — мазки, взятые там-
поном из зева и со слизистой оболочки носа людей (обслуживающий пер-
сонал больничного отделения), обследуемых на носительство стафилококка.
1. Бактериоскопическое исследование: приготовить, окрасить по Граму
и микроскопировать мазки из гноя и зева. Сделать заключение и наметить
план дальнейшего анализа.
2. Бактериологическое исследование: учесть результаты готовых посевов
гноя и мазков из зева на чашки с кровяным агаром: а) описать колонии и
отметить наличие гемолиза; б) приготовить, окрасить по Граму и микроскопи-
ровать мазки из колоний; в) пересеять колонию, в мазке из которой видны
стафилококки, в пробирку со скошенным питательным агаром для получения
133
132
чистой культуры стафилококка и другую, содержащую цепочки кокков, коло-
нию — на скошенный кровяной агар и сахарный бульон для получения чистой
культуры пиогенного стрептококка.
Занятие 2-е
1.	Продолжение бактериологического исследования гноя и мазков из зева
и носа бактерионосителей: а) отметить характер роста культур в пробирке с
питательным агаром, в частности наличие золотистого пигмента. Сделать мазок,
окрасить по Граму и микроскопировать; б) отметить характер роста культур
в пробирке с кровяным агаром (наличие гемолиза) и в пробирке с сахарным
бульоном (помутнение, осадок). Сделать мазок, окрасить по Граму и микро-
скопировать.
2.	В случар выделения золотистого стафилококка: а) определить его способ-
ность продуцировать плазмокоагулазу; б) установить фаготипы стафилококков,
выделенных из разных источников — больных и бактерионосителей по готовым
пробам или полученным от преподавателя данным.
3.	Отметить по готовым посевам чувствительность выделенных стафилокок-
ков к антибиотикам. Сделать окончательное заключение на основании анализа
собственных, демонстрационных и полученных из лаборатории данных о видах
выделенных культур стафилококка и стрептококка и об их патогенных свойст-
вах. Определить источник госпитальной инфекции на основании фаготипо!
выделенных от больных и носителей стафилококков.
Методические указания
Материал для исследования: гной, экссудат, раневое отде-
ляемое, перевязочный материал, слизь из носоглотки, мазки из
зева; при подозрении на сепсис — кровь.
Микробиологическая диагностика стафилококковых
инфекций
Бактериоскопическое исследование (схема 2). Из иссле-
дуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для
первичной бактериоскопии, окрашивают по Граму и микроско-
пируют. Наличие в препаратах грамположительных кокков,
располагающихся в виде скоплений, напоминающих виноград-
ные гроздья (рис. 62), позволяет поставить предварительный
диагноз стафилококковой инфекции.
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
засевают петлей на чашки с кровяным агаром и ЖСА для
получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при
37°С. На следующий день исследуют выросшие колонии на
обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутст-
вие гемолиза (рис. 63). На ЖСА Staph, aureus образуют золо-
тистые круглые выпуклые непрозрачные колонии. Вокруг
колоний стафилококков, обладающих лецитиназной актив-
ностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттен-
ком. Для окончательного установления вида стафилококка
2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питатель-
ным агаром для получения чистых культур. На следующий
134
Схема 2. Микробиологическое исследование при стафилококковых инфекциях
Определение чувствительности к антибиотикам
135
Таблица 22. Дифференциальные признаки стафилококков
Признак	Вид		
	Staph, aureus	Staph, epidcr- midis	Staph, sapro- phyticus
Образование: плазмокоагулазы	+				
лецитиназы	+	—	—
Ферментация: глюкозы	+	+	—
маннита в анаэробных условиях	+	—	+
Образование а-токсина	+	—	—
Чувствительность к новобиоцину	s	s	R
Условные обозначения. + наличие признака; — отсутствие признака;
S — чувствительный; R — резистентный.
день делают посевы с целью определения их дифференциаль-
ных признаков (табл. 22).
Постановка реакции на плазмокоагулазу.
Разведенную в 2 раза плазму крови разливают по 0,4 мл в
пробирки, в которые вносят одну петлю исследуемых чистых
культур стафилококка, и помещают в термостат при 37°С.
Через 2, 4 и 24 ч отмечают результаты опыта. При наличии
плазмокоагулазы образуется сгусток.
В некоторых случаях наряду с плазмокоагулазой и лецито-
вителлазой определяют другие ферменты — фибринолизин,
гиалуронидазу и ставят дермонекротическую пробу на кролике.
"Для этого на боку кролика выщипывают шерсть и внутрикожно
вводят 0,2 мл взвеси исследуемой культуры, содержащей
2 млрд/мл клеток по оптическому стандарту? Положительный
результат оценивают по появлению в месте инъекции инфильт-
рата, а затем (через 24—48 ч) некроза.
При подозрении на сепсис делают посевы крови больного.
Из локтевой вены берут шприцем 5—10 мл крови и вносят
в колбу с 50—100 мл сахарного бульона. Посевы инкубируют
при 37°С в течение нескольких суток, периодически делая
мазки для бактериоскопии и пересевы на кровяной агар в
чашки Петри. При положительном результате выделяют чистую
культуру стафилококка, которую идентифицируют по описанным
выше признакам.
Для установления источника госпитальной инфекции выде-
ляют чистые кульуры стафилококка от больных и бактерионо-
сителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью
набора типовых стафилофагов, устанавливая идентичность
фаготипов. Фаги разводят до титра, указанного на этикетке.
136
Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар
в чашку Петри газоном, подсушивают, а затем петлей наносят
по капле каждого фага на 22 квадрата (по числу фагов, вхо-
дящих в набор), предварительно намеченных карандашом на
дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37°С. Результаты
оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры
в квадратах (см. рис. 38). Определение чувствительночти стафило-
кокка к антибиотикам описано в теме 12.
Микробиологическая диагностика стрептококковых
инфекций
Бактериоскопическое исследование (схема 3). Мазки для
первичной бактериоскопии готовят из патологического мате-
риала, окрашивают по Граму и микроскопируют. При поло-
жительном результате обнаруживают грамположительные
кокки, располагающиеся в виде цепочек (см. рис. 62).
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
засевают на кровяной агар в чашку Петри. После инкубации
при 37°С в течение 24 ч изучают характер колоний и наличие
вокруг них зон гемолиза. Из части материала, взятого из коло-
ний, готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Для получения чистой культуры 2—3 подозрительные колонии
пересевают в пробирки со скошенным кровяным агаром и са-
харным бульоном.
На кровяном агаре Str. pyogenes образуют мелкие, величиной
с булавочную головку, мутноватые круглые колонии. В бульоне
Таблица 23. Дифференциальные признаки стрептококков
личие признака у одних штаммов и отсутствие его у других штаммов данного вида.
* Обитатели ротовой полости.
137
§
to
S
о
•а
□г
S
Е
с
ПЗ
S
о
X
О
р

Примечание. Бактериологическое исследование крови при сепсисе описано в тексте.
138
{
стрептококк в отличие от стафилококка дает придонно-присте-
ночный рост в виде хлопьев или зерен, оставляя всю среду
прозрачной.
По характеру гемолиза на кровяном агаре стрептококки делят
на три группы: 1) негемолитические; 2) а -гемолитические, или
зеленящие, образующие зеленоватую зону частичного гемолиза;
3) Р-гемолитические, образующие вокруг колонии полностью
прозрачную зону гемолиза.
Заключительным этапом бактериологического исследования
является идентификация выделенной культуры по антигенным
свойствам (табл. 23). По данному признаку все стрептококки
делят на серологические группы (А, В, С, D и т. д.). Серо-
группу стрептококков определяют в реакции преципитации с
полисахаридным приципитиногеном С, выделенным из иссле-
дуемой культуры, и сыворотками (обычно четырех наиболее
распространенных серогрупп; А, В, С и D). Большинство
патогенных для человека р-гемолитических стрептококков от-
носится к серологической группе А. По содержанию типоспе-
цифических антигенов протеиновой природы Р-гемолитические
стрептококки подразделяются на серовары, из которых 47 отно-
сятся к группе А. Серовар стрептококков определяют в реакции
агглютинации. Развернутое серологическое исследование и
типирование стрептококков проводят главным образом при
эпидемиологическом обследовании. Выделенную культуру
стрептококка проверяют на чувствительность к антибиотикам
методом дисков (см. рис. 46).
При подозрении на сепсис делают посевы крови больного
(см. с. 136). Инкубируют посевы длительный срок (до 3 нед).
Серодиагностика. При отдельных нозологических формах
^стрептококковой инфекции с помощью РСК или реакции
преципитации устанавливают наличие специфических антиге-
нов в крови больного. Антитела к О-стрептолизину определяют
главным образом для подтверждения диагноза ревматизма.
Реакция основана на нейтрализации способности О-стрептоли-
зина растворять эритроциты в случае наличия в крови больного
соответствующих антител. Реакцию ставят со стандартным
сухим О-стрептолизином.
Реакция Дика. Применяется для определения антитоксичес-
кого иммунитета против эритрогенного токсина скарлатинозного
стрептококка. Токсин Дика вводят внутрикожно в область
предплечья и через 24 ч учитывают результат, отмечая местную
воспалительную реакцию. Положительная реакция Дика свиде-
тельствует об отсутствии антитоксического иммунитета против
скарлатины; отрицательная указывает на наличие иммунитета,
так как введенный токсин нейтрализуется антитоксином, име-
ющимся в организме.
139
Диагностические, профилактические, и лечебные
препараты
Стафилококковый анатоксин (очищенный и адсорбированный).
Получается из нативного анатоксина путем его осаждения
трихлоруксусной кислотой с дополнительной очисткой эти-
ловым спиртом и адсорбцией на гидрате окиси алюминия.
Обладает высокими иммуногенными свойствами. Приме-
няется для активной иммунизации с целью профилактики
стафилококковых инфекций (у контингентов повышенного
риска — беременных и новорожденных, лиц, работающих на
соответствующих предприятиях) и для лечения стафилокок-
ковых заболеваний.
Стафилококковая вакцияа. Взвесь коагулазоположительных
золотистых стафилококков, инактивированных нагреванием.
Применяется для активной иммунизации с целью лечения
длительно, вяло текущих стафилококковых заболеваний. Чаще
используют аутовакцину.
Стафилококковый антифагин. Экстракт из культур патоген-
ных стафилококков, прогретых при 100°С и профильтрованных
через бактериальный фильтр. Содержит термостабильные
стафилококковые антигены. Применяется для специфической
иммунотерапии стафилококковых заболеваний.
Иммуноглобулин человеческий противостафилококковый.
Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержащая
стафилококковый антитоксин. Готовят из крови людей, содер-
жащих высокие титры антител, или доноров, иммунизированных
стафилококковым адсорбированным анатоксином. Применяется
для специфического лечения стафилококковых заболеваний.
Стафилококковый бактериофаг (жидкий). Фильтрат фаго-
лизата стафилококка. Применяется наружно, внутрикожно и
внутримышечно для лечения стафилококковых заболеваний.
Диагностические стафилококковые фаги. Набор типоспеци-
фических фагов для фаготипирования стафилококков.
Токсин Дика. Очищенный эритрогенный токсин пиогенного
стрептококка. Активность препарата измеряется в кожных
дозах. Применяется для постановки внутрикожной пробы
Дика с целью определения наличия антитоксического имму-
нитета у детей.
Стрептококковый бактериофаг (жидкий). Фильтрат фаго-
лизата стрептококка. Применяется наружно, внутрикожно
и внутримышечно для лечения стрептококковых заболева-
ний.
О-стрептолизин (сухой). Лиофильно высушенный фильтрат
бульонной культуры стрептококка — активного продуцента
140
О-стрептолизина. Применяется для постановки серологических
реакций — определения анти-О-стрептолизина в сыворотках
больных стрептокковыми инфекциями (чаще ревматизмом).
Тема 23. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ
АЭРОБНЫМИ И АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Гнойные инфекции могут быть вызваны как аэробными,
так и анаэробными бактериями (см. табл. 21) в разнообразных
сочетаниях. Наряду с гнойной инфекцией в хирургии различают
гнилостную инфекцию, при которой встречаются ассоциации
аэробных и анаэробных бактерий. В них чаще других обна-
руживаются протей, синегнойная палочка и анаэробные клост-
ридии. При гнилостной инфекции происходит распад тканей
с выделением зловонного гноя, геморрагического экссудата.
Это приводит к интоксикации организма бактериальными
токсинами и продуктами распада тканей. При поступлении
в кровь большого количества эндотоксина грамотрицательных
бактерий может наступить септический шок.
Основное значение в лабораторной диагностике раневой
инфекции имеет бактериологическое исследование — выделение
чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Бактериоско-
пический метод имеет ориентировочное значение, так как в
окрашенных мазках невозможно идентифицировать бактерии,
присутствующие в патологическом материале, и тем более
выяснить их роль в инфекции. Несмотря на это, бактериоско-
пия дает возможность распознать смешанную инфекцию и
сделать предположение о возбудителях.
Серодиагностика данных инфекций практически не прово-
дится в связи с трудностями в выборе антигенов и с низким
титром антител.
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики раневых аэробных и
анаэробных гнойных инфекций.
2.	Бактериоскопический и бактериологический методы, используемые в
лабораторной диагностике раневой инфекции.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Демонстрация
1.	Мазки из гноя и чистых культур синегнойной палочки, кишечной
палочки, протея, вейллонеллы, пептококка, пептострептококка, бактероида
и клостридий.
2.	Методика посева для выделения облигатных анаэробов.
3.	Аппаратура и питательные среды для выращивания анаэробов.
141
4.	Пестрые ряды с культурами клостридий — возбудителями раневой
анаэробной инфекции.
5.	Определение перфрингенс-токсина в раневом отделяемом с помощью
лецитовителлазной пробы.
Задавие для выполвенпя лабораторной работы
1	Бактериоскопическое исследование; приготовить мазки из гноя, окрасить
их по Граму и микроскопировать. Сделать предварительное заключение и
наметить ход дальнейшего анализа.
2.	Сделать окончательное заключение о возбудителе или возбудителях
раневой инфекции на основании бактериоскопических, бактериологических,
биохимических и других данных, полученных из бактериологической лабо-
ратории.
Методические указания
Материал для исследования: гной, раневое отделяемое,
отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный
материал и др.
Микробиологическая диагностика раневой и гнойной
аэробной инфекции
Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого мате-
риала готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроско-
пируют. Обнаружение в мазках разных форм бактерий (стафи-
лококка, стрептококка, грамотрицательных или грамположитель-
ных палочек) позволяет сделать предварительное заключение.
Бактериологическое исследование. 1. Методы выделения чис-
тых культур стафилококков и стрептококков и их идентифи-
кация описаны выше.
2.	Для выделения культуры бактерий Pseudomonas aeruginosa
(синегнойная палочка) исследуемый материал засевают на
питательный агар в чашки Петри с целью получения изоли-
рованных колонии. Посевы инкубируют при 37°С в течение
суток. Синегнойная палочка образует круглые плоские слизис-
тые колонии с характерным сине-зеленым пигментом, который
диффундирует в агар. При бактериоскопии нативных препара-
тов в «раздавленной» или «висячей» капле, приготовленных из
колоний, обнаруживаются подвижные и слегка изогнутые
палочки, в мазках, окрашенных по Граму, — грамотрицательные
палочки. Для установления вида получают чистую культуру,
которую идентифицируют по биохимическим признакам. Пато-
генные штаммы Pseudomonas aeruginosa образуют белковые
токсины (экзотоксины): гистотоксин, обладающий цитотокси-
ческим свойством, и лейкоцидин, лизирующий лейкоциты
человека, которые могут быть обнаружены путем биопробы.
142
3.	Для выделения культуры бактерий Е. coli исследуемый
материал засевают на одну из дифференциально-диагности-
ческих сред (например, среду Эндо, на которой кишечная палоч-
ка образует красные колонии). Дальнейшая идентификация
выделенной чистой культуры с определением серовара описана
на с. 178).
4.	Для выделения культуры бактерий рода Proteus исследу-
емый материал вносят в конденсационную воду скошенного
в пробирке питательного агара (метод Шукевича). Посевы
инкубируют при 37°С в течение 18—20 ч. Характерным призна-
ком протея является ползучий рост снизу вверх по поверх-
ности скошенного агара. При бактериоскопии препаратов в
«висячей» или «раздавленной» капле видны подвижные палочки,
в мазках, окрашенных по Граму, — грамотрицательные палочки.
Дальнейшая идентификация выделенной чистой культуры
Proteus до вида (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis и др.)
описана в теме 30.
Микробиологическая диагностика
гнойно-воспалительных процессов, вызванных
неспорообразующими анаэробными бактериями
Возбудителями разнообразных гнойно-воспалительных про-
цессов довольно часто являются неспорообразующие анаэроб-
ные бактерии, принадлежащие к родам Bacteroides, Veillonella,
Pcptococcus, Peptostreptococcus. Они вызывают как моноинфек-
ции, так и смешанные инфекции во всевозможных сочетаниях
друг с другом и с аэробными бактериями — Pseudomonas aerugi-
nosa, Proteus vulgaris, E. coli, кокками. Для микробиологической
диагностики этих заболеваний главным образом осуществляют
бактериологическое исследование в строго анаэробных усло-
виях, так как даже незначительное количество кислорода
воздуха резко тормозит размножение бактерий, в результате
чего они не растут на питательных средах.
Взятие материала (гной, отделяемое раны, отечная жидкость)
производят шприцем с хорошо притертым поршнем до полного
его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают
на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирку
со смесью инертных газов (N2 + Нг) и СОа, и вводят в нее
исследуемый материал.
Бактериологическое исследование. Посевы производят в про-
бирку с предварительно прокипяченной средой Китта—Тароцци
и в пробирку с полужидким тиогликолевым агаром. В его
состав входят дрожжевой экстракт, триптон, цистеин, хлорид
натрия, тиогликолевая кислота, метиленовый синий и 0,75%
143
Условные обозначения: + наличие признака; - отсутствие признака; х - непостоянный признак; + отсутствие признака у большин-
ства штаммов; ± наличие признака у большинства штаммов; с — слабая ферментация.
Рнс. 64. Возбудители анаэробной
раневой инфекции.
о - Clostridium perfringens; б - Cl. novyi;
в - Cl. septicus; г - Cl. histolyticum.
агара. Посевы помещают в
эксикатор или анаэростат, ко-
торый заполняют газовой
бескислородной смесью (с пал-
ладиевым катализатором) и
инкубируют при 37°С в тече-
ние 24-48 ч. После просмотра
выросшей культуры делают
мазки, окрашивают по Граму
и микроскопируют. Бактерио-
скопия дает возможность установить однородность или неодно-
родность культуры, а по морфологии клеток и отношению к
окраске по Граму ориентировочно отнести ее к определенному
роду. Для получения чистой культуры делают пересевы на
сахарный кровяной агар в чашки Петри, которые инкубируют
в анаэробных условиях 3—4 сут до формирования изолированных
колоний. После изучения колоний их пересевают на среду
Китта—Тароцци. Идентификацию выделенной чистой культуры
производят на основании присущих им дифференциальных при-
знаков, которые определяют в тех же строго анаэробных усло-
виях (табл. 24).
Микробиологическая диагностика раневой анаэробной
инфекции (газовой гангрены)
Возбудителями раневой анаэробной инфекции являются бак-
терии рода Clostridium (схема 4). К данному роду относятся
Cl. perfringens, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. sordellii, Cl. histo-
lyticum. Чаще других возбудителем является Cl. perfringens.
Заражение происходит при попадании в рану почвы или пыли,
загрязненной спорами клостридий. В анаэробных условиях
(в глубине раны) они прорастают в вегетативные клетки,
продуцирующие разнообразные токсины, которые вызывают
распад и некротизацию мышечной ткани. В этом процессе
участвуют стафилококки, синегнойная палочка, протей и другие
бактерии, в значительной мере осложняющие течение заболе-
вания.
Бактериоскопическое исследование. Проводится путем
микроскопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или
некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных
(1—1,5X3—10 мкм) грамположительных палочек (рис. 64), часть
145
Схема 4. Микробиологическое исследование при раневой анаэробной инфекции
Материал	Отделяемое ран, отечная жидкость, некротизированная ткань, перевязочный материал
Для уничтожения аэробной флоры половину засеянных пробирок прогревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин.
из которых (Cl. perfringens) образует капсулу (рис. 65), позволяет
поставить предварительный диагноз.
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
вносят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци,
железосульфитным агаром (среда Вильсона—Блера) и молоком.
Часть пробирок прогревают при 80°С в течение 30 мин для
уничтожения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют
в обычном термостате при 37°С. Cl. perfringens растет в глубине
среды. В молоке уже через 3—4 ч после посева образуется
губкообразный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделив-
шуюся прозрачную жидкость. На следующие сутки на среде
Китта—Тароцци отмечается помутнение и газообразование,
а на ЖСА несколько позднее появляются черные колонии в
глубине агарового столбика. Для получения культур других
видов клостридий требуются более строгие анаэробные условия.
Из всех посевов делают мазки, окрашивают по Граму и микро-
Таблица 25. Определение лецитиназной активности токсииа CL perfringens
(форма протокола)
Ингредиенты, мл	N? пробирки			
	1	1	3	4
Исследуемый материал	ОД	03	03	03
Лецитин	0,1	0,1	0,1	—
Раствор хлорида натрия	0,1	—	—	0,2
Сыворотка анти-С1. perfringens	—	0,1	—	—
Сыворотка анти-С1. novvi	—	—	0,1	—
Инкубация при 37°С в течение 46-60 мин
Учет результатов
скопируют. При положительном результате обнаруживают круп-
ные грамположительные палочки Cl. perfringens. Для получения
чистой культуры делают пересевы на сахарный кровяной агар в
чашки Петри, которые инкубируют в строго анаэробных усло-
виях при 37°С в течение 3-4 дней. Выросшие колонии пере-
севают в пробирки со средой Китта—Тароцци. Идентификацию
чистой культуры производят на основании признаков, перечис-
ленных в табл. 24.
Для определения токсигенности исследуемую культуру, выра-
щенную на среде Китта — Тароцци, центрифугируют и надоса-
дочную жидкость вводят морской свинке, которая в положи-
тельном случае погибает.
147
Для быстрого обнаружения токсина Cl. perfringens в раневом
отделяемом определяют его лецитиназную активность (табл. 25).
Положительная реакция на лецитиназу проявляется в виде
помутнения жидкости в пробирке при отрицательной реакции,
характеризующейся нейтрализацией фермента соответствующей
антисывороткой, жидкость остается прозрачной.
Вследствие того что токсины разных видов клостридий от-
личаются по своим антигенным свойствам, их серологическую
идентификацию проводят в реакции нейтрализации на лабора-
торных животных. С этой целью смесь исследуемого токсина
с антитоксической сывороткой (Cl. perfringens или Cl. novyi)
вводят подкожно морской свинке. В случае нейтрализации токси-
на животное остается живым; при отрицательной реакции мор-
ская свинка погибает через 30 мин — 4ч после инъекции.
Микробиологическая диагностика столбняка
Возбудитель столбняка Cl. tetani (рис. 66) проникает в орга-
низм человека через поврежденные кожные покровы при травмах
и ранениях, у женщин через родовые пути при родах и абортах,
у новорожденных через пупочную рану.
Материал для исследования: кусочки ткани вокруг предпола-
гаемых входных ворот инфекции, гной, перевязочный материал,
кетгут. При подозрении на столбняк у женщин после родов или
аборта — выделения из матки.
Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду
Кипа —Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при
37°С в течение 3—4 сут; наблюдают придонный рост бактерий.
Затем делают пересевы на сахарный кровяной агар в чашки
Петрй и в столбик сахарного питательного агара в пробирке.
Посевы также инкубируют в анаэробных условиях.
На поверхности кровяного агара палочка столбняка образует
нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной
гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные ко-
лонии пересевают в пробирки со средой Китта —Тароцци и со-
храняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе,
заполненном смесью инертных газов.
Биопроба. Основной метод лабораторной диагности столбняка.
Проводится для обнаружения столбнячного токсина в исследуе-
мом материале. С этой целью материал растирают в стерильной
ступке с песком, заливают изотоническим раствором хлорида
натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумаж-
ный фильтр. Часть фильтрата смешивают с антитоксической
сывороткой и внутримышечно вводят белым мышам (контроль-
ная группа); подопытным животным вводят один фильтрат.
148
Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и
задних конечностей. В результате резкого сокращения хвостовых
мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные жи-
вотные погибают. Для определения токсигенности выделенной
культуры белым мышам вводят надосадочную жидкость, полу-
ченную при центрифугировании этой культуры, выращенной на
жидкой питательной среде.
Профилактические и лечебные препараты
Антитоксические сыворотки — антиперфрингенс, ангиэдема-
тиенс (антинови), антисептикум. Выпускаются в жидком и
сухом виде после очистки и концентрации методом фермента-
тивного гидролиза (диаферм-3) антитоксической сыворотки,
полученной при иммунизации лошадей соответствующими
анатоксинами. Применяется для профилактики и специфи-
ческой терапии раневой анаэробной инфекции (газовой
гангрены).
Адсорбированный столбнячный анатоксин. Получен путем
обезвреживания формалином столбнячного токсина с после-
дующей его очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате
окиси алюминия. Входит в состав ассоциированной коклюш-
но-дифтерийно-столбнячной вакцины и других препаратов.
Применяется для активной иммунизации против столбняка.
Противостолбнячная сыворотка. Получена из крови лоша-
дей, гипериммунизированных столбнячных анатоксином.
Очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность
измеряется в международных единицах. Применяется для
профилактики и лечения столбняка.
Иммуноглобулин человеческий противостолбнячный. Получен
из гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови людей-
доноров, ревакцинированных очищенным сорбированным
столбнячным анатоксином. Применяется для пассивной
экстренной профилактики столбняка в сочетании со столбняч-
ным анатоксином при травмах кожных покровов, а также
для лечения начавшегося заболевания.
ВОЗБУДИТЕЛИ ВОЗДУШНО-КАПЕЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Возбудители инфекций, передающихся воздушно-капельным
путем, принадлежат к бактериям, риккетсиям и хламидиям,
микоплазмам (табл. 26).
Перечисленные в табл. 26 микроорганизмы относятся к
разным семействам, родам и видам, которые существенно
149
Таблица 26. Возбудители бактериальных воздушно-капельных инфекций
Наименование возбудителей и заболеваний, вызванных
бактериями	риккетсиями и хламидиями	микоплазмой
Staph, aureus — пневмония Str. pneumoniae — пневмония Str. pyogenes — пневмония Klebsiella pneumoniae — пневмония Bordetella pertussis — коклюш Corynebacterium diphtheriae — диф- ' терия Mycobacterium tuberculosis — туберку- лез легких Actinomyces bovis — актиномикоз л<г- ких Neisseria meningitidis — менингокок- ковая инфекция Veillonella sp. — пневмония? Bacteroides sp. — пневмония? Peptococcus sp. — пневмония?	Coxiella burnetii — пневмония(в 15% случаев) Chlamidia psitta- ci — пневмония	Mycoplasma pne- umoniae — пневмонии
отличаются друг от друга по морфологии, культуральным и
биохимическим свойствам, антигенной структуре. Многие из
них (Str. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Coxiella burnetii,
Chlamidia psittaci, Mycoplasma pneumoniae) вызывают, как
правило, пневмонию, другие (Staph, aureus, Str. pyogenes, Pep-
tostreptococcus, Peptococcus, Veillonella, Bacteroides) — разнообраз-
ные заболевания, в том числе респираторные инфекции.
Респираторные инфекции разной этиологии клинически диаг-
ностируются как острые респираторные заболевания (ОРЗ)
или как пневмонии; возбудители же могут быть идентифи-
цированы только с помощью микробиологического иссле-
дования.
Другие бактерии вызывают более избирательные поражения
определенных органов и тканей. Так, бактерии коклюша,
как правило, локализуются в эпителии респираторного
тракта; скарлатинозный стрептококк и бактерии дифтерии
вызывают воспалительный процесс в зеве (реже — местные
процессы иной локализации) и при этом возникают систем-
ные поражения, связанные с токсинемией; менингококки
локализуются в носоглотке, вызывают фарингиты, назофарин-
гиты, а проникая в мозговые оболочки и кровь, —менингит
и сепсис. К бактериям, вызывающим специфические пора-
жения респираторного тракта, относятся возбудители тубер-
кулеза и актиномикоза. Вместе с тем они поражают и другие
ISO
органы (кишечник, печень, кости, суставы и др.). Вызванные
всеми упомянутыми бактериями заболевания существенно
отличаются по клинической картине и патогенезу. Для
бактериологического подтверждения клинического диагноза
и выявления бактерионосителей используют главным образом
бактериоскопический и бактериологичекий методы, иногда
биопробы. Экспресс-диагностика осуществляется иммунофлюо-
ресцентным методом.
Тема 24. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОРЗ
И ПНЕВМОНИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ,
РИККЕТСИЯМИ БЕРНЕТА. ХЛАМИДИЯМИ И МИКОПЛАЗМОЙ
ПНЕВМОНИИ
Микробиологическая диагностика респираторных заболева-
ний, вызванных золотистым стафилококком, пиогенным стреп-
тококком, а также анаэробными бактериями (пептококки, вейл-
лонеллы, бактероиды), проводится теми же методами, которые
применяются при диагностике гнойных инфекций (темы 22,
23). Лабораторная диагностика респираторных инфекций,
вызванных другими бактериями, будет рассмотрена ниже.
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики ОРЗ и пневмоний,
вызванных разными микроорганизмами.
2.	Бактериологическая диагностика пневмоний, вызванных стрептококком
пневмонии и клебсиеллой пневмонии.
3.	Серодиагностика пневмоний, вызванных риккетсиями Бернета, хламидиями
пситтакоза (орнитоза) и микоплазмой пневмонии.
4.	Диагностические, профилактические н лечебные препараты, применяемые
при указанных заболеваниях.
Демонстрация
1.	Мазки из патологического материала и чистых культур стрептококка
пневмонии и клебсиеллы пневмонии.
2.	Колонии стрептококка пневмонии на кровяном агаре и клебсиеллы
пневмонии на питательном агаре.
3.	РСК с антигенами риккетсий Бернета, хламидий пситтакоза (орнитоза)
и микоплазмы пневмонии.
4.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Микроскопировать окрашенные мазки из исследуемого материала.
Сделать заключение и наметить план дальнейшего анализа.
2.	Сделать заключение о возможном возбудителе респираторной инфекции
на основании данных бактериоскопического и бактериологического исследова-
ний, полученных из лаборатории (студенты получают заполненные бланки
с результатами соответствующих анализов).
3.	Отмстить результаты и сделать заключение по реакции агглютинации
и РСК с антигеном риккетсий Бернета и РСК с орнитозным диагностикумом.
151
Схема 5. Микробиологическое исследование при пневмонии, вызванной стреп-
тококком пневмонии
Материал
1-й этап
2-й этап
3-й этап
Мокрота, промывные воды бронхов, гной, экссудат
I т
Бактериоскопиче-
ское исследование
Мазок,/окраска
по Г раму
Отеет
Бактериологиче-
ское исследование
1
Посевы на кровя-
ной агар «-
Характер колоний «----
Мазок, окраска <-------
по Г раму
а-Г емо-
лиз
Биопроба
(редко)
Заражение белых
мышей
-I
Мазки-отпечатки
из органов, окрас-
ка по Г раму
Отеет
Посев на скошенный кровяной агар
или сахарный бульон (чистая культура)
I
Посев на «пестрый»
ряд
Серотипирование ♦—
1
Чувствитель-
ность к желчи,
оптохину
-» Чувствительность
к антибиотикам
Окончательный отеет
Микробиологическая диагностика инфекций,
вызванных Стрептококком пневмонии
Str. pneumoniae относится к сем. Streptococcaceae. Является
возбудителем крупозной пневмонии, а также ползучей язвы
роговицы, а в более редких случаях — сепсиса и гнойно-
воспалительных процессов (отит, ринит, менингит и др.).
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 5). Мазки для
первичной бактериоскопии готовят из патологического мате-
риала (мокрота, гной и др.). Наличие в них грамположитель-
ных, несколько удлиненных, имеющих ланцетовидную форму
диплококков 0,5—1,25 мкм), окруженных капсулой, позволяет
поставить предварительный диагноз (рис. 67).
Бактериологическое исследование. Материал засевают на
кровяной агар и одновременно на сахарный бульон с добав-
лением сыворотки крови. После инкубации при 37°С через
24 ч образуются мелкие нежные колонии, окруженные неболь-
шой зеленоватой зоной гемолиза. Из колоний делают мазки
для изучения морфологии и тинкториальных свойств, а
152
затем пересев на скошенный кровяной агар или сывороточ-
ный бульон для выделения чистой культуры. Для отличия
стрептококка пневмонии от пиогенного стрептококка проверяют
чувствительность выделенной культуры к желчи, оптохину
и ферментацию инулина (табл. 27).
Серовар стрептококка устанавливают в реакции агглютина-
ции с типоспецифическими сыворотками (из 80 известных
вариантов в патологии человека основную роль играют
1-й, 2-й и 3-й серовары). Быстрым методом типирования
стрептококка пневмонии является реакция Нейфельда, которая
основана на феномене набухания капсул стрептококка под влия-
нием типоспецифической сыворотки. Результаты учитывают при
микроскопии препаратов «висячая» капля.
Для выделения чистой культуры стрептококка пневмонии
в некоторых случаях материал непосредственно вводят внутри-
брюшинно белым мышам, которые являются высокочувстви-
тельными к данному микробу. Культуру стрептококка выде-
ляют из крови и органов погибшего или забитого животно-
го, а также проводят бактериоскопию мазков-отпечатков,
сделанных из его органов.
Таблица 27. Дифференциальные признаки Str. pneumoniae и Str. pyogenes
Вил	Характер гемолиза	Ферментация инулина	Лизис в 10—40% раст- воре желчи	Чувствитель- ность к оп- тохину (1 : 100 000)
Str. pneumoniae Str. pyogenes	а аир	+	+	+
Примечание, а-иеполный гемолиз, связанный с переходом гемоглобина в мет-
гемоглобин серо-зеленого цвета; 0-полный гемолиз.
Микробиологическая диагностика респираторных
инфекций, вызванных клебсиеллами
К клебсиеллам, вызывающим поражения респираторного
тракта, относятся Klebsiella pneumoniae — возбудитель пневмо-
нии, К. ozaenae — возбудитель озены, или зловонного насмор-
ка, К. rhinoscleromatis — возбудитель риносклеромы или скле-
ромы.
Методические указания
Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной
бактериоскопии готовят из мокроты, слизи и соскобов из
носа, окрашивают по Граму и Бурри —Гинсу. Наличие в
153
мазках грамотрицательных капсульных бактерий (см. рис. 20)
позволяет сделать предварительное заключение. В случае
склеромы при гистологическом исследовании гранулематоз-
ной ткани, взятой из носа, обнаруживаются своеобразные
гигантские клетки Микулича, в которых содержатся клебси-
еллы.
Бактериологическое исследование. Материал засевают на
чашки Петри с питательным агаром, содержащим пенициллин
для подавления роста сопутствующей микрофлоры, или на
дифференциально-диагностические среды с лактозой и
бромтимоловым синим. На питательном агаре клебсиеллы
образуют блестящие выпуклые слизистые колонии. На диф-
ференциальной бромтимоловой среде колонии клебсиеллы
склеромы и клебсиеллы озены, нерасщепляющие лактозу,
окрашены в цвет среды (голубой), а на бромкрезоловой —
в фиолетовый. Лактозопозитивные клебсиеллы пневмонии
образуют колонии желтого цвета. На 2-й день из' подозритель-
ных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Бурри-
Гинсу и пересевают на скошенный агар или среду Ресселя
(см. с. 184) с бромтимоловым синим для получения чистой
культуры. На 3-й день учитывают рост на агаре и среде
Ресселя. Лактозонегативные бактерии окрашивают столбик
среды в желтый цвет, а лактозопозитивные — всю среду в
желтый цвет и часто разрывают ее в результате газообра-
зования при ферментации глюкозы. Идентификацию выделен-
ной культуры проводят по наличию капсулы, отсутствию
подвижности и другим признакам (табл. 28).
Для установления серовара выделенной культуры проводят
реакцию агглютинации или иммунофлюоресценции с типо-
специфическими противокапсульными сыворотками.
Таблица 28. Дифференциация Klebsiella pneumoniae, К. ozaenae, К. rhinoscleromatis
Признак или тест	К. pneumoniae	К. ozaenae	K.rhinosclero- matis
Расщепление глюкозы с образованием			
газа	4	х!	
Расщепление лактозы (до кислоты)	+	(+)	—
Расщепление дульцита (до кислоты)	X	—	—
Реакция с метиловым красным	—	+	+
Реакция Фогеса — Проскауэра	+	—	—
Утилизация цитрата	+	X	—
Образование уреазы		X	—
Образование лизиндекарбоксилазы	+	X	—
Условные обозначения: (+) — медленная ферментация; х — не все
штаммы.
154
Серодиагностика. Проводится с сыворотками больных
дюдей в РСК или РИГА с химическим склеромным диаг-
ностикумом.
Серодиагностика пневмоний, вызванных риккетсиями
Бернета, хламидиями пситтакоза и микоплазмой
пневмонии
Бактериологическая диагностика пневмоний, вызванных
перечисленными микроорганизмами, практически не проводит-
ся, поскольку риккетсии и хламидии не растут на искус-
ственных питательных средах. Выделение их на куриных
эмбрионах или клеточной культуре требует длительного
времени и не всегда бывает успешным. Хотя микоплазма
пневмонии растет на специальных питательных средах
(рис. 68), выделить ее в чистой культуре удается не всегда
и не ранее чем через месяц после посева. В этой связи
основным методом микробиологической диагностики данных
пневмоний является серологическое исследование.
Серодиагностика Ку-риккетсиоза. Начиная с 8-го дня бо-
лезни ставят реакцию агглютинации или РСК. Стандартные
диагностикумы готовят из риккетсий Бернета. Титр антител
в РСК достигает 1 :80 — 1:160 на 5—6-й неделе болезни
Реакция считается положительной при нарастании титра
антител не менее чем в 2 раза (табл. 29).
Серодиагностика пситтакоза (орнитоза). Ставят РСК со
стандартным орнитозным диагностикумом и сыворотками
больного, взятыми первый раз на 7-м дне заболевания, а
второй в конце 3-й недели. При отсутствии нарастания
титра антител реакцию повторяют через 4 нед после нача-
ла заболевания. Диагностическое значение имеет нарастание
титра антител на менее чем в 2 раза (табл. 31).
Кожно-аллергическая проба. Для ранней диагностики орни-
тоза ставят кожно-аллергическую пробу с пситтакозным
аллергеном.
Серодиагностика пневмонии, вызванной микоплазмой. Осу-
ществляется постановкой РСК с диагностикумом, приготов-
ленным из микоплазмы пневмонии, или РПГА, в которой
используют эритроциты барана с адсорбированным на них
микоплазменным антигеном. Диагностическое значение имеет
нарастание титра антител в 4 раза и более в парных сы-
воротках крови, взятых от больного на 7—8-й день и в
Конце 2-й недели болезни. Высокий титр антител, выявлен-
ный в этих реакциях при однократном исследовании, не
является доказательством наличия болезни, так как положи-
155
Рис. 68. Колонии My-
coplasma pneumoniae на
агаре с лошадиной сы-
вороткой, имеющие ти-
пичный вид яичницы-
глазуньи.
тельная реакция часто возникает после перенесения заболе-
вания даже в форме бессимптомной инфекции. Комплемент-
связываклцие антитела сохраняются после перенесения забо-
левания около 1У1 лет, а антитела, выявляемые в РТГА,—
несколько дольше. В лабораторных условиях РСК нередко
ставят одновременно с риккетсиозным, пситтакозным и
микоплазменным диагностикумами по следующей схеме
(табл. 29).
Таблица 29. Результаты РСК с тремя диагвостикумамн (форма протокола)							
Диагностикум	Разведение сыворотки						
	1 : 10	1 : 20	1 :40	1: 80	1 : 120	1 : 240	1 : 480 и т. д.
Риккетсий Бернета Хламидий пситтакоза Микоплазмы пневмонии	+	4-Н-	-н-+	-НН-	-НН-	+	—
Условные обозначения: +-Н- полное отсутствие гемолиза; + частичный гемолиз; — полный гемолиз.							
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Сыворотки противопневмококковые типоспецифические I,
II и III типов. Применяются для типирования (установления
серовара) стрептококков пневмонии.
Диагностикумы клебсиеллезные. Химические диагностикумы,
полученные по способу Буавена. Применяются для поста-
новки РСК и РПГА
156
Риккетсиозный сухой растворимый антиген риккетсий Бернета.
Получен путем экстракции с последующей обработкой
эфиром. Применяется для постановки РСК и РПГА. Обла-
дает более высокой активностью, чем риккетсиозный диагнос-
тикум.
Орнитозный диагностикум. Взвесь убитых хламидий псит-
такоза. Применяется для постановки РСК.
Микоплазменный диагностикум. Взвесь убитой культуры
микоплазмы пневмонии. Применяется для РСК и РПГ А.
Сухая живая вакцина М-44. Высушенная взвесь вакцинного
штамма риккетсий Бернета (мутанта 44), выращенного в кури-
ном эмбрионе. Применяется для профилактики Ку-лихорадки.
Антибиотики: бензилпенициллин, стрептомицин, левомице-
тин, тетрациклин, рондомицин.
Тема 25. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И КОКЛЮША
Возбудитель менингококковой инфекции (цереброспиналь-
ный менингит, назофарингит, менингококкемия) —Neisseria me-
ningitidis — относится к роду Neisseria сем. Neisseriaceae.
Основным методом лабораторной диагностики этих инфек-
ций является бактериологическое исследование, поскольку
бактериоскопия не позволяет дифференцировать как борде-
теллы, так и менингококки. Экспресс-диагностика проводится
иммунофлюоресцентным методом.
Возбудитель коклюша — Bordetella pertussis — относится к
роду Bordetella, который не включен в какое-либо семейство.
Бордетеллы играют важную роль в инфекционной патологии
детского возраста.
Программа занятия
1.	Изучение схемы микробиологической диагностики менингококковой
инфекции и коклюша.
2.	Бактериологическое и серологическое исследования.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при менингококковой инфекции и коклюше.
Демонстрация
1.	Окрашенные по Граму мазки из чистой культуры менингококка и ликвора.
2.	Культура менингококка на сывороточном агаре.
3.	Тампон для взятия материала из высоких отделов носоглотки.
4.	Мазки из чистых культур коклюшных и паракоклюшных бактерий,
- окрашенные по Граму.
5.	Колонии коклюшных бактерий на казеиноугольном агаре (КУА) и среде
Борде—Жангу.
6.	Определение уреазной активности паракоклюшных бактерий.
157
7	РСК для серодиагностики коклюша.
8.	Экспресс-диагностика коклюша с . помощью иммунофлюреспентного
метода.
9	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции; а) микро-
скопироватъ готовые мазки из ликвора и носоглотки и сделать заключение;
б) по данным бактериологического исследования, пол ченным из лаборатории,
сделать заключение о выделенных бактериях.
2. Микробиологическая диагностика коклюша: а) микроскопировать гото-
вые мазки из носоглотки, сделать заключение и наметить дальнейший план
анализа; б) сделать окончательное заключение на основании данных микро-
биологического исследования, полученных из бактериологической лаборатории.
Методические указания
Микробиологическая диагностика менингококковой
инфекции
Менингококки обнаруживаются в носоглотке у бактерионо-
сителей и больных, в спинномозговой жидкости (ликвор) при
эпидемическом цереброспинальном менингите.
Материал для исследования берут специальным тампоном
(который на % длины сгибают под углом 45°) из верхних
отделов носоглотки. При доставке в лабораторию его пред-
охраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менин-
гококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.
Ликвор берут путем пункции спинномозгового канала в
количестве 2—5 мл и делят на две части: одну центрифуги-
руют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую
питательную среду и выдерживают при 37°С для накопления
бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки и
производят посевы.
Бактериоскопическое исследование (схема 6). Мазки из
осадка ликвора окрашивают по Граму и микроскопируют.
При наличии гноя в большинстве случаев обнаруживаются
типичные грамотрицательные диплококки, имеющие характер-
ное расположение — внутри лейкоцитов, что позволяет сде-
лать окончательное заключение о менингококковой инфекции.
При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей
наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные
стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейс-
серии — бранхамелла и другие бактерии. Дифференцировать
их по морфологической картине мазка не представляется
возможным.
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержа-
158
Схема 6. Микробиологическое исследование при менингококковой инфекции
и у бактерионосителей
Материал
Ликвор, слизь из зева и носа, кровь, гной, Ликвор Сыворотка
экссудат
7------------
Бастериоскопиче-
ское исследование
1-й этап
Мазок, окраска по
Граму. Люмине-
сцентная микро-
скопия мазков,
обработанных
ф л ю оресцирующей
иммунной сыво-
роткой
Бактериологи-
ческое иссле-
дование
I
Посев на сыво-
роточный пита-
тельный агар
Обнаруже-
ние анти-
гена
РИГ А с эри-
троцитами,
нагружен-
ными анти-
телами
крови
т-
Серодиаг-
ностика
РПГА с пар-
ными сыво-
ротками
Ответ
Ответ
Ответ
2-й этан
3-й этап
Характер коло-
ний.
1
Мазок, окраска
по Граму
Посев на сывороточный
питательный агар (чистая
культура)
Посев на «пест-
рый» ряд
Серотипирова- <_
ние культуры
Определение
чувствительности
к антибиотикам
Окончательный ответ
щим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость,
которые способствуют росту менингококка. Кроме того, исполь-
зуют данную среду с добавлением антибиотика ристомицина
(150 ЕД/мл), который задерживает размножение грамполо-
жительных кокков, содержащихся в исследуемом материале,
и тем самым способствует выделению чистой культуры ме-
нингококка. Образование колоний менингококка на этих
средах наблюдается через 48 ч после инкубации посевов
при 37°С. В отличие от колоний других кокков колонии ме-
нингококка прозрачны, имеют голубоватый оттенок, ровные
края и величину с булавочную головку. Такие колонии
пересевают в пробирку со скошенным сывороточным агаром
для получения чистой культуры.
Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от
сапрофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят
по ряду признаков. Так, менингококк растет только в при-
сутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии
размножаются на простых средах и образуют пигмент; на
159
средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк
ферментирует до кислоты лактозу и мальтозу.
Фаготипирование менингококка проводят для эпидемиологи-
ческого анализа. Определение фаготипа производят в реакции
агглютинации в пробирках.
Схема 7 Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюше
Материал
Мокрота, слизь из носоглотки
“I
Бактериоскопическое
исследование
1-й этап
Люминесцентная
микроскопия мазков,
обработанных флюо-
ресцирующей иммун-
ной сывороткой
Ответ
Бактериологическое
исследование
и I
Посев материала
методом «кашлевых
пластинок» или но-
соглоточными там-
понами на КУА или
среду Борде — Жангу
Сыворотка крови
—I—
Серодиагностика
Реакция агглюти-
нации РСК
Ответ
Характер	Мазки,
колоний	окраска
по Граму
2-й этап
3-й этап
Пересев на пробирки
или чашки с КУА либо
средой Борде — Жангу
(чистая культура)
Рост на пи-	Проба на уреазу
тательном	Реакция агглютинации
агаре (пиг-
мент)
Окончательный ответ
Микробиологическая диагностика коклюша
Бактериоскопическое исследование (схема 7). Для быстрого
обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют
иммунофлюоресцентный метод. Материал берут стерильным
ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для
взятия материала у маленьких детей тампон, приготовленный
на тонкой эластичной проволоке, вводят через нос. Тампоном
делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют
на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующей им-
мунной противококлюшной сывороткой, другой — паракоклюш-
ной сывороткой. Препараты микроскопируют в люминесцент-
ном микроскопе; просматривают не менее 50 полей зрения.
160
Рис. 69. Bordetella pertussis (чис-
тая культура).
В положительном случае
обнаруживают В. pertussis,
для которых характерны
темные клетки с четким
светящимся венчиком.
Бактериологическое ис-
следование. Основной метод
лабораторной диагностики
коклюша. Материал для
посева берут носоглоточ-
ным тампоном (см. выше)
или методом «кашлевых пластинок». Для этого в момент
появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой
подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых
толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выде-
лить коклюшные микробы в начальном периоде болезни от
80-90% больных. Материал засевают на КУА или кровяные
среды — картофельно-глицериновый кровяной агар Борде-
Жангу и молочно-кровяной агар. В питательные среды добав-
ляют пенициллин для угнетения роста посторонней микро-
флоры. Колонии В. pertussis на указанных средах обычно
появляются через 48—72 ч культивирования, паракоклюшные —
несколько раньше: через 24—72 ч. Бордетеллы образуют мелкие
(диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии.
На КУА колонии имеют серовато-кремовый цвет, а на среде
Борде—Жангу приобретают жемчужный или ртутный блеск.
Колонии паракоклюшных бактерий более крупные. На среде
Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют огра-
ниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках,
готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При
наличии в мазках овоидных грамотрицательных палочек
(рис. 69) ставят ориентировочную реакцию агглютинации с кок-
люшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные
колонии пересевают в пробирки для дальнейшего изучения
чистых культур бордетелл (табл. 30).
В отличие от других бордетелл В. pertussis не растут на
питательном агаре и не изменяют цвета специальных пита-
тельных сред.
Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят 03 мл 2% раст-
вора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли
7-639
161
Таблица 30. Дифференциальные признаки бордетелл
Признак	В. pertussis	B.parapertussus	B.bronchisepticus
Рост на агаре (простом)	—	+	+
То же с тирозином			с коричневой окраской +	+
Изменение цвета: КУА		с ярко-коричневой окраской Буро-коричневый	
кровяного агара	—	Потемнение	—
Образование уреазы	—	+	+
Наличие антигенов: родового (общего)	7	7	7
видового (специфиче- ского)	1	14	12
Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; цифра-
ми обозначены номера антигенов.
0,1% спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через
20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление
мочевины уреазой.
Установление серологической специфичности бордетелл,
дифференциацию видов и определение сероваров проводят
в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сы-
воротками. При этом исходят из того, что антиген (фактор)
7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только
В. pertussis, 14 — В. parapertussis и 12 — В. bronchiseptica.
Бактериологическое исследование продолжается не менее
5 дней. При бактериологической диагностике коклюша мо-
жет возникнуть необходимость дифференциации бордетелл
от гемоглобинофильной бактерии Haemophilus influenzae, от-
носящейся к роду Haemophilus. Палочка инфлюэнцы часто
встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и
вызывает ряд воспалительных заболеваний. В отличие от
бордетелл Н. influenzae выращивается только на кровяных
питательных средах — кровяном агаре, «шоколадном» агаре
Левинталя, содержащих Х-фактор (гемин) и V-фактор (коэн-
зим дегидрогеназы). Идентификацию выделенной культуры
производят на основании комплексного изучения морфологи-
ческих, культуральных, биохимических и серологических
свойств.
Серодиагностика. Реакция агглютинации и РСК применяют-
ся в основном для ретроспективного подтверждения диагно-
за и дифференциальной диагностики атипичных форм кок-
люша. Агглютинины в крови больных появляются на
162
3-4-й неделе заболевания в титрах 1 20 и выше. В услови-
ях массовой вакцинации детей против коклюша диагности-
ческое значение имеет нарастание титра антител в динамике
болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Вакцина АКДС. Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-
столбнячная вакцина. Содержит взвесь коклюшных бактерий,
убитых формалином или мертиолатом, и очищенные концентри-
рованные дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорби-
рованные на гидрате окиси алюминия. Применяется для
ассоциированной вакцинации детей против коклюша, дифте-
рии и столбняка.
Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из
плацентарной или венозной крови человека. Содержит спе-
цифические антитела против возбудителей многих инфекцион-
ных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. При-
меняется для пассивной профилактики и лечения коклюша.
Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки.
Применяются для серологической дифференциации коклюшных
бактерий.
Тема 26. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ТУБЕРКУЛЕЗА И АКТИНОМИКОЗА
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики туберкулеза и акти-
номикоза.
2.	Бактериоскопическое и бактериологическое исследования при тубер-
кулезе и актиномикозе.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при туберкулезе и актиномикозе.
Демонстрадия
1.	Мазок из чистой культуры микобактерий туберкулеза, окрашенный по
Цилю—Нельсену.
2.	Препарат микобактерий туберкулеза в люминесцентном микроскопе.
3.	Ускоренный метод микробиологической диагностики туберкулеза.
4.	Рост туберкулезных микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена.
5.	Питательные среды для культивирования туберкулезных микобактерий.
6.	Туберкулин, вакцина БЦЖ, антибиотики и химиотерапевтические про-
тивотуберкулезные препараты.
7.	Мазки из чистой культуры актиномицетов.
8.	Друзы патогенных актиномицетов в препаратах гноя.
9	Рост актиномицетов на питательных средах.
7'
163
10.	Биохимические тесты для идентификации актиномицетов
11.	РСК для серодиагностики актиномикоза.
12.	Актинолизат, актиномицетная поливалентная вакцина.
13.	Антибиотики и химиотерапевтические препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Бактериоскопическое исследование при туберкулезе. Материал для
исследования — мокрота, взятая у больных с подозрением на туберкулез
легких. Окрасить приготовленные из мокроты мазки и провести микроскопи-
ческое исследование. Сделать заключение и наметить ход дальнейшего ис-
следования для подтверждения бактериоскопического даигноза.
2.	Бактериологическое исследование при туберкулезе: а) отметить характер
роста исследуемой культуры на среде Левенштейна—Йенсена; б) отметить
результаты ниациновой пробы; в) определить чувствительность микобактерий
туберкулеза к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Отметить
наличие или отсутствие роста микобактерий на среде Левенштейна—Йенсена с
разными концентрациями противотуберкулезных препаратов. Сопоставить
полученные данные с клиническими границами устойчивости туберкулезных
микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.
3.	Сделать заключение на основании лабораторных данных исследования
морфологических, культуральных и биохимических свойств выделенной
культуры, предположительно отнесенной к роду Actinomyces.
Микробиологическая диагностика туберкулеза
Возбудители туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis,
М. bovis — являются кислотоустойчивыми бактериями, характери-
зующимися медленным ростом на питательных средах.
Заражение происходит воздушно-капельным путем, иногда
через желудочно-кишечный тракт.
Основные методы, применяемые для микробиологической
диагностики туберкулеза, приведены на схеме 8.
Методические указания
Материал для исследования: мокрота, экссудат, гной, про-
мывные воды бронхов, желудка, ликвор, моча. Для консер-
вации и ингибиции сопутствующей микрофлоры патологи-
ческий материал перед транспортировкой в лабораторию обра-
батывают 10% раствором фосфата натрия.
Бактериоскопическое исследование (схема 8). Мокроту по-
мещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность.
Петлей или препаровальными иглами выбирают гнойный
комочек, переносят его на предметное стекло ближе к одно-
му из концов и, растирая между двумя стеклами, готовят
мазок. Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки
из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобакте-
рии туберкулеза и клеточные элементы. Мочу центрифугируют
164
Окончательный ответ
Человек ---> кожно-аллергическая проба с туберкулином
165
и делают мазки из осадка. Препараты из мочи обязательно
обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для
дифференциации микобактерий туберкулеза от М. smegmatis,
которые могут находиться в моче здоровых людей. В отли-
чие от микобактерий туберкулеза они обесцвечиваются
спиртом.
Мазки окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют,
просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобакте-
рии туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, распола-
гаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 17).
Единичные бактерии можно обнаружить в препарате, если их
содержание не менее 105 в 1 мл мокроты. Поэтому при
небольшом содержании микобактерий туберкулеза в материа-
ле применяют методы «обогащения» — гомогенизации и
осаждения или флотации.
Метод гомогенизации и осаждения. К суточной
порции мокроты добавляют равный объем 1%раствора едкого
натра (или антиформина) для гомогенизации, флакон плотно
закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение
10—15 мин После центрифугирования и нейтрализации кисло-
той из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю —
Нельсену.
Метод флотации. Мокроту гомогенизируют и прогре-
вают при 55°С в течение 30 мин на водяной бане. Затем
добавляют 1—2 мл ксилола, дистиллированную воду, повтор-
но встряхивают в течение 10 мин и отстаивают 20 мин
при комнатной температуре. На поверхности образуется
пена, состоящая из всплывших капелек ксилола с адсорби-
рованными микробами. Пипеткой или петлей из пенообраз-
ного слоя готовят мазок, несколько раз наслаивая материал
на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обез-
жиривают эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по
Цилю—Нельсену.
Применение люминесцентной микроскопии повышает число
находок микобактерий туберкулеза в патологическом мате-
риале.
Микроскопическое исследование является ориентировочным
и позволяет судить лишь о наличии кислотоустойчивых
бактерий в материале без определения видовой и типовой
принадлежности.
Бактериологическое исследование. Для посева используют
предварительно обработанный Na3PO4 исследуемый материал;
необработанный материал непосредственно перед посевом в
течение нескольких минут подвергают действию 10% серной
кислоты или 4 — 6% раствора едкого натра для освобождения
166
от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают
и центрифугируют. Осадок нейтрализуют и засевают на
несколько пробирок со средой Левенштейна — Йенсена или
другими специальными средами. Среду Левенштейна — Йенсена
готовят из суспензии свежих яиц, картофельной муки, гли-
церина, аспарагина, КН2РО4, сульфата и цитрата магния и
малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном
положении при 85°С в течение 45 мин. Посевы инкубируют
при 37°С 4 — 6 нед и более, так как микобактерии туберку-
леза размножаются очень медленно, особенно в первых
генерациях. Культуры этих микобактерий имеют вид серо-
ватого или светло-кремового морщинистого или крошкообраз-
ного сухого налета (рис. 70).
При идентификации выделенной культуры микобактерий
туберкулеза и дифференциации ее от потенциально-патоген-
ных микобактерий учитывают морфологические и тинкториаль-
ные особенности, характер и скорость роста на питательных
средах, биохимические свойства и вирулентность для лабо-
раторных животных. Из биохимических свойств чаще всего
определяют способность исследуемой культуры синтезировать
никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно). Это один
из важных признаков, с помощью которого удается отличить
Mycobacterium tuberculosis, хорошо синтезирующие никотино-
вую кислоту, от палочек М. bovis, образующих ее в мини-
мальных количествах.
Для определения ниацина к культуре микобактерий в
жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN
и 1 мл 5% раствора хлорамина. При наличии ниацина
через несколько минут появляется ярко-желтая окраска.
Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции
в пробирке добавляют 3—5 мл 10 % раствора гидрокарбоната
натрия.
Для ускорения диагностики используют метод микрокуль-
тур Прайса. На нескольких предметных стеклах (ближе к од-
ному концу) делают толстые мазки из исследуемого материа-
ла. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут
2-6% серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают
во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разве-
дении 1:4 — 1:8 и ставят в термостат. Через 7 — 14 дней
извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по
Цилю — Нельсону и микроскопируют (рис. 71) —вирулентные
штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или
кос (корд-фактор).
Определение чувствительности микобактерий туберкулеза
к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам проводят
167
методом серийных разведений. С этой целью по 0,1 мл
взвеси микобактерий туберкулеза засевают в пробирки со
средой Левенштейна — Йенсена, содержащей различные
концентрации антибактериальных препаратов первого и второ-
го ряда: 5, 10, 50 мкг/мл стрептомицина; 5, 10, 50, мкг/мл
ПАСК; 1, 5, 10, 25 мкг/мл тубазида; 30 мкг/мл циклосерина
и этионамида. Учитывают результаты на 12 — 21-й день
инкубации. Клинические границы устойчивости микобактерий
туберкулеза: стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК —10 мкг/мл,
тубазид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл.
Биопроба. Применяется при первичной диагностике с целью
выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза из
органов животного, зараженного исследуемым материалом, а
также для определения вирулентности этих микобактерий.
Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для
освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют
и вводят подкожно в количестве 2 — 3 мл морской свинке
с отрицательной туберкулиновой реакцией. Через 4 мес, если
животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и
микроскопическое исследование органов и делают посевы.
М. tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и
малопатогенны для кроликов, М. bovis непатогенны для морских
свинок и кроликов.
Серодиагностика. Проводится ограниченно, ставят РСК и
РПГА. Положительные результаты отмечаются при активном
туберкулезном процессе в организме, а также при инфици-
ровании микобактериями туберкулеза и вакцинации БЦЖ.
Кожно-аллергическая проба. Ставится с туберкулином —
очищенной белковой фракцией, полученной из микобактерий
туберкулеза, для характеристики состояния аллергии у людей
с целью определения инфицированное™, оценки течения
туберкулезного процесса, определения эффективности вакци-
нации и отбора контингентов для ревакцинации против ту-
беркулеза. Туберкулин вводят внутрикожно в строго определен-
ной дозировке. Учитывают реакцию через 24 — 48 ч по
образованию гиперемии и папулы (см. рис. 50).
»
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Туберкулин сухой очищенный. Получен из фильтрата бульон-
ной культуры микобактерий путем добавления химических ве-
ществ, осаждающих белок, с последующей очисткой. Приме-
няется для постановки кожно-аллергической пробы (реакция
Манту).
168
Вакцина БЦЖ. Живая лиофильно высушенная культура
апатогенного штамма микобактерий туберкулеза, полученного
французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется
внутрикожно для активной специфической профилактики тубер-
кулеза.
Антибиотики и химиотерапевтические препараты, применяемые
для лечения туберкулеза. К препаратам первого ряда относятся
основные противотуберкулезные препараты: стрептомицин,
ПАСК и производные ГИНК: тубазид, фтивазид, метазид, к
препаратам второго ряда — циклосерин, канамицин, этионамид.
При лечении больных обычно комбинируют препараты первого
и второго ряда с учетом клинической характеристики заболе-
вания и чувствительности микобактерий туберкулеза к лекарст-
венным препаратам.
Микробиологическая диагностика актиномикоза
Возбудителями актиномикоза являются Actinomyces bovis,
Actinomyces israelii. Они вызывают заболевания, проявляющиеся
в поражении легких и, реже, других органов и тканей. Основ-
ным методом лабораторной диагностики актиномикоза являются
бактериоскопическое и бактериологическое исследования.
Методические указания
Материал для исследования: гнойное отделяемое, мокрота,
моча, пунктат и биоптаты ткани из глубоких и закрытых очагов
поражения.
Микроскопическое исследование. Подозрительные плотные
комочки из патологического материала переносят на предметные
стекла в каплю 10—20% раствора гидрокарбоната натрия, слегка
подогревают и готовят препарат «раздавленная» капля, который
исследуют под микроскопом с объективами 8 и 40. В поло-
жительном случае в препаратах обнаруживаются актиномицеты
в виде друз — характерных зернистых образований с плотным
центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками. На-
ряду с друзами встречаются отдельные грамположительные
неравномерно окрашивающиеся ветвистые бактерии (см. рис. 15).
Бактериологическое исследование. Материал засевают штри-
хом на две чашки с кровяным агаром, содержащим экстракт
сердечной мышцы. Одну чашку инкубируют в атмосфере азота,
водорода и СОг, вторую —в анаэробных условиях с добавле-
нием 5% СО2. Через 18—24 ч образуются микроколонии, а через
1—2 нед —зрелые колонии. Характерным признаком является
«паукообразная» структура микроколонии с многочисленными
169
ветвящимися нитями или зернистый центр с ветвящимися
нитями по периферии. Зрелые колоний могут быть плоскими,
морщинистыми, бугристыми или пленчатыми. Характер колонии
и морфология клеток во многих случаях позволяют отнести
исследуемую культуру к роду Actinomyces. Окончательная
идентификация культуры до вида проводится на основании био-
химических и антигенных свойств (табл. 31).
Таблица 31. Дифференциальные признаки Actinomyces bovis и Actinomyces
israelii
Признак	A. bovis	A. israelii
Характер микроколоний	Г ладкие	Шероховатые
Гидролиз крахмала (широкая зона)	+	—
Ферментация (до кислоты):		
арабинозы	—	+/-
рибозы	—	+
КСИЛОЗЫ	+/-	+
рафинозы	—	+/-
растворимого крахмала	+	+/-
Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака;
+ / — вариабельность признака.
Быстрые и специфические результаты дает иммунофлюорес-
центное исследование.
Серодиагностика. Ставится РСК с сывороткой крови боль-
ного и антигеном, представляющим собой поливалентный
актинолизат. Положительная реакция наблюдается у 80% боль-
ных людей.
Кожно-аллергическая проба. Ставится с экстрактом из акти-
номицетов.
Диагностические и лечебные препараты
Актинолизат. Фильтрат бульонной культуры спонтанно лизи-
рованных штаммов актиномицетов. Применяется для специфи-
ческой иммунотерапии и в качестве антигена для постановки
РСК.
Актиномицетная поливалентная убитая вакцина. Готовится из
спороносных штаммов актиномицетов. Применяется с лечебной
целью.
Антибиотики и химиотерапевтические препараты: тетрациклин,
стрептомицин, левомицетин, ристомицин, канамицин, сульфа-
ниламиды.
170
Тема 27. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ДИФТЕРИИ
Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae - отно-
сится к порядку Actinomycetales роду Corynebacterium, не вклю-
ченному в какое-либо семейство. Кроме дифтерийной палочки,
к этому роду принадлежат псевдодифтерийная палочка С.
xerosis, а также дифтероиды — С. pseudodiphthenticum и др.,
являющиеся представителями нормальной микрофлоры. Основ-
ной биологической особенностью возбудителя дифтерии явля-
ется способность продуцировать токсин, определяющий пато-
генез заболевания. Местный патологический процесс обычно
локализуется в зеве.
Лабораторная диагностика проводится путем бактериоскопи-
ческого и бактериологического исследований.
Программа занятия
1.	Изучение схемы микробиологической диагностики дифтерии.
2.	Бактериоскопическое и бактериологическое исследования при дифтерии.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при дифтерии.
Демонстрация
1.	Мазки из чистых культур дифтерийных бактерий и дифтероидов, окра-
шенные по Нейссеру и Граму.
2.	Мазок дифтерийных бактерий, окрашенный корифосфином, в люминес-
центном микроскопе.
3.	Рост дифтерийных бактерий и дифтероидов на свернутой сыворотке и
теллуритовой среде.
4.	«Пестрые» ряды культур дифтерийной палочки и дифтероидов. Пробы
на цистиназу и уреазу.
5.	Определение токсигенности дифтерийной культуры (в реакции преципи-
тации в агаре).
6.	Ускоренный метод диагностики дифтерии.
7.	Токсин Шика, дифтерийный анатоксин, противодифтерийная сыворотка.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Бактериоскопическое исследование: а) микроскопировать мазки, приготов-
ленные из материала, взятого из зева лиц с подозрением на дифтерию или
бактерионосительство; б) определить метод окраски и дать предварительное
заключение. Наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения
бактериоскопического диагноза.
2. Бактериологическое исследование: а) описать рост культуры, полученной
на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде; б) отметить резуль-
таты готовых посевов исследуемых культур на средах «пестрого» ряда; в) в случае
обнаружения С. diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные
бактериоскопического и бактериологического исследований с целью идентифи-
кации выделенной культуры и поставить окончательный микробиологический
диагноз.
171
Схема 9. Микробиологическое исследовапие при дифтерии
Материал
Слизь из зева и носа, пленки миндалин и носоглотки и др.
Бактериоскопическое исследование
Бактериологическое исследование
1-й этап
Мазки, окраска
корифосфином
(люминесцент-
ная микроско-
пия)
Мазки, окраска
по Г раму и
Нейссеру
Посевы на свернутую сыворотку,
кровяной агар или среду Клау-
берга	I
2-й этап
Ответ
Характер куль-
тур и колоний
Мазки, ок-
раска по
Г раму и
Нейссеру
Посев на «пестрый» ряд <—1
Определение токсигенности
3-й этап
Пересев на свернутую сыворотку
(чистая культура)
1
Г емолиз
->Проба на цис-
тиназу
->Проба на уре-
азу
Реакция агглютинации
Окончательный ответ
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 9). Материал берут
двумя ватными стерильными тампонами, один из которых ис-
пользуют для приготовления мазков, другой —для посева.
Мазки окрашивают по Нейссеру и Граму. Для дифтерийной
палочки характерно наличие полярно расположенных зерен
волютина и положение в виде буквы «V» (см. рис. 19). Диф-
тероиды и псевдодифтерийная палочка не имеют зерен волю-
тина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме
того, сами бактерии располагаются в виде «частокола».
Применение люминесцентной микроскопии позволяет по-
высить эффективность исследования. При этом дифтерийные
палочки можно отличить от пседодифтерийных по коричнево-
красному свечению зерен волютина, которое они приобретают
после окраски флюорохромом — корифосфином. Цитоплазма
этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако дифте-
рийные палочки часто изменяют свою морфологию, в частности
при санации зева антибиотиками, поэтому для точной иденти-
фикации возбудителя проводят бактериологическое исследование.
172
Таблица 32. Биологические свойства дифтерийной палочки и сходных с ней
к оринебактерим
Вид
Зер-
на
во-
лю-
тина
Ге-
мо-
лиз
Ферментация
саха-
розы
глю-
козы
крах-
мала
Ток-
си-
ген-
ность
Цис-
тн-
наза
У ре- Аг-
аза глю-
тина- тина-
Пато-
ген-
ность
ция
про-
тиво-
диф-
те-
рий-
ной
сыво-
для
чело-
века
рот-
кой
С. diphtheriae:
биовар gravis
» mitis
С. xerosis
С. pseudodiphthericum
Условные обозначения те же, что и в табл. 31
Бактериологическое исследование. Материал засевают на элек-
тивные питательные среды — свернутую сыворотку и теллури-
товую среду Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия,
глицерином и дефибринированной кровью) для получения
чистой культуры. На этих средах задерживается рост кокков
и другой микрофлоры зева, что способствует размножению
бактерий дифтерии. Дифтерийная палочка образует на свернутой
сыворотке мелкие круглые колонии с уплотнением в центре.
При сплошном росте поверхность культуры напоминает шагре-
невую кожу. На теллуритовой среде бактерии дифтерии биовара
gravis формируют колонии серовато-черного цвета с радиальной
исчерченностью поверхности, напоминающей цветок марга-
ритки, тип mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета
вследствие интенсивного восстановления теллура (рис. 72).
Выделенную культуру дифференцируют от сходных с ней
непатогенных коринебактерий по морфологическим особен-
ностям, ферментации сахарозы, глюкозы, крахмала, токсиген-
ности и антигенным признакам (табл. 32).
Способность бактерий дифтерии продуцировать токсин уста-
навливают в реакции преципитации в агаре. Для этого в чашку
Петри с питательным агаром, содержащим 15—20% лошадиной
сыворотки, 03% мальтозы и 0,03% цистина, кладут полоску
фильтровальной бумаги (1,5X6 см), пропитанную антитоксичес-
кой противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл.
Чашку подсушивают при 37°С в течение 30 мин и засевают
исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге
173
штрихов на расстоянии 0,6-0,8 см от края бумаги. В качестве
контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы
инкубируют при 37°С до следующего дня. При размножении
токсигенной культуры в месте соединения токсина с антиток-
сином в плотной питательной среде образуется преципитат в
виде белых линий — «усов» (см. рис. 59).
В случае выделения нетоксигенной культуры ставят допол-
нительные пробы на цистиназу, уреазу и реакцию агглютинации
с агглютинирующей дифтерийной сывороткой.
Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питатель-
ного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру.
Посевы инкубируют при 37° С до следующего дня. Истинные
дифтерийные палочки вызывают почернение среды по ходу
посева (в результате образования сульфида свинца), вокруг кото-
рого появляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от
поверхности в среде образуется коричневое «облачко».
Для определения уреазы (проба Закса) готовят спиртовый
раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного,
которые смешивают перед употреблением в соотношении
1  9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные пробирки.
Затем одну петлю исследуемых бактерий вносят и растирают
по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при
37°С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате
чего среда приобретает красный цвет.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Токсин Шика. Высокоочищенный экзотоксин дифтерийных
бактерий. Применяется для постановки внутрикожной реакции
Шика с целью определения напряженности антитоксического
иммунитета против дифтерии у детей.
Дифтерийный адсорбированный очищенный анатоксин (АД).
Дифтерийный экзотоксин, обезвреженный формалином при
нагревании с последующей очисткой, концентрацией и адсор-
бцией на гидрате окиси алюминия. Применяется для проведения
активной иммунизации против дифтерии. Входит в состав
адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС)
и АКДС.
Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена
из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным ана-
токсином, очищают и концентрируют методом диаферм-3.
Активность сыворотки измеряется в международных единицах.
Применяется для профилактики и лечения дифтерии.
174
Агглютинирующая противодифтерийная сыворотка (поли-
валентная и типовые). Применяется для дифференциации бак-
терий дифтерии от дифтероидов.
ВОЗБУДИТЕЛИ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ,
ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ И ИНТОКСИКАЦИЙ
Кишечные инфекции вызываются; а) бактериями, принад-
лежащими к сем. Enterobacteriaceae, трибам Escherichieae,
Salmonella, Shigella и, реже, Yersiniae (Y. enterocolitica) и
Klebsielleae; б) холерными вибрионами (Vibrio cholerae и др.)
сем. yibrionaceae; в) анаэробными грамотрицательными неспо-
ровыми бактериями — бактероидами и вейллонеллами.
Пищевые отравления (токсикоинфекции и интоксикации)
вызываются сальмонеллами, протеями, относящимися к сем.
Enterobacteriaceae, и микроорганизмами, продуцирующими
токсины, относящимися к семействам Micrococcaceae (Staph,
aureus), Bacillaceae (Cl. perfringens и Cl. botulinum) (табл. 33).
Таблица 33 Возбудители бактериальных кишечных инфекции
Возбудители, вызывающие
острые кишечные заболевания	пищевые токсико- инфекции	пищевые инток- сикации
Е. coli — колиэнтериты, дизентерие- подобные и холероподобные за- болевания S. typhi, S. paratyphi A, S. schottmuei- leri — брюшной тиф и паратифы Yersinia enterocolitica — энтериты Enterobacter sp. — энтериты Bacteroides sp. — энтериты Veillonella sp. — энтериты Vibrio cholerae — холера (гастроэнте- роколит)	S. typhimurium и другие виды сальмонелл Shigella sonnei Proteus vulgaris и другие виды Proteus Е. coli	Белковые токсины: Staph, aureus, Cl. perfringens, Cl. botulinum
Обнаружение возбудителей кишечных инфекций и пищевых
отравлений имеет большое диагностическое и эпидемиологи-
ческое значение. Оно позволяет подтвердить клинический
диагноз заболевания, выявить бактерионосителей, установить
источник заражения, пути передачи и своевременно провести
противоэпидемические мероприятия. Основным (а при некото-
рых кишечных инфекциях единственным) методом определения
175
вида возбудителя является бактериологическое исследование,
так как клиническое течение кишечных заболеваний не всегда
позволяет поставить правильный диагноз.
Тема 28. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
В данную тему включены исследования при острых кишечных
инфекциях: колиэнтеритах детей раннего возраста, дизенте-
риеподобных заболеваниях детей и взрослых, дизентерии,
брюшном тифе и паратифах.
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики кишечных инфекций.
2.	Бактериологическая и серологическая диагностика кишечных инфекций.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при кишечных инфекциях.
Демонстрации
1.	Мазки из читых культур возбудителей кишечных инфекций; Е. coli,
S. typhi, S. paratyphi A, Shigella sonnei.
2.	Колонии эшерихий, шигелл, сальмонелл на дифференциально-диагности-
ческих питательных средах.
3.	Агглютинирующие сальмонеллезные, дизентерийные и ОВ-коли-сыво-
ротки, брюшнотифозные монодиагностикумы, вакцины, бактериофаги (брюшно-
тифозный, дизентерийный, коли-протейный и др.), антибиотики и химиотера-
певтические препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
Занятие 1-е
1.	Бактериологическая диагностика колиэнтерита — первый этап; материал
для исследования — фекалии больного ребенка посеять на чашки со средой Эидо.
2.	Бактериологическая диагностика дизентерии и дизентериеподобных
заболеваний, вызванных эшерихиями — первый этап; материал для исследо-
вания — фекалии больного посеять на чашки со средой Плоскирева и Эндо.
3.	Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.
I. Выделение гемокультуры. Материал для исследования — кровь больного.
Первый этап: исследование гемокультуры, ранее полученной на среде Рап-
попорт'; а) отметить характер роста, наличие или отсутствие газообразования;
б) приготовить мазки, окрасить по Г раму и микроскопировать; в) сделать пересевы
в пробирку со средой Ресселя и на чашки со средой Эндо.
II. Выделение копрокультуры — первый этап; материал для исследования —
фекалии больного посеять-в пробирку со средой Мюллера или с селенитовой
средой и на чашки со средой Эндо. Наметить план второго этапа бактериоло-
гического исследования при колиэнтерите, дизентерии и дизентериеподобном
заболевании, брюшном тифе.
’ Посев на среду Раппопорт следует произвести накануне (для экономии
времени).
176
Занятие 2-е
I.	Продолжение бактериологической дигностики колиэнтерита. Второй этап
а) описать колонии, выросшие на среде Эндо; б) приготовить мазки из колонии,
окрасить по Граму и микроскопировать; в) провести серологическую идентифи-
кацию выросших на среде Эндо колоний в реакции агглютинации на стекле
с ОВ-агглютинирующими сыворотками. Сделать заключение по проведенным
исследованиям и наметить план дальнейшего анализа для установления серовара
выделенной культуры.
2.	Продолжение бактериологической диагностики дизентерии и дизентерие-
подобного заболевания. Второй этап; а) описать колонии, выросшие на средах
Плоскирева и Эндо; б) сделать пересев бесцветной колонии со среды Плоски-
рева на среду Ресселя; в) провести серологическую идентификацию выросших
на среде Эндо колоний в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующими
диагностическими сыворотками для установления серотипа выделенной культуры.
Сделать заключение.
3.	Продолжение бактериологической диагностики брюшного тифа и пара-
тифов.
1. Выделение гемокультуры. Второй этап: а) отметить характер роста гемо-
культуры на среде Ресселя и на чашке со средой Эндо; б) провести сероло-
гическую идентификацию выделенной на среде Ресселя гемокультуры в
реакции агглютинации с агглютинирующими диагностическими сыворотками.
Сделать заключение по проведенным исследованиям.
II. Выделение копрокультуры. Второй этап: а) отметить характер роста на
средах Эндо и Мюллера; б) пересеять бесцветную колонию со среды Эндо в
пробирку со средой Ресселя.
4. Серодиагностика брюшного тифа и паратифов. Учесть результаты
реакции Видаля. На основании полученных данных поставить серологический
диагноз и в положительном случае определить период заболевания брюшным
тифом.
Занятие 3-е
1. Окончание бактериологической диагностики дизентерии. Третий этап
а) отметить характер роста на среде Ресселя; б) провести серологическую
идентификацию копрокультуры в реакции агглютинации на стекле с диагнос-
тическими агглютинирующими дизентерийными сыворотками. Сделать окон-
чательное заключение.
2. Окончание бактериологического исследования копрокультуры при брюш-
ном тифе. Третий этап; а) отметить рост на среде Ресселя; б) провести серо-
логическую идентификацию копрокультуры в реакции агглютинации на стекле
с диагностическими агглютинирующими тифозной и паратифозными сыворот-
ками. Сделать окончательное заключение.
Микробиологическая диагностика колиэнтеритов
и дизентериеподобных заболеваний (эшерихиозов)
Возбудителями колиэнтеритов являются эшерихии определен-
ных серогрупп (026, 055, ОШ и др.), отличающиеся друг от
друга антигенной структурой. Дизентериеподобные заболевания
вызываются эшерихиями серогрупп 025,0112,0124 и др. Микро-
биологическая диагностика этих инфекций проводится исключи-
тельно бактериологическими методами. Бактериоскопический
метод и серодиагностика не применяются.
177
Методические указания
Бактериологическое исследование (схема 10). Испражнения
ребенка засевают на чашки со средой Эндо для получения
изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37°С до сле-
дующего дня, затем из части красной колонии (рис. 73) делают
мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. По морфоло-
гии эшерихии практически не отличаются от шигелл и саль-
монелл (рис. 74). Материал из другой части колонии используют
для постановки реакции агглютинации на стекле со смесью
ОВ-сывороток, содержащих антитела против наиболее распрост-
раненных серогрупп энтеропатогенных эшерихий. Обычно
проверяют на агглютинабельность не менее 10 колоний с
каждой чашки. При положительном результате ставят реакцию
агглютинации с сыворотками О26:В6, О55'-В5, О111:В4, О124:В17
и др., после чего делают предварительное заключение. За-
тем пересевают несколько агглютинабельных колоний
на скошенный питательный агар для получения чистых
культур. На 3-й день проверяют агглютинабельность чистых
культур в реакции агглютинации на стекле со смесью ОВ-сыво-
Схема 10. Бактериологическое исследование при колиэитеритах и дизенте-
риеподобных заболеваниях (эшерихиозах)
Материал	Испражнения
I
1-й этап	Посев на среду
Эндо
2-й этап	Характер и цвет колоний <---1	।-----> Реакция агглютинации на
Мазки, окраска по Граму <-	стекле с материалом из
отдельных колоний и сме-
сями ОВ-сывороток
Ответ

Пересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар
(чистая культура)
этап Реакция агглютинации на
стекле со смесями ОВ-сы- <—
вороток
Реакция агглютинации с
типоспецифическими «-------------
сыворотками
|__* Развернутая реакция аг-
глютинации
---> Посев на «пестрый» ряд
Окончательный ответ
178
Рис. 74. Возбудители тифо-пара-
тифозных заболеваний.
I S. typhi; 2 - S. paratyphi; 3 Е. coli.
роток, а затем с отдельными
ОВ-сыворотками. При поло-
жительном результате ставят
развернутую реакцию аг-
глютинации в пробирках с
соответствующей ОВ-сыво-
роткой. Для этого готовят
два ряда разведений агглю-
тинирующей ОВ-сыворотки.
В пробирки первого ряда
вносят живую исследуемую
культуру Е. coli, второго
ряда — ту же культуру, пред-
варительно прокипяченную на водяной бане в течение часа.
Использование в качестве антигена убитых нагреванием бак-
терий связано С наличием у живых К-антигена, который часто
препятствует проявлению О-агглютинабельности.
Микробиологическая диагностика дизентерии
Возбудителями бактериальной дизентерии являются микро-
организмы, относящиеся к роду Shigella. Современная класси-
фикация шигелл приведена в табл. 34.
Микробиологическая диагностика дизентерии проводится
главным образом бактериологическим методом.
Методические указания
Бактериологическое исследование (схема 11). Фекалии боль-
ного засевают на среду Плоскирева. При наличии в исследу-
емых испражнениях гнойных или слизисто-кровянистых комоч-
ков их выбирают петлей, промывают в изотоническом растворе
хлорида натрия и наносят на поверхность среды Плоскирева,
после чего тщательно растирают шпателем. На 2-й день проз-
рачные бесцветные колонии пересевают на среду Ресселя
179
Схема 11. Микробиологическое исследование при дизентерии
Материал Испражнения
Бактериологическое исследование
1-й этап Посев на дифференциальные среды
(П лоскирева и др.)
2-й этап
I г~
Характер и цвет колоний
Мазок, окраска по Граму *-•
Реакция агглютинации на «-
стекле со смесями дизен-
терийных сывороток
Сыворотка крови
Серодиагностика
1
Реакция агглютинации
(по типу реакции Видаля)
с дизентерийными диа-
гностикумами. РПГА с
эритроцитарными диа-
гностикумами
Ответ
3-й этап
Ответ
Пересев бесцветных
колоний на среду Рес-
селя или трехсахарную среду
J	П I
Мазок, окраска по Г раму	Посев на «пестрый» ряд
Регистрация изменений <---	----► Реакция агглютинации на
цвета среды	стекле со смесями дизен-
терийных сывороток, а за-
тем с видовыми и типовы-
ми сыворотками
Окончательный ответ
или на короткий «пестрый» ряд с лактозой и глюкозой. Остав-
шуюся часть колоний используют для постановки ориентировоч-
ной реакции агглютинации на стекле со смесью дизентерийных
сывороток и смесью сывороток против сальмонелл (для исклю-
чения брюшного тифа или сальмонеллеза). Окончательное
включение дают на 4-й день по результатам изучения фермен-
тативных свойств (табл. 35) и реакции агглютинации.
Колициногенотипирование. Шигеллы Зонне содержат разные
типы колициногенных факторов, которые обнаруживаются с
помощью специального набора индикаторных штаммов. Коли-
циногенотипирование может быть использовано для эпиде-
миологических целей.
Серодиагностика. Применяется для ретроспективного обос-
нования диагноза дизентерии при стертых формах, а также для
уточнения вида возбудителя. Ставят реакцию агглютинации по
типу реакции Видаля и РПГА с эритроцитарными диагностику-
мами Флекснера и Зонне. Диагностическим титром при дизен-
терии, вызванной шигеллами Флекснера, считают разведение
1:200, а шигеллами Зонне — 1; 100.
180
Таблица 34. Международная классификация бактерий рода Shigella
Подгруппа	Вид	Серовар	Подвар
А	Sh. dysenteriae	1-10	
В	Sh. flexneri	1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й	la, 1b 2а, 2Ь За, ЗЬЗс 4а, 4Ь
С D	Sh. boydii Sh. sonnei	1-15	
Микробиологическая диагностика брюшного тифа
и паратифов
Брюшной тиф и п^ратифы вызываются бактериями рода
Salmonella, которые по антигенной структуре относятся к серо-
группам D, А и В. Микробиологическая диагностика тифо-пара-
тифозных заболеваний проводится на основании бактериологи-
ческого и серологического исследований. Бактериоскопия
первичного материала не применяется, так как в мазках из
испражнений невозможно отличить сальмонеллы от кишечной
палочки, а в другом материале (кровь, желчь) возбудителей
слишком мало, чтобы их можно было обнаружить при микро-
скопии мазков. Исходя из особенностей патогенеза брюшного
тифа, на 1-й неделе заболевания, в период бактериемии, воз-
будителей выделяют из крови (получение гемокультуры),
со 2-й недели заболевания — из испражнений (получение коп-
рокультуры), мочи или желчи. Антитела в сыворотке накап-
ливаются при брюшном тифе в конце 1-й недели заболевания.
Методические указания
Бактериологическое исследование (схема 12). Получение
гемокультуры. В 1-й день у больного из локтевой вены шпри-
цем берут 5—10 мл крови и засевают в колбочку с 50—100 мл
среды Раппопорт. Указанные соотношения крови и среды
необходимы для подавления бактерицидного действия белков
крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18—20 ч. На
2-й день при росте тифозных бактерий наблюдается помутнение
181

w Таблица 35. Ферментативные свойства пшгелл
Вид шнгелл	Ферментация								Образование		
	лактозы	глюкозы	маннита	мальтозы	сахарозы	сорбита	дульцита	мочевины	серово- дорода	индола	каталазы
Sh. dysenteriae серовар 1	-	к .	-	-	-		-		-	-	-
Sh. dysenteriae серовары 2—10	-	к	-	-	-	-	+	-	-	+	±
Sh. flexneri серовары 1—5	-	к	+	±	±	±	-	-	-	±	+
Sh. flexneri (Sh. newcastle) серовар 6	-	К или КГ	±	-	-	+	+	-	-	-	+
Sh. boydii серовары 1—15		К	+	±	-	±	±	-	-	±	+
Sh. sonnei	(+)	К	+	±	(+)	±	+	-	-	-	+
Условные обозначения: + положительная реакция; — отрицательная реакция; (+) поздняя реакция, наступаю-
щая не ранее 2—3-го дня; ± большее число штаммов дает положительную реакцию, меньшее — отрицательную; К — фер-
ментация до кислоты; КГ - ферментация до кислоты и газа.
Схема 12. Микробиологическое исследование при брюшном тифе и паратифах
Материал	Кровь	Испражнения, желчь, моча	Сыворотка крови
(на 1-й неделе болезни)	(со 2-й недели болезни)
Бактериологическое исследование-	Серодиагностика
I
1-й этап
2-й этап
Посев на среду
Раппопорт----------
I
Регистрация измене-
ний в среде
Мазок, окраска по
Граму	<—
Посев на среду Эндо или другую-
дифференциальную среду
Высев на дифферен-
циальную среду с
дальнейшим иссле-
Характер колоний
4.
Реакция агглюти-
Посев на среду —►
обогащения (Мюл-
лера илн селени-
товую)
Реакция агглютинации
Видаля
Реакция Vi-гемагглю-
тинации *-----------
Ответ
дованием по схеме	нации на стекле со
2—3-го этапов	смесью сальмонел-
Посев на среду Ресселя или
лезных сывороток
трехсахарную среду
4
Реакция агглютинации
на стекле с полива-
лентными и моноре-
цепторными сальмо-
неллезными сыворот-
ками
4
Регистрация изменения
цвета среды
-♦Фаготипирование
Посев на «пестрый» ряд
Окончательный ответ
и изменение цвета среды. При росте паратифозных бактерий
наряду с указанными изменениями появляются пузырьки газа
в поплавке. Для ускорения ответа из среды Раппопорт делают
мазки и препараты «висячая» капля. При наличии чистой куль-
туры грамотрицательных подвижных палочек и изменении
цвета среды (или наличии газа) дают первый предварительный
ответ. Затем культуру из среды Раппопорт пересевают в про-
бирку со средой Ресселя, полагая при этом, что из крови
выделена чистая культура и можно сразу приступить к ее
идентификации. Одновременно со среды Раппопорт делают
посевы на среду Эндо для получения изолированных колоний
с целью проверки чистоты выросшей культуры.
Состав среды Ресселя: питательный агар, 1% лактозы, 0,1% глюкозы
и индикатор Андреде. Среду готовят таким образом, чтобы внизу она была
в виде столбика, а верхняя часть имела скошенную поверхность. Исследуемую
культуру засевают уколом в столбик и на поверхность среды. При ферментации
углеводов происходит покраснение среды; разрывы столбика свидетельствуют
о газообразовании. Покраснение всей среды наблюдается при ферментации
лактозы, покраснение только столбика — глюкозы, так как содержание ее в среде
в 10 раз меньше, чем лактозы. Вместо среды Ресселя можно использовать
трехсахарную среду (в ее состав входят глюкоза, лактоза, сахароза, мочевина,
некоторые соли и индикатор — феноловый красный).
На 3-й день отмечают ферментацию глюкозы на среде Рес-
селя и ставят ориентировочную реакцию агглютинации на
стекле. На основании полученных данных дают второй пред-
варительный ответ.
Для дальнейшего исследования отбирают несколько бесцвет-
ных колоний со среды Эндо и пересевают их в среду Ресселя
или скошенный питательный агар (для контроля полученных
результатов). Чистую культуру, выросшую на среде Ресселя или
скошенном питательном агаре, пересевают на среды «пестрого»
ряда и используют для постановки реакции агглютинации на
стекле со смесью групповых сывороток, а затем с адсорбирован-
ными монорецепторными О- и Н-сальмонеллезными сыворот-
ками. Окончательный диагноз устанавливают на основании дан-
ных «пестрого» ряда (табл. 36) и реакции агглютинации.
По способности разлагать ксилозу и арабинозу культуры бак-
терий брюшного тифа могут быть разделены на три фермен-
тативных типа (биовара): 1) ксилозоположительные, арабинозо-
отрицательные; 2) ксилозоотрицательные, арабинозоотрицатель-
ные; 3) ксилозоположительные, арабинозоположительные.
Определение ксилозоарабинозного признака может быть исполь-
зовано для маркировки бактерий в эпидемиологических целях.
Фаготипирование. С помощью набора стандартных Vi-фагов
определяют до 78 фаготипов S. typhi. При этом необходимым
условием является наличие в культуре Vi-антигена. Культуры
184
S. schottmuelleri дифференцируются на 11 фаготипов и под-
типов.
Получение копрокультуры. Испражнения засевают на одну из
дифференциально-диагностических сред (Эндо или Левина).
Для посева петлю кала вносят в пробирку с изотоническим
раствором хлорида натрия и готовят суспензию. После оседания
крупных комочков петлю тонкой суспензии наносят на поверх-
ность агаровой среды — на одну половину чашки. Материал тща-
тельно растирают шпателем по одной, а затем по другой поло-
вине чашки для получения изолированных колоний. Посевы
инкубируют при 37°С в течение 18—20 ч. Одновременно испраж-
нения засевают на среду обогащения Мюллера или селенитовую
среду. На этих средах удается получить рост возбудителя даже
в том случае, когда он содержится в исследуемом материале в
незначительном количестве. Посевы инкубируют при 37°С
в течение 18—20 ч.
Состав среды Мюллера: 4,5 г х. ч. мела, 90 мл питательного
бульона, 2 мл раствора Люголя и 10 мл 50% раствора гипосульфита натрия.
Среду разливают по 8—10 мл в пробирки. При взаимодействии йода и гипосуль-
фита образуется тетратионат натрия, подавляющий рост кишечной палочки,
но не препятствующий росту сальмонелл.
Селенитовая среда готовиться из основного раствора, который содер-
жит 0,5% пептона, 0,7% фосфата натрия однозамещенного, 0,3% фосфата натрия
двузамещенного, 0,4% лактозы в дистиллированной воде. К 50 мл стерильной
основной среды добавляют ex tempore 2 мл 10% раствора кислого селенисто-
кислого натрия и разливают приготовленную среду по 5—7 мл в пробирки.
Селенистокислый натрий стимулирует рост сальмонелл и подавляет сопутст-
вующую флору.
Таблица 36. Биохимические свойства тифо-паратифозных бактерий
Вид бактерии	Ферментация					Образование			Действие на ла мусовое мо- ЛОКО
	Лак- , тозы	глю- козы	маль- тозы	саха- розы	ман- нита	H2S	Nila	индо- ла	
S. typhi-	-	к	к	-	к	+	-	-	Кислая реакция
S. paratyphi А	—	кг	кг	—	кг	—	—	—	То же
S. schottmuelleri	—	кг	кг	—	кг	+	+	—	Щелочная реакция
Условные обозначения те же, что и в табл. 35.
На 2-й день изучают характер колоний, выросших на чашках
(см. рис. 73), пересевают 2—3 бесцветные колонии на среду
Ресселя л в пробирки со скошенным питательным агаром.
При отсутствии подозрительных колоний на чашках делают
185
высевы из среды Мюллера или селенитовой среды на чашки
со средой Эндо для получения изолированных колоний тифоз-
ных или паратифозных бактерий. Для ускорения ответа ставят
ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с мате-
риалом, взятым из бесцветной колонии. Далее поступают так же,
как и при идентификации гемокультуры.
Серодиапюстика. В лабораторной практике широко приме-
няется реакция агглютинации Видаля, основанная на обнаруже-
нии в сыворотке крови людей агглютининов, которые появляют-
ся в конце 1-й —начале 2-й недели заболевания, и на изучении
динамики нарастания и длительности сохранения антител.
Реакция ставится одновременно с 4 антигенами: О- и Н-брюш-
нотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Брюш-
нотифозные монодиагностикумы применяются для установления
стадии болезни, так как содержание О- и Н-антител в разные
ее периоды неодинаково. О-антитела накапливаются в разгар
заболевания и исчезают к моменту выздоровления. Н-антитела
появляются к концу заболевания и сохраняются у переболев-
ших в течение длительного времени.
У людей, вакцинированных против брюшного тифа и пара-
тифов, также наблюдается положительная реакция Видаля,
причем в довольно высоком титре, поэтому «инфекционный
Видаль» удается отличить от «прививочного» только по нараста-
нию титра агглютининов у больных в процессе заболевания.
Реакцию Видаля ставят в четырех рядах пробирок по 7 про-
бирок в каждом ряду, из которых 5 опытных и 2 контрольные.
Техника приготовления разведений сыворотки описана в табл. 16.
Для, контроля каждого диагностикума в пробирки вносят по
1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в который добав-
ляют 2 капли диагностикума. В контрольной пробирке с 1 мл
сыворотки (без диагностикума) не должно быть хлопьев. При
спонтанной агглютинации реакция не учитывается. Диагности-
ческий титр реакции Видаля равен 1 : 200.
Для серологического исследования реконвалесцентов и выяв-
ления бактерионосителей широко используют реакцию пассив-
ной Vi-гемагглютинации, с помощью которой определяют
Vi-антитела в сыворотке крови людей. В качестве антигена
используют эритроцитарный Vi-диагностикум, который представ-
ляет собой взвесь эритроцитов человека 1(0) группы, обработан-
ных формалином и сенсибилизированных Vi-антигеном брюш-
нотифозных микробов. Испытуемую сыворотку разводят от
1 :10 до 1 :1280. При положительной реакции эритроциты
покрывают дно пробирки в виде диска с зазубренными краями,
а надосадочная жидкость остается прозрачной. При отрицатель-
ной реакции, так же как и в контроле, эритроциты осаждаются
186
на дне пробирки и имеют вид диска с ровными краями («пуговки»').
Диагностическое значение имеет титр пассивной Vi-гемагглюти-
нации, начиная с 1:40 и выше. Всех лиц, сыворотки которых
дают положительный результат в РПГА с эритроцитарным Vi-ди-
агностикумом, рассматривают как подозрительных на носитель-
ство брюшнотифозных бактерий и подвергают многократному
бактериологическому обследованию.
Лабораторная диагностика кишечных инфекций, вызванных
анаэробными бактериями (бактероиды, вейллонеллы), прово-
дится исключительно с помощью бактериологического метода.
Взятие материала и выделение чистой культуры описаны в
теме 23.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Агглютинирующие ОВ-сыворотки против энтеропатогенных
кишечных палочек: ОВ-колисыворотка 026 : В6, ОВ-колисыво-
ротка 0111 :В4, ОВ-колисыворотка 055 :В5 и др. Получены
путем иммунизации кроликов взвесью эшерихий соответству-
ющей серогруппы. Применяются в реакции агглютинации для
идентификации энтеропатогенных эшерихий.
Адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентифи-
кации шигелл. Групповые и моновалентные сыворотки. Полу-
чены путем иммунизации кроликов определенными видами и
сероварами шигелл дизентерии Флекснера, Бойда и Зонне с
последующей адсорбцией лишних антител.
Сальмонеллезные групповые, адсорбированные и монорецептор-
ные О- и Н-агглютинирующие сыворотки. Получены так же,
как и предыдущие сыворотки. Применяются для установления
серогрупп и сероваров сальмонелл в реакции агглютинации.
Сальмонеллезные О- и Н-монодиагностикумы. Взвеси саль-
монелл, убитых нагреванием (О-диагностикумы) или обработкой
формалином (Н-диагностикумы). Применяются для серодиагнос-
тики брюшного тифа в реакции Видаля.
Фаги. Применяются для типирования энтеропатогенных эше-
рихий, шигелл и сальмонелл.
Химическая сорбированная тифо-паратифозно-столбнячная
вакцина. Состоит из полных антигенов, извлеченных из воз-
будителей брюшного тифа, паратифов А и В, а также столб-
нячного анатоксина, адсорбированных на гидроокиси алюминия.
Применяется для специфической профилактики брюшного тифа
и столбняка.
Дизентерийная вакцина спиртовая, сухая. Содержит шигеллы
Флекснера и Зонне. Применяется для лечения хронических
форм дизентерии.
Брюшнотифозная вакцина с секста(тетра)анатоксином. Со-
держит О- и Vi-антигены брюшнотифозных бактерий и очи-
щенные анатоксины возбудителей столбняка, газовой гангрены
и ботулизма.
Поливалентный брюшнотифозный бактериофаг. Выпускается
в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяется
для специфической профилактики брюшного тифа.
Поливалентный дизентерийный бактериофаг. Содержит разные
фаги, лизирующие шигеллы Флекснера и Зонне. Выпускается
в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяется
с лечебно-профилактическими целями.
Коли-протейный бактериофаг. Содержит фаги, лизирующие
наиболее распространенные серогруппы энтеропатогенных эше-
рихий и протей. Выпускается в жидком виде. Применяется с
лечебно-профилактическими целями.
Колибактерин. Содержит высушенные живые клетки Е. coli
штамма М17, обладающего выраженными антагонистическими
свойствами в отношении ряда кишечных патогенных бактерий.
Применяется для лечения дисбактериоза и дизентерии, глав-
ным образом у детей.
Бифидумбактерин. Содержит лиофильно высушенную взвесь
живых клеток В. bifidum. Применяется для лечения дизентерии
и хронических кишечных инфекций невыясненной этиологии
у детей.
Бификол. Содержит смесь высушенных живых бактерий
Е. coli штамма М17 и В. bifidum. Показания к применению те
же.
Антибиотики и химиотерапевтические препараты, использу-
ющиеся для лечения кишечных инфекций.
Тема 29. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ
Возбудителями холеры являются два биовара холерного
вибриона — Vibrio cholerae и Vibrio eltor, которые относятся к
сем. Vibrionliceae. Холера — острое инфекционное заболевание,
характеризующееся общей интоксикацией организма и острым
гастроэнтеритом. Чрезвычайно важна быстрая лабораторная
диагностика холеры, так как первые случаи заболевания требуют
бактериологического подтверждения для своевременного при-
нятия эффективных противоэпидемических мероприятий. Лабо-
раторная диагностика холеры проводится путем бактериоско-
пического и бактериологического исследований. Трудности диаг-
ностики связаны с дифференциацией биоваров холерных виб-
188
рионов от сходных с ними холероподобных вибрионов (Меч-
никова, Финклера, Приора и др.), широко распространенных
в природе и непатогенных для человека.
Программа занятия
1.	Изучение схемы микробиологической диагностики холеры.
2.	Бактериологическое исследование при холере.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при холере.
Демонстрация
1.	Мазки, приготовленные из культуры холерного вибриона; окраска по
Граму.
2.	Реакция иммобилизации вибриона О-противохолерной сывороткой
3.	Тесты для дифференциации холерных вибрионов.
4.	Специальный патрон для взятия и транспортировки материала при
холере.
5.	Противохолерная агглютинирующая сыворотка, холерный бактериофаг,
холерная вакцина, холероген-анатоксин, антибиотики.
Задание для выполнения лабораторной работы
Материал для исследования; испражнения больного с подозрением на
холеру; а) микроскопировать готовые мазки из исследуемой культуры; б) опре-
делить подвижность культуры, выращенной на щелочной пептонной воде;
в) отметить результаты развернутой реакции агглютинации с О-противохолерной
сывороткой; г) отметить наличие или отсутствие роста исследуемой культуры
на среде с полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать заключение
по проведенным исследованиям.
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 13). Из исследу-
емого материала (испражнения, рвотные массы) готовят мазки,
окрашивают по Граму и водным фуксином. Кроме того, из
нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в кото-
ром определяют наличие подвижных вибрионов при обычной
или фазово-контрастной микроскопии. Обнаружение в мазках
большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых
палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активноподвижных виб-
рионов в препарате «висячая» капля позволяет дать первый
предварительный положительный ответ (рис. 75).
Бактериологическое исследование. Материал засевают в раз-
личные жидкие и на плотные питательные среды, в частности,
во флаконы со щелочной пептонной водой (1% пептонная
вода, 0,5% хлорида натрия, 0,01% KNOa и 0,2% NasCOa; pH 9,0),
на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пеп-
тонной воде инкубируют при 37°С в течение 5—6 ч, на чашках —
189
§
10—12 ч. Из пленки, образующейся на пептонной воде, или из
поверхностного слоя делают мазки и препараты «раздавленная»
и «висячая» капля. Этот же материал используется для поста-
новки реакции агглютинации на стекле со специфической
противохолерной О-сывороткой. Часть пептонной воды переносят
в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой пробы.
Для этого добавляют несколько капель серной кислоты.
В положительном случае появляется розовое окрашивание
вследствие образования нитрозоиндола (из индола и нитритов,
которые образуются под влиянием холерного вибриона).
Независимо от результатов исследования делают пересев на
вторую пептонную воду. Наличие грамотрицательных вибри-
онов, агглютинирующихся О-сывороткой, позволяет дать второй
предварительный ответ. Независимо от полученных результатов
продолжают исследование, как показано на схеме 13.
Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят
по 5—6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре.
Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию
агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из
колоний. Для этого -агглютинирующую О-сыворотку разводят
в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл).
Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий.
Результат реакции агглютинации учитывают после 3—4-часовой
инкубации при 37°С.
Окончательную идентификацию культуры проводят на осно-
вании определения чувствительности выделенных культур к
холерному фагу, их гемолитических свойств, биохимической
активности и агглютинабельности противохолерной О-сыворот-
кой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и
Огава (табл. 37). Таким образом, идентификацию культур
проводят в три этапа: 1) устанавливают их принадлежность
к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных виб-
рионов в реакции агглютинации с О-сывороткой, по чувствитель-
ности к специфическому фагу и другими тестами; 3) определяют
видовые признаки культур (см. табл. 37).
Окончательное заключение о выделении и дифференцирова-
нии холерных вибрионов дают через 36—48 ч на основании
комплексного изучения основных биологических признаков
возбудителя.
Трудности при оценке результатов бактериологического
исследования встречаются при выделении атипичных холерных
вибрионов и в первую очередь не агглютинирующихся холер-
ной О-сывороткой (Н АГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут
лизироваться одним из специфических холерных фагов и обла-
дать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами.
191
Таблица 37. Тесты для лнффоренцнации холерных вибрионов
Тест	Классический холерный вибрион	Холерный вибрион Эль-Тор	Неагглютн- нирующнеся вибрионы
Агглютинация О-сывороткой	+	+	—
Агглютинация типовыми сыворотками Огава и Инаба	+	+	—
Лизис фагами; холерный фаг С (фаг IV)	+	—	±
фаг Эль-Тор II	—	+	±
Агглютинация куриных эритроцитов	—	+	±
Гемолиз эритроцитов барана	—	±	±
Рост иа агаре с 50 ЕД полимиксина	—	+	±
Гексаминовый тест	—	+	±
Реакция Фогеса — Проскауэра (образо- вание ацетилметилкарбинола)	-	+	±
Условные обозначения; + наличие признака; — отсутствие при-
знака; ± признак непостоянный.
Ускоренные методы обнаружения холерных вибрионов. 1.
Иммобилизациявибрионовхолернымисы ворот-
ками и типовыми холерными фагами. Капли
испражнений или материала с поверхности пептонной воды
обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками
Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из
них препараты «раздавленная» капля, которые исследуют в мик-
роскопе, снабженном темнопольным или фазово-контрастным
устройством. В положительном случае через 3-б. мин движение
вибрионов прекращается.
2. И.мм уноф люоресцентный метод. Препараты из
исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей про-
тивохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном мик-
роскопе. Положительным результатом считается обнаружение
в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым,
свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки.
Положительный результат можно получить через 1—2 ч после
начала исследования при концентрации вибрионов не менее
106 клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное
подращивание материала на питательных средах.
Серодиагностика. Серологическое исследование является
вспомогательным и применяется для ретроспективной диаг-
ностики холеры, выявления вибриононосителей и оценки
напряженности постинфекционного и поствакцинального им-
мунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или
РПГА, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции
лизиса in vitro.
192
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Противохолерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые
сыворотки Огава и Инаба. Получены из крови кроликов, иммуни-
зированных холерными вибрионами. Применяются для серо-
логической идентификации и типирования холерных вибрионов
в реакции агглютинации.
Холерный фаг. Типовые холерные фаги применяются для
идентификации и типирования холерных вибрионов. Полива-
лентный холерный бактерйофаг используется для лечебно-
профилактических целей.
Холерная вакцина. Взвесь убитых холерных вибрионов.
Применяется для активной иммунизации против холеры. Гото-
вится из вибрионов Эль-Тор и классических холерных вибрионов
серотипов Инаба и Огава.
Холероген-анатоксин. Взвесь убитых холерных вибрионов,
выращенных в жидкой питательной среде. Препарат очищен от
балластных веществ, выпускается в сухом виде. Применяется
для специфической профилактики холеры.
Антибиотики; тетрациклин, морфоциклин, сигмамицин.
Тема 30. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ И ИНТОКСИКАЦИЙ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ
Наиболее распространенными возбудителями пищевых токси-
коинфекций являются сальмонеллы — Salmonella typhimurium,
S. enteritidis, S. choleraesuis, S. heidelberg, S. anatum, S. derby.
Реже эти заболевания вызываются Е. coli, Proteus vulgaris,
Proteus morganii и другими энтеробактериями.
Патогенез и клиническая картина пищевых токсикоинфекций
определяются проникновением в желудочно-кишечный тракт
большого количества соответствующих бактерий с заражен-
ными пищевыми продуктами (мясо, рыба), подвергшимися не-
достаточной термической обработке. При этом сохранившие
жизнеспособность бактериальные клетки быстро размножаются
в благоприятных условиях. Одновременное проникновение
в кишечник массивной дозы возбудителя, его последующее
размножение и разрушение бактериальных клеток приводят
к освобождению значительного количества эндотоксина, ока-
зывающего воздействие на интрамуральный нейрорецепторныи
аппарат тонкой кишки, периферические сосуды брюшной полос-
ти. Это сопровождается нейродистрофическими изменениями
в стенке кишки и поражением клеток других органов. При
пищевых токсикоинфекциях освобождение желудочно-кишеч-
193
8-639
ного тракта от возбудителей во многих случаях происходит
довольно быстро, иногда через несколько часов после начала
заболевания. Однако в ряде случаев сальмонеллы длительно,
в течение нескольких недель и месяцев, сохраняются в кишеч-
нике, выделяясь с испражнениями бактерионосителя. Бакте-
риемия при этих заболеваниях, как правило, не возникает.
Лабораторная диагностика проводится бактериологическим
методом. Материалом для исследования являются как испраж-
нения, рвотные массы, промывные воды желудка больных лю-
дей, так и остатки пищи и продуктов, из которых она была
приготовлена. Это необходимо для установления источника
инфекции.
Пищевые интоксикации бактериальной природы возникают
при попадании с пищей в желудочно-кишечный тракт бакте-
риальных токсинов, из которых наибольшую опасность пред-
ставляют энтеротоксины Staph, aureus, Cl. perfringens и особенно
ботулонейротоксин Cl. botulinum. Для возникновения пищевой
интоксикации не обязательно присутствие в пищевом продукте
живых возбудителей, так как это заболевание может быть
воспроизведено при помощи чистых токсинов.
Микробиологическая диагностика пищевых отравлений
проводится методом выявления токсинов, а также выделения
чистых культур возбудителей — продуцентов токсинов в остат-
ках пищи и материале, взятом от больных.
Программа занятия
1.	Бактериологическая диагностика пищевых токсикоинфскций, вызванных
сальмонеллами, шигеллами Зонне, эшерихиями и протеем.
2.	Определение токсинов Cl. perfringens и Cl. botulinum.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при указанных заболеваниях.
Демонстрация
1.	Мазки' из чистых культур сальмонелл, шигелл Зонне, эшерихий и
протея, окрашенные по Граму.
2.	Мазки из чистых культур токсигенного штамма Staph, aureus, окрашенные
по Граму, Cl. perfringens и Cl. botulinum, окрашенные по Граму и Ожешко.
3.	Реакции нейтрализации токсина Cl. botulinum моновалентными антиток-
сическими сыворотками А, В и Е.
4.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Бактериологическое исследование. Описать характер колоний, выросших
на чашках с дифференциально-диагностической средой после посева испраж-
нений больного и остатков пищи — возможных источников пищевой токсикоин-
фекции.
2.	Поставить реакцию агглютинации на стекле с монорецепторными саль-
монеллезными сыворотками.
194
3.	Отметить результаты изучения биохимических свойств исследуемой
культуры сальмонелл по ранее засеянному «пестрому» ряду. Сделать заключение
на основании полученных данных.
4.	Отметить характер роста посева на питательный агар по Шукевнчу и на
основании данных ранее засеянного «пестрого» ряда определить вид простея.
Сделать заключение.
Методические указания
Пищевые токсикоинфекции. Материал для иссле-
дования: фекалии, рвотные массы, промывные воды желудка
больного и остатки пищевых продуктов — возможные источ-
ники и факторы передачи инфекции.
Бактериологическое исследование. Производится путем посева
материала на дифференциально-диагностические среды (Эндо,
Плоскирева и др.) для выделения чистой культуры сальмонелл,
шигелл или эшерихий, а также в конденсационную воду ско-
шенного питательного агара для выделения протея. После
инкубации посевов при 37°С в течение 20—24 ч отмечают цвет
колоний на чашках с дифференциальной средой и наличие
«ползучего» роста, характерного для протея, в пробирке со
скошенным питательным агаром. Подозрительные колонии
пересевают; на скошенный питательный агар для получения
чистых культур и одновременно ставят с ними реакцию агглю-
тинации на стекле, используя смеси диагностических сывороток
к разным сероварам сальмонелл. Затем, в зависимости от резуль-
татов реакции, ставят повторную реакцию с тем же материалом
и с соответствующими монорецепторными сыворотками к
определенным сероварам сальмонелл. На следующий день
с чистой культурой сальмонелл ставят развернутую реакцию
агглютинации с соответствующей монорецепторной сывороткой
и делают посев на среды «пестрого» ряда. При выделении
одного и того же серовара сальмонелл из организма больных
людей и пищевого продукта делают окончательное заключение
об этиологии пищевой токсикоинфекции и источнике заболе-
вания. Важнейшие биохимические признаки и антигенная струк-
тура ряда сальмонелл приведены в табл. 38.'
При наличии ползучего роста на скошенном питательном
агаре из конденсационной воды петлей берут материал для
приготовления препарата «висячая» капля с целью установления
подвижности и для мазка, который окрашивают по Граму и
микроскопируют. Вид протея устанавливают на основании
биохимических признаков после посева выделенной чистой
культуры на среды «пестрого» ряда и других признаков (табл. 39).
Пищевые интоксикации. Материал для исследова-
ния: рвотные массы, промывные воды желудка больных и
8*
195
Таблица 38. Биохимические свойства и антигенная структура сальмонелл
|	Группа	Вид	Ферментация							Образо- вание		Антигены		
		ГЛЙХОЗЫ	лактозы I	маннита	ксилозы	сахарозы	дульцита	рамнозы	индола	H2S	Н — жгутиковые		
											О —• соматичес кие	фа-ml	фаза 2
В	S. typhimurium	+	-	+	±	-	+	±	-	+	1,4 5,12	i	1,2
	S. derby.	+	-	+	+	-	+	+	—	+	1,4 12	f, g	-
	S. heidelberg	+	-	+	+	±	4-	+	—	+	4,5 12	г	-
С	S. choleraesuis	+	-	+	+	-	±	+	-	±	6,7	с	1,5
	S. newport	+	-	+	+	-	4-	+	-	+	6,8	с, h	1,2
D	S. enteritidis	+	-	+	+	-	±	+	±	+	1,9 и	g, m	-
Е	S. anatum	+	-	+	+	-	+	+	-	+	3,10	е, h	1,6
Условные обозначения те же, что и в т?Ал. 35.
остатки пищи (чаще кремы, сметана, мороженое, но и мясные
продукты, в которых хорошо размножаются стафилококки).
Энтеротоксин стафилококков экстрагируют изотоническим раст-
вором хлорида натрия и определяют его присутствие, и серо-
логическую специфичность реакцией преципитации в геле с
иммунными антитоксическими сыворотками А, В, С. Техника
постановки реакции описана выше (см. рис. 58). Можно исполь-
зовать биопробу — скормить изучаемый материал котятам-
сосункам, у которых стафилококковый энтеротоксин вызы-
вает рвоту и понос через 30—60 мин после скармливания.
С целью выделения чистой культуры стафилококка иссле-
дуемые материалы, которые могут содержать жизнеспособ-
196
Таблица 39. Биохимические тесты для дифференциации бактерий рода
Proteus
Признак	Р. vulgaris	Р mirabilis	Р. morganii	Р. rettgeri
Ферментация:				
маннита	—	—	—	+
мальтозы	+	—	—	—
ксилозы	+	+	—	—
Разжижение желатина	+	+	—	—
Образование HsS	+	+	+	—
Ассимиляция цитрата	—	—	—	+
Образование индола	+	—	+	+
Условные обозначения те же, что и в табл. 35.
ные бактерии, засевают в чашки с ЖСА. Полученные по
схеме 2 чистые культуры проверяют на способность проду-
цировать энтеротоксины.
Для эпидемиологического анализа массовых стафилокок-
ковых интоксикаций проводят фаготипирование выделенных
из разных источников культур с помощью стафилококкового
набора фагов.
Материалом для выявления энтеротоксина Cl. perfringens
являются мясные, рыбные консервы и другие продукты, из
которых экстрагируют токсин изотоническим раствором хло-
рида натрия. Экстракт центрифугируют и надосадочную
жидкость вводят внутрибрюшинно белым мышам или внутри-
кожно морским свинкам. Гибель животных в течение пер-
вых 3-4 ч или появление некроза на месте внутрикожных
инъекций свидетельствует о наличии токсина. Для его
идентификации ставят реакцию нейтрализации с антитокси-
ческими сыворотками Cl. perfringens.
Выделение чистой культуры Cl. perfringens и Cl. botulinum
производят, используя методы выделения анаэробных бакте-
рий (см. схему 4).
Материалом для выявления ботулотоксина служат сыворот-
ка крови, моча, испражнения, промывные воды желудка
больного, остатки пищи или подозреваемые продукты (кол-
басы, мясные, рыбные, фруктовые, овощные консервы и др.).
Для обнаружения ботулотоксина в сыворотке крови больного
ставят РПГА с эритроцитами, нагруженными моновалентными
антитоксическими противоботулиническими , сыворотками
типов А, В, Е. В качестве контроля берут нормальную
сыворотку крови. Обнаружение ботулотоксина в пищевых про-
дуктах и определение токсигенности Cl. botulinum проводят
в реакции нейтрализации токсина на белых мышах. Для оп-
197
ределения серотипа токсина реакцию ставят с моновалентны-
ми сыворотками типов А, В, Е. При' нейтрализации токсина
гомологичной антитоксической сывороткой мыши остаются
живыми.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Сальмонеллезные групповые, адсорбированные и монорецеп-
торпые О- и Н-агглютинируюшие сыворотки. Применяются
для постановки реакции агглютинации с целью определения
вида сальмонелл, выделенных при пищевой токсикоинфекции.
Адсорбированная агглютинирующая сыворотка Зонне. Исполь-
зуется для идентификации шигелл Зонне, выделенных при
пищевой токсикоинфекции.
Стафилококковые бактериофаги (международный набор).
Применяются для фаготипирования стафилококков с целью
эпидемиологического анализа пищевой интоксикации.
Антитоксическая сыворотка Cl. perfringens. Применяется
с диагностической целью в реакции нейтрализации исследуе-
мого токсина на белых мышах.
Противоботулинические сыворотки. Получены из крови
лошадей, гипериммунизированных ботулиническими анатокси-
нами. Очищены и концентрированы методом диаферм-3.
Для лечебно-профилактических целей готовят противоботули-
нические сыворотки четырех типов: А, В, Е, F. Монова-
лентные сыворотки перечисленных типов используются в
диагностических целях для определения серотипа токсина
в исследуемом материале в реакции нейтрализации на бе-
лых мышах.
ВОЗБУДИТЕЛИ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ
К зоонозным инфекциям относятся такие заболевания,
возбудители которых передаются человеку от животных.
Они принадлежат к разным семействам и родам: возбудите-
ли чумы — Yersinia pestis, туляремии — FranciselJa tularensis,
бруцеллеза —Brucella abortus, Br. melitensis, Br. suis; сибирской
язвы —Вас. anthracis, лептоспирозов — Leptospira icterohaemorra-
giae, L. grippotyphosa. Перечисленные бактерии отличаются
высокой вирулентностью и вызывают особо опасные инфек-
ционные заболевания. Работа с данными бактериями прово-
дится в специальных лабораториях с обязательным соблюде-
нием режима безопасности.
198
Для лабораторной диагностики зоонозных инфекций приме-
няются бактериоскопические, бактериологические, серологи-
ческие методы исследования, биопробы. Кроме того, ставятся
кожно-аллергические пробы.
Тема 31. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Программа занятия
1.	Изучение схем микробиологической диагностики чумы, туляремии,
бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза.
2.	Бактериологические и серологические исследования при зоонозных
инфекциях.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при зоонозных инфекциях.
Демонстрация
1.	Мазки, приготовленные из органов зараженных животных и чистых
культур возбудителей зоонозных инфекций.
2.	Препарат из культуры лептоспиры в темном поле зрения.
3.	Рост Вас. anthracoides на питательных средах.
4.	Реакция агглютинации — лизиса лептоспир.
5.	Реакция Хеддлсона для серодиагностики бруцеллеза.
6.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Микробиологическое исследование при чуме. Материал для исследования:
гной из бубона, органы погибших грызунов с подозрением на чумную инфекцию.
Микроскопировать готовые мазки. Поставить предварительный диагноз.
Наметить ход дальнейшего исследования с учетом использования тестов для
дифференциации возбудителя чумы от бактерий псевдотуберкулеза грызунов,
2.	Серодиагностика туляремии. Материал для исследования: сыворотка
крови больного с подозрением на туляремию. Провести учет результатов реакции
агглютинации с парными сыворотками. Сделать заключение.
3.	Серологическая диагностика бруцеллеза. Материал для исследования;
сыворотка крови больного с подозрением на бруцеллез. Провести учет резуль-
татов реакции агглютинации Райта. Сделать заключение.
4.	Микробиологическое исследование при сибирской язве. Материал для
исследования: содержимое везикул и пустул,- отделяемое карбункула и язвы:
а) микроскопировать готовый препарат. Поставить предварительный диагноз.
Наметить ход бактериологического исследования; б) определить наличие си-
биреязвенного антигена в исследуемом материале (шерсти погибшего живот-
ного) реакцией кольцепреципитации Асколи.
5.	Микробиологическая диагностика лептоспироза. Отметить результаты
реакции агглютинации — лизиса лептоспир и сделать заключение.
Микробиологическая диагностика чумы
Возбудитель чумы Yersinia pestis относится к роду Yersinia,
сем. Enterobacteriaceae, в который также включена группа
бактерий, вызывающих иерсиниозы, — Y. pseudotuberculosis,
199
s»
Окончательный ответ
200
Y. enterocolitica. В естественных условиях Y. pestis содержат-
ся у грызунов, вызывая у них эпизоотии со смертельным ис-
ходом. Исключительную важность приобретает выделение
культур чумных бактерий от больных людей, так как первые
случаи заболевания нуждаются в бактериологическом под-
тверждении для своевременного принятия эффективных про-
тивоэпидемических мер.
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 14). Из исследуе-
мого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и вод-
ным раствором метиленового синего. Бактерии чумы имеют
вид палочек овоидной формы (0,5 X 1,7 мкм), грамотрицатель-
ны. В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо
заметно биполярное распределение краски (рис. 76). Встре-
чаются полиморфные формы.
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
засевают на чашки с питательным агаром. Посевы инкуби-
руют при 25—28°С. Первичное изучение посевов производят
через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде
«батистового платочка», которые образуют вирулентные
R-формы микроба. Мало- и авирулентные бактерии формиру-
ют S-формы колоний. Идентификацию чистой культуры
проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру
роста, антигенным и биохимическим свойствам, чувствитель-
ности к специфическому фагу и биопробе.
На бульоне бактерии чумы образуют пленку со спуска-
ющимися нитями, напоминающими сталактиты; ферментиру-
ют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин
не разжижают. Бактерии чумы содержат групповой термоста-
бильный соматический антиген и специфический термола-
бильный капсульный антиген, который обнаруживается только
у вирулентных штаммов.
В случае исследования материала, взятого у погибших
грызунов, проводится дифференциальная диагностика с
бактериями псевдотуберкулеза грызунов Yersinia pseudotubercu-
losis на основании характера роста на специальных средах,
ферментации рамнозы, адонита и других признаков (табл. 40).
Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры
из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.
Наиболее чувствительными лабораторными животными явля-
ются морские свинки, которым материал вводят подкожно.
Внутрибрюшинно материал вводят в том случае, если он
не загрязнен другими бактериями. Загнивший материал
201
Таблица 40. Дифференциально-диагностические признаки возбудителей чумы
и псевдотуберкулеза
Признак	Y. pestis	Y. pseudotube?- culosis
Подвижность			4-при 22°С
Рост наголо дном (без пептона) 3% агаре	—	+
Уреазная активность Лизис'фагами;	—	+
Y. pestis	+	—
Y. pscudotuberculosis Наличие бактериоциногенных (пестицино-	—	+
генных) плазмид	+	—
Условные обозначения те же, что и в табл. 35.
втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области
живота. После гибели животных (на 3—7-й день, в зависимости
от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают
патологические изменения органов и производят бактериоло-
гическое исследование по схеме 14.
Ускоренные методы лабораторной диагностики. 1. Иммуно-
флюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие
возбудителя как в патологическом материале, так и в
объектах окружающей среды (вода, воздух), а также в
пищевых продуктах и эктопаразитах. С этой целью исполь-
зуют люминесцентную видоспецифическую противочумную
сыворотку, люминесцентные противокапсульную и противосо-
матичес^ую сыворотки.
2. РТПГА применяется для обнаружения антигенов бакте-
рий чумы в исследуемом материале с помощью стандартной
противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на
эритроциты.
Микробиологическая диагностика туляремии
Возбудитель туляремии Francisella tularensis относится к
роду Francisella, не включенному в определенное семейство.
В естественных условиях встречается у грызунов, вызывая
у них смертельную инфекцию. Для диагностики туляремии
у людей обычно применяют кожно-аллергическую пробу и
серологические реакции. Микробиологическая диагностика
проводится в специальных лабораториях путем заражения
лабораторных животных, так как непосредственное выделение
возбудителя на питательных средах из крови или другого
материала, взятого от больных людей, удается редко.
202
Схема 15. Микробиологическое исследование при туляремии
Материал Содержимое бубонов, кровь, органы животных
“I	I——
Бактериоскопи- Биопроба и бактериологическое
ческое исследо- исследование
вание
I
1-й этап Мазок, окраска Заражение морской свинки
по Граму
Сыворотка крови
1
Серодиагностика
Развернутая Щ1ГА
реакция аг-
глютинации
2-й этап
Ответ
Вскрытие трупа
Ответ
3-й этап
Мазки, окраска по
Г раму и Романов-
скому — Г имзе
Ответ
Посевы на
нутую желточную
или другие среды
свер-
Характер роста
Мазок, окраска
по Граму
Л"
Реакция агглютит
нации с противо-
туляремийной сы-
вороткой
Окончательный ответ
Больной человек
кожно-аллергическая проба с тулярином
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 15). Из исследуемо-
го материала готовят мазки, окрашивают по Граму и мети-
леновым синим. Бактерии туляремии весьма полиморфны.
В чистой культуре они представляют собой очень мелкие
микроорганизмы (0,3—0,5 мкм) коккобактериальной формы
(рис. 77). В мазках из органов преобладают палочковидные
формы. Спор не образуют, имеют небольшую капсулу, не-
подвижны, грамотрицательны, иногда выражена биполярная
окраска.
Бактериологическое исследование и биопроба. Применяются
для выделения чистой культуры бактерий туляремии. Наибо-
лее чувствительными животными являются белые мыши и
морские свинки, которые заболевают со смертельным исхо-
дом даже при подкожном введении единичных бактерий.
Выделение бактерий туляремии проводят на свернутой
яично-желточной среде, глюкозоцистиновом кровяном агаре.
Вирулентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие,
гладкие, беловатого цвета с голубоватым оттенком.
203
Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии
бактериальных клеток, характеру роста, биохимическим и
антигенным свойствам. Бактерии туляремии в отличие от
бруцелл разлагают глюкозу, мальтозу и маннозу до кислоты.
Биохимические свойства этих бактерий выявляются на
специальной плотной среде с ограниченным содержанием
белка. Бактерии туляремии содержат оболочечный антиген,
с которым связаны их вирулентные и иммуногенные свойст-
ва, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам
близки к бруцеллам.
Серодиагностика. Ставится реакция агглютинации с туляре-
мийным диагностикумом по типу реакции Видаля (см.
с. 186). Относительно позднее появление агглютининов в
крови (на 2-й неделе болезни) затрудняет применение этой
реакции для ранней диагностики, однако их длительное
сохранение делает возможной ретроспективную диагностику.
Диагностический титр реакции равен 1:100. Обязательно
прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных
сыворотках). Наиболее чувствительным методом серодиагности-
ки туляремии является РПГА, которая бывает положительной
в конце 1-й —начале 2-й неделе заболевания. Титры сыворо-
ток в разгар заболевания достигают 1:1280—1:2560 и выше.
Для ускоренной диагностики применяется кровяно-капель-
ная реакция: кровь из пальца больного наносят на обезжи-
ренное- предметное стекло, добавляют каплю дистиллирован-
ной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности-
кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в кро-
ви агглютининов в диагностическом титре (1:100 и выше)
в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума;
при титрах ниже диагностических агглютинация происходит
через 2—3 мин.
Кожно-аллергическая проба. Выпускаются два вида тулярина:
для внутрикожной пробы и для накожной. Проба высокочувст-.
вительна и дает положительные результаты у больных,
начиная с 3—5-го дня болезни, но также и у переболевших
и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна про-
водиться с осторожностью
Микробиологическая диагностика бруцеллеза
Возбудители бруцеллеза — бактерии рода Brucella, не вклю-
чены в определенное семейство. По происхождению и неко-
торым биологическим особенностям различают следующие
виды: Вг. melitensis — возбудитель бруцеллеза мелкого рога-
того ’ скота, Вг. abortus — возбудитель бруцеллеза крупного
204
Окончательный ответ
Больной человек -----► кожно-аллергическая проба с бруцеллином
205
Рис. 78. Brucella melitensis (чистая
культура).
рогатого скота, Br. suis —воз-
будитель бруцеллеза свиней.
Все три вида патогенны для
человека. Наиболее вирулент-
ным является первый вид;
третий вид вызывает споради-
ческие случаи заболеваний.
Микробиологическая диа-
гностика обычно проводится
путем серологических иссле-
дований (реакция Райта и Хедцлсона). К выделению культур
бруцелл прибегают сравнительно редко.
Методические указания
Бактериологическое исследование (схема 16). Для получения
гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены
больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного
бульона. Один из них (для выделения культур Br. melitensis)
инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для
выделения первичной культуры Br. abortus) — в атмосфере
с 10% СО2. В первых генерациях бруцеллы растут очень
медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не
менее месяца. В то же время рост лабораторных культур
наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют
бесцветные с перламутровым блеском колонии, в бульоне —
помутнение и слизистый осадок. В мазках, окрашенных по
Граму, обнаруживаются мелкие (от 0,3—0,5 до 1,5 мкм)
грамотрицательные коккобактериальные или более удлиненные
формы (рис. 78). Они неподвижны, спор не образуют, в
определенных условиях появляется видимая капсула.
Для быстрой идентификации бруцелл ставят реакцию аг-
глютинации со специфическими агглютинирующими сыворот-
ками на стекле и определяют чувствительность к специфи-
ческому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углево-
ды. Их дифференцируют по образованию H2S, чувствитель-
ности к СО2, действию анилиновых красок (основной фук-
син и тионин) и другим признакам.
Серодиагностика. Чаще всего используют реакцию агглю-
тинации Райта с бруцеллезным диагностикумом, которая
ставится по типу реакции Видаля (см. с. 186). Реакция доста-
206
точно специфична. Положительные результаты отмечаются
спустя. 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у
переболевших многие годы. Диагностический титр реакции
равен 1:200.
Для ускоренной серодиагностики применяется реакция
агглютинации Хеддлсона, которая ставится с неразведенной
сывороткой больного и с концентрированным антигеном —
диагностикумом, окрашенным метиленовым синим.
Обезжиренное квадратное стекло размером 9 X 12 см делят
на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиен-
ты, как указано в табл. 41. Капли смешивают палочкой,
начиная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно
подогревают над пламенем примерно до 37°С в течение
2 мин. При положительной реакции в первые минуты по-
являются хлопья синего цвета. Реакция положительна при
наличии агглютинации на ++ в дозах сыворотки 0,02—
0,01 мл.
Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют
РПГА, реакцию иммунофлюоресценции, опсонофагоцитарную
реакцию, РСК, определение неполных антител и др. Эти
серологические реакции обладают достаточно высокой чувст-
вительностью и специфичностью. В поздние периоды заболе-
вания процент положительных серологических реакций (аг-
глютинации, РПГА и РСК) начинает снижаться и большее
диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая
проба и реакция Кумбса, поэтому комплексный сероаллерги-
ческий метод является наиболее надежным в диагностике
бруцеллеза.
Биопроба. Применяется для выделения чистой культуры
из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или
содержащего небольшое количество бруцелл. Материал
вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в
Таблица 41. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддлсона
Ингредиенты, мл	Квадрат				
	1	2	3	4	5
				контроль сыворотки	контроль диа- гностикума
Сыворотка	0,04	0,02	0,01	0,02		
Диагностикум Изотонический раствор хло-	0,03	0,03	0,03	—	0,03
рида натрия	—	—	—	0,03	0,03
207
паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после
заражения, морских свинок —через 30. Кусочки органов и
лимфатических узлов засевают на питательные среды для
получения чистой культуры и ее идентификации.
Кожно-аллергическая проба (реакция Бюрне). На ладонной
поверхности предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцел-
лина. При наличии аллергии уже через 6—8 ч могут появить-
ся гиперемия кожи и болезненная отечность. Учет реакции
производят через 24 ч (см. рис. 50). Реакция чувствительна
и появляется не только у больных и переболевших, но и
у’ вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая
оценка должна производиться с осторожностью.
Микробиологическая диагностика сибирской язвы
Возбудитель сибирской язвы — спорообразующая аэробная
палочка Вас. anthracis, относится к семейству Bacillaceae.
Наиболее достоверным методом лабораторной диагностики
сибирской язвы является выделение из исследуемого мате-
риала культуры возбудителя. Диагностическую ценность
представляют также реакция термопреципитации по Асколи
и кожно-аллергическая проба.
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 17). Изучение
окрашенных по Граму мазков из патологического материала
позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой
грамположительную крупную (1-2X6-10 мкм) неподвижную
стрептобациллу. В организме больных и на белковой пита-
тельной среде микробы образуют капсулу (рис. 79), в почве —
споры (см. рис. 18).
Бактериологическое исследование. Исследуемый материал
засевают на чашки с питательным агаром, кровяным агаром
и в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют
при 37°С в течение 18—20 ч. В бульоне культура Вас. anthra-
cis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные
штаммы образуют колонии в R-форме, имеющие под малым
увеличением микроскопа вид «львиной гривы» или «головы
медузы». Авирулентные или слабовирулентные бактерии
образуют S-формы колоний.
Сибиреязвенная палочка обладает сахаролитическими свойст-
вами, не гемолизирует эритроциты, медленно разжижает же-
латину (в виде елочки верхушкой вниз). Под действием
пенициллина сибиреязвенные палочки образуют сферопласты,
208
Окончательный ответ	-х
Больной человек -► кожно-аллергическая проба с антраксином
90Q
имеющие вид «жемчужин». Это явление используется для
дифференциации Вас. anthracis от непатогенных бацилл.
Биопроба. Исследуемый материал вводят подкожно белым
мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных
вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов,
делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя.
Серодиагностика. При необходимости диагностировать
сибирскую язву у павших животных или у людей, умерших
от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму
сибирской язвы, а также для определения зараженности
сырья (кожа, мех, шерсть) ставят реакцию термопреципитации
по Асколи. Кусочки органов, шерсти, меха измельчают и
кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида
натрия в течение 10—15 мин, после чего фильтруют до
полной прозрачности. Контрольный термоэкстракт готовят
из того же материала, взятого от здорового животного (табл. 42).
Таблица 42. Постановка реакции термопреципитации (форма протокола)
Ингредиенты, мл	Опытная проба	N? контрольной пробирки			
		1	2	3	4
Сибиреязвенная преци- питирующая сыворотка	0,3		0,3	0,3	о,3
Нормальная кроличья сыворотка	-	0,3	-	-	—
Осторожно наслаивать по стенке пробирки
Испытуемый термоэкст- ракт Стандартный сибиреяз- венный антиген Контрольный нормаль- ный термоэкстракт Изотонический раствор хлорида натрия	0,3	0,3	0,3	0,3	03
Результаты					
Ускоренная диагностика сибирской язвы проводится мето-
дом иммунофлюоресценции, который позволяет выявить
капсульные формы Вас. anthracis в экссудате. Мазки из
экссудата через 5—18 ч после заражения животного обраба-
210
Рнс. 80. Лептоспира в темном поле
зрения.
тывают капсульной сибиреяз-
венной антисывороткой, а за-
тем флюоресцирующей анти-
кроличьей сывороткой, мечен-
ной'родамином. В препаратах,
содержащих капсульные ба-
циллы, наблюдается желто-
зеленое свечение возбудителя.
Кожно-аллергическая проба.
Ставится на внутренней по-
верхности предплечья — внут-
рикожно вводят 0,1 мл антраксина. При положительной реак-
ции через 24 ч появляются гиперемия и инфильтрат.
Микробиологическая диагностика лептоспирозов
Возбудители лептоспироза относятся к порядку Spirochaeta-
les, роду Leptospira.'Патогенные лептоспиры, циркулирующие
в нашей стране, относятся к виду L. interrogans, включающему
18 серогрупп, объединяющих 160 сероваров. Из них чаще всего
встречаются L. icterohaemorragiae — возбудитель желтушного
лептоспироза (болезни Васильева — Вейля) и L. grippotyp-
hosa — возбудитель безжелтушного лептоспироза (водная лихо-
радка).
Материалом для микробиологического исследования в
разных стадиях болезни служат кровь, ликвор и моча.
В первые 5 дней заболевания проводят бактериоскопическое
и бактериологическое исследования крови и биопробы, с
10-го дня —бактериоскопию мочи, а с конца 1-й недели —
серологическое исследование (реакция агглютинации — лизиса).
Методические указания
Бактериоскопическое исследование (схема 18). Из исследуе-
мого материала готовят препарат в «раздавленной» капле
и микроскопируют. его в темном поле зрения. В положитель-
ном случае видны серебристые лептоспиры, представляющие
собой подвижные изогнутые нити длиной 6—9 мкм с первич-
ными и вторичными завитками (рис. 80), которые имеют вид
загнутых крючкообразных концов, придающих лептоспирам
S-образную форму. Для живых лептоспир характерны актив-
ное поступательное (прямолинейное) движение, вращение
211
на месте и перемещение по кругу. Ввиду очень слабой
восприимчивости лептоспир к красителям исследуют только
нативные препараты.
Бактериоскопия крови (а при’ менингеальных явлениях и
ликвора) позволяет установить диагноз в ранней стадии
заболевания. Однако отрицательные результаты не исключают
лептоспирозной природы заболевания.
Бактериологическое исследование. Культуры лептоспир вы-
деляют на водно-сывороточной или фосфатно-сывороточной
среде с добавлением инактивированной кроличьей сыворотки.
Исследуемый материал засевают у постели больного в 3—5
пробирок, заливают стерильным вазелиновым маслом (для
ограничения доступа кислорода воздуха) и инкубируют при
температуре 28°С не менее 2 мес. Вследствие того что
при росте лептоспир среда остается прозрачной, через каждые
5—6 дней из среды готовят препараты для микроскопии в темном
поле. Серогруппу выделенной культуры устанавливают в
реакции агглютинации с набором диагностических сыворо-
ток.
Биопроба. Внутрибрюшинно или подкожно заражают мор-
ских свинок, крольчат или золотистых хомячков. Животных
держат под наблюдением в течение месяца. При заболевании
или гибели животного готовят препараты из крови, мочи,
материала вскрытия, микроскопируют в темном поле и де-
лают посевы для выделения чистой культуры лептоспир.
Серодиагностика. Ставится реакция агглютинации — лизиса
с живыми эталонными культурами лептоспир разных серогрупп
и сероваров. Учет результатов реакции проводят в препа-
ратах «раздавленная» капля в темном поле. В положитель-
ном случае отмечают агглютинацию и лизис лептоспир.
При этом в первых разведениях сыворотки наблюдается
полное растворение лептоспир, частичный лизис или зернис-
тое набухание, в последующих разведениях — агглютинация
лептоспир и появление агломератов в виде «паучков».
Диагностический титр реакции равен 1: 100. Максимальный
титр антител (1:1000—1:10000 и выше) наблюдается на
15—30-й день болезни. Ввиду того что у части переболевших
антитела сохраняются в течение многих лет, реакцию агглю-
тинации рекомендуется ставить повторно для установления
нарастания титра антител.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Бруцеллезный диагностикум. Взвесь убитых бруцелл, окрашен-
ных метиленовым синим. Применяется для серологической
212
Схема 18. Микробиологическое исследование при лептоспирозах
213
диагностики бруцеллеза при постановке реакции агглютинации
Райта и Хеддлсона.
Туляремийный диагностикум. Взвесь убитых бактерий туля-
ремии. Применяется при постановке реакции агглютинации для
серодиагностики туляремии.
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Получена из
крови кролика, гйпериммунизированного культурой сибиреяз-
венных бацилл. Применяется для постановки реакции термо-
преципитации по Асколи.
Чумиой бактериофаг. Используется для идентификации
Y. pestis.
Сибиреязвенный бактериофаг. Применяется для идентифика-
ции Вас. anthracis.
Бруцеллин. Фильтрат 3-недельных бульонных культур
Brucella melitensis, Вг. abortus, Br. suis, убитых нагреванием.
Применяется для постановки кожно-аллергической пробы
Бюрне.
Тулярин. Взвесь туляремийных бактерий (вакцинного
штамма), убитых нагреванием. Используется для постановки
кожно-аллергической пробы.
Антраксин. Белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс,
извлеченный при гидролизе сибиреязвенных бацилл. Приме-
няется для постановки кожно-аллергической пробы.
Чумная живая сухая вакцина. Высушенная живая культу-
ра Y. pestis вакцинного штамма EV. Используется для про-
филактики чумы.
Туляремийная живая сухая накожная вакцина. Высушен-
ная живая культура вакцинного штамма Francisella tularensis.
Применяется для профилактики туляремии.
Накожная сухая живая бруцеллезная профилактическая
вакцина. Взвесь вакцинного штамма Br. abortus. Применяется
для профилактики бруцеллеза.
Бруцеллезная лечебная вакцина. Взвесь убитых нагреванием
бруцелл. Используется с лечебной целью, способствует
десенсибилизации организма.
Сибиреязвенная живая вакцина СТИ. Названа в честь
Санитарно-технического института, в котором была впервые
получена. Представляет собой высушенную взвесь живых спор
сибиреязвенных бацилл. Применяется для профилактики
сибирской язвы.
Противосибиреязвенный иммуноглобулин. Г амма-глобулиновая
фракция сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных
живой сибиреязвенной вакциной и вирулентным штаммом
Вас. anthracis. Используется с профилактической и лечебной
целью.
214
Лептоспирозный антигеи. Живая 7—10-дневная культура основ-
ных сероваров лептоспир. Применяется для серодиагностики
лептоспирозов в реакции агглютинации и лизиса.
Лептоспирозная вакцина. Содержит культуры основных
сероваров лептоспир, распространенных в пределах СССР,
убитых нагреванием и консервированных фенолом. Применяется
для профилактики лептоспирозов в эндемичных очагах
инфекции.
Лептоспирозный иммуноглобулин. Применяется для лечения
и профилактики лептоспирозов.
Антибиотики: стрептомицин, тетрациклины, левомицетин.
ВОЗБУДИТЕЛИ КРОВЯНЫХ И ТРАНСМИССИВНЫХ
ИНФЕКЦИЙ (СПИРОХЕТОЗОВ И РИККЕТСИОЗОВ)
Возбудители кровяных и трансмиссивных инфекций, пере-
дающиеся членистоногими (вши и клещи), относятся к разным
порядкам бактерий —Spirochaetales и Rickettsiales (табл. 43).
Таблица 43. Возбудители бактериальных кровяных и трансмиссивных
инфекций
Возбудители, вызывающие
возвратные тифы	риккетсиозы
Передающиеся вшами;	Сыпные тифы:
Borrelia reccurentis	Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi (mooseri)
Передающиеся клещами;	Пятнистые лихорадки;
Borrelia caucasica и другие виды	Rickettsia rickettsii. Rickettsia akari Лихорадка тсутсугамуши: Rickettsia tsutsugamushi
Возбудителями спирохетоза (возвратного тифа) являются бор-
релии, а риккетсиозов — риккетсии. Они отличаются друг от
друга разнообразными признаками, но прежде всего тем, что
риккетсии, являясь облигатными внутриклеточными паразитами,
не растут на питательных средах. Возвратный тиф и риккет-
сиозы характеризуются специфическими для каждой группы
заболеваний патогенетическими и клиническими признаками.
Источником инфекции при возвратном тифе, вызванном
Borrelia reccurentis, является человек, а переносчиком — вошь.
Если заболевание вызывают Borrelia caucasica, то источником
215
инфекции служат грызуны, а переносчикомклещ. Природными
хозяевами риккетсий являются различные членистоногие
и млекопитающие. Передаются они также членистоногими —
вшами и клещами.
Основным методом лабораторной диагностики спирохетозов
является бактериоскопическое исследование мазков крови
или нативных препаратов в темном поле, а риккетсиозов —
серодиагностика, поскольку бактериоскопия крови не дает
положительных результатов, а выделение чистых культур на
искусственных питательных средах невозможно.
Тема 32. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ВОЗВРАТНОГО ТИФА И РИККЕТСИОЗОВ
Программа занятия
1.	Методы лабораторной диагностики возвратного тифа и риккетсиозов.
2.	Бактериоскопическая и серологическая диагностика спирохетозов.
3.	Серодиагностика риккетсиозов.
4.	Диагностические,профилактические и лечебные Препараты, применяемые
при этих заболеваниях.
Демонстрация
1.	Препарат из чистой культуры лептоспир в темном поле.
2.	Препарат боррелий возвратного тифа из крови больного. Окраска по
Романовскому—Гимзе.
3.	Микропрепараты риккетсий в пораженных клетках и из сыпнотифозной
вакцины. Окраска по Здродовскому.
Схема 19. Микробиологическое исследование при возвратном тифе
Материал
Кровь
Микроскопическое исследование
Мазок, окраска
водным фукси-
ном
J.
Препарат «толстая
капля, окраска по
Романовскому —
Гимзе
Биопрооа
!
Заражение морской свинки
Ответ
2-й этан
Мазок из крови,
окраска фукси-
ном
Препарат «толс-
тая» капля, окраска
по Романовско-
му-Гимзе
Окончательный ответ
216
4.	Методы выделения риккетсий в куриных эмбрионах, клеточных' куль-
турах и путем заражения животных.
5.	Риккетсиозные диагностические и профилактические препараты (кор-
пускулярные и растворимые антигены, сыпнотифозная вакцина).
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Микроскопическая диагностика возвратного тифа. Микроскопировать пре-
параты крови «толстой» капли, окрашенные по Романовскому—Гимзе, и мазок,
окрашенный фуксином. Сделать заключение по данным микроскопического
исследования.
2.	Учесть результаты реакции агглютинации риккетсий с сыворотками
крови больных эпидемическим и крысиным сыпным тифом по данным,
полученным из серологической лаборатории. Определить титр агглютининов
в реакциях с антигенами из риккетсий Провацека и Музера, сопоставить ре-
зультаты и-обосновать серологический диагноз заболевания.
3.	Учесть результаты РСК, поставленных для дифференциации эпидемичес-
кого и повторного сыпного тифа (болезнь Брилла—Цинссера) по данным,
полученным из серологической лаборатории.
Методические указания
Микробиологическая диагностика возвратного тифа
Бактериоскопическое исследование (схема 19). Основной
метод лабораторной диагностики возвратного тифа. У боль-
ного во время приступа болезни (высокой температурной
реакции) берут кровь, готовят мазки и окрашивают фуксином,
а также препарат «толстая» капля, который окрашивают по
Романовскому—Гимзе. Borrelia reccurentis представляют собой
тонкие изогнутые нити длиной 8—16 мкм с 4—12 завитками
(рис. 81). В мазках они окрашиваются фуксином в красный
цвет, в препарате «толстая» капля — в фиолетово-розовый.
Биопроба. Кровью больных заражают морских свинок. Через
5—6 дней при положительном результате в крови животных
появляется большое количество боррелий.
Микробиологическая диагностика риккетсиозов
Материалом для выделения возбудителей при всех видах
риккетсиозов служит кровь, взятая у больного в возможно
раннем периоде лихорадки (схема 20). Однако выделение
риккетсий с диагностической целью практически не произво-
дится, поскольку они размножаются только в клеточных куль-
турах и куриных эмбрионах, а для выделения риккетсий
Провацека приходится предварительно заражать кровью вшей.
Биопроба. Применяется для дифференциации возбудителей
эндемических риккетсиозов от риккетсий Провацека. Для этого
самцу морской свинки внутрибрюшинно вводят кровь боль-
217
ного. При большинстве эндемических риккетсиозов у живот-
ных развивается специфический периорхит, сопровождающийся
накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек
яичка.
Для обнаружения риккетсий в переносчиках, органах зара-
женных животных и клеточных культурах готовят препараты,
окрашивают их по Здродовскому и микроскопируют. Рик-
кетсии Провацека полиморфны. В зависимости от стадии
инфекции, вида клеточной культуры различные морфологи-
ческие типы риккетсий обнаруживаются в цитоплазме и ядрах
зараженных клеток (рис. 82). Использование иммунофлюорес-
центного метода облегчает обнаружение риккетсий.
Серодиагностика. Серологическое исследование является
наиболее распространенным и доступным методом лаборатор-
ной диагностики риккетсиозов. Оно проводится в реакциях
агглютинации, РСК и РПГА (см. схему 20).
Схема 20. Микробиологическое исследование при риккетсиозах
Материал
Сыворотка крови
1-й этап
2-й этап
Кровь больного, переносчики, органы
зараженных животных
Выделение возбудителей Биопроба
Введение в жел- Заражение кле- Заражение сам-
точный мешок точных куль-	цов морских
куриного эмб- тур	свинок
риона
Препараты, окраска
по Здродовскому
Вскрытие жи-
вотных
Серодиагностика
Реакция РСК РПГА
агглюти-
нации рик-
кетсий
Ответ
I I Г
Ответ Иммунофлюорес-
центный метод
Ответ
Препараты из орга-
нов, окраска по Здро
довскому
Ответ
Реакция агглютинации риккетсий применяется для
серодиагностики всех риккетсиозов и характеризуется высокой
специфичностью. Реакция ставится в пробирках с двукратными
разведениями исследуемой сыворотки крови (1 :50,1 :100 и т. д.).
К каждому разведению сыворотки в объеме 0,25 мл добавляют
по 0,25 мл соответствующего антигена. Через 18 ч инкубации
при 37° С учитывают результаты реакции, не встряхивая про-
218
бирок. Интенсивность реакции обозначают следующим образом:
++++ полное просветление с нежным мелкозернистым осад-
ком на дне пробирки в виде зонтика; +-1—I- неполное про-
светление с таким же осадком; ++ незначительное просвет-
ление с зернистым осадком; + незначительный зернистый
осадок. Положительной считается реакция, которая проявляется
не менее чем на ++.
РСК ставят по обычной методике (см. с. 121) с использованием
корпускулярных и растворимых антигенов риккетсий. Реакция
считается положительной при задержке гемолиза не менее
чем на ++. Специфичность РСК позволяет дифференцировать
риккетсиозы.
РПГА ставят с растворимым риккетсиозным антигеном,
адсорбированным на поверхности эритроцитов. Исследуемые
сыворотки разводят от 1 :250 до 1 :64 000. В отличие от РСК
по РПГА нельзя провести внутригрупповую дифференцировку
риккетсиозов. Однако РПГА позволяет определить фазу инфек-
ции, поскольку гемагглютинирующие антитела накапливаются
в высоком титре на протяжении инфекционного процесса и
титр их быстро падает в период реконвалесценции, а через
6 мес после выздоровления они не обнаруживаются. Исполь-
зование РСК в сочетании с РПГА позволяет дифференцировать
текущее заболевание от перенесенного в прошлом (анамнести-
ческого).
Серологическое дифференцирование первичного (эпидемичес-
кого) и повторного сыпного тифа (болезнь Брилла) основана
на образовании при этих двух формах болезни различных клас-
сов иммуноглобулинов — IgM (19S) и IgG(7S) соответственно.
Дифференциация IgM-антител от IgG-антител проводится по их
различной чувствительности к действию 2-меркаптоэтанола,
цистеина или других редуцирующих веществ, которые вызывают
разрыв дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на
субъединицы, лишенные активности антител. IgG при этом не
Таблица 44. Результаты РСК при дифференцировании первичного сыпного
тифа от болезни Брилла
219
изменяются. Дифференцирование первичного сыпного тифа от
болезни Брилла проводится путем постановки РСК с испыту-
емой исходной сывороткой и обработанной 2-меркаптоэтанолом
или цистеином. В случае первичного сыпного тифа, для ко-
торого характерно преобладание IgM-антител, наблюдается
снижение титра антител в обработанной сыворотке не менее
чем в 4 раза по сравнению с интактной исходной сывороткой
(табл. 44). При болезни Брилла, протекающей с преобладанием
IgG, титр антител в обеих сыворотках будет примерно оди-
наковым (допускается снижение титра не более чем в 2 раза).
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Риккетсиозные антигены сухие корпускулярные. Взвесь
убитых риккетсий, выращенных в курином эмбрионе и хорошо
очищенных от примесей. Применяется для постановки реакции
агглютинации, РПГА и РСК.
Риккетсиозные антигены сухие растворимые. Получены из
суспензии риккетсий путем экстрагирования и обработки эфи-
ром. Используются для постановки РСК и РПГА.
Сухая живая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е„
(ЖКСВ-Е). Смесь живой культуры риккетсий Провацека (вак-
цинный штамм Е), выращенного в курином эмбрионе, с раст-
воримым антигеном вирулентного штамма риккетсий Провацека.
Применяется для активной иммунизации против сыпного тифа.
ВОЗБУДИТЕЛИ ВЕНЕРИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Для возбудителей венерических заболеваний характерен
половой путь передачи инфекции. К ним относятся возбудитель
сифилиса — бледная трепонема, возбудитель гонореи — гонококк,
негонорейных уретритов — стафилококки, стрептококки, урет-
ральные микоплазмы и хламидии, возбудитель мягкого шан-
кра—гемофильная палочка Дюкрея (табл. 45).
Указанные в табл. 45 микроорганизмы вызывают различные
по патогенетическим и клиническим признакам заболевания.
Кокки и уретральные микоплазмы избирательно поражают
эпителий уретры, шейки матки, палочка Дюкрея — слизистую
оболочку мочеполовых путей и лимфатические сосуды. Бледная
трепонема вызывает генерализованную инфекцию, сопровож-
дающуюся поражением внутренних органов (печени) и ЦНС.
Хламидии трахомы вызывают венерический лимфогранулема-
тоз, а также конъюнктивит новорожденных или бленнорею
с включениями, характеризующиеся инфильтрацией конъюнк-
220
Таблица 45. Возбудители венерических заболевании
Наименование возбудителей и заболеваний, вызванных
бактериями	спирохетами	микоплазмами и хламидиями
Neisseria gonorrhoeae — го- норея Staphylococcus aureus, Streprococcus pyogenes — уретриты Haemophilus ducreyi — мягкий шанкр	Treponema pallidum — сифилис	Mycolasma hominis. Mycoplasma urealyticum — уретриты Chlamidia trachomatis — вене- рический лимфогрануле- матоз
тивы. Микробиологическая диагностика этих заболеваний
проводится разными методами в зависимости от свойств
возбудителя, его способности расти на питательных средах,
локализации, периода заболевания и т. д. Микробиологическая
диагностика стафилококковых или стрептококковых уретритов
проводится так же, как и других заболеваний, вызванных
этими бактериями.
Тема 33. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
УРЕТРИТОВ, МЯГКОГО ШАНКРА И СИФИЛИСА
Программа занятия
1.	Микробиологическая диагностика гонореи и негонорейных уретритов.
2.	Микробиологическая диагностика мягкого шанкра.
3.	Микробиологическая диагностика сифилиса.
Демонстрация
1.	Мазки из гноя и чистых культур гонококков, стрептококков и стафило-
кокков. Окраска по Граму.
2.	Мазки из отделяемого язвы при мягком шанкре, содержащие Haemophilus
ducrey. Окраска метиленовым синим и по Граму.
3.	Колонии Mycoplasma horn inis на питательном агаре или фотографии этих
колоний.
4.	Мазок из отделяемого твердого шанкра. Окраска Treponema pallidum
методом серебрения и при контрастировании тушью.
5.	Антигены для реакций Вассермана и осадочных реакций.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Микроскопировать мазки из уретрального гноя, окрашенные по Граму.
Сделать заключение о возможном возбудителе уретрита.
2.	Учесть поставленную для серодиагностики хронической гонореи реакцию
Борде—Жангу. Сделать заключение по результатам реакции.
3.	Учесть реакции Вассермана и осадочные, поставленные для серодиагности-
ки сифилиса. Сделать заключение по результатам реакций.
221
Методические указания
Материал для исследования: гной или слизь из уретры,
сперма, гной из шеечного канала, а также нити и осадок мочи
лиц обоего пола.
Микробиологическая диагностика гонореи
и негонорейного уретрита
Бактериоскопическое исследование (схема 21). Из иссле-
дуемого материала готовят мазки и окрашивают по Граму.
В положительном случае обнаруживают кокки. Дифференцирова-
ние стафилококков, стрептококков и гонококков проводится
на основании взаимного расположения клеток, локализации их
внутри или вне лейкоцитов, окраски по Граму. Стафилококки
и стрептококки являются грамположительными кокками, кото-
рые располагаются, как правило, вне лейкоцитов. Гонококки —
грамотрицательные диплококки бобовидной формы (0,96—1 мкм),
располагающиеся внутри лейкоцитов (рис. 83). Положительный
бактериоскопический диагноз ставится в основном при острой
форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической
гонорее бактериоскопическое исследование часто дает отри-
цательный результат.
Бактериологическое исследование’. Исследуемый материал
петлей засевают на чашки с сывороточным или асцитическим
питательным агаром для получения изолированных колоний.
Посевы инкубируют при 37°С в течение 24—72 ч. Гонококки
образуют круглые прозрачные колонии, напоминающие капли
росы, в отличие от более мутных колоний стрептококка или
пигментированных колоний стафилококка, которые также будут
расти на данной среде. Подозрительные колонии пересевают
в пробирки с той же средой для получения чистых культур,
которые идентифицируют по сахаролитическим свойствам
на средах «пестрого» ряда. Гонококк в отличие от других
гноеродных кокков ферментирует только глюкозу с образованием
кислоты.
Микробиологическая диагностика уретрита,
вызванного микоплазмой
Бактериоскопия не применяется, поскольку обнаружить
Mycoplasma hominis или Mycoplasma urealyticum в патологи-
ческом материале не представляется возможным.
1 Бактериологическое исследование при бленнорее проводят точно так же.
222
Бактериологическое исследование. Проводится путем посева
материала, взятого из уретры, петлей на твердую питательную
среду в чашку Петри и уколом в пробирку с полужидкой
средой того же состава. В качестве питательной среды исполь-
зуют триптический перевар бычьего сердца, пептон, хлорид
натрия, к которому добавляют дрожжевой экстракт и пеницил-
лин (1000 ЕД) для задержки роста бактериальной микрофлоры.
Посевы инкубируют при 37°С в течение 48 ч. Микоплазма
образует колонии в виде яичницы-глазуньи с врастающим в
среду центром и полупрозрачной периферией. Идентификацию
выделенной культуры микоплазмы проводят по ферментации
углеводов, разложению аргинина и серологическим свойствам
в реакции ингибиции роста культуры специфической сывороткой
и нейтрализации метаболизма аргинина той же сывороткой.
М. hominis в отличие от других видов микоплазм не фермен-
тирует углеводы и разлагает аргинин.
Микробиологическая диагностика мягкого шанкра
Материал для исследования: отделяемое язвы (мягкого
шанкра).
Бактериоскопическое исследование. Проводится путем мик-
роскопии мазков, окрашенных по Граму и метиленовым синим.
Материал
Схема 21. Микробиологическое исследование при гонорее и бленнорее
Гной из мочеполовых органов, осадок мочи, гной Сыворотка крови
из конъюнктивы глаза при бленнорее
Серодиагностика
Бактериоско-
пическое ис-
следование
Бактериологическое исследо-
вание
1-й этап
Мазок, окраска
по Граму
Посев на сывороточный пи-
тательный агар в чашку
Петри
РСК
Ответ
Ответ
2-й этап Характер колоний ♦--------
Мазок, окраска по Граму «-
 3-й этап
Пересев на сывороточный пи-
тательный агар (чистая куль-
тура)
п 1 n I
Посев на «пест- Определение чувст-
рый» ряд вительности к анти-
биотикам
Окончательный ответ
223
Схема 22 Микробиологическое исследование при сифилисе
Материал Отделяемое твердого
шанкра, пунктат лимфати-
ческих узлов, отделяемое
кожных поражений при
вторичном сифилисе
Сыворотка крови, ликвор
I
Серодиагностика
1
Микроскопическое ис-
следование
т ——
Нативный препарат для
микроскопии в темном
поле
I
Реакция Вассермана
РИГА-»----
Реакция иммобилиза-
ции трепонем
Осадочные реакции <-
Закса — Витебского,
Кана
—> Иммунофлюорссцент-
ное исследование
Ответ
Ответ
Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, располага-
ющихся в виде длинных цепочек, позволяет подозревать при-
сутствие возбудителя — палочки Дюкрея—Унны.
Бактериологическое исследование. Проводится путем выде-
ления чистой культуры возбудителя. Материал засевают на
кровяной агар или другие среды, содержащие дефибринирован-
ную кровь. На этих средах гемофильная палочка Дюкрея—
Унны через 48—72 ч образует мелкие круглые колонии, окру-
женные зоной гемолиза. Идентификацию выделенной культуры
проводят по ферментации сахаров и по способности агглюти-
нироваться сывороткой этого же больного.
Кожно-аллергическая проба. Ставится с антигеном из гемо-
фильных бактерий Дюкрея—Унны для подтверждения диагноза.
Микробиологическая диагностика сифилиса
Наиболее достоверный метод лабораторной диагностики
сифилиса — выявление возбудителя в пробах, взятых у больных
в ранних стадиях заболевания, путем бактериоскопического
исследования в темном поле (схема 22).
Методы и материал, используемые для лабораторной диаг-
ностики сифилиса, зависят от периода заболевания.
Бактериоскопическое исследование. Проводят при первичном
сифилисе во время появления твердого шанкра. Материалом
для исследования служат отделяемое шанкра, содержимое
регионарных лимфатических узлов, из которого готовят препа-
рат «раздавленная» капля и исследуют в темном поле. В поло-
жительном случае видны тонкие извитые нити длиной 6—14 мкм,
имеющие 10—12 равномерных мелких завитков правильной
224
|Рис. 84. Treponema pallidum в
F темном поле зрения.
формы (рис. 84). Для блед-
ной трепонемы характерны
маятникообразные и посту-
пательно - сгибательные
движения. При локализации
твердого шанкра в полости
-рта приходится дифферен-
цировать бледную трепо-
нему от сапрофитных тре-
понем, являющихся пред-
ставителями нормальной микрофлоры организма. В этом случае
решающее диагностическое значение имеет обнаружение ти-
пичных трепонем в пунктате регионарных лимфатических узлов.
Серодиагностика. Наиболее доступна и применяется как
основной метод диагностики сифилиса во всех периодах забо-
левания. Ставятся РСК, реакция Вассермана, осадочные реак-
ции Кана и Закса—Витебского (цитохолевая), реакция иммоби-
лизации трепонем и реакция непрямой иммунофлюоресценции.
Реакцию Вассермана ставят одновременно с тремя
антигенами: 1) специфическим, содержащим антигены возбу-
дителя — разрушенные ультразвуком трепонемы, 2) неспецифи-
ческим — кардиолипиновым (экстракт бычьего сердца с лецити-
ном и холестерином); 3) неспецифическим — спиртовым экстрак-
том липоидов из мышцы сердца быка с холестерином. Иссле-
дуемую сыворотку разводят 1:4 и разливают в 4 пробирки
по 0,1 мл. В табл. 46 показана схема постановки этой реакции.
Первый период сифилиса является серонегативным и харак-
теризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50% больных
реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 йед
после появления твердого шанкра. Во втором и третьем периодах
сифилиса частота положительных реакций достигает 75—90%.
После проведенного курса лечения реакция Вассермана стано-
вится отрицательной.
Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса
можно использовать реакцию Вассермана с ликвором, применив
те же антигены, что и для реакции с сывороткой больного.
Параллельно реакции Вассермана ставятся две осадочные
реакции; Кана и Закса—Витебского (цитохолевая).
Для их постановки используют сыворотку больного и соот-
ветствующие антигены (табл. 47 и 48).
9—639
225
Непрямая реакция иммуноф люоресценции
наиболее специфична. Антигеном является взвесь тканевых
трепонем. Сыворотку больного инактивируют так же, как для
реакции Вассермана, и разводят 1;200. На предметные стекла
наносят капли антигена, высушивают и фиксируют 5 мин в
ацетоне. Затем на препарат наносят сыворотку больного, через
30 мин промывают и высушивают. Следующим этапом является
Таблица 46. Постановка реакции Вассермана
Ингредиенты, мл	№ пробирки			
	1	2	3	4 (контроль)
Инактивированная испытуемая сы-				
воротка	0,1	о,1	о,1	о,1-
Изотонический раствор хлорида натрия	0,4	0,4	0,4	0,9
Антиген Ns 1, разведенный по титру	0,5	—	—	—
Антиген N? 2, разведенный по титру	—	0,5	—	—
Антиген N? 3, разведенный по титру	—	—	0,5	—'
Комплемент (в рабочей дозе)	0,5	0,5	0,5	0,5
В термостат на 45 мин				
Гемолитическая система (сенсибили-				
зированная)	1,0	1,0	1,0	1,0
В термостат на 40—60 мин в зависимости от наступления гемолиза в контроле
Регистрация результатов реакции после наступления гемолиза в контроле
Результат
Условные обозначения: -ЦЧ полная задержка гемолиза; — ге-
молиз.
обработка препарата флюоресцирующей сывороткой против
глобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминес-
центного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.
Реакция иммобилизации трепонем является
специфической реакцией для диагностики сифилиса. Принцип
реакции заключается в угнетении движения бледных трепонем
(иммобилизация) антителами сыворотки крови в присутствии
комплемента. Трепонемы получают из яичка кролика, заражен-
ного экспериментальным сифилисом. Яичко измельчают в
специальной среде, в которой трепонемы сохраняют подвиж-
ность. Ставят реакцию следующим образом: взвесь тканевых
226
Таблица 47. Постаноика реакции Кана
Ингредиенты, мл	Ns пробирки					
	1	2	3	4	5	6
Антиген Испытуемая сыворотка Изотонический раствор хлорида натрия	0,05 0,15	0,025 0,15	0,0125 0,15	0,05 0,15	0,025 0,15	0,0125 0,15
Тщательно встряхивать в теч	ение 3 м	ИН				
Изотонический раствор хлорида натрия	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Встряхивать 1 мин						
Результаты при положи- тельной реакции	4-Н-	+++	-н-+	—	—	—
Условные обозн дение хлопьев; — отсутствие	а ч е н и хлопьев	я: +++	появлен	ие прицг	шитата	и выпа-
(подвижных) трепонем соединяют в пробирке с исследуемой
сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контроль-
ную пробирку вместо исследуемой сыворотки наливают сыво-
ротку здорового человека, в другую — вместо свежего компле-
мента добавляют инактивированный, неактивный. После
выдерживания при 35°С в анаэробных условиях (анаэростат)
из всех пробирок готовят препарат «раздавленная» капля и
в темном поле определяют количество подвижных и непод-
вижных трепонем. Процент специфически иммобилизованных
спирохет определяют по формуле:
где Тк — число подвижных трепонем в контроле (с инактиви-
рованным комплементом); То~ число подвижных трепонем в
опыте (с активным комплементом). Результат реакции считают
положительным, если процент иммобилизации выше 50, слабо-
положительным — от 31 до 50, сомнительным —от 21 до 30
и отрицательным — ниже 20.
9*
227
Таблица 48. Постановка реакции Закса — Витебского
Ингредиенты, мл	№ пробирки		
	опытная	контрольные	
		с антигеном	с сывороткой
	1	2	3
Испытуемая сыворотка	0,2	—	0,2
Антиген	0,1	о,1	—
Спирт 95%, разведенный 1 ; 2 Изотонический раствор хлорида	—	—	0,1
натрия	—	0,2	—
Встряхивать 1 мин, затем оставить при комнатной температуре на 30 мин
Изотонический раствор хлорида натрия	1,о	1,0	1,0
Результаты при положительной реакции	-м—	—	-
Условные обозначения те же, что и в табл. 47.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Гонококковый антиген. Взвесь убитой культуры гонококка.
Применяется для постановки РСК.
Гонококковая вакцина. Взвесь гонококков, убитых нагрева-
нием. Используется для вакцинотерапии хронической гонореи,
а также для «провокации» при диагностике этого заболевания.
Антигены для реакции Вассермана: № 1 — специфический
из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком; No 2 —
спиртовой экстракт липоидов из мышцы сердца быка с добав-
лением 0,3% холестерина (неспецифический) ; № 3 —кардиоли-
пиновый (также неспецифический), — высокоочищенный экст-
ракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав
липоидов и смешанный в определенной пропорции с лецитином
и холестерином.' Антигены разводят согласно инструкции
и используют в рабочих дозах, указанных на этикетках.
Антиген Кана. Для постановки осадочной реакции Кана
разводят в соответствии с указаниями на этикетке.
Антиген цитохолевый. Для постановки осадочной реакции
228
Закса—Витебского разводят по титру, указанному на этикетке.
Этот антиген более концентрированный по сравнению с
антигеном Кана, что позволяет быстрее учитывать поставлен-
ную с ним осадочную реакцию.
Антибиотики и химиотерапевтические Препараты: пенициллин,
тетрациклины и др.
Таблица 49. Возбудители вирусных респираторных инфекций
Наименование вирусов	Вызываемые заболевания
днк-1	Ир у с ы
Семейство Adenoviridae Аденовирусы	Риниты, ларингиты, трахеобронхиты, ОРЗ, пневмонии, отиты, острый конъюнктивит
Семейство Herpesviridae Вирус герпеса 1-го типа Вирус герпеса 2-го типа Вирус ветряной оспы и опоясываю- щего лишая	Острый гингивостоматит у малень- ких детей, герпетическая экзема, кератоконъюнктивит, герпетиче- ская лихорадка Герпес новорожденных (генерализо- ванный, генитальный герпес) Ветряная оспа у детей, опоясываю- ющий лишай у взрослых
РНК-вирусы	
Семейство Orthomyxoviridae Вирусы гриппа-А Вирусы гриппа В и С	Грипп (эпидемии, пандемии, спора- дические случаи) Грипп (спорадические случаи, эпи- демии)
Семейство Paramyxoviridae Вирусы парагриппа, болезни Ньюкастла, респираторно-синци- тиальный вирус (РСВ) Вирус паротита Вирус кори	ОРЗ Паротит Корь
Семейство Coronaviridae Коронавирусы	ОРЗ
Семейство Picomaviridae Риновирусы Вирусы Коксаки Aio, An, А24, Вз, Аг, Ал, As и др. Вирус ЕСНО20 и др.	Риниты, бронхиты, ОРЗ ОРЗ Герпангина ОРЗ
Семейство Reoviridae Реовирусы	ОРЗ, пневмонии (редко)
229
Лабораторная диагностика вирусных инфекций
Для лабораторной диагностики вирусных инфекций исполь-
зуют вирусологические, серологические и биологические
методы исследования. Среди них наиболее трудоемкими
являются ^вирусологические, заключающиеся в заражении
исследуемым материалом клеточных культур или куриных
эмбрионов. В связи с различной чувствительностью клеточных
культур к вирусам приходится одновременно заражать несколько
первичных или перевиваемых культур. Некоторые вирусы
могут быть обнаружены при заражении лабораторных животных.
Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью
серологических реакций: нейтрализации, РСК, РТГА, преци-
питации в агаре и др. Выбор той или другой реакции связан
с особенностями антигенной структуры исследуемого вируса.
Выделение вируса и его идентификация требуют сравнительно
много времени: от 7—10 до 30 дней и более. Это объясняется
тем, что во многих случаях приходится 2—3 раза пассировать
вирус в культуре клеток для его накопления (слепые пассажи).
Поэтому особое значение для ускорения проведения анализов
имеет иммунофлюоресцентный метод, позволяющий в неко-
торых случаях обнаружить и идентифицировать вирус в иссле-
дуемом материале в течение 30—60 мин.
Серодиагностика вирусных инфекций носит в основном
ретроспективный характер и применяется для подтверждения
диагноза. Чаще всего ставят РСК и РТГА, реже реакцию
нейтрализации и др. не менее чем с двумя сыворотками одного
и того же больного, взятыми в разные сроки заболевания
(парные, сыворотки) для обнаружения нарастания титра антител.
Особое значение вирусологических и серологических иссле-
дований состоит в том, что только на основании полученных
данных можно провести эпидемиологический анализ вспышек
вирусных заболеваний для установления источников инфекции
и путей циркуляции вируса среди людей и животных как в
эпидемическом, так и в межэпидемическом периодах.
ВОЗБУДИТЕЛИ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ
ИНФЕКЦИЙ
Возбудители респираторных вирусных инфекций относятся
к разным семействам РНК- и ДНК-co держащих вирусов (табл. 49).
Они объединены в одну группу на основании способности
проникать в организм преимущественно через слизистую обо-
лочку верхних дыхательных путей, а также общих принципов
лабораторной диагностики. Приведенные в табл. 49 вирусы
230
вызывают главным образом поражения респираторного тракта.
Однако некоторые из них могут поражать другие ткани и органы
человеческого организма. Так, ряд вирусов, например вирус
паротита, преимущественно поражает слюнные железы, ткани
яичек у мальчиков и другие органы, а вирус краснухи вызывает
системное поражение лимфатических узлов, эмбриональных
тканей у беременных (см. на с. 229, табл. 49).
Для респираторного тракта наиболее характерны смешанные
инфекции, вызванные вирусными, вирусно-бактериальными,
вирусно-микоплазменными ассоциациями, что необходимо
учитывать при лабораторной диагностике. При всех респиратор-
ных инфекциях возбудитель локализуется в верхних дыхатель-
ных путях, поэтому материалом для исследования служат мазки
и смывы из носоглотки, а при поражении легких — мокрота
и промывные воды бронхов. При герпесе и ветряной оспе
вирусы также обнаруживаются в высыпаниях на слизистой
оболочке полости рта и на коже. Вирусемия наблюдается
лишь при самых тяжелых формах заболеваний, вызванных
перечисленными вирусами, а также при детских инфекциях:
кори, паротите, краснухе, ветряной оспе.
В лабораторной диагностике ОРЗ наиболее широкое приме-
нение нашли экспресс-методы: иммунофлюоресценция и рино-
цитоскопия, позволяющие в течение 2—3 ч поставить ориен-
тировочный диагноз. Вирусологические методы с выделением
Й идентификацией возбудителя используются преимущественно
для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, вызы-
ваемых данными вирусами. Серологическая диагностика при
гриппе и других ОРЗ носит ретроспективный характер, так как
накопление антител происходит в период реконвалесценции
(через 2—3 нед после начала заболевания). Несколько более
раннее накопление антител характерно для детских инфекций.
Для серодиагностики используют РТГА, РСК и реакцию
нейтрализации вируса.
Тема 34. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА ГРИППА, ПАРАГРИППА И АДЕНОВИРУСНОЙ
ИНФЕКЦИИ
Программа занятия
1.	Изучение схемы диагностики респираторных вирусных инфекций.
2.	Экспресс-методы диагностики.
3.	Вирусологическая диагностика гриппа и других респираторных вирусных
инфекций.	,
4.	Серодиагностика гриппа и других респираторных вирусных инфекций.
5.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при указанных заболеваниях.
231
Е
в-
232
Демонстрация
1.	Иммунофлюоресцентный метод экспресс-диагностики гриппа и ОРЗ.
2.	Риноцитоскопия при гриппе и аденовирусной инфекции.
3.	Вакцины, иммуноглобулины, лечебные сыворотки, диагностикумы, диаг-
ностические моно- и поливалентные сыворотки.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Исследовать полученную из зараженных куриных эмбрионов амниотичес-
кую и аллантоисную жидкость на присутствие вируса гриппа в реакции гемаг-
глютинации.
2.	Учесть результаты идентификации выделенного вируса гриппа в РТГА.
Сделать заключение.
3.	Учесть результаты идентификации аденовирусов, выделенных в культуре
клеток, в РСК. Сделать заключение.
4.	Оценить результаты серодиагностики разных респираторных вирусных
инфекций в РТГА и РСК.
Методические указания
Материал для исследования: смывы из носоглотки, мокрота,
мазки из зева. Риноцитоскопическое исследование является
ориентировочным экспресс-методом лабораторной диагностики
гриппа. С поверхности нижней носовор раковины больных
берут мазки-отпечатки (с помощью узких стекол со шлифо-
ванным краем или пластинок из плексигласа). Препараты окра-
шивают смесью основного фуксина и метиленового синего.
В цитоплазме цилиндрического эпителия, а также в цитоплазме
дегенерированных макрофагов, в лейкоцитах располагаются
ширококонтурированные включения, окрашенные в красный
цвет. Риноцитоскопическое исследование не является специфи-
ческим методом диагностики гриппа, однако данный метод
позволяет дифференцировать грипп от аденовирусных инфекций,
при которых наблюдаются деструкция клеток, вакуолизация
ядер и образование внутриядерных включений.
При репродукции аденовирусов в эпителиальных клетках
наблюдаются характерные цитопатические изменения, сущест-
венно отличающиеся от тех, которые вызываются другими виру-
сами: своеобразная группировка дегенерированных клеток в
виде гроздьев на периферии клеточного пласта и быстрое
отслоение пораженных клеток от поверхности стекла. В культурах
фибробластов цитопатические изменения развиваются медлен-
нее и характеризуются резким набуханием клеток с распадом
ядра. Для аденовирусной инфекции эпителиальных клеток и
фибробластов характерно образование внутриядерных вклю-
чений.
Экспресс-диагностика (схема 23). Иммунофлюоресцентный
233
метод Кунса является наиболее специфичным, универсальным
в отношении разных видов возбудителей. Определение вирус-
ных антигенов с помощью флюоресцентных антител проводится
прямым и непрямым способами.
Материалом для исследования служат смывы из зева и носо-
глотки больных, а также зараженные смывами клеточные
культуры. Для приготовления препаратов смыв центрифугируют
при 2000—3000 оборотов в течение Ю мин. Из осадка готовят
нативные мазки на нескольких обезжиренных предметных
стеклах для обработки различными флюоресцирующими сыво-
ротками: против вирусов гриппа Al, А2 и В, против вирусов
парагриппа II и III типов, против респираторно-синцитиального
вируса, поливалентной противоаденовирусной сывороткой.
При микроскопии препаратов обращают внимание на светя-
щиеся вирусные частицы, располагающиеся внутри клеток:
аденовирусы — в ядре, вирусы гриппа и парагриппа —в цито-
плазме в виде круглых или овальных мелких образований.
Число светящихся вирусных частиц может быть различным —
от единичных до больших скоплений.
Вирусологическое исследование. Носоглоточные смывы обра-
батывают смесью антибиотиков (пенициллина и стрептомицина
по 1000 ЕД/мл) и центрифугируют. Надосадочной жидкостью
производят заражение куриного эмбриона (для вируса гриппа),
клеточных культур перевиваемых клеток почек обезьян МК-2
(для вирусов гриппа и парагриппа) и клеток НЕР-2 (для аде-
новирусов).
Для приготовления препаратов в пробирки, предназначенные
для клеточных культур, предварительно помещают половинки
покровных стекол. Через 24 ч после заражения при первых
признаках ЦПД вирусов покровные стекла извлекают и обра-
батывают различными флюоресцирующими антисыворотками.
Метод флюоресцирующих антител дает возмож-
ность выявить респираторные вирусы в зараженных клеточ-
ных культурах в более .ранние сроки, чем их индикация по
ЦПД или по гемадсорбции, и при весьма малой инфицирующей
дозе. С помощью иммунофлюоресцентного метода проводится
не только индикация, но и идентификация вирусов парагриппа,
РСВ, аденовирусов и микоплазм в зараженных клеточных
культурах. Кроме того, после накопления в клеточных культурах
можно идентифицировать аденовирусы — в РСК, вирусы пара-
гриппа—в РТГА, РСК и в реакции нейтрализации со специ-
фическими антисыворотками.
Для выделения, пассирования и титрования вирусов гриппа
их культивируют в развивающихся куриных эмбрионах.
Наличие вируса гриппа в амниотической или аллантоисной
234
Рис. 85. Постановка реакции торможения гемагглютинации.
жидкости определяется ориентировочно с помощью РГА.
Вирусы гриппа А хорошо агглютинируют эритроциты курицы,
морской свинки, человека с группой крови I (0); вирусы гриппа
В — эритроциты курицы.
Для титрования вируса в реакции гемагглютинации берут
1% взвесь эритроцитов. Титром вируса считается то наиболь-
шее разведение, при котором наблюдается агглютинация эрит-
роцитов не менее чем на ++ (1 АЕ — одна агглютинирующая
единица).
Штаммы вируса гриппа, выделенные от больных во время
эпидемических вспышек или в межэпидемические периоды,
подлежат изучению с целью определения их серологического
типа. Типирование вируса проводят в РТГА с набором типо-
специфических сывороток. Результаты реакции учитывают по
отсутствию гемагглютинации. Тип вируса (А, В или С) диф-
ференцируют в РСК. Подтипы вируса А с антигенами H0N1,
H1N1, H2N2, H3N2 и др. могут быть дифференцированы в
РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток
(табл. 50 и 51).
Для идентификации Н- и N-антигенов используют моно-
рецепторные сыворотки, полученные отдельно к гемагглюти-
нину и нейраминидазе. При этом идентификация Н-антигена
проводится в РТГА или с помощью реакции иммунопреципи-
тации в геле, а N-антигена —в реакции ингибиции нейрамини-
дазы и реакции иммунопреципитации в геле.
235
Таблица 50. Постановка P ITA для типированвЯ вируса гриппа
Ингредиенты, мл	N> пробирки						
	опытные				контрольные		
	1	2	3	4 ...	1 сыво- ротки	2 виру-  са	3 эритро- цитов
Разведение типо- специфической сыворотки Вирус (4-гемагглю- тинирующие	1 :10 0,2	1 : 20 0,2	1 : 40 0,2	1 :80 и т. д. ОД до титра	0,2	—	-
дозы) Изотонический раствор хлорида	0,2	0,2	0,2	0,2 ...	—	0,2	
натрия	—	—	—	— ...	0,2	0,2	0,2
Экспозиция 60 мин при комнатной температуре
1% суспензия эритроцитов курицы	0,4	0,4	0,4	0,4 ...	0,4	0,4	0,4
Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре
Результаты							
Таблица 51. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа.
Типоспецифиче- ская противогрип- позная сыворотка	Разведение сыворотки					Контроль		
	1 : 10	1 : 20	1 :40	1 :80	1 : 160	сыво- ротки	вируса	эритро- цитов
HONi	—	+	। ।	1 1 1	J 1 1	—	| । ।	—
H1N1	—	+4"	)||	1 1 1	] 1 1	—.	}||	—
H3N2	—	—	—	—	—	—	I 1 1	—
Условные обозначения: I I I | выраженная гемагглютинация
(тонкая пленка из склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид
зонтика); I I I наличие просветов в пленке; ++ наличие пленки с фестонча-
тыми краями из склеившихся эритроцитов; + хлопьевидный осадок эритро-
цитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; — резко
очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля.
236
Таблица 52. Результаты РСК с парными сыворотками больного (1 и 2)
при серодиагностике гриппа и ОРЗ
Диагностикум	Разведение сыворотки					. Контроль сыворотки
	1 : 10	1 :20	1 :40	I : 80	1 :160	
Вирус гриппа А 1	+	+				
(H3N2)	2	+	+	+	+	—	—
Вирус гриппа В 1	+	—	—	—	—	—
2	+	—	—	—	—	—
Аденовирус (полива-						
лентный)	1	+	—	•—	—	—	—
2	+	—	—	—	—	—
РСВ	1	+	—	—	—	—	—
2	+	—	—	—	*-	—
Результаты РТГА (рис. 85, 86), приведенные в табл. 51,
свидетельствуют, что гемагглютинирующая активность иссле-
дуемого вируса нейтрализуется типоспецифической сывороткой
H3N2 в разведениях 1:10—1 :160 (до его титра), т. е. иссле-
дуемый вирус относится к подтипу A(H3N2).
Серодиагностика. Осуществляется с помощью РСК и РТГА
со стандартными диагностикумами, представляющими собой
наборы эталонных штаммов различных серологических типов
вируса гриппа (табл. 52 и 53). РСК более чувствительна, чем
РТГА, и позволяет выявить антитела для всех штаммов одного
и того же серотипа вируса. Диагностическое значение имеет
четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках
Таблица 53. Результаты РТГА с парными сыворотками больного (1 и 2)
при серодиагностике гриппа и парагриппа
Диагностикум	Разведение сыворотки					. Контроль сыворотки
	1 : 10	1 : 20	1 : 40	1 : 80	1 : 160	
Вирус гриппа А 1	—	—								
(H3N2)	2	—	—	—	—	—	—
Вирус гриппа В 1	—	—	—	—-	—	—
2	—	—	—	—	—	—-
Вирус парагриппа! 1	+	—		—	—	—
2	+	+	+	—	—	—
Вирус парагриппа II 1		—	—	—	—	—
2	+	—	—	—	—	—
Вирус парагриппа III 1	+	—	—	—	—	—
2	+	—	—	—	—	—
(в период эпидемии гриппа) и двукратное нарастание в сыво-
ротках больных при характерной клинической картине. Отсутст-
вие нарастания титра антител, однако, не исключает грип-
позной инфекции. РТГА применяется для уточнения антиген-
ных разновидностей вируса в пределах одного серотипа и
подтипа.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Типоспецифические гриппозные сыворотки HON, H1N1, H2N2,
H3N2, В и С. Применяются для серотипирования вирусов
гриппа в РТГА и РСК.
Типоспецифические парагриппозные сыворотки. Используются
для дифференцирования и серотипирования вирусов парагриппа.
Сухие типоспецифические диагностикумы (гриппозный и
парагриппозный). Применяются для серодиагностики соответ-
ствующих инфекций.
Таблица 54. Возбудители иейровирусиых инфекций
Наименование вирусов	Вызываемые заболевания
Энтеровирусы Семейство Picornaviridae Полиовирусы 1,2,3 Вирусы ЕСНО< s е и м и др. Вирусы Коксаки Ат, Ао Вирусы Коксаки Bi—в	Непаралитический полиомиелит (асептический менингит). Парали- тический полиомиелит Асептический менингит Асептический менингит Энцефаломиелокардит у детей
Группа арбовирусов Семейство Togaviridae Вирус клещевого энцефалита Вирус японского	« Вирус омской геморрагической лихорадки Семейство Bunyaviridae Вирус крымской геморрагической лихорадки Семейство Arenaviridae Вирус лимфоцитарного хорио- менингита	Энцефалит, асептический менингит Энцефалит, асептический менингит Геморрагическая лихорадка с крово- течениями и поражениями ЦНС Геморрагическая лихорадка с крово- течениями и поражениями ЦНС Асептический менингит или энце- фаломиелит
Семейство Rhabdoviridae Вирус бешенства	Энцефаломиелит с поражением ней- ронов головного и спинного мозга
238
Живая гриппозная вакцина. Готовится из аллантоисной
жидкости куриных эмбрионов, зараженных вакцинными штам-
мами вируса гриппа основных серотипов, вакцину одного вида
вводят через нос, другую — через рот.
Лечебно-профилактическая поливалентная гриппозная сыво-
ротка. Получена путем гипериммунизации лошадей вирусами
гриппа разных серотипов. Выпускается в сухом виде в смеси
с антибиотиками и сульфаниламидами Применяется интрана-
зально с целью профилактики гриппа и для лечения больных
в самом начале заболевания.
Противогриппозный донорский иммуноглобулин. Готовится
из сыворотки крови доноров, иммунизированных живой грип-
позной вакциной типов А и В. Применяется для профилактики
и лечения гриппа в эпидемических очагах.
Человеческий лейкоцитарный интерферон. Видоспецифиче-
ский белок, синтезированный лейкоцитами человека, находящи-
мися в культуральной среде, в ответ на воздействие вируса-
интерфероногена. Применяется для профилактики и лечения
гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.
Аденовирусные диагностикумы. Применяются для серодиаг-
ностики соответствующих инфекций.
Типоспецифические аденовирусные сыворотки. Используются
для серологического типирования аденовирусов в реакции
нейтрализации и РТГА.
ВОЗБУДИТЕЛИ НЕЙРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Нейровирусные инфекции вызываются представителями раз-
ных семейств, главным образом РНК-содержащих вирусов,
отличающихся друг от друга многими признаками (табл. 54).
К ним относятся тогавирусы, аренавирусы, рабдовирусы, а
также ряд пикорнавирусов, объединенных в род энтеровиру-
сов — вирусы полиомиелита, Коксаки и ECHO, которые первично
репродуцируются в лимфатических узлах тонкой кишки и вы-
деляются с фекалиями. Однако по патогенетическим и клини-
ческим признакам вызываемых ими заболеваний (полиомиелит,
серозные менингиты, менингоэнцефалиты и др.) данные
вирусы можно отнести к возбудителям нейровирусных инфек-
ций. В более редких случаях поражение ЦНС вызывают и ДНК-
содержащие вирусы, например герпесвирусы 1-го и 2-го
типов.
Для лабораторной диагностики нейровирусных инфекций
существенное значение имеет стадия заболевания. Почти во
всех случаях в течение первых 5—6 сут вирус обнаруживается
в крови (стадия вирусемии), после появления неврологических
239
симптомов — в ликворе. При некоторых нейровирусных инфек-
циях, например полиомиелите, вирус выделяется с фекалиями
больного, а при бешенстве —со слюной. Наиболее доступным
методом лабораторной диагностики этих инфекций являются
серологические исследования, которые проводят с помощью
РСК, РТГА, реакции нейтрализации и др. Серологические
реакции всегда ставят не менее чем с двумя сыворотками
крови больного, взятыми в острый период болезни и в стадии
реконвалесценции.
Тема 35. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА НЕЙРОИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ
ПИКОРНАВИРУСАМИ, ФЛАВИВИРУСАМИ, ВИРУСАМИ
БЕШЕНСТВА И ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА
Программа занятия
1.	Изучение схемы диагностики нейровирусных инфекций.
2.	Вирусологическая диагностика полиомиелита.
3.	Серологическая диагностика нейровирусных инфекций.
4.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
гри этих заболеваниях.
Демонстрация
1. Тельца Бабеша — Негри.
2. Диагностйкумы, сыворотки и вакцины, применяемые при диагностике,
лечении и профилактике нейровирусных инфекций.
Задание для выполнения лабораторной работы
1.	Учесть результаты заражения исследуемым материалом культуры клеток.
Отметить наличие и выраженность ЦПД, его характер и наметить план даль-
нейшего вирусологического исследования.
2.	Учесть результаты идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации
со специфическими иммунными сыворотками. Сделать заключение на основании
полученных данных.
3.	Оценить результаты титрования вируснейтрализующих антител в парных
сыворотках больного к эталонным штаммам энтеровирусов. Сделать заклю-
чение.
4.	Учесть результаты РСК с парными сыворотками больного энцефалитом и
обосновать серологический диагноз заболевания.
Методические указания
Вирусологическая и серологическая диагностика
полиомиелита и инфекций, вызванных вирусами
Коксаки и ECHO
Материал для исследования: фекалии, смывы из зева, ликвор.
В первые 10 дней заболевания энтеровирусы выделяются с
240
фекалиями и только в течение первых 3 дней обнаруживаются
в носоглоточном отделяемом.
Вирусологическое исследование. Испражнения больного со-
бирают в стерильный флакон троекратно на протяжении
первых 3—5 дней заболевания. Для уничтожения много-
численной бактериальной флоры обрабатывают их анти-
биотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержа-
щая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса)
в течение суток при 4°С, после чего проводят контрольный
высев на стерильность. При отсутствии бактерий суспензию
испражнений используют для заражения клеточных культур,
а при сохранении бактериальной флоры повторно обрабатывают
теми же антибиотиками. Заражают одновременно по 2—3
пробирки с первичной культурой клеток (фибробластов эмбриона
человека или почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток
(линии HeLa, амниона человека и др.), поскольку одни виды
энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие —
в перевиваемых клетках. Обычно на 2—3-й день после инку-
бации зараженных клеточных культур при 35° С наблюдается
полная или частичная дегенерация клеток. При этом интенсив-
нось ЦПД зависит от многих причин: дозы вируса, вида и
состояния культуры клеток и др. В случае слабовьфаженного
или полного отсутствия ЦПД проводят дополнительно 2—3
пассажа. При отрицательном результате исследование прекра-
щают, при положительном—приступают к идентификации выде-
ленного цитопатогенного агента (вируса). Исследуемый вирус
предварительно титруют в той же клеточной культуре, на
которой он был выделен. Для реакции нейтрализации берут
100 ЦПД50 данного вируса (за 1 ЦПДво, принимают максималь-
ное разведение вируса* вызывающее дегенерацию не менее
50% клеток культуры).
Идентификацию энтеровирусов проводят путем
серотипирования в реакции нейтрализации в культуре клеток.
С этой целью используют смеси диагностических моновалент-
ных сывороток или стандартные поливалентные сыворотки,
а затем соответствующие моновалентные сыворотки. Вначале
устанавливают принадлежность исследуемого агента к вирусам
полиомиелита, Коксаки или ECHO в реакциях нейтрализации
с поливалентными сыворотками к каждой из трех упомянутых
групп вирусов. Так, если нейтрализация исследуемого вируса
произошла с поливалентной сывороткой Коксаки, то на следую-
щем этапе ставят реакцию нейтрализации с моновалентными
сыворотками к каждому серотипу данного вируса (табл. 55—57).
Некоторые серотипы вирусов ECHO (3, 6, 7), Коксаки А
(20, 21), Коксаки В (1—5), обладающие гемагглютинирующими
241
Таблица 55. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных
вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита
I—III типов
Тип сыворотки к вирусам по- лиомиелита	День учета						Контроль .сыворотки	Тип выделен- ного вируса полиомиелита
	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й	7-й		
I												1
II	—	—	+	1 1 1	++++	-н-н-	—	
III	—	—	++	1 1 1	++++	++++	—	
Контроль								
вируса	—	+	 +4-	1 1 1	-н-н-	-н-н-		
Условные обозначения: Н-Н I выраженная дегенерация клеток
с их отслаиванием от стенок пробирки; I I I менее выраженная дегенерация
клеток с частичным отслаиванием от стенок пробирки; ++ наличие не более
50% дегенерированных клеток; + наличие одиночных дегенерированных кле-
ток; — отсутствие ЦПД.
Таблица 56. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных
вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам Коксаки
свойствами, типируют в РТГА. Для выделения вирусов Коксаки
А, которые плохо репродуцируются в клеточных культурах,
заражают новорожденных белых мышей, у которых на 3—5-й
день развиваются вялые параличи. Идентификацию этих вирусов
проводят в реакции нейтрализации на новорожденных мышах
с моновалентными диагностическими сыворотками против
серотипов вирусов Коксаки А.
242
Таблица 57. Результаты реакции нейтрализации вируса моновалентными
иммунными сыворотками против 9—16-го типов вирусов ECHO
Тип сыворотки к вирусам ECHO			День учета				Контроль	Тип выделен- ного вируса
	2-й	3-й	4-й	5-й	6-й	7-й		
9 11 12- 13 14 15 16	-	+ + + +	:ФФФ । +	4-Н-		-н-н- -н-н- -н-н-	-	11
	-		+++		-н-н-	++++	-	
Контроль вируса	—	++	+-Н-	4-Н-	-н-н-	-н-н-	-	
Условные обозначения те же, что и в1 табл. 55.
Таблица 58. Результаты реакции нейтрализации с парными сыворотками крови
больного и антигенами — вирусами Коксаки Вз и Bs
Сроки взятия сыво- ротки крови после начала заболе- вания, дни	Вирус	Разведение сыворотки						Конт- роль сыво- ротки	Титр антител	Крат- ность нарас- тания титра
		1:4	1:16	1:64	1:256	1:512	1:1024			
3	Кокса-									
	киВз	—	-Н-Н-	-н-н-	-н-н-			—	1:4	|	64
20	То же	—	—	—	—	++++	-н-н	—	1: 256|	
3	Кокса-									
	ки Bs	—	—	-н-н-	++++	-н-н-	++++	—	1:161	о
20	То же	—	—	-н-н-	-н-н-	-н-н-	-н-н-	—	1:16 1	
Условные обозначения те же, что и в табл. 55.
Серодиагностика. Ретроспективный метод лабораторной
диагностики, поскольку ответ обычно дается после выздоровле-
ния или смерти больного. Серодиагностика энтеровирусных
инфекций основана не на абсолютных показателях титра
антител в исследуемой сыворотке, а на его увеличении не менее
чем в 4 раза в процессе заболевания. С этой целью кровь
у больного берут 2 раза: в первые дни болезни и вторично
через 3—4 нед. Сыворотку первой пробы крови сохраняют в
243
холодильнике, и реакцию ставят одновременно с обеими
сыворотками.
Для серодиагностики применяют реакцию нейтрализации
в культуре клеток с эталонными штаммами тех типов энте-
ровирусов, которые чаще всего выделяют от больных. Выбор
эталонных штаммов зависит от эпидемиологической обстановки
и клинических симптомов заболевания. Эталонный вирус берут
в количестве 100 ЦПД. Парные сыворотки разводят с коэф-
фициентом 4: от 1/4 до 1/1024 (табл. 58). Серодиагностику
заболеваний, вызванных гемагглютинирующими типами вирусов
Коксаки и ECHO, проводят в РТГА.
Серологическая диагностика клещевого энцефалита
и хронического менингоэнцефалита
Экспресс-диагностика. Для определения зараженности клещей
используют иммунофлюоресцентный метод (мазки-отпечатки)
и РПГА со взвесью исследуемого материала и эритроцитами,
нагруженными антителами к вирусу клещевого энцефалита.
Предварительный ответ получают спустя 2—3 ч.
Серодиагностика. Проводится в реакции нейтрализации,
РСК и РТГА со стандартными вирусными антигенами и пар-
ными сыворотками больного, взятыми в начале болезни и через
5—7 нед. Постановка реакции требует соблюдения мер безопас-
ности вследствие возможного присутствия вируса в исследуемых
пробах крови больного в острый период заболевания. Оценка
результатов серологических реакций производится с учетом
анамнестических данных (ревакцинация, введение противоэнце-
фалитного иммуноглобулина).
Лабораторная диагностика бешенства
Прижизненная диагностика бешенства у людей не раз-
работана. Лабораторная диагностика бешенства у животных
(собак и др.) проводится постмортально по обнаружению
включений: телец Бабеша—Негри. Морфологическому исследо-
ванию подлежат срезы аммонова рога и мозжечка. Выявление
включений с несомненностью подтверждает диагноз бешенства,
а их отсутствие не исключает его. Тельца Бабеша—Негри
имеют округлую или овальную форму, размеры 4—10 нм, окру-
жены оболочкой, содержат от 1 до 15 зернышек разной вели-
чины. В большинстве случаев включения окрашиваются в
красный цвет на голубом фоне цитоплазмы (рис. 87).
Широкое распространение в лабораторной диагностике бешен-
ства получил иммунофлюоресцентный метод.
244
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Поливалентная и типоспецифические полиомиелитные сыворот-
ки I—III типов. Применяются для типирования вирусов поли-
миелита.
Поливалентные и типоспецифические (моновалентные) сыво-
ротки Коксаки и ECHO. Применяются для дифференцировки
и типирования соответствующих вирусов.
Пероральная живая вакцина против полиомиелита. Содержит
аттенуированные штаммы вирусов полиомиелита I—III типов,
выращенных на культуре клеток почек африканских зеленых
мартышек. Вакцина выпускается в жидком виде и в форме
драже для перорального применения.
Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получается путем
фракционирования крови человека (донорской, плацентарной
или абортивной), содержащей антитела. Применяется для
профилактики и лечения полиомиелита.
Диагностические эталонные типоспецифические сыворотки
против вируса клещевого энцефалита и других арбовирусов.
Получены путем иммунизации животных определенными арбо-
вирусами или используются сыворотки людей, переболевших
соответствующей арбовирусной инфекцией. В каждом случае
предварительно устанавливают титр антител.
Диагностикум из вируса клещевого энцефалита. Готовится
из мозга мышей, зараженных выделенным вирусом, прошедшим
1—2 пассажа на мышах. Применяется для постановки РСК.
Инактивированная культуральная вакцина против клещевого
энцефалита. Стерильный культуральный специфический антиген
вируса клещевого энцефалита, инактивированного формалином.
Применяется для профилактики энцефалита у населения и
персонала лабораторий в природных очагах по эпидемиологи-
ческим показаниям.
Иммуноглобулин против клещевого энцефалита. Содержит в
высоком титре специфические противовирусные антитела,
которые извлекают из сыворотки крови лошадей, гипериммуни-
зированных вирусом клещевого энцефалита. Данный иммуно-
глобулин применяют для лечения и профилактики клещевого
энцефалита.
Сухая антирабическая вакцина Ферми. Изготовляется из мозга
овец в возрасте до 1 года, зараженных вирусом бешенства,
и выпускается в сухом виде. Антирабические вакцины вводят
лицам, укушенным больными или подозрительными на бешен-
ство животными. Прививки проводят по специальной инструк-
ции. Антирабические вакцины обладают высокой эффектив-
245
Таблица 59. Возбудители вирусных кишечных инфекций и гепатита
Наименование вирусов	Вызываемые заболевания
Семейство Picornaviridae' Энтеровирусы ECHO к, ш ЕСНОг, 5, В, 9, 22 и др. Вирус гепатита (HAY)	Вспышки энтерита у детей младшего возраста Спорадические случаи энтерита Инфекционный гепатит
Семейство Reoviridae Рсовирусы Ротавирусы	Энтериты у детей Энтериты и гастроэнтериты у детей младшего возраста
Семейство Coronaviridae Коронаварусы	Г астроэнтериты
Семейство Hepatoviridac Вирус гепатита В (HBY)2	Сывороточный гепатит
1 В редких случаях гепатит вызывается вирусами Коксаки, желтой лихо-
радки, краснухи, герпеса.
2 В отличие от перечисленных РНК-содержащих вирусов HBv содержит
ДНК.
ностью и проверены многолетней практикой. Поствакциналь-
ный иммунитет развивается через 2 нед и сохраняется в тече-
ние 6 мес.
Антирабический иммуноглобулин. Получен путем гиперим-
мунизации лошадей фиксированным вирусом. Вводится не
позднее 72 ч после укуса животного в сочетании с антира-
бическими вакцинами. Препарат обезвреживает вирус уличного
бешенства и предупреждает поствакцинальные энцефалиты.
ВОЗБУДИТЕЛИ КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
Возбудители кишечных вирусных инфекций относятся к
разным семействам РНК- и ДНК-содержащих вирусов (табл. 59).
Они объединены в одну группу на основании их общей способ-
ности проникать в организм фекально-оральным путем, вызы-
вать поражения преимущественно органов желудочно-кишеч-
ного тракта, а также на основании общих принципов лабора-
торной диагностики.
246
Основным материалом для исследования служат испражнения,
а также (с учетом возможных входных ворот инфекции и
клинических проявлений) мазки со слизистой оболочки полости
рта (ящур) или носоглотки (вирусы Коксаки, ECHO). Учитывая
способность большинства вирусов этой группы вызывать виру-
семию, в качестве материала для исследования используют
кровь (особенно при вирусном гепатите).
Вирусологические методы с выделением и идентификацией
возбудителя используют при кишечных вирусных инфекциях
для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, вызы-
ваемых энтеровирусами, вирусами ящура.
Для лабораторной диагностики гепатита применяют сероло-
гические методы исследования сывороток крови больных,
контактировавших с ними лиц, переболевших, доноров с целью
выявления специфических антигенов и антител вируса гепа-
тита В.
Тема 36. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ
ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ВИРУСНОГО
ГЕПАТИТА
Программа занятия.
1.	Изучение схемы диагностики энтеровирусных инфекций.
2.	Вирусологическая диагностика.
3.	Серодиагностика вирусного гепатита В.
4.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при этих заболеваниях.	•
Демонстрация
1.	Реакция преципитации в агаре (двойная диффузия в геле по Оухтерлони)
для обнаружения антител (anrn-HBs) в сыворотке крови больного вирусным
гепатитом В.	,
2.	Метод встречного электрофореза для выявления антигенов- и антител
в сыворотке больных вирусным гепатитом В.
3.	Иммуноглобулины, диагностикумы, диагностические моно- и поливалент-
ные сыворотки.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Учесть результаты выявления специфических антигенов и антител в сыво-
ротке больного гепатитом В методом преципитации в агаре.
2. Оценить результаты серодиагностики вирусного гепатита В.
Методические указания
Вирусологические и серологические методы диагностики
энтеровирусных инфекций (вирусы Коксаки и ECHO) описаны
в разделе «Возбудители нейровирусных инфекций». В сыворотке
крови людей, заболевших гепатитом В, через 3—5 нед после
247
инфицирования обнаруживается HBS-антиген (австралийский
антиген). Исчезновение этого антигена совпадает с началом
выздоровления или предшествует ему; персистирование вируса
в большинстве случаев сопутствует хроническому течению
гепатита. Антитела к HBS-антигену значительно реже выявля-
ются при остром вирусном гепатите В.
Самым распространенным методом определения антигена
и антител является преципитация в агаре (реакция двойной
диффузии в геле по Оухтерлони). Преимуществами данной
реакции являются относительная простота, высокая специфич-
ность, отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных
ответов, небольшой расход материалов и возможность опре-
деления полноты антигенной идентичности. Недостатками
реакции являются низкая чувствительность, длительность:
получение предварительного ответа через 24 ч, а окончатель-
ного—лишь спустя 48—72 ч. Для исследования берут кровь
больного в количестве, необходимом для получения 0,3 мл
сыворотки. Реакции ставят на пластинах, в 1% агаре, в котором
вырезают лунки для ингредиентов реакции. В качестве тест-
системы используют стандартный австралийский антиген и
соответствующую специфическую антисыворотку. Учет реакции
проводят через 1—3 дня по появлении дуг преципитации
между лунками.
Реакция встречного электрофореза в агаровом геле по чув-
ствительности не отличается от реакции преципитации, но
несколько уступает ей по специфичности, однако значительно
превосходит ее по скорости получения результатов: в течение
2 ч можно одновременно исследовать около 200 сывороток.
РСК обладает сравнительно более высокой чувствительнос-
тью, но ее использование ограничивается часто встречающейся
антикомплементарной активностью сывороток крови больных.
Для серодиагностики вирусного гепатита В наиболее чувст-
вительной и специфичной является РПГА, однако эта реакция
требует затраты больших количеств тест-системы.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
Тест-система для серодиагностики гепатита В: стандартный
австралийский антиген и соответствующая специфическая анти-
сыворотка.
Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получается из
крови человека (донорской, плацентарной) путем фракциони-
рования. Применяется для профилактики и лечения вирусного
гепатита.
248
ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ МИКОЛОГИЯ
Тема 37. МОРФОЛОГИЯ ГРИБОВ
Программа занятия
1. Морфология плесневых грибов, дрожжеподобных грибов.
2. Методы изучения морфологии грибов.
Грибы —растительные организмы, имеющие как макро-, так
и микроскопические размеры и характеризующиеся следую-
щими основными свойствами: наличием дифференцированного
ядра, отсутствием хлорофилла, размножением спорами, нали-
чием у большинства видов вегетативных органов — гифов,
которые, переплетаясь, образуют мицелий. У грибов различают
субстратный мицелий, погруженный в питательную среду, и
мицелий воздушный, растущий на ее поверхности. Многие
грибы имеют септированный (многоклеточный) мицелий, гифы
которого разделены внутренними перегородками — септами;
для других грибов характерен несептированный мицелий.
Споры грибов располагаются внутри мицелия (эндоспоры)
или вне его (экзоспоры). Среди гифов выделяют так назы-
ваемые плодоносящие (спороносные) гифы. Так, например,
у мукоровой плесени (Мисог) плодоносящие гифы —споран-
гиеносцы, на конце имеют расширение: спорангии, внутри
которых находятся эндоспоры (рис. 88). Плодоносящие гифы
грибов рода Aspergillium и Penicillium называются конидие-
носцами. На их концах имеются небольшие клетки —сте-
ригмы, на которых свободно располагаются цепочки кони-
дий (экзоспоры). У некоторых грибов споры покрыты толстой
двухконтурной оболочкой (хламидоспоры) и располагаются
внутри нити мицелия или на ее конце. Существуют и другие
типы спор, отличающиеся друг от друга по происхождению,
структуре и расположению в мицелии гриба. Дрожжевые грибы
представляют собой крупные клетки овальной, шаровидной и
палочковидной формы; они не образуют мицелия и размно-
жаются различными путями: почкованием, делением, половым
путем и эндоспорами, которые располагаются в особых сумках
(асках) и называются аскоспорами. Бластоспорами называют
экзоспоры дрожжевых или других грибов, образующиеся в ре-
зультате почкования материнской клетки. Однако при раз-
249
Рис. 88. Мукоровая плесень (Mucor).
множении клетки дрожжеподобных грибов располагаются
цепочками и вытягиваются в длинные нити — псевдо мицелий.
Демонстрация
1. Методика приготовления препаратов из культур грибов.
2. Препараты дрожжеподобных грибов, окрашенные метиленовым синим.
Задание для выполнения лабораторной работы
Определить родовую принадлежность плесневых грибов на основании
особенностей строения мицелия, плодоносящих гифов и спор, пользуясь табл. 60.
Методические указания
При приготовлении препарата «раздавленная» капля препа-
ровальными иглами отделяют небольшой участок мицелия с
плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем
питательной среды. Материал помещают в каплю воды на
предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавливают
покровным стеклом и микроскопируют при опущенном кон-
денсоре. Препарат просматривают с объективом 8, а затем
250
Таблица 60. Морфологические признаки плесневых грибов
Род	Мицелий	Плодоносящие гифы	Тип спор	Расположение спор
Mucor	Несептиро- ванный	Несептирован- ный спорангие- носец	Эндоспоры	В спорангии
Aspergil- lus	Септиро- ванный	Несептирован- ный конидиено- сец	Экзоспоры (конидии)	В виде	Свободное «лейки» на концах В виде 1 ответвлений «кисточек»} плодонося- J щих гифов
Penicil- liura	То же	Септированный конидиеносец	То же	
с объективом 40. Предварительно колонии или культуры грибов
микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках
под малым увеличением.
Лабораторная диагностика микозов
Заболевания, вызываемые грибами (myces), — микозы, чрез-
вычайно разнообразны как по биологическим особенностям их
возбудителей, так и по патогенезу и клинике. Раздел микро-
биологии, занимающийся изучением патогенных грибов,
называется медицинской микологией.
Среди патогенных грибов можно выделить следующие груп-
пы: 1) дерматофиты — возбудители эпидермикозов' (дерматоми-
козов) — заболеваний кожи и ее придатков (волосы, ногти);
2) грибы рода Candida — возбудители кандидозов — заболеваний
кожи и слизистых оболочек, иногда внутренних органов;
3) криптококки, гистоплазмы, бластомицеты, кокцидиоиды, а
также плесневые грибы — возбудители глубоких микозов,
поражающие различные органы и ткани.
Микробиологическая диагностика микозов осуществляется
главным образом путем микроскопического и культурального
исследований. Идентификацию и дифференцирование выделен-
ной чистой культуры гриба проводят по морфологическим,
культуральным и биохимическим признакам и в некоторых
случаях —по антигенной структуре. Определение патогенных
свойств грибов в опытах на животных во многих случаях не
удается. Серодиагностика разработана не для всех микозов.
Аллергические пробы самостоятельного значения не имеют,
так как аллергены, полученные из грибов, недостаточно
специфичны.
251
Тема 38. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ДЕРМАТОМИКОЗОВ И КАНДИДОЗОВ
Дерматофиты являются возбудителями фавуса, трихофитии,
микроспории и эпидермофитии. Они принадлежат к группе
несовершенных грибов. Заражение происходит при непосред-
ственном контакте с больными людьми и животными, а также
через игрушки, банные принадлежности, головные уборы и
другие вещи.
Возбудителями кандидозов являются грибы рода Candida,
обитающие на коже и слизистых оболочках человека, а также
домашних птиц и некоторых животных, на плодах, ягодах.
Программа занятия
1.	Изучение схемы микробиологической диагностики кандидозов.
2.	Микроскопические, культуральные и серологические методы диагностики
грибковых заболеваний.
3.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые
при микозах.
Демонстрация
1.	Препараты из чистых культур грибов рода Candida.
2.	Мазки из патологического материала от больных, пораженных кандидо-
зом (окраска генциановым фиолетовым).
3.	Типы филаментации грибов рода Candida на картофельном агаре.
4.	Колонии патогенных грибов на плотной питательной среде.
5.	РСК, и реакции агглютинации при серодиагностике висцерального
кандидамикоза.
6.	Диагностические, профилактические и лечебные препараты: а) грибковые
антигены для серологических реакций; б) грибковые аллергены; в) противо-
грибковые антибиотики: нистатин, леворин, гризеофульвин.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Микроскопическое исследование при дерматомикозах: из пораженных
волос, кожных чешуек приготовить препарат для микроскопии и поставить
микроскопический диагноз заболевания трихофитии, микроспории, фавуса или
эпидермофитии.
2. Определить видовую принадлежность дрожжеподобного гриба рода
Candida на основании морфологии клеток и колоний, типа филаментации и био-
химических свойств.
Методические указания
Микроскопическое исследование. Для приготовления пре-
парата на предметное стекло наносят каплю 10% едкой щелочи
или спирта с глицерином, в которую помещают 2—3 подо-
зрительных волоса или несколько кожных чешуек, или беловатые
влажные налеты со слизистых оболочек. Препарат (со щелочью)
252
Рис. 89. Дерматофиты в пораженном волосе.
1 - Microsporon; 2 - Trichophyton; 3 - Achorion.
осторожно подогревают над пламенем до появления белого
ободка из кристаллов щелочи по периферии капли, не доводя
ее до кипения. Затем каплю накрывают покровным стеклом
и рассматривают под микроскопом с объективом 8 и 40.
При ф а в у с е в волосе обнаруживают полиморфные гриб-
ковые элементы. Наряду с тонким мицелием встречается мице-
лий широкий, состоящий из прямоугольных клеток. Часто
наблюдаются споры круглой или прямоугольной формы, а
также пузырьки воздуха (рис. 89).
При трихофитии локализация элементов гриба в
патологическом материале может быть различной. Споры гриба
Trichophyton либо располагаются только внутри пораженного
волоса, сплошь заполняя его содержимое (эндотрикс), либо
253
несколькими слоями окружают волос снаружи в виде чехла
(эктотрикс), либо споры и мицелий находятся как внутри, так
и снаружи волоса (эндоэктотрикс).
При микроспории волос в фолликулярной части окру-
жен «чехлом» из мозаично расположенных мелких спор гриба.
Внутри волоса обнаруживаются фрагменты гриба и споры.
При эпидермофитии элементы гриба содержатся в че-
шуйках кожи, где располагаются в виде толстых септирован-
ных ветвящихся нитей мицелия наряду со спорами многогран-
ной формы.
При кандидозах в патологическом материале видны
одноклеточные грамположительные микроорганизмы круглой и
овальной формы, не образующие истинных спор и истинного
мицелия. Грибы рода Candida формируют псевдомицелий,
который отличается от истинного отсутствием общей оболочки
и перегородок и состоит из длинных тонких клеток, сопри-
касающихся друг с другом узким основанием. Для установления
диагноза кандидоза необходимы многократные количественные
Высевы патологического материала на агаровую среду в чашки
Петри. Нарастающее количество колоний, обнаруженных в посе-
вах, а также антител в сыворотке крови подтверждает диагноз.
Культуральное исследованне. Проводится для установления
родовой и видовой принадлежности возбудителя путем выделе-
ния чистой культуры гриба и изучения его биологических
свойств. Материал предварительно обрабатывают кислотами
или антибиотиками. Затем делают посев на сахарный питатель-
ный агар, сусло-агар (готовится из неохмеленного пивного сусла),
агар Сабуро (пептонная вода с мальтозой и агаром), овощные
среды (Морковный агар), куда добавляют антибиотики для
задержки роста бактериальной флоры. Посевы инкубируют при
ЗО°С. В положительных случаях рост наблюдается на 3—5-е
сутки в виде разнообразных колоний; гладких, морщинистых,
мучнистых, пушистых, часто пигментированных. При микроско-
пии препаратов, приготовленных из культур, хорошо заметен
развитой, широко ветвящийся септированный мицелий. Органа-
ми размножения служат споры, которые могут быть как внутрен-
ними (эндоспоры), расположенными внутри мицелия, так и
наружными (экзоспоры), расположенными на концах или по
сторонам нитей мицелия. Специальных органов плодоношения
типа асков (сумок) у дерматофитов не обнаружено, что дало
основание отнести их к несовершенным грибам —Fungi imper-
fecti.
Грибы рода Candida на 2—3-й день после посева образуют
мелкие выпуклые колонии, которые нередко сливаются в мощ-
ные образования, врастающие в среду. Идентификацию грибов
254
1
Рис. 90. Типы роста (филаментации) дрожжеподобных грибов рода Candida.
1 - mycotorula; 2 - mycotoruloides; 3 - Candida; 4 - mycocandida.
рода Candida проводят на основании данных микроскопии
патологического материала, культуральных признаков, биохи-
мической активности, типов роста — филаментации (рис. 90) и
1 патогенности, которую определяют при заражении лабораторных
животных.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
ГЛУБОКИХ (СИСТЕМНЫХ) МИКОЗОВ
Возбудителями глубоких микозов являются грибы; Cryptococ-
cus neoformans, вызывающие криптококкоз. Histoplasma
capsulatum — гистоплазмоз. Coccidioides immitis — кокцидиоидоз,
Blastomyces dermatitidis — бластомикоз и др. Микробиологиче-
ская диагностика проводится путем микроскопического ис-
следования, при котором выявляются характерные морфологи-
ческие особенности возбудителя, и путем микологического
исследования, т. е. выделения чистой культуры гриба.
Диагностические, профилактические и лечебные
препараты
.	Кандидозный антиген — взвесь двухсуточной агаровой куль-
:	туры грибов рода Candida в изотоническом растворе хлорида
натрия. Применяется для постановки реакции агглютинации
г	при кандидозах.
Кандидозный антиген для РСК — спиртоводный экстракт из
а	культуры грибов рода Candida. Применяется для постановки
РСК и кожно-аллергических проб при кандидозах.
Противогрибковые антибиотики: нистатин, леворин, гри-
зеофульвин, амфотерицин В.
255
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие..................................................... 3
ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ............................................. 5
Микробиологические лаборатории и их оборудование................ S
Морфология микроорганизм ои.................................... 20
Асептика и антисептика. Дезинфекция	.....	36
Физиология микроорганизмов......................................  42
Антибиотики....................................................   75
Микроорганизмы окружающей среды и санитарно-бактериологические ме-
тоды их обнаружения ...	...	.......... 79
ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ........................................  96
ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ............................ 126
Микробиологическая и иммунологическая диагностика иажнейших инфек-
ционных заболеианий и клиническая микробиология............... 126
Возбудители раневой и гнойной инфекции . .	............... 131
Возбудители воздушно-капельных инфекций....................... 149
Возбудители кишечных инфекций, пищевых токсикоинфекций и интокси-
каций ....................................... ...	175
Возбудители зоонозных инфекций ...	....	198
Возбудители кровяных и трансмиссивных инфекций (спирохетозов и
риккетсиозов) ...	...	215
Возбудители венерических заболеваний.......................... 220
Возбудители респираторных вирусных инфекций	.	230
Возбудители нейровирусных инфекций............................ 239
Возбудители кишечных вирусных инфекций ...	246
ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ МИКОЛОГИЯ.............................. .	249
Леонил Борисович Борисов, Борис Николаевич Козьмин-Соколов,
Ирина Соломоновна Фрейллии, Зинаида Федоровна Федорова
РУКОВОДСТВО К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ
Зав. редакцией С. Д. Крылов. Редактор А. М. Смирнова. Редактор издательства В. Ю. Лернер.
Художественный редактор С. М. Лымина. Оформление художника В. С. Сергеевой.
Технический редактор В. П. Сорокина. Корректор II. Л. Кузнецова
ИБ № 3548
Сдано в набор 21.09.83. Подписано к печати 16.03.84 Т-02470. Формат бумаги 84 X 108'/зг.
Бумага кн. журн. Гарнитура Таймс Печать высокая. Усл. печ. л. 14,28. Усл. кр.-отт. 16,80.
Уч.-изд. л. 15,83.Тираж 50 000 экз. Заказ 639.Цена 90 к.
Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Медицина»
103062 Москва, Петроверитский пер.. 6/8
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014, Ярославль, ул. Свободы, 97